ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΘΕΙΟΛΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ο-φθαλαδιαλδεϋδησ ΚΑΙ MONOBROMOBIMANE ΩΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΑΝΩ Δ. ΚΑΡΑΚΩΣΤΑ ΧΗΜΙΚΟΣ Επιβλέπων: Λέκτορας Π.Δ. Τζαναβάρας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2009

2 Πρόλογος i Πρόλογος Στην παρούσα µεταπτυχιακή εργασία αναπτύχθηκαν δύο νέες, αυτόµατες µέθοδοι για τον φθορισµοµετρικό προσδιορισµό φαρµακευτικά δραστικών θειολών και πιο συγκεκριµένα της καπτοπρίλης, της Ν-ακέτυλοκυστεΐνης και της πενικιλλαµίνης. Οι προτεινόµενες µέθοδοι βασίζονται στην αυτόµατη τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή (Sequential Injection Analysis, SIA). Η εργασία χωρίζεται σε δύο ενότητες. Στο θεωρητικό µέρος αναφέρονται αρχικά κάποιοι ορισµοί, ενώ στη συνέχεια καταγράφονται όλες οι αρχές που διέπουν τις αντιδράσεις παραγωγοποίησης, τον φθορισµό και τις τεχνικές FIA και SIA. Στο τέλος παρουσιάζεται µια βιβλιογραφική ανασκόπηση των εργασιών που είχαν ήδη, κατά το παρελθόν, προτείνει διαφορετικές µεθόδους προσδιορισµού για τις συγκεκριµένες ενώσεις. Στο δεύτερο µέρος της εργασίας επιχειρείται µια προσπάθεια, όσο το δυνατόν λεπτοµερέστερης περιγραφής όλων των πειραµατικών προσδιορισµών, που πραγµατοποιήθηκαν στο εργαστήριο, για την ανάπτυξη των νέων µεθόδων. Τα πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν στο εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, του τµήµατος Χηµείας, της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήµιου Θεσσαλονίκης και διήρκησαν από τον Αύγουστο του 2008 µέχρι τον εκέµβριο του ίδιου έτους. Το θέµα της µεταπτυχιακής µου εργασίας υποδείχθηκε από τον λέκτορα Παρασκευά. Τζαναβάρα, ο οποίος και είχε την εποπτεία της µέχρι την ολοκλήρωσή της. Τον ευχαριστώ θερµά για την αµέριστη συµπαράστασή του, τη συνεχή επιστηµονική του καθοδήγηση και την καθηµερινή του παρουσία. Ιδιαίτερες ευχαριστίες χρωστώ στον αναπληρωτή καθηγητή ηµήτριο Γ. Θεµελή και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Ζώτου Αναστασία για την εµπιστοσύνη που µου έδειξαν και το αµείωτο ενδιαφέρον τους από την αρχή µέχρι το τέλος των µεταπτυχιακών µου σπουδών. Κλείνοντας το προλογικό αυτό σηµείωµα θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους µε βοήθησαν σε αυτήν µου την προσπάθεια. Ευχαριστίες για την φιλική ατµόσφαιρα στο καθηµερινό περιβάλλον εργασίας οφείλω στον λέκτορα Π.. 407/80 κ. Κώστα Ζαχαρή, µα πάνω απ όλα στους καθηγητές µου, του Τοµέα Αναλυτικής και Περιβαλλοντολογικής Χηµείας, για όλα όσα µου προσέφεραν κατά την διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών.

3 Πρόλογος ii Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά µου για την ηθική και υλική συµπαράστασή της, χωρίς την οποία η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήταν αδύνατη. Στους καθηγητές µου και στην οικογένειά µου οφείλω πολύ περισσότερα από όσα η απλή µνεία εδώ θα µπορούσε να αποδώσει. Θεανώ. Καρακώστα Θεσσαλονίκη, Ιανουάριος 2009

4 Περιεχόµενα Περιεχόµενα Πρόλογος i ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή 1 1. Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο Ορισµοί Ανάγκη για αυτοµατοποίηση - Πλεονεκτήµατα 5 Βιβλιογραφία 5 2. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Βασικές αρχές λειτουργίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA Αναχαίτιση ροής σε συτήµατα SIA Πλεονεκτήµατα Μειονεκτήµατα SIA 13 Βιβλιογραφία Παραγωγοποίηση : Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 15 Βιβλιογραφία Φθορισµοµετρία Φωταύγεια Σχέση δοµής ενώσεως και φθορισµού Φαινόµενο Quenching Αναλυτική φθορισµοµετρία 23 Βιβλιογραφία 24

5 Περιεχόµενα 5. Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση 25 Βιβλιογραφία Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και χρησιµοποιούµενων αντιδραστηρίων Καπτοπρίλη Ν-ακέτυλοκυστεΐνη Πενικιλλαµίνη Ο φθαλαλδεΰδη Monobromobimane 32 Βιβλιογραφία Βιβλιογραφική επισκόπηση 34 Βιβλιογραφία 40 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8. Αντιδραστήρια Οργανολογία Αντιδραστήρια Οργανολογία Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός φαρµακευτικά δραστικών θειολών µε την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων µετά από παραγωγοποίηση µε ο-φθαλαδιαλδεΰδη Αρχή µεθόδου Προσδιορισµός των θειολών σε υδατικά διαλύµατα Προσδιορισµός των θειολών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός CAP σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Αποτελέσµατα και Συζήτηση 49

6 Περιεχόµενα Προκαταρκτικά Πειράµατα Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων Επίδραση παροχής όγκου µεταφορέα προς τον ανιχνευτή Επίδραση του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος Επίδραση του όγκου του αντιδραστηρίου (R) Επίδραση του όγκου της ΟΡΑ Επίδραση του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης Μελέτη χηµικών παραµέτρων Επίδραση της θερµοκρασίας Επίδραση του είδους του αµινοξέως και του ph Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της γλυκίνης Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της OPA Επικύρωση της αναλυτικής µεθόδου Γραµµικότητα της µεθόδου Εύρος προσδιορισµού της µεθόδου Επαναληψιµότητα της µεθόδου Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού Εκλεκτικότητα της µεθόδου Ακρίβεια της µεθόδου Εφαρµογές της µεθόδου Συµπεράσµατα Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός φαρµακευτικά δραστικών θειολών µε την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων µετά από παραγωγοποίηση µε monoboromobimane Αρχή µεθόδου Προσδιορισµός των θειολών σε υδατικά διαλύµατα Προσδιορισµός των θειολών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός CAP σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα 73

7 Περιεχόµενα Αποτελέσµατα και Συζήτηση Προκαταρκτικά Πειράµατα Μελέτη χηµικών παραµέτρων Επίδραση του ph Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ΜΒΒ Επίδραση της θερµοκρασίας Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων Επίδραση του όγκου του ΜΒΒ Επίδραση του όγκου του ρυθµιστικού διαλύµατος Επίδραση του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος Επίδραση παροχής όγκου µεταφορέα προς τον ανιχνευτή Επίδραση του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης Επικύρωση της αναλυτικής µεθόδου Γραµµικότητα της µεθόδου Εύρος προσδιορισµού της µεθόδου Επαναληψιµότητα της µεθόδου Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού Εκλεκτικότητα της µεθόδου Ακρίβεια της µεθόδου Εφαρµογές της µεθόδου Συµπεράσµατα Περίληψη 95

8 Εισαγωγή 1 Εισαγωγή Η προσπάθεια για βελτιστοποίηση των ήδη υπαρχουσών αναλυτικών µεθόδων από άποψη ευαισθησίας, ακρίβειας επαναληψιµότητας, µείωσης του χρόνου και του κόστους ανάλυσης και ταυτόχρονα µερικής ή ολικής αντικατάστασης του ανθρώπινου παράγοντα σε αναλύσεις ρουτίνας οδήγησε στην έρευνα για την αυτοµατοποίηση των αναλυτικών τεχνικών. Η έρευνα αυτή είχε σαν αποτέλεσµα την εξέλιξη ενός σηµαντικού κλάδου της αναλυτικής χηµείας. Η τεχνική που κυριάρχησε αρχικά και µονοπώλησε την πρωτοκαθεδρία στην αυτοµατοποιηµένη ανάλυση ήταν αυτή της αεροδιαχωριζόµενης ροής. Όταν µερικά χρόνια αργότερα εµφανίστηκαν η τεχνική αναλύσεων µε εισαγωγή του δείγµατος σε συνεχή ροή (FIA) και η διαδοχική έγχυση του δείγµατος σε ροή (SIA) οριοθετήθηκε µια νέα εποχή στις αυτοµατοποιηµένες µεθόδους αναλύσεων. Οι παραπάνω τεχνικές στηρίζονται στη χρησιµοποίηση µη διαχωριζόµενων ρευµάτων αντιδραστηρίων και δείγµατος και εισήγαγαν σηµαντικές βελτιώσεις, όπως η αυξηµένη συχνότητα δειγµατοληψίας και αναλύσεων, η άµεση λήψη αποτελεσµάτων, η ευελιξία της ανάλυσης και το µειωµένο κόστος ανάλυσης. Μα πάνω από όλα η ελεγχόµενη διασπορά της ζώνης του δείγµατος σε συνδυασµό µε τον επαναλήψιµο χρόνο από την εισαγωγή του δείγµατος µέχρι την είσοδό του στον ανιχνευτή κατέστησαν δυνατή τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσµάτων ακόµα και όταν στο σύστηµα της αντίδρασης δεν έχει προλάβει να επιτευχθεί κατάσταση φυσικής και χηµικής ισορροπίας. Στην παρούσα µεταπτυχιακή εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη δυο νέων αυτοµατοποιηµένων αναλυτικών µεθόδων για τον φθορισµοµετρικό προσδιορισµό θειολικών ενώσεων, χρησιµοποιώντας τη διαδοχική έγχυση του δείγµατος σε ροή (SIA). Οι θειόλες είναι ευρέως διαδεδοµένες στα ανθρώπινα κύτταρα καθώς είτε βρίσκονται ελεύθερα µέσα σε αυτά, είτε συναντώνται στα µόρια των πρωτεϊνών. Η σουλφυδρυλική οµάδα συναντάται επιπλέον, πολύ συχνά και σε πολλά φαρµακευτικά σκευάσµατα. Οι αναλύσεις συνεπώς των ενώσεων αυτών απασχολεί το ενδιαφέρον πολλών ερευνητικών πεδίων, όπως αυτό της βιοχηµείας, του κλινικού ελέγχου και της φαρµακευτικής ανάλυσης. Η παραγωγοποίηση των θειολικών ενώσεων είναι συχνά αναγκαία προκειµένου να σχηµατιστούν σταθερότερες ενώσεις, µε µεγαλύτερη ικανότητα διαχωρισµού και µε καλύτερη ανιχνευσιµότητα. Τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης που χρησιµοποιούνται αποτελούνται από δύο µέρη. Το δραστικό κοµµάτι του µορίου, το οποίο αντιδρά µε

9 Εισαγωγή 2 την ένωση και το κοµµάτι εκείνο, το οποίο µπορεί να ανιχνευτεί και έτσι έµµεσα να ανιχνευτεί και η προσδιοριζόµενη ένωση. Ειδικότερα, αναπτύχθηκαν, βελτιστοποιήθηκαν και εφαρµόστηκαν µε επιτυχία στη φαρµακευτική ανάλυση οι παρακάτω µέθοδοι: 1. Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός SIA φαρµακευτικά ενεργών θειολών µε χρήση της ο-φθαλαδιαλδεΰδης ως αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης Η προτεινόµενη µέθοδος βασίζεται στην αντίδραση των προσδιοριζόµενων συστατικών καπτοπρίλη, Ν-ακετυλοκυστεΐνη και πενικιλλαµίνη µε την ο- φθαλαδιαλδεΰδη παρουσία γλυκίνης προς σχηµατισµό ισχυρά φθοριζόντων παραγώγων. Η διεργασία της αντίδρασης πραγµατοποιείται εν-ροή σε σύστηµα SIA. Mελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν όλες οι βασικές χηµικές και γεωµετρικές παράµετροι που επηρεάζουν την αποτελεσµατικότητα της µεθόδου. Η προτεινόµενη µέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραµµικότητα και το εύρος προσδιορισµού, την επαναληπτικότητα, την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα. Εφαρµόστηκε µε επιτυχία στον έλεγχο ποιότητας εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων των παραπάνω δραστικών θειολών. 2. Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός SIA φαρµακευτικά ενεργών θειολών µε χρήση του monobromobimane ως αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης Η προτεινόµενη µέθοδος βασίζεται στην αντίδραση των προσδιοριζόµενων συστατικών καπτοπρίλη, Ν-ακετυλοκυστεΐνη και πενικιλλαµίνη µε το monobromobimane σε αλκαλικό περιβάλλον προς σχηµατισµό ισχυρά φθοριζόντων παραγώγων. Η διεργασία της αντίδρασης πραγµατοποιείται εν-ροή σε σύστηµα SIA. Mελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν όλες οι βασικές χηµικές και γεωµετρικές παράµετροι που επηρεάζουν την αποτελεσµατικότητα της µεθόδου. Η προτεινόµενη µέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραµµικότητα και το εύρος προσδιορισµού, την επαναληπτικότητα, την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα. Εφαρµόστηκε µε επιτυχία στον έλεγχο ποιότητας εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων των παραπάνω δραστικών θειολών. Η µέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν η πρώτη χρησιµοποίηση του monobromobimane ως αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης σε συστήµατα συνεχούς ροής FIA ή SIA. Και οι δύο µέθοδοι που αναπτύχθηκαν είναι απλές, γρήγορες, µε µικρή κατανάλωση δειγµάτων και αντιδραστηρίων. εν απαιτούν πολύπλοκη

10 Εισαγωγή 3 προκατεργασία των δειγµάτων πριν την εισαγωγή τους στον αναλυτή, ενώ έχουν επαρκή αναλυτικά χαρακτηριστικά για τον αποτελεσµατικό έλεγχο ποιότητας των φαρµακευτικών σκευασµάτων.

11 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 4 Κεφάλαιο 1 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.1. Ορισµοί Η έννοια της «αυτοµατοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της ιεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC) [1], παρερµηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χηµικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισµός καθαυτός συµπεριλαµβάνει στη διατύπωσή του ορισµούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, εποµένως ο ορισµός της «αυτοµατοποίησης» κρίνεται σκόπιµο να δοθούν αρχικά οι ορισµοί όλων εκείνων των εννοιών που µπορεί να συγχέονται µεταξύ τους [1,2]. Σύµφωνα, λοιπόν, µε την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της ιεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC), «µηχανισµός» ονοµάζεται ο κατάλληλος συνδυασµός των εξαρτηµάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή µπορεί να κινείται. Μια «µηχανή» είναι µια διάταξη που αποτελείται από έναν οι περισσότερους µηχανισµούς. Οι µηχανισµοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν µια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύµφωνα πάντα µε την IUPAC µε τον όρο «µηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιµοποίηση µηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συµπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστηµονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιµοποιούνται για την παρατήρηση, µέτρηση ή έλεγχο µιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συµπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιµοποιούνται για την εκτέλεση µιας αναλυτικής µεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους µηχανισµούς. «Αυτοµατοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασµένη χρήση µηχανών και οργάνων µε σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συµπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγµατοποίηση µιας δεδοµένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέµβαση αλλά από ένα σύστηµα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστηµα ανάδρασης είναι µια µηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που συνδυάζει την λήψη πληροφοριών, από διάφορους αισθητήρες, και την αποστολή

12 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 5 εντολών τροποποιώντας τις επιµέρους λειτουργίες των οργάνων µε σκοπό την παραγωγή συγκεκριµένου έργου Ανάγκη για αυτοµατοποίηση - Πλεονεκτήµατα Οι ολοένα αυξανόµενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονοµικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγµάτων (βιολογικών, βιοµηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρµακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοµατοποιηµένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές οµάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [3]. Οι στόχοι, που έπρεπε να επιτευχθούν, ήταν πολλοί, µε αρχικό πάντα γνώµονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σηµαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη αυτοµατοποιηµένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναµικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σηµαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι µόνο στον µεγαλύτερο δυνατό αριθµό αναλύσεων, αλλά και στην µεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, µιας και η έκθεσή του σε επικινδύνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, µε τον τρόπο αυτό, σηµαντικά. Πολύπλοκες µεθοδολογίες µπορούν πλέον να πραγµατοποιούνται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα και µε λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγµατος αλλά και πολύ πιο οικονοµικά. Ο µεγάλος αριθµός αναλύσεων οδηγεί στην µείωση του κόστους τις κάθε επιµέρους ανάλυσης και το πλεονέκτηµα αυτό γίνεται ακόµα σηµαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγµατα είναι πολύτιµα ή περιορισµένης ποσότητας. Η ανάγκη για άµεση λήψη αναλυτικών αποτελεσµάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές µε τη σειρά τους στην αυτοµατοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισµός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηµατικών σφαλµάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιµότητα των µετρήσεων. Βιβλιογραφία [1] IUPAC, Compendium of Analytical Nomenclature, The Orange Book, 1 st Edition, Pergamon Press, New York, [2] Σηµειώσεις µαθήµατος του Μ.Π.Σ. του τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ., «Προχωρηµένη Ενόργανη Χηµική Ανάλυση» ( ιδάσκον: Επικ. Καθ. Α. Ανθεµίδης).

13 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 6 [3].Γ. Θεµελή, Αυτόµατες µέθοδοι χηµικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη, 1998.

14 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 7 Κεφάλαιο 2 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 2.1 Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Η τεχνική των Aυτόµατων Aναλύσεων µε Έγχυση του είγµατος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε κάπου στα µέσα του 1974 όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισµό ατµών αµµωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη µέτρηση της µερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάµειξη του δείγµατος µε κινούµενο ρεύµα NaOH µε την βοήθεια µιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάµειξη των ρευµάτων γινόταν αµέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόµενοι ατµοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβληµα, όµως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγµατα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε µία στιγµή εκνευρισµού οι ερευνητές, µε τη χρήση µιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύµα NaOH µια ποσότητα δείγµατος ορισµένης συγκέντρωσης και προς µεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή µιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιµη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [1]. Χωρίς ακόµα να έχουν συνειδητοποιήσει την σηµαντικότητα της ανακάλυψης τους, δηµοσιεύουν στα 1975 την πρώτη τους εργασία [2] και µερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισµό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [3]. Σύµφωνα µε τους ερευνητές, «Η FIA είναι µια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγµατος σε συνεχές, µη διακοπτόµενο, κινούµενο ρεύµα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόµενο δείγµα σχηµατίζει µια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος µετρά τη συνεχή µεταβολή µιας φυσικοχηµικής παραµέτρου του δείγµατος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισµό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγµή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγµατος σε µη διακοπτόµενο ρεύµα ροής. Παρόλαυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισµός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονοµάζεται η συλλογή πληροφοριών µέσω της βαθµίδωσης της συγκέντρωσης που δηµιουργείται όταν µια αυστηρά καθορισµένη ζώνη δείγµατος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα µη διακοπτόµενο ρεύµα µεταφορέα» [1]. Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούµενη αλλά δρα συµπληρωµατικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η

15 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 8 αυστηρά καθορισµένη και ελεγχόµενη διασπορά της ζώνης του δείγµατος. Αυτή η αρχή, συνεπώς δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για λήψη αποτελεσµάτων πριν ακόµα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση, τόσο φυσικής όσο και χηµικής, ισορροπίας. Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [4]: 1. Ο αυστηρά καθορισµένος όγκος δείγµατος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύµα κατάλληλου µεταφορέα ή αντιδραστηρίου 2. Η συνεχής και µη διακοπτόµενη ροή των διαλυµάτων 3. Η ελεγχόµενη και επαναλήψιµη διασπορά της ζώνης του δείγµατος. 4. Ο επαναλήψιµος χρόνο παραµονής του δείγµατος στο σύστηµα. Μια δεκαετία περίπου µετά την εισαγωγή της FIA στην πραγµατικότητα της χηµικής ανάλυσης, η αυξανόµενη απαίτηση κυρίως από τους χώρους της βιοµηχανίας και της κλινικής χηµείας για µια αυτοµατοποιηµένη τεχνική, µε πιο απλά και ανθεκτικά µηχανικά µέρη, τα οποία να µην έχουν αυξηµένες απαιτήσεις για συντήρηση αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες µετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της ιαδοχικής Έγχυσης του δείγµατος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [5]. Η τεχνική αυτή αποτελεί ουσιαστικά τη δεύτερη γενιά της FIA, και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήµατα αυτής. Τα προβλήµατα αυτά ήταν : 1. Η κατανάλωση µεγάλων όγκων αντιδραστηρίου, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου 2. Η συχνά απαιτούµενη βαθµονόµηση του συστήµατος 3. Το υψηλό πολλές φορές κόστος συντήρησης των µηχανικών τµηµάτων του συστήµατος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιµων τµηµάτων, όπως τα κανάλια ροής που µε το πέρασµα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιµοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάµιξη των διαλυµάτων και την αντίδραση τους. 2.2 Βασικές αρχές λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγµατος και αντιδραστηρίου, ελεγχόµενη διασπορά και επαναλήψιµος χρόνος από τη στιγµή της έγχυσης του δείγµατος µέχρι την έξοδό του.) Η επιτυχία της νέας αυτής τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συµβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς µετακινείται το δείγµα

16 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 9 µέσα στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη µία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγµατος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χηµική διεργασία σχηµατισµού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγµατος και του αντιδραστηρίου µε τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να µπορούν να πραγµατοποιηθούν διάφορες χηµικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασµός του πολλαπλού τµήµατος ανάµειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. Η καρδία εποµένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεµένες µε τους περιέκτες των δειγµάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστηµα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται µέσω ενός σπειράµατος παραµονής (holding coil - HC) µε κατάλληλη αντλία, µε τη βοήθεια της οποίας µπορούµε να επιλέξουµε τη φορά της ροής των διαλυµάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη µια κατεύθυνση αναρροφώνται, µέσω της βαλβίδας, συγκεκριµένοι όγκοι δείγµατος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνται στοιβάζονται στο σπείραµα παραµονής. Στη συνέχεια θέτουµε την αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγµένες ζώνες προωθούνται µέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστηµα ανίχνευσης. Η χηµική αντίδραση πραγµατοποιείται µε διέλευση των ζωνών δια µέσω κατάλληλου σπειράµατος, στο οποίο λαµβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηµατισµός του επιθυµητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η µείωση κατανάλωσης όγκου δείγµατος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η µείωση του όγκου των παραγόµενων αποβλήτων. Ένα τυπικό διάγραµµα ροής SIA καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται σχηµατικά στα σχήµατα 2.1 και 2.2 αντίστοιχα. Σχήµα 2.1. Τυπικό διάγραµµα ροής αναλυτή SIA.

17 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 10 Σχήµα 2.2. Αρχή λειτουργίας της SIA [6]. (A) Έγχυση καθορισµένου όγκου δείγµατος. (B)Έγχυση καθορισµένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηµατίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύµατος του µεταφορέα ή δεύτερου διαλύµατος αντιδραστηρίου ( ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. Συνοψίζοντας µπορούµε να πούµε ότι η SIA είναι µια τεχνική συνεχούς ροής που πραγµατοποιείται µε απόλυτα επαναλήψιµο χειρισµό των ζωνών του δείγµατος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες µη θερµοδυναµικής ισορροπίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τα βασικά τµήµατα από τα οποία αποτελείται ένας αναλυτής SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγµατοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγµάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, µε αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγµατοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισµικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιµη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιµοποιούνται σε συστήµατα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτηµα των περισταλτικών αντλιών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγµένες από παλµούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιµοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσµατος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το

18 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 11 µειονέκτηµα της καθορισµένης χωρητικότητας, µε αποτέλεσµα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέµισµά τους µε το διάλυµα του µεταφορέα. 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχουν συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει µια βαλβίδα είναι οι µικροί νεκροί όγκοι ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών όταν δεν είναι επιθυµητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστηµένο λογισµικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραµα παραµονής (holding coil). Το σπείραµα αυτό τοποθετείται µεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και µε τη σειρά που επιθυµεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγµάτων και των αντιδραστηρίων πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράµατος αυτού θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγµατος και αντιδραστηρίου στο διάλυµα του µεταφορέα και να αποφεύγεται η επιµόλυνσή του. 4. Σύστηµα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιµοποιούνται όλα τα διαθέσιµα συστήµατα ανίχνευσης τα οποία µπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 5. Λογισµικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισµικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά µεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισµικό αυτό ελέγχονται πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγµάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάµιξης, παροχές όγκου κ.α.) Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA Ένας τυπικός κύκλος ανάλυσης µε την τεχνική της SIA περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύµατος του µεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράµατος συγκράτησης, του σπειράµατος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) µέχρι λήψη σταθερής γραµµής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισµένου όγκου δείγµατος στο σπείραµα παραµονής. 3. Αναρρόφηση καθορισµένων όγκων διαλυµάτων αντιδραστηρίων στο σπείραµα παραµονής. 4. Προώθηση του µίγµατος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρµοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σηµάτων

19 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα Αναχαίτιση ροής σε συστήµατα SIA (stopped flow -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χηµικό σύστηµα περισσότερος χρόνος προκειµένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγµατος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρµογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισµού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεµποδίσεων υποστρώµατος. 3. Η κινητική θεωρητική µελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη µεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισµών µε κινητική διαφοροποίηση. Στα σχήµατα 2.3 και 2.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαµβανόµενα καταγραφήµατα. Σχήµα 2.3 : Προφίλ ζώνης του δείγµατος µε εφαρµογή αναχαίτισης της ροής [7].

20 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA 13 Σχήµα 2.4: Τυπικό γράφηµα εφαρµογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστηµα SIA / FIA [8]. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηµατισµός του προϊόντος της αντίδρασης µε το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδοµείται κατά τον χρονικό διάστηµα αναχαίτισης της ροής. Η αναχαίτιση της ροής µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε πριν είτε µέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής µέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συµπερασµάτων που αφορούν στο µηχανισµό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση Πλεονεκτήµατα Μειονεκτήµατα SIA Τα βασικά πλεονεκτήµατα της SIA σε σχέση µε την FIA είναι:

21 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή - SIA Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθµό των διαλυµάτων, χρησιµοποιείται µια και µόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, µια µονοκαναλική αντλία και µόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισµό γίνονται σε µονοκαναλικό σύστηµα. 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγµάτων καθώς και οι όγκοι των παραγόµενων αποβλήτων είναι σηµαντικά µικρότεροι αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται µέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισµένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωµετρικές παράµετροι ενός συστήµατος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, µπορούν εύκολα να µεταβάλλονται µε τη βοήθεια κατάλληλου λογισµικού. Τα κυριότερα µειονεκτήµατα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδροµή της, FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισµικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρµογή πολύπλοκων χηµικών συστηµάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας όπως η εκχύλιση υγρού. Βιβλιογραφία [1] Ε.Η. Hansen, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 3. [2] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145. [3] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Flow injection analysis, 1 st edition, Wiley, New York, [4].Γ. Θεµελή, Αυτόµατες µέθοδοι χηµικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη [5] J.Ruzicka, G.D. Marschall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329. [6] J.Ruzicka, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 23. [7] Φ.Σ. Κίκα, «Αναλυτικές εφαρµογές του χρωµοτροπικού οξέως σε αυτοµατοποιηµένα συστήµατα συνεχούς ροής µε τις τεχνικές FIA και SIA». ιδακτορική ιατριβή, Θεσσαλονίκη, [8] Π. Τζαναβάρα, «Ανάπτυξη µεθόδων προσδιορισµού ορισµένων ανιόντων µε την τεχνική της έγχυσης του δείγµατος σε συνεχή ροή», ιδακτορική ιατριβή, Θεσσαλονίκη, 2003.

22 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 15 Κεφάλαιο 3 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα Καθώς κύριος στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί ο προσδιορισµός της καπτοπρίλης, της Ν-ακέτυλοκυστεΐνης και της πενικιλλαµίνης σε υδατικά διαλύµατα και φαρµακευτικά σκευάσµατα, ύστερα από παραγωγοποίηση τους µε τα αντιδραστήρια ο-φθαλαδιαλδεΰδη και monobromobimane, κρίνεται απαραίτητη µια σύντοµη αναφορά στον ορισµό της παραγωγοποίησης, στους στόχους της και στα πλεονεκτήµατά της. Ως παραγωγοποίηση (derivatization) καλείται κάθε πορεία τροποποίησης µιας ένωσης µε χηµικές ή φυσικές µεθόδους υπό κατάλληλες συνθήκες [1], ώστε να δηµιουργηθεί µια νέα ένωση, συνήθως µε δοµή παρόµοια µε αυτήν της αρχικής (παράγωγο), κατάλληλη για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό της µε συνήθεις και καθιερωµένες µεθόδους χηµικής ανάλυσης. Το γενικό σχήµα µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης είναι: Α (αρχική ένωση) + R (αντιδραστήριο) P (παράγωγο) Πιο συγκεκριµένα, κατά την παραγωγοποίηση, που δεν είναι τίποτα άλλο παρά ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος, µια συγκεκριµένη δραστική οµάδα της ένωσης συµµετέχει στην αντίδραση παραγωγοποίησης µε αποτέλεσµα την µετατροπή της ένωσης σε ένα παράγωγο, το οποίο διαφέρει από την αρχική ένωση ως προς διάφορες φυσικές ή χηµικές ιδιότητες, (π.χ. τη δραστικότητα, τη διαλυτότητα, την πολικότητα, το σηµείο ζέσεως, το σηµείο τήξεως, την ικανότητα φθορισµού, φωσφορισµού κ.α.). Οι νέες χαρακτηριστικές ιδιότητες που αποκτά το παράγωγο, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό του. Στην παραγωγοποίηση καταφεύγει συχνά ο αναλυτικός χηµικός όταν η υπό µελέτη ένωση είναι µη επαρκώς σταθερή, όταν δεν είναι πτητική ή επαρκώς πτητική και τέλος όταν δεν είναι επαρκώς ανιχνεύσιµη µε το σύστηµα ανίχνευσης που είναι διαθέσιµο. Με την παραγωγοποίηση αίρονται οι παραπάνω δυσκολίες στην ανάλυση, καθώς, αυξάνεται η πτητικότητα των µη πτητικών ενώσεων,

23 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 16 ελαττώνεται η πτητικότητα των πολύ πτητικών ενώσεων, εξουδετερώνονται ή παρακάµπτονται οι πολικές οµάδες των µορίων, αυξάνεται η ανιχνευσιµότητα, και η σταθερότητα των ενώσεων καθώς και η ευαισθησία της ανάλυσης. Στη βιβλιογραφία υπάρχει αναφορά σε µεγάλο αριθµό εργασιών που έχουν χρησιµοποιήσει την παραγωγοποίηση ως στάδιο προκατεργασίας των δειγµάτων πριν την ανάλυσή τους. Στις περισσότερες εργασίες τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης είναι εµπορικά διαθέσιµα, ενώ σε λίγες περιπτώσεις γίνεται αναφορά στην οργανική σύνθεση των αντιδραστηρίων αυτών πριν τη χρήση τους [2]. Η παραγωγοποίηση, παρά τα πολύ σηµαντικά πλεονεκτήµατα που προσφέρει στη χηµική ανάλυση, δεν παύει να αποτελεί ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος. εν είναι λίγοι οι ερευνητές που έχουν δηλώσει ότι η παραγωγοποίηση είναι στις περισσότερες των περιπτώσεων αναγκαίο κακό [2], καθώς βασικός στόχος µιας σύγχρονης αναλυτικής µεθόδου είναι να πραγµατοποιείται ο προσδιορισµός µε όσο το δυνατό λιγότερα στάδια προκατεργασίας του δείγµατος. Είναι φανερό, ότι η εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου προκατεργασίας, αυξάνει την αβεβαιότητα των αποτελεσµάτων µιας ανάλυσης. Ακόµα µεγαλύτερη είναι η αβεβαιότητα αυτή, όταν τα στάδια της παραγωγοποίησης και ο χειρισµός όλων των διαλυµάτων της γίνονται από κάποιον άνθρωπο. Στην περίπτωση αυτή θα πρέπει να συνυπολογίσει κανείς όλα εκείνα τυχαία και στατιστικά σφάλµατα, που εισάγονται στην ανάλυση λόγω του ανθρώπινου παράγοντα. Επιπλέον, κατά την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης, υπάρχουν πάρα πολλές παράµεροι, που πρέπει να µελετηθούν και να βελτιστοποιηθούν ώστε να πετύχουµε τελικά τη µεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και εκλεκτικότητα προσδιορισµού. Οι παράµετροι που µελετώνται συνήθως είναι η θερµοκρασία, ο χρόνος αντίδρασης, το ph, ο χρησιµοποιούµενος διαλύτης, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και της ένωσης που θέλουµε να παραγωγοποιήσουµε και τέλος η συγκέντρωση όλων εκείνων των ενώσεων, η παρουσία των οποίων µπορεί πολλές φορές να είναι απαραίτητη για την πραγµατοποίηση της αντίδρασης ή την πορεία εξέλιξης της. Στο τελικό στάδιο της ανάλυσης, επιλέγονται και χρησιµοποιούνται εκείνες οι τιµές των παραµέτρων, οι οποίες προσδίδουν στη µέθοδο τη µεγαλύτερη εκλεκτικότητα, ακρίβεια και ευαισθησία [2]. Οι συχνότερα απαντηµένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης είναι οι αντιδράσεις ακυλίωσης, συλιλίωσης, αλκυκίωσης και εστεροποίησης [3]. Σε τι

24 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 17 είδους αντίδραση παραγωγοποίησης θα προχωρήσει ένας αναλυτικός χηµικός, εξαρτάται από την ελεύθερη οµάδα της ένωσης που θέλει να παραγωγοποιήσει, από την αναλυτική τεχνική που χρησιµοποιεί για τους προσδιορισµούς και τέλος από το είδος των δειγµάτων που πρόκειται να αναλυθούν. Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης, που πραγµατοποιούνται ευκολότερα, είναι εκείνες στις οποίες υπάρχει ένα τουλάχιστον ευκίνητο άτοµο υδρογόνου στο µόριο της ένωσης. Σε αυτές τις κατηγορίες ενώσεων ανήκουν οι ενώσεις που περιέχουν ελεύθερες αµινοµάδες, ιµινοµάδες, καβοξυλοµάδες, σουλφυδρυλοµάδες και υδροξυλοµάδες. Τα περισσότερο υποσχόµενα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης, που χρησιµοποιούνται συνήθως για την παραγωγοποίηση θειολικών ενώσεων, πρέπει να πληρούν τις εξής 2 προϋποθέσεις, ως προς τα δοµικά χαρακτηριστικά τους. Πρέπει από τη µια να περιέχουν στο µόριό τους µια λειτουργική οµάδα, η οποία να µπορεί να αντιδρά µε τις θειολικές οµάδες (συνήθως αµινοµάδα ή αλογόνο), και από την άλλη να έχει µια επιπλέον οµάδα, η οποία θα προσδίδει στο µόριο ικανοποιητική δυνατότητα ανίχνευσης (κάποιο χρωµοφόρο ή φθοροφόρο [4]. Σχήµα 3.1: Σχηµατική απεικόνιση ενός αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης [3]. Καθώς η αντίδραση παραγωγοποίησης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, είναι συνήθως µια σχετικά επίπονη διαδικασία (από τη µια λόγω του ότι µπορεί να αποτελείται από περισσότερα του ενός στάδια και από την άλλη γιατί ο ανθρώπινος παράγοντας επιβαρύνει την ανάλυση µε σφάλµατα), ήταν αναγκαία η

25 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 18 αυτοµατοποίησή της. Οι περισσότερες αυτοµατοποιηµένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης χρησιµοποιούνται στη χρωµατογραφία. Εκεί το προς ανάλυση δείγµα παραγωγοποιείται είτε πριν τη χρωµατογραφική στήλη (pre-column derivatization), για αύξηση της διαχωριστικής ικανότητας και ελάττωση του χρόνου διαχωρισµού, είτε µετά τη στήλη (post column derivatization) για αύξηση της ευαισθησίας και εκλεκτικότητας της ανάλυσης. Ιδιαίτερα σηµαντική, όµως, ήταν η είσοδος της παραγωγοποίησης στις αυτοµατοποιηµένες αναλυτικές τεχνικές FIA και SIA [5]. Η ικανότητα, από τη µία, ανίχνευσης σχεδόν κάθε είδους µορίου µετά από παραγωγοποίηση του µε κατάλληλο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης και ο αυτοµατισµός, από την άλλη, των τεχνικών αυτών, που εξαλείφει τις παρεµποδίσεις που προκύπτουν από τους ανθρώπινους χειρισµούς και αυξάνει στο µέγιστο δυνατό τον ρυθµό δειγµατοληψίας και αναλύσεων, καθιστά τη σύζευξη αυτών ένα ιδιαίτερα χρήσιµο εργαλείο σε κάθε αναλυτικό εργαστήριο, τόσο για µεµονωµένες αναλύσεις, όσο και για αναλύσεις ρουτίνας. Βιβλιογραφία [1] R.M. Smith, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 3 [2] H. Lingeman, W. J. M. Underberg, Detection-Oriented Derivatization Techniques in Liquid Cromatography, New York, 1990 [3] Σηµειώσεις µαθήµατος του Μ.Π.Σ. του τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ., «Ειδικά θέµατα Οργανικής Χηµείας» ( ιδάσκον: Επικ. Καθ. Κ. Χατζηαντωνίου-Μαρούλη). [4] K. Shimad, K. Mitamura, Journal of Chromatography B 659 (1994) 227 [5] Κ. Ζαχαρής, Αυτοµατισµός στην προκατεργασία και ανάλυση δειγµάτων µε χρήση της τεχνικής της διαδοχικής έγχυσης δείγµατος σε συνδυασµό µε διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση, ιδακτορική ιατριβή, Α.Π.Θ. 2006

26 Φθορισµοµετρία 19 Κεφάλαιο 4 Φθορισµοµετρία 4.1 Φωταύγεια Άτοµα και µόρια πολλών ουσιών έχουν την ικανότητα να απορροφούν ενέργεια, µεταβαίνοντας σε µια νέα, υψηλότερης ενέργειας, ενεργειακή κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται ως διεγερµένη. Κατόπιν, η ενέργεια αυτή αποβάλλεται γρήγορα και τα µόρια επανέρχονται στη βασική ενεργειακή τους κατάσταση. Η περίσσεια ποσότητα ενέργειας του ατόµου ή του µορίου µπορεί, µέσω συγκρούσεων, να µεταδοθεί σε άλλα σωµατίδια ή µπορεί, µέσω ταλαντώσεων και περιστροφών, να χαθεί µε τη µορφή θερµότητας. Σε άλλες περιπτώσεις η πλεονάζουσα ποσότητα ενέργειας µπορεί να καταναλωθεί για να αποσπασθούν ηλεκτρόνια από το άτοµο, προκειµένου να κατασταθεί δυνατή η πραγµατοποίηση µιας φωτοχηµικής αντίδρασης. Στις περιπτώσεις αυτές, που τα διεγερµένα µόρια αποβάλλουν την ενέργεια διέγερσης ή µέρος αυτής µε τη µορφή ακτινοβολίας, παρατηρείται το φαινόµενο της φωταύγειας. Για συγκεκριµένα µόρια, όπως π.χ. δύσκαµπτα συζυγιακά συστήµατα, οι απώλεια της ενέργειας κατά την ταλάντωση και την περιστροφή είναι βραδύτερη. Τέτοιου είδους διεγερµένα µόρια µπορούν να αποβάλλουν την ενέργειά τους εκπέµποντας φωτόνια και προκαλώντας το φαινόµενο του φθορισµού. [1] Η φωταύγεια είναι χαρακτηριστική ιδιότητα όλων των συστηµάτων που δε βρίσκονται σε κατάσταση ισορροπίας. Το πιο χαρακτηριστικό γνώρισµά της είναι ότι η διάρκεια του φαινοµένου, µετά τη διακοπή της δράσης της πηγής διέγερσης, είναι πάρα πολύ µικρή, της τάξεως του 1 ps. Οι πιθανές ενεργειακές µεταπτώσεις, που λαµβάνουν χώρα κατά τη διέγερση και αποδιέγερση ενός µορίου παρουσιάζονται σχηµατικά στο ενεργειακό διάγραµµα του σχήµατος 4.1. Η διαφορά ανάµεσα σε µια απλή και µια τριπλή ενεργειακή κατάσταση αποτελεί συνέπεια της διαφοράς του spin (S) του ηλεκτρονίου. Η τιµή του αριθµού spin είναι +1/2 ή -1/2. Για κάθε οµοιοπολικό δεσµό απαιτούνται τουλάχιστον δύο ηλεκτρόνια, των οποίων µάλιστα τα spin θα πρέπει να είναι συζευγµένα (το ένα να έχει -1/2 και το άλλο +1/2). Η τροχιακή γωνιακή ροπή οποιασδήποτε ενεργειακής κατάστασης δίνεται από τη σχέση [2]

27 Φθορισµοµετρία 20 Μ = 2S + 1 όπου S: το συνολικό spin της συγκεκριµένης κατάστασης. Όταν όλα τα ηλεκτρόνια είναι συζευγµένα το Μ ισούται µε 1 ( 2 (1/ 2 1/ 2) + 1), ενώ όταν το spin ενός απλού ηλεκτρονίου αντιστρέφεται, η τιµή του Μ γίνεται 3. Αυτό δηµιουργεί αντίστοιχα και τις απλές, τριπλές καταστάσεις. Σχήµα 4.1. Ενεργειακό ιάγραµµα - Ηλεκτρονικές µεταπτώσεις - Μηχανισµοί διέγερσης και αποδιέγερσης των µορίων και οι προκύπτουσες εκπεµπόµενες ακτινοβολίες. Σαν S o χαρακτηρίζεται η χαµηλότερης ενέργειας, απλή, ενεργειακή κατάσταση, σαν S 1 η πρώτη απλή διεγερµένη κατάσταση και σαν S 2 η δεύτερη απλή διεγερµένη κατάσταση. Σαν Τ 1 και Τ 2 ορίζονται αντίστοιχα η πρώτη και η δεύτερη τριπλή διεγερµένη κατάσταση. Αναλυτικότερα τα στάδια που παρατηρούµε είναι: 1. Απορρόφηση ενέργειας και µετάπτωση ηλεκτρονίων από µη δεσµικά (n) ή δεσµικά (π) τροχιακά σε αντιδεσµικά (π*) τροχιακά, οπότε το µόριο µεταβαίνει από τη θεµελιώδη κατάσταση, σε απλές διεγερµένες δονητικές στάθµες (S 1 ή S 2 ), που είναι επιτρεπόµενες. 2. Αποβολή ενέργειας, µε µετάπτωση των ηλεκτρονίων στη χαµηλότερη δονητική στάθµη, της διεγερµένης κατάστασης στην οποία βρίσκεται, και

28 Φθορισµοµετρία 21 µετατροπή της ενέργειας αυτής σε θερµική ή ενέργεια δονήσεων, ταλαντώσεων και περιστροφών. 3. Εσωτερική µετατροπή, δηλαδή µεταφορά ενέργειας από τη χαµηλότερη δονητική στάθµη µιας ενεργειακής κατάστασης σε υψηλότερη δονητική στάθµη της αµέσως χαµηλότερης δονητικής κατάστασης. 4. Εκποµπή ακτινοβολίας κατά τη µετάπτωση µεταξύ ηλεκτρονικών καταστάσεων της ίδιας πολλαπλότητας και εκποµπή ακτινοβολίας φθορισµού. 5. Εξωτερική µετατροπή, η οποία πραγµατοποιείται µε µεταφορά ενέργειας στο διαλύτη ή άλλη συνυπάρχοντα στο διάλυµα µόρια, χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας 6. Η διέγερση σε τριπλή ενεργειακή κατάσταση είναι απαγορευµένη 7. Η διέγερση ηλεκτρονίων στην τριπλή κατάσταση ενισχύεται από την αποδιέγερση, χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας, σε καταστάσεις διαφορετικής πολλαπλότητας, (δηλαδή από S 1 σε T 1 ) 8. Η αποδιέγερση τριπλής κατάστασης µε εκποµπή ακτινοβολίας φωσφορισµού 4.2 Σχέση δοµής ενώσεως και φθορισµού Η δοµή των µορίων σχετίζεται άµεσα µε την ικανότητα τους να δίνουν αποδιεγέρσεις µε εκποµπή ακτινοβολίας φθορισµού. Απαραίτητη προϋπόθεση για να µπορεί µια ένωση να φθορίζει είναι να έχουν τα µόριά της τέτοια δοµή, ώστε να απορροφούν υπεριώδη ή ορατή ακτινοβολία. Η ακαµψία, δε, του µορίου πρέπει να είναι µεγάλη, γιατί µόνο στην περίπτωση αυτή η ενεργειακή διαφορά µεταξύ της βασικής (S 0 ) και της πρώτης απλής διεγερµένης (S 1 ) µπορεί να αποτρέψει την αποδιέγερση µέσω του µηχανισµού της εσωτερικής µετατροπής. Γενικά, κατά κανόνα, ικανότητα φθορισµού έχουν οι ενώσεις εκείνες που περιέχουν στο µόριό τους αρωµατικούς δακτυλίους ή πολλαπλούς συζυγιακούς διπλούς δεσµούς. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι, ο φθορισµός των συζυγιακών ενώσεων γίνεται ακόµα µεγαλύτερος σε περιπτώσεις µορίων µε επίπεδη συµµετρία, πράγµα αναµενόµενο, αν αναλογιστεί κανείς ότι η ακαµψία των µορίων είναι αποτέλεσµα της επίπεδης συµµετρίας τους [3]. Η παρουσία υποκαταστατών στο µόριο επηρεάζει σε µεγάλο βαθµό το φθορισµό του, καθώς η εισαγωγή υποκαταστατών επιφέρει µεταβολές στη µορφή των τροχιακών. Υποκαταστάτες δότες ηλεκτρονίων αυξάνουν την απόδοση φθορισµού, ενώ αντίθετα η προσθήκη υποκαταστατών δεκτών ηλεκτρονίων µειώνει την ικανότητα του φθορισµού. Η ικανότητα φθορισµού f είναι χαρακτηριστική παράµετρος για κάθε µόριο και ορίζεται ως ο αριθµός των φωτονίων που εκπέµπονται προς τον αριθµό των

29 Φθορισµοµετρία 22 φωτονίων που απορροφώνται, κατά τις διαδικασίες αποδιέγερσης και διέγερσης αντίστοιχα, στη µονάδα του χρόνου. Η σχέση ανάµεσα στην ένταση της ακτινοβολίας φθορισµού F και τη συγκέντρωση c δίνεται από τη σχέση: F = k * f * (I 0 I 0 * 10 -εcl ) όπου Ι ο : η ένταση της ακτινοβολίας απορρόφησης f : ικανότητα φθορισµού της ουσίας k: σταθερά που εξαρτάται από τις προδιαγραφες του οργάνου ε: µοριακός συντελεστής απόσβεσης l: η διαδροµή της ακτινοβολίας στη κυψελίδα του δείγµατος c: η συγκέντρωση ποσότητας της ουσίας Για αραιά διαλύµατα (c < 10-5 ) η παραπάνω εξίσωση γίνεται: F = k * f * I 0 * εlc Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ένταση της ακτινοβολίας φθορισµού είναι συνοπτικά οι παρακάτω. 1. Ακτινοβολία Ramman, που προέρχεται από τα µόρια του διαλύτη. Προκύπτει από την απορρόφηση µέρους της ακτινοβολίας διέγερσης από τα µόρια του περιβάλλοντος για δονητικές και περιστροφικές κινήσεις. Αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση ακτινοβολίας σκέδασης σε µήκη κύµατος µεγαλύτερα αυτών της ακτινοβολίας διέγερσης. 2. Ακτινοβολία φθορισµού που προκαλείται από το υλικό της κυψελίδας του ανιχνευτή (γηγενής φθορισµός) 3. Ακτινοβολία που προκαλείται από σκέδαση της ακτινοβολίας διέγερσης όταν αυτή προσπίπτει στα µόρια τις ουσίας. 4. Ακτινοβολία που προέρχεται από προσµίξεις που βρίσκονται στους διαλύτες ή στα αντιδραστήρια. 5. Ακτινοβολία από άλλα συστατικά του δείγµατος. Φαινόµενο παρόµοιο µε το φθορισµό αποτελεί ο φωσφορισµός. Η διαφορά των δύο αυτών φαινοµένων είναι ότι στο φθορισµό η εκποµπή ακτινοβολίας συµβαίνει από την απλή ενεργειακή κατάσταση στη βασική, µε το µηχανισµό S 1 S o, ενώ ο φωσφορισµός συµβαίνει από την τριπλή ενεργειακή κατάσταση στη βασική, µε το µηχανισµό Τ 1 S o.

30 Φθορισµοµετρία Φαινόµενο Quenching Ένας από τους παράγοντες που επηρεάζουν την ακρίβεια του ποσοτικού προσδιορισµού, όταν χρησιµοποιείται φθορισµοµετρικός ανιχνευτής, είναι η ελάττωση της έντασης φθορισµού (Quenching). Η ελάττωση αυτή οφείλεται σε αυξηµένη απορρόφηση είτε της προσπίπτουσας είτε της εκπεµπόµενης ακτινοβολίας από το διάλυµα. Η αυξηµένη απορρόφηση της ακτινοβολίας από την ουσία οφείλεται είτε στην ίδια την ουσία που προσδιορίζεται, όταν βρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις, είτε στην παρουσία ξένων µορίων. Μιας και η αύξηση της ευαισθησίας αποτελεί έναν από τους κυριότερους στόχους κατά την ανάπτυξη µιας φθορισµοµετρικής τεχνικής και η απόσβεση της ακτινοβολίας φθορισµού µειώνει την ευαισθησία, απαραίτητη προϋπόθεση, κατά τον σχεδιασµό µιας αναλυτικής πορείας, είναι να εξετάζεται προσεκτικά το σύστηµα για την εξάλειψη όλων εκείνων των παραµέτρων που συµβάλλουν στην ανάπτυξη του φαινοµένου Quenching Αναλυτική φθορισµοµετρία Το αρχικό στάδιο κατά την ανάπτυξη µιας αναλυτικής µεθοδολογίας που βασίζεται σε φθορισµοµετρική ανίχνευση περιλαµβάνει τη λήψη των φασµάτων διέγερσης και εκποµπής των προς µελέτη ενώσεων. Με τον όρο φάσµα διέγερσης (excitation spectrum) εννοούµε την γραφική απεικόνιση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού F, υπό σταθερό µήκος κύµατος ακτινοβολίας φθορισµού, λ em, σε συνάρτηση του µήκους κύµατος της ακτινοβολίας διέγερσης, λ ex. Αντιθέτως, µε τον όρο φάσµα εκποµπής (fluorescence spectrum) εννοούµε την γραφική απεικόνιση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού F, υπό σταθερό µήκος κύµατος ακτινοβολίας διέγερσης, λ ex, σε συνάρτηση του µήκους κύµατος της ακτινοβολίας φθορισµού, λ em. Για τη λήψη φασµάτων διέγερσης και εκποµπής απαιτείται η διαθέσιµη οργανολογία να παρέχει τη δυνατότητα σάρωσης του µήκους κύµατος διέγερσης και εκποµπής. Για την εκλεκτική µέτρηση ενός µόνο φθοροφόρου συστατικού, σε ένα διάλυµα µέσα στο οποίο µπορεί να υπάρχουν και άλλα φθοροφόρα, επιλέγεται το κατάλληλο µήκος κύµατος διέγερσης, ώστε να διεγερθεί εκλεκτικά µόνο τα µόρια της προς ανάλυση ουσίας, ή εκποµπής, ώστε να µετρηθεί εκλεκτικά η εκποµπή της ένωσης που ενδιαφέρει. Τα βασικά πλεονεκτήµατα της φθορισµοµετρικής ανίχνευσης είναι: 1. Υψηλή ευαισθησία.

31 Φθορισµοµετρία Υψηλή εκλεκτικότητα σε σχέση µε την φασµατοφωτοµετρία υπεριώδουςορατού λόγο του συνδυασµού των δύο µηκών κύµατος διέγερσης και εκποµπής. Σχήµα 4.2. ιάταξη σχισµών σε ένα τυπικό φθορισµότερο. Βιβλιογραφία [1] Ι.Ν. Παπαδογιάννης, Β.Φ. Σαµανίδου, Ενόργανη Χηµική Ανάλυση, Θεσσαλονίκη [2] Π.Π. Καραγιαννίδης, Ανόργανη Χηµεία, Θεσσαλονίκη, [3] Κ.Α. Τσίπη, Εισαγωγή στην Κβαντική χηµεία, τόµος 2 ος, Μοριακή οµή, Θεσσαλονίκη 1996.

32 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση 25 Κεφάλαιο 5 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση Οι ασθενείς οφείλουν να έχουν τον υψηλότερο δυνατό βαθµό εµπιστοσύνης όσον αφορά στην ποιότητα και την αποτελεσµατικότητα των φαρµάκων, τα οποία τους συνταγογραφούνται. Η λήψη, παρόλαυτα, φαρµάκων κρύβει τόσο οφέλη όσο και κινδύνους για την ανθρώπινη υγεία. Προκειµένου να διασφαλιστεί, ότι η ισορροπία µεταξύ των οφελών και των κινδύνων κλείνει προς όφελος του ασθενή, ο έλεγχος της αποτελεσµατικότητας των φαρµάκων και της ασφάλειάς τους πρέπει να είναι εξονυχιστικός και συνεχής. Για το λόγο αυτό, οι κανονισµοί, που αφορούν σήµερα στα φαρµακευτικά σκευάσµατα και καθορίζονται από αρµόδιους και εξουσιοδοτηµένους εθνικούς φορείς (Εθνικός Οργανισµός Φαρµάκων - ΕΟΦ), γίνονται ολοένα και πιο αυστηροί. Οι κανονισµοί αυτοί ελέγχουν και καθορίζουν όλα τα στάδια από τα οποία περνά ένα φαρµακευτικό προϊόν τόσο κατά την παραγωγή του, όσο και κατά τη διακίνηση και αποθήκευση. Ο έλεγχος ποιότητας ενός φαρµακευτικού σκευάσµατος περιλαµβάνει µια πληθώρα δοκιµών, στις οποίες περιλαµβάνονται µεταξύ άλλων: 1. Ποσοτικός προσδιορισµός και έλεγχος καθαρότητας του δραστικού συστατικού. 2. Έλεγχος διαλυτοποίησης. 3. Οµοιοµορφία της περιεκτικότητας. 4. Έλεγχος των Α υλών. 5. Έλεγχος διαδικασίας παραγωγής (in process control). Στα παραπάνω πλαίσια, η αναλυτική χηµεία παίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στη διασφάλιση της ποιότητας των εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων, όσο και στην έρευνα για ανάπτυξη νέων φαρµακοτεχνικών µορφών και δραστικών ουσιών. Οι απαιτήσεις των αναλυτικών µεθόδων για την αποτελεσµατική εφαρµογή τους στον έλεγχο ποιότητας των φαρµάκων µεταξύ άλλων περιλαµβάνουν: 1. Υψηλό βαθµό αυτοµατοποίησης. 2. Υψηλό ρυθµό ανάλυσης δειγµάτων σε βιοµηχανική κλίµακα. 3. Απλή προκατεργασία των δειγµάτων. 4. Χαµηλό κόστος αντιδραστηρίων. 5. Απλές διαδικασίες ελέγχου και χειρισµού.

33 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση 26 Είναι φανερό ότι οι τεχνικές συνεχούς ροής όπως η FIA και η SIA πληρούν τα περισσότερα, αν όχι όλα, από τα παραπάνω κριτήρια. Αποτέλεσµα αυτού είναι η ύπαρξη στη διεθνή βιβλιογραφία εκατοντάδων αναφορών που περιγράφουν την ανάπτυξη αυτόµατων µεθόδων FIA και SIA για τον έλεγχο ποιότητας φαρµακευτικών σκευασµάτων, τόσο σε ακαδηµαϊκό όσο και σε βιοµηχανικό επίπεδο [1-5]. Βιβλιογραφία [1] M. Polasek, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 591. [2] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Chim. Acta 588 (2007) 1. [3] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, T. Balloma, J. Pharm. Biomed. Anal. 41 (2006) 437. [4] P. D. Tzanavaras, D. G. Themelis, Anal. Lett. 38 (2005) [5] P. D. Tzanavaras, A. Verdoukas, D.G. Themelis, Anal. Sci. 21 (2005) 1515.

34 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 27 Κεφάλαιο 6 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και χρησιµοποιούµενων αντιδραστηρίων 6.1. Καπτοπρίλη Μέχρι σήµερα µία από τις αποτελεσµατικότερες δραστικές φαρµακευτικές ουσίες που χρησιµοποιούνται για την πρόληψη ενός δεύτερου καρδιακού επεισοδίου, µετά από έµφραγµα του µυοκαρδίου, είναι η καπτοπρίλη (σχήµα 6.1). Η καπτοπρίλη ανήκει στην κατηγορία των αναστολέων του µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτασίνης I. Αναστέλλει δηλαδή την µετατροπή της αγγειοτασίνης I σε αγγειοτασίνη II, µειώνοντας έτσι την αύξηση της πίεσης που προκαλεί η τελευταία. Σχήµα 6.1. Συντακτικός τύπος καπτοπρίλης. (C 9 H 15 NO 3 S - ΜW = 217,29 g mol -1 ) Η καπτοπρίλη µειώνει επίσης τους θανάτους που προκαλούνται από καρδιακά νοσήµατα, όπως η καρδιακή υπερτροφία. Είναι ο πρώτος ενεργός αναστολέας του µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτασίνης I που µπορεί να λαµβάνεται από τη στοµατική οδό και έχει εγκριθεί ώστε να µπορεί να χρησιµοποιείται ως αντιυπερτασικό και ως φάρµακο για την καρδιακή ανεπάρκεια. Η χηµική της δοµή την κάνει να ξεχωρίζει από τους υπόλοιπους αναστολείς του µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτασίνης I ως προς στο ότι περιέχει µια σουλφυδρυλική (-SH) οµάδα. Η καπτοπρίλη απορροφάται ταχέως µετά τη χορήγηση από το στόµα. Στον ορό αρχίζει να ανιχνεύεται 15 λεπτά µετά τη λήψη. Μέγιστα επίπεδα επιτυγχάνονται µετά από 30 έως 90 λεπτά [1].

35 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 28 Σηµαντική παρενέργεια της καπτοπρίλη ήταν ότι το 30% των ασθενών στους οποίους χρειάστηκε να χορηγηθεί το φάρµακο, παρουσίασαν επίµονο βήχα, εξανθήµατα και αλλαγές στη γεύση. Λιγότερο συχνές καταγεγραµµένες παρενέργειες περιλαµβάνουν υπόταση, ίλιγγο, κεφαλαλγία, αδυναµία, αίσθηµα κοπώσεως, ναυτία, εµετούς και διάρροια. Οι αντιδράσεις αυτές είναι κοινές όλων των αναστολέων του µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτασίνης I, µερικές όµως ίσως είναι ειδικές της καπτοπρίλης και οφείλονται πιθανώς στην σουλφυδρυλική οµάδα του µορίου. 6.2 Ν-ακέτυλοκυστεΐνη Η Ν-ακέτυλοκυστεΐνη αποτελεί το Ν-ακετυλικό παράγωγο του αµινοξέως L- κυστεΐνη (σχήµατα 6.2 και 6.3) και είναι πρόδροµη ένωση για το σχηµατισµό του αντιοξειδωτικού γλουταθείου στο ανθρώπινο σώµα. Η σουλφίδρυλοµάδα του µορίου δίνει σε αυτό αντιοξειδωτικές ιδιότητες, µπορεί δηλαδή να καταπολεµά τις ελεύθερες ρίζες. Σχήµα 6.2. Συντακτικός τύπος κυστεΐνης (C 3 H 7 NO 2 S - MW = g mol 1 ). Σχήµα 6.3. Συντακτικός τύπος Ν-ακέτυλοκυστεΐνης (C 5 H 9 NO 3 S MW = 163,19 g mol 1 ). Η Ν-ακέτυλοκυστεΐνη χρησιµοποιείται στην παρασκευή φαρµάκων [2,3], λόγω των βλεννολυτικών ιδιοτήτων που παρουσιάζει. Μερικά από τα εµπορικά

36 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 29 διαθέσιµα φάρµακα που περιέχουν ακέτυλοκυστεΐνη είναι τα: ASĐST (Bilim Pharmaceuticals), ACC (Hexal AG), Mucomyst (Bristol-Myers Squibb), Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals), Fluimucil (Zambon), Parvolex (GSK), Lysox (Menarini), Mucomelt-A tab (Venus Remedies, India) and Mucolysin (Sandoz). Τα φάρµακα αυτά χορηγούνται κυρίως από το στόµα (διαλύµατα, αναβράζοντα δισκία, χάπια) αλλά σε ορισµένες περιπτώσεις η χορήγησή τους µπορεί να γίνει µέσω της αναπνευστικής οδού ή ακόµα και ενδοφλεβίως. Η χορήγηση Ν-ακέτυλοκυστεΐνης ενδείκνυται στις βλεννολυτικές θεραπείες σε περιπτώσεις εµφυσήµατος, βρογχίτιδας, φυµατίωσης, βρογχοεστίασης και πνευµονίας. Η δράση της στηρίζεται στη µείωση του ιξώδους της βλέννας, καθώς το µόριο αυτό µπορεί να διασπά τους δισουλφιδικούς δεσµούς που αναπτύσσονται ανάµεσα στης πρωτεΐνες της βλέννας Πενικιλλαµίνη Η πενικιλλαµίνη ανήκει στην κατηγορία των συµπλοκοποιητών και βρίσκεται εµπορικά διαθέσιµη µε τα ονόµατα Cuprimine και Depen (σχήµα 6.4). Στα φάρµακα αυτά συναντάται η D- µορφή του µορίου, καθώς η L- µορφή του είναι ιδιαίτερα τοξική. Η τοξική δράση της L-πενικιλλαµίνης οφείλεται στην αναχαίτιση της δράσης της πυριδοξίνης [4]. Η πενικιλλαµίνη είναι µεταβολίτης της πενικιλίνης, σε αντίθεση όµως µε αυτή δεν έχει καµία αντιβιοτική ικανότητα. Σχήµα 6.4. Συντακτικός τύπος της πενικιλλαµίνης (C 5 H 11 NO 2 S - ΜW = 149,212 g mol -1 ). Κατά κύριο λόγο η πενικιλλαµίνη χρησιµοποιείται για την αντιµετώπιση ασθενειών όπως:

37 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων Η ασθένεια Wilson. 2. Η σκληροδερµία. 3. Η ρευµατοειδής αρθρίτιδα. 4. Η κυστινουρία. 5. Η δηλητηρίαση από υδράργυρο. Μερικές από τις παρενέργειες του φαρµάκου που έχουν καταγραφεί είναι δυσλειτουργία του πεπτικού συστήµατος, απώλεια όρεξης, ναυτία ή διάρροια. Τα συµπτώµατα αυτά µπορεί να τα εµφανίσει ο ασθενής τις πρώτες µέρες της θεραπείας µε πενικιλλαµίνη, καθώς ο οργανισµός προσπαθεί να προσαρµοστεί στη θεραπεία. Ξηροστοµία, τριχόπτωση, απώλεια γεύσης είναι παρενέργειες, οι οποίες, όµως, αν δεν υποχωρήσουν, θα πρέπει ο ασθενής να σταµατήσει τη λήψη του φαρµάκου Ο φθαλαδιαλδεΰδη Η ο-φθαλαδιαλδεΰδη (ΟΡΑ) (σχήµα 6.5), µε συστηµατική ονοµασία κατά IUPAC 1,2-δικαρβοξυλαλδεΰδη, είναι ένα γνωστό αντιδραστήριο παραγωγοποίησης το οποίο έχει χαµηλό γηγενή φθορισµό. Παρουσία, όµως, θειολικών ενώσεων και ενώσεων µε πρωτοταγή αµινοµάδα, πραγµατοποιείται αντίδραση σχηµατισµού ισοϊνδολών, οι οποίες έχουν έντονη ικανότητα φθορισµού [5-10] (σχήµα 6.6). Η αντίδραση γίνεται γρήγορα σε θερµοκρασία δωµατίου και σε αλκαλικό ph (ph: 8 11), ενώ τα φθοροφόρα παράγωγα, συχνά, µπορεί να δώσουν δευτερεύουσες αντιδράσεις µε άλλα µόρια του περιβάλλοντος, µε αποτέλεσµα της µείωσης της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού [6]. O H H O Σχήµα 6.5: Συντακτικός τύπος της ο φθαλαδιαλδεΰδης (ΟΡΑ). ΜW = 134 g mol -1.

38 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 31 CHO SR + RSH + R'NH N R' 2 CHO Σχήµα 6.6: Αντίδραση ΟΡΑ µε θειόλες παρουσία ενώσεων µε πρωτοταγή αµινοµάδα. Ακόµα και σήµερα ο µηχανισµός της αντίδρασης δεν είναι πλήρως κατανοητός [7]. Οι Wong, Larry, Sternson και Schowen είχαν προσπαθήσει παλαιότερα, µε µελέτες της κινητικής της αντίδρασης, να εξηγήσουν το µηχανισµό της και κατέληξαν σε δύο πιθανές εκδοχές, όπως φαίνεται στο σχήµα 6.7. Σχήµα 6.7: Πιθανοί µηχανισµοί αντίδρασης της ΟΡΑ µε θειόλες παρουσία ενώσεων µε πρωτοταγείς αµινο-οµάδες.

39 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 32 Σε υδατικά διαλύµατα η ΟΡΑ βρίσκεται σε τρείς διαφορετικές µορφές, όπως φαίνεται στο σχήµα 6.8. Την άνυδρη, την ένυδρη και την ηµικεταλική [8,9]. Σχήµα 6.8: Μορφές ΟΡΑ σε υδατικά διαλύµατα. Άνυδρη µορφή (Α), ένυδρη µορφή (Β) και ηµικεταλική µορφή του µορίου (Γ) [8,9]. Η ΟΡΑ έχει χρησιµοποιηθεί ευρύτατα σε προσδιορισµούς αµινοξέων και άλλων αµινοενώσεων αλλά και σε προσδιορισµούς θειολικών ενώσεων ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης σε συστήµατα HPLC. Μάλιστα από το 1982 µέχρι το 1998, σχεδόν το 30% όλων των εργασιών που αναφέρονταν σε παραγωγοποίηση και HPLC, χρησιµοποιούσαν την ΟΡΑ. Οι αναφορές αντίθετα του αντιδραστηρίου σε συστήµατα SIA ή FIA είναι πιο περιορισµένες [10] Monobromobimane Το monobromobimane (σχήµα 6.9) αποτελεί ένα αρκετά εκλεκτικό αντιδραστήριο παραγωγοποίησης θειολικών ενώσεων [8]. Αντιδρά µε θειολικές ενώσεις, σε αλκαλικό ph και σε θερµοκρασία δωµατίου, προς το σχηµατισµό θειαιθέρων, που έχουν µεγάλη ικανότητα φθορισµού (σχήµα 6.10). Σχήµα 6.9. Συντακτικός τύπος του Monobromobimane. MW = g mol -1

40 Χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 33 Σχήµα Αντίδραση monobromobimane µε θειόλες (R = H). Το άτοµο του Br στο µόριο είναι αυτό που του προσδίδει τις ξεχωριστές του ιδιότητες. Παρουσία του ατόµου το Br στο µόριο του monobromobimane, το µόριο έχει χαµηλή ικανότητα φθορισµού. Τα προϊόντα αποσύνθεσης, όµως του monobromobimane, και ιδιαίτερα εκείνα τα οποία προκύπτουν από αποµάκρυνση του Br, χαρακτηρίζονται από µεγάλη ικανότητα φθορισµού. Το αντιδραστήριο αυτό παρουσία ενώσεων µε υδροξυλοµάδες δεν δίνει καµία αντίδραση. Συνεπώς, οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης των θειολικών ενώσεων µπορούν εύκολα να πραγµατοποιηθούν σε υδατικά διαλύµατα, καθώς δεν παρατηρούνται σηµαντικές παρεµποδίσεις υποβάθρου. Βιβλιογραφία [1] [2] [3] [4] [5] P. Zuman, Anal. Lett. 38 (2005) [6] N. Salem, S. Andersen, E. Kulla, P. Zuman, J. Phys. Chem. A. 111 (2007) [7] O.S. Wong, Ν. Larry, A. Sternson, R.L. Schowen, J. Am. Chem. Soc. 107 (1985) [8] K. Shimada, K. Mitamura, J.Chromatogr. B. 659 (1994) 227. [9] P. Zuman, Chem. Rev. 104 (2004) [10] I.Μ. Perl, J. Chromatogr. A 913 (2001) 283.

41 Κεφάλαιο 7 34 Κεφάλαιο 7 Βιβλιογραφική επισκόπηση Οι αυτόµατες µέθοδοι FIA και SIA που έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία παρατίθενται στους Πίνακες Στους πίνακες δίνεται η τεχνική που χρησιµοποιήθηκε, το σύστηµα ανίχνευσης / αρχή της µεθόδου, το γραµµικό εύρος προσδιορισµού, το όριο ανίχνευσης, ο ρυθµός ανάλυσης των δειγµάτων και τα δείγµατα που εφαρµόστηκαν. Αξίζει να παρατηρηθεί ότι οι µέθοδοι που χρησιµοποιούν την τεχνική SIA είναι σχετικά περιορισµένες για την CAP [4, 7, 12, 13] και την PEN [24, 25, 27], ενώ δεν έχει αναφερθεί µέχρι στιγµής στη διεθνή βιβλιογραφία µέθοδος SIA για τον προσδιορισµό της NAC. Χρησιµοποιείται αρκετά µεγάλη γκάµα ενόργανων τεχνικών ανίχνευσης, συµπεριλαµβανοµένων τόσο οπτικών (UV-Vis, φθορισµοµετρία, χηµειοφωταύγεια), όσο και ηλεκτροχηµικών (βολταµµετρία και αµπεροµετρία). Η συντριπτική πλειοψηφία των µεθόδων FIA και SIA για τον προσδιορισµό των τριών θειολών βρίσκει εφαρµογές σε φαρµακευτικά σκευάσµατα.

42 Κεφάλαιο 7 35

43 Κεφάλαιο 7 36

44 Κεφάλαιο 7 37

45 Κεφάλαιο 7 38

46 Κεφάλαιο 7 39

47 Κεφάλαιο 7 40 Βιβλιογραφία [1] W.T. Suarez, A.A. Madi, L.C.S. de Figueiredo-Filho, O.Fatibello-Filho, J. Braz. Chem. Soc.18 (2007) [2] J.A.V. Prior, J.L.M. Santos, J.L.F.C. Lima, Anal. Chim. Acta 600 (2007) 183. [3] Z. Song, S. Hou, X.Yu, X. Xie, X. Shao, Anal. Let. 39 (2006) [4] P.D. Tzanavaras, D.G. Themelis, A. Economou, G. Theodoridis, Microchim. Acta 142 (2003) 55. [5] W. Siangproh, P. Ngamukot, O. Chailapakul, Sens. Αctuators. B 91 (2003) 60. [6] M.E. Palomeque, B.S. Fernandez Band, J. Pharm. Biomed. Anal. 30 (2002) 547. [7] R.I. Stefan, J.F. Van Staden, H.Y. Aboul-Enein, Instrum. Sci. & Technol. 30 (2002) 243. [8] A.Economou, D.G. Themelis, G. Theodoridis, P.D. Tzanavaras, Anal. Chim. Acta 463 (2002) 249. [9] P.D. Tzanavaras, D.G. Themelis, A. Economou, G.Theodoridis, Talanta 57 (2002) 575. [10] B. Li, Z. Zhang, M. Wu, Microchem. J. 70 (2001) 85. [11] X. Zheng, Z. Zhang, B. Li, Electroanalysis 13 (2001) [12] A.M. Pimenta, A.N. Araújo, M. Conceição, Anal. Chim. Acta 438 (2001) 31. [13] R.I. Stefan, J.F. van Staden, H.Y. Aboul-Enein, Anal. Chim. Acta 411 (2000) 51. [14] Z.D. Zhang, W.R.G. Baeyens, X.R. Zhang, G. Van der Weken, J. Pharm. Biomed. Anal 14 (1996) 939. [15] M.I. Alberto, C. Sanchez-Petreno, M.S. Garcia, V. Rodenas, J. Pharm. Biomed. Anal 11 (1993) 887. [16] W.T. Suarez, A.A. Madi, F.C. Vicentini, O. Fatibello-Filho, Anal. Let. 40 (2007) [17] W.T. Suarez, H.J. Vieira, O. Fatibello-Filho, J. Braz. Chem. Soc. 18 (2007) [18] A.L. Fornazari, W.T. Suarez, H.J. Vieira, O. Fatibello-Filho, Acta Chim. Slov. 52 (2005) 164. [19] W.T. Suarez, H.J. Vieira, O. Fatibello-Filho, J. Pharm. Biomed. Anal. 37 (2005) 771. [20] Y. Li, A. Zhang, J. Du, J. Lu, Anal. Let. 36 (2003) 871. [21] J. Du, Y. Li, J. Lu, Anal. Chim. Acta 448 (2001) 79. [22] M.C. Icardo, O.A. Estrela, M. Sajewicz, J.V.G. Mateo, J.M. Calatayud,

48 Κεφάλαιο 7 41 Anal. Chim. Acta 438 (2001) 281. [23] P. Vinas, I.L. Garcia, J.A.M. Gil, J. Pharm. Biomed. Anal. 11 (1993) 15. [24] F.E.O. Suliman, Z.H. Al-Lawati, S.M.Z. Al-Kindy, J. Fluoresc. 18 (2008) [25] F.E.O. Suliman, M.M. Al-Hinai, S.M.Z. Al-Kindy, S.B. Salama, Talanta 74 (2008) [26] B.G.T. Corominas, J. Pferzschner, M.C.Icardo, L.L. Zamora, J.M. Calatayud, J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 281. [27] F.E.O. Suliman, H.A.J. Al-Lawati, S.M.Z. Al-Kindy, I.E.M. Nour, S.B. Salama, Talanta 61 (2003) 221. [28] N. Wangfuengkanagul, O. Chailapakul, Talanta 58 (2002) [29] T.P. Ruiz, C. Martinez-Lozano, V. Tomds, C.S. Cardona, J. Pharm. Biomed. Anal. 15 (1996) 33. [30] Z.D. Zhang, W.R.G. Baeyens, X.R. Zhang, G.Van der Weken, Biomed. Chromatogr. 9 (1995) 287. [31] M.S. Garcia, C. Sanchez-Pedreno, M.I. Albero, V. Rodenas, J. Pharm. Biomed. Anal. 11 (1993) 633. [32] P. Vinas, J.A. Sanchez-Prieto, M. Hernandez Cordoba, Microchem. J. 41 (1990) 2.

49 Αντιδραστήρια - οργανολογία 42 Κεφάλαιο 8 Αντιδραστήρια - Οργανολογία 8.1 Αντιδραστήρια Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν στο πειραµατικό µέρος της παρούσας µεταπτυχιακής εργασίας ήταν αναλυτικού βαθµού καθαρότητας και προµηθεύτηκαν από τον οίκο Merck, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Ως διαλύτης αραίωσης χρησιµοποιήθηκε δις-απιονισµένο νερό. Τα πυκνά διαλύµατα της ο-φθαλαδιαλδεΰδης (OPA) (Fluka) είχαν συγκέντρωση ποσότητας 0,01 mol L -1 και παρασκευαζόταν µε διάλυση ακριβώς ζυγισµένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 10 ml δις-απιονισµένου νερού. Τα διαλύµατα εργασίας της OPA συγκέντρωσης ποσότητας 1, mol L -1, παρασκευάζονταν από το πυκνό µε κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό. Το πυκνό διάλυµα του αντιδραστηρίου ήταν σταθερό για µία εβδοµάδα εφόσον φυλάσσονταν στους 4 ο C προστατευµένο από το φως. Τα διαλύµατα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθηµερινή βάση. Τα διαλύµατατα εργασίας του monobromobimane (MBB) (Sigma) είχαν συγκέντρωση ποσότητας 1, mol L -1 και παρασκευαζόταν καθηµερινά µε διάλυση ακριβώς ζυγισµένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 5 ml υδατικού διαλύµατος ACN (φ = 4 %). Κατά τη διάρκεια των πειραµάτων, τα διαλύµατα του ΜΒΒ φυλάσσονταν σε σκουρόχρωµες φιάλες προστατευµένα από το φως. Τα πυκνά πρότυπα διαλύµατα της καπτοπρίλης (Sigma) συγκέντρωσης µάζας 500 mg L -1, παρασκευαζόταν µε διάλυση 25.0 mg στερεής ουσίας σε 50 ml διςαπιονισµένου νερού. Τα διαλύµατα αυτά ήταν σταθερά για µία εβδοµάδα σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Τα πρότυπα διαλύµατα εργασίας παρασκευάζονταν καθηµερινά µε κατάλληλες αραιώσεις σε δις-απιονισµένο νερό. Τα πυκνά πρότυπα διαλύµατα της N-ακετυλοκυστεΐνης (Fluka) συγκέντρωσης µάζας 500 mg L -1, παρασκευαζόταν µε διάλυση 25.0 mg στερεής ουσίας σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού. Τα διαλύµατα αυτά ήταν σταθερά για µία εβδοµάδα σε

50 Αντιδραστήρια - οργανολογία 43 θερµοκρασία περιβάλλοντος. Τα πρότυπα διαλύµατα εργασίας παρασκευάζονταν καθηµερινά µε κατάλληλες αραιώσεις σε δις-απιονισµένο νερό. Τα πυκνά πρότυπα διαλύµατα της πενικιλλαµίνης (Sigma) συγκέντρωσης µάζας 500 mg L -1, παρασκευαζόταν καθηµερινά µε διάλυση 25.0 mg στερεής ουσίας σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού. Τα πρότυπα διαλύµατα εργασίας παρασκευάζονταν µε κατάλληλες αραιώσεις σε δις-απιονισµένο νερό. Τα πυκνά διαλύµατα γλυκίνης συγκέντρωσης ποσότητας 0.02 mol L -1 παρασκευάζονταν µε διάλυση ακριβώς ζυγισµένης ποσότητας του στερεού αντιδραστηρίου σε 100 ml δις-απιονισµένου νερού. Τα διαλύµατα εργασίας συγκέντρωσης ποσότητας 3, mol L -1 παρασκευάζονταν µε κατάλληλη αραίωση σε ρυθµιστικό διάλυµα. Τα ρυθµιστικά διαλύµατα βορικών ιόντων συγκέντρωσης ποσότητας 0,1 mol L -1 παρασκευάζονταν µε διάλυση κατάλληλης ποσότητας βόρακα (Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) σε 1 L δις-απιονισµένου νερού και ρύθµιση του ph µε διάλυµα ΝaOH συγκέντρωσης ποσότητας 0,1 mol L -1. Το ph του πυκνού ρυθµιστικού διαλύµατος ελέγχονταν σε καθηµερινή βάση πριν την έναρξη των πειραµάτων. Τα ρυθµιστικά διαλύµατα ανθρακικών ιόντων συγκέντρωσης ποσότητας 0,1 mol L -1 παρασκευάζονταν µε διάλυση κατάλληλης ποσότητας στερεού NaCO 3 σε 1 L δις-απιονισµένου νερού και ρύθµιση του ph µε διάλυµα ΝaOH συγκέντρωσης ποσότητας 0,1 mol L -1. Το ph του πυκνού ρυθµιστικού διαλύµατος ελέγχονταν σε καθηµερινή βάση πριν την έναρξη των πειραµάτων. Το ψευδοφάρµακο (placebo) που χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της ακρίβειας και εκλεκτικότητας των προτεινόµενων µεθόδων αποτελούνταν από τα παρακάτω έκδοχα: µονοϋδρική λακτόζη, στεατικό µαγνήσιο, ταλκ, κολλοειδές οξείδιο του πυριτίου, κιτρικό οξύ, σακχαρίνη, άµυλο, οξείδιο του τιτανίου, σορβιτόλη, µικροκρυσταλλική κυτταρίνη, υδροξυπροπυλική κυτταρίνη, πολυβίνυλοπυρολιδόνη. Για την παρασκευή του, ζυγίζονταν 1 g από κάθε έκδοχο και το µίγµα που προέκυψε λειοτριβήθηκε µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Το διάλυµα των εκδόχων παρασκευάζονταν µε διασπορά ακριβώς ζυγισµένης ποσότητας σε νερό. Ακολουθούσε διάλυση µε τη βοήθεια λουτρού υπερήχων για 15 min, φυγοκέντρηση και διήθηση σε φίλτρα πορώδους 0,45 µm. H θεωρητική συγκέντρωση του τελικού διαλύµατος των εκδόχων ήταν 10 g L -1.

51 Αντιδραστήρια - οργανολογία Οργανολογία Ο αυτόµατος αναλυτής SIA που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη των µεθόδων προσδιορισµού της καπτοπρίλης, της Ν-ακέτυλοκυστεΐνης και της πενικιλλαµίνης, αποτελούνταν από τα επιµέρους οργανολογικά τµήµατα: 1. Αυτόµατη βαλβίδα επιλογής 10 θέσεων (Valco, Ελβετία). 2. Περισταλτική αντλία (Gilson Miniplus3, Γαλλία). 3. Φθορισµοµετρικό ανιχνευτή του οίκου Shimadzu, µοντέλο RF-551. Το σύστηµα ροής αποτελούνταν από σωλήνες Teflon, εσωτερικής διαµέτρου 0.5 mm, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Το σπείραµα συγκράτησης (HC) είχε µήκος 300 cm και εσωτερική διάµετρο 0,7 mm. Όπου απαιτούνταν εν-ροή θερµοστάτηση των διαλυµάτων, αυτή επιτυγχάνονταν µε τη χρήση του θερµοστάτη FIAStar 5101 (Tecator, Σουηδία). Η λειτουργία του αναλυτή ελέγχονταν µέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή µε κάρτα εισόδου / εξόδου (6025 Ε, National Instrument, Austin, TX). Ο έλεγχος του συστήµατος και η λήψη των δεδοµένων γινόταν µε τη χρήση ενός λογισµικού LabVIEW (National Instrument, Austin, TX). Το πρόγραµµα αναπτύχθηκε στο εργαστήριο αναλυτικής Χηµείας, του τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. Τα αποτελέσµατα αποθηκεύονταν µε τη µορφή ASCII για περαιτέρω επεξεργασία. Τα λαµβανόµενα σήµατα από το σύστηµα ανίχνευσης καταγράφονταν και αποτιµούνταν µε τη βοήθεια του λογισµικού Clarity Station for Windows (DatApex, Τσεχία). Ο επιπλέον συνήθης εργαστηριακός εξοπλισµός περιλάµβανε κατά τη διάρκεια της εργασίας: - αναλυτικό ζυγό του οίκου Sartorius, µοντέλο πεχάµετρο του οίκου Orion, µοντέλο EA940 - λουτρό υπερήχων του οίκου Elma Transonic, µοντέλο 460/H και - φυγόκεντρο του οίκου Hermle, µοντέλο Z230

52 Κεφάλαιο 9 45 Κεφάλαιο 9 Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός φαρµακευτικά δραστικών θειολών µε την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων µετά από παραγωγοποίηση µε ο-φθαλαδιαλδεΰδη 9.1 Αρχή µεθόδου Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφεται η ανάπτυξη µιας µεθόδου SIA για το φθορισµοµετρικό προσδιορισµό τριών φαρµακευτικά δραστικών θειολών καπτοπρίλης (CAP), Ν-ακετυλοκυστεΐνης (NAC) και πενικιλλαµίνης (PEN) σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. Η µέθοδος στηρίζεται στον εν-ροή σχηµατισµό φθοριζόντων παραγώγων ύστερα από αντίδραση των προσδιοριζόµενων συστατικών µε το αντιδραστήριο ο-φθαλαδιαλδεΰδη (OPA), σε αλκαλικό περιβάλλον, παρουσία γλυκίνης. Το προϊόν της αντίδρασης είναι µια ισοϊνδόλη, όπως φαίνεται στο σχήµα Προσδιορισµός των θειολών σε υδατικά διαλύµατα Το βελτιστοποιηµένο διάγραµµα ροής της SIA φαίνεται στο σχήµα 9.2. Η ακολουθία της SIA για τον προσδιορισµό των θειολών περιγράφεται αναλυτικά στον Πίνακα 9.1. Εν συντοµία, 50 µl διαλύµατος OPA (c = 1, mol L -1 ), 75 µl διαλύµατος γλυκίνης (R = 3, mol L -1 γλυκίνη σε ρυθµιστικό διάλυµα 0,05 mol L -1 βορικών, ph = 9.5) και 50 µl δείγµατος αναρροφώνται διαδοχικά µε αυτή τη σειρά στο σπείραµα συγκράτησης µέσω των θέσεων 1, 2 και 3 της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής αντίστοιχα. Στη συνέχεια, µε αναστροφή της φοράς ροής της αντλίας, οι τρείς ζώνες προωθούνται προς στον ανιχνευτή µε παροχή όγκου 1,2 ml min -1. Tα παράγωγα σχηµατίζονται σε σπείραµα αντίδρασης (RC = 30 cm / 0.5 mm i.d.) και ανιχνεύονται φθορισµοµετρικά (λ ex = 340 nm / λ em = 455 nm για τις CAP, NAC και λ ex = 320 nm / λ em = 420 nm για την PEN). Συνολικά ο κύκλος ανάλυσης διαρκεί 45 s και συνεπώς ο ρυθµός εγχύσεων είναι 70 h -1. Τα σήµατα του ανιχνευτή καταγράφονται ως κορυφές, το ύψος των οποίων είναι ανάλογο των συγκεντρώσεων των προσδιοριζόµενων ουσιών στα δείγµατα. Για κάθε δείγµα πραγµατοποιούνταν τρεις διαδοχικές µετρήσεις..

53 Κεφάλαιο 9 46 Σηµειώνεται ότι κατά την αλλαγή δειγµάτων ακολουθείται ένα επιπλέον στάδιο πλύσης προς αποφυγή φαινοµένων επιµόλυνσης. O S N H H R-NH 2 Captopril R O COOH O O O S OH H H R-NH 2 N-acetylcysteine R NH 2 O O O S OH H R-NH 2 R NH 2 H Penicillamine O Σχήµα 9.1. Αντιδράσεις παραγωγοποίησης φαρµακευτικά δραστικών θειολών.

54 Κεφάλαιο 9 47 Σχήµα 9.2. ιάγραµµα ροής SIA για τον προσδιορισµό θειολών (καπτοπρίλης, Ν- ακέτυλοκυστεΐνης και πενικιλλαµίνης) σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. S = είγµα, R = 3, mol L -1 γλυκίνη (σε ρυθµιστικό διάλυµα 0,05 mol L -1 βορικών, ph = 9.5), OPA (c = 1, mol L -1 ), C = Η 2 Ο, D = ανιχνευτής (λ ex = 340 nm / λ em = 455 nm για τις CAP, NAC και λ ex = 320 nm / λ em = 420 nm για την PEN), ΡΡ = περισταλτική αντλία, HC = σπείραµα παραµονής (300 cm 0,7 mm i.d.), RC = σπείραµα αντίδρασης (30 cm 0,5 mm i.d.) Προσδιορισµός των θειολών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός CAP σε φαρµακευτικά σκευάσµατα εκαπέντε δισκία από το κάθε φάρµακο (Capoten tabs, 25 mg / tab και Dosturel tabs, 50 mg / tab) ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη

55 Κεφάλαιο 9 48 Πίνακας 9.1: Στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA. α/α Χρόνος (s) Θέση Βαλβίδας Λειτουργία Αντλίας Παροχή όγκου (ml min 1 ) Περιγραφή διαδικασίας ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,6 Έγχυση 50 µl OPA ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,9 Έγχυση 75 µl R ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,6 Έγχυση 50 µl δείγµατος ,0 Επιλογή θέσης Προώθηση 1,2 Προώθηση των ζωνών στον ανιχνευτή διαδικασία που περιγράφεται στην προηγούµενη παράγραφο. Για τον προσδιορισµό της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας των δισκίων της CAP (Content Uniformity Test), 10 δισκία διαλύονταν ξεχωριστά σε κατάλληλες ποσότητες δις-απιονισµένου νερού µε τη βοήθεια λουτρού υπερήχων. Τα προκύπτοντα διαλύµατα αναλύονταν µε τη µέθοδο SIA µετά από τη συνήθη διαδικασία φυγοκέντρησης / διήθησης / αραίωσης που περιγράφεται παραπάνω Προσδιορισµός NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Για τον προσδιορισµό της NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα (Trebon tabs, 600 mg / tab και Trebon sach., 200 mg / sach) ακολουθήθηκε παρόµοια διαδικασία προκατεργασίας µε αυτή που περιγράφεται στην προηγούµενη παράγραφο. εκαπέντε δισκία ή το περιεχόµενο 15 φακελίσκων µιας δόσης αντίστοιχα, ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml διςαπιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο 9.2.

56 Κεφάλαιο 9 49 Για τον προσδιορισµό της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας των δισκίων και των φακελίσκων της NAC, 10 δισκία και 10 φακελίσκοι διαλύονταν ξεχωριστά σε κατάλληλες ποσότητες δις-απιονισµένου νερού µε τη βοήθεια λουτρού υπερήχων. Τα προκύπτοντα διαλύµατα αναλύονταν µε τη µέθοδο SIA µετά από τη συνήθη διαδικασία φυγοκέντρησης / διήθησης / αραίωσης που περιγράφεται παραπάνω Προσδιορισµός PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Για τον προσδιορισµό της PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα (Penicillamine caps, 250 mg / cap), το περιεχόµενο 15 καψουλών ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο Αποτελέσµατα και Συζήτηση Προκαταρκτικά Πειράµατα Ο στόχος των προκαταρκτικών πειραµάτων ήταν να διαπιστωθεί αν είναι δυνατή η πραγµατοποίηση της αντίδρασης παραγωγοποίησης των προς ανάλυση ουσιών σε συστήµατα ροής µε την τεχνική της SIA. Τα προκαταρκτικά πειράµατα έδειξαν, πράγµατι, ότι οι αντιδράσεις αυτές είναι εφικτό να πραγµατοποιηθούν εν ροή. Τα βέλτιστα µήκη κύµατος διέγερσης και εκποµπής για τις προσδιοριζόµενες θειόλες ήταν λ ex = 340 nm / λ em = 455 nm για τις CAP, NAC και λ ex = 320 nm / λ em = 420 nm για την PEN. Οι αρχικές χηµικές και γεωµετρικές παράµετροι κατά την διεξαγωγή των προκαταρκτικών πειραµάτων ήταν: c(opa) = 1, mol L -1, c(γλυκίνη) = 1, mol L -1, ph = 9,5 (0,05 mol L -1 Ρ.. βορικών ιόντων), γ(cap) = γ(nac) = γ(pen) = 5 mg L -1, l(rc) = 60 cm (0,5 mm i.d.), q V (C) = 0,6 ml min -1, V(CAP) = V(NAC) = V(PEN) = 50 µl, V(OPA) = 50 µl, V(R) = 50 µl. Η σειρά αναρρόφησης των δειγµάτων, του διαλύµατος της OPA και του αντιδραστηρίου R αποδείχθηκε ότι έχει µέτρια επίδραση στην ευαισθησία του προσδιορισµού για όλες τις θειόλες. Η ακολουθία OPA / R / S επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραµάτων, καθώς χαρακτηρίζονταν συγκριτικά από τη µεγαλύτερη ευαισθησία και ικανοποιητική επαναληψιµότητα.

57 Κεφάλαιο Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων Οι γεωµετρικές παράµετροι επηρεάζουν σηµαντικά την πορεία της αντίδρασης προτού οι ζώνες δείγµατος και αντιδραστηρίων φτάσουν στον ανιχνευτή. Η µελέτη, συνεπώς, των παραµέτρων αυτών, βοηθά στη βελτιστοποίηση της ανάλυσης και στην αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου. Η βελτιστοποίηση των γεωµετρικών παραµέτρων πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας το διάγραµµα ροής της SIA που φαίνεται στο σχήµα 9.2 και τις αρχικές συνθήκες που περιγράφονται στην προηγούµενη παράγραφο. Η µελέτη των παραπάνω παραµέτρων έγινε, µεταβάλλοντας µία παράµετρο την κάθε φορά και διατηρώντας όλες τις υπόλοιπες σταθερές. Αναλυτικά µελετήθηκε η επίδραση των παρακάτω παραµέτρων: 1. Της παροχής όγκου του µεταφορέα προς τον ανιχνευτή. 2. Του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος. 3. Του όγκου του εγχυόµενου αντιδραστηρίου/ρυθµιστικού διαλύµατος. 4. Του όγκου του εγχυόµενου διαλύµατος της OPA. 5. Του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης Επίδραση παροχής όγκου µεταφορέα προς τον ανιχνευτή Η παροχή όγκου µε την οποία προωθούνται οι ζώνες του δείγµατος και των αντιδραστηρίων προς τον ανιχνευτή είναι µια σηµαντική παράµετρος στα συστήµατα συνεχούς ροής, καθώς καθορίζει το χρόνο εξέλιξης της χηµικής αντίδρασης. Η επίδρασή της µελετήθηκε σε εύρος ροών 0,45 1,5 ml min -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για τις µελετούµενες θειόλες φαίνονται στο σχήµα 9.3. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσµατα του σχήµατος 9.3, αύξηση της παροχής όγκου του µεταφορέα στο µελετούµενο εύρος οδήγησε σε ελάττωση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού και για τις τρεις ενώσεις. Οι ποσοστιαίες µειώσεις σε όλο το εύρος µεταβολής των παροχών όγκου, ήταν περίπου 26 % για την CAP, 27 % για την NAC και 67 % για την PEN. Παράλληλα, η συχνότητα δειγµατοληψίας αυξάνονταν σχεδόν γραµµικά (βλ. δευτερεύοντες άξονες ψ στο σχήµα 9.3). Ως βέλτιστη παροχή επιλέχτηκε τελικά αυτή των 1,2 ml min -1, ως συµβιβασµός µεταξύ της ευαισθησίας της ανάλυσης και του ρυθµού εγχύσεων των δειγµάτων.

58 Κεφάλαιο 9 51 Σχήµα 9.3. Επίδραση της παροχής όγκου του µεταφορέα στον προσδιορισµό.

59 Κεφάλαιο Επίδραση του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος Ο όγκος του εγχυόµενου δείγµατος είναι µια σηµαντική παράµετρος κατά τη βελτιστοποίηση µιας αναλυτικής µεθόδου SIA, καθότι καθορίζει τη διασπορά της ζώνης του δείγµατος και, κατά συνέπεια, την ευαισθησία του προσδιορισµού. Η επίδρασή του µελετήθηκε σε εύρος όγκων µl και για τις τρεις θειόλες. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα 9.4. Σχήµα 9.4. Επίδραση του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος στον προσδιορισµό. Όπως φαίνεται και από το παρακάτω σχήµα, αύξηση του όγκου του δείγµατος προκαλεί αύξηση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού. Οι ποσοστιαίες αυξήσεις σε όλο το εύρος µεταβολής του όγκου, ήταν περίπου 240 % για την CAP, 205 % για την NAC και 154 % για την PEN. Ο όγκος του εγχυόµενου δείγµατος που επιλέχτηκε τελικά και για τις τρεις ενώσεις ήταν αυτός των 50 µl, ως συµβιβασµός µεταξύ της ευαισθησίας της ανάλυσης και του ρυθµού εγχύσεων των δειγµάτων Επίδραση του όγκου του αντιδραστηρίου (R) Η µελέτη της επίδρασης του όγκου του αντιδραστηρίου (R = γλυκίνη / ρυθµιστικό διάλυµα) πραγµατοποιήθηκε σε εύρος τιµών από 25 µl µέχρι 75 µl. Η συγκέντρωση της γλυκίνης ήταν 1, mol L -1. Όπως φαίνεται και στο σχήµα 9.5, µεταβολή του όγκου του αντιδραστηρίου (R) δεν προκαλεί σηµαντικές µεταβολές στην ευαισθησία της ανάλυσης όσον αφορά στις CAP και NAC. Αντίθετα, στην περίπτωση προσδιορισµού της PEN, παρατηρείται σηµαντική

60 Κεφάλαιο 9 53 αύξηση της έντασης φθορισµού της τάξης του 53 %. Τελικά όγκος που επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραµάτων ήταν αυτός των 75 µl. Σχήµα 9.5. Επίδραση του όγκου του αντιδραστηρίου (R) στον προσδιορισµό Επίδραση του όγκου της ΟΡΑ Η µελέτη της επίδρασης του όγκου της ΟΡΑ πραγµατοποιήθηκε σε εύρος τιµών από 25 µl µέχρι 75 µl. Η συγκέντρωση ποσότητας του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης ήταν 1, mol L -1. Όπως φαίνεται και στο σχήµα 9.6, µεταβολή του όγκου της ΟΡΑ δεν προκαλεί σηµαντικές µεταβολές στην ευαισθησία της ανάλυσης όσον αφορά στις CAP και NAC µε τις ποσοστιαίες αυξήσεις να είναι 9 και 14 % αντίστοιχα σε όλο το εύρος µεταβολής. Αντίθετα, στην περίπτωση προσδιορισµού της PEN, παρατηρείται σηµαντική αύξηση της έντασης φθορισµού της τάξης του 108 %. Τελικά όγκος που επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραµάτων ήταν αυτός των 50 µl ως συµβιβασµός µεταξύ της ευαισθησίας της ανάλυσης και της κατανάλωσης του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης Επίδραση του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης Το µήκος του σπειράµατος αντίδρασης είναι µια εν δυνάµει σηµαντική παράµετρος σε συστήµατα SIA, καθότι, εκτός από το διαθέσιµο χρόνο αντίδρασης, επηρεάζει και την αποτελεσµατικότητα της επικάλυψης των ζωνών του δείγµατος και των αντιδραστηρίων.

61 Κεφάλαιο 9 54 Σχήµα 9.6. Επίδραση του όγκου της OPA στον προσδιορισµό. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν τρία διαφορετικά σπειράµατα αντίδρασης, σταθερής εσωτερικής διαµέτρου, 0,5 mm, και µήκους 30, 60 και 90 cm. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στο σχήµα 9.7. Και για τις τρεις θειόλες δεν παρατηρήθηκαν αξιόλογες µεταβολές στο µελετούµενο εύρος. Τα 30 cm επιλέχθηκαν ως βέλτιστη τιµή του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης. Σχήµα 9.7. Επίδραση του µήκους του σπειράµατος αντίδρασης στον προσδιορισµό.

62 Κεφάλαιο Μελέτη χηµικών παραµέτρων Η µελέτη της επίδρασης των διάφορων χηµικών παραµέτρων στον αυτόµατο προσδιορισµό των θειολών µε τη SIA πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας τις βέλτιστες τιµές των γεωµετρικών παραµέτρων, όπως αυτές επιλέχθηκαν παραπάνω. Οι αρχικές τιµές των χηµικών παραµέτρων ήταν αυτές που αναφέρονται στην παράγραφο Η µελέτη των παραµέτρων αυτών έγινε, όπως και στην περίπτωση της µελέτης των γεωµετρικών παραµέτρων, µεταβάλλοντας µία παράµετρο την κάθε φορά και διατηρώντας σταθερές όλες τις υπόλοιπες. Αναλυτικά µελετήθηκε η επίδραση των παρακάτω παραµέτρων: 1. Της θερµοκρασίας του σπειράµατος αντίδρασης. 2. Του είδους του αµινοξέως. 3. Του ph. 4. Της συγκέντρωσης του αµινοξέως. 5. Του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος. 6. Της συγκέντρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος. 7. Της συγκέντρωσης της OPA Επίδραση της θερµοκρασίας Η µελέτη της επίδρασης της παραµέτρου αυτής πραγµατοποιήθηκε θερµοστατώντας το σπείραµα αντίδρασης σε θερµοκρασίες o C. Από το γράφηµα του σχήµατος 9.8 γίνεται εµφανές ότι η θερµοκρασία δεν παίζει σηµαντικό ρόλο στην πορεία εξέλιξης της αντίδρασης. Για λόγους ευκολίας και απλότητας επιλέχθηκε η θερµοκρασία δωµατίου για την εκτέλεση των επόµενων πειραµάτων. Σχήµα 9.8. Επίδραση της θερµοκρασίας στον προσδιορισµό.

63 Κεφάλαιο Επίδραση του είδους του αµινοξέως και του ph Στη συνέχεια µελετήθηκαν η επίδραση του είδους του αµινοξέως και του ph στον προσδιορισµό. Σχήµα 9.9. Επίδραση είδους αµινοξέως και ph στον προσδιορισµό.

64 Κεφάλαιο 9 57 Η µελέτη έγινε ταυτόχρονα, µελετώντας την επίδραση έξι αµινοξέων (γλυκίνης, ιστιδίνης, λυσίνης, D-L αλανίνης, λευκίνης και ασπαρτικού οξέως) σε τέσσερις διαφορετικές τιµές ph (9,0 10,5). Η συγκέντρωση ποσότητας όλων των αµινοξέων ήταν 1, mol L -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται συγκεντρωτικά στο σχήµα 9.9. Όσον αφορά στην ευαισθησία του προσδιορισµού, η γλυκίνη έδωσε τα καλύτερα αποτελέσµατα σε σχέση µε τα υπόλοιπα αµινοξέα και για τις τρεις θειόλες. Η συµπεριφορά όµως των θειολών ήταν διαφορετική όσον αφορά στο βέλτιστο ph της αντίδρασης. Όπως φαίνεται στο σχήµα 9.9, η βέλτιστη τιµή ph για την CAP ήταν 9,5, για την NAC 9,0 και για την PEN 10,0. Η συµπεριφορά αυτή βρίσκεται σε συµφωνία µε τις pka των σουλφυδρυλικών οµάδων των ενώσεων, που είναι 9,5, 9,8 και 10,5 για τις NAC, CAP και PEN αντίστοιχα. Για λόγους απλότητας επιλέχθηκε ως κοινή τιµή ph η 9,5, χωρίς σηµαντικές απώλειες στην ευαισθησία προσδιορισµού των NAC και PEN (8 και 5 % αντίστοιχα). Στα πλαίσια της µελέτης της επίδρασης του ph, µελετήθηκε η πιθανή επίδραση του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος στον προσδιορισµό. Τα ρυθµιστικά διαλύµατα που επιλέχθηκαν να µελετηθούν ήταν ανθρακικών, φωσφορικών και βορικών ιόντων σε συγκεντρώσεις ποσότητας 0,05 mol L -1 και τιµή ph = 9,5. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στο σχήµα Και για τις τρεις θειόλες, το καλύτερο ρυθµιστικό διάλυµα όσον αφορά στην ευαισθησία ήταν αυτό των βορικών ιόντων, το οποίο και επιλέχθηκε τελικά. Σχήµα Επίδραση του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος στον προσδιορισµό.

65 Κεφάλαιο 9 58 Στη συνέχεια µελετήθηκε επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθµιστικού διαλύµατος στην ένταση φθορισµού. Η µελέτη έγινε σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας των βορικών ιόντων mol L -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στο σχήµα Όσον αφορά στις CAP και NAC δεν παρατηρήθηκε αξιοσηµείωτη επίδραση στην αντίδραση παραγωγοποίησης, ενώ για την PEN η αύξηση των λαµβανόµενων σηµάτων ήταν της τάξης του 37 % στο µελετούµενο εύρος. Η τιµή των mol L -1 επιλέχθηκε ως βέλτιστη. Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ρυθµιστικού διαλύµατος στον προσδιορισµό Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της γλυκίνης Η µελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας του αµινοξέως στον προσδιορισµό έγινε σε περιοχή εύρους συγκεντρώσεων ποσότητας από 0, , mol L -1. Τα αποτελέσµατα για τις τρεις θειόλες δίνονται γραφικά στο σχήµα Όσον αφορά στην CAP, παρατηρήθηκε µη γραµµική αύξηση των σηµάτων σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας γλυκίνης 0, , mol L -1, ενώ η ένταση του φθορισµού παρέµενε πρακτικά σταθερή για µεγαλύτερες τιµές. Όσον αφορά στην NAC, παρατηρήθηκε παρόµοιο φαινόµενο, µε µη γραµµική αύξηση των σηµάτων σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας γλυκίνης 0, , mol L -1, ενώ η ένταση του φθορισµού παρέµενε πρακτικά σταθερή σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας 1, , mol L -1. Η παρατηρούµενη επίδραση στην PEN ήταν πολύ πιο δραµατική. Όπως φαίνεται στο σχήµα 9.12, η αύξηση της έντασης του φθορισµού ήταν σχεδόν γραµµική σε εύρος

66 Κεφάλαιο 9 59 συγκεντρώσεων ποσότητας γλυκίνης 0, , mol L -1, ενώ παρέµεινε αµετάβλητη για µεγαλύτερες τιµές. Τελικά, ως βέλτιστη και για τις τρεις θειόλες επιλέχθηκε η τιµή των 3, mol L -1. Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της γλυκίνης στον προσδιορισµό Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της OPA Τέλος, η µελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης ποσότητας της ΟΡΑ στον προσδιορισµό έγινε σε εύρος τιµών 0, , mol L -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στο σχήµα Όσον αφορά στις CAP και NAC, τα λαµβανόµενα σήµατα ήταν σταθερά για συγκεντρώσεις ποσότητας του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης µεγαλύτερες από 1, mol L -1. Αντίθετα, όσον αφορά στην PEN, παρατηρήθηκε µη γραµµική αύξηση των σηµάτων σε όλο το εύρος των µελετούµενων συγκεντρώσεων ποσότητας της ΟΡΑ. Ως βέλτιστη τιµή επιλέχθηκε αυτή των 1, mol L -1 κάνοντας συµβιβασµό µεταξύ της ευαισθησίας και της κατανάλωσης του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης. Οι µελετούµενες γεωµετρικές και χηµικές παράµετροι της µεθόδου, το εύρος µελέτης και η επιλεχθείσες τιµές δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 9.2.

67 Κεφάλαιο 9 60 Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της ΟΡΑ στον προσδιορισµό. Πίνακας 9.2. Συγκεντρωτικός πίνακας χηµικών και γεωµετρικών παραµέτρων. Παράµετροι Εύρος τιµών µελέτης Επιλεχθείσα τιµή Γεωµετρικές q V (C) / ml min -1 0,45 1,5 1,2 V(S) / µl V(R) / µl V(OPA) / µl l(rc) / cm Χηµικές T / ο C ph 9,0 10,5 9,5 c(ρ..) / mol L c(γλυκίνης) / mol L -1 0,1 5, , c(ορα) / mol L -1 0,2 2, ,0 10-3

68 Κεφάλαιο Επικύρωση της αναλυτικής µεθόδου Η µέθοδος SIA που αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε επικυρώθηκε για την εφαρµογή της στην ανάλυση και τον έλεγχο ποιότητας φαρµακευτικών σκευασµάτων των δραστικών θειολών. Οι παράµετροι που επικυρώθηκαν ήταν: 1. Η γραµµικότητα 2. Το εύρος προσδιορισµού 3. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού 4. Η επαναληψιµότητα 5. Η ακρίβεια 6. Η εκλεκτικότητα Γραµµικότητα της µεθόδου Η γραµµικότητα της µεθόδου επικυρώθηκε λαµβάνοντας καµπύλες αναφοράς για τις τρεις προσδιοριζόµενες θειόλες κάτω από τις βέλτιστες χηµικές και γεωµετρικές παραµέτρους του συστήµατος. Η µελέτη γίνονταν σε οκτώ επίπεδα συγκεντρώσεων σε όλες τις περιπτώσεις. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα έδειξαν ότι η γραµµικότητα υπακούονταν σε εύρος συγκεντρώσεων µάζας ως 20 mg L -1 για την CAP (r 2 = 0,9991), ως 15 mg L -1 για την NAC (r 2 = 0,9998) και ως 15 mg L -1 για την PEN (r 2 = 0,9993). Οι αντίστοιχες εξισώσεις των καµπύλων αναφοράς ήταν οι παρακάτω: F = 4,916 (± 3,334) + 45,393 (± 0,448) γ(cap) F = 3,451 (± 2,003) + 62,342 (± 0,741) γ(nac) F = 1,342 (± 1,764) + 52,959 (± 0,552) γ(pen) Όπου F η ένταση του φθορισµού και γ οι συγκεντρώσεις µάζας των προσδιοριζόµενων συστατικών σε mg L Εύρος προσδιορισµού της µεθόδου Για την επικύρωση του εύρους προσδιορισµού της αναπτυσσόµενης µεθόδου, επιλέχθηκε ως επίπεδο συγκέντρωσης 100 % αυτή των 5 mg L -1. Η επικύρωση του εύρους προσδιορισµού επιλέχθηκε να γίνει µεταξύ των ορίων %, ώστε να καλύψει τις απαιτήσεις και τα όρια της φαρµακοποιίας σε δοκιµές που αφορούν στην οµοιοµορφία της περιεκτικότητας των φαρµακευτικών σκευασµάτων (τα

69 Κεφάλαιο 9 62 συνήθη αποδεκτά όρια είναι %). Κατά συνέπεια, το εύρος προσδιορισµού και για τις τρεις δραστικές θειόλες επικυρώθηκε σε εύρος συγκεντρώσεων 2,5 7,5 mg L -1 χρησιµοποιώντας έξι επίπεδα συγκεντρώσεων. Σε όλες τις περιπτώσεις η γραµµικότητα ήταν πολύ ικανοποιητική, ενώ οι αντίστοιχες λαµβανόµενες εξισώσεις συσχέτισης φαίνονται παρακάτω: F = 3,122 (± 1,467) + 44,198 (± 0,531) γ(cap), r 2 = 0,9995 F = 4,786 (± 3,673) + 63,901 (± 0,627) γ(nac), r 2 = 0,9997 F = 2,093 (± 1,562) + 51,349 (± 0,692) γ(pen), r 2 = 0,9995 Όπου F η ένταση του φθορισµού και γ οι συγκεντρώσεις µάζας των προσδιοριζόµενων συστατικών σε mg L -1. Η αποτελεσµατικότητα της προτεινόµενης µεθόδου ως προς το εύρος προσδιορισµού ελέγχθηκε και µε τον υπολογισµό των υπολοίπων (residuals). To ποσοστιαίο εύρος των υπολοίπων κυµάνθηκε σε ικανοποιητικά επίπεδα και σε κάθε περίπτωση σε εύρος µικρότερο του ± 3,0 %. Αναλυτικά, κυµάνθηκε από 1,4 έως + 2,1 % για την CAP, από 2,2 έως + 1,9 % για τη NAC και από 1,1 έως + 1,8 % για την PEN Επαναληψιµότητα της µεθόδου Η επαναληψιµότητα της µεθόδου ελέγχθηκε τόσο κατά την ίδια ηµέρα, όσο και σε διάστηµα έξι διαδοχικών ηµερών. Στην πρώτη περίπτωση, ο έλεγχος έγινε εγχύοντας διαδοχικά οκτώ διαφορετικά πρότυπα διαλύµατα των προς ανάλυση θειολών στο επίπεδο συγκέντρωσης του 100 % (5 mg L -1 ) και υπολογίζοντας τις αντίστοιχες σχετικές τυπικές αποκλίσεις, s r. Οι λαµβανόµενες πειραµατικές τιµές ήταν 1,2 % για την CAP, 1,0 % για τη NAC και 0,9 % για την PEN. Για να ελεγχθεί η επαναληψιµότητα της µεθόδου από µέρα σε µέρα, λήφθηκαν καµπύλες αναφοράς των προσδιοριζόµενων συστατικών σε διάστηµα έξι ηµερών και υπολογίστηκε η σχετική τυπική απόκλιση, s r, των κλίσεών τους. Σε όλες τις περιπτώσεις οι καµπύλες αναφοράς λήφθηκαν σε πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων και εύρος 2,5 7,5 mg L -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για την CAP φαίνονται στις παρακάτω εξισώσεις παλινδρόµησης: F 1 = 4, ,345 γ(cap), r 2 = 0,9991

70 Κεφάλαιο 9 63 F 2 = 6, ,932 γ(cap), r 2 = 0,9993 F 3 = 3, ,074 γ(cap), r 2 = 0,9993 F 4 = 4, ,471 γ(cap), r 2 = 0,9999 F 5 = 6, ,252 γ(cap), r 2 = 0,9992 F 6 = 3, ,225 γ(cap), r 2 = 0,9991 Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για την NAC φαίνονται στις παρακάτω εξισώσεις παλινδρόµησης: F 1 = 2, ,214 γ(nac), r 2 = 0,9993 F 2 = 5, ,764 γ(nac), r 2 = 0,9994 F 3 = 4, ,632 γ(nac), r 2 = 0,9991 F 4 = 5, ,802 γ(nac), r 2 = 0,9998 F 5 = 2, ,396 γ(nac), r 2 = 0,9996 F 6 = 6, ,951 γ(nac), r 2 = 0,9993 Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για την PEN φαίνονται στις παρακάτω εξισώσεις παλινδρόµησης: F 1 = 3, ,690 γ(pen), r 2 = 0,9992 F 2 = 2, ,428 γ(pen), r 2 = 0,9998 F 3 = 2, ,737 γ(pen), r 2 = 0,9999 F 4 = 4, ,289 γ(pen), r 2 = 0,9999 F 5 = 3, ,392 γ(pen), r 2 = 0,9994

71 Κεφάλαιο 9 64 F 6 = 4, ,902 γ(pen), r 2 = 0,9992 Η σχετική τυπική απόκλιση των κλίσεων (n = 6) ήταν 4,9 % για την CAP, 3,5 % για τη NAC και 4,3 % για την PEN, επιβεβαιώνοντας την επαναληψιµότητα της µεθόδου από µέρα σε µέρα και για τις τρεις θειόλες Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού Τα όρια ανίχνευσης, c L, και ποσοτικού προσδιορισµού, c Q, της µεθόδου για τις τρεις θειόλες υπολογίστηκαν µε βάση το λόγο των λαµβανόµενων σηµάτων προς το θόρυβο (S / N). To επίπεδο του θορύβου υπολογίστηκε από το λογισµικό αποτίµησης των αποτελεσµάτων (Clarity ), προωθώντας το ρεύµα του µεταφορέα µέσα από την κυψελίδα του φθορισµοµετρικού ανιχνευτή για χρονικό διάστηµα 10 min. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 9.3. Πίνακας 9.3. Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού Προσδιοριζόµενες ενώσεις a Όριο ανίχνευσης / µg L -1 (S / N = 3) Όριο ποσοτικού προσδιορισµού / µg L -1 (S / N = 10) CAP 2,3 7,7 NAC 1,6 5,3 PEN 2,0 6,6 a Ο θόρυβος υπολογίστηκε σε 0,0345 mv Εκλεκτικότητα της µεθόδου Η εκλεκτικότητα της µεθόδου ως προς την πιθανή παρεµποδιστική δράση των εκδόχων που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή των φαρµακευτικών σκευασµάτων µελετήθηκε µε την µέθοδο του ψευδοφαρµάκου (placebo). Ως ψευδοφάρµακο ορίζεται το µίγµα όλων των εκδόχων πλην του δραστικού συστατικού. Η παρασκευή και η σύσταση του ψευδοφαρµάκου περιγράφονται λεπτοµερώς στην παράγραφο 8.1. Η διαδικασία επικύρωσης της εκλεκτικότητας της µεθόδου περιελάµβανε επιµόλυνση πρότυπων διαλυµάτων των τριών θειολών

72 Κεφάλαιο 9 65 (γ = 5,0 mg L -1 ) µε αυξανόµενες συγκεντρώσεις του ψευδοφαρµάκου σε εύρος mg L -1. Το αποδεκτό όριο ανακτήσεων ορίστηκε σε %. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα συνοψίζονται στον Πίνακα 9.4. Από τα δεδοµένα του Πίνακα 9.4 προκύπτει ότι ακόµα και η µέγιστη συγκέντρωση εκδόχων που εξετάστηκε (500 mg L -1 ή αναλογία 100 : 1) δεν προκαλεί καµία παρεµποδιστική δράση στην προτεινόµενη µέθοδο SIA για κανένα από τα προσδιοριζόµενα συστατικά. Πίνακας 9.4. Μελέτη της εκλεκτικότητας της µεθόδου Ψευδοφάρµακο Ανάκτηση (%) / γ = 5 mg L -1 (mg L -1 Αναλογία ) CAP NAC PEN : : : Ακρίβεια της µεθόδου Η ακρίβεια της προτεινόµενης µεθόδου επικυρώθηκε και για τις τρεις προσδιοριζόµενες θειόλες σε τρία επίπεδα συγκεντρώσεων και συγκεκριµένα στα 2,5, 5,0 και 7,5 mg L -1 (50, 100 και 150 %), αναλύοντας τρία συνθετικά δείγµατα για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης. Τα συνθετικά δείγµατα παρασκευάζονταν µε κατάλληλες προσθήκες προτύπων ενώσεων σε διαλύµατα ψευδοφαρµάκου συγκέντρωσης µάζας 500 mg L -1. Ως αποδεκτό εύρος ανακτήσεων ορίστηκε από 95,0 105,0 %. Τα λαµβανόµενα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 9.5. Η ακρίβεια της προτεινόµενης µεθόδου επαληθεύτηκε σε όλες τις περιπτώσεις, µε τις ποσοστιαίες ανακτήσεις να βρίσκονται εντός του αποδεκτού εύρους τιµών Εφαρµογές της µεθόδου Η προτεινόµενη µέθοδος εφαρµόστηκε στον έλεγχο ποιότητας εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων των τριών θειολών, και συγκεκριµένα τόσο στον ποσοτικό προσδιορισµό της δραστικής ουσίας (assay), όσο και στον έλεγχο της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας (content uniformity) των

73 Κεφάλαιο 9 66 Πίνακας 9.5. Ακρίβεια της µεθόδου. είγµα Συγκέντρωση (mg L -1 ) Ψευδοφάρµακο Ανάκτηση (%) (mg L -1 ) CAP NAC PEN 1 2, , , , , , , , , σκευασµάτων. Οι αποδεκτές ανακτήσεις, όπως αυτές ορίζονται από τη φαρµακοποιία, κυµαίνονται από % στον ποσοτικό προσδιορισµό και από % στον έλεγχο της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας. Η προκατεργασία των σκευασµάτων για κάθε δοκιµή, περιγράφεται λεπτοµερώς στην παράγραφο 9.3. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στους Πίνακες Πίνακας 9.6. Προσδιορισµός CAP σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. είγµα Περιεκτικότητα Ανάκτηση (%) Capoten tabs 25 mg / tab 1 99,1 2 98, ,6 Dosturel tabs 50 mg / tab 1 102, , ,5

74 Κεφάλαιο 9 67 Πίνακας 9.7. Έλεγχος οµοιοµορφίας περιεκτικότητας σκευασµάτων CAP. είγµα Capoten tabs, 25 mg / tab Ανάκτηση (%) Dosturel tabs, 50 mg / tab 1 94,3 101,6 2 96,2 95, ,1 96, ,6 103,5 5 95,6 95, ,2 97,8 7 99,2 99, ,8 98, ,1 101, ,6 102,7 Πίνακας 9.8. Προσδιορισµός NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. είγµα Περιεκτικότητα Ανάκτηση (%) Trebon tabs 600 mg / tab Trebon sach 200 mg / sach

75 Κεφάλαιο 9 68 Πίνακας 9.9. Έλεγχος οµοιοµορφίας περιεκτικότητας σκευασµάτων NAC. είγµα Trebon tabs, 600 mg / tab Ανάκτηση (%) Trebon sach, 200 mg / sach Πίνακας Προσδιορισµός PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. είγµα Περιεκτικότητα Ανάκτηση (%) Penicillamine caps 250 mg / cap

76 Κεφάλαιο Συµπεράσµατα Τα συµπεράσµατα από την ανάπτυξη, βελτιστοποίηση, επικύρωση και εφαρµογή της προτεινόµενης µεθόδου SIA µπορούν να συνοψιστούν στα παρακάτω: 1. Η µέθοδος είναι αυτοµατοποιηµένη, απλή και κάνει χρήση εµπορικά διαθέσιµων αντιδραστηρίων. 2. Είναι ταχεία, καθώς επιτρέπει την έγχυση 75 δειγµάτων / h. 3. Η κατανάλωση αντιδραστηρίων και η παραγωγή αποβλήτων είναι ελάχιστη. 4. Η απαιτούµενη προκατεργασία των δειγµάτων είναι απλή και εύκολη. 5. Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά της µεθόδου είναι πολύ ικανοποιητικά για τον έλεγχο ποιότητας φαρµακευτικών σκευασµάτων. 6. Η ευαισθησία της µεθόδου την καθιστά κατάλληλη για σύζευξη µε την υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) µε σκοπό την αυτοµατοποιηµένη παραγωγοποίηση πριν τη στήλη και ανάλυση βιολογικών δειγµάτων.

77 Κεφάλαιο Κεφάλαιο 10 Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός φαρµακευτικά δραστικών θειολών µε την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων µετά από παραγωγοποίηση µε monoboromobimane 10.1 Αρχή µεθόδου Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφεται η ανάπτυξη µιας µεθόδου SIA για το φθορισµοµετρικό προσδιορισµό τριών φαρµακευτικά δραστικών θειολών καπτοπρίλης (CAP), Ν-ακετυλοκυστεΐνης (NAC) και πενικιλλαµίνης (PEN) σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. Η µέθοδος στηρίζεται στον εν-ροή σχηµατισµό φθοριζόντων παραγώγων ύστερα από αντίδραση των προσδιοριζόµενων συστατικών µε το αντιδραστήριο monobromobimane (MBB) σε αλκαλικό περιβάλλον. H αντίδρασης παραγωγοποίησης φαίνεται στο σχήµα Προσδιορισµός των θειολών σε υδατικά διαλύµατα Το βελτιστοποιηµένο διάγραµµα ροής της SIA φαίνεται στο σχήµα Η ακολουθία της SIA για τον προσδιορισµό των θειολών περιγράφεται αναλυτικά στον Πίνακα Εν συντοµία, 50 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ανθρακικών ιόντων (c = 0,1 mol L -1, ph = 11,0), 50 µl δείγµατος και 25 µl ΜΒΒ αναρροφώνται διαδοχικά µε αυτή τη σειρά στο σπείραµα συγκράτησης µέσω των θέσεων 2, 3 και 1 της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής αντίστοιχα. Στη συνέχεια, µε αναστροφή της φοράς ροής της αντλίας, οι τρείς ζώνες προωθούνται προς στον ανιχνευτή µε παροχή όγκου 0,6 ml min -1 µέσω της θέσης 5 της βαλβίδας. Tα παράγωγα σχηµατίζονται εν-ροή σε σπείραµα αντίδρασης (RC = 30 cm / 0.5 mm i.d.) και ανιχνεύονται φθορισµοµετρικά (λ ex = 390 nm / λ em = 480 nm). Συνολικά ο κύκλος ανάλυσης διαρκεί 100 s και συνεπώς ο ρυθµός εγχύσεων είναι 36 h -1. Τα σήµατα του ανιχνευτή καταγράφονται ως κορυφές, το ύψος των οποίων είναι ανάλογο των συγκεντρώσεων των προσδιοριζόµενων ουσιών στα δείγµατα. Για κάθε δείγµα πραγµατοποιούνταν τρεις διαδοχικές µετρήσεις.. Σηµειώνεται ότι κατά την αλλαγή δειγµάτων ακολουθείται ένα επιπλέον στάδιο πλύσης προς αποφυγή φαινοµένων επιµόλυνσης.

78 Κεφάλαιο O O O O H 3 C H 3 C H 2 C Br CH 3 + HS O N COOH H 3 C H 3 C H 2 C Br CH 3 + HS NH 2 O OH Monobromobimane Captopril Monobromobimane N-acetylocysteine O O O O H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 O H 3 C H 2 C S N H 3 C H 2 C S OH O COOH NH 2 Captopril - monobromobimane derivative N-acetylcysteine - monobromobimane detivative O O O H 3 C CH 3 + HS OH H 3 C H 2 C Br NH 2 Monobromobimane Penicillamine O O H 3 C CH 3 O H 3 C H 2 C S OH NH 2 Penicillamine - monobromobimane derivative Σχήµα Αντίδραση ΜΒΒ µε CAP, NAC και PEN Προσδιορισµός των θειολών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός CAP σε φαρµακευτικά σκευάσµατα εκαπέντε δισκία από το κάθε φάρµακο (Capoten tabs, 25 mg / tab και Dosturel tabs, 50 mg / tab) ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και

79 Κεφάλαιο Σχήµα ιάγραµµα ροής SIA για τον προσδιορισµό θειολών (καπτοπρίλης, Ν- ακέτυλοκυστεΐνης και πενικιλλαµίνης) σε φαρµακευτικά σκευάσµατα. S = είγµα, Buffer = ρυθµιστικό διάλυµα 0,1 mol L -1 ανθρακικών ιόντων, ph = 11,0, ΜΒΒ (c = 1, mol L -1 ), C = Η 2 Ο, D = ανιχνευτής (λ ex = 390 nm / λ em = 480 nm), ΡΡ = περισταλτική αντλία, HC = σπείραµα παραµονής (300 cm 0,7 mm i.d.), RC = σπείραµα αντίδρασης (30 cm 0,5 mm i.d.). διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται στην προηγούµενη παράγραφο. Για τον προσδιορισµό της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας των δισκίων της CAP (Content Uniformity Test), 10 δισκία διαλύονταν ξεχωριστά σε κατάλληλες ποσότητες δις-απιονισµένου νερού µε τη βοήθεια λουτρού υπερήχων. Τα προκύπτοντα διαλύµατα αναλύονταν µε τη µέθοδο SIA µετά από τη συνήθη διαδικασία φυγοκέντρησης / διήθησης / αραίωσης που περιγράφεται παραπάνω Προσδιορισµός NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Για τον προσδιορισµό της NAC σε φαρµακευτικά σκευάσµατα (Trebon tabs, 600 mg / tab και Trebon sach., 200 mg / sach) ακολουθήθηκε παρόµοια διαδικασία προκατεργασίας µε αυτή που περιγράφεται στην προηγούµενη παράγραφο.

80 Κεφάλαιο Πίνακας Στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA. α/α Χρόνος (s) Θέση Βαλβίδας Λειτουργία Αντλίας Παροχή όγκου (ml min 1 ) Περιγραφή διαδικασίας ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,6 Έγχυση 50 µl Ρ ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,6 Έγχυση 50 µl δείγµατος ,0 Επιλογή θέσης Αναρρόφηση 0,3 Έγχυση 25 µl MBB ,0 Επιλογή θέσης Προώθηση 0,6 Προώθηση των ζωνών στον ανιχνευτή εκαπέντε δισκία ή το περιεχόµενο 15 φακελίσκων µιας δόσης αντίστοιχα, ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml διςαπιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο 9.2. Για τον προσδιορισµό της οµοιοµορφίας της περιεκτικότητας των δισκίων και των φακελίσκων της NAC, 10 δισκία και 10 φακελίσκοι διαλύονταν ξεχωριστά σε κατάλληλες ποσότητες δις-απιονισµένου νερού µε τη βοήθεια λουτρού υπερήχων. Τα προκύπτοντα διαλύµατα αναλύονταν µε τη µέθοδο SIA µετά από τη συνήθη διαδικασία φυγοκέντρησης / διήθησης / αραίωσης που περιγράφεται παραπάνω Προσδιορισµός PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Για τον προσδιορισµό της PEN σε φαρµακευτικά σκευάσµατα (Penicillamine caps, 250 mg / cap), το περιεχόµενο 15 καψουλών ζυγίζονταν και λειοτριβούνταν µέχρι

81 Κεφάλαιο πλήρους οµογενοποίησης. Ακριβώς ζυγισµένες ποσότητες της σκόνης ( mg) διασπείρονταν σε 50 ml δις-απιονισµένου νερού και τοποθετούνταν σε λουτρό υπερήχων για 15 min. Τα προκύπτοντα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν για 10 min στις 3000 r.p.m. και διηθούνταν µε φίλτρα τύπου σύριγγας πορώδους 0,45 µm. Μετά από κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισµένο νερό, τα δείγµατα αναλύονταν σύµφωνα µε τη διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο Αποτελέσµατα και Συζήτηση Προκαταρκτικά Πειράµατα Ο στόχος των προκαταρκτικών πειραµάτων ήταν να διαπιστωθεί αν είναι δυνατή η πραγµατοποίηση της αντίδρασης παραγωγοποίησης των προς ανάλυση ουσιών σε συστήµατα ροής µε την τεχνική της SIA. Τα προκαταρκτικά πειράµατα έδειξαν, πράγµατι, ότι οι αντιδράσεις αυτές είναι εφικτό να πραγµατοποιηθούν εν ροή. Τα βέλτιστα µήκη κύµατος διέγερσης και εκποµπής για τις προσδιοριζόµενες θειόλες ήταν λ ex = 390 nm / λ em = 480 nm. Οι αρχικές χηµικές και γεωµετρικές παράµετροι κατά την διεξαγωγή των προκαταρκτικών πειραµάτων ήταν: c(μββ) = 1, mol L -1, ph = 9,0 (0,05 mol L -1 Ρ.. βορικών ιόντων),γ(cap) = γ(nac) = γ(pen) = 50 mg L -1, l(rc) = 100 cm (0,5 mm i.d.), q V (C) = 0,6 ml min -1, V(CAP) = V(NAC) = V(PEN) = 50 µl, V(ΜΒΒ) = 25 µl, V(Β) = 50 µl. Η σειρά αναρρόφησης των δειγµάτων, του διαλύµατος του ΜΒΒ και του ρυθµιστικού διαλύµατος αποδείχθηκε ότι δεν είχαν ιδιαίτερη επίδραση στην ευαισθησία του προσδιορισµού για όλες τις θειόλες. Η ακολουθία B / S / MBB επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραµάτων. Στο σηµείο αυτό πρέπει να τονιστεί ότι το αντιδραστήριο παρουσιάζει περιορισµένο γηγενή φθορισµό ακόµα και απουσία των θειολών. Στη βιβλιογραφία γίνεται αναφορά για έντονο φθορισµό του ΜΒΒ µετά από υδρόλυσή του και αντίδραση µε πυρηνόφιλα ανιοντικά συστατικά των ρυθµιστικών διαλυµάτων (φωσφορικά, βορικά, ανθρακικά ιόντα). Μελετώντας σε προκαταρκτικό επίπεδο τη συµπεριφορά του αντιδραστηρίου, δε διαπιστώθηκε αξιοσηµείωτη διαφορά στο φθορισµό παρουσία και απουσία τέτοιων ιόντων. Το φαινόµενο αυτό, το οποίο αποτελεί σηµαντικό πλεονέκτηµα της µεθόδου, οφείλεται στον περιορισµένο χρόνο επαφής των αντιδραστηρίων στο σύστηµα της SIA. Το αποτέλεσµα είναι να υπάρχει πολύ χαµηλό τυφλό σήµα σε σχέση µε τον φθορισµό των παραγώγων, επιτρέποντας τον προσδιορισµό τους χωρίς να είναι απαραίτητος ο διαχωρισµός τους από την περίσσεια του αντιδραστηρίου.

82 Κεφάλαιο Μελέτη χηµικών παραµέτρων Η µελέτη της επίδρασης των διάφορων χηµικών παραµέτρων στον αυτόµατο προσδιορισµό των θειολών µε τη SIA πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας τις αρχικές τιµές των παραµέτρων που αναφέρονται στην παράγραφο Η µελέτη των χηµικών παραµέτρων έγινε µεταβάλλοντας µία παράµετρο τη φορά και διατηρώντας σταθερές όλες τις υπόλοιπες. Αναλυτικά µελετήθηκε η επίδραση των παρακάτω: 1. Του ph. 2. Του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος. 3. Της συγκέντρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος. 4. Της συγκέντρωσης του ΜΒΒ. 5. Της θερµοκρασίας του σπειράµατος αντίδρασης Επίδραση του ph H επίδραση του ph στην αντίδραση παραγωγοποίησης των θειολών µε το ΜΒΒ µελετήθηκε σε προκαταρκτικό στάδιο σε εύρος 7 11 χρησιµοποιώντας κατάλληλα ρυθµισµένα διαλύµατα βορικών ιόντων συγκέντρωσης ποσότητας 0,05 mol L -1. Τα πειράµατα έδειξαν ισχυρή εξάρτηση της χηµικής αντίδρασης από την παράµετρο αυτή. Αντίθετα, ο γηγενής φθορισµός του αντιδραστηρίου παρέµενε χαµηλός και ανεπηρέαστος σε όλο το εύρος τιµών του ph. Ένα τυπικό διάγραµµα των προκαταρκτικών αυτών πειραµατικών µετρήσεων για την CAP φαίνεται στο σχήµα Η NAC και η PEN παρουσίασαν ανάλογη συµπεριφορά. Σχήµα Επίδραση του ph προκαταρκτικά πειράµατα.

83 Κεφάλαιο Από τα παραπάνω πειράµατα κατέστη σαφές ότι η ταχύτητα της αντίδρασης και ο φθορισµός των παραγώγων ευνοούνται σε αλκαλικά ph. Για το λόγο αυτό µελετήθηκε η επίδρασή του διεξοδικότερα σε εύρος τιµών ph 10,0 12,0, χρησιµοποιώντας ρυθµιστικό διάλυµα ανθρακικών ιόντων συγκέντρωσης ποσότητας 0,05 mol L -1. Τα πειραµατικά αποτελέσµατα για τις τρεις µελετούµενες θειόλες δίνονται στο σχήµα Σχήµα Επίδραση του ph στον προσδιορισµό. Ως βέλτιστη τιµή ph επιλέχθηκε αυτή των 11,0, καθότι για µεγαλύτερες τιµές δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές µεταβολές της έντασης του φθορισµού των παραγώγων. Η πιθανή επίδραση του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος στον προσδιορισµό µελετήθηκε συγκρίνοντας διαλύµατα ανθρακικών και βορικών ιόντων ίδιας συγκέντρωσης ποσότητας (0,05 mol L -1 ) και ph (11,0). Τα πειραµατικά αποτελέσµατα δίνονται στο σχήµα Ο γηγενής φθορισµός του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης ήταν ανεπηρέαστος από το είδος του διαλύµατος. Όσον αφορά στις προσδιοριζόµενες θειόλες, αποδείχτηκε ότι το ρυθµιστικό διάλυµα ανθρακικών ιόντων υπερτερεί των βορικών στον προσδιορισµό της NAC, παρουσιάζοντας αύξηση της έντασης του φθορισµού του παραγώγου της τάξης του 20 % περίπου. Για την CAP και την PEN οι διαφορές ήταν λιγότερο σηµαντικές. Τελικά, για τη συνέχεια των πειραµάτων, επιλέχθηκε το ρυθµιστικό διάλυµα των ανθρακικών ιόντων.

84 Κεφάλαιο Σχήµα Επίδραση του είδους του ρυθµιστικού διαλύµατος στον προσδιορισµό. Η επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας των ανθρακικών ιόντων στον προσδιορισµό µελετήθηκε σε εύρος 0,025 0,100 mol L -1, κρατώντας την τιµή του ph σταθερή (ph = 11,0). Τα πειραµατικά αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε µη γραµµική αύξηση των λαµβανόµενων σηµάτων της τάξης του 12 % για την CAP, 17 % για τη NAC και 30 % για την PEN. Ταυτόχρονα, η αύξηση που παρατηρήθηκε στα σήµατα του τυφλού προσδιορισµού ήταν πολύ µικρή, της τάξης του 5 %. Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας των ανθρακικών ιόντων στον προσδιορισµό.