ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Β ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Α.Π.Θ. ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΤΑΣΚΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Β ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Α.Π.Θ. ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΤΑΣΚΟΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμός: 2363 Η ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗΣ-β ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΟΛΛΑΠΛΗ ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ, ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΤΡΟΠΩΝ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΒΙΡΓΙΝΙΑ Ν. ΓΙΑΝΤΖΗ ΝΕΥΡΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΥΛΩΝΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, Ομότιμος Καθηγητής Νευρολογίας ΤΑΣΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, Καθηγητής Νευρολογίας ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, Καθηγητής Παθολογίας Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΥΛΩΝΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, Ομότιμος Καθηγητής Νευρολογίας ΤΑΣΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, Καθηγητής Νευρολογίας ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, Καθηγητής Παθολογίας ΒΛΑΪΚΙΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, Καθηγητής Νευρολογίας ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΝΟΡΜΑ, Καθηγήτρια Βιοχημείας ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΕΥΔΟΞΙΑ, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας ΚΟΥΤΣΟΥΡΑΚΗ ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ, Επίκουρη Καθηγήτρια Νευρολογίας «Ἡ ἔγκρισις τῆς Διδακτορικῆς Διατριβῆς ὑπό τῆς Ἰατρικῆς Σχολῆς τοῡ Ἀριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δέν ὑποδηλοῖ ἀποδοχήν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως» (Νόμος 5343/32. ἀρθρ καί ν. 1268/82, ἀρθρ. 50 8)

4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΑΣ

6

7 Στους δασκάλους μου Στους ασθενείς μου

8

9 Στον σύζυγό μου Στην οικογένειά μου Στη μνήμη του πατέρα μου

10

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Φυσική ιστορία Παθογένεια-Διάγνωση Σκλήρυνσης κατά πλάκας Εισαγωγή Ηλικία κατά την έναρξη της νόσου Αναλογία των φύλων στη ΣΚΠ Σταθμοί στην πορεία της ΣΚΠ Φλεγμονή-Παθογένεια Παθολογία ΣΚΠ Κλινικές εκδηλώσεις Διάγνωση της ΣΚΠ Η θεραπεία της Σκλήρυνσης κατά Πλάκας Θεραπεία της οξείας υποτροπής Προφυλακτικές θεραπείες Αντισώματα έναντι της IFN-β Η γένεση των αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Η διάσπαση της ανοχής των Β κυττάρων Η αντιγονικότητα των θεραπειών με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Οι αντιγονικές ιδιότητες της ιντερφερόνης βήτα Οι ιδιότητες των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης βήτα Η βιολογική δράση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β Διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ των ιντερφερονών β Αίτια αντιγονικότητας Εμφάνιση των αντισωμάτων στην κλινική πράξη Εξαφάνιση των εξουδετερωτικών και συνδετικών αντισωμάτων Μέθοδοι ανίχνευσης των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Ο κλινικός αντίκτυπος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Η πρόληψη στη δημιουργία των εξουδετερωτικών αντισωμάτων ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μέθοδοι και υλικά Ασθενείς και θεραπεία Τεχνικές ανίχνευσης συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β Στατιστική ανάλυση

12 5. Αποτελέσματα Χαρακτηριστικά ασθενών με ενδιάμεσης δραστηριότητας νόσο ή πτωχή ανταπόκριση στη θεραπεία με INF-β Η συχνότητα εμφάνισης των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Διαχωρισμός των ασθενών ανάλογα με τον φαινότυπο συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Τα χαρακτηριστικά των ασθενών σε υποτροπή υπό θεραπεία με ενδοφλέβια μεθύλ-πρεδνιζολόνη Οι τίτλοι των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων πριν τη χορήγηση της κορτιζόνης Αλλαγές στους τίτλους των Nabs και Babs μετά τη χορήγηση της ΕΦΜΠ Ο αρχικός τίτλος των Nabs και Babs καθορίζει την ανταπόκρισή τους στην ΕΦΜΠ Ο κλινικός αντίκτυπος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Σύγκριση μεθόδων ανίχνευσης συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Συζήτηση ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

13 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΚΠ ΚΝΣ IFN sc im ΥΔΣΚΠ ΠΠΣΚΠ ΔΠΣΚΠ ΕΦΜΠ ΓΚ Babs Nabs EDSS ΑΕΦ MBP PLP MOG ICAM VCAM σκλήρυνση κατά πλάκας κεντρικό νευρικό σύστημα interferon ιντερφερόνη subcutaneous υποδόρια intramuscular ενδομυϊκά υποτροπιάζουσα-διαλείπουσα σκλήρυνση κατά πλάκας πρωτοπαθώς προϊούσα σκλήρυνση κατά πλάκας δευτεροπαθώς προϊούσα σκλήρυνση κατά πλάκας ενδοφλέβια μεθύλ-πρεδνιζολόνη γλυκοκορτικοειδή binding antibodies συνδετικά αντισώματα neutralizing antibodies εξουδετερωτικά αντισώματα expanded disability status scale αιματοεγκεφαλικός φραγμός myelin basic protein βασική πρωτεΐνη της μυελίνης proteolipid protein πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη myelin oligodendrocyte glycoprotein ολιγοδενδροκυτταρική γλυκοπρωτεΐνη της μυελίνης intercellular adhesion molecule μόριο διακυτταρικής προσκόλλησης vascular adhesion molecule αγγειακό μόριο προσκόλλησης

14 TNF-α tumor necrosis factor-α παράγοντας νέκρωσης όγκων-α TNF-β tumor necrosis factor-β παράγοντας νέκρωσης όγκων-β ή λεμφοτοξίνη ν.μ. νωτιαίος μυελός MRI magnetic resonance imaging μαγνητική τομογραφία ΕΝΥ εγκεφαλονωτιαίο υγρό VLA very late antigen πολύ όψιμα αντιγόνα LFA-1 leukocyte function-associated antigen 1 αντιγόνο-1 σχετιζόμενο με τη λειτουργία των λεμφοκυττάρων MxA myxovirus resistance protein A Mx1 γονίδιο κωδικοποίησης της πρωτεΐνης MxA GA glatiramer acetate οξική γλατιραμέρη TGF-β transforming growth factor-β μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β TRAIL tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand συνδέτης επάγων απόπτωση μέσω TNF

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια αυτοάνοση φλεγμονώδης απομυελινωτική νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) στην οποία οι βλάβες παρουσιάζουν διασπορά στον χρόνο και τόπο (εμφανίζονται σε διαφορετικές θέσεις στο ΚΝΣ και επέρχονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές). Παρά το γεγονός ότι χαρακτηρίζεται ως νόσος της νεαρής ηλικίας με πορεία εξάρσεων και υφέσεων, παρουσιάζει μεγάλη κλινική ανομοιογένεια. Αυτή έγκειται στην ηλικία έναρξης, τον τρόπο εμφάνισης των πρώτων κλινικών εκδηλώσεων, τη συχνότητα, τη βαρύτητα και τα υπολείμματα μιας υποτροπής, την ποικιλία και τον διάσπαρτο χαρακτήρα των συμπτωμάτων, την πορεία της νόσου (με εμφάνιση πολλές φορές προϊούσης επιδείνωσης χωρίς εξάρσεις), τη συσσωρευόμενη αναπηρία με την πάροδο του χρόνου και σε ποσοστό 20% την απουσία οποιασδήποτε αναπηρίας, ακόμη και 10 έτη μετά την έναρξη της νόσου. Η μεγάλη ποικιλία της κλινικής εικόνας είναι η αντανάκλαση των πολλαπλών περιοχών με καταστροφή της μυελίνης στο ΚΝΣ (απομυελινωτικές πλάκες), αν και υπάρχει συχνά μεγάλη διαφορά μεταξύ των κλινικών ευρημάτων και των απομυελινωτικών εστιών, όπως αυτά αποκαλύπτονται στη μαγνητική τομογραφία. Η θεραπευτική αντιμετώπιση της ΣΚΠ διακρίνεται στη θεραπεία των οξέων υποτροπών, τη συμπτωματική, την υποστηρικτική και την προφυλακτική θεραπεία. Τα στεροειδή είναι τα φάρμακα εκλογής για την αντιμετώπιση των εξάρσεων της νόσου. Σε σχετικά ήπιες ώσεις χορηγείται κορτιζόνη από το στόμα, ενώ μεγαλύτερης βαρύτητας υποτροπές αντιμετωπίζονται με ενδοφλέβια έγχυση μεθύλ-πρεδνιζολόνης. Η προφυλακτική αγωγή περιλαμβάνει ανοσοτροποποιητικά και ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Η ιντερφερόνη-β (IFN-β) αποτελεί ανοσοτροποποιητικό φάρμακο πρώτης γραμμής για την αντιμετώπιση της υποτροπιάζουσας-διαλείπουσας ΣΚΠ (ΥΔΣΚΠ). Πολυκεντρικές κλινικές μελέτες έδειξαν ότι μειώνει τη συχνότητα και τη βαρύτητα των υποτροπών, επιβραδύνει την εξέλιξη της αναπηρίας και καταστέλλει τους δείκτες δραστηριότητας της νόσου, όπως φαίνεται στη μαγνητική τομογραφία. Η IFN-β ενδείκνυται επιπλέον, στη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ με εξάρσεις. 15

16 Η εισαγωγή της IFN-β στη θεραπεία της ΣΚΠ άλλαξε τη φυσική πορεία της νόσου. μειονέκτημα όμως αποτελεί το γεγονός ότι τα σκευάσματα της IFN-β έχουν ανοσογονικές ιδιότητες και πυροδοτούν την ανάπτυξη συνδετικών (Babs) και εξουδετερωτικών αντισωμάτων (Nabs). Τα Nabs είναι υποομάδα των Babs, τα οποία αποτρέπουν την επιτυχή σύνδεση της IFN-β με τον υποδοχέα της και κατά συνέπεια εμποδίζει τη βιολογική δράση της IFN-β. Η επιζήμιος δράση των Nabs οδηγεί στην εξασθένιση του θεραπευτικού αποτελέσματος και την αύξηση της δραστηριότητας της νόσου και αυτό αποτυπώνεται στην επιδείνωση κλινικών και παρακλινικών παραμέτρων δραστηριότητας της νόσου. Η κλινική σημασία των Babs δεν έχει διευκρινιστεί. Το δυσεπίλυτο θέμα των Nabs προσεγγίστηκε πολλές φορές με τη σχεδίαση μελετών είτε προφυλακτικών τακτικών είτε θεραπευτικών χειρισμών για την αντιμετώπισή τους 159,158,160,174,175. Ο Pozzilli και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η ενδοφλέβια χορήγηση 1gr μεθύλ-πρεδνιζολόνης άπαξ μηνιαίως σε ασθενείς υπό INFβ-1b μειώνει το ποσοστό ανάπτυξης Nabs, αλλά δεν επηρεάζει τα επίπεδά τους όταν αυτά εμφανιστούν 46. Ο προβληματισμός πάνω στον κλινικό αντίκτυπο των εξουδετερωτικών αντισωμάτων και την αντιμετώπισή τους, ώστε να βελτιστοποιηθεί η θεραπεία με IFN-β, υπήρξε το ερέθισμα για να μελετηθεί η επίδραση της ενδοφλέβιας χορήγησης μεθύλ-πρεδνιζολόνης (ΕΦΜΠ) στην κινητική των Nabs και Babs σε ασθενείς με ΥΔΣΚΠ υπό θεραπεία με IFN-β ενώ βρίσκονται σε έξαρση της νόσου. Σε λόγους που αφορούν στην αξιοπιστία των μεθόδων ανίχνευσης των Nabs και Babs που χρησιμοποιήθηκαν στο εργαστήριο της Β Νευρολογικής κλινικής μελετήθηκε η συχνότητα εμφάνισης των αντισωμάτων έναντι της IFN-β σε ασθενείς με ανεπαρκή ανταπόκριση στη θεραπεία. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν ότι μεγάλο ποσοστό των ασθενών με ανεπαρκή ανταπόκριση στη θεραπεία με IFN-β παρουσιάζει εξουδετερωτική δραστηριότητα, η οποία οφείλεται κατ εξοχήν στα Nabs, και επιπρόσθετα, η ΕΦΜΠ μειώνει σημαντικά τον τίτλο των Nabs όχι όμως και των Babs. Η δράση αυτή αυξάνεται στον 1 μήνα μετά την εφαρμογή της θεραπείας και παραμένει για περίπου 6 μήνες. Κατά τη διάρκεια της μελέτης προέκυψαν επιπλέον ερωτήματα και αναζητήσαμε απαντήσεις για την ευαισθησία των καθιερωμένων, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο 16

17 Οργανισμό Υγείας, μεθόδων εντοπισμού των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Ολοκληρώνοντας την προσπάθεια θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλλαν στην πραγματοποίηση αυτής της διατριβής. Αρχικά επιθυμώ να ευχαριστήσω το δάσκαλό μου και επιβλέποντα της διατριβής μου, ομότιμο καθηγητή νευρολογίας κ. Ιωάννη Μυλωνά για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε ήδη από τα πρώτα στάδια της πορείας μου στη νευρολογία. Υπήρξε ο εμπνευστής και συμπαραστάτης όλης της προσπάθειάς μου κατά τη διάρκεια της μελέτης μου, αλλά και κατά τη διάρκεια της ειδικότητάς μου στη νευρολογία. Tον καθηγητή νευρολογίας και διευθυντή της κλινικής κ. Νικόλαο Τάσκο, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη συμπαράσταση του, αλλά κυρίως για την ικανότητα που διαθέτει να απλοποιεί τις δυσκολίες και τα προβλήματα που προκύπτουν δίνοντας απεριόριστο κουράγιο για τη συνέχιση της κάθε προσπάθειας. Τον ευχαριστώ επίσης διότι ως δάσκαλος και καθοδηγητής μου στον χώρο της κλινικής νευρολογίας συνέβαλε στο να κατευθύνω τις ερευνητικές μου προσπάθειες έχοντας ως γνώμονα την κλινική πραγματικότητα και τα προβλήματα των ασθενών μας. Ακόμη ευχαριστώ ιδιαίτερα τον καθηγητή παθολογίας κ. Μιχαήλ Δανιηλίδη και μέλος της τριμελούς επιτροπής μου ευχαριστώ ιδιαίτερα καθώς η βοήθειά του ήταν καταλυτική, κυρίως στην τελική διαμόρφωση της διατριβής μετά από ιδιαίτερα εποικοδομητικές παρατηρήσεις και συμβουλές μετατρέποντας σε συναρπαστικό το χαώδες πεδίο της ανοσολογίας. Στο σημείο αυτό θεωρώ χρέος μου να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στον επίκουρο καθηγητή κ. Νικόλαο Γρηγοριάδη ο οποίος με δέχτηκε στην ερευνητική του ομάδα στο εργαστήριο πειραματικής νευρολογίας και νευροανοσολογίας της Β Νευρολογικής κλινικής. Καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής, μου έδειξε αμέριστη εμπιστοσύνη, ενώ η συνεχής καθοδήγηση, ενθάρρυνση και υπομονή του ήταν ανεκτίμητης αξίας για τη συνέχιση της μελέτης μου. Οι παρατηρήσεις, τα σχόλιά του και οι διορθώσεις του ήταν καίριας σημασίας και βοήθησαν στην ολοκληρωμένη και επιστημονικά εμπεριστατωμένη διεξαγωγή της παρούσας διατριβής. 17

18 Επιθυμώ επίσης να ευχαριστήσω θερμά όλα τα μέλη του εργαστηρίου πειραματικής νευρολογίας και νευροανοσολογίας της Β Νευρολογικής κλινικής για τη φιλοξενία, την προθυμία και τη συνεργασία τους. Η παρούσα διατριβή αποτελεί το αποτέλεσμα της συνεργασίας πολλών ανθρώπων στους οποίους είμαι ευγνώμων. Ιδιαίτερα, θέλω να ευχαριστήσω την κ. Ρόζα Λαγουδάκη, βιολόγο, με την οποία συνεργαστήκαμε στενά κατά την εφαρμογή των μεθόδων εντοπισμού των αντισωμάτων, και ήταν πάντα πρόθυμη να αντιμετωπίσουμε από κοινού προβλήματα που ορισμένες φορές ανέκυπταν κατά την ανάλυση των δειγμάτων. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην κ. Κυριακή-Νεφέλη Πουλατσίδου, μοριακή βιολόγο, για την καθοριστική βοήθεια και συνεργασία της στην εφαρμογή των μεθόδων εντοπισμού των αντισωμάτων. Επίσης, επιθυμώ να ευχαριστήσω την κ. Κωνσταντία Κώττα, βιολόγο, για την εργαστηριακή υποστήριξη καθώς και τον κ. Αθανάσιο Λουρμπόπουλο, ειδικευόμενο ιατρό νευρολογίας, για τη συμβολή του στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Την ιατρό κ. Έλενα Πολυζωίδου,, και την κ. Όλγα Τουλούμη, τεχνολόγο ιατρικών εργαστηρίων, μέλη του εργαστήριου, ευχαριστώ για την αμέριστη ηθική υποστήριξη και τις χρήσιμες συμβουλές που μου πρόσφεραν ήδη από το ξεκίνημα της εκπόνησης της διατριβής. Την Προϊσταμένη και το νοσηλευτικό προσωπικό της Β Νευρολογικής κλινικής του Α.Π.Θ. ευχαριστώ θερμά για τη βοήθεια που προσέφεραν στην οργάνωση νοσηλείας των ασθενών ώστε η συλλογή του υπό μελέτη υλικού να διεξάγεται χωρίς προβλήματα ή καθυστερήσεις. Τους συναδέλφους ιατρούς νευρολόγους από τα διάφορα κέντρα της πατρίδας μας ευχαριστώ για την αποστολή δειγμάτων των ασθενών τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ στους ασθενείς μας οι οποίοι παρά τα όποια προβλήματά τους πρόθυμα ανταποκρίνονται σε όποια ερευνητική προσπάθεια γίνεται στην πατρίδα μας για την αντιμετώπιση της νόσου τους. Ευχαριστώ επίσης, τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής για τα εποικοδομητικά σχόλια και παρατηρήσεις τους. Τέλος, θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω τον σύζυγό μου Αντώνη Σπυριδάκη, για την αγάπη του, την ενθάρρυνση και συμπαράσταση στις δύσκολες στιγμές, την υπομονή και την κατανόηση που επέδειξε σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής αυτής. Ολοκληρώνοντας, θέλω να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην 18

19 οικογένειά μου, τη μητέρα και την αδελφή μου για την αγάπη τους και τη συνεχή υποστήριξη και προσφορά τους. Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι η παρούσα εργασία χρηματοδοτήθηκε από λογαριασμό κονδυλίων έρευνας της Επιτροπής Ερευνών του Α.Π.Θ. 19

20 20

21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 21

22 22

23 1. Φυσική ιστορία Παθογένεια-Διάγνωση Σκλήρυνσης κατά πλάκας 1.1. Εισαγωγή Η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης απομυελινωτική νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος αυτοάνοσης αρχής, που προσβάλλει συνήθως νεαρά άτομα. Η νόσος χαρακτηρίζεται παθολογοανατομικά από διήθηση λεμφοκυττάρων και μακροφάγων, απομυελίνωση και αξονική βλάβη και κλινικά από νευρολογική συμπτωματολογία διασπαρμένη σε χρόνο και χώρο 5,25. Η πρώτη δημοσιευμένη αναφορά περιστατικού στην ιατρική βιβλιογραφία που περιγράφει ένα αδιαμφισβήτητο παράδειγμα ΣΚΠ με υποτροπιάζουσα-διαλείπουσα πορεία, έγινε στο Maladies de la moelle epinière από τον Charles Prosper Ollivier, στο Παρίσι το Τις επόμενες έξι δεκαετίες που ακολούθησαν, Γάλλοι και Γερμανοί ιατροί συνέθεσαν την κλινικοπαθολογική εικόνα της νόσου. Μέχρι τις αρχές του 20 ου αιώνα μια νόσος, η οποία μόλις λίγα χρόνια πριν διέθετε μεμονωμένες αναφορές περιστατικών, είχε γίνει η πιο συχνή αιτία νοσηλείας σε νευρολογική κλινική. Σήμερα η ΣΚΠ είναι παγκοσμίως αναγνωρίσιμη με δυόμισι εκατομμύρια ασθενείς και κόστος δισεκατομμυρίων ευρώ, που προκύπτει από την παροχή ιατρικών υπηρεσιών και την απώλεια εισοδήματος από την πλευρά των ασθενών. Καθώς η ΣΚΠ έγινε καλύτερα γνωστή στις αρχές του 20 ου αιώνα άρχισαν να σχηματίζονται κάποιες ιδέες για την αιτιολογία και την παθογένεση. Η έρευνα που έλαβε μέρος τα τελευταία πενήντα χρόνια φώτισε τους μηχανισμούς της βλάβης και η θεραπευτική εποχή ξεκίνησε. Ιδιαίτερη μνεία πρέπει να γίνει για τον Charcot, ο οποίος έπαιξε σημαντικό ρόλο στην καθιέρωση της νόσου ως κλινική και ιστοπαθολογική οντότητα 23. Όρισε τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου και αναγνώρισε άτυπες μορφές. Διερεύνησε το ιστορικό των ασθενών οδηγούμενος στην αποκάλυψη προηγούμενων επεισοδίων και γνώρισε την ύπαρξη των περιόδων ύφεσης της νόσου. Επίσης έφερε στο φως τις μυελικές μορφές της νόσου, ενώ ήταν ο πρώτος που περιέγραψε την παθολογοανατομική εικόνα (οι πλάκες της ΣΚΠ από τον Charcot). Για τον ασθενή, η ΣΚΠ είναι μια απειλή με μεγάλη ποικιλία συμπτωμάτων, υποτροπιάζουσα και απροσδιόριστη πορεία. Για τον νευρολόγο, η ΣΚΠ είναι μια διαταραχή των νέων κυρίως ατόμων της οποίας η διάγνωση βασίζεται σε κλινικές 23

24 και παρακλινικές ενδείξεις δύο τουλάχιστον βλαβών που προσβάλλουν διαφορετικά σημεία του εγκεφάλου ή του νωτιαίου μυελού σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Για τον παθολογοανατόμο, η ΣΚΠ είναι μια διαταραχή του κεντρικού νευρικού συστήματος η οποία εκδηλώνεται ως εστιακή φλεγμονώδης απομυελίνωση και απώλεια αξόνων με περιορισμένη επαναμυελίνωση, η οποία οδηγεί σε χρόνιες πολυεστιακές πλάκες από τις οποίες παίρνει η νόσος το όνομά της. Για τον νευροφυσιολόγο, είναι μια κατάσταση στην οποία οι διεργασίες της νόσου προκαλούν μια σειρά από διαταραχές στην αγωγή του ηλεκτρικού ερεθίσματος. Για τον κλινικό ιατρό, η ΣΚΠ είναι η χαρακτηριστική χρόνια φλεγμονώδης νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος για την οποία η γνώση που έχει προκύψει από μακροχρόνια έρευνα στο πεδίο των νευροεπιστημών πρόσφερε αρκετές θεραπευτικές επιλογές για την αντιμετώπιση της. Για όλες αυτές τις ομάδες η ΣΚΠ παραμένει μια δύσκολη νόσος αφού οι λύσεις εξακολουθούν να είναι προσιτές αλλά συγχρόνως ασύλληπτες Ηλικία κατά την έναρξη της νόσου Δεν είναι πάντα εύκολο να καθοριστεί η ηλικία κατά την οποία εμφανίζονται τα πρώτα συμπτώματα. Κάποια ενοχλήματα όπως η παραισθησία, συχνά παραβλέπονται. Παρόλα αυτά υπάρχει συμφωνία στο ότι η μεγαλύτερη κατανομή είναι γύρω από την ηλικία των τριάντα ετών. Στην πλειοψηφία των αντιπροσωπευτικών μελετών η κατανομή των ασθενών με ΣΚΠ με βάση την ηλικία έναρξης της νόσου είναι κανονική. Στο 10% των περιπτώσεων η έναρξη είναι κάτω των είκοσι ετών (<20 έτη), στις ηλικίες είκοσι με σαράντα (20-40 έτη) το ποσοστό ανέρχεται στο 70%, ενώ σε ηλικίες άνω των σαράντα ετών (>40 έτη) διαμορφώνεται στο 20%. Στις γυναίκες φαίνεται ότι η ηλικία έναρξης είναι λίγο μικρότερη από ότι στους άνδρες. Επίσης, η αναλογία γυναικών ανδρών τείνει να μειωθεί καθώς η ηλικία έναρξης αυξάνει, ενώ κάποιοι συγγραφείς δεν δέχονται ότι το φύλο επηρεάζει την ηλικία εμφάνισης της νόσου. (Σχήμα 1) 24

25 Σχήμα 1: Η κατανομή ασθενών με βάση την ηλικία έναρξης της νόσου, ανάμεσα σε 812 ασθενείς με ΣΚΠ, είναι κανονική με το υψηλότερο σημείο να εντοπίζεται στο εύρος ηλικιών έτη Αναλογία των φύλων στη ΣΚΠ Η επικράτηση του θηλυκού γένους είναι προφανής σε όλες τις αντιπροσωπευτικές μελέτες 1.Η συνήθης αναλογία γυναικών-ανδρών είναι δύο προς ένα (2Γ:A). Η υψηλότερη αναλογία που έχει σημειωθεί είναι 71% (2,5Γ:A) και έχει παρατηρηθεί στη Βόρεια Αμερική και τη Νέα Ζηλανδία ενώ η χαμηλότερη αναλογία είναι 51% (1,04Γ:Α) και σημειώθηκε στο Ισραήλ Σταθμοί στην πορεία της ΣΚΠ Είναι πλέον αναγνωρισμένο ότι η πορεία της ΣΚΠ μπορεί να περιγραφεί με τους όρους των υποτροπών, των υφέσεων και της προϊούσας εξέλιξης είτε από την αρχή είτε μετά από μια περίοδο εξάρσεων-υφέσεων. Δύο είναι οι σημαντικές παράμετροι που καθορίζουν την κλινική πορεία και πρόγνωση : η ποιοτική περιγραφή, η οποία είναι έκφραση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των υποτροπών και των υφέσεων, και η ποσοτική περιγραφή, η οποία αναφέρεται στη συσσώρευση των νευρολογικών 25

26 ελλειμμάτων και χαρακτηρίζεται από την αναπηρία, την έκπτωση ή απώλεια των κοινωνικών λειτουργιών Μεταβλητές που εξαρτώνται από την πορεία της νόσου-οι μορφές της ΣΚΠ Η συνήθης πορεία της ΣΚΠ χαρακτηρίζεται από επαναλαμβανόμενες υποτροπές ακολουθούμενες, στην πλειοψηφία των ασθενών, από την προϊούσα εξέλιξη της νόσου και της αναπηρίας. Δεν είναι απαραίτητο ότι όλοι οι ασθενείς θα μεταπέσουν στην προϊούσα μορφή αλλά, εάν συμβεί αυτό, τότε η πορεία είναι πλέον μονόδρομος αν και στην αρχή είναι δύσκολο να αναγνωριστεί, κυρίως στις περιπτώσεις εκείνες όπου η πρώιμη φάση της δευτεροπαθούς προϊούσας πορείας χαρακτηρίζεται από συνεχόμενες ώσεις. Έγινε από νωρίς γνωστό ότι η νόσος μπορεί να ακολουθήσει προοδευτικά επιδεινούμενη πορεία από την έναρξή της. Σήμερα, μετά από κοινή συναίνεση και κάτω από την αιγίδα της Διεθνούς Εταιρείας για τη Σκλήρυνση Κατά Πλάκας των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής, αναγνωρίζονται τέσσερις μορφές της νόσου: Υποτροπιάζουσα διαλείπουσα ΣΚΠ 1,144 (ΥΔΣΚΠ) : χαρακτηρίζεται από σαφώς καθορισμένες υποτροπές με πλήρη αποκατάσταση ή υπολειμματική συμπτωματολογία. οι περίοδοι ανάμεσα στις ώσεις χαρακτηρίζονται από έλλειψη δραστηριότητας της νόσου. Δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ 1,144 (ΔΠΣΚΠ):χαρακτηρίζεται από αρχική πορεία με εξάρσεις και υφέσεις, ακολουθούμενη από προϊούσα επιδείνωση με ή χωρίς υποτροπές, μερική ύφεση των ώσεων και περιόδους στασιμότητας (plateau). Πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ 1,144 (ΠΠΣΚΠ): σημειώνεται προοδευτική επιδείνωση από την έναρξη της νόσου με περιστασιακές περιόδους στασιμότητας και προσωρινή ήπια βελτίωση. Προϊούσα υποτροπιάζουσα ΣΚΠ 1,144 ( progressive relapsing)(πυσκπ): σημειώνεται προοδευτική επιδείνωση από την έναρξη της νόσου, με σαφείς οξείες υποτροπές με ή χωρίς πλήρη αποκατάσταση. οι περίοδοι ανάμεσα στις ώσεις χαρακτηρίζονται από συνεχή επιδείνωση. (Σχήμα 2) 26

27 Σχήμα 2: Κατάταξη των μορφών της σκλήρυνσης κατά πλάκας. Αναγνωρίζονται 4 κύριες μορφές της νόσου, η υποτροπιάζουσα-διαλείπουσα ΣΚΠ, η δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ, η πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ και η προϊούσα-υποτροπιάζουσα ΣΚΠ 1. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε αυτή την κατάταξη η παρουσία υποτροπών επιτρέπεται στις περιπτώσεις της δευτεροπαθώς προϊούσας μορφής, αντίθετα, η πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή χωρίς υποτροπές (ΠΠΣΚΠ) διαχωρίζεται από τη μορφή με ώσεις (ΠΥΣΚΠ). Επιπλέον, ο όρος «υποτροπιάζουσα προϊούσα ΣΚΠ» έχει εγκαταλειφθεί λόγω της διαφωνίας των νευρολόγων που συμμετείχαν επάνω στον ορισμό αυτής και του γεγονότος ότι οι προτεινόμενοι ορισμοί συνεπίπταν με τους ήδη υπάρχοντες 1,144. Κάποιοι συγγραφείς πρόσθεσαν τον όρο «μεταβατική προϊούσα ΣΚΠ» σε αυτή την κατάταξη θέλοντας να συμπεριλάβουν κάποιους ασθενείς με προϊούσα πορεία και την παρουσία ενός μοναδικού επεισοδίου κάποια χρονική στιγμή της νόσου. Μια άλλη ομάδα συγγραφέων χρησιμοποίησαν τον όρο μόνο σε περιπτώσεις με προϊούσα πορεία χωρίς υποτροπές, η οποία ξεκίνησε πολλά χρόνια μετά από ένα μεμονωμένο επεισόδιο, ενώ κάποιοι άλλοι επιτρέπουν 27

28 μία ώση πριν ή μετά την έναρξη της προοδευτικής εξέλιξης της νόσου. Επειδή δεν επιτεύχθη συμφωνία μεταξύ των συγγραφέων, η Διεθνής Εταιρεία για τη Σκλήρυνση κατά Πλάκας υποστηρίζει την άποψη ότι κάποιες λίγες περιπτώσεις μεταβατικής ΣΚΠ μπορούν να συμπεριληφθούν στις άλλες κατηγορίες της κατάταξης με δευτεροπαθώς ή πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή ανάλογα με τη χρονική τοποθέτηση του επεισοδίου. Όσον αφορά στην κλινική βαρύτητα της νόσου, επικυρώθηκαν δύο ορισμοί οι οποίοι εξυπηρετούν περισσότερο σκοπούς ερευνητικούς σε κλινικές μελέτες κι όχι στην καθημερινή πράξη κι επικοινωνία με τους ασθενείς 144,163 : Καλοήθης ΣΚΠ: ο ασθενής παραμένει πλήρως ενεργός σε όλα τα λειτουργικά συστήματα 15 χρόνια μετά την έναρξη της νόσου (κλίμακα αναπηρίας EDSS 3). Ο ορισμός αυτός επικεντρώνεται στην ομαλή κινητικότητα του ασθενούς υποβαθμίζοντας την πιθανή έκπτωση των γνωστικών λειτουργιών, που σαφώς επηρεάζουν την καθημερινότητα και τη λειτουργικότητα των ασθενών 163. Κακοήθης ΣΚΠ: η νόσος ακολουθεί ταχεία προοδευτική πορεία οδηγώντας σε σημαντική αναπηρία σε πολλαπλά νευρολογικά συστήματα ή τον θάνατο σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα μετά την έναρξη της νόσου. Η φυσική πορεία της νόσου μας έδειξε ότι με την πάροδο του χρόνου, η πλειοψηφία των ασθενών θα εμφανίσει προοδευτική νευρολογική επιδείνωση. Περίπου το 50% των ασθενών με ΣΚΠ θα χρησιμοποιήσει βακτηρία για το βάδισμα 10 χρόνια μετά, ενώ το 90% περίπου των ασθενών θα μεταπέσει στην προϊούσα μορφή 25 χρόνια μετά τη διάγνωση της νόσου Προγνωστικοί δείκτες της ΣΚΠ Η δεύτερη παράμετρος στη φυσική πορεία της νόσου είναι η εμφάνιση της αναπηρίας. αυτή είναι ποσοτική και μπορεί να χαρακτηριστεί ως παροδική, μερικώς αναστρέψιμη ή οριστικά μη αναστρέψιμη. Ένας τρόπος για να περιγραφεί η φυσική πορεία της ΣΚΠ είναι η παρακολούθηση και καταγραφή της εξέλιξης της αναπηρίας σε βάθος χρόνου. Υπάρχουν πολλές κλίμακες αξιολόγησης του ρυθμού εξέλιξης αλλά όλες στηρίζονται σε δύο κλίμακες πολύ στενά συνδεδεμένες: την DSS (Disability Status Scale Kurtzke 1961) και την πιο λεπτομερή μορφή αυτής, την EDSS (Expanded Disability Status Scale Kurtzke 1983). Μέχρι τα μέσα του εικοστού 28

29 αιώνα τα εργαλεία που χρησιμοποιούσαν για την αξιολόγηση της ανικανότητας στη ΣΚΠ στηρίζονταν είτε στην ικανότητα για εργασία, είτε την κινητικότητα. Όμως το πρώτο κριτήριο είναι υποκειμενικό γιατί βασίζεται στο σθένος, στις οικονομικές ανάγκες και στη φύση της εργασίας κάθε ασθενούς. Έτσι ο βαθμός κινητικότητας σύντομα αποδείχτηκε καλύτερο εργαλείο παρά το γεγονός ότι και σε αυτήν την περίπτωση δυνητικά ισχύουν ορισμένοι περιορισμοί. Οι ταξινομήσεις που βασίζονται στην κινητικότητα δεν λαμβάνουν υπ όψιν τη λειτουργικότητα των άνω άκρων, τις αισθητικές διαταραχές, τις διαταραχές της ορθοκυστικής λειτουργίας, τις παρέσεις κρανιακών νεύρων, την έκπτωση ανώτερων φλοιικών λειτουργιών, τις διαταραχές του συναισθήματος και την κόπωση. Επιπρόσθετα, η διαδικασία του φυσιολογικού γήρατος μπορεί να αλλοιώσει τα αποτελέσματα αυτών των ταξινομήσεων διότι σε ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας συμπτώματα από συνυπάρχοντα μυοσκελετικά, καρδιαγγειακά ή αναπνευστικά νοσήματα, μπορεί να αλλάξουν την κλινική εικόνα. Αντιθέτως, οι κλίμακες DSS και EDSS αντικατοπτρίζουν τη συνολική αναπηρία του ασθενούς, δίνοντας μεγαλύτερη βαρύτητα στη διαταραχή της βάδισης και αυτό τις καθιστά παγκόσμιας αποδοχής και χρήσης των κλιμάκων αυτών από τους νευρολόγους με εξειδίκευση στη ΣΚΠ. Βεβαίως έχουν σχεδιαστεί και εφαρμοστεί κι άλλες κλίμακες αξιολόγησης αλλά καμία δεν πληροί τις προϋποθέσεις της παγκόσμιας κοινότητας ΣΚΠ. Εκ των δύο, αυτή που χρησιμοποιείται ευρέως είναι η EDSS, η οποία εφαρμόζεται στις περισσότερες κλινικές μελέτες. Πρέπει βέβαια να αναφερθεί ότι οι δύο κλίμακες δεν είναι άμοιρες παραλείψεων και αδυναμιών, λόγος για τον οποίο κατά καιρούς έχουν δεχτεί κριτική. Σημαντικοί περιορισμοί αφορούν στη συμφωνία ανάμεσα στους εκτιμητές ιατρούς, στην υποκειμενικότητα και στην ασύμμετρη βαρύτητα που δίνεται στη βαδιστική ικανότητα. Επιπλέον η EDSS είναι χρονοβόρα και πολύπλοκη για τους ιατρούς που δεν εξειδικεύονται στη ΣΚΠ και πολύ περισσότερο όταν χρησιμοποιείται για επιδημιολογικούς σκοπούς που απαιτούν παρακολούθηση πολλών ετών σε ένα μεγάλο αριθμό ασθενών. Πρέπει να γίνει κατανοητό ότι η EDSS δεν είναι μια αξιολόγηση ποσοτική ή συνεχής. H υπόθεση ότι η αναπηρία συνεχίζει να εξελίσσεται με παρόμοιο ρυθμό κατά τη διάρκεια της νόσου έρχεται σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις που έγιναν σε διάφορα δείγματα: η κατανομή των ασθενών σύμφωνα με την ΕDSS είναι δικόρυφη 29

30 με δύο διακριτές κορυφές στην ΕDSS 1-2 και ΕDSS 6-7. Η διάρκεια του χρονικού διαστήματος που οι ασθενείς βρίσκονται σε κάθε στάδιο της κλίμακας είναι επίσης άνισο με κορυφή στα βήματα 1-2 και 6-7. Είναι επόμενο ότι η εξέλιξη από ένα επίπεδο σε άλλο δεν είναι δυνατό να προβλεφθεί ή να θεωρηθεί ισοδύναμο. Αυτό σημαίνει ότι μία αλλαγή στη μέση τιμή της ΕDSS δεν αποτελεί επαρκές στοιχείο για να περιγραφεί η αλλαγή ή για να συγκριθούν ομάδες. Διαφορές στο ποσοστό των ασθενών που αλλάζουν κατά ένα δεδομένο βαθμό αναπηρίας και το χρονικό διάστημα κατά το οποίο γίνεται αυτή η αλλαγή, είναι η πιο αποδεκτή από άποψη μεθοδικότητας Φλεγμονή-Παθογένεια Στη ΣΚΠ τα λεμφοκύτταρα Τh1 ενεργοποιούνται έναντι άγνωστου αντιγόνου στα περιφερικά λεμφογενή όργανα, μεταναστεύουν μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ) στο ΚΝΣ και εκεί, δρώντας συνεργικά με τα μονοκύτταρα/μακροφάγα τα οποία ελκύουν μέσα στο ΚΝΣ και τη μικρογλοία, την οποία και ενεργοποιούν επί τόπο, επιτίθενται στη μυελίνη και τα ολιγοδενδροκύτταρα, δημιουργώντας τις απομυελινωτικές πλάκες. Η απομυελίνωση εμποδίζει την αγωγή του ερεθίσματος κατά μήκος του νευράξονα οδηγώντας στα κλινικά συμπτώματα και σημεία της νόσου. Στα αρχικά στάδια η απομυελίνωση ακολουθείται από σημαντική αποκατάσταση της λειτουργικότητας, αλλά προοδευτικά η διαδικασία αποκατάστασης αποτυγχάνει και παρουσιάζονται μόνιμες βλάβες. Κατά την εξέλιξη της νόσου εμφανίζεται μη αναστρέψιμη βλάβη του νευράξονα, η οποία επικάθεται στην απομυελινωτική κατάσταση και φαίνεται ότι ευθύνεται για τη μόνιμη αναπηρία 147. Οι βλάβες στην οξεία κλινική επιδείνωση της νόσου παρουσιάζουν εστίες φλεγμονής και συνδυάζονται με ενεργή καταστροφή της μυελίνης και φαγοκυττάρωση 62. Θέμα προς συζήτηση είναι το εάν η φλεγμονώδης διεργασία στο ΚΝΣ ξεκινάει από διαταραχή του ανοσοποιητικού συστήματος ή αποτελεί απάντηση σε γεγονότα που πρωτογενώς επιδρούν στα νευρικά κύτταρα. 30

31 Υπόθεση ανοσολογικής αρχής της νόσου Η υπόθεση αυτή υποστηρίζει ότι τα αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα παράγονται στην περιφέρεια εισέρχονται στο ΚΝΣ οπού και εγκαθίστανται και διεγείρουν τον καταρράκτη της φλεγμονώδους διαδικασίας που καταλήγει σε τραυματισμό υγειών νευρικών ιστών CD4 Η εμφανής αύξηση της συχνότητας των δραστικών CD4 + Τ λεμφοκυττάρων έναντι της μυελίνης στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΚΠ, συγκριτικά με τους υγιείς, φαίνεται να προέρχεται από τα Τ λεμφοκύτταρα μνήμης. Αυτό προϋποθέτει προηγούμενη ευαισθητοποίηση με αντιγόνα σχετικά της νόσου. Τα ενεργοποιημένα κύτταρα έναντι της μυελίνης ανήκουν φυσιολογικά στη δεξαμενή των Τ- λεμφοκυττάρων, αλλά στη ΣΚΠ η συχνότητα τους είναι αυξημένη 148. Μελέτες συγγένειας ανέδειξαν νέες πεπτιδικές περιοχές υπεύθυνες για την πρόκληση αντιγονικότητας από αυτές που θεωρούνταν ως επικρατούσες 63. Για παράδειγμα ο επίτοπος MBP 83-99, ο οποίος σε πολλές μελέτες αναγνωριζόταν ως κυρίαρχος, είχε δευτερεύουσα σημασία. Αντίθετα άλλοι επίτοποι είχαν κυρίαρχο ρόλο στην πρόκληση αντιγονικότητας, όπως η βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (myelin basic protein-mbp) MBP 13-32, MBP και MBP , η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη (proteolipid protein-plp) PLP και η ολιγοδενδροκυτταρική γλυκοπρωτεΐνη της μυελίνης (myelin oligodendrocyte glycoprotein-mog) MOG 1-20, MOG Η αντιδραστικότητα στη μυελίνη, σε πολλές περιπτώσεις, αντικατοπτρίζει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε εξωγενή πεπτίδια, γεγονός που στηρίζει την υπόθεση ότι η αρχική ανοσολογική ευαισθητοποίηση προκαλείται από εξωγενείς παράγοντες, φαινόμενο γνωστό και ως μοριακή μίμηση (molecular mimicry). Μελέτες με αντικείμενο τον εκφυλισμό του TCR υποδοχέα υποδηλώνουν ότι μία υποομάδα Τ-λεμφοκυττάρων επιδεικνύουν υψηλού βαθμού εκφυλισμό του TCR υποδοχέα, προσδίδοντας σε κάθε TCR υποδοχέα την ικανότητα να ανταποκρίνεται σε έως και ένα εκατομμύριο συνδέτες προκειμένου να είναι ανοσολογικά επαρκής 148. Ο εκφυλισμός του TCR υποδοχέα εγείρει τη δυνατότητα διασταυρούμενης αντίδρασης μεταξύ ιογενών/βακτηριδιακών αντιγόνων και αυτοαντιγόνων και κατ επέκταση την επαγωγή της παθολογικής αυτοάνοσης 31

32 αντίδρασης. Η μοριακή μίμηση καταλήγει σε αυτοάνοση νόσο όταν συμβαίνει σε περιβάλλον εστιακής φλεγμονής, παρουσίαση απελευθερούμενων αυτοαντιγόνων και επαρκούς αριθμού αυτοδραστικών Τ-λεμφοκυττάρων CD8 Τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα είναι ο προεξάρχων τύπος Τ λεμφοκυττάρων στις βλάβες της ΣΚΠ. Είναι γνωστό ότι Τ κύτταρα στις εστίες της ΣΚΠ εκφράζουν περιορισμένη δεξαμενή υποδοχέων Τ κυττάρου (TCR) 62,64. Η έκφραση των μορίων MHC I στα νευρικά κύτταρα σε φλεγμονώδεις καταστάσεις και καταστάσεις στρες εμπλέκει τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα στη διαδικασία τραυματισμού. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία ανευρίσκονται στις εστίες της ΣΚΠ, δύνανται να αποκτήσουν κυτταροτοξική ικανότητα μη εξαρτώμενη από το MHC έναντι των νευρώνων, των αξόνων και των ολιγοδενδροκυττάρων 62, Αντισώματα Τα αντισώματα έναντι της μυελίνης συνεισφέρουν στην έκταση της απομυελίνωσης στο πειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ, αλλά μέχρι σήμερα δεν έχει αποδειχθεί η συμμετοχή τους στην έναρξη της απομυελινωτικής διαδικασίας. Τα ειδικά αντισώματα έναντι της μυελίνης ανευρίσκονται στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) των ασθενών, αλλά δεν υπάρχει ομοφωνία για την πραγματική συχνότητα ή συνεισφορά τους στην πορεία και τον φαινότυπο της νόσου 62,66. Φαινοτυπικές και μοριακές μελέτες Β λεμφοκυττάρων που αποκομίστηκαν από το ΕΝΥ πρώιμα στην πορεία της νόσου, αποκάλυψαν ότι αυτά τα κύτταρα υπόκεινται σε κλωνική έκπτυξη και είναι δραστικά έναντι του αντιγόνου, αν και το ακριβές αντιγόνο δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα 62,66,67. Η κλωνική έκπτυξη των Β κυττάρων στο ΕΝΥ προηγείται της εμφάνισης των ολιγοκλωνικών ζωνών και των εστιών που υποδεικνύουν διασπορά στη μαγνητική τομογραφία σε ασθενείς που παρουσίασαν ένα κλινικά μεμονωμένο επεισόδιο Συνδιεγερτικές οδοί Η ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων απαιτεί τη δέσμευση του TCR υποδοχέα, η οποία και προσδίδει την ειδικότητα για το αντιγόνο, και παράλληλα απαιτεί ένα δεύτερο συνδιεγερτικό σήμα το οποίο μεταβάλλει την ουδό ενεργοποίησης και το 32

33 λειτουργικό αποτέλεσμα της ειδικής για το αντιγόνο ενεργοποίησης. Τα CD28, CTLA- 4/CD80 και CD86 είναι η πιο σημαντική και περισσότερο μελετημένη συνδιεγερτική οδός. Η συνδιέγερση του CD28 προκαλεί την επαγωγή πολλών κυτταροκινών. Μετά την ενεργοποίηση τα CD4 κύτταρα καταστέλλουν τα CD28 και εκφράζουν CTLA-4, ένα δομικό ανάλογο του CD28. Το CTLA-4 δίνει αρνητικό σήμα για την ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων και με αυτόν τον τρόπο τελειώνει η διαδικασία πολλαπλασιασμού. Δυσλειτουργία των συνδιεγερτικών οδών σε πειραματικά μοντέλα μπορεί να ελαττώσει τον ουδό ενεργοποίησης και να οδηγήσει σε αυτοάνοση απάντηση. Σχετικά πρόσφατα βρέθηκε σε ασθενείς με ΣΚΠ μια υποομάδα CD4 κυττάρων χωρίς την επιφανειακή έκφραση CD28. Τα CD4+/CD28- κύτταρα ενεργοποιούνται πλήρως, παράγουν προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες και επιδεικνύουν παρατεταμένο πολλαπλασιασμό και αυξημένη επιβίωση Υπόθεση νευρογενούς αρχής της νόσου Αυτή η υπόθεση υποστηρίζει ότι γεγονότα μέσα στο ΚΝΣ ευθύνονται για την έναρξη της φλεγμονώδους διεργασίας. Η επικρατούσα άποψη είναι ότι μια επίκτητη οξεία ή χρόνια λοίμωξη των νευρικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στην απελευθέρωση ιστικών αντιγόνων, τα οποία στη συνέχεια πυροδοτούν την αυτοάνοση αντίδραση. Προτεινόμενοι μηχανισμοί αποτελούν η άμεση κυτταροτοξική επίδραση της λοίμωξης στα νευρικά κύτταρα, η οποία είναι λιγότερο πιθανή, η μοριακή μίμηση, ή διαταραγμένοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί του ανοσολογικού συστήματος. Η έκφραση ιών στο ΚΝΣ μπορεί να εξηγεί τη γένεση της φλεγμονής, ένα ζήτημα που ηγέρθηκε μετά την ανακάλυψη του ανθρώπινου ιού του έρπητα-6 (human herpes virus-6, HHV-6) και του ανθρώπινου ενδογενούς ρετροιού (human endogenous retrovirus-hervs) σε βλάβες της ΣΚΠ 62,68,69. Η έκφραση του mrna και της πρωτεΐνης συνσιτίνης (syncytin), που κωδικοποιείται από το γονίδιο HERV-W env, είναι αυξημένη στον εγκέφαλο ασθενών με ΣΚΠ και σε συγκεκριμένα κύτταρα που εμπλέκονται στη φλεγμονή του ΚΝΣ. Σε in vitro εργασίες έχει βρεθεί ότι η συνσιτίνη επάγει την παραγωγή προφλεγμονωδών μορίων, όπως η inos, IL-1β και αντιδρώντων οξειδοαναγωγής, τα οποία σε υψηλά επίπεδα είναι βλαπτικά για τον εγκέφαλο. Η γλυκοπρωτεΐνη συνσιτίνη επάγεται στα γλοιακά 33

34 κύτταρα που βρίσκονται στις οξείες απομυελινωτικές πλάκες σε ασθενείς με ΣΚΠ 69. Αυξημένη έκφραση του HERV-W env στα αστροκύτταρα μπορεί να οδηγήσει στην απελευθέρωση κυτταροτοξικών διαμεσολαβητών για τα ολιγοδενδροκύτταρα 69. Οι Barnett και Prineas 70 παρατήρησαν ότι σε πρώιμο στάδιο της εξέλιξης των απομυελινωτικών πλακών, οι νέες εστίες μπορεί να μην είναι εμφανείς στις τομές μονιμοποιημένου εγκεφαλικού ιστού, γεγονός που μπορεί να οφείλεται στην παρουσία ακόμα μεγάλης ποσότητας ανεπηρέαστων περιβλημάτων μυελίνης μέσα στην πλάκα. Μέσα σε ώρες, στο πλαίσιο του βλαμμένου ιστού παρουσιάζονται αποπτωτικά ολιγοδενδροκύτταρα, περιβλήματα μυελίνης που προσλαμβάνουν χρώση για ενεργοποιημένο συμπλήρωμα και μικρογλοιακά κύτταρα με διακλαδώσεις σε αυξανόμενο αριθμό. Τ λεμφοκύτταρα, πρώιμα ενεργοποιημένα μακροφάγα και φαγοκύτταρα μυελίνης είναι σπάνια ή απουσιάζουν στην αποπτωτική ζώνη αλλά κάνουν την παρουσία τους σε άλλες περιοχές της βλάβης. Οι αλλαγές στα ολιγοδενδροκύτταρα μπορεί να αποτελούν το αρχικό γεγονός στον σχηματισμό της απομυελινωτικής πλάκας, το οποίο εξυπηρετεί αρχικά στη στρατολόγηση της έμφυτης (μικρογλοία) και στη συνέχεια της επίκτητης ανοσολογικής απάντησης. Δεν έχει διευκρινιστεί ο μηχανισμός της αποπτωτικής διαδικασίας των ολιγοδενδροκυττάρων αλλά πιθανόν να αντικατοπτρίζει πρωτογενή κυτταρική βλάβη, που εναρμονίζεται με τη θεωρία περί λοίμωξης του ΚΝΣ ή άλλων επιθέσεων όπως η ισχαιμία ή το τραύμα. Στη συνέχεια, ο Trapp αναρωτήθηκε εάν η φλεγμονώδης απομυελινωτική διεργασία αποτελεί κεντρικό γεγονός στην παθογένεση της ΣΚΠ ή είναι μέρος ενός καταρράκτη αντιδράσεων της ειδικής ανοσολογικής απάντησης που εξελίχθηκε σε κριτικό παράγοντα της ιστικής αποκατάστασης Θεωρία για την υποτροπιάζουσα πορεία της νόσου και την εξέλιξη της αναπηρίας Η υποτροπιάζουσα ή προϊούσα πορεία της νόσου πιθανόν αντικατοπτρίζει γεγονότα που συμβαίνουν στο συστηματικό ανοσολογικό σύστημα, τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) και το ΚΝΣ 62. Ο πολυμορφισμός σε ένα ευρύ φάσμα γονιδίων (MHC II, NOS2A, CCR5δ, CTL-A4, APOE-ε4), ο οποίος μπορεί να 34

35 επιδράσει σε αυτές τις παραμέτρους και να επηρεάσει την ανάπτυξη και την πορεία της νόσου δεν έχει ταυτοποιηθεί πλήρως Γεγονότα που σχετίζονται με το συστηματικό ανοσολογικό σύστημα Μελέτες σε Τ κύτταρα του περιφερικού αίματος δείχνουν ότι αυξάνεται η δεξαμενή των αντιγόνων που αναγνωρίζονται με το πέρασμα του χρόνου (epitope και determinant spreading). Τα νευροαντιγόνα μπορεί να μεταφερθούν από το ΚΝΣ στα αυχενικά λεμφοζίδια μέσω των λεμφαγγείων που δημιουργούνται στην περιοχή των οσφρητικών βολβών, τα οποία στη συνέχεια φέρονται στις περιφερικές λεμφικές δομές διαμέσου του τετριμμένου πετάλου του ηθμοειδούς οστού. Τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα πιθανόν να έχουν ελαττωμένη ανάγκη συνδιεγερτικών σημάτων για να απαντήσουν στην παρουσίαση του αντιγόνου. Κυκλοφορόντα Β κύτταρα στη ΣΚΠ περιέχουν αυξημένο ποσοστό μνημονικών κυττάρων τα οποία εξυπηρετούν αντιγονοπαρουσιαστικές λειτουργίες και ευνοούν την αντίδραση των Τ κυττάρων προς συγκεκριμένο προφίλ κυτταροκινών 72. Ένα έμφυτο ή επίκτητο λειτουργικό έλλειμμα των ρυθμιστικών κυττάρων, των CD25CD4 73 και NKCD95 κυττάρων, θα μπορούσε επιπλέον να συντελέσει στην υποτροπιάζουσα πορεία της νόσου Γεγονότα που σχετίζονται με τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό Οι ιδιότητες του ΑΕΦ, οι οποίες ενεργά ρυθμίζουν την είσοδο των λευκοκυττάρων στο ΚΝΣ (προσκόλληση, χημειοταξία), τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους διαδικασίας 62. Η μετανάστευση των λευκοκυττάρων διαμέσου του ΑΕΦ επιτυγχάνεται τόσο στα σημεία επαφής των ενδοθηλιακών κυττάρωνόσο και διαμέσου αυτών. Η επαφή των λευκοκυττάρων με το ενδοθήλιο του ΑΕΦ προκαλεί άμεση αντίδραση αυτών με αναδιοργάνωση των κυτταρικών μεμβρανών τους, δημιουργώντας κυπελλοειδείς περιοχές πλούσιες σε μόριο διακυτταρικής προσκόλλησης 1 (intercellular adhesion molecule 1-ICAM-1) και αγγειακό μόριο προσκόλλησης 1 (vascular adhesion molecule-vcam-1), προεκβολές που περιβάλλουν τα λευκοκύτταρα που μεταναστεύουν και επιτρέπουν την είσοδο τους διαμέσου του ενδοθηλίου, χωρίς την καταστροφή του ΑΕΦ. Το μόριο ICAM-1 σηματοδοτεί, μέσω της οδού Rho, τη ρύθμιση της κυτταροπλασματικής ακτίνης των 35

36 ενδοθηλιακών κυττάρων και πιθανώς τον σχηματισμό των μικροπροεκβολών οι οποίες βοηθούν το πέρασμα των λευκοκυττάρων διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι προφυλακτικές θεραπείες οξική γλατιραμέρη, ιντερφερόνη-β και το μονοκλωνικό αντίσωμα natalizumab επιδρούν στη μετανάστευση των λευκοκυττάρων διά του ΑΕΦ Γεγονότα που σχετίζονται με το κεντρικό νευρικό σύστημα Μέσα στο ΚΝΣ το μικρογλοιακά κύτταρα δρουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και αυτή είναι μια λειτουργία που εξαρτάται από την κατάσταση ενεργοποίησής τους. Η ενεργοποίηση των μικρογλοιακών/μακροφάγων κυττάρων, τα σημαντικότερα φαγοκύτταρα του ΚΝΣ, τα καθιστά ικανά να απομακρύνουν τον κατεστραμμένο ιστό, προϋπόθεση για την άριστη ιστική αποκατάσταση. Η ενεργοποίηση επάγεται ή καταστέλλεται από σήματα «κινδύνου» (φλεγμονώδης/ανοσολογικής αιτιολογίας) ή «εισβολέα» (ιστική βλάβη) τα οποία προέρχονται από το περιβάλλον τους. Η αποδόμηση αποπτωτικών Τ κυττάρων καταστέλλει την δραστηριότητά τους, αντιπροσωπεύοντας δυνητικά ένα μέσο τερματισμού της φλεγμονώδους διαδικασίας. Η ενεργοποίηση των μικρογλοιακών/μακροφάγων κυττάρων από τα Τ λεμφοκύτταρα μέσω αλληλεπιδράσεων ειδικών μορίων της κυτταρικής επιφανείας (CD40:CD154) και προφλεγμονωδών κυτταροκινών οδηγεί στην επαγωγή μορίων που υπεισέρχονται στη χημειοταξία και την παρουσίαση του αντιγόνου. Η αποδόμηση των υπολειμμάτων μυελίνης ενεργοποιεί τη μικρογλοία. Νευρώνες που έχουν υποστεί βλάβη ή στρες απελευθερώνουν μία ομάδα κυκλικών νουκλεοτιδίων τα οποία αλληλεπιδρούν με πουρινεργικούς υποδοχείς πάνω στα μικρογλοιακά κύτταρα, οδηγώντας στην απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Χαρακτηριστικό στοιχείο της ΣΚΠ αποτελεί η παραμονή της παραγωγής ανοσοσφαιρινών μέσα στο ΚΝΣ, μη ειδικών για τα νευρικά κύτταρα. Η παρουσία έκτοπων λεμφογενών δομών με ενεργά βλαστικά κέντρα, οι οποίες αναγνωρίζονται ευρέως στις μήνιγγες ασθενών με δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ, αποτελεί μια δυνητική πηγή συνεχούς παραγωγής Β κυτταρικών απαντήσεων, οι οποίες δεν είναι απαραίτητο να είναι ειδικές για συγκεκριμένο αντιγόνο 74,75,76. Ο σχηματισμός των έκτοπων θυλάκων στις μήνιγγες του εγκεφάλου παρατηρήθηκε κυρίως σε ασθενείς 36

37 με δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ κι όχι στην υποτροπιάζουσα ή την πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ. Το γεγονός αυτό πιθανώς υποδηλώνει ότι επαναλαμβανόμενες ανοσολογικές αντιδράσεις είναι απαραίτητες για τον σχηματισμό των θυλάκων. Η παρουσία αυτών έχει συσχετιστεί με μικρότερη ηλικία εμφάνισης της νόσου, μη αναστρέψιμη αναπηρία, επιθετικότερη πορεία της νόσου και σοβαρότερη φλοιική βλάβη. Δεν έχει αποσαφηνιστεί εάν η δημιουργία των έκτοπων θυλάκων αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα ή τη συνέπεια μιας πιο επιθετικής μορφής της νόσου. Η παρουσία τους έχει συνδυαστεί με εκτενέστερη υποχοριοειδή απομυελίνωση, αυξημένο αριθμό ενεργών φλοιικών εστιών και εντονότερη ενεργοποίηση της μικρογλοίας και νευρωνική καταστροφή στην περιοχή της υποχοριοειδούς απομυελίνωσης και την παρακείμενη φαινομενικά φυσιολογική φαιά ουσία. Οι φλοιικές βλάβες είναι πιο συνήθεις στη ΔΠΣΚΠ, συγκριτικά με την υποτροπιάζουσα και την ΠΠΣΚΠ 76. Οι βλάβες που εμφανίζονται στο όψιμο στάδιο της προοδευτικής πορείας της νόσου φαίνεται ότι οφείλονται σε δραστηριότητα των μικρογλοιακών/μακροφάγων κυττάρων κι όχι σε λεμφοκυτταρικές διηθήσεις 62. Η συσσώρευση της ιστικής καταστροφής μπορεί να αντικατοπτρίζει την επίδραση των επαναλαμβανόμενων επιθέσεων, κατά τις οποίες τα κύτταρα που τραυματίστηκαν αρχικά καθίστανται πιο επιρρεπή σε δραστικά μόρια (multiple hit hypothesis) 62. Η χρόνια απομυελίνωση per se έχει αρνητική επίδραση στην επιβίωση των αξόνων, ως αποτέλεσμα της αναδιοργάνωσης των διαύλων νατρίου 62,77. Οι δίαυλοι νατρίου Na v 1,6 επάγονται και εκφράζονται κατά μήκος των απομυελινωμένων νευραξόνων οπού προκαλούν ένα συνεχές ρεύμα νατρίου. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε αναστροφή της αντλίας νατρίου/ασβεστίου με συνέπεια τη συσσώρευση ασβεστίου μέσα στον άξονα και την πυροδότηση μιας αλυσίδας γεγονότων που καταλήγουν στην εκφύλιση των νευραξόνων 77,84,85. Στις οξείες βλάβες παρατηρείται η συνύπαρξη των διαύλων νατρίου Na v 1,6 με την αντλία ανταλλαγής Na + /Ca 2+ και την πρωτεΐνη β-amyloid precursor, καθώς επίσης και διάχυτη διανομή των διαύλων Na v 1,6 και Na v 1,2 κατά μήκος των απομυελινωμένων αξόνων 77,84. Αντίθετα, στις χρόνιες βλάβες δεν ανιχνεύτηκαν δίαυλοι Na v 1,2 κατά μήκος των απομυελινωμένων αξόνων, αλλά εκφράζονταν ουλή και ενεργοποιημένα αστροκύτταρα μέσα στην πλάκα 85. Οι δίαυλοι Na v 1,6 ανιχνεύτηκαν στους απομυελινωμένους άξονες μέσα στις βλάβες, 37

38 αλλά σε ομαδική διάταξη κι όχι διάχυτα 85,88. Η αντλία ανταλλαγής Na + /Ca 2+ δεν ανιχνεύτηκε στους απομυελινωμένους άξονες μέσα στις πλάκες, αν και ήταν παρόντες στα αστροκύτταρα της ουλής που περιέβαλαν τους απομυελινωμένους άξονες 85. Επίσης η β-πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (β-amyloid precursor protein) βρέθηκε σε ένα μικρό ποσοστό των αξόνων μέσα στις χρόνιες βλάβες, αλλά δεν παρατηρήθηκε εκλεκτική συνύπαρξη με τους διαύλους Na v 1,6 85. Όλα αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ισχύουν διαφορετικοί μηχανισμοί στην αξονική εκφύλιση στις οξείες και τις χρόνιες βλάβες, με την αξονική εκφύλιση να συμβαίνει στις περιοχές ταυτόχρονης έκφρασης των διαύλων Na v 1,6 και της αντλίας ανταλλαγής Na + /Ca 2+ στις οξείες βλάβες, αλλά ανεξάρτητα από τη συνύπαρξή τους στις χρόνιες εστίες 85. Επιπρόσθετα, η Na + /Κ + ATPase, η οποία εντοπίζεται σε μεγάλη έκταση του άξονα μεταξύ των περισφίξεων Ranvier σε φυσιολογικούς άξονες, ανιχνεύεται σε σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης στις οξείες βλάβες της ΣΚΠ, γεγονός που δεν ισχύει στις χρόνιες εστίες, οπού αντιθέτως είναι σαφώς ελαττωμένα ή και απόντα σε ορισμένες περιπτώσεις 88. Υπάρχουν στοιχεία που υποστηρίζουν διαταραγμένη χωρική κατανομή των πρωτεϊνών Caspr και Caspr2 παρά των περισφίξεων του Ranvier κατά μήκος των απομυελινωμένων αξόνων. Στο σύνολο τους αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι υπάρχει γενικευμένη διάσπαση της αρχιτεκτονικής της μεμβράνης του άξονα μετά από μακροχρόνια απομυελίνωση στη ΣΚΠ 88. Η κλινική εξέλιξη στη ΣΚΠ πιθανόν να μην είναι αποτέλεσμα μόνο της αξονικής εκφύλισης αλλά και άλλων παραγόντων που αποτυγχάνουν να διατηρήσουν την αρχιτεκτονική του άξονα, η οποία και είναι απαραίτητη για την ομαλή αγωγή του ερεθίσματος κατά μήκος των χρόνια απομυελινωμένων αξόνων που όμως δεν εκφυλίστηκαν ακόμα 88. Πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι ενώ η πυκνότητα των διαύλων νατρίου είναι πολύ μεγαλύτερη στις περισφίξεις του Ranvier, το αξονόπλασμα μεταξύ των περισφίξεων λόγω της μεγαλύτερης έκτασης του, έχει υψηλότερο αριθμό διαύλων 86. Ο ρόλος αυτών των διαύλων νατρίου πιθανολογείται από τα εξής: πρώτον, οι δίαυλοι των περισφίξεων μπορεί να βοηθούν στην κάλυψη μικρών εκτάσεων απομυελινωμένων τμημάτων με συνεχές ρεύμα. Δεύτερον, αυτά τα κανάλια πιθανόν να προσφέρουν μια δεξαμενή για τις νέες περισφίξεις κατά την 38

39 επαναμυελίνωση των αξόνων. Εναλλακτικά, οι δίαυλοι νατρίου μπορεί να μεταναστεύουν από τις περισφίξεις του Ranvier μέσω πλάγιας διάχυσης ή μπορεί να συνθέτονται εκ νέου και να μεταφέρονται στο σημείο της βλάβης για να εκπληρώσουν τη λειτουργία τους 86, Επιδείνωση της νόσου οφειλόμενη σε αποτυχία αποκατάστασης/αναγέννησης Η αρχική αποκατάσταση των βλαβών στη ΣΚΠ μπορεί να αντικατοπτρίζει, τουλάχιστον εν μέρει, διαδικασίες αναγέννησης εξαρτημένες από προγονικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους διαδικασίας πιθανώς αυτά τα κύτταρα να βλάπτονται Παθολογία ΣΚΠ Η ΣΚΠ θεωρείται μία χρόνια φλεγμονώδης νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος, η οποία οδηγεί σε πολυεστιακές απομυελινωτικές πλάκες. Τα χαρακτηριστικά παθολογοανατομικά στοιχεία των βλαβών της ΣΚΠ είναι η φλεγμονή με συμμετοχή των Τ και Β λεμφοκυττάρων, και των μακροφάγων/μικρογλοιακών κυττάρων. η απομυελίνωση με απώλεια των ολιγοδενδροκυττάρων κατά τη χρόνια φάση της νόσου και ποικίλο βαθμό επαναμυελίνωσης. η απώλεια αξόνων και η γλοίωση με πολλαπλασιασμό των αστροκυττάρων και εκτεταμένη παραγωγή γλοιακών ινών 81. Η ΣΚΠ είναι εντυπωσιακά ετερογενής, ιδιαίτερα αν ληφθούν υπ όψιν οι φλεγμονώδεις μηχανισμοί που οδηγούν στην ιστική βλάβη. Η αναγνώριση τεσσάρων ανοσοπαθολογικών προτύπων της ΣΚΠ έγειρε πολλές συζητήσεις για την παθογένεια της νόσου 82. Μία πρόσφατη μελέτη των Barnett και Prineas 70 περιγράφει τις πρώιμες παθολογοανατομικές αλλαγές στην ανάπτυξη της βλάβης στη ΣΚΠ, οι οποίες περιλαμβάνουν εκτεταμένη απόπτωση των ολιγοδενδροκυττάρων, ενεργοποίηση της μικρογλοίας και απουσία φλεγμονωδών διηθήσεων. Παρά το γεγονός ότι αυτές δεν ήταν παρούσες στο σύνολο των περιπτώσεων, η υπόθεση αυτή κέντρισε το ενδιαφέρον. Οι ερευνητές κατέληξαν στο ότι όλες οι βλάβες ξεκινούν με αυτόν τον τρόπο και στη συνέχεια ακολουθεί η ενεργοποίηση του συμπληρώματος και η διήθηση από φλεγμονώδη κύτταρα. 39

40 Ωστόσο, παθολογοανατομικές αναλύσεις ενεργών απομυελινωτικών εστιών από ασθενείς με ΣΚΠ αποκάλυψαν πολλά διαφορετικά δομικά και ανοσολογικά χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν την ύπαρξη πολλαπλών δυνατών μηχανισμών σε αυτή τη διαδικασία 81,82. Αυτοί περιλαμβάνουν την εμπλοκή των ενεργοποιημένων μακροφάγων ή των μικρογλοιακών κυττάρων, κυτταροτοξικές κυτταροκίνες, ενεργά παράγωγα οξυγόνου ή αζώτου, ειδικά αντισώματα ή ενεργοποιημένοι παράγοντες του συμπληρώματος, και σε άλλες περιπτώσεις, τη συμμετοχή δυστροφικών ολιγοδενδροκυττάρων. Ο στόχος του τραυματισμού (μυελίνη ή ολιγοδενδροκύτταρα) και ο μηχανισμός απομυελίνωσης είναι διακριτοί στους διάφορους υποτύπους της νόσου και στα διάφορα στάδια εξέλιξης της νόσου 82. Έτσι αναγνωρίζονται συνολικά τέσσερα ανοσοπαθολογικά πρότυπα της ενεργής απομυελινωτικής πλάκας 1, Ανοσοπαθολογικά μοντέλα Πρότυπο I Η ενεργός απομυελίνωση συνδυάζεται με φλεγμονώδη διήθηση από Τ λεμφοκύτταρα και μακροφάγα 1. Στις εστίες κυριαρχούν τα MHC κλάσης Ι CD8 + Τ λεμφοκύτταρα. Σε αυτή την περίπτωση η φλεγμονώδης διαδικασία συνδυάζεται με ενεργοποίηση των τοπικών μικρογλοιακών κυττάρων και σε μικρότερο βαθμό με την επιστράτευση αιματογενώς των μακροφάγων. Η ιστική βλάβη προκαλείται κυρίως, από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα/μικρογλοία μέσω των τοξικών προϊόντων που εκκρίνουν, όπως ο TNF-α, πρωτεολυτικά και λιπολυτικά ένζυμα και κυτταροτοξικές κυτταροκίνες. Η δράση των μακροφάγων συμπληρώνεται από την άμεση τοξική επίδραση των Τ λεμφοκυττάρων στους άξονες των νευρικών κυττάρων 1,62,64,65,83. Οι βλάβες εντοπίζονται γύρω από μικρές φλέβες και φλεβίδια και παρουσιάζουν σαφή όρια από το περιβάλλον παρέγχυμα. Η απώλεια των πρωτεϊνών της μυελίνης φαίνεται να συμβαίνει ομοιόμορφα. Στις βλάβες του μοντέλου Ι υπάρχει ποικίλη απώλεια των ολιγοδενδροκυττάρων στα όρια της απομυελινωτικής εστίας, ενώ στο ανενεργό κέντρο της παρατηρείται επανεμφάνιση μεγάλου αριθμού ολιγοδενδροκυττάρων. Αυτό το γεγονός συνάδει με την υψηλή συχνότητα εμφάνισης των επαναμυελινωμένων σκιωδών πλακών (shadow plaques). 40

41 Σε αυτό το ανοσολογικό μοντέλο ιστικής βλάβης παρατηρούνται συχνά συρρέουσες απομυελινωτικές εστίες και σχετική διατήρηση των νευραξόνων. (Σχήμα 3) Πρότυπο II Χαρακτηρίζεται από φλεγμονώδη διήθηση από Τ λεμφοκύτταρα και μακροφάγα, όπως το μοντέλο Ι. Η ειδοποιός διαφορά είναι η προεξάρχουσα παρουσία εναποθέσεων ανοσοσφαιρινών (κυρίως IgG) και ενεργοποιημένου συμπληρώματος, κυρίως το C9neo αντιγόνο του παράγοντα C9, στις περιοχές ενεργούς απομυελίνωσης 1. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος συσχετίζεται αυστηρά με την απομυελινωτική δραστηριότητα στις βλάβες, αφού είναι παρούσα στα πρώιμα στάδια της καταστροφής της μυελίνης. Η απομυελίνωση μέσω των αντισωμάτων έχει συνδυαστεί με την παρουσία υψηλού αριθμού Β λεμφοκυττάρων και πλασματοκυττάρων μέσα στις πλάκες. Οι εστίες στο μοντέλο ΙΙ είναι σαφώς αφοριζόμενες και περιβάλλουν μια φλεγμαίνουσα φλέβα ή φλεβίδιο. Τέλος, κοινό στοιχείο με το μοντέλο Ι αποτελεί η επιστράτευση νέων ολιγοδενδροκυττάρων και η επαναμυελίνωση. Ακραίος εκπρόσωπος της απομυελίνωσης οφειλόμενης στη δράση των αντισωμάτων αποτελεί η οπτική νευρομυελίτιδα (νόσος Devic). (Σχήμα 3) Πρότυπο III Παρατηρείται φλεγμονώδης διήθηση από Τ λεμφοκύτταρα και μακροφάγα και ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα 1. Η απομυελίνωση δεν επικεντρώνεται σε φλέβες και φλεβίδια, αντιθέτως, διατηρείται μία άλως μυελίνης γύρω από φλεγμαίνοντα αγγεία μέσα στην απομυελινωτική πλάκα. Τα όρια της ενεργούς βλάβης δεν είναι σαφή, δίνοντας έτσι την εικόνα διάχυτης επέκτασης στην περιβάλλουσα λευκή ουσία. Επιπλέον, σε αρκετές περιπτώσεις ανευρίσκονται συγκεντρικές εναλλασσόμενες ζώνες απομυελίνωσης και μυελίνωσης στην περιφέρεια της βλάβης. Ωστόσο το χαρακτηριστικό στοιχείο του μοντέλου ΙΙΙ είναι η επιλεκτική απώλεια της myelin-associated glycoprotein-mag, ενώ οι άλλες πρωτεΐνες της μυελίνης (PLP, MBP, CNP) είναι παρούσες μέσα στα μερικώς βλαμμένα περιβλήματα μυελίνης. Αυτές οι αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών της μυελίνης επιφέρουν παθολογικές μεταβολές στις απομακρυσμένες αποφυάδες 41

42 των ολιγοδενδροκυττάρων, με κατάληξη τον αποπτωτικό θάνατο τους. Σε αυτό το μοντέλο ανευρίσκεται σημαντική απώλεια ολιγοδενδροκυττάρων στα όρια της ενεργούς πλάκας, η οποία πολλές φορές επεκτείνεται και στη φαινομενικά υγιή περιβάλλουσα λευκή ουσία. Το ανενεργό κέντρο της βλάβης πρακτικά στερείται ολιγοδενδροκυττάρων και οι εστίες επαναμυελίνωσης (σκιώδεις πλάκες) είναι απούσες. Η πιο δραματική εκδήλωση των βλαβών του μοντέλου ΙΙΙ αποτελεί η συγκεντρική σκλήρυνση του Balo. (Σχήμα 3) Πρότυπο IV Στις φλεγμονώδεις διηθήσεις κυριαρχούν τα Τ λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα 1. Δεν παρατηρούνται εναποθέσεις ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος. Η απομυελίνωση σχετίζεται με τον θάνατο ολιγοδενδροκυττάρων σε μια μικρή άλω στην περιβάλλουσα λευκή ουσία γύρω από τη βλάβη, σε γειτνίαση με τη ζώνη ενεργούς καταστροφής της μυελίνης. Ο θάνατος των ολιγοδενδροκυττάρων δεν έχει τα στοιχεία της απόπτωσης. Η βλάβη περιβάλλει φλέβες, έχει σαφή όρια και παρουσιάζει ακτινοειδείς προεκβολές. Οι ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ανέδειξαν ομοιόμορφη απώλεια των πρωτεϊνών της μυελίνης. Η σχεδόν απόλυτη απουσία ολιγοδενδροκυττάρων τόσο στις ενεργές όσο και τις ανενεργές περιοχές της βλάβης ευθύνεται για την απουσία των επαναμυελινωμένων σκιωδών πλακών. Αυτές οι βλάβες είναι παρούσες σε ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών με πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ, και θεωρείται ότι αποτελούν παράδειγμα πρωτοπαθούς βλάβης των ολιγοδενδροκυττάρων με δευτερογενή απομυελίνωση. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των μοντέλων αποτελεί η διήθηση από φλεγμονώδη κύτταρα, τα οποία στην πλειοψηφία τους είναι μονοκύτταρα. Στις ενεργές βλάβες της ΣΚΠ τα φλεγμονώδη κύτταρα είναι παρόντα στον περιαγγειακό χώρο, αλλά και διάσπαρτα στο παρέγχυμα του κεντρικού νευρικού συστήματος. Αυτό ισχύει για τα Τ λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα. Όσον αφορά στα Β λεμφοκύτταρα και τα πλασματοκύτταρα, αυτά βρίσκονται περισσότερο συγκεντρωμένα στον περιαγγειακό χώρο και τις μήνιγγες και μόνο σπάνια διηθούν το παρέγχυμα 1. (Σχήμα 3) 42

43 Σχήμα 3: Σχηματική παράσταση των 4 ανοσοπαθολογικών προτύπων φλεγμονής. Οι βλάβες αναπτύσσονται με έδαφος φλεγμονώδους αντίδρασης μεσολαβούμενης από Τ-λεμφοκύτταρα. OG= ολιγοδενδροκύτταρα, ROI= ενεργά ενδιάμεσα οξυγόνου, RNI= ενεργά ενδιάμεσα αζώτου, T= Τ-λεμφοκύτταρα, M= μακροφάγα, MG= μικρογλοία, MY= μυελίνη, TNF-α= tumor necrosis factor-α, MOG= ολιγοδενδροκυτταρική γλυκοπρωτεΐνη της μυελίνης, GC=γαλακτοκερεβροζίτης Οι τύποι των εστιών στη ΣΚΠ Οξεία απομυελινωτική βλάβη Το κριτήριο για να οριστεί ως οξεία μια απομυελινωτική βλάβη, είναι η παρουσία περιβλημάτων μυελίνης σε πορεία αποσύνθεσης και των προϊόντων αποδόμησης στο εσωτερικό των μακροφάγων που διήθησαν τον ιστό. Δύο είδη βλαβών διακρίνονται: η οξεία πλάκα και η χρόνια ενεργός πλάκα. Στην πρώτη, η απομυελίνωση εξελίσσεται ταυτόχρονα στο σύνολο της πλάκας ενώ αντίθετα, στη χρόνια ενεργό πλάκα η διαδικασία της αποδόμησης της μυελίνης εξελίσσεται στην περιφέρεια της βλάβης, γύρω από το ήδη απομυελινωμένο κέντρο της πλάκας. Οι 43

44 οξείες βλάβες συναντώνται στα αρχικά στάδια της νόσου, στην υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, και δυσκολότερα στα όψιμα στάδια ή την προϊούσα μορφή. Σε αυτήν την περίπτωση, υπάρχει μια αργά εξελισσόμενη απομυελινωτική διαδικασία, η οποία πιθανότατα επηρεάζει μόνο λίγες ίνες κάθε φορά, στην περιφέρεια της πλάκας. Δεν είναι εύκολο να εκτιμηθεί εάν αυτό οφείλεται σε μια εξελισσόμενη ανοσολογική αντίδραση ή αποτελεί συνέπεια δευτερογενούς εκφύλισης της ίνας (βαλλεριανή εκφύλιση) σε άξονες που υπέστησαν διατομή στο κέντρο της ανενεργούς πλάκας. Η χρόνια ενεργός πλάκα χαρακτηρίζεται από πυκνή διήθηση από μακροφάγα που περιέχουν προϊόντα αποδόμησης της μυελίνης Ανενεργός απομυελινωτική βλάβη Το χαρακτηριστικό της βλάβης αυτής αποτελεί η απουσία εξελισσόμενης διαδικασίας αποδόμησης της μυελίνης. Αυτό δεν σημαίνει ότι έχει πάψει πλήρως η φλεγμονώδης διαδικασία ή ότι τα μακροφάγα δεν επιδίδονται περαιτέρω στην πέψη των προϊόντων αποδόμησης της μυελίνης. Τα μακροφάγα μπορεί να παραμείνουν στο ΚΝΣ για σημαντικό χρονικό διάστημα (>6 μήνες), υποδηλώνοντας ότι η διαδικασία αποσύνθεσης των υπολειμμάτων της μυελίνης μπορεί να είναι αρκετά αργή. Επομένως στα αρχικά στάδια της νόσου, οι ανενεργές πλάκες μπορεί να είναι κυτταροβριθείς και να διηθούνται από λεμφοκύτταρα και μακροφάγα. Σε αυτό το στάδιο τα μακροφάγα είναι πιθανό να περιέχουν μεγάλη ποσότητα προϊόντων αποδόμησης της μυελίνης, και η γλοιοτική ουλή να μην έχει δημιουργηθεί ακόμα. Στις παλιές πλάκες υπάρχουν λιγοστά μόνο λεμφοκύτταρα και μακροφάγα στους περιαγγειακούς χώρους. Ο ιστός περιέχει λίγα κύτταρα, λόγω σημαντικής απώλειας μυελίνης, ολιγοδενδροκυττάρων και της μικρογλοίας, ενώ οι εναπομείναντες άξονες περιβάλλονται από πυκνό αστροκυτταρικό γλοιοτικό ιστό Καταστροφική βλάβη Οι καταστροφικές βλάβες ευθύνονται για τη σοβαρή και ταχέως εξελισσόμενη οξεία και χρόνια ΣΚΠ. Η απομυελίνωση συνοδεύεται από εκτεταμένη ιστική καταστροφή, η οποία επηρεάζει τους άξονες και τα αστροκύτταρα. Σε ακραίες καταστάσεις μπορεί να δημιουργηθούν κυστικές βλάβες, οι οποίες θέτουν διαφοροδιαγνωστικό πρόβλημα. 44

45 Σκιώδεις πλάκες (Shadow plaques) Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για να περιγράψει περιοχές πλήρους επαναμυελίνωσης σε προηγουμένως απομυελινωτικές πλάκες. Υπάρχουν όμως και περιοχές μειωμένης πυκνότητας μυελίνης στο ΚΝΣ, οι οποίες αντικατοπτρίζουν άλλες καταστάσεις. Στα αρχικά στάδια της οξείας απομυελίνωσης κάποια περιβλήματα μυελίνης έχουν καταστραφεί ενώ άλλα σώζονται, δίνοντας την εικόνα των σκιωδών πλακών. Επίσης, σε άλλες βλάβες μπορεί να υπάρχει ελάττωση της πυκνότητας των εμμύελων αξόνων λόγω σημαντικής αξονικής απώλειας Πρώιμες αλλοιώσεις (Preactive lesion) Αυτές προέκυψαν από στοιχεία συσχέτισης της μαγνητικής τομογραφίας με παθολογοανατομικά ευρήματα. Θεωρείται ότι αντιστοιχούν σε πολύ αρχικά στάδια της απομυελινωτικής διαδικασίας όπου σημειώνεται μέτριος βαθμός φλεγμονής κι ενεργοποίησης της μικρογλοίας και των μακροφάγων, ήπια ελάττωση της πυκνότητας της μυελίνης και ελάχιστες εμμύελες ίνες σε πορεία αποδόμησης της μυελίνης Φλεγμονώδη στοιχεία Τ λεμφοκύτταρα Η πλειοψηφία των διηθούντων λεμφοκυττάρων είναι Τ κύτταρα. Τα CD4 + και τα CD8 + κύτταρα ανευρίσκονται σε αφθονία στις οξείες εστίες και τα ενεργά όρια των χρόνιων ενεργών εστιών, ενώ ο αριθμός τους είναι σημαντικά μικρότερος στις ανενεργές βλάβες. Οι σχετικές αναλογίες των CD8 + και CD4 + κυττάρων διαφέρουν ανάμεσα στις διάφορες μελέτες, κάποιες εκ των οποίων περιγράφουν την υπεροχή των CD8 + και κάποιες άλλες την υπεροχή των CD4 + κυττάρων. Αυτές οι διαφορές πιθανά να αντικατοπτρίζουν τη διαφορετική τοποθεσία των κυττάρων επειδή τα CD4 + ανευρίσκονται κυρίως στους περιαγγειακούς χώρους και τις μήνιγγες, ενώ τα CD8 + βρίσκονται τόσο στους περιαγγειακούς χώρους όσο και στο παρέγχυμα 161. Η ΣΚΠ θεωρείται νόσος που μεσολαβείται από τα CD4 + T-helper 1 λεμφοκύτταρα 161. Αυτά τα κύτταρα διαφοροποιούνται σε απάντηση της ιντερλευκίνης 12 (IL-12) και χαρακτηρίζονται από την έκφραση της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης ιντερφερόνη-γ. 45

46 Πρόσφατα, η έρευνα επικεντρώθηκε σε μια τρίτη ομάδα των βοηθητικών Τ- λεμφοκυττάρων, τα Τh-17. Πρόκειται για ισχυρά προφλεγμονώδη κύτταρα που συμμετέχουν στην ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, η ψωρίαση. Μια πρόσφατη μελέτη απέδειξε ότι τα Th17 κύτταρα είναι παρόντα στις οξείες αλλά και στις χρόνιες ενεργές βλάβες, γεγονός που σημαίνει ότι η IL-17 εμπλέκεται όχι μόνο στην έναρξη αλλά και τη συντήρηση των βλαβών της ΣΚΠ. Επίσης, τα Th17 κύτταρα αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό τόσο των CD4 + όσο και των CD8 + Τ-λεμφοκυττάρων. Επειδή τα CD8 + κύτταρα κυριαρχούν στο εγκεφαλικό παρέγχυμα και τα CD4 + στον περιαγγειακό χώρο, τα ευρήματα αυτά ενισχύουν την κυρίαρχη δράση των CD8 + λεμφοκυττάρων στην ιστική καταστροφή σε αντίθεση με τον εναρκτήριο ρόλο των CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων. Επιπρόσθετα, πολλά αστροκύτταρα και κάποια ολιγοδενδροκύτταρα εκφράζουν mrna και πρωτεΐνη της IL-17 στις ενεργές εστίες της ΣΚΠ. Επομένως, η παραγόμενη IL-17 από τα CD4 + και CD8 + κύτταρα που εισέρχονται στο ΚΝΣ και τα ενεργοποιημένα αστροκύτταρα πιθανά πυροδοτούν θετική επανατροφοδότηση που ελκύει περαιτέρω Th17 αλλά και Th1 κύτταρα 161. Τα CD8 + κύτταρα έρχονται σε άμεση επαφή με τους απομυελινωμένους νευράξονες και κατευθύνουν τα κυτταροτοξικά κυστίδιά τους στη ζώνη επαφής 64. Υπάρχει θετική συσχέτιση ανάμεσα στην οξεία αξονική βλάβη και τον αριθμό των διηθητικών CD8 + Τ κυττάρων, επίσης υπάρχει θετική συσχέτιση ανάμεσα στα ενεργοποιημένα CD8 + κύτταρα που ανιχνεύονται στο περιφερικό αίμα και παράγουν κυτταροκίνες και σε στοιχεία από τη μαγνητική τομογραφία ενδεικτικά ιστικής καταστροφής 64. Η κλωνική έκπτυξη των CD4 + κυττάρων στις εστίες υποδηλώνει τη συμμετοχή τους μετά την αναγνώριση ειδικού αντιγόνου. Είναι πιθανό τα CD8 + κύτταρα να εξαρτώνται από τη «βοήθεια» των CD4 + ρυθμιστικών κυττάρων 64. Επιπρόσθετα, τα CD4 + effector κύτταρα μπορεί να συμβάλλουν άμεσα στην ιστική βλάβη 64. Στις χρόνιες βλάβες της ΣΚΠ, Β κύτταρα και πλασματοκύτταρα συσσωρεύονται και υπόκεινται σε κλωνική έκπτυξη στον περιαγγειακό χώρο και στους μηνιγγικούς ιστούς 1,66,67,75,76. Αυτά υποδηλώνουν ότι η φλεγμονή οδηγείται από αμφότερα MHC κλάσης Ι και κλάσης ΙΙ Τ λεμφοκύτταρα. Επίσης, φαίνεται ότι η συχνότητα των CD45R (putative suppressor/inducer) κυττάρων είναι χαμηλότερη στις ενεργές 46

47 συγκριτικά με τις ανενεργές εστίες της ΣΚΠ, υποδηλώνοντας δυσλειτουργία της ανοσολογικής απάντησης μέσα στις πλάκες. Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η Τ κυτταρική αυτοανοσία μπορεί να περιορίζεται σε ένα μικρό πληθυσμό πολύ ειδικών υποτύπων υποδοχέα Τ κυττάρου Β κύτταρα Εκτός από τα Τ κύτταρα, ένας ποικίλος αλλά μικρός αριθμός Β κυττάρων κάνουν την παρουσία τους μέσα στις πλάκες. Ο απόλυτος και σχετικός αριθμός τους είναι πολύ υψηλότερος στη χρόνια ΣΚΠ συγκριτικά με την οξεία ΣΚΠ αλλά και τα πρώιμα στάδια της χρόνιας φάσης 1,76. Είναι εμφανή στις ενεργές πλάκες και μόνο σπάνια στις ανενεργές. Η κλωνική έκπτυξη των Β κυττάρων στις βλάβες φαίνεται από το φάσμα των ανοσοσφαιρινών στις εστίες και το ΕΝΥ, ενώ πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι αυτή η διαδικασία οδηγείται από ειδικό αντιγόνο Μακροφάγα και μικρογλοία Τα μακροφάγα είναι διεσπαρμένα σε όλη την έκταση της εστίας, και πιο ειδικά στις ενεργές απομυελινωτικές πλάκες. Η παρουσία των προϊόντων αποδόμησης της μυελίνης μέσα στα μακροφάγα αποτελεί τον πιο αξιόπιστο δείκτη απομυελίνωσης σε εξέλιξη. Επιπλέον, υπάρχει εκτεταμένη πρόσληψη χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών από τα μακροφάγα και τη μικρογλοία μέσα στις ενεργές πλάκες, γεγονός που πιθανότατα συμβάλλει στον μεταβολισμό των λιπιδίων τα οποία ελευθερώνονται στην πορεία της διαδικασίας καταστροφής της μυελίνης. Εκτός από τα προϊόντα αποδόμησης της μυελίνης, η έκφραση αντιγόνων ενεργοποίησης στα μακροφάγα και τα μικρογλοιακά κύτταρα είναι δείκτης ενεργών απομυελινωτικών πλακών. Αν και η πλειοψηφία των μακροφάγων στις βλάβες προέρχονται από τα μονοκύτταρα της συστηματικής κυκλοφορίας, η τοπική μικρογλοία πιθανόν να παίζει σημαντικότερο ρόλο στην ανάπτυξη της βλάβης. Ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα τα οποία εκφράζουν αντιγόνα ιστοσυμβατότητας, μόρια προσκόλλησης ή δείκτες ενεργοποιημένων περιφερικών μακροφάγων βρίσκονται στη λευκή ή τη φαιά ουσία που περιβάλλει ενεργείς αλλά και ανενεργείς εστίες. Λεπτομερείς ποιοτικές αναλύσεις της ανοσολογικής απάντησης στις εστίες σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης αποκαλύπτουν ότι η ενεργοποίηση της μικρογλοίας και 47

48 η απομυελίνωση προϋπάρχει της επιστράτευσης μεγάλου μέρους των αιματογενώς προερχόμενων κυττάρων στις εστίες. Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι σε πρώιμο στάδιο ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα οδηγούν στην απομυελίνωση, επεξεργάζονται προϊόντα αποδόμησης και μεταμορφώνονται σε κύτταρα τύπου μακροφάγων (macrophage-like cells). Ανεξάρτητα από την προέλευση τους τα μακροφάγα και τα μικρογλοιακά κύτταρα στις εστίες της ΣΚΠ εκφράζουν μια ποικιλία μορίων απαραίτητων για την εξάπλωση και τη ρύθμιση της φλεγμονώδους απάντησης και την επαγωγή της ιστικής βλάβης. Αυτά περιλαμβάνουν συνδιεγερτικά μόρια, αντιγόνα MHC, Toll-like υποδοχείς, macrophage colonystimulating factor, annexin 1, Fc υποδοχείς, επαγόμενες συνθετάσες του νιτρικού οξέος, πρωτεάσες, διάφορους διαύλους ιόντων, κυτταροκίνες και υποδοχείς κυτταροκινών Αντιγόνα του μέγιστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας Τα Τ λεμφοκύτταρα δεν αναγνωρίζουν διαλυτά μόρια ή πεπτίδια αλλά αλληλεπιδρούν με αντιγόνα συνδεδεμένα με τα μόρια του μέγιστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Η πλειοψηφία των κυττάρων στο ΚΝΣ που εκφράζουν μόρια MHC κλάσης ΙΙ είναι τα τοπικά μικρογλοιακά κύτταρα και τα αιματογενώς προερχόμενα μακροφάγα. Τα μόρια MHC κλάσης Ι μπορούν να εκφραστούν σε σχεδόν όλα τα κύτταρα κατόπιν κατάλληλου ανοσολογικού ερεθίσματος. Τα μόρια MHC κλάσης Ι ανευρίσκονται κυρίως στις ενεργές εστίες και σε μικρότερο βαθμό, στη χρόνια ΣΚΠ, είναι διάσπαρτα παρόντα τόσο στα διηθητικά φλεγμονώδη κύτταρα όσο και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τη μικρογλοία, τα ολιγοδενδροκύτταρα, τα αστροκύτταρα και τους νευράξονες. Η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων απαιτεί την αλληλεπίδραση συνδιεγερτικών μορίων. Η απουσία αλληλεπίδρασης των Τ λεμφοκυττάρων με τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε ανέργεια και περιορισμό της φλεγμονώδους απάντησης παρά σε εξάπλωσή της Μόρια προσκόλλησης Συμμετέχουν στα πρώτα στάδια διαταραχής των φραγμών. Πρόκειται για μόρια τα οποία εκφράζονται τόσο στα λεμφοκύτταρα όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα 48

49 και επιφέρουν επιβράδυνση και προσκόλληση των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων πάνω στο ενδοθήλιο, διευκολύνοντας τελικά την εξαγγείωσηείσοδο των λεμφοκυττάρων μέσα στον νευρικό ιστό. Διακρίνονται τέσσερεις κατηγορίες: η υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών, οι σελεκτίνες, οι ιντεγκρίνες και οι καντερίνες. Αφού ολοκληρώσουν τη δράση τους, απομακρύνονται από τα κύτταρα στα οποία εκφράζονται και επανακυκλοφορούν, ώστε να διευκολύνουν ακόμη περισσότερο την προσκόλληση των λεμφοκυττάρων 25. Στα φυσιολογικά αγγεία του εγκεφάλου τα μόρια προσκόλλησης εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα. Τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα συνδέονται με αυτά και προσδένονται στην επιφάνεια του ενδοθηλίου πριν μεταναστεύσουν διά του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Όταν ξεκινήσει μια φλεγμονώδης εστία, τα μόρια προσκόλλησης στα εγκεφαλικά ενδοθηλιακά κύτταρα και οι τοπικοί κυτταρικοί πληθυσμοί επάγονται και μπορεί να λειτουργήσουν ως υποδοχείς προσκόλλησης για ένα μεγάλο φάσμα δευτερευόντων εκτελεστικών κυττάρων. Η είσοδος των φλεγμονωδών κυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου προϋποθέτει διαφορετικά διαδοχικά στάδια. Αρχικά, η αλληλεπίδραση των σελεκτινών με καρβοξυλιωμένες περιοχές, οδηγεί σε χαλαρή αλληλεπίδραση των λευκοκυττάρων με το ενδοθήλιο, η οποία συνίσταται στην αργή στροφική κίνηση των φλεγμονωδών κυττάρων κατά μήκος της ενδοαυλικής επιφάνειας του ενδοθηλίου 1,113. Στη συνέχεια, η αλληλεπίδραση ανάμεσα στα μόρια προσκόλλησης της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών και τις ιντεγκρίνες οδηγεί σε σταθερό δεσμό των φλεγμονωδών κυττάρων με την ενδοαυλική επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων 1,113. Αυτός ο δεσμός, μαζί με την έκφραση πρωτεολυτικών ενζύμων στην επιφάνεια των φλεγμονωδών κυττάρων, επιτρέπει στα τελευταία είτε να περνούν ανάμεσα είτε διά αυλών των ενδοθηλιακών κυττάρων, και να προσεγγίζουν τον περιαγγειακό χώρο. Στα αγγεία του εγκεφάλου λόγω του ΑΕΦ προτιμάται η είσοδος δια του ενδοθηλίου. Τα μόρια προσκόλλησης που βρέθηκαν στα ενδοθηλιακά κύτταρα των ενεργών πλακών είναι η Ε-σελεκτίνη, ICAM-1, VCAM-1 και μη ταξινομημένες αγγειακές «διευθυνσίνες» (vascular addressins). Το VCAM-1 εκφράζεται και στα ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα σε στενή επαφή με τα ολιγοδενδροκύτταρα. Άλλα μόρια προσκόλλησης που πιθανόν να συμμετέχουν στην επιστράτευση και ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων είναι τα CD97 και CD55. Αυτά 49

50 εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα λευκοκύτταρα στις εστίες της ΣΚΠ, αλλά ο λειτουργικός τους ρόλος δεν έχει διευκρινιστεί. Επιπλέον, μόρια που εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις κύτταρο με κύτταρο όπως η φιμπρονεκτίνη, ουροκινάση, υποδοχέας ενεργοποίησης της πλασμίνης (plasmin activator receptor) και ενεργοποιημένοι παράγοντες του συμπληρώματος, έχουν αναγνωριστεί στα αγγεία ενεργών εστιών καταλήγοντας σε σημαντικές αλλαγές στη σύσταση του στρώματος της συγκριτικά με τον υγιή ιστό. Η έκφραση των ICAM-1 και VCAM-1 επάγεται από τις προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και tumor necrosis factor-α 113. Παράγονται επίσης και οι διαλυτές μορφές των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1 (sicam-1 και svcam-1), οι οποίες θεωρείται ότι δρουν ανασταλτικά στη διαδικασία της προσκόλλησης Χυμοκίνες Πρόκειται για κυτταροκίνες που με βάση τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες: CXC, CC, C και CX3C. Έχουν την ιδιότητα να προσελκύουν διάφορους υποπληθυσμούς Τ-λεμφοκυττάρων μέσω των αντίστοιχων υποδοχέων που αυτά εκφράζουν. Βοηθούν στην κινητοποίηση όλο και περισσότερων Τ-κυττάρων προς τις περιοχές φλεγμονής μέσα στο νευρικό παρέγχυμα, οπού υπάρχει βαθμίδωση συγκέντρωσης χυμοκινών 25. Παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιστράτευση των φλεγμονωδών κυττάρων. Πρόκειται για μικρά πεπτίδια τα οποία απελευθερώνονται από φλεγμονώδη και τοπικά παρεγχυματικά κύτταρα ως απάντηση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα. Φτάνοντας στον εξωκυττάριο χώρο είναι ικανές είτε άμεσα, είτε μεταβάλλοντας την έκφραση και τη συγγένεια των μορίων προσκόλλησης, να ελκύουν εκτελεστικά κύτταρα (μονοκύτταρα, μακροφάγα, πολυμορφοπύρηνα). Τα τελευταία ακολουθούν τη βαθμίδωση συγκέντρωσης των παραγόμενων χυμοκινών. Ο κυρίαρχος τύπος Τ κυττάρων που επιστρατεύονται στις βλάβες είναι θετικά για CD3/CCR5/CXCR3, ενώ τα μακροφάγα είναι κυρίως CCR1/CCR5 θετικά. Μια ποικιλία χυμοκινών, οι οποίες μπορούν να αλληλεπιδρούν με αυτούς τους υποδοχείς, έχουν βρεθεί στις εστίες της ΣΚΠ. οι πιο σημαντικές αυτών είναι οι MCP-1, MIP-1a, 50

51 RANTES, και IP-10. Εκτός από τα μακροφάγα και τη μικρογλοία, και τα αστροκύτταρα αποτελούν σημαντική πηγή χυμοκινών στο ΚΝΣ Τοπική έκφραση πρωτεϊνών στρες Περιλαμβάνουν μια ποικιλία πολυπεπτιδίων που παράγονται από τα κύτταρα ως απάντηση στο τραύμα. Έχουν διάφορες λειτουργίες, όπως τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων, την ενδοκυτταρική κυκλοφορία πρωτεϊνών και την αποικοδόμηση αποδιαταγμένων πρωτεϊνών. Η φλεγμονή είναι ένας μηχανισμός ο οποίος θα μπορούσε να ευθύνεται για την τοπική επαγωγή-των πρωτεϊνών στρες. Τα γδ Τ λεμφοκύτταρα χρησιμοποιούν τις πρωτεΐνες στρες για να καταστρέψουν μικροοργανισμούς που εισέβαλαν στον οργανισμό. Παρ όλα αυτά οι ανοσολογικές απαντήσεις που κατευθύνονται ενάντια των πρωτεϊνών στρες μπορεί να εκτραπούν και να αυξήσουν τη φλεγμονή μέσω αυτοάνοσων μηχανισμών. Τα γδ Τ λεμφοκύτταρα τα οποία έχουν υποστεί κλωνική έκπτυξη σε βλάβες της ΣΚΠ λύουν τα ολιγοδενδροκύτταρα μέσω των heat-shock proteins 65 και 70. Μια άλλη πρωτεΐνη στρες που ενοχοποιήθηκε στην παθογένεση της νόσου είναι η αβ-κρυσταλλίνη, η οποία φαίνεται ότι είναι το κυρίαρχο αντιγόνο σε μια ομάδα ασθενών με ΣΚΠ. Τα αστροκύτταρα την εκφράζουν μέσα σε ενεργές και ανενεργές εστίες, ενώ τα ολιγοδενδροκύτταρα την εκφράζουν αυστηρά σε περιοχές απομυελίνωσης σε εξέλιξη. Άλλα μόρια όπως τα heat-shock proteins 27, 90 και c-fos είναι κυρίως παρόντα στα αστροκύτταρα και τα φλεγμονώδη κύτταρα. Το μοντέλο έκφρασης και η πιθανή απελευθέρωση τους στον εξωκυττάριο χώρο συνάδουν με την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες στρες αναγνωρίζονται από ειδικές Τ-κυτταρικές ανοσολογικές αντιδράσεις. Παρά ταύτα, η επαγωγή των heat-shock proteins 65 και 70 στα ολιγοδενδροκύτταρα στα όρια των ενεργών εστιών πιθανώς να προστατεύει αυτά τα κύτταρα από περαιτέρω βλάβη στην εξαπλούμενη ενεργή βλάβη Κυτταροκίνες στις εστίες της ΣΚΠ Η αυτάνοση φλεγμονή, όπως συμβαίνει στην ΣΚΠ, επηρεάζεται από ένα ευρύ φάσμα κυτταροκινών. Αυτές παράγονται είτε από φλεγμονώδη κύτταρα είτε από τοπικούς ιστικούς παράγοντες και διευκολύνουν την επικοινωνία ανάμεσα στα φλεγμονώδη κύτταρα και τους τοπικούς ιστικούς παράγοντες. Κάποιες είναι 51

52 προφλεγμονώδεις, ενεργοποιώντας συγκεκριμένους παράγοντες του ανοσολογικού συστήματος και κατ επέκταση εξαπλώνουν τις ανοσολογικές απαντήσεις και τη φλεγμονή. Υψηλά επίπεδα TNF-α στο ΕΝΥ ασθενών με ΣΚΠ, σχετίζονται με ενεργότητα της νόσου και διάσπαση του ΑΕΦ. Αντίθετα, οι IL-4 και IL-10 μπορεί να καταστείλουν τις όψιμες αντιδράσεις υπερευαισθησίας καθώς και την Τ κυτταρική φλεγμονή ή την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Η ίδια δράση αποδίδεται και στον μετασχηματίζοντα αυξητικό παράγοντα-β (transforming growth factor-β TGF-β). Επιπλέον, μόρια όπως η λεμφοτοξίνη (TNF-β), ο TNF-α και η περφορίνη μπορεί να εμπλέκονται άμεσα στην καταστροφή των ολιγοδενδροκυττάρων και της μυελίνης 1,147. Ο TNF-α είναι μία πολυδύναμη κυτοκίνη, η οποία παράγεται από αλλά και ενεργοποιεί πολλούς κυτταρικούς τύπους, συμπεριλαμβανομένων των Β, Τ, και δενδριτικών κυττάρων 72. Είναι απαραίτητος παράγοντας για τον πολλαπλασιασμό των Β κυττάρων σε απάντηση των CD40 και BCR ερεθισμάτων. Η δράση του TNF-α που παράγεται από τα Β κύτταρα μπορεί να είναι αυτοκρινής ή και παρακρινής, αλλά η κατάληξη είναι διεγερτική για την αλληλεπίδραση των Β/Τ κυττάρων 72. Η λεμφοτοξίνη αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την πρώιμη διαφοροποίηση και λειτουργία των Β λεμφοκυττάρων, ενώ μπορεί να δρα συνεργικά με τον TNF-α στην προαγωγή του σχηματισμού των βλαστικών κέντρων 72. Η ενεργοποίηση των Β κυττάρων από τη διαδοχική δέσμευση των CD40 και BCR οδηγεί στην παραγωγή των IL-6, lymphotoxin και TNF-α, ένας συνδυασμός ικανός να ενισχύσει τις Β και Τ κυτταρικές απαντήσεις 72. Αντίθετα, η ατελής ενεργοποίηση των Β κυττάρων από τον CD40 παράγοντα μόνο, αποτυγχάνει να παράξει προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, ενώ όταν εκκρίνεται η IL-10 καταστέλλει την πρώιμη ανοσολογική απάντηση και περιορίζει την ακατάλληλη ενεργοποίηση των Β κυττάρων 72. Μελέτες ανοσοϊστοχημείας αποκαλύπτουν την παρουσία των IL-1, IL-2, lymphotoxin, TNF-α, ιντερφερόνες, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18. Με τη μέθοδο της PCR βρέθηκε η παρουσία της IL-1 σε όλες τις ενεργές πλάκες, ενώ το mrna των IL-2, IL- 4, IL-10 σε μικρότερη κλίμακα. In situ μελέτες υβριδισμού αποκαλύπτουν mrna διάφορων κυτταροκινών, όπως IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ, TNF-α, TGF-β1, TGFβ2. Τέλος, οι κυτταροκίνες απαντώνται περισσότερο στις ενεργές απομυελινωτικές πλάκες συγκριτικά με τις ανενεργές ή την φαινομενικά φυσιολογική λευκή ουσία. 52

53 Αντισώματα και παράγοντες του συμπληρώματος Οι ενεργές βλάβες στη ΣΚΠ έχουν συνδυαστεί με διάσπαση του ΑΕΦ με επακόλουθο την είσοδο αντισωμάτων ή παραγόντων του συμπληρώματος. Τα Β λεμφοκύτταρα συσσωρεύονται και μπορεί να παραμείνουν στις περιοχές ενεργούς φλεγμονής. Αυτά τα κύτταρα παράγουν αντισώματα τοπικά, όπως φαίνεται από τον αυξημένο δείκτη ανοσοσφαιρινών και τις ολιγοκλωνικές ζώνες στο ΕΝΥ. Παράγονται κυρίως IgG και σε μικρότερο βαθμό IgM και IgA. Ο αριθμός των Β κυττάρων και των πλασματοκυττάρων ποικίλλει και εξαρτάται από το στάδιο της νόσου και τη δραστηριότητα των εστιών. Όταν υπάρχει δραστηριότητα ο υψηλός αριθμός των διηθούντων λευκοκυττάρων περιλαμβάνει και υψηλό αριθμό Β λεμφοκυττάρων συγκριτικά με τις ανενεργές εστίες. Επίσης, υπάρχει σημαντική διαφορά στην έκταση της διήθησης των Β λεμφοκυττάρων και των πλασμακυττάρων στις βλάβες που δημιουργούνται στα πρώιμα στάδια σε σχέση με αυτές που σχηματίζονται μετά το πέρασμα αρκετών ετών. Στα πρώιμα στάδια οι διηθήσεις αποτελούνται κυρίως από Τ κύτταρα και μακροφάγα και μόνο η μειοψηφία των φλεγμονωδών κυττάρων παράγει ανοσοσφαιρίνες (περίπου 0,5-1%), ενώ σε μετέπειτα στάδια η αναλογία Β προς Τ λεμφοκυττάρων είναι περίπου 1 προς 7. Η εναπόθεση των ανοσοσφαιρινών στις θέσεις ενεργούς καταστροφής μυελίνης εντοπίζεται είτε στα ενεργοποιημένα μακροφάγα, είτε στην επιφάνεια των περιβλημάτων μυελίνης σε πορεία καταστροφής και χαρακτηρίζει τις ενεργά απομυελινωτικές πλάκες. Οι παράγοντες του συμπληρώματος εναποτίθενται στις ενεργώς απομυελινωτικές πλάκες και κυρίως στα τοιχώματα των αγγείων. Σε μια ομάδα ασθενών με ΣΚΠ η εναπόθεση παραγόντων συμπληρώματος είναι παρούσα στα όρια της ενεργούς πλάκας. Το συμπλήρωμα φαίνεται ότι προέρχεται από τη συστηματική κυκλοφορία μέσω του διασπασμένου ΑΕΦ, υπάρχουν όμως ενδείξεις ότι παράγεται και τοπικά από τα μακροφάγα και τη μικρογλοία Αλλαγές στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό Ανοσοϊστοχημικές μελέτες πάνω στην κατανομή των πρωτεϊνών του πλάσματος μέσα στις βλάβες δείχνουν ότι ο ΑΕΦ στις πλάκες είναι διαταραγμένος συγκριτικά με την φυσιολογική λευκή και φαιά ουσία σε ασθενείς με ΣΚΠ και τους μάρτυρες. Χαμηλά επίπεδα διαρροής γαδολινίου από τον ΑΕΦ μπορεί να ανιχνευθούν και στις 53

54 χρόνιες βλάβες. Η διήθηση του αγγειακού τοιχώματος από φλεγμονώδη κύτταρα υποδηλώνει ότι μεγαλύτερη διάσπαση του ΑΕΦ συμβαίνει στις βλάβες με ενεργό απομυελίνωση, αν και κάποιες φορές έχει παρατηρηθεί έντονη περιαγγειακή εναπόθεση πρωτεϊνών του πλάσματος γύρω από αγγεία που δεν συμμετέχουν στην φλεγμονή. Φλεγμονώδης διήθηση του αγγειακού τοιχώματος με περιαγγειακή συσσώρευση λευκοκυττάρων και εναπόθεση πρωτεϊνών του πλάσματος δεν συνδυάζεται απαραιτήτως με απομυελίνωση. Είναι πιθανόν η ενεργός φλεγμονή στη ΣΚΠ να μην καταλήγει πάντα σε απομυελίνωση. Μικροσκοπικές μελέτες δείχνουν αυξημένο αριθμό πινοκυτταρικών κυστιδίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, που πιθανότατα αντανακλά την αυξημένη διαπερατότητα του ΑΕΦ. Λεπτομερείς ανοσοϊστοχημικές έρευνες των occludin και ZO-1 πρωτεϊνών αποκάλυψαν εστιακή διάσπαση των στενοσυνδέσμων ανάμεσα στα κύτταρα. Εκτός από τις αλλοιώσεις του ενδοθηλίου, παρατηρούνται παθολογικές αλλαγές στις αποφυάδες των αστροκυττάρων, που μπορεί να αποτελεί το αποδεικτικό στοιχείο του περάσματος των φλεγμονωδών κυττάρων από τον ΑΕΦ. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του στρώματος (matrix metalloproteinases-mmps) αποτελούν μια οικογένεια ψευδαργυρικών ενδοπρωτεϊνασών, οι οποίες δρουν ως εκτελεστικά μόρια σε πολλά βήματα στην παθογένεια της ΣΚΠ. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της ΣΚΠ αποτελεί η επαγωγή και παρουσία τους στο ΚΝΣ και το περιφερικό αίμα χωρίς την ταυτόχρονη εξισορροπητική επαγωγή των ενδογενών ιστικών αναστολέων τους (TIMPs), η οποία και οδηγεί σε επίμονη διαταραχή της ισορροπίας προς την πλευρά της πρωτεολυτικής υπερδραστηριότητας 128. Αύξηση της MMP-9 ή της αναλογίας MMP-9/TIMP-1 στον ορό των ασθενών με υποτροπιάζουσα και δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ προαναγγέλλει επικείμενη υποκλινική δραστηριότητα της νόσου όπως αυτή ανιχνεύεται από τη δημιουργία νέων εστιών που προσλαμβάνουν γαδολίνιο στη μαγνητική τομογραφία 128. Η υποοικογένεια των γελατινασών (MMP-2 και MMP-9) διευκολύνει τη διάσπαση του ΑΕΦ και την εξαγγείωση των ανοσολογικών κυττάρων στο εγκεφαλικό παρέγχυμα σε πειραματικά μοντέλα in vitro αλλά και σε ζώα. Άλλες ιδιότητες των MMPs σχετικές με την παθογένεια της ΣΚΠ είναι η ικανότητά τους να ρυθμίζουν την δραστηριότητα διάφορων κυτταροκινών και των υποδοχέων τους, μορίων προσκόλλησης αλλά και η λύση συστατικών της μυελίνης, 54

55 συμμετέχοντας με αυτόν τον τρόπο στη διαδικασία της διασποράς του επιτόπου μέσω της απελευθέρωσης προϊόντων αποδόμησης. Στην υποτροπιάζουσα και τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ τα επίπεδα της MMP-9 είναι μονίμως αυξημένα στον εγκεφαλικό ιστό, το ΕΝΥ και το πλάσμα Ανοσολογικός μηχανισμός της απομυελίνωσης Το περίβλημα της μυελίνης έχει μια περίπλοκη δομή, αποτελούμενη από την ελικοειδή περιτύλιξη κυτταρική μεμβράνη του ολιγοδενδροκυττάρου γύρω από τον άξονα της. Ένα ολιγοδενδροκύτταρο μπορεί να σχηματίσει πολλαπλά τμήματα, αλλά ο αριθμός των περιβλημάτων εξαρτάται από τον άξονα και το πάχος της μυελίνης. Η μυελίνη αποτελείται από λιπίδια και πρωτεΐνες. Η σημαντικότερη πρωτεΐνη της μυελίνης του ΚΝΣ είναι η MBP και η PLP. Και οι δύο συμμετέχουν στη σταθεροποίηση των πολύπλοκων λιπιδικών στρωμάτων. Ελάσσονος σημασίας πρωτεΐνες είναι η πρωτεϊνη σχετιζόμενη με τη μυελίνη (myelin associated protein- MAP), η MOG, η 2 3 -κυκλικό νουκλεοτίδιο 3 -φωσφοδιεστεράση (2 3 -cyclic nucleotide 3 -phosphodiesterase-cnpase), οι οποίες παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση άξονα-μυελίνης ή είναι οι υποδοχείς επιφανείας των ολιγοδενδροκυττάρων. Θεωρητικά όλες οι πρωτεΐνες λειτουργούν σαν δυνητικά αντιγόνα-στόχος για τις ανοσολογικές Τ κυτταρικές εγκεφαλοτιδογόνες αντιδράσεις. Για να αναγνωριστούν από τα CD4 λεμφοκύτταρα αυτά τα αντιγόνα πρέπει να ελευθερωθούν στον εξωκυττάριο χώρο και να επεξεργαστούν από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, κυρίως τα περιαγγειακά μακροφάγα ή τη μικρογλοία και πιθανότατα και τα αστροκύτταρα. Η ανοσολογική απάντηση μέσω των Τ κυττάρων φαίνεται υπεύθυνη για την επαγωγή της φλεγμονής, αν και δεν είναι ικανή από μόνη της να καταστρέψει τα περιβλήματα της μυελίνης. Τα ολιγοδενδροκύτταρα μπορεί να εκφράσουν μόρια MHC κλάσης Ι στα πλαίσια της φλεγμονώδους διαδικασίας στις ενεργές βλάβες της ΣΚΠ, και κατ επέκταση μπορούν να γίνουν άμεσος στόχος της Τ κυτταροτοξικότητας επαγόμενης από ειδικό αντιγόνο 1,65,62. Επιπρόσθετα, το περίβλημα της μυελίνης είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στις ανοσοτοξίνες επιφανείας ή τις διαλυτές που παράγονται από τα μακροφάγα ή τα λεμφοκύτταρα, όπως ο TNF-α, η λεμφοτοξίνη και η περφορίνη. Εναλλακτικά, τα Τ κύτταρα μπορούν να 55

56 καταστρέψουν τα ολιγοδενδροκύτταρα και τη μυελίνη χωρίς τη συμβολή του MHC-I για την αναγνώριση του αντιγόνου 1,62,65,83. Τα Τ λεμφοκύτταρα ασκούν την κυτταροτοξική δράση τους είτε μέσω της απελευθέρωσης κυτταροτοξικών κυστιδίων, είτε μέσω ενεργοποίησης των δεσμευμένων με τη μεμβράνη υποδοχέων θανάτου. Η πρώτη οδός προϋποθέτει την απελευθέρωση περφορίνης και ενζύμων από τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα, ενώ στη δεύτερη εμπλέκεται η αλληλεπίδραση του TNF-like υποδοχέα με τους ειδικούς συνδέτες (ligands) τους. Η ενεργοποίηση του Fas αντιγόνου από τον Fas συνδέτη μπορεί να πυροδοτήσει μια ενδοκυττάρια αντίδραση οδηγώντας στον αποπτωτικό θάνατο των κυττάρων-στόχο. Η απομυελίνωση μπορεί επίσης να ακολουθήσει την ειδική αναγνώριση και οψωνοποίηση των περιβλημάτων της μυελίνης από αντισώματα τα οποία βρίσκονται στην εξωκυττάρια επιφάνεια της μυελίνης ή των ολιγοδενδροκυττάρων. Μέχρι τώρα, μόνο λίγα αντιγόνα έχουν αναγνωριστεί στην εξωκυττάρια επιφάνεια και αυτά δυνητικά δρουν ως στόχοι για την απομυελίνωση μέσω αντισωμάτων. Εκτός από τα λιπίδια της μυελίνης, η MOG φαίνεται να είναι το σημαντικότερο αντιγόνο για την απομυελίνωση μέσω αντισωμάτων. Σε άλλες περιπτώσεις έχουν ανευρεθεί αντισώματα έναντι προγονικών κυττάρων των ολιγοδενδροκυττάρων και επιφανειακών αντιγόνων των νευρώνων. Επιπλέον, έχουν βρεθεί αντισώματα υψηλής ειδικότητας έναντι του DNA, τα οποία δεσμεύονται στην επιφάνεια των νευρώνων και των ολιγοδενδροκυττάρων. Η καταστροφή της οψωνοποιημένης μυελίνης γίνεται με τη βοήθεια είτε του συμπληρώματος, είτε της ενεργοποιημένης μικρογλοίας μέσω της αλληλεπίδρασης με τους Fc υποδοχείς. Εκτός από τις ειδικές ανοσολογικές διαδικασίες, η ιστική καταστροφή μπορεί να συμβεί με μη ειδικό τρόπο από τοξικά μόρια που παράγονται από τα ενεργοποιημένα εκτελεστικά κύτταρα, όπως τα μακροφάγα και η μικρογλοία 1,83. Τα μακροφάγα παράγουν ένα ευρύ φάσμα ουσιών που είναι θανατηφόρες για τα κύτταρα και τους εισβάλοντες μικροοργανισμούς ή διασπούν την εξωκυττάρια ουσία. Αυτές περιλαμβάνουν πρωτεολυτικά και λιπολυτικά ένζυμα, δραστικές μορφές του οξυγόνου και του αζώτου, παράγοντες του συμπληρώματος, κυτταροτοξικές κυτταροκίνες και τοξίνες οι οποίες απελευθερώνονται στις βλάβες λόγω της διαταραγμένης ομοιόστασης του γλουταμικού στους νευρώνες και τη γλοία. Αυτά τα μόρια ασκούν την τοξική τους δράση με μη ειδικό τρόπο σε όλα τα 56

57 κυτταρικά συστατικά του φλεγμαίνοντος ιστού. Κάποια κύτταρα και δομές είναι πιο επιρρεπή σε σύγκριση με άλλα. Το περίβλημα της μυελίνης και τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα και καταστρέφονται από την πλειοψηφία αυτών των τοξινών σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από ότι χρειάζονται για να βλαφτούν άλλα κύτταρα. Η φλεγμονώδης ιστική καταστροφή στο ΚΝΣ μέσω των μακροφάγων χαρακτηρίζεται από ψεύδο-επιλεκτική ιστική βλάβηαπομυελίνωση και απώλεια ολιγοδενδροκυττάρων, με σχεδόν πλήρη διατήρηση των αστροκυττάρων και των μικρογλοιακών κυττάρων Απώλεια της λειτουργικότητας Οι ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ τυπικά παρουσιάζουν περιοδικά επεισόδια, κατά τα οποία νέα λειτουργικά ελλείμματα εμφανίζονται σε χρονικό διάστημα ημερών ή λίγων εβδομάδων, και στη συνέχεια αποδράμουν τις επόμενες εβδομάδες ή μήνες. Παρά το γεγονός ότι η μαγνητική τομογραφία μπορεί να ανιχνεύσει μια νέα περιοχή δραστηριότητας της νόσου, δεν είναι αποτελεσματική στην παρακολούθηση της απώλειας ή της αποκατάστασης της λειτουργικότητας μέσα στη βλάβη. Ο λόγος είναι ότι οι υπεύθυνες αλλαγές για τα λειτουργικά ελλείμματα και την αποκατάσταση αυτών συμβαίνει, σε μοριακό επίπεδο, στις μεμβράνες των μεμονωμένων αξόνων. Η κύρια αιτία της υποτροπής είναι η αποτυχία της αγωγής του ερεθίσματος κατά μήκος του άξονα στο σημείο της βλάβης 1,84,87. Δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι η απώλεια της λειτουργικότητας συμβαίνει συχνότερα σε περιοχές με φλεγμονώδη απομυελίνωση, γιατί εκεί δρουν πολλαπλοί μηχανισμοί και ο καθένας ξεχωριστά συνεισφέρει στο μπλοκ αγωγής. Το γεγονός ότι τα συμπτώματα συνήθως αναπτύσσονται στο μέγιστο σε 2 με 3 ημέρες, στη συνέχεια σταθεροποιούνται και υφίονται τις επόμενες εβδομάδες, δείχνει ότι το μέγεθος της βλάβης που είναι υπεύθυνο για το μπλοκ αγωγής εξελίσσεται πλήρως μέσα σε λίγες ημέρες από την έναρξη των συμπτωμάτων Ο ρόλος της απομυελίνωσης Ο παθολογικός μηχανισμός, ο οποίος σαφώς είναι υπεύθυνος για το μπλοκ αγωγής είναι η τμηματική απομυελίνωση, που οδηγεί σε απώλεια της μυελίνης μεταξύ των περισφίξεων του Ranvier. Νευροφυσιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η 57

58 αγωγή του ερεθίσματος αποτυγχάνει ειδικά στο σημείο της βλάβης, ενώ σε μορφολογικά μη επηρεασμένα τμήματα του άξονα η αγωγή εξελίσσεται φυσιολογικά. Οι παράγοντες που καθορίζουν εάν η αγωγιμότητα θα σταματήσει σε έναν απομυελινωμένο άξονα είναι το χρονικό διάστημα από τη στιγμή που συνέβη η απομυελίνωση, το μέγεθος της βλάβης και η έκταση της απώλειας της μυελίνης κατά μήκος του άξονα μεταξύ των περισφίξεων. Παράλληλα, η διάρκεια της απομυελίνωσης είναι σημαντική διότι η απώλεια της μυελίνης πυροδοτεί μηχανισμούς προσαρμογής από τον άξονα, σημαντικότερος των οποίων είναι η εμφάνιση κατά μήκος του απομυελινωμένου άξονα ιοντικών διαύλων, με στόχο την αποκατάσταση της αγωγής. Το μέγεθος της βλάβης είναι επίσης σημαντικό επειδή οι άξονες φαίνεται ότι αποκαθιστούν τη βλάβη με κεντρομόλα κατεύθυνση, επομένως μεγάλες εκτάσεις απομυελίνωσης αποκαθίστανται με αργότερο ρυθμό. Η πιθανότητα λειτουργικής αποκατάστασης είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος της βλάβης. Πλήρης απώλεια της μυελίνης μεταξύ 2 περισφίξεων είναι αρκετή για να προκαλέσει μπλοκ αγωγής, αλλά και η μερική λέπτυνση της μυελίνης κατά μήκος αυτής της περιοχής μπορεί επίσης να οδηγήσει σε αποτυχία αγωγιμότητας. Η συμμετοχή της περιοχής περί των περισφίξεων του Ranvier και η επακόλουθη πάχυνση των περισφίξεων οδηγούν πάντα σε μπλοκ αγωγής. Από πειραματικά μοντέλα έχει φανεί ότι η τμηματική απώλεια της μυελίνης (μεταξύ 2 περισφίξεων) οδηγεί πάντα σε μπλοκ αγωγής η οποία παραμένει αρκετές ημέρες. Αυτό το χρονικό διάστημα σχετίζεται με την αρχική ελαχιστοποίηση των ιόντων νατρίου στο υποκείμενο εκτεθειμένο αξονόπλασμα και η μικρή συγκέντρωση ιόντων νατρίου πιθανότατα είναι ανεπαρκής για την αγωγή της ώσης Πάχυνση των περισφίξεων Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι μερικές περισφίξεις είναι παθολογικά διευρυμένες στις βλάβες της ΣΚΠ λόγω απομυελίνωσης γύρω από τις περισφίξεις ή υποχώρησης των περιοχών παρά των περισφίξεων. Εργαστηριακές εργασίες δείχνουν ότι αυτές οι αλλαγές είναι ικανές να προκαλέσουν μπλοκ αγωγής. Η μυελίνη φυσιολογικά βοηθάει τον περιορισμό της αγωγής του δυναμικού ενεργείας σε μια μικρή περιοχή του αξονοπλάσματος στην περίσφιξη του Ranvier, αλλά σε 58

59 απουσία της μυελίνης το ρεύμα διαχέεται σε μεγαλύτερη επιφάνεια της μεμβράνης του άξονα. Επίσης, η χωρητικότητα της μεμβράνης αυξάνεται, με αποτέλεσμα να αυξάνεται και το τοπικό ρεύμα που χρειάζεται για να εκπολώσει τη μεμβράνη Απώλεια των διαύλων νατρίου στις περισφίξεις του Ranvier Το πειραματικό μοντέλο της αυτοάνοσης νευρίτιδας προτείνει την απώλεια των διαύλων νατρίου από τις περισφίξεις του Ranvier, γεγονός που πιθανότατα τις καθιστά ανερέθιστες και οδηγεί σε μπλοκ αγωγής. Χρονικά σχετίζεται η απώλεια των διαύλων με την εμφάνιση των κλινικών συμπτωμάτων, αλλά ο μηχανισμός είναι άγνωστος. Πιθανές εξηγήσεις περιλαμβάνουν μοριακή μίμηση ανάμεσα στο αντιγόνο και τους διαύλους νατρίου, τραύμα μέσω του συμπληρώματος, και εσωτερίκευση των διαύλων. Εάν παρόμοια γεγονότα λαμβάνουν χώρα και στη ΣΚΠ, είναι άγνωστο. Όπως αναφέρθηκε, η απώλεια της μυελίνης οδηγεί σε αποτυχία μετάδοσης του δυναμικού ενεργείας και αυτό μεταφράζεται σε εμφάνιση κλινικών υποτροπών. Αλλά η αγωγή του ερεθίσματος κατά μήκος του άξονα μπορεί να επανέλθει ως αποτέλεσμα της έκφρασης νέων διαύλων νατρίου κατά μήκος των απομυελινωμένων αξόνων, παρέχοντας υπόστρωμα για ύφεση των συμπτωμάτων 77,88. Η αύξηση της πυκνότητας των διαύλων νατρίου μπορεί όμως να αποτελέσει, εκτός από ένα μηχανισμό προσαρμογής και διάσωσης, ένα δυσλειτουργικό μηχανισμό εισαγωγής ασβεστίου στον άξονα, η οποία κατ επέκταση θα ενεργοποιήσει μια αλυσίδα άλλων μορίων (όπως πρωτεάσες και λιπάσες) καταστροφικών για αυτόν 88. Παρατηρήθηκαν επίσης αλλαγές στην έκφραση των διαύλων νατρίου στους απομυελινωμένους άξονες της ΣΚΠ 77. Συγκεκριμένα, ενώ οι δίαυλοι Na v 1,6 εντοπίζονται σχεδόν αποκλειστικά στις περισφίξεις του Ranvier, στις οξείες πλάκες της ΣΚΠ, ανευρέθηκε διάχυτη κατανομή των διαύλων Na v 1,6 και Na v 1,2 κατά μήκος των απομυελινωμένων αξόνων 77,84. Επίσης, βρέθηκε ότι ο δίαυλος Na v 1,6, ο οποίος προκαλεί συνεχές ρεύμα νατρίου, και η αντλία ανταλλαγής νατρίου/ασβεστίου, η οποία οδηγείται από το συνεχές ρεύμα νατρίου στην είσοδο καταστροφικών επιπέδων ασβεστίου στον άξονα, συνυπάρχουν με τη β-πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς, η οποία και αποτελεί δείκτη αξονικής βλάβης, στις οξείες βλάβες της 59

60 ΣΚΠ 77,84,85. Η ταυτόχρονη έκφραση του διαύλου Na v 1,6 και της αντλίας ανταλλαγής Na + /Ca 2+ είναι συνδεδεμένη με αξονική εκφύλιση. Επιπρόσθετα η Na + /Κ + ATPase, η οποία εντοπίζεται σε μεγάλη έκταση του άξονα μεταξύ των περισφίξεων σε φυσιολογικούς άξονες, ανιχνεύεται σε σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης στις οξείες βλάβες της ΣΚΠ. Αυτό δεν ισχύει στις χρόνιες εστίες, οπού τα επίπεδα είναι σαφώς ελαττωμένα ή και απόντα σε ορισμένες περιπτώσεις Παράγοντας ασφαλείας για την αγωγή του νευρικού ερεθίσματος Ο παράγοντας ασφαλείας (ΠΑ) είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την κατανόηση των ελλειμμάτων αγωγής στη ΣΚΠ. Ορίζεται ως «το διαθέσιμο ρεύμα για την εκπόλωση του αξονοπλάσματος, διαιρούμενου διά του απαραίτητου ρεύματος για να συμβεί αυτό». Οι φυσιολογικοί άξονες έχουν ΠΑ 3-5, δηλαδή το δυναμικό ενεργείας σε μία μεμονωμένη περίσφιξη δημιουργεί περίπου 3-5 φορές περισσότερο ρεύμα από το απαιτούμενο για να πυροδοτηθεί η επόμενη περίσφιξη κατά μήκος του άξονα. Στους απομυελινωμένους άξονες ο ΠΑ μειώνεται γύρω στη μονάδα. Είναι αυτονόητο ότι εάν οι συνθήκες είναι ευνοϊκές (ΠΑ>1,0) η αγωγή θα είναι επιτυχής, ενώ αντίθετα εάν αντίξοες συνθήκες μειώνουν τον ΠΑ, τότε δεν ευοδώνεται η αγωγή του ερεθίσματος. Εάν ληφθεί υπ όψιν ότι πολλοί άξονες σε μία βλάβη έχουν ΠΑ κοντά στη μονάδα, είναι επόμενο ότι μικρές αλλαγές στο περιβάλλον των αξόνων μπορεί να επιφέρουν σοβαρές επιπτώσεις στην εμφάνιση των συμπτωμάτων. Η θερμοκρασία είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας που επιδρά στον ΠΑ και την εμφάνιση συμπτωμάτων ενώ και η διάσπαση του ΑΕΦ μπορεί επιφέρει αλλαγές στο μικροπεριβάλλον των αξόνων και να επηρεάσει την αγωγή Ο ρόλος της δυσλειτουργίας της γλοίας Η δυσλειτουργία των γλοιακών κυττάρων είναι πιθανό να επηρεάζουν σημαντικά την ικανότητα αγωγής της ώσης στους άξονες. Τα αστροκύτταρα παίζουν καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του εξωκυττάριου περιβάλλοντος στο ΚΝΣ. Τα αστροκύτταρα είναι σαφώς διαταραγμένα στις βλάβες της ΣΚΠ, και αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της ιοντικής ισορροπίας στο 60

61 μικροπεριβάλλον των απομυελινωμένων αξόνων. Το πρόβλημα αυτό συνδυάζεται και με τις αλλαγές στον ΑΕΦ. Επιπλέον, οι νευράξονες που απειλούνται από ένα φλεγμονώδες περιβάλλον είναι πιθανό να εξαρτώνται από αυξητικούς και τροφικούς παράγοντες που προσφέρονται από τα κύτταρα της γλοίας. Τα αστροκύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην οργάνωση των ιοντικών διαύλων κατά μήκος της μεμβράνης των αξόνων. Συναθροίσεις διαύλων νατρίου συχνά έρχονται σε άμεση επαφή με τις αποφυάδες των αστροκυττάρων. Οι περιελύξεις της μυελίνης γύρω τις περισφύξεις του Ranvier είναι φυσιολογικές σε άμεση επαφή με το αξονόπλασμα και αυτή η αλληλεπίδραση είναι μεγάλης σημασίας τόσο στη διατήρηση συγκεκριμένης οργάνωσης των διαύλων, όσο και στην εξασφάλιση της αγωγής του ερεθίσματος. Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτές οι στενές επαφές διακόπτονται στις περισφίξεις κοντά στα όρια των βλαβών της ΣΚΠ, με επακόλουθη διαταραχή στη λειτουργία του άξονα Ο ρόλος της φλεγμονής Η φλεγμονή μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο κι ίσως τον πιο καθοριστικό, στην πρόκληση παροδικών συμπτωμάτων. Ενώ παλαιότερα λειτουργικά ελλείμματα αποδίδονταν σχεδόν αποκλειστικά στην απομυελίνωση, φαίνεται ότι μερικές υποτροπές (κυρίως οι σύντομες) εξαρτώνται πλήρως από φλεγμονώδεις μεσολαβητές. Νέα δεδομένα από υλικό αυτοψίας, υποστηρίζουν ότι η φλεγμονή είναι ικανή από μόνη της να προκαλέσει κλινικά ελλείμματα χωρίς τη συμμετοχή της απομυελίνωσης Οίδημα Η ανάπτυξη του οιδήματος χρησιμοποιήθηκε για να δικαιολογήσει έκπτωση της λειτουργικότητας και αποκατάστασή της στη ΣΚΠ. Πρέπει να σημειωθεί ότι δεν είναι γνωστό με ποιο τρόπο επηρεάζει η αύξηση του εξωκυττάριου υγρού την αγωγή του ερεθίσματος ή εάν αλλάζει η σύνθεση των ιόντων από το οίδημα και τη διάσπαση της μυελίνης. Το οίδημα δεν θεωρείται σοβαρός παράγοντας πρόκλησης μπλοκ αγωγής, εκτός από τις περιπτώσεις οπού πιέζει νευρικές δομές σε ανένδοτους χώρους. 61

62 Ο ρόλος των Τ κυττάρων και των διαλυτών μεσολαβητών τους Η διήθηση των βλαβών από τα CD4 και CD8 Τ λεμφοκύτταρα μπορεί άμεσα να επηρεάσει την αγωγή της ώσης κατά μήκος του νευράξονα. Οι μελέτες υπήρξαν αντικρουόμενες για το κατά πόσο είναι ικανά τα Τ λεμφοκύτταρα να προκαλέσουν μπλοκ αγωγής. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι τα ενεργοποιημένα γδ Τ κύτταρα (αλλά όχι τα αβ Τ κύτταρα) τα οποία ανασύρθηκαν από το ΕΝΥ ή το περιφερικό αίμα ασθενών με ΣΚΠ, μπορούν να εμποδίσουν τη μετάδοση του ερεθίσματος σε οπτικό νεύρο μυός. Το μπλοκ αγωγής σημειώθηκε 6 ώρες μετά, διήρκησε σε μεγάλο βαθμό 19 ώρες αργότερα και φαίνεται ότι συμβαίνει σε συνδυασμό με την καταστροφή του άξονα και της μυελίνης. Σε in vivo μελέτες, τα CD8 Τ κύτταρα έχουν εμπλακεί στην πρόκληση νευρολογικών ελλειμμάτων σε μύες μολυσμένους με τον ιό Theiler murine encephalomyelitis μέσω της έκκρισης περφορίνης 1,83. Αυτή παράγεται από τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και δημιουργεί οπές στις μεμβράνες των κυττάρων στόχος, με αποτέλεσμα τα κύτταρα αυτά να πεθαίνουν λόγω διαταραχής της ισορροπίας των ιόντων και της οσμωτικής ομοιόστασης. Επίσης, μία πρόσφατη μελέτη με τη χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου αποκάλυψε ότι τα Τ κύτταρα έρχονται σε άμεση επαφή με το σώμα ή τις αποφυάδες των νευρώνων 1,65. Αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να καταλήξει σε εμμένουσα εισαγωγή και υπερφόρτωση ασβεστίου στους νευρώνες, ενδεικτικό κυτταρικού θανάτου 1, Ο ρόλος του μονοξειδίου του αζώτου (ΜΟ) Το ένζυμο επαγόμενη συνθετάση του νιτρικού μονοξειδίου (inducible nitric oxide synthase-inos) βρίσκεται σε αφθονία ειδικά στις ενεργές φλεγμονώδεις βλάβες της ΣΚΠ. Αυτή η μορφή του ενζύμου είναι υπεύθυνη για τη συνεχή παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου, και σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Υπάρχουν ενδείξεις ότι το ΜΟ είναι παρόν στις βλάβες της ΣΚΠ, ακόμα και στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή ουσία. Το ΜΟ θεωρείται ότι μπορεί να δράσει σαν τοπικό αναισθητικό προκαλώντας αναστρέψιμη διακοπή της αγωγής του ερεθίσματος κατά μήκος του άξονα. Δεδομένου ότι το ΜΟ είναι παρόν σε πολλές βλάβες της ΣΚΠ, λογικά προκύπτει ότι θα μπορούσε να ενοχοποιηθεί για συνεισφορά στην επιδείνωση των συμπτωμάτων κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου. Ο πιθανότερος μηχανισμός 62

63 πρόκλησης μπλοκ αγωγής θεωρείται η διαταραχή της λειτουργίας των διαύλων νατρίου, οι οποίοι αποτελούν τον θεμέλιο λίθο για τη μετάδοση του ερεθίσματος. Επίσης, η δράση του ΜΟ μπορεί να συντελείται μέσω επίδρασης στους διαύλους καλίου και ασβεστίου, επεμβαίνοντας τόσο στην ομαλή λειτουργία του άξονα όσο και τη σύναψη. Επιπρόσθετα, το ΜΟ μπορεί να ασκεί τη δράση του εκπολώνοντας τους άξονες είτε μέσω του cgmp, είτε με απευθείας δράση στην αντλία Na + /K + ATPase. Το ΜΟ μπορεί επίσης, να διαταράξει τον μεταβολισμό των μιτοχονδρίων, μειώνοντας την παραγωγή ATP σε επίπεδα χαμηλότερα των απαιτούμενων για τη διατήρηση της κατάλληλης ιοντικής ισορροπίας στην αγωγή του ερεθίσματος. Το ΜΟ δύναται να τροποποιήσει τις βιολογικές ιδιότητες της γλοίας κι, αν ληφθεί υπ όψιν η συμβολή τους στη ρύθμιση της ιοντικής δραστηριότητας και της διάθεσης των νευροδιαβιβαστών, είναι κατανοητό ότι μπορεί να μεταβάλλει τις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των αξόνων. Το ΜΟ μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία των αξόνων της φαιάς ουσίας, δεδομένου ότι πολλές εστίες φλεγμονής εντοπίζονται σε αυτή. Είναι δυνατόν να προκαλέσει τόσο διέγερση όσο και καταστολή της αυτόματης δραστηριότητας των νευρώνων του νωτιαίου μυελού και να επέμβει στη λειτουργία της σύναψης. Φυσιολογικά, παράγεται ΜΟ σε χαμηλές ποσότητες για τη ρύθμιση της λειτουργίας της σύναψης και την πλαστικότητα της σύναψης. Η παραγωγή μεγαλύτερων συγκεντρώσεων ΜΟ υπερνικούν τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς απομάκρυνσής του. Ο διττός χαρακτήρας του ΜΟ το καθιστά δύσκολο θεραπευτικό στόχο Κυκλοφορόντες παράγοντες που διαταράσσουν την αγωγή του ερεθίσματος Υπάρχουν υποψίες ότι εξωκυττάριοι παράγοντες είναι παρόντες στις βλάβες της ΣΚΠ και διαταράσσουν τη νευροφυσιολογική λειτουργία. Δεν επικρατεί ομοφωνία στην ταυτοποίηση και το βαθμό συμμετοχής στη διατάραξη της νευροφυσιολογικής λειτουργίας, αλλά προς το παρόν θεωρείται ότι δυνητικά μπορεί να συμβάλλουν προς αυτή την κατεύθυνση. 63

64 Ενδοκαΐνη (QYNAD) Είναι ένα πενταπεπτίδιο (γλυκίνη-τυροσίνη-αsn-αλανίνη-ασπαρτικό), το οποίο βρέθηκε κυρίως στο ΕΝΥ ασθενών με ΣΚΠ και σύνδρομο Guillain-Barré. Σε συγκεντρώσεις που συναντώνται ενδογενώς έχει αναισθητική δράση στους διαύλους νατρίου. Τα στοιχεία αυτά δεν αναπαράχθηκαν σε άλλες μελέτες, αλλά δεδομένα από ανέκδοτες έρευνες υποδηλώνουν ότι μπορεί να προκαλέσει μπλοκ αγωγής Αντισώματα Είναι πιθανό τα αντισώματα να συμμετέχουν απευθείας στη διαταραχή της αγωγής του ερεθίσματος, μέσω της δέσμευσής τους σε ιοντικούς διαύλους ή μέσω κάποιων μορίων. Δεν έχουν αναγνωριστεί ακόμα αντισώματα που να επηρεάζουν την αγωγή του ερεθίσματος στη ΣΚΠ, αλλά σαφή στοιχεία υπάρχουν όσον αφορά στην επίδραση των αντισωμάτων στις νευροφυσιολογικές ιδιότητες των νευρώνων του ΚΝΣ στη μυελοπάθεια από τον ιό HTLV-1. Επίσης, έχουν βρεθεί αντιγαγγλιοσιδικά αντισώματα σε μερικούς ασθενείς με ΣΚΠ, κυρίως σε αυτούς με σημαντική αξονική βλάβη και κάποιες μελέτες έχουν δείξει ότι μπορεί να επηρεάσουν την αγωγή του ερεθίσματος στους περιφερικούς νευρώνες. Τα αντισώματα, εμμέσως, θα μπορούσαν να δράσουν με ποικίλους τρόπους, είτε προκαλώντας απομυελίνωση, είτε διαταράσσοντας το εξωκυττάριο μικροπεριβάλλον μέσω της διάσπασης του ΑΕΦ Κυτταροκίνες Στις ενεργές βλάβες της ΣΚΠ η φλεγμονώδης αντίδραση είναι έντονη και η παρουσία των κυτταροκινών στο ΕΝΥ είναι εκσεσημασμένη, όπως οι ιντερλευκίνες IL-1β, IL-2, IL-6 και ο παράγοντας TNF-α. Η IL-1β και ο TNF-α έχουν βρεθεί και στις πλάκες της ΣΚΠ. Η δράση τους ασκείται είτε επιδρώντας απευθείας στις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των νευρώνων και των αξόνων, είτε επιφέροντας αγγειακές αλλαγές. Οι TNF-α και IFN-γ είναι ισχυροί επαγωγείς της inos κι επομένως, μέσω της παραγωγής του ΜΟ, μπορούν να βλάψουν τη λειτουργία του άξονα, αλλά είναι επίσης ικανές να επηρεάσουν τις αντλίες ιόντων. Στη φαιά ουσία έχει βρεθεί ότι οι ιντερλευκίνες IL-1β και IL-6 επιδρούν στη συναπτική μετάδοση. 64

65 Άμεση δράση των κυτταροκινών στην αγωγή του ερεθίσματος είναι δύσκολο να αποδειχτεί. Επίσης, οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές έχουν επίδραση και στα αστροκύτταρα και τη μικρογλοία, και κατ επέκταση στην ομαλή λειτουργία των νευρώνων Προσταγλανδίνες Είναι πιθανό οι προσταγλανδίνες να παίζουν κάποιο ρόλο στην τροποποίηση των ηλεκτροφυσιολογικών ιδιοτήτων των απομυελινωμένων αξόνων. Συγκεκριμένα η προσταγλανδίνη Ε 2 φάνηκε ότι επηρεάζει το ρεύμα νατρίου ανθιστάμενου στην τετραδοτοξίνη (tetrodotoxin-resistant sodium current) και το ρεύμα του καλίου στους νευρώνες, οδηγώντας σε αυξημένη ευερεθιστότητα μέσω ενδοκυττάριων οδών. Το αραχιδονικό οξύ (το οποίο μεταβολίζεται σε προσταγλανδίνες) καταστέλλει το ρεύμα καλίου, οδηγώντας σε διεύρυνση του δυναμικού ενεργείας. Αυτές οι παρατηρήσεις εγείρουν την υποψία ότι οι προσταγλανδίνες μπορεί να επηρεάζουν την αγωγή του ερεθίσματος στη ΣΚΠ Κλινικές εκδηλώσεις Συμπτώματα με τα οποία πρωτοεμφανίζεται η ΣΚΠ Τα συμπτώματα και σημεία της ΣΚΠ είναι ποικίλα και γενικά αντικατοπτρίζουν το μέγεθος της βλάβης των τμημάτων του ΚΝΣ στα οποία υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση των εμμύελων ινών που εξυπηρετούν τις κινητικές και αισθητικές λειτουργίες, όπως το στέλεχος, η παρεγκεφαλίδα και ο νωτιαίος μυελός (ν.μ.). Οι αρχικές εκδηλώσεις της ΣΚΠ έχουν μελετηθεί σε πολλές σειρές ασθενών, αλλά οι περισσότερες υπόκεινται σε μεροληπτικές διαδικασίες με συνέπεια να εξάγονται λάθος συμπεράσματα. Επίσης, από τους ασθενείς στους οποίους είχε γίνει πλήρης καταγραφή του πρώτου επεισοδίου προκύπτει ότι υπήρχε θολή ανάμνηση κάποιων συμπτωμάτων, που δεν είχαν αναφερθεί νωρίτερα και που είχαν ξεχαστεί. Είναι λογικό να υποτεθεί ότι όσο μεγαλύτερο χρονικό διάστημα έχει περάσει ανάμεσα στην έναρξη των συμπτωμάτων και την πρώτη επίσκεψη στο ιατρό τόσο περισσότερες θα είναι και οι ανακρίβειες στη λήψη του ιστορικού. Άλλος παράγοντας που επηρεάζει τη εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων είναι οι διαφορετικές μέθοδοι και κριτήρια που χρησιμοποιούνται στις διάφορες μελέτες. Ο 65

66 Mc Alpine (1972) σε μια ανασκόπηση προηγούμενα δημοσιευμένων μελετών βρήκε ότι η επίπτωση των αρχικών συμπτωμάτων ήταν περίπου η εξής 1 : μυϊκή αδυναμία σε ένα ή περισσότερα άκρα 35% οπισθοβολβική νευρίτιδα 20% (optic neuritis) παραισθησίες 20% διπλωπία 10% ίλιγγος 5% διαταραχές ούρησης 5% άλλα <5% Δεν ήταν βέβαια δυνατό να προσδιοριστούν παρεγκεφαλιδικά συμπτώματα από ασαφείς περιγραφές όπως έλλειψη ισορροπίας. Ο Mc Alpine και οι συνεργάτες του σε μια δική του σειρά ασθενών βρήκε διαφορετικά ποσοστά όπως αδυναμία 39%, παραισθησίες 40%, οπτική νευρίτιδα 29%. Η μεγαλύτερη διάκριση έγινε ανάμεσα σε πολυσυμπτωματική (55%) και μονοσυμπτωματική (45%) έναρξη. Στην πρώτη περίπτωση η αδυναμία συναντήθηκε στο 50%, ενώ στη δεύτερη σε ποσοστό μόνο 26%. Η οπτική νευρίτιδα υπήρξε το σύμπτωμα το οποίο εμφανίζεται πιο συχνά μόνο του, ενώ η παρεγκεφαλιδική αταξία παρουσιάζεται μαζί με μια πιο διάσπαρτη σημειολογία. Οι Sanders και Arts αναφέρουν μονοσυμπτωματική έναρξη σε ποσοστό 57% 1. Αντίθετα, ο Kurtzke και οι συνεργάτες βρήκαν αρχική συμμετοχή ενός μείζονος συστήματος (οριζόμενο ως κινητικό, αισθητικό, συνέργεια -co-ordination- ή στέλεχος) σε ποσοστό μόνο 14%. Η έκπτωση της οπτικής οξύτητας ήταν σπάνια. Οι πιο συχνοί συνδυασμοί ήταν η συμμετοχή και των τεσσάρων συστημάτων σε ποσοστό 14%, κινητικός και αισθητικός μηχανισμός 12%, συνέργεια και αισθητικός 12% και τέλος συνέργεια και στέλεχος 10%. Οι Paty και Poser, σε μια σειρά 461 ασθενών με διαγνωσμένη ΣΚΠ, συνάντησαν ως αρχικό σύμπτωμα την έκπτωση της όρασης στον ένα οφθαλμό σε ποσοστό 17%, διπλωπία 13%, αισθητικές διαταραχές 36%, διαταραχή ισορροπίας και βάδισης (μη καθοριζόμενης αιτιολογίας) 18% 1. Η αδυναμία αναφέρθηκε μόνο στην περίπτωση που ήταν προοδευτική (10%) και σε μια μικρή μειοψηφία ασθενών (6%) το αρχικό σύμπτωμα ήταν η οξεία μυελίτιδα. Το πρώτο επεισόδιο φαίνεται ότι ήταν μονοσυμπτωματικό στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. 66

67 Είναι αξιοσημείωτο το ότι, καθώς αυξάνεται η γνώση και η εμπειρία, η αναλογία των ασθενών που αναγνωρίζει αισθητικά και παροξυντικά συμπτώματα αυξάνεται Συμπτώματα και σημεία στην πορεία της νόσου Εκτιμήσεις για την επίπτωση του κάθε συμπτώματος ξεχωριστά μπορεί να γίνει μόνο κατά προσέγγιση. Τα στοιχεία που λαμβάνονται από το αρχείο των νοσοκομείων ή από πληθυσμιακές σειρές εξαρτώνται από τη διάρκεια της νόσου που ασφαλώς ποικίλλει ανάμεσα στους ασθενείς. Μια επιπλέον δυσκολία προκύπτει από τη διαλείπουσα φύση της νόσου, διότι αρκετά συμπτώματα μπορεί να μην καταγράφηκαν τη χρονική στιγμή της εξέτασης. Παρά τις δυσκολίες στην καταγραφή των συμπτωμάτων, τα αποτελέσματα σε τρεις σειρές ασθενών είναι συγκρίσιμα και συμφωνούν 1. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν οκτώ με δεκατέσσερα χρόνια. Η μυϊκή αδυναμία, ακολουθούμενη από αλλαγή των τενόντιων αντανακλάσεων, ήταν παρούσα σε ποσοστό περίπου 80%. Αισθητικές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων των παραισθησιών, παρατηρήθηκαν στο ίδιο περίπου ποσοστό. Σημεία παρεγκεφαλιδικής συμμετοχής, μερικές φορές συνδεδεμένα με συμπτώματα από το στέλεχος, ήταν λιγότερο συχνά. Οπτική νευρίτιδα βρέθηκε σε αναλογία 44% και 70% σε δύο άλλες σειρές. Διαταραχές στους σφιγκτήρες παρατηρήθηκαν σε ποσοστό 56-74%. Σημείααπό τις ανώτερες φλοιικές λειτουργίες, με κύρια εκδήλωση την έκπτωση των γνωσιακών λειτουργιών ήταν παρόντα σε ποσοστό 30%. Τα αποτελέσματα των Bauer και Hanefeld (1993) 1 είναι σε γενικές γραμμές σε συμφωνία με αυτές τις μελέτες, με τη διαφορά ότι στα αισθητικά συμπτώματα γίνεται ξεχωριστή αναφορά στα άνω και τα κάτω άκρα. Παράλληλα η συμπτωματολογία, συμπεριλαμβανομένων και των αρχικών ενοχλημάτων, είναι δυνατόν να διαφέρουν στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές. Επιδημιολογικές και περιγραφικές κλινικές μελέτες ανέδειξαν ότι η απομυελινωτική νόσος έχει διαφορετικό φαινότυπο στους μη καυκάσιους πληθυσμούς. Η πιο αξιοσημείωτη διαφορά είναι η μεγαλύτερη συχνότητα της οπτικο-νωτιαίας μορφής της νόσου στις Αφρικανικές και Ανατολικές(oriental) χώρες. Τα κλινικά κριτήρια για τη διάγνωση της Ο-Ν ΣΚΠ είναι τα εξής: κύρια συμπτώματα από τον νωτιαίο μυελό και τα οπτικά νεύρα, απουσία συμπτωμάτων από την παρεγκεφαλίδα και τα 67

68 εγκεφαλικά ημισφαίρια, λίγα ή καθόλου συμπτώματα από το στέλεχος και τέλος, δύο ή περισσότερες υποτροπές. Άλλες χαρακτηριστικές διαφορές της Ο-Ν ΣΚΠ και της ΥΔ-ΣΚΠ είναι η υψηλότερη αναλογία γυναικών-ανδρών, μεγαλύτερη συχνότητα υποτροπών, γρηγορότερη συσσώρευση αναπηρίας, μικρότερος αριθμός βλαβών στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου, μεγαλύτερες βλάβες στον νωτιαίο μυελό οι οποίες εκτείνονται σε περισσότερα μυελοτόμια, παρουσία κυττάρων και απουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και τέλος, απουσία του HLA DR15 αλληλίου. Η απομυελινωτική νόσος στην Αφρική, Ασία και τους Ανατολικούς-Orient και Αβορίγινες-Aboriginal πληθυσμούς είναι τυπικά η Ο-Ν μορφή, ενώ η κλασσική μορφή της ΥΔ-ΣΚΠ που συναντάται στους βόρειους Ευρωπαίους είναι ασυνήθης. Επιπρόσθετα, η παρεγκεφαλιδική συμμετοχή είναι σπάνια ακόμη και στις περιπτώσεις με ενδιάμεσο φαινότυπο Κινητικός μηχανισμός Έκπτωση της μυϊκής ισχύος Η κινητική αναπηρία απαντάται σε μεγάλο βαθμό, όπως έχει ήδη αναφερθεί, σε ασθενείς με ΣΚΠ. Οι κινητικές εκδηλώσεις απορρέουν από τη συμμετοχή διαφόρων συστημάτων, όπως το φλοίο-στελεχιαίο, φλοίο-νωτιαίο, παρεγκεφαλιδικών και αισθητικών οδών καθώς και από την επιρροή της κόπωσης και των από μέρα σε μέρα εναλλαγών στην επίδοση, στις οποίες οι απομυελινωμένοι νευρώνες του ΚΝΣ υπόκεινται. Η μυϊκή αδυναμία των άκρων είναι μόνιμο ενόχλημα στη νόσο. Συνηθέστερα προσβάλλονται αμφότερα τα δύο κάτω άκρα, ασύμμετρα κυρίως, και, σε μειούμενη συχνότητα, συναντάται αδυναμία του ενός κάτω άκρου, συνδυασμός ενός κάτω κι ενός άνω άκρου, σχεδόν πάντα σύστοιχα. Μυϊκή αδυναμία ενός άνω άκρου χωρίς συμμετοχή των κάτω άκρων είναι σπάνια, ενώ αδυναμία μόνο στα δύο άνω άκρα είναι εξαιρετικά σπάνια. Η αναπηρία των άκρων πολλές φορές απορρέει όχι μόνο από τη μυϊκή αδυναμία, αλλά από το συνδυασμό της με παρεγκεφαλιδική αταξία και διαταγμένη κιναισθησία. Αρχικά η μυϊκή αδυναμία μπορεί να παρουσιάζεται μόνο μετά από δραστηριότητα (προσπάθεια ή κόπωση), αλλά στη συνέχεια είναι μόνιμα παρούσα. 68

69 Οξεία εγκάρσια προσβολή του νωτιαίου μυελού είναι ασυνήθης, αλλά μικρότερου βαθμού μυϊκή αδυναμία, αποτέλεσμα προσβολής του νωτιαίου μυελού, μπορεί να εγκατασταθεί γρήγορα ή ακόμα και αιφνιδίως. Αρκετές φορές προκύπτει διαφοροδιαγνωστικό πρόβλημα όταν εγκαθίσταται οξεία ή προοδευτικά επιδεινούμενη ημιπάρεση, το οποίο μερικώς μπορεί να λυθεί με τη χρήση της μαγνητικής τομογραφίας (προσομοιάζει με ισχαιμικό ΑΕΕ). Επίσης, ημιπληγία στη ΣΚΠ είναι δυνατόν να παρουσιαστεί αιφνιδίως. Η συνηθέστερη μορφή ημιπάρεσης στη ΣΚΠ ξεκινάει με αδυναμία ενός κάτω άκρου, που σταδιακά επεκτείνεται στο σύστοιχο χέρι αλλά όχι το πρόσωπο. Καθώς η ώση εξελίσσεται, εμφανίζεται αδυναμία και στο αντίστοιχο κάτω άκρο υποδηλώνοντας προσβολή του αυχενικού ν.μ. Χαρακτηριστικό πολλών συμπτωμάτων της νόσου, κυρίως της μυϊκής αδυναμίας και των οφθαλμικών ενοχλημάτων, είναι η επιδείνωση αυτών με τη θερμότητα, πολλές φορές σε σοβαρό βαθμό. Αυτό δεν αποτελεί παθογνωμικό σημείο της νόσου, αλλά σίγουρα είναι ισχυρή ένδειξη προς αυτή την κατεύθυνση Αναπνευστική αδυναμία Ο Kurtzke (1970) έδωσε ιδιαίτερη βαρύτητα στην οξεία αναπνευστική αδυναμία ως αιτία θανάτου στη ΣΚΠ. Δεν είναι σύνηθες, αλλά καλό είναι λαμβάνεται υπ όψιν στις περιπτώσεις οξείας επιδείνωσης, ιδίως όταν υπάρχει συμμετοχή των άνω άκρων. Τα προειδοποιητικά σημεία αυτής είναι η ρηχή αναπνοή και ο εμφανής περιορισμός των αναπνευστικών κινήσεων. Απεικονιστικό εύρημα αποτελεί η ύπαρξη απομυελινωτικής εστίας στη μέση γραμμή του προμήκη, ενώ δεν αποκλείεται, σε κάποιες περιπτώσεις, η διαταραχή του κεντρικού ελέγχου της αναπνοής Κινητικές οδοί Η μυϊκή αδυναμία των άκρων συνοδεύεται συνήθως από σημεία προσβολής του ανώτερου κινητικού νευρώνα, τα οποία πολλές φορές ανευρίσκονται και σε ασθενείς με φυσιολογική μυϊκή ισχύ. Απουσία των κοιλιακών αντανακλάσεων ανευρίσκεται σε ποσοστό 67% περίπου. Προοδευτική σπαστική πάρεση ενός κάτω άκρου πολλές φορές συνοδεύεται από εκτατικό πελματιαίο αντανακλαστικό στο 69

70 άλλο κάτω άκρο, ακόμα κι αν ο ασθενής αρνείται την ύπαρξη συμπτωμάτων. Συχνά επίσης ανευρίσκεται ασυμμετρία των τενόντιων αντανακλάσεων στα άνω άκρα, ενδεικτική ανωμαλίας. Τα τενόντια αντανακλαστικά των κάτω άκρων μπορεί να καταστούν κλονικά, όπως συχνά υπάρχει κλόνος στην απότομη ραχιαία κάμψη της ποδοκνημικής άρθρωσης ή λιγότερο συχνά επιγονάτιος κλόνος. Αυτόματος κλόνος παρατηρείται όταν κατεβαίνουν το πεζοδρόμιο ή ένα σκαλοπάτι, λόγω της σπαστικότητας του πέλματος του ποδιού Σπαστικότητα Αυτή ορίζεται ως αυξημένη αντίσταση στην ταχεία παθητική κίνηση των μελών, και συσχετίζεται με την ανάπτυξη εκβλαστήσεων από κατιόντες κινητικές οδούς, για να σχηματίσουν νέες συνάψεις με νωτιαίους νευρώνες, και με την υπερδιεγερσιμότητα λόγω απονεύρωσης. Η σπαστικότητα αποτελεί μόνο ένα από τα σημεία προσβολής του ανώτερου κινητικού νευρώνα, δεδομένου ότι η βλάβη των κατιόντων κινητικών οδών προκαλεί επίσης έκπτωση της μυϊκής ισχύος και βραδύτητα των κινήσεων, εικόνα όμως που επισκιάζεται συνήθως από τη σπαστικότητα. Στην πράξη, η έννοια της σπαστικότητας επεκτείνεται πέρα από την αντίσταση στην παθητική κίνηση των μελών, για να συμπεριλάβει μια πολύπλοκη διαταραχή των εκούσιων κινήσεων και αλλαγών στους μυς και τους τένοντες. Η σπαστικότητα, περισσότερο από την έκπτωση της μυϊκής ισχύος ευθύνεται για την αναπηρία που προκαλείται από τη βλάβη του ανώτερου κινητικού νευρώνα στη ΣΚΠ, ιδιαίτερα όταν προσβάλλονται τα κάτω άκρα. Ο τόνος αυξάνεται και στα άνω άκρα, αλλά σπάνια παρατηρείται η χαρακτηριστική θέση που λαμβάνει το άνω άκρο στην ημιπληγία με κάμψη στον αγκώνα, στον καρπό και στα δάχτυλα μετά από αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο. Βέβαια στην προϊούσα φάση της νόσου αυξημένος εκτατικός τόνος μπορεί να εκδηλώνεται ως εκτατικοί σπασμοί που τείνουν να συμβαίνουν πιο συχνά κατά τη διάρκεια της νυκτερινής κατάκλισης ή κατά την πρωινή αφύπνιση. Τα πόδια έχουν την εικόνα ενός δύσκαμπτου εκτατικού ποδιού με πελματιαία κάμψη διάρκειας αρκετών λεπτών. Οι σπασμοί προκαλούν δυσφορία, αλλά σπάνια είναι επώδυνοι. Αργότερα, στην πορεία της νόσου, αλλαγή της ισορροπίας ανάμεσα σε ανασταλτικές και ευοδωτικές ώσεις πάνω σε καμπτικά αντανακλαστικά έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση των καμπτικών σπασμών. Όταν 70

71 στη συνέχεια κυριαρχεί ο καμπτικός τόνος παρατηρούνται απότομες πτώσεις χωρίς προειδοποίηση. Σε αντίθεση με τους εκτατικούς σπασμούς, οι καμπτικοί είναι συχνά επώδυνοι. Ο σπασμός των προσαγωγών εμφανίζεται όταν υπάρχει ο εκτατικός αλλά παραμένει και στον καμπτικό αυξάνοντας τη νοσηρότητα. Παράλληλα οι τενόντιες αντανακλάσεις μπορεί να είναι νωθρές ή και κατηργημένες. Αυτό εξηγείται από την ανεύρεση εστιών στη θέση εισόδου της οπίσθιας ρίζας στον ν.μ. και τη φαιά ουσία του ν.μ. Μυϊκή ατροφία συναντάται αργά μόνο στην πορεία της νόσου και πιο συχνά στα άνω άκρα ΣΚΠ και περιφερική νευροπάθεια Δεδομένου ότι και οι δύο οντότητες δεν είναι ασυνήθεις, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι μπορεί να συνυπάρχουν. Υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν τη βλάβη των περιφερικών νεύρων σε ασθενείς με ΣΚΠ. Αντίθετα, άλλοι ερευνητές περιγράφουν περιστατικά ασθενών με χρόνια απομυελινωτική πολυνευροπάθεια οι οποίοι παρουσίασαν συμπτώματα από το ΚΝΣ και οι οποίοι πληρούν τα κριτήρια για ΣΚΠ. Προφανώς, η ανοσολογική αντίδραση κατευθύνθηκε σε ένα αντιγόνο κοινό ανάμεσα στη μυελίνη του ΚΝΣ και του ΠΝΣ Κόπωση Η εύκολη κόπωση είναι ένα συχνό ενόχλημα των ασθενών με ΣΚΠ. Παρά το γεγονός ότι η φυσική αναπηρία μπορεί να συνεισφέρει σε αυτήν την κατάσταση, δεν εξηγεί πλήρως γιατί παρατηρείται και σε άτομα με ήπια αναπηρία. Το πιο συχνό ενόχλημα είναι το αίσθημα κόπωσης που συνοδεύει τις συνήθεις καθημερινές δραστηριότητες. Επίσης, πολλές φορές εμφανίζεται σε εντονότερο βαθμό άσχετα με δραστηριότητες και κατά τη διάρκεια μιας υποτροπής της νόσου. Τα συμπτώματα τείνουν να είναι πιο έντονα κατά τις πρώτες απογευματινές ώρες. Ο ακριβής μηχανισμός δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως αλλά έχουν ενοχοποιηθεί πολλαπλοί παράγοντες Παρεγκεφαλιδική συμπτωματολογία Σημεία παρεγκεφαλιδικής προσβολής είναι αρκετά συχνά στη ΣΚΠ. Πολλές φορές είναι δύσκολο να αξιολογηθούν λόγω συνυπάρξεως σπαστικότητας, μυϊκής 71

72 αδυναμίας, διαταραχής της εν τω βάθει αισθητικότητας και ιλίγγου. Παρεγκεφαλιδική σημειολογία κατά την έναρξη της νόσου δεν συναντάται συχνά. Σε αυτήν την περίπτωση τις περισσότερες φορές συνυπάρχει σημειολογία και από άλλα συστήματα. Ασθενής με αμιγώς παρεγκεφαλιδική σημειολογία είναι πιθανότερο να πάσχει από κάποια άλλη νόσο, και η διερεύνηση καλό είναι να προσανατολιστεί σε άλλη κατεύθυνση όπως κάποια κληρονομική νωτιοπαρεγκεφαλιδική αταξία. Η πρώιμη εμφάνιση παρεγκεφαλιδικών συμπτωμάτων είναι ενδεικτική πτωχής πρόγνωσης. Επιπλέον, τα συμπτώματα αυτά επιμένουν στον χρόνο και χαρακτηρίζονται από μερική ύφεση κατά κανόνα. Αστάθεια βάδισης, αταξία των άκρων και του κορμού, τρόμος της κεφαλής ( titubation ), νυσταγμός και δυσαρθρία είναι τα πιο συνήθη ευρήματα από την κλινική εξέταση προκαλώντας λειτουργική δυσκολία ανάλογα με την ένταση τους Διαταραχή της οφθαλμοκίνησης Οι ασθενείς χρησιμοποιούν ποικίλες εκφράσεις στην προσπάθειά τους να αποδώσουν διαταραχές από την οφθαλμοκίνηση και είναι δύσκολο κάποιες φορές να διασαφηνιστεί η συμμετοχή των οπτικών νεύρων. Βλάβες κατά μήκος των οδών του κεντρικού ελέγχου της οφθαλμοκίνησης ή των διαπυρηνικών συνδέσεων προκαλεί διπλωπία και διαταραχές στην ισορροπία. Διαταραχές στην οφθαλμοκίνηση μπορούν να προκύψουν από βλάβη στα εγκεφαλικά ημισφαίρια, την παρεγκεφαλίδα, το στέλεχος, το αιθουσαίο σύστημα ή τον ανώτερο αυχενικό μυελό. Η διπλωπία ως αρχικό σύμπτωμα ποικίλλει από 8% έως 22%, ενώ κατά τη διάρκεια της νόσου εμφανίζεται σε ποσοστό από 29% έως 39%. Η διπλωπία είναι συνήθως παροδικό σύμπτωμα και αποτέλεσμα διακοπής των στελεχιαίων κυκλωμάτων υπεύθυνων για τις συζυγείς κινήσεις και της σταθερής καθήλωσης, ιδιαίτερα της διαπυρηνικής οφθαλμοπληγίας. Μεμονωμένη βλάβη στο τρίτο, τέταρτο ή έκτο κρανιακό νεύρο στην έναρξη της νόσου είναι σπάνια αλλά συναντάται Στελεχιαίες βλάβες Λιγότερο συνήθη συμπτώματα από προσβολή του στελέχους αποτελούν το locked-in σύνδρομο και το πλάγιο προμηκικό σύνδρομο. Αναπνευστική ανεπάρκεια 72

73 από βλάβη στο αναπνευστικό κέντρο είναι σπάνια, αλλά έχει απαντηθεί. Επίσης επίμονος λόξυγγας έχει συναντηθεί σε ασθενείς με ΣΚΠ οι οποίοι είχαν βλάβες στο στέλεχος και χρησιμοποιήθηκε η καρβαμαζεπίνη, με επιτυχία σε μία περίπτωση, αλλά κατά πόσο ο λόξυγγας αποτελεί παροξυντικό σύμπτωμα αμφισβητείται. Σε άλλες περιπτώσεις θεραπευτικά έδρασε η χορήγηση κορτικοστεροειδών Αισθητικά συμπτώματα και σημεία Τα αισθητικά συμπτώματα είναι συχνά στην έναρξη ή κατά την πορεία της νόσου, σε αποκλειστικότητα ή σε συνδυασμό με άλλα ενοχλήματα. Συνήθως οι ασθενείς παραπονιούνται για δυσαισθησίες, όπως αιμωδία ή αίσθημα «μυρμηκιάσματος», οι οποίες εμφανίζονται σε ένα άκρο και επιδεινώνονται σε ένταση και έκταση για να συμπεριλάβουν και τα δύο άκρα. Στην περίπτωση των κάτω άκρων επεκτείνονται ως το περίνεο με διαταραχές στην ούρηση και την αφόδευση. Η εξέλιξη των συμπτωμάτων είναι ποικίλη, διότι εξαρτάται από την εντόπιση της βλάβης και την κατεύθυνση επέκτασης της. Παρά το γεγονός ότι μια αισθητική υποτροπή μπορεί να εμφανιστεί με πολλές παραλλαγές, διακρίνεται εύκολα από την περιγραφή του ασθενούς. Διαταραχές στην αισθητικότητα μπορεί να μην γίνουν αντιληπτές, όταν αφορούν την παλλαισθησία, ενώ διαπιστώνονται στην κλινική εξέταση. Διαταραχή στην παλλαισθησία προηγείται πολλές φορές των συμπτωμάτων από προσβολή των οπίσθιων δεσμών, τα οποία προκαλούν λειτουργική δυσκολία στον ασθενή. Συχνό παράπονο των ασθενών είναι η αδεξιότητα ενός άνω άκρου. Επίσης παρατηρείται αλλαγή στην αντίληψη του θερμού και του ψυχρού και υπαισθησία στο πρόσωπο, τον κορμό ή τα άκρα. Διαταραχή της αισθητικότητας φλοιικού τύπου είναι σπάνια, αλλά εμφανίζεται όταν υπάρχει μαζική απομυελίνωση των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, και δη των βρεγματικών λοβών. Ο πόνος είναι συχνό ενόχλημα, αλλά σε μικρό ποσοστό περιορίζει τις καθημερινές δραστηριότητες των ασθενών. Στα επώδυνα συμπτώματα ανήκουν η νευραλγία τριδύμου, το σημείο Lhermitte, η δυσαισθησία, η οσφυαλγία και οι επώδυνοι τονικοί σπασμοί. Χαρακτηριστικό και συχνό σημείο της ΣΚΠ αποτελεί το σημείο Lhermitte. Πρόκειται για αίσθημα ηλεκτρικού ρεύματος που διαπερνά τη σπονδυλική στήλη ή τα άκρα σε κάμψη της κεφαλής. Άλλο σημείο 73

74 προσβολής του αυχενικού μυελού αποτελεί το σημείο Bristow κατά το οποίο πυροδοτούνται συμπτώματα πυραμιδικής βλάβης σε κάμψη της κεφαλής και τα οποία εξαλείφονται με την έκταση αυτής Διαταραχές των ανώτερων φλοιικών λειτουργιών και του συναισθήματος Είναι ευρέως αποδεκτό ότι επηρεάζονται οι γνωστικές λειτουργίες στη ΣΚΠ. Εκτιμάται ότι ανέρχονται σε ποσοστό 45-65%, και κάνουν την παρουσία τους νωρίς στην πορεία της νόσου. Υπάρχει μεγάλη διαφοροποίηση ανάμεσα στους ασθενείς, αλλά κατά κανόνα, σε βάθος μιας δεκαετίας, σημειώνεται κάποιου βαθμού έκπτωση των νοητικών λειτουργιών, η οποία πιθανότατα συμβάλλει στη διαμάχη για το εάν η νοητική έκπτωση είναι μεγαλύτερη στην πρωτοπαθώς ή τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ. Ακόμη παρατηρείται διαταραχή της προσοχής, με οπτικά και ακουστικά ελλείμματα προσοχής και καθυστέρηση στην επεξεργασία των πληροφοριών. Όταν υπάρχει διαταραχή μνήμης, επηρεάζεται η πρόσφατη μνήμη. Συχνότερα επηρεάζονται η πρόσφατη μνήμη, η ευφράδεια λόγου, ο προγραμματισμός, η στρατηγική και η αφαιρετική σκέψη ενώ ο λόγος συνήθως διατηρείται με μικρά σημασιολογικά και περιφραστικά κατονομαστικά λάθη. Όσον αφορά στις συναισθηματικές διαταραχές, πιο συχνά απαντάται η κατάθλιψη από ότι η ευφορία. Η συχνότητα της κατάθλιψης στη ΣΚΠ και η δια βίου επίπτωση πλησιάζει το 50%. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων η κατάθλιψη είναι αντιδραστική. Το ερώτημα εάν αποτελεί άμεση συνέπεια των απομυελινωτικών βλαβών στον εγκέφαλο παραμένει ανοικτό. Η ΣΚΠ αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης ψυχιατρικής νόσου, συμπεριλαμβανομένης και της διπολικής διαταραχής, χωρίς να είναι δυνατόν να δοθεί σαφή εξήγηση. Επίσης έχει παρατηρηθεί μεγαλύτερη συχνότητα αυτοχειρίας σε ασθενείς με ΣΚΠ. Ένα οξύ ψυχωσικό επεισόδιο μπορεί να αποτελέσει την αρχική εκδήλωση της ΣΚΠ. Τέλος, κατά τη διάρκεια της νόσου είναι δυνατόν να εμφανιστεί ψυχιατρική νόσος προτείνοντας μια «αιτιολογική συσχέτιση» ανάμεσα στην παθογένεια της ΣΚΠ και του ψυχιατρικού νοσήματος. 74

75 Ασυνήθη συμπτώματα Αν και σπάνια, η εμφάνιση αφασίας έχει περιγραφεί. Απαντάται σε ασθενείς με μαζική απομυελίνωση στον εγκέφαλο, μιμούμενη την ανάπτυξη κακοήθους όγκου στις περιπτώσεις που προσβάλεται το επικρατητικό ημισφαίριο και είναι πιθανή η πλήρης ύφεση της αφασικής διαταραχής. Τα ποσοστά εμφάνισης επιληψίας σε ασθενή με ΣΚΠ ποικίλλουν, αλλά ανασκόπηση εικοσιεννέα μελετών ανέδειξε επίπτωση που ανέρχεται στο 2,3%. Το είδος των επιληπτικών κρίσεων που εμφανίζονται πιο συχνά, όταν η επιληψία αποδίδεται στη ΣΚΠ, είναι τονικοκλονικοί σπασμοί με ή χωρίς εστιακή έναρξη. Μπορεί να εκδηλωθεί όμως και με τη μορφή των εστιακών επιληπτικών κρίσεων και συνήθως απαντάει εύκολα στην αντιεπιληπτική αγωγή. Σπάνια, είναι δυνατόν να μιμηθεί νεοπλασματική εξεργασία εγκεφάλου, όταν τα συμπτώματα είναι ταχέως εξελισσόμενη ημιπληγία, εστιακές ή γενικευμένες επιληπτικές κρίσεις, αφασία σε προσβολή του επικρατητικού ημισφαιρίου, κεφαλαλγία και σύγχυση. Τέλος, διαταραχή του επιπέδου συνειδήσεως είναι σπάνιο στη ΣΚΠ Παροξυντικά συμπτώματα Τα παροξυντικά συμπτώματα αποτελούν την κλινική έκφραση των φυσιολογικών συνεπειών της απομυελίνωσης στην αγωγή των ερεθισμάτων, κατά μήκος των νευραξόνων. Πρόκειται για συμπτώματα σύντομα, συχνά στερεότυπα για κάθε ασθενή, τα οποία τυπικά συμβαίνουν πολλές φορές μέσα στην ημέρα, με συνολική διάρκεια του φαινομένου αρκετών ημερών ή εβδομάδων. Συνήθως πυροδοτούνται από κίνηση, αισθητικά ερεθίσματα ή την υπέρπνοια. Ελέγχονται εύκολα με αντιεπιληπτική αγωγή ή σταθεροποιητές της μεμβράνης. Η επίπτωση κυμαίνεται σε ποσοστό 8,6% περίπου. Υπάρχει η τάση να συμβαίνουν νωρίς στην πορεία της νόσου, καθώς επίσης και να εκδηλώνονται περισσότερες της μίας μορφές σε έναν ασθενή κατά τη διάρκεια της νόσου. Ανάμεσα σε αυτά τα συμπτώματα είναι η νευραλγία τριδύμου, ο συνδυασμός δυσαρθρίας και παρεγκεφαλιδικής αταξίας κι άλλοτε, αισθητικών συμπτωμάτων, τονικοί σπασμοί, δυσαισθητικά συμπτώματα και άλγος, κνησμός, διπλωπία, ακινησία των άκρων ή ακούσιες κινήσεις. 75

76 Οπτική νευρίτιδα Τα οπτικά νεύρα είναι επιρρεπή στη ΣΚΠ. Η επίπτωση της οπτικής νευρίτιδας σαν αρχική εκδήλωση της νόσου υπολογίζεται στο 20% για τους Ευρωπαίους. Η συχνότητά της κατά τη διάρκεια της νόσου δεν μπορεί να εκτιμηθεί με ακρίβεια. Η προσβολή του οπτικού νεύρου μπορεί να είναι ασυμπτωματική και να αποκαλυφθεί από τα παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά ή κατά τη βυθοσκόπηση. Η συχνότητα στα δύο φύλα δείχνει υπεροχή στο θήλυ, ενώ συμβαίνει με την ίδια συχνότητα και στους δύο οφθαλμούς. Άλγος μπορεί να προηγείται ή να συνοδεύει την έναρξη των οπτικών συμπτωμάτων και εμφανίζεται στο 90% περίπου των ασθενών. Είναι ήπιος, χαρακτηρίζεται δε από επιδείνωση κατά τις κινήσεις των οφθαλμών και αποδίδεται στη διάταση της σκληράς μήνιγγας γύρω από το οιδηματώδες και φλεγμένον οπτικό νεύρο. Συναντάται περισσότερο στην οπισθοβολβική νευρίτιδα. Η διαταραχή της όρασης παρατηρείται συνήθως κατά την αφύπνιση από τον νυκτερινό ύπνο κι εξελίσσεται σε χρονικό διάστημα λίγων ημερών, όχι περισσότερο από μία εβδομάδα. Το αρχικό σύμπτωμα είναι η θόλωση της όρασης ενώ η έκπτωση της οπτικής οξύτητας ποικίλλει από ελάχιστη έως πλήρη τύφλωση. Τα ευρήματα από τη βυθοσκόπηση κυμαίνονται από φυσιολογικά, οίδημα της οπτικής θηλής, σπανιότερα μικροαιμορραγίες, έως οπτική ατροφία. Ορισμένες φορές μπορεί να παραμείνουν διαταραχές του οπτικού πεδίου, τυπικότερα κεντρικό σκότωμα. Χαρακτηριστικό σημείο σε ασθενείς με ΣΚΠ είναι η κόρη Marcus Gunn. Η αποκατάσταση της οπτικής οξύτητας εκτείνεται, κατά μέσο όρο στους δύο μήνες, με μεγάλη διαφοροποίηση ανάμεσα στους ασθενείς. Η αντίληψη των χρωμάτων ανευρίσκεται επηρεασμένη συχνά σε ασθενείς με ΣΚΠ. Η διαδοχική προσβολή των δύο οφθαλμών πρέπει να διαφοροποιηθεί από την ταυτόχρονη οπτική νευρίτιδα. Είναι αρκετά συχνή η διαδοχική προσβολή των δύο οφθαλμών με μεσοδιάστημα κατά μέσο όρο τέσσερεις εβδομάδες έως τρεις μήνες. Η ταυτόχρονη προσβολή παραπέμπει στην οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτιδα η οποία σπάνια ακολουθείται από υποτροπή. Αρχικά υποστηρίχτηκε η άποψη ότι έναρξη της νόσου με οπτική νευρίτιδα προδιαθέτει σε καλοήθη πορεία, αλλά είναι πιθανό ότι η αρχική ήπια κλινική πορεία, μετά από μια οπτική νευρίτιδα, δεν διαφέρει από αυτή 76

77 που ακολουθεί άλλες μονοσυμπτωματικές εναρκτήριες μορφές, όπως στελεχιαίες βλάβες ή αισθητικά συμπτώματα Συμμετοχή των υπόλοιπων κρανιακών νεύρων Οσφρητικό νεύρο Ορισμένες φορές οι ασθενείς αναφέρουν οξεία απώλεια της όσφρησης. Αυτό μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια μίας ώσης μαζί με άλλα συμπτώματα και υποχωρεί με την ύφεση της υποτροπής Τρίδυμο νεύρο Εκτός από τη νευραλγία του τριδύμου, σπάνια παρατηρείται παράλυση της κινητικής μοίρας. Πιο συνηθισμένη είναι η παρουσία δυσαισθητικών συμπτωμάτων, ενώ το αντανακλαστικό του κερατοειδούς σπάνια καταργείται Προσωπικό νεύρο Η εμφάνιση της παράλυσης του προσωπικού νεύρου κατά τη διάρκεια της νόσου ποικίλλει στις διάφορες μελέτες από 3% έως 10 ή 20% ή μπορεί ακόμα να φτάσει το ποσοστό του 52%. Η πάρεση είναι ήπια, συνήθως περιφερικού τύπου και μπορεί να εμφανιστεί με πάρεση κι άλλων κρανιακών νεύρων. Διαταραχές στη γεύση μπορεί να παρατηρηθούν και σχετίζονται με προσβολή της μονήρους δεσμίδας Όγδοη συζυγία Έκπτωση της ακοής είναι δυνατόν να συμβεί στη ΣΚΠ. Συνήθως είναι οξεία στην έναρξη, έντονη, συνοδεύεται από εμβοές και ίλιγγο και μπορεί να προσβάλλει και τα δύο αυτιά. Στην κλινική εξέταση ανευρίσκονται τις περισσότερες φορές σημεία από την παρεγκεφαλίδα και το στέλεχος. Ο ίλιγγος αποτελεί συχνό σύμπτωμα της ΣΚΠ τόσο στην έναρξη όσο και στις υποτροπές. Στην πιο θορυβώδη μορφή του μπορεί να προσομοιάσει την αιθουσαία νευρωνίτιδα με οξεία έναρξη, εμέτους, κεφαλαλγία και μεγάλη δυσκολία στη βάδιση. Η διάρκεια των συμπτωμάτων ποικίλλει. 77

78 Κατώτερες εγκεφαλικές συζυγίες Δυσφαγία μπορεί να συναντηθεί σε οποιοδήποτε στάδιο της νόσου, αλλά είναι πιο συχνή σε προχωρημένες μορφές ενώ η δυσαρθρία είναι συνήθως αποτέλεσμα παρεγκεφαλιδικής ή πυραμιδικής βλάβης και λιγότερο συχνά συνέπεια στελεχιαίας βλάβης. Έκπτωση της αισθητικότητας του φάρυγγα είναι σπανιότερη Αυτόνομο νευρικό σύστημα (ΑΝΣ) Οι διαταραχές του ΑΝΣ επηρεάζουν σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών. Έχουν συνδυαστεί με βλάβες στον υποθάλαμο, το στέλεχος του εγκεφάλου και τον νωτιαίο μυελό. Υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι η διαταραχή του παρασυμπαθητικού συστήματος σχετίζεται με την εξέλιξη της αναπηρίας, ενώ η διαταραχή του συμπαθητικού συστήματος συσχετίζεται με την ενεργότητα της νόσου Ουροδόχος κύστη Η επιτακτική ούρηση, η συχνουρία και η ακράτεια είναι πιο συχνά συμπτώματα στη ΣΚΠ από τη δυσκολία στην έναρξη της ούρησης και την επίσχεση ούρων. Η σπαστική κύστη παριστά δυσλειτουργία στην πλήρωση της κύστης, που αντανακλά αδυναμία στη συγκράτηση των συσπάσεων του εξωστήρα μυ στο σημείο που χρειάζεται για να συγκεντρωθεί ουσιαστικός όγκος ούρων. Χαρακτηρίζεται από αυτόματη περιοδική κένωση (σε ακανόνιστα χρονικά διαστήματα και χωρίς προειδοποίηση), με ερεθίσματα από διάταση της κύστης ή με προκλητά από έξω ερεθίσματα στην κοιλιά, το περίνεο, τα κάτω άκρα κτλ. Η δυσενεργία εξωστήρα-έξω σφιγκτήρα αναφέρεται σε νευρογενή (πάνω από το επίπεδο του ιερού ν.μ.) διαταραχή στον μηχανισμό της κένωσης από σύσπαση του εξωστήρα συγχρόνως με σύσπαση του έξω σφιγκτήρα. Αυτή η κατάσταση συχνά συνδυάζεται με ατελή κένωση, αφήνοντας σημαντικό υπόλειμμα στην ουροδόχο κύστη. Η συχνότητα προσβολής της κύστης στη ΣΚΠ αυξάνει με την άνοδο της ηλικίας, τη διάρκεια της νόσου και τον βαθμό αναπηρίας. Γενικά, η παρουσία και η βαρύτητα της κυστικής δυσλειτουργίας είναι συνδεδεμένη με τον βαθμό σπαστικής παραπάρεσης. Δευτεροπαθής προσβολή των νεφρών είναι πλέον συχνή επιπλοκή. 78

79 Έντερο-Ορθό Περιστασιακή ακράτεια κοπράνων είναι αρκετά συχνή σε ασθενείς με ΣΚΠ, αλλά η επίμονη ακράτεια είναι ασυνήθης. Δυσκοιλιότητα, η οποία ορίζεται ως δύο ή λιγότερες κενώσεις εβδομαδιαίως, εμφανίζεται περίπου στο 43% των ασθενών. Η συνηθισμένη αύξηση της περισταλτικότητας του εντέρου μετά τα γεύματα βρέθηκε ότι είναι απούσα στα προχωρημένα στάδια της νόσου 1. Οι Wiesel και συνεργάτες (2001) υποστήριξαν ότι το 70% περίπου των ασθενών υποφέρει από δυσκοιλιότητα και/ή ακράτεια κοπράνων 1. Και τα δύο αυτά συμπτώματα προκαλούν ψυχολογική και κοινωνική αναπηρία. Παθοφυσιολογικά δεν έχουν εξηγηθεί πλήρως οι μηχανισμοί, αλλά φαίνεται ότι προσβολή του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού διακόπτει προσαγωγές και απαγωγές οδούς που εξυπηρετούν την ομαλή λειτουργία του εντέρου Σεξουαλική λειτουργία Η σεξουαλική λειτουργία επηρεάζεται σε μεγάλο ποσοστό ασθενών, ανδρών και γυναικών. Ο Miller και οι συνεργάτες βρήκαν αδυναμία στύσης σε ποσοστό 44%. Σε μια άλλη μελέτη (Minderhoud και συνεργάτες 1984) βρέθηκε ότι το 48% των ανδρών κάτω της ηλικίας των 50 είχαν σημαντικά σεξουαλικά προβλήματα, κυρίως αδυναμία στύσης, αλλά και δυσκολία εκσπερμάτισης και οργασμού 1. Ο ρόλος του ΑΝΣ σε αυτά τα προβλήματα είναι εμφανής από το γεγονός ότι είναι σε στενή σχέση με άλλες λειτουργικές διαταραχές. Υπάρχει σαφής συσχετισμός μεταξύ της διαταραχής στύσης και της ορθοκυστικής λειτουργίας, καθώς και την απουσία θερμορύθμισης στο κάτω ήμισυ του σώματος. O Betts και οι συνεργάτες του (1994) βρήκαν ότι η διαταραχή στύσης σχεδόν πάντα συνοδεύεται από διαταραχές στην ούρηση και σημεία προσβολής του ν.μ. Ο Zorzon και οι συνεργάτες του (2001) υποστήριξαν ότι με την πάροδο του χρόνου οι σεξουαλικές διαταραχές μεταβάλλονται ανεξάρτητα από τις κυστικές 1. Η σεξουαλική δυσλειτουργία είναι πιο δύσκολο να εκτιμηθεί στις γυναίκες, αλλά απουσία της επιθυμίας και αποτυχία οργασμού είναι συχνά παράπονα. Και στα δύο φύλα η αλλαγή της αισθητικότητας στη γεννητική περιοχή, η κόπωση και η σπαστικότητα των κάτω άκρων συνεισφέρουν στις σεξουαλικές δυσκολίες και αυτές οι δυσκολίες αυξάνονται με 79

80 την πάροδο του χρόνου. Στοιχεία από την ανάλυση MRI συσχετίζουν τη σεξουαλική δυσλειτουργία με την παρουσία ατροφίας στη γέφυρα Εφίδρωση Μερική ή ακόμα και εμφανής απουσία της θερμορυθμιστικής εφίδρωσης είναι συχνή στην εγκαταστημένη νόσο. Παρά την ύπαρξη αυτών των μεγάλων διαταραχών, δεν υπάρχει ένδειξη έντονης δυσφορίας από αποτυχία αποβολής θερμότητας. Υπερθερμία έχει σημειωθεί στη ΣΚΠ, αλλά δεν είναι σίγουρο ότι ήταν αποτέλεσμα της ανιδρωσίας Σύνδρομο Horner Σύνδρομο Horner έχει παρατηρηθεί σε σπάνιες περιπτώσεις ασθενών Καρδιαγγειακές διαταραχές Διαταραγμένες καρδιαγγειακές απαντήσεις σε διάφορα ερεθίσματα κατά τη διάρκεια εξετάσεων έχουν ανιχνευτεί σε μεγάλο ποσοστό ασθενών, αλλά σπάνια δίνουν συμπτώματα και εξελίσσονται με την πάροδο του χρόνου. Ορθοστατική υπόταση βρέθηκε στο 13% των ασθενών, αλλά συγκοπή μόνο σπάνια συμβαίνει. Παροξυσμική ή επίμονη κολπική μαρμαρυγή μπορεί να συμβεί στην περίπτωση ύπαρξης οξέων βλαβών στο στέλεχος. Οξύ νευρογενές πνευμονικό οίδημα, μη συνοδευόμενο από καρδιακή ανεπάρκεια είναι σπάνια εκδήλωση, ενώ μπορεί ακόμα να αποτελέσει και το πρωταρχικό σύμπτωμα Υποθάλαμος Ένας αριθμός περίεργων συμπτωμάτων αποδόθηκαν σε πιθανή προσβολή του υποθαλάμου στη ΣΚΠ. Αυτά περιλαμβάνουν αιφνίδια, μοιραία απίσχναση, οξεία κατάθλιψη με υπερθερμία, και απρόσφορη έκκριση αντιδιουρητικής ορμόνης, τα οποία συνοδεύονταν από πιο χαρακτηριστικά συμπτώματα της νόσου. Ο ύπνος διαταράσσεται συχνά λόγω της σπαστικότητας και των διαταραχών ούρησης αλλά δεν υπάρχουν ενδείξεις για διαταραχή του κιρκαδιανού κύκλου ύπνου-εγρήγορσης. 80

81 Σπάνιες εκδηλώσεις Η ΣΚΠ προκαλεί βλάβες σε οποιοδήποτε σημείο του ΚΝΣ, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφαλικού φλοιού, τους εν τω βάθει πυρήνες και τα πρόσθια κέρατα, επομένως είναι ελάχιστα τα νευρολογικά συμπτώματα που δεν μπορεί να παρουσιαστούν στη ΣΚΠ. Ανθεκτικός λόξυγγας με συγκοπικό επεισόδιο μετά από βήχα έχει συνδυαστεί με βλάβες στον αυχενικό μυελό και τον προμήκη. Μεμονωμένη μονόπλευρη παράλυση των κοιλιακών μυών, μονόπλευρη παράλυση του υπογλώσσιου νεύρου και του παλλίνδρομου λαρυγγικού νεύρου έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με ΣΚΠ Το αρχικό νευρολογικό επεισόδιο Η αρχική πορεία της ΣΚΠ στην πλειοψηφία των περιπτώσεων παρουσιάζει εξάρσεις και υφέσεις, και σε μικρότερο ποσοστό έχει προϊούσα μορφή εξαρχής. Η συχνότητα εμφάνισης της ΠΠΣΚΠ ποικίλλει από 5% έως 37% 1,89, ενώ όταν οι ασθενείς παρακολουθούνται από το πρώτο νευρολογικό επεισόδιο το ποσοστό πέφτει στο 7,7% 89. Η συχνότητα των αρχικών συμπτωμάτων διαφέρει στις δύο περιπτώσεις, συμπτωματολογία από το πυραμιδικό σύστημα εμφανίζεται σε ποσοστό 32% και 54% στην υποτροπιάζουσα και την ΠΠΣΚΠ αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα ποσοστά για τα παρεγκεφαλιδικά συμπτώματα είναι 16% και 23%, η συμμετοχή του στελέχους είναι σε ποσοστά 24% και 7%, ο αισθητικός μηχανισμός προσβάλλεται σε συχνότητα 48% και 32%, και τέλος η οπτική λειτουργία διαταράσσεται σε ποσοστά 26% και 17%. Κατά μέσο όρο το 85% των αρχικών νευρολογικών επεισοδίων υφίεται, τουλάχιστον εν μέρει. Σε μια μελέτη με συμμετοχή 220 αρρένων ασθενών που νοσηλεύτηκαν σε νοσοκομείο, ο καθοριστικός παράγοντας αυτόματης ύφεσης των συμπτωμάτων στα αρχικά στάδια της νόσου ήταν η χρονική διάρκεια του επεισοδίου προ της εισαγωγής. Υπήρχε αναλόγως αντίστροφη σχέση ανάμεσα στη διάρκεια και την πιθανότητα βελτίωσης. Το ποσοστό των ασθενών που αποκαταστάθηκε παρουσίασε εύρος από 86%, για διάρκεια συμπτώματος ίση ή λιγότερη από 7 ημέρες, έως 0%, για διάρκεια μεγαλύτερη των 2 ετών, με σταθερή πτωτική πορεία για τα ενδιάμεσα χρονικά διαστήματα. Η τελική κατάληξη του σε εξέλιξη 81

82 νευρολογικού επεισοδίου δεν μπορούσε να συσχετιστεί με την ηλικία εμφάνισης της νόσου, τη διάρκεια της νόσου προ της εισαγωγής, την ηλικία κατά τη νοσηλεία, τα συμπτώματα, τη βαρύτητα των συμπτωμάτων του επεισοδίου Υποτροπή Τόσο οι ιατροί όσο και οι ασθενείς γνωρίζουν ότι τα πρωτεύοντα στοιχεία που χαρακτηρίζουν την κλινική πορεία της νόσου είναι τα εξής: επεισόδια με πλήρη βελτίωση, επεισόδια με μερική αποκατάσταση και η προοδευτική επιδείνωση. Υποτροπή ή ώση (ή έξαρση) ορίζεται η πρώτη εκδήλωση ή υποτροπή ή επιδείνωση συμπτωμάτων που υποδηλώνουν νευρολογική δυσλειτουργία και χαρακτηρίζονται από υποξεία έναρξη και μια περίοδο στασιμότητας, η οποία ακολουθείται από μερική ή πλήρη αποκατάσταση με συνολική διάρκεια αυτής της διαδικασίας ίση ή μεγαλύτερης από 24 ώρες. Χρησιμοποιείται καταχρηστικά ο όρος υποτροπή στην πρώτη εμφάνιση της νόσου, αν και θεωρείται πιο κατάλληλος ο όρος εναρκτήριο επεισόδιο, ενώ οι επόμενες εκδηλώσεις χαρακτηρίζονται ως υποτροπές. Επίσης γίνεται διαχωρισμός των συμπτωμάτων που εμφανίζονται μετά από κόπωση καθώς και αυτών που ακολουθούν εμπύρετο. Πρέπει να τονιστεί ότι συμπτώματα τα οποία παρουσιάζονται μέσα σε χρονικό διάστημα ενός μηνός είναι μέρος της ίδιας ώσης. Παρά τους σαφείς ορισμούς είναι δύσκολο, ακόμα και για έναν έμπειρο νευρολόγο πολλές φορές, να αποφασίσει εάν κάποια ιδιαίτερα συμπτώματα συνιστούν όντως νέα υποτροπή. Έχουν γίνει προσπάθειες να ιεραρχηθεί το επίπεδο βεβαιότητας για μία θεωρητική υποτροπή ξεκινώντας από σαφώς ενδεικτικά συμπτώματα, με ή χωρίς αντικειμενικά ευρήματα από την κλινική νευρολογική εξέταση, έως κάποια άτυπα και υποτυπώδη παράπονα. Η ιεράρχηση μπορεί να γίνει με βάση τη βαρύτητα της υποτροπής κρίνοντας τη δυσλειτουργία που προκαλεί στην καθημερινή δραστηριότητα του ασθενούς, τον αντίκτυπο σε αντικειμενικές νευρολογικές κλίμακες, την απόφαση να νοσηλευτεί ο ασθενής και να χορηγηθούν κορτικοστεροειδή και τη διάκριση ανάμεσα σε νέα συμπτώματα, παλαιότερες ενοχλήσεις και την επιδείνωση πρόσφατων εκδηλώσεων της νόσου. Θολό τοπίο θα μπορούσε να χαρακτηριστεί η αντιμετώπιση των παροξυντικών συμπτωμάτων, η έναρξη των οποίων μπορεί να θεωρηθεί νέα υποτροπή ενδεικτική 82

83 εστίας φλεγμονώδους απομυελίνωσης, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την εφαπτική μετάδοση των ερεθισμάτων. Η κλινική υποτροπή εξαρτάται από τη συμμετοχή μιας ευάλωτης περιοχής του εγκεφάλου 144. Μεγάλη σύγχυση υπάρχει γύρω από τον όρο της προϊούσας εξέλιξης της νόσου. Ως προϊούσα εξέλιξη νοείται η επιδείνωση της αναπηρίας, η οποία διατηρείται και αντικειμενικοποιείται στην κλινική εξέταση που λαμβάνει χώρα σε χρονικά διαστήματα που απέχουν τρεις με έξι μήνες. Παρ όλα αυτά επιδείνωση της αναπηρίας, η οποία διατηρείται για έξι μήνες, δεν είναι απαραίτητο να ισοδυναμεί και με μη αναστρέψιμη εξέλιξη αυτής. Ο όρος προϊούσα εξέλιξη είναι πιο φρόνιμο να χρησιμοποιείται στις περιπτώσεις εκείνες κατά τις οποίες η αναπηρία αυξάνεται συστηματικά με την πάροδο του χρόνου, ακόμα και όταν εναλλάσσεται με περιόδους σχετικής σταθερότητας, ενώ δεν θεωρείται σωστή η χρήση του όρου για να χαρακτηρίσει την επιδείνωση της νευρολογικής αναπηρίας, απότοκη νευρολογικών ελλειμμάτων μετά από μία σοβαρή υποτροπή Η ανάπτυξη του δεύτερου νευρολογικού επεισοδίου Η εμφάνιση του δεύτερου επεισοδίου είναι πλέον αρκετή για να στοιχειοθετηθεί η μετατροπή σε βέβαιη ΣΚΠ, με την προϋπόθεση ότι το τελευταίο αφορά σε διαφορετικό σημείο του ΚΝΣ. Αρχικά, οι McAlpine και Compston δήλωσαν ότι η πιθανότητα για δεύτερο νευρολογικό επεισόδιο είναι μεγαλύτερη στο άμεσο μέλλον του πρώτου και ότι αυτή μειώνεται με την πάροδο του χρόνου 1. Το 65%, 45% και 25% των ασθενών με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ παρουσιάζουν μεσοδιάστημα μεταξύ πρώτου και δεύτερου επεισοδίου 1, 2 και 5 χρόνια αντίστοιχα. Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώθηκαν σε σειρές ασθενών στη Γαλλία και τη Νορβηγία, μόνο μια Σουηδική μελέτη είχε διαφορετικές πληροφορίες, δίνοντας μέσο χρονικό διάστημα για τη δεύτερη ώση 3,5 έτη. Όσον αφορά στις κλινικές παραμέτρους που μπορεί να προκαθορίσουν την εμφάνιση της δεύτερης ώσης φαίνεται ότι το φύλο και η ηλικία έναρξης της νόσου δεν επηρεάζουν. Επίσης δεν επιδρά η μονοεστιακή ή πολυεστιακή φύση των αρχικών συμπτωμάτων, ο βαθμός αποκατάστασης από την πρώτη ώση, ή εάν η μετέπειτα πορεία της νόσου είναι υποτροπιάζουσα ή ΔΠΣΚΠ, τη χρονική στιγμή της εξέτασης. Αντιθέτως, οπτικά και αισθητικά συμπτώματα στο 83

84 πρώτο επεισόδιο συσχετίστηκαν με μακρύτερο χρονικό διάστημα εμφάνισης του δεύτερου επεισοδίου, ενώ συμπτώματα από τον νωτιαίο μυελό συνδυάστηκαν με μικρότερο μεσοδιάστημα. Αναλύοντας στοιχεία από μελέτες βασισμένες στη μαγνητική τομογραφία κατά την έναρξη της νόσου, προκύπτει ότι η πολυεστιακή εντόπιση των βλαβών, το φορτίο των Τ2 εστιών και η παρουσία εμπλουτιζόμενων εστιών στην Τ1 ακολουθία αποτελούν δυσμενή παράγοντα εμφάνισης δεύτερου επεισοδίου. Η παρουσία υποφλοιωδών, υποσκηνίδιων ή περικοιλιακών εστιών αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες εμφάνισης δεύτερου επεισοδίου σε σύντομο χρονικό διάστημα. Σε αυτή την κατεύθυνση συμβάλλουν, επίσης, η παρουσία νέων Τ2 εστιών στη μαγνητική τομογραφία 3 μήνες μετά την πρώτη ή 12 μήνες μετά το πρώτο επεισόδιο. Τέλος, τα τυπικά παθολογικά ευρήματα από την εξέταση του ΕΝΥ, τα προκλητά δυναμικά και η ταυτοποίηση του αντιγόνου HLA-DR15 συνηγορούν υπέρ συντομότερης εμφάνισης δεύτερου επεισοδίου Η επίδραση των υποτροπών στην εξέλιξη της νόσου Υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις για τη συχνότητα των υποτροπών στην υποτροπιάζουσα φάση της νόσου, οι εκτιμήσεις ποικίλλουν από 0,1 έως >1 ετησίως. Δυσκολίες προκύπτουν από την αξιολόγηση κάποιων συμπτωμάτων ως υποτροπή της νόσου, τη συχνότητα και τη χρονική στιγμή παρακολούθησης των ασθενών από τους κλινικούς ιατρούς. Πέρα από αυτούς τους παράγοντες υπάρχει αντικειμενικά μεγάλο εύρος στη συχνότητα των ώσεων πιθανότατα λόγω βιολογικών διαφοροποιήσεων. Σε γενικές γραμμές ισχύει ότι η συχνότητα είναι 0,5 ή ελαφρώς υψηλότερη ετησίως σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ. Το φύλο και η ηλικία εμφάνισης της νόσου δεν φαίνεται να επηρεάζουν τη συχνότητα των ώσεων, με εξαίρεση τη Σουηδική μελέτη, όπου η ηλικία έναρξης σχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με τη συχνότητα. Πολλοί συγγραφείς πιστεύουν ότι η συχνότητα των υποτροπών μειώνεται όσο αυξάνεται η διάρκεια της νόσου 1,17. Οι McAlpine και Compston βρήκαν ότι τα 5 πρώτα χρόνια η συχνότητα ήταν 0,4 η οποία έπεσε στο 0,22 μετά από χρόνια 1. 84

85 Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η μερική ύφεση των συμπτωμάτων δεν σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου αλλά με την ανάπτυξη νέων ώσεων τους επόμενους μήνες, δηλαδή τη βραχυπρόθεσμη συχνότητα υποτροπών 93. Ωστόσο καλοήθη πορεία της νόσου έχει συσχετιστεί με το θήλυ φύλο, τη νεότερη ηλικία εμφάνισης της νόσου και την απουσία κινητικών συμπτωμάτων στο πρώτο επεισόδιο 94. Αντίθετα, όψιμη έναρξη της νόσου, βραχύ μεσοδιάστημα μεταξύ πρώτου και δεύτερου επεισοδίου και πρωτοπαθώς προϊούσα πορεία συνδυάζεται με δυσμενή πρόγνωση 1,95,96. Κάποιοι συγγραφείς θεωρούν ότι η έναρξη της νόσου με οπτική νευρίτιδα συνδυάζεται με μεγαλύτερο χρονικό διάστημα εξέλιξης της αναπηρίας, ενώ συμπτώματα από τον νωτιαίο μυελό, κινητικά και παρεγκεφαλιδικά συμπτώματα σχετίζονται με βραχύ μεσοδιάστημα 1. Κάποιοι άλλοι ερευνητές δεν επιβεβαίωσαν αυτά τα ευρήματα. Επιπρόσθετα, ενώ ορισμένοι συγγραφείς πιστεύουν ότι η συμμετοχή πολλών συστημάτων στην πρώτη εμφάνιση της νόσου συνδυάζεται με βραχύτερη εξέλιξη της αναπηρίας, άλλοι διαφωνούν 1. Διαφωνία υπάρχει, επίσης, για την επίδραση της υψηλής συχνότητας των υποτροπών στην εξέλιξη της αναπηρίας 1. Ιδιαίτερη προγνωστική αξία έχει το κλινικό status στα 5 χρόνια της νόσου. Το υψηλότερο σκορ στην EDSS, η παρουσία κινητικών ή παρεγκεφαλιδικών συμπτωμάτων και ο αριθμός των λειτουργικών συστημάτων που έχουν επηρεαστεί, προκαθορίζουν δυσμενή εξέλιξη 1,147. Η νευρολογική αναπηρία μπορεί να προκύψει είτε από υποτροπές με μερική αποκατάσταση, είτε από την προϊούσα πορεία της νόσου, είτε από τον συνδυασμό τους 96. Το μεσοδιάστημα μετάβασης από την υποτροπιάζουσα στη δευτεροπαθώς προϊούσα μορφή της νόσου, είναι κατά μέσο όρο 19 έτη Η μαγνητική τομογραφία στην ώση Η ΣΚΠ γενικά χαρακτηρίζεται από νέα επεισόδια φλεγμονής 90. Συχνά αυτά τα επεισόδια είναι κλινικά σιωπηλά, αλλά εύκολα ανιχνεύονται στη μαγνητική τομογραφία. Η νέα φλεγμονώδης δραστηριότητα της νόσου μπορεί να απεικονιστεί με εστίες που προσλαμβάνουν γαδολίνιο στην Τ1 ακολουθία και την παρουσία νέων ή αύξηση παλαιών εστιών στην Τ2 ακολουθία 90. Φυσιολογικά η παραμαγνητική ουσία αποκλείεται από τον εγκέφαλο και τον ν.μ. λόγω του ΑΕΦ. Η παρουσία εμπλουτισμού με γαδολίνιο σημαίνει αύξηση της διαπερατότητας του ΑΕΦ η οποία 85

86 συμβαίνει στη φλεγμονή 1,90. Κάποιες εστίες προσλαμβάνουν ομοιόμορφα, ενώ εστιακή ομοιογενής πρόσληψη μπορεί να παρατηρηθεί μέσα σε μεγαλύτερες εστίες. Άλλες φορές σημειώνεται δακτυλιοειδής εμπλουτισμός, κυρίως σε μεγαλύτερες βλάβες. Ο δακτύλιος μπορεί να είναι πλήρης ή ημιτελής (open-ring enhancement), στοιχείο χαρακτηριστικό της ΣΚΠ 1. Οι ανοικτοί δακτύλιοι πρόσληψης σκιαγραφικής ουσίας στη ΣΚΠ παρουσιάζονται παχύτεροι στην πλευρά που συνορεύει με τη λευκή ουσία και πιο λεπτοί στην πλευρά που αντικρίζει τη φαιά ουσία ή τα βασικά γάγγλια 129,146. Ο εμπλουτισμός είναι η πρωιμότερη αλλαγή που ανιχνεύεται στην MRI κατά τη δημιουργία νέων εστιών στην ΥΔΣΚΠ και τη ΔΠΣΚΠ. Η ενίσχυση με γαδολίνιο είναι παροδική και μπορεί να προηγηθεί της εμφάνισης Τ2 ανωμαλίας με διαφορά ωρών ή ημερών 1,90. Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η διάσπαση του ΑΕΦ είναι το πρωταρχικό γεγονός στην παθογένεση της νέας εστίας στη ΣΚΠ 1,114. Σχεδόν πάντα αφορά στην περιοχή που ευθύνεται για την κλινική εικόνα του ασθενούς, αλλά μπορεί να βρεθεί και σε άλλες περιοχές, κυρίως κατά τις υποτροπές κι όχι στις υφέσεις. Θα πρέπει να προστεθεί ότι το μέγιστο του εμπλουτισμού διαρκεί περίπου 4 εβδομάδες και στη συνέχεια παρατηρείται σταδιακή μείωση τις επόμενες 2-4 εβδομάδες 90,110. Ορισμένες φορές μπορεί να διαρκέσει και μικρότερο χρονικό διάστημα, 1 εβδομάδας περίπου 1,114, ενώ σπάνια παρατείνεται πέρα των 2-3 μηνών κι αυτό το στοιχείο μπορεί να χρησιμοποιηθεί διαφοροδιαγνωστικά από άλλες καταστάσεις. Σε μία εργασία κατά την οποία διενεργούνταν μηνιαίως μαγνητική τομογραφία σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, η συντριπτική πλειοψηφία (90%) των ασθενών, χωρίς προφυλακτική θεραπεία, εμφάνιζε νέα φλεγμονώδη δραστηριότητα στην MRI σε χρονικό διάστημα 9 μηνών και το γαδολίνιο ανίχνευσε το 88% αυτής 90. Σε μια μελέτη βασισμένη σε στοιχεία βιοψίας 40 ασθενών, οι εστίες που προσελάμβαναν γαδολίνιο συνδυάστηκαν με ιστοπαθολογικά ευρήματα διάσπασης του ΑΕΦ και διήθηση Τ λεμφοκυττάρων και μακροφάγων στο εγκεφαλικό παρέγχυμα 90,114. Ο αριθμός των νέων εστιών που προσλαμβάνουν γαδολίνιο θεωρείται αξιόπιστος δείκτης ενεργότητας της νόσου 110. Σύμφωνα με στοιχεία από πολλές μελέτες ο αριθμός των εμπλουτιζόμενων εστιών είναι 86

87 μεγαλύτερος από τον αριθμό των υποτροπών, με μια αναλογία 10 ή ακόμα και 15 προς 1 112,114. Επίσης, μικρότερος αριθμός εμπλουτιζόμενων εστιών προκαλεί συμπτώματα στον εγκέφαλο συγκριτικά με αυτές στο νωτιαίο μυελό 112. Η δραστηριότητα στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου είναι υψηλότερη όταν βρίσκεται σε χρονική συνάφεια με κλινική υποτροπή. Επιπρόσθετα, η δραστηριότητα στον εγκέφαλο συμβαίνει συνηθέστερα παράλληλα με την παρουσία ενεργότητας στο νωτιαίο μυελό 112. Όπως αναφέρθηκε, η πρόσληψη του γαδολινίου είναι παροδική και συμβαίνει μόνο όταν υπάρχει οξεία φλεγμονή. Παρά το γεγονός ότι η συνοδευόμενη νέα Τ2 εστία μπορεί να μειωθεί σε μέγεθος με την υποχώρηση της φλεγμονής, συχνά παραμένει μία μόνιμη εστία στην Τ2 ακολουθία μετά την εξαφάνιση του γαδολινίου 90,110. Κατά την πορεία της νόσου αυτές οι βλάβες συσσωρεύονται προκαλώντας αύξηση του όγκου των Τ2 εστιών 5% έως 10% ετησίως, ενώ πολλές βλάβες συρρέουν. Οι Τ2 βλάβες είναι ανομοιογενείς ιστοπαθολογικά. Επιπρόσθετα, μπορεί να συναντηθούν εστίες που προσλαμβάνουν γαδολίνιο χωρίς την ταυτόχρονη συνοδεία εστίας στην Τ2 ακολουθία 114. Ένα μέρος αυτών μπορεί να φανούν υπόπυκνες στην Τ1 ακολουθία χωρίς σκιαστικό, και αναφέρονται ως «μαύρες τρύπες» 90. Στο 21 0 Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) αναφέρθηκε ότι το 55% των νέων εστιών με διάμετρο άνω των 10 χιλιοστών (μεγάλες εστίες) εξελίχθηκαν σε μαύρες τρύπες. Όταν συμβεί αυτό υποδηλώνει μεγαλύτερη αξονική απώλεια συγκριτικά με τις ισόπυκνες Τ1 εστίες 1. Συνακόλουθα, οι νέες εστίες στη μαγνητική τομογραφία αποτελούν σημαντικό παράγοντα αξονικής καταστροφής 90. Επίσης, μελέτη που διεξήχθη σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα και ΔΠΣΚΠ φάνηκε ότι οι ασθενείς με εμπλουτιζόμενες εστίες στη μαγνητική τομογραφία είχαν μεγαλύτερη εγκεφαλική ατροφία 90. Η MRI είναι πολύ ευαίσθητη στην ανίχνευση νέας φλεγμονώδους δραστηριότητας με τη μορφή των εμπλουτιζόμενων εστιών και την εμφάνιση νέων ή τη μεγέθυνση παλαιότερων Τ2 εστιών. Συνέπεια είναι η συσσώρευση των Τ2 εστιών (ή το φορτίο της νόσου), οι χρόνιες μαύρες τρύπες συνδυασμένες με σοβαρή αξονική απώλεια και η γενικευμένη εγκεφαλική ατροφία 90. Πολλές νέες εμπλουτιζόμενες εστίες είναι υπόπυκνες στην Τ1 ακολουθία χωρίς σκιαστικό, ενώ παρακολούθηση αυτών σε βάθος χρόνου αποκαλύπτει ότι 87

88 παραμένουν υπόπυκνες μόνο το 50% των αρχικών. Όταν συμβεί αυτό υποδηλώνει μεγαλύτερη αξονική απώλεια συγκριτικά με τις ισόπυκνες Τ1 εστίες 1,92. Ο Van Waesberghe και οι συνεργάτες του περιέγραψαν τέσσερα διαφορετικά πρότυπα οξέων εστιών στην Τ1 πριν την έγχυση γαδολινίου: 1) 15% ήταν αρχικά ισόπυκνες και παρέμειναν ισόπυκνες, 2) 5% ήταν ισόπυκνες και έγιναν υπόπυκνες, 3) 44% ήταν υπόπυκνες και έγιναν ισόπυκνες, 4) 36% ήταν υπόπυκνες και παρέμειναν υπόπυκνες 92. Σε μια πιο πρόσφατη μελέτη του G.J. Zhao και των συνεργατών του βρέθηκε ότι το 40% των εμπλουτιζόμενων εστιών, που αρχικά ήταν υπόπυκνες στην Τ1, συνδυάστηκαν με οξείες «μαύρες τρύπες», ενώ το αντίστοιχο της προηγούμενης μελέτης ήταν 80%. Το 74% αυτών έγιναν ισόπυκνες. Από το υπόλοιπο 26%, οι οποίες παρέμειναν υπόπυκνες, το 70% μειώθηκαν σε μέγεθος, 16% παρέμειναν αμετάβλητες, 11% μεγάλωσαν σε μέγεθος και 3% μειώθηκαν αρχικά και στη συνέχεια μεγάλωσαν σε μέγεθος 92. Μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης εμπλουτισμού σε νέες εστίες σημειώνεται στην υποτροπιάζουσα ΣΚΠ και τη ΔΠΣΚΠ. Στη ΔΠΣΚΠ η συχνότητα είναι χαμηλότερη από την υποτροπιάζουσα, ενώ στην ΠΠΣΚΠ μόνο το 5% των νέων εστιών προσλαμβάνει σκιαστικό. Στην ΠΠΣΚΠ σε μικρό μόνο ποσοστό συναντώνται εμπλουτιζόμενες εστίες, οι οποίες γίνονται πιο εμφανείς με τη χρήση μεγαλύτερης δόσης σκιαγραφικής ουσίας 114. Υπάρχουν δεδομένα που φανερώνουν ότι κάποιες εστίες αποτυγχάνουν να προσλάβουν σκιαστικό χρησιμοποιώντας τις συμβατικές δόσεις σκιαστικού (0.1 mmol/kg), ενώ υπάρχει αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων 1. Ο αριθμός των εστιών που προσλαμβάνουν μπορεί να αυξηθεί κατά 120% όταν τριπλασιαστεί η δόση του χορηγούμενου σκιαστικού (0.3 mmol/kg), συνδυαστεί με απεικόνιση μεταφοράς μαγνήτισης (magnetization transfer imaging) και η λήψη καθυστερήσει λεπτά μετά την έγχυση. Υπάρχει ισχυρή σχέση ανάμεσα στις νέες και εμπλουτιζόμενες εστίες και την εμφάνιση υποτροπής, κυρίως στα αρχικά στάδια της νόσου. Νέες εστίες, που εμφανίζονται 3-12 μήνες μετά από ένα κλινικά μεμονωμένο επεισόδιο συνδυάζονται με υψηλή πιθανότητα εμφάνισης νέας υποτροπής τα επόμενα 3 χρόνια. Αντιθέτως, υπάρχει καθόλου ή μικρή σχέση μεταξύ των Τ2 ή των εμπλουτιζόμενων εστιών και τη συσσώρευση αναπηρίας 1,111. Δύο πρόσφατες 88

89 μελέτες έδειξαν ότι η εντόπιση και το συνολικό φορτίο των Τ2 εστιών κατά την έναρξη της νόσου μπορεί να προβλέψει την αναπηρία όπως υπολογίζεται από την EDSS, μετά από 8,7 και 14 έτη. Η έλλειψη ισχυρής σχέσης μεταξύ της απεικόνισης κατά την έναρξη της νόσου και μακροπρόθεσμα, υποδηλώνει ότι άλλοι ιστοπαθολογικοί παράγοντες, εκτός από τις ορατές βλάβες, καθορίζουν τη μακροπρόθεσμη κλινική πορεία της νόσου. Είναι γνωστό ότι οι φαινομενικά φυσιολογικές λευκή και φαιά ουσία είναι διαταραγμένες στα αρχικά στάδια της ΥΔΣΚΠ καθώς και σε ασθενείς με κλινικά μεμονωμένο επεισόδιο. Άλλες μελέτες δείχνουν ότι οι ανωμαλίες στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή ουσία μπορεί να προηγούνται των εστιακών φλεγμονωδών βλαβών που προσλαμβάνουν γαδολίνιο με χρονική διαφορά κάποιων μηνών ή και περισσότερο. Οι ανωμαλίες αυτές περιλαμβάνουν την αύξηση των λιπιδίων στη λευκή ουσία, τη μείωση του συντελεστή μεταφοράς μαγνήτισης και της Ν-ακετυλοασπαρτάσης (NAA), την αύξηση του Τ1 χρόνου ηρεμίας τόσο στη λευκή όσο και τη φαιά ουσία και την αύξηση της διάχυσης και της μυοϊνοσιτόλης στη λευκή ουσία. Φαίνεται ότι το πρωταρχικό γεγονός στην εμφάνιση της εστιακής βλάβης είναι η διάσπαση του ΑΕΦ με επακόλουθη εισαγωγή φλεγμονωδών κυττάρων στο ΚΝΣ. Πάρα ταύτα, η ύπαρξη χαμηλού βαθμού διαρροής και η ενεργοποίηση της μικρογλοίας έχει αποδειχθεί από ιστολογικές εξετάσεις της φαινομενικά φυσιολογικής λευκής ουσίας, υποδηλώνοντας ότι η οπτική ανίχνευση εμπλουτισμού με γαδολίνιο έχει περιορισμένη ευαισθησία Διάγνωση της ΣΚΠ Η διερεύνηση ενός ασθενούς με ύποπτα συμπτώματα ΣΚΠ περιλαμβάνει τις εξής εξετάσεις: μαγνητική τομογραφία, προκλητά δυναμικά και εξέταση του ΕΝΥ. Ο σκοπός αυτών των εξετάσεων είναι η καταγραφή της διασποράς στον χρόνο και τον χώρο, η επιβεβαίωση της ύπαρξης φλεγμονής στο ΚΝΣ και ο αποκλεισμός νοσημάτων που μιμούνται τη ΣΚΠ. Το σημείο εκκίνησης για τη διάγνωση της νόσου είναι η κλινική πορεία του ασθενούς. Περισσότερο από κάθε άλλο στοιχείο, καθορίζει τη φύση και τον αριθμό των παρακλινικών εξετάσεων που θα ακολουθήσουν προκειμένου να τεθεί ασφαλώς η διάγνωση της ΣΚΠ. 89

90 Μαγνητική τομογραφία Η μαγνητική τομογραφία βοήθησε τα μέγιστα στην κλινική ιατρική και ειδικά στη νευρολογία. Αποτελεί μία μη επεμβατική, ελεύθερης από παράσιτα, μέθοδο που προσφέρει εικόνα υψηλής ανάλυσης του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού. Ο κυρίαρχος τρόπος διαφοροποίησης του φυσιολογικού από τον παθολογικό ιστό, στη συμβατική MRI, είναι η συγκέντρωση και το μεγαλομοριακό περιβάλλον των μορίων του ύδατος. Αυτό συνεπάγεται ένα σημαντικό πλεονέκτημα αλλά και ένα μειονέκτημα. το πρώτο είναι η υψηλή ευαισθησία στην ανίχνευση παθολογίας στους μαλακούς ιστούς, ενώ το μειονέκτημα είναι η περιορισμένη ειδικότητα στην ταυτοποίηση της συγκεκριμένης παθολογίας. Εξαιρετικό βοήθημα αποτελεί η χρήση παραμαγνητικής ουσίας με γαδολίνιο η οποία λειτουργεί ως παράγοντας αντίθεσης. Το γαδολινίου -σκιαγραφική ουσία- δεν εισέρχεται στον εγκέφαλο λόγω του σφικτού αιματοεγκεφαλικού φραγμού, τον διαπερνάει όμως σε σημεία όπου αυτός έχει διασπαστεί MRI εγκεφάλου Τ2 ακολουθία Η Τ2 ακολουθία απεικονίζει με τον καλύτερο τρόπο τις εστιακές βλάβες στη λευκή ουσία στη ΣΚΠ. Πολλαπλές εστίες υψηλού σήματος συναντώνται στην περικοιλιακή λευκή ουσία στο 95% περίπου των ασθενών. Αυτές οι βλάβες μπορεί να είναι διακριτές και εστιακές ή συρρέουσες. Περισσότερο συμμετέχει η εν τω βάθει λευκή ουσία αλλά εστιακές βλάβες υπάρχουν και πιο περιφερικά. Παράλληλα οι υποφλοιώδεις εστίες είναι παρούσες στα 2/3 περίπου των ασθενών (Miller 1988). Συχνή είναι η συμμετοχή του μεσολοβίου, στην απεικόνιση του οποίου βοηθάει περισσότερο η οβελιαία τομή. Επίσης συχνές είναι οι βλάβες στις οπίσθιες οπτικές οδούς. Περιοχές που προσβάλλονται συνήθως είναι το στέλεχος και η παρεγκεφαλίδα, στο στέλεχος κοντά στους χώρους του ΕΝΥ, ενώ βλάβες στη λευκή ουσία της παρεγκεφαλίδας απαντώνται στο 50% περίπου των ασθενών. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι διαταραχές στη φαιά ουσία απεικονίζονται σε πολύ μικρότερο βαθμό σε σχέση με αυτές στη λευκή ουσία. Βλάβες στον θάλαμο συναντώνται post mortem, αλλά όχι στη μαγνητική τομογραφία. Η συμμετοχή του φλοιού είναι συχνή στην αυτοψία αλλά σπάνια απεικονίζεται. Αυτό συμβαίνει εν μέρει λόγω του ότι οι φλοιικές απομυελινωτικές πλάκες έχουν πυκνότητα 90

91 πρωτονίων και μετρήσεις χαλάρωσης με την τεχνική Τ2, οριακά διαφορετικές από την περιβάλλουσα φαιά ουσία. Περιστασιακά αυτές οι πλάκες προσλαμβάνουν σκιαγραφική ουσία. Υπόπυκνες εστίες στην Τ2 ακολουθία στη φαιά ουσία του φλοιού και των εν τω βάθει δομών συσχετίζονται με αύξηση της αναπηρίας, του φορτίου στην Τ2 και την εγκεφαλική ατροφία 1. Η πλειοψηφία των εστιών έχει διάμετρο μικρότερη των 5mm, αρκετές φορές όμως έχουν μεγαλύτερο μέγεθος προκαλώντας φαινόμενα μάζας και χρήζουν διαφοροδιάγνωσης από ενδοεγκεφαλικό όγκο. Οι οξείες βλάβες συχνά παρουσιάζουν ένα μεμονωμένο υπόπυκνο δακτύλιο στην Τ2 που σχετίζεται με διήθηση από μακροφάγα, διάσπαση λίπους στο χείλος της βλάβης και πρόσληψη σκιαστικού στην Τ1 μετά την έγχυση παραμαγνητικής ουσίας. Συγκριτικά με την T2-weighted spin echo και τη fast spin echo τεχνική, η fast FLAIR έχει το πλεονέκτημα της μεγαλύτερης ευαισθησίας στην απεικόνιση των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, κυρίως της υποφλοιώδους λευκής ουσίας. Το πλεονέκτημα αυτό αντισταθμίζεται από το γεγονός ότι έχει χαμηλή ευαισθησία στον οπίσθιο κρανιακό βόθρο και τον νωτιαίο μυελό ΜRI νωτιαίου μυελού Τ2 ακολουθία Οι βλάβες του ν.μ. ανιχνεύονται καλύτερα με την τεχνική proton density και την Τ2 ακολουθία. Στο οβελιαίο επίπεδο οι βλάβες καταλαμβάνουν λιγότερο από ένα σπονδυλικό διάστημα σε μήκος, ενώ στον προσθιο-οπίσθιο άξονα καταλαμβάνουν μέρος μόνο του ν.μ. Στις εγκάρσιες τομές αποκαλύπτονται εστίες οι οποίες αφορούν μέρος του ν.μ., είναι ασύμμετρες και εκτείνονται μέχρι την επιφάνεια, κάποιες φορές με σφηνοειδές σχήμα 1. Οι οξείες βλάβες μπορεί να παρουσιάσουν οίδημα, ενώ οι χρόνιες σχετίζονται με εστιακή ατροφία του ν.μ. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι οι οβελιαίες Τ2 ακολουθίες, fast ή συμβατική spin echo, συνοδευόμενες από εγκάρσιες τομές ως επιβεβαίωση μιας αμφισβητούμενης εστίας στην Τ2. Βλάβες στον ν.μ. μπορεί να βρεθούν όταν η MRI εγκεφάλου είναι αρνητική, εύρημα πολύ σημαντικό στην ΠΠΣΚΠ, όπου οι εστίες στον εγκέφαλο είναι λιγότερες συγκριτικά με άλλες μορφές της νόσου ή και απούσες 1. Διάχυτο υψηλό σήμα στην proton density ακολουθία του ν.μ. μπορεί να σημειωθεί, περισσότερο συχνά στην 91

92 ΠΠΣΚΠ 1. Ο ν.μ. εμπλέκεται σπανιότερα σε αγγειακές νόσους και σε ασυμπτωματικές βλάβες υψηλού σήματος, όπως τυχαία ευρισκόμενες βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία Ενίσχυση με γαδολίνιο Φυσιολογικά η παραμαγνητική ουσία αποκλείεται από τον εγκέφαλο και τον ν.μ. λόγω του ΑΕΦ. Η παρουσία εμπλουτισμού με γαδολίνιο σημαίνει αύξηση της διαπερατότητας του ΑΕΦ η οποία συμβαίνει στη φλεγμονή. Κάποιες εστίες προσλαμβάνουν ομοιόμορφα, ενώ εστιακή ομοιογενής πρόσληψη μπορεί να παρατηρηθεί μέσα σε μεγαλύτερες εστίες. Άλλες φορές σημειώνεται δακτυλιοειδής εμπλουτισμός, κυρίως σε μεγαλύτερες βλάβες. Ο δακτύλιος μπορεί να είναι πλήρης ή ημιτελής, στοιχείο χαρακτηριστικό της ΣΚΠ. Ο εμπλουτισμός είναι η πρωιμότερη αλλαγή που ανιχνεύεται στην MRI κατά τη δημιουργία νέων εστιών στην υποτροπιάζουσα ΣΚΠ και τη ΔΠΣΚΠ. Σχεδόν πάντα αφορά στην περιοχή που ευθύνεται για την κλινική εικόνα του ασθενούς, αλλά μπορεί να βρεθεί και σε άλλες περιοχές, κυρίως κατά τις υποτροπές κι όχι στις υφέσεις. Ο εμπλουτισμός διαρκεί περίπου 4 με 6 εβδομάδες 1, αλλά ορισμένες φορές μπορεί να διαρκέσει και μικρότερο χρονικό διάστημα 1 εβδομάδας περίπου. Σπάνια παρατείνεται πέρα των 2-3 μηνών κι αυτό το στοιχείο μπορεί να χρησιμοποιηθεί διαφοροδιαγνωστικά από άλλες καταστάσεις. Μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης εμπλουτισμού σε νέες εστίες σημειώνεται στην υποτροπιάζουσα ΣΚΠ και τη ΔΠΣΚΠ. Στη ΔΠΣΚΠ η συχνότητα είναι χαμηλότερη από την υποτροπιάζουσα, ενώ στην ΠΠΣΚΠ μόνο το 5% των νέων εστιών προσλαμβάνει σκιαστικό. Υπάρχουν δεδομένα που φανερώνουν ότι κάποιες εστίες αποτυγχάνουν να προσλάβουν σκιαστικό χρησιμοποιώντας τις συμβατικές δόσεις σκιαστικού (0.1 mmol/kg), ενώ υπάρχει αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων. Ο αριθμός των εστιών που προσλαμβάνουν μπορεί να αυξηθεί κατά 120%, όταν τριπλασιαστεί η δόση του χορηγούμενου σκιαστικού (0.3 mmol/kg), συνδυαστεί με magnetization transfer imaging και η λήψη καθυστερήσει λεπτά μετά την έγχυση. 92

93 Υπόπυκνες εστίες στην Τ1 ακολουθία Η Τ1-weighted spin echo ακολουθία απέκτησε ενδιαφέρον πρόσφατα επειδή δύναται να αποκαλύψει περιοχές παρεγχυματικής καταστροφής. To 20-30% των χρόνιων εστιών στην Τ2 παραμένουν υπόπυκνες στην Τ1 ακολουθία. Οι υπόπυκνες Τ1 εστίες σχετίζονται με μεγαλύτερη αξονική καταστροφή σε σχέση με τις ισόπυκνες Τ1 βλάβες. Παρ όλα αυτά, ο κλινικός ιατρός πρέπει να ερμηνεύει με επιφυλακτικότητα τις υπόπυκνες Τ1 εστίες, όταν δεν μπορεί να καθοριστεί η ηλικία τους, για τον λόγο ότι δεν είναι ασυνήθιστο μια υπόπυκνη Τ1 εστία να αποτελεί αναστρέψιμο εύρημα μιας οξείας βλάβης που εμπλουτίζει. Η υποχώρησή της, όταν συμβεί σε τέτοιες βλάβες, μπορεί να διαρκέσει αρκετούς μήνες Μαγνητική φασματοσκοπία (Magnetic Resonance Spectoscropy-MRS) Η μαγνητική φασματοσκοπία ερευνά μεταβολίτες που περιέχουν πρωτόνια εκτός του ύδατος. Δύο μεταβολίτες έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, το Ν-ακέτυλο ασπαρτικό και η μυοϊνοσιτόλη. Το πρώτο περιέχεται σχεδόν αποκλειστικά στους νευρώνες και τους νευράξονες, επομένως αποτελεί μάρτυρα νευραξονικής βλάβης και καταστροφής, η οποία θεωρείται η κύρια αιτία με αναστρέψιμης αναπηρίας στη ΣΚΠ 1,147. Το ΝΑΑ παρουσιάζεται μειωμένο στις βλάβες της ΣΚΠ 147. Πάρα ταύτα, έχουν καταγραφεί μερικώς αναστρέψιμες μειώσεις του ΝΑΑ. Μείωση του ΝΑΑ μερικές φορές αντικατοπτρίζει αναστρέψιμη βλάβη των μιτοχονδρίων κι όχι κυτταρικό θάνατο. Τα επίπεδα του ΝΑΑ εμφανίζονται μειωμένα και στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή ουσία, γεγονός που αντικατοπτρίζει γενικευμένη παθολογία του μεταβολισμού του νευρικού κυττάρου 147. Η μυοϊνοσιτόλη παράγεται από τη γλοία. Είναι αυξημένη στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή ουσία πρώιμα στη ΣΚΠ, πιθανόν αντανακλώντας την επέκταση της φλεγμονής πέρα από τα όρια της απομυελινωτικής πλάκας. Η διαγνωστική αξία της MRS είναι περιορισμένη Λειτουργική μαγνητική τομογραφία (Functional MRI-fMRI) Η λειτουργική μαγνητική τομογραφία μελετάει τις αλλαγές στην περιοχική ροή αίματος στον εγκέφαλο σε απάντηση ειδικών αλγορίθμων ερεθισμού. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν την παρουσία παθολογικών μοντέλων εγκεφαλικής διέγερσης σε 93

94 ασθενείς με μεμονωμένο κλινικό επεισόδιο. Η πλαστικότητα του φλοιού αποτελεί πρώιμο σημείο σε ασθενείς με απομυελινωτική νόσο του ΚΝΣ Απεικόνιση μεταφοράς μαγνήτισης (Magnetization transfer imaging) Αυτή η μέθοδος είναι ευαίσθητη στην αποκάλυψη ιστικής αποδιοργάνωσης. Σε συνδυασμό με τις πληροφορίες από την Τ2 ακολουθία προσφέρουν χρήσιμα στοιχεία για την εξέλιξη της νόσου και της αναπηρίας. Ο συντελεστής μεταφοράς μαγνήτισης αποτελεί ευαίσθητο δείκτη εξέλιξης της νόσου στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή και φαιά ουσία και αποκαλύπτει διαταραχές από τα πρώιμα στάδια της νόσου. Ο συντελεστής μεταφοράς μαγνήτισης της βλάβης προσφέρει μία ένδειξη μυελίνωσης. Η διαφοροδιαγνωστική αξία αυτής της τεχνικής είναι περιορισμένη Άλλες απεικονιστικές μέθοδοι Η απεικόνιση διάχυσης (diffusion weighted imaging) 1,91 δείχνει αύξηση της διάχυσης στη φαινομενικά φυσιολογική λευκή και φαιά ουσία και μείωση στην κλασματική ανισοτροπία (fractional anisotropy) στη λευκή ουσία. Μείωση της ανισοτροπίας σημαίνει δομική βλάβη στην πορεία της νευρικής ίνας. Η δεσμιδογραφία (diffusion tractography) αποτελεί μία ελπιδοφόρο τεχνική στον υπολογισμό της ακεραιότητας των δεσμίδων νευρικών ινών, εκτιμώντας τον όγκο τους και την κλασματική ανισοτροπία αλλά προς το παρόν έχει περιορισμένη χρήση. Επίσης η τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (positron emission tomography- PET) χρησιμοποιήθηκε ως εργαλείο έρευνας της ΣΚΠ. Η μειωμένη κατανάλωση οξυγόνου που παρατηρήθηκε στον εγκέφαλο συνάδει με την καταστροφή νευραξόνων. Μια άλλη τεχνική που χρησιμοποιεί 18 F-δεοξυγλυκόζη, υπολογίζει την κατανάλωση γλυκόζης από τη φαιά ουσία τόσο του φλοιού όσο και των εν τω βάθει δομών ασθενών με ΣΚΠ και τη συγκρίνει με την αντίστοιχη υγιών ατόμων. Η μείωση του μεταβολισμού της γλυκόζης συνδυάζεται με αύξηση του φορτίου στην Τ2 ακολουθία και έκπτωση γνωστικών λειτουργιών. Η υπολογιστική τομογραφία εκπομπής μονού ποζιτρονίου (single positron emission computed tomography-spect) ανέδειξε συσχέτιση ανάμεσα στη μειωμένη περιοχική ροή αίματος και την έκπτωση των ανώτερων φλοιικών λειτουργιών. 94

95 Τέλος η απεικόνιση του στρώματος των νευρικών ινών του αμφιβληστροειδούς (retinal nerve fibre layer imaging) αποτελεί μία μη επεμβατική μέθοδο, η οποία υπολογίζει το πάχος του στρώματος των νευρικών ινών του αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιώντας τομογραφία οπτικής συνοχής (optical coherence tomography). Το πάχος είναι μειωμένο σε ασθενείς με οπτική νευρίτιδα (περίπου 33%) συγκριτικά με υγιή άτομα, ακόμη και όταν έχει επέλθει πλήρης αποκατάσταση Προκλητά Δυναμικά Οπτικά προκλητά δυναμικά (ΟΠΔ) Στην οξεία φάση της οπτικής νευρίτιδας η απάντηση (κύμα Ρ100) είναι μειωμένη σε εύρος ή απούσα όταν η έκπτωση της οπτικής οξύτητας είναι σημαντική. Οποιαδήποτε εναπομένουσα απάντηση είναι καθυστερημένη. Καθώς βελτιώνεται η οπτική οξύτητα το εύρος αυξάνεται και παραμένει μια καλά σχηματισμένη κυματομορφή, με αύξηση του λανθάνοντος χρόνου στο 90% περίπου των ασθενών. Ο μέσος όρος καθυστέρησης είναι 35ms περίπου. Η αύξηση του λανθάνοντος χρόνου παραμένει στο 90% περίπου των ασθενών, αν και μπορεί να επανέλθει στις φυσιολογικές τιμές. Σε αυτές τις περιπτώσεις βοηθάει η μέτρηση της διοφθάλμιας διαφοράς. Η χρησιμότητα των ΟΠΔ στη διάγνωση της ΣΚΠ προκύπτει από τη μεγάλη συχνότητα προσβολής του οπτικού νεύρου, με ή χωρίς αντίστοιχα συμπτώματα, και τη συνήθη επιμονή των παθολογικών ευρημάτων. Σε γενικές γραμμές αυτά είναι καθυστερημένα σε ποσοστό 70% περίπου των ασθενών με βέβαιη ΣΚΠ. Ο κίνδυνος εμφάνισης της νόσου αυξάνεται στους μονοσυμπτωματικούς ασθενείς οι οποίοι δεν έχουν οπτικά συμπτώματα αλλά αποκαλύπτεται αύξηση του λανθάνοντος χρόνου του Ρ100 κύματος (ένδειξη απομυελινωτικής βλάβης). Αυτό σημαίνει ότι υπάρχει προσβολή δεύτερου σημείου-διασπορά στον χώρο. Τα ΟΠΔ είναι η μοναδική νευροφυσιολογική εξέταση που διατηρήθηκε στα διαγνωστικά κριτήρια του McDonald Σωματοαισθητικά προκλητά δυναμικά (ΣΠΔ) Η αξία των ΣΠΔ είναι η ανάδειξη διασποράς στον χώρο, κυρίως σε μονοσυμπτωματικούς ασθενείς. Όπως και στα ΟΠΔ, παρατηρείται καθυστέρηση ή 95

96 απουσία της απάντησης στην οξεία φάση απομυελινωτικής μυελοπάθειας που προσβάλλει τις οπίσθιες δέσμες του ν.μ. Όταν απέρχεται η οξεία φάση παραμένει καθυστέρηση της απάντησης (συνήθως μόνιμη). Στο σύνολο των ασθενών με βέβαιη ΣΚΠ το 80% περίπου έχει παθολογικά ΣΠΔ, ενώ αυτό το ποσοστό υποχωρεί σε περιπτώσεις μικρότερης διαγνωστικής βεβαιότητας Ακουστικά προκλητά δυναμικά (ΑΠΔ) Στις απομυελινωτικές νόσους υπάρχει χαρακτηριστικά αύξηση του λανθάνοντος χρόνου ανάμεσα στο Ι/ΙΙ κύμα και τα κύματα ΙΙΙ,ΙV και V, το εύρος των οποίων μειώνεται. Διαταραχές στα ΑΠΔ είναι λιγότερο συχνές συγκριτικά με τα ΟΠΔ και τα ΣΠΔ στη βέβαιη ΣΚΠ (κατά προσέγγιση 50-75%) και τη δυνατή ΣΚΠ (περίπου 25%) Εξέταση Εγκεφαλονωτιαίου υγρού Κύτταρα Συνήθως ανευρίσκεται μέτρια αύξηση των κυττάρων στο ΕΝΥ κύτταρα/cm 3 κατά τη διάρκεια της υποτροπής. Κάποιες φορές αυτές οι τιμές ανευρίσκονται και σε περιόδους ύφεσης, δεδομένης της χρόνιας φλεγμονώδους διαδικασίας που εξελίσσεται στον εγκέφαλο ασθενών με ΣΚΠ. Αριθμός κυττάρων άνω των 50/cm 3 είναι σπάνιος και εγείρει την υποψία άλλης διάγνωσης. Στην οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτιδα και την εγκάρσια μυελίτιδα ο τίτλος των κυττάρων μπορεί να είναι πολύ υψηλότερος (>100/ cm 3 ) κατά την οξεία φάση. Παρ όλα αυτά, έχουν συναντηθεί τιμές κυττάρων έως 100/ cm 3 σε ασθενείς που ικανοποιούσαν πλήρως τα κριτήρια της βέβαιης ΣΚΠ. Τα λεμφοκύτταρα αποτελούν το 90% του πληθυσμού και τα πολυμορφοπύρηνα το άλλο 5% Λεύκωμα Το ολικό λεύκωμα είναι φυσιολογικό στα 2/3 των ασθενών, ενώ στο υπόλοιπο 1/3 είναι μέτρια αυξημένο ( g/l). Κατ εξαίρεση, βρίσκονται μεγαλύτερες τιμές, και όταν υπάρχει οίδημα στον ν.μ. σε οξεία βλάβη ο τίτλος μπορεί να ανέβει άνω του 1 g/l. Υψηλότερα επίπεδα καταγράφονται στις περιπτώσεις που συνυπάρχει κεντρική και περιφερική απομυελινωτική νόσος, ΣΚΠ και χρόνια φλεγμονώδης απομυελινωτική πολυνευροπάθεια. 96

97 Σύνθεση IgG στο ΚΝΣ Η σύνθεση των IgG ανοσοσφαιρινών στο ΚΝΣ είναι χαρακτηριστικό της ΣΚΠ. Η πιο διαδεδομένη μέθοδος είναι ο ισοηλεκτρικός εστιασμός συγχρόνως των λευκωμάτων του ορού και του ΕΝΥ, για να μπορεί να εκτιμηθεί η σύνθεση των IgG στο ΚΝΣ. Κάποια εργαστήρια χρησιμοποιούν τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης λόγω του χαμηλότερου ποσοστού ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, αλλά αυτή η τεχνική διαθέτει μικρότερη ευαισθησία. Η ύπαρξη ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ αλλά όχι στον ορό ή η ύπαρξη επιπλέον ζωνών στο ΕΝΥ παρά την παρουσία ανωμαλιών στον ορό, δίνει σαφείς ενδείξεις για σύνθεση ανοσοσφαιρινών στο ΚΝΣ και εξέλιξη ενεργούς ανοσολογικής διαδικασίας μέσα σε αυτό. Χρησιμοποιώντας τον ισοηλεκτρικό εστιασμό, ολιγοκλονικές ζώνες ανευρίσκονται στο 95% των ασθενών με κλινικά βέβαιη ΣΚΠ. Η απουσία τους σε έναν ασθενή ύποπτο για ΣΚΠ πρέπει να βάζει σκέψεις για αναθεώρηση της διάγνωσης. Η παρουσία πανομοιότυπων ζωνών στον ορό και το ΕΝΥ καταδεικνύει συστηματική ανοσολογική απάντηση με παθητική διάχυση των ανοσοσφαιρινών από τον ορό και δεν έχει διαγνωστική αξία. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε ασθενείς από την Ανατολή με βέβαιη ΣΚΠ, το ποσοστό των ολιγοκλονικών ζωνών είναι σαφώς χαμηλότερο (περίπου 33%) συγκριτικά με Ευρωπαίους ασθενείς (>90%). Δεν είναι σίγουρο εάν αυτή η παρατήρηση σχετίζεται με το γεγονός ότι στους Ανατολικούς πληθυσμούς είναι συχνότερη η οπτικο-μυελική μορφή της νόσου. Οι ολιγοκλωνικές ζώνες ορισμένες φορές είναι αρνητικές ή απουσιάζουν όταν πρωτοεκδηλώνεται η νόσος, αλλά σε επόμενη παρακέντηση θετικοποιούνται. Η παρουσία των ζωνών παραμένει μόνιμα άπαξ και δημιουργηθούν σε ασθενείς με ΣΚΠ. Η παρουσία των ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ δεν συσχετίζεται με την κλινική πορεία της νόσου 147. Η εξαφάνισή τους, όπως συμβαίνει στην οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτιδα, καθιστά τη διάγνωση της ΣΚΠ απίθανη. Η παρουσία τους σε ασθενείς με οπτική νευρίτιδα ή άλλο μεμονωμένο κλινικό επεισόδιο αυξάνει την πιθανότητα μετατροπής σε κλινικά βέβαιη ΣΚΠ τα επόμενα 5 χρόνια. Έχουν χρησιμοποιηθεί κι άλλες τεχνικές για την ανάδειξη της σύνθεσης των ανοσοσφαιρινών στο ΚΝΣ. Ο δείκτης IgG στηρίζεται στις αναλογίες μεταξύ 97

98 λευκωματίνης και IgG του ΕΝΥ και του ορού. Είναι λιγότερο ευαίσθητος από τον ισοηλεκτρικό εστιασμό. Πρέπει να επισημανθεί ότι η ύπαρξη των ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ δεν είναι παθογνωμικό της ΣΚΠ, δεδομένου ότι συναντάται και σε άλλα νοσήματα (οξείες και χρόνιες φλεγμονές του εγκεφάλου και των μηνίγγων, ανοσολογικά και παρανεοπλασματικά νοσήματα). Εκτός του IgG κλάσματος, έχουν βρεθεί επίσης ανοσοσφαιρίνες IgA και IgM. Η παρουσία των IgM έχει συσχετιστεί με πτωχή πρόγνωση. Αλλά αυτό το στοιχείο χρήζει περαιτέρω διερεύνησης Διαγνωστικά κριτήρια Η θέσπιση κριτηρίων δημιουργήθηκε από την ανάγκη για ομοιομορφία στη διάγνωση στις κλινικές ερευνητικές μελέτες. Αυτά τα κριτήρια έχασαν το ειδικό τους βάρος με την εμφάνιση των παρακλινικών εξετάσεων, όπως η μαγνητική τομογραφία και οι μελέτες του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Παρ όλα αυτά, κάποιες φορές τίθεται λάθος διάγνωση και προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν αυτές οι περιπτώσεις είναι απαραίτητο να εφαρμόζονται τα κατάλληλα διαγνωστικά κριτήρια 23. Σε μερικές περιπτώσεις, η κλινική εικόνα μόνο είναι αρκετή για να θέσει τη διάγνωση με σημαντική βεβαιότητα. Ακόμη όμως και τότε ο νευρολόγος χρειάζεται την επιβεβαίωση από τις εργαστηριακές μεθόδους, δεδομένου ότι η επιλογή για θεραπεία συνεπάγεται δυνητικά και τις γνωστές ή άγνωστες ανεπιθύμητες ενέργειες. Συχνά, υπάρχει γνήσιος διαγνωστικός προβληματισμός, ειδικά στα πρώτα στάδια της νόσου. Διάφορα σχήματα έχουν προταθεί κατά καιρούς στην προσπάθεια να αποδοθεί σχετική βεβαιότητα στη διάγνωση της νόσου. Στην αρχή βασίστηκαν σε κλινικά στοιχεία μόνο, αλλά το 1983 μια διακεκριμένη ομάδα νευρολόγων συμφώνησαν σε μια κατάταξη η οποία, αν και είχε κάποια μειονεκτήματα, κέρδισε γενικής αποδοχής στην κλινική πράξη, την επιδημιολογία και τις κλινικές μελέτες. Τα κριτήρια του Poser χρησιμοποίησαν, σαν χρυσό κανόνα για τη διάγνωση της ΣΚΠ, τις δύο ή περισσότερες υποτροπές που αφορούσαν δύο ή περισσότερα διαφορετικά σημεία του Κ.Ν.Σ. (περιλαμβάνοντας το ένα ή και τα δύο οπτικά νεύρα), αλλά για την κλινικά βέβαιη ΣΚΠ, επέτρεπε την αντικατάσταση της κλινικής ένδειξης από παθολογικό εργαστηριακό εύρημα στο 98

99 δεύτερο σημείο. Η απεικόνιση, η νευροφυσιολογική μελέτη και η εξέταση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού χρησιμοποιήθηκαν ως επιπρόσθετες ενδείξεις για την διάγνωση περιπτώσεων που δεν πληρούσαν τα κριτήρια, είτε από απουσία της δεύτερης υποτροπής είτε από έλλειψη του δεύτερου σημείου βλάβης. Το 2001, το International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis παρουσίασε νέα διαγνωστικά κριτήρια για τη ΣΚΠ τα οποία έγιναν γνωστά ως «κριτήρια Mc Donald», από το όνομα του προέδρου της ομάδας Dr W. Ian McDonald. Τα κριτήρια έγιναν παγκοσμίως γνωστά και υιοθετήθηκαν από την κοινότητα της ΣΚΠ. Η πρόθεση του Mc Donald ήταν να παρουσιάσει ένα διαγνωστικό σχήμα το οποίο θα βοηθούσε τον νευρολόγο να διαγνώσει τη ΣΚΠ πιο γρήγορα και πιο αξιόπιστα, ισορροπώντας μεταξύ της πρώιμης διάγνωσης και της ανάγκης να αποφύγει την ψευδώς θετική διάγνωση 24. Η κύρια αλλαγή είναι η ενσωμάτωση ειδικών χαρακτηριστικών στη μαγνητική τομογραφία που υποδηλώνουν διασπορά στον χρόνο και τον χώρο 1. Τα στοιχεία της MRI ενδεικτικά για διασπορά στον χώρο αποτελούν την εξέλιξη προηγούμενων προσπαθειών από αρκετές ερευνητικές ομάδες να αυξήσουν την ειδικότητα των ευρημάτων της MRI στη διάγνωση της ΣΚΠ. Σε πρώιμο στάδιο ο Fazekas και οι συνεργάτες του (1998) 1 πρότειναν την παρουσία 3 ή περισσότερων εστιών στην Τ2-weighted MRI και δύο εκ των τριών παρακάτω χαρακτηριστικών: περιοχές παθολογικού σήματος διαμέτρου 6 mm περιοχές παθολογικού σήματος πέριξ των σωμάτων των κοιλιών περιοχές παθολογικού σήματος υποσκηνιδίως Στη συνέχεια, ο Barkhof και οι συνεργάτες του (1997) 1 κατόπιν τριετούς μελέτης κατάφεραν να προβλέψουν με υψηλό δείκτη αξιοπιστίας τη μετατροπή του μεμονωμένου κλινικού γεγονότος σε ΣΚΠ, εάν ισχύουν 4 στοιχεία: 1 ή περισσότερες εστίες προσλαμβάνουσες σκιαστικό 3 ή περισσότερες περικοιλιακές εστίες 1 ή περισσότερες υποφλοιώδεις εστίες 1 ή περισσότερες υποσκηνίδιες εστίες Η Tintoré και οι συνεργάτες της (2000) πρότειναν την τροποποίηση των κριτηρίων του Barkhof, σύμφωνα με την οποία, η παρουσία οποιοδήποτε τριών εκ 99

100 των τεσσάρων κριτηρίων ήταν αρκετή, ενώ επιπλέον, τέθηκε το εναλλακτικό στοιχείο των 9 εστιών στην Τ2 αντί της μίας εμπλουτιζόμενης εστίας. Ο συνδυασμός των κριτηρίων του Barkhof και των αναθεωρημένων της Tintoré υιοθετήθηκε από το International Panel ως τα κριτήρια για τη διασπορά στον χώρο 199. Το Panel συμπεριέλαβε δύο επιπλέον χαρακτηριστικά για τη διασπορά στον χώρο. Πρώτον, μία εστία στον ν.μ. μπορεί να αντικαταστήσει μία εστία στον εγκέφαλο. Δεύτερον, τα κριτήρια πληρούνται όταν υπάρχει ο συνδυασμός 2 εστιών στην Τ2 με την παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ. Το κυρίαρχο χαρακτηριστικό της MRI για τη στοιχειοθέτηση της διασποράς στον χρόνο, χρησιμοποιώντας τα αναθεωρημένα κριτήρια, είναι η παρουσία μιας νέας εστίας 3 μήνες μετά την έναρξη της κλινικής υποτροπής. Δηλαδή, η εμφάνιση 1 εμπλουτιζόμενης εστίας 3 μήνες μετά την έναρξη της ώσης ή εάν δεν υπάρχει εστία που προσλαμβάνει, είναι αρκετή η παρουσία μιας νέας εστίας στην Τ2 σε μια επόμενη απεικόνιση. Τα κριτήρια υπαγορεύουν ότι είναι καλύτερα εφαρμόσιμα σε άτομα μεταξύ 10 και 59 ετών. Επίσης, δεν περιλαμβάνουν πλέον τις κατηγορίες των κλινικά βέβαιη ή δυνατή ΣΚΠ. Αντιθέτως, οι διαγνωστικές κατηγορίες είναι οι εξής: Σκλήρυνση κατά πλάκας- όταν πληρούνται τα κριτήρια Δυνατή ΣΚΠ-για τους ασθενείς με υψηλό κίνδυνο να εμφανίσουν ΣΚΠ, για τους οποίους η διαγνωστική εκτίμηση δεν είναι καταληκτική Δεν είναι ΣΚΠ 100

101 Πίνακας 1. Ταξινόμηση της διάγνωσης της ΣΚΠ σύμφωνα με τα κριτήρια Poser Υποτροπές Κλινικές Παρακλινικές ΕΝΥ/ΟΖ ενδείξεις ενδείξεις Α.Κλινικά βέβαιη ΣΚΠ CDMS A1 2 2 CDMS A2 2 1 και 1 B.Εργαστηριακά τεκμηριωμένη Βέβαιη ΣΚΠ LSDMS B1 2 1 Ή 1 + LSDMS B LSDMS B3 1 1 και 1 + Γ. Κλινικά δυνατή ΣΚΠ CPMS Γ1 2 1 CPMS Γ2 1 2 CPMS Γ3 1 1 και 1 Δ.Εργαστηριακά τεκμηριωμένη δυνατή ΣΚΠ LSPMS Δ1 2 + Σημείωση: CDMS: Κλινικά βέβαιη ΣΚΠ, LSDMS: εργαστηριακά υποστηριζόμενη βέβαιη ΣΚΠ, CPMS: κλινικά δυνατή ΣΚΠ, LSPMS: εργαστηριακά υποστηριζόμενη δυνατή ΣΚΠ 1 101

102 Πίνακας 2. Κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ : στοιχεία από την MRI για διασπορά στον χώρο Κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ : στοιχεία από την MRI για διασπορά στον χώρο Τρία από τα παρακάτω: μία ή περισσότερες εστίες που προσλαμβάνουν σκιαστικό ή 9 ή περισσότερες υπέρπυκνες εστίες στην Τ2, εάν δεν υπάρχει εστία που εμπλουτίζει μία ή περισσότερες υποσκηνίδιες εστίες μία ή περισσότερες υποφλοιώδεις εστίες τρεις ή περισσότερες περικοιλιακές εστίες Σημείωση: 1.μία εστία στον ν.μ. μπορεί να αντικαταστήσει μία εστία στον εγκέφαλο, 2. 2 εστίες στην Τ2 και παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ επίσης αποδεικνύουν διασπορά στον χώρo

103 Πίνακας 3. Κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ : στοιχεία από την MRI για τη διασπορά στον χρόνο Κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ : στοιχεία από την MRI για τη διασπορά στον χρόνο 1. Εάν η πρώτη απεικόνιση διενεργήθηκε >3 μήνες από την έναρξη της ώσης, η παρουσία μίας εμπλουτιζόμενης εστίας στοιχειοθετεί διασπορά στον χρόνο, δεδομένου ότι δεν εμπλέκεται η ίδια περιοχή με το προηγούμενο κλινικό γεγονός. Εάν δεν υπάρχει εμπλουτιζόμενη εστία αυτή τη χρονική στιγμή, είναι απαραίτητη επανάληψη της απεικόνισης. Συστήνεται χρονικό διάστημα 3 μηνών περίπου, χωρίς όμως να είναι κριτική η ακριβής χρονική στιγμή. Μία νέα Τ2 ή εμπλουτιζόμενη εστία στη νέα MRI πληροί τα κριτήρια για διασπορά στον χρόνο. 2. Εάν η πρώτη απεικόνιση διενεργήθηκε < 3 μήνες από την έναρξη της ώσης, μια δεύτερη απεικόνιση 3 μήνες ή περισσότερο μετά το κλινικό γεγονός, δείξει μία νέα εμπλουτιζόμενη εστία στοιχειοθετεί διασπορά στον χρόνο. Παρ όλα αυτά, εάν δεν σημειωθεί εμπλουτιζόμενη εστία στη δεύτερη MRI, νέα απεικόνιση 3 μήνες από την πρώτη MRI η οποία δείχνει μία νέα Τ2 ή εμπλουτιζόμενη εστία είναι αρκετή 199. Πίνακας 4. Κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ :κατηγορίες της ΣΚΠ Κλινικά στοιχεία Δύο ή περισσότερες ώσεις, αντικειμενικά ευρήματα δύο ή περισσότερων βλαβών Δύο ή περισσότερες ώσεις, αντικειμενικά ευρήματα μίας βλάβης Επιπρόσθετα δεδομένα απαραίτητα για τη διάγνωση της ΣΚΠ Κανένα α Διασπορά στον χρόνο όπως προκύπτει από την MRI β ή έως 2 εστίες στην MRI συμβατές με τη ΣΚΠ και θετικό ΕΝΥ γ ή 103

104 αναμονή για δεύτερη κλινική υποτροπή που αφορά σε διαφορετική περιοχή Μία ώση, αντικειμενικά κλινικά ευρήματα 2 ή περισσότερων βλαβών Μία ώση, αντικειμενικά κλινικά ευρήματα μίας βλάβης (μονοσυμπτωματική εμφάνιση, κλινικά μεμονωμένο γεγονός CIS) Προοδευτικά εξελισσόμενη νευρολογική συμπτωματολογία ενδεικτική για ΣΚΠ Διασπορά στον χρόνο όπως προκύπτει από την MRI δ ή δεύτερη κλινική υποτροπή Διασπορά στον χώρο όπως προκύπτει από την MRI β ή έως 2 εστίες στην MRI συμβατές με ΣΚΠ και θετικό ΕΝΥ γ και διασπορά στον χρόνο όπως προκύπτει από την MRI δ ή δεύτερη κλινική υποτροπή Θετικό ΕΝΥ γ και διασπορά στον χώρο όπως προκύπτει από: 9 ή περισσότερες Τ2 εστίες στον εγκέφαλο ή 2 ή περισσότερες εστίες στον ν.μ. ή 4 έως 8 εστίες στον εγκέφαλο και 1 εστία στον ν.μ. ή παθολογικά οπτικά ε προκλητά δυναμικά συνδυαζόμενα με 4 έως 8 εστίες στον εγκέφαλο και 1 εστία στον ν μ. όπως φαίνεται στην MRI 104

105 και διασπορά στον χρόνο όπως προκύπτει από την MRI δ ή συνεχιζόμενη εξέλιξη για 1 χρόνο α: δεν είναι απαραίτητες επιπλέον παρακλινικές εξέτασεις (παρ όλα αυτά, αν η MRI και το ΕΝΥ είναι αρνητικά η διάγνωση της ΣΚΠ πρέπει να τεθεί με μεγάλη επιφύλαξη. Καλό είναι να συζητηθεί εναλλακτική διάγνωση και να μην υπάρχει καλύτερη εξήγηση για την κλινική εικόνα του ασθενούς) β: πρέπει να πληρούνται τα κριτήρια του Barkhof/Tintoré γ: θετικό ΕΝΥ στοιχειοθετούμενο με την ανεύρεση ολιγοκλωνικών ζωνών σύμφωνα με καθιερωμένες μεθόδους και να είναι διαφορετικές από ζώνες στον ορό ή από αυξημένο IgG δείκτη δ: πρέπει να πληρούνται τα κριτήρια Mc Donald για τη ΣΚΠ με στοιχεία από την MRI για διασπορά στον χρόνο ε: παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά με ευρήματα συμβατά με αυτά που συναντώνται στη ΣΚΠ (καθυστέρηση με καλά διατηρημένο το σχήμα της κυματομορφής) 199 Το International Panel συνεδρίασε ξανά τον Μάρτιο 2005 στο Άμστερνταμ, περίπου 5 χρόνια από το πρώτο συνέδριο στο Λονδίνο, προκειμένου να επανεξετάσει την πρόοδο από τη γένεση των κριτηρίων Mc Donald, να εκτιμήσει εάν εξακολουθούν να είναι κατάλληλα και να συστήσει αναθεώρηση αυτών. Το αποτέλεσμα ήταν τα αναθεωρημένα κριτήρια Mc Donald Όσον αφορά στα κριτήρια για διασπορά στον χρόνο, τα δεδομένα που συγκεντρώθηκαν αναδεικνύουν τον ρόλο των Τ2 βλαβών, κι όχι μόνο των εμπλουτιζόμενων, για να αποδειχθεί η διασπορά στον χρόνο. Το Panel πιστεύει ότι οι Τ2 βλάβες μπορεί να είναι χρήσιμες στην ανάδειξη της διασποράς στον χρόνο πιο γρήγορα συγκριτικά με την απαιτούμενη τρίμηνη περίοδο των αρχικών κριτηρίων. Κάθε νέα Τ2 βλάβη που εμφανίζεται σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή μετά την MRI 105

106 αναφοράς και απέχει τουλάχιστον 30 ημέρες από την έναρξη της αρχικής ώσης, είναι χρήσιμη στην πλήρωση των κριτηρίων για διασπορά στον χρόνο. Στα αρχικά κριτήρια του McDonald μία βλάβη στον ν.μ. αντικαθιστά μία βλάβη στον εγκέφαλο. Στα αναθεωρημένα κριτήρια δόθηκε περισσότερο βάρος στην απεικόνιση του ν.μ. καθώς εισήχθησαν τα εξής σημεία: Η απεικόνιση του ν.μ. μπορεί να βοηθήσει πολύ στον αποκλεισμό εναλλακτικών διαγνώσεων. Επίσης, βλάβες που μπορεί να αναπτυχθούν σε έναν εγκέφαλο που γερνά φυσιολογικά, δεν παρατηρούνται στον ν.μ. Εμφάνιση κλασσικών εστιών ΣΚΠ στον ν.μ. (ελάχιστο ή καθόλου οίδημα του ν.μ., υπέρπυκνες εστίες στην Τ2 ακολουθία, μέγεθος εστίας τουλάχιστον 3mm αλλά να μην επεκτείνεται πάνω από 2 μυελοτόμια, και τέλος να καταλαμβάνει μέρος μόνο του ν.μ. σε εγκάρσιο επίπεδο) είναι βοηθητική, ιδίως όταν η απεικόνιση του εγκεφάλου δεν αποδεικνύει διασπορά στον χώρο. Όσον αφορά στη διασπορά στον χώρο, μία εστία στον ν.μ. είναι ισοδύναμη με, και μπορεί να αντικαταστήσει μία υποσκηνιδιακή, αλλά όχι υποφλοιώδη ή περικοιλιακή, βλάβη. Εστία του ν.μ. που προσλαμβάνει σκιαστικό είναι ισοδύναμη με εμπλουτιζόμενη εστία στον εγκέφαλο. Μία εμπλουτιζόμενη εστία στον ν.μ. μπορεί να «υπολογιστεί» διπλά στην πλήρωση των κριτηρίων (π.χ. μία εμπλουτιζόμενη βλάβη στον ν.μ. «μετράει» σαν μία εμπλουτιζόμενη εστία και μία υποσκηνίδια εστία). Μεμονωμένες εστίες στον ν.μ. μπορούν να συνεισφέρουν σε μεμονωμένες εστίες στον εγκέφαλο για να ικανοποιηθεί το κριτήριο των 9 εστιών στην Τ2 ακολουθία στα κριτήρια των Barkhof/Tintoré. Οι βλάβες του ν.μ. πρέπει να είναι εστιακές (δηλαδή, σαφώς αφοριζόμενες και περιγεγραμμένες όπως φαίνονται στην Τ2 ακολουθία ) για να θεωρηθούν ύποπτες για ΣΚΠ. Αν και διάχυτες βλάβες είναι δυνατόν να υπάρχουν στη ΣΚΠ, ιδίως στην πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ, αυτές οι αλλαγές δεν είναι πλήρως αξιόπιστες για να ενσωματωθούν στα διαγνωστικά κριτήρια. 106

107 Τέλος, επανάληψη απεικονίσεων στον ν.μ. χωρίς συμπτωματική μυελίτιδα ελάχιστα προσφέρει στην απόδειξη διασποράς στον χρόνο. Επομένως, επανάληψη των απεικονίσεων στον ν.μ. συνιστάται στις περιπτώσεις στοιχειοθέτησης της διάγνωσης ΣΚΠ όταν υπάρχουν κλινικές ενδείξεις νέας μυελικής προσβολής. Ο καθορισμός του ορισμού της πρωτοπαθώς προϊούσας ΣΚΠ ασχολήθηκε ο Thompson και οι συνεργάτες του (2000) 1, ο οποίος υποστήριξε ότι θα έπρεπε να σημειωθεί κλινική εξέλιξη για ένα χρόνο τουλάχιστον και να ισχύουν τρία επίπεδα διαγνωστικής βεβαιότητας βασισμένα στα ευρήματα από το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, τα προκλητά δυναμικά και τη μαγνητική τομογραφία. Για να τεθεί η διάγνωση της βέβαιης ΣΚΠ σύμφωνα με αυτά τα κριτήρια, πρέπει να υπάρχουν ολιγοκλωνικές ζώνες στο ΕΝΥ. Επιπρόσθετα, απαιτείται να υπάρχει «βέβαιη» βλάβη στην MRI (δηλαδή 9 ή περισσότερες εστίες στον εγκέφαλο, ή 2 ή περισσότερες εστίες στον νωτιαίο μυελό, ή 1 εστία στον νωτιαίο μυελό και 4 έως 8 εστίες στον εγκέφαλο), διαφορετικά θα πρέπει να υπάρχουν αμφισβητούμενες βλάβες στην MRI (δηλαδή βλάβες που δεν πληρούν τα κριτήρια) μαζί με παθολογικά προκλητά δυναμικά. Στην ουσία, οι κατηγορίες της δυνατής και πιθανής πρωτοπαθώς προϊούσας ΣΚΠ απαιτούν μικρότερο βαθμό διαταραχής στο φάσμα των εργαστηριακών ευρημάτων (Thompson και οι συνεργάτες, 2000) 1. Η διάγνωση της πρωτοπαθούς προϊούσας ΣΚΠ παραμένει δύσκολη. Η αναθεώρηση των κριτηρίων το 2005 απλοποίησε τη διάγνωση της ΠΠΣΚΠ, αξιοποίησε τα στοιχεία νέων μελετών που δείχνουν ότι η διάγνωση της ΠΠΣΚΠ μπορεί να τεθεί χωρίς τη συνεισφορά του ΕΝΥ (τουλάχιστον όταν υπάρχουν επαρκή στοιχεία από την MRI), και τέλος, προσφέρει μια πιο λεπτομερή περιγραφή της ιστοπαθολογίας του εγκεφάλου και του ν.μ. όπως φαίνεται στην MRI. To Panel εξακολουθεί να πιστεύει ότι το θετικό ΕΝΥ προσφέρει ένα επιπλέον δείκτη ασφαλείας σε ασθενείς με προοδευτική εξέλιξη της νόσου εξ αρχής. Ανάλογα με τη βαρύτητα των άλλων διαγνωστικών κριτηρίων, η παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ δεν αποτελεί πλέον απαραίτητη προϋπόθεση για τη διάγνωση της ΠΠΣΚΠ. Πίνακας 5. Κριτήρια μαγνητικής τομογραφίας για τη διασπορά των βλαβών στον χρόνο σύμφωνα με τα αναθεωρημένα κριτηρία McDonald

108 Κριτήρια μαγνητικής τομογραφίας για τη διασπορά των βλαβών στον χρόνο Αναθεώρηση των κριτηρίων McDonald Υπάρχουν 2 τρόποι για αποδειχθεί η διασπορά στον χρόνο καθοριζόμενη από την απεικόνιση: I. Ανίχνευση πρόσληψης σκιαστικού τουλάχιστον 3 μήνες μετά την έναρξη της πρώτης κλινικής ώσης, αν όχι στο σημείο που αντιστοιχεί στο αρχικό γεγονός II. Ανίχνευση νέας Τ2 βλάβης, οποιαδήποτε χρονική στιγμή μετά την MRI αναφοράς μετά την πάροδο τουλάχιστον 30 ημερών μετά την έναρξη της πρώτης κλινικής ώσης 108

109 Πίνακας 6. Κριτήρια μαγνητικής τομογραφίας για τη διασπορά των βλαβών στον χώρο σύμφωνα με τα αναθεωρημένα κριτηρία McDonald Κριτήρια μαγνητικής τομογραφίας για τη διασπορά των βλαβών στον χώρο Αναθεώρηση των κριτηρίων McDonald 2005 Τρία από τα ακόλουθα: 1. τουλάχιστον μία εστία που προσλαμβάνει σκιαστικό ή 9 υπέρπυκνες εστίες στην Τ2, εάν δεν υπάρχει εστία που εμπλουτίζει 2. τουλάχιστον μία υποσκηνίδια εστία 3. τουλάχιστον μία υποφλοιώδη εστία 4. τουλάχιστον τρεις περικοιλιακές εστίες Σημειώση: μία εστία στον ν.μ. ισοδυναμεί με μία βλάβη υποσκηνίδια εστία στον εγκέφαλο: μία εμπλουτιζόμενη εστία στον ν.μ. ισοδυναμεί με μία εμπλουτιζόμενη εστία στον εγκέφαλο, μεμονωμένες εστίες στον ν.μ. μπορούν να συνεισφέρουν σε μεμονωμένες εστίες στον εγκέφαλο για να ικανοποιηθεί ο απαιτούμενος αριθμός των 9 εστιών στην Τ2 ακολουθία. Βασισμένα σε στοιχεία των Barkhof και συνεργατών και του Tintor é και συνεργατών. Πίνακας 7. Διάγνωση της Πρωτοπαθώς Προϊούσας ΣΚΠ σύμφωνα με τα αναθεωρημένα κριτηρία McDonald Διάγνωση της Πρωτοπαθώς Προϊούσας ΣΚΠ Αναθεώρηση των κριτηρίων McDonald Ένας χρόνος προοδευτικής εξέλιξης της νόσου (καθοριζόμενη αναδρομικά ή προοπτικά) 2. Συν δύο από τα παρακάτω: Θετική MRI εγκεφάλου (9 εστίες στην Τ2 ακολουθία ή 4 ή περισσότερες Τ2 εστίες με παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά) θετική MRI ν.μ. (2 εστιακές βλάβες στην Τ2 ακολουθία) θετικό ΕΝΥ α α η MRI πρέπει να πληροί τα κριτήρια διασποράς στον χώρο των Barkhof και συνεργατών και της Tintoré και συνεργατών. 109

110 Πίνακας 8. Αναθεωρημένα κριτήρια McDonald 2005 για τη διάγνωση της ΣΚΠ 24 Κλινικά ευρήματα Δύο ή περισσότερες ώσεις, αντικειμενικά κλινικά ευρήματα 2 ή περισσότερων βλαβών Δύο ή περισσότερες ώσεις, αντικειμενικά ευρήματα μίας βλάβης Μία ώση, αντικειμενικά κλινικά ευρήματα 2 ή περισσότερων βλαβών Επιπρόσθετα στοιχεία απαραίτητα για τη διάγνωση της ΣΚΠ κανένα β Διασπορά στον χρόνο, όπως φαίνεται από: ΜRI γ 2 ή περισσότερες εστίες στην ΜRI συμβατές με ΣΚΠ συν θετικό ΕΝΥ δ ή Αναμονή δεύτερης κλινικής ώσης α που αφορά σε άλλο σημείο Διασπορά στον χρόνο, όπως φαίνεται από: ΜRI ε ή Δεύτερη κλινική ώση α Μία ώση, αντικειμενικά κλινικά ευρήματα μίας βλάβης (μονοσυμπτωματική εμφάνιση, κλινικά μεμονωμένο γεγονός CIS) Διασπορά στον χώρο, όπως φαίνεται από: ΜRI γ ή 2 ή περισσότερες εστίες στην MRI συμβατές με ΣΚΠ συν θετικό ΕΝΥ δ και Διασπορά στον χρόνο, όπως φαίνεται από: ΜRI ε ή Δεύτερη κλινική ώση α 110

111 Προοδευτική εξέλιξη νευρολογικής συμπτωματολογίας ενδεικτική ΣΚΠ 1. Ένας χρόνος προοδευτικής εξέλιξης της νόσου(καθοριζόμενη αναδρομικά ή προοπτικά) και Δύο από τα παρακάτω: Θετική MRI εγκεφάλου (9 εστίες στην Τ2 ακολουθία ή 4 ή περισσότερες Τ2 εστίες με παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά) ζ Θετική MRI ν.μ. (2 εστιακές βλάβες στην Τ2 ακολουθία) Θετικό ΕΝΥ δ Σημειώσεις: Αν τα κριτήρια πληρούνται και δεν υπάρχει καλύτερη εξήγηση για την κλινική εικόνα του ασθενούς τότε η διάγνωση είναι ΣΚΠ. Αν είναι ύποπτος για ΣΚΠ αλλά δεν ικανοποιούνται πλήρως τα κριτήρια, η διάγνωση είναι «δυνατή ΣΚΠ». Τέλος, αν κάποια άλλη διάγνωση τεθεί κατά τη διάρκεια παρακολούθησης του ασθενούς τότε η διάγνωση είναι «όχι ΣΚΠ». α : ώση ορίζεται ως ένα επεισόδιο νευρολογικής διαταραχής φλεγμονώδους και απομυελινωτικής αρχής. Πρέπει να υπάρχει αντικειμενική μαρτυρία ή αντικειμενική παρατήρηση του επεισοδίου και η διάρκεια του πρέπει να είναι τουλάχιστον 24 ώρες. β : δεν χρειάζονται επιπλέον εξετάσεις. Παρ όλα αυτά, αν διενεργήθηκαν (MRI,ΕΝΥ) και είναι αρνητικές η διάγνωση της ΣΚΠ πρέπει να τεθεί με μεγάλη επιφύλαξη. Καλό είναι να συζητηθεί εναλλακτική διάγνωση και να μην υπάρχει καλύτερη εξήγηση για την κλινική εικόνα του ασθενούς. γ : η MRI πρέπει να πληροί τα κριτήρια διασποράς στον χώρο των Barkhof και συνεργατών και της Tintoré και συνεργατών δ : θετικό ΕΝΥ στοιχειοθετούμενο με την ανεύρεση ολιγοκλωνικών ζωνών σύμφωνα με καθιερομένες μεθόδους και να είναι διαφορετικές από ζώνες στον ορό ή από αυξημένο IgG δείκτη 111

112 ε : η MRI πρέπει να πληροί τα κριτήρια διασποράς στον χρόνο των Barkhof και των συνεργατών και της Tintoré και των συνεργατών ζ : παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά συμβατά με ΣΚΠ. Εν κατακλείδι, τα αναθεωρημένα κριτήρια McDonald διατηρούν τα κύρια χαρακτηριστικά των αρχικών κριτηρίων: δίνουν έμφαση στα αντικειμενικά κλινικά ευρήματα, βασίζονται στη διασπορά στον χρόνο και τον χώρο, χρησιμοποιούν υποστηρικτικές και επιβεβαιωτικές παρακλινικές εξετάσεις για να επιταχύνουν τη διαδικασία και να ελαχιστοποιήσουν τις ψευδώς θετικές και ψευδώς αρνητικές διαγνώσεις, επικεντρώνονται στην ειδικότητα περισσότερο από ότι στην ευαισθησία και τέλος, δίνουν σημασία στον αποκλεισμό άλλων νοσημάτων Διαφορική διάγνωση Η διάγνωση της ΣΚΠ συνήθως τίθεται από το ιστορικό του ασθενούς, την κλινική εξέταση, την ανάλυση του ΕΝΥ και τη μελέτη της μαγνητικής τομογραφίας. Παρ όλα αυτά, μερικές φορές τα κριτήρια δεν είναι καταληκτικά, ακόμα και με την υποστήριξη των παρακλινικών εξετάσεων. Πολλά νοσήματα μπορεί να εκδηλωθούν με πολυεστιακή συμπτωματολογία από το ΚΝΣ ακλουθώντας κλινική πορεία εξάρσεων και υφέσεων. Η ύπαρξη των ολιγοκλονικών ζωνών δεν είναι ειδική για τη ΣΚΠ, δεδομένου ότι ανευρίσκονται σε ευρύ φάσμα φλεγμονωδών και ανοσολογικών νοσημάτων. Επίσης, η παρουσία υπέρπυκνων εστιών στην Τ2 ακολουθία στην MRI εγκεφάλου έχει μεν υψηλή ευαισθησία για τη διάγνωση της ΣΚΠ (ανευρίσκεται στο 95% περίπου των ασθενών με ΣΚΠ), αλλά ένας μεγάλος αριθμός νοσημάτων παρουσιάζει διακριτές εστίες υψηλού σήματος στην Τ2. Το ποσοστό της λαθεμένης διάγνωσης κυμαίνεται στο 5% περίπου. Να προστεθεί βεβαίως ότι δεν υπάρχει κάποια εξέταση παθογνωμική για τη ΣΚΠ. Πολλές καταστάσεις μπορούν να μιμηθούν τη ΣΚΠ και πρέπει να διερευνώνται. Μπορούν να γίνουν δύο κατατάξεις αυτών των νοσημάτων, η μία σύμφωνα με την αιτιοπαθογένεια της νόσου 27. Η άλλη κατάταξη χωρίζει τις νόσους σε αυτές που μιμούνται κλινικά μόνο τη ΣΚΠ και διαφέρουν στα απεικονιστικά ευρήματα, σε αυτές που μιμούνται τη ΣΚΠ στην κλινική πορεία και τα ευρήματα στην MRI 26, και τέλος νοσήματα που μιμούνται τη ΣΚΠ κλινικά, απεικονιστικά και την ανάλυση του 112

113 ENY. Σημαντικά στοιχεία για τη διαφορική διάγνωση προέρχονται από τη διενέργεια πλήρους αιματολογικού και βιοχημικού ελέγχου, ανοσολογικού και ορμονικού ελέγχου, εξέταση δεικτών φλεγμονής και βιταμινών Β12, φυλικού οξέος, και ομοκυστεϊνης. Ανάλογα με τα ευρήματα των παραπάνω εξετάσεων θα ακολουθήσουν πιο εξειδικευμένες εργαστηριακές και παρακλινικές εξετάσεις. Κατάταξη 1 I. Φλεγμονώδη νοσήματα: Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος Σύνδρομο Sjögren Αγγειίτιδα Σαρκοείδωση Νόσος Behçet II. Λοιμώξεις: Νόσος Lyme Σύφιλη Προϊούσα πολυεστιακή λευκοεγκεφαλοπάθεια HTLV-I Έρπης Ζωστήρας III. Μεταβολικά και γενετικά νοσήματα: Έλλειψη βιταμίνης Β12 Λυσοσωμιακές διαταραχές: μεταγχρωματική λευκοδυστροφία, νόσος Fabry, νόσος Krabbe Αδρενολευκοδυστροφία Μιτοχονδριακές διαταραχές CADASIL κλινικά καθοριζόμενα ταυτοποιημένα γενετικά νοσήματα IV. Λέμφωμα του ΚΝΣ V. Νοσήματα του νωτιαίου μυελού: αγγειακές διαμαρτίες, αυχενική σπονδύλωση 113

114 Κατάταξη 2 I. Νοσήματα που μιμούνται τη ΣΚΠ κλινικά αλλά διαφέρουν στα απεικονιστικά ευρήματα: Κοκκιωμάτωση Wegener Νόσος Whipple Διαμαρτία Arnold-Chiari Ενδοεγκεφαλικός όγκος Μονοφασική μυελίτιδα: ενδο- ή εξωμυελική πίεση επί του ν.μ., έλλειψη βιταμίνης Β12 II. Νοσήματα που μιμούνται τη ΣΚΠ στην κλινική πορεία και τα απεικονιστικά ευρήματα: AIDS Μιτοχονδριακές εγκεφαλοπάθειες Αγγειακές νόσοι του εγκεφάλου CADASIL III. Νοσήματα που μιμούνται τη ΣΚΠ κλινικά, απεικονιστικά και την ανάλυση του ΕΝΥ: Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος Σύνδρομο Sjögren Οζώδης πολυαρτηρίτιδα Νόσος Behçet Νόσος Lyme Σαρκοείδωση Αδρενολευκοδυστροφία Human lymphotropic virus I Οπτική ατροφία Leber Οξεία διάσπαρτη εγκεφαλομυελίτιδα 114

115 2. Η θεραπεία της Σκλήρυνσης κατά Πλάκας Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις στη ΣΚΠ περιλαμβάνουν την αντιμετώπιση των οξέων υποτροπών, τη συμπτωματική, την υποστηρικτική αγωγή και την προφυλακτική θεραπεία. Η συμπτωματική πραγματεύεται την αντιμετώπιση των διαφόρων συμπτωμάτων όπως σπαστικότητα, αίσθημα κόπωσης, κυστικές διαταραχές. Η υποστηρικτική περιλαμβάνει τη συμβουλευτική, τη φυσική αποκατάσταση και την ψυχολογική υποστήριξη. Την τελευταία δεκαετία σημειώθηκε μεγάλη πρόοδος στη δημιουργία θεραπειών που μεταβάλλουν την πορεία της νόσου 5. Μελέτες του πειραματικού μοντέλου της ΣΚΠ αποτέλεσαν τη βάση θεραπευτικών προσεγγίσεων ελέγχου της εξέλιξης της νόσου, όπως αντιφλεγμονώδη, ανοσοτροποποιητικά και ανοσοκατασταλτικά φάρμακα στοχεύοντας στην καταστολή της αυτοάνοσης διαδικασίας. Ανάμεσα στις ανοσοτροποιητικές θεραπείες συγκαταλέγονται οι δύο τύποι ιντερφερόνης-β (IFNβ) η IFN-β-1b (υποδόρια IFN-β-1b, Betaferon : Schering, Berlin, Germany και Extavia : Novartis, Basel, Switzerland) και η IFN-β-1a (ενδομυϊκή IFN-β-1a [IFN-β-1a im], Avonex : Biogen, Cambridge, USA και υποδόρια IFN-β-1a [IFN-β-1a sc], Rebif : Serono, Genevè, Switzerland), η οξική γλατιραμέρη (Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries), το μονοκλωνικό αντίσωμα natalizumab (Tysabri, Biogen Idec and Elan Pharmaceuticals), τέλος πολλές θεραπείες βρίσκονται σε επίπεδο κλινικών μελετών προκειμένου να διαπιστωθεί η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια τους Θεραπεία της οξείας υποτροπής Αδρενοκορτικοτροπός ορμόνη Η κορτικοτροπίνη χρησιμοποιούνταν στο παρελθόν σε ενδομυϊκή χορήγηση για την αντιμετώπιση της οξείας υποτροπής. Ήταν αποτελεσματική στη μείωση της χρονικής διάρκειας της υποτροπής, αλλά δεν επηρέαζε καθόλου τον βαθμό αποκατάστασης καθώς και τη μακροπρόθεσμη πορεία της νόσου. Για αρκετά χρόνια αποτέλεσε θεραπεία εκλογής για την αντιμετώπιση των υποτροπών αλλά, λόγω των ανεπιθύμητων ενεργειών (αύξηση σωματικού βάρους, ακμή, ήπια υπέρταση, γλυκοζουρία), η χρήση της περιοριζόταν στις περιπτώσεις εκείνες που ήταν απολύτως απαραίτητη. Διεξάχθηκαν μελέτες για να τεκμηριώσουν την 115

116 αποτελεσματικότητα της κορτικοτρόπου ορμόνης, οι οποίες έδειξαν ότι υπερείχαν του εικονικού φαρμάκου. Προέκυψε επίσης ότι η βελτίωση της κλινικής εικόνας δεν παρέμενε πέρα των δύο πρώτων εβδομάδων μετά το τέλος της θεραπείας. Η κορτικοτρόπος ορμόνη σπάνια εφαρμόζεται κι έχει αντικατασταθεί από την ενδοφλέβια ή από του στόματος χορήγηση γλυκοκορτικοστεροειδών Μεθύλ-πρεδνιζολόνη Οι φυσικές στεροειδείς ορμόνες απομονώθηκαν από τα επινεφρίδια για πρώτη φορά το Λίγα χρόνια αργότερα, το 1947, επιτεύχθηκε η σύνθεση των στεροειδών ορμονών και με αυτόν τον τρόπο άνοιξε ο δρόμος για τη θεραπεία των αυτοάνοσων νοσημάτων. Μέχρι σήμερα τα γλυκοκορτικοστεροειδή (ΓΚ) συμπεριλαμβάνονται στα πιο ισχυρά ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Τη δεκαετία του 1950 μεγάλη πρόοδος σημειώθηκε στην ανάπτυξη νέων και πιο ισχυρών στεροειδικών παραγώγων. Παρ όλα αυτά, η θεραπεία με αδρενοκορτικοτρόπο ορμόνη (ACTH) υποφυσιακής προέλευσης, η οποία στηρίχτηκε στην έμμεση απελευθέρωση των ενδογενών γλυκοκορτικοστεροειδών και αλατοκορτικοστεροειδών ορμονών, χρησιμοποιήθηκε έως το Η χρήση της ACTH έχει εγκαταλειφθεί σχεδόν για όλα τα νευροανοσολογικά νοσήματα. Η ισχύουσα τακτική για την αντιμετώπιση των εξάρσεων των νευροανοσολογικών νοσημάτων είναι η χορήγηση υψηλής δόσης γλυκοκορτικοστεροειδών ορμονών. Η ενδοφλέβια έγχυση ΜΠ δόσης 0,5-1g ανά ημέρα, επιτυγχάνει επίπεδα στεροειδών στο αίμα 5-10 φορές υψηλότερα από αυτά των ενδογενών στεροειδών που λαμβάνονται μετά την απελευθέρωση της ACTH. Οι περισσότεροι μηχανισμοί δράσης των στεροειδών σε γενομικό επίπεδο, δηλαδή αυτών που επιτυγχάνονται με κυτταροπλασματικό υποδοχέα, μελετήθηκαν νωρίς μετά την ανακάλυψή τους. Για την αλληλεπίδραση με τον κυτταροπλασματικό υποδοχέα είναι αρκετές μικρές συγκεντρώσεις στεροειδών, όπως οι ενδογενείς ορμόνες που λαμβάνονται ως απάντηση σε θεραπεία με ACTH ή μετά από αγωγή με χαμηλές δόσεις ΓΚ. Πρόσφατα έγινε αντιληπτό ότι ενεργοποιούνται επιπρόσθετοι μηχανισμοί δράσης όταν χορηγούνται υψηλές δόσεις κορτικοστεροειδών, πιθανότατα διαμέσου άμεσης επίδρασης επί της κυτταρικής μεμβράνης και επακόλουθη μεταφορά ιόντων. Ακολουθεί μείωση της διαθεσιμότητας του ΑΤΡ, 116

117 γεγονός που παρατηρείται στην απόπτωση λίγο πριν την αποδόμηση του DNA, και το οποίο εξηγεί τα πειραματικά ευρήματα επαγωγής της απόπτωσης. Στα πειραματικά μοντέλα του συνδρόμου Guillain-Barré και της ΣΚΠ, υψηλές δόσεις ΓΚ αυξάνουν την απόπτωση των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων και επιταχύνουν την αποκατάσταση.(σχήμα 4) Μη γενομικός μηχανισμός δράσης των γλυκοκορτικοστεροειδών στον ενεργειακό μεταβολισμό του κυττάρου: θεραπευτική στόχευση των λεμφοκυττάρων χρησιμοποιώντας υψηλές δόσεις κορτικοστεροειδών Οι ενδείξεις για την ύπαρξη μη-γενομικών μηχανισμών δράσης προέκυψαν από την κλινική ιατρική και τις βασικές επιστήμες, οπού άμεσες απαντήσεις μετά από θεραπεία με ΓΚ ήταν ασύμβατες με τις πιο καθυστερημένες αποκρίσεις που λαμβάνονται από τους γενομικούς μηχανισμούς δράσης. Οι μη-γενομικοί μηχανισμοί δράσης θεωρείται ότι προκύπτουν από την αλληλεπίδραση με τις βιολογικές μεμβράνες, είτε διαμέσου ενός υποδοχέα δεσμευμένου στη μεμβράνη (ειδικοί μη-γενομικοί μηχανισμοί δράσης), είτε διαμέσου άμεσων φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων (μη ειδικοί μη-γενομικοί μηχανισμοί δράσης). Η λύση των κυττάρων του λεμφώματος αποδόθηκε πρόσφατα, σε μηχανισμό διαμέσου αλληλεπίδρασης με υποδοχέα της μεμβράνης. Η επαγωγή της απόπτωσης από τα ΓΚ επιτυγχάνεται και με τον γενομικό τρόπο δράσης, αλλά η προσφορά των μηγενομικών μηχανισμών δράσης υποδηλώνεται από τη σχέση μεταξύ απόπτωσης επαγόμενης από τα ΓΚ και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων, τουλάχιστον στις υψηλές δόσεις αυτών. Έχει αποδειχτεί ότι τα ΓΚ και άλλοι επαγωγοί της απόπτωσης μειώνουν και τελικά διασπούν το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Η επακόλουθη ελάττωση της διαθεσιμότητας του ΑΤΡ παρατηρείται φυσιολογικά στην απόπτωση πριν τη διάσπαση του DNA και συνδυάζεται με αλλαγή στη δομή και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Στην κλινική πράξη, το άμεσο αποτέλεσμα των υψηλών δόσεων ΓΚ μπορεί να είναι επιπρόσθετο του αποτελέσματος που επιτυγχάνεται διαμέσου του πυρηνικού υποδοχέα. Αυτή η πρόταση συνάδει με την κλινική παρατήρηση ότι συχνά μόνο υψηλές δόσεις ΓΚ επιτυγχάνουν να αντιμετωπίσουν τις οξείες υποτροπές των αυτοάνοσων νευρολογικών νοσημάτων. Τα αρχικά αποτελέσματα των υψηλών 117

118 δόσεων ΓΚ συμβαίνουν πολύ γρήγορα, την πρώτη εβδομάδα εφαρμογής της θεραπείας. Έχει προταθεί, αλλά δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα, ότι μη ειδικός μη γενομικός μηχανισμός δράσης είναι μόνο παρών κατά τη διάρκεια θεραπείας με υψηλές δόσεις ΓΚ, και εξαφανίζεται όταν η δόση των ΓΚ σταδιακά μειώνεται. Επίσης δεν είναι γνωστό εάν εφαρμόζεται το αποτέλεσμα του ανώτατου ορίου (ceiling effect) στον μη γενομικό μηχανισμό δράσης των υψηλών δόσεων ΓΚ. Οι παραπάνω παρατηρήσεις οδήγησαν στην υπόθεση ότι η σχετική ισχύς του γενομικού και του μη γενομικού μηχανισμού δράσης μέσα στο θεραπευτικό φάσμα των ΓΚ μπορεί να διαφέρει σημαντικά. Αναφέρονται οι σχετικές ισχύς του μη γενομικού μηχανισμό δράσης 5 κλινικά σημαντικών γλυκοκορτικοστεροειδών : πρεδνιλιδίνη(3,0) > δεξαμεθαζόνη (1,2) > ΜΠ (1,0) > πρεδνιζολόνη (0,4) > βηταμεθαζόνη (0,2). Η σειρά της ισχύος για τον γενομικό μηχανισμό δράσης είναι η εξής: δεξαμεθαζόνη, βηταμεθαζόνη (25) > ΜΠ (5) > πρεδνιζολόνη (4) > πρεδνιλιδίνη (3,5). Παρόμοια αναλογία ισχύει και για τα ανθρώπινα κύτταρα. Επομένως, η επιλογή του κατάλληλου ΓΚ μπορεί να χρειαστεί αναθεωρηθεί προκειμένου να επιτύχουμε το καλύτερο δυνατό θεραπευτικό αποτέλεσμα. (Σχήμα 4) Τα κορτικοστεροειδή αποτελούν την προεξάρχουσα θεραπευτική προσέγγιση στην αντιμετώπιση της οξείας υποτροπής στη ΣΚΠ. Κατέχουν ανοσοτροποποιητική και αντιφλεγμονώδη ιδιότητα, αποκαθιστούν τον ΑΕΦ και μειώνουν το οίδημα 45. πιθανόν να βελτιώνουν την αγωγή του ερεθίσματος κατά μήκος του άξονα 45. Μειώνουν τη διάρκεια των οξέων υποτροπών και επιταχύνουν την αποκατάσταση. Παρ όλα αυτά δεν συμμετέχουν στη βελτίωση του ολικού βαθμού αποκατάστασης και δεν αλλάζουν την πορεία της νόσου μακροπρόθεσμα 45. Επιπρόσθετα, τα κορτικοστεροειδή προλαμβάνουν τη διάσπαση του ΑΕΦ, το πρώτο εμφανές γεγονός στην παθολογία της ΣΚΠ. Αυτό επιτυγχάνεται με τους εξής μηχανισμούς: 1) μειώνουν τη μετανάστευση των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων και την απάντηση των Τ κυττάρων στα αντιγόνα, 2) καταστέλλουν την έκφραση των μορίων προσκόλλησης (ICAM-1, VCAM-1 και HLA-DR) στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μονοκύτταρα. Στο σημείο της φλεγμονής τα κορτικοστεροειδή μειώνουν την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-2) και την έκκριση μεταλλοπρωτεϊνασών. Αυτό καταλήγει σε καταστολή της φλεγμονής και της διάσπασης του ΑΕΦ. Επίσης τα κορτικοστεροειδή επάγουν την έκφραση των IL-10, 118

119 TGF-β, μειώνουν την έκκριση ανοσοσφαιρινών και την έκφραση του Fc υποδοχέα από τα μακροφάγα, αναστέλλουν την έκφραση των MHC-II αντιγόνα στα μακροφάγα και τη μικρογλοία. Οι λειτουργίες αυτές αποκαθιστούν περαιτέρω τον ΑΕΦ και την ιστική καταστροφή. Η δράση της κορτιζόνης επεκτείνεται στο σημείο της απομυελίνωσης και της διαδικασίας κυτταρικού θανάτου. Υψηλά επίπεδα MBP στο ΕΝΥ θεωρούνται ως in vivo δείκτης απομυελίνωσης, υπάρχουν στοιχεία που υποστηρίζουν τη δυνατότητα της ενδοφλέβιας κορτιζόνης να μειώνει την έκφραση της MBP. Η απόπτωση των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων είναι ένας από τους μηχανισμούς που βελτιώνουν το πειραματικό μοντέλο της αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας. Τα κορτικοστεροειδή ενισχύουν την απόπτωση των Τ κυττάρων έναντι της MBP και προστατεύει τα ολιγοδενδροκύτταρα από τον επαγόμενο από τις κυτταροκίνες κυτταρικό θάνατο. Σε αυτές τις περιπτώσεις φαίνεται ότι το αποτέλεσμα της κορτιζόνης είναι δοσοεξαρτώμενο. Ο ΑΕΦ είναι πιθανότατα ημιδιαπερατός στην κορτιζόνη κι επομένως η διέλευση της προς το ΕΝΥ μπορεί να επηρεάζεται από τη δόση της. Σχήμα 4: Απεικονίζει τον γενομικό και τους μη γενομικούς (ειδικό και μη ειδικό) μηχανισμούς δράσης της κορτιζόνης στον ενεργειακό μεταβολισμό του κυττάρου

120 Πίνακας 9. Ο μηχανισμός δράσης της κορτιζόνης στη ΣΚΠ Μηχανισμός δράσης της κορτιζόνης Δράσεις στη φλεγμονή Μείωση της μετανάστευσης των αυτοδραστικών Τ κυττάρων Μείωση της απόκρισης των Τ κυττάρων στα αντιγόνα Καταστολή της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης Μειώνει την παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτταροκινών Μειώνει την έκκριση των μεταλλοπρωτεϊνασών του στρώματος Αυξάνει την παραγωγή των IL-10 και TGFβ Μειώνει την έκκριση των ανοσοσφαιρινών Μειώνει την έκφραση του Fc υποδοχέα από τα μακροφάγα Αναστέλλει την έκφραση των MHC-II αντιγόνων στα μακροφάγα και τη μικρογλοία Δράσεις στην απόπτωση Αυξάνει την απόπτωση των αυτοδραστικών Τ-κυττάρων έναντι της MBP Δράσεις στην απομυελίνωση Μειώνει τα επίπεδα της MBP στο ΕΝΥ Προστατεύει τα ολιγοδενδροκύτταρα από τον επαγόμενο από τις κυτταροκίνες κυτταρικό θάνατο Βραχυχρόνια χορήγηση κορτιζόνης στα πλαίσια οξείας υποτροπής Τα αποτελέσματα της βραχυχρόνιας χορήγησης κορτιζόνης για την αντιμετώπιση της κλινικής υποτροπής αξιολογήθηκαν είτε κατά τη διάρκεια μικρού χρονικού διαστήματος είτε κατά τη διάρκεια μεγαλύτερου χρονικού παραθύρου στα πλαίσια παρακολούθησης των ασθενών. Έτσι, τα κορτικοστεροειδή επιταχύνουν την αποκατάσταση της αναπηρίας, όπως εκτιμάται από την κλίμακα Expanded Disability Status Scale (EDSS) σε ασθενείς που βρίσκονται σε ώση. Δοκιμάστηκε η αποτελεσματικότητα της υψηλής δόσης μεθύλ-πρεδνιζολόνης (ΜΠ) (>500mg/ημέρα για τουλάχιστον 3 ημέρες) έναντι της χαμηλότερης δόσης 48mg/ημέρα) ( για την αντιμετώπιση της οξείας υποτροπής. Η υψηλή δόση αποδείχθηκε πιο αποτελεσματική στην αντιμετώπιση της ώσης. 120

121 Παράλληλα τα αποτελέσματα από τη μακροχρόνια παρακολούθηση των ασθενών μετά από υποτροπή και θεραπεία με ενδοφλέβια κορτιζόνη, διέφεραν. Η άμεση βελτίωση που παρατηρείται στην αναπηρία και την οπτική οξύτητα, σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, διαρκεί έως 30 ημέρες μετά την κλινική υποτροπή, αλλά δεν είναι πλέον εμφανής 6 και 36 μήνες αργότερα. Επιπλέον, τα κορτικοστεροειδή δεν μειώνουν σημαντικά τον αριθμό των ασθενών που θα αναπτύξουν επόμενη ώση. Επίσης μελετήθηκαν τα οφέλη της κορτιζόνης όσον αφορά στη μετατροπή της δυνατής σε βέβαιη ΣΚΠ. Ασθενείς που έλαβαν υψηλή δόση (1g/ημέρα για 3 τουλάχιστον ημέρες) έδειξαν χαμηλότερο βαθμό μετατροπής σε βέβαιη ΣΚΠ κατά τη διάρκεια των επόμενων 2 ετών συγκριτικά με ασθενείς που έλαβαν εικονικό φάρμακο ή κορτιζόνη από του στόματος (1mg/kg ΒΣ για 14 ημέρες). Υψηλή δόση κορτικοστεροειδών προκαλεί γρήγορη αλλά παροδική (λιγότερο από 2 μήνες) μείωση στον αριθμό των εμπλουτιζόμενων εστιών. Η μείωση ξεκίνησε 30 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας και διήρκησε 60 ημέρες. Βραχυχρόνια αγωγή με υψηλές δόσεις κορτικοστεροειδών προκάλεσε σημαντική μείωση του συντελεστή εγεφαλικού παρεγχύματος. Αυτή η μείωση διήρκησε 1 μήνα και πιθανότατα οφειλόταν στη υποχώρηση του οιδήματος μετά τη δραστική μείωση των εμπλουτιζόμενων εστιών. Αξιολογήθηκαν επίσης, τα αποτελέσματα των στεροειδών σύμφωνα με τη χορηγούμενη δοσολογία, την οδό και τα είδη χορήγησης. Χρησιμοποιήθηκαν δύο δοσολογίες ενδοφλέβιας ΜΠ, 0,5mg/ημέρα για 5 ημέρες και 2g/ημέρα για 5 ημέρες. Η υψηλή δόση αποδείχτηκε πιο δραστική στη μείωση των νέων εμπλουτιζόμενων εστιών, αποτέλεσμα που διήρκησε έως 60 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας. Όσον αφορά στην οδό χορήγησης, δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στον μέσο όρο αλλαγής της EDSS μεταξύ ασθενών υπό ενδοφλέβια ΜΠ (1g/ημέρα για 3 ημέρες) και από του στόματος ΜΠ (έναρξη με 48mg/ημέρα σε σταδιακή μείωση), για χρονικό διάστημα 6 μηνών παρακολούθησης μετά τη θεραπεία. Η ενδοφλέβια ΜΠ ακολουθούμενη από του στόματος ΜΠ οδήγησε σε επιτάχυνση της αποκατάστασης της οπτικής οξύτητας, ενώ η μεμονωμένη από του στόματος χορήγηση ΜΠ ήταν αναποτελεσματική. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι η ενδοφλέβια έγχυση υψηλής δόσης ΜΠ υπερτερεί τόσο της χαμηλής ενδοφλέβιας 121

122 δόσης όσο και της από του στόματος χορήγησης. Το αποτέλεσμα αυτό δεν διαρκεί περισσότερο από 2 μήνες και δεν αποτρέπει την επανεμφάνιση εμπλουτιζόμενων εστιών στη μαγνητική τομογραφία Μακροχρόνια χορήγηση κορτικοστεροειδών Σε μια 5ετή τυχαιοποιημένη, μονή τυφλή κλινική μελέτη φάσης ΙΙ που αφορούσε σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, δοκιμάστηκε στον ένα βραχίονα ενδοφλέβια ΜΠ σε δόση 1g/ημέρα για 5 ημέρες ακολουθούμενη από ΜΠ από του στόματος κάθε 4 μήνες και στον άλλο βραχίονα, ίδια δόση ενδοφλέβιας ΜΠ μόνο μετά από κλινική υποτροπή. Στην πρώτη ομάδα παρατηρήθηκε μικρότερη συσσώρευση αναπηρίας συνοδευόμενη από σημαντική μείωση στην πιθανότητα εμμένουσας επιδείνωσης της EDSS. Στην ίδια ομάδα η αύξηση των Τ1 υπόπυκνων εστιών και η εγκεφαλική ατροφία ήταν σε μικρότερα επίπεδα συγκριτικά με τη δεύτερη ομάδα. Διενεργήθηκε μελέτη σε ασθενείς με ΔΠΣΚΠ χρησιμοποιώντας θεραπεία είτε με ενδοφλέβια ΜΠ υψηλής δόσης (500mg/ημέρα για 3 ημέρες ακολουθούμενη από του στόματος χορήγηση πρεδνιζολόνη με σταδιακή μείωση από τα 64mg), είτε με ΜΠ χαμηλής δόσης (10mg/ημέρα για 3 ημέρες ακολουθούμενη από του στόματος χορήγηση πρεδνιζολόνη με σταδιακή μείωση από τα 8mg) χορηγούμενη κάθε 8 εβδομάδες για 2 χρόνια. Ωστόσο δεν προέκυψαν ουσιαστικές διαφορές ανάμεσα στις δύο ομάδες Σύγκριση των οδών χορήγησης των γλυκοκορτικοστεροειδών Η σύγκριση της ενδοφλέβιας (ε.φ.) με την από του στόματος χορήγησης (per os) μεθύλ-πρεδνιζολόνης αποτελεί αντικείμενο μελετών, προκειμένου να βρεθεί ο πιο ωφέλιμος τρόπος αντιμετώπισης των οξέων υποτροπών. Σε μία μελέτη οπού συμμετείχαν 35 ασθενείς, με οξεία υποτροπή της νόσου, συγκρίθηκε η ενδοφλέβια έγχυση 500mg/ημέρα ΜΠ με την από του στόματος χορήγησης της ίδιας δόσης ΜΠ για 5 ημέρες. Η κλινική εκτίμηση έγινε την 5 η και την 28 η ημέρα. Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στις δύο ομάδες όσον αφορά στην αναπηρία και την απόδοση στις λειτουργικές δοκιμασίες. Σε αυτή τη μελέτη οι οδοί χορήγησης της ΜΠ ήταν ισοδύναμες

123 Σε μια άλλη έρευνα μελετήθηκε η επίδραση της ε.φ. και της per os. ΜΠ στη μετέπειτα συχνότητα των υποτροπών από χρήση τους σε υποτροπή της νόσου. Η συχνότητα υποτροπών ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην ομάδα της per os. ΜΠ, αλλά όχι στατιστικά σημαντική. Αντίθετα, το χρονικό διάστημα μέχρι την επόμενη υποτροπή, η ένταση της επόμενης ώσης, ο αριθμός των ασθενών ελεύθερων υποτροπών και η σοβαρότητα των υποτροπών μέχρι το τέλος της περιόδου παρακολούθησης ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες. Η συγκεκριμένη μελέτη δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα των υποτροπών τα δύο πρώτα χρόνια της παρακολούθησης ανάμεσα στις δύο θεραπευτικές προσεγγίσεις 56. Η ίδια ομάδα ερευνητών μελέτησε επίσης την επίδραση των δύο οδών χορηγήσεων όσον αφορά στην EDSS. Δεν προέκυψε διαφορά στην EDSS ανάμεσα στις δύο ομάδες για το χρονικό διάστημα των 4 εβδομάδων παρακολούθησης των ασθενών μετά την εφαρμογή της αγωγής 57. Μια ομάδα ερευνητών σύγκρινε τη βιοδιαθεσιμότητα της ΜΠ χορηγούμενης ενδοφλεβίως και από το στόμα και κατέληξαν ότι η ποσότητα των κορτικοστεροειδών που απορροφάται είναι παρόμοια για τα δύο δοσολογικά σχήματα που χρησιμοποιήθηκαν (1250mg per os πρεδνιζολόνης και 1g ε.φ. ΜΠ) 58. Τα παραπάνω ευρήματα υποστηρίζονται και από τον McAlpine και τους συνεργάτες του, παρά το γεγονός ότι παραδέχεται ότι η ενδοφλέβια είναι πιο διαδεδομένη από την από του στόματος χορήγηση Η επίδραση των κορτικοστεροειδών στη δημιουργία των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Ταυτόχρονη χορήγηση κορτικοστεροειδών και IFN-β μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης των Nabs σε ασθενείς με ΣΚΠ κατά τη διάρκεια 18 μηνών παρακολούθησης 46. Αυτό φάνηκε σε μία μελέτη που συμπεριέλαβε 161 ασθενείς και τους χορηγήθηκε υποδόρια IFN-β-1b σε δόση 8 MIU. Στους 81 εξ αυτών προστέθηκε μηνιαία θεραπεία με 1g ΜΠ ενδοφλεβίως. Δείγματα αίματος λαμβάνονταν κάθε 4 μήνες και ακολουθήθηκε η μέθοδος της βιολογικής δράσης της MxA για την ανίχνευση των Nabs. Οροθετικός για εξουδετερωτικά αντισώματα θεωρήθηκε ο ασθενής στον οποίο ο τίτλος αντισωμάτων ήταν τουλάχιστον

124 εξουδετερωτικές μονάδες, ενώ τίτλος 1:100 θεωρήθηκε δείγμα με υψηλό τίτλο αντισωμάτων. Σε αυτή τη μελέτη υιοθετήθηκαν δύο κριτήρια για την αποδοχή θετικότητας των αντισωμάτων: 1. κατά τον ορισμό Ι, ανιχνεύτηκε τίτλος 1:20 μία φορά, 2. κατά τον ορισμό ΙΙ, ανιχνεύτηκε τίτλος 1:20 σε δύο συνεχόμενα δείγματα. Η ανάπτυξη των αντισωμάτων καθυστέρησε σημαντικά στην ομάδα της συνδυασμένης θεραπείας σύμφωνα και με τους δύο ορισμούς θετικότητας. Η μείωση του σχηματισμού των Nabs ήταν της τάξεως του 54,9% και του 52,9% σύμφωνα με τους ορισμούς Ι και ΙΙ αντίστοιχα. Παρά ταύτα, η χορήγηση κορτικοστεροειδών απέτυχε να μειώσει τους τίτλους των αντισωμάτων όταν αυτά είχαν εμφανιστεί. Όσον αφορά στο κλινικό αποτέλεσμα, δεν σημειώθηκαν διαφορές στη συχνότητα των υποτροπών ανάμεσα στους ασθενείς υπό IFN-β και αυτούς υπό τη διπλή αγωγή. Η διπλή αγωγή ήταν καλά ανεκτή από τους περισσότερους ασθενείς. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες της IFN-β μειώθηκαν από τη συγχορήγηση της ΜΠ, ενώ στην ίδια ομάδα παρουσιάστηκε υψηλότερη συχνότητα ήπιας ηπατοτοξικότητας με ασυμπτωματική αύξηση των τρανσαμινασών. Τέλος, πρέπει να ληφθεί υπ όψιν το ενδεχόμενο ότι η συγχορηγούμενη ΜΠ μπορεί να επεμβαίνει ή να μειώνει τη δράση της IFN-β Η επίδραση των κορτικοστεροειδών στις εστίες που προσλαμβάνουν γαδολίνιο στη μαγνητική τομογραφία Η πρόσληψη γαδολινίου από τις εγκεφαλικές βλάβες στην MRI αποτελεί δείκτη ενεργούς διάσπασης του ΑΕΦ, συνέπεια της φλεγμονώδους διαδικασίας. Μελετήθηκε το αποτέλεσμα της ενδοφλέβιας έγχυσης μεθύλ-πρεδνιζολόνης σε υψηλή δόση (1g/ημέρα ) για 4 έως 8 ημέρες στις εμπλουτιζόμενες εστίες σε 7 ασθενείς με οξεία απομυελινωτική νόσο και συγκρίθηκαν οι προ της αγωγής μαγνητικές τομογραφίες με αυτές μετά την εφαρμογή της. Βρέθηκε ότι βραχυχρόνια χορήγηση υψηλών δόσεων ΜΠ καταστέλλει τις εμπλουτιζόμενες εστίες και αυτό συνάδει με τη βελτίωση της κλινικής εικόνας των ασθενών 48. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμπίπτουν με αυτά άλλων μελετών που ερευνούν την επίδραση υψηλών δόσεων ΜΠ στις εμπλουτιζόμενες εστίες κατά τη διάρκεια 124

125 υποτροπών της νόσου. Καταγράφηκαν οι εμπλουτιζόμενες εστίες σε μια σειρά μαγνητικών τομογραφιών πριν και μετά την τριήμερη εφαρμογή υψηλών δόσεων ΜΠ για την αντιμετώπιση οξείας υποτροπής της νόσου. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας σημειώθηκε γρήγορη μείωση των διαταραχών του ΑΕΦ στο 96% των εμπλουτιζόμενων εστιών. Παρά τη βελτίωση της κλινικής εικόνας των ασθενών, λίγες ημέρες μετά τη διακοπή της ΜΠ, επανεμφανίστηκαν πολλές από αυτές τις εστίες κι επιπλέον, συχνά έκαναν την παρουσία τους και νέες στον μήνα που ακολούθησε. Επομένως, είναι δυνατόν η γρήγορη αλλά παροδική αναστροφή των διαταραχών του ΑΕΦ να συμμετέχει στην επιτάχυνση της ανάρρωσης, που παρατηρείται μετά τη θεραπεία με κορτικοστεροειδή 49. Τα παραπάνω ενισχύονται από τη μελέτη των Barkhof και των συνεργατών του, η οποία έχει να προσθέσει στοιχεία από την Τ1 ακολουθία, πριν την έγχυση γαδολινίου. Διενεργήθηκαν μαγνητικές τομογραφίες πριν και μετά την εφαρμογή της θεραπείας (υψηλή δόση ΜΠ ενδοφλεβίως, 1g/ημέρα για 10 ημέρες). Οι εστίες που «έχασαν» τον εμπλουτισμό τους μετά την αγωγή παρέμειναν ορατές στην Τ1 χωρίς σκιαστικό. Συμπερασματικά, η συνοχή του ΑΕΦ βελτιώθηκε μετά τη χορήγηση υψηλής δόσης ΜΠ, γεγονός που συμφωνεί με την κλινική αποκατάσταση. Οι βλάβες όμως που παραμένουν ορατές στην Τ1 ακολουθία χωρίς σκιαστικό φανερώνουν ατελή ιστολογική αποκατάσταση τη χρονική στιγμή της επαναληπτικής μαγνητικής τομογραφίας. Επίσης υποδηλώνουν ότι η μαγνητική τομογραφία χωρίς την έγχυση γαδολινίου δεν είναι αρκετή για την παρακολούθηση της δραστηριότητας της νόσου βραχυπρόθεσμα 50. Σε μια προοπτική μελέτη συγκρίθηκε ο αριθμός των εμπλουτιζόμενων εστιών με γαδολίνο στην MRI με στοιχεία από το ΕΝΥ και την κλινική εικόνα πριν και μετά τη θεραπεία με υψηλή δόση μεθύλ-πρεδνιζολόνης. Πριν την αγωγή υπήρχε σαφής συσχέτιση της ενίσχυσης με γαδολίνιο και την παρουσία της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης στο ΕΝΥ. Εάν η πρόσληψη σκιαστικού αντανακλά τη διάσπαση του ΑΕΦ και η παρουσία της MBP στο ΕΝΥ τη διάσπαση της μυελίνης, τότε το μέγεθος του φλεγμαίνοντος ιστού θα πρέπει να σχετίζεται με το μέγεθος της μυελίνης που καταστρέφεται. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στη μείωση της MBP στο ΕΝΥ, την ενίσχυση με γαδολίνιο και την κλινική 125

126 αναπηρία. Επομένως το κλινικό αποτέλεσμα της ΜΠ μπορεί να συνοδεύεται από ελάττωση της φλεγμονής και της διάσπασης της μυελίνης 51. Μια πρόσφατη μελέτη εξέτασε το αποτέλεσμα της μηνιαίας έγχυσης κορτικοστεροειδών στη φλεγμονώδη διεργασία όπως απεικονίζεται στη μαγνητική τομογραφία. Εγγράφηκαν εννέα ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, οι οποίοι τους πρώτους έξι μήνες δεν έλαβαν αγωγή, ενώ από τον έβδομο έως τον ενδέκατο μήνα έλαβαν μεθύλ-πρεδνιζολόνη σε ενδοφλέβια έγχυση σε δοσολογία 500mg/ημέρα για μία ημέρα μηνιαίως, ακολουθούμενη από τριήμερη από του στόματος χορήγηση ΜΠ με σταδιακή ελάττωση της δόσης. Κατέληξε στο συμπέρασμα ότι αυτή η τακτική ελαττώνει τη φλεγμονώδη δραστηριότητα, όπως φαίνεται από τις εμπλουτιζόμενες εστίες στην Τ1 ακολουθία με γαδολίνιο, καθώς επίσης έχει ευεργετικό αποτέλεσμα στον όγκο των βλαβών στην Τ2 ακολουθία. Λόγω του μικρού αριθμού ασθενών δεν ήταν δυνατόν να προκύψουν αξιόπιστα κλινικά συμπεράσματα. Η θεραπεία για αυτό το χρονικό διάστημα ήταν ασφαλής. Παράλληλα, παρακολουθήθηκε η τιμή της προλακτίνης στο αίμα. Σύμφωνα με κάποια στοιχεία είναι αυξημένη κατά τη διάρκεια των υποτροπών και επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα στην ύφεση της νόσου. Σε άλλες μελέτες υποστηρίζεται ότι η προλακτίνη είναι είτε πιο αυξημένη σε ασθενείς με ΣΚΠ, αλλά μέσα στα φυσιολογικά όρια, είτε είναι φυσιολογική. Αυξημένα επίπεδα ενδογενών ή θεραπευτικών γλυκοκορτικοειδών σχετίζονται με κλινικά σημαντική ανοσοκαταστολή μέσω διάφορων μηχανισμών, ενώ παράλληλα μειώνουν την παραγωγή και έκφραση Οι εργαστηριακές εξετάσεις έδειξαν χαμηλά επίπεδα προλακτίνης την περίοδο εφαρμογής της αγωγής, αλλά δεν είναι γνωστό αν αυτό ευθύνεται για την ελάττωση της φλεγμονής ή εάν η κατεσταλμένη φλεγμονή οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα στρεσσογόνων παραγόντων που μη ειδικά διεγείρουν την έκκρισή της Η επίδραση των κορτικοστεροειδών στην εγκεφαλική ατροφία σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ Διεξάχθηκε μια μελέτη για να εξετάσει την επίδραση της κορτιζόνης στους δείκτες νευραξονικής καταστροφής στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου. Εξετάστηκαν 88 ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ για 5 χρόνια. Οι δύο βραχίονες 126

127 της εργασίας περιέλαβαν την ομάδα ασθενών που έλαβε ενδοφλέβια ΜΠ (1g/ημέρα για 5 ημέρες και στη συνέχεια ΜΠ από το στόμα σε σταδιακή μείωση), ανά τακτά χρονικά διαστήματα (κάθε 4 μήνες τα 3 πρώτα χρόνια και ανά 6μηνο τα επόμενα 2 χρόνια) και κατά τις υποτροπές, εάν συνέβαιναν στο μεσοδιάστημα, και την ομάδα ασθενών που έπαιρναν ΜΠ στο ίδιο δοσολογικό σχήμα μόνο ως θεραπεία υποτροπής της νόσου. Διεξάχθηκαν MRI στην έναρξη της μελέτης και στο τέλος των 5 ετών παρακολούθησης. Κλινική εξέταση γινόταν ανά 4 με 6 μήνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στην πρώτη ομάδα ασθενών η χορήγηση ΜΠ ανά τακτά χρονικά διαστήματα επιβραδύνει την ανάπτυξη των μαύρων τρυπών στην Τ1 ακολουθία, αποτρέπει ή καθυστερεί την εγκεφαλική ατροφία και τέλος, καθυστερεί την εξέλιξη της αναπηρίας όπως καταγράφεται στην κλίμακα αναπηρίας EDSS Τοξικότητα Οι ανεπιθύμητες ενέργειες των κορτικοστεροειδών βραχυχρόνιας χορήγησης είναι παροδικές, δοσοεξαρτώμενες και αντιμετωπίζονται με την κατάλληλη συμπτωματική αγωγή. Αυτές περιλαμβάνουν διαταραχές συναισθήματος (άγχος, κατάθλιψη και μανιακά επεισόδια), γαστρεντερικές διαταραχές (άλγος, ναυτία, έμετοι), κεφαλαλγία και μυαλγία. Χρόνια χορήγηση κορτιζόνης μπορεί να προκαλέσει μείωση της οστικής μάζας, οστεοπόρωση και αυξημένο κίνδυνο παθολογικών καταγμάτων, άσηπτη νέκρωση κεφαλής μηριαίου οστού, λιπώδης διήθηση ήπατος, λοιμώξεις και καταρράκτη. Αυτές οι ανεπιθύμητες ενέργειες αντιμετωπίζονται πιο δύσκολα και επιβάλλουν διακοπή της χορήγησης της κορτιζόνης μέχρι να υποχωρήσουν. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί σε ασθενείς με ιστορικό αρτηριακής υπέρτασης, σακχαρώδους διαβήτη και καρδιακών νοσημάτων, διότι η κορτιζόνη δύναται να τα επιδεινώσει. Τέλος, σπάνια έχουν παρατηρηθεί αναφυλακτικές αντιδράσεις κατά τη διάρκεια θεραπείας με κορτιζόνη Πλασμαφαίρεση Αν και τα γλυκοκορτικοειδή παραμένουν η πρώτη γραμμή αντιμετώπισης της υποτροπής σε ορισμένους ασθενείς, η κλινική απάντηση στα στεροειδή είναι ανεπαρκής. Για το λόγο αυτό ασθενείς με σοβαρές υποτροπές ανθεκτικές στα στεροειδή ή με παραλλαγές της νόσου (ADEM, Ν.Devic), επωφελούνται από την 127

128 πλασμαφαίρεση. Η κατάλληλη χρονική στιγμή για να εφαρμοστεί προκειμένου να σημειωθεί η μέγιστη απάντηση είναι ένας μήνας από την έναρξη των συμπτωμάτων της ώσης. Σε μια πρόσφατη μελέτη, καλύτερο αποτέλεσμα στην πλασμαφαίρεση συσχετίζεται με το ανοσοπαθολογικό μοντέλο ΙΙ κατά τη βιοψία, το οποίο χαρακτηρίζεται από εναποθέσεις ανοσοσφαιρινών και ενεργοποίηση του συμπληρώματος μέσα στις απομυελινωτικές πλάκες Ενδοφλέβια έγχυση ανοσοσφαιρινών (IVIG) Λίγες μελέτες έχουν διεξαχθεί όσον αφορά στην αποτελεσματικότητα της ενδοφλέβιας έγχυσης ανοσοσφαιρινών για την αντιμετώπιση της οξείας υποτροπής, η οποία δεν απαντάει στην ενδοφλέβια χορήγηση υψηλής δόσης κορτιζόνης. Σε μια μελέτη συμμετείχαν 76 ασθενείς με οξεία υποτροπή, οι οποίοι έλαβαν είτε μία δόση IVIG (1g/kg) είτε εικονικό φάρμακο μετά από τριήμερη αγωγή ενδοφλέβιας έγχυσης 1g ΜΠ, προκειμένου να καταγραφεί εάν αυτή η προσέγγιση βελτιώνει το τελικό αποτέλεσμα. Το αποτέλεσμα ήταν αρνητικό 12 εβδομάδες μετά την εφαρμογή της θεραπείας. Τα ευρήματα αυτά συνάδουν με τα αποτελέσματα άλλης μελέτης, στην οποία έλαβαν μέρος 19 ασθενείς με οξεία υποτροπή της νόσου. Χορηγήθηκε είτε IVIG, είτε εικονικό φάρμακο μετά από πενθήμερη έγχυση 500mg ΜΠ. Τελικά, δεν προέκυψε διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες Προφυλακτικές θεραπείες Ιντερφερόνη-β Η εισαγωγή της ιντερφερόνης-β (IFN-β) στη θεραπεία της ΣΚΠ άλλαξε τη φυσική πορεία της νόσου. Η ετήσια συχνότητα υποτροπών σε ασθενείς υπό αγωγή είναι μικρότερη από την αντίστοιχη των μαρτύρων, ενώ μεγαλύτερος αριθμός αυτών παραμένουν ελεύθεροι συμπτωμάτων για αρκετά χρόνια, συγκριτικά με τους ασθενείς άνευ θεραπείας. Στην κεντρική μελέτη για την IFN-β-1a sc (PRISMS Study Group,1993) 133 εξετάστηκαν 560 ασθενείς οι οποίοι τυχαιοποιήθηκαν σε τρεις βραχίονες: την ομάδα των 22μg, την ομάδα των 44μg και την ομάδα του εικονικού φαρμάκου. Παρατηρήθηκε μείωση της συχνότητας υποτροπών 27% για την πρώτη και 33% για τη δεύτερη ομάδα ασθενών συγκριτικά με το εικονικό φάρμακο. Ο μέσος αριθμός 128

129 μέτριας και σοβαρής βαρύτητας υποτροπών στις δύο ομάδες του φαρμάκου ήταν επίσης χαμηλότερος από τον αντίστοιχο του εικονικού φαρμάκου. Ο μέσος χρόνος εμφάνισης της δεύτερης υποτροπής παρατάθηκε κατά 3 και 5 μήνες για την πρώτη και δεύτερη ομάδα αντίστοιχα. Το φορτίο της νόσου στη μαγνητική τομογραφία (proton density T2 ακολουθία) έδειξε προοδευτική αύξηση της τάξεως του 10.9% στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου, ενώ στις ομάδες των 22μg και 44μg σημειώθηκε μείωση 1,2% και 3,8% αντίστοιχα. Ο αριθμός των Τ2 ενεργών εστιών παρουσίασε μείωση της τάξεως του 67% και 78% για τη χαμηλή και υψηλή δόση αντίστοιχα. Τέλος, το φάρμακο αποδείχτηκε ασφαλές για τους ασθενείς 133. Στην παράταση της μελέτης (PRISMS-4, 2001) το ευεργετικό αποτέλεσμα της IFN-β-1a, όσον αφορά στη συχνότητα των υποτροπών, την εξέλιξη της αναπηρίας και τις μεταβλητές στη μαγνητική τομογραφία, διατηρήθηκε στα 4 έτη παρακολούθησης ευνοώντας την υψηλότερη δόση των 44μg 16. Στην πρώτη κεντρική μελέτη της IFN-β-1a im φάνηκε ότι το φάρμακο επιβραδύνει σημαντικά τη συσσώρευση της αναπηρίας, που αποτελεί αναπόφευκτα την εξέλιξη της νόσου 138. Η εξέλιξη της αναπηρίας στα δύο χρόνια της μελέτης ήταν 34,9% για τους ασθενείς που έλαβαν εικονικό φάρμακο, ενώ στην ομάδα της ιντερφερόνης το αντίστοιχο ποσοστό ήταν 21,9%. Η πιθανότητα εξέλιξης της αναπηρίας για την ομάδα του εικονικού φαρμάκου κυμάνθηκε στο 16,5% και στο 10,8% στην ομάδα της ιντερφερόνης. Η ετήσια συχνότητα υποτροπών, στα 2 χρόνια της μελέτης, ήταν 0,90 για τους ασθενείς που έλαβαν εικονικό φάρμακο και 0,61 για τους ασθενείς υπό ιντερφερόνη. Τα αποτελέσματα του φαρμάκου όσον αφορά στη δραστηριότητα της νόσου, όπως αποτυπώνεται στη μαγνητική τομογραφία (αριθμός και όγκος των Τ2 εστιών), ήταν σαφώς ευνοϊκότερα για τους ασθενείς υπό IFN-β-1a συγκριτικά με την ομάδα του εικονικού φαρμάκου. Τέλος, το φάρμακο αποδείχτηκε καλά ανεκτό από τους ασθενείς. Η πολυκεντρική κλινική μελέτη για την IFN-β-1b έδειξε ότι επέφερε θετικό κλινικό και απεικονιστικό αποτέλεσμα στις ομάδες που χορηγήθηκε φάρμακο (χρησιμοποιήθηκαν 2 δοσολογικά σχήματα) συγκριτικά με την ομάδα που έλαβε εικονικό φάρμακο 170,202. Η ετήσια συχνότητα υποτροπών στα 2 χρόνια ήταν 0.84, για την υψηλή δόση, σε σχέση με 1.17 και 1.27 για τις ομάδες της χαμηλής δόσης και του εικονικού φαρμάκου, αντίστοιχα. Ο αριθμός των ασθενών που παρέμειναν 129

130 ελεύθεροι υποτροπών ήταν 18, 23, 36 για τις ομάδες εικονικού φαρμάκου, χαμηλής δόσης και υψηλής δόσης, αντίστοιχα. Επίσης, σημειώθηκε παράταση του χρονικού διαστήματος μέχρι την εμφάνιση των επόμενων υποτροπών για την ομάδα υψηλής δοσολογίας φαρμάκου και ελάττωση της βαρύτητας των υποτροπών. Οι ακτινολογικές παράμετροι ήταν βέβαια, θετικές κυρίως για την ομάδα υψηλής δόσης. Στο τέλος του 1 ου έτους παρακολούθησης υπήρξε αύξηση του μέσου φορτίου εστιών στην Τ2 ακολουθία κατά 12.2% και 4.1% για τις ομάδες εικονικού και χαμηλής δόσης φαρμάκου, ενώ για την υψηλής δόσης φάρμακο σημειώθηκε μείωση κατά 1.1%. Τα αντίστοιχα ποσοστά για το 2 ο και 3 ο έτος διαμορφώθηκαν στο 20% αύξηση, 10.5% αύξηση, 0.1% μείωση και 17.1% αύξηση, 1.1% αύξηση, 6.2% μείωση, αντίστοιχα. Συμπερασματικά μπορεί να σημειωθεί ότι η αγωγή ήταν καλά ανεκτή, χωρίς σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες Μηχανισμός δράσης Η IFN-β στην περιφέρεια επηρεάζει την παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ- λεμφοκύτταρα καθώς και το μικροπεριβάλλον των κυτταροκινών. Ασκώντας δράση πάνω στους υποδοχείς της στα Τ-λεμφοκύτταρα και στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, μειώνει την έκφραση των απαραίτητων μορίων για τη διαδικασία της παρουσίασης του αντιγόνου (μόρια μέγιστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας MHC). Επιπλέον, καταστέλλει την έκφραση συν-διεγερτικών μορίων. Η IFN-β αναστέλλει τον κλωνικό πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων, ενώ έχει βρεθεί ότι μειώνει την παραγωγή ιντερλευκίνης 12 (IL-12) από τα δενδριτικά κύτταρα, η οποία είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των Τ-λεμφοκυτάρων προς τη σειρά Th1. Τέλος, αναστέλλει την έκφραση της FLIP, μιας αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης, οδηγώντας σε αυξημένο θάνατο Τ-λεμφοκυττάρων. Είναι ασαφές εάν η IFN-β προκαλεί μεταβολή προς την Th2 σειρά, αλλά είναι πιθανό να δημιουργεί μια γενικότερη καταστολή των Th1 και Th2 σειρών. Θολό είναι επίσης το τοπίο όσον αφορά στα CD8 κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, τα οποία φαίνεται να μεταβάλλονται. Η δράση της IFN-β στον ΑΕΦ έγκειται στη μείωση της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης (αντιγόνο-1 σχετιζόμενο με τη λειτουργία των λεμφοκυττάρων leukocyte function-associated antigen 1 LFA-1, πολύ όψιμα αντιγόνα very late 130

131 antigen VLA-4, διακυτταρικά προσκολλητικά μόρια intercellular adhesion molecules ICAM-1, αγγειακών κυττάρων προσκολλητικά μόρια vascular cell adhesion molecules VCAM-1). Πολλά μόρια επεξεργάζονται στη διαλυτή τους μορφή τα οποία, όταν συνδεθούν με τους υποδοχείς τους στα Τ-λεμφοκύτταρα, εμποδίζουν την αλληλεπίδραση αυτών με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στο επίπεδο των χυμοκινών και την έκφραση των υποδοχέων τους, η θεραπεία με IFN-β μειώνει την έκφραση διάφορων χυμοκινών καθώς και του υποδοχέα CCR5, αν και αυτό δεν έχει επιβεβαιωθεί. Αποτέλεσμα είναι η ελάττωση της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης των χυμοκινών και κατ επέκταση παρεμποδίζεται η διευκόλυνση εισόδου των κυττάρων στο ΚΝΣ. Όσον αφορά στις μεταλλοπρωτεΐνάσες, η παραγωγή της ΜΜΡ-9 και της ΜΜΡ-7 από τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα ελαττώνεται και αυτό μεταφράζεται σε μείωση της ικανότητας των Τ-λεμφοκυττάρων να μεταναστεύουν διαμέσου του εξωκυττάριου στρώματος-matrix 2,128. Συνέπεια αυτών είναι η μείωση των φλεγμονωδών κυττάρων που εισέρχονται στο ΚΝΣ. Εκτός της καταστολής της έκφρασης της ΜΜΡ-9, η IFN-β αυξάνει τα επίπεδα του ενδογενούς ιστικού αναστολέα TIMP-1, διορθώνοντας με αυτόν τον τρόπο την υπερβολική πρωτεολυτική δραστηριότητα 128. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ΜΜΡ-9 ασκεί πρωτεολυτική δράση στην IFN-β, επομένως τα αυξημένα επίπεδα ΜΜΡ-9 στο ΚΝΣ, στο ΕΝΥ και στον ορό καταστρέφουν τη βιολογική δράση της ενδογενούς και της θεραπευτικά χορηγούμενης IFN-β 128. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και άλλα κύτταρα του αγγειακού αυλού συμμετέχουν στην παραγωγή των ΜΜΡs και TIMPs 128. Τα λευκοκύτταρα παράγουν κυρίως ΜΜΡ-9 και ελάχιστη ΜΜΡ-2, ενώ για τα ενδοθηλιακά κύτταρα ισχύει ακριβώς το αντίστροφο 128. Υπάρχουν έμμεσα στοιχεία ότι η IFN-β ρυθμίζει την παραγωγή του TIMP-1 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στους ασθενείς με ΣΚΠ η μειωμένη παραγωγή της αντιφλεγμονώδους ιντερλευκίνης 10 (IL- 10) από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC), διορθώνεται με τη δράση της IFN-β. Αυτή η κυτοκίνη αυξάνει την παραγωγή του TIMP-1,ενώ μειώνει την παραγωγή των ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η IFN-β μειώνει επίσης την παραγωγή της ΜΜΡ-2 από τα PBMC 128. Οι πολλαπλοί τρόποι με τους οποίους η IFN-β αποτρέπει την είσοδο των Τ-λεμφοκυττάρων και κυρίως η ελάττωση των επιπέδων των μεταλλοπρωτεΐνασών ευθύνονται για τη γρήγορη 131

132 έκπτωση της ενεργότητας στη μαγνητική τομογραφία, όπως καταγράφεται με τις εστίες που προσλαμβάνουν σκιαγραφική ουσία 2. (Πίνακας 10) Το θεραπευτικό αποτέλεσμα της IFN-β φαίνεται και από τη βελτίωση των επιπέδων του Ν-ακέτυλο ασπαρτικού στην MRS, η οποία γίνεται εμφανής μετά τους 6 μήνες αγωγής και καθίσταται σημαντική μετά τον 1 χρόνο 147. Η χρονική καθυστέρηση μπορεί να οφείλεται είτε στην αργή διαδικασία αποκατάστασης των νευρώνων, είτε στην καθυστερημένη ευεργετική επίδραση της IFN-β στον μεταβολισμό του νευρώνα

133 Πίνακας 10. Ο μηχανισμός δράσης της IFN-β στη ΣΚΠ Μηχανισμός δράσης της IFN-β Α. Περιφέρεια 1. Μειώνει την έκφραση MHC μορίων στα Τ λεμφοκύτταρα και μακροφάγα επηρεάζει παρουσίαση αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα 2. Καταστέλλει την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων 3. Αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων 4. Μειώνει την παραγωγή IL-12 από τα δενδριτικά κύτταρα (IL-12 απαραίτητη για διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων προς την Th1 σειρά) 5. Αναστέλλει την έκφραση της FLIP (αποπτωτική πρωτεΐνη) αυξημένος θάνατος Τ λεμφοκυττάρων Β. Α.Ε.Φ. 1. Μειώνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης (ICAM-1, VCAM-1, LFA-1, VLA-4) 2. Μειώνει την έκφραση διαφόρων χυμοκινών και του υποδοχέα CCR5 παρεμποδίζεται η διευκόλυνση της εισόδου κυττάρων στο ΚΝΣ 3. Ελαττώνει την παραγωγή των MMP-9 και MMP-7 από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα 4. Αυξάνει τα επίπεδα του ενδογενούς ιστικού αναστολέα TIMP-1 5. Αυξάνει την παραγωγή IL-10 από τα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος αύξηση παραγωγής TIMP-1 και μείωση παραγωγής MMP- 9 και MMP-2 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος 133

134 Μηχανισμός δράσης σε κυτταρικό επίπεδο Οι ιντερφερόνες έχουν πολλαπλές βιολογικές δράσεις πάνω στα κύτταρα. Οι δράσεις τους περιλαμβάνουν την αντιική δράση, την καταστολή της κυτταρικής αύξησης, την τροποποίηση του ανοσολογικού συστήματος και τη διατάραξη της κυτταρικής μεμβράνης. Το αρχικό γεγονός είναι η σύνδεση της IFN-β με τον υποδοχέα της στην επιφάνεια του κυττάρου. Μελέτες δείχνουν ότι η ιντερφερόνηάλφα (IFN-α) και η IFN-β συνδέονται με κοινό υποδοχέα (τύπος Ι), ενώ η ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) συνδέεται με διαφορετικό υποδοχέα (τύπος ΙΙ). Πολλοί υπότυποι ανθρώπινης IFN-α έχουν διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες και δεσμευτική συγγένεια με μια ποικιλία κυττάρων. Οι υπότυποι της IFN-α αλληλεπιδρούν με τον κοινό υποδοχέα αλλά διαφέρουν στον βαθμό συγγένειας με αυτόν, γεγονός που μεταφράζεται σε έκφραση διαφορετικών ιδιοτήτων. Επίσης, μελέτες υποστηρίζουν ότι υπάρχουν πολλαπλά σημεία σύνδεσης ή περισσότεροι του ενός υποδοχείς σε ένα κύτταρο για την ανθρώπειο IFN-α όπως και σε διαφορετικά κύτταρα. Επιπρόσθετα, ο υποδοχέας της IFN-α ενδέχεται να είναι πολυτμηματικός. Η αλληλεπίδραση της ιντερφερόνης με τον υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου προκαλεί τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Jak 9. Με αυτόν τον τρόπο ενεργοποιούνται οι τυροσινικές 9 κινάσες της οικογένειας Jak, οι οποίες στη συνέχεια φωσφορυλιώνουν πρωτεϊνικά υποστρώματα του συστήματος STAT. Οι φωσφορυλιωμένες STAT πρωτεΐνες κινούνται προς τον πυρήνα, συνδέονται με ειδικά στοιχεία του DNA και κατευθύνουν τη μεταγραφή 7. Οι πρωτεΐνες STAT (signal transducers and activators of transcription) είναι μια οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών οι οποίες με την ενεργοποίησή τους συμμετέχουν στον έλεγχο των γονιδίων όταν το κύτταρο αντιμετωπίζει διάφορα εξωκυττάρια πολυπεπτίδια. Μελέτες βιοχημικές και μοριακής γενετικής έδειξαν ότι αποτελούνται από ένα σημείο τυροσικής φωσφορυλίωσης και από ένα διμερές μόριο το οποίο περιέχει ένα σημείο Src ομολογίας 2 (SH2) φωσφοροτυρισινικής δέσμευσης (Src omology 2 phosphotyrosine-binding), σημείο αλληλεπίδρασης με το DNA (DNA interaction domain), και έναν αριθμό σημείων αλληλεπίδρασης 134

135 πρωτεΐνης με πρωτεΐνη (με υποδοχείς, άλλους παράγοντες μεταγραφής, τον μεταγραφικό μηχανισμό και πιθανότατα και με μια τυροσινική φωσφατάση) 8. Ακόμη, η φωσφορυλίωση της STAT1 στην τυροσίνη 701 είναι σημαντική για τον σχηματισμό του συμπλόκου STAT1, STAT 2 και p48 γνωστό ως IFN-stimulated gene factor-3 (ISGF3). Δέκα λεπτά μετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα από την IFN το σύμπλοκο ISGF3 μεταφέρεται στον πυρήνα και ενώνεται με στοιχεία απάντησης ενεργοποιούμενα από την IFN (IFN-stimulated response elements-isre). Τα ISRE ενεργοποιούν τη μεταγραφή αρκετών εκατοντάδων γονιδίων που ρυθμίζονται από την IFN. Τα γονίδια αυτά περιλαμβάνουν τα πρώιμα γονίδια όπως τον ρυθμιστικό παράγοντα της IFN (IFN regulatory factor -1 - IRF-1), τον πρωταρχικό θετικό παράγοντα ρύθμισης της παραγωγής της IFN και τον IRF-2, ο οποίος έχει ανασταλτική δράση στην παραγωγή της IFN. Επίσης, περιλαμβάνει τα όψιμα γονίδια όπως την IFN-β, και αντι-ιικές πρωτεΐνες όπως την 2,5 -oligoadenylate synthetase (2,5 -OAS), τη Myxovirus protein A (MxA), οι οποίες ειδικώς επάγονται από τις τύπου Ι ιντερφερόνες. Η MxA έχει την υψηλότερη ειδικότητα για την IFN-β, λόγω του ότι επάγεται επιλεκτικά από τις τύπου Ι ιντερφερόνες με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 10,98,99,100,102,106. Οι ιντερφερόνες φωσφορυλιώνουν επίσης και τη STAT1 στη σερίνη 727. Η P-Ser 727 STAT1 προάγει τη μεταγραφή της IFN-γ και των IFN-α/β. Η φωσφορυλίωση της σερίνης της STAT1 είναι σημαντική στη ΣΚΠ επειδή οι IFN-α/β και η IFN-γ έχουν ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσία και, πιο συγκεκριμένα, η IFN-β μειώνει τις υποτροπές, ενώ η IFN-γ τις προκαλεί 9. (Σχήμα 5) Μεταξύ των πρωτεϊνών που παράγονται από την IFN-β είναι και η νεοπτερίνη, η β-2 μικροσφαιρίνη, και η IL Η ανίχνευση των πρωτεϊνών αυτών χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης βιοδιαθεσιμότητας της IFN-β. Η νεοπτερίνη είναι προϊόν της ενεργοποίησης των μακροφάγων από την IFN-γ και αποτελεί έναν έμμεσο δείκτη τόσο των επιπέδων της IFN-γ, όσο και της δραστηριότητας των μακροφάγων που ενεργοποιούνται από την IFN-γ. Επίσης, η παραγωγή της αυξάνεται και από τον παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (tumor necrosis factor-α TNFα). Δεν ενδείκνυται να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης, επειδή οι IFN-α και IFN-β προκαλούν μη ειδική αύξηση της παραγωγής αυτής από τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα. Αντιθέτως, αποτελεί έναν ευαίσθητο δείκτη για τη δραστηριότητα των μονοκυττάρων και μακροφάγων που επάγονται από την IFN-γ, και τα Τ 135

136 λεμφοκύτταρα που παράγουν IFN-γ εμπλέκονται ισχυρά στην ανοσοπαθογένεια της σκλήρυνσης κατά πλάκας. Έχει αποδειχθεί σε μελέτες η παραγωγή της IFN-γ στις ενεργώς φλεγμαίνουσες πλάκες της ΣΚΠ 11. Δυνητικά η νεοπτερίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης ενεργής φλεγμονής σε ασθενείς με ΣΚΠ. Σχήμα 5: Το σχήμα απεικονίζεται την οδό μετάδοσης του σήματος από τον υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα με αποτέλεσμα την έκφραση των επαγόμενων από την IFN-β γονιδίων Οξική γλατιραμέρη (Glatiramer acetate GA) Η οξική γλατιραμέρη είναι ένα μείγμα συνθετικών πολυπεπτιδίων το οποίο αποτελείται από τέσσερα αμινοξέα, την L-τυροσίνη, το L-γλουταμικό οξύ, την L- αλανίνη και την L-λυσίνη, σε καθορισμένη μοριακή αναλογία 1,0:1,4:4,2:3,4 μήκους 40 έως 100 κατάλοιπα αμινοξέων και μοριακού βάρους με daltons 137,139,140. Συντέθηκε αρχικά, πριν 30 χρόνια, σε μια προσπάθεια να μιμηθεί τις εγκεφαλιτογόνες ιδιότητες της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης. Αποδείχτηκε όμως ότι αναστέλλει την επαγωγή της πειραματικής αλλεργικής εγκεφαλομυελίτιδας 137,139,140. Στη συνέχεια μελετήθηκε σε ασθενείς με ΣΚΠ λαμβάνοντας τελικά έγκριση ως προφυλακτική θεραπεία για τη νόσο

137 Να σημειωθεί ότι η GA επιδρά τόσο στη διαδικασία της παρουσίασης του αντιγόνου όσο και στο μικροπεριβάλλον των κυτταροκινών 2. Έχει υψηλή συγγένεια με το σημείο συνδέσεως (σχισμή) των μορίων MHC και πιστεύεται ότι συνδέεται με αυτό και παρουσιάζεται ως αντιγόνο μέσα στη σχισμή 2,139,140,143. Εναλλακτικά, η GA εγκολπώνεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και στη συνέχεια παρουσιάζονται τμήματα αυτού. Και στις δύο περιπτώσεις η παρουσίαση της GA οδηγεί στη γένεση ειδικών Τ-λεμφοκυττάρων έναντι της GA. Χωρίς να είναι γνωστοί οι μηχανισμοί, τα ειδικά Τ-λεμφοκύτταρα έναντι της GA, στην πλειοψηφία τους, ανήκουν στην Τh2 σειρά ασκώντας ανοσορυθμιστική δράση 2,139,140,143. Επιπλέον, η GA επάγει τις απαντήσεις των CD8 κυτταροτοξικών Τ-κυττάρων και τα αποκαθιστά στα επίπεδα που παρατηρούνται και στα υγιή άτομα, ενώ ένα μέρος των CD8 κυττάρων πιστεύεται ότι έχει ρυθμιστικό ρόλο στη ΣΚΠ και την πειραματική αλλεργική εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ). Σε αντίθεση με την IFN-β η GA δεν φαίνεται να επηρεάζει τη μετανάστευση των λευκοκυττάρων στο ΚΝΣ. Δεδομένου ότι δεν επιδρά στα μόρια προσκόλλησης ή τις μεταλλοπρωτεϊνάσες, τα ενεργοποιημένα ειδικά Τh2 λεμφοκυττάρα έναντι της GA εισέρχονται στο ΚΝΣ. Στο ΚΝΣ τα Th2 διαφοροποιημένα κύτταρα θεωρείται ότι καταστέλλουν τη φλεγμονή με το λεγόμενο φαινόμενο της έμμεσης καταστολής (bystander suppression). Τα ειδικά Τh2 κύτταρα έναντι της GA επανενεργοποιούνται μέσα στο ΚΝΣ από την παρουσίαση αντιγόνου από κύτταρα που πιθανόν είναι μικρογλοία ή μακροφάγα που πέρασαν τον ΑΕΦ. Το αντιγόνο που παρουσιάζεται δεν είναι η GA επειδή μεταβολίζεται μετά τη χορήγηση του και δεν θεωρείται ότι εισέρχεται στο ΚΝΣ. Πιστεύεται ότι η παρουσίαση τμημάτων αποδόμησης της μυελίνης από τη μικρογλοία ή τα μακροφάγα μέσα στο ΚΝΣ επανενεργοποιεί τα ειδικά Τh2 λεμφοκύτταρα έναντι της GA. Η κλωνική έκπτυξη αυτών των κυττάρων μέσα στο ΚΝΣ έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-4, IL-10, TGF-β), οι οποίες παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των αυτοδραστικών Τ κυττάρων έναντι της μυελίνης 2,143. Αυτή η διαδικασία συνιστά το φαινόμενο της έμμεσης καταστολής. Βρέθηκε επίσης, ότι κατά τη διάρκεια θεραπείας με οξική γλατιραμέρη το μέγιστο της έκκρισης των αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών εμφανίζεται τους πρώτους 6 μήνες της αγωγής και προοδευτικά ελαττώνονται, ενώ οι προφλεγμονώδεις συνεχίζουν να μειώνονται

138 Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι κάποια αυτοδραστικά Τ κύτταρα έχουν νευροπροστατευτική δράση. Τα Τ και Β λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα εκκρίνουν μια ποικιλία από νευροτροφικούς παράγοντες, όπως ο νευροτροφικός παράγοντας προερχόμενος από τον εγκέφαλο (brain derived neurotrophic factor-bdnf). Σε ασθενείς με ΣΚΠ που βρίσκονται σε αγωγή με GA, τα ενεργοποιημένα ειδικά Th2 κύτταρα έναντι της GA δυνητικά έχουν νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Η πολυκεντρική μελέτη φάσης ΙΙΙ που διενεργήθηκε για την αποτελεσματικότητα της GA έδειξε σημαντική μείωση της συχνότητας υποτροπών στα 2 χρόνια (29%) 139. Η ετήσια συχνότητα υποτροπών ήταν 0,59 και 0,84 αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα για το μέσο χρόνο έως την πρώτη υποτροπή (287 έναντι 198) και η αναλογία των ασθενών ελεύθερων υποτροπών (33,6% έναντι 27%), παρά το γεγονός ότι δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά, ευνόησαν την ομάδα των ασθενών υπό την GA. Σημειώθηκε θετική επίδραση της GA στη νευρολογική κατάσταση, αλλά χωρίς στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η ίδια παρατήρηση έγινε για τον δείκτη βάδισης και την εγκατεστημένη εξέλιξη της νόσου. Η αναλογία των ασθενών χωρίς εγκατεστημένη εξέλιξη της νόσου για 90 ή περισσότερες ημέρες (EDSS 1) ήταν 78,4% για την ομάδα της GA και 75,4% για την ομάδα του εικονικού φαρμάκου στο πέρας των 2 ετών. Όσον αφορά στην ασφάλεια του φαρμάκου, η οξική γλατιραμέρη αποδείχτηκε ασφαλής για τους ασθενείς 139. Στην παράταση της μελέτης επιβεβαιώθηκε η θετική επίδραση της GA στην επιβράδυνση της νευρολογικής αναπηρίας και τη μείωση του αριθμού των υποτροπών 140. Η επίδραση της οξικής γλατιραμέρης στη δραστηριότητα της νόσου, όπως απεικονίζεται στη μαγνητική τομογραφία, εξετάστηκε σε μια μεταγενέστερη μελέτη των Comi και συνεργατών (2001) 143. Ο αριθμός των εστιών που εμπλουτίζουν μειώθηκε κατά 29%. Σημειώθηκε μείωση των νέων εμπλουτιζόμενων εστιών και του ολικού όγκου εγκεφάλου που εμπλουτίζει. Μείωση παρατηρήθηκε επίσης, στον αριθμό των νέων εστιών στην Τ2 ακολουθία. Το θεραπευτικό αποτέλεσμα της GA γίνεται αντιληπτό μετά την πάροδο έξι μηνών από την έναρξη της αγωγής 142. Μακροχρόνια θεραπεία με GA πυροδοτεί την ανάπτυξη αντισωμάτων στον ορό 2. Το μέγιστο της παραγωγής τους εμφανίζεται τον 3 ο με 6 ο μήνα μετά την έναρξη της θεραπείας και σταδιακά ο τίτλος τους μειώνεται αλλά δεν φτάνει τα επίπεδα πριν την έναρξη της αγωγής 137,140. Μία μελέτη 138

139 αποκάλυψε ότι το 33% περίπου των ασθενών ανέπτυξε υψηλό τίτλο αντισωμάτων μετά από 12 μήνες θεραπείας και το 14% χαμηλό τίτλο 2. Τα αντισώματα είναι της τάξης IgG1, IgG2 και IgG Η παραγωγή των IgG4 αντισωμάτων ρυθμίζεται από την ιντερλευκίνη 4 η οποία παράγεται από τα λεμφοκύτταρα Τh2. Επίσης, προέκυψε ότι αυτά τα αντισώματα εμποδίζουν τη δράση της GA. Σε μια άλλη μελέτη δεν επιβεβαιώθηκε αυτό το στοιχείο ούτε in vivo, ούτε σε πειραματικό μοντέλο 29. Δεν είναι σαφές, προς το παρόν, εάν τα αντισώματα καταστέλλουν την κλινική αποτελεσματικότητα της GA 137, Μιτοξανδρόνη Είναι ένας αντικαρκινικός παράγοντας ο οποίος ενσωματώνεται στο DNA και εμποδίζει τη σύνθεση τόσο του DNA όσο και του RNA, με αποτέλεσμα την καταστολή της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας. Η μιτοξανδρόνη αναστέλλει λειτουργίες των Β λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της έκκρισης των αντισωμάτων, καταστέλλει τη δραστηριότητα των βοηθητικών και κυτοτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, μειώνει την έκκριση κυτταροκινών από τα Τh1 λεμφοκύτταρα, όπως η ιντερφερόνη γ, ο παράγοντας TNF και η IL-2. Η μιτοξανδρόνη αποδεσμεύεται αργά από τους ιστούς κι η τελική ημίσεια ζωή κυμαίνεται από 8-9 ώρες έως 9 μέρες. Μπορεί να παραμείνει στο σώμα έως και 272 ημέρες μετά το τέλος της θεραπείας ενώ μπορεί να καταστείλει με επιτυχία την πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα. Ο Mauch και οι συνεργάτες του το 1992 χρησιμοποίησαν πρώτοι τη μιτοξανδρόνη σε δώδεκα ασθενείς με ταχεία εξέλιξη της αναπηρίας σε δοσολογία 12mg/m 2. Όλοι οι ασθενείς σημείωσαν σταθεροποίηση της κλινικής κατάστασης ενώ οκτώ από αυτούς παρουσίασαν βελτίωση στον ένα χρόνο 1. Οι ασθενείς είχαν 169 εστίες εμπλουτιζόμενες με γαδολίνιο κατά την εισαγωγή αλλά μόνο 10 ήταν ορατές στο τέλος της μελέτης. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που σημειώθηκαν ήταν ελάχιστες. Η μελέτη αυτή ήταν η απαρχή για το σχεδιασμό μιας σειράς μελετών σε ασθενείς με ταχέως εξελισσόμενη υποτροπιάζουσα διαλείπουσα καθώς και δευτεροπαθώς προϊούσα μορφή ΣΚΠ. Στο σύνολο τους οι μελέτες καταδεικνύουν ότι η μιτοξανδρόνη μειώνει τη συχνότητα των υποτροπών και τη διάσπαση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού όπως αποδεικνύεται στη μαγνητική τομογραφία σε 139

140 ασθενείς με ταχέως εξελισσόμενη ΣΚΠ. Το όφελος για τους ασθενείς με προϊούσα μορφή δεν είναι τόσο βέβαιη. Στην πρόσφατα δημοσιευμένη αναφορά της Therapeutics and Technology Assessment Subcommittee of the American Academy of Neurology συνιστά προσοχή στη χρήση αυτού του φαρμάκου και προτρέπει για τη διενέργεια περισσότερων μελετών 1. Το μέγεθος του αναμενόμενου αποτελέσματος από τη θεραπεία εκφράζεται καλύτερα από «τον αριθμό των ασθενών που πρέπει να λάβουν την αγωγή» (numbers needed to treat- NNT) 1. Στη μελέτη MIMS (Mitoxandrone in MS Study Group), μια διεθνής πολυκεντρική διπλή τυφλή μελέτη με ομάδα ελέγχου ασθενείς σε εικονικό φάρμακο, έλαβαν μέρος 194 ασθενείς με επιδεινούμενη υποτροπιάζουσα διαλείπουσα και δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ. Οι βραχίονες της μελέτης περιλάμβαναν είτε μιτοξανδρόνη 5 ή 12 mg/m 2 χορηγούμενη ενδοφλεβίως κάθε 12 εβδομάδες για 24 μήνες είτε εικονικό φάρμακο. Σε αυτή προέκυψε ότι έπρεπε να χορηγηθεί το φάρμακο σε 11 ασθενείς με δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ για δύο χρόνια προκειμένου να αποτραπεί η επιδείνωση κατά 1.0 βαθμό στην κλίμακα EDSS σε έναν ασθενή. Επιπλέον, φάνηκε ότι η δοσολογία των 12 mg/m 2 είναι καλά ανεκτή και αποτελεσματική μειώνοντας την εξέλιξη της αναπηρίας και τις κλινικές υποτροπές 164. Το θεραπευτικό αποτέλεσμα παρέμεινε για τουλάχιστον 12 μήνες μετά το τέλος της αγωγής, ενώ τα οφέλη από την εφαρμογή της χαμηλότερης δοσολογίας δεν ήταν το ίδιο πειστικά. Η μιτοξανδρόνη είναι τοξικός παράγοντας κι αυτό επιβάλλει τη συνετή χρήση του προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα εμφάνισης καταστολής του μυελού των οστών, ευκαιριακών λοιμώξεων και μυοκαρδιοπάθειας 1,29. Επίσης, η αμηνόρροια αποτελεί σημαντική ανεπιθύμητη ενέργεια για τις νέες γυναίκες. Ο κίνδυνος μυοκαρδιοπάθειας γενικά είναι δοσοεξαρτώμενος και μπορεί να ανέλθει στο 6% των καρκινοπαθών ασθενών που λαμβάνουν δόσεις έως 140 mg/m 2. Σε ασθενείς με ΣΚΠ καλό είναι να διενεργείται υπερηχογραφικός έλεγχος καρδιάς πριν την έγχυση της επόμενης δόσης του φαρμάκου, με σκοπό την ανάδειξη τυχόν δυσλειτουργίας της αριστερής κοιλίας. Στην πράξη, μετράται το κλάσμα εξώθησης πριν από κάθε έγχυση και γίνεται διακοπή του φαρμάκου εάν παρατηρηθεί ελάττωσή του. Επιπρόσθετα, η μιτοξανδρόνη αποτελεί αναστολέα της τοποϊσομεράσης II και για τον λόγο αυτό ευθύνεται για την εμφάνιση ιατρογενούς λευχαιμίας 1,29. Ο κίνδυνος εμφάνισης ιατρογενούς λευχαιμίας σε ασθενείς με ΣΚΠ που λαμβάνουν 140

141 μιτοξανδρόνη εκτιμάται γύρω στο 0,05-0,1%. Στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής οι ενδείξεις της μιτοξανδρόνης είναι οι εξής: η μείωση της νευρολογικής αναπηρίας και/ή της συχνότητας των κλινικών υποτροπών σε ασθενείς με δευτεροπαθώς προϊούσα, προϊούσα υποτροπιάζουσα ή επιδεινούμενη υποτροπιάζουσα διαλείπουσα ΣΚΠ (ασθενείς των οποίων η κλινική εικόνα είναι σαφώς επηρεασμένη στα μεσοδιαστήματα των ώσεων). Η μιτοξανδρόνη δεν ενδείκνυται σε ασθενείς με πρωτοπαθώς προϊούσα ΣΚΠ. Στην Ευρώπη χρησιμοποιείται σε ασθενείς που χειροτερεύουν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του ΕΟΦ. Χρησιμοποιείται σε ασθενείς με κλινικές και απεικονιστικές ενδείξεις ενεργούς νόσου (συχνές σημαντικής βαρύτητας ώσεις και πολλαπλές εστίες προσλαμβάνουσες γαδολίνιο), παρά την αγωγή με ιντερφερόνη ή οξική γλατιραμέρη. Σύμφωνα με τον McAlpine και συνεργάτες ακολουθείται το εξής πρωτόκολλο: προϋπόθεση εφαρμογής της αγωγής αποτελεί η επιδείνωση τουλάχιστον 2 μονάδων στην κλίμακα αναπηρίας EDSS, σε διάστημα 12 μηνών, σε συνδυασμό με ενδείξεις ενεργής φλεγμονώδους νόσου βασισμένη είτε σε κλινικές υποτροπές είτε στην παρουσία εστιών που προσλαμβάνουν γαδολίνιο στη μαγνητική τομογραφία. Χορηγούν 12 mg/m 2 μιτοξανδρόνης ενδοφλεβίως κάθε 3 μήνες για όχι περισσότερο από οκτώ κύκλους. Σε ορισμένες περιπτώσεις ακολουθείται το πρωτόκολλο του Edan και των συνεργατών του (1997) 1. Συγκεκριμένα χορηγούνται 20 mg ενδοφλεβίως μηνιαίως, για έξι μήνες, σε ασθενείς με ιδιαίτερα επιθετική νόσο με ταχέως επιδεινούμενη αναπηρία, η οποία προκύπτει από συχνές σοβαρές υποτροπές και πολλές ενεργές φλεγμονώδεις εστίες που εμπλουτίζουν στη μαγνητική τομογραφία μετά την έγχυση σκιαγραφικού υλικού. Τέλος, πρέπει να αναφερθεί ότι η μιτοξανδρόνη έχει χρησιμοποιηθεί επίσης σε μελέτες σε συνδυασμό με άλλα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα με καλά αποτελέσματα όσον αφορά στη μείωση της δραστηριότητας της νόσου και την ασφάλεια Αζαθειοπρίνη (ΑΖΑ) Η αζαθειοπρίνη δημιουργήθηκε τα μέσα του Είναι ανταγωνιστής της πουρίνης και επιδρά στην αντιγραφή του DNA και το ανοσολογικό σύστημα με διάφορους τρόπους. Εμποδίζει τη λειτουργία των Τ κυττάρων και είναι πιο 141

142 επιλεκτική για τα Τ λεμφοκύτταρα σε σχέση με τα Β λεμφοκύτταρα 80. Χρησιμοποιήθηκε για πολλά χρόνια στην αντιμετώπιση ασθενών με ΣΚΠ, γεγονός που έδωσε το έναυσμα για τη διεξαγωγή κλινικών μελετών κατά τη διάρκεια των δεκαετιών 1970 και Παρατηρήθηκε πιο αργός ρυθμός επιδείνωσης και λιγότερες υποτροπές στους ασθενείς υπό αζαθειοπρίνη, αλλά αυτές οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Η σχέση κόστος-όφελος δεν ευνόησε την αζαθειοπρίνη 1. Πρόσφατες μελέτες αποκαλύπτουν ότι η αζαθειοπρίνη μειώνει τον όγκο των Τ2 βλαβών και των εστιών που προσλαμβάνουν γαδολίνιο στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου. Επίσης, το νευρολογικό έλλειμμα παρέμεινε σταθερό και ο ρυθμός υποτροπών μειώθηκε, γεγονός που συνάδει με την καταστολή της δραστηριότητας της νόσου στη μαγνητική τομογραφία. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες ήταν ήπιες και εύκολα ελεγχόμενες με μείωση της δόσης του φαρμάκου 78. Η μεγαλύτερη τυχαιοποιημένη μελέτη έδειξε σημαντική προστατευτική δράση της αζαθειοπρίνης στις υποτροπές της νόσου κατά τη διάρκεια του πρώτου, δεύτερου και τρίτου έτους θεραπείας. Οι άλλες τέσσερις μικρότερες μελέτες δεν ανέδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά όσον αφορά στις υποτροπές της ΑΖΑ έναντι του εικονικού φαρμάκου. Γαστρεντερικές διαταραχές, καταστολή του μυελού των οστών και ηπατική τοξικότητα αποτελούν συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες, οι οποίες αντιμετωπίζονται ικανοποιητικά με μείωση της δόσης. Σοβαρό μειονέκτημα της μακροχρόνιας χορήγησης ΑΖΑ είναι η αυξημένη πιθανότητα καρκινογένεσης. Στα 3 χρόνια της μελέτης δεν φάνηκε αύξηση του κινδύνου εμφάνισης καρκίνου. Υπάρχει πιθανότατα, αυξημένος κίνδυνος καρκινογένεσης σε χορήγηση του φαρμάκου άνω των 10 ετών και συνολική χορηγούμενη δόση άνω των 600g 80. Μελέτη ανασκόπισης διερεύνησε την πιθανότητα ελεύθερων διαστημάτων από υποτροπές στα 2 χρόνια σε ασθενείς με ΣΚΠ υπό IFN-β, οξική γλατιραμέρη ή ενδοφλέβια έγχυση ανοσοσφαιρινών συγκριτικά με την αντίστοιχη της ΑΖΑ, αποκάλυψε ότι αυτές οι θεραπείες είναι ισοδύναμες 80. Νέο πεδίο ενδιαφέροντος αποτελεί η συγχορήγηση αζαθειοπρίνης με άλλες θεραπείες. Η συγχορήγηση ΑΖΑ και ανοσοσφαιρίνης ενδοφλεβίως είχε θετικά αποτελέσματα σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, αλλά μέχρι σήμερα δεν έχουν επιβεβαιωθεί 1. Η συγχορήγηση ΑΖΑ και IFN-β (IFN-β-1a και IFN β-1b) ανέδειξε μείωση του ρυθμού υποτροπών και της δραστηριότητας της νόσου στη μαγνητική 142

143 τομογραφία, ενώ παράλληλα ήταν ασφαλής και καλά ανεκτή από τους ασθενείς 1,79. Παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα της ΑΖΑ στην αντιμετώπιση των ασθενών με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, η χρήση της είναι περιορισμένη λόγω των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών που δυνητικά μπορεί να εμφανιστούν σε μακροχρόνια χρήση του φαρμάκου 1. Η ΑΖΑ μπορεί να αποτελέσει ικανή αγωγή συντήρησης σε ασθενείς με συχνές υποτροπές που χρήζουν κορτικοστεροειδών. Η συνολική δόση των 600g δεν πρέπει να υπερβαίνεται ή η συνολική διάρκεια των 10 ετών, αναφορικά με την πιθανότητα ανάπτυξης νεοπλασματικής εξεργασίας. Δίκαια μπορεί να αποτελέσει εναλλακτική θεραπεία, αντί της ιντερφερόνης, για την αντιμετώπιση της ΣΚΠ Alemtuzumab ή Campath-1H Είναι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του CD52 αντιγόνου. Θεωρείται ότι ελαττώνει τον αριθμό των Τ και Β λεμφοκυττάρων, τα μακροφάγα και τα μονοκύτταρα 44. Αποτελέσματα μελέτης φάσης ΙΙ δείχνουν ότι προκαλεί σημαντική μείωση των εμπλουτιζόμενων εστιών στην MRI κατά τη διάρκεια της 18μηνης παρακολούθησης. Επίσης, αποκάλυψαν ότι το 1/3 περίπου των ασθενών ανέπτυξαν αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα Graves. Διεξάγονται μελέτες για να τεκμηριωθεί η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα του στη ΣΚΠ Cladribine Είναι πουρίνη ανθεκτική στην αδενοσινική απαμινάση. Προκαλεί τη συσσώρευση δεοξυνουκλεοτιδίων στα λεμφοκύτταρα με συνέπεια την απόπτωσή τους. Η κύρια δράση της είναι η ελάττωση των ανοσολογικών κυττάρων και το φάρμακο μειώνει τα ενεργοποιημένα και μη λεμφοκύτταρα. Στοχεύει τα CD4+ κυρίως παρά τα CD8+ λεμφοκύτταρα ενώ δεν επηρεάζει άλλα κύτταρα του αίματος και του ανοσοποιητικού συστήματος όπως τα Β κύτταρα και τους φυσικούς φονείς Daclizumab Το μονοκλωνικό αντίσωμα daclizumab στοχεύει το CD25 αντιγόνο, το οποίο είναι η α αλυσίδα του υποδοχέα της ιντερλευκίνης Δοκιμάστηκε σε ασθενείς με ανεπαρκή απάντηση σε θεραπεία IFN-β και υψηλή ενεργότητα νόσου. Η δόση που χορηγήθηκε ήταν 1mg/kg/δόση ενδοφλεβίως με μεσοδιάστηματα 2 εβδομάδων για 143

144 τις δύο πρώτες εγχύσεις και 4 εβδομάδων στη συνέχεια. Τα αποτελέσματα 2 μελετών ανέδειξαν καλή ανοχή στο φάρμακο. Παρατηρήθηκε αύξηση των λοιμώξεων κατά τη διάρκεια της θεραπείας, αλλά ήταν ήπιου βαθμού λοιμώξεις του ουροποιητικού και του αναπνευστικού συστήματος. Η αγωγή με daclizumab οδήγησε σε μείωση των νέων καθώς και του ολικού φορτίου εμπλουτιζόμενων εστιών κατά 78% 38. Το αποτέλεσμα αυτό δεν επήλθε άμεσα αλλά σε χρονικό διάστημα 1,5-2 μηνών, γεγονός που σημαίνει ότι υπήρξε μια σταδιακή ανοσοτροποποιητική αλλαγή υπεύθυνη για την παρατηρούμενη μείωση της φλεγμονής στον εγκέφαλο 38. Επιπλέον, σημειώθηκε μείωση της συχνότητας υποτροπών κατά 81% και βελτίωση στη δοκιμασία 9-hole peg test και Scripps NRS κατά 5% και 9% αντίστοιχα. Η βελτίωση κλινικών και απεικονιστικών δεικτών ήταν εμφανής και μεταγενέστερη μελέτη με μικρό αριθμό ασθενών γεγονός που καθιστά απαραίτητη τη διενέργεια μεγάλων πολυκεντρικών μελετών προκειμένου να επιβεβαιωθεί η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου Εστέρες του φουμαρικού οξέος (ΕΦΟ) Οι εστέρες του φουμαρικού οξέος επηρεάζουν διάφορα σημεία της ανοσολογικής απάντησης που υπεισέρχονται στη ΣΚΠ. Η θεραπεία με ΕΦΟ έδειξε ότι επάγει τις Τh2 κυτταροκίνες (IL-4, IL-5 και IL-10), επάγει την απόπτωση των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και καταστέλλει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM 35. Η τελευταία δράση ευθύνεται, πιθανόν, για τη μειωμένη μετανάστευση των λεμφοκυττάρων διά του ΑΕΦ. Οι ΕΦΟ χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της ψωριάσης. Η αποτελεσματικότητα των από του στόματος χορήγησης ΕΦΟ μελετήθηκε σε ανοικτή κεντρική έρευνα σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ. Τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά δείχνοντας μείωση του αριθμού και του όγκου των εμπλουτιζόμενων βλαβών στις 18 εβδομάδες με περαιτέρω μείωση μετά από 70 εβδομάδες. Επίσης οι κλινικές παράμετροι έμειναν σταθερές ή είχαν ήπια βελτίωση (EDSS, 9-HPT, AI). Ήταν γενικά καλά ανεκτό από τους ασθενείς, οι πιο συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες ήταν γαστρεντερικές διαταραχές (ναυτία, διάρροια, κράμπες) και flushing, οι οποίες υποχώρησαν σταδιακά τις επόμενες 6 εβδομάδες. 144

145 FTY720 (fingolimod) Το FTY720 είναι ανοσοτροποποιητικός παράγοντας δραστικός σε μοντέλα μεταμόσχευσης και αυτοανοσίας 42. Προκαλεί λεμφοπενία η οποία προκύπτει από αναστρέψιμη ανακατανομή των λεμφοκυττάρων από την κυκλοφορία στα δευτερογενή λεμφικά όργανα χωρίς να επιφέρει γενική ανοσοκαταστολή επειδή παραμένει άθικτη η ενεργοποίηση των Β και Τ λεμφοκυττάρων και η μνημονική λειτουργία των Τ κυττάρων 33,40. Αποτελέσματα μελετών δείχνουν ότι το FTY720 μειώνει σημαντικά τους παράγοντες δραστηριότητας στην MRI. Επιπλέον, ένας σημαντικός αριθμός ασθενών παρέμεινε ελεύθερος υποτροπών και η ολική συχνότητα υποτροπών μειώθηκε κατά 53% και 55% για τις δοσολογίες 1,5mg και 5mg αντίστοιχα Laquinimod Αποτελεί ανοσοτροποποιητικό παράγοντα ο οποίος χορηγείται από το στόμα. Προκαλεί την απελευθέρωση του TGF-β και την αλλαγή της ανοσολογικής απάντησης υπέρ των Th2 κυτταροκινών, χωρίς να προκαλεί ανοσοκαταστολή Minocycline Η minocycline αποτελεί φάρμακο μεγάλου ενδιαφέροντος. Σε μια μικρή ανοικτή μελέτη 10 ασθενών με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, είχε εντυπωσιακά αποτελέσματα στη μείωση των εμπλουτιζόμενων εστιών. Ο μηχανισμός δράσης της κατευθύνεται στην αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών του στρώματος, οι οποίες επιτρέπουν την είσοδο των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων διαμέσου του ΑΕΦ στον εγκέφαλο 36,44. Επίσης φαίνεται ότι απενεργοποιεί τα μικρογλοιακά κύτταρα, εξασθενεί την απόπτωση των νευρώνων και καταστέλλει την παραγωγή ελεύθερων ριζών. Πρόσφατα στοιχεία που προέκυψαν από in vitro μελέτες, έδειξαν ότι αναστέλλοντας τα μακροφάγα και τη γλοία μπορεί να έχουν αρνητική επίδραση στα ολιγοδενδροκύτταρα εμποδίζοντας την ικανότητα τους για επαναμυελίνωση. Χρειάζονται περαιτέρω έρευνες για να διευκρινιστεί η δράση της minocycline στη ΣΚΠ. 145

146 Natalizumab Το natalizumab είναι ένας επιλεκτικός αναστολέας των μορίων προσκόλλησης και δεσμεύεται στην α4-υπομονάδα των ανθρώπινων ιντεγκρινών, η οποία εκφράζεται δυναμικά στην επιφάνεια όλων των λευκοκυττάρων, με εξαίρεση τα ουδετερόφιλα. Συγκεκριμένα, το natalizumab δεσμεύεται στην α4β1 ιντεγκρίνη αναστέλλοντας την επίδραση με τον συγγενικό της υποδοχέα, το αγγειακό μόριο προσκόλλησης-1 (VCAM-1), τους συνδέτες της οστεοποντίνης και ένα εναλλακτικά συνδετικό πεδίο φιμπρονεκτίνης που συνδέει το τμήμα-1 (CS-1). Το natalizumab αναστέλλει την αλληλεπίδραση της α4β7 ιντεγκρίνης με το μόριο προσκόλλησης βλεννογονική αντρεσίνη-1 μονοπύρηνων λευκοκυττάρων μέσω του ενδοθηλίου στο φλεγμαίνοντα παρεγχυματικό ιστό. Ένας επιπρόσθετος μηχανισμός δράσης του natalizumab ενδέχεται να είναι η καταστολή των υπό εξέλιξη φλεγμονωδών αντιδράσεων σε νοσούντες ιστούς μέσω της αναστολής της αλληλεπίδρασης των λευκοκυττάρων α4-εκφραστών με τους συνδέτες τους στον εξωκυττάριο χώρο και στα παρεγχυματικά κύτταρα. Υπ αυτήν την έννοια, το natalizumab ενδέχεται να δρα ως καταστολέας της φλεγμονώδους δράσης που υπάρχει στο σημείο της νόσου και να αναστέλλει περαιτέρω τη στρατολόγηση των ανοσοκυττάρων στους φλεγμαίνοντες ιστούς. Στη ΣΚΠ, οι βλάβες θεωρείται ότι συμβαίνουν όταν ενεργοποιημένα Τ- λεμφοκύτταρα διαπερνούν τον ΑΕΦ. Η μετανάστευση λευκοκυττάρων μέσω του ΑΕΦ προϋποθέτει την αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων προσκόλλησης που βρίσκονται επί των φλεγμονωδών κυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων του αγγειακού τοιχώματος. Η αλληλεπίδραση μεταξύ α4β1 και των στόχων της αποτελεί σημαντική συνιστώσα της παθολογικής φλεγμονής στον εγκέφαλο και η διακοπή αυτών των αλληλεπιδράσεων οδηγεί στον περιορισμό της φλεγμονής. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το VCAM-1 δεν εκφράζεται στο παρέγχυμα του εγκεφάλου. Ωστόσο, υπό την παρουσία προφλεγμονωδών κυτταροκινών, το VCAM-1 αυξάνεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και ενδεχομένως στα νευρογλοιακά κύτταρα κοντά στα σημεία της φλεγμονής. Σε κατάσταση φλεγμονής του ΚΝΣ στη ΣΚΠ, η αλληλεπίδραση της α4β1 με το VCAM-1, CS-1 και την οστεποντίνη, είναι αυτή που παίζει διαμεσολαβητικό ρόλο στη σταθερή προσκόλληση και μετανάστευση των 146

147 λευκοκυττάρων στο παρέγχυμα του εγκεφάλου και ενδεχομένως συντηρεί τη φλεγμονώδη αλληλουχία στον ιστό του ΚΝΣ. Ο αποκλεισμός των μοριακών αλληλεπιδράσεων της α4β1 με τους στόχους της περιορίζει τη φλεγμονώδη δράση που υπάρχει στον εγκέφαλο στη ΣΚΠ και αναστέλλει περαιτέρω τη στρατολόγηση των ανοσοκυττάρων στο φλεγμαίνοντα ιστό, περιορίζοντας έτσι το σχηματισμό ή τη διεύρυνση των βλαβών της ΣΚΠ. Στην Ευρώπη το natalizumab έχει ένδειξη ως μονοθεραπεία στις υποτροπιάζουσες μορφές ΣΚΠ με υψηλή ενεργότητα νόσου, παρά τη θεραπεία με ιντερφερόνη-β, καθώς και σε ασθενείς με υψηλή δραστηριότητα νόσου εξαρχής 33. Τα αποτελέσματα της μελέτης AFFIRM επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι η αλληλεπίδραση της α4β1 ιντεγκρίνης με τους στόχους της είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τη φλεγμονώδη διαδικασία στο ΚΝΣ και ότι η λύση αυτής είναι ωφέλιμη για τους ασθενείς. Σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, το natalizumab μείωσε σημαντικά τον κίνδυνο εξέλιξης της αναπηρίας και την ετήσια συχνότητα υποτροπών σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο. Η σχετική μείωση με το natalizumab ήταν 68%. Το ποσοστό των ελεύθερων υποτροπών ήταν σημαντικά υψηλότερο στην ομάδα του natalizumab από αυτό στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου στο 1 ο έτος (76% έναντι 53%) και στο 2 ο έτος (67% έναντι 41%). Το natalizumab μείωσε την αθροιστική επιδείνωση της εμμένουσας αναπηρίας, (η οποία παραμένει για 3 μήνες). Η σχετική μείωση ήταν 42%. Όσον αφορά στη δράση του natalizumab στη μαγνητική τομογραφία, μείωσε σημαντικά τον αριθμό των νέων ή αυξανόμενων Τ2 υπέρπυκνων εστιών κατά 83%, σε σύγκριση με με το εικονικό φάρμακο. Παράλληλα σημείωσε μείωση του μέσου αριθμού των εμπλουτιζόμενων εστιών και τον μέσο αριθμό των νέων Τ1 υπόπυκνων εστιών (αναστρέψιμες και μη αναστρέψιμες βλάβες) κατά 92% και 76% αντίστοιχα συγκριτικά με το εικονικό φάρμακο. Το natalizumab ήταν γενικά καλά ανεκτό. Οι συχνότερα αναφερθείσες σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες στη μελέτη AFFIRM ήταν λοιμώξεις (3,2% natalizumab, 2,6% εικονικό φάρμακο), οξείες αντιδράσεις υπερευαισθησίας (1,1% και 0,3% συμπεριλαμβανομένων αναφυλακτικών αντιδράσεων), κατάθλιψη (1% και 1% αντίστοιχα) και χολολιθίαση. Αντιδράσεις σχετικές με την έγχυση συνέβησαν στο 23,1% των ασθενών με ΣΚΠ υπό natalizumab συγκριτικά με το 18,7% των ασθενών 147

148 που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Σε κεντρικές κλινικές μελέτες συνέβησαν 2 περιπτώσεις προϊούσας πολυεστιακής λευκοεγκεφαλοπάθειας, συμπεριλαμβανομένου και ενός θανάτου, σε ασθενείς που λάμβαναν ταυτόχρονα θεραπεία με IFN-β -1a για περισσότερο από 2 χρόνια. Σε μια άλλη μελέτη, ένας άλλος ασθενής με νόσο Crohn ανέπτυξε επίσης PML και κατέληξε, αλλά είχε μακρύ ιστορικό θεραπείας με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα και σχετιζόμενη λεμφοπενία. Στις ελεγχόμενες κλινικές μελέτες διάρκειας 2 ετών 10% των ασθενών εμφάνισαν αντισώματα στο natalizumab τουλάχιστον μία φορά. Εμμένοντα αντι-natalizumab αντισώματα (ένα θετικό τεστ που επιβεβαιώνεται με δεύτερο θετικό τεστ μετά από τουλάχιστον 6 εβδομάδες) αναπτύχθηκαν στο 6% περίπου των ασθενών. Περίπου το 82% των ασθενών που ανέπτυξαν τελικά εμμένοντα θετικά αντισώματα, αυτά εμφανίστηκαν στις πρώτες 12 εβδομάδες της θεραπείας. Τα μόνιμα αντισώματα σχετίζονταν με μια σημαντική μείωση στην αποτελεσματικότητα του natalizumab καθώς και με αυξημένη συχνότητα αντιδράσεων υπερευαισθησίας Rituximab Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για τη συμμετοχή των Β λεμφοκυττάρων στην παθογένεση της ΣΚΠ και μπορεί να αποτελέσουν θεραπευτικό στόχο. Πρόκειται για μονοκλωνικό αντίσωμα, το οποίο επιλεκτικά στοχεύει και ελαττώνει τον αριθμό των CD20+ Β λεμφοκυττάρων 33,34. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του μη-hodgkin λεμφώματος και της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Από κλινικές μελέτες φάσης ΙΙ σε ΠΠΣΚΠ και ΥΔΣΚΠ, προέκυψε σημαντική κλινική βελτίωση, μείωση των δεικτών φλεγμονής στην MRI, καθώς, ελαττώνουν τα Β λεμφοκύτταρα από το ΕΝΥ και το περιφερικό αίμα. Από τον ΕΟΦ ανακοινώθηκε μία περίπτωση PML σε ασθενή που λάμβανε rituximab ως θεραπεία για συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Δεν είναι σίγουρη η αιτιολογική σχέση αλλά πρέπει να ληφθεί υπ όψη όταν επιλεγεί το rituximab ως θεραπευτική προσέγγιση Teriflunomide Χρησιμοποιείται στη θεραπεία της ρευματοειδούς αρθρίτιδας προκαλώντας αναστρέψιμη αναστολή της dihydro-orotate dehydrogenase, η οποία είναι 148

149 ρυθμιστικός παράγοντας στη de novo σύνθεση των πυριμιδινών. Επίσης, δύναται να καταστείλει την ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων ποικιλοτρόπως IVIG Ενδιαφέρον έχει εκδηλωθεί από πολλούς νευρολόγους για τη χρήση των ανοσοσφαιρινών στη θεραπεία της υποτροπιάζουσας ΣΚΠ. Κάποια δεδομένα υποστηρίζουν μια μικρή μείωση της συχνότητας των υποτροπών, αλλά δεν προκύπτουν αξιόπιστα στοιχεία για την αναχαίτιση της εξέλιξης της αναπηρίας ή τη μείωση του φορτίου των βλαβών στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου 59,60,61. Τα μέχρι στιγμής αποτελέσματα δεν υποστηρίζουν την υιοθέτηση αυτής της αγωγής ως θεραπεία πρώτης εκλογής Λοιπά Πολλά φάρμακα δοκιμάζονται για τη θεραπεία της ΣΚΠ, όπως οι στατίνες οι οποίες φαίνεται να έχουν αντιφλεγμονώδεις και νευροπροστατευτικές ιδιότητες. Ωστόσο είναι απαραίτητη η διενέργεια περαιτέρω μελετών για να τεκμηριωθεί η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα τους 29. Ένας άλλος παράγοντας είναι ο CC chemokine receptor 1 antagonist BX-471, ο οποίος παρουσίασε θετικά αποτελέσματα σε προκαταρκτικές δοκιμασίες σε αυτοάνοσα νοσήματα συμπεριλαμβανομένης και της ΣΚΠ 33. Ελπιδοφόρο φάρμακο αποτελεί ένας ανοσοκατασταλτικός παράγοντας, η pixantrone, η οποία είναι παράγωγο της μιτοξανδρόνης, διαθέτει την ίδια ισχυρή δράση, αλλά στερείται καρδιοτοξικότητας

150 3. Αντισώματα έναντι της IFN-β H IFN-β αποτελεί θεραπεία πρώτης γραμμής για την υποτροπιάζουσα μορφή της νόσου και σύμφωνα με πολλές τυχαιοποιημένες μελέτες, έχει αποδειχτεί ότι μειώνει τη συχνότητα και τη βαρύτητα των υποτροπών, επιβραδύνει την εξέλιξη της αναπηρίας και τέλος καταστέλλει τη δραστηριότητα της νόσου στην MRI 18,115,123,127. Το μειονέκτημα της θεραπείας αυτής αποτελεί η ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β, τα οποία σε μεγάλες συγκεντρώσεις έχουν συσχετιστεί με μείωση του θεραπευτικού αποτελέσματος 21,18,117,118,132,134,135,152. Σε κεντρικές μελέτες των διάφορων τύπων ιντερφερόνης-β η συχνότητα εμφάνισης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στη ΣΚΠ ποικίλλει από 2% έως 45%, ενώ η συχνότητα των συνδετικών αντισωμάτων ανήλθε στο 81% των ασθενών. Τα αντισώματα έναντι των IFN-β χωρίζονται σε δύο τύπους, τα συνδετικά (binding antibodies-babs) και τα εξουδετερωτικά (neutralizing antibodies- Nabs) 14,17,115,117,132. Τα Babs συνδέονται σε διαφορετικούς επιτόπους στο μόριο της IFN-β, μερικοί των οποίων δεν εμπλέκονται στη σύνδεση της IFN-β με τον υποδοχέα. Μέχρι στιγμής δεν έχει αναγνωριστεί κάποια βιολογική ή κλινική σημασία σε αυτά 14,17,115,117,118,121,132. Παρ όλα αυτά, είναι πιθανό τα συνδετικά αντισώματα να ελαττώνουν τα επίπεδα της IFN-β στον ορό μέσω της αύξησης της κάθαρσης της IFN-β από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα 117. Τα Nabs είναι ένας υποπληθυσμός των συνδετικών αντισωμάτων τα οποία αντιδρούν με τα βιολογικώς ενεργά σημεία του μορίου της IFN-β, εμποδίζοντας την αλληλεπίδραση της με τον υποδοχέα της 14,98,115,117,132,135. Κατά τη διάρκεια θεραπείας με IFN-β τα Babs παράγονται σε μεγαλύτερο ποσοστό και σε πρωιμότερο στάδιο σε σχέση με τα Nabs 17,21,14,108,132. (Σχήμα 6) 150

151 Σχήμα 6: (Α) Για να ασκήσει η IFN-β τη βιολογική της δράση είναι απαραίτητη η σύνδεσή της με τον πολυτμηματικό υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα από την IFN-β πυροδοτεί έναν καταρράκτη αντιδράσεων που οδηγεί στην έκφραση γονιδίων επαγόμενων από την IFN-β. Τα πρωτεϊνικά προϊόντα μεσολαβούν για τη θεραπευτική δράση της IFN-β σε ασθενείς με ΣΚΠ. (Β) Η παρουσία Nabs εμποδίζει την επιτυχή σύνδεση της IFN-β με τον υποδοχέα με επακόλουθο την κατάργηση της βιολογικής δράσης της IFN-β. GTP: τριφωσφορική γουανοσίνη, Mx: myxovirus, ISRE: στοιχείο απόκρισης διεγερμένο από την IFN (IFNstimulated response element) Η γένεση των αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Το επίκτητο ανοσολογικό σύστημα, το οποίο αποτελείται από τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, μπορεί να πυροδοτήσει μια ειδική ανοσολογική απάντηση σε έναν απεριόριστο αριθμό αντιγόνων 12. Τα Β κύτταρα είναι υπεύθυνα για τη χυμική άνοση απόκριση. Αυτά εκφράζουν έναν αντιγονικό υποδοχέα, ο οποίος παράγεται από γονίδια στη θέση των ανοσοσφαιρινών. Μετά από μια τυχαία διαδικασία 151

152 αναδιάταξης, κάθε Β κύτταρο φέρει έναν μοναδικό υποδοχέα με καθορισμένη ειδικότητα αναγνώρισης αντιγόνου. Ακολουθούν διαδικασίες επιλογής στον μυελό των οστών με στόχο τα Β κύτταρα να μην απαντούν σε αυτοαντιγόνα αλλά πρέπει να είναι παράλληλα προετοιμασμένα για κάθε πρόκληση από ξένα αντιγόνα. Τα Β κύτταρα αλληλεπιδρούν με ακέραιες πρωτεΐνες και γραμμικά πεπτίδια ενωμένα στις κυτταρικές μεμβράνες των δενδριτικών κυττάρων στους λεμφαδένες. Εναλλακτικά, τα Β κύτταρα μπορεί να απαντήσουν σε διαλυτές πρωτεΐνες που θα συναντήσουν στην αιματική κυκλοφορία ή τον σπλήνα. Για παρατεταμένες απαντήσεις των Β λεμφοκυττάρων σε πρωτεϊνικά αντιγόνα, είναι απαραίτητη η αλληλεπίδραση με ειδικά για το αντιγόνο Τ λεμφοκύτταρα. Κατά τη διάρκεια αντιγονικών προκλήσεων, τα Β κύτταρα υπόκεινται μεταλλάξεων στο DNA του αναδιατεταγμένου υποδοχέα αυτών, οι οποίες μπορεί να καταλήξουν σε ήπιες αλλαγές στη δομή του υποδοχέα. Οι περισσότερες αλλαγές μειώνουν τη συγγένεια των Β κυττάρων για το αντιγόνο στόχος αλλά, σε σπάνιες περιπτώσεις, έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση της συγγένειας. Τα Β κύτταρα με αυξημένη συγγένεια στη συνέχεια θα συνεισφέρουν στην ειδική απάντηση με την παραγωγή των αντισωμάτων έναντι του συγκεκριμένου αντιγόνου. Τα ενεργοποιημένα κύτταρα εξελίσσονται σε Β κύτταρα μνήμης και πλασματοκύτταρα τα οποία ελευθερώνουν έναν μεγάλο αριθμό των διαλυτών υποδοχέων τους, τις ανοσοσφαιρίνες. Οι IgM είναι οι κυριάρχουσες ανοσοσφαιρίνες στην οξεία φάση μιας ανοσολογικής απάντησης, αλλά ακολουθεί αλλαγή κλάσης, κυρίως μετά από επανέκθεση στο ίδιο αντιγόνο. Σε αυτήν την περίπτωση ο αριθμός των υψηλής συγγένειας Β κυττάρων αυξάνεται σημαντικά στο επίπεδο του 0-1% των Β κυττάρων. Μερικά από τα Β κύτταρα εξελίσσονται σε πλασματοκύτταρα μακράς βιωσιμότητας τα οποία μεταναστεύουν στον μυελό των οστών και στη συνέχεια απελευθερώνουν ειδικές IgG ανοσοσφαιρίνες για πολλά χρόνια, παρέχοντας προστασία υψηλής αποτελεσματικότητας στον ξενιστή Η διάσπαση της ανοχής των Β κυττάρων Αποτέλεσμα της διαδικασίας επιλογής είναι τα εξωτερικά αντιγόνα να προκαλούν ισχυρή ανοσολογική απάντηση ενώ τα αυτοαντιγόνα, λόγω της ανοχής, δεν την πυροδοτούν. Τα ανώριμα Β κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνο 152

153 ενώ είναι ακόμη στον μυελό των οστών αποκλείονται από περαιτέρω ωρίμανση και παραγωγή αντισωμάτων εναντίον ιδίων κυττάρων και ιστών. Αυτό καταλήγει σε μια δεξαμενή Β κυττάρων, τα οποία αναπτύσσουν ανοχή έναντι αυτόλογων. Μόνο μετά από αυτόν τον έλεγχο για δυνητική αυτοδραστικότητα τα Β κύτταρα συμπληρώνουν την ωρίμανση τους και μεταναστεύουν στους περιφερικούς λεμφικούς ιστούς. Εδώ, αυτά μπορούν να αναγνωρίσουν άλλα αυτοαντιγόνα, που δεν αντιπροσωπεύονται στο περιβάλλον του μυελού των οστών. Ώριμα Β κύτταρα που μπορούν να αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα γίνονται ανενεργά μέσω μιας ποικιλίας μηχανισμών 13. Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την παραγωγή των αντισωμάτων όπως η δόση, η φύση και ο τύπος κατασκευής του αντιγόνου, σύγχρονη επιμόλυνση του αντιγόνου, η οδός χορήγησης και η γενετικά καθορισμένη σύσταση του ανοσολογικού συστήματος του ξενιστή. Με την αυξημένη ομοιότητα των ιδίων πρωτεϊνών η αντιγονικότητα των εξωτερικών πρωτεϊνών μειώνεται. Επιπρόσθετα, μεγάλες πρωτεΐνες (σχετική μοριακή μάζα > 2500), πολύπλοκη δομή και απενεργοποιημένες πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη αντιγονικότητα από μικρές, απλές, διαλυτές και αθώες πρωτεΐνες. Η αργή απελευθέρωση του αντιγόνου, η αποτελεσματική σύνδεση με το MHC του ξενιστή, η δημιουργία συσσωματωμάτων και η προσθήκη βακτηριακού υλικού πυροδοτεί μια ισχυρή ανοσολογική απάντηση. Επιπλέον, η ενδοφλέβια, ρινική και η από του στόματος οδός χορήγησης προκαλούν πιο ασθενή αντίδραση αντισωμάτων συγκριτικά με την ενδοπεριτοναϊκή ή ακόμη και την ενδομυϊκή και υποδόρια έγχυση. Εάν οι δύο τελευταίες οδοί χορήγησης διαφέρουν στο μέγεθος πρόκλησης την παραγωγή αντισωμάτων, δεν είναι ακόμα σαφές. Η επαναληπτική έκθεση μέσης δόσης αντιγόνου σε συνδυασμό με έκδοχα ή μη ειδικούς διεγέρτες (π.χ. λιποπολυσακχαρίτες, βακτηριδιακού DNA) μπορεί να οδηγήσουν σε ισχυρή παραγωγή αντισωμάτων σε ένα χαμηλής αντιγονικότητας αυτοαντιγόνο Η αντιγονικότητα των θεραπειών με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Τα τελευταία χρόνια εισάχθηκε ένας αυξανόμενος αριθμός πρωτεϊνικών θεραπειών στην κλινική πράξη. Οι περισσότερες από αυτές προέρχονται από ανθρώπινες πρωτεΐνες ή μιμητές αυτών. Μεγαλύτερη εμπειρία υπάρχει στις θεραπείες υποκατάστασης σε ασθενείς με έλλειψη ζωτικών πρωτεϊνών. Παλαιότερα οι πρωτεϊνικές θεραπείες προέρχονταν από μη ανθρώπινες πηγές, συνήθως με 153

154 σημαντική επιμόλυνση (π.χ. η χοίρειος ινσουλίνη). Κατείχαν σημαντική αντιγονικότητα παρά το γεγονός ότι ήταν καλά ανεκτές από τους ασθενείς. Με την εισαγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνικών σκευασμάτων και των καλύτερων μεθόδων κάθαρσης, οι πρωτεϊνικές θεραπείες έγιναν λιγότερο αντιγονικές. Πάρα ταύτα, αναπτύσσονται εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι ορισμένων ενέσιμων πρωτεϊνών, ανάμεσα τους η ιντερφερόνη άλφα, η αλλαντική τοξίνη, οι παράγοντες πήξεως VIII και IX, η ινσουλίνη, η ερυθροποιητίνη, και η αυξητική ορμόνη 12,119,124,132. Η ποσότητα, η κινητική και οι κλινικές επιπτώσεις των αντισωμάτων δεν επηρεάζεται μόνο από την προετοιμασία και τη χορήγηση των πρωτεϊνών αλλά και από την υποκείμενη νόσο του ασθενούς. Ένα σημαντικό παράδειγμα της βιολογικής δράσης των αντισωμάτων αποτελεί η αγωγή με ερυθροποιητίνη σε ασθενείς με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Ορισμένοι από τους ασθενείς, όχι μόνο ανέπτυξαν εξουδετερωτικά αντισώματα τα οποία εμπόδιζαν το θεραπευτικό αποτέλεσμα, αλλά κατέστειλαν και την ενδογενή παραγωγή ερυθροποιητίνης οδηγώντας σε απλασία ερυθρών κυττάρων 12,119, Οι αντιγονικές ιδιότητες της ιντερφερόνης βήτα Η ιντερφερόνη βήτα εγκρίθηκε για τη θεραπεία της υποτροπιάζουσας ΣΚΠ, με βάση τα σημαντικά οφέλη που παρουσίασε σε κλινικούς και ακτινολογικούς δείκτες δραστηριότητας της νόσου. Χρησιμοποιούνται τέσσερα είδη σκευασμάτων ανασυνδυασμένης IFN-β για τη θεραπεία της ΣΚΠ. Οι διαφορές τους αφορούν στη βιοχημική δομή, τη δόση, τη συχνότητα και την οδό χορήγησης 106. Η IFN-β-1a είναι μια γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη 23 kda που λαμβάνεται από κύτταρα ωοθήκης χάμστερ. Ενίεται ενδομυϊκώς μία φορά εβδομαδιαίως (Avonex) στη δόση των 30μg ή υποδορίως τρεις φορές εβδομαδιαίως (Rebif) στη δόση των 22μg ή 44μg. Η IFN-β- 1b (Betaseron, Betaferon, Extavia) είναι πρωτεΐνη 18.5 kda, η οποία παράγεται από την Escherichia Coli. Επίσης, η αλληλουχία των βάσεων της η IFN-β-1b είναι ελαφρώς τροποποιημένη λόγω της έλλειψης της μεθειονίνης στη θέση 1 και την αντικατάσταση της κυστεΐνης με σερίνη στη θέση 17. Ενίεται υποδορίως κάθε δεύτερη ημέρα στη δόση των 8 MUI (250μg). Επίσης, επειδή τα κύτταρα των βακτηρίων και αυτά των ωοθηκών χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς μετάφρασης, οι δύο τύποι ανασυνδυασμένης ιντερφερόνης διαφέρουν στη 154

155 γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών. Η IFN-β-1b περιέχει βακτηριακή μετα-μεταφραστική τροποποίηση κι επομένως δεν είναι γλυκοζυλιωμένη, ενώ η IFN-β-1a μεταφέρει τις τροποποιήσεις που εξελίσσονται στα κύτταρα των θηλαστικών. Και οι δύο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες μπορεί να υποστούν δομικές αλλαγές κατά τη διάρκεια των διαδικασιών κάθαρσης. Παρά το γεγονός ότι διαφέρουν δομικά, ενώνονται στον ίδιο υποδοχέα και κατέχουν τις ίδιες βιολογικές ιδιότητες 12, Οι ιδιότητες των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης βήτα Κατά συνθήκη, οροθετικός για εξουδετερωτικά αντισώματα θεωρείται ο ασθενής στον οποίο προκύπτει σε δύο συνεχόμενες μετρήσεις, με χρονικό μεσοδιάστημα 3 μηνών, τίτλος αντισωμάτων τουλάχιστον 20 εξουδετερωτικών μονάδων 12,108,131. Υψηλός τίτλος αντισωμάτων θεωρείται όταν αυτός ισούται ή υπερβαίνει τις NU/mL 122. Οι περισσότερες μελέτες υποδεικνύουν μια ελαφρά υπεροχή στην παραγωγή των αντισωμάτων από την IFN-β-1b και την IFN-β-1a sc συγκριτικά με την IFN-β-1a im (5%). Η διαφορά ανάμεσα στις υποδόριες ιντερφερόνες είναι λιγότερο σαφής. Πάρα ταύτα, οι περισσότερες μελέτες δείχνουν μια ήπια υπεροχή στην παραγωγή των αντισωμάτων κατά τη διάρκεια της θεραπείας με την IFN-β-1b σε σχέση με τις IFN-β-1a. Αυτές οι διαφορές ανάμεσα στις διάφορες IFN-β πιθανότατα οφείλονται σε συνδυασμό παραγόντων όπως οι δομικές διαφορές, η πηγή προέλευσης των πρωτεϊνών, η παρασκευή της ουσίας, η παρουσία και ο βαθμός της συσσωμάτωσης, η οδός και η συχνότητα χορήγησης και η δόση. Συγκριτικές μελέτες έδειξαν ότι δεν υπάρχουν διαφορές στην κινητική των αντισωμάτων ανάμεσα στις τρεις ιντερφερόνες. Οι περισσότεροι ασθενείς γίνονται οροθετικοί τα πρώτα δύο χρόνια της θεραπείας. Μετά τους 24 μήνες θεραπείας μόνο λίγοι ασθενείς αναπτύσσουν αντισώματα 12,108, ενώ η μετατροπή από οροθετική κατάσταση σε οροαρνητική αναφέρεται στο 50% των ασθενών. Η μετατροπή σε οροαρνητική κατάσταση είναι πιθανότερη σε ασθενείς με χαμηλό τίτλο αντισωμάτων. Επίσης, πρόσφατη μελέτη φανερώνει ότι η μετατροπή σε οροαρνητική κατάσταση είναι πιο συνηθισμένη σε ασθενείς υπό αγωγή με IFN-β-1b. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι των IFN-β-1b και IFN-β-1a παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίδραση, αλλά δεν συνδέονται με την ομόλογη τύπου Ι IFN-α. Τα 155

156 εξουδετερωτικά και τα συνδετικά αντισώματα ανήκουν κυρίως στην τάξη των IgG αντισωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι παράγονται με τη μεσολάβηση των Τ λεμφοκυττάρων 12,119. Πάρα του ότι έχουν βρεθεί όλοι οι υπότυποι, τα εξουδετερωτικά αντισώματα βρίσκονται στα κλάσματα IgG2 και IgG4. Τα αντισώματα που εμφανίζονται πρώιμα είναι χαμηλής συγγένειας IgG και IgM τάξης 108. Πιθανότατα, η διαφορά ανάμεσα στα συνδετικά και τα εξουδετερωτικά αντισώματα είναι περισσότερο ποσοτική παρά ποιοτική, όπως π.χ. μπορεί να καθορίζεται από διαφορές στη συνδετική συγγένεια παρά από διαφορές στην ειδικότητα των επιτόπων 108. Οι επίτοποι που αφορούν στην ένωση με την ιντερφερόνη-β δεν έχουν πλήρως αποκαλυφθεί. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα σε μύες συνδέονται με τα αμινοξέα 39-48, ενώ τα μη εξουδετερωτικά φαίνεται να αναγνωρίζουν άλλους επιτόπους. Τα σημεία σύνδεσης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στους ανθρώπους είναι λιγότερο σαφή. Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι τα εξουδετερωτικά αντισώματα ενώνονται με το καρβόξυ-τελικό και το άμινο-τελικό επίτοπο της πρωτεΐνης, αν και αυτές οι περιοχές δεν θεωρείται ότι εμπλέκονται στη σύνδεση με τον υποδοχέα. Σε μια εργασία των Redlich και των συνεργατών του (1991) φάνηκε ότι τα Nabs αναγνωρίζουν την περιοχή των κατάλοιπων 32-56, η οποία είναι κοινή για τις IFN-β-1b και IFN-β-1a 127. Σε μια πρόσφατη μελέτη προέκυψε ότι τα αντισώματα συνδέονται συχνότερα με τα κατάλοιπα 1-12, και , ενώ τα αντισώματα που συνδέονται με τα κατάλοιπα 1-12 και ήταν σε υψηλότερο βαθμό εξουδετερωτικά. Υπάρχει σαφής θετική συσχέτιση μεταξύ του τίτλου των Nabs και του τίτλου εναντίον των κατάλοιπων Η βιολογική δράση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β Ο κλινικός αντίκτυπος των Nabs στον ρυθμό των υποτροπών και τη δραστηριότητα στη μαγνητική τομογραφία γίνεται εμφανής μόνο μετά από 12 με 18 μήνες θεραπείας (αρκετούς μήνες μετά την εμφάνιση των Nabs), ενώ το αποτέλεσμα στην εξέλιξη της αναπηρίας γίνεται αντιληπτό αργότερα στην παρακολούθηση των ασθενών 15,108,145. Η ανάπτυξη των Nabs δεν εξαρτάται και δεν επιβαρύνεται από τη βαρύτητα της νόσου πριν την εμφάνισή τους 15,

157 Χρησιμοποιούνται δύο προσεγγίσεις για την παρακολούθηση του κλινικού αποτελέσματος των Nabs. Στις διασταυρούμενες κλινικές μελέτες μετρούνται οι τίτλοι των αντισωμάτων σε μία δεδομένη χρονική στιγμή και διαχωρίζονται οι ασθενείς σε δύο ομάδες, η μία με θετικό και η άλλη με αρνητικό τίτλο αντισωμάτων. Στη συνέχεια συγκρίνονται οι κλινικές παράμετροι ανάμεσα στις δύο ομάδες. Σε αυτήν την περίπτωση, οι οροθετικοί ασθενείς θεωρούνται για πάντα θετικοί, οπότε αλλαγές στην κατάσταση των αντισωμάτων δεν λαμβάνονται υπ όψιν (γνωστό ως once-positive-always-positive [OPAP] ). Αντίθετα, στην προοπτική προσέγγιση υπολογίζονται οι αλλαγές στην κατάσταση των αντισωμάτων κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Οι κλινικές παράμετροι συγκρίνονται με βάση τις περιόδους οροθετικότητας ή οροαρνητικότητας. Αν και αυτή η μέθοδος (γνωστή ως all-switches μέθοδος) είναι πιο απαιτητική, φαίνεται πιο κατάλληλη για τον προσδιορισμό του αντίκτυπου των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στις κλινικές παραμέτρους. Πολλές μελέτες δείχνουν ότι τα εξουδετερωτικά αντισώματα εμποδίζουν τη βιολογική δράση της ιντερφερόνης-β και μειώνουν το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Αυτό έγινε φανερό από τη συγκριτική ανάλυση ανάπτυξης αντισωμάτων στην πρώτη μελέτη της υποδόριας IFN-β-1b (250 μg μέρα παρά μέρα), σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, με την προσέγγιση OPAP. Αντισώματα ανιχνεύτηκαν στο 35% περίπου των ασθενών τους πρώτους 12 μήνες θεραπείας (εύρος 6-18 μήνες). Αν και το θεραπευτικό αποτέλεσμα κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους ήταν παρόμοιο στους οροθετικούς και τους οροαρνητικούς ασθενείς, διαφορά σημειώθηκε τον 2 ο και 3 ο χρόνο αγωγής οπού οι ασθενείς με αντισώματα υπέστησαν περισσότερες υποτροπές. Η συχνότητα των υποτροπών ήταν περίπου ίδια με αυτή του εικονικού φαρμάκου, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα εξουδετερωτικά αντισώματα μειώνουν τη βιολογική δράση του φαρμάκου. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχτηκαν από την ανάλυση στοιχείων της μαγνητικής τομογραφίας, τα οποία έδειξαν αύξηση του αριθμού των νέων αλλά και παλαιότερων βλαβών με αυξημένο μέγεθος. Περαιτέρω προοπτικές μελέτες ασθενών με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ υπό θεραπεία με υποδόρια IFN-β-1b αποκάλυψαν ότι ο ρυθμός υποτροπών και η δραστηριότητα στην MRI αυξάνεται στους οροθετικούς ασθενείς. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν πιο έντονο στους ασθενείς με υψηλό τίτλο αντισωμάτων. Αντίθετα, όταν οι ασθενείς περνούσαν στην 157

158 οροαρνητική κατάσταση, τόσο ο ρυθμός υποτροπών όσο και η δραστηριότητα στην MRI μειώνονταν. Σε μελέτη φάσης ΙΙΙ της IFN-β-1a im, το 19% των ασθενών ανέπτυξε αντισώματα αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία επίπτωση στην αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Στην επαναξιολόγηση των αποτελεσμάτων βρέθηκε ότι η εμφάνιση των αντισωμάτων οδηγεί σε δοσοεξαρτώμενη μείωση των επιπέδων νεοπτερίνης και β2 μικροσφαιρίνης στον ορό και σε περιορισμό του θετικού αποτελέσματος στην MRI 18,153. Στη μελέτη PRISMS (Prevention of Relapses and Disability by Interferon beta-1a Subcutaneously in Multiple Sclerosis) ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ υπό θεραπεία με IFN-β-1a sc οι οποίοι εμφάνισαν Nabs (20% 18 ), παρουσίασαν υψηλότερο ρυθμό υποτροπών κατά τον 3 ο και 4 ο χρόνο θεραπείας, συγκριτικά με αυτούς χωρίς αντισώματα 12,16,133. Τα δύο πρώτα χρόνια θεραπείας δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ανάμεσα στις δύο ομάδες. Σε αυτήν τη διασταυρούμενη κλινική μελέτη, ο αριθμός των Τ2 βλαβών καθώς και το φορτίο της νόσου στην MRI ήταν μεγαλύτερα στους ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων. Αυτό το αποτέλεσμα όμως έπαψε στο τέλος του τέταρτου έτους θεραπείας. Δεδομένα για τη βιολογική δράση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων προκύπτουν επίσης, και από την Ευρωπαϊκή μελέτη της IFN-β-1b για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ 12,141. Η συχνότητα υποτροπών ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με αρνητικό τίτλο συγκριτικά με αυτούς που είχαν αντισώματα. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν πιο εμφανές κατά τον 3 ο και 4 ο χρόνο θεραπείας. Η δραστηριότητα στην MRI ήταν υψηλότερη στους οροθετικούς ασθενείς, αλλά χαμηλότερη από την ομάδα του εικονικού φαρμάκου. Δεν προέκυψε επιβάρυνση στην εξέλιξη της αναπηρίας όπως μετρήθηκε με την κλίμακα αναπηρίας Expanded Disability Status Scale (EDSS). Στην κλινική μελέτη της IFN-β-1b που εφαρμόστηκε στη ΔΠΣΚΠ και διεξήχθη στη Βόρειο Αμερική, το αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο έντονο. Με την προσέγγιση ΟΡΑΡ ο ρυθμός υποτροπών ήταν ελαφρώς πιο μεγάλος συγκριτικά με τους οροαρνητικούς ασθενείς, ενώ στην all-switches μέθοδο δεν προέκυψε αυτό το στοιχείο. Και στις προσεγγίσεις δεν επηρεάστηκε η εξέλιξη της νόσου ή η δραστηριότητα στην MRI. 158

159 Πρόσφατα, μια μεγάλη Δανέζικη μελέτη απευθύνθηκε στον ρόλο των εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε ασθενείς υπό αγωγή με διαφορετικά παρασκευάσματα IFN-β, για χρονικό διάστημα 6 ετών. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε την cross-sectional ΟΡΑΡ μέθοδο. Το αποτέλεσμα των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στην κλινική δράση της IFN-β επιβεβαιώθηκε ανεξάρτητα από τον τύπο του παρασκευάσματος. Ασθενείς που ανάπτυξαν αντισώματα τον πρώτο χρόνο, παρουσίασαν υψηλότερη συχνότητα υποτροπών κατά άνω του 50% συγκριτικά με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. Τα σκορ της EDSS ήταν σαφώς μεγαλύτερα στους οροθετικούς ασθενείς σε σχέση με τους οροαρνητικούς μετά από 42 και 48 μήνες, ενώ το φαινόμενο αυτό εξασθένισε μετά τους 48 μήνες. Σε αυτή τη μελέτη τα αντισώματα αναπτύχθηκαν κυρίως τον πρώτο χρόνο και μειώθηκαν τα επόμενα χρόνια. Η ανάπτυξη εξουδετερωτικών αντισωμάτων Nabs έναντι των ιντερφερονών έχει μελετηθεί καλά σε ασθενείς με ιογενή ηπατίτιδα ή κάποιους τύπους καρκίνου που θεραπεύονται με ιντερφερόνη 4,17,121,127,132. Σε ασθενείς με ηπατίτιδα η παραγωγή Nabs έχει συσχετιστεί με βελτίωση των ανεπιθύμητων ενεργειών, που οφείλονται στην IFN και επαναδραστηριοποίηση της νόσου 4,121. Η αποτυχία της θεραπείας σε ασθενείς με ηπατίτιδα ή καρκίνο είναι εύκολο να αναγνωριστεί με την παρακολούθηση ευαίσθητων δεικτών ενεργότητας της νόσου (επίπεδα ηπατικών ενζύμων και καρκινικών δεικτών) στο αίμα 4. Όπως και άλλοι ασθενείς που θεραπεύονται με IFN, ασθενείς με ΣΚΠ μπορεί να αναπτύξουν εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι στην IFN. Πράγματι, οι ασθενείς με ΣΚΠ παράγουν Nabs σε μεγαλύτερο βαθμό, γεγονός που πιθανότατα οφείλεται στην ιδιάζουσα φύση της υποκείμενης νόσου. Περίπου το ένα τρίτο των ασθενών που βρίσκονταν υπό IFN-β- 1b ανέπτυξαν Nabs στην κεντρική μελέτη αυτού του φαρμάκου 4. Η κλινική σημασία των Nabs βρίσκεται υπό αμφισβήτηση. Παρ όλα αυτά, η ανάπτυξη αυτών έχει συνδυαστεί με έκπτωση της κλινικής αποτελεσματικότητας. Επίσης ο υπολογισμός του κλινικού αποτελέσματος των Nabs εξαρτάται από την καταγραφή των υποτροπών ή της αναπηρίας μετά την ανεύρεση θετικού τίτλου αντισωμάτων 4. Η παρουσία των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έχει αρνητική επίδραση στο θεραπευτικό αποτέλεσμα της αγωγής όπως αντανακλάται από τη συχνότητα των υποτροπών και τη δραστηριότητα της νόσου στη μαγνητική τομογραφία 12,118. Από 159

160 βιολογικής πλευράς, η παρουσία των Nabs έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με μειωμένα επίπεδα πρωτεϊνών που επάγονται από την IFN, όπως η νεοπτερίνη και η β2-μικροσφαιρίνη 18,120. Τίθεται το ερώτημα εάν η παρουσία των αντισωμάτων εξαλείφει όλη τη δράση της ιντερφερόνης, αλλά παλαιότερες μελέτες για την ιντερφερόνη που χορηγείται στην ηπατίτιδα και τον καρκίνο φάνηκε ότι αυτό δεν συμβαίνει 4. Τέλος υπάρχουν παρατηρήσεις που υποστηρίζουν ότι τα αντισώματα μπορεί να εξαφανιστούν σε ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών 4. Μια πιθανή εξήγηση είναι η ανάπτυξη ανοχής από τα Β λεμφοκύτταρα, αλλά αυτό χρειάζεται περισσότερη διερεύνηση Διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ των ιντερφερονών β Οι Omar A. Khan και Suhayl S. Dhib-Jalbut απέδειξαν ότι τα συνδετικά αντισώματα έναντι της IFN-β-1a παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίδραση με αυτά της IFN-β-1b. Επίσης, τα εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι της IFN-β-1a παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίδραση με αυτά της IFN-β-1b 115,127. Τα Nabs που αναπτύσσονται κατά τη θεραπεία με IFN-β, ανεξάρτητα από τον τύπο της IFN που χορηγείται, αναγνωρίζουν και τους δύο τύπους IFN, επιβεβαιώνοντας τη διασταυρούμενη αντίδραση αλλά δεικνύουν συγχρόνως ότι υπάρχει ουσιαστική αντιγονική ομολογία ανάμεσα στα δύο μόρια 3,17. Εάν για παράδειγμα, η κλινική αποτυχία στη ΣΚΠ οφείλεται στην ανάπτυξη Nabs έναντι της IFN-β-1a, η αλλαγή σε IFN-β-1b και το αντίστροφο, δεν οδηγεί σε ανάκαμψη της κλινικής και βιολογικής απάντησης. Αυτό δεν ισχύει στους ασθενείς με ηπατίτιδα C που λαμβάνουν IFN-α, αφού έχει αποδειχτεί ότι αλλαγή σε άλλο τύπο IFN-α (IFN-α-2a και IFN-α-2b) επί αποτυχίας της αγωγής, συνοδεύεται από αποκατάσταση της κλινικής απάντησης. Στην περίπτωση της IFN-α, η ομολογία της αλληλουχίας των βάσεων ανάμεσα στους υποτύπους αγγίζει το 90%. Συνεπώς, η παρουσία της διασταυρούμενης αντίδρασης επηρεάζει τη θεραπευτική στρατηγική και την κλινική προσέγγιση των ασθενών που λαμβάνουν ένα από τέσσερα σκευάσματα IFN-β

161 3.8. Αίτια αντιγονικότητας Η αιτία της αντιγονικότητας της IFN-β δεν είναι πλήρως γνωστή. Είναι ευρέως αναγνωρισμένο ότι βιοφαρμακευτικά σκευάσματα τα οποία είναι ανασυνδυασμένα ανθρώπινα ανάλογα, όπως η IFN-β, αυξητικοί παράγοντες και ορμόνες, έχουν αντιγονικές ιδιότητες, ακόμη και στην περίπτωση που κατέχουν την ίδια ακολουθία αμινοξέων με το ανθρώπινο μόριο 108. Αντίθετα με την κλασική απάντηση στις εξωγενείς πρωτεΐνες, οι οποίες προκαλούν ανοσιακή απόκριση μετά μία χορήγηση, τα αντισώματα έναντι της IFN-β παράγονται από τη διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής σε αυτοαντιγόνα, τα οποία φυσιολογικά υπάρχουν 108,119,145. Το αυτοαντιγόνο πρέπει να παρουσιάζεται στο ανοσολογικό σύστημα κατ εξακολούθηση για χρονικό διάστημα αρκετών μηνών προτού διασπαστεί η ανοσολογική ανοχή 108. Πολλοί παράγοντες καθορίζουν την ανάπτυξη των Nabs. Κάποιοι σημαντικοί παράγοντες συνδέονται με τον ασθενή 185. Η προδιάθεση για την ανάπτυξη ανοσολογικής διαταραχής καθορίζεται γενετικά. Διαφορές στο ανοσολογικό σύστημα των ασθενών παίζουν επίσης ρόλο, όπως για παράδειγμα οι ασθενείς με ΣΚΠ με ικανό ανοσοποιητικό σύστημα είναι πιο επιρρεπείς στην ανάπτυξη αντισωμάτων συγκριτικά με ασθενείς με νεοπλασία των οποίων το ανοσοποιητικό σύστημα είναι κατεσταλμένο 108. Ασθενείς που φέρουν τα αλλήλια HLA-DRB1*0401 και HLA-DRB1*0408 εμφανίζουν 5 και 14 φορές αντίστοιχα, μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης αντισωμάτων έναντι της IFN-β 156. Κι ενώ η παρουσία τους έχει ισχυρή συσχέτιση με την παραγωγή των αντισωμάτων, η εξουδετερωτική δράση των αντισωμάτων αυτών δεν επηρεάζεται σημαντικά από τα δύο αλλήλια. Φαίνεται ότι άλλοι παράγοντες είναι αυτοί που καθορίζουν το εάν τα αντισώματα θα εξουδετερώσουν την IFN-β 156. Συμπληρωμαατικά, έχει αναφερθεί συσχέτιση ανάμεσα στη δημιουργία εξουδετερωτικών αντισωμάτων και το αλλήλιο DRB1*0701 του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ 108. Άλλοι παράγοντες που επιδρούν είναι η μη καθαρότητα των σκευασμάτων και η επιμόλυνση από τα βακτήρια και τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται στην παρασκευή των ιντερφερονών 108,132. Όπως έγινε αντιληπτό από την ανομοιογένεια 161

162 των αποτελεσμάτων των διάφορων μελετών για τα τρία σκευάσματα IFN-β, το μέγεθος της δόσης κάθε σκευάσματος επηρεάζει, αλλά με ασαφή τρόπο Τζ,132. Επίσης, η δομή των πρωτεϊνών που παράγονται σε κύτταρα μη προερχόμενα από θηλαστικά μπορεί να διαφέρουν από τα ανθρώπινα και να αποκαλύπτουν νέους επιτόπους 108,119,131,132. Επιπρόσθετα, η γλυκοζυλίωση και διαφορές στις γλυκοπρωτεΐνες είναι δυνατόν να εκθέσουν νέους επιτόπους ή να καταστήσουν το μόριο λιγότερο διαλυτό 108,131,132. Η παρουσία συσσωμάτων στο προϊόν έχει συνδυαστεί με την παραγωγή αντισωμάτων 108,131. Το πρωτεϊνικό φορτίο σε κάθε έγχυση φαίνεται ότι παίζει ρόλο στη διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής 108,131. Σε κάθε μεμονωμένη έγχυση IFN-β-1b υπάρχει 10 φορές περίπου μεγαλύτερο πρωτεϊνικό φορτίο συγκριτικά με την IFN-β-1a, προκειμένου να επιτευχθεί το επιθυμητό επίπεδο δραστηριότητας 108,131. Η ενδομυϊκή χορήγηση είναι λιγότερο αντιγονική σε σχέση με την υποδόρια έγχυση 4,108. Η συχνότητα χορήγησης είναι ένας άλλος παράγοντας, αφού η συχνότερη χορήγηση προκαλεί αντισώματα σε μεγαλύτερο βαθμό. Η επίδραση του μεγέθους κάθε δόσης φαίνεται ότι συμβάλλει στην παραγωγή των αντισωμάτων 108. Για την υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, στην κεντρική μελέτη για την IFN-β-1b (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group,1993), το ποσοστό των ασθενών που εμφάνισαν Nabs ανήλθε στο 35% τον πρώτο χρόνο, ενώ στο πέρας της ανήλθε στο 45% για τη δόση των 8 MIU και στο 47% για τη δόση των 1,6 MIU 5,12,124,131,132,145. Η IFN-β-1a sc (PRISMS) παρουσίασε Nabs σε συχνότητα 12,5% στους ασθενείς που έλαβαν 44μg και 23,8% σε αυτούς που έλαβαν 22 μg 124,131,132,133. Στην PRISMS παρατηρήθηκε μια δοσοεξαρτώμενη απάντηση, αφού η χαμηλότερη δόση της IFNβ-1a sc προκάλεσε υψηλότερη συχνότητα αντισωμάτων συγκριτικά με τη μεγαλύτερη δόση. Παράλληλα, επανειλημμένως θετικοί τίτλοι Nabs (>20 NU/mL) σημειώθηκαν στο 24% των ασθενών υπό τη δόση των 22 μg και στο 14% των ασθενών υπό τη δόση των 44 μg 124. Στην επέκταση της μελέτης PRISMS-4, η τελική ανάλυση των Nabs έδειξε ότι αναπτύχθηκαν σε ποσοστό 23,7%, για την ομάδα των 22 μg, και 14,3% για την ομάδα των 44 μg 16,132. Όσον αφορά στην κεντρική μελέτη της IFN-β-1a im η συχνότητα εμφάνισης Nabs ανήλθε στο 22% 124,131,132,138. Στην επέκταση της μελέτης η επίπτωση των Nabs κυμάνθηκε στο 5% 24 μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας. Η διαφορά αυτή 162

163 αποδόθηκε στις αλλαγές στη διαδικασία παραγωγής του φαρμάκου 132. Σε επόμενες μελέτες τα Nabs αναπτύχθηκαν σε ποσοστά από 2% έως 5,8% 5,132,124,145,167. Όταν μελετήθηκε η IFN-β-1a sc σε μία εβδομαδιαία έγχυση σημειώθηκε συχνότητα εμφάνισης Nabs 16,3% για τη δόση των 44 μg και 5,3% για τη δόση των 22 μg 124,132. Παρομοίως, στην Ευρωπαϊκή μελέτη σύγκρισης για την IFN-β-1a im, η επίπτωση των Nabs ήταν υψηλότερη (5,8%) για τους ασθενείς που έλαβαν 60 μg, συγκριτικά με τους ασθενείς που έλαβαν 30 μg (2,3%) 132. Πάρα ταύτα, δεν σημειώθηκε αύξηση της επίπτωσης των Nabs στους ασθενείς που έλαβαν την υψηλότερη δόση του φαρμάκου στη μελέτη φάσης ΙΙΙ για την IFN-β-1a sc (PRISMS Study Group,1998) ή τη μελέτη φάσης ΙΙΙ για την IFN-β-1b (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group,1993) 132,133. Τα ποσοστά για την Ευρωπαϊκή μελέτη για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ (1998) οι ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων ήταν στο 27,8% 131,141. Στην αντίστοιχη μελέτη που διεξήχθη στη Βόρειο Αμερική η συχνότητα κυμάνθηκε στο 23%, για την ομάδα ασθενών που έλαβαν 250 μg και 32%, για την ομάδα ασθενών που έλαβαν 160 μg μέρα παρά μέρα 131. Στη μειοψηφία των ασθενών υπό αγωγή με IFN-β εμφανίζεται εξουδετερωτική δραστηριότητα μη οφειλούμενη σε αντισώματα, η οποία αναστέλλει τη βιολογική δράση της in vitro και in vivo 168. Η Gilli και οι συνεργάτες της 200 έδειξαν ότι αναπτύσσεται εξουδετερωτική ικανότητα μη-μεσολαβούμενη από αντισώματα (non-antibody mediated neutralization-namn) στο 4% των ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία με IFN-β. Αυτή η εξουδετερωτική δραστηριότητα φάνηκε ότι μεσολαβείται από κυκλοφορούντες διαλυτούς υποδοχείς της IFN (sifnar). Με τη χρήση των καθιερωμένων μεθόδων εντοπισμού των αντισωμάτων αυτοί οι ασθενείς θα είναι Nab-θετικοί, αλλά Bab-αρνητικοί 168. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η εξουδετερωτική δραστηριότητα μη-μεσολαβούμενη από αντισώματα παρατηρήθηκε μόνο σε δείγματα ασθενών που υποβάλλονταν σε θεραπεία με υποδόρια IFN-β (δηλαδή IFN-β-1b και IFN-β-1a sc), αλλά όχι σε ασθενείς που λάμβαναν την IFN-β-1a im. Προηγουμένως, ο Dupont και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι μπορεί να σημειωθεί μείωση της έκφρασης υποδοχέων IFN-β στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων ενώ ο ασθενής υποβάλλεται σε 163

164 θεραπεία με IFN-β. Αυτό το γεγονός δύναται να συμβάλλει στην εξουδετέρωση της δράσης της IFN-β 203. Σε μελέτες παρακολούθησης της ανάπτυξης Nabs βρέθηκε ότι η IFN-β-1b είναι πιο αντιγονική από την IFN-β-1a ενώ η IFN-β-1a im είναι λιγότερο αντιγονική από την IFN-β-1a sc 4,17,20,21,108,109,117,119,120,121,124,127,131,132,135,145,149,150. Πρόσφατα παράχθηκε νέο σκεύασμα IFN-β-1a sc, με μειωμένη αντιγονικότητα σε σύγκριση με το προηγούμενο, αλλά όχι στα επίπεδα της IFN-β-1a im 108. Εν κατακλείδι, δεν υπάρχει τρόπος να προβλεφθεί ποιοί ασθενείς θα αναπτύξουν συνδετικά και εξουδετερωτικά αντισώματα, μέχρι τώρα Εμφάνιση των αντισωμάτων στην κλινική πράξη Οι αναφερόμενες συχνότητες εμφάνισης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στη ΣΚΠ ποικίλλουν από 2 έως 45%, αν και τα συνδετικά αντισώματα έχουν βρεθεί σε ποσοστό έως 82% 127 σε ασθενείς υπό IFN-β 22,109,127,131,135. Αυτοί οι αριθμοί δεν εξαρτώνται μόνο από τα τρία σκευάσματα IFN-β, τη δοσολογία, τη διάρκεια της θεραπείας, τη συχνότητα και την οδό χορήγησης, αλλά και από τη μέθοδο ανίχνευσης των αντισωμάτων, γεγονός που καθιστά εμφανή την ανάγκη τυποποιημένων μεθόδων ανίχνευσης των αντισωμάτων έναντι στην IFNβ 22,98,127,131,132,135,149,150. Τα συνδετικά αντισώματα μπορούν να ανιχνευθούν 3 με 6 μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας και είναι παρόντα σε διαφορετικές συχνότητες, ανάλογα με το σκεύασμα της ιντερφερόνης. Στους οροθετικούς ασθενείς για Nabs η δημιουργία των Babs αποτελεί πρώιμο φαινόμενο και τα επίπεδα τους είναι υψηλότερα από αυτά των ασθενών χωρίς Nabs 21. Προς το παρόν δεν είναι δυνατόν να προβλεφθεί ποιοι ασθενείς θα αναπτύξουν Nabs, έχει παρατηρηθεί όμως ότι η πλειονότητα των ασθενών που παρουσιάζουν συνδετικά αντισώματα πρώιμα μετά την έναρξη της θεραπείας με IFN-β, αναπτύσσει και εξουδετερωτικά αντισώματα 152. Εξουδετερωτικά αντισώματα είναι δυνατόν να εντοπιστούν in vitro 6 μήνες μετά την έναρξη της αγωγής με τη χρήση ευαίσθητης μεθόδου ανίχνευσης αυτών 108,131,132,152,153. Η επίδραση των αντισωμάτων στη βιολογική απάντηση της IFN-β γίνεται εμφανής 9 με 12 μήνες μετά την έναρξη της αγωγής 131,155. Κλινικά σημαντικά Nabs μπορούν να ανιχνευθούν 9 με 18 μήνες μετά την έναρξη της 164

165 θεραπείας με IFN-β 15,108,109,123,126,127,128,131,145,153. Φαίνεται ότι ο κλινικός αντίκτυπος και η επίδραση στην αναπηρία αυξάνει κατά το τρίτο και τέταρτο έτος της θεραπείας 18,145,153. Δεν έχει καθοριστεί, προς το παρόν, η ελάχιστη συγκέντρωση εξουδετερωτικών αντισωμάτων με κλινική σημασία 17,109. Τίτλοι Nabs που παραμένουν αρνητικοί τα 2 πρώτα χρόνια της θεραπείας σπάνια θετικοποιούνται μετά από αυτό το χρονικό διάστημα 3,18,108,109,117,127,152. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η διάσπαση της ανοχής συμβαίνει τους πρώτους 12 με 18 μήνες της θεραπείας 109. Τελικά, τα Nabs δημιουργούνται γρηγορότερα έναντι στην IFN-β-1b συγκριτικά με την IFN-β-1a sc, αλλά μετά 12 μήνες εφαρμογής της αγωγής οι αναλογίες των ασθενών με θετικό τίτλο αντισωμάτων είναι παρόμοιες 108, Εξαφάνιση των εξουδετερωτικών και συνδετικών αντισωμάτων Από την παρακολούθηση των Nabs και των Babs προέκυψε η παρατήρηση ότι η παρουσία των αντισωμάτων έναντι της IFN-β είναι παροδική διότι μπορεί να εξαφανιστούν από τον ορό ακόμη κι αν ο ασθενής βρίσκεται υπό αγωγή 4,14,17,108,109,117,121,123,124,127,128,131,132,135,145,150,152. Από τις IFN-β με τον υψηλότερο βαθμό ανάπτυξης Nabs, το φαινόμενο αυτό είναι πιο σύνηθες στην IFNβ-1b συγκριτικά με την IFN-β-1a sc. Στοιχεία από μελέτες δείχνουν ότι αντισώματα υψηλής συγγένειας παράγονται έναντι της IFN-β-1a, και αυτό το γεγονός πιθανά να εξηγεί την επιμονή των Nabs σε αυτούς τους ασθενείς 124. Κατά προσέγγιση το 50% των θετικών για Nabs ασθενών επανήλθε στην οροαρνητική κατάσταση 4 χρόνια μετά την ανάπτυξη των αντισωμάτων 21,108. Επιπρόσθετα, η μεταβολή αυτή επανέφερε την πλήρη δραστικότητα της IFN-β. Τα Nabs παραμένουν για 3 έτη στη θεραπεία με IFN-β-1b (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group, the University of British Columbia MS/MRI Analysis Group,1996), 4 έτη στη θεραπεία με IFN-β-1a sc (PRISMS Study Group and the University of British Columbia MS/MRI Analysis Group,2001) 16,132. Τα Nabs έναντι της IFN-β εξαφανίζονται 6-8 χρόνια μετά την έναρξη της θεραπείας 132. Διεξάχθηκε μια έρευνα σε ασθενείς υπό IFN-β για 6 χρόνια, για να μελετηθεί αυτό το φαινόμενο και τα αποτελέσματα αυτής υποστήριξαν αυτή την παρατήρηση 14,121. Τα Nabs εξαφανίζονται στην πλειονότητα των ασθενών κατά τα 6 χρόνια παρακολούθησης, και αυτό είναι ανεξάρτητο από τον τύπο της IFN-β που λάμβανε ο ασθενής. Πράγματι, τα αντισώματα 165

166 εξαφανίστηκαν στους ασθενείς υπό IFN-β-1a, καθώς και σε αυτούς που αρχικά βρίσκονταν υπό IFN-β-1a και στη συνέχεια έλαβαν IFN-β-1b, η οποία είναι περισσότερο αντιγονική από την IFN-β 1α. Οι ασθενείς που παρέμειναν οροθετικοί ήταν αυτοί με υψηλό τίτλο αντισωμάτων στον ορό, αλλά ο τίτλος μειώθηκε σημαντικά μετά από 6 χρόνια θεραπείας. Επιπρόσθετα, η διασταυρούμενη αντίδραση των αντισωμάτων παραμένει για τους δύο τύπους IFN-β. Τα αποτελέσματα για τα Babs δεν είναι σαφή. Μειώνονται σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών στα 6 χρόνια, αλλά μερικοί ασθενείς εξακολουθούν να τα παράγουν 14. Η μετάβαση στην οροαρνητική κατάσταση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον τίτλο των αντισωμάτων 21,108,109,117,121,123,128,130,131,145,152,155. Ασθενείς με χαμηλό τίτλο αντισωμάτων (< NU/ml) έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να τα αρνητικοποιήσουν. Αντίθετα, τίτλοι αντισωμάτων άνω των 500 NU/ml σπάνια γίνονται αρνητικοί σε χρονικό διάστημα 2 με 3 ετών 17,108. Πρέπει να προστεθεί εδώ ότι δεν υπάρχει σαφής εξήγηση για την παρατηρούμενη διαφορά στα ποσοστά μετάβασης στην οροαρνητική κατάσταση σε ασθενείς υπό IFN-β-1b (50%) και IFN-β-1a sc (20%) 108,109,119,152. Μία υπόθεση στηρίζεται στο πρωτεϊνικό φορτίο που περιέχεται σε κάθε έγχυση. Δικαιολογεί, εν μέρει, τη διάσπαση της ανοσολογικής ανοχής και πιθανότατα ευθύνεται για την αποκατάστασή της 108,109,119,152. Μια πολύ πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ασθενείς χωρίς εξουδετερωτικά αντισώματα ή με χαμηλούς τίτλους, έχουν >90% πιθανότητα να εξακολουθήσουν να χαίρουν της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας του φαρμάκου για τουλάχιστον τα επόμενα 3 έτη. Ασθενείς με πολύ υψηλούς τίτλους Νabs, υπάρχει 15% πιθανότητα να επανακτήσουν τη βιολογική δράση της IFN-β τα επόμενα 3 χρόνια. Δηλαδή, οι τίτλοι των Νabs παραμένουν σταθεροί για χρονικό διάστημα 1-3 ετών, αλλά οι ασθενείς κοντά στο κλινικά κριτικό όριο (οποίο τέθηκε στο επίπεδο των 150 TRU/ml) έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να χάσουν ή να επανακτήσουν τη βιολογική δράση της IFN-β. Αυτές οι παρατηρήσεις ήταν ανεξάρτητες από το σκεύασμα της IFN-β, τη διάρκεια της θεραπείας και το μεσοδιάστημα των δειγματοληψιών 154. Στοιχεία από ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs, οι οποίοι διέκοψαν τη θεραπεία, δείχνουν ότι τα αντισώματα είναι δυνατόν να παραμείνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά τη διακοπή της αγωγής 108,123. Σε μερικούς ασθενείς μπορεί ακόμη 166

167 και να αυξηθεί ο τίτλος των αντισωμάτων. Αν και η αιτία της παραμονής τους δεν είναι γνωστή μία πιθανή εξήγηση είναι η παρουσία των μακρόβιων Β-κυττάρων μνήμης. Φαίνεται αντιφατικό το γεγονός ότι τα αντισώματα τείνουν να μειώνονται σε μακροχρόνια θεραπεία με ιντερφερόνη-β, ενώ το κλινικό αποτέλεσμα αυτών αυξάνει κατά τον τρίτο και τέταρτο χρόνο μετά την έναρξη της αγωγής 18,106,145. Η συγγένεια των αντισωμάτων για τον υποδοχέα ποικίλλει, ενώ η συγγένεια της IFN-β για τον υποδοχέα της είναι μεγάλη. Επομένως, αντισώματα με χαμηλή συγγένεια για τον υποδοχέα, πιθανότατα, δεν αλληλεπιδρούν με αυτόν. Με την ωρίμανση του επίτοπου κατά τη διάρκεια της θεραπείας με IFN-β, οι ασθενείς συγκεντρώνουν αντισώματα με αυξημένη συγγένεια πιθανότατα σε βάρος αυτών με χαμηλή συγγένεια 18,109. Η εξήγηση για την εξαφάνιση των Nabs και των Babs δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Πιθανόν να οφείλεται στην ανάπτυξη ανοχής στην IFN-β μέσω απευαισθητοποίησης, η οποία επιτυγχάνεται με τη συνεχή χορήγηση του αντιγόνου σε σχετικά μεγάλες δόσεις 14, Μέθοδοι ανίχνευσης των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Ένα σημαντικό μέρος των ασθενών που λαμβάνουν IFN-β δεν απαντούν στη θεραπεία. Σε αυτούς τους ασθενείς η αποτυχία ανταπόκρισης οφείλεται κυρίως στην ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β (συνδετικά ή εξουδετερωτικά αντισώματα), αλλά πιθανότατα συμβάλλουν κι άλλοι μηχανισμοί (μειωμένη έκφραση υποδοχέων IFN-β ή αυξημένη συγκέντρωση κυκλοφορούντων διαλυτών υποδοχέων) 102,107,108,117,168. Οι μέθοδοι ανίχνευσης των αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε δύο τύπους 98,105,131,132 : 1) οι μέθοδοι εντοπισμού των συνδετικών αντισωμάτων, στις οποίες μετράται η ικανότητα του ορού του ασθενούς να δεσμεύει το μόριο της IFNβ, 2) οι μέθοδοι εντοπισμού των εξουδετερωτικών αντισωμάτων, στις οποίες μετράται η ικανότητα των αντισωμάτων που υπάρχουν στον ορό των ασθενών να εξουδετερώνουν τη βιολογική δράση της IFN-β. (Σχήμα 7) Οι δεσμευτικές μέθοδοι είναι ευαίσθητες με σχετικά χαμηλό κόστος, αλλά έχουν υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Για παράδειγμα, τα επίπεδα των 167

168 συνδετικών αντισωμάτων σε έναν ασθενή μπορεί να είναι σημαντικά χωρίς την παρουσία εξουδετερωτικής δραστηριότητας ή ενδείξεις απώλειας της βιοδιαθεσιμότητας. Οι εξουδετερωτικές μέθοδοι αναγνωρίζουν τη δραστηριότητα αντισωμάτων με πιθανό κλινικό αντίκτυπο, αλλά είναι υψηλού κόστους, με τεχνική δυσκολία και ασαφείς κριτικές τιμές 105. Σχήμα 7: Σχηματική παράσταση των μεθόδων εντοπισμού (Α) των Babs με τη βοήθεια της celisa (Β), (Γ) των Nabs με τη χρήση της μεθόδου του κυτταροπαθολογικού φαινομένου και της επαγωγής της MxA, αντίστοιχα. (Δ) Η παρουσία Nabs συνεπάγεται μειωμένη παραγωγή MxA, ενώ η απρόσκοπτη δράση της έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση της MxA Συνδετικά αντισώματα Η παρουσία αντισωμάτων ικανών να αλληλεπιδρούν ή να δεσμεύουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο μετράται με τις δεσμευτικές μεθόδους. Αυτές οι τεχνικές εξυπηρετούν συνήθως στον προσυμπτωματικό έλεγχο ασθενών για την παρουσία αντισωμάτων. Οι πιο διαδεδομένες τεχνικές είναι η εξαρτημένη από ένζυμο ανοσοπροσροφητική αναλυτική μέθοδος (enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA), η μέθοδος ανοσοστυπώματος κατά Western (Western blot-wb), η ράδιοανοσοκατακρήμνιση (radioimmunoprecipitation assay-ripa), η μέθοδος 168

169 βασισμένη σε στήλη (column-based assay) και οι μέθοδοι χρωματογραφίας συγγένειας (affinity chromatography assays) 98, ELISA Οι δύο κύριες τεχνικές της ELISA είναι η άμεση και η έμμεση. Στην πρώτη, η IFN-β τοποθετείται στην κυψέλη και απορροφάται πάνω στο πλαστικό με υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις. Ως αποτέλεσμα είναι η μερική απενεργοποίηση της IFN-β και επίσης το είδος των Babs που θα ανιχνευθούν μπορεί να είναι παραπλανητικό. Τα Babs που αναγνωρίζουν συγκεκριμένους φυσικούς επιτόπους μπορεί να μην συνδεθούν με την απενεργοποιημένη IFN-β, παρ όλα αυτά, αν περιέχεται μια μικρή ποσότητα απενεργοποιημένης IFN-β στο σκεύασμα που χορηγείται στους ασθενείς, τότε αυτό το εμπόδιο προσπερνάται. Στη δεύτερη μέθοδο, η IFN-β βρίσκεται στην φυσική της μορφή, ανιχνεύοντας τα αντισώματα που αναγνωρίζουν και εξουδετερώνουν τη φυσική IFN-β. Αυτή η μέθοδος μπορεί να «αποκρύψει» μερικούς επιτόπους και τα Babs του ασθενούς έναντι αυτών των επίτοπων να χαθούν. Επειδή όμως ο ορός των ασθενών περιέχει ένα μείγμα διαφορετικών αντισωμάτων, η απώλεια ενός δεν είναι ικανή να δώσει ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα. Η έμμεση ELISA υπερτερεί της άμεσης μεθόδου σε ευαισθησία 150,169. Η ELISA ανιχνεύει όλα τα αντισώματα έναντι της IFN-β ανεξάρτητα από το αν εξουδετερώνουν τη βιολογική δράση της. Το θετικό αποτέλεσμα δεν σημαίνει απαραιτήτως και την παρουσία Nabs. Οι τίτλοι της ELISA συσχετίζονται ασθενώς με τους τίτλους των Nabs, αλλά τα αρνητικά δείγματα για Babs προβλέπουν αξιόπιστα την αρνητικότητα των Nabs, εκτός από ένα μικρό ποσοστό ασθενών, με εξουδετερωτική δραστηριότητα που δεν οφείλεται στα αντισώματα 108,131. Παρ όλα αυτά η διαθεσιμότητα των αντιδραστηρίων, η απλή διαδικασία της, το βραχύ χρονικό διάστημα που απαιτείται και η ευκολία να τυποποιηθεί, την καθιστούν μέθοδο προσυμπτωματικού ελέγχου (screening) υψηλής αποτελεσματικότητας Ανοσοστύπωμα κατά Western Αυτή η μέθοδος αποδίδει παρόμοια αποτελέσματα με την ELISA. Παρουσιάζει χαμηλότερα ποσοστά ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων κατά τον έλεγχο για την 169

170 παρουσία Nabs. Δεν μετρώνται τίτλοι Babs με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος κατά Western RIPA, affinity chromatography και column assays Σε αυτές τις μεθόδους χρησιμοποιείται ραδιοσημασμένη IFN-β αναμεμειγμένη με τον ορό του ασθενούς, έτσι ώστε τα Babs να δεσμεύσουν τη ραδιενεργό IFN-β. Τα αντισώματα απομονώνονται είτε με κατακρήμνιση (RIPA), είτε με δέσμευση τους σε στήλη. Η ποσότητα της σημασμένης IFN-β που ενώνεται με τα απομονωμένα αντισώματα επιτρέπει τον υπολογισμό του επιπέδου των Babs. Το πλεονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι η δέσμευση των Babs γίνεται σε διάλυμα, μιμούμενη δυνητικά την in vivo διαδικασία κι επομένως συνεισφέρει στην ταυτοποίηση των αντισωμάτων έναντι της φυσικής IFN-β. Τα δύο μειονεκτήματα είναι η χρήση σημασμένης IFN-β και η δυσκολία διενέργειας τους συγκριτικά με την ELISA. Επίσης, η μέθοδος RIPA χρησιμοποιείται ευρέως στον εντοπισμό παθογόνων αυτοαντισωμάτων, όπως αντισώματα έναντι των υποδοχέων ακετυλοχολίνης, των διαύλων ασβεστίου και καλίου, ή της αλλαντικής τοξίνης 150. Υπάρχουν ενδείξεις τάξης Ι ότι οι μέθοδοι εντόπισης των συνδετικών αντισωμάτων έχουν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και μπορούν αξιόπιστα να χρησιμοποιηθούν για προσυμπτωματικό έλεγχο αντισωμάτων έναντι της IFN-β προτού εφαρμοστούν οι εξουδετερωτικές μέθοδοι 131,150. Η έμμεση ELISA και η μέθοδος RIPA μπορούν να θεωρηθούν ως οι μέθοδοι «δεύτερης γενιάς» συγκριτικά με την «πρώτης γενιάς» μέθοδο την άμεση ELISA Εξουδετερωτικά αντισώματα Η παρουσία των Nabs υπολογίζεται με βάση την ικανότητα τους να εμποδίζουν τη βιολογική δράση της IFN-β in vitro. Επειδή η άσκηση της βιολογικής δράσης της IFN-β γίνεται μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα, τα αντισώματα που εμποδίζουν την ενεργοποίησή του θα εξουδετερώνουν και τις θεραπευτικές ιδιότητες της IFNβ 98. Παρουσιάζουν 2-4% ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων

171 Μέθοδος κυτταροπαθολογικού φαινομένου (cytopathic effect assay-cpe) Αποτελεί τη συνιστώμενη μέθοδο για την ανίχνευση των Nabs σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας. Εξετάζει την ικανότητα των αντισωμάτων να παρεμβαίνουν στη δέσμευση του υποδοχέα μέσω μέτρησης της αντι-ιικής δράσης της IFN-β 98,131. Δύο πλεονεκτήματα έχει η μέθοδος κυτταροπαθολογικού φαινομένου: την υψηλή ευαισθησία και το ότι απαιτεί σύνθετη κυτταρική απάντηση στην IFN-β. Το τελευταίο είναι σημαντικό και ο λόγος είναι ότι η αναστολή αυτής της απάντησης είναι ενδεικτική αναστολής πολλαπλών οδών δράσης της IFN-β, συμπεριλαμβανομένων και αυτών απαραίτητων για την κλινική δράση στη ΣΚΠ. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η χαμηλή ειδικότητα, καθώς κάποια συστατικά του ορού μπορούν να παρέμβουν ή να μιμηθούν την αντι-ιική ιδιότητα της IFN-β, όπως η IL-6 ή η IFN-γ και να επηρεάσουν το αποτέλεσμα. Μια παραλλαγή της μεθόδου κυτταροπαθολογικού φαινομένου χρησιμοποιεί το άλας του τετραζολίου (MTT) 101. Θεωρήθηκε κατάλληλο για την ποσοτικοποίηση της ιικής CPE και κατά συνέπεια για την ποσοτικοποίηση και την εξουδετέρωσή της δραστηριότητας της IFN-β. Βρέθηκε παράλληλα ότι αποδίδει πιο λεπτομερή διαβάθμιση των αποτελεσμάτων, λειτουργεί σε χαμηλές συγκεντρώσεις ιντερφερόνης και είναι ικανή να ανιχνεύσει πολύ χαμηλά επίπεδα εξουδετέρωσης της ιντερφερόνης Η μέθοδος επαγωγής της έκφρασης MxA πρωτεΐνης (Myxovirus protein A-MxA) Αναπτύχθηκε για να ξεπεράσει τα προβλήματα της μεθόδου κυτταροπαθολογικού φαινομένου. Στηρίχτηκε στις ενδείξεις ότι οι ιντερφερόνες τύπου Ι επάγουν επιλεκτικά το γονίδιο MxA στα ανθρώπινα κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο 10,98,99,100,102,106,131. Διακρίνεται η in vitrο και η in vivo μέθοδος 98,132. Η μέθοδος MxA κατέχει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία. Μπορεί να διενεργηθεί πιο γρήγορα από τη CPE (2,5 έναντι 4 ημερών) και δεν περιλαμβάνει ιογενή λοίμωξη, η οποία μπορεί να εισάγει διακυμάνσεις στη CPE 98,132. Το μειονέκτημα είναι η δυσκολία πρόσβασης των αντιδραστηρίων για την ELISA της 171

172 MxA και τη μεταβλητότητα που δεδομένα, υφίστανται σε κάθε μέθοδο που βασίζεται σε κυτταρικές σειρές 98,132. Στις in vivo μεθόδους μετράται η ενεργοποίηση επαγόμενων από την IFN-β γονιδίων (όπως το MxA mrnα) ή το προϊόν τους (όπως η MxA πρωτεΐνη ή η νεοπτερίνη) 132,102,103,123. Με αυτό τον τρόπο καθορίζεται εάν η χορηγούμενη στον ασθενή IFN-β προκαλεί βιολογικό αποτέλεσμα 132. H MxA πρωτεΐνη εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα προ της εφαρμογής της θεραπείας και σε υψηλά επίπεδα μετά την έγχυσή της 98. Εφαρμόστηκε η μέθοδος στο αγγελιοφόρο RNA (mrna) αυτού του γονιδίου χρησιμοποιώντας την ποσοτική PCR για τον προσδιορισμό της βιολογικής δράσης in vivο της χορηγούμενης IFN-β. Είναι απαραίτητη η λήψη αίματος τόσο πριν όσο και 12 ώρες μετά την έγχυση της δόσης της IFN-β. Το πιο σημαντικό πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι προσδιορίζει in vivo τη βιολογική απάντηση κάθε ασθενή στη θεραπεία του με IFN-β. Επιπλέον, είναι σχετικά απλή μέθοδος, υπάρχει μεγάλη διακύμανση μεταξύ της προ και μετά την έγχυση έκφραση της MxA και τέλος πλεονέκτημα της αποτελεί η ειδικότητα της MxA για τις τύπου Ι ιντερφερόνες. Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελεί το στενό χρονικό περιθώριο που πρέπει να γίνει η αιμοληψία 98,102. Τα επίπεδα του mrna αυξάνουν και μειώνονται ταχέως. Η ανάλυση καμπυλών έκφρασης MxA και χρόνου έδειξε ότι η επαγωγή του γονιδίου γίνεται εμφανής ακόμη και 3 ώρες μετά την έγχυση της IFN-β, η κορυφή της έκφρασης εμφανίζεται στις 9 με 12 ώρες μετά την έγχυση του φαρμάκου και στη συνέχεια μειώνεται σταδιακά τις επόμενες 24 ώρες επιστρέφοντας στα προ της χορήγησης επίπεδα 102,107,116. Όπως ειπώθηκε η θεραπεία με IFN-β είναι ωφέλιμη στη ΣΚΠ 100. Το ποσοστό των ασθενών που δεν ανταποκρίνεται στην αγωγή είναι σχετικό και η απουσία βιολογικών εξετάσεων ταυτοποίησής του περιορίζει την αναγνώρισή του μόνο από την κλινική εξέλιξη της νόσου 100,102,116. Μία ομάδα ασθενών, που δεν ανταποκρίνονται στην IFN-β, χαρακτηρίζεται από μειωμένη ή καταργημένη βιοδιαθεσιμότητα της ιντερφερόνης, η οποία μπορεί να εκτιμηθεί μέσω της ποσοτικοποίησης-μέτρησης ενός μορίου που επάγεται από την ιντερφερόνη 100,102,103,107,116. Οι πρωτεΐνες που επάγονται από την IFN-β όπως η β2- μικροσφαιρίνη, η oligoadenylate synthetase, η νεοπτερίνη, η ιντερλευκίνη 10, 172

173 το διαλυτό αγγειακό κυτταρικό προσκολλητικό μόριο (svcam) και οι myxovirus resistance proteins (MxA και MxB) εμφανίζουν οξεία επαγωγή μετά την έγχυση IFNβ 10,102,103,104,105,106,124. Από αυτές τις πρωτεΐνες, η MxA, αν και δεν έχει αποδειχτεί σαφώς η εμπλοκή της στη θεραπευτική δράση της IFN-β 107,124, θεωρείται η πιο κατάλληλη, επειδή μόνο η IFN-β τύπου Ι (IFN-α, IFN-β και IFN-ω) και κάποιοι ιοί (HIV 103 ) μπορούν να επηρεάσουν τα επίπεδά της 100,102,103,104,105,106,107,130,132. Η MxA είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, μοριακού βάρους 75kD περίπου, η οποία διαθέτει ενδογενή δράση GTPάσης ικανής να αναστείλει τον ιικό πολλαπλασιασμό 103,104,105,116. Κωδικοποιείται από το γονίδιο Mx1 το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 21q ,105. Η ένωση της IFN-β με τον υποδοχέα της οδηγεί σε ισχυρή επαγωγή του mrna της MxA πρωτεΐνης και την επακόλουθη μετάφραση της πρωτεΐνης 105. Καθώς ο στόχος της ποσοτικοποίησης της MxA είναι η αξιολόγηση της βιοδιαθεσιμότητας της IFN-β, δηλαδή η ένωσή της με τον υποδοχέα και η ενεργοποίηση κυτταρικών οδών, τα επίπεδα του mrna της MxA συνδέονται πιο ισχυρά με την αλληλεπίδραση μεταξύ IFN-β και υποδοχέα συγκριτικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης 100,102,103,106,107,130. Αυτό συμβαίνει διότι το mrna δεν επηρεάζεται από τα μετά-μεταγραφικά φαινόμενα τα οποία, αντιθέτως, σαφώς καθορίζουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης 100,107,130. Επιπλέον, ο χρόνος ημίσειας ζωής της πρωτεΐνης είναι κάποιες ημέρες πιο μακρύς από αυτόν του mrna 100,102,106,107. Αυτό σημαίνει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης αντικατοπτρίζουν όλα τα γεγονότα της προηγούμενης εβδομάδας της αιμοληψίας. Πρέπει να σημειωθεί ότι κάθε μέθοδος που μετράει την MxA εκτιμάει τη βιοδιαθεσιμότητα της IFN-β κι όχι την κλινική αποτελεσματικότητά της, αν και η βιοδιαθεσιμότητα αποτελεί απαραίτητο βήμα για την κλινική αποτελεσματικότητα 100,107. Η συγκριτική μελέτη των μεθόδων εντοπισμού των εξουδετερωτικών μεθόδων έδειξε ότι η MxA mrna είναι πιο ευαίσθητη στην ανίχνευση χαμηλών επιπέδων Nabs 108. Η MxA μπορεί να χρησιμεύσει εκτός της μέτρησης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων και στην παρακολούθηση της προφυλακτικής θεραπείας 103,105,116,118. Μια ιδανική περίπτωση θα ήταν η μέτρηση της MxA προ της έναρξης της αγωγής και στη συνέχεια ανά 3 ή 6 μήνες. Τα επίπεδα παραμένουν σταθερά εκτός κι αν δημιουργηθούν Nabs. Στους Nabs θετικούς ασθενείς, ιδίως όταν παραμένουν σε 173

174 υψηλά επίπεδα, η MxA ελαττώνεται σημαντικά στο βαθμό προ της έναρξης της θεραπείας, υποδηλώνοντας αδυναμία ενεργοποίησης του υποδοχέα της IFN-β. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται μείωση της βιολογικής δράσης μεσολαβούμενη από αντισώματα (antibody-mediated decreased bioactivity-adb) και παρουσιάζει διαβαθμίσεις 103,105,136,151. Επιπρόσθετα, η MxA μπορεί να συμβάλλει στην αναγνώριση των ασθενών που δεν ανταποκρίνονται στην αγωγή, ανεξάρτητα από την κατάσταση των Nabs 103,130. Ασθενείς χωρίς αντισώματα, που δεν απαντούν στην IFN-β, βρέθηκε ότι έχουν χαμηλότερα επίπεδα MxA συγκριτικά με ασθενείς αρνητικούς για Nabs, οι οποίοι ανταποκρίνονται στη θεραπεία Luciferase assay Πρόκειται για νέα μέθοδο η οποία χρησιμοποιεί ανθρώπινα κύτταρα ινοσαρκώματος, τα οποία έχουν σταθερώς επιμολυνθεί με γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (luciferase reporter gene). Όταν τα μόρια της IFN-β ενώνονται με τον υποδοχέα της ενεργοποιείται μια αλυσίδα γεγονότων που οδηγούν στη μετάφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης. Η ποσότητα της επαγόμενης λουσιφεράσης μπορεί να μετρηθεί σε εκπομπή ανά δευτερόλεπτο. Εάν υπάρχουν εξουδετερωτικά αντισώματα η απάντηση αναστέλλεται Παράγοντες που επηρεάζουν τη μέτρηση των Nabs Πολλοί παράγοντες επιδρούν στον εντοπισμό των αντισωμάτων επηρεάζοντας τελικά την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα των μεθόδων ανίχνευσης. Οι μεταβλητές που επηρεάζουν την μέθοδο κυτταροπαθολογικού φαινομένου περιλαμβάνουν τον τύπο των κυττάρων, τον τύπο και την ποσότητα του ιού που χρησιμοποιούνται. Κάθε ένας από αυτούς τους παράγοντες μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία και το αποτέλεσμα της εξέτασης. Επίσης, πρέπει να σημειωθεί ότι συστατικά του ορού, εκτός των αντισωμάτων, μπορούν να εξουδετερώσουν την αντι-ιική δράση της IFN-β οδηγώντας σε ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Στη μέθοδο της MxA πρωτεΐνης οι περιορισμοί αφορούν στη διαθεσιμότητα των αντιδραστηρίων και των ενδιάμεσων σταδίων για την ποσοτικοποίηση της παραγόμενης MxA. 174

175 Ένας άλλος παράγοντας διακύμανσης αποτελεί η ποσότητα ιντερφερόνης που προστίθεται στον ορό, διότι η πρόσθεση αυξανόμενων ποσοτήτων ιντερφερόνης μειώνει σημαντικά την ευαισθησία της μεθόδου. Άρα η χρήση υψηλών ποσοτήτων IFN-β μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, ενώ το αντίθετο παρατηρείται όταν χρησιμοποιούνται πολύ χαμηλές δόσεις. Ένα παρόμοιο θέμα προκύπτει από τη σχετική διαφορά στη βιολογική δράση των τριών παρασκευασμάτων IFN-β. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει συναίνεση για τη χρήση της εξισώσεως Kawade, δεν ισχύει το ίδιο για το όριο του τίτλου των αντισωμάτων που εκτιμάται κλινικά σημαντικό. Επίσης, διαφορές υπάρχουν όσον αφορά στη χρονική διάρκεια που πρέπει να παραμένουν τα αντισώματα σε έναν ασθενή για να θεωρηθεί ότι έχουν κλινικό αντίκτυπο. Έχουν γίνει κάποιες προτάσεις προκειμένου να σταθεροποιηθεί η μέτρηση των αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β 98 : 1) θα πρέπει να καθιερωθεί η ELISA ως μέθοδος ανίχνευσης των Babs ή μέθοδος προσυμπτωματικού ελέγχου, επειδή είναι αποτελεσματική και προσιτή. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος θα πρέπει να γίνεται περαιτέρω έλεγχος για Nabs, 2) αν τα αντιδραστήρια γίνουν εύκολα διαθέσιμα, η μέθοδος MxA πρέπει να χρησιμοποιείται ως σταθερή τεχνική για την ποσοτικοποίηση των Nabs επειδή έχει υψηλή ειδικότητα για την IFN-β, μεγάλο εύρος ευαισθησίας και αποφεύγει το ενδιάμεσο στάδιο της προσθήκης ιού και κατ επέκταση μεταβλητών που μπορούν να αλλοιώσουν το αποτέλεσμα της μεθόδου, 3) θετικό αποτέλεσμα Nabs πρέπει να θεωρείται όταν ο τίτλος σε δύο διαδοχικές μετρήσεις είναι 20 ή οποιοσδήποτε τίτλος έχει θεωρηθεί ότι έχει βιολογικές επιπτώσεις στη συγκεκριμένη τεχνική, 4) καλό είναι να εμβαθύνουμε την έρευνα στη μέθοδο της in vivo MxA mrna, επειδή υπολογίζει την απάντηση στη θεραπεία της ιντερφερόνης-β με πιο εξατομικευμένο τρόπο για τον κάθε ασθενή Η επίδραση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στη βιοδιαθεσιμότητα της IFN-β Όπως έχει ήδη αναφερθεί η IFN-β και η IFN-α ενώνονται με τον ίδιο υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου και η ενεργοποίησή του οδηγεί στην επαγωγή ή την καταστολή της έκφρασης ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων 108,135. Η παρεμπόδιση της 175

176 αλληλεπίδρασης της IFN-β με τον υποδοχέα της από τα εξουδετερωτικά αντισώματα, συνεπάγεται την κατάργηση της βιολογικής και κατ επέκταση της κλινικής δράσης της 123,132,145,153. Επειδή ο προσδιορισμός του κλινικού οφέλους της IFN-β στους ασθενείς είναι δύσκολος, η βιολογική δράση της IFN-β μπορεί να εξεταστεί μέσω της μέτρησης των προϊόντων ενός αριθμού επαγόμενων γονιδίων από την IFN-β, όπως η οικογένεια των myxovirus resistance proteins (MxA και MxB), β2-μικροσφαιρίνη, νεοπτερίνη, 2,5 oligoadenylate synthase (2,5 OAS), μόρια του μέγιστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι, Stat-1, συνδέτης επάγων απόπτωση μέσω TNF (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TRAIL) 108,123,132,135. Η MxA πρωτεΐνη αποδείχτηκε ότι αποτελεί τον πιο αξιόπιστο δείκτη της in vivo βιολογικής δράσης της IFN-β 108,116,123,132. Η επαγωγή της MxA πρωτεΐνης είναι φανερή στους ασθενείς με ΣΚΠ από την πρώτη έγχυση της IFNβ 108,116,118. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι ασθενείς με Nabs, κυρίως σε αυτούς με υψηλά επίπεδα, η απάντηση της MxA πρωτεΐνης επιστρέφει στα προ της έναρξης της θεραπείας επίπεδα. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι τα Nabs καταργούν τη βιολογική δράση της IFN-β 108,118,120,123,127,135,145. Σε πολλές περιπτώσεις, η ελάττωση των επιπέδων της MxA πρωτεΐνης προηγείται της ανάπτυξης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων 118. Η βιοδιαθεσιμότητα αποτελεί απαραίτητη συνθήκη για την κλινική αποτελεσματικότητα επειδή αντιπροσωπεύει την ποσότητα του φαρμάκου που αλληλεπιδρά με ειδικά κύτταρα, τα οποία συμμετέχουν στην κλινική δράση 107. H συνύπαρξη υψηλών επιπέδων και επίμονης παρουσίας των Nabs έχει συσχετιστεί με μείωση της βιολογικής δραστηριότητας, όπως προκύπτει από την ελάττωση της έκφρασης του MxA mrna 106,107,120. Ο Bertolotto και συνεργάτες του 106 πρότειναν ότι υπό αυτές τις συνθήκες, οι εγχύσεις IFN-β αποτυγχάνουν πάντα να αυξήσουν τα επίπεδα του MxA mrna, ανεξάρτητα από τη δόση ή τη συχνότητα χορήγησης. Αντίθετα, σε ασθενείς με χαμηλά επίπεδα Nabs (<45 TRU) παρουσιάζουν επαγωγή του MxA, έστω και σε χαμηλά επίπεδα. Αυτό σημαίνει ότι χαμηλός τίτλος Nabs μπορεί να ξεπεραστεί αν αυξηθεί η δόση της χορηγούμενης IFN-β, ενώ στην περίπτωση υψηλών τίτλων Nabs, η βιολογική απάντηση στην IFN-β είναι πάντα κατηργημένη, ακόμα κι αν αυξηθεί η δόση ή η συχνότητα της θεραπείας. Επιπρόσθετα, σε ασθενείς που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με IFN-β, από τις 176

177 καμπύλες συγκέντρωσης MxA στον χρόνο, προκύπτει ότι η ειδική οδός μεταφοράς σήματος και οι ειδικοί κυτταρικοί υποδοχείς επιφανείας μπορούν να ερεθιστούν περισσότερο από μία φορές 106. Πάρα ταύτα, η χορήγηση IFN-β τρεις φορές εβδομαδιαίως προκαλεί 18% βιολογικά «μη αποτελεσματικές» εγχύσεις, όπως αναγνωρίζεται από την απουσία βιολογικής δραστηριότητας. Αύξηση της MxA μετά από κάθε έγχυση IFN-β ενιέμενης τρεις φορές εβδομαδιαίως (IFN-β-1a sc και IFN-β- 1b) βρέθηκε στο 64% των ασθενών που απαντούν στη θεραπεία σε σύγκριση με το 100% των ασθενών υπό IFN-β χορηγούμενης άπαξ εβδομαδιαίως. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να οφείλεται σε μη συνεργασία των ασθενών, αν και είναι απομακρυσμένη πιθανότητα, λόγω της εμφάνισης έστω και μικρής αύξησης της έκφρασης του MxA γονιδίου μετά από κάποιες «μη αποτελεσματικές» εγχύσεις. Θεωρείται πιθανότερο το ενδεχόμενο ότι τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος υπόκεινται διαδικασία απευαισθητοποίησης ως απάντηση στην επαναλαμβανόμενη έκθεση στην IFN-β 106. Σύμφωνα με τον σχεδιασμό της μελέτης, στο πέρας των 5 ημερών παρακολούθησης των ασθενών, η συνολική βιολογική απάντηση στις IFN-β-1a sc και IFN-β-1b ήταν στατιστικά υψηλότερη από αυτή στην IFN-β-1a im. Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν σαφείς ενδείξεις για την επαγωγή υψηλότερης βιολογικής απάντησης σε ασθενείς υπό IFN-β ενιέμενης τρεις φορές εβδομαδιαίως (IFN-β-1a sc και IFN-β- 1b), δεν είναι ξεκάθαρο εάν αυτή η διαφορά έχει κλινική σημασία, καθώς η χαμηλότερη βιολογική απάντηση στην IFN-β-1a im μπορεί να εξισορροπηθεί από τη μικρότερη επίπτωση Nabs 106. Επίσης, πρέπει να ληφθεί υπ όψιν ότι μεγαλύτερη συσσώρευση βιολογικής δραστηριότητας δεν καταλήγει κατ ανάγκη σε υψηλότερη κλινική αποτελεσματικότητα. Η κλινική αποτελεσματικότητα συνδέεται με το χρόνο ημίσειας ζωής των επαγόμενων μορίων και/ή τις μεταβολές κυτταρικών πληθυσμών με θεραπευτική δράση. Υπάρχουν ενδείξεις που υπογραμμίζουν τη σημασία της ρύθμισης κυτταροκινών και χυμοκινών, με ταχεία επαγωγή και μικρό χρόνο ημίσειας ζωής. Αντίθετα, η IFN-β έχει και μακροπρόθεσμες ιδιότητες, όπως τη ρύθμιση άλλων κυτταροκινών, την ανάπτυξη διαφορετικών κυτταρικών σειρών, αυξάνει τη δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων, ή καταστέλλει τις μεταλλοπρωτέασες του στρώματος. Επομένως, αυτές οι ιδιότητες οι οποίες διατηρούνται για μία εβδομάδα ή περισσότερο, χρήζουν λιγότερο συχνής έγχυσης του φαρμάκου. 177

178 Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη έδειξε ότι δεν υπάρχει ιδανική θεραπευτικό σχήμα IFN-β. Η IFN-β-1a im έχει σημαντικά χαμηλότερη βιολογική δραστηριότητα, αλλά σαφώς μικρότερη επίπτωση ανάπτυξης Nabs συγκριτικά με την IFN-β-1a sc και IFNβ-1b 106,116. Από την άλλη πλευρά, αυτές οι δύο IFN-β δείχνουν υψηλότερη βιολογική δραστηριότητα αλλά προκαλούν μεγαλύτερη εμφάνιση εξουδετερωτικών αντισωμάτων, τα οποία μειώνουν τη θεραπευτική τους δράση 106. Επιπρόσθετα, οι ασθενείς υπό IFN-β-1a im και IFN-β-1a sc (22 και 44μg) δείχνουν καθυστερημένη έκφραση σε σύγκριση με τους ασθενείς υπό IFN-β-1b, γεγονός που πιθανότατα οφείλεται στη διαφορετική βιοχημική δομή των μορίων των τριών ιντερφερονών β 116,130. Παρά τις διαφορές αυτές, η συνολική βιολογική απάντηση μετά από κάθε δόση IFN-1β είναι η ίδια για τις τρεις ιντερφερόνες 116. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενη μελέτη του Bertolotto και των συνεργατών του, οπού 18,5% των ασθενών υπό θεραπεία με IFN-β δεν ανέπτυξε επίπεδα MxA mrna πάνω από το όριο αναφοράς 107,130. Αυτό σημαίνει ότι ένα υπολογίσιμο ποσοστό ασθενών δεν επηρεάζεται από τη χορήγηση της IFN-β. Για αυτό μπορεί να ενοχοποιηθεί η απρόβλεπτη βιοδιαθεσιμότητα της υποδορίως χορηγούμενης IFN-β ή η έλλειψη λειτουργικών υποδοχέων στα κυκλοφορόντα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) 130. Μία άλλη εξήγηση αποτελεί η ανάπτυξη εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Τρεις κατηγορίες ασθενών εμφανίστηκαν : Nabs-, μεμονωμένη μέτρηση Nabs+, επανειλημμένως Nabs+. Στους ασθενείς υπό IFN-β, τα επίπεδα έκφρασης του MxA ήταν υψηλότερα στους Nabs- και αυτούς με μεμονωμένη μέτρηση Nabs+, σε σχέση με τους επανειλημμένως Nabs+ ασθενείς. Επομένως, η παρουσία των Nabs εμπλέκεται στην ελάττωση του θεραπευτικού αποτελέσματος, ανεξάρτητα από τη δόση και τη συχνότητα χορήγησης. Πιο συγκεκριμένα, τίτλος Nabs 20LU σε τουλάχιστον 2 διαδοχικά δείγματα (επανειλημμένως Nabs+) συσχετίστηκαν με οξεία μείωση της βιοδιαθεσιμότητας. Αντίθετα, η παρουσία ενός θετικού δείγματος Nabs δεν την επηρεάζει. Σε αυτή τη μελέτη υπήρξαν τρεις Nabs- ασθενείς οι οποίοι παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα MxA mrna. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι εμπλέκονται κι άλλοι μηχανισμοί στη μείωση της βιολογικής δράσης της IFN-β, όπως η παρουσία υψηλών τίτλων Babs, η μειωμένη έκφραση υποδοχέων IFN-β ή η αυξημένη συγκέντρωση διαλυτών κυκλοφορούντων υποδοχέων IFN-β 102,107,108,168. Η εξουδετέρωση της 178

179 βιολογικής δράσης της IFN-β εξαρτάται από τον τίτλο των Nabs 10,107. Η έκφραση της MxA καταργήθηκε στους ασθενείς με τίτλο Nabs 45 LU, ενώ παρατηρήθηκε ποικίλη μείωση της έκφρασης σε ασθενείς με τίτλο αντισωμάτων μεταξύ 20 και 45 LU. Η βιοδιαθεσιμότητα ήταν παρόμοια ανάμεσα στα τρία σκευάσματα IFN-β 12 ώρες μετά την έγχυση στους Nabs- ασθενείς, ενώ στους επανειλημμένως Nabs+ ασθενείς με τίτλο 45 LU η βιοδιαθεσιμότητα ήταν όμοια κατηργημένη. Πρόσφατα, ο Pachner και οι συνεργάτες συμφώνησαν με αυτά τα ευρήματα 105. Σε ποσοστό 27% των ασθενών υπό IFN-β είχαν σημαντικά μειωμένη βιολογική δράση κοντά στα επίπεδα των μαρτύρων ή των ασθενών χωρίς αγωγή. Επίσης, για τους ασθενείς υπό IFN-β-1a im, στο 4% αυτών σημειώθηκε μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα λόγω εμφάνισης αντισωμάτων (ADB), στο 43% των ασθενών υπό IFN-β-1a sc και στο 45% των ασθενών υπό IFN-β-1b. Τέλος, σε τέσσερεις ασθενείς με ελαττωμένη βιοδιαθεσιμότητα λόγω εμφάνισης αντισωμάτων δεν ανιχνεύτηκαν Nabs. Αυτοί οι ασθενείς μπορούν να χαρακτηριστούν ως «προ Nab» κατάσταση, η οποία είναι δυνατόν να αναγνωριστεί από την ταχεία εμφάνιση των Babs τους πρώτους 6 μήνες της θεραπείας 105. Παρ όλα αυτά, η καταστολή των επαγόμενων από την IFN-β γονιδίων λόγω της παρουσίας των αντισωμάτων, παρουσιάζει διαβαθμίσεις και δεν ακολουθεί τον νόμο του «όλον ή ουδέν» 108,123. Όταν οι τίτλοι των Nabs είναι 5 έως 20, η επαγωγή της νεοπτερίνης μειώνεται προοδευτικά, ενώ σε τίτλους άνω των 20 η ελάττωση είναι πολύ σημαντική 20,108,126. Παρόμοια στοιχεία λαμβάνονται και για τα επίπεδα της β2 μικροσφαιρίνης 20,108,126. Χαμηλά επίπεδα νεοπτερίνης έχουν συνδυαστεί με υψηλά επίπεδα Nabs. Ασθενείς με τίτλο Nabs έως 150 TRU/ml διατηρούν χαμηλά επίπεδα βιολογικής δράσης της IFN-β και αυτή μειώνεται σημαντικά όταν ο τίτλος ανέρχεται στις TRU/ml, ενώ τίτλοι άνω των 600 TRU/ml συσχετίζονται με απώλεια της βιολογικής δράσης της IFN-β 108,126. Το TRAIL επάγεται επιλεκτικά από την IFN-β, αλλά όχι από τις άλλες τύπου Ι ιντερφερόνες. Θεωρήθηκε ότι πιθανότατα να συμμετέχει στις θεραπευτικές ιδιότητες της IFN-β επειδή κατέχει ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση στο επίπεδο των Τ λεμφοκυττάρων και επάγει την απόπτωση. Σε μια μελέτη όπου ποσοτικοποιήθηκε το mrna των γονιδίων TRAIL και MxA σε ασθενείς με Nabs, διαπιστώθηκε ότι καταργήθηκε η επαγωγή τους σε αυτή την ομάδα ασθενών

180 Διερευνήθηκε επίσης, ο ρόλος των μεταλλοπρωτεασών του στρώματος (MMPs). Η μείωση της σύνθεσης της MMP9 από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) αποτελεί μία από τους αναγνωρισμένους μηχανισμούς δράσης της IFN-β 123,128. Παρ όλα αυτά, οι MMP9, MMP2 καθώς και οι ιστικοί αναστολείς τους (tissue inhibitors of metelloproteinase 1 και 2) δεν επάγονται άμεσα από την IFN-β. Ποσοτικοποιήθηκε το mrna αυτών των γονιδίων και τα επίπεδα των Nabs σε ασθενείς πριν την έναρξη της θεραπείας, μετά την πρώτη έγχυση της IFN-β και κατά τη διάρκεια της αγωγής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα της MMP-9 μειώθηκαν μετά τον τρίτο μήνα της θεραπείας σε ασθενείς χωρίς Nabs, ενώ η βιολογική δράση καταργήθηκε πλήρως σε ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων. Στην τελευταία ομάδα ασθενών τα επίπεδα των MMP ήταν συγκρίσιμα με αυτά των ασθενών χωρίς αγωγή 123,128. Πρόσφατα μελετήθηκε και συγκρίθηκε η επαγωγή των γονιδίων 2-5 OAS και βιπερίνης (viperin-vip) με το γονίδιο MxA, σε ασθενείς με απόντα ή χαμηλά, μέτρια και υψηλά επίπεδα Nabs, με τη χρήση μιας νέας μεθόδου, τη multiplex real-time RT- PCR 125. Σε αυτή την εργασία προέκυψε ότι η έκφραση των τριών γονιδίων ήταν συγκρίσιμη. Στην περίπτωση των χαμηλών και μέτριων επιπέδων Nabs, η αλληλεπίδρασή τους στη σύνδεση της IFN-β με τον υποδοχέα της έφεραν το ίδιο αποτέλεσμα για τα τρία γονίδια. Σε αρκετούς ασθενείς με χαμηλά ή μέτρια επίπεδα Nabs, π.χ. 20 έως 100, διατηρείται κάποια βιολογική δράση. Επίσης, σε αυτό το εύρος επιπέδων οι τίτλοι εξουδετερωτικών αντισωμάτων δεν συσχετίζονται με την απώλεια της βιολογικής δράσης. Υψηλά επίπεδα Nabs επιφέρουν κατάργηση της βιολογικής δράσης, ενώ επί απουσίας τους, ακολουθεί πλήρης έκφραση αυτών. Στην περίπτωση που τα επίπεδα των Nabs κυμαίνονται ανάμεσα στο 20 και 100, γεγονός που συναντάται συχνά, η ιδανικός τρόπος για τη μέτρηση της βιολογικής δράσης είναι η απευθείας μέτρησή της 125,109. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνονται από μελέτη των Sorensen και συνεργατών του, στην οποία φάνηκε ότι σε ασθενείς χωρίς Nabs παρατηρήθηκε πλήρης ή μερική απάντηση στην IFN-β, κατηργημένη απόκριση σε ασθενείς με υψηλό τίτλο, ενώ σε ασθενείς με χαμηλό τίτλο αντισωμάτων η απάντηση ήταν απρόβλεπτη: περίπου το ένα τρίτο των ασθενών αυτής της ομάδας δεν έδειξε απόκριση, ένα τρίτο παρουσίασε μερική και ένα τρίτο πλήρη απάντηση

181 Οι ανεπιθύμητες ενέργειες της IFN-β αποτελούν έως ένα βαθμό έμμεσο δείκτη βιολογικής δράσης της IFN-β Ο κλινικός αντίκτυπος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Τα αντισώματα έναντι της ιντερφερόνης-β μπορεί να αποδυναμώσουν ή να καταργήσουν την κυτταρική απάντηση στην IFN-β και να εξουδετερώσουν το θεραπευτικό της αποτέλεσμα 17,108,116,117,119,122,131,132,152,154. Οι ασθενείς με εξουδετερωτικά αντισώματα και κύρια αυτοί με επανειλημμένως υψηλούς τίτλους, παρουσιάζουν υψηλότερο ρυθμό υποτροπών, μεγαλύτερο κίνδυνο να εμφανίσουν δεύτερη υποτροπή, υψηλότερο κίνδυνο εξέλιξης της αναπηρίας και μικρότερο πιθανότητα να παραμείνουν ελεύθεροι ώσεων 109,120,121,122,124,154. Σήμερα, ομοφωνία έχει επιτευχθεί όσον αφορά στην ύπαρξη των Nabs και την ικανότητά τους να μειώνουν τη βιοδιαθεσιμότητα της IFN-β 108. Παλαιότερα υπήρχε αβεβαιότητα, η οποία μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι τα κλινικά σημαντικά Nabs εμφανίζονται 9-18 μήνες μετά την έναρξη της αγωγής με IFN-β και στο ότι τα αντισώματα που παρουσιάζονται πρώιμα στους 6-12 μήνες έχουν χαμηλή συγγένεια και δύνανται να επιτείνουν το θεραπευτικό αποτέλεσμα της IFN-β. Αυτό βέβαια μπορεί να οδηγήσει σε παράβλεψη της επιβλαβούς δράσης των αντισωμάτων, όταν τα δεδομένα περιορίζονται σε χρόνο παρακολούθησης μικρότερο των 2 ετών 108. Ασθενείς με υψηλή συνδετική δραστηριότητα έχουν επίσης και εξουδετερωτική δραστηριότητα εάν χρησιμοποιηθεί μέθοδος υψηλής ευαισθησίας. Ασθενείς με θετικούς τίτλους συνδετικών αντισωμάτων έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να μην απαντήσουν στη θεραπεία, να παρουσιάσουν συχνότερα υποτροπές και αύξηση της κλίμακας EDSS 150. Επιπρόσθετα, η ταυτόχρονη παρουσία υψηλών τίτλων Babs και Nabs σχετίζεται με εντονότερη δραστηριότητα και εξέλιξη της νόσου 21. Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί τρόποι για να αξιολογηθεί η θετικότητα των Nabs 108,117 : 1) η μέθοδος «οποιαδήποτε φορά θετικό, πάντα θετικό» «anytime positive, always positive» χαρακτηρίζει τους ασθενείς θετικούς στηριζόμενη σε μία μόνο θετική μέτρηση, και μόνο οι ασθενείς με αρνητικό τίτλο αντισωμάτων καθ όλη τη διάρκεια της παρακολούθησης χαρακτηρίζονται ως αρνητικοί, 181

182 2) η μέθοδος «άπαξ θετικό, πάντα θετικό» «once positive, always positive», λαμβάνει υπ όψιν μόνο τις παρατηρήσεις μετά τον εντοπισμό θετικού τίτλου αντισωμάτων. Αυτή η μέθοδος συνήθως απαιτεί 2 διαδοχικές θετικές μετρήσεις για να χαρακτηρίσει θετικό τον ασθενή για Nabs, 3) η μέθοδος «interval analysis» ή «all swiches considered» χρησιμοποιεί όλα τα γεγονότα στο διάστημα ανάμεσα σε μια αρνητική ή μια θετική μέτρηση μέχρι την επόμενη (συνήθως μετά από 6 μήνες) εξέταση και τους χαρακτηρίζει ως αρνητική ή θετική κατάσταση αντίστοιχα. Καμία από τις μεθόδους δεν λαμβάνει υπ όψιν ότι ο κλινικός αντίκτυπος των Nabs μπορεί να εκδηλωθεί κάποιο χρονικό διάστημα μετά την εμφάνιση των αντισωμάτων Η επίδραση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στις υποτροπές Η κεντρική μελέτη της IFN-β-1b περιέλαβε 372 ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ, οι οποίοι έλαβαν είτε 1,6 MIU, είτε 8 MIU, είτε εικονικό φάρμακο, μέρα παρά μέρα για χρονικό διάστημα 3 ετών. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο «οποιαδήποτε φορά θετικό, πάντα θετικό» για την εκτίμηση της θετικότητας των Nabs, φάνηκε ότι το 11% των ασθενών υπό εικονικό φάρμακο, το 47% της ομάδας υπό1,6 MIU και το 45% της ομάδας υπό 8 MIU IFN-β-1b ανέπτυξαν Nabs. Ο ετήσιος ρυθμός υποτροπών προέκυψε σαφώς υψηλότερος στους ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων, σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. Αργότερα, διενεργήθηκε ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης με τις μεθόδους«άπαξ θετικό, πάντα θετικό» και την «ανάλυση κατά διαστήματα», η οποία επιβεβαίωσε τον υψηλότερο βαθμό υποτροπών σε ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs. Στην κεντρική μελέτη φάσης ΙΙΙ της IFN-β-1a im, σε δόση 30 μg εβδομαδιαίως για χρονικό διάστημα 2 ετών, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο ρυθμό των υποτροπών ή την εξέλιξη της νόσου ανάμεσα στους ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs και αυτούς χωρίς αντισώματα. Στη μελέτη PRISMS συγκρίθηκε η IFN-β-1a sc σε δόση 22 μg και 44μg, με εικονικό φάρμακο τρεις φορές εβδομαδιαίως για χρονικό διάστημα 2 ετών. Η θετικότητα προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο «οποιαδήποτε φορά θετικό, πάντα θετικό». Δεν προέκυψαν σημαντικές διαφορές στο ρυθμό υποτροπών ή την εξέλιξη της νόσου ανάμεσα στους ασθενείς με Nabs και αυτούς χωρίς αντισώματα, για το 182

183 χρονικό διάστημα παρακολούθησης. Στην παράταση της μελέτης, όμως, την PRISMS-4, τα Nabs προκάλεσαν σαφή μείωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας στις υποτροπές το τρίτο και τέταρτο έτος 16,108,133. Η επανεκτίμηση των αποτελεσμάτων της μελέτης και με τις δύο μεθόδους, «οποιαδήποτε φορά θετικό, πάντα θετικό» και «interval analysis», επιβεβαίωσε την επιβλαβή επίδραση των Nabs. Η Ευρωπαϊκή μελέτη για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ περιέλαβε 718 ασθενείς, στους οποίους χορηγήθηκε είτε IFN-β-1b σε δόση 8 MIU, είτε εικονικό φάρμακο μέρα παρά μέρα. Με τη χρήση της μεθόδου «άπαξ θετικό, πάντα θετικό» παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ρυθμού υποτροπών (45%), ενώ με τη μέθοδο «interval analysis» βρέθηκε οριακή μόνο αύξηση του ρυθμού 108,141. Επίσης, υψηλότεροι τίτλοι φαίνεται ότι μειώνουν το θεραπευτικό αποτέλεσμα σε πιο σοβαρό βαθμό. Η μελέτη North American Placebo Randomized Study of IFN-β-1b για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ διάρκειας 3 ετών, έδειξε σημαντικά υψηλότερο ρυθμό υποτροπών στους ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs. Η μελέτη SPECTRIMS για την IFN-β-1a sc σε ασθενείς με δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ είναι η μοναδική μελέτη η οποία δεν έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στην επίδραση των Nabs στο ρυθμό των υποτροπών. Στη μελέτη σύγκρισης της IFN-β-1a im σε δόση 30μg έναντι των 60μg μία φορά εβδομαδιαίως για χρονική διάρκεια 4 ετών έδειξε ότι οι ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs είχαν υψηλότερο ρυθμό υποτροπών, σε σχέση με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. Η μελέτη INCOMIN, ανοικτή τυχαιοποιημένη μελέτη στην οποία αντιπαρατέθηκε η IFN-β-1b 8 MIU μέρα παρά μέρα με την IFN-β-1a im 30μg, δεν συμπεριέλαβε τη σύγκριση των ασθενών με θετικό και αρνητικό τίτλο αντισωμάτων. Στη Δανία διεξάχθηκε μελέτη σε 541 Δανούς ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ υπό θεραπεία με IFN-β. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για χρονικό διάστημα 60 μηνών και η επίδραση των Nabs εκτιμήθηκε με βάση τη μέθοδο «interval analysis». Στις περιόδους με θετικό τίτλο Nabs η ετήσια συχνότητα υποτροπών σημειώθηκε αυξημένη κατά 50% σε σύγκριση με τις περιόδους χωρίς αντισώματα. Επίσης, ο χρόνος έως την πρώτη υποτροπή καθώς και το ποσοστό των ασθενών ελεύθερων 183

184 υποτροπών ήταν σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα από τα αντίστοιχα των ασθενών χωρίς αντισώματα 18,108. Σε μια αναδρομική μελέτη, η οποία διεξάχθηκε σε 262 ασθενείς υπό θεραπεία με IFN-β με χρονική διάρκεια 3 ετών, φάνηκε ότι τα πρώτα 2 χρόνια ο ετήσιος ρυθμός υποτροπών δεν επηρεάστηκε από την κατάσταση των Nabs. Αντίθετα, τον τρίτο και τέταρτο χρόνο παρακολούθησης ο ετήσιος ρυθμός επηρεάστηκε αρνητικά στους ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων. Τέλος, σε μια μελέτη, η οποία στηρίχτηκε στη συχνότητα των θετικών ασθενών για Nabs σύμφωνα με αποτελέσματα εργαστηρίων σε Ευρώπη, Βόρειο Αμερική και Αυστραλία, βγήκε το συμπέρασμα ότι η παρουσία των Nabs δεν είναι σημαντικός παράγοντας για την επιδείνωση της νόσου. Ωστόσο σημειώθηκαν σοβαρές κριτικές για τη συγκεκριμένη μελέτη Η επίδραση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στην εξέλιξη της νόσου Καμία από τις κεντρικές μελέτες σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ δεν ανέδειξε επίδραση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στην εξέλιξη της νόσου, όπως επίσης και οι μελέτες για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η θεραπεία με IFN-β δεν έχει αντίκτυπο στην εξέλιξη της νόσου. Επιπλέον, η Δανέζικη μελέτη έδειξε μία τάση μεγαλύτερης εξέλιξης σε ασθενείς με θετικό τίτλο αντισωμάτων 18,108. Στη μελέτη σύγκρισης της IFN-β-1a im σε δόση 30μg έναντι των 60μg μία φορά εβδομαδιαίως για χρονική διάρκεια 4 ετών έδειξε αρνητική επίδραση των Nabs στην εξέλιξη της νόσου. Αυτό εκφράστηκε με τον υψηλότερο ρυθμό αλλαγής του μέσου όρου της EDSS από την ημέρα εκκίνησης έως τους 48 μήνες παρακολούθησης. Στη μελέτη σύγκρισης της IFN-β-1a im 30μg εβδομαδιαίως και της IFN-β-1a sc 44μg τρεις φορές την εβδομάδα για 5 χρόνια βρέθηκε ότι περισσότεροι ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs είχαν εξέλιξη της νόσου, σε αντιπαράθεση με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. Η παρουσία Nabs συσχετίστηκε με υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης αναπηρίας κατά τη διάρκεια πενταετούς παρακολούθησης 68 ασθενών υπό IFN-β, καθώς και σε μια μελέτη 78 ασθενών διάρκειας 3 ετών, οπού 13 ασθενείς με επανειλημμένως 184

185 θετικό τίτλο αντισωμάτων επιδεινώθηκαν κατά ένα ή περισσότερους βαθμούς στην κλίμακα EDSS Η επίδραση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στα σημεία ενεργότητας της νόσου στη μαγνητική τομογραφία Όλες οι μελέτες έδειξαν επίδραση των Nabs στην ενεργότητα της νόσου, όπως αυτή αναδεικνύεται στη μαγνητική τομογραφία με την πρόσληψη σκιαγραφικής ουσίας ή τις νέες Τ2 εστίες καθώς και τη βαρύτητα της νόσου, όπως αντανακλάται από το φορτίο των Τ2 βλαβών. Στην κεντρική μελέτη της IFN-β-1b χορηγούμενης υποδορίως, ο μέσος αριθμός των νέων ή των αυξανόμενων Τ2 εστιών ήταν σαφώς υψηλότερος για τους θετικούς για Nabs ασθενείς. Στην κεντρική μελέτη φάσης ΙΙΙ της IFN-β-1a im φάνηκε ισχυρή τάση εμφάνισης εστιών που προσελάμβαναν γαδολίνιο, σε ασθενείς με εξουδετερωτικά αντισώματα. Το αρνητικό αποτέλεσμα των Nabs στη μαγνητική τομογραφία έγινε σαφές στην κεντρική μελέτη PRISMS για την IFN-β-1a sc 133. Στην Ευρωπαϊκή μελέτη για τη δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ, οι ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs έδειξαν υψηλότερη ποσοστιαία αύξηση των Τ2 εστιών στη μαγνητική τομογραφία αναφοράς, σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. Η μελέτη EVIDENCE, οπού συγκρίθηκε η IFN-β-1a sc 44μg τρεις φορές την εβδομάδα με την IFN-β-1a 30μg im, ανέδειξε υψηλότερη δραστηριότητα της νόσου σε ασθενείς με Nabs. Στη συγκριτική μελέτη της IFN-β-1a im 30μg έναντι των 60 μg διάρκειας 4 ετών φάνηκε ότι η ενεργότητα της νόσου, όπως αναδεικνύεται στη μαγνητική τομογραφία, ήταν υψηλότερη για τους ασθενείς με εξουδετερωτικά αντισώματα. Τέλος, σε μια ανοικτή μελέτη παρακολούθησης 30 ασθενών με υποτροπιάζουσα ΣΚΠ υπό θεραπεία με IFN-β-1b ανευρέθη ότι οι ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs είχαν περισσότερες εστίες που εμπλούτιζαν με γαδολίνιο και υψηλότερο φορτίο Τ2 εστιών, σε σχέση με τους ασθενείς χωρίς αντισώματα. 185

186 Οι ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Έχει παρατηρηθεί ότι υψηλοί τίτλοι Nabs συνοδεύονται από ποικίλης βαρύτητας κλινικό αποτέλεσμα. Ένας πιθανός μηχανισμός έγκειται στις ανοσορυθμιστικές ιδιότητες των ανοσοσυμπλεγμάτων των κυτταροκινών με τα αντισώματα έναντι αυτών. Η IFN-β, η οποία είναι κυτοκίνη, και τα Nabs πιθανόν να σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα τα οποία μπορεί να συνδέονται είτε με τον υποδοχέα της ιντερφερόνης, είτε με τον Fc υποδοχέα των ανοσολογικών κυττάρων. Το αποτέλεσμα της ιντερφερόνης στο ανοσοσύμπλεγμα πάνω στην ενεργοποίηση του υποδοχέα της δεν είναι γνωστή. Η Fc περιοχή της ανοσοσφαιρίνης στο σύμπλεγμα IFN-β-Nab έχει τη δυνατότητα να συνδέεται με τους Fc υποδοχείς των ανοσολογικών κυττάρων (π.χ. μονοκύτταρα και Β κύτταρα) και να καταστέλλει τη δράση τους. Επομένως, ενώ η βιοδιαθεσιμότητα της IFN-β μπορεί να επηρεαστεί από την παρουσία των Nabs, τα ανοσοσυμπλεγμάτα των Nabs πιθανότατα να ασκούν ευεργετική δράση στη ΣΚΠ Οδηγίες που αφορούν στην κλινική εφαρμογή του εντοπισμού των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Οι Ευρωπαϊκές οδηγίες προτείνουν 108,122,131 : 1. Οι μέθοδοι εντοπισμού Babs μπορούν να χρησιμοποιηθούν με αξιοπιστία ως προσυμπτωματικός έλεγχος και να προηγηθούν των μεθόδων ανίχνευσης των Nabs. (οδηγία επιπέδου Α), 2. Η ανίχνευση των δεσμευτικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β πρέπει να διενεργείται σε εξειδικευμένα εργαστήρια. (οδηγία επιπέδου Α), 3. Η ανίχνευση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων πρέπει να διενεργείται με την πιστοποιημένη μέθοδο του κυταροπαθητικού αποτελέσματος ή τη μέθοδο επαγωγής της έκφρασης MxA, χρησιμοποιώντας ορό σε διαδοχικές διαλύσεις. Ο τίτλος των Nabs πρέπει να υπολογίζεται με την εφαρμογή του τύπου Kawade. (οδηγία επιπέδου Α), 4. Οι εξετάσεις για την ανίχνευση Nabs πρέπει να διενεργούνται κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 μηνών της θεραπείας (οδηγία επιπέδου Α), 5. Οι μετρήσεις των Nabs πρέπει να διακόπτεται στους ασθενείς που παραμένουν οροαρνητικοί τα πρώτα 2 χρόνια της θεραπείας, αλλά θα πρέπει να επανεξετάζονται όταν αυξάνει η δραστηριότητα της νόσου (οδηγία επιπέδου Β), 6. Σε ασθενείς με Nabs η εξέταση πρέπει να επαναλαμβάνεται μετά από 3-6 μήνες 186

187 (οδηγία επιπέδου Α), 7. η θεραπεία με IFN-β πρέπει να διακόπτεται σε ασθενείς με υψηλούς τίτλους Nabs, οι οποίοι επιμένουν σε επαναλαμβανόμενες μετρήσεις με μεσοδιάστημα 3-6 μηνών (οδηγία επιπέδου Α). Η αναφορά της Βορείου Αμερικής κατέληξε στα εξής συμπεράσματα 117 : 1. Η θεραπεία των ασθενών με IFN-β σχετίζεται με την παραγωγή Nabs έναντι του μορίου της IFN-β (οδηγία επιπέδου Α), 2. Είναι πιθανό ότι η παρουσία των Nabs, κυρίως σε επίμονα υψηλούς τίτλους, συνδυάζεται με μείωση της απεικονιστικής και κλινικής θεραπευτικής αποτελεσματικότητας της IFN-β (επίπεδο Β), 3. Είναι πιθανό ότι ο ρυθμός παραγωγής των Nabs είναι χαμηλότερος με τη θεραπεία με IFN-β-1a συγκριτικά με την IFN-β-1b (επίπεδο Β). Παρ όλα αυτά, λόγω της ποικιλομορφίας των δεδομένων και επειδή τα Nabs εξαφανίζονται στην πλειοψηφία των ασθενών (ειδικά σε αυτούς με χαμηλούς τίτλους Nabs), η έκταση και η επιμονή οποιασδήποτε διαφοράς στη συχνότητα εμφάνισης των Nabs των τριών ιντερφερονών είναι δύσκολη να καθοριστεί, 4. Είναι πιθανό ότι η συχνότητα εμφάνισης των Nabs έναντι στην IFN-β επηρεάζεται από έναν ή περισσότερους από τους παρακάτω παράγοντες: έκδοχα, οδό χορήγησης, δόση, συχνότητα χορήγησης (επίπεδο Β). Ανεξάρτητα από την εξήγηση, φαίνεται ότι η IFN-β-1a im είναι λιγοτερο αντιγονική από τα άλλα δύο σκευάσματα IFN-β. Επειδή τα Nabs μπορεί να εξαφανιστούν σε πολλούς ασθενείς που συνεχίζουν τη θεραπεία, η επιμονή αυτής της διαφοράς είναι δύσκολο να καθοριστεί (επίπεδο Β). 5. Παρά το γεγονός ότι η επίμονη παρουσία υψηλών τίτλων Nabs (> NU/ml) έχει συσχετιστεί με μείωση του απεικονιστικού και κλινικού αποτελέσματος της IFN-β, δεν υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες για τη χρησιμότητα των μετρήσεων των Nabs στον καθορισμό ειδικών οδηγιών που αφορούν στη χρονική στιγμή διεξαγωγής των εξετάσεων, την επιλογή της μεθόδου εντοπισμού τους, τον αναγκαίο αριθμό των μετρήσεων και τον ορισμό του κριτικού τίτλου (επίπεδο U). Ασθενείς με υψηλούς τίτλους αντισωμάτων δεν λαμβάνουν πλέον βιολογικά ενεργή θεραπεία και η IFN-β θα πρέπει να διακόπτεται ανεξάρτητα από την κλινική πορεία της νόσου 108,115,145. Χαμηλοί και μέτριοι τίτλοι αντισωμάτων χρειάζονται περισσότερη παρακολούθηση και οι θεραπευτικές επιλογές θα πρέπει να στηρίζονται και να καθοδηγούνται από επαγωγή του mrna του MxA γονιδίου. Εάν απουσιάζει, τότε ο ασθενής καθίσταται επιρρεπής να μην ανταποκριθεί πλέον στη 187

188 θεραπεία λόγω αναπτύξεως αντισωμάτων και θα πρέπει να συζητηθεί μαζί του η πιθανότητα αλλαγής της αγωγής. Εάν, αντίθετα, ανιχνεύεται η βιολογική δράση της IFN-β τότε θα πρέπει να επαναλαμβάνονται οι μετρήσεις, να παρακολουθείται η κλινική πορεία του ασθενούς και οι θεραπευτικές επιλογές θα κριθούν από την ενεργότητα της νόσου 108. Πρόσφατα προτάθηκαν νέες κατευθύνσεις στη χρησιμοποίηση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στην καθημερινή κλινική πράξη 184. Οι συστάσεις περιληπτικά δίνονται σε 3 τρία σημεία: 1) ακόμη και ασθενείς που έχουν καλή κλινική πορεία, οι εξετάσεις εντοπισμού των Nabs και/ή της βιολογικής δράσης της MxA θα πρέπει να αξιοποιούνται, 2) ασθενείς με ενδιάμεσης δραστηριότητας νόσο, η συνέχιση της θεραπείας μπορεί να προταθεί σε Nabs-αρνητικούς ασθενείς, ενώ υψηλοί τίτλοι Nabs και/ή απώλεια της δράσης της MxA θα ήταν βάση για αλλαγή σε άλλη ανοσοτροποιητική αγωγή πλην της IFN-β, 3) σε ασθενείς με δυσμενή πορεία θα έπρεπε να συσταθεί αλλαγή της αγωγής, ανεξάρτητα από την κατάσταση των Nabs ή της MxA Προγνωστικοί δείκτες απάντησης στη θεραπεία με ιντερφερόνη βήτα Η μέτρηση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων προσφέρει προγνωστική αξία στην πρόβλεψη της κλινικής ανταπόκρισης του ασθενούς στη θεραπεία με IFN-β. Σε μια πρόσφατη μελέτη φάνηκε για πρώτη φορά ότι η ποσοτικοποίηση του MxA mrna έχει ισχυρή προγνωστική αξία του κινδύνου εμφάνισης νέων υποτροπών. Προέκυψε ότι η προγνωστική της αξία είναι ανώτερη της μέτρησης των Nabs Η πρόληψη στη δημιουργία των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Κορτικοστεροειδή Βραχείες εγχύσεις κορτικοστεροειδών αποδείχτηκαν ασφαλείς, καλά ανεκτές και κλινικά αποτελεσματικές σε ασθενείς με ΣΚΠ. Σύμφωνα με τη μελέτη των Pozzilli και των συνεργατών του (2002) η χρόνια χορήγηση στεροειδών προλαμβάνει ή καθυστερεί την παραγωγή των Nabs, αλλά δεν μειώνει τον τίτλο τους όταν έχουν ήδη δημιουργηθεί. Επιπλέον, πρέπει να ληφθεί υπ όψιν το ενδεχόμενο η συγχορηγούμενη μεθύλ-πρεδνιζολόνη να επεμβαίνει ή να μειώνει τη δράση της IFN-β. Πρόσφατα ο Pachner και οι συνεργάτες πρότειναν την αντιμετώπιση του προβλήματος των Nabs με πρώιμη ανίχνευση του πληθυσμού «υψηλού κινδύνου» 188

189 (ασθενείς με υψηλό τίτλο συνδετικών αντισωμάτων πριν αυτά μετατραπούν σε εξουδετερωτικά, με επανειλλημένες αιμοληψίες τους πρώτους 6 μήνες) και την πρώιμη εφαρμογή θεραπείας με κορτικοστεροειδή. Επειδή το συμπέρασμα αυτό προέκυψε από την παρακολούθηση μικρού αριθμού ασθενών θα πρέπει να επιβεβαιωθεί κατόπιν μελέτης μεγαλύτερου πληθυσμού, ώστε να βγουν ασφαλή αποτελέσματα 158. Πρόσφατα εφαρμόστηκε η μηνιαία χορήγηση υψηλής δόσης μεθυλπρεδνιζολόνης από το στόμα για χρονικό διάστημα 6 μηνών, σε ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs, μετά τη διακοπή της ιντερφερόνης. Η μελέτη δεν κατάφερε να δείξει ωφέλιμο αποτέλεσμα συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου όσον αφορά στα εξουδετερωτικά αντισώματα και τη βιολογική δράση της IFN-β στο τέλος αυτού του χρονικού διαστήματος. Επομένως δεν προσφέρεται σαν μια λύση για τη γρήγορη επαναφορά στην οροαρνητική κατάσταση ώστε να μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί η ιντερφερόνη-β ως θεραπευτική επιλογή 159. Στην προσπάθεια να επιλυθεί το κώλυμα των εξουδετερωτικών αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε κυκλική χορήγηση μεθυλπρεδνιζολόνης, σε συνδυασμό με αζαθειοπρίνη, σε ασθενείς με επίμονα θετικό τίτλο Nabs μετά ενός έτους θεραπείας με IFN-β και για χρονικό διάστημα 6 μηνών. Και σε αυτή την περίπτωση τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά για αποκατάστασης της in vivo απάντησης στην ιντερφερόνη-β 160. Ο Cohen και οι συνεργάτες του αξιολόγησαν την ασφάλεια, την ανοχή και την αποτελεσματικότητα της IFN-β-1a im σε συνδυασμό με χαμηλής δόσης μεθοτρεξάτη από το στόμα, ΕΦΜΠ κάθε δεύτερο μήνα, ή και τα δύο, σε ασθενείς με ενεργή RRMS 201. Η μελέτη απέτυχε να αποδείξει ευεργετική επίδραση της συνδυαστικής θεραπείας στην αντιμετώπιση της ενεργούς RRMS. Επιπρόσθετα, 5.1% των ασθενών είχαν θετικό τίτλο Nab στην εκκίνηση της μελέτης και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΕΦΜΠ μπορεί να μειώσει τους τίτλους των Nab. Πρόσφατα ο Zakrou και οι συνεργάτες του έκαναν ανασκόπηση, σε τέσσερα άρθρα, με θέμα την εφαρμογή της κορτιζόνης σε ώσεις, είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με άλλη ανοσοκατασταλτική αγωγή 175. Τα συμπεράσματα που διεξήχθησαν ήταν ότι η κορτιζόνη χορηγούμενη σε ώσεις μπορεί να ελαττώσει τον κίνδυνο ανάπτυξης Nabs, αλλά όχι όταν αυτά είναι παρόντα σε υψηλούς τίτλους (με κλινική σημασία), όταν συγχορηγηθεί με πρόσφατα αρχόμενη θεραπεία με IFN-β. 189

190 Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι η θεραπεία με ΕΦΜΠ δεν αποκαθιστά τη βιολογική δράση της IFN-β σε ασθενείς με επανειλημμένως θετικούς τίτλους Nabs Ανοσοκατασταλτικά φάρμακα Έχουν διεξαχθεί μελέτες σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα και δευτεροπαθώς προϊούσα ΣΚΠ προκειμένου να αξιολογηθεί η χρήση της IFN-β σε συνδυασμό με κάποιο ανοσοκατασταλτικό παράγοντα. Δεν διεξήχθησαν ομοιογενή και καταληκτικά αποτελέσματα για το αν η επιπρόσθετη χορήγηση ανοσοκατασταλτικού παράγοντα ελαττώνει τη δημιουργία των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Αλλαγή σε διαφορετικό σκεύασμα IFN-β ή αύξηση της δόσης της IFN-β Η αλλαγή σε διαφορετικό σκεύασμα IFN-β δεν είναι αποδεκτή λύση, λόγω της διασταυρούμενης αντίδρασης που παρατηρείται ανάμεσα στις ιντερφερόνες 131,152. Σε πρόσφατη μελέτη αποδείχτηκε ότι η αλλαγή θεραπείας, από ιντερφερόνη-β υψηλής αντιγονικότητας (IFN-β-1a sc και IFN-β-1b) σε ιντερφερόνη-β χαμηλής αντιγονικότητας (IFN-β-1a im), δεν συνεπάγεται στατιστικά σημαντική μείωση του τίτλου των εξουδετερωτικών αντισωμάτων 166. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν ενδείξεις που να υποστηρίζουν ότι η αύξηση της δόσης της IFN-β ωφελεί τους ασθενείς με θετικό τίτλο εξουδετερωτικών αντισωμάτων Πλασμαφαίρεση και ενδοφλέβια έγχυση ανοσοσφαιρινών Η πλασμαφαίρεση και η ενδοφλέβια έγχυση ανοσοσφαιρινών θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην ελάττωση της δημιουργίας των εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Αυτές οι μέθοδοι δεν επηρεάζουν τα πλασματοκύτταρα μνήμης. Επομένως, η χορήγηση ανοσοσφαιρινών ή η πλασμαφαίρεση μπορεί να μειώσουν τα κυκλοφορόντα αντισώματα, αλλά δεν είναι δύνανται να αναστείλουν την παραγωγή των Nabs όταν έχει ήδη πυροδοτηθεί η δημιουργία τους. 190

191 Απευαισθητοποίηση Η απευαισθητοποίηση αναπτύχθηκε ως μέθοδος μείωσης της αντιγονικότητας των θεραπειών που χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα. Εάν η μέθοδος αυτή μπορεί να εφαρμοστεί και στην IFN-β δεν είναι ακόμα γνωστό. Μέχρι τώρα, δεν έχει καταστεί δυνατό να προβλεφθεί ποιοι ασθενείς θα αναπτύξουν εξουδετερωτικά αντισώματα, σε ποιο βαθμό και για ποιο χρονικό διάστημα θα αποδυναμώνουν το θεραπευτικό αποτέλεσμα της ιντερφερόνης 135,

192 192

193 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 193

194 194

195 4. Μέθοδοι και υλικά 4.1. Ασθενείς και θεραπεία Σχεδιασμός μελέτης και ασθενείς Σκοπός της μελέτης ήταν η καταγραφή της επίδρασης της ενδοφλέβιας χορήγησης μεθύλ-πρεδνιζολόνης στην κινητική των αντισωμάτων έναντι της IFN-β, σε ασθενείς με ΥΔΣΚΠ κατά τη διάρκεια της υποτροπής της νόσου. Για λόγους που αφορούν στην αξιοπιστία των μεθόδων εντοπισμού των αντισωμάτων που εφαρμόστηκαν στο εργαστήριο της Β νευρολογικής κλινικής, μελετήθηκε αρχικά η συχνότητα εμφάνισης των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε ασθενείς με ανεπαρκή ανταπόκριση στη θεραπεία με IFN-β. Εξαιτίας των παρατηρήσεων που προέκυψαν κατά τη διάρκεια της μελέτης κρίθηκε απαραίτητη η συγκριτική μελέτη των καθιερωμένων, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, μεθόδων ανίχνευσης των αντισωμάτων. Η μελέτη ακολούθησε μια συγκεκριμένη διαδικασία. Εξετάστηκαν 434 δείγματα ασθενών με ΥΔΣΚΠ υπό θεραπεία με IFN-β, που παρουσίασαν ενδιάμεσης δραστηριότητας νόσο ή πτωχή ανταπόκριση στη θεραπεία τους. Χωρίστηκαν σε 2 ομάδες, την υποομάδα Α1, η οποία συμπεριέλαβε 162 δείγματα ασθενών που παρουσίαζαν υποτροπή τη χρονική στιγμή της αιμοληψίας και την υποομάδα Β, η οποία συμπεριέλαβε 272 δείγματα ασθενών με σταθερή νευρολογική κατάσταση τη χρονική στιγμή της αιμοληψίας. Στη συνέχεια, από τους 162 ασθενείς σε υποτροπή, 60 συγκατένευσαν να συμμετάσχουν στο πρωτόκολλο παρακολούθησης της κινητικής των αντισωμάτων έναντι της IFN-β, (υποομάδα Α2). Οι ασθενείς της υποομάδας Α2 νοσηλεύτηκαν στη Β Νευρολογική Κλινική, Γ.Π.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ, Α.Π.Θ. (Σχήμα 8, Α και Β) Οι ασθενείς λάμβαναν οποιαδήποτε από τα τρία σκευάσματα ιντερφερόνης-β (Avonex, Rebif, Betaferon) για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 1 έτους. Ασθενείς υπό υποδόρια IFN-β-1b (Extavia) δεν συμπεριλήφθησαν στην παρούσα μελέτη επειδή δεν ήταν ακόμη εμπορικά διαθέσιμη. 195

196 Η διάγνωση της ΣΚΠ τέθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια McDonald ή τα αναθεωρημένα κριτήρια McDonald 24,199 ανάλογα με τη χρονική στιγμή που έγινε η διάγνωση. Έτσι, η ενδιάμεσης δραστηριότητας νόσος ορίστηκε ως μία υποτροπή κατά τη διάρκεια της θεραπείας, με καθόλου ή περιορισμένη δραστηριότητα στη μαγνητική τομογραφία (εστίες που προσλαμβάνουν γαδολίνιο και/ή νέες Τ2 εστίες), ενώ ως πτωχή απάντηση ορίστηκαν πολλαπλές υποτροπές ή μία υποτροπή και εκτεταμένη δραστηριότητα στη μαγνητική τομογραφία (πολλαπλές εστίες που προσλαμβάνουν γαδολίνιο και νέες Τ2 εστίες) 184. Η ανεπαρκής ανταπόκριση στην IFN-β ορίστηκε στο παρελθόν ως η εμφάνιση 2 υποτροπών σε χρονικό διάστημα 18 μηνών από την έναρξη της θεραπείας 21. Ως υποτροπή ορίστηκε η εμφάνιση νέων συμπτωμάτων ή η επανεμφάνιση ή η επιδείνωση παλαιών που αντικατοπτρίζουν νευρολογική δυσλειτουργία και χαρακτηρίστηκε από υποξεία έναρξη μέσα σε ημέρες ή εβδομάδες και διάρκεια άνω των 48 ωρών. Η κλινική επιδείνωση επιβεβαιώθηκε με τη διενέργεια νευρολογικής εξέτασης και την αντικειμενική αύξηση της EDSS κατά 0.5 ή την αύξηση κατά 1 βαθμό σε δύο λειτουργικά συστήματα, ή κατά 2 βαθμούς σε ένα λειτουργικό σύστημα. Διαχωρισμός έγινε μεταξύ υποτροπής και συμπτωμάτων που οφείλονταν σε κόπωση, λοίμωξη και πυρετό. Τα συμπτώματα που εμφανίστηκαν σε χρονικό διάστημα ενός μηνός θεωρήθηκαν μέρος του ίδιου επεισοδίου. Ειδικά για την υποομάδα Α2, την 1 η ημέρα χορήγησης της ΕΦΜΠ διενεργήθηκε νευρολογική εξέταση, αιμοληψία για την ανίχνευση Babs και Nabs και εργαστηριακός έλεγχος. Την 5 η ημέρα, τον 1 ο και 6 ο μήνα επανελέγχου διενεργήθηκε νευρολογική εξέταση και αιμοληψία για την ανίχνευση Babs και Nabs. (Σχήμα 8, Γ) Η επεξεργασία όλων των δειγμάτων για την ανίχνευση των Babs έγινε με την εφαρμογή της μεθόδου της έμμεσης ELISA και για τον εντοπισμό των Nabs με τη χρήση της μεθόδου του κυτταροπαθολογικού φαινομένου. Στην πορεία της εξαγωγής των αποτελεσμάτων αντιμετωπίσαμε το παράδοξο της παρουσίας εξουδετερωτικής δραστηριότητας απουσία συνδετικών αντισωμάτων, όπως προέκυψε από την εφαρμογή της μεθόδου έμμεσης ELISA, σε ένα μέρος των δειγμάτων. Αυτό αποτέλεσε το κίνητρο για να επανεξετάσουμε τα 64 δείγματα με 196

197 αυτή την εικόνα, με τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος κατά Western, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η αρνητικότητα των Babs και να επαληθεύσουμε την ευαισθησία των καθιερωμένων μεθόδων εντοπισμού τους. Για τον ίδιο σκοπό, επανεξετάστηκαν 30 ασθενείς με θετικό τίτλο Babs όπως πρόεκυψε με τη μέθοδο της έμμεσης ELISA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του ανοσοστυπώματος κατά Western. Η προσπάθεια ολοκληρώθηκε με τον έλεγχο της θετικότητας των Nabs. Για αυτό το σκοπό, αναλύθηκαν 15 δείγματα με θετικό τίτλο και 15 δείγματα με αρνητικό τίτλο εξουδετερωτικών αντισωμάτων, όπως προέκυψε από την εφαρμογή της μεθόδου του κυτταροπαθολογικού φαινομένου, με τη χρήση της μεθόδου ποσοτικής Real time-pcr για τον προσδιορισμό της έκφρασης του γονιδίου Mx1. Α 197

198 Β Γ Σχήμα 8: Σχηματική απεικόνιση του σχεδιασμού της μελέτης. (Α) Σκοπός της μελέτης. (Β) Υποομάδες ασθενών υπό διερεύνηση. (Γ) Κλινική και εργαστηριακή διερεύνηση των ασθενών της υποομάδας Α θεραπευτικό σχήμα Το θεραπευτικό σχήμα που εφαρμόστηκε στην ομάδα Α ήταν ενδοφλέβια χορήγηση μεθύλ-πρεδνιζολόνης, 1 γραμμάριου ανά ημέρα, για πέντε συνεχόμενες ημέρες. 198

199 Νευρολογική εκτίμηση Τυποποιημένη Νευρολογική Εξέταση Λειτουργικών Συστημάτων Kurtzke και Διευρυμένη Κλίμακα Κατάστασης Αναπηρίας (EXPANDED DISABILITY STATUS SCALE - EDSS) Γενικές οδηγίες Για να διασφαλιστεί μια αμερόληπτη αξιολόγηση σε ελεγχόμενες κλινικές μελέτες, ο αξιολογητής EDSS δεν πρέπει να ρωτά για την κατάσταση των ασθενών, εκτός εάν αυτό είναι απαραίτητο για τη διεξαγωγή της αξιολόγησης EDSS. Οι ασθενείς θα πρέπει να παρατηρούνται όταν βαδίζουν την απαιτούμενη απόσταση. Νευρολογική κατάσταση Στη νευρολογική κατάσταση σημειώνεται «μόνο ενδείξεις», όταν η εξέταση αποκαλύπτει σημεία για τα οποία δεν έχει επίγνωση ο ασθενής. Λειτουργικά συστήματα Βαθμολογία 1 σε ένα λειτουργικό σύστημα υποδεικνύει ότι ο ασθενής δεν έχει επίγνωση της δυσλειτουργίας και ότι η δυσλειτουργία ή το σημείο δεν επηρεάζει τις συνήθεις καθημερινές δραστηριότητες. Ωστόσο ο γενικός αυτός κανόνας δεν ισχύει για το οπτικό λειτουργικό σύστημα, για το λειτουργικό σύστημα του εντέρου/της ουροδόχου κύστης και για το παρεγκεφαλιδικό λειτουργικό σύστημα. Διευρυμένη κλίμακα κατάστασης αναπηρίας (EDSS) Το στάδιο EDSS δεν πρέπει να είναι χαμηλότερο από τη βαθμολογία κάθε μεμονωμένου λειτουργικού συστήματος, με εξαίρεση το οπτικό λειτουργικό σύστημα και το λειτουργικό σύστημα του εντέρου/της ουροδόχου κύστης. Σημεία ή συμπτώματα που δεν οφείλονται στη σκλήρυνση κατά πλάκας δεν θα λαμβάνονται υπόψη για τις αξιολογήσεις, ωστόσο πρέπει να σημειώνονται. 199

200 ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ορισμοί Οπτική οξύτητα Η βαθμολόγηση της οπτικής οξύτητας βασίζεται στη γραμμή στο διάγραμμα Snellen σε 20 πόδια (5 μέτρα) για την οποία ο ασθενής κάνει μόνο ένα σφάλμα (χρήση της βέλτιστης διαθέσιμης διόρθωσης). Εναλλακτικά, μπορεί να εκτιμηθεί η βέλτιστα διορθωμένη εγγύς όραση, αλλά αυτό πρέπει να σημειώνεται και να εκτελείται σε σταθερή βάση σε κάθε εξέταση παρακολούθησης. Δ.Ο. = Δεξιός οφθαλμός, Α.Ο. = Αριστερός οφθαλμός Οπτικά πεδία 0 = φυσιολογικά 1 = μόνο ενδείξεις: δυσλειτουργία παρούσα μόνο κατά τη διάρκεια επίσημης εξέτασης (αμφισβητήσιμη) 2 = μέτρια δυσλειτουργία: ο ασθενής έχει επίγνωση της δυσλειτουργίας αλλά μη πλήρη ημιανοψία κατά την εξέταση 3 = σοβαρή δυσλειτουργία, πλήρης ομώνυμη ημιανοψία ή ισοδύναμο Σκότωμα 0 = κανένα 1 = μικρό: ανιχνεύσιμο μόνο τη διάρκεια επίσημης εξέτασης (αμφισβητήσιμο) 2 = μεγάλο: αναφέρεται αυθόρμητα από τον ασθενή Ωχρότητα οπτικής θηλής (ο.θ.) 0 = μη παρούσα 1 = παρούσα ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Δ.Ο. Α.Ο. Οπτική οξύτητα (διορθωμένη) Οπτικά πεδία Σκότωμα Ωχρότητα ο. θ. 200

201 Σημείωση: Κατά τον προσδιορισμό του σταδίου, η βαθμολογία του οπτικού λειτουργικού συστήματος μετατρέπεται σε χαμηλότερη βαθμολογία ως εξής: 6=4, 5=3, 4=3, 3=2, 2=2, 1=1 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = ωχρότητα ο.θ. και/ή ήπιο σκότωμα και/ή οπτική οξύτητα (διορθωμένη) του οφθαλμού στη χειρότερη κατάσταση κάτω από 20/20 (1,0) αλλά καλύτερη από 20/30 (0,67) 2 = οφθαλμός στη χειρότερη κατάσταση με μεγάλο σκότωμα και/ή μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) 20/30 έως 20/59 (0,67-0,34) 3 = οφθαλμός στη χειρότερη κατάσταση με μεγάλο σκότωμα ή μέτρια μείωση στα οπτικά πεδία και/ή μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) 20/60 έως 20/99 (0,33-0,2) 4 = οφθαλμός στη χειρότερη κατάσταση με αισθητή μείωση των οπτικών πεδίων και/ή μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) 20/100 έως 20/200 (0,2-0,1), βαθμός 3 και μέγιστη οπτική οξύτητα του οφθαλμού στην καλύτερη κατάσταση 20/60 (0,3) ή μικρότερη 5 = οφθαλμός στη χειρότερη κατάσταση με μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) κάτω από 20/200 (0,1), βαθμός 4 και μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) του οφθαλμού στην καλύτερη κατάσταση 20/60 (0,3) ή μικρότερη 6 = βαθμός 5 και μέγιστη οπτική οξύτητα (διορθωμένη) του οφθαλμού στην καλύτερη κατάσταση 20/60 (0,3) ή μικρότερη ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ Ορισμοί Αξιολόγηση διαταραχών/αναπηρίας 0 = φυσιολογικό 1 = μόνο ενδείξεις 2 = ήπια : κλινικά ανιχνεύσιμη αιμωδία, πάρεση προσωπικού, δυσαρθρία ή πάρεση κρανιακού νεύρου την οποία ο ασθενής αντιλαμβάνεται 201

202 3 = μέτρια : διπλωπία με πάρεση οφθαλμικών κινήσεων, διαταραγμένη διάκριση ανάμεσα σε αμβλύ οξύ σε 1 ή 2 κλάδους του τρίδυμου νεύρου, νευραλγία τριδύμου (παρούσα ή πυροδοτούμενη κατά την εξέταση), αδυναμία στη σύγκλειση των οφθαλμών, υπακουσία (δεν μπορεί να ακούσει το τρίψιμο των δακτύλων και/ή χάνει αρκετούς ψιθυριστούς αριθμούς), εμφανής δυσαρθρία κατά τη διάρκεια μιας συνηθισμένης συζήτησης η οποία εμποδίζει την κατανόηση 4 = σοβαρή : πλήρης αδυναμία κίνησης του ενός οφθαλμού σε μια κατεύθυνση, διαταραγμένη διάκριση ανάμεσα σε αμβλύ οξύ ή αναισθησία σε όλη την κατανομή του ενός ή και των δύο τρίδυμων νεύρων, μονόπλευρη ή αμφοτερόπλευρη πάρεση του προσωπικού νεύρου, δυσκαταποσία, ακατάληπτη φωνή Νυσταγμός 0 = κανένας 1 = μόνο ενδείξεις 2 = ήπιος, ο ασθενής νιώθει ενόχληση 3 = μέτριος, σταθερός νυσταγμός στις 30 ο στο οριζόντιο ή κάθετο επίπεδο, αλλά όχι στην πρόσθια ατένιση του βλέμματος 4 = σοβαρός, σταθερός νυσταγμός στην πρόσθια ατένιση ή εμμένων νυσταγμός σε όλες τις βλεμματικές θέσεις που επηρεάζει την οπτική οξύτητα, πλήρη διαπυρηνική οφθαλμοπληγία με σταθερό νυσταγμό του οφθαλμού που απάγει, αναπήδηση του ορίζοντα κατά τη βάδιση ΕΞΕΤΑΣΗ ΚΡΑΝΙΑΚΩΝ ΝΕΥΡΩΝ Διαταραχή οφθαλμικών κινήσεων Νυσταγμός Βλάβη του τρίδυμου νεύρου Πάρεση προσωπικού νεύρου Απώλεια ακοής Δυσαρθρία Δυσφαγία Άλλα σημεία του στελέχους 202

203 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = μόνο ενδείξεις 2 α = μέτριος νυσταγμός ή/και 2 β = άλλη ήπια αναπηρία 3 α = σοβαρός νυσταγμός ή/και 3 β = σοβαρή βλάβη της οφθαλμοκίνησης ή/και 3 γ = μέτρια πάρεση άλλων κρανιακών νεύρων 4 α = σοβαρή δυσαρθρία ή/και 4 β = άλλη σοβαρή αναπηρία 5 = ανικανότητα κατάποσης ή ομιλίας ΠΥΡΑΜΙΔΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ορισμοί * = προαιρετικό Τενόντια αντανακλαστικά 0 = απόντα, 1 = νωθρά, 2 = φυσιολογικά, 3 = ζωηρά, 4 = εξαντλούμενος κλόνο, 5 = κλόνος μη εξαντλούμενος (να επισημανθεί η διαφορά δεξιού αριστερού, Δ Α, με τα σύμβολα < ή >) Πελματιαίο αντανακλαστικό 0 = καμπτικό 1 = βουβό 2 = εκτατικό Επιπολής νωτιαία αντανακλαστικά 0 = φυσιολογικά 1 = νωθρά 2 = απόντα 203

204 *Παλαμοπωγωνικό αντανακλαστικό 0 = απόν 1 = παρόν Μυϊκή ισχύς Ο πιο αδύναμος μυς σε κάθε ομάδα καθορίζει τη βαθμολογία για τη συγκεκριμένη ομάδα. Συνιστάται η χρήση λειτουργικών ελέγχων, π.χ. πήδημα στο ένα πόδι και βάδισμα στα δάκτυλα των ποδιών/ φτέρνες, για να εκτιμηθούν οι βαθμοί 3-5 Κλίμακα αξιολόγησης BMRC 0 = δεν εντοπίζεται καμία σύσπαση μυός 1 = ορατή σύσπαση χωρίς ορατή κίνηση της άρθρωσης 2 = ορατές κινήσεις ενάντια στη βαρύτητα μόνο 3 = ενεργή κίνηση ενάντια στη βαρύτητα δυνατή αλλά μειωμένη 4 = ενεργή κίνηση ενάντια σε αντίσταση, δυνατή αλλά μειωμένη 5 = φυσιολογική δύναμη Λειτουργικές δοκιμασίες * Δοκιμασία Barre άνω άκρων Πτώση, 0 = απούσα, 1 = ήπια, 2 = εμφανής * Δοκιμασία Barre κάτω άκρων Πτώση, 0 = απούσα, 1 = ήπια, 2 = εμφανής 1 = δυνατή η ανύψωση μόνο του ενός κ/ά (μοίρες ανύψωσης από το οριζόντιο επίπεδο) 2 = αδύνατη ακόμη και η ανύψωση κάθε άκρου ξεχωριστά *Βάδισμα στα δάκτυλα των ποδιών/φτέρνες 0 = φυσιολογικό, 1 = επιβαρυμένο, 2 = αδύνατο *Πήδημα στο ένα πόδι 0 = φυσιολογικό, 1 = 6-10 φορές, 2 = 1-5 φορές, 3 = αδύνατο 204

205 Σπαστικότητα των άκρων 0 = κατά φύση, 1 = ήπια, ελαφρώς αυξημένος μυϊκός τόνος μετά την ταχεία κάμψη ενός άκρου, 2 = μέτρια, 3 = σοβαρή, μη εξαντλούμενος κλόνος μετά την ταχεία κάμψη ενός άκρου, 4 = σε σύσπαση Σπαστικότητα βάδισης 0 = καμία, 1 = ήπια, 2 = εμφανής, ελάχιστα επηρεάζει τη λειτουργικότητα, 3 = μόνιμη διαταραχή βάδισης λόγω της σπαστικότητας Τ.ΑΝΤΑΝΑΚΛΑΣΕΙΣ Δ > < Α Δικεφάλου Τρικεφάλου Βραχιονοκερκιδικό Επιγονάτιο Αχίλλειο Πελματιαίο Επιπολής νωτιαία αντ. *Παλαμοπωγωνικό ΜΥΙΚΗ ΙΣΧΥΣ Δελτοειδής Καμπτήρες του αντιβραχίου Εκτείνοντες του αντιβραχίου Καμπτήρες καρπού/δακτύλων Εκτείνοντες καρπού/δακτύλων Κάμψη ισχίου Καμπτήρες γαστροκνημίας Εκτείνοντες γαστροκνημίας Καμπτήρες πέλματος/δακτύλων Εκτείνοντες πέλματος/δακτύλων *Δοκ. Barre άνω άκρων, πρηνισμός *Δοκ. Barre άνω άκρων, πτώση 205

206 *Δοκ. Barre κάτω άκρων, πτώση ανύψωση μόνο του ενός κ/ά *Βάδισμα στις φτέρνες *Βάδισμα στα δάκτυλα των ποδιών *Πήδημα στο ένα πόδι ο ο ΣΠΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ Άνω άκρο Κάτω άκρο Βάδιση ΒΑΘΜΟΛΟΓΗΣΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = παθολογικές ενδείξεις χωρίς αναπηρία 2 = ελάχιστη αναπηρία: ασθενής παραπονείται για κόπωση στις κινητικές εργασίες και/ή BMRC βαθμός 4 σε μία ή δύο μυϊκές ομάδες 3 α = ήπια έως μέτρια παραπάρεση ή ημιπάρεση, πλήρης δυνατότητα κίνησης ενάντια στη βαρύτητα 3 β = σοβαρή μονοπάρεση, BMRC βαθμός 2 ή λιγότερο σε μία μυϊκή ομάδα 4 α = σοβαρή παραπάρεση ή ημιπάρεση 4 β = μέτρια τετραπάρεση (BMRC βαθμός 3) 4 γ = μονοπληγία 5 α = παραπληγία, βαθμός 0 ή 1 σε όλες τις μυϊκές ομάδες των κάτω άκρων 5 β = ημιπληγία 5 γ = σοβαρή τετραπάρεση (BMRC βαθμός 2 ή λιγότερο) 6 = τετραπληγία (BMRC βαθμός 0 ή 1 σε όλες τις μυϊκές ομάδες των άνω και κάτω άκρων) 206

207 ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ορισμοί ΑΑ = άνω άκρα ΚΑ = κάτω άκρα ΜΑ = μάτια ανοικτά ΜΚ = μάτια κλειστά Τρόμος κεφαλής 0 = απών 1 = ήπιος 2 = μέτριος 3 = σοβαρός Κορμική αταξία 0 = απούσα 1 = μόνο ενδείξεις 2 = ήπια: ταλάντευση με μάτια κλειστά (ΜΚ) 3 = μέτρια: ταλάντευση με μάτια ανοικτά (ΜΑ) 4 = σoβαρή: αδυνατεί να καθίσει χωρίς βοήθεια Αταξία των άκρων 0 = απούσα 1 = μόνο ενδείξεις 2 = ήπια: τρόμος ή αδέξιες κινήσεις εύκολα ορατές, επηρεάζουν ελάχιστα τη λειτουργικότητα 3 = μέτρια: τρόμος ή αδέξιες κινήσεις που επηρεάζουν τη λειτουργικότητα σε όλες τις σφαίρες 4 = σοβαρή: οι περισσότερες λειτουργίες είναι πολύ δύσκολες 207

208 Αταξία βάδισης 0 = απούσα 1 = μόνο ενδείξεις 2 = μέτρια: διαταραχή της ισορροπίας μόνο στη βάδιση στις φτέρνες ή τα δάκτυλα των ποδιών ή την επιτηδευμένη βάδιση 3 = μέτρια: διαταραχή της ισορροπίας στη βάδιση ή στην καθιστή θέση 4 = σοβαρή: αδυναμία βάδισης περισσότερο από μερικά βήματα ή χρήζει στήριξης από άλλο άτομο ή βοηθητικό μέσο λόγω της αταξίας Δοκιμασία Romberg 0 = φυσιολογική 1 = ήπια: ήπια ανασφάλεια με ΜΚ 2 = μέτρια: αστάθεια με ΜΚ 3 = σοβαρή, αστάθεια με ΜΑ Επιτηδευμένη βάδιση 0 = φυσιολογική 1 = επιβαρυμένη 2 = αδύνατη Σημείωση Η παρουσία σοβαρής αταξίας κατά τη βάδιση συνεπάγεται βαθμολογία παρεγκεφαλιδικού λειτουργικού συστήματος 3. Εάν η έκπτωση της μυϊκής ισχύος επηρεάζει την εξέταση της αταξίας, η βαθμολογία του ασθενούς καθορίζεται από την απόδοση του ασθενούς σημειώνοντας Χ μετά τη βαθμολογία του παρεγκεφαλιδικού λειτουργικού συστήματος. ΕΞΕΤΑΣΗ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑΣ Τρόμος κεφαλής Κορμική αταξία, ΜΑ Κορμική αταξία, ΜΚ 208

209 Δ Α Τρόμος/δυσμετρία ΑΑ Τρόμος/δυσμετρία ΚΑ Διαδοχοκινησία ΑΑ Διαδοχοκινησία ΚΑ Αταξία βάδισης, ΜΑ Επιτηδευμένη βάδιση, ΜΑ Άλλα, π.χ. δοκ. ανάπλασης Δοκιμασία Romberg ΣΚΟΡ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = παθολογικά σημεία χωρίς αναπηρία 2 = ήπια αταξία 3 α = μέτρια κορμική αταξία 3 β = μέτρια αταξία των άκρων 4 = σοβαρή αταξία σε όλα τα άκρα ή τον κορμό 5 = αδυναμία εκτέλεσης συντονισμένων κινήσεων λόγω της αταξίας Χ = μυϊκή αδυναμία (βαθμός 3 ή περισσότερο στην πυραμιδική οδό) η οποία επηρεάζει την εξέταση ΑΙΣΘΗΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ορισμοί ΑΑ = άνω άκρα ΚΑ = κάτω άκρα * = προαιρετικό Επιπολής αισθητικότητα αφή/άλγος 0 = φυσιολογική 1 = ήπια, ο ασθενής έχει έκπτωση στην αφή ή το άλγος αλλά αντιλαμβάνεται τη διαφορά αμβλύ - οξύ 2 = μέτρια, διαταραγμένη αντίληψη ανάμεσα σε αμβλύ οξύ 209

210 3 = σοβαρή, αδυναμία διαχωρισμού ανάμεσα σε αμβλύ οξύ και/ή αναισθησία στην αφή 4 = αναισθησία Παλλαισθησία 0 = φυσιολογική 1 = ήπια, διαπασών 5-7 από 8, εναλλακτικά αισθάνεται περισσότερο από 10 δευτερόλεπτα αλλά λιγότερο από τον εξεταστή 2 = μέτρια, διαπασών 1-4 από 8, εναλλακτικά αισθάνεται περισσότερο από 2 δευτερόλεπτα αλλά λιγότερο από 11 3 = σοβαρή, πλήρης απώλεια παλλαισθησίας Κιναισθησία / Δοκιμασία Romberg 0 = φυσιολογική 1 = ήπια, 1-2 λάθος απαντήσεις, μόνο οι περιφερικές αρθρώσεις επηρεασμένες/ήπια αστάθεια-ταλάντωση στη δοκιμασία Romberg 2 = μέτρια, χάνει πολλές κινήσεις στα δάχτυλα των άκρων, οι κεντρικές αρθρώσεις επηρεασμένες/ αδυναμία ορθοστάτισης στη δοκιμασία Romberg χωρίς βοήθεια 3 = σοβαρή, καμία αντίληψη κίνησης / αστασία *Σημείο Lhermitte 0 = αρνητικό 1 = θετικό *Παραισθησία (αιμωδία) (δεν επηρεάζει το σκορ του λειτουργικού συστήματος) 0 = απούσα 1 = παρούσα 210

211 ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΙΣΘΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Δ Α Επιπολής αισθητικότητα ΑΑ Επιπολής αισθητικότητα κορμού Επιπολής αισθητικότητα ΚΑ Παλλαισθησία ΑΑ Παλλαισθησία ΚΑ Κιναισθησία ΑΑ Κιναισθησία ΚΑ * Σημείο Lhermitte * Παραισθησίες ΑΑ * Παραισθησίες κορμού * Παραισθησίες ΚΑ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = ήπια έκπτωση παλλαισθησίας ή γραφαισθησίας σε 1 ή 2 άκρα 2 α = ήπια έκπτωση στην αφή ή τον πόνο ή την κιναισθησία και/ή μέτρια έκπτωση παλλαισθησίας σε 1 ή 2 άκρα 2 β = ήπια έκπτωση παλλαισθησίας ή γραφαισθησίας μόνο σε 3 ή 4 άκρα 3 α = μέτρια έκπτωση της αφής ή του πόνου ή της κιναισθησίας και/ή πρακτικά απώλεια παλλαισθησίας σε 1 ή 2 άκρα 3 β = μέτρια έκπτωση της αφής ή τον πόνο και/ή μέτρια έκπτωση όλων των δοκιμασιών εν τω βάθει αισθητικότητας σε 3 ή 4 άκρα 4 α = σοβαρή έκπτωση της αφής ή του πόνου ή απώλεια εν τω βάθει αισθητικότητας, ξεχωριστά ή σε συνδυασμό σε 1 ή 2 άκρα 4 β = μέτρια έκπτωση της αφής ή του άλγους και/ή σημαντική έκπτωση της εν τω βάθει αισθητικότητας σε περισσότερα από 2 άκρα 5 α = απώλεια (πρακτικά) αισθητικότητας σε 1 ή 2 άκρα 5 β = μέτρια έκπτωση της αφής ή του πόνου και/ή απώλεια της εν τω βάθει αισθητικότητας για το μεγαλύτερο μέρος του σώματος από την κεφαλή και κάτω 6 = πρακτικά απώλεια της αισθητικότητας από την κεφαλή και κάτω 211

212 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΕΝΤΕΡΟΥ/ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΕΩΣ Ορισμοί * = προαιρετικό Ουροδόχος κύστη Επίσχεση ούρων και κατακράτηση 0 = απούσα 1 = ήπια, δεν επηρεάζει σημαντικά την τρόπο ζωής 2 = μέτρια, επίσχεση ούρων-συχνές λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος 3 = σοβαρή, χρήζει καθετηριασμών 4 = απώλεια της λειτουργίας, ακράτεια από υπερπλήρωση Έπειξη προς ούρηση/ακράτεια 0 = απούσα 1 = ήπια, δεν επηρεάζει σημαντικά την τρόπο ζωής 2 = μέτρια, σπάνια ακράτεια, όχι περισσότερο από μία φορά την εβδομάδα, απαραίτητη χρήση πάνας ενηλίκων 3 = σοβαρή, συχνά επεισόδια ακράτειας, αρκετές φορές την εβδομάδα έως μία φορά την ημέρα, απαραίτητη χρήση πάνας ενηλίκων 4 = απώλεια της λειτουργίας, απώλεια ελέγχου της κύστεως Καθετηριασμός 0 = απών 1 = διαλείποντες, έως δύο την ημέρα 2 = διαλείποντες, περισσότεροι από δύο την ημέρα 3 = συνεχείς Δυσλειτουργία εντέρου 0 = απούσα 1 = ήπια, απουσία ακράτειας, δεν επηρεάζει σημαντικά την τρόπο ζωής, δυσκοιλιότητα 2 = μέτρια, απαραίτητη χρήση πάνας ενηλίκων ή να αλλάξει τον τρόπο ζωής για να βρίσκεται κοντά σε αποχωρητήρια 3 = σοβαρή, χρήζει διαλειπόντων ενεμάτων 212

213 4 = πλήρης απώλεια της λειτουργίας * Σεξουαλική δυσλειτουργία 0 = απούσα 1 = ήπια 2 = μέτρια 3 = σοβαρή 4 = απώλεια Σημείωση: Κατά τον προσδιορισμό του σταδίου, η βαθμολογία του λειτουργικού συστήματος εντέρου/κύστεως μετατρέπεται σε χαμηλότερη βαθμολογία ως εξής: 6=5, 5=4, 4=3, 3=3, 2=2, 1=1 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΚΑΙ ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΕΩΣ Επίσχεση ούρων και κατακράτηση Έπειξη προς ούρηση και ακράτεια Καθετηριασμός κύστης Δυσλειτουργία εντέρου * Σεξουαλική δυσλειτουργία ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = ήπια επίσχεση ούρων, έπειξη προς ούρηση και/ή δυσκοιλιότητα 2 = μέτρια επίσχεση ούρων και/ή έπειξη και/ή σπάνια ακράτεια και/ή σοβαρή δυσκοιλιότητα 3 = συχνά επεισόδια ακράτειας ούρων ή διαλείποντες αυτοκαθετηριασμοί μία ή δύο φορές ημερησίως, ο ασθενής χρειάζεται μονίμως κλύσματα ή χειρισμούς για την κένωση του εντέρου 4 = χρήζει συνεχών καθετηριασμών, διαλείποντες αυτοκαθετηριασμοί περισσότερο από δύο φορές ημερησίως 213

214 5 = απώλεια κυστικής λειτουργίας, εξωτερικός ή μόνιμος καθετήρα 6 = απώλεια ορθοκυστικής λειτουργίας ΑΝΩΤΕΡΕΣ ΦΛΟΙΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ Ορισμοί Η παρουσία κατάθλιψης και/ή ευφορίας μόνο συνεπάγεται σκορ 1 στο λειτουργικό σύστημα των εγκεφαλικών λειτουργιών, αλλά δεν επηρεάζει το σκορ της EDSS. Κατάθλιψη/ευφορία 0 = απούσα 1 = παρούσα Ο ασθενής παραπονιέται για κατάθλιψη ή κρίνεται καταθλιπτικός ή ευφορικός από τον εξεταστή ή από άλλο άτομο. Έκπτωση των ανώτερων φλοιϊκών λειτουργιών 0 = απούσα 1 = σημεία μόνο, δεν είναι εμφανή στον ασθενή ή σε τρίτο άτομο 2 = ήπια, δυσκολίες εμφανείς στον ασθενή και/ή σε τρίτο άτομο, όπως μειωμένη ικανότητα να παρακολουθήσει μία γρήγορη συζήτηση και την ανάλυση πολύπλοκων θεμάτων, μειωμένη κριτική ικανότητα σε ορισμένες απαιτητικές καταστάσεις, ικανός να χειριστεί τις απαιτήσεις της καθημερινότητας αλλά δεν ανταπεξέρχεται σε επιπρόσθετες στρεσσογόνες καταστάσεις, ενίοτε συμπτωματικός ακόμα και στις συνήθεις δραστηριότητες, μειωμένη αποδοτικότητα, τάση αδιαφορίας λόγω άγνοιας ή κόπωσης. Παρ όλα αυτά, δεν είναι εμφανές κατά τη λήψη του ιστορικού ή την κλινική εξέταση. 3 = μέτρια, σαφής διαταραχή στην εξέταση των ανώτερων φλοιϊκών λειτουργιών, αλλά προσανατολισμένος στον χώρο, τον χρόνο και τα πρόσωπα 4 = σημαντική, αποπροσανατολισμένος σε 1 ή 2 σφαίρες χρόνο, χώρο ή πρόσωπα, σημαντικός αντίκτυπος στον τρόπο ζωής 5 = άνοια, σύγχυση και/ή πλήρης αποπροσανατολισμός 214

215 Κόπωση 0 = απούσα 1 = παρούσα, αλλά δεν ελαττώνει άνω του 50% των καθημερινών δραστηριοτήτων του 2 = μειώνει πάνω από 50% τις καθημερινές δραστηριότητες Η παρουσία της κόπωσης σημειώνεται αλλά δεν επηρεάζει το σκορ του λειτουργικού συστήματος των εγκεφαλικών λειτουργιών. ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΟΗΤΙΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ Κατάθλιψη Ευφορία Έκπτωση γνωστικών λειτουργιών Κόπωση ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤHΜΑΤΟΣ 0 = φυσιολογικό 1 = διαταραχή του συναισθήματος μόνο (δεν επηρεάζει το στάδιο EDSS) 2 = ήπια έκπτωση νοητικών λειτουργιών 3 = μέτρια έκπτωση νοητικών λειτουργιών 4 = σοβαρή έκπτωση νοητικών λειτουργιών 5 = άνοια 215

216 ΒΑΔΙΣΗ Ορισμοί Η πραγματική απόσταση βάδισης χωρίς υποστήριξη είναι υποχρεωτικά 500 μέτρα (εάν είναι δυνατόν). Η πραγματική απόσταση με βοηθητικό μέσο είναι υποχρεωτικά 150 μέτρα (εάν είναι δυνατόν). Στον ορισμό των σκορ της EDSS οι βαθμοί 6.0 και 6.5 απαιτούν και την περιγραφή του βοηθητικού μέσου που χρησιμοποιεί ο ασθενής, αλλά και την απόσταση που διανύει. Γενικά, η διάκριση ανάμεσα στη χρήση μονόπλευρης ή αμφοτερόπλευρης υποστήριξης υπερέχει της απόστασης. Παρ όλα αυτά, προτείνονται οι εξής εξαιρέσεις, εάν ο ασθενής δύναται να περπατήσει αρκετά μεγαλύτερη απόσταση από 100 μέτρα (>120μ) με δύο βακτηρίες, αγκώνα ή μασχάλης, λαμβάνει 6.0. Εάν μπορεί να περπατήσει περισσότερο από 10μ αλλά λιγότερο από 100μ με δύο βακτηρίες, αγκώνα ή μασχάλης, παίρνει βαθμό 6.5 στην κλίμακα EDSS. Εάν ο ασθενής χρειάζεται υποστήριξη από δεύτερο άτομο (ενώ χρησιμοποιεί βακτηρία αγκώνα ή μασχάλης) και/ή δεν δύναται να περπατήσει περισσότερο από 50μ με τη βοήθεια μίας βακτηρίας, αγκώνα ή μασχάλης, λαμβάνει βαθμό 6.5 στην κλίμακα EDSS. 216

217 ΒΑΔΙΣΗ Απόσταση βάδισης όπως αναφέρεται (χωρίς βοήθεια ή βακτηρία) μέτρα σε λεπτά της ώρας Δύναται να βαδίσει χωρίς παύση ή βοήθεια 100μ, αλλά < 200μ 200μ, αλλά < 300μ 300μ, αλλά < 500μ 500μ, αλλά όχι απεριόριστα απεριόριστα Πραγματική απόσταση (υποχρεωτικά έως 500μ εάν είναι δυνατόν) μέτρα Ανίκανος να βαδίσει 100μ χωρίς συνεχή υποστήριξη Μονόπλευρη υποστήριξη βακτηρία αγκώνα ή μασχάλης άλλο Αμφοτερόπλευρη υποστήριξη βακτηρία αγκώνα ή μασχάλης άλλο Άλλο άτομο μέτρα μέτρα ΣΥΝΟΨΗ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ Οπτικό 1,3 Εγκεφαλικό στέλεχος Πυραμιδικό Παρεγκεφαλιδικό Αισθητικό Έντερο και ουροδόχος κύστη 2,3 Ανώτερες φλοιικές λειτουργίες 217

218 Σημείωση 1: για τον υπολογισμό της EDSS η βαθμολογία του οπτικού λειτουργικού συστήματος γίνονται οι εξής μετατροπές, 6 = 4, 5 = 3, 3 = 2, 2 = 2, 1 = 1 2: ο βαθμός 5 και 6 στο λειτουργικό σύστημα εντέρου και ουροδόχου κύστης μετατρέπεται σε 4 και 5 αντίστοιχα 3: σημειώνεται και ο αρχικός αλλά και ο βαθμός μετά τη μετατροπή Kurtzke Expanded Disability Scale ( EDSS) Τα βήματα κάτω από το 4 αναφέρονται σε ασθενείς οι οποίοι είναι πλήρως περιπατητικοί, και ο ακριβής βαθμός καθορίζεται από τα επιμέρους λειτουργικά συστήματα. Τα βήματα 4.0 έως 5.0 καθορίζονται και από τα επιμέρους λειτουργικά συστήματα αλλά και από την απόσταση βάδισης. Γενικά, το χειρότερο από τα δύο πρέπει να προσδιορίζει τον τελικό βαθμό. Τα βήματα 5.5 έως 8 προκύπτουν αποκλειστικά από την ικανότητα να βαδίσει ή τη χρήση αναπηρικής καρέκλας. Η EDSS δεν πρέπει να αλλάζει κατά 1.0 βαθμό εκτός κι αν υπάρχει αλλαγή σε αυτήν την κατεύθυνση σε τουλάχιστον ένα βήμα σε τουλάχιστον ένα λειτουργικό σύστημα. Το στάδιο EDSS δεν πρέπει να είναι χαμηλότερο από τη βαθμολογία κάθε μεμονωμένου λειτουργικού συστήματος (με εξαίρεση το οπτικό λειτουργικό σύστημα και το λειτουργικό σύστημα εντέρου και ουροδόχου κύστης). 0 φυσιολογική νευρολογική εξέταση (όλα τα λειτουργικά συστήματα με βαθμό 0) 1.0 ο ασθενής δεν έχει καμία αναπηρία, ελάχιστες ενδείξεις σε ένα λειτουργικό σύστημα (π.χ. βαθμολογία 1) 1.5 ο ασθενής δεν έχει καμία αναπηρία, ελάχιστες ενδείξεις σε περισσότερα από ένα λειτουργικά συστήματα (περισσότερα από ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 1) 2.0 ο ασθενής έχει ελάχιστη αναπηρία σε ένα λειτουργικό σύστημα (ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 2, τα άλλα 0 ή 1) 2.5 ο ασθενής έχει ελάχιστη αναπηρία σε δύο λειτουργικά συστήματα (δύο λειτουργικά συστήματα με βαθμό 2, τα άλλα 0 ή 1) 218

219 3.0 ο ασθενής έχει μέτρια αναπηρία σε ένα λειτουργικό σύστημα (ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 3, τα άλλα 0 ή 1) ή ήπια αναπηρία σε τρία ή τέσσερα λειτουργικά συστήματα ( τρία/τέσσερα λειτουργικά συστήματα με βαθμό 2, τα άλλα 0 ή 1) ενώ είναι πλήρως περιπατητικός 3.5 ο ασθενής είναι πλήρως περιπατητικός αλλά με μέτρια αναπηρία σε ένα λειτουργικό σύστημα (έναν βαθμό 3) και ένα ή δύο λειτουργικά συστήματα με βαθμό 2, ή δύο λειτουργικά συστήματα με βαθμό 3, ή πέντε λειτουργικά συστήματα με βαθμό 2 (τα άλλα 0 ή 1) 4.0 ο ασθενής είναι περιπατητικός χωρίς υποστήριξη ή παύση για 500μ, βρίσκεται σε δραστηριότητα 12 ώρες περίπου ημερησίως παρά την πρακτικά σοβαρή αναπηρία, δηλαδή ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 4 (τα άλλα 0 ή 1), ή συνδυασμός μικρότερων βαθμών που υπερβαίνει τα όρια των προηγούμενων βημάτων 4.5 ο ασθενής είναι περιπατητικός χωρίς υποστήριξη ή παύση για >300μ, βρίσκεται σε δραστηριότητα τις περισσότερες ώρες της ημέρας, χαρακτηρίζεται από σοβαρή αναπηρία συνήθως αποτελούμενη από ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 4 ή συνδυασμούς μικρότερων βαθμών που υπερβαίνουν τα όρια των προηγούμενων βημάτων 5.0 ο ασθενής είναι περιπατητικός χωρίς υποστήριξη ή παύση για >200μ (αυτό ισοδυναμεί συνήθως με τουλάχιστον ένα λειτουργικό σύστημα με βαθμό 5, τα άλλα 0 ή 1, ή συνδυασμός μικρότερων βαθμών που υπερβαίνουν τα όρια του βήματος 4.5) 5.5 ο ασθενής είναι περιπατητικός χωρίς υποστήριξη ή παύση για >100μ 6.0 ο ασθενής είναι απαιτεί μονόπλευρη στήριξη, βακτηρία αγκώνα ή μασχάλης, η οποία είναι απαραίτητη για να βαδίσει τουλάχιστον 100μ, με ή χωρίς ανάπαυση 6.5 ο ασθενής απαιτεί συνεχή αμφοτερόπλευρη στήριξη βακτηρία αγκώνα ή μασχάλης είναι απαραίτητη για να βαδίσει τουλάχιστον 20μ χωρίς ανάπαυση 7.0 ο ασθενής είναι ανίκανος να βαδίσει 20μ ακόμη και με υποστήριξη, πρακτικά καθηλωμένος σε αναπηρική καρέκλα, την οποία είναι σε θέση να την χειρίζεται και να μεταφέρεται μόνος του και δραστηριοποιείται περίπου 12 ώρες ημερησίως 219

220 7.5 ο ασθενής είναι ανίκανος να κάνει έστω και λίγα βήματα, καθηλωμένος στην αναπηρική καρέκλα, πιθανόν να χρειαστεί βοήθεια για τον χειρισμό της και την μεταφορά του 8.0 ο ασθενής είναι πρακτικά καθηλωμένος στην κλίνη ή την αναπηρική καρέκλα, αλλά βρίσκεται εκτός της κλίνης τις περισσότερες ώρες της ημέρας, αυτοεξυπηρετείται στις περισσότερες λειτουργίες, γενικά διατηρεί τη λειτουργικότητα των άνω άκρων 8.5 ο ασθενής είναι πρακτικά καθηλωμένος στην κλίνη τις περισσότερες ώρες της ημέρας, διατηρεί σχετικά καλή λειτουργικότητα των άνω άκρων, αυτοεξυπηρετείται σε μερικές λειτουργίες 9.0 ο ασθενής είναι ανήμπορος καθηλωμένος στην κλίνη, όμως μπορεί να επικοινωνεί και να τρώει 9.5 ο ασθενής είναι πλήρως ανήμπορος, καθηλωμένος στην κλίνη, δεν δύναται να επικοινωνεί επαρκώς ή να τρώει/καταπίνει 10.0 θάνατος, οφειλόμενος στη ΣΚΠ Φυσιολογική νευρολογική εξέταση Απουσία αναπηρίας Απουσία Ελάχιστη αναπηρία αναπηρία Μέτρια αναπηρία Σχετικά σοβαρή Μέτρια αναπηρία αναπηρία Περιορισμός καθημερινών δραστηριοτήτων Χρήση βοηθήματος στη βάδιση Περιορισμός σε αμαξίδιο Περιορισμός στην κλίνη ή στο αμαξίδιο Περιορισμός στην κλίνη Θάνατος Προσαρμογή από Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology. 1983; 33:

221 4.2. Τεχνικές ανίχνευσης συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β Οι τεχνικές για την ανίχνευση αντισωμάτων με ενδεχόμενη εξουδετερωτική δράση έναντι της IFN-β μπορούν να διαχωριστούν σε δυο κατηγορίες : α) τις τεχνικές σύνδεσης (binding assays), οι οποίες βασίζονται στην ικανότητα των αντισωμάτων του ορού ενός ασθενούς να συνδέουν το μόριο της IFN-β και β) τις τεχνικές εξουδετέρωσης (neutralizing assays), που βασίζονται στην ικανότητα των αντισωμάτων του ορού του ασθενούς να εξουδετερώνουν τη βιολογική δράση της IFN-β. Οι ασθενείς με ΣκΠ που υπόκεινται σε θεραπεία με IFN-β έχουν πιθανότητες να αναπτύξουν συνδετικά αντισώματα για το μόριο της ιντερφερόνης-β. Σε ορισμένους από αυτούς τους ασθενείς, ένα μέρος των συνδετικών τους αντισωμάτων θα μετατραπεί σε εξουδετερωτικά. Πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι οι τεχνικές εντοπισμού των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης-β διενεργήθηκαν στο εργαστήριο πειραματικής νευρολογίας και νευροανοσολογίας της Β Νευρολογικής κλινικής, Γ.Π.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ, Α.Π.Θ., σύμφωνα με τις συστάσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Το εργαστήριο αυτό είναι διαπιστευμένο, ως το μόνο στην Ελλάδα και πέμπτο κατά σειρά στην Ευρώπη, για να διενεργεί αυτές τις εξειδικευμένες εξετάσεις Εντοπισμός των Συνδετικών Αντισωμάτων (ΣΑ) Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές σύνδεσης για τον εντοπισμό συνδετικών αντισωμάτων είναι η ELISA (εξαρτώμενη από ένζυμο ανοσοπροσροφητική εξέταση), η ραδιοανοσοκατακρήμνιση και η χρωματογραφία στήλης. Με τη μέθοδο ELISA εντοπίζονται τα αντισώματα (Ig) του ορού που συνδέονται με την IFN-β. Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο γίνεται αρχικά προσρόφηση των μορίων IFN-β στην επιφάνεια των κελιών μιας μικροπλάκας. Στη συνέχεια προστίθεται ορός του κάθε ασθενούς. Τα στοιχεία του ορού που δεν συνδέονται με το μόριο της IFN-β απομακρύνονται με πλύσεις των πλακών και παραμένουν στη μικροπλάκα μόνο τα 221

222 συνδετικά αντισώματα για την IFN-β. Τέλος, ένα δεύτερο αντίσωμα ειδικό για τα ανθρώπινα συνδετικά αντισώματα έναντι IFN-β προστίθεται στην πλάκα. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με ένζυμο και έτσι με την προσθήκη του κατάλληλου χρωμογόνου υποστρώματος καθίσταται δυνατός ο εντοπισμός του, επομένως και ο εντοπισμός των συνδετικών αντισωμάτων που πιθανώς να υπάρχουν. Συνήθως χρησιμοποιείται η παραλλαγή της μεθόδου (capture ELISA) κατά την οποία το μόριο της IFN-β δεν προσροφάται στην επιφάνεια των κελιών αλλά συγκρατείται από ένα ειδικό για το μόριο αντίσωμα. Η συγκεκριμένη μέθοδος πληροφορεί για την παρουσία συνδετικών αντισωμάτων στον ορό του ασθενή αλλά όχι για την παρουσία εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Παρόλα αυτά εφαρμόζεται για την επιλογή των ορολογικών δειγμάτων στα οποία υπάρχει παρουσία αντισωμάτων, για να γίνουν σε αυτά οι περαιτέρω εξετάσεις εντοπισμού εξουδετερωτικής δράσης. Πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχει ένα ποσοστό ασθενών στους οποίους δεν ανιχνεύονται συνδετικά, ενώ ανευρίσκονται εξουδετερωτικά, αντισώματα. Αυτό εν μέρει οφείλεται στο διαφορετικό επίπεδο ευαισθησίας των μεθόδων εντοπισμού. Αλλιώς, αντικατοπτρίζει την εξουδετερωτική δράση που δεν μεσολαβείται από τα αντισώματα αλλά από τους κυκλοφορόντες διαλυτούς υποδοχείς της ιντερφερόνης. Στην παρούσα μελέτη οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό των συνδετικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β είναι η τροποποιημένη τεχνική ELISA (ανίχνευση ΣΑ) και η μέθοδος ανοσοστυπώματος κατά Western (ανίχνευση ΣΑ) Εντοπισμός Συνδετικών αντισωμάτων με τη μέθοδο ELISA Εισαγωγή Η μέθοδος ELISA αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για τον εντοπισμό ειδικών μορίων με τη βοήθεια αντισωμάτων που προσδένονται ειδικά σε αυτά. Υπάρχουν δυο τύποι της τεχνικής ELISA, η άμεση και η έμμεση. Στην άμεση ELISA τοποθετούνται πρώτα τα μόρια προς ανίχνευση και στη συνέχεια τα αντισώματα που τα αναγνωρίζουν, ενώ στον έμμεσο τύπο πρώτα τοποθετούνται αντισώματα ειδικά για τα μόρια που θα προστεθούν αμέσως μετά και τέλος, δεύτερα 222

223 αντισώματα εντοπίζουν το σύμπλοκο πρώτου αντισώματος-μορίου. Στην παρούσα τεχνική χρησιμοποιείται ο έμμεσος τύπος. Σε κελιά ειδικών πλακών πρώτα προσροφάται το αντίσωμα έναντι της IFN-β, στη συνέχεια προστίθενται μόρια IFN-β που θα συνδεθούν στα αντισώματα και τέλος τοποθετείται ο ορός του ασθενή προς διερεύνηση, στον οποίο πιθανώς να εμφανίζονται αντισώματα έναντι της IFN-β. Τα αντισώματα, εφόσον υπάρχουν, προσδένουν το δεύτερο αντίσωμα που προστίθεται στη φάση αυτή. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με ένζυμο που, με την προσθήκη του κατάλληλου υποστρώματος, οδηγεί στην παραγωγή έγχρωμου προϊόντος, το οποίο μπορεί να ανιχνευτεί και να ποσοτικοποιηθεί. Πρέπει να αναφερθεί ότι στην τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ο τύπος ιντερφερόνης (Avonex, Betaferon, Rebif) που λαμβάνει ο ασθενής κατά τη θεραπεία του. Για τη βελτιστοποίηση της τεχνικής απαραίτητη είναι η χρήση θετικού μάρτυρα (ασθενής με υψηλό τίτλο αντισωμάτων που έχει πρωτίστως ποσοτικοποιηθεί). Υλικά: 1. NUNC-Immuno-plates Maxisorp (NUNC, F96) 2. Carbonate-Bicarbonate Buffer (0,2M Sodium Carbonate-Bicarbonate Buffer, ph 9.4±0.2) (Pierce, 28382) 3. Γάλα χωρίς λιπαρά σε σκόνη (Nestle) 4. TMB Substrate Peroxidase Solution (Sigma, T8665) 5. Purified Mouse Monoclonal BO2 Coating Antibody (Yamasa Corporation, 7889) 6. Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP (DakoCytomation, P0214) Μέσα και ρυθμιστικά διαλύματα: 1. 10xPBS (1L): 80g NaCl, 2g KCl, 11.5g NaH 2 PO 4, 2g KH 2 PO 4 διαλυμένα σε1l απεσταγμένο νερό. 2. Carbonate Buffer για τη διάλυση του πρώτου αντισώματος- 0.1M Sodium Bicarbonate: 4.2 g Sodium Bicarbonate σε 500ml απεσταγμένο νερό (ph. 9.6) 3. Ρυθμιστικό διάλυμα κορεσμού: 0.25 g γάλα χωρίς λιπαρά σε σκόνη διαλυμένου σε 50ml 1xPBS 4. Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεων- 1xPBS-0.05% Tween (PBS Tween): 200ml 10XPBS, 5ml Tween-20 και απεσταγμένο νερό μέχρι τα 2 L 223

224 5. Ρυθμιστικό διάλυμα αραιώσεων:, 0.5g γάλα χωρίς λιπαρά σε σκόνη διαλυμένου σε 100ml διαλύματος πλύσης 6. Ρυθμιστικό διάλυμα για αναστολής της αντίδρασης : 2N H 2 SO 4 7. Tween 20%: 20ml Tween-20 σε 80ml απεσταγμένο νερό Μέθοδος: Πριν την έναρξη της διαδικασίας απαραίτητος είναι ο σχεδιασμός της πλάκας, για την ομαλότερη εξέλιξη της διαδικασίας και για την εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Απαραίτητο είναι να αναφερθεί ότι όλοι οι οροί προς εξέταση τοποθετούνται σε δύο όμοια κελιά. Ημέρα πρώτη: Προετοιμάζεται το διάλυμα επικάλυψης (BO2 Anti-human IFN-β Antibody + Carbonate Buffer => τελικής συγκέντρωσης 2μg/ml). Από το διάλυμα αυτό τοποθετούνται 50μl σε κάθε κελί της πλάκας 96 κελιών. Η πλάκα καλύπτεται ώστε να αποφευχθεί η εξάτμιση και επωάζεται στους 4 ο C κατά τη διάρκεια μιας νύχτας. Ημέρα δεύτερη: Πριν την έναρξη της διαδικασίας απαραίτητη είναι η προετοιμασία των εξής διαλυμάτων: ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, ρυθμιστικό διάλυμα κορεσμού, ρυθμιστικό διάλυμα για τις αραιώσεις. Το περιεχόμενο των κελιών αφαιρείται και πραγματοποιούνται, με τη χρήση πλυστικής συσκευής (ELISA washer), τρεις πλύσεις. Σε κάθε κελί προστίθενται 200μl διαλύματος κορεσμού και η πλάκα επωάζεται για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της επώασης πραγματοποιούνται οι αραιώσεις της IFNβ που θα χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια. Η συγκέντρωση της IFN-β-1a πρέπει να είναι 150ng/ml ενώ της IFN-β-1b 1.5μg/ml. Το περιεχόμενο των κελιών αφαιρείται με τη βοήθεια κενού και προστίθενται 50μl IFN-β ή ρυθμιστικού διαλύματος των αραιώσεων στα κελιά, βάση του σχεδιαγράμματος της πλάκας (Σχήμα 9). Η πλάκα επωάζεται για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της επώασης προετοιμάζονται οι διαλύσεις του θετικού μάρτυρα, του αρνητικού μάρτυρα καθώς και των δειγμάτων των ασθενών προς διερεύνηση. 224

225 Οι αραιώσεις του θετικού μάρτυρα αντιστοιχούν σε 1:100 (5μl ορού θετικού μάρτυρα + 495μl ρυθμιστικού διαλύματος ), 1:400 (400μl διαλυμένου ορού 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος), 1:800 (500μl από διάλυση 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος), 1:1600 (500μl διάλυσης 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος), 1:3200 (500μl διάλυσης 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος), 1:6400 (500μl από διάλυση 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος), 1:12800 (500μl από διάλυση 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος),1:25600 (500μl διάλυσης 1: μl ρυθμιστικού διαλύματος) Οι αραιώσεις των δειγμάτων προς διερεύνηση είναι 1:100 (5μl ορός ασθενούς μl ρυθμιστικού διαλύματος) Το διάλυμα με το οποίο έγιναν οι διαλύσεις του θετικού μάρτυρα καθώς και των ορών ασθενών προς διερεύνηση χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας. Μετά το πέρας της επώασης, η πλάκα 96 κελιών ξεπλένεται τρεις φορές στη πλυστική συσκευή και σε κάθε κελί προστίθενται 50μl, είτε από τους μάρτυρες είτε από τα δείγματα, σύμφωνα με το σχεδιάγραμμα και η πλάκα επωάζεται για μια επιπλέον ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της επώασης διαλύεται το δεύτερο αντίσωμα (Anti Human IgG, horseradish peroxidase labeled) σε ρυθμιστικό διάλυμα ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 1:8000. Ακολουθούν τρεις πλύσεις στη πλυστική συσκευή, και προστίθενται 200μl διαλύματος σημασμένου αντισώματος σε κάθε κελί. Ακολουθεί επώαση 1.5 ώρας σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του επιπλέον αντισώματος μέσω διαδοχικών πλύσεων. Στο επόμενο στάδιο προστίθεται 100μl υποστρώματος TMB σε κάθε κελί, παρατηρώντας την αλλαγή του χρώματος της αντίδρασης και μετά από λίγα λεπτά η αντίδραση καταστέλλεται με την προσθήκη 100μl 2Ν θειικού οξέος. Τέλος η απορρόφηση της πλάκας υπολογίζεται στα 450nm σε συσκευή ELISA reader. Ανάλυση αποτελεσμάτων: Αρχικά υπολογίζεται ο μέσος όρος των δύο μετρήσεων των όμοιων κελιών. Στη συνέχεια υπολογίζεται η πρότυπη τιμή των δειγμάτων, αφαιρώντας την απορρόφηση του δείγματος χωρίς την προσθήκη IFN-β, από την απορρόφηση του 225

226 ίδιου δείγματος με IFN-β. Επιπλέον, προσδιορίζονται οι μονάδες θετικότητας (Positivity Units) των συνδετικών αντισωμάτων της πρότυπης καμπύλης ως εξής: 100 PU για τη διάλυση 1:400, 50 PU για τη διάλυση 1:800, 25 PU για τη διάλυση 1:1600, 12,5 PU για τη διάλυση 1:3200, 6,125 PU για τη διάλυση 1:6400 και 3,125 PU για τη διάλυση 1: Τέλος, προσδιορίζεται ο τίτλος των συνδετικών αντισωμάτων τοποθετώντας τις τιμές απορρόφησης των δειγμάτων υπό διερεύνηση πάνω στην καμπύλη του θετικού δείγματος αναφοράς. 226

227 A Αρνητικός Αρνητικός Δείγμα 1 Δείγμα 1 Δείγμα 9 Δείγμα 9 μάρτυρας μάρτυρας B 1: :25600 Δείγμα 2 Δείγμα 2 Δείγμα 10 Δείγμα 10 C 1: :12800 Δείγμα 3 Δείγμα 3 Δείγμα 11 Δείγμα 11 D 1:6400 1:6400 Δείγμα 4 Δείγμα 4 Δείγμα 12 Δείγμα 12 E 1:3200 1:3200 Δείγμα 5 Δείγμα 5 Δείγμα 13 Δείγμα 13 F 1:1600 1:1600 Δείγμα 6 Δείγμα 6 Δείγμα 14 Δείγμα 14 G 1:800 1:800 Δείγμα 7 Δείγμα 7 Δείγμα 15 Δείγμα 15 H 1:400 1:400 Δείγμα 8 Δείγμα 8 Δείγμα 16 Δείγμα 16 +IFN-β +IFN-β +IFN-β Σχήμα 9: Απεικονίζει το πρότυπο σχεδιαγράμματος πλάκας 96 θέσεων για τη διερεύνηση των συνδετικών αντισωμάτων έναντι της ιντερφερόνης. 227

228 Εντοπισμός Συνδετικών αντισωμάτων με τη μέθοδο ανοσοστυπώματος κατά Western Η μέθοδος ανοσοστυπώματος κατά Western (Western blot-wb) είναι μια γρήγορη και ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνών. Η αρχή λειτουργίας της εκμεταλλεύεται την ειδικότητα της σχέσης αντιγόνου-αντισώματος. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου βάσει του μοριακού βάρους και μεταφέρονται σε μεμβράνη, συνήθως νιτροκυτταρίνης ή polyvinylidene difluoride-pvdf. Στη συνέχεια, η υπό μελέτη πρωτεΐνη ανιχνεύεται με τη βοήθεια ειδικών αντισωμάτων συζευγμένων με κάποιο ένζυμο το οποίο παράγει χρώμα με την προσθήκη του κατάλληλου χρωμογόνου υποστρώματος. Υλικά: Betaferon 8x10 6 U/ml stock: (1 φυαλίδιο Betaferon 250μg + 1ml NaCl) 4 o C MES-Buffer: Προσθήκη 1900ml dh 2 O NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x, Invitrogen NP0002) 4 o C Blotting Buffer 375ml dh 2 O + 25ml NuPAGE Transfer Buffer (20x, Invitrogen NP0006-1) + 0.5ml Antioxidant NuPAGE (Invitrogen, NP0005) + 100ml Methanol 4 o C PBS-T 0.05% 1L PBS + 500μl Tween-20 (Sigma) RT Διάλυμα blocking 2g Skim milk powder (Merck ) + 100ml PBS-T NuPAGE 10% Bis-Tris Gel 10 mm x 2D well, Invitrogen, NP0306BOX NuPAGE Antioxidant (Invitrogen, NP0005) Anti-β-Interferon Human (rabbit) Calbiochem # Ponceau S solution (Sigma, P-7170) AXELL AP Goat X Mse IgG (H+L), JGM AP conj. AffiniPure Goat-anti-human IgG (H+L) AP Substrate buffer: 100ml Tris-HCl 1M, ph ml MgCl 2 0.5M + 20ml NaCl 2 5M + DW up to 1000ml NBT/BCIP stock solution (ROCHE ) 228

229 Μέθοδος: Ημέρα πρώτη: Γίνεται η προετοιμασία των διαλυμάτων Betaferon, MES-Buffer, διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς-blotting Buffer, PBS-T 0.05%, διάλυμα blocking που θα χρειαστούν. Ηλεκτροφόρηση Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών τοποθετήθηκαν τα NuPAGE 10% Bis-Tris Gel στη συσκευή της ηλεκτροφόρησης την οποία γεμίσαμε με MES-Buffer και προσθέσαμε 500μl NuPAGE Antioxidant. Στο πρώτο κελί της πηκτής τοποθετείται μάρτυρας μοριακού βάρους. Στις υπόλοιπες θέσεις της πηκτής τοποθετούνται τα πρωτεϊνικά μείγματα. Αυτά αποτελούνται από 100μl της ιντερφερόνης υπό διερεύνηση, 40μl διαλύματος μετουσίωσης πρωτεϊνών, 16 μl αναγωγικού παράγοντα και 4μl dh 2 O, αφού βράσουν στους 100 ο C για 5 λεπτά προκειμένου να διασπαστούν οι τριτοταγείς και τεταρτοταγείς δομές των πρωτεϊνών. Στη συσκευή τοποθετούνται τα ηλεκτρόδια και εφαρμόζονται 200Vσταθερά για 45 λεπτά. Ηλεκτρομεταφορά Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης αποκαλύπτεται η πηκτή από το περίβλημά της και γίνονται πλύσεις με διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς. Στη συσκευή της ηλεκτρομεταφοράς τοποθετούνται διαδοχικά τα εξής: ένας σπόγγος, τρία διηθητικά χαρτιά, η πηκτή, μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, τρία διηθητικά χαρτιά και τέλος ένας σπόγγος (μέθοδος sandwich). Στη συνέχεια γεμίζουμε τη συσκευή με διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς. Αφού τοποθετηθούν τα ηλεκτρόδια στη συσκευή ακολουθεί ηλεκτρομεταφορά διάρκειας 85 λεπτών σε σταθερά 30V. 229

230 Προετοιμασία δειγμάτων Σε κάθε δοκιμασία μπορούμε να επεξεργαστούμε μέχρι 25 δείγματα ασθενών, ενώ παράλληλα απαιτούνται ένας θετικός μάρτυρας, ένας αρνητικός μάρτυρας και ένας μάρτυρας κονίκλου. Η διάλυση που χρησιμοποιείται για τους ορούς των ασθενών, του θετικού και του αρνητικού μάρτυρα, είναι 1:1000 σε διάλυμα κορεσμού, ενώ ο μάρτυρας κονίκλου είναι σε διάλυση 1: Ανοσοστύπωμα κατά Western Μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης καλύπτεται από διάλυμα Ponceau S για δύο λεπτά. Στη συνέχεια ξεπλένεται με απεσταγμένο νερό. Σε αυτό το στάδιο οι ζώνες της ιντερφερόνης-β χρωματίζονται με μωβ χρώμα. Το μέγεθος της ζώνης εντοπίζεται σύμφωνα με τον μάρτυρα στα 40KDa. Στη συνέχεια, σχεδιάζεται το περίγραμμα των ζωνών, η μεμβράνη αποχρωματίζεται με τη χρήση 0.2Μ ΝaΟΗ και έχουμε απενεργοποίηση αυτού με απεσταγμένο νερό. Ακολούθως, επωάζεται η μεμβράνη σε διάλυμα κορεσμού για μία ώρα. Στο τέλος της επώασης κόβουμε τη μεμβράνη σε 30 ισομεγέθεις λωρίδες με τη βοήθεια του προσχεδιασμένου περιγράμματος των ζωνών και τοποθετούνται σε ειδικές πλάκες για περαιτέρω επεξεργασία. Στις λωρίδες 2,3 και 4 προστίθεται 1ml διαλύματος θετικού, αρνητικού και μάρτυρα κονίκλου αντίστοιχα, ενώ στις υπόλοιπες λωρίδες βάζουμε διάλυμα ορού των ασθενών υπό διερεύνηση. Ακολουθεί επώαση στους 4 o C κατά τη διάρκεια της νύκτας. Ημέρα δεύτερη: Μετά το πέρας της επώασης η μεμβράνη ξεπλένεται με τη χρήση PBS-T, προστίθεται σε αυτήν 1ml δεύτερου αντισώματος και επωάζεται για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για τους ορούς καθώς και τον θετικό και αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιείται το δεύτερο αντίσωμα anti-human IgG σε διάλυση 1:5000, ενώ για τον μάρτυρα κόνικλο το goat-anti-rabbit IgG σε διάλυση 1:5000. Το αδέσμευτο αντίσωμα ξεπλένεται μέσω πλύσεων με PBS-T. Για την εμφάνιση χρησιμοποιείται 1ml AP Substrate buffer ανά κανάλι και επωάζεται για 10 λεπτά. Στη συνέχεια προστίθεται 1ml διαλύματος NBT/BCIP και 230

231 επωάζεται για 30 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου, μέχρι την αποκάλυψη των ζωνών. Τέλος, η αντίδραση καταστέλλεται με την προσθήκη απεσταγμένου νερού Εντοπισμός των Εξουδετερωτικών Αντισωμάτων (ΕΑ) Εισαγωγή Για την ανίχνευση ΕΑ έναντι του μορίου της IFN-β στον ορό ασθενών με ΣΚΠ έχουν εφαρμοστεί διάφορες μέθοδοι. Όλες βασίζονται στην ιδιότητα των αντισωμάτων να εξουδετερώνουν τη βιολογική δράση της ιντερφερόνης-β in vitro. Η βιοδιαθεσιμότητα της IFN-β υπολογίζεται με μέτρηση της έκφρασης γονιδίων και προϊόντων γονιδίων που επάγονται με τη δράση της IFN-β. Τα γονίδια που επάγονται από την IFN-β είναι οι όλιγο-α-συνθετάσες, η νεοπτερίνη, η 2-μικροσφαιρίνη, η ιντερλευκίνη-10 (IL-10), το διαλυτό μόριο συνάφειας αγγειακών κυττάρων (V-CAM) και το Mx1. Το γονίδιο Mx1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 21q22.3 και ρυθμίζεται αποκλειστικά από την IFN-β. Το προϊόν του γονιδίου ονομάζεται MxA πρωτεΐνη και είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη (75kD) με ενδογενή ενεργότητα GTPάσης, η οποία εμποδίζει την αντιγραφή ιών. Μεταξύ των μεθόδων που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι εκείνη του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (cytopathic effect assay, CPE) και η μέθοδος προσδιορισμού της Myxovirus resistance protein A (MxA πρωτεΐνη). Στην πρώτη μέθοδο εξετάζεται η ικανότητα των αντισωμάτων του ορού ενός δείγματος να παρεμβάλλονται στην ικανότητα σύνδεσης της ιντερφερόνης-β με τον υποδοχέα της. Κατά τη μέθοδο αυτή, κύτταρα (κύτταρα ανθρώπινου μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, κυτταρική σειρά Α549) με παρουσία γνωστής συγκέντρωσης IFN-β και ορού ασθενούς σε διαδοχικές διαλύσεις, τοποθετούνται σε κελιά μιας μικροπλάκας και μολύνονται από έναν ιό (EMC- Encephalomyοcarditis Murine Virus). Η τιτλοποίηση των αντισωμάτων γίνεται με τον τύπο Kawade. Η ποσότητα της IFN-β που χρησιμοποιείται εκφράζεται σε εργαστηριακές μονάδες (Laboratory Units, LU). Η μια εργαστηριακή μονάδα αντιστοιχεί στο 50% του κυτταροπαθολογικού φαινομένου. Με βάση τον τύπο Kawade, ο τίτλος των ΕΑ καθορίζεται από τη διάλυση του ορού στην οποία η 231

232 δραστικότητα των 10 LU/ml IFN-β μειώνεται σε δραστικότητα της τάξης του 1 LU/ml. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μεθόδου αυτής συγκαταλέγονται η ευαισθησία της και το σύνθετο των κυτταρικών ανταποκρίσεων προς την IFN-β που προϋποθέτει. Το τελευταίο θεωρείται ιδιαίτερα σημαντικό καθώς μεταξύ των σύνθετων μηχανισμών κυτταρικής ανταπόκρισης στην IFN-β που αναστέλλονται, μπορεί να περιλαμβάνονται και εκείνοι που υπεισέρχονται στη δράση της IFN-β στη ΣκΠ. Μεταξύ των μειονεκτημάτων της μεθόδου είναι ότι άλλα συστατικά του ορού, όπως η IL-6, η IFN-γ που παρεμβαίνουν ή μιμούνται την αντιιική δράση της IFN-β, μπορούν να επηρεάσουν τα αποτελέσματα της μεθόδου. Η μέθοδος επαγωγής της έκφρασης MxA πρωτεΐνης (MxA protein induction assay, MPA), αναπτύχθηκε για να ξεπεράσει τους περιορισμούς της δοκιμασίας του κυτταροπαθολογικού φαινομένου. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στο ότι οι ιντερφερόνες-β προκαλούν δοσοεξαρτώμενη εκλεκτική έκφραση του γονιδίου της MxA πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινων κυττάρων. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται και σε αυτή τη μέθοδο είναι τα Α549. Επωάζονται σε κελιά μικροπλάκας με σταθερή συγκέντρωση IFN-β (συνήθως 10 LU/ml) και ορού ασθενών. Μετά από ώρες τα κύτταρα λύονται και απελευθερώνεται η MxA πρωτεΐνη, η οποία είναι ενδοκυττάρια. Η συγκέντρωσή της προσδιορίζεται με ELISA μέσω δυο μονοκλωνικών αντισωμάτων για την MxA πρωτεΐνη. Ο τίτλος του ορού που επιφέρει εξουδετερωτική δράση στην IFN-β προσδιορίζεται με βάση μια σταθερά καμπύλη από την ELISA και τη μέθοδο Kawade. Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγεται η ευαισθησία της και η ειδικότητά της. Επίσης δεν προϋποθέτει τη χρήση ιού. Μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι είναι χρονοβόρα διαδικασία 100. Μια τρίτη εναλλακτική μέθοδος προσδιορισμού της παρουσίας των ΕΑ είναι η μέτρηση της έκφρασης γονιδίων που εκφράζονται, in vivo, εξειδικευμένα λόγω της δράσης της IFN-β. Το καταλληλότερο γονίδιο για τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι αυτό της MxA πρωτεΐνης, διότι η έγχυση της IFN-β επάγει ειδικά την υπερέκφρασή του μετά την έγχυση της IFN-β. Ο προσδιορισμός της έκφρασης του γονιδίου γίνεται με την τεχνική της real time PCR. Η μέθοδος αυτή είναι περισσότερο αξιόπιστη και ακριβής σε σχέση με τις προηγούμενες. Στην παρούσα μελέτη, για τον εντοπισμό 232

233 των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στο Εργαστήριο Πειραματικής Νευρολογίας και Νευροανοσολογίας της Β Νευρολογικής κλινικής χρησιμοποιήθηκαν η μέθοδος του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (CPE) και η μέθοδος μέτρησης της έκφρασης του γονιδίου Mx1, δυο ανεξάρτητες μέθοδοι Μέθοδος εντοπισμού εξουδετερωτικών αντισωμάτων με τη μέθοδο της quantitative real time PCR Καλλιέργεια κυτταρικής σειράς Α549 Εισαγωγή Για τη μέθοδο αυτή απαραίτητη είναι η διατήρηση και η χρήση της κυτταρικής σειράς Α549. Τα Α549 είναι μικροκυτταρικά επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπινου πνεύμονα. Τα κύτταρα αυτά εμπίπτουν στις φολιδωτές υποδιαιρέσεις των επιθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με τη διάχυση νερού, ηλεκτρολυτών και άλλων ουσιών. Ως κυτταροκαλλιέργεια ορίζουμε τη διαδικασία διατήρησης και ανάπτυξης κυτταρικών σειρών σε τεχνητές συνθήκες in vitro και οι συνθήκες ανάπτυξης ποικίλουν αναλόγως του κυτταρικού τύπου. Για την ανάπτυξή των Α549 κυττάρων απαιτείται απλό καλλιεργητικό μέσο που περιέχει αντιβιοτικά και αμινοξύ L-γλουταμίνη, ενώ οι συνθήκες διατήρησης τους είναι σε υγρό κλίβανο θερμοκρασίας 37 ο C, 5% CO 2. (Σχήμα 10) 233

234 Σχήμα 10: Απεικόνιση υπό στερεοτακτικού μικροσκοπίου κυτταρικής σειράς Α549 σε χαμηλή και υψηλή συγκέντρωση μέσα σε καλλιεργητικό μέσο. Υλικά: 1. Alpha-MEM Medium (Life Technologies cat# ) 2. Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco 3. L-glutamine (200 mm solution in 0.85% NaCl solution) (Gibco, Trypsin-EDTA (Gibco, ) x διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης (Life Technologies, ) 6. Αssay Plates (Corning 96-well plates) 7. IFN-β Stock 1000 IU/mL Καλλιεργητικό μέσο a-mem 5% FBS: 470 ml alpha-mem Medium + 25 ml απενεργοποιημένο FBS (5 %) + 5 ml L-Glutamine + 5ml διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης. Πριν τη χρήση το μέσο φιλτράρεται, διαμέσου 0.2 µm φίλτρου μεμβράνης νιτροκυτταρίνης. alpha-mem 2% FBS : 480ml alpha-mem Medium + 10ml ενεργοποιημένος ορός FBS + 5ml L-Glutamine + 5ml διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης 234

235 Μέθοδος: Απόψυξη Κυττάρων Α549 Τα κύτταρα μεταφέρονται από το υγρό άζωτο σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 ο C, όπου και ανακινούνται ελαφρά μέχρι την παρουσία του τελευταίου κρυστάλλου ψύξης. Στη συνέχεια μεταφέρονται σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου διαλύονται σε 20ml καλλιεργητικού μέσου και φυγοκεντρούνται στα 1200rpm για 5λεπτά σε 4 C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης αφαιρείται το υπερκείμενο, το ίζημα επαναιωρείται σε επιπλέον 20ml καλλιεργητικού μέσου και επαναλαμβάνεται η ίδια φυγοκέντρηση. Για τη συντήρηση των κυττάρων σε υγρό άζωτο χρησιμοποιείται DMSO (dimethyl sulfoxide), το οποίο σε θερμοκρασία δωματίου είναι τοξικό για τα κύτταρα. Για το λόγο αυτό απαραίτητη είναι η απομάκρυνση του υλικού ψύξης πριν την επανακαλλιέργεια της κυτταρικής σειράς ώστε να επιτευχθεί η ομαλή ανάπτυξη τους. Το παραγόμενο ίζημα διαλύεται σε 15ml καλλιεργητικού μέσου, μεταφέρεται σε μια Τ-75cm 2 καλλιεργητική φλάσκα. Η φλάσκα επωάζεται σε κλίβανο 5%CO 2 σταθερής θερμοκρασίας 37 ο C. Συντήρηση και διαχωρισμός των Α549 κυττάρων Τα κύτταρα, καθώς αναπτύσσονται, καταναλώνουν τα θρεπτικά συστατικά του καλλιεργητικού μέσου και απελευθερώνουν επίσης μεταβολικά παραπροϊόντα. Για το λόγο αυτό, απαραίτητη είναι η αλλαγή του καλλιεργητικού μέσου ανά τρεις ημέρες για τη φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων και την απομάκρυνση τυχόν νεκρών κυττάρων που πιθανώς την παρεμποδίζουν. Κατά την αλλαγή αφαιρείται όλο το περιεχόμενο της φλάσκας και προστίθεται νέα ποσότητα 15 ml καλλιεργητικού μέσου. Επιπλέον απαραίτητος για την ομαλή ανάπτυξη της κυτταρικής σειράς είναι ο διαχωρισμός των κυττάρων. Τα Α549 κύτταρα, σε διάστημα 5-6 ημερών, αυξάνονται πληθυσμιακά με συνέπεια να μην έχουν στις συνθήκες καλλιέργειας χώρο και θρεπτικά υλικά ικανά για τον ομαλό πολλαπλασιασμό τους. 235

236 Τα Α549 κύτταρα που καλλιεργούμε είναι επικαθήμενα και άρα, για την απομάκρυνση τους από την καλλιεργητική φλάσκα, απαραίτητη είναι η χημική τους διάσπαση μέσω τρυψίνης. Κατά τη διαδικασία, όλο το περιεχόμενο της καλλιεργητικής φλάσκας αφαιρείται με τη βοήθεια αντλίας κενού, πλένεται με 5ml τρυψίνης θερμοκρασίας 37 ο C και προστίθενται επιπλέον 2ml τρυψίνης η οποία επωάζεται για 10 λεπτά σε κλίβανο 5% CO 2,37 ο C. Μετά το πέρας της επώασης προστίθενται 8 ml καλλιεργητικού μέσου για την απενεργοποίηση της τρυψίνης μέσω διάλυσης. Από το παραπάνω κυτταρικό μείγμα απομονώνονται 50μl και διαλύονται σε 50μl χρωστική trypan blue 4% και προσδιορίζονται τα κύτταρα σε πλάκα Neubauer. Σε κάθε καινούργια καλλιεργητική φλάσκα τοποθετείται ο κατάλληλος όγκος μείγματος κυττάρων και προστίθεται ο ανάλογος όγκος καλλιεργητικού μέσου έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 1,25 x Οι νέες καλλιεργητικές φλάσκες επωάζονται σε υγρό κλίβανο CO 2 5%,37 ο C. Ενεργοποίηση κυττάρων Α549 Τα κύτταρα κατά την ενεργοποίηση επωάζονται με IFN-β και ορό του κάθε ασθενούς υπό διερεύνηση. Η IFN-β στα κύτταρα επάγει την αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της MxA πρωτεΐνης (Μx1). Εάν ο ορός του ασθενούς όμως περιέχει εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι της IFN-β, η IFN-β χάνει τη βιολογική δράση της και κατά συνέπεια δεν επάγεται η έκφραση του γονιδίου Μx1. Απαραίτητος και σε αυτή τη διαδικασία είναι ο σχεδιασμός διαγράμματος της πλάκας που θα ωφελήσει μετέπειτα κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Εδώ πρέπει να αναφερθεί ότι η IFN-β που χρησιμοποιείται είναι φυσιολογική ανθρώπινη και διατίθεται από το National Institute of Health (ΝΙΗ). Τέλος η στήλη της μικροπλάκας με τις διαδοχικές διαλύσεις της IFN χρησιμοποιείται ως μάρτυρας για την εγκυρότητα της διαδικασίας και άρα των αποτελεσμάτων. Ημέρα πρώτη: Προετοιμάζεται διάλυμα κυττάρων συγκέντρωσης 7 x 10 6 κύτταρα/ml σε καλλιεργητικό υλικό α-mem 2%. Σε κάθε κελί πλάκας 96 θέσεων προστίθενται 100μl 236

237 του κυτταρικού διαλύματος, δηλαδή 700 κύτταρα. Η πλάκα επωάζεται σε κλίβανο CO 2 5%, 37 ο C κατά τη διάρκεια μίας νύχτας. Ημέρα δεύτερη: Κατά τη δεύτερη ημέρα δημιουργείται νέα πλάκα 96 θέσεων, όπου γίνονται οι διαλύσεις της IFN-β και των ορών προς διερεύνηση. Η πρώτη στήλη της πλάκας περιέχει τις διαλύσεις της ιντερφερόνης IFN-β. Η IFNβ συγκέντρωσης 1000IU/ml διαλύεται 1:50 σε α-mem Medium2%. Ακολουθούν διαδοχικές διαλύσεις 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 και 1:64 σε α-mem Medium2%. Επιπλέον, χρησιμοποιείται ένα κελί ως αρνητικός μάρτυρας που περιέχει μόνο τον διαλύτη. (Σχήμα 11) Οι υπόλοιπες στήλες της πλάκας περιέχουν δείγματα ορών ασθενών υπό διερεύνηση. 12μl ορού αναμειγνύονται σε 48μl α-μεμ και προστίθενται 60μl του διαλύματος IFN-β. Η πλάκα επωάζεται σε κλίβανο CO 2 5% για 45 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης αφαιρείται από την πλάκα 96 θέσεων, που περιέχει τα Α549 κύτταρα, το θρεπτικό υλικό, με τη βοήθεια κενού, και μεταφέρονται σε αυτή 100μl υλικού της δεύτερης πλάκας στις αντίστοιχες θέσεις. Η πλάκα, που πλέον περιέχει τα Α549 κύτταρα, τους ορούς των ασθενών και την IFN-β, επωάζεται σε κλίβανο CO 2 5%, 37 ο C για 6,5 (εξίμισι) ώρες. Απομόνωση RNA To RNA είναι ένα κεντρικό μόριο στη γονιδιακή έκφραση. Τρεις κύριες τάξεις του εμπλέκονται στην πρωτεϊνοσύνθεση, το αγγελιοφόρο RNA, το μεταφορικό και το ριβοσωμικό. Το αγγελιοφόρο RNA (mrna) κάποιου γονιδίου είναι αυτό που αυξάνεται όταν επάγεται η έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου. Είναι δύσκολο να απομονωθεί όμως το mrna, λόγω του μικρού χρόνου ημίσειας ζωής του, και προτιμήθηκε στη μέθοδο αυτή η απομόνωση ολικού RNA. Υλικά: Total RNA Isolation Nucleospin 96 RNA MACHEREY-NAGEL GERMANY (2x96 preps) Μετά τη επώαση των εξίμισι ωρών για την ενεργοποίηση των κυττάρων, αφαιρείται το περιεχόμενο της πλάκας με τη χρήση κενού και προστίθενται 170μl 237

238 RA1 διαλύματος λύσης σε κάθε κελί. Η πλάκα αποθηκεύεται στους -20 ο C, όπου και μπορεί να συντηρηθεί για διάστημα 30 ημερών. Αφού αποψυχθεί ήπια η πλάκα, ακολουθείται το πρωτόκολλο απομόνωσης ολικού RNA με το Total RNA Isolation Nucleospin 96 RNA (MACHEREY-NAGEL) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αναλυτικά, η διαδικασία λαμβάνει χώρα σε συσκευή κενού στην οποία είναι τοποθετημένο το πιάτο υπολειμμάτων, πάνω από το οποίο βρίσκεται το πιάτο πλύσης και αμέσως πάνω του το πιάτο για την πρόσδεση του RNA, ενώ στην επίπεδη επιφάνειά του έχει μια διαπερατή μεμβράνη που προσδένει ειδικά μόνο το RNA, λειτουργώντας σαν φίλτρο. Προστίθενται 170μl αλκοολούχου διαλύματος RA4 για την κατακρύμνιση νουκλεικών οξέων, ίσος όγκος με τον όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, σε κάθε κελί και μεταφέρεται σε αντίστοιχο κελί στην πλάκα πρόσδεσης RNA. Προστίθενται 500μl ρυθμιστικού διαλύματος RA3 και εφαρμόζεται πίεση 450mbarr για ένα λεπτό. Στην επιφάνεια κάθε μεμβράνης της πλάκας πρόσδεσης τοποθετούνται 30 μl DNAase Ι (δεοξυριβονουκλεάση) για την καταστροφή του γενομικού DNA, επωάζοντας για τριάντα λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν πλύσεις με 500 μl διαλύματος RA2, για την απενεργοποίηση της DNAase Ι και εφαρμογής πίεσης 450 mbar για ένα λεπτό, 800 μl ρυθμιστικού διαλύματος RA3 και εφαρμογής πίεσης 450 mbar για ένα λεπτό και 500μl buffer RA4 και εφαρμογή πίεσης 450 mbar για ένα λεπτό. Η περίσσεια αλκοόλης απομακρύνεται με στύπωμα της πλάκας πρόσδεσης σε απορροφητικό χαρτί και με εφαρμογή πίεσης 600 mbar για δέκα λεπτά. Τέλος, για τη συλλογή του RNA που έχει προσδεθεί στα φίλτρα της πλάκας, τοποθετείται πλάκα συλλογής (96-well plate), κάτω από την πλάκα πρόσδεσης στη συσκευή κενού και προστίθενται 70μl νερού χωρίς νουκλεάσες στην επιφάνεια του φίλτρου. Ασκείται πίεση 450 mbar και στην πλάκα συλλέγεται το RNA που αποθηκεύεται στους -80 ο C και συντηρείται μέχρι και για 6 μήνες. 238

239 Παραγωγή cdna από ολικό RNA με τη μέθοδο της PCR αντίστροφης μεταγραφής Το RNA μετατρέπεται σε DNA με τη μέθοδο της PCR αντίστροφης μεταγραφής. Τα πλεονεκτήματα της τεχνικής είναι η ευαισθησία και η ειδικότητά της στον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση του mrna. Στην αντίδραση, τα μόρια του mrna, με τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης, αντιγράφονται σε DNA με την προσθήκη δεσοξυριβονουκλεοτιδίων και εκκινητών για την έναρξη της αντιγραφής. Στην παρούσα τεχνική ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν τυχαία εξαμερή ολιγονουκλεοτίδια. Τα υβριδικά μόρια RNA:DNA που προκύπτουν, μετατρέπονται σε μονόκλωνο DNA με την κατακρήμνιση του RNA, και το μονόκλωνο cdna, με τη σειρά του, μπορεί να αντιγραφεί σε δίκλωνο με απλή αντίδραση PCR. Υλικά: Omniscript RT Kit Qiagen cat # reactions Random Primers Perkin Elmer cat # N M RNA Inhibitor Promega cat # N Units Μέθοδος: Όπως προαναφέρθηκε, η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA γίνεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής ( reverse transcript PCR ) με τη χρήση του Omniscript RT Kit Qiagen ακολουθώντας τις οδηγίες της κατασκευαστικής εταιρείας. Αναλυτικά, η πλάκα 96 θέσεων που περιέχει το απομονωμένο RNA αποψύχεται ήπια. προετοιμάζεται master mix που περιέχει τις ακόλουθες ποσότητες αντιδραστηρίων ανά αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Omniscript RT (αντίστροφη μεταγραφάση) 1 μl ρυθμιστικό διάλυμα (buffer RT 10x) 2 μl dntps διάλυμα 2 μl random hexamers 2μl νερό ελεύθερο νουκλεασών 1 μl Το master mix διαμοιράζεται στα κελιά της πλάκας όπου θα πραγματοποιηθεί η αντίδραση (8 μl ανά κελί) και προστίθενται 12 μl RNA από το αντίστοιχο δείγμα RNA 239

240 που αντιστοιχεί σε κάθε ασθενή. Η πλάκα ασφαλίζεται με ειδικό κάλυμμα και τοποθετείται σε θερμοκυκλοποιητή. Το πρόγραμμα της αντίδρασης αποτελείται από 3 στάδια. 5 λεπτά στους 64 ο C, 60 λεπτά στους 37 ο C και 10 λεπτά στους 90 ο C Tο προϊόν της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής αποθηκεύεται στους -20 ο C. Real Time PCR Η μέθοδος ποσοτικοποίησης Real-Time PCR έχει την ικανότητα να ελέγχει και να ποσοτικοποιεί σχετικά την αντίδραση καθώς η διαδικασία πολλαπλασιασμού είναι σε εξέλιξη. Δηλαδή δεδομένα συλλέγονται κατά τη διάρκεια της PCR και όχι στο τέλος της διαδικασίας. Κατά τη Real-Time PCR οι αντιδράσεις χαρακτηρίζονται από το χρονικό εκείνο σημείο του κάθε κύκλου, στο οποίο ο πολλαπλασιασμός των γονιδίων-στόχων επιτυγχάνει συγκεκριμένα επίπεδα φθορισμού, και όχι από το τελικό προϊόν που συναθροίζεται μετά από συγκεκριμένους κύκλους PCR. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιούνται TaqMan probes, που είναι ολιγονουκλεοτίδια που προσδένουν σε μια περιοχή μέσα στο γονίδιο που μελετάμε. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά στο ένα άκρο τους έχουν ένα φθοροφόρο μόριο και στο άλλο άκρο ένα μόριο που καταστέλλει τον φθορισμό. Όταν ένα probe είναι προσδεμένο στο DNA δεν φθορίζει, επειδή τα δυο άκρα του είναι κοντά το ένα στο άλλο και ο φθορισμός καταστέλλεται. Καθώς όμως η DNA πολυμεράση αντιγράφει το γονίδιο με τη δράση της 5-3 εξωνουκλεάσης αποικοδομεί το probe και παράγεται φθορισμός (ο καταστολές του φθορισμού απομακρύνεται). Υλικά: TAQ Mann Universal Master Mix (Applied Biosystems, PN ) MicroAmp Optical 96-well plate ειδικό για την αντίδραση real time-pcr (Applied Biosystems, PN ) Optical Adhesive Cover (Applied Biosystems, PN ) Assays-on-Demand Gene Expression Products (predesigned primers and probes) (Applied Biosystems, PN ) Gene Mx1 Assay ID Hs _m1 Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (PDAR) Human 18S rrna Endogenous control (VIC/MGB Probe, Primer limited) 240

241 (Applied Biosystems, E) Νερό ελεύθερο νουκλεασών Η πλάκα 96 θέσεων που περιέχει το cdna αποψύχεται ήπια. Προετοιμάζεται το master mix προσθέτοντας τις παρακάτω ποσότητες για κάθε αντίδραση: 15 μl TAQ Mann master mix 1,5 μl ανιχνευτή Mx1 1,5 μl ανιχνευτή για ανθρώπινο 18s RNA (γονίδιο αναφοράς) 9μl νερό ελεύθερο νουκλεάσων Το master mix διαμοιράζεται ανά 27 μl σε κάθε κελί όπου θα πραγματοποιηθεί η αντίδραση της PCR και προστίθενται 3 μl cdna που αντιστοιχεί σε κάθε ασθενή υπό διερεύνηση. Ασφαλίζεται η πλάκα με ειδικό αυτοκόλλητο κάλυμμα και τοποθετείτε στο μηχάνημα της real time PCR. Σχεδιάζουμε στο πρόγραμμα του μηχανήματος το πώς είναι τοποθετημένα τα δείγματα, καθορίζουμε τους ανιχνευτές, τους ενδογενείς μάρτυρες και αποθηκεύουμε το αρχείο. Το πρόγραμμα της αντίδρασης είναι το εξής: 2 λεπτά στους 50 C, 10 λεπτά στους 95 C [15 sec στους 95 C + 60 sec στους 60 C] για 40 κύκλους. Ανάλυση των αποτελεσμάτων: Οι τιμές που προκύπτουν από τις μετρήσεις χρησιμοποιούνται στη φόρμουλα Kawade. Ο τύπος αυτός μετατρέπει τις μετρήσεις ανάμεσα στο cdna του γονιδίου Μx1 και της 18s σε τιμή τίτλου εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Ο τύπος του Kawade είναι ο εξής: Τίτλος αντισωμάτων = (δείγμα EC50) x (10/Standard EC50)

242 A 20IU/ml Δ1 Δ9 Δ17 Δ25 Δ33 Δ41 Δ49 Δ57 Δ65 Δ73 Δ81 B 10IU/ml Δ2 Δ10 Δ18 Δ26 Δ34 Δ42 Δ50 Δ58 Δ66 Δ74 Δ82 C 5IU/ml Δ3 Δ11 Δ19 Δ27 Δ35 Δ43 Δ51 Δ59 Δ67 Δ75 Δ83 D 2,5lU/ml Δ4 Δ12 Δ20 Δ28 Δ36 Δ44 Δ52 Δ60 Δ68 Δ76 Δ84 E 1,25 lu/ml Δ5 Δ13 Δ21 Δ29 Δ37 Δ45 Δ53 Δ61 Δ69 Δ77 Δ85 F 0,625IU/ml Δ6 Δ14 Δ22 Δ30 Δ38 Δ46 Δ54 Δ62 Δ70 Δ78 Δ86 G IU/ml Δ7 Δ15 Δ23 Δ31 Δ39 Δ47 Δ55 Δ63 Δ71 Δ79 Δ87 H a-mem 2% Δ8 Δ16 Δ24 Δ32 Δ40 Δ48 Δ56 Δ64 Δ72 Δ80 Δ88 IFN-β +IFN-β 20IU/ml Σχήμα 11: Το διάγραμμα αναπαριστά τη μικροπλάκα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων με τη μέθοδο της Real time PCR Εντοπισμός εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β μέσω της μεθόδου του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (CPE) Καλλιέργεια κυττάρων Α549 Η διαδικασία καλλιέργειας και διαχωρισμού των κυττάρων της σειράς Α549 για την τεχνική CPE είναι η ίδια με αυτή που περιγράφεται στην τεχνική προσδιορισμού της έκφρασης του γονιδίου της MxA πρωτεΐνης με ποσοτική PCR. Στη συγκεκριμένη μέθοδο όμως τα κύτταρα στα οποία η IFN-β είναι ενεργή, επάγεται η έκφραση της MxA πρωτεΐνης. Όταν στα κύτταρα προστίθεται ο ιός, η MxA πρωτεΐνη, που είναι αντιιική, εμποδίζει τον ιό να προσβάλλει τα κύτταρα. Στην αντίθετη περίπτωση που ο ορός του ασθενούς έχει αντισώματα και επομένως η IFN-β είναι ανενεργή, ο ιός προσβάλλει τα κύτταρα και τα θανατώνει. Έτσι, με τη μέτρηση της απορρόφησης 242

243 εκπομπής στο σπεκτοφωτόμετρο εντοπίζεται το ποσοστό θνητότητας σε κάθε κελί και εν συνεχεία υπολογίζεται ο τίτλος των αντισωμάτων. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται επίσης και η κυτταρική σειρά L929 ( NCTC clone 929 L) για την αντιγραφή και τον πολλαπλασιασμό του ιού. Η καλλιέργεια της παραπάνω κυτταρικής σειράς ακολουθεί πανομοιότυπες διαδικασίες με την κυτταρική σειρά Α549. Υλικά: α-mem Medium Fetal Bovine Serum (FBS) L-γλουταμίνη (200mM διαλυμένη σε 0.85% NaCI διάλυμα). (Gibco cat. # ) 1OOX διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης (Life Technologies cat.# ) 96-well μικροπλάκες με κάλυμμα Ιός Encephalomyocarditis (EMC) IFN-β-1a ή -1b 20 UI T-75 φλάσκα καλλιέργειας με L929 T-75 φλάσκα καλλιέργειας με A549 Καλλιεργητικά μέσα: α-mem 10% FBS (καλλιεργητικό μέσο) (440 ml Α-ΜΕΜ Medium + 50 ml απενεργοποιημένος ορός + 5 ml L-γλουταμίνη + 5 ml διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης ) α-mem 2% FBS (μέσο για εξέταση) (480 ml Α-MEM Medium + 10 ml απενεργοποιημένος ορός FBS + 5 ml L-γλουταμίνη + 5 ml διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης) α-mem 0% FBS (μέσο για τη μόλυνση) 490 ml Α-MEM Medium + 5 ml L-γλουταμίνη + 5 ml διάλυμα πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης) Αντιγραφή του ιού EMC Ημέρα πρώτη: Το θρεπτικό υλικό αφαιρείται από την καλλιεργητική φλάσκα των L929 κυττάρων και τα κύτταρα, μετά από πλύση τους με PBS, αποκολλώνται από τη φλάσκα με δίλεπτη επώαση τους, παρουσία 5ml τρυψίνης. Προστίθενται 10ml καλλιεργητικού υλικού για την απενεργοποίηση της τρυψίνης και για τη συλλογή των κυττάρων. 5ml του παραπάνω 243

244 μίγματος κυττάρων αναμιγνύεται με 5ml καλλιεργητικού μέσου και επωάζεται σε καλλιεργητική φλάσκα σε συνθήκες 5% CO 2 /37 Ο C για ώρες. Παράλληλα ακολουθείται διαδικασία τρυψινοποίησης σε καλλιεργητική φλάσκα Α549 κυττάρων. Η τελική συγκέντρωση του διαλύματος των κυττάρων πρέπει να είναι 30 x 10 4 κύτταρα ανά ml. Από αυτό το διάλυμα τοποθετούνται 100μl σε κάθε κελί μικροπλάκας 96 θέσεων και η πλάκα επωάζεται για μια νύχτα σε συνθήκες 5% CO 2 /37 Ο C. Ημέρα δεύτερη: Από μια φλάσκα μεγάλης συγκέντρωσης σε κύτταρα L929 αφαιρείται το καλλιεργητικό μέσο και προστίθεται 1ml ιού διαλυμένου σε 4ml καλλιεργητικού μέσου. Η φλάσκα επωάζεται σε κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για ώρες. Παράλληλα προετοιμάζεται η μικροπλάκα με τις διαλύσεις της τιτλοποίησης του ιού. Σε κάθε κελί στις στήλες 1-10 προστίθενται 100μl ιντερφερόνη-β 20IU στη σειρά Α της μικροπλάκας και διαδοχικές διαλύσεις υποδιπλασιασμού. Στις στήλες προστίθενται 100μl καλλιεργητικού μέσου 2%. Στη συνέχεια, αφαιρείται το καλλιεργητικό μέσο από τη μικροπλάκα με τα κύτταρα Α549, μεταφέρονται 100μl από την αντίστοιχη θέση της μικροπλάκας τιτλοποίησης και η μικροπλάκα επωάζεται σε κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για ώρες. Ημέρα τρίτη: Η φλάσκα με τα L929 παρατηρείται κάτω από στερεοτακτικό μικροσκόπιο για να διαπιστωθεί ο θάνατος των κυττάρων, γεγονός που πιστοποιεί τον φυσιολογικό πολλαπλασιασμό του ιού. Μετά από τη συλλογή του καλλιεργητικού μέσου της φλάσκας όπου υπάρχουν τα αντίγραφα του ιού, ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 1500rpm. Τα νεκρά κύτταρα πλέον βρίσκονται στο ίζημα και ο ιός περιέχεται στο υπερκείμενο. Από το υπερκείμενο συλλέγεται 1μl και τοποθετείται σε ειδικά κρυοσωληνάρια όπου και ψύχεται για τη συντήρηση τους στους -80 ο C. Για να πιστοποιηθεί η σωστή διάλυση του ιού, που θα χρησιμοποιηθεί κατά την εξέταση των ορών ασθενών, ακολουθείται η διαδικασία τιτλοποίησης. Ετοιμάζονται 4 διαφορετικές διαλύσεις του ιού σε μέσο ειδικό για τη μόλυνση (0%FBS). 1:100, 1:200, 1:400 και 1:800, από τις οποίες τοποθετούνται 100μl σε κάθε κελί, έτσι ώστε κάθε δυο στήλες να έχουν από μια διαφορετική συγκέντρωση του ιού (για παράδειγμα οι στήλες 3-4 περιέχουν ιό σε διάλυση 1:100, οι στήλες 5-6 έχουν ιό σε 244

245 διάλυση 1:200 κ.ο.κ). Στις στήλες 1-2, όπως και στα κελιά που θα περιέχουν μόνο τον ιό για μάρτυρα (σειρές Α-B-C-D και στήλες 11-12), τοποθετούνται 100μl ιού γνωστής συγκέντρωσης από προηγούμενο πείραμα τιτλοποίησης. Τέλος, προσθέτονται 100μl του μέσου μόλυνσης (0%FBS) στα κελιά που θα περιέχουν μόνο κύτταρα ( στήλες 11-12). Η μικροπλάκα αυτή επωάζεται στους 5% CO 2 /37 Ο C για διάρκεια μιας νύχτας. Ημέρα τέταρτη: Παρατηρείται η μικροπλάκα στο στερεοτακτικό μικροσκόπιο για να διαπιστωθεί εάν όλα τα κύτταρα των κελιών που περιείχαν ιό έχουν πεθάνει και εάν τα κύτταρα των κελιών χωρίς ιό παραμένουν ζωντανά. Αφού αφαιρεθεί το περιεχόμενο των κελιών, προστίθενται 50μl χρωστικής Crystal Violet για 10 λεπτά και, αφού αφαιρεθεί η χρωστική, ακολουθούν πλύσεις με νερό βρύσης. Τέλος προστίθενται 100μl οξικού οξέος 33% και μετράται η απορρόφηση σε σπεκτοφωτόμετρο στα 620nm. Στη συνέχεια υπολογίζεται η τιμή 50% του κυτταρικού θανάτου βάσει της καμπύλης του ήδη τιτλοποιημένου ιού, τιμή που θα χρησιμοποιηθεί σε περαιτέρω πειράματα. Εφόσον προσδιοριστεί η κατάλληλη συγκέντρωση του ιού για την τεχνική ανίχνευσης εξουδετερωτικών αντισωμάτων, μπορούμε να προχωρήσουμε στη διαδικασία της εξέτασης των δειγμάτων των ασθενών. Ενεργοποίηση των κυττάρων Ημέρα πρώτη: Ακολουθείται η διαδικασία διαχωρισμού κυττάρων (τρυψινοποίησης) σε μια φλάσκα Α549 και προετοιμάζεται μια μικροπλάκα, τοποθετώντας 100 μl σε κάθε κελί από κυτταρικό διάλυμα συγκέντρωσης 30xl0 4 κύτταρα/ml. Η μικροπλάκα αυτή τοποθετείται σε κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για ώρες. Ημέρα δεύτερη: Το μέσο για την εξέταση (α-μεμ 2% FBS) θερμαίνεται σε υδατόλουτρο 37 ο C. Στη συνέχεια προετοιμάζεται μικροπλάκα με τις διαλύσεις της ιντερφερόνης (ο τύπος IFN-β που χρησιμοποιεί ο κάθε ασθενής) και των δειγμάτων. Προσθέτονται 60 μl α-μεμ 2% FBS στα κελιά των σειρών Β,C,D,F,G,Η στις στήλες 3-10 της μικροπλάκας. Επιπλέον, προσθέτονται στα κελιά των σειρών Α και Ε από τις 245

246 στήλες 3-10 από 96 μl του μέσου εξέτασης και 24 μl από τον ορό του κάθε ασθενούς ανά δυο κυψέλες, σύμφωνα με το σχεδιάγραμμα (διάλυση 1:5). Για τις διαλύσεις του ορού αναδεύεται το πρώτο κελί, αφαιρούνται 60 μl και μεταφέρονται στο επόμενο κελί καθοδικά στη μικροπλάκα, επιτυγχάνοντας διάλυση 1:2 σε κάθε μεταφορά. Στις δυο πρώτες στήλες της μικροπλάκας περιέχονται οι διαλύσεις της IFN-β. Για τις στήλες αυτές προετοιμάζεται διάλυμα IFN-β 20IU/ml σε α-μεμ 2% FBS. Από το διάλυμα αυτό τοποθετούνται 120μl στα κελιά Α1-2 και Β1-2. Στα κελιά των σειρών C- H από τις στήλες 1-2 προσθέτονται 120 μl α-μεμ 2% FBS. Στη συνέχεια μετά από ανάδευση μεταφέρονται 120 μl από τα κελιά Β1 στην επόμενη, καθοδικά της μικροπλάκας και αντίστοιχα από τη Β2 στη C2. Συνεχίζοντας την ίδια διαδικασία σε κάθε κυψέλη επιτυγχάνονται διαδοχικές διαλύσεις 1:2 σε κάθε μεταφορά. Αυτά τα κελιά αποτελούν τον ενδογενή έλεγχο της εξέτασης CPE. 60 μl του μέσου εξέτασης τοποθετούνται σε κάθε κελί από τις στήλες 4,6,8,10 και 60 μl του διαλύματος IFN-β (20IU/ml) σε κάθε κελί από τις στήλες 3,5,7,9. Στις στήλες 11 και 12 τοποθετούνται μόνο 120 μl του μέσου εξέτασης σε κάθε κυψέλη. Η μικροπλάκα επωάζεται στον κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για μια ώρα. Στη συνέχεια αφαιρείται το υπερκείμενο της μικροπλάκας με τα Α549 κύτταρα και μεταφέρονται σε αυτή 100μl αντίστοιχων θέσεων από τη μικροπλάκα με τις διαλύσεις των ορών και της IFN-β. Ακολουθεί επώαση σε κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για 24 ώρες. Ημέρα τρίτη : Την τρίτη ημέρα της εξέτασης πραγματοποιείται η μόλυνση από τον ιό. Μετά από την επώαση των 24 ωρών, απομακρύνεται από τη μικροπλάκα το υπερκείμενο των κελιών και προστίθενται 100 μl διαλύματος ιού EMC σε α-μεμ 0% FBS, στη συγκέντρωση που έχει πρωτίστως υπολογιστεί. Εξαιρούνται τα κελιά των σειρών Ε-Η από τις στήλες 11-12, στις οποίες προσθέτονται 100μl α-μεμ 0% FBS. Η μικροπλάκα επωάζεται σε κλίβανο 5% CO 2 /37 Ο C για 24 ώρες. Ημέρα τέταρτη : Με τη χρήση κενού αφαιρείται το περιεχόμενο των κελιών και προστίθενται 50μl χρωστικής Crystal Violet σε κάθε κελί. Μετά από 10 λεπτά επώασης αφαιρείται η χρωστική και ακολουθούν πλύσεις με νερό βρύσης. Η αντίδραση καταστέλλεται με 246

247 την προσθήκη 100 μl διαλύματος οξικού οξέος 33% και η απορρόφηση υπολογίζεται σε σπεκτοφωτόμετρο στα 620nm. Ανάλυση αποτελεσμάτων: 1. Υπολογίζεται ο μέσος όρος των απορροφήσεων των κελιών που περιείχαν μόνο τον ιό. Αυτή η τιμή αντικατοπτρίζει το 100% της θνησιμότητας των κυττάρων. (Σχήμα 12) 2. Υπολογίζεται ο μέσος όρος των απορροφήσεων των κελιών που περιείχαν μόνο κύτταρα. Η τιμή αυτή αντικατοπτρίζει το 100% της βιωσιμότητας. 3. Από τις τιμές αυτές υπολογίζεται το 50% της απορρόφησης: (τιμή βιωσιμότητας + τιμή θνησιμότητας)/2. Η τιμή αυτή στη στήλη της ιντερφερόνης θα πρέπει να παρεμβάλλεται ανάμεσα στις διαλύσεις 1:16 και 1:32, ώστε να επιβεβαιωθεί ότι η συγκέντρωση της IFN-β που χρησιμοποιήθηκε κατά την εξέταση ήταν η κατάλληλη. 4. Διαιρείται η τιμή απορρόφησης της IFN-β διά του 2, επειδή η IFN-β στα δείγματα είναι σε διάλυση 1:2. 5. Η συγκέντρωση του δείγματος που θα χρησιμοποιηθεί για την τιτλοποίηση είναι αυτή στην οποία αντιστοιχεί το 50% βιωσιμότηταςθνησιμότητας. 6. Ο τίτλος των αντισωμάτων υπολογίζεται με την εφαρμογή του τύπου Kawade Τίτλος αντισωμάτων = διάλυση ορού x (τίτλος IFN-1) 9 247

248 A 20IU Δ1 1:5 B 10IU Δ1 1:10 C 5IU Δ1 1:20 Δ1 1:5 Δ1 1:10 Δ1 1:20 Δ3 1:5 Δ3 1:10 Δ3 1:20 Δ3 1:5 Δ3 1:10 Δ3 1:20 Δ5 1:5 Δ5 1:10 Δ5 1:20 Δ5 1:5 Δ5 1:10 Δ5 1:20 Δ7 1:5 Δ7 1:10 Δ7 1:20 Δ7 1:5 Δ7 1:10 Δ7 1:20 Καλλιεργητικό μέσο D 2,5IU Δ1 Δ1 Δ3 Δ3 Δ5 Δ5 Δ7 Δ7 1:40 1:40 1:40 1:40 1:40 1:40 1:40 1:40 E 1,2IU Δ2 1:5 F 0,6IU Δ2 1:10 G 0,3IU Δ2 1:20 H 0,1IU Δ2 1:40 Δ2 1:5 Δ2 1:10 Δ2 1:20 Δ2 1:40 Δ4 1:5 Δ4 1:10 Δ4 1:20 Δ4 1:40 Δ4 1:5 Δ4 1:10 Δ4 1:20 Δ4 1:40 Δ6 1:5 Δ6 1:10 Δ6 1:20 Δ6 1:40 Δ6 1:5 Δ6 1:10 Δ6 1:20 Δ6 1:40 Δ8 1:5 Δ8 1:10 Δ8 1:20 Δ8 1:40 Δ8 1:5 Δ8 1:10 Δ8 1:20 Δ8 1:40 Καλλιεργητικό μέσο + EMC IFN-β IFN-β +EMC IFN-β +EMC IFN-β +EMC IFN-β +EMC +EMC +EMC +EMC +EMC +EMC Σχήμα 12: Αναπαράσταση του σχεδίου μικροπλάκας που χρησιμοποιείται κατά τη διεξαγωγή της εξέτασης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι της IFN-β με τη μέθοδο του κυτταροπαθολογικού φαινομένου. 248

249 4.3. Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPSS Η κανονικότητα των δεδομένων εκτιμήθηκε με τη χρήση του Kolmogorov-Smirnov test. Η σύγκριση ανάμεσα στις τρεις ομάδες διενεργήθηκε με την εφαρμογή του one-way ANOVA test (παραμετρικά δεδομένα) ή Kruskal-Wallis test (μηπαραμετρικά δεδομένα),με τα απαραίτητα post-hoc tests. Οι ποσοστιαίες αλλαγές της EDSS (%ΔEDSS) τις ημέρες 5 και 30, λόγω της ενδοφλέβιας χορήγησης ΜΠ, καθώς επίσης και οι αλλαγές των τίτλων των συνδετικών (%ΔBabs) και εξουδετερωτικών (%ΔNabs) αντισωμάτων υπολογίστηκαν με τη χρήση formula %Δ = (τελική τιμή αρχική τιμή /αρχική τιμή)*100. Χρησιμοποιήθηκε η Multinomial Logistic Regression ή η Binary Logistic Regression για την εκτίμηση της δράσης της INFβ στους τίτλους των αντισωμάτων. Υπολογίστηκε το Odds ratio Cochran's test statistics για τους υψηλούς και χαμηλούς τίτλους των Nabs και τις αλλαγές τους μετά την εφαρμογή της κορτιζόνης. Τιμές με P < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Τα δεδομένα εκφράστηκαν σε mean±sem, εκτός κι αν έχει σημειωθεί διαφορετικά. 249

250 5. Αποτελέσματα 5.1. Χαρακτηριστικά ασθενών με ενδιάμεσης δραστηριότητας νόσο ή πτωχή ανταπόκριση στη θεραπεία με INF-β Συμπεριλήφθησαν 434 ασθενείς (Πίνακας 11). Στην πλειοψηφία τους ήταν γυναίκες 306/434, ενώ οι άνδρες ήταν 128/434. Το εύρος ηλικίας ήταν έτη (μέσος όρος ηλικίας 38,21 έτη). Η κατανομή των ασθενών στα 3 σκευάσματα ιντερφερόνης-β ήταν ως εξής: 142 ασθενείς έλαβαν IFN-β-1a im, 123 έλαβαν IFN-β- 1a sc και 169 βρίσκονταν υπό IFN-β-1b. Στην υποομάδα Α1 συναντήθηκαν 57 ασθενείς υπό IFN-β-1a im, 50 ασθενείς υπό IFN-β-1a sc και 55 ασθενείς υπό IFN-β- 1b. Η κατανομή των IFN-β-1a im, IFN-β-1a sc και IFN-β-1b στην υποομάδα Β ήταν 85, 115 και 72 ασθενείς αντίστοιχα. Πίνακας 11. Δημογραφικά και περιγραφικά στοιχεία των ασθενών που περιελήφθησαν στη μελέτη Σύνολο ασθενών (No:434) Φύλο (Θ/Α) 306:128 Ηλικία 38.2 (εύρος 15-69) Nabs+ 195/434 (44,93%) Babs + 213/434 (48,15%) Nabs+/Babs+ 123/434 (28,34%) Nabs+/Babs- 64/434 (14.74%) Nabs-/Babs+ 88/434 (20,27%) Nabs-/Babs- 146/434 (33,64%) 5.2. Η συχνότητα εμφάνισης των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Ανεξάρτητα από το χορηγούμενο σκεύασμα ιντερφερόνης-β, 195/434 (44.93%) παρουσίασαν θετικούς τίτλους Nabs, ενώ 237/434 (54,60%) δεν εμφάνισαν εξουδετερωτικά αντισώματα. Υπήρχαν 2/434 (0,46%) χαμένα δεδομένα οπού ως χαμένα δεδομένα ορίζονται δείγματα ασθενών που ήταν ανεπαρκή σε ποσότητα 250

251 ώστε να εκτελεστεί η μέθοδος. (Σχήμα 13Α). Στο σύνολο των ασθενών με θετικούς τίτλους Nabs οι 3 ιντερφερόνες (IFN-β-1a im, IFN-β-1a sc και IFN-β-1b) συμμετείχαν κατά 57/195 (28,23%), 53/195 (27,17%) και 85/195 (43,58%) αντίστοιχα (Σχήμα 14Α). Α B Σχήμα 13: Επίπτωση των (Α) Nabs-θετικών και Nabs-αρνητικών δειγμάτων και (Β) των Babs-θετικών και Babs-αρνητικών δειγμάτων στο σύνολο των ασθενών που περιελήφθησαν στη μελέτη Από την υποανάλυση στα 3 σκευάσματα IFN-β, προέκυψε ότι τα ποσοστά στους θετικούς και αρνητικούς τίτλους και τα χαμένα δεδομένα διαμορφώθηκαν ως εξής: 57/142 (40,14%), 85/142 (59,85%) και 0/142 για την IFN-β-1a im. Τα αντίστοιχα 251

252 ευρήματα για την INFβ-1a sc είχαν ως ακολούθως: 53/123 (43,08%), 69/123 (56,09%) και 1/123 (0,81%). Η INFβ-1b παρουσίασε 85/169 (50,29%) θετικούς τίτλους, 83/169 (49,11%) αρνητικούς τίτλους και 1/169 (0,59%) χαμένα δεδομένα. Η αξιολόγηση των τίτλων των συνδετικών αντισωμάτων στο σύνολο των ασθενών ανεξάρτητα από το σκεύασμα IFN-β ανέδειξε ότι 213/434 (49,07%) ασθενείς παρουσίασαν θετικούς τίτλους, 209/434 (48,15%) αρνητικούς και 12/434 (2,76%) χαμένα δεδομένα (Σχήμα 13Β). Στο σύνολο των ασθενών με θετικούς τίτλους Babs οι 3 ιντερφερόνες (IFN-β-1a im, INFβ-1a sc και INFβ-1b) συμμετείχαν κατά 60/213 (28,16%), 48/213 (22,53%) και 105/213 (49,29%) αντίστοιχα (Σχήμα 14Β). A Β Σχήμα 14: Συμμετοχή των σκευασμάτων IFN-β στους ασθενείς με θετικό τίτλο (Α) Nabs και (Β) Babs 252

253 Από την υποανάλυση στα 3 σκευάσματα IFN-β, προέκυψε ότι τα ποσοστά στους θετικούς και αρνητικούς τίτλους Babs και τα χαμένα δεδομένα διαμορφώθηκαν ως εξής: 60/142 (42,25%), 79/142 (55,63%) και 3/142 (2,11%) για την IFN-β-1a im. Τα αντίστοιχα ευρήματα για την IFN-β-1a sc είχαν ως ακολούθως: 48/123 (39,02%), 70/123 (56,91%) και 5/123 (4,06%). Η IFN-β-1b παρουσίασε 105/169 (62,13%) θετικούς τίτλους, 62/169 (36,68%) αρνητικούς τίτλους και 2/169 (0,11%) χαμένα δεδομένα. Για την υποομάδα Α1, το ποσοστό των Nabs θετικών δειγμάτων ήταν 79/162 (48,76%) και των Nabs αρνητικών 83/162 (51,23%) (Σχήμα 15Α). Αναφορικά με τα 3 προϊόντα IFN-β, το ποσοστό των ασθενών υπό IFN-β-1a im που ανέπτυξαν Nabs ήταν 22/79 (27,84%), για την INF-β-1a sc 21/79 (26,58%) ασθενείς και για την INF-β- 1b 36/79 (45,56%) παρουσίασαν εξουδετερωτικά αντισώματα (Σχήμα 16Α). Αναλύοντας το κάθε σκεύασμα INF-β ξεχωριστά, βρέθηκε ότι η IFN-β-1a im παρουσίασε θετικούς και αρνητικούς τίτλους Nabs σε ποσοστά 22/57 (38,59%) και 35/57 (61,40%) αντίστοιχα. Τα ποσοστά για την INF-β-1a sc διαμορφώθηκαν σε 21/50 (42%) και 29/50 (58%). Η INF-β-1b πυροδότησε θετικά Nabs σε 36/55 (65,45%) ασθενείς, ενώ 19/55 (34,54%) δεν ανέπτυξαν Nabs. 253

254 Α Β Σχήμα 15: Επίπτωση των (Α) Nabs-θετικών και Nabs-αρνητικών δειγμάτων και (Β) των Babs-θετικών και Babs-αρνητικών δειγμάτων στο σύνολο των ασθενών της υποομάδας Α1. Για την ίδια ομάδα τα ποσοστά των θετικών και αρνητικών Babs διαμορφώθηκαν ως εξής: 77/162 (47,53%) και 85/162 (52,46%) αντίστοιχα (Σχήμα 15Β). Στη συνέχεια, διεξήχθη υποανάλυση στους θετικούς τίτλους για τα 3 σκευάσματα INF-β, IFN-β-1a im, INF-β-1a sc και INF-β-1b, και βρέθηκε ότι 23/77 (29,87%), 17/77 (22,07%) και 37/77 (48,05%) παρουσίασαν Babs+ αντίστοιχα (Σχήμα 16Β). Αναλύοντας το κάθε σκεύασμα INF-β ξεχωριστά, βρέθηκε ότι η IFN-β-1a im παρουσίασε θετικούς και αρνητικούς τίτλους Babs σε ποσοστά 23/57 (40,35%) και 254

255 34/57 (59,64%) αντίστοιχα. Τα ποσοστά για την INF-β-1a sc διαμορφώθηκαν σε 17/50 (34%) και 33/50 (66%). Η INF-β-1b πυροδότησε θετικά Babs σε 27/55 (49,09%) ασθενείς, ενώ 18/55 (32,72%) δεν ανέπτυξαν Babs. A B Σχήμα 16: Απεικονίζονται τα ποσοστά συμμετοχής του κάθε σκευάσματος IFN-β στο σύνολο των (Α) Nabs-θετικών και (Β) των Babs-θετικών δειγμάτων της υποομάδας Α1. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων από τα δείγματα της υποομάδας Β έδειξε ότι τα Nabs+ στο σύνολο των 272 δειγμάτων ήταν 113/272 (41,54%), ενώ το ποσοστό των Nabs- ανήλθε σε 151/272 (55,51%) (Σχήμα 17Α). Στο σύνολο των θετικών για τις 3 255

256 INF-β, IFN-β-1a im, INF-β-1a sc και INF-β-1b, τα ποσοστά των Nabs+ δειγμάτων διαμορφώθηκαν σε 36/113 (31,85%), 27/113 (23,89%) και 50/113 (44,24%) αντίστοιχα (Σχήμα 18Α). A B Σχήμα 17: Η συχνότητα εμφάνισης των (Α) Nabs-θετικών και Nabs-αρνητικών δειγμάτων και (Β) των Babs-θετικών και Babs-αρνητικών δειγμάτων στο σύνολο των ασθενών της υποομάδας Β. 256

257 Λαμβάνοντας υπ όψιν την IFN-β-1a im θετικοί και αρνητικοί τίτλοι Nabs βρέθηκαν σε 36/85 (42,35%) και 48/85 (56,47%) αντίστοιχα. Τα ποσοστά για την INF-β-1a sc διαμορφώθηκαν σε 27/72 (37,50%) και 40/72 (55,55%) αντίστοιχα. Η INF-β-1b προκάλεσε την ανάπτυξη θετικών και αρνητικών τίτλων Nabs σε 50/115 (43,47%) και 63/115 (54,78%) αντίστοιχα. Για την υποομάδα Β, Babs+ δείγματα βρέθηκαν σε 138/272 (50,73%) και Babs- σε ποσοστό 134/272 (49,26%) (Σχήμα 17Β). Οι θετικοί Babs τίτλοι κατανεμήθηκαν στις IFN-β-1a im, INF-β-1a sc και INF-β-1b ως εξής: 39/138 (28,26%), 30/138 (21,73%) και 69/138 (50,00%) αντίστοιχα (Σχήμα 18Β). Αναλύοντας το κάθε σκεύασμα INF-β για την υποομάδα Β ξεχωριστά, βρέθηκε ότι η IFN-β-1a im παρουσίασε θετικούς και αρνητικούς τίτλους Babs σε ποσοστά 39/85 (45,88%) και 45/85 (52,94%) αντίστοιχα. Τα ποσοστά για την INF-β-1a sc διαμορφώθηκαν σε 30/72 (41,66%) και 37/72 (51,38%). Η INF-β-1b πυροδότησε θετικά Babs σε 69/115 (60,00%) ασθενείς, ενώ 44/115 (38,26%) δεν ανέπτυξαν Babs. 257

258 A Σχήμα 18: Το διάγραμμα αναπαριστά τα ποσοστά συμμετοχής του κάθε σκευάσματος IFN-β στο σύνολο των (Α) Nabs-θετικών και (Β) των Babs-θετικών δειγμάτων της υποομάδας Β. B 5.3. Διαχωρισμός των ασθενών ανάλογα με τον φαινότυπο συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Ο συσχετισμός ανάμεσα στην κατάσταση των τίτλων των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων ανέδειξε 4 ομάδες ασθενών. Nabs+/Babs+, Nabs- /Babs-, Nabs-/Babs+, και Nabs+/Babs-. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι 258

259 124/434 (28,34%) ασθενείς παρουσίασαν Nabs+/Babs+, 146/434 (33,64%) είχαν Nabs-/Babs-, 88/434 (20,27%) εμφάνισαν Nabs-/Babs+ και 64/434 (14,74%) ανήκαν στην ομάδα Nabs+/Babs- (Σχήμα 19Α). Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων όσον αφορά στα 3 σκευάσματα IFN-β έδειξε ότι τα αντίστοιχα ποσοστά για τις 4 ομάδες ασθενών (Nabs+/Babs+, Nabs-/Babs-, Nabs-/Babs+, και Nabs+/Babs-) έχουν ως εξής: για την IFN-β-1a im 32/123 (26,01%), 56/146 (38,85%), 28/88 (31,81%) και 23/64 (35,93%). Για την IFN-β-1a sc τα αντίστοιχα στοιχεία διαμορφώθηκαν ως ακολούθως: 29/123 (23,57%), 49/146 (33,56%), 18/88 (20,45%) και 20/64 (31,25%). Τα αποτελέσματα για την IFN-β-1b είχαν ως εξής: 62/123 (50,40), 41/146 (28,08%), 41/88 (46,59%) και 21/64 (32,81%) αντίστοιχα (Σχήμα 19Β). 259

260 A B Σχήμα 19: Συσχετισμός ανάμεσα στην κατάσταση των Nabs και των Babs και η κατανομή των ασθενών (Α) ανεξάρτητα από το σκεύασμα IFN-β και (Β) με βάση το θεραπευτικό σχήμα, στις 4 υποομάδες που προκύπτουν (1. Nabs+/Babs+, 2. Nabs- /Babs-, 3. Nabs-/Babs+, 4. Nabs+/Babs-) Η ανάλυση των αποτελεσμάτων για την υποομάδα Α1 έδειξε ότι στο σύνολό της τα ποσοστά στους 4 φαινότυπους Nabs/Babs όπως αναφέρθηκαν πιο πάνω, αναπτύχθηκαν ως εξής: 58/162 (35,80%), 64/162 (39,50%), 19/162 (11,72%) και 260

261 21/162 (12,96%) αντίστοιχα (Σχήμα 20Α). Στην υποανάλυση για την IFN-β-1a im τα ποσοστά διαμορφώθηκαν σε 15/57 (26,32%), 27/57 (47,37%), 8/57 (14,03%) και 7/57 (12,28%). Τα αποτελέσματα για την IFN-β-1a sc ήταν 14/50 (28%), 26/50 (52%), 3/50 (6%) και 7/50 (14%) αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα ποσοστά για την IFN-β-1b είχαν ως εξής: 29/55 (52,73%), 11/55 (20%), 8/55 (14,54%) και 7/55 (12,73%) (Σχήμα 20Β). Α Σχήμα 20: Συσχετισμός ανάμεσα στην κατάσταση των Nabs και των Babs και η κατανομή των ασθενών της υποομάδας Α1 (Α) ανεξάρτητα από το σκεύασμα IFN-β και (Β) βάσει του θεραπευτικού σχήματος, στις 4 ομάδες που προκύπτουν (1. Nabs+/Babs+, 2. Nabs-/Babs-, 3. Nabs-/ Babs+, 4. Nabs+/Babs-). B 261

262 Ο συσχετισμός ανάμεσα στην κατάσταση των τίτλων των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων στο σύνολο των ασθενών της υποομάδας Β ανέδειξε ότι 69/272 (25,36%), 82/272 (30,14%), 69/272 (25,36%) και 44/272 (16,17%) παρουσίασαν Nabs+/Babs+, Nabs-/Babs-, Nabs-/Babs+ και Nabs+/Babsαντίστοιχα (Σχήμα 21Α). Αναλύοντας ξεχωριστά το κάθε σκεύασμα IFN-β, βρέθηκε ότι για την IFN-β-1a im τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 19/85(22,35%), 28/85(32,94%), 20/85(23,53%) και 17/85(20%). Η IFN-β-1a sc παρουσίασε τα εξής αποτελέσματα: 14/72(19,44%), 24/72 (33,33%), 16/72 (22,22%) και 13/72 (18,06%) αντίστοιχα. Επιπλέον για την IFN-β-1b παρατηρήθηκαν 36/115(31,30%), 30/115 (26,08%), 33/115(28,69%) και 14/115(12,17%) αντίστοιχα (Σχήμα 21Β). 262

263 A B Σχήμα 21: Συσχετισμός ανάμεσα στην κατάσταση των Nabs και των Babs και η κατανομή των ασθενών της υποομάδας Β (Α) ανεξάρτητα από το σκεύασμα IFN-β και (Β) βάσει του θεραπευτικού σχήματος, στις 4 ομάδες που προκύπτουν (1. Nabs+/Babs+, 2. Nabs-/Babs-, 3. Nabs-/ Babs+, 4. Nabs+/Babs-). 263

264 5.4. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών σε υποτροπή υπό θεραπεία με ενδοφλέβια μεθύλ-πρεδνιζολόνη Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται περιληπτικά στον πίνακα 12. Εξήντα ασθενείς ικανοποίησαν τα κριτήρια εισαγωγής στη μελέτη. Η μέση ηλικία ήταν 35,5 (εύρος έτη), 42 ασθενείς ήταν θήλεα και 18 άρρενες. Η μέση διάρκεια νόσου ήταν 9,6 χρόνια (εύρος 1-7,5 χρόνια). Την πρώτη ημέρα της θεραπείας η μέση βαθμολογία της EDSS ήταν 4.54 (εύρος ). Από τους 60 ασθενείς οι 17 υποβάλλονταν σε θεραπεία με ενδομυϊκά χορηγούμενη IFN-β-1a (IFN-β-1a im) 30μg μία φορά εβδομαδιαίως, 11 βρίσκονταν υπό υποδορίως χορηγούμενη IFN-β-1a (IFN-β-1a sc) 44 μg τρεις φορές εβδομαδιαίως και τέλος 32 ασθενείς υποβάλλονταν σε υποδορίως χορηγούμενη IFN-β-1b 250 μg μέρα παρά μέρα. Η ανάλυση των συμπτωμάτων των υποτροπών αποκάλυψε ότι στην πλειοψηφία τους ήταν κινητικά και στη συνέχεια, σε ίση περίπου συχνότητα, περιγράφονται αισθητικές διαταραχές και συμπτώματα παρεγκεφαλιδικής δυσλειτουργίας. Σε μικρότερο ποσοστό συναντήθηκε ορθοκυστική δυσλειτουργία, οπισθοβολβική νευρίτιδα και συμπτώματα βλάβης του στελέχους. Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν από την ανάλυση των συμπτωμάτων όσον αφορά στις τρεις ιντεφερόνες. 264

265 Πίνακας 12. Δημογραφικά και περιγραφικά στοιχεία των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με ΕΦΜΠ IFN-β-1b (n=32) IFN-β-1a im (n=17) IFN-β-1a sc (n=11) Φύλο (Θ:Α) 21:11 12:5 9:2 Ηλικία 35.1±9.9 (23-66) 37.3±12.0 (20-60) 34.3±8.1 (20-49) EDSS (ημέρα 0) μ.ο.=4.5( ) μ.ο.=4.0 ( ) μ.ο.=4.5 ( ) Διάρκεια νόσου (έτη) 2-28 (8.9±7.1) (11.7±8.2) (9.7±6.5) Διάρκεια θεραπείας (έτη) 1-8 (3.0±1.8) (2.7±2.4) (2.5±1.6) Nabs+ (ημέρα 0) 28 (87.5%) 9 (52.9%) 7 (63.6%) Υψηλοί τίτλοι Nabs (ημέρα 0) 9/27 (33.33%) 2/9 (22.22%) 4/8 (50.0%) Babs + (ημέρα 0) 18/32 (56.25%) 8/17 (47.05%) 7/10 (70.00%) Υψηλοί τίτλοι Babs (ημέρα 0) 0 2/17 (11.76%) 2/10 (20.00%) Babs+/Nabs+ 16/32 (50.00%) 3/17 (17.64%) 6/10 (60.00%) Υψηλοί τίτλοι Babs/ Υψηλοί 0 0 1/11 (9.09%) τίτλοι Nabs Babs-/Nabs+ 12/32 (37.50%) 6/17 (35.29%) 1/10 (10.00%) ΔEDSS (ημέρα 1-ημέρα 5) -11.7±14.3% -7.5±15.9% -7.9±9.4% ΔEDSS (ημέρα 0-ημέρα 30) -16.9±18.1% -19.6±18.4% -20.6±22.1% Σημείωση: μ.ο.=μέσος όρος 5.5. Οι τίτλοι των συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων πριν τη χορήγηση της κορτιζόνης Ανεξάρτητα από το σκεύασμα της ιντερφερόνης που χρησιμοποιήθηκε, την πρώτη ημέρα της θεραπείας, 44/60 (73,3%) ασθενείς παρουσίασαν θετικό τίτλο Nabs, ενώ 16/60 (26,7%) ήταν οροαρνητικοί. Η υποανάλυση για τις 3 ιντερφερόνες έδειξε ότι 9/17 (52.9%), 8/11 (72.7%) και 27/32 (84.4%) ασθενείς υπό αγωγή με IFNβ-1a im, INFβ-1a sc και INFβ-1b αντίστοιχα ήταν Nabs+ (Σχήμα 22Α). Ανάμεσα στους Nabs+ ασθενείς 2/9 (22.2%), 4/8 (50.0%) και 9/27 (33.3%) για τις ιντερφερόνες IFNβ-1a im, INFβ-1a sc και INFβ-1b αντίστοιχα, παρουσίασαν υψηλούς τίτλους, γεγονός 265

266 που υποδηλώνει μια τάση για υψηλότερη αντιγονικότητα κυρίως για την INFβ-1a sc (Multinomial Logistic Regression, p=0.065) (Σχήμα 22Ε). Παρ όλα αυτά, το σκεύασμα της ιντερφερόνης που χρησιμοποιήθηκε δεν επηρέασε τη μέση τιμή των αρχικών τίτλων των εξουδετερωτικών αντισωμάτων. (IFN-β-1a im=97.3±40.6, INFβ- 1a sc=101.2±33.2, INFβ-1b=134.7±28.9; Kruskal-Wallis test p>0.05) (Σχήμα 22Γ). Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων των υψηλών τίτλων Nabs (11/15) η διάρκεια θεραπείας ήταν ανάμεσα στα 2 και 3 έτη. Στο υπόλοιπο των περιπτώσεων η διάρκεια ήταν 1, 1,5, 3,5 και 7,5 έτη. Η εξέταση των Babs την πρώτη ημέρα της υποτροπής έδειξε ότι 33/59 (55,9%) ασθενείς είχαν θετικό τίτλο αντισωμάτων, ενώ 26/59 (44,1%) παρουσίασαν αρνητικό τίτλο. Επιπλέον, διενεργήθηκε υποανάλυση για την κατανομή των Babs στις τρεις ιντερφερόνες, η οποία αποκάλυψε μη στατιστικά σημαντική τάση για μεγαλύτερη αντιγονικότητα των δύο υποδορίως χορηγούμενων ιντερφερονών και ειδικότερα της INFβ-1a sc [IFN-β-1a im 8/17 (47.05%), INFβ-1a sc 7/10 (70.0%) και INFβ-1b 18/32 (56.25%) (Σχήμα 22Β); Multinomial Logistic Regression, p=0.079]. Υψηλοί τίτλοι Babs εμφανίστηκαν σε 4/33 (12,12%) ασθενείς (IFN-β-1a im 2/17 [11.76%] και INFβ-1a sc 2/10 [20.0%]). Επιπρόσθετα, η εξέταση των θετικών τίτλων Babs στο σύνολο τους έδειξε τάση υπεροχής των INFβ-1a sc και IFN-β-1a im για υψηλότερους τίτλους (IFN-β-1a im=263.4±130.5, INFβ-1a sc=208.7±92.6, INFβ- 1b=90.3±22.1; Kruskal-Wallis test p>0.05) (Σχήμα 22Δ). Η συσχέτιση ανάμεσα στην κατάσταση των Babs και Nabs (εκτίμηση Nabs/Babs θετικότητας) έδειξε ότι 25/59 (42,4%) ήταν Nabs+/Babs+. Το σκεύασμα ιντερφερόνης που χρησιμοποιήθηκε επηρέασε σημαντικά την αντιγονικότητα [IFNβ-1a im 3/17 (17.6%), INFβ-1a sc 6/10 (60.0%) και INFβ-1b 16/32 (50.0%) (Πίνακας 11); Binary Logistic Regression, p=0.050] καταδεικνύοντας την IFN-β-1a im ως τη λιγότερο αντιγονική. Περίπου το ένα τρίτο των Nabs+/Babs+ ασθενών (9/25) εμφάνισαν υψηλούς τίτλους Nabs (>100), από τους οποίους οι 5 ήταν υπό αγωγή με INFβ-1b και οι 4 υπό INFβ-1a sc (Binary Logistic regression, p>0.05). Παρατηρήθηκαν 19/59 (32,20%) δείγματα ασθενών που παρουσίασαν θετικό τίτλο Nabs και αρνητικά Babs. Η συμμετοχή των 3 προϊόντων INFβ ( IFN-β-1a im, INFβ-1a sc, INFβ- 1b) διαμορφώθηκε ως εξής: 6/17 (35.29%), 1/10 (10%) και 12/32 (37.50%) 266

267 αντιστοίχως (Πίνακας 11). Επιπλέον, υπήρχε ένας ασθενής με υψηλό τίτλο Babs και υψηλό τίτλο Nabs υπό θεραπεία με INFβ-1a sc. Babs Θετικοί Γ Δ Σχήμα 22: Σχηματική αναπαράσταση της κατανομής των (Α) Nabs θετικών και (Β) Babs θετικών τίτλων ανάμεσα στα 3 σκευάσματα INFβ. Οι παραστάσεις (Γ) και (Δ) απεικονίζουν τη μέση τιμή των τίτλων Nabs στους Nabs θετικούς ασθενείς και των τίτλων Babs στους Babs θετικούς ασθενείς, αντίστοιχα. Το διάγραμμα (Ε) παρουσιάζει τη συχνότητα εμφάνισης των υψηλών τίτλων Nabs στα 3 σκευάσματα INFβ. 267

268 5.6. Αλλαγές στους τίτλους των Nabs και Babs μετά τη χορήγηση της ΕΦΜΠ Η θεραπεία της υποτροπής με ΕΦΜΠ οδήγησε σε σημαντική μείωση του τίτλων των Nabs (Kruskal-Wallis test, p<0.05) των ασθενών. Ειδικότερα, η δράση αυτή της κορτιζόνης εμφανίζεται την πέμπτη ημέρα της θεραπείας (-5.7±10.4%), κορυφώνεται 1 μήνα μετά (-39.4±8.6%; Mann-Whitney U test p<0.01) και παραμένει σταθερή στους 6 μήνες παρακολούθησης (-23.2±14.5%; Mann-Whitney U test p>0.05) (Σχήμα 23Β). Το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στους ασθενείς με θετικό τίτλο Nabs, τις χρονικές στιγμές πέμπτη ημέρα (-3.9±12.8%), 1 (-44.3±10.4%) και 6 μήνες (-33.1±19.8%) μετά το πέρας της θεραπείας (Σχήμα 23Γ). Η μέση τιμή των τίτλων των Babs στο σύνολο των ασθενών έδειξαν παρόμοια τάση αλλαγής (σε κάποιους ασθενείς μειώθηκε ο τίτλος, ενώ σε άλλους αυξήθηκε) τις αντίστοιχες χρονικές στιγμές, αλλά δεν παρουσίασε στατιστική σημαντικότητα. (Kruskal-Wallis test, p>0.05; Σχήμα 23Α). Παρομοίως, οι τίτλοι των θετικών Babs παρουσίασαν μείωση μη στατιστικά σημαντική (Kruskal-Wallis test, p>0.05) στο πέρας της θεραπείας με ΕΦΜΠ έως και 1 μήνα μετά (-38.4±23.4% και -69.7±17.4%, αντίστοιχα), ενώ παρατηρήθηκε ήπια αύξηση στους 6 μήνες επανελέγχου (11.4±74.7%). Οι αλλαγές των τίτλων των συνδετικών αντισωμάτων παρουσίασαν μεγάλη ποικιλομορφία τις διάφορες χρονικές στιγμές για τον κάθε ασθενή ξεχωριστά ("min to max" % για τις 3 χρονικές στιγμές: -100 έως 622%, -100 έως 184% και -100 έως 684% για τις 3 διαδοχικές χρονικές στιγμές). Διενεργήθηκε υποανάλυση η οποία αποκάλυψε ότι οι ρυθμοί μείωσης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων την πέμπτη ημέρα της θεραπείας με ΕΦΜΠ είχαν την τάση να εξαρτώνται από το σκεύασμα της ιντερφερόνης (IFN-β-1a im= - 7.7±27.3%, INFβ-1a sc = -57.3±8.9%, INFβ-1b= -10.5±15.7%), χωρίς όμως να παρουσιάζει στατιστική σημαντικότητα (Kruskal-Wallis test, p>0.05; Σχήμα 23Δ). Στον επανέλεγχο των ασθενών την 30 η ημέρα της θεραπείας σημειώθηκε μείωση των θετικών τίτλων Nabs, ανεξάρτητα από το σκεύασμα IFN-β (IFN-β-1a im= ±20.5%, INFβ-1a sc= -43.2±37.9%, INFβ-1b= -61.5±5.3%; Kruskal-Wallis test, p>0.05) (Σχήμα 23E). 268

269 Οι αντίστοιχες αλλαγές των τίτλων των συνδετικών αντισωμάτων ποικίλε σημαντικά ανάμεσα στους ασθενείς, αλλά δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά ανάμεσα στα τρία σκευάσματα ιντερφερόνης που εξετάστηκαν (p>0.05). Γ Δ Ημέρα 30 Ημέρα 5 Σχήμα 23: (Α) Διαγραμματική αναπαράσταση των μεταβολών, εκφρασμένων σε ποσοστά, των τίτλων Babs μετά την εφαρμογή της 5ημερης θεραπείας με ΕΦΜΠ στις χρονικές στιγμές ημέρα 5 η, 30 η και 180 η. Οι παραστάσεις (Β) και (Γ) απεικονίζουν τις αλλαγές των τίτλων Nabs στο σύνολο των ασθενών και στο υποσύνολο των Nab-θετικών ασθενών αντίστοιχα, κατά την παρακολούθησή τους την ημέρα 5 η, 30 η και 180 η μετά τη χορήγηση της ΕΦΜΠ. Τα διαγράμματα (Δ) και (Ε) 269

270 παρουσιάζουν τις μεταβολές των τίτλων Nabs στα 3 προϊόντα IFN-β, τις ημέρες 5 και 30 μετά την εφαρμογή της ΕΦΜΠ αντίστοιχα Ο αρχικός τίτλος των Nabs και Babs καθορίζει την ανταπόκρισή τους στην ΕΦΜΠ Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι ο αρχικός τίτλος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων καθόριζε την κινητική τους την πέμπτη ημέρα της θεραπείας με ΕΦΜΠ (odds ratio statistics, Mantel-Haenszel chi-square, p<0.05) και αυτό το φαινόμενο διατηρήθηκε στον 1 μήνα επανελέγχου, παρ όλο που δεν κατέγραψε στατιστική σημαντικότητα (odds ratio statistics, Mantel-Haenszel chi-square, p>0.05). Επομένως στις περιπτώσεις οπού ο τίτλος των Nabs κυμαίνονταν ανάμεσα στις NU/mL, παρουσίασε είτε μείωση είτε αύξηση, ενώ όταν αυτοί υπερέβαιναν τις 100NU/mL η αλλαγή είχε πάντα πτωτική πορεία (Σχήμα 24). Επιπρόσθετα, η δράση της ΕΦΜΠ είχε ως αποτέλεσμα τη μεταβολή 24/42 (57,1%) των Nabs θετικών τίτλων σε Nabs αρνητικούς, για το χρονικό διάστημα του 1 μηνός μετά το πέρας της θεραπείας. Αυτή η δράση είχε σημαντική συσχέτιση με τους αρχικούς τίτλους των Nabs (χαμηλοί ή υψηλοί τίτλοι) με 9,445 (95% CI ) odds ratio, δείχνοντας ότι οι χαμηλοί τίτλοι Nabs είχαν μεγαλύτερες πιθανότητες να αρνητικοποιηθούν συγκριτικά με τους υψηλούς τίτλους (Cochran's odds ratio statistic test, p<0.005). Επιπλέον, η πλειοψηφία των υψηλών τίτλων Nabs (60%) παρέμειναν υψηλοί ακόμα κι αν μειώθηκε η τιμή τους στον 1 μήνα επανελέγχου. Το σκεύασμα INFβ που χρησιμοποιήθηκε δεν είχε καμία επίδραση στη συμπεριφορά των τίτλων των Nabs, 1 μήνα μετά το τέλος της ΕΦΜΠ (chi-square test, p>0.05). 270

271 Σχήμα 24: Τα scatterplots (Α) και (Β) υποδεικνύουν ότι τίτλοι Nabs ανάμεσα στις NU/mL είτε αυξάνονται είτε μειώνονται μετά τη χορήγηση της ΕΦΜΠ, ενώ όταν οι τίτλοι υπερβαίνουν τις 100NU/mL η αλλαγή που σημειώνεται είναι μόνο η ελάττωσή τους τις ημέρες 5 και 30 αντίστοιχα Ο κλινικός αντίκτυπος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων Όσον αφορά στις κλινικές προεκτάσεις της παρουσίας των Nabs, οι ασθενείς που ανέπτυξαν Nabs είχαν την τάση να υποφέρουν από μεγαλύτερης βαρύτητας υποτροπή, όπως καταγράφεται από την αλλαγή της βαθμολογίας στην κλίμακα EDSS (ΔEDSS= 22.5±9.2% και 29.9±5.1% για τους Nabs- και Nabs+ ασθενείς αντίστοιχα, p>0.05; Σχήμα 25Α). Σε αυτές τις περιπτώσεις, η αντιμετώπιση της υποτροπής με ε.φ. χορήγηση ΜΠ κατέληξε σε καλύτερη αποκατάσταση των συμπτωμάτων την πέμπτη (ΔEDSS = -4.3±2.0% και -10.9±2.4% αντίστοιχα, Mann- Whitney U test, p>0.05) και την τριακοστή ημέρα της θεραπείας (ΔEDSS = ±7.0% και -20.4±3.5% αντίστοιχα, Mann-Whitney U test, p>0.05) (Σχήμα 25Β,Γ). 271

272 Γ Σχήμα 25: Διαγραμματική αναπαράσταση των ποσοστιαίων μεταβολών της κλίμακας αναπηρίας EDSS (Α) λόγω της υποτροπής, (Β) την ημέρα 5 και (Γ) την ημέρα 30 της παρακολούθησης μετά την εφαρμογή της θεραπείας ΕΦΜΠ στους Nabs-θετικούς και Nabs-αρνητικούς ασθενείς Σύγκριση μεθόδων ανίχνευσης συνδετικών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων Τα αποτελέσματα από τη διενέργεια της έμμεσης ELISA ήταν αρνητικά για την παρουσία συνδετικών αντισωμάτων. Αντίθετα η μέθοδος ανοσοστυπώματος κατά Western έδειξε ότι 49/64 (76,56%) δείγματα αποδείχτηκαν θετικά και 15/64 (23,43%) δείγματα ήταν αρνητικά. (Σχήμα 26) Η επανεξέταση των θετικών δειγμάτων Babs με τη μέθοδο ανοσοστυπώματος κατά Western επιβεβαίωσε τη θετικότητά τους στο σύνολό τους (100%). (Σχήμα 27) Επανεξετάστηκαν 15 δείγματα με θετικό τίτλο και 15 δείγματα με αρνητικό τίτλο Nabs, όπως χαρακτηρίστηκαν με την εφαρμογή της μεθόδου του κυτταροπαθολογικού φαινομένου, με τη μέθοδο της Real-Time-PCR. Η Real-Time- PCR επιβεβαίωσε με σαφήνεια τα αποτελέσματα στο σύνολο των δειγμάτων που αναλύθηκαν (100.00%). Ακολούθως παραθέτονται οι πρότυπες καμπύλες της IFN-β που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των συνδετικών αντισωμάτων με τη μέθοδο τη ELISA (Σχήμα 28), καθώς και των εξουδετερωτικών αντισωμάτων με τη μέθοδο του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (Σχήμα 29) και της Real time PCR (Σχήμα 30). Επίσης, απεικονίζεται παράδειγμα χαρακτηριστικών καμπυλών πολλαπλασιασμού δειγμάτων υπό διερεύνηση, με τη μέθοδο της ποσοτικής real-time PCR (Σχήμα 31). 272

273 Σχήμα 26: Διαγραμματική παράσταση των αποτελεσμάτων της μεθόδου WB σε δείγματα ασθενών που είχαν χαρακτηριστεί αρνητικά με τη χρήση της έμμεσης ELISA. Η 1η ράβδος απεικονίζει το ποσοστό των θετικών και η 2η το ποσοστό των αρνητικών αποτελεσμάτων. 273

274 Σχήμα 27: Μέθοδος ανοσοστυπώματος κατά Western. Απεικονίζονται οι λωρίδες, η κάθε μια των οποίων αντιστοιχεί σε διαφορετικό ασθενή. Η πρώτη λωρίδα είναι ο δείκτης μοριακού βάρους (molecular weight marker). Οι επόμενες 2 παριστούν αρνητικό αποτέλεσμα, ενώ οι επόμενες αποκαλύπτουν τις ζώνες στην περιοχή του μοριακού βάρους για την INFβ του θετικού μάρτυρα. Η παρουσία των ζωνών σημαίνει ότι στον ορό του ασθενούς υπήρχε αντίσωμα το οποίο συνδέθηκε με την INFβ. Το 2 ο αντίσωμα που προστέθηκε με τη βοήθεια του χρωμογόνου αποκαλύπτουν τη σύνδεση INFβ-Bab. 274

275 Σχήμα 28: Το διάγραμμα αναπαριστά χαρακτηριστικό παράδειγμα πρότυπης καμπύλης της IFN-β όπως προκύπτει από τη μέθοδο ανίχνευσης των Babs με ELISA. Η καμπύλη χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων υπό διερεύνηση 275

276 Σχήμα 29: Πρότυπη καμπύλη IFN-β όπως προκύπτει από τις διαδοχικές διαλύσεις της IFN-β κατά τη μέθοδο του κυτταροπαθολογικού φαινομένου. Οι μετρήσεις που χρησιμοποιούνται είναι απορροφήσεις σε μήκος κύματος 620nm. 276

277 Σχήμα 30: Στο σχήμα απεικονίζεται παράδειγμα πρότυπης καμπύλης της IFN-β όπως προκύπτει από τη μέτρηση Nabs έναντι της IFN-β με τη μέθοδο της ποσοτικής realtime PCR. Στον x άξονα απεικονίζονται οι διαλύσεις της IFN-β, ενώ στον y το 2(-ΔCT), όπως προκύπτει από την ανάλυση των αποτελεσμάτων (CT values) της real-time PCR. 277