ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Α ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΩΤΙΟΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Α ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΩΤΙΟΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΩΝ ΚΥΡΙΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIII ΜΕ ΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΣΕ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΑ ΠΑΙΔΙΑ ΙΣΙΔΩΡΑΣ ΗΛ. ΒΑΓΙΑΝΟΥ ΠΑΙΔΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΓΟΜΠΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΜΙΡΑΝΤΑ ΑΘΑΝΑΣΙΟΥ-ΜΕΤΑΞΑ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗΣ-ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΓΟΜΠΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΙΡΑΝΤΑ ΑΘΑΝΑΣΙΟΥ-ΜΕΤΑΞΑ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΦΩΤΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΑΡΥΠΙΔΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΚΑΛΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΦΙΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΝΑ-ΚΕΛΥ ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ 3

4 4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Κ. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗΣ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ 5

6 6

7 Στους γονείς και τα αδέλφια μου Στο σύζυγό μου Στα παιδιά μου 7

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑ Α ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ VIII (FVIII) - Ο ρόλος του στην πήξη ΓΕΝΕΤΙΚΗ Γονίδιο Δομή, θέσεις ενεργοποίησης και συνθήκες ενεργοποίησης του παράγοντα VIII Μεταλλάξεις Συνήθεις μεταλλάξεις στο γονίδιο F Αναστροφή του ιντρονίου Αναστροφή του ιντρονίου Συσχέτιση του τύπου της μετάλλαξης με τη βαρύτητα της αιμορροφιλίας Μέθοδοι ανίχνευσης των μεταλλάξεων ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Αιμορραγικές εκδηλώσεις Επιπλοκές των αιμορραγιών ΔΙΑΓΝΩΣΗ Εργαστηριακός έλεγχος Δοκιμασίες πήξης Επίπεδα παράγοντα VIII Γενετική διάγνωση Διαφορική διάγνωση ΘΕΡΑΠΕΙΑ 42 9

10 9.1. Αναπλήρωση του ελλείποντα παράγοντα VIII Επιπλοκές θεραπείας Μετάδοση λοιμώξεων Αναστολείς Σχήματα θεραπείας Αντιμετώπιση των οξέων αιμορραγικών επεισοδίων Προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης στα παιδιά Εναλλακτική μορφή θεραπείας (DDAVP) Αντιμετώπιση των αναστολέων Αντιμετώπιση της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Θεραπείες υπό έρευνα ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΕΛΕΓΧΟΥ Γενετικά σχετιζόμενες διαταραχές Έλεγχος των συγγενών ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μέτρηση του ΑΡΤΤ Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VIII Ανίχνευση αναστολέων Τεχνικές ανάλυσης DNA DNA Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Subcycling PCR Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογράφηση των PCR προϊόντων Ερμηνεία των προϊόντων της PCR.. 66 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΟ Ασθενείς Πρωτόκολλο ελέγχου 71 10

11 3. ΜΕΘΟΔΟΙ Εργαστηριακό μέρος Γενετικός έλεγχος Λήψη βιολογικού υλικού Απομόνωση DNA Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Αντιδραστήρια Προετοιμασία της PCR Πραγματοποίηση της Subcycling PCR Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Μεταφορά πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας, φωτογράφηση των PCR προϊόντων και ερμηνεία των προϊόντων της PCR Κλινικό μέρος Βαρύτητα της νόσου Ηλικία διάγνωσης Κλινική εικόνα Θεραπεία Ανάπτυξη αναστολέα ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αποτελέσματα καταγραφής Δημογραφικά στοιχεία ασθενών Χαρακτηριστικά της νόσου Ανίχνευση της μετάλλαξης Έλεγχος συσχετίσεων Κατανομή της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου Συσχέτιση ύπαρξης αναστολέα και βαρύτητας νόσου Συσχέτιση Ύπαρξης της μετάλλαξης - Βαρύτητας νόσου (εργ. εικόνα ποσοστό παράγοντα VIII Συσχέτιση της μετάλλαξης με την αιμορρροφιλική αρθροπάθεια (HJHS, αριθμός αρθρώσεων στόχος Συσχέτιση της μετάλλαξης με τις λοιπές επιπλοκές Συσχέτιση Ύπαρξης της μετάλλαξης και Παρουσίας αναστολέα

12 Συσχέτιση Παρουσίας αναστολέα-αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Συχνότητα θεραπείας HJHS ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. 128 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 130 ABSTRACT. 133 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η αιμορροφιλία Α είναι η πιο σοβαρή κληρονομική διαταραχή της πήξης του αίματος στον άνθρωπο. Μεταβιβάζεται με το φυλοσύνδετο υπολειπόμενο χαρακτήρα. Προσβάλλει περίπου 1-2 στα ζώντα άρρενα και συγκαταλέγεται ανάμεσα στα πιο συχνά αίτια αιμορραγίας 1. Σε παγκόσμιο επίπεδο περίπου άνθρωποι υποφέρουν από αιμορροφιλία, ενώ ο εκτιμώμενος αριθμός ασθενών στην Ελλάδα είναι περίπου 850. Η αιμορροφιλία Α οφείλεται σε γενετική βλάβη του γονιδίου που ρυθμίζει την παραγωγή του παράγοντα VIII, με αποτέλεσμα την πλήρη ή μερική έλλειψη, ή τη δυσλειτουργία του πηκτικού τμήματος του παράγοντα. Κατά τη μοριακή ανάλυση του DNA αποκαλύπτονται περισσότερες από 1000 μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα VIII 2,3,4,5,6,7. Η σοβαρότητα της κλινικής εικόνας σχετίζεται με τα επίπεδα του παράγοντα VIII στο αίμα. Έτσι η αιμορροφιλία διακρίνεται σε βαριά, ενδιάμεση και ήπια 1,8,9. Η θεραπεία της αιμορροφιλίας συνίσταται στην ενδοφλέβια έγχυση του ελλείποντα παράγοντα. Η παρασκευή και χορήγηση σκευασμάτων παράγοντα VIII υπήρξε καταλυτική στην πορεία της νόσου, τόσο ως προς την ποιότητα της ζωής όσο ως προς το προσδόκιμο επιβίωσης των ασθενών 10. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν πλασματικοί παράγοντες, ενώ στην πορεία της θεραπείας παρασκευάσθηκαν με την εξέλιξη της βιοτεχνολογίας ανασυνδυασμένοι παράγοντες οι οποίοι χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο 11,12. Tον αρχικό όμως ενθουσιασμό στην αντιμετώπιση της νόσου και των επιπλοκών της με τη χορήγηση του ελλείποντα παράγοντα της πήξης, περιόρισε η ανάπτυξη αναστολέων, δηλαδή αντισωμάτων εναντίον του παράγοντα VIII, σε ποσοστό που κυμαίνεται έως και 30% στους ασθενείς με βαριά αιμορροφιλία Α 13,14. Σε πολλαπλές διεθνείς μελέτες διαπιστώθηκε ότι τόσο ο τύπος η βαρύτητα της αιμορροφιλίας Α, όσο και η ανάπτυξη αναστολέων, σχετίζονται συχνότερα με κάποιες συγκεκριμένες μεταλλάξεις του παράγοντα VIII 13,15. Ειδικότερα οι ασθενείς που πάσχουν από τη βαριά μορφή της αιμορροφιλίας παρουσιάζουν σε ποσοστό μεγαλύτερο από 40% μία συγκεκριμένη μετάλλαξη στο γονίδιο του παράγοντα VIII που περιγράφεται ως αναστροφή του ιντρονίου

14 Σκοπός της μελέτης μας είναι η καταγραφή της συχνότητας της αναστροφής του ιντρονίου 22 σε παιδιατρικούς ασθενείς της Βορείου Ελλάδας με αιμορροφιλία Α και η αναζήτηση ύπαρξης συσχέτισης της βαρύτητας της μορφής με τον τύπο αυτό της μετάλλαξης, καθώς και τη συσχέτιση της μετάλλαξης αυτής με την ανάπτυξη αναστολέων έναντι του παράγοντα VIII 16,17,18,19. Το γεγονός ότι δεν υπάρχει παρόμοια συγκριτική μελέτη στην Ελλάδα καθιστά πρωτότυπη τη μελέτη. Η μελέτη διαιρείται σε δύο μέρη, το Γενικό και το Ειδικό μέρος. Το Γενικό μέρος περιλαμβάνει ουσιαστικά δύο ενότητες: Η πρώτη αναφέρεται γενικά στην αιμορροφιλία Α, στις μεταλλάξεις που σχετίζονται με τη νόσο και τέλος στο φαινόμενο της ανάπτυξης αντισωμάτων (αναστoλέων) εναντίον του παράγοντα VIII. Η δεύτερη αναφέρεται στις εργαστηριακές τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της αιμορροφιλίας Α. Το Ειδικό μέρος περιλαμβάνει την περιγραφή του υλικού και των ασθενών που μελετήθηκαν, τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν, τα αποτελέσματα, τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, τη συζήτηση και τα συμπεράσματα. Ακολουθούν η Περίληψη στα Ελληνικά και στα Αγγλικά και η Βιβλιογραφία. Η συλλογή του υλικού έγινε στο ειδικό ιατρείο αιμορροφιλίας της Α Πανεπιστημιακής Παιδιατρικής κλινικής του ΑΠΘ στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης, το οποίο πραγματοποιούνταν υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας κ. Μιράντας Αθανασίου-Μεταξά αρχικά και έπειτα υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Νικόλαου Γομπάκη. Οι εργαστηριακές εξετάσεις έγιναν στα ειδικά εργαστήρια του Ιπποκρατείου νοσοκομείου Θεσσαλονίκης (μέτρηση του ΑΡΤΤ) και του νοσοκομείου Παπαγεωργίου Θεσσαλονίκης (μέτρηση των αναστολέων) και οι απεικονιστικές στα ειδικά τμήματα του Ιπποκρατείου νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Το ειδικό μέρος της Μοριακής Ανάλυσης πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Βιοχημείας του ΑΠΘ υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας Νόρμας Βαβάτση Χριστάκη. Τα δείγματα στάλθηκαν για επαλήθευση (control) των αποτελεσμάτων στη Μονάδα Αιμορραγικών Διαθέσεων του Νοσοκομείου Αθηνών Παίδων Αγία Σοφία υπό την επίβλεψη της Διευθύντριας κ. Ελένης Πλατοκούκη Κομιτοπούλου. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Καθηγητή κ. Νικόλαο Γομπάκη, Καθηγήτρια κ. Μιράντα 14

15 Αθανασίου-Μεταξά και Καθηγήτρια κ. Νόρμα Βαβάτση-Χριστάκη για την ανάθεση και την επίβλεψη του θέματος αυτής της μελέτης. Στον πρώτο επιβλέποντα Καθηγητή κ. Νικόλαο Γομπάκη, Καθηγητή Παδιατρικής-Αιματολογίας επιθυμώ να εκφράσω τη μεγάλη ευγνωμοσύνη μου για την καθοδήγηση και την πολύτιμη επίβλεψη στη διαμόρφωση και διεκπεραίωση της μελέτης και την αμέριστη συμπαράσταση που μου προσέφερε. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα τόσο για την επιστημονική συμβουλευτική και συντονιστική του παρουσία όσο και για τη γενικότερη πολύπλευρη βοήθειά του καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης. Την Καθηγήτρια κ. Μιράντα Αθανασίου-Μεταξά, Καθηγήτρια Παδιατρικής Αιματολογίας ευχαριστώ εκ βαθέων για τη δυνατότητα που μου έδωσε ως διευθύντρια της κλινικής και σε συνεργασία με τα άλλα μέλη της τριμελούς επιτροπής να εκπονήσω την παρούσα μελέτη ως άμισθη επιστημονική συνεργάτης της Α Παιδιατρικής Κλινικής. Την ευχαριστώ επίσης για την πολύπλευρη βοήθεια και την ανεκτίμητη καθοδήγηση τόσο κατά την παρακολούθηση του ειδικού ιατρείου και την «γνωριμία» με τη αιμορροφιλία όσο και για την στήριξή της καθ`όλη τη διάρκεια της μελέτης. Θερμές ευχαριστίες στην Καθηγήτρια Βιολογικής Χημείας κ. Νόρμα Βαβάτση- Χριστάκη για τον καθοριστικό της ρόλο στην εκπόνηση της εργασίας αυτής, καθώς με εισήγαγε στις πολύπλοκες τεχνικές και μεθόδους της Μοριακής Βιολογίας. Χωρίς τις ειδικές γνώσεις και την εμπειρία της η κατανόηση της μοριακής ανάλυσης από μέρους μου θα ήταν ιδιαίτερα δύσκολη. Τέλος, την ευχαριστώ θερμά επίσης για τη γενικότερη βοήθεια και καθοδήγηση στη συγγραφή της παρούσας μελέτης. Ευχαριστώ επίσης ιδιαιτέρως την διευθύντρια της Μονάδας Αιμορραγικών Διαθέσεων του Νοσοκομείου Αθηνών Παίδων «Αγία Σοφία» κ. Ελένη Πλατοκούκη Κομιτοπούλου για τη δυνατότητα που μου έδωσε, ώστε να γίνει «control» των αποτελεσμάτων της Γενετικής Ανάλυσης των δειγμάτων στο κέντρο αιμορροφιλίας της Μονάδας Αιμορραγικών Διαθέσεων του Νοσοκομείου Αθηνών Παίδων «Αγία Σοφία». Επίσης ευχαριστώ θερμά την κ. Γαρυπίδου Βασιλεία, Καθηγήτρια Παθολογίας- Αιματολογίας, καθώς στο Αιματολογικό τμήμα της Β Προπαιδευτικής Παθολογικής κλινικής, το οποίο διευθύνει, έγινε η μέτρηση των επιπέδων του παράγοντα VIII. 15

16 Την κ. Ιωάννα Τσάτρα Παιδίατρο, Διευθύντρια ΕΣΥ και υπεύθυνη της Μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας του Ιπποκρατείου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης ευχαριστώ θερμά για την πολύτιμη υποστήριξη και βοήθεια. Επίσης, ευχαριστώ θερμά την Λέκτορα Παιδιατρικής Αιματολογίας κ. Μαρίνα- Κέλυ Οικονόμου για την πολύτιμη καθοδήγηση και πολύπλευρη βοήθειά της τόσο κατά την παρακολούθηση του ειδικού ιατρείου, όσο και κατά την λοιπή εκπόνηση και τη συγγραφή της παρούσας μελέτης. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ την Βιοχημικό κ. Καψιμάλλη Ζωή, η οποία πραγματοποίησε το ειδικό εργαστηριακό μέρος της Γενετικής Ανάλυσης και τον επανέλεγχο (control) των δειγμάτων στο εργαστήριο του κέντρου αιμορροφιλίας της Μονάδας Αιμορραγικών Διαθέσεων του Νοσοκομείου Αθηνών Παίδων «Αγία Σοφία» για την προσωπική της εργασία, την πολύτιμη βοήθεια και την άψογη συνεργασία της. Θερμές ευχαριστίες στον Ιατρό-Ειδικό Ιατρικών Εργαστηρίων κ. Fekri Samarah για την ευγενική και ακούραστη καθοδήγηση του στην πρώτη αυτή γνωριμία μου με τον «κόσμο» της Μοριακής Βιολογίας στο εργαστήριο της Βιοχημείας του ΑΠΘ υπό την επίβλεψη της κ. Βαβάτση. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον κ. Κωνσταντίνο Κρικόνη Μαθηματικό και την εταιρία DatAnalysis για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων της εργασίας και την καθοδήγησή του στην κατανόηση των αποτελεσμάτων. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύζυγό μου επιμελητή Α Γενικής Ιατρικής κ. Κωσταντίνο Τσακιρίδη για την διαρκή ενθάρρυνση και την πολύπλευρη στήριξή του. Χωρίς τη δική του παρουσία, τη βοήθεια και την υπομονή, χωρίς την αμέριστη συμπαράσταση του η ολοκλήρωση αυτής της προσπάθειας θα ήταν ουσιαστικά αδύνατη. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τους μικρούς ασθενείς οι οποίοι συμμετείχαν στη μελέτη αυτή, καθώς και τις οικογένειές τους, τόσο για τη συναίνεσή τους στην πραγματοποίηση της έρευνας, όσο και για την εξαιρετική συνεργασία τους. Μέσα από την εργασία αυτή είχα την ευκαιρία να γνωρίσω «εκ βαθέων» τη νόσο, τη δραματική της επίδραση στη ζωή των ασθενών και των γονέων τους καθώς και τον καθημερινό τους αγώνα για μια όσο το δυνατόν ανώδυνη και φυσιολογική ζωή. 16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18 1. ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑ Α - ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η αιμορροφιλία είναι γνωστή ως η νόσος των βασιλέων. Η πιο διάσημη φορέας η βασίλισσα Βικτώρια 20 το 1853 αποκτά το γιο της Λεοπόλδο ο οποίος είναι αιμορροφιλικός και ο οποίος πεθαίνει σε ηλικία 31 ετών από μετατραυματική εγκεφαλική αιμορραγία 21. Δύο θυγατέρες της η Βεατρίκη και η Αλίκη, φορείς επίσης, μεταβιβάζουν τη νόσο σε τρία εγγόνια και επτά δισσέγγονα της βασίλισσας και μέσω αυτών στις βασιλικές οικογένειες της Ισπανίας, της Γερμανίας και της Ρωσίας. 18

19 Οι πρώτες γραπτές αναφορές εντοπίζονται στις εβραϊκές γραφές του δευτέρου αιώνα AD (Apre David): «ο τρίτος γιος μιας γυναίκας εξαιρείτο της περιτομής, αν τα δύο πρώτα αγόρια της είχαν πεθάνει από αιμορραγία μετά από περιτομή». 22,23 Στα μέσα του 12 ου αιώνα ένας Άραβας ιατρός περιγράφει μια οικογένεια, τα άρρενα μέλη της οποίας πεθαίνουν έπειτα από ήσσονες χειρουργικές πράξεις. Το 1803 περιγράφεται το πρώτο τυπικό οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας το οποίο αφορά τρεις γενεές 24. Ο όρος αιμορροφιλία χρησιμοποιείται για πρώτη φορα το 1828 από τον Ελβετό φοιτητή Friedrich Hopff 25. O Konig το 1890 περιγράφει πρώτος την συχνότερη επιπλοκή της νόσου, την αιμορροφιλική αρθροπάθεια 26. Το 1910, ο Addis προσθέτει τον παρατεταμένο χρόνο πήξης σαν χαρακτηριστικό της νόσου στην υπόλοιπη εικόνα της αιμορροφιλίας, δηλαδή στο συνδυασμό φύλο (αγόρι), οικογενειακό ιστορικό και αίμαρθρα 27. Οι Bulloch & Fildes το 1911 συγκεντρώνοντας βιβλιογραφικές αναφορές και περιγραφές περιπτώσεων περιγράφουν τον τρόπο μεταβίβασης, την κλινική εικόνα και τη θνητότητα της αιμορροφιλίας 28. Το 1937 δύο ιατροί οι Patek καιtaylor από το Harvard ανακαλύπτουν την αντιαιμορροφιλική σφαιρίνη. 29 Το 1947 ο Pavlovsky διαχωρίζει και περιγράφει τις δύο μορφές της αιμορροφιλίας, Α και Β. Το 1965 ο Pool ανακαλύπτει το κρυοκαθίζημα, ενώ στις αρχές της δεκαετίας του 1970 κυκλοφορούν τα πρώτα σκευάσματα συμπυκνωμένων παραγόντων VIII και IX 30. Το 1973, ο Peter Walsh για πρώτη φορά συσχετίζει τη συχνότητα των αιμορραγικών επεισοδίων σε βαρέως πάσχοντες αιμορροφιλικούς με την αντίδραση των αιμοπεταλίων τους 31. Το 1983 παρασκευάζεται ο πρώτος υψηλής καθαρότητας παράγοντας VIII από ανθρώπινο πλάσμα 32, ενώ στις αρχές της δεκαετίας του 1990 κυκλοφορούν για πρώτη φορά οι ανασυνδυασμένοι παράγοντες. Η αναπλήρωση του ελλείποντα παράγοντα ως θεραπευτική επιλογή αλλάζει ριζικά την πρόγνωση και πορεία της νόσου. 19

20 2. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ - ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ Η αιμορροφιλία Α είναι η πιο σοβαρή κληρονομική διαταραχή της πήξης του αίματος στον άνθρωπο. Οφείλεται σε γενετική βλάβη του γονιδίου F8 το οποίο ρυθμίζει την παραγωγή του παράγοντα VIII, με αποτέλεσμα την πλήρη ή μερική έλλειψη, ή τη δυσλειτουργία του πηκτικού τμήματος του παράγοντα. Παρουσιάζεται περίπου σε 1-2 ανά ζώντα άρρενα και συγκαταλέγεται ανάμεσα στα πιο συχνά αίτια σοβαρής αιμορραγίας ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ Μεταβιβάζεται με τον υπολειπόμενο φυλοσύνδετο χαρακτήρα, συνεπώς εκφράζεται στους άρρενες, ενώ για να εκφρασθεί σε θήλυ, ο πατέρας πρέπει να είναι αιμορροφιλικός και η μητέρα φορέας της νόσου. Οι γυναίκες φορείς έχουν 50% πιθανότητα να μεταφέρουν την μετάλλαξη σε κάθε εγκυμοσύνη. Αγόρια που κληρονομούν την μετάλλαξη είναι πάσχοντες, ενώ τα κορίτσια που κληρονομούν την μετάλλαξη είναι φορείς. Οι πάσχοντες άνδρες μεταφέρουν την μετάλλαξη σε όλες τις κόρες και σε κανένα γιο. Σχήμα 1. Φυλοσύνδετη κληρονομικότητα 20

21 4. ΠAΡΑΓΟΝΤΑΣ VIII (FVIII) - Ο ρόλος του στην πήξη Δεν είναι γνωστός ακόμη ο κύριος τόπος παραγωγής του FVIII in vivo, αν και ένα πολύ μεγάλο μέρος του παράγεται στο ήπαρ. Έχει, επίσης, βρεθεί έκφραση του γονιδίου και στο τοίχωμα των αγγείων (από τα ενδοθηλιακά κύτταρα με την άσκηση απελευθερώνονται πολλαπλάσια επίπεδα του παράγοντα που κυκλοφορεί σε φυσιολογικές συνθήκες) και τέλος ενυπάρχει και στα αιμοπετάλια. Η πρωτεΐνη του παράγοντα VIII κυκλοφορεί σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις στο πλάσμα (περίπου 100mg/ml). Πολύ μικρές συγκεντρώσεις παράγοντα (0,2μg ανά ml πλάσματος) είναι απαραίτητες για την πήξη του αίματος, ενώ η ελάττωσή του ή απουσία του οδηγεί σε αιμορραγική διάθεση. Ο παράγων VIII (FVIII) συμμετέχει στην ενδογενή οδό της πήξης μαζί με τους FXII, FXI, και FIX όπου λειτουργεί σαν απαραίτητος συμπαράγοντας του FIX, κατά την πρωτεολυτική ενεργοποίηση του FX στην ενεργή του μορφή FXa. Aναλυτικότερα, ενώ ο ίδιος ο FVIII δεν διαθέτει ενζυμική δραστηριότητα, ενεργοποιούμενος μετατρέπεται σε δραστικό ένζυμο και μαζί με τον ενεργοποιημένο FIX, φωσφολιπίδια (από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια) και ιόντα ασβεστίου σχηματίζουν ένα ιδιαίτερα δραστικό ενζυμικό σύμπλεγμα, τη δεκάση του ενδογενούς δρόμου. Ενεργοποιούμενος ο FIX μετατρέπεται σε σερινοπρωτεάση που όμως εξαρτάται απόλυτα από την παρουσία του ενεργοποιημένου FVIII ως συμπαράγοντα. Κατά την ενεργοποίηση της πηκτικής διαδικασίας σχηματίζεται, όπως προαναφέρθηκε, η δεκάση (ενζυμικό σύμπλεγμα το οποίο ενεργοποιεί τον παράγοντα X). Στη συνέχεια ο FX μαζί με τον ενεργοποιημένο FV, ιόντα ασβεστίου και ανάλογα φωσφολιπίδια σχηματίζουν το κύριο ενζυμικό σύμπλεγμα της πήξης, την προθρομβινάση, η οποία και ενεργοποιεί την προθρομβίνη (παράγοντας ΙΙ) σε θρομβίνη που με τη σειρά της πέπτει το ινωδογόνο σε ινική (σχήμα 2). Παράλληλα, λειτουργεί η εξωγενής οδός της πήξης στην οποία η ενεργοποίηση του FX συμβαίνει με τη δράση του FVII και του ιστικού παράγοντα. Οι οδοί ενεργοποίησης της πήξης είναι ταχύτατες και άκρως αποτελεσματικές (όπως προκύπτει από τη μελέτη της κινητικής του Hemker 1980). Παράλληλα όμως, η ενεργοποίηση της πήξης περιορίζεται σε τοπικό επίπεδο χάρη στην παρουσία οδών αναστολής, οι οποίες εμποδίζουν την επέκταση της ενεργοποίησης εκτός του σημείου βλάβης του ενδοθηλίου. Οι οδοί αυτοί είναι το 21

22 σύστημα της πρωτεΐνης C (αναστέλλει την ενεργοποίηση του παράγοντα VIII και V), η αντιθρομβίνη (που αναστέλλει την ενεργοποίηση της προθρομβίνης σε θρομβίνη, την ενεργοποίηση του παράγοντα VII, του XI και XII καθώς και του IX), και τέλος, ο ανασταλτής του ιστικού δρόμου (tissue-factor-pathway inhibitor, TFPI-αναστέλλει τη δεκάση του ιστικού παράγοντα). Μία ανεπάρκεια ή δυσλειτουργία του FVIII δυσχεραίνει την ενεργοποίηση του FX, όπως και τα ακόλουθα στάδια της αιμοστατικής διαδικασίας, με αποτέλεσμα ο σχηματισμός ινικής και θρόμβου να είναι ατελής. Ο FVIII είναι ασταθής και απαιτεί ισχυρή σύνδεση με τον παράγοντα von Willebrand (vw) για σταθερότητα στο πλάσμα. Η αστάθεια του FVIII σε απουσία του vw έχει σαν συνέπεια τις εξαιρετικά χαμηλές τιμές του FVIII που ανιχνεύονται σε ασθενείς με βαριά νόσο von Willebrand 33. Ενδογενής οδός Σύστημα επαφής TFPI Εξωγενής οδός Ιστικός παράγοντας (TF) FXII FXIIa FXI FVIII ΑΤ Ινωδοπεπτίδια Α &Β FIX FXIa Ca++ FIXa FVIIIa FII προθρομβίνη Ινωδογόνο Ca++ Pl FX FVIIa/TF FVII FXa F1+2 Ca++φωσφολιπίδια (Pl) FVa FIIa θρομβίνη Μονομερή Ινώδους FV Ασταθές Ινώδες PS, APC PC TM FXIII FXIIIa Σταθερό Ινώδες Μηχανισμός πήξης του αίματος, (MacFarlane, Nature 1964) Σχήμα 2: Μηχανισμός της πήξης 22

23 5. ΓΕΝΕΤΙΚΗ Στα γονίδια ευκαρυωτικών οργανισμών περιέχονται συχνά κάποιες περιοχές που αποκαλούνται ιντρόνια. Βρίσκονται σε πρόδρομες μορφές mrna και αφαιρούνται από το mrna σε μια διαδικασία γνωστή ως συγκόλληση ή ωρίμανση του mrna, που γίνεται στον πυρήνα (splicing). Οι περιοχές που συμμετέχουν στην κωδικοποίηση του προϊόντος των γονιδίων, είναι γνωστές ως εξόνια. Πρόκειται για αλληλουχίες νουκλεϊκού οξέος οι οποίες παρουσιάζονται στο ώριμο mrna είτε μετά την αποκόλληση ιντρονίων (splicing) από το ίδιο μόριο πρόδρομου mrna, είτε μετά τη συγκόλληση των άκρων δύο διαφορετικών προδρόμων mrna, τα οποία έχουν επίσης υποστεί splicing. 5.1.Γονίδιο Το F8 είναι το μόνο γονίδιο που έχει συσχετισθεί μέχρι σήμερα με την αιμορροφιλία Α. Βρίσκεται στην περιοχή Χq28 (σχήμα 3), καταλαμβάνει έκταση 186 kb και εμπεριέχει 26 εξόνια. Το mrna έχει μέγεθος 9kb και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 2332 αμινοξέων (300kDa). Σχήμα 3: Γενετικός τόπος του γονιδίου του παράγοντα VIII 23

24 Αναλυτικότερα: το ιντρόνιο 22 του γονιδίου περιέχει μια «νησίδα» CpG, η οποία δρα ως προαγωγέας (promoter) δύο κατευθύνσεων προς δύο άλλα γονίδια, το F8A και το F8B. Η νησίδα CpG και το F8A περιέχονται σε μία περιοχή DNA μήκους περίπου 9,5kb και η οποία επαναλαμβάνεται τουλάχιστον δύο φορές μέσα στο Χ χρωμόσωμα, προς το τελομερίδιο και εκτός του γονιδίου του παράγοντα VIII. Οι ομόλογες αυτές περιοχές είναι γνωστές ως int22h-1 (ενδογονιδιακή), int22h-2 και int22h-3 (εξωγονιδιακές) 34,35. Το F8B περιλαμβάνει ένα εξόνιο 5 μέσα στα εξόνια του γονιδίου του παράγοντα VIII. Το εξόνιο 5 κωδικοποιεί 8 αμινοξέα, ενώ διατηρείται το πλαίσιο ανάγνωσης του παράγοντα για τα εξόνια Το αποτέλεσμα είναι μια πρωτεΐνη σημαντικά μικρότερη από τον παράγοντα VIII που συμπεριλαμβάνει την περιοχή σύνδεσης για τα φωσφολιπίδια. Το mrna του γονιδίου του παράγοντα VIII έχει μήκος 9010 βάσεων και περιλαμβάνει μια μικρή 5 μη μεταφρασμένη περιοχή (150 βάσεων), ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης μαζί με ένα κωδικόνιο τερματισμού (7056 βάσεων), και μια ασυνήθιστα μακριά 3 μη μεταφρασμένη περιοχή (1806 βάσεων). Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο εκκινήσεως 19 αμινοξέων, το οποίο και κατευθύνει το πέρασμα του παράγοντα διαμέσου του κυττάρου και μια ώριμη πρωτεΐνη 2332 αμινοξέων, η οποία είναι ο ανενεργός προσυμπαράγοντας που βρίσκεται στην κυκλοφορία. Αυτή η πρωτεΐνη είναι οργανωμένη σε διακριτές δομές Δομή, θέσεις ενεργοποίησης και συνθήκες ενεργοποίησης του παράγοντα VIII Το κατασκευαστικό μοντέλο του παράγοντα VIII αποτελεί μία μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα μήκους 2332 αμινοξέων η οποία παρουσιάζει τρεις Α περιοχές (domains), μία Β και δύο C (A1-A2-B-Α3-C1-C2). Οι δύο Α βρίσκονται στη βαριά άλυσο του παράγοντα και μία τρίτη στο τελικό άκρο της ελαφράς αλύσου. Η Β περιοχή είναι συνδετική περιοχή, η οποία κωδικοποιείται από το εξόνιο 14 και διαχωρίζει την δεύτερη και τρίτη Α περιοχή του παράγοντα. Η λειτουργία της Β περιοχής δεν είναι απόλυτα γνωστή και δεν φαίνεται να είναι βασική για την 24

25 προπηκτική δραστηριότητα του παράγοντα VIII 34, αφού κατά την ενεργοποίησή του είναι η περιοχή που αποκόπτεται. Πρόσφατα η Β περιοχή ενοχοποιήθηκε για την ανάπτυξη αναστολέων κατά του παράγοντα VIII (η γνώση αυτή αξιοποιήθηκε μάλιστα και θεραπευτικά, αφού παρασκευάστηκαν ειδικοί ανασυνδυασμένοι παράγοντες για θεραπευτική χρήση, στους οποίους έχει αφαιρεθεί η Β περιοχή) 36. Αν και ο παράγοντας VIII συντίθεται σαν μονή πολυπεπτιδική άλυσος, μια πρωτεάση διασπά την πρωτεΐνη αμέσως μετά τη σύνθεσή της, και έτσι ο παράγοντας VIII που κυκλοφορεί στο πλάσμα είναι ένα ετεροδιμερές (μία ελαφρά άλυσος 80-kd και μια βαριά άλυσος που περιέχει ποικίλη ποσότητα Β περιοχής) συνδεμένο με τον παράγοντα Willebrand 37. Η ενεργοποίηση του παράγοντα VIII και η συμμετοχή του στην πηκτική διαδικασία επιτυγχάνεται μέσω της δράσης της θρομβίνης και του παράγοντα Xa στις θέσεις Arg 372 και Arg : Η αρχική διάσπαση και ενεργοποίηση του παράγοντα VIII μπορεί να προκληθεί από ίχνη παράγοντα Xa που έχουν σχηματιστεί από τη δεκάση του ιστικού παράγοντα (καταλυτικό σύμπλεγμα ιστικού παράγοντα και παράγοντα VIIa). Ταυτόχρονα η ενεργοποίηση της πήξης μεγιστοποιείται από την παραγόμενη θρομβίνη που οδηγεί σε αυξημένη ενεργοποίηση μορίων παράγοντα Xa ικανά να σχηματίζουν μόρια προθρομβινάσης, τόσο από την δεκάση του ιστικού παράγοντα, όσο και από την δεκάση του ενδογενή δρόμου. Η τελευταία επιφέρει περαιτέρω επιτάχυνση της παραγόμενης θρομβίνης. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας VIII, VIIIa, είναι ένα ασταθές μόριο που γρήγορα χάνει τη λειτουργία του ως συμπαράγοντας. Η απώλεια αυτή όμως, δεν είναι συνέπεια προοδευτικής πρωτεόλυσης από τη θρομβίνη ή τον παράγοντα Xa. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οφείλεται σε διαχωρισμό των υποομάδων του. Η απώλεια της προπηκτικής του δραστηριότητας οφείλεται στον διαχωρισμό της Α2 περιοχής από το ετεροτριμερές του παράγοντα VIIIa, ενώ επίσης ο παράγοντας VIIIa απενεργοποιείται με πρωτεολυτική διάσπαση από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C στις θέσεις Arg 336 και Arg

26 5.3.Μεταλλάξεις Συνήθεις μεταλλάξεις στο γονίδιο F8 Όπως προαναφέρθηκε, το γονίδιο του παράγοντα VIII είναι ασυνήθιστα μεγάλο και αυτό εξηγεί τον μεγάλο αριθμό ανεξάρτητων και ποικίλων γενετικών διαταραχών. Οι μεταλλάξεις αυτές δεν εμφανίζονται μόνο σε άτομα με οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας, αλλά παρατηρούνται και σε άτομα με ελεύθερο οικογενειακό ιστορικό και ονομάζονται σποραδικές (νέα ή de novo μετάλλαξη). Η διάγνωση στηρίζεται στην ανάλυση του DNA του γονιδίου του παράγοντα VIII και πραγματοποιείται με απομόνωση του γονιδίου και αναζήτηση της υπεύθυνης μετάλλαξης. Έχουν ανιχνευθεί περισσότερες από 1000 μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα VIII 2-8. Σε μεγάλο ποσοστό πρόκειται για σημειακές μεταλλάξεις και ελλείψεις, αλλά συχνά επίσης πρόκειται για προσθήκες τμημάτων γονιδίων και ανακατανομές - αναστροφές τμημάτων γονιδίων. Οι σημειακές μεταλλάξεις παρατηρούνται στο 90% των περιπτώσεων και μπορεί να είναι δυσνοηματικές (missense αλλαγή κάποιου κωδικονίου που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή διαφορετικού αμινοξέος), μεταλλάξεις χωρίς νόημα (nonsense - η μετάλλαξη έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή κάποιου κωδικονίου stop και πρόωρο τερματισμό της μετάφρασης) και μεταλλάξεις σε θέσεις διασύνθεσης του mrna (mrna slice site εδώ καταργείται μια θέση διασύνθεσης του mrna ή δημιουργείται μια καινούργια). Δεύτερες σε συχνότητα μεταλλάξεις είναι οι ελλείψεις. Παρατηρούνται στο 5-10% των ασθενών. Αφορούν άλλοτε ολόκληρο το γονίδιο, άλλοτε τμήμα του γονιδίου και άλλοτε πρόκειται για μικροελλείψεις (ενός ή περισσότερων ζευγών βάσεων). Δεν φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη τάση συγκέντρωσης σε κάποιες περιοχές του γονιδίου. Μία έλλειψη παρουσιάζει μεγάλη πιθανότητα να διαταρράξει τη γονιδιακή λειτουργία αφαιρώντας ένα ολόκληρο τμήμα της πρωτεΐνης. Οι προσθήκες μπορεί να αφορούν αρκετά ή ακόμη και ένα νουκλεοτίδιο και να επηρεάζουν ανάλογα τη γονιδιακή λειτουργία. Τέλος, οι αναστροφές γενικά είναι σπάνιες με εξαίρεση την αναστροφή του ιντρονίου 22 και του ιντρονίου 1. 26

27 5.3.2.Αναστροφή του ιντρονίου 22 Ένα χαρακτηριστικό αυτής είναι ότι η μετάλλαξη εμφανίζεται αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της μείωσης στα άρρενα γαμετοκύτταρα. Απουσία ομολογίας μεταξύ Χ και Υ χρωμοσώματος κατά το μειωτικό ζευγάρωμα οδηγεί σε διαφορετική αντιστοιχία των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, με αποτέλεσμα παθολογικό ανασυνδυασμό και αναστροφή του γονιδίου (σχήμα 4). Η αρχιτεκτονική του γονιδίου του παράγοντα VIII διαταράσσεται εντελώς: τα ιντρόνια 1 και 22 τοποθετούνται μακρυά από τη φυσική τους θέση, ενώ επιπλέον αντιστρέφεται ο προσανατολισμός της μεταγραφής τους. Η παρουσία δεύτερου Χ χρωμοσώματος αποτρέπει το φαινόμενο αυτό κατά τη φάση της μείωσης στους θηλυκούς γαμέτες Αναστροφή του ιντρονίου 1 Ανευρίσκεται στα 2/3 των σποραδικών περιπτώσεων. Δημιουργείται με παρόμοιο μηχανισμό με την αναστροφή του ιντρονίου 22, ο οποίος έχει σαν αποτέλεσμα αντίστοιχο παθολογικό ανασυνδυασμό και αναστροφή και σε αυτή την περίπτωση. Η μετάλλαξη εμφανίζεται αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της μείωσης στα άρρενα γαμετοκύτταρα (Σχήμα 4). Σχήμα 4. α)αναστροφή του ιντρονίου 1. β) Αναστροφή του ιντρονίου 22 27

28 Συσχέτιση του τύπου της μετάλλαξης με τη βαρύτητα της αιμορροφιλίας Σε πολλαπλές διεθνείς μελέτες διαπιστώθηκε ότι ο τύπος η βαρύτητα της αιμορροφιλίας σχετίζεται συχνότερα με κάποιες συγκεκριμένες μεταλλάξεις του αντίστοιχου παράγοντα. Παρατηρήθηκε ότι οι μεταλλάξεις οι οποίες σχετίζονται συχνότερα με βαριά αιμορροφιλία Α είναι η αναστροφή του ιντρονίου 22 σε ποσοστό περίπου 45% και η αναστροφή του ιντρονίου 1 σε ποσοστό 2-5% 8,18,36. Η βαρύτητα της ασθένειας της αιμορροφιλίας Α σχετίζεται άμεσα με τη δομική αλλαγή της αναστροφής του ιντρονίου 22, δεδομένου ότι εμποδίζεται ο σχηματισμός του ολικού mrna. Μεγάλες ελλείψεις επίσης παρατηρούνται στο 5% έως 13% των ασθενών με βαριά νόσο. Οι ελλείψεις στο χρωμόσωμα F8 συνδέονται με υψηλή πιθανότητα αναστολής της γενετικής λειτουργίας και ελλειμματικής παραγωγής της πρωτεΐνης του παράγοντα VIII. Συγκεκριμένες μη νοηματικές (nonsense) μεταλλάξεις οι οποίες οδηγούν σε νέα κωδικόνια τερματισμού, επίσης συνδέονται με βαριά αιμορροφιλία. Μεταλλάξεις τύπου θέσης συρραφής (splice site) συχνά επίσης ευθύνονται για βαριά αιμορροφιλία, αν και αναλόγως με τη θέση τους μπορεί άλλοτε να προκαλούν ήπια νόσο 32. Σε λιγότερο από το 20% των περιπτώσεων σοβαρής νόσου παρατηρούνται δυσνοηματικές (missense) μεταλλάξεις, ενώ στις υπόλοιπες περιπτώσεις, αυτού του τύπου οι μεταλλάξεις προκαλούν ενδιάμεση και ήπια αιμορροφιλία 31. Οι υπόλοιπες περιπτώσεις σοβαρής νόσου, καθώς και όλες οι περιπτώσεις με ενδιάμεση και ήπια νόσο, οφείλονται σε πολυάριθμες σημειακές μεταλλάξεις, μικρές αναστροφές και μικρές ελλείψεις, οι οποίες στο ένα τρίτο των περιστατικών είναι νέες «de novo» μεταλλάξεις. Εντωμεταξύ οι έρευνες συνεχίζονται και διαρκώς αποκαλύπτονται νέες μεταλλάξεις, ενώ επιπλέον τα αποτελέσματα πολλαπλών διεθνών μελετών μαρτυρούν πως υπάρχει ετερογένεια στη συχνότητα των διαφόρων μεταλλάξεων μεταξύ των εθνών. Σε πρόσφατη μελέτη αιμορροφιλικών ασθενών στην Αίγυπτο έγινε άμεση ανίχνευση όλων των δομικών παραλλαγών που σχετίζονται με το ιντρόνιο 22 του χρωμοσώματος F8, χρησιμοποιώντας Inverse Shifting-PCR (ανάστροφη). Ανιχνεύθηκε στο 33,3% των ασθενών ανασυνδυασμός του ιντρονίου 22 που αποτελεί μια σημαντική αιτία της αιμορροφιλίας Α. Πιο συγκεκριμένα, στο 23,3% 28

29 των ασθενών ανιχνεύθηκε η πιο συχνή ανακατανομή του χρωμοσώματος F8, η αναστροφή του ιντρονίου 22, ενώ στο 10% έλλειψη του ιντρονίου Η έλλειψη του ιντρονίου ή ο διπλασιασμός του προβλέπεται ότι προκύπτουν, εάν συμβεί ανασυνδυασμός μεταξύ όμοια προσανατολισμένων αντιγράφων. Ο σωματικός μωσαϊκισμός της αναστροφής του ιντρονίου 22 υποδηλώνει ότι αυτή η μετάλλαξη δεν είναι αποκλειστικά αποτέλεσμα της μειωτικής διαίρεσης των κυττάρων, αλλά μπορεί επίσης να συμβεί κατά τη διάρκεια των μιτωτικών κυτταρικών διαιρέσεων της πρώιμης εμβρυογένεσης είτε σε γεννητικά κύτταρα, είτε σε σωματικά κύτταρα 40. Σε πρόσφατες μελέτες έχουν αναγνωριστεί νεότερες μεταλλάξεις που οδηγούν σε βαριά μορφή αιμορροφιλίας Α. Δεκαέξι νέες μεταλλάξεις και δύο νέες αντινοηματικές μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε σχετικά πρόσφατες μελέτες 41,42 και συγκεκριμένα έχει αποδεδειχθεί η συσχέτιση τους με την ανεπάρκεια του παράγοντα FVIII, και πλέον θεωρούνται ως παράγοντες πρόκλησης βαριάς μορφής αιμορροφιλίας Α. Σε έρευνα που πραγματοποιήθηκε σε αιμορροφιλικούς ασθενείς της Ιορδανίας εντοπίστηκαν πέντε νέες μεταλλάξεις του γονιδίου F8. Μία από αυτές οφείλεται σε αλλαγή αναγνωστικού πλαισίου, που αντιστοιχεί σε εισαγωγή μιας βάσης μεταξύ των νουκλεοτιδίων c , το οποίο έχει ως αποτέλεσμα πρόωρη εισαγωγή ενός κωδικονίου λήξης στο εξόνιο 14 του γονιδίου F8. Αυτή η νέα μετάλλαξη συσχετίστηκε με σοβαρή μορφή της νόσου. Επιπλέον στη συγκεκριμένη μελέτη εντοπίστηκαν τέσσερις νέες μη νοηματικές μεταλλάξεις 47. Οι νέες μη νοηματικές μεταλλάξεις E79G και M320I σχετίζονται με μέτρια μορφή αντίστοιχα. Μία πρόσφατη έρευνα του καταδεικνύει την ύπαρξη 7 νέων μεταλλάξεων του F8 γονιδίου, σε ασθενείς με βαριά αιμορροφιλία Α από τη Βενεζουέλα. Δύο από αυτές είναι μη νοηματικές μεταλλάξεις (p.s524x και p.e1896x), που οδηγούν στην εισαγωγή ενός κωδικονίου λήξης στα εξόνια 11 και 17 του γονιδίου F8 αντίστοιχα. Άλλες 3 μεταλλάξεις σχετίζονται με την αλλαγή του αναγνωστικού πλαισίου, από τις οποίες οι 2 προέρχονται από αφαίρεση μιας μόνο βάσης, ενώ η άλλη από μια εισαγωγή μιας μοναδικής βάσης (c.3006delg, c.6535delg και c insa), στα εξόνια 14, 23 και 16 του γονιδίου F8 αντίστοιχα. Επιπλέον ανίχνευσαν μια μετάλλαξη σε σημείο συρραφής c a>t, ενώ άλλη μελέτη των Jayandharan και συν. 44 χαρακτήρισε μια διαφορετική μετάλλαξη στην ίδια θέση (c a>g). Περαιτέρω ανάλυση της συγκεκριμένης μετάλλαξης έδειξε ότι πιθανότατα προκαλεί την απώλεια του εξωνίου 11 ή τη χρήση διαφορετικού 29

30 σημείου συρραφής μέσα στο εξόνιο οδηγώντας και στις 2 περιπτώσεις στον σχηματισμό κωδικονίου λήξης. Συνοπτικά θα λέγαμε ότι: Η μετάλλαξη που σχετίζεται συχνότερα με τη βαριά μορφή της αιμορροφιλίας είναι η αναστροφή του ιντρονίου 22, η οποία ανιχνεύεται στο 45% των ασθενών με βαριά μορφή αιμορροφιλίας Α. Ακολουθεί η αναστροφή του ιντρονίου 1, η οποία απαντάται στο 2-5% των ασθενών αυτών 8,18,36. Στο υπόλοιπο 50% περίπου από τις ανιχνεύσιμες μεταλλάξεις στη βαριά αιμορροφιλία Α περιλαμβάνονται μεγάλες ελλείψεις, σημειακές (κυρίως μεταλλάξεις χωρίς νόημα), μεταλλάξεις τύπου θέσης συρραφής 36,45,46. Στις ήπιες και στις ενδιάμεσης βαρύτητας περιπτώσεις αιμορροφιλίας Α συνήθως ανιχνεύονται μικρές ελλείψεις, μικρές αναστροφές, κάποιες μεταλλάξεις χωρίς νόημα, μεταξύ των εξονίων που κωδικοποιούν τις τρεις Α περιοχές του παράγοντα VIII και δυσνοηματικές μεταλλάξεις 36, Μέθοδοι ανίχνευσης των μεταλλάξεων Για την γενετική ανάλυση της αιμορροφιλίας χρησιμοποιούνται οι παρακάτω τεχνικές ανίχνευσης των μεταλλάξεων (αναλόγως με το είδος της μετάλλαξης): Στοχευμένη ανίχνευση της μετάλλαξης o Η αναστροφή του ιντρονίου 22 μπορεί να ανιχθευθεί με τη μέθοδο ανάλυσης με Southern Blotting ή πιο πρόσφατα με PCR (μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης) μακράς αλύσου 47 ή subcycling PCR ή ανάστροφη PCR 48. o Η αναστροφή του ιντρονίου 1 τυπικά ανιχνεύεται με ανάστροφη PCR 49. Η αναζήτηση της μετάλλαξης ή ανάλυση «sequence»(αλληλουχίας αμινοξέων) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της υπεύθυνης μετάλλαξης σε άτομα με αιμορροφιλία Α που δεν φέρουν μία από τις συνήθεις αναστροφές ιντρονίων ποικίλει από 75% έως 98%, και εξαρτάται από τη μέθοδο ανίχνευσης που χρησιμοποιείται. 30

31 Η αναλυτική μέθοδος ανίχνευσης των μεταλλάξεων τύπου ελλείψεων χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μονοεξονικών, πολυεξονικών ή και μεγαλύτερων ελλείψεων στα πάσχοντα άρρενα άτομα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται και στον εντοπισμό των πιθανών θήλεων φορέων. Ακολουθεί συνοπτικός πίνακας των μεθόδων ανίχνευσης των μεταλλάξεων: Πίνακας 1. Μέθοδοι ανίχνευσης των μεταλλάξεων Μοριακή γενετική διάγνωση για την αιμορροφιλία Α Μέθοδος Στοχευμένη ανίχνευση μετάλλαξης της Μεταλλάξεις που ανιχνεύονται Αναστροφή του Συχνότητα ανίχνευσης της μετάλλαξης με τη μέθοδο Περιπτώσεις με Περιπτώσεις με βαριά ενδιάμεση αιμορροφιλία Α αιμορροφιλία Α ιντρονίου % 0% Αναστροφή ιντρονίου 1 του 3% 0% Ανίχνευση της μετάλλαξης ή sequence ανάλυση Ανάλυση των μεταλλάξεων τύπου ελλείψεων Ανίχνευση ποικιλίας μεταλλάξεων 2 F8 Ανίχνευση μονο-, πολύ-εξονικών και μεγαλύτερων ελλείψεων F8 43% 98% 6% <1% 1. Οι αναστροφές του ιντρονίου 22 μπορεί να συνοδεύονται από τμηματικές ελλείψεις γονιδίου ή διπλασιασμούς ή προσθήκες αυτού Υπάρχει μέθοδος που ανιχνεύει τις έως σήμερα γνωστές σημειακές μεταλλάξεις σε ποσοστό 96%

32 Εντοπισμός μη αναγνωρίσιμων μεταλλάξεων: Η ανάλυση της σύνδεσης γονιδίων (Linkage analysis) χρησιμοποιείται για να διαπιστώσει και να περιγράψει μια μη αναγνωρίσιμη μετάλλαξη σε μια οικογένεια και για να εντοπίσει την προέλευση (πρώτος φορέας στο οικογενειακό δέντρο) των αυτόματων (de novo) μεταλλάξεων: Όταν κατά τον έλεγχο ατόμου με αιμορροφιλία Α δεν εντοπίζεται γνωστή μετάλλαξη με τη μέθοδο της άμεσης εξέτασης του DNA, τότε μπορεί να χρησιμοποιηθεί η ανάλυση της σύνδεσης γονιδίων, ειδικά σε οικογένειες στις οποίες πάνω από ένα πάσχον άτομο δεν φέρει γνωστή μετάλλαξη στο γονίδιο του παράγοντα VIII. Η μέθοδος βασίζεται στην κλινικά σίγουρη διάγνωση αιμορροφιλίας Α στα προσβεβλημένα μέλη της οικογένειας και στην κατανόηση των γενετικών συσχετίσεων στην οικογένεια. Επιπρόσθετα, η διεξαγωγή της εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα και την προθυμία των μελών της οικογένειας να ελεγχθούν και στην παρουσία αποτελεσματικών ετεροζυγωτικών πολυμορφικών δεικτών (markers). Η χρήση έως και πέντε ενδογενών πολυμορφισμών και ενός εξωγενούς πολυμορφισμού είναι αποτελεσματική για το 80%-90% των οικογενειών. Φαινόμενα ανασυνδυασμού μεταξύ του γονιδίου του παράγοντα VIII και του εξωγενούς πολυμορφισμού συμβαίνουν στο 5% των περιπτώσεων, αλλά δεν παρατηρείται ανάλογο φαινόμενο μεταξύ των αιμορροφιλικών μεταλλάξεων και του ενδογενούς πολυμορφισμού αυτού 52. Σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% σε οικογένειες με μεμονωμένες περιπτώσεις αιμορροφιλίας Α (ένα άτομο στην οικογένεια) είναι δυνατό να εντοπισθεί ο πρώτος φορέας της de novo μετάλλαξης χρησιμοποιώντας μοριακή γενετική ανάλυση σε συνδυασμό με ανάλυση της σύνδεσης γονιδίων. Η μετάλλαξη που αναγνωρίσθηκε στο πάσχον μέλος αναζητάται στους γονείς και στους άρρενες συγγενείς της μητέρας. 32

33 6.ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Τα συμπτώματα και η βαρύτητα αυτών χαρακτηρίζονται από το ποσοστό των επιπέδων του φυσιολογικού πηκτικού παράγοντα VIII, ο οποίος ανιχνεύεται στο αίμα των αιμορροφιλικών ασθενών. Έτσι, έχουμε τη βαριά μορφή με ποσοστό έως 1% παράγοντα VIII, την ενδιάμεση μορφή ή μέσης βαρύτητας, με ποσοστό από 2-5% και την ήπια μορφή με ποσοστό από 5% και πάνω. Περίπου το 50% των αρρώστων έχει επίπεδα παράγοντα VIII <1%. Αυτοί οι ασθενείς αιμορραγούν αυτόματα, συνήθως στις αρθρώσεις, στους μύες και στα ενδοκοιλιακά όργανα. Το 10% των ασθενών με επίπεδα παράγοντα από 2-5% έχει μέσης βαρύτητας αιμορραγικό σύνδρομο με αιμορραγίες κυρίως ύστερα από τραυματισμούς. Στο υπόλοιπο 30-40% των ασθενών το επίπεδο του παράγοντα VIII κυμαίνεται από 5-30% (ή και 60%) του φυσιολογικού και οι ασθενείς αυτοί αιμορραγούν μόνο ύστερα από σημαντικά τραύματα και επεμβάσεις (χειρουργεία, οδοντιατρικές πράξεις κλπ). Πίνακας 2. Βαρύτητα αιμορροφιλίας Βαριά μορφή <1% FVIII Ενδιάμεση μορφή 2-5% FVIII Ήπια μορφή >5% FVIII 33

34 7. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ 7.1. Αιμορραγικές εκδηλώσεις Η αιμορροφιλία χαρακτηρίζεται από ελάσσονες ή μείζονες αιμορραγικές εκδηλώσεις, οι οποίες μπορεί να είναι αυτόματες, ή να συμβαίνουν μετά από τραυματισμούς και επεμβάσεις (Πιν.3 ). Πίνακας 3. Κλινικές εκδηλώσεις ΑΥΤΟΜΑΤΕΣ ΑΙΜΟΡΡΑΓΙΕΣ Ή ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΡΑΥΜΑΤΙΣΜΟΥΣ Αρθρώσεις (αίμαρθρα) Μύες (ως επιπολής ή "εν τω βάθει" μεσομύια. αιματώματα) Δέρμα (εκχυμώσεις) Βλεννογόνοι (γαστρορραγία, ρινορραγία, ουλορραγία,. αιματουρία) Εγκέφαλος (μηνιγγοεγκεφαλική αιμορραγία) ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΕΜΒΑΣΕΙΣ Εμμένουσες αιμορραγίες μετά από χειρουργεία Αιμορραγίες μετά από εξαγωγές δοντιών Αιματώματα μετά από ενδομυικές ενέσεις (απλή ενδομυϊκή ένεση είναι ικανή να προκαλέσει πολύ μεγάλα μεσομύια αιματώματα στο γλουτό) Οι συχνότερες θέσεις αιμορραγιών στην αιμορροφιλία είναι οι αρθρώσεις (αίμαρθρα). Συχνότερα προσβεβλημένες αρθρώσεις αποτελούν τα γόνατα, τα ισχία, οι αγκώνες, οι ώμοι και οι αστράγαλοι. Συχνά είναι και τα μεσομύια αιματώματα. Οι μύες που αιμορραγούν συνηθέστερα στην αιμορροφιλία βρίσκονται στο βραχίονα, στο μηρό, στη γαστροκνημία και στη βουβωνική περιοχή. Οι αιμορραγίες τόσο στις αρθρώσεις, όσο και στους μύες εκδηλώνονται με οίδημα, δυσκαμψία, θερμότητα, πόνο και παράδοξη θέση του πάσχοντος άκρου. 34

35 Τα άτομα με βαριά αιμορροφιλία Α συνήθως διαγιγνώσκονται κατά τη διάρκεια του πρώτου χρόνου ζωής 36. Σε σπάνιες περιπτώσεις βρέφη με βαριά αιμορροφιλία Α παρουσιάζουν εξωκρανιακές ή ενδοκρανιακές αιμορραγίες αμέσως μετά τη γέννηση. Συνήθως όμως οι πρώτες αιμορραγικές εκδηλώσεις εμφανίζονται με την έκφυση των πρώτων νεογιλών δοντιών και με τον τραυματισμό του χαλινού της γλώσσας ή του άνω χείλους. Τα επόμενα περιστατικά αιμορραγίας παρουσιάζονται όταν το βρέφος αρχίζει να έρπει και να κινείται αυτόνομα. Τότε παρατηρούνται επιμένουσες «αδικαιολόγητες» εκχυμώσεις σε διάφορα σημεία των χεριών, των ποδιών ή του μετώπου. Έτσι τίθενται οι πρώτες υποψίες για πιθανή διαταραχή της αιμόστασης. Όταν πλέον το βρέφος περπατά, ολοκληρώνεται η εικόνα με την εμφάνιση των πρώτων τυπικών αιμάρθρων τα οποία και αποτελούν την κύρια αιμορραγική εκδήλωση στη μετέπειτα ζωή του ασθενούς. Καθώς το παιδί αναπτύσσεται και γίνεται πιο ενεργητικό και ανεξάρτητο κινητικά, παρουσιάζει όλο και πιο συχνά αυτόματα αίμαρθρα, εκτός και αν έχει μπει σε προφυλακτική θεραπεία. Οι αυτόματες αιμορραγίες αρθρώσεων καθώς και τα εν τω βάθει μυϊκά αιματώματα χαρακτηρίζονται συνήθως, πριν ακόμα παρουσιασθεί το οίδημα, από άλγος στο πάσχον άκρο. Τα παιδιά και οι ενήλικες που δεν βρίσκονται σε προφύλαξη παρουσιάζουν κατά μέσο όρο δύο με πέντε επεισόδια αυτόματης αιμορραγίας μηνιαίως. Συνήθως όργανα στόχους αποτελούν οι αρθρώσεις, ενώ σπανιότερα οι νεφροί, ο γαστρεντερικός σωλήνας και ο εγκέφαλος. Επιπλέον τα άτομα που δεν λαμβάνουν προφύλαξη παρουσιάζουν επίμονα άλγη και αιμορραγίες μετά από ήσσονος σημασίας επεμβάσεις, όπως μικροχειρουργεία και εξαγωγές οδόντων κλπ. 24 Τα άτομα με μέτριας βαρύτητας αιμορροφιλία Α σπάνια παρουσιάζουν αυτόματες αιμορραγίες. Αν μείνουν όμως χωρίς θεραπεία, παρουσιάζουν παρατεινόμενη ή καθυστερημένη πήξη έπειτα από σχετικά μικρά τραύματα και συνήθως διαγιγνώσκονται συχνά μετά την ηλικία των τεσσάρων ετών. Η συχνότητα των επεισοδίων αιμορραγίας, όταν δεν λαμβάνουν προφυλακτική θεραπεία, ποικίλει από ένα το μήνα έως ένα το χρόνο. Τα σημεία και συμπτώματα των αιμορραγικών επεισοδίων είναι παρόμοια με αυτά της βαριάς μορφής αιμορροφιλίας Α. Άτομα με ήπιας μορφής αιμορροφιλία Α δεν παρουσιάζουν αυτόματες αιμορραγίες. Μπορεί όμως να παρουσιασθεί μη αναμενόμενη αιμορραγία μετά από μικροεπεμβάσεις, χειρουργεία και εξαγωγές οδόντων. Η συχνότητα των 35

36 αιμορραγικών επεισοδίων ποικίλλει από ένα μηνιαίως έως ένα ετησίως. Τα άτομα με ήπια αιμορροφιλία Α συχνά δεν διαγιγνώσκονται πριν να χρειασθεί να υποβληθούν σε κάποια επέμβαση ή εξαγωγή οδόντος είτε πριν τραυματισθούν σοβαρά. Οι γυναίκες φορείς γενικά είναι ασυμπτωματικές - αυτές όμως με επίπεδα δραστικού παράγοντα VIII χαμηλότερα από 35% παρουσιάζουν πιθανότητα αιμορραγίας ανάλογη με αυτή των ανδρών με ενδιάμεσης μορφής αιμορροφιλία Α. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι ήπιες αιμορραγικές εκδηλώσεις παρατηρούνται ακόμη και με επίπεδα παράγοντα μεταξύ 35% και 60% 53. Πίνακας 4. Συμπτώματα που σχετίζονται με τη βαρύτητα της κλινικής εικόνας στην αιμορροφιλία Α χωρίς θεραπεία. Βαρύτητα Επίπεδα δραστικού παράγοντα VIII Συμπτώματα Συνήθης ηλικία διάγνωσης Συχνές αυτόματες αιμορραγίες. Βαριά <1% Μη αναμενόμενη αιμορραγία έπειτα από ήσσονες επεμβάσεις, μικροχειρουργεία και εξαγωγές οδόντων μήνες Ενδιάμεση 2%-5% Δεν παρουσιάζονται αυτόματες αιμορραγίες. Μη αναμενόμενη αιμορραγία έπειτα από ήσσονες επεμβάσεις, μικροχειρουργεία και εξαγωγές οδόντων Όχι πριν την ηλικία των 3 ετών Ήπια >5% Δεν παρουσιάζονται αυτόματες αιμορραγίες. Μη αναμενόμενη αιμορραγία έπειτα από μείζονες επεμβάσεις, μεγάλα χειρουργεία και επιπλεγμένες εξαγωγές οδόντων Συνήθως όψιμα, σε μεγαλύτερη ηλικία 36

37 Επείγουσες αιμορραγικές εκδηλώσεις στη βαριά νόσο: Ανάλογα με τη θέση τους κάποιες αιμορραγίες μπορούν να προκαλέσουν άμεσες σοβαρές επιπλοκές ή ακόμα και να θέσουν σε κίνδυνο τη ζωή του ασθενούς. Τέτοιες είναι οι αιμορραγίες του κεντρικού νευρικού συστήματος, οι αιμορραγίες στην περιοχή του τραχήλου, στο γαστρεντερικό σύστημα και στην περιοχή του λαγονοψοΐτη μυ. Η αιμορραγία στο ΚΝΣ είναι η πιο επικίνδυνη εκδήλωση στους αιμορροφιλικούς ασθενείς. Η ενδοκρανιακή αιμορραγία μπορεί να είναι αυτόματη ή να ακολουθεί τραυματισμό, ακόμα και επιπόλαιο. Σε αιμορροφιλικούς ασθενείς με ναυτία, εμέτους, κεφαλαλγία, νωθρότητα, σύγχυση, διαταραχές όρασης ή απώλεια αισθήσεων πρέπει να τίθεται η υποψία ενδοκρανιακής αιμορραγίας. Επίσης, αιμορραγία στο νωτιαίο σωλήνα μπορεί να προκαλέσει παραπληγία, ενώ η πίεση περιφερικού νεύρου είναι συχνή επιπλοκή των μεσομύιων αιματωμάτων, κυρίως στα άκρα 24. Την υπόνοια αιμορραγίας στον τράχηλο θέτουν ο πόνος και το οίδημα της περιοχής, η δύσπνοια και η δυσκαταποσία. Ανάλογα, πόνος και ευαισθησία στην κοιλιακή χώρα, τυμπανισμός και/ή αίμα στα κόπρανα, μας κατευθύνουν σε αιμορραγία του γαστρεντερικού συστήματος. Τέλος, η αιμορραγία στην περιοχή του λαγονοψοΐτη μυ είναι δυνατό να διαφύγει της διάγνωσης λόγω της άτυπης συμπτωματολογίας (πόνος στην πλάτη, κοιλιακό άλγος, αιμωδίες, μειωμένη κινητικότητα χαρακτηριστική θέση του άκρου κατά την κατάκλιση). 7.2 Επιπλοκές των αιμορραγιών Συνήθεις επιπλοκές των επαναλαμβανόμενων αιμορραγιών που ταλαιπωρούν ασθενείς με αιμορροφιλία είναι: Αρθρίτιδα/ αρθροπάθεια Οστεοπόρωση Μυϊκές ατροφίες Σύνδρομο διαμερίσματος Αιμορροφιλική οδοντοπάθεια 37

38 Η αιμορροφιλική αρθροπάθεια είναι η συχνότερη επιπλοκή της αιμορραγικής νόσου 36. Συμβαίνει λόγω των επανειλημμένων αιμορραγιών μέσα στις αρθρώσεις. Οι επανειλημμένες αιμορραγίες σε μια άρθρωση έχουν σαν αποτέλεσμα την υπερτροφία του αρθρικού θύλακα με συνοδό βλάβη του αρθρικού χόνδρου και σμίκρυνση του μεσάρθριου διαστήματος. Αρχικά ο αρθρικός θύλακας και οι αρθρικές επιφάνειες διηθούνται με φλεγμονώδη κύτταρα. Στη συνέχεια οι φυσιολογικές αρθρικές επιφάνειες αντικαθίστανται από ινώδη στοιχεία. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η παραμόρφωση και αγκύλωση της άρθρωσης, ενώ συγχρόνως καταργείται προοδευτικά η κάμψη και η έκταση των σύστοιχων μυών και σταδιακά παρουσιάζονται μυικές ατροφίες στην περιοχή των συγκεκριμένων αρθρώσεων και στις σοβαρότερες περιπτώσεις παρατηρούνται αντιρροπιστικές θέσεις της σπονδυλικής στήλης. Παράλληλα, λόγω της τοπικής αχρηστίας και της μυϊκής ατροφίας, παρατηρείται μια γενικευμένη μείωση της φυσικής δραστηριότητας του ασθενούς. Το γεγονός αυτό επηρεάζει σαφώς την επίτευξη της υψηλής οστικής μάζας με αποτέλεσμα την εμφάνιση οστεοπενίας - οστεοπόρωσης. Ο χρόνιος πόνος, οι παραμορφώσεις, η δυσκαμψία των αρθρώσεων και η μειωμένη κινητικότητα αποτελούν την καθημερινότητα των αιμορροφιλικών παιδιών με σοβαρές επιπτώσεις στην ψυχολογία των ίδιων και των οικογενειών τους. Μια ήσσονος σημασίας, αλλά μη αγνοήσιμη επιπλοκή της αιμορροφιλίας είναι επίσης η αιμορροφιλική οδοντοπάθεια (δεύτερη κατά σειρά συχνότητας επιπλοκή). Οφείλεται στις επανειλημμένες αιμορραγίες στο σωλήνα της οδοντικής ρίζας με αποτέλεσμα την καταστροφή των δοντιών. Επιπλέον η ανεπαρκής μάσηση οδηγεί σε επεισόδια τραυματισμού και αιμορραγίας του γαστρικού βλεννογόνου. 38

39 8. ΔΙΑΓΝΩΣΗ Όπως προαναφέρθηκε η ηλικία της διάγνωσης της βαριάς μορφής αιμορροφιλίας είναι περίπου ο ένατος έως δωδέκατος μήνας, τα τρία χρόνια για την ενδιάμεσης βαρύτητας μορφή, ενώ για την ήπια μορφή το τέλος της παιδικής ηλικίας ή και η εφηβεία. Η διάγνωση της αιμορροφιλίας βασίζεται στην κλινική εικόνα του ασθενούς (συμπτώματα και σημεία), στο οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας, στο ατομικό ιστορικό αιμορραγικών εκδηλώσεων (ελάσσονων ή μείζονων) και τέλος στα αποτελέσματα του εργαστηριακού ελέγχου. 8.1.Εργαστηριακός έλεγχος έλεγχο: Αφού προηγηθεί ένας αδρός βιοχημικός έλεγχος, προχωρούμε στον ειδικό Δοκιμασίες πήξης Σε 1 ο επίπεδο αιμόστασης (αγγείο-αιμοπετάλιο), τα ευρήματα είναι φυσιολογικά. Αυτό σημαίνει ότι τα αιμοπετάλια είναι φυσιολογικά ως προς τον αριθμό και τη λειτουργικότητά τους (προσκόληση, ενεργοποίηση,συσσώρευση). Σε 2 ο επίπεδο και σε ότι αφορά τις δοκιμασίες ελέγχου της επάρκειας του πηκτικού μηχανισμού διαπιστώνεται η ακόλουθη εικόνα : α) ο χρόνος προθρομβίνης (PT, ελέγχει την εξωγενή οδό της πήξης) είναι φυσιολογικός. β) αντίθετα, ο χρόνος μερικής θρομβοπλαστίνης είναι αυξημένος 32 (aptt, ελέγχει την ενδογενή οδό, αξιολογείται υπό την προϋπόθεση ότι τα επίπεδα του ινωδογόνου είναι φυσιολογικά) Επίπεδα παράγοντα VIII Τη διάγνωση θα θέσει η μέτρηση των επιπέδων του παράγοντα VIII. Τα επίπεδα του πηκτικού παράγοντα VIII είναι σημαντικά ελαττωμένα, ενώ ο παράγοντας Willebrand (αντιγονικός και λειτουργικός) είναι φυσιολογικός (vwfag =100%, vwf =100%). 39

40 8.1.3.Γενετική διάγνωση Η διάγνωση στηρίζεται στην ανάλυση του DNA του γονιδίου του παράγοντα VIII:C και πραγματοποιείται με απομόνωση του γονιδίου του παράγοντα και αναζήτηση της υπεύθυνης μετάλλαξης. Ο ακόλουθος πίνακας συνοψίζει την εργαστηριακή εικόνα. Πίνακας 5. Διάγνωση Εργαστηριακή εικόνα Γενική αίματος / αιμοπετάλια: κφ Βιοχημικός έλεγχος: κφ Έλεγχος πήξης : PTT παρατεταμένος, PT και λοιποί χρόνοι φυσιολογικοί Επίπεδα παράγοντα VIII: ελαττωμένα Γενετικός έλεγχος: ανίχνευση της υπεύθυνης μετάλλαξης 8.2.Διαφορική Διάγνωση Όταν ένα άτομο παρουσιάζεται με αιμορραγία ή ιστορικό αιμορραγιών, το πρώτο βήμα για τον εξεταστή είναι να αποφασίσει εάν πραγματικά πρόκειται για αιμορραγία μη φυσιολογική, μη αναμενόμενη. Μια επίμονη αιμορραγία μετά από ένα σοβαρό τραυματισμό ή μια αμυγδαλεκτομή, ή μια αιμορραγία που επιμένει για λίγες ώρες μετά από μια εξαγωγή δοντιού, ίσως και να μην είναι αξιολογήσιμη. Αντίθετα, μια επιμένουσα ή υποτροπιάζουσα διόγκωση για αρκετές ημέρες μετά από μια εξαγωγή δοντιού ή μια μικροεπέμβαση στη στοματική κοιλότητα, η υποτροπή αιμορραγίας ή το αυξανόμενο άλγος και οίδημα μετά από ένα χειρουργείο, καθώς και 40

41 η ανάπτυξη αιματώματος αρκετές ημέρες μετά από μία επέμβαση, σχεδόν πάντα υποδεικνύουν ότι υπάρχει διαταραχή της πήξης του αίματος. Ένα λεπτομερές ιστορικό του πάσχοντα θα κατευθύνει τη διάγνωση είτε προς μία κληρονομούμενη κατάσταση είτε προς μια επίκτητη και συχνά προσωρινή διαταραχή 24,36. Όταν πλέον έχει τεθεί σοβαρά η υποψία της αιμορροφιλίας, ένα οικογενειακό ιστορικό με στοιχεία που να μαρτυρούν μια αυτοσωματική επικρατούσα ή μια φυλοσύνδετη κληρονομικότητα προσανατολίζει με σχετική βεβαιότητα προς τη διάγνωση της συγκεκριμένης αιμορραγικής διαταραχής. Η αιμορροφιλία Α και η αιμορροφιλία Β κληρονομούνται και οι δύο με το X- φυλοσύνδετο χαρακτήρα. Κάποιες οικογένειες με ήπια αιμορροφιλία Α έχουν λανθασμένα διαγνωσθεί ως πάσχοντες από νόσο von Willebrand, επειδή άρρενα και θήλεα μέλη παρουσιάζουν αιμορραγικές εκδηλώσεις. Χάρη στις νεότερες βελτιωμένες μεθόδους διάγνωσης πλέον αναγνωρίζονται οι περιπτώσεις εκείνες των γυναικών οι οποίες δεν πάσχουν από von Willebrand, αλλά είναι συμπτωματικοί φορείς αιμορροφιλίας Α. Η λεπτομερής φυσική εξέταση αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για τη διάγνωση. Ένα μεγαλύτερο άτομο με βαριά ή ενδιάμεση αιμορροφιλία Α μπορεί να παρουσιάζει δυσλειτουργία ή δυσμορφίες αρθρώσεων ή μυών. Επίσης είναι δυνατόν να παρατηρηθούν αδικαιολόγητες (χωρίς ιστορικό πρόσφατου τραυματισμού) ευμεγέθεις εκχυμώσεις και υποδόρια αιματώματα. Άτομα με ήπια διαταραχή συνήθως δεν παρουσιάζουν τέτοια κλινικά σημεία αιμορραγικής διάθεσης παρά μόνο μετά από σοβαρό τραυματισμό. Από την άλλη οι πετεχειώδεις αιμορραγικές εκδηλώσεις προσανατολίζουν προς μια σοβαρή θρομβοπάθεια και δεν είναι χαρακτηριστικό της αιμορροφιλίας. Η αιμορροφιλία Α είναι μονάχα μία από τις διάφορες χρόνιες αιμορραγικές διαταραχές. Ο ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός των παραγόντων πήξης αποτελεί τη βασική διαγνωστική μέθοδο. Άλλες κληρονομικές διαταραχές της πήξης που πρέπει να αποκλειστούν περιλαμβάνουν τις παρακάτω: Nόσος von Willebrand (VWD) Ηπια συνδυασμένη ανεπάρκεια παραγόντων V και VIII Αιμοροφιλία Β Ανεπάρκεια του παράγοντα XI 54 41

42 Ανεπάρκειες παράγοντα XII, προκαλλικρείνης ή υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνου Ανεπάρκειες παραγόντων II (προθρομβίνη), V, X καιvi I56 Διαταραχές του ινωδογόνου 56 Ανεπάρκεια του παράγοντα XIII 56 Διαταραχές της λειτουργίας των αιμοπεταλίων 9. ΘΕΡΑΠΕΙΑ 9.1.Αναπλήρωση του ελλείποντα παράγοντα Τις τελευταίες 4 δεκαετίες έχει βελτιωθεί σημαντικά τόσο το προσδόκιμο επιβίωσης για τα άτομα με αιμορροφιλία Α 55, όσο και η ποιότητα ζωής χάρη στην ενδοφλέβια χορήγηση σκευασμάτων παράγοντα VIII. Ο παράγοντας χορηγείται κατ επίκληση («on demand») σε αιμορραγικά επεισόδια και χειρουργεία, και ως προφυλακτική θεραπεία είτε στο νοσοκομείο, είτε στο σπίτι μετά από εκπαίδευση των γονέων και αργότερα των ίδιων των ασθενών, στην ενδοφλέβια χορήγηση των σκευασμάτων. 9.2.Επιπλοκές θεραπείας Μετάδοση λοιμώξεων Αρχικά χορηγήθηκαν πλασματικοί παράγοντες. Η εφαρμογή τους αποτέλεσε επανάσταση στη θεραπεία των αιμορροφιλικών. Η μετάδοση όμως σοβαρών λοιμώξεων κατά τη μετάγγιση (ηπατίτιδες, AIDS) αποτέλεσε για δεκαετίες το σημαντικότερο πρόβλημα των ασθενών και των θεράποντων ιατρών. Με την έναρξη χορήγησης ανασυνδυασμένων παραγόντων VIII (περίπου από 15ετίας), καθώς και με 42

43 την επίτευξη, με τις εξελιγμένες εργαστηριακές μεθόδους, σκευασμάτων πλασματικού παράγοντα υψηλής καθαρότητας, έπαψε ουσιαστικά η μετάδοση ιών να αποτελεί πρόβλημα στη θεραπεία της αιμορροφιλίας Α (εξαίρεση αποτελούν ο ιός της ηπατίτιδας Α και ο Parvo B19 καθώς παρά τις σύγχρονες μεθόδους δεν επιτυγχάνεται συχνά η πλήρης κάθαρση του πλάσματος από αυτούς 56 ) Αναστολείς Σημαντικός αριθμός παιδιών με αιμoρρoφιλία Α (15-30%) αναπτύσσoυν αντισώματα - αναστoλείς έναντι τoυ παράγoντα VIII (FVIII-inh). H ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι του παράγοντα VIII σε ασθενείς με αιμορροφιλία Α αποτελεί ένα γεγονός που εξαρτάται από τα Τ βοηθητικά κύτταρα και περιλαμβάνει επίσης τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, καθώς και τα Β-λεμφοκύτταρα 57,58. H ανάπτυξη των αναστoλέων επηρεάζει σημαντικά τη νoσηρότητα και τη θνητότητα των παιδιών με αιμoρρoφιλία 58,59. H ανάπτυξη των αναστoλέων απoτελεί σoβαρή επιπλoκή της θεραπείας είτε με συμπυκνωμένoυς παράγoντες πρoερχόμενoυς από πλάσμα (pdfviii), είτε με τους βιoτεχνoλoγικά παραγόμενoυς (rfviii). Τo 70% των παιδιών πoυ αναπτύσσoυν αναστoλείς παρoυσιάζoυν υψηλό τίτλo αντισωμάτων (FVIIIinh>5ΒU). Ασθενείς με αιμoρρoφιλία πoυ παρoυσιάζoυν τίτλo αντισωμάτων <5BU θεωρoύνται "χαμηλoί απαντητές" (low responders, LR), ενώ όταν o τίτλoς των ανασταλτών είναι >5BU θεωρoύνται "υψηλoί απαντητές" (high responders, HR). Η παρoυσία υψηλoύ τίτλoυ αναστoλέων δυσκoλεύει και περιπλέκει την αντιμετώπιση των παιδιών με αιμoρρoφιλία, πoλλαπλασιάζει τo κόστoς θεραπείας και επηρεάζει σημαντικά τη νoσηρότητα και θνητότητα από τη νόσo, λόγω των συχνών και μερικές φορές δύσκολα αντιμετωπίσιμων αιμoρραγικών επεισoδίων 9,11,12. Η παθογένεια της ανάπτυξης αναστολέων είναι πολυπαραγοντική. Τo θετικό oικoγενειακό ιστoρικό αναστολέων, η φυλή (Αφροαμερικανοί), η χoρήγηση τoυ παράγoντα πρo της ηλικίας των 2 ετών, το εντατικό σχήμα κατά την έναρξη θεραπείας, ο τύπος του χορηγούμενου παράγοντα, η εναλλαγή προϊόντων και η βαρύτητα της αιμoρρoφιλίας είναι παράγoντες πoυ αυξάνoυν την πιθανότητα εμφάνισης αναστoλέων 60. Τέλος σημαντικό ρόλο παίζει ο τύπος της μετάλλαξης και ο γονότυπος HLA (πιν.6). 43

44 Πίνακας 6. Παράγοντες κινδύνου για εμφάνιση αναστολέα Βαρύτητα νόσου Οικογενειακό ιστορικό Φυλή Μικρή ηλικία έναρξης (<2 ετών) Εντατικό σχήμα κατά την έναρξη θεραπείας (χειρουργικές επεμβάσεις, σημαντικές αιμορραγίες που απαιτούν υψηλές δόσεις ή παρατεταμένο χρόνο θεραπείας) Είδος χορηγούμενου παράγοντα VIII (πλασματικός ή ανασυνδυασμένος) εναλλαγή σκευασμάτων Γονότυπος HLA Τύπος μετάλλαξης Ολοένα και περισσότερες μελέτες σχετικά με τους παράγοντες κινδύνου στην ανάπτυξη αναστολέα αφορούν τον τύπο της μετάλλαξης του γονιδίου του FVIII. Συγκεκριμένα ασθενείς με μεγάλες ελλείψεις γονιδίων, μη νοηματικές μεταλλάξεις και ενδοχρωμοσωμικές αναστροφές εμφανίζουν σχετικά υψηλότερο κίνδυνο σε σχέση με ασθενείς που φέρουν μικρές ελλείψεις/ενθέσεις και μεταλλάξεις των σημείων συρραφής 60. Ασθενείς με αναστροφή του ιντρονίου 22 βρέθηκαν να έχουν την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης αναστολέων 50 (πιν.7). 44

45 Πίνακας 7. Συσχέτιση μεταλλάξεων με την ανάπτυξη αναστολέα ΥΨΗΛΗ Μεγάλες ελλείψεις Μη νοηματικές μεταλλάξεις Αναστροφές (αναστροφή του ιντρονίου 22 ) ΧΑΜΗΛΗ Μικρές ελλείψεις/ενθέσεις Δυσνοηματικές μεταλλάξεις Μεταλλάξεις σε θέσεις συρραφής Ωστόσο κάποιες οικογενειακές μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι η μετάλλαξη από μόνη της δεν παρέχει επαρκή πληροφόρηση για την κατανόηση της ανάπτυξης του αναστολέα 60. Η ανοσολογική απάντηση του ασθενούς είναι παράγοντας υψηλού κινδύνου. Τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (ΜΗC) της τάξης ΙΙ παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο, καθώς καθορίζουν τα πεπτίδια που προσδένονται και παρουσιάζονται στα Τ-λεμφοκύτταρα. Διάφορα αλληλόμορφα της τάξης ΙΙ έχει προταθεί ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη αναστολέα, ωστόσο οι συσχετίσεις που έχουν προκύψει μέχρι σήμερα είναι περιορισμένες και η συνολική επίδραση του συμπλέγματος ΜΗC δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Επιπλέον γενετικοί παράγοντες που έχουν προταθεί περιλαμβάνουν πολυμορφισμούς των γονιδίων που κωδικοποιούν την Ιντερλευκίνη 10 (ΙL-10), τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων TNF-a και το αντιγόνο των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων CTLA Σχήματα θεραπείας Η θεραπεία της αιμορροφιλίας σήμερα συνίσταται στην: 1) αντιμετώπιση των οξέων αιμορραγικών επεισοδίων, 2) προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης, 3) εναλλακτική μορφή θεραπείας (DDAVP), 4) αντιμετώπιση των αναστολέων, 5) αντιμετώπιση της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας, και 6) θεραπείες υπό έρευνα

46 Αντιμετώπιση των οξέων αιμορραγικών επεισοδίων Διακρίνεται: ι) στην λήψη απλών ανακουφιστικών βοηθητικών μέτρων και ιι) στην θεραπεία υποκατάστασης. ι) Λήψη απλών ανακουφιστικών βοηθητικών μέτρων: Ο πόνος αντιμετωπίζεται στις περισσότερες περιπτώσεις με πάγο, ακινητοποίηση και ανύψωση άκρου και με τη χορήγηση κοινών αναλγητικών, απαγορεύεται όμως χορήγηση της ασπιρίνης και από τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη όσα παρατείνουν τη δράση τους πέραν των 3-4 ωρών. Δεν επιτρέπεται η χρήση αναλγητικών σε ενδομυικές ενέσεις (οι οποίες απαγορεύονται αυστηρά για κάθε είδος φαρμάκου εξαιτίας των αιματωμάτων που προκαλούν). ιι) Θεραπεία υποκατάστασης: Είναι η θεραπεία που γίνεται κάθε φορά με την ευκαιρία αιμορραγικού επεισοδίου. Πρόκειται για θεραπεία υποκατάστασης κατ επίκληση. Έχει παρατηρηθεί σημαντική ανακουφιστική δράση με τη χορήγηση του θεραπευτικού παράγοντα. Αυτή τις περισσότερες φορές είναι ψυχολογική, αφού ο παράγοντας δεν προλαβαίνει να δράσει αιμοστατικά. Σήμερα η θεραπεία υποκατάστασης πραγματοποιείται με συμπυκνωμένους πλασματικούς παράγοντες VIII (20-30x πιο πυκνούς από το πλάσμα και υποδεκαπλάσιους σε όγκο) και με ανασυνδυασμένους παράγοντες. Η θεραπεία πρέπει να ξεκινήσει άμεσα με την αναγνώριση του αιμορραγικού επεισοδίου, εάν είναι δυνατόν και μέσα στην πρώτη ώρα 62. Η επιλογή των θεραπευτικών μέσων είναι συνάρτηση των επιπέδων του παράγοντα VIII του ασθενούς, της συχνότητας και της βαρύτητας των αιμορραγικών επεισοδίων και της παρουσίας αναστολέα 63. Η άριστη δόση εξατομικεύεται κάθε φορά ανάλογα με τη βαρύτητα της αιμορραγικής εκδήλωσης, καθώς και με το βάρος του σώματος (ΒΣ) του ασθενή. Η δόση του παράγοντα VIII εκφράζεται σε Διεθνείς Μονάδες (IU), οι οποίες σχετίζονται με το πρότυπο του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για τα προϊόντα τα οποία περιέχουν παράγοντα VIII. Η δραστικότητα του παράγοντα VIII στο πλάσμα εκφράζεται είτε ως ποσοστό (σε σχέση με το φυσιολογικό ανθρώπινο πλάσμα), είτε σε IU (σε σχέση με το διεθνές πρότυπο για τον παράγοντα VIII στο πλάσμα). Μία IU δραστικότητας του παράγοντα VIII ισοδυναμεί με εκείνη την ποσότητα του παράγοντα που περιέχεται σε ένα ml φυσιολογικού ανθρώπινου 46

47 πλάσματος. Ο υπολογισμός της απαιτούμενης δόσης παράγοντα VIII βασίζεται στο εμπειρικό εύρημα ότι 1 IU παράγοντα VIII ανά κιλό σωματικού βάρους αυξάνει τη δραστικότητα του παράγοντα VIII του πλάσματος κατά 2 IU/dl. Η δόση καθορίζεται με βάση τον ακόλουθο τύπο: Απαιτούμενες μονάδες (IU) = (σωματικό βάρος σε κιλά) x (επιθυμητή αύξηση του παράγοντα VIII %) x 0,5 Σε περιπτώσεις προγραμματισμένης χειρουργικής επέμβασης η κάλυψη φθάνει μέχρι 100μονάδες/kgΒΣ. Στις σοβαρές αιμορραγίες (όπως γαστρορραγία ή ενδοκρανιακή αιμορραγία) η δόση στην οξεία φάση πρέπει να αυξήσει το επίπεδο του παράγοντα στο %. Η θεραπεία συνεχίζεται μέχρι να σταματήσει η αιμορραγία διατηρώντας τα επίπεδα του παράγοντα VIII στο 20-40%. Η διάρκεια της θεραπείας εξαρτάται από την αιμορραγική εκδήλωση Προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης στα παιδιά 64 Αναλόγως της συχνότητας των αιμορραγικών επεισοδίων που παρουσιάζει ο μικρός ασθενής στις αρθρώσεις αποφασίζεται το αν, το πότε και το πόσο συχνά θα χορηγηθεί προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης με σκευάσματα του ελλείποντα παράγοντα. Η έγκαιρη έναρξη προφύλαξης έχει βρεθεί ότι ελαττώνει τη συχνότητα των αιμορραγικών επεισοδίων και τις επιπλοκές τους, είτε πρώιμες (δυσκαμψία, πόνος), είτε απώτερες (αιμορροφιλική αρθροπάθεια, οδοντοπάθεια,κλπ) 65. Για μακροπρόθεσμη προφύλαξη κατά των αιμορραγιών σε ασθενείς με βαριά αιμορροφιλία Α, οι συνήθεις δόσεις είναι 20 έως 40 IU παράγοντα VIII ανά κιλό σωματικού βάρους ανά διαστήματα 2 έως 3 ημερών. Σε ασθενείς ηλικίας κάτω των 6 ετών, συνιστώναι δόσεις των 20 έως 50 IU παράγοντα VIII ανά κιλό σωματικού βάρους 3-4 φορές την εβδομάδα. Η συχνότητα των εβδομαδιαίων δόσεων της προφυλακτικής θεραπείας με σκευάσματα συμπυκνωμένων παραγόντων ποικίλει αναλόγως με το ποσοστό του παράγοντα VIII στο αίμα, τη συχνότητα και τη βαρύτητα των αιμορραγικών επεισοδίων, τις ήδη υπάρχουσες επιπλοκές. Τέλος διαφοροποιούνται τα θεραπευτικά πρωτόκολλα από κράτος σε κράτος. Σχετικά με το χρόνο έναρξης της προφυλακτικής 47

48 θεραπείας των βρεφών οι γνώμες διίστανται. Μπορεί να αρχίσει από το πρώτο ή δεύτερο έτος της ζωής του αιμορροφιλικού βρέφους και είναι συνάρτηση της συχνότητας και της σοβαρότητας των αιμορραγικών επεισοδίων. Πρέπει πάντα να λαμβάνονται υπόψην οι δυσκολίες και οι πιθανές επιπλοκές των συχνών φλεβοκεντήσεων 66. Έτσι βασική προϋπόθεση είναι η εκπαίδευση των γονέων στη χορήγηση των παραγόντων και σε περιπτώσεις που καθίσταται αναγκαία η εξασφάλιση των απαραίτητων όρων (προσπέλαση των φλεβών με τοποθέτηση καθετήρα Hickmann ή Broviac). Τέλος, κατά το σχεδιασμό του θεραπευτικού σχήματος, τόσο ως προς την έναρξη, όσο και ως προς την επιλογή εντατικού σχήματος, συνυπολογίζεται και ο κίνδυνος ανάπτυξης αναστολέα Εναλλακτική μορφή θεραπείας (DDAVP) Στις περιπτώσεις ήπιας και σε κάποιες περιπτώσεις ενδιάμεσης βαρύτητας αιμορροφιλίας και κυρίως για βλεννοδερματικές αιμορραγίες, χρησιμοποιείται αποτελεσματικά η ημισυνθετική βαζοπρεσσίνη, η οποία έχει την ικανότητα να απελευθερώνει από τις αποθήκες των αγγείων τα αποθέματα του οργανισμού σε παράγοντα VIII Αντιμετώπιση των αναστολέων Για την αντιμετώπιση της αιμoρραγίας σε ασθενείς που παρουσιάζουν αναστολείς έχoυν χρησιμoπoιηθεί πoικίλα θεραπευτικά μέσα πoυ στoχεύoυν στη δημιoυργία θρόμβoυ και την ανάσχεση της αιμoρραγίας, όπως πολύ υψηλές δόσεις παράγoντα VIII ή πρoϊόντα πoυ παρακάμπτoυν την ενδoγενή oδό της πήξης, όπως τo ενεργοποιημένο πρoθρoμβινικό σύμπλεγμα (apcc) και o ανασυνδυασμένoς ενεργοποιημένος παράγoντας VIIa (rfviia). Θεραπεία εκλoγής για την εκρίζωση τoυ αναστoλέα απoτελεί η θεραπεία ανoσoανoχής (immune tolerance therapy, ITT), πoυ επιτυγχάνεται με συχνές εγχύσεις υψηλών δόσεων παράγoντα VIII (FVIII). Η ITT απoδίδει περισσότερo όσo νωρίτερα εφαρμόζεται και όταν o FVIII-inh είναι <5BU πριν την έναρξη της ΙΤΤ 5. Η απάντηση στη θεραπεία ανoσoανoχής ποκίλλει. Σχετικά με τον τύπο της υπεύθυνης μετάλλαξης, έχει βρεθεί ότι για τα άτομα που παρουσιάζουν μεγάλες ελλείψεις δεν αναμένεται ανάλογη ανταπόκριση στη θεραπεία 48

49 ανoσoανoχής με αυτά που παρουσιάζουν άλλου τύπου μεταλλάξεις 67. Σε παιδιά HR με πρoβληματική πoρεία νόσoυ αναζητείται η επιλoγή κατάλληλoυ παράγoντα πoυ θα πρoκαλoύσε ταχύτατη πτώση τoυ τίτλου του αναστολέα (FVIII-inh), ώστε να εφαρμoσθεί ITT. Τo αντι-cd20 χιμαιρικό μoνoκλωνικό αντίσωμα έχει ήδη χρησιμoπoιηθεί απoτελεσματικά σε νoσήματα αυτoάνoσης αιτιoλoγίας (αυτoάνoση αιμoλυτική αναιμία, συστηματικός ερυθηματώδης λύκoς, ρευματoειδής αρθρίτιδα), καθώς και σε άτoμα με επίκτητη αιμoρρoφιλία πoυ έχoυν αναπτύξει αναστολείς. To αντι-cd20 χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα αποτελείται από ένα σταθερό τμήμα ανθρώπειου IgG1κ αντισώματος και από μεταβλητές περιοχές της ελαφριάς και της βαριάς αλυσίδας του IgG αντισώματος που προέρχονται από ποντίκι. Η σύνθεση μέρους του μονοκλωνικού αντισώματος από άνθρωπο συντελεί ώστε το σκεύασμα να έχει μειωμένη αντιγονικότητα και να προκαλεί λιγότερες αλλεργικές αντιδράσεις. Το CD20 είναι διαμεμβρανικό αντιγόνο (37-kd φωσφοπρωτεΐνη) στην επιφάνεια των Β- λεμφοκυττάρων που επηρεάζει την ενεργοποίηση των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και τη μετάβασή τους από τη φάση G1 του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στη φάση S, ενεργοποιώντας το κανάλι διαύλου του ασβεστίου. Εμφανίζεται στα τελικά στάδια διαφοροποίησης του Β-λεμφοκυττάρου και δεν εκφράζεται στο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο, ούτε σε άλλους φυσιολογικούς ιστούς. Για το λόγο αυτό, το CD-20 αντιγόνο είναι ιδανικό για θεραπεία-στόχο, καθώς δεν προκαλεί τοξικότητα από άλλα συστήματα Αντιμετώπιση της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Η σημαντικότερη αντιμετώπιση της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας είναι η έγκαιρη αντιμετώπιση των οξέων αιμορραγικών επεισοδίων και η προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης. Επικουρικό, αλλά επίσης σημαντικό ρόλο, έχει αφενός η συστηματική φυσιοθεραπεία-κινησιοθεραπεία τόσο κατά την περίοδο που δεν υπάρχουν προβλήματα όσο και κατά την περίοδο αμέσως μετά την επίσχεση της αιμορραγίας (με τη σύγχρονη κάλυψη παραγόντων), αφετέρου η άθληση (συγκεκριμένα αθλήματα πχ.κολύμβηση και υπό ειδικούς όρους) με σκοπό την ενδυνάμωση των μυών, την καλή φυσική κατάσταση και τη βελτίωση της ψυχολογίας του παιδιού. Τέλος, κάποιες φορές, σε βαριές ή παραμελημένες περιπτώσεις έχουν θέση άλλες μέθοδοι όπως η χειρουργική υμενεκτομή, ανοιχτή ή αρθροσκοπική, και η ισοτοπική υμενεκτομή. 49

50 Πίνακας 8. Θεραπεία της αιμορροφιλίας Α α. Αντιμετώπιση των οξέων αιμορραγικών επεισοδίων έγκαιρα (Οξέα αιμορραγικά επεισόδια, οδοντιατρικές πράξεις, χειρουργεία) 1)πάγος, ακινητοποίηση, ανύψωση άκρου 2)χορήγηση παράγοντα VIII κατ επίκληση (on demand) Πλασματικοί Ανασυνδυασμένοι παράγοντες β. Προφυλακτική χορήγηση ( 2-3 φορές εβδομαδιαίως) χορήγηση παράγοντα VIII Πλασματικοί Ανασυνδυασμένοι παράγοντες γ. DDAVP (ήπια και ενδιάμεση μορφή) (Βλεννοδερματικές αιμορραγίες) δ. Αντιμετώπιση της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Προφύλαξη, φυσιοθεραπεία, άθληση, ορθοπαιδικές επεμβάσεις Θεραπείες υπό έρευνα Ένα νέο σκεύασμα συμπυκνωμένου παράγοντα VIII με σημαντικά παρατεταμένο χρόνο δράσης εγκρίθηκε πρόσφατα από τον FDA για κλινικές μελέτες. Η κυκλοφορία ενός τέτοιου σκευάσματος θα σημαίνει σαφώς καλύτερη συμμόρφωση των μικρών ασθενών στη θεραπεία, συνεπώς και αποτελεσματικότερη προφύλαξη, αφού οι εβδομαδιαίες εγχύσεις θα μειωθούν από τρεις με τέσσερις σε μία την εβδομάδα 68. Συνεχίζονται οι έρευνες στον τομέα της ανοσολογίας των αναστολέων με σκοπό την αντιμετώπισή τους και τη βελτίωση των μεθόδων ανοσοανοχής 69. Οι περισσότερες κλινικές μελέτες για γονιδιακή θεραπεία στην αιμορροφιλία Α είναι σχετικά στάσιμες λόγω της αδυναμίας να επιτευχθεί σε σημαντικό βαθμό έκφραση του γονιδίου του παράγοντα VIII σε ασθενείς με αιμορροφιλία Α λόγω του μεγέθους του. Πάραυτα οι επιστήμονες συνεχίζουν τις προσπάθειές τους με νέες κλινικές μελέτες

51 10.ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ Τα άτομα με αιμορροφιλία που παρακολουθούνται σε ειδικά κέντρα αντιμετώπισης αιμορροφιλίας (HTCs) παρουσιάζουν χαμηλότερη θνησιμότητα από αυτά που δεν παρακολουθούνται 71. Τα μικρά παιδιά με ενδιάμεση ή βαριά μορφή αιμρροφιλίας πρέπει να επισκέπτονται τα ειδικά ιατρεία σε κάθε εμμένον αιμορραγικό επεισόδιο και σε τακτική βάση τουλάχιστον κάθε 6 με 12 μήνες για να ενημερώνεται το ιστορικό τους σχετικά με τη συχνότητα και τη διάρκεια των αιμορραγικών επεισοδίων και αναλόγως να τροποποιείται η θεραπεία τους. Η παρακολούθηση πρέπει επιπλέον να περιλαμβάνει εκτίμηση (κλινική και απεικονιστική) των αρθρώσεων-στόχος, τακτικό έλεγχο αναζήτησης αναστολέων, έλεγχο για λοιμώξεις. Τέλος, στις τακτικές επισκέψεις των οικογενειών είναι καλό να συζητώνται και εάν είναι δυνατόν να επιλύονται τα διάφορα προβλήματα και οι δυσκολίες που αντιμετωπίζουν στην καθημερινότητά τους οι μικροί ασθενείς λόγω της νόσου. Ο έλεγχος για την ανάπτυξη αναστολέων στα άτομα με βαριά αιμορροφιλία αρχικά πραγματοποιείται κάθε 3-6 μήνες μετά την πρώτη θεραπεία υποκατάστασης με τον ελλείποντα παράγοντα, ενώ μετά περίπου τις πρώτες 100 εγχύσεις αρκεί ένας έλεγχος ετησίως. Μεγαλύτερα παιδιά με ενδιάμεση ή βαριά μορφή αιμορροφιλίας πρέπει επίσης να επισκέπτονται τα ειδικά ιατρεία σε τακτική βάση. Η παρακολούθηση τους πρέπει επίσης να περιλαμβάνει εκτίμηση (κλινική και απεικονιστική) των αρθρώσεων-στόχος, τακτικό έλεγχο αναζήτησης αναστολέων και έλεγχο για λοιμώξεις, καθώς και συζήτηση με τους νεαρούς αιμορροφιλικούς για τις πιθανές δυσκολίες που αντιμετωπίζουν καθημερινά (π.χ. συμμόρφωση στη θεραπεία κατά την εφηβεία κλπ). Άτομα με ήπια αιμορροφιλία Α επισκέπτονται τα ειδικά ιατρεία κάθε 2-3 χρόνια. Τι πρέπει να αποφεύγεται: Δραστηριότητες που παρουσιάζουν σημαντικό κίνδυνο τραυματισμού, ειδικά στην περιοχή της κεφαλής. Η ασπιρίνη και προιόντα που την περιέχουν. 51

52 Τα καλλυντικά και τα φάρμακα που περιέχουν ουσίες που μπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία των αιμοπεταλίων πρέπει να χρησιμοποιούνται με προσοχή. 11.ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΕΛΕΓΧΟΥ Κατά τον έλεγχο των πασχόντων μελών μιας οικογένειας διενεργείται μοριακή γενετική ανάλυση για να προσδιορισθεί η υπεύθυνη μετάλλαξη, με σκοπό τη γενετική καθοδήγηση των μελών της οικογένειας. Σε μεμονωμένες περιπτώσεις αιμορροφιλίας σε μια οικογένεια η αναγνώριση της υπεύθυνης μετάλλαξης βοηθά σημαντικά στην πρόβλεψη της κλινικής εικόνας και της πιθανότητας να αναπτύξει ο πάσχον αναστολέα έναντι του παράγοντα VIII. Η αναγνώριση και ο έλεγχος των φορέων προϋποθέτει τη γνώση της υπεύθυνης μετάλλαξης (οι φορείς είναι ετεροζυγώτες σε μία Χ φυλοσύνδετη διαταραχή και μπορεί να παρουσιάσουν κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου). Επίσης, η προγεννητική διάγνωση καθώς και η προεμφυτευτική διάγνωση προϋποθέτουν τη γνώση της υπεύθυνης μετάλλαξης Γενετικά σχετιζόμενες διαταραχές Δεν αναφέρονται κλινικά σύνδρομα με διαφορετικό φαινότυπο που να συσχετίζονται με μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα VIII Έλεγχος των συγγενών Αναγνώριση των πιθανών φορέων και πασχόντων. Ένα αναλυτικό ιστορικό μπορεί να οδηγήσει στην αναγνώριση φορέων, αλλά και πασχόντων συγγενών (πριν την κλινική εκδήλωση), ειδικά σε οικογένειες με ήπια αιμορροφιλία Α. 52

53 Προγενετική διάγνωση: Αφού προσδιοριστεί το φύλλο του εμβρύου προχωρούμε στη μέτρηση του παράγοντα στο εμβρυικό αίμα των αρρένων εμβρύων που λαμβάνεται από τον ομφάλιο λώρο με εμβρυοσκόπηση ή με υπερηχογραφική καθοδήγηση. Η πρόοδος όμως στην τεχνολογική εξέλιξη της μοριακής βιολογίας συντόμευσε σημαντικά τη χρονική δυνατότητα της προγενετικής διάγνωσης (κατά 8-10 εβδομάδες, γεγονός που ελαχιστοποίησε τις επιπλοκές από την παρέμβαση στη διάρκεια προχωρημένης κύησης). Έτσι την 8-10 εβδομάδα της κύησης λαμβάνεται τμήμα τροφοβλάστης από τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη. Ακολουθεί ανάλυση του DNA του παράγοντα VIII και αναζήτηση πιθανής μετάλλαξης. Αξιολόγηση των θήλεων φορέων: Περίπου ένα 10% των φορέων παρουσιάζουν δραστικότητα παράγοντα VIII χαμηλότερη από το 30%-35% της φυσιολογικής και μπορεί να παρουσιάζουν αιμορραγίες οι ίδιες 54. Είναι απαραίτητο λοιπόν όλες οι μητέρες και οι κόρες αιμορροφιλικών ανδρών να υποβάλλονται σε ένα βασικό έλεγχο με μέτρηση των δραστικών επιπέδων του παράγοντα VIII. Δεν χρειάζεται να ελεγχθούν αυτές που έχουν υποβληθεί σε γενετικό έλεγχο στον οποίο αποδείχθηκε ότι δεν είναι φορείς αιμορροφιλίας. στην αρχή της. Είναι απαραίτητο να διαπιστώνεται η πιθανή φορεία πριν την εγκυμοσύνη, ή Πιθανότητα φορείας ή νόσου στους συγγενείς άρρενος πάσχοντος: Ο πατέρας του πάσχοντος αιμορροφιλικού ούτε πάσχει, ούτε είναι φορέας της νόσου. Οι γυναίκες που έχουν ένα πάσχοντα γιο και ακόμη έναν πάσχοντα συγγενή είναι υποχρεωτικοί φορείς. Εάν μία γυναίκα παρουσιάζει περισσότερους από έναν γιους πάσχοντες και δεν ανιχνεύεται στην ίδια η υπεύθυνη μετάλλαξη τότε πρόκειται για μωσαϊκισμό γεννητικών κυττάρων. Το ένα τρίτο με ένα δεύτερο των πασχόντων δεν έχουν οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας. Εάν ένας πάσχων είναι μεμονωμένη περίπτωση στην οικογένειά του, τότε υπάρχουν οι εξής πιθανότητες: 1. Είναι δυνατόν η μητέρα να μην είναι φορέας και ο πάσχων να παρουσιάζει de novo μετάλλαξη. Μωσαϊκισμός σωματικών κυττάρων μπορεί να συμβεί στο 15% των πασχόντων που φέρουν σημειακές μεταλλάξεις και δεν παρουσιάζουν 53

54 οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας 72. Ο μωσαϊκισμός γεννητικών κυττάρων είναι σπάνιος. 2. Να είναι η μητέρα φορέας de novo μετάλλαξης η οποία μπορεί να είναι αποτέλεσμα: μετάλλαξης σε επίπεδο γεννητικών κυττάρων μετάλλαξης σε επίπεδο σωματικών κυττάρων μωσαϊκισμού γεννητικών κυττάρων 3. Η μητέρα είναι φορέας και έχει κληρονομήσει τη μετάλλαξη είτε από τη μητέρα της, η οποία παρουσίασε την de novo μετάλλαξη, είτε από τον ασυμπτωματικό πατέρα της, ο οποίος παρουσιάζει μωσαϊκισμό. 4. Η μητέρα είναι φορέας και έχει κληρονομήσει τη μετάλλαξη από προηγούμενες γενεές και πέρασε σε αυτήν μέσω ασυμπτωματικών γυναικών φορέων. Είναι σημαντικό πάντως να αναφέρουμε ότι η μητέρα πάσχοντος παρουσιάζει πιθανότητα 80% να είναι φορέας της υπεύθυνης μετάλλαξης. Ειδικά η μητέρα πάσχοντος που φέρει αναστροφή του ιντρονίου 22 παρουσιάζει πιθανότητα 98% να είναι φορέας της μετάλλαξης. Είναι απαραίτητο λοιπόν όλοι οι συγγενείς αιμορροφιλικών ανδρών να υποβάλλονται σε ένα βασικό έλεγχο με μέτρηση των δραστικών επιπέδων του παράγοντα VIII. Δεν χρειάζεται να ελεγχθούν αυτοί που έχουν υποβληθεί σε γενετικό έλεγχο στον οποίο αποδείχθηκε ότι δεν είναι φορείς της μετάλλαξης. 12.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μέτρηση του APTT Στη μέτρηση του APTT χρησιμοποιείται ένας ενεργοποιητής επαφής για την ενεργοποίηση της παραγωγής του παράγοντα XIIa παρέχοντας επιφάνεια για τη δράση του υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνου, της καλλικρεΐνης και του παράγοντα XIIa. Η ενεργοποίηση επαφής γίνεται στους 37 ο C και για συγκεκριμένο χρόνο. Κατόπιν προστίθεται ασβέστιο για να εκκινήσει περαιτέρω αντιδράσεις και μετράται ο χρόνος που απαιτείται για τον σχηματισμό θρόμβου. Τα φωσφολιπίδια 54

55 απαιτούνται για το σχηματισμό συμπλόκων με τον παράγοντα X και την προθρομβίνη Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VIII. Η βιολογική μέθοδος του προσδιορισμού της δραστικότητας ενός παράγοντα πήξης έγκειται στην ποσοτικοποίηση του βαθμού διόρθωσης του χρόνου πήξεως και επιτυγχάνεται, όταν το υπό εξέταση πλάσμα αναμιγνύεται με ένα σύστημα, όπου απουσιάζει ο υπό έρευνα παράγοντας, αλλά όλοι οι άλλοι παράγοντες βρίσκονται σε φυσιολογικά επίπεδα. Ο βαθμός της διόρθωσης τότε συγκρίνεται με αυτόν που επιτυγχάνεται όταν προστίθεται μια γνωστή ποσότητα παράγοντα (standard) στο ίδιο σύστημα. Κατόπιν η δραστικότητα του προς μέτρηση παράγοντα εκφράζεται ως ποσοστό επί τη δραστικότητα μιας γνωστής και φυσιολογικής ποσότητας παράγοντα (συνήθως επί τις %). Οι πηξιολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των παραγόντων πήξης βασίζονται στο χρόνο προθρομβίνης PT ή στο χρόνο μερικής θρομβοπλαστίνης APTT, ανάλογα με την επιμήκυνση που προκαλεί η έλλειψη του προς μελέτη παράγοντα. Έτσι η αρχή του προσδιορισμού του παράγοντα VIII συνίσταται στη μέτρηση του χρόνου πήξεως APTT, παρουσία κεφαλίνης και ενεργοποιητή, σε ένα σύστημα όπου όλοι οι πηκτικοί παράγοντες βρίσκονται σε περίσσεια, εκτός από τον παράγοντα VIII ο οποίος προέρχεται μόνο από το προς εξέταση πλάσμα. Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται με την ανάμειξη του εξεταστέου πλάσματος με πλάσμα που του λείπει ο παράγοντας. Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα VIII στο πλάσμα είναι μεταξύ του 60 και 150% Aνίχνευση αναστολέων Για την ανίχνευση των αναστολέων γενικά, βασιζόμαστε στη γνώση ότι οι αναστολείς διαχωρίζονται, βάσει του τρόπου δράσης, σε αντισώματα που στρέφονται 55

56 ειδικώς έναντι ενός παράγοντα και εξουδετερώνουν τη δραστικότητά του και σε αντισώματα που αδρανοποιούν γενικώς πρωτεΐνες της πήξεως ή αναχαιτίζουν τις αντιδράσεις τους (π.χ. μέσω φωσφολιπιδίων). Στην πρώτη περίπτωση, η εξουδετέρωση του παράγοντα γίνεται σταδιακά, κατά γραμμικό, αλλά μη αντιστρεπτό τρόπο σε σχέση με το χρόνο (IgG4, κ άλυσος), οπότε παραμένει υπολειπόμενη ποσότητα του παράγοντα. Στη δεύτερη περίπτωση τα αντισώματα δρουν ανεξαρτήτως του χρόνου και πάντως κατ αντιστρεπτό τρόπο (σχηματισμός συμπλεγμάτων πρωτεϊνών/αντισωμάτων), οπότε επιτυγχάνεται ταχεία εξουδετέρωση 73. Πλείστοι όσοι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί εμπλέκονται στην ανάπτυξη αναστολέων της πήξης: αναστολή της λειτουργίας των πρωτεϊνών της πήξης λόγω απευθείας πρόσδεσης του αντισώματος, ταχεία κάθαρση των συμπλεγμάτων πρωτεϊνών/αντισωμάτων, δέσμευση και απομάκρυνση των παραγόντων από μονοκλωνικά αντισώματα, απελευθέρωση από τον εξωκυττάριο χώρο παθολογικών πρωτεϊνών που προσδένονται στα φυσιολογικά στοιχεία της πήξης, αλλά περιγράφεται και εκλεκτική αναστολή τμημάτων των μορίων που στερούνται πηξιογόνου δραστικότητας 73. Παρά τη διαπίστωση όμως επίκτητων αναστολέων, απαιτείται η αναζήτηση αντιπηκτικών λύκου (LA), εφόσον υπάρχει παράταση στο ΑΡΤΤ, οπότε ανίχνευση θετικών LA με οποιαδήποτε μέθοδο ελέγχου (tissue thromboplastin inhibitor - TTI, platelet neutralization procedure - PNP, dilute Russel viper venom time - drvvt κ.λπ.), δεν αποκλείεται. Η μέτρηση ειδικών αναστολέων (έναντι των ανεπαρκών παραγόντων) δεν αποδίδει πάντοτε. Μόνον αν υπάρχει μεγάλη έκπτωση των επιπέδων καθίστανται μετρήσιμοι. Ειδικά για τους αναστολείς έναντι του παράγοντα VIII μέθοδο ελέγχου αποτελεί η δοκιμασία Bethesda. Ως 1 BU (Bethesda Unit) ορίζεται η ποσότητα του αντισώματος στο πλάσμα του ασθενούς, που ανιχνεύει το 50% της δραστικότητας του εναπομείναντος παράγοντα, μετά από την ανάμιξη με φυσιολογικό πλάσμα

57 12.4. Τεχνικές ανάλυσης DNA DNA Το DNA είναι ένα μακρομόριο που αποτελείται από νουκλεοτίδια. Κάθε νουκλεοτίδιο του DNA αποτελείται από μία πεντόζη, τη δεοξυριβόζη, ενωμένη με μία φωσφορική ομάδα και μία αζωτούχο βάση. Η αζωτούχα βάση μπορεί να είναι η αδενίνη (Α), η γουανίνη (G), η κυτοσίνη C και η θυμίνη (Τ). Σε κάθε νουκλεοτίδιο η βάση συνδέεται με τον 1 ο άνθρακα της δεοξυριβόζης και η φωσφορική ομάδα με τον 5 ο. Μία πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα σχηματίζεται από την ένωση πολλών νουκλεοτιδίων με ομοιοπολικό δεσμό. Ο δεσμός αυτός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3 ου άνθρακα της πεντόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5 ο άνθρακα του επόμενου νουκλεοτιδίου. Ο δεσμός αυτός ονομάζεται 3-5 φωσφοδιεστερικός δεσμός. Οι Watson και Crick το 1953 διατύπωσαν το μοντέλο της δίκλωνης δεξιόστροφης έλικας του DNA, που αναφέρεται στη δομή του γενετικού υλικού στο χώρο: Το DNA αποτελείται από δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες που είναι συμπληρωματικές και η αλληλουχία της μίας καθορίζει την αλληλουχία της άλλης. Η συμπληρωματικότητα των βάσεων είναι μέγιστης σημασίας για τον αυτοδιπλασιασμό του DNA και κατ επέκταση για τη διατήρηση και μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας. Μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων (Α-Τ) και (G-C) σχηματίζονται δύο και τρείς δεσμοί υδρογόνου αντίστοιχα, οι οποίοι σταθεροποιούν τη δευτεροταγή δομή του μορίου Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR, amplification) είναι μια μέθοδος που αναπτύχθηκε το 1985 από τους Mullis και Silverstein και άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως το 1987 με την χρήση θερμοοανθεκτικών DNA πολυμερασών. Με τη μέθοδο αυτή συντίθεται μεγάλος 57

58 αριθμός αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA σε μια ενζυματική αντίδραση in vitro. Η ευαισθησία και ταχύτητα της μεθόδου αυτής έχει επιφέρει επανάσταση στη Μοριακή Γενετική δίνοντας καινούργιες προοπτικές για τη μελέτη και ανάλυση γονιδίων. Η PCR βασίζεται στον ενζυμικό πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που οριοθετείται δεξιά και αριστερά από δύο εκκινητές-ολιγoνουκλεοτίδια (primers). Η αλληλουχία του κάθε εκκινητή είναι συμπληρωματική προς τη μία από τις δύο αλυσίδες του δίκλωνου DNA-εκμαγείου. Η αντίδραση περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενους κύκλους. Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια: 1)Αποδιάταξη του δίκλωνου DNA (denaturation) 2)Υβριδοποίηση εκκινητών (primer annealing) στις αλληλουχίες του DNAστόχου 3) Επιµήκυνση εκκινητών (extension). Κατά την διάρκεια του πρώτου σταδίου το επιθυμητό τµήµα DNA υποβάλλεται σε θερµοκρασία 94 ο C προκειµένου να επιτευχθεί ο διαχωρισµός των αλυσίδων του δίκλωνου αυτού DNA. Στο δεύτερο στάδιο η θερµοκρασία µειώνεται στους o C και έτσι επιτυγχάνεται η ένωση των εκκινητών µε τις συµπληρωµατικές αλληλουχίες του DNA σε κάθε αλυσίδα. Στο τρίτο και τελευταίο στάδιο η θερµοκρασία αυξάνεται στους 72 o C και µε την βοήθεια της DNA πολυµεράσης, που προσθέτει τα νουκλεοτίδια (dntp s) στο 3 άκρο των εκκινητών, επιτυγχάνεται η σύνθεση των νέων συµπληρωµατικών αλυσίδων DNA. Η σύνθεση των αντιγράφων γίνεται από την DNA πολυµεράση πάντα µε κατεύθυνση 5 προς 3 (Εικόνα 1). Το προϊόν επιμήκυνσης του κάθε εκκινητή από τον πρώτο κύκλο της αντίδρασης αποτελεί εκμαγείο για τον άλλο εκκινητή στον επόμενο κύκλο. Μετά από n κύκλους το προϊόν PCR περιέχει 2 δίκλωνα μόρια DNA που είναι αντίγραφα της αλληλουχίας που ορίζεται από τους εκκινητές. 58

59 Εικόνα 1. Τα βασικά στάδια της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυµεράσης (PCR). Στάδιο 1 (Step 1): Αποδιάταξη της διπλής αλυσίδας του τµήµατος DNA (denaturation), Στάδιο 2 (Step 2): Ένωση των εκκινητών σε κάθε αλυσίδα (annealing), Στάδιο 3 (Step 3): Σύνθεση των νέων µορίων DNA (extension) (Vierstraete, 1999). Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε ειδικές συσκευές που ονομάζονται θερμικοί κυκλοποιητές (thermal cycler) που εναλλάσσουν τη θερμοκρασία βάσει προγραμματισμού. Οι παράμετροι που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού (PCR) είναι: Η συγκέντρωση των εκκινητών πρέπει να είναι αρκετά υψηλή, ώστε η σύνδεσή τους με την αντίστοιχη μονόκλωνη αλυσίδα να γίνεται γρήγορα και κατά την εξέλιξη της αντίδρασης η σύνδεση αυτή να είναι γρηγορότερη από την επανασύνδεση εκμαγείου- εκμαγείου. Η εκλογή κατάλληλης θερμοκρασίας και χρόνου σε κάθε στάδιο της αντίδρασης βοηθά την ειδικότητα της αντίδρασης. 59

60 Η ειδικότητα και απόδοση της μεθόδου αυξήθηκε με τη χρήση της Taq πολυμεράσης, αφού χρησιμοποιούνται υψηλότερες θερμοκρασίες στα στάδια σύνδεσης και επιμήκυνσης. Η θερμοανθεκτική Taq DNA πολυμεράση έχει μοριακό βάρος 94 kda και ειδική ενεργότητα μονάδες/mg ενζύμου. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μόνο 5 3 και όχι 3 5 εξωνουκλεοτιδική δράση. Η πιστότητα του ενζύμου, δηλαδή η σύνθεση DNA απόλυτα συμπληρωματικού προς το εκμαγείο, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των νουκλεοτιδίων στην αντίδραση, από τη συγκέντρωση Mg2+, το μήκος του τμήματος DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε, τον αριθμό των κύκλων της PCR και τη θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητή-μήτρας. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι: (α) παρέχει τη δυνατότητα παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένου τμήματος DNA σε μικρό χρονικό διάστημα, (β) η αντίδραση μπορεί να γίνει με τη χρήση ελάχιστης ποσότητας γενωμικού DNA καθώς και DNA πολύ κακής ποιότητας (σπασμένου ή ακάθαρτου). Παράδειγμα αποτελεί η χρησιμοποίηση υλικού για PCR του DNA κυττάρων που προέρχονται από τη στοματική κοιλότητα, από μια τρίχα ή ακόμα και από ένα μόνο σπερματοζωάριο ή λεμφοκύτταρο (single-cell PCR). Η χρήση της αντίδρασης PCR έχει ανοίξει καινούργιους ορίζοντες τόσο στον ερευνητικό όσο και στο διαγνωστικό τομέα. Στον ερευνητικό τομέα: έλεγχος με PCR κλωνοποιημένων τμημάτων DNA σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους ανίχνευση αλληλουχιών ανθρώπινου γονιδιώματος σε υβριδικά κύτταρα εισαγωγή νέων αλληλουχιών σε προϊόντα PCR με την προσθήκη ή αλλαγή των εκκινητών ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεϊνης DNA xαρτογράφηση ανθρώπινου γονιδιώματος δημιουργία φυλογενετικών δένδρων 60

61 ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίου μετά από επίδραση διαφόρων παραγόντων ανίχνευση μεταλλαγών και νέων γονιδίων πολυγονιδιακών οικογενειών Στο διαγνωστικό τομέα: προγεννητική διάγνωση προσδιορισμός φύλου στο ανθρώπινο έμβρυο πριν από την γονιμοποίηση in vitro για τη διάγνωση φυλοσύνδετων ασθενειών ανάλυση HLA για προσδιορισμό γενετικής προδιάθεσης για ανοσολογικές ασθένειες και ταυτοποίηση ιστών δότη και δέκτη πριν από την μεταμόσχευση ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών και σωματικών μεταλλαγών που συνδέονται με διάφορους τύπους καρκίνων διάγνωση λοιμώξεων ανάλυση πολυμορφικών τμημάτων του ανθρώπινου γονιδιώματος που διαφέρουν σε μέγεθος (VNTRs, variable number tandem repeats). Πέρα όµως από την συµβατική (standard) PCR σήµερα έχουν αναπτυχθεί πολλές παραλλαγές της, ορισµένες από τις οποίες είναι οι παρακάτω: Multiplex PCR : Είναι µια τεχνική που δίνει δυνατότητα εξέτασης πολλών αλληλουχιών-στόχων σε ένα µόνο δείγµα χωρίς να απαιτούνται πολλές αντιδράσεις. Η Multiplex PCR επιτρέπει τη χρήση πολλών διαφορετικών ζευγαριών εκκινητών σε µία µόνο αντίδραση, καθώς και τη χρήση πολλαπλών ιχνηλατών µε διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές για την διάκριση κάθε προϊόντος που θα παραχθεί από τους διάφορους εκκινητές της αντίδρασης. Χρησιµοποιείται για τη ανίχνευση διάφορων γενετικών ασθενειών και παθογόνων

62 Nested PCR : Αυτή η µέθοδος χρησιµοποιεί δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR. Στην πρώτη αντίδραση χρησιµοποιείται ένα ζευγάρι εκκινητών όπως στη συµβατική PCR, ενώ στη δεύτερη αντίδραση χρησιµοποιούνται εκκινητές (nested primers) που ενώνονται σε τµήµα της αλληλουχίας του προϊόντος της πρώτης PCR. Τα προϊόντα της πρώτης αντίδρασης χρησιµοποιούνται ως αλληλουχία-στόχος για την δεύτερη. Το προϊόν που παράγεται από την δεύτερη αντίδραση είναι µικρότερου µεγέθους 76. Hotstart PCR: Αποτελεί τη µέθοδο στην οποία αλλάζει ο τρόπος που θερµαίνεται το διάλυµα της αντίδρασης στο πρώτο στάδιο του κύκλου. Στην συµβατική PCR όταν αρχίζει η θέρµανση του διαλύµατος, η Taq πολυµεράση είναι ήδη ενεργή, ενώ το τµήµα DNA δεν έχει αποδιαταχθεί ακόµα, και έτσι υπάρχει η πιθανότητα να έχουµε ένωση των εκκινήτων µεταξύ τους (primer dimmer formation) ή να προσδεθούν σε λάθος θεσεις (π.χ. µερικώς συµπληρωµατικές αλληλουχίες µε τις δικές τους). Με την µέθοδο της Hotstart PCR µπορούµε να θερµάνουµε πρώτα το διάλυµα στους ο C και µετά να προσθέσουµε την Taq πολυµεράση, αποφεύγοντας έτσι το φαινόµενο ένωσης µεταξύ των εκκινητών ή ανεπιθύµητων προϊόντων PCR 77. Touchdown PCR: Αποτελεί µια µέθοδο που έχει ως σκοπό την αποφυγή δηµιουργίας ανεπιθύµητων προϊόντων PCR. Για να επιτευχθεί, η πρόσδεση των εκκινητών κατά τους πρώτους κύκλους γινεται σε θερµοκρασία 3-5 C πάνω από την τιµή αποδιάταξης (Tm) των εκκινητών, και ακολουθεί µια σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας πρόσδεσης εκκινητών στους επόµενους κύκλους 78. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR): Η µέθοδος αυτή εφαρµόζεται για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση mrna που προέρχεται από κάποιο ιστό. Θα πρέπει πρώτα να αποµονωθεί το mrna από τον ιστό και έπειτα να αντιγραφεί σε συµπληρωµατικό DNA (cdna) µε την βοήθεια του ενζύµου αντίστροφης µεταγραφάσης (reverse transcriptase). Στη συνέχεια ακολουθεί η συµβατική PCR. Η µέθοδος χρησιµοποιείται κυρίως στον έλεγχο και ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης 77. In situ PCR: Η µέθοδος αυτή συνδυάζει την ευαισθησία της PCR µε την τεχνική της In situ υβριδοποίησης και εφαρµόζεται σε ιστούς ή κύτταρα. Η ανίχνευση των προϊόντων γίνεται µε σηµασµένους ιχνηλάτες ή µε σηµασµένα 62

63 νουκλεοτίδια και για την εφαρµογή αυτής της µεθόδου θα πρέπει να γίνουν αλλαγές στις παραµέτρους της αντίδρασης (π.χ. στην συγκέντρωση του MgCl2) 77. Real Time PCR: H Real Time PCR αποτελεί παραλλαγή της συµβατικής PCR και χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό, την ανίχνευση καθώς και την ποσοτικοποίηση ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA σε πραγµατικό χρόνο Subcycling PCR Προκειμένου να ανιχνευθεί η αναστροφή του ιντρονίου 22 του παράγοντα FVIII η οποία αποτελεί τη συχνότερη γενετική διαταραχή που οδηγεί σε βαριά αιμορροφιλία Α πραγματοποιείται Υποκυκλική PCR (Subcycling PCR), που παρέχει ακριβή αποτελέσματα γενετικής διάγνωσης 79. Για την ανίχνευση της αναστροφής του ιντρονίου 22 έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς και άλλες πειραματικές προσεγγίσεις, όπως η ανάστροφη PCR (inverse PCR) 80 και η έμμεση ανάλυση πολυμορφισμών 78. Ωστόσο οι συγκεκριμένες πειραματικές προσεγγίσεις απαιτούν μεγαλύτερα ποσά γενωμικού DNA, ενώ παράλληλα αποτελούν περισσότερο χρονοβόρες διαδικασίες σε σύγκριση με την υποκυκλική PCR. Η Subcycling PCR επιτρέπει την ενίσχυση προϊόντων PCR, με πολύ μεγαλύτερο μέγεθος από αυτά που προκύπτουν από τη δράση των συμβατικών Τaq πολυμερασών. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη χρήση ενός μίγματος θερμοσταθερών DNA πολυμερασών, συνήθως Ταq DNA πολυμεράσης υψηλής διεισδυτικότητας και μιας άλλης πολυμεράσης με δυνατότητα 3-5 διόρθωσης. Ο συνδυασμός των συγκεκριμένων χαρακτηριστικών επιτρέπει μια πιο εκτεταμένη επιμήκυνση των εκκινητών σε σχέση με αυτή που επιτυγχάνεται όταν χρησιμοποιείται μόνο η Taq πολυμεράση. Η συγκεκριμένη μέθοδος για την ανίχνευση της αντιστροφής του ιντρονίου 22 αναιρεί την ανάγκη για στύπωση κατά Southern, ενώ τα αποτελέσματα προκύπτουν μέσα σε 24 ώρες. 63

64 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης είναι η τεχνική με την οποία καθορίζεται το μοριακό βάρος των προϊόντων της αντίδρασης. Η αγαρόζη είναι ένας φυτικός πολυσακχαρίτης που παράγεται από θαλάσσια φύκη. Η πηκτή αυτή φέρνει στο εσωτερικό της, πόρους μεγέθους που εξαρτώνται άμεσα με την συγκέντρωση της αγαρόζης. Όσο μικρότερη είναι η συγκέντρωση της χρησιμοποιούμενης αγαρόζης, τόσο μεγαλύτερο είναι το μέγεθος των πόρων του σχηματιζόμενου πλέγματος. Η ηλεκτροφόρηση είναι μια μέθοδος που στηρίζεται στο γεγονός ότι τα περισσότερα μακρομόρια όπως το DNA, RNA και πρωτεΐνες, διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους καθόσον είναι ηλεκτρικά φορτισμένα. Άρα, όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο, κινούνται με ταχύτητα που εξαρτάται από τον λόγο του ηλεκτρικού φορτίου προς την μάζα τους. Τα νουκλεϊκά οξέα είναι συνήθως αρνητικά φορτισμένα λόγω των φωσφορικών τους ομάδων, με αποτέλεσμα να κινούνται προς τον θετικό πόλο κατά την διάρκεια της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή µαζί µε µοριακούς δείκτες των οποίων τα µεγέθη θα είναι γνωστά (molecular markers). Έτσι µπορουµε να διαπιστώσουµε αν το προιόν της PCR έχει το αναµενόµενο µέγεθος. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε ρυθμιστικά διαλύματα με σκοπό τη μείωση των αλλαγών του ph λόγω του ηλεκτρικού πεδίου. Τα προϊόντα της PCR γίνονται ορατά µε την βαφή του βρωµιούχου αιθιδίου (Ethidium bromide) το οποίο φθορίζει έντονα υπό υπεριώδη ακτινοβολία (UV), όταν συγκεντρώνεται στις περιοχές των προϊόντων της PCR, εφόσον παρεµβάλλεται µεταξύ των ζευγών των βάσεων του δίκλωνου DNA 81,82. Το βρωµιούχο αιθίδιο µπορεί να ενσωµατωθεί στη πηκτή αγαρόζης πριν την ηλεκτροφόρηση ή να εµβαπτιστεί η πηκτή σε διάλυµά του µετά την ηλεκτροφόρηση. Χρησιμοποιείται ειδική συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης σε ένα ηλεκτρικό πεδίο σταθερής τάσης και κατεύθυνσης και περιλαμβάνει μια οριζόντια τράπεζα πηκτής που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο δεξαμενές ηλεκτροφόρησης. 64

65 Eικόνα 2. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογράφηση των PCR προιόντων Μετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί η μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογράφηση των PCR προιόντων (εικόνα 3) Εικόνα 3. Απεικόνιση των προϊόντων της PCR του ιντρονίου 22 σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Ν: άτομα που δεν φέρουν την αναστροφή του ιντρονίου 22, Ι: αρσενικά ημίζυγα άτομα για την αναστροφή του ιντρονίου 22, ΗΙ: θηλυκά άτομα ετερόζυγα για την αναστροφή του ιντρονίου 22, Μ: μεγέθη μάρτυρα 65

66 Ερμηνεία των προϊόντων της PCR Το τελικό στάδιο της διαδικασίας περιλαμβάνει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και συγκεκριμένα των προϊόντων που προκύπτουν από την PCR. H παρουσία μιας ανώτερης ζώνης των 12 kb και μιας χαμηλότερης στα 10 kb δηλώνει ότι η αναστροφή απουσιάζει. Η παρουσία μιας ενδιάμεσης ζώνης 11kb και μιας χαμηλότερα στα 10 kb χαρακτηρίζει την ύπαρξη αναστροφής σε παθολογικό αρσενικό άτομο. Οι ζώνες που παρουσιάζονται στα 10, 11 και 12 kb χαρακτηρίζουν ένα θηλυκό άτομο φορέα της ασθένειας (Εικόνα 4,5). Εικόνα 4: Απεικόνιση των ζωνών που προκύπτουν από την Subcycling PCR και συνεισφέρουν στη διάγνωση της παρουσίας αναστροφής του ιντρονίου 22 66

67 Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση των ζωνών που προκύπτουν από την Subcycling PCR και συνεισφέρουν στη διάγνωση της παρουσίας αναστροφής του ιντρονίου 22 67

68 68 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

69 1. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της μελέτης μας είναι η καταγραφή της συχνότητας της αναστροφής του ιντρονίου 22 σε παιδιατρικούς ασθενείς της Βορείου Ελλάδας με αιμορροφιλία Α και η αναζήτηση ύπαρξης συσχέτισης της βαρύτητας της μορφής με τον τύπο αυτό της μετάλλαξης, καθώς και τη συσχέτιση της μετάλλαξης αυτής με την ανάπτυξη αναστολέων έναντι του παράγοντα VIII 83,84,85,86. Το γεγονός ότι δεν υπάρχει παρόμοια συγκριτική μελέτη σε ομοιογενή Ελληνικό πληθυσμό καθιστά πρωτότυπη τη μελέτη. 69

70 2. ΥΛΙΚΟ 2.1Ασθενείς Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν συνολικά 39 παιδιά και έφηβοι, ηλικίας 3 μηνών έως 21 ετών, με αιμορροφιλία Α από τη Βόρεια Ελλάδα. Η παρακολούθηση των ασθενών πραγματοποιήθηκε στο αιματολογικό ιατρείο της Α Παιδιατρικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Το ειδικό πειραματικό μέρος της γενετικής ανάλυσης πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Α.Π.Θ. Τα δείγματα στάλθηκαν για επαλήθευση στο κέντρο αιμορροφιλίας της Μονάδας Αιμορραγικών Διαθέσεων του Νοσοκομείου Αθηνών Παίδων Αγία Σοφία. Η συγκέντρωση των ασθενών ξεκίνησε το Μάιο του 2008 και τελείωσε το Μάιο του 2009, ενώ όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για τους σκοπούς της διατριβής έως το Μάιο του Συλλέγχθηκαν πληροφορίες από το οικογενειακό και το ατομικό τους ιστορικό και καταγράφηκε η κλινική και η εργαστηριακή-αιματολογική εικόνα και ο απεικονιστικός έλεγχος, τόσο κατά τη διάγνωση όσο και σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά την παρακολούθηση των παιδιών στο παιδοαιμορροφιλικό ιατρείο. Επιπλέον καταγράφηκε το είδος της θεραπείας και η ανάπτυξη ή όχι αναστολέων έναντι του παράγοντα VIII. Ο σχετικός αιματολογικός εργαστηριακός έλεγχος περιελάμβανε μέτρηση PTT κατά τη διάγνωση, καθορισμό του ποσοστού του λειτουργικού παράγοντα VIII και αναζήτηση αναστολέων έναντι του παράγοντα ανά εξάμηνο. Ο απεικονιστικός έλεγχος περιελάμβανε έλεγχο των πάσχουσων αρθρώσεων με απλή ακτινογραφία, υπερηχογράφημα και μαγνητική τομογραφία καθώς και έλεγχο για οστεοπενία-οστεοπόρωση με DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry). 70

71 Η κλινική εκτίμηση των αρθρώσεων και αξιολόγησή τους έγινε βάσει του HJHS (Haemophilia Joint Health Score). Αναλυτικά για κάθε ασθενή συμπληρώθηκε ειδικό πρωτόκολλο. 2.2.Πρωτόκολλο ελέγχου Τα δημογραφικά και κλινικά στοιχεία περιελάμβαναν: Ονοματεπώνυμο Ηλικία Ηλικία διάγνωσης. Βαρύτητα της νόσου Ατομικό ιστορικό: Αναφερόμενα επεισόδια αιμορραγικών εκδηλώσεων που προηγήθηκαν της διάγνωσης (κυρίως αίμαρθρα). Οικογενειακό ιστορικό: Συγγενείς πάσχοντες από αιμορροφιλία Α. Κλινική εικόνα κατά τη διάγνωση και κατά την πορεία της νόσου. α. Συχνότητα των αιμορραγικών επεισοδίων, με ιδιαίτερη έμφαση στην εμφάνιση αιμορραγικών αρθρώσεων β. Βαρύτητα των επεισοδίων γ. Επίπτωση τους στην καθημερινή ζωή - προσωρινή αποχή (αριθμός ημερών) - μόνιμη (είδος δραστηριοτήτων). Είδος θεραπείας Αναπλήρωση ελλείποντα παράγοντα α. Προφυλακτική χορήγηση (2-3 φορές εβδομαδιαίως) β. On demand (κατ`επίκληση) 71

72 Τα εργαστηριακά στοιχεία περιελάμβαναν: Εργαστηριακός έλεγχος α. Μέτρηση PTT β. Μέτρηση λειτουργικού παράγοντα VIII γ. Αναζήτηση αναστολέων (αντισωμάτων έναντι του FVIII) - κατά τη διάγνωση - ανά εξάμηνο Απεικονιστικός έλεγχος Περιελάμβανε κατά τακτά χρονικά διαστήματα, έλεγχο τόσο της προσωρινής όσο και της μόνιμης βλάβης των αρθρώσεων (αιμορροφιλική αρθροπάθεια), καθώς επίσης και έλεγχο για οστεοπενία-οστεοπόρωση. Περιλαμβάνονταν οι παρακάτω απεικονιστικές μέθοδοι: 1.ακτινογραφία 2.ECHO 3.MRI 4.DEXA Γενετικός έλεγχος Έγινε σε όλα τα δείγματα γενετικός έλεγχος προς αναζήτηση της κύριας μετάλλαξης (αναστροφή του ιντρονίου 21) που σχετίζεται με βαριά αιμορροφιλία Α. 72

73 3. ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Εργαστηριακό μέρος Γενετικός έλεγχος Τα βήματα που ακολουθήθηκαν στον γενετικό έλεγχο είναι τα εξής: α. Λήψη βιολογικού υλικού. β. Απομόνωση DNA. γ. Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (Subcycling PCR) δ. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης ε.μεταφορά της πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογράφηση των PCR προιόντων στ. Ερμηνεία των προϊόντων της PCR Αναλυτικά οι διαδικασίες: Λήψη βιολογικού υλικού. Για τη λήψη του βιολογικού υλικού της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιήθηκε λήψη περιφερικού αίματος στο οποίο προστέθηκε ο αντιπηκτικός παράγοντας EDTA. 73

74 Απομόνωση DNA H διαδικασία της απομόνωσης DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αυτοματοποιημένου κιτ QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Αναλυτικά η διαδικασία της απομόνωσης είχε ως εξής: 1. Πρόσθεση σε αποστειρωμένο μικροσωλήνα eppendorf των 1.5ml,ποσότητας 20μl πρωτεάσης, 200μl του ολικού αίματος και 200μl του ρυθμιστικού διαλύματος ΑL που περιλαμβάνει το κιτ. Ακολουθεί ανάμιξη του μίγματος με ανάδευση (pulse vortexing) για 10 δευτερόλεπτα. 2. Επώαση μίγματος στους 56 o C για 10 λεπτά. 3. Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά. 4. Απομόνωση υπερκείμενου και πρόσθεση 200μl αιθανόλης (96-100%). Ακολουθεί ανάμειξη μίγματος με ανάδευση (pulse vortexing) για 15 δευτερόλεπτα. 5. Φυγοκέντρηση για 10 λεπτά. 6. Μεταφορά μίγματος σε μικροσωλήνες spin column οι οποίοι εμπεριέχονται σε απλούς μικροσωλήνες συλλογής των 2ml. Φυγοκέντρηση στις 8000 x rpm (στροφές ανά 1 λεπτό). Τοποθέτηση του κάθε μικροσωλήνα spin column σε νέο καθαρό μικροσωλήνα συλλογής των 2 ml. 7. Πρόσθεση ποσότητας 500μl ρυθμιστικού διαλύματος AW1 σε κάθε μικροσωλήνα spin column. Φυγοκέντρηση στις 8000 x rpm για 1 λεπτό. Τοποθέτηση του κάθε μικροσωλήνα spin column σε καθαρό μικροσωλήνα συλλογής 2ml και πετάμε τον παλιό. 8. Πρόσθεση ποσότητας 500μl ρυθμιστικού διαλύματος AW2 σε κάθε μικροσωλήνα spin column. Φυγοκέντρηση στις x rpm για 3 λεπτά. 9. Τοποθέτηση του κάθε μικροσωλήνα spin column σε καθαρό μικροσωλήνα eppendorf των 1.5ml. Πρόσθεση ποσότητας 50μl ρυθμιστικού διαλύματος AΕ. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό. 10. Φυγοκέντρηση στις 8000 x rpm για 1 λεπτό. 74

75 Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποήθηκε η διαδικασία της Subcycling PCR που προτείνει το: Central Manchester and Manchester Children s University Hospitals NHS Trust, Laboratory Medicine,Department Mollecular Diagnostics και αναφέρεται ως : PCR amplification of the F8 gene intron 22 inversion (edition:001,filename:lp MDC F8 intron 22 PCR.doc.Author Dorte Wren/Zoe Welsh, authorized by Steeve Keeney). Το μοντέλο του κυκλοποιητή που χρησιμοποιήθηκε είναι MJ RESEARCH, PTC-200, Peltier Thermal Cycler Aντιδραστήρια Εκκινητές Αρχικά οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως αποθέματα σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις (4 μμ για τους P και Q, 2 μμ για τους Α και Β) και αποθηκεύτηκαν στους -70 o C. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων περιλάμβαναν μίγμα ίσου όγκου από τον κάθε εκκινητή. Η αναλυτική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκε παρουσιάζεται στον Πίνακα 9. Μίγμα υψηλής πιστότητας PCR (AB gene 0795/b) To συγκεκριμένο μίγμα περιείχε μίγμα ενζύμων, dntps, ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και MgCl 2 75

76 Πίνακας 9. Αλληλουχία βάσεων των εκκινητών του υπό μελέτη ιντρονίου 22 του παράγοντα FVIII Τύπος εκκινητή Αλληλουχία INT22 P 5 -GCCCTGCCTGTCCATTACACTGATGACATTATGCTGAC-3 INT22 Q 5 -GGCCCTACAACCATTCTGCCTTTCACTTTCAGTGCAATA-3' INT22 A 5 -CACAAGGGGGAAGAGTGTGAGGGTGTGGGATAAGAA-3 INT22 B 5 -CCCCAAACTATAACCAGCACCTTGAACTTCCCCTCTCATA-3 DMSO(Dimethyl Sulfoxide) Xρησιμοποιήθηκε 100% DMSO το οποίο διατηρήθηκε στους C. Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων (5x) Για την παρασκευή του συγκεκριμένου διαλύματος αναμίχθηκαν 4.8ml γλυκερόλης, 0.025g βρωμοφαινόλης blue (0.25%), 0.2ml 20% SDS, και 5ml διαλύματος 10x TBE. Το ΤΒΕ παρασκευάζεται ξεχωριστά ως διάλυμα που προκύπτει από την ανάμειξη 108g Tris, 55g βορικού οξέος, 40ml EDTA 0.5M με ph 8.0 με ένα λίτρο αποστειρωμένου αποσταγμένου νερού. 76

77 Προετοιμασία της PCR Για την πραγματοποίηση της PCR χρησιμοποιήθηκε γενωμικό DNA συγκέντρωσης ng σε ίση ποσότητα (0.7 μl) ανά αντίδραση και σε τελικό όγκο 25μl. Δεδομένου ότι η μεγάλη ποσότητα DNA παρεμποδίζει την ενίσχυση, πραγματοποιήθηκε ογκομετρική ανάλυση του DNA συγκεκριμένου δείγματος προκειμένου να επιλεχθεί η συγκέντρωση που επιτρέπει την αποδοτικότερη ενίσχυση κατά την PCR. Η κάθε αντίδραση περιλάμβανε τελικό όγκο 25μl. Στον πίνακα 10 παρατίθεται η αναλογία των όγκων των συστατικών του μίγματος της PCR για κάθε δείγμα. Κατά την προετοιμασία της αντίδρασης της PCR παρασκευάστηκε ένα ενιαίο μίγμα των συστατικών (εκτός από το DNA) για τον συνολικό αριθμό των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση. Πίνακας 10. Σύσταση του μίγματος της PCR για κάθε δείγμα Συστατικό του μίγματος Όγκος (μl) Μίγμα Abgene 0795/b 12.5 Mίγμα των PQ εκκινητών 2 Mίγμα των ΑΒ εκκινητών 3 DMSO Απεσταγμένο νερό DNA

78 Πραγματοποίηση της Subcycling PCR Για την μελέτη της αναστροφής τoυ ιντρονίου 22 που ενοχοποιείται για την αιμορροφιλία Α εφαρμόστηκε το ειδικό πρωτόκολλο της subcycling PCR που παρατίθεται στον Πίνακα Η αντίδραση περιλαμβάνει συνολικά 30 βασικούς κύκλους καθένας από τους οποίους περιλαμβάνει 4 υποκύκλους. Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκε ένα δείγμα μάρτυρας που δεν περιείχε DNA, καθώς επίσης ένα δείγμα μάρτυρας από ετερόζυγο αρσενικό φορέα της αναστροφής του ιντρονίου. Μετά το πέρας της αντίδρασης (13 ώρες) τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C όπου και διατηρήθηκαν μέχρι τη διαδικασία της πέψης. Πίνακας 11. Πρωτόκολλο της αντίδρασης Subcycling PCR Κύκλοι Θερμοκρασία Χρόνος Αποδιάταξη 1 94 ο C 2 min o C 12 sec 4 υποκύκλοι/κύκλο 60 ο C 120 sec 65 o C 120 sec o C 12 sec 4 υποκύκλοι/κύκλο 60 ο C 120sec+3sec/pc 65 o C 120sec+3sec/pc 78

79 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Συγκεκριμένα παρασκευάστηκε πηκτή αγαρόζης 0,7% έπειτα από την ανάμειξη 0,7gr στερεής αγαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1xΤΒΕ (0,9 M Τris, 0,9 M βορικό οξύ, 0,5 Μ ΕDTA ph 8) σε γυάλινη φιάλη Erlenmeyer. Η γυάλινη φιάλη τοποθετήθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων για 2-3 min προκειμένου να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη. Έπειτα από την ψύξη του μίγματος προστέθηκε συγκεκριμένη ποσότητα βρωμιούχου αιθιδίου με τελική συγκέντρωση 0,5μg/ml και ακολούθησε γρήγορη ανάμειξη της αγαρόζης. Ακολούθησε απόχυση της θερμής αγαρόζης σε μήτρα συσκευής της ηλεκτροφόρησης και τοποθέτηση ειδικής χτένας για το σχηματισμό σχισμών. Η πηκτή πρέπει να καλύπτεται πλήρως με το ρυθμιστικό διάλυμα που δεν υπερβαίνει το 1cm από την επιφάνεια της. Τα δείγματα φορτώθηκαν στη πηκτή σε όγκο 5μl και χωρίς την χρήση χρωστικής δεδομένου ότι περιέχεται στο ΑΒgene μίγμα. Ταυτόχρονα με τα δείγματα φορτώθηκε και δείκτης με γνωστά μοριακά βάρη. Η ηλεκτροφόρηση έτρεξε στα 130 Volts για περίπου 3-4 ώρες Μεταφορά πηκτής σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας, φωτογράφηση των PCR προϊόντων και ερμηνεία των προϊόντων της PCR Η οπτικοποίηση των περιοχών του DNA στην πηκτή έγινε με τη χρήση οπτικοποιητή (κάμερας) με UV ακτινοβολία. Εικόνα 6: Ερμηνεία των προϊόντων. Η παρουσία μιας ενδιάμεσης ζώνης 11kb και μιας χαμηλότερα στα 10 kb χαρακτηρίζει την ύπαρξη αναστροφής σε παθολογικό αρσενικό άτομο. Οι ζώνες που παρουσιάζονται στα 10, 11 και 12 kb χαρακτηρίζουν ένα θηλυκό άτομο φορέα της ασθένειας 79

80 Ακολουθεί η απεικόνιση των PCR προϊόντων (εικόνες 7 α,β,γ,δ). Εικόνα 7 α. Εικόνα 7 β 80

81 Εικόνα 7 γ Εικόνα 7 δ Εικόνες 7 α,β,γ,δ: Απεικόνιση των προιόντων της PCR του ιντρονίου 22 σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. (10-12 kb): άτομα που δεν φέρουν την αναστροφή του ιντρονίου 22, (10-11 kb): άτομα που παρουσιάζουν την αναστροφή του ιντρονίου 22 (βλέπε εικόνα 14β). Δεν συμμετείχαν στη μελέτη θήλεα άτομα γι αυτό δεν παρατηρείται φορεία. 81

82 3.2. Κλινικό μέρος Βαρύτητα της νόσου Η βαρύτητα της νόσου σε κάθε ασθενή ορίσθηκε σύμφωνα με τα επίπεδα του παράγοντα VIII στο αίμα (βαριά <1%,ενδιάμεση 2-5%,ήπια >5%). Για στατιστικούς λόγους σε κάποιες συσχετίσεις έγινε αδρότερος διαχωρισμός σε βαριά μορφή και ήπια-ενδιάμεση μορφή Ηλικία διάγνωσης Η ηλικία διάγνωσης μελετήθηκε ως: κάτω του έτους, μεταξύ ενός και τριών ετών και πάνω από τριών ετών Κλινική εικόνα παράμετροι: Για την εκτίμηση της κλινικής εικόνας χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω α. Συχνότητα των αιμορραγικών επεισοδίων, με ιδιαίτερη έμφαση στην εμφάνιση αιμορραγικών αρθρώσεων καταγραφή αρθρώσεων στόχος β. Βαρύτητα των επεισοδίων εκτίμηση των αρθρώσεων και αξιολόγησή τους βάσει του Haemophilia Joint Health Score (HJHS). Αρθρώσεις-στόχος Ως άρθρωση στόχος ορίσθηκε κάθε άρθρωση στην οποία διαπιστώθηκαν περισσότερες από τρεις αιμορραγίες σε διάστημα έξι μηνών. Haemophilia Joint Health Score (HJHS) Η εκτίμηση της κατάστασης των αρθρώσεων πραγματοποιήθηκε με το HJHS (Haemophilia Joint Health Score) 87,88,89. 82

83 Πρόκειται για εργαλείο εκτίμησης της κατάστασης των αρθρώσεων του αιμορροφιλικού ασθενούς. Διενεργείται από εκπαιδευμένο φυσιοθεραπευτή και αφορά τις ποδοκνημικές, τα γόνατα και τους αγκώνες. Για κάθε μία από τις συγκεκριμένες αρθρώσεις βαθμολογούνται η διόγκωση της άρθρωσης, η διάρκεια της διόγκωσης, η μυϊκή ατροφία, η ευθυγράμμιση του άξονα της άρθρωσης (μόνο στο γόνατο και στον αστράγαλο), ο ερπεισμός στην κίνηση, ο περιορισμός κάμψης της άρθρωσης, ο περιορισμός έκτασης της άρθρωσης, ο πόνος στην άρθρωση και η δύναμη της άρθρωσης. Για τη βαθμολόγηση χρησιμοποιούνται συγκεκριμένα χαρακτηριστικά (βλέπε πίνακες 12 α-η). Υπολογίζεται το ολικό score για κάθε άρθρωση και όλα μαζί αθροίζονται σε ένα συνολικό αποτέλεσμα της κατάστασης των αρθρώσεων. Τέλος βαθμολογείται η συνολική επίπτωση στη βάδιση (βάδιση, ανεβοκατέβασμα σκάλας, τρέξιμο, πήδημα στο ένα πόδι - βλέπε πίνακα 12θ-) και το score προστίθεται στο συνολικό αποτέλεσμα το οποίο κυμαίνεται από 0 έως 148. Πίνακας 12. Εκτίμηση κατάστασης αρθρώσεων ασθενούς βάσει του HJHS Παράμετροι Διόγκωση Διάρκεια διόγκωσης Μυϊκή ατροφία Ευθυγράμμιση άξονα Ερπεισμός στην κίνηση Απώλεια κάμψης Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ.κατ αγκώνα Δε.κατ αγκώνα Αρ.κατά γόνυ Δε.κατά γόνυ Απώλεια έκτασης Αστάθεια Πόνος άρθρωση Δύναμη στην Σύνολο Σφαιρικό αποτέλεσμα βάδισης 83

84 Η βαθμολόγηση της κάθε παραμέτρου έχει ορισθεί να γίνεται ως εξής: Πίνακες 12 α,β,γ,δ,ε,στ,ζ,η,θ : Βαθμολόγηση των παραμέτρων Πίνακας 12α Διόγκωση 0 = καμμία 1 = ήπια 2 = μέτρια 3 = έντονη Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ Πίνακας 12β Διάρκεια διόγκωσης 0 = καμμία διόγκωση ή < 6 μηνών 1 =διάρκεια διόγκωσης > 6 μηνών Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ Πίνακας 12γ Μυϊκή ατροφία 0 = καμμία 1 = ήπια 2 = έντονη Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ Πίνακας 12δ Ευθυγράμμιση άξονα (γον.,ποδοκν.) 0 = μέσα στα φυσιολογικά όρια 1 = έξω από τα φυσιολογικά όρια Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ 84

85 Πίνακας 12ε Απώλεια κάμψης 0 = <5 μοίρες 1 = 5-10 μοίρες 2 = μοίρες 3 = >20 μοίρες Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ Πίνακας 12στ Αρ. Απώλεια έκτασης 0 = <5 μοίρες 1 = 5-10 μοίρες 2 = μοίρες 3 = >20 μοίρες ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ Πίνακας 12ζ Πόνος άρθρωσης 0 = καθόλου πόνος (παθητική /ενεργητ.κίνηση) 1 = πόνος ενεργητ.κίνηση 2 = πόνος παθητική κίνηση Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ 85

86 Πίνακας 12η Δύναμη Αρ. ποδ/μική Δε. ποδ/μική Αρ. κατ αγκ. Δε. κατ αγκ. Αρ. κατά γόνυ Δε. κατά γόνυ 0 = μέγιστη αντίσταση 1 = μεσαία αντίσταση 2 = ήπια αντίσταση 3 = δοκιμασία διακοπτόμενη ή αδυναμία ολοκλήρωσης δοκιμασίας 4 = αποτυχία Πίνακας 12θ Βάδιση Απλή βάδιση Σκάλες Τρέξιμο Πήδημα στο ένα πόδι Σφαιρικό αποτέλεσμα βάδισης 0 = σε κάθε δοκιμασία εντός φυσιολογικών ορών 1 = σε μία δοκιμασία εκτός των φυσιολογικών ορίων 2 = σε δύο δοκιμασίες εκτός των φυσιολογικών ορίων 3 = σε τρεις δοκιμασίες εκτός των φυσιολογικών ορίων 4 = σε όλες τις δοκιμασίες εκτός των φυσιολογικών ορίων HJHS Total Score: Άθροισμα των score των αρθρώσεων + Σφαιρικό αποτέλεσμα βάδισης. Στην παρούσα μελέτη για λόγους στατιστικής ευκολίας χρησιμοποιήθηκε η διαβάθμιση για το score: χαμηλό (0-5), μέτριο (6-10), υψηλό (>10). 86

87 Θεραπεία Η θεραπεία των ασθενών ορίσθηκε ως: προφυλακτική χορήγηση (2-3 φορές εβδομαδιαίως) του ελλείποντα παράγοντα και κατ επίκληση χορήγηση του ελλείποντα παράγοντα (χορήγηση του παράγοντα μόνο επί αιμορραγικών επεισοδίων). Τα φαρμακευτικά σκευάσματα που χορηγήθηκαν κατά την θεραπεία υποκατάστασης περιελάμβαναν τόσο ανασυνδυασμένους όσο και πλασματικούς παράγοντες, ενώ στους ασθενείς που ανέπτυξαν αναστολέα χορηγήθηκε κατά περίπτωση ενεργοποιημένος παράγοντας VII (ανασυνδυασμένος) ή και ενεργοποιημένο προθρομβινικό σύμπλεγμα παραγόντων. Τα φαρμακευτικά σκευάσματα που χορηγήθηκαν κατά την θεραπεία υποκατάστασης περιγράφονται στον Πίνακα 13. Πίνακας 13. Φαρμακευτικά σκευάσματα θεραπείας υποκατάστασης Ονομασία φαρμάκου Περιγραφή φαρμάκου Advate (Βaxter) Αντιαιμορροφιλικός παράγοντας (ανασυνδυασμένος) Kogenate (Bayer) Αντιαιμορροφιλικός παράγοντας (ανασυνδυασμένος) Novoseven (Novo Nordisk) Ενεργοποιημένος παράγοντας VII (ανασυνδυασμένος) Feiba (Βaxter) Μείγμα πηκτικών παραγόντων Haemoctin (Biotest Hellas) Αντιαιμορροφιλικός παράγοντας (πλασματικός FVIII + παράγ. von Willebrand) Haemate (Behring UK) Αντιαιμορροφιλικός παράγοντας (πλασματικός FVIII + παράγ. von Willebrand) Helixate (Behring UK) Αντιαιμορροφιλικός παράγοντας (ανασυνδυασμένος) 87

88 Μελετήθηκε επίσης η συμμόρφωση των ασθενών στη θεραπεία ως πολύ καλή (συνεπής χορήγηση της θεραπευτικής αγωγής), μέτρια (μεμονωμένες, σποραδικές παρεκκλίσεις στη θεραπεία), κακή (σοβαρή ασυνέπεια, μη συμμόρφωση) σύμφωνα με τις πληροφορίες από τους γονείς. Η συμμόρφωση των ασθενών στη θεραπεία αντικατοπτρίζει την επιτυχία της πορείας της νόσου και βοηθά στην εκτίμηση των λοιπών αποτελεσμάτων Ανάπτυξη αναστολέα Ορίσθηκε η ανίχνευση ή όχι αναστολέα. 88

89 4. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Τα δεδομένα κωδικοποιήθηκαν κατάλληλα και εισήχθησαν σε κατάλληλη βάση δεδομένων. Η ανάλυσή τους έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα IBM SPSS για Windows v.20 (IBM, New York, USA). Για τον έλεγχο της κανονικότητας των διαφόρων μεταβλητών μετρήσεων χρησιμοποιήθηκαν εκτός απο τις γραφικές μεθόδους τα test Kolmogorov-Smirnov και Shapiro-Wilk λαμβάνοντας κατά περίπτωση υπόψιν το μέγεθος του δείγματος. Όλες οι ποσοτικές μεταβλητές που ακολουθούν την κανονική κατανομή περιγράφονται χρησιμοποιώντας τη Μέση Τιμή και την Τυπική Απόκλιση (Mean ± SD), ενώ εκείνες που δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή περιγράφονται χρησιμοποιώντας την Διάμεσο, τα Ενδοτεταρτημόρια, το μέγιστο και το ελάχιστο. Οι ποιοτικές μεταβλητές περιγράφονται με Απόλυτες και Σχετικές Συχνότητες. Για την εκτίμηση της συσχέτισης μεταβλητών, κατά ζεύγη, χρησιμοποιήθηκαν οι συντελεστές Pearson & Spearman κατά περίπτωση. Για τον έλεγχο ανεξαρτησίας στους πίνακες συνάφειας χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Χ 2 και το Fisher s Exact test κατά περίπτωση, ενώ όλες οι αναλύσεις έγιναν σε στάθμη σημαντικότητας 0,05. 89

90 5.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1. Αποτελέσματα καταγραφής Δημογραφικά στοιχεία ασθενών Φύλο Στην παρούσα μελέτη συμμετείχαν 39 άρρενες πάσχοντες από αιμορροφιλία Α. Ηλικία διάγνωσης Η διάγνωση της νόσου τέθηκε σε ηλικία κάτω του έτους στους 23/39 (ποσοστό 60%), στους 8/39 (ποσοστό 20%) μεταξύ ενός και τριών ετών και στους 8/39 (ποσοστό 20%) άνω των τριών ετών. Οικογενειακό ιστορικό Από το ιστορικό 16/39 παιδιά (ποσοστό 41%), παρουσιάζουν οικογενειακό ιστορικό αιμορροφιλίας ενώ τα υπόλοιπα όχι. Πίνακας 14. Δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών ΑΡΙΘΜΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ 39 ΦΥΛΟ ΑΣΘΕΝΩΝ 39 ΑΡΡΕΝΕΣ ΗΛΙΚΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ 23 <1 ΕΤΟΥΣ ΕΤΩΝ 8 >3ΕΤΩΝ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΚΟ ΙΣΤ.ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ 16 90

91 Χαρακτηριστικά της νόσου Πίνακες 15 α,β. Στοιχεία ασθενών σχεικά με την πορεία της νόσου α/α ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ ΣΥΧΝ.ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ 1 βαριά ναι ναι προφύλαξη 2 ενδιάμεση όχι όχι Κατ απαίτηση 3 βαριά ναι όχι προφύλαξη 4 βαριά όχι όχι προφύλαξη 5 Ήπια όχι όχι προφύλαξη 6 βαριά όχι όχι προφύλαξη 7 βαριά όχι όχι προφύλαξη 8 βαριά όχι όχι προφύλαξη 9 βαριά ναι όχι προφύλαξη 10 βαριά ναι ναι προφύλαξη 11 βαριά ναι όχι προφύλαξη 12 βαριά ναι όχι προφύλαξη 13 βαριά ναι ναι προφύλαξη 14 βαριά ναι όχι προφύλαξη 15 βαριά όχι όχι προφύλαξη 16 βαριά όχι ναι προφύλαξη 17 βαριά όχι όχι προφύλαξη 18 βαριά όχι ναι προφύλαξη 19 βαριά όχι όχι προφύλαξη 20 βαριά όχι ναι προφύλαξη 21 βαριά όχι όχι προφύλαξη 22 βαριά ναι ναι προφύλαξη 23 βαριά ναι όχι προφύλαξη 24 ενδιάμεση ναι όχι προφύλαξη 25 βαριά όχι όχι προφύλαξη 26 βαριά όχι όχι προφύλαξη 27 ενδιάμεση όχι όχι προφύλαξη 28 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 29 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 30 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 31 Ήπια όχι όχι Κατ παίτηση 32 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 33 ενδιάμεση όχι όχι προφύλαξη 34 βαριά όχι όχι καταπαίτηση 35 βαριά ναι ναι προφύλαξη 36 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 37 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 38 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 39 Ήπια όχι όχι Κατ απαίτηση 91

92 α/α ΑΙΜ.ΑΡΘΡΟΠΑΘΕΙΑ ΑΙΜΑΤΟΥΡΙΑ ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΑ ΕΝΔΟΚΡΑΝΙΑ ΑΙΜΟΡ 1 ναι ναι ναι ναι 2 όχι όχι όχι όχι 3 ναι όχι όχι όχι 4 ναι όχι όχι όχι 5 όχι όχι όχι όχι 6 ναι ναι όχι όχι 7 ναι όχι όχι όχι 8 ναι ναι όχι όχι 9 όχι όχι όχι όχι 10 ναι όχι όχι όχι 11 ναι όχι όχι όχι 12 ναι ναι όχι όχι 13 ναι όχι όχι όχι 14 ναι όχι όχι όχι 15 ναι όχι ναι όχι 16 ναι όχι όχι όχι 17 ναι όχι όχι όχι 18 ναι ναι όχι όχι 19 ναι όχι όχι όχι 20 ναι ναι ναι όχι 21 όχι όχι όχι όχι 22 ναι ναι όχι όχι 23 ναι όχι ναι όχι 24 ναι όχι όχι όχι 25 όχι όχι όχι όχι 26 ναι όχι όχι όχι 27 ναι όχι όχι όχι 28 όχι όχι όχι όχι 29 oxi όχι όχι όχι 30 όχι όχι όχι όχι 31 όχι όχι όχι όχι 32 όχι όχι όχι όχι 33 oxi όχι όχι όχι 34 ναι όχι όχι όχι 35 όχι όχι όχι όχι 36 όχι όχι όχι όχι 37 όχι όχι όχι όχι 38 όχι όχι όχι όχι 39 όχι όχι όχι όχι Βαρύτητα νόσου 92

93 Από τα 39 παιδιά τα 25 (64,1%) παρουσιάζουν βαριά νόσο, τα 5 (12,8%) παρουσιάζουν νόσο ενδιάμεσης βαρύτητας και τα 9 (23,1%) παρουσιάζουν ήπια νόσο. Επιπλοκές Η κυρίαρχη συνοδή επιπλοκή των αιμορροφιλικών ασθενών η αιμορροφιλική αρθροπάθεια καθώς και οι λοιπές συνοδές επιπλοκές που παρουσίασαν οι ασθενείς της παρούσας μελέτης συνοψίζονται στον πίνακα 16. Πίνακας 16. Επιπλοκές της αιμορροφιλίας Α ΕΠΙΠΛΟΚΕΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ Ενδοκρανιακή αιμορραγία 1/39 Αιμορροφιλική αρθροπάθεια 25/39 Αιματουρία 7/39 Οστεοπενία 4/39 Άρθρωση στόχος Άρθρωση στόχος στο 23,07% των παιδιών ήταν αυτή του γόνατος, στο 30,76% των παιδιών ήταν η άρθρωση του αγκώνα και στο 23,07% η ποδοκνημική άρθρωση. Δώδεκα ασθενείς με βαριά νόσο (30,45%) παρουσίαζαν περισσότερες από μία αρθρώσεις στόχο. Θεραπεία Καταγράφηκε η συχνότητα του τύπου της θεραπείας που χορηγήθηκε στο σύνολο των ασθενών που μελετήθηκαν, ανάλογα με την κλινική εικόνα και τις ανάγκες που 93

94 επιτάσσει η διαβάθμιση της νόσου όσον αφορά στη βαρύτητά της. Προφυλακτική θεραπεία έλαβαν 28 ασθενείς (71,8%), ενώ θεραπεία κατ απαίτηση 11 (28,2%). Συμμόρφωση στη θεραπεία Όσον αφορά στον παράγοντα της συμμόρφωσης στη θεραπεία, στο 82,1 % των ασθενών ήταν πολύ καλή. Στο 7,7 % και 10,30 % ήταν μέτρια και κακή αντίστοιχα, γεγονός που αντικατοπτρίζει την επιτυχία της πορείας της θεραπείας και βοηθά στην ερμήνευση των αποτελεσμάτων. Ανάπτυξη αναστολέα Οκτώ ασθενείς, όλοι με βαριά νόσο, ανέπτυξαν αναστολέα έναντι του χορηγούμενου παράγοντα VIII Ανίχνευση της μετάλλαξης Όπως προαναφέρθηκε αναζητήθηκε η ύπαρξη της αναστροφής του ιντρονίου 22 στα δείγματά μας. Μετάλλαξη DNA Σε δώδεκα ασθενείς ανιχνεύθηκε η μετάλλαξη, δηλαδή το 30,8% παρουσιάζει τη μετάλλαξη, ενώ το 69,2% όχι. 94

95 Γράφημα 1: Ραβδόγραμμα Σχετικών Συχνότητων της μεταβλητής Μετάλλαξη DNA 5.3 Έλεγχος συσχετίσεων Τα αποτελέσματα της επεξεργασίας των δεδομένων των 39 παιδιατρικών ασθενών όπως καταχωρήθηκαν στη βάση δεδομένων απεικονίζονται στους πίνακες που ακολουθούν. Πριν μελετηθούν οι συσχετίσεις των μεταβλητών με τη μετάλλαξη καταγράφηκε αρχικά η αιμορροφιλική αρθροπάθεια και η παρουσία αναστολέα αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου. 95

96 Κατανομή της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου 0ι 25 από τους 39 ασθενείς (64,1%) εμφάνισαν αιμορροφιλική αρθροπάθεια επιβεβαιωμένη με μαγνητική τομογραφία. Από τους 25 οι 22 παρουσιάζουν βαριά μορφή αιμορροφιλίας. Δηλαδή το 88% των ασθενών με βαριά νόσο παρουσιάζει αιμορροφιλική αρθροπάθεια. Αντίστοιχα μόνο το 21,4% των ασθενών με ήπια-ενδιάμεση νόσο παρουσιάζει αιμορροφιλική αρθροπάθεια. Πίνακας 17. Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα της μεταβλητής Αιμορροφιλική Αρθροπάθεια και Βαρύτητα Νόσου ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ * ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΗ ΑΡΘΡΟΠΑΘΕΙΑ Crosstabulation ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΗ ΑΡΘΡΟΠΑΘΕΙΑ ΟΧΙ ΝΑΙ Total ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΗΠΙΑ- Count ΝΟΣΟΥ ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ 78.6% 21,4% 100,0% ΝΟΣΟΥ ΣΟΒΑΡΗ Count % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ 12% 88% 100,0% ΝΟΣΟΥ Total Count % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 35.9% 64.1% 100,0% 96

97 Γράφημα 2: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Αιμορροφιλική Αρθροπάθεια για κάθε επίπεδο του παράγοντα Βαρύτητα Νόσου Όπως προαναφέρθηκε για την εκτίμηση της αρθροπάθειας χρησιμοποιήθηκε ο αριθμός των αρθρώσεων στόχος και το HJHS. Στον παρακάτω πίνακα βλέπουμε την συχνότητα του αριθμού αρθρώσεων στόχος αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου. 97

98 Πίνακας 18. Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα της μεταβλητής Αριθμός αρθρώσεων Στόχος και Βαρύτητα Νόσου ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ * ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ Crosstabulation ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ ΗΠΙΑ- ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ,00 1,00 2,00 Total Count Expected Count % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 5,0 4,7 4,3 14,0 78,6% 14,3% 7,1% 100,0% ΣΟΒΑΡΗ Count Expected Count % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 9,0 8,3 7,7 25,0 12,0% 44,0% 44,0% 100,0% Total Count Expected Count % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 14,0 13,0 12,0 39,0 35,9% 33,3% 30,8% 100,0% Βλέπουμε ότι 11 από τους 14 ασθενείς με ήπια - ενδιάμεση νόσο δεν παρουσιάζουν καμμία άρθρωση στόχο και ότι 22 από τους 25 ασθενείς με βαριά νόσο παρουσιάζουν μία και περισσότερες αρθρώσεις στόχο. Ακολουθεί η κατανομή του HJHS αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου: 98

99 Πίνακας 19. Μέσος όρος, τυπική απόκλιση, μέγιστη τιμή, ελάχιστη τιμή του HJHS αναλόγως με τη βαρύτητα της νόσου ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ Statistic Std. Error ΗΠΙΑ- ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ Mean 2,4286 1, % Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound -,8131 5,6702 5% Trimmed Mean 2,1984 Median,0000 Variance 12,286 Std. Deviation 3,50510 Minimum,00 Maximum 9,00 Range 9,00 Interquartile Range 5,00 Skewness 1320,794 Kurtosis,931 1,587 ΣΟΒΑΡΗ Mean 8,3000 1, % Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 4, ,7462 5% Trimmed Mean 7,6667 Median 6,5000 Variance 54,221 Std. Deviation 7,36349 Minimum,00 Maximum 28,00 Range 28,00 Interquartile Range 9,00 Skewness 1,312,512 Kurtosis 1,773,992 99

100 Γράφημα 3: Συγκριτικό θηκόγραμμα της μεταβλητής Βαρύτητα Νόσου για κάθε επίπεδο του παράγοντα HJHS Ο μέσος όρος του HJHS για την ήπια-ενδιάμεση νόσο είναι 2,42 με τυπική απόκλιση 3,5 και μέγιστο 9, ενώ για την βαριά νόσο ο μέσος όρος του HJHS είναι 8,3 με τυπική απόκλιση 7,36 και μέγιστο 28. Τα αποτελέσματα είναι αναμενόμενα αφού η αιμορροφιλική αρθροπάθεια η οποία και εκτιμάται με το συγκεκριμένο score είναι ουσιαστικά πρόβλημα της βαριάς νόσου. 100

101 Συσχέτιση ύπαρξης αναστολέα και βαρύτητας νόσου Οκτώ ασθενείς, όλοι πάσχοντες από βαριά νόσο, παρουσίασαν αναστολέα έναντι του παράγοντα VIII. Πίνακας 20. Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητών Ύπαρξη Αναστολέα και Βαρύτητα Νόσου ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ * ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ Crosstabulation ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΟΧΙ ΝΑΙ Total ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΗΠΙΑ- Count ΝΟΣΟΥ ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ Expected Count 11,1 2,9 14,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ 100,0%,0% 100,0% ΝΟΣΟΥ ΣΟΒΑΡΗ Count Expected Count 19,9 5,1 25,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ 68,0% 32,0% 100,0% ΝΟΣΟΥ Total Count Expected Count 31,0 8,0 39,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ 79,5% 20,5% 100,0% ΝΟΣΟΥ 101

102 Γράφημα 4: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Ύπαρξη Αναστολέα για κάθε επίπεδο του παράγοντα Βαρύτητα Νόσου Χρησιμοποιώντας το test Χ 2 σαν έλεγχο ανεξαρτησίας συμπεραίνουμε ότι απορρίπτουμε την μηδενική υπόθεση ανεξαρτησίας των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Βαρύτητα Νόσου και δεχόμαστε ότι τα γεγονότα Ύπαρξη Αναστολέα και Βαρύτητα Νόσου είναι εξαρτημένα. [Χ 2 (1,39)=5,636, p=0,018] Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Βαρύτητα Νόσου χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Όπως φαίνεται η Βαρύτητα Νόσου και η Ύπαρξη Αναστολέα σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,380, p < 0,05). 102 Το αποτέλεσμα αυτό είναι αναμενόμενο και αντικατοπτρίζει το ότι η ανάπτυξη αναστολέα είναι ουσιαστικά πρόβλημα της σοβαρής νόσου όπου τα

103 σχήματα θεραπείας είναι εντατικά και ξεκινούν από τη βρεφική ή την πρώιμη νηπιακή ηλικία Συσχέτιση Ύπαρξης της μετάλλαξης - Βαρύτητας νόσου (εργ. εικόνα - ποσοστό παράγοντα VIII) Από τους 39 ασθενείς που μελετήθηκαν, οι 25 παρουσίαζαν βαριά νόσο. Το 43,5% των ασθενών με βαριά αιμορροφιλία Α είχαν τη μετάλλαξη. Μόνο το 2,6% των ασθενών με ενδιάμεση και ήπια αντίστοιχα βαρύτητα της νόσου είχαν τη μετάλλαξη. Η συσχέτιση της ύπαρξης της αντιστροφής του ιντρονίου 22 με τη βαρύτητα της αιμορροφιλίας συνοψίζεται στον ακόλουθο πίνακα: Πίνακας 21. Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητών Μετάλλαξη DNA και Βαρύτητα Νόσου ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ * ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA Crosstabulation ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ ΗΠΙΑ- ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA ΟΧΙ ΝΑΙ Total Count Expected Count 9,7 4,3 14,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 92,9% 7,1% 100,0% ΣΟΒΑΡΗ Count Expected Count 17,3 7,7 25,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 56,0% 44,0% 100,0% Total Count Expected Count 27,0 12,0 39,0 % within ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ 69,2% 30,8% 100,0% 103

104 Γράφημα 5: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Μετάλλαξη DNA για κάθε επίπεδο του παράγοντα Βαρύτητα Νόσου Χρησιμοποιώντας το test Χ 2 σαν έλεγχο ανεξαρτησίας συμπεραίνουμε ότι απορρίπτουμε την μηδενική υπόθεση ανεξαρτησίας των γεγονότων Μετάλλαξη DNA και Βαρύτητα Νόσου και δεχόμαστε ότι τα γεγονότα Μετάλλαξη DNA και Βαρύτητα Νόσου είναι εξαρτημένα. [Χ 2 (1,39)=5,723, p=0,017] Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Βαρύτητα Νόσου και Μετάλλαξη DNA χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Όπως φαίνεται η Βαρύτητα Νόσου και η Μετάλλαξη του DNA σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,383, p < 0,05). Τα αποτελέσματα συμφωνούν με τη διεθνή βιβλιογραφία αφού η αναστροφή του ιντρονίου 22 είναι διεθνώς η συχνότερη αιτία βαριάς αιμορροφιλίας Α. 104

105 Ακολουθούν συσχετίσεις της μετάλλαξης με την κλινική εικόνα της νόσου: Συσχέτιση της μετάλλαξης με την αιμορρροφιλική αρθροπάθεια (HJHS, αριθμός αρθρώσεων στόχος) Αναζητήθηκε συσχέτιση της μετάλλαξης με την αιμορρροφιλική αρθροπάθεια όπως αυτή περιγράφεται i) με το HJHS Για λόγους στατιστικής ανάλυσης έγινε κατηγοριοποίηση στο HJHS: 0-5, 5-10, >10. Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Μετάλλαξη DNA και HJHS χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω Πίνακα.: Πίνακας 22. Έλεγχος συσχέτισης των μεταβλητών Μετάλλαξη DNA και HJHS Correlations ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA Pearson Correlation HAEMOPHILIA JOINT ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ HEALTH DNA SCORE cat 1,507 ** HAEMOPHILIA JOINT HEALTH SCORE cat Sig. (2- tailed),006 N Pearson Correlation Sig. (2- tailed),507 ** 1,006 N **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). 105

106 Γράφημα 6: Συγκριτικό θηκόγραμμα της μεταβλητής Μετάλλαξη DNA για κάθε επίπεδο του παράγοντα HJHS Όπως φαίνεται από τον παραπάνω Πίνακα η Μετάλλαξη DNA και το HJHS σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,507, p < 0,05). Για να εξετάσουμε την σχέση της Μετάλλαξης και του HJHS χρησιμοποιήσαμε λογιστική παλινδρόμηση. 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a HJHScat 1,553,641 5,864 1,015 4,726 1,345 16,608 Constant -1,761,729 5,836 1,016,172 a. Variable(s) entered on step 1: HJHScat. 106

107 Ο λόγος των σχετικών πιθανοτήτων της HJHS είναι 4,726 (CI1,345-16,608) κάτι που σημαίνει ότι, καθώς ανεβαίνουμε κατά 1 κατηγορία στο score, η πιθανότητα να υπάρχει η μετάλλαξη αυξάνει 4,7 φορές. ii)με τις αρθρώσεις-στόχο Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Μετάλλαξη DNA και Άρθρωση Στόχος χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω Πίνακα. Πίνακας 23. Έλεγχος συσχέτισης των μεταβλητών Μετάλλαξη DNA και Άρθρωση Στόχος Correlations ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA Pearson Correlation ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΑΡΘΡΩΣΗ DNA ΣΤΟΧΟΣ 1,383 * ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ Sig. (2- tailed),016 N Pearson Correlation,383 * 1 Sig. (2- tailed),016 N *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Όπως φαίνεται από τον παραπάνω Πίνακα, η Μετάλλαξη DNA και η Άρθρωση Στόχος σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,383, p < 0,05). Δηλαδή, τόσο πιθανότερη είναι η ύπαρξη της μετάλλαξης, όσο αυξάνεται ο αριθμός των αρθρώσεων - στόχος 107

108 Συσχέτιση της μετάλλαξης με τις λοιπές αιμορραγικές εκδηλώσεις, επιπλοκές Μετάλλαξη αιματουρία Το δείγμα είναι μικρό και δεν μπορεί να μελετηθεί η ύπαρξη συσχέτισης. Είναι σημαντικό όμως να αναφέρουμε ότι από τους 39 ασθενείς που μελετήθηκαν οι 7 (όλοι με βαριά νόσο) εμφάνισαν αιματουρία, ενώ οι 3 από αυτούς είχαν την αναστροφή του ιντρονίου 22 (πίνακας 24). Δηλαδή το 42,6% των ασθενών που εμφάνισαν αιματουρία παρουσιάζουν τη μετάλλαξη. Πίνακας 24. Αριθμός ασθενών με αιματουρία αναλόγως με την ύπαρξη μετάλλαξης και τη βαρύτητα. ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ ΗΠΙΑ- ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA ΟΧΙ ΝΑΙ Count Count ΑΙΜΑΤΟΥΡΙΑ ΝΑΙ 0 1 ΟΧΙ 13 0 ΣΟΒΑΡΗ ΑΙΜΑΤΟΥΡΙΑ ΝΑΙ 4 3 ΟΧΙ 10 8 Μετάλλαξη - οστεοπενία Το δείγμα είναι μικρό και δεν μπορεί να μελετηθεί η ύπαρξη συσχέτισης. Είναι σημαντικό όμως να αναφέρουμε ότι από τους 39 παιδιατρικούς ασθενείς που μελετήθηκαν οι 4(όλοι με βαριά νόσο) εμφάνισαν οστεοπενία. Οι 2 (50 %) από αυτούς είχαν τη μετάλλαξη. Πίνακας 25. Αριθμός ασθενών με οστεοπενία αναλόγως με την ύπαρξη μετάλλαξης και τη βαρύτητα ΒΑΡΥΤΗΤΑ ΝΟΣΟΥ ΗΠΙΑ- ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA ΟΧΙ ΝΑΙ Count Count ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΑ ΟΧΙ 13 1 ΝΑΙ 0 0 ΣΟΒΑΡΗ ΟΣΤΕΟΠΕΝΙΑ ΟΧΙ

109 ΝΑΙ 2 2 Δηλαδή, το 50% των ασθενών που εμφάνισαν οστεοπενία, παρουσιάζουν τη μετάλλαξη. Τέλος, ένας μόνο ασθενής εμφάνισε ενδοκράνια αιμορραγία, ο οποίος παρουσιάζει και τη μετάλλαξη Συσχέτιση Ύπαρξης της μετάλλαξης και Παρουσίας αναστολέα Από τους 12 ασθενείς που είχαν τη μετάλλαξη, ανέπτυξαν αναστολέα οι 5 (41,7%) (πίνακας 26) Πίνακας 26: Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητών Ύπαρξη Αναστολέα και Μετάλλαξη DNA ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA * ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ Crosstabulation ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΟΧΙ ΝΑΙ Total ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA ΟΧΙ Count Expected Count 21,5 5,5 27,0 % within ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA 88,9% 11,1% 100,0% ΝΑΙ Count Expected Count 9,5 2,5 12,0 % within ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA 58,3% 41,7% 100,0% Total Count Expected Count 31,0 8,0 39,0 % within ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ DNA 79,5% 20,5% 100,0% 109

110 Γράφημα 7: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Μετάλλαξη DNA για κάθε επίπεδο του παράγοντα Ύπαρξη Αναστολέα Χρησιμοποιώντας το test Χ 2 σαν έλεγχο ανεξαρτησίας συμπεραίνουμε ότι απορρίπτουμε την μηδενική υπόθεση ανεξαρτησίας των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Μετάλλαξη DNA και δεχόμαστε ότι τα γεγονότα Ύπαρξη Αναστολέα και Μετάλλαξη DNA είναι εξαρτημένα. [Χ2(1,39)=4,757, p=0,029] Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Μετάλλαξη DNA χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Όπως φαίνεται η Ύπαρξη αναστολέα και η Μετάλλαξη του DNA σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,349, p < 0,05). Τα αποτελέσματα συμφωνούν με τη διεθνή βιβλιογραφία όπου επισημαίνεται ότι 110

111 είναι πιθανότερο οι φορείς της μετάλλαξης να αναπτύξουν αναστολέα σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς. Επιπλέον μελετήθηκαν οι συσχετίσεις: Συσχέτιση Παρουσίας αναστολέα - αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία η ύπαρξη αναστολέα επηρεάζει σαφώς την πορεία της νόσου και την αιμορροφιλική αρθροπάθεια. Έτσι μελετήθηκε η ύπαρξη συσχέτισης στην παρούσα μελέτη μεταξύ: α) ύπαρξης αναστολέα HJHS Πίνακας 27. Συχνότητα, Αναμενόμη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητων HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ * HAEMOPHILIA JOINT HEALTH SCORE cat Crosstabulation HAEMOPHILIA JOINT HEALTH SCORE cat ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ > 10 Total ΟΧΙ Count Expected Count % within ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ 8,6 7,1 4,3 20,0 60,0% 30,0% 10,0% 100,0% ΝΑΙ Count Expected Count % within ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ 3,4 2,9 1,7 8,0,0% 50,0% 50,0% 100,0% Total Count Expected Count % within ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ 12,0 10,0 6,0 28,0 42,9% 35,7% 21,4% 100,0% 111

112 Γράφημα 8: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Ύπαρξη Αναστολέα για κάθε επίπεδο του παράγοντα HJHS Πίνακας 28. Συχνότητα, Αναμενόμενη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητών HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα HAEMOPHILIA JOINT HEALTH SCORE cat ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ Pearson Correlation Sig. (2- tailed) HAEMOPHILIA JOINT HEALTH ΥΠΑΡΞΗ SCORE cat ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ 1,585 **,001 N Pearson Correlation,585 ** 1 Sig. (2- tailed),001 N

113 Χρησιμοποιώντας το test Χ 2 σαν έλεγχο ανεξαρτησίας συμπεραίνουμε ότι απορρίπτουμε την μηδενική υπόθεση ανεξαρτησίας των γεγονότων HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα και δεχόμαστε ότι τα γεγονότα HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα είναι εξαρτημένα. [Χ 2 (1,39)=9,707 p=0,008] Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Όπως φαίνεται η μεταβλητή HJHS και η Ύπαρξη Αναστολέα σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,585, p < 0,01). Πίνακας 28. Σχετικές πιθανότητες των μεταβλητών HJHS και Ύπαρξη Αναστολέα Variables in the Equation 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a HJHScat 2,079,803 6,711 1,010 8,000 1,659 38,578 Constant -2,996 1,059 8,002 1,005,050 Ο λόγος των σχετικών πιθανοτήτων της μεταβλητής HJHS είναι 8 κάτι που σημαίνει ότι καθώς ανεβαίνουμε κατα 1 κατηγορία στο score ή πιθανότητα να έχουμε αναστολέα αυξάνει 8 φορές β) Επίσης μελετήθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της Ύπαρξης αναστολέα με τον Αριθμό αρθρώσεων στόχος (μία/περισσότερες από μία) 113

114 Πίνακας 29. Συχνότητα, Αναμενόμενη Συχνότητα και Σχετική Συχνότητα των μεταβλητών Ύπαρξη Αναστολέα και Άρθρωση Στόχος ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ * ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ Crosstabulation ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ ΥΠΑΡΞΗ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΟΧΙ ΝΑΙ Total 0 Count Expected Count % within ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ 2,9 1,1 4,0 75,0% 25,0% 100,0% 1 Count Expected Count % within ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ 9,3 3,7 13,0 100,0%,0% 100,0% >1 Count Expected Count % within ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ 7,9 3,1 11,0 36,4% 63,6% 100,0% Total Count Expected Count % within ΑΡΘΡΩΣΗ ΣΤΟΧΟΣ 20,0 8,0 28,0 71,4% 28,6% 100,0% 114

115 Γράφημα 9: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Ύπαρξη Αναστολέα για κάθε επίπεδο του παράγοντα Αριθμός Αρθρώσεων Στόχος Όπως φαίνεται στο παραπάνω γράφημα από τους ασθενείς που είχαν παραπάνω από μία άρθρωση στόχο, το 63,6% παρουσίαζαν αναστολέα. Χρησιμοποιώντας το test Χ 2 σαν έλεγχο ανεξαρτησίας συμπεραίνουμε ότι απορρίπτουμε την μηδενική υπόθεση ανεξαρτησίας των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Άρθρωση Στόχος και δεχόμαστε ότι τα γεγονότα Ύπαρξη Αναστολέα και Άρθρωση Στόχος είναι εξαρτημένα. [Χ 2 (2,39)=11,852, p<<0,05] Προκειμένου να διερευνηθεί ο βαθμός και η κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ των γεγονότων Ύπαρξη Αναστολέα και Άρθρωση Στόχος χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson r, ο οποίος είναι δείκτης του μεγέθους της συσχέτισης και της κατεύθυνσης αυτής. Όπως φαίνεται η Ύπαρξη Αναστολέα και η Άρθρωση Στόχος σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά και με θετική κατεύθυνση (r = 0,460, p < 0,05). 115

116 Συχνότητα θεραπείας HJHS Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία η προφυλακτική θεραπεία βελτιώνει την πορεία της αιμορροφιλικής αρθροπάθειας. Στην παρούσα μελέτη δεν μπορεί να μελετηθεί η ύπαρξη συσχέτισης στη συγκεκριμένη περίπτωση επειδή είναι μικρό το στατιστικό δείγμα ανά κατηγορία. Μπορούμε όμως να παραθέσουμε τον παρακάτω πίνακα που αφορά στους ασθενείς οι οποίοι βρίσκονταν σε σχήμα προφύλαξης. Πίνακας 30. Συχνότητες και Σχετικές Συχνότητες Προφυλακτικής Θεραπείας και HJHS HAEMOPHILIA JOINT HEALTH SCORE cat Valid Cumulative Frequency Percent Percent Percent Valid ,1 37,5 37, ,1 37,5 75,0 > ,4 25,0 100,0 Total 24 85,7 100,0 Missing System 4 14,3 Total ,0 Γράφημα 10: Συγκριτικό ραβδόγραμμα της μεταβλητής Προφυλακτική Θεραπεία για κάθε επίπεδο του παράγοντα HJHS 116