ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, του Τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, του τμήματος Χημείας Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Χολή-Παπαδοπούλου (Επιβλέπουσα ) Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Βιζιριανάκης Ιωάννης (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Νικολακάκη Ελένη (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής κ. Τσιφτσόγλου Αστέριος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής κ. Κυριακίδης Δημήτριος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καθηγήτρια κ. Κουΐδου Σοφία (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αναπληρώτρια κ. Καθηγήτρια Παπαμαρκάκη Θωμαΐς (Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

3 Παπαχρήστου Ελένη Α.Π.Θ. ΤΙΤΛΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ: "ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΑΠΟ ΠΟΝΤΙΚΙ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ" ISBN "Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως" (Ν. 5343/1932, αρθρο 202, παρ.2)

4 Αφιερώνεται Στους πολυαγαπημένους μου γονείς Θωμά & Σταθούλα και στον αγαπημένο αδερφό μου Λάμπρο για την διαχρονική αγάπη, βοήθεια, συμπαράσταση & στήριξη που μου προσφέρουν Στον αγαπημένο μου αρραβωνιαστικό, Σπύρο για την απεριόριστη αγάπη, κουράγιο & στήριξη που προσφέρει στη ζωή μου

5 Στην αγαπημένη δασκάλα μου, κυρία Δώρα για τις πολύτιμες γνώσεις & την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ To αντικείμενο της Βιοχημείας είναι η μελέτη βιολογικών φαινομένων σε μοριακό επίπεδο σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Με τη συγκεκριμένη διατριβή μου δόθηκε η δυνατότητα να μελετήσω το ευκαρυωτικό ριβόσωμα και συγκεκριμένα η μελέτη μιας ριβοσωμικής πρωτεΐνης της μικρής υπομονάδας 40S, την S5 από ποντίκι, (rps5). Τα τελευταία χρόνια αναφέρονται πολλά παραδείγματα εμπλοκής των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν σχετίζονται με την μετάφραση αποκλειστικά, όπως για παράδειγμα στην επιδιόρθωση του DNA, στον κακοήθη μετασχηματισμό, στον κυτταρικό θάνατο. Διερευνήθηκε λοιπόν η μεταφορά της S5 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και κατ επέκταση στους πυρηνίσκους, προκειμένου να λάβει χώρα η βιογένεση των ριβοσωμάτων, καθώς επίσης και ο χαρακτηρισμός δομικών στοιχείων στο μόριο της πρωτεΐνης, με πιθανή λειτουργική συμμετοχή στην «ενδοκυτταρική κυκλοφορία». Επιπρόσθετα μελετήθηκε ο πολυλειτουργικός ρόλος της rps5 στην ερυθροδιαφοροποίηση και απόπτωση. Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κάτω από την καθοδήγηση της αναπληρώτριας καθηγήτριας κα. Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρας. Η κα. Δώρα αποτελεί για μένα δασκάλα, η οποία τόσο στις προπτυχιακές όσο και στις μεταπτυχιακές σπουδές μου, με έκανε να αγαπήσω πολύ την Βιοχημεία και να διεισδύω σε λεπτομέρειες για την επίλυση ερευνητικών προβλημάτων. Την ευχαριστώ πάρα πολύ για τη σημαντική ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω την παρούσα διατριβή και να διευρύνω τους επιστημονικούς μου ορίζοντες, αλλά και γιατί αποτέλεσε για μένα πάντοτε πρότυπο επιστημονικού ήθους και ανθρωπιάς. Στάθηκε δίπλα στις αδυναμίες του χαρακτήρα μου, με ενθάρρυνε να συνεχίσω την έρευνα και με στήριξε σε δύσκολες στιγμές. Την ευχαριστώ για το μεγάλο ενδιαφέρον που δείχνει για μένα και πάντα είναι δίπλα μου σε ότι και αν κάνω. Θέλω να την ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου για την πραγματική αγάπη της προς εμένα, για την υπόδειξη του θέματος, την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε και μου προσφέρει κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας αλλά και κατά τη διόρθωση της διατριβής. Ευχαριστώ τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Ι. Βιζιριανάκη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη συνεργασία του, καθώς και για τη βοήθεια του και το σχεδιασμό πειραμάτων της συγκεκριμένης διατριβής, που αφορούσαν τις κυτταροκαλλιέργειες, κλώνοι C56, C14 και πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης (RNAi παρεμβολής). Τα πειράματα αυτά διεκπαιρεώθηκαν, σε συνεργασία με το

7 εργαστήριο Bιοχημείας, στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος της Φαρμακευτικής του ΑΠΘ. Θερμότατες ευχαριστίες από τα βάθη της καρδιάς μου και ιδιαίτερη εκτίμηση θα ήθελα να αποδώσω επίσης στην επίκουρο καθηγήτρια κα Νικολακάκη Ελένη για τις πολύτιμες γνώσεις στο χώρο της μοριακής βιολογίας και βιοχημείας που είχα την τύχη να αποκομίσω μαθητεύοντας δίπλα της. Επίσης, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις συμβουλές της, τη βοήθεια της στάθηκε δίπλα μου σε οποιοδήποτε πρόβλημα και αν είχα, την αγάπη της και την ιδιαίτερη φιλική διάθεση της. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω την ιδιαίτερη εκτίμηση και τις απεριόριστες ευχαριστίες στον Καθηγητή κ. Α. Τσιφτσόγλου, για τις συμβουλές του και το μεγάλο ενδιαφέρον του για την συγκεκριμένη διατριβή. Επίσης, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για τις εποικοδομητικές συζητήσεις καθώς και για τον σωστό τρόπο σκέψης και επίλυσης ενός ερευνητικού προβλήματος. Τον ευχαριστώ θερμά για την στήριξή του να συνεχίσω την διατριβή, την εμπιστοσύνη και που με ενσωμάτωσε στο εργαστήριο του και ποτέ δεν με ξεχώρισε από τους υπόλοιπους υποψήφιους διδάκτορες του. Θα ήταν σημαντική παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γιανακούρο Θωμά για την πειραματική του βοήθεια και για τις συμβουλές του, τη στήριξή του και την άκρως φιλική του διάθεση. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Βιολόγο Α. Κουρκουτέλη, για την οργάνωση του λογισμικού της κυτταρομετρίας ροής καθώς και τον λέκτορα κ. Γ. Παπαδόπουλο για τις μελέτες μοριακής δυναμικής και τη βοήθεια του. Ευχαριστώ επίσης τον καθηγητή κ. Δ. Κυριακίδη που με παρότρυνε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού να συνεχίσω για διδακτορικό και για την πρώτη μου δημοσίευση στο περιοδικό Ιατρική και Φαρμακευτική. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω ένα άλλο μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Παπαμαρκάκη Θωμαΐδα για την συνεργασία της. Ευχαριστώ την καθηγήτρια κα Κουίδου Σοφία που δέχτηκε να είναι στην επταμελή επιτροπή μου, καθώς και για τις εύστοχες και σημαντικές παρατηρήσεις κατά τη διόρθωση της συγκεκριμένης διατριβής. Θέλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την κα. Ζαριφέ Φωτεινή για τις πολύτιμες συμβουλές και το ενδιαφέρον της όλα αυτά τα χρόνια, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη Δ.Ε.Π., τους συναδέλφους και όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Βιοχημείας, για την ευχάριστη συνεργασία. Ευχαριστώ, επίσης, όλους τους συναδέλφους με τους οποίους δουλέψαμε στον ίδιο χώρο: τους κ. Ν. Βουκαλή, Ι. Σανίδα, Φ. Κωτάκη, Φ. Πειδη και την κα. Μ. Δανιηλίδου για την βοήθεια στον πειραματικό τομέα και για το ευχάριστο και φιλικό

8 κλίμα. Ευχαριστώ τους προπτυχιακούς φοιτητές που δουλέψαμε μαζί κ. Α. Ασημίνα, κα Μ. Καρατάσιου, κ. Γ. Ερκέκογλου καθώς και τον κ. Π. Λαζαρίδη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τη φίλη μου Δρ. Χρ. Ματράγκου, για τη πολύτιμη βοήθεια της στο μεταπτυχιακό και στα πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τους υποψήφιους διδάκτορες κ. Ι. Μπονοβόλια και κ. Π. Λάμπρου για την πειραματική βοήθεια τους. Μεγάλες ευχαριστίες οφείλω στη φίλη μου και συνάδελφο μου που μοιραστήκαμε τον ίδιο εργαστηριακό πάγκο, κ. Τσαγκάλια Κατερίνα για την συμπαράστασή της και βοήθεια της όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου τις φίλες μου και υποψήφιες διδακτόρισες κα. Ι. Τριβιάη και ιδιαίτερα την κ. Παπαζαχαρίου Λ. για το μεγάλο ενδιαφέρον και την αγάπη τους. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους μου κ. Θεοδώρου Μαρίνα και Βαγγέλη, καθώς και την κα. Παπή Ρηγίνη για την βοήθεια στο πειραματικό μέρος της διατριβής και τη συμπαράστασή τους. Ευχαριστώ την φίλη μου κα. Παπαδοπούλου Ε. για την συμπαράσταση και κατανόηση της. Ευχαριστώ τον φίλο μου κ. Ζαχαριάδη Ι. για την βοήθεια καθώς και συμπαράσταση του κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής. Τέλος, θέλω να εκφράσω ένα μεγάλο ευχαριστώ και ευγνωμοσύνη στους γονείς μου, Θωμά και Σταθούλα καθώς και στον αδερφό μου Λάμπρο, οι οποίοι είναι δίπλα μου και στηρίζουν τα όνειρα μου. Χωρίς την υποστήριξη τους, κυρίως την οικονομική, την συμπαράσταση, την κατανόηση και τη βοήθειά τους, αυτή η διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Τους ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για την απεριόριστη αγάπη τους και την στήριξη που μου δίνουν στη ζωή μου. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον άνθρωπο μου, τον αρραβωνιαστικό μου Σπύρο για την στήριξή του, την απέραντη αγάπη και την υπομονή του. Τον ευχαριστώ μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για την πολύτιμη βοήθεια του στη διδακτορική διατριβή και ένα μεγάλο ευχαριστώ για τη δύναμη που μου δίνει στη ζωή μου. Παπαχρήστου Ελένη

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 A.1 Ευκαρυωτικό Ριβόσωμα 1 Α.1.1 Γενικά για το ριβόσωμα 1 A.1.2 Γενικά για την Βιογένεση ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων 5 Α Επεξεργασία του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna 7 Α Παράγοντες που συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος 11 A Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα 13 Α.2 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες 17 A.2.1 Χαρακτηριστικά των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 17 Α.2.2 Mεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 21 Α.3 Η πολυλειτουργικότητα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 25 Α.4 Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών. 31 A.5 Γονιδιακή καταστολή με RNA παρεμβολή 37 A.5.1 Μηχανισμός της γονιδιακής αποσιώπησης 38 Α.5.2 Κατηγορίες των small RNAs 41 A.5.3 Μονοπάτια γονιδιακής αποσιώπησης 43 Α.5.4 Καταστολή της μετάφρασης 45 Α.6 Ερυθροδιαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων 48 Α.6.1 Αιμοποίηση 48 Α.6.2 Οι λευχαιμίες ως διαταραχή της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων. 50 Α.7 Το σύστημα των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστημα μελέτης, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro 51 Α.7.1 MEL (Murine ErythroLeukemia) ή Friend leukemia κύτταρα 51 Α.7.2 Το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων 54

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα A.8 Κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου 57 A.9 Χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων 58 A.10 Βιοχημικά μονοπάτια Απόπτωσης 61 A.11 Κυτταρικός κύκλος 65 Α.11.1 Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο 65 Α.11.2 Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω των Cdks 67 Α.11.3 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) 70 ΣΚΟΠΟΣ 76 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 77 Β.1 ΥΛΙΚΑ 77 Β.1.1 Βιολογικά υλικά 77 Β.1.2 Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών 77 Β.1.3 Χημικά αντιδραστήρια 78 Β.1.4 Υλικά χρωματογραφίας 78 B.1.5 Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας 78 Β.2 ΜΕΘΟΔΟΙ 80 Β.2.1 Καλλιέργεια των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL 80 Β.2.2 Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης 81 Β.2.3 Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων MEL με τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 81 B.2.4 Μέτρηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο με την χρωστική Trypan Blue 82 Β.2.5 Απομόνωση κυτταρικών εκχυλισμάτων από MEL κύτταρα 83 Β.2.6 Απομόνωση κυταροπλασματικού RNA από MEL κύτταρα 83 Β Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με την μέθοδο της φαινόλης 83 B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με τη μέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης 85 B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein της εταιρίας Macherey-Nagel 86 Β.2.7 Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων 88 Β.2.8 Υποκυτταρική κλασμάτωση των MEL κυττάρων 88 Β.2.9 Απομόνωση ριβοσωμάτων από MEL κύτταρα 89 Β.2.10 Ανάλυση κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry) 90 B.2.11 Μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry) κατόπιν χρώσης με τις φθορίζουσες χρωστικές ανεξίνη V (FITC-Annexin V) και προπίδιοιωδίδιο (Propidium-Iodide - PI) 92 Β.2.12 Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με ανίχνευση του DNA των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-flow cytometry) κατόπιν χρώσης με προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) 96 B.2.13 Τεχνική της RNA παρεμβολής σε MEL κύτταρα 98 B Σχεδιασμός των sirnas που στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 98 B Προετοιμασία των δίκλωνων RNAs (sirna) 100 B Πειραματική διαδικασία για την αποσιώπηση (silencing) 101 Β.2.14 Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli 103 Β.2.15 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden 104 Β.2.16 Ηλεκτροφόρηση 104 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 104 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) 106 Β.2.17 Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 108 Β Βαφή με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R Β Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) 109 B.2.18 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε μεμβράνη 110 B.2.19 Ανοσοανίχνευση 111 Β.2.20 Ανοσοκατακρήμνιση 113 B.2.21 Αυτοραδιογραφία 114

12 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Β.2.22 Διδιάστατη ηλεκροφόρηση ριβοσωμικών πρωτεϊνών 115 Β.2.23 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτές δύο διαστάσεων κατά (Kaltschmidt and Wittmann 1970) 118 Β.2.24 Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA 118 Β Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης 118 Β.2.25 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR). 119 Β.2.26 Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με την τεχνική του σχεδιασμού megaprimer. 124 Β.2.27 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης τρανσκριπτάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 126 B.2.28 Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR 128 B.2.29 Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης 129 B.2.30 Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς 130 Β Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού 131 Β Αντίδραση λιγάσης 133 B Aποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου 134 B.2.31 Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό βακτηρίων (competent cells) 135 B Μέθοδος των δυο διαλυμάτων CaCl B Μέθοδος δυο διαλυμάτων CaCl 2 (αποθηκεύονται στους -700C) 136 Β.2.33 Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E. coli (μετασχηματισμός). 137 Β.2.34 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA. 138 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση και καθαρισμός με φαινόλη / χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη 138 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) 139 B.2.35 Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 139 B.2.36 Έλεγχος in vivo φωσφορυλίωσης με την χρήση χρωματογραφίας

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα αγχιστείας σε σφαιρίδια με καθηλωμένα δισθενή μέταλλα (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) 142 Β.2.37 Έμμεσος ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκόπηση 143 Β.2.38 Μελέτες μοριακής δυναμικής της rps5 144 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 146 Γ.1 Μελέτη των δομικών στοιχείων και έλεγχος φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 146 Γ.1.1 Παρασκευή υποκυτταρικών εκχυλισμάτων από ευκαρυωτικά κύτταρα και ενδοκυτταρική εντόπιση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 146 Γ.1.2 In vivo πρωτεόλυση της rps5 149 Γ.1.3 Φωσφορυλίωση της rps5 και «ενδοκυτταρική κυκλοφορία» 154 Γ.1.4 Θεωρητική προσέγγιση των αμινοξέων στόχων φωσφορυλίωσης της rps5 155 Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων της rps5 στους πλασμιδιακούς φορείς pegfp-c1 157 Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP-rpS5 Thr-133 (mut), GFP-rpS5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) 159 Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων GFP- rps5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t για πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης με την κινάση της καζεΐνης ΙΙ (CKII) 160 Γ Υπερπαραγωγή και καθαρισμός των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) 162 Γ In vitro φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-24mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) με την κινάση της καζεΐνης II (CKII) 165 Γ.1.5 Ενδοκυτταρική φωσφορυλίωση ( in vivo ) της rps5 από την CK II και ανοσοκατακρήμνιση 167 Γ.1.6 Μετακίνηση της πρωτεΐνης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα 169 Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-37 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης 169

14 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-50 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης. 171 Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP- rps και GFP- rps Γ.1.7 Θεωρητικές προσεγγίσεις με προσομοίωση μοριακής δυναμικής 174 Γ.1.8 Φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στα κύτταρα MEL με Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) 176 Γ.1.9 Έλεγχος φωσφορυλίωσης της rps5 στο ριβόσωμα 179 Γ.2 Μελέτη του ρόλου της rps5 στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης και πιθανή εμπλοκή της σε βιοχημικά μονοπάτια της απόπτωσης στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL 182 Γ.2.1 Έλεγχος της έκφρασης του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα pcdna-3.1-rps5 (sense) σε κλώνους επιμολυσμένων MEL κυττάρων 182 Γ Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης στον κλώνο MEL-rpS5 C Γ Μελέτη κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C56 παρουσία ή απουσία των χημικών επαγωγέων της διαφοροποίησης, HMBA (εξαμεθυλενο-δισακεταμίδιο) και DMSO (διμέθυλο-σουλφοξείδιο) 186 Γ.2.2 Η υστέρηση στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης στην καλλιέργεια των μόνιμα επιμολυσμένων κυττάρων με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5 συμβαδίζει με την υστέρηση στη φάση G1/Go του κυτταρικού κύκλου 188 Γ.2.3 Aποσιώπηση του γονιδίου της rps5 σε MEL parental κύτταρα 193 Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου RPS5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_2_HP sirna 194 Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_4_HP sirna 198 Γ.2.4 Επιβεβαίωση της αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ΜΕL μετά από επιμόλυνση με 120 nm του δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου Rps5_4_HP sirna και σε επίπεδο πρωτεΐνης 202 Γ.2.5 Η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα κύτταρα ΜΕL επιβεβαιώνει την εμπλοκή της rps5 στη διαφοροποίηση 206 Γ.2.6 Έλεγχος απόπτωσης και νέκρωσης στις καλλιέργειες MEL που επιμολύνθηκαν είτε με το control είτε με το Rps5_4_HP sirna με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry), με FITC-Annexin V και 7-Αμινο-Ακτινομυκίνης D 211 Γ.2.7 Ανάκτηση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στην καλλιέργεια MEL που επιμολύνθηκε με το specific sirna, Rps5_4_HP sirna 215 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 221 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 244 SUMMARY 245 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 246

16 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 7-AAD: ACS: Ag: ATN: ATP: BCIP: BFU-Es: bp: BSA: CAK: CDKIs : CDKs: cdna: CFU-Es: 7-amino actinomycin D American Cancer Society Antigen Adenine noucleotide exchanger Adenosine 5'-triphosphate Bromo-chloro-indolyl phosphate Burst Forming Unit-Erythroid Base pairs Bovine serum albumin Cdk Activating Kinase CDK inhibitors Cyclin Dependent Kinases complementary Deoxyribonucleic acid Colony Forming Unit-Erythroid CFU-GEMM: Colony Forming Unit for Granulocytes, Erythrocytes, Macrophages and Megakaryocytes CFU-M,L: CFU-S: CLL: CML: CRDs: CSF: DAPI: DBA: DDA: DEPC: Colony Forming Unit of the Myeloid and Lymphoid cells Colony Forming Unit in spleen Chronic Lymphoblastic Leukemia Chronic Myelogenous Leukemia Cysteine rich domains Colony Stimulating Factor 4-6-Diamidino-2-phenylindole Diamond Blackfan Anemia Differentiation-Dependent- Apoptosis, DDA Diethyl-pyrocarbonate

17 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ DFC: DISC: DMEM: DMSO: DNA: DNA-PK: dntp: Dense Fibrillar Component Death-inducing signaling complex Dulbecco s Μodified Εagle s Μedium Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid DNA dependent protein kinase deoxynucleotide triphosphate DR 3: Death receptor 3 DTT: EDTA: EGFP: EGFR: eif4e: EPO: ERK: ETS: FACS: FBS: FC: FITC: FLV: GAIT: GC: G-CSF: GFP: GM-CSF: GST: GTP: Dithiothreitol Ethylene-diamine-tetraacetic acid Enhanced green fluorescent protein Epidermal Growth Factor Receptor Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E Erythropoietin Extracellular Signal Regulated Kinase External Transcribed Spacers Fluorescence activated cell sorting Fetal bovine serum Fibrillar Center Fluorescent isothio cyanate Friend Leukemia Virus Gamma Activated Inhibitor of Translation Granular Component Granulocyte-Colony Stimulating Factor Green Fluorescent Protein Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor Glutathione S-transferase Guanosine-5'-triphosphate

18 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Hb: HeBPs: HeLa: HEPES: HL-60: HMBA: hnrnp: HSCs: HSV-1: IFN-a: IL: IMAC: INF-γ: IRES: ITS: LIF: MAPK: MCS: M-CSF: MEK/ERK: MEL: mirnas: mrna: NBT: NES: NES: Hemoglobin Hemin Binding Proteins Human cervical adenocarcinoma cells 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethane-sulfonic acid Human promyelocytic Leukemia cells Hexamethylene bisacetamide heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein Hematopoietic Stem Cells Herpes Simplex Virus Interferon-a Interleukin Immobilized Metal Affinity Chromatography Interferone-γ Internal ribosome entry site Internal Transcribed Spacers Leukemia Inhibiting Factor Mitogen -Activated Protein Kinase Multiple cloning sites Macrophage-Colony Stimulating Factor mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase Murine erythroleukemia cells micrornas messenger Ribonucleic acid Nitro blue tetrazolium Nuclear Export Signal Nuclear Export Signal NF-E2: Nuclear Factor (erythroid-derived 2) NLS: Nuclear Localization Signal

19 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ NMR: NOR: NPC: NS: NTR: PBS: PCR: PI: PI3K: PIPES: pirnas: PKC: PMSF: PS: PSRP-1: PTEN: Rb: RBCs: RBDs: RISC: RPs: RT-PCR: SCF: SDS: SH: SID-1: sirna: sirna: Nuclear Magnetic Resonance Nucleolar Organiser Regions Nuclear Pore Complex Nucleostemin Non Translated Region Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction Propidium iodide Phosphatidylinositol-3 Kinase Piperazine-1,4-bis(2-ethane-sulfonic acid) piwi-interacting RNA Protein Kinase C Phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride Phosphatidyl-serine Phloem Small RNA binding Protein-1) Phosphatase and Tensin Homolog Retinoblastoma protein Red Blood Cells RNA Binding Domains RNA Induced Silencing Complex Ribosomal Proteins Reverse transcription-polymerase chain reaction Stem Cell Factor Sodium dodecyl sulfate Src Homology domain Systematic RNA Interference Defective Short interfering RNAs Small interference RNA

20 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ snrnp: TEMED: TGFb: TNF: TRITC: UBF: UDPs: VDAC: Small nuclear Ribonucleoprotein N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylene-diamine Transforming Growth Factor beta Tumor Necrosis Factor Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate Upstream Transcription Factor Ureido derivatives of pyridine Voltage dependent anion channel

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1 Ευκαρυωτικό Ριβόσωμα Α.1.1 Γενικά για το ριβόσωμα Τα ριβοσώματα βρίσκονται στα κύτταρα όλων των ζωντανών οργανισμών, με εξαίρεση τα ώριμα ερυθροκύτταρα θηλαστικών. Πρόκειται για σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνών με μοριακό μέγεθος που κυμαίνεται μεταξύ ~2.4 MDa (βακτήρια) και ~4 MDa (ευκαρυωτικά κύτταρα) και στην ενεργή τους μορφή συγκροτούνται από δύο υπομονάδες. Το ριβοσωμικό RNA (rrna) αποτελεί το ~ 65 % σε βάρος του ριβοσώματος και τα δύο τρίτα του ριβοσώματος ενώ το υπόλοιπο 1/3 είναι ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών, στους χλωροπλάστες των φυτών και αποτελούν τις πιο πολύπλοκες μοριακές μηχανές του κυττάρου. Τα ριβοσώματα αποτελούν περίπου το ~30% της κυτταρικής μάζας του κυττάρου 10 5 και 10 6 αριθμός ριβοσωμάτων σε βακτήρια και θηλαστικά, αντίστοιχα (Bashan and Yonath 2008). Σε αναπτυσσόμενα κύτταρα τα περισσότερα ριβοσώματα είναι ενεργά συνθέτοντας πολυπεπτιδικές αλυσίδες (ενσωματώνονται 20 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδή αλυσίδα στα βακτήρια και 5-9 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς). Ένα ριβόσωμα του βακτηρίου E.coli είναι ένα ριβονουκλεοσωματίδιο με συντελεστή καθίζησης 70S και διίσταται σε μια μεγάλη (L) 50S και μια μικρή υπομονάδα (S) 30S. Oι υπομονάδες, όπως προανεφέρθη αποτελούνται από rrna και πρωτεΐνες οι οποίες για την μεγάλη υπομονάδα συμβολίζονται με το L και για την μικρή με το S. Η μικρή υπομονάδα 30S περιέχει 21 διαφορετικές πρωτεΐνες (S1 έως S21) και ένα μόριο RNA 16S. Η μεγάλη υπομονάδα 50S περιέχει 34 διαφορετικές πρωτεΐνες (L1 έως L34) και δύο μόρια RNA, το 23S και το 5S. Στο προκαρυωτικό ριβόσωμα όλα τα συστατικά, εκτός από τις πρωτεΐνες L7 και L12 (δημιουργούν τετραμερές), βρίσκονται με ένα αντίγραφο. Να τονιστεί πως το πρόθεμα ριβο-στο ριβόσωμα οφείλεται στο ότι το RNA αποτελεί σχεδόν τα δύο τρίτα της μάζας των μεγάλων μοριακών συγκροτημάτων. Τα τρία μόρια RNA 5S, 16S και 23S είναι πολύ σημαντικά για την λειτουργική αρχιτεκτονική των ριβοσωμάτων Τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα είναι μεγαλύτερα από τα προκαρυωτικά. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα τα ριβοσώματα έχουν σταθερά καθίζησης 80S και οι 1

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υπομονάδες τους έχουν σταθερές καθίζησης 60S και 40S. Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από ένα μόριο 18S rrna και 30 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ενώ η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από τρία μόρια rrna, τα 28S rrna, 5S rrna και 5,8S rrna και 40 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Το ευκαρυωτικό ριβόσωμα επομένως περιέχει επιπλέον ένα μόριο rrna και ~ περισσότερες πρωτεΐνες, από ότι το προκαρυωτικό ριβόσωμα. Στα διάφορα στάδια της μετάφρασης του mrna υπάρχουν αρκετοί πρωτεϊνικοί παράγοντες που συμμετέχουν σ αυτή τη διαδικασία συνδεόμενοι παροδικά με το ριβόσωμα. O ριβοσωμικός πυρήνας είναι συντηρημένος σε όλους τους οργανισμούς (Doudna and Rath 2002). Η αλληλουχία των βάσεων ενός δεδομένου τύπου rrna είναι παρόμοια σε στενά συγγενή είδη αλλά αντίθετα μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών υπάρχουν πολύ λίγες ομοιότητες στην αλληλουχία βάσεων του συγκεκριμένου rrna. Το ποσοστό ομοιότητας ενός συγκεκριμένου rrna μεταξύ δύο διαφορετικών ειδών αντανακλά την εξελικτική ιστορία και τη συγγένεια των συγκρινόμενων αυτών οργανισμών. Το 5S rrna είναι το πλέον εξελικτικά σταθερό από όλα τα είδη rrna. Τα ριβοσώματα των ευκαρυωτικών κυττάρων χωρίζονται σε δυο τύπους ριβοσωμάτων στα ελεύθερα και στα συνδεδεμένα ριβοσώματα, δεν έχουν δομικές διαφορές, εναλλάσσονται μεταξύ τους και οι ριβοσωμικές υπομονάδες τους «αποθηκεύονται» στο κυτταρόπλασμα μέχρις ότου ξαναχρησιμοποιηθούν σ ένα νέο κύκλο πρωτεϊνικής σύνθεσης. Τα ριβοσώματα που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα δεν είναι τυχαία διασκορπισμένα, αλλά σχηματίζουν ομάδες από δέκα ή περισσότερα ριβοσώματα, τα πολυσώματα (εντοπίζονται στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο) που συνδέονται και μεταφράζουν ένα μόριο mrna. Τα ριβοσώματα της κατηγορίας αυτής, παράγουν κυρίως πρωτεΐνες που προορίζονται για έκκριση (εξωκύττωση), για τα λυσοσωμάτια και για τη μεμβράνη του πλάσματος. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς τα ριβοσώματα είναι ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα. Αύξηση του αριθμού των ριβοσωμάτων, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευρυκαρυωτικά κύτταρα, παρατηρείται κατά την ωογένεση, την ανάπτυξη και γενικώς όταν υπάρχουν αυξημένες κυτταρικές ανάγκες για τη σύνθεση μεγαλύτερου αριθμού πρωτεϊνών. Ο μικρότερος αριθμός ριβοσωμάτων παρατηρείται στα σπερματοκύτταρα, ενώ ο μεγαλύτερος στα εμβρυακά κύτταρα, καθώς και στα κύτταρα που παράγουν πρωτεΐνες που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον (Taylor, Morris et al. 1998). H δομή του ριβοσώματος με την βοήθεια κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχει απεικονιστεί σε βακτήρια και αρχαιοβακτήρια (Rheinberger et al., 2004). Η δομή του ευκαρυωτικού ριβοσώματος είναι πολύπλοκή σε σύγκριση με το προκαρυωτικό ριβόσωμα. Στο σχήμα Α.1 συγκρίνεται η δομή προκαρυωτικού (Thermus 2

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ thermophilus) και κατώτερου ευκαρυωτικού ριβοσώματος (S. cerevisiae) (Dinman 2009). Σχήμα A.1 Σύγκριση ριβοσωμάτων από ζύμη και Thermus thermophilus. (Dinman et al., 2009) Κρυσταλλική δομή του ριβοσώματος της S.cerevisiae με ευκρίνεια 11.7 A (Protein Data Bank codes 1s1h and 1s1i) και του ριβοσώματος του T. thermophilus με ευκρίνεια 5.90 Α(Protein Data Bank codes 2b64 and 2b66). SSU, small subunit; LSU, large subunit Κάθε ριβοσωμική υπομονάδα έχει μια χαρακτηριστική μορφολογία. Η μικρή υπομονάδα αποτελείται από μία κεφαλή (head), ένα σώμα (body) και μια πλατφόρμα (platform), ενώ η μεγάλη υπομονάδα έχει τρία εξογκώματα στην ανώτερη περιοχή, με πιο χαρακτηριστικό το κεντρικό εξόγκωμα (Wolfe, 1993). Η θέση αποκωδικοποίησης, δηλαδή η περιοχή αναγνώρισης των κωδικονίων του mrna από τα αντικωδικόνια του trna, βρίσκεται στη μικρή υπομονάδα στη βάση της ρωγμής που χωρίζει την κεφαλή από την πλατφόρμα. Στην μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα εντοπίζεται το κανάλι που εκτείνεται από την ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης στην οποία βρίσκονται οι θέσεις Α και P, μέχρι το σημείο εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Brandt et al., 2009) 3

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.2 Δομική σύγκριση συγκεκριμένων περιοχών στο 80S ριβόσωμα και στην μικρή υπομονάδα 40S της ζύμης με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (διακριτικότητα 19 Α). (Gilbert et al., 2007) Α. Δομική σύγκριση των περιοχών κεφαλής (head), πλατφόρμας (platform) και σώματος (body) της μικρής υπομονάδας και του 80S ριβοσώματος. Η προφανής παρατηρούμενη διαφορά είναι μια όρθωση της κεφαλής ~10 A της μικρής υπομονάδας σε σχέση με την αντίστοιχη περιοχή του ριβοσώματος εξαιτίας της έλλειψης μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων. Β. Η ισχυρότερη αλληλεπίδραση που παρατηρείται στο ριβόσωμα είναι η περιοχή μεταξύ της κεφαλής και της περιοχής σύνδεσης πλατφόρμας/σώματος και των ελίκωνh1-2/h28 του rrna. Επίσης, εντοπίζεται ένας μη ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ των ελίκων h18/h34 του rrna, καθώς επίσης και ένας ασθενής δεσμός μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών rps5 και rps14 οι οποίες εντοπίζονται στο κανάλι εξόδου του mrna. Η μετάφραση και στους προκαρυωτικούς και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι μια ενορχηστρωμένη δυναμική διαδικασία που «υπηρετείται» από ριβοσώματα, mrna, trnas καθώς επίσης και από παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού. Η έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης αρχίζει με την ενσωμάτωση των παραγόντων έναρξης eif-2, eif-3, trna Met και GTP στην 40S υπομονάδα με αποτέλεσμα την δημιουργία συμπλόκου 43S. Στην συνέχεια ο παράγοντας eif-4e στρατολογεί στο συγκροτημένο σωματίδιο 43S το mrna στόχο με συνέπεια την δημιουργία 48S συμπλόκου. Τέλος η 60S υπομονάδα 4

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνδέεται με το 48S σύμπλοκο για τον τελικό σχηματισμό του 80S συμπλόκου (Scheper, van der Knaap et al. 2007). A.1.2 Γενικά για την βιογένεση ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων Η βιογένεση των ριβοσωμάτων είναι το αποτέλεσμα της συγχρονισμένης συγκέντρωσης αρκετών μοριακών προϊόντων στον πυρηνίσκο. Τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα 18S, 28S και 5,8S rrna βρίσκονται στον «οργανωτή» του πυρηνίσκου, τα γονίδια για το 5S rrna βρίσκονται σε άλλες περιοχές του γενώματος και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παράγονται στο κυτταρόπλασμα. Το 5S rrna και οι πρωτεΐνες μεταφέρονται στον πυρηνίσκο όπου τελικά σχηματίζονται οι ενεργές ριβοσωμικές υπομονάδες. Οι πολύπλοκοι μηχανισμοί που λαμβάνουν χώρα στη βιογένεση των ριβοσωμάτων αποτελούν ένα θαυμάσιο παράδειγμα κυτταρικής ρύθμισης και αλληλοσυσχέτισης του μοριακού και κυτταρικού επιπέδου. H όλη πολύπλοκη διαδικασία αρχίζει στον πυρηνίσκο και ολοκληρώνεται στο κυτταρόπλασμα. Ο πυρηνίσκος αποτελεί μια «δυναμική δομή» του πυρήνα χωρίς μεμβράνη, και συγκροτείται γύρω από δέσμες διαδοχικά επαναλαμβανόμενων ριβοσωμικών γονιδίων, (rdna γονιδίων), τα οποία μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση Ι. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται οργανωτές πυρηνίσκου, (Nucleolar Organiser Regions, NOR), και αποτελούν τη βάση της δομικής οργάνωσης του πυρηνίσκου, προκειμένου να στρατολογηθούν όλα τα απαραίτητα συστατικά επεξεργασίας και συγκρότησης, που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των ριβοσωμάτων. Ο πυρηνίσκος, μορφολογικά χωρίζεται σε τρεις διακριτές περιοχές (Dundr and Misteli 2001, Olson 2000, Scheer and Campos-Ortega 1999). Στο σχήμα Α.3. απεικονίζονται οι τρεις περιοχές του πυρηνίσκου. Το ινώδες κέντρο, (Fibrillar Center, FC), το οποίο αποτελεί μια περιοχή ή σωματίδια, που έπειτα από χρώση με βαρέα μέταλλα, βάφονται ασθενώς. Το πυκνό ινώδες συστατικό, (Dense Fibrillar Component, DFC), το οποίο περιβάλλει μερικώς ή ολικώς το ινώδες κέντρο και βάφεται εντονότερα με συγκεκριμένες χρωστικές. Το κοκκιώδες συστατικό, (Granular Component, GC), που αποτελεί το εξωτερικό τμήμα του πυρηνίσκου και περιέχει κοκκία, στο μέγεθος των ριβοσωμάτων. 5

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.3 Πυρηνίσκοι από κύτταρα HeLa (Andersen et al., 2002). Είναι ευδιάκριτες οι τρεις περιοχές του πυρηνίσκου. Αρχικά πειράματα ανασυγκρότησης προκαρυωτικών ριβοσωμάτων in vitro, έδειξαν ότι όλες οι απαραίτητες πληροφορίες περιέχονταν στα rrnas και στις πρωτεΐνες. Όσον αφορά όμως τη βιογένεση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, η κατάσταση είναι τελείως διαφορετική. Πρόκειται για μια διαδικασία εξαιρετικά πολύπλοκη και ρυθμισμένη, η οποία πραγματοποιείται κάτω από στενά όρια χώρου και χρόνου, παρουσία πληθώρας μη ριβοσωμικών παραγόντων (Tschochner and Hurt 2003). Η συγκρότηση των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχει μελετηθεί κυρίως στη ζύμη S. cerevisae, όπου έχει απομονωθεί ένας μεγάλος αριθμός πρόδρομων ριβοσωμάτων και έχουν ταυτοποιηθεί τα συστατικά τους. Διάφορα πειράματα έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση ενός πρόδρομου ριβοσωμικού σωματιδίου του 90S στην ζύμη και στην ύπαρξη δύο πρόδρομων μορίων υπομονάδων (66S και 43S) πρόδρομες μορφές των 60S και 40S υπομονάδων, αντίστοιχα (Fatica and Tollervey 2002). Στην όλη αυτή διαδικασία απαιτείται η ύπαρξη μιας πληθώρας μη ριβοσωμικών παραγόντων, οι οποίοι δρουν σε διάφορα στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων (Venema and Tollervey 1999). Όπως προαναφέρθηκε, στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα υπάρχουν τέσσερα είδη ριβοσωμικού RNA, το 5S, 5.8S, 25/28S στην 60S υπομονάδα, και το 18S, στην 40S μικρή υπομονάδα. Κατά την διάρκεια της διαδικασίας βιογένεσης ένα πολυκιστρονικό πρόδομο ριβοσωμικό RNA, pre-rna (35S στην περίπτωση της ζύμης) μεταγράφεται στο ώριμο 18S που αποτελεί συστατικό της μικρής υπομονάδας και στο 5.8S και 25/28S που αποτελούν συστατικά της μεγάλης υπομονάδας. Κατά 6

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την ωρίμανση του rrna λαμβάνουν χώρα διάφορες χημικές τροποποιήσεις και αλληλεπιδράσεις με μικρά πυρηνικά μόρια RNAs, snornas. Α Επεξεργασία του πρόδρομου ριβοσωμικού rrna Η ωρίμανση του pre-rrna είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την «συναρμολόγηση» των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στο ριβόσωμα. Αυτή η διαδικασία απαιτεί μια πληθώρα cis-δραστικών παραγόντων (Allmang and Tollervey 1998)) καθώς επίσης και έναν μεγάλο αριθμό μη ριβοσωμικών πρωτεϊνών trans- δραστικών στοιχείων (Lafontaine and Tollervey 1995). Στην S. cerevisae στην 60S υπομονάδα εντοπίζονται 46 ριβοσωμικές πρωτεΐνες και στην μικρή υπομονάδα 40S 32 πρωτεΐνες. Και τα τέσσερα rrnas κωδικοποιούνται από μια μονάδα ριβοσωμικού DNA, (rdna), μοριακού μεγέθους 9.1 kb, η οποία επαναλαμβάνεται φορές, και βρίσκεται στο χρωμόσωμα XII (Kressler et al., 1999), σχήμα Α.4. Σχήμα Α.4 Δομή της επαναλαμβανόμενης rdna μονάδας στο ζυμομύκητα. (Kressler D. et al., 1999) Η επεξεργασία στην οποία υπόκειται το πρόδρομο 35 S pre-rrna είναι στενά συσχετισμένη με πολλές ριβοσωμικές πρωτεΐνες στον πυρηνίσκο όπως φαίνεται στο σχήμα Α.5. Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία τα πρόδρομα ριβοσώματα, στον πυρηνίσκο, αλληλεπιδρούν όπως αναφέρθηκε με πολλές μη ριβοσωμικές πρωτεΐνες που είναι γνωστοί ως trans - δραστικοί παράγοντες και συμμετέχουν στη συγκρότηση των επιμέρους μορφωμάτων του pre-rrna με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Περισσότεροι από εξήντα trans δραστικοί ριβοσωμικοί παράγοντες έχουν 7

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ταυτοποιηθεί οι οποίοι είτε αλληλεπιδρούν με snornas είτε με άλλες πρωτεΐνες στα διάφορα στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων. Το 35S ανιχνεύσιμο ενδιάμεσο προϊόν (στη ζύμη), όπως φαίνεται στο σχήμα Α.4 περιλαμβάνει 5' και 3' εξωτερικά μεταγραφόμενες περιοχές, (External Transcribed Spacers, 5 ETS και 3 ΕTS), τα ώριμα ριβοσωμικά RNAs, 18S, 5.8S και 25S rrna, καθώς και τουλάχιστον δυο εσωτερικά κωδικοποιούμενες περιοχές, (Internal Transcribed Spacers, ITS1 και ITS2). H ωρίμανση του πρόδρομου 35S περιέχει 10 περίπου περιοχές επεξεργασίας και είναι ένα πολύπλοκο μονοπάτι στο οποίο συμμετέχουν διάφοροι trans παράγοντες (Kempers-Veenstra, et al., 1986). Το 35S πρόδρομο rrna της ζύμης είναι μία από τις βραχύτερες πρόδρομες μορφές, ενώ το 45S του ανθρώπου, μία από τις μεγαλύτερες και μόνο κύρια τμήματα της δομής είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς. (Nazar 2004). Συνοπτικά το 35S πρόδρομο rrna διασπάται στο 5' ETS στο σημείο Α 0, και προκύπτει το 33S πρόδρομο rrna, στο σημείο Α 1 (5' άκρο του ώριμου 18S) και προκύπτει, το 32S πρόδρομο rrna και στο σημείο Α 2 στο ITS1, και προκύπτει τα 20 και 27SΑ 2 πρόδρομα rrnas. Η μετέπειτα επεξεργασία του 20S πρόδρομου rrna λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα, όπου μετά από διάσπαση στο σημείο D, προκύπτει το ώριμο πλέον 18S rrna. Η επεξεργασία του 27SA 2 συνεχίζεται στον πυρήνα, όπου τελικά προκύπτουν τα ώριμα 5.8 και 25S rrnas από δυο διαφορετικά μονοπάτια. Έτσι, το 85% του 27SA 2 διασπάται στο σημείο Α 3, στο ITS1, ενώ το 15% διασπάται απευθείας στο σημείο Β 1L (Fromont-Racine, et al., 2003) σχήμα Α.4. Προκειμένου να είναι αποτελεσματική η διαδικασία βιογένεσης των ριβοσωμάτων, είναι απαραίτητη η συμμετοχή μη ριβοσωμικών παραγόντων, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την επεξεργασία και τροποποίηση των rrnas, αναδίπλωση και συγκρότηση των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα η ισομερείωση των ουριδινών σε ψευδοουριδίνες, (Ψs), καθώς και η μεθυλίωση των 2 -ΟΗ των ριβοζών, αποτελούν τις κυρίαρχες τροποποιήσεις νουκλεοτιδίων των rrnas. Οι χημικές τροποποιήσεις που γίνονται στα rrna είναι σχετικά περιορισμένες και περιλαμβάνουν κυρίως μεθυλίωση των δομικών του συστατικών. Οι τροποποιήσεις αυτές είναι πιθανόν να προστατεύουν τμήματα του rrna από τη δράση νουκλεασών ή μπορεί να αποτελούν ειδικά σήματα επεξεργασίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Οι μη ριβοσωμικοί παράγοντες (trans δραστικοί παράγοντες ) μπορεί να ταξινομηθούν σε διάφορες κατηγορίες. Μια κατηγορία περιλαμβάνει παράγοντες που αλληλεπιδρούν με μικρά πυρηνικά μόρια snornas σχηματίζοντας ριβονουκλεοπρωτεϊνικά πυρηνικά σωματίδια snornps. Στη ζύμη, έχουν βρεθεί πάνω από 100 διαφορετικά snornas που χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: σε αυτά που 8

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανήκουν στο C/D κιβώτιο, στο Η/ACA κιβώτιο και στο RNA της MRP RNAάσης, το οποίο αποτελεί ειδική κατηγορία (Kressler D. et al, 1999). Οι παράγοντες αυτοί μπορεί να είναι επίσης ένζυμα τροποποίησης του rrna, είτε να δρουν σαν ενδονουκλεάσες ή εξωνουκλεάσες είτε ως RNA ελικάσες (Linder and Tuite 1999). Όσον αφορά τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, αυτές, αφού συντεθούν στο κυτταρόπλασμα από τα ριβοσώματα, στη συνέχεια κατευθύνονται στον πυρήνα και συγκεκριμένα στον πυρηνίσκο, προκειμένου να στρατολογηθούν στη δημιουργία του πρόδρομου ριβοσωμικού σωματιδίου. Κάποιες συγκροτούνται με τα πρόδρομα rrnas αμέσως μετά την είσοδό τους στον πυρηνίσκο όπως φαίνεται στο σχήμα Α.5, ενώ άλλες, σε επόμενα στάδια, συμπεριλαμβανομένων μερικών, οι οποίες, τουλάχιστον στο S. cerevisiae, προστίθενται αργότερα στο κυτταρόπλασμα. 9

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.5 Το μονοπάτι βιογένεσης ριβοσωμάτων στην S. cerevisiae, (Kressler D. et al., 1999). 10

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α Παράγοντες που συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος Ο χαρακτηρισμός διαφορετικών προ-ριβοσωμικών σωματιδίων έδειξε πως η σύσταση των αρχικών 90S συμπλόκων, διαφέρει σημαντικά από αυτή των 60 και 40S σωματιδίων. Ένα πολύ σημαντικό εύρημα (Grandi, Rybin et al. 2002), είναι ότι από το 90S προ-ριβόσωμα απουσιάζουν οι περισσότεροι παράγοντες που απαιτούνται για τη σύνθεση του 60S, όχι όμως και για τη σύνθεση του 40S. Μόνο ένας μικρός αριθμός πρωτεϊνών έχει βρεθεί να παίζει ρόλο, τόσο στα αρχικά, όσο και στα τελικά στάδια της ωρίμανσης των ριβοσωμάτων. Μια πρωτεΐνη στην οποία έχει αποδοθεί ο ρόλος της γέφυρας μεταξύ του 90S και 40S, είναι η Enp1p. Το σύμπλοκο που προέκυψε έπειτα από καθαρισμό αγχιστείας με την Enp1p, περιέχει όχι μόνο το 35S pre-rrna, αλλά και το διμεθυλιωμένο 20S prerrna. Διάφορες ριβοσωμικές πρωτεΐνες φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν με το πρόδρομο pre-rrna (early associating r-proteins). Η πρωτεΐνη Rio2 ανήκει στην οικογένεια κινασών σερίνης-θρεονίνης (Angermayr and Bandlow 2002), θεωρείται μάρτυρας της κυτταροπλασματικής εντόπισης του 40S σωματιδίου των τελευταίων σταδίων και φαίνεται ότι δεσμεύεται στο 40S, μετά από τις διασπάσεις στα σημεία Α 0 -Α 2, ενώ δεν έχει βρεθεί στο 90S πρόδρομο σωματίδιο (Schafer, et al. 2003). Ένας άλλος χαρακτηριστικός παράγοντας που φαίνεται να συσχετίζεται με την συγκρότηση της 40S υπομονάδας είναι η Rrp7p. Απάλειψη της πρωτεΐνης Rrp7p παρεμποδίζει την διάσπαση στις θέσεις Αο και Α2 του 35 S pre-rrna με αποτέλεσμα ελάττωση της σύνθεσης του 18 S rrna και μειωμένη παραγωγή της 40S υπομονάδας (Baudin-Baillieu, Tollervey et al. 1997). Μια άλλη πρωτεΐνη, με παρόμοια κυτταρική εντόπιση με τη Rio2 πρωτεΐνη, είναι η Nob1, η οποία μπορεί επίσης να θεωρηθεί μάρτυρας της κυτταροπλασματικής εντόπισης του 40S, αν και ο ρόλος της στο σωματίδιο αυτό δεν είναι ακόμη γνωστός (Tschochner and Hurt 2003). Η πρωτεΐνη Hrr25, εντοπίζεται διάχυτη στον πυρήνα, (πυρηνίσκοςπυρηνόπλασμα), αλλά και σε σχετικά υψηλό ποσοστό και στο κυτταρόπλασμα. H συγκεκριμένη αυτή πρωτεΐνη συμμετέχει στην ωρίμανση του πρόδρομου ριβοσωμικού 40S και παρουσιάζει μεγάλη κινητικότητα στο πυρηνόπλασμα. Παρουσιάζει δράση κινάσης, ενώ έχει αναφερθεί και πρόσθετος ρόλος της στην ενεργοποίηση της μετάφρασης σε απόκριση βλάβης του DNA. Η πρωτεΐνη αυτή, μαζί με την Tsr1, εντοπίζεται σε σύμπλοκα 40S ενδιάμεσων σταδίων. Η Tsr1, φαίνεται να 11

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σχετίζεται με την GTPάση Bms1 και είναι απαραίτητη για την επεξεργασία του 20S (Gelperin, et al. 2001). Ακολουθώντας την ωρίμανση των rrnas, τα 60S pre-ριβοσώματα, μετακινούμενα από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασμα υπόκεινται σε κυτταρικές διεργασίες και εμφανίζουν μεγάλες αλλαγές στην πρωτεϊνική σύσταση. Οι πρωτεΐνες Nog1, Nog2, Nug1 και Nug2 είναι πιθανές GTPάσες, και φαίνεται ότι εμπλέκονται στην επεξεργασία του 27SB και 7S pre-rrna, αφού βρέθηκαν να συνδέονται τόσο με 27SB και 7S pre-rrna, όσο και με 25S pre-rrna. Οι πρωτεΐνες αυτές, εντοπίζονται στον πυρηνίσκο, αλλά συνοδεύουν το 60S και στο πυρηνόπλασμα, μέχρι τους πυρηνικούς πόρους. Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση και την ενδοπυρηνική μετακίνηση των pre-ριβοσωμάτων, είναι τα Noc1p- Noc2p και Νοc2p-Noc3p (Milkereit, et al. 2001). Το πρωτεϊνικό σύμπλοκο Noc1p-Noc2p συσχετίζεται με τα 90S και 66S πρόδρομα ριβοσώματα και είναι εντοπισμένο κυρίως στον πυρήνα, ενώ το σύμπλοκο Noc2p-Noc3p συσχετίζεται μόνο με το πρόδρομο ριβόσωμα 66S και εντοπίζεται στο πυρηνόπλασμα (Fatica and Tollervey 2002). Απάλειψη των πρωτεϊνών Nop4p και Nop8p καθώς και των RNA ελικασών Dbp6p και Dbp9p, που δρουν στα πολύ αρχικά στάδια συγκρότησης της 60S υπομονάδας, οδηγεί σε μείωση των επιπέδων του 27S pre-rna (Berge`s et al., 1994, Daugeron et al., 1999, Kressler et al., 1998, Sun and Woolford, 1994, Zanchin and Goldfarb, 1999). Σε αντίθεση, απάλειψη των RNA ελικασών Spb4p και Dbp10p οδηγεί σε συσσώρευση του 27 S pre-rrna στα 66 S πρόδρομα ριβοσώματα. Η παραδοχή αυτή συνηγορεί στην εμπλοκή συγκεκριμένων RNA ελικασών σε «μετέπειτα» (late) στάδια συγκρότησης (de la Cruz, et al., 1998). Η Nip7p φαίνεται ότι είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη. Ενώ υπάρχουν ενδείξεις αναφορικά με την δράση της στον πυρήνα και κυρίως στον πυρηνίσκο, φαίνεται ότι ο εντοπισμός της στο κυτταρόπλασμα συσχετίζεται με την ελεύθερη ριβοσωμική υπομονάδα 60S. Η Ras1p φαίνεται να εμπλέκεται σε «μετέπειτα» στάδια (late) της πρόδρομης 60S υπομονάδας και απαιτείται για την στρατολόγηση του συμπλόκου Rpl10p/Qsr1p. Η παρουσία του συμπλόκου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rpl10p με την πρωτεΐνη Qsr1p στην 60S υπομονάδα είναι απαραίτητη διότι αποτελεί σημείο σύνδεσης της 40S με την 60S υπομονάδα (Eisinger, et al. 1997). Μία άλλη πρωτεΐνη, η Nmd3 που εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα όσο και στο κυτταρόπλασμα και συνδέεται με τη μεγάλη υπομονάδα, μέσω του συμπλόκου Rpl10p/Qsr1p, (Karl, et al., 1999), φαίνεται να είναι η κύρια πρωτεΐνη, η οποία παρέχει το σήμα για την έξοδο της 60S στο κυτταρόπλασμα. Αναφορικά με την σταθερότητα ή την αλληλεπίδραση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων έχει αναφερθεί στην βιβιογραφία ότι η 12

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Sqt1p αλληλεπιδρά ισχυρά με το σύμπλοκο σύνδεσης των δύο υπομονάδων η δε σταθερότητα της 60S υπομονάδας εξαρτάται από την παρουσία της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rp15p η οποία αλληλεπιδρά με το 5S rrna στα πρώιμα στάδια της συγκρότησης-βιογένεσης 60S υπομονάδας, (Deshmukh et al., 1993). Μια άλλη εξίσου σημαντική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στα στάδια βιογένεσης της 60S υπομονάδας στην S. cerevisiae είναι η Nop53p (Yp1146p), (Sydorskyy, et al. 2005). H Νοp53p εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και μεταλλάξεις ή απαλοιφή του γονιδίου της οδηγούν σε μειωμένη δημιουργία 60S υπομονάδων καθώς και διατάραξη του ρυθμού ισορροπίας 60S:40S. Συνοψίζοντας, η πολυπλοκότητα της βιογένεσης των ριβοσωμάτων είναι εμφανής και απαιτείται ακόμη πολλή προσπάθεια προκειμένου να γίνουν κατανοητά και άλλες κυτταρικές διεργασίες. Με την ανάπτυξη νέων και ευαίσθητων τεχνικών, όπως είναι η μέθοδος TAP, η φασματομετρία μάζας, τεχνικές υβριδισμού, είναι πολύ πιθανόν να διαλευκανθούν οι πολύπλοκες δυναμικές της διαδικασίας ωρίμανσης, καθώς και να συσχετιστούν με άλλες βασικές κυτταρικές λειτουργίες (Fromont and Racine et al., 2003, Nazar 2004). A Μετακίνηση ριβοσωμάτων από το πυρηνόπλασμα στο κυτταρόπλασμα Όλα τα μακρομόρια μεταφέρονται μέσω του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου (ΝPC, Nuclear Pore Complex) που συγκροτείται από τις νουκλεοπορίνες, (nucleoporins ή Νups) και εντοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο. Στην S.cerevisaea μόνο μια ριβοσωμική υπομονάδα μπορεί να περάσει μέσα από τον πυρηνικό πόρο την ίδια χρονική στιγμή λόγω του μεγέθους (ο πυρηνικός πόρος έχει μέγεθος 40 MDa Davis, et al, 1995). Η μακρομοριακή μεταφορά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα συνήθως είναι ενεργητική. Στο σχήμα A.6 δίδεται η «δομή» του πυρηνικού συμπλέγματος NPC. Πολύ συχνά η μεταφορά υποβοηθείται από πρωτεΐνες τις καρυοφερίνες (carrier proteins) οι οποίες αλληλεπιδρούν τόσο με το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου όσο και με άλλους ρυθμιστές (Rout et al., 2000). Πολλές νουκλεοπορίνες καθώς και άλλες πρωτεΐνες συστατικά του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου - περιέχουν αρνητικά φορτισμένες και μη διαμορφωμένες περιοχές (unstructured regions) με υδρόφοβες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες FG με τις οποίες αλληλεπιδρούν με τις καρυοφερίνες (Tran and Wente 2006). Μια από τις πιο γνωστές καρυοφερίνες είναι η importin β Crm1 που 13

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αναγνωρίζει μια πρωτεϊνική αλληλουχία πλούσια σε λευκίνη, ένα πυρηνικό σήμα εξόδου (NES, Nuclear Export Signal). Ο ακριβής μηχανισμός μεταφοράς διαμέσου του πυρηνικού πόρου δεν είναι πλήρως γνωστός. Το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου συγκροτείται από μη οργανωμένες περιοχές των νουκλεοπορινών δημιουργώντας ένα δίκτυο με ασθενείς υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επαναλαμβανόμενων FG (Ribbeck and Gorlich 2002). Σχήμα Α.6 Δομή του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου (NPC), Rout και Aitchison, (2001) Το σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου παρουσιάζει χαρακτηριστική οκταγωνική συμμετρία και οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε αυτή την περιοχή ονομάζονται νουκλεοπορίνες. Αποτελείται από δύο ομόκεντρους δακτυλίους, έναν στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (προς το κυτταρόπλασμα) και τον άλλον στην εσωτερική μεμβράνη (προς το πυρηνόπλασμα). Στην κυτταροπλασματική πλευρά του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου προεκβάλλουν οχτώ παχέα ινίδια τα οποία προορίζονται για την σύνδεση υλικών που προορίζονται για την μεταφορά στον πυρήνα. Ο δακτύλιος που βρίσκεται στην πυρηνική πλευρά είναι πιο λεπτός και από αυτόν προεκβάλλουν οχτώ λεπτά ινίδια τα οποία ενώνονται με έναν τελικό δακτύλιο, σχηματίζοντας έτσι μια δομή που μοιάζει με καλάθι. Ανάμεσα στους δύο αυτούς δακτυλίους βρίσκεται ένας τρίτος δακτύλιος που αποτελείται από οχτώ ακτινωτά διατεταγμένους κυλίνδρους οι οποίοι σχηματίζουν τον κεντρικό δίαυλο του πυρηνικού πόρου. Έτσι, η συγκρότηση αυτή του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου δημιουργεί ένα μεγάλο κεντρικό κανάλι, μέσω του οποίου γίνεται η «διαμεσολαβούμενη» πυρηνοπλασματική μεταφορά και οχτώ μικρότερα περιφερειακά κανάλια μέσω των οποίων γίνεται, πιθανότατα, η παθητική μεταφορά μορίων. Στα μονοπάτια μεταφοράς των ριβοσωμικών υπομονάδων προς το κυτταρόπλασμα εμπλέκονται διάφορες πρωτεΐνες προκειμένου να διευκολυνθεί η 14

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ έξοδος τους από τον πυρήνα, η δε pre-40s ριβοσωμική υπομονάδα απελευθερώνεται ταχύτατα διαμέσου του πυρηνικού πόρου στο κυτταρόπλασμα (Leger-Silvestre, Milkereit et al. 2004). Οι πρωτεΐνες Enp1p/Rio2 δεν είναι απαραίτητες μόνο στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων αλλά φαίνεται ότι εμπλέκονται και στην μεταφορά της 40S από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα αλληλεπιδρώντας με μια GTP-binding πρωτεΐνη, την Tsr1p, (Thorsten et al, 2003). Επιπρόσθετα έχει δειχθεί πως για την έξοδό της η 40S υπομονάδα υπόκειται σε διάφορες κυτταροπλασματικές διεργασίες στο 3 άκρο του 18 S rrna (Gleizes, Noaillac-Depeyre et al. 2001). Επίσης η GTPase Ran καθώς και οι νουκλεοπρωτεΐνες των πυρηνικών πόρων φαίνεται ότι συμμετέχουν στην έξοδο της 40S στο κυτταρόπλασμα (Moy and Silver 1999). Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία απάλειψη της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rps15p έχει ως αποτέλεσμα την συσσώρευση των pre-ριβοσωμικών 40S υπομονάδων στον πυρήνα, συνηγορώντας για την εμπλοκή της Rps15p στην έξοδο της υπομονάδας από τον πυρήνα, (Leger-Silvestre, Milkereit et al. 2004) πολύ πιθανόν μέσω της ύπαρξης ενός σήματος εξόδου από τον πυρήνα αλλά και θέσεων αλληλεπίδρασης με την καρυοφερίνη Crm1p. Να τονιστεί πως η Crm1/Xpo1 είναι μια κύρια καρυοφερίνη- importin και μεταφέρει κυρίως πρωτεΐνες πλούσιες σε λευκίνες που περιέχουν πυρηνικό σήμα εξόδου (NES, Nuclear Export Signal). Εντούτοις βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν πως αυτές οι καρυοφερίνες μπορούν να μεταφέρουν και πρωτεΐνες από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα χωρίς να διαθέτουν οπωσδήποτε κάποιο σήμα εξόδου (Fornerod, et al. 1997). Βιοχημικά πειράματα και πειράματα ανοσοφθορισμού έχουν δείξει πως υπάρχει ένας «λειτουργικός συσχετισμός» της πυρηνικής μυοσίνης Ι (NMI) και της ακτίνης με την μικρή υπομονάδα. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη rps6 συμπλέκεται με άλλες πρωτεΐνες και rrna και μεταφέρεται διαμέσου του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου. Παρεμπόδιση της πυρηνικής μυοσίνης και της ακτίνης σε HeLa κύτταρα οδηγεί στη συσσώρευση της rps6 στο πυρηνόπλασμα. Οι παλινδρομικές κινήσεις της πυρηνικής μυοσίνης και ακτίνης έχουν ως αποτέλεσμα την διευκόλυνση της εξόδου του ~10% της 40S υπομονάδων (Cisterna, et al. 2006). Σύμφωνα με πρόσφατες εργασίες για την έξοδο της 60S υπομονάδας απαιτούνται τρεις υποδοχείς εξόδου: η πρωτεΐνη Crm1 η οποία προσδένεται στην 60S μέσω της πρωτεΐνης Nmd3p (Gadal, et al. 2001), τo ετεροδιμερές Mex67/Mtr2 (Yao et al., 2007) και ένας μη κανονικός (noncanonical) υποδοχέας που προσδένεται απευθείας στην υπομονάδα και τις νουκλεοπορίνες (Hedges, et al. 2006). Ο πλήρης μηχανισμός μεταφοράς της 60S υπομονάδας δεν έχει αποσαφηνιστεί και διάφορες υποθέσεις έχουν διατυπωθεί. 15

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για παράδειγμα ένας πρωτεϊνικός υποδοχέας Nmd3 ο οποίος εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα, όσο και στο κυτταρόπλασμα, φαίνεται να παρέχει το σήμα για την έξοδο της μεγάλης υπομονάδας, 60S, στο κυτταρόπλασμα. Στην πρωτεΐνη αυτή, Nmd3, βρέθηκε μια ακολουθία λίγων αμινοξέων, NES, (Nuclear Export Signal), η οποία είναι πλούσια σε λευκίνη. Συγκεκριμένα όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.7 η Nmd3 συνδέεται στην πρόδρομη ριβοσωμική υπομονάδα 60S στο πυρηνόπλασμα. Στη συνέχεια ο υποδοχέας εξόδου, Xpo1/Crm1, αναγνωρίζει το σήμα NES της Nmd3, και οδηγεί τελικά το όλο σύμπλοκο στο κυτταρόπλασμα. Στο κυτταρόπλασμα συνδέεται με τη μεγάλη υπομονάδα, η ριβοσωμική πρωτεΐνη RpL10 καθώς ενσωματώνεται και μια άλλη κυτταροπλασματική GTPase, η Lsg1p,με κάποιο άγνωστο μηχανισμό. Με την υδρόλυση του GTP προκαλούνται αλλαγές στην διαμόρφωση της 60S υπομονάδας με συνέπεια την απελευθέρωση της Nmd3 και την μετακίνηση της στον πυρήνα (Hedges et al., 2006). Σχήμα Α.7 Πιθανό μοντέλο μεταφοράς της 60S υπομονάδας από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. (Hedges et al., 2006) Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα (Kain-Yin Lo and Arlen W. Johnson, 2009) έχουν αποκαλύψει, πως η έξοδος της μεγάλης υπομονάδας δεν στηρίζεται στην ύπαρξη εξειδικευμένων υποδοχέων, αλλά στην παρουσία ενός ισχυρού σήματος εξόδου πλούσιο σε λευκίνες, ανάλογο της Nmd3. Για παράδειγμα η προσθήκη ενός τέτοιου σήματος στη ριβοσωμική πρωτεΐνη RpL3 βοηθά την έξοδο της 60S υπομονάδας στο κυτταρόπλασμα. Λαμβάνοντας όλα τα παραπάνω, η έξοδος των ριβοσωμικών υπομονάδων διαμέσου του πυρηνικού πόρου ακολουθεί ένα "ευέλικτο" κυτταρικό μονοπάτι στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, που πιθανόν 16

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιλαμβάνει όχι μόνο την πρωτεΐνη Nmd3 με ισχυρό σήμα εξόδου NES αλλά μια πληθώρα ριβοσωμικών και μη ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Α.2 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες A.2.1 Χαρακτηριστικά των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.1, τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα αποτελούνται από 4 rrnas, (5S, 5.8S, 18S και 25/28S) και περισσότερες από 70 ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Ribosomal Proteins RPs) οι οποίες κατανέμονται στις δυο υπομονάδες του ριβοσώματος. Έτσι, στον επίμυ στη μικρή υπομονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 33 πρωτεΐνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα S, (Small), και έναν αριθμό, ενώ στη μεγάλη υπομονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 49 πρωτεΐνες οι οποίες χαρακτηρίζονται με το λατινικό γράμμα L, (Large), και έναν αριθμό. Η πλήρης αμινοξική ακολουθία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών του επίμυ είναι γνωστή για τις 75 από αυτές (Wool, 1995). Το ώριμο 5S rrna αποτελείται περίπου από 120 νουκλεοτίδια και μεταγράφεται ξεχωριστά από τα άλλα rrnas. Το γονίδιο του 5S rrna είναι ξεχωριστό από τα γονίδια των άλλων rrna και είναι πολύ συντηρημένο σε όλους τους οργανισμούς, στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες. Η μεταγραφή του 5 S rrna γίνεται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ έξω από τον πυρηνίσκο σε αντίθεση με τα άλλα rrna που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση Ι μέσα στον πυρηνίσκο. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από mrnas τα οποία συνθέτονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ, στον πυρήνα και στη συνέχεια, τα mrnas, μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η μετάφραση και η σύνθεση των πρωτεϊνών. Ακολούθως, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους, οδηγούνται στον πυρήνα και τελικά στον πυρηνίσκο, όπου συνδέονται με τα νεοσυντιθέμενα rrnas, προκειμένου να λάβει χώρα η συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων (Warner, 2001). Αναφορικά με την έξοδο των ημι-συγκροτημένων υπομονάδων (λείπουν μόνον ελάχιστες πρωτεΐνες) από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα υπάρχουν αρκετά ερωτηματικά για τον εξής λόγο: η διάμετρος των πόρων (περίπου 10 με 20 nm) είναι εμφανώς μικρότερη από την διάμετρο των πρωτογενών (ημι-συγκροτημένων) ριβοσωμικών υπομονάδων και πιθανόν οι πόροι να αλλάζουν σχήμα προκειμένου να γίνει η μεταφορά των ριβοσωμικών υπομονάδων. Η ταχύτητα διαμετακίνησης των ριβοσωμικών συστατικών και των ριβοσωμικών υπομονάδων είναι εντυπωσιακά 17

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υψηλή. Έχει βρεθεί, πως σε ένα κύτταρο ζύμης το οποίο βρίσκεται σε φάση ανάπτυξης, εισέρχονται στον πυρήνα, δια μέσου των πυρηνικών πόρων, περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες σε ένα λεπτό, ενώ εξέρχονται, στον ίδιο χρόνο, περίπου ριβοσωμικές υπομονάδες! (Warner, 1999) Όπως προαναφέρθηκε και όπως δίδεται στο σχήμα Α.3 οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παίζουν κύριο ρόλο στην επεξεργασία του pre-rrna, στην αναδίπλωση (folding) του rrna, στην μεταφορά πρόδρομων ριβοσωμάτων και στην σταθερότητα της δομής των ριβοσωμικών υπομονάδων, καθώς αλληλεπιδρούν με διάφορους παράγοντες τόσο στην διαδικασία της βιογένεσης όσο και της μετάφρασης (Blaha 2004). Έτσι μετά την μεταγραφή και τροποποίηση του το rrna «συμπλέκεται» με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες για την δημιουργία των ριβοσωμικών υπομονάδων, οι οποίες μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα όπου ανασυγκροτούνται για την δημιουργία του 80S ριβοσώματος που αποκωδικοποιεί το mrnas σε πρωτεΐνες και στην συνέχεια αποσυγκροτούνται (διίστανται) μετά την πρωτεϊνική σύνθεση. Η διαδικασία αυτή συναρμολόγησης και αποσύνδεσης των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων καλείται "Ανακύκλωση Ριβοσώματος " (σχήμα Α.8). Σχήμα Α.8 "Ανακύκλωση Ριβοσώματος" (Mao-De και Jing, 2007) Τα rrnas μεταγράφονται στον πυρηνίσκο και αλληλεπιδρούν με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες για την δημιουργία των πρόδρομων ριβοσωμικών υπομονάδων, οι οποίες μεταφέρονται στο 18

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κυτταρόπλασμα. Στην συνέχεια συγκροτείται το 80S ριβόσωμα -με ταυτόχρονη δράση διαφόρων παραγόντων - που μεταφράζει τα mrnas σε πρωτεΐνες και αποσυνδέεται μετά την πρωτεϊνική σύνθεση. Η σταθερή αναλογία rrna/ριβοσωμάτων και ριβοσωμικών πρωτεϊνών / ριβοσωμάτων ελέγχεται από δύο συστήματα ανάδρασης. Στο πρώτο από αυτά παράγονται λίγο περισσότερα ριβοσώματα από ότι χρειάζεται για τον απαιτούμενο ρυθμό πρωτεΐνοσύνθεση και τα πλεονάζοντα ελεύθερα ριβοσώματα καταστέλλουν κατά κάποιο τρόπο την σύνθεση των rrna, (ριβοσωμική ανάδραση, ribosomal feedback inhibition). Στην δεύτερη περίπτωση ορισμένες ριβοσωμικές πρωτεΐνες καταστέλλουν την μετάφραση ενός mrna που κωδικοποιεί μια ή περισσότερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, (μεταφραστική καταστολή, translational control). Εξαιτίας του ότι η συγκρότηση και η λειτουργία του ριβοσώματος εξαρτάται από μια στοιχειομετρική ισορροπία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, πτώση στα επίπεδα μιας ή περισσοτέρων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, μπορεί να μειώσει την μεταφραστική ικανότητα ή ακόμα και να καταστήσει τη μεταφραστική μηχανή μη λειτουργική και επομένως να δοθεί το σήμα στο κύτταρο για αυτοκαταστροφή (Naora, 1999 ). Οι αμινοξικές ακολουθίες των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε διάφορα είδη θηλαστικών, παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία. Συγκρίνοντας τις ακολουθίες από άνθρωπο και επίμυ, παρατηρείται ότι για 72 συγκρινόμενες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ο μέσος όρος της ομολογίας φτάνει στο 99%, ενώ οι 32 από αυτές παρουσιάζουν 100% ομολογία (Wool, 1995, Kenmochi, 1998). Στα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχει ένα λειτουργικό γονίδιο και ένας μεγάλος αριθμός ψευδογονιδίων για κάθε ριβοσωμική πρωτεΐνη. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παρουσιάζουν γενετικές ποικιλομορφίες. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S4 η οποία βρίσκεται στα χρωμοσώματα Χ και Ψ και οι S3, S6, S17 και L17 εμφανίζονται να έχουν μια πολλαπλή ομολογία ποικιλομορφιών. Στην S. cerevisaea 59 από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από δύο αντίγραφα γονιδίων, (Giaever et al., 2002). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μεγάλης και μικρής υπομονάδας μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: αυτές που είναι συντηρημένες στα βακτήρια, αρχαιοβακτήρια και στα ευκαρυωτικά (θηλαστικά και φυτά) και σε αυτές που είναι κοινές σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αρχαιοβακτήρια. Στην ζύμη οι 15 από τις 32 ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας εμφανίζουν υψηλή ομολογία μεταξύ των ευκαρυωτικών κυττάρων και των αρχαιοβακτηρίων. Δεν υπάρχει καμία αμφιβολία, πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες όλων των ευκαρυωτικών οργανισμών προέρχονται από μια κοινή ομάδα προγονικών γονιδίων. Η παραδοχή αυτή τεκμηριώνεται με τη σύγκριση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών του 19

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επίμυ και της ζύμης, που αποτελούν δυο ευκαρυωτικά είδη τα οποία απέχουν αρκετά εξελικτικά. Έτσι, από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες του επίμυ, οι 66 μπορούν να συσχετιστούν με κάποια ριβοσωμική πρωτεΐνη της ζύμης, η ομολογία δε της αμινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 60%, κυμαινόμενη από 40%-88% (Wool 1995, Kenmochi 1998). Έχει διαπιστωθεί πως οι αμινοξικές ακολουθίες των ριβοσωμικών πρωτεϊνών των αρχαιοβακτηρίων έχουν περισσότερες ομοιότητες με τις ακολουθίες των ευκαρυωτικών, παρά με τις ακολουθίες των βακτηριακών ομολόγων. Από τις 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες του επίμυ, οι 49 μπορούν να συσχετιστούν με κάποια ριβοσωμική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων και η ομολογία της αμινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 34%, κυμαινόμενη από 17%-55% (Wool, 1995, Kenmochi 1998). Κατά μέσο όρο, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, έχουν μοριακό μέγεθος Da, το οποίο κυμαίνεται από Da για την L4, έως Da για την L41 και ο αριθμός των αμινοξέων είναι κατά μέσο όρο 164, από 421 έως 25. Οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι βασικές, με μέσο ισοηλεκτρικό σημείο το 11.05, από 4.07 για την όξινη πρωτεΐνη P1, έως για την πολύ βασική L41 και περιέχουν 22moles % αργινίνη και λυσίνη και μόνο 9moles % ασπαραγινικό και γλουταμινικό οξύ (Wool, 1995). Στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, διακρίνονται κάποια δομικά χαρακτηριστικά. Έτσι, κοντά στο Ν-τελικό και στο C-τελικό άκρο, απαντώνται δέσμες 3 ή 4 βασικών αμινοξέων. Πιο σπάνια εντοπίζονται στο C-τελικό άκρο δέσμες όξινων αμινοξέων. Χαρακτηριστικό των ριβοσωμικών πρωτεϊνών είναι επίσης και οι επαναλαμβανόμενες ακολουθίες 3-8 αμινοξέων, όπως επίσης και οι δομές δακτύλου ψευδαργύρου και φερμουάρ λευκίνης (Wool, 1995). Το γεγονός ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχουν περίπου 30 ριβοσωμικές πρωτεΐνες περισσότερες από ότι στα βακτήρια, πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη περισσοτέρων και μεγαλυτέρων rrnas, στην πιο πολύπλοκη διαδικασία βιογένεσης των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων, στη συμμετοχή σε πολυπλοκότερους μηχανισμούς ρύθμισης της μετάφρασης, καθώς επίσης και στην σύνδεση των ριβοσωμάτων στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου. Υπάρχουν δυο πιθανές θεωρίες σχετικά με την προέλευση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Σύμφωνα με την πρώτη, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχεδιάστηκαν αποκλειστικά για το ριβόσωμα, ενώ η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι είχαν επιλεγεί ανάμεσα από ήδη υπάρχουσες πρωτεΐνες, οι οποίες είχαν καθορισμένες λειτουργίες. Οι δυο θεωρίες δεν είναι απόλυτες ούτε είναι πιθανό όλες οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες να είχαν προστεθεί στο ριβόσωμα την ίδια στιγμή. Αν υιοθετηθεί η θεωρία των 20

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ προϋπαρχουσών πρωτεϊνών, αυτές που είναι πιο πιθανό να έχουν επιλεγεί, είναι αυτές που έχουν την ικανότητα να δεσμεύονται σε νουκλεϊνικά οξέα (Wool, 1996). Α.2.2 Mεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Πολλές ευκαρυωτικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες τροποποιούνται με ακετυλίωση, μεθυλίωση ή φωσφορυλίωση. Η φωσφορυλίωση είναι η πλέον κοινή τροποποίηση που παρατηρείται στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα και είναι σημαντικός παράγοντας ρύθμισης της μετάφρασης. Από μελέτες πρωτεομικής ανάλυσης βρέθηκε ότι η ακετυλίωση λαμβάνει χώρα κύρια στο Ν-τελικό άκρο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών αλλά δεν έχει παρατηρηθεί ακετυλίωση στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες όταν απομονώνονται από ριβοσώματα. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες ακετυλιώνονται αρχικά και στην πορεία αποακετυλιώνονται. Πιθανόν η ακετυλίωση συμβάλλει στην «παραμονή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα ενώ η αποκετυλίωση εμπλέκεται σε περαιτέρω στάδια έτσι ώστε να διασφαλίζεται η βιογένεση των ριβοσωμάτων στον πυρηνίσκο (σχήμα Α.9). Η αποακετυλάση ιστόνης RPD3 παίζει σημαντικό ρόλο στην αποακετυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (Dinman, 2009). Σχήμα Α.9 Μοντέλο μεταμεταφραστικής ακετυλίωσης και απακετυλίωσης ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPs) (Dinman, 2009) 21

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βήμα 1, το pre-rrna μεταγράφεται στον πυρηνίσκο. Βήμα 2, συμμεταφραστική ακετυλίωση λαμβάνει χώρα στο Ν-τελικό άκρο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (NAT), στο κυτταρόπλασμα. Πιθανόν ενεργοποιούνται ενδο-ακετυλάσες. Βήμα 3, οι RPs μεταφέρονται στον πυρηνίσκο διαμέσου του πυρήνα. Αποακετυλίωση πιθανόν να συμβαίνει στο στάδιο αυτό. Η αποακετυλίωση (DAC) απαλείφει το αρνητικό φορτίο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η αλληλεπίδραση των RPs με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του pre-rrna. Βήμα 4, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με το pre-rrna προκειμένου να σχηματιστούν οι πρόδρομες ριβοσωμικές υπομονάδες. Βήμα 5, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες σε "περίσσεια" αποακετυλιώνονται στον πυρήνα ή στον πυρηνίσκο και οδηγούνται στο πρωτεόσωμα προκειμένου να αποικοδομηθούν Βήμα 6, έλλειψη δραστικότητας αποκετυλίωσης ή απορρύθμισης έχει ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση στην επεξεργασία του rrna και επιπτώσεις στην βιογένεση των ριβοσωμάτων. Μία άλλη συχνή μεταφραστική τροποποίηση η οποία έχει αναφερθεί στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες είναι η μεθυλίωση. Η ανθρώπινη ριβοσωμική πρωτεΐνη rps3 (243 αμινοξέα) μεθυλιώνεται από την μεθυλτρανσφεράση 1 (PRMT 1). Πρόκειται για μια υψηλά συντηρημένη πρωτεΐνη και η μεθυλίωση γίνεται σε κατάλοιπα αμινοξέων αργινίνης (στις θέσεις 64, 65 και 67). Πειράματα με μεταλλάξεις στα αμινοξέα που αποτελούν στόχο μεθυλίωσης έχουν ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της εισόδου της πρωτεΐνης στον πυρηνίσκο. Επομένως, η μεταμεταφραστική μεθυλίωση της rps3 είναι απαραίτητη για την είσοδο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης στον πυρηνίσκο για την ομαλή βιογένεση των ριβοσωμάτων (Shin, et al. 2009). Εκτός από την rps3 έχει βρεθεί ότι και η rps2 μεθυλιώνεται σε κατάλοιπα αργινίνης αλλά από την μεθυλτρανσφεράση 3 PRMT 3 (Swiercz, Cheng et al. 2007). Μία άλλη πολύ σημαντική μεταφραστική τροποποίηση είναι η φωσφορυλίωση. Αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε φωσφορυλίωση η οποία εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες (κυτταρική απόκριση, επίπεδο έκφρασης κ.τ.λ.). Σύμφωνα με τους Kim et al, (2009) η rps3 φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες ERK και PKC delta. Για κάποιες άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες υπάρχουν ενδείξεις ότι φωσφορυλιώνονται μεν αλλά δεν είναι γνωστό από ποιες κινάσες. Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα το 1978 οι Roberts & Ashby (1978) ανέφεραν την φωσφορυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (στον εγκεφαλικό φλοιό) rps2, rps3 και rps6 αλλά όχι φωσφορυλίωση της rps5. Αργότερα από τους Roberts & Morelos (1979) και Francis & Roberts (1982) αναφέρθηκε η φωσφορυλίωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών rps2 (στα πολυσώματα) ενώ για τις rps3a rpl14,rpl19 και rps5 φωσφορυλίωση μόνον σε ελεύθερες ριβοσωμικές υπομονάδες. H φωσφορυλίωση της rps5 έχει απασχολήσει κατά καιρούς την επιστημονική κοινότητα. Έτσι σύμφωνα με δεδομένα που δημοσιεύτηκαν πρόσφατα και αποτελούν 22

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μέρος αυτής της διατριβής η rps5 είναι φωσφορυλιωμένη όχι σε «ριβοσωμικό υλικό» (ελεύθερες υπομονάδες, πολυσώματα, ριβοσώματα) αλλά όταν δεν είναι ενσωματωμένη στο ριβόσωμα (Matragkou, Papachristou και συνεργάτες, 2009). Αυτά τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με μελέτες των Roberts & Ashby (1978), Ramagopal (1991) and Vladimirov et al, (1996) και θα συζητηθούν αναλυτικά στο κεφάλαιο ΣΥΖΗΤΗΣΗ της εργασίας. Η φωσφορυλίωση των όξινων ριβοσωμικών πρωτεϊνών, των αποκαλούμενων P- proteins, παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση και στην μεταφραστική δραστικότητα του ριβοσώματος. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη S6, η κύρια φωσφοπρωτεΐνη των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων (Gressner, 1974). Πρόκειται για μια πρωτεΐνη μοριακού μεγέθους περίπου 30 kda, η οποία περιλαμβάνει 249 αμινοξέα. Από τα αμινοξέα αυτά, τα 15 είναι σερίνες και 7 από αυτές εντοπίζονται σε μια ακολουθία 15 αμινοξέων στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης (Chan και Wool, 1988). Έχει βρεθεί πως φωσφορυλιώνεται διαδοχικά στις πέντε από αυτές, Ser 236, Ser 235, Ser 240, Ser 244, και Ser 247 (Radimerski et al., 2000). Αποτελεί μια από τις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας που συνδέονται με το πρόδρομο 45S rrνα και εντοπίζεται στην κεφαλή της κυτταροπλασματικής 40S υπομονάδας (Nygard και Nilsson, 1990). Η πρωτεΐνη αυτή μπορεί άμεσα να αλληλεπιδράσει με mrna, trna και παράγοντες έναρξης. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής στο κυτταρόπλασμα, φαίνεται να ενισχύει την επιλεκτική μετάφραση μιας σειράς εξειδικευμένων mrnas τα οποία περιέχουν μια μικρή ακολουθία 5-15 πυριμιδινών στην 5 μη μεταφραστική περιοχή του mrna (UTR), ακριβώς μετά το m 7 GTP κάλυμμα, (5 -TOP). H κατηγορία αυτή των mrnas αφορά ριβοσωμικές πρωτεΐνες, παράγοντες επιμήκυνσης (EEF1A1 και EEF2) και πολλές άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται είτε στα διάφορα στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων είτε στον έλεγχο της μετάφρασης. Η μεταφραστική ρύθμιση των 5 -TOP mrnas, δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τη φωσφορυλίωση της S6, αλλά και από άλλα αναπτυξιακά και μιτογόνα ερεθίσματα, αφού όπως έχει βρεθεί, στα MEL κύτταρα ή σε άλλα αιμοποιητικά κύτταρα, δεν παρατηρείται φωσφορυλιωμένη S6, παρόλα αυτά όμως, πραγματοποιείται σε κάποιο βαθμό η μετάφραση των 5 -TOP mrnas (Barth-Baus et al., 2002). Έχει αποδειχθεί πως η απενεργοποίηση της κινάσης που φωσφορυλιώνει την S6 (ds6k) στην Drosophila έχει ως συνέπεια μείωση του μεγέθους και επιπτώσεις στην κυτταρική ανάπτυξη (Montagne et al., 1999). Στα θηλαστικά η ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps6 είναι πιο πολύπλοκη. Η πολυπλοκότητα οφείλεται στην παρουσία μιας δεύτερης κινάσης η οποία εμφανίζει υψηλή ομολογία με την S6K2. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 23

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ λοιπόν, φωσφορυλιώνεται από διαφορετικούς τύπους κινασών, την p70/p85s6k, S6K1, και την pp90rsk, S6K2 (Shima et al., 1998). Ο ρόλος της S6K2 στη φωσφορυλίωση της S6, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες παραμένει αδιευκρίνιστος. Η S6K1, αποτελείται από δυο κινάσες, την p70s6k και την p85s6k. Οι δυο αυτές κινάσες μεταφράζονται από το ίδιο mrna, χρησιμοποιώντας εναλλακτικά σημεία έναρξης της μετάφρασης. Η αμινοξική τους ακολουθία είναι η ίδια, με εξαίρεση μια προέκταση 23 αμινοξέων στην N- τελική περιοχή της p85s6k, η οποία οδηγεί την πρωτεΐνη στον πυρηνίσκο, σε αντίθεση με την p70s6k, που είναι κυτταροπλασματική (Radimerski et al., 2000). Η φωσφορυλίωση της S6 απαιτεί την ενεργοποίηση των S6 κινασών. Διάφορα μιτογόνα, ινσουλίνη και αμινοξέα σε περίσσεια, ενεργοποιούν ένα μονοπάτι μεταγωγής σημάτων που οδηγεί στην ενεργοποίηση της S6 κινάσης με φωσφορυλιώσεις που αλλάζουν την διαμόρφωση της πρωτεΐνης (Williams et al., 2003). Όπως φαίνεται στο πιο κάτω σχήμα η γονιδιακή έκφραση του TOP εξαρτάται από την φωσφατιδυλο-ινισιτόλη 3-κινάση (PI3K), αλλά είναι ανεξάρτητη από την κινάση S6K1, (Stolovich et al, 2002). Το μονοπάτι αυτό φαίνεται στο σχήμα Α.10. Σχήμα Α.10 Μονοπάτι μεταγωγής σήματος που οδηγεί στην ενεργοποίηση της p70/p85s6k (Hans Trachel, 2002). 24

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.3 Η πολυλειτουργικότητα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών Όπως προαναφέρθηκε οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες λειτουργούν ως μοριακοί συνοδοί του RNA κατά την διαδικασία συγκρότησης των ριβοσωμικών υπομονάδων ή έχουν δομικό ρόλο in situ στο ριβόσωμα και επίσης συντονίζουν τις αλληλεπιδράσεις του ριβοσώματος με τους παράγοντες έναρξης και επιμήκυνσης του mrna. Εν τούτοις η υπερπαραγωγή πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε καρκινικές σειρές δείχνει την εμπλοκή τους σε άλλες μη ριβοσωμικές λειτουργίες. Πίνακας 1. Πολυλειτουργικές (μη-ριβοσωμικός ρόλος) ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Mao-De and Jing, 2007) 25

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Kondoh, Schweinfest et al. 1992; Wong, Mafune et al. 1993). Παράλληλα έχει αναφερθεί η παραγωγή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ακόμη και αν παρεμποδίζεται η σύνθεση του rrna ενισχύοντας την άποψη ότι οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες δεν συσχετίζονται απαραίτητα μόνον με την βιογένεση των ριβοσωμάτων. Πολλές λοιπόν ριβοσωμικές πρωτεΐνες συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, η επεξεργασία του RNA,στο μάτισμα του RNA, η επιδιόρθωση του DNA, η ρύθμιση της ανάπτυξης, ο κακοήθης μετασχηματισμός, η απόπτωση, ακόμα και η φλεγμονή (Wool et al., 1996). Μεταλλάξεις σε γονίδια ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή διαταραχή έκφρασης των επιπέδων τους έχουν βρεθεί σε διάφορες κληρονομήσιμες γενετικές ασθένειες, όπως στην αναιμία Diamond Blackfan, στο σύνδρομο Turner, σύνδρομο Noonan, σύνδρομο Bardet-Biedl (Kongsuwan, Yu et al. 1985), καθώς επίσης και σε διάφορες μορφές καρκίνου όπως είναι του μαστού, προστάτη, τραχήλου της μήτρας, οισοφάγου και ήπατος. Μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την ριβοσωμική πρωτεΐνη (RP) S19 είναι υπεύθυνες για το 25% των περιπτώσεων σε ασθενείς που πάσχουν από την αναιμία DBA (Diamond Blackfan Anemia). Η σύνδεση της συγκεκριμένης ριβοσωμικής πρωτεΐνης με την ερυθροποίηση δεν είναι ξεκάθαρη. Πιθανόν οι μεταλλάξεις αυτές ή επιφέρουν αλλαγές στην διαδικασία της πρωτεΐνοσύνθεσης ή έχουν επιπτώσεις στον «άγνωστο» μη-ριβοσωμικό ρόλο της rps19. Έχει βρεθεί πως η rps19 αλληλεπιδρά με την ογκοπρωτεΐνη PIM-1, πρόκειται για μια κινάση σερίνης-θρεονίνης, της οποίας η έκφραση επάγεται σε ερυθροποιητικά κύτταρα από πολλαπλούς παράγοντες ανάπτυξης, όπως η ερυθροποιητίνη (Chiocchetti et al, 2005). Επίσης οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες RPS24, RPS17 και RPL35A εμπλέκονται στο σύνδρομο DBA (Gazda et al., 2006; Cmejla et al., 2007; Farrar et al., 2008). Απάλειψη ενός αλληλόμορφου γονιδίου της rps14 συσχετίζεται με την εμφάνιση μιας άλλης μορφής συνδρόμου αναιμίας -το αποκαλούμενο 5qσύνδρομο - με εμφάνιση αιμοποιητικών όγκων, (Ebert et al., 2008). Δέκα γονίδια ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPS3, S4X, S27a, S3, L6, L9, S3A, S2, L3) υπερεκφράζονται σε αδενοκαρκινώματα (Lin et al., 2002). Επίσης σε κάποια είδη ψαριών (Solea senegalensis και Hippoglossus hippoglossus) τα επίπεδα των mrnas ριβοσωμικών πρωτεϊνών αυξάνονται στην εμβρυογένεση και στο προνυμφικό στάδιο (Manchado, Infante et al. 2007). Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός πως τα επίπεδα των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στα διάφορα στάδια μιας συγκεκριμένης μορφής καρκίνου ποικίλουν. Όλα αυτά συνηγορούν στην ύπαρξη ενός πολύπλοκου μηχανισμού μεταξύ της καρκινογένεσης και των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Έτσι λοιπόν υπάρχουν δύο ενδεχόμενα : α. η διαταραχή των επιπέδων των ριβοσωμικών πρωτεϊνών επηρεάζει 26

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την πρωτεϊνική σύνθεση, β άμεση συμμετοχή στον μηχανισμό της καρκινογένεσης μέσωτου μη-ριβοσωμικού τους ρόλου (Mao-De and Jing, 2007). Έχει βρεθεί ότι πολλοί καταστολείς όγκων και πρωτοογκογονίδια επηρεάζουν την συγκρότηση των ριβοσωμάτων ή ρυθμίζουν τη δραστικότητα των πρωτεϊνών. Ανάμεσα στον κυτταρικό κύκλο και στην παραγωγή των ριβοσωμάτων υπάρχει μια σημαντική σχέση η οποία διατηρείται μεν σε φυσιολογικά κύτταρα όχι όμως σε καρκινικά. Χρησιμοποιώντας εργαλεία πρωτεομικής ανάλυσης για την εύρεση μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων στην ζύμη, παρατηρήθηκε πως οι τροποποιήσεις αυτές λαμβάνουν χώρα σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Dinman et al., 2009). Πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης του γονιδίου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης της μεγάλης υπομονάδας L13 (211 αμινοξέα) σε ανθρώπινα γαστρεντερικά καρκινικά κύτταρα προκάλεσε δραστική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη, με συσσώρευση των κυττάρων στην G1 και G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου (Kobayashi, Sasaki et al. 2006). Όπως προαναφέρθηκε η σύνθεση του rrna απαιτεί την RNA πολυμεράση Ι, ενώ η πολυμεράση ΙΙΙ εμπλέκεται στην μεταγραφή του 5S rrna, trna και σε snrnas (Ruggero D και Pandolfi P, 2003). Ο παράγοντας UBF (Upstream Transcription Factor) είναι απαραίτητος για τη σύνθεση του rrna, όπου η ιδιότητα του είναι να ρυθμίζει τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης Ι. Θα πρέπει να τονιστεί πως πολλά πρωτοογκογονίδια και καταστολείς όγκων ρυθμίζουν την σύνθεση του rrna με το να καταστέλλουν την λειτουργία του UBF. Η φωσφορυλίωση του UBF έχει ως αποτέλεσμα την μη φυσιολογική σύνθεση του rrna. Μία από τις κινάσες που φωσφορυλιώνουν σε περιοχές στην αμινοτελική και καρβοξυτελική περιοχή του UBF είναι η κινάση της καζεϊνης ΙΙ (CKII) η οποία είναι μια κινάση σερινης-θρεονίνης και υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, (λευχαιμία) συμβάλλοντας στην ογκογένεση (σχήμα Α.11). Εκτός από την CK II έχουν βρεθεί και άλλες κινάσες που φωσφορυλιώνουν τον UBF (EPK1/2 φωσφορυλιώνει τον παράγοντα UBF σε δυο θρεονίνες), οδηγώντας σε μη φυσιολογική σύνθεση του rrna και υπερεκφράζονται σε περιπτώσεις καρκίνου. Η σύνθεση του rrna ρυθμίζεται επίσης και από μία οικογένεια πρωτεϊνών του ρετινοβλαστώματος (RB). Οι RB-πρωτεΐνες ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων καταστέλλοντας την σύνθεση του rrna. Συγκεκριμένα οι RB-πρωτεΐνες συσσωρεύονται στον πυρήνα, με την υπερέκφρασή τους καταστέλλουν τον προαγωγέα του rdna ενώ αλληλεπιδρώντας με τον UBF παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση του παράγοντα με άλλους συμπαράγοντες όπως με τον TIFI-B/SL1 προκειμένου να ενεργοποιηθεί η πολυμεράση Ι. Ένα άλλο μέλος της οικογένειας RB είναι η πρωτεΐνη p130 που καταστέλλει τη μεταγραφή του rrna. 27

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια RB και p53 καταστέλλουν τη μεταγραφική ικανότητα της πολυμεράσης Ι και της πολυμεράσης ΙΙ και κατά συνέπεια και τον ρυθμό της πρωτεϊνοσύνθεσης (σχήμα Α.10). Λαμβανομένου υπόψη του γεγονότος ότι σε ανθρώπινες νεοπλασίες τα επίπεδα των πιο πάνω κινασών αυξάνονται θα ήταν αναμενόμενη μια αύξηση της τροποποίησης των επιπέδων της φωσφορυλίωσης του UBF και επομένως αύξηση της μεταγραφής του rrna η οποία με την σειρά της θα οδηγούσε πιθανώς σε μετασχηματισμό των κυττάρων (Ruggero και Pandolfi, 2003). Σχήμα Α.11 Ρύθμιση της δραστικότητας των πολυμερασών Ι και ΙΙΙ με ογκοκατασταλτικά γονίδια και πρωτοογκογονίδια. (Ruggero και Pandolfi, 2003) Η βιογέννεση των ριβοσωμάτων ρυθμίζεται από το πρωτοογκογονίδιο c-myc (Coller, et al., 2000). Το myc ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη και επάγει ογκογένεση. Υπερέκφραση των c-myc γονιδίων οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους των πυρηνίσκων των κυττάρων και σε ταυτόχρονη υπερέκφραση πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και πρωτεϊνών του πυρηνίσκου (Kim, S., et al., 2000). Στο σχήμα Α.12 δίδονται οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες που αποτελούν στόχο των προϊόντων του c-myc, μια από αυτές είναι και η ριβοσωμική πρωτεΐνη S5. Η ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας L11 δρα ως αναδραστικός ρυθμιστής του c-myc, παρέχοντας ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα ρύθμισης του c-myc από μια ριβοσωμική πρωτεΐνη (Dai et al., 2007). Πειράματα γονιδιακής καταστολής της L11 δείχνουν δραματική αύξηση των επιπέδων του mrna του c-myc. Πιθανότατα η L11 δεσμεύεται στον προαγωγέα του γονιδίου c-myc δρώντας έτσι ως καταστολέας της γονιδιακής μεταγραφής του c-myc. Μια άλλη εκδοχή είναι πως η L11 ρυθμίζει τα επίπεδα του mrna του c-myc μέσω του μονοπατιού αποσιώπησης του microrna. Η τελευταία αυτή υπόθεση στηρίζεται από 28

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ δεδομένα αναφορικά με την συνύπαρξη της L11 στο σύμπλοκο αποσιώπησης RISC μαζί με την ριβοσωμική πρωτεΐνη L5 (Ishizuka et al., 2002). Παρόλο που δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί ο ακριβής μηχανισμός ρύθμισης του c-myc γονιδίου από την L11 είναι φανερό πως υπάρχει μια σχέση μεταξύ του c-myc και της βιογένεσης των ριβοσωμάτων (Dai and Lu, 2008). Ένας καταστολέας ογκογονιδίου, το PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog) ελέγχει την ωρίμανση του ριβοσώματος καταστέλλοντας την δράση της κινάσης που φωσφορυλιώνει την ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 μέσω του PI3K μονοπατιού, όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.2.2, (Vogt, 2001) και (Backman et al., 2002). Σχήμα Α.12 Ριβοσωμικές πρωτεΐνες που αποτελούν στόχο του πρωτοογκογονιδίου c- myc. (Ruggero και Pandolfi, 2003) Το παράδειγμα συσχετισμού ριβοσωμικών πρωτεϊνών και των πρωτοογκογονιδίων ενισχύει την άποψη πως οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εμπλέκονται άμεσα στα στάδια της καρκινογένεσης (Mao De and Jing, 2007). Για παράδειγμα η σύνδεση του ανθρώπινου πρωτοογκογονιδίου trk με την ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας rpl7a επάγει ογκογένεση (Ziemiecki et al., 1990). Έτσι λοιπόν, τα ογκογονίδια αυτά διαταράσσουν τα επίπεδα έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών με αποτέλεσμα το ριβόσωμα να παράγει "μη φυσιολογικές" πρωτεΐνες. Από την άλλη μεριά οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορεί να εμπλέκονται με έμμεσο τρόπο στα στάδια της καρκινογένεσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες rpl5, rpl11, rpl23 οι οποίες αλληλεπιδρούν απευθείας με την ογκοπρωτεΐνη ΜDM2 παρεμποδίζοντας την αλληλεπίδραση της ΜDM2 με την p53. Η ΜDM2 είναι μια πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της δραστικότητας της p53, μιας από τις σημαντικότερες ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες. Έτσι, εμποδίζεται η ουβικιτινιλίωση της p53 μέσω ΜDM2 με ενεργοποίηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα, δείχνουν πως απάλειψη της νουκλεοστεμίνης (nucleostemin, NS), μιας πρωτεΐνης που εντοπίζεται κυρίως στον 29

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πυρηνίσκο σε αρχέγονα κύτταρα (stem cells) και σε καρκινικά κύτταρα, έχει ως αποτέλεσμα όπως φαίνεται στο σχήμα Α.13 την αλληλεπίδραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11 και L5 με την πρωτεΐνη MDM2 παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Hanhui Ma and Thoru Pederson, 2008). Έτσι, οι ριβοσωμικές αυτές πρωτεΐνες, ανάλογα με τα ερεθίσματα που δέχονται τα κύτταρα, είτε δεσμεύονται με την ΜDM2 στο πυρηνόπλασμα, είτε βρίσκονται συνδεδεμένες στο ριβόσωμα (Zhang et al., 2003; Dai et al., 2004, Lohrum et al.,2003). Σχήμα Α.13 Λειτουργική συσχέτιση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11/L5 με τις πρωτεΐνες νουκλεοστεμίνη και MDM2 (Ma and Pederson, 2008) Aπάλειψη ή έλλειψη της δραστικότητας της νουκλεοστεμίνης (NS) οδηγεί στην αλληλεπίδραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L11 και L5 με την πρωτεΐνη MDM2 παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση της p53 και συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Η νουκλεοστεμίνη NS παρεμποδίζει επίσης τον παράγοντα παρεμπόδισης τελομερών TRF1 και κατά συνέπεια η NS προάγει την σύνθεση τελομερών. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μπορούν να παίζουν και άλλους σημαντικούς ρόλους όπως στην επιδιόρθωση του DNA και στην κυτταρική απόπτωση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ριβοσωμική πρωτεΐνη της 40S υπομονάδας, S3. Η rps3 έχει δράση ενδονουκλεάσης και επιδιορθώνει το DNA (Kim et al., 1995), ενεργοποιεί την κασπάση 8 και κασπάση 3 και επάγει απόπτωση. Ο διπλός μηριβοσωμικός της ρόλος οφείλεται στην παρουσία πολλαπλών κυρίαρχων περιοχών (domains) (Jang et al., 2004). Σε κύτταρα PC12 στα οποία είχε προστεθεί ο 30

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποπτωτικός παράγοντας 5-azacytidine παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της L4 πριν την αποικοδόμηση του DNA και σε NIH3T3 κύτταρα τα οποία είχαν επιμολυνθεί μόνιμα με το γονίδιο της S3a cdna η έκφραση του γονιδίου της που παρατηρήθηκε ήταν σχετική με την απόπτωση των κυττάρων (Naora et al., 1998). H γονιδιακή καταστολή ριβοσωμικών πρωτεϊνών στον οργανισμό Danio rerio έχει επιπτώσεις στην ανάπτυξη, επαληθεύοντας την υπόθεση της σχέσης του ριβοσώματος με την αναπτυξιακή βιολογία (Uechi et al., 2006). Ένα άλλο πολύ εντυπωσιακό παράδειγμα ριβοσωμικής πρωτεΐνης με μη ριβοσωμικές ιδιότητες, είναι αυτό της ανθρώπινης L13a. Η προσθήκη ιντερφερόνηςγ, (INF-γ), σε καλλιέργεια ανθρώπινων μονοκυττάρων, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μέσα σε λίγες ώρες της σερουλοπλασμίνης, μιας πρωτεΐνης η οποία συμμετέχει στο μηχανισμό της φλεγμονώδους απόκρισης. Βρέθηκε πως ώρες μετά την προσθήκη της INF-γ, παρατηρείται σιωπή στην έκφραση της πρωτεΐνης, που εξαρτάται από την παρουσία ενός τμήματος 29 νουκλεοτιδίων στην 3 -UTR περιοχή του mrna της. Η L13a εμπλέκεται με τον πρωτοφανή μηχανισμό ως μοριακού διακόπτη GAIT (Gamma Activated Inhibitor of Translation) στην μετάφραση της σερουλοπλασμίνης. Σύμφωνα με τον μηχανισμό αυτό η L13a απομακρύνεται από το ριβόσωμα μετά από φωσφορυλίωση προκειμένου να αλληλεπιδράσει με την περιοχή 3 -UTR περιοχή του mrna της σερουλοπλασμίνης προκαλώντας αναστολή της μετάφρασης γεγονός που προκαλεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον (Mazumder et al., 2003). Α.4 Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών Η ριβοσωμική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών οργανισμών ανήκει στην S7 οικογένεια των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Το χαρακτηριστικό της οικογένειας πρωτεϊνών S7, είναι ένα συντηρημένο τμήμα αμινοξέων στο C- τελικό άκρο, το οποίο έχει την εξής ακολουθία: [DENSK]-x-[LIVMDET]-x(3)-[LIVMFTA](2)- x(6)-g-k-[kr]-x(5)-[livmf]-[livmfc]-x(2)-[stac] ( prosite). Στην συγκεκριμένη αυτή οικογένεια των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, ανήκουν οι εξής κατηγορίες: οι S7 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των βακτηρίων, των φυκιών, των χλωροπλαστών, των κυανοβακτηρίων, των αρχαιοβακτηρίων, των μιτοχονδρίων, καθώς και οι S5 ριβοσωμικές πρωτεΐνες των φυτών και των θηλαστικών. Η S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη των βακτηρίων, είναι μια από τις πρωτεΐνες που δρουν στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωμάτων συμβάλλοντας στη σωστή αναδίπλωση του 3 κύριου τμήματος του 16S rrna, το οποίο τελικά σχηματίζει την 31

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κεφαλή της 30S υπομονάδας του ριβοσώματος (Nowotny και Nierhaus, 1988). Έχει παρατηρηθεί πως οι περιοχές σύνδεσης με το rrna, εντοπίζονται σε δυο εσωτερικές θηλιές της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna, μια ένωση τριπλής και τετραπλής έλικας, και συγκεκριμένα στα , και (Dragon et al., 1993, Powers και Noller, 1995). Εντοπίζεται λοιπόν, στην κεφαλή της 30S υπομονάδας, προς το μέρος της πλευρικής προεξοχής, πάνω από τη σχισμή και τη θέση αποκωδίκευσης. Συγκεκριμένα εντοπίζεται πολύ κοντά στα σημεία Α-, P- και E, όπου δεσμεύεται το trna. Όσον αφορά τη δομή της rps7 των βακτηρίων αποτελείται από έξι α-έλικες και μια β-φουρκέτα ανάμεσα στις έλικες 3 και 4. Τα Ν - και C- τελικά άκρα είναι εκτεθειμένα και χωρίς κάποια τάξη. Στο σχήμα Α.14, παριστάνεται η δομή της rps7. Σχήμα Α.14 Σχηματική αναπαράσταση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps7 από τον οργανισμό B. Stearothermophilus. Hosaka et al, (1997) Η rps7 αποτελείται από έξι α-έλικες, (γαλάζιο και κόκκινο), και μια β-φουρκέτα, (πράσινο). Επίσης έχει βρεθεί ότι η rps7 αλληλεπιδρά με τον παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης, IF-3 (Ehresmann et al., 1986), ενισχύοντας τον δυναμικό της ρόλο στο μηχανισμό της μετάφρασης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω η rps7/rps5 βρίσκεται στην θέση εξόδου (Ε) του trna στην μικρή υπομονάδα. Η rps7 συμβάλλει στην διαμόρφωση καναλιού εξόδου του mrna και αλληλεπιδρά με την ριβοσωμική πρωτεΐνη rps11 (σχήμα Α.15), στην περιοχή πλατφόρμας (platform) της 30 S υπομονάδας (Robert et al., 2003). Παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης με μεταλλάξεις είτε στη μια είτε στην άλλη πρωτεΐνη έχει σαν αποτέλεσμα το ριβόσωμα να είναι 32

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιρρεπές σε λάθη κατά τη μετάφραση στον οργανισμό E.coli. Θα πρέπει να τονιστεί πως η αλληλεπίδραση της rps7 με την rps11, δεν είναι συντηρημένη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (rps5/rps14), όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.2 της παραγράφου Α.1.1, και το κανάλι εξόδου του mrna που διαμορφώνεται από την αλληλεπίδραση της rps5 με την rps14 είναι ανοιχτό κατά την απομόνωση σε ζύμη της 40S υπομονάδας (Passmore et al. 2007). Σχήμα Α.15 Δομή 30S υπομονάδας σε E.coli. (PDB 1VS7). Η rps7 βρίσκεται στην κεφαλή (Galkin et al., 2007) Η rps7 απεικονίζεται με χρώμα μπλε και τα 20 επιπλέον αμινοξέα στο Ν-τελικό άκρο στην S.cerevisiae με κόκκινο. Από την άλλη μεριά, η S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων έχει μια προέκταση περίπου 60 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο, η οποία δεν υπάρχει στην ομόλογη πρωτεΐνη των βακτηρίων, ενώ υπάρχει σε αυτή των ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι Hosaka et al., (2001), δημοσίευσαν την κρυσταλλική δομή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps7 από το αρχαιοβακτήριο Pyrococcus horikoshii και όπως αναπαριστάνεται στο πιο κάτω σχήμα φαίνεται η χαρακτηριστική προέκταση στο Ν-τελικό άκρο. Όπως προαναφέρθηκε οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες των αρχαιοβακτηρίων βρίσκονται πλησιέστερα στις ομόλογες πρωτεΐνες των 33

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ευκαρυωτικών. Στο σχήμα Α.16, παριστάνεται η rps7 και η χαρακτηριστική προέκταση στο Ν-τελικό της άκρο από τον οργανισμό Pyrococcus horikoshii. Σχήμα Α.16 Σχηματική αναπαράσταση της δομής της πρωτεΐνης S7 από τον οργανισμό Pyrococcus horikoshii, όπως προέκυψε μετά από κρυστάλλωση (ευκρίνεια 2.1 Å) (Hosaka et al., 2001) Στο σχήμα Α.17 όπου παρουσιάζεται η πρωτοταγής δομή των S7 και S5 ριβοσωμικών πρωτεϊνών, από διάφορους οργανισμούς είναι εμφανής η προέκταση στο N-τελικό άκρο της ευκαρυωτικής rps5. Η ομολογία όλων των πρωτεϊνών στο C- τελικό άκρο του μορίου είναι αρκετά υψηλή, μικρότερη στις εσωτερικές ακολουθίες, ενώ στο N- τελικό άκρο υπάρχει ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνών των θηλαστικών και των αρχαιοβακτηρίων. 34

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.17 Ομοιοπαράθεση πρωτοταγούς δομής ριβοσωμικών πρωτεϊνών της οικογένειας S7 από διάφορους οργανισμούς. Στην rps5 του S.cerevisiae η προέκταση του Ν-τελικού άκρου είναι μεγαλύτερη κατά ~21 αμινοξέα(pi~3.27) σε σχέση με την ανθρώπινη rps5 (σχήμα Α.17). Η πρωτεΐνη S5 και στους τρεις οργανισμούς (ανθρωπο, ποντίκι και επίμυ) αποτελείται από 204 αμινοξέα και αυτή του ποντικού έχει μοριακό μέγεθος Da και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο Στην Sacharomyces cerevisiae το γονίδιο της rps5 βρίσκεται σε ένα και μόνο αντίγραφο και παίζει σημαντικό ρόλο στην βιωσιμότητα του κυττάρου (Ignatovich et al., 1995). Eπιπρόσθετα και στον επίμυ βρίσκεται σε ένα και μόνο αντίγραφο, σε αντίθεση με τον άνθρωπο και το ποντίκι απαντάται σε 5 με 6 και 3 με 4 αντίγραφα, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός πως η ευκαρυωτική rps5 έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την IRES (Internal Ribosome Entry Site) του ιού cricket paralysis, και είναι καθοριστική για τη μετέπειτα αλληλεπίδραση μεταξύ της IRES περιοχής και της 40S υπομονάδας του ριβοσώματος (Schuler et al., 2006). Είναι γνωστό πως οι RNAιοί, επειδή δεν διαθέτουν καλυμμένο το 5 άκρο του mrna τους, προκειμένου να 35

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνδεθεί ο παράγοντας έναρξης της επιμήκυνσης eif-4, συνδέονται με τη 40S υπομονάδα μέσω υψηλά δομημένων περιοχών στο 5' της μη μεταφράσιμης περιοχής, (Non Translated Region, NTR), του mrna (Fukushi et al., 2001). Όσο αφορά τον ρόλο της στην βιογένεση των ριβοσωμάτων η rps5 δρα στα αρχικά στάδια όπως απεικονίζεται στο σχήμα Α.5, σελίδα10. Επίσης έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την κινάση KKr1 (πιθανόν μια κινάση σερίνης / θρεονίνης) καθώς επίσης με τις YHR196w και ΥGR090w (U3 snorna μαζί με τις πρωτεΐνες 9 και 22, αντίστοιχα) οι οποίες εμπλέκονται στην διαδικασία ωρίμανσης (maturation) του 18 S rrna στον πυρηνίσκο, (Grandi et al., 2002). Η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη από ανθρώπινο πλακούντα, έχει βρεθεί πως αλληλεπιδρά με ένα ολιγονουκλεοτίδιo που είναι συμπληρωματικό της περιοχής του 18S rrna, , ομόλογη της υψηλά συντηρημένης περιοχής του 16S rrna 530 stem loop. Έτσι, φαίνεται πως και η πρωτεΐνη S5, όπως και η ομόλογή της S7 από βακτήρια, βρίσκεται κοντά στο κέντρο αποκωδίκευσης ριβοσώματος (Malygin et al., 1999). Σύμφωνα με τα πιο πάνω η rps5 είναι από τις πρόδρομες πρωτεΐνες που συνδέονται με το 18S rrna, προκειμένου να αρχίσει η συγκρότηση της μικρής υπομονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώματος (Kressler et al., 1999). Ένα ακόμα χαρακτηριστικό της rps5 στην S. cerevisiae είναι ότι υπόκειται σε φωσφορυλίωση (Ignatovich et al., 1995). Στον εγκεφαλικό φλοιό από επίμυ η rps5 μαζί με άλλες πρωτεΐνες S3a, L14 και την L19 έχουν εντοπιστεί φωσφορυλιωμένες στα ελεύθερα ριβοσώματα και όχι στα πολυσώματα, (Francis et al., 1982). Στον επίμυ έχει βρεθεί μία πρωτεΐνη, η S5a, η οποία είναι μεν ταυτόσημη με την rps5, λείπουν όμως τα 5 πρώτα αμινοξέα. Και οι δυο αυτές μορφές της rps5 προέρχονται από το ίδιο cdna μεταγράφημα και πιθανώς η S5a προκύπτει από την S5, έπειτα από πρωτεόλυση (Kuwano and Wool, 1992). Η rps5, αποτελεί μια από τις ανθρώπινες ριβοσωμικές πρωτεΐνες το γονίδιο των οποίων επάγεται από μια κατηγορία μεταγραφικών παραγόντων που πολύ συχνά ενεργοποιούνται σε ανθρώπινους όγκους και παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καρκίνο τα λεγόμενα myc ογκογονίδια, Εδώ πρέπει να σημειωθεί ότι η πλειοψηφία των γονιδίων που επάγονται από τα myc ογκογονίδια, έχουν κυρίαρχο ρόλο στη συγκρότηση και δραστικότητα του ριβοσώματος (Boon et al., 2001). Η έκφραση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5, έχει μελετηθεί κατά τη διάρκεια της επαγόμενης διαφοροποίησης ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL (Murine ErythroLeukemia Cells) και βρέθηκε ότι το γονίδιο της σε επίπεδο mrna καταστέλλεται σταδιακά κατά τη διαφοροποίηση (Vizirianakis et al., 1999). Αντίθετα, το ίδιο γονίδιο έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου, 36

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του εντέρου, (Atlas Select Human Tumor Array Gene List, atlas.clontech.com). Σύμφωνα με μελέτες των Chen & Huang (2001) η κινητικότητα της rps5 στον πυρηνίσκο και στο πυρηνόπλασμα είναι σημαντικά πιο αργή σε σχέση με άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε διάφορα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, όπως ο UBF, (Upstream Binding Factor), η νουκλεολίνη, η φιμπριλλαρίνη, η πρωτεΐνη Rpp29). A.5 Γονιδιακή καταστολή με RNA παρεμβολή Η RNA παρεμβολή (RNAi) είναι μια ενδοκυτταρική διαδικασία RNA εξαρτώμενη- η οποία αφορά την επιλεκτική «αποσιώπηση» συγκεκριμένων γονιδίων του κυττάρου (αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης) Μικρά μόρια RNA της τάξης μεγέθους νουκλεοτιδίων παίζουν κεντρικό ρόλο, ανιχνεύοντας ομόλογες αλληλουχίες και επηρεάζοντας κατ αυτόν τον τρόπο την μεταγραφή, τη σταθερότητα του mrna ή την μετάφραση. Η RNA παρεμβολή λαμβάνει χώρα στα βασίλεια των ευκαρυωτικών πρώτιστα, μύκητες, ζώα και φυτά - και πρόκειται για έναν σχετικά συντηρημένο εξελικτικά μηχανισμό που μοιράζεται κοινά βασικά χαρακτηριστικά στα 4 διαφορετικά βασίλεια. Οι διαφοροποιήσεις και προσαρμογές του όμως σε κάθε βασίλειο έχουν καθιερώσει και διαφορετική ονομασία όπως quelling στους μύκητες, RNA interference (RNAi) και RNA silencing σε ζώα και φυτά αντιστοίχως. Η βιολογική σημασία του μηχανισμού της RNA παρεμβολής αποδεικνύεται καθημερινά από την διεθνή βιβλιογραφία και φαίνεται ότι ο μηχανισμός αυτός εμπλέκεται σε ρύθμιση αναπτυξιακών γεγονότων, προστασία του γονιδιώματος από μεταθετά στοιχεία, στο σχηματισμό και διατήρηση ετεροχρωματικών περιοχών, και σε απόκριση του κυττάρου σε βιοτικό και αβιοτικό στρες. Ο ρόλος του σε κάθε βασίλειο διαφοροποιείται και σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιούνται διαφορετικοί ριβονουκλεϊκοί ρυθμιστές, οι οποίοι είναι ενδογενούς η μη- ενδογενούς προέλευσης. Η πρώτη αναφορά για τη διαδικασία της γονιδιακής αποσιώπησης μέσω των microrna μορίων έγινε το 1993, από τον Victor Ambros και τους συνεργάτες του Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum, οι οποίοι ανακάλυψαν ότι το lin-4, ένα γονίδιο που ελέγχει χρονικά την ανάπτυξη της λάρβας στον C. elegans, δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, αλλά παράγει δύο μικρά τμήματα RNA (Lee et al., 1993).Ο Baulcombe και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι μια μορφή μικρών RNAs (21-25 νουκλεοτίδια) υπήρχε σε φυτά τα οποία υποβάλλονταν σε γονιδιακή καταστολή μέσω του RNA 37

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Hamilton and Baulcombe, 1999), που στην πορεία ονομάστηκαν μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (small interfering RNAs -sirnas) (Elbashir et al., 2001). A.5.1 Μηχανισμός της γονιδιακής αποσιώπησης Τα μονοπάτια της RNA παρεμβολής μοιράζονται τρία κοινά βιοχημικά χαρακτηριστικά: τη δημιουργία δίκλωνου RNA (dsrna), την κοπή του σε μικρούς μονόκλωνους ριβονουκλεϊκούς ρυθμιστές (μικρά RNAs) και τέλος την παρεμποδιστική δράση του μικρού RNA με τη βοήθεια κατάλληλων συμπλόκων - σε μερικώς ή πλήρως συμπληρωματικό RNA ή DNA (Susi et al, 2004). Συγκεκριμένα, η πυροδότηση της RNA αποσιώπησης γίνεται με την ανίχνευση δίκλωνου μορίου RNA στο κύτταρο. Η δίκλωνη μορφή ενδέχεται να είναι αποτέλεσμα δευτεροταγούς δομής ενδογενούς μεταγράφου ή διαγονιδίου, είτε εξωγενής προερχόμενη RNA δομή. Η δίκλωνη μορφή του RNA αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες της οικογένειας Dicer και κόπτεται σε δίκλωνο RNA μικρού μεγέθους (20-30 νουκλεοτίδια). Η Dicer, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.18 αποτελείται από μια περιοχή ελικάσης/atpase, μια περιοχή άγνωστης λειτουργίας, DUF283, μια περιοχή PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille), δύο περιοχές RNase III και μια περιοχή δέσμευσης δίκλωνου RNA (dsrdb). Η περιοχή PAZ αναγνωρίζει τα 3προεξέχοντα άκρα που δημιουργούνται με τη δράση της πρωτεΐνης Drosha. Η Drosha εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και περιέχει 2 περιοχές RNase III, μια περιοχή δέσμευσης dsrna και ένα αμινο-τελικό τμήμα άγνωστης λειτουργίας (Lee et al., 2003). Καταλύει την νουκλεόλυση των πρωτογενών mirna, pri-mirnas σε πρόδρομα μόρια premirnas μεγέθους ~70 νουκλεοτιδίων που σχηματίζουν δομή ατελούς φουρκέτας (Lee et al., 2003). Οι πρωτεΐνες Dicer λοιπόν, είναι ATP εξαρτώμενες, RNAse III ενδονουκλεάσες που φέρουν περιοχές πρόσδεσης δίκλωνου RNA και κατέχουν σημαντικότατο ρόλο στο μηχανισμό (Vazquez, 2006). Η Dicer ανακαλύφθηκε αρχικά στη Drosophila (Bernstein et al., 2001) και στην συνέχεια και σε άλλους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων του ανθρώπου, των μυκήτων και των φυτών. Κάποιοι οργανισμοί έχουν μια πρωτεΐνη της οικογένειας Dicer (Dicerlike proteins - DCLs) (Verdel et al., 2004; Volpe et al., 2002; Zhang et al., 2002, 2004; Billy et al., 2001; Provost et al., 2002a, 2002b; Tabara et al., 2002), ενώ άλλοι πολλές. Στη Drosophila υπάρχουν 2 ομόλογες Dicer, η DCR1 και η DCR2. Η DCR1 είναι υπεύθυνη για την επεξεργασία των mirnas, ενώ η DCR2 για τα sirnas (Lee et al., 2004; Okamura et al., 2004; Liu et al., 2003). Από την άλλη μεριά στον νηματώδη 38

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σκώληκα C. elegans υπάρχει μόνο η DCR-1, η οποία απαιτείται για την επεξεργασία τόσο των mi RNA όσο και των sirnas. Στα θηλαστικά υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που έχουν περιοχές δέσμευσης dsrna και δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί. Tα φυτά διαθέτουν τέσσερις πρωτεΐνες της παραπάνω οικογένειας, με κάθε μία να κατέχει διακριτό ρόλο χωρίς αυτό να συνεπάγεται μη αλληλεπικαλυπτόμενη δράση των DCLs. Σχήμα A.18 Κοινά στοιχεία της γονιδιακής αποσιώπησης των sirnas/mirnas. (Carthew και Sontheimer, 2009) A. Κοινά μονοπάτια των sirnas/mirnas. Πρόδρομα δίκλωνα RNA κόπτονται με την ενδονουκλεάση Dicer σε δίκλωνο RNA μικρού μεγέθους (20-30 νουκλεοτίδια) και στην συνέχεια το μονόκλωνο RNA προσδένεται σε μια Ago πρωτεΐνη. B. Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Dicer (Giardia) C. Κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Ago (Thermus thermophilus) Στη συνέχεια, το μικρό μόριο RNA καθίσταται μονόκλωνο και ενσωματώνεται σε σύμπλοκα αποσιώπησης RISC (RNA Induced Silencing Complex). Τα σύμπλοκα αυτά παρουσιάζουν ετερογένεια, αλλά όλα ανεξαιρέτως περιέχουν πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute (ARGO) και είναι υπεύθυνα για την παρεμποδιστική δράση που απορρέει από τη φύση των μικρών RNAs (Hammond,2005). Κάθε σύμπλοκο 39

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ RISC φέρει μια Ago πρωτεΐνη, η οποία είναι πολύ στενά συνδεδεμένη με το μονόκλωνο είτε sirna είτε mirna (Martinez and Tuschl, 2004). Οι πρωτεΐνες της οικογένειας αυτής κατέχουν σημαντικό ρόλο, καθώς είναι αυτές που με οδηγό το μικρό ριβονουκεϊκό ρυθμιστή, οδηγούν σε καταστολή της έκφρασης, είτε αποικοδομώντας τον στόχο, είτε παρεμποδίζοντας τη μεταγραφή ή τη μετάφρασή του. Η πρωτεΐνη Ago έχει μοριακή μάζα ~100 kda και αποτελείται από δυο συντηρημένες περιοχές: την PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) -στο αμινοτελικό τους άκρο- και μια καρβοξυτελική περιοχή (PIWI περιοχή) με δράση ομοιάζουσα της RNAσηςΗ, η οποία προσδίδει την ικανότητα κοπής σε μετάγραφα που στοχεύονται για αποικοδόμηση (Carmell et al., 2002) (Σχήμα Α.18). Η περιοχή PIWI φαίνεται να αλληλεπιδρά με την Dicer (Tahbaz et al., 2004). Η PAZ είναι μια περιοχή δέσμευσης RNA (RNA Binding Domain), που αναγνωρίζει ειδικά τα άκρα του δίκλωνου mirna/sirna συμπεριλαμβανομένων και των 3 προεξεχόντων άκρων (Lingel et al., 2004). Αυτή η αλληλεπίδραση εξασφαλίζει την σωστή μετάβαση των μικρών RNAs στο σύμπλοκο RISC, ελαχιστοποιώντας την πιθανότητα λανθασμένης επεξεργασίας του RNA κατά το στάδιο του αποτελέσματος. Να τονιστεί πως ο μηχανισμός με τον οποίο μονόκλωνα sirnas/mirnas δεσμεύονται στην πρωτεΐνη Ago μετά το ξεδίπλωμα των δίκλωνων RNA δεν είναι πλήρως κατανοητός. Διαφορετικοί οργανισμοί έχουν διαφορετικό αριθμό πρωτεϊνών Ago που ποικίλει από 1 στον Schizosaccharomyces pombe, έως 20 στο νηματώδη σκώληκα (Carmell etal., 2002). Στο φυτό A. thaliana έχουν ταυτοποιηθεί 10 μέλη (Hunter et al., 2003), 5 στη D. Melanogaster (Williams et al., 2002) και 8 στον άνθρωπο (Sasaki et al., 2003). Μια μελέτη στη D.melanogaster αποκάλυψε ότι η AGO1 απαιτείται για τη συσσωμάτωση των mirnas ενώ η AGO2 χρειάζεται για την αποικοδόμηση του mrna στόχου μέσω των sirnas (Okamura et al., 2004). Στα φυτά υπάρχουν δέκα μέλη της παραπάνω οικογένειας, ορισμένα από τα οποία έχουν χαρακτηρισθεί και, όπως για την οικογένεια DCL, κατέχουν διακριτούς, αλλά και μερικώς αλληλεπικαλυπτόμενους ρόλους. Τέλος, ορισμένα από τα μονοπάτια της αποσιώπησης έχουν το χαρακτηριστικό της ανάδρασης. Πιο συγκεκριμένα, ο ίδιος ο μηχανισμός «δημιουργεί» δίκλωνο RNA που πυροδοτεί την αποσιώπηση. Υπεύθυνες για τη λειτουργία αυτή είναι οι RNA-εξαρτώμενες-RNA πολυμεράσες (RdRs), οι οποίες με μήτρα μονόκλωνο RNA και τη βοήθεια ή όχι κάποιου εκκινητή παράγουν δίκλωνο RNA, το οποίο χρησιμεύει ως υπόστρωμα των μελών της οικογένειας Dicer (Wasseneger and Krczal, 2006). 40

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.5.2. Κατηγορίες των small RNAs Διακρίνονται τέσσερις κύριες κατηγορίες των small RNAs: short interfering RNAs (sirna), micrornas, piwi-interacting RNA (pirnas) και 21-U RNAs. Μολονότι τα RNAs αυτά απαντώνται κυρίως στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς πρωτεΐνες της οικογένειας Argonaute που μεσολαβούν στην γονιδιακή αποσιώπηση στα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν εντοπιστεί και σε αρχαιοβακτήρια και σε βακτήρια(richard W. Carthew and Erik J. Sontheimer, 2009). Κατά την φυλογενετική πορεία, κατανέμονται κυρίως τα sirnas και τα mirnas τα οποία χαρακτηρίζονται ως δίκλωνα μόρια στοχεύοντας σε συγκεκριμένες λειτουργίες του κυττάρου. Τα mirnas είναι ενδογενή μικρά RNAs που προέρχονται από γενωμικές περιοχές ανεξάρτητες των υπολοίπων γονιδίων (Bartel, 2004). Στα ζώα είναι γνωστό ότι κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον καρκίνο, ενώ στα φυτά εκτός της ρύθμισης αναπτυξιακών προγραμμάτων, εμπλέκονται επίσης στη ρύθμιση διαδικασιών όπως η σηματοδότηση, η απόκριση σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις και η μετάβαση από βλαστητική σε αναπαραγωγική φάση (Zhang et al, 2007). Τα περισσότερα mirna γονίδια εντοπίζονται σε διακριτές περιοχές του γενώματος και αποτελούν ανεξάρτητες μεταγραφικές μονάδες (Lagos-Quintana et al.,2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros 2001). Ωστόσο, ένα μέρος βρίσκεται στα ιντρόνια των πρόδρομων mrnas. Σχεδόν όλα τα mirna γονίδια είναι εξελικτικά συντηρημένα σε συγγενή ζώα, όπως ο άνθρωπος και το ποντίκι, ή ο C. elegans και ο C. briggsae (Lagos-Quintana et al.,2003; Lim et al., 2003a, 2003b). Tα sirnas παράγονται από δίκλωνα RNA μόρια μεγαλύτερου μήκους τα οποία συνθέτονται είτε in vivo προκειμένου να ενεργοποιήσουν έναν προστατευτικό μηχανισμό που μπορεί να χρησιμοποιηθεί από τα κύτταρα για να επιδιορθώσει πρόσφατα βιοσυντιθέμενα mrna και να παρεμποδιστεί η παραγωγή ελαττωματικών πρωτεϊνικών μορίων, είτε in vitro (Bartel, 2004). Παρουσιάζουν δράση in cis δηλαδή στοχεύουν τα μόρια από τα οποία προέρχονται, αντίθετα με τα mirnas που στοχεύουν μετάγραφα με μερική ή πλήρη συμπληρωματικότητα (in trans). Τα αρχικά δίκλωνα μόρια των sirnas, μπορεί να προέρχονται από ιούς που εισβάλουν στο κύτταρο, από μεταθετά στοιχεία ή από διαγονίδια και των δύο κατευθύνσεων, δομής φουρκέτας ή ετεροχρωματινικό DNA (Tomari and Zamore, 2005). Σε πολλές περιπτώσεις, τα mirnas συνδέονται με την μη 3 μεταφράσιμη περιοχή του στόχου τους μέσω ατελούς συμπληρωματικότητας σε διάφορες θέσεις, με αποτέλεσμα να καταστέλλουν την έκφραση του γονιδίου στόχου τους σε επίπεδο 41

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετάφρασης. Αντίθετα, τα sirnas συνήθως συνδέονται με το στόχο τους σε μια θέση μέσω τέλειας συμπληρωματικότητας ζευγών βάσεων, επάγοντας έτσι την νουκλεόλυση του mrna στόχου. Τα ενδογενή sirnas συνήθως επάγουν την αυτοαποσιώπηση, δηλαδή καταστέλλουν ίδιες ή παρόμοιες γενωμικές περιοχές με αυτές από τις οποίες προέρχονται, ενώ τα mirnas επάγουν την ετερο-αποσιώπηση, δηλαδή παράγονται από γονίδια διαφορετικά από εκείνα που καταστέλλουν. Στην συγκεκριμένη διατριβή σχεδιάστηκαν in vitro μικρά δίκλωνα sirna μήκους ~22 νουκλεοτιδίων για την γονιδιακή αποσιώπηση του γονιδίου rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL. H τεχνική που χρησιμοποιήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες βρέθηκε ένα νέο είδος μικρών RNAs μήκους nt, που παράγονται με έναν μηχανισμό που δεν εξαρτάται από την Dicer και αλληλεπιδρούν με μια υποκατηγορία των Argonaute πρωτεϊνών, τις πρωτεΐνες Piwi (Aravin et al., 2006; Brennecke et al., 2007; Girard et al., 2006; Grivna et al., 2006a; Gunawardane et al., 2007; Houwing et al., 2007; Lau et al., 2006; Saito et al., 2006; Vagin et al., 2006; Watanabe et al., 2006), οι οποίες είναι απαραίτητες για την γονιμότητα θηλυκών και αρσενικών ατόμων στη Drosophila (Lin and Spradling et al., 1997). Αυτή η νέα τάξη μικρών RNAs, που αλληλεπιδρά με τις Piwi ονομάστηκαν pirnas. Σε ορισμένα συστήματα τα pirnas προέρχονται από μεταθετόνια και άλλες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Saito et al., 2006), γι αυτό και ονομάζονται εναλλακτικά rasirnas (μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs σχετιζόμενα με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες- repeat associated small interfering RNAs) (Aravin et al., 2003). Είναι πλέον γεγονός ότι τα pirnas μπορεί να προέλθουν από επαναλαμβανόμενες ή μη επαναλαμβανόμενες DNA αλληλουχίες (Aravin et al., 2007; Brennecke et al., 2007; Houwing et al., 2007) και ότι τα rasirnas είναι μια υποκατηγορία των pirnas. Το 2006 ο Ruby και οι συνεργάτες τους εντόπισαν στο νηματώδη σκώληκα C.elegans μια νέα τάξη των smalls RNAs, την 21U-RNAs. Πρόκειται για μόρια RNAs μήκους ακριβώς 21 νουκλεοτιδίων και με μια ουριδίνη στο 5 άκρο που επάγονται από δικούς τους προαγωγείς παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του σκώληκα (Afsar Raza Naqvi et al., 2009). 42

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.5.3 Μονοπάτια γονιδιακής αποσιώπησης Τα μόρια small RNAs εισέρχονται σε συγκεκριμένα κυτταρικά μονοπάτια που είναι γνωστά ως μονοπάτια του παρεμβαλλόμενου RNA, RNA interference pathways. Στάδιο έναρξης Τα πρωτογενή mirna μετάγραφα (pri-mirnas) καταλήγουν σε πρόδρομα μόρια mirna (pre-mirnas) μήκους ~70 νουκλεοτιδίων και στην συνέχεια τα pre-mirnas υφίστανται νουκλεόλυση με την δράση των ενζύμων τύπου RNase III Drosha και Dicer δίδοντας ώριμα mirnas μήκους ~21-25 νουκλεοτιδίων (Lee et al., 2002). Μετά την νουκλεόλυση από τη Drosha, τα πρόδρομα mirnas βγαίνουν από τον πυρήνα με τη βοήθεια της Exportin 5, μιας Ran-GTP πρωτεΐνης-μεταφορέα που βρίσκεται στο σύμπλεγμα του πυρηνικού πόρου (Lund et al., 2004). Η βιογένεση των mirnas και των sirnas στο κυτταρόπλασμα ακολουθεί κοινό μονοπάτι. Τα πρόδρομα mirnas και τα δίκλωνα RNAs από τα οποία θα προκύψουν τα sirnas, υφίστανται νουκλεόλυση από το ένζυμο Dicer, καταλήγοντας σε δίκλωνα τμήματα μήκους ~21 νουκλεοτιδίων, που έχουν 5 φωσφορυλιωμένα άκρα και 3 προεξέχοντα άκρα μήκους 2 νουκλεοτιδίων. Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν ότι η είσοδος ξένου sirna στα κύτταρα γίνεται διαμέσου μιας μεμβρανικής πρωτεΐνης που καλείται SID-1(Systematic RNA Interference Defective), (Afsar Raza Naqvi et. al., 2009). Η είσοδος των δίκλωνων dsrnas διαμέσου της SID-1 εξαρτάται από το μέγεθός τους, μεγαλύτερα μόρια (~500 bps) μεταφέρονται ταχύτερα σε σύγκριση με μικρότερα μεγέθους μόρια (~30 bps). Πρόκειται για μια παθητική μεταφορά που δεν απαιτεί κατανάλωση του ATP. Ανάλογη πρωτεΐνη με την ίδια δράση που απαντάται στα φυτά είναι η PSRP-1 (Phloem Small RNA binding Protein-1), (Afsar Raza Naqvi et. al., 2009). Στάδιο αποτελέσματος Τα μικρά μόρια δίκλωνου RNA που προκύπτουν, συναθροίζονται στο κυτταρόπλασμα, όπου συγκροτούν σύμπλοκες δομές, οι οποίες αποτελούνται από ενδο-ριβονουκλεάσες της οικογένειας Argonaute και RNA και ονομάζονται RNAεπαγόμενα σύμπλοκα αποσιώπησης (RISC: RNA-Induced Silencing Complexes). Στα συγκεκριμένα σύμπλοκα γίνεται αποδιάταξη των δίκλωνων sirnas/mirnas, με μια διαδικασία που απαιτεί υδρόλυση του ATP (Nykanen et al., 2001). Η εκτιμώμενη 43

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φαινόμενη μοριακή μάζα τους ποικίλει από 130 έως 160 kda κατά την απομόνωσή τους από ανθρώπινα κύτταρα παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων (Martinez et al. 2002; Martinez and Tuschl, 2004) και από 500 kda ως 80S σε κυτταρικά εκχυλίσματα D. melanogaster (Nykanen et al., 2001; Hammond et al., 2001; Hutvagner and Zamore 2002). Στη συνέχεια τα σύμπλοκα (RISC) κατευθύνονται σε ομόλογα mrnas τα οποία υβριδίζονται στα μονόκλωνα πλέον sirnas λόγω συμπληρωματκότητας. Σαν αποτέλεσμα, τα μόρια του mrna αρχικά πέπτονται από ενδοριβονουκλεάσες του συμπλόκου. Τα μονοπάτια του παρεμβαλλόμενου RNA (RNA Interference), παρουσιάζονται στο σχήμα Α.19 (Αrenz et al. 2003). Μετά την πέψη από το ένζυμο Dicer, ακολουθεί του ξετύλιγμα του RNA και η δημιουργία του συμπλόκου RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Μέσα στο σύμπλοκο το sirna, τοποθετείται με τέτοιο τρόπο, ώστε να προσελκύσει και να συνδεθεί με τα μόρια mrnas. Το RISC θα συναντήσει εκατοντάδες διαφορετικά mrnas, που βρίσκονται μέσα σε ένα τυπικό κύτταρο, σε κάθε δεδομένη στιγμή. Αλλά το sirna του RISC θα προσδεθεί ισχυρά μόνο με εκείνο το mrna, του οποίου η νουκλεοτιδική αλληλουχία είναι στενά συμπληρωματική με τη δική του. Η αποικοδόμηση του mrna επάγεται από την δομική περιοχή PIWI της πρωτεΐνης Αgo. Στη συνέχεια το RISC απελευθερώνει τα δυο κομμάτια του μορίου mrna τα οποία δεν είναι πλέον σε θέση να κατευθύνουν την πρωτεϊνοσύνθεση (Tomari and Zamore, 2005). Το σύμπλοκο RISC μένει αναλλοίωτο, ελεύθερο να βρει και να πέψει άλλα μόρια mrna. Εναλλακτικά, αν το sirna του RISC δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικό με την αλληλουχία του mrna, τότε το RISC παραμένει προσδεμένο στο mrna με αποτέλεσμα η πρωτεϊνοσύνθεση να εμποδίζεται. Σε κάθε περίπτωση δεν υπάρχει παραγωγή της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί το συγκεκριμένο mrna (Lau & Bartel 2003). Το στάδιο αποτελέσματος της μεταμεταγραφικής αποσιώπησης συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα. Τα sirnas μαζί με τις πρωτεΐνες Αgo συγκροτούν υποκυτταρικές εστίες που καλούνται P-bodies τα οποία περιέχουν μια πληθώρα παραγόντων για την αποικοδόμηση του RNA (Liu et al., 2005b). 44

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.19 Μηχανισμός γονιδιακής αποσιώπησης με την τεχνική του παρεμβαλλόμενου RNA (Αrenz et al., 2003) Α.5.4 Καταστολή της μετάφρασης Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το μονόκλωνο sirna/mirna του συμπλόκου RISC οδηγεί στην αποικοδόμηση του mrna στόχου όταν υπάρχει πλήρης ή σχεδόν πλήρης συμπληρωματικότητα βάσεων (Martinez et al., 2002; Martinez and Tuschl, 2004). Τα mirnas παρουσιάζουν ατελή συμπληρωματικότητα και συνεπώς καθοδηγούν καταστολή της μετάφρασης του στόχου, ενώ αντίθετα τα sirnas εμφανίζουν τέλεια συμπληρωματικότητα και προκαλούν την αποικοδόμηση του RNA στόχου. Το ερώτημα εάν η καταστολή της μετάφρασης λαμβάνει χώρα είτε στην έναρξη της μετάφρασης είτε μετά την έναρξη της δεν έχει αποσαφηνιστεί. Διάφορες υποθέσεις έχουν διατυπωθεί και παρουσιάζονται συνοπτικά στο σχήμα Α.20. Παρατηρήθηκε ότι κατά τον διαχωρισμό σε διαβαθμίσεις σουκρόζης τα mirnas και τα «υποστρώματά» τους συνδέονταν είτε με πολυσώματα (παρεμπόδιση 45

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στην επιμήκυνση και στον τερματισμό της πρωτεϊνικής αλυσίδας), είτε με ελεύθερα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια RNPs (καταστολή στην έναρξη της μετάφρασης). Σύμφωνα με μελέτες των Petersen et al, (2006) τα mirnas παρεμποδίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση μετά την έναρξη της μετάφρασης και η καταστολή του mrna συσχετίζεται με τα πολυσώματα. Η παρατήρηση ότι τα πολυσώματα μεταφράζουν χωρίς όμως να ανιχνεύεται το πρωτεϊνικό προϊόν, οδήγησε στην υπόθεση ότι η πολυπεπτιδική αλυσίδα είναι πιθανόν να αποικοδομείται συμμεταφραστικά από μια άγνωστη πρωτεάση, αλλά αναστολείς του πρωτεασώματος δεν προκαλούν αποκατάσταση της αποσιώπησης (Nottrott et. al, 2006). Ένα άλλο μοντέλο καταστολής προτείνει τον πρώιμο τερματισμό της μετάφρασης με απομάκρυνση των ριβοσωμάτων (ribosome drop off). Καταστολή της μετάφρασης με sirnas οδηγεί σε ταχεία αποσύνδεση των ριβοσωμάτων (Petersen et al., 2006). Σύμφωνα με μια άλλη υπόθεση προτείνεται ο συναγωνισμός του mirisc συμπλόκου με τον παράγοντα έναρξης eif4e (Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E) για την πρόσδεση στο 5` άκρο cap του mrna, παρεμποδίζοντας την έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Παρατηρήθηκε λοιπόν πως κεντρική περιοχή (Mid domain) των πρωτεϊνών της οικογένειας Agronaute, παρουσιάζει ομοιότητα στην αλληλουχία με τον κυτταροπλασματικό παράγοντα eif4e. O παράγοντας eif4e δεσμεύεται στην m7gppp-cap δομή μέσω δύο τρυπτοφανών. Στην αντίστοιχη θέση των 2 τρυπτοφανών, οι Ago φέρουν δυο φαινυλαλαλίνες. Μετάλλαξη μιας από τις δύο φαινυλαλαλίνες σε βαλίνη έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της δράσης των mirnas. Αυτά τα αποτελέσματα στηρίζουν την άποψη ότι τα mirnas εμποδίζουν τη μετάφραση στο στάδιο της αναγνώρισης της δομής cap, εκτοπίζοντας τον παράγοντα eif4e από τη δομή cap (Kiriakidou et al.,2007). Η Chendrimada και οι συνεργάτες της το 2007 παρατήρησαν πως το σύμπλοκο mirisc παρεμποδίζει την συναρμολόγηση της 60S υπομονάδας με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη AGO2 στρατολογεί τον παράγοντα eif6, ο οποίος δεσμεύεται στην μεγάλη ριβοσωμική μονάδα αποτρέποντας την πρόσδεση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων. Ο παράγοντας eif6 εμπλέκεται στην βιογένεση και στην ωρίμανση της μεγάλης υπομονάδας και αποτρέπει την πρόωρη σύνδεση με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Πειράματα έχουν δείξει πως απάλειψη του συγκεκριμένου παράγοντα σε ανθρώπινα κύτταρα ή στον C. elegans έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της καταστολής μέσω mirna (Chendrimada et al., 2007). 46

67 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι πρωτεΐνες Ago παρεμποδίζουν τον σχηματισμό δομής θηλιάς του mrna, μ έναν μηχανισμό που δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως αλλά περιλαμβάνει αποαδενυλιώσεις. Σε κύτταρα Drosophila η αποαδενυλίωση προάγεται από την πρωτεΐνη GW182 καταστέλλοντας την μετάφραση. Τα micrornas επάγουν την αποαδενυλίωση και την απομάκρυνση της cap δομής από το mrna στόχο (Behm- Ansmant et al., 2006). Σχήμα Α.20 Πιθανοί μηχανισμοί καταστολής της μετάφρασης (Carthew και Sontheimer, 2009) Όταν το σύμπλοκο mirisc προσδεθεί στο mrna καταστέλλει την έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης είτε εμποδίζοντας τη μετάφραση στο στάδιο της αναγνώρισης της δομής cap είτε παρεμποδίζοντας την συναρμολόγηση της 60S υπομονάδας με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα. Εναλλακτικά, μπορεί το σύμπλοκο αποσιώπησης να επάγει την αποαδενυλίωση και την απομάκρυνση της cap δομής από το mrna στόχο. Επίσης καταστολή μπορεί να συμβεί μετά την έναρξη της μετάφρασης με απομάκρυνση των ριβοσωμάτων (ribosome drop off). 47

68 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.6 Ερυθροδιαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων Α.6.1 Αιμοποίηση Αιμοποίηση ονομάζεται το σύνολο των ενορχηστρωμένων διαδικασιών ενός αυστηρά ρυθμιζόμενου συστήματος παραγωγής των έμμορφων στοιχείων του αίματος, στο μυελό των οστών και στη λέμφο. Ο αιμοποιητικός ιστός εντοπίζεται στις μυελικές κοιλότητες των οστών και αναπτύσσεται σε ορισμένες θέσεις που αποτελούνται κυρίως από κύτταρα λείων μυϊκών ινών, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, λιποκύτταρα και οστεοβλάστες. Τα κύτταρα αυτά αποτελούν το μυελικό στρώμα που είναι το κατάλληλο μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη τόσο των αρχέγονων και προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, όσο και των ώριμων κυττάρων των μυελικών σειρών (Beutler and Williams 1995). Οι αρχέγονες προγονικές κυτταρικές μορφές στον ερυθρό μυελό των οστών αντιπροσωπεύονται από δυο κατηγορίες κυττάρων: τα πολυδύναμα (pluripotent stem cells) και τα μονοδύναμα (monopotent stem cells) «δεσμευμένα» κύτταρα (committed cells), τα οποία προκύπτουν από τα πρώτα. Η αιμοποίηση ξεκινά από τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία αποτελούν το 0,5-1% του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων του μυελού των οστών. Στο σχήμα Α.21 δίνεται περιληπτικά η ανάπτυξη των κυττάρων της μυελικής και λεμφικής σειράς από το αρχέγονο πολυδύναμο αιμοποιητικό κύτταρο, καθώς και οι αναπτυξιακοί παράγοντες που συμβάλουν στη διαδικασία αυτή. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, με τη δυνατότητα που τους παρέχει η ασύμμετρη διαίρεσή τους, οδηγούνται στο σχηματισμό δύο θυγατρικών κυττάρων με διαφορετικές ιδιότητες. Το ένα είναι πανομοιότυπο με το μητρικό κύτταρο που το αναπαράγει, ενώ το άλλο είναι πολυδύναμο (multipotent stem cell) με δυναμικό διαφοροποίησης, από το οποίο θα προκύψουν τελικά τα δεσμευμένα κύτταρα (committed cells) και θα αρχίσει η παραγωγή των έμμορφων συστατικών του αίματος. «Δέσμευση» ονομάζεται η διαδικασία κατά την οποία το αρχέγονο κύτταρο χάνει τη δυνατότητα της αναπαραγωγής του. Σε αυτό το σημείο πρέπει να τονιστεί ότι όσο προχωράμε στα στάδια της διαφοροποίησης ενός κυττάρου, το δυναμικό της κυτταρικής αναπαραγωγής μειώνεται αντιστρόφως ανάλογα με το βαθμό της διαφοροποίησής του (Metcalf 1989; Dexter, Heyworth et al. 1990; Dexter and Fairbairn 1993). Αναλυτικότερα, από τα αρχέγονα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα παράγονται τα μερικώς διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και της λεμφικής σειράς. Από τα μητρικά κύτταρα της λεμφικής σειράς σχηματίζονται τα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα, ενώ 48

69 ΕΙΣΑΓΩΓΗ από τα μυελικά μητρικά κύτταρα τα RBCs, τα ουδετερόφιλα, τα ηωσινόφιλα, τα βασεόφιλα, τα αιμοπετάλια και τα μονοπύρηνα Gilbert and Singer, (2000). Σχήμα Α.21 Σχηματική απεικόνιση της ωρίμανσης των κυττάρων κατά την αιμοποίηση. (Gilbert and Singer, 2000) Ag: Antigen, EPO: Erythropoietin, G-CSF: Granulocyte- Colony Stimulating Factor, GM-CSF: Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, IL: Interleukin, LIF: Leukemia Inhibiting Factor, M-CSF: Macrophage-Colony Stimulating Factor, MHCI: Major Histocampatability 49

70 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Complex type I protein, MHCII: Major Histocampatability Complex type II protein, SCF: Stem Cell Factor, SDF-1: Stromal Derived Factor-1, TNF: Tumor Necrosis Factor, Tpo: Thrombopoietin. (Gilbert and Singer 2000) Ο αριθμός των ώριμων κυττάρων του αίματος διατηρείται σε φυσιολογικές συνθήκες μέσα σε καθορισμένα πλαίσια και αυτά που παράγονται αντικαθιστούν αυτά που φυσιολογικά καταστρέφονται. Η εφαρμογή in vitro καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων, επέτρεψε ώστε να καθοριστούν πειραματικά διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης (growth factors), οι οποίοι συμβάλουν στην αναπαραγωγή και τη διαφοροποίησή τους (Charbord, Fujiwara et al. 1986; Chang, Allen et al. 1989). Οι παράγοντες αυτοί διαχωρίζονται σε επαγωγείς της αύξησης και σε επαγωγείς της διαφοροποίησης. Οι μεν πρώτοι (με κυριότερους εκπροσώπους τις ιντερλευκίνες και τις κυτοκίνες), προάγουν την αύξηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ οι δεύτεροι (EPO, GM-CSF, CSF, κ.ά.) συμβάλλουν στη διαφοροποίηση των κυττάρων προς ένα συγκεκριμένο φαινότυπο (Metcalf 1989; Stamatoyannopoulos 2005). Α.6.2 Οι λευχαιμίες ως διαταραχή της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων Οι λευχαιμίες αποτελούν αιματολογικές δυσπλασίες και χαρακτηρίζονται από την παρουσία ανώμαλων αιμοποιητικών κυττάρων που αναπαράγονται αλλά δεν διαφοροποιούνται ώστε να σχηματίσουν ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια (Bonnet and Dick 1997; Enver and Greaves 1998; Tenen 2003). Οι λευχαιμίες καλύπτουν ένα μεγάλο ποσοστό των αιματολογικών διαταραχών και απαντώνται ως οξείες ή χρόνιες καταστάσεις, με σχετικά χαμηλή συχνότητα (5-8 περιπτώσεις ανά 105 άτομα) (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Φυσιολογικά, τα HSCs (Hematopoietic Stem Cells) είναι προγραμματισμένα να διαφοροποιούνται προς συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές, μετά την επαγωγή τους από εξειδικευμένους αναπτυξιακούς παράγοντες, οι οποίοι διατηρούν την ισορροπία μεταξύ κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωσης) στο μυελό των οστών (Socolovsky, Lodish et al. 1998; Cantor and Orkin 2001; Fisher 2002). Πρόσφατα έχει δειχτεί ότι στην παραπάνω διαδικασία εμπλέκονται και ορισμένοι ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες (Cantor and Orkin 2001; Graf 2002). Η «δέσμευση» των HSCs συνοδεύεται από τη μη αντιστρεπτή ωρίμανσή τους, την προοδευτική μείωση του δυναμικού της κυτταρικής αναπαραγωγής ή ακόμα και την απόπτωση τους (Enver and Greaves 1998). 50

71 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σε περιπτώσεις λευχαιμίας, τα πρόδρομα ερυθροκύτταρα αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στα εξωτερικά ερεθίσματα του μικρο-περιβάλλοντος του μυελού των οστών, με αποτέλεσμα να διαφοροποιούνται προς μη φυσιολογικές μορφές αιμοποιητικών κυττάρων (Fialkow, Singer et al. 1981). Στα λευχαιμικά κύτταρα ο μηχανισμός της απόπτωσης είναι συνήθως αδρανοποιημένος, και τα κύτταρα αυτά πολλαπλασιάζονται συνεχώς σε βάρος των υπολοίπων κυττάρων του μυελού των οστών και τελικά εισβάλουν στο περιφερικό αίμα. Έτσι, οι λευχαιμίες θεωρούνται διαταραχή τόσο της διαφοροποίησης όσο και της απόπτωσης των αιμοποιητικών κυττάρων (Domen 2001). Επίσης η επαγωγή της διαφοροποίησης είναι δυνατόν να μειώσει ή ακόμη να καταργήσει το δυναμικό της κακοήθειας στα λευχαιμικά κύτταρα (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Από τις αρχές τις δεκαετίας του 70, ξεκίνησαν να απομονώνονται διάφοροι κλώνοι λευχαιμικών κυττάρων που αναπαράγονται σε ιστοκαλλιέργειες διατηρώντας τον νεοπλασματικό τους φαινότυπο. Τέτοια κύτταρα ή κυτταρικές σειρές προήλθαν ή από πειραματόζωα (π.χ. MEL) ή από αρρώστους με κάποιο τύπο λευχαιμίας (HL-60, K-562, KG-1, U-937). Οι λευχαιμικές αυτές κυτταρικές σειρές έχουν σταθερή κινητική κυτταρικής αναπαραγωγής, που δεν μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, και σχηματίζουν ομοιογενείς πληθυσμούς. (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Η επαγωγή διαφοροποίησης λευχαιμικών κυττάρων με χημικούς ή φαρμακολογικούς παράγοντες ενισχύει την άποψη ότι τα λευχαιμικά κύτταρα που έχουν υποστεί αλλοιώσεις στο αναπτυξιακό τους πρόγραμμα μπορεί να επανέλθουν στον φυσιολογικό δρόμο της διαφοροποίησης Α.7. Το σύστημα των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστημα μελέτης, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων in vitro Α.7.1 MEL (Murine ErythroLeukemia) ή Friend leukemia κύτταρα: Τα ερυθρολευχαιµικά κύτταρα ποντικού MEL ή κύτταρα Friend απομονώθηκαν αρχικά από τους Friend et al., το 1966, από κυτταρικές αποικίες που εμφανίστηκαν σε διογκωμένο σπλήνα πειραματόζωων (ποντίκια του είδους DAB/2J), τα οποία είχαν εμβολιασθεί προηγούμενα µε ιό τύπου FLV, (Friend Leukemia Virus) (Harrison 1976). Τα κύτταρα αυτά, έχουν μορφολογικά χαρακτηριστικά προερυθροβλαστών, των πρόδρομων δηλαδή ερυθροκυττάρων, µε τη διαφορά ότι 51

72 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παραμένουν σε αυτό το αναπτυξιακό στάδιο, χωρίς να έχουν τη δυνατότητα περαιτέρω διαφοροποίησης. Η ανακάλυψη ότι τα MEL κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα που προσομοιάζουν με ορθοχρωματικούς νορμοβλάστες (Friend, Scher et al. 1971) ήταν η αρχή εκτεταμένης έρευνας παγκοσμίως που οδήγησε στην επονομαζόμενη «Θεραπεία του καρκίνου με διαφοροποίηση» (Differentiation Therapy of Cancer) (Lotan, Francis et al. 1990), δηλαδή τη θεραπεία καρκινοπαθών με χημικές ουσίες που επάγουν την τελική διαφοροποίηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Τέτοια κύτταρα αναπτύσσονται σε καλλιέργεια και διαφοροποιούνται προς την ερυθρά σειρά έπειτα από επώαση με διάφορες χημικές ενώσεις στις οποίες περιλαμβάνονται πολικοί διαλύτες (DMSO, DMF), βουτυρικό οξύ, αντινεοπλασματικά αντιβιοτικά (ακτινιμυκίνη D, ανθρακυκλίνες), παράγωγα ουρίας, πουρίνης και θειουρίας, υποκατασταμένα παράγωγα πυριμιδίνης, διακεταμίδια, αντιμεταβολίτες ιντερφερόνες, ουσίες που αναδομούν τη χρωματίνη κ. α. (Tsiftsoglou et al., 2003 a). Στην προκείμενη διδακτορική διατριβή, ο χημικός επαγωγέας που χρησιμοποιήθηκε για την διαφοροποίηση των MEL κυττάρων ήταν εξαμεθυλενοδισακεταμίδιο (HMBA). Η επαγωγή της διαφοροποίησης από το HMBA συνοδεύεται από αλλαγές στην έκφραση ορισμένων γονιδίων, που εμφανίζονται 1-4 ώρες μετά την έκθεση στο αντιδραστήριο. Οι αλλαγές αυτές, περιλαμβάνουν την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων c-myc και c-myb και την πτώση των επιπέδων της πρωτεΐνης p53 (Ramsay, Ikeda et al. 1986; Melloni, Pontremoli et al. 1987; Melloni, Pontremoli et al. 1989). Ενώ είναι αναγκαίες, δεν είναι ικανές από μόνες τους να οδηγήσουν στη δέσμευση και τελική διαφοροποίηση, η οποία παρατηρείται ώρες μετά την έναρξη της επαγωγής και η οποία μπορεί να αποφευχθεί με την αφαίρεση του επαγωγέα πριν περάσει το παραπάνω χρονικό διάστημα (Fibach, Reuben et al. 1977). Εκτός των MEL, το HMBA επάγει τη διαφοροποίηση των HL- 60, των U937 (Haces, Breitman et al. 1987) και των Κ562 κυττάρων (Green, Rockman et al. 1993). Τα διαφοροποιημένα MEL κύτταρα μπορεί να αποβάλλουν τον πυρήνα και να παράγουν μεγάλες ποσότητες αιμοσφαιρίνης μοιάζοντας με τα δικτυοερυθροκύτταρα. Κατά την διαφοροποίηση υπόκεινται σε μια σειρά μορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών, που προσομοιάζουν τις αντίστοιχες που παρατηρούνται κατά τη φυσιολογική διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων της ερυθράς σειράς (Tsiftsoglou and Robinson 1985). Αυτές περιλαμβάνουν ελάττωση του μεγέθους του κυττάρου, πύκνωση του πυρήνα, διαδοχικές αλλαγές της αρχιτεκτονικής της κυτταρικής μεμβράνης και μεταγραφική ενεργοποίηση ή καταστολή πολλών γονιδίων 52

73 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Sartorelli 1981). Στον πίνακα 2 αναφέρονται οι αλλαγές που παρατηρούνται κατά την διαφοροποίηση. Πίνακας 2: Μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές που παρατηρούνται κατά τη διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL in vitro Μορφολογικές: 1. Ελάττωση κυτταρικού μεγέθους 2. Εξαφάνιση των πυρηνίσκων 3. Συμπύκνωση του πυρηνικού υλικού 4. Ελάττωση του λόγου πυρήνα/κυτταροπλάσματος Μεταβολές κυτταρικής επιφάνειας και μεμβράνης: 1. Ελάττωση μεταφοράς αμινοξέων και νουκλεοζιτών 2. Μεταβολές στο ηλεκτροχημικό μηχανισμό 3. Ελάττωση της ρευστότητας της μεμβράνης 4. Μεταβολές στη σύσταση φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης 5. Ελάττωση στη σύνθεση γλυκοπρωτεϊνών 6. Αύξηση στον αριθμό των υποδοχέων της τρασνφερρίνης 7. Αύξηση στη μεταφορά ιόντων σιδήρου 8. Εμφάνιση ερυθροκυτταρικών αντιγόνων και σπεκτρίνης 9. Μεταβολές στη μεταφορά ιόντων και της Na + /K + -ATPase Αύξηση στη μεταφορά ιόντων Ca 11. Αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης Μεταβολές μεταβολισμού: 1. Μεταβολές στο μεταβολισμό του trna 2. Ελάττωση στο σχηματισμό S-αδενοσυλο-μεθειονίνης (SAM) 3. Αύξηση της αποαμινάσης της κυτιδίνης 4. Διαδοχική επαγωγή ενζύμων βιοσύνθεσης της αίμης 5. Αύξηση σταθερότητας του mrna της αιμοσφαιρίνης 6. Παραγωγή του mrna της αιμοσφαιρίνης και σύνθεση αιμοσφαιρίνης 7. Μεταβολές της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης 8. Δραματική πτώση στο ρυθμό πρωτεϊνικής σύνθεσης Πυρηνικές μεταβολές: 1. Μόνιμη διακοπή της αναπαραγωγής του DNA 2. Απενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων που κωδικοποιούνται προς rrna α 3. Εμφάνιση της πρωτεΐνης IP Εξαφάνιση των πυρηνικών πρωτεϊνών HMG-1 και HMG-2 5. Ελάττωση στο ρυθμό φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών 6. Μεταβολές στην ADP- ριβοσυλίωση των πρωτεϊνών 7. Ελάττωση του ρυθμού μεθυλίωσης του DNA 8. Διβασική αναστολή μεταγραφής των γονιδίων c-myc και p53 9. Αύξηση υπερευαισθησίας του DNA σε DNAase I (α και β γονίδια αιμοσφαιρίνης) 10. Ελάττωση της λιγάσης του DNA 11. Διάσπαση του DNA Αύξηση μιας ενδονουκλεάσης που ενεργοποιείται με Ca 13. Μεταβολές στο ρυθμό σύνθεσης και ακετυλίωσης των ιστονών Παρόλα αυτά, σε αντίθεση με τα φυσιολογικά πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (CFU-E), τα MEL κύτταρα δεν ανταποκρίνονται στη μιτογόνο δράση της ερυθροποιητίνης και δεν διαφοροποιούνται προς ερυθροκύτταρα. Κύτταρα MEL, δεσμευμένα προς την τελική διαφοροποίηση, εμφανίζουν προγραμματισμένο 53

74 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιορισμό της ανάπτυξής τους σε 4-5 κυτταρικές διαιρέσεις και στη συνέχεια εισέρχονται σε φάση στασιμότητας G 1 /G 0 (Tsiftsoglou, Pappas et al. 2003). Έχει βρεθεί, πως η έναρξη της διαφοροποίησης πιθανώς να συμβαίνει κατά τη G 1 /S φάση του κυτταρικού κύκλου (Friedman και Schildkraut, 1977, Geller et al., 1978). Όλα αυτά δείχνουν, πως η κυτταρική αναπαραγωγή και η διαφοροποίηση είναι διαδικασίες στενά εναρμονισμένες κατά την ερυθροποίηση. Η δέσμευση των MEL κυττάρων, προκειμένου να εισαχθούν στο πρόγραμμα διαφοροποίησης, αρχίζει από μια διαδικασία που έχει να κάνει με αλληλεπίδραση του επαγωγέα με κάποιον υποδοχέα. Αυτό ενισχύεται από το εύρημα πως η ριβοσωμική πρωτεΐνη της μικρής υπομονάδας, S3, πιθανώς να αλληλεπιδρά με τον παράγοντα SAHA, ο οποίος είναι ένας επαγωγέας της ερυθράς ωρίμανσης των MEL κυττάρων (Webb et al., 1999). Α.7.2 Το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων Η ανάλυση των μεταβολών που παρατηρούνται κατά την διαφοροποίηση των MEL κυττάρων σε συνάρτηση με το χρόνο, έδειξε ότι όλες σχεδόν οι μεταβολές που παρατηρούνται, συμβαίνουν προγραμματισμένα και συμβάλλουν στην έκφραση ενός συντονισμένου προγράμματος διαφοροποίησης που μοιάζει πολύ με την φυσιολογική διαφοροποίηση των προερυθροβλαστών προς ερυθρά αιμοσφαίρια. Η in vitro διαφοροποίηση των κυττάρων MEL χαρακτηρίζεται από παροδικές ή αντιστρεπτές και μόνιμες ή μη αντιστρεπτές μεταβολές. Οι παροδικές μεταβολές παρατηρούνται στις πρώτες ώρες επώασης των κυττάρων με τον επαγωγέα και δεν οδηγούν σε διαφοροποίηση καθώς μετά την απομάκρυνση του επαγωγέα τα κύτταρα παραμένουν αδιαφοροποίητα. Από την άλλη μεριά, οι μόνιμες μεταβολές παρατηρούνται μετά από ένα χρονικό διάστημα ωρών, (λανθάνουσα περίοδος), η οποία προηγείται της συσσώρευσης των δρομολογημένων κυττάρων στη διαφοροποίηση και κατά την οποία είναι απαραίτητη η παρουσία του επαγωγέα. Από το χρονικό αυτό σημείο και μετά, η παρουσία του επαγωγέα δεν κρίνεται απαραίτητη για το κύτταρο, προκειμένου να φτάσει σε υψηλά ποσοστά σύνθεσης αιμοσφαιρίνης και να περιορίσει το δυναμικό πολλαπλασιασμού του, ενώ τα κύτταρα δρομολογούνται για διαφοροποίηση. Η λανθάνουσα περίοδος, δεν εξαρτάται από την συγκέντρωση του επαγωγέα, ενώ από αυτήν εξαρτάται ο ρυθμός συσσώρευσης των δρομολογημένων κυττάρων (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Οι παροδικές μεταβολές αφορούν κυρίως μεταβολές της κυτταρικής επιφάνειας που επηρεάζουν την διαπερατότητα των ιόντων σιδήρου, καλίου, 54

75 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ασβεστίου καθώς και την τοπογραφία και ρευστότητα των μορίων της κυτταρικής μεμβράνης (π.χ. γλυκοπρωτεΐνες, φωσφολιπίδια). Έτσι λοιπόν η διαφοροποίηση των MEL κυττάρων συμβαίνει στοχαστικά, με μια συγκεκριμένη πιθανότητα P, που σημαίνει πως σε κάθε γενιά, μόνο ένας καθορισμένος αριθμός κυττάρων διαφοροποιείται μόνιμα. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα υπόκεινται σε 4-5 διαιρέσεις (Gusella et al., 1976) όπως φαίνεται στο σχήμα Α.22. Σχήμα Α.22 Σχηματική αναπαράσταση των κυριοτέρων σταδίων του αναπτυξιακού προγράμματος των MEL κυττάρων (Tsiftsoglou et al., 2003 a) Ο επαγωγέας, (I), αλληλεπιδρά εκλεκτικά με έναν κυτταροπλασματικό υποδοχέα, (R), και διεγείρει την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης, που συμβαίνει με μια πιθανότητα P. Μια λανθάνουσα περίοδος απαιτείται πριν τα κύτταρα δρομολογηθούν μη αντιστρεπτά στην ερυθρά ωρίμανση και ελαττωθεί το δυναμικό κυτταρικής αναπαραγωγής, (4-5 διαιρέσεις). Υπάρχουν ουσίες που μπορούν να σβήσουν την ιδιότητα της μνήμης. Με τη χρήση διαφόρων ουσιών, το πρόγραμμα θεωρητικά διαχωρίζεται σε δυο υποπρογράμματα που λαμβάνουν χώρα ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. Η διαφοροποίηση των MEL κυττάρων χαρακτηρίζεται από σημαντική αύξηση του mrna της αιμοσφαιρίνης. Παίρνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη και την 55

76 ΕΙΣΑΓΩΓΗ παρατήρηση ότι κύτταρα MEL που επωάστηκαν με τον επαγωγέα για κάποια χρονική περίοδο παρουσιάζουν την ικανότητα μνήμης, δηλαδή αναγνωρίζουν το αρχικό σήμα ή ερέθισμα και συνεχίζουν την διαφοροποίηση τους όταν μετά την απομάκρυνση του επαγωγέα επωαστούν ξανά με αυτόν, με άλλα λόγια φαίνεται πως τα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να θυμούνται την προηγούμενη έκθεση στον επαγωγέα (Levenson και Housman, 1979). Φαίνεται λοιπόν, πως το αναπτυξιακό πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από διάφορες κύριες διεργασίες ή προγράμματα, που συντονίζονται για την έκφραση του ερυθρού φαινότυπου. Το γεγονός ότι η μνήμη μπορεί να διαρκέσει για περισσότερες από μια ή δυο γενιές κυττάρων, δείχνει ότι αυτή μεταβιβάζεται από τα μητρικά στα θυγατρικά κύτταρα και δεν επηρεάζεται από την αντιγραφή και τη σύνθεση του DNA. Έχουν βρεθεί διάφορες ουσίες που έχουν την ιδιότητα να σβήνουν τη μνήμη των MEL κυττάρων, αναστέλλοντας συγχρόνως και τη διαφοροποίηση (Levenson και Housman, 1981, Tsiftsoglou et al., 1983). Με βάση αυτά τα δεδομένα, είναι λογικό να θεωρηθεί πως είτε ένα μόριο mrna, είτε ένα πρωτεϊνικό μόριο, είναι πιθανώς υπεύθυνο για την έκφραση της μνήμης των MEL κυττάρων σε μοριακό επίπεδο (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Με βάση τα παραπάνω, προτείνεται πως το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από δυο υποπρογράμματα (Τσιφτσόγλου, 1989). Το ένα διεγείρεται από την αίμη και είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της μεταφοράς των ιόντων Fe +++, τη βιοσύνθεση της αίμης, τη σύνθεση του mrna της αιμοσφαιρίνης, ενώ το άλλο, καθορίζει την ελάττωση του δυναμικού κυτταρικής αναπαραγωγής, την ικανότητα του DNA να μεταγράφεται και τη συμπύκνωση του πυρηνικού υλικού. Στο σχήμα Α.22, φαίνεται το αναπτυξιακό πρόγραμμα των MEL κυττάρων. Η κινητική μελέτη της έκφρασης γονιδίων σε κύτταρα MEL παρουσία επαγωγέα, έδειξε ότι η έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων αλλάζει κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας περιόδου, πριν και μετά την έναρξη της δρομολόγησης των κυττάρων. Αυτές οι αλλαγές αφορούν σε γονίδια που έχουν να κάνουν με την κυτταρική οικονομία, (housekeeping genes), που κωδικοποιούν προϊόντα ογκογονιδίων και μεταγραφικούς παράγοντες, ένζυμα του κυτταρικού κύκλου, μιτοχονδριακές αιμοπρωτεΐνες και αρκετές άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα, όπως είναι οι ιστόνες. Έχει βρεθεί πως τα επίπεδα των γονιδίων β major και β minor των σφαιρινών, πριν από τη δρομολόγηση είναι σταθερά, ενώ μετά από αυτή, αυξάνονται (Curtis et al., 1980). Η GATA-1, η οποία αποτελεί ένα μεταγραφικό διεγέρτη της διαφοροποίησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων και είναι υπεύθυνη για την αρχική και οριστική ερυθροποίηση, παρουσιάζει μια διφασική συμπεριφορά, (πτώση και αύξηση 56

77 ΕΙΣΑΓΩΓΗ των επιπέδων), πριν από τη δρομολόγηση, ενώ μετά από αυτή, παρατηρείται αύξηση (Green et al., 1992). Οι μεταγραφικοί παράγοντες GATA χαρακτηρίζονται από την παρουσία συντηρημένων zinc-finger περιοχών. Πειράματα γενετικής έχουν αποδείξει πως 5% της φυσιολογικής έκφρασης της GATA-1 παρεμποδίζει την απόπτωση, ρυθμίζοντας αντι-αποπτωτικά γονίδια όπως η Bcl-x L. Επίσης η GATA-1 προάγει τα κύτταρα που βρίσκονται στο τελικό στάδιο της διαφοροποίησης να σταματήσουν στη G 1 /G 0 φάση του κυτταρικού κύκλου με το να καταστέλλει μιτογόνα γονίδια όπως το c-myc. Την ίδια διφασική συμπεριφορά, αλλά με τελική πτώση των επιπέδων, παρουσιάζουν το ογκογονίδιο c-myc (Lachman και Skoultchi, 1984) και ο ογοκαταστολέας p53 (Tsiftsoglou et al., 1987). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος, (prb), αυξάνονται μετά την έναρξη της δρομολόγησης (Copppola et al., 1990), ενώ δεν υπάρχουν στοιχεία που να αναφέρουν τι συμβαίνει πριν από αυτή. Τα επίπεδα των κινασών του κυτταρικού κύκλου, Cdk2, Cdk4, παραμένουν σταθερά και στη συνέχεια πέφτουν, πριν και μετά τη δρομολόγηση των κυττάρων (Hsieh et al., 2000). Την ίδια συμπεριφορά παρουσιάζουν και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες S5 και L35a (Vizirianakis et al., 1999, Pappas et al., 2001). Τέλος, τα επίπεδα των ριβοσωμικών RNAs, (rrnas), φαίνεται να πέφτουν, τόσο πριν, όσο και μετά από τη δρομολόγηση των MEL κυττάρων (Tsiftsoglou et al., 1982). A.8 Κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου Οι δύο κύριες μορφές κυτταρικού θανάτου είναι η απόπτωση (apoptosis) και η νέκρωση (necrosis). Η απόπτωση αφοράν έναν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, που αποσκοπεί στην εξάλειψη κυττάρων τα οποία έχουν ολοκληρώσει τον κύκλο ζωής τους ή φέρουν γενετικές βλάβες. Αποτελεί δηλαδή ένα γενετικά ελεγχόμενο σύστημα «αυτοκαταστροφής» του κυττάρου, που παίζει σημαντικότατο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στην ωρίμανση και στη λειτουργία των πληθυσμών του ανοσοποιητικού και αιμοποιητικού συστήματος και στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς (Jacobson et al 1997). Από την άλλη πλευρά, η νέκρωση αποτελεί μια ανεξέλεγκτη, μη ρυθμιζόμενη γενετικά διαδικασία, που είναι το αποτέλεσμα οξέος κυτταρικού τραυματισμού, προερχόμενου από ποικίλες καταστάσεις, όπως μόλυνση, φλεγμονή κ.λ.π. και έχει ως συνέπεια την αποτυχία των φυσιολογικών μηχανισμών που είναι απαραίτητοι για τη διατήρηση της ομοιοστασίας, όπως η μεταφορά ιόντων, η παραγωγή ενέργειας και η διατήρηση της οξεοβασικής ισορροπίας. Πρόκειται για μια παθητική διαδικασία, που δεν απαιτεί την κατανάλωση ενέργειας και μορφολογικά χαρακτηρίζεται από 57

78 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διόγκωση του κυτταροπλάσματος, λύση της κυτταρικής μεμβράνης και αποβολή του κυτταροπλασματικού περιεχομένου (Nicotera et al 2004, Okada et al 2004) ενώ παράλληλα επέρχεται και πλήρης αποδόμηση και καταστροφή των ενδοκυττάριων οργανιδίων. Η έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου έχει ως αποτέλεσμα την κινητοποίηση φλεγμονώδους αντίδρασης από το ανοσοποιητικό σύστημα και την καταστροφή του ιστού που περιβάλλει τη νεκρωτική εστία. Μία άλλη μορφή μη-αποπτωτικού και μη-νεκρωτικού προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου είναι η «αυτοφαγία». Η κυτταρική αυτοφαγία επάγεται από την έλλειψη αμινοξέων και εξυπηρετεί πρωταρχικά μια ομοιοστατική λειτουργία που σχετίζεται με την ισορροπία αμινοξέων / πρωτεϊνών στο κύτταρο. Η αποκοδόμηση των ενδογενών πρωτεϊνών γίνεται στα λυσοσώματα με αυτοφαγοκύτωση. (Kim et al 2000). Τέλος μια άλλη μορφή κυτταρικού θανάτου είναι και η μιτωτική καταστροφή (mitotic catastrophy). A.9 Χαρακτηριστικά των αποπτωτικών κυττάρων Οι πιο σημαντικές μεταβολές που συμβαίνουν στα αποπτωτικά κύτταρα είναι η διάσπαση του DNA, η συμπύκνωση της χρωματίνης και η εξαφάνιση της πυρηνικής μεμβράνης. Η αποικοδόμηση του DNA αρχίζει μετά την πρωτεολυτική διάσπαση- από την κασπάση 3 ή 7 - του αναστολέα της DNAασης (ενεργοποιείται από την κασπάση, caspase activated DNAase-ICAD, ή DFF45), που έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση της CAD (DFF40 ή CPAN) και επομένως την διάσπαση (Sakahira et al 1998). Η διάσπαση του DNA προκαλείται επίσης και από την απελευθέρωση του παράγοντα AIF από τα μιτοχόνδρια, ο οποίος μετακινείται στον πυρήνα και διασπώντας το DNA σε μεγάλα τμήματα οδηγεί στον σχηματισμό DNA «σκάλας» (DNA ladder). Επίσης ο AIF προκαλεί και συμπύκνωση της χρωματίνης. Εκτός από τον AIF απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια και η ενδονουκλεάση G, η οποία μεταφέρεται με τη σειρά της στον πυρήνα και με συνέργεια διαφόρων εξωνουκλεασών και DNAασης Ι αποικοδομεί το DNA (Widlak et al 2001). Εκτός από τη διάσπαση του γενετικού υλικού κατά την απόπτωση παρατηρούνται και δομικές μεταβολές του κυτταρικού σκελετού, συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, συρρίκνωση των οργανιδίων, σχηματισμός φυσαλίδων (blebbing) στην κυτταρική μεμβράνη με τελικά σχηματισμός των αποπτοσωματίων. H διάσπαση των πρωτεϊνών των πυρηνικών πόρων (NUP 153), τόσο της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (LBR, Lap2) όσο και της εξωτερικής πυρηνικής (λαμινίνη Β) 58

79 ΕΙΣΑΓΩΓΗ που προκαλείται από τις κασπάσες οδηγεί σε διάλυση της πυρηνικής μεμβράνης (Buendia et al 1999). Ένα πρώιμο γεγονός κατά την αποπτωτική διαδικασία είναι η «απώλεια της αμινοφωσφολιπιδικής ασυμμετρίας» της κυτταρικής μεμβράνης, με την μετατόπιση της φωσφατιδυλοσερίνης (PS) από την εσωτερική προς την εξωτερική της στιβάδα. Η μετατόπιση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των αποπτωτικών σωματίων, που σχηματίζονται από εγκολπώσεις της κυτταρικής μεμβράνης και τα οποία περικλείουν τμήματα του κυτταροπλάσματος, από τα φαγοκύτταρα, τα οποία φέρουν αντίστοιχους υποδοχείς για την PS (Martin et al 1995). Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται οι κύριες διαφορές μεταξύ νέκρωσης και απόπτωσης. Πίνακας 3: Βασικές διαφορές απόπτωσης και νέκρωσης Αιτία Ενέργεια Χαρακτηριστικά Απόπτωση Ποικίλα εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια ερεθίσματα Ενεργητική διαδικασία που βασίζεται στην κατανάλωση ATP Συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος Φυσαλιδοποίηση (blebbing) της κυτταρικής μεμβράνης Τελικός σχηματισμός πολλαπλών κυστιδίων (αποπτωτικά σωμάτια) που περιβάλλονται από μεμβράνη και περικλείουν κυτταρόπλασμα και οργανίδια Νέκρωση Οξύς κυτταρικός τραυματισμός λόγω εξωκυττάριων ερεθισμάτων Παθητική διαδικασία, δεν απαιτείται η κατανάλωση ενέργειας Διόγκωση του κυτταροπλάσματος, αυξημένη κενοτοπίωση, διόγκωση μιτοχονδρίων και λύση κυτταρικών οργανιδίων Λύση της κυτταρικής μεμβράνης και έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου και των οργανιδίων Συμπύκνωση της χρωματίνης σε μάζες ομοιογενούς πυκνότητας Διάσπαση του DNA στο επίπεδο των νουκλεοσωμάτων - Τυχαία διάσπαση του DNA σε θραύσματα ποικίλων 59

80 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (χαρακτηριστική μορφή διαστάσεων «σκάλας» -DNA ladder στην ηλεκτροφόρηση) Βιοχημικά χαρακτηριστικά Εξαρτώμενη από τις κασπάσες Ανεξάρτητη από τις κασπάσες Αποτέλεσμα αντίδρασης Φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματίων χωρίς την πρόκληση φλεγμονώδους αντίδρασης Φλεγμονώδης αντίδραση Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα έχει αναφερθεί ότι η μετάπτωση της φωσφατιδυλοσερίνης (phosphatidyl-serine-ps) από την εσωτερική προς την εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης, που αποτελεί μία από τις πρώιμες μοριακές αλλαγές της απόπτωσης (Martin et al 1995) καθώς και η θραύση του DNA στο επίπεδο των νουκλεοσωμάτων μπορούν να παρατηρηθούν και στη νέκρωση (Hayashi et al 1998). Σύμφωνα με τον Shimuzu et al (1996) υπάρχουν κοινά μονοπάτια στην απόπτωση και τη νέκρωση διότι μπορούν να ανασταλούν από την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 και οι δύο τύποι κυτταρικού θανάτου όταν επάγονται σε κυτταρικές σειρές νευρώνων λόγω υποξείας ή ανοξείας. Γενικότερα όμως ισχύει η άποψη ότι τα εντονότερα ερεθίσματα επάγουν τη νέκρωση παρά την απόπτωση και ότι τελικά η τύχη του κυττάρου εξαρτάται από την ένταση του ερεθίσματος (Nakao et al 2000) και την ενεργειακή κατάσταση στην οποία βρίσκεται κατά την επαγωγή της βλάβης (Liest et al 1997). Τα γονίδια που ελέγχουν την απόπτωση έχουν μελετηθεί λεπτομερώς στον νηματοειδή σκώληκα Caenorhabditis elegans και καλούνται γονίδια κυτταρικού θανάτου ced (cell death). Συγκεκριμένα τα γονίδια ced3 και ced4, προάγουν τον κυτταρικό θάνατο, ενώ από την άλλη μεριά το γονίδιο ced9, τον καταστέλλει. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: εκείνα που προάγουν την απόπτωση (όπως p53, c-myc, E2F, Fas, Bax, Bad, Bak, Bcl-Xs) και σε εκείνα που την αναστέλλουν (όπως Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, MCL-1, A-I, crma, p35). Όπως αναφέρεται παρακάτω το σημείο ελέγχου G 2 του κυτταρικού κύκλου (G 2 checkpoint) είναι υπεύθυνο για την αναστολή της μιτωτικής διαδικασίας σε περίπτωση που το κύτταρο έχει υποστεί κάποια βλάβη στο γενετικό του υλικό σε αυτή ή σε προηγούμενες φάσεις (G 1 και S). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφόρων μορίων τα οποία είτε επάγουν την παύση του κυτταρικού κύκλου (cell cycle arrest), προκειμένου να επιδιορθωθεί η βλάβη, είτε διεγείρουν τους σηματοδοτικούς μηχανισμούς της απόπτωσης, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατόν να 60

81 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιδιορθωθεί. Παρόλα αυτά, όταν υπάρχει βλάβη στο σημείο ελέγχου G 2, τα κύτταρα εισέρχονται πρόωρα στη μίτωση, προτού προλάβει να ολοκληρωθεί η επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Αυτή η ανώμαλη μίτωση ονομάζεται μιτωτική καταστροφή. Η βλάβη μπορεί να αφορά την αναστολή ή απενεργοποίηση, οποιουδήποτε από τα γονίδια που εμπλέκονται σε αυτό το σημείο ελέγχου, συμπεριλαμβανομένων αυτών που εκφράζουν τις πρωτεΐνες ανίχνευσης των βλαβών του DNA (ATR και ΑΤΜ), τις κινάσες CHK1 και CHK2 που απαιτούνται για τη στάση του κυτταρικού κύκλου και τα μόρια που ευθύνονται για τη διατήρηση αυτής της στάσης, όπως τα p53, WAF1 (p21) και σ (Merritt et al 1997, Takai et al 2000). Τα παραπάνω έχουν ως αποτέλεσμα την πρόωρη ενεργοποίηση του συμπλέγματος επαγωγής της μίτωσης CDK1/cyclinB και την είσοδο του κυττάρου σε ανώμαλη μίτωση. Επιπλέον, άλλοι παράγοντες που μπορούν να καταστρέψουν τους μικροσωληνίσκους ή να διαταράξουν τα σημεία ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoints), μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε μιτωτική καταστροφή. Για παράδειγμα η φαρμακευτική ουσία palcitaxel (taxol) επάγει ανώμαλη μετάφαση στην οποία οι χρωματίδες αδυνατούν να αποχωριστούν με αποτέλεσμα τα κύτταρα να οδηγούνται σε μιτωτική καταστροφή (Jordan et al 1996). A.10. Βιοχημικά μονοπάτια απόπτωσης Η επαγωγή της απόπτωσης πραγματοποιείται είτε μέσω της ενδογενούς είτε μέσω της εξωγενούς οδού. Και οι δύο οδοί έχουν ως τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του καταρράκτη των πρωτεασών κυστεϊνης εξειδικευμένων για ασπαραγινικό οξύ (cystein dependent-aspartate-specific), που ονομάζονται κασπάσες (Enari et al 1996, Hasegawa et al 1996, Lamkanfi et al 2002). Τα μόρια αυτά συντίθενται ως ανενεργά προένζυμα (προ-κασπάσες). Οι προκασπάσες περιέχουν μια περιοχή ~100 αμινοξέα, (κασπάσες 2, 8, 9 και 10), αποτελούν τις εναρκτήριες κασπάσες (initiator caspases), εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα με την μορφή μονομερών και περιέχουν κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο. Έχουν δράση πεπτιδάσης και αναγνωρίζουν στα υποστρώματά τους μία πλευρική ομάδα ασπαραγινικού, στα πλαίσια ενός τετραπεπτιδίου όπου η θέση του ασπαραγινικού ορίζεται ως P1 και η ομάδα του εγγύτερου αμινοξέος προς το Ν-άκρο ορίζεται ως P4. Η αποκοπή γίνεται στον πεπτιδικό δεσμό προς το C-άκρο του στοχευμένου ασπαραγινικού (Reed, 2000). Τα μόρια αυτά στην συνέχεια ενεργοποιούνται σε διμερή είτε μέσω αλλαγών στη στερεοδομή τους είτε μέσω άλλων μεταβολών που συμβαίνουν κατά την 61

82 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετανάστευση τους σε μεγάλα μοριακά συμπλέγματα, όπως το σύμπλεγμα επαγωγής θανάτου (death-inducing signaling complex DISC) (Peter et al 2003), το αποπτόσωμα (apoptosome) (Acehan et al 2002), το PIDDόσωμα (Tinel et al 2004) ή το φλεγμονόσωμα (inflammasome) (Martinon et al 2002). Από την άλλη μεριά, οι προ-κασπάσες που περιέχουν μια μικρότερη περιοχή ~30 αμινοξέα (κάσπάσες 3, 6 και 7) αποτελούν τις "εκτελεστικές" κασπάσες (effector caspases). Ενεργοποιούνται από τις εναρκτήριες κασπάσες μετά από πρωτεολυτική αποικοδόμηση σε συγκεκριμένες θέσεις που φέρουν ασπαραγινικό (Asp) σχηματίζοντας τετραμερή σύμπλοκα (Salvessen et al 2004). Μετά την ενεργοποίηση ακολουθεί διάσπαση μια σειράς ενδοκυτταρικών υποστρωμάτων, όπως δομικά στοιχεία του κυτταροσκελετού και του πυρήνα, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος και στις διαδικασίες αναδιπλασιασμού και επιδιόρθωσης του DNA. Λαμβάνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη γίνεται αντιληπτό ότι η ενεργοποίηση των κασπασών ακολουθεί ένα πρότυπο αλυσιδωτής αντίδρασης που οδηγεί τελικά στην εμφάνιση των ιδιαίτερων μορφολογικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης (Saelens et al 2001, Fischer et al 2003, Lamkanfi et al 2002). Η ενδογενής οδός της απόπτωσης ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσματα ως απάντηση σε περιβαλλοντικό στρες (π.χ. βλάβη στο DNA από υπεριώδη ακτινοβολία ή χημειοθεραπευτικά, έλλειψη αυξητικών παραγόντων, υποξεία, απώλεια αλληλεπιδράσεων με την εξωκυττάριο ουσία, χημικές τοξίνες κα). Κεντρικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία διαδραματίζουν τα μιτοχόνδρια, μέσω της απελευθέρωσης μελών της οικογένειας Bcl-2 και άλλων πρωτεϊνών από το εσωτερικό τους (Festjens et al 2004, Saelens et al 2004). ΟΙ πρωτεΐνες της οικογένειας bcl-2 ρυθμίζουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και άλλων αποπτωτικών παραγόντων (Smac/DIABLO, Omi/HtrA2. AIF κ.α), με το να ενισχύουν ή να καταστέλλουν τη διαπερατότητα της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης (Saelens et al 2000). Θα πρέπει να αναφερθεί, πως η οικογένεια bcl-2 συμπεριλαμβάνει (προ) αποπτωτικούς και αντι-αποπτωτικούς παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί ταξινομούνται ανάλογα με την ομολογία των περιοχών (ΒΗ) που περιέχουν. Μέχρι στιγμής έχουν χαρακτηριστεί 4 τέτοιες περιοχές: ΒΗ1, ΒΗ2, ΒΗ3 και ΒΗ4 (Bouillet et al 2002, Liu et al 2003). Οι αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες, όπως οι Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1 κα, περιλαμβάνουν συνήθως 3 από τις τέσσερεις περιοχές. Οι (προ) αποπτωτικές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν από την άλλη είτε μόνο την περιοχή ΒΗ3 (ΒΗ3-only proteins), όπως οι Bad, Bid, Noxa, PUMA κ.α, είτε δύο ή τρεις διαφορετικές περιοχές, όπως οι Bax και Bad (Festjens et al 2004, Huang et al 2000). 62

83 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η πρωτεΐνη Bak αποτελεί απαραίτητη πρωτεΐνη της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, ενώ η πρωτεΐνη Bax μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια κατά την ενεργοποίηση του ενδογενούς δρόμου της απόπτωσης. Η αλληλεπίδραση των Bax και Bak με άλλες πρωτεΐνες που φέρουν μόνο τη ΒΗ3 περιοχή, έχει ως αποτέλεσμα τον πολυμερισμό τους τον σχηματισμό πόρου στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η διαπερατότητα της και να απελευθερώνονται αποπτωτικοί παράγοντες, όπως το κυτόχρωμα c, AIF μια φλαβοπρωτεΐνη, η οποία μετατοπίζεται στον πυρήνα και προκαλεί συμπύκνωση της χρωματίνης και διάσπαση του DNA, μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων από τις κασπάσες (Susin et al 1999) καθώς και άλλους παράγοντες (Antonsson et al 2000). Εναλλακτικά, οι πρωτεΐνες ΒΗ3 και το Bax μπορούν να αλληλεπιδράσουν με ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα (permeability transition pore-ptp) που βρίσκεται στα σημεία επαφής μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και περιλαμβάνει πρωτεΐνες όπως οι ATN (adenine noucleotide exchanger) και VDAC (voltage dependent anion channel). Το άνοιγμα του πόρου έχει ως συνέπεια μείωση του μιτοχονδριακού δυναμικού (Δψ m ), διόγκωση του μιτοχονδρίου και ρήξη της μιτοχονδριακής μεμβράνης με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και άλλων παραγόντων στη κυτταρόπλασμα (Zamzami et al 2000, Sugiyama et al 2002). Σχήμα Α.23 Σχηματική αναπαράσταση εξωγενούς και ενδογενούς οδού επαγωγής της απόπτωσης, (Bursch W. ECDO 2004) 63

84 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο εξωκυττάριος δρόμος ενεργοποιείται από την σύνδεση ενός εξωκυττάριου «προσδέτη θανάτου» (death ligand) στον αντίστοιχο «υποδοχέα θανάτου» (death receptor). Οι «προσδέτες θανάτου» είναι συνήθως ομοιοτριμερή οπότε η σύνδεσή τους με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους οδηγεί στον σχηματισμό τριμερικών σχηματισμών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Οι υποδοχείς αυτοί, οι οποίοι ανήκουν στην οικογένεια των TNF, αποτελούνται από ένα εξωκυττάριο τμήμα, που φέρει περιοχές πλούσιες σε κυστεϊνη (cysteine rich domains=crds), με την οποία συνδέεται ο αντίστοιχος συνδέτης και ένα ενδοκυττάριο τμήμα θανάτου (death domain=dd). Σε αυτούς περιλαμβάνονται ο TNF-R1 (= tumor necrosis factorreceptor 1), o Fas, o DR 3 (=death receptor 3 ή APO-3/TRAMP), O DR4 (TRAIL-R1), o DR5 (TRAIL-R2/TRICK2) και ο DR6 (Itoh et al 1993, Sheikh et al 2000, Chen et al 2002). Αντίστοιχα, στους συνδέτες (ligands) περιλαμβάνονται οι ο TNFa (Tumor necrosis factor alpha), o Fas ligand (FasL), o Apo-3 ligand, η λεμφοτοξίνη (lymphotoxin LTa) και ο TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand/apo-2 ligand) (Sheikh et al 2000, Chen et al 2002). Η σύνδεση των εξωκυττάριων σημάτων ligand με τους αντίστοιχους υποδοχείς οδηγεί σε μεταβολές των υποδοχέων, που τους καθιστούν ικανούς να ενώνονται μέσω του ενδοκυττάριου τμήματος τους (DD) με ειδικές ενδοκυττάριες πρωτεΐνες-προσαρμοστές (adaptor-proteins), όπως οι TRADD και FADD που επίσης φέρουν αντίστοιχες περιοχές (DD) (Aravind et al 1999, Hofmann 1999). Από εκεί και πέρα το ακριβές μονοπάτι απόπτωσης εξαρτάται από τον υποδοχέα που έχει ενεργοποιηθεί: Σε περίπτωση σύνδεσης Fas/FasL γίνεται προσέλκυση της προ-κασπάσης-8 ή και της προ-κασπάσης 10 καθώς και του κυτταροπλασματικού παράγοντα FADD μέσω των αντίστοιχων περιοχών τους DED (Thomas et al 2002), με αποτέλεσμα το σχηματισμό πρωτεϊνικού συμπλέγματος, γνωστού ως DISC (=death inducing signaling complex) (Kischkel et al 1995). Ο σχηματισμός του DISC οδηγεί στην ενεργοποίηση της προ-κασπάσης-8 σε κασπάση-8 η οποία στην συνέχεια ενεργοποιεί τη δραστική κασπάση-3 και οδηγεί στον μη αναστρέψιμο καταρράκτη της απόπτωσης (Riedl and Shi, 2004). Οι δύο παραπάνω δρόμοι αποτελούν δύο διαφορετικούς τρόπους επαγωγής κυτταρικού θανάτου ως απάντηση σε διαφορετικά ερεθίσματα απόπτωσης. Υπάρχει και η περίπτωση η παραπάνω διαδικασία να ενισχύεται και από τη μιτοχονδριακή οδό, όταν η κασπάση 8 ενεργοποιήσει την πρωτεΐνη Bid της οικογένειας Bcl-2, που με τη σειρά της εισέρχεται στο μιτοχόνδριο (ως tbid), προκαλεί την έξοδο του κυτοχρώματος c και έτσι ενεργοποιεί και την ενδογενή οδό (Li et al 1998). Μετά την ολοκλήρωση της αποστολής του το σύμπλεγμα Fas/FasL ενδοκυττώνεται ακολουθώντας των ενδοσωμική οδό (Algeciras-Schimnich et al 2002). 64

85 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σε περίπτωση σύνδεσης TNF-R1/TNFa γίνεται σύνδεση πρωτεϊνικού παράγοντα TRADD και κατόπιν της κινάσης σερίνης/θρεονίνης RIP1, που φέρει την περιοχή DD. Έτσι, σχηματίζεται το σύμπλεγμα Ι (Zhang et al 2000, Baud et al 2001). Το σύμπλεγμα αυτό με τη σειρά του ενεργοποιεί τον NF-kB, p38, MAPK και τα μονοπάτια JNK. Μετά από λίγες ώρες το σύμπλεγμα μεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου με ενδοκύττωση (Higushi et al 1994). Οι περιοχές θανάτου (DDs) των TRADD και RIP1 προκαλούν τη μετανάστευση του κυτταροπλασματικού παράγοντα FADD και αυτό με τη σειρά την ενεργοποίηση της προ-κασπάσης 8. Η υπόλοιπη διαδικασία είναι όπως περιγράφηκε και για τον Fas. Τέλος, σε περίπτωση ενεργοποίησης της απόπτωσης μέσω TRAIL (DR4 & DR5) προσελκύεται ο παράγοντας FADD και ακολούθως οι κασπάσες 8 και 10, που ενεργοποιούν διαφορετικά υποστρώματα (Zhang et al 2000, Kischkel et al 2001). A.11 Κυτταρικός κύκλος Α.11.1 Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο Σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, η ικανότητα αύξησης και πολλαπλασιασμού εξαρτάται από διεργασίες που γίνονται στο κυτταρικό επίπεδο οι οποίες χωρίζονται σε τρεις φάσεις: τη μεσόφαση (που διακρίνεται σε τρεις επιμέρους φάσεις G 1, S, G 2 ), την πυρηνοδιαίρεση (Μ) και την κυτταροδιαίρεση (D). Αυτή η διαδοχική ενορχηστρωμένη διαδικασία εναλλαγής των φάσεων G 1 -S-G 2 -M-D ονομάζεται «κύκλος ζωής του κυττάρου» ή «κυτταρικός κύκλος» (Θωμόπουλος, 1995, Μαρμάρας 1995). Το 1882, ο Flemming περιέγραψε μια διαδικασία πυρηνικής διαίρεσης του κυττάρου που την ονόμασε μίτωση (από τον ελληνικό όρο μίτος που σημαίνει νήμα, κλωστή). Επειδή τα κύτταρα φαίνονταν να είναι ενεργά μόνο στη φάση της μίτωση, ο υπόλοιπος κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίστηκε ως μεσόφαση ή φάση ηρεμίας (interphase). Στην πραγματικότητα όμως κατά τη διάρκεια της μεσόφασης συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δραστηριότητα που προετοιμάζει το κύτταρο για την κυτταρική διαίρεση, με κυρίαρχη την αντιγραφή του γενετικού υλικού (DNA) κατά τη φάση S (Nurse et al 2000). Κατά την μεσόφαση το κύτταρο θεωρείται ότι βρίσκεται σε περίοδο ηρεμίας γιατί φαινομενικά δεν παρατηρείται καμία δράση στον πυρήνα. Στην πραγματικότητα όμως στο στάδιο αυτό συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δράση και οι κυριότερες κυτταρικές διεργασίες που προετοιμάζουν το κύτταρο για κυτταρική διαίρεση. Η φάση G 1 (first gap phase), η οποία παρεμβάλλεται ανάμεσα στην πυρηνική διαίρεση (Μ 65

86 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φάση) και στη σύνθεση του DNA (S φάση) και η φάση G 2 (second gap phase), η οποία λαμβάνει χώρα μεταξύ S και Μ φάσης. Μετά την μεσόφαση το κύτταρο αρχίζει την διαίρεση του. Η μίτωση αντιπροσωπεύει ένα μικρό μόνο τμήμα του κύκλου ζωής ενός κυττάρου. Η δημιουργία των δυο επιπλέον φάσεων, προέκυψε από την ανάγκη ελέγχου της σωστής διαμόρφωσης του DNA και ενδεχόμενης επιδιόρθωσης αυτού (φάση G1), καθώς και ελέγχου και επιδιόρθωσης σφαλμάτων κατά την αντιγραφή του DNA (φάση G 2 ), (Massague 2004, Moeller et al 2005). Οι επιπλέον φάσεις, έχουν ως συνέπεια την αύξηση κατά πολύ του χρόνου ολοκλήρωσης ενός κυτταρικού κύκλου. Στο σχήμα A.24 παριστάνεται διαγραμματικά ο κυτταρικός κύκλος και η χρονική διάρκεια των φάσεων που τον απαρτίζουν. Οι χρόνοι που αναφέρονται είναι ενδεικτικοί και υποδεικνύουν τη σχετική διάρκεια της κάθε φάσης. Σχήμα Α.24 Απλουστευμένη σχηματική αναπαράσταση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (Israels 2000) Όπως φαίνεται από το παραπάνω σχήμα, Α.24 η χρονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται κυρίως από τη φάση G 1. Η φάση G 1 επηρεάζεται από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Όπως για παράδειγμα όταν υπάρχει περιορισμός των θρεπτικών συστατικών ή όταν δίνεται στα κύτταρα το σήμα για τελική διαφοροποίηση, είναι δυνατό κύτταρα που βρίσκονται στη G 1, αντί να προετοιμαστούν για τη σύνθεση του DNA, να εισέρχονται σ ένα στάδιο στασιμότητας, γνωστό ως στάδιο G 0. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται στην G 0 φάση δεν 66

87 ΕΙΣΑΓΩΓΗ είναι ανενεργά, αλλά αντίθετα βρίσκονται σε μία διαρκή διαδικασία πρωτεΐνοσύνθεσης, κίνησης ή έκκρισης ουσιών προς το περιβάλλον, καθώς μπορούν κάτω από κατάλληλα ερεθίσματα να εισέλθουν και πάλι στον κυτταρικό κύκλο. Η φάσης G 1 ελέγχεται από δύο σημεία ελέγχου (checkpoints), το σημείο περιορισμού (restriction point) και το σημείο βλάβης του DNA (G 1 DNA damage checkpoint), (Μαρμάρας 1995, Pollard & Earnshaw 2002, Moeller et al 2005). Η διάρκεια της φάσης S, καθώς και των λοιπών φάσεων G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου ποικίλλει στα διαφορετικά είδη κυττάρων, αλλά όχι σημαντικά σε κύτταρα του ίδιου είδους. Επιπλέον, σε αντίθεση με τη φάση G 1, η διάρκεια των φάσεων αυτών ελάχιστα επηρεάζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος και μπορεί να θεωρηθεί ως σταθερό χαρακτηριστικό κάθε κυτταρικού τύπου. Στην φάσης G2 τα κύτταρα ελέγχουν κάποια βλάβη στο γενετικό υλικό, γνωστό ως το σημείο ελέγχου βλαβών του DΝA της G 2 (G 2 DNA damage checkpoint), με τελικό αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των κινασών που είναι υπεύθυνες για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης. Ο κυτταρικός κύκλος εμφανίζει παύση στη G 2 (G 2 arrest) μέχρις ότου επιδιορθωθεί η βλάβη ή επάγεται η απόπτωση, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατό να επιδιορθωθεί (Pollard & Earnshaw 2002,Yang et al 2005). Α.11.2 Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω των Cdks Πειραματικά δεδομένα δείχνουν πως υπάρχει ένα σύστημα ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που ρυθμίζει την δράση κάθε συγκεκριμένου σταδίου. Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα των θηλαστικών ελέγχεται από τις πρωτεϊνικές κινάσες (Cyclin Dependent Kinases -CDKs): CDK2, CDK4, CDK6 (Morgan et al 1995). Η ενζυμική δραστικότητα των CDKs ρυθμίζεται σε πολλά επίπεδα: με την πρόσδεσή τους στις κυκλίνες, με την ενεργοποίηση από την CAK (Cdk Activating Kinase), με φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση των CDKs, καθώς και με την πρόσδεσή τους στους αναστολείς (CDKIs, CDK inhibitors). Οι πρωτεϊνικές κινάσες ρυθμίζονται λοιπόν από την ενεργοποίηση των κυκλινών και των αναστολέων των CDKs, οι οποίοι με την σειρά τους είτε ενεργοποιούν είτε παρεμπιδίζουν την δραστικότητα του συμπλέγματος CDKs-κυκλίνη. Οι CDKs έχουν την ιδιότητα να συντονίζουν τον κυτταρικό κύκλο, λειτουργώντας ως «μοριακοί διακόπτες». Όταν είναι ενεργές, ο κυτταρικός κύκλος προχωρά στο στάδιο που ελέγχει η συγκεκριμένη Cdk, ενώ το αντίθετο συμβαίνει όταν αυτές είναι ανενεργές (Morgan et al 1997). 67

88 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κυκλίνες αποτελούν μια συνεχώς αυξανόμενη οικογένεια πρωτεϊνών, που παρουσιάζουν ομολογία σε μια περιοχή ~100 αμινοξέων ( κουτί κυκλίνης cyclin box). Στο κουτί των κυκλινών, δεσμεύονται οι πρωτεϊνικές κινάσες προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Χαρακτηριστικό γνώρισμα των πρωτεϊνικών κινασών είναι ότι είναι αυστηρά συντηρημένες και απαιτείται η αντίστοιχη κυκλίνη προκειμένου να ενεργοποιηθούν (Murray et al 1993, Morgan et al 1995). Οι νεοσυντειθέμενες CDKs έχοντας ολοκληρώσει μερικώς την διαμόρφωση της τριτοταγούς τους δομής, με αποτέλεσμα το ενεργό τους κέντρο να παρεμποδίζεται από έναν βρόγχο του T-loop (DeBondt et al 1993). Ταυτόχρονα η ύπαρξη μιας μικρής α-έλικας (PSTAIRE helix) που περιέχει γλουταμικό οξύ και είναι απαραίτητη για τη σύνδεση με το ATP έχει προσανατολισμό, μακριά από την ενεργό κέντρο του ενζύμου, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η φωσφορυλίωση των αντίστοιχων υποστρωμάτων. Η ενεργοποίηση πραγματοποιείται μόνο με τη σύνδεση της CDK με την αντίστοιχη κυκλίνη, αλλάζοντας την στερεοχημική της δομή με συνέπεια την απομάκρυνση του Τ-βρόγχου από το ενεργό κέντρο (Russo et al 1996). Παράλληλα, η α-έλικα επαναπροσανατολίζεται κατά 90º και το γλουταμικό οξύ στρέφεται προς το ενεργό κέντρο και αλληλεπιδρά με το ATP. Ωστόσο, παρά τις παραπάνω αλλαγές, το σύμπλεγμα κυκλίνης-cdk είναι μόνο μερικώς ενεργοποιημένο. Η πλήρης ενεργοποίηση πραγματοποιείται με τη φωσφορυλίωση μιας συντηρημένης θρεονίνης, στη θέση 160 του Τ-βρόγχου, από την CAK, (Cdk Activating Kinase) (Russo et al 1996, Nabel 2002). Η CAK είναι ένα ένζυμο το οποίο αποτελείται από τρεις υπομονάδες, την CDK7, κυκλίνη Η και ΜΑΤ1 (ménage a trois) και είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των κινασών CDK1, CDK2, CDK4 και CDK6 και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Lolli et al 2005). Η φωσφορυλίωση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της καταλυτικής δραστηριότητας του συμπλέγματος Cdkκυκλίνης, περίπου κατά 300 φορές (Jeffrey et al 1995, Pollard & Earnshaw 2002). Σχήμα Α.25 Ενεργοποίηση των CDKs. (Pollard & Earnshaw 2002) 68

89 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η CDK2 προσδένεται στην κυκλίνη Α προκειμένου να ενεργοποιηθεί. Η ενεργοποίηση των CDKs δεν εξαρτάται μόνο από την πρόσδεση τους στις κυκλίνες αλλά υπάρχουν και τουλάχιστον δύο μηχανισμοί αρνητικής ρύθμισης. Ο πρώτος αφορά στη φάση G 2, όπου η δραστηριότητα των CDKs ελέγχεται με τη φωσφορυλίωση δύο αμινοξέων (θρεονίνη 14 και τυρισίνη 15 ) από τις πρωτεϊνικές κινάσες Myt1 και Wee 1 (Yang et al 2005). Η φωσφορυλίωση αυτή παρεμβάλλεται στο σημείο πρόσδεσης του ATP επηρεάζοντας τη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Αντίθετα, αυτές οι ανασταλτικές φωσφορυλιώσεις μπορούν να ακυρωθούν από τη δράση των φωσφατασών Cdc25. Από αυτές η Cdc25A εμπλέκεται στη ρύθμιση της μετάβασης από την G 1 στην S, ενώ οι Cdc25B και Cdc25C από τη G 2 στην Μ (Osmani et al 1997, Meszaros et al 2000). Ο δεύτερος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης των Cdks είναι η αλληλεπίδραση τους με διάφορα μόρια-αναστολείς (CDKIs, CDK inhibitors). Έχουν βρεθεί δύο οικογένειες των CDKIs: η INK4 περιλαμβάνει τέσσερις πρωτεΐνες που παρεμποδίζουν την καταλυτική δράση των πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες εξαρτώνται από την κυκλίνη D(CDK4,CDK6), μέλη της οποίας είναι οι p16 INK4A, p15 INK4B, p18 INK4C και p19 INK4D και η Kip/Cip περιλαμβάνει τρείς πρωτεΐνες που παρεμποδίζουν την δράση των πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες εξαρτώνται από τις κυκλίνες D-E και Α, μέσω μηχανισμών επαγόμενων από την ουβικιτίνη (ubiquitinmediated proteolytic machinery), γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των αντίστοιχων κινασών, με μέλη τους p21 CIP, p27 KIP1 και p57 KIP2 (Russo et al 1998, Brotherton et al 1998, Sherr et al 1999, Pavletich et al 1999). Σχήμα Α.26 Θετική και αρνητική ρύθμιση της ενζυμικής δράσης των Cdks σε διάφορα επίπεδα. (Pavletich N et al., 1999) 69

90 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.11.3 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) Ένα από τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά του κυτταρικού κύκλου είναι η μεγάλη ακρίβεια εκτέλεσης του. Η αξιοθαύμαστη αυτή πιστότητα στην αναπαραγωγή, επιτυγχάνεται με έναν μεγάλο αριθμό μονοπατιών μεταγωγής σημάτων, που είναι γνωστά ως σημεία ελέγχου (checkpoints). Τα σημεία αυτά, ελέγχουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, εξασφαλίζοντας την αλληλεξάρτηση της S φάσης με τη μίτωση, την ακεραιότητα του γονιδιώματος και την πιστότητα του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων. Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, πρέπει να εξασφαλίζει την ολοκλήρωση των γεγονότων σε κάθε φάση, πριν πραγματοποιηθεί η είσοδος στην επόμενη (Hartwell et al 1974, 1989, Nurse et al 2000, Hoffmann et al 2005). Το σημείο ελέγχου G 1 Κατά τη διάρκεια της φάσης G1, το κύτταρο καλείται ν αποφασίσει εάν θα συνεχίσει εκτελώντας έναν ακόμα κυτταρικό κύκλο ή αν θα παραμείνει σε μη διαιρούμενη κατάσταση μόνιμα ή προσωρινά. Το σημείο μεταξύ της αρχικής και της τελικής G 1 φάσης, το οποίο αντιπροσωπεύει την αμετάκλητη δρομολόγηση του κυττάρου προκειμένου να διαιρεθεί, ονομάζεται σημείο περιορισμού (restriction point). Η μεταγωγή σημάτων από τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες, οδηγεί τα κύτταρα που βρίσκονται στην αρχική φάση G 1, είτε να περάσουν το σημείο περιορισμού και να διαιρεθούν, είτε, εξαιτίας ανεπαρκών σημάτων, να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να οδηγηθούν στο σημείο G 0. Τελικά, κατά τη διάρκεια της G 1 φάσης, το κύτταρο παίρνει την απόφαση να διαιρεθεί, να διαφοροποιηθεί ή να πεθάνει (Schafer et al 1998, Ho et al 2002, Sanchez et al 2005, Moeller et al 2005). Όπως γίνεται κατανοητό, η διεκπεραίωση της σωστής απόφασης, περιλαμβάνει πολύπλοκα, αλληλοεξαρτώμενα μονοπάτια, στα οποία οποιοδήποτε λάθος μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση. Πολλά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως και οι θεραπείες που στοχεύουν σε αυτά, μπορούν να συνδεθούν με λάθη στο σημείο αυτό (Nakanishi et al 2006). Δύο συμπλέγματα των Cdks της G 1 φάσης, είναι αυτές που οδηγούν στην αντιγραφή του DNA, CDK4/6-κυκλίνη D και CDK2-κυκλίνη Ε, συνεργάζονται προκειμένου να εμποδίζουν την μεταγραφή ενός δυναμικού συμπλόκου που περιλαμβάνει την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος και τον παράγοντα E2F-1. Η ενεργοποίηση της CDK2, έχει ως αποτέλεσμα την κινητοποίηση ελικασών, πριμασών και πολυμερασών στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο, προκαλώντας το ξεδίπλωμα της διπλής έλικας του DNA και τελικά, την αντιγραφή αυτού. Ένας από τους 70

91 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μηχανισμούς, ο οποίος ελέγχει τη δραστικότητα της CDK2, είναι αυτός που βασίζεται στον περιορισμό της παροχής κυκλίνης Ε. Η έκφραση της κυκλίνης αυτής εξαρτάται από τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας Ε2F, (Early gene Factor 2) (Massague, 2004). Στα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση της μίτωσης ή μόλις έχουν βγει από αυτή, οι παράγοντες Ε2F, αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Rb, (retinoblastoma), ή με μέλη της οικογένειας στην οποία ανήκει. Η οικογένεια αυτή, ονομάζεται πρωτεΐνες τσέπης και εκτός από την Rb, περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες p107 και p130 (Stevaux et al 2002). Οι κυκλίνες τύπου D, (D1, D2 και D3)., αλληλεπιδρούν με τις CDK4, CDK6, δημιουργώντας ολοένζυμα-σύμπλοκα, που φωσφορυλιώνουν την Rb (Sherr 1995). Η Rb, είναι δυνατό να φωσφορυλιωθεί και από την κυκλίνη Ε-CDK2. Η φωσφορυλίωση της Rb από τις παραπάνω κινάσες, έχει σαν αποτέλεσμα την αποδέσμευσή της από τους E2F, επιτρέποντας έτσι μεταγραφή που εξαρτάται από αυτούς, δημιουργώντας έτσι, έναν μηχανισμό ανάδρασης, που βοηθάει στην είσοδο στη φάση S, όταν υπάρχει αρκετή ποσότητα ενεργού CDK2 (Israels et al 2000, Sears et al 2002, Massague 2004). Στην εικόνα Α.27 παρουσιάζεται διαγραμματικά το σημείο ελέγχου G 1. Σχήμα Α.27 Διαγραμματική αναπαράσταση του G 1 σημείου ελέγχου Israels και Israels, (Sears και Nevins, 2002) Είναι ευνόητο, πως το μονοπάτι Rb/E2F δεν είναι το μοναδικό που παίζει ρόλο στη μετάβαση του κυττάρου από τη G 1 στην S φάση. Το παραπάνω σχήμα αποτελεί μια υπεραπλούστευση των γεγονότων και διαδικασιών που συμβαίνουν σε αυτό το σημείο ελέγχου. Στην πραγματικότητα, ένας μεγάλος αριθμός μονοπατιών μεταγωγής σήματος, παίρνει μέρος στην απόφαση του κυττάρου να διαιρεθεί ή όχι. 71

92 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Για παράδειγμα η μπορεί να φωσφορυλιώσει τον παράγοντα FoxO1 εμποδίζοντας την μεταγραφική του ικανότητα. Στο σημείο αυτό θα ήταν ενδιαφέρον να αναφερθεί η εμπλοκή του ογκογονιδίου c-myc και του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, τα οποία επηρεάζουν άμεσα τις διαδικασίες στο σημείο αυτό (Σχήμα Α.27). Ειδικότερα το p53 παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των βλαβών του DNA στο τέλος της G 1 και πριν το κύτταρο προχωρήσει στην S (DNA damage G 1 checkpoint). Η οποιαδήποτε βλάβη του DNA ανιχνεύεται από ορισμένες κινάσες της οικογένειας PIK3 (phosphatidylinositol 3 kinase), όπως η ATM (ataxia-telangiectasia - mutated), η ATR (Rad-3 related) και η DNA-PK (DNA dependent protein kinase), οι οποίες φωσφορυλιώνουν το p53 απομακρύνοντας το από την ογκοπρωτεΐνη MDM 2 με την οποία είναι συνδεδεμένο σε ανενεργή κατάσταση και αυξάνοντας δραματικά τα επίπεδα του στον πυρήνα (Moeller et al 2005, Houtgraaf et al 2006). Το p53 αποτελεί έναν μεταγραφικό παράγοντα, ο οποίος ενεργοποιεί μια σειρά γονιδίων, μεταξύ των οποίων και τον αναστολέα των CDKs p21 cip1 με τον οποίο επάγεται παύση του κυτταρικού κύκλου στη G 1 (G 1 arrest) προκειμένου να επιδιορθωθεί η βλάβη. Σε περίπτωση ανεπιτυχούς επιδιόρθωσης, το p53 συμμετέχει στην ενεργοποίηση άλλων μονοπατιών που οδηγούν το κύτταρο σε απόπτωση (σχήμα Α.28). Σχήμα Α.28 Μονοπάτια μεταγωγής σήματος στο G 1 σημείο ελέγχου 72

93 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το σημείο ελέγχου S (intra-s checkpoint) Όπως στη φάση G1, έτσι και στην S, υπάρχουν μηχανισμοί ελέγχου των βλαβών του DNA. Όπως και στο σημείο ελέγχου G 1, η οποιαδήποτε βλάβη του DNA ανιχνεύεται από τις κινάσες ΑΤΜ/ΑΤR, που ενεργοποιούν τις εκτελεστικές κινάσες Chk1 και Chk2, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τη φωσφατάση Cdc25Α και την απενεργοποιούν. Με τον τρόπο αυτό αποτρέπεται η ενεργοποίηση της κυκλίνης CDK2 και καθυστερεί η αντιγραφή του γενετικού υλικού (αναστέλλοντας τη σύνδεση της Cdc45 στη χρωματίνη, η οποία με τη σειρά της επάγει τη σύνδεση της πολυμεράσης στα προαντιγραφικά συμπλέγματα δίνοντας έτσι χρόνο για επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Το σημείο ελέγχου G 2 Στη φάση G1 το κύτταρο αποφασίζει, όπως προαναφέρθηκε, αν θα προχωρήσει ή όχι σε έναν επόμενο κυτταρικό κύκλο. Στην φάση G 2 το κύτταρο καλείται να πάρει μια δεύτερη σημαντική απόφαση: αν είναι ασφαλές να προχωρήσει σε μίτωση και σε διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων. Εφόσον υπάρχει κάποια βλάβη του DNA προτού διαχωριστούν οι αδερφές χρωματίδες, οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις γενετικές πληροφορίες από τη «σωστή» χρωματίδα προκειμένου να διορθώσουν εκείνη που έχει υποστεί βλάβη. Για τον λόγο αυτόν τα κύτταρα χρησιμοποιούν το σημείο ελέγχου G 2, που είναι γνωστό ως G 2 -M, για την παρεμπόδιση της διαδικασίας της μίτωσης, εάν έχουν υποστεί κάποια βλάβη κατά τη διάρκεια της G 2 φάσης ή εάν έχουν εισέλθει στη φάση αυτή με κάποια βλάβη από τις προηγούμενες, S ή G 1. Η συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G 2, μπορεί επίσης να αντανακλά το σημείο ελέγχου της αντιγραφής του DNA (intra S checkpoint), και κατά το οποίο, γίνονται αντιληπτά τμήματα DNA που στην προηγούμενη φάση S, δεν αντιγράφηκαν σωστά ή πλήρως. Κατά την βλάβη του DNA στη G2 ανιχνεύεται μια πρωτεΐνη- κλειδί η Claspin η οποία προάγει την φωσφορυλίωση μέσω του μονοπατιού των κινασών ATM/ATR που έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κινάσης Chk1 (Harper and Elledge, 2007). Η Chk1 στη συνέχεια φωσφορυλιώνει την φωσφατάση Cdc25C, που αποτελεί βασικό επαγωγέα της μίτωσης και την απενεργοποιεί. Παράλληλα, στην απενεργοποίηση της φωσφορυλιωμένης Cdc25C συμβάλλει και η σύνδεση μιας ομάδας πρωτεϊνών σ, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να φωσφορυλιώνουν σερίνες. Η σύνδεση της Cdc25C με τις παραπάνω πρωτεΐνες, έχει ως αποτέλεσμα τη 73

94 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διάσπαση της στο κυτταρόπλασμα και κατ επέκταση την αναστολή της μίτωσης (Pollard & Earnshaw 2002, Yang et al 2005, Houtgraaf et al 2006). Από την άλλη μεριά η φωσφορυλίωση του p53 από τις ATM/ATR οδηγεί, όπως και στη φάση G 1, σε αύξηση του αναστολέα p21, ο οποίος αναστέλλει την έναρξη της πρόφασης, απενεργοποιώντας το σύμπλεγμα CDK1-κυκλίνης Α. Ο αναστολέας p21 φάση G 2 -M αποικοδομείται με oυβικιτυνιλίωση διαμέσου του συμπλέγματος APC/C (Anaphase Promoting Complex ή Cyclosome), (Amador et. al., 2007). Επιπλέον, ένας άλλος στόχος του p53 είναι και η πρωτεΐνη σ, η οποία συνδέεται με το σύμπλεγμα CDK1-κυκλίνης Β, με αποτέλεσμα την παραμονή του στο κυτταρόπλασμα, παρεμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα για την έναρξη της μίτωσης. Το σύμπλεγμα σ/ CDK1-κυκλίνης Β περιέχει επίσης και την ανασταλτική κινάση Wee1, που αποτελεί επιπλέον ασφαλιστική δικλείδα για τη διατήρηση του σε ανενεργό κατάσταση (Kastan and Bartek 2004). Στην εικόνα Α.29 παριστάνονται διαγραμματικά τα διαφορετικά μονοπάτια του σημείου ελέγχου της G2. Κατά τη διάρκεια της μίτωσης και της επακόλουθης κυτταροκίνησης, τα χρωμοσώματα και το κυτταρόπλασμα διαιρούνται σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων ελέγχεται από το σημείο ελέγχου της μετάφασης (metaphase checkpoint), που καθυστερεί το διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων, μέχρις ότου τα χρωμοσώματα έχουν ευθυγραμμιστεί πλήρως στη μιτωτική άτρακτο. Το σημείο αυτό ονομάζεται επίσης και σημείο ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoint). 74

95 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σχήμα Α.29 Σχηματική αναπαράσταση του G 2 σημείου ελέγχου Από όλα τα παραπάνω γίνεται κατανοητό, πως υπάρχουν πάρα πολλά κυτταρικά μονοπάτια που αλληλοσυνδέονται ελέγχοντας τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Επομένως, είναι αναγκαία η κατανόηση τους, προκειμένου να γίνει αντιληπτός ο μηχανισμός της καρκινογένεσης και της ανάπτυξης κατάλληλων θεραπευτικών αγωγών. 75

96 ΣΚΟΠΟΣ ΣΚΟΠΟΣ Τα τελευταία χρόνια έχουν δημοσιευτεί πολλές μελέτες αναφορικά με την δομή του ριβοσώματος τόσο σε προκαρυωτικούς όσο και σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Για τους μεν προκαρυωτικούς οργανισμούς υπάρχει πληθώρα πληροφοριών τόσο για την δομή όλης της μοριακής μηχανής, του ριβοσώματος, όσο και για τα επί μέρους συστατικά της, τις πρωτεΐνες και το rrna. Αντίθετα, για το ευκαρυωτικό ριβόσωμα λόγω της μεγαλύτερης πολυπλοκότητας του κυττάρου υπάρχουν ακόμη αρκετά κενά αναφορικά με την ριβοσωμική λειτουργία, την βιογένεση, και τέλος την εμπλοκή κάποιων συγκεκριμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν ταυτίζονται άμεσα με την μετάφραση (μη ριβοσωμικές λειτουργίες). Από προηγούμενες μελέτες μας βρέθηκε ότι η S5 ριβοσωμική πρωτεΐνη από ποντίκι φωσφορυλιώνεται στην αμινοτελική της περιοχή από την κινάση της καζεΐνης II, αλλά δεν είχαν εντοπιστεί τα αμινοξέα στόχοι, ούτε μια πιθανή λειτουργική συσχέτισή τους με την ενδοκυτταρική κυκλοφορία της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα τα ερωτήματα που προέκυψαν ήταν τα εξής: α. Πώς μεταφέρεται η πρωτεΐνη αυτή - από το κυτταρόπλασμα στο οποίο βιοσυντίθεται στους πυρήνες και περαιτέρω στους πυρηνίσκους ; β. Υπάρχουν δομικά στοιχεία τα οποία εμπλέκονται άμεσα σε αυτή τη διαμετακίνηση; γ. Ποια είναι τα αμινοξέα της S5 που αποτελούν υπόστρωμα για την κινάση της καζεΐνης II; δ. Ποια είναι η λειτουργική σημασία αυτών των φωσφορυλιώσεων; Είναι απαραίτητες αυτές οι μεταφραστικές τροποποιήσεις για την ενδοκυτταρική κυκλοφορία της πρωτεΐνης; Στα πλαίσια της εμπλοκής των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε λειτουργίες που δεν σχετίζονται με την μετάφραση αποκλειστικά ( μη- ριβοσωμικές λειτουργίες ) και σε συνέχεια προηγούμενων ερευνών μας,διερευνήθηκε ο ρόλος της rps5 στην έναρξη του προγράμματος κυτταρικής διαφοροποίησης και απόπτωσης. 76

97 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1 ΥΛΙΚΑ Β.1.1. Βιολογικά υλικά Χρησιμοποιήθηκαν ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL-745 AC από ποντίκι. Η κυτταρική σειρά MEL παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής. Παραχωρήθηκαν επίσης από το ίδιο εργαστήριο και κύτταρα MEL μόνιμα επιμολυσμένα με τον πλασμιδιακό φορέα pcdna-3.1 rps5 (κλώνος C14), (Matragkou, Papachristou et al. 2008). Χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP-10 (Invitrogen Life Technologies), XL1/B (Stratagene, La Jolla, CA, USA) και BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies). Β.1.2 Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών Για τις κυτταρικές καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα υλικά και αντιδραστήρια: Υλικό καλλιέργειας DMEM 1Χ, (Dulbecco s Modified Eagle Medium) με L- γλουταμίνη, (Gibco BRL, U.S.A, ) Μίγμα αντιβιοτικών πενικιλίνης, στρεπτομυκίνης και Βόειος εμβρυϊκός ορός (Fetal Bovine Serum- E.U approved Gibco BRL, ) Διάλυμα Trypan Blue 0.4% (Sigma-Aldrich, Inc, Saint Louis Missouri, U.S.A, T8154) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS 10X ph=7.2, Gibco BRL, ). Όλα τα αναλώσιμα των κυτταρικών καλλιεργειών (τρυβλία καλλιέργειας, φλάσκες, τρυβλία πολλαπλών πηγαδιών, σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια, αντικειμενοφόρες πλάκες κ.α), προμηθεύτηκαν από τις εταιρίες Corning (Inc, N.Y, U.S.A) και VWR Int. (Inc, West Chester,U.S.A). 77

98 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1.3 Χημικά αντιδραστήρια Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell, (Dassel, Germany) και οι μεμβράνες PVDF, (Polyvinylidene difluoride-immobilon) της εταιρείας Millipore, (Bedford, U.S.A.). Το ισότοπο [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmole ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Για τις αυτοραδιογραφίες χρησιμοποιήθηκαν ακτινογραφικά φιλμ τύπου Kodak-X- Omat S film, της εταιρείας Kodak, ενώ της ίδιας εταιρείας ήταν και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ X-Ray developer και X-Ray fixer, αντίστοιχα. Tα σφαιρίδια αγαρόζη-g της εταιρίας Upstate, (Protein G Agarose, Fast Flow, , USA). Β.1.4 Υλικά χρωματογραφίας Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST), χρησιμοποιήθηκε το υλικό χρωματογραφίας αγχιστείας σεφαρόζηγλουταθειόνη της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd, (Glutathione Sepharose 4B, , Buckinghamshire, UK). Το υλικό χρωματογραφίας που χρησιμοποιήθηκε για την in vivo φωσφορυλίωση, (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) που χρησιμοποιήθηκε ήταν ευγενική προσφορά από την Dr. R Kamp του τεχνικού πανεπιστημίου του Βερολίνου. B.1.5 Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προμηθεύτηκαν από την NEBiolabs, (Beverly, USA) και από την Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). Η πολυμεράση Expand long polymerase και το Rapid DNA ligation kit ήταν από την εταιρεία Roche. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε πολυμεράση BIOTAQ DNA Polymerase εταιρείας Bioline (BIO ), καθώς και το Robus RT PCR kit (F-580S) της εταιρείας Finnzymes. 78

99 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα της in vitro φωσφορυλίωσης ήταν προϊόν της εταιρίας NEBiolabs ( Units P6010S). Τα αντισώματα έναντι της κινάσης της καζεΐνης II, της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6, και τoυ non-phospho-src (Tyr416) ήταν των εταιρειών Abcam (ab70774), Acris (AP02734PU-S) και Cell Signaling (#2101), αντίστοιχα. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την αποσιώπηση του γονιδίου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 από ποντίκι ήταν της εταιρίας Qiagen. Για την απομόνωση RNA χρησιμοποιήθηκε το Kit NucleoSpin RNA/protein, (50 preps ) της εταιρίας Macherey-Nagel. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με κυτταρομετρία ροής, (FACS-Flow Cytometry Analysis) χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια Ανεξίνη V, (Annexin V-FITC/7- ΑΑD kit for flow cytometry, PN IM tests, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) για την μέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων, καθώς για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου το προπίδιο-ιωδίδιο, (DNA Prep Reagent Kit PN , Beckman Coulter, UK). Οι πλασμιδιακοί φορείς pegfp-c1 και PEGFP-N1 χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP, (Green Fluorescence Protein) και ήταν της εταιρείας Novagen. Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech. Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Το γονίδιο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 από ποντίκι, κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pbluescript, παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής, (Dr. Ι.Βιζιριανάκης). Επίσης, παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Dr.Huang και Dr.Danyang το γονίδιο της πρωτεΐνης κλωνοποιημένο στον ευκαρυωτικό φορέα pegfpc1. Το μονοκλωνικό αντίσωμα IgG 1 έναντι του myc επιτόπου ήταν από την εταιρεία Invitrogen (R ), ενώ το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της τομπουλίνης, (a-tubulin IgM, TU-16, sc-51503), ήταν της εταιρείας Santa Cruz. Tο πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του C-τελικού άκρου της rps5, ήταν ευγενική προσφορά του Dr.Fukushi και των συνεργατών του. Τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για Western blot ανάλυση ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc., 79

100 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Temecula, CA USA). Τα αντισώματα αυτά ήταν συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνουν τη χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση. Οι αναστολείς για πρωτεάσες των ευκαρυωτικών κυττάρων (λευπεπτίνη, πεπστατίνη, αποπροτινίνη κ.α.) είναι της εταιρίας Sigma-Aldrich, Inc., (Protease Inhibitor Cocktail, P8340). Β.2 ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.1 Καλλιέργεια των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL Τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ποντικού MEL, (murine erythroleukemia cells), ή κύτταρα Friend, απομονώθηκαν αρχικά από την Dr.Charlotte Friend και τους συνεργάτες της το 1966, από κυτταρικές αποικίες, (foci), που εμφανίστηκαν στη διογκωμένη σπλήνα πειραματόζωων, (ποντίκια DAB/ 2J), τα οποία είχαν εμβολιαστεί με τον λευχαιμικό ιό Friend. Ο κλώνος που χρησιμοποιήθηκε στην προκείμενη διδακτορική διατριβή είναι ο MEL-745 PC-4. Ο κλώνος αυτός απομονώθηκε από τον αρχικό κλώνο της Charlotte Friend, από τους (Gusella, Geller et al. 1976; Gusella and Housman 1976). Τα κύτταρα αυτά αναπτύχθηκαν σε εν αιωρήσει κυτταροκαλλιέργειες (suspension cultures) σε θρεπτικό υγρό DMEM (Dulbeco s Modified eagle medium) που περιείχε 10% v/v ορό εμβρύου μόσχου, (fetal bovine serum, FBS), καθώς και μίγμα αντιβιοτικών 100 μg/ml βένζυλο πενικιλίνης και 100 μg/ml στρεπτομυκίνης για την αναστολή ανάπτυξης μυκήτων και μικροβίων. Η ανάπτυξη έγινε σε κατάλληλο επωαστήρα, (water-jacketed incubator της Forma Scientific, Inc., U.S.A.) στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με υδρατμούς και με σταθερή παροχή 5% CO 2. Τα κύτταρα διατηρούνται σε συγκεντρώσεις 5x10 4-1x10 7 κύτταρα/ml και προκειμένου να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, αραιώνονται κάθε 48 ώρες με φρέσκο θρεπτικό υλικό. Η επαγωγή της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων έγινε με την προσθήκη 5 mm HMBA για 96 h, σε καλλιέργεια με αρχική συγκέντρωση 10 Στα επιμολυσμένα κύτταρα (κλώνοι C14, C56) προστέθηκε επιπλέον το αντιβιοτικό επιλογής geneticin (G-418), της εταιρίας Invitrogen (catalog number ) σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml, που είναι ανάλογο της νεομυκίνης. 5 κύτταρα/ml. 80

101 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.2 Προσδιορισμός του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης Για τον προσδιορισμό του ρυθμού της κυτταρικής ανάπτυξης των MEL στις καλλιέργειες, γίνεται μέτρηση του αριθμού των κυττάρων ανά μονάδα όγκου, (ml), θρεπτικού υγρού σε διάφορες χρονικές στιγμές (0.2,4,8,12,16,24,48,72,96 ώρες). Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιμοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (100x) (American Optical Corp., USA) ώστε να προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την μέτρηση των κυττάρων είναι αιμοκυτταρόμετρο, (πλάκα Neubauer) και καλυπτρίδες, (Thomas). Τοποθετούμε μια σταγόνα κυττάρων στην ειδική εσοχή κάτω από την καλυπτρίδα στο αιμοκυτταρόμετρο. Όπως φαίνεται στο σχήμα Β.1 η περιοχή με τις γραμμώσεις στο αιμοκυτταρόμετρο διαιρείται σε 9 μεγάλα τετράγωνα με πλευρά 1 mm το καθένα. Το κεντρικό μεγάλο τετράγωνο υποδιαιρείται σε άλλα 25 τετράγωνα μετρίου μεγέθους και το καθένα από αυτά υποδιαιρείται σε άλλα 16 μικρά τετράγωνα. Τα μικρά τετράγωνα έχουν πλευρά 1 20 mm και ο χώρος της πλάκας μέτρησης έχει βάθος 1 10 mm, (σχήμα Β1). Μετρώντας τα κύτταρα προτιμώνται τα τέσσερα γωνιακά όπως φαίνεται στο σχήμα. Πολλαπλασιάζεται ο ολικός αριθμός κυττάρων επί Ο αριθμός αυτός δίνει τον αριθμό των κυττάρων σε κάθε κυβικό χιλιοστόμετρο της καλλιέργειας. Σχήμα Β.2.1. :Σχηματική αναπαράσταση του αιμοκυτταρόμετρου Neubauer Β.2.3 Προσδιορισμός των διαφοροποιημένων κυττάρων MEL με τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 Η μέθοδος βασίζεται στην εκλεκτική αντίδραση και χρώση των κυττάρων MEL με διάλυμα βενζιδίνης και H 2 O. Τα κύτταρα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη δηλαδή τα διαφοροποιημένα κύτταρα βάφονται κυανά (Bz + ), ενώ τα αδιαφοροποίητα δεν χρωματίζονται. 81

102 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για τη μέθοδο αυτή, η οποία αποτελεί τροποποίηση της μεθόδου που έχει προταθεί από τον (Orkin, Harosi et al. 1975), χρησιμοποιούνται τα πιο κάτω διαλύματα: Διάλυμα Α Υδροχλωρική βενζιδίνη 0,1 gr CH 3 COOH 1,5 ml H 2 O μέχρι 50 ml Το διάλυμα Α φυλάσσεται σε σκοτεινόχρωμο φιαλίδιο στους 4 C και μπορεί να διατηρηθεί για ένα μήνα. Διάλυμα Β H 2 O 2 30% 50 μl H 2 O 450 μl Το διάλυμα Β πρέπει παρασκευάζεται πριν από κάθε προσδιορισμό. Η χρώση των κυττάρων γίνεται ως εξής: Μια σταγόνα κυττάρων, (~1x 10 6 /ml), τοποθετείται σε κατάλληλη υποδοχή, (96 well plate). Στη συνέχεια, προστίθεται μια σταγόνα από το διάλυμα Α και μια από το διάλυμα Β και ακολουθεί ανακίνηση. Κατόπιν, το διάλυμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, το 96 well plate τοποθετείται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και μετρείται τόσο ο συνολικός αριθμός των κυττάρων, (τουλάχιστον κύτταρα), όσο και ο αριθμός των κυττάρων που χρωματίζονται κυανά. Θεωρώντας ότι τα κυανά κύτταρα αντιστοιχούν σε εκείνα που περιέχουν αιμοσφαιρίνη, (διαφοροποιημένα) υπολογίζεται το % ποσοστό των διαφοροποιημένων κυττάρων στην καλλιέργεια, (% Bz + ). ο B.2.4 Μέτρηση του αριθμού των νεκρών κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο με την χρωστική Trypan Blue Σε μία ποσότητα κυττάρων, (~1x 10 6 /ml), που μεταφέρεται σε κατάλληλη υποδοχή, (96 well plate) προστίθεται χρωστική Trypan Blue 0.4%, (Sigma-Aldrich) σε αναλογία 1:1 και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Η χρωστική Trypan Blue έχει την ιδιότητα να διαπερνά μόνον την κυτταρική μεμβράνη των νεκρών κυττάρων και κατά συνέπεια ο αποκλεισμός της χρωστικής από ένα κύτταρο, (Trypan Blue exclusion) αποτελεί απόδειξη ακεραιότητας της κυτταρικής του μεμβράνης. Μετά την επώαση των 5 min, το τρυβλίο με τις 96 θέσεις τοποθετείται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και γίνεται καταμέτρηση τόσο του συνολικού αριθμού των κυττάρων (καταμετρώνται τουλάχιστον κύτταρα), όσο του αριθμού των νεκρών κυττάρων 82

103 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (κυανόχροα). Πρέπει να σημειωθεί ότι με τη μέθοδο αυτή δεν είναι δυνατόν να διευκρινιστεί το είδος του κυτταρικού θανάτου (απόπτωση ή νέκρωση). Β.2.5 Απομόνωση κυτταρικών εκχυλισμάτων από MEL κύτταρα. Tα MEL κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση σε 1000 στροφές/λεπτό, προκειμένου να απομακρυνθεί το μέσο ανάπτυξης, αιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,2 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε dd H 2 O) και φυγοκεντρήθηκαν εκ νέου σε 1000 στροφές/λεπτό. Στο ίζημα προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (βλέπε πιο κάτω) καθώς και αναστολείς πρωτεασών PMSF 1mM και 1μm αναστολείς, [proteases inhibitor cocktail, (Sigma)]. Το διάλυμα λύσης που χρησιμοποιήθηκε είχε την εξής σύσταση: Διάλυμα λύσης κυττάρων, (Lysis buffer,ripa buffer) NaCl 150 mm Tris-Cl ph 7.5 NP mm 0,5 % v/v Deoxyholic acid (Na) 0,5 % v/v Σε 1x10 7 κύτταρα, προστίθενται ~ 600μl διαλύματος λύσης. H λύση των κυττάρων έγινε ή με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, (ενδιάμεσα μεσολαβούσε κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ), ή με μηχανική διάρρηξη των μεμβρανών, (με τη χρήση potter). Και στις δύο περιπτώσεις ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε x g, για 15 λεπτά και συλλογή του υπερκειμένου (ολικό κυτταρόπλασμα). Β.2.6 Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA από MEL κύτταρα Β Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με την μέθοδο της φαινόλης Για τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα εξής διαλύματα: 83

104 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Διάλυμα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) NaCl 0,14 M MgCl 2 1,5 mm Τris-Cl ph mm NP-40 0,1 % v/v Ριβονουκλεοζιτικά σύμπλοκα του βαναδίου, (VRC), 10 mm Διάλυμα 2xPK Tris-Cl ph 7.5 0,2 M EDTA ph mm NaCl 0,3 M SDS 2 % w/v Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1X). Στη συνέχεια, προστίθενται 0,25 ml διαλύματος λύσης, για μία ποσότητα 1x10 7 κυττάρων. Ακολουθεί μηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 δευτερόλεπτα και τα κύτταρα λύονται κατά την διάρκεια της παραμονής τους στον πάγο. Στη συνέχεια το αιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται προσεκτικά (χωρίς να αναμειχθεί) σε σωλήνα φυγοκέντρησης που περιέχει ίσο όγκο διαλύματος λύσης με επιπλέον 24 % w/v σουκρόζη ελεύθερη RNάσης και 0,2 % v/v NP-40, αφήνεται στον πάγο για 5 λεπτά και αμέσως μετά φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, παραλαμβάνεται προσεκτικά η πάνω στοιβάδα, μεταφέρεται σε νέον σωλήνα, και προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος 2 x PK και πρωτεϊνάσης Κ, (200μg/ml). Το διάλυμα που προκύπτει, επωάζεται στους 37 ο C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, απομακρύνονται οι πρωτεΐνες, εκχυλίζοντας το μίγμα δυο φορές με ίσο όγκο φαινόλης/ χλωροφορμίου/ ισοαμυλικής αλκοόλης, (σε αναλογία 25:24:1), και μια φορά με χλωροφόρμιο / ισοαμυλική αλκοόλη, (24:1). Στην υδατική στοιβάδα που παραλαμβάνεται, (επάνω στοιβάδα), προστίθεται διάλυμα CH3COONa ph 5,2, σε τελική συγκέντρωση 0,3 Μ, και 2,5 όγκοι ψυχρής απόλυτης αιθανόλης, προκειμένου να γίνει η κατακρήμνιση του RNA. Το διάλυμα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Το RNA που παραλαμβάνεται σαν λευκό ίζημα, ξεπλένεται μια φορά με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται 84

105 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και στη συνέχεια διαλύεται σε αποστειρωμένο δις-απεσταγμένο νερό που έχει υποστεί κατεργασία με πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC) (Sambrook et al., 1989). B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με τη μέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην ιδιότητα θειοκυανικής γουανιδίνης να αποδιατάσσει μακρομόρια και να αναστέλλει την δράση νουκλεασών, (Feramisco, Smart et al. 1982). Για τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται τα εξής διαλύματα: Διάλυμα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) Θειοκυανική γουανιδίνη 4 Μ Κιτρικό Νάτριο ph ,2 mm N-lauroylsarcosine 0,528 % v/v Το διάλυμα λύσης φυλάσσεται στους -20 ο C πριν από τη χρήση του. Όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, αφού ξεπαγώσει, «ενεργοποιείται» με την προσθήκη μερκαπτοαιθανόλης 0,1 M, (0,72 ml για 100 ml διαλύματος λύσης). Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, προστίθενται 3 ml διαλύματος λύσης για μία ποσότητα 1x10 7 κυττάρων. Μετά από 5 λεπτά, αφού γίνει η λύση των κύτταρων, προστίθενται 0,5 ml CH 3 COONa 2 Μ, ph 4,2, 3 ml όξινης φαινόλης και 2 ml διαλύματος χλωροφορμίου/ ισοαμυλικής αλκοόλης, (24:1). Μετά την προσθήκη κάθε αντιδραστηρίου, ακολουθεί έντονη μηχανική ανακίνηση (vortex) για 10 sec και τελικά τα κύτταρα αφήνονται να παραμείνουν στον πάγο για 15 λεπτά. Κατόπιν, ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C για 20 λεπτά σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή). Στη συνέχεια, η υδατική στιβάδα, (η οποία περιέχει το RNA), χωρίζεται σε μικρότερες ποσότητες και μεταφέρεται σε νέο σωλήνα, προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης, το διάλυμα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. 85

106 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Το RNA που παραλαμβάνεται (λευκό ίζημα), ξεπλένεται μια φορά με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται και στη συνέχεια διαλυτοποιείται σε ~20 μl αποστειρωμένου διςαπεσταγμένου νερού, που έχει υποστεί κατεργασία με πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC). B Απομόνωση κυτταροπλασματικού RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein της εταιρίας Macherey-Nagel Η απομόνωση του RNA με το kit NucleoSpin RNA/protein στηρίζεται στην μέθοδο απομόνωσης με θειοκυανική γουανιδίνη. Το διάλυμα λύσης που χρησιμοποιείται για ποσότητα 5Χ10 6 κυττάρων περιέχει χαοτροπικά ιόντα σε υψηλές συγκεντρώσεις, προκειμένου να απενεργοποιηθούν ένζυμα όπως πρωτεάσες και RNases. Το διάλυμα λύσης διαλυτοποιεί δυσδιάλυτες πρωτεΐνες και δημιουργεί τις κατάλληλες συνθήκες για την προσκόλληση του RNA στο προσροφητικό υλικό (silica membrane) και για την διέλευση των πρωτεϊνών από την στήλη NucleoSpin. Η μεν απομάκρυνση του DNA από το προσροφητικό υλικό γίνεται με την χρήση του ενζύμου rdnase, η δε απομάκρυνση αλάτων, μεταβολιτών και διαφόρων άλλων μακρομορίων γίνεται με πλύσιμο της στήλης με δύο διαφορετικά διαλύματα. Η έκλουση του RNA πραγματοποιείται με συνθήκες χαμηλής ιονικής ισχύς με αποστειρωμένο νερό που δεν περιέχει RNAases ( RNase-free water). H διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Καλλιέργεια κυττάρων 5x10 6 MEL φυγοκεντρείται στα 900 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές (5 λεπτά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, προστίθενται 350 μl διαλύματος λύσης RP1 και 3,5 μl μερκαπτοαιθανόλη. Μετά την προσθήκη του διαλύματος λύσης, ακολουθεί έντονη μηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 δευτερόλεπτα και στην συνέχεια το ιξώδες μίγμα αφήνεται να διέλθει μέσω στήλης NucleoSpin Filter units. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g στους 4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή), απομακρύνεται η στήλη NucleoSpin Filter units, προστίθενται 350 μl ψυχρής αιθανόλης 70% και γίνεται ήπια ομογενοποίηση του μίγματος (pipetting up and down). Ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στην στήλη NucleoSpin RNA/Protein, (παρέχεται από την εταιρεία) και φυγοκεντρείται για 30 δευτερόλεπτα σε x g στους 4 ο C. Το RNA και το DNA 86

107 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ δεσμεύονται στο προσροφητικό της στήλης ενώ η ολική πρωτεΐνη απομακρύνεται με τη φυγοκέντρηση. Για την έκλουση του RNA ακολουθούνται τα εξής περαιτέρω στάδια: Για την αφαλάτωση του προσροφητικού υλικού, στο οποίο προσδέθηκαν το RNA και το DNA, προστίθενται 350 μl MDB (Membrane Desalting Buffer) και γίνεται φυγοκέντρηση σε 11,000 x g για1 λεπτό. Η απομάκρυνση του DNA γίνεται με επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με το ένζυμο rdnaase, (95 μl rdnase reaction mixture). Ακολουθούν τρία πλυσίματα της στήλης NucleoSpin RNA/Protein. Το πρώτο πλύσιμο γίνεται με προσθήκη του διαλύματος RA2 200 μl και φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στους 4 ο C σε 11,000 x g και το δεύτερο πλύσιμο πραγματοποιείται με την προσθήκη RA3 600 μl και έπειτα φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στους 4 ο C σε 11,000 x g. Ακολουθεί το τρίτο πλύσιμο της στήλης με το διάλυμα RA3, 350 μl, φυγοκέντρηση για 2 λεπτά και μια επιπλέον φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στους 4 ο C σε 11,000 x g. Η έκλουση του RNA πραγματοποιείται με προσθήκη 40 μl αποστειρωμένου νερού που δεν περιέχει RNAases, (RNase-free water) και ακολουθεί φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στους 4 ο C σε x g, (NucleoSpin RNA/Protein User manual, Macherey-Nagel). Στην συνέχεια, ηλεκτροφορείται σε 1,2 % φορμαλδεΰδης- αγαρόζη μια μικρή ποσότητα (2 μl-5 μl) από το εκλουόμενο RNA προκειμένου να ελεχθεί η καθαρότητα του και παράλληλα φωτομετρείται μια άλλη ποσότητα σε φωτόμετρο, Carywin UV Conc. Package, (παράγραφος Β.2.7). Το RNA που παραλαμβάνεται χρησιμοποιείται σε εφαρμοσμένες τεχνικές όπως στην Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης τρανσκριπτάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR, παράγραφος Β.2.21). Για την απομόνωση πρωτεϊνών ακολουθούνται τα εξής περαιτέρω στάδια. Όπως αναφέρθηκε, μετά την διαβίβαση του συνολικού όγκου στην στήλη NucleoSpin RNA/Protein τα νουκλεϊκά οξέα προσδένονται στο προσροφητικό της στήλης ενώ οι πρωτεΐνες απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Σε μια κατάλληλη ποσότητα ( μl) προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος PP (Protein Precipitator) και γίνεται ισχυρή ανάδευση. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 11,000 x g στους4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 κεφαλή) και στην συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο. Κατόπιν, προστίθενται 500 μl 50% ψυχρής αιθανόλης για πλύσιμο του ιζήματος (pellet) και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 11,000 x g. Έπειτα γίνεται ξήρανση 87

108 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ του ιζήματος για 5 με 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προσθήκη μl PLB-TCEP (Protein Loading Buffer που έχει αναγωγικές ιδιότητες) ανάλογα με την ποσότητα του ιζήματος. Ακολουθεί επώαση για 3 λεπτά στους ο C για την διαλυτοποίηση και αποδιάταξη των πρωτεϊνών, (NucleoSpin RNA/Protein User manual, Macherey-Nagel 2007). Οι πρωτεΐνες που απομονώνονται μπορούν να ηλεκτροφορηθούν σε PAGE-SDS ηλεκτροφόρηση και στην συνέχεια να ηλεκτρομεταφερθούν σε μεμβράνη για ανοσοανίχνευση. Β.2.7 Μέθοδος φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης νουκλεϊκών οξέων Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος. Έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA μια μικρή ποσότητα του δείγματος (2-3 μl) που πρόκειται να αναλυθεί αραιώνεται με αποστειρωμένο νερό (800 μl) και στη συνέχεια μετρείται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Λαμβάνοντας υπόψη ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm (1 OD 260 ) αντιστοιχεί με 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίζουμε την ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγμα (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμάται από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm (OD 260 /OD 280 ), διότι τα δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο περίπου 2. Β.2.8 Υποκυτταρική κλασμάτωση των MEL κυττάρων Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην λύση των κυττάρων με τη βοήθεια απορρυπαντικού και στον διαχωρισμό του διαλυτού κλάσματος από τα διάφορα πυρηνικά εκχυλίσματα, (Jiang, Wilford et al. 2001). Συλλέγεται ποσότητα κυττάρων 5 Χ 10 6, ξεπλένεται με ισότονο διάλυμα PBS, φυγοκεντρείται και αιωρείται σε 100 μl διαλύματος Α (20 mm Hepes-KOH ph 7,5, 100 mm KCl, 5% σουκρόζη, 1 mm DTT). Στο αιώρημα προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος 88

109 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α,το οποίο περιέχει και NP-40 0,8% (v/v,τελική περιεκτικότητα σε ΝΡ-40 0,4%) και τα κύτταρα παραμένουν για 10 λεπτά στον πάγο. Το απορρυπαντικό προστίθεται προκειμένου να σπάσουν μόνον οι κυττροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων και όχι και οι πυρηνικές. Στη συνέχεια το αιώρημα φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 4300 x g και συλλέγεται το υπερκείμενο (το διαλυτό κλάσμα του κυτταροπλάσματος). Το ίζημα επαναιωρείται σε 100 μl διαλύματος Α, επιστοιβάζεται σε μαξιλάρι σουκρόζης (1,2 ml διάλυμα A με 0,8 Μ σουκρόζη) και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 4300 x g (στο νέο προκύπτον ίζημα βρίσκονται καθαροί πυρήνες). Στους πυρήνες που ξεπλένονται με PBS προστίθενται 100 μλ διαλύματος EB (10 mm PIPES ph 6,8, 250 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2 και αναστολείς πρωτεασών 1 mm PMSF και 1 μm αναστολείς [proteases inhibitor cocktail (Sigma)] και το αιώρημα παραμένει 5 λεπτά στον πάγο. Με την διαδικασία αυτή σπάζουν οι πυρήνες και με μία φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 4300 x g συλλέγεται το υπερκείμενο που αποτελεί το διαλυτό κλάσμα του νουκλεοπλάσματος. Β.2.9 Απομόνωση ριβοσωμάτων από MEL κύτταρα Τα MEL κύτταρα, που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ριβοσωμάτων, (~8 x 10 8 κύτταρα) συλλέχθηκαν από την λογαριθμική φάση τους αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης, μετά από φυγοκέντρηση στις 900 στροφές/λεπτό και πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,2 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η πιο κάτω διαδικασία. Αιώρηση σε 9 ml διαλύματος Α, (20 mm Tris ph 7,4, 100 mm KCl, 10 mm MgCl 2 ) παρουσία αναστολέων cocktail 2 μm, λύση με υπέρηχους (5 κύκλοι διάρκειας 20 δευτερόλεπτα ο κάθε ένας και 40 δευτερόλεπτα στον πάγο μετά από κάθε κύκλο) και φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34) σε rpm (30000g), για 15 λεπτά στους ºC, ώστε 4 να απομακρυνθούν οι μεμβράνες. Παραλαμβάνεται το υπερκείμενο, επιστοιβάζεται σε μαξιλάρι σουκρόζης (10-50% διαβάθμιση σε διάλυμα Α) και φυγοκεντρείται για 3 ώρες στα x g.. Στη συνέχεια μετά από απομάκρυνση του υπερκείμενου το ίζημα αιωρείται, ο (ριβοσώματα) σε 400 μl διαλύματος Α υπό ανάδευση για 12 περίπου ώρες στους 4 C, (Dresios, Aschrafi et al. 2005). 89

110 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 260 και 280nm για προσδιορισμό της ποσότητας και καθαρότητας των ριβοσωμάτων, και στη συνέχεια διαχωρισμός του παρασκευάσματος σε μικρά κλάσματα πριν την αποθήκευσή τους στους 80 º C. Για την κατακρήμνιση ριβοσωμικών πρωτεϊνών ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: Προστίθενται 0,1 όγκοι (CH3COO) 2 Mg 1M και 2 όγκοι οξικού οξέος 100 % και το διάλυμα αναδεύεται για 45 λεπτά μέσα σε πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα x g για 30 λεπτά σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4º C). Το rrna που κατακρημνίζεται απομακρύνεται ενώ στο υπερκείμενο, που περιέχει τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, προστίθενται 5 όγκοι ψυχρής ακετόνης και τοποθετείται στους -20ºC για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των 3 ωρών, (για να κατακρημνιστούν). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες παραλαμβάνονται με φυγοκέντρηση στα 8000 rpm (10000g) για 30 λεπτά σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4º C). Μετά την απομάκρυνση της ακετόνης το ίζημα, (ριβοσωμικές πρωτεΐνες) παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου για 15min, έτσι ώστε να εξατμιστούν υπολείμματα του διαλύτη. Το ίζημα αιωρείται σε αποστειρωμένο νερό (ποσότητες του 1 Α260 ριβοσωμικών υπομονάδων). Ως μία ισοδύναμη μονάδα (1 equivalent unit, 1e.u.), ορίζεται η ποσότητα μιας πρωτεΐνης ή μιας ομάδας πρωτεϊνών που βρίσκεται σε 1 OD Α260 (Απορρόφηση στα 260 nm ίση με 1, Α 260 = 1), (Nierhaus 1990a). Β.2.10 Ανάλυση κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry) Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια χρήσιμη καινοτόμο μέθοδο που επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών φυσικοχημικών και βιολογικών χαρακτηριστικών ενός κυττάρου. Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό κυττάρων, ανάλογα με τη ποσότητα γενετικού υλικού DNA από διαφορετικά είδη (φυτά ή θηλαστικά). Επίσης χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση κυττάρων με διαφορετικά χαρακτηριστικά (traits) από μεικτούς πληθυσμούς. Οι μετρήσεις αυτές γίνονται ξεχωριστά σε κάθε κύτταρο, το οποίο βρίσκεται σε ροή και περιβάλλεται από ένα σύστημα κινητής φάσης. Ένας κυτταρομετρητής αποτελείται από ένα σύστημα ροής υγρών (fluidics), οπτικών (optics) και ηλεκτρονικών (electronics), ώστε να καταμετρώνται κύτταρα τα οποία βρίσκονται σε ροή (Robinson, 2006). Ειδικότερα, το σύστημα ροής υγρών αποτελείται από ένα σύνολο ομόκεντρων σωλήνων. Εξωτερικά ρέει συνεχώς ένα ισότονο υγρό και εσωτερικά το δείγμα βρίσκεται σε πολύ χαμηλό ρεύμα ροής, έτσι ώστε τα κύτταρα να περνούν έναένα. Το χαμηλό ρεύμα των κυττάρων που περιβάλλεται από το υγρό ροής περνά από 90

111 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μία σχισμή στην οποία είναι εστιασμένη ακτίνα laser ή UV. Κάθε κύτταρο μετά τη σύγκρουσή του με την ακτίνα σκεδάζει το φως σε συγκεκριμένες γωνίες, ανάλογα με την εξωτερική και την εσωτερική του μορφολογία. Η απόκλιση της φωτεινής δέσμης αναγνωρίζεται από ένα σύστημα ανιχνευτών (βολταϊκές φωτοδίοδοι) και με τον τρόπο αυτό διαχωρίζονται οι διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί, ανάλογα με το μέγεθος και την κυτταροπλασματική τους δομή (σχήμα Β.2.2.), (Ormerod 1990). Αντίστοιχα μπορεί να γίνει επιλογή κυτταρικών πληθυσμών οι οποίοι εκφράζουν φθορίζουσες πρωτεΐνες και ο φθορισμός συλλέγεται, φιλτράρεται και μετατρέπεται σε ψηφιακή τιμή ώστε να υποστεί ηλεκτρονική επεξεργασία. Σχήμα Β.2.2.: Απεικόνιση της λειτουργίας του FACS.. Ένας κυτταρομετρητής αποτελείται από ένα σύστημα ροής υγρών (fluidics), οπτικών (optics) και ηλεκτρονικών (electronics), ώστε να μετράει κύτταρα τα οποία βρίσκονται σε ροή, (Robinson, 2006). 91

112 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.2.11 Μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry) κατόπιν χρώσης με τις φθορίζουσες χρωστικές ανεξίνη V (FITC-Annexin V) και προπίδιοιωδίδιο (Propidium-Iodide - PI) Η μέτρηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, βασίζεται στη διαδικασία μεταφοράς της αρνητικά φορτισμένης φωσφατιδυλοσερίνης (PS) από την εσωτερική προς την εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης, (Savill, Fadok et al. 1993) η οποία γίνεται στην έναρξη της απόπτωσης. H ανεξίνη V ανήκει σε μία οικογένεια πρωτεϊνών με αντισυγκολλητικές ιδιότητες που συνδέεται κατά προτίμηση με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, όπως είναι η φωσφατιδυλοσερίνη της εξωτερικής μεμβράνης, παρουσία ιόντων Ca 2+, ενώ συνδέεται ελάχιστα με τη φωσφατιδυλοχολίνη και σφιγγομυελίνη, οι οποίες βρίσκονται επίσης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη. Η προσθήκη της φθορίζουσας χρωστικής FITC (fluorescent isothio cyanate) στην ανεξίνη καθιστά δυνατή την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποπτωτικών κυττάρων (De Francesco 1999). Επιπλέον, πρέπει να σημειωθεί ότι η ανίχνευση της φωσφατιδυλοσερίνης με τη μεταφορά της στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης με τη μέθοδο αυτή οδηγεί στον εντοπισμό των αποπτωτικών κυττάρων σε πολύ πρώιμα στάδια, προτού συμβούν οποιεσδήποτε άλλες μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές, όπως η συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, η απώλεια της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης και η ενδονουκλεοσωμική διάσπαση του DNA. Καθώς η αποπτωτική διαδικασία προχωράει η ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης καταστρέφεται. Η χρήση της χρωστικής 7-AAD (δείκτης βιωσιμότητας), βοηθά στον διαχωρισμό των πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων και βασίζεται στην ικανότητα της 7-αμινο-ακτινομυκίνης D (7-AAD) να παρεμβαίνει μεταξύ διαδοχικών βάσεων κυτοσίνη C / γουανίνη G του δίκλωνου DNA, όταν το εσωτερικό του κυττάρου και η πυρηνική χρωματίνη έχουν γίνει προσιτά, (Schmid I, 1992). Η 7-αμινο-ακτινομυκίνη D (7-AAD) είναι ένα ανάλογο της ακτινομυκίνης που περιέχει μια αμινο-ομάδα ως υποκατάστατο στην θέση 7 του χρωμοφόρου. Οι ακτινομυκίνες είναι αντιβιοτικά βακτηριακών προελεύσεων που χαρακτηρίστηκαν πρώτα στους ασκομύκητες του εδάφους και σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα με το δίκλωνο δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA), αλλά όχι με το δίκλωνο ριβονουκλεικό οξύ (RNA), ή με υβρίδια RNA-DNA, ή με μονόκλωνο DNA ή RNA. 92

113 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οι φασματοσκοπικές ιδιότητες της χρωστικής 7-AAD είναι ιδιαίτερα αξιοποιήσιμες στην ανάλυση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Η βέλτιστη εκπομπή φθορισμού στο σκούρο κόκκινο (635 με 675nm) αξιοποιείται με χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με φθορίζουσες ενώσεις (FITC, ή R Φυκοερυθρίνη PE). Τα μη βιώσιμα κύτταρα μπορούν να χαρακτηριστούν και να ταυτοποιηθούν αφού είναι σημασμένα με την χρωστική 7-AAD, ενώ τα ζωντανά κύτταρα που διατηρούν την μεμβρανική τους ακεραιότητα είναι μη διαπερατά στην χρωστική 7-AAD. Από την άλλη μεριά το προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodode-pi), όπως και η χρωστική 7-ΑΑD, μπορεί μεν να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη μόνο των νεκρωτικών κυττάρων παρουσιάζουν όμως περιορισμένη επικάλυψη του φάσματος εκπομπής (πορτοκαλί-κόκκινος φθορισμός σε μήκος κύματος 605 έως 635 nm) με το FITC και την PE. Σχήμα Β.2.3.: Σχηματική αναπαράσταση πρόσδεσης της ανεξίνης στην φωσφατιδυλοσερίνη. H ανεξίνη V συνδέεται κατά προτίμηση με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, όπως η φωσφατιδυλοσερίνη της εξωτερικής μεμβράνης, παρουσία ιόντων Ca +2,(Savill 1993). Επομένως, η ταυτόχρονη χρώση των κυττάρων με ανεξίνη V-FITC (πράσινος φθορισμός σε μήκος κύματος 488nm) και με την χρωστική 7-AAD (κόκκινος φθορισμός σε μήκος κύματος 635 με 675 nm), επιτρέπει τη διάκριση των τεσσάρων διαφορετικών κατηγοριών κυττάρων όπως φαίνεται πιο κάτω: Φυσιολογικά κύτταρα: αρνητικά και για τις 2 χρωστικές (FITC-/7-AAD-) Πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα (early apoptotic): θετικά μόνο για FITC(FITC+/7-AAD-) 93

114 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όψιμα αποπτωτικά κύτταρα (late apoptotic): θετικά και για τις 2 χρωστικές (FITC+/7- AAD+). Αυτό συμβαίνει διότι σε επίπεδο κυτταρικών καλλιεργειών δεν υπάρχουν τα κύτταρα του αμυντικού συστήματος (π.x μακροφάγα) για να απομακρύνουν τα αποπτωτικά κύτταρα. Νεκρωτικά κύτταρα (necrotic cells): κύτταρα θετικά μόνο για 7-AAD(FITC-/7-AAD+). Σχήμα Β.2.4: Διαχωρισμός ζωντανών, πρώιμων και όψιμων αποπτωτικών κυττάρων. Στα αποπτωτικά κύτταρα η αρνητικά φορτισμένη φωσφατιδυλοσερίνη (PS) μεταφέρεται από την εσωτερική προς την εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης και προσδένεται με την ανεξίνη. Τα πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα είναι θετικά μόνο για την χρωστική FITC, ενώ τα όψιμα είναι θετικά και για τις 2 χρωστικές FITC και 7-AAD (Schmid I, 1992).. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είχε ως εξής: Κύτταρα που συλλέχθηκαν μετά από 24, 48 και 72 ώρες, υπέστησαν κατεργασία για την αφαίρεση του θρεπτικού υλικού (φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1200 rpm/λεπτό), ξεπλύθηκαν δύο φορές με 5 ml ψυχρό PBS, ph=7,2, στη συνέχεια αιωρήθηκαν σε 200 μl PBS και καταμετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο (πλάκα Neubauer, παράγραφος Β.2.2.). Ο αριθμός των κυττάρων θα πρέπει να είναι περίπου 10 6 κύτταρα/ml. Απομακρύνθηκε το PBS με φυγοκέντρηση και τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος PBS και προστίθεται 1ml ρυθμιστικού διαλύματος (1X binding buffer και 10 μl ανεξίνη V-FITC και 20μl 7-AAD, σύμφωνα με το πρωτόκολλο (Annexin V-FITC/7-ΑΑΔ kit for flow cytometry, PN IM tests, Beckman Coulter, Inc, 94

115 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Miami,USA). Μετά από επώαση15 λεπτά στο σκοτάδι, έγινε ανάλυση των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής (Coulter Epics XL MCL Flow cytometer, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) σε μήκος κύματος 488 nm. Σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν τουλάχιστον κύτταρα. Τα κύτταρα που ήταν θετικά για ανεξίνη V-FITC ανιχνεύτηκαν από το φίλτρο FL1 (πράσινος φθορισμός), σε μήκος κύματος από 505 έως 545 nm, ενώ τα θετικά για 7- ΑΑD στο φίλτρο FL2 (σκούρος κόκκινος φθορισμός), σε μήκος κύματος από 605 έως 635 nm και τα αποτελέσματα μετετράπησαν σε γραμμικά / λογαριθμικά ιστογράμματα. Σχήμα Β.2.5.1: Χημική δομή προπίδιοιωδίδιο (propidium-iodode-pi) Σχήμα Β.2.5.2: Χημική δομή της 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD) 95

116 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.12 Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με ανίχνευση του DNA των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (FACS-flow cytometry), κατόπιν χρώσης με προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) Η ανάλυση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (G0/G1, S και G2/M) σε έναν λογαριθμικά αυξανόμενο κυτταρικό πληθυσμό βασίζεται στην ιδιότητα ορισμένων χρωστικών, όπως το προπίδιο-ιωδίδιο (propidium-iodide-pi) να συνδέονται στοιχειομετρικά με το πυρηνικό DNA, κάτω από κατάλληλες συνθήκες (Darzynkiewicz, Gong et al. 1994). Επομένως, ο φθορισμός που ανιχνεύεται από κυτταρομετρητή ροής σε μήκος κύματος 488 nm είναι ανάλογος με το DΝΑ των κυττάρων που αλληλεπίδρασε στοιχειομετρικά με την χρωστική που προαναφέρθηκε. Έτσι, κατά την ανίχνευση παρατηρείται μία πρώτη κορυφή που αντιστοιχεί στα κύτταρα της G0/G1 φάσης που φέρουν μία ορισμένη ποσότητα Ν γενετικού υλικού (DNA), (Ormerod, 2000). Η επόμενη κορυφή αντιστοιχεί στα κύτταρα της G2/Μ φάσης, τα οποία φέρουν διπλάσια ποσότητα 2Ν γενετικού υλικού, ενώ τέλος ανάμεσα στις δύο κορυφές, υπάρχει μία «πεδιάδα» από κύτταρα που φέρουν ποσότητα γενετικού υλικού ενδιάμεση μεταξύ Ν και 2Ν και είναι τα κύτταρα της φάσης S στην οποία δεν έχει ακόμα ολοκληρωθεί ο αναδιπλασιασμός του DNA, (σχήμα Β.2.6). Με την ίδια λογική, μπορούν να ανιχνευτούν και κύτταρα που φέρουν μικρότερη ποσότητα DNA από Ν (sub-g1 peak) και αποτελούν τα αποπτωτικά κύτταρα στα οποία έγινε διάσπαση του DNA τους, ή ακόμα και κύτταρα με μεγαλύτερη ποσότητα DNA από 2Ν (π.x 3Ν, 4Ν), δηλαδή πολυπλοειδικά κύτταρα, (Rabinovitch 1994). 96

117 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.6.: Συσχετισμός μεταξύ ιστογράμματος του DNA και του κυτταρικού κύκλου. Στο σχήμα δεν απεικονίζεται η φάση Go (έξω από τα όρια του κυτταρικού κύκλου). Τα κύτταρα που βρίσκονται στην φάση Go έχουν το ίδιο γενετικό υλικό με τα κύτταρα της G1 φάσης (Robinson, 2006). Για τα πειράματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν 100 μl κυτταρικού αιωρήματος (suspension) σε PBS (ph=7,2) (10 6 κύτταρα για κάθε δείγμα ). Σε κάθε ένα δείγμα προστέθηκαν 2 ml ειδικού αντιδραστηρίου (DNA Prep Stain), υπό ανάδευση σε κατάλληλη συσκευή (DNA Work Prep Station). Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται από τα ακόλουθα συστατικά (DNA Prep Reagent Kit PN , Beckman Coulter, UK): απορρυπαντικό (Triton-X 100) για τη διαλυτοποίηση (permeabilization) της κυτταρικής μεμβράνης, που διευκολύνει την είσοδο της χρωστικής κατάλληλη RNAάση, για τη διάσπαση του RNA, έτσι ώστε να παραμείνει μόνο το DNA από τα νουκλεϊκά οξέα για να συνδεθεί με το PI την χρωστική προπίδιο-ιωδίδιο (PI) Τα δείγματα μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου DNA Prep Stain, παρέμειναν για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και κατόπιν έγινε ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής (Coulter Epics XL MCL Flow cytometer, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) σε μήκος κύματος 488 nm. Σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν τουλάχιστον 10,000 κύτταρα. Τα «σήματα» του PI ανιχνεύτηκαν στο φίλτρο FL3 (>650 nm, κόκκινος φθορισμός) και μετετράπησαν σε γραμμικά /λογαριθμικά ιστογράμματα. Επίσης, η συλλογή των «σημάτων» τέθηκε σε ορισμένους περιορισμούς (gating), προκειμένου να αποκλειστούν οι διπλέτες (doublets) (= δύο κύτταρα ενωμένα) και τα 97

118 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ κομμάτια σπασμένων κυττάρων (cell debris). Τα ιστογράμματα αναλύθηκαν στη συνέχεια με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού (Multicycle Cell analysis Software, Phoenix Flow Systems, Inc, San Diego, CA), με το οποίο υπολογίστηκαν τα ποσοστά των κυττάρων που βρίσκονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου (G0/G1, S και G2/M). B.2.13 Τεχνική της RNA παρεμβολής σε MEL κύτταρα Η τεχνολογία της RNA παρεμβολής εμφανίζει μεγάλη εξειδίκευση, καθώς η εισαγωγή μορίων RNA ομόλογων με αλληλουχίες εξονίων συγκεκριμένων γονιδίων, έχει ως αποτέλεσμα την μείωση των επιπέδων μόνο του αντίστοιχου mrna. Παράγοντες που ίσως σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της τεχνικής της RNA παρεμβολής, είναι: σταθερότητα του συμπλόκου RISC, η ακριβής περιοχή σύνδεσης του δίκλωνου RNA (sirna) στο mrna στόχο, οι ανώτερες δομές του mrna ή οι συνδεδεμένες με αυτό πρωτεΐνες οι οποίες μπορεί να δρουν προστατευτικά παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση (Dykxhoorn, Novina et al. 2003), (Arenz and Schepers 2003), (Brummelkamp, Bernards et al. 2002). Για τα πειράματα με sirna που περιγράφονται στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν δίκλωνα sirnas -είχαν συντεθεί τεχνητά- για την καταστολή του mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 και η μεταφορά τους στα MEL έγινε με την τεχνική της λιποφεκταμίνης. B Σχεδιασμός των sirnas που στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 Τα μικρά δίκλωνα RNAs (sirnas) μπορούν να παραχθούν με διάφορους τρόπους όπως: Mε χημική σύνθεση Με in vitro μεταγραφή Με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιώντας κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης. Η επιλογή του κατάλληλου μορίου για τη επιτυχή γονιδιακή καταστολή, είναι μια εμπειρική διαδικασία, καθώς οι παράγοντες εκείνοι που καθορίζουν την αποτελεσματικότητα ενός μορίου sirna, δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. 98

119 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα κύρια χαρακτηριστικά ενός sirna που κατασκευάζεται με σκοπό την γονιδιακή αποσιώπηση είναι : μέγεθος νουκλεοτίδια 5 άκρο φωσφορυλιωμένο 3 άκρο μη φωσφορυλιωμένο μονόκλωνη περιοχή 2-4 νουκλεοτιδίων. Για την καταστολή του mrna του γονιδίου RPS5 σχεδιάστηκαν με αλγοριθμικό πρόγραμμα υψηλής ανάλυσης (High Performance, HP GenomeWide sirna , Qiagen) δυο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων. Συμφώνα με το πρόγραμμα το ποσοστό επιτυχίας της αποσιώπησης του γονιδίου RPS5 είναι υψηλότερο από 70%. Παρακάτω δίνονται οι αλληλουχίες βάσεων των δυο ζευγών ολιγονουκλεοτιδίων (Rps5_4_HP sirna και Rps5_2_HPsiRNA) που σχεδιάστηκαν: Rps5_4_HP sirna (SI , Qiagen) Νοηματικός κλώνος r (GCG CUU CCG CAA AGC ACA A)dTdT Αντινοηματικός κλώνος r (UUG UGC UUU GCG GAA GCG C)dTdT Rps5_2_HP sirna ( SI , Qiagen) Νοηματικός κλώνος r (UGG UGA AUG CUA UCA UCA A)dTdT Αντινοηματικός κλώνος r (UUG AUG AUA GCA UUC ACC A)dGdG Το δίκλωνο RNA, Rps5_4_HP sirna στοχεύει στην περιοχή AAG CGC TTC CGC AAA GCA CAA (στην περιοχή ολιγονουκλεοτίδίων) του mrna RPS5, ενώ το δίκλωνο Rps5_2_HP sirna στοχεύει στην περιοχή CCT GGT GAA TGC TAT CAT CAA (στην περιοχή ολιγονουκλεοτίδίων). 99

120 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Παράλληλα παραγγέλθηκαν και δίκλωνα RNAs που δεν έχουν κάποια γνωστή ομολογία με mrna ευκαρυωτικών κυττάρων και επομένως δεν στοχεύουν στο mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5, για να χρησιμοποιηθούν ως πείραμα αναφοράς, (control). H αλληλουχία βάσεων δίνεται παρακάτω: Control ( , Qiagen) Νοηματικός κλώνος UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdT dt Αντινοηματικός κλώνος ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdT dt B Προετοιμασία των δίκλωνων RNAs (sirna) Tα δίκλωνα RNAs εάν δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν άμεσα μετά την σύνθεσή τους υφίστανται την ακόλουθη επεξεργασία : Προστίθενται 250 μl ή 1 ml διαλύματος αιώρησης Suspension Buffer (Qiagen) σε 5 nmole και 20 nmole δίκλωνου RNA (sirna), αντίστοιχα, ώστε η τελική συγκέντρωση να γίνει 20 μm (~0.25 μg/μl). Τοποθετείται στους 90 0 C για ένα λεπτό και στη συνέχεια μεταφέρεται στους 37 ο C για μια ώρα. Ακολουθεί διαχωρισμός του δείγματος σε μικροσωλήνες φυγοκέντρου (eppendorf) και τοποθέτηση στους -20 ο C. Rps5_4_HP sirna Rps5_2_HP sirna 100

121 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.7. Απεικόνιση των δυο ζευγών ολιγονουκλεοτιδίων (sirna) που σχεδιάστηκαν για την αποσιώπηση του γονιδίου RPS5. Ο σχεδιασμός έγινε σύμφωνα με το πρόγραμμα υψηλής ανάλυσης (High Performance, HP GenomeWide sirna , Qiagen) B Πειραματική διαδικασία για την αποσιώπηση (silencing) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή δίκλωνων sirna σε ευκαρυωτικά κύτταρα ΜΕL με την τεχνική των λιποσωμάτων, χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα, (HiPerfect Transfection Reagent, Qiagen) που περιέχει κατιοντικά και ουδέτερα λιπίδια για την αποτελεσματική πρόσληψη των sirna. Αυτό που είναι πιο πιθανό να συμβαίνει, είναι οι αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες των sirna να δεσμεύονται στη θετικά φορτισμένη επιφάνεια των λιποσωμάτων και το υπολειπόμενο θετικό φορτίο, στη συνέχεια να δεσμεύεται στο αρνητικά φορτισμένο σιαλικό οξύ, της επιφάνειας των κυττάρων. H διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Καλλιέργεια 0,4-1,6 Χ10 6 κυττάρων MEL φυγοκεντρήθηκε στα 900 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δυο φορές ( από 5 λεπτά την κάθε φορά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια αφού αιωρήθηκαν σε DMEM (βλέπε στον Πίνακα 4), τοποθετήθηκαν σε κατάλληλη υποδοχή (σε τρυβλία καλλιέργειας ή σε τρυβλία πολλαπλών πηγαδιών) στα οποία προστέθηκαν επίσης οι κατάλληλες ποσότητες θρεπτικού υλικού και του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer, (Qiagen) όπως φαίνεται στον πίνακα 4 και επωάστηκαν στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5 % σε CO 2 για 16 περίπου ώρες. 101

122 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.2.8: Σχηματική αναπαράσταση των συμπλόκων sirna:hiperfect Reagent Buffer. Τα δίκλωνα sirna μεταφέρονται στα κύτταρα διαμέσου των λιποσωμάτων με την βοήθεια του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer. Για την αποτελεσματική αποσιώπηση (silencing) απαιτούνται υψηλές συγκεντρώσεις των sirna (Qiagen, 2006). Υποδοχή καλλιεργειών Ποσότητα θρεπτικού DMEM (μl) Ποσότητα Hi Perfect Reagent (μl) 96 well plate 150 0,75 48 well plate 250 1,5 24 well plate mm dish Πίνακας 4.: Ποσότητες θρεπτικού υλικού (DMEM) και του αντιδραστηρίου HiPerfect Reagent Buffer ανάλογα με το είδος υποδοχής καλλιεργειών. Για κάθε αντίδραση επιμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις sirna από 5nM έως 180nM. Συγκεκριμένα το Rps5_4_HP sirna είτε το Rps5_2_HP sirna, είτε 102

123 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και τα δύο μαζί και το control sirna (μάρτυρας) αραιώθηκαν σε 100 μl διαλύματος, (ECR, buffer Qiagen) χωρίς ορό και αντιβιοτικά και στη συνέχεια προστέθηκε και η κατάλληλη ποσότητα του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης HiPerfect Reagent Buffer όπως φαίνεται στον πίνακα 4. Ακολούθησαν ήπια ανάμειξη και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά, προκειμένου να σχηματιστούν τα σύμπλοκα sirna:hiperfect Reagent Buffer, (σχήμα Β.2.8). Τέλος, το μίγμα αυτό μεταφέρθηκε στάγδην στα κύτταρα με ήπια ανάδευση. Ακολούθησε επώαση σε θάλαμο κυτταροκαλλιεργειών (37 ο C, 5% CO 2 ) και μετά από 6-72 ώρες (από την στιγμή της επιμόλυνσης) τα κύτταρα συλλέχθηκαν, απομακρύνθηκε το υγρό μέσο ανάπτυξης και ακολούθησε η λύση τους για απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA και παραλαβή πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Β.2.14 Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli Τα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10, αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα LB, (Luria-Bertani) (Sambrook et al. 1989), του οποίου η σύσταση ήταν η εξής: Θρεπτικό υλικό LB Εκχύλισμα ζύμης 0,5 % w/v Τρυπτόνη 1,0 % w/v NaCl 1,0 % w/v Η ρύθμιση της οξύτητας έγινε με NaOH. Ακολούθησε αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση μιας Atm, για 30 λεπτά. ο Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν ήταν απαραίτητο. Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP 10 έγινε σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται παρακάτω: Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισμα ζύμης 0,5 % w/v Τρυπτόνη 2,0 % w/v NaCl 0,1 M MgSO 4 10 mm 103

124 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.15 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσμεύεται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465nm και το χρώμα της είναι καστανό. Η δημιουργία του συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κυανού χρώματος και τη μεταβολή του μέγιστου απορρόφησης στα 595nm, όπου και μετράται φωτομετρικά. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάστηκε ως εξής: Αντιδραστήριο Bradford CBB G mg/ml H 3 PO 4 85 % 200 ml Ανάδευση για ώρες, αραίωση του διαλύματος με απιονισμένο νερό στο 1lt. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγματα προσδιορίστηκε με ανάμιξη του κάθε δείγματος, (αραιωμένου στα 2ml με απιονισμένο νερό), με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολούθησε μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη αναφοράς με αλβουμίνη ή σφαιρίνη βόειου ορού, (BSA) (Bradford 1976; Bearden 1978). Β.2.16 Ηλεκτροφόρηση Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου Τα πρωτεϊνικά μόρια, όπως κάθε άλλο φορτισμένο σωματίδιο, μετακινούνται κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών εφαρμόστηκε από τον Tiselius το 1937 και έκτοτε χρησιμοποιείται ευρύτατα. Οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα σωματίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια μέσου των πόρων μιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η διεύθυνση της κινήσεως των μορίων προς το θετικό ή αρνητικό πόλο εξαρτάται από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης. Η ταχύτητα με την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, (v), εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού 104

125 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ του ηλεκτρικού πεδίου, (Ε) και από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης, (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: E q v = f όπου f είναι παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Το πολυακρυλαμίδιο, που χρησιμοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως είναι η χημική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερμοκρασία, και τα αποτελέσματα των ηλεκτροφορήσεων με πολυακρυλαμίδιο είναι επαναλήψιμα. Η δημιουργία των πηκτών πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται με τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου, (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), και του Ν,Νμεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου,(bis-ακρυλαμιδίου) (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO- CH=CH 2 ). Η αναλογία με την οποία χρησιμοποιούνται τα δυο υλικά είναι 30:1 w/w. Το bis-ακρυλαμίδιο, συντελεί στο σχηματισμό γεφυρών μεταξύ των αλυσίδων των πολυμερών του ακρυλαμιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δημιουργείται ένα τριδιάστατο πολυμερές πλέγμα, το μέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των μονομερών του ακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός πραγματοποιείται με το μηχανισμό των ελευθέρων ριζών. Σαν δότης των ελευθέρων ριζών χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχημικός καταλύτης Ν,Ν,-τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη, (TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει μια ελεύθερη ρίζα, (S 2 O 2-8 +e - SO SO4 -. ), η οποία διαδίδεται σε άλλα μόρια ακρυλαμιδίου προς σχηματισμό του πολυμερούς. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία μετουσιωτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου), ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους και παραμένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης μετουσιωτικών παραγόντων, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Επίσης, η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αναγωγικών αντιδραστηρίων, όπως είναι η β-μερκαπτοαιθανόλη και το DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Stern, Wilson et al. 1993). Τα αναγωγικά αντιδραστήρια ανάγουν τις σουλφιδρυλικές ομάδες των κυστεϊνών και καταστρέφουν τις δισουλφιδικές γέφυρες. 105

126 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Το σύστημα της ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστημα, χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τόσο στην πηκτή, όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστημα, χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης, όπου γίνεται συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια λεπτή στοιβάδα (χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~7) και η πηκτή διαχωρισμού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~9). Το διάλυμα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δυο προηγούμενα, (Andrews 1968). Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στο διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος. Το ηλεκτρικό φορτίο των πρωτεϊνών συνήθως δεν είναι μεγάλο και το σχήμα τους ποικίλει, επομένως είναι πολύ δύσκολο να προβλεφτεί η κίνηση τους στο ηλεκτρικό πεδίο. Για να απλοποιηθεί η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών και για να είναι η κίνηση τους ανάλογη με το μοριακό τους βάρος χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το ανιονικό τασιενεργό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου) το οποίο σε ουδέτερες τιμές ph είναι αρνητικά φορτισμένο. Το SDS δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τις αποδιατάσσει, με αποτέλεσμα όλες οι πρωτεΐνες να αποκτούν αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο άσχετα με το δικό τους αρχικό φορτίο. Η δέσμευση του SDS στα αμινοξέα της πρωτεΐνης οδηγεί στην καταστροφή της φυσικής δομής της πρωτεΐνης η οποία παίρνει την μορφή ελάσματος. Έτσι, δημιουργούνται επιμήκη μόρια, αρνητικά φορτισμένα, με σαφή και καθορισμένη δομή. Το ποσό του SDS που δεσμεύεται είναι αρκετά σταθερό, (1.4g SDS/g πρωτ.). Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού μεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό μέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό γλυκοζυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσμεύουν μικρότερα ποσά SDS ανά μονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισμού με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν φαινόμενο μοριακό βάρος υψηλότερο του πραγματικού. Όταν μια 106

127 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ πρωτεΐνη περιέχει υψηλά ποσοστά του αμινοξέως προλίνη τότε η τιμή του μοριακού βάρους που προκύπτει από την ηλεκτροφόρηση είναι πάντοτε υψηλότερη από την πραγματική, αυτό οφείλεται στις φυσικοχημικές ιδιότητες της προλίνης που είναι από τα πλέον υδρόφοβα αμινοξέα. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων, αποτελείται από την πηκτή διαχωρισμού, ύψους 7.5cm και πάχους 1.5mm, καθώς και την πηκτή επιστοίβαξης, όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1cm περίπου, πριν εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγματος, δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισμού και επιστοίβαξης ήταν η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης (Συνολικός όγκος 5 ml) Ακρυλαμίδιο 5 % w/v bis- ακρυλαμίδιο 0,17 % w/v SDS 0,50 % w/v Tris-HCl ph 6.8 0,125 M APS 0,08 % w/v TEMED 0,20 % v/v Πηκτή διαχωρισμού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαμίδιο 12 % w/v, 15 % w/v, 20 % w/v bis-ακρυλαμίδιο 0,4 % w/v SDS 0,5 % w/v Tris-HCl ph 8.9 0,375 M APS 0,08 % w/v TEMED 0,20 % v/v Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιήθηκε είχε την παρακάτω σύσταση: Διάλυμα ηλεκτροφόρησης ph 8.9 Tris 25 mm Γλυκίνη 0,192 M SDS 0,1% w/v Τα δείγματα πριν μεταφερθούν στις θέσεις που δημιουργήθηκαν στην πηκτή επιστοίβαξης αναμείχθηκαν με το εξής διάλυμα: Διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων 107

128 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ SDS 2% w/v Tris-HCl ph ,5 mm β- μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη 10% v/v Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,02% w/v Το αρχικό διάλυμα των ηλεκτροδίων ήταν τέσσερις φορές πυκνότερο, (4x). Τα δείγματα, πριν την επιστοίβαξή τους θερμάνθηκαν στους 100 ο C για 5 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών, καθώς και η δημιουργία συμπλόκων πρωτεΐνης-sds. Η β-μερκαπτοαιθανόλη προστίθεται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και το διαχωρισμό των υπομονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Η απουσία της β-μερκαπτοαιθανόλης δίνει τη δυνατότητα απεικόνισης πρωτεϊνών που αποτελούνται από παραπάνω από μία υπομονάδες. Η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων έγινε με σταθερή τάση 100V μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση αυτού του τύπου χρησιμοποιήθηκαν οι επίπεδες συσκευές πάχους 1,5 mm και μήκους 7,5 cm, που κατασκευάστηκαν στο Ινστιτούτο Max-Panck Μοριακής Γενετικής του Βερολίνου. Χρησιμοποιήθηκε το ασυνεχές σύστημα κατά Laemmli (Laemmli 1970). Β.2.17 Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου. Η βαφή των πρωτεϊνών έγινε με Coommassie Blue ή με νιτρικό άργυρο. Β Βαφή με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου κυανού χρώματος, μεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής CBB R-250. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν την εξής σύσταση: Διάλυμα χρώσης CBB R-250 0,1 % w/v Μεθανόλη 50 % v/v Οξικό οξύ 10 % v/v Διάλυμα αποχρωματισμού Μεθανόλη 50 % v/v Οξικό οξύ 10 % v/v 108

129 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προκειμένου να δημιουργηθεί το σύμπλοκο, η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα χρώσης και αφήνεται για μια ώρα περίπου. Με το διάλυμα αυτό, γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ακολούθως, η πηκτή τοποθετείται στο διάλυμα αποχρωματισμού και ανακινείται για αρκετές ώρες. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 0,1 μg πρωτεΐνης. Β Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) Το χαρακτηριστικό της τεχνικής αυτής είναι η μεγαλύτερη ευαισθησία που παρουσιάζει στην ανίχνευση πρωτεϊνών σε σχέση με τη χρώση με CBB. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που μπορεί να ανιχνευθεί είναι μέχρι και 0,1 ng. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ιόντων αργύρου να αντιδρούν με πρωτεΐνες και ιδιαίτερα με τις ελεύθερες αμινοομάδες και τις θειούχες ομάδες τους. Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν είναι η ακόλουθη: Διάλυμα στερέωσης Μεθανόλη 50 % v/v Οξικό οξύ 12 % v/v Διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου Na 2 S 2 O 3 0,02 % w/v Διάλυμα νιτρικού αργύρου AgNO 3 0,2 % w/v Φορμαλδεΰδη 0,028 % v/v Διάλυμα εμφάνισης Na 2 CO 3 6 % w/v Φορμαλδεΰδη 0,028 % v/v Na 2 S 2 O 3 0,02 % w/v Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα στερέωσης για τουλάχιστον δυο ώρες, προκειμένου να στερεωθούν οι ζώνες των πρωτεϊνών στην πηκτή. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 15 λεπτών με 50 % v/v αιθανόλη και μία πλύση των 20 λεπτών με 30 % v/v αιθανόλη. Κατόπιν γίνεται μια πλύση του ενός λεπτού με απιονισμένο νερό και στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 1 λεπτό στο διάλυμα του θειοθειϊκού νατρίου, (Na2S 2 O 3 ), το οποίο ακολούθως απομακρύνεται με 3 πλύσεις των 20 δευτερολέπτων με απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 20 λεπτά στο διάλυμα του νιτρικού αργύρου, (AgNO 3 ) και ξεπλένεται δύο φορές με 109

130 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ απιονισμένο νερό. Ακολουθεί εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα εμφάνισης, οπότε και εμφανίζονται οι πρωτεϊνικές ζώνες. Η αντίδραση σταματά με την εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα στερέωσης για 10 λεπτά. Η πηκτή ξεπλένεται και φυλάσσεται σε απιονισμένο νερό (Helmut Blum 1987). B.2.18 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε μεμβράνη Πρόκειται για μια εξειδικευμένη μέθοδο που επιτρέπει την ανίχνευση των καθηλωμένων πρωτεϊνών με χρήση κατάλληλων πολυκλωνικών ή μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η μεταφορά των πρωτεϊνών, (western blotting), από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF (Immobilon), βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, από την πηκτή προς τη μεμβράνη. Η κίνηση επιτυγχάνεται με την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού. Οι πρωτεΐνες βρίσκονται με τη μορφή συμπλόκου με το SDS, οπότε το σύμπλοκο είναι αρνητικά φορτισμένο. Επομένως, με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, το σύμπλοκο κινείται προς την άνοδο, εξέρχεται από την πηκτή και τελικά καθηλώνεται στο πλέγμα της μεμβράνης, εξαιτίας υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Μετά την ηλεκτρομεταφορά γίνεται κορεσμός της μεμβράνης με αλβουμίνη ορού μοσχαριού ή ορό γάλακτος. Στο επόμενο στάδιο οι πρωτεΐνες που βρίσκονται ακινητοποιημένες πάνω στην νιτροκυτταρίνη αντιδρούν με τα ειδικά αντισώματα (πρώτο αντίσωμα) και μετά με τα αντι-αντισώματα (δεύτερο αντίσωμα), τα οποία είναι συνδεδεμένα με ένα ένζυμο, συνήθως υπεροξειδάση ή αλκαλική φωσφατάση. Επίσης, μπορεί να γίνει προσδιορισμός της αμινοτελικής ακολουθίας τους, χρησιμοποιώντας αυτόματο αναλυτή (για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται αποκλειστικά η μεμβράνη PVDF). Το διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το εξής: Διάλυμα ηλεκτρο-μεταφοράς (transfer buffer) Tris 12,5 mm H 3 BO 3 12,5 mm SDS 0,02 % w/v DTT 0,5 mm Αναλυτικά η διαδικασία μεταφοράς των πρωτεϊνών σε μεμβράνη είχε ως εξής: Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτή SDS-PAGE, έγινε εμβάπτιση τόσο της πηκτής, όσο και της μεμβράνης, στο διάλυμα της μεταφοράς, (transfer buffer). 110

131 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αν χρησιμοποιείται η μεμβράνη PVDF, είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή της με μεθανόλη 100% για ένα λεπτό, πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα της μεταφοράς. Στη συσκευή της ηλεκτρομεταφοράς τοποθετήθηκε πρώτα ένα φύλλο Whatmann 3 MM, διαβρεγμένο στο πιο πάνω ρυθμιστικό διάλυμα, η μεμβράνη, η πηκτή και τέλος άλλο ένα φύλλο Whatmann. H μεμβράνη τοποθετήθηκε στην πάνω πλευρά της ανόδου και η πηκτή στην πλευρά της καθόδου. Δίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων, που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Για την συσκευή της εταιρείας Biorad (Kisker, SD10, 172) η ηλεκτρομεταφορά γίνεται με ρεύμα σταθερής έντασης 20 ma, για 30 λεπτά στην περίπτωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 και 30 ma για 45 λεπτά στην περίπτωση της τομπουλίνης αντίστοιχα. Ενώ για την συσκευή που είναι το μοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer η ηλεκτρομεταφορά στην περίπτωση της rps5 γίνεται με ρεύμα σταθερής έντασης 60 ma, για 30 λεπτά [(Choli and Wittmann-Liebold 1990), (Gershoni and Palade 1983)]. B.2.19 Ανοσοανίχνευση Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική σύμφωνα με την οποία μία πρωτεΐνη καθηλωμένη σε μεμβράνη ανιχνεύεται με τη βοήθεια πολυκλωνικού ή μονοκλωνικού αντισώματος. Η αρχή της βασίζεται στην αλληλεπίδραση της καθηλωμένης πρωτεΐνηςαντιγόνου με το κατάλληλο αντίσωμα. Η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο εκτός του ότι αναγνωρίζει και δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες IgG του πρώτου αντισώματος, συζευγνύεται με ένα ένζυμο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας με το εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα, δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση της ζώνης της πρωτεΐνης- αντιγόνου, (παράγραφος Β.2.18). Στην προκείμενη εργασία, η τεχνική της ανοσοανίχνευσης χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της ενδογενούς, εξωγενούς rps5 (recombinant rps5, πρωτεΐνη σύντηξης με το myc επίτοπο και μια ουρά έξι ιστιδινών) και της τομπουλίνης (πρωτεΐνη αναφοράς). Τα δεύτερο αντίσωμα έναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού και ποντικιού ήταν συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση. Χρησιμοποιήθηκαν τα πιο κάτω διαλύματα: Διάλυμα κορεσμού Γάλα χωρίς λιπαρά 5 % w/v 111

132 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ PBS 1X (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO Διάλυμα αλκαλικής φωσφατάσης (AP) Tris-Cl ph mm NaCl 100 mm MgCl 2 5 mm 4) Η μεθοδολογία αναλυτικά έχει ως εξής: Μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF εμβαπτίζεται στο διάλυμα κορεσμού και ανακινείται για μια ώρα. Αυτό γίνεται για τον κορεσμό της μεμβράνης, έτσι ώστε οι ελεύθερες υδρόφοβες ομάδες της να μην αλληλεπιδράσουν με το αντίσωμα. Κατόπιν, στην μεμβράνη το κατάλληλο αντίσωμα σε καθορισμένη αραίωση, σε 10ml διαλύματος κορεσμού που αποτελείται από 5% γάλα ή 1% ζελατίνη σε PBS 1Χ (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4 ), υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C ή για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η αραίωση στην οποία χρησιμοποιήθηκαν τα διάφορα αντισώματα είναι 1:500 για το μονοκλωνικό αντίσωμα της τομπουλίνης και 1:1000 για το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής περιοχής της rps5. Ακολουθούν τρεις δεκάλεπτες πλύσεις της μεμβράνης με διάλυμα PBS 1Χ που περιέχει 0.04 % v/v Tween-20 και στη συνέχεια, στην μεμβράνη προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα, (αραίωση 1 : 2000), κατάλληλα αραιωμένο σε διάλυμα κορεσμού, για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, υπό συνεχή ανακίνηση. Tα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν anti-rabbit και anti-mouse. Μετά τις δύο πλύσεις της μεμβράνης για 10 λεπτά με PBS/Tween-20, γίνεται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση, έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromochloro-indolyl phosphate, Sigma)) και 30 μl NBT (Nitro blue tetrazolium, Sigma) σε 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-HCl ph 9,5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3, (Harlow and Lane 1988). 112

133 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.20 Ανοσοκατακρήμνιση Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης G (Protein G) να δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Η πρωτεΐνη G, όπως και οι πρωτεΐνες A και L, είναι μια γενετικά τροποποιημένη πρωτεΐνη που περιέχει μια ουρά 6 ιστιδινών στο αμινοτελικό της άκρο και εκφράζεται σε E.coli. Περιέχει μόνον τις περιοχές δέσμευσης στις ανοσοσφαιρίνες IgG (έχουν εξαλειφτεί περιοχές υπεύθυνες για τη δέσμευση στο κυτταρικό τοίχωμα, με μόρια αλβουμίνης και άλλες μη εξειδικευμένες περιοχές δέσμευσης), έτσι ώστε να επιτυγχάνεται η μέγιστη προσκόλληση της στις ανοσοσφαιρίνες IgG, (Kaboord and Perr 2008). Αξιοποιώντας αυτή την ιδιότητα, τα αντισώματα με ήδη δεσμευμένο το αντιγόνο τους (π.χ. από ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα) αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη G, η οποία είναι καθηλωμένη σε ένα αδρανές υλικό, (σφαιρίδια αγαρόζης). Η επώαση του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με συγκεκριμένο αντίσωμα σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει σαν αποτέλεσμα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και την συμπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του πρωτεϊνικού μίγματος σε στήλη αγαρόζης-πρωτεΐνης G, εξισορροπημένης στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει σαν αποτέλεσμα την δέσμευση του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης G και την παραλαβή του από το εκχύλισμα. Κατά την διάρκεια της εργασίας χρησιμοποιήθηκαν τα σφαιρίδια αγαρόζη-g της εταιρίας Upstate, (USA) το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 και το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-myc (Invitrogen). εξής: Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την εντόπιση της εξωγενούς rps5 είναι η Συλλέχθηκαν περίπου 4Χ10 8 κύτταρα MEL μετά από φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές/λεπτό. Ακολούθησαν τρία πλυσίματα με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,2 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na 2 HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Στο ίζημα των κυττάρων που λήφθηκε μετά από φυγοκέντρηση, προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, όπως αναφέρεται στην παράγραφο Β.2.5 καθώς και αναστολείς πρωτεασών PMSF 1 mm και 1 μm αναστολείς cocktail (Sigma). Ακολούθησε λύση των κυττάρων με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβούσε κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο και συλλέγθηκε το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, το οποίο και αποτελούσε 3 mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος. Η ποσότητα των 3 mg 113

134 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος τοποθετήθηκε σε σφαιρίδια αγαρόζης G (25 μl-40 μl), ακολούθησε ανάδευση για 2-3 ώρες στους 4 ο C, φυγοκέντρηση σε θερμοκρασία δωματίου στις x g και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε σφαιρίδια αγαρόζης τα οποία είχαν προ-επωαστεί με 1-2 μl ή 1 μg anti-myc αντισώματος, παρουσία του διαλύματος λύσης (lysis buffer ή RIPA buffer), υπό ανακίνηση για χρονικό διάστημα 16 ωρών στους 4 C (αλληλεπίδραση αντισώματος πρωτεΐνης G) (Evan and Lennox 1985). Μετά το χρονικό διάστημα που προαναφέρθηκε, ακολούθησαν 3 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα wash buffer (50 mm Tris-ΗCl ph 7,5, 150 mm NaCl, 1mM MgCl 2, 0.5% NP-40), φυγοκέντρηση για απομάκρυνση του ρυθμιστικού διαλύματος και παραλαβή του ιζήματος (σφαιρίδια με ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες). Στη συνέχεια τα σφαιρίδια θερμάνθηκαν στους 95 C για 5 λεπτά σε διάλυμα δείγματος που χρησιμοποιείται στην PAGE-SDS ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος, ηλεκτροφορήθηκαν και η δεσμευμένη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη rps5 με το myc επίτοπο (εξωγενής rps5) ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής σε αραίωση 1:1000. B.2.21 Αυτοραδιογραφία Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεμπόμενη β-ακτινοβολία του ισοτόπου χρησιμοποιείται για την σήμανση διαφόρων πρωτεϊνικών μορίων και τμημάτων DNA. Στην περίπτωση πρωτεϊνικών μορίων - που έχουν στερεωθεί σε πηκτή- η πηκτή ανακινείται σε δις-απεσταγμένο νερό για 30 λεπτά, ώστε να ξεπλυθεί, ξηραίνεται σε κενό πάνω σε χαρτί Whatmann 3MM για μια ώρα και τοποθετείται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους, όπου γίνεται και η έκθεση του film. Την πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται, μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής, σε συσκευή Geiger. Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα (Garrison 1983). 32 Ρ, που 114

135 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.22 Διδιάστατη ηλεκροφόρηση ριβοσωμικών πρωτεϊνών Η ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου είναι πολύ χρήσιμη τεχνική στις περιπτώσεις διαχωρισμού μιγμάτων πρωτεϊνών, όπως είναι το σύνολο των πρωτεϊνών των ριβοσωμικών υπομονάδων. Για τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι πολύ βασικές, αναπτύχθηκε ένα συγκεκριμένο σύστημα διδιάστατης ηλεκτροφόρησης από τους Kaltschmidt και Wittmann (Kaltschmidt and Wittmann 1970), το οποίο τροποποιήθηκε αργότερα για πολύ μικρότερες ποσότητες δειγμάτων από τους Brockmoeller και Kamp (Brockmoller and Kamp 1985; Brockmöller J 1985). Στην πρώτη διάσταση, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται κυρίως σύμφωνα με το φορτίο τους επειδή η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου είναι 4% ενώ στην δεύτερη διάσταση ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών γίνεται κυρίως σύμφωνα με το μοριακό τους βάρος γιατί στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου είναι 22,5%. Όσο υψηλότερο είναι το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης τόσο πιο γρήγορα μετακινείται προς την κάθοδο (στο ph των διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται οι πρωτεΐνες είναι θετικά φορτισμένες). Οι μικροί πόροι της πηκτής της δεύτερης διάστασης (η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου κυμαίνεται από 18% έως 24% ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής), καθυστερούν τη μετακίνηση του μεγαλύτερου μεγέθους πρωτεϊνών, δημιουργείται δηλαδή ένα είδος μοριακού κόσκινου. Στην εργασία αυτή, το παραπάνω σύστημα διδιάστατης ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκε σε πολλά στάδια για την ταυτοποίηση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήθηκε η συσκευή (Σχήμα Β9), όπου η πρώτη διάσταση γίνεται σε κυλινδρικούς σωλήνες μήκους 10 cm και διαμέτρου 5 mm και η πηκτή της δεύτερης διάστασης έχει μέγεθος 10 cm x 10 cm. Στη συσκευή αυτή είναι δυνατός ο διαχωρισμός μg μίγματος πρωτεϊνών (0,1-0,4Α 230 ). Η συσκευή κατασκευάστηκε στο Ινστιτούτο Μοριακής Γενετικής Max-Planck του Βερολίνου. 115

136 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.9. Σχηματική απεικόνιση της διδιάστατης ηλεκροφόρησης Α. Συσκευή 1 ης διάστασης, α. άνοδος β. διάτρητο επίπεδο με λαστιχένιες υποδοχές για τις κυλινδρικές πηκτές της 1 ης διάστασης γ. δοχείο διαλύματος καθόδου δ. κάθοδος. Β. Συσκευή 2 ης διάστασης, α. άνοδος, β και γ δοχεία διαλύματος ηλεκτροδίων, δ. κάθοδος Το σημαντικότερο στάδιο στην διδιάστατη ηλεκτροφόρηση είναι η προκατεργασία του δείγματος, ώστε να περιοριστεί η συγκέντρωση των αλάτων. Για την επίτευξη αυτού του στόχου γίνονται διαδοχικά στάδια διαπίδυσης και συμπύκνωσης του δείγματος μέχρι ξηρού. Όταν ο όγκος του δείγματος γίνει μικρότερος των 100μλ (<100 μl), διαπιδύεται (χρησιμοποιούνται ειδικοί ηθμοί με διάμετρο μοριακών πόρων 50 nm (Millipore VFWP 0,05 μm)). Η διαδικασία της διαπίδυσης πραγματοποιείται σε χρόνο 30min σε θερμοκρασία δωματίου (Marusyk and Sergeant 1980). Το δείγμα συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού και αιωρείται σε 100μl διαλύματος δειγμάτων για διδιάστατη ηλεκροφόρηση. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα πιο κάτω : Πρώτη διάσταση Διάλυμα πηκτής : 4 % ακρυλαμίδιο : 0,1 % bis-ακρυλαμίδιο : 5,7 mm Bis-Tris 116

137 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ : 6 M ουρία : 5 mm EDTA To ph του διαλύματος ρυθμίζεται στο 5 με HCl Διάλυμα ανόδου : 0,1 M Bis-Tris (ph 4 με CH 3 COOH) (10x) (20,9 gr Bis-Tris, 45 ml CH 3 COOH, τελικός όγκος 1 lt,10х διάλυμα) Διάλυμα καθόδου : 1,8 Μ CH3COOK (ph 5 με CH 3 COOH) (10x) (175,7 g CH3COOK, 49 ml CH 3 COOH,τελικός όγκος 1 lt, 10х διάλυμα) Τα διαλύματα ανόδου και καθόδου αραιώνονται 10 φορές πριν χρησιμοποιηθούν. Διάλυμα δειγμάτων : 10 mm διθειοερυθριτόλη (DTE) : 6 M ουρία :0,5 μg/ml παραροσανιλίνη (C 19 H 17 N 3 C 2 H 4 O 2 ) διαλυμένη σε αραιωμένο (1X) διάλυμα ανόδου Τα δείγματα διαλύονται σε 100 μl του πιο πάνω διαλύματος. Δεύτερη διάσταση Διάλυμα πηκτής : 6,2 Μ ουρία : 22,5 % w/v ακρυλαμίδιο : 0,6 % bis-ακρυλαμίδιο : 5,4 % v/v CH 3 COOH : 1 % v/v 5 N KOH Διάλυμα ηλεκτροδίων : 14 % γλυκίνη : 1,5 % v/v CH 3 COOH Όλα τα διαλύματα διηθούνται και διατηρούνται στους 4 C. Ο πολυμερισμός της πρώτης διάστασης γίνεται με την προσθήκη 0,1 % w/v APS και 2,5 % v/v TEMED, ενώ της δεύτερης διάστασης με 0,2 % w/v APS και 0,67 % v/v TEMED. H διαδικασία της ηλεκτροφόρησης έχει ως εξής: οι κυλινδρικές πηκτές τοποθετούνται στην συσκευή της πρώτης διάστασης. Μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων στην πρώτη διάσταση, οι πηκτές τοποθετούνται επάνω στις επίπεδες πηκτές της δεύτερης διάστασης και συμπολυμερίζονται. Τέλος, εφαρμόζεται ένταση ρεύματος 1 ma / πηκτή για 30 λεπτά και στη συνέχεια 3 ma / πηκτή μέχρι το τέλος της πρώτης διάστασης (~4h) και στη δεύτερη διάσταση εφαρμόζεται σταθερή τάση 70 V για 16-18h. º 117

138 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.23 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτές δύο διαστάσεων κατά (Kaltschmidt and Wittmann 1970) Στην περίπτωση αυτή το διάλυμα της μεταφοράς ήταν 5% CH 3 COOH και 0,5 mm DTE(χρησιμοποιείται για βασικές πρωτεΐνες όπως είναι οι ριβοσωμικές). Δημιουργήθηκαν και πάλι σάντουιτς από χαρτιά Whatmann, μεμβράνη και πηκτή τα οποία εμβαπτίστηκαν προηγουμένως στο διάλυμα μεταφοράς. Η μεμβράνη τοποθετήθηκε προς την κάθοδο και η πηκτή προς την άνοδο. Η κίνηση των πρωτεϊνών γίνεται από την άνοδο προς την κάθοδο, αντίθετα δηλαδή από την κίνηση των πρωτεϊνών που βρίσκονται σε SDS πηκτή και είναι φορτισμένες αρνητικά. Η ηλεκτρομεταφορά έγινε σε ρεύμα σταθερής έντασης, 25 ma για 45 λεπτά. Β.2.24 Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA Β Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρασκευή πηκτών με τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού μεγέθους. Πρόκειται για ένα γραμμικό πολυμερές, με βασική μονάδα τη D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται με θέρμανση, παρουσία κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος. Η ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης, βασίζεται στη μετακίνηση των αρνητικά φορτισμένων μορίων DNA σε ουδέτερο ph, προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται: Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. Την συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. Την διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA, ίδιου μοριακού βάρους, κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. Το δυναμικό που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. Την σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης 118

139 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης από % w/v και τα εξής διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα TBE Tris 89 mm Η 3 ΒΟ 3 0,45 M EDTA ph mm. Ρυθμιστικό διάλυμα TAE Tris-acetate 40 mm EDTA ph mm Διάλυμα διαλυτοποιήσης δειγμάτων 6Χ γλυκερόλη 30 % v/v κυανούν του ξυλενίου 0,25 % w/v κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,25 % w/v Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά, γίνεται διαλυτοποίηση της αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα (TBE ή TAE ) με θέρμανση στους 100 ο C, ακολουθεί ελάττωση της θερμοκρασίας, (μέχρι τους 60 ο C περίπου), προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου, (EtBr), σε συγκέντρωση 0,5 μg/ml και μεταφορά στην ειδική συσκευή. Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης είναι το TBE ή το ΤΑΕ, σε τελική συγκέντρωση 1X. Η εμφάνιση των ζωνών των μορίων του DNA στην αγαρόζη, επιτυγχάνεται με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο διάλυμα της πηκτής ή/και στο διάλυμα των ηλεκτροδίων. Πρόκειται για μια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 και 366 nm και να την επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Η ένταση φθορισμού του ελεύθερου EtBr είναι πολύ μικρότερη από αυτή του συμπλόκου EtBr-DNA, επομένως είναι δυνατή η ανίχνευση μικρών ποσοτήτων DNA (Sharp, Sugden et al. 1973; Sambrook, Fritsch et al. 1989). Β.2.25 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) είναι μια in vitro μέθοδος για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε 119

140 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Έτσι, ακόμη και ένα μόνο αντίγραφο γονιδίου μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέσα σε λίγες ώρες σε εκατομμύρια αντίτυπα με τη μέθοδο αυτή. Επίσης, χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων, καθώς και για την ραδιοεπισήμανση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση (sequencing). Η τεχνική αυτή μπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, διαδικασία που γίνεται στα κύτταρα, αφού το αποτέλεσμα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συμπληρωματικών κλώνων DNA από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοανθεκτικής και επομένως ενεργής DNA πολυμεράσης που απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η DNA πολυμεράση ξεκινά τον πολυμερισμό από το 3 υδροξύλιο του εκκινητή, πολυμερίζοντας πάντα προς 5 3 κατεύθυνση. Κάθε κύκλος της PCR αποτελείται από τα ακόλουθα τρία βήματα: Βήμα 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με επώαση σε υψηλή θερμοκρασία, 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Βήμα 2 ο :Υβριδισμός Οι εκκινητές (primers) υβριδίζονται, λόγο συμπληρωματικότητας, στις κατάλληλες περιοχές του DNA στόχου. Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. 120

141 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Βήμα 3 ο : Πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται φορές και παράγονται 2n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 68 C για 5 λεπτά όταν χρησιμοποιείται η expand long πολυμεράση και στους 72 o C για 5 λεπτά όταν χρησιμοποιείται η taq πολυμεράση της Finnzymes και της Bioline, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis, Gelfand et al. 1990) Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης φαίνονται στον πιο κάτω πίνακα. DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (sense) Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10 x Πολυμεράση (Taq) H ng 20pmol 20pmol 3,5mM 5μl 1μl Έως 50μl Πίνακας 5. Σύσταση μίγματος και ποσότητες για κάθε αντίδραση PCR 121

142 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σχήμα Β.10: Αναπαράσταση της μεθόδου της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR). Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια, στάδιο αποδιάταξης, στάδιο υβριδισμού και το στάδιο πολυμερισμού (Andy Vierstracte 1999). Στην προκείμενη εργασία πολλαπλασιάστηκαν το γονίδιο της rps5, το τμήμα του γονιδίου της rps5 που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1 έως 37 και το τμήμα του γονιδίου της S5 που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1 έως 50. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε τμήμα, τα ένζυμα περιορισμού και ο πλασμιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση αναφέρονται στον πίνακα 6: 122

143 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εκκινητής Γονίδιο Ενζυμο περιορισμού Πλασμιδιακός φορέας 5 CGG GGT ACC GAG TGG GAA GCA GCC rps5 KpnI pegfp-c1 ACA 3 (νοηματικός) Α. w/t 5 CGC GGA TCC TCA GCG GTT AGA CTT rps5 BamHI pegfp-c1 GCG 3 (αντινοηματικός) Α. w/t 5 CGG GGG TAC CCA TGA CTG AGT GGG rps5 KpnI pegfp-c1 AAA GCA 3 (νοηματικός) Β GCG GGA TCC ATC CTG CAG AGA AAT rps5 BamHI pegfp-c1 ATC 3 (αντινοηματικός) Β CGG GGT ACC GAG TGG GAA GCA GCC rps5 KpnI pegfp-c1 ACA 3 (νοηματικός) Γ CGC GGA TCC GGG CAG GTA CTT GGC rps5 BamHI pegfp-c1 ATA 3 (αντινοηματικός) Γ Πίνακας 6. Ακολουθία εκκινητών, γονίδιο, ένζυμα περιορισμού και πλασμιδιακός φορέας. Στον πίνακα 7, φαίνονται αναλυτικά οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε αντίδραση. Θερμ. αποδιάταξης Χρόνος αποδιάταξης Θερμ. Υβριδισμού Χρόνος Υβριδισμού Θερμ. πολυμερισμού Χρόνος πολυμερισμού Κύκλοι Α. 92 ο C 1 min 62 ο C 1 min 68 o C 5 min 30 Β. 92 ο C 1 min 57 ο C/60 ο C 40sec/40 sec 68 ο C 5 min 15/15 Γ. 92 ο C 1 min 55 ο C 1 min 72 ο C 5 min 30 Πίνακας 7. Συνθήκες PCR. Ως Α αναφέρονται οι συνθήκες για το γονίδιο rps5 w/t, ως Β οι συνθήκες για το γονίδιο rps και ως Γ οι συνθήκες για το γονίδιο rps

144 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.26 Εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης με την τεχνική του σχεδιασμού megaprimer. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Β.2.25., η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, (PCR), χρησιμοποιείται και για την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων σε ένα τμήμα DNA. Στην περίπτωση αυτή, απαιτείται ο σχεδιασμός και η χρήση τριών συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων. Το πλεονέκτημα της συγκεκριμένης τεχνικής έγκειται στο ότι επιτρέπει τη γρήγορη και αποτελεσματική εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης, χωρίς να είναι απαραίτητος ο καθαρισμός των ενδιάμεσων προϊόντων (Picard, Ersdal- Badju et al. 1994). Τα τρία ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), που απαιτούνται είναι: ο 5'-εκκινητής (συμπληρωματικός ως προς το 5'-άκρο του εκμαγείου), ο 3'-εκκινητής (συμπληρωματικός ως προς το 3'-άκρο του εκμαγείου) και ο megaprimer (συμπληρωματικός μιας ακολουθίας περίπου 10 κωδικονίων της περιοχής του γονιδίου στην οποία πρόκειται να εισαχθεί η μετάλλαξη, που περιέχει όμως αλλαγμένη τη βάση ή τις βάσεις). Η PCR γίνεται σε τρεις φάσεις. Φάση 1 η : Το μίγμα της αντίδρασης αποτελείται από τα συστατικά που φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (5') Εκκινητής megaprimer Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10x Πολυμεράση (Taq) H ng 10pmol 10pmol 3,5mM 10μl 2 μl Έως τα 100 μl Πίνακας 8. Σύσταση μίγματος και ποσότητες για κάθε αντίδραση PCR. Γίνονται 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, (αποδιάταξη, υβριδισμός, πολυμερισμός). 124

145 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Φάση 2 η : Όταν τελειώσουν οι 10 κύκλοι της 1 ης φάσης, προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης ο 3'-εκκινητής κι επαναλαμβάνονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Φάση 3 η : Μετά το τέλος της 2 ης φάσης, προστίθεται πάλι ο 5'-εκκινητής και εφαρμόζονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Στο τέλος, έχει πλέον συντεθεί το τμήμα του DNA με την επιθυμητή μετάλλαξη. Η διαδοχική προσθήκη των εκκινητών, γίνεται προκειμένου να αυξηθεί το ποσοστό παρασκευής της μεταλλαγμένης ακολουθίας, σε σχέση με την αρχική (Picard, Ersdal- Badju et al. 1994). Στην προκείμενη εργασία, χρησιμοποιήθηκε η συγκεκριμένη τεχνική προκειμένου να γίνει μετάλλαξη τεσσάρων αμινοξέων της rps5. Τα δυο από τα αμινοξέα είναι, σύμφωνα με πληροφορίες από βάσεις δεδομένων, πιθανοί στόχοι φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), [S(24)G, S(34)G]. Η T(133)G και η S(125)G που εντοπίζονται στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης όπως βρέθηκε με εργαλεία βιοπληροφορικής, (σύμφωνα με το πρόγραμμα η Τ133 έδωσε το υψηλότερο score). Οι εκκινητές, (megaprimers), που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί. Εκκινητής 5 GCC GGT GGT GTG AGA CGA CAG 3 5 CTG CAC GTC ATC AGT CCC CCA TTT CCC AAA GAG 3 5 AAT GTA ATC CTG CAG CCC AAT ATC GTT GAT CTG 3 5 CCC CGA GAA GAC GGT ACA CGC ATT 3 Μετάλλαξη T(133)G S(24)G S(34)G S(125)G Πίνακας 9. Ακολουθία εκκινητών για την εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης Οι συνθήκες της αντίδρασης φαίνονται στον πίνακα

146 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Θερμ. αποδιάταξης Χρόνος Αποδιάταξης Θερμ. Υβριδισμού Χρόνος Υβριδισμού Θερμ. Πολυμερισμού Χρόνος πολυμερισμού A. 92 ο C 1min 56 ο C 1min 72 ο C 5 min 10 B. 92 ο C 1min 56 ο C 1min 72 ο C 5 min 10 Κύκλοι Γ. 92 ο C 1min 54 ο C 1min 72 ο C 5 min 10 Δ. 92 ο C 1min 54 ο C 1min 72 ο C 5 min 10 Πίνακας 10. Συνθήκες της PCR για την εισαγωγή σημειακής μετάλλαξης Β.2.27 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μετά από αντίδραση αντίστροφης τρανσκριπτάσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) Η τεχνική της PCR χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, με συνέπεια αυτή να γίνεται ανιχνεύσιμη και έμμεσα να διαπιστώνεται η ύπαρξη ενός γονιδίου. Κατά τον ίδιο τρόπο μπορούμε να ανιχνεύσουμε την ύπαρξη όχι του ίδιου του γονιδίου αλλά του μεταγραφήματος που προκύπτει από αυτό, δηλαδή του mrna. Αυτό γίνεται με την τεχνική της RT-PCR, η οποία είναι στην ουσία μία PCR με ένα επιπλέον βήμα, αυτό της παλίνδρομης μεταγραφής του mrna σε cdna. Πιο συγκεκριμένα, αφού απομονωθεί το mrna ή έστω συνολικό RNA από το βιολογικό υλικό που πρόκειται να μελετηθεί, αντιγράφεται παλίνδρομα το mrna με τη βοήθεια του ενζύμου της αντίστροφης τρανσκριπτάσης, και έτσι κατασκευάζεται το συμπληρωματικό προς αυτό cdna. Το τμήμα αυτό του DNA μπορεί στη συνέχεια να πολλαπλασιαστεί με PCR, το προϊόν της οποίας θα είναι στο τέλος ανιχνεύσιμο. Για να γίνει η παλίνδρομη αντιγραφή του mrna σε cdna πρέπει να είναι γνωστή η αλληλουχία των εκκινητών (primers) που είναι συμπληρωματική στην αλληλουχία των βάσεων του mrna. Η μέθοδος αυτή αποτελεί την πιο ευαίσθητη τεχνική για την ανίχνευση mrna (ακόμη και σε ίχνη), περισσότερο ευαίσθητη και από την τεχνική του υβριδισμού κατά Northern. Στη συγκεκριμένη εργασία, οι αντιδράσεις της RT-PCR έγιναν με τη χρήση του RobusT I kit, της εταιρίας Finnzymes. Πρόκειται για ένα kit, με τη βοήθεια του οποίου η αντίδραση πραγματοποιείται σε ένα μόνο βήμα, μέσα στον ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα. Για την καλύτερη αποδιάταξη του mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5, στο μίγμα της αντίδρασης προστέθηκε 5 % DMSO. Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης δίνονται στον πίνακα

147 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 10 x RobusT buffer (ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης) 5 μl 50 mm MgCl 1,5 μl 2 μίγμα dntps (10 mm το καθένα) 1 μl DMSO 5 % RNA εκμαγείο νοηματικός εκκινητής αντινοηματικός εκκινητής Αντίστροφη τρανσκριπτάση AMV RT (5 U/μl) DNA πολυμεράση DyNAzyme EXT DNA Pol (5 U/μl) ddh 2 O, ελεύθερο ριβονουκλεασών 1-2μg 10 pmol 10 pmol 1 μl 1 μl Έως τα 50 μl Πίνακας 11. Συστατικά μίγματος της αντίδρασης RT-PCR. Στάδιο θερμοκρασία χρόνος 1 Αποδιάταξη του RNA 68 o C 2 min 1 2 Σύνθεση του cdna 3 4 Απενεργοποίηση της AMV RT και αποδιάταξη του υβριδίου cdna - RNA Ενίσχυση με PCR (PCR amplification) 1) 55 o C 2) 50 o C 10 min για κάθε θερμοκρασία 94 o C 2 min 1 94 o C 40 sec 1) 60 o C 2) 68 o C 40 sec 72 o C 30 min 5 Τελική επιμήκυνση 72 o C 5 min αριθμός κύκλων 1 κύκλος για κάθε θερμοκρασία 19 κύκλοι για κάθε θερμοκρασία Πίνακας 12. Συνθήκες της αντίδρασης RT-PCR. 127

148 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η τεχνική της RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό της έκφρασης της εξωγενούς και ενδογενούς ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στους κλώνους C14 και C56, καθώς για τον έλεγχο της αποσιώπησης του γονιδίου RPS5. Το πρόγραμμα της αντίδρασης που ακολουθήθηκε δίνεται περιληπτικά στον πίνακα 12. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση είναι: για την εξωγενή rps5: Νοηματικός εκκινητής 5 - GCG GGA TCC ATG ACT GAG TGG GAA GCA- 3 Αντινοηματικός εκκινητής 5 - TAG AAG GCA CAG TCG AGG -3 για την ενδογενή rps5: Νοηματικός εκκινητής 5 - GCG GGA TCC ATG ACT GAG TGG GAA GCA -3 Αντινοηματικός εκκινητής 5 - GCG GAA TTC TCA GCG GTT AGA CTT GGC -3 Ο νοηματικός εκκινητής είναι ο ίδιος και στις δύο περιπτώσεις, ενώ ο αντινοηματικός εκκινητής για την εξωγενή rps5 είναι σχεδιασμένος έτσι ώστε να περιλαμβάνει την περιοχή του πλασμιδιακού φορέα pcdna-3.1, με τον οποίο έγινε η επιμόλυνση των κυττάρων MEL, η οποία κωδικοποιεί το γονίδιο για τον myc επίτοπο συζευγμένο με την ουρά των έξι ιστιδινών. Έτσι, είναι δυνατή η διάκριση του mrna της εξωγενούς rps5, από αυτό της ενδογενούς, λόγω μεγαλύτερης μοριακής μάζας. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές ενός γονιδίου που επιτελεί βασικές λειτουργίες του κυττάρου, housekeeping gene (γονίδιο κυτταρικής οικονομίας). Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές για την ακτίνη και αναφέρονται παρακάτω: για την ακτίνη: Νοηματικός εκκινητής 5 -TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3 Αντινοηματικός εκκινητής 5 -TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3 B.2.28 Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR Τα τμήματα DNA που προκύπτουν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, (PCR), ή μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε άλλες αντιδράσεις, θα πρέπει να διαχωριστούν από τους εκκινητές, το εκμαγείο, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυμεράση, ή τα αντίστοιχα ένζυμα. Ο καθαρισμός των τμημάτων αυτών DNA γίνεται με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της εταιρείας Qiagen. Στο μίγμα της αντίδρασης προστίθενται 5 όγκοι 128

149 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ διαλύματος PB, το οποίο περιέχει έναν χαοτροπικό παράγοντα, ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στη στήλη Qiaquick. Κατόπιν, γίνεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA δεσμεύεται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα συστατικά απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Ακολουθεί πλύσιμο της στήλης με το διάλυμα αιθανόλης PE και τελικά γίνεται έκλουση του DNA με μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του, (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). B.2.29 Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης H μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται όπως και η προηγούμενη, (παράγραφος Β.2.28), για τον καθαρισμό τμημάτων DNA μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, όταν η πέψη γίνεται διαδοχικά ή έπειτα από τον πολλαπλασιασμό τους με την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης, (PCR). Χρησιμοποιείται το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen. Η αρχή του συστήματος αυτού στηρίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται σε μικρές στήλες που περιέχουν πηκτές πυριτίου (silica gel), παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων και στην διέλευση των προσμίξεων από τις στήλες χωρίς να συγκρατώνται. Η διαδικασία έχει ως εξής: Το επιθυμητό τμήμα του DNA αποκόπτεται από την πηκτή και τοποθετείται σε σωλήνα επιτραπέζιας μικροφυγοκέντρου, (eppendorf). Κατόπιν, προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης, QG, σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση στους 50 ο C για 10 λεπτά με περιοδική ανάδευση, προκειμένου να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Στη συνέχεια, το μίγμα αυτό διαβιβάζεται σε στήλη Qiaquick και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη και ξεπλένεται από τις προσμίξεις με τη διαβίβαση του αιθανολικού διαλύματος PE. H έκλουση του DNA γίνεται με μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού ή ΤΕ, (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA ph 8.0). Κατόπιν, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DNA, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του και για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). 129

150 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.2.30 Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση, γίνεται εισαγωγή ενός τμήματος DNA στο γονιδίωμα ενός αυτόνομα πολλαπλασιαζόμενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασμιδίου. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι μικρά κυκλικά μόρια δίκλωνου DNA, που μπορούν να αναπτύσσονται ημι-αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασμιδιακός φορέας, όσο και το ξένο τμήμα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν, επωάζονται με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού και στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από μια DNA λιγάση, (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι εξής: pgex-2t, pcdna-3.1 και pegfp-c1. Ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t έχει μέγεθος 4948 ζεύγη βάσεων και περιέχει κι αυτός στο μόριο του έναν tac προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, το γονίδιο laq I q που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη καθώς και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης, (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασμιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει μεταξύ των άλλων θέσεις για τη διάσπαση του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού BamH I και EcoR I. Με τα δυο αυτά ένζυμα, γίνεται και η πέψη του τμήματος DNA που προορίζεται για την κλωνοποίηση στο πλασμίδιο αυτό. Ο πλασμιδιακός φορέας pcdna-3.1, έχει μέγεθος 5500 ζεύγη βάσεων και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών, ως πρωτεΐνες σύντηξης στο καρβοξυτελικό τους άκρο με την ακολουθία του myc επιτόπιου καθώς και με έξι ιστιδίνες, προκειμένου να είναι δυνατή η ανίχνευση της παραγόμενης πρωτεΐνης. Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για μόνιμη, καθώς και για παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το κλωνοποιημένο τμήμα DNA. Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV). Παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη, ενώ περιέχει και γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στη νεομυκίνη, έτσι ώστε να είναι δυνατή η επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει γίνει η 130

151 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ εισαγωγή του πλασμιδίου με το τμήμα του DNA. Η πέψη τόσο του πλασμιδίου όσο και του DNA, γίνεται χρησιμοποιώντας τα ένζυμα περιορισμού BamH I και EcoR I. Ο πλασμιδιακός φορέας pegfp-c1, έχει μέγεθος 4700 ζεύγη βάσεων και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο αμινοτελικό τους άκρο με την GFP, (Green Fluorescent Protein). Ο φορέας αυτός, είναι κατάλληλος για παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το κλωνοποιημένο τμήμα DNA. Η μεταγραφή των τμημάτων DNA, καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV) και παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό καναμυκίνη. Προκειμένου να γίνει εισαγωγή του τμήματος DNA που μας ενδιαφέρει στο πλασμίδιο αυτό, γίνεται πέψη και των δυο, με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού Kpn I και BamH I. Β Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DNA, (που μπορεί να είναι γενωμικό DNA, πλασμιδιακός φορέας, ή το τμήμα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυμα περιορισμού και σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουμίνη. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 έως 50 μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 ο C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10 % v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δυο με τρείς ώρες. Μερικές φορές όμως, για τα τμήματα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Στο πλασμίδιο pegfp-c1 κλωνοποιήθηκαν τα τμήματα του γονιδίου της rps5 που περιλαμβάνουν τα αμινοξέα 1-37, 1-50 δηλαδή τα rps5 1-37, rs Στα δυο πλασμίδια pgex-2t και pegfp-c1, κλωνοποιήθηκαν και τρεις μεταλλαγμένες μορφές της S5. Οι συνθήκες της αντίδρασης για κάθε πλασμίδιο και για κάθε τμήμα DNA που επρόκειτο να κλωνοποιηθεί στο εκάστοτε πλασμίδιο φαίνονται παρακάτω: 131

152 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για το πλασμίδιο PGEX- 2T γίνεται πέψη με τα ένζυμα περιορισμού EcoR I και BamH I τα οποία είναι συμβατά. EcoR I (20 U/μl) : 20 U BamH I (20 U/μl) : 20 U pgex-2t/ τμήμα DNA : 10/20 μg Ρυθμιστικό διάλυμα 10x : 2/5 μl BSA(10x) : 2/5 μl H 2 O : μέχρι 20/50 μl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος 10x είναι : 500 mm NaCl, 1 M Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 0,25% Triton X-100, (Πίνακας 13). Το συγκεκριμένο διάλυμα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυμο περιορισμού EcoR I. Για το πλασμίδιο PGEX- 2T γίνεται πέψη με τα ένζυμα περιορισμού Kpn I και τα BamH I οποία είναι συμβατά. Kpn I (10 U/μl) : 20 U pegfp-c1/ τμήμα DNA : 10/20 μg Ρυθμιστικό διάλυμα 10x : 2/5 μl BSA (10x) : 2/5 μl H 2 O : μέχρι 20/50 μl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται είναι αυτό που συνοδεύει την Kpn I, (I) και η σύστασή του είναι η εξής: 100mM Bis Tris Propane-HCl ph 7.0, 100mM MgCL 2, 10mM DDT, (Πίνακας 13). Στη συνέχεια, το πλασμίδιο ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή, (παράγραφο Β.2.29.). Το τμήμα του DNA καθαρίζεται όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Β Κατόπιν, γίνεται επώαση τόσο του πλασμιδίου, όσο και του DNA με το δεύτερο ένζυμο περιορισμού. BamH I (20 U/μl) pegfp-c1/ τμήμα DNA Ρυθμιστικό διάλυμα 10x BSA (10x) : 20 U : 10/20 μg : 2/5 μl : 2/5 μl 132

153 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ H 2 O ο : μέχρι 20/50 μl Επώαση στους 37 C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Το ρυθμιστικό διάλυμα είναι αυτό που συνοδεύει την BamH I, (Πίνακας 13). Όταν πρόκειται για πέψη πλασμιδίων, γίνεται επώαση πρώτα με το ένα ένζυμο, ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή αγαρόζης και μετά επώαση με το δεύτερο ένζυμο. Ο λόγος που γίνεται η διαδοχική πέψη, είναι προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι μετά την πέψη με το πρώτο ένζυμο, το πλασμίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραμμικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο μορφές του πλασμιδίου. Διαδοχική επώαση με τα δυο ένζυμα γίνεται, όταν αυτά δεν είναι συμβατά για να γίνει ταυτόχρονη επώαση. Οι πληροφορίες αυτές δίνονται αναλυτικά στον κατάλογο της εταιρείας NEBiolabs. Kpn I R0142L BamHI I R0136S EcoR I R0101S 10x buffer I: 10 mm Bis.Tris-Propane-HCl, ph 7, 10 mm MgCl 2, 1 mm DTT 100% της δράσης έχουμε με προσθήκη 0,01% BSA στο μίγμα της αντίδρασης. 10x buffer NEBuffer BamHI: 150 mm NaCl, ph 7,9, 10 mm MgCl 2, 10mM Tris-HCl, 1 mm DTT 100% της δράσης έχουμε με προσθήκη 0,01% BSA στο μίγμα της αντίδρασης. 10x buffer NEBuffer EcoRI: 100 mm Tris-HCl, ph 7,5, 10 mm MgCl 2,, 50 mm NaCl. 100% της δράσης έχουμε με προσθήκη 0,01% BSA και 0,025% Triton X- 100 στο μίγμα της αντίδρασης. Πίνακας 13. Ρυθμιστικά διαλύματα για τις αντιδράσεις πέψης με ένζυμα περιορισμού NEBiolabs. Β Αντίδραση λιγάσης Προκειμένου να γίνει η ενσωμάτωση του τμήματος του DNA που μας ενδιαφέρει στον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα, χρησιμοποιείται μια DNA λιγάση. Η αναλογία των δυο αντιδρώντων είναι συνήθως 6:1. Στην προκείμενη εργασία χρησιμοποιήθηκε το ligation kit, της εταιρείας Takara, (2011S). Οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: DNA πλασμιδιακού φορέα : 10 ng DNA τμήματος που θα ενσωματωθεί : 60 ng 133

154 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης του DNA 10x, (DNA Dilution buffer) : 2 μl T4 DNA λιγάση (5 units/μl) : 1 μl H 2 O : μέχρι τα 20 μl Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης μετά από την προσθήκη της λιγάσης είναι 20 μl. H επώαση γίνεται για 16 περίπου ώρες σε θερμοκρασία 15 ο C. B Aποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου Η αντίδραση λιγάσης (παράγραφος Β ) γίνεται και απουσία του τμήματος DNA που πρόκειται να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο, προκειμένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασμιδιακού φορέα, χωρίς την παρεμβολή του ξένου DNA. Αν παρατηρηθεί μεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιμο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου πριν αυτό χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριμένη εργασία, η φωσφατάση που χρησιμοποιήθηκε είναι της εταιρείας Roche. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης γίνεται ως εξής: DNA πλασμιδιακού φορέα : 100 ng Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφατάσης 10x : 2/3 μl SAP : 1 μl H 2 O : μέχρι τα 20/30 μl Επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C. Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί απενεργοποίηση του ενζύμου στους 65 ο C για 15 λεπτά. Στην συνέχεια ακολουθεί κατακρήμνιση του πλασμιδίου με 1/10 του όγκου CH 3 COONa 3 M ph 5,2 και τριπλάσια ποσότητα του όγκου με ψυχρή αιθανόλη 100 %. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις x g για 2 λεπτά και απομακρύνεται το υπερκείμενο. Το ίζημα ξηραίνεται και ακολουθεί αιώρηση με αποστειρωμένο νερό, (~16 μl αποστειρωμένο νερό). Τελικά, το αποφωσφορυλιωμένο πλέον πλασμίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. 134

155 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.2.31 Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό βακτηρίων (competent cells) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή τα βακτηριακά κύτταρα καθίστανται ικανά, (επιδεκτικά), προκειμένου να γίνει εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA (Sambrook, Fritsch et al. 1989). B Μέθοδος των δυο διαλυμάτων CaCl 2 Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο την επαγωγή της επιδεκτικότητας των βακτηριακών κυττάρων προκειμένου να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια που υπέστησαν κατεργασία με διαλύματα CaCl 2 στους 4 ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Η συγκεκριμένη τεχνική εφαρμόστηκε στα στελέχη E. coli XL1 και BL21(DE3) και αναλυτικά έχει ως εξής: 3ml θρεπτικού υλικού LB, (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1% w/v), εμβολιάζονται με κύτταρα Ε. coli, (XL1 ή BL21), και αφήνονται να αναπτυχθούν με ανακίνηση στους 37 ο C για ώρες (over night). Στη συνέχεια, 10ml LB εμβολιάζονται με 100 μl αυτής της καλλιέργειας και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C, μέχρις ότου η απορρόφηση φθάσει ~0,3, (αρχή της λογαριθμικής φάσης), στα 600 nm. Αμέσως μετά η καλλιέργεια τοποθετείται στον πάγο για 10 λεπτά, προκειμένου να σταματήσει η ανάπτυξη των κυττάρων κι ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 9000 x g για 10 λεπτά. Κατόπιν, αφού γίνει απόχυση του υπερκειμένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 5 ml CaCl mm, (1/2 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Τα κύτταρα παραμένουν για 20 λεπτά στον πάγο και ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση σε 9000 x g για άλλα 10 λεπτά. Τo υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά και τελικά τα κύτταρα αιωρούνται σε 1 ml CaCl 2 50 mm και παραμένουν στον πάγο για 45 λεπτά, οπότε και είναι έτοιμα να δεχθούν το DNA. Για κάθε δείγμα DNA χρησιμοποιούνται 200 μl επιδεκτικών κυττάρων (Mandel and Higa 1970). 135

156 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B Μέθοδος δυο διαλυμάτων CaCl 2 (αποθηκεύονται στους C) Η μέθοδος αυτή στηρίζεται, όπως και αυτή της παραγράφου Β , στην ιδιότητα του CaCl 2 να δημιουργεί επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα για την εισαγωγή DNA. Μπορεί να εφαρμοστεί στα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα TFB-I ph 7.0 CH 3 COOK 30 mm MnCl 2 50 mm KCl 100 mm CaCl 2 10 mm Γλυκερόλη 15% v/v Διάλυμα TFB-II ph 7.0 MOPS 10 mm CaCl 2 75 mm KCl 100 mm Γλυκερόλη 15% v/v 3 ml θρεπτικού υλικού LB ή TYM εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, [15μg/ml τετρακυκλίνη (XL1), 20μg/ml στρεπτομυκίνη (TOP 10)]. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml LB, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού LB και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή Η καλλιέργεια στη συνέχεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά, και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 20 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 25 ml, (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας), ρυθμιστικού διαλύματος TFB-I και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 4000 x g και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 1 ml διαλύματος TFB-II. Το αιώρημα που προκύπτει, χωρίζεται σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), σε κλάσματα των μl και αυτά εμβαπτίζονται για μικρό χρονικό διάστημα σε λουτρό, στο οποίο έχει προστεθεί ξηρός πάγος/αιθανόλη. Με τη διαδικασία αυτή, επιτυγχάνεται η άμεση ψύξη των κλασμάτων, τα οποία μπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους -70 C. 136

157 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.33 Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E. coli (μετασχηματισμός) Ένα τμήμα DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα πλασμίδιο και στην συνέχεια να εισαχθεί σε κύτταρα E.coli (μετασχηματισμός, transformation), ώστε να παραχθούν μέσα σε λίγες ώρες υψηλές ποσότητες του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, από το οποίο εύκολα μπορεί να απομονωθεί το κομμάτι DNA όπως επίσης και η υπερπαραγώμενη πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό το DNA. Τα επιδεκτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων, ( μl), προστίθενται ng πλασμιδιακού DNA ή 10 μl του μίγματος της αντίδρασης της λιγάσης και ακολουθεί επώαση για 45 λεπτά στον πάγο. Στη συνέχεια, το μίγμα των κυττάρων με το DNA υπόκειται σε θερμικό σοκ στους 42 ο C για 2 λεπτά και αμέσως μετά ψύχεται για 1 λεπτό στον πάγο. Στο μίγμα προστίθενται 800 μl LB και γίνεται επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C, προκειμένου να αρχίσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Κατόπιν, το μίγμα της επώασης φυγοκεντρείται σε 6000 x g για 2 λεπτά και απομακρύνεται το υπερκείμενο, (800 μl), ενώ τα κύτταρα αιωρούνται στα υπόλοιπα μl του LB. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ, το οποίο περιέχει και το αντίστοιχο αντιβιοτικό (αυτό στο οποίο προσδίδει αντίσταση το πλασμιδιακό DNA που έχουμε εισαγάγει). Με τον τρόπο αυτό γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Τα τρυβλία τοποθετούνται στους 37 C για ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού, ώστε είτε να χρησιμοποιηθούν ή για απομόνωση του πλασμιδιακού DNA ή για την υπερπαραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. 137

158 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.2.34 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση και καθαρισμός με φαινόλη / χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη Μια αποικία από τα μετασχηματισμένα κύτταρα έχουν αναπτυχθεί σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3ml θρεπτικού υλικού, στο οποίο έχει προστεθεί επίσης αντιβιοτικό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με ανάδευση, για ώρες στους 37 ο C. Ποσότητα 1,5 ml από την καλλιέργεια μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειμένου και στο ίζημα προστίθενται 50 μl ψυχρού διαλύματος που περιέχει 50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl ph 8,0 και 10 mm EDTA ph 8,0. Μετά από έντονη ανάδευση, στο ίδιο διάλυμα προστίθενται 100 μl πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 0,2 Ν NaOH και 1% w/v SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κατόπιν, ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος CH 3 COOK 5 M και έπειτα από έντονη ανάδευση ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Με τη φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα μεμβρανικά συστατικά, οι πρωτεΐνες, το χρωμοσωμικό DNA και το SDS. Στο υπερκείμενο προστίθενται 2,5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και στη συνέχεια αυτό αφήνεται στους -20 ο C για 30 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η κατακρήμνιση του DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Το ίζημα αιωρείται σε 50 μl διαλύματος ΤΕ, (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0), παρουσία RNase A, (20 μg/ml), και επωάζεται στους 37 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη 50 μl επιπλέον TE και κατόπιν, γίνεται εκχύλιση του DNA με προσθήκη 1 όγκου μίγματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης, σε αναλογία 25:24:1. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά. Στο τέλος γίνεται μια ακόμη εκχύλιση με την προσθήκη 1 όγκου χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 24:1, για την απομάκρυνση της εναπομένουσας φαινόλης. Κάθε φορά απομονώνεται η υδατική στοιβάδα έπειτα από φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Στο τέλος, προστίθενται 1/10 όγκου CH 3 COONa 3 M ph 5,2 και 2,5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και ύστερα από παραμονή στους -20 ο C για 30 λεπτά και φυγοκέντρηση, το DNA διαλυτοποιείται τελικά σε 20 μl 138

159 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) Σε 3 ml θρεπτικού υλικού LB παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, αιωρείται μια αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. Ποσότητα 1.5 ml της πλήρους ανεπτυγμένης καλλιέργειας, μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και φυγοκεντρείται στις x g για 1 λεπτό. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειμένου και αιώρηση των κυττάρων σε 250 μl διαλύματος P1. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη 250 μl διαλύματος P2 και ήπια ανάδευση. Έπειτα από παραμονή 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, προστίθενται 350 μl διαλύματος Ν3 και έπειτα από εντονότερη ανάδευση γίνεται φυγοκέντρηση σε x g για 10 λεπτά, για το διαχωρισμό του χρωμοσωμικού από το πλασμιδιακό DNA των βακτηρίων. Το υπερκείμενο διαβιβάζεται στη στήλη Qiagen tip-10 και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη, ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται. Για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων γίνεται πλύση με διάλυμα αιθανόλης PB. Το διάλυμα απομακρύνεται με διπλή φυγοκέντρηση σε x g, για 1 λεπτό. Η έκλουση του πλασμιδιακού DNA από τη στήλη γίνεται με 30 μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού. Για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλες ποσότητες, χρησιμοποιούνται οι στήλες Qiagen tip-100. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται εμβολιασμός 50 ή 100 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, από μια μικρότερη καλλιέργεια. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι ανάλογη αυτής που περιγράφηκε πιο πάνω (Qiagen Plasmid Purification Handbook, 1997). B.2.35 Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η συγκεκριμένη τεχνική επιτρέπει την έκφραση πρωτεϊνών με υψηλή απόδοση σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν, κλωνοποιούνται σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους προαγωγείς 139

160 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ τέτοιους, ώστε να επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτή. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας στήλη αγχιστείας, που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Κατά συνέπεια, ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα γίνεται εφικτός λόγω της αλληλεπίδρασης της GST με τη γλουταθειόνη που έχει ως αποτέλεσμα την καθήλωση της, στα σφαιρίδια της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη γίνεται με την προσθήκη διαλύματος αναγμένης γλουταθειόνης, σε περίσσεια. Με αυτόν τον τρόπο, αφενός μεν είναι δυνατή η εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, αφετέρου δε οι συνθήκες που χρησιμοποιούνται είναι πολύ ήπιες, έτσι ώστε ο κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης να είναι μηδαμινός. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν με τον τρόπο αυτό είναι η rps5 από ποντίκι καθώς και τα μεταλλάγματα της rps5, S(24)G, S(34)G. Ο πλασμιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση των παραπάνω γονιδίων είναι ο pgex-2t, (Pharmacia), ο οποίος φέρει το γονίδιο της GST. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα αιώρησης των κυττάρων PBS 1X Triton X % v/v β-μερκαπταιθανόλη 0,1 % v/v PMSF 1 mm Διάλυμα έκλουσης Αναγμένη Γλουταθειόνη 10 mm Tris-Cl ph mm Διάλυμα όξινο ph 4.5 CH 3 COONa 0,1 M NaCl 0,5 M Διάλυμα βασικό ph 8.5 Tris-Cl 0,1 M NaCl 0.1 M Διάλυμα εξισορρόπησης PBS 1X Triton X % v/v 140

161 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή για όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα, (BL21(DH3)), που έχουν μετασχηματιστεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα, απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Ακολουθεί εμβολιασμός 50ml υγρού θρεπτικού υλικού LB, (100 μg/ml αμπικιλλίνη), με μια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Κατόπιν, η καλλιέργεια αυτή επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. 10ml από την καλλιέργεια που προκύπτει, χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό 500ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνης. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ήπια ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων να φτάσει σε OD Στην πιο πάνω απορρόφηση, γίνεται προσθήκη 1 mm IPTG και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C, για περιορισμό δράσης πρωτεολυτικών ενζύμων, καθώς επίσης και για την ελαχιστοποίηση της δημιουργίας εγκλείστων σωματιδίων, (inclusion bodies). Η προσθήκη του IPTG, ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Η επώαση συνεχίζεται για ώρες και τελικά, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση 15 λεπτών σε 4500 x g. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου, το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 6ml διαλύματος αιώρησης των κυττάρων. Ακολουθεί λύση των κυττάρων με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβεί κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το τελικό αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά σε x g και λαμβάνεται το υπερκείμενο εκχύλισμα των πρωτεϊνών, το οποίο αναμιγνύεται με το αιώρημα των σφαιριδίων της στήλης. Ακολουθεί ανάδευση για 30 λεπτά στους 4 C, ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Στη συνέχεια, τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται για 2 λεπτά σε x g και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 λεπτά, στους 4 C υπό ανάδευση. Στο τέλος, μετά από φυγοκέντρηση 2 λεπτών σε x g, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε μία, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, με διάλυμα έκλουσης. Τα εκλούσματα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης, φυλάσσονται στους - 20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, μετά από κάθε χρήση, προκειμένου να επαναχρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό της ίδιας πρωτεΐνης σύντηξης, αναγεννάται με τρεις διαδοχικές πλύσεις στους 4 C, χρησιμοποιώντας για 30 λεπτά όξινο και για άλλα 30 λεπτά βασικό διάλυμα. Τελικά, η στήλη εξισορροπείται με διάλυμα PBST και 141

162 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ φυλάσσεται σε αυτό στους 4 C (Sambrook, Fritsch et al. 1989; Frangioni and Neel 1993). B.2.36 Έλεγχος in vivo φωσφορυλίωσης με την χρήση χρωματογραφίας αγχιστείας σε σφαιρίδια με καθηλωμένα δισθενή μέταλλα (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο ότι οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες δεσμεύονται ισχυρά σε μεταλλικά ιόντα δισθενών μετάλλων. Τα συγκεκριμένα σφαιρίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μείγμα καθηλωμένων μετάλλων όπως Fe 2+, Ca 2+, Al 2+, Zn 2+, geranium, iodium, lutenium. (το υλικό χρωματογραφίας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ευγενική προσφορά από την Dr. R Kamp). Προκειμένου να αποφευχθεί η μη εδική αλληλεπίδραση του υλικού με όξινες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα που περιείχαν εκτός των άλλων συστατικών ασπαρτικό οξύ και γλουταμινικό οξύ. Η διαδικασία που χρησιμοποιείται είναι η εξής: Tα MEL κύτταρα συλλέχθηκαν είτε από την λογαριθμική είτε από την στατική φάση ανάπτυξης των κυττάρων αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης, μετά από φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές/λεπτό. Έπειτα, ακολούθησε ένα πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, ph 7,4 (8,0 gr/l NaCl, 0,2 gr/l KCl, 1,15 gr/l Na2HPO 4, 0,2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O). Στο ίζημα των κυττάρων που λήφθηκε μετά από φυγοκέντρηση, προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, όπως αναφέρεται στην παράγραφο Β.2.5 καθώς και αναστολείς πρωτεασών PMSF 1 mm και 1 μm cocktail (Sigma). Ακολούθησε λύση των κυττάρων με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβούσε κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. H εξισορρόπηση του υλικού IMAC έγινε με τρία πλυσίματα των 10 λεπτών με αποστειρωμένο νερό και στην συνέχεια τρία πλυσίματα των 10 λεπτών με το διάλυμα εξισορρόπησης η σύσταση του οποίου αναφέρεται παρακάτω: Διάλυμα εξισορρόπησης ph 5,5: Ασπαρτικό οξύ 150 mm Γλουταμινικό οξύ 150 mm 142

163 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οξικό οξύ 20 mm Ιμιδαζόλιο 5 mm Στη συνέχεια, συλλέγθηκε το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, ακολούθησε φωτομέτρηση και ανάμιξη με το εξισορροπούμενο προσροφητικό υλικό ΙΜΑC, (200μg πρωτεϊνικού εκχυλίσματος/ 80mg υλικού IMAC). Ακολούθησε ανάδευση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση των πιθανών φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών στο υλικό IMAC, φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g και 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 15 λεπτών υπό ανάδευση, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, με διάλυμα έκλουσης, η σύσταση του οποίου αναφέρεται παρακάτω : Διάλυμα έκλουσης ph 7,5: Na 2 PO 4 100mM Na2HPO mm Η δεσμευμένη πρωτεΐνη rps5 μετά την έκλουση της από το υλικό IMAC ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής. Β.2.37 Έμμεσος ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκόπηση Τα συγκεκριμένα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, της Ιατρικής Σχολής, του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, (Dr. Θ. Παπαμαρκάκη). Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: Κύτταρα Hela διαμολύνθηκαν παροδικά με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια PEGFP-C1 χρησιμοποιώντας το KIT jetpei (Qbiogene) το οποίο χρησιμοποιεί υδατοδιαλυτά πολυμερή θετικά φορτισμένα. Το DNA συμπυκνώνεται και μαζί με τα θετικά φορτισμένα πολυμερή δημιουργεί θετικά φορτισμένα σωματίδια τα οποία εισέρχονται στο κύτταρο μετά από αντίδραση με τις αρνητικά φορτισμένες πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας. Συνοπτικά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από ώρες και στερεώθηκαν με 4% παραφορμαλδεύδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ακολούθησε επώαση με διάλυμα 50 mm NH 4 Cl σε PBS για 30 λεπτά, ώστε να εξουδετερωθεί η περίσσεια της παραφορμαλδεΰδης, ενώ ελαχιστοποιήθηκαν οι μη ειδικές συνδέσεις με επώαση με το διάλυμα δέσμευσης, 10% FCS σε PBS για 30 λεπτά. Ακολούθησε η προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος σε κατάλληλη αραίωση σε διάλυμα δέσμευσης και επώαση για 45 λεπτά. Κατόπιν, το αντίσωμα αφαιρέθηκε και το κυτταρικό ταπήτιο πλύθηκε τρεις φορές με PBS. Στη 143

164 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν επί 45 λεπτά με αντιορρό αιγός, έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού ή ποντικιού συζευγμένου με ισοθειοκυανική φλουερεσκεΐνη ή ροδαμίνη (FITC ή ΤRITC) σε αραίωση 1:200 σε 10% FCS σε PBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και οι καλυπτρίδες επικολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, με τη βοήθεια 5 μl διαλύματος Mowiol, που περιείχε 100 mg/ml diazabicylo (2.2.2) octane, DABCO (Sigma). Η διέργεση των FITC και TRITC επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τα μήκη κύματος 488 και 568 nm αντίστοιχα. Οι εικόνες συλλέχθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS-SP, εξοπλισμένο με λέιζερ αργού/κρυπτού και λογισμικό Leica TCS. Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν ήταν οι GFP-S5 1-37, GFP-S και τα μεταλλάγματα GFP-S5-Ser-24, GFP-S5-Ser-34 και GFP-S5-Thr-133. Για την ανίχνευση της rps5 ως πρωτεΐνη σύντηξης με τον myc-επίτοπο, τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με τον ανασυνδυασμένο φορέα pcdna 3.1-rpS5 χρησιμοποιώντας 0.1% Triton (σε PBS) για 4 λεπτά προκειμένου να αυξηθεί η διαπερατότητα της μεμβράνης. Ακολούθως, έγινε πλύση με PBS και επώαση με 10% FCS προκειμένου να καλυφθούν οι μη ειδικές αντιγονικές θέσεις. Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ήταν το μονοκλωνικό έναντι του myc (anti-myc) και το δεύτερο (anti mouse IgG) ήταν συζευγμένο με ένα παράγωγο της ροδαμίνης (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate TRITC). Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες σε διάλυμα Mowiol, που περιείχε 100 mg/ml diazabicylo (2.2.2) octane, DABCO από την εταιρία Sigma και παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS-SP, εξοπλισμένο με πηγή εκπομπής laser ακτινοβολίας (Argon- 488), laser στερεάς κατάστασης 561 και λογισμικό Leica TCS. Οι φωτογραφίες επεξεργάστηκαν με το Adobe Photoshop. Β.2.38 Μελέτες μοριακής δυναμικής της rps5 Για τις μελέτες μοριακής δυναμικής της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 από ποντίκι χρησιμοποιήθηκε server I-TASSER. Το πρόγραμμα αυτό παρείχε πέντε πιθανά μοντέλα, τα οποία δοκιμάστηκαν για τη δομική τους συμβατότητα με το μοριακό περιβάλλον της rps5, 1s1h.pdb. Το πιο συμβατό δομικό μοντέλο βασίστηκε στην περιοχή 2zkq.pdp (chain g) και στην περιοχή liqv.pdb, όπου έγινε ενεργειακή ελαχιστοποίηση και εξισορρόπηση στα 300Κ. Για να δοκιμαστεί η σταθερότητα 34-37, (κύριο τμήμα της α- έλικας 34-38) έγινε αποκοπή και στην συνέχεια εξισορρόπηση στα 300Κ. Οι μελέτες μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκαν σε μόρια τοποθετημένα σε μια σφαίρα νερού 144

165 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ με ακτίνα TIP3, χρησιμοποιώντας λογισμικό μοριακών δομών NAMD με το δυναμικό πεδίο CHARMM27 για πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Στο τέλος κάθε εξισορρόπησης, βγήκε ο μέσος όρος προκειμένου να δημιουργηθεί η πιο αντιπροσωπευτική δομή, η οποία χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Τα πειράματα μοριακής δυναμικής έγιναν από τον Δρ. Γ. Παπαδόπουλο. 145

166 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πρώτο μέρος της προκείμενης διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει πειράματα που αφορούν την φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 (rps5) και την μετακίνηση της από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και στους πυρηνίσκους, σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Παράλληλα, μελετήθηκε η λειτουργικότητα συγκεκριμένων περιοχών (domains) της rps5 ενδοκυτταρικά. Το δεύτερο μέρος αφορά σε μελέτες σχετικές με τον πιθανό ρόλο της rps5 στο πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων καθώς και την πιθανή εμπλοκή της σε βιοχημικά μονοπάτια της απόπτωσης. Συγκεκριμένα έγινε προσπάθεια να απαντηθεί το ερώτημα: κατά πόσο η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της rps5 σε ευκαρυωτικά κύτταρα (MEL) επιφέρει αλλαγές στην κυτταρική ανάπτυξη τους, στην έναρξη του προγράμματος διαφοροποίησης τους αλλά και στην απόπτωση. Γ.1 Μελέτη των δομικών στοιχείων και έλεγχος φωσφορυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 Γ.1.1 Παρασκευή υποκυτταρικών εκχυλισμάτων από ευκαρυωτικά κύτταρα και ενδοκυτταρική εντόπιση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 Από προηγούμενες μελέτες με πειράματα ανοσοφθορισμού σε HeLa ευκαρυωτικά κύτταρα βρέθηκε ότι η ριβοσωμική πρωτεΐνη rps5 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GFP (Green Fluorescent Protein), GFP-rpS5 wt, εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους των κυττάρων και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα (Δρ. Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή). Θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί περαιτέρω η υποκυτταρική εντόπιση της rps5 με βιοχημικές μεθόδους τόσο σε κύτταρα Hela, όσο σε κύτταρα MEL. Για τη μελέτη της υποκυτταρικής εντόπισης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στα MEL και HeLa κύτταρα, παρασκευάστηκαν υποκυτταρικά κλάσματα όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.8. Συγκεκριμένα, μετά την λύση το κυτταρικό εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε στα x g για 10 min και προέκυψε ένα υπερκείμενο και ένα πυρηνικό κλάσμα. Το αρχικό αυτό υπερκείμενο στη συνέχεια κλασματώθηκε, με φυγοκέντρηση στα 100,000 x g, για 1 h, σε ένα κυτταροπλασματικό και ένα μεμβρανικό κλάσμα. Καθαροί πυρήνες απομονώθηκαν 146

167 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μετά από διαβίβαση του αρχικού πυρηνικού κλάσματος μέσα από ένα "μαξιλάρι" σουκρόζης. Οι καθαροί πυρήνες κλασματώθηκαν στη συνέχεια στο κλάσμα του πυρηνοπλάσματος (nucleoplasm), του διαλυτού μέρους μετά από πέψη με δεοξυριβονουκλεάση (DNAse). Με Western blot ανάλυση των εκχυλισμάτων που λήφθηκαν, με τη χρήση πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της rps5 (το οποίο αναγνωρίζει το C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης), έδειξε εντόπιση της ριβοσωμικής rps5 κυρίως στο νουκλεόπλασμα και λιγότερη στο κυτταρόπλασμα και στα δύο είδη κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν (Hela και MEL, σχήμα Γ.1, Ν). Η καθαρότητα των εκχυλισμάτων του νουκλεοπλάσματος και του κυτταροπλάσματος ελέγχθηκε με την ανίχνευση της τομπουλίνης χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο μονοκλωνικό αντίσωμα. Η τομπουλίνη εντοπίζεται μόνον στο κυτταρόπλασμα και επομένως η απουσία της από το κλάσμα του νουκλεοσώματος διασφαλίζει την απουσία προσμίξεων των δύο αυτών κυτταρικών εκχυλισμάτων (σχήμα Γ.1., κάτω σειρά). Η ενδοκυτταρική εντόπιση της rps5 έγινε επίσης και με έμμεσο φθορισμό με μικροσκοπία συνεστίασης. Συγκεκριμένα με τον ανασυνδυασμένο ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pegfpc-1 με την rps5 κλωνοποιημένη στο καρβοξυτελικό άκρο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, GFP (ο ανασυνδυασμένος φορέας pegfprps5 είχε χορηγηθεί από τον Dr. S. Huang της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Σικάγου) διαμολύνθηκαν HeLa κύτταρα και ο φθορισμό ανιχνεύτηκε (σχήμα Γ.1.Β) όπως περιγράφεται στην σελίδα 143. Όπως είναι εμφανές, η rps5 εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους και δευτερευόντως στο κυτταρόπλασμα, όπως έδειξαν και τα πειράματα στα απομονωμένα και καθαρισμένα υποκυτταρικά σωματίδια. Στη συνέχεια, προκειμένου να μελετηθεί η κυτταρική εντόπιση της rps5 χωρίς την GFP, η οποία λόγω του υψηλού μοριακού μεγέθους (27kDa) θα υπήρχε περίπτωση να επηρεάσει την υποκυτταρική κατανομή, επελέγη ο ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας pcdna3.1-rps5 που εκφράζει την πρωτεΐνη rps5 ως πρωτεΐνη σύντηξης με τον myc επίτοπο και μια ουρά έξι ιστιδινών (σχήμα Γ.1.Β). Κύτταρα HeLa διαμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το KIT jetpei (Qbiogen) το οποίο χρησιμοποιεί υδατοδιαλυτά πολυμερή θετικά φορτισμένα. Το DNA συμπυκνώνεται και μαζί με τα θετικά φορτισμένα πολυμερή δημιουργεί θετικά φορτισμένα σωματίδια τα οποία εισέρχονται στο κύτταρο μετά από αντίδραση με τις αρνητικά φορτισμένες πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας. Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ήταν έναντι του myc (antimyc) και το δεύτερο (antimouse) ήταν συζευγμένο με ένα παράγωγο της ροδαμίνης (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate TRITC, κόκκινος φθορισμός). Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.1.Β και στις δύο περιπτώσεις (GFP-rpS5, myc-rps5) η rps5 εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους και δευτερευόντως στο κυτταρόπλασμα. 147

168 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προκειμένου να διαλευκανθεί περαιτέρω ο ρόλος της rps5 στους πυρηνίσκους έγινε συν-διαμόλυνση των HeLa κυττάρων με τους ανασυνδυασμένους φορείς pegfp-fibrillarin και pcdna3.1-rps5 (GFP- fibrillarin και myc-rps5, αντίστοιχα). H fibrillarin χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας για την ινώδη υποπεριοχή του πυρηνίσκου (Dense Fibrillar Component, DFC) και όχι για την κοκκιώδη. Η ινώδης περιοχή του πυρηνίσκου είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην σύνθεση, τροποποίηση και στα αρχικά στάδια υδρόλυσης (cleavage) για την ωρίμανση του pre-rrna. Σύμφωνα με το σχήμα Γ.1. Γ φαίνεται ότι η rps5 βρίσκεται «διάχυτη» στους πυρηνίσκους, δηλαδή καλύπτει και την ινώδη και την κοκκιώδη περιοχή. 148

169 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.1 Υποκυτταρική εντόπιση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 Α. Υποκυτταρική εντόπιση της ενδογενούς ( μη ανασυνδυασμένης) rps5 σε κύτταρα MEL και HeLa με ανοσοανίχνευση Διαδρομή 1 (WC) Δείγμα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL και HeLa Διαδρομή 2 (C ) Δείγμα από το κλάμα κυτταροπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL και HeLa Διαδρομή 3 (N ) Δείγμα από το κλάμα πυρηνοπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL και HeLa Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000, ενώ το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της τομπουλίνης, χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:500. Β. Υποκυτταρική εντόπιση της GFPrpS5 myc-rps5 σε HeLa κύτταρα με έμμεσο φθορισμό Η rps5 και στις δύο περιπτώσεις εντοπίζεται κυρίως στον πυρηνίσκο και δευτερευόντως στο κυτταρόπλασμα. Ο ανοσοφθορισμός έγινε όπως περιγράφεται στην σελίδα 143 Γ. Συνεντοπισμός GFP-fibrillarin και rps5-myc σε κύτταρα HeLa H fibrillarin χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας για την ανίχνευση του ινώδους τμήματος του πυρηνίσκου. Γ.1.2 In vivo πρωτεόλυση της rps5 Η ρυθμιζόμενη πρωτεόλυση των πρωτεϊνών είναι μία εξαιρετικά σημαντική κυτταρική λειτουργία τόσο στους προκαρυωτικούς όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία διάφορες πρωτεΐνες υφίστανται πρωτεόλυση μόνο σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου ή έπειτα από κάποιο περιβαλλοντικό ερέθισμα. 149

170 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Για την rps5 έχουν δημοσιευτεί διάφορες «πρωτεολυμένες» μορφές, που αφορούν την απουσία αρχικών αμινοτελικών αμινοξέων. Πιο συγκεκριμένα, η rps5 από ανθρώπινο πλακούντα εμφανίζεται με δυο μορφές S5 και S5a (και οι δύο προέρχονται από το ίδιο μεταγράφημα cdna) (Vladimirov, 1996). Επίσης η ομόλογη rps5 από επίμυ εμφανίζεται ενδοκυτταρικά και με την πρωτεολυμένη της μορφή, S5a, από την οποία λείπουν τα πέντε πρώτα αμινοξέα, (Kuwano and Wool, 1992). Σύμφωνα με τους Madjar, & Traut, (1980) η παρατηρούμενη πρωτεόλυση λαμβάνει χώρα κατά την διάρκεια της απομόνωσης και δεν αποτελεί ενδοκυτταρική διαδικασία. Σύμφωνα με θεωρητική προσέγγιση με εργαλεία βιοπληροφορικής (προκείμενη εργασία, πρόγραμμα analysis) βρέθηκε ότι στην αμινοτελική περιοχή της rps5 υπάρχει μια ακολουθία σήμα πρωτεόλυσης (MTEWEAATPAVAETPDIK---) (στα 18 πρώτα αμινοξέα), που ονομάζεται PEST η οποία οδηγεί την πρωτεΐνη σε αυτοπρωτεόλυση. Οι ακολουθίες αυτές ονομάζονται PEST, (Proline, Glutamic acid, Serine, Threonine), διότι περιέχουν συνήθως τα τέσσερα αμινοξέα προλίνη, γλουταμινικό οξύ, σερίνη και θρεονίνη, όχι απαραίτητα με αυτή τη σειρά και μια λανθάνουσα PEST περιοχή, (Rechsteiner and Rogers, 1996) ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση σε σερίνη ή θρεονίνη. Η τιμή για την συγκεκριμένη πρωτεΐνη ήταν 2,5 (ασθενές PEST σήμα). Σύμφωνα με το πρόγραμμα αυτό, τιμές πάνω από το μηδέν δηλώνουν την πιθανή ύπαρξη μιας PEST περιοχής, με ενδεχόμενη ενδοκυτταρική λειτουργία. Τα θεωρητικά αυτά ευρήματα στηρίχθηκαν σε πειράματα προκειμένου να μελετηθεί εάν η παρατηρούμενη πρωτεόλυση της rps5 είναι αποτέλεσμα μιας ενδοκυτταρικής διαδικασίας ή εάν αποτελεί τυχαίο γεγονός, το οποίο όμως είναι επαναλήψιμο και οφείλεται στην ιδιαιτερότητα της δομής της rps5. H «συμπεριφορά» της πρωτεΐνης μελετήθηκε σε κύτταρα που απομονώθηκαν σε δύο διαφορετικές φάσεις ανάπτυξης των κυττάρων, δηλαδή στην λογαριθμική (48 hrs) και στην στατική (96 hrs), όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.2. Συγκεκριμένα συλλέχθηκαν κύτταρα από την λογαριθμική (σχήμα Γ.2Α) και την στατική φάση ανάπτυξης των ΜΕL, (σχήμα Γ.2Β) και μετά από λύση των κυττάρων παρατηρήθηκε πρωτεόλυση μόνον στα κύτταρα εκείνα που είχαν συλλεγεί από την στατική φάση μετά από 96 hrs (2) και όχι από τα κύτταρα της λογαριθμικής φάσης (48hrs,1). Προκειμένου να διασφαλιστεί η «ιδιαιτερότητα» της παρατηρηθείσης πρωτεόλυσης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας μία άλλη πρωτεΐνη, η ακτίνη. Σύμφωνα με το σχήμα Γ.2Α, η ακτίνη παραμένει ακέραια και στην λογαριθμική (1) και στην στατική φάση (2). 150

171 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α. Β Σχήμα Γ.2 In vivo πρωτεόλυση της rps5 και κινητική ανάπτυξης MEL κυττάρων A. Ανοσοανίχνευση της rps5 και της ακτίνης σε κύτταρα λογαριθμικής και στατικής φάσης. Ολική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη απομονώθηκε από την λογαριθμική (1, 48 hrs ) και την στατική φάση (2, 96 hrs) από MEL parental κύτταρα. Και για τις δύο περιπτώσεις (rps5 και ακτίνη) 50μg ολικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 12% SDS-PAGE και ανοσοανιχνεύτηκαν οι πρωτεΐνες με τα αντίστοιχα αντισώματα. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 και το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες των οποίων το μοριακό μέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, Διαδρομή 1: Κυτταρικά εκχυλίσματα από την καλλιέργεια MEL parental μετά από επώαση 48 ωρών (λογαριθμική φάση, log phase). Διαδρομή 2: Κυτταρικά εκχυλίσματα από την καλλιέργεια MEL parental μετά από επώαση 96 ωρών (στατική φάση, stationary phase). 151

172 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Β. Κινητική ανάπτυξης MEL parental κυττάρων Κύτταρα της καλλιέργειας MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 μέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν μέτρηση των κυττάρων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.2. Στις48 ώρες (λογαριθμική φάση ανάπτυξης) και 96 ώρες (στατική φάση ανάπτυξης) απομονώθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα, προκειμένου να ελεγχθούν τα επίπεδα της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 και της ακτίνης με ανάλυση κατά Western. Επίδραση διαφορετικών ρυθμιστικών διαλυμάτων στην in vivo πρωτεόλυση Προκειμένου να ελεγχθεί εάν η παρατηρούμενη πρωτεόλυση της rps5 δεν ήταν αποτέλεσμα κάποιων συγκεκριμένων ρυθμιστικών διαλυμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά διαλύματα λύσης των κυττάρων. Συγκεκριμένα (σχήμα Γ.3) συλλέχθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα από την λογαριθμική φάση ανάπτυξης των MEL parental κυττάρων και η λύση έγινε ή με το RIPA buffer (σχήμα Γ.3 1 διαδρομές 1 και 2) όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.5 ή με το Buffer του kit NucleoSpin RNA/protein (σχήμα Γ.3 1 διαδρομές 3 και 4, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.6.3). Σχήμα Γ.3 Ανοσοανίχνευση της rps5 σε κυτταρικά εκχυλίσματα που προέκυψαν μετά από λύση των ΜEL parental κυττάρων με δύο διαφορετικά διαλύματα λύσης Ολική κυτταροπλασματική πρωτεΐνη απομονώθηκε από την λογαριθμική φάση (48 hrs ) από MEL parental κύτταρα με το RIPA buffer, διαδρομές 1 και 2 (50μg και 60μg, αντίστοιχα) ή με το διάλυμα λύσης του kit NucleoSpin RNA/protein, διαδρομές 3 και 4 ( 50μg και 60μg, αντίστοιχα) και ανοσοανιχνεύτηκαν όπως περιγράφεται στο σχήμα Γ.2.Α Διαδρομή 1: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα (50μg) MEL κυττάρων, χρησιμοποιώντας το διάλυμα λύσης RIPA buffer. Διαδρομή 2: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα(60μg) MEL κυττάρων, χρησιμοποιώντας το διάλυμα λύσης RIPA buffer. Διαδρομή 3: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα(60μg) MEL κυττάρων, χρησιμοποιώντας το διάλυμα λύσης buffer του kit NucleoSpin RNA/protein. 152

173 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαδρομή 4: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα(50μg) MEL κυττάρων, χρησιμοποιώντας το διάλυμα λύσης buffer του kit NucleoSpin RNA/protein. Σε όλες τις περιπτώσεις φαίνεται ότι το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε δεν είχε καμία επίδραση στην «ενδογενή» πρωτεόλυση της πρωτεΐνης. Το επόμενο βήμα ήταν να ελεγχθούν οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης και συγκεκριμένα ο βρασμός των δειγμάτων και η προσθήκη της μερκαπτοαιθανόλης. Και ο βρασμός και η προσθήκη μερκαπτοαιθανόλης είναι γνωστό από την διεθνή βιβλιογραφία ότι «διασπούν» πρωτεϊνικά συσσωματώματα ή ασθενείς ενδομοριακές ή διαμοριακές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών. Δείγματα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης από κύτταρα MEL, τα οποία συλλέχθηκαν από την λογαριθμική φάση ανάπτυξης, ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS PAGE ηλεκτροφόρηση απουσία β-μερκαπτοαιθανόλης και χωρίς βρασμό, (σχήμα Γ.4). Σχήμα Γ.4 SDS-PAGE 12% ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση της rps5 μετά από λύση των ΜEL κυττάρων που είχαν συλλεγεί από την λογαριθμική φάση ανάπτυξης Δείγματα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης, (50μg), που απομονώθηκαν από κύτταρα MEL, (από την λογαριθμική φάση ανάπτυξης), χρησιμοποιώντας το διάλυμα λύσης RIPA buffer ηλεκτροφορήθηκαν τόσο παρουσία, όσο και απουσία β-μερκαπτοαιθανόλης, προκειμένου να ελεγχθεί εάν εμφανιστεί το πρωτεόλυμα της rps5. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες των οποίων το μοριακό μέγεθος φαίνεται δεξιά σε kda, Διαδρομή 1: δείγμα παρουσία β-μερκαπτοαιθανόλη, Διαδρομή 2: δείγμα χωρίς β-μερκαπτοαιθανόλη, Διαδρομή 3: δείγμα χωρίς β-μερκαπτοαιθανόλη και χωρίς βρασμό Όπως φαίνεται από το πιο πάνω σχήμα η rps5 ανεξάρτητα από την παρουσία ή απουσία της μερκαπτοαιθανόλης ανιχνεύεται ως μία ζώνη. 153

174 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ένας τελευταίος έλεγχος έγινε και σε κυτταρική σειρά που προέκυψε από μόνιμη επιμόλυνση με τον ανασυνδυασμένο φορέα pcdna-3.1-rps5 (Δρ. Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή, σε αυτήν την κυτταρική σειρά τα επίπεδα του mrna της rps5 είναι υψηλότερα των φυσιολογικών). Και σε αυτήν την περίπτωση, όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.5 η rps5 πρωτεολύεται στην στατική φάση ανάπτυξης των MEL rps5 C14. Σχήμα Γ.5. Ανοσοανίχνευση της rps5 σε κυτταρικά εκχυλίσματα που απομονώθηκαν από την στατική φάση των MEL rps5 C14 κυττάρων Δείγματα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης, (50μg), απομονώθηκαν από την στατική φάση( 96 ώρες) των MEL rps5 C14 κυττάρων και αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Σύμφωνα με τις προαναφερθείσες μελέτες φαίνεται ότι η in vivo πρωτεόλυση της rps5 είναι εξειδικευμένη και λαμβάνει χώρα μόνον στην στατική φάση ανάπτυξης των κυττάρων και όχι στα αρχικά στάδια ανάπτυξης τους. Γ.1.3 Φωσφορυλίωση της rps5 και «ενδοκυτταρική κυκλοφορία» Όπως αναφέρθηκε παραπάνω με πειράματα ανοσοφθορισμού βρέθηκε ότι η ακέραια rps5 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GFP (GFP-rpS5 wt) καθώς επίσης και χωρίς την GFP ( myc-rps5), εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους των κυττάρων και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα σε αντίθεση με την κολοβή rps (GFP-rpS , Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή) η οποία εντοπίζεται παντού στον πυρήνα όχι όμως στο κυτταρόπλασμα. Επιπρόσθετα σύμφωνα με άλλα δεδομένα (Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή) αναφορικά με τη φωσφορυλίωση της rps5 (η rps5 154

175 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ φωσφορυλιώνεται από την κινάση της καζεΐνης in vitro στην αμινοτελική περιοχή της και συγκεκριμένα στα πρώτα 1-37 αμινοξέα) φαίνεται ότι η περιοχή των πρώτων 37 αμινοξέων περιέχει αμινοξέα- στόχους της κινάσης της καζεΐνης. Το εύρημα αυτό παραπέμπει σε μία πιθανή εμπλοκή του αμινοτελικού άκρου της rps5 στην ενδοκυτταρική εντόπιση αρχικά και πιθανώς κατ επέκταση στην ενδοκυτταρική «κυκλοφορία» της. Συγκεκριμένα στην αμινοτελική περιοχή των 37 πρώτων αμινοξέων της rps5, υπάρχουν πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης τόσο από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ (CK II) όσο και από άλλες κινάσες όπως απεικονίζεται στο σχήμα Γ.6. Η CK II είναι μια κινάση της οικογένειας σερίνης / θρεονίνης και πρόκειται για ένα τετραμερές ένζυμο που αποτελείται από δυο υπομονάδες α 2 β 2. Η α υπομονάδα, (44 kda) έχει καταλυτική δράση, ενώ η β υπομονάδα (26 kda) έχει ρυθμιστικό ρόλο. Το συγκεκριμένο ένζυμο φωσφορυλιώνει είτε σερίνες είτε θρεονίνες που συνοδεύονται συνήθως από μια σειρά όξινων αμινοξέων, στοχεύοντας σε ένα ευρύ φάσμα τόσο πυρηνοπλασματικών όσο και κυτταροπλασματικών υποστρωμάτων. Έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνει πρωτεΐνες του πυρηνίσκου, όπως για παράδειγμα την νουκλεολίνη, και ότι ενεργοποιεί την μεταγραφή των rrnas. Επίσης, διαδραματίζει σπουδαίο ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στον έλεγχο κυτταρικής διαίρεσης κατά την διάρκεια της G1 και G2/M φάση στην Saccharomyces cerevisiae, (Hanna, D.E.,1995). Μια άλλη ενδιαφέρουσα πληροφορία είναι η φωσφορυλίωση πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από πολύ σημαντικά λειτουργικά γονίδια, όπως το c-myc ογκογονίδιο (Hanna et. al, 1995). Λαμβάνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη σχεδιάστηκαν πειράματα που αφορούσαν στην α. in vitro φωσφορυλίωση συγκεκριμένων αμινοξέων της rps5 από την CKII, β. πειράματα που αφορούσαν στην υποκυτταρική εντόπιση των περιοχών εκείνων, οι οποίες περιλαμβάνουν τα αμινοξέα- στόχους της CKII και γ. πειράματα διερεύνησης της in vivo φωσφορυλίωσης της rps5 από την CKII. Γ.1.4 Θεωρητική προσέγγιση των αμινοξέων στόχων φωσφορυλίωσης της rps5 Στο σχήμα Γ.6 δίδονται η ακολουθία και οι πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης της rps5 όπως προέκυψε μετά από χρήση του υπολογιστικού προγράμματοςnetphos. Συγκεκριμένα στην αμινοτελική περιοχή των 37 πρώτων αμινοξέων της rps5, υπάρχουν τρεις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την CKII, η θρεονίνη στη θέση 2, [Τ (2)], η σερίνη στη θέση 24, [S(24)] και η σερίνη στη θέση 34, [S(34)]. 155

176 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην ίδια περιοχή υπάρχουν και άλλες δυο πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης, η θρεονίνη στη θέση 8, [Τ(8)], από την κινάση p38mapk και η θρεονίνη στη θέση 14, [Τ(14)] από μία άγνωστη κινάση. Στην περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου της πρωτεΐνης η θρεονίνη στη θέση 133, [Τ(133)], προτείνεται από το ίδιο υπολογιστικό πρόγραμμα (NetPhos) ως πιθανός στόχος φωσφορυλίωσης από την κινάση PKC. Λαμβάνοντας υπόψη τις πιο πάνω θεωρητικές προσεγγίσεις έγιναν μεταλλάξεις στις σερίνες 24, 34 προκειμένου να διερευνηθεί πειραματικά η in vitro φωσφορυλίωση τους από την CKII. Η εμπλοκή της θρεονίνης 2 είχε μελετηθεί στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής της κ. Χ. Ματράγκου και είχε βρεθεί ότι απάλειψη του αμινοξέος αυτού δεν επηρεάζει την υποκυτταρική εντόπιση της rps5 (η rps5 χωρίς την Thr-2 εντοπίστηκε στους πυρηνίσκους όπως και η ακέραια rps5). Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία στην υποκυτταρική εντόπιση αρκετών ριβοσωμικών πρωτεϊνών «συνεργάζονται» η ευρεία αμινοτελική και η ευρεία καρβοξυτελική περιοχή. Προκειμένου λοιπόν να μελετηθεί μία τέτοια πιθανή «συνεργασία» έγινε μετάλλαξη και στην θρεονίνη 133. Σχήμα Γ.6. Αμινοξική ακολουθία της rps5 με τη χρήση του προγράμματος NetPhos, TEWE, STDD, SLQD: πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση καζεΐνης ΙΙ CKII. ATPAV: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την p38mapk κινάση ETPDI: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από άγνωστη κινάση 156

177 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ TVR: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την PKC κινάση Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων της rps5 στους πλασμιδιακούς φορείς pegfp-c1 Η μετάλλαξη των σερινών S(24), S(34) και της θρεονίνης T(133) σε γλυκίνη (G) η οποία αποτελεί ένα ουδέτερο αμινοξύ, έγινε χρησιμοποιώντας την τεχνική του megaprimer για την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Σχεδιάστηκαν οι κατάλληλοι εκκινητές οι οποίοι έφεραν τη μετάλλαξη, (αναφέρονται στον πίνακα 9, παράγραφος Β.2.26) για κάθε περίπτωση και χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους 5 και 3 εκκινητές για κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 ( αναφέρονται στον πίνακα 6, παράγραφος Β.2.25) έγινε η αντίδραση PCR. Ο εκκινητής, (5 ), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού Kpn I και ο άλλος εκκινητής,(3 ), για το ένζυμο BamH I για κάθε μια μετάλλαξη αντίστοιχα. Η ακολουθία του κάθε εκκινητή, καθώς και οι συνθήκες της κάθε αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στις παραγράφους Β και Β Μετά το τέλος της κάθε αντίδρασης το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Στο σχήμα Γ.7 φαίνονται στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, ~ 620bp τα κύρια προϊόντα που προέκυψαν. Το DNA στις διαδρομές 1 και 3 σχήματος Α και διαδρομή 1 σχήματος Β, (σχήμα Γ.7), εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισμός με το Gel Extraction Kit, (αναφέρεται αναλυτικά η διαδικασία στην παράγραφο B.2.29). Τόσο τα DNA τμήματα που απομονώθηκαν όσο και το πλασμίδιο pegfp-c1, επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού Kpn I και BamΗ Ι. Μετά το τέλος της επώασης τα γονίδια της rps5 που φέρουν τις επιθυμητές μεταλλάξεις, καθαρίστηκαν με το PCR Purification Kit, (παράγραφοs B.2.28). Ο φορέας ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης με το Gel Extraction Kit, (αναφέρεται αναλυτικά η διαδικασία στην παράγραφο B.2.29) και ακολούθησαν αποφωσφορυλίωση του πλασμιδιακού φορέα, (παράγραφος Β.2.30) και η αντίδραση της DNA λιγάσης (Takara,παράγραφος Β.2.30). Η εισαγωγή του ανασυνδυασμένου φορέα pegfp-c1 έγινε σε επιδεκτικά κύτταρα E.coli TOP10, όπως περιγράφεται στη B.2.33 και τα μετασχηματισμένα κύτταρα, αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία 157

178 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ του αντιβιοτικού καναμυκίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριμένο πλασμίδιο, (pegfp-c1). Σχήμα Γ.7 Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v των προϊόντων PCR για την απομόνωση του γονιδίου της rps5 S(24) mut,s(34) mut και T(133) mut Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb Α. S (24) mut. Διαδρομή 1 : Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου pegfp-c1 (προϊόν στα ~620 bp). Διαδρομή 2: Αντίδραση απουσία του εκμαγείου pegfp-c1 (control). S (34) mut. Διαδρομή 3 : Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου pegfp-c1 (προϊόν στα ~620 bp). Διαδρομή 4: Αντίδραση απουσία του εκμαγείου για pegfp-c1. Β. T(133) mut. Διαδρομή 1 : Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου για pegfp-c1 (προϊόν στα ~620 bp). Από τις αποικίες που προέκυψαν, προκειμένου να βρεθούν οι θετικές που φέρουν τον αναμενόμενο ανασυνδυασμένο φορέα, έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με το kit mini prep Qiagen (παράγραφο B ) και το DNA που απομονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε με τα ένζυμα περιορισμού Kpn I και BamHI για να βρεθούν οι θετικοί κλώνοι (ύπαρξη του αναμενόμενου τμήματος DNA στα ~620bp, που αντιστοιχεί στην rps5). 158

179 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP-rpS5 Thr-133 (mut), GFP-rpS5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) Η αντικατάσταση των αμινοξέων σερίνη-24, σερίνη-34 και θρεονίνη-133 από την γλυκίνη επαληθεύτηκε μετά από ανάλυση της νουκεοτιδικής ακολουθίας των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που έφεραν τις αντίστοιχες μεταλλάξεις. Στη συνέχεια με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια διαμολύνθηκαν HeLa κύτταρα, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.37 και μελετήθηκε η κυτταρική εντόπιση των αντίστοιχων πρωτεϊνών με έμμεσο φθορισμό στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων από την ομάδα της Αναπλ. καθ. κ. Θ. Παπαμαρκάκη, (σχήμα Γ.8). Σχήμα Γ.8 Έμμεσος φθορισμός των μεταλλαγμάτων GFP-rpS5 Thr-133 (mut), GFP-rpS5 Ser-24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) με μικροσκοπία συνεστίασης (confocal analysis) Κύτταρα HeLa, διαμολύνθηκαν παροδικά με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια GFP-rpS5 Thr- 133 (mut), GFP-rpS5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) και μελετήθηκε ο έμμεσος φθορισμός. Α. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 S(34)mut,Β. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 S(24) mut, Γ. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 T(133) mut. Όπως χαρακτηριστικά φαίνεται στο πιο πάνω σχήμα οι πρωτεΐνες σύντηξης GFP-rpS5 Ser(34) mut και GFP-rpS5 Thr(133) mut εντοπίζονται παντού σε όλα τα 159

180 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ διαμερίσματα του κυττάρου χωρίς καμιά εξειδίκευση και ο φαινότυπος τους ομοιάζει με την εντόπιση της GFP, σε αντίθεση με την GFP-rpS5 w/t που εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα. Από την άλλη πλευρά η GFPrpS5 Ser (24) mut. εντοπίζεται στο πυρηνόπλασμα και στο κυτταρόπλασμα, αφήνοντας τελείως άδειους τους πυρηνίσκους. Για περισσότερες επεξηγήσεις βλέπε Συζήτηση, σελίδα 229. Γ Σχεδιασμός και κλωνοποίηση των μεταλλαγμάτων GFP- rps5 Ser -24 (mut) και GFP-rpS5 Ser-34(mut) στον πλασμιδιακό φορέα pgex- 2T για πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης με την κινάση της καζεΐνης ΙΙ (CKII) Δεδομένου ότι βρέθηκε πιθανή in vitro φωσφορυλίωση της rps5 από την CKII στις θέσεις σερίνης 34 και 24 σχεδιάστηκαν κατάλληλοι εκκινητές προκειμένου να κλωνοποιηθούν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t, (αναφέρονται στον πίνακα 6, παράγραφος Β.2.25), να παραχθούν οι πρωτεΐνες σύντηξης GST-rpS5 S(24)mut., GST-rpS5 S(34)mut και η διπλή μετάλλαξηgst-rps5 S[(24), (34)]mut και στη συνέχεια να υποβληθούν σε in vitro φωσφορυλίωση με την CKII, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Συγκεκριμένα ο εκκινητής, (5 ), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού EcoR I και ο άλλος εκκινητής (3 ), για το ένζυμο BamH I, για κάθε μια μετάλλαξη αντίστοιχα Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Για την παραγωγή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που «φέρει» και τις δύο μεταλλάξεις στις σερίνες στις θέσεις 34 και 24, pgex-2τ-rps5 S[(34),(24)] mut, χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2τ-rps5 S(34) και ο megaprimer για την μετάλλαξη της σερίνης στην θέση 24. Μετά το τέλος της αντίδρασης PCR με τους κατάλληλους εκκινητές, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Στο σχήμα Γ.9, φαίνονται τα κύρια προϊόντα που προέκυψαν στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος στα 620bp. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν και απουσία εκμαγείου (control). Στη συνέχεια οι ζώνες DNA στις διαδρομές 1 και 2 του σχήματος Α (σχήμα Γ.9) και στη διαδρομή 1 του σχήματος Β (σχήμα Γ.9) εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης με το Gel Extraction Kit, (παράγραφος B.2.29). Και τα τμήματα DNA που απομονώθηκαν και το πλασμίδιο pgex-2t, επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού EcoR I και BamΗ Ι. Μετά το τέλος της επώασης τα γονίδια της rps5 που φέρουν τις επιθυμητές μεταλλάξεις, καθαρίστηκαν με το PCR Purification Kit, (παράγραφος 160

181 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ B.2.28). Ο φορέας pgex-2t ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης με το Gel Extraction Kit, (παράγραφος B.2.29) και ακολούθησαν αποφωσφορυλίωση του πλασμιδιακού φορέα (παράγραφος Β.2.30) και η αντίδραση της DNA λιγάσης (Takara, παράγραφος Β.2.30). Με τους ανασυνδυασμένους φορείς μετασχηματίστηκαν επιδεκτικά κύτταρα E.coli TOP10, όπως περιγράφεται στη B Τα μετασχηματισμένα πλέον κύτταρα, αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριμένο πλασμίδιο. Στην συνέχεια έγινε έλεγχος των θετικών αποικιών που φέρουν τον αναμενόμενο ανασυνδυασμένο φορέα, με απομόνωση πλασμιδιακού DNA με τη βοήθεια του kit mini prep Qiagen (παράγραφο B ). Το DNA που απομονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε με τα ένζυμα περιορισμού EcoR I και BamHI, προκειμένου να διαπιστωθούν οι θετικοί κλώνοι, από την ύπαρξη του αναμενόμενου τμήματος DNA στα ~620bp, που αντιστοιχεί στο μεταγράφημα cdna της rps5. Σχήμα Γ.9 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v των προϊόντων PCR που προέκυψαν για τα μεταλλάγματα pgex-s5 Ser -24 (mut), pgex-s5 Ser-34(mut) και pgex-s5ser-24-ser-34(mut) Α Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb Διαδρομή 1. S(24) mut. Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου pgex-2t (προϊόν στα ~620 bp) Διαδρομή 2. S(34) mut. Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου pgex-2t (προϊόν στα ~620 bp) Διαδρομή 3. S(24) mut. Αντίδραση απουσία του εκμαγείου pgex-2t (control) Διαδρομή 4. S(34) mut. Αντίδραση απουσία του εκμαγείου για pgex-2t(control) Β Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb Διαδρομή 1. S[(24),(34)] mut. Αντίδραση παρουσία του εκμαγείου pgex-2τ-rps5s(34) (προϊόν στα ~620 bp) 161

182 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ Υπερπαραγωγή και καθαρισμός των πρωτεϊνών σύντηξης GSTrpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) Ο μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pgex-2t-rps5ser-24(mut), pgex-2τ-rps5ser-34 (mut) και GST-rpS5Ser-24-Ser-34(mut), έγινε σύμφωνα με την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ταυτόχρονα έγινε μετασχηματισμός και με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t-rps5 wt προκειμένου να χρησιμοποιηθεί η ακέραια αγρίου τύπου rps5 ως πρωτεΐνη αναφοράς. Συγκεκριμένα, μία αποικία από κάθε τρυβλίο με τα πιο πάνω αναφερθέντα μετασχηματισμένα κύτταρα - ανασυνδυασμένα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό 3 ml θρεπτικού υποστρώματος LB, παρουσία 100 μg/ml αμπικιλλίνης. Ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για ώρες, υπό ανάδευση. Από την αρχική αυτή καλλιέργεια, έγινε ενοφθάλμισμα 1:50 σε κωνική φιάλη των 2 lt που περιείχε 200 ml αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού LB και αμπικιλλίνης. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ο C, με ανάδευση, μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει ~0.7 και στην συνέχεια προστέθηκε 1mM IPTG, προκειμένου να ενεργοποιηθεί η μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και επομένως και του γονιδίου της rps5. Η επώαση μετά, την προσθήκη του IPTG, συνεχίστηκε για 1.5 ώρα στους 28 ο C για την ελαχιστοποίηση της δημιουργίας εγκλείστων σωματιδίων, (inclusion bodies). Ακολούθησε παραγωγή των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut), GST-rpS5 Ser-24- Ser- 34(mut) και της GST-rpS5 wt (το γονίδιο της rps5 είχε κλωνοποιηθεί στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t, στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής της Δρ. Χ. Ματράγκου, 2005). Για όλες τις περιπτώσεις ελήφθη 1ml δείγματος πριν την επαγωγή και μετά το τέλος αυτής. Στην συνέχεια, έγινε λύση των κυττάρων που συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση, με την προσθήκη 6Μ ουρίας και Tris-HCl ph 7.5 και διαδοχικό πάγωμα ξεπάγωμα, ανά 20 λεπτά. Το ολικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v. Στο σχήμα Γ.10, φαίνεται η υπερέκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS5 wt GST-rpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) 162

183 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.10 SDS-PAGE 12% v/v ηλεκτροφόρηση των ολικών εκχυλισμάτων κυττάρων E.coli BL21 (DE3) μετασχηματισμένων με pgex-2t-rps5 wt mut, pgex-2t-rps5-ser- 24mut και pgex-2t-rps5-ser 34 mut Κύτταρα E.coli BL21(DE3), με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pgex-2t-rps5 wt mut, pgex- 2T-rpS5-Ser-24mut και pgex-2t-rps5-ser 34 mut αναπτύχθηκαν απoυσία και παρουσία του IPTG και τα κυτταρικά εκχυλίσματα που προέκυψαν, αναλύθηκαν σε SDS-PAGE 12% v/v. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, το μέγεθος σε kda και παρουσιάζονται δεξιά. Διαδρομές 1,3,5: Δείγματα GST-rpS5 wt, GST-Ser-24mut και GST-Ser-34mut πριν την προσθήκη IPTG σε απορρόφηση 0.700, Διαδρομές 2,4,6: Δείγματα GST-rpS5 wt, GST-Ser-24mut και GST-Ser-34mut μετά την προσθήκη IPTG και επώαση για 1.5 ώρα στους 28 ο C, Αναμενόμενο προϊόν GST-rpS5 στα ~ daltons. Τα κύτταρα που συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (μετά από την υπερέκφραση) λύθηκαν με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβούσε κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το τελικό αιώρημα φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά σε 10,000 x g, το υπερκείμενο μαζί με το αιώρημα της στήλης υπεβλήθη στην διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο Β Στο σχήμα Γ.11 (Α και Β), φαίνεται ο καθαρισμός των τεσσάρων πρωτεϊνών σύντηξης σύντηξης GST-rpS5 wt GST-rpS5Ser-24(mut), GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) 163

184 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.11 SDS-PAGE 12% v/v ηλεκτροφόρηση των εκλουσμάτων των GST-rpS5 wt GST-rpS5Ser-24(mut),GST-rpS5Ser-34(mut) και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) που προέκυψαν από στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης Α: Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομές 1,2: 1 η έκλουση και 2 η έκλουση GST-rpS5 wt, Διαδρομές 3,4: 1 η έκλουση και 2 η έκλουση της GST-rpS5 Ser-24mut και Διαδρομές 5,6: 1 η έκλουση και 2 η έκλουση της GST-rpS5 S(34)mut. Το αναμενόμενο μέγεθος των προϊόντων είναι στα ~ 52.00Da. 164

185 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Β: Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομές 1,2: 1 η έκλουση και 2 η έκλουση της διπλής μετάλλαξης GST-rpS5-Ser-24-Ser-34mut. Γ In vitro φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-24mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34(mut) με την κινάση της καζεΐνης II (CKII) Οι πρωτεΐνες GST-rpS5wt, GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-34mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34mut χρησιμοποιήθηκαν για υποστρώματα της κινάσης της καζεΐνης ΙΙ (CKII) σε in vitro πειράματα (παράγραφος Β.2.21). Περιληπτικά, το μίγμα επώασης περιείχε 20 mm Tris-ΗCl ph 7,5, 10 mm MgCl 2, 50 mm ΚCl, 0,6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ (δότης φωσφορικών: [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ) και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ. Στον τελικό όγκο επώασης που ήταν 25 μl (με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας αποστειρωμένου Η 2 Ο), έγινε προσθήκη 1,5 μl του ενζύμου CK II (500,000 Units/ml) και τα δείγματα επωάστηκαν για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστέθηκε DTT 50 mm και ο κατάλληλος όγκος διαλύματος διαλυτοποίησης των δειγμάτων για SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12%v/v. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, αποχρωματισμός και ξήρανση της πηκτής. Η αποξηραμένη πηκτή τοποθετήθηκε στον ειδικό θάλαμο παρουσία φωτογραφικού φιλμ και προέκυψε η αυτοραδιογραφία που φαίνεται στο σχήμα Γ

186 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.12 Αυτοραδιογραφία των ανασυνδυασμένων χιμαιρικών πρωτεϊνών GSTrpS5wt, GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-34mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34mut μετά από in vitro φωσφορυλίωση με την CKII Οι πρωτεΐνες GST-rpS5wt, GST-rpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-34mut και GST-rpS5 Ser- 24- Ser-34mut επωάστηκαν με την CKII, παρουσία θερμού και ψυχρού ATP. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών, ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. A. Αυτοραδιογραφία. Διαδρομή 1: GST-rpS5 wt. Στις διαδρομές 2, 3 και 4 φαίνονται οι GSTrpS5-Ser-24mut, GST-rpS5-Ser-34mut και GST-rpS5 Ser-24- Ser-34mut, αντίστοιχα B. Πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, δείκτης ισόποσου φορτώματος, (20 μg από κάθε ανασυνδυασμένη χιμαιρική πρωτεΐνη). Το αναμενόμενο μέγεθος των προϊόντων είναι στα ~ Da Από το παραπάνω σχήμα (σχήμα Γ.12) διαπιστώνεται πως η μετάλλαξη των αμινοξέων σερίνης είτε στην θέση 34, είτε στην θέση 24 σε αλανίνη έχει ως αποτέλεσμα μείωση της φωσφορυλίωσης σε σχέση με την φωσφορυλίωση που παρατηρείται για την αγρίου τύπου πρωτεΐνη. Εμφανώς στην διπλή μετάλλαξη παρατηρείται απουσία ζώνης και επομένως μη δυνατότητα φωσφορυλίωσης από την CKII, αφού όπως αναφέρθηκε οι σερίνες στις θέσεις 24 και 34 αποτελούν στόχο της κινάσης της καζεΐνης ΙΙ. 166

187 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1.5 Ενδοκυτταρική φωσφορυλίωση ( in vivo ) της rps5 από την CK II και ανοσοκατακρήμνιση Λαμβάνοντας υπόψη τις πιο πάνω in vitro παρατηρήσεις αναφορικά με την φωσφορυλίωση της rps5 στις συγκεκριμένες σερίνες 24 και 34 μελετήθηκε και η in vivo φωσφορυλίωση της rps5 από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης (παράγραφος Β.2.20). Συγκεκριμένα, συλλέχθηκαν κύτταρα MEL parental από την στατική φάση ανάπτυξης του, πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό διάλυμα PBS ph 7,4. έγινε σπάσιμο των κυττάρων με RIPA buffer (παράγραφος Β.2.5) και τα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση στις 10, 000 x g (υπερκείμενα). Στην συνέχεια 3 mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος αναμίχθηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης G όγκου μl και επωάστηκαν ή με το μονοκλωνικό αντίσωμα [8 Ε5] CKII alpha, (σχήμα Α, Γ.13), ή με το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5, (σχήμα Β, Γ.13) και ακολούθησε ανακίνηση για χρονικό διάστημα 16 ωρών στους 4 C. Μετά το πέρας της διαδικασίας, ακολούθησαν 3 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα wash buffer, (όπως αναφέρεται στην παράγραφο Β.2.20) και μετά από βρασμό τα δείγματα για 5 λεπτά σε SDS διάλυμα (διάσπαση συμπλόκων αντιγόνου-αντισώματος) ηλεκτροφορήθηκαν SDS-PAGE 12%, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Immobilon PVDF και ανοσοανιχνεύτηκαν ή με το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 (σε αραίωση 1:1000) ή με το μονοκλωνικό αντίσωμα [8 Ε5] CKII alpha, (σε αραίωση 1 : 2000). Παράλληλα, 3mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος αναμίχθηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης G (χωρίς αντισώματα, αρνητικός έλεγχος) και ακολούθησε η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε πιο πάνω. Τα αποτελέσματα της ανοσοκατακρήμνισης και του control που προέκυψαν απεικονίζονται στο παρακάτω σχήμα Γ

188 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.13 Ανίχνευση της «in vivo» φωσφορυλίωσης της rps5 πρωτεΐνης από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ -σε κύτταρα MEL- με ανοσοκατακρήμνιση και Western Blot ανάλυση Α. Επώαση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-ck II με σφαιρίδια αγαρόζης G και 3mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος MEL parental κυττάρων για την ανοσοκατακρήμνιση της rps5. Η ανοσοανίχνευση της rps5 έγινε με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες των οποίων το μοριακό μέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, Διαδρομή 1: παρουσία αντισώματος CK II, Διαδρομή 2: απουσία αντισώματος CK II. Αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ~23,000 Da B. Επώαση του πολυκλωνικού αντισώματος της rps5 με σφαιρίδια αγαρόζης G και 3mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος MEL parental κυττάρων για την ανοσοκατακρήμνιση της κινάση της καζεΐνης ΙΙ. Η ανοσοανίχνευση της κινάσης της καζεΐνης ΙΙ έγινε με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-ck II σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες των οποίων το μοριακό μέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, Διαδρομή 1: παρουσία αντισώματος rps5, Διαδρομή 2: απουσία αντισώματος rps5. Αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ~45,000 Da Σύμφωνα με τα πιο πάνω αποτελέσματα η rps5 αποτελεί υπόστρωμα φωσφορυλίωσης της κινάσης της καζεΐνης ΙΙ και ενδοκυτταρικά ( in vivo ). Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία η CK II είναι η μόνη από τις τρεις κινάσες, [οι άλλες δύο είναι η PK60S Jakubowicz, et al., (1993),Pilecki et al., (1992) και η RAP(Szyszka et al.,1996)], που φωσφορυλιώνει όχι μόνο in vitro αλλά και in vivo [(Glover, C. V., 1998), (Pinna, 1997)] τις P-ριβοσωμικές πρωτεΐνες στην ζύμη, (ονομάζονται Ρ- ριβοσωμικές οι όξινες ριβοσωμικές πρωτεΐνες), παίζοντας έτσι σπουδαίο ρυθμιστικό ρόλο στην μεταφραστική δραστηριότητα του ριβοσώματος. Θα πρέπει να τονιστεί πως στο σχήμα Α, (σχήμα Γ.13) η παρουσία δεύτερης "ζώνης" - πρωτεολύματος της rps5 οφείλεται στην συλλογή των MEL κυττάρων από την στατική φάση ανάπτυξης τους, όπως αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο Γ

189 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1.6 Μετακίνηση της πρωτεΐνης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Όπως είναι γνωστό οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες βιοσυντίθενται στο κυτταρόπλασμα και στην συνέχεια μεταφέρονται στον πυρήνα (μερικές από αυτές περαιτέρω στους πυρηνίσκους) προκειμένου να λάβει χώρα η συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων. Υπάρχουν αρκετά παραδείγματα ριβοσωμικών πρωτεϊνών, όπως η L7a και η L25 της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και οι S7, S19, S6 της μικρής υπομονάδας, που διαθέτουν συγκεκριμένες αλληλουχίες σήματα για την είσοδο τους στον πυρήνα και στους πυρηνίσκους, [(Russo et al., 1997), (Annilo et al.,1998), (Da Costa et al., 2003), Schaap et al., 1991), (Schmidt et al., 1995)]. Αναφέρθηκε παραπάνω πως η πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 wt, εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους και δευτερευόντως στο κυτταρόπλασμα, ενώ η πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS , εντοπίζεται παντού στον πυρήνα, χωρίς να διακρίνεται εάν οι πυρηνίσκοι είναι άδειοι (Papachristou-Matragou et al., 2009). Έχοντας ενισχύσει την άποψη για την πιθανή σπουδαιότητα του αρχικού αμινοτελικού τμήματος της rps5, με πειράματα φωσφορυλίωσης και μεταλλάξεων στο τμήμα αυτό της πρωτεΐνης που περιλαμβάνει τα 37 πρώτα αμινοξέα, (1-37), και προκειμένου να εντοπίσουμε το τμήμα εκείνο της πρωτεΐνης το οποίο είναι απαραίτητο για την «ενδοκυτταρική κυκλοφορία» της κατασκευάστηκαν διάφορες μορφές της S5 (truncated forms) σε σύντηξη με την Green Fluorescen Protein (GFP). Συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι μορφές pegfp-c1- rps51-37 και pegfp-c1- rps5 1-50, που φέρουν δηλαδή το γονίδιο της GFP (Green Fluorescent Protein) και το γονίδιο της rps5 που κωδικοποιεί τα 37 πρώτα αμινοξέα του Ν-τελικού άκρου της καθώς και το γονίδιο της rps5 που κωδικοποιεί τα 50 πρώτα αμινοξέα της πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Η κλωνοποίηση των τμημάτων αυτών στον φορέα PEGFP- C1, καθώς οι μελέτες υποκυτταρικής κατανομής και θεωρητικές προσεγγίσεις με μοριακή δυναμική αναφέρονται παρακάτω. Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-37 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης Για την κλωνοποίηση της περιοχής 1-37 του γονιδίου στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pegfp-c1 σχεδιάστηκαν οι εκκινητές που απεικονίζονται στον πίνακα 6, παράγραφος B Ο ένας εκκινητής, (5 ), περιέχει την ακολουθία 169

190 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού Kpn I και ο άλλος, (3 ), για το ένζυμο BamH I. Μετά την PCR ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε και μια αντίδραση απουσία εκμαγείου, ως αρνητικός έλεγχος. Στο σχήμα Γ.14, στη διαδρομή 1, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, στα ~ 110bp. Σχήμα Γ.14 Ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων PCR σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v για την απομόνωση του τμήματος 1-37 της rps5 Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb το μέγεθος των οποίων απεικονίζεται δεξιά, Διαδρομή 1: Αντίδραση παρουσία εκμαγείου, προϊόν στα ~110bp, Διαδρομή 2: Αντίδραση απουσία εκμαγείου. Η ζώνη του DNA τμήματος που αντιστοιχεί στα ~110bp, στη διαδρομή 1, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε καθαρισμός με το Gel Extraction Kit (παράγραφος B.2.29). Το 1-37 του DNA και το πλασμίδιο pegfp-c1 επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού Kpn I και BamΗ Ι και καθαρίστηκε με το PCR Purification Kit, (παράγραφοs B.2.28). Ο φορέας ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης με το Gel Extraction Kit, (παράγραφος B.2.29), έγινε αποφωσφορυλίωση (παράγραφος Β.2.30) και ακολούθησε η αντίδραση της DNA λιγάσης (Takara) προκειμένου να παραχθεί το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pegfp-c1-rps5 1-37, (η διαδικασία αυτή αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.30). Στη συνέχεια με τον ανασυνδυασμένο φορέα pegfp-c1-rps5 μετασχηματίστηκαν E.coli TOP10 επιδεκτικά κύτταρα, όπως περιγράφεται στην

191 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παράγραφο B Τα μετασχηματισμένα κύτταρα, αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα ο συγκεκριμένος φορέας, (pegfp-c1). Από τις αποικίες που προέκυψαν, προκειμένου να βρεθούν οι θετικές που φέρουν τον αναμενόμενο ανασυνδυασμένο φορέα, έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με τη βοήθεια του kit mini prep Qiagen (παράγραφος B ). Το DNA που απομονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε με τα ένζυμα περιορισμού Kpn I και BamHI, προκειμένου να διαπιστωθούν οι θετικοί κλώνοι (ύπαρξη του αναμενόμενου τμήματος DNA στα ~110 bp, που αντιστοιχεί στο μεταγράφημα cdna της rps5) και στη συνέχεια απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, για επιμόλυνση HeLa κυττάρων για μελέτες έμμεσου φθορισμού με μικροσκοπία συνεστίασης. Γ Κλωνοποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων 1-50 της rps5 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-c1 και μελέτες υποκυτταρικής εντόπισης Μετά από σύγκριση της δομής της rps5 και της ομόλογής της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S7 από το αρχαιοβακτήριο Pyrococcus horikoshii βρέθηκε ότι στην περιοχή υπήρχε περίπτωση ύπαρξης (όπως και στην S7) μιας μικρής α- έλικας. Προκειμένου να διασφαλιστεί η δομή της πρωτεΐνης σε αυτή την περιοχή επελέγη μία ευρύτερη, 1-50 και κλωνοποιήθηκε όπως περιγράφεται αναλυτικά πιο κάτω (Hosaka et al, 2001). Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν για την κλωνοποίηση στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pegfp-c1 και οι συνθήκες PCR δίνονται στον πίνακα 6, παράγραφος B Ο ένας εκκινητής, (5 ), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού Kpn I και ο άλλος, (3 ), για το ένζυμο BamH I. Μετά το τέλος της αντίδρασης ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε και μια αντίδραση απουσία εκμαγείου ως αρνητικός έλεγχος. Στο σχήμα Γ.15, στη διαδρομή 1, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, στα ~ 150bp. 171

192 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.15 Ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων PCR σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v για την απομόνωση του τμήματος 1-50 της rps5 Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: Αντίδραση παρουσία εκμαγείου, προϊόν στα ~150bp, Διαδρομή 2: Αντίδραση απουσία εκμαγείου. Η ζώνη του DNA τμήματος που αντιστοιχεί στα ~150bp, στη διαδρομή 1 του σχήματος Γ.15, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία (τα ίδια ένζυμα περιορισμού) που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1.6.1,για την παραγωγή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου pegfp-c1-rps και στη συνέχεια απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, για επιμόλυνση HeLa κυττάρων για μελέτες έμμεσου φθορισμού με μικροσκοπία συνεστίασης. Γ Πειράματα ανοσοφθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης GFP- rps και GFP- rps Με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pegfp- rps και pegfp- rps διαμολύνθηκαν HeLa κύτταρα, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.37 και μελετήθηκε η κυτταρική εντόπιση των αντίστοιχων πρωτεϊνών με μικροσκοπία συνεστίασης στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων από την ομάδα της Αναπλ. καθ. κ. Θ. Παπαμαρκάκη) Το σχήμα Γ.16 φαίνεται η κυτταρική εντόπιση των αντίστοιχων «κολοβών» πρωτεϊνών της rps5. 172

193 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.16. Έμμεσος φθορισμός των «κολοβών» πρωτεϊνών σύντηξης GFP- rps5 1-37, GFP- rps με μικροσκοπία συνεστίασης (Confocal, Leica) Κύτταρα HeLa, επιμολύνθηκαν παροδικά με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, στερεώθηκαν πάνω σε ειδικές πλάκες και μελετήθηκε ο φθορισμός. A. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP- rps5 B. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP- rps5 Γ Πρωτεΐνη σύντηξης GFP- rps Όπως χαρακτηριστικά φαίνεται στο πιο πάνω σχήμα, η πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 1-37, βρίσκεται διάχυτη τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Μία παρόμοια συμπεριφορά (εντόπιση) εμφανίζει και η GFP. Αντίθετα η μορφή pegfp-c1-rps51-50, που φέρει το γονίδιο της rps5 που κωδικοποιεί τα 50 πρώτα αμινοξέα της πρωτεΐνης, συμπεριφέρθηκε τελείως διαφορετικά. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.16 η rps εντοπίζεται στον πυρήνα αφήνοντας άδειους τους πυρηνίσκους. 173

194 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1.7 Θεωρητικές προσεγγίσεις με προσομοίωση μοριακής δυναμικής Λαμβάνοντας υπόψη τα πιο πάνω ευρήματα αναφορικά με την εμπλοκή της ευρείας αμινοτελικής περιοχής 1-50 στην μεταφορά της rps5 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα καθώς επίσης και τα ευρήματα που αφορούν στην εντόπιση της κολοβής μορφής GFP-rpS [Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή και Papachristou-Matragkou et al., (2009)] φαίνεται ότι στην περιοχή υπάρχει «πληροφορία» -«σήμα εισόδου» για την διαμετακίνηση της rps5. Σύμφωνα με τις μελέτες μοριακής δυναμικής (σχήμα Γ.17) στην περιοχή 38- Tyr-.-Tyr-50 υπάρχει ένα τυχαίο σπείραμα (περιλαμβάνει τα 13 αυτά αμινοξέα (σχήμα b) το οποίο από μόνο του οδηγεί την πρωτεΐνη στον πυρήνα λόγω της συγκεκριμένης δομής ή μετά από αλληλεπίδραση με κάποια άλλα "κυτταροπλασματικά συστατικά» τα οποία πρέπει να μελετηθούν. Σχήμα Γ.17 a. Αναπαράσταση του σκελετού (backbone) της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 από ποντίκι. H περιοχή που περιλαμβάνει τα 1-37 αμινοξέα της πρωτεΐνης παριστάνονται με χρώμα μπλε, 38 με πράσινο, αμινοξέα με κόκκινο και η περιοχή που περιλαμβάνει τα με χρυσό. b. Αναπαράσταση του σκελετού backbone της αμινοτελικής περιοχής που περιλαμβάνει τα 1-50 αμινοξέα της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 μαζί με το εξισορροπημένο τμήμα που απεικονίζεται σε κίτρινο χρώμα. 174

195 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Θεωρητική προσέγγιση με προσομοίωση μοριακής δυνομικής έγιναν επίσης και για την Thr-133 η οποία είχε αντικατασταθεί με γλυκίνη (η Thr 133 σύμφωνα με εργαλεία βιοπληροφορικής αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης της PKC). Από πειράματα μικροσκοπίας συνεστίασης (σελίδα 158) φαίνεται ότι η GFP-rpS5-Thr-133 εντοπίζεται σε όλα τα διαμερίσματα του κυττάρου (κυτταρόπλασμα, πυρήνες, πυρηνίσκοι). Συγκεκριμένα με μία μόνον μετάλλαξη η πρωτεΐνη «έχασε» τον προσανατολισμό της. Μία πιθανή απώλεια της δομής της rps5- ως συνέπεια της ορθής αναδίπλωσης- μελετήθηκε όπως προαναφέρθηκε με προσομοίωση μοριακής δυνομικής (Σχήμα Γ.18). Σχήμα Γ.18. Δομική σύγκριση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 που φέρει την μετάλλαξη στην Thr-133 (rps5-thr-133), απεικονίζεται με χρώμα πορτοκαλί σε σχέση με του αγρίου τύπου rps5 (χρώμα κυανό) μετά από 3 ns MD προσομοίωση Η κύρια δομική αλλαγή που παρατηρείται με την μετάλλαξη της θρεονίνης στην θέση 133 σε γλυκίνη εντοπίζεται στο β- πτυχωτό φύλλο R122-I128:R135- V1412, (όπου βρίσκεται η μετάλλαξη και η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη απεικονίζεται με πορτοκαλί χρώμα σύμφωνα με το σχήμα Γ.18) δείχνει μια αλλαγή στον προσανατολισμό του βρόγχου-μετατόπιση σε σχέση με του αγρίου τύπου πρωτεΐνη. 175

196 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι μελέτες μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκαν από τον λέκτορα κ. Γ. Παπαδόπουλο. Γ.1.8 Φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 στα κύτταρα MEL με Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) Όπως αναφέρθηκε, τα πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης, έδειξαν πως η πρωτεΐνη rps5 φωσφορυλιώνεται από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII) και η φωσφορυλίωση αυτή αφορά τα 35 πρώτα αμινοξέα. Η φωσφορυλίωση της rps5 μελετήθηκε επιπρόσθετα και με την χρήση χρωματογραφίας αγχιστείας σε σφαιρίδια στα οποία υπάρχουν καθηλωμένα δισθενή μέταλλα (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography). Το υλικό χρωματογραφίας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ευγενική προσφορά από την Dr. R Kamp. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο ότι οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες δεσμεύονται ισχυρά σε μεταλλικά ιόντα δισθενών μετάλλων (τα συγκεκριμένα σφαιρίδια είχαν μείγμα καθηλωμένων μετάλλων). Προκειμένου να αποφευχθεί η μη εδική αλληλεπίδραση του υλικού με όξινες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.36, που περιείχαν εκτός των άλλων συστατικών ασπαραγινικό οξύ και γλουταμινικό οξύ. Συνοπτικά, κύτταρα MEL συλλέχθηκαν από την λογαριθμική φάση (48 ώρες) και τα κυτταρικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με το υλικό της στήλης, υπο ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Η δεσμευμένη πρωτεΐνη μετά την έκλουσή της από το υλικό IMAC ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής (σχήμα Γ.19). Παράλληλα 1mg εκλούσματος από το υλικό IMAC επωάστηκε με το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 που ήταν καθηλωμένο σε σφαιρίδια αγαρόζης G και η rps5 ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση ( σχήμα Γ. 20). Η διαδικασία περιγράφεται στην παράγραφο Β

197 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.19. Ανοσοανίχνευση της φωσφορυλιωμένης rps5 Πρωτεϊνικό εκχύλισμα από κύτταρα MEL, επωάστηκε με σφαιρίδια που είχαν καθηλωμένα δισθενή μεταλλικά ιόντα (ΙΜΑC). Διαδρομή 1: πείραμα αναφοράς (control), Διαδρομή 2, Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομή 3: η πρωτεΐνη rps5 που δεσμεύτηκε στα σφαιρίδια. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιμοποιήθηκε με αραίωση 1: Αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ~23,000 Da Σχήμα Γ.20. Ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοανίχνευση της φωσφορυλιωμένης rps5 Πρωτεϊνικό εκχύλισμα από ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, επωάστηκε με σφαιρίδια που είχαν καθηλωμένα δισθενή μεταλλικά ιόντα (ΙΜΑC). Στην συνέχεια το έκλουσμα από την στήλη IMAC επωάστηκε με σφαιρίδια αγαρόζης-g στα οποία ήταν καθηλωμένο το αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5. Διαδρομή 1: η πρωτεΐνη rps5 που παραλήφθηκε από την στήλη IMAC και δεσμεύτηκε στα σφαιρίδια αγαρόζης-g, στα οποία ήταν καθηλωμένο το αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5. Διαδρομή 2: ανοσοκατακρήμνιση με ολικά κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα σε σφαιρίδια αγαρόζης-g, στα οποία ήταν καθηλωμένο το αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5. Διαδρομή 3: πείραμα αναφοράς, σφαιρίδια αγαρόζης χωρίς την παρουσία κυτταρικών εκχυλισμάτων. Αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ~23,000 Da Από τα παραπάνω διαπιστώνεται πως η rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL είναι φωσφορυλιωμένη. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιήθηκαν και πρωτεΐνεςμάρτυρες για να αποδειχθεί πως το σύστημα που χρησιμοποιήθηκε είναι λειτουργικό (θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες φωσφορυλίωσης). Συγκεκριμένα επιλέχθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της S6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης (είναι γνωστό από βιβλιογραφικά δεδομένα οι 7 από τις 15 σερίνες στο καρβοξυτελικό της άκρο φωσφορυλιώνονται). Επομένως όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.21 στην διαδρομή 4 η rps6 έχει δεσμευτεί στο προσροφητικό υλικό του ΙΜAC. 177

198 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ως αρνητικός μάρτυρας- πρωτεΐνη, δηλαδή μια πρωτεΐνη που δεν εντοπίζεται φωσφορυλιωμένη σε ευκαρυωτικά κύτταρα μελετήθηκε η non-phospho-src (Tyr416), (χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα non-phospho-src -Tyr416 που αναγνωρίζει την μη φωσφορυλιωμένη μορφή Src, (σχήμα Γ.21). Συνοπτικά, η Src ανήκει στην οικογένεια κινασών τυροσίνης, παίζοντας σπουδαίο ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ευκαρυωτικών κυττάρων, (Thomas, S.M. και Brugge, 1997). Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ενζύμου ρυθμίζεται με φωσφορυλίωση δύο τυροσινών στις θέσεις 416 και 527 (Hunter T. et al., 1987). Το αντίσωμα αναγνωρίζει την μη φωσφορυλιωμένη μορφή της Src. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ21, διαδρομή 2, η Src δεν δεσμεύτηκε στην στήλη, όπως ήταν αναμενόμενο ενισχύοντας την λειτουργικότητα της IMAC ανάλυσης Σχήμα Γ.21 Ανοσοανίχνευση της φωσφορυλιωμένης rps6 και της μη φωσφορυλιωμένης μορφής της κινάσης τυροσίνης Src με ή χωρίς IMAC - : χωρίς IMAC, + : με IMAC Πρωτεϊνικό εκχύλισμα από ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, επωάστηκε με σφαιρίδια με καθηλωμένα δισθενή μεταλλικά ιόντα (ΙΜΑC). Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες, Διαδρομές 1 και 3 : ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνών SRC και rps6 με τα αντίστοιχα αντισώματα χωρίς IMAC. Διαδρομές 2 και 4 : ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνών SRC και rps6 με τα αντίστοιχα αντισώματα με IMAC Αναμενόμενα μοριακά μεγέθη : S6 ~30,000Da και Non-phospho-Src(Tyr416) ~57,000 Da Λαμβάνοντας υπόψη την υποκυτταρική εντόπιση της rps5 μελετήθηκε η φωσφορυλίωση της στο κλάσμα του κυτταροπλάσματος και του πυρηνοπλάματος. Έτσι, πραγματοποιήθηκε επώαση των δύο κλασμάτων (κυτταροπλάσματος και 178

199 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ πυρηνοπλάσματος ξεχωριστά) με το προσροφητικό υλικό της στήλης IMAC. Η δεσμευμένη πρωτεΐνη rps5 των δύο κλασμάτων μετά την έκλουσή της από το υλικό IMAC ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο σχήμα Γ.22. Σχήμα Γ.22 Ανοσοανίχνευση της φωσφορυλιωμένης μορφής rps5 στο κλάσμα του κυτταροπλάσματος και του πυρηνοπλάσματος Διαδρομή 1: (C ) Δείγμα από το κλάσμα κυτταροπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL Διαδρομή 2: (N ) Δείγμα από το κλάσμα πυρηνοπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL Διαδρομή 3: (C-ΙΜΑC) Δείγμα από το κλάσμα κυτταροπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL και στην συνέχεια υποβλήθηκε σε IMAC ανάλυση. Διαδρομή 4 : (N-IMAC) Δείγμα από το κλάσμα πυρηνοπλάσματος, (50μg), που απομονώθηκε από κύτταρα MEL και στην συνέχεια υποβλήθηκε σε IMAC ανάλυση. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Από το σχήμα Γ.22 διαπιστώνεται πως η rps5 φωσφορυλιώνεται τόσο στο κλάσμα του κυτταροπλάσματος όσο και του πυρηνοπλάσματος. Το ερώτημα που τέθηκε στην συνέχεια ήταν να διερευνηθεί εάν η rps5 που είναι ενσωματωμένη στο ριβόσωμα είναι επίσης φωσφορυλιωμένη. Γ.1.9 Έλεγχος φωσφορυλίωσης της rps5 στο ριβόσωμα Για τη διερεύνηση μιας ενδεχόμενης φωσφορυλίωσης της rps5 στο ριβόσωμα, απομονώθηκαν ριβοσώματα και εκχυλίστηκαν οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες. 179

200 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγκεκριμένα, MEL κύτταρα (~8 x 10 8 κύτταρα) συλλέχθηκαν από την λογαριθμική φάση και ακολούθησαν λύση και φυγοκέντρηση σε rpm (30000g). Το υπερκείμενο επιστοιβάχθηκε σε μαξιλάρι σουκρόζης και φυγοκεντρήθηκε για 3 ώρες στα x g. Μετά από απομάκρυνση του υπερκείμενου το ίζημα αιωρήθηκε (ριβοσώματα) παράγραφος Β.2.9 και οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν με εκχύλιση με οξικό οξύ. Έτσι, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με οξικό οξύ και (CH 3 COO) 2 Mg, διαπιδύθηκαν και ο διαλύτης (νερό) απομακρύνθηκε με ξήρανση σε κενό (παράγραφος Β.2.9). Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε διδιάστατη ηλεκτροφόρηση (παράγραφος Β.2.22) και η rps5 ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση (σχήμα Γ.23). Σχήμα Γ.23 Ηλεκτρομεταφορά και ανοσοανίχνευση της rps5 που εκχυλίστηκε με οξικό οξύ H κηλίδα αντιστοιχεί στην ριβοσωμική πρωτεΐνη rps5.οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες κατακρημνίστηκαν με οξικό οξύ, ηλεκτροφορήθηκαν σε διδιάστατη ηλεκτροφόρηση και μετά από ηλεκτρομεταφορά σε Immobilon μεμβράνη η ριβοσωμική rps5 ανοσοανιχνεύτηκε. Το πολυκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. IMAC ανάλυση της rps5 που εκχυλίστηκε από τα ριβοσώματα Προκειμένου να διαπιστωθεί αν η rps5 είναι φωσφορυλιωμένη πάνω στο ριβόσωμα χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία αγχιστείας (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται στην παράγραφο Γ.1.8. Συγκεκριμένα, έγινε δέσμευση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, οι οποίες εκχυλίστηκαν με οξικό οξύ και (CH 3 COO) 2 Mg αναμίχθηκαν με τα σφαιρίδια ΙMAC, 180

201 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, η δεσμευμένη πρωτεΐνη μετά την έκλουσή της από το υλικό IMAC ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση, σχήμα Γ.24. Σχήμα Γ.24 Ανοσοανίχνευση της rps5 (εκχυλίστηκε από το ριβόσωμα) μετά από IMAC ανάλυση Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εκχυλισμένες με οξικό οξύ και (CH 3 COO) 2 Mg, υπεβλήθησαν σε ανάλυση κατά IMAC και ανοσοανιχνεύτηκαν Διαδρομή 1: πρωτεϊνικό εκχύλισμα MEL κυττάρων (με IMAC, control), Διαδρομή 2: εκχυλισμένες ριβοσωμικές πρωτεΐνες που αναλύθηκαν με IMAC Μ: Mάρτυρες μοριακών μεγεθών σε kda. Το πολυκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε με αραίωση 1: Αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος ~23,000 Da Σύμφωνα με τα πιο πάνω η rps5 in situ στο ριβόσωμα δεν είναι φωσφορυλιωμένη σε αντίθεση με την μη ενσωματωμένη κυτταροπλασματική η οποία είναι στόχος κινασών 181

202 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.2 Μελέτη του ρόλου της rps5 στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης και πιθανή εμπλοκή της σε βιοχημικά μονοπάτια της απόπτωσης στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL. Είναι γνωστό πως τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL παρουσία χημικού επαγωγέα δρομολογούνται προς το πρόγραμμα της διαφοροποίησης (Friend et. al., 1971). Έχει βρεθεί πως το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από δυο υποπρογράμματα που ολοκληρώνονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο (Tsiftsoglou et al., 2003). Κατά την in vitro διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL με τον χημικό επαγωγέα διμεθυλοσουλφοξείδιο, (DMSO) η έκφραση του γονιδίου της rps5 καταστέλλεται (σε επίπεδο mrna) σύμφωνα με τους Vizirianakis, et al., (1999). Άλλα πειραματικά δεδομένα, έδειξαν ότι τα κύτταρα MEL rps5 C14, που εκφράζουν την πρωτεΐνη rps5 ως πρωτεΐνη σύντηξης με το myc επίτοπο και μια ουρά έξι ιστιδινών, παρουσιάζουν μια υστέρηση περίπου ώρες ως προς την έναρξη του προγράμματος διαφοροποίησης, ανεξάρτητα από την χρήση οποιουδήποτε χημικού επαγωγέα, ενώ φαίνεται να ολοκληρώνουν το πρόγραμμα διαφοροποίησης και ως προς τα δυο υποπρογράμματα (Matragou et al.,2008). Γ.2.1 Έλεγχος της έκφρασης του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα pcdna-3.1-rps5 (sense) σε κλώνους επιμολυσμένων MEL κυττάρων Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [Χ. Ματράγκου, διδακτορική διατριβή και Matragou et al., (2008)] κύτταρα MEL επιμολυσμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο MEL-pcDNA-3.1-rpS5, παρουσίαζαν μια υστέρηση στην διαφοροποίηση σε σχέση με τα parental ΜEL κύτταρα. Προκειμένου να επαληθευτούν τα πιο πάνω αναφερθέντα ευρήματα θεωρήθηκε σκόπιμο να διερευνηθεί η ύπαρξη και άλλων κλώνων με την ίδια συμπεριφορά. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είχε ως εξής: MEL κύτταρα επιμολυσμένα με το pcdna-3.1-rps5, (κλώνοι), ξεπάγωσαν σταδιακά από το υγρό άζωτο (η επιμόλυνση των MEL κυττάρων με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pcdna-3.1-rps5 είχε γίνει από την διδάκτορα Ματράγκου Χριστίνα) και αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM που περιείχε 10% 182

203 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ v/v ορό εμβρύου μόσχου, (FCS), 1% v/v αντιβιοτικό πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης, (PS), και το αντιβιοτικό επιλογής νεομυκίνη, (G-418, 0, mg/ml), για το φορέα pcdna Η επιβεβαίωση της ύπαρξης των θετικών κλώνων έγινε με την τεχνική της Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR (RT-PCR). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.27, το mrna ενός γονιδίου μετατρέπεται σε cdna, με τη βοήθεια του ενζύμου αντίστροφη τρανσκριπτάση και στη συνέχεια αυτό πολλαπλασιάζεται με τη χρήση μιας πολυμεράσης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν και οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Συνοπτικά, έγινε απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA (παράγραφος Β.2.6.2) από διάφορους κλώνους καθώς και από C14 κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός μάρτυρας (εκφράζουν το ανασυνδυασμένο cdna της rps5). Ολικό κυτταροπλασματικό RNA που απομονώθηκε από MEL κύτταρα που δεν επιμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας (control). Στο σχήμα Γ.25 απεικονίζονται οι θετικοί κλώνοι που επιβεβαιώθηκαν με την τεχνική της Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR (RT-PCR). Σχήμα Γ.25 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA για την επαλήθευση της έκφρασης του ανασυνδυασμένου cdna της rps5 στους κλώνους C56, C64, C71 Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), που απομονώθηκε από τους κλώνους C64, C56, C71 και από κύτταρα MEL-rpS5 C14, χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Χρησιμοποιήθηκαν δυο ζεύγη εκκινητών (παράγραφος Β.2.27). Με το ένα ζεύγος εκκινητών 183

204 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ λαμβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην εξωγενή rps5, ενώ με το δεύτερο, λαμβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην ενδογενή rps5. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Σχήμα Α. Διαδρομές 1,2,3,4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των κλώνων C64,C14, C56 και C71 με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για το εξωγενές ανασυνδυασμένο μεταγράφημα της rps5 (προϊόν στα ~ 700bp, όπως αναμένεται με βάση τον αρχικό σχεδιασμό του ανασυνδυασμένου φορέα pcdna-3.1-rps5), Διαδρομή 5 : Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA από MEL parental κύτταρα με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για εξωγενές ανασυνδυασμένο μεταγράφημα της rps5 ως αντίδραση αναφοράς (control), Σχήμα Β. Διαδρομές 1', 2', 3', 4': Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των κλώνων C64,C14, C56 και C71 για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp). Από το σχήμα Γ.25, φαίνεται ότι μόνον ο κλώνος C56, (διαδρομή 3, σχήμα Α), εκφράζει σε ίδιο ποσοστό το ανασυνδυασμένο cdna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 ενώ οι δυο άλλοι κλώνοι παρουσιάζουν χαμηλότερη έκφραση του ανασυνδυασμένου cdna της rps5. Η διαφορά μεγέθους ανάμεσα από την ενδογενή και την εξωγενή rps5 οφείλεται στο ότι η ανασυνδυασμένη rps5 περιέχει επιπλέον το myc επίτοπο και έξι ιστιδίνες. Γ Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης στον κλώνο MEL-rpS5 C56 Σε προηγούμενες μελέτες (Παπαχρήστου Ελένη, μεταπτυχιακή εργασία), η εντόπιση της εξωγενούς ανασυνδυασμένης rps5 στον κλώνο C14, ο οποίος εμφάνισε αυξημένη έκφραση του mrna της, έγινε με ανοσοκατακρήμνιση (3 mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος από κύτταρα ΜΕL-rpS5 C14 επωάστηκαν με το αντίσωμα anti-myc) και ανοσοανίχνευση της εξωγενούς rps5. Ακολουθώντας την ίδια διαδικασία έγινε επίσης ανοσοανίχνευση της ανασυνδυασμένης rps5 στον κλώνο C56. Συγκεκριμένα 3mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος από την καλλιέργεια MEL-rpS5 C56, καθώς επίσης και από την καλλιέργειαmel-rps5 C14, (χρησίμευσε ως μάρτυρας) αναμίχτηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης G και επωάστηκαν με το αντίσωμα anti-myc. Ακολούθησε ανακίνηση για χρονικό διάστημα 16 ωρών στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν το αντίσωμα και η πρωτεΐνη G. Μετά το πέρας της διαδικασίας, ακολούθησαν 3 πλύσεις των 10 λεπτών, σε ρυθμιστικό διάλυμα wash buffer και ακολούθησε βρασμός των σφαιριδίων με την ανοσοκατακριμνισμένη εξωγενή rps5 θερμαίνονται για 5 λεπτά σε SDS διάλυμα ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος. Η δεσμευμένη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη rps5 184

205 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ με τον myc επίτοπο (εξωγενής rps5) ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής σε αραίωση 1:1000, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Σχήμα Γ.26 Ανίχνευση της ενδογενούς και ανασυνδυασμένης εξωγενούς rps5 myc/his σε κύτταρα MEL rps5 C56 σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v Σχήμα Α: RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA του κλώνου C56 Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (0.5 μg),απομονώθηκε από MEL parental κύτταρα, από κύτταρα MEL-rpS5 C14 και από κύτταρα MEL-rpS5 C56 και έγιναν οι RT-PCR αντιδράσεις. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν δυο: με το πρώτο λαμβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην ενδογενή rps5, ενώ με το δεύτερο, λαμβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην εξωγενή rps5. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb παριστάνονται αριστερά, Διαδρομές 1 και 2: Αντιδράσεις PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MELrpS5 C56 κυττάρων και MEL-rpS5 C14 κυττάρων, με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομές 3 και 4: Αντιδράσεις PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MELrpS5 C56 κυττάρων και MEL-rpS5 C14 κυττάρων, με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του εξωγενούς ανασυνδυασμένου μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν στα ~ 700bp, όπως αναμένεται με βάση τον αρχικό σχεδιασμό του ανασυνδυασμένου φορέα pcdna-3.1-rps5 ). 185

206 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Β. Ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοανίχνευση της ανασυνδυασμένης rps5 πρωτεΐνης στα κύτταρα MEL-rpS5 C56 Aνοσοκατακρήμνιση 3mg ολικού κυτταροπλασματικού εκχυλίσματος από τις καλλιέργειες MEL-rpS5C56 και MEL-rpS5C14 (τα MEL-rpS5C14 χρησίμευαν ως μάρτυρας) με σφαιρίδια αγαρόζης G και επώαση με το αντίσωμα anti-myc. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη rps5 με τον myc επίτοπο (εξωγενής rps5) ταυτοποιήθηκε με ανοσοανίχνευση με αντίσωμα έναντι της καρβοξυτελικής της περιοχής σε αραίωση 1:1000. Το μοριακό μέγεθος των μαρτύρων σε kda απεικονίζεται αριστερά. Διαδρομή 1: ΜΕL-rpS5 C14 κύτταρα, Διαδρομή 2: ΜΕL-rpS5 C56 κύτταρα Από το σχήμα Γ.26 φαίνεται ότι και οι δύο κλώνοι C56 και C14 εκφράζουν ταυτόχρονα την ενδογενή και την εξωγενή rps5. Γ Μελέτη κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C56 παρουσία ή απουσία των χημικών επαγωγέων της διαφοροποίησης, HMBA (εξαμεθυλενο-δισακεταμίδιο) και DMSO (διμέθυλο-σουλφοξείδιο) Το επόμενο βήμα ήταν η μελέτη της κινητικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C56, παρουσία των χημικών επαγωγέων DMSO και HMBA. Το πρόγραμμα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται κατά βάση από δύο υποπρογράμματα. Το πρώτο αφορά την ικανότητα των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται και το δεύτερο την ικανότητά τους να παράγουν κάποιους πρωτεϊνικούς δείκτες (αιμοσφαιρίνη), οι οποίοι είναι χαρακτηριστικοί των διαφοροποιημένων κυττάρων. Όπως αναφέρθηκε, τόσο κύτταρα MEL-rpS5 C14 όσο κύτταρα MEL parental ολοκληρώνουν μεν το πρόγραμμα διαφοροποίησης και ως προς τα δυο υποπρογράμματα αλλά τα κύτταρα MEL-rpS5 C14 παρουσιάζουν μια υστέρηση ως προς την έναρξη του προγράμματος, ανεξάρτητα από την χρήση του χημικού επαγωγέα. Προκειμένου να μελετηθεί εάν τα κύτταρα MEL rps5 C56 συμπεριφέρονται κατά τον ίδιο τρόπο με τα κύτταρα MEL-rpS5 C14 έγιναν τα πιο κάτω πειράματα. Χρησιμοποιήθηκαν oι δύο καλλιέργειες ΜΕL rps5 C14 και η MEL rps5c56. Οι καλλιέργειες αυτές αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM που περιείχε 10% v/v FΒS και 100 μg/ml από κάθε αντιβιοτικό πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης. Στις 186

207 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ καλλιέργειες, προστέθηκε επίσης και το αντιβιοτικό επιλογής, (G-418), σε συγκέντρωση 0,6mg/ml. Καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε θρεπτικό μέσο DMEM, παρουσία είτε DMSO 1.5% v/v, είτε HMBA 5mM. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η κυτταρική ανάπτυξη και η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γίνονταν μέτρηση των κυττάρων που χρωματίζονταν μπλε με τη μέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.3), ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν συνολική μέτρηση των κυττάρων (παράγραφος Β.2.2), σχήμα Γ.27. Σχήμα Γ.27 Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας MEL rps5 C56 σε σχέση με την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental και MEL rps5 C14, είτε παρουσία 1.5% v/v DMSO είτε παρουσία 5mM HMBA Κύτταρα των καλλιεργειών MEL rps5 C14 και MEL rps5 C56 καθώς και της καλλιέργειας MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο, είτε παρουσία του χημικού επαγωγέα DMSO 1.5% v/v είτε παρουσία του χημικού επαγωγέα HMBA 5 mm. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγμα και 187

208 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ γινόταν μέτρηση των κυττάρων που χρωματίζονταν μπλε με τη μέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.3), ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν συνολική μέτρηση των κυττάρων. C και Ε. Κυτταρική ανάπτυξη. Το διάγραμμα C απεικονίζει τις καλλιέργειες που επωάστηκαν με DMSO, ενώ το διάγραμμα Ε απεικονίζει τις καλλιέργειες που επωάστηκαν με HMBA. D και F. Ποσοστό κυτταρικής διαφοροποίησης %. Το διάγραμμα D απεικονίζει τις καλλιέργειες που επωάστηκαν με DMSO, ενώ το διάγραμμα F απεικονίζει τις καλλιέργειες που επωάστηκαν με HMBA. Όπως φαίνεται στα πιο πάνω διαγράμματα C και Ε, τα κύτταρα στην καλλιέργεια MEL rps5 C56 αναπτύσσονται με τον ίδιο ρυθμό με την καλλιέργεια MEL rps5 C14 και με χωρίς καμία ουσιαστική απόκλιση σε σχέση με την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental. Αντίθετα, όσον αφορά την ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων τόσο παρουσία του επαγωγέα DMSO όσο και του HMBA, όπως φαίνεται στα διαγράμματα D και F, oι καλλιέργειες MEL rps5 C14 και MEL rps5 C56, επιτυγχάνουν ποσοστό διαφοροποίησης ~50% μετά από 96 ώρες. Πράγματι, η καλλιέργεια MEL rps5 C56 παρουσιάζει υστέρηση στην διαφοροποίηση όπως η καλλιέργεια MEL rps5 C14. Το στοιχείο αυτό ενισχύει τον σημαντικό ρόλο της rps5 στην διαφοροποίηση των MEL κυττάρων. Γ.2.2 Η υστέρηση στο πρόγραμμα της διαφοροποίησης στην καλλιέργεια των μόνιμα επιμολυσμένων κυττάρων με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5 συμβαδίζει με την υστέρηση στη φάση G1/Go του κυτταρικού κύκλου Προκειμένου να συσχετιστεί ο κυτταρικός κύκλος με την παρατηρηθείσα υστέρηση των κλώνων C14 και C56 έγινε κυτταρομετρία ροής. Συνοπτικά, καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml ΜΕL rps5 C14 και MEL parental αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM που περιείχε 10% v/v FΒS και 100 μg/ml από κάθε αντιβιοτικό πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης. Στην καλλιέργεια ΜΕL rps5 C14, προστέθηκε επίσης και το αντιβιοτικό επιλογής (G-418) σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml. Οι καλλιέργειες εκτέθηκαν σε χημικό επαγωγέα διαφοροποίησης, 5mM HMBA. 188

209 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στη συνέχεια ελέγχθηκε η κυτταρική ανάπτυξη και η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων(σχήμα Γ.28, B). Ανά 24ώρες συλλέγονταν δείγματα για μέτρηση των διαφοροποιημένων κυττάρων και για συνολική μέτρηση των κυττάρων, (σχήμα Γ.28 A). Η συγκομιδή των καλλιεργειών γίνονταν ανά 24 ώρες προκειμένου να γίνει ανάλυση στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου (παράγραφος Β.2.5). Χρησιμοποιήθηκαν 100 μl κυτταρικού αιωρήματος σε PBS (ph=7,2) που φέρει 10 6 κύτταρα για κάθε δείγμα. Σε κάθε δείγμα προστέθηκαν 2 ml ειδικού αντιδραστηρίου (DNA Prep Stain), υπό ανάδευση. Σχήμα Γ.28 Κινητική ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C14 σε σχέση με τα κύτταρα αναφοράς MEL parental παρουσία 5mM HMBA Κύτταρα MEL rps5 C14 MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο, παρουσία του χημικού επαγωγέα HMBA. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν μέτρηση των κυττάρων που χρωματίζονταν μπλε με τη μέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2 ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν συνολική μέτρηση των κυττάρων. A. Κυτταρική ανάπτυξη B. Ποσοστό κυτταρικής διαφοροποίησης %. Τα διαγράμματα (dotplots) που προέκυψαν από την κυτταρομετρία ροής και την ανάλυση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου των parental ΜEL και MEL rps5 C14 τόσο παρουσία HMBA όσο και απουσία χημικού επαγωγέα με ειδικό λογισμικό (multicycle) απεικονίζονται συγκεντρωτικά στα σχήματα Γ.29 και Γ.30. Επιπλέον, στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα ακριβή ποσοστά των 189

210 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου και τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης. Σχήμα Γ.29 Ιστογράμματα που προέκυψαν μετά από χρώση των κυττάρων MEL parental και MEL rps5 C14, που δεν είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, με προπίδιο-ιωδίδιο (PI) και ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής (με βάση το περιεχόμενο DNA τους, φίλτρο FL3, >650 nm, κόκκινος φθορισμός) Α. Ιστόγραμμα κυττάρων MEL parental που δεν είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, 5 mm για 72 ώρες B. Ιστόγραμμα κυττάρων MELrpS5 C14 που δεν είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, 5 mm για 72 ώρες.η πρώτη κορυφή (Ν ποσότητα DNA) αντιστοιχεί στα κύτταρα της G1, η δεύτερη κορυφή (2Ν ποσότητα DNA) στα κύτταρα της G2/Μ και το ενδιάμεσο τμήμα (ποσότητα DNA μεταξύ Ν και 2Ν) στα κύτταρα της φάσης S. 190

211 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.30 Ιστογράμματα που προέκυψαν μετά από χρώση των κυττάρων MEL parental και MEL rps5 C14, που είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, με προπίδιο-ιωδίδιο (PI) και ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής (με βάση το περιεχόμενο DNA τους,φίλτρο FL3, >650 nm, κόκκινος φθορισμός). Α. Ιστόγραμμα κυττάρων MEL rps5 C14 που είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, 5 mm για 72 ώρες Β. Ιστόγραμμα κυττάρων MEL rps5 C14 που είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, 5 mm για 72 ώρες Η πρώτη κορυφή (Ν ποσότητα DNA) αντιστοιχεί στα κύτταρα της G1, η δεύτερη κορυφή (2Ν ποσότητα DNA) στα κύτταρα της G2/Μ και το ενδιάμεσο τμήμα (ποσότητα DNA μεταξύ Ν και 2Ν) στα κύτταρα της φάσης S. 191

212 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Θα πρέπει να τονιστεί πως όταν τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα διαφοροποιούνται εξέρχονται στην G1/G0 φάση του κυτταρικού κύκλου. Στο σχήμα Γ.31 παρουσιάζονται διαγραμματικά τα ποσοστά της G1/G0 φάσης των καλλιεργειών MEL rps5 C14 είτε παρουσία είτε απουσία του χημικού επαγωγέα HMBA. H καλλιέργεια MELrpS5 C14 που εκτέθηκε στον χημικό επαγωγέα παρουσιάζει μεγαλύτερα ποσοστά στην G1/G0 φάση, αφού τα κύτταρα της συγκεκριμένης καλλιέργειας διαφοροποιούνται και εξέρχονται από τον κυτταρικό κύκλο. G1/Go % Χρόνος C14 HMBA C14 Σχήμα Γ.31 Διαγραμματική απεικόνιση των ποσοστών που αντιστοιχούν στην G1/G0 φάση του κυτταρικού κύκλου, των κυττάρων MEL rps5 C14 είτε παρουσία είτε απουσία HMBA. Όπου C14 HMBA : κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 που είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA, 5 mm για 96 ώρες Όπου C14 : κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 που δεν είχαν εκτεθεί στον χημικό επαγωγέα HMBA Ποσοστά των φάσεων κυτταρικού κύκλου των καλλιεργειών MEL rps5 C14 και MEL parental παρουσία χημικού επαγωγέα 5mM HMBA Ώρες MEL rps5 C14 MEL parental 24 G1/G ,5 G1/G1 9,1 0 G1/G2 55,9 52,5 48 G1/G0 36,8 38,2 G2 0 0 S 63,2 61,8 72 G1/G0 44,4 41,1 G2 12,5 16,5 S 43,1 42,4 192

213 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η κυτταρομετρία ροής δείχνει πως η πλειοψηφία των κυττάρων που δεν επωάστηκε με τον χημικό επαγωγέα (MEL parental και MEL rps5 C14) πολλαπλασιάζεται χωρίς να εμφανίζει αξιοσημείωτη διαφορά στα ποσοστά στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Αντίθετα, τα ποσοστά στην G1/G0 φάση που εξέρχονται τα κύτταρα μετά από 24 ώρες έκθεσης στον χημικό επαγωγέα είναι περίπου 47,5% και 35 % για τα parental ΜΕL και MEL rps5 C14, αντίστοιχα. Σε χρόνους 48 και 72 ώρες οι δύο καλλιέργειες δεν εμφανίζουν διαφορές στα ποσοστά G1/G0. Τα ευρήματα αυτά (υστέρηση του αριθμού των κυττάρων MEL rps5 C14 να εισέρχονται στην G1/G0 φάση σε σχέση με τα MEL parental κύτταρα) επαληθεύουν την υστέρηση των 24 ωρών που εμφανίζουν τα MEL rps5 C14 κύτταρα στην έναρξη του προγράμματος της διαφοροποίησης in vitro. Γ.2.3 Aποσιώπηση του γονιδίου της rps5 σε MEL parental κύτταρα Με βάση την γνωστή ακολουθία της rps5, σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία είναι συμπληρωματικά με το mrna της rps5, προκειμένου να επιτευχθεί η αποσιώπηση του γονιδίου της, ώστε να απαντηθεί το ερώτημα, κατά πόσο η καταστολή της έκφρασης της rps5 σε ευκαρυωτικά κύτταρα, (MEL), επιφέρει αλλαγές τόσο στην έναρξη του προγράμματος διαφοροποίησης όσο και στην απόπτωση. Ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδίων έγινε με τέτοιο τρόπο, έτσι ώστε να επιτευχθεί η καταστολή σε ποσοστό άνω του 70%. Για την καταστολή του mrna του γονιδίου RPS5 σχεδιάστηκαν με αλγοριθμικό πρόγραμμα υψηλής ανάλυσης (High Performance, HP GenomeWide sirna , Qiagen) δυο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων (Rps5_4_HP sirna και Rps5_2_HPsiRNA). Τόσο ο σχεδιασμός όσο και η τεχνική αναφέρονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Η τεχνική στηρίζεται στην διαμόλυνση των MEL κυττάρων μέσω λιποσωμάτων με δίκλωνα sirnas τα οποία έχουν συντεθεί τεχνητά, προκειμένου να επιτευχθεί η καταστολή του mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5. Για κάθε αντίδραση επιμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις κυττάρων, συγκεκριμένη ποσότητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (από 5nM έως 180nM) sirna [είτε το Rps5_4_HP sirna είτε το Rps5_2_HP sirna, είτε και τα δύο μαζί καθώς και το control sirna (μάρτυρας)], διαφορετικοί υποδοχείς κυττάρων καθώς και διαφορετική ποσότητα του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης HiPerfect Reagent Buffer. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε σε κάθε περίπτωση βασίστηκε στο πρωτόκολλο της Qiagen και αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο Β και στον πίνακα

214 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προκειμένου να ελεγχθεί σε ποια συγκέντρωση και ποιο από τα δυο ολιγονουκλεοτίδια που διαμόλυναν τα MEL parental κύτταρα επέφεραν το αναμενόμενο αποτέλεσμα (αποσιώπηση του γονιδίου), έγινε απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA, σύμφωνα με την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β Κατόπιν, ολικό κυτταροπλασματικό RNA απομονώθηκε και από MEL parental κύτταρα που επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια που δεν στοχεύουν στο mrna της rps5 (παράγραφος Β ), προκειμένου το RNA αυτό να χρησιμοποιηθεί ως μάρτυρας (control). Στη συνέχεια, η επιβεβαίωση της αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 έγινε με την τεχνική της Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR (RT-PCR). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν και οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου RPS5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_2_HP sirna Το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_2_HPsiRNA όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Β στοχεύει στην περιοχή CCT GGT GAA TGC TAT CAT CAA. Καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 1,2x10 5 κύτταρα/ml αφέθηκαν να αναπτυχθούν παρουσία θρεπτικού μέσου DMEM που περιείχε 10% v/v FCS και 100 μg/ml για κάθε ένα αντιβιοτικό (πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη). Ακολούθησε φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δυο φορές (5 λεπτά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7,2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν σε υποδοχή 48 well plate, προστέθηκαν 250 μl θρεπτικού υλικού όπως φαίνεται στον πίνακα 1 (παράγραφος Β ) και επωάστηκαν στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5% σε CO 2 για 16 περίπου ώρες. Για την αντίδραση επιμόλυνσης, χρησιμοποιήθηκε συγκέντρωση είτε 5 nm είτε 75 nm Rps5_2_HP sirna σε 100 μl διαλύματος, (ECR), χωρίς ορό και αντιβιοτικά και προστέθηκαν 1,5 μl αντιδραστηρίου επιμόλυνσης HiPerfect Reagent Buffer. Στη συνέχεια, το αντιδραστήριο και τα δίκλωνα sirna αναμίχθηκαν ελαφρά και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά, προκειμένου να σχηματιστούν τα σύμπλοκα sirna:hiperfect Reagent Buffer. Τέλος, το μίγμα αυτό μεταφέρθηκε στάγδην στα κύτταρα με ελαφρά ανάδευση. Ακολούθησε επώαση σε θάλαμο κυτταροκαλλιεργειών (37 ο C, 5% CO 2 ). Παράλληλα έγινε επιμόλυνση MEL parental κυττάρων των αντίστοιχων συγκεντρώσεων με το control sirna (μάρτυρας). Μετά την συμπλήρωση 48 ωρών από την στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα 194

215 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ συλλέχτηκαν (αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης ώστε να γίνει η λύση τους και να απομονωθεί ολικό κυτταροπλασματικό RNA), προκειμένου να ελεγχθούν τα επίπεδα mrna με RT-PCR, σχήμα Γ.32. Σχήμα Γ.32 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με 5nM είτε με 75nM με το sirna, Rps5_2_HP sirna Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), που απομονώθηκε από καλλιέργεια MEL parental αρχικής συγκέντρωσης1,2x10 5 κύτταρα/ml επιμολυσμένα ή με το sirna Rps5_2_HP sirna ή με το control sirna, χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, απεικονίζονται αριστερά, Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων Διαδρομή 2: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 5nM sirna, Rps5_2_HP sirna, Διαδρομή 3: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 5nM sirna, control, Διαδρομή 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 75 nm sirna, Rps5_2_HP sirna, Διαδρομή 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 75nM sirna control. Το προϊόν του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, ανιχνεύεται στα ~ 620 bp. 195

216 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σύμφωνα με το σχήμα Γ.32 δεν παρατηρείται αποσιώπηση του γονιδίου της rps5. Το ίδιο πείραμα επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας αυτή τη φορά συγκέντρωση είτε 12,5 nm είτε 60nM τόσο του sirna Rps5_2_HP sirna, όσο και του control sirna. Στα σχήματα Γ.33 και Γ.34, φαίνονται τα αποτελέσματα των πιο πάνω συνθηκών. Σχήμα Γ.33 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν με 12,5 nm sirna, Rps5_2_HP sirna Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), απομονώθηκε από καλλιέργεια MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 1,2 x 10 5 κύτταρα / ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_2_HP sirna είτε με το control sirna, χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp Διαδρομή 2: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 12,5 nm sirna, Rps5_2_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp), Διαδρομή 3: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 12,5 nm sirna, control, με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp), Διαδρομή 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν- DNA fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 12,5 nm sirna, Rps5_2_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 6: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που 196

217 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ επιμολύνθηκαν με 12,5 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp). Σχήμα Γ.34. RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν με 60 nm sirna, Rps5_2_HP sirna Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), απομονώθηκε από κύτταρα MEL parental αρχικής συγκέντρωσης1,2x10 5 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_2_HP sirna είτε με το control sirna, χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp), Διαδρομή 2: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 60 nm sirna, Rps5_2_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp), Διαδρομή 3: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 60 nm sirna, control, με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp), Διαδρομή 4: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 5: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 60 nm sirna, Rps5_2_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 6: PCR αντίδραση με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 60 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp). 197

218 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ Έλεγχος αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 μετά από διαμόλυνση των parental MEL κυττάρων με το ολιγονουκλεοτίδιο Rps5_4_HP sirna Όπως προκύπτει από τα πιο πάνω σχήματα, τα επίπεδα του mrna της ενδογενούς rps5 διατηρούνται σταθερά όταν χρησιμοποιείται το δίκλωνο sirna sirna Rps5_2_HP sirna. Στην συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το δίκλωνο RNA, Rps5_4_HP sirna που στοχεύει στην περιοχή AAG CGC TTC CGC AAA GCA CAA, προκειμένου να γίνει επιμόλυνση των parental ΜΕL κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 1,2x10 5 κύτταρα/ml είτε με 60 nm, είτε με 75nM, είτε με 12,5 nm του δίκλωνου sirna. Η ανίχνευση που ακολούθησε με την τεχνική της RT-PCR δεν έδειξε μείωση της έκφρασης της rps5, γι αυτό χρησιμοποιήθηκαν υψηλότερες συγκεντρώσεις τόσο του δίκλωνου sirna Rps5_4_HP sirna όσο και του δίκλωνου sirna Rps5_2_HP sirna, (σχήμα Γ.35). Σχήμα Γ.35 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με 120 nm είτε με 75 nm sirna, Rps5_4_HP καθώς και με 120 nm Rps5_2_HP sirna Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), απομονώθηκε από καλλιέργεια MEL parental αρχικής συγκέντρωσης1,2x10 5 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 2: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_2_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 3: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό 198

219 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 75 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 6: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 75 nm sirna, Rps5_4_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5. Σύμφωνα με το σχήμα Γ.35 (διαδρομή 4), χρησιμοποιώντας συγκέντρωση 120 nm του specific Rps5_4_HP sirna και όχι του sirna Rps5_2_HP, επιτυγχάνεται μείωση της έκφρασης του mrna της rps5 σε ποσοστό περίπου 50%. Για το λόγο αυτό θελήσαμε να μειώσουμε την αρχική συγκέντρωση των MEL parental κυττάρων και να γίνει επιμόλυνση με 120 nm του specific Rps5_4_HP sirna. Συνοπτικά η διαδικασία που ακολουθήθηκε έχει ως εξής: ετοιμάστηκαν καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 4-5x10 4 κύτταρα/ml και αφέθηκαν να αναπτυχθούν παρουσία θρεπτικού μέσου DMEM. Ακολούθησε συλλογή των κυττάρων και πλύσιμο δυο φορές (5 λεπτά) με ψυχρό ισότονο διάλυμα φωσφορικών ph 7.2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε υποδοχή 60mm dishes και προστέθηκαν 4ml θρεπτικού υλικού όπως φαίνεται στον πίνακα 4, (παράγραφος Β ) και επωάστηκαν στους 37 o C και σε ατμόσφαιρα 5% σε CO 2 για 16 περίπου ώρες. Μετά το πέρας των 16 ωρών ακολούθησε επιμόλυνση των κυττάρων με 120 nm Rps5_4_HP sirna σε 100 μl διαλύματος, (ECR), χωρίς ορό και αντιβιοτικά και προστέθηκαν 20 μl αντιδραστηρίου επιμόλυνσης HiPerfect Reagent Buffer. Στη συνέχεια, το αντιδραστήριο και τα δίκλωνο sirna αναμίχθηκαν ελαφρά και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά, προκειμένου να σχηματιστούν τα σύμπλοκα sirna:hiperfect Reagent Buffer. Τέλος, το μίγμα αυτό μεταφέρθηκε στάγδην στα κύτταρα με ελαφρά ανάδευση και ακολούθησε επώαση σε θάλαμο κυτταροκαλλιεργειών (37 ο C, 5% CO 2 ). Παράλληλα έγινε επιμόλυνση MEL parental κυττάρων των αντίστοιχων συγκεντρώσεων με το control sirna (μάρτυρας). Μετά από 48 ώρες απομονώθηκε ολικό κυτταροπλασματικό RNA που χρησιμοποιήθηκε για αντίδραση RT-PCR ( σχήμα Γ.36). 199

220 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.36 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), απομονώθηκε μετά από 48 ώρες από καλλιέργεια MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 4-5x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με 120 nm του sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna (120 nm), χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Σχήμα Α. Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 2: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων αρχικής 4 συγκέντρωσης 4x10 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν- DNA fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 3: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 4x10 4 κύτταρα/ml, που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp). Διαδρομή 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), Διαδρομή 200

221 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp). Σχήμα Β: Διαδρομή 1,2,3,4,5: PCR αντιδράσεις με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των αντίστοιχων διαδρομών του σχήματος Α με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση της ακτίνης, (προϊόν-dna fragment στα ~ 300 bp). Τα επίπεδα της ακτίνης παραμένουν σταθερά. Σύμφωνα με το σχήμα Γ.36 η αποσιώπηση του γονιδίου rps5 επιτυγχάνεται με επιμόλυνση αρχικής συγκέντρωσης καλλιέργειας MEL parental 5x10 4 κύτταρα/ml με το specific sirna Rps5_4_HP. Σύμφωνα με το σχήμα Γ.37 μόνο η συγκέντρωση 120nM του sirna Rps5_4_HP είναι ιδανική για την αποσιώπηση του συγκεκριμένου γονιδίου και όχι η ίδια συγκέντρωση του sirna Rps5_2_HP ή υψηλότερη του specific sirna Rps5_4_HP. Σχήμα Γ.37 RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασματικό RNA από κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με 120 nm είτε με 180 nm sirna, Rps5_4_HP Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1,5 μg), απομονώθηκε από καλλιέργεια MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκε είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna, χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 2: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna 201

222 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5. Διαδρομή 3: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 180 nm sirna control με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Διαδρομή 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 180 nm sirna, Rps5_4_HP sirna με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, Το βέλος στην διαδρομή 3 δείχνει ότι μόνον με την χρήση sirna, Rps5_4_HP sirna συγκέντρωσης 120 nm προκαλείται αποσιώπηση του γονιδίου της rps5. Γ.2.4 Επιβεβαίωση της αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ΜΕL μετά από επιμόλυνση με 120 nm του δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου Rps5_4_HP sirna και σε επίπεδο πρωτεΐνης Όπως αναφέρθηκε και στην προηγούμενη παράγραφο, Γ.2.3, η αποσιώπηση του γονιδίου, μετά από έλεγχο με RT-PCR, επιτυγχάνεται μετά από επιμόλυνση των MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml με το specific sirna Rps5_4_HP(120nM). Δεδομένου ότι βρέθηκε μείωση της έκφρασης του mrna μετά από 48 ώρες, ακολούθησε παραλαβή των κυτταρικών εκχυλισμάτων στις 72 ώρες, προκειμένου να ελεγχτούν τα επίπεδα πρωτεΐνης με ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση, χρησιμοποιώντας το αντίσωμα anti S5. Στο σχήμα Γ.38, φαίνονται τα αντίστοιχα αποτελέσματα. 202

223 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.38 Αποσιώπηση του γονιδίου RPS5 στα κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP είτε με RT-PCR σε επίπεδο πρωτεΐνης (Western blot ) Σχήμα Α. Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), απομονώθηκε μετά από 48 ώρες από καλλιέργεια MEL parental κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna, χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, καθώς και με την χρήση εκκινητών για την ανίχνευση της ακτίνης. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, Διαδρομή 1: MEL parental κυττάρων Διαδρομή 2: 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna Διαδρομή 3: 120 nm sirna control. H ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, προϊόν-dna fragment, στα ~ 620 bp και της ακτίνης στα 300 bp. Σχήμα Β.. Δείγματα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης που απομονώθηκε μετά από 72 ώρες από κύτταρα MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna, αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Διαδρομές 1, 3: ανοσοανίχνευση της rps5 από, 20μg, 25 μg, ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης MEL κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna, πρωτεϊνική ζώνη στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος ~ Da, Διαδρομές 2, 4: ανοσοανίχνευση της rps5 από 20μg, 25 μg, ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης κυττάρων MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna control, Διαδρομή 5: ανοσοανίχνευση της rps5 από 20μg, ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης MEL parental κυττάρων παρουσία του χημικού επαγωγέα HMBA μετά από 72 ώρες. Η πρωτεϊνική ζώνη ανιχνεύεται στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος ~ Da. 203

224 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έλεγχος της αποσιώπησης του γονιδίου της rps5 σε διαφορετικούς χρόνους ανάπτυξης των κυττάρων Καλλιέργεια MEL parental κυττάρων αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml επιμολύνθηκε με το specific sirna Rps5_4_HP(120nM) και σε τακτά χρονικά διαστήματα συλλέγονταν κύτταρα. Στη συνέχεια, έγινε απομόνωση κυτταρικών εκχυλισμάτων, σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.5. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v, μεταφορά σε μεμβράνη, ανοσοανίχνευση. Παράλληλα σε τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν και απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA για αντιδράσεις RT-PCR. Μελέτες σε επίπεδο mrna Σχήμα Γ.39. Ανάλυση RT-PCR για τον έλεγχο των επιπέδων του μεταγραφήματος της ενδογενούς rps5 μετά την επιμόλυνση των MEL κυττάρων με τα δίκλωνα sirnas. Ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), μετά από 2, 6, 12, 18, 24, 36, 48 και 72 ώρες από κύτταρα MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με 204

225 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ το sirna Rps5_4_HP specific (σχήμα Α) είτε με το control sirna (σχήμα Β), χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις της RT-PCR με τη χρήση εκκινητών σχεδιασμένων για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb, H ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, προϊόν-dna fragment, στα ~ 620 bp. Μελέτες σε επίπεδο πρωτεΐνης Σχήμα Γ.40 Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση των επιπέδων της rps5 μετά την επιμόλυνση των MEL κυττάρων με τα δίκλωνα sirnas. Δείγματα ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης, (30μg), απομονώθηκαν από κύτταρα MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP specific (σχήμα Α) είτε με το control sirna (σχήμα Β) και αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες των οποίων το μοριακό μέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda 205

226 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Από το παραπάνω σχήμα Γ.40 συμπεραίνεται πως το mrna της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 πέφτει στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση των MEL κυττάρων με το specific sirna. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης από την ανάλυση κατά Western φαίνεται ότι πέφτουν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Γ.2.5 Η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της rps5 στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ΜΕL επιβεβαιώνει την εμπλοκή της rps5 στη διαφοροποίηση Από τη στιγμή που αποσιωπήθηκε η έκφραση του γονιδίου της RPS5 το πείραμα που έλαβε χώρα ήταν η διερεύνηση της κυτταρικής ανάπτυξης σε καλλιέργεια που είχε αποσιωπηθεί το συγκεκριμένο γονίδιο σε σχέση με καλλιέργειες αναφοράς, (control), παρουσία του χημικού επαγωγέα HMBA. Συνοπτικά, πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση των MEL parental κυττάρων είτε με το specific sirna Rps5_4_HP είτε με το control sirna. Μετά το πέρας των 24 ωρών από την στιγμή της επιμόλυνσης προστέθηκε στην καλλιέργεια HMBA 5 mm. Στις 48 ώρες μετά την προσθήκη του χημικού επαγωγέα συλλέχθηκαν κύτταρα προκειμένου να γίνει απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA, και στις 72 ώρες συλλέχθηκαν κύτταρα για απομόνωση ολικής κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης. Ο σχεδιασμός του πειράματος δίδεται στο σχήμα Γ

227 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.41 Σχηματική αναπαράσταση του σχεδιασμού του πειράματος προκειμένου να ελεγχθεί η εμπλοκή της καταστολής του γονιδίου της rps5 στη διαφοροποίηση Στο σχήμα Γ.42 δίδονται τα αποτελέσματα της αντίδρασης RT-PCR μετά την απομόνωση του RNA στις 48 ώρες. Η ανάλυση με Western blot, προκειμένου να ανιχνευτούν τα επίπεδα της ριβοσωμικής πρωτεΐνης rps5 δίδεται στο σχήμα Γ.38(σχήμα Β). 207

228 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.42 Ανάλυση με RT-PCR του μεταγραφήματος της RPS5 στα κύτταρα MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με 120 nm sirna, Rps5_4_HP είτε με control sirna παρουσία χημικού επαγωγέα HMBA Ως εκμαγείο για τις αντιδράσεις της RT-PCR χρησιμοποιήθηκε ολικό κυτταροπλασματικό RNA, (1.5 μg), που απομονώθηκε 48 ώρες μετά την προσθήκη χημικού επαγωγέα HMBA από κύτταρα MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5 x10 4 κύτταρα/ml, που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna. Η ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: μάρτυρες μοριακού μεγέθους 1kb. Χρησιμοποιήθηκαν δύο ζεύγη εκκινητών είτε για ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, ( διαδρομές 1,2,3) είτε για την ανίχνευση της ακτίνης (διαδρομές 4,5) Διαδρομή 1: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων Διαδρομές 2 και 4: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna, Rps5_4_HP sirna Διαδρομές 3 και 5: Αντίδραση PCR με εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA των MEL parental κυττάρων που επιμολύνθηκαν με 120 nm sirna control H ανίχνευση του ενδογενούς μεταγραφήματος της rps5, προϊόν-dna fragment, στα ~ 620 bp και της ακτίνης στα 300 bp. Από την κυτταρική καλλιέργεια συλλέγονταν ανά 24 ώρες δείγμα, γίνονταν μέτρηση των κυττάρων και στη συνέχεια προσδιορισμός του ποσοστού κυτταρικής διαφοροποίησης, με τη μέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2. Παράλληλα συλλέγονταν δείγμα για τον προσδιορισμό του ποσοστού των νεκρών κυττάρων με την χρωστική trypan blue, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β

229 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.43 Κινητική της διαφοροποίησης των καλλιεργειών που επιμολύνθηκαν με τα δίκλωνα sirnas σε σχέση με τις καλλιέργεια αναφοράς, (parental MEL κυττάρων). Κύτταρα των καλλιεργειών MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna και των καλλιεργειών αναφοράς ΜΕL parental, αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο, παρουσία του χημικού επαγωγέα HMBA 5 mm. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγμα και γινόταν συνολική μέτρηση των κυττάρων, καθώς και μέτρηση των κυττάρων που χρωματίζονταν μπλε με τη μέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2.Παράλληλα έγινε μέτρηση του ποσοστού των διαφοροποιημένων κυττάρων και των καλλιεργειών MEL rps5 C14 και MEL rps5 C56. Παρατηρώντας το πιο πάνω σχήμα Γ.43 συμπεραίνουμε τα εξής: Αναφορικά με τα κύτταρα της καλλιέργειας που είχαν επιμολυνθεί με το control sirna, δεν παρατηρείται καμία ουσιαστική διαφορά σε σχέση με την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental,όπως άλλωστε ήταν αναμενόμενο αφού τα δίκλωνα control sirna δεν επηρεάζουν τα επίπεδα της rps5. Αντίθετα, κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το specific sirna Rps5_4_HP παρουσία του επαγωγέα HMBA, όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.43, δεν διαφοροποιούνται. Αναφορικά με τα κύτταρα MEL rps5 C14 και MEL rps5 C56 η υστέρηση στην διαφοροποίηση είναι εμφανής και αναμενόμενη όπως έχει προαναφερθεί διεξοδικά σε προηγούμενες παραγράφους. 209

230 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στις καλλιέργειες MEL parental που επιμολύνθηκαν είτε με το sirna Rps5_4_HP sirna είτε με το control sirna, στις 72 ώρες και 96 ώρες μετά την προσθήκη του χημικού επαγωγέα HMBA, μετρήθηκαν τα ποσοστά των νεκρών κυττάρων με τη δοκιμή αποκλεισμού με trypan blue. Στο σχήμα Γ.44 δίδονται τα ποσοστά των νεκρών κυττάρων στις δύο καλλιέργειες. Σχήμα Γ.44 Ραβδόγραμμα συσσώρευσης των νεκρών κυττάρων των καλλιεργειών που επιμολύνθηκαν με sirnas χρησιμοποιώντας την χρωστική Trypan Blue Ο ποσοτικός προσδιορισμός των νεκρών κυττάρων των καλλιεργειών MEL που επιμολύνθηκαν είτε με το control είτε με το specific sirna, έδειξε ότι η καλλιέργεια που δεν εκφράζει την ριβοσωμική πρωτεΐνη rps5 παρουσίασε ιδιαίτερα σοβαρή αύξηση κυτταρικού θανάτου (>50% του μάρτυρα), αυξανόμενη προοδευτικά από τις 72 έως τις 96 ώρες καλλιέργειας. Τα ποσοστά αυτά δείχνουν ότι μετά το πέρας των 72 ωρών τα επίπεδα της πρωτεΐνης πέφτουν δραματικά με αποτέλεσμα να μην γίνεται συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων, αφού ανήκει στις earlyπρώιμες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα η μεταφραστική μηχανή να μην είναι λειτουργική και το κύτταρο να οδηγείται στην αυτοκαταστροφή. 210

231 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.2.6 Έλεγχος απόπτωσης και νέκρωσης στις καλλιέργειες MEL που επιμολύνθηκαν είτε με το control είτε με το Rps5_4_HP sirna με κυτταρομετρία ροής (FACS-Flow Cytometry), με FITC-Annexin V και 7- Αμινο-Ακτινομυκίνης D Είναι γνωστό πως η διαφοροποίηση και η απόπτωση είναι στενά συνδεδεμένες κατά την ερυθρά ωρίμανση, προκειμένου ο αριθμός των ερυθρών κυττάρων στο αίμα να βρίσκεται σε ισορροπία. Έχει βρεθεί πως κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων το γονίδιο της rps5, καταστέλλεται ενώ δεν συμβαίνει το ίδιο κατά την απόπτωση (Vizirianakis et al., 1999). Χαρακτηριστικά, για να μελετηθεί το φαινόμενο της αποσιώπησης ο σχεδιασμός του πειράματος είναι ο ίδιος όπως και στην μελέτη της διαφοροποίησης, (σχήμα Γ.41). Για τον προσδιορισμό των αποπτωτικών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν FITC-Annexin V και 7-Αμινο-Ακτινομυκίνης D, (παράγραφος Β.2.11). Συνοπτικά, ανά 24 ώρες μετά την προσθήκη του HMBA, συλλέγονταν δείγμα από την καλλιέργεια, γίνονταν μέτρηση των κυττάρων και στην συνέχεια μετά από πλύσιμο με ψυχρό PBS τα δείγματα υπεβλήθησαν σε κυτταρομετρία ροής (Coulter Epics XL MCL Flow cytometer, Beckman Coulter, Inc, Miami,USA) σε μήκος κύματος 488 nm (ο αριθμός των κυττάρων θα πρέπει να είναι περίπου 10 6 κύτταρα/ml). Τα κύτταρα που ήταν θετικά για Ανεξίνη V-FITC ανιχνεύτηκαν από το φίλτρο FL1, σε μήκος κύματος από 505 έως 545 nm, ενώ τα θετικά για 7-ΑΑD στο φίλτρο FL2, σε μήκος κύματος από 605 έως 635 nm. Τα αποτελέσματα αποδόθηκαν συνολικά σε γραμμικά/λογαριθμικά ιστογράμματα. Τα διαγράμματα (dotplots) που προέκυψαν κατά την διέλευση των κυττάρων, (σχήμα Γ.45) από τον κυτταρομετρητή ροής μπορούν να διακριθούν 4 διαφορετικά τεταρτημόρια από τον συνδυασμό πράσινου φθορισμού (κύτταρα θετικά στην FITC- Annexin V) και κόκκινου φθορισμού (κύτταρα θετικά στο PI): Αριστερό κάτω τεταρτημόριο= ζωντανά κύτταρα: αρνητικά και για τις δύο χρωστικές (FITC-/7 AAD-) Δεξιό κάτω τεταρτημόριο= πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα (early apoptotic): θετικά μόνο για Annexin-FITC (FITC+/7AAD-) Δεξιό άνω τεταρτημόριο= όψιμα αποπτωτικά κύτταρα (late apoptotic or secondary necrotic): θετικά και για τις 2 χρωστικές (FITC+/7 AAD+). 211

232 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αριστερό άνω τεταρτημόριο= νεκρωτικά κύτταρα (necrotic cells): κύτταρα θετικά μόνο για PI (FITC-/7AAD+). Στα διαγράμματα που απεικονίζονται στο παρακάτω σχήμα, Γ.45 παρατηρείται η κατανομή των κυτταρικών πληθυσμών κάθε καλλιέργειας στα 4 τεταρτημόρια μετά από 24, 48 και 72 ώρες σε έκθεση στον χημικό επαγωγέα HMBA αντίστοιχα. Τα ακριβή ποσοστά των νεκρών, αποπτωτικών και ζωντανών κυττάρων των συγκεκριμένων καλλιεργειών δίδονται στο σχήμα Γ

233 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.45 Τυπικά διαγράμματα (dotplots) μετά από ανάλυση με κυτταρομετρίας ροής για την ανίχνευση των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων των κυτταρικών καλλιεργειών που επιμολύνθηκαν με sirnas, με annexin V - 7 ΑΑD Ανά 24 ώρες, μετά το πέρας των 24 ωρών προσθήκης του χημικού επαγωγέα HMBA, έγινε συγκομιδή των MEL κυττάρων που επιμολύνθηκαν είτε με το control είτε με το specific sirna. 213

234 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχήμα Γ.46 Τυπικά ιστογράμματα των ποσοστών των ζωντανών, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων που προέκυψαν από την ανάλυση με κυτταρομετρίας ροής των κυτταρικών καλλιεργειών που επιμολύνθηκαν με sirnas Από τα παραπάνω διαγράμματα διαπιστώνεται ότι στην καλλιέργεια που υπέστη επιμόλυνση με το specific sirna η συντριπτική πλειοψηφία του κυτταρικού πληθυσμού (95,5 % στις 24 ώρες, 84,2 % στις 48 ώρες, 78,1 % στις 72 ώρες και 72,9 % στις 96 ώρες) βρίσκεται στο αριστερό κάτω τεταρτημόριο και είναι αρνητικός και για τις δύο χρωστικές (ζωντανά κύτταρα). Μικρότερα ποσοστά του κυτταρικού 214