ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΜΦΥΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΑ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ. Αθανασία Λεοντιάδου Βιολόγος

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΜΦΥΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΑ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Αθανασία Λεοντιάδου Βιολόγος Θεσσαλονίκη 2009

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDIES STUDY ON INNATE IMMUNITY RECEPTORS OF B LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA Athanasia Leontiadou Biologist Thessaloniki

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εισαγωγή στις άνοσες αποκρίσεις Έµφυτη Ανοσία Υποδοχείς έµφυτης ανοσίας Υποδοχείς Τύπου Toll (Toll Like Receptors TRLs) Δοµή υποδοχέων TLR Προσδέτες των υποδοχέων TLR Πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR Σηµατοδοτικό µονοπάτι των υποδοχέων TLR MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι Εναλλακτικό MYD88-εξαρτώµενο µονοπάτι TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι Προϊόντα του µονοπατιού TLR Έκφραση και λειτουργία των υποδοχέων TLR στα Β λεµφοκύτταρα Υποδοχείς τύπου NOD (Nod-like Receptors, NLRs) Δοµή και έκφραση των υποδοχέων NOD1 και NOD Προσδέτες των υποδοχέων NOD1 και NOD Σηµατοδοτικό µονοπάτι..23 Α) Ενεργοποίηση NF-Κβ 23 Β) Ενεργοποίηση MAPK κινασών Αλληλεπίδραση των υποδοχέων NOD µε τις κασπάσες Αλληλεπίδραση υποδοχέων έµφυτης ανοσίας Προσαρµοστική ανοσία Υποδοχείς προσαρµοστικής ανοσίας Δοµή ανοσοσφαιρινών Γενετικοί τόποι ανοσοσφαιρινών Μηχανισµοί δηµιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών Διαφοροποίηση των Β λεµφοκυττάρων Φάση διαφοροποίησης ανεξάρτητη από το αντιγόνο Φάση διαφοροποίησης εξαρτώµενη από το αντιγόνο Σηµατοδοτική λειτουργία των υποδοχέων των Β λεµφοκυττάρων Χρόνια Λεµφοκυτταρική Λευχαιµία

4 1.9.1 Γενικά Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και στερέοτυπες ανοσοσφαιρίνες στη ΧΛΛ Αντιγονική διέγερση στη ΧΛΛ Υποδοχείς έµφυτης ανοσίας και ΧΛΛ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Οµάδα Μελέτης Υλικά και Μέθοδοι Αποµόνωση CD19 + κυττάρων από δείγµα αίµατος ασθενών µε ΧΛΛ Αποθήκευση των CD19 + κυττάρων Μέτρηση του ποσοστού των CD19 + κυττάρων µε κυτταροµετρία ροής Αποµόνωση RNA Ποιοτικός έλεγχος RNA Σύνθεση συµπληρωµατικού DNA (cdna) Ποιοτικός έλεγχος του cdna Ποιοτικός έλεγχος της PCR Real time RT-PCR...49 A. Real time PCR για τα γονίδια TLR.49 B. Real time PCR για τα γονίδια NOD Ανάλυση αποτελεσµάτων Μέθοδος ΔΔCt ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ρεπερτόριο γονίδιων IGHV της παρούσας µελέτης Πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR και NOD και των µορίων του σηµατοδοτικού µονοπατιού των TLR Συγκριτική ανάλυση των αποτελεσµάτων µε τη µέθοδο ΔΔCt ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NOD στη ΧΛΛ Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα των µορίων του σηµατοδοτικού µονοπατιού TLR στη ΧΛΛ Συγκριτική µελέτη της έκφρασης των TLR σε υποοµάδες ασθενών µε ΧΛΛ.66 Α. Είδη (Status) µεταλλάξεων 66 Β. Έκφραση του µορίου CD Γ. Το γονίδιο IGHV ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT 75 3

5 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ.87 4

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ H παρούσα διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε στα πλαίσια του Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών του Τµήµατος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη της κα. Αναστασίας Κουβάτση, Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του Τµήµατος Βιολογίας και του κ. Κώστα Σταµατόπουλου, Επιµελητή της Αιµατολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταµόσχευσης Αιµοποιητικών Κυττάρων του ΠΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου», τους οποίους ευχαριστώ θερµά για την εµπιστοσύνη που έδειξαν στο πρόσωπό µου και την ανάθεση της εργασίας καθώς επίσης και για την καθοδήγηση και την πολύτιµη βοήθειά τους σε όλα τα στάδια της εργασίας. Η παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας καθώς και στο Εργαστήριο Κυτταροµετρίας Ροής της Αιµατολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταµόσχευσης Αιµοποιητικών Κυττάρων του ΠΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου», που διευθύνουν οι κύριοι Αθανάσιος Φάσσας και Αχιλλέας Αναγνωστόπουλος. Υλικό της µελέτης προέρχεται επίσης και από το αρχείο του Αιµατολογικού Τµήµατος του ΠΓΝ Νίκαιας, που διευθύνει ο κ. Νικόλαος Λαουτάρης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά του Διευθυντές των Τµηµάτων για τη δυνατότητα που µου προσέφεραν και τη συµβολή τους στην εκπόνηση της παρούσας µελέτης. Η βασική εκπαίδευση, το πειραµατικό µέρος και η ανάλυση των αποτελεσµάτων της µελέτης έγιναν υπό την καθοδήγηση του κ. Κώστα Σταµατόπουλου και της κας. Χρυσούλας Μπέλεση, Βιοπαθολόγου, Αναπληρώτριας Διευθύντριας του Αιµατολογικού Τµήµατος του ΠΓΝ Νίκαιας, τους οποίους ευχαριστώ θερµά που µε καθοδήγησαν, παρακολούθησαν ενεργά όλες τις φάσεις εκπόνησης της παρούσας διπλωµατικής εργασίας και έδωσαν λύσεις στα µεθοδολογικά και άλλα προβλήµατα που ανέκυψαν στην εξέλιξη της µελέτης. Η παρούσα διπλωµατική εργασία δεν θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς τη βοήθεια των συνεργατών του Εργαστηρίου Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας της Αιµατολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταµόσχευσης Αιµοποιητικών Κυττάρων του ΠΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου». Στο σηµείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου ιδιαίτερα στη βιολόγο και υποψήφια διδάκτορα κα. Σταυρούλα Ντούφα για την καθοδήγηση, την υποµονή της και τη βοήθειά της στην πραγµατοποίηση της παρούσας µελέτης καθώς επίσης και τους κ. Νίκο Παπακωνσταντίνου, βιολόγο και υποψήφιο διδάκτορα και τον προπτυχιακό φοιτητή κ. Γεώργιο Κόγια για την άψογη συνεργασία σε όλα τα στάδια της εργασίας. Επιθυµώ να ευχαριστήσω θερµά, για τις υποδείξεις και την πολύπλευρη υποστήριξη που µου προσέφερε, την υπεύθυνη βιολόγο του Τµήµατος κα. Τασούλα Τουλουµενίδου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα µέλη 5

7 του εργαστηρίου για τη βοήθειά τους και τη δηµιουργία ενός ευχάριστου κλίµατος εργασίας. 6

8 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Εισαγωγή στις άνοσες αποκρίσεις Ο άνθρωπος είναι ξενιστής για µεγάλη ποικιλία µικροοργανισµών. Πολλοί από αυτούς είναι µολυσµατικοί και η είσοδός τους στον ξενιστή προκαλεί νόσο. Ο οργανισµός ανθίσταται στην είσοδο των παθογόνων µέσω ποικίλων φυσικών και βιοχηµικών φραγµών. Πολλοί από τους µολυσµατικούς παράγοντες, ωστόσο, καταφέρνουν να εισέλθουν. Οι µολύνσεις που προκαλούνται αντιµετωπίζονται από τον ανοσοποιητικό σύστηµα, κύρια λειτουργία του οποίου είναι η εξάλειψη των µολυσµατικών παραγόντων και η ελαχιστοποίηση των βλαβών που προκαλούν, δηλαδή η εξασφάλιση ανοσίας. Οι άνοσες απαντήσεις κυρίως εκτελούνται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: αποκρίσεις της έµφυτης ή µη ειδικής ανοσίας (innate immunity) και αποκρίσεις της προσαρµοστικής ή ειδικής ανοσίας (adaptive immunity). 1.2 Έµφυτη Ανοσία Στην έµφυτη ανοσία συµµετέχουν λεµφοκύτταρα (κύτταρα φυσικοί φονιάδες, natural killer cells), µακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα, τα οποία αποτελούν την πρώτη γραµµή άµυνας του οργανισµού. Ο αποτελεσµατικός έλεγχος πολλών λοιµώξεων κατά το αρχικό διάστηµα που µεσολαβεί από την εκδήλωση της λοίµωξης έως ότου αναλάβουν οι µηχανισµοί της ειδικής ανοσίας εξασφαλίζεται από το σύστηµα της έµφυτης ανοσίας. Για πολλά χρόνια η έµφυτη ανοσία θεωρούνταν µια απλή διαδικασία φαγοκυττάρωσης παθογόνων και παρουσίασής τους στα κύτταρα της επίκτητης ανοσίας (1). Ωστόσο, το 1996 φάνηκε για πρώτη φορά ότι η πρωτεΐνη Toll της Δροσόφιλα (Drosophila melanogaster) είναι απαραίτητη για την επαγωγή αποτελεσµατικής άνοσης απάντησης και ότι η έµφυτη ανοσία διαθέτει µηχανισµούς για την αναγνώριση παθογόνων (2). 1.3 Υποδοχείς έµφυτης ανοσίας Οι στόχοι της έµφυτης ανοσίας είναι διατηρηµένα µοριακά µοτίβα κοινών παθογόνων (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs). Γι αυτό το λόγο, οι υποδοχείς που εµπλέκονται στην αναγνώρισή τους ονοµάζονται υποδοχείς αναγνώρισης µοριακών µοτίβων (Pattern Recognition Receptors, PRRs) (3). Αυτά τα µοτίβα είναι απαραίτητα για την επιβίωση των παθογόνων και διακρίνονται από µόρια του ξενιστή 7

9 αποτρέποντας την εκδήλωση αυτοάνοσων απαντήσεων. Επιπλέον, αντιπροσωπεύουν οντογενετικά διατηρηµένες κοινές δοµές στις διάφορες κλάσεις των παθογόνων. Έτσι η έµφυτη ανοσία µπορεί να αναγνωρίζει όλο το εύρος των κοινών παθογόνων µε τη χρήση περιορισµένου αριθµού υποδοχέων. Οι υποδοχείς PRR ανήκουν σε διάφορες πρωτεϊνικές οικογένειες, τα γονίδια των οποίων διατηρήθηκαν οντογενετικά από πιέσεις επιλογής που ασκήθηκαν από τα παθογόνα σε πληθυσµιακό επίπεδο. Είναι χαρακτηριστικό ότι άλλα µέλη των πρωτεϊνικών οικογενειών, στις οποίες ανήκουν οι υποδοχείς PRR, εµπλέκονται σε διαδικασίες µοριακής αναγνώρισης που δεν έχουν σχέση µε την άνοση λειτουργία (4). Πολλοί υποδοχείς PRR κυκλοφορούν ως διαλυτές πρωτεΐνες, στο πλάσµα, ενώ άλλοι εκφράζονται στη µεµβράνη κυττάρων, τα οποία εντοπίζονται σε στρατηγικά σηµεία του οργανισµού, αναφορικά µε την είσοδο των παθογόνων, καθώς και στην επιφάνεια όλων των δραστικών κυττάρων της έµφυτης ανοσίας, µεταξύ άλλων και τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (antigen-presenting cells, APC) (5). Οι υποδοχείς PRR διακρίνονται σε τρεις οικογένειες: α) Υποδοχείς τύπου Toll (Tolllike receptors, TRLs), β) Υποδοχείς τύπου NOD (NOD-like receptors, NLRs) και γ)υποδοχείς RIG (RIG-I-receptors, RLRs) (6) Υποδοχείς Τύπου Toll (Toll Like Receptors, TRLs) Στα θηλαστικά αναγνωρίστηκαν πρωτεΐνες οµόλογες µε τους υποδοχείς Toll της Drosophila melanogaster και, λόγω της οµοιότητας τους, ονοµάστηκαν υποδοχείς τύπου Toll (Toll like receptors, TLRs) (7). Πρόκειται για µια οικογένεια εξελικτικά συντηρηµένων διαµεµβρανικών πρωτεϊνών. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί 11 µέλη της οικογένειας στον άνθρωπο και 13 µέλη στον ποντικό. Καθένα από αυτά αναγνωρίζει διαφορετικά PAMPs, τα οποία προέρχονται από ποικίλους µικροοργανισµούς, π.χ. βακτήρια, ιούς, πρωτόζωα και µύκητες (8) Δοµή υποδοχέων TLR Οι υποδοχείς TLR είναι τύπου Ι διαµεµβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται από µια κυτταροπλασµατική σηµατοδοτική περιοχή και µια εξωκυττάρια περιοχή που συνδέονται µεταξύ τους µέσω µιας µονής διαµεµβρανικής έλικας (9). Παρουσιάζουν σηµαντική οµολογία µε ορισµένα µέλη της οικογένειας του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-1 (Interleukini-1 Receptor, IL-1R). Συγκεκριµένα, διαθέτουν µια συντηρηµένη περιοχή περίπου 200 αµινοξέων στο κυτταροπλασµατικό 8

10 τµήµα τους, που είναι γνωστή ως περιοχή TIR (Toll/IL-1R domain) (10). Οι περιοχές TIR των υποδοχέων TLR1, TLR2 και TLR10 έχουν αναλυθεί µέσω κρυσταλλογραφίας µε ακτίνες X (11). Η ανάλυση έδειξε ότι κάθε περιοχή αποτελείται από τρία συντηρηµένα «κουτιά» (boxes), απαραίτητα για την ενδοκυττάρια µετάδοση του σήµατος (9-10). Εικόνα 1: Σχηµατική απεικόνιση της δοµής των υποδοχέων TLR. Βασίζεται στην εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα TLR3, και στην επικράτεια TIR του υποδοχέα TLR2. Η ECD όλων των TRL πιθανόν διµερίζεται σχηµατίζοντας µια πεταλοειδή δοµή πλούσια σε επαναλήψεις LRRs. Η περιοχή TIR είναι συµπαγής και σφαιρική και περιλαµβάνει µια δοµή, γνωστή ως, θηλιά ΒΒ (BB loop). Οι πρωτεΐνες προσαρµογείς (adapters), που είναι απαραίτητες για την ενδοκυττάρια µετάδοση του σήµατος, διαθέτουν επίσης µια περιοχή TIR, µέσω της οποίας αλληλεπιδρούν µε τους υποδοχείς TLR (12). 9

11 Η εξωκυττάρια περιοχή (ectodomain, ECD) των υποδοχέων TLR αποτελείται από µοτίβα πλούσια σ επαναλήψεις λευκίνης (Leucine- Rich Repeats, LRRs). Περιλαµβάνει διαδοχικά µοτίβα LRRs, καθένα από τα οποία περιλαµβάνει αµινοξέα, και αποτελείται από αλληλουχίες πλούσιες σε λευκίνη XLXXLXLXX και άλλες συντηρηµένες αλληλουχίες XΦXXΦXXXXFXXLX (όπου Φ πρόκειται για ένα υδρόφοβο αµινοξύ). Οι επαναλήψεις αυτές δηµιουργούν ένα β-κλώνο που συνδέεται µέσω µιας µονής διαµεµβρανικής έλικας µε µια α-έλικα. Έτσι, η εξωκυττάρια περιοχή σχηµατίζει µια πεταλοειδή δοµή, ικανή ν αναγνωρίζει µεγάλη ποικιλία παθογόνων µικροοργανισµών (Eικόνα 1) Προσδέτες των υποδοχέων TLR Κάθε µέλος της οικογένειας των TLR αναγνωρίζει διαφορετικά PAMPs. Η ικανότητα κάποιων από αυτούς να ετεροδιµερίζονται και να σχηµατίζουν σύµπλοκα µε άλλες πρωτεΐνες αυξάνει το εύρος των παθογόνων που αναγνωρίζουν. Μολονότι οι TLR διαθέτουν µια εξωκυττάρια, µια διαµεµβρανική και µια κυτταροπλασµατική περιοχή, µόνο οι TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, εκφράζονται στην επιφάνεια του κυττάρου. Οι TLR3, TLR7, TLR9 εντοπίζονται σε ενδοκυττάρια οργανίδια. Ο TLR8 εντοπίζεται κυρίως ενδοκυττάρια, αλλά µια µικρή ποσότητα του εκφράζεται στη µεµβράνη των κυττάρων. Τα µέλη της οικογένειας που εκφράζονται στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη αναγνωρίζουν PAMP µοναδικά σε κύτταρα βακτηρίων και µυκήτων. Αντίθετα, τα µέλη που εντοπίζονται στις µεµβράνες ενδοκυττάριων διαµερισµάτων αναγνωρίζουν ιικά και βακτηριακά νουκλεϊνικά οξέα. Προσδέτες έχουν αναγνωριστεί µόνο για 10 από τα 11 µέλη της οικογένειας (Εικόνα 2) (7). Ο TLR2 αναγνωρίζει πεπτιδογλυκάνες, λιποπρωτεϊνες και λιποπεπτίδια των Gram+ βακτηρών, καθώς επίσης και του µυκοπλάσµατος. Συνεργάζεται µε τους TLR1 και TLR6 σχηµατίζοντας ετεροδιµερή, ικανά ν ανιχνεύουν µοριακές δοµές, όπως διάκυλο- και τριάκυλο-λιποπεπτίδια, αντιστοίχως. Επίσης, σχηµατίζει σύµπλοκα µε άλλους υποδοχείς, αυξάνοντας έτσι την ποικιλοµορφία των προσδετών που αναγνωρίζει. Ο TLR3 εµπλέκεται στην αναγνώριση δίκλωνου RNA (double stranded RNA) το οποίο παράγεται κατά την αντιγραφή των ιών. Ο TLR4 είναι απαραίτητος για την αναγνώριση κυρίως του λιποπολυσακχαρίτη (Lipopolysaccharide, LPS), συστατικού του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram- βακτηρίων. Ο TLR5 ανιχνεύει φλαγκελίνες, οι οποίες είναι πρωτεϊνικές υποµονάδες των µαστίγιων τόσο των Gram+ όσο και των Gram- βακτηρίων. Οι υποδοχείς TLR7 και TLR8 αναγνωρίζουν µονόκλωνο RNA ιών 10

12 (single stranded RNA). Επίσης ανιχνεύουν συνθετικά συστατικά τύπου ιµιδαζοκινολίνης (imidazoquinoline-like) και ανάλογα γουανοσίνης. Ο TLR9 αναγνωρίζει κυρίως µη-µεθυλιωµένες νησίδες κυτοσίνης-γουανίνης (cytidinephosphate-guanosine, CpG), µοτίβα που συναντώνται στα βακτηριακά και ιικά νουκλεϊνικά οξέα καθώς και σε αυτοαντιγόνα. Ο TLR-11 αναγνωρίζει ουροπαθογόνα βακτήρια. Ωστόσο, η έκφραση του στον άνθρωπο είναι αµφιλεγόµενη, καθώς περιέχει στην κωδική περιοχή του ένα κωδικόνιο λήξης (13-14). ΦΛΑΓΚΕΛΙΝΗ ΔΙΚΛΩΝΟ RNA Εικόνα 2: Σχηµατική απεικόνιση της κυτταρικής εντόπισης των υποδοχέων TLR και των αντίστοιχων προσδετών (15) Πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR Οι υποδοχείς TLR εκφράζονται σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, όπως τα µακροφάγα, µονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, βασεόφιλα, δενδριτικά κύτταρα, σιτευτικά κύτταρα, Β-λεµφοκύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς (NK), ρυθµιστικά Τ-λεµφοκύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα της αναπνευστικής και γαστρεντερικής οδού, ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς και διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων (Πινάκας 1) (8,16). Η ενεργοποίησή τους έχει διαφορετικά αποτελέσµατα σε κάθε κυτταρικό τύπο. Έτσι, η ενεργοποίηση των υποδοχέων TLR στ αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα (haematopoietic stem cell, HSC) φαίνεται να επηρεάζει τη διαφοροποίηση τους σε µονοκύτταρα και µακροφάγα. Στα ουδετερόφιλα, η ενεργοποίηση τους αναστέλλει την απόπτωση και επιµηκύνει τη διάρκεια ζωής των λειτουργικών κυττάρων. Τέλος, η 11

13 ενεργοποίηση των TLR στα Β και Τ λεµφοκύτταρα οδηγεί σε πολλαπλασιασµό και διαφοροποίησή τους (14). Πίνακας 1: Πρότυπο της έκφρασης των υποδοχέων TLR στους διάφορους κυτταρικούς τύπους (14). TLRs TLR 1 TLR 2 TLR 3 ΕΚΦΡΑΣΗ Καθολική Μονοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα και Τ -κύτταρα Δενδριτικά και ΝΚ -κύτταρα TLR 4 Μακροφάγα, δενδριτικά κυτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, ουδετερόφιλα και Τ -κύτταρα TLR 5 Μονοκύτταρα, ανώριµα δενδριτικά κύτταρα, ΝΚ - κύτταρα και ουδετερόφιλα TLR 6 TLR 7 TLR 8 TLR 9 TLR 10 Β -κύτταρα, µονοκύτταρα, ΝΚ -κύτταρα και ουδετερόφιλα Β -κύτταρα, pdcs και ουδετερόφιλα Μονοκύτταρα, ΝΚ -, T κύτταρα και ουδετερόφιλα pdcs, B -κύτταρα, µακροφάγα, NK κύτταρα και ουδετερόφιλα B -κύτταρα, pdcs και ουδετερόφιλα TLR 11 - pdcs: πλασµατοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα Τα επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων TLR διαφέρουν σε κάθε κυτταρικό τύπο και ρυθµίζονται από διάφορους παράγοντες: 1. Είδος ιστού: εκφράζονται στην πλειονότητα των ιστών και οργάνων αλλά σε βαθµό που ποικίλει. 2. Τύπος της υποκείµενης φλεγµονής: παρατηρείται αυξηµένη έκφραση σε χρόνιες φλεγµονώδεις καταστάσεις. 3. Τύπος του TLR και του PAMP: Η έκφραση κάθε τύπου TLR επάγεται από την παρουσία του αντίστοιχου PAMP. 4. Παρουσία κυτταρoκινών: Η παρουσία IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-2, IL-15, TNF-α, GM-CSF και M-CSF επηρεάζουν την έκφραση των TRL. 5. Παρουσία αναστολέων του σηµατοδοτικού µονοπατιού (17).. 12

14 1.3.5 Σηµατοδοτικό µονοπάτι των υποδοχέων TLR Η ενεργοποίηση των υποδοχέων TLR έχει ως αποτέλεσµα την έναρξη της µετάδοσης ενός ενδοκυττάριου σήµατος. Διαφορετικά µέλη της οικογένειας των υποδοχέων TLR επάγουν διαφορετικά σηµατοδοτικά µονοπάτια. Η µοριακή βάση της ενδοκυττάριας µετάδοσης του σήµατος στηρίζεται στη δοµή TIR-TIR, που σχηµατίζεται λόγω διµερισµού του υποδοχέα. Αυτή η δοµή µπορεί να επιστρατεύσει κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες που διαθέτουν επίσης µια περιοχή TIR. Οι πρωτεΐνες αυτές, γνωστές ως προσαρµογείς (adapters), προσδένονται στον ενεργοποιηµένο υποδοχέα, µεσολαβώντας µε αυτόν τον τρόπο στη µετάδοση του σήµατος (14). Μέχρι σήµερα, έχουν αναγνωριστεί πέντε προσαρµογείς : MyD88 (myeloid differation primary response protein 88) Mal (MyD88-adapter like) ή TIRAP (TIR domain containing adapter) TRIF (TIR domain-containing adapter inducing interferon-β) ή TICAM-1 (TIR-containing adapter molecule-1) TRAM (TRIF-related adapter molecule) ή TICAM-2 (TIR-containing adapter molecule-2) SARM (sterile α and HEAT-Armadillo motifs) Οι MyD88, Mal, TRIF και TRAM παίζουν βασικό ρόλο στην ενδοκυττάρια σηµατοδότηση καθώς η επιστράτευση τους από τους υποδοχείς TLR συµβάλλει καθοριστικά στην πορεία του µονοπατιού καθοδικά του υποδοχέα. Αντίθετα, η SARM φαίνεται να παίζει το ρόλο του αρνητικού ρυθµιστή όσον αφορά στην ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων NF-κB και IRF3 από τους υποδοχείς TLR3 και TLR4 (9). Οι πρωτεΐνες MyD88 και TRIF επιστρατεύονται πρώτες στο σηµατοδοτικό µονοπάτι. Γι αυτό το λόγο, τα µονοπάτια που επάγονται από τους υποδοχείς TLR χαρακτηρίζονται είτε ως MyD88-εξαρτώµενα είτε ως TRIF-εξαρτώµενα (Εικόνες 3, 6). 13

15 Εικονα 3: MyD88-εξαρτώµενo και TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι (9). Και τα δύο µονοπάτια έχουν ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων NF-κB (Nuclear Factor κb) και IRFs (Interferon Regulatory Factors) καθώς και των MAP κινασών p38 και JNK. Οι παράγοντες αυτοί είτε συνεργάζονται µεταξύ τους, είτε δρουν ανεξάρτητα επάγοντας την παραγωγή µιας µεγάλης ποικιλίας κυτταροκινών, ιντερφερονών τύπου Ι και συνδιεγερτικών µορίων (18) MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι Η πρωτεΐνη MyD88 παίζει κεντρικό ρόλο καθώς αλληλεπιδρά µε όλα τα µέλη της οικογένειας των υποδοχέων TLR, εκτός από τον υποδοχέα TLR3. Η πρωτεΐνη Mal εµπλέκεται σε αυτό το µονοπάτι και δρα διασυνδέοντας τους υποδοχείς TLR4, TLR1/2, TLR2/6 µε των πρωτεΐνη MyD88 (19). Εκτός από την περιοχή TIR που διαθέτει στο C-τελικό άκρο της, η πρωτεΐνη MyD88 περιέχει επίσης και µια περιοχή θανάτου (death domain) στο Ν-τελικό άκρο της, µέσω της οποίας µπορεί να συνδέεται µε µέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών IRAK (interleukin-1 receptor associated kinase) που διαθέτουν µια αντίστοιχη περιοχή. Έτσι, η πρωτεΐνη IRAK4 συνδέεται µε την πρωτεΐνη MyD88 σχηµατίζοντας το σύµπλοκο TLR-MyD88-IRAK4. Με αυτόν τον τρόπο διευκολύνεται η επιστράτευση και φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης IRAK1. Στη συνέχεια, η ενεργοποιηµένη πλέον IRAK1 είναι ικανή ν αυτοφωσφορυλιώνει κατάλοιπα του Ν-τελικού άκρου της επάγοντας την πρόσδεση στο σύµπλοκο της πρωτεΐνης TRAF6 (tumor necrosis 14

16 factor receptor-associated factor 6). Έπειτα, το πρωτεϊνικό σύµπλοκο IRAK1-TRAF6 αποσυνδέεται από τον υποδοχέα και αλληλεπιδρά µ ένα προσχηµατισµένο σύµπλοκο που αποτελείται από τις πρωτεΐνες TAK 1(transforming growth factor (TGF)-β-activated kinase 1), TAB1, TAB2 και TAB3 επάγοντας έτσι τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών TAB2/TAB3 και TAK1. Επακόλουθο της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης TAK1 είναι η ενεργοποίηση της IκB κινάσης IKKβ (IκB kinase), η οποία µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη IκB. Η φωσφορυλίωση αυτή οδηγεί σε αποδόµηση της πρωτεΐνης I-kB και απελευθέρωση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Ένας παράλληλος κλάδος του µονοπατιού περιλαµβάνει φωσφορυλίωση των MKK3 και MKK6 από την TAK1. Αυτές ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες JNK (c-jun N-terminal kinase) και p38 µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του µεταγραφικού παραγοντα AP- 1 (Εικόνες 4, 6) (20). Εικόνα 4: MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι (9) Εναλλακτικό MYD88-εξαρτώµενο µονοπάτι Το MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι µπορεί να ενεργοποιήσει επίσης και ορισµένα µέλη της οικογένειας των µεταγραφικών παραγόντων IRF. Στα πλασµοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα (plasmacytoid DCs) οι υποδοχείς TLR7, TLR8 και TLR9 ενεργοποιούν το µεταγραφικό παράγοντα IRF7. Συγκεκριµένα, οι πρωτεΐνες MyD88, 15

17 IRAK1, TRAF6 και IRF7 σχηµατίζουν ένα σηµατοδοτικό σύµπλοκο, ενεργοποιώντας το µεταγραφικό παράγοντα IRF7. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη µετατόπιση του παράγοντα στον πυρήνα και την πρόσδεση του σε µοτίβα ISRE (IFN-stimulated response element) που οδηγεί σε παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι. Επιπλέον, ο µεταγραφικός παράγοντας IRF5 αλληλεπιδρά άµεσα µε την πρωτεΐνη MyD88. Η επακόλουθη µετατόπισή του στον πυρήνα και πρόσδεση του σε µοτίβα ISRE οδηγεί στην παραγωγή φλεγµονωδών κυτταροκινών (Εικόνα 6) (21) TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι Στο TRIF-εξαρτώµενο, ή MyD88-ανεξάρτητο, µονοπάτι εµπλέκεται η πρωτεΐνη προσαρµογέας TRIF. Η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά µε τους υποδοχείς TLR3 και TLR4 είτε άµεσα είτε µέσω της πρωτεΐνης TRAM, η οποία δρα γεφυρώνοντας την πρόσδεση της πρωτεΐνης TRIF στον υποδοχέα TLR4 (16). Η πρωτεΐνη TRIF διαθέτει δυο περιοχές υπεύθυνες για την ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Στο Ν-τελικό άκρο της υπάρχει ένα µοτίβο για πρόσδεση της πρωτεΐνης TRAF6. Η δηµιουργία του συµπλόκου οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης TAK1 και τελικά στην ενεργοποίηση του NF-κB µέσω µιας οδού παραπλήσιας µε το MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι. Αντίθετα, στο C-τελικό άκρο της διαθέτει ένα µοτίβο υπεύθυνο για πρόσδεση της κινάσης RIP1 (receptorinteracting protein-1), η οποία συµβάλει επίσης στην ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη TRIF αλληλεπιδρά µε τις κινάσες TANK1 (TRAF family member-associated NF-kB activator 1), TBK1 (TANK-binding kinase 1) και IKKε (inducible IκB kinase), οι οποίες προκαλούν φωσφορυλίωση του µεταγραφικού παράγοντα IRF3. Ο φωσφορυλιωµένος και ενεργοποιηµένος πλέον µεταγραφικός παράγοντας οµοδιµερίζεται και µετατοπίζεται στον πυρήνα όπου προσδένεται σε στοιχεία ISRE, επάγοντας την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι (Εικόνες 5, 6) (21). 16

18 Εικόνα 5: TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι (9). 17

19 Εικόνα 6: Τρία κοινά µονοπάτια που εµπλέκονται στη σηµατοδότηση µέσω των υποδοχέων TLR. Α. Το MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι που χρησιµοποιείται από όλους τους υποδοχείς TRL εκτός από τον TLR3 οδηγεί σ ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων NF-KB, IRF 5 και της πρωτεΐνης AP-1 µε αποτέλεσµα την παραγωγή φλεγµονωδών κυτταροκινών. Β. Το TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι που χρησιµοποιείται µόνο από τους υποδοχείς TLR3 και TLR4 οδηγεί σ ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα IRF3 και τελικά στην παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη RIP1 ενεργοποιεί την TRAF6 οδηγώντας στο MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι. Έτσι, παράγονται φλεγµονώδεις κυτταροκίνες. Γ. Το εναλλακτικό MyD88-εξαρτώµενο µονοπάτι υπάρχει µόνο στα πλασµοκυττοειδή δενδριτικά κύτταρα και µεσολαβείται από τον µεταγραφικό παράγοντα IRF7 επάγοντας την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι (22). 18

20 1.3.9 Προϊόντα του µονοπατιού TLR Όπως προαναφέρθηκε, η ενεργοποίηση των υποδοχέων TLR επάγει την έκκριση µιας µεγάλης ποικιλίας κυτταροκινών (π.χ. φλεγµονώδεις κυτταροκίνες, χηµειοκίνες, ιντερφερόνες τύπου Ι) καθώς και συνδιεγερτικών µορίων. Μέσω αυτών των χηµικών µεσολαβητών, που απελευθερώνονται από τα ενεργοποιηµένα κύτταρα και επηρεάζουν τη συµπεριφορά άλλων κυττάρων, διεκπεραιώνεται η φυσική ανοσία και ρυθµίζεται η προσαρµοστική ανοσία (23). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι κυτταροκίνες της φυσικής ανοσίας ασκούν άµεση επαγωγική δράση στους δραστικούς µηχανισµούς της προσαρµοστικής ανοσίας, σε διάφορα επίπεδα. Για παράδειγµα, οι ιντερφερόνες τύπου Ι, ενεργοποιούν τα µόρια MHC τάξης Ι και, κατ αυτόν τον τρόπο, αυξάνουν την ικανότητα παρουσίασης των ιικών πεπτιδίων στα κυτταροτοξικά Τ λεµφοκύτταρα. Η IL-1, ο TNF α και οι χηµειοκίνες προκαλούν µετακίνηση των ειδικών για το αντιγόνο T λεµφοκυττάρων, καθώς και άλλων ανοσοδραστικών κυττάρων, προς το σηµείο της ιστικής βλάβης, είτε επάγοντας την έκφραση µορίων προσκόλλησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα είτε διεγείροντας τη χηµειοταξία. Τέλος, η IL-6 προάγει τη διαφοροποίηση των Β λεµφοκυττάρων προς πλασµατοκύτταρα Έκφραση και λειτουργία των υποδοχέων TLR στα Β λεµφοκύτταρα Στον άνθρωπο, η έκφραση των TLR διαφέρει στα διαδοχικά στάδια ωρίµανσης των Β λεµφοκυττάρων. Τα Β λεµφοκύτταρα µνήµης εκφράζουν τους TLR1, TLR2, TLR6, TLR7, TLR9 και TLR10, ενώ η έκφρασή τους είναι πολύ χαµηλή (ακόµα και µηδενική) σε ανώριµα Β λεµφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση του Β κυτταρικού υποδοχέα στα ανώριµα Β λεµφοκύτταρα έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της έκφρασης των TLR, ιδίως των TLR9 και TLR10 (24). Συνεπώς, οι TLR µπορεί να ενεργοποιηθούν άµεσα στα Β λεµφοκύτταρα µνήµης αλλά όχι στ ανώριµα Β λεµφοκύτταρα. Φαίνεται λοιπόν ότι δρουν καθοδικά του Β κυτταρικού υποδοχέα και διαδραµατίζουν διαφορετικούς ρόλους στην πρωτογενή απάντηση και την άνοση µνήµη. Η διαφορετική έκφραση ρυθµίζεται από τo επίπεδο ενεργοποίησης του Β κυτταρικού υποδοχέα (25). Η ενεργοποίηση των Β λεµφοκυττάρων από τους TLR µπορεί να γίνει άµεσα, µέσω των υποδοχέων που εκφράζουν, ή έµµεσα, µέσω κυτταροκινών που απελευθερώνονται από τα δενδριτικά κύτταρα. Πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των TLR αποτελεί το τρίτο σήµα για την ενεργοποίηση των ανώριµων 19

21 Β λεµφοκυττάρων, σε συνδυασµό µε την ειδική πρόσδεση του αντιγόνου στον υποδοχέα και την αλληλεπίδραση µε τα βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα. Το τρίτο σήµα φαίνεται ότι αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση τόσο για την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασµό των Β λεµφοκυττάρων όσο και για την παραγωγή αντισωµάτων. Η παρατήρηση αυτή, σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι η ενεργοποίηση των ανώριµων Τ λεµφοκυττάρων και η διαφοροποίησή τους προϋποθέτει την αλληλεπίδρασή τους µε κυτταροκίνες που παράγονται από δενδριτικά κύτταρα διεγερµένα από υποδοχείς έµφυτης ανοσίας, ενισχύει την άποψη ότι οι υποδοχείς της έµφυτης ανοσίας ελέγχουν την επίκτητη ανοσία (26-27). 1.4 Υποδοχείς τύπου NOD (Nod-like Receptors, NLRs) Στα θηλαστικά, η οικογένεια των υποδοχέων NLR (Εικόνα 7) περιλαµβάνει περισσότερα από 20 µέλη. Φαίνεται ότι οι υποδοχείς είναι εξελικτικά διατηρηµένοι αφού µια µεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών µε παρόµοια δοµική οργάνωση υπάρχει και στα φυτά. Η οικογένεια αυτή καλείται NBS-LRR (Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeats) και εµπλέκεται στην άµυνα εναντίον των παθογόνων στα φυτά. Έχουν βρεθεί οµόλογες πρωτεΐνες των NLR στα ανώτερα θηλαστικά, αλλά φαίνεται ν απουσιάζουν από τα πρωτοχορδωτά και τα ασπόνδυλα ζώα (28). Τα δύο µέλη της οικογένειας NLR που έχουν µελετηθεί εκτενώς είναι οι υποδοχείς NOD1 (Nucleotide Oligomerization Domain 1) και NOD2. Το γονίδιο NOD1 βρίσκεται στο χρωµόσωµα 7p15-p14 και το γονίδιο NOD2 στο χρωµόσωµα 16q12-q Δοµή και έκφραση των υποδοχέων NOD1 και NOD2 To 1999, ανακαλύφθηκε ο υποδοχέας NOD1 µέσω της οµολογίας του µε τον προαποπτωτικό ρυθµιστή Apaf-1 (Apoptotic Protease-Activating Protein) (29-30). Κατ αναλογία προς τον Apaf-1, o NOD1 έχει µια Ν-τελική CARD (Caspase Activation and Recruitment Domain) περιοχή, µια κεντρική περιοχή σύνδεσης µε νουκλεοτίδια (Nucleotide Binding Site-NACHT/NBS), αλλά αντί για τις επαναλήψεις WD (τρυπτοφάνη, ασπαρτικό οξύ) που έχουν βρεθεί στον Apaf-1, ο NOD1 διαθέτει µια περιοχή LRR στο C-τελικό άκρο του. Μετά τον υποδοχέα NOD1, ανακαλύφθηκε o NOD2, ο οποίος έχει υψηλή οµολογία µε τον NOD1, αλλά διαθέτει δύο CARD περιοχές στο Ν-τελικό άκρο (Εικόνα 7) (31). Οι υποδοχείς NOD εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων, αλλά η έκφρασή τους ποικίλει στους διάφορους κυτταρικούς τύπους. Ο υποδοχέας NOD1 εκφράζεται 20

22 σε όλους τους ιστούς, ενώ η έκφραση του NOD2 περιορίζεται σε µονοκύτταρα, µακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα (32). Εικόνα 7: NLRs και οµόλογες πρωτεΐνες. Οι NLRs χαρακτηρίζονται από τρεις διακριτές περιοχές: µια Ν-τελική περιοχή-τελεστή (effector), που µπορεί να είναι περιοχή PYRIN (PYD), CARD ή BIR, µια κεντρική περιοχή NACHT(NBS) και µια C-τελική περιοχή LRR, η οποία πιστεύεται ότι ανιχνεύει ένα ιδιαίτερο τµήµα του µικροοργανισµού. Οι περιοχές NACHT και NAD (NACHT-associated domain) είναι οµόλογες µε περιοχές προαποπτωτικών ρυθµιστικών πρωτεϊνών, όπως ο Apaf-1 στα θηλαστικά και ο CED-4 στο C. elegans, και µε γονίδια των φυτών που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες R οι οποίες προσδίδουν ανθεκτικότητα σε ασθένειες (28) Προσδέτες των υποδοχέων NOD1 και NOD2 Οι υποδοχείς NOD αναγνωρίζουν την πεπτιδογλυκάνη (Peptidoglycan-PGN), ένα ανοσοδιεγερτικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώµατος των βακτηρίων. Το µόριο αυτό είναι πολυµερές ενός δισακχαρίτη (N-ακετυλογλυκοζαµίνης/ β(1-4) N- ακετυλοµουραµικού οξέος) συνδεδεµένου σε ένα στέλεχος 3-5 πεπτιδίων. Η φύση της τρίτης πεπτιδικής υποµονάδας του στελέχους είναι σηµαντικό διακριτικό χαρακτηριστικό της βακτηριακής πετπιδογλυκάνης. Ενώ τα περισσότερα Gramβακτήρια στην τρίτη θέση του στελέχους της πετπιδογλυκάνης έχουν µεσοδιαµινοπιµελικό οξύ (meso-diaminopimelic acid-dap) (Εικόνα 8α), τα περισσότερα 21

23 Gram+ βακτήρια στην αντίστοιχη θέση του µορίου φέρουν λυσίνη (lysine-lys) (33). Στην πραγµατικότητα, τόσο ο NOD1 όσο και ο NOD2 υποδοχέας ανιχνεύουν τα µονοµερή µουροπεπτιδίων που απελευθερώνονται από τη βακτηριακή πεπτιδογλυκάνη µετά τη δράση πεπτιδασών και υδρολασών. Ο NOD2 ανιχνεύει τόσο των Gram- βακτηριών όσο και των Gram+ βακτηρίων αφού το µουραµυλoδιπεπτίδιο (muramyl dipeptide-mdp), δηλαδή το ελάχιστο κοινό µοτίβο σε όλα τα είδη πεπτιδογλυκάνης, έχει δειχθεί ότι αναγνωρίζεται στερεοειδικά από το NOD2 (Εικόνα 8β) (34-35). O NOD2 ανιχνεύει επίσης τη µουραµυλo-τρι-λυσίνη (Mur-triLys) που βρίσκεται στην πεπτιδογλυκάνη των περισσοτέρων Gram+ βακτηρίων, αλλά όχι το µουραµυλ-τρι-διαµινοπυµελικό οξύ (Mur-triDap) που βρίσκεται στην πεπτιδογλυκάνη των περισσοτέρων Gram- βακτηρίων (36). Αντίθετα, ο NOD1 διαθέτει περιορισµένη ειδικότητα και αναγνωρίζει µόνο την πεπτιδογλυκάνη που περιέχει διαµινοπυµελικό οξύ. Ανιχνεύει αποτελεσµατικά το µουροπεπτίδιο GM-L- Ala-D-Glu-mesoDAP (37), αλλά το ελάχιστο µοτίβο που έχει βρεθεί να ενεργοποιεί τον υποδοχέα NOD1 του ανθρώπου είναι το διπεπτίδιο D-Glu-mesoDAP (38). Εικόνα 8: Οι δοµές της πεπτιδογλυκάνης που αναγνωρίζονται από τους NOD1 και NOD2. α) O NOD1 αναγνωρίζει τη δοµή της πετπιδογλυκάνης που φέρει mesodap στην τρίτη θέση του πεπτιδικού στελέχους (Gram- βακτήρια) και β) ο NOD2 ανιχνεύει το MDP, ένα συστατικό της βακτηριακής πεπτιδογλυκάνης κοινό και στα Gram+ και τα Gram- βακτήρια (33). Oι υποδοχείς NOD διαδραµατίζουν κεντρικό ρόλο στην άµυνα του ξενιστή µετά από διέγερση µε διαφορετικά βακτηριακά παθογόνα. Εµπλέκονται στην άµυνα εναντίον 22

24 ενδοκυττάριων, κυρίως, παθογόνων βακτηρίων και βακτηριακών συστατικών (Πίνακας 2) (39-45). Πίνακας 2: Βακτήρια και βακτηριακά συστατικά που αναγνωρίζουν οι υποδοχείς NOD. NOD1 NOD2 Shigella flexneri Listeria monocytogenes Helicobacter pylori S. pneumoniae Escherichia coli Ζωντανά βακτήρια Salmonella typhimurium Pseudomonas sp. Shigella flexneri Chlamydia sp. Listeria monocytogenes Bacillus sp. σπόρια B. anathracis Bacillus sp. Lactobacillus sp. σπόρια B. anathracis Corynebacterium xerosis Βακτηριακά συστατικά Listeria pneumophila Escherichia coli Salmonella typhimurium Pseudomonas sp. Mycobacterium tuberculosis Listeria pneumophila Mycobacterium tuberculosis Σηµατοδοτικό µονοπάτι Η ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών υποδοχέων NOD1 και NOD2 από τα τµήµατα της πεπτιδογλυκάνης των βακτηρίων πυροδοτεί µια σειρά κυτταρικών αποκρίσεων που έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ (Nuclear factor κβ) και των MAPK κινασών (Mitogen Activated Protein Kinases). Α) Ενεργοποίηση NF-κΒ Η ανίχνευση των συνδετών των υποδοχέων NOD προκαλεί τον οµο-ολιγοµερισµό τους µέσω των περιοχών NACHT και επιτρέπει την επιστράτευση της πρωτεΐνης RIP2 (Receptor Interacting Protein 2) (46). Η αλληλεπίδραση γίνεται µέσω των CARD περιοχών που υπάρχουν στις δύο πρωτεΐνες. Το σύµπλοκο NOD1-RIP2 (ή NOD2-RIP2) ενεργοποιεί τις κινάσες (IκB Kinases-ΙΚΚs) του αναστολέα ΙκB (Inhibitor of NF-κΒ). Έτσι προάγεται η αποδόµηση του ΙκΒ µέσω φωσφορυλίωσης και ουµπικουϊτυνυλίωσης µε αποτέλεσµα την απελευθέρωση του NF-κΒ, τη µετατόπισή του στον πυρήνα και την πρόσδεσή του σε ενισχυτές και υποκινητές των γονιδίων- 23

25 στόχων (Εικόνα 9). Τελικό αποτέλεσµα είναι η παραγωγή προφλεγµονωδών και αντιφλεγµονωδών κυτταροκινών (47). Υπάρχουν πολλά µόρια που εµπλέκονται στην ενεργοποίηση του NF-κB µέσω των υποδοχέων NOD. Το ενδιαφέρον είναι ότι τα µόρια αυτά εµφανίζουν ειδικότητα ως προς τους δύο υποδοχείς. Η TRIP6 (Thyroid Receptor Interacting Protein 6) µπορεί να ενισχύσει την ενεργοποίηση του NOD1, κυρίως µέσω αλληλεπίδρασης µε τη RIP2 (48). H GRIM19 (Gene associated with Retinoid-Interferon-Induced Mortality) απαιτείται για την ενεργοποίηση του NF-κB ύστερα από την αναγνώριση του MDP από τον υποδοχέα NOD2 (49). Επίσης, η κινάση TAK1 (TGF-β-Activated Kinase1) ρυθµίζει αρνητικά την ενεργοποίηση του NF-κΒ, µέσω άµεσης αλληλεπίδρασης µε τον υποδοχέα NOD2 (50). Άλλη µια πρωτεΐνη µε παρόµοια λειτουργία είναι η ERBIN (ErbB2 Interacting Protein) (51). Εικόνα 9: Μοντέλο ενεργοποίησης και ρύθµισης του υποδοχέα NOD2 από τµήµατα πεπτιδογλυκάνης. Μετά την αλληλεπίδραση της RIP2 µε το NOD2 ακολουθεί η ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ και AP-1 µέσω των κινασών IKK και MAPK, αντιστοίχως (47). 24

26 Β) Ενεργοποίηση MAPK κινασών Oι NOD1 και NOD2 αλληλεπιδρώντας µε τη RIP2 ενεργοποιούν επίσης και το µονοπάτι των MAPK κινασών. Φαίνεται ότι ενεργοποιούν όλα τα µέλη της σχετικής οικογένειας κινασών (p38 MAPK, JNK (c-jun Nterminal Kinase)), ERK1 και ERK2 (Extracellular Signalregulated Kinases 1 και 2). Τελικό αποτέλεσµα είναι ο σχηµατισµός του συµπλόκου AP-1, η µετατόπισή του στον πυρήνα και η επαγωγή της έκφρασης προφλεγµονωδών και αντιφλεγµονωδών κυτταροκινών (Εικόνα 9) (52-53). Εικόνα 10: Μονοπάτια µετάδοσης σήµατος των υποδοχέων NOD. Oι NOD1 και NOD2 µόλις ανιχνεύσουν τους αντίστοιχους συνδέτες (DAP και MDP) επιστρατεύουν τη RIP2. Στη συνέχεια, η RIP2 ενεργοποιεί το σύµπλοκο των κινασών IKK και στη συνέχεια τον NF-κΒ, προάγοντας τη φλεγµονώδη απόκριση. Μετά την αναγνώριση διαφόρων διεγερτικών µορίων, η NALP 3 σχηµατίζει το σωµατίδιο φλεγµονής (inflammasome), οδηγώντας στην ενεργοποίηση της κασπάσης 1, που µετατρέπει την προ-ιl-1β σε ώριµη IL-1β για να ξεκινήσει η φλεγµονώδης αντίδραση. Η φύση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της κασπάσης 1, προάγοντας έτσι την επεξεργασία της προ-il-1β ή την απόπτωση του κυττάρου (58). 25

27 1.4.4 Αλληλεπίδραση των υποδοχέων NOD µε τις κασπάσες Μελέτες υποστηρίζουν ότι οι υποδοχείς NOD1 και NOD2 εµπλέκονται και σε αποπτωτικά µονοπάτια. Πιο συγκεκριµένα, ο NOD1 συνδέεται µε την κασπάση 9, µέσω CARD-CARD αλληλεπιδράσεων, και προωθεί την απόπτωση (30). Ο NOD2 µπορεί επίσης να συµβάλει στην ίδια διαδικασία, αλλά δεν υπάρχουν δεδοµένα που να αποδεικνύουν την άµεση αλληλεπίδρασή του µε την κασπάση 9 (31). Επίσης, στην καρκινική κυτταρική σειρά MCF-7, ο υποδοχέας NOD1 βρέθηκε να προάγει την απόπτωση µέσω της κασπάσης 8 (54). Οι NOD1 και NOD2 υποδοχείς διεγείρουν την έκκριση της IL1-β από τ ανθρώπινα µονοκύτταρα. Η επεξεργασία και η έκκριση της προ-il1-β στηρίζεται στην πέψη της από την κασπάση 1. Αυτή η διαδικασία πραγµατοποιείται σε ένα πρωτεϊνικό σύµπλοκο, το σωµατίδιο φλεγµονής (inflammasome), αποτελούµενο από τις κασπάσες 1 και 5, την πρωτεΐνη προσαρµοστή ASC, που διαθέτει µια περιοχή CARD και µια περιοχή PYRIN, καθώς επίσης και πολλά µέλη πρωτεϊνών της οικογένειας NALP (55). Ο NOD1 ενισχύει την επεξεργασία της προ-il-1β µέσω CARD-CARD αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια NOD1, RIP2 και προ-κασπάση-1 (56). Ο NOD2 ενδεχοµένως εµπλέκεται στην έκκριση της IL-1β, επειδή η έκκριση της IL-1β µειώνεται µετά από διέγερση µε MDP σε µονοκύτταρα ασθενών µε νόσο του Chron, στην οποία ο NOD2 φέρει µετάλλαξη αλλαγής του πλαισίου ανάγνωσης (Εικόνα 10) (57) Αλληλεπίδραση υποδοχέων έµφυτης ανοσίας Οι υποδοχείς NOD συνεργάζονται µε πολλούς TLR για να ενισχύσουν τις άνοσες αποκρίσεις στ αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Για παράδειγµα, στα µονοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα, οι αγωνιστές των υποδοχέων NOD συνεργάζονται µε τους λιποπολυσακχαρίτες (LPS) για να διεγείρουν την παραγωγή προφλεγµονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFa (Tumor Necrosis Factor a) και η IL-6. Μπορούν επίσης να συνεργαστούν µε LPS, σε µικρότερες δόσεις, επάγοντας την ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση των υποδοχέων NOD συµβάλει στην έναρξη της επίκτητης ανοσίας. Στα δενδριτικά κύτταρα, οι υποδοχείς NOD συνεργάζονται µε τους TLR3, TLR4 και TLR9 για την παραγωγή IL-12p70, µε αποτέλεσµα την επαγωγή Th1 αποκρίσεων (59). Ο µοριακός µηχανισµός για τη συνεργασία των υποδοχέων NOD µε του υποδοχείς TLR µε σκοπό την παραγωγή κυτταροκινών δεν είναι γνωστός. Μελέτες έχουν δείξει 26

28 ότι η διέγερση του TLR4 επάγει την έκφραση του υποδοχέα NOD2 και της PIR2. Επίσης, η διέγερση του NOD2 και NOD1 επάγει την έκφραση του MyD88 και της TAK1, αντιστοίχως. Η διέγερση των µακροφάγων µε MDP επάγει την µεταγραφή του TNFa, αλλά το mrna του δεν µεταφράζεται αποτελεσµατικά σε πρωτεΐνη. Η συνδιέγερση των ίδιων κύτταρων µε LPS επιτρέπει τη σύνθεση και έκκριση αυτής της πρωτεΐνης. Στα µονοκύτταρα, ο αγωνιστής του υποδοχέα NOD δρα µαζί µε τους αγωνιστές των TLR2, TLR5 και TLR7, µε αποτέλεσµα τη διέγερσή τους. Eπίσης, το MDP φαίνεται να έχει κοινή δράση µε τους αγωνιστές των TLR2 και TLR9 στα µονοκύτταρα (Εικόνα 11) (60). Εικόνα 11: Στα κύτταρα της µυελικής σειράς, οι υποδοχείς NOD συνεργάζονται µε τους TLR µε αποτέλεσµα τη φλεγµονώδη απόκριση. Ο µηχανισµός δεν είναι γνωστός, αλλά η παραγωγή των κυτταροκινών επιτρέπει την επαγωγή της προσαρµοστικής ανοσίας (60). 1.5 Προσαρµοστική ανοσία Η ειδική ή προσαρµοστική άνοση απάντηση παρέχεται από τις λειτουργίες των λεµφοκυττάρων, που διακρίνονται σε Β και Τ λεµφοκύτταρα. Τα λεµφοκύτταρα αναγνωρίζουν και προσδένουν αντιγόνα µέσω υποδοχέων υψηλής ειδικότητας. Η σύνδεση αντιγόνου υποδοχέα σηµατοδοτεί την ενεργοποίηση και τον 27

29 πολλαπλασιασµό των λεµφοκυττάρων. Επιπλέον, η ειδική άνοση απάντηση γίνεται πιο αποτελεσµατική σε κάθε επόµενη επαφή µε το ίδιο παθογόνο. Εποµένως, χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση και µνήµη και διακρίνεται σε δύο ξεχωριστές κατηγορίες, την κυτταρική και τη χυµική ανοσία. Η κυτταρική ανοσία µεσολαβείται από τους διάφορους τύπους των Τ λεµφοκυττάρων και περιλαµβάνει την αλληλεπίδραση τους µε το µικροοργανισµό, µε αποτέλεσµα την καταστροφή του, ή µε άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Τα Β λεµφοκύτταρα εµπλέκονται στις αντιδράσεις της χυµικής ανοσίας. Όταν το Β λεµφοκύτταρο αναγνωρίσει το ειδικό αντιγόνο σ ένα περιφερικό λεµφικό όργανο, σταµατά να µεταναστεύει, πολλαπλασιάζεται και διαφοροποιείται σε πλασµατοκύτταρο ικανό να παράγει και να εκκρίνει ανοσοσφαιρίνες. Οι αρχές που διέπουν την ειδική ανοσία είναι η ποικιλότητα, η αυστηρή ειδικότητα, η άνοση µνήµη και η αυτοανοχή (self-tolerance). Καθηµερινά, στον ανθρώπινο οργανισµό παράγονται 10 7 νέα Β λεµφοκύτταρα, που παράγουν έναν µόνο τύπο υποδοχέα-ανοσοσφαιρίνης µε µια και µοναδική αντιγονική ειδικότητα. Το συνολικό ρεπερτόριο των αντιγονικών ειδικοτήτων είναι περίπου 10 9, ενώ ο συνολικός αριθµός των Β λεµφοκυττάρων στον ενήλικο άνθρωπο είναι περίπου (61). Οι ανοσοσφαιρίνες αναγνωρίζουν τ αντιγόνα και προσδένονται σε µια ειδική περιοχή τους, τον επίτοπο ή αντιγονικό καθοριστή. Κάθε ανοσοσφαιρίνη αναγνωρίζει και προσδένεται σ έναν µόνον, ειδικό γι αυτήν, επίτοπο. Η τεράστια δοµική ετερογένεια των ανοσοσφαιρινών είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των πολυάριθµων επιτόπων που υπάρχουν στη φύση. Για την παραγωγή επαρκούς αριθµού ειδικών δραστικών λεµφοκυττάρων, εποµένως και αντισωµάτων, πρέπει να προηγηθεί πολλαπλασιασµός του ενεργοποιηµένου λεµφοκυττάρου (κλωνική επαύξηση, clonal expansion). Τα διαφοροποιηµένα δραστικά κύτταρα που προέρχονται από ένα ενεργοποιηµένο Β λεµφοκύτταρο παράγουν υποδοχείς πανοµοιότυπης ειδικότητας µε αυτήν του κυττάρου από το οποίο προήλθαν. Τα κύτταρα που συµµετέχουν στην ειδική ανοσία δε µπορούν ν ανταποκριθούν άµεσα στην παρουσία των αντιγόνων. Η ειδική άνοση απάντηση εκδηλώνεται περίπου τέσσερις µέρες µετά την επαφή του οργανισµού µε το αντιγόνο. Η καθυστέρηση που παρατηρείται χαρακτηρίζει µόνο την πρωτογενή ανοσοποίηση. Ένας πληθυσµός αντιγονο-ειδικών κυττάρων παραµένει και µετά την αποµάκρυνση του αντιγόνου, αποτελώντας τη βάση της άνοσης µνήµης. Εποµένως, κάθε επόµενη επαφή µε το ίδιο αντιγόνο (δευτερογενής ανοσοποίηση) εµφανίζει µικρότερη περίοδο αναµονής και υψηλότερο και πιο παρατεταµένο επίπεδο µέγιστης απάντησης. 28

30 Η ειδική ανοσία προϋποθέτει επίσης ότι τα λεµφοκύτταρα αναγνωρίζουν µόνο αντιγονικούς επιτόπους παθογόνων και όχι συστατικά του ίδιου του οργανισµού (διάκριση µεταξύ «ξένου»/«εαυτού», «self»/«non-self»). Έτσι, τα λεµφοκύτταρα που έχουν υποδοχείς ειδικούς γι αυτόλογα µόρια εξαλείφονται σ ένα πρώιµο στάδιο ανάπτυξης και συνεπώς απουσιάζουν από το ρεπερτόριο των ώριµων λεµφοκυττάρων. 1.6 Υποδοχείς προσαρµοστικής ανοσίας Δοµή ανοσοσφαιρινών Οι ανοσοσφαιρίνες χαρακτηρίζονται από µια βασική δοµή που αποτελείται από δύο βαριές αλυσίδες (Η), µοριακού βάρους (Μ.Β.) kda, και δύο ελαφριές αλυσίδες (L) M.B. 25 kda (62). Κάθε βαριά αλυσίδα συνδέεται µε µια ελαφριά αλυσίδα µ έναν δισουλφυδριλικό δεσµο και οι δύο βαριές αλυσίδες συνδέονται µεταξύ τους επίσης µε δισουλφυδριλικούς δεσµούς (63). Σε κάθε µόριο ανοσοσφαιρίνης, οι δύο βαριές και οι δύο ελαφριές αλυσίδες είναι ταυτόσηµες, µε αποτέλεσµα το µόριο να έχει δίπτυχο άξονα συµµετρίας (Εικόνα 12). Εικόνα 12: Δοµή του µορίου της ανοσοσφαιρίνης. 29

31 Υπάρχουν µόνο δύο τύποι ελαφριάς αλυσίδας, οι οποίοι ορίζονται ως αλυσίδες κάππα (κ) και λάµβδα (λ). Δεν έχει ανακαλυφθεί καµία διαφορά στη λειτουργία µεταξύ των αντισωµάτων µε κ ή λ ελαφριές αλυσίδες. Η αναλογία των δύο τύπων διαφέρει σε κάθε είδος. Στον άνθρωπο, η αναλογία αλυσίδων κ:λ είναι περίπου 2:1. Υπάρχουν πέντε κύριες τάξεις ή ισότυποι ανοσοσφαιρινών: IgM, IgD, IgG, IgA και IgE (Εικόνα 13). Καθένας από αυτούς τους ισοτύπους έχει µια ιδιαίτερη βαριά αλυσίδα (µ, δ, γ, α και ε, αντιστοίχως) και συγκεκριµένη λειτουργία στις άνοσες απαντήσεις (64). Οι ανοσοσφαιρίνες IgG και IgA του ανθρώπου διακρίνονται σε τέσσερις (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) και δύο (IgA1, IgA2) υποοµάδες, αντιστοίχως, ανάλογα µε τα χαρακτηριστικά των βαριών αλυσίδων τους (γ1, γ2, γ3, γ4/ α1, α2). Με βάση την αµινοξική αλληλουχία τους, οι αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών υποδιαιρούνται σε διακριτές περιοχές που παρουσιάζουν οµοιότητα στην αλληλουχία τους. Οι ελαφριές αλυσίδες έχουν δύο περιοχές, ενώ σε κάθε βαριά αλυσίδα σχηµατίζονται τέσσερις ή πέντε περιοχές, ανάλογα µε τον ισότυπο (65). Οι οµοιότητες που παρατηρούνται υποδηλώνουν ότι οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών έχουν εξελιχθεί µέσω επαναλαµβανόµενων αντιγραφών ενός προγονικού γονιδίου (66). Εικόνα 13: Ισότυποι βαριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών (ΙgA, IgE, IgD, IgM, IgG). 30

32 Οι ανοσοσφαιρίνες έχουν διττή λειτουργία. Συνδέονται ειδικά µε το αντιγόνο και επιστρατεύουν άλλα µόρια και κύτταρα µε σκοπό την καταστροφή του παθογόνου µετά την πρόσδεσή του σε αυτό. Οι δύο αυτές λειτουργίες επιτελούνται από διαφορετικές περιοχές του αντισώµατος: ένα τµήµα αναγνωρίζει ειδικά το αντιγόνο, ενώ το υπόλοιπο εξασφαλίζει τους δραστικούς µηχανισµούς που θα το εξουδετερώσουν. Η περιοχή του αντισώµατος που συνδέεται µε το αντιγόνο ποικίλει µεταξύ των αντισωµάτων και για το λόγο αυτό είναι γνωστή ως µεταβλητή περιοχή (variable region) ή περιοχή V. Η µεταβλητότητα επιτρέπει σε κάθε αντίσωµα ν αναγνωρίζει µε υψηλή ειδικότητα ένα συγκεκριµένο αντιγόνο. Αντίθετα, η περιοχή που ευθύνεται για την ενεργοποίηση των µηχανισµών ανοσίας δεν εµφανίζει την ίδια ποικιλοµορφία και ονοµάζεται σταθερή περιοχή (constant region) ή περιοχή C. Η Ν- τελική περιοχή των ελαφριών και βαριών αλυσίδων είναι η µεταβλητή περιοχή (V). Οι C-τελικές περιοχές είναι σταθερές µεταξύ τόσο των βαριών όσο και των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών του ίδιου τύπου (περιοχές C). Από τη σύγκριση της αλληλουχίας των µεταβλητών περιοχών πολλών διαφορετικών ανοσοσφαιρινών αναγνωρίστηκαν τρεις περιοχές ιδιαίτερης µεταβλητότητας που ορίζονται αδρά από τα αµινοξέα 28-38, και Οι περιοχές αυτές ορίζονται ως υπερµεταβλητές (hypervariable regions) και συµβολίζονται ως HV1, HV2 και HV3. Το πιο µεταβλητό µέρος της περιοχής V βρίσκεται στην περιοχή HV3. Τα τµήµατα µεταξύ των υπερµεταβλητών περιοχών, που είναι λιγότερο µεταβλητά, ορίζονται ως περιοχές πλαισίου (framework regions, FRs) και συµβολίζονται ως FR1, FR2, FR3 και FR4. Οι περιοχές πλαισίου σχηµατίζουν το δοµικό πλαίσιο της περιοχής µε τις υπερµεταβλητές αλληλουχίες. Οι υπερµεταβλητές περιοχές αντιστοιχούν σε τρεις θηλιές (loops) που βρίσκονται κοντά όταν η πρωτεΐνη είναι διπλωµένη και σχηµατίζουν το σηµείο πρόσδεσης του αντιγόνου (Εικόνα 14). 31

33 Εικόνα 14: Οι υπερµεταβλητές περιοχές αντιστοιχούν σε τρεις θηλιές (loops), στο άκρο κάθε β-φύλλου, που βρίσκονται κοντά όταν η πρωτεΐνη είναι διπλωµένη και σχηµατίζουν το σηµείο πρόσδεσης του αντιγόνου. Κατ αυτόν τον τρόπο οι υπερµεταβλητές περιοχές καθορίζουν την εξειδίκευση του αντισώµατος και γι αυτό το λόγο ονοµάζονται περιοχές καθορισµού της συµπληρωµατικότητας (complementarity determining regions, CDRs: CDR1, CDR2 και CDR3) Γενετικοί τόποι ανοσοσφαιρινών Οι γενετικοί τόποι των ανοσοσφαιρινών περιλαµβάνουν οµάδες γονιδίων. Στις βαριές αλυσίδες υπάρχουν τέσσερις οµάδες γονιδίων, οι V, D, J και C, ενώ στις ελαφριές αλυσίδες τρεις, οι V, J και C. Για τη διαµόρφωση των αλληλουχιών που κωδικοποιούν για αµινοξέα της µεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών, επιλέγεται τυχαία ένα γονίδιο από την κάθε οµάδα. Εκτός από τις οµάδες γονιδίων, οι γενετικοί τόποι των ανοσοσφαιρινών περιλαµβάνουν και πλήθος ρυθµιστικών γονιδίων που καθορίζουν τη µεταγραφή ή την αποσιώπηση, όπως οι αλληλουχίεςοδηγοί (leader sequences, L) πριν από κάθε γονίδιο V (Εικόνα 15) (62). 32

34 Εικόνα 15: Η διάταξη των γονιδίων στους γενετικούς τόπους IGH, IGK, IGL Μηχανισµοί δηµιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών Το πλέον εντυπωσιακό χαρακτηριστικό του ανοσοποιητικού συστήµατος των σπονδυλωτών είναι η ικανότητα αναγνώρισης εκατοµµυρίων διαφορετικών παθογόνων µέσω υψηλής ειδικότητας αντιγονικών υποδοχέων των Β λεµφοκυττάρων (B cell receptors, BCRs) καθώς και των αντίστοιχων υποδοχέων στα T λεµφοκύτταρα (T cell receptors, TCRs). Πιστεύεται ότι ο άνθρωπος έχει την ικανότητα αναγνώρισης διαφορετικών επιτόπων, δηλαδή διαθέτει αντίστοιχο αριθµό διακριτών κλώνων Β-κυττάρων, καθένα µ έναν αντιγονικό υποδοχέα µοναδικής ειδικότητας. Για τη δηµιουργία αυτής της τεράστιας ποικιλότητας υπεύθυνοι είναι τέσσερις ειδικοί µηχανισµοί: - Συνδυαστική ποικιλότητα: Αναφέρεται στη σύνδεση των βαριών αλυσιδών µε τις ελαφριές για το σχηµατισµό του µορίου της ανοσοσφαιρίνης. - Ανασυνδυασµός V(D)J. - Συνδετική ποικιλότητα: Αναφέρεται στη δηµιουργία ποικιλοµoρφίας στα σηµεία ένωσης των ανασυνδυασµένων γονιδίων. - Σωµατική υπερµεταλλαξιγένεση: Αναφέρεται στην εισαγωγή µεταλλάξεων στη µεταβλητή περιοχή, υπό την επίδραση του αντιγόνου (67). 1.7 Διαφοροποίηση των Β λεµφοκυττάρων Τα Β λεµφοκύτταρα αναπτύσσονται από αρχέγονα αιµοποιητικά πολυδύναµα κύτταρα. Κατά την εµβρυική ζωή αυτή η διεργασία διαδραµατίζεται στα αιµονησίδια, 33

35 στον πλακούντα και στο ήπαρ, ενώ µετά τη γέννηση συνεχίζεται στο µυελό των οστών (68). Η ανάπτυξη των Β λεµφοκυττάρων παραδοσιακά διακρίνεται σε δύο φάσεις: Ανεξάρτητη από το αντιγόνο που συµβαίνει στο µυελό των οστών Εξαρτώµενη από το αντιγόνο που διαδραµατίζεται στα δευτερογενή λεµφικά όργανα (Εικόνα 16) (69). Εικόνα 16: Ωρίµανση Β λεµφοκυττάρων. Ο ανασυνδυασµός της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας πραγµατοποιείται στο µυελό των οστών (αριστερά). Τα παρθένα Β κύτταρα αποµακρύνονται από το µυελό των οστών και διέρχονται από τα δευτερογενή λεµφικά όργανα, έως ότου έρθουν σε επαφή µε κάποιο αντιγόνο (κέντρο). Η επαφή αυτή οδηγεί σε παραγωγή πλασµατοκυττάρων και κυττάρων µνήµης (δεξιά) Φάση διαφοροποίησης ανεξάρτητη από το αντιγόνο Η φάση αυτή διαρκεί περίπου πέντε ηµέρες µε τελικό προϊόν ένα ώριµο, «παρθένο» Β λεµφοκύτταρο (naive, virgin B cell). Το Β λεµφοκύτταρο εκφράζει στην επιφάνειά του µια µοναδική ανοσοσφαιρίνη IgM. H ανάπτυξη των Β λεµφοκυττάρων εξελίσσεται σε ποικίλα στάδια, καθένα από τα οποία καθορίζεται από τις αναδιατάξεις των γονίδιων των ανοσοσφαιρινών (Εικόνα 16) και την έκφραση ανοσοσφαιρινών, 34

36 προσδετικών µορίων και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των αναπτυσσόµενων Β λεµφοκυττάρων (70). Επειδή ο ανασυνδυασµός των γονιδίων γίνεται τυχαία, η επιφανειακή IgM µπορεί ν αναγνωρίζει αυτοαντιγόνα (self-antigens). Έτσι, τα Β λεµφοκύτταρα πρέπει να ελέγχονται για το ενδεχόµενο αυτοαντιδραστικότητας (self-reactivity) πριν την έξοδο τους στην περιφέρεια. Η αυτοανοχή (self tolerance) εξασφαλίζεται µε τους παρακάτω µηχανισµούς: 1. Εξάλειψη κλώνων (clonal deletion): τα Β λεµφοκύτταρα που αναγνωρίζουν πολυσθενή αντιγόνα µέσω της επιφανειακής IgM υφίστανται εξάλειψη µε απόπτωση 2. Ανεργία (anergy): τα Β λεµφοκύτταρα που αναγνωρίζουν χαµηλού σθένους αντιγόνα (πχ. διαλυτά) γίνονται ανεργικά, χάνουν την επιφανειακή IgM (διατηρούν, ωστόσο, IgM στο κυτταρόπλασµα), ενώ στην επιφάνεια εκφράζουν υψηλά επίπεδα IgD 3. Διόρθωση υποδοχέα (receptor editing): πολύ συχνά η πρόσδεση της IgM στον αντίστοιχο προσδέτη ενεργοποιεί το αυτοαντιδραστικό ανώριµο Β κύτταρο να εκφράσει τις πρωτεΐνες ανασυνδιασµού RAG1 και RAG2 επιτρέποντας να συµβεί περαιτέρω ανασυνδυασµός. Η διαδικασία αυτή µπορεί να προκαλέσει αντικατάσταση µιας ελαφριάς αλυσίδας από µια νέα ελαφριά αλυσίδα, γεγονός που δηµιουργεί µια νέα αντιγονική ειδικότητα Φάση διαφοροποίησης εξαρτώµενη από το αντιγόνο Μετά την ωρίµανσή τους στο µυελό των οστών, τα παρθένα Β λεµφοκύτταρα εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος. Μέσω των φλεβιδίων µε υψηλό ενδοθήλιο (high endothelium venules, HEVs) εισέρχονται στα δευτερογενή λεµφικά όργανα. Τα δευτερογενή λεµφικά όργανα περιλαµβάνουν το σπλήνα, τους λεµφαδένες, το λεµφικό ιστό που σχετίζεται µε τους βλεννογόνους (αµυγδαλές και πλάκες του Peyer στο έντερο) και το διάχυτο λεµφικό ιστό στο σώµα. Αν τα Β λεµφοκύτταρα δεν έρθουν σε επαφή µε αντιγόνο τότε περνούν και πάλι στην κυκλοφορία του αίµατος µέσω των απαγωγών λεµφαγγείων (Εικόνα 17). 35

37 Εικόνα 17: Τα ώριµα Β λεµφοκύτταρα µεταναστεύουν από το µυελό των οστών µέσω του αίµατος στα δευτερογενή λεµφικά όργανα. Αν όµως συναντήσουν αντιγόνα και ενεργοποιηθούν από τα κατάλληλα βοηθητικά κύτταρα, σταµατούν να µεταναστεύουν και αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται στις περιοχές των Τ λεµφοκυττάρων. Στις περιοχές αυτές επιτρέπονται εκτεταµένες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των Τ λεµφοκυττάρων, των Β λεµφοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων. Επτά έως 10 ηµέρες µετά την ανοσοποίηση, τα δευτερογενή λεµφοζίδια αποκτούν πολικότητα και το µικροοπεριβάλλον που δηµιουργείται ονοµάζεται βλαστικό κέντρο (germinal center) (71). Το βλαστικό κέντρο είναι ένα εξειδικευµένο µικροπεριβάλλον που συµµετέχει στον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των Β λεµφοκυττάρων. Τα Β λεµφοκύτταρα που έχουν διεγερθεί για ταχύ πολλαπλασιασµό ονοµάζονται κεντροβλάστες και δηµιουργούν τη σκοτεινή ζώνη του λεµφοζιδίου που βρίσκεται προς την πλευρά της περιοχής των Τ λεµφοκυττάρων (Εικόνα 18). Οι κεντροβλάστες είναι µεγάλα κύτταρα που διαιρούνται περίπου κάθε έξι ώρες, δεν εκφράζουν επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη και υπόκεινται στη διεργασία της σωµατικής υπερµεταλλαξιγένεσης (somatic hypermutation, ΣΥ) (72-73). Ο όρος σωµατική υπερµεταλλαξιγένεση αναφέρεται στην εισαγωγή µεταλλάξεων στα αναδιατεταγµένα γόνιδια IGV των βαριών και των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, σε συχνότητα πολύ υψηλότερη από το κανονικό. Οι µεταλλάξεις αφορούν κυρίως σε αντικαταστάσεις σε «επίκεντρα» (hotspots) της µεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών (π.χ. µοτίβα τρι- ή τετρα- νουκλεοτιδίων όπως το 36

38 µοτίβο RGYW, R: πουρίνη, Υ: πυριµιδίνη, W: αδενοσίνη ή θυµιδίνη). Η φύση των µεταλλάξεων αποδεικνύει προτίµηση σε µεταθέσεις σε σύγκριση µε τις µεταπτώσεις και σε πουρίνες συγκριτικά µε τις πυριµιδίνες. Επίσης, βρέθηκε ότι ο πιο συχνές µεταλλάξεις αφορούν σε G και C που αντικαθίστανται από A και T, αντιστοίχως. Πιθανολογείται ότι η ΣΥ αρχίζει από µια ειδική, για τα Β λεµφοκύτταρα, νουκλεάση, η οποία δηµιουργεί δίκλωνες εντοµές στο DNA κοντά στα «επίκεντρα». Στη συνέχεια, οι εντοµές επιδιορθώνονται από µια πολυµεράση επιρρεπή σε λάθη, µε αποτέλεσµα την εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων στο DNA. Το αποτέλεσµα της ΣΥ είναι η αύξηση της ποικιλοµορφίας των ανοσοφαιρινών και η δηµιουργία ανοσοσφαιρινών µε υψηλότερη συγγένεια για το αντιγόνο (74-75). Εικόνα 18: Η φωτεινή και η σκοτεινή ζώνη του βλαστικού κέντρου. Όταν οι κεντροβλάστες σταµατήσουν να διαιρούνται επανεκφράζουν την επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη και µεταναστεύουν στον αντίθετο πόλο του βλαστικού κέντρου. Το τµήµα αυτό ονοµάζεται φωτεινή ζώνη και είναι πλούσιο σε δενδριτικά κύτταρα των λεµφοζιδίων (follicular dendritic cells, FDCs) και CD4 Τ λεµφοκύτταρα. Σε αυτή τη φάση, τα Β λεµφοκύτταρα καλούνται κεντροκύτταρα, δεν εκφράζουν το Ki67 και το 37

39 CD77 και είναι προγραµµατισµένα να πεθάνουν, εκτός αν δεχτούν σήµατα επιβίωσης από βοηθητικά κύτταρα (75). 1.8 Σηµατοδοτική λειτουργία των υποδοχέων των Β λεµφοκυττάρων Στην επιφάνεια των Β λεµφοκυττάρων, οι ανοσοσφαιρίνες συναρµολογούνται µε τους συνυποδοχείς Iga (CD79a) και Igβ (CD79β) ώστε να σχηµατίσουν λειτουργικό BCR (76). Στα φυσιολογικά Β λεµφοκύτταρα, η διέγερση του BCR έχει ως αποτέλεσµα τη µεταφορά του σε συγκεκριµένες περιοχές της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης (lipid rafts) και τελικά τη φωσφορυλίωση του ετεροδιµερούς CD79a/CD79b στα µοτίβα ITAM (Immunoreceptor tyrosine based activation motif). H φωσφορυλίωση διεκπεραιώνεται από την πρωτεΐνη Lyn (77). Η Lyn είναι κινάση τυροσίνης, η οποία µεταπίπτει από ενεργό σε ανενεργό µορφή µέσω φωσφορυλίωσης της Tyr 507. Η καταστολή της επιτυγχάνεται µέσω της κινάσης Csk, ενώ η ενεργοποίησή της από τη διαµεµβρανική φωσφατάση CD45. H πρωτεΐνη Syk αναγνωρίζει τα ITAM και φωσφορυλιώνεται σε διάφορα κατάλοιπα τυροσίνης. Με τη σειρά της ενεργοποιεί διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες (π.χ., NF-κB) που εµπλέκονται στις σηµατοδοτικές οδούς των MAP κινασών και της Akt κινάσης. Το σήµα που µεταβιβάζεται µέσω του BCR υποδοχέα ενισχύεται από το σύµπλοκο CD21/CD19/CD81. Ένα Β λεµφοκύτταρο δέχεται σήµατα από τον BCR υποδοχέα σε όλη τη διάρκεια της διαφοροποίησης του. Το αποτέλεσµα αυτής της διέγερσης εξαρτάται από το στάδιο στο οποίο βρίσκεται το Β λεµφοκύτταρο και από την ένταση του σήµατος. Σ ένα ώριµο Β λεµφοκύτταρο µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα επιβίωση/απόπτωση, πολλαπλασιασµό, διαφοροποίηση ή ανοχή. 1.9 Χρόνια Λεµφοκυτταρική Λευχαιµία Γενικά Η χρόνια λεµφοκυτταρική λευχαιµία (ΧΛΛ) είναι κακόηθες νεόπλασµα Β λεµφοκυττάρων. Χαρακτηρίζεται από σταδιακή συσσώρευση µικρών, ώριµων λεµφοκυττάρων στο αίµα, το µυελό των οστών και τους λεµφικούς ιστούς (78-79). Τα νεοπλασµατικά κύτταρα έχουν φαινότυπο Β λεµφοκυττάρου µνήµης. Εµφανίζουν υψηλή έκφραση των δεικτών CD19, CD5, CD23 και µειωµένα επίπεδα των ανοσοσφαιρινών επιφανείας και του συνυποδοχέα CD79b. Η ΧΛΛ αποτελεί το 30% 38

40 του συνόλου των λευχαιµιών και είναι η πιο κοινή µορφή λευχαιµίας στους ενήλικες του Δυτικού ηµισφαιρίου (79). Μολονότι αρχικά επικρατούσε η άποψη ότι η ΧΛΛ είναι οµοιογενής νόσος, τα τελευταία χρόνια φάνηκε ότι εµφανίζει µεγάλη ετερογένεια. Η ετερογένεια αυτή αντανακλάται σε µοριακό, γενετικό και φαινοτυπικό επίπεδο (79). i) Ετερογένεια σε µοριακό επίπεδο Το 1999, δύο οµάδες ανέφεραν συγχρόνως και ανεξάρτητα την ύπαρξη δύο κατηγοριών ΧΛΛ, ανάλογα µε το ποσοστό των σωµατικών µεταλλάξεων (80-81). Οι µεταλλάξεις των γονιδίων IGHV ανιχνεύονται συγκρίνοντας τις αλληλουχίες DNA των αναδιατεταγµένων γονιδίων IGHV µε το αντίστοιχο µη αναδιατεταγµένο γονίδιο. Μια αλληλουχία που έχει οµολογία µικρότερη από 98%, χαρακτηρίζεται ως µεταλλαγµένη. Σύµφωνα µε αυτό το κριτήριο, οι αναδιατάξεις IGHV-D-J ορίζονται ως µεταλλαγµένες (<98%) ή αµετάλλακτες (>98%). Οι ασθενείς της πρώτης κατηγορίας εµφανίζουν πιο ήπια µορφή της νόσου και µεγαλύτερη ολική επιβίωση, ενώ οι ασθενείς της δεύτερης κατηγορίας παρουσιάζουν πιο επιθετική νόσο (81). ii) Ετερογένεια σε ανοσοφαινοτυπικό επίπεδο Η οµάδα ασθενών που εκφράζει µεταλλαγµένα γονίδια IGHV συνήθως παρουσιάζει χαµηλά επίπεδα CD38 και ZAP-70, σε αντίθεση µε τους ασθενείς µε αµετάλλακτα γονίδια που εκφράζουν υψηλά επίπεδα των αντίστοιχων δεικτών, χωρίς όµως να υπάρχει απόλυτη αντιστοιχία (82). iii) Ετερογένεια σε κυτταρογενετικό επίπεδο Η πιο κοινή ανωµαλία είναι η έλλειψη 13q14.3, η οποία εµφανίζεται στο 50% του συνόλου των περιπτώσεων (83). Το τµήµα που εξαλείφεται κωδικοποιεί δύο γονίδια micro-rna, τα mir-15a και mir Η ελαττωµένη έκφραση των δύο mirna έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένα επίπεδα της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης bcl-2 που σχετίζεται µε την αυξηµένη επιβίωση του λευχαιµικού κλώνου (84-85). Οι ελλείψεις 11q22-23, 17p13 και 6q21 είναι σχετικά συχνές στους ασθενείς µε αµετάλλακτα γονίδια IGHV. Παρότι τα γονίδια που κωδικοποιούνται σε αυτές τις περιοχές είναι άγνωστα, φαίνεται ότι ρυθµίζουν την απόπτωση και η εξάλειψή τους ευνοεί την ανάπτυξη του λευχαιµικού κλώνου (86). iv) Eτερογένεια στη σηµατοδότηση µέσω του BCR Τα νεοπλασµατικά κύτταρα της ΧΛΛ διαφορετικών ασθενών ποικίλουν ως προς την ικανότητά τους να µεταβιβάζουν το σήµα µετά από την ενεργοποίηση του Β 39

41 κυτταρικού υποδοχέα. Γενικά, τα κύτταρα αυτά εµφανίζουν ελαττωµένη απάντηση στη διέγερση του BCR (87-89). Οι ασθενείς µε «αµετάλλακτες» αλληλουχίες (90) και/ή έκφραση της πρωτεΐνης ZAP-70 (91) µεταβιβάζουν σήµα µέσω της ανοσοσφαιρίνης επιφάνειας IgM. Φαίνεται ότι η ZAP-70 εµπλέκεται και λειτουργικά σε αυτήν τη διαδικασία αφού µετά την ενεργοποίηση του BCR επιστρατεύεται στο σύµπλοκο του υποδοχέα και επάγει την ενεργοποίηση άλλων µορίων της σηµατοδοτικής οδού. Το γεγονός αυτό προάγει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό των Β κυττάρων και ίσως σχετίζεται µε την επιθετική πορεία της νόσου σε αυτήν την οµάδα ασθενών (Εικόνα 19)(92). Αντίθετα, στις περισσότερες «µεταλλαγµένες» περιπτώσεις ΧΛΛ, in vitro είναι αδύνατη η µεταβίβαση σήµατος µέσω της ανοσοσφαιρίνης IgM. Σε ποσοστό περίπου 50% αυτών των περιπτώσεων η µεταβίβαση σήµατος µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε µέσω της ανοσοσφαιρίνης επιφάνειας IgD είτε µέσω του επικουρικού µορίου Igα (CD79α) (93). Στις «µεταλλαγµένες» περιπτώσεις, στις οποίες είναι δυνατή η µεταβίβαση σήµατος, έχει παρατηρηθεί έκφραση του CD38 (94). Πρόσφατα δεδοµένα έδειξαν ότι ένα ποσοστό ασθενών µε ΧΛΛ παρουσιάζει ιδιοστατική ενεργοποίηση κάποιων µορίων που εµπλέκονται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι καθοδικά του BCR. Συγκεκριµένα, σε περιπτώσεις ΧΛΛ στις οποίες η µεταβίβαση σήµατος µέσω της ανοσοσφαιρίνης επιφάνειας IgM δεν ήταν δυνατή, βρέθηκε συνεχής ενεργοποίηση της ERK και απουσία ενεργοποίησης της κινάσης ΑΚΤ (95). Στα ποντίκια, αυτή η κατάσταση είναι χαρακτηριστική των ανεργικών Β λεµφοκυττάρων και µπορεί να θεωρηθεί ως αποτέλεσµα διαρκούς αλληλεπίδρασης µε αυτοαντιγόνα (96). Όλα τα παραπάνω αποτελούν ισχυρή ένδειξη ότι σε κάποιες περιπτώσεις ΧΛΛ τα λευχαιµικά κύτταρα είναι ανεργικά, ενδεχοµένως εξαιτίας προγενέστερων γεγονότων σηµατοδότησης που κατέστησαν την κυτταρική µεµβράνη ανθεκτική σε περαιτέρω διέγερση. 40

42 Ισχυρή σηµατοδότηση µέσω υποδοχέα Αυξηµένα επίπεδα ΑΚΤ, ERK Ενεργοποίηση NF κβ Ενισχυµένη απάντηση σε σήµατα επιβίωσης Αύξηση και/ή αντίσταση στην απόπτωση Σύνδεση σε αυτοαντιγόνα ή αντιγόνα του περιβάλλοντος Ασθενής σηµατοδότηση µέσω υποδοχέα Ανεργικός υποδοχέας Εικόνα 19. Μοντέλο για το ρόλο του αντιγόνου και της σηµατοδότησης µέσω του BCR στην εξέλιξη της ασθένειας (92) Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και στερέοτυπες ανοσοσφαιρίνες στη ΧΛΛ Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα και εµφανίζει σηµαντικές διαφορές από το αντίστοιχο των φυσιολογικών Β λεµφοκυττάρων. Ορισµένα γονίδια, ιδίως τα γονίδια IGHV1-69, IGHV4-34, IGHV3-7 και IGHV3-21, γενικά χρησιµοποιούνται µε µεγάλη συχνότητα, παρά τις αποκλίσεις που παρατηρούνται στις διάφορες µελέτες (97,98). Πρόσφατα, αναφέρθηκε η ύπαρξη πολλών υποσυνόλων ασθενών µε ΧΛΛ µε ταυτόσηµες ή πολύ όµοιες (στερεότυπες) αναδιατάξεις των γονιδίων της βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (99-102). Τα υποσύνολα ασθενών µε στερεότυπες ανοσοσφαιρίνες εµφανίζουν επίσης συγκεκριµένα κοινά βιολογικά κλινικά χαρακτηριστικά. Ένα παράδειγµα είναι το στερεότυπο υποσύνολο IGHV4-34/IGKV2-30 (στερεότυπο υποσύνολο 4), το οποίο αντιπροσωπεύει ποσοστό >1% των ασθενών µε ΧΛΛ. Οι ασθενείς του υποσυνόλου 4 εκδηλώνουν τη νόσο σε µικρότερη ηλικία και εµφανίζουν πολύ βραδεία κλινική εξέλιξη (103). Η έκφραση στερεότυπων Β κυτταρικών υποδοχέων είναι πολύ συχνότερη στους ασθενείς ΧΛΛ µε αµετάλλακτα γονίδια IGHV σε σύγκριση προς τους ασθενείς µε µεταλλαγµένα γονίδια IGHV. Η στερεοτυπία του Β κυτταρικού υποδοχέα είναι µοναδικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ και «καταργεί» τη µαθηµατική λογική, εφόσον η µαθηµατική πιθανότητα να υπάρχουν δύο λεµφοκύτταρα µε ίδια ανοσοσφαιρίνη είναι 41

43 απειροελάχιστη (10-12 ) ενώ η συχνότητα έκφρασης στερεότυπων υποδοχέων στη ΧΛΛ ξεπερνά το 20% (103). Η δοµική στερεοτυπία των BCR αποτελεί ισχυρότατη ένδειξη για αναγνώριση παρόµοιων αντιγονικών επιτόπων, υπαινίσσεται δηλαδή διέγερση των κλωνογενών κυττάρων της νόσου από περιορισµένο αριθµό µοριακών δοµών, άρα και πιθανή στερεοτυπία όσον αφορά στα αντιγόνα ( ). Η φύση των αντιγόνων δεν µπορεί να προσδιοριστεί µε βεβαιότητα αποκλειστικά και µόνο µε βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών. Ωστόσο, ορισµένες ενδείξεις µπορεί να προέλθουν από την αναγνώριση οµολογίας µε ανοσοσφαιρίνες γνωστής ειδικότητας. Για παράδειγµα τα νεοπλασµατικά Β λεµφοκύτταρα της ΧΛΛ συχνά εκφράζουν ανοσοσφαιρίνες οι οποίες εµφανίζουν αξιοσηµείωτη οµολογία µε ανοσοσφαιρίνες εναντίον αυτοαντιγόνων και κοινών βακτηριακών συστατικών (99, ). Επίσης υποδηλώνει ότι οι λευχαιµικοί κλώνοι µε στερεότυπους BCR πιθανόν προέρχονται από έναν πληθυσµό Β λεµφοκυττάρων µε ιδιότητες κυττάρων της έµφυτης ανοσίας, τα οποία εγγενώς εµφανίζουν περιορισµένη ποικιλότητα (106) Αντιγονική διέγερση στη ΧΛΛ Πολυάριθµα δεδοµένα στηρίζουν την άποψη ότι για την ανάπτυξη και εκδήλωση της ΧΛΛ είναι κρίσιµος ο ρόλος του αντιγόνου σε κάποιο πρώιµο ή µεταγενέστερο στάδιο της λευχαιµογένεσης. Μολονότι αρχικά θεωρήθηκε ότι τα νεοπλασµατικά Β κύτταρα των ασθενών µε αµετάλλακτα γονίδια IGHV προέρχονταν από παρθένα Β λεµφοκύτταρα, αργότερα αποδείχτηκε ότι όλα τα νεοπλασµατικά λεµφοκύτταρα, ανεξάρτητα από το status µεταλλάξεων των γονιδίων IGHV, έχουν ανοσοφαινότυπο έµπειρων Β λεµφοκυττάρων και προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρόµοιο µε τα Β λεµφοκύτταρα µνήµης (110,111). Τα ευρήµατα αυτά συνηγορούν στην υπόθεση αντιγονικής διέγερσης, ότι δηλαδή σε όλες τις περιπτώσεις ΧΛΛ έχει προηγηθεί επαφή του κλωνογενούς Β λεµφοκυττάρου µε το αντιγόνο (110,111). Επιπλέον, η ανακάλυψη των στερεότυπων υποδοχέων (BCR) αποτελεί µια ισχυρότατη ένδειξη για αντιγονική διέγερση (103, ). Η εκπληκτική οµοιότητα των περιοχών HCDR3 σε κλωνοτυπικές ανοσοσφαιρίνες διαφορετικών ασθενών τους κατατάσσει σε υποσύνολα τα οποία φέρουν κοινά πρότυπα µεταλλάξεων, εµφανίζουν οµολογία και ως προς τις ελαφριές αλυσίδες και φαίνεται ότι ίσως παρουσιάζουν και στερεότυπα κλινικά ευρήµατα. Τέλος, πρόσφατα πειράµατα µε αντισώµατα από ασθενείς µε ΧΛΛ που παράχθηκαν in vitro µε την τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA προσέφεραν µια πρώτη πειραµατική επιβεβαίωση στη θεωρία επιλογής από αντιγόνο στην οντογένεση της ΧΛΛ, αναφέροντας ότι τα αντισώµατα αυτά αναγνωρίσουν συστατικά κοινών 42

44 µικροβίων ( ). Τα παραπάνω δεδοµένα προτείνουν ένα πιθανό µοντέλο ανάπτυξης της ΧΛΛ, σύµφωνα µε το οποίο η νόσος µπορεί να προκαλείται από φυσιολογικά Β λεµφοκύτταρα η λειτουργία των οποίων είναι να συµµετέχουν στην αποµάκρυνση κυτταρικών υπολειµµάτων κατά την κυτταρική απόπτωση Υποδοχείς έµφυτης ανοσίας και ΧΛΛ Μετά την ανακάλυψη της δοµικής στερεοτυπίας των αντιγονικών υποδοχέων (99-102), οι θεωρίες σχετικά µε την ανάπτυξη της ΧΛΛ έχουν στραφεί στον πιθανό ρόλο της αντιγονικής διέγερσης στη λευχαιµογένεση. Το γεγονός ότι τα B λεµφοκύτταρα της ΧΛΛ µπορεί ν αναγνωρίζουν κοινά βακτηριακά συστατικά (99, ) έχει στρέψει το ενδιαφέρον στη µελέτη των υποδοχέων της έµφυτης ανοσίας. Η συνδιεγερτική δράση τους ως προς το B κυτταρικό υποδοχέα (114) σε συνδυασµό µε την ετερογένεια της σηµατοδότησης µέσω του BCR (93-94) καθιστά τη µελέτη τους στα Β κύτταρα της ΧΛΛ ένα νέο πεδίο έρευνας. Το 2007 ανακοινώθηκε η έκφραση και λειτουργία δύο TLR (TLR7, TLR9) στα νεοπλασµατικά κύτταρα της ΧΛΛ (115). Επίσης, το 2008, οι Muzio et al. διαπίστωσαν ότι τα λευχαιµικά κύτταρα που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε ΧΛΛ εκφράζουν επίσης υψηλά επίπεδα mrna για τους TLR1, TLR2, TLR6 και TLR10. Επιπλέον, παρατήρησαν ότι οι TLR3 και TLR5 δεν ανιχνεύονται, ενώ το mrna για τους TLR4 και TLR8 εκφράζεται σε πολύ χαµηλά έως µηδενικά επίπεδα. Τέλος, οι υποδοχείς NOD1 και NOD2 εκφράζονται στα Β λεµφοκύτταρα της ΧΛΛ (116). Σε άλλη εργασία (117), τα αποτελέσµατα ήταν εν µέρει αντικρουόµενα. Συγκεκριµένα, δεν παρατηρήθηκε έκφραση του TLR6, ενώ η έκφραση του TLR2 ήταν πολύ χαµηλή. Συνεπώς, το πρότυπο έκφρασης δεν έχει καθοριστεί σαφώς λόγω της ετερογένειας των αποτελεσµάτων. Χωρίς να είναι απόλυτο, φαίνεται ότι όσοι TLR εκφράζονται στα νεοπλασµατικά κύτταρα της ΧΛΛ είναι λειτουργικοί ( ). Η ενεργοποίησή τους µπορεί ενδεχοµένως να προκαλεί το θάνατο των νεοπλασµατικών κυττάρων είτε ενισχύοντας τη δράση των ΝΚ κυττάρων και των ειδικών του όγκου Τ λεµφοκυττάρων (tumor-reactive T cells) είτε αλλάζοντας το µικροπεριβάλλον του όγκου και παρεµποδίζοντας την αγγειογένεση. Επιπλέον, τα κύτταρα της ΧΛΛ µπορεί να ενεργοποιηθούν άµεσα από τους TLR7 και TLR9. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε παραγωγή κυτταροκινών και συνδιεγερτικών µορίων, ευαισθητοποιώντας τα νεοπλασµατικά Β λεµφοκύτταρα στη δράση των κυτταροτοξικών Τ λεµφοκυττάρων και των χηµειοθεραπευτικών φαρµάκων (115, 123). 43

45 Αναφορικά µε τον TLR9 υπάρχουν αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Κάποιες µελέτες υποστηρίζουν ότι η ενεργοποίησή του προκαλεί πολλαπλασιασµό των νεοπλασµατικών κυττάρων και παραγωγή κυτταροκινών µε αποτέλεσµα την αύξηση της ανοσογονικότητας (121), ενώ άλλες υποστηρίζουν ότι προάγει την απόπτωση σε κάποιες οµάδες ασθενών και έχει ετερογενή αποτελέσµατα σε άλλες (124). Σχετικά µε τον TLR7, τα αποτελέσµατα επίσης δεν είναι σαφή (123, 125). Υπάρχει µεγάλη ετερογένεια στις απαντήσεις διαφορετικών ασθενών, γεγονός που συνάδει µε την ετερογένεια της νόσου και υποδηλώνει την ανάγκη γι ανάλυση µεγαλύτερου δείγµατος ασθενών. 44

46 2. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι ανοσοσφαιρίνες των νεοπλασµατικών λεµφοκυττάρων της ΧΛΛ εµφανίζουν µοναδικά χαρακτηριστικά, ενδεικτικά επιλογής από ιδιαίτερα αντιγόνα, µε πιο αξιοσηµείωτο τη στερεοτυπία της περιοχής HCDR3 µεταξύ διαφορετικών ασθενών. Πρόσφατα in vitro δεδοµένα παρέχουν ενδείξεις για το ρόλο λοιµώξεων από κοινά παθογόνα (βακτήρια και ιούς) στη διέγερση των κλωνογενών κυττάρων της ΧΛΛ. Μάλιστα, οι σχετικές µελέτες επιβεβαιώνουν ότι η µοριακή στερεοτυπία του BCR συνοδεύεται από ειδική αναγνώριση διαφορετικών, κατά περίπτωση, παθογόνων µικροβίων. Εκτός από τις γενετικές µεταλλάξεις, η αλληλεπίδραση µε το µικροπεριβάλλον φαίνεται να συµβάλει στην επιλογή και τον πολλαπλασιασµό του νεοπλασµατικού κλώνου. Πολλά δεδοµένα υποστηρίζουν ότι η διέγερση µέσω του ΒCR επηρεάζει την επιβίωση και το θάνατο των λευχαιµικών κυττάρων ( ). Οι υποδοχείς της έµφυτης ανοσίας αναγνωρίζουν στερεότυπα δοµικά µοτίβα σε παθογόνους µικροοργανισµούς. Έτσι ενεργοποιείται η έµφυτη ανοσία και επάγονται οι µηχανισµοί της προσαρµοστικής ανοσίας (9). Η σηµατοδότηση µέσω των υποδοχέων της έµφυτης ανοσίας (TLR και NOD) εµπλέκεται στην παθογένεση αρκετών ανθρώπινων νοσηµάτων, όπως το άσθµα και τα αυτοάνοσα νοσήµατα. Αρκετές φορές, στην ανάπτυξη των αυτοάνοσων νοσηµάτων εµπλέκονται ιογενείς λοιµώξεις (π.χ. αναφερόµενη συσχέτιση για λοίµωξη από τον ιό Epstein-Barr και ανάπτυξη συστηµατικού ερυθηµατώδους λύκου). Πρόσφατες µελέτες αποδεικνύουν ότι η αναγνώριση ιικών µοτίβων από τους TLR επάγει την παραγωγή κυτταροκινών που ενεργοποιούν αυτοαντιδραστικά λεµφοκύτταρα και οδηγούν στην ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσηµάτων (13, 23, 28). Τα τελευταία χρόνια έχουν πραγµατοποιηθεί αρκετές µελέτες που αφορούν στο επίπεδο έκφρασης και λειτουργικότητας των υποδοχέων έµφυτης ανοσίας στα κύτταρα της ΧΛΛ. Τα αποτελέσµατα δεν είναι σαφή, γεγονός που οφείλεται κυρίως στο µικρό αριθµό των δειγµάτων που αναλύθηκαν. Επιπλέον, πρόσφατες µελέτες δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των TLR από τους αγωνιστές τους µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως ανοσοενισχυτικός µηχανισµός στα κύτταρα της ΧΛΛ. Με αυτόν τον τρόπο, τα κύτταρα γίνονται πιο επιρρεπή στην ανοσοθεραπεία. Ωστόσο, οι κλινικές µελέτες βρίσκονται σε αρχική φάση και τ αποτελέσµατά τους είναι αµφιλεγόµενα (26, 27). Τα παραπάνω δεδοµένα υποδηλώνουν την ανάγκη µελέτης όχι µόνο των υποδοχέων BCR αλλά επίσης και των υποδοχέων της έµφυτης ανοσίας για την εξαγωγή αξιόπιστων ενδείξεων αναφορικά µε τη φύση των αντιγόνων που διεγείρουν τα κλωνογενή λευχαιµικά κύτταρα. 45

47 Στόχος της παρούσας µελέτης είναι ο χαρακτηρισµός του ρεπερτορίου και του προτύπου έκφρασης των υποδοχέων ΤLR και NOD στα Β λεµφοκύτταρα της ΧΛΛ καθώς επίσης και η ανίχνευση του επιπέδου έκφρασης µορίων που συµµετέχουν στο σηµατοδοτικό µονοπάτι καθοδικά των υποδοχέων. Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε σε οµάδα 50 ασθενών µε ΧΛΛ στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας της Αιµατολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταµόσχευσης Μυελού των Οστών του ΓΝ Παπανικολάου. Η τελική ανάλυση έγινε µε σκοπό τη συσχέτιση του προτύπου έκφρασης TLR, NOD και BCR στη ΧΛΛ την αναζήτηση στερεοτυπίας ως προς το ρεπερτόριο των υποδοχέων TLR και NOD σε ασθενείς µε στερεότυπους υποδοχείς BCR τη διερεύνηση πιθανής προγνωστικής σηµασίας ειδικών προτύπων έκφρασης TLR και NOD στη ΧΛΛ. 46

48 3. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3.1 Οµάδα Μελέτης Η οµάδα µελέτης περιελάµβανε 50 ασθενείς µε χρόνια λεµφοκυτταρική λευχαιµία που έχουν νοσηλευτεί ή παρακολουθούνται στην Αιµατολογική Κλινική του ΓΝ Γ. Παπανικολάου και στο Αιµατολογικό Τµήµα του ΓΝ Νίκαιας Υλικά και Μέθοδοι Αποµόνωση CD19 + κυττάρων από δείγµα αίµατος ασθενών µε ΧΛΛ Ο διαχωρισµός των CD19+ κυττάρων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση της τεχνολογίας Rosette Sep. Η τεχνολογία συνδυάζει την αρνητική επιλογή των ανεπιθύµητων κυττάρων µε τη χρήση µονοκλωνικών αντισωµάτων και τη χρήση του αντιδραστηρίου φικόλλη (Ficoll-Hypaque) (Πίνακας 3). Η πρόσδεση των κυττάρων στα µονοκλωνικά αντισώµατα έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ροζετών µε τα ερυθρά αιµοσφαίρια και την καθίζηση τους. Πίνακας 3. Αντισώµατα για τους δείκτες των λευκών αιµοσφαιρίων. Δείκτες CD2 CD3 CD16 CD36 CD56 CD66b Κυτταρικός τύπος έκφρασης Τ λεµφοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα, Θυµοκύτταρα Τ λεµφοκύτταρα, Θυµοκύτταρα ΝΚ κύτταρα, Ουδετερόφιλα, Μακροφάγα Μονοπύρηνα, Αιµοπετάλια ΝΚ κύτταρα Κοκκιοκύτταρα Αποθήκευση των CD19 + κυττάρων Τα κύτταρα που αποµονώθηκαν, τοποθετήθηκαν σε διάλυµα DMSO (RPMI, 10% DMSO, 10% FBS) και φυλάχθηκαν στους -80 ο C. 47

49 3.2.3 Μέτρηση του ποσοστού των CD19 + κυττάρων µε κυτταροµετρία ροής Η µέτρηση του ποσοστού των CD19 + κυττάρων σε όλα τα δείγµατα πραγµατοποιήθηκε µε κυτταροµετρία ροής (FACS) σε αναλυτή BD FACS CANTO (λογισµικό BD FACS DIVA). Τα δείγµατα που περιείχαν CD19 + κύτταρα σε ποσοστό µεγαλύτερο από 95%, όπως ορίζεται από τη βιβλιογραφία, χρησιµοποιήθηκαν στα επόµενα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας Αποµόνωση RNA Η αποµόνωση του ολικού RNA από τα CD19 + κύτταρα πραγµατοποιήθηκε µε το Qiagen RNAeasy mini kit, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η διαδικασία στηρίζεται στη χρήση χαοτροπικών παραγόντων και αυστηρών συνθηκών αλατότητας. Κατά την διαδικασία παρεµβάλλεται ένα βήµα αποµάκρυνσης του γονιδιωµατικού DNA µε τη χρήση του ενζύµου DNase Ι, έτσι ώστε ν αποφευχθεί η επιµόλυνση των δειγµάτων µε γονιδιωµατικό DNA και να εξασφαλιστεί η µέγιστη δυνατή καθαρότητα των δειγµάτων RNA. Το βήµα αυτό είναι απαραίτητο για τους περαιτέρω χειρισµούς Ποιοτικός έλεγχος RNA Ο ποιοτικός έλεγχος του RNA πραγµατοποιήθηκε µε φωτoµέτρηση στα 280/260 nm. Τα δείγµατα µε λόγο 280/260 µεγαλύτερο από 1,8 και συγκέντρωση µεγαλύτερη από 100ng/µl χρησιµοποιήθηκαν στα επόµενα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας Σύνθεση cdna Η σύνθεση του cdna πραγµατοποιήθηκε µε το RT 2 First Strand Kit (SA Biosciences), µε τη χρήση τυχαίων εξαµερών εκκινητών, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αρχική ποσότητα του RNA που χρησιµοποιήθηκε ήταν 1 µg. Το πρώτο στάδιο αυτής της διαδικασίας περιλάµβανε ένα βήµα επώασης στους 42 0 C µε το ένζυµο DNase Ι για να εξασφαλιστεί η καθαρότητα των δειγµάτων µε RNA. 48

50 3.2.7 Ποιοτικός έλεγχος του cdna Ο έλεγχος του cdna για επιµόλυνση µε γονιδιοµατικό DNA πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο PCR. Στην αντίδραση χρησιµοποιήθηκαν οι ειδικοί εκκινητές Α2, Α10 που προσδένονται σε ιντρόνιο του γονιδίου της β-ακτίνης. Ως θετικός µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε ολικό DNA από Β λεµφοκύτταρα Ποιοτικός έλεγχος της PCR O ποιοτικός έλεγχος της PCR πραγµατοποιήθηκε µε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης σε πηκτή αγαρόζης 2%. Τα δείγµατα που δεν εµφάνισαν προϊόν PCR χρησιµοποιήθηκαν στα επόµενα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας. Η απουσία προϊόντος αποδεικνύει ότι το αρχικό δείγµα RNA δεν περιείχε γονιδωµατικό DNA Real time RT-PCR Στην παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις real time PCR για κάθε δείγµα ασθενούς. Η πρώτη αντίδραση αφορούσε στη µελέτη της έκφρασης 84 γονιδίων που κωδικοποιούν τους υποδοχείς TLR και µόρια του σηµατοδοτικού µονοπατιού (παράρτηµα 1, εικόνες 20, 21, 22, 23). Η δεύτερη αντίδραση αφορούσε στη µελέτη της έκφρασης των γονιδίων NOD1 και NOD2. A. Real time PCR για τα γονίδια TLR Η ποσοτική µελέτη της έκφρασης των mrna µεταγράφων των 84 γονιδίων πραγµατοποιήθηκε µέσω ενίσχυσης µε τη µέθοδο Real-time PCR σε πλάκα RT 2 Profiler TM PCR Array, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκεκριµένη τεχνική συνδυάζει την κλασική Real Time PCR µε την τεχνική των µικροσυστοιχιών (microarrays). Χρησιµοποίηθηκε η χρωστική SYBR GREEN, η οποία έχει την ικανότητα να προσδένεται µη ειδικά στην ελάσσονα αύλακα του δίκλωνου DNA. Για το λόγο αυτό κατά την αποµόνωση του RNA έγινε αποµάκρυνση του γονιδιωµατικού DNA µε τη χρήση του ενζύµου DNase Ι. Η τελευταία σειρά της πλάκας περιλαµβάνει τα γονίδια αναφοράς (B2M, HPRT1, RPL13A, GAPDH, ACTB, παράρτηµα 1). Επίσης περιλαµβάνει µια θέση για την ανίχνευση ύπαρξης γονιδιωµατικού DNA (HGD) και δύο µάρτυρες. Ο µάρτυρας RTC (Reverse Transcription Control) ελέγχει την απόδοση της αντίδρασης σύνθεσης του 49

51 cdna χρησιµοποιώντας ένα κατάλληλο ζεύγος εκκινητών. Ο µάρτυρας PPC (Positive PCR Control) ελέγχει την απόδοση της ίδιας της αντίδρασης χρησιµοποιώντας µια τεχνητή αλληλουχία DNA και το αντίστοιχο ζεύγος εκκινητών που την ενισχύει. Εικόνα 20: Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης της πλάκας που χρησιµοποιήθηκε. Με κίτρινο επισηµαίνονται τα µέλη της οικογένειας TLR. Εικόνα 21: Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης της πλάκας που χρησιµοποιήθηκε. Με µπλε επισηµαίνονται οι προσαρµοστές του µονοπατιού. 50

52 Εικόνα 22: Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης της πλάκας που χρησιµοποιήθηκε. Επισηµαίνονται διάφορα µόρια τα οποία συµµετέχουν σε µονοπάτια που αλληλεπιδρούν µε το σηµατοδοτικό µονοπάτι των TLR. Πράσινο: οδός NF-κB, Ροζ: οδός JNK/p38, Κόκκινο: οδός NF /IL6, Πορτοκαλί: οδός IRF, Γαλάζιo: ρύθµιση προσαρµοστικής ανοσίας. Εικόνα 23: Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης της πλάκας που χρησιµοποιήθηκε. Με πορτοκαλί επισηµαίνονται οι τελεστές (effectors) του µονοπατιού. B. Real time PCR για τα γονίδια NOD Η µελέτη της έκφρασης των γονιδίων NOD1 και NOD2 πραγµατοποιήθηκε µέσω ενίσχυσης µε τη µέθοδο της real-time PCR χρησιµοποιώντας τους αντίστοιχους εκκινητές (SA Bioscience). Οι αντιδράσεις για κάθε δείγµα ασθενούς πραγµατοποιήθηκαν δύο φορές (duplicated/εικόνα 24). Για το τελικό αποτέλεσµα υπολογίστηκε ο µέσος όρος της έκφρασης. Επίσης, τα γονίδια µελετήθηκαν σε 51

53 αραίωση cdna 1:10, για την εξασφάλιση της αξιοπιστίας των αποτελεσµάτων. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε το ABL. Για τον έλεγχο επιµολύνσεων χρησιµοποιήθηκαν δύο αρνητικοί µάρτυρες σε τρεις επαναλήψεις το καθένα (Εικόνα 24). Ο πρώτος (No Reverse Transcription, NRT) παρασκευάστηκε κατά τη σύνθεση του cdna για κάθε δείγµα ασθενούς. Κατά τη διαδικασία, δεν προστέθηκε το ένζυµο της αντίστροφης µεταγραφάσης µε αποτέλεσµα το αρχικό προϊόν να µη µεταγράφεται. Η ανίχνευση έκφρασης στις θέσεις C1, C2, C3 έδειχνε ότι τα δείγµατα περιείχαν γονιδιωµατικό DNA. Ο δεύτερος µάρτυρας (No template Control, NTC) χρησιµοποιήθηκε για την ανίχνευση επιµολύνσεων από DNA που µπορεί να προκύψουν κατά τη διαδικασία της προετοιµασίας της αντίδρασης. Στις αντίστοιχες θέσεις δεν υπήρχε υπόστρωµα (cdna), άρα η ανίχνευση έκφρασης ερµηνευόταν ως επιµόλυνση. Εικόνα 24: Διαγραµµατική απεικόνιση της διάταξης των γονιδίων που µελετήθηκαν. Με κίτρινο επισηµαίνονται τα γονίδια NOD1 και NOD2, µε πράσινο το γονίδιο αναφοράς (ABL), µε µπλε όλα τα παραπάνω γονίδια σε αραίωση 1/10, µε κόκκινο το εσωτερικό control NRT και µε πορτοκαλί το εσωτερικό control NTC. 3.3 Ανάλυση αποτελεσµάτων Η ανάλυση των αποτελεσµάτων της Real-time PCR µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε δύο διαφορετικές µεθόδους, την απόλυτη και τη σχετική ποσοτικοποίηση. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση µπορεί να δώσει τον απόλυτο αριθµό των µετάγραφων ενός γονιδίου χρησιµοποιώντας µια πρότυπη καµπύλη. Στην παρούσα µελέτη, η ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε σχετική ποσοτικοποίηση χρησιµοποιώντας τη µέθοδο ΔΔCt. 52

54 3.3.1 Μέθοδος ΔΔCt Η ΔΔCt συγκρίνει την έκφραση µεταξύ δυο διαφορετικών οµάδων δεδοµένων. Ο αλγόριθµος χρησιµοποιεί ως αρχικό δεδοµένο την τιµή Ct που είναι το σηµείο στο οποίο το προϊόν της αντίδρασης περνά στην εκθετική φάση. Το αρχικό βήµα στην ανάλυση είναι η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων µε τη χρήση γονιδίων αναφοράς (housekeeping genes) µε τον τύπο: ΔCt = Ct GOI AVG HKG - Ct Όπου GOI τo γονίδιo προς εξέταση και AVG HKG ο µέσος όρος των γονιδίων αναφοράς. Στη συνέχεια, υπολογίζεται η διαφορά µεταξύ των δύο οµάδων δεδοµένων σύµφωνα µε τον τύπο: ΔΔCt = ΔCt (οµάδας 2) ΔCt (οµάδας 1) Τελικά, η διαφορά στην έκφραση (fold-change) υπολογίζεται µέσω ενός πολύπλοκου αλγόριθµου από τον τύπο: Fold change= 2 -ΔΔCt 53

55 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV της παρούσας µελέτης Στην πειραµατική διαδικασία της παρούσας εργασίας χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα από 50 ασθενείς µε ΧΛΛ. Η κατανοµή των γονιδίων IGHV που εξέφραζαν οι ασθενείς, φαίνεται στην Εικόνα 20. Το µεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών εξέφραζαν γονίδια των υποοµάδων IGHV1, IGHV3 και IGHV4. Οι 10 από τους 50 ασθενείς εξέφραζαν το γονίδιο IGHV4-34 το οποίο υπεραντιπροσωπεύεται στο σύνολο των ασθενών της µελέτης. Εικόνα 20: Διαγραµµατική απεικόνιση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGVH στους ασθενείς της παρούσας µελέτης. 54

56 Συνολικά, 35/50 ασθενείς (70%) έφεραν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV, ενώ 15/46 (30%) έφεραν αµετάλλακτες αλληλουχίες IGHV. Το ποσοστό (%) των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένα και αµετάλλακτα γονίδια ανά υποοµάδα γονιδίων IGVH φαίνεται στην Εικόνα 21. Το σύνολο των ασθενών που εξέφραζαν τα γονίδια IGHV4-34, IGVH3-7 ή IGVH3-49 είχαν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV σε αντίθεση µε τους ασθενείς που εξέφραζαν τα γονίδια IGVH1-69 ή IGVH Εικόνα 21: Διαγραµµατική απεικόνιση του ποσοστού (%) των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένα και αµετάλλακτα γονίδια ανά υποοµάδα γονιδίων IGHV. Αναγράφονται τα πιο συχνά γονίδια. 4.2 Πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR και NOD και των µορίων του σηµατοδοτικού µονοπατιού των TLR Όπως έχει αναφερθεί λεπτοµερώς στη «Μεθοδολογία», µελετήθηκαν τα γονίδια των υποδοχέων TLR και NOD καθώς και άλλα γονίδια που εµπλέκονται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι των TLR στα Β λεµφοκύτταρα ασθενών µε ΧΛΛ. Στις Εικόνες απεικονίζονται διαγραµµατικά τα επίπεδα έκφρασης των µορίων που µελετήθηκαν µε την τεχνική Real time PCR. Αρχικά, υπολογίστηκε το ΔCt κάθε γονιδίου µε βάση το Ct (σηµείο στο οποίο το προϊόν της αντίδρασης περνά στην εκθετική φάση) για το συγκεκριµένο γονίδιο σε σχέση µε το Ct των γονιδίων αναφοράς, για κάθε ασθενή ξεχωριστά. Ακολούθησε ο υπολογισµός 2 -ΔCt κάθε µορίου έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η σύγκριση ανάµεσα στα επίπεδα έκφρασης 55

57 των γονιδίων, η οποία µπορεί να απεικονιστεί διαγραµµατικά. Σηµειώνεται ότι υπολογίστηκε η διάµεση τιµή 2 -ΔCt κάθε µορίου για το σύνολο των 50 ασθενών ώστε να µην επηρεαστεί το αποτέλεσµα από τις ακραίες τιµές 2 -ΔCt που εµφάνιζαν ορισµένα µόρια σε κάποιους ασθενείς. Εικόνα 22: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας των TLR στο σύνολο των ασθενών. Στην Εικόνα 22 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας των υποδοχέων TLR. Παρατηρείται υψηλή έκφραση των TLR6, TLR7 και TLR10 και απουσία έκφρασης των TLR3 και TLR5. Οι TLR4, TLR8 και TLR9 εµφανίζουν χαµηλή έκφραση, ενώ η έκφραση των TLR1 και TLR2 κυµαίνεται σε υψηλότερα επίπεδα σε σχέση µε τους TLR4, TLR8 και TLR9. Η έκφραση του αναστολέα του µονοπατιού SIGGIR είναι χαµηλή έως µηδενική. Στην Εικόνα 23 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων των υποδοχέων NOD. Όπως φαίνεται, τα επίπεδα του NOD1 υπερτερούν σε σχέση µε το NOD2. 56

58 Εικόνα 23: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων των υποδοχέων NOD στην παρούσα µελέτη. Στην Εικόνα 24 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων των προσαρµοστών του µονοπατιού των TLR. Οι προσαρµοστές γενικά εµφάνιζαν υψηλή έκφραση, µε εξαίρεση όσους συµµετέχουν στο TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι (TICAM2, TIRAP, CD14). Όπως φαίνεται, η έκφραση του γονιδίου PELI 1 σε επίπεδο mrna είναι πολύ υψηλότερη σε σύγκριση µε την έκφραση των υπολοίπων γονιδίων. Αντίθετα, παρατηρείται απουσία έκφρασης των γονιδίων TIRAP και CD14. Τα υπόλοιπα γονίδια παρουσιάζουν ενδιάµεση έκφραση, µε τα γονίδια LY86, HSPA1A και MAPK8IP3 να εµφανίζουν υψηλότερη έκφραση από τα γονίδια BTK, HMGB1, HRAS, HSPD1, LY96, MYD88, RIPK2, SARM1, TICAM2 και TOLLIP. Εικόνα 24: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων των προσαρµοστών του µονοπατιού των TLR στην παρούσα µελέτη. 57

59 Εικόνα 25: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων των τελεστών του µονοπατιού των TLR στην παρούσα µελέτη. Στην Εικόνα 25 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων των τελεστών του µονοπατιού των TLR. Όπως φαίνεται, η έκφραση του γονιδίου UBE2N σε επίπεδο mrna είναι πολύ υψηλότερη σε σύγκριση µε την έκφραση των υπολοίπων γονιδίων. Αντίθετα, παρατηρείται ασθενής έκφραση του γονιδίου UBE2V1. Τα υπόλοιπα γονίδια παρουσιάζουν ενδιάµεση έκφραση. Στην Εικόνα 26 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που εµπλέκονται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι του NF-κΒ. Παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση των µορίων της οικογένειας NF-κB και των MAP κινασών που αλληλεπιδρούν άµεσα µε αυτά τα µόρια, ενώ η έκφραση των µορίων που αποτελούν τελικούς στόχους του µονοπατιού ήταν γενικά χαµηλή. Όσων αφορά τις υποµονάδες του NF-κΒ, παρατηρείται υψηλή έκφραση της υποµονάδας NF-κB1A σε σύγκριση µε τις υποµονάδες NF-κB1 και NFκB2 και εκφράζεται, όπως είναι αναµενόµενο, ο IKB. Όπως φαίνεται, η έκφραση του γονιδίου MAP3K1 σε επίπεδο mrna είναι πολύ υψηλότερη σε σύγκριση µε την έκφραση των υπολοίπων γονιδίων. 58

60 Εικόνα 26: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του µονοπατιού του NF-κΒ στην παρούσα µελέτη. Στην Εικόνα 27 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων τα οποία εµπλέκονται σε µονοπάτια που αλληλεπιδρούν µε το σηµατοδοτικό µονοπάτι των TLR. Παρατηρήθηκε έκφραση για όλα τα µόρια, µε εξαίρεση τη χηµειοκίνη CXCL10 που είχε µηδενική έκφραση. Από την οδό των JNK/p38 (ροζ ράβδοι) το γονίδιο c-jun παρουσιάζει την υψηλότερη έκφραση, ενώ από την οδό IRF (πορτοκαλί ράβδοι) υψηλότερη έκφραση παρουσιάζει το γονίδιο IRF3. Από τα γονίδια που εµπλέκονται στη ρύθµιση της προσαρµοστικής ανοσίας, παρουσιάζει ασθενή έκφραση το γονίδιο CD80, ενώ τα υπόλοιπα εκφράζονται σε παρόµοια επίπεδα. 59

61 Εικόνα 27: Συγκριτική διαγραµµατική απεικόνιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που συµµετέχουν σε µονοπάτια που αλληλεπιδρούν µε το σηµατοδοτικό µονοπάτι των TLR. Ροζ: οδός JNK/p38, Κόκκινο: οδός NF /IL6, Πορτοκαλί: οδός IRF, Γαλάζιo: ρύθµιση προσαρµοστικής ανοσίας. 4.3 Συγκριτική ανάλυση των αποτελεσµάτων µε τη µέθοδο ΔΔCt Όπως προαναφέρθηκε, η συγκριτική ποσοτικοποίηση των αποτελεσµάτων βασίστηκε στη µέθοδο ΔΔCt, όπου ως αρχικό δεδοµένο χρησιµοποιήθηκε η τιµή Ct. Τα δεδοµένα αναλύθηκαν σύµφωνα µε τον αλγόριθµο χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα excel. Το τελικό αποτέλεσµα ορίστηκε ως η διαφορά στην έκφραση ενός γονιδίου ανάµεσα σε δύο οµάδες δεδοµένων (fold difference) και επισηµάνθηκαν τα γονίδια για τα οποία η διαφορά στην έκφραση ανάµεσα στις δύο οµάδες µελέτης είναι µεγαλύτερη από δύο ( fold difference >2). Για τη συγκριτική µελέτη των προτύπων έκφρασης στους ασθενείς, ορίστηκαν τρεις υποοµάδες µελέτης µε βάση τις εξής παραµέτρους: α) αριθµός µεταλλάξεων των γονιδίων IGHV (οµάδα ελέγχου: δείγµατα ασθενών µε µεταλλαγµένα γονίδια, οµάδα µαρτύρων: δείγµατα ασθενών µε αµετάλλακτα γονίδια) β) έκφραση του µορίου CD38 στα Β-λεµφοκύτταρα (οµάδα ελέγχου: δείγµατα ασθενών που είναι αρνητικά για το CD38, αµάδα µαρτύρων: δείγµατα ασθενών που είναι θετικά για το CD38 60

62 γ) ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV (οµάδα ελέγχου: δείγµατα ασθενών που φέρουν IGHV µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες εκτός από IGVH4-34, οµάδα µαρτύρων: δείγµατα ασθενών που φέρουν IGHV4-34 γονίδια) Κατά τη σύγκριση των δειγµάτων των ασθενών που φέρουν γονίδια IGHV µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες (M-IGHV) µε τα δείγµατα των ασθενών που φέρουν γονίδια µε αµετάλλακτες αλληλουχίες (U-IGHV) διαπιστώθηκε ότι τα µόρια CD80, CD86, IFNG, IL6, CD180 και PTGS2 υπερεκφράζονται στην οµάδα ελέγχου. Αντίθετα, ο TLR8 υποεκφράζεται στην οµάδα ελέγχου σε σύγκριση µε την οµάδα των µαρτύρων (Εικόνα 28). Εικόνα 28: Σύγκριση του προτύπου έκφρασης των µορίων που µελετήθηκαν σε ασθενείς µε γονίδια M-IGHV και ασθενείς µε γονίδια U-IGHV. Με πράσινο χρώµα απεικονίζονται τα µόρια CD80, CD86, IFNG, IL6, CD180 και PTGS2 που υπερεκφράζονται, ενώ µε κόκκινο χρώµα ο TLR8 που υποεκφράζεται. 61

63 Κατά τη σύγκριση των δειγµάτων των ασθενών που είναι αρνητικά για την έκφραση του CD38 (CD38-) µε τα δείγµατα των ασθενών που είναι θετικά για την έκφραση του CD38 (CD38+) διαπιστώθηκε ότι τα µόρια CD80, CD86, IFNG, IL6, CD180 υπερεκφράζονται στην οµάδα ελέγχου. Αντίθετα, ο TLR8 υποεκφράζεται στην οµάδα ελέγχου σε σύγκριση µε την οµάδα των µαρτύρων (Εικόνα 29). Εικόνα 29: Σύγκριση του προτύπου έκφρασης των µορίων που µελετήθηκαν ανάµεσα σε δείγµατα ασθενών µε γονίδια M-IGHV και σε δείγµατα ασθενών µε γονίδια IGHV4-34. Με πράσινο χρώµα απεικονίζονται τα µόρια CD80, CD86, IFNG, IL6 και CD180 που υπερεκφράζονται, ενώ και µε κόκκινο χρώµα ο TLR8 που υποεκφράζεται. Κατά τη σύγκριση των δειγµάτων των ασθενών που φέρουν γονίδια IVGH 4-34 µε τα δείγµατα των ασθενών που φέρουν IGHV γονίδια µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες (εκτός από γονίδια IGHV4-34) διαπιστώθηκε ότι τα µόρια FOS, HSPA1A, IFNG, IL6, IL10, IRAK2 και TNF υπερεκφράζονται στην οµάδα ελέγχου. (Εικόνα 30). 62

64 Μ-IGHV M-IGHV 4-34 Εικόνα 30: Σύγκριση του προτύπου έκφρασης των µορίων που µελετήθηκαν ανάµεσα σε δείγµατα ασθενών µε γονίδια M-IGHV και σε δείγµατα ασθενών µε γονίδια IGHV4-34. Με πράσινο χρώµα απεικονίζονται τα µόρια FOS, HSPA1A, IFNG, IL6, IL10, IRAK2 και TNF που υπερεκφράζονται. 63

65 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5.1 Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NOD στη χρόνια λεµφοκυτταρική λευχαιµία Η ΧΛΛ διακρίνεται για την ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών µε στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς. Η στερεοτυπία των BCR είναι µοναδικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ και η συχνότητα της φτάνει το 27%, εύρηµα που αντικρούεται µε την απειροελάχιστη πιθανότητα (10-12 ) ύπαρξης δύο Β κυττάρων µε ίδια ανοσοσφαιρίνη. Η δοµική στερεοτυπία του BCR αποτελεί ισχυρή ένδειξη επιλογής από περιορισµένη ποικιλία αντιγόνων. Πρόσφατα, µελέτες έδειξαν ότι οι στερεότυποι υποδοχείς ίσως αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα και κοινά βακτηριακά αντιγόνα. Επίσης υποδηλώνει ότι οι λευχαιµικοί κλώνοι µε στερεότυπους BCR πιθανόν προέρχονται από έναν πληθυσµό Β λεµφοκυττάρων µε ιδιότητες κυττάρων της έµφυτης ανοσίας τα οποία εγγενώς εµφανίζουν περιορισµένη ποικιλότητα (99-102). Σηµαντικό ρόλο στη λειτουργία των κυττάρων της έµφυτης ανοσίας διαδραµατίζουν οι υποδοχείς TLR και NOD, οι οποίοι αναγνωρίζουν στερεότυπα δοµικά µοτίβα σε παθογόνους µικροοργανισµούς και αυτοαντιγόνα (5-7). Τα ώριµα Β λεµφοκύτταρα εκφράζουν υποδοχείς TLR οι οποίοι δρουν συνδιεγερτικά ως προς τον BCR (26, 27). Παρότι έχει χαρακτηριστεί το ρεπερτόριο έκφρασης των TLR σε φυσιολογικά ανθρώπινα λεµφοκύτταρα, υπάρχουν πολύ λίγες πληροφορίες για την έκφρασή τους στα κύτταρα της ΧΛΛ (116, 117). Η παρούσα µελέτη παρακινήθηκε από την υπόθεση ότι σε κάποιους ασθενείς τα λευχαιµικά κύτταρα πιθανόν ενεργοποιούνται από την αναγνώριση µικροβιακών αντιγόνων ή αυτοαντιγόνων. Στα πλαίσια της συνδιεγερτικής δράσης των υποδοχέων έµφυτης ανοσίας προς τους BCR, αναλύθηκε το ρεπερτόριο και το πρότυπο έκφρασης των TLR και NOD στη ΧΛΛ. Η µελέτη της έκφρασης των υποδοχέων TLR και NOD µπορεί να προσφέρει σηµαντικές πληροφορίες για τον πιθανό τους ρόλο στην παθογένεια της νόσου. Η χρήση της τεχνολογίας των συστοιχιών PCR (PCR arrays) η οποία εφαρµόστηκε στην συγκεκριµένη µελέτη επέτρεψε τη συσσώρευση ενός µεγάλου όγκου πληροφοριών που αφορούν όχι µόνο στην έκφραση των ίδιων των υποδοχέων αλλά και πολλών µορίων που συµµετέχουν στη σηµατοδότηση. Οι 50 ασθενείς που αναλύθηκαν είναι η µεγαλύτερη σειρά µέχρι σήµερα στη βιβλιογραφία. Το γεγονός αυτό µαζί µε την επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων διασφαλίζουν την αξιοπιστία των συµπερασµάτων που προέκυψαν από την ανάλυση. Στην παρούσα µελέτη παρατηρήθηκε απουσία έκφρασης σε επίπεδο mrna µόνο των TLR3 και TLR5 γεγονός που υποδεικνύει ότι τα Β λεµφοκύτταρα των ασθενών 64

66 ίσως δεν ήρθαν σε επαφή µε RNA ιούς µε δίκλωνο RNA ή µαστιγοφόρα βακτήρια, δηλαδή τους προσδέτες των δύο υποδοχέων, αντιστοίχως. Αντίθετα, η συγκριτικά πολύ υψηλή έκφραση των TLR6 και TLR7 παρέχει ενδείξεις για την πιθανή διέγερση των κλωνογενών κυττάρων από διακυλο-λιποπεπτίδια Gram+ βακτηρίων και RNA ιούς µε µονόκλωνο RNA, προσδέτες των δύο υποδοχέων, αντιστοίχως (15). Η πολύ χαµηλή έκφραση των TLR4 και TLR9 περιορίζει τις ενδείξεις για παρουσία λιποπρωτεϊνών των Gram- βακτηρίων και µη µεθυλιωµένων νησίδων κυτοσίνηςγουανίνης στο περιβάλλον των B λεµφοκυττάρων (15). Επίσης, στους ασθενείς της παρούσας µελέτης, τα επίπεδα της πρωτεΐνης SIGIRR η οποία δρα ως αρνητικός ρυθµιστής του µονοπατιού (126), ήταν πολύ χαµηλά (έως µηδενικά), γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι ορισµένοι τουλάχιστον κλάδοι του σηµατοδοτικού µονοπατιού είναι ενεργοί. Σχετικά µε τους υποδοχείς NOD1 και NOD2, η υψηλή έκφραση και των δύο υποδηλώνει την πιθανή αναγνώριση Gram+ βακτηριών, η οποία υποστηρίζεται και από το ρεπερτόριο των εκφραζόµενων υποδοχέων TLR, χωρίς όµως ν αποκλείεται η αναγνώριση Gram- βακτηρίων, εφόσον ο υποδοχέας NOD1 έχει την ικανότητα ν αναγνωρίζει τόσο Gram+ όσο και Gram- βακτήρια (29, 31). 5.2 Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα των µορίων του σηµατοδοτικού µονοπατιού TLR στη χρόνια λεµφοκυτταρική λευχαιµία Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης στηρίζουν την άποψη ότι η σηµατοδοτική οδός TLR είναι ενεργός στη ΧΛΛ, καθώς τα περισσότερα γονίδια της οδού εκφράζονται (µε διακυµάνσεις ως προς τα επίπεδα έκφρασης). Συγκεκριµένα, από τα γονίδια των προσαρµοστών του µονοπατιού των TLR, τα γονίδια TICAM2 και TIRAP παρουσίαζαν πολύ χαµηλή έκφραση. Αυτό πιθανόν οφείλεται στο γεγονός ότι οι συγκεκριµένοι προσαρµοστές εµπλέκονται στο TRIF-εξαρτώµενο µονοπάτι που ενεργοποιείται είτε µέσω του TLR3 είτε, εναλλακτικά, µέσω του TLR4 και, όπως προαναφέρθηκε, ο µεν TLR3 δεν εκφράζεται καθόλου, ενώ ο TLR4 εκφράζεται σε πολύ χαµηλά επίπεδα. Η έκφραση του µορίου TICAM1 που δρα καθοδικά των TLR3 και TLR4 σε συνδυασµό µε την απουσία έκφρασης του TLR3 δείχνει ότι η όποια ενεργοποίηση του TRIF-εξαρτώµενου µονοπατιού στη ΧΛΛ γίνεται αποκλειστικά από τον υποδοχέα TLR4 και όχι από τον TLR3. Επίσης παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του γονιδίου PELI1, γεγονός αναµενόµενο αφού η αντίστοιχη πρωτεΐνη, σε συνδυασµό µε άλλες πρωτεΐνες της ίδιας οικογένειας, έχει προταθεί ότι λειτουργούν ως ικρίωµα (scaffold) στο σηµατοδοτικό µονοπάτι των TLR. Συγκεκριµένα, συνδέεται µε τις πρωτεΐνες TRAF6, TAK1, IRAK1 και IRAK4 (127, 128), οι οποίες εµπλέκονται 65

67 στο ΜyD88 µονοπάτι και επιπλέον παρουσιάζουν δράση Ε3 λιγκάσης της ουµπικουϊτίνης, άρα είναι ικανές να προωθήσουν την ουµπικουϊτινίωση της IRAK1 (129). Αναφορικά µε τους τελεστές, ενδιαφέρον παρουσιάζει η υψηλή έκφραση του µορίου UBE2N σε αντίθεση µε την χαµηλή έκφραση του UBE2V1. Πρόκειται για δυο µόρια που απαιτούνται για την ουµπικουιτινίωση της πρωτεΐνης TRAF6. Τα µόρια αυτά σχηµατίζουν ετεροδιµερή, τα οποία ενώνονται µε την TRAF6 ενεργοποιώντας την κινάση IKK και κατ επέκταση τους µεταγραφικούς παράγοντες NF-κΒ και AP-1 (130). Σχετικά µε τα µόρια που εµπλέκονται στο σηµατοδοτικό µονοπάτι ενεργοποίησης του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, φαίνεται ότι υπάρχει υψηλή έκφραση σε όλα τα µέλη της οικογένειας πρωτεϊνών του NF-κΒ καθώς και των κινασών που συµµετέχουν στην ενεργοποίησή του. Αντίθετα παρατηρείται χαµηλή έκφραση των τελικών στόχων του µονοπατιού, συµπεριλαµβανοµένων των φλεγµονωδών κυτταροκινών. Οι παρατηρήσεις αυτές αποτελούν ενδείξεις ότι το µονοπάτι είναι ενεργό. 5.3 Συγκριτική µελέτη της έκφρασης των TLR σε υποοµάδες ασθενών µε ΧΛΛ Η µέθοδος της ανάλυσης των αποτελεσµάτων (ΔΔCt) προϋποθέτει την ύπαρξη δύο οµάδων για σύγκριση. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας ορίστηκαν τρεις υποοµάδες µελέτης µε βάση: Α. την έκφραση µεταλλαγµένων/αµετάλλακτων αλληλουχιών IGHV γονιδίων Β. την έκφραση του δείκτη CD38 (CD38+/CD38-) Γ. το ρεπερτόριο γονιδίων IGHV (IGHV4-34/άλλες µεταλλαγµένες αλληλουχίες) Οι υποοµάδες αυτές επιλέχθηκαν επειδή εµφανίζουν µοναδικά χαρακτηριστικά και εµφανίζουν διαφορές τόσο σε µοριακό και ανοσοφαινοτυπικό επίπεδο καθώς και στην έκβαση της νόσου. Α. Status µεταλλάξεων Το status µεταλλάξεων των γονιδίων IGHV έχει καθιερωθεί ως ένας από τους σηµαντικότερους γενετικούς δείκτες στον καθορισµό προγνωστικών υποοµάδων στη ΧΛΛ. Σύµφωνα µε το κριτήριο αυτό, οι ασθενείς µε ΧΛΛ κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες: i) ασθενείς των οποίων τα γονίδια IGHV των νεοπλασµατικών Β κυττάρων φέρουν σωµατικές µεταλλάξεις και εµφανίζουν πιο ήπια κλινική εξέλιξη και 66

68 µεγαλύτερη ολική επιβίωση ii) ασθενείς µε αµετάλλακτες αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV οι οποίοι εµφανίζουν πιο δυσµενή εξέλιξη (80, 81). Όπως προκύπτει από την παρούσα µελέτη, αυτές οι δύο κατηγορίες ασθενών παρουσιάζουν διαφορές και ως προς την έκφραση των υποδοχέων TLR και των µορίων της σηµατοδοτικής οδού. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι υπάρχει σηµαντική διαφορά ως προς τα επίπεδα έκφρασης του TLR8 και άλλων µορίων που αποτελούν τελικούς στόχους στο µονοπάτι, ενώ η έκφραση όλων των άλλων µορίων κυµαίνεται στα ίδια επίπεδα. Η αυξηµένη έκφραση του TLR8 στην οµάδα των ασθενών που φέρουν αµετάλλακτες αλληλουχίες γονιδίων IGHV παρέχει ενδείξεις για την αναγνώριση ιικών µοτίβων (15). Η αυξηµένη έκφραση των συνδιεγερτικών µορίων CD80 και CD86 αποτελεί ένδειξη ότι τα κύτταρα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες γονιδίων IGHV έχουν τη δυνατότητα να επικοινωνούν περισσότερο µε τα κύτταρα του µικροπεριβάλλοντός τους. H αλληλεπίδραση των CD80 και CD86 µε τους υποδοχείς των Τ λεµφοκυττάρων CD28 και CTLA4, αντιστοίχως, έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή συνδιεγερτικών σηµάτων που οδηγούν σ ενεργοποίηση, πολλαπλασιασµό, διαφοροποίηση και επιβίωση των T λεµφοκυττάρων. Το µόριο CD154 είναι συνδέτης του υποδοχέα CD40 και αποτελεί µία επιφανειακή γλυκοπρωτεΐνη των CD4+ λεµφοκυττάρων ενώ ο υποδοχέας του, CD40, εκφράζεται στα φυσιολογικά Β λεµφοκύτταρα, τα µονοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα. Η έκφραση του CD154 από τα Τ λεµφοκύτταρα επιτρέπει την ενεργοποίηση µέσω του CD40 των Β λεµφοκυττάρων (και των υπολοίπων κυττάρων που φέρουν τον υποδοχέα CD40) και την παραγωγή συνδιεγερτικών µορίων από αυτά. Μάλιστα, έχει αναφερθεί ότι τα ενεργοποιηµένα Τ λεµφοκύτταρα µπορεί να συνδεθούν µέσω του υποδοχέα CD40 στα Β λεµφοκύτταρα της ΧΛΛ και, σε συνδυασµό µε σηµατοδότηση µέσω του TNF, να οδηγήσουν τα λευχαιµικά κύτταρα στην έκφραση επιφανειακών συνδιεγερτικών µορίων όπως το CD80. Τέτοια συµβάντα αυξάνουν την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα των λευχαιµικών Β λεµφοκυττάρων, η οποία είναι γενικά περιορισµένη. Η ερευνητική οµάδα του Kato (1998) κατασκεύασε ένα φορέα που κωδικοποιούσε ένα λειτουργικό ετερόλογο συνδέτη του υποδοχέα CD40 (CD154) και εξέτασε αν η µόλυνση Β λεµφοκυττάρων της ΧΛΛ µε τον παραπάνω φορέα µπορούσε να προκαλέσει αλλαγές στο φαινότυπό τους, οδηγώντας στην αναγνώρισή τους από τα Τ κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα. Τα αποτελέσµατα του πειράµατος ήταν θετικά και έδειξαν ότι όχι µόνο τα λευχαιµικά Β λεµφοκύτταρα που µολύνθηκαν από τον ιό µπορούσαν να δράσουν καλύτερα ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα αλλά και τα παρακείµενα Β λεµφοκύτταρα (131). 67

69 Έχει αναφερθεί ότι γενετικά τροποποιηµένα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν συνδιεγερτικά µόρια παρουσιάζουν αντικαρκινικές αποκρίσεις. Επίσης, σε ζωικά καρκινικά µοντέλα, η έκφραση των συνδιεγερτικών µορίων της οικογένειας στην οποία ανήκουν τα µόρια CD80 και CD86 (οικογένεια Β7) φαίνεται ότι συνδέεται µε ηπιότερη πορεία της νόσου ( ). Όλα τα παραπάνω θα µπορούσαν να ερµηνεύσουν εν µέρει την πιο ήπια κλινική πορεία που παρουσιάζουν οι ασθενείς που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV γονιδίων. Επιπλέον, η αυξηµένη έκφραση της IFNγ στην οµάδα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV γονιδίων µπορεί να ερµηνευτεί µε κριτήριο τις ιδιότητές της. Οι ιντερφερόνες παρεµποδίζουν την κυτταρική ανάπτυξη και ρυθµίζουν την απόπτωση (135): έχουν είτε προαποπτωτική είτε αντιαποπτωτική δράση, ανάλογα µε το στάδιο της κυτταρικής διαφοροποίησης ( ). Όλα τα µέλη της οικογένειας των ιντερφερονών έχουν την ικανότητα να ενισχύουν την έκφραση των αντιγόνων ιστοσυµβατότητας τάξης Ι (MHC class I) και έτσι να προωθούν την ανάπτυξη των CD8 Τ λεµφοκυττάρων (139). Η διεργασία αυτή διεκπεραιώνεται µέσω ρύθµισης της έκφρασης πολλών πρωτεϊνών που απαιτούνται για την παραγωγή των αντιγονικών πεπτιδίων (140). Τα παραπάνω λειτουργικά χαρακτηριστικά που προσδίδει η IFNγ στα κύτταρα από τα οποία εκφράζεται έρχονται σε συµφωνία µε τα χαρακτηριστικά που παρουσιάζουν τα B λεµφοκύτταρα της οµάδας των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV γονιδίων. Συγκεκριµένα, η αυξηµένη έκφραση της IFNγ από τα Β κύτταρα των ασθενών µε µεταλλαγµένες IGHV αλληλουχίες δείχνει ότι τα κύτταρα αυτά είναι πιο επιρρεπή σε απόπτωση και σε αναγνώριση από κυτταροτοξικά Τ λεµφοκύτταρα, µηχανισµοί που καταστέλλουν το νεοπλασµατικό κλώνο. Η παραπάνω ερµηνεία συµβαδίζει µε τη θετική έκβαση της νόσου στην οµάδα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV γονιδίων. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι τα Β λεµφοκύτταρα του ανθρώπου εκφράζουν την κυκλοοξυγενάση Cox-2 (PTGS2) και παράγουν προσταγλανδίνη PGE2 µετά από ενεργοποίηση µέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα και του υποδοχέα CD40 (141). Συνεπώς, η υψηλή έκφραση του PTGS2 στην οµάδα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV γονιδίων σχετίζεται άµεσα µε την υψηλή έκφραση CD80 και CD86, γεγονός που έχει συνδεθεί µε την ενεργοποίηση των Β λεµφοκυττάρων (131). Το γεγονός αυτό βρίσκεται σε αντίθεση µε την υπάρχουσα βιβλιογραφία που αναφέρει ότι παρατηρείται υψηλή έκφραση του PTGS2 σε ασθενείς που φέρουν αµετάλλακτες αλληλουχίες των γονιδίων IGHV (142). Το µόριο CD180 παρουσιάζει οµολογία µε τους υποδοχείς TLR (142) και αρχικά είχε αναγνωριστεί σε ανθρώπινα παρθένα Β λεµφοκύτταρα, αλλά όχι σε Β λεµφοκύτταρα 68

70 του βλαστικού κέντρου (144, 145). Στην παρούσα εργασία, τα επίπεδα έκφρασης του CD180 ήταν πολύ υψηλότερα σε ασθενείς µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες των γονιδίων IGHV (M-IGHV), εύρηµα σε συµφωνία µε πρόσφατη εργασία. Β. Έκφραση του µορίου CD38 Το µόριο CD38 έχει ενεργότητα κυκλάσης διφωσφορικής ριβόζης της αδενοσίνης και υπό συγκεκριµένες συνθήκες ενισχύει τη σηµατοδότηση του B κυτταρικού υποδοχέα (146). Ωστόσο, το µόριο CD38 από µόνο του δε µεσολαβεί τη σηµατοδότηση των B κυττάρων της ΧΛΛ, καθώς µετά τη διασύνδεσή του (cross-lining) δεν παρατηρείται εισροή ιόντων ασβεστίου στα κύτταρα. Η οµάδα ασθενών που εκφράζουν µεταλλαγµένα γονίδια IGHV συνήθως παρουσιάζουν χαµηλά επίπεδα CD38 (CD38-), σε αντίθεση µε τους ασθενείς µε αµετάλλακτα γονίδια που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του αντίστοιχου δείκτη (CD38+), χωρίς να υπάρχει απόλυτη αντιστοιχία ( ). Αυτό επαληθεύεται εν µέρει και από τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης. Συγκεκριµένα, η σύγκριση των οµάδων ασθενών µε χαµηλή ή υψηλή έκφραση του µορίου CD38 ανέδειξε υπερέκφραση των µορίων CD80, CD86, IFNγ, CD180 και υποέκφραση του TLR8 στην οµάδα CD38-. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι γενικά σύµφωνα µε τα ευρήµατα από την αντιπαραβολή των οµάδων µε µεταλλαγµένες ή αµετάλλακτες αλληλουχίες των IGHV γονιδίων. Γ. Το γονίδιο IGHV4-34 Το γονίδιο IGHV4-34 είναι ένα από τα πιο συχνά γονίδια στον ανθρώπινο οργανισµό και η έκφρασή του συνδέεται µε εκδηλώσεις αυτοανοσίας. Οι ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34 εµφανίζουν εγγενή αυτοαντιδραστικότητα, καθώς αναγνωρίζουν µέσω της περιοχής FR1 τον αντιγονικό καθοριστή της Ν-ακετυλο-λακτοζαµίνης (Nacetyllactosamine, NAL), που ανήκει στη οµάδα των αντιγόνων αίµατος I/i (150). Ορισµένες ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34 µπορούν να δεσµεύσουν µόρια DNA. Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι συγκεκριµένες ανοσοσφαιρίνες αναγνωρίζουν και µια ισοµορφή του επιφανειακού υποδοχέα CD45 που εκφράζεται κυρίως από άωρα Β λεµφοκύτταρα ( ). Ο επιφανειακός αυτός υποδοχέας είναι µια πρωτεΐνη µε κεντρική σηµασία για τη λειτουργία των Β λεµφοκυττάρων επειδή αποτελεί τον κύριο αντιγονικό καθοριστή των Τ λεµφοκυττάρων. Οι ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34 είναι σπάνιες στον ορό φυσιολογικών ανθρώπων, µολονότι το γονίδιο είναι πολύ συχνό στο ρεπερτόριο των περιφερικών Β λεµφοκυττάρων. Αυτό οδηγεί στο συµπέρασµα ότι το πεπρωµένο των περισσότερων 69

71 φυσιολογικών κύτταρων που εκφράζουν ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34 είναι να γίνουν ανεργικά, ώστε να περιοριστεί το ενδεχόµενο κλινικών εκδηλώσεων αυτοανοσίας (152). Κατά τη σύγκριση της οµάδας ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες για κάποιο IGHV γονίδιο εκτός από το γονίδιο IGHV4-34, µε την οµάδα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες για το γονίδιο IGHV4-34, στην πρώτη οµάδα παρατηρήθηκε πολύ υψηλή έκφραση του µορίου HSPA1A (HSP70), µέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών θερµικού shock. H HSP70 είναι αντιαποπτωτική πρωτεΐνη που ενισχύει την παρουσίαση αντιγόνων από διάφορα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως τα δενδριτικά κύτταρα και τα Β λεµφοκύτταρα (154). Οι πρωτεΐνες θερµικού shock διεγείρουν µια άνοση απάντηση µε δύο συστατικά: (i) µεταφορά του αντιγόνου για παρουσίαση στα αντιγόνα ιστοσυµβατότητας τάξης Ι των δενδριτικών κυττάρων, (ii) διέγερση των αντιγονοπαρουσιατικών κυττάρων για την παραγωγή φλεγµονωδών κυτταροκινών (IL-1β, ΙL-6, IL-10 και TNF) και συνδιεγερτικών µορίων, µε αποτέλεσµα την δηµιουργία ενός ανοσογονικού περιβάλλοντος που απαιτείται για την επαγωγή της προσαρµοστικής ανοσίας µέσω των Τ κυτταροτοξικών (CD8+) λεµφοκυττάρων (154, 155). Έτσι, ενδεχοµένως, µπορεί να εξηγηθεί η υψηλή έκφραση της IL-6, IL-10 και TNF στην οµάδα ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες για κάποιο IGHV γονίδιο εκτός από το IGHV4-34, της παρούσας µελέτης, ενώ παράλληλα να συσχετιστεί µε την υπόθεση ότι το πεπρωµένο των κυττάρων IGHV4-34 είναι να γίνουν ανεργικά. Στην οµάδα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες για κάποιο γονίδιο IGHV εκτός από το IGHV4-34, παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την IRAK2. Η πρωτεΐνη IRAK2 αλληλεπιδρά µε τους παράγοντες TRAF6 και MyD88 και ενεργοποιεί το µεταγραφικό παράγονται NF-κΒ. Επίσης, βρέθηκε ότι συνδέεται µε τη ΜAL µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του NF-κΒ µέσω του σηµατοδοτικού µονοπατιού των TLR2/TLR4 και TLR3 (156, 157). Σε πρωτεϊνικό επίπεδο, η απουσία της IRAK2 έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της παραγωγής ορισµένων προγλεφµονωδών κυτταροκινών (π.χ. TNF και IL-6) (158). Αυτό ίσως ερµηνεύει γιατί στην οµάδα µε υψηλή έκφραση της IRAK2 υπάρχει ταυτόχρονα υψηλή έκφραση των TNF και IL-6, προσδίδοντας παράλληλα έναν πιο ενεργό χαρακτήρα στα λευχαιµικά Β λεµφοκύτταρα των ασθενών που δεν φέρουν το γονίδιο IGHV4-34. Στην ίδια οµάδα ασθενών παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί τον παράγοντα FOS. Η υψηλή έκφραση του µεταγραφικού παράγοντα FΟS σχετίζεται µε υψηλή έκφραση των µορίων IL-6, IL-10, TNF και IFNγ. Η άποψη 70

72 αυτή στηρίζεται σε πρόσφατη µελέτη στην οποία διερευνήθηκαν τα αποτελέσµατα της συνδιεγερτικής δράσης των TLR και του CD40 στο B κυτταρικό υποδοχέα. Μετά από διέγερση µέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα, του CD40 και του TLR7, παρατηρήθηκε παραγωγή της IL-6 τόσο στα πρώιµα Β λεµφοκύτταρα του ανθρώπου όσο και στ αντίστοιχα του ποντικού. Φάνηκε ότι η υψηλή παραγωγή της IL-6 εξαρτάται από τη δραστικότητα της κινάσης c-jun (JNK) και c-fos. Η διπλή διέγερση µέσω του CD40 και του TLR7 ενίσχυσε τη δραστικότητα της JNK, γεγονός που συνοδεύτηκε από αύξηση των επιπέδων των µονοµερών του ενεργού συµπλόκου AP-1, c-jun και c-fos. Το τελικό αποτέλεσµα ήταν η αύξηση της παραγωγής κυτταροκινών (159). Τα παραπάνω δεδοµένα εξηγούν ενδεχοµένως γιατί παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του FOS στην ίδια οµάδα όπου παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση των µορίων IL-6, IL-10, TNF και IFNγ. Συνοψίζοντας, παρατηρήθηκε ότι στα λευχαιµικά Β λεµφοκύτταρα των ασθενών που φέρουν µεταλλαγµένες αλληλουχίες για κάποιο γονίδιο IGHV εκτός από το IGHV4-34, εκφράζονται τα γονίδια HSP70, IRAK2 και FOS σε πολύ υψηλότερα επίπεδα συγκριτικά µε τα λευχαιµικά Β λεµφοκύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο IGHV4-34. Οι παράγοντες που κωδικοποιούνται από τα παραπάνω γονίδια συµµετέχουν σε σηµατοδοτικά µονοπάτια µε αποτέλεσµα την παραγωγή των µορίων IL-6, Il-10, TNF, IFNγ. Αντίθετα, η συγκριτικά χαµηλή έκφραση των κυτταροκινών στην οµάδα των ασθενών που έφεραν το γονίδιο IGHV4-34 ενδεχοµένως υποδηλώνει την ανεργική κατάσταση των συγκεκριµένων λευχαιµικών Β λεµφοκυττάρων (Εικόνα 31). 71

73 Εικόνα 31 : Σχηµατική απεικόνιση των διαφορών στην έκφραση µορίων και την εξέλιξη ανάµεσα σε ένα λευχαιµικό Β-λεµφοκύτταρο µε οποιοδήποτε IGHV γονίδιο µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες και σε ένα λευχαιµικό Β-λεµφοκύτταρο µε µεταλλαγµένες αλληλουχίες IGHV