Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ BEVACIZUMAB ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ (ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ)

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Β ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΣΑΚΑΝΤΑΜΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ BEVACIZUMAB ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ (ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ) ΕΥΣΤΑΘΙΟΥ Θ ΠΑΥΛΙΔΗ ΙΑΤΡΟΥ- ΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΥ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Καθηγητής Βασίλειος Ταρλατζής ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΥ ΤΟΜΕΑ Καθηγητής Ιωάννης Μακρής 2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Μπαλλάς, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής (Επιβλέπων) Αθανάσιος Σακαντάμης, Καθηγητής Χειρουργικής Γεώργιος Μαράκης, Καθηγητής Χειρουργικής Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Μπαλλάς, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής (Επιβλέπων) Αθανάσιος Σακαντάμης, Καθηγητής Χειρουργικής Γεώργιος Μαράκης, Καθηγητής Χειρουργικής Χαράλαμπος Λαζαρίδης, Καθηγητής Χειρουργικής Ιωάννης Μακρής, Καθηγητής Χειρουργικής Ιωάννης Γαλάνης, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Κοκκώνα Κουζή- Κολιάκου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιστολογίας- Εμβρυολογίας Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλεί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 & 2 και Νόμος 1268/82, άρθρο 50 & 8) 3

4 4 Στους γονείς μου

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Πρόλογος 6 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Επούλωση τραύματος 9 Επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου 14 Διαφυγή από τις αναστομώσεις του παχέος εντέρου 16 Αναστολή της αγγειογένεσης σε κακοήθεις νεοπλασματικούς όγκους Ο ρόλος της bevacizumab 19 Νεότερες θεραπείες στον ορθοκολικό καρκίνο (στοχευμένες θεραπείες) 22 Bevacizumab και επούλωση τραύματος 27 Ανεπιθύμητες ενέργειες της bevacizumab 29 Βevacizumab και ορθοκολικός καρκίνος 34 Άλλες χρήσεις του Avastin εκτός του ορθοκολικού καρκίνου 36 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός και πρωτοτυπία 39 Υλικό και μέθοδοι 40 Εικόνες πειράματος 43 Αποτελέσματα 51 Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων 51 Γραφικές παραστάσεις 57 Χαρακτηριστικές ιστολογικές εικόνες 65 Συζήτηση 72 Περίληψη 85 Summary 88 Βιβλιογραφία 92 5

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η στοχευμένη θεραπεία εφαρμόζεται με όλο και μεγαλύτερη συχνότητα στη θεραπεία του καρκίνου, ανοίγει ελπιδοφόρους ορίζοντες και αποτελεί σύγχρονη θεραπευτική επιλογή. Η bevacizumab ως αναστολέας της αγγειογένεσης χρησιμοποιείται κυρίως στον προχωρημένο ορθοκολικό καρκίνο μαζί με άλλα χημειοθεραπευτικά, αλλά το εύρος εφαρμογής της επεκτείνεται σήμερα και σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, τόσο σε κλινικό, όσο και σε πειραματικό επίπεδο. Το φάρμακο γενικά θεωρείται ασφαλές, αλλά όμως σε μερικές σπάνιες περιπτώσεις δεν στερείται ανεπιθύμητων ενεργειών και επιπλοκών. Το θέμα συγκεντρώνει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον και διευρύνει τα πειραματικά πεδία. Η επούλωση του τραύματος είναι συντελεστής πρωταρχικής σημασίας για την επιτυχή έκβαση μίας χειρουργικής επέμβασης και η αγγειογένεση αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της. Η επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου αποτελεί αποδεκτό πειραματικό πρότυπο για τη μελέτη της επούλωσης και ιδανικό για την δοκιμασία της επίδρασης του συγκεκριμένου φαρμάκου, αφού ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η κυριότερη ένδειξη εφαρμογής του. Οι επίμυες και ποντικοί αποτελούν το συχνότερο πρότυπο πειραματοζώων αξιόπιστης εφαρμογής της στην σύγχρονη έρευνα. Η πειραματική αυτή μελέτη σε επίμυες εξετάζει την επίδραση που μπορεί να έχει η bevacizumab στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου. Η εκτίμηση του βαθμού της επίδρασης πραγματοποιείται με την αξιολόγηση διαφόρων καθιερωμένων παραμέτρων τόσο κλινικών, όσο και εργαστηριακών σε κυτταρικό επίπεδο. Η πολυπλοκότητα και αλληλεπίδραση των μηχανισμών της επούλωσης τραύματος σε μοριακό επίπεδο οδηγεί τελικά στην παραγωγή κολλαγόνου που αποτελεί τη θεμέλια ουσία της επουλωτικής διεργασίας. Η σύνθεση του κολλαγόνου στον ιστό αποτελεί τον κυριότερο δείκτη της επούλωσης. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Επιστημονικής Έρευνας και Πειραματικής Χειρουργικής της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Ιπποκράτειο Νοσοκομείο που διευθύνεται από τον Καθηγητή κύριο Αθανάσιο Σακαντάμη. Οι βιοχημικές εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Βιοχημείας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, από τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Γεώργιο Κολιάκο. Οι ιστολογικές εξετάσεις διενεργήθηκαν στο Εργαστήριο 6

7 Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης από την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία Κοκκώνα Κουζή- Κολιάκου. Θεωρώ υποχρέωση μου να εκφράσω στον Καθηγητή κύριο Αθανάσιο Σακαντάμη βαθειά ευγνωμοσύνη, απέραντο σεβασμό και θερμές ευχαριστίες για την εκπαίδευση μου, την επιλογή του θέματος και την ανάθεση, καθώς και την ολόπλευρη συμπαράσταση στη μελέτη αυτή. Στον Επίκουρο Καθηγητή κύριο Κωνσταντίνο Μπαλλά εκφράζω θερμές ευχαριστίες για την κύρια επίβλεψη της μελέτης και την ουσιαστική συμβολή του στο πειραματικό μέρος και την συγγραφή. Στον Καθηγητή κύριο Γεώργιο Μαράκη εκφράζω απέραντη εκτίμηση και θερμές ευχαριστίες για τις πολύτιμες συμβουλές του και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις σε όλη την διάρκεια της μελέτης και την συγγραφή. Στον Επιμελητή ΕΣΥ κύριο Κυριάκο Ψαρρά εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την καθοριστική συμβολή του και τη βοήθεια στο πειραματικό μέρος και τους θεωρητικούς προβληματισμούς κατά την αναζήτηση της βιβλιογραφίας. Στον Επιμελητή ΕΣΥ κύριο Νικόλαο Συμεωνίδη εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την καθοριστική συμβολή του και τη βοήθεια στο πειραματικό μέρος και την επίπονη προσπάθεια στην στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Γεώργιο Κολιάκο εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την ανάλυση των βιοχημικών εξετάσεων, την ερμηνεία τους και τις πολύτιμες συμβουλές του. Στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία Κοκώνα Κουζή- Κολιάκου εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την εκτέλεση των ιστολογικών εξετάσεων, την ερμηνεία τους και τις πολύτιμες συμβουλές της. Στην συνάδελφο Βιολόγο κυρία Κωνσταντίνα Τοπουρίδου, Επιστημονική συνεργάτιδα, εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την πολύτιμη βοήθεια και επίπονη προσπάθεια στην προετοιμασία και ανάλυση των βιοχημικών δειγμάτων. Στον Καθηγητή κύριο Δημήτριο Καρβουνάρη και τον Λέκτορα κύριο Σάββα Ραφαηλίδη εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την συμπαράσταση και τις πολύτιμες συμβουλές τους. Σε όλους τους συναδέλφους και το προσωπικό της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής και σε όσους άλλους συνέβαλλαν στην εκπόνηση αυτής της διατριβής εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες. 7

8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8

9 ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΡΑΥΜΑΤΟΣ Έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι σήμερα σημαντικές εξελίξεις που συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της επούλωσης του τραύματος. Αρκετοί αυξητικοί παράγοντες έχουν ήδη ανακαλυφθεί και καθορίσθηκε ο ακριβής ρόλος τους, καθώς επίσης και η αλληλουχία των σύνθετων και διαπλεκομένων διεργασιών που συμπεριλαμβάνονται και καθορίζουν τις φάσεις της επούλωσης ενός τραύματος. Με τον όρο επούλωση εννοείται το σύνολο των αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε κυτταρικό επίπεδο και αποσκοπούν στην αποκατάσταση των τραυματισμένων ιστών με τελικό αποτέλεσμα τη διατήρηση της ακεραιότητας του οργανισμού. Οι βασικές αρχές επούλωσης παραμένουν ίδιες σε όλους τους ιστούς και τα όργανα του σώματος, αλλά υπάρχουν και επιμέρους ιδιομορφίες. Αυτή η δυνατότητα ενεργού αποκατάστασης των τραυμάτων επιτρέπει και την διενέργεια χειρουργικών επεμβάσεων. Μέσα από τις έρευνες που έχουν διενεργηθεί σε μοριακό επίπεδο έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος, διευρύνοντας έτσι τους ορίζοντες της γνώσης και συνεισφέροντας στην καλύτερη κατανόηση της πολυπλοκότητας και της αλληλεπίδρασης των μηχανισμών του φαινομένου της επούλωσης (1,2). Οι βιολογικοί μηχανισμοί που υπεισέρχονται και διασφαλίζουν την επούλωση ενός τραύματος είναι η επιθηλιοποίηση, η εναπόθεση συνδετικού ιστού που παράγεται από τους ινοβλάστες και διαπλέκεται από το κολλαγόνο, η εισολκή με προς τα έσω επέκταση των χειλέων του τραύματος και η ρίκνωση επιμήκων σωλήνων. Η επούλωση ενός οξέος τραύματος είναι μια διαδικασία αλληλοδιάδοχων και σύνθετων διεργασιών, οι οποίες συνιστούν ένα ενιαίο σύνολο με κοινό στόχο και αποτέλεσμα. Αν και η διεργασία είναι συνεχής, για καλύτερη κατανόηση μπορεί να διακριθεί σχηματικά σε τέσσερις φάσεις: Α. Φάση της αιμόστασης και πήξης Β. Φάση της φλεγμονής Γ. Φάση σχηματισμού κοκκιώδους ιστού, παραγωγής κολλαγόνου και αγγειογένεσης ή άλλως παραγωγική φάση Δ. Φάση σχηματισμού ουλής και αναμόρφωσης του τραύματος 9

10 ΦΑΣΗ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ ΚΑΙ ΠΗΞΗΣ Μετά από κάθε βλάβη ιστών που προέρχεται είτε από εγχείρηση ή τραυματισμό απελευθερώνεται από την μεμβράνη των κυττάρων θρομβοξάνη Α 2 και προσταγλανδίνη 2-α (3). Αυτές είναι ισχυρές αγγειοσυσπαστικές ουσίες που προκαλούν σύσπαση των μικρών αγγείων που αιμορραγούν και περιορισμό της αιμορραγίας (αγγειακή φάση). Ακολουθεί η συσσώρευση των αιμοπεταλίων και ο σχηματισμός του προσωρινού ή αιμοπεταλιακού θρόμβου που αποτελείται από ινωδονεκτίνη, ινική, υαλονεκτίνη και θρομβοσπονδίνη (αιμοπεταλιακή φάση). Ο θρόμβος αυτός δεν είναι σημαντικός μόνο για την αιμόσταση, αλλά παρέχει και ένα επιπρόσθετο υπόστρωμα για τη μετανάστευση των κυττάρων που ακολουθεί στην επόμενη φλεγμονώδη φάση. Επιπλέον, το κυτταρόπλασμα των αιμοπεταλίων περιέχει και απελευθερώνει αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες, όπως αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας ( platelet derived growth factor, PDGF), μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-β ( transforming growth factor, TGF-β), επιδερμικός αυξητικός παράγοντας ( epidermal growth factor, EGF) και ομοιάζοντες με ινσουλίνη αυξητικοί παράγοντες ( insulin-like growth factors). Οι αιμοπεταλιακοί αυτοί παράγοντες προάγουν την επούλωση με συγκέντρωση και ενεργοποίηση ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων αρχικά και αργότερα μακροφάγων, ενδοθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών. Το κολλαγόνο στην περιοχή του τραύματος ενεργοποιεί τόσο την εξωγενή, όσο και την ενδογενή οδό του μηχανισμό πήξης (4). Η θρομβοκινάση που απελευθερώνεται από τα αιμοπετάλια και τους ιστούς μετατρέπει την προθρομβίνη σε θρομβίνη και αυτή με την σειρά της μετατρέπει το διαλυτό ινωδογόνο σε αδιάλυτο ινώδες που αποτελεί τον ισχυρό θρόμβο (φάση της πήξης). Επίσης, ενεργοποιείται από το κολλαγόνο ο μηχανισμός του συμπληρώματος, το σύστημα βραδυκινίνης, ισταμίνης, σεροτονίνης και η παραγωγή πλασμίνης (1). Μία δυναμική ισορροπία μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων, αιμοπεταλίων, πηκτικού μηχανισμού και ινωδόλυσης ρυθμίζει την φάση της αιμόστασης και καθορίζει την ποσότητα της ινικής που εναποτίθεται στην περιοχή του τραύματος και ως εκ τούτου επηρεάζει την διεργασία της αποκατάστασης. ΦΑΣΗ ΤΗΣ ΦΛΕΓΜΟΝΗΣ Οι αγγειοδραστικές ουσίες, σεροτονίνη, ισταμίνη, βραδυκινίνη που περιέχονται, αντίστοιχα, στα αιμοπετάλια, τα μαστοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα, προκαλούν 10

11 αγγειοδιαστολή και αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα και οδηγούν τελικά σε εξαγγείωση υγρών στους ιστούς και δημιουργία τοπικού οιδήματος (1). Εκτός τούτου, έτσι προάγεται και η έξοδος των λευκών αιμοσφαιρίων. Στην σειρά προηγούνται τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα (εντός ωρών) που έλκονται από διάφορους χημειοτακτικούς παράγοντες, για την παρεμπόδιση της επιμόλυνσης με φαγοκυττάρωση των μικροβίων, ξένων σωματιδίων και των κατεστραμμένων ιστών. Αυτά προσκολλώνται στο ενδοθήλιο των τριχοειδικών αγγείων αρχικά με χαλαρές συμφύσεις που ρυθμίζονται από την σελεκτίνη και αργότερα με ισχυρότερες συμφύσεις που ρυθμίζονται από τις ιντεγκρίνες. Αργότερα ακολουθούν τα μακροφάγα (μετά ώρες) που έλκονται από πολυάριθμους χημειοτακτικούς παράγοντες και συνεχίζουν και αυτά την φαγοκυττάρωση για περισσότερο χρονικό διάστημα από τα ουδετερόφιλα, ακόμα και σε χαμηλότερο ph. Επιπλέον, τα μακροφάγα παρέχουν σημαντικούς αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες ενεργοποιώντας τα κερατινοκύτταρα, τους ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η απουσία των μακροφάγων οδηγεί σε σοβαρή διαταραχή της επούλωσης λόγω καθυστέρησης στον πολλαπλασιασμό και ωρίμανση των ινοβλαστών, καθώς και της αγγειογένεσης. Τελευταία έρχονται τα λεμφοκύτταρα (μετά 72 ώρες) που εγκαθιστούν ένα ανοσιακό φραγμό μέσου της κυτταρικής και χυμικής ανοσίας και έλκονται κυρίως από την δράση της ιντερλευκίνης-1 (IL-1). Η τελευταία παίζει σπουδαίο ρόλο και στη ρύθμιση της κολλαγενάσης, η οποία χρειάζεται αργότερα στην αποδόμηση του κολλαγόνου (4). Η φάση της φλεγμονής διαρκεί από 2 έως 4 ημέρες (3). ΦΑΣΗ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΚΟΚΚΙΩΔΟΥΣ ΙΣΤΟΥ, ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ Ο σχηματισμός του κοκκιώδους ιστού καθορίζεται από διάφορους χημειοτακτικούς, αυξητικούς και ενεργοποιητικούς παράγοντες, που παράγονται στη φλεγμονώδη φάση, και διαρκεί από την 4 η έως και την 21 η ημέρα μετά τον τραυματισμό (1). Οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι οι κύριοι πρωταγωνιστές της φάσης αυτής. Οι ινοβλάστες μεταναστεύουν στην περιοχή του τραύματος από τους γύρω ιστούς, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα προέρχονται από τα υγιή τριχοειδή πέριξ της βλάβης. Αυτοί οι δυο τύποι των κυττάρων πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν για να καλύψουν το έλλειμμα των ιστών (2). Σχηματίζονται νέα τριχοειδή μέσα στον χαλαρό ιστό του τραύματος που συγχρόνως παράγει κολλαγόνο και στηρίζει τα νεόπλαστα αγγεία. Ο ιστός αυτός 11

12 ονομάζεται κοκκιώδης και αποτελείται από υπόστρωμα ινικής, ινωδονεκτίνης, κολλαγόνου, γλυκοζοαμινογλυκανών και υαλουρονικού οξέος. Επιπλέον περιέχει μακροφάγα, ινοβλάστες και νεόπλαστα αγγεία. Παράγοντες που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι αυτοί που εκκρίνονται από τα αιμοπετάλια και τα μακροφάγα (5,6). Σε ουδέτερες περιόδους οι ινοβλάστες παραμένουν στους ιστούς σε αδρανή κατάσταση. Η επίδραση των αυξητικών παραγόντων όπως οι PDGF, TGFb1 και EGF προκαλούν την ενεργοποίηση τους και προάγουν τον πολλαπλασιασμό τους, ούτως ώστε να μετακινηθούν στην περιοχή της βλάβης, ενώ παράλληλα παράγουν τη διάμεση ουσία (7). Ο παράγοντας EGF είναι ένα πολυπεπτίδιο μονής αλύσου που αποτελείται από 53 αμινοξέα. Ασκεί μιτογόνο δράση σε ποικιλία κυττάρων τόσο in vivo, όσο και in vitro. Αρχικά απομονώθηκε από τους υπογνάθιους αδένες του ποντικού (megf) και αργότερα από τα ουρά του ανθρώπου ( hegf), για αυτό αρχικά ήταν γνωστός ως ουρογαστρόνη. Φυσιολογικά ανευρίσκεται ακόμη στο γαστρικό επιθήλιο, στους αδένες Brunner του δωδεκαδακτύλου, στους ιδρωτοποιούς αδένες και στο μαστό (8). Αρχικά, οι ινοβλάστες εγκαθίστανται στις παρυφές της προσβεβλημένης περιοχής και εκτίθενται έτσι σε ένα περιβάλλον πλούσιο σε αυξητικούς παράγοντες και σε συνθήκες σχετικής υποξίας, γεγονός που εξασφαλίζει την αθρόα παραγωγή κολλαγόνου, ελαστίνης και κολλαγενάσης, ένζυμο απαραίτητο για τη μεταγενέστερη αποδόμηση του κολλαγόνου. Η αρχική φάση της σύνθεσης του κολλαγόνου πραγματοποιείται ενδοκυττάρια με την παραγωγή προκολλαγόνου που αργότερα ενεργοποιείται στον εξωκυττάριο χώρο και μετατρέπεται σε κολλαγόνο. Καθ όλη τη διάρκεια της επούλωσης η σύνθεση και αποδόμηση του κολλαγόνου είναι διαδικασίες που συμβαίνουν ταυτόχρονα και σε αρμονική ισορροπία, ώστε να εξασφαλίζεται η παραγωγή του κολλαγόνου που είναι απαραίτητο, όχι όμως πλεονάζουσας ποσότητας που μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό εκτεταμένης ουλής (9). Η αγγειογένεση κατά τα αρχικά στάδια προάγεται κυρίως από την ιστική υποξία, ενώ οι σημαντικότεροι παράγοντες που έχουν αγγειοενεργό δράση είναι οι FGF και TGF-a. Ο παράγοντας TGF-a, πολυπεπτίδιο μονής αλύσου 50 αμινοξέων, απομονώθηκε αρχικά από το υγρό καλλιεργειών ινοβλαστών επίμυων ενοφθαλμισμένο με ρετροϊούς. Αυτός είναι λειτουργικά και δομικά ένα ανάλογο του παράγοντα EGF. Φυσιολογικά ανευρίσκεται σε πολλούς ιστούς, όπως τα 12

13 κερατινοκύτταρα του δέρματος, στους βρόγχους, στο έντερο και στα νεφρικά σωληνάρια. Ο TGF-a και ο EGF συνδέονται με παρόμοια συγγένεια με τον υποδοχέα EGFR, έχουν την ίδια μιτογόνο δράση και μπορούν να αντικαταστήσουν ο ένας τον άλλον (10). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα με την επίδραση των προαναφερόμενων παραγόντων εμφανίζουν έντονη μιτωτική δραστηριότητα και εισβάλλουν στην περιοχή της βλάβης. Σχηματίζονται έτσι σωληνώδη μορφώματα αποτελούμενα από ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι σχηματισμοί αυτοί αποτελούν τα πρωτογενή τριχοειδή και εξασφαλίζουν την αρχική άρδευση της περιοχής με αίμα. Η διαδικασία της αγγειογένεσης θα διακοπεί, όταν εξασφαλισθεί επαρκής οξυγόνωση και πάψουν να υπάρχουν τα ερεθίσματα της τοπικής υποξίας και της αυξημένης συγκέντρωσης γαλακτικού οξέος. Η συρρίκνωση του τραύματος ξεκινά 8 με 10 ημέρες μετά τον τραυματισμό και έχει ως σκοπό τη συμπλησίαση των χειλέων του τραύματος, την ταχύτερη επούλωση του και τη δημιουργία μικρότερης ουλής (11). ΦΑΣΗ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΟΥΛΗΣ ΚΑΙ ΑΝΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΑΥΜΑΤΟΣ Η αναμόρφωση είναι η τελευταία φάση της επούλωσης και αποσκοπεί στην ανάπτυξη νέου επιθηλίου και την τελική διαμόρφωση του ουλώδους ιστού που μπορεί να διαρκέσει μέχρι 1 και 2 χρόνια ή μερικές φορές ακόμη περισσότερο (4). Η παραγωγή του κολλαγόνου διαρκεί μερικές εβδομάδες και στην συνέχεια υφίσταται διεργασία διάπλασης και αναμόρφωσης. Η σύνθεση του φθάνει τη μέγιστη τιμή εντός 5 έως 7 ημερών και μετά ακολουθεί προοδευτική ελάττωση. Η διαπλοκή των ινών του κολλαγόνου μεταξύ τους και με τα άλλα συστατικά του κοκκιώδους ιστού, καθώς εξελίσσεται σταδιακά, σχηματίζει την ώριμη ουλή που είναι μεταβολικά ενεργός ιστός, ο οποίος προσδίδει ελαστικότητα, ανθεκτικότητα και εξασφαλίζει την ακεραιότητα του τραύματος (1). Η φάση της αναμόρφωσης χαρακτηρίζεται από ελάττωση λόγω απόπτωσης των μακροφάγων και ινοβλαστών, καθώς και των άλλων στοιχείων της φλεγμονής. Η ανάπτυξη των τριχοειδών διακόπτεται και αναστέλλεται η αγγειογένεση, ενώ αυξάνεται η αποδόμηση του κολλαγόνου. Το ώριμο κολλαγόνο αποδομείται από την κολλαγενάση, η οποία βρίσκεται με τη μορφή προενζύμου και ενεργοποιείται στον εξωκυττάριο χώρο από ειδικά ένζυμα, τις μεταλλοπρωτεϊνάσες ( MMPs) που παράγονται από πολυμορφοπύρηνα, μακροφάγα και ινοβλάστες. Με ρυθμιστικό μηχανισμό εξασφαλίζεται η ομαλή δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών, ενώ η 13

14 αναστολή της δράσης τους επιτυγχάνεται με τους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών ( TIMPs). Ακόμη το κολλαγόνο μπορεί να απορροφηθεί και με φαγοκυττάρωση (1,4). Η αναμόρφωση του τραύματος υπόκειται σε ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν αυστηρά την σύνθεση και αποδόμηση του κολλαγόνου, έτσι ώστε να υπάρχει και να διατηρείται η επιθυμητή ισορροπία που εξασφαλίζει μία φυσιολογική επούλωση. Η διαταραχή αυτής της ισορροπίας οδηγεί σε παθολογική κατάσταση. Η αυξημένη σύνθεση και η ελαττωμένη αποδόμηση του κολλαγόνου ενοχοποιούνται για την εμφάνιση xηλοειδών και υπερτροφικής ουλής. Η υπερτροφική ουλή περιορίζεται μέσα στα όρια του τραύματος και σχεδόν πάντοτε υποστρέφεται με την πάροδο του χρόνου. Σε αντίθεση το χηλοειδές επεκτείνεται έξω από τα όρια του τραύματος και συνήθως όχι μόνο δεν υποστρέφεται, αλλά και συχνά υποτροπιάζει μετά τη χειρουργική αφαίρεση του (3). ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ Οι μηχανισμοί της επούλωσης του εντέρου (λεπτού και παχέος) ενεργοποιούνται μετά από βλάβη αυτών, η οποία μπορεί να οφείλεται σε τραύμα, έλκος, ισχαιμία, καθώς και σε άλλου είδους καταστροφή των ιστών, όπως για παράδειγμα η χειρουργική εκτομή και αναστόμωση. Τα στάδια της επούλωσης του εντέρου είναι κατά κανόνα ίδια με αυτά των υπόλοιπων ιστών. Μεσολαβεί δηλαδή η φλεγμονώδης αντίδραση, ακολουθεί η εναπόθεση του κολλαγόνου και τελικά σχηματίζεται η ώριμη ουλή. Παρ όλα αυτά υπάρχουν και διαφορές που έχουν να κάνουν με την ανατομική και τη φυσιολογία του οργάνου. Έτσι, συζητώντας για το παχύ έντερο, πρέπει να λάβουμε υπόψη, ότι αυτό έχει τέσσερις στιβάδες, τη βλεννογόνια, την υποβλεννογόνια, τη μυϊκή και την ορογόνο στιβάδα (12). Οι αναστομώσεις συνήθως επιτυγχάνονται με τη χρήση χειρουργικών ραφών η μεταλλικών αγκτήρων ( clips) τιτανίου με ειδικά συρραπτικά μηχανήματα, χωρίς τα οποία δεν είναι δυνατό να επιτευχθεί επαρκής συμπλησίαση των τραυματικών χειλέων για μια ασφαλή αναστόμωση. Η διατομή του εντερικού τοιχώματος προκαλεί αιμορραγία που ακολουθείται από αγγειοσύσπαση για τον περιορισμό της μετατραυματικής αιμορραγίας. Αφού επιτευχθεί τοπική αιμόσταση, ακολουθεί αγγειοδιαστολή με αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών που αποδίδεται στη 14

15 δράση των κινινών. Το αποτέλεσμα του σταδίου αυτού είναι η δημιουργία οιδήματος και διόγκωσης των τραυματικών χειλέων, που μπορεί να προκαλέσει ισχαιμία της συρραφείσας περιοχής ή και διάσχιση της, αν οι ραφές είναι πολύ σφικτά δεμένες (13,14). Κατά τη φλεγμονώδη φάση, η περιοχή του προς επούλωση τραύματος κατακλύζεται από πολυμορφοπύρηνα και μακροφάγα, ενώ απελευθερώνεται από τα μακροφάγα και σειρά κυτταροκινών ( TGF-b1, bfgf, EGF, PDGF, IL-1b, IL-2, IL-6, TNF-a και IFN-γ). Όλες αυτές οι κυτταροκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες δρουν ταυτόχρονα στα επιθηλιακά κύτταρα, στις λείες μυϊκές ίνες και στα λεμφοκύτταρα ελέγχοντας τον πολλαπλασιασμό τους, ενώ καθορίζουν και τη σύνθεση της ινωδονεκτίνης και του κολλαγόνου. Τα επιθηλιακά κύτταρα και τα λεμφοκύτταρα παράγουν και αυτά κυτταροκίνες αναπτύσσοντας κατ αυτό τον τρόπο ένα μηχανισμό αλληλεπίδρασης μεταξύ μακροφάγων και επιθηλιακών κυττάρων, όπου η IL-1b και ο bfgf προάγουν τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών ινών και της κολλαγενάσης. Οι λείες μυϊκές ίνες μεταναστεύουν στην περιοχή της βλάβης και συνθέτουν ινωδονεκτίνη και κολλαγόνο. Στη φάση αυτή η διάμεση ουσία, η οποία συμμετέχει ενεργά στη συγκράτηση των χειλέων του τραύματος, αποτελείται κυρίως από ινωδονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ. Η ινωδονεκτίνη αρχίζει να παράγεται από τις λείες μυϊκές ίνες ήδη από την πρώτη ημέρα και φτάνει στη μέγιστη συγκέντρωσή της την 5 η ημέρα μετά την αναστόμωση, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αρχίζει να παράγεται τη 2 η ημέρα και του τύπου Ι την 3 η ημέρα. Με τη δράση της κολλαγενάσης γίνεται αποδόμηση του παλιού κολλαγόνου και του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, το οποίο αντικαθίσταται προοδευτικά από κολλαγόνο τύπου Ι. Εκατέρωθεν της γραμμής αναστόμωσης και σε απόσταση 2-3 mm από αυτήν, η περιοχή χαρακτηρίζεται ως βιοχημικά ενεργός ζώνη. Στην περιοχή αυτή τις πρώτες μέρες μετά την αναστόμωση λαμβάνει χώρα έντονη κολλαγονόλυση (15,16). Μετά την τρίτη ημέρα αρχίζει η παραγωγική φάση της επούλωσης. Οι λείες μυϊκές ίνες με τη δράση του TGF-β1 παράγουν μεγάλες ποσότητες κολλαγόνου, κυρίως τύπου Ι, το οποίο φτάνει στο μέγιστο της τιμής του την 7 η ημέρα. Παράλληλα ολοκληρώνεται η αγγειογένεση και η κάλυψη της περιοχής της αναστόμωσης από επιθηλιακά κύτταρα. Η επιθηλιοποίηση έχει ήδη αρχίσει από τη φλεγμονώδη φάση και ολοκληρώνεται κατά την παραγωγική φάση, όταν τα επιθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν και πολλαπλασιάζονται, μέχρις ότου καλύψουν πλήρως την περιοχή της αναστόμωσης. Η μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων προάγεται από την 15

16 επαφή τους με την ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο τύπου Ι και τη λαμινίνη που βρίσκονται στο χόριο και την υποβλεννογόνια στιβάδα. Ο πολλαπλασιασμός τους εξαρτάται από τη δράση των αυξητικών παραγόντων και των κυτταροκινών που απελευθερώνονται από τα μακροφάγα. Τα επιθηλιακά κύτταρα με τη σειρά τους εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι προωθούν περαιτέρω τη διαδικασία της επούλωσης, όπως ακριβώς συμβαίνει και κατά την επούλωση του δέρματος και των λοιπών οργάνων. Εκτός από τους αυξητικούς παράγοντες που προέρχονται από τα μακροφάγα, σημαντικό ρόλο στην αναγέννηση του επιθηλίου διαδραματίζουν και τα πεπτίδια που εκκρίνονται από τα καλυκοειδή κύτταρα (17). Η αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου στο σημείο της βλάβης ισχυροποιεί την περιοχή της αναστόμωσης και περίπου μετά από ημέρες αυτή έχει αποκτήσει σημαντική ισχύ. Κατά τη φάση της αναμόρφωσης του τραύματος η αναστόμωση έχει καλυφθεί πλήρως από επιθήλιο και μεσοθηλιακά κύτταρα. Στην περιοχή της αναστόμωσης οι ίνες του κολλαγόνου προσανατολίζονται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να αντιμάχονται τις δυνάμεις που έχουν την τάση να διασπάσουν την αναστόμωση. Σε περίπτωση τώρα παράτασης της φλεγμονής, όπως για παράδειγμα σε διαφυγή, δημιουργείται αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου και άφθονος κοκκιώδης ιστός, με αποτέλεσμα ακόμα και τη στένωση του αυλού της αναστόμωσης (18,19). ΔΙΑΦΥΓΗ ΑΠΟ ΤΙΣ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ Μια από τις πλέον σοβαρές και επικίνδυνες μετεγχειρητικές επιπλοκές στις εγχειρήσεις αντιμετώπισης του ορθοκολικού καρκίνου είναι η ρήξη της αναστόμωσης. Η αποτυχία της επούλωσης της αναστόμωσης έχει ως συνέπεια την αύξηση της νοσηρότητας και της θνητότητας και κατ επέκταση του κόστους νοσηλείας του ασθενή, όπως επίσης και τα ποσοστά υποτροπής της νεοπλασματικής νόσου. Τα ποσοστά διαφυγής από την αναστόμωση κυμαίνονται από 1% έως 30%, αν και ένα ποσοστό από 3% έως 6% προτείνεται ως περισσότερο αποδεκτό. Οι επείγουσες εγχειρήσεις έχουν μεγαλύτερο κίνδυνο διάσπασης της αναστόμωσης, από ότι οι εκλεκτικές επεμβάσεις. Η διαφυγή του εντερικού περιεχομένου εξέρχεται μέσω του τραύματος, των παροχετεύσεων ή συλλέγεται τοπικά προκαλώντας περιτονίτιδα. Η ενδοκοιλιακή σήψη εκδηλώνεται με άλγος, πυρετό, ταχυκαρδία, κακουχία, κλινικά σημεία περιτονίτιδας, λευκοκυττάρωση και επιβεβαιώνεται απεικονιστικά με 16

17 υπερηχογράφημα ή αξονική τομογραφία που αναδεικνύουν πυκνόρρευστες συλλογές υγρού με ή χωρίς την χαρακτηριστική παρουσία φυσαλίδων αέρα. Οι παράγοντες κινδύνου, οι οποίοι επηρεάζουν τη λειτουργικότητα και τη βιωσιμότητα μιας αναστόμωσης θα μπορούσαν να διακριθούν αφενός μεν σε αυτούς που αφορούν την κατάσταση του ασθενούς και αφετέρου δε σε αυτούς που αφορούν τους εγχειρητικούς χειρισμούς. Η κατάσταση του ασθενούς αφορά την κακή θρέψη, την αναιμία ή υποξαιμία, τις ηλεκτρολυτικές διαταραχές, την ουραιμία, τα στεροειδή, τα ανοσοκατασταλτικά, την ακτινοθεραπεία, το κάπνισμα, τη χρήση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων και οινοπνευματωδών ποτών, τη λευκοπενία, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, καθώς και την εκκολπωματική νόσο του παχέος εντέρου. Οι διεγχειρητικοί παράγοντες που ενοχοποιούνται για αυξημένες πιθανότητες διάσπασης των αναστομώσεων είναι οι χαμηλές αναστομώσεις, η παράταση των εγχειρητικών χειρισμών (περισσότερο των δύο ωρών), η απόφραξη του παχέος εντέρου, η ανεπαρκής αιμάτωση της αναστόμωσης, η περιεγχειρητική μετάγγιση αίματος, καθώς και σηπτικές καταστάσεις. Στις χαμηλές αναστομώσεις φαίνεται να ενοχοποιείται τόσο το φύλλο (μεγαλύτερα ποσοστά στους άρρενες ασθενείς), όσο και η παχυσαρκία ή ασθενείς με ASA score 3 (20). Η προεγχειρητική ακτινοβολία για καρκίνο του ορθού αποτελεί ένα επιπρόσθετο επιβαρυντικό παράγοντα. Η διαφυγή από την αναστόμωση του παχέος εντέρου μπορεί να συμβεί από την 3 η μέχρι ακόμα και την 45 η μετεγχειρητική ημέρα, αλλά κατά κανόνα ο μέσος όρος είναι η 7 η μετεγχειρητική ημέρα. Σήμερα αρκετές μελέτες συσχετίζουν την διαφυγή της αναστόμωσης με αυξημένο κίνδυνο τοπικής υποτροπής της νόσου, χωρίς όμως να υπάρχει επαρκής εξήγηση. Υπάρχουν ορισμένα ζητήματα διχογνωμιών και αμφισβήτησης που απασχόλησαν ή απασχολούν ακόμα τους χειρουργούς σχετικά με τη χειρουργική του παχέος εντέρου. Οι λαπαροσκοπικές κολεκτομές έχουν παρόμοια ποσοστά διαφυγής με τις ανοικτές εγχειρήσεις, καθώς επίσης και η χειροποίητη τεχνική εκτέλεσης της αναστόμωσης συγκριτικά με τη χρησιμοποίηση συρραπτικού μηχανήματος. Η κεντρική προφυλακτική εγκαρσιοστομία δεν επηρεάζει την πιθανότητα διαφυγής των υψηλού κινδύνου αναστομώσεων του αριστερού κόλου και κυρίως των χαμηλών, αλλά οπωσδήποτε μετριάζει τα δυσμενή επακόλουθα της διαφυγής. Ο διεγχειρητικός έλεγχος της ακεραιότητας των χαμηλών ορθοσιγμοειδικών αναστομώσεων προσφέρει και θεωρείται απαραίτητος. Δεν υπάρχουν όμως επαρκή δεδομένα και τεκμηριωμένη κοινή άποψη, αλλά διαφορετικές απόψεις, σχετικά με την επικάλυψη της αναστόμωσης με κυκλοτερή 17

18 τοποθέτηση του μείζονος επιπλόου, τη χρησιμοποίηση παροχετευτικών σωλήνων στις χαμηλές αναστομώσεις ή τη μηχανική προετοιμασία του εντέρου. Οι βασικές εγχειρητικές αρχές της επαρκούς αιμάτωσης, της χωρίς τάση συμπλησίασης των χειλέων και της μη εκστροφής του βλεννογόνου εξακολουθούν να παραμένουν κεφαλαιώδους σημασίας για την σωστή εκτέλεση μιας αναστόμωσης, με σκοπό την εξασφάλιση της ακεραιότητας της και την αποτροπή διαφυγής ή πλήρους ρήξης με τα συνακόλουθα δυσάρεστα αποτελέσματα. Οι μηχανισμοί της επούλωσης και ιδιαίτερα ο σχηματισμός νεόπλαστων αγγείων διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη βιωσιμότητα και τη λειτουργικότητα των αναστομώσεων του εντέρου. Η χρήση της bevacizumab ως συμπληρωματικής θεραπείας μαζί με άλλους χημικοθεραπευτικούς παράγοντες στην αντιμετώπιση του ορθοκολικού καρκίνου έχει ως κύριο στόχο την αναστολή της αγγειογένεσης στοχεύοντας στην αδρανοποίηση της λειτουργικότητας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF). Τα παραπάνω εγείρουν προβληματισμούς σχετικά με το κατά πόσο η χρήση της bevacizumab επηρεάζει αρνητικά την επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου με συνοδό αύξηση των ποσοστών διαφυγής. Φαίνεται, ότι ο σχηματισμός μικροθρομβοεμβολικών εμφράκτων εντός των αγγείων, λόγω χρήσης της bevacizumab, είναι ο κύριος λόγος ισχαιμίας του παχέος εντέρου που μπορεί να οδηγήσει σε ανεπαρκή επούλωση της αναστόμωσης. Δεν είναι επαρκώς καθορισμένο και τεκμηριωμένο το χρονικό διάστημα χορήγησης του φαρμάκου από την εγχείρηση. Καθώς, ο χρόνος ημίσειας ζωής του φαρμάκου είναι 20 ημέρες, συνιστάται τριπλάσιο χρονικό διάστημα, δηλαδή αυτό των 60 ημερών (20). 18

19 ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΕ ΚΑΚΟΗΘΕΙΣ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΟΥΣ ΟΓΚΟΥΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ BEVACIZUMAB Μείζονος σημασίας στην αντιμετώπιση ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων είναι η δυνατότητα σταθεροποίησης ή ακόμα και ελάττωσης της αγγειογενετικής δραστηριότητας, δεδομένο το οποίο ενισχύει την ορθολογική βάση στην οποία στηρίζεται η αντινεοπλασματική θεραπεία μέσω αναστολής της αγγειογένεσης. Μια σειρά μοριακών στόχων, καθώς και κυτταρικών αντιδράσεων έχουν ταυτοποιηθεί με σκοπό την ανάπτυξη αντινεοπλασματικών φαρμάκων. Στην παραπάνω κατηγορία εντάσσεται και ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας ( VEGF). Στοχεύοντας τον VEGF με bevacizumab, η οποία είναι ανθρώπινο μονοκλωνικό IgG αντίσωμα, έχει αποδειχθεί, ότι είναι αποτελεσματική θεραπεία στην αντιμετώπιση της επέκτασης του καρκίνου του παχέος εντέρου, σε συνδυασμό βέβαια με συμπληρωματική χημειοθεραπευτική αγωγή. Ο ρόλος της αγγειογένεσης στην επούλωση του τραύματος είναι γνωστός και σημαντικός, δεδομένο το οποίο εγείρει περαιτέρω προβληματισμούς γύρω από τη χρήση της bevacizumab και τις τυχόν επιπλοκές που μπορεί να επιφέρει σε ασθενείς που πρόκειται να χειρουργηθούν σύντομα. Παρόλο που η bevacizumab είναι, γενικώς, καλά ανεκτή από τον ανθρώπινο οργανισμό, εντούτοις έχουν αναφερθεί επιπλοκές, τόσο στην επούλωση του τραύματος, καθώς και στη δημιουργία διατρήσεων κατά μήκος του γαστρεντερικού σωλήνα σε ένα ποσοστό 2% των ασθενών, μολονότι είχε προηγηθεί προεγχειρητική διακοπή λήψης της ουσίας 28 ημερών. Η συχνότητα των επιπλοκών αυξάνεται στους ασθενείς, οι οποίοι έχουν ένδειξη χειρουργικής θεραπείας και λαμβάνουν bevacizumab κατά την περίοδο της επέμβασης. Παρόλα αυτά, τα σημαντικά πλεονεκτήματα από τη χρήση της bevacizumab υποδηλώνουν την ευρεία χρήση της (21). Για την ανάπτυξη τους οι καρκινικοί όγκοι χρειάζονται θρεπτικά συστατικά, ενώ όγκοι μεγαλύτεροι από 1-2 mm 3 σε μέγεθος, αποκτούν αυτόνομη αιματική ροή, ούτως ώστε να συνεχίσουν να αναπτύσσονται. Τα νεόπλαστα αυτά αγγεία προκύπτουν από αγγειογένεση, μια διαδικασία η οποία θα μπορούσε να χαρακτηρισθεί ως η δημιουργία νέων αιμοφόρων αγγείων από το ήδη υπάρχον αγγειακό δίκτυο. Η ανεπαρκής αιματική παροχή οδηγεί σε υποξία, η οποία είναι το κύριο ερέθισμα έναρξης της αγγειογένεσης. Πρωτεΐνες, όπως η hypoxia inducible factor, 19

20 ενεργοποιούνται με αποτέλεσμα την υπερέκφραση των προαγγειογενετικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του VEGF και των ινοβλαστικών αυξητικών παραγόντων. Παράλληλα τα καρκινικά κύτταρα ελαττώνουν την έκφραση των αντιαγγειογενετικών παραγόντων, όπως της θρομβοσπονδίνης Ι. Μέσω αυτής της υπερέκφρασης των προαγγειογενετικών παραγόντων έναντι των αντιαγγειογενετικών, ενεργοποιούνται τα ενδοθηλιακά κύτταρα από τη φυσιολογική ανενεργή κατάσταση στην οποία βρίσκονται, γεγονός το οποίο σηματοδοτεί την έναρξη της αγγειογένεσης (21). Παρόλες τις ομοιότητες που χαρακτηρίζουν τη διαδικασία της αγγειογένεσης, τόσο στη φάση της επούλωσης ενός τραύματος, όσο και στη δημιουργία αγγειακού δικτύου σε νεοπλασματικές καταστάσεις, καταγράφονται διαφορές, σε μακροσκοπικό και μικροσκοπικό επίπεδο, όσον αφορά τη δομή των νεόπλαστων αγγείων. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας ( VEGF) διαδραματίζει σημαντικότατο ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης, τόσο σε φυσιολογικές καταστάσεις ανάπτυξης και αποκατάστασης, όσο και σε παθολογικές, όπως οι κακοήθεις νεοπλασίες. Τα επίπεδα του αγγειακού αυξητικού παράγοντα ( VEGF) ανευρίσκονται ιδιαιτέρως αυξημένα στην πλειονότητα των κακοήθων όγκων, συμπεριλαμβανομένου και αυτού του παχέος εντέρου, γεγονός το οποίο συσχετίζεται με την αυξημένη ικανότητα εξάπλωσης του όγκου και τη φτωχότερη πρόγνωση αυτού. Έχουν περιγραφεί 6 τύποι αγγειακών ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων. Ο VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, το ιικό ομόλογο VEGF-E και τέλος ο πλακουντιακός VEGF ( PΙGF). Ο ρόλος του VEGF-A είναι η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας και της εκφύλισης του εξωκυτταρικού δικτύου (ECM), καθώς και στη συγκόλληση των κυττάρων. Ο VEGF-C και VEGF-D προεξάρχουν στις διαδικασίες της λεμφαγγειογένεσης και τέλος ο πλακουντιακός VEGF ( PIGF), ο οποίος εκφράζεται από τους τροφοβλάστες, ελέγχει την αγγειογένεση στον πλακούντα (21). Τέσσερα ισομερή του VEGF-A έχουν περιγραφεί στον άνθρωπο ( VEGF 121, VEGF 165, VEGF 184, VEGF 206 ) και με τα οποία συνδέεται η bevacizumab. Με αυτό τον τρόπο αποτρέπεται η επαφή και αντίδραση του VEGF-A με τους υποδοχείς του και ως εκ τούτου επιτυγχάνεται η αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Διάφορες κλινικές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την αποτελεσματικότητα της bevacizumab τόσο στον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και σε άλλους 20

21 συμπαγείς όγκους, όπως καρκίνος μαστού, παγκρέατος, προστάτη, μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα. Προκλινικές μελέτες αποδεικνύουν, ότι οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένης και της bevacizumab μπορεί να επηρεάσουν αρνητικά την επούλωση του τραύματος και να οδηγήσουν σε μετεγχειρητικές επιπλοκές. Ένας σημαντικός παράγοντας, όσον αφορά τη δράση της bevacizumab, είναι ο υψηλός χρόνος ημίσειας ζωής, κυμαινόμενος από 11 έως 50 ημέρες με μέσο όρο τις 20 ημέρες. Ως αποτέλεσμα, ακόμα και μικρές δόσεις bevacizumab (0,3 mg/kg) μπορεί να συνδεθούν και να καταστήσουν ανενεργούς όλους τους υποδοχείς του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα. Σε συνδυασμό με τις τιμές αποδεκτής δόσης (5 mg/kg ανά δύο εβδομάδες) προκύπτει, ότι ενεργά επίπεδα του φαρμάκου ανιχνεύονται για διάστημα 12 εβδομάδων (21). 21

22 ΝΕΟΤΕΡΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΣΤΟΝ ΟΡΘΟΚΟΛΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ (ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ) Η κατανόηση του μηχανισμού πολλαπλασιασμού και διασποράς των καρκινικών κυττάρων στον ορθοκολικό καρκίνο βοηθά ώστε, ο ορθοκολικός καρκίνος να αποτελεί ένα εξαιρετικό μοντέλο μελέτης και ανάπτυξης νεότερων χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Σύμφωνα με επιδημιολογικά στοιχεία ο ορθοκολικός καρκίνος είναι η δεύτερη αιτία θανάτου εξαιτίας νεοπλασματικής νόσου στις ΗΠΑ. Παρόλη, την εξέλιξη που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στην συμπληρωματική χημειοθεραπευτική αγωγή τα ποσοστά θνητότητας είναι ακόμη υψηλά ( θάνατοι ανά έτος). Ως εκ τούτου, καθίσταται σαφής η συνεχιζόμενη ανάγκη για περισσότερο αποτελεσματικές θεραπείες. Η προσέγγιση της θεραπείας του ορθοκολικού καρκίνου σε μοριακό επίπεδο διευρύνει τόσο τους στόχους της χημειοθεραπευτικής αγωγής, όσο και την αποτελεσματικότητα της. Επομένως, η κατανόηση της βιολογικής συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων είναι θεμελιώδους σημασίας στη δημιουργία στοχευμένων θεραπειών. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ( EGFR) είναι ένας από τις τέσσερις τυροσινικές κινάσες της οικογένειας HER ( EGFR, erbb 2, erbb 3, erbb 4 ). Η ενεργοποίηση της προκαλεί σήματα για πολλαπλασιασμό και επιβίωση των κυττάρων μέσω των οδών Ras/Raf/MEK/ERK ή PI3K/AKT, αντίστοιχα. Η ενεργοποίηση του EGFR μπορεί να οδηγήσει ακόμα στην παραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας ( VEGF) και να διευκολύνει την καρκινική διήθηση μέσω της έκφρασης εξωκυττάριων συστατικών, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού (MMPs) που αποδομούν διάφορους τύπους κολλαγόνου (22). Η δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών αυξάνει σε κακοήθεις όγκους, προάγει τη μετάσταση και αποτελεί κακό προγνωστικό παράγοντα (23). Ο EGFR υπερεκφράζεται στο 25-77% του ορθοκολικού καρκίνου και υπάρχει αντιστρόφως ανάλογη συσχέτιση με την επιβίωση (22). Ο VEGF παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα και η παρουσία του προάγει την ανάπτυξη του ορθοκολικού καρκίνου (24). Σε πρόσφατη μελέτη όμως δεν τεκμηρι ώθηκε, ότι η έκφραση του EGFR και του VEGF αποτελεί προγνωστικό παράγοντα της επιβίωσης ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο, ούτε η έκφραση του EGFR προκαθορίζει λεμφαδενική 22

23 μετάσταση, αλλά το θέμα παραμένει ανοικτό για διερεύνηση (25). Η υπερέκφραση του VEGF και όχι η μικροαγγειακή πυκνότητα ή φλεβική διήθηση, παίζει σπουδαίο ρόλο και θεωρείται υπεύθυνη για την αιματογενή διασπορά μετά ριζική θεραπευτική εκτομή για καρκίνο στομάχου (26). Ένας άλλος αυξητικός παράγοντας ο TGF-β 1 (Transforming Growth Factor- Beta-1) φαίνεται σε πειραματική μελέτη, ότι ασκεί αρνητική επίδραση στην αναγέννηση του βλεννογόνου του εντερικού τοιχώματος και της αγγειογένεσης στην διαδικασία επούλωσης της αναστόμωσης του λεπτού εντέρου σε επίμυες (27). Η Capecitabine ένα νεότερο φλουοροπυριμιδικό αντινεοπλασματικό φάρμακο, πρόδρομη μορφή της 5- φλουοροουρακίλης (5 -FU) που χορηγείται από το στόμα, δεν επηρεάζει την επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου σε επίμυες (28). Το ίδιο ισχύει και για ένα άλλο νεότερο αντινεοπλασματικό φάρμακο, την Imatinib mesylate που είναι εκλεκτικός αναστολέας της τυροσινικής κινάσης και χρησιμοποιείται ως πρώτης εκλογής θεραπεία για χρόνια μυελογενή λευχαιμία κυρίως και στρωματικούς όγκους του γαστρεντερικού σωλήνα ( GISTs), αλλά τελευταία και σε ορθοκολικό καρκίνο (29,30). Επίσης, παρόμοια δράση και εφαρμογή με το τελευταίο έχει και το Gefitinib που είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας της σηματοδοτικής λειτουργίας της τυροσινικής κινάσης του EGRF και χρησιμοποιήθηκε αρχικά στην αντιμετώπιση του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (31). Με βάση τα παραπάνω ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) περιλαμβάνεται στην στοχευμένη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου. Διάφορες προσεγγίσεις έχουν πραγματοποιηθεί για την αναστολή του EGFR που περιλαμβάνουν τη χρησιμοποίηση αντισώματος και μικρομοριακούς αναστολείς. Αρκετοί τέτοιοι παράγοντες έχουν χρησιμοποιηθεί σε κλινικές μελέτες με χαμηλή γενικώς τοξικότητα. Τα αντισώματα μπορεί να προκαλέσουν παρενέργειες (εξάνθημα, πυρετός) και οι μικρομοριακοί αναστολείς μπορεί να προκαλέσουν ήπιες γαστρεντερικές διαταραχές, διάρροια και δερματικό εξάνθημα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα ( Cetuximab, ABX-EGF, EMD 72000) ασκούν την πιο ελπιδοφόρα δράση. Οι μικρομοριακοί αναστολείς ( ZD 1839, erlotinib, OSI-774, EKB-569, GI- 1033, GW ) βρίσκονται ακόμα σε πολύ πρώιμο στάδιο για εξαγωγή συμπερασμάτων (22). Εξαιτίας της πληθώρας των κυτταρικών στόχων και παραγόντων, τα νεότερα χημειοθεραπευτικά κατατάσσονται, σύμφωνα με το μηχανισμό δράσης τους, στις 23

24 παρακάτω κατηγορίες: i. αναστολείς των αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους (επιδερμικός αυξητικός παράγοντας, EGFR), ii. δρώντα στην επικοινωνία των κυττάρων (κυτταρικός κύκλος και μεταβολισμός, απόπτωση, οδοί μέσω γονιδίων και πρωτεϊνών, Ras/ Raf pathway), iii. δρώντα σε εξωκυτταρικό επίπεδο (αναστολείς της αγγειογένεσης και των μεταλλοπρωτεϊνασών), iv. συνδυασμένης δράσης (18,28). Σχηματικά οι εικόνες 1,2,3 δείχνουν τις διεργασίες που συντελούνται σε κυτταρικό επίπεδο και τους μηχανισμούς ρύθμισης και ελέγχου (22). Εικόνα 1 (22). Τα σήματα πολλαπλασιασμού του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF). Αυτά μέσω των υποδοχέων του ( EGFR) οδηγούν σε αλυσιδωτή ενεργοποίηση πρωτεϊνών που διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την παραγωγή του VEGF που προάγει την αγγειογένεση. Εικόνα 2 (22). Οι φάσεις της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου με τις κυκλίνες, τις κινάσες που εξαρτώνται από τις κυκλίνες (cdks) και τους αναστολείς τους (cdk). 24

25 Εικόνα 3 (22). Οι οδοί της απόπτωσης (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνα τος). (Α) ο μιτοχονδριακός και (Β) ο υποδοχέας του θανάτου. Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων διαδραματίζει η αγγειογένεση, μέσω του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα και των υποδοχέων του (VEGF, VEGFr). Μελέτες έχουν δείξει ότι σε ποσοστό 62% έχει ανευρεθεί τμήμα mrna του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα σε ορθοκολικό καρκίνο εντοπιζόμενο στο βλεννογόνο, ενώ τα ποσοστά ανέρχονται σε 100%, όταν τα καρκινικά κύτταρα τον διηθούν. Ο ρόλος του VEGF είναι σημαντικός και στην πρόγνωση της νεοπλασματικής νόσου, καθώς η ανεύρεση του στην πρωτοπαθή καρκινική εστία σχετίζεται με πτωχότερα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης. Γίνεται κατανοητό, ότι ο ρόλος της αγγειογένεσης και ιδιαίτερα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα, είναι μείζονος σημασίας στη στοχευμένη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου. Ο μηχανισμός δράσης της bevacizumab (ως ανασυνδυασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα) έναντι του VEGF και των υποδοχέων του και η αναστολή της αγγειογένεσης που προκαλεί αυτή, είναι η πλέον επαρκώς τεκμηριωμένη μελέτη, όσο αφορά τη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου. Μέσα από τυχαιοποιημένες μελέτες δευτέρου σταδίου ( phase II trials ) διαπιστώθηκε μικρή αύξηση των ποσοστών πενταετούς επιβίωσης των ασθενών, οι οποίοι έλαβαν συνδυασμένη χημειοθεραπεία (5- φλουοροουρακίλη/ λευκοβορίνη και bevacizumab), έναντι αυτών που αντιμετωπίσθηκαν μόνο με κλασική χημειοθεραπεία. Το γεγονός αυτό οδήγησε σε περαιτέρω μελέτες, από τις οποίες 25

26 διαπιστώθηκε σημαντική στατιστική διαφορά ανταπόκρισης του όγκου στη θεραπεία μεταξύ συνδυασμένης χημειοθεραπείας και κλασικής (45% έναντι 35 %). Στηριζόμενη σε αυτά τα στοιχεία, το 2004 η χρήση της bevacizumab (Avastin) έγινε αποδεκτή ως στοχευμένη θεραπεία πρώτης γραμμής στην αντιμετώπιση του ορθοκολικού καρκίνου σε συνδυασμό με την ενδοφλέβια χορήγηση φλουοροουρακίλης ως κλασσικό χημειοθεραπευτικό παράγοντα (22). Η ενδοστατίνη και η αγγειοστατίνη είναι δύο ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης και ανασυνδυασμένες μορφές τους έχουν χρησιμοποιηθεί, όπως επίσης και η θαλιδομίδη ως αναστολέας της αγγειογένεσης, σε ορθοκολικό καρκίνο για έλεγχο ηπατικών μεταστάσεων. Τα αποτελέσματα δεν μπορούν ακόμα να αξιολογηθούν (22). Η κυκλοοξυγενάση ( COX)-2 είναι ένα ενδοκυττάριο ένζυμο που μετατρέπει το αραχιδονικό οξύ σε προσταγλανδίνες. Η υπερέκφραση COX-2 επηρεάζει την ανασοκαταστολή, την μιτωτική δραστηριότητα, την απόπτωση και την μεταστατική ικανότητα. Η αναστολή της με φάρμακα, όπως η σελεκοξίμπη, παρεμποδίζει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε επίμυες με μη επακριβώς καθορισμένο μηχανισμό. Η χορήγηση του φαρμάκου όμως δεν επηρεάζει ουσιαστικά την επούλωση και ακεραιότητα των αναστομώσεων του παχέος εντέρου σε επίμυες (32). Ο συνδυασμός των νεότερων φαρμάκων στοχευμένης θεραπείας Irinotecan, Capecitabine, Avastin είναι ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος σήμερα στον ορθοκολικό καρκίνο και κυρίως τον μεταστατικό με αυξημένα ποσοστά ανταπόκρισης στο σχήμα αυτό (33-36). 26

27 BEVACIZUMAB ΚΑΙ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΡΑΥΜΑΤΟΣ Τα νεότερα δεδομένα στη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου αφορούν την αγγειογένεση, η οποία διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της δημιουργίας νεόπλαστων αγγείων. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας ( VEGF) και η συμμετοχή αυτού στη νεοαγγειογένεση έχει συσχετισθεί πλέον με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και ιδιαίτερα με την αύξηση του μεγέθους του όγκου πάνω από το κριτικό όριο των 1-2 mm. H bevacizumab, η οποία δρα ανταγωνιστικά στη δράση του VEGF, αναστέλλει τη διαδικασία της αγγειογένεσης και επιβραδύνει έτσι την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων (37). Μολονότι πλέον η χρήση της bevacizumab είναι στην πρώτη γραμμή της θεραπείας του μεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου, καθώς και άλλων προχωρημένων καρκίνων, η χρήση της ως αγγειοανασταλτικού παράγοντα έχει συσχετισθεί με επιπλοκές, με προεξάρχουσες αυτές που αφορούν την επούλωση του χειρουργικού τραύματος, κατά τις επεμβατικές μεθόδους αντιμετώπισης της νεοπλασματικής νόσου. Η αντιαγγειογενετική δράση της bevacizumab υποστηρίζεται, ότι μπορεί να περιπλέκει την επούλωση του χειρουργικού τραύματος κυρίως μέσω της αναστολής δημιουργίας νεόπλαστων αγγείων με αποτέλεσμα τον περιορισμό της δυνατότητας μεταφοράς των κυττάρων της φλεγμονής, του οξυγόνου, καθώς και των θρεπτικών ουσιών και των άλλων συστατικών που λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία της επούλωσης στην περιοχή του τραύματος. Μετά το 1971, και τις έρευνες του Folkman σχετικά με τους μηχανισμούς της επούλωσης ενός τραύματος, ακολούθησαν πολλές ανάλογες μελέτες, μέσα από τις οποίες έγινε καλύτερα κατανοητός ο μηχανισμός της επούλωσης του τραύματος, ειδικά σε μοριακό επίπεδο. Αρκετοί αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες οι οποίοι απελευθερώνονται από τα αιμοπετάλια, καθώς και από τα κύτταρα της φλεγμονής, συμμετέχουν στα στάδια της επούλωσης μέσω διάφορων μηχανισμών. Οι μηχανισμοί αυτοί επιγραμματικά περιλαμβάνουν την φωσφορυλίωση των υποδοχέων της τυροσινικής κινάσης, την ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, την μετανάστευση και τη δημιουργία σωληνοειδών σχηματισμών και τελικά την συμμετοχή αυτών στο σχηματισμό νεόπλαστων αγγείων. Από όλους τους γνωστούς αγγειογενετικούς παράγοντες ο VEGF παραμένει ο πλέον σημαντικός, με 27

28 το μηχανισμό δράσης του να έχει μελετηθεί καλύτερα από οποιοδήποτε άλλο. Λόγω των παραπάνω, αλλά και της συσχέτισης που υπάρχει μεταξύ της αγγειογένεσης και της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων αναπτύχθηκαν αρκετοί παράγοντες, οι οποίοι δρουν στοχευμένα αναστέλλοντας την αγγειογένεση. Στην κατηγορία αυτή ανήκει και η bevacizumab, ένα ανασυνδυασμένο ανθρώπινο μονοκλωνικό IgG1 αντίσωμα, το οποίο συνδεόμενο με τον VEGF και τις ισομορφές του αναστέλλει την αγγειογένεση και επιβραδύνει την καρκινική ανάπτυξη. Παρόλο που τα οφέλη από τη χρήση της bevacizumab στη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου είναι πλέον εμφανή και τεκμηριωμένα, εντούτοις έχουν αναφερθεί και επιπλοκές, όπως αυτές των αρτηριοφλεβικών θρομβώσεων, της υπέρτασης, της πρωτεϊνουρίας και της διάτρησης του γαστρεντερικού σωλήνα. Όσο αφορά το κομμάτι της χειρουργικής θεραπείας, οι κυριότερες και πλέον σημαντικές επιπλοκές είναι αυτές που σχετίζονται με τους μηχανισμούς επούλωσης του τραύματος, όπως διάσπαση, εκχύμωση, αιμορραγία του εγχειρητικού πεδίου και φλεγμονή τραύματος (37). Τα αποτελέσματα συγκριτικών μελετών ασθενών που έλαβαν ταυτόχρονα με το χημειοθεραπευτικό σχήμα και bevacizumab έδειξαν σημαντικά αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης μετεγχειρητικής αιμορραγίας (38,39). Αυτή αποδόθηκε στο γεγονός, ότι η αναστολή της λειτουργίας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα επηρεάζει τη λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων με αποτέλεσμα την ανεπαρκή τους απάντηση στο τραύμα. Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση και στα ποσοστά θρομβοεμβολικών επεισοδίων, όπως της εν τω βάθει φλεβικής θρόμβωσης, της πνευμονικής εμβολής και των παροδικών ισχαιμικών επεισοδίων (40). Μέσα από αρκετές μελέτες σχετικά με τη χρήση της bevacizumab, έχουν εξαχθεί ασφαλή συμπεράσματα, τόσο για την αποτελεσματικότητα της, όσο και τη χρήση της στη θεραπεία του ορθοκολικού καρκίνου. Η ελαχιστοποίηση των επιπλοκών από τη χρήση της bevacizumab επιτυγχάνεται με τον προγραμματισμό της χειρουργικής επέμβασης τουλάχιστον 6 έως 8 εβδομάδες μετά από τη διακοπή της χορήγησης του φαρμάκου. Η επαναχορήγηση του μετεγχειρητικά προτείνεται σε διάστημα 28 ημερών, με την προϋπόθεση, ότι το εγχειρητικό τραύμα έχει επουλωθεί πλήρως (39). Οι επιπλοκές της επούλωσης του τραύματος σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο που αναφέρθηκαν και σχετίζονται με την προσθήκη της bevacizumab στο χημειοθεραπευτικό σχήμα περιλαμβάνουν διάτρηση εντέρου, 28

29 εξωτερικά συρίγγια κοιλιάς, διάσπαση εντερικών αναστομώσεων, ενδοκοιλιακή αιμορραγία, αιμορραγία γαστρεντερικού σωλήνα και κυτταρίτιδα (37). Οι ειδικές επιπλοκές από τη χορήγηση bevacizumab που αφορούν την πλαστική χειρουργική σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο μαστού περιλαμβάνουν την ποιότητα της αισθητικής αποκατάστασης και λειτουργικότητας, την αποτυχία της μετάθεσης των ελεύθερων κρημνών απότοκης του αυξημένου κινδύνου θρόμβωσης, καθώς και αιμορραγικά επεισόδια που αυξάνουν την νοσηρότητα και θνητότητα (37). ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΤΗΣ BEVACIZUMAB Η αγγειογένεση, όπως έχει ήδη αναφερθεί, παίζει πρωταρχικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν VEGF-A που είναι ένα μέλος μιας εξαμελούς οικογένειας αυξητικών παραγόντων υπεύθυνων για τον σχηματισμό νεόπλαστων αιμοφόρων αγγείων με την δράση τους στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Η δράση αυτή των αυξητικών παραγόντων επιτυγχάνεται με σύνδεση με υποδοχείς της τυροσινικής κινάσης που βρίσκονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων (υποδοχείς VEGF ή VEGFRs). Ο VEGF-A που εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα διευκολύνει την δημιουργία αιματικής παροχής για τα κακοήθη κύτταρα και έτσι επιτρέπει την ανάπτυξη και εξάπλωση των όγκων. Τα αιμοφόρα αγγεία προάγουν την ανάπτυξη του όγκου, την διήθηση και τη μετάσταση εξασφαλίζοντας τα θρεπτικά συστατικά και το οξυγόνο των κακοήθων κυττάρων. Η bevacizumab, ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα, συνδέεται με τον VEGF-A σχηματίζοντας ένα καινούργιο μόριο, το οποίο αδυνατεί να συνδεθεί και έτσι αποτρέπεται η επαφή και δράση του με τους υποδοχείς του ( VEGFRs). Ο περιορισμός αυτός της δραστηριότητας των υποδοχέων του αγγειακού ενδοθηλιακού παράγοντα-α τελικά προκαλεί ελάττωση της ανάπτυξης των μικρών αγγείων, αναστέλλει τον σχηματισμό νεόπλαστων αγγείων και επαναφέρει στο φυσιολογικό την αγγείωση του όγκου, όπως φαίνεται χαρακτηριστικά στην παρακάτω εικόνα 4 σχηματικά (41). 29

30 Εικόνα 4 (41). Η διαδικασία της αγγειογένεσης και ο μηχανισμός δράσης της bevacizumab ( Avastin). ( A) τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν VEGF-A ( B) σύνδεση του με τους υποδοχείς της τυροσινικής κινάσης ( VEGFR) και προαγωγή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων ( C) προαγωγή της αγγειογένεσης που προκαλεί αύξηση του όγκου ( D) σύνδεση της bevacizumab με τον VEGF-A, αποτροπή της πρόσληψης και σύνδεσης του με τους υποδοχείς του και αντιαγγειογενετική δράση. Επίσης και άλλα φάρμακα, όπως η sorafenib και sunitinib ή η thalidomide αναστέλλουν την αγγειογένεση, αλλά με σύνδεση τους με τους υποδοχείς VEGFRs αδρανοποιώντας τους και όχι με τον VEGF-A (41). Με βάση τα παραπάνω, ο συνδυασμός της bevacizumab με κυτταροτοξικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε συμπαγείς όγκους βελτιώνει τα ποσοστά της ανταπόκρισης στη θεραπεία, της επιβίωσης ελεύθερης νόσου, καθώς και της συνολικής επιβίωσης σε ασθενείς με προχωρημένη νόσο, σε αντίθεση μόνο με χημειοθεραπεία (35,36,38). Παρόλα αυτά όμως, αν και γενικώς είναι καλώς ανεκτή, υπάρχουν και παρενέργειες σε μικρή αναλογία που μπορεί να προκαλέσουν προβληματισμούς. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που έχουν παρατηρηθεί από τη χρήση της είναι συγκεκριμένες και περιλαμβάνουν υπέρταση, πρωτεϊνουρία, θρομβοεμβολικά 30

31 επεισόδια, διαταραχές της επούλωσης, αιμορραγία, διάτρηση του εντέρου ή του ρινικού διαφράγματος, σύνδρομο αναστρέψιμης λευκοεγκεφαλοπάθειας, δερματικό αλλεργικό εξάνθημα και αλλεργικές αντιδράσεις υπερευαισθησίας (41,42). Εξαιτίας των παραπάνω ανεπιθύμητων ενεργειών, τόσο κατά τη διάρκεια όσο και μετά από τη χρήση της bevacizumab, οι ασθενείς θα πρέπει να βρίσκονται υπό συνεχή παρακολούθηση με σκοπό την έγκαιρη διάγνωση των συνοδών παρενεργειών και την ορθή αντιμετώπιση τους, ούτως ώστε να υπάρξει το καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα (43). Η ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης είναι συνδυασμός διάφορων παραμέτρων και επιτυγχάνεται με τη συνεργική δράση του καρδιαγγειακού συστήματος, των νεφρών, του νευρικού συστήματος και των ενδοκρινών αδένων. Ως υπέρταση ορίζεται η επιμένουσα αύξηση της αρτηριακής πίεσης παραπάνω από 140/90 mmhg ή παραπάνω από 130/80 mmhg σε ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο ή σακχαρώδη διαβήτη. Παρόλο που ο ακριβής μηχανισμός ρύθμισης δεν είναι απόλυτα γνωστός, φαίνεται, ότι βασικό ρόλο κατέχουν το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνηςαλδοστερόνης και η βιοσύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Ο μηχανισμός, με τον οποίο επηρεάζει η bevacizumab τους μηχανισμούς ρύθμισης της αρτηριακής πίεσης, δεν είναι σαφής και τεκμηριωμένος. Πιστεύεται, ότι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας συμβάλει στην παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου μέσω ενεργοποίησης της συνθετάσης του NO στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επομένως η αγγειοανασταλτική δράση της bevacizumab και η αδρανοποίηση του VEGF μειώνει την παραγωγή ΝΟ και την εναπόθεση αυτού στα τοιχώματα των αγγείων προκαλώντας αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνηςαλδοστερόνης θεωρείται και αυτό, δευτερευόντως όμως, υπεύθυνο για την εμφάνιση της υπέρτασης από bevacizumab και αποδίδεται στο γεγονός, ότι η αναστολή της δράσης του VEGF-A μεταβάλλει τους υποδοχείς της αγγειοτενσίνης I και II. Βιβλιογραφικά, συνιστάται η χρήση αντι-υπερτασικών φαρμάκων της κατηγορίας των αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης, καθώς και των αναστολέων των διαύλων ασβεστίου, για την αρτηριακή υπέρταση που σχετίζεται με τη bevacizumab (41). Υπό φυσιολογικές συνθήκες οι νεφροί διατηρούν σταθερή την αναλογία των πρωτεϊνών στο πλάσμα μέσω της λειτουργίας ηθμού των σπειραματικών σωληναρίων και της επαναρρόφησης που εκτελείται σε αυτά, ούτως ώστε μόνο μικρές ποσότητες πρωτεϊνών να ανιχνεύονται στα ούρα. Ως πρωτεϊνουρία 31

32 χαρακτηρίζεται η ανεύρεση πρωτεϊνών στα ούρα, ποσότητας 150 mg την ημέρα και είναι αποτέλεσμα δυσλειτουργίας των νεφρικών σωληναρίων ή των σπειραμάτων. Τα σπειραματικά σωληνάρια δρουν ως ηθμός μέσω της ενδοθηλιακής μεμβράνης, των ποδοκυττάρων και της βασικής μεμβράνης. Στα ποδοκύτταρα ανευρίσκεται ο VEGF, ο οποίος ενεργοποιεί τους υποδοχείς VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VEGF συμμετέχει στο σχηματισμό, αλλά και στην αποκατάσταση των σπειραμάτων, στα οποία, όπως προαναφέρθηκε, γίνεται η επαναρρόφηση των πρωτεϊνών. Αναστολή της δράσης του VEGF διαταράσσει τη νεφρική λειτουργία με αποτέλεσμα την εμφάνιση πρωτεϊνουρίας. Συνιστάται η τακτική εργαστηριακή παρακολούθηση των ούρων (κάθε 2-8 εβδομάδες) των ασθενών που βρίσκονται υπό χημειοθεραπευτική αγωγή και συγχορήγηση bevacizumab (41). Η αναστολή της αγγειογένεσης σχετίζεται επίσης με την εμφάνιση θρομβώσεων, καθώς και διαταραχών της επούλωσης λόγω της ανασταλτικής της δράσης έναντι του VEGF. Η αναστολή της δράσης του VEGF έχει ως αποτέλεσμα την καθυστερημένη κυτταρική απάντηση στο τραύμα με επακόλουθη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Εξαιτίας αυτής της δυσλειτουργίας του αγγειακού ενδοθηλίου και της απευθείας επίδρασης του υπενδοθηλιακού κολλαγόνου, απελευθερώνεται ιστικός παράγοντας ο οποίος προκαλεί ενεργοποίηση του μηχανισμού της πήξης. Παρόλο που υπάρχουν αρκετοί μηχανισμοί, οι οποίο δρουν ως ασφαλιστική δικλείδα και ελέγχουν την αιμόσταση, εντούτοις η δράση του VEGF είναι πρωτεύουσας σημασίας και επομένως η ανεπάρκεια του οδηγεί στο σχηματισμό θρόμβων. Στο σχηματισμό θρόμβων συμμετέχουν και τα καρκινικά κύτταρα, μέσα από διαφορετικούς μηχανισμούς, όπως απελευθέρωση κυτταροκινών, υπερπηκτικότητα και ινωδολυτική δραστηριότητα με απευθείας δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα αιμοπετάλια και στα μακροφάγα. Οι συνηθέστερες καταστάσεις που παρατηρούνται κατά τη χρήση της bevacizumab είναι η εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση, η πνευμονική εμβολή, καθώς και η εμβολή των μεσεντερίων αγγείων (44,45). Η αντιμετώπιση περιλαμβάνει τη διακοπή της χορήγησης bevacizumab για τουλάχιστον 2 εβδομάδες σε εμφάνιση συμπτωμάτων εν τω βάθει φλεβικής θρόμβωσης ή πνευμονικής εμβολής μέσης βαρύτητας και επαναχορήγηση αυτής κατόπιν χρήσης σταθερής δόσης αντιπηκτικής αγωγής. Σε σοβαρές περιπτώσεις πνευμονικής εμβολής απειλητικές για τη ζωή του ασθενή συνιστάται η οριστική διακοπή της αγγειοανασταλτικής θεραπείας. Η χρησιμοποίηση ηπαρινών χαμηλού μοριακού βάρους μπορεί να προφυλάξει από τις θρομβώσεις. Η χρήση της ασπιρίνης ή άλλων αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων μπορεί 32

33 να συσχετισθεί με τον κίνδυνο αιμορραγίας και μάλλον δεν πρέπει να συνιστάται Η bevacizumab δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί, αν δεν έχουν παρέλθει τουλάχιστον 6 μήνες από προηγούμενο αρτηριακό θρομβοεμβολικό επεισόδιο. Εάν ο ασθενής εμφανίσει τέτοιο επεισόδιο κατά την διάρκεια της θεραπείας, τότε αυτή πρέπει να διακοπεί οριστικά (41). Άλλες επιπλοκές που σχετίζονται με τη δράση της bevacizumab επί του VEGF είναι η εμφάνιση αιμορραγίας (επιστάξεων ή ακόμη και αιμορραγίας σταδίου 3 ή 4, απειλητικής για τη ζωή), καθώς και διάτρηση του εντέρου. Όσο αφορά την εντερική διάτρηση, αν και είναι σπάνια (ποσοστό 1,5%), είναι μια αρκετά σοβαρή επιπλοκή, η οποία παρουσιάζεται συνήθως σε ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ενδοσκόπηση μέσα σε διάστημα μικρότερο του ενός μηνός από τη χορήγηση bevacizumab ή σε ακτινοθεραπεία, καθώς και σε λήψη μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων και έχουν ιστορικό πεπτικού έλκους ή εκκολπωματίτιδας. Η εμφάνιση χαρακτηριστικών κλινικών συμπτωμάτων της διάτρησης του εντέρου (αιφνίδιο και διαξιφιστικό κοιλιακό άλγος, έμετοι, πυρετός, μετεωρισμός κοιλιάς) συμβάλλει στην διάγνωση. Η χορήγηση γαστροπροστατευτικών σκευασμάτων πριν από τη χορήγηση bevacizumab μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη της διάτρησης γαστροδωδεκαδακτυλικού έλκους. Η λευκοεγκεφαλοπάθεια είναι εξαιρετικά σπάνια, εκδηλώνεται ως οίδημα στη λευκή ουσία των οπισθίων τμημάτων των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, ο μηχανισμός πρόκλησης της είναι άγνωστος και θεωρείται αναστρέψιμη βλάβη (41). Τα δερματικά εξανθήματα και αντιδράσεις υπερευαισθησίας (εξάψεις, κνησμός, υπέρταση, βρογχόσπασμος, ρίγος, θωρακικό άλγος, εφιδρώσεις) είναι σχετικά σπάνια, προκαλούνται με άγνωστο μηχανισμό, αποδίδονται όμως στην δημιουργία ανθρώπινων αντισωμάτων έναντι του ειδικού ανασυνδυασμένου αντισώματος και δεν θεωρούνται αληθής αντίδραση υπερευαισθησίας μέσω της ανοσοσφαιρίνης E ( IgE) (41). 33

34 BEVACIZUMAB ΚΑΙ ΟΡΘΟΚΟΛΙΚΟΣ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Ως αγγειογένεση ορίζεται η σύνθετη εκείνη διαδικασία, κατά την οποία σχηματίζονται νέα αιμοφόρα αγγεία από προϋπάρχοντα αγγεία. Αυτή είναι απαραίτητη για την αύξηση και ανάπτυξη των φυσιολογικών κυττάρων και ιστών κατά την εμβρυϊκή και νεογνική περίοδο, αλλά και των καρκινικών κυττάρων. Ο φυσιολογικός ρόλος της στους ενήλικες περιορίζεται στην επούλωση τραύματος και στον αναπαραγωγικό κύκλο της γυναίκας. Η θεωρητική βάση, στην οποία στηρίζεται η στοχευμένη θεραπεία με bevacizumab στον προχωρημένο ορθοκολικό καρκίνο, είναι η αναστολή της αγγειογένεσης και ο περιορισμός της επέκτασης του όγκου, γιατί όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο σχηματισμός νεόπλαστων αγγείων είναι πρωταρχικής σημασίας για την ανάπτυξη και την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Μια σειρά παραγόντων λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία ρύθμισης της αγγειογένεσης μέσω προαγωγής ή αναστολής αυτής. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι από τους σημαντικότερους αυξητικούς παράγοντες που συμμετέχουν στο σχηματισμό αγγείων, επομένως και η θεραπευτική αγωγή πρέπει να κατευθύνεται στοχεύοντας στη δράση του. Αν και αρκετοί άλλοι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες έχουν εισέλθει στο στάδιο της κλινικής μελέτης, η bevacizumab παραμένει ο πλέον εξελιγμένος και ευρέως χρησιμοποιούμενος (46-48). Αυτή αποτελεί τον πρώτο αντιαγγειογενετικό παράγοντα που αποδείχθηκε, ότι επιδρά στην επιβίωση καρκινοπαθών ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου και ειδικότερα του μεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου βελτιώνοντας κατά 30% περίπου την επιβίωση (46). Πέραν τούτου, η bevacizumab καθιερώθηκε και συμπεριλαμβάνεται σήμερα στη θεραπεία πρώτης και δεύτερης γραμμής αυτού του καρκίνου, γιατί εξασφαλίζει πλεονεκτήματα έναντι της κλασσικής χημειοθεραπείας, όπως μικρότερη πιθανότητα ανάπτυξης αντίστασης και λιγότερη τοξικότητα (35). Επιπρόσθετο πλεονέκτημα αποτελεί και ο διαφορετικός μηχανισμός άσκησης της αντινεοπλασματικής της δράσης. Η ευεργετική επίδραση της bevacizumab στον προχωρημένο ορθοκολικό καρκίνο έχει πλέον αποδειχθεί σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙ και φάσης ΙΙΙ (38). Η bevacizumab είναι ανοσοσφαιρίνη G1 ( IgG1) και αναστέλλει τη δράση του VEGF και όλων των ισόμορφων του μέσω της αναστολής της σύνδεσης του με τους υποδοχείς του. Το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα αναπτύχθηκε από αντιανθρώπινο 34

35 VEGF μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικών και είναι κατά 93% ανθρώπινο και 7% ποντικών (46). Η απουσία του VEGF επηρεάζει τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία αδυνατούν να επιβιώσουν με αποτέλεσμα την καταστροφή των νεόπλαστων τριχοειδών. Επίσης, ορισμένα κύτταρα του ενδοθηλίου αναστέλλουν την ανάπτυξή τους, με επακόλουθη αναστολή της αγγειογένεσης, εξαιτίας της έλλειψης του VEGF. Αν και έχουν περιγραφεί καρκινικά κύτταρα, τα οποία συνεχίζουν να αναπτύσσονται, παρά την έλλειψη του VEGF, εντούτοις τα κύτταρα αυτά έχουν μειωμένη διηθητική ικανότητα, με αποτέλεσμα να ελαττώνεται η μεταστατική τους δραστηριότητα. Ακόμα, αυτή η μορφή των καρκινικών κυττάρων είναι περισσότερο συμβατή με αυτή των φυσιολογικών, γεγονός το οποίο επηρεάζει την ενδοκυττάρια πίεση. Η μείωση της ενδοκυττάριας πίεσης των καρκινικών κυττάρων τα καθιστά περισσότερο διαπερατά απέναντι στη χημειοθεραπευτική αγωγή. Τέλος, η ελαττωμένη ενδοκυττάρια πίεση αυξάνει την περιεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων σε οξυγόνο, στοιχείο που συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας. Η προτεινόμενη δόση ενδοφλέβιας χορήγησης bevacizumab, σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά, όπως irinotecan και 5-FU/LV, σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο, είναι 5mg/kgr βάρους σώματος κάθε 2 εβδομάδες. Ο ρυθμός χορήγησης είναι συνάρτηση της ανεκτικότητας του ασθενούς προς αυτό. Η χορήγηση κατά την έναρξη πραγματοποιείται σε 90 λεπτά και σταδιακά μειώνεται σε 60 λεπτά και ακολούθως σε 30 λεπτά, ενώ αντενδείκνυται η ταχεία (bolus) ενδοφλέβια έγχυση. Δεν υπάρχουν διαφορές στις φαρμακοκινητικές ιδιότητες της bevacizumab σε σχέση με την ηλικία. Η θεραπεία πρέπει να συνεχισθεί καθόλη την διάρκεια της νόσου, εκτός αν υπάρξει ειδικός λόγος διακοπής λόγω σοβαρής επιπλοκής (46). Η ανεκτικότητα της bevacizumab είναι γενικώς καλά αποδεκτή σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (47). Οι παρενέργειες συνήθως είναι μέτριας βαρύτητας, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Ο κίνδυνος όμως διάτρησης του γαστρεντερικού σωλήνα που ελλοχεύει (ελεύθερη διάτρηση, δημιουργία συριγγίων, ενδοκοιλιακό απόστημα), αποτελεί σχετικά σπάνια, αλλά σοβαρή επιπλοκή, η οποία μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη ζωή του ασθενή (49,50). Ο κίνδυνος διάτρησης εξαρτάται από τη δόση του φαρμάκου και αυξάνεται στους καρκινοπαθείς σε ορισμένες καταστάσεις, όπως λήψη κορτικοστεροειδών ή άλλων αντιφλεγμονωδών φαρμάκων, πεπτικό έλκος και εκκολπωματική νόσος παχέος εντέρου. Τονίζεται ιδιαίτερα, ότι υπάρχουν όμως και μεμονωμένες περιγραφές περιπτώσεων αυτόματης, καθυστερημένης (αρκετούς μήνες μετά την εγχείρηση ή και ένα έτος ακόμα) διαφυγής 35

36 από προηγηθείσα αναστόμωση παχέος εντέρου ή ορθού μετά από θεραπεία με bevacizumab (51-53). Οι αντενδείξεις χορήγησης της bevacizumab περιλαμβάνουν υπερευαισθησία στα ενεργά συστατικά του φαρμάκου γενικώς ή σε ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα, εγκυμοσύνη, θηλασμός (διακοπή κατά τη διάρκεια της θεραπείας και έναρξη μετά τουλάχιστον 6 μήνες από τη θεραπεία), ασθενείς με χωρίς θεραπεία εγκεφαλικές μεταστάσεις λόγω κινδύνου αιμορραγίας, διάτρηση γαστρεντερικού σωλήνα, επιπλοκές επούλωσης τραύματος (διακοπή 6 εβδομάδες πριν από προγραμματισμένη εγχείρηση και έναρξη μετά τουλάχιστον 28 ημέρες από την εγχείρηση), επίμονη υπέρταση, πρωτεϊνουρία, αρτηριακά θρομβοεμβολικά επεισόδια, αιμορραγία και συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια ή καρδιομυοπάθεια (46). ΑΛΛΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ ΤΟΥ AVASTIN ΕΚΤΟΣ ΤΟΥ ΟΡΘΟΚΟΛΙΚΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Η αποτελεσματικότητα της χρήσης της bevacizumab, συμπληρωματικά με τη χημειοθεραπεία, στην αντιμετώπιση του ορθοκολικού καρκίνου ενισχύεται διαρκώς μέσα από κλινικές μελέτες που διεξάγονται τα τελευταία χρόνια. Παρατηρώντας την αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης αυτής θεραπείας, καθώς και το γεγονός, ότι η αγγειογένεση και ο VEGF κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξάπλωση της νεοπλασματικής νόσου, ιδιαίτερα κατά τα πρώιμα στάδια αυτής, ενισχύεται η χρήση της bevacizumab και άλλων αντί- VEGF παραγόντων, με έμφαση στην όσο το δυνατόν πιο έγκαιρη χορήγησή τους με σκοπό το βέλτιστο αποτέλεσμα. Εκτός του ορθοκολικού καρκίνου η bevacizumab χρησιμοποιείται και σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως το μεταστατικό καρκίνωμα των νεφρικών κυττάρων, σε όγκους των ωοθηκών, σε καρκίνο του μαστού και μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (54-57). Πρόσφατα η στοχευμένη θεραπεία με διάφορους αντιαγγειογενετικούς παράγοντες ( sunitinib, sorafenib, temsirolimus, everolimus και bevacizumab) έχει χρησιμοποιηθεί ως πρώτης γραμμής συστηματική θεραπεία με πρωτοφανή επιτυχία σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο των νεφρικών κυττάρων που άλλως έχει φτωχή πρόγνωση (54). Η trastuzumab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα anti-erb-2 και η lapatinib, ένας διπλός (EGFR/ErB-2) αναστολέας της τυροσινικής κινάσης, είναι αποτελεσματικά σε 36

37 ασθενείς με καρκίνο του μαστού με υπερέκφραση ErB-2. Η bevacizumab, το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-vegf-a, έχει γίνει αποδεκτή σε συνδυασμό με ταξάνες για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του μαστού σε μη επιλεγμένους ασθενείς (55). Η bevacizumab ως μονοθεραπεία έχει αποδειχθεί, ότι έχει υψηλή αποτελεσματικότητα σε υποτροπιάζοντες στρωματικούς όγκους των ωοθηκών (56). Η στοχευμένη θεραπεία με bevacizumab σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία έχει καλύτερη αποτελεσματικότητα από τη χημειοθεραπεία μόνο σε ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα, η οποία είναι μία θανατηφόρος νόσος με φτωχή πρόγνωση (57). Η έγχυση bevacizumab εντός του υαλοειδούς χιτώνα του οφθαλμού αποτελεί μία ελπιδοφόρα θεραπευτική επιλογή σε ασθενείς με οξεία κεντρική ορώδη χοριοαμφιβληστροειδοπάθεια (58). Από τα παραπάνω, οι κλινικές μελέτες που αφορούν τη θεραπεία του μεταστατικού καρκινώματος του μαστού, καθώς και του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, είναι οι πλέον εξελιγμένες. Ο συνδυασμός bevacizumab και paclitaxel, ως θεραπείας του μεταστατικού καρκίνου του μαστού, σε σύγκριση με τη χορήγηση μόνο paclitaxel, είχε σημαντική στατιστική διαφορά, όσο αφορά την αποτελεσματικότητα της θεραπείας. Το ίδιο ενθαρρυντικά είναι και τα αποτελέσματα της θεραπείας του προχωρημένου μη μικροκυτταρικού καρκίνου των πνευμόνων (συνδυασμός paclitaxel /καρβοπλατίνης με αναστολέα της αγγειογένεσης είχε αύξηση στην αποτελεσματικότητα κατά 27%, έναντι 10% σε χρήση μόνο χημειοθεραπευτικών). Αύξηση παρατηρήθηκε και στο διάστημα μέσης επιβίωσης στους 12,5 μήνες, έναντι 10,2 μήνες (41,55,57). Εκτός όμως από τα παραπάνω που αφορούν την αναστολή της αγγειογένεσης, ενδιαφέρον έχει και η προαγωγή της στην επούλωση τραύματος. Η τοπική εφαρμογή του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα ( VEGF) σε αναστομώσεις του παχέος εντέρου προάγει την επούλωση και ισχυροποιεί την αναστόμωση σε πειραματική μελέτη σε κουνέλια (59). 37

38 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 38

39 ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΟΤΥΠΙΑ Η σύγχρονη εφαρμογή της bevacizumab περιλαμβάνει κυρίως τον προχωρημένο ορθοκολικό καρκίνο σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία (60-64), αλλά και τον καρκίνο του μαστού (65), τον καρκίνο των ωοθηκών (66) και το γλαύκωμα κλειστής γωνίας απότοκο νεοαγγειογένεσης (67). Η εξέλιξη στην κατανόηση του ρόλου του VEGF σε φυσιολογικές καταστάσεις οδήγησε στην αναζήτηση πιθανών παρενεργειών, που αφορούν την αγγείωση των οργάνων, από την χρήση των αναστολέων του VEGF στην κλινική ογκολογία (68). Ο μικρός κίνδυνος θεωρητικά από την αναστολή της αγγειογένεσης στην επούλωση του τραύματος και η μακρά ημιπερίοδος δράσης του φαρμάκου, οδήγησε στην εφαρμογή του χρονικά 4-5 εβδομάδες, πριν ή μετά, σε σχέση με την χειρουργική επέμβαση. Το θέμα όμως δεν έχει μελετηθεί επαρκώς και μπορεί να συγκεντρώσει ερευνητικό ενδιαφέρον. Δεν υπάρχουν συγκεκριμένες μελέτες που να τεκμηριώνουν την επίδραση της bevacizumab στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου. Επομένως η πρωτοτυπία αυτής της μελέτης είναι αδιαμφισβήτητη. Σκοπός της παρούσας πειραματικής μελέτης είναι η επίδραση του αναστολέα της αγγειογένεσης, της bevacizumab, στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου, με τον προσδιορισμό διαφόρων παραγόντων που εμπλέκονται σε κυτταρικό επίπεδο στην διαδικασία της επούλωσης και εκφράζουν τελικά το βαθμό της επουλωτικής ικανότητας. 39

40 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Για την εκπόνηση του πειραματικού σκέλους της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματόζωα 40 άρρενες επίμυες τύπου Wistar ηλικίας τριών έως τεσσάρων μηνών και βάρους γραμμαρίων. Σε όλη τη διάρκεια του πειράματος τα πειραματόζωα ζούσαν σε περιβάλλον σταθερής θερμοκρασίας (20-22 C), υγρασίας, αερισμού και υγιεινής με 12ωρο τεχνητό κύκλο εναλλαγής ημέρας και νύχτας. Κάθε ζώο φυλάσσονταν ξεχωριστά σε ειδικά κατασκευασμένο ατομικό κλωβό με ελεύθερη πρόσβαση στο νερό και σε ειδικά τροποποιημένη τροφή, σε όλη τη διάρκεια του εικοσιτετραώρου. Όλα τα πειραματόζωα ήταν υπό τακτική παρακολούθηση και ο πειραματισμός έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και τις διατάξεις της Ευρωπαϊκής σύμβασης για την προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς ή επιστημονικούς σκοπούς, καθώς και τις άλλες κείμενες διατάξεις περί προστασίας ζώων ( Ν. 1197/81 αρθρ. 4, Ν. 2015/92, Π.Δ. 160/91 ). Τα πειράματα εκτελέσθηκαν στο Εργαστήριο Επιστημονικής Έρευνας και Πειραματικής Χειρουργικής της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Ιπποκράτειο Νοσοκομείο που είναι επίσημα πιστοποιημένο και έχει σχετική άδεια πειραματισμού και αναπαραγωγής από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής της Νομαρχίας Θεσσαλονίκης (αριθμός άδειας: EL44BIO17). Για την εκπόνηση της συγκεκριμένης πειραματικής μελέτης υποβλήθηκε το ανάλογο πρωτόκολλο στην παραπάνω υπηρεσία και χορηγήθηκε ειδική έγκριση (Αριθμός Πρωτοκόλλου.: 13/17472/ ). Ομάδες πειράματος Οι επίμυες χωρίσθηκαν σε τέσσερις ομάδες των 10 πειραματόζωων έκαστη. Η Α και Β ομάδα (σύνολο 20 πειραματόζωα) αποτέλεσαν τις ομάδες μελέτης. Σε αυτές μετά την ολοκλήρωση της αναστόμωσης και πριν την σύγκλειση της κοιλιάς, πραγματοποιήθηκε εφάπαξ έγχυση ενδοπεριτοναϊκά διαλύματος της ουσίας bevacizumab, φιαλίδιο 100 mg σε 4 ml (σκεύασμα Avastin της εταιρίας Roche Pharma AG, Grenzach-Wyhlen, Germany) σε δόση 5 mg/kgr βάρους σώματος. Για 40

41 την προετοιμασία του χορηγούμενου διαλύματος χρησιμοποιήθηκαν 0,25 ml του σκευάσματος Avastin (25 mg bevacizumab/ ml) αραιωμένα με 4,75 ml διαλύματος φυσιολογικού ορού, ούτως ώστε 1ml του χορηγούμενου διαλύματος να περιέχει 1,25 mg της ουσίας bevacizumab. Η ποσότητα του χορηγούμενου διαλύματος ήταν 0,1 ml ανά 25 gr σωματικού βάρους. Η Γ και Δ ομάδα (σύνολο 20 πειραματόζωα) αποτέλεσαν τις ομάδες ελέγχου. Σε αυτές δε χορηγήθηκε κανένα άλλο φάρμακο και δεν έγινε τίποτα περισσότερο από την σχεδιασθείσα εγχείρηση. Χορηγήθηκε μόνο διάλυμα φυσιολογικού ορού (placebo) ενδοπεριτοναϊκά σε αντίστοιχη ποσότητα με τις ομάδες μελέτης, δηλαδή 0,1 ml ανά 25 gr σωματικού βάρους. Τα πειραματόζωα της ομάδας Α και της ομάδας Γ θυσιάσθηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα και αυτά της ομάδας Β και της ομάδας Δ την 14 η μετεγχειρητική ημέρα. Χειρουργική επέμβαση Αναισθησία και προετοιμασία Αρχικά το πειραματόζωο τοποθετούνταν σε γυάλινο κώδωνα που περιείχε κομπρέσα εμποτισμένη με το πτητικό αναισθητικό αιθέρα και επιτυγχάνονταν άμεση προσωρινή αναισθητοποίηση που επέτρεπε την ακριβή ζύγιση και την προετοιμασία του πειραματοζώου. Για τη διενέργεια της χειρουργικής επέμβασης που απαιτούσε μονιμότερη και καλύτερη αναισθησία χορηγούνταν ενδοπεριτοναϊκά κεταμίνη σε δόση 40mg ανά Kgr βάρους σώματος. Αυτή η δόση εξασφάλιζε αναλγησία και δυνατότητα εγχειρητικών χειρισμών, χωρίς να ταλαιπωρείται το πειραματόζωο, για περίπου 30 λεπτά, χρόνος εντός του οποίου ολοκληρώνονταν η εγχείρηση. Σε όλη την διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και της αναισθησίας ελέγχονταν μακροσκοπικά η αναπνοή του πειραματοζώου. Η μέθοδος αναισθησίας που ακολουθήθηκε θεωρείται γενικώς ασφαλής και αποτελεσματική, καθώς δεν δημιούργησε ιδιαίτερα προβλήματα ή θανάτους στα πειραματόζωα μας. Ο ευπρεπισμός της κοιλιακής χώρας πραγματοποιούνταν, μετά από επάλειψη με αραιό υδατικό διάλυμα του αντισηπτικού Cetavlon, με ξύρισμα όλου του εγχειρητικού πεδίου κατά τη μέση γραμμή της κοιλιάς μέχρι την ηβική σύμφυση. Το πειραματόζωο ακινητοποιούνταν στο χειρουργικό τραπέζι που ήταν μια επιτραπέζια χοντρή πλάκα από Plexiglas ( περίπου 30x 40 εκ. σε διαστάσεις) με εγκοπές στις τέσσερις γωνίες 41

42 χρησιμοποιώντας λεπτές λωρίδες πλαστικής περίδεσης. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην περίδεση των άνω άκρων που έπρεπε να είναι χαλαρότερη, για να μην παρεμποδίζει τις αναπνευστικές κινήσεις. Η αντισηψία του εγχειρητικού πεδίου επιτυγχάνονταν με ιωδιούχο προβιντόνη (διάλυμα Betadine 10%) και ακολουθούσε κάλυψη με αποστειρωμένο οθώνειο μίας χρήσης. Εγχείρηση Κάτω από άσηπτες συνθήκες εκτελούνταν λαπαροτομία με μέση τομή μήκους 4-5 εκ και έλεγχος της περιτοναϊκής κοιλότητας. Τα κοιλιακά τοιχώματα έλκονταν με αυτοσυγκρατούμενο διαστολέα Adson- Baby. Με έλξη του μείζονος επιπλόου και του λεπτού εντέρου που τοποθετούνταν με ήπιους χειρισμούς έξω από την περιτοναϊκή κοιλότητα, αναγνωρίζονταν το παχύ έντερο και ανευρίσκονταν το σιγμοειδές κόλον. Μετά από περιχαράκωση της περιοχής με γάζα, ακολουθούσε εκτομή τμήματος σιγμοειδούς σε μήκος 1 εκ. και μόλις 3 εκ. πριν την ανάκαμψη του περιτοναίου, με μεγάλη όμως προσοχή για την αποφυγή τραυματισμού του μεσεντερικού αγγειακού δικτύου (Εικόνα 5). Ιδιαίτερη φροντίδα λαμβάνονταν για το μηχανικό καθαρισμό, τόσο του κεντρικού όσο και του περιφερικού κολοβώματος του παχέος εντέρου από τα κόπρανα. Η συνέχεια του παχέος εντέρου πραγματοποιούνταν με τελικοτελική αναστόμωση σε ένα στρώμα με μεμονωμένες ραφές ατραυματικού Prolene 6-0 (Εικόνα 6). Η πρώτη ραφή τοποθετούνταν στο αντιμεσεντερικό χείλος του εντέρου και η δεύτερη στο μεσεντερικό χείλος, οι οποίες χρησιμοποιούνταν στη συνέχεια και ως οδηγά ράμματα για συγκράτηση και έλξη. Για την ολοκλήρωση της κάθε αναστόμωσης απαιτούνταν συνήθως 3 ραφές για το πρόσθιο και 3 ραφές για το οπίσθιο τοίχωμα ή σπανιότερα συνολικά 8 ραφές. Με λίγο φυσιολογικό ορό καθαρίζονταν η περιοχή της περιτοναϊκής κοιλότητας γύρω από την αναστόμωση, επανατοποθετούνταν τα σπλάγχνα στη θέση τους και συγκλείονταν το κοιλιακό τραύμα σε δύο στρώματα με συνεχή ραφή Prolene 2-0 (Εικόνα 7). Ακολουθού σε τοποθέτηση τοπικού αντισηπτικού Betadine 10% στην περιοχή του τραύματος. Η επέμβαση διαρκούσε λεπτά περίπου. Μετά την ανάνηψη το κάθε πειραματόζωο τοποθετούνταν μόνο του σε ξεχωριστό κλωβό, για να αποφευχθεί η κακοποίηση από άλλους επίμυες, όπου και παρέμεινε μέχρι τη θυσία. Η πρόσβαση στη λήψη νερού και τροφής ήταν ελεύθερη κατά βούληση σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. 42

43 EIK. 5. Tομή του σιγμοειδούς και αποφυγή τραυματισμού της αγγείωσης. ΕΙΚ. 6. Η εκτέλεση της αναστόμωσης που ολοκληρώνεται, διακρίνονται τα δύο οδηγά ράμματα. 43

44 ΕΙΚ. 7. Η σύγκλειση του κοιλιακού τραύματος με συνεχή ραφή, το πρώτο στρώμα. ΕΙΚ. 8. Θυσία, χωρίς ενδοκοιλιακές συμφύσεις, διακρίνεται η αναστόμωση. 44

45 ΕΙΚ. 9. Θυσία, διακρίνεται η αναστόμωση και χαλαρές συμφύσεις ΕΙΚ. 10. Το τμήμα του εκταμέντος σιγμοειδούς με την αναστόμωση στο μέσον. 45

46 ΕΙΚ. 11. Επιμήκης διάνοιξη της αναστόμωσης, διακρίνεται η γραμμή συρραφής και τα ράμματα. Εικ. 12. Θυσία, παρακέντηση της κάτω κοίλης φλέβας και αιμοληψία. 46

47 Θυσία πειραματοζώων Η επανεγχείρηση των πειραματοζώων με σκοπό τη θυσία τους πραγματοποιούνταν την 7 η ή την 14 η μετεγχειρητική ημέρα ανάλογα με την ομάδα, στην οποία εντάχθηκαν και σύμφωνα πάντα με τις αρχές ευθανασίας των πειραματοζώων. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες αναισθησίας και εγχείρησης, όπως και κατά την αρχική επέμβαση, τα πειραματόζωα αναισθητοποιούνταν με αιθέρα και κεταμίνη, ζυγίζονταν και τοποθετούνταν στο χειρουργικό τραπέζι. Το κοιλιακό τραύμα εξετάζονταν με επιμελή επισκόπηση από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές, οι οποίοι δεν γνώριζαν σε ποια ομάδα ανήκε το πειραματόζωο, για πιθανές επιπλοκές, όπως διαπύηση ή διάσπαση. Η αξιολόγηση της επούλωσης του τραύματος βαθμολογούνταν και καταγράφονταν σύμφωνα με προηγουμένως περιγραφείσα κλίμακα από 0 έως 5 (69). Η κλίμακα αυτή περιλάμβανε βαθμό : 0 για πλήρη διάσπαση τραύματος, 1 για εξέλκωση 50-75%, 2 για εξέλκωση 25-50%, 3 για εξέλκωση μικρότερη από 25%, 4 για ανυψωμένη φυσιολογική ουλή και 5 για σχεδόν μη ορατή ουλή. Με ατρακτοειδή τομή με νυστέρι λαμβάνονταν το δέρμα με το υποδόριο του κοιλιακού τραύματος και τοποθετούνταν σε διάλυμα φορμόλης 10% για ιστολογική εξέταση. Το κοιλιακό τοίχωμα διανοίγονταν και πραγματοποιούνταν επιμελής επισκόπηση της περιτοναϊκής κοιλότητας (Εικόνα 8) για πιθανή ύπαρξη αιματωμάτων, ενδοκοιλιακών συλλογών, περιτονίτιδας, συμφύσεων ή εντερικής απόφραξης. Πιο συγκεκριμένα η περιοχή της αναστόμωσης ελέγχονταν προσεκτικά (Εικόνα 9) για την ύπαρξη επιπλοκών, όπως αποστηματίων, διάσπασης και στένωσης αυτής. Η αναστόμωση χαρακτηρίζεται στενωμένη, όταν η διάμετρος του εντέρου είναι διπλάσια κεντρικά, σε σύγκριση με αυτή περιφερικά της αναστόμωσης. Η αξιολόγηση των συμφύσεων εκτιμήθηκε από τους δύο ανεξάρτητους παρατηρητές, όπως προηγούμενα αναφέρθηκε και καταγράφηκε με βάση τη βαθμολογία της κλίμακας Knightly (70), από το 0 έως το 4 κατά τον ακόλουθο τρόπο: 0 χωρίς συμφύσεις, 1 μια λεπτή σύμφυση που διαχωρίζεται εύκολα, 2 μετρίως εκτεταμένες συμφύσεις που δεν ανθίστανται στην τάση, 3 αρκετά εκτεταμένες ασθενείς συμφύσεις με σπλάχνα και περίτονο περιτόναιο, 4 πολλές εκτεταμένες ισχυρές συμφύσεις που αφορούν το μεσεντέριο, έντερο, μείζον επίπλουν και επεκτείνονται έως το κοιλιακό τοίχωμα. Ακολουθούσε η εκτομή τμήματος του παχέος εντέρου μήκους 5 εκ., στο μέσο του οποίου βρίσκονταν η αναστόμωση (Εικόνα 10) και διενεργούνταν επιμελής καθαρισμός του αυλού από το κοπρανώδες περιεχόμενο του. Τα δύο άκρα του 47

48 απολινώνονταν και στο ένα από αυτά, με τη βοήθεια συνδετικού τριών οδών (3-way), εφαρμόζονταν υδραργυρικό μανόμετρο, για την καταγραφή της ενδοαυλικής πίεσης και αντλία έγχυσης, για την παροχή φυσιολογικού ορού 1 ml το λεπτό. Το μοντέλο αυτό για την καταγραφή της πίεσης την στιγμή διάσπασης της αναστόμωσης είναι αποδεκτό και εφαρμόσθηκε με επιτυχία και σε άλλες πειραματικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στην Κλινική μας (28,29,31,32). Στην συνέχεια διανοίγονταν το τμήμα του εντέρου επιμήκως (Εικόνα 11) και με εκτομή, με νυστέρι και από τις δύο πλευρές, παρέμενε η περιοχή της αναστόμωσης, εύρους 1 εκ., που περιελάμβανε στο μέσο της την γραμμή συρραφής. Αυτή διαχωρίζονταν κατόπιν σε δύο τμήματα. Το ένα τρίτο της αναστόμωσης τοποθετούνταν σε διάλυμα φορμόλης 10%, για ιστολογική εξέταση. Tα υπόλοιπα δύο τρίτα αυτής που προοριζόταν για βιοχημική ανάλυση ζυγίζονταν με επιστημονική ζυγαριά ακριβείας σε mg, τοποθετούνταν σε ειδικά αποστειρωμένα φιαλίδια Eppendorf με 0,4 ml φυσιολογικού ορού και διατηρήθηκαν σε βαθιά κατάψυξη στους -70 C. Πριν την ολοκλήρωση της θυσίας, με παρακέντηση της κάτω κοίλης φλέβας λαμβάνονταν 3-5 cc αίματος (Εικόνα 12), ο ορός του οποίου μετά από φυγοκέντριση, διατηρήθηκε σε βαθιά κατάψυξη για βιοχημικό προσδιορισμό των παραμέτρων. Η ευθανασία του πειραματοζώου προκαλούνταν με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση θειοπεντάλης (Pentothal). Βιοχημική ανάλυση των δειγμάτων Ο προσδιορισμός των βιοχημικών παραμέτρων πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Από τα δείγματα ιστού της αναστόμωσης μετά από ομογενοποίηση και ειδική προπαρασκευή λαμβάνονταν το υπερκείμενο εναιώρημα, το οποίο τοποθετούνταν μέσα σε ειδικά αποστειρωμένα φιαλίδια Eppendorf και παρέμενε σε βαθιά κατάψυξη στους -70 C. Κατόπιν με μέθοδο ELISA χρησιμοποιώντας ειδικά Kits μελετήθηκαν οι παρακάτω παράμετροι: 1. Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), για πιθανή επίδραση του Avastin στην αγγειογένεση. Χρησιμοποιήθηκε ειδικό Kit για επίμυες που εφαρμόζεται για τον ποσοτικό προσδιορισμό του VEGF σε επίμυες στο υπερκείμενο εναιώρημα 48

49 ιστών. Αυτό αποτελείται από πλακίδια μικροτιτλοποίησης καλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα επίμυα έναντι του VEGF ( R & D Systems, Mineapolis, USA). 2. Ενδοθηλίνη 1, η οποία προέρχεται από το αγγειακό ενδοθήλιο και τα επίπεδα της σχετίζονται με το βαθμό της ιστικής βλάβης από ισχαιμία (71,72). Χρησιμοποιήθηκε ειδικό Kit για προσδιορισμό ενδοθηλίνης- 1 επίμυα με πεπτιδική ανοσοενζυμική μέθοδο ( EIA ), ( Peninsula Laboratories, LLC, A member of the Bachem Group, San Carlos, California, USA). 3. C- αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), μία πρωτεΐνη οξείας φάσης ως δείκτης της βαρύτητας της φλεγμονής. Χρησιμοποιήθηκε ειδικό Kit για επίμυες (Rat C- reactive protein ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, California, USA). Η μέθοδος στηρίζεται σε ειδικό αντίσωμα έναντι της CRP επίμυα. 4. Ισορροπία προοξειδωτικών- αντιοξειδωτικών παραγόντων ( PAB), μία καινούργια μέτρηση του οξειδωτικού stress, ως δείκτη των ελευθέρων ριζών οξυγόνου, οι οποίες σχετίζονται με τη βαρύτητα της ισχαιμικής βλάβης. Όσο μεγαλύτερη είναι η αναλογία αυτή, τόσο περισσότερο το οξειδωτικό stress και τόσο βαρύτερη θεωρείται η βλάβη. Για τον προσδιορισμό τους, χρησιμοποιήθηκε ειδικό πρωτόκολλο συγκεκριμένης μεθόδου που εφαρμόζεται από το Εργαστήριο Βιοχημείας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (73,74,75). 5. Επίπεδα καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών, τα οποία είναι πιο ευαίσθητος δείκτης και εκφράζουν το οξειδωτικό stress (76). Για τον προσδιορισμό τους, χρησιμοποιήθηκε συγκεκριμένη μέθοδος που εφαρμόζεται από το Εργαστήριο Βιοχημείας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (77). Αυτή είναι μέθοδος ELISA υψηλής ευαισθησίας για τη μέτρηση πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα με χαμηλή ποσότητα πρωτεΐνης. y=0,21x-0,01 (R 2 =0,97). 6. Επίπεδα υδροξυπρολίνης, με σκοπό την έμμεση εκτίμηση της σύνθεσης κολλαγόνου ως δείκτη που εκφράζει το βαθμό της επουλωτικής δραστηριότητας. Αυτή προσδιορίσθηκε στον ομογενοποιημένο ιστό της αναστόμωσης, καθώς και της ουλής του δέρματος. Για τον προσδιορισμό της, χρησιμοποιήθηκε η απλοποιημένη μέθοδος Reddy που εφαρμόζεται σε ομογενοποιημένους ιστούς από τραύμα (78). Ιστολογική εξέταση των παρασκευασμάτων Η ιστολογική εξέταση των παρασκευασμάτων διενεργήθηκε στο Εργαστήριο Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Τα παρασκευάσματα μονιμοποιήθηκαν σε παραφίνη. Από κάθε 49

50 ιστοτεμάχιο, που αφορούσε είτε την αναστόμωση ή το δέρμα πάρθηκαν τομές με αντιπροσωπευτικό υλικό πάχους 3-5 μm και εφαρμόσθηκε χρώση με αιματοξυλίνηεωσίνη. Η εξέταση πραγματοποιήθηκε με κοινό μικροσκόπιο και αναζητήθηκε η παρουσία επιθηλιακών κυττάρων (επιθηλιοποίηση), ινοβλαστών, κολλαγόνου και κοκκιώδους ιστού. Ο νεοσχηματισμένος κοκκιώδης ιστός γύρω από την γραμμή συρραφής ξεχώριζε χωρίς δυσκολία από τον περιβάλλοντα ιστό. Η αξιολόγηση των ιστολογικών ευρημάτων στηρίχθηκε σε διαβάθμιση κλίμακας από 0 έως 3, ως εξής: 0 απουσία, 1 μικρή, 2 μέτρια, 3 έντονη παρουσία στοιχείων. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος και τυπική απόκλιση, mean ± SD (SEM). Το τελευταίο είναι το σταθερό λάθος του μέσου όρου. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και η σύγκριση μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία Mann- Whitney U. Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε το p<0,05. Για την παραπάνω στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 13.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL, USA ). 50

51 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όλοι οι επίμυες της πειραματικής μελέτης ανένηψαν καλώς, ανέκτησαν βάρος και ολοκλήρωσαν το πείραμα. Κατά τη μετεγχειρητική παρακολούθηση δεν προέκυψε κάτι το ιδιαίτερο, η όλη πορεία υπήρξε ομαλή. Η καλή και ανεπίπλοκη κατάσταση συνάγεται από τη ζωηρότητα τους και από το γεγονός της διάθεσης για λήψη τροφής και νερού, καθώς και από την σημειωθείσα αύξηση του βάρους που ήταν εμφανείς σε όλες ανεξαιρέτως τις περιπτώσεις. Δεν παρατηρήθηκαν αιμορραγικές εκδηλώσεις, συρίγγια ή νεκρώσεις. Κατά την επανεγχείρηση της θυσίας πραγματοποιήθηκε λεπτομερής μακροσκοπική εξέταση της περιτοναϊκής κοιλότητας που βρέθηκε καθαρή χωρίς αιματώματα ή συλλογές, καθώς και επιμελής έλεγχος της προηγηθείσας αναστόμωσης, η οποία ήταν ακέραιη χωρίς διάσπαση ή ενδείξεις διαφυγής και στένωση. Βιοχημικές αναλύσεις ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VEGF) - (ΙΣΤΟΣ) Οι τιμές εκφράζονται σε pg/ ml ανά gr ιστού. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 13. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 1211,29±631,32 (199,64) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 906,82±383,92 (127,97) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 483,97±325,8 (145,7) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 1192,41±490,13 (219,19) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,010 στατιστικά σημαντικό Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,257 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,414 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,047 στατιστικά σημαντικό VEGF (AIMA) Η ποσότητα του VEGF στο αίμα ήταν μη ανιχνεύσιμη, αφού βρέθηκε απειροελάχιστη έως απροσδιόριστη σε όλα τα πειραματόζωα. ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ-1 (ΙΣΤΟΣ) Οι τιμές εκφράζονται σε ng/ ml ανά gr ιστού. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 14. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 0,166±0,074 (0,026) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 0,546±0,807 (0,269) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 0,171±0,098 (0,044) 51

52 Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 0,254±0,053 (0,026) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,884 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,503 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,021 στατιστικά σημαντικό Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,190 ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ-1 (AIMA) Οι τιμές εκφράζονται σε pg/ ml. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 24. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 0,530±0,296 (0,093) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 0,666±0,35 (0,11) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 1,0854±0,932 (0,416) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 0,454±0,258 (0,115) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,165 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,206 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,393 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,095 CRP (ΙΣΤΟΣ) Οι τιμές εκφράζονται σε μg/ ml ανά gr ιστού. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 15. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 641,357±218,3 (69,03) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 715,137±217,5 (68,78) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 381,357±64,78 (28,97) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 725,943±151,32 (67,67) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,007 στατιστικά σημαντικό Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,713 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,364 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,009 στατιστικά σημαντικό CRP (ΑΙΜΑ) Οι τιμές εκφράζονται σε ng/ ml. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 25. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 613,952±25,201 (7,96) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 613,768±26,769 (8,47) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 631,675±23,804 (10,64) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 830,20±49,65 (22,20) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,327 52

53 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,002 στατιστικά σημαντικό Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,850 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,009 στατιστικά σημαντικό ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ-ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ (ΙΣΤΟΣ) Οι τιμές εκφράζονται σε ΗΚ (αναλογία x σταθερά 6). Γραφική παράσταση στην Εικόνα 16. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα:162,15±37,04 (11,7) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα:128,05±24,4 (7,71) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 137,05±36,5 (16,3) Ομάδα placebo 14 η ημέρα:133,2±19,4 (8,6) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,327 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,951 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,021 στατιστικά σημαντικό Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,917 ΙΣΟΡΡΟΠΙΑ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ-ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ (ΑΙΜΑ) Οι τιμές εκφράζονται σε ΗΚ (αναλογία x σταθερά 6). Γραφική παράσταση στην Εικόνα 26. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα:51,94±6,42 (2,03) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα:57,78±7,45 (2,35) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 47,68±4,38 (1,95) Ομάδα placebo 14 η ημέρα:54,0±4,38 (1,95) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,140 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,356 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,095 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,074 ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ (ΙΣΤΟΣ) Οι τιμές εκφράζονται σε nmol καρβονυλίων ανά mg πρωτεΐνης. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 17. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 5,18±0,32 (0,1) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 4,96±0,62 (0,19) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 6,03±0,24 (0,1) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 5,14±0,54 (0,24) Συγκρίσεις 53

54 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,003 στατιστικά σημαντικό Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p= 0,462 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,496 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,009 στατιστικά σημαντικό ΚΑΡΒΟΝΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ (ΑΙΜΑ) Οι τιμές εκφράζονται σε nmol καρβονυλίων ανά mg πρωτεΐνης. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 27. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 5,6310±0,34 (0,11) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 6,0621±0,43 (0,13) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 5,9326±0,39 (0,17) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 6,18±0,51 (0,23) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,178 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p= 0,581 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,023 στατιστικά σημαντικό Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,347 ΥΔΡΟΞΥΠΡΟΛΙΝΗ (ΙΣΤΟΣ, ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΗ) Οι τιμές εκφράζονται σε μg/ mg ιστού. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 18. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 1,554±0,75 (0,23) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 1,655±1,65 (0,58) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 1,177±1,13 (0,56) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 2,064±0,82 (0,36) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,322 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,188 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,657 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,142 ΥΔΡΟΞΥΠΡΟΛΙΝΗ (ΙΣΤΟΣ, ΔΕΡΜΑ) Οι τιμές εκφράζονται σε μg/ mg ιστού. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 28. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 1,754±0,754 (0,238) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 1,833±1,456 (0,46) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 1,34±0,985 (0,44) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 2,264±0,827 (0,369) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,270 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,220 54

55 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,850 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,076 ΠΙΕΣΗ ΔΙΑΣΠΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΗΣ Αυτή εκφράζεται σε mm Hg. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 21. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 44,5±11,87 (4,84) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 190,5±22,79 (9,3) Ομάδα placebo Ομάδα 7 η ημέρα: 48±10,2 (4,17) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 197,67±11,02 (4,449) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,575 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,643 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Αυτή εκφράζεται σε κλίμακα από 0-5. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 22. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 3,4±0,843 (0,267) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 3,1±1,37 (0,433) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 2,8±0,837 (0,374) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 4,0±1,0 (0,447) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,188 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,255 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,684 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,082 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΕΝΔΟΚΟΙΛΙΑΚΩΝ ΣΥΜΦΥΣΕΩΝ Αυτή εκφράζεται σε κλίμακα από 0-4. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 20. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 2,0±0,816 (0,258) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 1,9±0,738 (0,233) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 2,2±0,837 (0,374) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 2,2±0,447 (0,2) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,648 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,403 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,776 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,905 55

56 ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Η ιστολογική εξέταση τόσο στο παρασκεύασμα της αναστόμωσης του παχέος εντέρου, όσο και αυτό του δέρματος, έδειξε παντελή έλλειψη επιθηλιοποίησης, μερικού βαθμού λιπώδη διήθηση ιδίως στο δέρμα, η οποία αποδίδεται στην ειδική τροφή, καθώς και κυμαινόμενη ίνωση διαφορετικού βαθμού, σε όλες τις ομάδες. Οι ινοβλάστες, η φλεγμονή και το κολλαγόνο ήταν σε παράλληλη αναλογία (ίδιος βαθμός) με την ίνωση. ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΗΣ Αυτή εκφράζεται σε κλίμακα από 0-3. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 19. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 2,2±0,789 (0,249) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 2,1±0,738 (0,233) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 2,4±0,894 (0,400) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 2,0±0,707 (0,316) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=0,597 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,787 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=0,744 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,371 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Αυτή εκφράζεται σε κλίμακα από 0-3. Γραφική παράσταση στην Εικόνα 23. Μ.Ο. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα: 2,0±0,667 (0,211) Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: 2,0±0,667 (0,211) Ομάδα placebo 7 η ημέρα: 2,0±0,707 (0,316) Ομάδα placebo 14 η ημέρα: 1,8±0,447 (0,2) Συγκρίσεις Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα placebo 7 η ημέρα: p=1,0 Ομάδα Avastin 14 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,557 Ομάδα Avastin 7 η ημέρα Ομάδα Avastin 14 η ημέρα: p=1,0 Ομάδα placebo 7 η ημέρα Ομάδα placebo 14 η ημέρα: p=0,606 56

57 ΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΣΤΑΣΕΙΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Ομάδα Avastin Placebo VEGF (pg/ml) η Ημέρα 14η ΕΙΚ.13. Μεταβολές VEGF ιστού αναστόμωσης. AV7η-PL7η: p = 0,010. PL7η-PL14η: p = 0,047. 0,4 Ομάδα Avastin Placebo ET-1 (ng/ml) 0,3 0,2 0,1 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.14. Μεταβολές ET-1 ιστού αναστόμωσης. AV7η-AV14η: p = 0,

58 1200 Ομάδα Avastin Placebo 1000 CRP (μg/ml) η Ημέρα 14η ΕΙΚ.15. Μεταβολές CRP ιστού αναστόμωσης. AV7η-PL 7η: p = PL7η-PL14η: p = Ομάδα Avastin Placebo 210 PAB (HK) η Ημέρα 14η ΕΙΚ.16. Μεταβολές PAB ιστού αναστόμωσης. AV7η-AV14η: p = 0,

59 Καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες (nmol/mg) 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Ομάδα Avastin Placebo 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.17. Μεταβολές καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών ιστού αναστόμωσης. AV7η-PL7η: p = 0,003. PL7η-PL14η: p = 0, Ομάδα Avastin Placebo 5 Υδροξυπρολίνη (μg/mg) η Ημέρα 14η ΕΙΚ.18. Μεταβολές υδροξυπρολίνης ιστού αναστόμωσης. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 59

60 Μέσος ιστολογικός βαθμός +/- SEM 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 Ομάδα Avastin Placebo 1,6 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.19. Ιστολογική διαβάθμιση επούλωσης αναστόμωσης. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. Μέσος βαθμός συμφύσεων +/- SEM 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 Ομάδα Avastin Placebo 1,6 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.20. Διαβάθμιση ενδοκοιλιακών συμφύσεων. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 60

61 Πίεση διάσπασης (mmhg) Ομάδα Avastin Placebo 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.21. Μεταβολές πίεσης διάσπασης αναστόμωσης. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 5 Ομάδα Avastin Placebo Βαθμός δέρματος +/- SEM η Ημέρα 14η ΕΙΚ.22. Μακροσκοπική διαβάθμιση επούλωσης δέρματος. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 61

62 Μέσος ιστολογικός βαθμός +/- SEM 3,0 2,5 2,0 1,5 Ομάδα Avastin Placebo 1,0 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.23. Ιστολογική διαβάθμιση επούλωσης δέρματος. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 3,0 2,5 Ομάδα Avastin Placebo ET-1 (ng/ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.24. Μεταβολές ET-1 στο αίμα. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 62

63 900 Ομάδα Avastin Placebo CRP (μg/ml) η Ημέρα 14η ΕΙΚ.25. Μεταβολές CRP στο αίμα. AV14η-PL14η: p=0,002. PL7η-PL14η: p=0, PAB (HK) Ομάδα Avastin Placebo 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.26. Μεταβολές PAB στο αίμα. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 63

64 Καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες (nmol/mg) 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 Ομάδα Avastin Placebo 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.27. Μεταβολές καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών στο αίμα. AV7η-AV14η: p=0,023. 6,0 5,0 Ομάδα Avastin Placebo Υδροξυπρολίνη (μg/ml) 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 7η Ημέρα 14η ΕΙΚ.28. Μεταβολές υδροξυπρολίνης ιστού δέρματος. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 64

65 ΑΝΤΙΠΡΟΣΩΠΕΥΤΙΚΕΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΙΚΟΝΕΣ ΕΙΚ.29. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα. Έντερο. Έντονη ίνωση. ΕΑ: 10X10 ΕΙΚ.30. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα. Έντερο. Μέτρια ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10 65

66 ΕΙΚ.31. Ομάδα Avastin 14 η ημέρα. Έντερο. Έντονη ίνωση. ΕΑ: 10X10. ΕΙΚ.32. Ομάδα Avastin 14 η ημέρα. Έντερο. Μέτρια ίνωση. ΕΑ: 10X10 66

67 ΕΙΚ.33. Ομάδα Placebo 7 η ημέρα. Έντερο. Έντονη ίνωση. ΕΑ: 10X10. ΕΙΚ.34. Ομάδα Placebo 7 η ημέρα. Έντερο. Μέτρια ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10. 67

68 ΕΙΚ.35. Ομάδα Placebo 14 η ημέρα. Έντερο. Έντονη ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10. ΕΙΚ.36. Ομάδα Placebo 14 η ημέρα. Έντερο. Μέτρια ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10. 68

69 ΕΙΚ.37. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα. Δέρμα. Έντονη ίνωση. ΕΑ: 10X10 ΕΙΚ.38. Ομάδα Avastin 7 η ημέρα. Δέρμα. Λίγη ίνωση. ΕΑ: 10X10 69

70 ΕΙΚ.39. Ομάδα Avastin 14 η ημέρα. Δέρμα. Έντονη ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10 ΕΙΚ.40. Ομάδα Avastin 14 η ημέρα. Δέρμα. Μέτρια ίνωση. ΕΑ: 10X10 70

71 ΕΙΚ.41. Ομάδα Placebo 7 η ημέρα. Δέρμα. Έντονη ίνωση, φαίνεται η γραμμή συρραφής. ΕΑ: 10X10. ΕΙΚ.42. Ομάδα Placebo 14 η ημέρα. Δέρμα. Έντονη ίνωση. ΕΑ: 10X10. 71