ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ"

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, του Τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, του τμήματος Χημείας Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Χολή-Παπαδοπούλου (Επιβλέπουσα ) Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Βιζιριανάκης Ιωάννης (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Νικολακάκη Ελένη (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής κ. Τσιφτσόγλου Αστέριος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής κ. Κυριακίδης Δημήτριος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγήτρια κ. Κουΐδου Σοφία (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αναπληρώτρια κ. Καθηγήτρια Παπαμαρκάκη Θωμαΐς (Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

3 Παπαχρήστου Ελένη Α.Π.Θ. ΤΙΤΛΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ: "ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ" ISBN "Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως" (Ν. 5343/1932, αρθρο 202, παρ.2)

4 Αφιερώνεται Στους πολυαγαπημένους μου γονείς Θωμά & Σταθούλα και στον αγαπημένο αδερφό μου Λάμπρο για την διαχρονική αγάπη, βοήθεια, συμπαράσταση & στήριξη που μου προσφέρουν Στον αγαπημένο μου αρραβωνιαστικό, Σπύρο για την απεριόριστη αγάπη, κουράγιο & στήριξη που προσφέρει στη ζωή μου

5 Στην αγαπημένη δασκάλα μου, κυρία Δώρα για τις πολύτιμες γνώσεις & την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ To αντικείμενο της Βιοχημείας είναι η μελέτη βιολογικών φαινομένων σε μοριακό επίπεδο σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Με τη συγκεκριμένη διατριβή μου δόθηκε η δυνατότητα να μελετήσω το ευκαρυωτικό ριβόσωμα και συγκεκριμένα η μελέτη μιας ριβοσωμικής πρωτεΐνης της μικρής υπομονάδας 40S, την S5 από ποντίκι, (rps5). Τα τελευταία χρόνια αναφέρονται πολλά παραδείγματα εμπλοκής των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν σχετίζονται με την μετάφραση αποκλειστικά, όπως για παράδειγμα στην επιδιόρθωση του DNA, στον κακοήθη μετασχηματισμό, στον κυτταρικό θάνατο. Διερευνήθηκε λοιπόν η μεταφορά της S5 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και κατ επέκταση στους πυρηνίσκους, προκειμένου να λάβει χώρα η βιογένεση των ριβοσωμάτων, καθώς επίσης και ο χαρακτηρισμός δομικών στοιχείων στο μόριο της πρωτεΐνης, με πιθανή λειτουργική συμμετοχή στην «ενδοκυτταρική κυκλοφορία». Επιπρόσθετα μελετήθηκε ο πολυλειτουργικός ρόλος της rps5 στην ερυθροδιαφοροποίηση και απόπτωση. Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κάτω από την καθοδήγηση της αναπληρώτριας καθηγήτριας κα. Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρας. Η κα. Δώρα αποτελεί για μένα δασκάλα, η οποία τόσο στις προπτυχιακές όσο και στις μεταπτυχιακές σπουδές μου, με έκανε να αγαπήσω πολύ την Βιοχημεία και να διεισδύω σε λεπτομέρειες για την επίλυση ερευνητικών προβλημάτων. Την ευχαριστώ πάρα πολύ για τη σημαντική ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω την παρούσα διατριβή και να διευρύνω τους επιστημονικούς μου ορίζοντες, αλλά και γιατί αποτέλεσε για μένα πάντοτε πρότυπο επιστημονικού ήθους και ανθρωπιάς. Στάθηκε δίπλα στις αδυναμίες του χαρακτήρα μου, με ενθάρρυνε να συνεχίσω την έρευνα και με στήριξε σε δύσκολες στιγμές. Την ευχαριστώ για το μεγάλο ενδιαφέρον που δείχνει για μένα και πάντα είναι δίπλα μου σε ότι και αν κάνω. Θέλω να την ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου για την πραγματική αγάπη της προς εμένα, για την υπόδειξη του θέματος, την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε και μου προσφέρει κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας αλλά και κατά τη διόρθωση της διατριβής. Ευχαριστώ τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Ι. Βιζιριανάκη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη συνεργασία του, καθώς και για τη βοήθεια του και το σχεδιασμό πειραμάτων της συγκεκριμένης διατριβής, που αφορούσαν τις κυτταροκαλλιέργειες, κλώνοι C56, C14 και πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης (RNAi παρεμβολής). Τα πειράματα αυτά διεκπαιρεώθηκαν, σε συνεργασία με το

7 εργαστήριο Bιοχημείας, στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος της Φαρμακευτικής του ΑΠΘ. Θερμότατες ευχαριστίες από τα βάθη της καρδιάς μου και ιδιαίτερη εκτίμηση θα ήθελα να αποδώσω επίσης στην επίκουρο καθηγήτρια κα Νικολακάκη Ελένη για τις πολύτιμες γνώσεις στο χώρο της μοριακής βιολογίας και βιοχημείας που είχα την τύχη να αποκομίσω μαθητεύοντας δίπλα της. Επίσης, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις συμβουλές της, τη βοήθεια της στάθηκε δίπλα μου σε οποιοδήποτε πρόβλημα και αν είχα, την αγάπη της και την ιδιαίτερη φιλική διάθεση της. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω την ιδιαίτερη εκτίμηση και τις απεριόριστες ευχαριστίες στον Καθηγητή κ. Α. Τσιφτσόγλου, για τις συμβουλές του και το μεγάλο ενδιαφέρον του για την συγκεκριμένη διατριβή. Επίσης, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για τις εποικοδομητικές συζητήσεις καθώς και για τον σωστό τρόπο σκέψης και επίλυσης ενός ερευνητικού προβλήματος. Τον ευχαριστώ θερμά για την στήριξή του να συνεχίσω την διατριβή, την εμπιστοσύνη και που με ενσωμάτωσε στο εργαστήριο του και ποτέ δεν με ξεχώρισε από τους υπόλοιπους υποψήφιους διδάκτορες του. Θα ήταν σημαντική παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γιανακούρο Θωμά για την πειραματική του βοήθεια και για τις συμβουλές του, τη στήριξή του και την άκρως φιλική του διάθεση. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Βιολόγο Α. Κουρκουτέλη, για την οργάνωση του λογισμικού της κυτταρομετρίας ροής καθώς και τον λέκτορα κ. Γ. Παπαδόπουλο για τις μελέτες μοριακής δυναμικής και τη βοήθεια του. Ευχαριστώ επίσης τον καθηγητή κ. Δ. Κυριακίδη που με παρότρυνε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού να συνεχίσω για διδακτορικό και για την πρώτη μου δημοσίευση στο περιοδικό Ιατρική και Φαρμακευτική. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω ένα άλλο μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Παπαμαρκάκη Θωμαΐδα για την συνεργασία της. Ευχαριστώ την καθηγήτρια κα Κουίδου Σοφία που δέχτηκε να είναι στην επταμελή επιτροπή μου, καθώς και για τις εύστοχες και σημαντικές παρατηρήσεις κατά τη διόρθωση της συγκεκριμένης διατριβής. Θέλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την κα. Ζαριφέ Φωτεινή για τις πολύτιμες συμβουλές και το ενδιαφέρον της όλα αυτά τα χρόνια, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη Δ.Ε.Π., τους συναδέλφους και όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Βιοχημείας, για την ευχάριστη συνεργασία. Ευχαριστώ, επίσης, όλους τους συναδέλφους με τους οποίους δουλέψαμε στον ίδιο χώρο: τους κ. Ν. Βουκαλή, Ι. Σανίδα, Φ. Κωτάκη, Φ. Πειδη και την κα. Μ. Δανιηλίδου για την βοήθεια στον πειραματικό τομέα και για το ευχάριστο και φιλικό

8 κλίμα. Ευχαριστώ τους προπτυχιακούς φοιτητές που δουλέψαμε μαζί κ. Α. Ασημίνα, κα Μ. Καρατάσιου, κ. Γ. Ερκέκογλου καθώς και τον κ. Π. Λαζαρίδη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τη φίλη μου Δρ. Χρ. Ματράγκου, για τη πολύτιμη βοήθεια της στο μεταπτυχιακό και στα πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τους υποψήφιους διδάκτορες κ. Ι. Μπονοβόλια και κ. Π. Λάμπρου για την πειραματική βοήθεια τους. Μεγάλες ευχαριστίες οφείλω στη φίλη μου και συνάδελφο μου που μοιραστήκαμε τον ίδιο εργαστηριακό πάγκο, κ. Τσαγκάλια Κατερίνα για την συμπαράστασή της και βοήθεια της όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου τις φίλες μου και υποψήφιες διδακτόρισες κα. Ι. Τριβιάη και ιδιαίτερα την κ. Παπαζαχαρίου Λ. για το μεγάλο ενδιαφέρον και την αγάπη τους. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους μου κ. Θεοδώρου Μαρίνα και Βαγγέλη, καθώς και την κα. Παπή Ρηγίνη για την βοήθεια στο πειραματικό μέρος της διατριβής και τη συμπαράστασή τους. Ευχαριστώ την φίλη μου κα. Παπαδοπούλου Ε. για την συμπαράσταση και κατανόηση της. Ευχαριστώ τον φίλο μου κ. Ζαχαριάδη Ι. για την βοήθεια καθώς και συμπαράσταση του κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής. Τέλος, θέλω να εκφράσω ένα μεγάλο ευχαριστώ και ευγνωμοσύνη στους γονείς μου, Θωμά και Σταθούλα καθώς και στον αδερφό μου Λάμπρο, οι οποίοι είναι δίπλα μου και στηρίζουν τα όνειρα μου. Χωρίς την υποστήριξη τους, κυρίως την οικονομική, την συμπαράσταση, την κατανόηση και τη βοήθειά τους, αυτή η διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Τους ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για την απεριόριστη αγάπη τους και την στήριξη που μου δίνουν στη ζωή μου. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον άνθρωπο μου, τον αρραβωνιαστικό μου Σπύρο για την στήριξή του, την απέραντη αγάπη και την υπομονή του. Τον ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για την πολύτιμη βοήθεια του στη διδακτορική διατριβή και ένα μεγάλο ευχαριστώ για τη δύναμη που μου δίνει στη ζωή μου. Παπαχρήστου Ελένη

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 A.1 Ευκαρυωτικό Ριβόσωμα 1 Α.1.1 Γενικά για το ριβόσωμα 1 A.1.2 Γενικά για την Βιογένεση ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων 5 Α Επεξεργασία του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna 7 Α Παράγοντες που συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος 11 A Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα 13 Α.2 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες 17 A.2.1 Χαρακτηριστικά των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 17 Α.2.2 Mεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 21 Α.3 Η πολυλειτουργικότητα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 25 Α.4 Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών. 31 A.5 Γονιδιακή καταστολή με RNA παρεμβολή 37 A.5.1 Μηχανισμός της γονιδιακής αποσιώπησης 38 Α.5.2 Κατηγορίες των small RNAs 41 A.5.3 Μονοπάτια γονιδιακής αποσιώπησης 43 Α.5.4 Καταστολή της μετάφρασης 45 Α.6 Ερυθροδιαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων 48 Α.6.1 Αιμοποίηση 48 Α.6.2 Οι λευχαιμίες ως διαταραχή της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων. 50 Α.7 Το σύστημα των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστημα μελέτης, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro 51 Α.7.1 MEL (Murine ErythroLeukemia) ή Friend leukemia κύτταρα 51 Α.7.2 Το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων 54

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα A.8 Κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου 57 A.9 Χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων 58 A.10 Βιοχημικά μονοπάτια Απόπτωσης 61 A.11 Κυτταρικός κύκλος 65 Α.11.1 Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο 65 Α.11.2 Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω των Cdks 67 Α.11.3 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) 70 ΣΚΟΠΟΣ 76 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 77 Β.1 ΥΛΙΚΑ 77 Β.1.1 Βιολογικά υλικά 77 Β.1.2 Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών 77 Β.1.3 Χημικά αντιδραστήρια 78 Β.1.4 Υλικά χρωματογραφίας 78 B.1.5 Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας 78 Β.2 ΜΕΘΟΔΟΙ 80 Β.2.1 Καλλιέργεια των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL 80 Β.2.2 Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης 81 Β.2.3 Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων MEL με τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 81 B.2.4 Μέτρηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο με την χρωστική Trypan Blue 82 Β.2.5 Απομόνωση κυτταρικών εκχυλισμάτων από MEL κύτταρα 83 Β.2.6 Απομόνωση κυταροπλασματικού RNA από MEL κύτταρα 83 Β Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με την μέθοδο της φαινόλης 83 B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με τη μέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης 85 B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein της εταιρίας Macherey-Nagel 86 Β.2.7 Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων 88 Β.2.8 Υποκυτταρική κλασμάτωση των MEL κυττάρων 88 Β.2.9 Απομόνωση ριβοσωμάτων από MEL κύτταρα 89 Β.2.10 Ανάλυση κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry) 90 B.2.11 Μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry) κατόπιν χρώσης με τις φθορίζουσες χρωστικές ανεξίνη V (FITC-Annexin V) και προπίδιοιωδίδιο (Propidium-Iodide - PI) 92 Β.2.12 Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με ανίχνευση του DNA των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-flow cytometry) κατόπιν χρώσης με προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) 96 B.2.13 Τεχνική της RNA παρεμβολής σε MEL κύτταρα 98 B Σχεδιασμός των sirnas που στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 98 B Προετοιμασία των δίκλωνων RNAs (sirna) 100 B Πειραματική διαδικασία για την αποσιώπηση (silencing) 101 Β.2.14 Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli 103 Β.2.15 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden 104 Β.2.16 Ηλεκτροφόρηση 104 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 104 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) 106 Β.2.17 Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 108 Β Βαφή με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R Β Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) 109 B.2.18 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε μεμβράνη 110 B.2.19 Ανοσοανίχνευση 111 Β.2.20 Ανοσοκατακρήμνιση 113 B.2.21 Αυτοραδιογραφία 114

12 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Β.2.22 Διδιάστατη ηλεκροφόρηση ριβοσωμικών πρωτεϊνών 115 Β.2.23 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτές δύο διαστάσεων κατά (Kaltschmidt and Wittmann 1970) 118 Β.2.24 Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA 118 Β Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης 118 Β.2.25 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR). 119 Β.2.26 Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με την τεχνική του σχεδιασμού megaprimer. 124 Β.2.27 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης τρανσκριπτάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 126 B.2.28 Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR 128 B.2.29 Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης 129 B.2.30 Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς 130 Β Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού 131 Β Αντίδραση λιγάσης 133 B Aποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου 134 B.2.31 Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό βακτηρίων (competent cells) 135 B Μέθοδος των δυο διαλυμάτων CaCl B Μέθοδος δυο διαλυμάτων CaCl 2 (αποθηκεύονται στους -700C) 136 Β.2.33 Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E. coli (μετασχηματισμός). 137 Β.2.34 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA. 138 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση και καθαρισμός με φαινόλη / χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη 138 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) 139 B.2.35 Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 139 B.2.36 Έλεγχος in vivo φωσφορυλίωσης με την χρήση χρωματογραφίας

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα αγχιστείας σε σφαιρίδια με καθηλωμένα δισθενή μέταλλα (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) 142 Β.2.37 Έμμεσος ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκόπηση 143 Β.2.38 Μελέτες μοριακής δυναμικής της rps5 144 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 146 Γ.1 Μελέτη των δομικών στοιχείων και έλεγχος φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 146 Γ.1.1 Παρασκευή υποκυτταρικών εκχυλισμάτων από ευκαρυωτικά κύτταρα και ενδοκυτταρική εντόπιση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 146 Γ.1.2 In vivo πρωτεόλυση της rps5 149 Γ.1.3 Φωσφορυλίωση της rps5 και «ενδοκυτταρική κυκλοφορία» 154 Γ.1.4 Θεωρητική προσέγγιση των αμινοξέων στόχων φωσφορυλίωσης της rps5 155 Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων της rps5 στους πλασμιδιακούς φορείς pegfp-c1 157 Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP-rpS5 Thr-133 (mut), GFP-rpS5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) 159 Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων GFP- rps5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t για πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης με την κινάση της καζεΐνης ΙΙ (CKII) 160 Γ Υπερπαραγωγή και καθαρισμός των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) 162 Γ In vitro φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-24mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) με την κινάση της καζεΐνης II (CKII) 165 Γ.1.5 Ενδοκυτταρική φωσφορυλίωση ( in vivo ) της rps5 από την CK II και ανοσοκατακρήμνιση 167 Γ.1.6 Μετακίνηση της πρωτεΐνης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα 169 Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-37 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης 169

14 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-50 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης. 171 Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP- rps και GFP- rps Γ.1.7 Θεωρητικές προσεγγίσεις με προσομοίωση μοριακής δυναμικής 174 Γ.1.8 Φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στα κύτταρα MEL με Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) 176 Γ.1.9 Έλεγχος φωσφορυλίωσης της rps5 στο ριβόσωμα 179 Γ.2 Μελέτη του ρόλου της rps5 στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης και πιθανή εμπλοκή της σε βιοχημικά μονοπάτια της απόπτωσης στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL 182 Γ.2.1 Έλεγχος της έκφρασης του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα pcdna-3.1-rps5 (sense) σε κλώνους επιμολυσμένων MEL κυττάρων 182 Γ Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης στον κλώνο MEL-rpS5 C Γ Μελέτη κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C56 παρουσία ή απουσία των χημικών επαγωγέων της διαφοροποίησης, HMBA (εξαμεθυλενο-δισακεταμίδιο) και DMSO (διμέθυλο-σουλφοξείδιο) 186 Γ.2.2 Η υστέρηση στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης στην καλλιέργεια των μόνιμα επιμολυσμένων κυττάρων με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5 συμβαδίζει με την υστέρηση στη φάση G1/Go του κυτταρικού κύκλου 188 Γ.2.3 Aποσιώπηση του γονιδίου της rps5 σε MEL parental κύτταρα 193 Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου RPS5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_2_HP sirna 194 Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_4_HP sirna 198 Γ.2.4 Επιβεβαίωση της αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ΜΕL μετά από επιμόλυνση με 120 nm του δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου Rps5_4_HP sirna και σε επίπεδο πρωτεΐνης 202 Γ.2.5 Η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα κύτταρα ΜΕL επιβεβαιώνει την εμπλοκή της rps5 στη διαφοροποίηση 206 Γ.2.6 Έλεγχος απόπτωσης και νέκρωσης στις καλλιέργειες MEL που επιμολύνθηκαν είτε με το control είτε με το Rps5_4_HP sirna με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry), με FITC-Annexin V και 7-Αμινο-Ακτινομυκίνης D 211 Γ.2.7 Ανάκτηση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στην καλλιέργεια MEL που επιμολύνθηκε με το specific sirna, Rps5_4_HP sirna 215 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 221 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 244 SUMMARY 245 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 246

16 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 7-AAD: ACS: Ag: ATN: ATP: BCIP: BFU-Es: bp: BSA: CAK: CDKIs : CDKs: cdna: CFU-Es: 7-amino actinomycin D American Cancer Society Antigen Adenine noucleotide exchanger Adenosine 5'-triphosphate Bromo-chloro-indolyl phosphate Burst Forming Unit-Erythroid Base pairs Bovine serum albumin Cdk Activating Kinase CDK inhibitors Cyclin Dependent Kinases complementary Deoxyribonucleic acid Colony Forming Unit-Erythroid CFU-GEMM: Colony Forming Unit for Granulocytes, Erythrocytes, Macrophages and Megakaryocytes CFU-M,L: CFU-S: CLL: CML: CRDs: CSF: DAPI: DBA: DDA: DEPC: Colony Forming Unit of the Myeloid and Lymphoid cells Colony Forming Unit in spleen Chronic Lymphoblastic Leukemia Chronic Myelogenous Leukemia Cysteine rich domains Colony Stimulating Factor 4-6-Diamidino-2-phenylindole Diamond Blackfan Anemia Differentiation-Dependent- Apoptosis, DDA Diethyl-pyrocarbonate

17 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ DFC: DISC: DMEM: DMSO: DNA: DNA-PK: dntp: Dense Fibrillar Component Death-inducing signaling complex Dulbecco s Μodified Εagle s Μedium Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid DNA dependent protein kinase deoxynucleotide triphosphate DR 3: Death receptor 3 DTT: EDTA: EGFP: EGFR: eif4e: EPO: ERK: ETS: FACS: FBS: FC: FITC: FLV: GAIT: GC: G-CSF: GFP: GM-CSF: GST: GTP: Dithiothreitol Ethylene-diamine-tetraacetic acid Enhanced green fluorescent protein Epidermal Growth Factor Receptor Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E Erythropoietin Extracellular Signal Regulated Kinase External Transcribed Spacers Fluorescence activated cell sorting Fetal bovine serum Fibrillar Center Fluorescent isothio cyanate Friend Leukemia Virus Gamma Activated Inhibitor of Translation Granular Component Granulocyte-Colony Stimulating Factor Green Fluorescent Protein Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor Glutathione S-transferase Guanosine-5'-triphosphate

18 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Hb: HeBPs: HeLa: HEPES: HL-60: HMBA: hnrnp: HSCs: HSV-1: IFN-a: IL: IMAC: INF-γ: IRES: ITS: LIF: MAPK: MCS: M-CSF: MEK/ERK: MEL: mirnas: mrna: NBT: NES: NES: Hemoglobin Hemin Binding Proteins Human cervical adenocarcinoma cells 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethane-sulfonic acid Human promyelocytic Leukemia cells Hexamethylene bisacetamide heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein Hematopoietic Stem Cells Herpes Simplex Virus Interferon-a Interleukin Immobilized Metal Affinity Chromatography Interferone-γ Internal ribosome entry site Internal Transcribed Spacers Leukemia Inhibiting Factor Mitogen -Activated Protein Kinase Multiple cloning sites Macrophage-Colony Stimulating Factor mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase Murine erythroleukemia cells micrornas messenger Ribonucleic acid Nitro blue tetrazolium Nuclear Export Signal Nuclear Export Signal NF-E2: Nuclear Factor (erythroid-derived 2) NLS: Nuclear Localization Signal

19 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ NMR: NOR: NPC: NS: NTR: PBS: PCR: PI: PI3K: PIPES: pirnas: PKC: PMSF: PS: PSRP-1: PTEN: Rb: RBCs: RBDs: RISC: RPs: RT-PCR: SCF: SDS: SH: SID-1: sirna: sirna: Nuclear Magnetic Resonance Nucleolar Organiser Regions Nuclear Pore Complex Nucleostemin Non Translated Region Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction Propidium iodide Phosphatidylinositol-3 Kinase Piperazine-1,4-bis(2-ethane-sulfonic acid) piwi-interacting RNA Protein Kinase C Phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride Phosphatidyl-serine Phloem Small RNA binding Protein-1) Phosphatase and Tensin Homolog Retinoblastoma protein Red Blood Cells RNA Binding Domains RNA Induced Silencing Complex Ribosomal Proteins Reverse transcription-polymerase chain reaction Stem Cell Factor Sodium dodecyl sulfate Src Homology domain Systematic RNA Interference Defective Short interfering RNAs Small interference RNA

20 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ snrnp: TEMED: TGFb: TNF: TRITC: UBF: UDPs: VDAC: Small nuclear Ribonucleoprotein N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylene-diamine Transforming Growth Factor beta Tumor Necrosis Factor Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate Upstream Transcription Factor Ureido derivatives of pyridine Voltage dependent anion channel

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1 Ευκαρυωτικό Ριβόσωμα Α.1.1 Γενικά για το ριβόσωμα Τα ριβοσώματα βρίσκονται στα κύτταρα όλων των ζωντανών οργανισμών, με εξαίρεση τα ώριμα ερυθροκύτταρα θηλαστικών. Πρόκειται για σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνών με μοριακό μέγεθος που κυμαίνεται μεταξύ ~2.4 MDa (βακτήρια) και ~4 MDa (ευκαρυωτικά κύτταρα) και στην ενεργή τους μορφή συγκροτούνται από δύο υπομονάδες. Το ριβοσωμικό RNA (rrna) αποτελεί το ~ 65 % σε βάρος του ριβοσώματος και τα δύο τρίτα του ριβοσώματος ενώ το υπόλοιπο 1/3 είναι ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών, στους χλωροπλάστες των φυτών και αποτελούν τις πιο πολύπλοκες μοριακές μηχανές του κυττάρου. Τα ριβοσώματα αποτελούν περίπου το ~30% της κυτταρικής μάζας του κυττάρου 10 5 και 10 6 αριθμός ριβοσωμάτων σε βακτήρια και θηλαστικά, αντίστοιχα (Bashan and Yonath 2008). Σε αναπτυσσόμενα κύτταρα τα περισσότερα ριβοσώματα είναι ενεργά συνθέτοντας πολυπεπτιδικές αλυσίδες (ενσωματώνονται 20 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδή αλυσίδα στα βακτήρια και 5-9 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς). Ένα ριβόσωμα του βακτηρίου E.coli είναι ένα ριβονουκλεοσωματίδιο με συντελεστή καθίζησης 70S και διίσταται σε μια μεγάλη (L) 50S και μια μικρή υπομονάδα (S) 30S. Oι υπομονάδες, όπως προανεφέρθη αποτελούνται από rrna και πρωτεΐνες οι οποίες για την μεγάλη υπομονάδα συμβολίζονται με το L και για την μικρή με το S. Η μικρή υπομονάδα 30S περιέχει 21 διαφορετικές πρωτεΐνες (S1 έως S21) και ένα μόριο RNA 16S. Η μεγάλη υπομονάδα 50S περιέχει 34 διαφορετικές πρωτεΐνες (L1 έως L34) και δύο μόρια RNA, το 23S και το 5S. Στο προκαρυωτικό ριβόσωμα όλα τα συστατικά, εκτός από τις πρωτεΐνες L7 και L12 (δημιουργούν τετραμερές), βρίσκονται με ένα αντίγραφο. Να τονιστεί πως το πρόθεμα ριβο-στο ριβόσωμα οφείλεται στο ότι το RNA αποτελεί σχεδόν τα δύο τρίτα της μάζας των μεγάλων μοριακών συγκροτημάτων. Τα τρία μόρια RNA 5S, 16S και 23S είναι πολύ σημαντικά για την λειτουργική αρχιτεκτονική των ριβοσωμάτων Τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα είναι μεγαλύτερα από τα προκαρυωτικά. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα τα ριβοσώματα έχουν σταθερά καθίζησης 80S και οι 1

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υπομονάδες τους έχουν σταθερές καθίζησης 60S και 40S. Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από ένα μόριο 18S rrna και 30 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ενώ η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από τρία μόρια rrna, τα 28S rrna, 5S rrna και 5,8S rrna και 40 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Το ευκαρυωτικό ριβόσωμα επομένως περιέχει επιπλέον ένα μόριο rrna και ~ περισσότερες πρωτεΐνες, από ότι το προκαρυωτικό ριβόσωμα. Στα διάφορα στάδια της μετάφρασης του mrna υπάρχουν αρκετοί πρωτεϊνικοί παράγοντες που συμμετέχουν σ αυτή τη διαδικασία συνδεόμενοι παροδικά με το ριβόσωμα. O ριβοσωμικός πυρήνας είναι συντηρημένος σε όλους τους οργανισμούς (Doudna and Rath 2002). Η αλληλουχία των βάσεων ενός δεδομένου τύπου rrna είναι παρόμοια σε στενά συγγενή είδη αλλά αντίθετα μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών υπάρχουν πολύ λίγες ομοιότητες στην αλληλουχία βάσεων του συγκεκριμένου rrna. Το ποσοστό ομοιότητας ενός συγκεκριμένου rrna μεταξύ δύο διαφορετικών ειδών αντανακλά την εξελικτική ιστορία και τη συγγένεια των συγκρινόμενων αυτών οργανισμών. Το 5S rrna είναι το πλέον εξελικτικά σταθερό από όλα τα είδη rrna. Τα ριβοσώματα των ευκαρυωτικών κυττάρων χωρίζονται σε δυο τύπους ριβοσωμάτων στα ελεύθερα και στα συνδεδεμένα ριβοσώματα, δεν έχουν δομικές διαφορές, εναλλάσσονται μεταξύ τους και οι ριβοσωμικές υπομονάδες τους «αποθηκεύονται» στο κυτταρόπλασμα μέχρις ότου ξαναχρησιμοποιηθούν σ ένα νέο κύκλο πρωτεϊνικής σύνθεσης. Τα ριβοσώματα που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα δεν είναι τυχαία διασκορπισμένα, αλλά σχηματίζουν ομάδες από δέκα ή περισσότερα ριβοσώματα, τα πολυσώματα (εντοπίζονται στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο) που συνδέονται και μεταφράζουν ένα μόριο mrna. Τα ριβοσώματα της κατηγορίας αυτής, παράγουν κυρίως πρωτεΐνες που προορίζονται για έκκριση (εξωκύττωση), για τα λυσοσωμάτια και για τη μεμβράνη του πλάσματος. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς τα ριβοσώματα είναι ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα. Αύξηση του αριθμού των ριβοσωμάτων, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευρυκαρυωτικά κύτταρα, παρατηρείται κατά την ωογένεση, την ανάπτυξη και γενικώς όταν υπάρχουν αυξημένες κυτταρικές ανάγκες για τη σύνθεση μεγαλύτερου αριθμού πρωτεϊνών. Ο μικρότερος αριθμός ριβοσωμάτων παρατηρείται στα σπερματοκύτταρα, ενώ ο μεγαλύτερος στα εμβρυακά κύτταρα, καθώς και στα κύτταρα που παράγουν πρωτεΐνες που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον (Taylor, Morris et al. 1998). H δομή του ριβοσώματος με την βοήθεια κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχει απεικονιστεί σε βακτήρια και αρχαιοβακτήρια (Rheinberger et al., 2004). Η δομή του ευκαρυωτικού ριβοσώματος είναι πολύπλοκή σε σύγκριση με το προκαρυωτικό ριβόσωμα. Στο σχήμα Α.1 συγκρίνεται η δομή προκαρυωτικού (Thermus 2

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ thermophilus) και κατώτερου ευκαρυωτικού ριβοσώματος (S. cerevisiae) (Dinman 2009). Σχήμα A.1 Σύγκριση ριβοσωμάτων από ζύμη και Thermus thermophilus. (Dinman et al., 2009) Κρυσταλλική δομή του ριβοσώματος της S.cerevisiae με ευκρίνεια 11.7 A (Protein Data Bank codes 1s1h and 1s1i) και του ριβοσώματος του T. thermophilus με ευκρίνεια 5.90 Α(Protein Data Bank codes 2b64 and 2b66). SSU, small subunit; LSU, large subunit Κάθε ριβοσωμική υπομονάδα έχει μια χαρακτηριστική μορφολογία. Η μικρή υπομονάδα αποτελείται από μία κεφαλή (head), ένα σώμα (body) και μια πλατφόρμα (platform), ενώ η μεγάλη υπομονάδα έχει τρία εξογκώματα στην ανώτερη περιοχή, με πιο χαρακτηριστικό το κεντρικό εξόγκωμα (Wolfe, 1993). Η θέση αποκωδικοποίησης, δηλαδή η περιοχή αναγνώρισης των κωδικονίων του mrna από τα αντικωδικόνια του trna, βρίσκεται στη μικρή υπομονάδα στη βάση της ρωγμής που χωρίζει την κεφαλή από την πλατφόρμα. Στην μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα εντοπίζεται το κανάλι που εκτείνεται από την ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης στην οποία βρίσκονται οι θέσεις Α και P, μέχρι το σημείο εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Brandt et al., 2009) 3

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.2 Δομική σύγκριση συγκεκριμένων περιοχών στο 80S ριβόσωμα και στην μικρή υπομονάδα 40S της ζύμης με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (διακριτικότητα 19 Α). (Gilbert et al., 2007) Α. Δομική σύγκριση των περιοχών κεφαλής (head), πλατφόρμας (platform) και σώματος (body) της μικρής υπομονάδας και του 80S ριβοσώματος. Η προφανής παρατηρούμενη διαφορά είναι μια όρθωση της κεφαλής ~10 A της μικρής υπομονάδας σε σχέση με την αντίστοιχη περιοχή του ριβοσώματος εξαιτίας της έλλειψης μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων. Β. Η ισχυρότερη αλληλεπίδραση που παρατηρείται στο ριβόσωμα είναι η περιοχή μεταξύ της κεφαλής και της περιοχής σύνδεσης πλατφόρμας/σώματος και των ελίκωνh1-2/h28 του rrna. Επίσης, εντοπίζεται ένας μη ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ των ελίκων h18/h34 του rrna, καθώς επίσης και ένας ασθενής δεσμός μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών rps5 και rps14 οι οποίες εντοπίζονται στο κανάλι εξόδου του mrna. Η μετάφραση και στους προκαρυωτικούς και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι μια ενορχηστρωμένη δυναμική διαδικασία που «υπηρετείται» από ριβοσώματα, mrna, trnas καθώς επίσης και από παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού. Η έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης αρχίζει με την ενσωμάτωση των παραγόντων έναρξης eif-2, eif-3, trna Met και GTP στην 40S υπομονάδα με αποτέλεσμα την δημιουργία συμπλόκου 43S. Στην συνέχεια ο παράγοντας eif-4e στρατολογεί στο συγκροτημένο σωματίδιο 43S το mrna στόχο με συνέπεια την δημιουργία 48S συμπλόκου. Τέλος η 60S υπομονάδα 4

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνδέεται με το 48S σύμπλοκο για τον τελικό σχηματισμό του 80S συμπλόκου (Scheper, van der Knaap et al. 2007). A.1.2 Γενικά για την βιογένεση ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων Η βιογένεση των ριβοσωμάτων είναι το αποτέλεσμα της συγχρονισμένης συγκέντρωσης αρκετών μοριακών προϊόντων στον πυρηνίσκο. Τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα 18S, 28S και 5,8S rrna βρίσκονται στον «οργανωτή» του πυρηνίσκου, τα γονίδια για το 5S rrna βρίσκονται σε άλλες περιοχές του γενώματος και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παράγονται στο κυτταρόπλασμα. Το 5S rrna και οι πρωτεΐνες μεταφέρονται στον πυρηνίσκο όπου τελικά σχηματίζονται οι ενεργές ριβοσωμικές υπομονάδες. Οι πολύπλοκοι μηχανισμοί που λαμβάνουν χώρα στη βιογένεση των ριβοσωμάτων αποτελούν ένα θαυμάσιο παράδειγμα κυτταρικής ρύθμισης και αλληλοσυσχέτισης του μοριακού και κυτταρικού επιπέδου. H όλη πολύπλοκη διαδικασία αρχίζει στον πυρηνίσκο και ολοκληρώνεται στο κυτταρόπλασμα. Ο πυρηνίσκος αποτελεί μια «δυναμική δομή» του πυρήνα χωρίς μεμβράνη, και συγκροτείται γύρω από δέσμες διαδοχικά επαναλαμβανόμενων ριβοσωμικών γονιδίων, (rdna γονιδίων), τα οποία μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση Ι. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται οργανωτές πυρηνίσκου, (Nucleolar Organiser Regions, NOR), και αποτελούν τη βάση της δομικής οργάνωσης του πυρηνίσκου, προκειμένου να στρατολογηθούν όλα τα απαραίτητα συστατικά επεξεργασίας και συγκρότησης, που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των ριβοσωμάτων. Ο πυρηνίσκος, μορφολογικά χωρίζεται σε τρεις διακριτές περιοχές (Dundr and Misteli 2001, Olson 2000, Scheer and Campos-Ortega 1999). Στο σχήμα Α.3. απεικονίζονται οι τρεις περιοχές του πυρηνίσκου. Το ινώδες κέντρο, (Fibrillar Center, FC), το οποίο αποτελεί μια περιοχή ή σωματίδια, που έπειτα από χρώση με βαρέα μέταλλα, βάφονται ασθενώς. Το πυκνό ινώδες συστατικό, (Dense Fibrillar Component, DFC), το οποίο περιβάλλει μερικώς ή ολικώς το ινώδες κέντρο και βάφεται εντονότερα με συγκεκριμένες χρωστικές. Το κοκκιώδες συστατικό, (Granular Component, GC), που αποτελεί το εξωτερικό τμήμα του πυρηνίσκου και περιέχει κοκκία, στο μέγεθος των ριβοσωμάτων. 5

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.3 Πυρηνίσκοι από κύτταρα HeLa (Andersen et al., 2002). Είναι ευδιάκριτες οι τρεις περιοχές του πυρηνίσκου. Αρχικά πειράματα ανασυγκρότησης προκαρυωτικών ριβοσωμάτων in vitro, έδειξαν ότι όλες οι απαραίτητες πληροφορίες περιέχονταν στα rrnas και στις πρωτεΐνες. Όσον αφορά όμως τη βιογένεση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, η κατάσταση είναι τελείως διαφορετική. Πρόκειται για μια διαδικασία εξαιρετικά πολύπλοκη και ρυθμισμένη, η οποία πραγματοποιείται κάτω από στενά όρια χώρου και χρόνου, παρουσία πληθώρας μη ριβοσωμικών παραγόντων (Tschochner and Hurt 2003). Η συγκρότηση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχει μελετηθεί κυρίως στη ζύμη S. cerevisae, όπου έχει απομονωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρόδρομων ριβοσωμάτων και έχουν ταυτοποιηθεί τα συστατικά τους. Διάφορα πειράματα έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση ενός πρόδρομου ριβοσωμικού σωματιδίου του 90S στην ζύμη και στην ύπαρξη δύο πρόδρομων μορίων υπομονάδων (66S και 43S) πρόδρομες μορφές των 60S και 40S υπομονάδων, αντίστοιχα (Fatica and Tollervey 2002). Στην όλη αυτή διαδικασία απαιτείται η ύπαρξη μιας πληθώρας μη ριβοσωμικών παραγόντων, οι οποίοι δρουν σε διάφορα στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων (Venema and Tollervey 1999). Όπως προαναφέρθηκε, στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα υπάρχουν τέσσερα είδη ριβοσωμικού RNA, το 5S, 5.8S, 25/28S στην 60S υπομονάδα, και το 18S, στην 40S μικρή υπομονάδα. Κατά την διάρκεια της διαδικασίας βιογένεσης ένα πολυκιστρονικό πρόδομο ριβοσωμικό RNA, pre-rna (35S στην περίπτωση της ζύμης) μεταγράφεται στο ώριμο 18S που αποτελεί συστατικό της μικρής υπομονάδας και στο 5.8S και 25/28S που αποτελούν συστατικά της μεγάλης υπομονάδας. Κατά 6

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την ωρίμανση του rrna λαμβάνουν χώρα διάφορες χημικές τροποποιήσεις και αλληλεπιδράσεις με μικρά πυρηνικά μόρια RNAs, snornas. Α Επεξεργασία του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna Η ωρίμανση του pre-rrna είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την «συναρμολόγηση» των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στο ριβόσωμα. Αυτή η διαδικασία απαιτεί μια πληθώρα cis-δραστικών παραγόντων (Allmang and Tollervey 1998)) καθώς επίσης και έναν μεγάλο αριθμό μη ριβοσωμικών πρωτεϊνών trans- δραστικών στοιχείων (Lafontaine and Tollervey 1995). Στην S. cerevisae στην 60S υπομονάδα εντοπίζονται 46 ριβοσωμικές πρωτεΐνες και στην μικρή υπομονάδα 40S 32 πρωτεΐνες. Και τα τέσσερα rrnas κωδικοποιούνται από μια μονάδα ριβοσωμικού DNA, (rdna), μοριακού μεγέθους 9.1 kb, η οποία επαναλαμβάνεται φορές, και βρίσκεται στο χρωμόσωμα XII (Kressler et al., 1999), σχήμα Α.4. Σχήμα Α.4 Δομή της επαναλαμβανόμενης rdna μονάδας στο ζυμομύκητα. (Kressler D. et al., 1999) Η επεξεργασία στην οποία υπόκειται το πρόδρομο 35 S pre-rrna είναι στενά συσχετισμένη με πολλές ριβοσωμικές πρωτεΐνες στον πυρηνίσκο όπως φαίνεται στο σχήμα Α.5. Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία τα πρόδρομα ριβοσώματα, στον πυρηνίσκο, αλληλεπιδρούν όπως αναφέρθηκε με πολλές μη ριβοσωμικές πρωτεΐνες που είναι γνωστοί ως trans - δραστικοί παράγοντες και συμμετέχουν στη συγκρότηση των επιμέρους μορφωμάτων του pre-rrna με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Περισσότεροι από εξήντα trans δραστικοί ριβοσωμικοί παράγοντες έχουν 7

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ταυτοποιηθεί οι οποίοι είτε αλληλεπιδρούν με snornas είτε με άλλες πρωτεΐνες στα διάφορα στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων. Το 35S ανιχνεύσιμο ενδιάμεσο προϊόν (στη ζύμη), όπως φαίνεται στο σχήμα Α.4 περιλαμβάνει 5' και 3' εξωτερικά μεταγραφόμενες περιοχές, (External Transcribed Spacers, 5 ETS και 3 ΕTS), τα ώριμα ριβοσωμικά RNAs, 18S, 5.8S και 25S rrna, καθώς και τουλάχιστον δυο εσωτερικά κωδικοποιούμενες περιοχές, (Internal Transcribed Spacers, ITS1 και ITS2). H ωρίμανση του πρόδρομου 35S περιέχει 10 περίπου περιοχές επεξεργασίας και είναι ένα πολύπλοκο μονοπάτι στο οποίο συμμετέχουν διάφοροι trans παράγοντες (Kempers-Veenstra, et al., 1986). Το 35S πρόδρομο rrna της ζύμης είναι μία από τις βραχύτερες πρόδρομες μορφές, ενώ το 45S του ανθρώπου, μία από τις μεγαλύτερες και μόνο κύρια τμήματα της δομής είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς. (Nazar 2004). Συνοπτικά το 35S πρόδρομο rrna διασπάται στο 5' ETS στο σημείο Α 0, και προκύπτει το 33S πρόδρομο rrna, στο σημείο Α 1 (5' άκρο του ώριμου 18S) και προκύπτει, το 32S πρόδρομο rrna και στο σημείο Α 2 στο ITS1, και προκύπτει τα 20 και 27SΑ 2 πρόδρομα rrnas. Η μετέπειτα επεξεργασία του 20S πρόδρομου rrna λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα, όπου μετά από διάσπαση στο σημείο D, προκύπτει το ώριμο πλέον 18S rrna. Η επεξεργασία του 27SA 2 συνεχίζεται στον πυρήνα, όπου τελικά προκύπτουν τα ώριμα 5.8 και 25S rrnas από δυο διαφορετικά μονοπάτια. Έτσι, το 85% του 27SA 2 διασπάται στο σημείο Α 3, στο ITS1, ενώ το 15% διασπάται απευθείας στο σημείο Β 1L (Fromont-Racine, et al., 2003) σχήμα Α.4. Προκειμένου να είναι αποτελεσματική η διαδικασία βιογένεσης των ριβοσωμάτων, είναι απαραίτητη η συμμετοχή μη ριβοσωμικών παραγόντων, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την επεξεργασία και τροποποίηση των rrnas, αναδίπλωση και συγκρότηση των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα η ισομερείωση των ουριδινών σε ψευδοουριδίνες, (Ψs), καθώς και η μεθυλίωση των 2 -ΟΗ των ριβοζών, αποτελούν τις κυρίαρχες τροποποιήσεις νουκλεοτιδίων των rrnas. Οι χημικές τροποποιήσεις που γίνονται στα rrna είναι σχετικά περιορισμένες και περιλαμβάνουν κυρίως μεθυλίωση των δομικών του συστατικών. Οι τροποποιήσεις αυτές είναι πιθανόν να προστατεύουν τμήματα του rrna από τη δράση νουκλεασών ή μπορεί να αποτελούν ειδικά σήματα επεξεργασίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Οι μη ριβοσωμικοί παράγοντες (trans δραστικοί παράγοντες ) μπορεί να ταξινομηθούν σε διάφορες κατηγορίες. Μια κατηγορία περιλαμβάνει παράγοντες που αλληλεπιδρούν με μικρά πυρηνικά μόρια snornas σχηματίζοντας ριβονουκλεοπρωτεϊνικά πυρηνικά σωματίδια snornps. Στη ζύμη, έχουν βρεθεί πάνω από 100 διαφορετικά snornas που χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: σε αυτά που 8

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανήκουν στο C/D κιβώτιο, στο Η/ACA κιβώτιο και στο RNA της MRP RNAάσης, το οποίο αποτελεί ειδική κατηγορία (Kressler D. et al, 1999). Οι παράγοντες αυτοί μπορεί να είναι επίσης ένζυμα τροποποίησης του rrna, είτε να δρουν σαν ενδονουκλεάσες ή εξωνουκλεάσες είτε ως RNA ελικάσες (Linder and Tuite 1999). Όσον αφορά τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, αυτές, αφού συντεθούν στο κυτταρόπλασμα από τα ριβοσώματα, στη συνέχεια κατευθύνονται στον πυρήνα και συγκεκριμένα στον πυρηνίσκο, προκειμένου να στρατολογηθούν στη δημιουργία του πρόδρομου ριβοσωμικού σωματιδίου. Κάποιες συγκροτούνται με τα πρόδρομα rrnas αμέσως μετά την είσοδό τους στον πυρηνίσκο όπως φαίνεται στο σχήμα Α.5, ενώ άλλες, σε επόμενα στάδια, συμπεριλαμβανομένων μερικών, οι οποίες, τουλάχιστον στο S. cerevisiae, προστίθενται αργότερα στο κυτταρόπλασμα. 9

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.5 Το μονοπάτι βιογένεσης ριβοσωμάτων στην S. cerevisiae, (Kressler D. et al., 1999). 10

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α Παράγοντες που συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος Ο χαρακτηρισμός διαφορετικών προ-ριβοσωμικών σωματιδίων έδειξε πως η σύσταση των αρχικών 90S συμπλόκων, διαφέρει σημαντικά από αυτή των 60 και 40S σωματιδίων. Ένα πολύ σημαντικό εύρημα (Grandi, Rybin et al. 2002), είναι ότι από το 90S προ-ριβόσωμα απουσιάζουν οι περισσότεροι παράγοντες που απαιτούνται για τη σύνθεση του 60S, όχι όμως και για τη σύνθεση του 40S. Μόνο ένας μικρός αριθμός πρωτεϊνών έχει βρεθεί να παίζει ρόλο, τόσο στα αρχικά, όσο και στα τελικά στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων. Μια πρωτεΐνη στην οποία έχει αποδοθεί ο ρόλος της γέφυρας μεταξύ του 90S και 40S, είναι η Enp1p. Το σύμπλοκο που προέκυψε έπειτα από καθαρισμό αγχιστείας με την Enp1p, περιέχει όχι μόνο το 35S pre-rrna, αλλά και το διμεθυλιωμένο 20S prerrna. Διάφορες ριβοσωμικές πρωτεΐνες φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν με το πρόδρομο pre-rrna (early associating r-proteins). Η πρωτεΐνη Rio2 ανήκει στην οικογένεια κινασών σερίνης-θρεονίνης (Angermayr and Bandlow 2002), θεωρείται μάρτυρας της κυτταροπλασματικής εντόπισης του 40S σωματιδίου των τελευταίων σταδίων και φαίνεται ότι δεσμεύεται στο 40S, μετά από τις διασπάσεις στα σημεία Α 0 -Α 2, ενώ δεν έχει βρεθεί στο 90S πρόδρομο σωματίδιο (Schafer, et al. 2003). Ένας άλλος χαρακτηριστικός παράγοντας που φαίνεται να συσχετίζεται με την συγκρότηση της 40S υπομονάδας είναι η Rrp7p. Απάλειψη της πρωτεΐνης Rrp7p παρεμποδίζει την διάσπαση στις θέσεις Αο και Α2 του 35 S pre-rrna με αποτέλεσμα ελάττωση της σύνθεσης του 18 S rrna και μειωμένη παραγωγή της 40S υπομονάδας (Baudin-Baillieu, Tollervey et al. 1997). Μια άλλη πρωτεΐνη, με παρόμοια κυτταρική εντόπιση με τη Rio2 πρωτεΐνη, είναι η Nob1, η οποία μπορεί επίσης να θεωρηθεί μάρτυρας της κυτταροπλασματικής εντόπισης του 40S, αν και ο ρόλος της στο σωματίδιο αυτό δεν είναι ακόμη γνωστός (Tschochner and Hurt 2003). Η πρωτεΐνη Hrr25, εντοπίζεται διάχυτη στον πυρήνα, (πυρηνίσκοςπυρηνόπλασμα), αλλά και σε σχετικά υψηλό ποσοστό και στο κυτταρόπλασμα. H συγκεκριμένη αυτή πρωτεΐνη συμμετέχει στην ωρίμανση του πρόδρομου ριβοσωμικού 40S και παρουσιάζει μεγάλη κινητικότητα στο πυρηνόπλασμα. Παρουσιάζει δράση κινάσης, ενώ έχει αναφερθεί και πρόσθετος ρόλος της στην ενεργοποίηση της μετάφρασης σε απόκριση βλάβης του DNA. Η πρωτεΐνη αυτή, μαζί με την Tsr1, εντοπίζεται σε σύμπλοκα 40S ενδιάμεσων σταδίων. Η Tsr1, φαίνεται να 11

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σχετίζεται με την GTPάση Bms1 και είναι απαραίτητη για την επεξεργασία του 20S (Gelperin, et al. 2001). Ακολουθώντας την ωρίμανση των rrnas, τα 60S pre-ριβοσώματα, μετακινούμενα από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασμα υπόκεινται σε κυτταρικές διεργασίες και εμφανίζουν μεγάλες αλλαγές στην πρωτεϊνική σύσταση. Οι πρωτεΐνες Nog1, Nog2, Nug1 και Nug2 είναι πιθανές GTPάσες, και φαίνεται ότι εμπλέκονται στην επεξεργασία του 27SB και 7S pre-rrna, αφού βρέθηκαν να συνδέονται τόσο με 27SB και 7S pre-rrna, όσο και με 25S pre-rrna. Οι πρωτεΐνες αυτές, εντοπίζονται στον πυρηνίσκο, αλλά συνοδεύουν το 60S και στο πυρηνόπλασμα, μέχρι τους πυρηνικούς πόρους. Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση και την ενδοπυρηνική μετακίνηση των pre-ριβοσωμάτων, είναι τα Noc1p- Noc2p και Νοc2p-Noc3p (Milkereit, et al. 2001). Το πρωτεϊνικό σύμπλοκο Noc1p-Noc2p συσχετίζεται με τα 90S και 66S πρόδρομα ριβοσώματα και είναι εντοπισμένο κυρίως στον πυρήνα, ενώ το σύμπλοκο Noc2p-Noc3p συσχετίζεται μόνο με το πρόδρομο ριβόσωμα 66S και εντοπίζεται στο πυρηνόπλασμα (Fatica and Tollervey 2002). Απάλειψη των πρωτεϊνών Nop4p και Nop8p καθώς και των RNA ελικασών Dbp6p και Dbp9p, που δρουν στα πολύ αρχικά στάδια συγκρότησης της 60S υπομονάδας, οδηγεί σε μείωση των επιπέδων του 27S pre-rna (Berge`s et al., 1994, Daugeron et al., 1999, Kressler et al., 1998, Sun and Woolford, 1994, Zanchin and Goldfarb, 1999). Σε αντίθεση, απάλειψη των RNA ελικασών Spb4p και Dbp10p οδηγεί σε συσσώρευση του 27 S pre-rrna στα 66 S πρόδρομα ριβοσώματα. Η παραδοχή αυτή συνηγορεί στην εμπλοκή συγκεκριμένων RNA ελικασών σε «μετέπειτα» (late) στάδια συγκρότησης (de la Cruz, et al., 1998). Η Nip7p φαίνεται ότι είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη. Ενώ υπάρχουν ενδείξεις αναφορικά με την δράση της στον πυρήνα και κυρίως στον πυρηνίσκο, φαίνεται ότι ο εντοπισμός της στο κυτταρόπλασμα συσχετίζεται με την ελεύθερη ριβοσωμική υπομονάδα 60S. Η Ras1p φαίνεται να εμπλέκεται σε «μετέπειτα» στάδια (late) της πρόδρομης 60S υπομονάδας και απαιτείται για την στρατολόγηση του συμπλόκου Rpl10p/Qsr1p. Η παρουσία του συμπλόκου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rpl10p με την πρωτεΐνη Qsr1p στην 60S υπομονάδα είναι απαραίτητη διότι αποτελεί σημείο σύνδεσης της 40S με την 60S υπομονάδα (Eisinger, et al. 1997). Μία άλλη πρωτεΐνη, η Nmd3 που εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα όσο και στο κυτταρόπλασμα και συνδέεται με τη μεγάλη υπομονάδα, μέσω του συμπλόκου Rpl10p/Qsr1p, (Karl, et al., 1999), φαίνεται να είναι η κύρια πρωτεΐνη, η οποία παρέχει το σήμα για την έξοδο της 60S στο κυτταρόπλασμα. Αναφορικά με την σταθερότητα ή την αλληλεπίδραση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων έχει αναφερθεί στην βιβιογραφία ότι η 12

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Sqt1p αλληλεπιδρά ισχυρά με το σύμπλοκο σύνδεσης των δύο υπομονάδων η δε σταθερότητα της 60S υπομονάδας εξαρτάται από την παρουσία της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rp15p η οποία αλληλεπιδρά με το 5S rrna στα πρώιμα στάδια της συγκρότησης-βιογένεσης 60S υπομονάδας, (Deshmukh et al., 1993). Μια άλλη εξίσου σημαντική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στα στάδια βιογένεσης της 60S υπομονάδας στην S. cerevisiae είναι η Nop53p (Yp1146p), (Sydorskyy, et al. 2005). H Νοp53p εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και μεταλλάξεις ή απαλοιφή του γονιδίου της οδηγούν σε μειωμένη δημιουργία 60S υπομονάδων καθώς και διατάραξη του ρυθμού ισορροπίας 60S:40S. Συνοψίζοντας, η πολυπλοκότητα της βιογένεσης των ριβοσωμάτων είναι εμφανής και απαιτείται ακόμη πολλή προσπάθεια προκειμένου να γίνουν κατανοητά και άλλες κυτταρικές διεργασίες. Με την ανάπτυξη νέων και ευαίσθητων τεχνικών, όπως είναι η μέθοδος TAP, η φασματομετρία μάζας, τεχνικές υβριδισμού, είναι πολύ πιθανόν να διαλευκανθούν οι πολύπλοκες δυναμικές της διαδικασίας ωρίμανσης, καθώς και να συσχετιστούν με άλλες βασικές κυτταρικές λειτουργίες (Fromont and Racine et al., 2003, Nazar 2004). A Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα Όλα τα μακρομόρια μεταφέρονται μέσω του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου (ΝPC, Nuclear Pore Complex) που συγκροτείται από τις νουκλεοπορίνες, (nucleoporins ή Νups) και εντοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο. Στην S.cerevisaea μόνο μια ριβοσωμική υπομονάδα μπορεί να περάσει μέσα από τον πυρηνικό πόρο την ίδια χρονική στιγμή λόγω του μεγέθους (ο πυρηνικός πόρος έχει μέγεθος 40 MDa Davis, et al, 1995). Η μακρομοριακή μεταφορά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα συνήθως είναι ενεργητική. Στο σχήμα A.6 δίδεται η «δομή» του πυρηνικού συμπλέγματος NPC. Πολύ συχνά η μεταφορά υποβοηθείται από πρωτεΐνες τις καρυοφερίνες (carrier proteins) οι οποίες αλληλεπιδρούν τόσο με το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου όσο και με άλλους ρυθμιστές (Rout et al., 2000). Πολλές νουκλεοπορίνες καθώς και άλλες πρωτεΐνες συστατικά του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου - περιέχουν αρνητικά φορτισμένες και μη διαμορφωμένες περιοχές (unstructured regions) με υδρόφοβες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες FG με τις οποίες αλληλεπιδρούν με τις καρυοφερίνες (Tran and Wente 2006). Μια από τις πιο γνωστές καρυοφερίνες είναι η importin β Crm1 που 13

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αναγνωρίζει μια πρωτεϊνική αλληλουχία πλούσια σε λευκίνη, ένα πυρηνικό σήμα εξόδου (NES, Nuclear Export Signal). Ο ακριβής μηχανισμός μεταφοράς διαμέσου του πυρηνικού πόρου δεν είναι πλήρως γνωστός. Το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου συγκροτείται από μη οργανωμένες περιοχές των νουκλεοπορινών δημιουργώντας ένα δίκτυο με ασθενείς υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επαναλαμβανόμενων FG (Ribbeck and Gorlich 2002). Σχήμα Α.6 Δομή του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου (NPC), Rout και Aitchison, (2001) Το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου παρουσιάζει χαρακτηριστική οκταγωνική συμμετρία και οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε αυτή την περιοχή ονομάζονται νουκλεοπορίνες. Αποτελείται από δύο ομόκεντρους δακτυλίους, έναν στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (προς το κυτταρόπλασμα) και τον άλλον στην εσωτερική μεμβράνη (προς το πυρηνόπλασμα). Στην κυτταροπλασματική πλευρά του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου προεκβάλλουν οχτώ παχέα ινίδια τα οποία προορίζονται για την σύνδεση υλικών που προορίζονται για την μεταφορά στον πυρήνα. Ο δακτύλιος που βρίσκεται στην πυρηνική πλευρά είναι πιο λεπτός και από αυτόν προεκβάλλουν οχτώ λεπτά ινίδια τα οποία ενώνονται με έναν τελικό δακτύλιο, σχηματίζοντας έτσι μια δομή που μοιάζει με καλάθι. Ανάμεσα στους δύο αυτούς δακτυλίους βρίσκεται ένας τρίτος δακτύλιος που αποτελείται από οχτώ ακτινωτά διατεταγμένους κυλίνδρους οι οποίοι σχηματίζουν τον κεντρικό δίαυλο του πυρηνικού πόρου. Έτσι, η συγκρότηση αυτή του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου δημιουργεί ένα μεγάλο κεντρικό κανάλι, μέσω του οποίου γίνεται η «διαμεσολαβούμενη» πυρηνοπλασματική μεταφορά και οχτώ μικρότερα περιφερειακά κανάλια μέσω των οποίων γίνεται, πιθανότατα, η παθητική μεταφορά μορίων. Στα μονοπάτια μεταφοράς των ριβοσωμικών υπομονάδων προς το κυτταρόπλασμα εμπλέκονται διάφορες πρωτεΐνες προκειμένου να διευκολυνθεί η 14

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ έξοδος τους από τον πυρήνα, η δε pre-40s ριβοσωμική υπομονάδα απελευθερώνεται ταχύτατα διαμέσου του πυρηνικού πόρου στο κυτταρόπλασμα (Leger-Silvestre, Milkereit et al. 2004). Οι πρωτεΐνες Enp1p/Rio2 δεν είναι απαραίτητες μόνο στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων αλλά φαίνεται ότι εμπλέκονται και στην μεταφορά της 40S από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα αλληλεπιδρώντας με μια GTP-binding πρωτεΐνη, την Tsr1p, (Thorsten et al, 2003). Επιπρόσθετα έχει δειχθεί πως για την έξοδό της η 40S υπομονάδα υπόκειται σε διάφορες κυτταροπλασματικές διεργασίες στο 3 άκρο του 18 S rrna (Gleizes, Noaillac-Depeyre et al. 2001). Επίσης η GTPase Ran καθώς και οι νουκλεοπρωτεΐνες των πυρηνικών πόρων φαίνεται ότι συμμετέχουν στην έξοδο της 40S στο κυτταρόπλασμα (Moy and Silver 1999). Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία απάλειψη της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rps15p έχει ως αποτέλεσμα την συσσώρευση των pre-ριβοσωμικών 40S υπομονάδων στον πυρήνα, συνηγορώντας για την εμπλοκή της Rps15p στην έξοδο της υπομονάδας από τον πυρήνα, (Leger-Silvestre, Milkereit et al. 2004) πολύ πιθανόν μέσω της ύπαρξης ενός σήματος εξόδου από τον πυρήνα αλλά και θέσεων αλληλεπίδρασης με την καρυοφερίνη Crm1p. Να τονιστεί πως η Crm1/Xpo1 είναι μια κύρια καρυοφερίνη- importin και μεταφέρει κυρίως πρωτεΐνες πλούσιες σε λευκίνες που περιέχουν πυρηνικό σήμα εξόδου (NES, Nuclear Export Signal). Εντούτοις βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν πως αυτές οι καρυοφερίνες μπορούν να μεταφέρουν και πρωτεΐνες από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα χωρίς να διαθέτουν οπωσδήποτε κάποιο σήμα εξόδου (Fornerod, et al. 1997). Βιοχημικά πειράματα και πειράματα ανοσοφθορισμού έχουν δείξει πως υπάρχει ένας «λειτουργικός συσχετισμός» της πυρηνικής μυοσίνης Ι (NMI) και της ακτίνης με την μικρή υπομονάδα. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη rps6 συμπλέκεται με άλλες πρωτεΐνες και rrna και μεταφέρεται διαμέσου του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου. Παρεμπόδιση της πυρηνικής μυοσίνης και της ακτίνης σε HeLa κύτταρα οδηγεί στη συσσώρευση της rps6 στο πυρηνόπλασμα. Οι παλινδρομικές κινήσεις της πυρηνικής μυοσίνης και ακτίνης έχουν ως αποτέλεσμα την διευκόλυνση της εξόδου του ~10% της 40S υπομονάδων (Cisterna, et al. 2006). Σύμφωνα με πρόσφατες εργασίες για την έξοδο της 60S υπομονάδας απαιτούνται τρεις υποδοχείς εξόδου: η πρωτεΐνη Crm1 η οποία προσδένεται στην 60S μέσω της πρωτεΐνης Nmd3p (Gadal, et al. 2001), τo ετεροδιμερές Mex67/Mtr2 (Yao et al., 2007) και ένας μη κανονικός (noncanonical) υποδοχέας που προσδένεται απευθείας στην υπομονάδα και τις νουκλεοπορίνες (Hedges, et al. 2006). Ο πλήρης μηχανισμός μεταφοράς της 60S υπομονάδας δεν έχει αποσαφηνιστεί και διάφορες υποθέσεις έχουν διατυπωθεί. 15

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για παράδειγμα ένας πρωτεϊνικός υποδοχέας Nmd3 ο οποίος εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα, όσο και στο κυτταρόπλασμα, φαίνεται να παρέχει το σήμα για την έξοδο της μεγάλης υπομονάδας, 60S, στο κυτταρόπλασμα. Στην πρωτεΐνη αυτή, Nmd3, βρέθηκε μια ακολουθία λίγων αμινοξέων, NES, (Nuclear Export Signal), η οποία είναι πλούσια σε λευκίνη. Συγκεκριμένα όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.7 η Nmd3 συνδέεται στην πρόδρομη ριβοσωμική υπομονάδα 60S στο πυρηνόπλασμα. Στη συνέχεια ο υποδοχέας εξόδου, Xpo1/Crm1, αναγνωρίζει το σήμα NES της Nmd3, και οδηγεί τελικά το όλο σύμπλοκο στο κυτταρόπλασμα. Στο κυτταρόπλασμα συνδέεται με τη μεγάλη υπομονάδα, η ριβοσωμική πρωτεΐνη RpL10 καθώς ενσωματώνεται και μια άλλη κυτταροπλασματική GTPase, η Lsg1p,με κάποιο άγνωστο μηχανισμό. Με την υδρόλυση του GTP προκαλούνται αλλαγές στην διαμόρφωση της 60S υπομονάδας με συνέπεια την απελευθέρωση της Nmd3 και την μετακίνηση της στον πυρήνα (Hedges et al., 2006). Σχήμα Α.7 Πιθανό μοντέλο μεταφοράς της 60S υπομονάδας από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. (Hedges et al., 2006) Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα (Kain-Yin Lo and Arlen W. Johnson, 2009) έχουν αποκαλύψει, πως η έξοδος της μεγάλης υπομονάδας δεν στηρίζεται στην ύπαρξη εξειδικευμένων υποδοχέων, αλλά στην παρουσία ενός ισχυρού σήματος εξόδου πλούσιο σε λευκίνες, ανάλογο της Nmd3. Για παράδειγμα η προσθήκη ενός τέτοιου σήματος στη ριβοσωμική πρωτεΐνη RpL3 βοηθά την έξοδο της 60S υπομονάδας στο κυτταρόπλασμα. Λαμβάνοντας όλα τα παραπάνω, η έξοδος των ριβοσωμικών υπομονάδων διαμέσου του πυρηνικού πόρου ακολουθεί ένα "ευέλικτο" κυτταρικό μονοπάτι στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, που πιθανόν 16

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιλαμβάνει όχι μόνο την πρωτεΐνη Nmd3 με ισχυρό σήμα εξόδου NES αλλά μια πληθώρα ριβοσωμικών και μη ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Α.2 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες A.2.1 Χαρακτηριστικά των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.1, τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα αποτελούνται από 4 rrnas, (5S, 5.8S, 18S και 25/28S) και περισσότερες από 70 ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Ribosomal Proteins RPs) οι οποίες κατανέμονται στις δυο υπομονάδες του ριβοσώματος. Έτσι, στον επίμυ στη μικρή υπομονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 33 πρωτεΐνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα S, (Small), και έναν αριθμό, ενώ στη μεγάλη υπομονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 49 πρωτεΐνες οι οποίες χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα L, (Large), και έναν αριθμό. Η πλήρης αμινοξική ακολουθία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών του επίμυ είναι γνωστή για τις 75 από αυτές (Wool, 1995). Το ώριμο 5S rrna αποτελείται περίπου από 120 νουκλεοτίδια και μεταγράφεται ξεχωριστά από τα άλλα rrnas. Το γονίδιο του 5S rrna είναι ξεχωριστό από τα γονίδια των άλλων rrna και είναι πολύ συντηρημένο σε όλους τους οργανισμούς, στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες. Η μεταγραφή του 5 S rrna γίνεται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ έξω από τον πυρηνίσκο σε αντίθεση με τα άλλα rrna που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση Ι μέσα στον πυρηνίσκο. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από mrnas τα οποία συνθέτονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ, στον πυρήνα και στη συνέχεια, τα mrnas, μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η μετάφραση και η σύνθεση των πρωτεϊνών. Ακολούθως, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους, οδηγούνται στον πυρήνα και τελικά στον πυρηνίσκο, όπου συνδέονται με τα νεοσυντιθέμενα rrnas, προκειμένου να λάβει χώρα η συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων (Warner, 2001). Αναφορικά με την έξοδο των ημι-συγκροτημένων υπομονάδων (λείπουν μόνον ελάχιστες πρωτεΐνες) από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα υπάρχουν αρκετά ερωτηματικά για τον εξής λόγο: η διάμετρος των πόρων (περίπου 10 με 20 nm) είναι εμφανώς μικρότερη από την διάμετρο των πρωτογενών (ημι-συγκροτημένων) ριβοσωμικών υπομονάδων και πιθανόν οι πόροι να αλλάζουν σχήμα προκειμένου να γίνει η μεταφορά των ριβοσωμικών υπομονάδων. Η ταχύτητα διαμετακίνησης των ριβοσωμικών συστατικών και των ριβοσωμικών υπομονάδων είναι εντυπωσιακά 17

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υψηλή. Έχει βρεθεί, πως σε ένα κύτταρο ζύμης το οποίο βρίσκεται σε φάση ανάπτυξης, εισέρχονται στον πυρήνα, δια μέσου των πυρηνικών πόρων, περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες σε ένα λεπτό, ενώ εξέρχονται, στον ίδιο χρόνο, περίπου ριβοσωμικές υπομονάδες! (Warner, 1999) Όπως προαναφέρθηκε και όπως δίδεται στο σχήμα Α.3 οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παίζουν κύριο ρόλο στην επεξεργασία του pre-rrna, στην αναδίπλωση (folding) του rrna, στην μεταφορά πρόδρομων ριβοσωμάτων και στην σταθερότητα της δομής των ριβοσωμικών υπομονάδων, καθώς αλληλεπιδρούν με διάφορους παράγοντες τόσο στην διαδικασία της βιογένεσης όσο και της μετάφρασης (Blaha 2004). Έτσι μετά την μεταγραφή και τροποποίηση του το rrna «συμπλέκεται» με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες για την δημιουργία των ριβοσωμικών υπομονάδων, οι οποίες μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα όπου ανασυγκροτούνται για την δημιουργία του 80S ριβοσώματος που αποκωδικοποιεί το mrnas σε πρωτεΐνες και στην συνέχεια αποσυγκροτούνται (διίστανται) μετά την πρωτεϊνική σύνθεση. Η διαδικασία αυτή συναρμολόγησης και αποσύνδεσης των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων καλείται "Ανακύκλωση Ριβοσώματος " (σχήμα Α.8). Σχήμα Α.8 "Ανακύκλωση Ριβοσώματος" (Mao-De και Jing, 2007) Τα rrnas μεταγράφονται στον πυρηνίσκο και αλληλεπιδρούν με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες για την δημιουργία των πρόδρομων ριβοσωμικών υπομονάδων, οι οποίες μεταφέρονται στο 18

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κυτταρόπλασμα. Στην συνέχεια συγκροτείται το 80S ριβόσωμα -με ταυτόχρονη δράση διαφόρων παραγόντων - που μεταφράζει τα mrnas σε πρωτεΐνες και αποσυνδέεται μετά την πρωτεϊνική σύνθεση. Η σταθερή αναλογία rrna/ριβοσωμάτων και ριβοσωμικών πρωτεϊνών / ριβοσωμάτων ελέγχεται από δύο συστήματα ανάδρασης. Στο πρώτο από αυτά παράγονται λίγο περισσότερα ριβοσώματα από ότι χρειάζεται για τον απαιτούμενο ρυθμό πρωτεΐνοσύνθεση και τα πλεονάζοντα ελεύθερα ριβοσώματα καταστέλλουν κατά κάποιο τρόπο την σύνθεση των rrna, (ριβοσωμική ανάδραση, ribosomal feedback inhibition). Στην δεύτερη περίπτωση ορισμένες ριβοσωμικές πρωτεΐνες καταστέλλουν την μετάφραση ενός mrna που κωδικοποιεί μια ή περισσότερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, (μεταφραστική καταστολή, translational control). Εξαιτίας του ότι η συγκρότηση και η λειτουργία του ριβοσώματος εξαρτάται από μια στοιχειομετρική ισορροπία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, πτώση στα επίπεδα μιας ή περισσοτέρων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, μπορεί να μειώσει την μεταφραστική ικανότητα ή ακόμα και να καταστήσει τη μεταφραστική μηχανή μη λειτουργική και επομένως να δοθεί το σήμα στο κύτταρο για αυτοκαταστροφή (Naora, 1999 ). Οι αμινοξικές ακολουθίες των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε διάφορα είδη θηλαστικών, παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία. Συγκρίνοντας τις ακολουθίες από άνθρωπο και επίμυ, παρατηρείται ότι για 72 συγκρινόμενες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ο μέσος όρος της ομολογίας φτάνει στο 99%, ενώ οι 32 από αυτές παρουσιάζουν 100% ομολογία (Wool, 1995, Kenmochi, 1998). Στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχει ένα λειτουργικό γονίδιο και ένας μεγάλος αριθμός ψευδογονιδίων για κάθε ριβοσωμική πρωτεΐνη. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παρουσιάζουν γενετικές ποικιλομορφίες. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S4 η οποία βρίσκεται στα χρωμοσώματα Χ και Ψ και οι S3, S6, S17 και L17 εμφανίζονται να έχουν μια πολλαπλή ομολογία ποικιλομορφιών. Στην S. cerevisaea 59 από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από δύο αντίγραφα γονιδίων, (Giaever et al., 2002). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μεγάλης και μικρής υπομονάδας μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: αυτές που είναι συντηρημένες στα βακτήρια, αρχαιοβακτήρια και στα ευκαρυωτικά (θηλαστικά και φυτά) και σε αυτές που είναι κοινές σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αρχαιοβακτήρια. Στην ζύμη οι 15 από τις 32 ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας εμφανίζουν υψηλή ομολογία μεταξύ των ευκαρυωτικών κυττάρων και των αρχαιοβακτηρίων. Δεν υπάρχει καμία αμφιβολία, πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες όλων των ευκαρυωτικών οργανισμών προέρχονται από μια κοινή ομάδα προγονικών γονιδίων. Η παραδοχή αυτή τεκμηριώνεται με τη σύγκριση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών του 19

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επίμυ και της ζύμης, που αποτελούν δυο ευκαρυωτικά είδη τα οποία απέχουν αρκετά εξελικτικά. Έτσι, από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες του επίμυ, οι 66 μπορούν να συσχετιστούν με κάποια ριβοσωμική πρωτεΐνη της ζύμης, η ομολογία δε της αμινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 60%, κυμαινόμενη από 40%-88% (Wool 1995, Kenmochi 1998). Έχει διαπιστωθεί πως οι αμινοξικές ακολουθίες των ριβοσωμικών πρωτεϊνών των αρχαιοβακτηρίων έχουν περισσότερες ομοιότητες με τις ακολουθίες των ευκαρυωτικών, παρά με τις ακολουθίες των βακτηριακών ομολόγων. Από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες του επίμυ, οι 49 μπορούν να συσχετιστούν με κάποια ριβοσωμική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων και η ομολογία της αμινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 34%, κυμαινόμενη από 17%-55% (Wool, 1995, Kenmochi 1998). Κατά μέσο όρο, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, έχουν μοριακό μέγεθος Da, το οποίο κυμαίνεται από Da για την L4, έως Da για την L41 και ο αριθμός των αμινοξέων είναι κατά μέσο όρο 164, από 421 έως 25. Οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι βασικές, με μέσο ισοηλεκτρικό σημείο το 11.05, από 4.07 για την όξινη πρωτεΐνη P1, έως για την πολύ βασική L41 και περιέχουν 22moles % αργινίνη και λυσίνη και μόνο 9moles % ασπαραγινικό και γλουταμινικό οξύ (Wool, 1995). Στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, διακρίνονται κάποια δομικά χαρακτηριστικά. Έτσι, κοντά στο Ν-τελικό και στο C-τελικό άκρο, απαντώνται δέσμες 3 ή 4 βασικών αμινοξέων. Πιο σπάνια εντοπίζονται στο C-τελικό άκρο δέσμες όξινων αμινοξέων. Χαρακτηριστικό των ριβοσωμικών πρωτεϊνών είναι επίσης και οι επαναλαμβανόμενες ακολουθίες 3-8 αμινοξέων, όπως επίσης και οι δομές δακτύλου ψευδαργύρου και φερμουάρ λευκίνης (Wool, 1995). Το γεγονός ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχουν περίπου 30 ριβοσωμικές πρωτεΐνες περισσότερες από ότι στα βακτήρια, πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη περισσοτέρων και μεγαλυτέρων rrnas, στην πιο πολύπλοκη διαδικασία βιογένεσης των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, στη συμμετοχή σε πολυπλοκότερους μηχανισμούς ρύθμισης της μετάφρασης, καθώς επίσης και στην σύνδεση των ριβοσωμάτων στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου. Υπάρχουν δυο πιθανές θεωρίες σχετικά με την προέλευση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Σύμφωνα με την πρώτη, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχεδιάστηκαν αποκλειστικά για το ριβόσωμα, ενώ η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι είχαν επιλεγεί ανάμεσα από ήδη υπάρχουσες πρωτεΐνες, οι οποίες είχαν καθορισμένες λειτουργίες. Οι δυο θεωρίες δεν είναι απόλυτες ούτε είναι πιθανό όλες οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες να είχαν προστεθεί στο ριβόσωμα την ίδια στιγμή. Αν υιοθετηθεί η θεωρία των 20

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ προϋπαρχουσών πρωτεϊνών, αυτές που είναι πιο πιθανό να έχουν επιλεγεί, είναι αυτές που έχουν την ικανότητα να δεσμεύονται σε νουκλεϊνικά οξέα (Wool, 1996). Α.2.2 Mεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Πολλές ευκαρυωτικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες τροποποιούνται με ακετυλίωση, μεθυλίωση ή φωσφορυλίωση. Η φωσφορυλίωση είναι η πλέον κοινή τροποποίηση που παρατηρείται στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα και είναι σημαντικός παράγοντας ρύθμισης της μετάφρασης. Από μελέτες πρωτεομικής ανάλυσης βρέθηκε ότι η ακετυλίωση λαμβάνει χώρα κύρια στο Ν-τελικό άκρο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών αλλά δεν έχει παρατηρηθεί ακετυλίωση στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες όταν απομονώνονται από ριβοσώματα. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες ακετυλιώνονται αρχικά και στην πορεία αποακετυλιώνονται. Πιθανόν η ακετυλίωση συμβάλλει στην «παραμονή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα ενώ η αποκετυλίωση εμπλέκεται σε περαιτέρω στάδια έτσι ώστε να διασφαλίζεται η βιογένεση των ριβοσωμάτων στον πυρηνίσκο (σχήμα Α.9). Η αποακετυλάση ιστόνης RPD3 παίζει σημαντικό ρόλο στην αποακετυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (Dinman, 2009). Σχήμα Α.9 Μοντέλο μεταμεταφραστικής ακετυλίωσης και απακετυλίωσης ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPs) (Dinman, 2009) 21

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βήμα 1, το pre-rrna μεταγράφεται στον πυρηνίσκο. Βήμα 2, συμμεταφραστική ακετυλίωση λαμβάνει χώρα στο Ν-τελικό άκρο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (NAT), στο κυτταρόπλασμα. Πιθανόν ενεργοποιούνται ενδο-ακετυλάσες. Βήμα 3, οι RPs μεταφέρονται στον πυρηνίσκο διαμέσου του πυρήνα. Αποακετυλίωση πιθανόν να συμβαίνει στο στάδιο αυτό. Η αποακετυλίωση (DAC) απαλείφει το αρνητικό φορτίο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η αλληλεπίδραση των RPs με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του pre-rrna. Βήμα 4, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με το pre-rrna προκειμένου να σχηματιστούν οι πρόδρομες ριβοσωμικές υπομονάδες. Βήμα 5, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σε "περίσσεια" αποακετυλιώνονται στον πυρήνα ή στον πυρηνίσκο και οδηγούνται στο πρωτεόσωμα προκειμένου να αποικοδομηθούν Βήμα 6, έλλειψη δραστικότητας αποκετυλίωσης ή απορρύθμισης έχει ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση στην επεξεργασία του rrna και επιπτώσεις στην βιογένεση των ριβοσωμάτων. Μία άλλη συχνή μεταφραστική τροποποίηση η οποία έχει αναφερθεί στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες είναι η μεθυλίωση. Η ανθρώπινη ριβοσωμική πρωτεΐνη rps3 (243 αμινοξέα) μεθυλιώνεται από την μεθυλτρανσφεράση 1 (PRMT 1). Πρόκειται για μια υψηλά συντηρημένη πρωτεΐνη και η μεθυλίωση γίνεται σε κατάλοιπα αμινοξέων αργινίνης (στις θέσεις 64, 65 και 67). Πειράματα με μεταλλάξεις στα αμινοξέα που αποτελούν στόχο μεθυλίωσης έχουν ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της εισόδου της πρωτεΐνης στον πυρηνίσκο. Επομένως, η μεταμεταφραστική μεθυλίωση της rps3 είναι απαραίτητη για την είσοδο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης στον πυρηνίσκο για την ομαλή βιογένεση των ριβοσωμάτων (Shin, et al. 2009). Εκτός από την rps3 έχει βρεθεί ότι και η rps2 μεθυλιώνεται σε κατάλοιπα αργινίνης αλλά από την μεθυλτρανσφεράση 3 PRMT 3 (Swiercz, Cheng et al. 2007). Μία άλλη πολύ σημαντική μεταφραστική τροποποίηση είναι η φωσφορυλίωση. Αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε φωσφορυλίωση η οποία εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες (κυτταρική απόκριση, επίπεδο έκφρασης κ.τ.λ.). Σύμφωνα με τους Kim et al, (2009) η rps3 φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες ERK και PKC delta. Για κάποιες άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες υπάρχουν ενδείξεις ότι φωσφορυλιώνονται μεν αλλά δεν είναι γνωστό από ποιες κινάσες. Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα το 1978 οι Roberts & Ashby (1978) ανέφεραν την φωσφορυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (στον εγκεφαλικό φλοιό) rps2, rps3 και rps6 αλλά όχι φωσφορυλίωση της rps5. Αργότερα από τους Roberts & Morelos (1979) και Francis & Roberts (1982) αναφέρθηκε η φωσφορυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών rps2 (στα πολυσώματα) ενώ για τις rps3a rpl14,rpl19 και rps5 φωσφορυλίωση μόνον σε ελεύθερες ριβοσωμικές υπομονάδες. H φωσφορυλίωση της rps5 έχει απασχολήσει κατά καιρούς την επιστημονική κοινότητα. Έτσι σύμφωνα με δεδομένα που δημοσιεύτηκαν πρόσφατα και αποτελούν 22

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μέρος αυτής της διατριβής η rps5 είναι φωσφορυλιωμένη όχι σε «ριβοσωμικό υλικό» (ελεύθερες υπομονάδες, πολυσώματα, ριβοσώματα) αλλά όταν δεν είναι ενσωματωμένη στο ριβόσωμα (Matragkou, Papachristou και συνεργάτες, 2009). Αυτά τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με μελέτες των Roberts & Ashby (1978), Ramagopal (1991) and Vladimirov et al, (1996) και θα συζητηθούν αναλυτικά στο κεφάλαιο ΣΥΖΗΤΗΣΗ της εργασίας. Η φωσφορυλίωση των όξινων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, των αποκαλούμενων P- proteins, παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση και στην μεταφραστική δραστικότητα του ριβοσώματος. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη S6, η κύρια φωσφοπρωτεΐνη των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων (Gressner, 1974). Πρόκειται για μια πρωτεΐνη μοριακού μεγέθους περίπου 30 kda, η οποία περιλαμβάνει 249 αμινοξέα. Από τα αμινοξέα αυτά, τα 15 είναι σερίνες και 7 από αυτές εντοπίζονται σε μια ακολουθία 15 αμινοξέων στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης (Chan και Wool, 1988). Έχει βρεθεί πως φωσφορυλιώνεται διαδοχικά στις πέντε από αυτές, Ser 236, Ser 235, Ser 240, Ser 244, και Ser 247 (Radimerski et al., 2000). Αποτελεί μια από τις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας που συνδέονται με το πρόδρομο 45S rrνα και εντοπίζεται στην κεφαλή της κυτταροπλασματικής 40S υπομονάδας (Nygard και Nilsson, 1990). Η πρωτεΐνη αυτή μπορεί άμεσα να αλληλεπιδράσει με mrna, trna και παράγοντες έναρξης. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής στο κυτταρόπλασμα, φαίνεται να ενισχύει την επιλεκτική μετάφραση μιας σειράς εξειδικευμένων mrnas τα οποία περιέχουν μια μικρή ακολουθία 5-15 πυριμιδινών στην 5 μη μεταφραστική περιοχή του mrna (UTR), ακριβώς μετά το m 7 GTP κάλυμμα, (5 -TOP). H κατηγορία αυτή των mrnas αφορά ριβοσωμικές πρωτεΐνες, παράγοντες επιμήκυνσης (EEF1A1 και EEF2) και πολλές άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται είτε στα διάφορα στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων είτε στον έλεγχο της μετάφρασης. Η μεταφραστική ρύθμιση των 5 -TOP mrnas, δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τη φωσφορυλίωση της S6, αλλά και από άλλα αναπτυξιακά και μιτογόνα ερεθίσματα, αφού όπως έχει βρεθεί, στα MEL κύτταρα ή σε άλλα αιμοποιητικά κύτταρα, δεν παρατηρείται φωσφορυλιωμένη S6, παρόλα αυτά όμως, πραγματοποιείται σε κάποιο βαθμό η μετάφραση των 5 -TOP mrnas (Barth-Baus et al., 2002). Έχει αποδειχθεί πως η απενεργοποίηση της κινάσης που φωσφορυλιώνει την S6 (ds6k) στην Drosophila έχει ως συνέπεια μείωση του μεγέθους και επιπτώσεις στην κυτταρική ανάπτυξη (Montagne et al., 1999). Στα θηλαστικά η ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps6 είναι πιο πολύπλοκη. Η πολυπλοκότητα οφείλεται στην παρουσία μιας δεύτερης κινάσης η οποία εμφανίζει υψηλή ομολογία με την S6K2. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 23

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ λοιπόν, φωσφορυλιώνεται από διαφορετικούς τύπους κινασών, την p70/p85s6k, S6K1, και την pp90rsk, S6K2 (Shima et al., 1998). Ο ρόλος της S6K2 στη φωσφορυλίωση της S6, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες παραμένει αδιευκρίνιστος. Η S6K1, αποτελείται από δυο κινάσες, την p70s6k και την p85s6k. Οι δυο αυτές κινάσες μεταφράζονται από το ίδιο mrna, χρησιμοποιώντας εναλλακτικά σημεία έναρξης της μετάφρασης. Η αμινοξική τους ακολουθία είναι η ίδια, με εξαίρεση μια προέκταση 23 αμινοξέων στην N- τελική περιοχή της p85s6k, η οποία οδηγεί την πρωτεΐνη στον πυρηνίσκο, σε αντίθεση με την p70s6k, που είναι κυτταροπλασματική (Radimerski et al., 2000). Η φωσφορυλίωση της S6 απαιτεί την ενεργοποίηση των S6 κινασών. Διάφορα μιτογόνα, ινσουλίνη και αμινοξέα σε περίσσεια, ενεργοποιούν ένα μονοπάτι μεταγωγής σημάτων που οδηγεί στην ενεργοποίηση της S6 κινάσης με φωσφορυλιώσεις που αλλάζουν την διαμόρφωση της πρωτεΐνης (Williams et al., 2003). Όπως φαίνεται στο πιο κάτω σχήμα η γονιδιακή έκφραση του TOP εξαρτάται από την φωσφατιδυλο-ινισιτόλη 3-κινάση (PI3K), αλλά είναι ανεξάρτητη από την κινάση S6K1, (Stolovich et al, 2002). Το μονοπάτι αυτό φαίνεται στο σχήμα Α.10. Σχήμα Α.10 Μονοπάτι μεταγωγής σήματος που οδηγεί στην ενεργοποίηση της p70/p85s6k (Hans Trachel, 2002). 24

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.3 Η πολυλειτουργικότητα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Όπως προαναφέρθηκε οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες λειτουργούν ως μοριακοί συνοδοί του RNA κατά την διαδικασία συγκρότησης των ριβοσωμικών υπομονάδων ή έχουν δομικό ρόλο in situ στο ριβόσωμα και επίσης συντονίζουν τις αλληλεπιδράσεις του ριβοσώματος με τους παράγοντες έναρξης και επιμήκυνσης του mrna. Εν τούτοις η υπερπαραγωγή πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε καρκινικές σειρές δείχνει την εμπλοκή τους σε άλλες μη ριβοσωμικές λειτουργίες. Πίνακας 1. Πολυλειτουργικές (μη-ριβοσωμικός ρόλος) ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Mao-De and Jing, 2007) 25

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Kondoh, Schweinfest et al. 1992; Wong, Mafune et al. 1993). Παράλληλα έχει αναφερθεί η παραγωγή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ακόμη και αν παρεμποδίζεται η σύνθεση του rrna ενισχύοντας την άποψη ότι οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες δεν συσχετίζονται απαραίτητα μόνον με την βιογένεση των ριβοσωμάτων. Πολλές λοιπόν ριβοσωμικές πρωτεΐνες συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, η επεξεργασία του RNA,στο μάτισμα του RNA, η επιδιόρθωση του DNA, η ρύθμιση της ανάπτυξης, ο κακοήθης μετασχηματισμός, η απόπτωση, ακόμα και η φλεγμονή (Wool et al., 1996). Μεταλλάξεις σε γονίδια ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή διαταραχή έκφρασης των επιπέδων τους έχουν βρεθεί σε διάφορες κληρονομήσιμες γενετικές ασθένειες, όπως στην αναιμία Diamond Blackfan, στο σύνδρομο Turner, σύνδρομο Noonan, σύνδρομο Bardet-Biedl (Kongsuwan, Yu et al. 1985), καθώς επίσης και σε διάφορες μορφές καρκίνου όπως είναι του μαστού, προστάτη, τραχήλου της μήτρας, οισοφάγου και ήπατος. Μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την ριβοσωμική πρωτεΐνη (RP) S19 είναι υπεύθυνες για το 25% των περιπτώσεων σε ασθενείς που πάσχουν από την αναιμία DBA (Diamond Blackfan Anemia). Η σύνδεση της συγκεκριμένης ριβοσωμικής πρωτεΐνης με την ερυθροποίηση δεν είναι ξεκάθαρη. Πιθανόν οι μεταλλάξεις αυτές ή επιφέρουν αλλαγές στην διαδικασία της πρωτεΐνοσύνθεσης ή έχουν επιπτώσεις στον «άγνωστο» μη-ριβοσωμικό ρόλο της rps19. Έχει βρεθεί πως η rps19 αλληλεπιδρά με την ογκοπρωτεΐνη PIM-1, πρόκειται για μια κινάση σερίνης-θρεονίνης, της οποίας η έκφραση επάγεται σε ερυθροποιητικά κύτταρα από πολλαπλούς παράγοντες ανάπτυξης, όπως η ερυθροποιητίνη (Chiocchetti et al, 2005). Επίσης οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες RPS24, RPS17 και RPL35A εμπλέκονται στο σύνδρομο DBA (Gazda et al., 2006; Cmejla et al., 2007; Farrar et al., 2008). Απάλειψη ενός αλληλόμορφου γονιδίου της rps14 συσχετίζεται με την εμφάνιση μιας άλλης μορφής συνδρόμου αναιμίας -το αποκαλούμενο 5qσύνδρομο - με εμφάνιση αιμοποιητικών όγκων, (Ebert et al., 2008). Δέκα γονίδια ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPS3, S4X, S27a, S3, L6, L9, S3A, S2, L3) υπερεκφράζονται σε αδενοκαρκινώματα (Lin et al., 2002). Επίσης σε κάποια είδη ψαριών (Solea senegalensis και Hippoglossus hippoglossus) τα επίπεδα των mrnas ριβοσωμικών πρωτεϊνών αυξάνονται στην εμβρυογένεση και στο προνυμφικό στάδιο (Manchado, Infante et al. 2007). Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός πως τα επίπεδα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στα διάφορα στάδια μιας συγκεκριμένης μορφής καρκίνου ποικίλουν. Όλα αυτά συνηγορούν στην ύπαρξη ενός πολύπλοκου μηχανισμού μεταξύ της καρκινογένεσης και των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Έτσι λοιπόν υπάρχουν δύο ενδεχόμενα : α. η διαταραχή των επιπέδων των ριβοσωμικών πρωτεϊνών επηρεάζει 26

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την πρωτεϊνική σύνθεση, β άμεση συμμετοχή στον μηχανισμό της καρκινογένεσης μέσωτου μη-ριβοσωμικού τους ρόλου (Mao-De and Jing, 2007). Έχει βρεθεί ότι πολλοί καταστολείς όγκων και πρωτοογκογονίδια επηρεάζουν την συγκρότηση των ριβοσωμάτων ή ρυθμίζουν τη δραστικότητα των πρωτεϊνών. Ανάμεσα στον κυτταρικό κύκλο και στην παραγωγή των ριβοσωμάτων υπάρχει μια σημαντική σχέση η οποία διατηρείται μεν σε φυσιολογικά κύτταρα όχι όμως σε καρκινικά. Χρησιμοποιώντας εργαλεία πρωτεομικής ανάλυσης για την εύρεση μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων στην ζύμη, παρατηρήθηκε πως οι τροποποιήσεις αυτές λαμβάνουν χώρα σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Dinman et al., 2009). Πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης του γονιδίου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης της μεγάλης υπομονάδας L13 (211 αμινοξέα) σε ανθρώπινα γαστρεντερικά καρκινικά κύτταρα προκάλεσε δραστική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη, με συσσώρευση των κυττάρων στην G1 και G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου (Kobayashi, Sasaki et al. 2006). Όπως προαναφέρθηκε η σύνθεση του rrna απαιτεί την RNA πολυμεράση Ι, ενώ η πολυμεράση ΙΙΙ εμπλέκεται στην μεταγραφή του 5S rrna, trna και σε snrnas (Ruggero D και Pandolfi P, 2003). Ο παράγοντας UBF (Upstream Transcription Factor) είναι απαραίτητος για τη σύνθεση του rrna, όπου η ιδιότητα του είναι να ρυθμίζει τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης Ι. Θα πρέπει να τονιστεί πως πολλά πρωτοογκογονίδια και καταστολείς όγκων ρυθμίζουν την σύνθεση του rrna με το να καταστέλλουν την λειτουργία του UBF. Η φωσφορυλίωση του UBF έχει ως αποτέλεσμα την μη φυσιολογική σύνθεση του rrna. Μία από τις κινάσες που φωσφορυλιώνουν σε περιοχές στην αμινοτελική και καρβοξυτελική περιοχή του UBF είναι η κινάση της καζεϊνης ΙΙ (CKII) η οποία είναι μια κινάση σερινης-θρεονίνης και υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, (λευχαιμία) συμβάλλοντας στην ογκογένεση (σχήμα Α.11). Εκτός από την CK II έχουν βρεθεί και άλλες κινάσες που φωσφορυλιώνουν τον UBF (EPK1/2 φωσφορυλιώνει τον παράγοντα UBF σε δυο θρεονίνες), οδηγώντας σε μη φυσιολογική σύνθεση του rrna και υπερεκφράζονται σε περιπτώσεις καρκίνου. Η σύνθεση του rrna ρυθμίζεται επίσης και από μία οικογένεια πρωτεϊνών του ρετινοβλαστώματος (RB). Οι RB-πρωτεΐνες ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων καταστέλλοντας την σύνθεση του rrna. Συγκεκριμένα οι RB-πρωτεΐνες συσσωρεύονται στον πυρήνα, με την υπερέκφρασή τους καταστέλλουν τον προαγωγέα του rdna ενώ αλληλεπιδρώντας με τον UBF παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση του παράγοντα με άλλους συμπαράγοντες όπως με τον TIFI-B/SL1 προκειμένου να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση Ι. Ένα άλλο μέλος της οικογένειας RB είναι η πρωτεΐνη p130 που καταστέλλει τη μεταγραφή του rrna. 27

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια RB και p53 καταστέλλουν τη μεταγραφική ικανότητα της πολυμεράσης Ι και της πολυμεράσης ΙΙ και κατά συνέπεια και τον ρυθμό της πρωτεϊνοσύνθεσης (σχήμα Α.10). Λαμβανομένου υπόψη του γεγονότος ότι σε ανθρώπινες νεοπλασίες τα επίπεδα των πιο πάνω κινασών αυξάνονται θα ήταν αναμενόμενη μια αύξηση της τροποποίησης των επιπέδων της φωσφορυλίωσης του UBF και επομένως αύξηση της μεταγραφής του rrna η οποία με την σειρά της θα οδηγούσε πιθανώς σε μετασχηματισμό των κυττάρων (Ruggero και Pandolfi, 2003). Σχήμα Α.11 Ρύθμιση της δραστικότητας των πολυμερασών Ι και ΙΙΙ με ογκοκατασταλτικά γονίδια και πρωτοογκογονίδια. (Ruggero και Pandolfi, 2003) Η βιογέννεση των ριβοσωμάτων ρυθμίζεται από το πρωτοογκογονίδιο c-myc (Coller, et al., 2000). Το myc ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη και επάγει ογκογένεση. Υπερέκφραση των c-myc γονιδίων οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους των πυρηνίσκων των κυττάρων και σε ταυτόχρονη υπερέκφραση πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και πρωτεϊνών του πυρηνίσκου (Kim, S., et al., 2000). Στο σχήμα Α.12 δίδονται οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες που αποτελούν στόχο των προϊόντων του c-myc, μια από αυτές είναι και η ριβοσωμική πρωτεΐνη S5. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας L11 δρα ως αναδραστικός ρυθμιστής του c-myc, παρέχοντας ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα ρύθμισης του c-myc από μια ριβοσωμική πρωτεΐνη (Dai et al., 2007). Πειράματα γονιδιακής καταστολής της L11 δείχνουν δραματική αύξηση των επιπέδων του mrna του c-myc. Πιθανότατα η L11 δεσμεύεται στον προαγωγέα του γονιδίου c-myc δρώντας έτσι ως καταστολέας της γονιδιακής μεταγραφής του c-myc. Μια άλλη εκδοχή είναι πως η L11 ρυθμίζει τα επίπεδα του mrna του c-myc μέσω του μονοπατιού αποσιώπησης του microrna. Η τελευταία αυτή υπόθεση στηρίζεται από 28

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ δεδομένα αναφορικά με την συνύπαρξη της L11 στο σύμπλοκο αποσιώπησης RISC μαζί με την ριβοσωμική πρωτεΐνη L5 (Ishizuka et al., 2002). Παρόλο που δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί ο ακριβής μηχανισμός ρύθμισης του c-myc γονιδίου από την L11 είναι φανερό πως υπάρχει μια σχέση μεταξύ του c-myc και της βιογένεσης των ριβοσωμάτων (Dai and Lu, 2008). Ένας καταστολέας ογκογονιδίου, το PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog) ελέγχει την ωρίμανση του ριβοσώματος καταστέλλοντας την δράση της κινάσης που φωσφορυλιώνει την ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 μέσω του PI3K μονοπατιού, όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.2.2, (Vogt, 2001) και (Backman et al., 2002). Σχήμα Α.12 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες που αποτελούν στόχο του πρωτοογκογονιδίου c- myc. (Ruggero και Pandolfi, 2003) Το παράδειγμα συσχετισμού ριβοσωμικών πρωτεϊνών και των πρωτοογκογονιδίων ενισχύει την άποψη πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εμπλέκονται άμεσα στα στάδια της καρκινογένεσης (Mao De and Jing, 2007). Για παράδειγμα η σύνδεση του ανθρώπινου πρωτοογκογονιδίου trk με την ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας rpl7a επάγει ογκογένεση (Ziemiecki et al., 1990). Έτσι λοιπόν, τα ογκογονίδια αυτά διαταράσσουν τα επίπεδα έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών με αποτέλεσμα το ριβόσωμα να παράγει "μη φυσιολογικές" πρωτεΐνες. Από την άλλη μεριά οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορεί να εμπλέκονται με έμμεσο τρόπο στα στάδια της καρκινογένεσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες rpl5, rpl11, rpl23 οι οποίες αλληλεπιδρούν απευθείας με την ογκοπρωτεΐνη ΜDM2 παρεμποδίζοντας την αλληλεπίδραση της ΜDM2 με την p53. Η ΜDM2 είναι μια πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της δραστικότητας της p53, μιας από τις σημαντικότερες ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες. Έτσι, εμποδίζεται η ουβικιτινιλίωση της p53 μέσω ΜDM2 με ενεργοποίηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα, δείχνουν πως απάλειψη της νουκλεοστεμίνης (nucleostemin, NS), μιας πρωτεΐνης που εντοπίζεται κυρίως στον 29

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πυρηνίσκο σε αρχέγονα κύτταρα (stem cells) και σε καρκινικά κύτταρα, έχει ως αποτέλεσμα όπως φαίνεται στο σχήμα Α.13 την αλληλεπίδραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11 και L5 με την πρωτεΐνη MDM2 παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Hanhui Ma and Thoru Pederson, 2008). Έτσι, οι ριβοσωμικές αυτές πρωτεΐνες, ανάλογα με τα ερεθίσματα που δέχονται τα κύτταρα, είτε δεσμεύονται με την ΜDM2 στο πυρηνόπλασμα, είτε βρίσκονται συνδεδεμένες στο ριβόσωμα (Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004, Lohrum et al.,2003). Σχήμα Α.13 Λειτουργική συσχέτιση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11/L5 με τις πρωτεΐνες νουκλεοστεμίνη και MDM2 (Ma and Pederson, 2008) Aπάλειψη ή έλλειψη της δραστικότητας της νουκλεοστεμίνης (NS) οδηγεί στην αλληλεπίδραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11 και L5 με την πρωτεΐνη MDM2 παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Η νουκλεοστεμίνη NS παρεμποδίζει επίσης τον παράγοντα παρεμπόδισης τελομερών TRF1 και κατά συνέπεια η NS προάγει την σύνθεση τελομερών. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορούν να παίζουν και άλλους σημαντικούς ρόλους όπως στην επιδιόρθωση του DNA και στην κυτταρική απόπτωση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη της 40S υπομονάδας, S3. Η rps3 έχει δράση ενδονουκλεάσης και επιδιορθώνει το DNA (Kim et al., 1995), ενεργοποιεί την κασπάση 8 και κασπάση 3 και επάγει απόπτωση. Ο διπλός μηριβοσωμικός της ρόλος οφείλεται στην παρουσία πολλαπλών κυρίαρχων περιοχών (domains) (Jang et al., 2004). Σε κύτταρα PC12 στα οποία είχε προστεθεί ο 30

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποπτωτικός παράγοντας 5-azacytidine παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της L4 πριν την αποικοδόμηση του DNA και σε NIH3T3 κύτταρα τα οποία είχαν επιμολυνθεί μόνιμα με το γονίδιο της S3a cdna η έκφραση του γονιδίου της που παρατηρήθηκε ήταν σχετική με την απόπτωση των κυττάρων (Naora et al., 1998). H γονιδιακή καταστολή ριβοσωμικών πρωτεϊνών στον οργανισμό Danio rerio έχει επιπτώσεις στην ανάπτυξη, επαληθεύοντας την υπόθεση της σχέσης του ριβοσώματος με την αναπτυξιακή βιολογία (Uechi et al., 2006). Ένα άλλο πολύ εντυπωσιακό παράδειγμα ριβοσωμικής πρωτεΐνης με μη ριβοσωμικές ιδιότητες, είναι αυτό της ανθρώπινης L13a. Η προσθήκη ιντερφερόνηςγ, (INF-γ), σε καλλιέργεια ανθρώπινων μονοκυττάρων, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μέσα σε λίγες ώρες της σερουλοπλασμίνης, μιας πρωτεΐνης η οποία συμμετέχει στο μηχανισμό της φλεγμονώδους απόκρισης. Βρέθηκε πως ώρες μετά την προσθήκη της INF-γ, παρατηρείται σιωπή στην έκφραση της πρωτεΐνης, που εξαρτάται από την παρουσία ενός τμήματος 29 νουκλεοτιδίων στην 3 -UTR περιοχή του mrna της. Η L13a εμπλέκεται με τον πρωτοφανή μηχανισμό ως μοριακού διακόπτη GAIT (Gamma Activated Inhibitor of Translation) στην μετάφραση της σερουλοπλασμίνης. Σύμφωνα με τον μηχανισμό αυτό η L13a απομακρύνεται από το ριβόσωμα μετά από φωσφορυλίωση προκειμένου να αλληλεπιδράσει με την περιοχή 3 -UTR περιοχή του mrna της σερουλοπλασμίνης προκαλώντας αναστολή της μετάφρασης γεγονός που προκαλεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον (Mazumder et al., 2003). Α.4 Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών Η ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών οργανισμών ανήκει στην S7 οικογένεια των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Το χαρακτηριστικό της οικογένειας πρωτεϊνών S7, είναι ένα συντηρημένο τμήμα αμινοξέων στο C- τελικό άκρο, το οποίο έχει την εξής ακολουθία: [DENSK]-x-[LIVMDET]-x(3)-[LIVMFTA](2)- x(6)-g-k-[kr]-x(5)-[livmf]-[livmfc]-x(2)-[stac] (www.expasy.ch, prosite). Στην συγκεκριμένη αυτή οικογένεια των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, ανήκουν οι εξής κατηγορίες: οι S7 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των βακτηρίων, των φυκιών, των χλωροπλαστών, των κυανοβακτηρίων, των αρχαιοβακτηρίων, των μιτοχονδρίων, καθώς και οι S5 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των φυτών και των θηλαστικών. Η S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη των βακτηρίων, είναι μια από τις πρωτεΐνες που δρουν στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων συμβάλλοντας στη σωστή αναδίπλωση του 3 κύριου τμήματος του 16S rrna, το οποίο τελικά σχηματίζει την 31

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κεφαλή της 30S υπομονάδας του ριβοσώματος (Nowotny και Nierhaus, 1988). Έχει παρατηρηθεί πως οι περιοχές σύνδεσης με το rrna, εντοπίζονται σε δυο εσωτερικές θηλιές της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna, μια ένωση τριπλής και τετραπλής έλικας, και συγκεκριμένα στα , και (Dragon et al., 1993, Powers και Noller, 1995). Εντοπίζεται λοιπόν, στην κεφαλή της 30S υπομονάδας, προς το μέρος της πλευρικής προεξοχής, πάνω από τη σχισμή και τη θέση αποκωδίκευσης. Συγκεκριμένα εντοπίζεται πολύ κοντά στα σημεία Α-, P- και E, όπου δεσμεύεται το trna. Όσον αφορά τη δομή της rps7 των βακτηρίων αποτελείται από έξι α-έλικες και μια β-φουρκέτα ανάμεσα στις έλικες 3 και 4. Τα Ν - και C- τελικά άκρα είναι εκτεθειμένα και χωρίς κάποια τάξη. Στο σχήμα Α.14, παριστάνεται η δομή της rps7. Σχήμα Α.14 Σχηματική αναπαράσταση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps7 από τον οργανισμό B. Stearothermophilus. Hosaka et al, (1997) Η rps7 αποτελείται από έξι α-έλικες, (γαλάζιο και κόκκινο), και μια β-φουρκέτα, (πράσινο). Επίσης έχει βρεθεί ότι η rps7 αλληλεπιδρά με τον παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης, IF-3 (Ehresmann et al., 1986), ενισχύοντας τον δυναμικό της ρόλο στο μηχανισμό της μετάφρασης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω η rps7/rps5 βρίσκεται στην θέση εξόδου (Ε) του trna στην μικρή υπομονάδα. Η rps7 συμβάλλει στην διαμόρφωση καναλιού εξόδου του mrna και αλληλεπιδρά με την ριβοσωμική πρωτεΐνη rps11 (σχήμα Α.15), στην περιοχή πλατφόρμας (platform) της 30 S υπομονάδας (Robert et al., 2003). Παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης με μεταλλάξεις είτε στη μια είτε στην άλλη πρωτεΐνη έχει σαν αποτέλεσμα το ριβόσωμα να είναι 32

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιρρεπές σε λάθη κατά τη μετάφραση στον οργανισμό E.coli. Θα πρέπει να τονιστεί πως η αλληλεπίδραση της rps7 με την rps11, δεν είναι συντηρημένη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (rps5/rps14), όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.2 της παραγράφου Α.1.1, και το κανάλι εξόδου του mrna που διαμορφώνεται από την αλληλεπίδραση της rps5 με την rps14 είναι ανοιχτό κατά την απομόνωση σε ζύμη της 40S υπομονάδας (Passmore et al. 2007). Σχήμα Α.15 Δομή 30S υπομονάδας σε E.coli. (PDB 1VS7). Η rps7 βρίσκεται στην κεφαλή (Galkin et al., 2007) Η rps7 απεικονίζεται με χρώμα μπλε και τα 20 επιπλέον αμινοξέα στο Ν-τελικό άκρο στην S.cerevisiae με κόκκινο. Από την άλλη μεριά, η S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων έχει μια προέκταση περίπου 60 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο, η οποία δεν υπάρχει στην ομόλογη πρωτεΐνη των βακτηρίων, ενώ υπάρχει σε αυτή των ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι Hosaka et al., (2001), δημοσίευσαν την κρυσταλλική δομή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps7 από το αρχαιοβακτήριο Pyrococcus horikoshii και όπως αναπαριστάνεται στο πιο κάτω σχήμα φαίνεται η χαρακτηριστική προέκταση στο Ν-τελικό άκρο. Όπως προαναφέρθηκε οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες των αρχαιοβακτηρίων βρίσκονται πλησιέστερα στις ομόλογες πρωτεΐνες των 33

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ευκαρυωτικών. Στο σχήμα Α.16, παριστάνεται η rps7 και η χαρακτηριστική προέκταση στο Ν-τελικό της άκρο από τον οργανισμό Pyrococcus horikoshii. Σχήμα Α.16 Σχηματική αναπαράσταση της δομής της πρωτεΐνης S7 από τον οργανισμό Pyrococcus horikoshii, όπως προέκυψε μετά από κρυστάλλωση (ευκρίνεια 2.1 Å) (Hosaka et al., 2001) Στο σχήμα Α.17 όπου παρουσιάζεται η πρωτοταγής δομή των S7 και S5 ριβοσωμικών πρωτεϊνών, από διάφορους οργανισμούς είναι εμφανής η προέκταση στο N-τελικό άκρο της ευκαρυωτικής rps5. Η ομολογία όλων των πρωτεϊνών στο C- τελικό άκρο του μορίου είναι αρκετά υψηλή, μικρότερη στις εσωτερικές ακολουθίες, ενώ στο N- τελικό άκρο υπάρχει ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνών των θηλαστικών και των αρχαιοβακτηρίων. 34

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.17 Ομοιοπαράθεση πρωτοταγούς δομής ριβοσωμικών πρωτεϊνών της οικογένειας S7 από διάφορους οργανισμούς. Στην rps5 του S.cerevisiae η προέκταση του Ν-τελικού άκρου είναι μεγαλύτερη κατά ~21 αμινοξέα(pi~3.27) σε σχέση με την ανθρώπινη rps5 (σχήμα Α.17). Η πρωτεΐνη S5 και στους τρεις οργανισμούς (ανθρωπο, ποντίκι και επίμυ) αποτελείται από 204 αμινοξέα και αυτή του ποντικού έχει μοριακό μέγεθος Da και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο Στην Sacharomyces cerevisiae το γονίδιο της rps5 βρίσκεται σε ένα και μόνο αντίγραφο και παίζει σημαντικό ρόλο στην βιωσιμότητα του κυττάρου (Ignatovich et al., 1995). Eπιπρόσθετα και στον επίμυ βρίσκεται σε ένα και μόνο αντίγραφο, σε αντίθεση με τον άνθρωπο και το ποντίκι απαντάται σε 5 με 6 και 3 με 4 αντίγραφα, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός πως η ευκαρυωτική rps5 έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την IRES (Internal Ribosome Entry Site) του ιού cricket paralysis, και είναι καθοριστική για τη μετέπειτα αλληλεπίδραση μεταξύ της IRES περιοχής και της 40S υπομονάδας του ριβοσώματος (Schuler et al., 2006). Είναι γνωστό πως οι RNAιοί, επειδή δεν διαθέτουν καλυμμένο το 5 άκρο του mrna τους, προκειμένου να 35

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνδεθεί ο παράγοντας έναρξης της επιμήκυνσης eif-4, συνδέονται με τη 40S υπομονάδα μέσω υψηλά δομημένων περιοχών στο 5' της μη μεταφράσιμης περιοχής, (Non Translated Region, NTR), του mrna (Fukushi et al., 2001). Όσο αφορά τον ρόλο της στην βιογένεση των ριβοσωμάτων η rps5 δρα στα αρχικά στάδια όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.5, σελίδα10. Επίσης έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την κινάση KKr1 (πιθανόν μια κινάση σερίνης / θρεονίνης) καθώς επίσης με τις YHR196w και ΥGR090w (U3 snorna μαζί με τις πρωτεΐνες 9 και 22, αντίστοιχα) οι οποίες εμπλέκονται στην διαδικασία ωρίμανσης (maturation) του 18 S rrna στον πυρηνίσκο, (Grandi et al., 2002). Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη από ανθρώπινο πλακούντα, έχει βρεθεί πως αλληλεπιδρά με ένα ολιγονουκλεοτίδιo που είναι συμπληρωματικό της περιοχής του 18S rrna, , ομόλογη της υψηλά συντηρημένης περιοχής του 16S rrna 530 stem loop. Έτσι, φαίνεται πως και η πρωτεΐνη S5, όπως και η ομόλογή της S7 από βακτήρια, βρίσκεται κοντά στο κέντρο αποκωδίκευσης ριβοσώματος (Malygin et al., 1999). Σύμφωνα με τα πιο πάνω η rps5 είναι από τις πρόδρομες πρωτεΐνες που συνδέονται με το 18S rrna, προκειμένου να αρχίσει η συγκρότηση της μικρής υπομονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώματος (Kressler et al., 1999). Ένα ακόμα χαρακτηριστικό της rps5 στην S. cerevisiae είναι ότι υπόκειται σε φωσφορυλίωση (Ignatovich et al., 1995). Στον εγκεφαλικό φλοιό από επίμυ η rps5 μαζί με άλλες πρωτεΐνες S3a, L14 και την L19 έχουν εντοπιστεί φωσφορυλιωμένες στα ελεύθερα ριβοσώματα και όχι στα πολυσώματα, (Francis et al., 1982). Στον επίμυ έχει βρεθεί μία πρωτεΐνη, η S5a, η οποία είναι μεν ταυτόσημη με την rps5, λείπουν όμως τα 5 πρώτα αμινοξέα. Και οι δυο αυτές μορφές της rps5 προέρχονται από το ίδιο cdna μεταγράφημα και πιθανώς η S5a προκύπτει από την S5, έπειτα από πρωτεόλυση (Kuwano and Wool, 1992). Η rps5, αποτελεί μια από τις ανθρώπινες ριβοσωμικές πρωτεΐνες το γονίδιο των οποίων επάγεται από μια κατηγορία μεταγραφικών παραγόντων που πολύ συχνά ενεργοποιούνται σε ανθρώπινους όγκους και παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καρκίνο τα λεγόμενα myc ογκογονίδια, Εδώ πρέπει να σημειωθεί ότι η πλειοψηφία των γονιδίων που επάγονται από τα myc ογκογονίδια, έχουν κυρίαρχο ρόλο στη συγκρότηση και δραστικότητα του ριβοσώματος (Boon et al., 2001). Η έκφραση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5, έχει μελετηθεί κατά τη διάρκεια της επαγόμενης διαφοροποίησης ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL (Murine ErythroLeukemia Cells) και βρέθηκε ότι το γονίδιο της σε επίπεδο mrna καταστέλλεται σταδιακά κατά τη διαφοροποίηση (Vizirianakis et al., 1999). Αντίθετα, το ίδιο γονίδιο έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου, 36

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του εντέρου, (Atlas Select Human Tumor Array Gene List, atlas.clontech.com). Σύμφωνα με μελέτες των Chen & Huang (2001) η κινητικότητα της rps5 στον πυρηνίσκο και στο πυρηνόπλασμα είναι σημαντικά πιο αργή σε σχέση με άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε διάφορα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, όπως ο UBF, (Upstream Binding Factor), η νουκλεολίνη, η φιμπριλλαρίνη, η πρωτεΐνη Rpp29). A.5 Γονιδιακή καταστολή με RNA παρεμβολή Η RNA παρεμβολή (RNAi) είναι μια ενδοκυτταρική διαδικασία RNA εξαρτώμενη- η οποία αφορά την επιλεκτική «αποσιώπηση» συγκεκριμένων γονιδίων του κυττάρου (αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης) Μικρά μόρια RNA της τάξης μεγέθους νουκλεοτιδίων παίζουν κεντρικό ρόλο, ανιχνεύοντας ομόλογες αλληλουχίες και επηρεάζοντας κατ αυτόν τον τρόπο την μεταγραφή, τη σταθερότητα του mrna ή την μετάφραση. Η RNA παρεμβολή λαμβάνει χώρα στα βασίλεια των ευκαρυωτικών πρώτιστα, μύκητες, ζώα και φυτά - και πρόκειται για έναν σχετικά συντηρημένο εξελικτικά μηχανισμό που μοιράζεται κοινά βασικά χαρακτηριστικά στα 4 διαφορετικά βασίλεια. Οι διαφοροποιήσεις και προσαρμογές του όμως σε κάθε βασίλειο έχουν καθιερώσει και διαφορετική ονομασία όπως quelling στους μύκητες, RNA interference (RNAi) και RNA silencing σε ζώα και φυτά αντιστοίχως. Η βιολογική σημασία του μηχανισμού της RNA παρεμβολής αποδεικνύεται καθημερινά από την διεθνή βιβλιογραφία και φαίνεται ότι ο μηχανισμός αυτός εμπλέκεται σε ρύθμιση αναπτυξιακών γεγονότων, προστασία του γονιδιώματος από μεταθετά στοιχεία, στο σχηματισμό και διατήρηση ετεροχρωματικών περιοχών, και σε απόκριση του κυττάρου σε βιοτικό και αβιοτικό στρες. Ο ρόλος του σε κάθε βασίλειο διαφοροποιείται και σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιούνται διαφορετικοί ριβονουκλεϊκοί ρυθμιστές, οι οποίοι είναι ενδογενούς η μη- ενδογενούς προέλευσης. Η πρώτη αναφορά για τη διαδικασία της γονιδιακής αποσιώπησης μέσω των microrna μορίων έγινε το 1993, από τον Victor Ambros και τους συνεργάτες του Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum, οι οποίοι ανακάλυψαν ότι το lin-4, ένα γονίδιο που ελέγχει χρονικά την ανάπτυξη της λάρβας στον C. elegans, δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, αλλά παράγει δύο μικρά τμήματα RNA (Lee et al., 1993).Ο Baulcombe και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι μια μορφή μικρών RNAs (21-25 νουκλεοτίδια) υπήρχε σε φυτά τα οποία υποβάλλονταν σε γονιδιακή καταστολή μέσω του RNA 37

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Hamilton and Baulcombe, 1999), που στην πορεία ονομάστηκαν μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (small interfering RNAs -sirnas) (Elbashir et al., 2001). A.5.1 Μηχανισμός της γονιδιακής αποσιώπησης Τα μονοπάτια της RNA παρεμβολής μοιράζονται τρία κοινά βιοχημικά χαρακτηριστικά: τη δημιουργία δίκλωνου RNA (dsrna), την κοπή του σε μικρούς μονόκλωνους ριβονουκλεϊκούς ρυθμιστές (μικρά RNAs) και τέλος την παρεμποδιστική δράση του μικρού RNA με τη βοήθεια κατάλληλων συμπλόκων - σε μερικώς ή πλήρως συμπληρωματικό RNA ή DNA (Susi et al, 2004). Συγκεκριμένα, η πυροδότηση της RNA αποσιώπησης γίνεται με την ανίχνευση δίκλωνου μορίου RNA στο κύτταρο. Η δίκλωνη μορφή ενδέχεται να είναι αποτέλεσμα δευτεροταγούς δομής ενδογενούς μεταγράφου ή διαγονιδίου, είτε εξωγενής προερχόμενη RNA δομή. Η δίκλωνη μορφή του RNA αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες της οικογένειας Dicer και κόπτεται σε δίκλωνο RNA μικρού μεγέθους (20-30 νουκλεοτίδια). Η Dicer, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.18 αποτελείται από μια περιοχή ελικάσης/atpase, μια περιοχή άγνωστης λειτουργίας, DUF283, μια περιοχή PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille), δύο περιοχές RNase III και μια περιοχή δέσμευσης δίκλωνου RNA (dsrdb). Η περιοχή PAZ αναγνωρίζει τα 3προεξέχοντα άκρα που δημιουργούνται με τη δράση της πρωτεΐνης Drosha. Η Drosha εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και περιέχει 2 περιοχές RNase III, μια περιοχή δέσμευσης dsrna και ένα αμινο-τελικό τμήμα άγνωστης λειτουργίας (Lee et al., 2003). Καταλύει την νουκλεόλυση των πρωτογενών mirna, pri-mirnas σε πρόδρομα μόρια premirnas μεγέθους ~70 νουκλεοτιδίων που σχηματίζουν δομή ατελούς φουρκέτας (Lee et al., 2003). Οι πρωτεΐνες Dicer λοιπόν, είναι ATP εξαρτώμενες, RNAse III ενδονουκλεάσες που φέρουν περιοχές πρόσδεσης δίκλωνου RNA και κατέχουν σημαντικότατο ρόλο στο μηχανισμό (Vazquez, 2006). Η Dicer ανακαλύφθηκε αρχικά στη Drosophila (Bernstein et al., 2001) και στην συνέχεια και σε άλλους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων του ανθρώπου, των μυκήτων και των φυτών. Κάποιοι οργανισμοί έχουν μια πρωτεΐνη της οικογένειας Dicer (Dicerlike proteins - DCLs) (Verdel et al., 2004; Volpe et al., 2002; Zhang et al., 2002, 2004; Billy et al., 2001; Provost et al., 2002a, 2002b; Tabara et al., 2002), ενώ άλλοι πολλές. Στη Drosophila υπάρχουν 2 ομόλογες Dicer, η DCR1 και η DCR2. Η DCR1 είναι υπεύθυνη για την επεξεργασία των mirnas, ενώ η DCR2 για τα sirnas (Lee et al., 2004; Okamura et al., 2004; Liu et al., 2003). Από την άλλη μεριά στον νηματώδη 38

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σκώληκα C. elegans υπάρχει μόνο η DCR-1, η οποία απαιτείται για την επεξεργασία τόσο των mi RNA όσο και των sirnas. Στα θηλαστικά υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που έχουν περιοχές δέσμευσης dsrna και δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί. Tα φυτά διαθέτουν τέσσερις πρωτεΐνες της παραπάνω οικογένειας, με κάθε μία να κατέχει διακριτό ρόλο χωρίς αυτό να συνεπάγεται μη αλληλεπικαλυπτόμενη δράση των DCLs. Σχήμα A.18 Κοινά στοιχεία της γονιδιακής αποσιώπησης των sirnas/mirnas. (Carthew και Sontheimer, 2009) A. Κοινά μονοπάτια των sirnas/mirnas. Πρόδρομα δίκλωνα RNA κόπτονται με την ενδονουκλεάση Dicer σε δίκλωνο RNA μικρού μεγέθους (20-30 νουκλεοτίδια) και στην συνέχεια το μονόκλωνο RNA προσδένεται σε μια Ago πρωτεΐνη. B. Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Dicer (Giardia) C. Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Ago (Thermus thermophilus) Στη συνέχεια, το μικρό μόριο RNA καθίσταται μονόκλωνο και ενσωματώνεται σε σύμπλοκα αποσιώπησης RISC (RNA Induced Silencing Complex). Τα σύμπλοκα αυτά παρουσιάζουν ετερογένεια, αλλά όλα ανεξαιρέτως περιέχουν πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute (ARGO) και είναι υπεύθυνα για την παρεμποδιστική δράση που απορρέει από τη φύση των μικρών RNAs (Hammond,2005). Κάθε σύμπλοκο 39

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ RISC φέρει μια Ago πρωτεΐνη, η οποία είναι πολύ στενά συνδεδεμένη με το μονόκλωνο είτε sirna είτε mirna (Martinez and Tuschl, 2004). Οι πρωτεΐνες της οικογένειας αυτής κατέχουν σημαντικό ρόλο, καθώς είναι αυτές που με οδηγό το μικρό ριβονουκεϊκό ρυθμιστή, οδηγούν σε καταστολή της έκφρασης, είτε αποικοδομώντας τον στόχο, είτε παρεμποδίζοντας τη μεταγραφή ή τη μετάφρασή του. Η πρωτεΐνη Ago έχει μοριακή μάζα ~100 kda και αποτελείται από δυο συντηρημένες περιοχές: την PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) -στο αμινοτελικό τους άκρο- και μια καρβοξυτελική περιοχή (PIWI περιοχή) με δράση ομοιάζουσα της RNAσηςΗ, η οποία προσδίδει την ικανότητα κοπής σε μετάγραφα που στοχεύονται για αποικοδόμηση (Carmell et al., 2002) (Σχήμα Α.18). Η περιοχή PIWI φαίνεται να αλληλεπιδρά με την Dicer (Tahbaz et al., 2004). Η PAZ είναι μια περιοχή δέσμευσης RNA (RNA Binding Domain), που αναγνωρίζει ειδικά τα άκρα του δίκλωνου mirna/sirna συμπεριλαμβανομένων και των 3 προεξεχόντων άκρων (Lingel et al., 2004). Αυτή η αλληλεπίδραση εξασφαλίζει την σωστή μετάβαση των μικρών RNAs στο σύμπλοκο RISC, ελαχιστοποιώντας την πιθανότητα λανθασμένης επεξεργασίας του RNA κατά το στάδιο του αποτελέσματος. Να τονιστεί πως ο μηχανισμός με τον οποίο μονόκλωνα sirnas/mirnas δεσμεύονται στην πρωτεΐνη Ago μετά το ξεδίπλωμα των δίκλωνων RNA δεν είναι πλήρως κατανοητός. Διαφορετικοί οργανισμοί έχουν διαφορετικό αριθμό πρωτεϊνών Ago που ποικίλει από 1 στον Schizosaccharomyces pombe, έως 20 στο νηματώδη σκώληκα (Carmell etal., 2002). Στο φυτό A. thaliana έχουν ταυτοποιηθεί 10 μέλη (Hunter et al., 2003), 5 στη D. Melanogaster (Williams et al., 2002) και 8 στον άνθρωπο (Sasaki et al., 2003). Μια μελέτη στη D.melanogaster αποκάλυψε ότι η AGO1 απαιτείται για τη συσσωμάτωση των mirnas ενώ η AGO2 χρειάζεται για την αποικοδόμηση του mrna στόχου μέσω των sirnas (Okamura et al., 2004). Στα φυτά υπάρχουν δέκα μέλη της παραπάνω οικογένειας, ορισμένα από τα οποία έχουν χαρακτηρισθεί και, όπως για την οικογένεια DCL, κατέχουν διακριτούς, αλλά και μερικώς αλληλεπικαλυπτόμενους ρόλους. Τέλος, ορισμένα από τα μονοπάτια της αποσιώπησης έχουν το χαρακτηριστικό της ανάδρασης. Πιο συγκεκριμένα, ο ίδιος ο μηχανισμός «δημιουργεί» δίκλωνο RNA που πυροδοτεί την αποσιώπηση. Υπεύθυνες για τη λειτουργία αυτή είναι οι RNA-εξαρτώμενες-RNA πολυμεράσες (RdRs), οι οποίες με μήτρα μονόκλωνο RNA και τη βοήθεια ή όχι κάποιου εκκινητή παράγουν δίκλωνο RNA, το οποίο χρησιμεύει ως υπόστρωμα των μελών της οικογένειας Dicer (Wasseneger and Krczal, 2006). 40

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.5.2. Κατηγορίες των small RNAs Διακρίνονται τέσσερις κύριες κατηγορίες των small RNAs: short interfering RNAs (sirna), micrornas, piwi-interacting RNA (pirnas) και 21-U RNAs. Μολονότι τα RNAs αυτά απαντώνται κυρίως στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute που μεσολαβούν στην γονιδιακή αποσιώπηση στα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν εντοπιστεί και σε αρχαιοβακτήρια και σε βακτήρια(richard W. Carthew and Erik J. Sontheimer, 2009). Κατά την φυλογενετική πορεία, κατανέμονται κυρίως τα sirnas και τα mirnas τα οποία χαρακτηρίζονται ως δίκλωνα μόρια στοχεύοντας σε συγκεκριμένες λειτουργίες του κυττάρου. Τα mirnas είναι ενδογενή μικρά RNAs που προέρχονται από γενωμικές περιοχές ανεξάρτητες των υπολοίπων γονιδίων (Bartel, 2004). Στα ζώα είναι γνωστό ότι κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον καρκίνο, ενώ στα φυτά εκτός της ρύθμισης αναπτυξιακών προγραμμάτων, εμπλέκονται επίσης στη ρύθμιση διαδικασιών όπως η σηματοδότηση, η απόκριση σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις και η μετάβαση από βλαστητική σε αναπαραγωγική φάση (Zhang et al, 2007). Τα περισσότερα mirna γονίδια εντοπίζονται σε διακριτές περιοχές του γενώματος και αποτελούν ανεξάρτητες μεταγραφικές μονάδες (Lagos-Quintana et al.,2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros 2001). Ωστόσο, ένα μέρος βρίσκεται στα ιντρόνια των πρόδρομων mrnas. Σχεδόν όλα τα mirna γονίδια είναι εξελικτικά συντηρημένα σε συγγενή ζώα, όπως ο άνθρωπος και το ποντίκι, ή ο C. elegans και ο C. briggsae (Lagos-Quintana et al.,2003; Lim et al., 2003a, 2003b). Tα sirnas παράγονται από δίκλωνα RNA μόρια μεγαλύτερου μήκους τα οποία συνθέτονται είτε in vivo προκειμένου να ενεργοποιήσουν έναν προστατευτικό μηχανισμό που μπορεί να χρησιμοποιηθεί από τα κύτταρα για να επιδιορθώσει πρόσφατα βιοσυντιθέμενα mrna και να παρεμποδιστεί η παραγωγή ελαττωματικών πρωτεϊνικών μορίων, είτε in vitro (Bartel, 2004). Παρουσιάζουν δράση in cis δηλαδή στοχεύουν τα μόρια από τα οποία προέρχονται, αντίθετα με τα mirnas που στοχεύουν μετάγραφα με μερική ή πλήρη συμπληρωματικότητα (in trans). Τα αρχικά δίκλωνα μόρια των sirnas, μπορεί να προέρχονται από ιούς που εισβάλουν στο κύτταρο, από μεταθετά στοιχεία ή από διαγονίδια και των δύο κατευθύνσεων, δομής φουρκέτας ή ετεροχρωματινικό DNA (Tomari and Zamore, 2005). Σε πολλές περιπτώσεις, τα mirnas συνδέονται με την μη 3 μεταφράσιμη περιοχή του στόχου τους μέσω ατελούς συμπληρωματικότητας σε διάφορες θέσεις, με αποτέλεσμα να καταστέλλουν την έκφραση του γονιδίου στόχου τους σε επίπεδο 41

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετάφρασης. Αντίθετα, τα sirnas συνήθως συνδέονται με το στόχο τους σε μια θέση μέσω τέλειας συμπληρωματικότητας ζευγών βάσεων, επάγοντας έτσι την νουκλεόλυση του mrna στόχου. Τα ενδογενή sirnas συνήθως επάγουν την αυτοαποσιώπηση, δηλαδή καταστέλλουν ίδιες ή παρόμοιες γενωμικές περιοχές με αυτές από τις οποίες προέρχονται, ενώ τα mirnas επάγουν την ετερο-αποσιώπηση, δηλαδή παράγονται από γονίδια διαφορετικά από εκείνα που καταστέλλουν. Στην συγκεκριμένη διατριβή σχεδιάστηκαν in vitro μικρά δίκλωνα sirna μήκους ~22 νουκλεοτιδίων για την γονιδιακή αποσιώπηση του γονιδίου rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL. H τεχνική που χρησιμοποιήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες βρέθηκε ένα νέο είδος μικρών RNAs μήκους nt, που παράγονται με έναν μηχανισμό που δεν εξαρτάται από την Dicer και αλληλεπιδρούν με μια υποκατηγορία των Argonaute πρωτεϊνών, τις πρωτεΐνες Piwi (Aravin et al., 2006; Brennecke et al., 2007; Girard et al., 2006; Grivna et al., 2006a; Gunawardane et al., 2007; Houwing et al., 2007; Lau et al., 2006; Saito et al., 2006; Vagin et al., 2006; Watanabe et al., 2006), οι οποίες είναι απαραίτητες για την γονιμότητα θηλυκών και αρσενικών ατόμων στη Drosophila (Lin and Spradling et al., 1997). Αυτή η νέα τάξη μικρών RNAs, που αλληλεπιδρά με τις Piwi ονομάστηκαν pirnas. Σε ορισμένα συστήματα τα pirnas προέρχονται από μεταθετόνια και άλλες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Saito et al., 2006), γι αυτό και ονομάζονται εναλλακτικά rasirnas (μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs σχετιζόμενα με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες- repeat associated small interfering RNAs) (Aravin et al., 2003). Είναι πλέον γεγονός ότι τα pirnas μπορεί να προέλθουν από επαναλαμβανόμενες ή μη επαναλαμβανόμενες DNA αλληλουχίες (Aravin et al., 2007; Brennecke et al., 2007; Houwing et al., 2007) και ότι τα rasirnas είναι μια υποκατηγορία των pirnas. Το 2006 ο Ruby και οι συνεργάτες τους εντόπισαν στο νηματώδη σκώληκα C.elegans μια νέα τάξη των smalls RNAs, την 21U-RNAs. Πρόκειται για μόρια RNAs μήκους ακριβώς 21 νουκλεοτιδίων και με μια ουριδίνη στο 5 άκρο που επάγονται από δικούς τους προαγωγείς παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του σκώληκα (Afsar Raza Naqvi et al., 2009). 42

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.5.3 Μονοπάτια γονιδιακής αποσιώπησης Τα μόρια small RNAs εισέρχονται σε συγκεκριμένα κυτταρικά μονοπάτια που είναι γνωστά ως μονοπάτια του παρεμβαλλόμενου RNA, RNA interference pathways. Στάδιο έναρξης Τα πρωτογενή mirna μετάγραφα (pri-mirnas) καταλήγουν σε πρόδρομα μόρια mirna (pre-mirnas) μήκους ~70 νουκλεοτιδίων και στην συνέχεια τα pre-mirnas υφίστανται νουκλεόλυση με την δράση των ενζύμων τύπου RNase III Drosha και Dicer δίδοντας ώριμα mirnas μήκους ~21-25 νουκλεοτιδίων (Lee et al., 2002). Μετά την νουκλεόλυση από τη Drosha, τα πρόδρομα mirnas βγαίνουν από τον πυρήνα με τη βοήθεια της Exportin 5, μιας Ran-GTP πρωτεΐνης-μεταφορέα που βρίσκεται στο σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου (Lund et al., 2004). Η βιογένεση των mirnas και των sirnas στο κυτταρόπλασμα ακολουθεί κοινό μονοπάτι. Τα πρόδρομα mirnas και τα δίκλωνα RNAs από τα οποία θα προκύψουν τα sirnas, υφίστανται νουκλεόλυση από το ένζυμο Dicer, καταλήγοντας σε δίκλωνα τμήματα μήκους ~21 νουκλεοτιδίων, που έχουν 5 φωσφορυλιωμένα άκρα και 3 προεξέχοντα άκρα μήκους 2 νουκλεοτιδίων. Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν ότι η είσοδος ξένου sirna στα κύτταρα γίνεται διαμέσου μιας μεμβρανικής πρωτεΐνης που καλείται SID-1(Systematic RNA Interference Defective), (Afsar Raza Naqvi et. al., 2009). Η είσοδος των δίκλωνων dsrnas διαμέσου της SID-1 εξαρτάται από το μέγεθός τους, μεγαλύτερα μόρια (~500 bps) μεταφέρονται ταχύτερα σε σύγκριση με μικρότερα μεγέθους μόρια (~30 bps). Πρόκειται για μια παθητική μεταφορά που δεν απαιτεί κατανάλωση του ATP. Ανάλογη πρωτεΐνη με την ίδια δράση που απαντάται στα φυτά είναι η PSRP-1 (Phloem Small RNA binding Protein-1), (Afsar Raza Naqvi et. al., 2009). Στάδιο αποτελέσματος Τα μικρά μόρια δίκλωνου RNA που προκύπτουν, συναθροίζονται στο κυτταρόπλασμα, όπου συγκροτούν σύμπλοκες δομές, οι οποίες αποτελούνται από ενδο-ριβονουκλεάσες της οικογένειας Argonaute και RNA και ονομάζονται RNAεπαγόμενα σύμπλοκα αποσιώπησης (RISC: RNA-Induced Silencing Complexes). Στα συγκεκριμένα σύμπλοκα γίνεται αποδιάταξη των δίκλωνων sirnas/mirnas, με μια διαδικασία που απαιτεί υδρόλυση του ATP (Nykanen et al., 2001). Η εκτιμώμενη 43

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φαινόμενη μοριακή μάζα τους ποικίλει από 130 έως 160 kda κατά την απομόνωσή τους από ανθρώπινα κύτταρα παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων (Martinez et al. 2002; Martinez and Tuschl, 2004) και από 500 kda ως 80S σε κυτταρικά εκχυλίσματα D. melanogaster (Nykanen et al., 2001; Hammond et al., 2001; Hutvagner and Zamore 2002). Στη συνέχεια τα σύμπλοκα (RISC) κατευθύνονται σε ομόλογα mrnas τα οποία υβριδίζονται στα μονόκλωνα πλέον sirnas λόγω συμπληρωματκότητας. Σαν αποτέλεσμα, τα μόρια του mrna αρχικά πέπτονται από ενδοριβονουκλεάσες του συμπλόκου. Τα μονοπάτια του παρεμβαλλόμενου RNA (RNA Interference), παρουσιάζονται στο σχήμα Α.19 (Αrenz et al. 2003). Μετά την πέψη από το ένζυμο Dicer, ακολουθεί του ξετύλιγμα του RNA και η δημιουργία του συμπλόκου RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Μέσα στο σύμπλοκο το sirna, τοποθετείται με τέτοιο τρόπο, ώστε να προσελκύσει και να συνδεθεί με τα μόρια mrnas. Το RISC θα συναντήσει εκατοντάδες διαφορετικά mrnas, που βρίσκονται μέσα σε ένα τυπικό κύτταρο, σε κάθε δεδομένη στιγμή. Αλλά το sirna του RISC θα προσδεθεί ισχυρά μόνο με εκείνο το mrna, του οποίου η νουκλεοτιδική αλληλουχία είναι στενά συμπληρωματική με τη δική του. Η αποικοδόμηση του mrna επάγεται από την δομική περιοχή PIWI της πρωτεΐνης Αgo. Στη συνέχεια το RISC απελευθερώνει τα δυο κομμάτια του μορίου mrna τα οποία δεν είναι πλέον σε θέση να κατευθύνουν την πρωτεϊνοσύνθεση (Tomari and Zamore, 2005). Το σύμπλοκο RISC μένει αναλλοίωτο, ελεύθερο να βρει και να πέψει άλλα μόρια mrna. Εναλλακτικά, αν το sirna του RISC δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικό με την αλληλουχία του mrna, τότε το RISC παραμένει προσδεμένο στο mrna με αποτέλεσμα η πρωτεϊνοσύνθεση να εμποδίζεται. Σε κάθε περίπτωση δεν υπάρχει παραγωγή της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί το συγκεκριμένο mrna (Lau & Bartel 2003). Το στάδιο αποτελέσματος της μεταμεταγραφικής αποσιώπησης συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα. Τα sirnas μαζί με τις πρωτεΐνες Αgo συγκροτούν υποκυτταρικές εστίες που καλούνται P-bodies τα οποία περιέχουν μια πληθώρα παραγόντων για την αποικοδόμηση του RNA (Liu et al., 2005b). 44

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.19 Μηχανισμός γονιδιακής αποσιώπησης με την τεχνική του παρεμβαλλόμενου RNA (Αrenz et al., 2003) Α.5.4 Καταστολή της μετάφρασης Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το μονόκλωνο sirna/mirna του συμπλόκου RISC οδηγεί στην αποικοδόμηση του mrna στόχου όταν υπάρχει πλήρης ή σχεδόν πλήρης συμπληρωματικότητα βάσεων (Martinez et al., 2002; Martinez and Tuschl, 2004). Τα mirnas παρουσιάζουν ατελή συμπληρωματικότητα και συνεπώς καθοδηγούν καταστολή της μετάφρασης του στόχου, ενώ αντίθετα τα sirnas εμφανίζουν τέλεια συμπληρωματικότητα και προκαλούν την αποικοδόμηση του RNA στόχου. Το ερώτημα εάν η καταστολή της μετάφρασης λαμβάνει χώρα είτε στην έναρξη της μετάφρασης είτε μετά την έναρξη της δεν έχει αποσαφηνιστεί. Διάφορες υποθέσεις έχουν διατυπωθεί και παρουσιάζονται συνοπτικά στο σχήμα Α.20. Παρατηρήθηκε ότι κατά τον διαχωρισμό σε διαβαθμίσεις σουκρόζης τα mirnas και τα «υποστρώματά» τους συνδέονταν είτε με πολυσώματα (παρεμπόδιση 45

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στην επιμήκυνση και στον τερματισμό της πρωτεϊνικής αλυσίδας), είτε με ελεύθερα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια RNPs (καταστολή στην έναρξη της μετάφρασης). Σύμφωνα με μελέτες των Petersen et al, (2006) τα mirnas παρεμποδίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση μετά την έναρξη της μετάφρασης και η καταστολή του mrna συσχετίζεται με τα πολυσώματα. Η παρατήρηση ότι τα πολυσώματα μεταφράζουν χωρίς όμως να ανιχνεύεται το πρωτεϊνικό προϊόν, οδήγησε στην υπόθεση ότι η πολυπεπτιδική αλυσίδα είναι πιθανόν να αποικοδομείται συμμεταφραστικά από μια άγνωστη πρωτεάση, αλλά αναστολείς του πρωτεασώματος δεν προκαλούν αποκατάσταση της αποσιώπησης (Nottrott et. al, 2006). Ένα άλλο μοντέλο καταστολής προτείνει τον πρώιμο τερματισμό της μετάφρασης με απομάκρυνση των ριβοσωμάτων (ribosome drop off). Καταστολή της μετάφρασης με sirnas οδηγεί σε ταχεία αποσύνδεση των ριβοσωμάτων (Petersen et al., 2006). Σύμφωνα με μια άλλη υπόθεση προτείνεται ο συναγωνισμός του mirisc συμπλόκου με τον παράγοντα έναρξης eif4e (Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E) για την πρόσδεση στο 5` άκρο cap του mrna, παρεμποδίζοντας την έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Παρατηρήθηκε λοιπόν πως κεντρική περιοχή (Mid domain) των πρωτεϊνών της οικογένειας Agronaute, παρουσιάζει ομοιότητα στην αλληλουχία με τον κυτταροπλασματικό παράγοντα eif4e. O παράγοντας eif4e δεσμεύεται στην m7gppp-cap δομή μέσω δύο τρυπτοφανών. Στην αντίστοιχη θέση των 2 τρυπτοφανών, οι Ago φέρουν δυο φαινυλαλαλίνες. Μετάλλαξη μιας από τις δύο φαινυλαλαλίνες σε βαλίνη έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της δράσης των mirnas. Αυτά τα αποτελέσματα στηρίζουν την άποψη ότι τα mirnas εμποδίζουν τη μετάφραση στο στάδιο της αναγνώρισης της δομής cap, εκτοπίζοντας τον παράγοντα eif4e από τη δομή cap (Kiriakidou et al.,2007). Η Chendrimada και οι συνεργάτες της το 2007 παρατήρησαν πως το σύμπλοκο mirisc παρεμποδίζει την συναρμολόγηση της 60S υπομονάδας με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη AGO2 στρατολογεί τον παράγοντα eif6, ο οποίος δεσμεύεται στην μεγάλη ριβοσωμική μονάδα αποτρέποντας την πρόσδεση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων. Ο παράγοντας eif6 εμπλέκεται στην βιογένεση και στην ωρίμανση της μεγάλης υπομονάδας και αποτρέπει την πρόωρη σύνδεση με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Πειράματα έχουν δείξει πως απάλειψη του συγκεκριμένου παράγοντα σε ανθρώπινα κύτταρα ή στον C. elegans έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της καταστολής μέσω mirna (Chendrimada et al., 2007). 46

67 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι πρωτεΐνες Ago παρεμποδίζουν τον σχηματισμό δομής θηλιάς του mrna, μ έναν μηχανισμό που δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως αλλά περιλαμβάνει αποαδενυλιώσεις. Σε κύτταρα Drosophila η αποαδενυλίωση προάγεται από την πρωτεΐνη GW182 καταστέλλοντας την μετάφραση. Τα micrornas επάγουν την αποαδενυλίωση και την απομάκρυνση της cap δομής από το mrna στόχο (Behm- Ansmant et al., 2006). Σχήμα Α.20 Πιθανοί μηχανισμοί καταστολής της μετάφρασης (Carthew και Sontheimer, 2009) Όταν το σύμπλοκο mirisc προσδεθεί στο mrna καταστέλλει την έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης είτε εμποδίζοντας τη μετάφραση στο στάδιο της αναγνώρισης της δομής cap είτε παρεμποδίζοντας την συναρμολόγηση της 60S υπομονάδας με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Εναλλακτικά, μπορεί το σύμπλοκο αποσιώπησης να επάγει την αποαδενυλίωση και την απομάκρυνση της cap δομής από το mrna στόχο. Επίσης καταστολή μπορεί να συμβεί μετά την έναρξη της μετάφρασης με απομάκρυνση των ριβοσωμάτων (ribosome drop off). 47

68 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.6 Ερυθροδιαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων Α.6.1 Αιμοποίηση Αιμοποίηση ονομάζεται το σύνολο των ενορχηστρωμένων διαδικασιών ενός αυστηρά ρυθμιζόμενου συστήματος παραγωγής των έμμορφων στοιχείων του αίματος, στο μυελό των οστών και στη λέμφο. Ο αιμοποιητικός ιστός εντοπίζεται στις μυελικές κοιλότητες των οστών και αναπτύσσεται σε ορισμένες θέσεις που αποτελούνται κυρίως από κύτταρα λείων μυϊκών ινών, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, λιποκύτταρα και οστεοβλάστες. Τα κύτταρα αυτά αποτελούν το μυελικό στρώμα που είναι το κατάλληλο μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη τόσο των αρχέγονων και προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, όσο και των ώριμων κυττάρων των μυελικών σειρών (Beutler and Williams 1995). Οι αρχέγονες προγονικές κυτταρικές μορφές στον ερυθρό μυελό των οστών αντιπροσωπεύονται από δυο κατηγορίες κυττάρων: τα πολυδύναμα (pluripotent stem cells) και τα μονοδύναμα (monopotent stem cells) «δεσμευμένα» κύτταρα (committed cells), τα οποία προκύπτουν από τα πρώτα. Η αιμοποίηση ξεκινά από τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία αποτελούν το 0,5-1% του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων του μυελού των οστών. Στο σχήμα Α.21 δίνεται περιληπτικά η ανάπτυξη των κυττάρων της μυελικής και λεμφικής σειράς από το αρχέγονο πολυδύναμο αιμοποιητικό κύτταρο, καθώς και οι αναπτυξιακοί παράγοντες που συμβάλουν στη διαδικασία αυτή. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, με τη δυνατότητα που τους παρέχει η ασύμμετρη διαίρεσή τους, οδηγούνται στο σχηματισμό δύο θυγατρικών κυττάρων με διαφορετικές ιδιότητες. Το ένα είναι πανομοιότυπο με το μητρικό κύτταρο που το αναπαράγει, ενώ το άλλο είναι πολυδύναμο (multipotent stem cell) με δυναμικό διαφοροποίησης, από το οποίο θα προκύψουν τελικά τα δεσμευμένα κύτταρα (committed cells) και θα αρχίσει η παραγωγή των έμμορφων συστατικών του αίματος. «Δέσμευση» ονομάζεται η διαδικασία κατά την οποία το αρχέγονο κύτταρο χάνει τη δυνατότητα της αναπαραγωγής του. Σε αυτό το σημείο πρέπει να τονιστεί ότι όσο προχωράμε στα στάδια της διαφοροποίησης ενός κυττάρου, το δυναμικό της κυτταρικής αναπαραγωγής μειώνεται αντιστρόφως ανάλογα με το βαθμό της διαφοροποίησής του (Metcalf 1989; Dexter, Heyworth et al. 1990; Dexter and Fairbairn 1993). Αναλυτικότερα, από τα αρχέγονα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα παράγονται τα μερικώς διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και της λεμφικής σειράς. Από τα μητρικά κύτταρα της λεμφικής σειράς σχηματίζονται τα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα, ενώ 48

69 ΕΙΣΑΓΩΓΗ από τα μυελικά μητρικά κύτταρα τα RBCs, τα ουδετερόφιλα, τα ηωσινόφιλα, τα βασεόφιλα, τα αιμοπετάλια και τα μονοπύρηνα Gilbert and Singer, (2000). Σχήμα Α.21 Σχηματική απεικόνιση της ωρίμανσης των κυττάρων κατά την αιμοποίηση. (Gilbert and Singer, 2000) Ag: Antigen, EPO: Erythropoietin, G-CSF: Granulocyte- Colony Stimulating Factor, GM-CSF: Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, IL: Interleukin, LIF: Leukemia Inhibiting Factor, M-CSF: Macrophage-Colony Stimulating Factor, MHCI: Major Histocampatability 49

70 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Complex type I protein, MHCII: Major Histocampatability Complex type II protein, SCF: Stem Cell Factor, SDF-1: Stromal Derived Factor-1, TNF: Tumor Necrosis Factor, Tpo: Thrombopoietin. (Gilbert and Singer 2000) Ο αριθμός των ώριμων κυττάρων του αίματος διατηρείται σε φυσιολογικές συνθήκες μέσα σε καθορισμένα πλαίσια και αυτά που παράγονται αντικαθιστούν αυτά που φυσιολογικά καταστρέφονται. Η εφαρμογή in vitro καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων, επέτρεψε ώστε να καθοριστούν πειραματικά διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης (growth factors), οι οποίοι συμβάλουν στην αναπαραγωγή και τη διαφοροποίησή τους (Charbord, Fujiwara et al. 1986; Chang, Allen et al. 1989). Οι παράγοντες αυτοί διαχωρίζονται σε επαγωγείς της αύξησης και σε επαγωγείς της διαφοροποίησης. Οι μεν πρώτοι (με κυριότερους εκπροσώπους τις ιντερλευκίνες και τις κυτοκίνες), προάγουν την αύξηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ οι δεύτεροι (EPO, GM-CSF, CSF, κ.ά.) συμβάλλουν στη διαφοροποίηση των κυττάρων προς ένα συγκεκριμένο φαινότυπο (Metcalf 1989; Stamatoyannopoulos 2005). Α.6.2 Οι λευχαιμίες ως διαταραχή της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων Οι λευχαιμίες αποτελούν αιματολογικές δυσπλασίες και χαρακτηρίζονται από την παρουσία ανώμαλων αιμοποιητικών κυττάρων που αναπαράγονται αλλά δεν διαφοροποιούνται ώστε να σχηματίσουν ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια (Bonnet and Dick 1997; Enver and Greaves 1998; Tenen 2003). Οι λευχαιμίες καλύπτουν ένα μεγάλο ποσοστό των αιματολογικών διαταραχών και απαντώνται ως οξείες ή χρόνιες καταστάσεις, με σχετικά χαμηλή συχνότητα (5-8 περιπτώσεις ανά 105 άτομα) (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Φυσιολογικά, τα HSCs (Hematopoietic Stem Cells) είναι προγραμματισμένα να διαφοροποιούνται προς συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές, μετά την επαγωγή τους από εξειδικευμένους αναπτυξιακούς παράγοντες, οι οποίοι διατηρούν την ισορροπία μεταξύ κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωσης) στο μυελό των οστών (Socolovsky, Lodish et al. 1998; Cantor and Orkin 2001; Fisher 2002). Πρόσφατα έχει δειχτεί ότι στην παραπάνω διαδικασία εμπλέκονται και ορισμένοι ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες (Cantor and Orkin 2001; Graf 2002). Η «δέσμευση» των HSCs συνοδεύεται από τη μη αντιστρεπτή ωρίμανσή τους, την προοδευτική μείωση του δυναμικού της κυτταρικής αναπαραγωγής ή ακόμα και την απόπτωση τους (Enver and Greaves 1998). 50

71 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σε περιπτώσεις λευχαιμίας, τα πρόδρομα ερυθροκύτταρα αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στα εξωτερικά ερεθίσματα του μικρο-περιβάλλοντος του μυελού των οστών, με αποτέλεσμα να διαφοροποιούνται προς μη φυσιολογικές μορφές αιμοποιητικών κυττάρων (Fialkow, Singer et al. 1981). Στα λευχαιμικά κύτταρα ο μηχανισμός της απόπτωσης είναι συνήθως αδρανοποιημένος, και τα κύτταρα αυτά πολλαπλασιάζονται συνεχώς σε βάρος των υπολοίπων κυττάρων του μυελού των οστών και τελικά εισβάλουν στο περιφερικό αίμα. Έτσι, οι λευχαιμίες θεωρούνται διαταραχή τόσο της διαφοροποίησης όσο και της απόπτωσης των αιμοποιητικών κυττάρων (Domen 2001). Επίσης η επαγωγή της διαφοροποίησης είναι δυνατόν να μειώσει ή ακόμη να καταργήσει το δυναμικό της κακοήθειας στα λευχαιμικά κύτταρα (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Από τις αρχές τις δεκαετίας του 70, ξεκίνησαν να απομονώνονται διάφοροι κλώνοι λευχαιμικών κυττάρων που αναπαράγονται σε ιστοκαλλιέργειες διατηρώντας τον νεοπλασματικό τους φαινότυπο. Τέτοια κύτταρα ή κυτταρικές σειρές προήλθαν ή από πειραματόζωα (π.χ. MEL) ή από αρρώστους με κάποιο τύπο λευχαιμίας (HL-60, K-562, KG-1, U-937). Οι λευχαιμικές αυτές κυτταρικές σειρές έχουν σταθερή κινητική κυτταρικής αναπαραγωγής, που δεν μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, και σχηματίζουν ομοιογενείς πληθυσμούς. (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Η επαγωγή διαφοροποίησης λευχαιμικών κυττάρων με χημικούς ή φαρμακολογικούς παράγοντες ενισχύει την άποψη ότι τα λευχαιμικά κύτταρα που έχουν υποστεί αλλοιώσεις στο αναπτυξιακό τους πρόγραμμα μπορεί να επανέλθουν στον φυσιολογικό δρόμο της διαφοροποίησης Α.7. Το σύστημα των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστημα μελέτης, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro Α.7.1 MEL (Murine ErythroLeukemia) ή Friend leukemia κύτταρα: Τα ερυθρολευχαιµικά κύτταρα ποντικού MEL ή κύτταρα Friend απομονώθηκαν αρχικά από τους Friend et al., το 1966, από κυτταρικές αποικίες που εμφανίστηκαν σε διογκωμένο σπλήνα πειραματόζωων (ποντίκια του είδους DAB/2J), τα οποία είχαν εμβολιασθεί προηγούμενα µε ιό τύπου FLV, (Friend Leukemia Virus) (Harrison 1976). Τα κύτταρα αυτά, έχουν μορφολογικά χαρακτηριστικά προερυθροβλαστών, των πρόδρομων δηλαδή ερυθροκυττάρων, µε τη διαφορά ότι 51

72 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παραμένουν σε αυτό το αναπτυξιακό στάδιο, χωρίς να έχουν τη δυνατότητα περαιτέρω διαφοροποίησης. Η ανακάλυψη ότι τα MEL κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα που προσομοιάζουν με ορθοχρωματικούς νορμοβλάστες (Friend, Scher et al. 1971) ήταν η αρχή εκτεταμένης έρευνας παγκοσμίως που οδήγησε στην επονομαζόμενη «Θεραπεία του καρκίνου με διαφοροποίηση» (Differentiation Therapy of Cancer) (Lotan, Francis et al. 1990), δηλαδή τη θεραπεία καρκινοπαθών με χημικές ουσίες που επάγουν την τελική διαφοροποίηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Τέτοια κύτταρα αναπτύσσονται σε καλλιέργεια και διαφοροποιούνται προς την ερυθρά σειρά έπειτα από επώαση με διάφορες χημικές ενώσεις στις οποίες περιλαμβάνονται πολικοί διαλύτες (DMSO, DMF), βουτυρικό οξύ, αντινεοπλασματικά αντιβιοτικά (ακτινιμυκίνη D, ανθρακυκλίνες), παράγωγα ουρίας, πουρίνης και θειουρίας, υποκατασταμένα παράγωγα πυριμιδίνης, διακεταμίδια, αντιμεταβολίτες ιντερφερόνες, ουσίες που αναδομούν τη χρωματίνη κ. α. (Tsiftsoglou et al., 2003 a). Στην προκείμενη διδακτορική διατριβή, ο χημικός επαγωγέας που χρησιμοποιήθηκε για την διαφοροποίηση των MEL κυττάρων ήταν εξαμεθυλενοδισακεταμίδιο (HMBA). Η επαγωγή της διαφοροποίησης από το HMBA συνοδεύεται από αλλαγές στην έκφραση ορισμένων γονιδίων, που εμφανίζονται 1-4 ώρες μετά την έκθεση στο αντιδραστήριο. Οι αλλαγές αυτές, περιλαμβάνουν την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων c-myc και c-myb και την πτώση των επιπέδων της πρωτεΐνης p53 (Ramsay, Ikeda et al. 1986; Melloni, Pontremoli et al. 1987; Melloni, Pontremoli et al. 1989). Ενώ είναι αναγκαίες, δεν είναι ικανές από μόνες τους να οδηγήσουν στη δέσμευση και τελική διαφοροποίηση, η οποία παρατηρείται ώρες μετά την έναρξη της επαγωγής και η οποία μπορεί να αποφευχθεί με την αφαίρεση του επαγωγέα πριν περάσει το παραπάνω χρονικό διάστημα (Fibach, Reuben et al. 1977). Εκτός των MEL, το HMBA επάγει τη διαφοροποίηση των HL- 60, των U937 (Haces, Breitman et al. 1987) και των Κ562 κυττάρων (Green, Rockman et al. 1993). Τα διαφοροποιημένα MEL κύτταρα μπορεί να αποβάλλουν τον πυρήνα και να παράγουν μεγάλες ποσότητες αιμοσφαιρίνης μοιάζοντας με τα δικτυοερυθροκύτταρα. Κατά την διαφοροποίηση υπόκεινται σε μια σειρά μορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών, που προσομοιάζουν τις αντίστοιχες που παρατηρούνται κατά τη φυσιολογική διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων της ερυθράς σειράς (Tsiftsoglou and Robinson 1985). Αυτές περιλαμβάνουν ελάττωση του μεγέθους του κυττάρου, πύκνωση του πυρήνα, διαδοχικές αλλαγές της αρχιτεκτονικής της κυτταρικής μεμβράνης και μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή πολλών γονιδίων 52

73 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Sartorelli 1981). Στον πίνακα 2 αναφέρονται οι αλλαγές που παρατηρούνται κατά την διαφοροποίηση. Πίνακας 2: Μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές που παρατηρούνται κατά τη διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL in vitro Μορφολογικές: 1. Ελάττωση κυτταρικού μεγέθους 2. Εξαφάνιση των πυρηνίσκων 3. Συμπύκνωση του πυρηνικού υλικού 4. Ελάττωση του λόγου πυρήνα/κυτταροπλάσματος Μεταβολές κυτταρικής επιφάνειας και μεμβράνης: 1. Ελάττωση μεταφοράς αμινοξέων και νουκλεοζιτών 2. Μεταβολές στο ηλεκτροχημικό μηχανισμό 3. Ελάττωση της ρευστότητας της μεμβράνης 4. Μεταβολές στη σύσταση φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης 5. Ελάττωση στη σύνθεση γλυκοπρωτεϊνών 6. Αύξηση στον αριθμό των υποδοχέων της τρασνφερρίνης 7. Αύξηση στη μεταφορά ιόντων σιδήρου 8. Εμφάνιση ερυθροκυτταρικών αντιγόνων και σπεκτρίνης 9. Μεταβολές στη μεταφορά ιόντων και της Na + /K + -ATPase Αύξηση στη μεταφορά ιόντων Ca 11. Αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης Μεταβολές μεταβολισμού: 1. Μεταβολές στο μεταβολισμό του trna 2. Ελάττωση στο σχηματισμό S-αδενοσυλο-μεθειονίνης (SAM) 3. Αύξηση της αποαμινάσης της κυτιδίνης 4. Διαδοχική επαγωγή ενζύμων βιοσύνθεσης της αίμης 5. Αύξηση σταθερότητας του mrna της αιμοσφαιρίνης 6. Παραγωγή του mrna της αιμοσφαιρίνης και σύνθεση αιμοσφαιρίνης 7. Μεταβολές της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης 8. Δραματική πτώση στο ρυθμό πρωτεϊνικής σύνθεσης Πυρηνικές μεταβολές: 1. Μόνιμη διακοπή της αναπαραγωγής του DNA 2. Απενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων που κωδικοποιούνται προς rrna α 3. Εμφάνιση της πρωτεΐνης IP Εξαφάνιση των πυρηνικών πρωτεϊνών HMG-1 και HMG-2 5. Ελάττωση στο ρυθμό φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών 6. Μεταβολές στην ADP- ριβοσυλίωση των πρωτεϊνών 7. Ελάττωση του ρυθμού μεθυλίωσης του DNA 8. Διβασική αναστολή μεταγραφής των γονιδίων c-myc και p53 9. Αύξηση υπερευαισθησίας του DNA σε DNAase I (α και β γονίδια αιμοσφαιρίνης) 10. Ελάττωση της λιγάσης του DNA 11. Διάσπαση του DNA Αύξηση μιας ενδονουκλεάσης που ενεργοποιείται με Ca 13. Μεταβολές στο ρυθμό σύνθεσης και ακετυλίωσης των ιστονών Παρόλα αυτά, σε αντίθεση με τα φυσιολογικά πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (CFU-E), τα MEL κύτταρα δεν ανταποκρίνονται στη μιτογόνο δράση της ερυθροποιητίνης και δεν διαφοροποιούνται προς ερυθροκύτταρα. Κύτταρα MEL, δεσμευμένα προς την τελική διαφοροποίηση, εμφανίζουν προγραμματισμένο 53

74 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιορισμό της ανάπτυξής τους σε 4-5 κυτταρικές διαιρέσεις και στη συνέχεια εισέρχονται σε φάση στασιμότητας G 1 /G 0 (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Έχει βρεθεί, πως η έναρξη της διαφοροποίησης πιθανώς να συμβαίνει κατά τη G 1 /S φάση του κυτταρικού κύκλου (Friedman και Schildkraut, 1977, Geller et al., 1978). Όλα αυτά δείχνουν, πως η κυτταρική αναπαραγωγή και η διαφοροποίηση είναι διαδικασίες στενά εναρμονισμένες κατά την ερυθροποίηση. Η δέσμευση των MEL κυττάρων, προκειμένου να εισαχθούν στο πρόγραμμα διαφοροποίησης, αρχίζει από μια διαδικασία που έχει να κάνει με αλληλεπίδραση του επαγωγέα με κάποιον υποδοχέα. Αυτό ενισχύεται από το εύρημα πως η ριβοσωμική πρωτεΐνη της μικρής υπομονάδας, S3, πιθανώς να αλληλεπιδρά με τον παράγοντα SAHA, ο οποίος είναι ένας επαγωγέας της ερυθράς ωρίμανσης των MEL κυττάρων (Webb et al., 1999). Α.7.2 Το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων Η ανάλυση των μεταβολών που παρατηρούνται κατά την διαφοροποίηση των MEL κυττάρων σε συνάρτηση με το χρόνο, έδειξε ότι όλες σχεδόν οι μεταβολές που παρατηρούνται, συμβαίνουν προγραμματισμένα και συμβάλλουν στην έκφραση ενός συντονισμένου προγράμματος διαφοροποίησης που μοιάζει πολύ με την φυσιολογική διαφοροποίηση των προερυθροβλαστών προς ερυθρά αιμοσφαίρια. Η in vitro διαφοροποίηση των κυττάρων MEL χαρακτηρίζεται από παροδικές ή αντιστρεπτές και μόνιμες ή μη αντιστρεπτές μεταβολές. Οι παροδικές μεταβολές παρατηρούνται στις πρώτες ώρες επώασης των κυττάρων με τον επαγωγέα και δεν οδηγούν σε διαφοροποίηση καθώς μετά την απομάκρυνση του επαγωγέα τα κύτταρα παραμένουν αδιαφοροποίητα. Από την άλλη μεριά, οι μόνιμες μεταβολές παρατηρούνται μετά από ένα χρονικό διάστημα ωρών, (λανθάνουσα περίοδος), η οποία προηγείται της συσσώρευσης των δρομολογημένων κυττάρων στη διαφοροποίηση και κατά την οποία είναι απαραίτητη η παρουσία του επαγωγέα. Από το χρονικό αυτό σημείο και μετά, η παρουσία του επαγωγέα δεν κρίνεται απαραίτητη για το κύτταρο, προκειμένου να φτάσει σε υψηλά ποσοστά σύνθεσης αιμοσφαιρίνης και να περιορίσει το δυναμικό πολλαπλασιασμού του, ενώ τα κύτταρα δρομολογούνται για διαφοροποίηση. Η λανθάνουσα περίοδος, δεν εξαρτάται από την συγκέντρωση του επαγωγέα, ενώ από αυτήν εξαρτάται ο ρυθμός συσσώρευσης των δρομολογημένων κυττάρων (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Οι παροδικές μεταβολές αφορούν κυρίως μεταβολές της κυτταρικής επιφάνειας που επηρεάζουν την διαπερατότητα των ιόντων σιδήρου, καλίου, 54

75 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ασβεστίου καθώς και την τοπογραφία και ρευστότητα των μορίων της κυτταρικής μεμβράνης (π.χ. γλυκοπρωτεΐνες, φωσφολιπίδια). Έτσι λοιπόν η διαφοροποίηση των MEL κυττάρων συμβαίνει στοχαστικά, με μια συγκεκριμένη πιθανότητα P, που σημαίνει πως σε κάθε γενιά, μόνο ένας καθορισμένος αριθμός κυττάρων διαφοροποιείται μόνιμα. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα υπόκεινται σε 4-5 διαιρέσεις (Gusella et al., 1976) όπως φαίνεται στο σχήμα Α.22. Σχήμα Α.22 Σχηματική αναπαράσταση των κυριοτέρων σταδίων του αναπτυξιακού προγράμματος των MEL κυττάρων (Tsiftsoglou et al., 2003 a) Ο επαγωγέας, (I), αλληλεπιδρά εκλεκτικά με έναν κυτταροπλασματικό υποδοχέα, (R), και διεγείρει την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης, που συμβαίνει με μια πιθανότητα P. Μια λανθάνουσα περίοδος απαιτείται πριν τα κύτταρα δρομολογηθούν μη αντιστρεπτά στην ερυθρά ωρίμανση και ελαττωθεί το δυναμικό κυτταρικής αναπαραγωγής, (4-5 διαιρέσεις). Υπάρχουν ουσίες που μπορούν να σβήσουν την ιδιότητα της μνήμης. Με τη χρήση διαφόρων ουσιών, το πρόγραμμα θεωρητικά διαχωρίζεται σε δυο υποπρογράμματα που λαμβάνουν χώρα ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. Η διαφοροποίηση των MEL κυττάρων χαρακτηρίζεται από σημαντική αύξηση του mrna της αιμοσφαιρίνης. Παίρνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη και την 55

76 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παρατήρηση ότι κύτταρα MEL που επωάστηκαν με τον επαγωγέα για κάποια χρονική περίοδο παρουσιάζουν την ικανότητα μνήμης, δηλαδή αναγνωρίζουν το αρχικό σήμα ή ερέθισμα και συνεχίζουν την διαφοροποίηση τους όταν μετά την απομάκρυνση του επαγωγέα επωαστούν ξανά με αυτόν, με άλλα λόγια φαίνεται πως τα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να θυμούνται την προηγούμενη έκθεση στον επαγωγέα (Levenson και Housman, 1979). Φαίνεται λοιπόν, πως το αναπτυξιακό πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από διάφορες κύριες διεργασίες ή προγράμματα, που συντονίζονται για την έκφραση του ερυθρού φαινότυπου. Το γεγονός ότι η μνήμη μπορεί να διαρκέσει για περισσότερες από μια ή δυο γενιές κυττάρων, δείχνει ότι αυτή μεταβιβάζεται από τα μητρικά στα θυγατρικά κύτταρα και δεν επηρεάζεται από την αντιγραφή και τη σύνθεση του DNA. Έχουν βρεθεί διάφορες ουσίες που έχουν την ιδιότητα να σβήνουν τη μνήμη των MEL κυττάρων, αναστέλλοντας συγχρόνως και τη διαφοροποίηση (Levenson και Housman, 1981, Tsiftsoglou et al., 1983). Με βάση αυτά τα δεδομένα, είναι λογικό να θεωρηθεί πως είτε ένα μόριο mrna, είτε ένα πρωτεϊνικό μόριο, είναι πιθανώς υπεύθυνο για την έκφραση της μνήμης των MEL κυττάρων σε μοριακό επίπεδο (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Με βάση τα παραπάνω, προτείνεται πως το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από δυο υποπρογράμματα (Τσιφτσόγλου, 1989). Το ένα διεγείρεται από την αίμη και είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της μεταφοράς των ιόντων Fe +++, τη βιοσύνθεση της αίμης, τη σύνθεση του mrna της αιμοσφαιρίνης, ενώ το άλλο, καθορίζει την ελάττωση του δυναμικού κυτταρικής αναπαραγωγής, την ικανότητα του DNA να μεταγράφεται και τη συμπύκνωση του πυρηνικού υλικού. Στο σχήμα Α.22, φαίνεται το αναπτυξιακό πρόγραμμα των MEL κυττάρων. Η κινητική μελέτη της έκφρασης γονιδίων σε κύτταρα MEL παρουσία επαγωγέα, έδειξε ότι η έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων αλλάζει κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας περιόδου, πριν και μετά την έναρξη της δρομολόγησης των κυττάρων. Αυτές οι αλλαγές αφορούν σε γονίδια που έχουν να κάνουν με την κυτταρική οικονομία, (housekeeping genes), που κωδικοποιούν προϊόντα ογκογονιδίων και μεταγραφικούς παράγοντες, ένζυμα του κυτταρικού κύκλου, μιτοχονδριακές αιμοπρωτεΐνες και αρκετές άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα, όπως είναι οι ιστόνες. Έχει βρεθεί πως τα επίπεδα των γονιδίων β major και β minor των σφαιρινών, πριν από τη δρομολόγηση είναι σταθερά, ενώ μετά από αυτή, αυξάνονται (Curtis et al., 1980). Η GATA-1, η οποία αποτελεί ένα μεταγραφικό διεγέρτη της διαφοροποίησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων και είναι υπεύθυνη για την αρχική και οριστική ερυθροποίηση, παρουσιάζει μια διφασική συμπεριφορά, (πτώση και αύξηση 56

77 ΕΙΣΑΓΩΓΗ των επιπέδων), πριν από τη δρομολόγηση, ενώ μετά από αυτή, παρατηρείται αύξηση (Green et al., 1992). Οι μεταγραφικοί παράγοντες GATA χαρακτηρίζονται από την παρουσία συντηρημένων zinc-finger περιοχών. Πειράματα γενετικής έχουν αποδείξει πως 5% της φυσιολογικής έκφρασης της GATA-1 παρεμποδίζει την απόπτωση, ρυθμίζοντας αντι-αποπτωτικά γονίδια όπως η Bcl-x L. Επίσης η GATA-1 προάγει τα κύτταρα που βρίσκονται στο τελικό στάδιο της διαφοροποίησης να σταματήσουν στη G 1 /G 0 φάση του κυτταρικού κύκλου με το να καταστέλλει μιτογόνα γονίδια όπως το c-myc. Την ίδια διφασική συμπεριφορά, αλλά με τελική πτώση των επιπέδων, παρουσιάζουν το ογκογονίδιο c-myc (Lachman και Skoultchi, 1984) και ο ογοκαταστολέας p53 (Tsiftsoglou et al., 1987). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος, (prb), αυξάνονται μετά την έναρξη της δρομολόγησης (Copppola et al., 1990), ενώ δεν υπάρχουν στοιχεία που να αναφέρουν τι συμβαίνει πριν από αυτή. Τα επίπεδα των κινασών του κυτταρικού κύκλου, Cdk2, Cdk4, παραμένουν σταθερά και στη συνέχεια πέφτουν, πριν και μετά τη δρομολόγηση των κυττάρων (Hsieh et al., 2000). Την ίδια συμπεριφορά παρουσιάζουν και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες S5 και L35a (Vizirianakis et al., 1999, Pappas et al., 2001). Τέλος, τα επίπεδα των ριβοσωμικών RNAs, (rrnas), φαίνεται να πέφτουν, τόσο πριν, όσο και μετά από τη δρομολόγηση των MEL κυττάρων (Tsiftsoglou et al., 1982). A.8 Κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου Οι δύο κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου είναι η απόπτωση (apoptosis) και η νέκρωση (necrosis). Η απόπτωση αφοράν έναν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, που αποσκοπεί στην εξάλειψη κυττάρων τα οποία έχουν ολοκληρώσει τον κύκλο ζωής τους ή φέρουν γενετικές βλάβες. Αποτελεί δηλαδή ένα γενετικά ελεγχόμενο σύστημα «αυτοκαταστροφής» του κυττάρου, που παίζει σημαντικότατο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στην ωρίμανση και στη λειτουργία των πληθυσμών του ανοσοποιητικού και αιμοποιητικού συστήματος και στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς (Jacobson et al 1997). Από την άλλη πλευρά, η νέκρωση αποτελεί μια ανεξέλεγκτη, μη ρυθμιζόμενη γενετικά διαδικασία, που είναι το αποτέλεσμα οξέος κυτταρικού τραυματισμού, προερχόμενου από ποικίλες καταστάσεις, όπως μόλυνση, φλεγμονή κ.λ.π. και έχει ως συνέπεια την αποτυχία των φυσιολογικών μηχανισμών που είναι απαραίτητοι για τη διατήρηση της ομοιοστασίας, όπως η μεταφορά ιόντων, η παραγωγή ενέργειας και η διατήρηση της οξεοβασικής ισορροπίας. Πρόκειται για μια παθητική διαδικασία, που δεν απαιτεί την κατανάλωση ενέργειας και μορφολογικά χαρακτηρίζεται από 57

78 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διόγκωση του κυτταροπλάσματος, λύση της κυτταρικής μεμβράνης και αποβολή του κυτταροπλασματικού περιεχομένου (Nicotera et al 2004, Okada et al 2004) ενώ παράλληλα επέρχεται και πλήρης αποδόμηση και καταστροφή των ενδοκυττάριων οργανιδίων. Η έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου έχει ως αποτέλεσμα την κινητοποίηση φλεγμονώδους αντίδρασης από το ανοσοποιητικό σύστημα και την καταστροφή του ιστού που περιβάλλει τη νεκρωτική εστία. Μία άλλη μορφή μη-αποπτωτικού και μη-νεκρωτικού προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου είναι η «αυτοφαγία». Η κυτταρική αυτοφαγία επάγεται από την έλλειψη αμινοξέων και εξυπηρετεί πρωταρχικά μια ομοιοστατική λειτουργία που σχετίζεται με την ισορροπία αμινοξέων / πρωτεϊνών στο κύτταρο. Η αποκοδόμηση των ενδογενών πρωτεϊνών γίνεται στα λυσοσώματα με αυτοφαγοκύτωση. (Kim et al 2000). Τέλος μια άλλη μορφή κυτταρικού θανάτου είναι και η μιτωτική καταστροφή (mitotic catastrophy). A.9 Χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων Οι πιο σημαντικές μεταβολές που συμβαίνουν στα αποπτωτικά κύτταρα είναι η διάσπαση του DNA, η συμπύκνωση της χρωματίνης και η εξαφάνιση της πυρηνικής μεμβράνης. Η αποικοδόμηση του DNA αρχίζει μετά την πρωτεολυτική διάσπαση- από την κασπάση 3 ή 7 - του αναστολέα της DNAασης (ενεργοποιείται από την κασπάση, caspase activated DNAase-ICAD, ή DFF45), που έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση της CAD (DFF40 ή CPAN) και επομένως την διάσπαση (Sakahira et al 1998). Η διάσπαση του DNA προκαλείται επίσης και από την απελευθέρωση του παράγοντα AIF από τα μιτοχόνδρια, ο οποίος μετακινείται στον πυρήνα και διασπώντας το DNA σε μεγάλα τμήματα οδηγεί στον σχηματισμό DNA «σκάλας» (DNA ladder). Επίσης ο AIF προκαλεί και συμπύκνωση της χρωματίνης. Εκτός από τον AIF απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια και η ενδονουκλεάση G, η οποία μεταφέρεται με τη σειρά της στον πυρήνα και με συνέργεια διαφόρων εξωνουκλεασών και DNAασης Ι αποικοδομεί το DNA (Widlak et al 2001). Εκτός από τη διάσπαση του γενετικού υλικού κατά την απόπτωση παρατηρούνται και δομικές μεταβολές του κυτταρικού σκελετού, συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, συρρίκνωση των οργανιδίων, σχηματισμός φυσαλίδων (blebbing) στην κυτταρική μεμβράνη με τελικά σχηματισμός των αποπτοσωματίων. H διάσπαση των πρωτεϊνών των πυρηνικών πόρων (NUP 153), τόσο της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (LBR, Lap2) όσο και της εξωτερικής πυρηνικής (λαμινίνη Β) 58

79 ΕΙΣΑΓΩΓΗ που προκαλείται από τις κασπάσες οδηγεί σε διάλυση της πυρηνικής μεμβράνης (Buendia et al 1999). Ένα πρώιμο γεγονός κατά την αποπτωτική διαδικασία είναι η «απώλεια της αμινοφωσφολιπιδικής ασυμμετρίας» της κυτταρικής μεμβράνης, με την μετατόπιση της φωσφατιδυλοσερίνης (PS) από την εσωτερική προς την εξωτερική της στιβάδα. Η μετατόπιση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των αποπτωτικών σωματίων, που σχηματίζονται από εγκολπώσεις της κυτταρικής μεμβράνης και τα οποία περικλείουν τμήματα του κυτταροπλάσματος, από τα φαγοκύτταρα, τα οποία φέρουν αντίστοιχους υποδοχείς για την PS (Martin et al 1995). Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται οι κύριες διαφορές μεταξύ νέκρωσης και απόπτωσης. Πίνακας 3: Βασικές διαφορές απόπτωσης και νέκρωσης Αιτία Ενέργεια Χαρακτηριστικά Απόπτωση Ποικίλα εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια ερεθίσματα Ενεργητική διαδικασία που βασίζεται στην κατανάλωση ATP Συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος Φυσαλιδοποίηση (blebbing) της κυτταρικής μεμβράνης Τελικός σχηματισμός πολλαπλών κυστιδίων (αποπτωτικά σωμάτια) που περιβάλλονται από μεμβράνη και περικλείουν κυτταρόπλασμα και οργανίδια Νέκρωση Οξύς κυτταρικός τραυματισμός λόγω εξωκυττάριων ερεθισμάτων Παθητική διαδικασία, δεν απαιτείται η κατανάλωση ενέργειας Διόγκωση του κυτταροπλάσματος, αυξημένη κενοτοπίωση, διόγκωση μιτοχονδρίων και λύση κυτταρικών οργανιδίων Λύση της κυτταρικής μεμβράνης και έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου και των οργανιδίων Συμπύκνωση της χρωματίνης σε μάζες ομοιογενούς πυκνότητας Διάσπαση του DNA στο επίπεδο των νουκλεοσωμάτων - Τυχαία διάσπαση του DNA σε θραύσματα ποικίλων 59

80 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (χαρακτηριστική μορφή διαστάσεων «σκάλας» -DNA ladder στην ηλεκτροφόρηση) Βιοχημικά χαρακτηριστικά Εξαρτώμενη από τις κασπάσες Ανεξάρτητη από τις κασπάσες Αποτέλεσμα αντίδρασης Φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματίων χωρίς την πρόκληση φλεγμονώδους αντίδρασης Φλεγμονώδης αντίδραση Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα έχει αναφερθεί ότι η μετάπτωση της φωσφατιδυλοσερίνης (phosphatidyl-serine-ps) από την εσωτερική προς την εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης, που αποτελεί μία από τις πρώιμες μοριακές αλλαγές της απόπτωσης (Martin et al 1995) καθώς και η θραύση του DNA στο επίπεδο των νουκλεοσωμάτων μπορούν να παρατηρηθούν και στη νέκρωση (Hayashi et al 1998). Σύμφωνα με τον Shimuzu et al (1996) υπάρχουν κοινά μονοπάτια στην απόπτωση και τη νέκρωση διότι μπορούν να ανασταλούν από την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και οι δύο τύποι κυτταρικού θανάτου όταν επάγονται σε κυτταρικές σειρές νευρώνων λόγω υποξείας ή ανοξείας. Γενικότερα όμως ισχύει η άποψη ότι τα εντονότερα ερεθίσματα επάγουν τη νέκρωση παρά την απόπτωση και ότι τελικά η τύχη του κυττάρου εξαρτάται από την ένταση του ερεθίσματος (Nakao et al 2000) και την ενεργειακή κατάσταση στην οποία βρίσκεται κατά την επαγωγή της βλάβης (Liest et al 1997). Τα γονίδια που ελέγχουν την απόπτωση έχουν μελετηθεί λεπτομερώς στον νηματοειδή σκώληκα Caenorhabditis elegans και καλούνται γονίδια κυτταρικού θανάτου ced (cell death). Συγκεκριμένα τα γονίδια ced3 και ced4, προάγουν τον κυτταρικό θάνατο, ενώ από την άλλη μεριά το γονίδιο ced9, τον καταστέλλει. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: εκείνα που προάγουν την απόπτωση (όπως p53, c-myc, E2F, Fas, Bax, Bad, Bak, Bcl-Xs) και σε εκείνα που την αναστέλλουν (όπως Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, MCL-1, A-I, crma, p35). Όπως αναφέρεται παρακάτω το σημείο ελέγχου G 2 του κυτταρικού κύκλου (G 2 checkpoint) είναι υπεύθυνο για την αναστολή της μιτωτικής διαδικασίας σε περίπτωση που το κύτταρο έχει υποστεί κάποια βλάβη στο γενετικό του υλικό σε αυτή ή σε προηγούμενες φάσεις (G 1 και S). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφόρων μορίων τα οποία είτε επάγουν την παύση του κυτταρικού κύκλου (cell cycle arrest), προκειμένου να επιδιορθωθεί η βλάβη, είτε διεγείρουν τους σηματοδοτικούς μηχανισμούς της απόπτωσης, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατόν να 60

81 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιδιορθωθεί. Παρόλα αυτά, όταν υπάρχει βλάβη στο σημείο ελέγχου G 2, τα κύτταρα εισέρχονται πρόωρα στη μίτωση, προτού προλάβει να ολοκληρωθεί η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Αυτή η ανώμαλη μίτωση ονομάζεται μιτωτική καταστροφή. Η βλάβη μπορεί να αφορά την αναστολή ή απενεργοποίηση, οποιουδήποτε από τα γονίδια που εμπλέκονται σε αυτό το σημείο ελέγχου, συμπεριλαμβανομένων αυτών που εκφράζουν τις πρωτεΐνες ανίχνευσης των βλαβών του DNA (ATR και ΑΤΜ), τις κινάσες CHK1 και CHK2 που απαιτούνται για τη στάση του κυτταρικού κύκλου και τα μόρια που ευθύνονται για τη διατήρηση αυτής της στάσης, όπως τα p53, WAF1 (p21) και σ (Merritt et al 1997, Takai et al 2000). Τα παραπάνω έχουν ως αποτέλεσμα την πρόωρη ενεργοποίηση του συμπλέγματος επαγωγής της μίτωσης CDK1/cyclinB και την είσοδο του κυττάρου σε ανώμαλη μίτωση. Επιπλέον, άλλοι παράγοντες που μπορούν να καταστρέψουν τους μικροσωληνίσκους ή να διαταράξουν τα σημεία ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoints), μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε μιτωτική καταστροφή. Για παράδειγμα η φαρμακευτική ουσία palcitaxel (taxol) επάγει ανώμαλη μετάφαση στην οποία οι χρωματίδες αδυνατούν να αποχωριστούν με αποτέλεσμα τα κύτταρα να οδηγούνται σε μιτωτική καταστροφή (Jordan et al 1996). A.10. Βιοχημικά μονοπάτια απόπτωσης Η επαγωγή της απόπτωσης πραγματοποιείται είτε μέσω της ενδογενούς είτε μέσω της εξωγενούς οδού. Και οι δύο οδοί έχουν ως τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του καταρράκτη των πρωτεασών κυστεϊνης εξειδικευμένων για ασπαραγινικό οξύ (cystein dependent-aspartate-specific), που ονομάζονται κασπάσες (Enari et al 1996, Hasegawa et al 1996, Lamkanfi et al 2002). Τα μόρια αυτά συντίθενται ως ανενεργά προένζυμα (προ-κασπάσες). Οι προκασπάσες περιέχουν μια περιοχή ~100 αμινοξέα, (κασπάσες 2, 8, 9 και 10), αποτελούν τις εναρκτήριες κασπάσες (initiator caspases), εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα με την μορφή μονομερών και περιέχουν κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο. Έχουν δράση πεπτιδάσης και αναγνωρίζουν στα υποστρώματά τους μία πλευρική ομάδα ασπαραγινικού, στα πλαίσια ενός τετραπεπτιδίου όπου η θέση του ασπαραγινικού ορίζεται ως P1 και η ομάδα του εγγύτερου αμινοξέος προς το Ν-άκρο ορίζεται ως P4. Η αποκοπή γίνεται στον πεπτιδικό δεσμό προς το C-άκρο του στοχευμένου ασπαραγινικού (Reed, 2000). Τα μόρια αυτά στην συνέχεια ενεργοποιούνται σε διμερή είτε μέσω αλλαγών στη στερεοδομή τους είτε μέσω άλλων μεταβολών που συμβαίνουν κατά την 61

82 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετανάστευση τους σε μεγάλα μοριακά συμπλέγματα, όπως το σύμπλεγμα επαγωγής θανάτου (death-inducing signaling complex DISC) (Peter et al 2003), το αποπτόσωμα (apoptosome) (Acehan et al 2002), το PIDDόσωμα (Tinel et al 2004) ή το φλεγμονόσωμα (inflammasome) (Martinon et al 2002). Από την άλλη μεριά, οι προ-κασπάσες που περιέχουν μια μικρότερη περιοχή ~30 αμινοξέα (κάσπάσες 3, 6 και 7) αποτελούν τις "εκτελεστικές" κασπάσες (effector caspases). Ενεργοποιούνται από τις εναρκτήριες κασπάσες μετά από πρωτεολυτική αποικοδόμηση σε συγκεκριμένες θέσεις που φέρουν ασπαραγινικό (Asp) σχηματίζοντας τετραμερή σύμπλοκα (Salvessen et al 2004). Μετά την ενεργοποίηση ακολουθεί διάσπαση μια σειράς ενδοκυτταρικών υποστρωμάτων, όπως δομικά στοιχεία του κυτταροσκελετού και του πυρήνα, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος και στις διαδικασίες αναδιπλασιασμού και επιδιόρθωσης του DNA. Λαμβάνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη γίνεται αντιληπτό ότι η ενεργοποίηση των κασπασών ακολουθεί ένα πρότυπο αλυσιδωτής αντίδρασης που οδηγεί τελικά στην εμφάνιση των ιδιαίτερων μορφολογικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης (Saelens et al 2001, Fischer et al 2003, Lamkanfi et al 2002). Η ενδογενής οδός της απόπτωσης ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσματα ως απάντηση σε περιβαλλοντικό στρες (π.χ. βλάβη στο DNA από υπεριώδη ακτινοβολία ή χημειοθεραπευτικά, έλλειψη αυξητικών παραγόντων, υποξεία, απώλεια αλληλεπιδράσεων με την εξωκυττάριο ουσία, χημικές τοξίνες κα). Κεντρικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία διαδραματίζουν τα μιτοχόνδρια, μέσω της απελευθέρωσης μελών της οικογένειας Bcl-2 και άλλων πρωτεϊνών από το εσωτερικό τους (Festjens et al 2004, Saelens et al 2004). ΟΙ πρωτεΐνες της οικογένειας bcl-2 ρυθμίζουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και άλλων αποπτωτικών παραγόντων (Smac/DIABLO, Omi/HtrA2. AIF κ.α), με το να ενισχύουν ή να καταστέλλουν τη διαπερατότητα της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης (Saelens et al 2000). Θα πρέπει να αναφερθεί, πως η οικογένεια bcl-2 συμπεριλαμβάνει (προ) αποπτωτικούς και αντι-αποπτωτικούς παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί ταξινομούνται ανάλογα με την ομολογία των περιοχών (ΒΗ) που περιέχουν. Μέχρι στιγμής έχουν χαρακτηριστεί 4 τέτοιες περιοχές: ΒΗ1, ΒΗ2, ΒΗ3 και ΒΗ4 (Bouillet et al 2002, Liu et al 2003). Οι αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες, όπως οι Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1 κα, περιλαμβάνουν συνήθως 3 από τις τέσσερεις περιοχές. Οι (προ) αποπτωτικές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν από την άλλη είτε μόνο την περιοχή ΒΗ3 (ΒΗ3-only proteins), όπως οι Bad, Bid, Noxa, PUMA κ.α, είτε δύο ή τρεις διαφορετικές περιοχές, όπως οι Bax και Bad (Festjens et al 2004, Huang et al 2000). 62

83 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η πρωτεΐνη Bak αποτελεί απαραίτητη πρωτεΐνη της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, ενώ η πρωτεΐνη Bax μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια κατά την ενεργοποίηση του ενδογενούς δρόμου της απόπτωσης. Η αλληλεπίδραση των Bax και Bak με άλλες πρωτεΐνες που φέρουν μόνο τη ΒΗ3 περιοχή, έχει ως αποτέλεσμα τον πολυμερισμό τους τον σχηματισμό πόρου στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η διαπερατότητα της και να απελευθερώνονται αποπτωτικοί παράγοντες, όπως το κυτόχρωμα c, AIF μια φλαβοπρωτεΐνη, η οποία μετατοπίζεται στον πυρήνα και προκαλεί συμπύκνωση της χρωματίνης και διάσπαση του DNA, μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων από τις κασπάσες (Susin et al 1999) καθώς και άλλους παράγοντες (Antonsson et al 2000). Εναλλακτικά, οι πρωτεΐνες ΒΗ3 και το Bax μπορούν να αλληλεπιδράσουν με ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα (permeability transition pore-ptp) που βρίσκεται στα σημεία επαφής μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και περιλαμβάνει πρωτεΐνες όπως οι ATN (adenine noucleotide exchanger) και VDAC (voltage dependent anion channel). Το άνοιγμα του πόρου έχει ως συνέπεια μείωση του μιτοχονδριακού δυναμικού (Δψ m ), διόγκωση του μιτοχονδρίου και ρήξη της μιτοχονδριακής μεμβράνης με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και άλλων παραγόντων στη κυτταρόπλασμα (Zamzami et al 2000, Sugiyama et al 2002). Σχήμα Α.23 Σχηματική αναπαράσταση εξωγενούς και ενδογενούς οδού επαγωγής της απόπτωσης, (Bursch W. ECDO 2004) 63

84 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο εξωκυττάριος δρόμος ενεργοποιείται από την σύνδεση ενός εξωκυττάριου «προσδέτη θανάτου» (death ligand) στον αντίστοιχο «υποδοχέα θανάτου» (death receptor). Οι «προσδέτες θανάτου» είναι συνήθως ομοιοτριμερή οπότε η σύνδεσή τους με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους οδηγεί στον σχηματισμό τριμερικών σχηματισμών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Οι υποδοχείς αυτοί, οι οποίοι ανήκουν στην οικογένεια των TNF, αποτελούνται από ένα εξωκυττάριο τμήμα, που φέρει περιοχές πλούσιες σε κυστεϊνη (cysteine rich domains=crds), με την οποία συνδέεται ο αντίστοιχος συνδέτης και ένα ενδοκυττάριο τμήμα θανάτου (death domain=dd). Σε αυτούς περιλαμβάνονται ο TNF-R1 (= tumor necrosis factorreceptor 1), o Fas, o DR 3 (=death receptor 3 ή APO-3/TRAMP), O DR4 (TRAIL-R1), o DR5 (TRAIL-R2/TRICK2) και ο DR6 (Itoh et al 1993, Sheikh et al 2000, Chen et al 2002). Αντίστοιχα, στους συνδέτες (ligands) περιλαμβάνονται οι ο TNFa (Tumor necrosis factor alpha), o Fas ligand (FasL), o Apo-3 ligand, η λεμφοτοξίνη (lymphotoxin LTa) και ο TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand/apo-2 ligand) (Sheikh et al 2000, Chen et al 2002). Η σύνδεση των εξωκυττάριων σημάτων ligand με τους αντίστοιχους υποδοχείς οδηγεί σε μεταβολές των υποδοχέων, που τους καθιστούν ικανούς να ενώνονται μέσω του ενδοκυττάριου τμήματος τους (DD) με ειδικές ενδοκυττάριες πρωτεΐνες-προσαρμοστές (adaptor-proteins), όπως οι TRADD και FADD που επίσης φέρουν αντίστοιχες περιοχές (DD) (Aravind et al 1999, Hofmann 1999). Από εκεί και πέρα το ακριβές μονοπάτι απόπτωσης εξαρτάται από τον υποδοχέα που έχει ενεργοποιηθεί: Σε περίπτωση σύνδεσης Fas/FasL γίνεται προσέλκυση της προ-κασπάσης-8 ή και της προ-κασπάσης 10 καθώς και του κυτταροπλασματικού παράγοντα FADD μέσω των αντίστοιχων περιοχών τους DED (Thomas et al 2002), με αποτέλεσμα το σχηματισμό πρωτεϊνικού συμπλέγματος, γνωστού ως DISC (=death inducing signaling complex) (Kischkel et al 1995). Ο σχηματισμός του DISC οδηγεί στην ενεργοποίηση της προ-κασπάσης-8 σε κασπάση-8 η οποία στην συνέχεια ενεργοποιεί τη δραστική κασπάση-3 και οδηγεί στον μη αναστρέψιμο καταρράκτη της απόπτωσης (Riedl and Shi, 2004). Οι δύο παραπάνω δρόμοι αποτελούν δύο διαφορετικούς τρόπους επαγωγής κυτταρικού θανάτου ως απάντηση σε διαφορετικά ερεθίσματα απόπτωσης. Υπάρχει και η περίπτωση η παραπάνω διαδικασία να ενισχύεται και από τη μιτοχονδριακή οδό, όταν η κασπάση 8 ενεργοποιήσει την πρωτεΐνη Bid της οικογένειας Bcl-2, που με τη σειρά της εισέρχεται στο μιτοχόνδριο (ως tbid), προκαλεί την έξοδο του κυτοχρώματος c και έτσι ενεργοποιεί και την ενδογενή οδό (Li et al 1998). Μετά την ολοκλήρωση της αποστολής του το σύμπλεγμα Fas/FasL ενδοκυττώνεται ακολουθώντας των ενδοσωμική οδό (Algeciras-Schimnich et al 2002). 64

85 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σε περίπτωση σύνδεσης TNF-R1/TNFa γίνεται σύνδεση πρωτεϊνικού παράγοντα TRADD και κατόπιν της κινάσης σερίνης/θρεονίνης RIP1, που φέρει την περιοχή DD. Έτσι, σχηματίζεται το σύμπλεγμα Ι (Zhang et al 2000, Baud et al 2001). Το σύμπλεγμα αυτό με τη σειρά του ενεργοποιεί τον NF-kB, p38, MAPK και τα μονοπάτια JNK. Μετά από λίγες ώρες το σύμπλεγμα μεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου με ενδοκύττωση (Higushi et al 1994). Οι περιοχές θανάτου (DDs) των TRADD και RIP1 προκαλούν τη μετανάστευση του κυτταροπλασματικού παράγοντα FADD και αυτό με τη σειρά την ενεργοποίηση της προ-κασπάσης 8. Η υπόλοιπη διαδικασία είναι όπως περιγράφηκε και για τον Fas. Τέλος, σε περίπτωση ενεργοποίησης της απόπτωσης μέσω TRAIL (DR4 & DR5) προσελκύεται ο παράγοντας FADD και ακολούθως οι κασπάσες 8 και 10, που ενεργοποιούν διαφορετικά υποστρώματα (Zhang et al 2000, Kischkel et al 2001). A.11 Κυτταρικός κύκλος Α.11.1 Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο Σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, η ικανότητα αύξησης και πολλαπλασιασμού εξαρτάται από διεργασίες που γίνονται στο κυτταρικό επίπεδο οι οποίες χωρίζονται σε τρεις φάσεις: τη μεσόφαση (που διακρίνεται σε τρεις επιμέρους φάσεις G 1, S, G 2 ), την πυρηνοδιαίρεση (Μ) και την κυτταροδιαίρεση (D). Αυτή η διαδοχική ενορχηστρωμένη διαδικασία εναλλαγής των φάσεων G 1 -S-G 2 -M-D ονομάζεται «κύκλος ζωής του κυττάρου» ή «κυτταρικός κύκλος» (Θωμόπουλος, 1995, Μαρμάρας 1995). Το 1882, ο Flemming περιέγραψε μια διαδικασία πυρηνικής διαίρεσης του κυττάρου που την ονόμασε μίτωση (από τον ελληνικό όρο μίτος που σημαίνει νήμα, κλωστή). Επειδή τα κύτταρα φαίνονταν να είναι ενεργά μόνο στη φάση της μίτωση, ο υπόλοιπος κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίστηκε ως μεσόφαση ή φάση ηρεμίας (interphase). Στην πραγματικότητα όμως κατά τη διάρκεια της μεσόφασης συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δραστηριότητα που προετοιμάζει το κύτταρο για την κυτταρική διαίρεση, με κυρίαρχη την αντιγραφή του γενετικού υλικού (DNA) κατά τη φάση S (Nurse et al 2000). Κατά την μεσόφαση το κύτταρο θεωρείται ότι βρίσκεται σε περίοδο ηρεμίας γιατί φαινομενικά δεν παρατηρείται καμία δράση στον πυρήνα. Στην πραγματικότητα όμως στο στάδιο αυτό συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δράση και οι κυριότερες κυτταρικές διεργασίες που προετοιμάζουν το κύτταρο για κυτταρική διαίρεση. Η φάση G 1 (first gap phase), η οποία παρεμβάλλεται ανάμεσα στην πυρηνική διαίρεση (Μ 65

86 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φάση) και στη σύνθεση του DNA (S φάση) και η φάση G 2 (second gap phase), η οποία λαμβάνει χώρα μεταξύ S και Μ φάσης. Μετά την μεσόφαση το κύτταρο αρχίζει την διαίρεση του. Η μίτωση αντιπροσωπεύει ένα μικρό μόνο τμήμα του κύκλου ζωής ενός κυττάρου. Η δημιουργία των δυο επιπλέον φάσεων, προέκυψε από την ανάγκη ελέγχου της σωστής διαμόρφωσης του DNA και ενδεχόμενης επιδιόρθωσης αυτού (φάση G1), καθώς και ελέγχου και επιδιόρθωσης σφαλμάτων κατά την αντιγραφή του DNA (φάση G 2 ), (Massague 2004, Moeller et al 2005). Οι επιπλέον φάσεις, έχουν ως συνέπεια την αύξηση κατά πολύ του χρόνου ολοκλήρωσης ενός κυτταρικού κύκλου. Στο σχήμα A.24 παριστάνεται διαγραμματικά ο κυτταρικός κύκλος και η χρονική διάρκεια των φάσεων που τον απαρτίζουν. Οι χρόνοι που αναφέρονται είναι ενδεικτικοί και υποδεικνύουν τη σχετική διάρκεια της κάθε φάσης. Σχήμα Α.24 Απλουστευμένη σχηματική αναπαράσταση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (Israels 2000) Όπως φαίνεται από το παραπάνω σχήμα, Α.24 η χρονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται κυρίως από τη φάση G 1. Η φάση G 1 επηρεάζεται από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Όπως για παράδειγμα όταν υπάρχει περιορισμός των θρεπτικών συστατικών ή όταν δίνεται στα κύτταρα το σήμα για τελική διαφοροποίηση, είναι δυνατό κύτταρα που βρίσκονται στη G 1, αντί να προετοιμαστούν για τη σύνθεση του DNA, να εισέρχονται σ ένα στάδιο στασιμότητας, γνωστό ως στάδιο G 0. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται στην G 0 φάση δεν 66

87 ΕΙΣΑΓΩΓΗ είναι ανενεργά, αλλά αντίθετα βρίσκονται σε μία διαρκή διαδικασία πρωτεΐνοσύνθεσης, κίνησης ή έκκρισης ουσιών προς το περιβάλλον, καθώς μπορούν κάτω από κατάλληλα ερεθίσματα να εισέλθουν και πάλι στον κυτταρικό κύκλο. Η φάσης G 1 ελέγχεται από δύο σημεία ελέγχου (checkpoints), το σημείο περιορισμού (restriction point) και το σημείο βλάβης του DNA (G 1 DNA damage checkpoint), (Μαρμάρας 1995, Pollard & Earnshaw 2002, Moeller et al 2005). Η διάρκεια της φάσης S, καθώς και των λοιπών φάσεων G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου ποικίλλει στα διαφορετικά είδη κυττάρων, αλλά όχι σημαντικά σε κύτταρα του ίδιου είδους. Επιπλέον, σε αντίθεση με τη φάση G 1, η διάρκεια των φάσεων αυτών ελάχιστα επηρεάζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος και μπορεί να θεωρηθεί ως σταθερό χαρακτηριστικό κάθε κυτταρικού τύπου. Στην φάσης G2 τα κύτταρα ελέγχουν κάποια βλάβη στο γενετικό υλικό, γνωστό ως το σημείο ελέγχου βλαβών του DΝA της G 2 (G 2 DNA damage checkpoint), με τελικό αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των κινασών που είναι υπεύθυνες για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης. Ο κυτταρικός κύκλος εμφανίζει παύση στη G 2 (G 2 arrest) μέχρις ότου επιδιορθωθεί η βλάβη ή επάγεται η απόπτωση, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατό να επιδιορθωθεί (Pollard & Earnshaw 2002,Yang et al 2005). Α.11.2 Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω των Cdks Πειραματικά δεδομένα δείχνουν πως υπάρχει ένα σύστημα ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ρυθμίζει την δράση κάθε συγκεκριμένου σταδίου. Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα των θηλαστικών ελέγχεται από τις πρωτεϊνικές κινάσες (Cyclin Dependent Kinases -CDKs): CDK2, CDK4, CDK6 (Morgan et al 1995). Η ενζυμική δραστικότητα των CDKs ρυθμίζεται σε πολλά επίπεδα: με την πρόσδεσή τους στις κυκλίνες, με την ενεργοποίηση από την CAK (Cdk Activating Kinase), με φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση των CDKs, καθώς και με την πρόσδεσή τους στους αναστολείς (CDKIs, CDK inhibitors). Οι πρωτεϊνικές κινάσες ρυθμίζονται λοιπόν από την ενεργοποίηση των κυκλινών και των αναστολέων των CDKs, οι οποίοι με την σειρά τους είτε ενεργοποιούν είτε παρεμπιδίζουν την δραστικότητα του συμπλέγματος CDKs-κυκλίνη. Οι CDKs έχουν την ιδιότητα να συντονίζουν τον κυτταρικό κύκλο, λειτουργώντας ως «μοριακοί διακόπτες». Όταν είναι ενεργές, ο κυτταρικός κύκλος προχωρά στο στάδιο που ελέγχει η συγκεκριμένη Cdk, ενώ το αντίθετο συμβαίνει όταν αυτές είναι ανενεργές (Morgan et al 1997). 67

88 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κυκλίνες αποτελούν μια συνεχώς αυξανόμενη οικογένεια πρωτεϊνών, που παρουσιάζουν ομολογία σε μια περιοχή ~100 αμινοξέων ( κουτί κυκλίνης cyclin box). Στο κουτί των κυκλινών, δεσμεύονται οι πρωτεϊνικές κινάσες προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Χαρακτηριστικό γνώρισμα των πρωτεϊνικών κινασών είναι ότι είναι αυστηρά συντηρημένες και απαιτείται η αντίστοιχη κυκλίνη προκειμένου να ενεργοποιηθούν (Murray et al 1993, Morgan et al 1995). Οι νεοσυντειθέμενες CDKs έχοντας ολοκληρώσει μερικώς την διαμόρφωση της τριτοταγούς τους δομής, με αποτέλεσμα το ενεργό τους κέντρο να παρεμποδίζεται από έναν βρόγχο του T-loop (DeBondt et al 1993). Ταυτόχρονα η ύπαρξη μιας μικρής α-έλικας (PSTAIRE helix) που περιέχει γλουταμικό οξύ και είναι απαραίτητη για τη σύνδεση με το ATP έχει προσανατολισμό, μακριά από την ενεργό κέντρο του ενζύμου, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η φωσφορυλίωση των αντίστοιχων υποστρωμάτων. Η ενεργοποίηση πραγματοποιείται μόνο με τη σύνδεση της CDK με την αντίστοιχη κυκλίνη, αλλάζοντας την στερεοχημική της δομή με συνέπεια την απομάκρυνση του Τ-βρόγχου από το ενεργό κέντρο (Russo et al 1996). Παράλληλα, η α-έλικα επαναπροσανατολίζεται κατά 90º και το γλουταμικό οξύ στρέφεται προς το ενεργό κέντρο και αλληλεπιδρά με το ATP. Ωστόσο, παρά τις παραπάνω αλλαγές, το σύμπλεγμα κυκλίνης-cdk είναι μόνο μερικώς ενεργοποιημένο. Η πλήρης ενεργοποίηση πραγματοποιείται με τη φωσφορυλίωση μιας συντηρημένης θρεονίνης, στη θέση 160 του Τ-βρόγχου, από την CAK, (Cdk Activating Kinase) (Russo et al 1996, Nabel 2002). Η CAK είναι ένα ένζυμο το οποίο αποτελείται από τρεις υπομονάδες, την CDK7, κυκλίνη Η και ΜΑΤ1 (ménage a trois) και είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των κινασών CDK1, CDK2, CDK4 και CDK6 και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Lolli et al 2005). Η φωσφορυλίωση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της καταλυτικής δραστηριότητας του συμπλέγματος Cdkκυκλίνης, περίπου κατά 300 φορές (Jeffrey et al 1995, Pollard & Earnshaw 2002). Σχήμα Α.25 Ενεργοποίηση των CDKs. (Pollard & Earnshaw 2002) 68

89 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η CDK2 προσδένεται στην κυκλίνη Α προκειμένου να ενεργοποιηθεί. Η ενεργοποίηση των CDKs δεν εξαρτάται μόνο από την πρόσδεση τους στις κυκλίνες αλλά υπάρχουν και τουλάχιστον δύο μηχανισμοί αρνητικής ρύθμισης. Ο πρώτος αφορά στη φάση G 2, όπου η δραστηριότητα των CDKs ελέγχεται με τη φωσφορυλίωση δύο αμινοξέων (θρεονίνη 14 και τυρισίνη 15 ) από τις πρωτεϊνικές κινάσες Myt1 και Wee 1 (Yang et al 2005). Η φωσφορυλίωση αυτή παρεμβάλλεται στο σημείο πρόσδεσης του ATP επηρεάζοντας τη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Αντίθετα, αυτές οι ανασταλτικές φωσφορυλιώσεις μπορούν να ακυρωθούν από τη δράση των φωσφατασών Cdc25. Από αυτές η Cdc25A εμπλέκεται στη ρύθμιση της μετάβασης από την G 1 στην S, ενώ οι Cdc25B και Cdc25C από τη G 2 στην Μ (Osmani et al 1997, Meszaros et al 2000). Ο δεύτερος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης των Cdks είναι η αλληλεπίδραση τους με διάφορα μόρια-αναστολείς (CDKIs, CDK inhibitors). Έχουν βρεθεί δύο οικογένειες των CDKIs: η INK4 περιλαμβάνει τέσσερις πρωτεΐνες που παρεμποδίζουν την καταλυτική δράση των πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες εξαρτώνται από την κυκλίνη D(CDK4,CDK6), μέλη της οποίας είναι οι p16 INK4A, p15 INK4B, p18 INK4C και p19 INK4D και η Kip/Cip περιλαμβάνει τρείς πρωτεΐνες που παρεμποδίζουν την δράση των πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες εξαρτώνται από τις κυκλίνες D-E και Α, μέσω μηχανισμών επαγόμενων από την ουβικιτίνη (ubiquitinmediated proteolytic machinery), γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των αντίστοιχων κινασών, με μέλη τους p21 CIP, p27 KIP1 και p57 KIP2 (Russo et al 1998, Brotherton et al 1998, Sherr et al 1999, Pavletich et al 1999). Σχήμα Α.26 Θετική και αρνητική ρύθμιση της ενζυμικής δράσης των Cdks σε διάφορα επίπεδα. (Pavletich N et al., 1999) 69

90 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.11.3 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) Ένα από τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά του κυτταρικού κύκλου είναι η μεγάλη ακρίβεια εκτέλεσης του. Η αξιοθαύμαστη αυτή πιστότητα στην αναπαραγωγή, επιτυγχάνεται με έναν μεγάλο αριθμό μονοπατιών μεταγωγής σημάτων, που είναι γνωστά ως σημεία ελέγχου (checkpoints). Τα σημεία αυτά, ελέγχουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, εξασφαλίζοντας την αλληλεξάρτηση της S φάσης με τη μίτωση, την ακεραιότητα του γονιδιώματος και την πιστότητα του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων. Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, πρέπει να εξασφαλίζει την ολοκλήρωση των γεγονότων σε κάθε φάση, πριν πραγματοποιηθεί η είσοδος στην επόμενη (Hartwell et al 1974, 1989, Nurse et al 2000, Hoffmann et al 2005). Το σημείο ελέγχου G 1 Κατά τη διάρκεια της φάσης G1, το κύτταρο καλείται ν αποφασίσει εάν θα συνεχίσει εκτελώντας έναν ακόμα κυτταρικό κύκλο ή αν θα παραμείνει σε μη διαιρούμενη κατάσταση μόνιμα ή προσωρινά. Το σημείο μεταξύ της αρχικής και της τελικής G 1 φάσης, το οποίο αντιπροσωπεύει την αμετάκλητη δρομολόγηση του κυττάρου προκειμένου να διαιρεθεί, ονομάζεται σημείο περιορισμού (restriction point). Η μεταγωγή σημάτων από τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες, οδηγεί τα κύτταρα που βρίσκονται στην αρχική φάση G 1, είτε να περάσουν το σημείο περιορισμού και να διαιρεθούν, είτε, εξαιτίας ανεπαρκών σημάτων, να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να οδηγηθούν στο σημείο G 0. Τελικά, κατά τη διάρκεια της G 1 φάσης, το κύτταρο παίρνει την απόφαση να διαιρεθεί, να διαφοροποιηθεί ή να πεθάνει (Schafer et al 1998, Ho et al 2002, Sanchez et al 2005, Moeller et al 2005). Όπως γίνεται κατανοητό, η διεκπεραίωση της σωστής απόφασης, περιλαμβάνει πολύπλοκα, αλληλοεξαρτώμενα μονοπάτια, στα οποία οποιοδήποτε λάθος μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση. Πολλά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως και οι θεραπείες που στοχεύουν σε αυτά, μπορούν να συνδεθούν με λάθη στο σημείο αυτό (Nakanishi et al 2006). Δύο συμπλέγματα των Cdks της G 1 φάσης, είναι αυτές που οδηγούν στην αντιγραφή του DNA, CDK4/6-κυκλίνη D και CDK2-κυκλίνη Ε, συνεργάζονται προκειμένου να εμποδίζουν την μεταγραφή ενός δυναμικού συμπλόκου που περιλαμβάνει την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος και τον παράγοντα E2F-1. Η ενεργοποίηση της CDK2, έχει ως αποτέλεσμα την κινητοποίηση ελικασών, πριμασών και πολυμερασών στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο, προκαλώντας το ξεδίπλωμα της διπλής έλικας του DNA και τελικά, την αντιγραφή αυτού. Ένας από τους 70

91 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μηχανισμούς, ο οποίος ελέγχει τη δραστικότητα της CDK2, είναι αυτός που βασίζεται στον περιορισμό της παροχής κυκλίνης Ε. Η έκφραση της κυκλίνης αυτής εξαρτάται από τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας Ε2F, (Early gene Factor 2) (Massague, 2004). Στα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση της μίτωσης ή μόλις έχουν βγει από αυτή, οι παράγοντες Ε2F, αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Rb, (retinoblastoma), ή με μέλη της οικογένειας στην οποία ανήκει. Η οικογένεια αυτή, ονομάζεται πρωτεΐνες τσέπης και εκτός από την Rb, περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες p107 και p130 (Stevaux et al 2002). Οι κυκλίνες τύπου D, (D1, D2 και D3)., αλληλεπιδρούν με τις CDK4, CDK6, δημιουργώντας ολοένζυμα-σύμπλοκα, που φωσφορυλιώνουν την Rb (Sherr 1995). Η Rb, είναι δυνατό να φωσφορυλιωθεί και από την κυκλίνη Ε-CDK2. Η φωσφορυλίωση της Rb από τις παραπάνω κινάσες, έχει σαν αποτέλεσμα την αποδέσμευσή της από τους E2F, επιτρέποντας έτσι μεταγραφή που εξαρτάται από αυτούς, δημιουργώντας έτσι, έναν μηχανισμό ανάδρασης, που βοηθάει στην είσοδο στη φάση S, όταν υπάρχει αρκετή ποσότητα ενεργού CDK2 (Israels et al 2000, Sears et al 2002, Massague 2004). Στην εικόνα Α.27 παρουσιάζεται διαγραμματικά το σημείο ελέγχου G 1. Σχήμα Α.27 Διαγραμματική αναπαράσταση του G 1 σημείου ελέγχου Israels και Israels, (Sears και Nevins, 2002) Είναι ευνόητο, πως το μονοπάτι Rb/E2F δεν είναι το μοναδικό που παίζει ρόλο στη μετάβαση του κυττάρου από τη G 1 στην S φάση. Το παραπάνω σχήμα αποτελεί μια υπεραπλούστευση των γεγονότων και διαδικασιών που συμβαίνουν σε αυτό το σημείο ελέγχου. Στην πραγματικότητα, ένας μεγάλος αριθμός μονοπατιών μεταγωγής σήματος, παίρνει μέρος στην απόφαση του κυττάρου να διαιρεθεί ή όχι. 71

92 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για παράδειγμα η μπορεί να φωσφορυλιώσει τον παράγοντα FoxO1 εμποδίζοντας την μεταγραφική του ικανότητα. Στο σημείο αυτό θα ήταν ενδιαφέρον να αναφερθεί η εμπλοκή του ογκογονιδίου c-myc και του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, τα οποία επηρεάζουν άμεσα τις διαδικασίες στο σημείο αυτό (Σχήμα Α.27). Ειδικότερα το p53 παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των βλαβών του DNA στο τέλος της G 1 και πριν το κύτταρο προχωρήσει στην S (DNA damage G 1 checkpoint). Η οποιαδήποτε βλάβη του DNA ανιχνεύεται από ορισμένες κινάσες της οικογένειας PIK3 (phosphatidylinositol 3 kinase), όπως η ATM (ataxia-telangiectasia - mutated), η ATR (Rad-3 related) και η DNA-PK (DNA dependent protein kinase), οι οποίες φωσφορυλιώνουν το p53 απομακρύνοντας το από την ογκοπρωτεΐνη MDM 2 με την οποία είναι συνδεδεμένο σε ανενεργή κατάσταση και αυξάνοντας δραματικά τα επίπεδα του στον πυρήνα (Moeller et al 2005, Houtgraaf et al 2006). Το p53 αποτελεί έναν μεταγραφικό παράγοντα, ο οποίος ενεργοποιεί μια σειρά γονιδίων, μεταξύ των οποίων και τον αναστολέα των CDKs p21 cip1 με τον οποίο επάγεται παύση του κυτταρικού κύκλου στη G 1 (G 1 arrest) προκειμένου να επιδιορθωθεί η βλάβη. Σε περίπτωση ανεπιτυχούς επιδιόρθωσης, το p53 συμμετέχει στην ενεργοποίηση άλλων μονοπατιών που οδηγούν το κύτταρο σε απόπτωση (σχήμα Α.28). Σχήμα Α.28 Μονοπάτια μεταγωγής σήματος στο G 1 σημείο ελέγχου 72

93 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το σημείο ελέγχου S (intra-s checkpoint) Όπως στη φάση G1, έτσι και στην S, υπάρχουν μηχανισμοί ελέγχου των βλαβών του DNA. Όπως και στο σημείο ελέγχου G 1, η οποιαδήποτε βλάβη του DNA ανιχνεύεται από τις κινάσες ΑΤΜ/ΑΤR, που ενεργοποιούν τις εκτελεστικές κινάσες Chk1 και Chk2, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τη φωσφατάση Cdc25Α και την απενεργοποιούν. Με τον τρόπο αυτό αποτρέπεται η ενεργοποίηση της κυκλίνης CDK2 και καθυστερεί η αντιγραφή του γενετικού υλικού (αναστέλλοντας τη σύνδεση της Cdc45 στη χρωματίνη, η οποία με τη σειρά της επάγει τη σύνδεση της πολυμεράσης στα προαντιγραφικά συμπλέγματα δίνοντας έτσι χρόνο για επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Το σημείο ελέγχου G 2 Στη φάση G1 το κύτταρο αποφασίζει, όπως προαναφέρθηκε, αν θα προχωρήσει ή όχι σε έναν επόμενο κυτταρικό κύκλο. Στην φάση G 2 το κύτταρο καλείται να πάρει μια δεύτερη σημαντική απόφαση: αν είναι ασφαλές να προχωρήσει σε μίτωση και σε διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων. Εφόσον υπάρχει κάποια βλάβη του DNA προτού διαχωριστούν οι αδερφές χρωματίδες, οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις γενετικές πληροφορίες από τη «σωστή» χρωματίδα προκειμένου να διορθώσουν εκείνη που έχει υποστεί βλάβη. Για τον λόγο αυτόν τα κύτταρα χρησιμοποιούν το σημείο ελέγχου G 2, που είναι γνωστό ως G 2 -M, για την παρεμπόδιση της διαδικασίας της μίτωσης, εάν έχουν υποστεί κάποια βλάβη κατά τη διάρκεια της G 2 φάσης ή εάν έχουν εισέλθει στη φάση αυτή με κάποια βλάβη από τις προηγούμενες, S ή G 1. Η συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G 2, μπορεί επίσης να αντανακλά το σημείο ελέγχου της αντιγραφής του DNA (intra S checkpoint), και κατά το οποίο, γίνονται αντιληπτά τμήματα DNA που στην προηγούμενη φάση S, δεν αντιγράφηκαν σωστά ή πλήρως. Κατά την βλάβη του DNA στη G2 ανιχνεύεται μια πρωτεΐνη- κλειδί η Claspin η οποία προάγει την φωσφορυλίωση μέσω του μονοπατιού των κινασών ATM/ATR που έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κινάσης Chk1 (Harper and Elledge, 2007). Η Chk1 στη συνέχεια φωσφορυλιώνει την φωσφατάση Cdc25C, που αποτελεί βασικό επαγωγέα της μίτωσης και την απενεργοποιεί. Παράλληλα, στην απενεργοποίηση της φωσφορυλιωμένης Cdc25C συμβάλλει και η σύνδεση μιας ομάδας πρωτεϊνών σ, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να φωσφορυλιώνουν σερίνες. Η σύνδεση της Cdc25C με τις παραπάνω πρωτεΐνες, έχει ως αποτέλεσμα τη 73

94 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διάσπαση της στο κυτταρόπλασμα και κατ επέκταση την αναστολή της μίτωσης (Pollard & Earnshaw 2002, Yang et al 2005, Houtgraaf et al 2006). Από την άλλη μεριά η φωσφορυλίωση του p53 από τις ATM/ATR οδηγεί, όπως και στη φάση G 1, σε αύξηση του αναστολέα p21, ο οποίος αναστέλλει την έναρξη της πρόφασης, απενεργοποιώντας το σύμπλεγμα CDK1-κυκλίνης Α. Ο αναστολέας p21 φάση G 2 -M αποικοδομείται με oυβικιτυνιλίωση διαμέσου του συμπλέγματος APC/C (Anaphase Promoting Complex ή Cyclosome), (Amador et. al., 2007). Επιπλέον, ένας άλλος στόχος του p53 είναι και η πρωτεΐνη σ, η οποία συνδέεται με το σύμπλεγμα CDK1-κυκλίνης Β, με αποτέλεσμα την παραμονή του στο κυτταρόπλασμα, παρεμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα για την έναρξη της μίτωσης. Το σύμπλεγμα σ/ CDK1-κυκλίνης Β περιέχει επίσης και την ανασταλτική κινάση Wee1, που αποτελεί επιπλέον ασφαλιστική δικλείδα για τη διατήρηση του σε ανενεργό κατάσταση (Kastan and Bartek 2004). Στην εικόνα Α.29 παριστάνονται διαγραμματικά τα διαφορετικά μονοπάτια του σημείου ελέγχου της G2. Κατά τη διάρκεια της μίτωσης και της επακόλουθης κυτταροκίνησης, τα χρωμοσώματα και το κυτταρόπλασμα διαιρούνται σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων ελέγχεται από το σημείο ελέγχου της μετάφασης (metaphase checkpoint), που καθυστερεί το διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων, μέχρις ότου τα χρωμοσώματα έχουν ευθυγραμμιστεί πλήρως στη μιτωτική άτρακτο. Το σημείο αυτό ονομάζεται επίσης και σημείο ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoint). 74

95 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.29 Σχηματική αναπαράσταση του G 2 σημείου ελέγχου Από όλα τα παραπάνω γίνεται κατανοητό, πως υπάρχουν πάρα πολλά κυτταρικά μονοπάτια που αλληλοσυνδέονται ελέγχοντας τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Επομένως, είναι αναγκαία η κατανόηση τους, προκειμένου να γίνει αντιληπτός ο μηχανισμός της καρκινογένεσης και της ανάπτυξης κατάλληλων θεραπευτικών αγωγών. 75

96 ΣΚΟΠΟΣ ΣΚΟΠΟΣ Τα τελευταία χρόνια έχουν δημοσιευτεί πολλές μελέτες αναφορικά με την δομή του ριβοσώματος τόσο σε προκαρυωτικούς όσο και σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Για τους μεν προκαρυωτικούς οργανισμούς υπάρχει πληθώρα πληροφοριών τόσο για την δομή όλης της μοριακής μηχανής, του ριβοσώματος, όσο και για τα επί μέρους συστατικά της, τις πρωτεΐνες και το rrna. Αντίθετα, για το ευκαρυωτικό ριβόσωμα λόγω της μεγαλύτερης πολυπλοκότητας του κυττάρου υπάρχουν ακόμη αρκετά κενά αναφορικά με την ριβοσωμική λειτουργία, την βιογένεση, και τέλος την εμπλοκή κάποιων συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν ταυτίζονται άμεσα με την μετάφραση (μη ριβοσωμικές λειτουργίες). Από προηγούμενες μελέτες μας βρέθηκε ότι η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη από ποντίκι φωσφορυλιώνεται στην αμινοτελική της περιοχή από την κινάση της καζεΐνης II, αλλά δεν είχαν εντοπιστεί τα αμινοξέα στόχοι, ούτε μια πιθανή λειτουργική συσχέτισή τους με την ενδοκυτταρική κυκλοφορία της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα τα ερωτήματα που προέκυψαν ήταν τα εξής: α. Πώς μεταφέρεται η πρωτεΐνη αυτή - από το κυτταρόπλασμα στο οποίο βιοσυντίθεται στους πυρήνες και περαιτέρω στους πυρηνίσκους ; β. Υπάρχουν δομικά στοιχεία τα οποία εμπλέκονται άμεσα σε αυτή τη διαμετακίνηση; γ. Ποια είναι τα αμινοξέα της S5 που αποτελούν υπόστρωμα για την κινάση της καζεΐνης II; δ. Ποια είναι η λειτουργική σημασία αυτών των φωσφορυλιώσεων; Είναι απαραίτητες αυτές οι μεταφραστικές τροποποιήσεις για την ενδοκυτταρική κυκλοφορία της πρωτεΐνης; Στα πλαίσια της εμπλοκής των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν σχετίζονται με την μετάφραση αποκλειστικά ( μη- ριβοσωμικές λειτουργίες ) και σε συνέχεια προηγούμενων ερευνών μας,διερευνήθηκε ο ρόλος της rps5 στην έναρξη του προγράμματος κυτταρικής διαφοροποίησης και απόπτωσης. 76

97 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1 ΥΛΙΚΑ Β.1.1. Βιολογικά υλικά Χρησιμοποιήθηκαν ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL-745 AC από ποντίκι. Η κυτταρική σειρά MEL παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής. Παραχωρήθηκαν επίσης από το ίδιο εργαστήριο και κύτταρα MEL μόνιμα επιμολυσμένα με τον πλασμιδιακό φορέα pcdna-3.1 rps5 (κλώνος C14), (Matragkou, Papachristou et al. 2008). Χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP-10 (Invitrogen Life Technologies), XL1/B (Stratagene, La Jolla, CA, USA) και BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies). Β.1.2 Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών Για τις κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα υλικά και αντιδραστήρια: Υλικό καλλιέργειας DMEM 1Χ, (Dulbecco s Modified Eagle Medium) με L- γλουταμίνη, (Gibco BRL, U.S.A, ) Μίγμα αντιβιοτικών πενικιλίνης, στρεπτομυκίνης και Βόειος εμβρυϊκός ορός (Fetal Bovine Serum- E.U approved Gibco BRL, ) Διάλυμα Trypan Blue 0.4% (Sigma-Aldrich, Inc, Saint Louis Missouri, U.S.A, T8154) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS 10X ph=7.2, Gibco BRL, ). Όλα τα αναλώσιμα των κυτταρικών καλλιεργειών (τρυβλία καλλιέργειας, φλάσκες, τρυβλία πολλαπλών πηγαδιών, σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια, αντικειμενοφόρες πλάκες κ.α), προμηθεύτηκαν από τις εταιρίες Corning (Inc, N.Y, U.S.A) και VWR Int. (Inc, West Chester,U.S.A). 77

98 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1.3 Χημικά αντιδραστήρια Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell, (Dassel, Germany) και οι μεμβράνες PVDF, (Polyvinylidene difluoride-immobilon) της εταιρείας Millipore, (Bedford, U.S.A.). Το ισότοπο [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmole ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Για τις αυτοραδιογραφίες χρησιμοποιήθηκαν ακτινογραφικά φιλμ τύπου Kodak-X- Omat S film, της εταιρείας Kodak, ενώ της ίδιας εταιρείας ήταν και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ X-Ray developer και X-Ray fixer, αντίστοιχα. Tα σφαιρίδια αγαρόζη-g της εταιρίας Upstate, (Protein G Agarose, Fast Flow, , USA). Β.1.4 Υλικά χρωματογραφίας Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST), χρησιμοποιήθηκε το υλικό χρωματογραφίας αγχιστείας σεφαρόζηγλουταθειόνη της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd, (Glutathione Sepharose 4B, , Buckinghamshire, UK). Το υλικό χρωματογραφίας που χρησιμοποιήθηκε για την in vivo φωσφορυλίωση, (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) που χρησιμοποιήθηκε ήταν ευγενική προσφορά από την Dr. R Kamp του τεχνικού πανεπιστημίου του Βερολίνου. B.1.5 Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προμηθεύτηκαν από την NEBiolabs, (Beverly, USA) και από την Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). Η πολυμεράση Expand long polymerase και το Rapid DNA ligation kit ήταν από την εταιρεία Roche. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε πολυμεράση BIOTAQ DNA Polymerase εταιρείας Bioline (BIO ), καθώς και το Robus RT PCR kit (F-580S) της εταιρείας Finnzymes. 78

99 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα της in vitro φωσφορυλίωσης ήταν προϊόν της εταιρίας NEBiolabs ( Units P6010S). Τα αντισώματα έναντι της κινάσης της καζεΐνης II, της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6, και τoυ non-phospho-src (Tyr416) ήταν των εταιρειών Abcam (ab70774), Acris (AP02734PU-S) και Cell Signaling (#2101), αντίστοιχα. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την αποσιώπηση του γονιδίου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 από ποντίκι ήταν της εταιρίας Qiagen. Για την απομόνωση RNA χρησιμοποιήθηκε το Kit NucleoSpin RNA/protein, (50 preps ) της εταιρίας Macherey-Nagel. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με κυτταρομετρία ροής, (FACS-Flow Cytometry Analysis) χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια Ανεξίνη V, (Annexin V-FITC/7- ΑΑD kit for flow cytometry, PN IM tests, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) για την μέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων, καθώς για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου το προπίδιο-ιωδίδιο, (DNA Prep Reagent Kit PN , Beckman Coulter, UK). Οι πλασμιδιακοί φορείς pegfp-c1 και PEGFP-N1 χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP, (Green Fluorescence Protein) και ήταν της εταιρείας Novagen. Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech. Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Το γονίδιο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 από ποντίκι, κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pbluescript, παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής, (Dr. Ι.Βιζιριανάκης). Επίσης, παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Dr.Huang και Dr.Danyang το γονίδιο της πρωτεΐνης κλωνοποιημένο στον ευκαρυωτικό φορέα pegfpc1. Το μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1 έναντι του myc επιτόπου ήταν από την εταιρεία Invitrogen (R ), ενώ το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της τομπουλίνης, (a-tubulin IgM, TU-16, sc-51503), ήταν της εταιρείας Santa Cruz. Tο πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του C-τελικού άκρου της rps5, ήταν ευγενική προσφορά του Dr.Fukushi και των συνεργατών του. Τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για Western blot ανάλυση ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc., 79

100 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Temecula, CA USA). Τα αντισώματα αυτά ήταν συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνουν τη χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση. Οι αναστολείς για πρωτεάσες των ευκαρυωτικών κυττάρων (λευπεπτίνη, πεπστατίνη, αποπροτινίνη κ.α.) είναι της εταιρίας Sigma-Aldrich, Inc., (Protease Inhibitor Cocktail, P8340). Β.2 ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.1 Καλλιέργεια των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL Τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ποντικού MEL, (murine erythroleukemia cells), ή κύτταρα Friend, απομονώθηκαν αρχικά από την Dr.Charlotte Friend και τους συνεργάτες της το 1966, από κυτταρικές αποικίες, (foci), που εμφανίστηκαν στη διογκωμένη σπλήνα πειραματόζωων, (ποντίκια DAB/ 2J), τα οποία είχαν εμβολιαστεί με τον λευχαιμικό ιό Friend. Ο κλώνος που χρησιμοποιήθηκε στην προκείμενη διδακτορική διατριβή είναι ο MEL-745 PC-4. Ο κλώνος αυτός απομονώθηκε από τον αρχικό κλώνο της Charlotte Friend, από τους (Gusella, Geller et al. 1976; Gusella and Housman 1976). Τα κύτταρα αυτά αναπτύχθηκαν σε εν αιωρήσει κυτταροκαλλιέργειες (suspension cultures) σε θρεπτικό υγρό DMEM (Dulbeco s Modified eagle medium) που περιείχε 10% v/v ορό εμβρύου μόσχου, (fetal bovine serum, FBS), καθώς και μίγμα αντιβιοτικών 100 μg/ml βένζυλο πενικιλίνης και 100 μg/ml στρεπτομυκίνης για την αναστολή ανάπτυξης μυκήτων και μικροβίων. Η ανάπτυξη έγινε σε κατάλληλο επωαστήρα, (water-jacketed incubator της Forma Scientific, Inc., U.S.A.) στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με υδρατμούς και με σταθερή παροχή 5% CO 2. Τα κύτταρα διατηρούνται σε συγκεντρώσεις 5x10 4-1x10 7 κύτταρα/ml και προκειμένου να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, αραιώνονται κάθε 48 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό. Η επαγωγή της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων έγινε με την προσθήκη 5 mm HMBA για 96 h, σε καλλιέργεια με αρχική συγκέντρωση 10 Στα επιμολυσμένα κύτταρα (κλώνοι C14, C56) προστέθηκε επιπλέον το αντιβιοτικό επιλογής geneticin (G-418), της εταιρίας Invitrogen (catalog number ) σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml, που είναι ανάλογο της νεομυκίνης. 5 κύτταρα/ml. 80

101 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.2 Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης Για τον προσδιορισμό του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης των MEL στις καλλιέργειες, γίνεται μέτρηση του αριθμού των κυττάρων ανά μονάδα όγκου, (ml), θρεπτικού υγρού σε διάφορες χρονικές στιγμές (0.2,4,8,12,16,24,48,72,96 ώρες). Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιμοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (100x) (American Optical Corp., USA) ώστε να προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την μέτρηση των κυττάρων είναι αιμοκυτταρόμετρο, (πλάκα Neubauer) και καλυπτρίδες, (Thomas). Τοποθετούμε μια σταγόνα κυττάρων στην ειδική εσοχή κάτω από την καλυπτρίδα στο αιμοκυτταρόμετρο. Όπως φαίνεται στο σχήμα Β.1 η περιοχή με τις γραμμώσεις στο αιμοκυτταρόμετρο διαιρείται σε 9 μεγάλα τετράγωνα με πλευρά 1 mm το καθένα. Το κεντρικό μεγάλο τετράγωνο υποδιαιρείται σε άλλα 25 τετράγωνα μετρίου μεγέθους και το καθένα από αυτά υποδιαιρείται σε άλλα 16 μικρά τετράγωνα. Τα μικρά τετράγωνα έχουν πλευρά 1 20 mm και ο χώρος της πλάκας μέτρησης έχει βάθος 1 10 mm, (σχήμα Β1). Μετρώντας τα κύτταρα προτιμώνται τα τέσσερα γωνιακά όπως φαίνεται στο σχήμα. Πολλαπλασιάζεται ο ολικός αριθμός κυττάρων επί Ο αριθμός αυτός δίνει τον αριθμό των κυττάρων σε κάθε κυβικό χιλιοστόμετρο της καλλιέργειας. Σχήμα Β.2.1. :Σχηματική αναπαράσταση του αιμοκυτταρόμετρου Neubauer Β.2.3 Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων MEL με τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 Η μέθοδος βασίζεται στην εκλεκτική αντίδραση και χρώση των κυττάρων MEL με διάλυμα βενζιδίνης και H 2 O. Τα κύτταρα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη δηλαδή τα διαφοροποιημένα κύτταρα βάφονται κυανά (Bz + ), ενώ τα αδιαφοροποίητα δεν χρωματίζονται. 81

102 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για τη μέθοδο αυτή, η οποία αποτελεί τροποποίηση της μεθόδου που έχει προταθεί από τον (Orkin, Harosi et al. 1975), χρησιμοποιούνται τα πιο κάτω διαλύματα: Διάλυμα Α Υδροχλωρική βενζιδίνη 0,1 gr CH 3 COOH 1,5 ml H 2 O μέχρι 50 ml Το διάλυμα Α φυλάσσεται σε σκοτεινόχρωμο φιαλίδιο στους 4 C και μπορεί να διατηρηθεί για ένα μήνα. Διάλυμα Β H 2 O 2 30% 50 μl H 2 O 450 μl Το διάλυμα Β πρέπει παρασκευάζεται πριν από κάθε προσδιορισμό. Η χρώση των κυττάρων γίνεται ως εξής: Μια σταγόνα κυττάρων, (~1x 10 6 /ml), τοποθετείται σε κατάλληλη υποδοχή, (96 well plate). Στη συνέχεια, προστίθεται μια σταγόνα από το διάλυμα Α και μια από το διάλυμα Β και ακολουθεί ανακίνηση. Κατόπιν, το διάλυμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, το 96 well plate τοποθετείται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και μετρείται τόσο ο συνολικός αριθμός των κυττάρων, (τουλάχιστον κύτταρα), όσο και ο αριθμός των κυττάρων που χρωματίζονται κυανά. Θεωρώντας ότι τα κυανά κύτταρα αντιστοιχούν σε εκείνα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη, (διαφοροποιημένα) υπολογίζεται το % ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων στην καλλιέργεια, (% Bz + ). ο B.2.4 Μέτρηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο με την χρωστική Trypan Blue Σε μία ποσότητα κυττάρων, (~1x 10 6 /ml), που μεταφέρεται σε κατάλληλη υποδοχή, (96 well plate) προστίθεται χρωστική Trypan Blue 0.4%, (Sigma-Aldrich) σε αναλογία 1:1 και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Η χρωστική Trypan Blue έχει την ιδιότητα να διαπερνά μόνον την κυτταρική μεμβράνη των νεκρών κυττάρων και κατά συνέπεια ο αποκλεισμός της χρωστικής από ένα κύτταρο, (Trypan Blue exclusion) αποτελεί απόδειξη ακεραιότητας της κυτταρικής του μεμβράνης. Μετά την επώαση των 5 min, το τρυβλίο με τις 96 θέσεις τοποθετείται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και γίνεται καταμέτρηση τόσο του συνολικού αριθμού των κυττάρων (καταμετρώνται τουλάχιστον κύτταρα), όσο του αριθμού των νεκρών κυττάρων 82

103 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (κυανόχροα). Πρέπει να σημειωθεί ότι με τη μέθοδο αυτή δεν είναι δυνατόν να διευκρινιστεί το είδος του κυτταρικού θανάτου (απόπτωση ή νέκρωση). Β.2.5 Απομόνωση κυτταρικών εκχυλισμάτων από MEL κύτταρα. Tα MEL κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση σε 1000 στροφές/λεπτό, προκειμένου να απομακρυνθεί το μέσο ανάπτυξης, αιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,2 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε dd H 2 O) και φυγοκεντρήθηκαν εκ νέου σε 1000 στροφές/λεπτό. Στο ίζημα προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (βλέπε πιο κάτω) καθώς και αναστολείς πρωτεασών PMSF 1mM και 1μm αναστολείς, [proteases inhibitor cocktail, (Sigma)]. Το διάλυμα λύσης που χρησιμοποιήθηκε είχε την εξής σύσταση: Διάλυμα λύσης κυττάρων, (Lysis buffer,ripa buffer) NaCl 150 mm Tris-Cl ph 7.5 NP mm 0,5 % v/v Deoxyholic acid (Na) 0,5 % v/v Σε 1x10 7 κύτταρα, προστίθενται ~ 600μl διαλύματος λύσης. H λύση των κυττάρων έγινε ή με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, (ενδιάμεσα μεσολαβούσε κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ), ή με μηχανική διάρρηξη των μεμβρανών, (με τη χρήση potter). Και στις δύο περιπτώσεις ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε x g, για 15 λεπτά και συλλογή του υπερκειμένου (ολικό κυτταρόπλασμα). Β.2.6 Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA από MEL κύτταρα Β Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με την μέθοδο της φαινόλης Για τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα εξής διαλύματα: 83

104 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Διάλυμα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) NaCl 0,14 M MgCl 2 1,5 mm Τris-Cl ph mm NP-40 0,1 % v/v Ριβονουκλεοζιτικά σύμπλοκα του βαναδίου, (VRC), 10 mm Διάλυμα 2xPK Tris-Cl ph 7.5 0,2 M EDTA ph mm NaCl 0,3 M SDS 2 % w/v Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1X). Στη συνέχεια, προστίθενται 0,25 ml διαλύματος λύσης, για μία ποσότητα 1x10 7 κυττάρων. Ακολουθεί μηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 δευτερόλεπτα και τα κύτταρα λύονται κατά την διάρκεια της παραμονής τους στον πάγο. Στη συνέχεια το αιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται προσεκτικά (χωρίς να αναμειχθεί) σε σωλήνα φυγοκέντρησης που περιέχει ίσο όγκο διαλύματος λύσης με επιπλέον 24 % w/v σουκρόζη ελεύθερη RNάσης και 0,2 % v/v NP-40, αφήνεται στον πάγο για 5 λεπτά και αμέσως μετά φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, παραλαμβάνεται προσεκτικά η πάνω στοιβάδα, μεταφέρεται σε νέον σωλήνα, και προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος 2 x PK και πρωτεϊνάσης Κ, (200μg/ml). Το διάλυμα που προκύπτει, επωάζεται στους 37 ο C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, απομακρύνονται οι πρωτεΐνες, εκχυλίζοντας το μίγμα δυο φορές με ίσο όγκο φαινόλης/ χλωροφορμίου/ ισοαμυλικής αλκοόλης, (σε αναλογία 25:24:1), και μια φορά με χλωροφόρμιο / ισοαμυλική αλκοόλη, (24:1). Στην υδατική στοιβάδα που παραλαμβάνεται, (επάνω στοιβάδα), προστίθεται διάλυμα CH3COONa ph 5,2, σε τελική συγκέντρωση 0,3 Μ, και 2,5 όγκοι ψυχρής απόλυτης αιθανόλης, προκειμένου να γίνει η κατακρήμνιση του RNA. Το διάλυμα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Το RNA που παραλαμβάνεται σαν λευκό ίζημα, ξεπλένεται μια φορά με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται 84

105 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και στη συνέχεια διαλύεται σε αποστειρωμένο δις-απεσταγμένο νερό που έχει υποστεί κατεργασία με πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC) (Sambrook et al., 1989). B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με τη μέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην ιδιότητα θειοκυανικής γουανιδίνης να αποδιατάσσει μακρομόρια και να αναστέλλει την δράση νουκλεασών, (Feramisco, Smart et al. 1982). Για τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται τα εξής διαλύματα: Διάλυμα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) Θειοκυανική γουανιδίνη 4 Μ Κιτρικό Νάτριο ph ,2 mm N-lauroylsarcosine 0,528 % v/v Το διάλυμα λύσης φυλάσσεται στους -20 ο C πριν από τη χρήση του. Όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, αφού ξεπαγώσει, «ενεργοποιείται» με την προσθήκη μερκαπτοαιθανόλης 0,1 M, (0,72 ml για 100 ml διαλύματος λύσης). Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, προστίθενται 3 ml διαλύματος λύσης για μία ποσότητα 1x10 7 κυττάρων. Μετά από 5 λεπτά, αφού γίνει η λύση των κύτταρων, προστίθενται 0,5 ml CH 3 COONa 2 Μ, ph 4,2, 3 ml όξινης φαινόλης και 2 ml διαλύματος χλωροφορμίου/ ισοαμυλικής αλκοόλης, (24:1). Μετά την προσθήκη κάθε αντιδραστηρίου, ακολουθεί έντονη μηχανική ανακίνηση (vortex) για 10 sec και τελικά τα κύτταρα αφήνονται να παραμείνουν στον πάγο για 15 λεπτά. Κατόπιν, ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C για 20 λεπτά σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή). Στη συνέχεια, η υδατική στιβάδα, (η οποία περιέχει το RNA), χωρίζεται σε μικρότερες ποσότητες και μεταφέρεται σε νέο σωλήνα, προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης, το διάλυμα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. 85

106 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Το RNA που παραλαμβάνεται (λευκό ίζημα), ξεπλένεται μια φορά με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται και στη συνέχεια διαλυτοποιείται σε ~20 μl αποστειρωμένου διςαπεσταγμένου νερού, που έχει υποστεί κατεργασία με πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC). B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein της εταιρίας Macherey-Nagel Η απομόνωση του RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein στηρίζεται στην μέθοδο απομόνωσης με θειοκυανική γουανιδίνη. Το διάλυμα λύσης που χρησιμοποιείται για ποσότητα 5Χ10 6 κυττάρων περιέχει χαοτροπικά ιόντα σε υψηλές συγκεντρώσεις, προκειμένου να απενεργοποιηθούν ένζυμα όπως πρωτεάσες και RNases. Το διάλυμα λύσης διαλυτοποιεί δυσδιάλυτες πρωτεΐνες και δημιουργεί τις κατάλληλες συνθήκες για την προσκόλληση του RNA στο προσροφητικό υλικό (silica membrane) και για την διέλευση των πρωτεϊνών από την στήλη NucleoSpin. Η μεν απομάκρυνση του DNA από το προσροφητικό υλικό γίνεται με την χρήση του ενζύμου rdnase, η δε απομάκρυνση αλάτων, μεταβολιτών και διαφόρων άλλων μακρομορίων γίνεται με πλύσιμο της στήλης με δύο διαφορετικά διαλύματα. Η έκλουση του RNA πραγματοποιείται με συνθήκες χαμηλής ιονικής ισχύς με αποστειρωμένο νερό που δεν περιέχει RNAases ( RNase-free water). H διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Καλλιέργεια κυττάρων 5x10 6 MEL φυγοκεντρείται στα 900 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές (5 λεπτά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, προστίθενται 350 μl διαλύματος λύσης RP1 και 3,5 μl μερκαπτοαιθανόλη. Μετά την προσθήκη του διαλύματος λύσης, ακολουθεί έντονη μηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 δευτερόλεπτα και στην συνέχεια το ιξώδες μίγμα αφήνεται να διέλθει μέσω στήλης NucleoSpin Filter units. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g στους 4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή), απομακρύνεται η στήλη NucleoSpin Filter units, προστίθενται 350 μl ψυχρής αιθανόλης 70% και γίνεται ήπια ομογενοποίηση του μίγματος (pipetting up and down). Ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στην στήλη NucleoSpin RNA/Protein, (παρέχεται από την εταιρεία) και φυγοκεντρείται για 30 δευτερόλεπτα σε x g στους 4 ο C. Το RNA και το DNA 86

107 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ δεσμεύονται στο προσροφητικό της στήλης ενώ η ολική πρωτεΐνη απομακρύνεται με τη φυγοκέντρηση. Για την έκλουση του RNA ακολουθούνται τα εξής περαιτέρω στάδια: Για την αφαλάτωση του προσροφητικού υλικού, στο οποίο προσδέθηκαν το RNA και το DNA, προστίθενται 350 μl MDB (Membrane Desalting Buffer) και γίνεται φυγοκέντρηση σε 11,000 x g για1 λεπτό. Η απομάκρυνση του DNA γίνεται με επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με το ένζυμο rdnaase, (95 μl rdnase reaction mixture). Ακολουθούν τρία πλυσίματα της στήλης NucleoSpin RNA/Protein. Το πρώτο πλύσιμο γίνεται με προσθήκη του διαλύματος RA2 200 μl και φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στους 4 ο C σε 11,000 x g και το δεύτερο πλύσιμο πραγματοποιείται με την προσθήκη RA3 600 μl και έπειτα φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στους 4 ο C σε 11,000 x g. Ακολουθεί το τρίτο πλύσιμο της στήλης με το διάλυμα RA3, 350 μl, φυγοκέντρηση για 2 λεπτά και μια επιπλέον φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στους 4 ο C σε 11,000 x g. Η έκλουση του RNA πραγματοποιείται με προσθήκη 40 μl αποστειρωμένου νερού που δεν περιέχει RNAases, (RNase-free water) και ακολουθεί φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στους 4 ο C σε x g, (NucleoSpin RNA/Protein User manual, Macherey-Nagel). Στην συνέχεια, ηλεκτροφορείται σε 1,2 % φορμαλδεΰδης- αγαρόζη μια μικρή ποσότητα (2 μl-5 μl) από το εκλουόμενο RNA προκειμένου να ελεχθεί η καθαρότητα του και παράλληλα φωτομετρείται μια άλλη ποσότητα σε φωτόμετρο, Carywin UV Conc. Package, (παράγραφος Β.2.7). Το RNA που παραλαμβάνεται χρησιμοποιείται σε εφαρμοσμένες τεχνικές όπως στην Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης τρανσκριπτάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR, παράγραφος Β.2.21). Για την απομόνωση πρωτεϊνών ακολουθούνται τα εξής περαιτέρω στάδια. Όπως αναφέρθηκε, μετά την διαβίβαση του συνολικού όγκου στην στήλη NucleoSpin RNA/Protein τα νουκλεϊκά οξέα προσδένονται στο προσροφητικό της στήλης ενώ οι πρωτεΐνες απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Σε μια κατάλληλη ποσότητα ( μl) προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος PP (Protein Precipitator) και γίνεται ισχυρή ανάδευση. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 11,000 x g στους4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή) και στην συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο. Κατόπιν, προστίθενται 500 μl 50% ψυχρής αιθανόλης για πλύσιμο του ιζήματος (pellet) και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 11,000 x g. Έπειτα γίνεται ξήρανση 87

108 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ του ιζήματος για 5 με 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προσθήκη μl PLB-TCEP (Protein Loading Buffer που έχει αναγωγικές ιδιότητες) ανάλογα με την ποσότητα του ιζήματος. Ακολουθεί επώαση για 3 λεπτά στους ο C για την διαλυτοποίηση και αποδιάταξη των πρωτεϊνών, (NucleoSpin RNA/Protein User manual, Macherey-Nagel 2007). Οι πρωτεΐνες που απομονώνονται μπορούν να ηλεκτροφορηθούν σε PAGE-SDS ηλεκτροφόρηση και στην συνέχεια να ηλεκτρομεταφερθούν σε μεμβράνη για ανοσοανίχνευση. Β.2.7 Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος. Έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του δείγματος (2-3 μl) που πρόκειται να αναλυθεί αραιώνεται με αποστειρωμένο νερό (800 μl) και στη συνέχεια μετρείται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Λαμβάνοντας υπόψη ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm (1 OD 260 ) αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίζουμε την ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγμα (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμάται από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm (OD 260 /OD 280 ), διότι τα δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο περίπου 2. Β.2.8 Υποκυτταρική κλασμάτωση των MEL κυττάρων Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην λύση των κυττάρων με τη βοήθεια απορρυπαντικού και στον διαχωρισμό του διαλυτού κλάσματος από τα διάφορα πυρηνικά εκχυλίσματα, (Jiang, Wilford et al. 2001). Συλλέγεται ποσότητα κυττάρων 5 Χ 10 6, ξεπλένεται με ισότονο διάλυμα PBS, φυγοκεντρείται και αιωρείται σε 100 μl διαλύματος Α (20 mm Hepes-KOH ph 7,5, 100 mm KCl, 5% σουκρόζη, 1 mm DTT). Στο αιώρημα προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος 88

109 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α,το οποίο περιέχει και NP-40 0,8% (v/v,τελική περιεκτικότητα σε ΝΡ-40 0,4%) και τα κύτταρα παραμένουν για 10 λεπτά στον πάγο. Το απορρυπαντικό προστίθεται προκειμένου να σπάσουν μόνον οι κυττροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων και όχι και οι πυρηνικές. Στη συνέχεια το αιώρημα φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 4300 x g και συλλέγεται το υπερκείμενο (το διαλυτό κλάσμα του κυτταροπλάσματος). Το ίζημα επαναιωρείται σε 100 μl διαλύματος Α, επιστοιβάζεται σε μαξιλάρι σουκρόζης (1,2 ml διάλυμα A με 0,8 Μ σουκρόζη) και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 4300 x g (στο νέο προκύπτον ίζημα βρίσκονται καθαροί πυρήνες). Στους πυρήνες που ξεπλένονται με PBS προστίθενται 100 μλ διαλύματος EB (10 mm PIPES ph 6,8, 250 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2 και αναστολείς πρωτεασών 1 mm PMSF και 1 μm αναστολείς [proteases inhibitor cocktail (Sigma)] και το αιώρημα παραμένει 5 λεπτά στον πάγο. Με την διαδικασία αυτή σπάζουν οι πυρήνες και με μία φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 4300 x g συλλέγεται το υπερκείμενο που αποτελεί το διαλυτό κλάσμα του νουκλεοπλάσματος. Β.2.9 Απομόνωση ριβοσωμάτων από MEL κύτταρα Τα MEL κύτταρα, που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ριβοσωμάτων, (~8 x 10 8 κύτταρα) συλλέχθηκαν από την λογαριθμική φάση τους αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης, μετά από φυγοκέντρηση στις 900 στροφές/λεπτό και πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,2 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η πιο κάτω διαδικασία. Αιώρηση σε 9 ml διαλύματος Α, (20 mm Tris ph 7,4, 100 mm KCl, 10 mm MgCl 2 ) παρουσία αναστολέων cocktail 2 μm, λύση με υπέρηχους (5 κύκλοι διάρκειας 20 δευτερόλεπτα ο κάθε ένας και 40 δευτερόλεπτα στον πάγο μετά από κάθε κύκλο) και φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34) σε rpm (30000g), για 15 λεπτά στους ºC, ώστε 4 να απομακρυνθούν οι μεμβράνες. Παραλαμβάνεται το υπερκείμενο, επιστοιβάζεται σε μαξιλάρι σουκρόζης (10-50% διαβάθμιση σε διάλυμα Α) και φυγοκεντρείται για 3 ώρες στα x g.. Στη συνέχεια μετά από απομάκρυνση του υπερκείμενου το ίζημα αιωρείται, ο (ριβοσώματα) σε 400 μl διαλύματος Α υπό ανάδευση για 12 περίπου ώρες στους 4 C, (Dresios, Aschrafi et al. 2005). 89

110 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 260 και 280nm για προσδιορισμό της ποσότητας και καθαρότητας των ριβοσωμάτων, και στη συνέχεια διαχωρισμός του παρασκευάσματος σε μικρά κλάσματα πριν την αποθήκευσή τους στους 80 º C. Για την κατακρήμνιση ριβοσωμικών πρωτεϊνών ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: Προστίθενται 0,1 όγκοι (CH3COO) 2 Mg 1M και 2 όγκοι οξικού οξέος 100 % και το διάλυμα αναδεύεται για 45 λεπτά μέσα σε πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα x g για 30 λεπτά σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4º C). Το rrna που κατακρημνίζεται απομακρύνεται ενώ στο υπερκείμενο, που περιέχει τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, προστίθενται 5 όγκοι ψυχρής ακετόνης και τοποθετείται στους -20ºC για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των 3 ωρών, (για να κατακρημνιστούν). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παραλαμβάνονται με φυγοκέντρηση στα 8000 rpm (10000g) για 30 λεπτά σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4º C). Μετά την απομάκρυνση της ακετόνης το ίζημα, (ριβοσωμικές πρωτεΐνες) παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου για 15min, έτσι ώστε να εξατμιστούν υπολείμματα του διαλύτη. Το ίζημα αιωρείται σε αποστειρωμένο νερό (ποσότητες του 1 Α260 ριβοσωμικών υπομονάδων). Ως μία ισοδύναμη μονάδα (1 equivalent unit, 1e.u.), ορίζεται η ποσότητα μιας πρωτεΐνης ή μιας ομάδας πρωτεϊνών που βρίσκεται σε 1 OD Α260 (Απορρόφηση στα 260 nm ίση με 1, Α 260 = 1), (Nierhaus 1990a). Β.2.10 Ανάλυση κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry) Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια χρήσιμη καινοτόμο μέθοδο που επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών φυσικοχημικών και βιολογικών χαρακτηριστικών ενός κυττάρου. Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό κυττάρων, ανάλογα με τη ποσότητα γενετικού υλικού DNA από διαφορετικά είδη (φυτά ή θηλαστικά). Επίσης χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση κυττάρων με διαφορετικά χαρακτηριστικά (traits) από μεικτούς πληθυσμούς. Οι μετρήσεις αυτές γίνονται ξεχωριστά σε κάθε κύτταρο, το οποίο βρίσκεται σε ροή και περιβάλλεται από ένα σύστημα κινητής φάσης. Ένας κυτταρομετρητής αποτελείται από ένα σύστημα ροής υγρών (fluidics), οπτικών (optics) και ηλεκτρονικών (electronics), ώστε να καταμετρώνται κύτταρα τα οποία βρίσκονται σε ροή (Robinson, 2006). Ειδικότερα, το σύστημα ροής υγρών αποτελείται από ένα σύνολο ομόκεντρων σωλήνων. Εξωτερικά ρέει συνεχώς ένα ισότονο υγρό και εσωτερικά το δείγμα βρίσκεται σε πολύ χαμηλό ρεύμα ροής, έτσι ώστε τα κύτταρα να περνούν έναένα. Το χαμηλό ρεύμα των κυττάρων που περιβάλλεται από το υγρό ροής περνά από 90

111 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μία σχισμή στην οποία είναι εστιασμένη ακτίνα laser ή UV. Κάθε κύτταρο μετά τη σύγκρουσή του με την ακτίνα σκεδάζει το φως σε συγκεκριμένες γωνίες, ανάλογα με την εξωτερική και την εσωτερική του μορφολογία. Η απόκλιση της φωτεινής δέσμης αναγνωρίζεται από ένα σύστημα ανιχνευτών (βολταϊκές φωτοδίοδοι) και με τον τρόπο αυτό διαχωρίζονται οι διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί, ανάλογα με το μέγεθος και την κυτταροπλασματική τους δομή (σχήμα Β.2.2.), (Ormerod 1990). Αντίστοιχα μπορεί να γίνει επιλογή κυτταρικών πληθυσμών οι οποίοι εκφράζουν φθορίζουσες πρωτεΐνες και ο φθορισμός συλλέγεται, φιλτράρεται και μετατρέπεται σε ψηφιακή τιμή ώστε να υποστεί ηλεκτρονική επεξεργασία. Σχήμα Β.2.2.: Απεικόνιση της λειτουργίας του FACS.. Ένας κυτταρομετρητής αποτελείται από ένα σύστημα ροής υγρών (fluidics), οπτικών (optics) και ηλεκτρονικών (electronics), ώστε να μετράει κύτταρα τα οποία βρίσκονται σε ροή, (Robinson, 2006). 91

112 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.2.11 Μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry) κατόπιν χρώσης με τις φθορίζουσες χρωστικές ανεξίνη V (FITC-Annexin V) και προπίδιοιωδίδιο (Propidium-Iodide - PI) Η μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, βασίζεται στη διαδικασία μεταφοράς της αρνητικά φορτισμένης φωσφατιδυλοσερίνης (PS) από την εσωτερική προς την εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης, (Savill, Fadok et al. 1993) η οποία γίνεται στην έναρξη της απόπτωσης. H ανεξίνη V ανήκει σε μία οικογένεια πρωτεϊνών με αντισυγκολλητικές ιδιότητες που συνδέεται κατά προτίμηση με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, όπως είναι η φωσφατιδυλοσερίνη της εξωτερικής μεμβράνης, παρουσία ιόντων Ca 2+, ενώ συνδέεται ελάχιστα με τη φωσφατιδυλοχολίνη και σφιγγομυελίνη, οι οποίες βρίσκονται επίσης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη. Η προσθήκη της φθορίζουσας χρωστικής FITC (fluorescent isothio cyanate) στην ανεξίνη καθιστά δυνατή την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποπτωτικών κυττάρων (De Francesco 1999). Επιπλέον, πρέπει να σημειωθεί ότι η ανίχνευση της φωσφατιδυλοσερίνης με τη μεταφορά της στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης με τη μέθοδο αυτή οδηγεί στον εντοπισμό των αποπτωτικών κυττάρων σε πολύ πρώιμα στάδια, προτού συμβούν οποιεσδήποτε άλλες μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές, όπως η συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, η απώλεια της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης και η ενδονουκλεοσωμική διάσπαση του DNA. Καθώς η αποπτωτική διαδικασία προχωράει η ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης καταστρέφεται. Η χρήση της χρωστικής 7-AAD (δείκτης βιωσιμότητας), βοηθά στον διαχωρισμό των πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων και βασίζεται στην ικανότητα της 7-αμινο-ακτινομυκίνης D (7-AAD) να παρεμβαίνει μεταξύ διαδοχικών βάσεων κυτοσίνη C / γουανίνη G του δίκλωνου DNA, όταν το εσωτερικό του κυττάρου και η πυρηνική χρωματίνη έχουν γίνει προσιτά, (Schmid I, 1992). Η 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (7-AAD) είναι ένα ανάλογο της ακτινομυκίνης που περιέχει μια αμινο-ομάδα ως υποκατάστατο στην θέση 7 του χρωμοφόρου. Οι ακτινομυκίνες είναι αντιβιοτικά βακτηριακών προελεύσεων που χαρακτηρίστηκαν πρώτα στους ασκομύκητες του εδάφους και σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα με το δίκλωνο δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA), αλλά όχι με το δίκλωνο ριβονουκλεικό οξύ (RNA), ή με υβρίδια RNA-DNA, ή με μονόκλωνο DNA ή RNA. 92

113 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οι φασματοσκοπικές ιδιότητες της χρωστικής 7-AAD είναι ιδιαίτερα αξιοποιήσιμες στην ανάλυση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Η βέλτιστη εκπομπή φθορισμού στο σκούρο κόκκινο (635 με 675nm) αξιοποιείται με χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με φθορίζουσες ενώσεις (FITC, ή R Φυκοερυθρίνη PE). Τα μη βιώσιμα κύτταρα μπορούν να χαρακτηριστούν και να ταυτοποιηθούν αφού είναι σημασμένα με την χρωστική 7-AAD, ενώ τα ζωντανά κύτταρα που διατηρούν την μεμβρανική τους ακεραιότητα είναι μη διαπερατά στην χρωστική 7-AAD. Από την άλλη μεριά το προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodode-pi), όπως και η χρωστική 7-ΑΑD, μπορεί μεν να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη μόνο των νεκρωτικών κυττάρων παρουσιάζουν όμως περιορισμένη επικάλυψη του φάσματος εκπομπής (πορτοκαλί-κόκκινος φθορισμός σε μήκος κύματος 605 έως 635 nm) με το FITC και την PE. Σχήμα Β.2.3.: Σχηματική αναπαράσταση πρόσδεσης της ανεξίνης στην φωσφατιδυλοσερίνη. H ανεξίνη V συνδέεται κατά προτίμηση με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, όπως η φωσφατιδυλοσερίνη της εξωτερικής μεμβράνης, παρουσία ιόντων Ca +2,(Savill 1993). Επομένως, η ταυτόχρονη χρώση των κυττάρων με ανεξίνη V-FITC (πράσινος φθορισμός σε μήκος κύματος 488nm) και με την χρωστική 7-AAD (κόκκινος φθορισμός σε μήκος κύματος 635 με 675 nm), επιτρέπει τη διάκριση των τεσσάρων διαφορετικών κατηγοριών κυττάρων όπως φαίνεται πιο κάτω: Φυσιολογικά κύτταρα: αρνητικά και για τις 2 χρωστικές (FITC-/7-AAD-) Πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα (early apoptotic): θετικά μόνο για FITC(FITC+/7-AAD-) 93

114 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όψιμα αποπτωτικά κύτταρα (late apoptotic): θετικά και για τις 2 χρωστικές (FITC+/7- AAD+). Αυτό συμβαίνει διότι σε επίπεδο κυτταρικών καλλιεργειών δεν υπάρχουν τα κύτταρα του αμυντικού συστήματος (π.x μακροφάγα) για να απομακρύνουν τα αποπτωτικά κύτταρα. Νεκρωτικά κύτταρα (necrotic cells): κύτταρα θετικά μόνο για 7-AAD(FITC-/7-AAD+). Σχήμα Β.2.4: Διαχωρισμός ζωντανών, πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων. Στα αποπτωτικά κύτταρα η αρνητικά φορτισμένη φωσφατιδυλοσερίνη (PS) μεταφέρεται από την εσωτερική προς την εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης και προσδένεται με την ανεξίνη. Τα πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα είναι θετικά μόνο για την χρωστική FITC, ενώ τα όψιμα είναι θετικά και για τις 2 χρωστικές FITC και 7-AAD (Schmid I, 1992).. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είχε ως εξής: Κύτταρα που συλλέχθηκαν μετά από 24, 48 και 72 ώρες, υπέστησαν κατεργασία για την αφαίρεση του θρεπτικού υλικού (φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1200 rpm/λεπτό), ξεπλύθηκαν δύο φορές με 5 ml ψυχρό PBS, ph=7,2, στη συνέχεια αιωρήθηκαν σε 200 μl PBS και καταμετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο (πλάκα Neubauer, παράγραφος Β.2.2.). Ο αριθμός των κυττάρων θα πρέπει να είναι περίπου 10 6 κύτταρα/ml. Απομακρύνθηκε το PBS με φυγοκέντρηση και τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος PBS και προστίθεται 1ml ρυθμιστικού διαλύματος (1X binding buffer και 10 μl ανεξίνη V-FITC και 20μl 7-AAD, σύμφωνα με το πρωτόκολλο (Annexin V-FITC/7-ΑΑΔ kit for flow cytometry, PN IM tests, Beckman Coulter, Inc, 94

115 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Miami,USA). Μετά από επώαση15 λεπτά στο σκοτάδι, έγινε ανάλυση των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής (Coulter Epics XL MCL Flow cytometer, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) σε μήκος κύματος 488 nm. Σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν τουλάχιστον κύτταρα. Τα κύτταρα που ήταν θετικά για ανεξίνη V-FITC ανιχνεύτηκαν από το φίλτρο FL1 (πράσινος φθορισμός), σε μήκος κύματος από 505 έως 545 nm, ενώ τα θετικά για 7- ΑΑD στο φίλτρο FL2 (σκούρος κόκκινος φθορισμός), σε μήκος κύματος από 605 έως 635 nm και τα αποτελέσματα μετετράπησαν σε γραμμικά / λογαριθμικά ιστογράμματα. Σχήμα Β.2.5.1: Χημική δομή προπίδιοιωδίδιο (propidium-iodode-pi) Σχήμα Β.2.5.2: Χημική δομή της 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD) 95

116 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.12 Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με ανίχνευση του DNA των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-flow cytometry), κατόπιν χρώσης με προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) Η ανάλυση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (G0/G1, S και G2/M) σε έναν λογαριθμικά αυξανόμενο κυτταρικό πληθυσμό βασίζεται στην ιδιότητα ορισμένων χρωστικών, όπως το προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) να συνδέονται στοιχειομετρικά με το πυρηνικό DNA, κάτω από κατάλληλες συνθήκες (Darzynkiewicz, Gong et al. 1994). Επομένως, ο φθορισμός που ανιχνεύεται από κυτταρομετρητή ροής σε μήκος κύματος 488 nm είναι ανάλογος με το DΝΑ των κυττάρων που αλληλεπίδρασε στοιχειομετρικά με την χρωστική που προαναφέρθηκε. Έτσι, κατά την ανίχνευση παρατηρείται μία πρώτη κορυφή που αντιστοιχεί στα κύτταρα της G0/G1 φάσης που φέρουν μία ορισμένη ποσότητα Ν γενετικού υλικού (DNA), (Ormerod, 2000). Η επόμενη κορυφή αντιστοιχεί στα κύτταρα της G2/Μ φάσης, τα οποία φέρουν διπλάσια ποσότητα 2Ν γενετικού υλικού, ενώ τέλος ανάμεσα στις δύο κορυφές, υπάρχει μία «πεδιάδα» από κύτταρα που φέρουν ποσότητα γενετικού υλικού ενδιάμεση μεταξύ Ν και 2Ν και είναι τα κύτταρα της φάσης S στην οποία δεν έχει ακόμα ολοκληρωθεί ο αναδιπλασιασμός του DNA, (σχήμα Β.2.6). Με την ίδια λογική, μπορούν να ανιχνευτούν και κύτταρα που φέρουν μικρότερη ποσότητα DNA από Ν (sub-g1 peak) και αποτελούν τα αποπτωτικά κύτταρα στα οποία έγινε διάσπαση του DNA τους, ή ακόμα και κύτταρα με μεγαλύτερη ποσότητα DNA από 2Ν (π.x 3Ν, 4Ν), δηλαδή πολυπλοειδικά κύτταρα, (Rabinovitch 1994). 96

117 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.6.: Συσχετισμός μεταξύ ιστογράμματος του DNA και του κυτταρικού κύκλου. Στο σχήμα δεν απεικονίζεται η φάση Go (έξω από τα όρια του κυτταρικού κύκλου). Τα κύτταρα που βρίσκονται στην φάση Go έχουν το ίδιο γενετικό υλικό με τα κύτταρα της G1 φάσης (Robinson, 2006). Για τα πειράματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν 100 μl κυτταρικού αιωρήματος (suspension) σε PBS (ph=7,2) (10 6 κύτταρα για κάθε δείγμα ). Σε κάθε ένα δείγμα προστέθηκαν 2 ml ειδικού αντιδραστηρίου (DNA Prep Stain), υπό ανάδευση σε κατάλληλη συσκευή (DNA Work Prep Station). Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται από τα ακόλουθα συστατικά (DNA Prep Reagent Kit PN , Beckman Coulter, UK): απορρυπαντικό (Triton-X 100) για τη διαλυτοποίηση (permeabilization) της κυτταρικής μεμβράνης, που διευκολύνει την είσοδο της χρωστικής κατάλληλη RNAάση, για τη διάσπαση του RNA, έτσι ώστε να παραμείνει μόνο το DNA από τα νουκλεϊκά οξέα για να συνδεθεί με το PI την χρωστική προπίδιο-ιωδίδιο (PI) Τα δείγματα μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου DNA Prep Stain, παρέμειναν για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και κατόπιν έγινε ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής (Coulter Epics XL MCL Flow cytometer, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) σε μήκος κύματος 488 nm. Σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν τουλάχιστον 10,000 κύτταρα. Τα «σήματα» του PI ανιχνεύτηκαν στο φίλτρο FL3 (>650 nm, κόκκινος φθορισμός) και μετετράπησαν σε γραμμικά /λογαριθμικά ιστογράμματα. Επίσης, η συλλογή των «σημάτων» τέθηκε σε ορισμένους περιορισμούς (gating), προκειμένου να αποκλειστούν οι διπλέτες (doublets) (= δύο κύτταρα ενωμένα) και τα 97

118 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ κομμάτια σπασμένων κυττάρων (cell debris). Τα ιστογράμματα αναλύθηκαν στη συνέχεια με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού (Multicycle Cell analysis Software, Phoenix Flow Systems, Inc, San Diego, CA), με το οποίο υπολογίστηκαν τα ποσοστά των κυττάρων που βρίσκονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου (G0/G1, S και G2/M). B.2.13 Τεχνική της RNA παρεμβολής σε MEL κύτταρα Η τεχνολογία της RNA παρεμβολής εμφανίζει μεγάλη εξειδίκευση, καθώς η εισαγωγή μορίων RNA ομόλογων με αλληλουχίες εξονίων συγκεκριμένων γονιδίων, έχει ως αποτέλεσμα την μείωση των επιπέδων μόνο του αντίστοιχου mrna. Παράγοντες που ίσως σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της τεχνικής της RNA παρεμβολής, είναι: σταθερότητα του συμπλόκου RISC, η ακριβής περιοχή σύνδεσης του δίκλωνου RNA (sirna) στο mrna στόχο, οι ανώτερες δομές του mrna ή οι συνδεδεμένες με αυτό πρωτεΐνες οι οποίες μπορεί να δρουν προστατευτικά παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση (Dykxhoorn, Novina et al. 2003), (Arenz and Schepers 2003), (Brummelkamp, Bernards et al. 2002). Για τα πειράματα με sirna που περιγράφονται στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν δίκλωνα sirnas -είχαν συντεθεί τεχνητά- για την καταστολή του mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 και η μεταφορά τους στα MEL έγινε με την τεχνική της λιποφεκταμίνης. B Σχεδιασμός των sirnas που στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 Τα μικρά δίκλωνα RNAs (sirnas) μπορούν να παραχθούν με διάφορους τρόπους όπως: Mε χημική σύνθεση Με in vitro μεταγραφή Με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιώντας κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης. Η επιλογή του κατάλληλου μορίου για τη επιτυχή γονιδιακή καταστολή, είναι μια εμπειρική διαδικασία, καθώς οι παράγοντες εκείνοι που καθορίζουν την αποτελεσματικότητα ενός μορίου sirna, δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. 98

119 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα κύρια χαρακτηριστικά ενός sirna που κατασκευάζεται με σκοπό την γονιδιακή αποσιώπηση είναι : μέγεθος νουκλεοτίδια 5 άκρο φωσφορυλιωμένο 3 άκρο μη φωσφορυλιωμένο μονόκλωνη περιοχή 2-4 νουκλεοτιδίων. Για την καταστολή του mrna του γονιδίου RPS5 σχεδιάστηκαν με αλγοριθμικό πρόγραμμα υψηλής ανάλυσης (High Performance, HP GenomeWide sirna , Qiagen) δυο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων. Συμφώνα με το πρόγραμμα το ποσοστό επιτυχίας της αποσιώπησης του γονιδίου RPS5 είναι υψηλότερο από 70%. Παρακάτω δίνονται οι αλληλουχίες βάσεων των δυο ζευγών ολιγονουκλεοτιδίων (Rps5_4_HP sirna και Rps5_2_HPsiRNA) που σχεδιάστηκαν: Rps5_4_HP sirna (SI , Qiagen) Νοηματικός κλώνος r (GCG CUU CCG CAA AGC ACA A)dTdT Αντινοηματικός κλώνος r (UUG UGC UUU GCG GAA GCG C)dTdT Rps5_2_HP sirna ( SI , Qiagen) Νοηματικός κλώνος r (UGG UGA AUG CUA UCA UCA A)dTdT Αντινοηματικός κλώνος r (UUG AUG AUA GCA UUC ACC A)dGdG Το δίκλωνο RNA, Rps5_4_HP sirna στοχεύει στην περιοχή AAG CGC TTC CGC AAA GCA CAA (στην περιοχή ολιγονουκλεοτίδίων) του mrna RPS5, ενώ το δίκλωνο Rps5_2_HP sirna στοχεύει στην περιοχή CCT GGT GAA TGC TAT CAT CAA (στην περιοχή ολιγονουκλεοτίδίων). 99

120 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Παράλληλα παραγγέλθηκαν και δίκλωνα RNAs που δεν έχουν κάποια γνωστή ομολογία με mrna ευκαρυωτικών κυττάρων και επομένως δεν στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5, για να χρησιμοποιηθούν ως πείραμα αναφοράς, (control). H αλληλουχία βάσεων δίνεται παρακάτω: Control ( , Qiagen) Νοηματικός κλώνος UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdT dt Αντινοηματικός κλώνος ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdT dt B Προετοιμασία των δίκλωνων RNAs (sirna) Tα δίκλωνα RNAs εάν δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα μετά την σύνθεσή τους υφίστανται την ακόλουθη επεξεργασία : Προστίθενται 250 μl ή 1 ml διαλύματος αιώρησης Suspension Buffer (Qiagen) σε 5 nmole και 20 nmole δίκλωνου RNA (sirna), αντίστοιχα, ώστε η τελική συγκέντρωση να γίνει 20 μm (~0.25 μg/μl). Τοποθετείται στους 90 0 C για ένα λεπτό και στη συνέχεια μεταφέρεται στους 37 ο C για μια ώρα. Ακολουθεί διαχωρισμός του δείγματος σε μικροσωλήνες φυγοκέντρου (eppendorf) και τοποθέτηση στους -20 ο C. Rps5_4_HP sirna Rps5_2_HP sirna 100

121 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.7. Απεικόνιση των δυο ζευγών ολιγονουκλεοτιδίων (sirna) που σχεδιάστηκαν για την αποσιώπηση του γονιδίου RPS5. Ο σχεδιασμός έγινε σύμφωνα με το πρόγραμμα υψηλής ανάλυσης (High Performance, HP GenomeWide sirna , Qiagen) B Πειραματική διαδικασία για την αποσιώπηση (silencing) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή δίκλωνων sirna σε ευκαρυωτικά κύτταρα ΜΕL με την τεχνική των λιποσωμάτων, χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα, (HiPerfect Transfection Reagent, Qiagen) που περιέχει κατιοντικά και ουδέτερα λιπίδια για την αποτελεσματική πρόσληψη των sirna. Αυτό που είναι πιο πιθανό να συμβαίνει, είναι οι αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των sirna να δεσμεύονται στη θετικά φορτισμένη επιφάνεια των λιποσωμάτων και το υπολειπόμενο θετικό φορτίο, στη συνέχεια να δεσμεύεται στο αρνητικά φορτισμένο σιαλικό οξύ, της επιφάνειας των κυττάρων. H διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Καλλιέργεια 0,4-1,6 Χ10 6 κυττάρων MEL φυγοκεντρήθηκε στα 900 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δυο φορές ( από 5 λεπτά την κάθε φορά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια αφού αιωρήθηκαν σε DMEM (βλέπε στον Πίνακα 4), τοποθετήθηκαν σε κατάλληλη υποδοχή (σε τρυβλία καλλιέργειας ή σε τρυβλία πολλαπλών πηγαδιών) στα οποία προστέθηκαν επίσης οι κατάλληλες ποσότητες θρεπτικού υλικού και του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer, (Qiagen) όπως φαίνεται στον πίνακα 4 και επωάστηκαν στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5 % σε CO 2 για 16 περίπου ώρες. 101

122 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.8: Σχηματική αναπαράσταση των συμπλόκων sirna:hiperfect Reagent Buffer. Τα δίκλωνα sirna μεταφέρονται στα κύτταρα διαμέσου των λιποσωμάτων με την βοήθεια του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer. Για την αποτελεσματική αποσιώπηση (silencing) απαιτούνται υψηλές συγκεντρώσεις των sirna (Qiagen, 2006). Υποδοχή καλλιεργειών Ποσότητα θρεπτικού DMEM (μl) Ποσότητα Hi Perfect Reagent (μl) 96 well plate 150 0,75 48 well plate 250 1,5 24 well plate mm dish Πίνακας 4.: Ποσότητες θρεπτικού υλικού (DMEM) και του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer ανάλογα με το είδος υποδοχής καλλιεργειών. Για κάθε αντίδραση επιμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις sirna από 5nM έως 180nM. Συγκεκριμένα το Rps5_4_HP sirna είτε το Rps5_2_HP sirna, είτε 102

123 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και τα δύο μαζί και το control sirna (μάρτυρας) αραιώθηκαν σε 100 μl διαλύματος, (ECR, buffer Qiagen) χωρίς ορό και αντιβιοτικά και στη συνέχεια προστέθηκε και η κατάλληλη ποσότητα του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης HiPerfect Reagent Buffer όπως φαίνεται στον πίνακα 4. Ακολούθησαν ήπια ανάμειξη και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά, προκειμένου να σχηματιστούν τα σύμπλοκα sirna:hiperfect Reagent Buffer, (σχήμα Β.2.8). Τέλος, το μίγμα αυτό μεταφέρθηκε στάγδην στα κύτταρα με ήπια ανάδευση. Ακολούθησε επώαση σε θάλαμο κυτταροκαλλιεργειών (37 ο C, 5% CO 2 ) και μετά από 6-72 ώρες (από την στιγμή της επιμόλυνσης) τα κύτταρα συλλέχθηκαν, απομακρύνθηκε το υγρό μέσο ανάπτυξης και ακολούθησε η λύση τους για απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA και παραλαβή πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Β.2.14 Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli Τα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10, αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα LB, (Luria-Bertani) (Sambrook et al. 1989), του οποίου η σύσταση ήταν η εξής: Θρεπτικό υλικό LB Εκχύλισμα ζύμης 0,5 % w/v Τρυπτόνη 1,0 % w/v NaCl 1,0 % w/v Η ρύθμιση της οξύτητας έγινε με NaOH. Ακολούθησε αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση μιας Atm, για 30 λεπτά. ο Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν ήταν απαραίτητο. Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP 10 έγινε σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται παρακάτω: Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισμα ζύμης 0,5 % w/v Τρυπτόνη 2,0 % w/v NaCl 0,1 M MgSO 4 10 mm 103

124 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.15 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσμεύεται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465nm και το χρώμα της είναι καστανό. Η δημιουργία του συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κυανού χρώματος και τη μεταβολή του μέγιστου απορρόφησης στα 595nm, όπου και μετράται φωτομετρικά. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάστηκε ως εξής: Αντιδραστήριο Bradford CBB G mg/ml H 3 PO 4 85 % 200 ml Ανάδευση για ώρες, αραίωση του διαλύματος με απιονισμένο νερό στο 1lt. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγματα προσδιορίστηκε με ανάμιξη του κάθε δείγματος, (αραιωμένου στα 2ml με απιονισμένο νερό), με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολούθησε μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη αναφοράς με αλβουμίνη ή σφαιρίνη βόειου ορού, (BSA) (Bradford 1976; Bearden 1978). Β.2.16 Ηλεκτροφόρηση Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου Τα πρωτεϊνικά μόρια, όπως κάθε άλλο φορτισμένο σωματίδιο, μετακινούνται κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών εφαρμόστηκε από τον Tiselius το 1937 και έκτοτε χρησιμοποιείται ευρύτατα. Οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα σωματίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια μέσου των πόρων μιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η διεύθυνση της κινήσεως των μορίων προς το θετικό ή αρνητικό πόλο εξαρτάται από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης. Η ταχύτητα με την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, (v), εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού 104

125 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ του ηλεκτρικού πεδίου, (Ε) και από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης, (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: E q v = f όπου f είναι παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Το πολυακρυλαμίδιο, που χρησιμοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως είναι η χημική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερμοκρασία, και τα αποτελέσματα των ηλεκτροφορήσεων με πολυακρυλαμίδιο είναι επαναλήψιμα. Η δημιουργία των πηκτών πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται με τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου, (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), και του Ν,Νμεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου,(bis-ακρυλαμιδίου) (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO- CH=CH 2 ). Η αναλογία με την οποία χρησιμοποιούνται τα δυο υλικά είναι 30:1 w/w. Το bis-ακρυλαμίδιο, συντελεί στο σχηματισμό γεφυρών μεταξύ των αλυσίδων των πολυμερών του ακρυλαμιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δημιουργείται ένα τριδιάστατο πολυμερές πλέγμα, το μέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των μονομερών του ακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός πραγματοποιείται με το μηχανισμό των ελευθέρων ριζών. Σαν δότης των ελευθέρων ριζών χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχημικός καταλύτης Ν,Ν,-τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη, (TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει μια ελεύθερη ρίζα, (S 2 O 2-8 +e - SO SO4 -. ), η οποία διαδίδεται σε άλλα μόρια ακρυλαμιδίου προς σχηματισμό του πολυμερούς. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία μετουσιωτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου), ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους και παραμένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης μετουσιωτικών παραγόντων, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Επίσης, η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αναγωγικών αντιδραστηρίων, όπως είναι η β-μερκαπτοαιθανόλη και το DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Stern, Wilson et al. 1993). Τα αναγωγικά αντιδραστήρια ανάγουν τις σουλφιδρυλικές ομάδες των κυστεϊνών και καταστρέφουν τις δισουλφιδικές γέφυρες. 105

126 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Το σύστημα της ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστημα, χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τόσο στην πηκτή, όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστημα, χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης, όπου γίνεται συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια λεπτή στοιβάδα (χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~7) και η πηκτή διαχωρισμού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~9). Το διάλυμα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δυο προηγούμενα, (Andrews 1968). Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στο διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος. Το ηλεκτρικό φορτίο των πρωτεϊνών συνήθως δεν είναι μεγάλο και το σχήμα τους ποικίλει, επομένως είναι πολύ δύσκολο να προβλεφτεί η κίνηση τους στο ηλεκτρικό πεδίο. Για να απλοποιηθεί η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών και για να είναι η κίνηση τους ανάλογη με το μοριακό τους βάρος χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το ανιονικό τασιενεργό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου) το οποίο σε ουδέτερες τιμές ph είναι αρνητικά φορτισμένο. Το SDS δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τις αποδιατάσσει, με αποτέλεσμα όλες οι πρωτεΐνες να αποκτούν αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο άσχετα με το δικό τους αρχικό φορτίο. Η δέσμευση του SDS στα αμινοξέα της πρωτεΐνης οδηγεί στην καταστροφή της φυσικής δομής της πρωτεΐνης η οποία παίρνει την μορφή ελάσματος. Έτσι, δημιουργούνται επιμήκη μόρια, αρνητικά φορτισμένα, με σαφή και καθορισμένη δομή. Το ποσό του SDS που δεσμεύεται είναι αρκετά σταθερό, (1.4g SDS/g πρωτ.). Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού μεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό μέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό γλυκοζυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσμεύουν μικρότερα ποσά SDS ανά μονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισμού με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν φαινόμενο μοριακό βάρος υψηλότερο του πραγματικού. Όταν μια 106

127 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ πρωτεΐνη περιέχει υψηλά ποσοστά του αμινοξέως προλίνη τότε η τιμή του μοριακού βάρους που προκύπτει από την ηλεκτροφόρηση είναι πάντοτε υψηλότερη από την πραγματική, αυτό οφείλεται στις φυσικοχημικές ιδιότητες της προλίνης που είναι από τα πλέον υδρόφοβα αμινοξέα. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων, αποτελείται από την πηκτή διαχωρισμού, ύψους 7.5cm και πάχους 1.5mm, καθώς και την πηκτή επιστοίβαξης, όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1cm περίπου, πριν εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγματος, δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισμού και επιστοίβαξης ήταν η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης (Συνολικός όγκος 5 ml) Ακρυλαμίδιο 5 % w/v bis- ακρυλαμίδιο 0,17 % w/v SDS 0,50 % w/v Tris-HCl ph 6.8 0,125 M APS 0,08 % w/v TEMED 0,20 % v/v Πηκτή διαχωρισμού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαμίδιο 12 % w/v, 15 % w/v, 20 % w/v bis-ακρυλαμίδιο 0,4 % w/v SDS 0,5 % w/v Tris-HCl ph 8.9 0,375 M APS 0,08 % w/v TEMED 0,20 % v/v Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιήθηκε είχε την παρακάτω σύσταση: Διάλυμα ηλεκτροφόρησης ph 8.9 Tris 25 mm Γλυκίνη 0,192 M SDS 0,1% w/v Τα δείγματα πριν μεταφερθούν στις θέσεις που δημιουργήθηκαν στην πηκτή επιστοίβαξης αναμείχθηκαν με το εξής διάλυμα: Διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων 107

128 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ SDS 2% w/v Tris-HCl ph ,5 mm β- μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη 10% v/v Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,02% w/v Το αρχικό διάλυμα των ηλεκτροδίων ήταν τέσσερις φορές πυκνότερο, (4x). Τα δείγματα, πριν την επιστοίβαξή τους θερμάνθηκαν στους 100 ο C για 5 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών, καθώς και η δημιουργία συμπλόκων πρωτεΐνης-sds. Η β-μερκαπτοαιθανόλη προστίθεται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και το διαχωρισμό των υπομονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Η απουσία της β-μερκαπτοαιθανόλης δίνει τη δυν&