ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ Ε ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΩΜΑΣ ΓΕΡΑΣΙΜΙΔΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ Ε ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΩΜΑΣ ΓΕΡΑΣΙΜΙΔΗΣ ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ Αριθμ.2052 ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΟΞΕΙΑΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ - ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΤΩ ΑΚΡΩΝ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΙΙΙ ΣΤΟ ΗΠΑΡ (ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ) ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ Γ. ΚΑΡΑΜΑΝΟΥ ΙΑΤΡΟΥ-ΑΓΓΕΙΟΧΕΙΡΟΥΡΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Καθηγητής Νικόλαος Ντόμπρος ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΥ ΤΟΜΕΑ Καθηγητής Θωμάς Γερασιμίδης 3

4

5 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Θ. ΓΕΡΑΣΙΜΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) Δ. ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΜΩΡΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Θ. ΓΕΡΑΣΙΜΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Δ. ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΜΩΡΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΠΑΠΑΓΕΩΡΓΙΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. ΚΟΥΖΗ-ΚΟΛΙΑΚΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΣΑΡΑΤΖΗΣ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α. ΚΑΜΠΑΡΟΥΔΗΣ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, άρθρ και ν.1268/82, άρθρ.50 8). 5

6

7 Στη μητέρα μου, που μου μαθε να επικοινωνώ με τα μάτια 7

8

9 Στον πατέρα μου, που μου έδειξε ότι ο άνθρωπος αλλάζει, αρκεί να αγαπάει και να έχει υπομονή 9

10

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 13 Α.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.ΗΠΑΡ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Ενδοθηλιακά κύτταρα Αρτηριόλια Τριχοειδή Μετα-τριχοειδή φλεβίδια Αγγειακά αποτελέσματα υποξίας Ο ρόλος των λευκών αιμοσφαιρίων Φαινόμενο μη-επανακυκλοφορίας Δραστικές μορφές οξυγόνου Ο ρόλος του συμπληρώματος Απομακρυσμένα αποτελέσματα ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ Μυοκάρδιο Αρρυθμίες Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Γαστρεντερικό Σύστημα Σύνδρομο Πολυοργανικής Δυσλειτουργίας ΘΕΡΑΠΕΙΑ Λευκά αιμοσφαίρια Ισχαιμική προετοιμασία Αντιοξειδωτικοί παράγοντες Αναστολείς συμπληρώματος ΙΣΧΑΙΜΙΑ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ ΗΠΑΤΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΗ ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Σχηματισμός 50 11

12 4.1.2 Βασικές χημικές ιδιότητες ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Γενικά Σχηματισμός ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΩΣΗΣ Γενικά Μαλονική διαλδεΰδη (MDA) ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΙΙΙ Εισαγωγή Ιδιότητες και τρόπος δράσης Κλινικές εφαρμογές Σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης και ΑΤΙΙΙ. 60 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6. ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ Πειραματόζωα Πρόκληση ισχαμίας Ομάδες Πειραματική διάταξη Πειραματικοί χρόνοι Τεχνική επεξεργασίας των δειγμάτων Βιοχημικοί και αιματολογικοί παράμετροι Οπτικό μικροσκόπιο Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Μαλονική διαλδεΰδη (MDA) ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΗΠΑΤΟΣ ΕΠΙΜΥ 72 9.ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΕΙΚΟΝΕΣ ΠΙΝΑΚΕΣ-ΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η οξεία ισχαιμία των ιστών διαφόρων συστημάτων του οργανισμού αποτελεί πεδίο έρευνας εδώ και πολλά χρόνια. Παρά τις προόδους που έχουν γίνει αρκετά σημεία εξακολουθούν να είναι αδιευκρίνιστα κεντρίζοντας το ενδιαφέρον για νέες μελέτες. Η διακοπή παροχής αίματος στους σκελετικούς μυς συνοδεύεται από μία σειρά μεταβολικών διαταραχών που εξαρτάται από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Η δαικοπή αυτή μπορεί να οφείλεται σε τραυματισμούς ή σε θρομβοεμβολικά επεισόδια ή να προκαλείται και διεγχειρητικά όπως πχ. σε αποκλεισμό της κοιλιακής αορτής ή άλλων αρτηριών κατά τη διάρκεια επεμβάσεων (μεταμοσχεύσεις, αρτηριακές παρακάμψεις κτλ). Η έγκαιρη αποκατάσταση της ροής αίματος σε ένα ισχαιμικό μυ είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μη-αναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Προσφέρει το απαιτούμενο οξυγόνο που είναι απαραίτητο για τις μεταβολικές διεργασίες, ταυτόχρονα ό- μως παράγονται διάφορα τοξικά προϊόντα με τοπική και συστηματική βλαπτική επίδραση. Έτσι, η ίδια η επαναιμάτωση,αυτή καθ' εαυτή,μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών, συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Το ήπαρ, θέση μεταβολισμού και παραγωγής πολλών ουσιών, είναι ένα από τα απομακρυσμένα όργανα - στόχος που δυνητικά υφίστανται βλάβη κατά την ισχαιμία και επαναιμάτωση των μυών. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ φαίνεται ότι συμβάλλει στην προστασία των ιστών όταν αυτά επαναιματώνονται μετά από περιόδους ισχαιμίας. Στην παρούσα πειραματική μελέτη αναπτύσσονται βασικές έννοιες που σχετίζονται με την ιστολογία και φυσιολογία του ήπατος καθώς και στοιχεία από την παθοφυσιολογία του συνδρόμου της ισχαιμίας και επαναιμάτωσης με βάση τη διεθνή έρευνα και τη μέχρι τώρα διαθέσιμη βιβλιογραφία. Ακολούθως περιγράφεται η αντιθρομβίνη ΙΙΙ και ερευνάται η πιθανή της προστατευτική δράση στο ήπαρ μετά από ισχαιμία και επαναιμάτωση των κάτω άκρων. Το πειραματικό μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε στο πειραματικό χειρουργείο της Ε' Χειρουργικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στο Ιπποκράτειο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης με τις προβλεπόμενες άδειες από την Κτηνιατρική Υπηρεσία. Ευχαριστώ ιδιαίτερα θερμά το δάσκαλό μου στην Αγγειοχειρουργική, Καθηγητή κ.θωμά Γερασιμίδη, τόσο για την τιμή να μου αναθέσει την εκπόνηση της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής, όσο και για το ενδιαφέρον με το οποίο επό- 13

14 πτευσε την όλη εργασία, έλεγξε την ορθή εκτέλεση της και βοήθησε αποτελεσματικά στη διαμόρφωση της. Επίσης, τον ευχαριστώ εγκάρδια για τη θεωρητική και πρακτική χειρουργική κατάρτιση που μου πρόσφερε καθώς και για τις ερευνητικές και επιστημονικές ανησυχίες που μου μετέδωσε. Η ηθική του συμπαράσταση υπήρξε αμέριστη σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής, ενώ η συνεχής παρότρυνση του για την ενασχόλησή μου με θέματα της ιατρικής επιστήμης και της χειρουργικής ειδικότητας με βοήθησε να εμβαθύνω τις γνώσεις μου και να πλατύνω τον ορίζοντα και την κρίση μου ώστε να μπορέσω να δημιουργήσω μία ολοκληρωμένη ιατρική, επιστημονική αλλά κυρίως ανθρώπινη σκέψη και προσωπικότητα. Στον Επίκουρο Καθηγητή κ. Απόστολο Καμπαρούδη οφείλω να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες, τόσο για την ηθική συμπαράσταση, όσο και για τις καθοριστικής σημασίας οδηγίες στην εκτέλεση του πειραματικού μέρους και τη συγγραφή της διατριβής. Η εμπειρία του πάνω στα θέματα του συνδρόμου επαναιμάτωσης των σκελετικών μυών αποδείχθηκε ιδιαίτερα σημαντική. Η παρατήρηση των παρασκευασμάτων στο οπτικό μικροσκόπιο έγινε στο εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ ιδιαίτερα θερμά την Ιατρό Παθολογοανατόμο κ.δομνίκη Γερασιμίδου που βοήθησε στη λήψη και επεξεργασία κατάλληλων τεμαχίων, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ.πρόδρομο Χυτίρογλου για την εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Η παρατήρηση των παρασκευασμάτων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έγινε στο εργαστήριο Ιστολογίας-Εμβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ θερμά την παρασκευάστρια κ. Αναστασία Χατζή για τη συνεχή βοήθειά της στην επεξεργασία των δειγμάτων. Ιδιαίτερα θερμά ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Κοκκώνα Κούζη- Κολιάκου για τη συνεχή και αμέριστη βοήθειά της τόσο στην επεξεργασία των δειγμάτων όσο και κυρίως κατά την εξαγωγή και συζήτηση των αποτελεσμάτων στην παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Ο έλεγχος των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων έγινε στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τομέα Κλινικών της Κτηνιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης.Ευχαριστώ πολύ θερμά την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Μαρία Κριτσέπη - Κωνσταντίνου η οποία από την αρχή με βοήθησε και με προμήθευσε με βιβλιογραφία σχετική με τους επίμυες και εργάστηκε επιμελώς στην ανάλυση των παραμέτρων. Η μέτρηση της Μαλονικής Διαλδεΰδης διενεργήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. 14

15 Ευχαριστώ θερμά τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Παπαγεωργίου καθώς και τον Λέκτορα κ. Σταύρο Ηλιάδη για τις ώρες που αφιέρωσαν για να με εμβαθύνουν στο μαγικό κόσμο των ελευθέρων ριζών οξυγόνου. Το σύγγραμμα του Καθηγητού «Βιοχημεία ελευθέρων ριζών, αντιοξειδωτικά και λιπιδική υπεροξείδωση» ήταν ιδιαίτερα χρήσιμο. Η στατιστική επεξεργασία έγινε στο Εργαστήριο Ιατρικής Πληροφορικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης από τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δημήτρη Κουφογιάννη. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για το χρόνο που μου αφιέρωσε. Επίσης ευχαριστώ τους Καθηγητές κ. Δημήτριο Παπαδημητρίου και κ. Ιωάννη Μώρο, μέλη της τριμελούς επιτροπής, για την πολύτιμη βοήθεια και καθοδήγηση τους στην πραγματοποίηση αυτής της μελέτης. Τους ειδικευόμενους Χειρουργικής κ. Ντίνα Αχιλλέα και κ. Ζαμπά Νεόφυτο ο- φείλω ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ για τη βοήθειά τους στην εκτέλεση των πειραμάτων καθώς και την επεξεργασία των δειγμάτων. Τέλος, έκφραση βαθιάς ευγνωμοσύνης οφείλω και στην ιατρό κ. Ευδοξία Σαπουντζή. Την ευχαριστώ ιδιαίτερα εγκάρδια για τη βοήθειά της σε ορισμένα πειράματα και για την αμέριστη ηθική της συμπαράσταση στην εκπόνιση της διατριβής. 15

16

17 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18

19 1. ΗΠΑΡ 1.1 ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ Το ήπαρ είναι αδένας του πεπτικού συστήματος και ο μεγαλύτερος αδένας του σώματος. Χαρακτηριστικό του ήπατος είναι η διπλή αιματική άρδευσή του. Παραλαμβάνει οξυγονωμένο αίμα μέσω της ηπατικής αρτηρίας (25-30%) και μεγάλη ποσότητα φτωχού σε οξυγόνο αίματος, μέσω της πυλαίας φλέβας (70-75%). Το αίμα από τις δύο αυτές πηγές αναμιγνύεται στα κολποειδή του ήπατος, εισέρχεται στα ηπατικά κύτταρα και απομακρύνεται, μέσω των ηπατικών φλεβών στην κάτω κοίλη φλέβα. Το ήπαρ μπορεί να θεωρηθεί το βασικό ρυθμιστικό όργανο του μεταβολισμού. Η πυλαία φλέβα προσάγει στο ήπαρ θρεπτικές ουσίες που απορροφούνται από το πεπτικό σύστημα. Εκεί αποθηκεύονται ή μεταβολίζονται και αποδίδονται στη συστηματική κυκλοφορία, με τέτοιο τρόπο, ώστε να διατηρείται η ομοιόσταση του οργανισμού. Επιπλέον, το ήπαρ παράγει αδιάκοπα χολή, η οποία τελικά εκκρίνεται στο 12δάκτυλο μέσω του χοληφόρου δέντρου. Η χολή διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πέψη, μέσω γαλακτοποίησης των λιπών που προσλαμβάνονται με την τροφή, μετατρέποντας τα σε μικκύλια που απορροφούνται ευκολότερα από το επιθήλιο του εντέρου. Πέρα από την εξωκρινή του λειτουργία, το ήπαρ συνθέτει πρωτεΐνες του αίματος, που τις διοχετεύει άμεσα στη συστηματική κυκλοφορία. Παράλληλα ασκεί βασικό έλεγχο στο γενικό μεταβολισμό, διαμέσου της ικανότητας του να αποθηκεύει υδατάνθρακες με τη μορφή του γλυκογόνου και να αποδίδει στην αιματική κυκλοφορία γλυκόζη, διατηρώντας τη συγκέντρωσης της, στα απαιτούμενα επίπεδα. Τέλος, το ήπαρ συμβάλλει στην απομάκρυνση από τον οργανισμό, φαρμάκων και άλλων βλαβερών ουσιών που απορροφούνται από το έντερο, είτε μέσω οξείδωσης τους, είτε μέσω μετατροπής τους σε λιγότερο βλαβερά παράγωγα, τα οποία εκκρίνονται με τη χολή στο έντερο και αποβάλλονται από τον οργανισμό με την εντερική οδό. Η βασική λειτουργική μονάδα του ήπατος είναι το ηπατικό λόβιο. Το ηπατικό λόβιο είναι μια πρισματκή πολύγωνη (εξάγωνη) μάζα ηπατικού ιστού, μήκους 2mm και διαμέτρου 0,7mm η οποία περιβάλλεται από συνδετικό ιστό, οποίος στον άνθρωπο και τον επίμυ είναι εμφανής μόνο στα μεσολόβια διαστήματα και έτσι τα ηπατικά λόβια δε ξεχωρίζουν μεταξύ τους. Στο κέντρο του ηπατικού λοβίου διελαύνει από την κορυφή μέχρι τη βάση μια φλέβα, που αποτελεί την αρχή του δικτύου των ηπατικών φλεβών, που καλείται κεντρική ή ενδολόβιος φλέβα. Γύρω από την κεντρική φλέβα, παρεγχυματικά κύτταρα, διατάσσονται α- κτινοειδώς κατά δοκίδες και σχηματίζουν πλάκες πάχους ενός κυττάρου. Οι δοκίδες αυτές αναστομώνονται πολλαπλά μεταξύ τους και αφορίζουν κατά τις τρείς 19

20 διαστάσεις του χώρου λαβυρινθώδες δίκτυο, τα διάκενα του οποίου πληρούνται από τα κολπώδη τριχοειδή της πυλαίας φλέβας. Στις τρείς γωνίες της πολύγωνης αυτής περιοχής υπάρχει μια μικρότερη τριγωνική περιοχή συνδετικού ιστού που περιέχει ένα μικρό χοληφόρο πόρο, έναν κλάδο της ηπατικής αρτηρίας και έναν κλάδο της πυλαίας φλέβας. Το σύμπλεγμα αυτό αποτελεί την πυλαία τριάδα ή πυλαία περιοχή. Στο ηπατικό λόβιο, εκτός από τα κολπώδη τριχοειδή υπάρχει και ένα άλλο σύστημα τριχοειδών ανεξάρτητο μέσω του οποίου αρχίζει η αποχέτευση της χολής. Τα ηπατοκύτταρα των δοκίδων, στις πλευρές που εφάπτονται μεταξύ τους, αφήνουν να σχηματισθούν σωληνοειδείς χώροι που επικοινωνούν μεταξύ τους, αναστομώνονται σε δίκτυο και σχηματίζουν το σύστημα των χοληφόρων τριχοειδών. Το τοίχωμα των τριχοειδών αυτών αφορίζεται μόνο από τις κυτταρικές μεμβράνες των ηπατοκυττάρων. Τα χοληφόρα τριχοειδή μόλις εξέλθουν από το ηπατικό λόβιο αποκτούν δικό τους τοίχωμα και ονομάζονται σωλήνες του Hering ή περιλόβιοι χοληφόροι πόροι. Το τοίχωμα τους αποτελείται από κυβοειδή κύτταρα και μετά από βραχεία διαδρομή εκβάλλουν στο μεσολόβιο χοληφόρο πόρο. Οι χοληφόροι πόροι μαζί με κλάδους της πυλαίας φλέβας, της ηπατικής αρτηρίας, λεμφαγγεία και νεύρα διελαύνουν στις εξωτερικές γωνίες των ηπατικών λοβίων, περιβάλλονται από συνδετικό ιστό και έτσι σχηματίζονται τα μεσολόβια ή πυλαία διαστήματα. Από τα μεσολόβια διαστήματα ξεκινούν οι τελικοί κλάδοι της πυλαίας φλέβας και της ηπατικής αρτηρίας (περιλόβιοι κλάδοι) που περιβάλλουν το ηπατικό λόβιο μαζί με τους σωλήνες του Hering, με τελικούς κλάδους των νεύρων και των λεμφαγγείων και τελικά εκβάλλουν στα κολπώδη τριχοειδή του ηπατικού λοβίου. Διαπιστώνει κανείς ότι η ροή του αίματος μέσα στο ηπατικό λόβιο είναι αντίθετη από τη ροή της χολής που γίνεται από εντελώς διαφορετικό σύστημα αγγείων. Η διαφορά πίεσης που δημιουργείται από την εισροή του αίματος της ηπατικής αρτηρίας στα κολπώδη τριχοειδή, θεωρείται η κινητήρια δύναμη της ροής του αίματος. Το αίμα της ηπατικής αρτηρίας και της πυλαίας φλέβας αναμιγνύεται μέσα στα κολπώδη τριχοειδή, όπου δέχεται την επίδραση των ηπατοκυττάρων και εισέρχεται στην κεντρική φλέβα, η οποία το οδηγεί στις υπολόβιες φλέβες. Αυτές με τη σειρά τους σταδιακά συμβάλλουν μεταξύ τους, σχηματίζοντας δύο ή περισσότερες ηπατικές φλέβες που τελικά καταλήγουν στην κάτω κοίλη φλέβα. Αν και το ηπατικό λόβιο αποτελεί το κλασικό πρότυπο για την περιγραφή της ι- στολογικής υφής του ήπατος, δεν εξηγεί απόλυτα τη σχέση δομής και λειτουργίας του οργάνου. Έτσι προτάθηκε μια εναλλακτική ερμηνεία της οργάνωσης της δομής του ήπατος, με σημείο αναφοράς όχι την κεντρική ή ενδολόβιο φλέβα, αλλά το πυλαίο διάστημα, που ονομάστηκε πυλαίο λόβιο. Το λόβιο αυτό, με κέντρο ένα 20

21 πυλαίο διάστημα, έχει τριγωνικό σχήμα και σχηματίζεται από τις περιοχές των ηπατικών λοβίων των οποίων τα χοληφόρα αγγεία κατευθύνονται προς αυτό, με επακόλουθο μια κεντρική φλέβα σε κάθε γωνία του. ΗΠΑΤΙΚΑ ΚΟΛΠΟΕΙΔΗ Τα ηπατικά κολποειδή είναι ευρύτερα από τα τριχοειδή και το τοίχωμα τους σχηματίζεται από μια στιβάδα ηπατοκυττάρων στη μια πλευρά αλλά χωρίζονται απ αυτή με ένα στενό διάστημα. Μελέτες με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, φυσιολογικές μελέτες του βαθμού διαλυτότητας και κάθαρσης του αίματος που διαπερνά το ήπαρ και παρατηρήσεις του μεγέθους των κολποειδικών σωματίων, αποδεικνύουν ότι υπάρχει ασυνέχεια στο τοίχωμα, το οποίο επιτρέπει την απ ευθείας είσοδο του πλάσματος του αίματος στα ηπατικά κύτταρα. Επίσης το τοίχωμα των ενδοθηλιακών κυττάρων των κολποειδών εμφανίζει και θυρίδες, που συχνά σχηματίζουν ομάδες που ονομάζονται sieve-plates. Υπάρχουν σημαντικές διαφορές στα μεσοδιαστήματα του κολποειδικού ενδοθηλίου. Στα πρόβατα πχ, το κολποειδικό ενδοθήλιο έχει ευδιάκριτο βασικό υμένα και σχετικά αρκετές θυρίδες, στους επίμυς ο βασικός υμένας λείπει και δεν υπάρχει επομένως σημαντικό εμπόδιο στη δίοδο ουσιών. ΚΥΤΤΑΡΑ KUPFFER Το 1898 ο Kupffer παρατήρησε αστεροειδή κύτταρα στα ηπατικά κολποειδή τα οποία μπόρεσαν να απομονωθούν με χρώση με χλωριούχο χρυσό. Κάποιοι ερευνητές προσπάθησαν να βρουν μεσολαβητές μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και κυττάρων Kupffer και υπήρχε διαφωνία για το αν αποτελούν ξεχωριστούς τύπους κυττάρων ή διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις ενός μοναδικού κυτταρικού τύπου. Σήμερα γνωρίζουμε ότι αποτελούν ευδιάκριτους κυτταρικούς τύπους με διαφορετική προέλευση και λειτουργία. Τα κύτταρα Kupffer πιστεύεται ότι προέρχονται από το μυελό των οστών και ότι σε περιπτώσεις αυξημένης ανάγκης του οργανισμού διαφοροποιούνται άωρα ενδοθηλιακά κύτταρα του τοιχώματος του κολπώδους τριχοειδούς και μετατρέπονται σε κύτταρα Kupffer. Όπως όλα τα μακροφάγα έτσι και τα Kupffer παράγονται από κυκλοφορούντα μακροκύτταρα του αίματος και αποτελούν μέρος του μονοπυρηνικού φαγοκυτταρικού συστήματος του οργανισμού. Βρίσκονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσα στον αυλό και ανάμεσα σ αυτά. Δε σχηματίζουν δεσμοσωμάτια ή άλλες ιδιαίτερες συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων. Παρατήρησή τους στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δείχνει ότι έχουν μικρολάχνες και κυτταροπλασματικές προσεκβολές. Έχουν μεγάλο πυρήνα και πλούσιο κυτταρόπλασμα, ενώ διαθέτουν μικρό σύστημα Golgi 21

22 και πολυάριθμα μιτοχόνδρια. Υπάρχει στενό ενδοπλασματικό δίκτυο, το οποίο μπορεί να χρωματιστεί με ιστοχημική μέθοδο υπεροξειδάσης. Αυτή η αντίδραση χρησιμεύει για το διαχωρισμό τους από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα οποία λείπει αυτό το ένζυμο. Το κυτταρόπλασμα είναι γεμάτο κενοτόπια, φαγοσωμάτια, λυσοσωμάτια και διάσπαρτα τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο. Στο πρωτόπλασμα εμφανίζουν βαθυχρωματικά κοκκία, μερικά από τα οποία περιέχουν σίδηρο, καθώς και κατεστραμμένα ερυθρά. ΠΕΡΙΚΟΛΠΟΕΙΔΙΚΑ ΔΙΑΣΤΗΜΑΤΑ Ως περικολποειδικό διάστημα ή χώρος του Disse καλείται το διάστημα μεταξύ των κολποειδών και των παρεγχυματικών κυττάρων. Λεπτές δεσμίδες κολλαγόνων ινών σ αυτό το χώρο σχηματίζουν ένα χαλαρό δίκτυο. Τα δίκτυα των συνδετικών ινών γύρω από τα γειτονικά κολποειδή συνδέονται μέσω χοντρών δεσμίδων κολλαγόνου που περνούν μεταξύ των κυττάρων. Συνήθως αμύελοι νευρικοί άξονες βρίσκονται στο περικολποειδικό διάστημα. Η εξωκυτταρική μεσοκυττάρια ουσία που έχει την όψη κολλοειδούς συνήθως συνδέεται με συνδετικό ιστό που φαίνεται να λείπει στο περικολποειδικό διάστημα και το πλάσμα διαφεύγει διαμέσου των θυρίδων, στο ενδοθήλιο, με ελεύθερη είσοδο στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων, διευκολύνοτας αναμφίβολα την ανταλλαγή μεταβολιτών μεταξύ αυτών και του αίματος. ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΑ Τα ηπατοκύτταρα αποτελούν περίπου το 80% του κυτταρικού πληθυσμού του ή- πατος. Τα ηπατοκύτταρα είναι πολύγωνα και διατάσσονται σε στιβάδες ή δοκίδες μεταξύ των κολποειδών. Τα ηπατοκύτταρα διαθέτουν στρογγυλό πυρήνα με περιφερικές ομάδες ετεροχρωματίνης και ένα ή δύο ευδιάκριτα πυρήνια. Το μέγεθος του πυρήνα ποικίλει, με το 40-60% να είναι πολυπλοειδικοί. Στην πλειοψηφία τα ηπατοκύτταρα έχουν ένα πυρήνα, το 25% όμως εμφανίζει δύο πυρήνες. Στο κυτταρόπλασμα διακρίνονται βασεόφιλα σωμάτια που αποτελούν το κοκκώδες ενδοπλασματικό δίκτυο. Το κοκκώδες ενδοπλασματικό δίκτυο αποτελεί τον τόπο σύνθεσης πρωτεϊνών του κυτταροπλάσματος αλλά και πρωτεϊνών του αίματος. Το λείο ενδοπλασματικό δίκτυο παρουσιάζει μεγάλη ποικιλία και περιλαμβάνει ένα δίκτυο από κλάδους και αναστομώσεις σωληναρίων. Ομάδες ενζύμων αποτελούν το κυτόχρωμα P-450, το οποίο συμμετέχει στη σύνθεση προσταγλανδινών και άλλων βιολογικά δραστικών παραγόντων. Τα μιτοχόνδρια του ηπατοκυττάρου επιμηκύνονται με πεταλιοειδείς ή σωληνοειδείς ακρολοφίες, που προβάλλουν στο εσωτερικό και περιέχουν σχετικά χαμηλής πυκνότητας μεσοκυττάρια ουσία με 22

23 αρκετά πυκνά μεσοκυττάρια κοκκία. Αν και η δομή των μιτοχονδρίων δεν είναι ασυνήθης, εντούτοις υπάρχουν εντυπωσιακές διαφορές κατά τόπους, σε μέγεθος και αριθμό. Το σύμπλεγμα Golgi στο ηπατοκύτταρο αποτελείται από πολλαπλές στιβάδες (5-9) κατά μήκος και των δύο πλευρών του κυττάρου κοντά στο χοληφόρο σωληνάριο. Συνήθως υπάρχουν μερικές μεμβράνες συνδεδεμένες με σωμάτια διαμέτρου (0,2-0,5μm) κοντά στα σωμάτια Golgi. Αυτά δίνουν θετική αντίδραση στη χρώση με όξινη υδρολάση και ταυτοποιούνται ως λυσοσωμάτια. Άλλα σωματίδια στο όριο των μεμβρανών (0,2-0,8μm), διασκορπίζονται στο κυτταρόπλασμα και αποτελούν τα υπεροξυσωμάτια. Τα τελευταία περιέχουν καταλάση και άλλα υπεροξείδια του υδρογόνου, παραγόμενα από οξειδάσες. Ο κυτταροσκελετός των ηπατικών κυττάρων αποτελείται από στιβάδες κυτταροκερατίνης και νημάτια ακτίνης. Η στιβάδα αυτή εντοπίζεται εξ ολοκλήρου περιφερικά του κυττάρου, αλλά είναι παχύτερη στην περιοχή των χοληφόρων σωληναρίων, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της βατότητας τους. Δεσμίδες νηματίων που μεσολαβούν, προβάλλουν εσωτερικά και συγκλίνουν προς το κεντρόσωμα και το πορώδες σύμπλεγμα του πυρήνα δίνοντας ελαστικότητα στο κυτταροπλασματικό πλαίσιο εντός του κυτταροπλάσματος. Η κυτταρική μεμβράνη σε μικροσκόπηση έχει ομοιόμορφη δομή σε όλη την επιφάνεια της, αλλά λειτουργικά ευδιάκριτες περιοχές αναγνωρίζονται με κυτταροχημικές μεθόδους. Με ταυτοποιημένα αντισώματα, υποδοχείς σιαλογλυκοπρωτεϊνών, μανόζη-6-φωσφατάση και άλλες ουσίες, παραλαμβάνονται από υποδοχείς ενδοκύττωσης και εντοπίζονται σε κολποειδικές περιοχές. Η περιοχή των χοληφόρων σωληναρίων περιέχει αμινοπεπτιδάση, φωσφατάσες και τρεις γλυκοπρωτεΐνες που δε βρίσκονται σε άλλες κυτταρικές επιφάνειες. Αδενοκυκλάση και Να+-Κ+-ATPάση εντοπίζονται και στις δύο κολποειδικές περιοχές που διαχωρίζονται από παρακείμενα κύτταρα 1,2,3,4, ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Μία από τις πιο βασικές λειτουργίες του ήπατος είναι η συμβολή του στη διαδικασία της πέψης μέσω της έκκρισης χολής. Η χολή αποτελείται από χοληστερόλη, λεκιθίνη, λιπαρά οξέα και χολικά άλατα. Από τα συστατικά αυτά, τα σημαντικότερα είναι τα χολικά άλατα, που σχηματίζονται από χοληστερόλη με μετατροπή σε χολικό και χηνοχολικό οξύ, τα οποία ενώνονται με γλυκίνη και ταυρίνη με δεσμούς άλατος. Περίπου 0,5g αυτών των συνδεδεμένων χολικών οξέων εκκρίνονται ημερησίως και προκαλούν γαλακτοματοποίηση των λιπών που προσλαμβάνονται με τη διατροφή, προάγοντας έτσι την απορρόφηση των λιπαρών οξέων. Σε απουσία χολικών οξέων, πολλά από τα διαιτητικά λίπη δεν απορροφούνται, με 23

24 απότέλεσμα την αποβολή κοπράνων πλούσια σε λίπος. Μια σημαντική απεκκριτική λειτουργία του ήπατος που συνδέεται με την έκκριση χολής, είναι η αποβολή χολερυθρίνης από το αίμα. Η χολερυθρίνη είναι μια πρασινωπή χρωστική που δημιουργείται από τη μετατροπή της αιμοσφαιρίνης των γηρασμένων ερυθροκυττάρων, που μεταφέρονται στην κυκλοφορία με τα κύτταρα Kupffer στο ήπαρ και με άλλα φαγοκύτταρα στο σπλήνα. Στο ήπαρ παραλαμβάνονται από τα κύτταρα του ήπατος και συνδέονται με γλυκουρονίδια στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Το μεγαλύτερο μέρος της συζευγμένης με γλυκουρονίδια χολερυθρίνης εκκρίνεται στη χολή, αλλά ένα ποσό παραμένει και στο αίμα. Ανώμαλη συσσώρευση χολερυθρίνης στο αίμα προκαλεί ίκτερο. Αυτό μπορεί να συμβεί όταν η παραγωγή της χολερυθρίνης υπερβαίνει την ικανότητα του φυσιολογικού ήπατος να την εκκρίνει ή όταν η πρόσληψη χολερυθρίνης ή η σύζευξη μειώνεται όπως συμβαίνει σε παθήσεις του ήπατος. Ο καθορισμός της σχέσης του ποσού συζευγμένης και ασύζευκτης χολερυθρίνης σε δείγμα αίματος είναι ευρέως χρησιμοποιούμενος ως δείκτης της ηπατικής λειτουργίας και καθορίζει την πιθανή αιτία σε ασθενείς με ίκτερο. Το ήπαρ βρίσκεται στρατηγικά τοποθετημένο μεταξύ του πυλαίου συστήματος και της συστηματικής κυκλοφορίας, ώστε να απορροφά συστατικά που προέρχονται από το έντερο. Μια από τις σημαντικότερες λειτουργίες του είναι η διατήρηση στο αίμα φυσιολογικών συγκεντρώσεων γλυκόζης. Η απορροφούμενη γλυκόζη παραλαμβάνεται από το πυλαίο αίμα και πολυμερίζεται με μια σειρά ενζυμικών αντιδράσεων σε γλυκογόνο, που αποτελεί τη μορφή αποθήκευσης υδρογονανθράκων. Άλλες ενώσεις όπως το γαλακτικό οξύ, γλυκερόλη και πυρουβικό οξύ μπορούν να μετατραπούν από τα ηπατικά κύτταρα σε γλυκόζη και έπειτα σε γλυκογόνο. Όταν χρειάζεται, το γλυκογόνο μετατρέπεται σε γλυκόζη με μια διαδικασία που καταλύεται από το ένζυμο φωσφορυλάση. Το ήπαρ παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων και στη διατήρηση φυσιολογικών επιπέδων στο αίμα. Τα λιπίδια του αίματος προέρχονται από την προσλαμβανόμενη τροφή ή από την κινητοποίηση των αποθεμάτων λίπους από το λιπώδη ιστό. Τα λιπίδια μεταφέρονται στο αίμα με τη μορφή λιποπρωτεϊνών του ορού. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μικρά πυκνά σωματίδια (διαμέτρου nm) παρατηρούνται στις τελικές επεκτάσεις των κυστιδίων του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου, στα σωληνοειδή στοιχεία του λείου ενδοπλασματικού δικτύου, σε μικρά μεταφερόμενα κυστίδια και στο χώρο του Disse. Αυτές είναι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) που σχηματίζονται στο ήπαρ και απομακρύνονται με εξωκύττωση στο χώρο του Disse. Τα τριγλυκερίδια είναι τα πρώτα που παράγονται από τα λιπαρά οξέα στο λείο ενδοπλασματικό δίκτυο και εκεί συνδέονται με πρωτεΐνες που συντίθενται στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο για να σχηματιστούν τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Το λείο ενδοπλασματικό δίκτυο είναι προφανώς ο τόπος σύνθεσης 24

25 της χοληστερόλης. Όταν πειραματικά προκληθεί υπερτροφία των οργανιλίων αυτών, το ήπαρ εμφανίζει αυξημένη ικανότητα σύνθεσης χοληστερόλης από οξεικό άλας. Το ήπαρ είναι ο τόπος σύνθεσης πρωτεϊνών του πλάσματος. Τα εξειδικευμένα για το σκοπό αυτό οργανίλια είναι το αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο λεπτή κροκυδωμένη ουσία παρατηρείται σε τμήματα μικροσωματίων μετά από ομογενοποίηση του ήπατος. Στο ήπαρ παράγονται και άλλες πρωτεΐνες, απαραίτητες για την πήξη του αίματος, όπως πχ το ινωδογόνο, η θρομβίνη και η αντιθρομβίνη ΙΙΙ. Μειωμένη σύνθεση αυτών των παραγόντων πήξης σε παθήσεις του ήπατος έχει ως αποτέλεσμα αιμορραγική διάθεση μετά από ελάχιστο τραυματισμό. Η συγκέντρωση αυτών των ουσιών στο αίμα είναι δείκτης της λειτουργίας των ηπατικών κυττάρων. Τα ηπατοκύτταρα έχουν σημαντική συμπληρωματική λειτουργία στο ανοσολογικό σύστημα του εντέρου. Η ανοσοσφαιρίνη Α συντίθεται στα κύτταρα του πλάσματος στη στιβάδα του συνδετικού ιστού, συμπλέκεται με εκκριτικά συστατικά στα κύτταρα του εντερικού επιθηλίου και εκκρίνεται στον εντερικό αυλό. Ωστόσο μόνο τμήματα των αντισωμάτων που παράγονται στη στιβάδα του συνδετικού ι- στού παίρνουν σαφή πορεία προς τον εντερικό αυλό, τα υπόλοιπα με τη λέμφο μεταφέρονται στο θωρακικό πόρο και μετά στη συστηματική κυκλοφορία. Το μεγαλύτερο μέρος της ανοσοσφαιρίνης Α του αίματος είναι προορισμένο να φτάνει στον αυλό του εντέρου μέσω της ηπατοχολικής οδού. Η ανοσοσφαιρίνη Α της χολής είναι τετραπλάσια της συγκέντρωσης της στο αίμα. Αν ο χοληφόρος πόρος αποφραχθεί χειρουργικά σε πειραματόζωα, το ποσό της IgA στο αίμα αυξάνεται εμφανώς, ενώ το ποσό στον αυλό του εντέρου πέφτει στο 1/10 της φυσιολογικής συγκέντρωσης. Είναι επομένως προφανές ότι η IgA των χοληφόρων συμβάλλει σημαντικά στα επίπεδα του αντισώματος στον εντερικό αυλό. Το ήπαρ προσλαμβάνει με ενδοκύττωση μέσω υποδοχέων ορμόνες που παράγονται από τους ενδοκρινείς αδένες και εκκρίνονται στη χολή. Μερικές απ αυτές τις πρωτεΐνες και τα στεροειδή διασχίζουν το κύτταρο άμεσα, ενωμένα με τα μεταφορικά κυστίδια στη μεμβράνη των χοληφόρων σωληναρίων και φτάνουν άθικτα στη χολή. Άλλα ακολουθούν έναν έμμεσο δρόμο στον οποίο τα κυστίδια συγχωνεύονται στη διαδρομή με μικρά βασικά λυσοσωμάτια που μετατρέπουν το περιεχόμενο τους. Τα διάσπαρτα προϊόντα μεταφέρονται στη χολή. Τέλος το ήπαρ συμμετέχει στη διήθηση του αίματος. Είναι ένα όργανο που δέχεται κάθε λεπτό γύρω στα 1000ml αίματος από την πυλαία φλέβα και 350ml από την ηπατική αρτηρία. Καθώς ρέει εντός των κολποειδών, το αίμα εκτείθεται σε περίπου 1,2 x 10 (7) φαγοκύτταρα Kupffer για κάθε γραμμάριο ιστού και αυτά 25

26 απομακρύνουν νεκρωμένους ιστούς και ξένες ουσίες που περιέχονται σε μικροοργανισμούς, οι οποίοι μπορούν να εισβάλλουν στο αίμα από τον αυλό του εντέρου. Τα κύτταρα Kupffer διαθέτουν υποδοχείς επιφανείας για τις ανοσοσφαιρίνες και το συμπλήρωμα και εκκρίνουν κυτοκίνες, ιντερλευκίνη 1 και παράγων νέκρωσης των όγκων (TNF). Έτσι το ήπαρ συμμετέχει ενεργώς στην ανοσολογική άμυνα του οργανισμού 1,6, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΥΡΟΥΒΙΚΗ ΓΛΟΥΤΑΜΙΚΗ ΤΡΑΝΣΑΜΙΝΑΣΗ (ΑΛΑΝΙΝΟ-ΑΜΙΝΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ) - SGPT (ALT) H πυρουβική γλουταμική τρανσαμινάση ή αλανινο-αμινοτρανσφεράση αποτελεί ένζυμο ελεύθερο στο κυτόπλασμα. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις ανευρίσκεται στα ηπατοκύτταρα,ανευρίσκεται όμως και στο σκελετικό ή καρδιακό μυ. Θεωρείται πιο ειδικό για τις βλάβες του ήπατος και αυξάνεται σε διάφορες καταστάσεις. Η υποξία,οι μικροβιακές τοξίνες,η φλεγμονή,η νεοπλασία καθώς και κάποια φάρμακα μπορεί να οδηγήσουν σε ηπατοκυτταρική βλάβη η οποία θα συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων του ενζύμου. ΟΞΑΛΟΞΕΙΚΗ ΓΛΟΥΤΑΜΙΚΗ ΤΡΑΝΣΑΜΙΝΑΣΗ (ΑΣΠΑΡΤΙΚΗ ΑΜΙΝΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ) - SGOT (AST) Η οξαλοξεική γλουταμική τρανσαμινάση ή ασπαρτική αμινοτρανσφεράση βρίσκεται ελεύθερη στο κυτόπλασμα των ηπατοκυττάρων και των μυϊκών κυττάρων. Δεν θεωρείται ένζυμο ειδικό του ήπατος και μπορεί να αυξηθεί τόσο σε ηπατοκυτταρική όσο και μυϊκή βλάβη. ΑΛΚΑΛΙΚΗ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗ (ALP) Η αλκαλική φωσφατάση αποτελεί ένζυμο που συντίθεται κυρίως στο ήπαρ και λιγότερο στους οστεοβλάστες. Αυξάνεται σε παθήσεις που συνοδεύονται από α- πόφραξη των ενδο- ή εξωηπατικών χοληφόρων οδών, μπορεί όμως να αυξηθεί και σε καταστάσεις που οδηγούν σε σημαντικό ηπατοκυτταρικό οίδημα. γ-γλουταμινικη ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ (γ-gt) Η γ-γλουταμινική τρανσφεράση αποτελεί ένζυμο που παράγεται από το ήπαρ. Αυξάνεται σε παθήσεις που συνοδεύονται από χολόσταση 1,7. 26

27 2. ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ (ΣΙΕ) Οι συνέπειες της στέρησης ενός οργάνου από την προσφορά αίματος έχουν αναγνωριστεί από καιρό ως κρίσιμος παράγοντας στην κλινική έκβαση καταστάσεων όπως του αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου, του εμφράγματος του μυοκαρδίου, της μεταμόσχευσης οργάνων καθώς και της ισχαιμίας των άκρων. Η έγκαιρη αποκατάσταση της ροής αίματος σε ένα ισχαιμικό ιστό ή όργανο είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μη-αναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Εντούτοις όμως,η ίδια η επαναιμάτωση,αυτή καθ' εαυτή,μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών, συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Έτσι έχει παρατηρηθεί ότι οι ιστολογικές μεταβολές της βλάβης μετά από 3 ώρες ισχαιμίας του ήπατος ή του εντέρου που ακολουθείται από 1 ώρα επαναιμάτωσης, είναι πολύ χειρότερες από τις μεταβολές που παρατηρούνται μετά από 4 ώρες μόνο ισχαιμίας 8,9. Η κυτταρικές βλάβες καθώς και το σύνολο των αλλοιώσεων που παρατηρούνται μετά από επαναιμάτωση βιώσιμων ισχαιμικών ιστών ορίζονται ως σύνδρομο ι- σχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) 10. Το σύνδρομο ισχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) μπορεί να εμφανιστεί σε ποικίλες κλινικές καταστάσεις, όπως π.χ. μετά από θρομβολυτική θεραπεία, αγγειοπλαστική των στεφανιαίων, μεταμόσχευση οργάνων, καρδιοπνευμονική παράκαμψη καθώς και αρτηριακές επεμβάσεις. Η επαναιμάτωση των ισχαιμικών ιστών οδηγεί τόσο σε τοπική όσο και σε συστηματική φλεγμονώδη απάντηση η οποία, μπορεί στη συνέχεια, να οδηγήσει σε εκτεταμένη μικροαγγειακή δυσλειτουργία. Εάν μάλιστα είναι αρκετά σοβαρή, οι αλλοιώσεις μπορούν να επεκταθούν πέρα από την ισχαιμική περιοχή, με κίνδυνο να προσβάλλουν και απομεμακρυσμένα μη-ισχαιμούντα όργανα,όπως πνεύμονες, μυοκάρδιο, ήπαρ ή νεφροί. Αποτέλεσμα είναι το Σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (systemic inflammatory response syndrome SIRS) ή ακόμη και το Σύνδρομο δυσλειτουργίας πολλών οργάνων (multiple organ dysfunction syndrome MODS), που ευθύνεται για το 30-40% της θνητότητας στις μονάδες εντατικής θεραπείας 11. Οι γνώσεις για την παθοφυσιολογία, τις κλινικές εκδηλώσεις και τις θεραπευτικές στρατηγικές για την πρόληψη ή τη θεραπεία του συνδρόμου ισχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) συνεχώς εμπλουτίζονται από διάφορες πειραματικές αλλά και κλινικές μελέτες ενώ συχνά αναθεωρούνται 12. Σίγουρα απαιτούνται αρκετές τυχαιοποιημένες μελέτες για να αποδειχθεί η ασφάλεια και αποτελεσματικότητα δια- 27

28 φόρων παραγόντων που χρησιμοποιούνται και εφαρμόζονται στη διαγνωστική και θεραπευτική παρέμβαση μας. 2.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η περιγραφή της ισχαιμικής σύσπασης μετά από κάταγμα από τον Volkmann το 1881, ήταν πιθανότατα ο πρώτος προσδιορισμός μιας επιπλοκής σχετικής με τον ισχαιμικό μυ. Το 1926 ο Jepson κατέδειξε πειραματικά σε σκυλιά ότι η ίσχαιμη περίδεση του σκέλους ακολουθείται από οίδημα, και το 1945 ο Dennis αποσυμπίεσε τον οιδηματώδη μυ μετά από απολίνωση μηριαίας φλέβας με απονευροτομή. Η διάδοση όμως της απονευροτομής στην αντιμετώπιση του ισχαιμικού μυός με οίδημα ανήκει στους Patman, Poulos, και Shires που το 1964 περιέγραψαν 76 α- σθενείς στους οποίους η απονευροτομή χρησιμοποιήθηκε για να αποσυμπιέσει τον οιδηματώδη μυ μετά από την αποκατάσταση των αρτηριακών τραυματισμών. Όσον αφορά τα συστηματικά αποτελέσματα της αποκατάστασης της αιμάτωσης στον ισχαιμικό ιστό, η εργασία του Cannon στη δεκαετία του 1920 για τους τοξικούς παράγοντες που σχετίζονται με την καταπληξία έθεσε τη βάση για την αναγνώριση των επιπλοκών της επαναιμάτωσης. Το 1937 οι Husveldt και Bjering περιέγραψαν τις νεφρικές βλάβες λόγω καταπληξίας. Εντούτοις, αυτές αποτελούσαν μεμονωμένες περιπτώσεις. Ο Bywaters επέστησε παγκοσμίως την προσοχή στο πρόβλημα της επαναιμάτωσης όταν δημοσίευσε μια μεγάλη κλινική εμπειρία με νεφρική ανεπάρκεια μετά από τραυματισμούς κατάχωσης των άκρων κατά τη διάρκεια των βομβαρδισμών του Λονδίνου στον 2 ο παγκόσμιο πόλεμο. Ο Bywaters επισήμανε ότι η καφέ χρωστική ουσία που εμφανίστηκε στα ούρα των ασθενών που πέθαναν με τη νεφρική ανεπάρκεια ήταν η μυοσφαιρίνη. Το 1960, πρώτος ο Haimovici, τεκμηρίωσε τον κίνδυνο της αρτηριακής αποκατάστασης των ισχαιμικών άκρων και χρησιμοποίησε τότε τον όρο "μυονεφροπαθητικό-μεταβολικό σύνδρομο" για τη νεφρική ανεπάρκεια που ακολουθούσε την επαναιμάτωση των άκρων. Σχεδόν μία δεκαετία μετά παρατηρήθηκε ότι η θνητότητα άγγιζε το 85%, όταν γινόταν επαναιμάτωση σε ισχαμικά άκρα με παράλυση. Η υψηλή αυτή θνητότητα αποδόθηκε σε καρδιο-πνευμονικά αίτια ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Η ομοιόσταση του οξυγόνου αποτελεί θεμελιώδη παράγοντα στην ανθρώπινη φυσιολογία και τη διατήρηση της ζωής. Η ουσιαστική απαίτηση για την παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ισορροπείται από τον κίνδυνο οξειδωτικής βλάβης στα κυτταρικά λιπίδια, τα νουκλεϊνικά 28

29 οξέα και τις πρωτεΐνες. Κατά συνέπεια οι κυτταρικές και συστηματικές συγκεντρώσεις του οξυγόνου είναι στενά ρυθμισμένες μέσα από βραχείας και παρατεταμένης διάρκειας οδούς αντίδρασης,που έχουν επιπτώσεις στην κυτταρική πρωτεϊνική έκφραση και δραστικότητα. Η διακοπή της παροχής αίματος στους σκελετικούς μύες συνοδεύεται από μια σειρά μεταβολικών, βιοχημικών και ηλεκτρολυτικών διαταραχών, εξαρτώμενων άμεσα από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Οι διαταραχές αυτές, κατά κανόνα, επιτείνονται στη φάση αποκαταστάσεως της κυκλοφορίας. Ο βαθμός επιδεινώσεως είναι ανάλογος της βαρύτητας της ισχαιμικής βλάβης. Η παθογένεια των διαταραχών αυτών, παρά το πλήθος των κλινικών και πειραματικών ερευνών, δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Έτσι εξακολουθεί να αποτελεί πεδίο συνεχούς ενδιαφέροντος με αποτέλεσμα συχνά αλληλοσυγκρουόμενα, αναλόγως των συνθηκών εκτελέσεως κάθε μελέτης. Σ όλους τους αερόβιους οργανισμούς η παροχή οξυγόνου στο μυϊκό κύτταρο και η οξειδωτική φωσφορυλίωση αποτελούν ζωτικούς παράγοντες για την παραγωγή ενέργειας και τη διατήρηση ομοιοστάσεως. Η διακοπή της παροχής οξυγόνου που ακολουθεί την οξεία ισχαιμία οδηγεί σε στροφή του μεταβολισμού προς την αναερόβια οδό με παραγωγή πυρουβικού οξέος, το οποίο αδυνατεί να εισέλθει στον κύκλο του κιτρικού οξέος (αερόβιος γλυκόλυση) μετατρέπεται όμως σε γαλακτικό οξύ κατόπιν αναγωγής με τη δράση της γαλακτικής δεϋδρογενάσης: Πυρουβικό οξύ NADH+H+ NAD+ Γαλακτικό οξύ Γαλακτική Δευδρογενάση Το γαλακτικό οξύ εν συνεχεία αποβάλλεται από τα κύτταρα ταχέως, για να μεταφερθεί στο ήπαρ, όπου μέσω της οδού της γλυκονεογενέσεως (κύκλος του Cori) μετατρέπεται σε γλυκόζη 14,15. Το σύνολο σχεδόν των μελετών αναφέρει αύξηση του γαλακτικού οξέος του αίματος, με μικρές μεταβολές του πυρουβικού οξέος, κατάσταση που οδηγεί σε αύξηση του λόγου γαλακτικού/πυρουβικού οξέος. Οι μεταβολές αυτές εξαρτώνται άμεσα από το βαθμό ισχαμίας. Σε ατελή ισχαιμία ή σε ύπαρξη ικανής παράπλευρης κυκλοφορίας η αύξηση του γαλακτικού οξέος είναι μικρή, το πυρουβικό οξύ παραμένει σχεδόν αμετάβλητο και η αύξηση του λόγου γαλακτικού/πυρουβικού επίσης είναι μικρή. Κατά την επαναιμάτωση οι μεταβολές εξαρτώνται και από το χρόνο ισχαιμίας. Έτσι το γαλακτικό οξύ συνεχίζει να είναι αυξημένο για χρονικό διάστημα αυξανόμενο ανάλογο της αυξήσεως του χρόνου ισχαιμίας. Το ενδοκυττάριο γαλακτικό οξύ κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας αυξάνεται σε υψηλότερα επίπεδα απ αυτά που ελέγχονται στο φλεβικό αίμα που προέρχεται από την πάσχουσα περιοχή ενώ το ενδοκυττάριο πυρουβικό οξύ δεν παρουσιάζει σημαντικές μεταβολές. Έτσι ο λόγος ενδοκυττάριου γαλακτι- 29

30 κού/ενδοκυττάριου πυρουβικού είναι σαφώς μεγαλύτερος του αντίστοιχου λόγου του φλεβικού αίματος του προερχόμενου από το πάσχον τμήμα. Κατά την επαναιμάτωση η αύξηση του γαλακτικού οξέος στο ενδοκυττάριο περιβάλλον συνεχίζεται. Ο χρόνος διατηρήσεως σε υψηλά επίπεδα εξαρτάται από το χρόνο και το βαθμό ισχαιμίας. Παράλληλα όμως παρατηρείται και αύξηση του ενδοκυττάριου πυρουβικού οξέος με αποτέλεσμα την ελάττωση του λόγου ενδοκυττάριου γαλακτικού/ενδοκυττάριου πυρουβικού. 16,17,18,19 Το ενεργειακό φορτίο των κυττάρων εκφράζεται από τις δύο δεξαμενές ενέργειας. Η μία είναι η δεξαμενή των αδενυλικών (ATP+ADP+AMP) και η δεύτερη η δεξαμενή της κρεατίνης (PC+Cr). Το ATP είναι το άμεσα χρησιμοποιούμενο υλικό από το μυϊκό κύτταρο για την παραγωγή ενέργειας προς εκτέλεση οποιασδήποτε μυϊκής δραστηριότητας. Παράγεται στις μιτοχονδριακές μεμβράνες με τη βοήθεια οξειδωτικής φωσφορυλιώσεως και παρουσία οξυγόνου. Σε οξεία ισχαιμία παρατηρείται πτώση του ATP που προέρχεται πλέον μόνο από την αναερόβια γλυκόλυση και από την κατανάλωση του ενεργειακού φορτίου της φωσφοκρεατίνης (PC) PCr + ADP ATP + Κρεατίνη Επί παρατεταμένης ισχαιμίας επέρχεται κατανάλωση και της δεξαμενής των αδενυλικών με διάσπαση του ATP μέχρι το επίπεδο της αδενοσίνης. ATP ADP AMP Αδενοσίνη Τα προϊόντα διασπάσεως του ATP μέχρι το επίπεδο του AMP είναι αδιαπέραστα για την κυτταρική μεμβράνη και μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν. Η αδενοσίνη διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη. Ως εκ τούτου, όταν η διάσπαση φθάσει στο επίπεδο της αδενοσίνης, αυτή διαχέεται στον εξωκυττάριο χώρο και στερεί το ενδοκυττάριο περιβάλλον από το κατάλληλο υπόστρωμα παραγωγής ενέργειας. Ε- πιπλέον παραπέρα διάσπαση της αδενοσίνης οδηγεί σε υποξανθίνη, η οποία στη φάση της επαναιματώσεως οδηγεί με τη βοήθεια του Cα++ και του ενζύμου οξειδάση της ξανθίνης στην παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου: Ο 2 Αδενοσίνη Ινοσίνη Υποξανθίνη Ξανθίνη + Ο 2 Ουρικό οξύ + Ο 2 Οξειδάση Ξανθίνης Cα++ + Πρωτεΐνη Αφυδρογονάση της Ξανθίνης Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των σκελετικών μυών είναι η αδυναμία μετατροπής, σε συνθήκες ισχαιμίας, της αφυδρογονάσης της ξανθίνης σε οξειδάση της ξανθίνης. 30

31 Αυτός είναι ίσως και ένας από τους λόγους της μεγαλύτερης αντοχής του σκελετικού μυïκού ιστού σε συνθήκες ισχαιμίας σε σύγκριση με άλλους ιστούς και όργανα. 20,21,17,22 Μετά την αποκατάσταση της κυκλοφορίας το ATP παραμένει χαμηλό με τάση όμως αυξήσεως που εξαρτάται από το χρόνο ισχαιμίας. Οι τιμές του ενεργειακού φορτίου και των δεξαμενών των αδενυλικών και της PCr επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα σε χρόνο εξαρτώμενο από την ισχαιμική βλάβη. Η μη αποκατάσταση των των επιπέδων του ATP, ή πολύ βραδεία επανάκαμψη στα φυσιολογικά επίπεδα, αντανακλά αφ ενός εκτεταμένη ισχαιμική βλάβη των κυτταρικών μεμβρανών, αφ ετέρου ιδιαίτερη βλάβη της δομής και της λειτουργίας των μιτοχονδρίων των μυïκών κυττάρων. 20,21,17,22 Οι τρανσαμινάσες, (γλουταμινική-οξαλοξική τρανσαμινάση (SGOT) και γλουταμινική- πυροσταφυλική τρανσαμινάση (SGPT) διαδραματίζουν ιδιαίτερο ρόλο στο μεταβολισμό των αμινοξέων, όπως προαναφέρθηκε. Παρατηρείται αύξηση αυτών σχετικά ανάλογη του βαθμού ισχαιμίας και εκφράζουν μυïκή βλάβη. Σε ήπιες περιπτώσεις μυïκής ισχαιμίας επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα εντός ολίγων ημερών. Μη αναστρέψιμες νεκρωτικές βλάβες του μυïκού ιστού συνοδεύονται από σταθερά υψηλά επίπεδα τρανσαμινασών. Η ερμηνεία των μεταβολών αυτών των ενζύμων (SGOT, SGPT, CPK) κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της επαναιματώσεως, σαν απόλυτος εκφραστής του βαθμού της μυïκής βλάβης κρύβει πολλές παγίδες, εφόσον μεγάλο φάσμα νοσημάτων επηρεάζει τις συγκεντρώσεις τους. Ως εκ τούτου οι ενζυμικές αυτές μεταβολές έχουν αξία, όταν συνδιάζονται κατάλληλα με την κλινική εικόνα και τα εγχειρητικά ευρήματα. 23,24,25,26 Η παρατεταμένη ισχαιμία οδηγεί σε πολλαπλές κυτταρικές, μεταβολικές και δομικές αλλαγές (πίνακας 1). Αν και η υποξική ανοχή μεταξύ των διαφόρων τύπων κυττάρων διαφέρει ανάλογα με το μεταβολικό ποσοστό και τους εγγενείς προσαρμοστικούς μηχανισμούς, η κυτταρική νέκρωση ακολουθεί αναπόφευκτα τις εκτεταμένες περιόδους ανοξίας (απουσία οξυγόνου) ή σοβαρής υποξίας (προσφορά οξυγόνου που μειώνεται σχετικά με τη μεταβολική απαίτηση). Σε γενικές γραμμές ο μυς ανέχεται την ισχαιμία για περιπού 4-6 ώρες, τα νεύρα περί τις 8, το λίπος για 13, το δέρμα για 24 ώρες, ενώ το οστό έως και 4 ημέρες. 27 Η προκληθείσα από την ισχαιμία μείωση στην κυτταρική οξειδωτική φωσφορυλίωση οδηγεί σε αποτυχία επανασύνθεσης πλούσιων σε ενέργεια φωσφορικών αλάτων συμπεριλαμβανομένου του ATP και της φωσφοκρεατίνης. Κατά συνέπεια, η ATP-εξαρτώμενη λειτουργία των αντλίων ιόντων στις μεμβράνες μεταβάλλεταιι, ευνοώντας την είσοδο του ασβεστίου, του νατρίου και του ύδατος στο κύτταρο. Επιπλέον, ο καταβολισμός των αδενικών νουκλεοτιδίων κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας οδηγεί στην ενδοκυτταρική συσσώρευση της υποξανθίνης, που μετατρέπεται στη συνέχεια στις τοξικές δραστικές μορφές οξυγόνου(δμο) (reactive 31

32 oxygen species ROS) όταν το μοριακό οξυγόνο επαναπροσφέρεται. 28 Στο ενδοθήλιο η ισχαιμία προωθεί την έκφραση ορισμένων προ-φλεγμονωδών προϊόντων (όπως π.χ. μόριο προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων, κυτοκίνες) και των βιοενεργών παραγόντων (π.χ. ενδοθηλίνη, θρομβοξάνη A 2 ), ενώ καταστέλλει άλλα προστατευτικά προϊόντα [όπως π.χ. συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (NO),θρομβομοδουλίνη] και βιοενεργούς παράγοντες (όπως π.χ. προστακυκλίνη, μονοξείδιο του αζώτου (NO). 10,29 Έτσι η ισχαιμία προκαλεί μία προ-φλεγμονώδη κατάσταση που αυξάνει την ευπάθεια του ιστού στον περαιτέρω τραυματισμό από την επαναιμάτωση. Πίνακας 1. Κυτταρικά αποτελέσματα της ισχαιμίας ή υποξίας Κυτταρική οξείδωση Μεταβολή δυναμικού της μεμβράνης Μεταβολή στην κατανομή των ιόντων (αυξημένη αναλογία ενδοκυτταρικού Ca 2+ /Nα + ) Κυτταρικό οίδημα Κυτοσκελετική αποδιοργάνωση Αύξηση υποξανθίνης Ελλάτωση ATP Ελλάτωση γλουταθειόνης Ελλάτωση φωσφοκρεατίνης Αύξηση έκφρασης μορίων προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων Αύξηση φωσφοϋδρόλυσης των νουκλεοτιδίων (μέσω CD39 και CD73) ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα αποτελούν μια δυναμική και πολυσύνθετη δομή που ρυθμίζει τις αγγειακές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένης της ροής, της διαπερατότητας, και της μετακίνησης κυττάρων. Έτσι κατέχουν σημαντική θέση στην παθοφυσιολογία του ΣΙΕ λόγω του κρίσιμου ρόλου τους στη ρύθμιση της αγγειακής λειτουργίας. Το ΣΙΕ προκαλεί πολλές αλλαγές στα ενδοθηλιακά κύτταρα,όπως αποπόλωση και αυξανόμενη ρευστότητα των μεμβρανών, διαταραχές στη κατανομή των ιόντων, κυτταρικό οίδημα, κυτοσκελετική αποδιοργάνωση και συγκέντρωση και ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων. Τα πρόσφατα πειραματικά ευρήματα έχουν παράσχει σημαντικές πληροφορίες για αυτές τις αλλαγές. 32

33 Το κυτταρικό οίδημα είναι μια κλασική ιστολογική συνέπεια της κυτταρικής βλάβης και παρατηρείται ομοιόμορφα μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων στο ΣΙΕ. Διάφοροι μηχανισμοί είναι πιθανώς υπεύθυνοι για αυτές τις αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της οξειδωτικής βλάβης στις μεμβράνες, της απορρύθμισης της ομοιόστασης των ιόντων, και της ωσμωτικής καταπόνησης. Μια πρόσφατη μελέτη έδωσε έμφαση στο ρόλο των όγκο-ρυθμιζόμένων καναλιών ανιόντων στη διατήρηση της ομοιόστασης του όγκου κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ. 30 Άλλοι ερευνητές, εντούτοις, θεωρούν ότι η κυτταρική διόγκωση στα τριχοειδή αγγεία στο ΣΙΕ είναι συνέπεια της αγγειοσυστολής και της συσσώρευσης των κυττάρων, παρά μια πραγματική αλλαγή στον κυτταρικό όγκο 31. Η αποπόλωση των μεμβρανών είναι μεταξύ των πιό πρόωρων αλλαγών του ενδοθηλίου στο ΣΙΕ. Η αδυναμία της ενέργειο-εξαρτώμενης ανταλλαγής ιόντων, λόγω της μείωσης των τριφωσφορικών αλάτων αδενοσίνης (ATP) κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας, έχει θεωρηθεί από καιρό ως μεσολαβιτικός παράγοντας στην αποπόλωση των μεμβρανών. Εντούτοις, μελέτες δείχνουν ότι η άμεση μεταβολή των ρόο-ρυθμιζόμενων καναλιών του καλίου(κ + ) είναι η πρωτογενώς υπεύθυνη βλάβη. Μελέτες πνευμόνων σε επίμυες έχουν δείξει ότι, παρά τον ικανοποιητικό εφοδιασμό με ATP, η αποπόλωση των μεμβρανών των ενδοθηλιακών κυττάρων εμφανίζεται σύντομα μετά από την επαναιμάτωση λόγω της αδρανοποίησης των ρόο-ρυθμιζόμενων καναλιών του καλίου (Κ + ). 32 Μια άλλη λεπτομερής μελέτη των επιδράσεων των δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ) στο αγγειακό ενδοθήλιο έδειξε αντιδράσεις υπερπόλωσης και αποπόλωσης εξαρτημένες από τη συγκέντρωση του καλίου. 33 Οι μελέτες αυτές τονίζουν ότι το δυναμικό των μεμβρανών δεν είναι μόνο θέμα ενέργειας. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) φαίνεται να μεσολαβούν σε πολλά από τα επιβλαβή αποτελέσματα του ΣΙΕ. Σε ένα μοντέλο εντερικής ισχαιμίας και επαναιμάτωσης, οι μέτριες μειώσεις της περιεκτικότητας σε οξυγόνο κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης μετέβαλε σημαντικά τη βλάβη, υπογραμμίζοντας τη σημασία της δημιουργίας των ΔΜΟ 34. Διάφορες μελέτες έχουν καταδείξει ότι οι αντιοξειδωτικοί παράγοντες προστατεύουν από τις χαρακτηριστικές ιστολογικές αλλαγές που συνδέονται με το ΣΙΕ. 35 Οι μελέτες του ΣΙΕ στο μυοκάρδιο έδειξαν ότι οι αλλαγές στα ενδοθηλιακά κύτταρα αποτράπηκαν κατά ένα μεγάλο μέρος κατά την επαναιμάτωση με δεσφεροξαμίνη αλλά όχι με καταλάση ή υπεροξειδική δισμουτάση, αποδεικνύοντας ότι οι ρίζες υδροξυλίου είναι ιδιαίτερα σημαντικοί στο ΣΙΕ του μυοκαρδίου. 36 Οι συγκεκριμένοι ρόλοι των διαφόρων δραστικών μορφών ο- ξυγόνου (ΔΜΟ) φαίνεται να ποικίλλουν ανάλογα με τον ιστό, τη διαθεσιμότητα των αντιδραστηρίων όπως το μονοξείδιο του αζώτου (NO), καθώς και τη διάρκεια και έκταση του ΣΙΕ. 33

34 Το εκτεταμένο οξειδωτικό στρες στο ΣΙΕ κινεί τη θανατηφόρα διαδικασία της απόπτωσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εκτός από τα οξέα αποτελέσματά τους, όπως η υπεροξείδωση λιπιδίων, οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) εμποδίζουν τις αντιαποπτωτικές πρωτεϊνες μέσα στο κύτταρο, όπως την οικογένεια των πρωτεϊνών Bcl-2. Προϊόντα αυτών των πρωτεϊνών που διαπερνούν τη μεμβράνη αποκαθιστούν μερικές από τις αποπτωτικές καταστάσεις του κυττάρου και αποτρέπουν την απόπτωση. 37 Οι ανεξέλεγκτες εισροές του ασβεστίου λόγω της βλάβης των μεμβρανών και της διαταραγμένης ομοιόστασης των ιόντων, ενεργοποιεί ένα πλήθος ενδοκυτταρικών ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων των λιπάσων, των πρωτεάσεων, και των ενδονουκλεάσεων που είναι σημαντικά στη σηματοδότηση της απόπτωσης. Τα πρόσφατα πειραματικά στοιχεία εκχωρούν έναν σημαντικό ρόλο στα μιτοχόνδρια για τη ρύθμιση της ανεξέλεγκτης εισροής ασβεστίου κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ. 38 Εντούτοις, η ικανότητα της μιτοχονδριακής ρύθμισης του ασβεστίου είναι περιορισμένη και μπορεί να ξεπεραστεί από την έντονη εισροή του ΑΡΤΗΡΙΟΛΙΑ: ΕΛΑΤΤΩΜΕΝΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗ ΑΓΓΕΙΟΔΙΑΣΤΟΛΗ Η αρχική εκδήλωση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας των αρτηριολίων στο ΣΙΕ είναι η ελλατωμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή. Η επαναιμάτωση μετά από ισχαιμία έχει δειχθεί ότι αυξάνει σημαντικά την αντιδραστικότητα των αρτηριολίων. 39 Μία μελέτη σταθμός του Palmer το 1987 επιβεβαίωσε την ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή, και προσδιόρισε το μονοξείδιο του αζώτου (NO) ως τον ενδοθήλιο-εξαρτώμενο παράγοντα χάλασης. 40 Από την περίοδο της ανακάλυψής του, θεωρείται βασικός παθογενετικός μηχανισμός της αρτηριδιακής δυσλειτουργίας ως απάντηση σε μια ευρεία σειρά παραγόντων καταπόνησης. Βέβαια δεν αποτελεί το μοναδικό παράγοντα της επηρεασμένης αγγειοδιαστολής στο ΣΙΕ,όπου φαίνεται να συμμετέχουν πολλαπλάσιοι μηχανισμοί. Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) συντίθεται από μια οικογένεια ενζύμων,τις συνθάσες του ΝΟ (ΝΟS) που μετατρέπουν την L-αργινίνη σε ΝΟ και κιτρουλίνη με συμπαράγοντες την τετραϋδροβιοπτερίνη (BH4) και την αναχθείσα μορφή του φωσφορικού νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτιδίου (NADPH). Δύο μορφές του ενζύμου υπάρχουν στα ενδοθηλιακά κύτταρα: η ενδοθηλιακή NOS (enos), η οποία εκφράζεται συνεχώς, και μια επαγώγιμη μορφή (inducible inos). Στα ενδοθηλιακά κύτταρα οι ΝΟS ανταγωνίζονται με την αργινάση για την L-αργινίνη. Η δραστηριότητα της αργινάσης έχει αναφερθεί ότι αυξάνει μετά από ΣΙΕ, 41 με αποτέλεσμα να μειώνει την L-αργινίνη που είναι απαραίτητη για τη σύνθεση του ΝΟ. Η παρεμπόδιση της αργινάσης στο ΣΙΕ συντηρεί την ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειο- 34

35 διαστολή, αν και όχι πλήρως, αναδεικνύοντας ότι αποτελεί έναν από τους διάφορους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αρτηριδιακή δυσλειτουργία. Η έκταση της ενδοθηλιακής βλάβης και της δυσλειτουργίας στο ΣΙΕ εξαρτάται από τη διάρκεια και την ένταση της ισχαιμίας. Γενικά, η σοβαρότερη ενδοθηλιακή δυσλειτουργία εμφανίζεται νωρίς, μπορεί όμως να βελτιωθεί στην πορεία με την επαναιμάτωση. 42,43 Μελέτες σε πειραματόζωα με ισχαιμία των κάτω άκρων έχουν αναδείξει πρώιμα την εξασθενημένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή στα αρτηριόλια και όψιμα τη λειτουργική διαταραχή των λείων μυϊκών ινών του τοιχώματος. Οι αλλαγές αυτές ενεργούν εις βάρος της ροής αίματος μέσω της σύσπασης των μυϊκών ινών και μπορούν τελικά να περιορίσουν την έκβαση της ε- παναιμάτωσης. 44 Επίσης υπάρχουν στοιχεία για διαφοροποιημένη απάντηση στην ισχαιμία εξαρτώμενη από το μέγεθος των αρτηριολίων, που δείχνουν εντονότερη εξασθένιση της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης αγγειοδιαστολής στα μικρότερα προβλεννογόνια αρτηριόλια. 45 Επηρεασμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή μετά από ΣΙΕ έχει περιγραφεί στους σκελετικούς μυς, στους πνεύμονες, το έντερο, και τον εγκέφαλο 46,47,48,45,49, με ξεχωριστή κάθε φορά ένταση στην απάντηση. Έτσι, ακόμη και σύντομες περίοδοι υποξίας προκαλούν ενδοθηλιακή δυσλειτουργία στα εγκεφαλικά αρτηριόλια. 49, ενώ οι μελέτες στο νεφρό, έχουν καταδείξει τη μοναδική ανθεκτικότητά του στην ισχαιμία. 50 Άν και είναι σαφές ότι το μονοξείδιο του αζώτου (NO) είναι ο μεσολαβητής της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης αγγειοδιαστολής, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο αυτή η απάντηση είναι εξασθενισμένη στο ΣΙΕ δεν είναι πλήρως σαφής. Το γεγονός όμως ότι η η ελλάτωση αυτή είναι πιο έντονη κατά την επαναιμάτωση, εμπλέκει τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) ως σημαντικούς μεσολαβητές στην ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. 51 Οι Flynn και συν 52 έχουν δώσει έμφαση στη σημασία της ξάνθινο-οξειδάσης (XO) ως μεσολαβητή της ελλατωμένης ροής αίματος στη μεσεντέριο μικροκυκλοφορία. Η εικόνα βελτιώθηκε με τη χορήγηση αλλοπουρινόλης, ενός ανασταλτικού παράγοντα της XO, που δείχνει ότι οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) που παράγονται από την XO είναι σημαντικοί μεσολαβητές στο ΣΙΕ του εντέρου και ότι η παραγωγή ΔΜΟ μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος στόχος για θεραπεία. Η απομόνωση και η συγκέντρωση των λευκοκυττάρων διαδραματίζουν έναν προεξέχοντα ρόλο στην παθοφυσιολογία του ΣΙΕ στα τριχοειδή αγγεία και φλεβίδια, αλλά δεν έχουν θεωρηθεί ως σημαντικό συστατικό της δυσλειτουργίας. Η προς τα πάνω ρύθμιση των μορίων προσκόλλησης μετά από ΣΙΕ, έχει αποδειχθεί ότι προ- 35

36 ωθεί τη συγκέντρωση και ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων στα αρτηριόλια, που παρέχουν μια πρόσθετη, σημαντική πηγή ROS. Παρά την ύπαρξη στοιχείων που υποστηρίζουν τη δράση των ΔΜΟ ως μεσολαβητές της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας, φαίνεται ότι η απάντηση είναι σύνθετη, περιλαμβάνοντας και διάφορες άλλες οδούς ΤΡΙΧΟΕΙΔΗ: ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΦΡΑΓΜΟΥ ΚΑΙ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΜΗ-ΕΠΑΝΑΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ Οι μεταβολές στα τριχοειδή μετά από ΣΙΕ χαρακτηρίζονται από μείωση στον α- ριθμό των τριχοειδών αγγείων που αιματώνονται και αύξηση στη διήθηση των υγρών. Δεν έχει επιτευχθεί ακόμη συναίνεση για τους υπεύθυνους,για αυτές τις αλλαγές, μηχανισμούς. Οι πρόσφατες μελέτες εμπλέκουν πολλές διαφορετικές διαδικασίες. Ο μειωμένος αριθμός αιματούμενων τριχοειδών αγγείων μετά από το ΣΙΕ μπορεί να εξηγηθεί με την απόφραξη ή τη στένωση του αγγείου. Η προσκόλληση των αιμοπεταλίων και η επιστράτευση-συγκέντρωση των λευκοκυττάρων οδηγούν στη συμφορητική απόφραξη των τριχοειδών αγγείων, ενώ η διάσπαση του ενδοθηλιακού φραγμού και η αυξημένη υδραυλική αγωγιμότητα-διαπίδυση στη συμπίεση του αγγείου από το διάμεσο οίδημα. Η συμπίεση του αγγείου μαζί με την ενδοαυλική συμφόρηση δεν επιτρέπουν την αιμάτωση, ακόμα και όταν αποκαθίσταται η συστηματική πίεση. Οι πειραματικές μελέτες σε μεθαιμορραγική καταπληξία επιβεβαιώνουν αυτές τις αλλαγές, με την άμεση παρατήρηση της διόγκωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων, την αυξημένη τριχοειδική αντίσταση, και τον αυξημένο χρόνο διέλευσης των λευκοκυττάρων. Ενώ όμως η συσσώρευση των λευκοκυττάρων και η δυσλειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού παίζουν ένα σημαντικό ρόλο, η μεγαλομοριακή διαρροή και η συμπίεση των αγγείων είναι οι αρχικοί μεσολαβητές της μειωμένης τριχοειδικής αιμάτωσης. 53 Ακόμη και οι μικρές χρονικές περίοδοι ισχαιμίας στους πνεύμονες, χωρίς απόφραξη των αεροφόρων οδών, αυξάνουν την πνευμονική αγγειακή διαπερατότητα σε πειραματικό μοντέλο. 54 Διάφορες μελέτες έχουν επιδιώξει να διευκρινίσουν το μηχανισμό που ευθύνεται για τη διαταραχή της πνευμονικής μικροκυκλοφορίας κατά το ΣΙΕ. Σε μοριακό επίπεδο, η τριχοειδική βλάβη έχει αποδοθεί στη διάσπαση των πρωτεϊνών προσκόλλησης που συμβάλλουν στη συντήρηση της λειτουργίας φραγμού υπό κανονικές συνθήκες. Η μείωση των αποθεμάτων ATP και η παραγωγή ΔΜΟ, που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ, έχουν αποδειχθεί ότι οδηγούν στη διάσπαση της κυτοσκελετικής οργάνωσης και,ενδεχομένως, και των μεσοκυττάριων συνδέσεων. Οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές και οι ΔΜΟ έχουν αποδειχθεί ότι 36

37 μειώνουν την έκφραση των μορίων καντχερίνης (cadherin) στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων με μια διαδικασία εσωτερικοποίησης και, συνεπώς, ότι αυξάνουν τη διαπερατότητα του ενδοθηλιακού φραγμού. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των λευκοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλουν στη βλάβη στα τριχοειδή αγγεία στο ΣΙΕ με διάφορους τρόπους. Τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα γίνονται άκαμπτα και έχουν έναν πιό αργό χρόνο διέλευσης στα τριχοειδή, που οδηγεί στην κυτταρική συμφόρηση και την απόφραξη των αγγείων. Τα λευκοκύτταρα εν συνεχεία διαπερνούν το ενδοθήλιο, διασπούν τις μεσοκυττάριες συνδέσεις, και διαταράσσουν την ακεραιότητα του ενδοθηλιακού φραγμού. 55 Ε- πίσης τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα απελευθερώνουν αποθηκευμένες ΔΜΟ σε μια "οξειδωτική έκρηξη", προσθέτοντας έτσι στη συσσωρευτική οξειδωτική καταπόνηση του ΣΙΕ και επιδεινώνοντας τη βλάβη στα αγγεία και τον περιβάλλοντα ιστό ΜΕΤΑ-ΤΡΙΧΟΕΙΔΗ ΦΛΕΒΙΔΙΑ: Ο ΚΕΝΤΡΙΚΟΣ ΡΟΛΟΣ ΓΙΑ ΤΑ ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΑ Οι αλλαγές στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια στο ΣΙΕ είναι, κατά ένα μεγάλο μέρος, συνέπεια της συσσώρευσης, της προσκόλλησης, και της μετακίνησης λευκοκυττάρων στον ενδοθηλιακό φραγμό και της απελευθέρωσης ΔΜΟ. Τα ουδετερόφιλα είναι η κυρίαρχη κατηγορία λευκοκυττάρων που συμμετέχει στη φλεβική απάντηση στην ισχαιμία, επάγοντας τη βλάβη, είτε μέσω των άμεσων επιδράσεων με τη διάσπαση των μεσοκυττάριων συνδέσεων κατά τη διάρκεια της μετακίνησης, είτε έμμεσα μέσω των αλληλεπιδράσεων με άλλα κύτταρα,και ειδικά τα αιμοπετάλια. 56 Αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας είναι η αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα στα μακρομόρια. Το διάχυτο οίδημα του ιστού και η αιμοδυναμική αστάθεια που ακολουθούν συνεπεία της αυξημένης ενδοθηλιακής διαπερατότητας και μείωσης του ενδοαγγειακού όγκου, οδηγούν σε επιβλαβή τοπικά και συστηματικά αποτελέσματα. Λόγω της σημασίας των,όχι μόνο στο ΣΙΕ αλλά, σχεδόν σε όλες τις φλεγμονώδεις διαδικασίες, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ουδετεροφίλων και ενδοθηλιακών κυττάρων, έχουν αποτελέσει και συνεχίζουν να είναι το αντικείμενο ευρείας έρευνας. Οι μελέτες σε ΣΙΕ στο ήπαρ έχουν δείξει έναν κεντρικό ρόλο για την Π-Σελεκτίνη (P- Selectin), το μόριο προσκόλλησης που είναι αρμόδιο για τον εντοπισμό των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο. Η Π-Σελεκτίνη εκφράζεται κατά τρόπο διφασικό στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων σε απάντηση σε ΣΙΕ. 57 Διάφορες μελέτες που χρησιμοποιούν μονοκλονικά αντισώματα έχουν ε- μπλέξει έναν πλήθος μορίων δεκτών στη διαδικασία προσκόλλησης των ουδετεροφίλων. Έτσι ο αποκλεισμός του ICAM- 1 (ενδοθηλιακό μεσοκυττάριο μόριο προσκόλλησης 1, intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1) 58 στην ενδοθηλιακή 37

38 επιφάνεια και των CD11 και CD1852 στην επιφάνεια των ουδετεροφίλων μείωσε εμφανώς την προσκόλληση και δεν επιδείνωσε σημαντικά την αγγειακή διαπερατότητα. Τα λευκοκύτταρα διαδραματίζουν έναν προεξέχοντα ρόλο στη συγκέντρωση των αιμοπεταλίων στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια. Μελέτη έδειξε ότι μεγάλος αριθμός των προσκολλημένων αιμοπεταλίων δεσμεύθηκε επίσης και στα λευκοκύτταρα, δείχνοντας ότι τα λευκοκύτταρα ενισχύουν την προσκόλληση και τη συσσώρευση αιμοπεταλίων στο ΣΙΕ. 59 Η χαμηλή ροή που συνδέεται με το ΣΙΕ προωθεί επίσης τις αλληλεπιδράσεις λευκοκυττάρων-αιμοπεταλίων, που επιτρέπουν το σχηματισμό μιας πλατφόρμας λευκοκυττάρων επάνω στην οποία τα αιμοπετάλια μπορούν να δεσμευτούν στο φλεβικό τοίχωμα. Ενώ τα λευκοκύτταρα έχουν πάρα πολύ μεγάλη σημασία για τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, ο σχηματισμός θρόμβου μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας στον καθορισμό του ΣΙΕ. Η θρομβίνη έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την επαγώμενη από την ισχαιμία συσσώρευση και προσκόλληση λευκοκυττάρων, προτείνοντας έναν θεραπευτικό ρόλο για τους αντιθρομβωτικούς παράγοντες στο ΣΙΕ. 60 Η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας σε λευκοπενικά πειραματόζωα μειώθηκε με τη χορήγηση του ιστικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου, που προτείνει έναν ανεξάρτητο ρόλο για το σχηματισμό του θρόμβου στο ΣΙΕ. 61 Οι ΔΜΟ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο σε όλες τις αγγειακές απαντήσεις. Προωθούν το σχηματισμό του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων και της λευκοτριένης B4 από τα μαστικά και ενδοθηλιακά κύτταρα,με αποτέλεσμα τη συσσώρευση και ενεργοποίηση των λευκοκυτάρρων στα φλεβίδια. Τα προσκολλημένα λευκοκύτταρα οδηγούν εν συνεχεία στην αυξημένη εξαγγείωση λευκωματίνης στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια. 62 Η παραγωγή ΔΜΟ από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ειδικά κατά τη διάρκεια της περιόδου επαναιμάτωσης, είναι επίσης εμφανής στα φλεβίδια. Μερικές μελέτες αναφέρουν ότι οι πηγές όπως η XO (ξανθινοοξειδάση), είναι πρώτιστα αρμόδιες για τη μετα-ισχαιμική βλάβη στο σκελετικό μυ, παρά τα τοξικά προϊόντα που παράγονται με τη σύνδεση και προσκόλληση των λευκοκυτάαρων στα φλεβίδια ΑΓΓΕΙΑΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΥΠΟΞΙΑΣ Η παθογένεια του ΣΙΕ ξεκινάει με την προσβολή από την υποξία του αγγειακού ενδοθηλίου το οποίο όχι μόνο αποτελεί αγγειακό φραγμό, αλλά ρυθμίζει και τη μετακίνηση των πολυμορφοπύρηνων (ΠΜΠ) λευκών αιμοσφαιρίων (polymorphonuclear leukocyte PMN). 14 H υποξία ενεργοποιεί τόσο τις μεταγραφικές όσο και τις μη-μεταγραφικές οδούς,ενώ διάφοροι παράλληλοι μηχανισμοί υπάρχουν 38

39 μεταξύ των απαντήσεων του ιστού στην υποξία και στην οξεία φλεγμονή. 15 Τα ΠΜΠ μετακινούνται κατά τη διάρκεια της υποξίας από τον ενδοαγγειακό προς το διάμεσο χώρο, και συμβάλουν σημαντικά στη βλάβη του ιστού κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Η μετανάστευση των ΠΜΠ δια του ενδοθηλίου μπορεί να αποδιοργανώσει τους ιστικούς φραγμούς και να δημιουργήσει τις προϋποθέσεις για εξωαγγείωση και δημιουργία οιδήματος. Διάφοροι ενδογενείς μηχανισμοί υπάρχουν για να ενισχύσουν τον αγγειακό φραγμό κατά τη διάρκεια των ισχαιμικών προσβολών. Τα ενεργοποιημένα ΠΜΠ απελευθερώνουν ποικίλους διαλυτούς μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένου των νουκλεοτιδίων της αδενίνης [υπό μορφή ATP ή AMP που, μέσω της μεταβολικής μετατροπής, απελευθερώνουν αδενοσίνη στην αγγειακή επιφάνεια], που ρυθμίζουν την αγγειακή διαπερατότητα. Ειδικότερα,η αδενοσίνη προστατεύει τη λειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού αποκαθιστώντας την επαφή μεταξύ των κυττάρων μετά από τη μετανάστευση των ΠΜΠ. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υποξία επηρεάζει σε διάφορο βαθμό την αγγειακή διαπερατότητα σε απάντηση στα ενεργοποιημένα ΠΜΠ. Το υποξικό ενδοθήλιο εμφανίζει αυξημένη προστατευτική απάντηση στα ενεργοποιημένα ΠΜΠ που μεσολαβείται εν μέρει μέσω του ΠΜΠ-παραγόμενου ATP. Κατά συνέπεια, η υποξία αρχίζει μια συντονισμένη προστατευτική για τον ενδοθηλιακό φραγμό απάντηση, που συνδέεται με την ενισχυμένη εξωκυττάρια συγκέντρωση και σηματοδότηση της αδενοσίνης. Σε αντίθεση, τα ΠΜΠ απελευθερώνουν και παράγοντες που μπορούν να αποδιοργανώσουν τον ενδοθηλιακό φραγμό. Η ενεργοποίηση των ΠΜΠ μέσω της β 2 integrins επάγει την απελευθέρωση διαλυτών παραγόντων που προκαλούν κυτοσκελετική αποδιοργάνωση και χάσματα, με αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η πρωτεΐνη που συνδέεται με την ηπαρίνη (heparin binding protein HBP) και η οποία προκαλεί Cα 2+ -εξαρτώμενες κυτοσκελετικές αλλαγές και μακρομοριακή διαρροή ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΛΕΥΚΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΩΝ Το ΣΙΕ χαρακτηρίζεται από την ενεργοποίηση, το χημειοτακτισμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. 32 Τα λευκά αιμοσφαίρια αλληλεπιδρούν με το αγγειακό ενδοθήλιο μέσω μιας σειράς διάκριτων βημάτων που χαρακτηρίζονται από το λευκό αιμοσφαίριο που ολισθαίνει στο ενδοθήλιο, την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στο ενδοθήλιο και τη μετανάστευση. Το πρώτο βήμα γίνεται με την επαγόμενη από το ΣΙΕ αύξηση στην έκφραση της ενδοθηλιακής P- Selectin (CD62P), η οποία αλληλεπι- 39

40 δρά με τα λευκά αιμοσφαίρια. Αυτή η αρχική αλληλεπίδραση χαμηλής συγγένειας οδηγεί στη ενδιάμεση σύνδεση μεταξύ λευκοκυττάρου και ενδοθηλίου ή του λευκού αιμοσφαιρίου που ολισθαίνει. Η σταθερή προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων προκύπτει από την αλληλεπίδραση των β 2 integrins CD11a/CD18 και CD11b/CD18 του λευκού αιμοσφαιρίου με το ενδοθηλιακό μεσοκυττάριο μόριο προσκόλλησης 1 (intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1). Η μετανάστευση των λευκών αιμοσφαιρίων στο διάμεσο χώρο διευκολύνεται από το μόριο προσκόλλησης-1 αιμοπεταλίων - ενδοθηλιακών κυττάρων (platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 PECAM-1) που εκφράζεται κατά μήκος των συνδέσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με την αφιξή τους στον εξωαγγειακό χώρο,τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα απελευθερώνουν τοξικές δραστικές μορφές οξυγόνου(δμο), πρωτεάσες και ελαστάσες, με συνέπεια την αυξημένη μικροαγγειακή διαπερατότητα, το οίδημα, τη θρόμβωση και το θάνατο των κυττάρων. 32 Η συσσώρευση ΠΜΠ στον εξωαγγειακό χώρο διευκολύνεται επίσης από την ιντερλευκίνη - 8 (IL-8) που απελευθερώνεται από τους υποξικούς ιστούς, με συνέπεια μια χημειοτακτική κλίση που κατευθύνει τα ΠΜΠ από το ενδοαγγειακό διάστημα προς το διάμεσο χώρο ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΜΗ-ΕΠΑΝΑΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ Το φαινόμενο της μη-επανακυκλοφορίας αναφέρεται στην κλινική παρατήρηση σύμφωνα με την οποία η ροή αίματος σε ένα ισχαιμικό όργανο συχνά δεν αποκαθίσταται πλήρως μετά από την αποκατάσταση της αγγειακής βλάβης. Οι πιθανοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την αυξημένη συγκόλληση μεταξύ αιμοπεταλίων και λευκών αιμοσφαιρίων, την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, τη συσσώρευση διάμεσου υγρού και τη μειωμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοχάλαση. 36,66 Το φαινόμενο αυτό μπορεί να εκδηλωθεί κλινικά ως συνεχιζόμενη οργανική δυσλειτουργία, αποτυχία ενός μεταμοσχευμένου οργάνου ή αυξημένο μέγεθος εμφράγματος στην περίοδο μετά την επαναιμάτωση. Οι πειραματικές μελέτες δείχνουν έναν κεντρικό ρόλο για την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στο φαινόμενο μη-επανακυκλοφορίας, δεδομένου ότι η μείωση λευκών αιμοσφαιρίων σε αυτά τα πρότυπα βελτιώνει τη στεφανιαία ροή αίματος, μειώνει το μέγεθος του μυοκαρδιακού εμφράγματος και βελτιώνει τις κοιλιακές αρρυθμίες. 40

41 2.2.8 ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ΔΜΟ) Η επαναιμάτωση των ισχαιμικών ιστών οδηγεί σε παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου, όπως σουπεροξείδιο (Ο 2- ), ρίζες υδροξυλίου (OH - ),υποχλωριώδες οξύ (HOCl), υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και υπεροξυνιτρώδες. Η κυτταρική ισχαιμία οδηγεί στη διάσπαση του ATP και την παραγωγή υποξανθίνης. Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες, η υποξανθίνη οξειδώνεται από τη δεϋδρογενάση της ξανθίνης σε ξανθίνη. Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας όμως, η δεϋδρογενάση της ξανθίνης μετατρέπεται σε ξανθινο-οξειδάση. Σε αντίθεση με τη δεϋδρογενάση, που χρησιμοποιεί νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτίδιο (NAD) ως υπόστρωμά της, η οξειδάση χρησιμοποιεί το οξυγόνο. Έτσι κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας, που δεν καταλύεται η μετατροπή της υποξανθίνης σε ξανθίνη, παρατηρείται συγκέντρωση υπερβολικών επιπέδων υποξανθίνης. Όταν το οξυγόνο επανεισάγεται κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης, η μετατροπή της υπερβολικής υποξανθίνης από την ξανθινο-οξειδάση οδηγεί στο σχηματισμό τοξικών ΔΜΟ. 67,68 Οι ΔΜΟ μπορεί να προκαλέσουν βλάβη των ιστών μέσω διάφορων μηχανισμών. Δεδομένου ότι είναι ισχυροί οξειδωτικοί και αναγωγικοί παράγοντες, προκαλούν άμεσα βλάβες στις κυτταρικές μεμβράνες μέσω της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. 67 Οι ΔΜΟ υποκινούν επίσης την ενεργοποίηση και το χημειοτακτισμό των λευκοκυττάρων με την παραγωγή, μέσω της φωσφολιπάσης A 2,του αραχιδονικού οξέος,που είναι ένας σημαντικός πρόδρομος της σύνθεσης των εικοσανοειδών (π.χ. θρομβοξάνη A 2 και λευκοτριένη B 4 ). Επίσης οι ΔΜΟ αυξάνουν τα λευκοκυτταρικά μόρια προσκόλλησης και την έκφραση των γονιδίων των κυτοκινών με την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής όπως ο πυρηνικός παράγοντας κβ (nuclear factor kb NF-kB) και ο ενεργοποιητής πρωτεΐνης- 1 (activator protein -1 AP- 1) Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Το ΣΙΕ οδηγεί στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος και το σχηματισμό διαφόρων μεσολαβητών της φλεγμονής που μπορούν να μεταβάλλουν την αγγειακή ομοιόσταση, όπως οι αναφυλατοξίνες C3a και C5a, και τα τμήματα συμπληρώματος ic3b και C5b-9. Το C5a που είναι περίπου 20 φορές πιό ισχυρό από το C3a, μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω τη φλεγμονώδη απάντηση επάγοντας την παραγωγή και απελευθέρωση διάφορων προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, όπως IL-1, IL-6, της χημειοτακτικής πρωτεΐνης -1 των μονοκυττάρων (MCP-1) και του παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (tumor nekrosis factor α TNF-α)

42 Η αγγειακή ενδοθηλιακή λειτουργία μπορεί επίσης να τροποποιηθεί από τα C5b-9 και ic3b. Το ic3b αποτελεί συνδετικό κρίκο για την προσκόλληση λευκών αιμοσφαιρίων στο αγγειακό ενδοθήλιο μέσω του β 2 integrin CD11b/CD18. Το C5b-9 ενεργοποιεί τον πυρηνικό παράγοντα κβ (NF-kB) ώστε να αυξηθεί η μεταγραφή και η έκφραση των μορίων προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων, ενώ αυξάνει την ενεργοποίηση και το χημειοτακτισμό των λευκών αιμοσφαιρίων επάγοντας την έκκριση ενδοθηλιακής IL-8 και MCP Τέλος, το C5b-9 μπορεί άμεσα να αλλάξει τον αγγειακό τόνο με την αναστολή της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης χάλασης και την ελλάτωση του ενδοθηλιακού κυκλικόυ γουανόσινο-5 - φωσφορικού οξέος (cgmp). Με την αλλαγή της αγγειακής ομοιόστασης και την προώθηση της προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων στο αγγειακό ενδοθήλιο, το συμπλήρωμα μπορεί περαιτέρω να περιορίσει τη ροή αίματος στους ισχαιμικούς ιστούς ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: SIRS ΚΑΙ MODS (σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης και σύνδρομο δυσλειτουργίας πολλών οργάνων) Τα τοπικά αποτελέσματα του ΣΙΕ μπορούν να προκαλέσουν εκσεσημασμένη βλάβη στη θέση της ισχαιμίας, αλλά τα πιό καταστρεπτικά αποτελέσματα δημιουργούνται συχνά μέσω MODS, την κύρια αιτία θανάτου στους ασθενείς των Μονάδων εντατικής θεραπείας. Η αναπνευστική ανεπάρκεια, με την αυξημένη διαπερατότητα των αγγείων και τη συσσώρευση υγρού πλούσιου σε ουδετερόφιλα στο κυψελιδικό χώρο, είναι συχνά το πρώτο κλινικό σημάδι MODS. MODS αναπτύσσεται ως αποτέλεσμα του ΣΙΕ σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των σκελετικών μυών, 70,71 του εντέρου 72 και του ήπατος 73,74. Αν και η βλάβη των πνευμόνων είναι αυτή που έχει μελετηθεί περισσότερο από το σύνολο των απομεμακρυσμένων συνεπειών του ΣΙΕ, MODS μπορεί να περιλάβει τη δυσλειτουργία των νεφρών, του γαστροεντερικού συστήματος, του ήπατος, του μυοκαρδίου και του κεντρικού νευρικού συστήματος. Τα ουδετερόφιλα έχουν χαρακτηριστεί ως οι αρχικοί μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων. Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικών παραγόντων φαίνεται να βελτιώνει τη βλάβη των πνευμόνων μετά από ισχαιμία του εντέρου, στοιχείο που στηρίζει την υπόθεση του κεντρικού ρόλου σε ένα συντονισμένο ά- νοσο-μεσολαβητικό μοντέλο 75,76. Εντούτοις, η ενεργοποίηση και η συσσώρευση των ουδετεροφίλων εξαρτώνται από άλλους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης του συμπληρώματος, την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και την παραγωγή κυτοκινών και ΔΜΟ 77,78. 42

43 Ουσιαστικά πειραματικά στοιχεία. στηρίζουν την ύπαρξη κεντρικού ρόλου για τους κλασικούς και εναλλακτικούς καταρράκτες του συμπληρώματος ως μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων μετά από ΣΙΕ 79. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι ο αποκλεισμός διαφορετικών σημείων στον καταρράκτη του συμπληρώματος αποτρέπει την απομεμακρυσμένη βλάβη 80. Το συμπλήρωμα αυξάνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης στα ουδετερόφιλα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα 81, προωθώντας τη συσσώρευση και τη μετανάστευση των φλεγμονωδών κυττάρων που μεσολαβούν τη βλάβη στο μακρινό ιστό. Η έκφραση των μορίων προσκόλλησης είναι αρμόδια για τη συσσώρευση και την προσκόλληση των ουδετεροφίλων στην ενδοθηλιακή επιφάνεια, ένα βασικό στοιχείο στη μετανάστευση των φλεγμονωδών κυττάρων στον περιβάλλοντα ιστό. Με τη χρήση των μονοκλονικών αντισωμάτων έχει δειχθεί ότι, ποικίλα μόρια προσκόλλησης (συμπεριλαμβανομένου του L -, E - και του P- Selectin) είναι σημαντικοί μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων στο ΣΙΕ, με ποικίλους ρόλους σε διαφορετικά αγγειακό πεδία 82. Εκτός από την παρεμπόδιση της απομάκρυνσης των λευκοκυττάρων, ο εκλεκτικός αποκλεισμός του P- Selectin αποδείχθηκε ότι μειώνει την εναπόθεση συμπληρώματος, προσδίνοντας ένα πιό εκτενή ρόλο στα μόρια προσκόλλησης στη μεσολάβηση της απομεμακρυσμένης βλάβης. Η διακυττάρια σηματοδότηση με τις κυτοκίνες θεωρείται επίσης ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο βλάβη αυτή. Ίσως η καλύτερα μελετημένη κυτοκίνη είναι ο παράγοντας νέκρωσης όγκων -άλφα (TNFa). Ο TNFa έχει αποδειχθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη μεσολάβηση της συστηματικής βλάβης μετά από ισχαιμία εντέρου ή σκέλους. Στα πλαίσια της μεσεντερίου ισχαιμίας, η αλλόθεση των ε- ντερικών βακτηριδίων υποκινεί την απελευθέρωση TNFa από τα εντερικά μακρόφαγα. Φαίνεται όμως ότι ο καταρράκτης σηματοδότησης της απομεμακρυσμένης βλάβης περιλαμβάνει περισσότερες κυτοκίνες, ενώ πειράματα δείχνον ότι οι ΔΜΟ που παράγονται στο ΣΙΕ πιθανότατα επάγουν την έκφραση των κυτοκινών. 83 Η ξανθινο-οξειδάση (XO) θεωρείται σημαντική πηγή οξειδωτικών στην περίοδο επαναιμάτωσης και απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος μετά από τον ισχαιμική βλάβη, επεκτείνοντας συστηματικά το πεδίο της παραγωγής οξειδωτικών με επιπτώσεις στο μακρινό ιστό 84. Στο ΣΙΕ κάτω άκρων, η XO που απελευθερώνεται δεσμεύεται στο ήπαρ, όπου ενεργοποιεί τα κύτταρα Kupffer και τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα (ΠΜΠ), τα οποία συμβάλλουν στη δυσλειτουργία πολλών οργάνων 85. Η αναστολή της XO έχει αποδειχθεί να μειώνει την ενεργοποίηση των ΠΜΠ και την οξειδωτική καταπόνηση μετά από την ισχαιμία του εντέρου, προτείνοντας έ- ναν θεραπευτικό ρόλο για την παρεμπόδιση της XO

44 2.3 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΣΙΕ Οι κλινικές εκδηλώσεις του ΣΙΕ περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα, κυμαινόμενο από τις παροδικές αρρυθμίες έως την ανάπτυξη μοιραίου MODS. Ενώ η απάντηση στο ΣΙΕ μπορεί να ποικίλει μεταξύ των ατόμων, παράγοντες κινδύνου όπως ο διαβήτης, η υπέρταση ή η υπερχοληστεριναιμία αυξάνουν την ευπάθεια στις βλάβες ΜΥΟΚΑΡΔΙΟ To μυοκάρδιο μπορεί να παρουσιάσει κάποιο βαθμό δυσλειτουργίας μετά από την επαναιμάτωση. Η συσταλτική δυσλειτουργία είναι παροδική και πλήρως αντιστρέψιμη με το χρόνο, αν και μπορεί να απαιτηθεί η προσωρινή ινότροπη ή μηχανική υποστήριξη. Η μυοκαρδιακή αυτή δυσλειτουργία πρέπει να διαφοροποιείται από την επίμονη ισχαιμία. Οι μηχανισμοί που πιθανώς εμπλέκονται, περιλαμβάνουν τη μειωμένη επανασύνθεση ATP, το μικροαγγειακό σπασμό, την κυτταροτοξική βλάβη από τις ΔΜΟ και τη διαταραγμένη διακίνηση του ενδοκυτταρίου ασβεστίου 29, ΑΡΡΥΘΜΙΕΣ Οι αρρυθμίες είναι συχνές στους ασθενείς που υποβάλλονται σε θρομβολυτική θεραπεία ή χειρουργική επαναιμάτωση του μυοκαρδίου, και μπορεί να αποτελούν αιτία αιφνίδιου θανάτου μετά από την αποκατάσταση της στεφανιαίας ισχαιμίας. Αρρυθμίες όπως, κοιλιακή ταχυκαρδία, κοιλιακός πτερυγισμός ή ιδιοκοιλιακός ρυθμός, έχουν παρατηρηθεί και μετά από μυοκαρδιακή ΙΕ σε πειραματόζωα με κανονικές στεφανιαίες αρτηρίες, ιδιαίτερα εάν η επαναιμάτωση εγκατασταθεί α- πότομα. Οι αρρυθμίες μπορεί εν μέρει να οφείλονται στις γρήγορες και ξαφνικές αλλαγές συγκέντρωσης των ιόντων μέσα στους ισχαιμικούς ιστούς μετά την επαναιμάτωση. Η βαθμιαία επαναιμάτωση μπορεί να μειώσει την επίπτωση κακοήθων αρρυθμιών ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΚΝΣ) Η βλάβη επαναιμάτωσης στο κεντρικό νευρικό σύστημα μπορεί να συμβάλει στη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα που παρατηρείται μετά από αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, τραύμα κεφαλής, ή αποκατάσταση καρωτιδικής στένωσης. Το ΣΙΕ στο ΚΝΣ χαρακτηρίζεται από τη διάσπαση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, με συνέπεια το εγκεφαλικό οίδημα, την αυξημένη ενδοκρανιακή πίεση και τη μετακί- 44

45 νηση λευκών αιμοσφαιρίων στον περιβάλλοντα εγκεφαλικό ιστό. 69 Τα λευκά αιμοσφαίρια μπορεί εν συνεχεία να απελευθερώσουν διάφορες πρωτεάσες, μεσολαβητές και ΔΜΟ που μπορούν να οδηγήσουν στην αμετάκλητη βλάβη του ιστού, ιδιαίτερα στη μεταβατική ζώνη. Επιπλέον, λόγω απώλειας της εγκεφαλικής αγγειοδραστικότητας, η αντιδραστική υπεραιμία που μπορεί να εμφανιστεί δύναται να επιδεινώσει το εγκεφαλικό οίδημα. Κατά συνέπεια το ΣΙΕ στο ΚΝΣ μπορεί να εκδηλωθεί κλινικά ως επιδείνωση της αισθητικής, μηχανικής ή γνωστικής λειτουργίας ή ακόμη να οδηγήσει και στο θάνατο ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ΣΙΕ στο γαστροεντερικό σύστημα εμφανίζεται μετά από διάφορες καταστάσεις όπως αιμορραγική καταπληξία,στραγγαλισμός του εντέρου καθώς και μετά από αγγειοχειρουργικές επεμβάσεις. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο εντερικός φραγμός προστατεύει τον οργανισμό από το εχθρικό περιβάλλον του εντερικού αυλού. Στο ΣΙΕ διασπάται ο φραγμός, διαταράσσεται η προστασία, με αποτέλεσμα την αύξηση της εντερικής διαπερατότητας και τη μικροβιακή μετακίνησηαλλόθεση στην πυλαία και συστηματική κυκλοφορία 69. Επίσης μπορεί να οδηγήσει σε εξασθένηση της κινητικότητας και της απορροφητικότητας του εντέρου. Φαίνεται επίσης ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων Kupffer του ήπατος σε ισχαιμία και επαναιμάτωση σκέλους έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της οξειδωτικής καταπόνησης 88,89. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος και των λευκών αιμοσφαιρίων από τα βακτηρίδια μπορεί τελικά να οδηγήσει στην ανάπτυξη του MODS ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ (MODS) Η καταστρεπτική συνέπεια του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης είναι η ανάπτυξη βλαβών σε απομεμακρυσμένα όργανα και η πολυοργανική ανεπάρκεια, που μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο. Η πολυοργανική ανεπάρκεια είναι η κύρια αιτία θανάτου στις μονάδες εντατικής θεραπείας, με θνησιμότητα που σχετίζεται άμεσα με τον αριθμό των ανεπαρκούντων οργάνων. Οι πνεύμονες ανήκουν στα πιο συχνά προσβεβλημένα όργανα στους ασθενείς που πάσχουν από MODS 90. Η αναπνευστική ανεπάρκεια ακολουθείται συχνά από ηπατική, νεφρική, γαστροεντερική, μυοκαρδιακή και δυσλειτουργία του ΚΝΣ. Εκτός από την αυξημένη μικροαγγειακή διαπερατότητα, το MODS χαρακτηρίζεται και από δυσλειτουργία της πήξης και του ανοσοποιητικού συστήματος, που οδηγεί στη θρόμβωση, τη διάχυτη ενδοαγγειακή πήξη και την ανοσοκαταστολή. 45

46 Λόγω των καταστρεπτικών αποτελεσμάτων του ΣΙΕ σε απομακρυσμένα όργανα που οδηγεί σε MODS, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη των στρατηγικών για να αποτρέψει ή να μειώσει τα αποτελέσματά του. 2.4 ΘΕΡΑΠΕΙΑ Τα τελευταία χρόνια καταβάλλονται σημαντικές προσπάθειες ώστε να προληφθεί ή να περιοριστεί η έκταση του ΣΙΕ. Αν και πολλές θεραπευτικές στρατηγικές έ- χουν αποδειχθεί να είναι αποτελεσματικές στα ελεγχόμενα πειραματικά πρότυπα, εντούτοις δεν κατάφεραν να αναπαραγάγουνε αποτελέσματα στην κλινική πρακτική ή δεν έχουν φθάσει ακόμα στις ανθρώπινες κλινικές δοκιμές. Επομένως η έγκαιρη επαναιμάτωση της ισχαιμικής περιοχής παραμένει ο ακρογωνιαίος λίθος της κλινικής αντιμετώπισης ΛΕΥΚΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ Οι θεραπευτικές στρατηγικές που στρέφονται στα λευκά αιμοσφαίρια περιλαμβάνουν την αναστολή της σύνθεσης μορίων προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων και της απελευθέρωσης φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως ο παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (platelet activation factor PAF), η ισταμίνη, η λευκοτριένη B4 (LTB4), και o TNF-α που προάγουν την ενεργοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων. Μια πειραματική προσέγγιση ήταν να ανασταλεί η απελευθέρωση ή οι υποδοχείς αυτών των μεσολαβητών χρησιμοποιώντας αντισώματα, ή ανταγωνιστές. 69 Μια δεύτερη θεραπευτική προσέγγιση είναι να μειωθεί η σύνθεση μορίων προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων. Πολλά αντιφλεγμονώδη φάρμακα, όπως η α- σπιρίνη και τα γλυκοκορτικοειδή μειώνουν την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής (π.χ. NF-κΒ, AP-1) που ρυθμίζουν τη σύνθεση των μορίων προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων ή την έκφραση των κυτοκινών. 69 Η βλάβη από το ΣΙΕ μπορεί επίσης να μειωθεί με την παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ λευκών αιμοσφαιρίων και ενδοθηλίου. Τα μονοκλονικά αντισώματα που κατευθύνονται ενάντια στα μόρια προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων ή τις διαλυτές μορφές τους έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς σε διάφορα πειραματικά πρότυπα για να αποτρέψουν τη σύνδεση. Aν και αυτές οι στρατηγικές έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά αποτελεσματικές στα πειραματόζωα, τα ανθρώπινα κλινικά στοιχεία είναιπεριορισμένα

47 2.4.2 ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Η επαναλαμβανόμενη έκθεση των ιστών σε περιοδικές μικρής διάρκειας ισχαιμίας ή υποξίας μπορεί να προστατεύσει από τα επιβλαβή αποτελέσματα της παρατεταμένης ΙΕ. Αυτό το φαινόμενο αναφέρεται ως ισχαιμική προετοιμασία. Στα πειραματικά μοντέλα ΙΕ, η ισχαιμική προετοιμασία έχει αποδειχθεί να βελτιώνει την κοιλιακή λειτουργία και να μειώνει τη μυοκαρδιακή συσσώρευση των λευκών αιμοσφαιρίων και την απόπτωση 87,91. Αν και τα ανθρώπινα κλινικά στοιχεία είναι ακόμη περιορισμένα, φαίνεται oτι μειώνει τον κίνδυνο μετεγχειρητικών αρρυθμιών στους ασθενείς που υποβάλλονται σε στεφανιαία παράκαμψη 92 και την ηπατική βλάβη στις διάφορες ηπατεκτομές 93. Η προστατευτική αυτή δράση σχετίζεται με τη μεταβολή στην έκφραση γονιδίων, τη σύνθεση νέων πρωτεϊνών, τη σύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου και την αυξημένη παραγωγή αδενοσίνης με αποτέλεσμα τη βελτίωση των ενεργειακών αποθεμάτων των κυττάρων ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι παράγοντες σε πειραματικά μοντέλα,όπως Ν- ακετυλοκυστεΐνη, μαννιτόλη, καταλάση, δισμουτάση υπεροξιδίου, αλλοπουρινόλη και βιταμίνη Ε, που δείχνουν ότι η αντιοξειδωτική θεραπεία μπορεί να προλάβει ή να βελτιώσει τις εκδηλώσεις του ΣΙΕ. 95 Εντούτοις, σε πολλές ανθρώπινες μελέτες τα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής θεραπείας ήταν διφορούμενα. Κατά συνέπεια, ενώ τα πειραματικά στοιχεία υποστηρίζουν έντονα το ρόλο της οξειδωτικής καταπόνησης στο ΣΙΕ και υποστηρίζουν έναν προστατευτικό ρόλο για την αντιοξειδωτική θεραπεία, περαιτέρω τυχαιοποιημένες μελέτες σε ανθρώπους είναι απαραίτητες ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Η αναστολή της ενεργοποίησης του συμπληρώματος σε πειραματικά μοντέλα έχει δείξει να μειώνει τις βλάβες από ΙΕ. 69 Έτσι η χορήγηση ενός αναστολέα της μετατροπής του παράγοντα C3, βελτίωσε σημαντικά το μέγεθος του μυοκαρδιακού εμφράγματος (κατά 44%) σε πειραματικό μοντέλο. 96 Και σε αυτό το πεδίο χρειάζονται περαιτέρω μελέτες ώστε να κριθεί η αποτελεσματικότητα στον άνθρωπο. 47

48 3. ΙΣΧΑΙΜΙΑ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ ΗΠΑΤΟΣ Οι μεταβολές του ήπατος λόγω ισχαιμίας και επαναιμάτωσης αντιπροσωπεύουν μια διαδικασία που έχει ως αποτέλεσμα την ηπατοκυτταρική βλάβη. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα όταν το ήπαρ βρίσκεται σε συνθήκες ισχαιμίας - υποξίας και επαναιμάτωσης - επανοξυγόνωσης και μπορεί να συμβεί σε ποικίλες κλινικές καταστάσεις όπως π.χ. σε συνθήκες χαμηλής παροχής προς το ήπαρ (καταπληξία), χειρουργικές επεμβάσεις και μεταμοσχεύσεις. Το σύνδρομο ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης αποτελεί μια μη αντιγονοεξαρτώμενη βλάβη που καθορίζει την έκβαση των μεταμοσχεύσεων, ευθύνεται για πάνω από το 10% της πρώιμης ανεπάρκειας οργάνων και μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη συχνότητα οξείας και χρόνιας απόρριψης του μοσχεύματος. 97,98 Στις περισσότερες έρευνες θεωρείται ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων Kuppfer, των πολυμορφοπυρήνων (ΠΜΠ), των ενδοθηλιακών κυττάρων (ΕΚ) και των δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ) είναι κρίσιμης σημασίας για τη παθογένεση της βλάβης από ισχαιμία-αιπαναιμάτωση. 97,98 Το τελικό αποτέλεσμα είναι η ηπατική δυσλειτουργία. Οι ιστοπαθολογικές μεταβολές που παρατηρούνται στο ήπαρ μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση περιλαμβάνουν το κυτταρικό οίδημα, την αύξηση των κενοτοπίων, την καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αύξηση της διαπερατότητας των ΠΜΠ. Φαίνεται ότι τα μη παρεγχυματικά κύτταρα (Kuppfer, ΕΚ) είναι πιο ευαίσθητα στο ψυχρό σύνδρομο ισχαμίαςεπαναιμάτωσης συγκρινόμενα με τα ηπατοκύτταρα. Η απόπτωση των κολποειδών ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και η πηκτική νέκρωση φαίνεται να αυξάνεται κατά την ψυχρή διατήρηση του οργάνου και επαναιμάτωση του ηπατικού μοσχεύματος. Η πρώτη συνέπεια του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης είναι η κυτταρική ανοξία, η οποία βλάπτει τον ενδοκυττάριο μεταβολισμό και την ενζυματική λειτουργία, με συνέπεια τη μείωση του ATP, τη συσσώρευση του ενδοκυτταρίου νατριόυ Να + και το κυτταρικό οίδημα. Η ανταπόκριση των ηπατικών ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία αποτελούν τα πιο ευαίσθητα μη παρεγχυματικά ηπατικά κύτταρα, αποτελεί προγνωστικό παράγοντα του συνδρόμου. 99 Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενεργοποιούμενα κατά τη διάρκεια του συνδρόμου ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης εκφράζουν στην επιφάνεια τους αντιγόνα του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας και άλλα μόρια προσκόλλησης, προάγοντας το ενδοθήλιο σε περαιτέρω αλληλεπίδραση με τα ΠΜΠ. Η ενεργοποίηση των ΠΜΠ οδηγεί στη διαταραχή της μικροκυκλοφορίας στην περιοχή της βλάβης. Η ΠΜΠ- 48

49 επαγόμενη βλάβη του ήπατος, είναι αποτέλεσμα της προσκόλλησης μεταξύ δύο κυττάρων, στην οποία πιθανώς μεσολαβούν οι ιντεργκρίνες και άλλα μόρια προσκόλλησης. 100 Στο σύνδρομο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης συμμετέχουν και τα κύτταρα του Kuppfer, τα οποία παρουσιάζουν μια σχετική αντίσταση κατά τη διάρκεια της ι- σχαιμίας. Κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης όμως παράγουν μια ποικιλία παραγόντων, όπως προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες [προσταγλανδίνες (PGs), παράγων ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF), παράγων νέκρωσης όγκου (TNF-a), ιντερλευκίνες (IL-1, IL-6), ιντερφερόνη (IFN-γ)] και δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) που δρουν άμεσα κυτταροτοξικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα ηπατοκύτταρα, επάγουν αλλαγές στους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης στα η- πατοκύτταρα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα ΠΜΠ και ενεργοποιούν περαιτέρω άλλα κύτταρα του Kuppfer και ΠΜΠ. 100 Οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) αποτελούν τους πιο πρώιμους και σημαντικότερους παράγοντες της βλάβης του ήπατος μετά από ισχαιμίαεπαναιμάτωση. Οι κυριότερες ΔΜΟ είναι οι ρίζες υπεροξειδίου, υδροξυλίου και υπεροξειδίου του υδρογόνου. Οι πηγές ΔΜΟ στο ισχαιμικό ήπαρ περιλαμβάνουν την ξανθινοξειδάση (ΧΟ), τα κύτταρα Kuppfer και τα προσκολλημένα ΠΜΠ. Οι ΔΜΟ προκαλούν βλάβες σε πρωτεΐνες, ένζυμα, στο νουκλεικό οξύ, στον κυτταροσκελετό, στην κυτταρική μεμβράνη και στα λιπίδια, με αποτέλεσμα την ελάττωση της μιτοχονδριακής λειτουργίας και την υπεροξείδωση των λιπιδίων. 101 Η ενδοθηλιακή βλάβη από τις ΔΜΟ οδηγεί σε διαταραχή της μικροκυκλοφορίας και τη μείωση της αιματικής παροχής. Ενδογενείς αντιοξειδωτικοί παράγοντες όπως υπεροξείδια δισμουτάσης, καταλάσης και γλουταθειόνης και η β-καροτίνη, μπορεί να περιορίσουν τη δράση των ΔΜΟ, αλλά υπερνικώνται όταν υπάρχουν μεγάλες ποσότητες ΔΜΟ. Θεραπευτικές στρατηγικές αποτελούν οι γενετικοί φορείς, οι οποίοι μεταφερόμενοι σε ποντίκια με αδενοϊούς φαίνεται να μειώνουν την ηπατοτοξικότητα

50 4. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΗ 4.1 EΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Σε ένα κανονικό ομοιοπολικό δεσμό τα δύο ηλεκτρόνια που συμμετέχουν σε ένα μοριακό τροχιακό είναι συζευγμένα (paired) και έχουν αντιπαράλληλο spin που συμβολίζεται με ( ). Αντίθετα στις ρίζες (radicals) που ονομάζονται και ελεύθερες ρίζες (free radicals, FRs) ένα ή περισσότερα ηλεκτρόνια σε ένα η περισσότερα ατομικά η μοριακά τροχιακά είναι ασύζευκτο ή ασύζευκτα (unpaired) και έχουν παράλληλο spin που συμβολίζεται με ( ). Σύμφωνα με τα παραπάνω ελεύθερες ρίζες είναι άτομα ή μόρια που περιέχουν ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Ο ευρύς αυτός ορισμός συμπεριλαμβάνει το άτομο του υδρογόνου (Η) που έχει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, το μόριο του οξυγόνου (O 2 ) που έχει δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια, το οξείδιο του αζώτου (ΝΟ) που έχει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, καθώς και τα περισσότερα μεταβατικά μέταλλα, όπως ο Fe 2+ και ο Fe 3+ που έχουν αντίστοιχα 4 και 5 ασύζευκτα ηλεκτρόνια και ο Cu 2+ πού έχει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο προσδίδει συνήθως στις ελεύθερες ρίζες μεγάλη χημική δραστηριότητα και συμβολίζεται συνήθως με μια τελεία στο επάνω δεξιό μέρος του χημικού τύπου (Ρ ) ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να σχηματιστούν με δύο τρόπους: α) ομολυτική διάσπαση: ο ομοιοπολικός δεσμός αποτελείται από ένα ζεύγος ηλεκτρονίων (:) που περιέχεται μεταξύ δύο ατόμων. Με τη διάσπαση ενός τέτοιου δεσμού, το ζεύγος των ηλεκτρονίων μπορεί να παραμένει στο ένα μόνο άτομο του μητρικού μορίου (ετερολυτική διάσπαση) με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντων: A : B A + + B - ή να διαχωριστεί και κάθε άτομο να διατηρήσει ένα ηλεκτρόνιο από το ζεύγος (ομολυτική διάσπαση) και να παραχθούν δύο ελεύθερες ρίζες: A : B A + B Η ομολυτική διάσπαση ενός ομοιοπολικού δεσμού απαιτεί, γενικά, για να γίνει μεγάλη ποσότητα ενέργειας, όπως είναι αυτή που περιέχεται στις ακτινοβολίες ιονισμού, στις ακτινοβολίες UV και στη θερμότητα. β) οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις: με την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου σε ένα κανονικό μόριο (αναγωγή): 50

51 Α + e - A - Ή με την αφαίρεση ενός ηλεκτρονίου από ένα κανονικό μόριο (οξείδωση): Α + e + A + Η προσθήκη ή η αφαίρεση ενός ηλεκτρονίου σε ένα κανονικό μόριο μπορεί να γίνει με απλές οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις ή με οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα ή μέταλλα. Στα βιολογικά συστήματα, η παραγωγή ελευθέρων ριζών γίνεται συνήθως με ο- ξειδοαναγωγικές αντιδράσεις, επειδή αυτές δεν απαιτούν μεγάλη ενέργεια. Στις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις μεταφέρονται ηλεκτρόνια από ένα δότη ηλεκτρονίων ή από ένα αναγωγικό αντιδραστήριο σε ένα δέκτη ηλεκτρονίων ή οξειδωτικό αντιδραστήριο 103, ΒΑΣΙΚΕΣ ΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ Οι ελεύθερες ρίζες είναι συνήθως χημικά πολύ δραστικές επειδή έχουν ισχυρή τάση να ζευγαρώνουν με το ασύζευκτο τους ηλεκτρόνιο. Έτσι, αν μια ελεύθερη ρίζα αντιδράσει με μια ένωση που δεν είναι ελεύθερη ρίζα, τότε θα παραχθεί μια νέα ρίζα. Α + Β Α +Β Η χαρακτηριστική αυτή ιδιότητα εμπλέκει ένα μηχανισμό αλυσιδωτών αντιδράσεων στον οποίο η αρχική ελεύθερη ρίζα υφίσταται μια σειρά από αντιδράσεις διάδοσης οι οποίες οδηγούν τελικά στο σχηματισμό αλυσιδωτών αντιδράσεων και στην αναγέννηση της αρχικής ρίζας. Αν όμως μια ελεύθερη ρίζα αντιδράσει με μια άλλη ελεύθερη ρίζα, τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια θα ζευγαρώσουν και η ένωση που θα προκύψει δεν θα είναι πλέον ε- λεύθερη ρίζα 105. Α + Β Α : Β 4.2 ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΓΕΝΙΚΑ Από το πλήθος των ελευθέρων ριζών εκείνες που παρουσιάζουν μεγαλύτερο ενδιαφέρον στα βιολογικά συστήματα είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (oxygen free radicals, OFRs) και γενικότερα οι δραστικές μορφές οξυγόνου ΔΜΟ (reactive oxygen species, ROS). Ο όρος δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) ή δραστικοί 51

52 μεταβολίτες του οξυγόνου (reactive oxygen metabolites, ROM) αναφέρεται στις ενώσεις που παράγονται από το μοριακό οξυγόνο με αναγωγή ενός, δύο ή τριών ηλεκτρονίων, καθώς και σε ρίζες οξυγόνου ή οργανικές ρίζες και υπεροξείδια, που παράγονται από ενώσεις που έχουν αντιδράσει με ρίζες οξυγόνου. Έτσι η ρίζα του ανιόντος του σουπεροξειδίου (02.- ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και η υδροξυλική ρίζα (ΗΟ. ) μπορούν να θεωρηθούν ΔΜΟ, επειδή παράγονται με αναγωγή του Ο 2 με ένα, δύο ή τρία ηλεκτρόνια αντίστoιχα. Στις ΔΜΟ συγκαταλέγονται επίσης το μονήρες οξυγόνο ( 1 Ο 2 ) και το όζον (Ο 3 ) επειδή μπορούν να προκαλέσουν την παραγωγή ελευθέρων ριζών. Το μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) έχει ασυνήθιστη ηλεκτρονική δομή, επειδή, ενώ έχει άρτιο αριθμό ηλεκτρονίων, δύο από αυτά είναι ασύζευκτα με παράλληλο σπιν. Το μοριακό οξυγόνο, παρόλο που είναι ρίζα, έχει περιορισμένη οξειδωτική ικανότητα. Αυτό οφείλεται στο παράλληλο σπιν των δύο ασύζευκτων ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια αυτά για να ζευγαρώσουν θα πρέπει το οξυγόνο να πάρει από ένα άλλο άτομο ή μόριο δύο ηλεκτρόνια που να έχουν και αυτά παράλληλο σπιν (αναγωγή δύο ηλεκτρονίων). Συνήθως όμως τα άτομα ή τα μόρια στο ατομικό ή μοριακό τους τροχιακό έχουν ένα ζεύγος ηλεκτρονίων με αντιπαράλληλο σπιν και έτσι περιορίζεται η οξειδωτική ικανότητα του οξυγόνου. Όταν λοιπόν το Ο 2 αντιδρά με άτομα ή μόρια που έχουν αντιπαράλληλο σπιν, τότε το Ο 2 έχει την τάση να πάρει ένα μόνο ηλεκτρόνιο (αναγωγή ενός ηλεκτρονίου). Θερμοδυναμικά όμως η αναγωγή ενός ηλεκτρονίου του οξυγόνου είναι δυσμενής και έτσι περιορίζεται και πάλι η οξειδωτική του ικανότητα. Ένας τρόπος με τον οποίο μπορεί να παρακαμφθεί ο περιορισμός της οξειδωτικής ικανότητας του Ο 2 είναι να αντιδράσει με ά- τομα ή μόρια που έχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια (ελεύθερες ρίζες). Τα μεταβατικά στοιχεία, όπως ο σίδηρος και ο χαλκός, έχουν συνήθως ασύζευκτα ηλεκτρόνια και είναι εξαιρετικοί καταλύτες αναγωγής ενός ηλεκτρονίου του Ο 2 106, ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ Το οξυγόνο βρίσκεται στον αέρα με τη μορφή του μοριακού οξυγόνου (Ο 2 ). Οι αερόβιoι οργανισμοί χρησιμοποιούν το οξυγόνο για να οξειδώσουν τον άνθρακα και ουσίες πλούσιες σε υδρογόνο, όπως είναι τα τρόφιμα, για να λάβουντην απαραίτητη για την επιβίωσή τους χημική και θερμική ενέργεια. Εκτιμάται ότι από το ολικό οξυγόνο που καταναλώνουν τα θηλαστικά, το 85-90% καταναλώνεται στα μιτοχόνδρια. Από αυτό περίπου το 98% μεταβολίζεται από ένα μόνο ένζυμο, την οξειδάση του κυτοχρώματος, που μεταφέρει τέσσερα ηλεκτρόνια στο Ο 2 και παράγει δύο μόρια Η 2 Ο 52

53 Η διεργασία αυτή γίνεται στην αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων και συνδέεται με την παραγωγή του ΑΤΡ. Κάτω από φυσιoλoγικές συνθήκες το υπόλοιπο 1-2% του Ο 2, ανάγεται μερικώς κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων κατά μήκος της αναπνευστικής αλυσίδας και σχηματίζει το σουπεροξείδιο 105. Η μεγάλη όμως συγκέντρωση της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου στη μιτοχονδριακή ουσία ε- ξουδετερώνει τα βασικά αυτά επίπεδά του, που παράγονται στην κανονική αυτή διεργασία,πριν προκαλέσουν βλάβες στο κύτταρο. Άλλες ενδοκυτταρικές πηγές ΔΜΟ είναι το ενδοπλασματικό δίκτυο, οι πυρηνικές και πλασματικές μεμβράνες καθώς και το κυτταροδιάλυμα. Έτσι, στους αερόβιους οργανισμούς η παραγωγή ΔΜΟ είναι μία κανονική διεργασία. Στα βιολογικά συστήματα η παραγωγή ΔΜΟ γίνεται κυρίως με ενζυμικές οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις. Τα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα και μακροφάγα), όταν έρθουν α- ντιμέτωπα με ξένα σωματίδια ή βακτηρίδια ενεργοποιούνται και αρχίζουν να καταναλώνουν μεγάλες ποσότητες Ο 2 πολύ μεγαλύτερες από αυτές που χρησιμοποιούν τα μιτοχόνδριά τους για την παραγωγή ενέργειας με την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Η επιπλέον αυτή κατανάλωση Ο 2 χρησιμοποιείται από τα φαγοκύτταρα για την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου με τις οποίες καταστρέφουν τα παθογόνα μικρόβια 108. Η οξείδωση της ξανθίνης γίνεται κυρίως με τη δεϋδρογονάση της ξανθίνης (τύπος D). Η δεϋδρογονάση της ξανθίνης καταλύει την αντίδραση της οξείδωσης της υ- ποξανθίνης και ξανθίνης σε ουρικό οξύ (Σχ. 1) Σε υγιείς ιστούς η μορφή αυτή του ενζύμου κατέχει περίπου το 90% της ενεργότητας και μεταφέρει ηλεκτρόνια στο NAD+. Όμως περίπου ένα 10% του ενζύμου βρίσκεται στους ιστούς με τη μορφή της οξειδάσης της ξανθίνης (τύπος Ο), η οποία μεταφέρει ηλεκτρόνια όχι στο NAD+ αλλά στο οξυγόνο και σχηματίζει Ο (Σχ. 2) Σχ. 1 Δράση της δεϋδρογονάσης της ξανθίνης 53

54 Σχ. 2 Δράση της οξειδάσης της ξανθίνης Οι αντιδράσεις αυτές αναστέλλονται από την οξυπουρινόλη που είναι ο κυριότερος μεταβολίτης της αλλοπουρινόλης. Η μετατροπή της D μορφής του ενζύμου σε Ο μορφή οφείλεται στην οξείδωση ορισμένων σoυλφυδρυλικών ομάδων (-SH) του ενζύμου ή σε μερική πρωτεόλυση του ενζύμου. Παρ' όλο που ήταν γνωστή από πολύ καιρό η μετατροπή αυτή του ενζύμου, έρευνες τα τελευταία χρόνια δεν έδειξαν να γίνεται η διεργασία αυτή in νίνο ή να έχει κάποια φυσιoπαθoλoγική σημασία. Έχει βρεθεί όμως η μετατροπή αυτή να γίνεται σε ισχαιμικούς ιστούς 110. Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου παράγονται και από την οξειδωτική μετατροπή της αιμοσφαιρίνης (HbFe 2+ ) σε μεθαιμοσφαιρίνη (methbfe 3+ ). Η μετατροπή αυτή είναι μία κανονική διαδικασία και εκτιμάται ότι περίπου το 3% της αιμοσφαιρίνης των ερυθροκυττάρων υφίσταται καθημερινά αυτή την οξείδωση 111. Οι προσταγλανδίνες, τα λευκοτριένια και άλλες σχετικές με αυτές ουσίες, όπως τα θρομβοξάνια και οι προστακυκλίνες, συχνά αναφέρονται ως εικοσανοειδή,επειδή η βιοσύνθεσή τους γίνεται από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα με είκοσι άτομα άνθρακα. Η σημαντικότερη πρόδρομη ουσία των εικοσανοειδών είναι το αραχιδονικό οξύ, που απελευθερώνεται με τη δράση της φωσφολιπάσης Α 2 από τα φωσφογλυκερίδια των κυτταρικών μεμβρανών 112. Η μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε βιολογικά ενεργά εικοσανοειδή γίνεται με δύο διαφορετικούς μεταβολικούς δρόμους και είναι μία ενζυμική λιπιδική υπεροξείδωση. Ο ένας μεταβολικός δρόμος επειδή οδηγεί στο σχηματισμό του δακτυλίου του κυκλοπεντανίου των προσταγλαδινών ονομάζεται κυκλικός μεταβολικός δρόμος (cyclic pathway), ενώ ο άλλος μεταβολικός δρόμος που οδηγεί στο σχηματισμότων λευκοτριενίων, επειδή δεν οδηγεί στο σχηματισμό κυκλικών παραγώγων 113,114 ονομάζεται γραμμικός μεταβολικός δρόμος (linear pathway). 54

55 Κυκλικός δρόμος: Ο δρόμος αυτός αρχίζει με τις προσταγλανδινο-ενδοϋπεροξειδάσες-η-συνθάσες 1 και 2 (prostaglandin endoperoxide-h-synthases, PGHS- 1 και PGHS-2) ή κυκλοοξυγονάσες (cyclooxygenase, COX-1 και COX-2). Ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος αρχίζει με τη δράση της PGHS που καταλύει την εισαγωγή δύο μορίων οξυγόνου στο αραχιδονικό οξύ. Με την αντίδραση αυτή σχηματίζεται ένα ασταθές ενδοϋπεροξείδιο, το οποίο στη συνέχεια ανάγεται σε υδροξυπεροξείδιο 115 με αποτέλεσμα την παραγωγή ριζων οξυγόνου. Γραμμικός δρόμος: Ο μεταβολικός αυτός δρόμος αρχίζει με τις λιποοξυγονάσες. Τα ένζυμα αυτά περιέχουν στην ενεργή τους περιοχή ένα άτομο σιδήρου και είναι διοξυγονάσες. Καταλύουν, δηλαδή, απευθείας την εισαγωγή δύο ατόμων οξυγόνου στις θέσεις 5 ή 12 ή 15 του αραχιδονικού οξέος και έτσι σχηματίζονται το 5 ή το 12 ή το15 υ- δροϋπεροξυ-εικοσιτετραενοϊκό οξύ (ΗΡΕΤΕ). Αυτά όμως δεν είναι σταθερά και μπορούν να αναχθούν στα αντίστοιχα υδροξυ-παράγωγα (5,12 και15 ΗΕΤΕ) με την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και τη γλουταθειόνη (GSH) και να παραχθούν ρίζες οξυγόνου. 4.3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΓΕΝΙΚΑ H παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ) είναι συνεχής, τόσο κάτω από παθολογικές όσο και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Οί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί του οργανισμού εξουδετερώνοντας τις μορφές αυτές συμβάλλουν στη διατήρηση της ισορροπίας. Όταν διαταράσσεται η ισορροπία προκαλείται το οξειδωτικό στρές. Η διαταραχή της ισορροπίας μπορεί να οφείλεται σε υπέρμετρη παραγωγή ROS, σε παρουσία τοξικών ουσιών οι οποίες μεταβολίζονται μέσα στα κύτταρα και παράγουν ROS, σε υπερβολική ενεργοποίηση των συστημάτων παραγωγής ROS, όπως των φαγοκυττάρων στη ρευματοειδή αρθρίτιδα ή σε ανεπάρκεια των αντιοξειδωτικών ουσιών. Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεση ενός μεγάλου αριθμού ασθενειών, επειδή οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που ξεφεύγουν από τους ενδογενείς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες, είναι δυνατόν να προκαλέσουν σημαντικές οξειδωτικές βλάβες σε όλες τις κύριες τάξεις των βιομορίων, όπως είναι οι υδατάνθρακες, τα λιπίδια, οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα 116. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η λιπιδική υπεροξείδωση η οποία οδηγεί σε παραγωγή προϊόντων που μπορούν να προσβάλλουν 55

56 τις πρωτεΐνες των μεμβρανών και να προκαλέσουν σημαντικές αλλοιώσεις. Έτσι οι υποδοχείς μπορεί να χάσουν τη λειτουργικότητά τους και οι αντλίες νατρίουκαλίου (Na + /K + -ATPase) και ασβεστίου (Ca 2+ -ATPase) μπορεί να υποστούν βλάβες και να μην είναι σε θέση να ρυθμίσουν τις συγκεvrρώσεις των ιόvrων στα φυσιολογικά επίπεδα μέσα και έξω από τα κύτταρα. Επίσης, πολλά ένζυμα μπορεί να χάσουν την ενεργότητά τους και να μην μπορούν να ανταποκριθούν στην καταλυτική τους δράση. Γενικά οι πρωτεΐνες, που είναι συνδεμένες στις μεμβράνες, χάνουν τη λειτουργικότητά τους. Η διαπερατότητα σε ιόντα και άλλες ουσίες αυξάνεται, επειδή παρεμβάλλονται πολικές ουσίες στα υδρόφοβά τμήματα των μεμβρανών. Η μεμβράνη χάνει τη ρευστότητα εξαιτίας της μείωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, που έχουν μεγαλύτερη ρευστότητα από τα κορεσμένα και μονοακόρεστα. Έτσι η δυναμική τείνει στη λύση τηςσυνέχειας της μεμβράνης με κίνδυνο την αρχή της πρόωρης γήρανσης και νέκρωσης του κυττάρου. Η εκτίμηση της ίδιας της οξειδωτικής βλάβης καθώς και του προστατευτικού ρόλου των αντιοξειδωτικών μηχανισμών στηρίζεται στη μέτρηση κάποιων παραμέτρων. Τα προϊόντα του οξειδωτικού μηχανισμού είναι σχετικά ασταθή και μεταβολίζονται γρήγορα. Απαιτείται λοιπόν μία μέθοδος ειδική και ευαίσθητη ώστε να είναι είναι αξιόπιστη. Η μέθοδος θα πρέπει να προσδιορίζει μία ουσία η οποία να αποτελεί τον κατάλληλο δείκτη της οξειδωτικής κατάστασης και της βλάβης που προκαλείται στα λιπίδια, τις πρωτεΐνες ή και το DNA. Η ουσία πρέπει να απαντάται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα στα βιολογικά υλικά (ιστοί ή υγρά) και να μην αλλοιώνεται κατά την αποθήκευση ή επεξεργασία του δείγματος. Οι ουσίες που χρησιμοποιούνται σήμερα ευρύτερα προσδιορίζουν την οξειδωτική βλάβη στα λιπίδια και αποτελούν τελικά προϊόντα λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η λιπιδική υπεροξείδωση αποτελεί μία σύνθετη και πολύπλοκη διαδικασία με παραγωγή διαφόρων ενδιάμεσων και τελικών προϊόντων. Αντίστοιχα υπάρχουν και διάφορες μέθοδοι οι οποίες μετρούν την ελλάτωση των υποστρωμάτων, προσδιορίζουν τα επίπεδα των υπεροξειδίων ή εκτιμούν τελικά προϊόντα. Οι μέθοδοι που προτιμώνται συνήθως είναι αυτές που προσδιορίζουν τη συγκέντρωση κάποιων τελικών προϊόντων, όπως η μαλονική διαλδεΰδη, τα F 2 - ισοποροστάνια και τα αέρια αιθάνιο και πεντάνιο, λόγω σταθερότητας των ουσιών ΜΑΛΟΝΙΚΗ ΔΙΑΛΔΕΫΔΗ (MDA) Η δοκιμασία με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) στηρίζεται στον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της MDA στο βιολογικό υλικό που εξετάζεται. Είναι εύκολη 56

57 στην εκτέλεση, δεν απαιτεί πολύπλοκο εξοπλισμό και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται ευρύτατα. Η MDA προέρχεται από τη διάσπαση των υπεροξέων των PUFAs (polyunsaturated fatty acids, πολυακόρεστα λιπαρά οξέα) που περιέχουν ένα ή περισσότερους διπλούς δεσμούς, όπως το αραχιδονικό οξύ, και αποτελεί ένα υδρόφιλο τελικό προϊόν της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Μεταβολίζεται πολύ γρήγορα και σχηματίζει βάσεις του Schiff με τις αμινομάδες των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα να ανιχνεύεται ελεύθερη σε πολύ μικρές ποσότητες. Κατά τη διενέργεια της δοκιμασίας πραγματοποιείται αρχικά θέρμανση του δείγματος με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) σε όξινο περιβάλλον και εν συνεχεία μέτρηση της απορρόφησης του συμπλόκου MDA - TBA στα 532 nm. H διαδικασία ενώ φαίνεται απλή, παρουσιάζει προβλήματα τα οποία οφείλονται στην επεξεργασία του δείγματος ή την απορρόφηση του συμπλόκου. Έτσι η αποδόμηση υπεροξειδίων κατά την επεξεργασία μπορεί να οδηγήσει σε μη ελεγχόμενη παραγωγή MDA με αποτέλεσμα την εμφάνιση διακυμάνσεων στις ευρισκόμενες τιμές. Παρόμοια προβλήματα προκύπτουν όταν δεν προστατεύονται τα άθικτα PUFAs από την οξείδωση και οδηγούν σε υπερεκτίμηση της MDA. Αντίθετα η μεγάλη τάση σύζευξης με τις αμινοομάδες δυσχεραίνει την ανάκτησή της από το βιολογικό υλικό και οδηγεί σε υποτίμησή της. Ουσίες, όπως η χολερυθρίνη μπορεί με τη σειρά της, λόγω απορρόφησης στο ίδιο μήκος κύματος, να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσματα. Επίσης ορισμένοι υδατάνθρακες, αμινοξέα και νουκλεϊνικά οξέα μπορούν να δημιουργήσουν σύμπλοκο με το TBA και να παρενοχλούν τη μέτρηση. Λόγω αυτών των παρενοχλήσεων πολλοί ερευνητές που χρησιμοποιούν αυτή τη μέθοδο αναφέρουν τα αποτελέσματά τους σε TBARs (TBA Reactive Substances), ως ουσίες δηλαδή που αντιδρούν με το TBA. Η παραπάνω περιγραφόμενη φωτομετρική μέθοδος παρουσίασε σημαντικές δυσκολίες και αρκετοί ερευνητές έχουν επισημάνει ότι η εκτίμηση της λιπιδικής υ- περοξείδωσης με αυτόν τον τρόπο πρέπει να γίνεται με επιφυλακτικότητα. Έχοντας γνώση αλλά και ίδια εμπειρία αυτών των προβλημάτων, καταβλήθηκε σημαντική προσπάθεια ώστε να βελτιωθεί η μεθοδολογία στην ειδικότητα και ευαισθησία για να είναι η εξέταση αξιόπιστη. Βελτιώθηκε τόσο το στάδιο της κατεργασίας του δείγματος, όσο και το στάδιο της μέτρησης της απορρόφησης. Με τον τρόπο αυτό περιορίστηκαν οι υπερεκτιμήσεις, εξουδετερώθηκαν οι παρενοχλήσεις και βελτιώθηκε η επαναληψιμότητα των μετρήσεων. Η τροποποιημένη μέθοδος βασίστηκε στην παραγώγηση του φάσματος του συμπλόκου MDA-TBA που καταγράφεται στην περιοχή nm (Σχ. 3). Η μέ- 57

58 θοδος αυτή προσέφερε τη δυνατότητα αξιόπιστων μετρήσεων στο εργαστήριο Βιοχημείας του Α.Π.Θ πάνω σε διάφορα πειραματικά μοντέλα 117. Σχ. 3 Κανονικό φάσμα απορρόφησης (-) και φάσμα τρίτης παραγώγου (--) του προϊόντος της αντίδρασης 32 ng MDA /ml με TBA. Το ύψος της κορυφής h σε αυθαίρετες μονάδες χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της MDA. 58

59 5. ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΙΙΙ 5.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όταν ο μηχανισμός της πήξης ενεργοποιείται λόγω μιας τοπικής βλάβης ενός αγγείου, τότε η διαδικασία σχηματισμού θρόμβου πρέπει να είναι περιορισμένη στο σημείο της βλάβης και όχι σε ολόκληρο το αγγειακό δίκτυο. Αυτό επιτυγχάνεται με τη δράση ορισμένων ανασταλτών της πήξης, οι οποίοι ενεργοποιούνται κατά τη διαδικασία της πήξεως. Ο πιο σημαντικός από αυτούς τους ανασταλτές είναι η αντιθρομβίνη ΙΙΙ (ΑΤ ΙΙΙ) που αναστέλλει τη δράση της θρομβίνης και του παράγοντα Xa καθώς επίσης και άλλες πρωτεάσες της σερίνης. 5.2 ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΑΙ ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ Η ΑΤΙΙΙ είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μονής αλύσου, με μοριακό βάρος Daltons, που συντίθεται στο ήπαρ και έχει ημιπερίοδο ζωής 2-3 ημέρες. Η ημιπερίοδος ζωής της ΑΤΙΙΙ είναι δυνατόν να μειωθεί σε λίγες ώρες σε περιπτώσεις ο- ξείας κατανάλωσης της 118. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ αδρανοποιεί τη θρομβίνη, την καλλικρεΐνη και τους παράγοντες VIIa, IXa, Xa και XIa μέσω της μη αναστρέψιμης σύνδεσής της με καθένα από αυτούς ξεχωριστά και σχηματίζοντας 1:1 συμπλέγματα. Η ηπαρίνη ενισχύει αυτή τη διαδικασία όταν συνδέεται με την ΑΤΙΙΙ δημιουργώντας μια διαμορφωτική αλλαγή η οποία προάγει τη συγγένεια της ΑΤΙΙΙ προς τη θρομβίνη και τις άλλες πρωτεάσες. Το σύμπλεγμα ΑΤΙΙΙ με τη θρομβίνη ονομάζεται ΤΑΤ σύμπλεγμα και η κάθαρση του επιτυγχάνεται από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (ΔΕΣ). Η ηπαρίνη απελευθερώνεται από το σύμπλεγμα πριν από τη κάθαρση του από το ΔΕΣ και συνεχίζει να αλληλεπιδρά με την επιπρόσθετη ΑΤΙΙΙ. Η δράση της ηπαρίνης εξαρτάται από τη παρουσία ΑΤΙΙΙ ενώ σε έλλειψη αυτής είναι σημαντικά περιορισμένη. Κατά παρόμοιο τρόπο οι γλυκοζοαμινογλυκάνες (GAGs) που μοιάζουν με την ηπαρίνη και είναι τοποθετημένες στην ε- λεύθερη επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, συνδέονται με τη ΑΤΙΙΙ και επιτυγχάνουν αναστολή της δράσης της θρομβίνης 119. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ όμως εμφανίζει, πέρα από την αντιπηκτική, επίσης και αντιφλεγμονώδη δράση. Η προσκόλληση της ΑΤΙΙΙ στις GAGs τού ενδοθηλίου προκαλεί την απελευθέρωση προστακυκλίνης (PGI 2 ), μιας ουσίας που εμφανίζει ι- σχυρή αντιφλεγμονώδη δράση. Ωστόσο η ηπαρίνη ανταγωνίζεται τις GAGs ως προς την προσκόλληση τους με την ΑΤΙΙΙ και επηρεάζει την αντιφλεγμονώδη δράση. Η PGI 2 με τη σειρά της αναστέλλει την ενεργοποίηση των λευκοκυττά- 59

60 ρων, την παραγωγή του TNF-α από τα μονοκύτταρα, την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων και την προσκόλληση τους στα κύτταρα του ενδοθηλίου. Επίσης η ΑΤΙΙΙ μειώνει την απελευθέρωση λυσοσωμικών πρωτεϊνασών, κυτοκινών και διαλυτών ενδοκυττάριων μορίων προσκόλλησης ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΑΤΙΙΙ Η ανεπάρκεια της ΑΤΙΙΙ μπορεί να είναι συγγενής η επίκτητη. Οι ασθενείς οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα ΑΤΙΙΙ εξαιτίας συγγενούς ή ε- πίκτητης ανεπάρκειας είναι υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση θρόμβωσης ή διάχυτης ενδαγγειακής πήξης (ΔΕΠ) 121,122. Ειδικά σε σοβαρές ασθένειες, η μείωση των επιπέδων της δραστικότητας της ΑΤΙΙΙ, θα πρέπει να ρυθμίζεται με τη χορήγηση υψηλής καθαρότητας συμπυκνώματος ΑΤΙΙΙ ώστε να προληφθούν ή να θεραπευτούν οι θρομβοεμβολικές επιπλοκές και η διάχυτη ενδαγγειακή πήξη (ΔΕΠ). Προφυλακτική θεραπεία με ΑΤΙΙΙ μπορεί να χορηγηθεί σε ασθενείς με συγγενή ανεπάρκεια της ΑΤΙΙΙ κατά τη διάρκεια της εγχείρησης, ή σε τοκετό, ή σε νεογνά κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου. Στόχος της θεραπείας είναι η επίτευξη επιπέδων δραστικότητας της ΑΤΙΙΙ στα 80%. 123,124,125,126 Η επίκτητη ανεπάρκεια της ΑΤΙΙΙ μπορεί να προκύψει από την αυξημένη κατανάλωση ΑΤΙΙΙ, όπως στη ΔΕΠ ή στη σήψη, τη μειωμένη παραγωγή που σχετίζεται με ηπατικές διαταραχές ή στην αυξημένη απώλεια ΑΤΙΙΙ η οποία παρατηρείται π.χ. στα εγκαύματα και στους πολυτραυματίες. Η συγγενής ανεπάρκεια της ΑΤΙΙΙ, όπως αναφέρθηκε ήδη, συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης θρομβοεμβολικών επεισοδίων, συνήθως με τη μορφή της εν τω βάθει φλεβικής θρόμβωσης των κάτω άκρων και της πυέλου. Σε ασθενείς που εμφανίζουν τέτοια επεισόδια τα επίπεδα της ΑΤΙΙΙ πιθανόν να είναι χαμηλότερα κατά 50% του φυσιολογικού, αν και έχουν περιγραφεί θρομβοεμβολικές επιπλοκές με τιμές έως και 70%. Η ΑΤΙΙΙ μπορεί να χορηγηθεί σε περιπτώσεις ανεπάρκειας ΑΤΙΙΙ είτε για την πρόληψη είτε για τη θεραπεία των θρομβοεμβολικών επιπλοκών. 5.4 ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗΣ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΟΥΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΤ ΙΙΙ Η Αμερικάνικη Πνευμολογική εταιρία και η Εταιρία Ιατρικής Φροντίδας (ACCP/SCCM) ανακοίνωσε ομόφωνες θέσεις για τους ορισμούς και τα διαγνω- 60

61 στικά κριτήρια που ισχύουν σήμερα για τη σήψη και τις σχετικές καταστάσεις 127. Το σύνδρομο της συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (SIRS) έχει ένα ευρύτερο ορισμό, περιλαμβάνοντας καταστάσεις οι οποίες προκαλούνται από μια ποικιλία διαφόρων κλινικών παθήσεων συμπεριλαμβανομένης (όχι όμως αποκλειστικά) της λοίμωξης. Η σήψη μπορεί να θεωρηθεί σαν μια ειδική μορφή ή σαν ένα τμήμα του SIRS. Κατά τη διάρκεια του SIRS είναι δυνατόν να ενεργοποιηθεί ο μηχανισμός της πήξης, με αποτέλεσμα την πλημμελή αιμάτωση των οργάνων και την εμφάνιση ανεπάρκειας που αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με σήψη. Υπάρχουν διάφορα στάδια στην εμφάνιση της διαταραχής του πηκτικού μηχανισμού, που συχνά συνδυάζεται με την εμφάνιση ταυτόχρονης αιμορραγίας και υ- περπηκτικότητας. Η μείωση των επιπέδων της ΑΤΙΙΙ οφείλεται σε αυξημένη κατανάλωση κατά τη διάρκεια της πήξης, σε μείωση πιθανότατα της σύνθεσης της στο ήπαρ και σε πρωτεολυτική αδρανοποίηση της ΑΤΙΙΙ από μια ελαστάση που προέρχεται από ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα. Τα επίπεδα ΑΤΙΙΙ είναι γενικά χαμηλότερα στους ασθενείς με σήψη που δεν επιβίωσαν απ ότι σε αυτούς που επιβίωσαν. Οι χαμηλές τιμές ΑΤΙΙΙ είναι ένας ευαίσθητος δείκτης κακής πρόγνωσης. Ο Fourrier και συν σε μελέτη 60 ασθενών με σηπτική καταπληξία, συνέκριναν τα επίπεδα των παραγόντων πήξεως σε σχέση με τη πορεία της κατάστασης των ασθενών 128. Τα επίπεδα της ΑΤΙΙΙ παρουσίασαν υψηλότερη προγνωστική αξία για τη δυσμενή πρόγνωση των ασθενών. Η μείωση των επιπέδων ΑΤΙΙΙ κάτω από 50% εμφάνιζε θετική προγνωστική ευαισθησία 96% και ειδικότητα 76% για τον επικείμενο θάνατο (p<0,0001). Στους μη επιβιώσαντες, τα επίπεδα ΑΤΙΙΙ παρέμειναν χαμηλά έως το θάνατο, ενώ τα επίπεδα ΑΤΙΙΙ αυξήθηκαν σταθερά στους ασθενείς που ε- πιβίωσαν. Οι συγγραφείς κατέληξαν ότι η παρατεταμένη κατανάλωση ή η αναστολή της ΑΤΙΙΙ μπορεί να ευθύνονται για τη παρατεταμένη ενεργοποίηση του μηχανισμού πήξεως, και ότι τα αρχικά χαμηλά επίπεδα ΑΤΙΙΙ ήταν οι καλύτεροι δείκτες πρόγνωσης της έκβασης των ασθενών. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί και από άλλους συγγραφείς σε ασθενείς με αναστρέψιμη σοβαρή σήψη ή θανάσιμη σηπτική καταπληξία. Οι συγγραφείς συμπέραναν ότι οι μετρήσεις της δραστικότητας της ΑΤΙΙΙ μπορεί να αποδειχθούν πολύτιμές για το καθορισμό τόσο της σοβαρότητας όσο και της πρόγνωσης της σηπτικής φλεγμονώδους ανταπόκρισης σε διάφορους ασθενείς. Σε μία τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη συγκρίθηκε η αποτελεσματικότητα της χορήγησης υψηλών δόσεων ΑΤΙΙΙ σε ασθενείς με σοβαρή σήψη. Στη μελέτη αυτή περιελήφθησαν 29 ασθενείς που ταξινομήθηκαν σε 2 ομάδες. Στην πρώτη ομάδα χορηγήθηκαν υψηλές δόσεις ΑΤΙΙΙ μαζί με τη κλασσική θεραπεία ενώ στη 61

62 δεύτερη ομάδα χορηγήθηκε μόνο η κλασσική θεραπεία 129,130. Η χορήγηση ΑΤΙΙΙ βελτίωσε σημαντικά την αναπνευστική λειτουργία των ασθενών, με λιγότερο έκδηλη την ανάγκη αναπνευστικής υποστήριξης κατά τη τελική περίοδο της μελέτης. Εκτός όμως από τη βελτίωση της αναπνευστικής λειτουργίας η χορήγηση ΑΤΙΙΙ έδρασε προστατευτικά στη λειτουργία του ήπατος και των νεφρών. Διατυπώθηκε η άποψη ότι η ΑΤΙΙΙ έχει ωφέλιμη νεφρική επίδραση, προλαμβάνοντας την εναπόθεση ινικής στα σπειράματα. Η μακροχρόνια χορήγηση ΑΤΙΙΙ προκάλεσε μια σημαντική αντιφλεγμονώδη ανταπόκριση, η οποία ήταν περισσότερο έκδηλη κατά τη διάρκεια της δεύτερης εβδομάδας από τη χορήγηση της. Όπως αναφέρεται στην ίδια μελέτη, δεν μειώθηκαν μόνο τα επίπεδα της ιντερλευκίνης -6 (IL-6) και της ιντερλευκίνης -8 (IL-8), αλλά υπήρξε και αναστολή της δράσης των διαλυτών μορίων προσκόλλησης που προέρχονται από το ενδοθήλιο που είναι δείκτες δραστικότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της σήψης. Ο Fourrier και οι συν μελέτησαν τη δράση της ΑΤΙΙΙ σε ασθενείς με σοβαρή σήψη 131 σε μια τυχαιοποιημένη, διπλή τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο με 35 α- σθενείς. Τα επίπεδα ΑΤΙΙΙ στην ομάδα των ασθενών που χορηγήθηκε, αυξήθηκαν ταχέως και παρέμειναν σε υψηλά επίπεδα έως και τη 10 μέρα της μελέτης. Η διάρκεια των διαταραχών της πήξης μειώθηκε, η ΔΕΠ αποκαταστάθηκε στο 64% των ασθενών την 2 η μέρα της θεραπείας έναντι 11% της ομάδας με εικονικό φάρμακο (p<0,01) και στο 71% των ασθενών στο τέλος της θεραπείας (4 η μέρα) έναντι 33% της ομάδας με εικονικό φάρμακο αντίστοιχα (p<0,05). Τα διαλυτά συμπλέγματα ινώδους εξαφανίστηκαν γρήγορα στη ομάδα των ασθενών που χορηγήθηκε ΑΤΙΙΙ και η θνητότητα μειώθηκε κατά 44%. Ο Eisele και συν 132 σε μια τυχαιοποιημένη διπλή τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο χορήγησαν ATIII για ένα χρονικό διάστημα 5 ημερών σε ασθενείς με σοβαρή σήψη. Η χορήγηση ΑΤΙΙΙ είχε σαν συνέπεια τη μείωση της θνησιμότητας κατά 39% σε διάστημα 30 ημερών και την αρκετά βραχύτερη παραμονή στη ΜΕΘ. Οι ασθενείς στους οποίους χορηγήθηκε ΑΤΙΙΙ εμφάνισαν καλύτερη έκβαση της βαρύτητας νόσου και της ανεπάρκειας των οργάνων αμέσως μετά την έναρξη της θεραπείας. Οι ασθενείς αυτοί όχι μόνο βελτίωσαν τις ήδη εγκαταστημένες ανεπάρκειες οργάνων αλλά και εμφάνισαν και χαμηλότερη επίπτωση εμφάνισης νέων ανεπαρκειών. Η βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών που αποδόθηκε στη ΑΤΙΙΙ εμφανίστηκε τη δεύτερη εβδομάδα της θεραπείας και αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της τρίτης εβδομάδας. Σε μετανάλυση τριών κλινικών μελετών της ΑΤΙΙΙ που πραγματοποιήθηκε από τους Eisele και συν και περιελάμβανε 122 ασθενείς με σοβαρή σήψη 132, οι συγγραφείς ανέφεραν 22,9% μείωση της θνησιμότητας σε περίοδο παρακολούθησης 30 ημερών. 62

63 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 63

64

65 6. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της πιθανής προστατευτικής δράσης της αντιθρομβίνης ΙΙΙ (ΑΤ ΙΙΙ) στη βλαπτική επίδραση στο ήπαρ, όταν προκαλείται ισχαιμία και επαναιμάτωση των κάτω άκρων που διαθέτουν μεγάλες μυϊκές μάζες. 7. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ 7.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Για τη πραγματοποίηση της πειραματικής μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 70 άρρενες επίμυες της φυλής Wistar βάρους gr και ηλικίας 70 εως 100 ημερών οι οποίοι παραχωρήθηκαν από τη μονάδα πειραματοζώων του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Α.Π.Θ. Ο χειρισμός των πειραματοζώων έγινε σύμφωνα με την ειδική νομοθεσία της Ευρωπαïκής Ένωσης. Όλα τα πειραματόζωα τοποθετήθηκαν σε κλουβιά από πλαστικό και ατσάλι και αφέθηκαν να εγκλιματισθούν επί δύο εβδομάδες στο πειραματικό χειρουργείο του Ιπποκρατείου Γ.Π.Ν.Θ. Τα πειραματόζωα είχαν ε- λεύθερη πρόσβαση σε νερό και τροφή (φύραμα Νο 510 της εταιρείας ΕΛΒΙΖ). Ο χώρος διαμονής είχε σταθερή θερμοκρασία και εξαερισμό και ο φωτισμός ήταν ρυθμισμένος σε κύκλο 12 ωρών φωτός και σκότους. Οι 60 από αυτούς υποβλήθηκαν σε πλήρη ισχαιμία του δεξιού οπισθίου άκρου. Οι άλλοι 10 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα μαρτύρων και υποβλήθηκαν σε εικονική επέμβαση χωρίς να διενεργηθεί ισχαιμία και επαναιμάτωση στο σκέλος. Χωρίστηκαν σε δύο ομάδες των 5. Στην πρώτη ομάδα χορηγήθηκε AT III σε δόση 250ΙU/kg βάρους σώματος (ΒΣ), ενώ στη δεύτερη χορηγήθηκε εικονικό φάρμακο NaCl 0,9%. Η επιλογή της δόσης στηρίχτηκε σε άλλες μελέτες που είχαν παρόμοιο σχεδιασμό 133, ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ Η πρόκληση ισχαιμίας πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία (αιθέρας) με την ε- φαρμογή ίσχαιμης περίδεσης στο ριζομήριο του επίμυος. Η επιβεβαίωση της πλήρους ισχαιμίας έγινε με αγγειογραφικό έλεγχο ή έλεγχο με Doppler. Η διάρκεια 65

66 ισχαιμίας ήταν έξι (6) ώρες. Τριάντα (30) λεπτά πριν την άρση της ισχαιμίας οι επίμυες τυχαιοποιήθηκαν σε δυο (2) ομάδες (Α,Β,) 7.3 ΟΜΑΔΕΣ ΟΜΑΔΑ Α: (30 επίμυες): Σε όλους τους επίμυες χορηγήθηκε ενδοφλεβίως ΑΤΙΙΙ 30 λεπτά πριν την άρση της ισχαιμίας σε δόση 250ΙU/kg βάρους σώματος (ΒΣ). Μετά την άρση της ισχαιμίας οι επίμυες χωρίστηκαν σε τρεις υποομάδες των 10 (Α1, Α2, Α3 ) Oμάδα Α1: Λήφθηκε βιοψία (ιστοτεμάχιο ήπατος) αμέσως μετά την άρση της ι- σχαιμίας του σκέλους. Ομάδα Α2: Λήφθηκε βιοψία (ιστοτεμάχιο ήπατος) σε χρόνο 30 λεπτά μετά την άρση της ισχαιμίας του σκέλους. Ομάδα Α3: Λήφθηκε βιοψία (ιστοτεμάχιο ήπατος) σε χρόνο 4 ώρες μετά την άρση της ισχαιμίας του σκέλους. ΟΜΑΔΑ Β: (30 επίμυες): Σε όλους τους επίμυες χορηγήθηκε ενδοφλεβίως εικονικό φάρμακο (διάλυμα NaCl 0.9%) 30 λεπτά πριν την άρση της ισχαιμίας. Μετά την άρση της ισχαιμίας χωρίστηκαν παρομοίως με την ομάδα Α σε τρεις υποομάδες των 10 (Β1, Β2, Β3) ανάλογα με το χρόνο επαναιμάτωσης. ΟΜΑΔΑ Γ: Δέκα (10) επίμυες χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα μαρτύρων. Οι επίμυες αυτοί υποβλήθηκαν μόνο σε αναισθησία και στη συνέχεια οι πέντε (5) σε χορήγηση ΑΤΙΙΙ και οι υπόλοιποι σε χορήγηση εικονικού φαρμάκου (διάλυμα NaCl 0,9%). Υποβλήθηκαν σε εικονική επέμβαση χωρίς να διενεργηθεί ισχαιμία και επαναιμάτωση στο σκέλος και από όλους λήφθηκαν βιοψίες ήπατος και δείγματα αίματος. Η εικονική επέμβαση (sham operation) έγινε για να αποκλεισθεί η επίπτωση της εγχειρητικής καταπόνησης στα αποτελέσματα. Τα ιστοτεμάχια ήπατος μελετήθηκαν με οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και χρησιμοποιήθηκαν για τον έμμεσο προσδιορισμό των ελευθέρων ριζών οξυγόνου με τη μέτρηση της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA). Πριν τη λήψη του ιστοτεμαχίου σε όλους τους επίμυες διενεργήθηκε αιμοληψία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των εξής παραγόντων: Τρανσαμινάσες (SGOT, SGPT), γ-γλουταμική αμινοτρανσφεράση (γ- GT), αλκαλική φωσφατάση (ALP),λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια Μετά την αιμοληψία και τη λήψη βιοψιών τα πειραματόζωα θανατώθηκαν με τη χορήγηση χλωριούχου καλίου (KCl). 66

67 7.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΑΞΗ Η εισαγωγή στην αναισθησία γίνεται με την τοποθέτηση του πειραματοζώου σε γυάλινο κώδωνα, ο οποίος περιέχει τολύπιο εμποτισμένο με αιθέρα. Απαιτείται προσοχή κατά τη φάση αυτή, επειδή η παρατεταμένη παραμονή του πειραματοζώου στον κώδωνα καταλήγει σε θάνατο από άπνοια. Μόλις το ζώο κοιμηθεί και σταματήσουν οι καταποτικές κινήσεις και οι κινήσεις των τριχών του ρύγχους του, θεωρείται ότι το βάθος της αναισθησίας είναι ικανοποιητικό και εξάγεται από τον κώδωνα. Η αναισθησία, όποτε αυτή απαιτείται,διατηρείται με προσωπίδα, η οποία περιέχει τολύπιο εμποτισμένο με αιθέρα. Ακολουθούν η ζύγιση και η α- τραυματική ακινητοποίηση του πειραματόζωου και εν συνεχεία η πρόκληση ι- σχαιμίας με την εφαρμογή ίσχαιμης περίδεσης στο ριζομήριο. Αφού έγινε τεκμηρίωση της προκληθείσας ισχαιμίας με ενδαρτηριακή αγγειογραφία (βλ. εικ. 1-3), πλέον ο έλεγχος της ισχαιμίας συνεχιζόταν με χρήση υπερηχητικού αιματοταχύμετρου (doppler). Με αυτόν τον τρόπο αποκλείεται η επίδραση του σκιαστικού μέσου και η καταπόνηση από την ίδια την αγγειογραφία στα αποτελέσματα των μετρήσεων. Μετά την πρόκληση της ισχαιμίας στο δεξιό οπίσθιο άκρο του επίμυος το πειραματόζωο επανατοποθετείται στο χώρο του για 5,5 ώρες έχοντας πρόσβαση μόνο σε νερό. Εν συνεχεία πάλι υπό γενική αναισθησία με αιθέρα χορηγείται από την πεϊκή φλέβα (βλ. εικ. 4) στις ομάδες Α και Β η ΑΤΙΙΙ και ίσου όγκου διάλυμα φυσιολογικού ορού NaCl 0,9% αντίστοιχα. Στις έξι ώρες ισχαιμίας, δηλαδή 30 λεπτά μετά τη χορήγηση των ουσιών, ακολουθεί υπό γενική αναισθησία με αιθέρα η άρση της ισχαιμίας με λύση της περίδεσης. Στα πειραματόζωα των ομάδων Α1 και Β1 διενεργείται αμέσως η επέμβαση, ενώ στις ομάδες Α2, Α3 και Β2, Β3 τα πειραματόζωα επανατοποθετούνται στο χώρο τους και ακολουθεί στο προβλεπόμενο χρόνο η θυσία τους. Στα πειραματόζωα της ομάδας Γ χορηγείται με τις ίδιες συνθήκες το φάρμακο και μετά από 30 λεπτά ακολουθεί η επέμβαση. Η επέμβαση γίνεται υπό γενική αναισθησία με αιθέρα. Το πειραματόζωο τοποθετείται στη πειραματική χειρουργική τράπεζα σε ύπτια θέση και ακινητοποιείται με την καθήλωση των άκρων του. Ακολουθεί η διαβροχή της κοιλιακής επιφάνειας του πειραματοζώου με χλιαρό, αραιό, υδατικό διάλυμα Cetavlon και ξυρίζεται, από το κατώτερο θωρακικό τοίχωμα μέχρι τη βουβωνική χώρα. Εν συνεχεία το εγχειρητικό πεδίο επιστρώνεται με διάλυμα ιωδιούχου ποβιδόνης (betadine) και καλύπτεται με αποστειρωμένο σχιστό οθόνιο μιας χρήσης. 67

68 7.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΧΡΟΝΟΙ 1) Μέση τομή στη κοιλιακή χώρα. 2) Διάνοιξη του περιτοναίου και απώθηση των σπλάχνων κεντρικά. 3) Με προσεχτικούς χειρισμούς αποκάλυψη της κάτω κοίλης φλέβας και διενέργεια αιμοληψίας για τον προσδιορισμό των βιοχημικών και αιματολογικών παραμέτρων (τρανσαμινάσες, γ-γλουταμινική τρανσφεράση, αλκαλική φωσφατάση, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια) στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τομέα Κλινικών της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. 4) Λήψη τεμαχίου από το δεξιό λοβό του ήπατος το οποίο τοποθετείται σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια στη βαθιά κατάψυξη (-80 ο C) για να ακολουθήσει η επεξεργασία για τη μέτρηση της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) στο εργαστήριο της Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. 5) Λήψη τεμαχίου από το μέσο λοβό του ήπατος το οποίο τοποθετείται σε διάλυμα φορμόλης 10% και αποστέλλεται για παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο στο εργαστήριο της Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. 6) Έγχυση γλουταραλδεύδης 3% στην πυλαία (το ήπαρ σκλήρυνε,είχε χρώμα κιτρινωπό και ήταν έξαιμο) και λήψη τεμαχίου από το μέσο λοβό του ήπατος, από κεντικά και περιφερικά σημεία, το οποίο τεμαχίζεται σε μικρά κομμάτια επεξεργάζεται κατάλληλα και αποστέλλεται για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο στο Εργαστήριο της Ιστολογίας-Εμβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. 7) Θανάτωση του πειαραματοζώου με χορήγηση χλωριούχου καλίου (KCl). Ως δείκτες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν με βάση το πρωτόκολλο τα ακόλουθα: α) Ο προσδιορισμός των ελευθέρων ριζών οξυγόνου με τη μέτρηση της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) στο ιστοτεμάχιο του ήπατος. β) Η μεταβολή των βιοχημικών και αιματολογικών παραμέτρων (τρανσαμινάσες,γ-γλουταμική αμινοτρανσφεράση, αλκαλική φωσφατάση, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια). γ) Οι ιστολογικές αλλοιώσεις του ήπατος τόσο στο οπτικό όσο και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. 68

69 7.6 ΤΕΧΝΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΚΑΙ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ Τα δείγματα του αίματος για το προσδιορισμό των βιοχημικών και αιματολογικών παραμέτρων μετά την αιμοληψία τοποθετούνταν σε ειδικά φιαλίδια με αντιπηκτικό. Η αιματολογική εξέταση (αίμα σε φιαλίδιο με αντιπηκτικό EDTA KE /1.3ml) έγινε σε κτηνιατρικό αναλυτή τύπου Scill Vet abc (Animal Blood Counter), εκτός από το λευκοκυτταρικό τύπο η μελέτη του οποίου έγινε σε επιχρίσματα αίματος (χρώση Giemsa). Η έκφραση των τιμών γινόταν ανά μl. Η βιοχημική εξέταση έγινε σε πλάσμα (αίμα σε φιαλίδιο με αντιπηκτικό Li- Heparin/1.3ml) σε βιοχημικό αναλυτή ανοικτού τύπου VITALAB Flexor E Clinical Chemistry Analyser της Vital Scientific NV. Η φυγοκέντρηση για τη λήψη του πλάσματος έγινε σε φυγόκεντρο Stat Spin MP multi purpose centrifuge για 30 sec (Plasma Rotor). Η έκφραση των τιμών γινόταν σε u/l. Η αιματολογική και η βιοχημική εξέταση γινόταν αυθημερόν ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Τα ιστοτεμάχια από το μέσο λοβό του ηπατικού παρεγχύματος που προορίζονταν για εξέταση με το οπτικό μικροσκόπιο τοποθετήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεϋδης 10% για 24 ώρες. Ακολούθησε αφυδάτωση σε ανιόντα διαλύματα αλκοόλης (70%, 80%, 96% και 100%), φορμόλης, ακετόνης, ξυλόλης και εγκλεισμός σε κύβους παραφίνης. Εν συνεχεία ελήφθησαν τομές πάχους 4 μm, οι οποίες αφού υ- πέστησαν αποπαραφίνωση σε κλίβανο 100 ο C για 15 και σε διαλύματα οργανικών διαλυτών (ξυλόλης και αλκοοόλης 96%) τοποθετήθηκαν σε νερό. Οι ιστολογικές χρώσεις αιματοξυλίνης-εωσίνης (Η&Ε) πραγματοποιήθηκαν με βάση κλασσική μεθοδολογία ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Αρχικά γίνεται παρακέντηση της πυλαίας και έγχυση διαλύματος γλουταραλδεύδης 3% ώστε το ήπαρ να γίνει σκλρό, να έχει χρώμα κιτρινωπό και να είναι έξαιμο. Εν συνεχεία λαμβάνονται μικρά ιστοτεμάχια από κεντρικά και περιφερικά σημεία του μέσου λοβού του ήπατος, τα οποία σε διάλυμα γλουταραλδεύδης 3% κόβονται σε μικρότερα τεμάχια διαμέτρου 3 mm. Παραμένουν στο διάλυμα για 2 ώρες 69

70 σε κοινό ψυγείο στους 4 0 C και εν συνεχεία γίνεται έκπλυση των τεμαχίων με ρυθμιστικό διάλυμα ph 7,3 4 0 C. Η μονιμποίηση του ιστού συμπληρώνεται με την εμβάπτιση των τεμαχίων σε διάλυμα τετραοξειδίου του οσμίου 2% σε ρυθμιστικό διάλυμα ph 7,3 όπου παρέμειναν για 90 λεπτά. Μετά την έκπλυσή τους με ρυθμιστικό διάλυμα του ίδιου ph και με δισαποσταγμένο νερό γίνεται χρώση των τεμαχίων με την εμβάπτισή τους σε διάλυμα οξεικού ουρανυλίου 1% για 17 ώρες. Μετά την έκπλυσή τους με δισαποσταγμένο νερό γίνεται αφυδάτωση των τεμαχίων με την εμβάπτισή τους σε αυξανόμενης πυκνότητας υδατικά διαλύματα αλκοόλης (30%, 50%, 70%, 96%) για 5 λεπτά σε κάθε διάλυμα και στη συνέχεια σε απόλυτη αλκοόλη για 30 λεπτά με 6 αλλαγές της αλκοόλης που ήταν εμβαπτισμένα. Ακολουθούσε η έγκλεισή τους σε ρητίνες Epon. Η κοπή των τομών έγινε σε υ- περμικροτόμο τύπου Reichert Om U 2. Το χρώμα των τομών ήταν από χρυσό μέχρι ασημένιο και το πάχος τους από 1000 έως 1400 Å. Κατόπιν γινόταν βαφή των λεπτών τομών με διάλυμα νιτρικού μολύβδου για 20 λεπτά κατά τη μέθοδο Reynolds. Η εξέταση και φωτογράφηση των τεμαχίων έγινε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο τύπου JEM 2000 FX II ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΑΛΟΝΙΚΗΣ ΔΙΑΛΔΕΫΔΗΣ (MDA) Ο προσδιορισμός της MDA στηρίχτηκε στη μέθοδο των Μπότσογλου και Παπαγεωργίου 117. Αμέσως μετά τη λήψη γινόταν τοποθέτηση του τεμαχίου ήπατος σε υγρό άζωτο και εν συνεχεία σε βαθιά κατάψυξη στους C,ακολουθούσε ζύγιση και λήψη δύο γραμμαρίων ηπατικού ιστού και μεταφορά σε σωληνάριο με 5 ml υδατικού διαλύματος 5% TCA (τριχλωροοξεικό οξύ) και 2 ml εξανίου στο οποίο ήταν διαλυμένο 1% κορεσμένο διάλυμα BHT (βουτυλιομένο υδροξυτολουόλιο, αντιοξειδωτικό που προφυλάσσει από τις υπόλοιπες οξειδώσεις). Η διαδικασία ομογενοποίησης γινόταν σε ομογενοποιητή Polytron για 60 δευτερόλεπτα σε υψηλές στροφές και η φυγοκέντρηση σε απλή φυγόκεντρο στις 3000 στροφές/λεπτό για 10 λεπτά. Ακολουθούσε λήψη 2,5 ml από την υποκείμενη υδαρή στοιβάδα, προσθήκη 1,5 ml θειοβαρβιτουρικού οξέος (διάλυμα κορεσμένο 0,8%) (είναι το αντιδραστήριο που αντιδρά με την MDA και δίνει το ερυθρό χρώμα που απορροφάται από το φασματοφωτόμετρο), ανακίνηση σε αναδευτήρα (vortex), επώαση σε υδατόλουτρο για 30 λεπτά στους 70 0 C και ψύξη κάτω από νερό βρύσης. Εν συνεχεία γινόταν μέτρηση σε φασματοφωτόμετρο στην περιοχή απορροφητικότητας από nm έναντι αναλόγου τυφλού δείγματος από νερό και λήψη 70

71 της τρίτης παραγώγου του φάσματος στα 521 nm όπου απομονώνεται η MDA (φάσμα απορροφητικότητας). Η συγκέντρωση της MDA στα δείγματα εκφράζονταν σε nmols/gr ιστού και η τελική τιμή δίνονταν από την εξίσωση της πρότυπης καμπύλης που έγινε με καθαρή MDA σε διάφορες συγκεντρώσεις: ψ = -2, , χ όπου ψ η τιμή που έδειχνε το όργανο και χ η MDA σε nmols/gr ιστού. Η τελική τιμή του χ πολλαπλασιαζόταν επί 8. Οι μετρήσεις έγιναν σε φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης (Shimadzu UV-160A) που διαθέτει το απαραίτητο λογισμικό για τη μέτρηση, αποθήκευση και μαθηματική επεξεργασία του φάσματος. 71

72 8. ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΗΠΑΤΟΣ ΕΠΙΜΥ Το ήπαρ του επίμυος αποτελεί το 4 ± 0.25% του βάρους του ζώου το οποίο, όμως, εξαρτάται από τη φυλή, το φύλο και την ηλικία του. Αποτελείται από τέσσερις λοβούς, οι οποίοι διαχωρίζονται με βαθειές σχισμές. 136,137 Περιτοναïκές πτυχές συνδέουν τους λοβούς τόσο μεταξύ τους όσο και με το διάφραγμα και το οπίσθιο κοιλιακό τοίχωμα και αποτελούν τους κρεμαστήρες συνδέσμους του οργάνου. Βρίσκεται στην άνω κοιλία, καταλαμβάνει το δεξιό υποχόνδριο, ένα μέρος από το ιδίως επιγάστριο και ένα μέρος από το αριστερό υποχόνδριο. Το σχήμα του μοιάζει με σφήνα ή λοξό παραλληλεπίπεδο. Η βάση του βρίσκεται στο δεξιό υποχόνδριο και η κορυφή στο αριστερό. Το μεγαλύτερο τμήμα του ήπατος βρίσκεται σε στενή επαφή με το διάφραγμα και εγκλωβίζεται από τις πλευρές, κατά μήκος των οποίων επεκτείνεται κοιλιακώς προς τα εμπρός. Για την περιγραφή του διακρίνουμε ένα πρόσθιο χείλος, ένα δεξιό και ένα αριστερό χείλος. Ακόμη διακρίνουμε τρεις επιφάνειες άνω, κάτω και οπίσθια. Η άνω επιφάνεια είναι έντονα κυρτή και καταλήγει στο πρόσθιο οξύ χείλος. Η κάτω επιφάνεια εφάπτεται στο στόμαχο, στην κατιούσα μοίρα του 12δακτύλου, το εγκάρσιο κόλον, τη νήστιδα και το σπλήνα. Δύο οβελιαίες αύλακες στην κάτω επιφάνεια χωρίζουν το ήπαρ σε τρεις λοβούς, τον αριστερό, το μέσο και το δεξιό. Μεταξύ των αυλάκων βρίσκεται ο κερκοφόρος λοβός. Οι δύο αυτές αύλακες ενώνονται πίσω από τον κερκοφόρο λοβό με μια εγκάρσια αύλακα σχηματίζοντας την πύλη του ήπατος, από την οποία διέρχονται η ηπατική αρτηρία, η πυλαία φλέβα, οι χοληφόροι πόροι και εκβάλλει η κάτω κοίλη φλέβα. Ο μέσος λοβός φέρει επιμήκη σχισμή, η οποία τον διαιρεί σε δύο τμήματα το δεξιό κεντρικό και το αριστερό κεντρικό τμήμα. Στη σχισμή του μέσου λοβού καταλήγει ο στρογγύλος σύνδεσμος του ήπατος και στη διαφραγματική (πρόσθια) επιφάνεια του προσφύεται ο δρεπανοειδής σύνδεσμος ο οποίος τον ενώνει με την κοιλιακή επιφάνεια του δεξιού ημιδιαφράγματος. Ο μέσος λοβός προσφύεται στο οπίσθιο (άνω) κοιλιακό τοίχωμα, στην περιοχή εκφύσεως της πλευρικής μοίρας και του σκέλους του δεξιού ημιδιαφράγματος. Στο σημείο της προσφύσεως του διατιτραίνεται από την κάτω κοίλη φλέβα, επί της οποίας εφιππεύει. Ο αριστερός πλάγιος λοβός, ευρίσκεται μπροστά (κοιλιακά) από το αριστερό κεντρικό τμήμα του μέσου λοβού και είναι ο μεγαλύτερος από όλους τους λοβούς. Η έκφυση του από την περιοχή των πυλών του ήπατος παρουσιάζει τη μορφή λεπτού μίσχου, ο οποίος, στη συνέχεια, διαπλατύνεται και παίρνει σχήμα απιοειδές. Συνδέεται με μεμβρανώδεις περιτοναïκές πτυχές, τόσο με το δεξιό σκέλος του διαφράγματος, 72

73 όσο και με το έλασσον τόξο του στομάχου. Οι πτυχές αυτές θα μπορούσαν να ο- νομαστούν κατά αντιστοιχία με την ανατομική του ανθρώπου, αριστερός τριγωνικός και ηπατογαστρικός σύνδεσμος. Ο δεξιός πλάγιος λοβός, ευρίσκεται μπροστά (κοιλιακά) από το δεξιό κεντρικό τμήμα του μέσου λοβού. Διαχωρίζεται από μια εγκάρσια σχισμή σε δύο επιμέρους τμήματα, το δεξιό πρόσθιο και το δεξιό οπίσθιο τμήμα. Το τελευταίο εφάπτεται με τον άνω (πρόσθιο) πόλο του δεξιού νεφρού. Η άνω (πρόσθια) επιφάνεια του οπίσθιου τμήματος συνδέεται μέσω μιας μεμβρανώδους πτυχής του περιτοναίου με την κοιλιακή επιφάνεια του δεξιού η- μιδιαφράγματος (δεξιός τριγωνικός σύνδεσμος). Η έκφυση του δεξιού λοβού συνδέεται μέσω μιας γέφυρας ηπατικού παρεγχύματος, η οποία φέρεται μπροστά (κοιλιακά) από την κάτω (ουραία) κοίλη φλέβα με την έκφυση του κερκοφόρου λοβού, σχηματίζοντας έτσι τις πύλες του οργάνου. Ο κερκοφόρος λοβός είναι ο μικρότερος όλων. Μετά την έκφυση του από τις πύλες του ήπατος το παρέγχυμα του διχάζεται σε δύο λεπτούς μίσχους, οι οποίοι περιβάλλουν την κοιλιακή μοίρα του οισοφάγου και στη συνέχεια διαπλατύνονται σε επιμέρους τμήματα, το πρόσθιο και το οπίσθιο. Το μεν πρόσθιο τμήμα βρίσκεται μπροστά από την πρόσθια επιφάνεια του στομάχου, με την οποία συνδέεται με μεμβρανώδη πτυχή του περιτοναίου. Το οπίσθιο τμήμα του κερκοφόρου λοβού φέρεται πίσω από τον οισοφάγο και από την οπίσθια (ραχιαία) επιφάνεια του στομάχου και ευρίσκεται εντός του ελάσσονος επιπλοïκού θυλάκου. Δε φαίνεται αμέσως κατά τη λαπαροτομία γιατί πρέπει είτε να διαταμεί ο οισοφάγος κατά την καρδιοοισοφαγική συμβολή είτε να διανοιχθεί ο ελάσσων επιπλοïκός θύλακος από την περιοχή του σπληνογαστρικού συνδέσμου. Στις πύλες του ήπατος καταλήγουν η πυλαία φλέβα και η ηπατική αρτηρία και διαιρούνται σε κλάδους, οι οποίοι εισέρχονται στους αντίστοιχους λοβούς. Ο μέσος και ο αριστερός λοβός δέχονται ξεχωριστούς αγγειακούς κλάδους και γι αυτό είναι δυνατή η εκτομή τους χωρίς να επηρεασθεί η αιμάτωση των δύο υπολοίπων λοβών. Στην περιοχή των πυλών σχηματίζεται και ο χοληδόχος πόρος από τη συμβολή των πόρων των επιμέρους λοβών. Ο επίμυς δεν έχει χοληδόχο κύστη 136,137,

74 9. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ Τα δεδομένα των εργαστηριακών ελέγχων, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε, αρχικά καταγράφηκαν ηλεκτρονικά στο πακέτο φύλλων εργασίας (speadsheet) EXCEL version 2003 for Windows XP (Microsoft Corp., 1997) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο στατιστικό πακέτο SPSS (Statistical Package for Social Sciences) version 13 for Windows XP (SPSS Inc. 1998). Με τον τρόπο αυτό διαμορφώθηκε μία βάση δεδομένων (database), ώστε να μπορεί να γίνει ευχερής ανάκλησή τους για έλεγχο της εγκυρότητας των καταγραφών. Για την περιγραφή του υλικού χρησιμοποιήθηκαν η μέση τιμή, ΜV (mean value), και η τυπική απόκλιση, SD (standard deviation). Για τον έλεγχο των βιοστατιστικών υποθέσεων (hypothesis tests) εφαρμόσθηκε, για όλες τις μεταβλητές,η μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney U test για ανεξάρτητα δείγματα. Η διαφορά ήταν στατιστικώς σημαντική όταν το p < ,139,

75 10. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΜΑΔΑ Γ (ΟΜΑΔΑ ΜΑΡΤΥΡΩΝ) ΟΜΑΔΑ Γ 1: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Γ1 βρέθηκε 1,46 με σταθερή απόκλιση 0,23. Ομολογουμένως αποτελεί μία σχετικά υψηλή τιμή η οποία μάλιστα είχε στατιστικώς σημαντική διαφορά από την ομάδα Γ2 (p<0.01). Για αυτό το λόγο ο αριθμός των πειραματοζώων επεκτάθηκε από τα 5 στα 10. Στην προσιτή βιβλιογραφία δεν μπορέσαμε να βρούμε τεκμηριωμένη απάντηση. Χρειάζονται προφανώς και άλλες μελέτες ώστε να διευκρινιστεί αυτή η παρατήρηση. Ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων ήταν 7, /μl με σταθερή απόκλιση 1, / μl, ενώ ο αριθμός των αιμοπεταλίων προσδιορίστηκε στις 892, / μl με σταθερή απόκλιση 137, / μl. Τιμή η οποία ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την ομάδα Γ2 (p<0.01). Η αύξηση των αιμοπεταλίων παρατηρήθηκε και στην ομάδα της ισχαιμίας και επαναιμάτωσης στην οποία χορηγήθηκε ΑΤ ΙΙΙ. Στην προσιτή βιβλιογραφία δεν μπορέσαμε να βρούμε τεκμηριωμένη απάντηση και ίσως αποτελεί θέμα περαιτέρω έρευνας. Ίσως η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙΙ υπεισέρχεται σε ένα μηχανισμό προσωρινής αύξησης των αιμοπεταλίων τα οποία εν συνεχεία έχουν πτωτική τάση (βλ. και ομάδα Α). Η μέση τιμή της SGOT(AST) ήταν 49,20 u/l με σταθερή απόκλιση 1,3, ενώ της SGPT (ALT) 24,40 u/l με σταθερή απόκλιση 2,07. Και οι δύο τιμές ήταν στατιστικά σημαντικά ελλατωμένες σε σχέση με την ομάδα Γ2 (p<0.01) κάτι που μας επιτρέπει να υποθέσουμε ότι η ΑΤ ΙΙΙ δρα ίσως προστατευτικά στο εγχειρητικό στρες. Η μέση τιμή της ALP βρέθηκε 559 u/l με σταθερή απόκλιση 55,5 και της γ-gt 1,6 u/l με σταθερή απόκλιση 0,5 (αναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Γ1 περιγράφονται στον πίνακα 2). ΟΜΑΔΑ Γ 2: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Γ2 ήταν 0,87 με σταθερή απόκλιση 0,22, ο α- ριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων 5, /μl με σταθερή απόκλιση 2, /μl, ενώ ο αριθμός των αιμοπεταλίων 655, /μl με σταθερή απόκλιση 60, /μl. 75

76 Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 70,40 u/l με σταθερή απόκλιση 11,61, ενώ της SGPT (ALT) στις 41,20 u/l με σταθερή απόκλιση 7,25. Η μέση τιμή της ALP ήταν 312,40 u/l με σταθερή απόκλιση 66,93 και της γ-gt 1,6 iu/l με σταθερή απόκλιση 0,8. Και στις δύο ομάδες το ήπαρ ήταν ομαλό με διατήρηση φυσιολογικών δομών τόσο κατά την παρατήρηση στο οπτικό όσο και κατά την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (βλ. εικ. 5,6,27). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Γ2 περιγράφονται στον πίνακα 3.) ΟΜΑΔΑ Β (ισχαιμία και επαναιμάτωση χωρίς ΑΤ ΙΙΙ) ΟΜΑΔΑ Β 1: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Β1 βρέθηκε 1,30 με σταθερή απόκλιση 0,44. Ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων ήταν 10, / μl με σταθερή απόκλιση 2, / μl, ενώ ο αριθμός των αιμοπεταλίων 540, / μl με σταθερή απόκλιση 198, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 320,30 u/l με σταθερή απόκλιση 158,98, ενώ της SGPT (ALT) στις 93,50 u/l με σταθερή απόκλιση 33,74. Η μέση τιμή της ALP βρέθηκε 478,2 u/l με σταθερή απόκλιση 197,56 και της γ- GT 2,0 u/l με σταθερή απόκλιση 0,6. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διαπιστώθηκε περιορισμένο οίδημα του κυτταροπλάσματος με διάταση του ενδοπλασματικού δικτύου, πύκνωση των μιτοχονδρίων με εξαφάνιση των ακρολοφιών,καθώς και ρίκνωση του πυρήνα με διαταραχή της φυσιολογικής κατανομής της χρωματίνης και ασαφή διαγραφή της πυρηνικής μεμβράνης (βλ. εικ. 7,8,9,10). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Β1 περιγράφονται στον πίνακα 4.) ΟΜΑΔΑ Β 2: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα B2 ήταν 1,35 με σταθερή απόκλιση 0,25, ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων 10, / μl με σταθερή απόκλιση 2, / μl, ενώ ο αριθμός των αιμοπεταλίων / μl με σταθερή απόκλιση 39, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 471,30 u/l με σταθερή απόκλιση 66,68, της SGPT (ALT) στις 102,60 u/l με σταθερή απόκλιση 44,57, της 76

77 ALP στις 328,20 u/l με σταθερή απόκλιση 16,40 και της γ-gt 1,6 u/l με σταθερή απόκλιση 0,5. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διαπιστώθηκε εντονότερο ενδοκυττάριο οίδημα με ρίκνωση του πυρήνα σε σχέση με την ομάδα Β1(βλ. εικ. 11,12,13). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Β2 περιγράφονται στον πίνακα 5). ΟΜΑΔΑ Β 3: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Β3 ήταν 1,58 με σταθερή απόκλιση 0,49, ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων ήταν 13, / μl με σταθερή απόκλιση 2, / μl και ο αριθμός των αιμοπεταλίων 756, / μl με σταθερή απόκλιση 174, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 714,0 u/l με σταθερή απόκλιση 274,66, της SGPT (ALT) στις 179,20 u/l με σταθερή απόκλιση 82,91, της ALP στις 393,8 u/l με σταθερή απόκλιση 50,94 και της γ-gt 1,6 u/l με σταθερή απόκλιση 0,6. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αναγνωρίστηκε επιδείνωση της μορφολογικής εικόνας των ηπατοκυττάρων με σημαντικό ενδοκυττάριο οίδημα έως και λύση των μιτοχονδρίων. Ο πυρήνας ήταν ρικνωτικός με έντονο περιπυρηνικό οίδημα. Επίσης διαπιστώθηκε νεκρωτικό υλικό μεταξύ των ηπατικών κυττάρων ενώ βρέθηκαν ερυθρά αιμοσφαίρια στο χώρο του Disse (βλ. εικ. 14, 15,16,17). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Β3 περιγράφονται στον πίνακα 6). Η τιμή των λευκών αιμοσφαιρίων βαίνει αυξανόμενη με την εξέλιξη της επαναιμάτωσης και η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης (p<0.05). Σε σύγκριση με την ομάδα μαρτύρων Γ2 η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική σε όλες τις φάσεις της επαναιμάτωσης (p<0.01). Η τιμή της MDA παρουσιάζει και αυτή αυξητική τάση με την πρόοδο της επαναιμάτωσης, όμως δεν μπορέσαμε να τεκμηριώσουμε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά. Αντίθετα η σημαντικότητα αναδείχθηκε στην υπο-ομάδα 2 και 3 κατά τη σύγκριση με τη Γ2 (B2: p<0.01, B3: p<0.01). Παρόμοια αυξητική κινητική αλλά με στατιστικά σημαντική διαφορά αποδείχθηκε στην παρακολούθηση της τιμής των τρανσαμινασών (p<0.05), αύξηση που ήταν σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης και μάλιστα στατιστικά σημαντικά σε σχέση με τη Γ2 (SGOT: p<0.01, SGPT: p<0.05). 77

78 ΟΜΑΔΑ Α (ισχαιμία και επαναιμάτωση με ΑΤ ΙΙΙ) ΟΜΑΔΑ Α 1: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Α1 ήταν 0,86 με σταθερή απόκλιση 0,57,ο α- ριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων 8, / μl με σταθερή απόκλιση 2, / μl και ο αριθμός των αιμοπεταλίων 760, / μl με σταθερή απόκλιση 151, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 344,0 u/l με σταθερή απόκλιση 112,63, της SGPT (ALT) στις 98,40 u/l με σταθερή απόκλιση 37,54, της ALP στις 417,30 u/l με σταθερή απόκλιση 24,64 και της γ-gt στις 1,5 u/l με σταθερή απόκλιση 0,5. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αναδείχθηκε φυσιολογικό το ηπατικό κύτταρο με φυσιολογικά μιτοχόνδρια και μόνο ελαφρά διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου (βλ.εικ.18,19,20). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Α1 περιγράφονται στον πίνακα 7.) ΟΜΑΔΑ Α 2: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Α2 βρέθηκε 0,94 με σταθερή απόκλιση 0,49, ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων 10, / μl με σταθερή απόκλιση 1, / μl και ο αριθμός των αιμοπεταλίων 931, / μl με σταθερή απόκλιση 150, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) ήταν 372,0 u/l με σταθερή απόκλιση 151,49, της SGPT (ALT) 113,10 u/l με σταθερή απόκλιση 47,45, της ALP 395,2 u/l με σταθερή απόκλιση 54,16 και της γ-gt 1,2 u/l με σταθερή απόκλιση 0,4. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο τα μιτοχόνδρια παρουσίαζαν ευδιάκριτες ακρολοφίες και ο πυρήνας είχε φυσιολογική κατανομή χρωματίνης. Ελάχιστα μιτοχόνδρια εμφανίζονταν οιδηματικά με πλήρη εκφύλιση της μητρικής τους ουσίας ενώ διαπιστώθηκε ήπιο ενδοκυτταρικό οίδημα με σαφώς καλύτερη εικόνα από την ομάδα Β2 (βλ. εικ. 21,22,23). (αναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Α2 περιγράφονται στον πίνακα 8) ΟΜΑΔΑ Α 3: Η μέση τιμή της MDA στην ομάδα Α3 ήταν 1,12 με σταθερή απόκλιση 0,28, ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων 15, / μl με σταθερή απόκλιση 78

79 2, / μl και ο αριθμός των αιμοπεταλίων βρέθηκε στις 767, / μl με σταθερή απόκλιση 88, / μl. Η μέση τιμή της SGOT(AST) προσδιορίστηκε στις 309,40 u/l με σταθερή απόκλιση 120,20, της SGPT (ALT) στις 237,50 u/l με σταθερή απόκλιση 51,36, της ALP 436,30 u/l με σταθερή απόκλιση 110,19 και της γ-gt 1,5 u/l με σταθερή α- πόκλιση 0,5. Η παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ανέδειξε εκφυλισμένα μιτοχόνδρια και διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου σε μικρότερο όμως βαθμό από την αντίστοιχη ομάδα χωρίς ΑΤΙΙΙ (βλ. εικ. 24,25,26). (Aναλυτικά οι τιμές των παραμέτρων της ομάδας Α3 περιγράφονται στον πίνακα 9.) Η τιμή της MDA παρουσιάζει αυξητική τάση με την πρόοδο της επαναιμάτωσης, όμως δεν μπoρέσαμε να τεκμηριώσουμε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά. Παρομοίως δεν αναδείχθηκε καμμία στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα Γ2. Η τιμή των λευκών αιμοσφαιρίων βαίνει αυξανόμενη με την εξέλιξη της επαναιμάτωσης, και η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης (p<0.01). Παρόμοια αυξητική κινητική αλλά με στατιστικά σημαντική διαφορά αποδείχθηκε στην παρακολούθηση της τιμής μόνο της SGPT (p<0.001) από τις τρανσαμινάσες. Και εδώ η αύξηση ήταν σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης. Ιδιαίτερη εντύπωση προκαλεί η αύξηση των αιμοπεταλίων στην επαναιμάτωση των 30 λεπτών (1 ώρα από τη χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ) τόσο σε σχέση με την ομάδα Γ2 αλλά όσο και με την ομάδα Β. Η τιμή βέβαια επανέρχεται στις 4 ώρες και προφανώς σχετίζεται με τη μέγιστη δράση της ΑΤ ΙΙΙ που παρατηρείται στην 1 ώρα από τη χορήγησή της. ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Κατά την παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο διαπιστώθηκε διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος σε όλες τις ομάδες που ελέχθησαν. Δεν αναγνωρίσθηκε αξιόλογη αύξηση του αριθμού των φλεγμονωδών κυτταρικών στοιχείων εντός των ορίων των πυλαίων διαστημάτων, ή σε ενδολόβιες θέσεις. Δεν παρατηρήθηκε νέκρωση ή βλάβη ηπατοκυττάρων, ή αλλοιώσεις του επιθηλίου των χοληφόρων πόρων. Ο αριθμός των κυττάρων Kupffer προσδιορίσθηκε εντός φυσιολογικών ορίων. (βλ. εικ. 27,28,29,30,31,32,33,34). 79

80 11. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι συνέπειες της ισχαιμίας ενός ιστού ή οργάνου έχουν αναγνωριστεί από καιρό ως κρίσιμος παράγοντας στην κλινική έκβαση της βιωσιμότητας,όπως π.χ. του εγκεφάλου σε ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο,της καρδιάς σε έμφραγμα του μυοκαρδίου,του μεταμοσχευμένου οργάνου στη μεταμόσχευση καθώς και των ά- κρων στην ισχαιμία τους. Η έγκαιρη αποκατάσταση της ροής αίματος σε ένα ισχαιμικό ιστό ή όργανο είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μη-αναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Εντούτοις όμως,η ίδια η επαναιμάτωση,αυτή καθ' εαυτή,μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών,συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Διάφοροι παράγοντες,όπως τα λευκά αιμοσφαίρια,οι δραστικές μορφές οξυγόνου ή το συμπλήρωμα αλλά και άλλοι έχουν ενοχοποιηθεί για τη βλάβη που προκαλείται τόσο στα ίδια τα όργανα ή ιστούς που επαναιματώνονται αλλά και σε απομακρυσμένα όργανα. 141 Η ισχαιμία οδηγεί σε σημαντικές δομικές και λειτουργικές κυτταρικές μεταβολές. Ελαττώνεται η σύνθεση ΑΤP, διαταράσσεται η λειτουργία των αντλιών ενώ συσσωρεύεται ενδοκυττάρια υποξανθίνη. Στο ενδοθήλιο αυξάνει η έκφραση και παραγωγή μορίων προσκόλλησης των λευκοκυττάρων, αυξάνει η παραγωγή κυτοκινών, ενδοθηλίνης και θρομβοξάνης Α2, ενώ ελαττώνεται η παραγωγή θρομβομοδουλίνης, προστακυκλίνης και μονοξειδίου του αζώτου. 142 Στην επαναιμάτωση με την προσφορά οξυγόνου ο μεταβολισμός της υποξανθίνης, που σε φυσιολογικές συνθήκες γίνεται από την ξάνθινο-δεϋδρογενάση, γίνεται από την ξάνθινο-οξειδάση και οδηγεί στην παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου προάγουν την ενεργοποίηση του συμπληρώματος, ενεργοποιούν την παραγωγή εικοσανοειδών (θρομβοξάνη Α2, λευκοτριένη Β4) και την απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών (παράγων ενεργοποίησης αιμοπεταλίων PAF, παράγων νέκρωσης όγκου TNF-α), προκαλούν υπεροξείδωση των λιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών και αυξάνουν την ενεργοποίηση, τη χημειοταξία και την προσκόλληση των λευκοκυττάρων. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος ενισχύει τη φλεγμονώδη αντίδραση επάγοντας την παραγωγή κυτοκινών όπως ο παράγων νέκρωσης του όγκου (TNF-α), ιντερλευκίνη-1 (IL-1), ι- ντερλευκίνη (IL-6), μονοκυτταρική χημειοτακτική πρωτείνη 1 (MCP-1) και αυξάνοντας την ενεργοποίηση,χημειοταξία και προσκόλληση των λευκοκυττάρων. 143,144,145 Η MCP-1 επάγει με τη σειρά της τον ιστικό παράγοντα με αποτέλε- 80

81 σμα την ενεργοποίηση του πηκτικού μηχανισμού, το σχηματισμό μικροθρόμβων και την επίταση της βλάβης. 146 Τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα επιδεινώνουν τη βλάβη απελευθερώνοντας πρωτεάσες,ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και ελαστάση που προκαλεί διάσπαση της αντιθρομβίνης III και του συμπαράγοντα II, και απενεργοποίηση της θρομβομοδουλίνης 144. Η αντιθρομβίνη III (ATIII) είναι μία α 2 -σφαιρίνη η οποία αδρανοποιεί πρωτεάσες όπως η θρομβίνη, οι παράγοντες Xα,IXα,XIα και η καλλικρεϊνη. Έχει διαπιστωθεί ότι η ATIII μπορεί να προάγει μέσω αλληλεπίδρασης με γλυκοζοαμινογλυκάνες της επιφανείας των ενδοθηλιακών κυττάρων την παραγωγή προστακυκλίνης (PGI2) τόσο in vivo όσο και in vitro. 147 Η PGI2 είναι μια ουσία με γνωστή αγγειοδιασταλτική και αντιαιμοπεταλιακή δράση, αλλά και ποικίλη προστατευτική δράση στη βλάβη του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Μπορεί να προστατεύσει τους ιστούς από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου ή τις πρωτεάσες που α- πελευθερώνονται από τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα. 148 Επιπλέον μπορεί να ελαττώσει την απελευθέρωση του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNFa). 149 Σε κλινικές και πειραματικές μελέτες η χορήγηση ATIII βρέθηκε ότι βελτιώνει τη φλεγμονώδη αντίδραση και τη διάχυτη ενδαγγειακή πήξη που προκαλείται από σήψη,τραύμα και ενδοτοξίνες 150. Ελαττώνει τη συσσώρευση των λευκοκυττάρων και την τριχοειδική διαβατότητα στο σύνδρομο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Επίσης, έχει αναφερθεί πειραματικά η προστατευτική της δράση μετά από ισχαιμία και επαναιμάτωση των διαφόρων οργάνων, όπως νεφροί, πνεύμονες, ήπαρ και έ- ντερο 151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161. Η αναφορά της βλαπτικής επίδρασης της ισχαιμίας και επαναιμάτωσης των μυών σε απομακρυσμένα όργανα όπως το ήπαρ δεν συνοδεύεται από ανάλογες αναφορές της προστατευτικής δράσης της ΑΤ ΙΙΙ. Για να ελεχθεί η πιθανή αυτή δράση μελετήθηκαν τα λευκά αιμσφαίρια, τα αιμοπετάλια, οι τρανσαμινάσες,η αλκαλική φωσφατάση, η γ-γλουταμική τρανσαμινάση, η μαλονική διαλδεΰδη και οι ιστολογικές αλλοιώσεις σε οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο με πειραματική διάταξη που περιελάμβανε πειραματόζωα μάρτυρες και πειραματόζωα με ισχαιμία και επαναιμάτωση σε διάφορα χρονικά διαστήματα με και χωρίς χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ. Τα ανάλογα μοντέλα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία διαφοροποιούνται στο χρόνο της ισχαιμίας και της επαναιμάτωσης. Ο Mizutani 159 έκανε 45 λεπτά ισχαμία και 3,6,12,24, και 48 ώρες επαναιμάτωση στο νεφρό, ο Duru 160 διενήργησε 3 ώρες αμφοτερόπλευρη ισχαιμία και 2 ώρες επαναιμάτωση στα σκέλη, ο Yassin ώρες αμφοτερόπλευρη ισχαιμία και 1, 2, και 3 ώρες επαναιμάτωση στα σκέλη, ενώ ο Harada 158 εφάρμοσε 60 λεπτά ισχαιμία και 12 ώρες επαναιμάτωση στο ήπαρ. Εμείς επικεντρωθήκαμε στην αναζήτηση της πιθανής προστατευτικής δράσης της ΑΤ ΙΙΙ στο ήπαρ σχετικά με τη 81

82 δοσολογία και το χρόνο χορήγησής πρίν την επαναιμάτωση των σκελών. Η επιλογή της δόσης στηρίχτηκε σε άλλες μελέτες που είχαν παρόμοιο σχεδιασμό 133,134,ενώ ο χρόνος χορήγησης επιλέχθηκε ώστε να είναι δυνατή, εφόσον υπάρχει προστατευτική δράση, η μεταφορά της γνώσης και στον άνθρωπο. Στην πειραματική μας μελέτη διαπιστώσαμε στατιστικά σημαντική αύξηση στις τρανσαμινάσες στις ομάδες που υποβλήθηκαν σε ισχαιμία και επαναιμάτωση σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων Γ2. Η παρατήρηση αυτή συμφωνεί με τα ευρήματα της μελέτης του Yassin 162,ο οποίος μελέτησε επίσης και τα επίπεδα της ιντερλευκίνης-6 και του TNF-α σε πειραματικό μοντέλο ισχαιμίας και επαναιμάτωσης σκελών σε επίμυες και βρέθηκαν αυξημένα. Απέδωσε την παραγωγή τους στο μυ χωρίς να μπορεί να αποκλείσει με βεβαιότητα και τη συμμετοχή των κυττάρων του Kupffer του ήπατος. Η αυξητική αυτή τάση στην παρακολούθηση της τιμής των τρανσαμινασών διαπιστώθηκε με στατιστικά σημαντική διαφορά και κατά την πρόοδο της επαναιμάτωσης στις υπο-ομάδες. Στην ομάδα Β η διαφορά αφορούσε και την SGOT και SGPT (p<0.05), ενώ στην Α η διαφορά αφορούσε μόνο την SGPT (p<0.001). Η αύξηση ήταν σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης και μάλιστα στατιστικά σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων Γ2 (SGOT:p<0.01,SGPT:p<0.05). Αυτή η παρατήρηση μας διαφοροποιεί από την παραπάνω μελέτη η οποία αναγνώρισε μία πτωτική πλέον τάση στην τρίτη ώρα επαναιμάτωσης. Μία σημαντική όμως διαφορά είναι και ο χρόνος ισχαιμίας στο κάθε πείραμα. Ο Yassin είχαν 3 ενώ εμείς 6 ώρες ισχαιμίας. Κατά τη σύγκριση των ομάδων Α και Β διαπιστώθηκε βελτίωση στα επίπεδα της SGOT που γίνεται στατιστικά σημαντική στις 4 ώρες (p<0.01). Η παρατήρηση αυτή σε συνδυασμό με τη διαπίστωση ότι στις υπο-ομάδες της Α η τιμή της SGOT δεν αυξάνει σημαντικά μας επιτρέπει να αποδώσουμε προστατευτική δράση στην ΑΤΙΙΙ. Μπορούμε βέβαια να ισχυριστούμε ότι η δράση αφορά τους μυς, μια και η SGOT αποτελεί κυρίως ένζυμο του μυός. Στον αντίποδα είναι η παρατήρηση που κάναμε στις υπο-ομάδες Γ1 και Γ2 που δεν διενεργήσαμε ισχαιμία. Τα επίπεδα των τρανσαμινασών ήταν στατιστικά σημαντικά ελαττωμένα στην ομάδα που έλαβε ΑΤΙΙΙ (Γ1) (p<0.01). Ίσως η χορήγηση της ΑΤΙΙΙ προστατεύει από την καταπόνηση της α- ναισθησίας και της εγχειρήσεως. Ο Okano 152 μελετώντας τα επίπεδα των τρανσαμινασών σε ισχαιμία και επαναιμάτωση του ίδιου του ήπατος, τεκμηρίωσε τόσο την αύξησή τους,όσο και τη σημαντική βελτίωσή τους από τη χορήγηση της ΑΤΙΙΙ. Μία παρατήρηση που κάνει εντύπωση είναι η συμπεριφορά της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP). Η τιμή της ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη στην ομάδα Γ1 που έλαβε ΑΤΙΙΙ σε σχέση με τη Γ2 που δεν έλαβε. Επίσης παρουσιάζεται μια αύξηση στις υπο-ομάδες Α1 και Α3 και Β1 και Β3 σε σχέση με τη Γ2. Η αύξηση 82

83 αυτή ήταν στατιστικά σημαντική μόνο στις Α1 και Α3 που έλαβαν ΑΤ ΙΙΙ, ενώ μεταξύ των ομάδων Α και Β τεκμηριώθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση μόνο στην υπο-ομάδα Α2 που επίσης έλαβε ΑΤ ΙΙΙ. Θα μπορούσε κανείς να αποδώσει την αύξηση αυτή της ALP στη χορήγηση της ΑΤΙΙΙ,δεν εξηγείται όμως η έλλειψη διαφοράς στα υπόλοιπα στιγμιότυπα. Η παρατήρηση αυτή χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Οι τιμές της γ-γλουταμινικής τρανσφεράσης (γ-gt) δεν παρουσίασαν καμμία διαφορά σε όλες τις ομάδες,όπως αναμένετο, αφού οι μεταβολές της σχετίζονται με παθήσεις που συνοδεύονται από χολόσταση 1,7. Διακρίνεται όμως ότι η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ δεν δημιοργεί ανάλογη εικόνα. Η τιμή των λευκών αιμοσφαιρίων παρουσιάζει προοδευτική αύξηση με την εξέλιξη της επαναιμάτωσης, που είναι στατιστικά σημαντική στις 4 ώρες επαναιμάτωσης (p<0.05). Σε σύγκριση με την ομάδα μαρτύρων Γ2 η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική σε όλες τις φάσεις της επαναιμάτωσης (p<0.01). Δεν τεκμηριώθηκε από τη μελέτη μας βελτίωση των επιπέδων από τη χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ. Από ότι αναδεικνύεται και από άλλες μελέτες η προστατευτική δράση της ΑΤ ΙΙΙ έγκειται κυρίως στην ελάττωση της τοπικής διήθησης των ιστών με πολυμορφοπύρηνα 153,160,163. Ιδιαίτερη εντύπωση προκαλεί η αύξηση των αιμοπεταλίων στην επαναιμάτωση των 30 λεπτών (1 ώρα από τη χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ) τόσο σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων Γ2 αλλά όσο και με την ομάδα Β που δεν έλαβαν ΑΤ ΙΙΙ. Η αύξηση των αιμοπεταλίων παρατηρήθηκε επίσης και στην ομάδα μαρτύρων Γ1 στην ο- ποία χορηγήθηκε και εδώ ΑΤ ΙΙΙ. Η τιμή βέβαια επανέρχεται στις 4 ώρες και ίσως σχετίζεται με τη μέγιστη δράση της ΑΤ ΙΙΙ που παρατηρείται στην 1 ώρα από τη χορήγησή της. Δεν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα που να τεκμηριώνουν αυτή την παρατήρηση. Ίσως η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙΙ υπεισέρχεται σε ένα μηχανισμό προσωρινής αύξησης των αιμοπεταλίων τα οποία εν συνεχεία έχουν πτωτική τάση. Η τιμή της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) παρουσιάζει στη μελέτη μας αυξητική τάση με την πρόοδο της επαναιμάτωσης σε αναλογία με την αύξηση που διαπίστωσαν στις 2 ώρες επαναιμάτωσης οι Ward και συν 89. Κατά τη σύγκριση της ομάδας Β με τη Γ2 αναδείχθηκε στην υπο-ομάδα Β2 και Β3 στατιστικά σημαντική διαφορά (B2: p<0.01, B3: p<0.01) ενώ δεν τεκμηριώθηκε κάτι ανάλογο στη σύγκριση των ομάδων Α και Γ2. Η προοδευτική αύξηση της οξειδωτικής καταπόνησης έχει αναγνωριστεί ήδη και από άλλους συγγραφείς και πιστεύεται ότι μεσολαβείται από την ξανθινο-οξειδάση που απελευθερώνεται κατά την επαναιμάτωση 164. Κατά τη σύγκριση της ομάδας Α με την ομάδα Β αποδείχθηκε ελάττωση 83

84 της MDA σε όλες τις υπο-ομάδες. Η ελάττωση αυτή είναι στατιστικά σημαντική στην υπο-ομάδα 2 και 3,δηλ. στην επαναιμάτωση των 30 λεπτών (p<0.05) και των 4 ωρών (p<0.05). Έτσι επιτρέπεται να συμπεράνουμε ότι η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ βοηθάει στην ελλάτωση της οξειδωτικής καταπόνησης όπως αυτή καταγράφεται από την MDA, εύρημα που συμβαδίζει με τα αποτελέσματα χορήγησης ΑΤ ΙΙΙ σε ι- σχαιμία και επαναιμάτωση του νεφρού 153 όπου επίσης διαπιστώθηκε βελτίωση των τιμών της MDA. Στη μελέτη μας κατά την παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο διαπιστώθηκε διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος σε όλες τις ο- μάδες που ελέχθησαν. Δεν αναγνωρίσθηκε αξιόλογη αύξηση του αριθμού των φλεγμονωδών κυτταρικών στοιχείων εντός των ορίων των πυλαίων διαστημάτων, ή σε ενδολόβιες θέσεις. Δεν παρατηρήθηκε νέκρωση ή βλάβη ηπατοκυττάρων ή αλλοιώσεις του επιθηλίου των χοληφόρων πόρων,ενώ αριθμός των κυττάρων Kupffer προσδιορίσθηκε εντός φυσιολογικών ορίων. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν στη μελέτη του Yassin 162 με αδυναμία αναγνώρισης βλαβών στο ήπαρ αλλά και το νεφρό κατά τον έλεγχο με οπτικό μικροσκόπιο που αποδόθηκε στη μικρή διάρκεια ισχαιμίας (3 ώρες) και ελέγχου μετά από επαναιμάτωση (3 ώρες). Η έλλειψη βλαβών στο ήπαρ σε παράταση του χρόνου ισχαιμίας (6 ώρες) και ε- παναιμάτωσης (4 ώρες) στη δική μας μελέτη αποδεικνύει ότι τα ευρήματα του ο- πτικού μικροσκοπίου δεν μπορούν να βοηθήσουν στην αξιολόγηση των ιστολογικών αλλοιώσεων. Μία άλλη πιθανή εξήγηση αυτής της παρατήρησης είναι ότι ίσως οι ρίζες οξυγόνου που παράγονται στο πείραμά μας δεν είναι τόσο αυξημένες ώστε να προκληθούν βλάβες αναγνωρίσιμες στο οπτικό μικροσκόπιο. Αντίθετα σε ισχαιμία και επαναιμάτωση του ίδιου του ήπατος 100,152 ή του νεφρού 153 διαπιστώθηκε συμφόρηση, οίδημα και διήθηση με πολυμορφοπύρηνα, ενώ παρόμοια διήθηση με πολυμορφοπύρηνα παρατηρείται στον πνεύμονα όταν προκαλείται ισχαιμία και επαναιμάτωση των σκελών 160,162. Η μεγαλύτερη ευπάθεια του πνεύμονα αποδίδεται στην παρουσία τοπικών φλεγμονωδών κυττάρων τα οποία ενισχύουν τη βλάβη από την επαναιμάτωση 165. Σε αντίθεση με την απουσία ανίχνευσης ευρημάτων στο οπτικό μικροσκόπιο οι βλάβες κατά την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι σημαντικές. Ήδη ανχνεύονται αλλοιώσεις αμέσως μετά την άρση της ισχαιμίας. Έτσι στην ομάδα Β1 διαπιστώθηκε περιορισμένο οίδημα του κυτταροπλάσματος με διάταση του ενδοπλασματικού δικτύου. Επίσης αναγνωρίστηκε πύκνωση των μιτοχονδρίων με εξαφάνιση των ακρολοφιών,καθώς και ρίκνωση του πυρήνα με διαταράχη της φυσιολογικής κατανομής της χρωματίνης και ασαφή διαγραφή της πυρηνικής μεμβράνης. Οι βλάβες επιδεινώνονται στα 30 λεπτά επαναιμάτωσης με αύξηση του οιδήματος. Στις 4 ώρες το ενδοκυττάριο οίδημα είναι πολύ σημαντικό ενώ 84

85 εμφανίζεται και λύση των μιτοχονδρίων. Ο πυρήνας είναι ρικνωτικός με έντονο περιπυρηνικό οίδημα. Επίσης διαπιστώθηκε νεκρωτικό υλικό μεταξύ των ηπατικών κυττάρων ενώ βρέθηκαν και ερυθρά αιμοσφαίρια στο χώρο του Disse. Η χορήγηση ΑΤΙΙΙ φαίνεται να βελτίωσε την κατάσταση. Ελάχιστα μιτοχόνδρια εμφανίζονται οιδηματικά σε σχέση με την ομάδα Β, ενώ το ενδοκυτταρικό οίδημα ήταν σαφώς πιο ήπιο. Η διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου αναγνωρίστηκε σε μικρότερο βαθμό,ενώ δεν διαπιστώθηκαν νεκρώσεις ή μεγάλες αλλοιώσεις στους πυρήνες. Βελτίωση της εικόνας του ίδιου του ήπατος παρατήρησαν και οι Okano και συν 152 σε ισχαιμία 30 λεπτών και επαναιμάτωση 60 λεπτών μετα από χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ. Ο Duru 160 σε πειραματική μελέτη με ισχαιμία και επαναιμάτωση σκελών σε επίμυες μπόρεσε να αναδείξει την προστατευτική δράση της ΑΤ ΙΙΙ στην επίπτωση του συνδρόμου στον πνεύμονα. Η διήθηση με πολυμορφοπύρηνα που ανευρέθηκε στην ομάδα της ΑΤ ΙΙΙ ήταν σαφώς ηπιότερη. Παρόμοια αποτελέσματα είχαν και οι Özden και συν 153 όταν μελέτησαν την επίδραση της ΑΤΙΙΙ στην ισχαιμία και επαναιμάτωση του νεφρού. Διαπίστωσαν ελάττωση της δραστικότητας της μυελοϋπεροξειδάσης η οποία αντικατόπτριζε την αναστολή της ενεργοποίησης και διήθησης με πολυμορφοπύρηνα στο νεφρικό ιστό. Το ίδιο εύρημα είχαν και οι Harada και συν 158 όταν διενήργησαν ισχαιμία και επαναιμάτωση στο ήπαρ και χορήγησαν ΑΤ ΙΙΙ. Ο Okano και συν 152 απέδωσαν τη βελτίωση της ιστολογικής εικόνας μετά από χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ στη βελτίωση της μικροκυκλοφορίας και της ενεργειακής κατάστασης που σχετίζεται με την έκλυση προστακυκλίνης. Στη μελέτη μας φάνηκε ότι η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ πριν από την επαναιμάτωση του ίσχαιμου μυ ασκεί προστατευτική δράση στο ήπαρ τόσο σε βιοχημικό επίπεδο, όσο και στο επίπεδο της οξειδωτικής καταπόνησης, όπως καταγράφτηκε από τα επίπεδα της MDA. Μεγάλη επίσης διαφορά διαπιστώθηκε στην παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Οι αλλοιώσεις μετά από χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ ήταν σαφώς ηπιότερες. Η δράση της ΑΤ ΙΙΙ φαίνεται ότι είναι πολύ πιο σύνθετη και πιο ευρεία από ότι γνωρίζαμε. Η αντιπηκτική της δράση σχετίζεται με την επίδρασή της σε διάφορους παράγοντες που σχετίζονται με τον καταρράκτη της πήξης. Κυρίως δρα στη θρομβίνη και τους παράγοντες Xα,IΧα, δρα όμως και στους παράγοντες VIIa,XIIa και Xια. Η ΑΤ ΙΙΙ επιπλέον διαθέτει και αντιφλεγμονώδη δράση η οποία είναι α- νεξάρτητη από την αντιπηκτική της δράση. Η χορήγηση της σε ασθενείς με σοβαρή σήψη βελτίωσε τη θνητότητα κατά 39% σε κάποιες μελέτες 132,ενώ και η εφαρμογή της σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ισχαιμίας και επαναιμάτωσης είχε ευεργητική δράση,155,156, 158,159,160,161. Αντίστοιχα η χορήγηση ανασυνδυασμένης ι- ρουδίνης, η οποία αναστέλλει εκλεκτικά τη θρομβίνη, δεν είχε παρόμοια αποτε- 85

86 λέσματα 167. Η προστατευτική αυτή δράση της ΑΤ ΙΙΙ αποδόθηκε κυρίως στην α- πελευθέρωση προστακυκλίνης μέσω της σύνδεσης με τις γλυκοζοαμινογλυκάνες από τα ενδοθηλιακά κύτταρα 147,148,168. Η παρατήρηση επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι μετά τη χορήγηση αυξάνονται τα επίπεδα της 6-κετο-προσταγλανδίνης F 1a ενός μεταβολίτη της προστακυκλίνης. Σε αναλογία τόσο τα επίπεδα του μεταβολίτη όσο και οι ευργετικές δράσεις της ΑΤ ΙΙΙ αναστέλλονται από τη χορήγηση ινδομεθακίνης 120. Η δράση αυτή φαίνεται ότι σε κάποιο βαθμό αναστέλλεται και από τη χορήγηση της ηπαρίνης η οποία δεσμεύει τις θέσεις σύνδεσης της ΑΤ ΙΙΙ με τις γλυκοζοαμινογλυκάνες 169,170,171. Μία πρόσφατη μετά-ανάλυση έρχεται να αμφισβητήσει την προστατευτική της δράση σε ασθενείς της ΜΕΘ με σήψη, με αδυναμία τεκμηρίωσης όφελους από τη χορήγησή της 172. Νέες μελέτες όμως έρχονται να προσθέσουν και άλλες δράσεις στην ΑΤ ΙΙΙ όπως η αντι-αγγειογενετική δράση μέσω αναστολής διαφόρων αυξητικών παραγόντων 173. Οπωσδήποτε η μεταφορά των αποτελεσμάτων μιας πειραματικής μελέτης στην κλινική πράξη δεν είναι εύκολη. Απαιτούνται σαφώς περισσότερες τυχαιοποιήμενες,προοπτικές, διπλές τυφλές μελέτες σε ανθρώπους ώστε να μπορέσει να αποδειχτεί η προστευτική δράση της ΑΤ ΙΙΙ καθώς επίσης και να διευκρινειστεί το ευρύ φάσμα δράσης που διαθέτει αυτή η γλυκοπρωτεΐνη. 86

87 12. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από την ανάλυση των στοιχείων της πειραματικής μας μελέτης προκύπτει ότι: Η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ δεν επηρεάζει τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων,των αιμοπεταλίων,όπως και την τιμή της SGPT,της ALP και της γ-gt. Η στατιστικά σημαντική πτωτική τάση της SGOT που παρουσιάζεται στην ομάδα Α που χορηγήθηκε ΑΤ ΙΙΙ σε σχέση με τη Β τεκμηριώνει την προστατευτική της δράση σε βιοχημικό επίπεδο. Τα επίπεδα της MDA ελαττώθηκαν στατιστικά σημαντική στην ομάδα ι- σχαιμίας-επαναιμάτωσης μετά από χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ, δεδομένο που επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ βοηθάει στην ελλάτωση της οξειδωτικής καταπόνησης. Κατά την παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο δεν αναδείχθηκαν βλάβες, έτσι δεν μπορεί να αξιολογηθεί η δράση της ΑΤ ΙΙΙ με τον τρόπο αυτό. Η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ ελάττωσε σε σημαντικό βαθμό τις βλάβες που ε- λέγχονται με το ηλεκρονικό μικροσκόπιο,εύρημα που μας επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι ασκεί προστατευτική δράση στις ιστολογικές αλλοιώσεις. Συνεπώς από το συνδυασμό των αποτελεσμάτων,κυρίως όμως των ευρημάτων του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) στις διάφορες ομάδες, μπορούμε να ισχυριστούμε ότι η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ ασκεί προστατευτική δράση στο ήπαρ, όταν προκαλείται ισχαιμία και επαναιμάτωση σκελών σε επίμυες. 87

88

89 13. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ισχαιμία των σκελετικών μυών συνοδεύεται από μία σειρά μεταβολικών διαταραχών που εξαρτάται από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Η επαναιμάτωση σε ένα ισχαιμικό μυ είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μηαναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Προσφέρει το απαιτούμενο οξυγόνο που είναι α- παραίτητο για τις μεταβολικές διεργασίες, ταυτόχρονα όμως παράγονται διάφορα τοξικά προϊόντα με τοπική και συστηματική βλαπτική επίδραση. Έτσι, η ίδια η επαναιμάτωση,αυτή καθ' εαυτή,μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών, συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Το ήπαρ, θέση μεταβολισμού και παραγωγής πολλών ουσιών, είναι ένα από τα απομακρυσμένα όργανα στόχος που δυνητικά υφίστανται βλάβη κατά την ισχαιμία και επαναιμάτωση των μυών. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ φαίνεται ότι συμβάλλει στην προστασία των ιστών όταν αυτά επαναιματώνονται μετά από περιόδους ισχαιμίας. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της πιθανής προστατευτικής δράσης της αντιθρομβίνης ΙΙΙ (ΑΤ ΙΙΙ) στη βλαπτική επίδραση στο ήπαρ όταν προκαλείται ισχαιμία και επαναιμάτωση των κάτω άκρων που διαθέτουν μεγάλες μυϊκές μάζες. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ:Στην πειραματική μας μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 70 άρρενες επίμυες της φυλής Wistar βάρους γρ. Οι 60 από αυτούς υποβλήθηκαν σε πλήρη ισχαιμία του δεξιού οπισθίου άκρου και οι 10 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα μαρτύρων. Η πρόκληση ισχαιμίας πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ίσχαιμης περίδεσης στο ριζομήριο του επίμυος και επιβεβαιώθηκε με αγγειογραφικό έλεγχο ή υπερήχους. Η διάρκεια ισχαιμίας ήταν έξι (6) ώρες. Τριάντα (30) λεπτά πριν την άρση της ισχαιμίας οι επίμυες τυχαιοποιήθηκαν σε δυο (2) ομάδες (Α,Β). Στην ομάδα Α χορηγήθηκε ενδοφλεβίως ΑΤ ΙΙΙ ενώ στην ομάδα Β εικονικό φάρμακο (διάλυμα NaCl 0.9%). Μετά την άρση της ισχαιμίας έγινε επιπλέον διάκριση σε τρείς υποομάδες ανάλογα με τη διάρκεια της επαναιμάτωσης και τη διενέργεια της επέμβασης. (Α1,Β1: αμέσως μετά την άρση, Α2,Β2: 30 λεπτά, Α3,Β3: 4 ώρες.) Από όλα τα πειραματόζωα λήφθηκαν ιστοτεμάχια ήπατος τα οποία μελετήθηκαν με οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης και χρησιμοποιήθηκαν για τον έμμεσο προσδιορισμό των ελευθέρων ριζών οξυγόνου με τη μέτρηση της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA). Επίσης σε όλους τους επίμυες διενεργήθηκε αιμοληψία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των εξής παραγόντων: 89

90 Τρανσαμινάσες (SGOT, SGPT), γ-γλουταμική αμινοτρανσφεράση (γ- GT), αλκαλική φωσφατάση (ALP),λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια. Μετά την αιμοληψία και τη λήψη βιοψιών τα πειραματόζωα θανατώθηκαν με τη χορήγηση χλωριούχου καλίου (KCl). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:Κατά τη σύγκριση της ομάδας Α με την ομάδα Β τεκμηριώθηκε ελλάτωση της MDA σε όλες τις υπο-ομάδες. Η ελλάτωση αυτή αποδείχθηκε στατιστικώς σημαντική στην 2 και 3, δηλ. στην επαναιμάτωση των 30 λεπτών (p<0.05) και των 4 ωρών (p<0.05). Η παρακολούθηση των άλλων αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων ανέδειξε πτωτική τάση στις τιμές της SGOT στην ομάδα Α η οποία γίνεται στατιστικώς σημαντική στις 4 ώρες (p<0.01). Από την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ελάχιστα μιτοχόνδρια της ομάδας Α εμφανίζονται οιδηματικά σε σχέση με την ομάδα Β, ενώ το ενδοκυτταρικό οίδημα ήταν σαφώς πιο ήπιο. Η διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου αναγνωρίστηκε σε μικρότερο βαθμό, ενώ δεν διαπιστώθηκαν νεκρώσεις ή μεγάλες αλλοιώσεις στους πυρήνες. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ φαίνεται ότι βοηθάει στην ελλάτωση της οξειδωτικής καταπόνησης όπως αυτή καταγράφεται από την MDA,ενώ παρατηρείται και κάποια βιοχημική βελτίωση από τη χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ. Εκείνο ό- μως που τεκμηριώνει σημαντικά την προστατευτική δράση της ΑΤ ΙΙΙ είναι τα ευρήματα στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Συμπερασματικά μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ πριν από την αποκατάσταση της αιμάτωσης σε ισχαιμικούς μυς ασκεί προστατευτική επίδραση στις εκδηλώσεις από το ήπαρ. 90

91 14. SUMMARY INTRODUCTION: Ischaemia of skeletal muscles is followed by a series of metabolic disturbances that depend on the degree and duration of ischaemia. Reperfusion is crucial if a non-reversible damage is to be prevented. On the other hand, reperfusion results in several metabolites being released in the systemic circulation with a potentially deleterious effect. As a result, this could lead to a multiplied increase of intensity and extent of tissue damage. The liver, an anatomical site for metabolism and production of several substances, is one of the remote organs that could be damaged induced by ischaemia and reperfusion of skeletal muscles. Antithrombin III seems to protect tissues during reperfusion after prolonged ischaemia. PURPOSE: The aim of this study was to investigate the possible protective function of Antithrombin III on the harmful effects of free oxygen radicals in liver following ischaemia and reperfusion of the lower limbs with large skeletal muscle mass. METHODS: In this experimental study, we used 70 Wistar male rats, weighing gr. Sixty animals were submitted to complete ischaemia of the right hind limb and 10 were used as controls. Ischaemia was induced by tourniquet application to the upper thigh region and confirmed by angiography or ultrasonography. The duration of ischaemia was 6 hours. Thirty minutes before the end of ischaemia, the animals were randomised in two groups (A, B). In group A, antithrombin III was given intravenously, whereas in group B placebo (NaCl 0.9%) was given instead. After reperfusion, a further 3 subgroups were formed depending on the duration of reperfusion and timing of the procedure (Α1, Β1: immediately after the end of ischaemia; Α2, Β2: 30 min; Α3, Β3: 4 h). Hepatic tissue specimens were taken from all animals and studied under optical and electron microscopy. These samples were also used for the indirect quantification of free oxygen radicals by measuring malondialdehyde (MDA). Blood samples were also taken from all animals to measure the following: Transaminases (SGOT, SGPT), γ-glutamic aminotransferase (γ-gt), alkaline phosphatase (ALP), white cell count and platelets. After taking blood samples and tissue specimens, animals were killed by the administration of potassium chloride. RESULTS: Comparing group A with B, there was a decrease of MDA in all subgroups. This decrease was statistically significant in 2 and 3, i.e. in 30-min reperfusion (p<0.05) and in 4h (p<0.05). Measurement of the other haematological and 91

92 biochemical parameters showed a diminishing tendency for SGOT in group A which becomes statistically significant in 4h (p<0.01). Nevertheless, electrone microscopy findings are the one thing that substantially documents the protective function of antithrombin III. Few mitochondria appear oedematous compared with group B, whereas intracellular oedema is clearly milder. Endoplasmic reticulum widening was recognised in a lesser degree and there were no necrosis or extensive damage to nuclei. CONCLUSIONS: This study suggests that antithrombin III administration helps in attenuating the oxidative reaction which is recorded by MDA, and there is also a biochemical improvement. In conclusion, antithrombin III administration prior to blood restoration in an ischaemic muscle seems to exert a protective action to the hepatic manifestations. 92

93 15. ΕΙΚΟΝΕΣ ΕΙΚ. 1 Αγγειογραφία χωρίς περίδεση του σκέλους ΕΙΚ. 2 Αγγειογραφία με περίδεση του σκέλους 93

94 ΕΙΚ. 3 Αγγειογραφία μετά από άρση της περίδεση του σκέλους ΕΙΚ. 4 Έγχυση από πεϊκή φλέβα 94

95 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΕΙΚ. 5 ΟΜΑΔΑ Γ1: Ήπαρ ομαλό, φυσιολογικό ΕΙΚ. 6 ΟΜΑΔΑ Γ2: Ήπαρ ομαλό, φυσιολογικό 95

96 ΕΙΚ. 7 ΟΜΑΔΑ Β1:Περιορισμένο οίδημα, εμφανής ρικνωτικός πυρήνας ΕΙΚ. 8 ΟΜΑΔΑ Β1: Περιορισμένο οίδημα του κυτταροπλάσματος,διάταση ενδοπλασματικού δικτύου 96

97 ΕΙΚ. 9 ΟΜΑΔΑ Β1: πύκνωση των μιτοχονδρίων, εξαφάνιση των ακρολοφιών, ενδοκυττάριο οίδημα ΕΙΚ.10 ΟΜΑΔΑ Β1: ρίκνωση του πυρήνα, μη φυσιολογική κατανομή της χρωματίνης,ασαφής διαγραφή της πυρηνικής μεμβράνης 97

98 ΕΙΚ. 11 ΟΜΑΔΑ Β2: Ενδοκυτταρικό οίδημα, ρικνός πυρήνας ΕΙΚ. 12 ΟΜΑΔΑ Β2: Ενδοκυττάριο οίδημα, ρίκνωση του πυρήνα 98

99 ΕΙΚ. 13 ΟΜΑΔΑ Β2: Ενδοκυττάριο οίδημα ΕΙΚ. 14 ΟΜΑΔΑ Β3: Ενδοκυττάριο οίδημα, λύση μιτοχονδρίων,ρικνωτικός πυρήνας,έντονο περιπυρηνικό οίδημα 99

100 ΕΙΚ. 15 ΟΜΑΔΑ Β3: Σημαντικό ενδοκυττάριο οίδημα, οίδημα μιτοχονδρίων ΕΙΚ. 16 ΟΜΑΔΑ Β3: Ερυθρά στο χώρο του Disse 100

101 ΕΙΚ. 17 ΟΜΑΔΑ Β3: Νεκρωτικό υλικό μεταξύ των ηπατικών κυττάρων, επιδείνωση της μορφολογικής εικόνας των ηπατοκυττάρων ΕΙΚ. 18 ΟΜΑΔΑ Α1: Φυσιολογικό ηπατικό κύτταρο,φυσιολογικά μιτοχόνδρια 101

102 ΕΙΚ. 19 ΟΜΑΔΑ Α1: Φυσιολογικό ηπατικό κύτταρο,φυσιολογικά μιτοχόνδρια ΕΙΚ. 20 ΟΜΑΔΑ Α1: Φυσιολογικό ηπατικό κύτταρο,(ηλεκτρ.μικροσκόπιο) 102

103 ΕΙΚ. 21 ΟΜΑΔΑ Α2: Ελάχιστο ενδοκυττάριο οίδημα ΕΙΚ. 22 ΟΜΑΔΑ Α2: Ελάχιστα μιτοχόνδρια εμφανίζονται οιδηματικά με πλήρη εκφύλιση της μητρικής τους ουσίας,φυσιολογική εμφάνιση του πυρήνα 103

104 ΕΙΚ. 23 ΟΜΑΔΑ Α2: Ήπιο ενδοκυτταρικό οίδημα, σαφώς καλύτερη εικόνα από την ομάδα Β2.Μιτοχόνδρια με ευδιάκριτες ακρολοφίες και πυρήνας με φυσιολογική κατανομή χρωματίνης ΕΙΚ. 24 ΟΜΑΔΑ Α3: Λίγα εκφυλισμένα μιτοχόνδρια 104

105 ΕΙΚ. 25 ΟΜΑΔΑ Α3: Αρκετά εκφυλισμένα μιτοχόνδρια,διεύρυνση ενδοπλασματικού δικτύου ΕΙΚ. 26 ΟΜΑΔΑ Α3: Αρκετά μιτοχόνδρια είναι σε εκφύλιση 105

106 ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΕΙΚ. 27: Ομάδα Γ1. Διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος. (Η&Ε Χ 100) ΕΙΚ. 28: Ομάδα Γ2. Απουσία ιστολογικών αλλοιώσεων σε περιπυλαίες θέσεις. (Η&Ε Χ 400) 106

107 ΕΙΚ. 29 ΟΜΑΔΑ Β1. Ηπατικό παρέγχυμα χωρίς ιστολογικά άνιχνεύσιμες διαταραχές. (Η&Ε Χ 100) ΕΙΚ. 30: Ομάδα Β2. Απουσία φλεγμονωδών κυτταρικών διηθήσεων και ιστολογικά αναγνωρίσιμης ηπατοκυτταρικής βλάβης σε κεντρολοβιακές θέσεις. (Η&Ε Χ 400) 107

108 ΕΙΚ. 31: Ομάδα B3. Κεντρολοβιακή ζώνη Κεντρική φλέβα. Απουσία μικροσκοπικά ανιχνεύσιμων αλλοιώσεων. (Η&Ε Χ 400) ΕΙΚ.32: Ομάδα Α1. Επιθήλιο χοληφόρων πόρων χωρίς ιστολογικές αλλοιώσεις. Διατήρηση αριθμού φλεγμονωδών κυτταρικών στοιχείων εντός φυσιολογικών ορίων. (Η&Ε Χ 400) 108

109 ΕΙΚ. 33: Ομάδα Α2. Διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής του ηπατικού παρεγχύματος σε περιπυλαίες θέσεις. Απουσία παθολογικών εναποθέσεων. (Η&Ε Χ 400) ΕΙΚ. 34: Ομάδα Α3. Ηπατικό παρέγχυμα χωρίς ιστολογικά άνιχνεύσιμες αλλοιώσεις. (Η&Ε Χ 400) 109