ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ"

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ «Ανίχνευση μεταλλαγών με τη μέθοδο των γενετικών αλληλουχιών στον α- αντιγονικό καθοριστή (επίτοπο) του γονιδίου S του ιού της ηπατίτιδας Β σε χρόνιους φορείς στην Ελλάδα» ΑΣΗΜΙΝΑ ΦΥΛΑΚΤΟΥ, ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Διδακτορική Διατριβή ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Α ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ιός Ηπατίτιδας Β (ΗΒV) Ιστορική Ανασκόπηση...13 Ταξινόμηση Δομή του ιού Οργάνωση του γονιδιώματος Πολλαπλασιασμός του ιού Πρωτεΐνες του ιού...29 Τύποι και υπότυποι του ιού...32 Μεταλλαγές του ιού...36 Ηπατίτιδα Β...41 Επιδημιολογία...41 Τρόποι μετάδοσης...41 Γεωγραφική διασπορά του ιού 44 Μοριακή επιδημιολογία της HBV λοίμωξης Ανοσοπαθολογία της HBV λοίμωξης...50 Φυσική πορεία της HBV λοίμωξης...52 Κλινική Εικόνα της Νόσου 56 Οξεία Ηπατίτιδα Β..56 Χρόνια Ηπατίτιδα Β 57 Κίρρωση- Εξέλιξη σε Κίρρωση Ηπατοκυτταρικός Καρκίνος (ΗΚΚ)...63 Εξωηπατικές εκδηλώσεις της λοίμωξης από HBV.64 3

4 Εργαστηριακή Διάγνωση και Ορολογικοί Δείκτες της HBV Λοίμωξης.65 Θεραπεία και Πρόληψη o Ενδείξεις θεραπείας Aντιικά Φάρμακα o Ιντερφερόνη (IFN-α)...70 o Νουκλεοτιδικά ή νουκλεοσιδικά ανάλογα Λαμιβουδίνη Αδεφοβίρη...73 o Άλλα νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα.74 Πρόληψη...75 o Τρέχοντα εμβόλια...75 o Μεταλλαγές διαφυγής του εμβολίου Β ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός...85 Υλικό Μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Συμπεράσματα-Προοπτικές. 131 Περίληψη 135 Παράρτημα Εικόνων και Πινάκων..139 Βιβλιογραφία.151 4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο ιός της ηπατίτιδας Β (HBV) είναι ένας από τους ευρύτερα διαδεδομένους ιούς στον πλανήτη. Περίπου 2 δισεκατομμύρια άνθρωποι έχουν μολυνθεί από τον ιό και εκατομμύρια είναι χρόνιοι φορείς. Παρά την ύπαρξη αποτελεσματικών εμβολίων η χρόνια ηπατίτιδα Β παραμένει κύριος αιτιολογικός παράγοντας κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Η HBV λοίμωξη παρουσιάζει διαφορετικά κλινικά και ιολογικά χαρακτηριστικά σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές του πλανήτη και αυτό όλο και περισσότερο συσχετίζεται με τη γενετική ποικιλομορφία του ιού. Ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι ένας μερικώς διπλής έλικας DNA ιός ο οποίος έχει ένα μοναδικό τρόπο πολλαπλασιασμού μέσω της αντίστροφης μεταγραφάσης με συχνότητα εμφάνισης λαθών κατά την αντιγραφή του RNA ή του DNA παρόμοια με αυτή που εμφανίζεται στους RNA ιούς. Έτσι ο HBV παρουσιάζει ρυθμό μεταλλαγών μεγαλύτερο από το δεκαπλάσιο του ρυθμού των DNA ιών. Ο ρυθμός της υποκατάστασης των νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία του DNA ποικίλει και εξαρτάται από το στάδιο της HBV λοίμωξης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την τεράστια ποικιλομορφία του ιού με διαφορετικούς γονότυπους, υπογονότυπους, υπότυπους και διαφορετικά μεταλλαγμένα στελέχη. Οι γονότυποι αποτελούν σταθερές μορφές του ιού, αποτέλεσμα τυχαίων αλλαγών που επικράτησαν κάτω από την πίεση της φυσικής επιλογής σε μεγάλες πληθυσμιακές ομάδες, μέσα στο πέρασμα των χρόνων, ενώ τα μεταλλαγμένα στελέχη έχουν εξατομικευμένη εμφάνιση κάτω από την ιατρικώς ή φυσικώς (όπως στη χρόνια ηπατίτιδα Β) προκαλούμενη ανοσιακή πίεση συμπεριλαμβανομένου του εμβολιασμού, της αντιικής θεραπείας και της χορήγησης ειδικής έναντι της ηπατίτιδας Β ανοσοσφαιρίνης (Hepatitis B Immune Globulin/HBIG). Έτσι ο HBV εμφανίζει 8 διαφορετικούς γονότυπους με ονόματα από το A έως το H οι οποίοι έχουν σαφή γεωγραφική κατανομή. Η αναλυτική ευαισθησία των 5

6 διαφόρων εμπορικών σκευασμάτων ανίχνευσης του επιφανειακού αντιγόνου του ιού (Hepatitis B surface Antigen/HBsAg) και του αντισώματος έναντι του επιφανειακού αντιγόνου του ιού (Hepatitis B surface antibody/anti-hbs) μπορεί να εξαρτάται από το είδος του γονότυπου ή του υπότυπου και θα μπορούσε να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα σε ορούς με χαμηλή συγκέντρωση HBsAg. Δεν μπορούν επίσης να εγγυηθούν την ανίχνευση του HBsAg στην περίπτωση ύπαρξης μεταλλαγών στο γονίδιο της πρωτεΐνης S στον κύριο αντιγονικό επίτοπο στον α- αντιγονικό καθοριστή. Οι παραπάνω περιορισμοί αφορούν και την αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού όπου τα παραγόμενα αντισώματα στοχεύουν στο HBsAg και στον α-αντιγονικό καθοριστή. Έτσι η αποτυχία εμβολιασμών εναντίον του ιού μπορεί να οφείλεται σε μονές ή πολλαπλές μεταλλαγές στην περιοχή του α-αντιγονικού καθοριστή με δημιουργία μεταλλαγμένων στελεχών διαφυγής της ανοσίας. Στην Ελλάδα τα δημοσιευμένα επιδημιολογικά δεδομένα σε σχέση με τη διασπορά των γονοτύπων του HBV και τις μεταλλαγές στον α-αντιγονικό καθοριστή είναι πολύ περιορισμένα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν: α) η ανίχνευση μεταλλαγών στο γονίδιο που κωδικοποιεί για τον α-αντιγονικό καθοριστή του αντιγόνου επιφανείας του ιού της ηπατίτιδας Β (HBsAg) σε χρόνιους φορείς της νόσου στη Βόρεια Ελλάδα με τη μέθοδο ανάλυσης της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στην αντίστοιχη περιοχή του γονιδίου, β) ο προσδιορισμός των γονότυπων και των υπότυπων του ιού, η φυλογενετική τους ανάλυση και η μελέτη της μοριακής επιδημιολογίας του ιού της ηπατίτιδας Β. Η μελέτη αποτελείται από το Γενικό και το Ειδικό Μέρος. Το Γενικό Μέρος περιλαμβάνει το κεφάλαιο των γενικών χαρακτηριστικών του ιού της ηπατίτιδας Β: την ιστορία, την ταξινόμηση, τη δομή, την οργάνωση του γονιδιώματος, τις πρωτεΐνες του ιού, τον πολλαπλασιασμό, τους τύπους και υποτύπους και τις μεταλλαγές του ιού, 6

7 και το κεφάλαιο για την ηπατίτιδα Β: την επιδημιολογία της λοίμωξης, την ανοσοπαθολογία, την φυσική πορεία και την κλινική εικόνα όπως και την εργαστηριακή διάγνωση, τους ορολογικούς δείκτες και τέλος τη θεραπεία και πρόληψη της νόσου. Το Ειδικό Μέρος περιλαμβάνει το υλικό και τις μεθόδους, τα αποτελέσματα της μελέτης, τη συζήτηση των αποτελεσμάτων και τη σύγκρισή τους με τη βιβλιογραφία, τα συμπεράσματα και τις προοπτικές και τέλος την περίληψη και τις βιβλιογραφικές αναφορές. Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν δημοσιευθεί στο περιοδικό «Journal of Medical Virology» 83: (2011). Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς αυτούς που βοήθησαν στην ολοκλήρωση αυτής της μελέτης. Αρχικά προς τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής: Προς την Ομότιμη Καθηγήτρια του Εργαστηρίου Βιοχημείας του Α.Π.Θ. κ. Δημητριάδου Αφροδίτη, κυρίως επιβλέπουσα της διατριβής μου, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με τη ανάθεση του θέματος της διατριβής. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Βιοχημείας του Α.Π.Θ. κ. Μαρία Νταουντάκη ευχαριστώ θερμά για το αμέριστο ενδιαφέρον που επέδειξε και την υποστήριξη που παρείχε καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της μελέτης. Την ευχαριστώ επίσης γιατί με τις γνώσεις και την εμπειρία της συνέβαλε καθοριστικά στη διόρθωση του κειμένου της διατριβής όπως και στην όλη προσπάθεια της δημοσίευσης των αποτελεσμάτων της μελέτης σε διεθνές περιοδικό. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στον Καθηγητή Μικροβιολογίας του Α.Π.Θ. κ. Νικόλαο Μαλισιόβα για τις πολύτιμες συμβουλές, το ενδιαφέρον, την ενθάρρυνση και τι πολύτιμες υποδείξεις στη διόρθωση και την τελική δομή του κειμένου της διατριβής. Νιώθω την ανάγκη να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στον εκλιπόντα Διευθυντή του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» 7

8 Δρ. Ματθαίο Μοσχοφίδη ο οποίος πρότεινε και υποστήριξε το θέμα της διατριβής. Η διαρκής και αμέριστη συμπαράσταση και καθοδήγησή του ακόμα και πριν τον ορισμό του θέματος της διατριβής, αλλά και μέχρι το τέλος της ζωής του αποτέλεσαν για μένα στήριγμα, παράδειγμα προσφοράς και συνέπειας, αλλά και ηθικό χρέος αποπεράτωσης αυτής της προσπάθειας. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω το Διευθυντή του Εργαστηρίου Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας του Νοσοκομείου «Ιπποκράτειο» κ. Ζαφείριο Πολυμενίδη για την παρότρυνσή του να ξεκινήσω εκπόνηση διδακτορικής διατριβής και το ενδιαφέρον και την ηθική στήριξη που μου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης, παρά το γεγονός ότι το αντικείμενό της ήταν τελικά διαφορετικό από αυτό του επιστημονικού του αντικειμένου. Για την τιμή που μου έκαναν ως μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής ευχαριστώ πολύ την Καθηγήτρια Βιοχημείας του Α.Π.Θ. και Διευθύντρια Εργαστηρίου Βιοχημείας κ. Νόρμα Βαβάτση, τον Καθηγητή Μικροβιολογίας του Α.Π.Θ. κ Γεώργιο Κυριαζή, τον Καθηγητή Παθολογίας του Α.Π.Θ. κ. Παύλο Νικολαΐδη και τον Επίκουρο Καθηγητή Μικροβιολογίας του Α.Π.Θ. κ. Τιμολέωντα- Αχιλλέα Βυζαντιάδη. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στο συνάδελφο Βιοπαθολόγο κ. Δημήτριο Παπαβέντση Επιμελητή Α του Νοσοκομείου Αθηνών «Σωτηρία», για τις πολύτιμες συμβουλές του και την καθοδήγηση την οποία παρείχε σε θέματα φυλογενετικής και στατιστικής ανάλυσης, όπως επίσης και στη προσπάθεια δημοσίευσης της παρούσας μελέτης. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας του Α.Π.Θ. κ. Λεμονιά Σκούρα για την ενθάρρυνση και τη σημαντική βοήθεια που μου παρείχε στη διόρθωση του κειμένου της μελέτης. 8

9 Ευχαριστίες επίσης οφείλω σε όλο το προσωπικό του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου», τεχνολόγους και συναδέλφους ιατρούς, οι οποίοι έδειξαν καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης του εργαστηριακού μέρους της μελέτης αμέριστη συμπαράσταση. Τέλος ευχαριστώ τα μέλη της οικογένειάς μου, το σύζυγό μου Μιχάλη και τις κόρες μου Άρτεμις, Μυρτώ και Δάφνη, για την υπομονή και την κατανόηση που έδειξαν, αλλά και τη στήριξη που μου παρείχαν σε όλες τις δύσκολες στιγμές αυτής της προσπάθειας. 9

10 10

11 Α ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 12

13 Ιός Ηπατίτιδας Β Ιστορική Ανασκόπηση Το 19 ο αιώνα και στις αρχές του 20 ου τεκμηριώθηκαν οι πρώτες αποδείξεις για την ύπαρξη ενός δεύτερου ιού Ηπατίτιδας (εκτός από αυτόν της ηπατίτιδας Α/ HAV) ο οποίος μεταδίδεται δια μέσου του αίματος και άλλων υγρών του σώματος. Οι έρευνες για τις επιδημίες ηπατίτιδας που εμφανίστηκαν μετά τη διενέργεια εμβολιασμών για ιλαρά, παρωτίτιδα και κίτρινο πυρετό τις δεκαετίες 1930 και συνετέλεσαν στην ευρεία αποδοχή του ιού. Τα εμβόλια περιείχαν ανθρώπινο ορό ή πλάσμα που ήταν μολυσμένα από κάποιον νοσογόνο παράγοντα που διέλαθε της προσοχής. Η νόσος συσχετίστηκε επίσης με τη χρήση μη αποστειρωμένων βελονών στη δεκαετία του 60. Η ανακάλυψη του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) έγινε με έμμεσο τρόπο από τον Blumberg και τους συνεργάτες του 4 υποθέτοντας ότι ο ορός πολυμεταγγιζόμενων ατόμων περιέχει πολλά αντισώματα έναντι πρωτεϊνών διαφορετικών από εκείνες των ληπτών. Βρέθηκε ένα αντιγόνο στον ορό ενός αυστραλού ιθαγενή το οποίο ονόμασαν αυστραλιανό 5 και η παρουσία του συσχετίστηκε σύντομα με την ηπατίτιδα ασθενών προερχόμενη από μετάγγιση αίματος Για την ανακάλυψη αυτή ο Blumberg τιμήθηκε με το βραβείο Nobel Ιατρικής το Παράλληλα ο Prince και συνεργάτες προχώρησαν στην απευθείας ανίχνευση της αιτίας της ιογενούς ηπατίτιδας χρησιμοποιώντας αντιορό από ασθενείς με οξεία ηπατίτιδα. Ανίχνευσαν τον ιό με μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού σε ιστοτεμάχια ήπατος πασχόντων. Τα ηπατοκύτταρα είχαν κυτταροπλασματική και πυρηνική φθορίζουσα χρωστική 13 που αφορούσε πιθανά το αυτραλιανό αντιγόνο και το νουκλεοκαψίδιο του ιού αντίστοιχα. Επιπλέον ο Prince ταυτοποίησε μια πρωτεΐνη στον ορό ασθενών με ηπατίτιδα μετά από μετάγγιση με το όνομα SH 14, η οποία αργότερα αποδείχθηκε ότι ήταν ταυτόσημη με το αυστραλιανό αντιγόνο. 13

14 Αναδρομικές μελέτες επιβεβαίωσαν υποψίες ότι ο HBV ήταν υπεύθυνος για τη χρόνια ηπατίτιδα η οποία οδηγούσε σε κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνο

15 Ταξινόμηση Ο ιός της ηπατίτιδας Β αποτελεί τον πρότυπο ιό της οικογένειας των Hepadnaviridae (hepatitis DNA virus), οι οποίοι παρουσιάζουν αξιοσημείωτες ομοιότητες στην οργάνωση του γονιδιώματός τους και στην στρατηγική του πολλαπλασιασμού τους. Μαζί με τους Spumaviridae είναι οι μόνοι DNA ιοί στα ζώα που χρησιμοποιούν για τον πολλαπλασιασμό τους μια RNA αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase-rt). Οι Hepadnaviridae αποτελούν ξεχωριστή οικογένεια ιών εξαιτίας του εξαιρετικά μικρού μεγέθους του γονιδιώματος (3-3.3 kbp), την οργάνωσή του με ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης, και τη μοναδική στρατηγική πολλαπλασιασμού του με την αντίστροφη μεταγραφάση. Η οικογένεια των Hepadnaviridae αποτελείται από δύο γένη: τους Orthohepadnaviruses οι οποίοι προσβάλλουν τα θηλαστικά και τους Avihepadnaviruses οι οποίοι προσβάλουν τα πτηνά 28 (πίνακας 1). Η διαφοροποίηση στο γονιδίωμα φτάνει στο 35% στους Orthohepadnaviruses και το 25% στους Avihepadnaviruses. Η κατάταξή τους σε δύο γένη έγινε με βάση τη διαφορά των βάσεων αλλά και τη σχεδόν παντελή έλλειψη ομολογίας στο RNA των δύο γενών, αν και υπάρχουν μεγάλες ομοιότητες στην αλληλουχία των βάσεων του DNA μεταξύ των ειδών του ίδιου γένους (εικόνα 1). Πίνακας 1. Η οικογένεια των Hepadnavridae αποτελείται από δύο γένη: τους Orthohepadnaviruses και τους Avihepadnaviruses Γένος Αντιπροσωπευτικά Είδη Orthohepadnaviruses HBV (Hepatitis B Virus) WHV (Woodchucks Hepatitis B Virus) GSHV (Grand Squirrels Hepatitis B Virus) WMHV (Woolly Monkey Hepatitis Virus) AGSHV (Arctic Ground Squirrels Hepatitis B Virus) Avihepadnaviruses DHBV (Duck Hepatitis B Virus) HHBV (Heron Hepatitis B Virus) 15

16 Εικόνα 1. Φυλογενετικό δέντρο των avi-(κορυφή) και ortho-(βάση) hepadnaviruses

17 Δομή του ιού Ο ιός της ηπατίτιδας Β (HBV) είναι ένας πολύ μικρός σφαιρικός ιός με διάμετρο μόλις nm (εικόνα 2). Ο HBV κυκλοφορεί στον ορό ως σωμάτιο Dane, το οποίο αποτελείται από ένα εξωτερικό περίβλημα στο οποίο βρίσκεται το αντιγόνο επιφανείας του ιού HBsAg, περιέχει δε τρεις μορφές πρωτεΐνης: τη μικρή-small (S), τη μεσαία-middle (M) (που προκύπτει από την πρωτεΐνη S με την προσθήκη του τμήματος pres2) και τη μεγάλη-large (L) (που προκύπτει από την πρωτεΐνη Μ με την προσθήκη του τμήματος pres1) και (εικόνα 2,3). Εικόνα 2. Μορφολογία του ιού της ηπατίτιδας Β (σωμάτιο Dane) και του επιφανειακού αντιγόνου (HBsAg). Tο σφαιρικό HBsAg αποτελείται κυρίως από την S μορφή HBsAg με ολίγη Μ. Το νηματοειδές HBsAg έχει τις μορφές S, M και L 30 17

18 Εικόνα 3. Δομή του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) (τροποποίηση από ) Εσωτερικά του περιβλήματος βρίσκεται το εικοσαεδρικό πυρηνοκαψίδιο του ιού με διάμετρο περίπου 28 nm, το οποίο αποτελείται από 128 διμερή της πυρηνικής πρωτεΐνης (core-c) και αποτελεί το πυρηνικό αντιγόνο (HBcAg). Μέσα στο καψίδιο βρίσκεται το γονιδίωμα του ιού το οποίο είναι μερικώς διπλής και μερικώς απλής έλικας DNA με 3200 ζεύγη βάσεων (bp), καθώς και το ένζυμο της αντιγραφής DNA πολυμεράση, η οποία δρα ως αντίστροφη μεταγραφάση (RT ) 31 (εικόνες 3 και 4). Στον ορό απελευθερώνονται επίσης σωματίδια μη μολυσματικά τα οποία περιέχουν HBsAg και υπερτερούν αριθμητικά των πραγματικών σωματιδίων του ιού (εικόνα 2), είναι σφαιρικά (αλλά μικρότερα από το σωματίδιο Dane), περιέχουν Μ και S πρωτεΐνες σε αναλογία 1:2 και ελάχιστη ποσότητα πρωτεΐνης L 32, ή νηματοειδή και περιέχουν δε ίδιες ποσότητες Μ και L πρωτεϊνών. Τα σωματίδια αυτά είναι 18

19 Εικόνα 4. Οργάνωση του γονιδιώματος του ιού της ηπατίτιδας Β. Το relaxed circular DNA (RCDNA) με μια ολοκληρωμένη αρνητική αλυσίδα και μια ελλειμματική αρνητική αλυσίδα, μαζί με τα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης και τα mrnas (τροποιημένη από Prof. Dr. rer. nat. Eberhard Hildt, Molecular medical virology of hepatitis B virus and hepatitis C virus, ανοσογόνα και χρησιμοποιήθηκαν στο πρώτο εμπορικό εμβόλιο για τον HBV. Ο ακριβής τους ρόλος δεν είναι ακόμη γνωστός. Πιστεύεται ότι απορροφώντας τα εξουδετερωτικά αντισώματα του ξενιστή διευκολύνουν την εξάπλωση και παραμονή του ιού σε αυτόν. 19

20 Οργάνωση του γονιδιώματος Το πυρηνοκαψίδιο περιέχει το DNA του ιού, που αποτελείται από δύο έλικες διαφορετικού μήκους. Η μακρύτερη (έλικα L ή αρνητική έλικα) περιέχει όλες τις γενετικές πληροφορίες του ιού και προσκολλάται ομοιοπολικά με το 5 άκρο της στην πολυμεράση του ιού. Η βραχεία έλικα (έλικα S ή θετική έλικα) περιέχει αλληλουχίες που ταιριάζουν στα 3 και 5 άκρα της μακράς έλικας, επιτρέποντας τις δύο έλικες να σχηματίσουν δομή κλειστής αγκύλης γνωστής ως χαλαρό κυκλικό DNA (relaxed circular DNA/RC-DNA). Επιπλέον η S έλικα επεκτείνεται με μια μικρή ακολουθία ολιγοριβονουκλεοτιδίων (εικόνα 4). Λάθος στην έναρξη της αντιγραφής της θετικής έλικας οδηγεί στη σύνθεση γραμμικού δίκλωνου DNA (Double Strand Linear DNA/DSL-DNA), αντί του χαλαρού κυκλικού DNA, σε μικρό ποσοστό (5%-20%) των ιικών σωματιδίων. Ιοί με γραμμικό DNA είναι επίσης μολυσματικοί Η οργάνωση του γονιδιώματος του ιού είναι πολύπλοκη, λόγω της ανάγκης κωδικοποίησης πολλών πρωτεϊνών από ένα σχετικά πολύ μικρού μήκους DNA γονιδίωμα. Το κυκλικό μερικώς δίκλωνο DNA του HBV έχει 4 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (open reading frames/orf), τα οποία αλληλοκαλύπτονται σε σημαντική έκταση, εδράζονται όλα στην αρνητική αλυσίδα και κωδικοποιούν τις 7 πρωτεΐνες του ιού 36,37. Έτσι υπάρχει το πλαίσιο ανάγνωσης της πρωτεΐνης του περιβλήματος, το πλαίσιο ανάγνωσης της προπυρηνικής-πυρηνικής περιοχής (pre C/C), το πλαίσιο ανάγνωσης της πολυμεράσης (P) και τέλος αυτό της περιοχής Χ (Εικόνα 4). Η κωδικοποίηση διαφορετικών πρωτεϊνών από το ίδιο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης είναι δυνατή από την ύπαρξη διαφορετικών θέσεων έναρξης μεταγραφής. Το πλαίσιο ανάγνωσης της πρωτεΐνης του περιβλήματος του ιού καλύπτει περισσότερο από το ένα τρίτο του ιικού γονιδιώματος και κωδικοποιεί τρεις πρωτεΐνες: την πρωτεΐνη επιφανείας (S) ή «μικρή» πρωτεΐνη, τη «μεσαία» πρωτεΐνη 20

21 Μ που αποτελείται από την πρωτεΐνη S και την προεπιφανειακή πρωτεΐνη S 2 (pre S 2 ) και τη «μεγάλη» πρωτεΐνη L που αποτελείται από την πρωτεΐνη Μ και την προεπιφανειακή πρωτεΐνη S 1 (pre S 1 ) με 226, 281 και 400 αμινοξέα αντίστοιχα 38. Η προπυρηνική-πυρηνική περιοχή (pre-c/c) διαθέτει δύο κωδικόνια έναρξης της μετάφρασης (ATG). Κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες, την πρωτεΐνη e της οποίας η μετάφραση αρχίζει από το πρώτο κωδικόνιο και την πρωτεΐνη του πυρηνοκαψιδίου (c) που αρχίζει από το δεύτερο κωδικόνιο. Το πλαίσιο ανάγνωσης της πολυμεράσης (P) επικαλύπτει πλήρως το πλαίσιο ανάγνωσης του περιβλήματος pre S 1 και pre S 2 και μερικώς τα πλαίσια της πρωτεΐνης X και της προπυρηνικής πυρηνικής πρωτεΐνης (pre-c/c), καλύπτοντας το 80% του συνολικού γονιδιώματος Τέλος η περιοχή X κωδικοποιεί την πρωτεΐνη X με 154 αμινοξέα, και παίζει το ρόλο του ενεργοποιητή της έκφρασης διαφόρων γονιδίων απαραίτητων για τη μολυσματικότητα του ιού. Επιπρόσθετα στο γονιδίωμα του ιού εμπεριέχονται και προαγωγείς της μεταγραφής (promoters) όπως και ενισχυτές (enhancers) οι οποίοι διευκολύνουν τη σύνδεση με μεταγραφικούς παράγοντες του ξενιστή και την έναρξη της σύνθεσης των αγγελιοφόρων RNA (mrna) από τα διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης του DNA του ιού. 21

22 Πολλαπλασιασμός του ιού Ο ιός της ηπατίτιδας Β προσβάλλει κύρια τα ηπατοκύτταρα, αλλά και άλλοι τύποι κυττάρων όπως τα επιθηλιακά κύτταρα της χοληδόχου κύστης, το πάγκρεας, οι νεφροί, το δέρμα, ο σπλήνας, ο μυελός των οστών και τα μεγάλα μονοπύρηνα του αίματος έχει φανεί να φιλοξενούν γονιδίωμα του ιού και να ευνοούν την έκφραση του HBV σε κάποιο βαθμό 39,40. Το αν όλα αυτά τα κύτταρα μπορούν να παίξουν το ρόλο μιας εξωηπατικής δεξαμενής για την παραγωγή μολυσματικών σωματιδίων του ιού αποτελεί θέμα αντιπαράθεσης. Ο HBV χαρακτηρίζεται από μια μοναδική στρατηγική πολλαπλασιασμού. Κατ αρχήν προσκολλάται στη μεμβράνη του ηπατοκυττάρου και αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα του. Οι προσπάθειες για την εύρεση του υποδοχέα οδήγησαν σε μια πληθώρα υποψηφίων υποδοχέων όπως η απολιποπρωτεΐνη H (apo-h) 41, μια παραλλαγή της apo-h (alt. apo-h) 42, η αλβουμίνη από πολυανθρώπειο ορό (phsa) 43, η φιμπρονεκτίνη 44 και η ιντερλευκίνη 6 (IL-6) 45. Πιο πρόσφατα έχει βρεθεί μια πρωτεΐνη (gp180) να αλληλεπιδρά με την περιοχή pres1 του γονότυπου D του HBV. Έχει βρεθεί επίσης μια πρωτεΐνη 80 kd να συνδέεται με τον ανθρώπειο HBV, η οποία δεν έχει ακόμη ταυτοποιηθεί. Παρά τα παραπάνω ευρήματα οι πρωτεΐνες υποδοχείς και ο μηχανισμός εισόδου του HBV στο ηπατοκύτταρο δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Στη συνέχεια μετά την προσκόλλησή του, το σωματίδιο συντήκεται με τη μεμβράνη του ηπατοκυττάρου, χάνει το περίβλημά του, εισέρχεται στο ηπατοκύτταρο και το πυρηνοκαψίδιο μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου ξενιστή (εικόνα 5 και 6) 46. Εκεί το χαλαρά κυκλικό (relaxed circular-rc) DNA μετατρέπεται σε υπερελικωμένο κλειστό κυκλικό DNA (covalently closed circular ccc DNA) 40,47 (εικόνα 5). Η διαδικασία αυτή απαιτεί την αποκοπή της ομοιοπολικά συνδεδεμένης 22

23 Εικόνα 5. Σχηματική παράσταση του κύκλου αναπαραγωγής του ιού 48 πολυμεράσης του ιού από την αρνητική αλυσίδα, την αποκοπή μιας αλληλουχίας ολιγοριβονουκλεοτιδίων από το 5 άκρο της θετικής αλυσίδας, τη συμπλήρωση της θετικής αλυσίδας, και τη σύνδεση των άκρων των δύο αλυσίδων ώστε να σχηματιστεί ένα ομοιοπολικό κλειστό μόριο, και τέλος την υπερελίκωση του ιικού DNA με τη χρωματίνη του ξενιστή (εικόνα 5). Η ακριβής ενζυμική διαδικασία που εμπλέκεται δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί. Μελέτες έδειξαν ότι ο αρχικός σχηματισμός του ccc DNA από εισερχόμενα ιικά σωμάτια δεν μπορεί να αποτραπεί με τη χρήση πιθανών νουκλεοσιδικών αναλόγων που θα εμποδίζουν την ιική πολυμεράση και τη σύνθεση της θετικής αλυσίδας του DNA Από την παρατήρηση αυτή συνάγεται ότι, σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν χρόνια αντιική θεραπεία, υπολειπόμενα στη ροή του αίματος ιικά σωμάτια πιθανόν να μπορούν ακόμη να μολύνουν νέα κύτταρα παρά την παρουσία του φαρμάκου. 23

24 Υπό φυσιολογικές συνθήκες το ccc-dna έχει τη μεγαλύτερη πιθανότητα σύνδεσης με ιστούς και άλλες πρωτεΐνες προς σχηματισμό μικροχρωμοσωμάτων. Ιοί με γραμμικό διπλοελικωμένο DNA (double stranded linear-dsl DNA) μπορούν επίσης να μολύνουν το ηπατοκύτταρο και το γραμμικό γονιδίωμα είναι δυνατό να μετατραπεί σε ccc DNA διαμέσου ενός «παράδοξου» ανασυνδυασμού 35, το οποίο (ccc-dna) είναι συχνά ελαττωματικό για περαιτέρω πολλαπλασιασμό λόγω της απώλειας αλληλουχιών από τα 3 και 5 άκρα του γραμμικού μορίου 53 (εικόνα 7). Εικόνα 6. Αναπαραγωγή του ιού της ηπατίτιδας Β 30 24

25 Tο ccc DNA αποτελεί το εκμαγείο για τη μεταγραφή του ιικού γονιδιώματος, και τη μεταγραφή του ιικού RNA. Έχουν ανακαλυφθεί 4 αγγελιοφόρα RNA (mrna) 54,55, τα οποία προέρχονται από την αρνητική αλυσίδα του HBV DNA, συντίθενται με τη δράση της RNA πολυμεράσης του ξενιστή και μεταφράζονται στις πρωτεΐνεςσυστατικά του HBV. Τα κύρια μεταγραφήματα τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν με ανάλυση Northern Blot σε ήπαρ μολυσμένο από τον HBV είναι τα 3.5, 2.4 και 2.1 kb μήκους mrnas τα οποία ονομάζονται pre-c/c, pre-s και SmRNAs αντίστοιχα 56,57. Επιπροσθέτως έχει ανιχνευθεί ένα ακόμη μικρότερου μήκους mrna (0.9 kb) το Εικόνα 7. Ο κύκλος αναπαραγωγής του HBV. Οι ιοί με RC DNA και DSL DNA είναι ικανοί να μολύνουν τα ηπατοκύτταρα 29 25

26 XmRNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Χ Κάθε μεταγράφημα έχει ένα κοινό 3 άκρο που σχηματίζεται από ένα σήμα πολυαδενυλίωσης του core γονιδίου. Το 3.5 kb mrna είναι μεγαλύτερο και από το γονιδίωμα του ιού και κωδικοποιεί τα HBc και HBe αντιγόνα, την πολυμεράση του ιού, μια πρωτεΐνη έναρξης του διπλασιασμού του DNA και αποτελεί το εκμαγείο για το σχηματισμό της αρνητικής αλυσίδας του DNA του ιού (προγονιδιακό-pregenomic RNA). Όσον αφορά τα υπόλοιπα τρία mrna, το 2.4 kb κωδικοποιεί τη μεγάλη (large- L) πρωτεΐνη του επιφανειακού αντιγόνου και επικαλύπτει το 2.1 kb mrna το οποίο κωδικοποιεί τη μεσαία (medium-m) και τη μικρή (small-s) πρωτεΐνες του επιφανειακού αντιγόνου, ενώ το 0.9 kb mrna κωδικοποιεί την πρωτεΐνη X. Η μετάφραση αυτή ρυθμίζεται από διάφορα ρυθμιστικά γονίδια όπως 4 προαγωγείς (promoters pres1 και pres2/ S, pre-c/ C, Χ), δύο ενισχυτές (enhancers I, II), αλληλουχίες-σήματα πολυαδενυλίωσης κ.ά. Μετά την ολοκλήρωση της μεταγραφής τα αγγελιοφόρα RNA, συμπεριλαμβανομένων του προγονιδιακού RNA μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα του ηπατοκυττάρου όπου μεταφράζονται σε πρωτεΐνες, ενώ το προγονιδιακό RNA, εγκαψιδώνεται στο πρόσφατα σχηματιζόμενο πυρηνοκαψίδιο του ιού μαζί με την DNA πολυμεράση του ιού. Μέσα στο νουκλεοκαψίδιο, γίνεται αρχικά η σύνθεση της αρνητικής DNA αλυσίδας του ιού με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης και με τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης η οποία χρησιμοποιεί ως εκμαγείο το προγονιδιακό RNA Καθώς προχωράει η σύνθεση της αρνητικής αλυσίδας συμβαίνει η προοδευτική απομάκρυνση του προγονιδιακού RNA από την περιοχή (RNase H) της πολυμεράσης. Στη συνέχεια γίνεται η σύνθεση της θετικής αλυσίδας του DNA με εκμαγείο την αρνητική αλυσίδα 64. Η ωρίμανση του πυρηνοκαψιδίου ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης core, η οποία κατόπιν συνδέεται ισχυρά με τη διπλή έλικα του νεοσυντεθέντος DNA. 26

27 Σε αυτό το στάδιο το πυρηνοκαψίδιο είναι πλέον ώριμο και περιβάλλεται από τις πρωτεΐνες επιφανείας του ιού που βρίσκονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Το πλήρες ιικό σωμάτιο μπορεί τώρα να εξέλθει με εξωκυττάρωση από τα μολυσμένα ηπατοκύτταρα στην κυκλοφορία του αίματος χωρίς να τα σκοτώνει ή να προκαλεί τη λύση τους 30,36,65,66 (εικόνα 5 και 6), ή να μεταφερθεί εκ νέου στον πυρήνα του κυττάρου για να εμπλουτίσει έτσι τη δεξαμενή του ccc DNA 67 με το σχηματισμό νέων αντιγράφων ccc DNA Κατά την ανωτέρω διαδικασία συμβαίνει όμως να συντίθεται περισσότερες πρωτεΐνες επιφανείας από όσες χρειάζονται για τη συσκευασία των ιικών σωματιδίων, πολλές από τις οποίες ενώνονται μεταξύ τους και σχηματίζουν σφαιρικά και ραβδόμορφα σωματίδια, τα οποία ανιχνεύονται με τις εργαστηριακές δοκιμασίες ορολογικού ελέγχου του αίματος (ορολογική ανίχνευση του HBsAg). Τα νέα αντίγραφα του ιού και η περίσσεια του επιφανειακού αντιγόνου, απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του ασθενούς από τη μεμβράνη του ηπατοκυττάρου και είναι έτοιμα από το σημείο αυτό να μολύνουν άλλα κύτταρα και επομένως να πολλαπλασιαστούν επιτυχώς 68. Ο πυρήνας των μόνιμα μολυσμένων ηπατοκυττάρων περιέχει από 30 έως 50 αντίγραφα ccc DNA. Αυτά λειτουργούν ως δεξαμενή για νέους μελλοντικούς κύκλους πολλαπλασιασμού του ιού. Η αύξηση των αντιγράφων του νέου ccc DNA μπορεί να περιοριστεί μόνο με την αναστολή της ανάστροφης μεταγραφής. Επομένως η σύνθεση του προγονιδιακού RNA από το ccc DNA αποτελεί ένα σημαντικό σημείο στην ενίσχυση του γονιδιώματος του HBV και κατά συνέπεια καθορίζει το ρυθμό πολλαπλασιασμού HBV, εφόσον η ενεργός HBV λοίμωξη οξεία ή χρόνια, προϋποθέτει την παρουσία ενός σταθερού πολλαπλασιασμού ενεργών ccc DNA μορίων τα οποία θα αποτελέσουν τη σταθερή πηγή πολλαπλασιασμού του προγονιδιακού RNA και στη συνέχεια την παραγωγή των πρωτεϊνών του ιού 47,69. 27

28 Η παρουσία του ccc DNA αποτελεί απόδειξη πολλαπλασιαζόμενου HBV. Επιπλέον το ιικό DNA μπορεί ευθέως να ενσωματωθεί στο DNA του ξενιστή κυρίως διαμέσου της διπλής έλικας γραμμικού DNA (DSL DNA) και του παράδοξου ανασυνδυασμού του 70. Αυτό το ενσωματωμένο ιικό DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή δεν μπορεί να λειτουργήσει ως εκμαγείο παραγωγής προγονιδιακού ιικού RNA. Εντούτοις η παρουσία ξένου ιικού DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή μπορεί να ενέχεται στην ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκίνου (HCC). Η συνεχής σύνθεση των πρωτεϊνών επιφανείας από τα αντίστοιχα αγγελιοφόρα RNA, και η αύξηση της σύνθεσης της μεγάλης πρωτεΐνης του περιβλήματος (large env protein) σε σχέση με τις υπόλοιπες, οδηγεί στη συσσώρευση ιικών σωματίων μέσα στο ενδοπλασματικό δίκτυο, αναστολή της μεταφοράς τους στο σύστημα Golgi και απελευθέρωσης από το κύτταρο, με αποτέλεσμα την πρόκληση οξειδωτικού στρες στο ηπατοκύτταρο. Συχνά κατά τη διάρκεια της μόλυνσης και της αναπαραγωγής του ιού, δημιουργούνται αλλαγές στο γενετικό υλικό του ιού, οι λεγόμενες μεταλλαγές ή μεταλλάξεις. Κατά τις μεταλλαγές συμβαίνουν εισαγωγές ή διαγραφές γονιδίων ή αλλαγές σε ένα ή περισσότερα νουκλεοτίδια και προκαλούνται από διάφορους παράγοντες και μηχανισμούς (λάθη στο μηχανισμό μοριακής αντιγραφής του γενετικού υλικού, ακτινοβολίες, χημικές ουσίες κ.ά.). 28

29 Πρωτεΐνες του ιού Η πολυμεράση του ιού (εικόνα 3) είναι μία 812 αμινοξέων πρωτεΐνη με πολλαπλές δράσεις. Έτσι, ως αντίστροφη μεταγραφάση καταλύει τη σύνθεση της αρνητικής έλικας του DNA, ως RNAάση καταλύει την αντίδραση διάσπασης του προγονιδιακού RNA, ως DNA πολυμεράση καταλύει τη σύνθεση της θετικής έλικας του DNA χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την αρνητική έλικα. Η πολυμεράση συνδέεται ομοιοπολικά με την αρνητική έλικα του DNA και το καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεΐνης λειτουργεί ως ενεργοποιητής για τη σύνθεση της θετικής αλυσίδας του DNA. Η διαφοροποίηση στην αλληλουχία των αμινοξέων από τυχόν μεταλλαγές σε αυτό το τμήμα έχει συνέπειες σημαντικές στην ενζυματική του δράση. Τέλος το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης παρουσιάζει επίσης δράση RNAάσης, η οποία επιτρέπει τη διάσπαση του RNA εκμαγείου όταν η αντίστροφη μεταγραφή έχει ολοκληρωθεί. Το πυρηνοκαψίδιο του ιού (εικόνα 3) σχηματίζεται από το αντιγόνο του πυρήνα (HBcAg) μια μικρή πρωτεΐνη αμινοξέων με Μ.Β. 21 kd με μια πολύ βασική αλληλουχία αμινοξέων στο καρβοξυτελικό της άκρο, η οποία της παρέχει τη δυνατότητα ισχυρής σύνδεσης με το ιικό DNA. Επιπλέον, η πρωτεΐνη core φέρει οδηγά πεπτίδια, τα οποία στοχεύουν στο κύτταρο του ιστού του ξενιστή μετά τη μόλυνση. Η φωσφορυλίωση της πυρηνικής πρωτεΐνης (core) από κινάση του κυττάρου του ξενιστή ρυθμίζει τη σύνδεση του πυρηνοκαψιδίου με το γονιδίωμα του ιού, τη σταθεροποίηση του πυρηνοκαψιδίου και πιθανότατα παίζει σημαντικό ρόλο στα πρώτα στάδια του πολλαπλασιασμού του ιού 65. Η προπυρηνική-πυρηνική πρωτεΐνη (precore-core) περιέχει ένα οδηγό πεπτίδιο ακολουθούμενο από μια ομόλογη αλληλουχία αμινοξέων με αυτή του πυρηνικού αντιγόνου HBcAg. Το οδηγό πεπτίδιο είναι υδρόφοβο επιτρέποντας την είσοδο της πρωτεΐνης στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου του κυττάρου ξενιστή 75, 29

30 προκειμένου να απεκκριθεί δια μέσου αυτού. Όταν ολοκληρωθεί η μεταφορά απομακρύνεται το οδηγό πεπτίδιο και απελευθερώνεται το HBe πεπτίδιο (αντιγόνο e), το οποίο απαρτίζεται από 212 συνολικά αμινοξέα, και εμφανίζεται στην κυκλοφορία του αίματος σαν διαλυτό αντιγόνο. Το αντιγόνο e (HBeAg) μπορεί επίσης να διαπερνάει τον πλακούντα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και πιστεύεται ότι προκαλεί ενός είδους ειδική ανοχή έναντι των αντιγόνων του HBV 76. Η πρωτεΐνη e είναι καλώς διατηρημένη μεταξύ των στελεχών του ιού Β (HBV) καθώς και μεταξύ των μελών της οικογένειας των ιών Hepadna 77. Η πρωτεΐνη S (εικόνα 3), η κύρια πρωτεΐνη του περιβλήματος του ιού η οποία αποτελείται από 226 αμινοξέα, περιέχει το επιφανειακό αντιγόνο (surface antigen- HBsAg), καλύπτει το ένα τρίτο του ιικού γονιδιώματος και εντοπίζεται στο καρβοξυλικό άκρο του πλαισίου των πρωτεϊνών 78, μαζί με τις δύο μεγαλύτερες προεπιφανειακές πρωτεΐνες την προ S1 (pre-s1) και την προ S2 (pre-s2) εισέρχεται στη λιποειδική διπλοστιβάδα η οποία περιβάλλει το καψίδιο του ιού διαπερνώντας την πάνω από μία φορά 79. Η HBs πρωτεΐνη μπορεί από μόνη της να «αυτοσυναρμολογηθεί» σε άδεια ιικά περιβλήματα ακόμη και σε απουσία των άλλων πρωτεϊνών του ιού και των νουκλεϊκών του οξέων, όπως ήδη αναφέρθηκε στο κεφάλαιο της δομής του ιού. Η ανάλυση της περιοχής της S πρωτεΐνης έδειξε ότι υπάρχουν τουλάχιστον τρεις υδρόφοβες και δύο υδροφιλικές περιοχές σε αυτή. Η δεύτερη υδροφιλική περιοχή εξέχει από την εξωτερική επιφάνεια του ιού και καλείται κύρια υδροφιλική περιοχή (Major Hydrophilic Region/MHR) από τα αμινοξέα 99 έως 169 γιατί περιέχει την κύρια ομάδα αντιγονικών καθοριστών μαζί με τους υπεύθυνους για τον καθορισμό των υποτύπων του ιού. Ο κύριος επίτοπος των κυττάρων, ο ονομαζόμενος α-αντιγονικός καθοριστής, εδράζεται στη δεύτερη υδροφιλική περιοχή και αποτελείται από μια μικρή αλυσίδα 24 περίπου αμινοξέων, από το αμινοξύ 124 έως το 147. O α-αντιγονικός καθοριστής είναι ο κύριος επίτοπος των 30

31 εξουδετερωτικών αντισωμάτων, είναι κοινός σε όλες τις μορφές του απομονωθέντος HBsAg του ιού και εξέχει από την επιφάνειά του. Αντισώματα έναντι αυτού παρέχουν προστασία έναντι όλων των HBV γονοτύπων. Ο «α» καθοριστής παρουσιάζει δυνατότητα αλλαγής της διαμόρφωσής του στο χώρο και αποτελεί μια υδροφιλική, δύο δακτυλίων, κατασκευή που συγκρατείται με δισουλφιδικούς δεσμούς μεταξύ των αμινοξέων κυστεΐνης στις θέσεις 124 και 137 και στις θέσεις 139 και 147 αντίστοιχα. Η υδρόφιλη επίσης περιοχή της πρωτεΐνης S είναι αυτή που συνδέεται με έναν υποδοχέα αναγνώρισης στην μεμβράνη των ηπατικών κυττάρων, επιτρέποντας τη μόλυνσή τους. Η φύση του υποδοχέα του ηπατοκυτάρου με το οποίο συνδέεται η ιική πρωτεΐνη δεν έχει διευκρινισθεί, όπως έχει ήδη αναφερθεί στο κεφάλαιο του πολλαπλασιασμού. Οι προεπιφανειακές πρωτεΐνες pre-s1 και pre-s2 εντοπίζονται στο αμινοτελικό άκρο του πλαισίου των πρωτεϊνών και είναι υπεύθυνες για τη λοιμογόνο δράση του ιού, εξασφαλίζοντας ισχυρή σύνδεση του ιού στη μεμβράνη του ηπατοκυττάρου, προαπαίτηση της εισόδου του στο ηπατοκύτταρο. Οι πρωτεΐνες επιφανείας οι οποίες εκκρίνονται στον ορό κυκλοφορούν κυρίως στη γλυκοζυλιωμένη μορφή τους. Οι προεπιφανειακές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τους ίδιους Τ και Β επιτόπους. Τέλος η πρωτεΐνη X (HBΧ) η οποία περιέχει 154 αμινοξέα, έχει ελάχιστα μελετηθεί και η λειτουργία της παραμένει μη σαφώς καθορισμένη. Η θέση της στα σωματίδια του ιού και στο κύτταρο του ξενιστή αποτελεί αντικείμενο συζήτησης. Φαίνεται να παίζει ρόλο στη μολυσματικότητα του ιού in vivo, στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού του ιού αλλά και του ηπατοκυττάρου, στην ενεργοποίηση ιικών και κυτταρικών γονιδίων, στη λειτουργία της απόπτωσης και πιθανότατα εμπλέκεται στο μηχανισμό ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκίνου (HΚΚ) αναφερόμενη ως «ιική ογκοπρωτεΐνη» από πολλούς συγγραφείς 69,80,81. 31

32 Τύποι και υπότυποι του ιού Ο παγκόσμιος πληθυσμός του HBV παρουσιάζει τεράστια ποικιλομορφία. Αυτό οφείλεται στο ότι ο ιός δε διαθέτει μηχανισμούς διόρθωσης του DNA οι οποίοι θα εξασφάλιζαν μία σταθερότητα στην αλληλουχία των βάσεων του DNA κατά τον πολλαπλασιασμό του. Υπολογίζεται ότι σε κάθε άτομο το οποίο μολύνεται από τον HBV, εισέρχονται λάθος νουκλεοτίδια στα ιικά σωμάτια αποτελώντας μια τεράστια δεξαμενή γενετικής ποικιλίας (genetic variants). Αυτές οι γενετικές ποικιλίες μπορεί να διαφέρουν μεταξύ τους στη βιωσιμότητα, στον πολλαπλασιασμό αλλά και στην ευαισθησία τους στα αντιικά φάρμακα. Σε κάθε πληθυσμό ιών η ποικιλία η οποία έχει καλύτερη βιωσιμότητα ή μεγαλύτερη ικανότητα αναπαραγωγής της είναι αυτή η οποία θα κυριαρχήσει. Εντούτοις αυτή η κατάσταση μπορεί να αλλάζει από την πίεση της φυσικής επιλογής η οποία επιδρά στη σχετική βιωσιμότητα της επιλογής. Το ανοσιακό σύστημα καθώς και τα αντιικά φάρμακα αυξάνουν αυτήν την πίεση και αλλάζουν την ιεραρχία των γενετικών ποικιλιών στον πληθυσμό των HBV. Στα πλαίσια της γενετικής ποικιλομορφίας του ιού θα πρέπει να γίνει σαφής ο διαχωρισμός των γονοτύπων από τα μεταλλαγμένα στελέχη. Οι γονότυποι αποτελούν σταθερές μορφές του ιού σε διάφορους πληθυσμούς, οι οποίοι είναι αποτέλεσμα της πίεσης της φυσικής επιλογής ενός πληθυσμού μέσα σε μεγάλο χρονικό διάστημα. Τα μεταλλαγμένα στελέχη εμφανίζονται σε άτομα ως αποτέλεσμα ιατρικώς (εμβόλια, ανοσοσφαιρίνες, αντιική θεραπευτική αγωγή) ή φυσικώς (χρόνια ηπατίτιδα Β) επαγόμενης ανοσολογικής πίεσης 82. Κατ αυτόν τον τρόπο ο HBV εμφανίζει 8 γονοτύπους (A, B, C, D, E, F, G, H) σύμφωνα με την κατάταξη η οποία έγινε παγκοσμίως ύστερα από την ανάλυση του γονιδιώματος του ιού σε επίπεδο νουκλεοτιδίων (sequencing) 62,78, Οι γονότυποι διαφέρουν μεταξύ τους πάνω από 4% της περιοχής S ή περισσότερο από 7,5-8% 32

33 κατά την ανάλυση κατά μήκος όλου του γονιδιώματος και παρουσιάζουν σαφείς δομικές και κλινικές διαφορές 36-38,86. Ο όρος υπογονότυπος χρησιμοποιείται για να διακρίνει υποομάδες του γονότυπου με διαφορά στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων μεταξύ 4 και 8% κατά την ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος, ενώ ο όρος κλάδος αναφέρεται σε υποδιαίρεση του γονότυπου με διαφορά νουκλεοτιδίων μικρότερη από 4%. Οι όροι ορότυπος και υπότυπος χρησιμοποιούνται ως συνώνυμοι στη βιβλιογραφία και αναφέρονται σε πληθυσμό στελεχών του HBV. Διακρίνονται με βάση την αντιγονική ετερογένεια του αντιγόνου επιφανείας (HBsAg). Διαπιστώνεται ότι υπάρχει αντιστοιχία μεταξύ οροτύπων και γονοτύπων. Ο κύριος καθοριστής είναι ο αντιγονικός επίτοπος «α» (θέσεις αμινοξέων ) 87, ενώ δευτερεύοντες καθοριστές είναι τα αμινοξέα Lys/Arg στις θέσεις 122 και 160 (καθοριστές d/y και w/r αντίστοιχα) 88. Με βάση τα ανωτέρω προκύπτουν οι τέσσερεις κύριοι αντιγονικοί καθοριστές του αντιγόνου επιφανείας (HBsAg): ayw, ayr, adw και adr. Οι επιπρόσθετοι καθοριστές όπως τα αμινοξέα (Pro/Thr/Leu/Ile) στη θέση 127 (καθοριστές w1, w2, w3, w4, με Pro για τους w1 και w2, Thr για τον w3 και Leu ή Ile για τον w4) και του καθοριστή q+/q- του ορότυπου adr ορίζουν τελικά 9 υπότυπους/ορότυπους ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adw2, adw4, ayr, adrq-, adrq+ 88. Η διάκριση μεταξύ του ayw1 και ayw2 βασίζεται στις θέσεις αμινοξέων 134 και 159, με Phe και Ala για τον ayw1 και Thr και Gly για τον ayw2 αντίστοιχα 38. Από επιδημιολογική άποψη οι γονότυποι αυτοί παρουσιάζουν διαφορετική γεωγραφική κατανομή (εικόνα 8). Για παράδειγμα ο γονότυπος D έχει μια παγκόσμια εξάπλωση αλλά κυριαρχεί στην περιοχή της Μεσογείου, στην Εγγύς Ανατολή και στην Ινδία, με τον υπογονότυπο D 1 να απαντά στη Βόρεια Αφρική, στην Ευρώπη και στην Κεντρική Ασία, τον D 2 στη Βόρεια Ευρώπη, Ρωσία και Ιαπωνία, τον D 3 στην Νότια Αφρική και στην Ευρώπη, τον D 4 στην Αυστραλία και τον D 5 στην Ανατολική 33

34 Ινδία. Ο γονότυπος Α διακρίνεται στους υπογονότυπους Α 1 που απαντώνται κυρίως στην Αφρική, Ασία και Αμερική, Α 2 κυρίως στη Βορειοδυτική Ευρώπη και Βόρεια Αμερική, ενώ οι Α 3, Α 4 και Α 5 στη Δυτική Αφρική 85. Οι γονότυποι B και C είναι περισσότερο συχνοί στην Ασία και οι F και H στην Νότιο Αμερική. Εικόνα 8. Γεωγραφική κατανομή HBV γονοτύπων. Όλο και περισσότερες μελέτες επιβεβαιώνουν τη συσχέτιση των γονότυπων με την κλινική εικόνα της λοίμωξης, την απάντηση στη θεραπεία και τη μακροχρόνια πρόγνωση της νόσου. Έτσι για παράδειγμα, μελέτη έδειξε ότι ο γονότυπος D σχετίζεται με βαρύτερη εικόνα της νόσου σε σχέση με το γονότυπο Α 89. Ενώ ο γονότυπος Α έχει μεγαλύτερη πιθανότητα μετάπτωσης σε χρονιότητα σε σχέση με τους γονότυπους B και C 90. Επιπρόσθετα, πρόσφατες μελέτες στην Ασία προτείνουν ότι ο γονότυπος C σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης ΗΚΚ. Ο ρυθμός απώλειας του HBeAg παρουσιάζει διακύμανση ανάμεσα στους γονότυπους, με τους γονότυπους Β έως Ε να έχουν τη μεγαλύτερη πιθανότητα και το γονότυπο G να φθάνει το 100%. 34

35 Οι απαντήσεις σε θεραπεία με ιντερφερόνη α (IFN-α) ποικίλουν ανάλογα με το γονότυπο του ιού. Συγκεκριμένα λοιμώξεις με στελέχη των γονοτύπων Α και Β απαντούν καλύτερα από εκείνες των γονοτύπων D και C 91,92. Η συσχέτιση αυτή έχει πρόσφατα επιβεβαιωθεί σε μεγάλη πολυκεντρική μελέτη δοκιμασίας της πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης 93. Αντίθετα, οι περισσότερες αναφορές καταγράφουν μη εμφανείς διαφορές σε θεραπευτικές απαντήσεις σε νουκλεοσιδικά ανάλογα μεταξύ των ιικών γονοτύπων, αν και μελέτες έδειξαν ότι στο γονότυπο D η αντίσταση στη λαμιβουδίνη εμφανίζεται πολύ αργότερα

36 Μεταλλαγές του ιού Οι μεταλλαγές (mutations) οι οποίες συμβαίνουν συνήθως στα γονίδια της πρωτεΐνης επιφανείας (surface), της πυρηνικής πρωτεΐνης (core), της προπυρηνικής πρωτεΐνης (precore) και της πολυμεράσης (polymerase) 100, έχουν ως αποτέλεσμα την αλλαγή στην ικανότητα πολλαπλασιασμού του ιού, στη φυσική πορεία της νόσου, στην απάντηση στην αντιική αγωγή, στη δημιουργία διαφευγόντων της ανοσίας στελεχών, στην αποτυχία των εμβολίων και στην αδυναμία ανίχνευσης των μεταλλαγμένων στελεχών 68. Οι μεταλλαγές στην προπυρηνική περιοχή έχουν ως αποτέλεσμα αλλαγές στην έκφραση του αντιγόνου e HBeAg χωρίς αυτό να επηρεάζει την έκφραση των πρωτεϊνών του καψιδίου 76,101,102. Έχουν περιγραφεί δύο τύποι τέτοιων μεταλλαγών: αυτές που αφορούν το κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης κι αυτές που αφορούν τον βασικό πυρηνικό προαγωγέα (basic core promoter/bcp variants). Έτσι η αντικατάσταση της γουανίνης από αδενίνη στη θέση 1896 (G1896A) έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός κωδικόνιου τερματισμού της μετάφρασης η οποία οδηγεί στην αποτυχία παραγωγής του αντιγόνου HBeAg. Η επικράτηση της μεταλλαγής εξαρτάται από την παρουσία θυμίνης Τ ή κυτοσίνης C στη θέση 1858, έτσι ώστε να σταθεροποιείται το ζεύγος των βάσεων στις θέσεις 1858 και Η πιθανότητα εμφάνισης αυτής της μεταλλαγής διαφέρει στους διάφορους γονότυπους και είναι πιο συχνή στους γονότυπους Β, C και D με ποσοστά 50%, 50% και 43% αντίστοιχα Πιο συχνή μεταλλαγή στην περιοχή του βασικού πυρηνικού προαγωγέα είναι η διπλή μεταλλαγή Α1762Τ και G1764A που ελαττώνει τη σύνθεση του pre core mrna και κατά συνέπεια του αντιγόνου HBeAg 36,76,104,105. Η μεταλλαγή αυτή εμφανίζεται πιο συχνά στους γονότυπους A και C 92,

37 Η παρουσία μεταλλαγών στην προπυρηνική περιοχή πιστεύεται ότι επιτρέπει στον ιό να διαφύγει της ανοσιακής απάντησης η οποία πυροδοτείται από το HBeAg και ευθύνεται για τη χρόνια ηπατίτιδα η οποία είναι αρνητική για HBeAg και τείνει να έχει πιο χρόνια πορεία με υψηλότερη πιθανότητα εμφάνισης κίρρωσης. Οι μεταλλαγές στο γονίδιο της πολυμεράσης είναι συνήθως αποτέλεσμα της χορήγησης νουκλεοσιδικών αναλόγων όπως η λαμιβουδίνη, έχουν περιγραφεί εκτενώς και εδράζονται στη συντηρημένη αλληλουχία YMDD μέσα στην περιοχή C του ενζύμου. Οι μεταλλαγές στην περιοχή pres/s κυρίως στην MHR περιοχή ( αμινοξέα) και ειδικά στη σταθερή περιοχή του α-αντιγονικού καθοριστή, (αμινοξέα 124 έως 147) 107, οδηγούν σε αλλαγή της τριτοταγούς δομής του, με αποτέλεσμα την αδυναμία σύνδεσης των αντισωμάτων έναντι του επιφανειακού αντιγόνου και επομένως τη διαφυγή τόσο της ανοσίας όσο και της ανίχνευσης 82. Κάποιες από αυτές τις μεταλλαγές μπορούν να επηρεάσουν τη βιωσιμότητα ή τη δυνατότητα αναπαραγωγής του ιού, επειδή υπάρχει αλληλοεπικάλυψη του HBs γονιδίου με αυτό της πολυμεράσης. Η παρουσία μεταλλαγών στην περιοχή του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg και ειδικότερα στον α-αντιγονικό καθοριστή μπορεί να είναι υπεύθυνη για μια σειρά κλινικών καταστάσεων όπως ανεπιτυχής εμβολιασμός από διαφυγόντα της ανοσίας του εμβολίου μεταλλαγμένα στελέχη, λοίμωξη σε νεογνά μητέρων με ηπατίτιδα Β παρά την προφύλαξη με ειδική ανοσοσφαιρίνη (Hepatitis B Immunoglobulin, HBIG) και τον εμβολιασμό και «σιωπηρές» HBV λοιμώξεις σε ασθενείς με μη ανιχνεύσιμο (ψευδώς αρνητικό) HBsAg Σε πολλούς ασθενείς οι μεταλλαγές, χαρακτηρίζονται από μια αλλαγή στο αμινοξύ 145 από γλυκίνη σε αργινίνη (G145R) στον α-αντιγονικό καθοριστή, λόγω της αλλαγής της γουανίνης από αδενίνη στο νουκλεοτίδιο 587. Η μεταλλαγή αυτή πιστεύεται ότι προκαλεί αλλαγή της δομής του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg. 37

38 Ασθενείς στους οποίους κυριαρχεί το μεταλλαγμένο στέλεχος G145R παρουσιάζουν συνήθως κυκλοφορούντα στελέχη ιών και με άλλες μεταλλαγές στον α-αντιγονικό καθοριστή όπως επίσης τέτοιες μεταλλαγές εμφανίζονται και σε απουσία της συνήθους G145R 114 (εικόνα 9). Μερικές από τις συνήθεις μεταλλαγές «ανοσιακής διαφυγής» στον α-αντιγονικό καθοριστή είναι οι D144A, P142S, Q129H, I/T 126 N/A και N133L 115. Ο άγριος τύπος του HBV είναι δυνατόν να ανιχνευθεί στον ορό ασθενών με κυκλοφορούντα μεταλλαγμένα στελέχη στον α επίτοπο 116,117, πράγμα που σημαίνει ότι η διαμέσου αντισωμάτων επιλογή μπορεί να μην αποτελεί το μηχανισμό εμφάνισης αυτών των μεταλλαγών 118. Εικόνα 9. O α-αντιγονικός καθοριστής του επιφανειακού αντιγόνου και η μεταλλαγή στο αμινοξύ 145 Οι μεταλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του γενετικού υλικού των ιών, αποτελούν τυχαία λάθη της πολυμεράσης κατά τον πολλαπλασιασμό τους και τους παρέχουν πλεονεκτήματα επικράτησης-επιλογής. Η HBV πολυμεράση παρουσιάζει έλλειψη ικανότητας απόλυτα πιστής αντιγραφής της αλληλουχίας 38

39 νουκλεοτιδίων, καθώς και έλλειψη μηχανισμών επιδιόρθωσης. Η πιθανότητα λάθους της αντιστοιχεί σε 1 νουκλεοτίδιο/1000 ζεύγη βάσεων/ ανά κύκλο πολλαπλασιασμού του ιού 119,120. Η συχνότητα πολλαπλασιασμού του ιού της ηπατίτιδας Β σε ασθενείς HBeAg θετικούς υπολογίζεται σε γονιδιώματα την ημέρα και η πιθανότητα μεταλλαγής κατά θέση νουκλεοτιδίου και κατά έτος, υπολογίζεται σε 2,1-2,5x10 10, 10 φορές μεγαλύτερη από άλλους DNA ιούς. 39

40 40

41 Hπατίτιδα Β Επιδημιολογία Παρά τα σπουδαία επιτεύγματα των περασμένων δεκαετιών όσον αφορά τη θεραπεία και την πρόληψη της HBV λοίμωξης, αυτή παραμένει ένα σημαντικό παγκόσμιο πρόβλημα υγείας. Σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (Π.Ο.Υ.) δύο δισεκατομμύρια άνθρωποι, σχεδόν το ένα τρίτο του παγκόσμιου πληθυσμού, έχει ορολογικούς δείκτες που δείχνουν επαφή με τον ιό, πάνω από 400 εκατομμύρια άνθρωποι, όπως αναφέρεται, είναι χρόνιοι φορείς του HBV, ενώ εξακολουθούν να εμφανίζονται περισσότερες από νέες περιπτώσεις οξείας ηπατίτιδας Β κάθε χρόνο. Το 15-25% των χρόνιων φορέων οι οποίοι αναπτύσσουν χρόνια ηπατίτιδα καταλήγουν από ηπατική νόσο συμπεριλαμβανομένων της κίρρωσης και του ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ). Ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους παγκοσμίως είναι ο ΗΚΚ και ο HBV είναι υπεύθυνος για το 75% αυτών των καρκίνων. Έτσι σήμερα η HBV λοίμωξη, η οποία ευθύνεται για περίπου 0,5-1,2 εκατομμύρια θανάτους κάθε χρόνο, αποτελεί τη 10 η αιτία θανάτου παγκόσμια, και ο ΗΚΚ αποτελεί τον 5 ο συχνότερο καρκίνο, υπεύθυνο για θανάτους ετησίως. Εντούτοις, η επίπτωση της νόσου παρουσιάζει σημαντικές γεωγραφικές διαφορές με διαφορετικό βαθμό ενδημικότητας και τρόπους μετάδοσης. Τρόποι μετάδοσης Ο άνθρωπος είναι η μόνη δεξαμενή του HBV. Εντούτοις η εξαιρετική ικανότητα του ιού να πολλαπλασιάζεται, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων μολυσματικών σωματίων στο αίμα και σε άλλα υγρά του σώματος, κάνει την ηπατίτιδα Β μια ιδιαίτερα μεταδοτική νόσο. Η μετάδοση της νόσου γίνεται με διάφορους τρόπους (πίνακας 2), όπως περιγεννητικά, οριζόντια, 41

42 σεξουαλικά και παρεντερικά. Υπάρχει σοβαρή γεωγραφική διαφοροποίηση ως προς τον τρόπο μετάδοσης και αυτό έχει να κάνει με το βαθμό ενδημικότητας της νόσου σε μια περιοχή, τις κοινωνικές συμπεριφορές, όπως και το βαθμό ανάπτυξης των υγειονομικών υπηρεσιών στις διάφορες χώρες 121. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση του ιού όπως και του επιφανειακού αντιγόνου (HBsAg), του σημαντικότερου δείκτη της HBV λοίμωξης, συναντώνται στο αίμα. Εντούτοις ο σίελος και το σπέρμα θεωρούνται επίσης μολυσματικά υγρά. Ο HBV παραμένει ζωντανός κα μολυσματικός στο περιβάλλον για τουλάχιστον 7 ημέρες, και μπορεί επίσης να παραμείνει σε μεγάλες συγκεντρώσεις πάνω σε αντικείμενα ακόμη και σε απουσία ορατού αίματος 122,123. Η διαδερμική μετάδοση λοιπόν γίνεται με τη μετάγγιση μολυσμένου αίματος ή προϊόντων του ή με τη χρήση μολυσμένων εργαλείων για μικρές επεμβατικές πράξεις, τη χρήση κοινής σύριγγας-βελόνας από τους χρήστες ναρκωτικών ουσιών, ή τέλος με τατουάζ ή τρύπημα αυτιών. Πίνακας 2. Τρόποι μετάδοσης του HBV και πληθυσμοί υψηλού κινδύνου 124 Τρόποι μετάδοσης του ιού Άτομα υψηλού κινδύνου Κάθετος τρόπος μετάδοσης Μωρά που γεννιούνται από HΒsAgθετικές μητέρες Οριζόντιος τρόπος μετάδοσης (Διαδερμικός Σεξουαλικός Νοσοκομειακοί Επαγγελματικοί) Παιδιά σε περιοχές υψηλής ενδημικότητας Άνδρες και γυναίκες με άστατη σεξουαλική ζωή Χρήστες ενδοφλεβίων ουσιών Σύζυγοι και άτομα που έρχονται σε επαφή με την οικογένεια μολυσμένων ατόμων Επαγγελματίες υγείας Φυλακισμένοι Τρόφιμοι ιδρυμάτων 42

43 Το υγειονομικό προσωπικό κινδυνεύει από ατυχήματα με βελόνες ή αιχμηρά εργαλεία. Ελάχιστες είναι οι περιπτώσεις μετάδοσης της λοίμωξης από το υγειονομικό προσωπικό στους ασθενείς 125. Στον ανεπτυγμένο κόσμο ο έλεγχος των αιμοδοτών με τη χρήση μοριακών τεχνικών, όπως και η εφαρμογή μέτρων αδρανοποίησης του ιού και η χρήση αποστειρωμένων εργαλείων ή υλικών μιας χρήσης, έχουν ως αποτέλεσμα την ελαχιστοποίηση της μετάδοσης του ιού μέσω μετάγγισης. Παρόλα αυτά, στις αναπτυσσόμενες χώρες υπάρχει ακόμη μεγάλο πρόβλημα μετάδοσης του ιού μέσω ξαναχρησιμοποιημένων ή μη σωστά αποστειρωμένων ιατρικών εργαλείων. Η κάθετη μετάδοση του ιού από μολυσμένες μητέρες στα παιδιά τους αποτελεί ακόμη σοβαρή αιτία μετάδοσης σε υπανάπτυκτες περιοχές όπου δεν εφαρμόζονται ολοκληρωμένα προγράμματα εμβολιασμού. Ο κίνδυνος μετάδοσης του ιού από HBeAg θετικές μητέρες φθάνει στο 70-90% στα παιδιά τους μέχρι την ηλικία των 6 μηνών. Ο κίνδυνος αυτός είναι μικρότερος για HBeAg αρνητικές μητέρες όπου φθάνει το 10-40%. Στους ενήλικες η σεξουαλική μετάδοση αποτελεί σοβαρό παράγοντα κινδύνου, ενώ τα άτομα με χρόνια ηπατίτιδα αποτελούν την κυριότερη και μεγαλύτερη δεξαμενή του ιού. Η μη σεξουαλική, από άτομο σε άτομο, μετάδοση είναι ακόμα ένας αναγνωρισμένος τρόπος μετάδοσης, διαδεδομένος σε οικογένειες με στενή προσωπική επαφή, οι οποίες έχουν χρόνιους φορείς. Ο ακριβής τρόπος της μετάδοσης δεν είναι εντελώς διευκρινισμένος, αλλά πιθανότατα η παρατεταμένη δερματική επαφή ή επαφή των βλεννογόνων με μολυσμένες επιφάνειες προσωπικών αντικειμένων του χρόνιου φορέα τα οποία φέρουν υψηλό ιικό φορτίο, μπορεί να προκαλέσουν τη μετάδοση

44 Γεωγραφική διασπορά του ιού Τα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της HBV λοίμωξης παρουσιάζουν ευρεία διαφοροποίηση στα διάφορα μέρη του πλανήτη και έχουν στενή σχέση με την ηλικία των ασθενών τη στιγμή της μετάδοσης. Τρεις είναι οι κατηγορίες επιπολασμού της νόσου (πίνακας 3), με διαφορετική γεωγραφική κατανομή, κατά την οποία ο επιπολασμός αυξάνεται από Βορρά προς Νότο και από Δύση προς Ανατολή. (εικόνα 10). Πίνακας 3. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της HBV λοίμωξης, σύμφωνα με το βαθμό γεωγραφικής ενδημικότητας Ενδημικότητα της HBV λοίμωξης χαμηλή μέση υψηλή Επικράτηση χρόνιας < λοίμωξης (%) Επικράτηση παλαιάς λοίμωξης (%) Ηλικία κατά τη λοίμωξη -πρώιμη παιδική σπάνια συχνή πολύ συχνή -λοίμωξη σε πολύ συνηθισμένη ασυνήθιστη εφήβους/ενήλικες Κύριοι οδοί μετάδοσης συνηθισμένη σεξουαλικοί ενδοφλέβια χορήγηση φαρμάκων επαγγελματικοί οικογενειακοί σεξουαλικοί ενδοφλέβια χορήγηση φαρμάκων επαγγελματικοί νοσοκομειακοί περιγενετικοί οικογενειακοί νοσοκομειακοί Η ενδημικότητα της λοίμωξης θεωρείται υψηλή στις περιοχές του κόσμου όπου τουλάχιστον 8% του γενικού πληθυσμού είναι HBsAg θετικοί. Στις περιοχές αυτές, όπως η Κίνα, η Νοτιοανατολική Ασία, η υποσαχάρια Αφρική, η Μέση Ανατολή και η περιοχή του Αμαζονίου, που αντιπροσωπεύουν περίπου το 45% του παγκόσμιου πληθυσμού, το 50-90% του γενικού τους πληθυσμού εμφανίζει ορολογική ένδειξη παρελθούσας HBV λοίμωξης. 44

45 Η λοίμωξη συνήθως γίνεται περιγενετικά ή κατά την πρώτη παιδική ηλικία και έχει ως αποτέλεσμα υψηλά ποσοστά χρονιότητας, υψηλό βαθμό μετάδοσης και εμφάνιση ΗΚΚ σε μικρή ηλικία. Εικόνα 10. Γεωγραφική κατανομή της χρόνιας ηπατίτιδας Β (HBV λοίμωξης) σε όλο τον κόσμο Σε περιοχές με ενδιάμεση ενδημικότητα της HBV λοίμωξης όπως η Ινδία, η Νότια και Ανατολική Ευρώπη, η περιοχή της Μεσογείου, οι χώρες της πρώην Σοβιετικής Ένωσης, το Ισραήλ, η Ιαπωνία, η Κεντρική και Νότια Αμερική, η συχνότητα ανεύρεσης θετικού HBsAg κυμαίνεται μεταξύ 2-7% και οι ορολογικές ενδείξεις παρελθούσας λοίμωξης μεταξύ 15-50% του πληθυσμού. Περίπου το 43% του παγκόσμιου πληθυσμού ζει σε αυτές τις περιοχές. Η μετάδοση της λοίμωξης γίνεται σε όλες τις ηλικίες. Η συμπτωματική αλλά αυτοπεριοριζόμενη νόσος είναι συχνή στους εφήβους και στους ενήλικες, ενώ τα υψηλά ποσοστά χρόνιας ηπατίτιδας σχετίζονται με τη μετάδοση του ιού σε βρέφη και μικρά παιδιά. Τέλος στις περισσότερες περιοχές του ανεπτυγμένου κόσμου όπως στη Βορειοδυτική Ευρώπη, στη Βόρεια Αμερική, στην Αυστραλία και στη Νέα Ζηλανδία, ο επιπολασμός της χρόνιας HBV λοίμωξης είναι <2% ενώ, στο γενικό πληθυσμό το 45

46 5-7% παρουσιάζει ορολογική ένδειξη παρελθούσης λοίμωξης. Στις περιοχές αυτές ζει μόνο το 12% του παγκόσμιου πληθυσμού. Παρόλα αυτά υπάρχουν κάποιοι πληθυσμοί μέσα στη κατηγορία αυτή, όπως οι Εσκιμώοι της Αλάσκας, οι Μαορί της Ν. Ζηλανδίας, οι ιθαγενείς της Αυστραλίας οι οποίοι παρουσιάζουν υψηλή ενδημικότητα. Στους πληθυσμούς χαμηλού επιπολασμού όπως για παράδειγμα στη Β. Αμερική, η λοίμωξη συμβαίνει στους ενήλικες, έχει οριζόντια μετάδοση κυρίως μέσω ετεροφυλικής σεξουαλικής επαφής (41%), ενδοφλέβιας χρήσης ναρκωτικών ουσιών (15%), ομοφυλοφιλικής σχέσης (9%), ενδοοικογενεικής μετάδοσης (2%) και στα επαγγέλματα υγείας (1%) 128,129. Στην Ευρώπη κατά την Π.Ο.Υ. η συχνότητα της λοίμωξης κυμαίνεται από <0,3% στις Σκανδιναβικές χώρες έως 14% στην Κυργιζία. Στην Ευρώπη επίσης παρατηρείται το φαινόμενο Βορά-Νότου, Ανατολής-Δύσης ακόμη και μέσα στην ίδια χώρα, όπως για παράδειγμα στην Ιταλία. Ο μέσος αριθμός φορέων της HBV λοίμωξης στην Ευρώπη εκτιμάται στα 3,5 εκατομμύρια. Η Ελλάδα σύμφωνα με την Π.Ο.Υ. ανήκει στις χώρες με χαμηλή προς ενδιάμεση ενδημικότητα Τα επιδημιολογικά δεδομένα αναφέρονται κυρίως σε ειδικές πληθυσμιακές ομάδες (αιμοδότες, εθνοθρησκευτικές μειονότητες, οικονομικοί μετανάστες, στρατιώτες, παιδιά ή εγκυμονούσες γυναίκες) ή σε ομάδες υψηλού κινδύνου (φυλακισμένους, χρήστες ουσιών ενδοφλεβίως, φορείς HIV, άτομα σε αιμοκάθαρση κλπ.) οι οποίοι δεν αντιπροσωπεύουν το γενικό πληθυσμό. Έτσι από τις οροεπιδημιολογικές μελέτες των τελευταίων ετών στις παραπάνω πληθυσμιακές ομάδες, εκτιμάται ότι ο επιπολασμός της HBV λοίμωξης είναι μεταξύ του 0,8% (στους σποραδικούς αιμοδότες) 134 και 0,29 έως 2,6% στο γενικό πληθυσμό 135, ενώ οι χρόνιοι φορείς της λοίμωξης φτάνουν τους Η μετανάστευση όμως ατόμων από χώρες υψηλής ή ενδιάμεσης ενδημικότητας οδήγησε στη δημιουργία θυλάκων υψηλότερου επιπολασμού. Σύμφωνα με το Εθνικό Ινστιτούτο Απασχόλησης όπως και 46

47 την Εθνική Στατιστική Υπηρεσία, ο αριθμός των καταγεγραμμένων ξένων μεταναστών στην Ελλάδα στις αρχές του 2001 έφθανε τις (7,2% του πληθυσμού) και η πλειονότητα αυτών ήταν από την Αλβανία, χώρα υψηλής ενδημικότητας. Μια σημαντική μείωση της επίπτωσης του HBsAg στο 2,15% και της συχνότητας έκθεσης στον ιό στο 22,6% αναφέρεται στην πρώτη δημοσιευμένη μελέτη που αφορά το γενικό πληθυσμό στην περιοχή της νοτιοδυτικής Ελλάδας, ενώ στην περιοχή της Ηπείρου σε μια προοπτική μελέτη αιμοδοτών η επίπτωση του HBsAg ήταν κατά 0,83% υψηλότερη απ ότι σε άλλες περιοχές της Ελλάδας 132,136. Σημαντικές αλλαγές στην επιδημιολογία της νόσου συμβαίνουν παγκόσμια λόγω εφαρμογής προγραμμάτων μαζικού εμβολιασμού και λόγω της βελτίωσης των κοινωνικών και οικονομικών συνθηκών στις λιγότερο ανεπτυγμένες περιοχές 137. Έτσι στις Η.Π.Α. έχει παρατηρηθεί μια σημαντική μείωση (76%) της επίπτωσης της οξείας ηπατίτιδας μεταξύ του τέλους της δεκαετίας του 80 και του τέλους της δεκαετίας του 90. Η μεγαλύτερη ελάττωση παρατηρήθηκε σε ηλικίες μεταξύ ετών (72,5%) όπως και ετών (70,6%). Ελάττωση επίσης έχει παρατηρηθεί και σε άλλες χώρες της Ευρώπης όπως την Ιταλία, Πολωνία, Γαλλία, Βέλγιο, Αγγλία, Ισπανία και Ελλάδα 134, Η Π.Ο.Υ. το 1992 συνέστησε την εφαρμογή καθολικού εμβολιασμού των νεογνών σε όλο τον κόσμο. Στη χώρα μας ο εμβολιασμός έναντι του HBV εντάχθηκε στο υποχρεωτικό πρόγραμμα εμβολιασμού των νεογνών το έτος 1998, όπως επίσης και των εφήβων και των ατόμων υψηλού κινδύνου λοίμωξης με τον HBV (άτομα από χώρες υψηλής ενδημικότητας, άτομα με πολλαπλούς ερωτικούς συντρόφους, χρήστες τοξικών ουσιών, άτομα με ενδοοικογενειακή ή σεξουαλική επαφή με HBsAg θετικούς ασθενείς). 47

48 Εντούτοις η έλλειψη προληπτικών κα προφυλακτικών μέτρων σε πολλές χώρες υψηλής ενδημικότητας και η μαζική μετανάστευση η οποία παρατηρείται τα τελευταία 15 χρόνια από χώρες μέσης ή υψηλής ενδημικότητας σε χώρες με χαμηλή ενδημικότητα, προκάλεσαν σημαντικές αλλαγές στα επιδημιολογικά δεδομένα. Μοριακή επιδημιολογία της HBV λοίμωξης Παρόλο που υπάρχουν ελλιπείς πληροφορίες επειδή ακόμη δεν έχουν διενεργηθεί ολοκληρωμένες και αντιπροσωπευτικές ορολογικές επιδημιολογικές μελέτες σε πολλές χώρες του πλανήτη, τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν μια ανισοκατανομή των 8 διαφορετικών γονότυπων του HBV, όπως και μια διακριτή γεωγραφική κατανομή (εικόνα 8). Η μετανάστευση με την πάροδο των ετών από χώρες υψηλής ενδημικότητας σε χώρες χαμηλής ενδημικότητας περιπλέκει ακόμη περισσότερο το χάρτη της γεωγραφικής κατανομής των HBV γονοτύπων. Έτσι οι γονότυποι Β και C με 3215 βάσεις απαντώνται κυρίως στην Ασία, ο γονότυπος Α με 3221 βάσεις στη ΒΔ Ευρώπη, τη Β. Αμερική 142, τη Νότιο Αφρική, τη Βραζιλία και την Ιαπωνία, ο γονότυπος D με 3182 βάσεις στη Νότια και Ανατολική Ευρώπη, στη Μεσόγειο και στην Ινδία με μια σχετικά παγκόσμια κατανομή 78,143. Ο γονότυπος Ε με 3182 βάσεις απαντάται στη δυτική και κεντρική Αφρική, ο γονότυπος F με 3125 βάσεις στη Νότιο Αμερική και στην Πολυνησία 78, ενώ ο γονότυπος G με 3248 βάσεις στη Γαλλία, τη Γερμανία, την Αγγλία, την Ιταλία και τις Η.Π.Α. 96. Τέλος ο γονότυπος H με 3215 βάσεις συναντάται στην Κεντρική Αμερική και την Καλιφόρνια 144. Τέλος παρατηρείται μια διαφορά στην επίπτωση της χρόνιας ηπατίτιδας Β με αρνητικό το HBeAg αντιγόνο, λόγω μεταλλαγής στην πυρηνική περιοχή ή στην περιοχή του προπυρηνικού προαγωγέα, και κάποιοι γονότυποι παρουσιάζουν μεγαλύτερη τάση για εμφάνιση HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας σε σχέση με άλλους. Έτσι η επίπτωση της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β στο σύνολο των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β είναι 37% στη Μεσόγειο, 15% στην Ασία και 48

49 14% στις Η.Π.Α., και την Ευρώπη 145. Ωστόσο μεταγενέστερες μελέτες στην Ιταλία 146, τη Γαλλία και την Ισπανία δείχνουν ότι οι μορφές της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β φθάνουν μέχρι το 80-90% των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β. 49

50 Ανοσοπαθολογία της HBV λοίμωξης Η παθολογία της HBV λοίμωξης μπορεί να γίνει κατανοητή κάτω από το πρίσμα της ανοσιακής απάντησης του οργανισμού έναντι του ιού. Η απάντηση αυτή προκαλείται από ιικούς αντιγονικούς επιτόπους. Ειδικά από την πυρηνική πρωτεΐνη (HBc protein) και σε μικρότερη έκταση από την πρωτεΐνη του περιβλήματος (HBs envelope protein) και αφορά τόσο την κυτταρική όσο και τη χυμική ανοσία. Διάφορες κλινικές μελέτες όπως και πειραματικά μοντέλα έχουν περιγράψει και αποδείξει με λεπτομέρεια τους μηχανισμούς οι οποίοι εμπλέκονται στην κάθαρση του ιού, η οποία απαιτεί τη συγχρονισμένη συνεργασία διάφορων στοιχείων του ανοσιακού συστήματος 147, όπως: 1. Κυτταροτοξικής Th1 απάντησης από CD8+T λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν τα μολυσμένα ηπατοκύτταρα, δια μέσου της έκφρασης ιικών αντιγόνων. 2. Μη κυτταροτοξικής Th1 απάντησης, όπου τα CD8+T λεμφοκύτταρα παράγουν Th1 κυτταροκίνες όπως ιντερφερόνη γ (INF-γ), παράγοντα νέκρωσης των όγκων α (TNF)-α, και ιντελευκίνη 12 (IL-12), οι οποίες έχουν μια άμεση αντιική δράση στο μολυσμένο ηπατοκύτταρο. 3. Απάντησης φυσικής ανοσίας διαμεσολαβούμενης από ΝΚ και ΝΚ-Τ λεμφοκύτταρα. 4. Παραγωγής εξουδετερωτικών αντισωμάτων από Β λεμφοκύτταρα, τα οποία εμποδίζουν τη μόλυνση των ηπατοκυττάρων. 5. Λύσης των ηπατοκυττάρων και αντικατάστασης αυτών με δημιουργία νέων μη μολυσμένων που θα αναγεννήσουν το ήπαρ. Παρόλο που υπάρχει συμφωνία ως προς τη συμμετοχή όλων των παραπάνω μηχανισμών στην ανοσιακή απάντηση του οργανισμού έναντι του ιού, η σειρά με την οποία αυτό γίνεται, αποτελεί ακόμη αντικείμενο διαφωνίας. Πάντως η κυτταρική ανοσία είναι αυτή η οποία ευθύνεται για την καταστροφή του ήπατος. Τα μολυσμένα 50

51 ηπατοκύτταρα δέχονται την επίθεση των κυτταροτοξικών CD8+T λεμφοκυττάρων, τα οποία απελευθερώνουν φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και προκαλούν τη λύση τους διευκολύνοντας την εξάλειψή τους από τα μακροφάγα. Αυτή είναι η αιτία της αύξησης των τρανσαμινασών που παρατηρείται κατά την οξεία και χρόνια ηπατίτιδα. Επιπρόσθετα κυτταροκίνες όπως η INF-γ οι οποίες εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του ιού. Η χυμική ανοσία εμπλέκεται με την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων έναντι ιικών επιτόπων από τα Β-λεμφοκύτταρα. Άλλοι κυτταρικοί καθοριστές της ανοσιακής απάντησης όπως αυτοί της φυσικής ανοσίας με τα ΝΚ Τ κύτταρα και η αναγέννηση των ηπατοκυττάρων συνεισφέρουν στην ενορχήστρωση της ανοσιακής απάντησης από τα Τ αι Β λεμφοκύτταρα για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού του ιού. Επομένως η ικανότητα του ανοσιακού συστήματος να ελέγχει την αρχική λοίμωξη είναι αυτή η οποία καθορίζει και την κλινική έκβαση της νόσου. Αν η διαδικασία εξάλειψης των μολυσμένων ηπατοκυττάρων είναι βραδύτερη από το ρυθμό της συνεχιζόμενης μόλυνσης νέων ηπατοκυττάρων, έχει σαν αποτέλεσμα τη χρόνια ηπατίτιδα. Η μεγάλη καταστροφή ηπατικού παρεγχύματος σε μικρό χρονικό διάστημα η οποία ξεπερνά την αναγεννητική ικανότητα του ήπατος, οδηγεί σε οξεία ηπατίτιδα ή έξαρση της νόσου στη χρόνια μορφή της με ίκτερο, ραγδαία εξέλιξη της κίρρωσης, άρση αντιρρόπησης ή σπανιότερα σε κεραυνοβόλο ηπατίτιδα. 51

52 Φυσική πορεία της HBV λοίμωξης Η φυσική πορεία της HBV λοίμωξης χαρακτηρίζεται από διακριτές φάσεις οι οποίες διαφέρουν ως προς την ικανότητα του ιού για πολλαπλασιασμό, το ιικό φορτίο κα την ένταση της ανοσιακής απάντησης (πίνακας 4). Έτσι αρχικά χωρίστηκε σε 3 φάσεις: τη φάση της ανοσιακής ανοχής, τη φάση της ανοσιακής απάντησης και τη φάση του χαμηλού βαθμού ιικού πολλαπλασιασμού 148,149. Αργότερα προστέθηκε η φάση της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β και η φάση της αρνητικοποίησης του HBsAg με ύπαρξη σιωπηρής λοίμωξης. Πίνακας 4. Εξέλιξη των δεικτών στον ορό κατά τα διάφορα στάδια της χρόνιας ηπατίτιδας Β 150 Φάση της Λοίμωξη Ορολογικοί Δείκτες Κλινικός κίνδυνος Φάση ανοσιακής ανοχής HBV DNA υψηλό HBsAg υψηλό HBeAg υψηλό Τρανσαμινάσες κανονικές Υψηλός κίνδυνος μετάδοσης Ανοσοενεργός φάση Χρόνια ηπατίτιδα Φάση χαμηλού ιικού πολλαπλασιασμού Ασυμπτωματική φορεία Φάση κάθαρσης HBsAg HBV DNA μείωση HBsAg υψηλό HBeAg μείωση Τρανσαμινάσες υψηλές HBV DNA πολύ χαμηλό HBsAg μείωση HBeAg απών, αντι- HBe-θετικό Τρανσαμινάσες κανονικές HBsAg-αρνητικό Anti-HBc-θετικό Anti-HBs-θετικό ή αρνητικό Φυσιολογική ALT HBV DNA πιθανόν θετικό με PCR Ανάπτυξη κίρρωσης και ΗΚΚ Ανάπτυξη ΗΚΚ Ιική επανενεργοποίηση: άγριου τύπου ή προπυρηνικές μεταλλαγές Λανθάνουσα HBV λοίμωξη Ιική επανενεργοποίηση (ανοσοκαταστολή) Μετάδοση της λανθάνουσας HBV (νοσοκομειακή λοίμωξη) Κατά τη φάση της ανοσολογικής ανοχής τα μολυσμένα ηπατοκύτταρα δεν προκαλούν ανοσιακή απάντηση διασπείροντας συνεχώς νέα ιικά σωμάτια. Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα ιικών αντιγόνων (HBeAg, HBsAg) και 52

53 DNA του ιού, με φυσιολογικές ή ελαφρώς αυξημένες τρανσαμινάσες και ήπια νεκροφλεγμονώδη βλάβη με ήπια ή καθόλου ίνωση. Η φάση αυτή παρατηρείται συχνότερα και εμφανίζει παρατεταμένη διάρκεια όταν η λοίμωξη επέλθει περιγεννητικά ή κατά τον πρώτο χρόνο της ζωής. Λόγω του υψηλού ιικού φορτίου οι ασθενείς παρουσιάζουν μεγάλη μεταδοτικότητα. Κατά τη φάση της «ανοσιακής απάντησης» ή ανοσοενεργού φάσης ενεργοποιείται η ανοσιακή απάντηση του ξενιστή έναντι του ιού και το ανοσιακό σύστημα επιτίθεται έναντι των μολυσμένων από τον HBV ηπατοκυττάρων. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης τα επίπεδα του ιικού DNA στον ορό προοδευτικά ελαττώνονται, οι τρανσαμινάσεις αυξάνονται, εμφανίζονται κλινικά συμπτώματα, ενώ το ήπαρ παρουσιάζει μέτρια ή βαριά νεκροφλεγμονώδη αντίδραση και ταχεία εξέλιξη της ίνωσης. Η φάση αυτή είναι πιο συχνή στις HBV λοιμώξεις των ενηλίκων. Εφόσον η διάρκεια αυτού του σταδίου παραταθεί λόγω της αδυναμίας του ανοσιακού συστήματος να ελέγξει τη λοίμωξη, τότε αυτή θα εξελιχθεί σε χρόνια ηπατίτιδα. Η χρόνια ηπατίτιδα μπορεί ωστόσο να παραμείνει κλινικά ανενεργός (λανθάνουσα) για μεγάλο χρονικό διάστημα. Η φάση του χαμηλού βαθμού πολλαπλασιασμού του ιού ή φάση της ανενεργού HBV φορείας μπορεί να ακολουθήσει την ορομετατροπή του HBeAg σε anti-hbe αντίσωμα. Χαρακτηρίζεται από πολύ χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα HBV DNA στον ορό, από φυσιολογικές τιμές τρανσαμινασών και μικρή πιθανότητα κίρρωσης ή ηπατοκυτταρικού καρκίνου στην πλειονότητα των ασθενών. Αυτό είναι αποτέλεσμα του ελέγχου της λοίμωξης από το ανοσιακό σύστημα 151. Κατά τη φάση αυτή μπορεί να συμβεί απώλεια του HBsAg και ορομετατροπή σε anti-hbs σε ποσοστό 1-3% κατά έτος, συνήθως μετά από πολλά χρόνια κατά τα οποία το HBV DNA παραμένει μη ανιχνεύσιμο 152. Παρόλα αυτά και δεδομένου ότι ο ιός παραμένει στο ήπαρ υπό τη μορφή του υπερελικωμένου DNA (cccdna), ένα ποσοστό (20-53

54 30%) των ανενεργών φορέων μπορεί να εμφανίσει ενεργοποίηση της νόσου είτε αιφνίδια είτε μετά από ανοσοκαταστολή. Θεωρείται ότι η ενεργοποίηση της νόσου οφείλεται στην επανεμφάνιση του «άγριου» τύπου (wild type) του ιού και του HBeAg ή στον πολλαπλασιασμό μεταλλαγμένου στελέχους του ιού, το οποίο δεν επιτρέπει την έκφραση του HBeAg 153. Η επίπτωση της HBeAg- αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας διαφέρει από περιοχή σε περιοχή και είναι για παράδειγμα, μεγαλύτερη στην περιοχή της Μεσογείου σε σχέση με την υπόλοιπη Ευρώπη. Έτσι σε ένα ποσοστό ασθενών 20-30% παρά την ορομετατροπή του HBeAg σε antihbe, η νόσος παραμένει σε ενεργό φάση. Η νόσος χαρακτηρίζεται ως HBeAg(-) χρόνια ηπατίτιδα Β κατά την οποία υπάρχει ανάδυση ή επιλογή μεταλλαγμένου στελέχους του HBV, με μεταλλαγή στην προπυρηνική περιοχή ή στην περιοχή του προπυρηνικού προαγωγέα (precore promoter region) και με αδυναμία έκφρασης του HBeAg. Η χρόνια HBeAg(-) ηπατίτιδα Β η οποία είναι μία όψιμη φάση στη φυσική πορεία της χρόνιας ηπατίτιδας B, αποτελεί μια δυνητικά εξελισσόμενη μορφή της νόσου, με πολύ μικρή πιθανότητα αυτόματης ύφεσης, συχνή εξέλιξη σε κίρρωση και αυξημένο κίνδυνο ΗΚΚ. Χαρακτηρίζεται από περιοδικές επανεργοποιήσεις με κυμαινόμενα επίπεδα ιικού DNA και τρανσαμινασών. Η HBeAg(-) χρόνια ηπατίτιδα Β εμφανίζεται συχνότερα σε ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας, είναι συνήθως ασυμπτωματική και για το λόγο αυτό οι ασθενείς έχουν ήδη σημαντική ίνωση κατά την πρώτη διάγνωση της νόσου. Επιπλέον, είναι αρκετές φορές δύσκολο να διαφοροδιαγνωσθούν οι ασθενείς αυτοί από τους ανενεργούς HBV φορείς στους οποίους υπάρχει ορομετατροπή του HBeAg σε anti-hbe. Για το λόγο αυτό απαιτείται προσεκτικός έλεγχος των επιπέδων ιικού DNA και αμινοτρασφερασών για τουλάχιστον ένα έτος και για κάθε 3 μήνες ούτως ώστε να γίνει δυνατή η διαφοροδιάγνωση. 54

55 Την τελευταία φάση της πορείας της HBV λοίμωξης αντιπροσωπεύει η κάθαρση του HBsAg με θετικό anti-hbc και με θετικό ή όχι anti-hbs. Σ αυτή τη φάση το ιικό DNA μπορεί να παραμείνει ανιχνεύσιμο στον ορό, και στο ήπαρ ως ιικό cccdna 154 ή ως ιικό DNA ενσωματωμένο στο γενετικό υλικό του ξενιστή. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε λανθάνουσα μορφή της HBV λοίμωξης με χαμηλά επίπεδα ιικού πολλαπλασιασμού (λιγότερα από 200IU/ml στον ορό) και δυνατότητα επανεργοποίησης μετά από ανοσοκαταστολή 155 ή με εξέλιξη σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο ιδίως σε ασθενείς που καθάρθηκαν από HBsAg αφού πρώτα είχαν παρουσιάσει κίρρωση. 55

56 Κλινική Εικόνα της Νόσου (εικόνα 11) Οξεία Ηπατίτιδα Μετά τη μετάδοση του ιού που γίνεται παρεντερικά, σεξουαλικά και περιγεννητικά ακολουθεί περίοδος επώασης που διαρκεί περίπου 1 έως 6 μήνες και αντιστοιχεί στο χρόνο διασποράς του ιού στο ήπαρ. Στη συνέχεια απαντά το ανοσιακό σύστημα με στόχο την ίαση της λοίμωξης. Στους περισσότερους ασθενείς (~63%) τόσο η λοίμωξη όσο και η ίαση δεν έχουν κλινικά συμπτώματα. Ωστόσο η οξεία ηπατίτιδα έχει ύπουλη έναρξη και μπορεί να παρουσιάσει ένα ευρύ φάσμα συμπτωμάτων τόσο στα παιδιά, όσο και στους ενήλικες, με πυρετό, αδιαθεσία, απώλεια της όρεξης, ναυτία, έμετους, αίσθημα κόπωσης, ρίγη και κοιλιακά άλγη. Αυτά πιθανά οφείλονται στην έκκριση υψηλών επιπέδων ιντερφερόνης (IFN), TNF-α και άλλων κυταροκινών της φλεγμονής. Όταν κατά την ανοσιακή απάντηση προκληθεί μαζική καταστροφή ηπατοκυττάρων μέσα σε μικρό σχετικά χρονικό διάστημα, οι ασθενείς εμφανίζουν ίκτερο, σκοτεινόχρωμα ούρα και ανοιχτόχρωμα κόπρανα (30-50% των περιπτώσεων). Τα επίπεδα της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) στον ορό αυξάνονται συνήθως πάνω από 10 φορές του φυσιολογικού κατά την ίαση μιας παροδικής λοίμωξης, ενώ στην ικτερική μορφή μπορεί να ανέβουν μέχρι και πάνω από 100 φορές του φυσιολογικού. Σε ένα μικρό ποσοστό (~0,1-1%) των ασθενών είναι δυνατόν, η καταστροφή των ηπατοκυττάρων να οδηγήσει σε κεραυνοβόλο ηπατίτιδα και ηπατική ανεπάρκεια με ασκίτη και αιμορραγίες, η οποία απαιτεί μεταμόσχευση ήπατος. Οι παθογενετικοί μηχανισμοί οι οποίοι προκαλούν κεραυνοβόλο ηπατίτιδα Β δεν είναι ακόμα εντελώς κατανοητοί. Έχουν βρεθεί παράγοντες που ενέχονται, όπως η συλλοίμωξη από ιό της ηπατίτιδας D (HDV) ή από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV), όπως και η κατανάλωση αλκοόλ ή η χρήση κάποιων φαρμάκων. Στα νεογνά και στα παιδιά η νόσος συνήθως διαδράμει υποκλινικά χωρίς ίκτερο, αν και έχουν περιγραφεί περιπτώσεις κεραυνοβόλου 56

57 Εικόνα 11. Κλινικά παρεπόμενα της οξείας ηπατίτιδας Β 30 ηπατίτιδας. Η μετάδοση του ιού σε νεογνά από μητέρες HBeAg αρνητικές- antihbe θετικές έχει λιγότερες πιθανότητες εξέλιξης σε χρόνια ηπατίτιδα, αλλά 5% περίπου των παιδιών παρουσιάζουν οξεία συμπτωματική ή κεραυνοβόλο ηπατίτιδα στους 2 ή 3 πρώτους μήνες της ζωής τους, με υψηλά ποσοστά θνητότητας. Μετά την οξεία λοίμωξη μπορεί να συμβεί πλήρης ίαση αυτής, από το ανοσιακό σύστημα με εξάλειψη όλων των συμπτωμάτων (πτώση του πυρετού, επιστροφή της όρεξης) απώλεια του HBsAg και παρουσία στον ορό των ασθενών προστατευτικών επιπέδων anti-hbs που προσδίδουν δια βίου ανοσία. Χρόνια Ηπατίτιδα Την έναρξη της χρόνιας ηπατίτιδας χαρακτηρίζει η παραμονή του HBsAg, του HBeAg και ενός σχετικά υψηλού ιικού φορτίου στον ορό για πάνω από έξι μήνες μετά την οξεία λοίμωξη. Το ποσοστό των ασθενών στους οποίους η ηπατίτιδα 57

58 εξελίσσεται σε χρόνια είναι αντιστρόφως ανάλογο με την ηλικία των ασθενών. Η έκθεση στον ιό κατά τη γέννηση ή κατά τη βρεφική ηλικία, όταν το ανοσιακό σύστημα είναι ακόμη ανώριμο, έχει τη μεγαλύτερη πιθανότητα εξέλιξης σε χρόνια ηπατίτιδα. Tο ποσοστό ανάπτυξης χρόνιας ηπατίτιδας φθάνει το 90% στα νεογνά που γεννιούνται από HBeAg θετικές μητέρες, στο 25-30% στα παιδιά που μολύνονται στην ηλικία μεταξύ 1 και 5 ετών και είναι μικρότερο από το 1% στους ενήλικες. Με βάση την φυσική πορεία της HBV λοίμωξης η χρόνια ηπατίτιδα απαντά με τρεις κλινικές-ορολογικές-ιολογικές μορφές-φάσεις: α) η HBeAg θετική χρόνια ηπατίτιδα που οφείλεται στον άγριο τύπο του ιού και η οποία αντιπροσωπεύει την πρώιμη φάση της χρόνιας λοίμωξης. Η κλινική εικόνα αυτής της μορφής ποικίλει κι εξαρτάται από το αν βρίσκεται στη φάση της ανοσολογικής ανοχής ή στην ανοσοενεργό φάση. Για παράδειγμα τα παιδιά τα οποία μολύνονται περιγεννητικά παρουσιάζουν εικόνα ανοσοανοχής με θετικό HBeAg, πολύ υψηλά επίπεδα ιικού πολλαπλασιασμού, καθόλου ενεργό ηπατική νόσο, φυσιολογικά επίπεδα της ALT στον ορό και ελάχιστες αλλοιώσεις στη βιοψία του ήπατος. Αυτή η φάση συνήθως διαρκεί για τα πρώτα 20 ή και 30 χρόνια της ζωής αυτών των ασθενών. Αντίθετα, παιδιά τα οποία μολύνονται σε μεγαλύτερη ηλικία ή κατά την εφηβεία, όπως και οι ενήλικες παρουσιάζουν εικόνα ανοσοενεργούς αντίδρασης με αυξημένα επίπεδα ALT στον ορό και εικόνα χρόνιας ηπατίτιδας στη βιοψία του ήπατος. Τα επίπεδα του HBV-DNA στον ορό συνήθως ξεπερνούν τα 10 5 copies/ml και μπορεί να φθάνουν τα copies/ml. Η HBeAg θετική χρόνια ηπατίτιδα Β είναι πιο συχνή στους άντρες. Το φάσμα της ηπατικής βλάβης κυμαίνεται από την ήπια βλάβη στο 20 έως 40% των ασθενών, τη μέση ή τη βαριά χρόνια ηπατίτιδα στο 40 με 60% των ασθενών, και την ενεργό κίρρωση στο 10 έως 25% των ασθενών 156. Η ορομετατροπή από HBeAg σε anti-hbe θετικότητα αποτελεί σημαντικό γεγονός γιατί σηματοδοτεί την ελάττωση του HBV-DNA στον ορό, επάνοδο της ALT στα φυσιολογικά επίπεδα, μείωση της 58

59 νεκροφλεγμονώδους βλάβης του ήπατος με παράλληλη ελάττωση του κινδύνου για επιδείνωση στην πλειονότητα των ασθενών (65-85%) 156,157. Περίπου το 70% με χρόνια ηπατίτιδα Β αποβάλλουν το HBeAg μέσα σε 10 χρόνια 158. Η μεγάλη ηλικία, οι γυναίκες και τα υψηλά επίπεδα ALT αποτελούν προδιαθεσικούς παράγοντες για HBeAg ορομετατροπή. Συχνά η απώλεια του HBeAg συνοδεύεται από παροδική επιδείνωση της ηπατίτιδας. Εντούτοις πολλοί ασθενείς μπορεί να έχουν επαναλαμβανόμενα επεισόδια έξαρσης της ηπατίτιδας χωρίς να απωλέσουν το HBeAg. Η οξεία επιδείνωση μπορεί να είναι ασυμπτωματική ή να παρουσιάζει κλινικά συμπτώματα όμοια με της οξείας ηπατίτιδας και στην χειρότερη των περιπτώσεων μη αντιρροπούμενη ηπατική βλάβη. β) Η HBeAg-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα που οφείλεται σε ποικιλίες του ιού οι οποίες έχουν υποστεί μεταλλαγές στην προπυρηνική περιοχή ή στην περιοχή του πυρηνικού προαγωγέα με αποτέλεσμα την παραγωγή κωδικονίου το οποίο οδηγεί στον τερματισμό της σύνθεσης του HBeAg. Έτσι παρά την απώλεια του HΒeAg, ένα ποσοστό των ασθενών διατηρεί (1-5%) ή επανακτά (20-25%) υψηλά επίπεδα HBV- DNA με μόνιμα ή διαλείπουσα αύξηση της ALT και ενεργό νεκροφλεγμονώδη νόσο στη βιοψία. Αυτοί οι ασθενείς έχουν HBeAg αρνητική χρόνια ηπατίτιδα και παραμένουν στην ανοσοενεργό φάση. Οι ασθενείς με αυτού του τύπου χρόνια ηπατίτιδα παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα HBV-DNA (10 4 έως 10 8 copies/ml) σε σχέση με τους HBeAg θετικούς ασθενείς. Υπάρχουν κλινικές, ορολογικές και ιολογικές διαφορές μεταξύ της HBeAg θετικής και της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β (πίνακας 5). Η κλινική πορεία της HBeAg αρνητικής ηπατίτιδας ποικίλει. Κάποιοι ασθενείς παρουσιάζουν μόνιμα αυξημένα επίπεδα της ALT, αλλά οι περισσότεροι (πάνω από το 50%) παρουσιάζουν μεγάλη διακύμανση τόσο στην ιαιμία όσο και στα επίπεδα της ALT. Οι ασθενείς αυτοί είναι δυνατόν σε κάποιες χρονικές στιγμές να έχουν ιικό 59

60 φορτίο πολύ χαμηλό (κάτω από το όριο των 10 4 copies/ml, απαραίτητο για την πρόκληση ηπατοκυτταρικής βλάβης). Πίνακας 5. Κλινικά, ορολογικά και ιολογικά χαρακτηριστικά της HΒeAg θετικής και HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β 159 HΒeAg θετική HBeAg αρνητική HBV άγριος τύπος μεταλλαγή προπυρηνικού/πυρηνικούπροαγωγέα Μέσος όρος ηλικίας (έτη) Ιστολογική εικόνα κατά τη διάγνωση (%) -ήπια χρόνια ηπατίτιδα μέτρια/βαριά χρόνια ηπατίτιδα ~60 -κίρρωση Διαρκής ύφεση μη συνηθισμένη Εξάλειψη του HΒsAg (%/έτος) ~1 0,5 Άλλοι ασθενείς μπορεί να διανύουν μακρά διαστήματα με φυσιολογική ALT και με επεισόδια οξείας επιδείνωσης. Η αυθόρμητη διαρκής ύφεση της νόσου είναι σπάνια ενώ η καθυστερημένη αυθόρμητη απώλεια του HBsAg συμβαίνει μόνο στο 0,5% των ασθενών 156,160. γ) Η διάγνωση της ανενεργού HBsAg φορείας βασίζεται στο ιστορικό της χρόνιας λοίμωξης, στην HBeAg αρνητικότητα, στην anti-hbe θετικότητα, στα μη ανιχνεύσιμα ή πολύ χαμηλά επίπεδα HBV-DNA (μικρότερα από 10 3 copies/ml), στα σταθερά φυσιολογικά επίπεδα ALT και στην απουσία σημαντικών ηπατικών βλαβών. Σ αυτούς τους ασθενείς οι οποίοι πέρασαν στο στάδιο της ανενεργού φορείας ενώ πριν είχαν εμφανίσει κίρρωση, η εικόνα τους ταυτίζεται με αυτή της ανενεργούς κίρρωσης. Ωστόσο υπάρχει πρόβλημα διαφοροδιάγνωσης μεταξύ ανενεργούς χρόνιας φορείας και HBeAg αρνητικής ηπατίτιδας. Για το λόγο αυτό απαιτείται συστηματική 60

61 παρακολούθηση των επιπέδων της ALT για τουλάχιστον ένα χρόνο 149,160. Οι ασθενείς αυτής της φάσης συνήθως έχουν καλή πρόγνωση. Μακροχρόνιες μελέτες και παρακολούθηση αυτών των ασθενών έδειξε ότι η νόσος παραμένει ανενεργός χωρίς ηπατικές βλάβες και με πολύ μικρή πιθανότητα εμφάνισης κίρρωσης ή ΗΚΚ. Η συχνότητα με την οποία μπορεί σ αυτούς τους ασθενείς να συμβεί μια αυθόρμητη επανεργοποίηση της νόσου φθάνει στο 20-25%. Οξείες εξάρσεις της ηπατίτιδας οφείλονται σε επανεργοποίηση του HBV πολλαπλασιασμού αλλά και σε άλλους παράγοντες όπως η HDV, HCV, HAV ή HIV συλλοίμωξη, η κατανάλωση αλκοόλ ή ηπατοκυτταροτοξικών φαρμάκων. Η οξεία επιδείνωση μπορεί να είναι ασυμπτωματική αν και μερικές φορές έχει την εικόνα οξείας ηπατίτιδας με ή χωρίς ίκτερο. Κίρρωση- Εξέλιξη σε Κίρρωση Μακροχρόνιες μελέτες ασθενών με HBeAg θετική χρόνια ηπατίτιδα χωρίς θεραπεία δείχνουν ότι το ποσοστό εμφάνισης κίρρωσης κυμαίνεται στο 2 με 6 % για κάθε χρόνο με συνολική επίπτωση 8-20% σε χρονικό διάστημα 5 ετών 156,161, ενώ η ετήσια επίπτωση της κίρρωσης σε ασθενείς με HBeAg-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα φθάνει το 8-10%. Τα τελευταία χρόνια έχουν περιγραφεί παράγοντες ενοχοποιητικοί για εμφάνιση κίρρωσης. Έτσι το HBV ιικό φορτίο θεωρείται ο πιο ισχυρός προγνωστικός δείκτης κίρρωσης και ο σχετικός κίνδυνος (relative risk, RR) αυξάνει θεαματικά με την αύξηση του ιικού φορτίου άσχετα από τα επίπεδα της ALT ή της HBeAg θετικότητας. Ο γονότυπος του ιού και οι μεταλλαγές αποτελούν επίσης προγνωστικούς δείκτες. Έτσι για παράδειγμα ο γονότυπος Α έχει μεγαλύτερη πιθανότητα εξέλιξης σε χρονιότητα σε σχέση με το γονότυπο D (80% έναντι 11%), και γενικά οι γονότυποι A και D μεγαλύτερη πιθανότητα από τους Β και C Ωστόσο μια αναδρομική μελέτη επιβεβαιώνει ότι οι ασθενείς με γονότυπο C 61

62 παρουσιάζουν πιο βαριά ηπατική νόσο που οδηγεί σε κίρρωση ή ηπατοκυτταρικό καρκίνο σε σχέση με αυτούς που έχουν γονότυπο Β 24,92,165,166. Επίσης διάφορα HBV μεταλλαγμένα στελέχη με μεταλλαγές στην προπυρηνική περιοχή, στην περιοχή του πυρηνικού προωθητή, όπως και μεταλλαγές απάλειψης στα προs/s γονίδια έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με την παθογένεια της HBV λοίμωξης, όπως και την εμφάνιση κίρρωσης ή ΗΚΚ. Γενικά η εμφάνιση κίρρωσης γίνεται συνήθως ύπουλα χωρίς συμπτώματα και μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών έχουν συμπτώματα κατά τη διάγνωσή της. Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών με διάγνωση αντιρροπούμενης κίρρωσης είναι έτη, όπως προκύπτει από μελέτες στην Ευρώπη και την Ανατολική Ασία, και οι περισσότεροι είναι άνδρες. Το ποσοστό μετάπτωσης της κίρρωσης από την αντιρροπούμενη στη μη αντιρροπούμενη μορφή κυμαίνεται στο 3,9%. Η μη αντιρροπούμενη κίρρωση χαρακτηρίζεται από βαριές κλινικές επιπλοκές όπως ασκίτη, ίκτερο, αιμορραγίες από κιρσούς οισοφάγου και ηπατική εγκεφαλοπάθεια. Οι ασθενείς καταλήγουν από ηπατική νόσο τελικού σταδίου, εκτός αν υποβληθούν σε μεταμόσχευση ήπατος. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι η πενταετής θνητότητα ανέρχεται στο 0-2% στους ασθενείς χωρίς κίρρωση, στο 14-20% στους ασθενείς με αντιρροπούμενη κίρρωση και στο 70-86% στους ασθενείς με μη αντιρροπούμενη Η βιοχημική και ιστολογική εικόνα της λοίμωξης είναι σημαντικοί δείκτες της εξέλιξης προς κίρρωση. Κατ αυτόν τον τρόπο οι πολλαπλές αυθόρμητες διαλείπουσες αυξήσεις της ALT κατά τη διάρκεια της χρόνιας πορείας της νόσου, όπως και η βαρύτητα της ίνωσης που προκαλείται από βαριές νεκροφλεγμονώδεις βλάβες, σχετίζονται με την πιθανότητα εξέλιξης προς κίρρωση 170. Διάφοροι επίσης εξωτερικοί παράγοντες όπως η κατανάλωση αλκοόλ, το κάπνισμα, η δίαιτα, 62

63 περιβαλλοντικοί παράγοντες (αφλατοξίνη) σχετίζονται με την εμφάνιση κίρρωσης και/ή ΗΚΚ (πίνακας 6). Πίνακας 6. Παράγοντες εξέλιξης της χρόνιας ηπατίτιδας και της αντιρροπούμενης κίρρωσης οι οποίες οφείλονται σε ιό της ηπατίτιδας Β 159 Παράγοντες Σχόλιο Σχετικοί με τον ιό -HBV κατάσταση αναπαραγωγής κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης -HBV γονότυπος -HDV συλλοίμωξη σημαντικός χρειάζεται περισσότερη έρευνα σημαντικός - HCV σημαντικός -HIV συλλοίμωξη χρειάζεται περισσότερη έρευνα Σχετικοί με τον ξενιστή -ηλικία κατά τη λοίμωξη -ηλικία κατά τη διάγνωση -φύλο -στάδιο της ηπατικής νόσου κατά την εξέταση -επαναλαμβανόμενες εξάρσεις της ηπατίτιδας -παρατεταμένα φυσιολογική ALT σημαντικός σημαντικός σημαντικός σημαντικός σημαντικός σημαντικός Εξωτερικοί -αλκοόλ -κάπνισμα -περιβαλλοντικοί ρύποι (αφλατοξίνες) σημαντικός χρειάζεται περισσότερη έρευνα σημαντικός σε περιοχές ενδημικής HBV λοίμωξης Ηπατοκυτταρικός Καρκίνος (ΗΚΚ) Σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα η πιθανότητα εμφάνισης ηπατοκυτταρικού καρκίνου διαφέρει κι εξαρτάται από τη γεωγραφική περιοχή, καθώς και από το 63

64 επίπεδο της ηπατοκυτταρικής βλάβης. Σε κιρρωτικό ασθενή, ο κίνδυνος ΗΚΚ αυξάνεται σε σχέση με τους ασθενείς χωρίς κίρρωση. Μελέτες σε χώρες της Ανατολικής Ασίας έδειξαν ανάπτυξη ΗΚΚ σε ποσοστό 0,2% το χρόνο στους ανενεργούς φορείς, 1% στους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα χωρίς κίρρωση και 3,2% σε ασθενείς με αντιρροπούμενη κίρρωση 171. Μελέτες στην Ευρώπη όπου υπάρχει χαμηλή ή μέτρια ενδημικότητα της HBV λοίμωξης, παρουσίασαν χαμηλότερα ποσοστά ανάπτυξης ΗΚΚ 0,02% για τους ανενεργούς φορείς, 0,1% για τους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα χωρίς κίρρωση και 2,2% για τους ασθενείς με αντιρροπούμενη κίρρωση 171. Μακροχρόνιες μελέτες έδειξαν ότι ο ΗΚΚ συνήθως εκδηλώνεται σε ασθενείς με λανθάνουσα κλινική νόσο, καθώς οι περισσότεροι δεν είχαν παρουσιάσει ηπατική ανεπάρκεια πριν ή κατά το χρόνο της διάγνωσης του καρκίνου 172. Εξωηπατικές εκδηλώσεις της λοίμωξης από HBV Οι εξωηπατικές εκδηλώσεις της HBV λοίμωξης, όπως η οζώδης περιαρτηρίτιδα ή η σπειραματονεφρίτιδα, κυρίως οφείλονται στη δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων από αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών επιφανείας του ιού. Η δημιουργία αυτών των ανοσοσυμπλεγμάτων είναι αποτέλεσμα ενεργού ιικού πολλαπλασιασμού και συνήθως ξεκινάει στα αρχικά στάδια της λοίμωξης, κυρίως σε παιδιά. Αυτός είναι εξάλλου ο λόγος που η θεραπεία έναντι των παραπάνω κλινικών εκδηλώσεων είναι κατά βάση αντιική, η οποία δυνατό να συνδυαστεί με πλασμαφαίρεση και με λήψη κορτικοστεροειδών. Ο έλεγχος του ιικού πολλαπλασιασμού με τα αντιικά φάρμακα συνδέεται με την ελάττωση των συμπτωμάτων από αγγειίτιδα. Πολλές έρευνες έχουν δείξει ότι η κάθαρση από τον ιό συνδέεται με τη σύγχρονη ίαση της αγγειίτιδας 173,

65 Εργαστηριακή Διάγνωση και Ορολογικοί Δείκτες της HBV Λοίμωξης Το ορολογικό προφίλ της λοίμωξης από HBV ποικίλει και είναι πολύπλοκο. Τα αντιγόνα και τα αντισώματα που σχετίζονται με τη λοίμωξη είναι το αντιγόνο επιφανείας (HBsAg) και το αντίσωμα έναντι αυτού (anti-hbs), το πυρηνικό αντιγόνο (HBcAg) και το αντίστοιχο αντίσωμα (anti-hbc), το αντιγόνο e (HBeAg) και το αντίσωμά του (anti-hbe). Υπάρχουν επίσης μέθοδοι εξέτασης οι οποίες ανιχνεύουν και προσδιορίζουν τη συγκέντρωση του κυκλοφορούντος στον ορό HBV DNΑ. Τουλάχιστον ένας ορολογικός δείκτης είναι παρόν κατά τη διάρκεια των διαφόρων φάσεων της HBV λοίμωξης. (εικόνα 12). Στο εμπόριο διατίθενται διάφορες ορολογικές μέθοδοι για την ανίχνευση των παραπάνω δεικτών, εκτός του HBcAg διότι αυτό δεν κυκλοφορεί ελεύθερο στο αίμα. Οι ορολογικοί δείκτες που συνήθως χρησιμοποιούνται για τη διαφοροδιάγνωση μεταξύ οξείας, χρόνιας, αποδραμούσας ή παλαιάς λοίμωξης είναι οι HBsAg, IgM anti-hbc και ο anti-hbs (πίνακας 7). Η παρουσία του HBeAg και του HBV-DNA γενικά υποδηλώνουν υψηλά επίπεδα ιικού πολλαπλασιασμού. Η εμφάνιση στον ορό του anti-hbe συνήθως σχετίζεται με τα μειωμένα ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα HBV- DNA και πολύ χαμηλά επίπεδα ιικού πολλαπλασιασμού. Στα άτομα που πρόσφατα μολύνθηκαν, το HBsAg είναι ο μόνος ορολογικός δείκτης που ανιχνεύεται κατά την 3 η έως την 5 η εβδομάδα μετά τη λοίμωξη. Ο μέσος χρόνος ανίχνευσης του HBsAg από την έκθεση στον ιό, είναι περίπου 30 ημέρες (6-60 ημέρες). Υψηλής ευαισθησίας εξετάσεις ιικού φορτίου μπορούν να ανιχνεύουν το HBV-DNA στον ορό ημέρες νωρίτερα της ανίχνευσης του HBsAg 175. Παροδική θετικότητα του HBsAg έχει αναφερθεί για πάνω από 18 ημέρες μετά τον εμβολιασμό για HBV και δεν έχει κλινική σημασία. Το IgM antihbc εμφανίζεται με την έναρξη των κλινικών συμπτωμάτων (αδιαθεσία, ίκτερος, ανορεξία, ναυτία, κνησμός κλπ.) και την αύξηση της ALT στην οξεία λοίμωξη, το δε anti-hbc IgG 65

66 Εικόνα 12. Α. Ορολογικά γεγονότα συνδεόμενα με την τυπική πορεία της οξείας ηπατίτιδας. Β. Ανάπτυξη της κατάστασης χρονίου φορέα του HBV. H κλασσική ορολογική διάγνωση είναι δυσχερής όσο διαρκεί το παράθυρο το HBsAg, όταν δεν ανιχνεύεται ούτε το anti-hbs 176. παραμένει στον ορό στην πλειονότητα των ασθενών για δεκαετίες μετά την αποδρομή της νόσου. Η οξεία ή η αρχόμενη ηπατίτιδα μπορεί να διαφοροδιαγνωσθεί από την χρόνια, με την παρουσία antihbc IgM αντισώματος, το οποίο ανιχνεύεται και πέραν 66

67 των 6 μηνών από την έναρξη της οξείας νόσου, αν βέβαια αυτή αποδράμει. Στη χρόνια λοίμωξη τα επίπεδα του IgM-antiHBc είναι ουσιαστικά μη ανιχνεύσιμα. Εντούτοις, κατά τις εξάρσεις της νόσου μπορεί οι ασθενείς να γίνουν ξανά θετικοί ως προς το IgM antihbc. Πίνακας 7. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των ορολογικών δοκιμασιών για τη λοίμωξη από ιό της ηπατίτιδας Β 127 Τυπική ερμηνεία των αποτελεσμάτων των ορολογικών δοκιμασιών για τη λοίμωξη από ιό της ηπατίτιδας Β Ορολογικοί δείκτες HBsAg* Total anti-hbc IgM anti-hbc Anti-HBs Ερμηνεία - ** Καμία μόλυνση χωρίς ένδειξη εμβολιασμού Χρόνια λοίμωξη Οξεία λοίμωξη Ανάκαμψη από παρελθούσα λοίμωξη και ανοσία Ανοσία (ανοσοποίηση ή φυσική ανοσία) * επιφανειακό αντιγόνο ηπατίτιδας Β Αντίσωμα στο αντιγόνο του πυρήνα της ηπατίτιδας Β Ανοσοσφαιρίνη Μ. Αντίσωμα στο HBsAg ** Αρνητικό αποτέλεσμα της δοκιμασίας Θετικό αποτέλεσμα της δοκιμασίας. Στα άτομα που η HBV λοίμωξη είναι σε αποδρομή το HBsAg και το HBV DNA συνήθως εξαφανίζονται από το αίμα ενώ εμφανίζεται το antihbs. Στους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα το HBsAg και το HBV DNA εμμένουν για πάνω από 6 μήνες ενώ έχουν αυξημένα επίπεδα της ALT στην χρόνια ενεργό λοίμωξη 169. Στους ασθενείς οι οποίοι αναρρώνουν από χρόνια HBV λοίμωξη χάνεται το HBsAg, μένει το anti-hbc και στην πλειονότητα αυτών θα εμφανιστεί το anti-hbs

68 Σε πάρα πολλά άτομα το anti-hbc είναι ο μόνος ανιχνεύσιμος ορολογικός δείκτης. Η μεμονωμένη anti-hbc θετικότητα μπορεί να σημαίνει: 1) Παλαιά λοίμωξη σε άτομα τα οποία έχουν αναρρώσει αλλά το anti-hbs αντίσωμά τους έχει εξαφανιστεί, κυρίως σε πληθυσμούς με υψηλή επίπτωση της HBV λοίμωξης. 2) Χρόνια λοίμωξη κατά την οποία το HBsAg δεν ανιχνεύεται με τις συμβατικές μεθόδους, κυρίως σε ενδημικούς πληθυσμούς ή σε άτομα με HIV ή HCV συλλοίμωξη 177. HBV-DNA έχει ανιχνευθεί στο 5% των ατόμων με μόνο antihbc ορολογικό δείκτη. 3) Ψευδώς θετική αντίδραση. Άτομα που φέρουν μόνο το anti-hbc είναι απίθανο να μπορούν να μεταδώσουν τη λοίμωξη εκτός ιδιαίτερων συνθηκών όπως σε ευαίσθητους σε πολύ μικρές ποσότητες του ιού, όπως οι λήπτες μοσχευμάτων οργάνων ή αίματος κατά τη μετάγγιση 177. To HBeAg ανιχνεύεται στον ορό ασθενών με οξεία ή χρόνια λοίμωξη. Στην πλειονότητα των ασθενών με χρόνια λοίμωξη παρατηρείται ορομετατροπή HBeAg σε anti-hbe. Η παρουσία του HBeAg σχετίζεται με την ενεργότητα της νόσου και με υψηλά επίπεδα HBV DNA ( IU/ml) ενώ η απουσία του μαζί με θετικό anti-hbe έχει σχέση γενικά με χαμηλά ή μέτρια επίπεδα HBV DNA ( IU/ml). 68

69 Θεραπεία και Πρόληψη Μολονότι δεν υπάρχει θεραπεία για την οξεία λοίμωξη είναι δυνατό να χορηγηθεί ανοσοσφαιρίνη της ηπατίτιδας Β εντός μιας εβδομάδας από την έκθεση ακόμη και στα νεογνά από μητέρα HbsAg θετική προκειμένου να προληφθεί και να βελτιωθεί η νόσος. Στη χρόνια ηπατίτιδα Β το πλάνο της θεραπείας είναι η καταστολή του πολλαπλασιασμού του ιού και η παρεμπόδιση ή καθυστέρηση της εξέλιξης της νόσου προς κίρρωση, ηπατική ανεπάρκεια και ΗΚΚ 178. Έχοντας σα βασικό στόχο της θεραπείας την καταστολή του ιικού πολλαπλασιασμού, θα πρέπει να επιτευχθεί δευτερευόντως η επαναφορά της ALT σε φυσιολογικά επίπεδα και η βελτίωση της ιστολογικής εικόνας με περιορισμό της εξέλιξης προς κίρρωση και τις επιπλοκές της 179,180. Οι θεραπευτικοί στόχοι θα μπορούσαν να διακριθούν σε 176 : 1. Επίτευξη βιοχημικής απάντησης με επάνοδο της ALT σε φυσιολογικές τιμές. Το κριτήριο αυτό δεν είναι ασφαλές ως θεραπευτικός στόχος, καθώς υπάρχουν περιπτώσεις ασθενών με φυσιολογικές τιμές παρά την ενεργό νόσο τους και περιπτώσεις με αυξημένες τιμές μετά από επιτυχή θεραπεία, η οποία οφείλεται σε άλλα αίτια. 2. Επίτευξη ιστολογικής απάντησης βασισμένης στην αξιολόγηση του βαθμού της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας και του σταδίου της ίνωσης. Η εκτίμησή της δεν μπορεί να αποτελεί στην κλινική πράξη σταθερό θεραπευτικό στόχο καθώς χρειάζεται βιοψία ήπατος, η οποία ως παρεμβατική πράξη δεν μπορεί να διενεργείται επανειλημμένα. 3. Επίτευξη ιολογικής απάντησης με μέτρηση των επιπέδων του HBV DNA στον ορό η οποία φαίνεται να αποτελεί τον πιο ασφαλή τρόπο εκτίμησης της απάντησης του ασθενή στην θεραπεία. 69

70 Επιπλέον, η απώλεια του HBeAg ή η ορομετατροπή σε antihbe έχει χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικός στόχος για την εκτίμηση επιτυχούς θεραπείας και άλλωστε φαίνεται να αποτελεί έναν πιο σταθερό δείκτη από την ελάττωση ή μη ανίχνευση του HBV DNA στον ορό. Διαπιστώθηκε όμως ότι και ο δείκτης αυτός δεν είναι απόλυτα ασφαλής. Βρέθηκε ότι το HBeAg επανέρχεται μετά από θεραπεία με ιντερφερόνη σε ποσοστό 10-30% και έως 60% μετά από θεραπεία με νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα, όταν η θεραπεία διακόπτεται γρήγορα. Υπάρχουν ασθενείς οι οποίοι δεν βελτιώνονται παρά την απώλεια του HBeAg και μεταπίπτουν σε HBeAg (-) χρόνια ηπατίτιδα Β 157. Η απώλεια του HBsAg και η ορομετατροπή σε antihbs θεωρείται ο πλέον επιθυμητός θεραπευτικός στόχος και αποτελεί την πλήρη απάντηση στη θεραπεία, εκτός από ένα μικρό ποσοστό ασθενών, οι οποίοι έχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα HBV DNA στο ήπαρ και συνιστούν την ομάδα των ασθενών με λανθάνουσα HBV λοίμωξη. Ενδείξεις θεραπείας Οι ενδείξεις θεραπείας δεν διαφέρουν στους ασθενείς με HBeAg (+) ή ΗΒeAg (-) χρόνια ηπατίτιδα Β και βασίζονται σε 3 κριτήρια: τα επίπεδα του HBV DNA στον ορό, τα επίπεδα των τρανσαμινασών και την ιστολογική βλάβη. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της EASL (European Association for the Study of Liver) οι ασθενείς υποβάλλονται σε θεραπεία όταν τα επίπεδα του HBV DNA είναι >2000 IU/ml (10000 copies/ml), οι τρανσαμινάσες είναι πάνω από τα φυσιολογικά όρια του τοπικού εργαστηρίου και η βιοψία ήπατος (ή οι μη επεμβατικοί δείκτες) δείχνει παρουσία μέτριας ή βαριάς νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας ή/και ίνωση 178. Aντιικά Φάρμακα o Ιντερφερόνη (IFN-α) Η κύρια ανοσολογική θεραπεία είναι με ιντερφερόνη-α (IFN-α) η οποία χρησιμοποιείται από τη δεκαετία του 50. Παρουσιάζει τέσσερα βασικά 70

71 πλεονεκτήματα στη θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β: α) ένα άμεσο αντιικό αποτέλεσμα, β) διέγερση της Τ κυτταρικής ανοσιακής απάντησης, γ) ελάττωση της ικανότητας πολλαπλασιασμού του ιού και δ) δράση κατά της ηπατικής ίνωσης. Στους ασθενείς με HBeAg (+) χρόνια ηπατίτιδα η θεραπεία οδηγεί σε απώλεια του HBeAg, ελάττωση του ιικού φορτίου και ύφεση της νόσου σε ποσοστό 20-25%, βασικά χωρίς απώλεια του HBsAg 181,182. Παρουσιάζει το πλεονέκτημα της διατήρησης του κλινικού οφέλους για μακρύ χρονικό διάστημα στους ασθενείς που απαντούν στην θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης και της ελαττωμένης πιθανότητας εξέλιξης σε κίρρωση και ΗΚΚ. Επιπλέον δεν εμφανίζονται αυθεντικά μεταλλαγμένα στελέχη του ιού ενώ υπάρχει και η πιθανότητα απώλειας του HBsAg στους ασθενείς οι οποίοι εμφανίζουν μη ανιχνεύσιμο HBV DNA το οποίο και διατηρούν για πολλά χρόνια. Ωστόσο η θεραπεία με IFN-α έχει τα μειονεκτήματα της παρεντερικής χορήγησης 3 φορές την εβδομάδα για 6 μήνες, και των παρενεργειών που μοιάζουν με γριππώδη συνδρομή σε πολλούς ασθενείς. Επιπλέον, η χορήγησή της αντενδείκνυται σε ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση, αυτοάνοσα νοσήματα, ή σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση ήπατος. Τα τελευταία χρόνια, η πεγκυλιωμένη IFN-α (PEG-IFN-α) χρησιμοποιείται αντί της απλής IFN-α. Πρόσφατες μελέτες της χρήσης της IFN-α2α ή 2b στη θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β για 48 εβδομάδες έδειξαν καλύτερα αποτελέσματα ιολογικής ανταπόκρισης σε σχέση με την απλή IFN-α και απώλεια του HBeAg σε ποσοστό 30% σε έλεγχο που έγινε 6 μήνες μετά τη θεραπεία 62,93. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αύξηση του ρυθμού ορομετατροπής του HΒsAg σε αντίσωμα anti-hbs από 3% έως 5%, όπως και η απλή απώλεια του HBsAg που φθάνει το 7%. Αυτές οι μελέτες έδειξαν την ύπαρξη προδιαθετικών παραγόντων για HBeAg ορομετατροπή στους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β πριν τη θεραπεία όπως τα υψηλά επίπεδα της ALT στον ορό (>5 71

72 φορές των φυσιολογικών τιμών), τα σχετικά χαμηλά επίπεδα HBV DNA (<10 7 αντίγραφα/ml) και η λοίμωξη από γονότυπο Α. Στην HBeAg(-) χρόνια ηπατίτιδα Β η χρήση της απλής ή της πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης παρουσιάζει επίσης τους περιορισμούς των παρενεργειών όπως και της μεγάλου χρονικού διαστήματος θεραπείας για την επίτευξη ιολογικής απάντησης και κλινικού αποτελέσματος 153,183. Η διατήρηση της απάντησης κυμαίνεται στο ~20% ελαφρώς μικρότερη από αυτή στους HBsAg (+) ασθενείς που δέχονται το ίδιο θεραπευτικό σχήμα και μετά από έλεγχο 6 μηνών μετά από θεραπεία 153. o Νουκλεοτιδικά ή νουκλεοσιδικά ανάλογα Τα νουκλεοτιδικά ή νουκλεοσιδικά ανάλογα που είναι η λαμιβουδίνη, η αδεφοβίρη, η εντεκαβίρη, η τενοφοβίρη και η τελμπιβουδίνη αποτελούν αναστολείς της ανάστροφης τρανσκριπτάσης εμποδίζοντας τη σύνθεση ιικού DNA και τον πολλαπλασιασμό του μέσα στο ηπατοκύτταρο. Με αυτά τα φάρμακα επιτυγχάνεται μακράς διάρκειας απάντηση με συνεχή θεραπεία, η διακοπή της οποίας σχετίζεται με υποτροπή της νόσου ενώ η εμφάνιση ανθεκτικών μεταλλαγών του ιού έναντι αυτών των φαρμάκων με πιθανό επακόλουθο την αντίσταση στη θεραπεία και την ενεργοποίηση της νόσου είναι ένα ακόμη πιθανό μειονέκτημα της θεραπείας με νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα. Λαμιβουδίνη Η λαμιβουδίνη (2 3 dideoxycytidine) αναστέλλει την ανάστροφη μεταγραφάση του ιού. Είναι ένα καλά ανεκτό ασφαλές φάρμακο που χορηγείται από το στόμα. Σύμφωνα με μελέτες κατά τη χορήγησή της στην HBeAg (+) χρόνια ηπατίτιδα Β φαίνεται ότι προκαλεί μεγάλη ελάττωση του ιικού φορτίου με πτώση των επιπέδων του HBV DNA (44%), αύξηση των κυκλοφορούντων αντιικών CD4 και CD8 θετικών Τ λεμφοκυττάρων και βελτίωση της ιστολογικής εικόνας κατά τη βιοψία ήπατος 49,184,185. Η θεραπεία με λαμιβουδίνη φάνηκε επίσης να βελτιώνει την ηπατική 72

73 λειτουργία και να μειώνει τον κίνδυνο εξέλιξης σε ΗΚΚ σε ασθενείς με κίρρωση ήπατος 186. Ο ρυθμός ορομετατροπής του HBeAg είναι περίπου 15-20% το χρόνο πράγμα που σημαίνει ότι απαιτείται μακράς διάρκειας θεραπεία στην πλειονότητα των ασθενών. Στην HBeAg (-) χρόνια ηπατίτιδα Β χρειάζεται μεγαλύτερης διάρκειας θεραπεία προφανώς μέχρι εξαλείψεως του HBsAg, αφού η εξάλειψη του HBeAg δεν μπορεί να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο 146,187. Δυστυχώς ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα της θεραπείας με λαμιβουδίνη είναι η ανάπτυξη αντοχής του ιού στο φάρμακο, λόγω του υψηλού ρυθμού αυθόρμητων μεταλλαγών του HBV. Οι κύριες μεταλλαγές που οδηγούν σε αντίσταση στο φάρμακο, εδράζονται μέσα στη YMDD αλληλουχία της περιοχής C της ιικής πολυμεράσης. Τα αποτελέσματα κλινικών δοκιμών και μελετών έχουν δείξει ότι το ποσοστό αντοχής φθάνει το 20% για κάθε χρόνο θεραπείας. Αντίσταση δε στη λαμιβουδίνη παρατηρείται στο 70% των ασθενών μετά από 4 χρόνια θεραπείας 165. Το πρόβλημα της ανάπτυξης αντοχής θα μπορούσε πιθανά να ελαττωθεί αν η θεραπεία γινόταν με ένα συνδυασμό νουκλεοτ(σ)ιδικών αναλόγων και όχι με ένα μόνο φάρμακο. Αδεφοβίρη Είναι νουκλεοτιδικό παράγωγο της αδενίνης. Μια μεγάλη μελέτη αξιολόγησε την αντιική αποτελεσματικότητα της από του στόματος χορήγησης της αδεφοβίρης σε 515 ασθενείς με HBeAg (+) χρόνια ηπατίτιδα Β 99. Μετά από 48 εβδομάδες θεραπείας, η μέση μείωση του ιικού φορτίου ήταν περίπου 3,5 δεκαδικοί λογάριθμοι αντίγραφα ανά ml σε σύγκριση με τις τιμές προ της θεραπείας. Το ποσοστό ορομετατροπής του HBeAg ήταν 12% στην ομάδα των ασθενών που ελάμβαναν 10 mg ημερησίως αδεφοβίρη έναντι 6% στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου. Αυτό συνοδεύτηκε από σημαντική βελτίωση των επιπέδων ALT και της ιστολογικής εικόνας του ήπατος. 73

74 Σε HBeAg αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β, η χορήγηση αδεφοβίρης έδειξε παρόμοια αποτελέσματα μετά από 1 χρόνο θεραπείας σε σύγκριση με τη θεραπεία της HBeAg (+) χρόνιας ηπατίτιδας Β 99. Μια μεγαλύτερης διάρκειας μελέτη 144 εβδομάδων έδειξε διατήρηση της ιολογικής απάντησης 188. Στην πλειονότητα των ασθενών οι οποίοι μεταφέρθηκαν από την αδεφοβίρη στο εικονικό φάρμακο, το όφελος της θεραπείας χάθηκε, δείχνοντας ότι, όπως και με τη λαμιβουδίνη, η αντιική θεραπεία, σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών, θα πρέπει να χρησιμοποιεί την HBsAg ορομετατροπή ως τελικό της στόχο ώστε να αποφύγει την επανενεργοποίηση του ιού και τις απότομες αυξήσεις της ALT. Ως μεταλλαγές αντίστασης στο φάρμακο εντοπίστηκαν οι N236T και A181V 189,190, αλλά αντίσταση μέχρι στιγμής, εμφανίστηκε λιγότερο συχνά σε σχέση με τη λαμιβουδίνη δηλαδή στο 3% και 5,9% των ασθενών μετά από 96 και 144 εβδομάδες θεραπείας, αντίστοιχα. Πρόσφατα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 28% των ασθενών ανέπτυξαν αντοχή στην αδεφοβίρη μετά από 5 χρόνια χορήγησης του φαρμάκου 188. Σε ασθενείς με αντοχή στη λαμιβουδίνη, οι οποίοι λαμβάνουν αδεφοβίρη, η αντοχή πιο συχνά παρατηρείται όταν αυτή χορηγείται ως μονοθεραπεία σε σχέση με τη συγχορήγηση με λαμιβουδίνη 191. Άλλα νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα Τέλος μελέτες έδειξαν ότι η εντεκαβίρη και η τενοφοβίρη είναι ισχυροί αναστολείς του HBV εμφανίζοντας υψηλό φραγμό στην αντίσταση 24. Η αντίσταση στην εντεκαβίρη σε πρωτοθεραπευόμενους ασθενείς δεν υπερβαίνει το 1%, στα 2 χρόνια θεραπείας αλλά εμφανίζεται υψηλότερη σε ασθενείς με αντίσταση στη λαμιβουδίνη 192. Η τενοφοβίρη φαίνεται να είναι φάρμακο εκλογής στους ασθενείς που παρουσιάζουν αντοχή στη λαμιβουδίνη και πιθανώς θα αντικαταστήσει την αδεφοβίρη στη θεραπεία της ηπατίτιδας Β. Λόγω του υψηλού φραγμού αντίστασης 74

75 που εμφανίζει εγγυάται τη χρησιμοποίησή της σε θεραπευτική στρατηγική μονοθεραπείας πρώτης γραμμής 193. Πρόληψη o Τρέχοντα εμβόλια Το χρησιμοποιούμενα σήμερα στην Ευρώπη εμβόλια κατά της ηπατίτιδας Β αποτελούνται από τη μικρή (S) και τη μεσαία (M) πρωτεΐνη του περιβλήματος που αυτοσυναρμολογούνται σε σωματίδια 22 nm. Τόσο η S όσο και η M (pres 2 +S) πρωτεΐνη εμπεριέχουν το αντιγόνο επιφανείας HBsAg, το οποίο αποτελείται από τον κοινό αντιγονικό καθοριστή και διάφορους άλλους καθοριστές των υποτύπων. Τα εμβόλια με πρωτεΐνη S παράγονται από την επεξεργασία του πλάσματος HBV φορέων για τη λήψη κεκαθαρμένου HBsAg, όπως και από τον ζυμομύκητα (Saccharomyces cerevisiae), με ένθεση πλασμιδίου που περιέχει το γονίδιο S για το HBsAg. Το M / S εμβόλιο είναι ένα ανασυνδυασμένο εμβόλιο που παρασκευάζεται με την έκφραση σε CHO (Chinese Ηamster Οvary) κύτταρα. Τα εμβόλια αυτά χορηγούνται ενδομυϊκά στο δελτοειδή μυ και είναι ιδιαίτερα ανοσογονικά προκαλώντας την παραγωγή ενός προστατευτικού τίτλου αντισωμάτων anti-hbs (> 10 IU ανά ml) σε ποσοστό άνω του 95% υγιών παιδιών και νέων ενηλίκων 121,168,194. Δύο σχήματα χορήγησης είναι αποδεκτά: (α) τρεις αρχικές δόσεις ανά μήνα, και μία αναμνηστική στους 12 μήνες και (β) δύο αρχικές δόσεις ανά μήνα, που ακολουθούνται από μία αναμνηστική στους 6 μήνες. Περίπου 5% των εμβολιασμένων αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στο εμβόλιο. Διάφοροι παράγοντες της αποτυχίας απάντησης στο εμβόλιο έχουν αναγνωριστεί, συμπεριλαμβανομένων της γενετικά καθορισμένης αποτυχίας απάντησης και κάποια HLA DR αλλήλια, της ηλικίας άνω των 40 ετών, του υψηλού δείκτη μάζας σώματος, και της ανοσοκαταστολής ή ανοσοανεπάρκειας 121,168,194. Το εμβόλιο HBV σπάνια έχει παρενέργειες, με πιο συχνές τον πόνο στο σημείο της ένεσης. Νευρολογικές 75

76 διαταραχές, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας, το σύνδρομο Guillain Barre, και η εγκάρσια μυελίτιδα δεν έχουν αιτιώδη σχέση με το εμβόλιο ηπατίτιδας Β 194,195. Η αποτελεσματικότητα της προστασίας έναντι της λοίμωξης από HBV έχει αποδειχθεί σε μεγάλες κλινικές μελέτες πληθυσμών με ιδιαίτερη έκθεση στον ιό, όπως οι ομοφυλόφιλοι άνδρες, οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας, καθώς και βρέφη από HBsAg-θετικές μητέρες 121,168,194. Σε αυτές τις κλινικές μελέτες, η προστασία ήταν εμφανής όταν ο τίτλος του anti-hbsab ήταν πάνω από 10 IU/ml. Αρκετά χρόνια μετά τον εμβολιασμό, ο τίτλος των anti-hbsab μπορεί να ελαττωθεί σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα, αλλά η ανοσία έναντι της κλινικής νόσου μπορεί να παραμένει για πολλά χρόνια, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη μιας ανοσολογικής μνήμης 121,168,194. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, η αναμνηστική δόση δεν είναι απαραίτητη σε υγιή άτομα τα οποία δεν είναι εκτεθειμένα σε υψηλό κίνδυνο λοίμωξης από HBV. Παρ όλη την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα των σύγχρονων εμβολίων ακόμη υπάρχει ένα μικρό ποσοστό μη απαντήσεων στο εμβόλιο. Συνιστάται σε αυτούς 1 έως 3 επιπλέον δόσεις. Τα άτομα που δεν απαντούν σε δύο πλήρη σχήματα εμβολιασμού είναι σχεδόν απίθανο να ωφεληθούν από ένα τρίτο. Τα τελευταία χρόνια έκανε λοιπόν την εμφάνισή του μιας τρίτης γενιάς ανασυνδυασμένο εμβόλιο το οποίο περιέχει και τις τρεις αντιγονικές περιοχές της πρωτεΐνης S δηλαδή, την pre- S 1, την pre-s 2 και την S από δύο υπότυπους, τον adw και ayw. Οι περιοχές pre-s 1 και pre-s 2 πιστεύεται ότι αυξάνουν τις anti-hbs απαντήσεις. Μπορούν επίσης να διεγείρουν μια κυτταρική ανοσιακή απάντηση και να βοηθήσουν από παράπλευρη οδό στην γενετικής αιτιολογίας μη απαντητικότητα (ΗLA DRII) στο S αντιγόνο. Μελέτες έδειξαν ότι το εμβόλιο είναι καλά ανεκτό και ότι σε άτομα που δεν απαντούσαν με τα τρέχοντα εμβόλια προκάλεσε παραγωγή προστατευτικών αντισωμάτων σε υψηλότερα επίπεδα

77 Όσον αφορά τη δημόσια υγεία, η καλύτερη στρατηγική για την εξάλειψη της HBV λοίμωξης είναι ένα παγκόσμιο πρόγραμμα εμβολιασμού, όπως συνιστάται από την ΠΟΥ. Στην Ταϊβάν και την Ιταλία για παράδειγμα, μαζικοί εμβολιασμοί των βρεφών έχουν μειώσει την επίπτωση της λοίμωξης από HBV, καθώς και τον επιπολασμό των χρόνιων HBsAg φορέων και του ΗΚΚ 24,197. Αν και η εφαρμογή ενός καθολικού προγράμματος εμβολιασμού των βρεφών είναι πολύ επιθυμητή, είναι επίσης αναγκαία η εφαρμογή εμβολιασμού σε καταστάσεις υψηλού κινδύνου. Ενδέχεται όμως να μην είναι επαρκώς καθορισμένη ή προβλεπόμενη από τα προγράμματα, όπως ο εμβολιασμός των παιδιών 11 έως 13 ετών, ο εμβολιασμός των εφήβων και ενηλίκων υψηλού κινδύνου, η εξέταση για HBV και ο εμβολιασμός των ατόμων σε οικογένειες με χρόνιους φορείς, και ο εμβολιασμός των μεταναστών από υπερενδημικές περιοχές. Επίσης είναι απαραίτητος ο προγεννητικός έλεγχος των εγκύων γυναικών για HBV, καθώς και η χορήγηση εμβολίου και HBIG σε νεογνά από HBV-θετικές μητέρες 121,168,194. Επιπρόσθετα, πρέπει να υπάρχει πρόνοια χορήγησης HBIG και εμβολίου σε μη ανοσοποιημένα άτομα που τραυματίζονται από μολυσματικές βελόνες. Με βάση τις δυσκολίες στην αντιμετώπιση της χρόνιας HBV λοίμωξης, συμπεριλαμβανομένων της εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών στα φάρμακα, και του κινδύνου ανάπτυξης ΗΚΚ, η αποτελεσματική πρόληψη επιβάλλει τη συνέχιση του προγράμματος μαζικού εμβολιασμού σε όλο τον κόσμο 198. Αποτελεί πρόκληση για το μέχρι τώρα μαζικό εμβολιασμό η εμφάνιση μεταλλαγμένων στελεχών που διαφεύγουν του εμβολίου, λόγω μεταλλαγής στον α-αντιγονικό καθοριστή με αποτέλεσμα την μη αναγνώρισή τους από τα εμβολιασμένα άτομα. Μεταλλαγές διαφυγής του εμβολίου Έχουν αναφερθεί μεταλλαγές διαφυγής του εμβολίου σε μελέτες παρακολούθησης ατόμων στα οποία χορηγήθηκαν HBsAg εμβόλια αποτελούμενα 77

78 από πρωτεΐνη S. Το εμβόλιο προκαλεί συνήθως μια πολύ ισχυρή ανοσιακή απάντηση με παραγωγή αντισωμάτων έναντι του α-αντιγονικού καθοριστή, που βρίσκεται στην εκτεθειμένη υδροφιλική περιοχή μεταξύ των αμινοξέων 99 και Αυτός καθαυτός ο α-αντιγονικός καθοριστής έχει χαρτογραφηθεί μεταξύ των αμινοξέων 124 και , , αν και ορισμένοι συγγραφείς έχουν επεκτείνει την περιοχή μερικά αμινοξέα εκατέρωθεν. Δύο βρόγχοι που συγκρατούνται από δισουλφιδικούς δεσμούς, σύμφωνα με κάποιους συγγραφείς, υπάρχουν μεταξύ των C124 και C137, και C139 και C147 αμινοξέων, ενώ κι άλλα ζεύγη αμινοξέων έχουν επίσης προταθεί 206. Ο α- αντιγονικός καθοριστής είναι εξαιρετικά συντηρημένη περιοχή και απαντάται σε όλους τους γονότυπους του HBV 84. Η ορολογική τυποποίηση του ΗBsAg με κατάλληλα αντισώματα χρησιμοποιήθηκε, πριν τη δυνατότητα γονιδιακής ανάλυσης, για να γίνει διάκριση των διαφόρων υποτύπων του HBV. Συγκεκριμένα αμινοξέα, ειδικά για κάθε υπότυπο, έχουν χαρτογραφηθεί εξωτερικά της περιοχής του HBsAg, εκατέρωθεν του α- αντιγονικού καθοριστή, και είναι πλέον σαφές ότι πολλοί υπότυποι μπορούν να βρεθούν στον ίδιο γονότυπο 38,84,87,207. Τα άτομα που έχουν χρόνια λοίμωξη, χωρίς να έχουν εμβολιασθεί και είναι οροθετικοί για HBsAg μπορεί την ίδια στιγμή να είναι οροθετικοί και για το anti-hbs, αν και σε αυτές τις περιπτώσεις, τα anti-hbs αντισώματα δεν είναι έναντι του α-αντιγονικού καθοριστή αλλά κάποιου οροτυπικού καθοριστή του HBsAg διαφορετικού του επικρατούντος HBsAg στον ορό 163, Η αντιδραστικότητα σε έναν άλλο υπότυπο μπορεί να αντανακλά ανοσιακή επιλογή κατά ενός υποτύπου που ήταν αρχικά παρόν στο λοιμογόνο ιό. Η διαφυγή στο εμβόλιο ουσιαστικά αποτελεί ένα ξεχωριστό φαινόμενο, κατά το οποίο ο εμβολιαζόμενος αναπτύσσει χρόνια HBV λοίμωξη και είναι οροθετικός τόσο για HBsAg όσο και για αντισώματα ειδικά έναντι του α-αντιγονικού καθοριστή του HBsAg. Αυτό είναι δυνατό επειδή το υπάρχον HBsAg στον ορό των ασθενών αυτών 78

79 στερείται της ειδικής αλληλουχίας αμινοξέων του α-αντιγονικού καθοριστή, ως αποτέλεσμα της μεταλλαγής στην S περιοχή περιλαμβανομένης μεταξύ των αμινοξέων 124 έως 147. Ο εμβολιασμός προφανώς δεν αποτρέπει πλήρως τη λοίμωξη του ήπατος μετά την έκθεση στον ιό. Πιθανόν η εξάπλωση του ιού από τα μολυσμένα στα μη μολυσμένα ηπατοκύτταρα επιβραδύνεται από τα αντισώματα μέχρι τη στιγμή που η ανοσιακή απάντηση μπορεί να καταστρέψει τα μολυσμένα κύτταρα. Γι αυτό το λόγο η διαφυγή από το εμβόλιο είναι ακόμη σπάνια και περισσότερο απαντάται σε ασθενείς οι οποίοι, εάν δεν είχαν εμβολιασθεί, θα είχαν μεγάλη πιθανότητα ανάπτυξης χρόνιας λοίμωξης μετά την έκθεση στον HBV (όπως, τα μικρά παιδιά ή ανοσοκατεσταλμένοι ενήλικες). Είναι σπάνια σε υγιείς ενήλικες, επειδή αυτοί παρουσιάζουν μικρή πιθανότητα ανάπτυξης χρόνιας λοίμωξης σε κάθε περίπτωση. Οι μεταλλαγές οι οποίες διαφεύγουν του εμβολίου μπορεί να μην είναι δυνατό να ανιχνευθούν από ορισμένες διαγνωστικές εξετάσεις για HBsAg, οι οποίες συχνά χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της εξέλιξης της HBV λοίμωξης 210. Οι περισσότερες μελέτες μεταλλαγών διαφυγής από το εμβόλιο αφορούν παιδιά υψηλού κινδύνου και βρέφη που είτε είχαν εμβολιαστεί είτε εμβολιάσθηκαν και επιπλέον έλαβαν HBIG ((αντι-hbs, υπεράνοσος γ-σφαιρίνη), που αντιδρά έντονα με τον α-αντιγονικό καθοριστή του HBsAg. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1980, μια μελέτη παρακολούθησης του παιδικού εμβολιασμού στην Ιταλία αποκάλυψε ότι εμβολιασμένοι ήταν HBsAg θετικοί, παρά την παρουσία μιας ισχυρής αντισωματικής απάντησης στο HBsAg. Η συχνότητα εμφάνισης ήταν σπάνια, στο 2% περίπου των παιδιών από HBsAg-θετικές μητέρες, ή με HBsAg-θετικά άτομα στην οικογένειά τους 211,212. Πιο λεπτομερής ανάλυση του ιού από έναν ασθενή αποκάλυψε μια σημαντική μεταλλαγή που κωδικοποιεί την υποκατάσταση G145R στο αμινοξύ 145 της πρωτεΐνης S 211. Ανάλυση με μονοκλωνικά αντισώματα στον α-αντιγονικό 79

80 καθοριστή του άγριου HBV αποκάλυψε απώλεια σύνδεσης με το μεταλλαγμένο HBsAg 211,213. Μεταγενέστερες μελέτες σε άλλους πληθυσμούς με υψηλή ενδημικότητα του HBV επιβεβαίωσε την σπάνια εμφάνιση των μεταλλαγών διαφυγής του εμβολίου σε παιδιά, συμπεριλαμβανομένης της G145R αντικατάστασης, άλλες αντικαταστάσεις ή προσθήκες στην περιοχή του α καθοριστή και μεταλλαγές στην υδροφιλική περιοχή εξωτερικά του α-αντιγονικού καθοριστή 36, Μεταλλαγμένα στελέχη από διαφυγή στο εμβόλιο έχουν επίσης ανιχνευθεί σε μη εμβολιασμένα παιδιά και ενήλικες θετικούς στον ιό και στο anti-hbs 36,216, πράγμα που αντικατοπτρίζει την παρελθούσα ταυτόχρονη λοίμωξη με τον άγριο τύπο του ιού και το μεταλλαγμένο ιό. Έτσι θα χρειασθεί νέα προσέγγιση για την αντιμετώπιση αυτών των μεταλλαγμένων στελεχών, μιας και άτομα στα οποία οι εν λόγω μεταλλαγές κυριαρχούν αποτελούν ένα αυξανόμενο ποσοστό στη δεξαμενή της HBV φορείας 216. Τα εμβόλια που προκαλούν μεταλλαγές διαφυγής σε παιδιά παραμένουν η μεγαλύτερη πρόκληση για τη δημόσια υγεία. Ωστόσο, το ίδιο πρόβλημα υπάρχει και σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς οι οποίοι εκτίθενται στον HBV, όπως αυτό συμβαίνει στους λήπτες ηπατικού μοσχεύματος. Ο εμβολιασμός και η χορήγηση HBIG (αντι-hbs) σε αυτούς τους ασθενείς μπορεί να ευθύνονται για την εμφάνιση μεταλλαγών στον α-αντιγονικό καθοριστή που μπορεί να είναι υπεύθυνες για την επανεμφάνιση του HBV στο ηπατικό μόσχευμα 217. Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η θεραπεία με λαμιβουδίνη μπορεί να διευκολύνει αυτή τη διαδικασία δια μέσου της επιλογής μεταλλαγών στο υποκείμενο γονίδιο της πολυμεράσης 115,218. Η προστατευτική δράση των αδειοδοτημένων εμβολίων για την ηπατίτιδα Β αξιολογήθηκε και κατά του G145R μεταλλαγμένου ιού σε ώριμο ανοσολογικά ξενιστή. Συγκεκριμένα χιμπατζήδες είχαν εμβολιαστεί με ανασυνδυασμένα εμβόλια ηπατίτιδας Β. Λίγο μετά, αφού οι χιμπατζήδες ανέπτυξαν αντισώματα κατά του αντιγόνου επιφανείας της ηπατίτιδας Β (anti-hbs), τους χορηγήθηκε ενδοφλεβίως 80

81 μεταλλαγμένο στέλεχος του HBV. Οι εμβολιασμένοι χιμπατζήδες δεν ανέπτυξαν λοίμωξη από HBV κατά τη διάρκεια 2 ετών παρακολούθησης. Αντίθετα, μη εμβολιασμένοι χιμπατζήδες ανέπτυξαν HBV λοίμωξη και ηπατίτιδα. Τα αντισώματα anti-hbs του ορού στους εμβολιασμένους χιμπατζήδες αντέδρασαν όχι μόνο με το επιφανειακό αντιγόνο άγριου τύπου, αλλά και με αυτό του μεταλλαγμένου. Έτσι διατυπώθηκε η άποψη ότι η ανοσοποίηση των χιμπατζήδων με τα αδειοδοτημένα ανασυνδυασμένα εμβόλια κατά της ηπατίτιδας Β προκαλούν παραγωγή anti-hbs αντισωμάτων, τα οποία αντιδρούν συνολικά προσφέροντας προστασία και κατά της λοίμωξης από ιό HBV με μεταλλαγμένο το γονίδιο επιφάνειας 219. Από αυτό φαίνεται να προκύπτει και πάλι ότι οι μεταλλαγές διαφυγής από το εμβόλιο μπορεί να αποτελούν πρόβλημα κυρίως στην προστασία των μικρών παιδιών ή άλλων των οποίων το ανοσιακό σύστημα δεν είναι πλήρως λειτουργικό. 81

82 82

83 Β ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 83

84 84

85 Σκοπός Οι γονότυποι του HBV παρουσιάζουν γεωγραφική διακύμανση με το γονότυπο D να είναι ο πλέον διαδεδομένος στην περιοχή της Μεσογείου. Οι υπότυποι-ορότυποι μέσα σε κάθε γονότυπο δείχνουν επίσης σαφώς ξεχωριστή γεωγραφική κατανομή εκτός από αυτούς του γονότυπου D, οι οποίοι απαντώνται σε όλο τον κόσμο 84. Στην Ελλάδα τα δημοσιευμένα επιδημιολογικά δεδομένα όσον αναφορά τη διασπορά των γονοτύπων του HBV είναι πολύ περιορισμένα 220. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι: α) η ανίχνευση μεταλλαγών στον «α-αντιγονικό καθοριστή» του αντιγόνου επιφανείας του ιού της ηπατίτιδας Β (HBsAg) σε χρόνιους φορείς της νόσου στη Βόρεια Ελλάδα με τη μέθοδο των γενετικών αλληλουχιών, β) η μελέτη της μοριακής επιδημιολογίας του ιού της ηπατίτιδας Β με τον προσδιορισμό των γονότυπων και των υπότυπων του ιού και γ) η φυλογενετική τους ανάλυση. Οι μεταλλαγές στην περιοχή του α-αντιγονικού καθοριστή οδηγούν σε αλλαγή της τρισδιάστατης δομής του με αποτέλεσμα την αδυναμία σύνδεσης των αντισωμάτων έναντι του αντιγόνου κι άρα τη διαφυγή της ανοσίας αλλά και της ανίχνευσης του ιού 82. Μια τέτοιου είδους μελέτη η οποία να αφορά τους Έλληνες φορείς του ιού δεν αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Επιπλέον, η μελέτη θα μπορούσε να συμβάλλει στον προγραμματισμό ειδικών για την Ελλάδα εμβολίων έναντι των μεταλλαγμένων στελεχών του ιού της ηπατίτιδας Β μετά τη γνωστοποίηση των μεταλλαγών του α- αντιγονικού καθοριστή, στους χρόνιους φορείς, οι οποίοι αποτελούν τη μεγαλύτερη πηγή μόλυνσης από τον ιό. 85

86 86

87 Υλικό Η παρούσα διατριβή αποτελεί μια αναδρομική μελέτη των δειγμάτων αίματος 215 χρονίων φορέων ηπατίτιδας Β από την Βόρεια Ελλάδα (θετικοί για HBsAg για πάνω από 6 μήνες), οι οποίοι προσήλθαν για έλεγχο ρουτίνας (ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού του HBV DNA) στο Εργαστήριο Βιοχημείας- Μικροβιολογίας του Γενικού Νοσοκομείου «Παπαγεωργίου» κατά τη χρονική περίοδο από το Δεκέμβριο του 2000 έως τον Ιανουάριο του Ασθενείς που παρουσίαζαν συλλοίμωξη από HCV και HIV εξαιρέθηκαν από τη μελέτη. Έγινε δυνατή η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν για τη συγκεκριμένη περιοχή σε 135 από αυτούς, που αποτέλεσαν και την ομάδα μελέτης. Έγινε δημογραφική καταγραφή κάθε ασθενούς. Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών ήταν 45,5 έτη (9 έως 92 ετών) και επρόκειτο για 93 άνδρες και 42 γυναίκες. Από αυτούς τους 135 ασθενείς, 124 ήταν Έλληνες κάτοικοι της Βορείου Ελλάδας, ενώ οι υπόλοιποι ήταν μετανάστες από την Αλβανία (5 ασθενείς, 4 γυναίκες και ένας άνδρας), την Κίνα (2 άνδρες ασθενείς), την Τουρκία (2 ασθενείς, ένας άνδρας και μία γυναίκα) και τη Γεωργία (2 ασθενείς, ένας άνδρας και μία γυναίκα). Όλοι οι ασθενείς ήταν HBsAg θετικοί και οι περισσότεροι είχαν αυξημένες τιμές τρανσαμινασών με μέση τιμή στην ALT 238 IU/L (SD=576,84) και στην AST 152 IU/L (SD=282,65). Τα βιοχημικά χαρακτηριστικά και η ηλικία των ασθενών φαίνονται στον πίνακα 8 (πίνακας 8). Πίνακας 8. Τιμές τρανσαμινασών (ΑLT, AST) και ηλικίας των ασθενών της μελέτης Ηλικία ALT AST Αριθμός ασθενών 135 Μέσος όρος 45, Τυπική απόκλιση (SD) 17,69 576,84 282,65 Ελάχιστη τιμή Μέγιστη τιμή

88 88

89 Μέθοδοι Στους 135 ασθενείς που πήραν μέρος στη μελέτη προσδιορίστηκαν οι παρακάτω παράμετροι: 1) Προσδιορισμός των επιπέδων των τρανσαμινασών AST και ALT. 2) Ποσοτικός προσδιορισμός των δεικτών: HBsAg, anti-hbc (ολικό), anti-hbc-igm, HBeAg και anti-hbe στον ορό του αίματος των ασθενών. 3) Μέτρηση του ιικού φορτίου του HBV στον ορό των παραπάνω ασθενών. 4) Εκχύλιση και απομόνωση του DNA του ιού 5) Ανίχνευση του ειδικού HBV DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR. 6) Καθαρισμός του προϊόντος της PCR. 7) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του κεκαθαρμένου προϊόντος DNA φωτομετρικά. 8) Ηλεκτροφόρηση του κεκαθαρμένου προϊόντος σε γέλη αγαρόζης. 9) Προσδιορισμός και ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA με τη μέθοδο sequencing και αντιστοίχησή τους σε αμινοξέα από τα κωδικόνια δια μέσου ηλεκτρονικής βάσης δεδομένων. Τα δεδομένα καταχωρήθηκαν στην DDBJ/EMBL/GenBank. 10) Καθορισμός των υποτύπων του HBsAg. 11) Καθορισμός των HBV γονοτύπων και φυλογενετική ανάλυση. 12) Προσδιορισμός των μεταλλαγών. 13) Στατιστική ανάλυση των δεδομένων. Παρακάτω αναφέρονται αναλυτικότερα στοιχεία για τον προσδιορισμό των παραπάνω παραμέτρων. 1) Η μέτρηση των επιπέδων της αλανινοαμινοτρανσφεράσης (ALT) και της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST) έγιναν με αυτόματο βιοχημικό αναλυτή που βασίζεται στη μέτρηση του ρυθμού μείωσης της απορρόφησης στα 340 nm λόγω της 89

90 οξείδωσης του NADH σε NAD. Το εύρος των φυσιολογικών τιμών για ALT και AST ήταν U/L. 2) Τα HBsAg, anti-hbc (ολικό), anti-hbc-igm, HBeAg και anti-hbe προσδιορίστηκαν με αυτοματοποιημένη μικροενζυμική μέθοδο (MΕIA) (AxSYM assay; Abbott Laboratories, Dallas, TX). Η μέθοδος για την ανίχνευση του HBsAg χρησιμοποιεί ειδικά επιλεγμένα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι επιτόπων εκτός και εντός του α-αντιγονικού καθοριστή κατά τη στερεά φάση δέσμευσης και πολυκλωνικά αντισώματα για τη φάση ανίχνευσης, γεγονός που αυξάνει την ευαισθησία της σε τυχόν μεταλλαγές στην περιοχή του α-αντιγονικού καθοριστή 210,221. 3) Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του HBV-DNA στον ορό (μέτρηση του ιικού φορτίου) χρησιμοποιήθηκε το COBAS-ABLICOR HBV MONITOR Test που αποτελεί in vitro ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος με τον COBAS-ABLICOR Αναλυτή (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN). Η μέθοδος η οποία επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό του HBV DNA σε εύρος IU/ml ( αντίγραφα HBV DNA/ ml), βασίζεται σε τέσσερεις κύριες διαδικασίες: α) Προετοιμασία του δείγματος κατά την οποία γίνεται απομόνωση του HBV DNA από ορό ή πλάσμα με κατακρήμνιση πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG), ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση και επαναδιάλυση του ιζήματος HBV DNA με τη προσθήκη αλκαλικού διαλύματος. Σε κάθε δείγμα εισάγεται ένας γνωστός αριθμός μορίων HBV DNA πρότυπου ποσοτικοποίησης με το αντιδραστήριο λύσης. β) Ενίσχυση με Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) του DNA στόχου με τη χρήση ειδικών για τον HBV συμπληρωματικών εκκινητών. Η επιλογή της αλληλουχίας-στόχου εξαρτάται από τον εντοπισμό περιοχών οι οποίες παρουσιάζουν μέγιστο βαθμό ομολογίας μεταξύ των γονοτύπων και επιλέγεται 90

91 μια αλληλουχία 104 νουκλεοτιδίων εντός της προπυρηνικής/πυρηνικής περιοχής με υψηλό βαθμό ομολογίας (υψηλή διατήρηση) του γονιδιώματος του HBV. Η επιλογή αυτή έχει αποδειχθεί ότι παρέχει ισοδύναμη ενίσχυση των γονοτύπων Α έως Ε, μειωμένη στους F και G ενώ δεν υπάρχουν δεδομένα για τον γονότυπο Η. γ) Υβριδισμό των ενισχυμένων προϊόντων σε ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες ειδικών για το στόχο(ους), και τέλος δ) ανίχνευση των δεσμευμένων στον ιχνηθέτη ενισχυμένων προϊόντων με χρωματομετρικό προσδιορισμό. Το COBAS-ABLICOR προσδιορίζει ποσοτικά το DNA του HBV χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχου (πρότυπο ποσοτικοποίησης HBV) η οποία προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. 4) Εκχύλιση και απομόνωση του DNA του ιού Για την εκχύλιση του DNA χρησιμοποιήθηκε εμπορικό σκεύασμα (kit) του οίκου QIAGEN με στήλες (QIADNA blood Mini kit, Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Η διαδικασία είναι η εξής: 1. Σε 200 μl ορού προστίθενται 20 μl Qiagen πρωτεάσης (ή πρωτεϊνάσης Κ- Sigma Laboratories, Germany) και 200 μl διαλύματος λύσης. Ακολουθεί γρήγορη ανάδευση (vortex ) για 15 sec. 2. Eπώαση στους 56 C για 10min. 3. Προσθήκη 200 μl απόλυτης αιθανόλης και κατόπιν μεταφορά του δείγματος σε στήλη QIA spin Column με σωληνάριο συλλογής 2 ml το οποίο φέρει ειδικό φίλτρο κατασκευασμένο να δεσμεύει το DNA. 4. Φυγοκέντρηση για 2 min σε g. 5. Προσθήκη 500 μl διαλύματος έκλπυσης (wash buffer) (AW1 στη στήλη QIA mp spin Column) και νέα φυγοκέντρηση σε g για 2 min. 91

92 6. Απόρριψη του υγρού έκλπυσης στο σωληνάριο των 2 ml μαζί με το σωληνάριο, τοποθέτηση του φίλτρου με το DNA σε νέο καθαρό σωληνάριο και προσθήκη 500 μl διαλύματος έκλπυσης (AW2). 7. Nέα φυγοκέντρηση στις g για 3 min με σκοπό την απομάκρυνση κάθε υπολείμματος του υγρού εναιωρήματος από το φίλτρο. 8. Τοποθέτηση του φίλτρου σε νέο σωληνάριο (Eppendorf safe lock PCR clean 1,5 ml) και προσθήκη 200 μl διαλύματος έκλουσης για την απομόνωση του DNA. 9. Φυγοκέντρηση στις g για 3 min, ώστε τελικά το σωληνάριο να περιέχει 200 μl του απομονωθέντος DNA. Συντήρηση του DNA στους -30 C, για την περαιτέρω χρήση του στις μοριακές τεχνικές. 5) Ανίχνευση του ειδικού HBV-DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction/PCR). H PCR είναι η αλυσιδωτή αντίδραση του ενζύμου DNA πολυμεράση με την οποία επιτυγχάνεται πολλαπλή αντιγραφή in vitro μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας στο DNA, μεγέθους από 50 έως περισσότερο από 2000 βάσεις. Η DNA πολυμεράση βρίσκεται στους ζώντες οργανισμούς και αποτελεί το ένζυμο αντιγραφής του DNA κατά τη διαίρεση του κυττάρου. Η DNA πολυμεράση ενεργοποιείται όταν εκδιπλώνονται οι κλώνοι του DNA και δρα επιμηκύνοντας τον ένα κλώνο προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3 άκρο του, που χρησιμεύει ως αφετηρία (primer), χρησιμοποιώντας τον άλλο κλώνο ως πρότυπο (template). H αλληλουχία των συντιθέμενων νουκλεοτιδίων είναι συμπληρωματική ως προς την αλυσίδα πρότυπο. Στην αντίδραση PCR αξιοποιείται η ιδιότητα αυτή της DNA πολυμεράσης. Επιλέγεται το τμήμα του DNA, που περιέχει την ελεγχόμενη γονιδιακή περιοχή. Η περιοχή αυτή αποτελεί το DNA στόχο, ο οποίος με πολλαπλές αντιγραφές 92

93 μεγεθύνεται. Στην αντίδραση χρησιμοποιούνται ως άλυσοι αφετηρίες ή εκκινητές (primers), δύο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που έχουν δομή συμπληρωματική προς τις πλευρικές αλληλουχίες του DNA στόχου. Όταν αποδιατάσσονται οι δύο κλώνοι του DNA (μετουσίωση του DNA), αρχίζει να συντίθεται συμπληρωματική άλυσος DNA, με κατεύθυνση από το άκρο 5 της αλύσου, προς το άκρο 3, και έχει ως πρότυπο (template) τον ένα κλώνο (3-5 DNA). Για την σύνθεση της αλύσου είναι απαραίτητη η παρουσία των δομικών υλικών, που είναι τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (deoxiribonucleotide triphosphates, dntps) καθώς και η παρουσία ιόντων Mg ++. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε διαδοχικούς επαναλαμβανόμενους θερμικούς κύκλους. Κάθε κύκλος PCR περιλαμβάνει 3 στάδια. Στο πρώτο στάδιο α) γίνεται αποδιάταξη του DNA του δείγματος σε υψηλή θερμοκρασία, το δίκλωνο DNA μετατρέπεται σε μονόκλωνο. Στο δεύτερο στάδιο β) σε χαμηλότερη θερμοκρασία, γίνεται η σύνδεση η υβριδισμός των εκκινητών, στις πλευρικές αλληλουχίες του DNA στόχου, και στους δύο κλώνους. Στο τρίτο στάδιο γ) με τη δράση της DNA πολυμεράσης, προστίθενται βάσεις δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), στο 3 άκρο κάθε αφετηρίας, με αποτέλεσμα την επιμήκυνση της αφετηρίας και το σχηματισμό δύο νέων αλύσων (κλώνων) DNA, που είναι συμπληρωματικοί των δύο κλώνων του πρότυπου DNA. Τελικό αποτέλεσμα κάθε θερμικού κύκλου είναι ο διπλασιασμός του DNA στόχου. Στο τέλος του πρώτου κύκλου της αντίδρασης οι κλώνοι του DNA στόχου είναι τέσσερεις και αποτελούν τα πρότυπα για σύνθεση καινούργιου DNA στο δεύτερο κύκλο. Με αυτή τη διαδικασία των επαναλαμβανόμενων θερμικών κύκλων αυξάνεται εκθετικά ο αριθμός των αντιγράφων του DNA στόχου, αφού οι κλώνοι που σχηματίζονται χρησιμοποιούνται ως πρότυπο στον επόμενο κύκλο. Με την PCR, επιτυγχάνεται ενίσχυση (amplification) 2 ν (ν= ο αριθμός των κύκλων) του DNA στόχου. 93

94 Σε κάθε στάδιο απαιτείται διαφορετική θερμοκρασία. Η αποδιάταξη του DNA επιτυγχάνεται σε υψηλή θερμοκρασία 90-95º C για ελάχιστο χρονικό διάστημα 1-2 min. Η σύνδεση των αφετηριών (annealing) επιτυγχάνεται σε θερμοκρασία 40-60º C για περίπου 30 sec. Αυτή η θερμοκρασία είναι συνήθως 5º C χαμηλότερη από την υπολογιζόμενη Tm (melting temperature) που ορίζεται ως η θερμοκρασία στην οποία έχουν συνδεθεί οι μισές θέσεις των αφετηριών. Στη θερμοκρασία 70-75º C η DNA πολυμεράση καταλύει την ενζυμική αντίδραση για τη σύνθεση του καινούργιου DNA. Οι ταχύτατες κυκλικές εναλλαγές της θερμοκρασίας, που απαιτούνται για την PCR, πραγματοποιούνται σε ειδικά αυτοματοποιημένες συσκευές που κυκλοφορούν στο εμπόριο και ονομάζονται θερμικοί κυκλοποιητές (thermocyclers). Συγκεκριμένα στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές 21 βάσεων από την αλληλουχία του γονιδίου του αντιγόνου επιφανείας S του HBV (HB1: 5 - CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT -3 και HB2: 5 - AAA GCC CTA CGA ACC ACT GAA -3 ) 222 με στόχο τον πολλαπλασιασμό αλληλουχίας 259 ζευγών νουκλεοτιδίων ( nt) τα οποία αντιστοιχούν στην αλληλουχία των αμινοξέων της πεπτιδικής αλύσου του S αντιγόνου επιφανείας. Ο α-αντιγονικός καθοριστής εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων Πιο συγκεκριμένα η αντίδραση PCR έγινε σε συνολικό όγκο μίγματος 100 μl, ο οποίος περιείχε: 10 μl του DNA και 90 μl PCR-HBV-Master Mix με τελικές συγκεντρώσεις (HB1-Εκκινητή και HB2-Εκκινητή 1,0 μμ, PCR ρυθμιστικό διάλυμα ph 8,4 (Cibco-BRL) με Tris-HCL 20 mm και KCL 50 mm, 2,5 mm MgCl2, dntp 200 μμ (για κάθε ένα από τα τέσσερα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια) 4 Units Taq DNA πολυμεράση recombinant (ανασυνδυασμένου DNA, Cibco-BRL). Προκειμένου να επιτευχθεί συνολικός όγκος 200 μl PCR-προϊόντος η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε εις διπλούν για κάθε δείγμα. Προετοιμασία αντιδραστηρίων PCR 94

95 1. Τοποθέτηση των δειγμάτων με το προϊόν DNΑ σε παγωμένες βάσεις στους 4º C, σε σωληνάρια των 0,2 ml με καπάκι. Τοποθέτηση του θετικού και αρνητικού μάρτυρα. 2. Τοποθέτηση των σωληναρίων με τα Primer Mixes τα οποία βρίσκονται στους -20º C τοποθετούνται σε ψυχόμενη πλάκα στους 4º C, προκειμένου να αποψυχθούν. Παραμονή του ενζύμου στους -20º C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για το μείγμα των αντιδραστηρίων (master mix). 3. Το μείγμα των αντιδραστηρίων (master mix) γίνεται σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 1,5 ml, το οποίο διατηρείται στον πάγο καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης. 4. Ήπια ανάμειξη του master mix λόγω ευαισθησίας του ενζύμου. Ο συνολικός όγκος χωρίζεται σε σωληνάρια των 1,5 ml με 1000 μl Primer Mix το καθένα. Σε κάθε 1000 μl Primer Mix προστίθεται 8,8 μl Taq DNA polymerase (5 Units/μl). Για κάθε PCR αντίδραση χρησιμοποιούνται 90 μl Primer Mix με την Taq και 10 μl απομονωθέντος DNA (εικόνα 13). Ενίσχυση προϊόντος PCR Τα PCR σωληνάρια των 0,2 ml, τα οποία περιέχουν το master mix μαζί με το DNA, εισάγονται στον θερμοκυκλοποιητή, ο οποίος έχει προθερμανθεί στη θερμοκρασία των 94º C. Οι συνθήκες της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης παρουσιάζονται στον πίνακα 9. Στη συνέχεια ακολουθεί ηλεκτροφόρηση 5 μl του προϊόντος της PCR σε γέλη αγαρόζης, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη προϊόντος. 95

96 Εικόνα 13. Πρωτόκολλο προετοιμασίας Master Mix για PCR για τον ιό της ηπατίτιδας Β, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας. Πίνακας 9. Πρόγραμμα Θερμοκυκλοποιητή PCR 6) Καθαρισμός του προϊόντος της PCR (purification of PCR product) σύμφωνα με το QIA quick PCR Purification Kit Protocol (QIAGEN). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο γινόταν: 96

97 1. Προσθήκη 200 μl του προϊόντος της PCR σε 1000 μl ρυθμιστικού δεσμευτικού διαλύματος PBI. 2. Καλή ανακίνηση και μεταφορά του μίγματος σε 2 στήλες (από 600 μl) με σωληνάριο συλλογής 2 ml. 3. Φυγοκέντρηση για 2 min στις g. 4. Εκ νέου τοποθέτηση των φίλτρων στα σωληνάρια. 5. Προσθήκη 750 μl διαλύματος εκπλύσεως που περιέχει αιθανόλη (wash buffer, H2: NaCl, CDTA, Tris-HCL ethanol). 6. Φυγοκέντρηση για 2 min στις g και απομάκρυνση του διαλύματος. 7. Νέα φυγοκέντρηση στις g για 2 min, για την πλήρη απομάκρυνση κάθε υπολοίπου του διαλύματος. 8. Τοποθέτηση του φίλτρου σε καινούργιο κωνικό σωληνάριο των 1,5 ml (eppendorf) και προσθήκη 55 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (10 mm Tris-HCl ph 8,5) για την έκλoυση του DNA. 9. Φυγοκέντρηση για 2 min στις g. 1. Απομάκρυνση του φίλτρου, ενώ στο σωληνάριο παρέμενε το καθαρό προϊόν της PCR. 2. Ένωση των 2 σωληναρίων τα οποία αντιστοιχούν σε κάθε δείγμα, σε ένα με συνολικό όγκο 100 μl καθαρού προϊόντος της PCR. 7) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του καθαρού προϊόντος της PCR με φωτομέτρηση: 30 μl του προϊόντος της αντίδρασης PCR προστίθενται σε 1500 μl απεσταγμένου νερού σε σωληνάρια eppendorf (αραίωση 1:50). Ακολουθούσε η φωτομέτρηση σε κυψελίδες χαλαζία (τυφλό απεσταγμένο νερό) του κάθε δείγματος. Το αποτέλεσμα έδινε τη συγκέντρωση του ολικού 97

98 κυτταρικού DNA σε κάθε δείγμα, ενώ ταυτόχρονα έδινε πληροφορίες για την καθαρότητά του. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του DNA προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση σε δύο διαφορετικά μήκη κύματος, 260 nm και 280 nm. Από τη φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 260 nm προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε DNA και με τη φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 280 nm ελέγχεται η πρόσμιξή του με πρωτεΐνες. Οι απορροφήσεις και στα δύο μήκη κύματος πρέπει να είναι μεγαλύτερες από 0,15. Από το λόγο Α 260 /Α 280 ελέγχεται η καθαρότητα του ολικού DNA που απομονώθηκε και η ορθή εφαρμογή του πρωτοκόλλου της απομόνωσης. Το DNA έχει υψηλή καθαρότητα όταν ο λόγος Α 260 /Α 280 βρίσκεται μεταξύ 1,6-2,1. 8) Ηλεκτροφόρηση του κεκαθαρμένου προϊόντος της PCR σε γέλη αγαρόζης. 1. Ανάμιξη 1,5 gr Nu Sieve Αgarose με 50 ml ΤΒΕ-buffer ph 8,5 σε δοχείο Erlmeyer. 2. Βρασμός του παραπάνω μείγματος για 1 min σε θάλαμο μικροκυμάτων και αμέσως μετά προσθήκη στο διάλυμα 5 μl βρωμιούχου αιθιδίου 0,5% (δισκίο των 10 mg σε 2 ml TBE). 3. Τοποθέτηση του παραπάνω διαλύματος σε συσκευή για τη παρασκευή της πηκτής και προσθήκη 60 ml TBE διαλύματος ph 8,5. Τοποθέτηση 10 μl από κάθε δείγμα (3 μl διαλύματος φόρτωσης και 10 μl προϊόντος PCR) σε αντίστοιχη σχισμή της πηκτής. Σε κάθε ηλεκτροφόρηση συμπεριλαμβάνονταν μοριακός μάρτυρας με γνωστή διαβάθμιση μοριακών βαρών. 4. Ηλεκτροφόρηση για 1 ώρα στα 60 Volt (σταθερά) και φωτογράφηση του προϊόντος της ηλεκτροφόρησης σε επιφάνεια UV συσκευής με Camera Polaroid διάφραγμα 16 και εμφάνιση σε 1,5 min. 98

99 9) Προσδιορισμός και ανάλυση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων τμήματος του γονιδίου της επιφανειακής πρωτεΐνης S (Sequencing). Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου της επιφανειακής πρωτεΐνης S έγινε με τη μέθοδο των διδεόξυ-αναλόγων του Sanger (ρυθμιζόμενη διακοπή της αντιγραφής του DNA) σε αναλυτή ABI Prism 3700 DNA, με τη χρήση του πακέτου «ABI Prism Big Dye TM Terminators v3.0» (Applied biosystems, Foster City, CA). Πλέον, χρησιμοποιείται μια παραλλαγή της μεθόδου Sanger, που ονομάζεται «dye-terminator sequencing», και συνίσταται στο γεγονός ότι η αλληλούχιση γίνεται σε μια αντίδραση αντί για τέσσερις, όπου κάθε ένα από τα τέσσερα ddntps σημαίνεται με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική, οπότε και εκπέμπουν σε διαφορετικό μήκος κύματος. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται μια αλυσίδα DNA ως καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας, με καθορισμένη ποσότητα των διδεόξυ αναλόγων των νουκλεοτιδίων από τα οποία λείπει η 3 -ΟΗ. Αποτέλεσμα είναι όταν ενσωματώνονται στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα DNA να δρουν ως σημεία λήξης και να εμποδίζουν την προσθήκη άλλων νουκλεοτιδίων. Για τη διαδικασία απαιτείται ολιγονουκλεοτίδιο, συμπληρωματικό με ένα τμήμα του καλουπιού, που χρησιμεύει ως εκκινητής. Το σύμπλεγμα καλούπι εκκινητής μοιράζεται σε τέσσερα μέρη και στο καθένα προστίθεται DNA πολυμεράση. Ένα μέρος επωάζεται με μείγμα ddgtp και των τεσσάρων τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων, από τα οποία το ένα είναι σημασμένο με φθορίζουσα ομάδα. Καθώς αρχίζει ο πολυμερισμός του εκκινητή οι θέσεις της γουανίνης καταλαμβάνονται από το φυσιολογικό dg αλλά συχνά ενσωματώνεται ddgtp και σταματάει ο πολυμερισμός. Το ίδιο γίνεται και με τα υπόλοιπα τρία νουκλεοτίδια (A,C,T) με αποτέλεσμα τη λήξη του πολυμερισμού στις αντίστοιχες θέσεις. Τελικά λοιπόν έχουμε σημασμένες αλυσίδες, τα μήκη των οποίων θα εξαρτώνται από τη σχετική θέση της βάσης από το άκρο του DNA. Τα μείγματα 99

100 ηλεκτροφορούνται και γίνεται διαχωρισμός των αλυσίδων βάση του μήκους τους. Κατά την ηλεκτροφόρηση οι αλυσίδες ενεργοποιούνται από ανιχνευτή λέιζερ οπότε εκπέμπουν σε διαφορετικό μήκος κύματος. Μέσω κατάλληλου λογισμικού η εικόνα μετατρέπεται σε χρωματογράφημα (εικόνα 14). Για την απευθείας αλληλούχιση χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές: HB1: 5 - CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT -3 και HB2: 5 - AAA GCC CTΑ CGA ACC ACT GAA -3. Εικόνα 14. Χρωματογράφημα απεικόνισης νουκλεοτιδίων Η ελάχιστη απαιτούμενη συγκέντρωση καθαρού προϊόντος PCR για την παραπάνω διαδικασία είναι 20 ng/μl με βάση τις οδηγίες της QIAGEN Sequencing Services. Το πρόγραμμα για την ανάλυση πρωτοδιάταξης παρουσιάζεται στον πίνακα 10. Πίνακας 10. Πρόγραμμα PCR για την ανάγνωση της πρωτοδιάταξης Η τεχνική αυτή επιτρέπει την εμφάνιση όλων των νουκλεοτιδίων της περιοχής που μελετάται και κατ επέκταση την ανίχνευση σημειακών μεταλλαγών. Επίσης 100

101 δίνει τη δυνατότητα να προσδιοριστεί ο γονότυπος του ιού της ηπατίτιδας Β, κατόπιν σύγκρισης της υπό ανάλυση αλληλουχίας με τον πλησιέστερο γονότυπο. Για τη σύγκριση της υπό ανάλυση αλληλουχίας, χρησιμοποιείται ειδικό λογισμικό με μία βάση δεδομένων στην οποία περιέχονται όλοι οι γονότυποι της ηπατίτιδας Β. Με το λογισμικό αυτό συγκρίνεται αυτόματα η ανάλυση αλληλουχίας με τον πλησιέστερο γονότυπο, ο οποίος και είναι καταχωρημένος στις επιλεγμένες βιβλιοθήκες. Κατ αυτό τον τρόπο απλοποιείται η ταυτοποίηση και δίνεται η δυνατότητα σύγκρισης της υπό ανάλυση ακολουθίας με τις ακολουθίες του άγριου τύπου HBV. Η τεχνική αλληλούχισης (sequencing) μπορεί να ανιχνεύσει μικτούς πληθυσμούς σε ποσοστό >20% του συνολικού. Οι μικτοί πληθυσμοί αποτελούνται από μεταλλαγμένα και μη στελέχη του ιού Β, σε επί τοις εκατό αναλογία, στο υπό εξέταση δείγμα. 10) Καθορισμός των υποτύπων του HBsAg. Η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων μεταφράστηκε σε αλληλουχία αμινοξέων σύμφωνα με το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης τμήματος του γονιδίου S. Οι υπότυποι του HBsAg προσδιορίστηκαν με βάση τα αμινοξέα Λυσίνη και Αργινίνη στη θέση 122 για τον d για τον y καθοριστή αντίστοιχα, το αμινοξέα στη θέση 127 Προλίνη για τον w1-2, Θρεονίνη για τον w3 και Λευκίνη, Ισολευκίνη για τον w4 και τα αμινοξέα στη θέση 160 Λυσίνη για τον w και Αργινίνη για τον r σύμφωνα με τους Margnius and Norder 223. O διαχωρισμός του υποτύπου ayw1και ayw2 βασίστηκε στα αμινοξέα των θέσεων 134 και 159, τα οποία είναι Φαινυλαλανίνη και Αλανίνη για τον υπότυπο ayw1 και Τυροσίνη και Γλυκίνη για τον υποτύπο ayw2 38 (πίνακας 11). 11) Καθορισμός των HBV γονοτύπων και φυλογενετική ανάλυση. Οι HBV γονότυποι προσδιορίστηκαν με βάση την ανάλυση των αλληλουχιών των 195 ζευγών βάσεων (bp) της γενωμικής περιοχής του α-αντιγονικού καθοριστή 101

102 Πίνακας 11. Προσδιορισμός του HBsAg υπότυπων από τις θέσεις των αμινοξέων που προκύπτουν από την ανάλυση αλληλουχίας του DNA της S πρωτεΐνης 83 Θέσεις αμινοξέων στο HBsAg Προβλεπόμενος HBsAg υπότυπος Lys Pro Phe Ala Lys Val Pro adw2 Lys Thr Phe Ala Lys Val Pro adw3 Lys Leu Phe Gly Lys Val Gln adw4q- Lys Pro Phe Ala Arg Val Pro adr Lys Pro Phe Val Arg Ala Pro adrq- Arg Pro Phe Ala Lys Val Pro ayw1 Arg Pro Tyr Gly Lys Val Pro ayw2 Arg Thr Phe Gly Lys Val Pro ayw3 Arg Leu/Ile Phe Gly Lys Val Pro ayw4 Arg Pro Phe Ala Arg Val Pro ayr του HBV και τη χρήση του γονοτυπικού εργαλείου (Genotyping tool) που είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην ιστοσελίδα της Εθνικής Βιβλιοθήκης της Ιατρικής του Εθνικού Κέντρου για την Βιοτεχνολογική Πληροφόρηση των ΗΠΑ (National Library of Medicine National Center for Biotechnology Information, NCBI) 224. Ειδικότερα, ο γονότυπος των απομονωθέντων HBV στελεχών προσδιορίσθηκε με βάση τη σύγκριση των αλληλουχιών ενός μέρους της επιφανειακής πρωτεΐνης S με αντίστοιχες αλληλουχίες όλων των HBV στελεχών που έχουν κατατεθεί και είναι διαθέσιμες στην Διαδικτυακή Τράπεζα Δεδομένων GenBANK/EMBL/DDBJ ( με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος BLAST έκδοση 22.8 (διαθέσιμο στην ηλεκτρονική διεύθυνση 61,225. Η φυλογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με βάση την ανά ζεύγος σύγκριση των αλληλουχιών τμήματος της επιφανειακής πρωτεΐνης S των 135 στελεχών που ανιχνεύθηκαν στη παρούσα μελέτη, με τις αντίστοιχες τμηματικές αλληλουχίες στελεχών αναφοράς και κλινικών στελεχών του ίδιου γονοτύπου οι οποίες είναι επίσης διαθέσιμες στη βάση δεδομένων GenBANK/EMBL/DDBJ. Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού ClustalW, το οποίο είναι 102

103 διαθέσιμο από τον διαδικτυακό τόπο του Ευρωπαϊκού Ινστιτούτου Βιοπληροφορικής (European Bioinformatics Institute, EBI) στην ηλεκτρονική διεύθυνση Ο σχεδιασμός των φυλογενετικών δένδρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ClustalX (έκδοση 1.83), χρησιμοποιώντας τα αρχεία ευθυγράμμισης (Alignment files) που αποκτήθηκαν από την ανάλυση με το λογισμικό ClustalW. Επιπλέον υπολογίστηκαν τα διαστήματα εμπιστοσύνης (confidence values) για τις ομάδες του δέντρου (bookstrap values σε κλίμακα από 1 έως 1000). Τα δενδρογράμματα που απεικονίζουν τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των απομονωθέντων στελεχών του HBV στην παρούσα μελέτη και των κλινικών στελεχών και στελεχών αναφοράς που έχουν κατατεθεί στη βάση GenBANK/EMBL/DDBJ, σχεδιάστηκαν σε μορφή PHYLIP με τη χρήση του λογισμικού Tree View (έκδοση 3.0), από τον διαδικτυακό τόπο του Πανεπιστημίου Γλασκόβης ( 12) Προσδιορισμός των μεταλλαγών. Μετά την αποκωδικοποίηση της αλληλουχίας των βάσεων DNA με την αντιστοίχησή τους σε αμινοξέα προσδιορίστηκαν οι μεταλλαγές με βάση τη σύγκριση των αλληλουχιών με αυτές του άγριου τύπου ιού. Έτσι βρέθηκαν απλές ή πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές σε 35 ασθενείς 26%. Έγινε συσχέτιση αυτών με τη συνεμφάνιση διάφορων ορολογικών δεικτών όπως anti-hbs, HBeAg ή anti-hbe, με το ιικό φορτίο στον ορό των παραπάνω ασθενών, όπως και με το είδος του υποτύπου του ιού. 103

104 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων της μελέτης έγινε με τη χρήση του στατιστικού προγράμματος (SPSS- Statistical Program for Social Sciences) έκδοση Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση (Standard Deviation/SD). Η σύγκριση μεταξύ των διαφόρων ομάδων ασθενών διενεργήθηκε με τη χρήση του Student s t-test ή του μη παραμετρικού Mann-Whitney U-test. Τιμή p<0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. 104

105 Αποτελέσματα O συνολικός αριθμός των ασθενών οι οποίοι εισήχθηκαν μέρος στη μελέτη ήταν 215 χρόνιων φορέων ηπατίτιδας Β από την Βόρεια Ελλάδα (θετικοί για HBsAg για πάνω από 6 μήνες). Σε 135 από αυτούς (93 άνδρες και 42 γυναίκες), έγινε δυνατή η απομόνωση του DNA του ιού και η ανάλυση νουκλεοτιδίων τμήματος της επιφανειακής πρωτεΐνης S (στον α-αντιγονικό καθοριστή). Οι περισσότεροι ασθενείς είχαν αυξημένες τιμές τρανσαμινασών με μέσες τιμές για την ALT και AST 238 IU/l (SD=576,84) και 152 IU/l (SD=282,65) αντίστοιχα (πίνακας 8). Όλοι οι ασθενείς ήταν θετικοί για HBsAg και η πλειονότητα αυτών (62,5%, 84/135) ήταν και anti-hbe θετικοί. Το 35,5% των ασθενών (48/135) ήταν HBeAg θετικοί ενώ 2,2% αυτών (3/135) ήταν θετικοί τόσο για HBeAg όσο και για anti-hbe. Οροθετικότητα ως προς το anti-hbc ανιχνεύθηκε στο 97% των ασθενών της μελέτης, ενώ 4/135 ήταν αρνητικοί ως προς το anti-hβc (πίνακας 12). Το 4,4% (6/135) των ασθενών παρουσίασε θετικότητα τόσο για το HBsAg αντιγόνο όσο και για το anti-hbs αντίσωμα. Τα επίπεδα δε του ιικού φορτίου στους παραπάνω ασθενείς κυμάνθηκαν μεταξύ του 1,01x10 5 και του 1,22x10 7 IU/ml (πίνακας 13). Ασθενείς θετικοί τόσο για το HBsAg όσο και για το HBeAg είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ιικού DNA σε σχέση με αυτούς που ήταν HBeAg αρνητικοί (2,29x10 6 έναντι 1,3x10 6 ; p<0,01) (πίνακας 13). Τα επίπεδα του HBsAg δεν παρουσίασαν συσχέτιση με τα επίπεδα του ιικού φορτίου (πίνακας 13). Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης για την ανίχνευση του προϊόντος της PCR όπως και αυτά μετά τον καθαρισμό του DNA φαίνονται στις εικόνες 15 και 16. Στον πίνακα 14 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της φωτομέτρησης και του προσδιορισμού της συγκέντρωσης του DNA σε αντιπροσωπευτικό δείγμα και η συσχέτισή τους με το ιικό φορτίο (πίνακας 14). 105

106 Πίνακας 12. Δημογραφικά στοιχεία, ορολογικό, βιοχημικό προφίλ, ιικό φορτίο και μεταλλαγές ασθενών με anti-hbc αρνητικό. CODE ΗΒV253 HBV347 ΗΒV742 ΗΒV1642 Φύλο M M M M Ηλικία (έτη) Εθνικότητα GR GR GR GR HBsAg HBsAb (-) 29 (-) (-) HBeAg HBeAb (-) (-) (-) (-) AST ALT Ιικό Φορτίο IU/ml ΔΠ * 2,12x10 6 ΔΠ * 7,7x10 6 Γονότυπος/υπότυπος D/ayw2 D D/ayw2 D/ayw2 Μεταλλαγές S136F S136F Q129R * ΔΠ: Δεν προσδιορίστηκε Πίνακας 13. Αποτελέσματα μέτρησης επιπέδων ΗΒsAg (όριο θετικότητας >2 IU/ml), anti-hbs (όριο θετικότητας >10 miu/ml), anti-hbc (όριο θετικότητας <1), HBeAg (όριο θετικότητας >1), anti-hbe (όριο θετικότητας <1), τρανσαμινασών και ιικού φορτίου (IU/ml) στον ορό χρόνιων φορέων της ηπατίτιδας Β. CODE HBsAg HBcAb HBsAb HBeAg HBeAb AST ALT Ιικό Φορτίο IU/ml , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

107 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , Εικόνα 15. Ηλεκτροφόρηση ανίχνευσης του προϊόντος της PCR σε γέλη αγαρόζης (1-10: προϊόν PCR 10 διαφορετικών ασθενών, 11 και 13: αρνητικοί μάρτυρες για HBV DNA, 12 και 14: θετικοί μάρτυρες για HBV DNA και 15:κλίμακα 100 bps) 107

108 Εικόνα 16. Ηλεκτροφόρηση κεκαθαρμένου προϊόντος PCR σε γέλη αγαρόζης (1-10: κεκαθαρμένο προϊόν PCR 10 διαφορετικών ασθενών, 11: αρνητικός μάρτυρας για HBV DNA, 12-13: θετικοί μάρτυρες για HBV DNA και 14:κλίμακα 100 bps) Πίνακας 14. Αντιπροσωπευτικό δείγμα αποτελεσμάτων συγκέντρωσης DNA με βάση την απορρόφηση στα 260 nm και συσχέτισή του με το ιικό φορτίο. CODE Απορρόφηση στα 260 HBV-DNA Ιικό Φορτίο IU/ml nm ng/μl 204 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , Προσδιορισμός των HBV γονοτύπων Τα αποτελέσματα της ανάλυσης της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων όπως αυτή προέκυψε από το Sequencing των 135 δειγμάτων που εξετάσθηκαν, ομαδοποιήθηκαν 108

109 ανάλογα με τους γονότυπους A,B,C και D του HBV. Κανένα από τα δείγματα δεν ανήκε στους γονοτύπους E, F, G ή H. Η συσχέτιση των γονοτύπων που ανιχνεύθηκαν με τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών που συμμετείχαν στη μελέτη φαίνονται στον πίνακα 15. Κατά τη φυλογενετική ανάλυση (εικόνες 17 και 18, βλ. παράρτημα) υπήρξε συμφωνία σε όλες τις περιπτώσεις των αποτελεσμάτων που προέκυψαν με αυτά από τη χρήση του γονοτυπικού εργαλείου (Genotyping tool) που διατίθεται στην Εθνική Βιβλιοθήκη της Ιατρικής του Εθνικού Κέντρου για την Βιοτεχνολογική Πληροφόρηση των ΗΠΑ (National Library of Medicine National Center for Biotechnology Information, NCBI). Για όλες τις γονοτυπικές ομάδες του δέντρου υπολογίστηκαν τα διαστήματα εμπιστοσύνης (confidence values/ bookstrap values σε κλίμακα 1/1000). Προσδιορίστηκε δε ο γονότυπος του ιού για όλους τους ασθενείς. Πίνακας 15. Συσχέτιση των δημογραφικών χαρακτηριστικών των ασθενών της μελέτης και στοιχεία που αφορούν τους γονοτύπους και υποτύπους Αριθμός ασθενών Φύλο (άνδρες/γυναίκες) 135 (93/42) Γονότυπος/Υπότυπος (αριθμός ασθενών) Ηλικία (μέσος όρος σε 45,5 (9-92) έτη/ εύρος) Ελλάδα 124 D/ayw3 (30) D/ayw2 (93) A2/adw2 (1) Αλβανία 5 D/ayw3 (4) D/ayw2 (1) Κίνα 2 C/adr (1), B/ΜΠ (1) Γεωργία 2 D/ayw3 (2) Τουρκία 2 D/ayw3 (1) D/ayw2 (1) Οι αλληλουχίες των ασθενών αναφέρθηκαν στη βάση δεδομένων GenBANK/EMBL/DDBJ με αριθμούς πρόσβασης FJ17843-FJ ΜΠ= Μη προσδιορισμένο Οι γονότυποι λοιπόν που βρέθηκαν για τους 135 ασθενείς ήταν σχεδόν αποκλειστικά ο D κατά 98%, ο γονότυπος Α κατά 0,7% και οι γονότυποι B και C από 109

110 0,7%, οι οποίοι κατ εξαίρεση ανιχνεύθηκαν στους μετανάστες από την Κίνα (πίνακες 15 και 16). Πίνακας 16. Συσχέτιση HBsAg υπότυπων με HBV γονότυπους Γονότυπος HBsAg υπότυπος Α Β C D E F G Σύνολο ayw ayw adw2 1 1 adr 1 1 Κανένας 1 1 υποτύπος Σύνολο Δεν παρατηρήθηκε επίσης ανασυνδυασμός των HBV γονιδίων σε κανέναν από τους διάφορους γονότυπους. Οι αλληλουχίες τμήματος του S γονιδίου από τους 135 ασθενείς που πήραν μέρος στη μελέτη διατίθενται στη βάση δεδομένων GenBANK/EMBL/DDBJ με αριθμούς πρόσβασης FJ17843-FJ (πίνακας 17, βλ. παράρτημα ). Προσδιορισμός των HBsAg υποτύπων και συσχέτισή τους με τους HBV γονότυπους Από την ανάλυση των αλληλουχιών του τμήματος του γονιδίου της S πρωτεΐνης που αφορά τον α-αντιγονικό καθοριστή έγινε δυνατός και ο προσδιορισμός των υποτύπων του HBsAg σε όλες τις περιπτώσεις εκτός από μία (πίνακες 15 και 16). Τα στελέχη του ιού που ανήκαν στο γονότυπο D είχαν αποκλειστικά τους υποτύπους ayw2 (96 από τους 132 ασθενείς και ποσοστό 73%) και ayw3 (36 από τους 132 ασθενείς και ποσοστό 27%). Σχεδόν όλα τα παραπάνω στελέχη ομαδοποιήθηκαν μαζί ως HBsAg υπότυποι στο φυλογενετικό δέντρο (εικόνα 18, βλ. παράρτημα). Το μόνο στέλεχος το οποίο ανήκε στο γονότυπο Α αντιστοιχούσε στον adw2 υπότυπο και απομονώθηκε σε έναν 110

111 Έλληνα χρόνιο φορέα HBV (εικόνα 17, βλ. παράρτημα). Επιπρόσθετα το απομονωθέν στέλεχος το οποίο ανήκε στο γονότυπο C ανιχνεύθηκε σε μετανάστη από την Κίνα και αντιστοιχούσε στον υποτύπο adr. Το δεύτερο απομονωθέν στέλεχος από τον άλλο μετανάστη από την Κίνα ανήκε στο γονότυπο Β αλλά ο υπότυπος του HBsAg δεν ήταν δυνατό να τυποποιηθεί λόγω του ότι η αλληλουχία των αμινοξέων η οποία μπορούσε να διαβαστεί αφορούσε την αλληλουχία μεταξύ των αμινοξέων 121 έως 154. Το πρώτο τμήμα της αλληλουχίας φαινόταν να αντιστοιχεί στον υπότυπο ayw με Thr στη θέση 126, ενώ το δεύτερο τμήμα της στον υπότυπο adw με Thr στη θέση 143. Δεν υπήρχε κανένας μη αναμενόμενος συνδυασμός γονοτύπου και HBsAg υποτύπου. Η συσχέτιση των HBsAg υποτύπων με τους γονοτύπους όπως και με το ορολογικό, το βιοχημικό προφίλ και το ιικό φορτίο των ασθενών που έφεραν τους παραπάνω υπότυπους φαίνεται στους πίνακες 15 και 17 (πίνακας 18, βλ. παράρτημα). Ο ayw2 HBsAg υπότυπος ήταν ο κυρίαρχος τόσο στους HBeAg θετικούς όσο και στους anti-hbe θετικούς ασθενείς με 74% (32 στους 43) και 71% (58 στους 82) αντίστοιχα. Ο υπότυπος ayw3 ήταν ο λιγότερο συχνός με ποσοστό 26% (11 στους 43) στους HBeAg θετικούς ασθενείς και 29% (24 στους 82) στους anti-hbe θετικούς ασθενείς. Ανίχνευση των μεταλλαγών Απλές ή πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές βρέθηκαν στο 26% των ασθενών οι οποίοι συμμετείχαν στη μελέτη όπως φαίνεται στον πίνακα 19 (πίνακας 19, βλ. παράρτημα). Σε 5 απομονωθέντα στελέχη ανιχνεύθηκαν μεταλλαγές στις θέσεις αμινοξέων 129 και 134, σε 4 στελέχη στις θέσεις 133 και 145 συμπεριλαμβανομένης και της γνωστής μεταλλαγής διαφυγής του εμβολίου G145R, και σε 3 στελέχη μεταλλαγές στις θέσεις 128,144, 164 και

112 Οι πιο συχνές μεταλλαγές που ανιχνεύθηκαν ήταν η Μ133Τ, η Y134Ν και η S174N σε 3 απομονωθέντα στελέχη. Στην ομάδα ασθενών με anti-hbe θετικό το ποσοστό μεταλλαγών ήταν σημαντικά υψηλότερο στους ασθενείς με HBsAg υπότυπο ayw3 σε σχέση με αυτούς με υπότυπο ayw2 (42% έναντι 15% αντίστοιχα p<0,01). Τέτοιες διαφορές δεν παρατηρήθηκαν στην ομάδα των ασθενών με HBeAg θετικό των οποίων τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 27% έναντι 22% (p>0,01) (πίνακας 19, παράρτημα). Πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές παρατηρήθηκαν σε μεγαλύτερο ποσοστό στην ομάδα των ασθενών με HBeAg θετικό και σε δύο από τους τέσσερεις ασθενείς της ομάδας με θετικό το HBsAg, το anti-hbs, όπως και το HBeAg. Τα περισσότερα στελέχη με μεταλλαγές ανήκαν στον υπότυπο ayw2, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι οι 5 και 4 σημείων πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές βρέθηκαν στους ασθενείς με θετικό το HBsAg και το anti-hbs (πίνακας 19 βλ. παράρτημα). Η πρώτη περίπτωση αφορά έναν άνδρα λευχαιμικό ασθενή 83 ετών, με HBsAg+ (236 IU), HBcAb+ (0,07), HBsAb + (71), HBeAg+ (444), HBeAb- με τιμές AST και ALT 8 και 6 αντίστοιχα, υπό χημειοθεραπεία. Οι σημειακές μεταλλαγές που εμφάνισε το HBV απομονωθέν στέλεχος με αριθμό HBV 420 GR ήταν οι Υ134Η, P142L, S143L, D144E όπως και η μεταλλαγή στο αμινοξύ 145 που σχετίζεται με διαφυγή από το εμβόλιο δεν ήταν η αναμενόμενη G145R αλλά η G145K (εικόνα 19). Εικόνα 19. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV420GR με την αλληλουχία αναφοράς. 112

113 Η δεύτερη περίπτωση αφορά έναν χρόνιο anti-hbe θετικό φορέα 92 ετών που το απομονωθέν στέλεχος (HBV 804GR) είχε τις σημειακές μεταλλαγές: T123N, I126T, M133L, V177A και τη μεταλλαγή διαφυγή του εμβολίου G145R. Ο ασθενής κατά τον ορολογικό έλεγχο εμφάνισε HBsAg+ (22 IU), HBcAb+ (0,06), HBsAb+ (36), HBeAg-, HBeAb+ (0,09) AST: 77 και ALT: 39 (εικόνα 20). Εικόνα 20. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV804GR με την αλληλουχία αναφοράς. Ανιχνεύθηκε επίσης μεταλλαγή (I126T) σε στέλεχος HBV 690GR από την ομάδα HBsAg+/HBeAg+ το οποίο ανήκε στο γονότυπο C και στον υπότυπο adr. Το στέλεχος προερχόταν από ασθενή 20 ετών μετανάστη από την Κίνα με HBsAg+ (188 IU), HBcAb+ (0,07), HBsAb-, HBeAg+ (292) και HBeAb-. Οι τιμές δε των AST και ALT ήταν 17 και 15 αντίστοιχα. Στον πίνακα 20 και στις εικόνες (βλ. παράρτημα) παρουσιάζονται οι ασθενείς με τα αντίστοιχα απομονωθέντα στελέχη που εμφάνισαν τρεις ή δύο σημειακές μεταλλαγές. 113

114 114

115 Συζήτηση Η χρόνια ηπατίτιδα Β αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα υγείας παρά την ύπαρξη εμβολίων. Σύμφωνα με την Π.Ο.Υ. 400 εκατομμύρια άνθρωποι πάσχουν από χρόνια ηπατίτιδα Β 226 με υψηλό κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου, ενώ 0,5-1,2 εκατομμύρια θάνατοι το χρόνο είναι αποτέλεσμα των οξέων ή χρόνιων συνεπειών της λοίμωξης από τον HBV 148. Στην Ελλάδα η HBV λοίμωξη αποτελεί χαμηλής προς μέτριας ενδημικότητας νόσο, ενώ η HBsAg φορεία κυμαίνεται από 0,29% έως 2,6% 130. Από την παρούσα αναδρομική μελέτη, προέκυψαν σημαντικά στοιχεία σε σχέση με τους γονότυπους, τους υπότυπους και τις μεταλλαγές στην περιοχή του α- αντιγονικού καθοριστή του επιφανειακού αντιγόνου. Στη μελέτη πήραν μέρος αρχικά 215 χρόνιοι φορείς από την Βόρεια Ελλάδα, ενώ έγινε δυνατή η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν για τη συγκεκριμένη περιοχή σε 135 από αυτούς. Όλοι οι ασθενείς ήταν θετικοί ως προς το HBsAg ενώ δεν φάνηκε να υπάρχει συσχέτιση των επιπέδων του HBsAg και του ιικού φορτίου, παρά την πιθανή συσχέτιση που περιγράφεται στη βιβλιογραφία, σε ασθενείς με γονότυπο D και ανάλογα με το στάδιο της φυσικής πορείας της λοίμωξης (πίνακας 13) 227,228. Τέσσερεις ασθενείς ήταν αρνητικοί ως προς το anti-hbc και σε τρεις από αυτούς ανιχνεύθηκαν μεταλλαγές. Ένας από αυτούς τους ασθενείς ήταν θετικός τόσο για το HBsAg όσο και για το anti-hbs. Χαρακτηριστικό είναι ότι όλοι οι ασθενείς αυτής της ομάδας παρουσίαζαν φυσιολογικά επίπεδα τρανσαμινασών και ήταν όλοι θετικοί ως προς το HBeAg 229 (πίνακας 12). Ο HBV εμφανίζει 8 γονότυπους (Α έως Η) που διαφέρουν μεταξύ τους περισσότερο από 7,5 έως 8% μετά από ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων σε όλο το γονιδίωμα του ιού. Οι γονότυποι επίσης παρουσιάζουν σαφή γεωγραφική κατανομή 84, και χωρίζονται σε υπογονότυπους και αυτοί σε υπότυπους τους HBsAg 115

116 με βάση τις διαφορές των επιτόπων στην περιοχή του α-αντιγονικού καθοριστή 83. Ο τρόπος πολλαπλασιασμού του ιού διαμέσου της RNA ανάστροφης μεταγραφάσης, όπως και η πολυπλοκότητα της οργάνωσης του γονιδιώματός του με τα αλληλεπικαλυπτόμενα πλαίσια ανάγνωσης, έχουν ως αποτέλεσμα τη μεγάλη ποικιλομορφία που παρουσιάζει ο HBV και αφορά τόσο τους γονότυπους και υπότυπους του ιού, όσο και τα μεταλλαγμένα στελέχη 210. Στους Έλληνες ασθενείς της μελέτης μας ανιχνεύθηκαν δύο γονότυποι ο Α και ο D, με το γονότυπο D να είναι σχεδόν ο αποκλειστικά κυρίαρχος, και να απαντά στο 98% των περιπτώσεων, έναντι του Α που ανιχνεύθηκε στο 0,7% του πληθυσμού της μελέτης. Το 73% των ασθενών με γονότυπο D (96/132) αντιστοιχούνται στον υπότυπο ayw2 και το 27% (36/132) στον υπότυπο ayw3. Ο γονότυπος D περιλαμβάνει τους υπότυπους ayw2 και ayw3 83. Το ένα απομονωθέν στέλεχος αυτής της μελέτης ανήκε στο γονότυπο Α, αντιστοιχούσε τελικά στον υπογονότυπο Α 2 υποδηλώνοντας προέλευση από την Ευρώπη. Όπως δε αναμενόταν για στελέχη του Ευρωπαϊκού πληθυσμού αυτό ανήκε στον υπότυπο adw2 83. Το υπόλοιπο 1,4% της μελέτης αφορούσε HBV στελέχη από μετανάστες από την Κίνα που είχαν τους γονότυπους B και C. Ο γονότυπος C αντιστοιχούσε στον υπότυπο adr ενώ δεν προσδιορίστηκε ο υπότυπος του γονότυπου Β. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν με τη βιβλιογραφία κατά την οποία στην Κίνα και την Ταϊβάν επικρατούν οι γονότυποι Β 2 και C 2 με υπότυπο adr 83,85. Από μελέτες που έγιναν παλαιότερα στον Ελληνικό πληθυσμό προκύπτει επίσης η επικράτηση του γονότυπου D 220. Παρόλα αυτά η βιβλιογραφία που σχετίζεται με το θέμα στην Ελλάδα είναι φτωχή και αφορά κυρίως επιλεγμένες πληθυσμιακές ομάδες σε συγκεκριμένα γεωγραφικά διαμερίσματα. Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη η οποία στηρίζεται στη μοριακή ανάλυση του γονιδίου S σε μεγάλο αριθμό χρονίων 116

117 φορέων και προσδιόρισε το γονότυπο, τον υπότυπο και την ύπαρξη μεταλλαγών 130,132,134,136. Η ανάλυση της αλληλουχίας των αμινοξέων σε ένα σχετικά μικρό τμήμα του γονιδίου το οποίο κωδικοποιεί το HBsAg με τη μέθοδο της αλληλούχισης, φάνηκε ότι ήταν ικανή, προκειμένου να προσδιοριστούν τόσο οι γονότυποι και των 135 απομονωθέντων στελεχών, όσο και οι υπότυποι πλην ενός (αυτού του γονότυπου Β). Ο γονότυπος D είναι επίσης ο μόνος γονότυπος ο οποίος ανιχνεύθηκε στην Τουρκία και όλα τα στελέχη ανήκουν στον υπότυπο ayw3 230,231. Στη Σερβία σύμφωνα με μελέτη των Lazarevic και συνεργατών μετά από ανάλυση αλληλουχιών τμήματος του S/pol γονιδίου στελεχών από 89 ασθενείς βρέθηκαν να ανήκουν στους γονότυπους Α και D σε ποσοστά 82% και 18% αντίστοιχα, ενώ ο υπογονότυπος D 3 να είναι κυρίαρχος 47,9% μαζί με τον υπότυπο ayw2 53,4% 232. Παρόμοια αποτελέσματα παρουσίασαν μελέτες από χώρες της Μεσογείου με αποκλειστική κυριαρχία του γονότυπου D (ayw2) στην Τυνησία και του γονότυπου D στην Αίγυπτο 233,234. Σε ανάλογη μελέτη στην Ουγγαρία οι γονότυποι D και Α ήταν επίσης αυτοί οι οποίοι ανιχνεύθηκαν 235. Οι γονότυποι D 1, D 2 και D 3 σε ποσοστό 79,36% (100/126) και Α 2 σε ποσοστό 20,64% (26/126) ανιχνεύθηκαν σε μελέτη από την Tatjana Tallo και συνεργάτες στη Ρωσία και στην περιοχή της Βαλτικής 236. Στη Λευκορωσία ανιχνεύθηκαν οι γονότυποι D (86,6%) και Α 2 (11,6%) με τον υπογονότυπο D 2 να κυριαρχεί (58,1%) 237. Στην Ινδία οι γονότυποι Α και D ανιχνεύθηκαν σε ποσοστά 17% και 71% αντίστοιχα σε ασθενείς με ΗΚΚ 238. Σύμφωνα με τους Banerjee A. και συνεργάτες οι γονότυποι D, A και C απαντώνται στην Ινδία σε ποσοστά 74%, 8% και 18,6% αντίστοιχα 239. Ο γονότυπος D παρουσιάζει την πιο ευρεία διασπορά στον κόσμο και κυριαρχεί στην περιοχή της Μεσογείου, στην Εγγύς Ανατολή και στην Ινδία. Τα στελέχη του γονότυπου D φέρουν στο HBsAg τον υπότυπο ayw2, ayw3, ayw4 ή τον adw3 (σε δύο 117

118 ευρωπαϊκά στελέχη με το αμινοξύ Lys στη θέση 122, Thre στη θέση 127 και Lys στη θέση Στην παρούσα μελέτη η φυλογενετική ανάλυση των τμημάτων του S γονιδίου των στελεχών του γονοτύπου D δείχνει το διαχωρισμό τους στους υπογονότυπους D 1, D 4, D 3, D 5, D 2, με D 1 /D 4 και υπότυπο ayw2, D 2, D 3 /D 5 και υπότυπο ayw3. Τα στελέχη από τη Μέση Ανατολή κύρια ανήκουν στον υπογονότυπο D 1. Αυτά από τη Νότιο Αφρική και την Αλάσκα κυρίως στον υπογονότυπο D 3, ενώ αυτά από την Αυστραλία και τη Σομαλία στον υπογονότυπο D Στο φυλογενετικό δέντρο της εικόνας 18 (εικόνα 18, βλ. παράρτημα) και στην ομάδα στελεχών τα οποία ανήκουν στον υπότυπο ayw2 φαίνεται ότι αρκετά στελέχη της μελέτης μας όπως το HBV914GR ή το HBV933GR παρουσιάζουν πολύ μικρή γενετική απόσταση (<1%) από το στέλεχος AY από την Τουρκία με υπογονότυπο D 1 και υπότυπο ayw2. Μελέτες από την Τουρκία επιβεβαιώνουν την επικράτηση του υπογονότυπου D 1 με υπότυπο ayw2 από ασθενείς στη Δυτική Τουρκία, ενώ μελέτη του Ozaslan και συνεργατών με ασθενείς από την Βορειοανατολική Τουρκία δείχνουν επικράτηση του γονότυπου D με υπότυπο ayw3 230,231. Στελέχη της ίδιας ομάδας φάνηκε επίσης να παρουσιάζουν μικρή γενετική απόσταση (~2%) από στέλεχος (ΑΒ048702) από την Αυστραλία με υπογονότυπο D 4 και υπότυπο ayw2. Σε μελέτη επιβεβαιώνεται η επικράτηση των στελεχών με υπότυπο ayw2 και υπογονότυπους D 1 και D Όλα τα στελέχη της ίδιας ομάδας παρουσιάζουν μικρές γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους με πιο μεγάλη ίσως αυτή του στελέχους HBV420GR (~2,5-3% ). Στην ομάδα των στελεχών με υπογονότυπο ayw3 φαίνεται ότι στελέχη της μελέτης όπως HBV1010GR, HBV548GR και HBV829GR να παρουσιάζουν μικρή γενετική απόσταση (<1%) από στελέχη από τη Γαλλία (ΑJ με υπογονότυπο D 3 και υπότυπο ayw3) και από την Ιαπωνία (ΑΒ με υπογονότυπο D 2 και υπότυπο ayw3). Στην Ιαπωνία σύμφωνα με μελέτη των Michitaka και συνεργατών από το 2007 ο γονότυπος D απαντά σε ποσοστό μόνο 0,4% με εξαίρεση μια μικρή 118

119 περιοχή (Εhime) στην οποία το ποσοστό φθάνει το 9% και όπου υπάρχει μικρή γενετική απόσταση από στελέχη του γονότυπου D που απαντούν στη Ρωσία και την Ευρώπη 240. Επίσης τα στελέχη αυτής της ομάδας παρουσιάζουν απόσταση μικρότερη από 2% από στέλεχος από την Ινδία (DR315779) με υπογονότυπο D 5. Μελέτη των Banerjee και συνεργατών δείχνει την επικράτηση των υπογονοτύπων D 3, D 5 και D 2 και υπότυπο ayw Οι περισσότεροι υπότυποι ayw3 σχετίζονται με τους υπογονότυπους D 2 και D 3 όπως και στη μελέτη μας. Στην εικόνα 17 (εικόνα 17, βλ. παράρτημα) φαίνεται ότι το στέλεχος HBV189GR ανήκει στον υπογονότυπο Α 2 όπως και στελέχη από την Εσθονία, Ιαπωνία. Σε μελέτη των Tallο και συνεργατών φαίνεται ότι στην Εσθονία όλοι οι γονότυποι Α ανήκουν στον υπογονότυπο Α Σε μελέτη των Orito και συνεργατών φαίνεται ότι στην Ιαπωνία μόνο το 2% ανήκουν στο γονότυπο Α 106. Τέλος, πρέπει επίσης να επισημανθεί ότι συνεχώς προκύπτουν αποδείξεις για την επίδραση του γονότυπου στην ορομετατροπή του HBeAg (με το γονότυπο Β να παρουσιάζει υψηλότερους ρυθμούς κάθαρσης του HBeAg σε σχέση με το γονότυπο C , και στην απάντηση στη θεραπεία με ιντερφερόνη (όπου ο γονότυπος Α δείχνει μεγαλύτερο ρυθμό κάθαρσης σε σχέση με το γονότυπο D 91,244. Σε άλλη επίσης μελέτη αναφέρεται ότι ο υπότυπος adw είναι περισσότερο πιθανό να αναπτύξει αντίσταση στη λαμιβουδίνη 245. Συσχέτιση επίσης φαίνεται να υπάρχει μεταξύ των γονοτύπων και της απώλειας από μεταλλαγή του HBeAg λόγω δημιουργίας ενός κωδικονίου τερματισμού στο προπυρηνικό γονίδιο (G1896A) με τους γονότυπους B, C και D να έχουν μεγαλύτερη συσχέτιση από ότι ο Α 94,105,242,243, Στην παρούσα μελέτη φαίνεται ότι οι χρόνιοι φορείς με HBeAg(-) εμφανίζονται σε ποσοστό 62,5% (84/135) και ανήκουν στο γονότυπο D (ένας μόνο στο γονότυπο C) ενώ οι δύο ασθενείς με γονότυπο Α 2 και Β ήταν HBeAg θετικοί. 119

120 Η βαρύτητα της ηπατικής νόσου φαίνεται επίσης να σχετίζεται με το γονότυπο του ιού και το γονότυπο C να εμφανίζει μεγαλύτερο ποσοστό κίρρωσης 15,1% ενώ δεν υπάρχει επιβεβαίωση της συσχέτισης του γονότυπου Β με τον ΗΚΚ 92,106,249. Περισσότερες μελέτες είναι απαραίτητες προκειμένου να επιβεβαιωθεί το αν ο καθορισμός του γονότυπου θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται στην κλινική εκτίμηση της HBV λοίμωξη καθώς και αν η θεραπεία θα πρέπει να προσαρμόζεται ανάλογα. Το επιφανειακό αντιγόνο του HBV (HBsAg) αποτελεί τη μεγάλη πρωτεΐνη του περιβλήματος του ιού και περιλαμβάνει τις περιοχές οι οποίες σχετίζονται με την προσκόλληση του ιού στην εξωτερική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή, όπως επίσης και με τους κύριους επιτόπους τους οποίους αναγνωρίζουν τα εξουδετερωτικά αντισώματα. Το γονίδιο του περιβλήματος έχει τρία ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης pres1, pres2 και pres3, και κωδικοποιεί 3 πρωτεΐνες τη μικρή, τη μεσαία και τη μεγάλη. Κοινός και για τις τρεις είναι ο α-αντιγονικός καθοριστής και εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων 124 έως 147 μέσα στη μεγάλη υδροφιλική περιοχή του S γονιδίου (Major Hydrophilic Region/ MHR). Αυτός ο αντιγονικός καθοριστής αποτελεί τον κύριο στόχο των anti-hbs αντισωμάτων κατά την αρχική ανοσιακή απάντηση στην οξεία ηπατίτιδα Β. Από την ανάλυση των αλληλουχιών των 259 ζευγών νουκλεοτιδίων ( ) που κωδικοποιούν τμήματα της πρωτεΐνης S και συγκεκριμένα την αλληλουχία αμινοξέων που περιλαμβάνει τον α- αντιγονικό καθοριστή προέκυψε η ύπαρξη απλών ή πολλαπλών σημειακών μεταλλαγών σε 35 στελέχη 26%. Οι πιο πολλές μεταλλαγές παρατηρήθηκαν στις θέσεις των αμινοξέων 129 και 134 όπως και 133 και 145 συμπεριλαμβανομένης και της μεταλλαγής διαφυγής του εμβολίου G145R. Επίσης μεταλλαγές βρέθηκαν στις θέσεις αμινοξέων 128, 144, 164 και 174 (εικόνα 25). Τα μεταλλαγμένα στελέχη με μονές ή πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές στον α-αντιγονικό καθοριστή μπορεί να εμφανίζονται ως αποτέλεσμα 120

121 πίεσης επιλογής στην S πρωτεΐνη. Και πραγματικά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία οι μεταλλαγές ανοσιακής διαφυγής εμφανίζονται σε ασθενείς που εμβολιάστηκαν ή σε ασθενείς που έκαναν μεταμόσχευση ήπατος και τους χορηγήθηκε μονοκλωνική ή πολυκλωνική ανοσοσφαιρίνη έναντι του επιφανειακού αντιγόνου 107,110,250. O α αντιγονικός καθοριστής του HBsAg G R(2) H(2) T(4) L L H N(3) V E(2) A V(2) R(3) N(2) 177 S Εικόνα 25. Οι θέσεις των αμινοξέων του α-αντιγονικού καθοριστή στις οποίες ανιχνεύθηκαν οι πιο συχνές μεταλλαγές. H V(2) G 164 E H HBIG χορηγείται σε HBV θετικούς ασθενείς οι οποίοι μεταμοσχεύονται με ήπαρ μη μολυσμένο από τον ιό, προκειμένου να προφυλαχθεί το μόσχευμα από τον κυκλοφορούντα ιό στον ορό του λήπτη. Εντούτοις πολλές φορές υπάρχει αποτυχία στην αποτροπή της λοίμωξης και η HBIG φαίνεται να ασκεί μια επιλεκτική πίεση που οδηγεί στην εμφάνιση μεταλλαγμένων HBV στελεχών. Η επαναλοίμωξη σ αυτές τις περιπτώσεις κυμαίνεται στο 17% με 100% σε διάφορες χώρες της Ευρώπης και της Αμερικής 94,155,217,227, Μελέτη σε Γερμανούς ασθενείς, έδειξε παραμονή των μεταλλαγμένων στελεχών από μήνες έως και χρόνια μετά από τη διακοπή της χορήγησης HBIG 155. Η 121

122 εμφάνιση δε των μεταλλαγών σε άλλη μελέτη φαίνεται να σχετίζεται με το χρόνο χορήγησης της HBIG 250. Επιπρόσθετα μεταλλαγές διαφυγής της ανοσίας στον α-αντιγονικό καθοριστή μπορεί να αποτελούν απόρροια της φυσικής πορείας της λοίμωξης με ενεργό ιικό πολλαπλασιασμό και ηπατική νόσο παρά την ορομετατροπή και το σχηματισμό του anti-hbs αντισώματος 36,62, Στη βιβλιογραφία αναφέρονται επίσης μεταλλαγές στο HBsAg προκαλούμενες από αντιική αγωγή όπως αυτό προέκυψε από ανάλυση αλληλουχιών HBV στελεχών από ασθενείς που ήταν κάτω από μακρόχρονη θεραπεία με λαμιβουδίνη 219,256. Αυτό προφανώς συμβαίνει λόγω της πλήρους επικάλυψης του S γονιδίου από το γονίδιο της πολυμεράσης. Με την εφαρμογή αντιικής θεραπείας και πρωτοκόλλων προφύλαξης με χορήγηση HBIG και νουκλεοτιδικών αναλόγων σε ασθενείς οι οποίοι υπόκεινται σε μεταμόσχευση ήπατος, επιλέγονται νέα HBV μεταλλαγμένα στελέχη με αλλαγές στην πολυμεράση οι οποίες αντανακλούν στην επιφανειακή πρωτεΐνη 2,115. Περιγράφεται επίσης και η αντίστροφη επιλογή κατά την οποία μεταλλαγές στο HBsAg μετά από εμβόλιο ή χορήγηση HBIG συνοδεύονται από μεταλλαγές στο γονίδιο της πολυμεράσης 115. Tα στελέχη που φέρουν αυτές τις διπλές μεταλλαγές παρουσιάζουν μεγαλύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού in vitro με παρουσία λαμιβουδίνης σε σχέση με τις καλλιέργειες στελεχών μαρτύρων 257. Στη μελέτη μας υπήρχαν 13 ασθενείς που ήταν σε θεραπεία με λαμιβουδίνη από τους οποίους οι δύο παρουσίασαν μεταλλαγές. HBV λοιμώξεις έχουν ανακοινωθεί σε νεογνά στην Ευρώπη και Β. Αμερική (Η.Π.Α., Μ. Βρετανία, Ιταλία) από HBV θετικές μητέρες παρά τον εμβολιασμό και παρά τη χορήγηση HBIG. Τα απομονωθέντα στελέχη HBV από αυτά τα παιδιά περιείχαν μεταλλαγές στον α-αντιγονικό καθοριστή, κάποιες από τις οποίες ήταν G145R 110,117,

123 Κάποιες από τις πιο κοινές μεταλλαγές που καταγράφονται στη βιβλιογραφία είναι αυτές των G145R, D144A, P142S, Q129H, I/T126N/A και M133L αμινοξέων 115. Στην παρούσα μελέτη οι μεταλλαγές που ανιχνεύθηκαν στις παραπάνω θέσεις αμινοξέων ήταν οι G145R και G145Q, D144V και D144Ε, P142T και P142L, Q129H και Q129Q και Q129,. I126T και M133T. Τα αποτελέσματα δε της μελέτης ήταν συγκρίσιμα με αυτά των Yamamoto και συνεργατών 1994, Kohno και συνεργατών 1996, Lada και συνεργατών 2006, Jose M Echevarria και Avellon ,83,259,260. Η μεταλλαγή Gly145Arg λόγω της αλλαγής της γουανίνης από αδενίνη στο νουκλεοτίδιο 587 είναι αυτή η οποία περιγράφεται ως η κυρίαρχη HBsAg μεταλλαγή στη βιβλιογραφία 100. Στη μελέτη μας αφορούσε 4 στελέχη από τα 35. Σε μελέτη στη Σιγκαπούρη η συγκεκριμένη μεταλλαγή ανιχνεύθηκε μόνη της ή σε συνδυασμό με άλλες στο 75% των απομονωθέντων HBsAg μεταλλαγών σε λοιμώξεις νεογέννητων από μητέρες χρόνιους φορείς 215. O έλεγχος HBV φορέων στην Ταϊλανδή έδειξε ότι η μεταλλαγή Gly/Arg 145 εμφανιζόταν περίπου σε ποσοστό 1/ Καθώς επεκτείνεται παγκόσμια ο έλεγχος και η επιτήρηση για τις HBsAg μεταλλαγές η επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό του ιού και στην πορεία της νόσου θα γίνονται πιο ξεκάθαρες. Μεταλλαγές στον α-αντιγονικό καθοριστή έχουν αναφερθεί στη Γερμανία και στην Ισπανία σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β που δεν έχουν εμβολιαστεί έναντι του HBV ούτε τους είχε χορηγηθεί HBIG 94,155,252,262. Κατά την πορεία της χρόνιας HBV λοίμωξης σε αυτές τις περιπτώσεις ο ιός μπορεί να κυκλοφορεί ως μικτός πληθυσμός διαφορετικών μεταλλαγμένων στελεχών. Το γεγονός ότι το ένα ή το άλλο μεταλλαγμένο στέλεχος κυριαρχεί στον ορό του ασθενούς μπορεί να οφείλεται σε αδιευκρίνιστους μηχανισμούς πίεσης επιλογής όπως η απάντηση του ξενιστή έναντι του άγριου τύπου του ιού, που δίνει ένα πλεονέκτημα στην κυριαρχία του μεταλλαγμένου στελέχους. 123

124 Δεν πρέπει επίσης να προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι μπορεί οι ίδιοι μηχανισμοί πίεσης επιλογής να δρουν κατά του μεταλλαγμένου στελέχους. Για παράδειγμα στη βιβλιογραφία αναφέρονται ασθενείς από τη Γερμανία στους οποίους οι μεταλλαγές στον α-αντιγονικό επίτοπο πριν τη μεταμόσχευση ήπατος εξαφανίστηκαν μετά από αυτή 252. Στην παρούσα μελέτη δεν υπάρχει ιστορικό εμβολιασμού σε κανέναν από τους ασθενείς που παρουσιάζουν μεταλλαγές, ούτε χορήγησης HBIG, εκτός από έναν που υποβλήθηκε σε μεταμόσχευση νεφρού. Πέντε από τους ασθενείς με μεταλλαγές υποβάλλονταν σε θεραπεία για λέμφωμα. Στα υπόλοιπα στελέχη η εμφάνιση μεταλλαγών θα μπορούσε να αποδοθεί σε μηχανισμούς πίεσης επιλογής στα πλαίσια της χρόνιας πορείας της νόσου ή στην απ ευθείας λοίμωξη από μεταλλαγμένο στέλεχος και μετάδοση από άλλον φορέα. Πειράματα κατά τα οποία προκλήθηκαν σημειακές μεταλλαγές ούτως ώστε κάθε αμινοξύ να αντικατασταθεί με όλα τα δυνατά εναλλακτικά υπολείμματα αμινοξέων, έδειξαν ότι τα αμινοξέα των θέσεων 141 έως 145 παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη σύνδεση των anti-hbs αντισωμάτων που παράγονται από τα ανασυνδυασμένα εμβόλια 263. Αν και φαίνεται αρκετά πειστική η άποψη ότι όλες αυτές οι αλλαγές μπορεί να τροποποιούν την αναγνώριση της S πρωτεΐνης του ιού από τα αντισώματα, πολύ λίγα είναι γνωστά για τις συνέπειες αυτών των αλλαγών στην αναγνώριση των επιτόπων από τα Τ κύτταρα. Το γονίδιο επιφανείας του HBV περιλαμβάνει επίσης τους κατ εξοχήν Τ κυτταρικούς επιτόπους με HLA τάξης Ι περιορισμό. Σύμφωνα με τους Bauer και συνεργάτες η συσσώρευση αλλαγώνμεταλλαγών στους επιτόπους των Τ βοηθητικών κυττάρων στα στελέχη των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β μπορεί να τροποποιεί την αποτελεσματικότητα της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης, λόγω απενεργοποίησης των Τ κυτταρικών υποδοχέων, και έτσι να διευκολύνει την παραμονή του ιού μετά τον εμβολιασμό 255,

125 Συμπερασματικά η συγκέντρωση μεταλλαγών μέσα και γύρω από την περιοχή του α- αντιγονικού καθοριστή οδηγεί στη δημιουργία HBV μεταλλαγμένων στελεχών με διαφοροποίηση στην αντιγονικότητά τους και πιθανά στη δομή των Τ κυτταρικών επιτόπων με επακόλουθη συνέπεια την αποτυχία στην εξουδετέρωσή τους. Έτσι σε αντίθεση με αυτό που συνήθως περιγράφεται ως επιδιωκόμενο αποτέλεσμα στην χρόνια ηπατίτιδα Β και είναι η εμφάνιση των anti-hbs αντισωμάτων, αυτό δε σημαίνει απαραίτητα και την απώλεια του HBsAg. Πράγματι η συνύπαρξη του HBsAg και του anti-hbs αντισώματος στους χρόνιους φορείς της ηπατίτιδας Β έχει περιγραφεί στο 10% έως 25% των ασθενών από διάφορους συγγραφείς 259,265. Στην παρούσα μελέτη η σύγχρονη παρουσία του HBsAg και του anti-hbs βρέθηκε στο 4% (6/135) του πληθυσμού της μελέτης. Σε 3 από αυτά τα στελέχη (50%) εμφανίστηκαν πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές στις θέσεις αμινοξέων 123, 133, 136, 142,143, 144, 145, 177 (εικόνα 26). Το ποσοστό μεταλλαγών στην ομάδα ασθενών με μόνο το HBsAg θετικό ήταν 24,8%. Πράγματι η συσσώρευση μεταλλαγών στην MHR στον α-αντιγονικού καθοριστή του κύριου στόχου των anti-hbs μπορεί να οδήγησε σε διαφυγή της αναγνώρισης από το ανοσιακό σύστημα του ξενιστή. Η διασπορά λοιπόν των μεταλλαγών που ανιχνεύθηκαν δεν ήταν ομοιογενής κατά μήκος της S πρωτεΐνης η οποία αναλύθηκε αλλά υπήρξε συσσώρευση στον α-αντιγονικό καθοριστή. Αυτός ο αντιγονικός δακτύλιος περιγράφεται ως ο κύριος στόχος της χυμικής ανοσιακής απάντησης και κάθε αλλαγή της αρχικής αντιγονικής δομής του θα μπορούσε να τον οδηγήσει σε μη αποτελεσματική απάντηση. Συνεπώς στους διπλά θετικά ασθενείς ως προς το HBsAg και το anti-hbs αντίσωμα υπάρχει μικτός πληθυσμός ιικών στελεχών, αυτών του άγριου τύπου του ιού έναντι του οποίου ανιχνεύονται τα αντισώματα χωρίς το HBsAg και των διάφορων μεταλλαγμένων στελεχών των οποίων ανιχνεύουμε το HBsAg και όχι το αντίσωμα. 125

126 Εικόνα 26. Μεταλλαγές που παρουσίασαν τα στελέχη HBsAg+ και HBsAb+ Συνοψίζοντας η επικράτηση των μεταλλαγών του α-αντιγονικού καθοριστή στο γενικό πληθυσμό καθορίζεται από την αλληλεπίδραση τριών παραγόντων: 1. Από το βαθμό ενδημικότητας της νόσου και τους χρόνιους φορείς. Σε περιοχές με υψηλή ενδημικότητα πάνω από 8% (Υποσαχάρια Αφρική, Νοτιοανατολική Ασία, Αλάσκα και χώρες της Νότιας Αμερικής) η επίπτωση των μεταλλαγών είναι υψηλή λόγω της επιλογής των μεταλλαγμένων στελεχών που κυκλοφορούν στο αίμα των χρόνιων φορέων από την ανοσιακή πίεση της χυμικής και κυτταρικής ανοσίας Την κάθετη μετάδοση του HBV: Υπολογίζεται ότι το 23% των φορέων στην Ασία και το 8% των φορέων στην Αφρική είναι αποτέλεσμα περιγεννητικής λοίμωξης 266. Το σπουδαιότερο δε χαρακτηριστικό της HBV λοίμωξης στα νεογέννητα είναι η χρονιότητα της νόσου. Λόγω της ανωριμότητας της ανοσιακής 126

127 απάντησης σε αυτή την ηλικία η λοίμωξη παραμένει δια βίου σε ένα υψηλό ποσοστό και αποτελεί εξαιρετικό έδαφος ανάπτυξης μεταλλαγμένων στελεχών. 3. Την ανοσοπροφύλαξη στην κάθετη μετάδοση της λοίμωξης και στα παγκόσμια προγράμματα εμβολιασμού στις περιοχές με υψηλή ενδημικότητα της νόσου. Λόγω της υψηλής επίπτωσης του κυκλοφορούντος ιού στο γενικό πληθυσμό και της επιλεκτικής ανοσιακής πίεσης, ο ρυθμός εμφάνισης μεταλλαγμένων στελεχών διαφυγής του εμβολίου είναι αυξητικός. Για παράδειγμα στην Ταϊβάν η συχνότητα εμφάνισης μεταλλαγμένων στελεχών διαφυγής της ανοσίας κυρίως με G145R αυξήθηκε στο γενικό πληθυσμό από το 7,8% σε περισσότερο από 25% μέσα σε 10 χρόνια μετά την εφαρμογή του προγράμματος γενικού εμβολισμού 216. Δεν υπάρχουν ανάλογα δεδομένα για την Ελλάδα λόγω μη ύπαρξης μελετών ανίχνευσης μεταλλαγών πριν κα μετά την εφαρμογή του προγράμματος εμβολιασμού. Η επιλογή των μεταλλαγμένων στελεχών διαφυγής της ανοσίας κατά τη διάρκεια της φυσικής πορείας της λοίμωξης και ειδικά στη χρόνια φορεία θα μπορούσε να έχει εξαιρετικά επικίνδυνες συνέπειες όπως: Πρώτον η συνάθροιση όλων των μεταλλαγμένων αμινοξέων μέσα στην MHR μπορεί να οδηγήσει σε μη αναγνώριση του HBsAg από τις διαγνωστικές εξετάσεις που διατίθενται στο εμπόριο. Αυτό το πρόβλημα έχει κατά πολύ αναφερθεί σε πολλές μελέτες και υπάρχουν εμπορικές μεθοδολογίες που αδυνατούν να ανιχνεύουν τις G145R μεταλλαγές ενώ κάποιες άλλες δείχνουν μια δραματικά χαμηλή ευαισθησία στην ανίχνευση άλλων μεταλλαγών 112,210. Οι λόγοι μιας τέτοιας αποτυχίας εξαρτώνται από τον τύπο του αντισώματος (μονοκλωνικού ή πολυκλωνικού) και επιτόπου στόχου που χρησιμοποιούν 210, Στην παρούσα μελέτη τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την καλή επίδοση των εμπορικών μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν αφού ανιχνεύθηκε το HBsAg ακόμα και παρουσία πολλαπλών σημειακών μεταλλαγών. Θα πρέπει όμως στο σημείο αυτό να αναφερθεί ο βασικός 127

128 περιορισμός της μελέτης, η οποία εξέτασε πληθυσμό γνωστών χρόνιων φορέων και όχι γενικό πληθυσμό όπου η πιθανότητα μη ανίχνευσης του HBsAg θα αυξάνονταν. Στην ύπαρξη τέτοιου τύπου μεταλλαγών θα μπορούσε να αποδοθεί η σιωπηρή μορφή ηπατίτιδας με ανίχνευση μόνο του ιικού DNA και κανενός άλλου ορολογικού δείκτη εκτός ίσως μόνο του anti-hbc με ή χωρίς το anti-hbs αντίσωμα. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται τέτοιες περιπτώσεις μεταλλαγμένων στελεχών με μεταλλαγές διαφορετικές από την G145R 108,109, Η επίπτωση αυτή της μορφής σιωπηρής ηπατίτιδας στους Έλληνες αιμοδότες φθάνει το 1/6080 μονάδες αίματος 271. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων μας φαίνεται ότι υπήρχε ασθενής με μοναδικό δείκτη το anti-hbc. Ο ασθενής αυτός μετά από ένα χρόνο εμφάνισε υποτροπή με θετικό HBsAg, HBcAb και HBeAg, 8,9x10 6 IU/ml HBV DNA, ALT: 176 και μεταλλαγή V177L. Οι μεταλλαγές που σχετίζονται με ελάττωση της αντιγονικότητας του α- αντιγονικού καθοριστή και διαγνωστικά προβλήματα είναι οι P120S, T123A, T126I, M133T και η D144A 62,107,210,272. Το στέλεχος της μελέτης μας δεν παρουσίασε καμιά από τις παραπάνω μεταλλαγές. Ωστόσο οι περισσότεροι ασθενείς με μόνο το anti- HBc δεν έχουν ανιχνεύσιμο ούτε το HBV DNA 108,255. Δεύτερον η συγκέντρωση μεταλλαγών στην περιοχή MHR των στελεχών που φέρουν ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β και με σχετικά υψηλά επίπεδα ιικού φορτίου αυξάνει επικίνδυνα την πιθανότητα μετάδοσης αυτών των μεταλλαγμένων στελεχών 214,273. Όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως αυτά τα μεταλλαγμένα στελέχη μπορεί να μην εξουδετερώνονται πλήρως από τα παραγόμενα από τα εμβόλια αντισώματα και άρα να μεταδίδονται στον εμβολιασμένο πληθυσμό. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής παρέχουν στοιχεία για τους διπλά θετικούς φορείς για το HBsAg και για το anti-hbs αντίσωμα. 1) Αποτελούν δυνητικές δεξαμενές μεταλλαγμένων στελεχών διαφυγής της ανοσίας και γι' αυτό χρειάζονται περισσότερες επιδημιολογικές μελέτες οι οποίες θα 128

129 εκτιμήσουν με επιστημονικό τρόπο τη δυνητική απειλή της χρόνιας φορείας σε περιοχές υψηλής ενδημικότητας όπου έχει εφαρμοστεί ο εμβολιασμός σε παιδιά. 2) Ο έλεγχος των ασθενών για την παρουσία αντισωμάτων μετά από εμβολιασμό θα πρέπει να συνοδεύεται και από έλεγχο για την παρουσία των HBsAg και του anti-hbc αντισώματος, επειδή δεν αποκλείεται η ταυτόχρονη παρουσία αυτών των δεικτών. 3) Τα αμινοξέα τα οποία βρίσκονται στις θέσεις 122 και 160 είναι υπεύθυνα για τον καθορισμό των υποτύπων d/y και w/r του HBsAg και αποτελούν θέσεις εξαιρετικά συντηρημένες 87. Εντούτοις μεταλλαγές- υποκαταστάσεις αμινοξέων σε αυτές τις θέσεις θα έχουν ως αποτέλεσμα την αλλαγή του HBsAg υποτύπου 103,254,259. Έτσι είναι δυνατή η ανίχνευση στον ίδιο ασθενή της συνύπαρξης HBsAg στελεχών ενός συγκεκριμένου υποτύπου και anti-hbs αντισωμάτων ειδικά για άλλον υπότυπο τον οποίο παλαιότερα είχε ο ασθενής και οποίος δεν κυκλοφορεί πλέον στον οργανισμό του. Αυτός ο μηχανισμός θα μπορούσε να αποτελεί ένα ακόμη αίτιο εμμένουσας λοίμωξης και να εξηγεί την ύπαρξη στελεχών στην παρούσα διατριβή με HBsAg και anti-hbs αντίσωμα χωρίς την ύπαρξη μεταλλαγών στον α-αντιγονικό καθοριστή (3/6 στελέχη). 129

130 130

131 Συμπεράσματα-Προοπτικές Τα συμπεράσματα που συνάγονται από τη μελέτη μας είναι τα ακόλουθα: Η ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων τμήματος του γονιδίου της πρωτεΐνης επιφανείας S (α-αντιγονικός καθοριστής) έδωσε τη δυνατότητα του προσδιορισμού του γονότυπου και των υποτύπων των 135 στελεχών του HBV από ίσο αριθμό ασθενών χρόνιων φορέων από τη Βόρεια Ελλάδα που συμμετείχαν στη μελέτη. Έτσι 98% των στελεχών ανήκαν στο γονότυπο D, 0,7% στο γονότυπο Α, 0,7% στο γονότυπο Β και 0,7% στο γονότυπο C. Όλα τα στελέχη τα οποία ανήκαν στο γονότυπο D αντιστοιχούσαν στον υπότυπο του HBsAg ayw2 (73%) και ayw3 (27%). Σχεδόν όλα ομαδοποιήθηκαν μαζί στους HBsAg υπότυπους στο φυλογενετικό δέντρο. Το στέλεχος που ανήκε στο γονότυπο Α αντιστοιχήθηκε στον υπότυπο adw2, αυτό του γονότυπου C στον υπότυπο adr ενώ δεν προσδιορίστηκε ο υπότυπος του στελέχους που ανήκε στο γονότυπο Β. Οι υπότυποι που προσδιορίστηκαν ήταν οι αναμενόμενοι σύμφωνα με τη συσχέτιση γονοτύπων-υποτύπων που υπάρχει στη βιβλιογραφία. Η ανάλυση των σημειακών μεταλλαγών στη περιοχή του S γονιδίου η οποία μελετήθηκε, αποκάλυψε υποκαταστάσεις αμινοξέων σε ανοσογονικούς επιτόπους που σχετίζονται με την B και Τ κυτταρική αναγνώριση και μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα την ανοσιακή διαφυγή του εμβολίου ή της διάγνωσης και άρα να λειτουργούν ως δεξαμενές μετάδοσης μεταλλαγμένων στελεχών. Στην παρούσα μελέτη ήταν δυνατή η ανίχνευση του HBsAg σε όλους τους ασθενείς πλην ενός ο οποίος αρχικά εμφάνιζε μόνο anti-hbc και στη συνέχεια το HBsAg και το HBeAg. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη το γεγονός ότι οι ασθενείς ήταν γνωστοί χρόνιοι φορείς του HBsAg και όχι γενικός πληθυσμός όπως συμβαίνει στους αιμοδότες. 131

132 Τα αποτελέσματα τη μελέτης συνεισφέρουν στην έρευνα που αφορά τη διασπορά των γονοτύπων και υποτύπων στην Ελλάδα, όπως και των μεταλλαγών που επηρεάζουν την ανοσογονικότητα του HBsAg, οι οποίες πρέπει να ληφθούν υπόψη στη διάγνωση της φορείας όπως και στο σχεδιασμό των εμβολίων και στον έλεγχο των αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό. Η ανίχνευση των HBsAg μεταλλαγών πρέπει να ενισχυθεί με την εισαγωγή νέων μεθόδων που θα αυξάνουν την ευαισθησία ανιχνεύοντας και πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις του HBsAg. Επιπρόσθετα για τις περισσότερες αναλυτικές μεθόδους οι οποίες διατίθενται στο εμπόριο, η δυνατότητα αναγνώρισης της G145R μεταλλαγής πρέπει να βελτιωθεί. Ανιχνευτικά και δεσμευτικά αντισώματα έναντι της pre-s περιοχής του γονιδίου πρέπει να συμπεριληφθούν στις διαγνωστικές μεθόδους με σκοπό να ελαττώσουν την πιθανότητα διαγνωστικής αποτυχίας που σχετίζεται με τις μεταλλαγές διαφυγής της ανοσίας στον α-αντιγονικό καθοριστή. Εντούτοις ο αντίκτυπος της ποικιλομορφίας του HBsAg χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Ο έλεγχος του anti-hbc είναι απαραίτητος στους αιμοδότες μαζί με του HBsAg μιας και υπάρχει η πιθανότητα χρόνιας φορείας με μόνο δείκτη το anti-hbc ενώ το ιικό φορτίο μερικές φορές είναι τόσο χαμηλό που ο έλεγχος για HBV DNA με τη ΝΑΤ αποβαίνει ψευδώς αρνητικός. Χρειάζονται περισσότερα επιδημιολογικά στοιχεία τα οποία αφορούν τη διασπορά των γονοτύπων και την επίπτωση των HBsAg μεταλλαγμένων στελεχών στα περισσότερα μέρη του κόσμου και στην Ευρώπη ειδικότερα 274. Ένα παγκόσμιο δίκτυο επιτήρησης των μεταλλαγών είναι απαραίτητο με σκοπό την εκτίμηση του κινδύνου HBV λοίμωξης από μεταλλαγμένα στελέχη μετά από εμβολιασμό ή μετά από έκθεση στον ιό ανοσοπροφύλαξη. Στις περιοχές δε όπου υπάρχει μεγάλη αύξηση της επίπτωσης του G145R μεταλλαγμένων στελεχών λόγω της ανοσιακής πίεσης 132

133 επιλογής από τα παγκόσμια προγράμματα εμβολιασμού, θα πρέπει να δοθεί έμφαση στην εισαγωγή του μεταλλαγμένου HBsAg στελέχους στα HBV εμβόλια. Τέλος η τεράστια γενετική ποικιλομορφία του HBV και η αύξηση της γνώσης την οποία αποκτούμε για αυτή, συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της σχέσης της ιστορίας του ιού με αυτή του ανθρώπου πάνω στον πλανήτη. Αυτή δε η γνώση αναδεικνύει σημαντικά προβλήματα σε σχέση με την HBV λοίμωξη τα οποία αποτελούν νέες προκλήσεις για τη δημόσια υγεία, για τη πρόγνωση, διάγνωση και θεραπεία. 133

134 134

135 Περίληψη Τα δεδομένα μοριακής επιδημιολογίας για την ηπατίτιδα Β που αφορούν τον Ελληνικό πληθυσμό είναι περιορισμένα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των γονοτύπων, των υποτύπων του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg και των μεταλλαγών στον α-αντιγονικό καθοριστή του επιφανειακού αντιγόνου σε χρόνιους φορείς της ηπατίτιδας Β. Εξετάσθηκαν οι οροί αίματος 135 φορέων θετικών για το επιφανειακό αντιγόνο. Προσδιορίστηκαν οι ορολογικοί δείκτες (HBsAg, anti- HBs, anti-hbc (ολικό), anti-hbc IgM, HBeAg και anti-hbe) το ιικό φορτίο (HBV- DNA ποσοτικός προσδιορισμός) και οι βιοχημικοί δείκτες (αλανινοαμινοτρασφεράση/ ALT και ασπαρτική αμινοτρασφεράση/ AST) στον ορό των παραπάνω ασθενών. Από την ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων τμήματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη S προσδιορίστηκαν οι γονότυποι των HBV στελεχών των παραπάνω ασθενών όπως και οι HBsAg υπότυποι. Η γονοτυπική ανάλυση έγινε με τη χρήση του γονοτυπικού εργαλείου (Genotyping tool) που είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην ιστοσελίδα της Εθνικής Βιβλιοθήκης του Εθνικού Κέντρου για την Βιοτεχνολογική Πληροφόρηση των Η.Π.Α. (NCBI) και με φυλογενετική ανάλυση. Έγινε ανά ζεύγος σύγκριση των αλληλουχιών με αντίστοιχες αλληλουχίες στελεχών αναφοράς του ίδιου γονοτύπου με τη βοήθεια του λογισμικού ClustalW ενώ ο σχεδιασμός των φυλογενετικών δέντρων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο neighbor-joining. Η ανάλυση των αλληλουχιών χρησιμοποιήθηκε επίσης και για τον προσδιορισμό των HBsAg υποτύπων. Σε έξι ασθενείς (4%) ανιχνεύθηκαν συγχρόνως τόσο το HBsAg όσο και το anti-hbs αντίσωμα, ενώ 47 ασθενείς (35%) ήταν HBeAg θετικοί, 84 (62,5%) ήταν θετικοί για anti-hbe αντίσωμα ενώ σε 3 ασθενείς (2,2%) υπήρχε ταυτόχρονη παρουσία του HBeAg και του anti-hbe. Η μέση τιμή της ALT ήταν 238IU/L με SD=576,84 και τα επίπεδα του ιικού φορτίου κυμάνθηκαν στα 1,01 135

136 x 10 5 έως 1,2 x 10 7 IU/ml. Ο γονότυπος D ήταν ο κυρίαρχος (98%) με τον υπότυπο D/ayw2 να φθάνει το 73% και τον D/ayw3 το 27%. Ο γονότυπος A με υπότυπο adw αφορούσε το 0,7%. Οι γονότυποι B και C βρέθηκαν αποκλειστικά σε μετανάστες από την Κίνα στο 1,4%. Απλές ή πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές βρέθηκαν σε 35 ασθενείς (26%). Μερικές από τις πιο συχνές μεταλλαγές ήταν στις θέσεις αμινοξέων 129, 133, 134, 144 και145, συμπεριλαμβανομένης και της μεταλλαγής διαφυγής του εμβολίου G145R. Από την ανάλυση των μεταλλαγών φάνηκε ότι οι υποκαταστάσεις αμινοξέων στις διάφορες θέσεις του α-αντιγονικού καθοριστή δεν επηρέασαν τη δυνατότητα ανίχνευσης του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg από όλα τα στελέχη πλην ενός. 136

137 Summary Virological data on chronic hepatitis B virus (HBV) infection in Greece are limited. The aim of this study was to investigate the HBV genotypes, surface antigen (HBsAg) subtypes, and HBsAg a determinant mutations among patients infected chronically with HBV. Serum samples from 135 HBsAg positive patients were tested. Serologic (HBsAg, anti-hbs, anti-hbc (total), anti-hbc IgM, HBeAg, and anti-hbe), virologic (HBV-DNA quantitation) and biochemical markers (serum alanine aminotransferase/ ALT and aspartate aminotransferase/ AST) were analyzed. HBV genotypes and HBsAg subtypes were determined by partial sequencing of the S gene. Genotyping was performed by using the National Center for Biotechnology Information online Genotyping tool and phylogenetic analysis. Nucleotide sequences were aligned pair wise with ClustalW and phylogenetic trees were constructed by the neighbor-joining method. Sequences were also used to predict HBV HBsAg subtypes. In six patients (4%), simultaneous presence of HBsAg and anti-hbs was determined, whereas 47 patients (35%) were HBeAg positive, 84 (62.5%) were anti-hbe positive, and three patients (2,2%) were characterized by the simultaneous presence of HBeAg and anti-hbe. Mean ALT was 238 IU/L (standard deviation=576.84), and HBV-DNA levels ranged from 1,01 x 10 5 to 1,2 x 10 7 IU/ml. Genotype D was predominant (98%), with viral groups D/ ayw2 (73%) and D/ayw3 (27%). Group A/adw accounted for 0,7% of cases. Genotypes B and C were found exclusively in the Chinese immigrants (1,4%). Single or multiple point mutations were found in 35 cases (26%). Some of the most common mutations occurred at amino acid positions 129, 133, 134, 144, 145, including the vaccine escape mutation G145R. Mutations analysis revealed that amino acid substitutions did not affect detection by commercial immunoassays, except for one case. 137

138 138

139 Παράρτημα Εικόνων και Πινάκων A3 HBV189GR Thessaloniki 2000 A2 Γονότυπος A A1 Εικόνα 17. Φυλογενετικό δέντρο του HBV απομονωθέντος στελέχους από γονότυπο A. 139

140 Εικόνα 18. Φυλογενετικό δέντρο των HBV απομονωθέντων στελεχών που ανήκουν στο γονότυπο D. 140

141 Πίνακας 17. Αριθμοί καταχώρησης των στελεχών στην Τράπεζα δεδομένων Gen Bank Φύλο Αριθ. Πρόσβασης Ηλικία Αριθμός Στελέχους Εθνικότητα Γονότυπος Υπότυπος Μεταλλαγές 1 M FJ HBV133GR GR D ayw3 2 M FJ HBV166GR GR D ayw2 3 M FJ HBV169GR TU D ayw2 4 M FJ HBV189GR GR A2 adw2 5 F FJ HBV191GR GR D ayw2 6 M FJ HBV202GR GR D ayw3 7 F FJ HBV204GR GR D ayw2 T126S 8 M FJ HBV205GR GR D ayw3 F158L 9 M FJ HBV206GR GR D ayw2 10 M FJ HBV216GR GR D ayw2 11 M FJ HBV253GR GR D ayw2 12 F FJ HBV222GR GR D ayw2 13 M FJ HBV262GR GR D ayw2 Q129H 14 M FJ HBV266GR GR D ayw2 15 M FJ HBV275GR GR D ayw3 M133T 16 M FJ HBV285GR GR D ayw2 17 F FJ HBV290GR GR D ayw2 18 M FJ HBV302GR GR D ayw2 19 M FJ HBV304GR GR D ayw2 20 M FJ HBV306GR GR D ayw2 21 M FJ HBV316GR GR D ayw2 22 M FJ HBV343GR GR D ayw2 23 M FJ HBV389GR GR D ayw2 141

142 24 M FJ HBV400GR GR D ayw3 M133T 25 M FJ HBV412GR GR D ayw2 26 M FJ HBV426GR GR D ayw3 27 M FJ HBV430GR GR D ayw2 28 F FJ HBV481GR GR D ayw2 29 M FJ HBV482GR GR D ayw3 30 F FJ HBV483GR GR D ayw2 Y134N 31 F FJ HBV494GR GR D ayw2 32 M FJ HBV506GR GR D ayw2 33 M FJ HBV532GR GR D ayw2 34 M FJ HBV548GR AL D ayw3 A128v 35 M FJ HBV552GR GR D ayw2 Q129H,G130R 36 F FJ HBV560GR GR D ayw2 37 F FJ HBV561GR GR D ayw2 38 M FJ HBV576GR GR D ayw2 39 F FJ HBV589GR GR D ayw2 40 M FJ HBV595GR GR D ayw2 S174N 41 F FJ HBV596GR GR D ayw2 42 M FJ HBV597GR GR D ayw2 43 M FJ HBV604GR GR D ayw3 44 M FJ HBV606GR GR D ayw2 45 F FJ HBV610GR GR D ayw2 46 M FJ HBV615GR GR D ayw2 47 M FJ HBV633GR GR D ayw2 48 M FJ HBV634GR GR D ayw2 142

143 49 M FJ HBV635GR AL D ayw2 50 M FJ HBV641GR GR D ayw3 D144E 51 M FJ HBV660GR GR D ayw3 52 M FJ HBV667GR GR D ayw2 53 M FJ HBV669GR GR D ayw2 54 F FJ HBV677GR TU D ayw3 55 M FJ HBV736GR GR D ayw3 56 M FJ HBV742GR GR D ayw2 S136F 57 F FJ HBV748GR AL D ayw3 58 M FJ HBV780GR GR D ayw2 59 M FJ HBV785GR GR D ayw2 Y134H 60 M FJ HBV794GR GR D ayw2 61 M FJ HBV796GR GR D ayw3 62 F FJ HBV806GR GR D ayw2 63 M FJ HBV827GR GR D ayw2 64 F FJ HBV829GR AL D ayw3 A128L 65 M FJ HBV855GR GR D ayw2 66 M FJ HBV863GR GR D ayw3 Y134N 67 M FJ HBV865GR GR D ayw3 68 M FJ HBV868GR GR D ayw2 Q129G 69 F FJ HBV872GR GR D ayw2 70 M FJ HBV895GR GR D ayw3 M133T 71 M FJ HBV903GR GR D ayw2 72 M FJ HBV914GR GR D ayw2 73 F FJ HBV917GR AL D ayw3 143

144 74 M FJ HBV925GR GR D ayw3 75 M FJ HBV927GR GR D ayw3 76 F FJ HBV928GR GR D ayw2 E164V 77 M FJ HBV933GR GR D ayw2 78 M FJ HBV934GR GR D ayw3 79 M FJ HBV935GR GR D ayw2 80 M FJ HBV946GR GR D ayw2 81 M FJ HBV950GR GR D ayw2 82 M FJ HBV951GR GR D ayw2 83 F FJ HBV958GR GR D ayw2 84 M FJ HBV973GR GR D ayw2 85 M FJ HBV982GR GR D ayw2 T131I 86 M FJ HBV991GR GR D ayw2 87 M FJ HBV997GR GR D ayw2 88 M FJ HBV998GR GR D ayw2 E164G, S174N, S167L 89 F FJ HBV1000GR GEO D ayw3 90 M FJ HBV1002GR GR D ayw E164V 91 F FJ HBV1010GR GR D ayw3 A128V 92 M FJ HBV1017GR GR D ayw2 93 F FJ HBV1019GR GR D ayw2 94 M FJ HBV1020GR GR D ayw3 95 F FJ HBV1021GR GR D ayw3 96 F FJ HBV1040GR GR D ayw2 97 M FJ HBV1041GR GR D ayw2 144

145 98 M FJ HBV1050GR GR D ayw2 99 M FJ HBV1051GR GR D ayw2 100 F FJ HBV1060GR GR D ayw2 101 M FJ HBV1065GR GR D ayw2 102 F FJ HBV1069GR GR D ayw3 103 M FJ HBV1070GR GR D ayw2 104 F FJ HBV1073GR GR D ayw2 105 M FJ HBV1075GR GR D ayw3 106 M FJ HBV1076GR GR D ayw2 107 M FJ HBV1090GR GEO D ayw3 G145A 108 F FJ HBV1102GR GR D ayw2 109 F FJ HBV1141GR GR D ayw2 S174N 110 F FJ HBV1154GR GR D ayw2 111 F FJ HBV1155GR GR D ayw2 112 F FJ HBV1223GR GR D ayw2 113 F FJ HBV1225GR GR D ayw3 114 M FJ HBV1268GR GR D ayw3 115 F FJ HBV1478GR GR D ayw2 116 F FJ HBV1506GR GR D ayw2 117 F FJ HBV1696GR GR D ayw2 P127L 118 M FJ HBV1737GR GR D ayw2 119 M FJ HBV516GR GR D ayw3 120 M FJ HBV1059GR GR D ayw3 P127A, Q129R 121 M FJ HBV1387GR GR D ayw2 P142T, D144V 122 M FJ HBV1471GR GR D ayw2 145

146 123 F FJ HBV1450GR GR D ayw3 G145R, P151L, K160N 124 F FJ HBV1464GR GR D ayw2 125 M FJ HBV1586GR GR D ayw3 Y134N 126 M FJ HBV1642GR GR D ayw2 Q129R 127 F FJ HBV1774GR GR D ayw2 V177L 128 M FJ HBV347GR GR D ayw S136F 129 M FJ HBV360GR GR D ayw2 130 M FJ HBV420GR GR D ayw2 Y134H,S143L,P 142L,D144E,G1 45K 131 F FJ HBV804GR GR D ayw2 T123N, G145R, M133L, V177A 132 F FJ HBV897GR GR D ayw3 133 M FJ HBV1345GR GR D ayw2 134 M FJ HBV690GR CHINA C adr I126T 135 M FJ HBV685GR CHINA B - 146

147 Πίνακας 18. Συσχέτιση των HBsAg υποτύπων με το ορολογικό, το βιοχημικό προφίλ και το ιικό φορτίο των ασθενών που έφεραν τους παρακάτω υπότυπους *Στην ομάδα HBsAg+/HBeAg+ υπάρχουν τρεις ασθενείς με διαφορετικούς υποτύπους από τους ayw2 και ayw3. Ο πρώτος με adr (**) υπότυπο, ο δεύτερος με adw2 υπότυπο και ο τρίτος χωρίς προσδιορισμένο υπότυπο. # Στην ομάδα HBsAg+/HBcAb-/HBeAg+ υπάρχουν 2 ασθενείς (HBV1642GR, HBV742GR) που ανήκουν και στην ομάδα HBsAg+/HBeAg+, και ένας ασθενής (HBV347GR) που ανήκει και στην ομάδα HBsAg+/HBsAb+. 147

148 Πίνακας 19. Συσχέτιση των ανιχνευθέντων μεταλλαγών με το ορολογικό προφίλ και τους υπότυπους των στελεχών. *Στην ομάδα HBsAg+/HBeAg+ υπάρχουν τρεις ασθενείς με διαφορετικούς υποτύπους από τους ayw2 και ayw3. Ο πρώτος με adr (**) υπότυπο, ο δεύτερος με adw2 υπότυπο και ο τρίτος χωρίς προσδιορισμένο υπότυπο. #Στην ομάδα HBsAg+/HBcAb-/HBeAg+ υπάρχουν 2 ασθενείς (HBV1642GR, HBV742GR) που ανήκουν και στην ομάδα HBsAg+/HBeAg+, και ένας ασθενής (HBV347GR) που ανήκει και στην ομάδα HBsAg+/HBsAb+. 148

149 Πίνακας 20. Σύγκριση στελεχών με πολλαπλές μεταλλαγές με τα δημογραφικά στοιχεία, το ορολογικό, το βιοχημικό προφίλ και το ιικό φορτίο των ασθενών που φέρουν τις παραπάνω μεταλλαγές HBV998GR HBV1059GR HBV1387GR HBV552GR Φύλο Άνδρας Άνδρας Άνδρας Άνδρας Καταγωγή Έλληνας Έλληνας Έλληνας Έλληνας Ηλικία Γονότυπος D D D D Υπότυπος ayw2 ayw3 ayw2 ayw2 HBsAg HBsAb (-) (-) (-) (-) HBcAb +0,04 +0,05 +0,06 +0,05 HBeAg (-) (-) HBeAb +0,08 (-) (-) +0,09 HBV-DNA 3,76 x ,75 x ,943 x ,66 x 10 6 (IU/ml) ALT/ AST 57 / / / / 50 μεταλλαγές E164G, S174N, S167L P127A, Q129R P142T, D144V Q129H, G130R Εικόνα 21. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV998GR με την αλληλουχία αναφοράς. 149

150 Εικόνα 22. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV1059GR με την αλληλουχία αναφοράς. Εικόνα 23. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV1387GR με την αλληλουχία αναφοράς. Εικόνα 24. Σύγκριση των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων και των αμινοξέων του μεταλλαγμένου στελέχους HBV552GR με την αλληλουχία αναφοράς. 150

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Καθώς η επιστημονική γνώση και κατανόηση αναπτύσσονται, ο μελλοντικός σχεδιασμός βιοτεχνολογικών προϊόντων περιορίζεται μόνο από τη φαντασία μας Βιοτεχνολογία

Διαβάστε περισσότερα

ΗΠΑΤΙΤΙ Α C. Ερωτήσεις-Απαντήσεις (μπορεί να υπάρχουν περισσότερες από μια σωστές απαντήσεις, οι σωστές απαντήσεις είναι με bold)

ΗΠΑΤΙΤΙ Α C. Ερωτήσεις-Απαντήσεις (μπορεί να υπάρχουν περισσότερες από μια σωστές απαντήσεις, οι σωστές απαντήσεις είναι με bold) ΗΠΑΤΙΤΙ Α C Ερωτήσεις-Απαντήσεις (μπορεί να υπάρχουν περισσότερες από μια σωστές απαντήσεις, οι σωστές απαντήσεις είναι με bold) 1) Τι είναι λάθος σχετικά με την επιδημιολογία της HCV λοίμωξης: Α. Η μέση

Διαβάστε περισσότερα

Ιοί & HPV. Ευστάθιος Α. Ράλλης. Επικ. Καθηγητής Δερματολογίας - Αφροδισιολογίας

Ιοί & HPV. Ευστάθιος Α. Ράλλης. Επικ. Καθηγητής Δερματολογίας - Αφροδισιολογίας Ιοί & HPV Ευστάθιος Α. Ράλλης Επικ. Καθηγητής Δερματολογίας - Αφροδισιολογίας Περί ΙΩΝ Ορισμός Οι ιοί είναι ατελείς, λοιμώδεις οργανισμοί μικρότεροι σε μέγεθος από τα μικρόβια και ορατοί μόνο με το ηλεκτρονικό

Διαβάστε περισσότερα

Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ»

Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ» DNA RNA: ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ DNA RNA: Βασικά Χαρακτηριστικά Ρόλος Κεντικό Δόγμα της Βιολογίας:

Διαβάστε περισσότερα

ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ (AIDS)

ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ (AIDS) ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ (AIDS) Στα τέλη της δεκαετίας του 1970 εμφανίστηκε μία από τις σοβαρότερες ασθένειες ανεπάρκειας του ανοσοβιολογικού συστήματος Ανοσοβιολογική ανεπάρκεια

Διαβάστε περισσότερα

- Ποιά εικόνα παρουσιάζει η νόσος;

- Ποιά εικόνα παρουσιάζει η νόσος; Ηπατίτιδα είναι μία νόσος που χαρακτηρίζεται από βλάβη ενός ζωτικού οργάνου που είναι το ήπαρ, η σοβαρότητα της οποίας εξαρτάται από την αιτία που την προκαλεί, από την γενική κατάσταση του ατόμου και

Διαβάστε περισσότερα

IOΓΕΝΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΣ Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής ΑΠΘ

IOΓΕΝΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΣ Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής ΑΠΘ IOΓΕΝΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΣ Βαλεντίνη Τζιούφα-Ασημακοπούλου Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής ΑΠΘ Μάρτιος 2015 Οξεία ιογενής ηπατίτιδα Αίτια Ιός της ηπατίτιδας Α (Hepatitis A Virus-HAV) Iός

Διαβάστε περισσότερα

Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών

Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών Η οικογενειακή ομοιότητα, οφείλεται στα κοινά γονίδια. Τα γονίδια πρέπει να εκφραστούν για να έχουν αποτέλεσμα, και η έκφραση αυτή ρυθμίζεται από πρωτεΐνες.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 1. Με ποιο μηχανισμό αντιγράφεται το DNA σύμφωνα με τους Watson και Crick; 2. Ένα κύτταρο που περιέχει ένα μόνο χρωμόσωμα τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει ραδιενεργό

Διαβάστε περισσότερα

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους;

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους; Βιολογία Γ Ενιαίου Λυκείου / Θετική Κατεύθυνση κεφαλαιο 2ο: αντιγραφη, εκφραση και ρυθμιση τησ ΓενετικηΣ ΠληροφοριαΣ 1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; Ευκαρυωτικά κύτταρα: στον πυρήνα,

Διαβάστε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα Εργασία στη Βιολογία ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Η ροή της πληροφορίας για το σχηματισμό των πρωτεϊνών, προϋποθέτει τη μεταφορά της από το DNA στο RNA (ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ).

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΑΚΑΒΑΣ 1 ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Μ.Δ.Ε

ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΑΚΑΒΑΣ 1 ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Μ.Δ.Ε ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ον. ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ ΤΙ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΞΕΡΩ. 1. Τη δομή της δίκλωνης έλικας πάρα πολύ καλά. 2. Τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων και την επίπτωσή

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες του DNA αποτελούνται από νουκλεοτίδια τα οποία ενώνονται με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Πιο συγκεκριμένα

Διαβάστε περισσότερα

Οργάνωση των NA σε ιούς. 09/04/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς

Οργάνωση των NA σε ιούς. 09/04/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς Οργάνωση των NA σε ιούς 09/04/2014 1 Η οργάνωση των ιών γίνεται µε βάση το εύρος των ξενιστών που µπορούν να µολύνουν και συµπεριφέρονται σαν παράσιτα: Μόνο βακτήρια: βακτηριοφάγος ή φάγος (phage) Ζωϊκά

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΩΝ 2017 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Ι Α, ΙΙ Ε, ΙΙΙ ΣΤ, ΙV Β, V Ζ, VII Γ, VII Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

Πρόταση: καινούργιος ευρωπαϊκός ορισμός κρούσματος για ηπατίτιδα Β

Πρόταση: καινούργιος ευρωπαϊκός ορισμός κρούσματος για ηπατίτιδα Β ΚΕΝΤΡΟ ΕΛΕΓΧΟΥ & ΠΡΟΛΗΨΗΣ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ (ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ.) ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΥΓΕΙΑΣ & ΚΟΙΝΩΝΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΕΓΓΥΗΣ Αλλαγή του ορισμού κρούσματος της Ηπατίτιδας Β και C Δήλωση των περιστατικών χρόνιας ηπατίτιδας Το ECDC προτείνει

Διαβάστε περισσότερα

Ενημερώσου... γιατί. η ΗΠΑΤIΤΙΔΑ μπορεί να μη σου δώσει ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΗΠΑΤΟΣ. Αθήνα, Μάϊος 2008

Ενημερώσου... γιατί. η ΗΠΑΤIΤΙΔΑ μπορεί να μη σου δώσει ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΗΠΑΤΟΣ. Αθήνα, Μάϊος 2008 Ενημερώσου... γιατί η ΗΠΑΤIΤΙΔΑ μπορεί να μη σου δώσει μιαbευκαιρiα Αθήνα, Μάϊος 2008 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΗΠΑΤΟΣ Ηπατίτιδα Β & Επιδημιολογία ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΗΠΑΤΟΣ ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά;

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΘΡΩΠΟΛΟΓΙΑ 12 26/10/2016 Κεφάλαιο 3 Α μέρος Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; Ποια είναι η δομή

Διαβάστε περισσότερα

ΠΤΩΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΤΙ- HCV(+) ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΤΑΓΓΙΖΟΜΕΝΟΥΣ β-θαλασσαιμικουσ ΤΗΝ ΕΙΚΟΣΑΕΤΙΑ

ΠΤΩΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΤΙ- HCV(+) ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΤΑΓΓΙΖΟΜΕΝΟΥΣ β-θαλασσαιμικουσ ΤΗΝ ΕΙΚΟΣΑΕΤΙΑ ΠΤΩΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΑΝΤΙ- HCV(+) ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΤΑΓΓΙΖΟΜΕΝΟΥΣ β-θαλασσαιμικουσ ΤΗΝ ΕΙΚΟΣΑΕΤΙΑ 1998-2017 Γατοπούλου Αικατερίνη 1,2, Γιορμέζης Νικόλαος 1, Μιχαήλ Παρασκευή 1, Παρατήρας Σωτήριος 1, Διαμαντή Βασιλική

Διαβάστε περισσότερα

ΔΕΛΤΙΟ ΤΥΠΟΥ Η ΝΕΑ ΓΡΙΠΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ

ΔΕΛΤΙΟ ΤΥΠΟΥ Η ΝΕΑ ΓΡΙΠΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΟ ΕΠΙΜΕΛΗΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΚΕΝΤΡΙΚΗΣ ΕΛΛΑΔΑΣ ΚΑΨΟΥΡΗ 4 412 22 ΛΑΡΙΣΑ ΤΗΛ. 2410 627142 FAX 2410 627143 E-MAIL:GEOTEE_L@OTENET.GR Λάρισα 30-04-2009 ΔΕΛΤΙΟ ΤΥΠΟΥ Η ΝΕΑ ΓΡΙΠΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ Παγκόσμια ανησυχία

Διαβάστε περισσότερα

Ποικιλίες RhD - Σύγχρονη προσέγγιση κατά τις μεταγγίσεις. M. Ξημέρη, ειδικ. Αιματολογίας

Ποικιλίες RhD - Σύγχρονη προσέγγιση κατά τις μεταγγίσεις. M. Ξημέρη, ειδικ. Αιματολογίας Ποικιλίες RhD - Σύγχρονη προσέγγιση κατά τις μεταγγίσεις M. Ξημέρη, ειδικ. Αιματολογίας Εισαγωγή Σύστημα RhD : - αναγνωρίστηκε το 1939 - το πιο σημαντικό κλινικά σύστημα μετά το ΑΒΟ - προκαλεί αιμολυτικές

Διαβάστε περισσότερα

ΤΟ DNA ΚΑΙ RNA. Θανος Εξαρχου Γ1

ΤΟ DNA ΚΑΙ RNA. Θανος Εξαρχου Γ1 ΤΟ DNA ΚΑΙ RNA Θανος Εξαρχου Γ1 ΤΟ DNA Το δε(σ)οξυριβο(ζο)νουκλεϊ(νι)κό οξu είναι νουκλεϊκό οξύ που περιέχει τις γενετικές πληροφορίες που καθορίζουν τη βιολογική ανάπτυξη όλων των κυτταρικών μορφών ζωής

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ ΣΥΣΤΗΜΑ) ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ Απαντήσεις του κριτηρίου αξιολόγησης στη βιολογία γενικής παιδείας 1 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΘΕΜΑ 1 ο Να γράψετε τον αριθμό καθεμίας από τις ημιτελείς προτάσεις 1 έως και 5, και δίπλα σε αυτόν το γράμμα που αντιστοιχεί

Διαβάστε περισσότερα

Γενική Μικροβιολογία. Ενότητα 12 η ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΙΟΛΟΓΙΑ

Γενική Μικροβιολογία. Ενότητα 12 η ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΙΟΛΟΓΙΑ Γενική Μικροβιολογία Ενότητα 12 η ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΙΟΛΟΓΙΑ Όνομα καθηγητή: Δ. ΓΕΩΡΓΑΚΟΠΟΥΛΟΣ Όνομα καθηγητή: Γ. ΖΕΡΒΑΚΗΣ Όνομα καθηγητή: ΑΝ. ΤΑΜΠΑΚΑΚΗ Τμήμα: ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΣΤΟΧΟΙ ΤΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β

Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β ΤΙ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΝΑ ΓΝΩΡΙΖΕΤΕ Είστε σίγουροι πως έχετε πάρει τα κατάλληλα μέτρα για να προσατευτείτε από την ηπατίτιδα Β; ΕΝΗΜΕΡΩΘΕΙΤΕ! ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΕΙΤΕ! ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΕΙΤΕ! ΕΜΒΟΛΙΟ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ

Διαβάστε περισσότερα

Επιδίωρθωση Βλαβών στο DNA Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Εργαστήριο Βιολογίας

Επιδίωρθωση Βλαβών στο DNA Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Εργαστήριο Βιολογίας Επιδίωρθωση Βλαβών στο DNA 18.02.2019 Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια, Εργαστήριο Βιολογίας Πηγές Βλαβών στο DNA 1. Ενδογενείς βλάβες: Προκαλούνται κατά τη διάρκεια κυτταρικών διαδικασιών όπως η αντιγραφή

Διαβάστε περισσότερα

Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα Β. Συχνές Ερωτήσεις

Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα Β. Συχνές Ερωτήσεις Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα Β Συχνές Ερωτήσεις Tι είναι ηπατίτιδα; Το ήπαρ (συκώτι) είναι ένα ζωτικό όργανο που βρίσκεται στο δεξιό άνω τμήμα της κοιλιακής χώρας. Έχει πολλές λειτουργίες και διαδραματίζει

Διαβάστε περισσότερα

Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Γίνεται σύνθεση DNA. Γίνεται σύνθεση RNA. Εξασφαλίζεται η διαιώνιση της γενετικής

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2.

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2. ΘΕΜΑ Α Α1. γ (το πριμόσωμα) Α2. γ (οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες κάθε γονιδίου) Α3. α (μεταφέρει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ στο ριβόσωμα) Α4. β (αποδιάταξη των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων)

Διαβάστε περισσότερα

Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των. μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία

Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των. μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία της Δημόσιας Υγείας Α. Βανταράκης Εργαστήριο Υγιεινής, Ιατρική Σχολή,

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΙΚΟΝΑ 2.4 ΣΤΑΔΙΑ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ σ ε λ ί δ α 1 ΕΙΚΟΝΑ 4.2β ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Να συμπληρώσετε τα κενά πλαίσια της εικόνας με την κατάλληλη λέξη ή φράση 2. Να γράψετε τον προσανατολισμό της μετακίνησης του ριβοσώματος

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. Ν. ΝΤΑΛΕΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων A. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ Αιμοσφαιρίνες Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 S HbS s α 2 β 2 Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ Αλλαγή σε αζωτούχες

Διαβάστε περισσότερα

Β1. Β2. ΘΕΜΑ 2ο 1. 2.

Β1. Β2. ΘΕΜΑ 2ο 1. 2. 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 20 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2002 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: BΙΟΛΟΓΙΑ (ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ) ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο Α1.

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ 1 ο Α. Ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής 1. δ 2. β 3. γ 4. γ 5. β Β. Ερωτήσεις σωστού λάθους 1. Λάθος 2. Σωστό 3. Λάθος 4. Λάθος 5. Σωστό ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014 ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ : - ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014 ΘΕΜΑ A Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ B Β1. 4 2 1 6 3 5 Β2. α. DNA πολυμεράση β. Πριμόσωμα γ. DNA δεσμάση δ. DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ. Αλεξόπουλος Κώστας Χημικός M.Sc, PhD

ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ. Αλεξόπουλος Κώστας Χημικός M.Sc, PhD ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Αλεξόπουλος Κώστας Χημικός M.Sc, PhD Μοριακός Έλεγχος (Nucleic Acid Testing = NAT) Μοριακός Έλεγχος είναι η μέθοδος που ακολουθείται στα Κέντρα Αίματος για

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ_ Β ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ_ Β ΛΥΚΕΙΟΥ Θα πρέπει να γνωρίζετε: Τη χημική σύσταση και τη δομή των νουκλεοτιδίων Πώς σχηματίζεται μια πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα Πώς σταθεροποιείται η διπλή έλικα του DNA Τι υποδηλώνει ο όρος συμπληρωματικές αλυσίδες

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α 1. α 2. δ 3. γ 4. δ 5. γ. ΘΕΜΑ Β 1. Τα αντισώματα αποτελούν το πιο αποτελεσματικό φυσικό φάρμακο για την αντιμετώπιση

Διαβάστε περισσότερα

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στην κόλλα σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία συμπληρώνει σωστά την ημιτελή πρόταση.

Διαβάστε περισσότερα

Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης. Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ

Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης. Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ Διάγνωση της HIV λοίμωξης Από το 1985 και μέχρι σήμερα η διαγνωστική διαδικασία

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ)

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ) ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ) ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθμό κάθε μιας από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1-5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε την ορθή πρόταση: ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1. Το κωδικόνιο του mrna που κωδικοποιεί το αµινοξύ µεθειονίνη είναι α. 5 GUA

Διαβάστε περισσότερα

Ι. Βλαχογιαννάκος, Γ. Β. Παπαθεοδωρίδης, Γ.Ν. Νταλέκος, Α. Αλεξοπούλου, Χ. Τριάντος, Ε. Χολόγκιτας, Ι. Κοσκίνας

Ι. Βλαχογιαννάκος, Γ. Β. Παπαθεοδωρίδης, Γ.Ν. Νταλέκος, Α. Αλεξοπούλου, Χ. Τριάντος, Ε. Χολόγκιτας, Ι. Κοσκίνας ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΤΗΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΗΠΑΤΟΣ (ΕΕΜΗ) ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β ΚΑΤΑ ΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ Ι. Βλαχογιαννάκος,

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 5 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ:

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

Β. Σελ 60 σχολικού: «Η αποµόνωση του συνολικού έως και σελ 61 από µία cdna βιβλιοθήκη.». Γ. ι ι α α α ι α α ι α α α! " # $ % & ' ( ) ( ) ( * % + α ι α

Β. Σελ 60 σχολικού: «Η αποµόνωση του συνολικού έως και σελ 61 από µία cdna βιβλιοθήκη.». Γ. ι ι α α α ι α α ι α α α!  # $ % & ' ( ) ( ) ( * % + α ι α ! THΛ: 270727 222594 THΛ: 919113 949422 Απαντήσεις: " # $ % & ' 1=γ, 2=β, 3=γ, 4=β, 5=δ. " # $ % ( ' εδοµένα από την ανάλυση του ποσοστού των βάσεων σε µόρια DNA από διαφορετικούς οργανισµούς έδειχναν

Διαβάστε περισσότερα

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής Κεφάλαιο 6: ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ -ΘΕΩΡΙΑ- Μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές που συμβαίνουν στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού, τόσο σε γονιδιακό επίπεδο (γονιδιακές μεταλλάξεις) όσο και σε χρωμοσωμικό επίπεδο (χρωμοσωμικές

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΤΑΞΗ

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΤΑΞΗ ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Σ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 2 ΙΟΥΝΙΟΥ 2006 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙ ΩΝ: ΠΕΝΤΕ (5) ΘΕΜΑ 1ο Α. Για τις ημιτελείς προτάσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. γ 3. α 4. γ 5. δ ΘΕΜΑ 2ο 1. Σχολικό

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16-06-2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α. φωσφορική ομάδα (Ι) E. υδροξύλιο (II) Β. mrna

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ & ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β )

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ & ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ & ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 18 / 05 / 2011 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΧΕΙΡΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. α Α4. δ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Σελ. 123 124 σχολ. βιβλίου: «Η διαδικασία που ακολουθείται παράγουν το ένζυμο ADA». Β2. Σελ. 133 σχολ.

Διαβάστε περισσότερα

ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ H ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ IΩΝ ΙΟΙ ΓΕΝΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Είναι ΔΟΜΕΣ στο όριο μεταξύ ζωντανού και μη ζωντανού. Χρησιμοποιούμε τον όρο ενεργοί-μη ενεργοί παρά ζωντανοί-νεκροί Δεν έχουν κυτταρική

Διαβάστε περισσότερα

Αθήνα, 18/5/2011 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ

Αθήνα, 18/5/2011 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Αθήνα, 18/5/2011 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Ημερησίων Γενικών Λυκείων. Η Επιτροπή Παιδείας

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ Θέµα 1 ο 1. Τα άτοµα που είναι ετερόζυγα για τη β-θαλασσαιµία: α. Εµφανίζουν ήπια αναιµία β. Έχουν ευαισθησία στην ελονοσία γ. Συνθέτουν µεγάλη ποσότητα HbF δ.

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΚΑΙ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 6 ΙΟΥΝΙΟΥ 207 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5.

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ Β ΚΥΚΛΟΥ

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ Β ΚΥΚΛΟΥ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ Β ΚΥΚΛΟΥ ΜΑΘΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΤΑΞΗ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ 25/4/2016 ΘΕΜΑ Α Α1. Μέσω του καρυότυπου δεν μπορούν να ανιχνευτούν : α. οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες β.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ο.Π. ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ Α1. Β. Α2. Δ. Α3. Α. Α4. Δ. Α5. Α. 1. Οι σωστές απαντήσεις είναι:

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ο.Π. ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ Α1. Β. Α2. Δ. Α3. Α. Α4. Δ. Α5. Α. 1. Οι σωστές απαντήσεις είναι: Κανάρη 36, Δάφνη Τηλ. 210 9713934 & 210 9769376 ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ο.Π. ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. Β. Α2. Δ. Α3. Α. Α4. Δ. Α5. Α. ΘΕΜΑ Β 1. Οι σωστές απαντήσεις είναι: A. Σχολικό

Διαβάστε περισσότερα

ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΕΙΡΑ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΡΟΣ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΣΥΝΙΣΤΩΣΕΣ ΠΟΥ ΠΑΙΡΝΟΥΝ ΜΕΡΟΣ ΣΕ ΕΝΑΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΔΟ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ

ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΕΙΡΑ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΡΟΣ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΣΥΝΙΣΤΩΣΕΣ ΠΟΥ ΠΑΙΡΝΟΥΝ ΜΕΡΟΣ ΣΕ ΕΝΑΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΔΟ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΕΞΕΛΙΞΗ ΣΕΙΡΑ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΡΟΣ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΣΥΝΙΣΤΩΣΕΣ ΠΟΥ ΠΑΙΡΝΟΥΝ ΜΕΡΟΣ ΣΕ ΕΝΑΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΔΟ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΖΩΟΛΟΓΙΑ Δ. ΜΑΤΘΟΠΟΥΛΟΣ 1 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

γ ρ α π τ ή ε ξ έ τ α σ η σ τ ο μ ά θ η μ α ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

γ ρ α π τ ή ε ξ έ τ α σ η σ τ ο μ ά θ η μ α ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ γ ρ α π τ ή ε ξ έ τ α σ η σ τ ο μ ά θ η μ α ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ' ΛΥΚΕΙΟΥ Τάξη: Γ Λυκείου Τμήμα: Βαθμός: Ονοματεπώνυμο: Καθηγητές: Θ Ε Μ Α A 1. Να επιλέξετε τη σωστή απάντηση: Α1. Το γονίδιο

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Β Β1. Η σειρά των βημάτων που οδηγούν στην κατασκευή καρυότυπου είναι: 4, 2, 1, 6, 3, 5 Β2. α.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ EIKONA 2.1 Ημισυντηρητικός μηχανισμός αντιγραφής του DNA 1. Να γράψετε τα ένζυμα που (α) προκαλούν ξετύλιγμα των αλυσίδων του αρχικού (μητρικού μορίου) DNA και (β) συνθέτουν τις νέες αλυσίδες του DNA.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. α Α4. γ Α5. δ ΘΕΜΑ Β Β1.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

Παγκόσμια Ημέρα κατά της Ηπατίτιδας

Παγκόσμια Ημέρα κατά της Ηπατίτιδας Παγκόσμια Ημέρα κατά της Ηπατίτιδας Η Παγκόσμια Ημέρα κατά της Ηπατίτιδας εορτάζεται κάθε χρόνο στις 28 Ιουλίου και καθιερώθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας με σκοπό την ενημέρωση και ευαισθητοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου. Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση:

KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου. Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση: KΕΦΑΛΑΙΟ 1ο Χημική σύσταση του κυττάρου Ενότητα 1.1: Χημεία της ζωής Ενότητα 2.1: Μακρομόρια Να απαντήσετε σε καθεμιά από τις παρακάτω ερωτήσεις με μια πρόταση: 1. Για ποιο λόγο θεωρείται αναγκαία η σταθερότητα

Διαβάστε περισσότερα

Τα χημικά στοιχεία που είναι επικρατέστερα στους οργανισμούς είναι: i..

Τα χημικά στοιχεία που είναι επικρατέστερα στους οργανισμούς είναι: i.. ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ 1 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ «XHMIKH ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ» ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΑΙ Η ΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Α. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΣΑ ΣΤΗΝ ΤΑΞΗ 1. Όταν αναφερόμαστε στον όρο «Χημική Σύσταση του Κυττάρου», τί νομίζετε ότι

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις

Ενδεικτικές απαντήσεις ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 8 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ενδεικτικές απαντήσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α Α1. Β, Α2. Β, Α3. Δ, Α4. Γ, Α5. γ ΘΕΜΑ Β Β1. 1 Α, 2 Γ, 3 Α,4 Β, 5 Α, 6 Α, 7 Γ Β2. Βλ. σχολικό βιβλίο, σελ.24(έκδοση 2014-15)

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1 γ Α2 β Α3 α Α4 δ Α5 α ΘΕΜΑ Β Β1. Σχολικό βιβλίο, Σελ.: 123-124: «Η διαδικασία που ακολουθείται με ενδοφλέβια ένεση στον οργανισμό». Β2. Σχολικό βιβλίο, Σελ.: 133: «Διαγονιδιακά

Διαβάστε περισσότερα

Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β

Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β Εμβόλιο Ηπατίτιδας Β ΤΙ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΝΑ ΓΝΩΡΙΖΕΤΕ Είστε σίγουροι πως έχετε πάρει τα κατάλληλα μέτρα για να προστατευτείτε από την ηπατίτιδα Β; ΕΝΗΜΕΡΩΣΟΥ! ΕΜΒΟΛΙΑΣΟΥ! ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΣΟΥ! ΕΜΒΟΛΙΟ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β Γνωρίζετε

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ & ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΝΕΟ & ΠΑΛΑΙΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: 27/05/2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΠ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ Θέμα Α Α1:

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ

ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ 1. Το γενεαλογικό δένδρο είναι η διαγραμματική απεικόνιση των μελών μιας οικογένειας για πολλές γενιές, στην οποία αναπαριστώνται οι γάμοι, η σειρά των γεννήσεων, το φύλο

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Το γενετικό υλικό ΘΕΜΑ: 1 ο (Μονάδες 25 ) Να επιλέξετε τη σωστή απάντηση στις παρακάτω ερωτήσεις. 1. Το πείραµα των Hershey και Chase ήταν:

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ. Σταθμός Αιμοδοσίας Νοσοκομείου Λαμίας Ξυνοτρούλας Π. Ιωάννης Ειδικός Παθολόγος Επιμελητής Β

ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ. Σταθμός Αιμοδοσίας Νοσοκομείου Λαμίας Ξυνοτρούλας Π. Ιωάννης Ειδικός Παθολόγος Επιμελητής Β ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Σταθμός Αιμοδοσίας Νοσοκομείου Λαμίας Ξυνοτρούλας Π. Ιωάννης Ειδικός Παθολόγος Επιμελητής Β ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Η μετάγγιση αίματος είναι μια ζωτική θεραπευτική πράξη

Διαβάστε περισσότερα

ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΩΝ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ

ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΩΝ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ 1η ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΔΙΗΜΕΡΙΔΑ «ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΑΘΗΜΕΡΙΝΗ ΠΡΑΞΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ» ΛΑΜΙΑ 21 22 22 ΟΚΤΩΒΡΙΟΥ 2005 ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΤΕΤΑΡΤΗ 15 ΙΟΥΝΙΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ

Διαβάστε περισσότερα

Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη

Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη Γυμνάσιο Κερατέας ΚΑΡΚΙΝΟΣ & ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Αναστασία Σουλαχάκη Κωνσταντίνα Πρίφτη 2013 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ : Ορολογία και λίγα λόγια για τον καρκίνο Χαρακτηριστικά του καρκίνου Μεταλλάξεις Μεταλλάξεις και καρκίνος

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA 1. Η ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής επέτρεψε: α. την κατανόηση των μηχανισμών αντιγραφής του γενετικού υλικού β. την απομόνωση των πλασμιδίων από τα βακτήρια γ. την πραγματοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΠΑΝΕΛΛΑ ΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΕΠΑΛ (ΟΜΑ Α Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 22 ΜΑΪΟΥ 2009 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 27 Μαΐου 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλαδικών Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων (Νέο & Παλιό Σύστημα) ΘΕΜΑ Γ Γ.1 Ο χαρακτήρας της ομάδας αίματος στον άνθρωπο

Διαβάστε περισσότερα

Ορισμός επιδημιολογίας

Ορισμός επιδημιολογίας Ορισμός επιδημιολογίας Επιδημιολογία είναι η μελέτη της κατανομής των παραγόντων που επηρεάζουν τη συχνότητα των νοσημάτων στον άνθρωπο (MacMahon, 1970) Επιδημιολογία είναι η μελέτη της κατανομής των παραγόντων

Διαβάστε περισσότερα

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. β Α4. β Α5. β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ B B1. Ο όρος γονιδιακή έκφραση αναφέρεται συνήθως σε όλη τη διαδικασία με την οποία

Διαβάστε περισσότερα

Απαντήσεις Θεμάτων Πανελληνίων Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων

Απαντήσεις Θεμάτων Πανελληνίων Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων 4 Ιουνίου 2014 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Απαντήσεις Θεμάτων Πανελληνίων Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων ΘΕΜΑ Α Α.1δ Α.2 γ Α.3 β Α.4 γ Α.5 β ΘΕΜΑ Β B.1 4 2 1 6 3 5 B.2 α. DNAπολυμεράση β. πριμόσωμα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις Α1 έως Α5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη

Διαβάστε περισσότερα

ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ

ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ 1. Ο γενετικός κώδικας είναι ένας κώδικας αντιστοίχισης των κωδικονίων του mrna με αμινοξέα στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Σύμφωνα με αυτόν η 3 μετάφραση όλων των mrna αρχίζει

Διαβάστε περισσότερα

Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις

Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. β Α4. δ Α5. γ ΘΕΜΑ B B1. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια του ανθρώπου περιέχουν κυρίως μια πρωτεΐνη, την αιμοσφαιρίνη. Κάθε μόριο αιμοσφαιρίνης

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25)

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25) ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 ΕΠΩΝΥΜΟ:... ΟΝΟΜΑ:... ΤΜΗΜΑ:... ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ:... ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΟΝΟΜΑ:ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΕΠΙΘΕΤΟ:ΠΡΙΦΤΗ ΤΑΞΗ:Γ ΤΜΗΜΑ:4

ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΟΝΟΜΑ:ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΕΠΙΘΕΤΟ:ΠΡΙΦΤΗ ΤΑΞΗ:Γ ΤΜΗΜΑ:4 ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΟΝΟΜΑ:ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΕΠΙΘΕΤΟ:ΠΡΙΦΤΗ ΤΑΞΗ:Γ ΤΜΗΜΑ:4 Τι εννοούμε με τον όρο μεταλλάξεις; Το γενετικό υλικό μπορεί να υποστεί αλλαγές με πολλούς διαφορετικούς

Διαβάστε περισσότερα

Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα C. Συχνές Ερωτήσεις

Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα C. Συχνές Ερωτήσεις Ιογενείς Ηπατίτιδες Ηπατίτιδα C Συχνές Ερωτήσεις Tι είναι ηπατίτιδα; Το ήπαρ (συκώτι) είναι ένα ζωτικό όργανο που βρίσκεται στο δεξιό άνω τμήμα της κοιλιακής χώρας. Έχει πολλές λειτουργίες και διαδραματίζει

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Β ΓΕΛ 05/ 05/ 2019 Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Εσώνια δεν υπάρχουν: Α. Στο DNA των ιών που προσβάλλουν

Διαβάστε περισσότερα

Σεξουαλικώς Μεταδιδόμενα Νοσήματα. Εργασία: Γιάννης Π.

Σεξουαλικώς Μεταδιδόμενα Νοσήματα. Εργασία: Γιάννης Π. Σεξουαλικώς Μεταδιδόμενα Νοσήματα Εργασία: Γιάννης Π. Εισαγωγή Σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα ή σεξουαλικώς μεταδιδόμενες ασθένειες ή αφροδίσια νοσήματα ονομάζονται ασθένειες ή μολύνσεις, οι οποίες

Διαβάστε περισσότερα