ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ"

Transcript

1 AΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΑΪΚΟΥΣΗ ΧΑΡΙΚΛΕΙΑ Γεωπόνος Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θεσσαλονίκη 2009

2

3 ΒΑΪΚΟΥΣΗ ΧΑΡΙΚΛΕΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Τομέας Επιστήμης & Τεχνολογίας Τροφίμων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 11 Ιουνίου, 2009 Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής Αν. Καθ. Αν. Καθ. Κ. Μπιλιαδέρης, Επιβλέπων Β. Κιοσέογλου, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Δ. Γερασόπουλος, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Επίκ. Καθ. Καθηγητής Επικ. Κάθ. Αν. Καθ. Κ. Κουτσουμανής, Εξεταστής Χ. Λαζαρίδης, Εξεταστής Ν. Στοφόρος, Εξεταστής Π. Ταούκης, Εξεταστής

4 Βαϊκούση Χαρίκλεια Α.Π.Θ. Ανάπτυξη και Εφαρμογή Κινητικών Μεθόδων Εκτίμησης της Ποιότητας των Τροφίμων ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Aριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2)

5 Στην εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής ιδιαίτερη ήταν η συνεισφορά του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ) με τη χορήγηση υποτροφίας στην υποψήφια διδάκτορα Βαϊκούση Χαρίκλεια. Μέρος της παρούσας διατριβής υλοποιήθηκε στα πλαίσια του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα, Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης και συγχρηματοδοτήθηκε κατά -75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση - Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο και -25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο - Υπουργείο Ανάπτυξης - Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας.

6

7 στο Γιώργο

8

9 Ευχαριστίες Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Βιοχημείας Τροφίμων και το Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων του Τομέα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Θέλω να εκφράσω τις θερμότατες ευχαριστίες και τη βαθύτατη ευγνωμοσύνη μου στον αγαπητό μου καθηγητή και εξαίρετο επιστήμονα κ. Μπιλιαδέρη Κωνσταντίνο για την ουσιαστική συμβολή του στην πραγματοποίηση της διδακτορικής αυτής διατριβής. Τον ευχαριστώ θερμά για την ευκαιρία που μου έδωσε, αλλά και που επέμενε ενθαρρυντικά να συνεχίσω τις πανεπιστημιακές μου σπουδές με την εκπόνηση της διδακτορικής αυτής μελέτης. Έχοντας φτάσει στο τέλος της προσπάθειας αυτής, χαίρομαι ιδιαίτερα για την άριστη συνεργασία δίπλα του όλα αυτά τα χρόνια, μέσω της οποίας κατάφερα να εντρυφήσω στο μαγικό κόσμο της επιστήμης, ακολουθώντας τη δική του καθαρή σκέψη και διανόηση. Τον ευχαριστώ θερμά για την πολύτιμη καθοδήγηση, την αμέριστη συμπαράσταση και βοήθεια του τόσο κατά την εκπόνηση όσο και κατά τη συγγραφή αυτής της διατριβής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στον κ. Κουτσουμανή Κωνσταντίνο, Επίκουρο Καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. για την εμπιστοσύνη του, και την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ και να υλοποιήσω υπό την επίβλεψή του την εξαιρετική ιδέα που είχε για την ανάπτυξη του μικροβιακού Χρόνο-θερμοκρασιακού Δείκτη, ως ένα από τα αντικείμενα της διδακτορικής αυτής μελέτης. Εκτιμώ βαθιά την εξαίρετη συνεργασία μας, την πολύτιμη καθοδήγησή του και την ανιδιοτελή μετάδοση των πολλών και πλούσιων γνώσεων του στο αντικείμενο της ποσοτικής μικροβιολογίας. Τον ευγνωμονώ ιδιαίτερα που στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής μου είχα τη δυνατότητα να γνωρίσω, να κατανοήσω και να εφαρμόσω ορισμένα από τα μέχρι πριν άγνωστα και δυσνόητα μαθηματικά μοντέλα πρόβλεψης. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στο Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) για τη χορήγηση υποτροφίας και τη σημαντική οικονομική ενίσχυση που μου παρείχε κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας για τη χρηματοδότηση μέρους της παρούσας διατριβής και τη χορήγηση υποτροφίας στα πλαίσια του Ερευνητικού Έργου ΠΕΝΕΔ 2003 με τίτλο Ανάπτυξη και Εφαρµογή Μικροβιακών Χρονοθερµοκρασιακών εικτών (Time- Temperature Indicators-TTI) για την Παρακολούθηση της Ποιότητας των Τροφίμων. Ευχαριστώ πολύ τον κ. Δροσινό Ε., Επίκουρο Καθηγητή του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών για την προσφορά του στελέχους του γαλακτικού βακτηρίου Lactobacillus sakei που

10 χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή. Τις ευχαριστίες μου απευθύνω στον κ. Νυχά Γ.Ι., Καθηγητή του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, και το Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων για τη φιλοξενία που μου προσέφεραν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων που αφορούσαν τη μικροβιολογική αλλοίωση του συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα βοδινού κιμά. Επιπλέον, θέλω να ευχαριστήσω τον κ. Ταούκη Π., Αναπληρωτή Καθηγητή της Σχολής Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Π., για τις χρήσιμες υποδείξεις του και την προσφορά της τεχνογνωσίας στην ανάπτυξη του εμπορικού σκευάσματος του Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη. Ευχαριστίες οφείλω και στα λοιπά μέλη της τριμελούς επιτροπής κ. Κιοσέογλου Β., Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. και κ. Γερασόπουλο Δ., Αναπληρωτή Καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. για τις χρήσιμες υποδείξεις τους στην πορεία εκτέλεσης της διατριβής μου. Στους συναδέλφους, συνεργάτες και συμφοιτητές συμπεριλαμβανομένων και των προπτυχιακών φοιτητών, χρωστώ ένα μεγάλο ευχαριστώ για τη βοήθεια και ουσιαστική συμβολή τους καθ όλη τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής. Την ιδιαίτερη αγάπη μου θέλω να εκφράσω στην Λαζαρίδου Αθηνά και Χρήστου Ελεάνα για τις αξέχαστες και ταυτόχρονα πολύτιμες και όμορφες στιγμές που ζήσαμε στο εργαστήριο και οι οποίες αποτελούν πλέον αναπόσπαστο κομμάτι της καρδιάς μου, αλλά και στη Γουγουλή Μαρία για την αμέριστη βοήθειά της οποτεδήποτε τη ζήτησα. Τέλος, στους γονείς μου Γιώργο και Αναστασία και τις αδερφές μου Ειρήνη και Αγγελική οφείλω παντοτινή ευγνωμοσύνη για τη συνεχή και ανεξάντλητη συμπαράσταση, υποστήριξη και αγάπη τους, όλα τα χρόνια των σπουδών μου.

11 Διδακτορική Διατριβή Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ... v ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ... vii ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... xiii ΠΕΡΙΛΗΨΗ...xv SHORT ABSTRACT... xix EXTENDED ABSTRACT... xxi 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Μαθηματικά μοντέλα Κινητικά μοντέλα και μοντέλα πιθανοτήτων Εμπειρικά μοντέλα και μοντέλα μηχανιστικής βάσης Πρωτογενή Δευτερογενή και Τριτογενή μοντέλα Αρχές κινητικής υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων Μοντέλα ανάπτυξης Μοντέλο Monod Γραμμικό μοντέλο τριών φάσεων Buchanan Μοντέλο Gompertz Λογιστικό μοντέλο Μοντέλο Baranyi και Roberts Μοντέλο Weibull Μοντέλο McKellar Μοντέλα επιβίωσης Κλασικά γραμμικά μοντέλα Μη γραμμικά μοντέλα Επίδραση των ενδογενών και εξωγενών παραγόντων στην ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων Θερμοκρασία Μοντέλο Arrhenius Μοντέλο τετραγωνικής ρίζας Γραμμικό μοντέλο Εκθετικό μοντέλο λογαριθμικό μοντέλο προσδιορισμού της διάρκειας ζωής Μοντέλο WLF Πολυωνυμικά μοντέλα Περιεχόμενη υγρασία και ενεργότητα νερού (α w ) ph Σύσταση αερίων Προστιθέμενα συντηρητικά (οργανικά οξέα, νιτρώδη και καρυκεύματα) Ανάπτυξη, προσαρμογή και αξιολόγηση των μαθηματικών μοντέλων Πειραματικός σχεδιασμός Συλλογή και ανάλυση δεδομένων...55 i

12 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Προσαρμογή των μοντέλων και μαθηματική περιγραφή Αξιολόγηση και επιλογή των μαθηματικών μοντέλων Ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων σε μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης ή επεξεργασίας Θερμοκρασιακές συνθήκες στην ψυκτική αλυσίδα διανομής των τροφίμων Πρόβλεψη της ποιότητας σε μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης Εφαρμογές της μεθόδου θερμοκρασιακής ολοκλήρωσης Χρόνο-θερμοκρασιακοί Δείκτες ή Ολοκληρωτές (Time Temperature Indicators or Integrators) Ταξινόμηση των ΤΤΙ Χαρακτηριστικά ενός αποτελεσματικού ΤΤΙ Παραδείγματα διαθέσιμων εμπορικών ΤΤΙ προτύπων Δείκτες μοριακής διάχυσης Δείκτες βασιζόμενοι στον πολυμερισμό Ενζυμικοί Δείκτες Μικροβιακοί Δείκτες Αρχές εφαρμογής των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών Εφαρμογές των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών Μελλοντικές τάσεις για τη χρήση των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών Ποιοτική υποβάθμιση τροφίμων εξαιτίας της μη ενζυμικής αμαύρωσης Χημεία της αντίδρασης Παράγοντες που επηρεάζουν την αντίδραση Maillard Τύπος αμινοξέος Τύπος σακχάρου ph Αναλογία σακχάρου αμινοξέος Κατάσταση διαλύτη Θερμοκρασία Κινητική της αντίδρασης Maillard Μη ενζυμική μελάνωση προϊόντων τροφίμων μέσης και χαμηλής περιεκτικότητας σε υγρασία Χυμός μήλου Μέλι ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης προϊόντων τροφίμων μέσης και υψηλής περιεκτικότητας σε υγρασία Υλικά Προετοιμασία δειγμάτων Δείγματα συμπυκνωμένου χυμού μήλου Αραιωμένα συστήματα μελιού Μετρήσεις α w, υγρασίας και ph Ισόθερμη θέρμανση και φασματοφωτομετρικές μετρήσεις Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Περίπτωση μελιού Ανάπτυξη κινητικών μοντέλων Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Περίπτωση μελιού Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) Αξιολόγηση των κινητικών μοντέλων ii

13 Διδακτορική Διατριβή Περιεχόμενα Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Περίπτωση μελιού Ανάπτυξη και αξιολόγηση ενός μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη Διερεύνηση των δομικών συστατικών του μικροβιακού ΤΤΙ Στελέχη μικροοργανισμών Προετοιμασία εμβολίου Προετοιμασία μικροβιολογικών υποστρωμάτων Χημικοί χρωματικοί δείκτες Προετοιμασία δειγμάτων Μικροβιολογικές αναλύσεις Μετρήσεις ph Μετρήσεις χρώματος Μελέτη φάσματος απορρόφησης χημικών δεικτών Ανάπτυξη του μικροβιακού συστήματος ΤΤΙ Προετοιμασία του τελικού συστήματος μικροβιακού δείκτη Μικροβιολογικές αναλύσεις Φυσικοχημικές αναλύσεις Μετρήσεις χρώματος Μαθηματική περιγραφή του συστήματος Ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ Αξιολόγηση του ΤΤΙ σε φρέσκο βοδινό κιμά συσκευασμένο υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα (Modified Atmosphere Packed, MAP) Προετοιμασία δειγμάτων βοδινού κιμά Μικροβιολογικές αναλύσεις στο βοδινό κιμά MAP Μέτρηση σύστασης αερίων Οργανοληπτική αξιολόγηση Μέτρηση της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ Ανάλυση δεδομένων Σχεδιασμός της εμπορικής μορφής του μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διαφέρουν στην ενεργότητα νερού κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θέρμανσης Μεταβολές απορρόφησης κατά την ισόθερμη θέρμανση του χυμού μήλου Ανάπτυξη του μοντέλου Προσαρμογή των πρωτογενών μοντέλων και σύγκριση αυτών Περιγραφή της εξάρτησης των παραμέτρων k και A max από τη θερμοκρασία και την α w με δευτερογενή μοντέλα Αξιολόγηση του μοντέλου κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θερμικής επεξεργασίας Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και αραιωμένα συστήματα μελιού που υποβάλλονται σε ισόθερμα και δυναμικά πρωτόκολλα θέρμανσης Σχηματισμός μελανών χρωμοφόρων ουσιών κατά την ισόθερμη θέρμανση του μελιού και των αραιωμένων αιωρημάτων αυτού Ανάπτυξη του μοντέλου Προσαρμογή του πρωτογενούς λογιστικού μοντέλου iii

14 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Προσαρμογή των δευτερογενών μοντέλων στις παραμέτρους k και A max που εξήχθησαν από το πρωτογενές μοντέλο Προσαρμογή του μοντέλου WLF στις σταθερές των ρυθμών μη ενζυμικής αμαύρωσης Αξιολόγηση του μοντέλου σε ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θέρμανσης Ανάπτυξη ενός μικροβιακού Χρονοθερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη Επιλογή των δομικών συστατικών του ΤΤΙ Επιλογή μικροοργανισμού Επιλογή υποστρώματος Επιλογή χημικού δείκτη Περιγραφή του συστήματος ΤΤΙ Θερμοκρασιακή εξάρτηση της απόκρισης του ΤΤΙ Ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ Αξιολόγηση του μοντέλου των διαφορικών εξισώσεων Εφαρμογή του μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) στην παρακολούθηση της αλλοίωσης συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα αλεσμένου βοδινού κρέατος Αλλοίωση του αλεσμένου βοδινού κρέατος MAP Σύγκριση της αλλοίωσης του βοδινού κιμά MAP και της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ Αξιολόγηση της δυνατότητα εφαρμογής του μικροβιακού ΤΤΙ σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης Σχεδιασμός της εμπορικής μορφής του χρονοθερμοκρασιακού δείκτη ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Κατάλογος δημοσιεύσεων Παρουσιάσεις σε συνέδρια Δημοσιευμένες Εργασίες iv

15 Διδακτορική Διατριβή Ευρετήριο Πινάκων ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1. Κατηγορίες μεταβολών που συμβαίνουν στα τρόφιμα κατά το χειρισμό, επεξεργασία και αποθήκευσή τους Πίνακας 1.2. Ορισμένες χημικές και βιοχημικές αντιδράσεις που μπορούν να προκαλέσουν μεταβολές στην ποιότητα και ασφάλεια των τροφίμων Πίνακας 2.1. Θερμοκρασίες των οικιακών ψυγείων όπως μετρήθηκαν σε διάφορες μελέτες Πίνακας 2.2. Χημική σύσταση 92 εμπορικών δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου Πίνακας 3.1. Χημικοί δείκτες, εύρος ph στο οποίο συμβαίνει η χρωματική αλλαγή και μεταβολή του χρώματός τους στο εύρος αυτό Πίνακας 4.1. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±, P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τεσσάρων δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου (k) από τη θερμοκρασία και την α w Πίνακας 4.2. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±. P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τριών δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της μέγιστης απορρόφησης, Α max, και της παραμέτρου t i του λογιστικού μοντέλου από τη θερμοκρασία και την α w κατά τη θέρμανση των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου Πίνακας 4.3. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±, P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τεσσάρων δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού αμαύρωσης των δειγμάτων μελιού (k), από τη θερμοκρασία και την α w..158 Πίνακας 4.4. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±. P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της μέγιστης απορρόφησης, Α max του λογιστικού μοντέλου, από τη θερμοκρασία και την α w, κατά τη θέρμανση των δειγμάτων μελιού Πίνακας 4.5. Θερμοκρασίες υαλώδους μετάπτωσης των δειγμάτων μελιού και εκτιμούμενες παράμετροι του μοντέλου WLF Πίνακας 4.6. Εκτιμούμενες παράμετροι για τις εξισώσεις α Πίνακας 4.7. Παράμετροι και στατιστικά στοιχεία κατά την εφαρμογή του μοντέλου Arrhenius και την περιγραφή της επίδραση της θερμοκρασίας στο μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας στο αλεσμένο βοδινό κρέας MAP Πίνακας 4.8. Εκτίμηση της διάρκειας ζωής του βοδινού κιμά MAP κατά την ισόθερμη συντήρησή του σε διάφορες θερμοκρασίες, και επίπεδα των αλλοιογόνων μικροοργανισμών στο ίδιο προϊόν κατά τη στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης Πίνακας 4.9. Παράμετροι και στατιστικά στοιχεία κατά την εφαρμογή του μοντέλου Arrhenius για την περιγραφή της επίδρασης της θερμοκρασίας στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων που αναπτύσσονται στο βοδινό κιμά MAP ή το ΤΤΙ, και στο ρυθμό που παρατηρείται v

16 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή κατά τη μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ, ή στο αντίστροφο της παραμέτρου t i (1/t i ), όρος που εμπεριέχεται στην ίδια συνάρτηση περιγραφής της αλλαγής του χρώματος στο μικροβιακό ΤΤΙ vi

17 Διδακτορική Διατριβή Ευρετήριο Σχημάτων ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 2.1. Τυπική καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης Σχήμα 2.2. Καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης και γραφική απεικόνιση των παραμέτρων του μοντέλου Baranyi και Roberts (1994) Σχήμα 2.3. Γεωμετρική περιγραφή των D- και z- τιμών Σχήμα 2.4. Γραφική απεικόνιση των εξισώσεων 2.43 (συμπαγής γραμμή) και 2.44 (διακεκομμένη γραμμή) (Πηγή: Ross και Dalgaard, 2004) Σχήμα 2.5. Επίδραση της ενεργότητας νερού στο ρυθμό διαφόρων αντιδράσεων που σχετίζονται με την ποιότητα των τροφίμων Σχήμα 2.6. Σχηματική απεικόνιση της συστηματικής προσέγγισης για την εφαρμογή των ΤΤΙ ως δείκτες ποιότητας (Πηγή: Taoukis, 2001) Σχήμα 2.7. Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων Maillard όπως αναπτύχθηκε από τον Hodge (1953) Σχήμα 4.1. Καμπύλες απορρόφησης χρόνου της κινητικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου με παραπλήσιο α w αλλά διαφορετική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων κατά τη θέρμανση σε διάφορες θερμοκρασίες: (α) συμπύκνωμα χυμού που έχει αραιωθεί στο αναφερόμενο επίπεδο α w με την προσθήκη σορβιτόλης, (β) συμπύκνωμα χυμού που έχει αραιωθεί με νερό στο αναφερόμενο επίπεδο α w Σχήμα 4.2. Καμπύλες απορρόφησης χρόνου της κινητικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διαφέρουν ως προς την α w και έχουν την ίδια (α, β) ή διαφορετική (γ, δ) αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων κατά τη θέρμανσή τους στους 70 και 90 C Σχήμα 4.3. Γραφική σύγκριση των πέντε κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν (γραμμές) κατά την προσαρμογή τους στα πειραματικά δεδομένα (σύμβολα) μιας αντιπροσωπευτικής καμπύλης σχηματισμού χρωμοφόρων ουσιών κίτρινου-καφέ χρωματισμού σε χυμό μήλου με α w 0.99 που θερμάνθηκε ισόθερμα στους 80 C Σχήμα 4.4 Σύγκριση καλής προσαρμογής των πέντε κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν, κάνοντας χρήση της διαφοράς των υπολοίπων των μέσων τετραγώνων (rms) μεταξύ των κινητικών μοντέλων μηδενικής και πρώτης τάξης (α), και σύγκριση του μοντέλου weibull με το μοντέλο μηδενικής τάξης (β), το παραβολικό μοντέλο (γ) και το λογιστικό μοντέλο (δ) Σχήμα 4.5. Καμπύλες Arrhenius που εικονίζουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού της μη-ενζυμικής αμαύρωσης (k) συμπυκνωμάτων χυμού μήλου με διαφορετική α w Σχήμα 4.6. Επίδραση της θερμοκρασίας (α), και της ενεργότητας του νερού (β), στη σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης. Οι γραμμές στα δύο σχήματα παρουσιάζουν τις προβλεπόμενες τιμές του ρυθμού της αντίδρασης σε σταθερά επίπεδα α w (α) ή θερμοκρασιακές συνθήκες (β) Σχήμα 4.7. Καμπύλη πρόβλεψης της επιφάνειας που εικονίζει την εξάρτηση της μέγιστης στο πλατό απορρόφησης, A max, ως συνάρτηση της θερμοκρασίας και της α w. Τα σημεία και οι ράβδοι στην εικονιζόμενη επιφάνεια αποτελούν την πρόβλεψη και τα αντίστοιχα εύρη της πρόβλεψης της απόκρισης ln (A max ) για κάθε συνδυασμό θερμοκρασίας και α w Σχήμα 4.8. Επί τοις εκατό (%) διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων (k παρατ ) σε ανεξάρτητα πειράματα και των προβλεπόμενων (k προβ ), όπως εκτιμήθηκαν από τα τέσσερα δευτερογενή μοντέλα που εξετάστηκαν, τιμών των ρυθμών αμαύρωσης (k) των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου Σχήμα 4.9. Απεικόνιση των προβλεπόμενων τιμών του ρυθμού αμαύρωσης του χυμού μήλου (k προβ ) (χρησιμοποιώντας το μοντέλο Arrhenius) ως συνάρτηση των αντίστοιχων παρατηρούμενων τιμών (k παρατ ) κατά τη θέρμανση σε ποικίλους συνδυασμούς θερμοκρασίας και α w. Τα ανοιχτά σύμβολα αντιπροσωπεύουν τους ρυθμούς αμαύρωσης που καταγράφηκαν κατά το πρώτο στάδιο του vii

18 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή πειραματικού σχεδιασμού εφαρμόζοντας θερμική επεξεργασία κάτω από ισόθερμες συνθήκες και τα κλειστά σύμβολα τις τιμές των σταθερών της αντίδρασης αμαύρωσης που προέκυψαν στα λεγόμενα ανεξάρτητα πειράματα Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.865) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 65 C και 12 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμής) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.865) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 65 C, 6 ώρες στους 75 C και 6 ώρες στους 85 C (β). Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμές) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.740) που θερμάνθηκε για 2 ώρες στους 65 C, 2 ώρες στους 75 C και 2 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμές) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.740) που θερμάνθηκε για 3 ώρες στους 65 C και 3 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Επίδραση της θερμοκρασίας στις καμπύλες απορρόφησης χρόνου που περιγράφουν την κινητική μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού με διαφορετική α w κατά την ισόθερμη θέρμανση τους σε διάφορες θερμοκρασίες Σχήμα Επίδραση της ενεργότητας νερού στις καμπύλες απορρόφησης χρόνου που περιγράφουν την κινητική μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού κατά την ισόθερμη θέρμανσή τους στους 50, 60, 70 και 80 C Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση των σταθερών του ρυθμού της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης (k) δειγμάτων μελιού που διαφέρουν ως προς την α w (α), και επίδραση της ενεργότητας του νερού στις σταθερές των ρυθμών της αντίδρασης (β). Οι γραμμές και στα δύο σχήματα παρουσιάζουν τις προβλεπόμενες τιμές των ρυθμών της αντίδρασης στα αντίστοιχα αμετάβλητα επίπεδα α w (α) και τις αντίστοιχες σταθερές θερμοκρασιακές συνθήκες (β) Σχήμα Θερμογραφήμματα DSC για το μέλι, τα αραιωμένα και συμπυκνωμένα (ένθετο γράφημα) συστήματα μελιού με διαφορετική ενεργότητα νερού. Η θερμοκρασία έναρξης της υαλώδους μετάπτωσης, T g, εικονίζεται ως το σημείο τομής των εφαπτόμενων γραμμών σε κάθε καμπύλη θερμικής σάρωσης Σχήμα Σχέση θερμοκρασίας υαλώδους μετάπτωσης και περιεχόμενης υγρασίας στο μέλι και τα αραιωμένα ή συμπυκνωμένα συστήματα αυτού. Η γραμμή παριστάνει την καμπύλη Gordon Taylor όπως αυτή προέκυψε από τα πειραματικά δεδομένα προσδιορισμού των T g των δειγμάτων που αναλύθηκαν στο DSC Σχήμα Θερμοκρασιακή εξάρτηση των σταθερών του ρυθμού αμαύρωσης του μελιού σύμφωνα με την κινητική θεωρία WLF, κάνοντας χρήση των πειραματικών τιμών T g που προσδιορίστηκαν στο DSC και αφήνοντας τους συντελεστές της εξίσωσης να μεταβάλλονται ελεύθερα Σχήμα Επί τοις εκατό (%) διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων (k παρατ ) και των προβλεπόμενων (k προβ ) τιμών των ρυθμών αμαύρωσης κατά τη θέρμανση δειγμάτων μελιού όπως αυτοί εκτιμήθηκαν από τα τέσσερα δευτερογενή μοντέλα που εξετάστηκαν. Τα κλειστά σύμβολα αντιπροσωπεύουν τιμές των ρυθμών αμαύρωσης k, σε ανεξάρτητα πειράματα, ενώ τα ανοιχτά σύμβολα το σύνολο των τιμών k όλων των πειραματικών μεταχειρίσεων που μελετήθηκαν Σχήμα Καμπύλη προβλεπόμενων (k προβ ) έναντι παρατηρούμενων (k παρατ ) τιμών των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης κατά τη θέρμανσή τους κάτω από διάφορα πρωτόκολλα viii

19 Διδακτορική Διατριβή Ευρετήριο Σχημάτων θερμοκρασίας και α w κάνοντας χρήση του τροποποιημένου μοντέλου Arrhenius (α) και του μοντέλου WLF (β). Τα ανοιχτά σύμβολα και στα δύο Σχήματα παριστάνουν τις σταθερές των ρυθμών αμαύρωσης που προέκυψαν κατά το πρώτο στάδιο του πειραματικού σχεδιασμού και την εφαρμογή ισόθερμων συνθηκών θέρμανσης, και τα κλειστά σύμβολα τις αντίστοιχες σταθερές k όπως προέκυψαν από τη διεξαγωγή των ανεξάρτητων πειραμάτων (α) Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης στο μέλι (α w 0.54) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 55 και 12 ώρες στους 75 C. Οι πλατιές διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα επί 95% όρια εμπιστοσύνης της καμπύλης πρόβλεψης της απορρόφησης, ενώ η λεπτή διακεκομμένη γραμμή εικονίζει τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης στο μέλι (α w 0.54) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 55, 6 h στους 65 και 6 ώρες στους 75 C. Οι πλατιές διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα επί 95% όρια εμπιστοσύνης της καμπύλης πρόβλεψης της απορρόφησης, ενώ η λεπτή διακεκομμένη γραμμή εικονίζει τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Σχήμα Μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) στο υπόστρωμα Nutrient broth (εμπλουτισμένο με % (α) και με % w/v γλυκόζη (β)) και μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) του Lb. sakei LQC 1089 στο ίδιο υπόστρωμα κατά τη συντήρησή του στους 10 C Σχήμα Μεταβολή του ph του υποστρώματος (NB εμπλουτισμένο με 1% w/v γλυκόζη) κατά τη συντήρηση στους 10 C από διάφορα στελέχη γαλακτικών βακτηρίων. Το αρχικό επίπεδο εμβολίου είναι 10 2 CFU/ml Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη διαφόρων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων σε ΝΒ (εμπλουτισμένο με 0.25 % w/v γλυκόζη) κατά τη συντήρηση στους 10 C Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη και μεταβολή του ph του Lb. sakei LQC 1089 σε ΝΒ (α) και Saline (β) εμπλουτισμένα με 1% w/v γλυκόζη στους 10 C Σχήμα Μεταβολή του ph (α) και μικροβιακή ανάπτυξη (β) των Lb. sakei LQC 1089 και Lb. curvatus L3.8 (γ, δ) σε διάφορα υποστρώματα κατά τη συντήρηση στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα μέσα ανάπτυξης είναι 2% w/v και το εμβόλιο των μικροοργανισμών 10 2 cfu/ml Σχήμα Μεταβολή του ph και μικροβιακή ανάπτυξη διαφόρων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων σε διάφορα υποστρώματα κατά τη συντήρηση στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα μέσα ανάπτυξης είναι 2% w/v και το εμβόλιο των μικροοργανισμών CFU/ml Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) του Lb. sakei LQC 1089 σε ΝΒ (α) και TSB (β) εμπλουτισμένα με 0.5% Yeast extract (YE) στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης είναι 2% w/v και στα δύο θρεπτικά μέσα ανάπτυξης. 177 Σχήμα Μεταβολή χρώματος διαλυμάτων διαφορετικής συγκέντρωσης γαλακτικού οξέος και διαφορετικού ph σε ΝΒ στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v δείκτη: α) Methyl red (MR), β) Chlorophenol red (CPR), γ) Bromocresol purple (BCP), δ) μίγματος Bromocresol green Chlorophenol red (BCG+CPR), ε) resazurin, στ) alizarin, ζ) p-nitrophenol Σχήμα Χρωματικές συνιστώσες L, a, b, ως συνάρτηση του ph διαλυμάτων γαλακτικού οξέος σε ΝΒ στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v των χημικών δεικτών: methyl red, chlorophenol red, Bromocresol purple, μίγματος Bromocresol green και chlorophenol red, resazurin, alizarin και p- nitrophenol Σχήμα Μεταβολή του μήκους κύματος στο οποίο παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση (λ max, ανοιχτά σύμβολα) σειράς διαλυμάτων γαλακτικού οξέος διαφορετικού ph σε NB στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v των χημικών δεικτών methyl red, chlorophenol red, Bromocresol purple, μίγματος Bromocresol green και chlorophenol red και resazurin και η παρατηρούμενη μέγιστη Απορρόφηση (Abs, κλειστά σύμβολα) στο συγκεκριμένο μήκος κύματος. Η απότομη μεταβολή ix

20 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή στην κλίση της καμπύλης λ max υποδεικνύει διαφοροποίηση της χημικής ένωσης που απορροφά και άρα μεταβολή του χρώματος του χημικού δείκτη στο συγκεκριμένο ph. Η λήψη του φάσματος απορρόφησης έγινε με βαθμιαία μεταβολή του μήκους κύματος στην περιοχή του ορατού ( nm) Σχήμα Μεταβολή του ph του υποστρώματος (ΝΒ εμπλουτισμένο με 0.25% γλυκόζη) (α) και της μικροβιακής ανάπτυξης (β) του Lb. sakei LQC 1089 κατά τη συντήρηση στους 10 C απουσία (μάρτυρας, ανοιχτά σύμβολα) και παρουσία (κλειστά σύμβολα) του χημικού δείκτη Methyl red (MR, διάλυμα 0.04% w/v) σε συγκέντρωση 1% v/v. Οι καμπύλες αποτελούν το μέσο όρο τριών επαναλήψεων Σχήμα Οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (α) και η αντίστοιχη μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ (β) κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με 0.25 % w/v γλυκόζη, δείκτης: methyl red, (MR, διάλυμα 0.04% w/v) σε συγκέντρωση 1% v/v) Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ στους 10 και 20 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Οπτική απεικόνιση της μεταβολής του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ σε διάφορα υποστρώματα κατά την πορεία ανάπτυξης του μικροοργανισμού Lb. sakei LQC 1089 στους 10 C (0-10η ημέρα). Σε κάθε εικόνα οι δυο πρώτες φιάλες αριστερά έχουν ΝΒ, οι δυο μεσαίες TSB και οι δυο δεξιά MRS. Σε όλες τις φιάλες έχει προστεθεί 3% v/v διαλύματος δείκτη MR 0.04% w/v. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα υποστρώματα ρυθμίστηκε στο 2% w/v Σχήμα Οπτική απεικόνιση της μεταβολής του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ σε διάφορα υποστρώματα κατά την πορεία ανάπτυξης (0-10d) του μικροοργανισμού Lb. sakei LQC 1089 στους 20 C. Σε κάθε εικόνα οι δυο πρώτες φιάλες αριστερά έχουν ΝΒ, οι δυο μεσαίες TSB και οι δυο δεξιά MRS. Σε όλες τις φιάλες έχει προστεθεί 3% v/v διαλύματος δείκτη MR 0.04% w/v. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα υποστρώματα ρυθμίστηκε στο 2% w/v Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v από διάλυμα 0.04 % w/v) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 20 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v από διάλυμα 0.04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ αριστερά και TSB δεξιά εμπλουτισμένα με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης χημικού δείκτη ΜR στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στην οπτική μεταβολή του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE x

21 Διδακτορική Διατριβή Ευρετήριο Σχημάτων 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 5, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στην οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: TSB εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0,5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0,04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στη μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: TSB εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0,5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0,04 % w/v) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης και του χημικού δείκτη CPR στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης Chlorophenol red, CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Chlorophenol red στην οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M) Σχήμα Μικροβιολογικές, φυσικοχημικές μεταβολές, και μεταβολές χρώματος που συμβαίνουν στο σύστημα ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 8 C. Τα σημεία που απεικονίζουν τα δεδομένα στην καμπύλη ΔΕ έχουν αντικατασταθεί με έγχρωμα τετραγωνίδια τα οποία παρουσιάζουν το χρώμα του συστήματος ΤΤΙ στους αντίστοιχους χρόνους δειγματοληψίας Σχήμα Μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές που συμβαίνουν στο σύστημα ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του ισόθερμα στους 0, 4, 8, 12 και 16 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του μοντέλου στις πειραματικές εκτιμήσεις Σχήμα Ανάπτυξη της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ κατά την ισόθερμη συντήρηση του συστήματος ΤΤΙ στους 0, 4, 8, 12 και 16 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του λογιστικού μοντέλου σ αυτά Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του μικροοργανισμού, μ max, και του αντιστρόφου του χρόνου στον οποίο xi

22 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή σημειώνεται το σημείο λήξης του συστήματος ΤΤΙ Σχήμα Σχέση μεταξύ του πληθυσμού του L. sakei και της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (α) και του ph (β) του υπό ανάπτυξη συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 0, 4, 8, 12 και 16 C Σχήμα Επίδραση του αρχικού επιπέδου εμβολίου στην κινητική της μικροβιακής ανάπτυξης (κλειστά σύμβολα) και της πτώσης του ph (ανοιχτά σύμβολα) (α), στις τιμές της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (β), και στα σημεία λήξης (γ) του συστήματος ΤΤΙ κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 8 C Σχήμα Μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές που συμβαίνουν, στο εμβολιασμένο με διαφορετικά αρχικά επίπεδα του μικροοργανισμού, σύστημα ΤΤΙ, κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 8 C. Τα σύμβολα παριστάνουν τα παρατηρούμενα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές τις προβλέψεις του μοντέλου Σχήμα Ανάπτυξη της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας στο βοδινό κιμά MAP κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 0, 5, 10 και 15 C. Βακτήρια που αναπτύχθηκαν στα αντίστοιχα υποστρώματα: PCA για τη συνολική αερόβια μικροχλωρίδα, CFC για τις ψευδομονάδες, STAA για το Brochothrix thermosphacta, MRS για τα γαλακτικά βακτήρια, VRBG για τα ενεροβακτήρια. Οι καμπύλες ανάπτυξης αποτελούν το μέσο όρο δύο επαναλήψεων Σχήμα Μέσος όρος βαθμολογίας κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση του βοδινού κιμά MAP κατά τη συντήρησή του στους 0, 5, 10 και 15 C (σημεία) και γραμμές τάσεις που περιγράφουν τη μεταβολή του σκορ της οργανοληπτικής αξιολόγησης ως συνάρτηση του χρόνου συντήρησης. Το κάθε σημείο αποτελεί το μέσο όρο της βαθμολογίας των πέντε εξεταστών ενώ η οριζόντια δικεκομμένη γραμμή απεικονίζει το όριο στη βαθμολογία που σηματοδοτεί την οργανοληπτική απόρριψη του προϊόντος Σχήμα Ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ, καθώς και μεταβολές στο ph και τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ του συστήματος ΤΤΙ, κατά την ισόθερμη συντήρησή του σε διάφορες θερμοκρασίες Σχήμα Ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 15 C, καθώς και μεταβολές στο ph και το χρώμα (ΔΕ) του συστήματος ΤΤΙ στην ίδια θερμοκρασία. Τα σημεία των πειραματικών δεδομένων στην καμπύλη μεταβολής της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ έχουν αντικατασταθεί από έγχρωμα τετραγωνίδια που αντιπροσωπεύουν το χρώμα του ΤΤΙ στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές της δειγματοληψίας Σχήμα Μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ κατά την ισόθερμη συντήρηση του συστήματος ΤΤΙ στους 0, 5, 8, 10, 12 και 15 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του λογιστικού μοντέλου σ αυτά Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης, μ max, των γαλακτικών βακτηρίων στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ και θερμοκρασιακή εξάρτηση του μέγιστου ρυθμού που παρατηρείται στην καμπύλη μεταβολής της συνάρτησης ΔΕ, και του αντιστρόφου της παραμέτρου ti (1/t i ), που επίσης συμμετέχει στην λογιστική εξίσωση έκφρασης της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ Σχήμα Σύγκριση της ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ, σε συνδυασμό με τις μεταβολές στο ph και τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ του μικροβιακού ΤΤΙ κατά τη συντήρησή τους στις ίδιες περιοδικά μεταβαλλόμενες θερμοκρασίες ψύξης. Το πρώτο πρωτόκολλο ψύξης περιλάμβανε έναν περιοδικώς επαναλαμβανόμενο 24-ωρο κύκλο αποτελούμενο από ψύξη για 18 h στους 5 και 6 h στους 15 C (α), και το δεύτερο συντήρηση για 24 h στους 0, 6h στους 15 και 12 h στους 10 C (β) Σχήμα Εμπορική μορφή πρότυπου μικροβιακού ΤΤΙ, πριν την ενεργοποίηση (α), κατά την ενεργοποίηση (β), στην αρχή της ενεργοποίησης (γ) και κατά το σημείο λήξης (δ) xii

23 Διδακτορική Διατριβή Σύντομη Περίληψη ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η χρήση της κινητικής προσέγγισης στην περιγραφή μεταβολών που συμβαίνουν σε συστήματα τροφίμων, τα οποία υποβαθμίζονται τόσο εξαιτίας χημικών αντιδράσεων, όσο και λόγω της μικροβιακής αλλοίωσης ως συνέπεια της ανάπτυξης της ενδογενούς σ αυτά μικροχλωρίδας, σε στατικές, ισόθερμες συνθήκες επεξεργασίας ή συντήρησης, όσο και σε δυναμικά μεταβαλλόμενες συνθήκες. Για την περίπτωση υποβάθμισης των τροφίμων εξαιτίας χημικών αντιδράσεων μελετήθηκε η μη ενζυμική αμαύρωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου, του μελιού και των αραιωμένων συστημάτων αυτών. Εξετάστηκε η μεμονωμένη και συνδυασμένη δράση των παραγόντων θερμοκρασία, α w ή / και των περιεχόμενων αντιδρώντων διαλυτών στερεών συστατικών στη μεταβολή του χρώματος, όπως αποτυπώνεται από τη μετρούμενη απορρόφηση (absorbance) των προϊόντων αυτών κατά τη θέρμανση. Η κινητική σχηματισμού έγχρωμων μελανών συστατικών και στα δύο συστήματα περιγράφηκε ικανοποιητικά από το λογιστικό μοντέλο ενώ η μελέτη της προσαρμογής των δευτερογενών μοντέλων ανέδειξε ότι α) το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius περιγράφει με τον καλύτερο τρόπο τη μεμονωμένη και συνδυασμένη επίδραση των παραπάνω παραγόντων στη μεταβολή του ρυθμού της αντίδρασης, β) η πορεία του ίδιου φαινομένου μπορεί να προβλεφθεί ικανοποιητικά σε συνθήκες διαφορετικές από αυτές που επιλέχτηκαν για τον αρχικό πειραματικό σχεδιασμό και γ) ότι το ανασχηματισμένο ολοκληρωμένο μοντέλο που προέκυψε μπορεί να περιγράψει την έκταση της μη ενζυμικής αμαύρωσης των δύο προϊόντων κάτω από δυναμικές συνθήκες θέρμανσης, προσομοιάζοντας τα συνεχώς μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα θέρμανσης που συχνά εφαρμόζονται στη βιομηχανική παραγωγή των τροφίμων. Ακολούθως η κινητική μοντελοποίηση χρησιμοποιήθηκε στην εκτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας των τροφίμων. Η συνεχής παρακολούθηση της προκαλούμενης μικροβιολογικής αλλοίωσης των τροφίμων στην ψυκτική αλυσίδα, επιχειρήθηκε μέσω της ανάπτυξης ενός συστήματος Μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (Time Temperature Indicator, ΤΤΙ) βασιζόμενο στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα ενός στελέχους γαλακτικού βακτηρίου, του Lactobacillus sakei. Συγκεκριμένα, η κατανάλωση της περιεχόμενης στο υπόστρωμα γλυκόζης από το μικροοργανισμό συντελεί στην παραγωγή γαλακτικού οξέος που ακολούθως προκαλεί την πτώση του ph, και κατά συνέπεια μια εμφανή χρωματική μεταβολή ενός χημικού δείκτη, που επίσης περιλαμβάνεται στο σύστημα, από τον αρχικό κόκκινο στον τελικό κίτρινο χρωματισμό. Η xiii

24 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μελέτη της κινητικής του συστήματος (ισόθερμες συνθήκες ψύξης) ανέδειξε πως η μεταβολή του χρώματος και του ph σχετίστηκε στενά με τη βακτηριακή ανάπτυξη. Το σημείο λήξης του ΤΤΙ σημειώθηκε όταν ο μικροβιακός πληθυσμός έφτασε στα όρια της αλλοίωσης, με θερμοκρασιακή εξάρτηση όμοια με εκείνη της μικροβιακής ανάπτυξης. Επιπρόσθετα, το επιθυμητό σημείο λήξης του ΤΤΙ μπορεί να επιτευχθεί με την κατάλληλη ρύθμιση της αρχικής συγκέντρωσης του μικροοργανισμού στο μέσο ανάπτυξης. Το υπό ανάπτυξη ΤΤΙ εφαρμόστηκε επιτυχώς στην παρακολούθηση της ποιότητας βοδινού κιμά συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα, με το σημείο λήξης του ΤΤΙ να συμπίπτει με τη χρονική στιγμή κατά την οποία παρατηρείται η οργανοληπτική απόρριψη του εν λόγω τροφίμου κατά την συντήρησή του τόσο ισόθερμα όσο και κάτω από περιοδικά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα ψύξης. xiv

25 Διδακτορική Διατριβή Περίληψη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η χρήση της κινητικής προσεγγίσης στην περιγραφή μεταβολών που συμβαίνουν σε συστήματα τροφίμων τα οποία υποβαθμίζονται τόσο εξαιτίας χημικών αντιδράσεων, όσο και λόγω της μικροβιακής αλλοίωσης, ως συνέπεια της ανάπτυξης της ενδογενούς μικροχλωρίδας, υπό στατικές ή ισόθερμες συνθήκες επεξεργασίας - συντήρησης, όπως και σε δυναμικά μεταβαλλόμενες συνθήκες. Αρχικά μελετήθηκε η μη ενζυμική αμαύρωση συμπυκνωμάτων χυμού μήλου. Η επίδραση της ενεργότητας νερού, α w (στο εύρος ), ή /και της συγκέντρωσης των αντιδρώντων συστατικών στο σχηματισμό μελανών χρωμοφόρων ουσιών εξετάστηκε σε τέσσερις ισόθερμες συνθήκες θέρμανσης σε συμπυκνώματα του χυμού που είχαν είτε την ίδια είτε διαφορετική αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων συστατικών. Η έκταση της αντίδρασης Maillard στην πορεία του χρόνου εκτιμήθηκε φασματοφωτομετρικά μετρώντας την απορρόφηση στα 420 nm (Α 420 ). Τα πειραματικά δεδομένα από τις καμπύλες απορρόφησης - χρόνου προσαρμόστηκαν σε πέντε διαφορετικά κινητικά μοντέλα (το μοντέλο μηδενικής και πρώτης τάξης, το μοντέλο weibull, το λογιστικό και το παραβολικό μοντέλο) οπότε και εκτιμήθηκαν οι τιμές των σταθερών του ρυθμού αμαύρωσης και των λοιπών παραμέτρων αυτών των μοντέλων. Η ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι το λογιστικό μοντέλο ήταν το καταλληλότερο για την περιγραφή της αμαύρωσης του χυμού μήλου. Σημαντική ήταν η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης των αντιδρώντων συστατικών στη μεταβολή του χρώματος του χυμού μήλου, ενώ μη σημαντική αναδείχθηκε η μεμονωμένη δράση της ενεργότητας νερού. Η θερμοκρασία που εφαρμόστηκε κατά την επεξεργασία εμφάνισε επίσης σημαντική επίδραση στην κινητική της αντίδρασης αμαύρωσης. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν δευτερογενή μοντέλα που περιγράφουν την εξάρτηση των κινητικών παραμέτρων που εξήχθησαν από τα πρωτογενή μοντέλα τόσο από τη θερμοκρασία όσο και από την α w, τα οποία και αξιολογήθηκαν συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες τιμές των παραμέτρων με αυτές που παρατηρήθηκαν σε ανεξάρτητα ισόθερμα πειράματα διαφορετικά από εκείνα που χρησιμοποιήθηκαν στον αρχικό πειραματικό σχεδιασμό. Τέλος, το συνολικό ανασχηματισμένο και ολοκληρωμένο μοντέλο που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε περαιτέρω έναντι των παρατηρούμενων αποκρίσεων αμαύρωσης του χυμού μήλου υπό δυναμικές συνθήκες θέρμανσης, δίνοντας έμφαση στη δυνατότητα εφαρμογής του μοντέλου ως πρακτικό εργαλείο στη μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης. xv

26 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ομοίως, μελετήθηκε και η μη ενζυμική αμαύρωση σε μέλι και αραιωμένα συστήματα μελιού. Η επίδραση της ενεργότητας του νερού στο σχηματισμό ουσιών κίτρινου χρωματισμού διεξήχθη σε αιωρήματα μελιού που διαφοροποιούνταν ως προς την α w στο εύρος , λόγω διαφοροποίησης στην αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών, υπό ισόθερμες συνθήκες σε τέσσερις σταθερές θερμοκρασίες (50, 60, 70, 80 C). Η έκταση της μη ενζυμικής αμαύρωσης εκτιμήθηκε και πάλι φασματοφωτομετρικά μετρώντας την απορρόφηση των αιωρημάτων στα 420 nm. Τα δεδομένα που περιγράφουν τη μεταβολή της απορρόφησης ως συνάρτηση του χρόνου προσαρμόστηκαν στο λογιστικό μοντέλο με στόχο τη μαθηματική περιγραφή της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι. Η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία αλλά και η ενεργότητα νερού, ή η αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων ουσιών είχαν σημαντική επίδραση στην κινητική αμαύρωσης και τη μεταβολή του χρώματος του μελιού. Ακολούθως, αναπτύχθηκαν δευτερογενή μοντέλα που περιγράφουν την επίδραση της θερμοκρασίας και της α w στις παραμέτρους του πρωτογενούς λογιστικού μοντέλου (ρυθμός αμαύρωσης και μέγιστη τιμή απορρόφησης). Επιπλέον, η κινητική WLF βασιζόμενη στη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης, εφαρμόστηκε εναλλακτικά στην περιγραφή της εξάρτησης των σταθερών του ρυθμού αμαύρωσης από τη θερμοκρασία. Τα βασικά δευτερογενή μοντέλα αξιολογήθηκαν συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες από τα μοντέλα τιμές των παραμέτρων με τις αντίστοιχες παρατηρούμενες τιμές όπως αυτές προέκυψαν από τα ισόθερμα πειράματα. Τέλος, το ολοκληρωμένο μοντέλο που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε ως προς τη δυνατότητά του να προβλέπει ικανοποιητικά τις πραγματικές (παρατηρούμενες) αποκρίσεις των μεταβολών της απορρόφησης κατά την αμαύρωση του μελιού κάτω από μεταβαλλόμενα χρόνοθερμοκρασιακά προφίλ θερμικής επεξεργασίας. Σε ότι αφορά τη συνεχή παρακολούθηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης των τροφίμων κατά την παραμονή τους στην ψυκτική αλυσίδα, αναπτύχθηκε ένα σύστημα μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (Time Temperature Indicator) βασιζόμενο στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα ενός στελέχους γαλακτικού βακτηρίου, του Lactobacillus sakei. Στο σύστημα αυτό συμβαίνει μια μη αντιστρεπτή μεταβολή στο χρώμα ενός χημικού χρωματικού δείκτη (από το αρχικό κόκκινο στο τελικό κίτρινο) εξαιτίας της πτώσης του ph που προκαλείται από τη μικροβιακή ανάπτυξη και το μεταβολισμό σε ένα επιλεγμένο υπόστρωμα. Μελετήθηκε η σχέση μεταξύ της απόκρισης του ΤΤΙ (χρωματική αλλαγή) και της μικροβιακής ανάπτυξης και μεταβολικής δραστηριότητας (κατανάλωση γλυκόζης, παραγωγή γαλακτικού οξέος, μείωση του ph). Επιπρόσθετα, η θερμοκρασιακή εξάρτηση της κινητικής του ΤΤΙ εξετάστηκε ισόθερμα στο εύρος θερμοκρασιών 0-16 C, xvi

27 Διδακτορική Διατριβή Περίληψη και μοντελοποιήθηκε κάνοντας χρήση ενός συστήματος διαφορικών εξισώσεων. Σε όλες τις θερμοκρασίες που εξετάστηκαν οι μεταβολές του ph και του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ ακολούθησαν στενά την πορεία της ανάπτυξης του L. sakei με το σημείο λήξης του ΤΤΙ (χρονική στιγμή κατά την οποία παρατηρείται ευδιάκριτη χρωματική αλλαγή από το αρχικό κόκκινο στο τελικό κίτρινο) να συμπίπτει με πληθυσμό του L. sakei στο επίπεδο των CFU/ml. Το σημείο λήξης μειώθηκε από 27 ημέρες κατά τη συντήρηση του ΤΤΙ στους 0 C και στις 2.5 ημέρες κατά τη συντήρησή του στους 16 C, με ενέργεια ενεργοποίησης 97.7 kj/mol, τιμή που βρίσκεται πολύ κοντά στην τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης που εκφράζει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της ανάπτυξης του L. sakei στο υπόστρωμα ανάπτυξης του συστήματος ΤΤΙ (103.2 kj/mol). Επιπλέον, η μελέτη της επίδρασης του αρχικού επιπέδου εμβολίου ανέδειξε πως η εξίσωση μιας αρνητικής γραμμικής συμμεταβολής περιγράφει ικανοποιητικά τη σχέση μεταξύ της αρχικής συγκέντρωσης μικροοργανισμού με την οποία εμβολιάζεται το υπόστρωμα του συστήματος και του σημείου λήξης του ΤΤΙ. Πιο συγκεκριμένα το σημείο λήξης του ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 8 C κυμάνθηκε από 6 ως 2 ημέρες για αρχικά επίπεδα εμβολίου μεταξύ 10 1 και 10 6 CFU/ml, αντίστοιχα. Η σχέση αυτή επιτρέπει την εύκολη ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του υπό μελέτη προϊόντος χρησιμοποιώντας το κατάλληλο επίπεδο εμβολίου του L. sakei. Το μικροβιακό πρότυπο ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως αποτελεσματικό εργαλείο για τον έλεγχο της διάρκειας ζωής των τροφίμων κατά τη διανομή και αποθήκευση προϊόντων τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη και όταν αυτά αλλοιώνονται πρωτίστως από γαλακτικά βακτήρια ή άλλους μικροοργανισμούς που παρουσιάζουν παρόμοιες κινητικές αποκρίσεις ή πιθανές αλλοιώσεις. Πράγματι, η μελέτη της αλλοίωσης ενός προϊόντος κρέατος (βοδινός κιμάς) συσκευασμένου υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (Modified atmosphere Packaging, MAP) κατά τη συντήρηση διακίνησή του σε ισόθερμες (0-15 C) αλλά και μεταβαλλόμενες (δυναμικές) συνθήκες ψύξης, ανέδειξε τα γαλακτικά βακτήρια ως τον ειδικό αλλοιογόνο οργανισμό. Επίσης, κατά την παράλληλη συντήρηση του συστήματος ΤΤΙ στις ίδιες συνθήκες η καμπύλη ανάπτυξης του L. sakei στο ΤΤΙ συνέπεσε με αυτή των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το σημείο λήξης του ΤΤΙ βρέθηκε χρονικά κοντά στη στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης του τροφίμου, κατά τη συντήρηση τόσο υπό ισόθερμες όσο και δυναμικές συνθήκες, αποδεικνύοντας πως η απόκριση του προτεινόμενου ΤΤΙ αντικατοπτρίζει σχεδόν απόλυτα την απώλεια της ποιότητας του εν xvii

28 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή λόγω προϊόντος. Επιχειρήθηκε τέλος, ο σχεδιασμός της εμπορικής μορφής του μικροβιακού ΤΤΙ που αναπτύχθηκε. xviii

29 Διδακτορική Διατριβή Short Abstract SHORT ABSTRACT The non - enzymatic browning of concentrated apple juice, honey and their diluted systems was investigated. The effects of temperature, α w and / or the initial reactant concentration on colour change of both food systems were evaluated by spectrophotometric absorbance measurements (A 420 ). The kinetics of brown pigment formation in both systems was described by the logistic model, while the fitting of secondary models revealed the following: a) the modified Arrhenius model was the most appropriate in describing the combined effect of the above mentioned factors on browning reaction kinetic constants; b) the browning reaction rates can be adequately predicted under conditions differing from those used in the initial experimental design; and c) the final combined dynamic model that was developed can predict the extent of non-enzymatic browning of both products under dynamic conditions of fluctuating temperature protocols, usually applied in the food industry. The development of a microbial TTI system was based on the microbial growth and metabolism of a lactic acid bacteria strain in a model substrate system (glucose consumption, lactic acid production and the following ph drop progressively lead to the color change from red to yellow of a chemical chromatic indicator which also exists in the system). The study of the TTI kinetics (under isothermal storage conditions) showed that the ph and colour change of the TTI followed closely the bacterial growth. The end point of the TTI coincided with a bacterial population similar to that observed at spoilage levels and with activation energy almost identical to the one of the lactobacillus strain growth. Furthermore, the desired end point of the TTI at a certain temperature can be achieved by appropriate adjustment of the initial microbial concentration of the inoculated in the system microorganism. The developed microbial TTI system was successfully applied to monitor the quality status of minced beef packed under modified atmosphere with the end point of the TTI coinciding with the time of sensory rejection point of the product during its storage under either isothermal chilled temperature conditions or under low temperature periodic changing protocols. xix

30 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή xx

31 Διδακτορική Διατριβή Extended Abstract EXTENDED ABSTRACT The kinetics of non-enzymatic browning in apple juice concentrates was investigated. The effect of α w and / or reactant concentration on brown pigment formation was monitored under isothermal heat treatment at four temperatures (60, 70, 80 and 90 C) in apple juice solutions having either the same or different concentration of reactant solutes (the a w ranged in both situations between ). The extent of Maillard reaction was evaluated by spectrophotometric measurements at 420 nm (A 420 ). The absorbance-time curves were fitted to five different kinetic models (zero and first order, weibull, logistic and the parabolic model) and estimates of browning rate constants and other model parameters were obtained. Regression analysis revealed that the logistic model was the most appropriate in describing browning in apple juice. The initial reactant concentration but not water activity had a significant effect on the colour change of apple juice. The processing temperature also had a strong impact on browning kinetics. Secondary models expressing the dependence of the best fitted primary model parameters on temperature and α w were further developed and validated by comparing the predicted model parameters with the values observed in independent isothermal experiments. The modified Arrhenius model was revealed as the most appropriate among all tested secondary models. Finally, the overall derived model was further evaluated against the observed browning responses of apple juice under dynamic heating conditions, underlying the applicability of the developed model as a practical prediction tool for the study of non-enzymatic browning. Similarly, the kinetics of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems was investigated. The effect of α w (in the range of ) on brown pigment formation was monitored under isothermal heat treatment at four temperatures (50, 60, 70 and 80 C) in honey and its diluted solutions, differing in the concentration of reactant solutes. The extent of browning was again evaluated by spectrophotometric measurements at 420 nm (A 420 ). Experimental data describing the absorbance change as a function of time were fitted to the logistic model. The processing temperature and water activity, or the initial reactant concentration, had a significant effect on browning kinetics and the colour change of honey. Secondary models expressing the effect of temperature and α w on the parameters derived by the primary model were further developed. In addition, an alternative method of expressing the temperature dependence of browning rate constants using the WLF kinetic formalism, which is based on the glass transition temperature, T g, was applied. The main secondary models (modified Arrhenius model and WLF model) were validated by comparing the xxi

32 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή predicted model parameters with those obtained from the isothermal experiments. Finally, the overall derived model was able to predict the extent of the observed browning responses of honey under dynamic heating conditions A Time Temperature Indicator (TTI) system, based on the growth and metabolic activity of a Lactobacillus sakei strain, was developed for monitoring food quality throughout the chilled food chain. In the designed system, an irreversible colour change of a chemical chromatic indicator (from red to yellow) progressively occurs due to the ph decline as a result of microbial growth and metabolism in a selected medium. The relation of the TTI response (colour change) to the growth and metabolic activity (glucose consumption, lactic acid production, ph decrease) of L. sakei was studied. In addition, the temperature dependence of the TTI kinetics has been investigated isothermally, in the range of 0 to 16 C, and modeled with a series of differential equations. At all temperatures tested, the ph and colour change of the TTI followed closely the growth of L. sakei, with the end point (time at which a distinct visual colour change to the final yellow was observed) of the TTI coinciding with a population level of cfu/ml. The end point decreased from 27 days at 0 C to 2.5 days at 16 C, yielding an activation energy value of 97.7 kj/mol which was very close to the activation energy of L. sakei growth rate in the TTI substrate (103.2 kj/mol). Furthermore, experiments conducted on the effect of inoculum level showed a negative linear relationship between the level of L sakei inoculated in the system medium and the end point of the TTI. For example, the end point at 8 C ranged from 6 to 2 days for inoculum levels varying between 10 1 and 10 6 CFU/ml, respectively. The above relationship provides the means of easily adjusting the TTI end point at a certain temperature according to the shelf life of the food product of concern by using an appropriate inoculum level of L sakei. The microbial TTI prototype developed in the present study could be used as an effective tool for monitoring shelf life during distribution and storage of food products that are primarily spoiled by lactic acid bacteria or other bacteria exhibiting similar kinetic response and spoilage potential. Indeed, studying the spoilage of a meat product (minced beef) packed under modified atmosphere conditions (MAP), during the storage and distribution at isothermal or dynamic chilled temperatures, revealed lactic acid bacteria (LAB) as the specific spoilage organism. Moreover, the parallel exposure of the TTI system at the same conditions showed that the growth curve of L. sakei coincided with that of LAB in the meat product and the end point of TTI was close to the end of the food product s shelf life (time of organoleptic rejection), verifying that the response of TTI closely matches the quality loss of the food product by xxii

33 Διδακτορική Διατριβή Extended Abstract simulating the microbial spoilage process occurring in such an environment. Finally, the design of a commercial form of the developed TTI was also attempted. xxiii

34

35 Διδακτορική Διατριβή 1. Εισαγωγή Σκοπός μελέτης 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Τα τρόφιμα αποτελούν πολύπλοκα φυσικοχημικά και βιολογικά ενεργά συστήματα των οποίων τα βασικά συστατικά, οι πρωτεΐνες οι υδατάνθρακες και τα περιεχόμενα σε αυτά λιπίδια συμμετέχουν σε πλήθος αντιδράσεων, συντελώντας στην αλλοίωση των οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών, την υποβάθμιση της θρεπτικής τους αξίας και τη βαθμιαία απώλεια της ασφάλειάς τους. Στις μέρες μας, η βιομηχανία τροφίμων ενθαρρύνει την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών, προσπαθώντας να ικανοποιήσει τις απαιτήσεις των καταναλωτών για προϊόντα εξαιρετικά ασφαλή, με μοναδικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, που να φέρουν ταυτόχρονα αξιόλογες βιολειτουργικές και θρεπτικές ιδιότητες, και μακρά διάρκεια ζωής, όπως και για προϊόντα που να περιέχουν λιγότερα πρόσθετα, λιγότερες θερμίδες και συστατικά όπως τα κορεσμένα ή trans-λιπαρά οξέα, το αλάτι και η χοληστερόλη, και να παρουσιάζουν ιδιαίτερη ευκολία κατά τη χρήση τους (Nychas et al., 2008, Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003). Στην προσπάθεια αυτή, και κατά την εφαρμογή των διαφόρων επεξεργασιών στα τρόφιμα, συμβαίνουν τόσο επιθυμητές όσο και ανεπιθύμητες μεταβολές. Μεταξύ των επιθυμητών μεταβολών συγκαταλέγονται: i) η ανάπτυξη και διατήρηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των τροφίμων όπως το χρώμα, η γεύση, το άρωμα και η υφή, ii) η βελτίωση της λειτουργικότητας ορισμένων συστατικών όπως είναι η ζελατινοποίηση και η χημική τροποποίηση του αμύλου, η δημιουργία ισομερών της γλυκόζης, και η αλκαλική επεξεργασία των πρωτεϊνών σόγιας, iii) η θερμική αδρανοποίηση των ενζύμων ή ο έλεγχος αυτών με χημική αδρανοποίηση ή μέσω της ρύθμισης του ph, και τέλος iv) η βελτίωση της θρεπτικής αξίας ή της πέψης διαφόρων συστατικών και η αδρανοποίηση ορισμένων αντιθρεπτικών παραγόντων. Στις μη επιθυμητές μεταβολές συμπεριλαμβάνονται: i) η αλλοίωση του χρώματος, του αρώματος και της υφής, όπως συμβαίνει με το γάλα υψηλής παστερίωσης (UHT, Ultra High Temperature), η απώλεια της χλωροφύλλης και της υφής σε κονσερβοποιημένα ή αφυδατωμένα λαχανικά, και η σκλήρυνση των ιστών 1

36 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή κατεψυγμένων αλιευμάτων, ii) η υποβάθμιση λειτουργικών ιδιοτήτων των συστατικών των τροφίμων, όπως απώλεια της ικανότητας συγκράτησης νερού, της γαλακτωματοποιητικής ικανότητας και της ικανότητας σχηματισμού αφρού των πρωτεϊνών που υφίστανται θέρμανση, iii) η απώλεια της διατροφικής αξίας των ευαίσθητων στη θέρμανση, στην οξείδωση ή στο φως βιταμινών, και ο πιθανός σχηματισμός τοξικών παραγώγων (Taoukis και Labuza, 1996). Στους Πίνακες 1.1 και 1.2 παρουσιάζονται μερικά παραδείγματα των μεταβολών που συμβαίνουν στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων και ορισμένες από τις χημικές και βιοχημικές αντιδράσεις που ευθύνονται για τις παρατηρούμενες μεταβολές κι έχουν ως συνέπεια την υποβάθμιση της ποιότητας και ασφάλειας των τροφίμων (Fennema και Tannenbaum, 1996). Το σύνολο των χαρακτηριστικών, που αναφέρθηκαν παραπάνω, κι επιτρέπουν το διαχωρισμό του τροφίμου ή καθορίζουν το βαθμό αποδοχής του από τον καταναλωτή, ορίζουν την ποιότητά του. Οι μεταβολές των ποιοτικών χαρακτηριστικών ενός τροφίμου συμβαίνουν όχι μόνο κατά την εφαρμογή των διαφόρων επεξεργασιών, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αλλά και μετά το πέρας αυτών κατά τη συντήρησή του, με ρυθμό που προσδιορίζεται από τις ίδιες τις ιδιότητες του τροφίμου αλλά και από τον τύπο της συσκευασίας του ή τις συνθήκες συντήρησης και διανομής του. Παράδειγμα ποιοτικής υποβάθμισης των τροφίμων κατά τη συντήρησή τους αποτελεί η μικροβιολογική αλλοίωση των συντηρούμενων υπό ψύξη προϊόντων, προκαλούμενη από τη δράση της ενδογενούς μικροχλωρίδας ή βακτηρίων του περιβάλλοντος χώρου κατά την επιμόλυνσή τους. Πρόκειται λοιπόν για μια δυναμική κατάσταση με φθίνουσα συνήθως πορεία, που οδηγεί σε πεπερασμένη διατηρησιμότητα ή διάρκεια ζωής (shelf life). Εξαίρεση από τον κανόνα αυτόν αποτελούν τα προϊόντα των οποίων η ποιότητα βελτιώνεται με την πάροδο του χρόνου, όπως συμβαίνει κατά την ωρίμανση των τυριών ή παλαίωση των κρασιών, ή κατά την προσθήκη συστατικών (fortification) με στόχο τη βελτίωση των διατροφικών χαρακτηριστικών του προϊόντος. Διάφοροι ορισμοί έχουν διατυπωθεί για την έννοια της διάρκειας ζωής, χωρίς κάποιος από αυτούς να έχει υιοθετηθεί ως ο πλέον εφαρμόσιμος. Ο καθορισμός της διάρκειας ζωής και των κριτηρίων που οριοθετούν το τέλος της, εξαρτάται από το ίδιο το προϊόν και τη χρήση για την οποία αυτό προορίζεται. Σύμφωνα με τους Fu και Labuza (1993), ως διάρκεια ζωής ορίζεται η χρονική περίοδος που μεσολαβεί μέχρι το προϊόν να καταστεί μη αποδεκτό από πλευράς ασφάλειας, οργανοληπτικών ή /και θρεπτικών χαρακτηριστικών. Η βιομηχανία, καθορίζει από την πλευρά της το τέλος του χρόνου ζωής ενός προϊόντος που παράγει, βάσει της έκτασης που μπορεί να λάβει η απώλεια ενός ποιοτικού χαρακτηριστι- 2

37 Διδακτορική Διατριβή 1. Εισαγωγή Σκοπός μελέτης Πίνακας 1.1. Κατηγορίες μεταβολών που συμβαίνουν στα τρόφιμα κατά το χειρισμό, επεξεργασία και αποθήκευσή τους. Ποιοτικά χαρακτηριστικά Υφή Γεύση-Άρωμα Χρώμα Θρεπτική αξία Μεταβολές Μείωση διαλυτότητας Μείωση της ικανότητας συγκράτησης νερού Φαινόμενα σκλήρυνσης Φαινόμενα απώλειας τραγανότητας Ανάπτυξη: ταγγής γεύσης και οσμής αρώματος ψημένου ή αρώματος καραμέλας άλλων ανεπιθύμητων οσμών επιθυμητού αρώματος Αμαύρωση Λεύκανση Αποχρωματισμός Ανάπτυξη άλλων ανεπιθύμητων χρωματισμών Ανάπτυξη επιθυμητού χρώματος (π.χ. καστανό χρώμα ψημένων προϊόντων) Απώλεια, αποικοδόμηση, ή μεταβολή στη βιοδιαθεσιμότητα πρωτεϊνών, λιπιδίων, βιταμινών και ιχνοστοιχείων Ασφάλεια Σχηματισμός τοξικών ουσιών Ανάπτυξη ουσιών με προστατευτική δράση στην υγεία Αδρανοποίηση τοξικών ουσιών Πηγή: Fennema και Tannenbaum, 1996 Πίνακας 1.2. Ορισμένες χημικές και βιοχημικές αντιδράσεις που μπορούν να προκαλέσουν μεταβολές στην ποιότητα και ασφάλεια των τροφίμων. Τύπος αντίδρασης Παραδείγματα Μη ενζυμική αμαύρωση Ψημένα προϊόντα Ενζυμική αμαύρωση Κομμένα φρούτα Οξείδωση Λίπη (δυσάρεστη οσμή γεύση), αποικοδόμηση βιταμινών απόχρωματισμός χρωστικών, πρωτεΐνες (απώλεια διατροφικής αξίας) Υδρόλυση Λιπίδια, πρωτεΐνες, βιταμίνες, υδατάνθρακες, χρωστικές Αλληλεπιδράσεις μετάλλων Σύμπλοκα (ανθοκυανίνες), απώλεια Mg από τη χλωροφύλλη, κατάλυση οξειδωτικών αντιδράσεων Ισομερίωση λιπών Cis trans, μη σύζευξη σύζευξη Κυκλοποίηση λιπών Μονοκυκλικά λιπαρά οξέα Πολυμερισμός λιπών Αφρισμός κατά το τηγάνισμα λίπους Μετουσίωση πρωτεϊνών Θρόμβωση του λευκού των αυγών, αδρανοποίηση ενζύμων Σύζευξη πρωτεϊνών Απώλεια διατροφικής αξίας κατά την επεξεργασία με αλκάλεα (cross-linking) Σύνθεση πολυσακχαριτών Στα φυτά μετά τη συγκομιδή Μεταβολές γλυκόλυσης Ιστοί των ζώων μετά θάνατον, ιστοί φυτών μετά τη συγκομιδή Πηγή: Fennema και Tannenbaum, 1996 κού και που η ίδια επιτρέπει να συμβεί, πριν την κατανάλωση του προϊόντος (Fu και Labuza 1993). Ο καταναλωτής από τη δική του σκοπιά, ορίζει ως τέλος της διάρκειας ζωής 3

38 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή το χρόνο κατά τον οποίο το τρόφιμο είναι μη αποδεκτό ως προς τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Συνειδητοποιώντας ότι είναι ανέφικτη η ικανοποίηση όλων των καταναλωτών ανά πάσα στιγμή, και λαμβάνοντας επίσης υπόψη την πολυπλοκότητα που διέπει τους μηχανισμούς ποιοτικής υποβάθμισης των συστημάτων τροφίμων, είναι στην πραγματικότητα αδύνατη η υιοθέτηση ενός και μόνο ορισμού του χρόνου ζωής αυτών. Ωστόσο, η διάρκεια ζωής μπορεί να προσδιοριστεί και ακολούθως να προβλεφθεί για μεμονωμένα προϊόντα τροφίμων με βάση κάποιο πρωτεύοντα μηχανισμό υποβάθμισης (Fu και Labuza, 1993). Η ακριβής πρόβλεψη της διάρκειας ζωής των τροφίμων είναι υψίστης σημασίας στην επιστήμη των τροφίμων, όχι μόνο για τις εταιρίες αλλά και για τις κρατικές υπηρεσίες και τους καταναλωτές. Όπως ήδη αναφέρθηκε, η μικροβιολογική αλλοίωση αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους τύπους υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων, ιδιαίτερα για τα ελάχιστα επεξεργασμένα προϊόντα που συντηρούνται υπό ψύξη. Οι μικροοργανισμοί μπορούν να προκαλέσουν αλλοίωση στο προϊόν ή και τροφικές δηλητηριάσεις (παθογόνα στελέχη). Συνεπώς, οι παραγωγοί τέτοιων τροφίμων, οφείλουν να διεξάγουν δοκιμές εκτίμησης της διάρκειας ζωής των προϊόντων που παράγουν, να προσδιορίζουν τη χρονική στιγμή της αλλοίωσης και να αξιολογούν την αποτελεσματικότητα της εφαρμογής διαφόρων μεθόδων παρεμπόδισης της ανάπτυξης των παθογόνων μικροοργανισμών, κάνοντας χρήση των κατάλληλων επιστημονικών μελετών και εκτιμώντας την πιθανή επικινδυνότητα των παραγόμενων τροφίμων. Μια πρόωρη απώλεια του χρόνου ζωής μπορεί να οδηγήσει στη μείωση της εμπιστοσύνης του καταναλωτή και σε επιστροφές των αλλοιωμένων προϊόντων πίσω στη βιομηχανία τροφίμων. Επιπλέον, η εξέταση της διάρκειας ζωής των τροφίμων επιτρέπει τη μείωση του κόστους των εταιριών σε ότι αφορά το σχεδιασμό νέων προϊόντων και τη συσκευασία τους. Η αναγραφή των ενδείξεων πώληση πριν ή ανάλωση πριν στη συσκευασία του προϊόντος, στηρίζεται ασφαλώς σε κάποιου είδους εκτίμηση του χρόνου ζωής των προϊόντων. Η εκτίμηση της διάρκειας ζωής ενός τροφίμου γίνεται συνήθως με την υιοθέτηση κάποιου δείκτη ποιότητας που να σχετίζεται με τη μικροβιακή σταθερότητα, τις φυσικές και οργανοληπτικές ιδιότητες του τροφίμου ή το ρυθμό των χημικών μεταβολών που είναι δυνατό να συμβούν στο προϊόν. Ακολούθως, ορίζονται τα επίπεδα απώλειας της κάθε ποιοτικής παραμέτρου, τα οποία και θα σημάνουν τη λήξη της εμπορικής διάρκειας ζωής του προϊόντος, καθώς και η μεθοδολογία βάσει της οποίας θα γίνεται η εκτίμηση των ποιοτικών αυτών παραμέτρων. Η εκτίμηση των ποιοτικών παραμέτρων γίνεται διεξάγοντας μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, μικροβιολογικές ή φυσικοχημικές αναλύσεις ή εξετάζοντας 4

39 Διδακτορική Διατριβή 1. Εισαγωγή Σκοπός μελέτης παράλληλα τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος στόχου, ενώ αναγκαία είναι επίσης η τακτική παρακολούθηση του δείκτη ποιότητας στην πορεία του χρόνου, κάνοντας χρήση των αρχών της κινητικής μοντελοποίησης. Επιπρόσθετα, απαραίτητη κρίνεται η πολύ καλή γνώση της σύστασης του υπό μελέτη προϊόντος και των ενδογενών παραγόντων που καθορίζουν την ποιότητά του (ph, ενεργότητα νερού, οξειδοαναγωγικό δυναμικό, δομή), των συνθηκών του περιβάλλοντος που επικρατούν κατά την αποθήκευση ή επεξεργασία του (εξωγενείς παράγοντες όπως η θερμοκρασία, η πιθανή συντήρηση σε ατμόσφαιρα αερίων, η σχετική υγρασία του περιβάλλοντα χώρου), καθώς και το πώς οι μεταβολές αυτών των παραγόντων επηρεάζουν και επιδρούν στις κινητικές παραμέτρους του ποιοτικού δείκτη, η απώλεια του οποίου έχει υιοθετηθεί για την περιγραφή του φαινομένου. Η κινητική μοντελοποίηση έχει εφαρμοστεί εκτενώς στην περιγραφή των μικροβιολογικών μεταβολών που συμβαίνουν στα τρόφιμα και αναφέρεται ως ποσοτική μικροβιολογία (predictive microbiology) (Buchanan, 1993a, Fu και Labuza, 1993, McMeekin και Ross, 1996a, Ross και McMeekin, 1994, Zwietering et al., 1993). Στην ουσία, προκειμένου να προβλεφθεί η μικροβιολογική ποιότητα ενός τροφίμου, χρησιμοποιείται μια μαθηματική εξίσωση η οποία περιγράφει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών ως συνάρτηση του χρόνου, της θερμοκρασίας και των λοιπών παραγόντων (πχ. του ph και της ενεργότητας νερού) που επηρεάζουν την εν λόγω υποβάθμιση (Van Boekel, 1996). Μερικά από τα βασικά οφέλη της μικροβιολογίας πρόρρησης και των μοντέλων πρόβλεψης της ποιότητας και ασφάλειας των τροφίμων που αυτή χρησιμοποιεί είναι: i) η αυξημένη εμπιστοσύνη που παρέχει κατά την εκτίμηση της ποιότητας και εμπορικής διάρκειας ζωής του προϊόντος, επιτρέποντας την ανάπτυξη των περισσότερο απομακρυσμένων αγορών, ii) ο προσδιορισμός συγκεκριμένων παραμέτρων που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ανάπτυξη νέων μικροβιολογικά σταθερών προϊόντων από τη βιομηχανία παραγωγής τροφίμων, iii) η επισήμανση και ποσοτικοποίηση της επίδρασης των σφαλμάτων που ενδεχομένως συμβαίνουν κατά την επεξεργασία ή βαρύνουν το σύστημα διανομής και τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε απόρριψη των προϊόντων, και iv) η παροχή των βασικών θεμελίων για την ανάπτυξη ορθολογικότερων συστημάτων διασφάλισης της ποιότητας, όπως το HACCP, με τη συλλογή πλήθους πληροφοριών γύρω από τη συμπεριφορά των μικροοργανισμών στα τρόφιμα και άρα τον προσδιορισμό συγκεκριμένων παραμέτρων επεξεργασίας, το σχεδιασμό των προϊόντων και των πρακτικών που υιοθετούνται κατά την αποθήκευση και διανομή, με απώτερο στόχο την παρεμπόδιση ή τον περιορισμό της μικροβιακής ανάπτυξης σε ένα αποδεκτό επίπεδο 5

40 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή (McMeekin και Ross, 1996a). Επιπλέον, τα μοντέλα πρόβλεψης της μικροβιολογικής ποιότητας συμβάλλουν: α) στην καλύτερη εφαρμογή της Ανάλυσης Επικινδυνότητας (Risk Assessment), και συνεπώς στην αποτελεσματικότερη εκτίμηση της ασφάλειας των τροφίμων και την προστασία του καταναλωτικού κοινού από την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών στα τρόφιμα και τη μείωση του κινδύνου πρόκλησης τροφικών δηλητηριάσεων, β) στη μείωση του κόστους και του απαιτούμενου χρόνου κατά τη διαδικασία εκτίμησης της διάρκειας ζωής των προϊόντων, με τη διεξαγωγή λιγότερων τεστ πρόκλησης υποβάθμισης της ποιότητας, από τη βιομηχανία, γ) στη δυνατότητα εκτίμησης του χρόνου ζωής των προϊόντων με ακρίβεια, ακόμη και στην περίπτωση που οι παράγοντες που επιδρούν στη διατηρησιμότητα μεταβάλλονται συνεχώς, όπως στην περίπτωση χρήσης των δυναμικών μοντέλων που προβλέπουν την ποιότητα, κάτω από μεταβαλλόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες που επικρατούν κατά την επεξεργασία και διανομή των προϊόντων, δ) στην τεχνική ολοκλήρωσης του χρονο-θερμοκρασιακού ιστορικού ενός προϊόντος και συσχέτισης αυτού με κάποιο από τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του, τα οποία επίσης εξαρτώνται έντονα από τη θερμοκρασία, όπως συμβαίνει με την εφαρμογή των χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών (Time-Temperature-Indicators) στην παρακολούθηση της ποιότητας των τροφίμων (McDonald και Sun, 1999). Οι βασικές αρχές της κινητικής μοντελοποίησης που χρησιμοποιεί η επιστήμη της μικροβιολογίας πρόρρησης μπορούν να εφαρμοστούν και για την εκτίμηση των χημικών μεταβολών στα τρόφιμα, αρκεί η μαθηματική εξίσωση που θα επιλεγεί για να προβλέψει τις χημικές φυσικοχημικές ιδιότητες στη συγκεκριμένη περίπτωση, να σχετίζεται με τις υπό μελέτη αντιδράσεις που ευθύνονται για τη συγκεκριμένη υποβάθμιση. Για την εκτίμηση των σχετικών παραμέτρων της μαθηματικής εξίσωσης απαραίτητη είναι η συλλογή ικανοποιητικού αριθμού αξιόπιστων και ορθών πειραματικών δεδομένων, ώστε να διασφαλιστεί η εγκυρότητα των μαθηματικών προσεγγίσεων για τον προσδιορισμό κινητικών παραμέτρων και άρα των απορρεουσών προβλέψεων. Στην περίπτωση που εκτιμηθούν λανθασμένες τιμές για τις παραμέτρους των μαθηματικών εξισώσεων, ο τελικός έλεγχος της ποιότητας των τροφίμων θα είναι ανεπαρκής - άστοχος. Στη βέλτιστη εκτίμηση των παραμέτρων των μαθηματικών μοντέλων, συμβάλλει ουσιαστικά η χρήση των κατάλληλων στατιστικών πακέτων και λογισμικών προγραμμάτων (Van Boekel, 1996). Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη και εφαρμογή κινητικών μεθόδων στην εκτίμηση της ποιότητας των τροφίμων. Αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η χρήση της κινητικής προσέγγισης στην περιγραφή μεταβολών που συμβαίνουν σε συστήματα τροφίμων, τα οποία υποβαθμίζονται τόσο εξαιτίας χημικών αντιδράσεων, όσο 6

41 Διδακτορική Διατριβή 1. Εισαγωγή Σκοπός μελέτης και λόγω της μικροβιακής αλλοίωσης ως συνέπεια της ανάπτυξης της ενδογενούς μικροχλωρίδας, τόσο σε στατικές (ισόθερμες) συνθήκες επεξεργασίας ή συντήρησης, όσο και σε δυναμικά μεταβαλλόμενες συνθήκες. Σε πρώτη φάση άξια έρευνας κρίθηκε η μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης συμπυκνωμένου χυμού μήλου, του μελιού και των αραιωμένων συστημάτων αυτών (διαφοροποίηση ως προς την α w ), κατά τη θερμική τους επεξεργασία. Τα δύο αυτά προϊόντα, συμπυκνωμένος χυμός μήλου και μέλι, αποτελούν αντιπροσωπευτικά παραδείγματα συστημάτων τροφίμων με μέση ή χαμηλή περιεκτικότητα σε υγρασία, αντίστοιχα, που εμφανίζονται μεν μικροβιολογικά σταθερά εξαιτίας της χαμηλής ενεργότητας νερού, ωστόσο υπόκεινται σε υποβάθμιση της ποιότητάς τους εξαιτίας της αντίδρασης Maillard μεταξύ των περιεχόμενων σε αυτά αναγωγικών σακχάρων και αμινοξέων. Το φαινόμενο της αμαύρωσης είναι εντονότερο στις υψηλές θερμοκρασίες της παστερίωσης αποστείρωσης του χυμού, ή όσον αφορά στο μέλι, κατά την εφαρμοζόμενη θέρμανση που έχει ως στόχους τη μείωση της τάσης του να κρυσταλλώνει, την αδρανοποίηση της ενδογενούς σε αυτό μικροχλωρίδας, ή τη μείωση του ιξώδους του και την συνακόλουθη ευκολότερη πλήρωση των περιεκτών κατά τη συσκευασία του. Αναλυτικότερα, μελετήθηκε η μεμονωμένη και συνδυασμένη δράση των παραγόντων θερμοκρασία, α w ή / και των περιεχόμενων διαλυτών αντιδρώντων στερεών συστατικών, στη μεταβολή του χρώματος, όπως περιγράφεται από την μετρούμενη απορρόφηση (absorbance), αυτών των προϊόντων κατά τη θέρμανση. Το χρώμα αποτελεί ένα από τα βασικότερα κριτήρια εκτίμησης της ποιότητας τέτοιου είδους αγαθών από τον καταναλωτή. Η κινητική σχηματισμού έγχρωμων μελανών συστατικών περιγράφηκε με μια σειρά μαθηματικών μοντέλων, ενώ η συνδυασμένη δράση των παραπάνω παραγόντων στη μεταβολή του ρυθμού της αντίδρασης, με τη βοήθεια των δευτερογενών μοντέλων, έδωσε την δυνατότητα αξιολόγησης α) του κινητικού μοντέλου που επιλέχτηκε στην πρόβλεψη της πορείας του ίδιου φαινομένου σε πειράματα που διεξήχθησαν σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που επιλέχθηκαν στον αρχικό πειραματικό σχεδιασμό, και β) του ανασχηματισμένου ολοκληρωμένου δυναμικού μοντέλου που προέκυψε στην πρόβλεψη της έκτασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης των δύο προϊόντων κάτω από δυναμικές συνθήκες θέρμανσης, σε μια προσπάθεια σύγκρισης της πειραματικής θερμικής επεξεργασίας με τα συνεχώς μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα θέρμανσης που συχνά εφαρμόζονται στη βιομηχανική παραγωγή των τροφίμων. Δεύτερο αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η χρήση της κινητικής μοντελοποίησης στην εκτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας των τροφίμων. Ειδικότερα, 7

42 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η συνεχής παρακολούθηση της προκαλούμενης στα τρόφιμα αλλοίωσης από τη δράση των υπεύθυνων μικροοργανισμών, μέσω της ανάπτυξης ενός νέου τύπου χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη (ΤΤΙ), με βασική αρχή λειτουργίας τη μικροβιακή ανάπτυξη και τον κυτταρικό μεταβολισμό. Το εν λόγω μικροβιακό ΤΤΙ μπορεί να καταγράφει τη συνολική επίδραση του θερμοκρασιακού ιστορικού στην ποιότητα των προϊόντων που συνοδεύει, και να την αποτυπώνει μέσω μιας εύκολα μετρήσιμης και ευδιάκριτης χρωματικής μεταβολής ενός χημικού δείκτη, που επίσης συμπεριλαμβάνεται στο σύστημα του ΤΤΙ. Η αλλαγή στο χρώμα του χημικού δείκτη συμβαίνει κατά την πτώση του ph η οποία προκαλείται από την παραγωγή γαλακτικού οξέος, ως αποτέλεσμα της μεταβολικής δραστηριότητας ενός γαλακτικού βακτηρίου σε κάποιο κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα. Συνεπώς, η αναμενόμενη κινητική της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ, όπως περιγράφηκε παραπάνω, μπορεί να σχετιστεί άμεσα με την ποιοτική υποβάθμιση ενός προϊόντος, λόγω της προκαλούμενης σ αυτό αλλοίωσης από τα γαλακτικά βακτήρια. Αντίθετα, τα ήδη γνωστά στη βιβλιογραφία συστήματα χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών, που έχουν κατά καιρούς αναπτυχθεί, υστερούν ως προς την αξιοπιστία τους να μεταφράζουν με ακρίβεια την υποβάθμιση της ποιότητας των τροφίμων, αφού έχοντας ως βασικές αρχές λειτουργίας τη μοριακή διάχυση, τις αντιδράσεις πολυμερισμού ή τις ενζυμικές μεταβολές, προσπαθούν να περιγράψουν μια εντελώς διαφορετική διεργασία, όπως αυτή της μικροβιακής αλλοίωσης των τροφίμων. Αρχικός στόχος στη μελέτη ανάπτυξης του μικροβιακού ΤΤΙ, ήταν η αναζήτηση επιλογή των βασικών δομικών συστατικών του, δηλαδή του κατάλληλου βακτηριακού στελέχους, του θρεπτικού υποστρώματος στο οποίο αυτό θα αναπτύσσονταν και του αντίστοιχου χημικού δείκτη. Άλλα αντικείμενα αποτέλεσαν, η διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της απόκρισης του ΤΤΙ και της μεταβολικής δραστηριότητας του βακτηριακού στελέχους, η μελέτη της κινητικής του υπό ανάπτυξη συστήματος και η δυνατότητα ρύθμισης του σημείου λήξης του, ώστε να μπορεί αυτό να εφαρμοστεί σε μεγάλο εύρος προϊόντων με ποικίλες δυνατότητες διατήρησης και άρα διαφορετικούς χρόνους ζωής. Τέλος, το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητά του να εκτιμήσει την πραγματική αλλοίωση αλεσμένου βοδινού κρέατος συσκευασμένου σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (Modified Atmosphere Packed, MAP). Ως γνωστό, τα προϊόντα κρέατος MAP αλλοιώνονται πρωτίστως από την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων και δεδομένου ότι το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στηρίχτηκε στη μεταβολική δραστηριότητα ενός γαλακτικού βακτηρίου, το εν λόγω προϊόν αποτέλεσε το καταλληλότερο τρόφιμο για την επαλήθευση της αξιοπιστίας του αναπτυχθέντως ΤΤΙ. 8

43 Διδακτορική Διατριβή 1. Εισαγωγή Σκοπός μελέτης Συγκεκριμένα, εξετάστηκε ταυτόχρονα, τόσο η κινητική αλλοίωσης των δειγμάτων βοδινού κιμά συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα (MAP), όσο και της κινητικής του μικροβιακού ΤΤΙ (χρωματικές μεταβολές), ενώ παράλληλα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις, η οργανοληπτική αξιολόγηση του προϊόντος κρέατος έδωσε σημαντικές πληροφορίες για τη διάρκεια ζωής του εν λόγω προϊόντος, τόσο σε ισόθερμες όσο και σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης, σε μια προσπάθεια προσομοίωσης των πραγματικών συνθηκών που επικρατούν στην ψυκτική αλυσίδα. 9

44 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 10

45 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση 2. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 2.1 Μαθηματικά μοντέλα Ως μαθηματικό μοντέλο ορίζεται η μαθηματική περιγραφή μιας φυσικής, χημικής η βιολογικής κατάστασης ή διεργασίας. Κατά μία έννοια, το μοντέλο απλοποιεί ένα σύστημα κάνοντας χρήση ενός συνδυασμού από εκφράσεις, μαθηματικές συναρτήσεις και εξισώσεις, όπως και συγκεκριμένες συνθήκες εκκίνησης. Τα μαθηματικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν εκτενώς σε όλες τις επιστήμες. Για πρώτη φορά εφαρμόστηκαν στη μικροβιολογία τροφίμων στις αρχές του 20 ου αιώνα για να περιγράψουν την αδρανοποίηση των παθογόνων μικροοργανισμών που έχουν προέλευση τα τρόφιμα, κατά τη θερμική επεξεργασία των προϊόντων τροφίμων. Από τότε, και με την έλευση των προσωπικών ηλεκτρονικών υπολογιστών και την ανάπτυξη στατιστικών πακέτων με μεγαλύτερες δυνατότητες, η χρήση της μοντελοποίησης στη μικροβιολογία τροφίμων αναπτύχθηκε ευρέως, που πλέον αναγνωρίζεται ως ένας διακριτός κλάδος της εν λόγω επιστήμης, οριζόμενος ως Ποσοτική Μικροβιολογία (McKellar και Lu, 2004). Η επιστήμη της μικροβιολογίας πρόρρησης έχει πολλές εφαρμογές τόσο στη μικροβιολογική ασφάλεια αλλά και στη μικροβιολογική ποιότητα των τροφίμων, ενώ πρόσφατα η σημαντικότερη συνεισφορά της είναι στην ανάπτυξη και υποστήριξη καινοτομιών που σχετίζονται με την ασφάλεια των τροφίμων. Τα μοντέλα μικροβιακής ανάπτυξης και αδρανοποίησης παρουσιάζονται πλέον αρκετά λεπτομερή και ακριβή ώστε να μπορούν να συνεισφέρουν σημαντικά στις προβλέψεις επιστημόνων και νομοθετών σχετικά με τον αντίστοιχο κίνδυνο που εγκυμονεί η παραγωγική διαδικασία ενός προϊόντος, η συντήρηση ή η κατανάλωσή του (McKellar και Lu, 2004). Αναγνωρίζοντας λοιπόν την αναμφισβήτητη προσφορά του κλάδου της επιστήμης της μικροβιολογίας τροφίμων στην ανάπτυξη και εφαρμογή της μοντελοποίησης, η παρούσα βιβλιογραφική ανασκόπηση θα εστιαστεί στην περιγραφή των σημαντικότερων μαθηματικών μοντέλων που μπορούν να εφαρμοστούν στη μελέτη της εκτίμησης της 11

46 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ποιότητας των τροφίμων, βασιζόμενη στην κατηγοριοποίηση των μοντέλων όπως αυτή χρησιμοποιείται από την επιστήμη της μικροβιολογίας πρόρρησης. Πολλοί και διαφορετικοί τρόποι κατηγοριοποιήσεων, έχουν προταθεί για το πλήθος των μαθηματικών εξισώσεων που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική μικροβιολογία των τροφίμων, χωρίς να έχει αποφασιστεί απόλυτα η αποδοχή ενός μοναδικού τύπου κατάταξης (McDonald και Sun, 1999). Εντούτοις, με στόχο την ευκολότερη χρήση της μικροβιολογίας πρόρρησης κρίνεται αναγκαία η χρήση μιας ενιαίας ορολογίας και ενός κοινού τρόπου κατάταξης των μοντέλων από όλους τους ερευνητές. Έτσι, το μόνο σύστημα κατάταξης που μπορεί να συμπεριλάβει πολλές διαφορετικές κατηγορίες μοντέλων είναι αυτό που προτάθηκε από τους Whiting και Buchanan (1993) και ομαδοποιεί τα μοντέλα σε πρωτογενή, δευτερογενή και τριτογενή, ανάλογα με τη δυνατότητα χρήσης τους. Άλλου είδους ομαδοποιήσεις που έχουν επίσης προταθεί είναι η κατάταξή τους ανάλογα με τη συμπεριφορά των μικροοργανισμών σε μοντέλα ανάπτυξης, μοντέλα επιβίωσης και μοντέλα αδρανοποίησης, ή αν βασίζονται στην κινητική του πληθυσμού των μικροοργανισμών ή στις πιθανότητες, δηλαδή σε κινητικά μοντέλα ή μοντέλα πιθανοτήτων, αντίστοιχα. Επιπλέον, ένα άλλο κριτήριο κατάταξης είναι αν στηρίζονται σε κάποιου είδους θεωρητική βάση ή όχι, οπότε και διακρίνονται σε μηχανιστικά ή εμπειρικά. Ορισμένοι από τους βασικούς τύπους ομαδοποίησης των μοντέλων αναφέρονται στη συνέχεια Κινητικά μοντέλα και μοντέλα πιθανοτήτων Στη μοντελοποίηση με δυνατότητες πρόβλεψης, η χρήση των μαθηματικών συναρτήσεων αποτελεί ένα μέσο για τη διάκρισή τους. Ένα μαθηματικό μοντέλο μπορεί να βασίζεται στις αρχές της κινητικής προσέγγισης ή στις αρχές των πιθανοτήτων. Η επιλογή της προσέγγισης που χρησιμοποιείται κάθε φορά εξαρτάται κυρίως από τον τύπο του μικροοργανισμού που αναμένεται να προσδιοριστεί και τον αριθμό των μεταβλητών που απαιτούνται για την ολοκληρωμένη περιγραφή της επιθυμητής απόκρισης που επιχειρείται (McDonald και Sun, 1999). Τα κινητικά μοντέλα μπορούν να προβλέψουν την έκταση και το ρυθμό ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού (Buchanan, 1993a). Προσπαθούν να περιγράψουν το χρόνο που απαιτείται για μια δεδομένη απόκριση ανάπτυξης, λαμβάνοντας παράλληλα υπόψη περιβαλλοντικές παραμέτρους όπως η θερμοκρασία, το ph και την α w, (Van Boekel, 1996). Ένας τρόπος προσέγγισης των κινητικών μοντέλων είναι η αρχική εκτίμηση του ρυθμού ανάπτυξης του μικροοργανισμού, και με βάση την εκθετική ανάπτυξη του μικροβιακού 12

47 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση πληθυσμού ακολουθούν οι αντίστοιχες προβλέψεις. Μια άλλη μέθοδος στηρίζεται στην προσαρμογή μιας σιγμοειδούς συνάρτησης ή καμπύλης στα δεδομένα της μικροβιακής ανάπτυξης του πληθυσμού ενός μικροοργανισμού, ενώ στη συνέχεια στην ίδια συνάρτηση ενσωματώνονται οι επιδράσεις διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως η θερμοκρασία. Η προσαρμογή της σιγμοειδούς αυτής συνάρτησης δίνει τη δυνατότητα να γίνουν προβλέψεις για τους υπό μελέτη μικροοργανισμούς σε κάποιο συγκεκριμένο σύστημα τροφίμου. Και στις δύο αυτές περιπτώσεις τα μοντέλα δομούνται μετά από προσεκτική αξιολόγηση των δεδομένων που έχουν συλλεχθεί και αφορούν την αύξηση της μικροβιακής βιομάζας και του πληθυσμού σε καθορισμένες από τη μελέτη συνθήκες των ενδογενών και εξωγενών παραγόντων, όπως είναι η θερμοκρασία, το ph ή η α w, με στόχο την πρόβλεψη της φάσης προσαρμογής, του χρόνου αναπαραγωγής ή του εκθετικού ρυθμού ανάπτυξης των μικροοργανισμών που μελετούνται (Van Impe et al., 1995, Zwietering et al., 1991). Άλλες μεταβλητές που μπορούν να συμπεριληφθούν είναι η ατμόσφαιρα αερίων, το οξειδοαναγωγικό δυναμικό (Eh), η βιολογική δομή, η σχετική υγρασία, η συγκέντρωση σε θρεπτικά συστατικά και η παρουσία αντιμικροβιακών παραγόντων. Τα κινητικά μοντέλα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στην πρόβλεψη των μικροβιακών πληθυσμών ως συνάρτηση του χρόνου, ακόμα κι αν μια από τις ελεγχόμενες παραμέτρους που αναφέρθηκαν και επηρεάζουν την ανάπτυξη μεταβάλλεται. Ωστόσο, είναι δύσκολο να αναπτυχθούν, καθώς απαιτούν μεγάλο αριθμό πειραματικών δεδομένων και άρα μικροβιολογικών αναλύσεων (Baranyi et al., 1995). Συνεπώς, τα κινητικά μοντέλα χαρακτηρίζονται από την ιδιότητά τους να μπορούν να προσδιορίζουν και να προβλέπουν την κατάσταση ενός συστήματος τροφίμου σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή, εφόσον είναι γνωστές οι συνθήκες που επικρατούν κατά την έναρξη μιας διαδικασίας ή ενός φαινομένου, συνδυάζοντας στην προσπάθεια αυτή όλες τις δυνατότητες που παρέχουν οι μαθηματικές συναρτήσεις. Όμως, ενώ ο ορισμός μιας συνάρτησης είναι σχετικά εφικτός, δε συμβαίνει το ίδιο με τις συνθήκες κατά την έναρξη των φαινομένων, ιδιαίτερα όταν πρόκειται για μεμονωμένα κύτταρα μικροοργανισμών και ιδιαίτερα όταν οι συνθήκες περιβάλλοντος μεταβάλλονται. Τα μοντέλα που λαμβάνουν υπόψη τους τον παράγοντα αβεβαιότητα και διακύμανση σε ένα πειραματικό σύστημα καλούνται μοντέλα πιθανοτήτων, και περιγράφουν την πιθανότητα παρατήρησης μιας συγκεκριμένης απόκρισης ή το χρόνο για την εμφάνιση ενός φαινομένου. Τα μοντέλα αυτά έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα στο παρελθόν για την πρόβλεψη της πιθανότητας εκβλάστησης των παθογόνων σπορογόνων βακτηρίων (McKellar και Lu, 2004), όπως του 13

48 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Clostridium botulinum. Επίσης, εξετάζουν την πιθανότητα ένας μικροοργανισμός να αναπτυχθεί, ή να μην αναπτυχθεί, να πεθάνει ή να παράγει κάποιο μεταβολίτη σε κάποιο χρονικό διάστημα. Η βάση των μοντέλων πιθανότητας είναι η σχέση μεταξύ της ανάπτυξης των μικροβιακών κυττάρων και των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του περιβάλλοντος. Ωστόσο, η πιθανότητα είναι μια έννοια που μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, οπότε τα μοντέλα πιθανοτήτων ίσως χρειάζεται να συνδυάζονται κάποιες φορές με τα κινητικά μοντέλα, γεγονός που ευθύνεται για τη σύγχυση που επικρατεί κατά τη διάκριση των δύο αυτών τύπων μοντέλων (McDonald και Sun, 1999). Για παράδειγμα, αν η κατανομή πιθανότητας για κάποιο χρόνο απόκρισης είναι γνωστή, μπορεί να προσδιοριστεί η πιθανότητα ένας μικροοργανισμός να αναπτυχθεί γρηγορότερα από μια προβλεπόμενη απόκριση. Συνεπώς, τα κινητικά μοντέλα μπορούν να περιγράψουν με συνέπεια τις αποκρίσεις της μικροβιακής ανάπτυξης αλλά κάποιες φορές ίσως είναι αναγκαία και η χρήση κάποιου μοντέλου πιθανότητας (Ratkowsky et al., 1996). Στις συνθήκες περιορισμένης ανάπτυξης, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και η πιθανότητα για την επίτευξη ενός προβλεπόμενου ρυθμού ανάπτυξης ή μη ανάπτυξης (Ross και McMeekin, 1995). Ο συνδυασμός των προσεγγίσεων της κινητικής και των πιθανοτήτων μπορεί να θεωρηθεί ως μια περισσότερο ολοκληρωμένη μεθοδολογία στην επιστήμη της μικροβιολογίας πρόρρησης αλλά και ως ένας τρόπος άμεσου συσχετισμού αυτού του κλάδου της μικροβιολογίας με τη θεωρία των εμποδίων (Ratkowsky και Ross, 1995) Εμπειρικά μοντέλα και μοντέλα μηχανιστικής βάσης Τα εμπειρικά μοντέλα συσχετίζουν με απλό τρόπο τις αποκρίσεις της μικροβιακής ανάπτυξης, επιβίωσης ή θανάτου με τα επίπεδα των ελεγχόμενων παραγόντων στο χώρο και τα εύρη του πειραματικού σχεδιασμού. Δεν παρέχουν καμιά πληροφορία σχετικά με τους φυσιολογικούς μηχανισμούς, ή τις βιολογικές, χημικές και φυσικές αρχές που ευθύνονται για τις μετρούμενες αποκρίσεις. Τα εμπειρικά μοντέλα δεν πρέπει να εφαρμόζονται εκτός του εύρους των παραγόντων που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξή τους, αφού δεν υπάρχει κάποια αρχή βάσει της οποίας μπορεί να επιτραπεί η επέκταση της χρήσης τους πέραν του εύρους των επιπέδων που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξή τους (Clive και McClure, 2002). Οι πολυωνυμικές εξισώσεις, τα τεχνητά νευρωνικά δίκτυα (artificial neural networks) και η ανάλυση πρωτευόντων συνιστωσών (principal component analysis) αποτελούν παραδείγματα εμπειρικών μοντέλων (McKellar και Lu, 2004). Τα πολυωνυμικά μοντέλα για παράδειγμα είναι εύκολα και άμεσα στη χρήση τους, χωρίς να 14

49 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση απαιτείται η γνώση κάποιας ιδιαίτερης επεξεργασίας για την εφαρμογή τους. Ωστόσο, τα πολυώνυμα δεν έχουν κάποιο θεωρητικό υπόβαθρο, είναι μη γραμμικές εξισώσεις, ισχύουν μόνο στο εύρος των μεταβλητών που ορίζεται από τα δεδομένα, κι εμπλέκουν πλήθος παραμέτρων - συντελεστών χωρίς κάποια βιολογική ερμηνεία και σημασία, οπότε τα μοντέλα αυτά δεν παρέχουν καμία πληροφορία σχετικά με τους μηχανισμούς των υπό μελέτη διεργασιών (Delignette-Muller, et al., 1995). Τα μοντέλα μηχανιστικής βάσης (ή επεξηγηματικά, ή παραγωγικά μοντέλα) στοχεύουν να συσχετίσουν τα πειραματικά δεδομένα με θεμελιώδεις επιστημονικές αρχές, ή τουλάχιστον με κάποιες φυσιολογικές διεργασίες ή μηχανισμούς. Πολλά μοντέλα, που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική μικροβιολογία, εμπλέκουν παραμέτρους που σχετίζονται με το παρατηρούμενο φαινόμενο και συνεπώς θεωρούνται μηχανιστικά. Οι πιο κοινοί τύποι μηχανιστικών μοντέλων είναι οι αναλυτικές εξισώσεις που μπορούν να προσαρμοστούν σε πειραματικά δεδομένα. Ωστόσο, για να χαρακτηριστεί ένα μοντέλο μηχανιστικό, θα πρέπει να εγείρει νέα ερωτήματα και υποθέσεις, που να μπορούν στη συνέχεια να διερευνηθούν. Κάτι τέτοιο δεν είναι πάντα εύκολο με τα μηχανιστικά μοντέλα, των οποίων η εφαρμογή επεκτείνεται δύσκολα σε δυναμικές συνθήκες, ενώ είναι επίσης δύσκολη η προσθήκη σε αυτά συμπληρωματικών σταδίων για την περιγραφή μιας επιπλέον διεργασίας (McKellar και Lu, 2004). Με τον καιρό, η κατανόηση των κυριότερων μηχανισμών που συμβαίνουν σε επίπεδο κυτταρικού μεταβολισμού, και κατά τον οποίο παράγονται δεδομένα, θα δώσει τη δυνατότητα ανάπτυξης περισσότερο αξιόπιστων μηχανιστικών μοντέλων. Τα μοντέλα αυτά θα παρουσιάζουν τον εμπλεκόμενο μηχανισμό με περισσότερη ακρίβεια, και θα αποτελούν το μέσο για την παραγωγή προβλέψεων από αντίστοιχες υποθέσεις (Bazin και Prosser, 1992). Στη συνέχεια, θα γίνεται εφικτή η ερμηνεία της μοντελοποιημένης απόκρισης με όρους γνωστών φαινομένων και διεργασιών (Krist et al., 1998). Σύμφωνα με τους Baranyi και Roberts (1994) τα μοντέλα μηχανιστικής βάσης θα μπορούσαν να αναπτυχθούν περαιτέρω καθώς αυξάνεται η ποσότητα και ποιότητα των πληροφοριών του υπό ανάλυση συστήματος. Ωστόσο, δεν υπάρχουν ολοκληρωμένα μηχανιστικά μοντέλα που να περιέχουν το σύνολο των ενδογενών και εξωγενών μεταβλητών που επηρεάζουν τη μικροβιακή ανάπτυξη (Labuza και Fu, 1993, Ross et al., 1993). Οι περισσότεροι ερευνητές θεωρούν ότι τα μηχανιστικά μοντέλα υπερέχουν σε σχέση με τα εμπειρικά και προτείνουν την ανάπτυξη μοντέλων που να αντανακλούν την υπάρχουσα γνώση γύρω από τη μικροβιακή δυναμική και την αναπαραγωγή ποιοτικών δεδομένων, τάση που ίσως σταδιακά μειώσει την ζήτηση των εμπειρικών μοντέλων ανάπτυξης. 15

50 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Πρωτογενή Δευτερογενή και Τριτογενή μοντέλα Η ομαδοποίηση των μαθηματικών μοντέλων από τους Whiting και Buchanan (1993) σε πρωτογενή δευτερογενή και τριτογενή, θεωρείται πλέον ο πιο αποδεκτός τρόπος ταξινόμησης, αφού μπορεί να συμπεριλάβει στην ίδια ομάδα διάφορες κατηγορίες μοντέλων, ανάλογα με τη χρήση τους. Τα πρωτογενή μοντέλα περιγράφουν τη μεταβολή του βακτηριακού πληθυσμού κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές και καλλιεργητικές συνθήκες. Η απόκριση μπορεί να μετρηθεί άμεσα υπολογίζοντας το συνολικό αριθμό ζώντων κυττάρων (total viable count, TVC), το σχηματισμό κάποιας τοξίνης, ή το επίπεδο συγκέντρωσης του υποστρώματος ή των προϊόντων μεταβολισμού, ή έμμεσα καταγράφοντας την απορρόφηση, την οπτική πυκνότητα και την εμπέδηση. Αν η καταγραφή της καμπύλης μικροβιακής ανάπτυξης εκφραστεί ως μεταβολή του συνολικού πληθυσμού συναρτήσει του χρόνου, τα δεδομένα αυτά μπορούν να απεικονιστούν γραφικά χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές μοντέλο. Η διαδικασία αυτή δίνει τη δυνατότητα για την απόκτηση σχετικών με το μικροοργανισμό πληροφοριών, όπως είναι ο χρόνος αναπαραγωγής, η διάρκεια της φάσης προσαρμογής, ο εκθετικός ρυθμός ανάπτυξης και η μέγιστη πυκνότητα του πληθυσμού (Whiting και Buchanan, 1993). Τα δευτερογενή μοντέλα περιγράφουν την επίδραση της μεταβολής ενός ή περισσότερων περιβαλλοντικών παραγόντων ή καλλιεργητικών συνθηκών (ph, α w, Eh, θερμοκρασία) στην απόκριση μιας ή περισσότερων παραμέτρων του πρωτογενούς μοντέλου. Για παράδειγμα, εξετάζοντας την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού σε διάφορες θερμοκρασίες συντήρησης, και χρησιμοποιώντας το κατάλληλο πρωτογενές μοντέλο είναι δυνατό να προσδιοριστούν οι διαφορετικοί ρυθμοί ανάπτυξης σε κάθε θερμοκρασία. Το δευτερογενές μοντέλο αποτελεί τη μαθηματική εξίσωση η οποία θα περιγράψει με ακρίβεια τη θερμοκρασιακή αυτή εξάρτηση, με αποτέλεσμα να γίνεται εφικτός ο υπολογισμός του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης σε μια νέα θερμοκρασία Τ, από αυτές που εξετάστηκαν κατά τον πειραματισμό (McDonald και Sun, 1999). Τα τριτογενή μοντέλα ουσιαστικά συνθέτουν την τελική μορφή της μοντελοποίησης. Πρόκειται για εφαρμογές ενός ή περισσοτέρων πρωτογενών και δευτερογενών μοντέλων, που ενσωματώνονται σε κάποιο εύκολο στη χρήση του λογισμικό πακέτο ηλεκτρονικού υπολογιστή. Τα μοντέλα αυτά ενσωματώνονται σε ποικίλους ολοκληρωτές μεταβλητών, όπως η θερμοκρασία, η α w και το ph. Στη συνέχεια το ιστορικό ενός ολοκληρωτή που περιγράφει μια χρονο-εξαρτώμενη μεταβλητή μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με 16

51 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση κάποιο δευτερογενές μοντέλο για τον προσδιορισμό της έκτασης και του ρυθμού της ανάπτυξης του υπό μελέτη μικροοργανισμού. Επίσης, χρησιμοποιώντας τα τριτογενή μοντέλα και κάποια αντίστοιχη βάση δεδομένων, είναι δυνατό να εκτιμηθούν οι μικροβιακές αποκρίσεις σε μεταβαλλόμενες συνθήκες και να γίνει σύγκριση και αντιπαράθεση των επιδράσεων αυτών με τη συμπεριφορά άλλων μικροβιακών ειδών. Οι τελικοί χρήστες των συστημάτων αυτών δεν απαιτείται να είναι γνώστες των τεχνικών μοντελοποίησης ή των πρωτογενών και δευτερογενών μοντέλων που χρησιμοποιούνται. Συνεπώς, τα τριτογενή μοντέλα καθιστούν την ποσοτική μικροβιολογία ένα δυναμικό και εύκολα προσβάσιμο εργαλείο σε όλους του τομείς της βιομηχανίας τροφίμων και έρευνας (Buchanan, 1993b, McDonald και Sun, 1999, Whiting και Buchanan, 1993). 2.2 Αρχές κινητικής υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων Ως ποιότητα των τροφίμων, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ορίζεται το σύνολο των χαρακτηριστικών που επιτρέπουν τη διάκρισή τους και καθορίζουν το βαθμό αποδοχής τους από τον καταναλωτή. Η μεταβολή των χαρακτηριστικών αυτών, κατά την επεξεργασία και συντήρηση των προϊόντων στην πορεία του χρόνου, είναι μια αναπόφευκτη διαδικασία που σταδιακά οδηγεί στην υποβάθμιση της συνολικής ποιότητας. Η έκταση της ποιοτικής υποβάθμισης, ή ο ρυθμός μεταβολής της ποιότητας εξαρτάται τόσο από ενδογενείς όσο και από εξωγενείς παράγοντες. Στους ενδογενείς παράγοντες περιλαμβάνονται όλες οι παράμετροι σύστασης του προϊόντος, (αντιδρώντα συστατικά, ένζυμα, καταλύτες, παρεμποδιστές, ph, ενεργότητα νερού, μικροβιακή χλωρίδα), ενώ στους εξωγενείς οι διάφοροι περιβαλλοντικοί παράγοντες (θερμοκρασία, σχετική υγρασία, ολική και μερική πίεση των περιβαλλόντων αερίων, π.χ. CO 2, N 2, και O 2, φως, μηχανικές καταπονήσεις). Θεωρώντας λοιπόν την ποιότητα Q ενός προϊόντος ως μια ανεξάρτητη μεταβλητή, θα μπορούσε κανείς να περιγράψει το ρυθμό της ποιοτικής υποβάθμισης (μεταβολή του όρου Q στη μονάδα του χρόνου) με την ακόλουθη μαθηματική εξίσωση: [ Q] F( C, E ) = k( C E ) d dt = (2.1) i j i, j όπου Q είναι η ποιότητα, C i και Ε j οι ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες που επιδρούν στην ποιότητα, και k ο ρυθμός της αντίδρασης. Η ποσοτική έκφραση της ποιοτικής υποβάθμισης των τροφίμων περιγράφεται συνήθως με την υιοθέτηση κάποιου μετρήσιμου δείκτη ποιότητας, που σχετίζεται με τη μικροβιακή σταθερότητα, τις φυσικές και οργανοληπτικές ιδιότητες του τροφίμου ή τις χημικές μεταβολές που είναι δυνατό να συμβούν στο προϊόν. Κατ αυτόν τον τρόπο, είναι πλέον 17

52 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή εύκολη η παρακολούθηση του δείκτη αυτού στην πορεία του χρόνου, και η περιγραφή των μεταβολών του με όρους κινητικής. Για παράδειγμα, αν η ποιοτική υποβάθμιση σχετίζεται με την απώλεια μιας επιθυμητής μετρήσιμης ποιοτικής παραμέτρου Α (κάποιο θρεπτικό συστατικό, ή χαρακτηριστικό άρωμα) ή το σχηματισμό μιας άλλης ανεπιθύμητης ποιοτικής παραμέτρου Β (άρωμα, χρώμα, μικροβιακό φορτίο), τότε οι ρυθμοί απώλειας του ποιοτικού δείκτη Α ή σχηματισμού του δείκτη Β μπορούν να εκφραστούν από τις ακόλουθες εξισώσεις (Taoukis και Labuza, 1996): r - d[a] dt n A = = k[a] (2.2) r d[b] dt n' B = = k' [B] (2.3) όπου k και k είναι οι φαινομενικές σταθερές του ρυθμού της αντίδρασης και n και n οι φαινομενικές τάξεις των αντιδράσεων. Η ολοκλήρωση των δύο παραπάνω εξισώσεων οδηγεί σε μια νέα έκφραση της μεταβολής του ποιοτικού δείκτη ως συνάρτηση του χρόνου, η οποία ορίζεται ως συνάρτηση ποιότητας, Q(A). Για παράδειγμα, η ολοκλήρωση της εξίσωσης 2.2, δίνει: A d[ A] n [ A] = kt Q(A) = kt (2.4) A0 Η συνάρτηση ποιότητας Q(A) εκφράζεται με διαφορετική εξίσωση, ανάλογα με την τάξη της αντίδρασης που διέπει τη μεταβολή που μελετάται. Έτσι, η μορφή της συνάρτησης ποιότητας για αντιδράσεις μηδενικής, πρώτης, δεύτερης και νιοστής (n) τάξης περιγράφεται από τις ακόλουθες εξισώσεις (Van Boekel, 1996): μηδενικής τάξης (0) At = A0 kt (2.5) πρώτης τάξης (1) A t = A0 exp( kt) (2.6) δεύτερης τάξης (2) 1 1 = + kt At A0 (2.7) A 1-n 1 t n- νιοστής τάξης (n 1) = 1+ (n 1) ka 0 t A0 (2.8) όπου Α t είναι η τιμή του ποιοτικού δείκτη σε χρόνο t και Α 0 η αντίστοιχη τιμή του σε χρόνο μηδέν. Στη μέθοδο ολοκλήρωσης που μόλις περιγράφηκε, ο ποσοτικός προσδιορισμός του ποιοτικού δείκτη Α, που γίνεται με τη βοήθεια κάποιας χημικής ή φυσικοχημικής μεθόδου, και η ακόλουθη γραφική απεικόνιση της συγκέντρωσής του ως συνάρτηση του χρόνου (έπειτα από τις κατάλληλες τροποποιήσεις όπου κρίνεται απαραίτητο, π.χ. η λογαρίθμηση 18

53 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση της εξ. 2.6 καταλήγει σε μια γραμμική εξίσωση) δίνει τη δυνατότητα μιας πρώτης εκτίμησης της τάξης της αντίδρασης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων και βάσει της καλύτερης στατιστικής προσαρμογής των εξισώσεων στα πειραματικά δεδομένα, επιλέγεται το καταλληλότερο μοντέλο. Τέλος, γίνεται στατιστική ανάλυση του μοντέλου, οπότε και προσδιορίζονται όλες οι κρίσιμες παράμετροι που συμμετέχουν στη μαθηματική εξίσωση, με ιδιαίτερη έμφαση στην εκτίμηση του συντελεστή συσχετίσεως, τη διασπορά των μετρήσεων και τα διαστήματα εμπιστοσύνης της προσδιοριζόμενης παραμέτρου. Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τα κριτήρια επιλογής των κατάλληλων μαθηματικών συναρτήσεων αναφέρονται στη συνέχεια. Η έννοια της τάξης της αντίδρασης είναι καθαρά εμπειρική. Πρόκειται δηλαδή για ένα μαθηματικό εργαλείο με το οποίο μπορούν να περιγραφούν τα πειραματικά δεδομένα, χωρίς όμως να παρέχεται καμιά πληροφορία σχετικά με το μηχανισμό της αντίδρασης. Για το λόγο αυτό, ο όρος τάξη αντίδρασης πρέπει να διακρίνεται από την έννοια της μοριακότητας, κατά την οποία προτείνεται κάποιος μοριακός μηχανισμός για μια συγκεκριμένη αντίδραση. Η μοριακότητα δίνει πληροφορίες σχετικά τον αριθμό των αντιδρώντων που λαμβάνουν μέρος μόνο σε ένα από τα στάδια της χημικής αντίδρασης. (Van Boekel, 1996). Η χρήση των απλών τάξεων αντιδράσεων για την περιγραφή πολύπλοκων αντιδράσεων είναι συχνά χρήσιμη στην περίπτωση που το ενδιαφέρον εστιάζεται στη μοντελοποίηση της διάρκειας ζωής ή σε μεταβολές που συμβαίνουν κατά την επεξεργασία ενός προϊόντος, και όχι στη χημεία ή στη διερεύνηση του μηχανισμού μιας αντίδρασης. Ωστόσο, αν σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση και η κατανόηση μιας αντίδρασης λεπτομερώς, απαραίτητο είναι αρχικά να προταθεί ένας μηχανισμός αντίδρασης, κι έπειτα να αναπαραχθούν οι κατάλληλες διαφορικές εξισώσεις που βασίζονται στο μηχανισμό αυτόν ώστε να ελεγχθεί πειραματικά ο τελευταίος (Van Boekel, 1996). Συχνά, η κινητική των μεταβολών που συμβαίνουν σε ένα τρόφιμο δεν μπορεί να περιγραφεί ικανοποιητικά κάνοντας χρήση της προσέγγισης της τάξης της αντίδρασης. Αυτό συμβαίνει για παράδειγμα στην περίπτωση που τα κινητικά δεδομένα της παρατηρούμενης υποβάθμισης έχουν τη μορφή μιας σιγμοειδούς καμπύλης, οπότε απαραίτητη είναι η χρήση διαφορετικών εμπειρικών εξισώσεων προκειμένου να επιτευχθεί μια ικανοποιητική προσαρμογή. Στο σημείο αυτό κρίνεται απαραίτητη η παράθεση των σημαντικότερων μαθηματικών εξισώσεων που χρησιμοποιούνται συχνά στη βιβλιογραφία για την περιγραφή τόσο της μικροβιακής ανάπτυξης ή της αδρανοποίησης αλλά και άλλων χαρακτηριστικών αποκρίσεων ποιότητας, καθώς επίσης και των συναρτήσεων που 19

54 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αντικατοπτρίζουν τη θερμοκρασιακή επίδραση των διαφόρων παραγόντων σύστασης και περιβάλλοντος του τροφίμου στις βασικές κινητικές παραμέτρους των αποκρίσεων αυτών. Με γνώμονα την ευρεία εφαρμογή των εξισώσεων αυτών στην ποσοτική μικροβιολογία, τα μοντέλα που περιγράφονται στη συνέχεια αναφέρονται συχνά στην απόκριση της μικροβιακής ανάπτυξης, εντούτοις μπορούν να εφαρμοστούν και για την περιγραφή άλλων παραμέτρων ποιότητας που παρουσιάζουν όμοια κινητική συμπεριφορά, ιδιαίτερα στην περίπτωση των εμπειρικών προσεγγίσεων Μοντέλα ανάπτυξης Σημαντική εξέλιξη που επέτρεψε την ταχεία ανάπτυξη του κλάδου της μικροβιολογίας πρόρρησης αποτέλεσε η αναγνώριση της ύπαρξης ορισμένων σιγμοειδών συναρτήσεων ή πρωτογενών μοντέλων που περιγράφουν ικανοποιητικά και με μεγάλη ακρίβεια τη μικροβιακή ανάπτυξη, τόσο σε μοντέλα συστήματα όσο και σε πραγματικά τρόφιμα. Η μαθηματική έκφραση της καμπύλης ανάπτυξης των μικροοργανισμών επίσης συνέβαλε ουσιαστικά στην ανάπτυξη των δευτερογενών μοντέλων για την περιγραφή των κινητικών παραμέτρων της μικροβιακής ανάπτυξης (Buchanan, 1993a). Πολλά εμπειρικά μοντέλα έχουν αναπτυχθεί και συγκριθεί ως προς την ικανότητά τους να προβλέπουν τη μικροβιακή ανάπτυξη συναρτήσει του χρόνου σε κάποια συγκεκριμένη θερμοκρασία. Τα σημαντικότερα από αυτά θα περιγραφούν ακολούθως Μοντέλο Monod Σύμφωνα με το Monod (1949), ο ρυθμός με τον οποίο αυξάνεται ο πληθυσμός είναι ανάλογος του αριθμού των μελών του πληθυσμού, δηλαδή, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης ή ο χρόνος αναπαραγωγής θεωρείται αμετάβλητος για σταθερές περιβαλλοντικές συνθήκες. Αυτό είναι εφικτό για μικρά χρονικά διαστήματα, πριν την έναρξη της ανάπτυξης, η οποία στη συνέχεια θα επιφέρει σημαντική μείωση του διαθέσιμου υποστρώματος ως πηγή ενέργειας του μικροοργανισμού ή τη μεταβολή κάποιου παράγοντα στο περιβάλλον του μικροοργανισμού (π.χ. μείωση του ph). Το μοντέλο που πρότεινε ο Monod μετά την ολοκλήρωσή του περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: N = N 0 exp( k( t t )) (2.9) L όπου Ν είναι ο αριθμός των μικροοργανισμών στο χρόνο t, Ν 0 είναι ο αρχικός πληθυσμός του, k είναι ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης και t L είναι ο χρόνος προσαρμογής. Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης αποτελεί την κλίση μιας τυπικής καμπύλης μικροβιακής ανάπτυξης, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2.1 για το τμήμα της καμπύλης μετά την πάροδο 20

55 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση της φάσης προσαρμογής (t>t L ). Βασικό μειονέκτημα του μοντέλου είναι ότι η φάση προσαρμογής μπορεί να προσδιοριστεί μόνο γραφικά, και αναφέρεται στο σημείο τομής των ευθειών logν 0 και της καμπύλης γραμμικής παλινδρόμησης της εκθετικής φάσης ανάπτυξης, όπως φαίνεται στο ίδιο σχήμα. Το μοντέλο αυτό είναι απλό, με σχετικά καλή ακρίβεια κι έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε μελέτες σχετικές με τη μικροβιακή ανάπτυξη σε συσκευασμένο βοδινό κρέας συντηρούμενο υπό ψύξη (Zamora και Zaritzky, 1985) ή με την επίδραση της τροποποιημένης ατμόσφαιρας στην ανάπτυξη της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας και της L. monocytogenes σε ωμό κοτόπουλο (Wimptheimer et al., 1990). Log10 CFU/ml k: κλίση logn 0 Lag t L Time Σχήμα 2.1. Τυπική καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης Γραμμικό μοντέλο τριών φάσεων Buchanan Οι Buchanan et al. (1997a) εισήγαγαν ένα νέο μοντέλο τριών φάσεων που περιγράφει τον πληθυσμό των μικροοργανισμών στη λανθάνουσα φάση προσαρμογής, την εκθετική φάση ανάπτυξης και τη φάση στασιμότητας ως ακολούθως: Λανθάνουσα φάση: για t t LAG, N t = N 0 Φάση εκθετικής ανάπτυξης: για t LAG t t MAX N t = N 0 + μ ( t - t LAG ) (2.10) Φάση στασιμότητας: για t t MAX N t = N MAX 21

56 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή όπου N t είναι ο λογάριθμος της πυκνότητας του πληθυσμού σε χρόνο t (log cfu/ml), N 0 ο λογάριθμος της πυκνότητας του αρχικού πληθυσμού, Ν ΜΑΧ ο λογάριθμος της πυκνότητας του μέγιστου πληθυσμού, t ο χρόνος, t LAG ο χρόνος στον οποίο σταματά η λανθάνουσα φάση (h), t MAX ο χρόνος στον οποίο επιτυγχάνεται ο μέγιστος πληθυσμός (h), και μ ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (log cfu ml -1 h -1 ). Στο μοντέλο αυτό, ο ρυθμός ανάπτυξης είναι πάντα μέγιστος μεταξύ της φάσης προσαρμογής και της φάσης σταθερότητας, ενώ παίρνει μηδενική τιμή κατά τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής και της φάσης σταθερότητας Μοντέλο Gompertz Η εξίσωση Gompertz που εισήχθηκε για πρώτη φορά από τους Gibson et al. (1987) μπορεί επίσης να περιγράψει τη μικροβιακή ανάπτυξη. Εξαιτίας των περιορισμών που υπάρχουν στο χώρο αλλά και για τα θρεπτικά συστατικά, όπως και λόγω των παραγόμενων τοξικών μεταβολιτών, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης δεν παραμένει σταθερός κατά την πάροδο του χρόνου αλλά αυξάνεται σε ένα μέγιστο και μετά μειώνεται. Ο τύπος της εξίσωσης Gompertz έχει ως εξής: {- exp [- B( t - M )]} Log N = A + C exp (2.11) όπου Ν είναι ο πληθυσμός σε CFU / μονάδα μάζας ή όγκου σε χρόνο t, Α είναι η ασύμπτωτη του λογαρίθμου του μικροβιακού πληθυσμού όταν ο χρόνος τείνει στο μηδέν, C είναι η διαφορά της άνω και κάτω ασύμπτωτης του λογαρίθμου του πληθυσμού, Μ είναι ο χρόνος στον οποίο η απόλυτη τιμή του ρυθμού ανάπτυξης γίνεται μέγιστη, και Β είναι ο σχετικός ρυθμός ανάπτυξης στο χρόνο t=m. Η παραπάνω εξίσωση χρησιμοποιεί ως απόκριση το λογάριθμο του μετρούμενου πληθυσμού, και συνεπώς πρόκειται για μια τροποποιημένη μορφή της αυθεντικής συνάρτησης Gompertz. Το μοντέλο αυτό θεωρείται εμπειρικό, ενώ η αυθεντική εξίσωση είναι μηχανιστικής βάσης. Από τις τέσσερις παραμέτρους της τροποποιημένης εξίσωσης Gompertz, και χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της μη γραμμικής παλινδρόμησης της απόκρισης logν συναρτήσει του χρόνου, εξάγονται πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τη μικροβιακή ανάπτυξη και ειδικότερα τον προσδιορισμό της διάρκειας της λανθάνουσας φάσης, τον εκθετικό ρυθμό ανάπτυξης ή το χρόνο αναπαραγωγής ως ακολούθως (McKellar και Lu, 2004): LogN(0) - A lag time = M - (1/B) + (2.12) BC/ e 22

57 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση εκθετικός ρυθμός ανάπτυξης = BC/e (2.13) χρόνος αναπαραγωγής = log(2) e / BC = / BC (2.14) όπου e = Αντίστοιχες τροποποιήσεις έγιναν και από τους Zwietering et al. (1990), οι οποίοι ενσωμάτωσαν στο αρχικό τροποποιημένο μοντέλο τρεις παραμέτρους βιολογικής σημασίας, του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης (μ max ), της φάσης προσαρμογής (λ) και της μέγιστης μικροβιακής πυκνότητας (C), όπως δίνεται από την παρακάτω εξίσωση: Nt Log N 0 μmaxe = C exp - exp C λ (2.15) ( t) + 1 Η αυθεντική και η τροποποιημένη εξίσωση Gompertz έχουν χρησιμοποιηθεί πολλές φορές στην προσαρμογή δεδομένων ανάπτυξης ποικίλων μικροοργανισμών παρουσιάζοντας ικανοποιητική προσαρμογή. Ωστόσο, η προσαρμογή επηρεάζεται σημαντικά από τον αριθμό των παρατηρήσεων πειραματικών δεδομένων και την στατιστική ποιότητα των δεδομένων αυτών. Συνήθως απαιτούνται τουλάχιστον 15 σημεία κατανεμημένα ομοιόμορφα σε όλες τις φάσεις της καμπύλης ανάπτυξης, ενώ προβλήματα δημιουργούνται όταν η ανάπτυξη είναι πολύ γρήγορη, ή η φάση προσαρμογής πολύ μικρής διάρκειας, ή όταν το πείραμα σταματά πολύ νωρίτερα πριν την εμφάνιση της φάσης στασιμότητας (Labuza και Fu, 1993). Άλλοι περιορισμοί σχετικοί με τη χρήση της εξίσωσης Gompertz είναι ότι ο προσδιοριζόμενος ρυθμός ανάπτυξης είναι πάντα ο μέγιστος ρυθμός και απαντάται σε κάποιο αυθαίρετο σημείο καμπής, με συνέπεια την εκτίμηση μικρότερων τιμών του χρόνου αναπαραγωγής σε ποσοστό που φτάνει και το 13% (Miles et al., 1997). Τέλος από τη στιγμή που η κλίση της εξίσωσης δεν μπορεί να είναι μηδενική, η κατώτερη ασύμπτωτος πολλές φορές καταλήγει να είναι χαμηλότερη από το αρχικό επίπεδο εμβολίου, δίνοντας αρνητική τιμή κατά τον προσδιορισμού της λανθάνουσας φάσης σε κάποια ζεύγη τιμών πειραματικών δεδομένων Λογιστικό μοντέλο Το λογιστικό μοντέλο, καθ όμοιο τρόπο με το μοντέλο Gompertz, περιλαμβάνει τέσσερις παραμέτρους και η τροποποιημένη του μορφή περιγράφει το λογάριθμο του πληθυσμού των μικροοργανισμών, σύμφωνα με την εξίσωση: Nmax - Nmin Log( N t) = Log Nmin + (2.16) 1+ exp[-μ max( t - t i )] όπου N t, η συγκέντρωση του πληθυσμού του υπό μελέτη μικροοργανισμού (CFU / g ή ml 23

58 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή προϊόντος) στο χρόνο t, N min και N max αποτελούν την κατώτατη και ανώτατη ασύμπτωτη της συγκέντρωσης των κυττάρων του μικροοργανισμού κατά την έναρξη του πειραματισμού και τη φάση στασιμότητας, αντίστοιχα, μ max ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ), και t i το σημείο καμπής όπου και παρατηρείται το ήμισυ του μέγιστου πληθυσμού του μικροοργανισμού, N max. Η λογιστική εξίσωση είναι συμμετρική ως προς το σημείο καμπής. Η τροποποιημένη λογαριθμική της μορφή όπως παρουσιάστηκε είναι ένα εμπειρικό μοντέλο, σε αντίθεση με την αυθεντική λογιστική εξίσωση που θεωρείται μοντέλο μηχανιστικής βάσης. Παραλείποντας τον όρο N min, η εξίσωση 2.16 μετατρέπεται σε μοντέλο τριών παραμέτρων. Ωστόσο, η παράμετρος N min επιτρέπει στο λογιστικό μοντέλο των τεσσάρων παραμέτρων να προσδιορίζει τιμή για την κατώτερη ασύμπτωτη συγκέντρωση του πληθυσμού των μικροοργανισμών διαφορετική του μηδενός (Dalgaard, 1995). Η λογιστική εξίσωση δεν περιλαμβάνει κάποιον όρο που να σχετίζεται με τη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης προσαρμογής. Εντούτοις, η εκτίμηση της χρόνου προσαρμογής είναι εφικτή, υιοθετώντας την προσέγγιση που εφαρμόστηκε για πρώτη φορά από τον Dalgaard (1995) σύμφωνα με την εξίσωση: 1 N max+ N max exp( μmax ti ) Lag time = t - ln 1 i (2.17) μmax N min+ N min exp( μmax ti ) Περιορισμένες είναι οι εφαρμογές του λογιστικού μοντέλου στην προσαρμογή των δεδομένων μικροβιακής ανάπτυξης, κυρίως λόγω της συμμετρίας που εμφανίζει η συγκεκριμένη συνάρτηση στο σημείο καμπής, οπότε και προτιμάται το μη συμμετρικό μοντέλο Gompertz που μόλις περιγράφηκε (Peleg, 1997, Skinner et al., 1994). Παραδείγματα επιτυχούς εφαρμογής του λογιστικού μοντέλου αποτελούν οι μελέτες της μικροβιακής αλλοίωσης ψαριών (Dalgaard et al., 1997, Koutsoumanis et al., 2000, Koutsoumanis και Nychas, 2000) Μοντέλο Baranyi και Roberts Ο Baranyi και οι συνεργάτες του σε μια σειρά δημοσιευμένων μελετών εισήγαγαν ένα μηχανιστικό μοντέλο σχετικό με τη βακτηριακή ανάπτυξη (Baranyi et al., 1993, Baranyi και Roberts 1994, 1995). Συγκεκριμένα, απέδωσαν την παρουσία της φάσης προσαρμογής στην ανάγκη που εμφανίζεται για τη σύνθεση ενός άγνωστου συστατικού q, που αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Όταν πλέον τα κύτταρα του υπό μελέτη οργανισμού έχουν προσαρμοστεί στο νέο περιβάλλον ακολουθεί η εκθετική ανάπτυξή τους μέχρι αυτή να περιοριστεί λόγω των σταδιακά μειούμενων συγκεντρώσεων 24

59 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση στα συστατικά του μέσου ανάπτυξης. Οπότε αν ως x εκφραστεί ο αριθμός των κυττάρων στο χρόνο t, η μεταβολή του πληθυσμού στη μονάδα του χρόνου δίνεται από την εξίσωση: dx dt m q( t) x( t) μmax = 1 x( t) q( t) 1 (2.18) + xmax όπου x max είναι η μέγιστη πυκνότητα των κυττάρων του μικροοργανισμού, και q(t) είναι η συγκέντρωση του περιοριστικού παράγοντα που μεταβάλλεται με το χρόνο ως εξής: dq dt = μmax q( t) (2.19) Η αρχική συγκέντρωση του περιοριστικού παράγοντα q (q 0 ), αποτελεί ένα μέτρο της αρχικής φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων. Μια τροποποιημένη έκφραση του παράγοντα q 0 είναι η ακόλουθη: 1 h 0 = ln 1 + = μ max λ (2.20) q0 όπου h 0 είναι μια παράμετρος που χαρακτηρίζει το έργο προσαρμογής που απαιτείται ώστε τα κύτταρα να προσαρμοστούν στο νέο περιβάλλον (Baranyi και Roberts, 1994), και ο υπολογισμός του οποίου παρουσιάζεται γραφικά στο Σχήμα 2.2. Η παράμετρος m χαρακτηρίζει την κυρτότητα της καμπύλης ανάπτυξης και τη μετάβαση από την εκθετική φάση στη φάση προσαρμογής. Όταν m = 1 η συνάρτηση μετατρέπεται σε μια λογιστική καμπύλη, το οποίο αποτελεί και μια μορφή απλοποίησης του μοντέλου που συχνά λαμβάνεται ως παραδοχή. Συνεπώς, το τελικό μοντέλο έχει τέσσερις παραμέτρους: x 0, ο αρχικός αριθμός των κυττάρων, h 0, η παράμετρος που σχετίζεται με τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων, x max και μ max. 25 ln cfu ml h 0 5 λ μ max Time Σχήμα 2.2. Καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης και γραφική απεικόνιση των παραμέτρων του μοντέλου Baranyi και Roberts (1994). Μια λεπτομερέστερη έκφραση του μοντέλου Baranyi είναι η ακόλουθη: 25

60 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή y( t) = y mμ ( ) 1 e maxa t 1 + μ max A( t) ln 1+ m( y ) (2.21) m e max 0 0 y όπου y max και y 0 είναι οι φυσικοί λογάριθμοι της μέγιστης και αρχικής συγκέντρωσης των κυττάρων, αντίστοιχα, και Α(t) είναι η συγκέντρωση του περιοριστικού παράγοντα, η οποία μεταβάλλεται με το χρόνο σύμφωνα με την εξίσωση: 1 A( t) = t + μ max ln(e μ max t 0 + e h + e μ max t h 0 ) (2.22) Το μοντέλο των Baranyi και Roberts έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς στη μοντελοποίηση της μικροβιακής ανάπτυξης κυρίως εξαιτίας των συνοδευτικών λογισμικών προγραμμάτων DMFit και MicroFit που επιτρέπουν την εύκολη προσαρμογή των δεδομένων στις εξισώσεις του μοντέλου αυτού. Αναφορικά, έχει χρησιμοποιηθεί στη μελέτη μικροβιακής ανάπτυξης πολλών διαφορετικών μικροοργανισμών όπως L. monocytogenes (McClure et al., 1997, Fernández et al., 1997), B. cereus (Sutherland et al., 1996), Escerichia coli (Sutherland et al., 1997), Y. enterocolitica (Pin et al., 2000), καθώς και στη μελέτη αύξησης της διαμέτρου θερμοανθεκτικών μυκήτων (Valik και Pieckova, 2001). Το βασικό πλεονέκτημα του μοντέλου αυτού είναι ότι το πλήθος των διαθέσιμων εξισώσεων δίνει τη δυνατότητα ανάπτυξης μοντέλων σε δυναμικές συνθήκες και μεταβαλλόμενα θερμοκρασιακά προφίλ Μοντέλο Weibull Το μοντέλο Weibull είναι επίσης μία σιγμοειδής συνάρτηση, η οποία μπορεί να περιγράψει τις μεταβολές διαφόρων παραμέτρων είτε πρόκειται για μικροβιακή ανάπτυξη ή για τη συγκέντρωση ενός συστατικού, κι έχει την ακόλουθη μαθηματική έκφραση: ( )exp[ β C = C + C Cmax ( kt) ] (2.23) max 0 όπου C είναι o πληθυσμός του υπό μελέτη μικροοργανισμού ή η συγκέντρωση ενός συστατικού τη χρονική στιγμή t, C 0 είναι η αρχική πυκνότητα του πληθυσμού ή η αρχική συγκέντρωση (t=0), k είναι ο ρυθμός της προκαλούμενης μεταβολής (h -1 ), C max είναι η μέγιστη τιμή του πληθυσμού / συγκέντρωσης, και β είναι μια σταθερά που σχετίζεται με το σχήμα της καμπύλης Μοντέλο McKellar Ένας από τους περιορισμούς των υπαρχόντων μοντέλων είναι ότι όλα υποθέτουν την ύπαρξη ομογενών πληθυσμών βακτηριακών κυττάρων. Η ανάπτυξη σε ετερογενείς πληθυσμούς μπορεί να εκφραστεί ως συνάρτηση δύο διαφορετικών πληθυσμών 26

61 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση βακτηριακών κυττάρων εφαρμόζοντας ένα νέο μοντέλο, που προτάθηκε σχετικά πρόσφατα από τον McKellar (1997). Η φιλοσοφία του έγκειται στην παραδοχή ότι τα κύτταρα των μικροοργανισμών ενυπάρχουν σε δύο πιθανές καταστάσεις: την κατάσταση ανάπτυξης και την κατάσταση μη ανάπτυξης. Άλλη βασική θεώρηση είναι ότι όλη η ανάπτυξη ορίζεται από ένα μικρό τμήμα του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων το οποίο βρίσκεται στην κατάσταση ανάπτυξης τη χρονική στιγμή t=0. Συνεπώς η ανάπτυξη βασίζεται στην ακόλουθη λογιστική εξίσωση: dg dt G G μ 1 N = max (2.24) όπου G είναι ο αριθμός των αναπτυσσόμενων κυττάρων που βρίσκονται σε κατάσταση ανάπτυξης. Η πλειοψηφία των κυττάρων θεωρείται ότι δε συμμετέχουν στην ανάπτυξη και ότι παραμένουν στη φάση μη ανάπτυξης. Ωστόσο, παρά το γεγονός αυτό, τα κύτταρα αυτά συμπεριλαμβάνονται στην εκτίμηση του συνολικού πληθυσμού. Ενώ λοιπόν το μοντέλο McKellar είναι ένα εμπειρικό μοντέλο, η υιοθέτησή του συνδράμει στην ενίσχυση της άποψης ότι στην ανάπτυξη των καλλιεργειών υγρής μορφής κυριαρχούν κατά κύριο λόγο τα πρώτα κύτταρα που ξεκινούν να αναπτύσσονται, ενώ τα υπόλοιπα κύτταρα που προσαρμόζονται ακολούθως στην ανάπτυξη είναι ελάσσονος σημασίας (McKellar, 1997). Το άθροισμα των δύο ξεχωριστών πληθυσμών που αναφέρθηκε προηγουμένως μπορεί να περιγράψει αποτελεσματικά τη μετάβαση από τη λανθάνουσα φάση προσαρμογής στην εκθετική φάση ανάπτυξης, και ορίζει μια νέα παράμετρο G 0, ως τον αρχικό πληθυσμό που εμφανίζει δυνατότητες να αναπτυχθεί. Η επαναπαραμετροποίηση του μοντέλου συντελεί στην εύρεση μιας σχέσης μεταξύ του μ max και του λ, όμοια με τη σχέση που προκύπτει από το μοντέλο Baranyi και απεικονίζεται γραφικά στο Σχήμα 2.2. Συνεπώς το μοντέλο McKellar αποτελεί μια απλοποιημένη μορφή του μοντέλου Baranyi με τις ίδιες παραμέτρους. Η έννοια της ετερογένειας στα κύτταρα του πληθυσμού επεκτάθηκε περαιτέρω κατά την ανάπτυξη ενός συνδυασμού διακεκριμένου και συνεχούς μοντέλου προσομοίωσης της μικροβιακής ανάπτυξης. Κατά την έναρξη της προσομοίωσης της ανάπτυξης όλα τα κύτταρα θεωρήθηκε πως βρίσκονται στην κατάσταση μη ανάπτυξης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η κατανομή των φάσεων προσαρμογής των μεμονωμένων κυττάρων για την αναπαραγωγή ξεχωριστών γεγονότων στα οποία κάθε κύτταρο μεταφέρεται από την κατάσταση μη ανάπτυξης στην κατάσταση ανάπτυξης, τη χρονική στιγμή που αντιστοιχεί στη φάση προσαρμογής του κάθε κυττάρου χωριστά. Όντας στην κατάσταση ανάπτυξης τα κύτταρα ξεκινούν να αναπτύσσονται αμέσως, σύμφωνα με την εξίσωση Ο 27

62 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή συνδυασμός του ξεχωριστού σταδίου με τη συνάρτηση συνεχούς ανάπτυξης, περιγράφει με ακρίβεια τη μετάβαση από τη φάση προσαρμογής στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Το μοντέλο τροποποιήθηκε εκ νέου με σκοπό να συμπεριλάβει τη συνεχή φάση προσαρμογής που προηγείται του διακριτού γεγονότος (McKellar, 2001). Στην περίπτωση αυτή εισήχθηκε μια νέα παράμετρος φυσιολογικής έννοιας, p 0, η οποία αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των αρχικών φυσιολογικών καταστάσεων των μεμονωμένων κυττάρων. Το μοντέλο αυτό παρουσιάζεται δυναμικό στις φάσεις προσαρμογής και εκθετικής ανάπτυξης, και άρα μπορεί να αποβεί χρήσιμο στην προσομοίωση της συμπεριφοράς των μεμονωμένων κυττάρων σε μεταβαλλόμενα περιβάλλοντα Μοντέλα επιβίωσης Τα μοντέλα επιβίωσης έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς στη μελέτη επιβίωσης των παθογόνων και αλλοιογόνων μικροοργανισμών στα τρόφιμα άλλα και κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας ως πολύτιμα εργαλεία εκτίμησης της ασφάλειας - αλλοίωσης των παραγόμενων προϊόντων. Συνεπώς, μοντέλα που περιγράφουν την μικροβιακή θνησιμότητα ως αποτέλεσμα της θέρμανσης χρησιμοποιούνται από το 1920, και αποτελούν την πρώτη μορφή της μικροβιολογίας πρόρρησης. Η εφαρμογή τους επικεντρώθηκε κυρίως στην ανάγκη καταστροφής των σπορίων του Cl. botulinum στα χαμηλής οξύτητας κονσερβοποιημένα τρόφιμα, ενώ μεγάλη βαρύτητα δόθηκε στο χαρακτηρισμό της κινητικής της αδρανοποίησης των σπορίων (Baker και Genigeorgis, 1993). Στις επόμενες ενότητες θα περιγραφούν μοντέλα επιβίωσης που βασίζονται στην απλή γραμμική προσέγγιση, ενώ θα γίνει αναφορά και σε εξισώσεις περισσότερο πολύπλοκες για την περιγραφή των καμπυλών αδρανοποίησης που αποκλίνουν από τη γραμμικότητα Κλασικά γραμμικά μοντέλα Ως γνωστόν, οι περισσότερες διεργασίες αδρανοποίησης βιολογικών παραγόντων (ένζυμα, μικρόβια) ακολουθούν την κινητική αντιδράσεων πρώτης τάξης. Η αδρανοποίηση, για παράδειγμα, των σπορίων ενός μικροοργανισμού περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: ds dt t = - k' S (2.25) t όπου S t είναι η αναλογία επιβίωσης (N t /N 0 ) και k η σταθερά του ρυθμού της διεργασίας. Συνεπώς ο αριθμός των κυττάρων που επιβιώνουν μειώνεται εκθετικά ως ακολούθως: S t e k't = (2.26) 28

63 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση και όταν εκφράζεται ως δεκαδικός λογάριθμος παίρνει τη μορφή: log S t = kt (2.27) όπου k=k /ln10. Η έκφραση D-τιμή (γνωστή ως χρόνος που απαιτείται για μείωση κατά 1 λογάριθμο) είναι ίση με 1/k, όπου k είναι η κλίση στο Σχήμα 2.3. Οι τιμές D μπορούν επίσης να εκφραστούν ως: t D - τιμή = (2.28) log N 0 - log Nt Όταν οι τιμές log D παριστάνονται γραφικά ως συνάρτηση των αντίστοιχων θερμοκρασιών, το αντίστροφο της κλίσης είναι ίσο με την τιμή z, η οποία αποτελεί την απαιτούμενη αύξηση της θερμοκρασίας για μείωση της τιμής D κατά 1 λογάριθμο (ένθετο στο Σχήμα 2.3), και εκφράζει τη θερμοευαισθησία του μικροβιακού παράγοντα. Από τη λογαριθμική φύση της αντίδρασης πρώτης τάξης, φαίνεται ότι δεν είναι δυνατό να πετύχουμε απόλυτη καταστροφή όλων των σπορίων του Cl. botulinum σε ένα δεδομένο όγκο προϊόντος. Ένα σπόριο θα υπάρχει πάντα άθικτο σε κάποια κονσέρβα αν εξεταστεί ικανοποιητικός αριθμός κονσερβών. Για το λόγο αυτό έχει υιοθετηθεί ότι μείωση κατά 12 δεκαδικούς λογαρίθμους (12 D) είναι ικανοποιητική για την ονομαζόμενη εμπορική αποστείρωση ή για ένα αποδεκτό επίπεδο κινδύνου επιβίωσης του Cl. botulinum. Συγκρίσιμες τυπικές τιμές της παραμέτρου D για άλλα παθογόνα δεν υπάρχουν, ωστόσο είναι γενικά αποδεκτό ότι μια μείωση κατά 4 ή 5 λογαρίθμους (4 D ή 5 D) θεωρείται ικανοποιητική για τα περισσότερα προϊόντα (Baker και Genigeorgis, 1993). 5 3 log S D=1/slope log D z=1/slope T ( C) Time (min) Σχήμα 2.3. Γεωμετρική περιγραφή των D- και z- τιμών Μη γραμμικά μοντέλα Πέρα από τα γραμμικά μοντέλα που αποτελούν πλέον δόγμα για τη βιομηχανία παραγωγής κονσερβών, αφού επιτυγχάνουν την απόλυτη ασφάλεια αυτών των προϊόντων, 29

64 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μη γραμμικές καμπύλες επιβίωσης, έχουν επίσης αναφερθεί για ορισμένα βακτήρια (Moats et al., 1971). Κατά γενική ομολογία υπάρχουν δύο κατηγορίες μη γραμμικών καμπυλών, αυτές που παρουσιάζουν μια φάση προσαρμογής πριν την έναρξη της αδρανοποίησης (καμπύλες που εμφανίζουν ένα χαρακτηριστικό ώμο ) και αυτές που παρουσιάζουν μια ουρά στην τελική φάση της καμπύλης αδρανοποίησης. Για τις περιπτώσεις αυτές, υπάρχει ένα πλήθος από πολύπλοκες κινητικές εξισώσεις αδρανοποίησης. Κοινή θεωρητική βάση για την υιοθέτηση της λογαριθμικής συμπεριφοράς των μικροοοργανισμών κατά την αδρανοποίηση είναι η υπόθεση ότι πρώτον, οι βακτηριακοί πληθυσμοί είναι ομογενείς ως προς την ανθεκτικότητά τους στη θέρμανση και δεύτερον, πως η αδρανοποίηση συμβαίνει απευθείας με μία μόνο κρίσιμη επέμβαση σε κάθε κύτταρο (Moats et al., 1971). Γραμμική προσέγγιση Οι καμπύλες αδρανοποίησης που αποκλίνουν από την απλή εκθετική μορφή παρουσιάζουν συχνά μια φάση προσαρμογής πριν την έναρξη της εκθετικής αδρανοποίησης. Αυτή η μορφή της καμπύλης αδρανοποίησης είναι μάλλον η πιο κοινή που απαντάται στη βιβλιογραφία. Ένα απλό γραμμικό μοντέλο που περιγράφει τη συμπεριφορά αυτή αναπτύχθηκε από το Whiting (1993). όταν 0< t < t L log N = log N 0 1 log 0 (2.29) D όταν t > t L N = Log N - ( t tl) Το πλεονέκτημα του μοντέλου αυτού είναι ότι η εκτίμηση των παραμέτρων του μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας μια απλή γραμμική παλινδρόμηση. Οι απλές αυτές εξισώσεις έχουν εφαρμοστεί αποτελεσματικά στην περιγραφή της μη θερμικής αδρανοποίησης της L. monocytogenes ως συνάρτηση της συγκέντρωσης σε οργανικά οξέα και νιτρώδη (Buchanan και Golden, 1994, Buchanan και Golden, 1998, Buchanan et al., 1994, Buchanan et al., 1997b), όπως και σε συνθήκες μειωμένου οξυγόνου (Buchanan και Golden, 1995). Συνήθως η περιοχή της φάσης προσαρμογής διαφοροποιείται πολύ σε μια καμπύλη αδρανοποίησης. Το γεγονός αυτό καθιστά δύσκολη την ανάπτυξη δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την επίδραση του περιβάλλοντος στη φάση προσαρμογής. Οπότε, κάνοντας χρήση αυτού του μοντέλου, η επιβίωση εκφράζεται ως ο χρόνος που απαιτείται για μια μείωση 4 λογαρίθμων στην τιμή D (T 4D ) (Buchanan και Golden, 1994, Buchanan και Golden, 1998): T 4 D = TL + 4 D (2.30) 30

65 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Μη γραμμική προσέγγιση Οι πολύπλοκες κινητικές αδρανοποίησης απαιτούν τη χρήση μη γραμμικών μοντέλων. Η μη γραμμικότητα σε ότι αφορά τις μαθηματικές συναρτήσεις σημαίνει ότι οι παράμετροι της εξίσωσης δεν είναι γραμμικές, με αποτέλεσμα και η καμπύλη αδρανοποίησης να μην είναι επίσης γραμμική. Η μέθοδος της γραμμικής παλινδρόμησης μπορεί να υποστηριχτεί εύκολα από όλα σχεδόν τα προγράμματα ηλεκτρονικών υπολογιστών που είναι ευρέως διαδεδομένα, σε αντίθεση με τη μη γραμμική παλινδρόμηση που απαιτεί περισσότερο σύνθετα λογισμικά προγράμματα. Τα λογισμικά αυτά πακέτα είναι όμως διαθέσιμα, επιτρέποντας σημαντικές προόδους στην ανάπτυξη των μη γραμμικών μοντέλων. Ένα άλλο από τα πιο γνωστά σχήματα μιας καμπύλης επιβίωσης είναι η κοίλη καμπύλη που στερείται φάσης προσαρμογής αλλά φέρει πληθυσμό ουράς και παρουσιάζεται από το ακόλουθο εκθετικό μοντέλο (power law model): p N t log = (2.31) N0 D όπου p είναι η εκθετική δύναμη. Μια κοίλη καμπύλη παράγεται όταν ο όρος p γίνει μικρότερος της μονάδας (p < 1), ενώ σε αντίθετη περίπτωση το σχήμα της καμπύλης είναι κυρτό με την εμφάνιση του χαρακτηριστικού ώμου (p > 1). Το εκθετικό μοντέλο έχει χρησιμοποιηθεί στη μοντελοποίηση της κυρτότητας σε καμπύλες επιβίωσης του Enterococus faecium (Ross et al., 1998) και της αλκαλικής φωσφατάσης (McKellar et al., 1994) στο γάλα. Καμπύλες επιβίωσης με ουρά μπορούν να παρουσιαστούν ικανοποιητικά και από ένα εκθετικά μειούμενο πολυωνυμικό μοντέλο. Στο μοντέλο αυτό παρατηρήθηκε απόκλιση από την απλή γραμμική κινητική προσέγγιση, όπως στην επιβίωση του Staphylococcus aureus κατά τη θέρμανση σε αποβουτυρωμένο γάλα, και για τη συμπεριφορά αυτή χρησιμοποιήθηκε η προσαρμογή στο ακόλουθο μη γραμμικό μοντέλο: N log N λt = kte (2.32) 0 όπου k είναι ο συντελεστής που ορίζει το ρυθμό της επιφερόμενης μείωσης και λ ο συντελεστής υποβάθμισης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η λογιστική εξίσωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μοντελοποίηση της ανάπτυξης με σκοπό την τροποποίηση της απλής εκθετικής ανάπτυξης προκειμένου να λάβει υπόψη τον περιορισμό στο μέγεθος του μέγιστου πληθυσμού ως αποτέλεσμα της έλλειψης σε θρεπτικά συστατικά. Με όμοιο τρόπο, η λογιστική εξίσωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την περιγραφή της περιορισμένης θανάτωσης ενός 31

66 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μικροοργανισμού εξαιτίας κάποιου παράγοντα που προκαλεί στρες ή την καταστροφή στο κύτταρο (Pruitt και Kamau, 1993). Η ακριβώς αντίστροφη μορφή της λογιστικής συνάρτησης, κατάλληλη να περιγράφει την καταστροφή (αντί για την ανάπτυξη), καλείται εξίσωση Fermi και χρησιμοποιείται στις καμπύλες υποβάθμισης που εμφανίζουν συμμετρία: N log N 1+ e log 1+ e btl = b(t tl) 0 (2.33) όπου Ν είναι ο πληθυσμός (cfu/ml) που επιζεί τη χρονική στιγμή t, Ν 0 είναι ο πληθυσμός που επιζεί τη χρονική στιγμή 0, b ο μέγιστος ειδικός ρυθμός θανάτωσης, και t L είναι η φάση προσαρμογής πριν την έναρξη της αδρανοποίησης. Η εξίσωση αυτή έχει τροποποιηθεί με σκοπό να συμπεριλάβει τις περιπτώσεις όπου ένα μέρος του πληθυσμού των μικροοργανισμών είναι ευαίσθητος στη θέρμανση (πρωτογενής πληθυσμός) ενώ ένα άλλο εμφανίζεται περισσότερο ανθεκτικό (δευτερογενής πληθυσμός) (Whiting, 1993): b1tl b 2 log N = F(1+ e ) (1 F)(1+ e log + b1( t tl) b 2( t 0 (1+ ) (1+ tl N e e ) ) tl ) (2.34) όπου b 1 και b 2 είναι οι μέγιστοι ρυθμού θανάτωσης για τον πρωτογενή και δευτερογενή πληθυσμό, αντίστοιχα. Οι παραδοσιακές τιμές D μπορούν να προσδιοριστούν ως 2.3/b για κάθε πληθυσμό. Φυσικά, οι φάσεις προσαρμογής μπορεί να εκλείπουν σε κάποιες περιπτώσεις, οπότε ο όρος t L παίρνει μηδενική τιμή. Το διφασικό λογιστικό μοντέλο έχει χρησιμοποιηθεί στη μοντελοποίηση της αδρανοποίησης σπορίων του Cl. botulinum (Juneja et al.,1995), και της μη θερμικής αδρανοποίησης της L. monocytogenes (Buchanan et al., 1994, Buchanan και Golden, 1995, 1998) και του S. aureus (Whiting et al., 1996), ενώ έχει επίσης εφαρμοστεί στη θερμική αδρανοποίηση της καταλάσης βοδινού γάλατος (Hirvi et al., 1996). Στις περιπτώσεις που παρατηρείται μόνο ένας πληθυσμός ο όρος F παίρνει τιμή ίση με τη μονάδα, οπότε η εξίσωση παίρνει την προηγούμενη μορφή της (εξίσωση 2.33). Άλλες παραλλαγές της λογιστικής εξίσωσης έχουν επίσης προταθεί. Ειδικότερα ένα λογιστικό μοντέλο τεσσάρων παραμέτρων εισήχθηκε από τους Cole et al. (1993): ω α y (2.35) = α + 4σ x ω α 1+ e ( τ ) όπου y = log 10 cfu/ml, x = log 10 χρόνου, α = η ανώτατη ασύμπτωτη, ω = η κατώτατη ασύμπτωτη, τ ο χρόνος στον οποίο παρατηρείται η μέγιστη κλίση της καμπύλης και σ = η μέγιστη κλίση. Το μοντέλο αυτό εφαρμόστηκε στη μελέτη επιβίωσης του μικροοργανισμού Y. entrocolitica σε ph και θερμοκρασίες συντήρησης κάτω από τις άριστες τιμές (Little et al., 1994), καθώς και στη θερμική αδρανοποίηση της Salmonella typhimurium (Duffy et al., 32

67 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση 1995), του Cl. botulinum (Anderson et al., 1996), της Salmonella enteritidis και της Escherichia coli (Blackburn et al., 1997). Όμοια, η εξίσωση Gompertz που περιγράφηκε προηγουμένως είναι δυνατόν μετά από τις κατάλληλες τροποποιήσεις να περιγράψει και τη διεργασία αδρανοποίησης όπως προτάθηκε από τους Linton et al. (1995): N log N 0 = C exp( exp( A + Bt)) C exp( exp( A)) (2.36) Η εξίσωση αυτή έχει χρησιμοποιηθεί για την προσαρμογή των μη γραμμικών καμπυλών επιβίωσης της L. monocytogenes σε ρυθμιστικό διάλυμα (Linton et al., 1995) και σε προϊόν παιδικής διατροφής (Linton et al., 1996). Άλλο παράδειγμα εφαρμογής της ίδιας συνάρτησης αποτελούν μελέτες σχετικές με τη συνδυασμένη δράση εφαρμογής υψηλής πίεσης και ήπιας θέρμανσης στην αδρανοποίηση της Eschericia coli και του Staphylococcus aureus σε γάλα και πουλερικά (Patterson και Kilpatrick, 1998). 2.3 Επίδραση των ενδογενών και εξωγενών παραγόντων στην ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων. Το σύνολο των μαθηματικών συναρτήσεων που αναλύθηκαν προηγουμένως μπορούν να περιγράψουν τις μεταβολές χαρακτηριστικών ποιοτικών παραμέτρων ενός συστήματος τροφίμου θεωρώντας ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες παραμένουν σταθεροί. Στην πραγματικότητα όμως μεταβάλλονται συνεχώς και επηρεάζουν κατά κύριο λόγο τους ρυθμούς των αντιδράσεων που συμβαίνουν σε ένα σύστημα, αλλά και τις λοιπές παραμέτρους που συμμετέχουν στις μαθηματικές συναρτήσεις οι οποίες έχουν επιλεχτεί να περιγράψουν τη μεταβολή του υπό μελέτη ποιοτικού δείκτη. Συνεπώς, στην ολοκληρωμένη κινητική μελέτη της ποιοτικής υποβάθμισης, είναι αναγκαία η γενίκευση των μαθηματικών μοντέλων, ώστε να περιλαμβάνουν ως μεταβλητές και τους περιβαλλοντικούς παράγοντες ή και τις παραμέτρους σύστασης όπου κρίνεται απαραίτητο. Ένας τρόπος ενσωμάτωσης της επίδρασης των παραμέτρων αυτών στα παραπάνω μοντέλα, είναι η έκφραση της σταθεράς του ρυθμού της μεταβολής στη συνάρτηση ποιότητας, ως συνάρτηση των παραμέτρων αυτών. Στη συνέχεια, θα γίνει μια συνοπτική αναφορά στους κυριότερους περιβαλλοντικούς παράγοντες που επηρεάζουν τις κινητικές παραμέτρους που σχετίζονται με την απώλεια της ποιότητας καθώς και στις μαθηματικές εξισώσεις (δευτερογενή μαθηματικά μοντέλα) που εκφράζουν ποσοτικά την επίδραση αυτή. 33

68 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Θερμοκρασία Η θερμοκρασία θεωρείται ως ο σημαντικότερος παράγοντας που καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την διατηρησιμότητα των τροφίμων και τη συνολική διάρκεια ζωής τους, καθώς επηρεάζει έντονα τους ρυθμούς όλων των αντιδράσεων που οδηγούν στην απώλεια των ποιοτικών χαρακτηριστικών των τροφίμων. Η μεγάλη πλειοψηφία των μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν την επίδραση της θερμοκρασίας βασίζονται σε αρχές χημικής κινητικής (Labuza και Fu, 1993), και τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα είναι το μοντέλο Arrhenius, και οι τροποποιημένες μορφές αυτού, τα μοντέλα τετραγωνικής ρίζας και τα πολυωνυμικά μοντέλα Μοντέλο Arrhenius Η εξίσωση Arrhenius βασισμένη στις κλασικές αρχές της θερμοδυναμικής, γνώρισε ευρύτατη εφαρμογή στην περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης πλήθους χημικών αντιδράσεων που σχετίζονται με τη διάρκεια ζωής των τροφίμων συμπεριλαμβανομένου και των απωλειών των τροφίμων σε οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Η εμπειρική μορφή της εξίσωσης αυτής έχει ως εξής: k Ea RT = k 0 e (2.37) όπου k είναι ο ρυθμός της αντίδρασης (ή ο ρυθμός της μικροβιακής ανάπτυξης), k 0 η σταθερά που σχετίζεται με τον αριθμό των συγκρούσεων μεταξύ των αντιδρώντων ανά μονάδα χρόνου, Τ η απόλυτη θερμοκρασία (Kelvin), R η παγκόσμια σταθερά των αερίων (8.314 J mol -1 K -1 ) και E α η θερμοδυναμικά οριζόμενη παράμετρος ως ενέργεια ενεργοποίησης, η οποία αποτελεί μέτρο της θερμοκρασιακής ευαισθησίας των υπεύθυνων για την ποιοτική υποβάθμιση αντιδράσεων. Στην εξίσωση αυτή, αν η σταθερά του ρυθμού μιας αντίδρασης καταγραφεί σε διάφορες θερμοκρασίες και αν ο φυσικός λογάριθμος των τιμών αυτών (ln k) απεικονιστεί γραφικά ως συνάρτηση του αντιστρόφου της απόλυτης θερμοκρασίας (1/Τ), τα δεδομένα εμπίπτουν πάνω σε μια ευθεία γραμμή με κλίση που αντιστοιχεί στον όρο -Ε α /R της παραπάνω εξίσωσης (Labuza και Fu, 1993). Επειδή όλες οι διεργασίες που σχετίζονται με τη ζωή είναι το αποτέλεσμα χημικώνβιοχημικών αντιδράσεων, έχει εκφραστεί η άποψη πως ο ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών που δεν μπορούν να επιτύχουν θερμική ομοιόσταση μπορεί επίσης να περιγραφεί από την κινητική Arrhenius. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετοί που υποστηρίζουν πως η βακτηριακή ανάπτυξη περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση πολλών πολύπλοκων αντιδράσεων, με αποτέλεσμα οι καμπύλες Arrhenius να αποκλίνουν από τη γραμμικότητα 34

69 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται η μειώνεται σε εύρος τιμών που βρίσκονται μακριά από τις άριστες συνθήκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών (Heitzer et al., 1991, Ratkowsky et al., 1982, Stannard et al., 1985, Phillips και Griffiths, 1987). Η εξίσωση λοιπόν αυτή μπορεί να εφαρμοστεί μόνο σε ένα περιορισμένο εύρος θερμοκρασιών (Labuza και Fu, 1993). Διάφορες τροποποιήσεις της κλασικής εξίσωσης Arrhenius έχουν προταθεί με στόχο την προσαρμογή του μοντέλου σε ακραίες θερμοκρασίες. Κάποιες από τις τροποποιήσεις αυτές είναι μηχανιστικής βάσης ενώ άλλες εμπειρικές. Οι τροποποιήσεις μηχανιστικής βάσης στηρίζονται στην υπόθεση ότι οι ρυθμοί ανάπτυξης όλων των μικροοργανισμών ελέγχονται καθοριστικά από μια ενζυμική αντίδραση η οποία εξαρτάται έντονα από τη θερμοκρασία και η οποία ακολουθεί την κινητική Arrhenius. Τα ένζυμα ως πρωτεϊνικά μόρια είναι δυνατό να μετουσιωθούν σε ακραίες θερμοκρασίες και να χάσουν την ενεργότητά τους. Συνεπώς, οι εφαρμοζόμενες τροποποιήσεις στο μοντέλο Arrhenius έχουν ως στόχο να συμπεριλάβουν στην αρχική εξίσωση όρους που να σχετίζονται με την εκτίμηση της πιθανότητας το υπεύθυνο ένζυμο για την κατάλυση της κρίσιμης αντίδρασης να βρίσκεται στην ενεργή μορφή του. Μια τέτοιου είδους τροποποίηση έγινε από τους Schoolfield et al. (1981) οι οποίοι επαναπαραμετροποίησαν μια παλιότερη εξίσωση (Sharpe και DeMichele, 1977) σε ένα μη γραμμικό μοντέλο έξι παραμέτρων ως ακολούθως: ρ (25 k( T ) = ΔΗ 1+ exp R L T ΔΗ Α 1 1 C) exp 298 R 298 T 1 1 ΔHH 1 + exp T 1 / 2 L T R T 1 / 2H 1 T (2.38) όπου Τ η απόλυτη θερμοκρασία, R η παγκόσμια σταθερά των αερίων, k η απόκριση (ρυθμός ανάπτυξης ή αντίστροφο του χρόνου διπλασιασμού), ρ (25 C) ένας παράγοντας ίσος με το ρυθμό της απόκρισης στους 25 C, ΔΗ Α η ενέργεια ενεργοποίησης της κύριας αντίδρασης που καθορίζει το ρυθμό ανάπτυξης, και ΔΗ L και ΔΗ Η οι ενέργειες ενεργοποίησης της μετουσίωσης του ενζύμου σε χαμηλές και υψηλές θερμοκρασίες, αντίστοιχα, Τ 1/2L και T 1/2H η χαμηλότερη και υψηλότερη αντίστοιχα θερμοκρασία, στις οποίες το ήμισυ του υπεύθυνου για το ρυθμό ανάπτυξης ενζύμου έχει μετουσιωθεί. Αντίστοιχα, μια άλλη τροποποίηση από τους Zwietering et al. (1991) είναι η ακόλουθη: k 01 a 02 α RT = k exp( E / RT ) k exp( E high / ) (2.39) όπου R, T, k 0, και E α έχουν τις ίδιες έννοιες όπως και παραπάνω, ενώ E α high είναι η ενέργεια ενεργοποίησης της μετουσίωσης του ενζύμου που καθορίζει το ρυθμό της αντίδρασης στην υψηλή θερμοκρασία. 35

70 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Το μοντέλο Arrhenius μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στην έκφραση της θερμοκρασιακής εξάρτησης της λανθάνουσας φάσης προσαρμογής, το οποίο είναι κρίσιμης σημασίας για την πρόβλεψη της διάρκειας ζωής σε ποικίλες θερμοκρασιακές συνθήκες όταν υπάρχει χαμηλό αρχικό επίπεδο μικροβιολογικού φορτίου σε ένα προϊόν. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται το αντίστροφο της φάσης προσαρμογής (ρυθμός προσαρμογής) για την κατασκευή της αντίστοιχης καμπύλης Arrhenius. Συνήθως, η προσαρμογή των δεδομένων του χρόνου παραμονής στη λανθάνουσα φάση δεν είναι τόσο καλή όσο των δεδομένων που αφορούν τους ρυθμούς ανάπτυξης της εκθετικής φάσης (Labuza και Fu, 1993). Μια άλλη κατηγορία μοντέλων που βασίζεται στην εξίσωση Arrhenius παρουσιάστηκε από τον Davey (1989). Το μοντέλο αυτό περιγράφει την επίδραση της θερμοκρασίας και της ενεργότητας νερού με ένα γραμμικό μοντέλο τύπου Arrhenius, το οποίο δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης των άριστων τιμών των παραμέτρων, κι έχει την παρακάτω μορφή: ln C C 2 = C4aw (2.40) T T 1 2 k C C 2 3aw + όπου Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία (Κ), α w η ενεργότητα νερού και C 0, C 1, C 2, C 3, C 4 είναι οι συντελεστές προς εκτίμηση. Το ίδιο μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για την περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης του αντιστρόφου του χρόνου προσαρμογής (Davey, 1991), ή για την περιγραφή του ρυθμού ανάπτυξης του μικροοργανισμού Yersinia enterocolitica, περιλαμβάνοντας αυτή τη φορά όρους για την επίδραση της θερμοκρασίας και του ph κατά ανάλογο τρόπο με αυτό της εξίσωσης 2.40 (Davey, 1994). Άλλες εφαρμογές του μοντέλου Arrhenius αποτελούν η μοντελοποίηση της επίδρασης της θερμοκρασίας (μεταξύ 0 και 15 C) στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης και το χρόνο της λανθάνουσας φάσης προσαρμογής κατά την αερόβια ανάπτυξη των απαντούμενων ψευδομονάδων σε ένα είδος ψαριού της Μεσογείου (Koutsoumanis και Nychas, 2000). Επιπλέον, η κλασική εξίσωση Arrhenius τροποποιήθηκε από τους Koutsoumanis et al. (2000), με σκοπό να συμπεριλάβει τη συνδυασμένη δράση της θερμοκρασίας και του CO 2 στους ρυθμούς ανάπτυξης των αλλοιογόνων βακτηρίων σε φρέσκο ψάρι συσκευασμένο υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας, όπως δίνεται από την ακόλουθη συνάρτηση: E 1 1 μ ( ref dco 2) (2.41) R T T ln( a max ) = + ln μ 2 % CO ref όπου %CO 2 είναι η συγκέντρωση ισορροπίας του διοξειδίου του άνθρακα όπως μετρήθηκε στο διάκενο των αερίων συσκευασιών, d CO 2 είναι μία σταθερά που εκφράζει την επίδραση 36

71 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση του CO 2 στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης μ max, και Τ ref και μ ref η θερμοκρασία και ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, αντίστοιχα στους 273 Κ και σε 0 % CO 2. Τέλος, άξια αναφοράς είναι η χρήση του απλού μοντέλου Arrhenius στην εκτίμηση του σχετικού ρυθμού αλλοίωσης (relative rate of spoilage, RRS). Ως σχετικός ρυθμός αλλοίωσης ορίζεται το πηλίκο της διάρκειας ζωής ενός προϊόντος σε μια θερμοκρασία αναφοράς (Τ ref ) διαιρεμένο με τη διάρκεια ζωής που παρατηρείται στην πραγματική θερμοκρασία αποθήκευσης: Διάρκεια ζωής στη θερμοκρασία Τ RRS = Διάρκεια ζωής στη θερμοκρασία Τ ref E = exp R 1 1 T T όπου T ref είναι η θερμοκρασία αναφοράς στην οποία η διάρκεια ζωής είναι γνωστή. α ref (2.42) Σε κάθε περίπτωση πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στους παράγοντες οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν αποκλίσεις από την κλασική Arrhenius συμπεριφορά (Taoukis και Labuza, 1996). Πιθανές αιτίες που συντελούν στην εμφάνιση μη γραμμικών καμπυλών μεταβολής του ρυθμού μιας αντίδρασης ως προς το αντίστροφο της απόλυτης θερμοκρασίας έχουν συζητηθεί διεξοδικά στη βιβλιογραφία (Labuza και Riboh, 1982), και περιλαμβάνουν α) μεταβολές στην α w ή την υγρασία, β) μεταβολές στη φυσική κατάσταση του τροφίμου ή συστατικών του, όπως συμβαίνει κατά το σχηματισμό πάγου, κρυστάλλωση συστατικών, ή όταν το σύστημα του τροφίμου μεταπίπτει από την υαλώδη στην πλαστική κατάσταση (glass transition), γ) οποιαδήποτε αλλαγή στην κρίσιμη αντίδραση που ευθύνεται για την ποιοτική υποβάθμιση του υπό μελέτη προϊόντος, δ) αλλαγή στο ph του συστήματος με αλλαγή στη θερμοκρασία συντήρησης ή επεξεργασίας, ε) μείωση του διαλυτού οξυγόνου καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται, η οποία μπορεί να προκαλέσει επιβράδυνση της οξείδωσης, στ) συνύπαρξη των αντιδρώντων σε δύο φάσεις, όπως συμβαίνει με τη συμπύκνωση των αντιδρώντων συστατικών κατά την κατάψυξη, ζ) μη αντιστρεπτές μεταβολές που συνδέονται με το ιστορικό θερμοκρασιακής έκθεσης ενός προϊόντος, π.χ. οι μεταβολές που μπορεί να συμβούν σε υψηλές θερμοκρασίες επηρεάζουν μη αντιστρεπτά το ρυθμό μιας αντίδρασης κατά την ακόλουθη ψύξη του προϊόντος (Labuza και Ragnarsson, 1985) Μοντέλο τετραγωνικής ρίζας Το μοντέλο Belehradek που δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά το 1926 ήταν σχεδόν άγνωστο στον τομέα της μικροβιολογίας τροφίμων για πολλά χρόνια (Ross, 1993). Οι Ratkowsky et al. (1982) πρότειναν για πρώτη φορά τη χρήση του μοντέλου αυτού στη μικροβιολογία τροφίμων. Το μοντέλο, γνωστό επίσης ως μοντέλο τετραγωνικής ρίζας, 37

72 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή δίνεται παρακάτω: k = b( T Tmin) (2.43) όπου k είναι όπως και πριν ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, b είναι η κλίση της γραμμής παλινδρόμησης κατά την απεικόνιση του k ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, Τ είναι η θερμοκρασία πειραματισμού (σε C ή Κ) και T min η θεωρητικά ελάχιστη θερμοκρασία στην οποία συμβαίνει μικροβιακή ανάπτυξη και η οποία προσδιορίζεται ως το σημείο τομής της γραμμής παλινδρόμησης με τον άξονα της θερμοκρασίας για τιμή k =0. Ο Ratkowsky απέδειξε πως η εξίσωση αυτή μπορεί να περιγράψει ικανοποιητικά τη σχέση μεταξύ του μικροβιακού ρυθμού ανάπτυξης και της θερμοκρασίας σε περισσότερα από 50 σετ δεδομένων ανάπτυξης (Ratkowsky et al., 1982) καθώς και σε 30 επιπλέον μικροοργανισμούς (Ratkowsky et al., 1983). Η ίδια εξίσωση επεκτάθηκε στη συνέχεια με σκοπό να καλύψει το συνολικό βιοκινητικό εύρος θερμοκρασιών και να συμπεριλάβει τη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης σε θερμοκρασίες πάνω από την άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης (T opt ) (Ratkowsky et al., 1983). Το εν λόγω μη γραμμικό εμπειρικό μοντέλο περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: k { 1 exp[ c( T max) ]} = b( T T min) T (2.44) όπου b είναι ο συντελεστής παλινδρόμησης του k ως προς Τ (σε Κ) για θερμοκρασίες Τ < Τ opt, c μια πρόσθετη παράμετρος που επιτρέπει στο μοντέλο να προσαρμόσει τα δεδομένα της θερμοκρασίας πάνω από τη θερμοκρασία Τ opt, και T max είναι η ανώτατη θερμοκρασία όπου η γραμμή παλινδρόμησης τέμνει τον άξονα της θερμοκρασίας για τιμή k =0, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.4. T opt k 0.5 (h) T min T max Temperature ( C) Σχήμα 2.4. Γραφική απεικόνιση των εξισώσεων 2.43 (συμπαγής γραμμή) και 2.44 (διακεκομμένη γραμμή) (Πηγή: Ross και Dalgaard, 2004). 38

73 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Εκτός από τους Ratkowsky et al. (1983) που εφάρμοσαν επιτυχώς την εξίσωση 2.44 στα κινητικά δεδομένα 29 στελεχών μικροοργανισμών, και άλλοι ερευνητές αποφάνθηκαν για την αποτελεσματική εφαρμογή της ίδιας σχέσης στην πρόβλεψη της επίδρασης της αποθήκευσης σε σταθερές θερμοκρασίες στους ρυθμούς μικροβιακής ανάπτυξης (Chandler και McMeekin, 1985, Phillips και Griffiths, 1987, Buchanan και Klawitter, 1992). Από τη στιγμή που η συλλογή αξιόπιστων δεδομένων σε μικρούς ρυθμούς ανάπτυξης είναι πολύ δύσκολη, οι θερμοκρασίες T min και Τ max είναι θεωρητικές (εκτιμετέες) και μπορεί να μην ανταποκρίνονται στις πραγματικές θερμοκρασίες όπου η ανάπτυξη είναι μηδενική. Επιπλέον, η εκτιμούμενη τιμή της παραμέτρου T min, μπορεί να βρίσκεται κάτω από τη θερμοκρασία κατάψυξης του τροφίμου. Η κατάψυξη αποτελεί μια κατάσταση στην οποία αλλάζουν η φάση και η ενεργότητα νερού και οι οποίες επηρεάζουν σημαντικά το ρυθμό ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού, δημιουργώντας έτσι αποκλίσεις από τη γραμμικότητα. Συνεπώς, η πραγματική T min μπορεί να βρίσκεται αρκετούς βαθμούς υψηλότερα από την τιμή που προσδιορίζεται κατά την επέκταση των δεδομένων με τη χρήση του μοντέλου τετραγωνικής ρίζας, με αποτέλεσμα η προβλεπόμενη διάρκεια ζωής να είναι μικρότερη από την πραγματική (Labuza και Fu, 1993). Άλλες τροποποιήσεις που έγιναν στην εξίσωση 2.44, περιλαμβάνουν την προσθήκη σ αυτήν της παραμέτρου α w (McMeekin et al., 1987) ή του ph (Adams et al., 1991), ή ακόμη την προσθήκη και των δύο παραμέτρων ταυτόχρονα (α w και ph) (McMeekin et al., 1992), ώστε να περιγράφεται ταυτόχρονα η συνδυασμένη δράση της θερμοκρασίας και της α w ή και του ph, στους ρυθμούς ανάπτυξης των μικροοργανισμών. Οι τροποποιημένες αυτές εξισώσεις έχουν ως εξής: k = b( T T min) ( aw aw min) (2.45) k = b( T T min) (ph ph min) (2.46) k = b( T T min) ( aw aw min) (ph ph min) (2.47) Ομοίως, με μια νέα τροποποίηση του μοντέλου τετραγωνικής ρίζας, διερευνήθηκε και η επίδραση του CO 2 και του γαλακτικού νατρίου (NaL, sodium lactate), στην ανάπτυξη του Lactobacillus sakei και της Listeria monocytogenes σε σταθερό ph (Devlieghere et al., 1998a, 2000a, b, 2001), σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση: k = max b( T T min ) ( aw aw min) ( CO2 max CO2) NaL NaL (2.48) 39

74 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Γραμμικό μοντέλο Οι Spencer και Baines (1967) πρότειναν ένα γραμμικό μοντέλο για τη μελέτη της μικροβιακής ανάπτυξης σε λευκό ψάρι. Μεταξύ άλλων απέδειξαν ότι η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό αλλοίωσης του ψαριού κατά την ισόθερμη συντήρησή του μεταξύ των -1 και 25 C βρέθηκε σχεδόν γραμμική και ότι μπορεί να εκφραστεί από την εξίσωση: k = k 0(1 + ct ) (2.49) όπου k ο ειδικό ρυθμός αλλοίωσης, (μονάδες αλλοίωσης / ημέρα) στη θερμοκρασία Τ, k 0, ο ειδικός ρυθμός αλλοίωσης στους 0 C, και c μια σταθερά θερμοκρασίας. Επομένως, η γραφική απεικόνιση του k ως συνάρτηση της θερμοκρασίας δίνει ευθεία γραμμή. Αυτή η συμπεριφορά θα ήταν αναμενόμενη στην περίπτωση που το εύρος θερμοκρασιών και ενεργειών ενεργοποίησης ήταν πραγματικά στενό, και άρα έχει περιορισμένη εφαρμογή (Labuza και Fu, 1993) Εκθετικό μοντέλο λογαριθμικό μοντέλο προσδιορισμού της διάρκειας ζωής Αν το εύρος των θερμοκρασιών που μας ενδιαφέρει δεν είναι μεγαλύτερο από βαθμούς, τότε η απεικόνιση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης σε ημιλογαριθμικό χαρτί ως συνάρτηση της θερμοκρασίας (αντί του αντιστρόφου της απόλυτης θερμοκρασίας) δίνει επίσης ευθεία γραμμή. Το εκθετικό αυτό μοντέλο έχει την ακόλουθη μορφή: k = k 0 exp( st ) (2.50) όπου k είναι ο ειδικός ρυθμός στη θερμοκρασία Τ (σε C), k 0 ο αντίστοιχος ρυθμός στους 0 C, και s η κλίση της καμπύλης του lnk ως προς τη θερμοκρασία Τ. Το μοντέλο αυτό έχει επίσης εφαρμογή στην περιγραφή του χρόνου λανθάνουσας φάσης προσαρμογής ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Η ίδια εξίσωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της διάρκειας ζωής αν οι όροι k και k 0 αντικατασταθούν με τους όρους t s και t 0, ως η διάρκεια ζωής ενός προϊόντος σε θερμοκρασία Τ και τους 0 C, αντίστοιχα, με τον όρο b να εκφράζει την κλίση της ευθείας: ts = t 0 exp( bt) (2.51) Η καμπύλη αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μοντελοποίηση των επιδράσεων διαφόρων επεξεργασιών, της σύστασης, και των συνθηκών συσκευασίας καθώς και για την εκτίμηση της θερμοκρασιακής ευαισθησίας ενός προϊόντος. Η ίδια εξίσωση, χρησιμοποιείται στην προσέγγιση της θερμοκρασιακής εξάρτησης της τιμής Q 10, που ορίζεται ως η μείωση που παρατηρείται στο χρόνο ζωής ενός προϊόντος όταν η 40

75 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση θερμοκρασία συντήρησης αυξάνεται κατά 10 C, ή ως ο λόγος της σταθεράς του ρυθμού της αντίδρασης σε δύο θερμοκρασίες που διαφέρουν κατά 10 C (Taoukis και Labuza, 1996): Q 10 k( T + 10) = = k( T ) t s ts ( T ) (2.52) ( T + 10) Oπότε τόσο η τιμή Q 10 όσο και της κλίσης b μπορούν να δοθούν ως συνάρτηση της ενέργειας ενεργοποίησης της κύριας αντίδρασης που επηρεάζει την ποιοτική υποβάθμιση του τροφίμου από τη σχέση: Q 10 Ea = exp(10b) = exp R T 10 ( T + 10) (2.53) Η αξιοπιστία της καμπύλης προσδιορισμού της διάρκειας ζωής και της προσέγγισης που περιγράφηκε για την τιμή Q 10, επίσης περιορίζεται σε ένα στενό εύρος θερμοκρασιών. Ισχύουν κι εδώ οι ίδιοι προβληματισμοί που εκφράστηκαν για τις αποκλίσεις από τη γραμμικότητα της εξίσωσης Arrhenius, ενώ όπως ξεκάθαρα αναδεικνύεται από την εξίσωση 2.53, η τιμή Q 10 εξαρτάται από τη θερμοκρασία με εντονότερη την εμφάνιση της επίδρασης αυτής για τις αντιδράσεις που παρουσιάζουν υψηλές τιμές ενέργειας ενεργοποίησης (Ε α ). Επίσης, ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται κατά την εφαρμογή της προσέγγισης αυτής σε αφυδατωμένα τρόφιμα, όπου η α w πρέπει να παραμένει σταθερή, αφού και αυτή η παράμετρος επηρεάζει σημαντικά την τιμή Q 10 (Taoukis και Labuza, 1996) Μοντέλο WLF Η εξάρτηση του ρυθμού μιας αντίδρασης σε εύρος θερμοκρασιών 100 C πάνω από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης (Τ g < Τ < T g +100), όταν δηλαδή το υπό μελέτη σύστημα βρίσκεται στην ελαστοπλαστική κατάσταση, δεν φαίνεται ότι ακολουθεί την κινητική προσέγγιση Arrhenius. Η κλίση της καμπύλης Arrhenius και άρα η ενέργεια ενεργοποίησης αλλάζει δραστικά, υποδηλώνοντας ότι η θερμοκρασιακή εξάρτηση περιγράφεται καλύτερα από κάποιου άλλου είδους σχέση, όπως αυτή της εξίσωσης WLF. Οι Williams Landel και Ferry (1955) εισήγαγαν ένα μοντέλο για την περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης των μηχανικών και διηλεκτρικών χαλαρώσεων που συμβαίνουν στην ελαστοπλαστική κατάσταση ως αποτέλεσμα έντονων μεταβολών στην μοριακή κινητικότητα των συστατικών του υλικού. Η ίδια εξίσωση μπορεί να εκφράσει τη θερμοκρασιακή ευαισθησία διαφόρων χημικών αντιδράσεων σε άμορφα συστήματα τροφίμων σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από το T g (Slade et al., 1989). Σε συστήματα 41

76 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή περιορισμένης διάχυσης, όπου η διάχυση των συστατικών εξαρτάται από τον ελεύθερο όγκο οι σταθερές των ρυθμών της αντίδρασης που ευθύνεται για την υποβάθμιση της ποιότητας μπορεί να εκφραστεί ως συνάρτηση της θερμοκρασίας από την παρακάτω εξίσωση: k log k ref C1 = C 2 + ( T Tref ) ( T Tref ) (2.54) όπου k ref είναι η σταθερά του ρυθμού στη θερμοκρασία αναφοράς T ref (T ref > T g ), και C 1, C 2 συντελεστές που εξαρτώνται από το σύστημα. ΟιWilliams et al.(1955), θέτοντας T ref = T g, και με βάση ένα πλήθος διαθέσιμων δεδομένων για διάφορα πολυμερή κατάφεραν να εκτιμήσουν τις μέσες τιμές των σταθερών C 1 και C 2 σε = και 51.6, αντίστοιχα. Στη βιβλιογραφία οι τιμές αυτές χρησιμοποιούνται συχνά κατά την απόδειξη της δυνατότητας εφαρμογής της εξίσωσης WLF σε ποικίλα συστήματα. Ωστόσο, οι ίδιοι οι εισηγητές του μοντέλου αυτού συμβουλεύουν ενάντια στη χρήση των παγκόσμιων αυτών σταθερών και την εκ νέου εκτίμηση των συντελεστών C 1 και C 2 για κάθε σύστημα, χωριστά, με στόχο την ορθότερη εκτίμηση της παραμέτρου T g και της περισσότερο αξιόπιστης χρήσης του εν λόγω μοντέλου σε σύγκριση με την εξίσωση Arrhenius (Williams et al., 1955). Μεταβολές που συμβαίνουν στην ποιότητα των τροφίμων και εξαρτώνται άμεσα από το ιξώδες μοριακή κινητικότητα, όπως η κρυστάλλωση και οι μεταβολές στην υφή των προϊόντων, περιγράφονται ικανοποιητικά από το μοντέλο WLF Πολυωνυμικά μοντέλα Τα πολυωνυμικά μοντέλα αποτελούν τον τύπο των δευτερογενών μοντέλων που απαντάται συχνότερα στη βιβλιογραφία. Τα γραμμικά αυτά μοντέλα έχουν περιγράψει την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων (π.χ. θερμοκρασία, συγκέντρωση NaCl, ή α w, ph, νιτρώδη, CO 2, οργανικά οξέα, φυσικές αντιμικροβιακές ουσίες). Τα πολυωνυμικά μοντέλα είναι ιδιαίτερα ελκυστικά στο χρήστη, κατά κύριο λόγο εξαιτίας της εύκολης προσαρμογής των δεδομένων με την πολλαπλή γραμμική παλινδρόμηση, η οποία εμπεριέχεται στα περισσότερα στατιστικά πακέτα. Κατά δεύτερον, επιτρέπουν στην πραγματικότητα την εξέταση και συμμετοχή στη μελέτη όλων των πιθανών περιβαλλοντικών παραμέτρων και των αλληλεπιδράσεων αυτών, οπότε η εφαρμογή τους αποτελεί έναν εύκολο τρόπο συλλογής πληροφοριών από τα πειραματικά δεδομένα. Ακολούθως δίνεται μια εξίσωση δευτέρου βαθμού ως χαρακτηριστικό παράδειγμα της μαθηματικής έκφρασης ενός πολυωνυμικού μοντέλου: ln y = p1 + p2 x1 + p3x2 + p4x3 + p5x1x2 + p6 x1x3 (2.55) p x x + p x + p x + p x + e

77 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση όπου ln y είναι ο φυσικός λογάριθμος της απόκρισης (μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, χρόνος διάρκειας της φάσης προσαρμογής, μέγιστη πυκνότητα του πληθυσμού των μικροοργανισμών), p i (i=1,...10) οι προς εκτίμηση συντελεστές, x j (j=1,..3) οι περιβαλλοντικοί παράγοντες π.χ. θερμοκρασία, ph, συγκέντρωση NaCl (% w/v), και e ένα τυχαίο σφάλμα για το οποίο γίνεται η υπόθεση ότι έχει μηδενικό μέσο όρο και σταθερή διακύμανση. Σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι με την ίδια εξίσωση μπορούν να μοντελοποιηθούν περισσότερες από μια παράμετροι - αποκρίσεις ανάπτυξης ως συνάρτηση των περιβαλλοντικών παραγόντων. Επίσης, οι αποκρίσεις αυτές μπορούν να έχουν τη φυσική τους μορφή ή να μετατραπούν αντίστοιχα στους φυσικούς ή δεκαδικούς λογαρίθμους χωρίς να είναι απαραίτητη η μετατροπή ολόκληρου του μοντέλου (Ross και Dalgaard, 2004). Εντούτοις, οι πολυωνυμικές εξισώσεις παρουσιάζουν κάποιες ιδιαιτερότητες που περιορίζουν τη χρησιμότητά τους ως δευτερογενή μοντέλα πρόβλεψης. Ειδικότερα, φέρουν μεγάλο αριθμό συντελεστών οι οποίοι δεν έχουν καμία βιολογική σημασία, γεγονός που καθιστά δύσκολη τη σύγκρισή τους με τα κλασικά δευτερογενή μοντέλα πρόβλεψης. Επιπλέον, τα πολυωνυμικά μοντέλα μεγαλύτερης τάξης (τρίτου και τετάρτου βαθμού) έχουν δεχτεί έντονη κριτική για τη μεγάλη ευαισθησία τους αλλά και για το γεγονός ότι προσπαθούν να μοντελοποιήσουν παρά να περιορίσουν το πειραματικό σφάλμα (Baranyi et al., 1996). Για το λόγο αυτό δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται εκτός και αν τα πειραματικά δεδομένα είναι πολύ υψηλής ποιότητας και υποστηρίζουν ισχυρά την εφαρμογή τους. Προκειμένου να ξεπεραστεί το πρόβλημα της μεγάλης ευαισθησίας των πολυωνυμικών μοντέλων δευτέρου βαθμού αλλά και των μη λογικών προβλέψεων που συνεπάγεται αυτό, προτάθηκε η ανάπτυξη πολυωνυμικών μοντέλων με περιορισμούς (constrained polynomial models) (Geeraerd et al., 2004). Στην προσέγγιση αυτή, βασική ιδέα ήταν να συνδυαστούν οι θεμελιώδεις βασικές πληροφορίες που σχετίζονται με την επίδραση των περιβαλλοντικών παραμέτρων στις αποκρίσεις ανάπτυξης, με τα κλασικά πολυωνυμικά μοντέλα. Για παράδειγμα, σε συνθήκες εκτός του εύρους των άριστων τιμών, θεωρείται ότι ο ρυθμός της ανάπτυξης αυξάνεται πάντα με την αύξηση της θερμοκρασίας και της α w, ενώ μειώνεται με την αύξηση των επιπέδων CO 2. Συνεπώς, η μερική παράγωγος του μοντέλου που σχετίζεται με τη θερμοκρασία και την α w πρέπει να είναι πάντα θετική, ενώ η μερική παράγωγος που αφορά το CO 2 να είναι πάντα αρνητική. Στη συνέχεια, έγινε προσαρμογή των συντελεστών του πολυωνυμικού μοντέλου, με την προϋπόθεση να υπακούουν στους συγκεκριμένους περιορισμούς σε όλα τα ακραία σημεία του πειραματικού σχεδιασμού. Η 43

78 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή προσαρμογή του νέου τύπου μοντέλων στηρίχτηκε και πάλι στην κλασική διαδικασία ελαχιστοποίησης του αθροίσματος των τετραγώνων του σφάλματος, χρησιμοποιώντας την επιλογή Optimization Toolbox που υπάρχει στο λογισμικό Matlab. Συγκρινόμενα με τα κλασικά πολυωνυμικά μοντέλα τα πολυώνυμα με περιορισμούς παρουσιάζονται περισσότερο υγιή αλλά πιο δύσκολα στην προσαρμογή τους Περιεχόμενη υγρασία και ενεργότητα νερού (α w ) Είναι αναμφισβήτητο, ότι η περιεχόμενη υγρασία σχετίζεται άμεσα με την ευπάθεια των τροφίμων και συνεπώς με την πιθανή απώλεια της ποιότητάς τους. Οι διεργασίες συμπύκνωσης και ξήρανσης έχουν ως πρωταρχικό στόχο τη μείωση της περιεχόμενης υγρασίας, και την αύξηση της διατηρησιμότητάς τους. Επιπλέον, η ενεργότητα νερού, α w, αποτελεί μια άλλη έκφραση της διαθεσιμότητας του νερού στα τρόφιμα. Συγκεκριμένα, η α w περιγράφει το πόσο ισχυρά συνδέεται το νερό με τα μη υδατικά συστατικά και καθορίζει το βαθμό με τον οποίο αυτό μπορεί να συμμετέχει σε διεργασίες ποιοτικής υποβάθμισης, όπως είναι η ανάπτυξη των μικροοργανισμών και οι χημικές αντιδράσεις (Fennema, 1996). Το νερό που βρίσκεται στην μονομοριακή στοιβάδα είναι ισχυρά δεσμευμένο μη μπορώντας να λάβει μέρος στις διεργασίες που σχετίζονται με την υποβάθμιση της ποιότητας των τροφίμων. Επίσης, ο ρυθμός των μεταβολών που συμβαίνουν στην περιοχή αυτή θεωρείται πολύ μικρός, με αποτέλεσμα το νερό να μην επηρεάζει ουσιαστικά τη σταθερότητα του τροφίμου. Σε τιμές α w πάνω από το μονομοριακό στρώμα νερού, η μοριακή κινητικότητα των αντιδρώντων συστατικών αυξάνεται, επιτρέπεται η διαλυτοποίησή τους και η συμμετοχή τους σε πλήθος αντιδράσεων, των οποίων ο ρυθμός ολοένα και αυξάνεται. Συνεπώς, η α w σχετίζεται άμεσα με τους ρυθμούς διαφόρων αντιδράσεων (Σχήμα 2.5), και θεωρείται ως ένας χρήσιμος δείκτης για τη σταθερότητα και ασφάλεια των τροφίμων. Η φυσική σταθερότητα των τροφίμων, και ειδικότερα οι χαρακτηριστικές ιδιότητες της κρυστάλλωσης των συστατικών, του κολλώδους και της υφής των προϊόντων, επηρεάζονται άμεσα από την περιεχόμενη στα τρόφιμα υγρασία και ενεργότητα νερού. Ο ρυθμός της κρυστάλλωσης αυξάνεται με την αύξηση της υγρασίας, ενώ επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό και από τη θερμοκρασία στις περιπτώσεις όπου αυτή βρίσκεται πάνω από το σημείο T g. Ως γνωστό, σε θερμοκρασίες πάνω από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης το ιξώδες του συστήματος μειώνεται δραματικά επιτρέποντας την έντονη κίνηση των μορίων και τη διενέργεια διαφόρων αντιδράσεων. Τα σάκχαρα, που είναι έντονα 44

79 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση υγροσκοπικές ουσίες, εκτιθέμενα σε υψηλές υγρασίες στην πλαστική κατάσταση, κρυσταλλώνουν προσδίδοντας τραχεία και κοκκώδη υφή στο προϊόν (Roos και Karel, 1991). Παραδείγματα απώλειας της συνολικής ποιότητας των τροφίμων λόγω της ανεπιθύμητης κρυστάλλωσης των σακχάρων αποτελούν η απώλεια της μαλακής υφής σε σοκολατάκια, κρέμες και μαρμελάδες γέμισης αρτοσκευασμάτων (Hartel, 1993), και σε μπισκότα τύπου cookies (Nelson και Labuza, 1993). Επιπλέον, η κρυστάλλωση των σακχάρων κατά την αύξηση της α w σε τιμές μεγαλύτερες του μπορεί σταδιακά να οδηγήσει στην απελευθέρωση υγρασίας και τελικά στη δημιουργία ιδανικού περιβάλλοντος για την ανάπτυξη μυκήτων (Labuza και Hyman, 1998). Σχετικός ρυθμός μεταβολής Οξείδωση Ισόθερμες λιπαρών νερού ρόφησης Μη ενζυμική μελάνωση Ενζυμική δραστηριότητα Ανάπτυξη Ανάπτυξη μυκήτων ζυμών Ανάπτυξη βακτηρίων Υγρασία Ενεργότητα νερού, α w Σχήμα 2.5. Επίδραση της ενεργότητας νερού στο ρυθμό διαφόρων αντιδράσεων που σχετίζονται με την ποιότητα των τροφίμων. Τα προϊόντα τροφίμων σε μορφή σκόνης γίνονται κολλώδη σε κάποια κρίσιμη θερμοκρασία και συγκέντρωση υγρασίας, εξαιτίας της σταδιακής συσσωμάτωσης των κόκκων της σκόνης που προκαλεί η περιεχόμενη υγρασία (Peleg και Mannheim, 1977). Η κρυστάλλωση και η κολλώδης υφή στα συστήματα τροφίμων έχει αρνητικές επιπτώσεις στην αποδοχή των προϊόντων από τον καταναλωτή. Όμοια, η απώλεια της τραγανής υφής των ημιαποξηραμένων τροφίμων κατά την αύξηση της α w σε τιμές μεγαλύτερες από 0.50, όπως συμβαίνει κατά την επαφή τους με άλλα τρόφιμα μεγαλύτερης περιεκτικότητας σε υγρασία, επηρεάζει επίσης την αποδοχή διαφόρων προϊόντων από τον καταναλωτή (Sauvageot και Blond, 1991). Τέτοιες περιπτώσεις αποτελούν τα κράκερ κατά την επαφή τους με τυρί, μαρμελάδα, ή πολτό φρούτων, τα δημητριακά πρωινού με ημιαποξηραμένα φρούτα, τα οποία προσλαμβάνουν σταδιακά νερό και γίνονται λιγότερο τραγανά, ή το τραγανό χωνάκι παγωτού κατά την επαφή του με το παγωτό. Τα ξηρά τρόφιμα, όπως τσιπς, 45

80 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αλατισμένα κράκερ, και ποπ κορν, κατά τη διατήρησή τους σε συσκευασίες που επιτρέπουν τη διαπερατότητα σε υδρατμούς, επιδεικνύουν παρόμοιες μεταβολές και χάνουν τη τραγανή τους υφή όταν η υγρασία που προσλαμβάνουν φτάσει σε επίπεδα α w (Katz και Labuza, 1981). Τα δημητριακά πρωινού χάνουν την τραγανή τους υφή όταν η α w φτάσει σε επίπεδα μεγαλύτερα από Στην υαλώδη κατάσταση τα ξηρά δημητριακά έχουν χαρακτηριστική τραγανή υφή, ωστόσο, η πλαστικοποιητική δράση του νερού, που προκαλείται λόγω αύξησης της υγρασίας, ή η αύξηση της θερμοκρασίας οδηγούν το σύστημα στην ελαστοπλαστική κατάσταση, καθιστώντας το προϊόν περισσότερο μαλακό και υγρό (Nelson και Labuza, 1993). Αντίθετα, σε κάποια άλλα τρόφιμα, όπως οι σταφίδες και τα αποξηραμένα φρούτα, η υψηλή σχετικά περιεκτικότητα σε υγρασία κρίνεται απαραίτητη για την απόκτηση της χαρακτηριστικής μαλακής και υγρής υφής τους. Η απώλεια υγρασίας από τα προϊόντα αυτά τα καθιστά σκληρά και οργανοληπτικά μη αποδεκτά σε εύρος τιμών α w μεταξύ 0.5 και 0.7 (Labuza και Contreras- Medellin, 1981). Οι χημικές αντιδράσεις και πιο συγκεκριμένα η οξείδωση των λιπών και οι αντιδράσεις μη-ενζυμικής αμαύρωσης (non-enzymatic browning), επηρεάζονται επίσης από την απώλεια ή πρόσληψη υγρασίας και εξαρτώνται έντονα από τα αντιδρώντα συστατικά και πως αυτά αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (φύση και συγκέντρωσή τους). Ο ρυθμός της μηενζυμικής αμαύρωσης ή της οξείδωσης εξαρτάται από τα συστατικά που υπάρχουν στο σύστημα, το ιξώδες του συστήματος, τη διαλυτοποίηση των αντιδρώντων μορίων, και τη μοριακή κινητικότητα αυτών. Σε ότι αφορά τη μη ενζυμική αμαύρωση, ο μέγιστος ρυθμός της αντίδρασης συνήθως παρατηρείται σε εύρος α w μεταξύ (Labuza και Saltmarch, 1981a). Για την οξείδωση των λιπών ο ρυθμός αυξάνεται πάνω και κάτω από την περιεχόμενη υγρασία μονοστιβάδας, επομένως η παρεμπόδιση της εναλλαγής υγρασίας είναι κρίσιμη, εκτός κι αν απομακρυνθεί το οξυγόνο, με την υπό κενό συσκευασία, τη διοχέτευση ατμόσφαιρας αερίων ή τη χρήση κατάλληλων παραγόντων ικανών να δεσμεύουν οξυγόνο, πρακτική που δε λειτουργεί αποτελεσματικά στα ξηρά τρόφιμα, αφού οι εν λόγω παράγοντες δε δουλεύουν αρκετά καλά σε σχετική υγρασία < 50% (Labuza και Hyman, 1998). Η ανάπτυξη και ο μεταβολισμός των μικροβίων επίσης απαιτεί την παρουσία νερού στην κατάλληλη μορφή. Η ενεργότητα του νερού σε φρέσκα τρόφιμα όπως το κρέας, τα ψάρια, τα πουλερικά, τα φρούτα και λαχανικά είναι μεγαλύτερη από 0.98, όπου ευνοείται και η ανάπτυξη των περισσότερων μικροοργανισμών. Η μείωση της α w είναι εφικτή με αύξηση της συγκέντρωσης των διαλυτών μικρού μοριακού βάρους συστατικών (οσμωτικά 46

81 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση ενεργών) στην υδατική φάση του τροφίμου, είτε απομακρύνοντας την υγρασία ή προσθέτοντας υγροσκοπικές ουσίες όπως το αλάτι, και η ζάχαρη. Πολλοί μικροοργανισμοί, συμπεριλαμβανομένων και των παθογόνων βακτηρίων, αναπτύσσονται σε επίπεδα ενεργότητας νερού μεγαλύτερα από 0.91, ωστόσο, το παθογόνο βακτήριο Staphylococcus aureus φέρει ως κρίσιμο όριο ανάπτυξης την τιμή α w Σε γενικές γραμμές, τα βακτήρια απαιτούν μεγαλύτερα επίπεδα α w για την ανάπτυξή τους σε σχέση με τις ζύμες που αναπτύσσονται σε τιμές α w >0.85, ενώ οι μύκητες είναι ανθεκτικοί σε ακόμη χαμηλότερες τιμές α w, κοντά στο Ωστόσο, υπάρχουν και οι αλατοάντοχοι οργανισμοί που μπορούν και αναπτύσσονται σε τιμές α w μεγαλύτερες από Εντούτοις, πρέπει να αναφερθεί πως η α w δεν είναι ο μοναδικός παράγοντας που καθορίζει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Η ενεργότητα νερού αποτελεί μέρος της συνδυασμένης δράσης διαφόρων εμποδίων, όπου και άλλοι παράγοντες όπως το ph, η θερμοκρασία συντήρησης, η θερμική επεξεργασία, η προσθήκη συντηρητικών, το οξειδοαναγωγικό δυναμικό, και η ανταγωνιστική μικροχλωρίδα, συμβάλλουν συνεργιστικά στην αύξηση της προστασίας των τροφίμων έναντι της μικροβιακής ανάπτυξης (αλλοίωσης). Διάφορα μαθηματικά μοντέλα έχουν αναπτυχθεί κατά καιρούς για την πρόβλεψη της πρόσληψης υγρασίας με την πάροδο του χρόνου σε συσκευασμένα τρόφιμα (Labuza και Contreras-Medellin, 1981, Mizrahi et al., 1970, Quast και Karel, 1972, Simon et al., 1971), τα οποία όμως ξεφεύγουν από το σκοπό της παρούσας ανασκόπησης. Άλλες εξισώσεις που να περιγράφουν την επίδραση του παράγοντα α w στο ρυθμό μεταβολών που συμβαίνουν στα τρόφιμα σε συνδυασμό με την επίδραση άλλων παραγόντων όπως η θερμοκρασία, έχουν ήδη περιγραφεί (εξισώσεις 2.40 και 2.42) ph Η επίδραση του ph έχει μελετηθεί σε πολλές αντιδράσεις ποιοτικής υποβάθμισης των τροφίμων. Η ενζυμική και μικροβιακή δραστηριότητα επηρεάζονται έντονα από το ph, και για κάθε μια από αυτές υπάρχει ένα βέλτιστο εύρος τιμών ph στο οποίο παρατηρείται μέγιστη δραστηριότητα και κάποια όρια επάνω και κάτω από τα οποία η δραστηριότητα αυτή σταματά. Η λειτουργικότητα και η διαλυτότητα των πρωτεϊνών εξαρτάται επίσης από το ph, με την ελάχιστη διαλυτότητα αυτών να παρατηρείται κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο, επηρεάζοντας άμεσα τη συμπεριφορά τους στις διάφορες αντιδράσεις. Η επίδραση του ph σε πλήθος μικροβιακών, ενζυμικών και πρωτεϊνικών αντιδράσεων έχει μελετηθεί 47

82 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή τόσο σε μοντέλα συστήματα που περιείχαν τα κατάλληλα θρεπτικά συστατικά, όσο και σε βιοχημικά συστήματα και συστήματα τροφίμων. Ωστόσο οι περισσότερες μελέτες δε λαμβάνουν υπόψη τους τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων, με πιο σημαντική αυτή μεταξύ του ph και της θερμοκρασίας. Σημαντικές αντιδράσεις για τα τρόφιμα που καταλύονται σε όξινο ή αλκαλικό περιβάλλον, όπως είναι η μη-ενζυμική αμαύρωση και η αποικοδόμηση (υδρόλυση) της ασπαρτάμης, εξαρτώνται έντονα από το ph. Η μη ενζυμική αμαύρωση των πρωτεϊνών εμφανίζει ένα ελάχιστο σε τιμές ph 3-4 και υψηλούς ρυθμούς σε έντονα όξινο ή αλκαλικό περιβάλλον (Feeney και Whitaker, 1982). Η αποικοδόμηση της ασπαρτάμης παρουσιάζει ελάχιστο στο ph 4.5 (Holmer, 1984), αλλά ο σχετικός ρυθμός της εν λόγω υποβάθμισης εξαρτάται επίσης από τη ρυθμιστική ικανότητα του συστήματος και τα παρόντα σε αυτό ιόντα (Tsoubeli και Labuza, 1991). Μελέτες σχετικές με την επίδραση της θερμοκρασίας, της α w και του ph στην αποικοδόμηση της ασπαρτάμης έχουν κάνει σαφή τη σημασία των παραγόντων αυτών και των αλληλεπιδράσεών τους καθώς και τα ενδεχόμενα σφάλματα πρόβλεψης για το συγκεκριμένο σύστημα στην περίπτωση παράβλεψης των αλληλεπιδράσεων αυτών (Bell και Labuza, 1991, 1994). Σε ότι αφορά τους μικροοργανισμούς, μικρές διακυμάνσεις του ph στο εύρος 6-7 έχουν πολύ μικρή ή καθόλου επίδραση στην κινητική του πληθυσμού. Ωστόσο, στα όξινα τρόφιμα το ph αυτό καθαυτό, μπορεί να επηρεάσει έντονα την κινητική των μικροοργανισμών, αλλά και να τονίσει την παράλληλη επίδραση και των λοιπών συστατικών που συμβάλλουν στη διατήρηση του προϊόντος (Ross και Dalgaard, 2004) Σύσταση αερίων Η σύσταση των αερίων αποτελεί έναν επιπλέον παράγοντα που παίζει σημαντικό ρόλο σε ορισμένες αντιδράσεις ποιοτικής υποβάθμισης. Τα τρόφιμα συντηρούνται συνήθως σε αερόβιες συνθήκες, υπό κενό ή συσκευασμένα σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (Modified Atmosphere Packing, MAP). Τα τρόφιμα MAP εκτίθενται σε ένα περιβάλλον όπου η δημιουργούμενη ατμόσφαιρα περιλαμβάνει μίγμα των αερίων διοξειδίου του άνθρακα (CO 2 ), αζώτου (N 2 ) και οξυγόνου (O 2 ). Η συσκευασία υπό κενό μπορεί επίσης να θεωρηθεί ως ένας τύπος της συσκευασίας MAP (O Connor-Shaw και Reyes, 1999). Η συσκευασία υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα έχει εφαρμοστεί ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων, συνήθως χωρίς την απόλυτη γνώση των μηχανισμών που βρίσκονται πίσω από την προστατευτική της δράση (Devlieghere et al., 2004). Η παρουσία και η σχετική 48

83 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αναλογία των αερίων της ατμόσφαιρας MAP και ειδικά του CO 2, επηρεάζει έντονα τις βιολογικές και μικροβιακές αντιδράσεις στο φρέσκο κρέας, τα ψάρια, τα φρούτα και λαχανικά (Taoukis και Labuza, 1996). Για παράδειγμα, στην περίπτωση των τροφίμων που αναπνέουν έντονα, όπως είναι τα φρούτα και τα λαχανικά, ο πρωταρχικός ρόλος της ατμόσφαιρας MAP είναι η επιβράδυνση των φυσιολογικών διεργασιών υποβάθμισης, π.χ. της αναπνοής, ενώ σε ότι αφορά το κρέας η συσκευασία υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα χρησιμοποιείται για την παρεμπόδιση της μικροβιακής αλλοίωσης (O Connor-Shaw και Reyes, 1999). Σημαντική δυσκολία στην εφαρμογή της τεχνολογίας MAP είναι η εύρεση της άριστης ατμόσφαιρας αερίων για κάθε προϊόν τροφίμου σε κάποιο συγκεκριμένο υλικό συσκευασίας. Παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την επιλογή αυτή είναι τόσο οι ενδογενείς παράμετροι σύστασης του τροφίμου (ph, ενεργότητα νερού, περιεκτικότητα σε λίπος και είδος των λιπαρών ουσιών) όσο και η αναλογία όγκων του εφαρμοζόμενου αερίου προς προϊόν στον επιλεγμένο τύπο συσκευασίας. Οι παράγοντες αυτοί καθορίζουν την ευαισθησία του προϊόντος στις εξειδικευμένες μικροβιακές, χημικές και ενζυμικές διεργασίες ποιοτικής υποβάθμισης (Devlieghere et al., 2004). Η διαθεσιμότητα του οξυγόνου είναι πολύ σημαντική για τις οξειδωτικές αντιδράσεις και δύναται να επηρεάσει τόσο το ρυθμό της αντίδρασης όσο και την τάξη αυτής, ανάλογα με το αν το οξυγόνο βρίσκεται σε περίσσεια η όχι. Επίσης, η συσκευασία υπό κενό ή σε ατμόσφαιρα εμπλουτισμένη με άζωτο, στηρίζεται κατά κύριο λόγο στην επιβράδυνση των ανεπιθύμητων αντιδράσεων περιορίζοντας το διαθέσιμο οξυγόνο (Taoukis και Labuza, 1996). Το Ν 2 είναι ένα αδρανές αέριο και στην τροποποιημένη ατμόσφαιρα έχει το ρόλο του αερίου πλήρωσης της συσκευασίας, με παράλληλο στόχο να επιτευχθεί η επιθυμητή αναλογία των δύο άλλων αερίων. Το Ν 2, σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 20% στην συνολική αναλογία των αερίων, συμβάλλει στην αποτροπή της κατάρρευσης της συσκευασίας MAP με υψηλή συγκέντρωση σε αέριο CO 2 (O Connor-Shaw και Reyes, 1999). Το Ο 2 και το CO 2 επιδρούν στην ανάπτυξη των περισσότερων μικροοργανισμών, και συνεπώς τα δευτερογενή μοντέλα θα πρέπει να λαμβάνουν υπόψη τους τις επιδράσεις αυτών των αερίων (Ross και Dalgaard, 2004). Η διαλυτότητα του Ο 2 στο νερό και άρα στην υδατική φάση των τροφίμων είναι μικρή (~0.03 l/l), αλλά σημαντική για την ανάπτυξη και το μεταβολισμό των μικροοργανισμών στα τρόφιμα που συντηρούνται αερόβια ή σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (Dainty και Mackey, 1992). Ο αποκλεισμός του οξυγόνου εμποδίζει την ανάπτυξη των αρνητικών κατά gram αερόβιων αλλοιογόνων μικροοργανισμών, όπως το γένος Pseudomonas, ενώ ευνοεί την ανάπτυξη των θετικών κατά gram βακτηρίων, των 49

84 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μικροαερόφιλων ειδών όπως τα γένη Lactobacillus και Brochothrix. Οι προαιρετικά αναερόβιοι μικροοργανισμοί (gram θετικοί ή αρνητικοί) δεν επηρεάζονται από την απουσία οξυγόνου και μπορούν να κυριαρχήσουν στο περιβάλλον του τροφίμου. Ωστόσο για τον προσδιορισμό της δράσης του Ο 2 στα τρόφιμα και την ασφάλεια αυτών απαιτούνται δεδομένα που αφορούν τόσο την αλλοίωση των προϊόντων, όσο και την ανάπτυξη των παθογόνων μικροοργανισμών σε αυτά, υπό διαφορετικές θερμοκρασίες (Labuza και Fu, 1993). Επιπλέον, είναι πιθανό το κατάλληλο μικροπεριβάλλον (ειδικά σε τρόφιμα με ιδιαίτερα ετερογενή δομή) στο οποίο η τάση του οξυγόνου είναι αρκετά χαμηλή, να επιτρέψει την ανάπτυξη ορισμένων αναερόβιων παθογόνων, παρότι το επίπεδο οξυγόνου στο μεγαλύτερο μέρος του όγκου θα απέτρεπε κάτι τέτοιο (Jones, 1989). Επειδή οι περισσότεροι από τους ιστούς των τροφίμων χρησιμοποιούν οξυγόνο σε κάποιο βαθμό (κατά την αναπνοή, την οξείδωση ή τη μικροβιακή δράση), και από τη στιγμή που οι περισσότερες μεμβράνες συσκευασίας είναι διαπερατές στα αέρια όπως το οξυγόνο, αναμένεται μεταβολή της συγκέντρωσης του οξυγόνου στο διάκενο των συσκευασιών με την πάροδο του χρόνου. Η μεταβολή αυτή δυσχεραίνει τη μοντελοποίηση και την πρόβλεψη της επίδρασης του συγκεκριμένου παράγοντα (Labuza και Fu, 1993). Η αδυναμία αυτή ενισχύεται επιπλέον, ιδιαίτερα σε μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες από το γεγονός ότι οι ρυθμοί διαπερατότητας των μεμβρανών συσκευασίας καθώς και οι ρυθμοί αναπνοής εξαρτώνται έντονα από μεταβολές της θερμοκρασίας και της σχετικής υγρασίας. Παράγοντες όπως η διαλυτότητα του Ο 2 στο σύστημα τροφίμου, οι συνθήκες επεξεργασίας και η θερμοκρασία επεξεργασίας είναι σημαντικοί. Πέρα από τη διαπερατότητα του φιλμ συσκευασίας σε οξυγόνο, χρειάζονται επίσης δεδομένα που αφορούν τον όγκο στο διάκενο των συσκευασιών, το εμβαδόν επιφάνειας της συσκευασίας και τους ρυθμούς κατανάλωσης οξυγόνου εξαιτίας των συνδυασμένων δράσεων του μικροβιακού φορτίου, του ρυθμού αναπνοής του προϊόντος ή του ρυθμού χημικής οξείδωσης. Η παρουσία του Ο 2 επηρεάζει επίσης έντονα το χρώμα σε φρέσκα προϊόντα κρέατος, ένα από τα σημαντικότερα ποιοτικά χαρακτηριστικά που καθορίζουν τη διάρκεια ζωής, και την προτίμηση των καταναλωτών. Το έντονο, λαμπερό, κόκκινο χρώμα του βοδινού οφείλεται στην επικράτηση της οξυμυογλοβίνης κατά την ισχυρή δέσμευση του Ο 2 στο σίδηρο της αίμης (ανηγμένη μορφή της χρωστικής, Fe 2+ ). Η δεοξυμυογλοβίνη (η ανηγμένη μορφή της μυογλοβίνης) δίνει πορφυρό χρώμα στο κρέας απουσία οξυγόνου όταν το κρέας τεμαχίζεται για πρώτη φορά ή όταν συσκευάζεται υπό κενό. Η μεθμυογλοβίνη οφείλεται στην οξείδωση της αίμης και προσδίδει το χαρακτηριστικό καφέ χρώμα στο κρέας. Το βάθος διείσδυσης του οξυγόνου και το πάχος της στιβάδας οξυμυογλοβίνης εξαρτάται από 50

85 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση τη θερμοκρασία συντήρησης, τη μερική πίεση του οξυγόνου, το ph και τον ανταγωνισμό για το Ο 2 από τις διεργασίες αναπνοής. Η μεθμυογλοβίνη σχηματίζεται όταν οι χρωστικές εκτίθενται παρατεταμένα στο φως, τη θερμότητα, το Ο 2, τη μικροβιακή ανάπτυξη ή την κατάψυξη. Η καρβόξυ-μυογλοβίνη σχηματίζεται κατά την έκθεση της δεοξυμυογλοβίνης στο μονοξείδιο του άνθρακα (CO). Απουσία του CO, οι τρεις μορφές της μυογλοβίνης μπορούν να συνυπάρχουν ταυτόχρονα σε ποικίλες συγκεντρώσεις, ανάλογα με τις επικρατούσες συνθήκες του οξειδοαναγωγικού δυναμικού του συστήματος. Η δεοξυμυογλοβίνη επικρατεί σε συγκεντρώσεις οξυγόνου μικρότερες του 0.2%, η οξυμυογλοβίνη επικρατεί σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 13%, ενώ η μεθμυογλοβίνη σε διαθέσιμα επίπεδα οξυγόνου μεταξύ 0.2 και 13%. Υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου ευνοούν την επικράτηση της οξυμυογλοβίνης, αλλά μπορεί να προκαλέσουν άλλες ανεπιθύμητες οξειδωτικές αντιδράσεις (McMillin, 2008). To διοξείδιο του άνθρακα, διαλυτό στο νερό και τις λιπαρές ουσίες, και άρα στα προϊόντα κρέατος σε κάποιο βαθμό (O Connor-Shaw και Reyes, 1999) έχει επιλεκτική ανασταλτική δράση έναντι των μυκήτων, και των αερόβιων βακτηρίων όπως οι ψευδομονάδες, αλλά μικρή μόνο δράση κατά των ζυμών, και των αναερόβιων μικροοργανισμών, των γαλακτικών βακτηρίων, εντεροβακτηρίων και του B. thermosphacta (Guerrero και Chabela, 1999), πιθανώς λόγω της μείωσης που προκαλεί στο ρυθμό ανάπτυξης των μικροοργανισμών που αναφέρθηκαν. Επίσης, αποτρέπει τη μικροβιακή ανάπτυξη επιμηκύνοντας τόσο τη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης προσαρμογής, η οποία με τη σειρά της επηρεάζεται από τη φυσιολογική κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα βακτήρια κατά την εφαρμογή του CO 2 (O Connor-Shaw και Reyes, 1999), όσο και του χρόνου αναπαραγωγής (διπλασιασμού) των κυττάρων, αποτέλεσμα που εμφανίζεται εντονότερο στις χαμηλές θερμοκρασίες συντήρησης (O Connor-Shaw και Reyes, 1999, Daniels et al., 1985). Το CO 2 είναι περισσότερο αποτελεσματικό σε χαμηλά επίπεδα αρχικής επιμόλυνσης του προϊόντος. Η διαλυτότητά του αυξάνεται προοδευτικά με τη μείωση της θερμοκρασίας (Enfors και Molin, 1981, O Connor-Shaw και Reyes, 1999) αλλά και με την αύξηση του ph. Η μικρότερη διαλυτότητα του διοξειδίου του άνθρακα στην υδατική φάση του προϊόντος σε υψηλότερες θερμοκρασίες, περιορίζει πιθανώς το σχηματισμό καρβονικού οξέος και τη διάστασή του σε H + και HCO - 3, συμβάλλοντας σε μικρότερη ανασταλτική δράση (Lambert et al., 1991). Εξαιτίας της διαλυτότητάς του, πρέπει να προστίθεται σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις στο μίγμα αερίου, υπολογίζοντας την απορρόφηση μέρους αυτού από το προϊόν αλλά και την απώλεια κάποιας ποσότητας από την ατμόσφαιρα στο εσωτερικό της συσκευασίας ώστε να διατηρηθεί ο 51

86 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αποτελεσματικός έλεγχος της μικροχλωρίδας. Όπως και στην περίπτωση του οξυγόνου, κάθε προσπάθεια μοντελοποίησης της επίδρασης του διοξειδίου του άνθρακα στη διάρκεια ζωής ή την ασφάλεια των προϊόντων λόγω ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών, πρέπει να λαμβάνει υπόψη της τη σύσταση του τροφίμου, τη σύνθεση και τα επίπεδα των αερίων της ατμόσφαιρας που χρησιμοποιείται, και τις μεταβολές στη θερμοκρασία και στην ενεργότητα νερού (Labuza και Fu, 1993). Καμιά επίδραση του διοξειδίου του άνθρακα στο χρώμα του κρέατος δεν έχει αναφερθεί σύμφωνα με μια εκτεταμένη ανασκόπηση σε θέματα εναλλακτικών μεθόδων συσκευασίας στη διακίνηση φρέσκων προϊόντων κρέατος που έγινε από τον Jeremiah (2001). Προκειμένου να μπορεί να προβλεφθεί η μικροβιακή ανάπτυξη σε τρόφιμα MAP, σημαντικός κρίνεται ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ισορροπίας του CO 2 στην αέρια φάση ή της συγκέντρωσης του CO 2 που έχει διαλυθεί στην υδατική φάση του τροφίμου. Στην κατάσταση ισορροπίας η συγκέντρωση του CO 2 είναι ανάλογη της μερικής πίεσης του CO 2 στην ατμόσφαιρα που περιβάλλει το προϊόν. Ο νόμος του Henry παρέχει μια αρκετά καλή προσέγγιση για την εκτίμηση της διαλυτότητας του CO 2 : Ισορροπία [ CO2] Κ pco2 υδατική φάση = (2.56) Η όπου Κ Η είναι η σταθερά Henry (mg/l/atm) και pco 2 η μερική πίεση (σε atm) του CO 2. Μεταξύ 0 και 160 C, η θερμοκρασιακή εξάρτηση της σταθεράς Henry μπορεί να προβλεφθεί από την ακόλουθη εξίσωση: K H ( mg l -1 atm 1 ) = exp( / K / K / K 3 ) (2.57) όπου K είναι η απόλυτη θερμοκρασία (Carroll et al., 1991). Οι συγγραφείς αυτοί εξέφρασαν την σταθερά Henry Κ Η σε MPa/mole, οπότε οι σταθερές Pa/atm και χρησιμοποιήθηκαν για την μετατροπή αυτής της μονάδας σε mg CO 2 /l H 2 O/atm. Οι Devlieghere et al. (1998a) πρότειναν μία εξίσωση για την πρόβλεψη της συγκέντρωσης του CO 2 στην υδατική φάση ως συνάρτηση του αρχικού ποσοστού CO 2 (%CO 2 Initial ) και της αρχικής αναλογίας όγκων αερίου / προϊόντος. Στην εξίσωση αυτή (2.58) ο όρος dco 2 είναι η πυκνότητα του CO 2 (1.976 g/l): [ CO2] ισορροπία υδατική φάση = G P dco 2 G dco P + K 2 H + K H K 2 H G %CO P Αρχική 2 dco 2 (2.58) 52

87 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Η εξίσωση αυτή δεν λαμβάνει υπόψη της την επίδραση της θερμοκρασίας, οπότε οι ίδιοι ερευνητές ανάπτυξαν ένα πολυωνυμικό μοντέλο για την πρόβλεψη της συγκέντρωσης του διαλυτού CO 2 ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, του αρχικού ποσοστού CO 2 και της αναλογίας όγκων αερίου / προϊόντος. Εντούτοις, οι Ross και Dalgaard (2004) πρότειναν τη συνδυασμένη χρήση των δύο εξισώσεων που προαναφέρθηκαν (εξισώσεις 2.57 και 2.58) για την επίτευξη ρεαλιστικών προβλέψεων εκτίμησης της συγκέντρωσης του CO Προστιθέμενα συντηρητικά (οργανικά οξέα, νιτρώδη και καρυκεύματα) Μερικά τρόφιμα περιέχουν από τη φύση τους υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών οξέων μικρού μοριακού βάρους, γνωστών για την αντιμικροβιακή τους δράση, ενώ άλλα οργανικά οξέα προστίθενται στα τρόφιμα, συμπεριλαμβανομένου του οξικού, ασκορβικού, βενζοϊκού κιτρικού, γαλακτικού και σορβικού οξέος. Η προσθήκη τους έχει ως στόχο την αναστολή της ανάπτυξης των μικροοργανισμών και συνεπώς συχνά απαιτούνται τα κατάλληλα δευτερογενή μοντέλα με σκοπό την πρόβλεψη της ανασταλτικής τους δράσης. Τα δευτερογενή μοντέλα πρέπει να λαμβάνουν υπόψη τη συγκέντρωση των οργανικών οξέων στην υδατική φάση των προϊόντων. Επιπλέον, κάποιες φορές κρίνεται απαραίτητο τα ίδια δευτερογενή μοντέλα να περιγράφουν τη συνδυασμένη δράση των οργανικών οξέων και άλλων περιβαλλοντικών παραμέτρων όπως του ph (Ross και Dalgaard, 2004). Στο διάλυμα, τα οργανικά οξέα βρίσκονται είτε στη διισταμένη είτε στην αδιάστατη μορφή τους. Η εξίσωση Henderson-Hasselbalch συσχετίζει το κλάσμα της αδιάστατης και εν διαστάσει μορφής του οργανικού οξέος με το ph και τη σταθερά pk a του οξέος σύμφωνα με την εξίσωση: [A ] [HA] ph pka = 10 (2.59) όπου [ΗΑ] είναι η συγκέντρωση του αδιάστατου οξέος, [Α - ] η ανιονική συγκέντρωση του διισταμένου οξέος, pka είναι η τιμή του ph στην οποία οι συγκεντρώσεις των δύο αυτών μορφών είναι ίσες. Ενώ και οι δύο μορφές των οργανικών οξέων (αδιάστατη και διισταμένη) έχουν ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών, η αδιάστατη μορφή είναι περισσότερο αποτελεσματική κατά δύο ή τρεις τάξης μεγέθους (Eklund, 1989). Η αναπροσαρμογή της εξίσωσης 2.59 λύνοντας ως προς [ΗΑ] δίνει: ph pka [ HA] [ LAC] /( ) = (2.60) όπου [LAC] είναι η συνολική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος και οι λοιπές παράμετροι παραμένουν ίδιες. 53

88 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Καθώς η συγκέντρωση του αδιάστατου οξέος αυξάνεται ο ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών μειώνεται και τελικά παύει σε ένα ορισμένο επίπεδο. Απλά ενζυμικά kit είναι διαθέσιμα για τον προσδιορισμό διαφόρων οργανικών οξέων που χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα, ενώ εφικτή είναι επίσης και η εκτίμησή τους με τη χρήση της ανάλυσης χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC (Ross και Dalgaard, 2004). Τα νιτρώδη μπορούν να προστεθούν σε ορισμένους τύπους προϊόντων κρέατος και η συγκέντρωσή τους στην υδατική φάση των προϊόντων πρέπει να λαμβάνεται υπόψη όταν αναπτύσσονται δευτερογενή μοντέλα για τέτοια τρόφιμα. Τα καρυκεύματα μπορεί να έχουν επίσης σημαντική αντιμικροβιακή δράση και θα έπρεπε να περιλαμβάνονται ως όροι σε δευτερογενή μοντέλα (Koutsoumanis et al., 1999). Μάλιστα, οι εμπλεκόμενοι στα δευτερογενή μοντέλα όροι για την επίδραση των συστατικών αυτών πρέπει να βασίζονται στη συγκέντρωση των ενεργών αντιμικροβιακών ουσιών που αυτά περιέχουν, γεγονός που συνεπάγεται τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενεργών συστατικών μέσω της ανάλυσης κατάλληλων εκχυλισμάτων με τεχνικές που συνδυάζουν Αέριο Χρωματογραφία ή Υγρή Χρωματογραφία και Φασματοφωτομετρία Μάζας (GC/MS ή LC/MS). 2.4 Ανάπτυξη, προσαρμογή και αξιολόγηση των μαθηματικών μοντέλων Έχοντας ορίσει τις βασικές αρχές της κινητικής προσέγγισης που χρησιμοποιούνται κατά τη μελέτη υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων, όπως και τις συνήθεις μαθηματικές συναρτήσεις που εκφράζουν την περιγραφή των παρατηρούμενων μεταβολών (πρωτογενή μοντέλα που περιγράφουν τις μεταβολές των παραμέτρων απόκρισης στην πορεία του χρόνου, αλλά και τα δευτερογενή μοντέλα που εκφράζουν την επίδραση των ενδογενών και εξωγενών παραγόντων στις κινητικές παραμέτρους των πρωτογενών μοντέλων), ακολουθεί μια σύντομη περιγραφή των κυριότερων σταδίων που εφαρμόζονται κατά την ανάπτυξη ενός κινητικού μοντέλου πρόβλεψης συμπεριλαμβανομένης της προσαρμογής και αξιολόγησης αυτού. Σε γενικές γραμμές, η μεθοδολογία αυτή περιλαμβάνει τον πειραματικό σχεδιασμό, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, την προσαρμογή των μαθηματικών μοντέλων και τελικώς την αξιολόγηση αυτών όπως περιγράφεται αναλυτικότερα στη συνέχεια Πειραματικός σχεδιασμός Στην ανάπτυξη ενός μοντέλου για την περιγραφή της ποιοτικής υποβάθμισης ενός τροφίμου, σημαντική είναι η πολύ καλή γνώση των απαιτήσεων του μοντέλου. Ο 54

89 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση πειραματικός σχεδιασμός πρέπει να γίνει με τέτοιο τρόπο ώστε να εξασφαλιστεί η καλύτερη χρήση τόσο του χρόνου όσο και των διαθέσιμων πηγών από πλευράς αναλυτικών τεχνικών και υλικών που χρειάζονται για τη διεκπεραίωσή τους. Οι απαιτήσεις του μοντέλου εξαρτώνται από τους στόχους που θέτονται εξ αρχής, οι οποίοι μπορεί να αφορούν την κατανόηση των επιδράσεων των διαφόρων ανεξάρτητων μεταβλητών στη μεταβολή του υπό μελέτη ποιοτικού δείκτη που έχει επιλεχτεί, ή την ανίχνευση των ανώτατων και κατώτατων ορίων που μπορούν να πάρουν οι τιμές των μεταβλητών αυτών στον καθορισμό του χρόνου διατήρησης (McDonald και Sun, 1999). Ένα γενικό περίγραμμα του πειραματικού σχεδιασμού που αποτυπώθηκε για τη μοντελοποίηση στην ποσοτική μικροβιολογία, αλλά μπορεί να εφαρμοστεί γενικά στην ανάπτυξη των κινητικών μοντέλων πρόβλεψης περιλαμβάνει: i) τον ορισμό του πειραματικού στόχου, ii) την καταγραφή όλων των μεταβλητών που εμπλέκονται στη μεταβολή των ποιοτικών παραμέτρων, iii) τον προσδιορισμό των σημαντικότερων παραγόντων ή μεταβλητών, iv) τον προσδιορισμό του εύρους των μεταβλητών αυτών, και v) την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών των υπό μελέτη αποκρίσεων ή τη βελτίωση της κατανόησης των διεργασιών υποβάθμισης (Davies, 1993). Ειδικότερα, η επιλογή των καταλληλότερων παραγόντων που επηρεάζουν τη μεταβολή κάποιας διεργασίας ποιοτικής υποβάθμισης, συμβάλλει στην πρακτική χρήση των μοντέλων πρόβλεψης. Συνήθως, οι παράγοντες που επιλέγονται δεν ξεπερνούν τους τρεις ή τέσσερις συνολικά και είναι όλοι σχετικοί με την αναμενόμενη χρήση του μοντέλου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η χρήση περισσότερων μεταβλητών αυξάνει σημαντικά το πλήθος, την πολυπλοκότητα και τελικά το κόστος των πειραματικών αναλύσεων. Σημαντική παράμετρο αποτελεί επίσης και η διερεύνηση τυχόν αλληλεπιδράσεων μεταξύ των παραγόντων. Ιδιαίτερη αναφορά πρέπει να γίνει στον καθορισμό εξ αρχής του εύρους που μπορούν να λάβουν οι ανεξάρτητες μεταβλητές, ανάλογα φυσικά με το εύρος των περιβαλλοντικών παραγόντων στους οποίους πρόκειται να εκτεθεί το προϊόν, αφού το υπό ανάπτυξη μαθηματικό μοντέλο δεν μπορεί να εφαρμοστεί και να προβλέψει ικανοποιητικά τη συμπεριφορά των αποκρίσεων πέραν του διαστήματος που έχει οριστεί για το εύρος διακύμανσης των μεταβλητών αυτών Συλλογή και ανάλυση δεδομένων Η ανάπτυξη ενός μαθηματικού μοντέλου απαιτεί την αναπαραγωγή δεδομένων που προέρχονται από τον αντίστοιχο πειραματισμό. Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα των 55

90 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή δεδομένων που συλλέγονται τόσο καλύτερη είναι η ακρίβεια και η αξιοπιστία του παραγόμενου μοντέλου. Κλειδί στην προσαρμογή τόσο των πρωτογενών όσο και των δευτερογενών μοντέλων είναι η συλλογή ικανοποιητικού αριθμού δεδομένων από το σύνολο της χρονικής περιόδου που διαρκεί ο πειραματισμός, προϋπόθεση που καθιστά τα παραγόμενα πειραματικά δεδομένα ποιοτικά και ικανά να συμβάλλουν ουσιαστικά στην εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων των μαθηματικών συναρτήσεων που θα αναπτυχθούν εφαρμοστούν στη συνέχεια. Συνήθως, απαιτείται η συλλογή δεδομένων που αφορούν μεγάλο αριθμό πρωτογενών καμπυλών ανάπτυξης ή αδρανοποίησης, γεγονός που πολλές φορές αντιστοιχεί σε αρκετούς μήνες πειραματισμού. Αναγκαία μεταξύ άλλων είναι η επανάληψη των πειραματικών δοκιμών με στόχο την ελαχιστοποίηση της εν γένει παραλλακτικότητας της μετρούμενης απόκρισης, ιδιαίτερα όταν αυτή αφορά τη μικροβιακή ανάπτυξη ή θανάτωση. Η παραλλακτικότητα βέβαια παρουσιάζεται μεγαλύτερη στις οριακές συνθήκες του πειραματισμού (ακραίες τιμές των παραγόντων που επιδρούν στη μεταβολή της απόκρισης) και η επανάληψη του πειράματος στις συνθήκες αυτές κρίνεται εξαιρετικά αναγκαία. Μεγάλης σημασίας είναι επίσης η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου για την παρακολούθηση της ποιοτικής παραμέτρου, της οποίας κύρια χαρακτηριστικά πρέπει να είναι η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα των δεδομένων που παράγει. Κάποιες από τις εφαρμοζόμενες μεθόδους περιγράφουν άμεσα την παρατηρούμενη ποιοτική υποβάθμιση, ενώ άλλες μεταφράζουν με έμμεσο τρόπο το αποτέλεσμα της μεταβολής μιας ποιοτικής παραμέτρου σε απώλεια της συνολικής ποιότητας. Γενικά, ο μεγάλος αριθμός των πειραματικών δεδομένων που απαιτείται επιβάλει κατά κάποιο τρόπο την επιλογή μιας γρήγορης και αξιόπιστης μεθόδου εκτίμησης μιας ποιοτικής παραμέτρου, χωρίς βέβαια αυτό να σημαίνει ότι οι κλασικές μέθοδοι αναφοράς-ανάλυσης θεωρούνται αναχρονιστικές λόγω του χρονοβόρου χαρακτήρα τους. Η ανάλυση των πειραματικών δεδομένων αποτελεί κύριο μεταβατικό στάδιο για την μετέπειτα προσαρμογή σε αυτά της κατάλληλης μαθηματικής συνάρτησης. Η γραφική απεικόνιση των δεδομένων που έχουν συλλεχτεί ως συνάρτηση του χρόνου δίνει μια πρώτη εκτίμηση της κινητικής της καταγραφούμενης μεταβολής και προδιαθέτει για το είδος και το πλήθος των μαθηματικών συναρτήσεων που δύνανται να περιγράψουν το υπό μελέτη φαινόμενο. Κατάλληλοι μετασχηματισμοί της απόκρισης που μελετάται (π.χ. λογαριθμική έκφραση αυτής ή υπολογισμός της τετραγωνικής ρίζας των τιμών της απόκρισης) μπορεί επίσης να εφαρμοστούν προκειμένου να υπάρξει ακριβέστερη προσαρμογή των μαθηματικών μοντέλων, και να επιτευχθεί η απαραίτητη ακολουθία κανονικής κατανομής 56

91 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση από τα πειραματικά δεδομένα Προσαρμογή των μοντέλων και μαθηματική περιγραφή Η προσαρμογή των κατάλληλων μαθηματικών συναρτήσεων στα πρωτογενή πειραματικά δεδομένα δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης όλων των σημαντικών κινητικών παραμέτρων (υπολογισμός του ρυθμού μιας αντίδρασης υποβάθμισης, της φάσης προσαρμογής κλπ.) σε όλες τις συνθήκες πειραματισμού. Ακολουθεί η προσαρμογή των δευτερογενών μοντέλων στις κινητικές παραμέτρους που έχουν εκτιμηθεί από τα πρωτογενή μοντέλα, και άρα η περιγραφή της επίδρασης των περιβαλλοντικών παραγόντων και των παραμέτρων σύστασης του προϊόντος στην έκβαση της ποιοτικής υποβάθμισης που μελετάται. Και στις δύο περιπτώσεις προσαρμογής μαθηματικών μοντέλων χρησιμοποιούνται τα κατάλληλα εργαλεία (λογισμικά ηλεκτρονικών υπολογιστών και στατιστικά πακέτα) τα οποία στηρίζονται στις κλασικές αρχές παλινδρόμησης και τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Ιδιαίτερη έμφαση κατά την προσαρμογή δίνεται στην εκτίμηση του συντελεστή προσδιορισμού ή συντελεστή συσχετίσεως (R 2 ή r, αντίστοιχα), τον προσδιορισμό του στατιστικώς σημαντικού όρου F για το κάθε μοντέλο, ή την αποτυχία της προσαρμογής μιας εξίσωσης όπως αυτή περιγράφεται από τον όρο έλλειψη προσαρμογής (lack of fit), τη σημαντικότητα των προσδιοριζόμενων κινητικών παραμέτρων και τα διαστήματα εμπιστοσύνης αυτών, τη διερεύνηση αν οι τιμές των εκτιμούμενων παραμέτρων έχουν νόημα και αν είναι ρεαλιστικές ή όχι, τη διασπορά των μετρήσεων, την ακολουθία κανονικής κατανομής από το σετ των δεδομένων που εξετάζονται, και φυσικά τον προσδιορισμό του σφάλματος προσαρμογής Αξιολόγηση και επιλογή των μαθηματικών μοντέλων Επακόλουθο της ανάπτυξης ενός μαθηματικού μοντέλου, κάνοντας χρήση των πειραματικών δεδομένων, είναι η αξιολόγησή του ως προς την αξιοπιστία του να περιγράφει τις παρατηρούμενες μεταβολές υπό πραγματικές συνθήκες (McMeekin και Ross, 1996b). Τυπικά, η διαδικασία της αξιολόγησης ενός μοντέλου περιλαμβάνει τη σύγκριση των προβλέψεων που δίνει το μοντέλο με ανάλογες παρατηρήσεις που δεν χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάπτυξη κατασκευή του μοντέλου, τα λεγόμενα ανεξάρτητα πειράματα (Brocklehurst, 2004). Αν και πολλά μοντέλα πρόβλεψης έχουν αναπτυχθεί σε πραγματικά τρόφιμα, η μεγάλη πλειοψηφία των μοντέλων προέρχεται από 57

92 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή πειράματα που διεξήχθησαν σε εργαστηριακά μέσα (κυρίως υγρά συστήματα ζωμών, broths). Σε κάθε περίπτωση πάντως, η διαδικασία ης αξιολόγησης πρέπει να γίνεται ιδανικά σε πραγματικά τρόφιμα ή διεργασίες επεξεργασίας τροφίμων. Ωστόσο κάποιες φορές και προκειμένου να μειωθεί το κόστος, η αξιολόγηση ενός μοντέλου μπορεί να διεξαχθεί σε μοντέλα συστήματα ή κάνοντας αναφορά σε αποτελέσματα που έχουν δημοσιευθεί στη βιβλιογραφία (Blackburn et al., 1997). Η τελευταία προσέγγιση έχει περιορισμένη εφαρμογή εξαιτίας ανεπαρκούς αριθμού ή ακατάλληλης φύσης δεδομένων. Ειδικά για την περίπτωση της μοντελοποίησης της συμπεριφοράς των μικροοργανισμών και δεδομένης της πολυπλοκότητας που παρουσιάζουν τα τρόφιμα, η ανάγκη αξιολόγησης των μοντέλων σε πραγματικά τρόφιμα κρίνεται επιτακτική (Koutsoumanis και Nychas, 2000). Η χρήση ορισμένων μοντέλων προϋποθέτει τη γνώση των ορίων επίδοσης ενός μοντέλου και την κατανόηση του εύρους της δυνατότητας εφαρμογής τους. Στην πράξη αυτό που ενδιαφέρει κάποιες φορές δεν είναι πόσο καλά ένα μοντέλο προσαρμόζεται στα πειραματικά δεδομένα, αλλά η ακρίβεια με την οποία αυτό μιμείται την απόκριση του μελετάται (Jones et al., 1994). Οι προβλέψεις των μοντέλων δεν ταυτίζονται ποτέ απόλυτα με τις παρατηρήσεις. Αυτό συμβαίνει γιατί κάθε βήμα της διαδικασίας ανάπτυξης ενός μοντέλου αποτελεί και μια πηγή σφάλματος που συμβάλλει στη συνολική απόκλιση από την αρτιότητα. Τα σφάλματα μπορεί να οφείλονται στη έλλειψη ομοιογένειας του τροφίμου, στην απλοποίηση στην οποία οδηγεί η υιοθέτηση ενός μοντέλου με τη συμμετοχή σ αυτό ενός μέρους των περιβαλλοντικών παραγόντων που ενδεχομένως επιδρούν στη μεταβολή μιας απόκρισης, στη χρήση εμπειρικών εξισώσεων με συνέπεια την κατά προσέγγιση περιγραφή του πραγματικού φαινομένου, στη χρήση πειραματικών δεδομένων χαμηλής ακρίβειας ή εξαιτίας δικής μας αδυναμίας να μετρήσουμε σωστά τη μεταβλητή απόκρισης, και τέλος στην υιοθέτηση διαφόρων αριθμητικών τεχνικών και διεργασιών κατά την προσαρμογή των μοντέλων (Ross et al., 1999). Η ποσοτικοποίηση των παρατηρούμενων αποκλίσεων μεταξύ των προβλέψεων του μοντέλου και των πραγματικών παρατηρήσεων είναι χρήσιμη, και πολλοί τρόποι έχουν προταθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό του σφάλματος στη διαδικασία της αξιολόγησης των μαθηματικών μοντέλων (Ross, 1996). Ο Ross (1996) πρότεινε τη χρήση απλών δεικτών που να χαρακτηρίζουν την επιτυχία ενός μοντέλου ως ένα στάδιο για τον αντικειμενικό ορισμό του όρου μοντέλο που έχει αξιολογηθεί. Οι δείκτες αυτοί είναι ενδεικτικοί α) της εμπιστοσύνης που συνοδεύει τη χρήση ενός μοντέλου (συντελεστής ακρίβειας, accuracy factor) και β) της μεροληψίας του μοντέλου όταν αυτό ρέπει προς την 58

93 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αναπαραγωγή προβλέψεων στην περιοχή μη ασφαλούς λειτουργίας (fail-dangerous). Ο τελευταίος δείκτης ονομάζεται συντελεστής μεροληψίας (bias factor). Ακολούθως, ως δείκτης ακρίβειας ορίζεται: ( log( GTpredicted / GTobserved ) / n) Accuracy factor = 10 (2.61) όπου GT predicted είναι ο προβλεπόμενος χρόνος γενεάς (generation time) και GT observed ο παρατηρούμενος χρόνος γενεάς, n ο αριθμός των παρατηρήσεων. Όσο λιγότερο ακριβείς είναι οι προβλέψεις του μοντέλου τόσο μεγαλύτερος είναι ο συντελεστής ακρίβειας. Ως συντελεστής μεροληψίας ορίζεται: ( ( log( GTpredicted / GTobserved )/ n) Bias factor = 10 (2.62) Όταν υπάρχει απόλυτη συμφωνία μεταξύ των προβλεπόμενων και παρατηρούμενων τιμών της παραμέτρου που εξετάζεται τότε ο συντελεστής μεροληψίας είναι ίσος με τη μονάδα, ενώ τιμές αυτού μεγαλύτερες της μονάδος υποδηλώνουν ότι το μοντέλο κάνει μη ασφαλείς προβλέψεις (fail-dangerous) αφού προβλέπει τιμές για το χρόνο γενεάς μεγαλύτερες από αυτές που πραγματικά παρατηρούνται. Οι ίδιοι συντελεστές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ομοίως και για άλλες παραμέτρους που σχετίζονται με το χρόνο όπως τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής και το ρυθμό ανάπτυξης των μικροοργανισμών. Αξίζει βέβαια να σημειωθεί πως στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται οι ρυθμοί ανάπτυξης για τον υπολογισμό του συντελεστή μεροληψίας, ένα μη ασφαλές μοντέλο χαρακτηρίζεται από τιμές μικρότερες της μονάδας για τον εν λόγω δείκτη (Brocklehurst, 2004). Η επιλογή ενός μοντέλου έναντι κάποιου άλλου είναι μια αρκετά δύσκολη διαδικασία. Η σύγκριση της ακρίβειας με την οποία περιγράφει κάθε μοντέλο τη μεταβλητή απόκρισης γίνεται με τεχνικές που χρησιμοποιούν στατιστικά εργαλεία όπως το t τεστ και F τεστ για τον προσδιορισμό των ορίων εμπιστοσύνης μιας κινητικής παραμέτρου και της απόκλισης από την έλλειψη προσαρμογής (lack of fit), αντίστοιχα. Συχνά αναφερόμενο στη βιβλιογραφία, ως μέτρο της καλής προσαρμογής ενός μοντέλου παλινδρόμησης, είναι ο συντελεστής προσδιορισμού R 2. Ουσιαστικά, πρόκειται για το κλάσμα αναλογία του αθροίσματος τετραγώνων που οφείλεται στην παλινδρόμηση διαιρεμένο με το συνολικό άθροισμα τετραγώνων της μεταβλητής που ορίζει την απόκριση γύρω από το μέσο όρο αυτής. Σύμφωνα με τον ορισμό αυτό, ο όρος R 2 δείχνει σε ποιο ποσοστό η συνολική διακύμανση της μεταβλητής που ορίζει την απόκριση, περιγράφεται από το μοντέλο παλινδρόμησης, δηλαδή από τους όρους που συμπεριλαμβάνονται και οι οποίοι έχουν εισαχθεί στο μοντέλο προκειμένου να βοηθήσουν στην ερμηνεία της διακύμανσης που παρατηρείται στη μεταβλητή απόκρισης. Η χρήση του μέτρου αυτού για 59

94 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή τις περιπτώσεις της μη γραμμικής παλινδρόμησης είναι ακατάλληλη και οδηγεί σε υπεραισιόδοξες απόψεις για την επιτυχή έκβαση κάποιας διαδικασίας μοντελοποίησης (Ratkowsky, 2004). Αντίθετα, το μέσο τετράγωνο των υπολοίπων (RMS, residual mean square, ή διαφορετικά το μέσο τετράγωνο του σφάλματος) και ακόμη καλύτερα η τετραγωνική ρίζα του μέσου τετραγώνου του σφάλματος (RMSE, root mean square error) αποτελεί μάλλον το πιο αξιόπιστο μέτρο για την εκτίμηση της καλής προσαρμογής των γραμμικών και μη γραμμικών μοντέλων παλινδρόμησης. Μπορεί να θεωρηθεί ως ο μέσος όρος της παρατηρούμενης ασυμφωνίας μεταξύ των παρατηρήσεων (δεδομένα μέτρησης) και των προβλέψεων του μοντέλου. Συνεπώς, το μέγεθος του RMS, ειδικά όταν κάποιος λαμβάνει υπόψη του και την ακρίβεια των αρχικών δεδομένων, είναι χρήσιμο στην εξέταση για το αν ένα μοντέλο περιγράφει ικανοποιητικά καλά τα πειραματικά δεδομένα (Ratkowsky, 2004). Αν μετά την εφαρμογή των κατάλληλων στατιστικών τεχνικών δύο συγκρινόμενα μοντέλα προσαρμόζονται εξίσου καλά στα πειραματικά δεδομένα, τότε η επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου γίνεται με άλλα κριτήρια, όπως για παράδειγμα η επιλογή του μοντέλου με τις λιγότερες παραμέτρους, η δυνατότητα ερμηνείας των εκτιμούμενων κινητικών παραμέτρων και η σωστή περιγραφή του σφάλματος. Η εξέταση των υπολοίπων (residuals) είναι ένα σημαντικό συστατικό για την αξιολόγηση των μοντέλων παλινδρόμησης, επιτρέποντας στο χρήστη να εξετάσει αν ένα μοντέλο προσαρμόζεται ικανοποιητικά στα δεδομένα. Ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ μιας παρατήρησης και της αντίστοιχης προβλεπόμενης ή προσαρμοζόμενης τιμής. Οι τεχνικές που συνήθως χρησιμοποιούνται για την εξέταση των υπολοίπων περιλαμβάνουν τη απεικόνιση καμπυλών των υπολοίπων ως συνάρτηση των προβλεπόμενων τιμών, καμπύλες κανονικής κατανομής κλπ. Εφαρμόζοντας τις μεθόδους αυτές είναι δυνατή η διερεύνηση των εγγενών υποθέσεων που συνήθως γίνονται κατά την εφαρμογή της ανάλυσης παλινδρόμησης, όπως είναι η ύπαρξη κανονικότητας των υπολοίπων και η ισότητα στη διακύμανση του σφάλματος. Ειδικότερα είναι δυνατή η άμεση ανίχνευση των απόμακρων παρατηρήσεων (outliers), πολλές από τις οποίες πιθανώς οφείλονται σε σφάλματα κατά την εισαγωγή των δεδομένων (Ratkowsky, 2004). 2.5 Ποιοτική υποβάθμιση των τροφίμων σε μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης ή επεξεργασίας Όπως έχει ήδη αναφερθεί η ποσοτική μικροβιολογία στοχεύει στην ποσοτικοποίηση 60

95 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση της ανάπτυξης της μικροβιακής χλωρίδας των τροφίμων μέσω των μαθηματικών μοντέλων που χρησιμοποιεί. Τα μοντέλα που ήδη έχουν περιγραφεί μπορούν να εφαρμοστούν στην πρόβλεψη της μικροβιολογικής ασφάλειας (παθογόνα) και την εκτίμηση της διάρκειας ζωής των προϊόντων (αλλοιογόνος χλωρίδα), στην ανάπτυξη και ενίσχυση των συστημάτων διασφάλισης της ποιότητας στη βιομηχανία τροφίμων και τη θέσπιση των βασικών αρχών σε μελέτες σχετικές με την ανάλυση επικινδυνότητας (Whiting και Buchanan, 1994). Αν και οι δοκιμές πρόκλησης τείνουν να αποτελέσουν τη συνήθη πρακτική που ακολουθείται από τη βιομηχανία τροφίμων, η πληροφόρηση σχετικά με τη μικροβιακή κινητική των τροφίμων, εδραιώνεται ολοένα και περισσότερο μέσω των μαθηματικών μοντέλων, μειώνοντας κατά πολύ τον απαιτούμενο αριθμό των δοκιμών πρόκλησης, όπως συμβαίνει για παράδειγμα κατά τον προσδιορισμό της διάρκειας ζωής των προϊόντων. Σε συνδυασμό με τα μοντέλα πρόβλεψης που αφορούν τη μεταφορά θερμότητας και άλλες μεταβλητές που συμμετέχουν σε διάφορες διεργασίες και το αρχικό επίπεδο επιμόλυνσης, τα μοντέλα αυτά αποτελούν σημαντικούς πυλώνες σε μελέτες προσομοίωσης και εξοικονόμησης χρόνου, στοχεύοντας στη βελτιστοποίηση και στον αρτιότερο σχεδιασμό διαφόρων διεργασιών επεξεργασίας, καθώς και των συνθηκών διανομής και αποθήκευσης των προϊόντων (π.χ. σε μεταβαλλόμενα διαστήματα θερμοκρασίας χρόνου) που επηρεάζουν σημαντικά την ασφάλεια και την αλλοίωση των τροφίμων (Bernaerts et al., 2004). Τα πρωτογενή και δευτερογενή μοντέλα που περιγράφηκαν εκφράζουν τις μεταβολές μιας απόκρισης ως συνάρτηση του χρόνου και τις περιβαλλοντικές επιδράσεις στις παραμέτρους των πρωτογενών μοντέλων, αντίστοιχα, σε σταθερές συνθήκες συντήρησης επεξεργασίας. Ωστόσο, οι πραγματικές συνθήκες που επικρατούν κατά τη συντήρηση των τροφίμων πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιχειρούμενη μοντελοποίηση. Η θερμοκρασιακή κακομεταχείριση των προϊόντων που συμβαίνει στις έντονα κυμαινόμενες θερμοκρασίες συντήρησης, είναι ο σημαντικότερος παράγοντας των τροφογενών επιδημιών και ασθενειών, χωρίς να είναι απόλυτα γνωστή η έκταση στην οποία οι θερμοκρασιακές διακυμάνσεις επηρεάζουν τη διάρκεια ζωής. Στη βιβλιογραφία, λίγα είναι τα δεδομένα που αφορούν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας στην αλυσίδα διανομής των ευπαθών τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη, κατά τη φόρτωση και εκφόρτωση των προϊόντων, την έκθεσή τους στα σημεία λιανικής πώλησης, τη μεταφορά τους από τα σημεία πώλησης στο σπίτι και τη συντήρησή τους στα οικιακά ψυγεία. Ιδιαίτερα μεγάλου κόστους και σχετικά μη πρακτική κρίνεται η διεξαγωγή μικροβιολογικών δοκιμών αλλοίωσης για όλα τα πιθανά σενάρια θερμοκρασιακής έκθεσης. Καλύτερη προσέγγιση αποτελεί η διενέργεια περιορισμένου αριθμού πειραματικών 61

96 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή δοκιμών σε σταθερές θερμοκρασιακές συνθήκες με στόχο τη δημιουργία μιας επιφάνειας απόκρισης για το ρυθμό ανάπτυξης κι έπειτα τη χρήση τεχνικών που εφαρμόζουν διάφορα μαθηματικά μοντέλα για την εκτίμηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης για ένα δεδομένο χρονο-θερμοκρασιακό ιστορικό. Στην περίπτωση αυτή μπορεί να παραχθεί σημαντικό λάθος αν υπάρχει προηγούμενο χρονο-θερμοκρασιακό ιστορικό που επιδρά στην ανάπτυξη. Η επίδραση του ιστορικού έγκειται στο ότι ο μετρούμενος πραγματικός ρυθμός ανάπτυξης μετά από μια μεταβολή της θερμοκρασίας διαφέρει σημαντικά από αυτόν που προβλέπει το μοντέλο χρησιμοποιώντας μια βάση δεδομένων και πειραματικά δεδομένα που έχουν ληφθεί στην ίδια θερμοκρασία. Μια άλλη παράμετρος που πρέπει να προσμετρηθεί είναι η πιθανή διαφορετική θερμοκρασιακά εξαρτώμενη συμπεριφορά διαφορετικών στελεχών του ίδιου βακτηριακού είδους καθώς και τα διαφορετικά ανταγωνιστικά είδη κατά την έκθεση σε ένα μεταβαλλόμενο προφίλ θερμοκρασιών, όπως και οι επιδράσεις αυτών των θερμοκρασιακών μεταβολών στα λοιπά εμπόδια που ενδεχομένως υπάρχουν στο ίδιο σύστημα τροφίμου. Επιπλέον, μελέτες σε διαφορετικά επίπεδα ενεργότητας νερού, οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα είναι απαραίτητες για τον προσδιορισμό των μεμονωμένων ή/και συνδυασμένων δράσεων αυτών των παραγόντων στο ρυθμό ανάπτυξης (Labuza και Fu, 1993). Δυναμικά πρωτογενή μοντέλα ικανά i) να περιγράψουν τις πραγματικές μεταβαλλόμενες κατά την πάροδο του χρόνου συνθήκες και ii) να συμπεριλάβουν το προηγούμενο ιστορικό του προϊόντος τροφίμου, έκαναν την πρώτη εμφάνισή τους στις αρχές της δεκαετίας του 90 (Baranyi et al., 1993, Van Impe et al., 1992). Στις επόμενες σελίδες θα περιγραφεί η επικρατούσα κατάσταση στην αλυσίδα διανομής των προϊόντων τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη βάσει των περιορισμένων στοιχείων που έχουν καταγραφεί στη βιβλιογραφία και η ανάγκη χρήσης των μαθηματικών μοντέλων στις μελέτες μικροβιακής ανάπτυξης υπό μεταβαλλόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες Θερμοκρασιακές συνθήκες στην ψυκτική αλυσίδα διανομής των τροφίμων Η ασφάλεια και ποιότητα των τροφίμων εξαρτώνται από το είδος των συστατικών τους και τον έλεγχο των συνθηκών που επικρατούν κατά την επεξεργασία και διανομή. Από τα τέλη της δεκαετίας του 80, υπήρξε σημαντική αύξηση των νομοθετικών ρυθμίσεων παγκοσμίως που όριζαν τις μέγιστες θερμοκρασίες κατά την παραγωγή, διακίνηση και τη λιανική πώληση των συντηρούμενων υπό ψύξη προϊόντων (James et al., 2008). Οι παραγωγείς τροφίμων είναι αυτοί που φέρουν την ευθύνη της άριστης ποιότητας και της 62

97 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση ασφάλειας των προϊόντων τους ακόμα κι αν δεν έχουν τη δυνατότητα να ελέγχουν πλήρως την αλυσίδα διανομής (Fu και Labuza, 1992). Ωστόσο, συχνά αναφέρεται ότι η έκθεση των προϊόντων σε καταστήματα λιανικής πώλησης αποτελεί τον ασθενέστερο κρίκο στην ψυκτική αλυσίδα διανομής του φρέσκου κρέατος που συντηρείται υπό ψύξη (James, 1996). Επιπλέον, από τη στιγμή που ο καταναλωτής αγοράσει το προϊόν, το τρόφιμο παύει να υπόκειται στις απαιτήσεις των προαναφερόμενων κανονισμών. Μόλις το τρόφιμο απομακρυνθεί από το ράφι του καταστήματος, βρίσκεται σε περιβάλλον εκτός ψυγείου για το διάστημα μέχρι ο καταναλωτής να ολοκληρώσει τις αγορές του καθώς και κατά τη μεταφορά του στο σπίτι για την περαιτέρω συντήρησή του εκεί (James et al., 2008). Σημαντικό ενδιαφέρον έχει υπάρξει τα τελευταία χρόνια για το ρόλο που διαδραματίζει ο ανεπαρκής έλεγχος της θερμοκρασίας και ο οικιακός χειρισμός των τροφίμων από τον καταναλωτή, στη συχνότητα εμφάνισης διαφόρων περιστατικών τροφογενών δηλητηριάσεων. Πολλές μελέτες έχουν δείξει πως οι θερμοκρασίες των υπό ψύξη προϊόντων δεν έχουν μεταβληθεί για πολλά χρόνια υποδηλώνοντας πως οι πρωτοβουλίες που λήφθηκαν τόσο από τη βιομηχανία όσο και κατά τη θέσπιση των νομοθετικών κανονισμών, με στόχο τη μείωση της θερμοκρασίας συντήρησης των προϊόντων αυτών, έχουν αποδειχτεί αναποτελεσματικές (Greer et al., 1994). Συνεπώς, το σύστημα διανομής των προϊόντων που συντηρούνται υπό ψύξη παρουσιάζει σημαντικές αποκλίσεις από τις απαιτήσεις για τη διατήρηση της ασφάλειας και ποιότητας, συντελώντας σε μεγάλες απώλειες των προϊόντων και πολλές επιστροφές των ευπαθών τροφίμων. Για παράδειγμα το Διεθνές Ινστιτούτο Ψύξης (International Institute of Refrigeration, IIR) αναφέρει πως 300 εκατομμύρια τόνοι προϊόντων απορρίπτονται ετησίως σε παγκόσμιο επίπεδο, εξαιτίας της ανεπαρκούς ψύξης. Το πρόβλημα δεν εντοπίζεται μόνο στις αναπτυσσόμενες χώρες, αφού στις Η.Π.Α. οι απώλειες των αλλοιωμένων προϊόντων για τη βιομηχανία τροφίμων ανέρχονται ετησίως σε 35 δισεκατομμύρια δολάρια, ενώ κάθε οικογένεια απορρίπτει κατά προσέγγιση τραυματισμένα φρούτα, αλλοιωμένο κρέας και άλλα ευπαθή τρόφιμα αξίας 380 δολαρίων, κατά μέσο όρο (IIR, 2008). Το μέγεθος των απωλειών είναι μεγάλο, δεδομένου ότι παγκοσμίως χρησιμοποιούνται 1 εκατομμύριο οχήματα με σύστημα ψύξης καθώς και ψυχόμενα containers, ενώ η λιανική αξία των μεταφερόμενων προϊόντων τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη ανέρχεται σε δισεκατομμύρια δολάρια (Gac, 2002). Μια παλαιότερη σχετικά μελέτη που έλαβε χώρα στη Γερμανία και είχε ως στόχο την πρακτική εφαρμογή της παρακολούθησης της ψυκτικής αλυσίδας, κατέληξε στη διαπίστωση ότι η θερμοκρασιακή κακομεταχείριση των ψυγμένων τροφίμων αποτελεί μια 63

98 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή πραγματικότητα (Tolstoy, 1991). Πιο συγκεκριμένα, η παρακολούθηση της θερμοκρασίας ψυγμένων προϊόντων, στις εξόδους φρέσκων τροφίμων ενός λιμανιού συμπεριλήφθηκε στο σύστημα διασφάλισης της ποιότητας μιας αλυσίδας λιανικού εμπορίου για χρονικό διάστημα δεκατεσσάρων (14) μηνών. Κάθε παρτίδα προϊόντων που έφτανε στο λιμάνι ελέγχονταν κατά την άφιξή της και απορρίπτονταν αν η θερμοκρασία ξεπερνούσε το νόμιμο όριο των 7 ή 5 C, ανάλογα με το προϊόν. Οι παρτίδες που απορρίφθηκαν αφορούσαν επεξεργασμένο κρέας και ήταν περισσότερες τους θερινούς μήνες εξαιτίας της υψηλότερης εξωτερικής θερμοκρασίας. Ωστόσο, κατά τη δεύτερη καλοκαιρινή περίοδο οι απορριπτόμενες παρτίδες ήταν λιγότερες, υποδηλώνοντας αυξημένη προσπάθεια των προμηθευτών να αντιμετωπίσουν τη δυσμενή κατάσταση των υψηλών θερμοκρασιών που παρατηρείται το καλοκαίρι. Η συστηματική απόρριψη των προϊόντων που ξεπέρασαν τα προκαθορισμένα όρια θερμοκρασίας, προκάλεσε μεταγενέστερα τη σημαντική μείωση του αριθμού των παρτίδων που παραβίαζαν το θερμοκρασιακό όριο. Η έρευνα καταλήγει στην ανάγκη για αυστηρότερη τήρηση των προβλεπόμενων συνθηκών στην ψυκτική αλυσίδα, όπως και στην παραδοχή ότι οι διακυμάνσεις των θερμοκρασιών διανομής μπορούν να βελτιωθούν απλώς καταγράφοντας συστηματικά τη θερμοκρασία σε κάθε στάδιο της ψυκτικής αλυσίδας. Σε μια εκτεταμένη μελέτη ανασκόπησης από τον James (1999) συνοψίστηκαν τα αποτελέσματα ενός πολυετούς προγράμματος διάρκειας 32 χρόνων στο Langford του Ην. Βασιλείου πάνω σε πειραματικές και θεωρητικές μελέτες στις θεματικές ενότητες της πρωτογενούς ψύξης, απόψυξης, κατάψυξης, δευτερογενούς ψύξης, συντήρησης μεταφοράς και έκθεσης των προϊόντων, καθώς και του οικιακού χειρισμού, μαγειρέματος και παστερίωσης των τροφίμων. Η πρωτογενής ψύξη αμέσως μετά τη συγκομιδή των φυτικών προϊόντων ή τη σφαγή των ζώων εφαρμόζεται συνήθως σε μεγάλα μεμονωμένα τεμάχια ή μικρότερα τεμάχια που ψύχονται σε ογκώδεις ποσότητες. Μεγάλη είναι η επίδραση που ασκείται στην εν λόγω διεργασία από τις εφαρμοζόμενες θερμοκρασίες ψύξης και την ταχύτητα του αέρα ως ψυκτικού μέσου. Η άμεση και ταχεία ψύξη μετά τη σφαγή φαίνεται να επηρεάζει έντονα τη σκληρότητα του κόκκινου κρέατος, η οποία δεν επανέρχεται με καμιά από τις ακόλουθες διεργασίες επεξεργασίας (James, 1999). Σημαντικό μέλημα της βιομηχανίας είναι επίσης και οι παρατηρούμενες απώλειες βάρους στα τεμάχια κρέατος. Όμοια, απώλειες νερού παρατηρούνται και στα λαχανικά λόγω εξάτμισης μειώνοντας τη διάρκεια ζωής τους (James, 2003). Τα λαχανικά ψύχονται με ποικίλους τρόπους. Ένα συμβατικό σύστημα ψύξης αποτελεί η διοχέτευση ψυχρού αέρα σε μεγάλα κιβώτια με λαχανικά, με παράλληλη 64

99 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση χρήση ενός συστήματος διύγρανσης του αέρα. Επίσης, τα λαχανικά μπορούν να ψυχθούν με τρεχούμενο νερό, μέθοδος που εκμηδενίζει τις παρατηρούμενες απώλειες λόγω εξάτμισης του νερού. Τα φυλλώδη λαχανικά μπορούν ψυχθούν και υπό κενό (James, 2003). Η δευτερογενής ψύξη αναφέρεται στην ψύξη των προϊόντων τροφίμων που έχουν προηγουμένως υποστεί κάποια θερμική επεξεργασία όπως το μαγείρεμα, η παστερίωση κλπ. προκειμένου να αποφευχθεί η ανάπτυξη των μικροοργανισμών που επιβιώνουν και η εκβλάστηση των σπορίων. Στην περίπτωση αυτή απαιτούνται υψηλοί ρυθμοί ψύξης που επιτυγχάνονται με διοχέτευση κινούμενου ψυχρού αέρα, βύθιση των προϊόντων σε νερό 0 C και η ψύξη υπό κενό. Γενικά, μετά την αρχική ψύξη των προϊόντων τροφίμων και καθώς τα προϊόντα διακινούνται στην ψυκτική αλυσίδα, είναι δύσκολος ο έλεγχος και η διατήρηση της θερμοκρασίας τους. Τα πακέτα μεγάλου όγκου που συντηρούνται σε μεγάλες αποθήκες είναι λιγότερο ευαίσθητα σε μικρές ποσότητες θερμότητας που μπορεί να φτάσουν στο χώρο συντήρησης σε σύγκριση με τα μεμονωμένα πακέτα λιανικής που προορίζονται για τους καταναλωτές ή τις μικρές συσκευασίες στις βιτρίνες έκθεσης αυτών των προϊόντων. Στην περίπτωση που η πρωτογενής και δευτερογενής ψύξη διενεργήθηκαν σωστά, τα προϊόντα θα φτάσουν στην ενδεδειγμένη θερμοκρασία συντήρησης πριν την τοποθέτησή τους στην αποθήκη, οπότε το σύστημα ψύξης συντελεί μόνο στην απομάκρυνση της εξωτερικής θερμότητας που διαπερνά τους τοίχους ή τις πόρτες κατά το άνοιγμά τους. Η επαρκής ψύξη είναι επίσης απαραίτητη και πριν την έναρξη της μεταφοράς των προϊόντων. Η θερμοκρασία που σημειώθηκε στο εσωτερικό τεμαχίων βοδινών πλευρών (τεταρτημορίων) τη στιγμή της φόρτωσής τους στα μεταφορικά μέσα τριών εργοστασίων στις Η.Π.Α. ήταν μεταξύ 6 και 18 C (James, 2003). Σε βαγόνια τρένου η επιφανειακή θερμοκρασία μειώθηκε τις πρώτες 24 ώρες και ακολούθως παρέμεινε σταθερή στους 0 ± 1 C. Στα μεταφορικά φορτηγά οχήματα η επιφανειακή θερμοκρασία βρέθηκε να μειώνεται συνεχώς κατά τη διάρκεια του ταξιδιού χωρίς να φτάνει ποτέ σε κάποια σταθερή ελάχιστη τιμή ούτε ακόμα και κατά την εκφόρτωση. Κατά τη μεταφορά μεγάλου όγκου συσκευασιών η προκαλούμενη αύξηση της θερμοκρασίας είναι μικρή και το σύστημα ψύξης του οχήματος επαναφέρει γρήγορα το προϊόν στην απαιτούμενη θερμοκρασία. Μεγαλύτερα είναι τα προβλήματα κατά τη διανομή των προϊόντων σε μεμονωμένα καταστήματα λιανικής πώλησης. Η διατήρηση της θερμοκρασίας στα οχήματα, όταν αυτά διενεργούν πολλαπλές φορτοεκφορτώσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας, είναι δύσκολη αφού στα οχήματα ενυπάρχουν πολλά διαφορετικά προϊόντα σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Κάθε προϊόν υπό ψύξη μπορεί να υποστεί μέχρι και 50 65

100 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ανοίγματα πόρτας κατά τη διάρκεια μιας και μόνο διανομής, γεγονός που προκαλεί είσοδο θερμότητας από το εξωτερικό περιβάλλον ή κατά την κίνηση του προσωπικού μέσα στο φορτηγό για την επιλογή και μετακίνηση των προϊόντων. Συνεπώς, το σύστημα ψύξης πρέπει να επιτρέπει εκτεταμένες διαφοροποιήσεις στη διανομή του φορτίου, ενώ πολλές φορές η ικανότητα του συστήματος να ανταποκριθεί στις έκτακτες ανάγκες για ψύξη συχνά παρεμποδίζεται από τη διαθέσιμη ισχύ του οχήματος (James, 1999, 2003). Η διάρκεια ζωής των υπό ψύξη συσκευασμένων προϊόντων κρέατος, ψαριών λαχανικών και επεξεργασμένων τροφίμων στα ψυγεία-βιτρίνες των καταστημάτων λιανικής πώλησης ποικίλει από μερικές μέρες ως πολλές εβδομάδες και περιορίζεται κατά κύριο λόγο από τους μικροβιολογικούς κινδύνους. Ο έλεγχος της κίνησης του αέρα στα ψυγεία των καταστημάτων λιανικής πώλησης και η αλληλεπίδραση μεταξύ του υπό ψύξη σε αυτά αέρα και του περιβάλλοντος χώρου μέσα στο κατάστημα αποτελεί πάντα ένα κρίσιμο παράγοντα στην αποτελεσματικότητα λειτουργίας μιας τέτοιας συσκευής. Ο σχεδιασμός και η θέση των ραφιών επηρεάζουν δραστικά τη διοχέτευση του ψυχρού αέρα μέσα στο κατάστημα. Σε ότι αφορά τις θερμοκρασιακές συνθήκες που επικρατούν στη λιανική αγορά των προϊόντων τροφίμων, η μελέτη που διεξήχθη από τους Gill et al. (2002) σχετικά με τη θερμοκρασία 1703 συσκευασιών βοδινού κρέατος σε 41 καταστήματα του Καναδά είχε σχετικά ενθαρρυντικά αποτελέσματα όσον αφορά στις συνθήκες που επικρατούν στο στάδιο λιανικής πώλησης της ψυκτικής αλυσίδας. Η θερμοκρασία μετρούνταν τρεις φορές την ημέρα, 1 ώρα μετά το άνοιγμα, το μεσημέρι 12:00-14:00, και 1 ώρα πριν το κλείσιμο του καταστήματος σε προκαθορισμένα σημεία. Η διάμεσος θερμοκρασία στην επιφάνεια των πακέτων των συσκευασιών βοδινού ήταν μικρότερη των 4 C, μεταξύ 4 και 12 C, και μεγαλύτερη των 7 C σε 3, 18 και 20 καταστήματα, αντίστοιχα. Οι θερμοκρασίες εμφανίστηκαν χαμηλότερες στο πίσω μέρος σε σύγκριση με το μπροστινό μέρος των βιτρινών, όπως και στα κάτω ράφια συγκριτικά με τα ενδιάμεσα και πάνω ράφια. Ωστόσο, οι θερμοκρασίες των πακέτων δε βρέθηκαν να μεταβάλλονται κατά μήκος του ραφιού της βιτρίνας ούτε κατά τη διάρκεια της ημέρας, το οποίο ήταν μη αναμενόμενο καθώς θα περίμενε κανείς ότι κατά τη φάση απόψυξης της συσκευής η θερμοκρασία θα αυξάνονταν. Επιπλέον, οι θερμοκρασίες των συσκευασιών που μόλις είχαν φτάσει στο κατάστημα (1 ημέρας) ήταν μεγαλύτερες από αυτές των παλιότερων πακέτων, γεγονός που δείχνει πως τα προϊόντα ψύχονταν ολοένα και περισσότερο κατά την παραμονή τους στο κατάστημα, αντικρούοντας την άποψη πως η συντήρηση των υπό ψύξη προϊόντων στα καταστήματα λιανικής πώλησης είναι ο πιο αδύναμος κρίκος της ψυκτικής αλυσίδας. Προφανώς η 66

101 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση τελευταία παρατήρηση αντανακλά στο φαινόμενο της θέρμανσης που παρατηρείται κατά την προετοιμασία των συσκευασιών λιανικής πώλησης στους χώρους τεμαχισμού του κρέατος (Gill et al., 2002). Στη μελέτη αυτή το 40% των προϊόντων βρέθηκε σε θερμοκρασίες μικρότερες των 4 C, ένα ποσοστό μικρότερο από το 5% σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 7 C, και η μέση παρατηρούμενη θερμοκρασία ήταν 3.5 C. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε αντιπαράθεση με παλαιότερες μελέτες όπου το 50% ή και περισσότερα προϊόντα βρίσκονταν σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 4 C και 10% αυτών σε θερμοκρασίες πάνω από 7 C (Bogh-Sorensen, 1980). Σε ότι αφορά την ελληνική ψυκτική αλυσίδα, μια μελέτη που έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων του Α.Π.Θ. έδειξε ότι στο 60% του συνόλου των ψυγείων λιανικής πώλησης που εξετάστηκαν η θερμοκρασία ήταν μικρότερη των 6 C, στο 30% μεταξύ 6 ως 10 C, και στο 10% μεταξύ C (Ξανθιάκος, 2006). Τέλος, αναλύοντας την κατάσταση που επικρατεί κατά το χειρισμό των υπό ψύξη τροφίμων από τους καταναλωτές και τη συντήρησή τους στα οικιακά ψυγεία, μια μελέτη των James και Evans (1992) έδειξε πως η θερμοκρασία 19 δειγμάτων διαφορετικού τύπου προϊόντων που αγοράστηκαν από ένα μεγάλο κατάστημα λιανικής πώλησης μέχρι αυτά να φτάσουν στο αυτοκίνητο κυμάνθηκε από 4-20 C, με τη μεγαλύτερη θερμοκρασία να σημειώνεται σε προϊόντα τεμαχισμένα σε φέτες. Τα μισά από τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε κουτί πάγου, κατά τη μεταφορά τους στο ταξίδι επιστροφής των καταναλωτών στο σπίτι διάρκειας μίας ώρας. Η θερμοκρασία ορισμένων δειγμάτων που βρίσκονταν στο χώρο αποσκευών του αυτοκινήτου (port baggage) πλησίασε τους 40 C κατά τη διάρκεια του ταξιδιού, ενώ αυτή των προϊόντων που τοποθετήθηκαν στα προστατευτικά κουτιά με πάγο διατηρήθηκε ίδια με την αρχική θερμοκρασία στη βιτρίνα του ψυγείου λιανικής πώλησης. Γενικώς, μετά το ταξίδι, τα προϊόντα χρειάστηκαν περίπου 5 ώρες στο οικιακό ψυγείο μέχρι να φτάσουν σε θερμοκρασία μικρότερη των 7 C. Στο εύρος των 252 οικιακών ψυγείων που εξετάστηκαν η μέγιστη και ελάχιστη θερμοκρασία που σημειώθηκαν ήταν 11.4 C και -0.9 C, αντίστοιχα, ενώ η συνολική μέση θερμοκρασία όλων των ψυγείων ήταν 6.4 C. Στο 68.9 % των ψυγείων το θερμότερο σημείο ήταν το πάνω ράφι και στο 45.1 % το ψυχρότερο σημείο βρέθηκε να είναι το μεσαίο ράφι. Η ανάλυση της παραλλακτικότητας για τη μέση θερμοκρασία όλων των ψυγείων ανέδειξε πως δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ αυτής και της θερμοκρασίας στο μεσαίο και κάτω ράφι, ενώ η θερμοκρασία στο πάνω ράφι βρέθηκε σταθερά σημαντικά μεγαλύτερη από τα υπόλοιπα σημεία του ψυγείου. Επίσης, στο μεγαλύτερο ποσοστό των ψυγείων (86.9%) η διαφορά μεταξύ της μέσης παρατηρούμενης μέγιστης και ελάχιστης θερμοκρασίας ήταν μικρότερη 67

102 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή των 5 C, ενώ το μεγαλύτερο εύρος που σημειώθηκε ήταν 12 C. Ωστόσο, σε μεμονωμένες περιπτώσεις το ελάχιστο εύρος μεταξύ της μέγιστης και ελάχιστης θερμοκρασία καθενός ψυγείου χωριστά βρέθηκε 4.5 C, ενώ το μέγιστο εύρος 30.5 C, διαφορά που μπορεί να ήταν ακόμα μεγαλύτερη αν οι θερμοκρασίες που καταγράφονταν δεν ομαδοποιούνταν ως προς το μέσο όρο τους ανά 5 λεπτά. Αντίστοιχα, σε μια μελέτη ανασκόπησης της αποδοτικότητας των οικιακών ψυγείων στην οποία συνοψίζονται τα δημοσιευμένα δεδομένα σε παγκόσμιο επίπεδο για τα τελευταία 30 χρόνια, αποδεικνύεται πως παρά τις επανειλημμένες συστάσεις, η στάση των καταναλωτών ως προς το χειρισμό των τροφίμων είναι παρόμοια σε όλο τον κόσμο και ότι η επικρατούσα κατάσταση στα οικιακά ψυγεία δεν έχει μεταβληθεί ιδιαίτερα για το μεγάλο αυτό χρονικό διάστημα (James et al., 2008). Στον Πίνακα 2.1 παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα διαφόρων μελετών σχετικά με την καταμέτρηση της θερμοκρασίας σε οικιακά ψυγεία, όπως συνοψίστηκαν στη βιβλιογραφική ανασκόπηση των James et al. (2008). Όμοια, για τα ελληνικά οικιακά ψυγεία, η μελέτη που διεξήχθη από το εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων του Α.Π.Θ. εμφάνισε σημαντικές διαφοροποιήσεις της θερμοκρασίας από ράφι σε ράφι που σε κάποιες περιπτώσεις έφτασε τους 8 C (Ξανθιάκος, 2006). Σημαντικό ποσοστό των ψυγείων που εξετάστηκαν, συγκεκριμένα 18, 7, 14 και 30 % αυτών, εμφάνισαν μέση θερμοκρασία συντήρησης μεγαλύτερη των 10 C στο επάνω, μεσαίο, κάτω ράφι και το ράφι πόρτας, αντίστοιχα. Οι μέσες τιμές θερμοκρασίας που σημειώθηκαν στα παραπάνω σημεία καταγραφής των ελληνικών οικιακών ψυγείων ήταν αντίστοιχα 7.6, 6.3, 6.7, και 8.4 C, ενώ ιδιαίτερα υψηλές ήταν οι τιμές των μέγιστων παρατηρούμενων θερμοκρασιών (14.3, 13, 18, και 15 C, αντίστοιχα). Συνολικά, η μέση θερμοκρασία στο ράφι της πόρτας των ψυγείων ήταν στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή στα υπόλοιπα ράφια του ψυγείου και ακολούθως η μέση θερμοκρασία στο επάνω ράφι ήταν σημαντικά ψηλότερη από αυτή του μεσαίου ραφιού, ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις τιμές της θερμοκρασίας μεταξύ του μεσαίου και κάτω ραφιού του ψυγείου (Ξανθιάκος, 2006). Συνεπώς είναι ολοφάνερο πως πολλά από τα οικιακά ψυγεία σε διάφορα μέρη ανά τον κόσμο λειτουργούν σε υψηλότερες από τις προτεινόμενες θερμοκρασίες και άρα, η συντήρηση των υπό ψύξη προϊόντων τροφίμων σ αυτά, αποτελεί τον πιο αδύναμο κρίκο στην ψυκτική αλυσίδα, αποτελώντας πολλές φορές τη βασική αιτία για τις τροφογενείς δηλητηριάσεις που σημειώνονται τακτικά. 68

103 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Πίνακας 2.1. Θερμοκρασίες των οικιακών ψυγείων όπως μετρήθηκαν σε διάφορες μελέτες. Βιβλιογραφική αναφορά Χώρα n δ Τρόπος μέτρησης Τ min Τ mean Τ max % ψυγείων στο αντίστοιχο εύρος θερμοκρασιών Van Garde και ΗΠΑ - Άγνωστος 21% 10 C Woodburne (1987) Rose et al. (1990) Ην. Βασίλειο 75 Άγνωστος < % > 5 C Evans et al. (1991) Ην. Βασίλειο 252 Ψηφιακό καταγραφικό 3 επ.(π, Μ, Κ) % > 5 C Flynn et al. (1992) Β. Ιρλανδία 150 Θερμόμετρο % > 5 C 3.επ. (Π, Μ, Κ) Victoria (1993) α Γαλλία 102 Θερμόμετρο 14 70% > 6 C 3 επ. (Π, Μ, Κ) Lezenne Coulander de (1994) β Ολλανδία 125 Θερμόμετρο 30% < 5 C, 42% 5-7 C, 26% 7-9 C, 2% > 9 C O Brien (1997) Ν. Ζηλανδία 50 Θερμόμετρο % > 4 C 2.επ. (Π, Κ) Sergelidis et Ελλάδα 136 Θερμόμετρο 50% > 9 C al. (1997) Worsfold και Griffith (1997) Ην. Βασίλειο 108 Ψηφιακό καταγραφικό % > 5 C 1 επ. Daniels (1998) ΗΠΑ 106 Άγνωστος 69% > 9 C Johnson et al. (1998) Ην. Βασίλειο 645 Θερμόμετρο % > 5 C Laguerre et al. Γαλλία 119 Ψηφιακό % > 5 C (2002) καταγραφικό 3 επ.(π, Μ, Κ) Ghebrehewet και Ην. Βασίλειο 901 Άγνωστος 69.3% 0-4 C, Stevenson (2003) 27.9% 5-9 C, 2.8% > 10 C ARS (2004) γ Ν. Ζηλανδία 53 Άγνωστος 33% >5 C Bakalis et al. (2003) Ελλάδα 110 Ψηφιακό καταγραφικό 3 επ.(π, Μ, Κ) Kennedy et al. (2005) Ιρλανδία 100 Ψηφιακό καταγραφικό 1 επ.(μ) Πορτογαλία 86 Ψηφιακό θερμόμετρο Azevedo et al. (2005) Taoukis et al. (2005) Ελλάδα 250 Ψηφιακό καταγραφικό Terpstra et al. (2005) Ολλανδία 31 Γυάλινο θερμόμετρο Breen et al. (2006) Ην. Βασίλειο 24 Γυάλινο θερμόμετρο σε πηκτή 26% < 4 C, 28% 4-6 C, 23% 6-8 C, 15% 8-10 C, 8% C % >5 C 70% > 6 C % > 6 C, 10% > 10 C % > 7 C % > 5 C α Αναφερόμενο από τους Laguerre et al. (2002), β αναφερόμενο από τους Notermans et al. (1997), γ αναφερόμενο από τον Anon (2007), δ n: αριθμός παρατηρούμενων συσκευών. Πηγή: James et al., 2008 Εμφανίζεται λοιπόν επιτακτική ανάγκη για βελτίωση των θερμοκρασιακών συνθηκών συντήρησης ή ακόμη η εύρεση τεχνικών και μεθόδων συνεχούς παρακολούθησης και 69

104 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή καταγραφής του θερμοκρασιακού ιστορικού κατά την πορεία διανομής των τροφίμων, ξεκινώντας από τα σημεία παραγωγής και φτάνοντας ως τα οικιακά ψυγεία των καταναλωτών. Μια τέτοια προσέγγιση θα επέτρεπε την παρακολούθηση της συνολικής ποιότητας των προϊόντων και κατά συνέπεια της εναπομένουσας διάρκειας ζωής αυτών αλλά και τον έλεγχο του συστήματος διανομής των προϊόντων με στόχο τη βελτιστοποίηση της ποιότητάς τους μέχρι το τελικό στάδιο της διαδρομής τους στον καταναλωτή (Wells και Singh, 1989) Πρόβλεψη της ποιότητας σε μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης Η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον τομέα της Ποσοτικής μικροβιολογίας έχει επιτρέψει την αποτελεσματική και επαληθευμένη μοντελοποίηση της ποιότητας και ασφάλειας των τροφίμων, έχοντας ως κύρια βάση τον προσδιορισμό και την ποσοτική έκφραση όλων των κρίσιμων παραμέτρων από τις οποίες επηρεάζονται τόσο η ποιότητα όσο και η ασφάλεια. Σε ότι αφορά την κατάσταση των προϊόντων σε μεταβλητά θερμοκρασιακά σενάρια συντήρησης, αυτή μπορεί να εκτιμηθεί χρησιμοποιώντας την τεχνική της ολοκλήρωσης της συνάρτησης που περιγράφει τη θερμοκρασιακή διακύμανση (Temperature Function Integration, TFI). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί το προγενέστερο θερμοκρασιακό ιστορικό του προϊόντος με βάση το οποίο ολοκληρώνονται τα σχετιζόμενα με τη θερμοκρασία χαρακτηριστικά συγκεκριμένων μικροοργανισμών ή οι φυσικοχημικές μεταβολές που επηρεάζουν την ποιότητα και την ασφάλεια. Η χρήση των μαθηματικών μοντέλων πρόβλεψης στη μελέτη της μικροβιακής ανάπτυξης σε μεταβαλλόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες που επικρατούν κατά την εμπορική διανομή των τροφίμων προσεγγίστηκε για πρώτη φορά από τους Powers et al. (1965) που προέβλεψαν το ρυθμό ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού, πολλαπλασιάζοντας το ρυθμό ανάπτυξης που αντιστοιχεί στη μέση θερμοκρασία με ένα μεταβλητό συντελεστή όπως αυτός προέκυψε από την τιμή Q 10. Ωστόσο, οι πραγματικοί και προβλεπόμενοι ρυθμοί δεν συσχετίζονταν ικανοποιητικά σ αυτή την πρώτη προσέγγιση, γεγονός που αποδόθηκε στη διακύμανση της τιμής Q 10, η οποία παραμένει σταθερή μόνο για ένα στενό εύρος θερμοκρασιών, αλλά και στη χρήση μιας μέσης τιμής του ρυθμού ανάπτυξης που στη συγκεκριμένη περίπτωση περιλάμβανε τόσο τη φάση προσαρμογής όσο και την εκθετική φάση ανάπτυξης των μικροοργανισμών. Η πρόβλεψη της διάρκειας ζωής ενός συστήματος τροφίμου με πολλά διαφορετικά συστατικά, χημικής και μικροβιολογικής φύσης, είναι πολύπλοκη καθώς υπάρχουν 70

105 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση διαφορετικοί μηχανισμοί υποβάθμισης και καθένας από αυτούς παρουσιάζει τη δική του θερμοκρασιακή ευαισθησία. Η διάρκεια ζωής του συνολικού προϊόντος σε κάθε θερμοκρασία προσδιορίζεται από το μηχανισμό υποβάθμισης του συστατικού που εξελίσσεται γρηγορότερα και οδηγεί σε μικρότερο χρόνο ζωής. Επίσης, το φυσικοχημικό ή μεταβολικό μονοπάτι του κάθε τροφίμου και της αντίστοιχης ενδογενούς χλωρίδας που υπάρχει σ αυτό επηρεάζεται διαφορετικά από τις μεταβολές της θερμοκρασίας, την ενεργότητα του νερού ή τη σύσταση των αερίων, δημιουργώντας σημαντικές δυσκολίες στην ακριβή πρόβλεψη της διάρκειας ζωής του (Labuza και Fu, 1993). Δεδομένου ότι όλοι οι παράγοντες εκτός από τη θερμοκρασία παραμένουν σταθεροί, η ακόλουθη γενική εξίσωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ολοκλήρωση και τον προσδιορισμό της επίδρασης του χρόνο-θερμοκρασιακού ιστορικού ενός τροφίμου (Labuza και Fu, 1993): f A) = k dt (2.63) ( [ f ( Tt )] όπου f(a) η συνάρτηση ποιότητας και k [f(tt)] η χρόνο-θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού απώλειας ποιότητας. Οι Taoukis και Labuza (1989a,b), ανέπτυξαν μια μέθοδο για τη λύση της εξίσωσης αυτής χρησιμοποιώντας το μοντέλο Arrhenius: t t Ea f ( A) t = k A( T () t ) dt = k0a exp dt RT t (2.64) 0 0 ( ) Το ολοκλήρωμα αυτό μπορεί να υπολογιστεί ή εκτιμηθεί αναλυτικώς για τις απλές συναρτήσεις θερμοκρασίας - χρόνου T(t), είτε αριθμητικώς για περισσότερο πολύπλοκες περιπτώσεις, όπως οι ημιτονοειδείς συναρτήσεις θερμοκρασίας χρόνου (Fu και Labuza, 1992). Για την απλοποίηση της λύσης του ολοκληρώματος αυτού είναι δυνατό η χρόνοθερμοκρασιακή περίοδος έκθεσης ενός τροφίμου να διαιρεθεί σε μικρά χρονικά διαστήματα, στα οποία θεωρείται ότι η θερμοκρασία διατηρείται σταθερή, και ακολούθως το αποτέλεσμα της συνολικής έκθεσης να συναθροιστεί στο δεύτερο μέρος της εξίσωσης όπως δίνεται στην ακόλουθη εξίσωση (Labuza και Fu, 1993): i-n f ( A) = k i Δt i (2.65) i= 1 Στην πραγματικότητα, οποιαδήποτε εξίσωση ή μοντέλο που περιγράφει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού μιας αντίδρασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της ποσότητας k i για το μικρό χρονικό διάστημα που περιγράφηκε προηγουμένως. Η προσέγγιση της δραστικής θερμοκρασίας, T eff (effective temperature), μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ποιοτικής μεταβολής σε κάποιο μεταβλητό 71

106 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή χρόνο-θερμοκρασιακό προφίλ. Η δραστική θερμοκρασία ορίζεται ως η σταθερή θερμοκρασία στην οποία όταν εκτίθεται το προϊόν για το ίδιο χρονικό διάστημα είναι δυνατό να προκληθεί η ίδια ποιοτική μεταβολή με αυτή που παρατηρείται κατά την έκθεση του τροφίμου στη μεταβλητή θερμοκρασιακή κατανομή για την ίδια χρονική περίοδο (Taoukis και Labuza, 1989a). Συνεπώς, η συνάρτηση ποιότητας τη χρονική στιγμή t, f(a) t, μπορεί να εκφραστεί ως εξής: E a f ( A) t = k0aexp t (2.66) RTeff Όπως θα αναλυθεί εκτενέστερα στη συνέχεια, ο προσδιορισμός της δραστικής θερμοκρασίας είναι πολύ σημαντικός, ιδιαίτερα στην ανάπτυξη των χρόνο-θερμοκρασιακών δεικτών (Time Temperature Indicators or Integrators, ΤΤΙ). Ειδικότερα, κατά την εφαρμογή των ΤΤΙ και μέσω της απόκρισης των δεικτών αυτών έπειτα από την έκθεσή τους στο ίδιο θερμοκρασιακό ιστορικό με αυτό του υπό μελέτη προϊόντος, είναι δυνατός ο προσδιορισμός της δραστικής θερμοκρασίας και ακολούθως η παρακολούθηση και εκτίμηση της ποιοτικής παραμέτρου Α του τροφίμου σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή (Taoukis και Labuza, 1989a) Εφαρμογές της μεθόδου θερμοκρασιακής ολοκλήρωσης Η μέθοδος της χρονο-θερμοκρασιακής ολοκλήρωσης (TFI) μπορεί να εφαρμοστεί στη συντήρηση των τροφίμων, την ψύξη, τη διανομή και την έκθεσή τους στα καταστήματα λιανικής πώλησης (Gill, 1996a). Στις μελέτες που εφαρμόστηκε η τεχνική αυτή, ουσιαστικά χρησιμοποιήθηκαν θερμοκρασιακοί καταγραφείς για την παρακολούθηση των διακυμάνσεων της θερμοκρασίας, που μετά την ολοκλήρωσή τους έδωσαν μια εκτίμηση για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στόχου σε μια θερμοκρασία αναφοράς. Οι εφαρμογές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία αφορούν την ανάλυση και παρακολούθηση των διαδικασιών ψύξης κρέατος (Gill et al., 1991a,b, Gill και Jones 1992a,b, Reichel et al., 1991), τον προσδιορισμό της υγιεινούς αποδοτικότητας των διεργασιών απόψυξης του κρέατος (Lowry et al., 1989), και την εκτίμηση της διάρκειας ζωής του κρέατος κατά τη διηπειρωτική μεταφορά του (Gill και Phillips, 1993). Συνεπώς, ο Gill και οι συνεργάτες του θεμελίωσαν ακλόνητα τη χρήση της τεχνικής TFI στη βιομηχανία κρέατος και της ιδέας του δείκτη υγιεινής επεξεργασίας (Process Hygiene Index, PHI) ως έναν εναλλακτικό τρόπο μέτρησης και εκτίμησης της επάρκειας των διαφόρων επεξεργασιών διεργασιών (McMeekin, 2007). 72

107 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Στην Αυστραλία αντίστοιχα, ένα μαθηματικό μοντέλο που είχε αναπτυχθεί για το βακτήριο της E. coli χρησιμοποιήθηκε για την καθιέρωση του δείκτη ψύξης (Refrigeration Index, RI). Το επιστημονικό υπόβαθρο στο οποίο στηρίχτηκε η ανάπτυξη και αξιολόγηση του δείκτη RI κρίθηκε εκτεταμένο, επαρκές και ακριβές, με αποτέλεσμα η ψύξη των μεγάλων τεμαχίων κρέατος στα σφαγεία εξαγωγών της Αυστραλίας, να βασίζεται στο μοντέλο ανάπτυξης της Ε.coli, ερμηνεύοντας μέσω του μοντέλου αυτού τα προφίλ ψύξης που μετρώνται από τους θερμοκρασιακούς καταγραφείς (McMeekin, 2007) Η μέθοδος της τεχνικής ολοκλήρωσης χαρακτηρίζεται γρήγορη και αποτελεσματική στην ποσοτικοποίηση μιας θερμοκρασιακά εξαρτώμενης διεργασίας σε ότι αφορά την πιθανή μικροβιακή ανάπτυξη (McDonald και Sun, 1999). Η ενσωμάτωση των μοντέλων πρόβλεψης στις συσκευές καταγραφής της θερμοκρασίας έχει εφαρμοστεί για τους μικροοργανισμούς E. coli και Pseudomonas spp. στο κρέας, με τα θερμοκρασιακά δεδομένα να χρησιμοποιούνται στην ερμηνεία της μικροβιακής ανάπτυξης (McMeekin και Ross, 1996a). Επίσης, οι Skinner και Larkin (1998) υπέδειξαν πως οι χρόνοθερμοκρασιακοί δείκτες με δυνατότητες ολοκλήρωσης μπορούν να προειδοποιήσουν τους παραγωγούς αλλά και τους καταναλωτές για τις συνθήκες συντήρησης, που ενδεχομένως εγκυμονούν πιθανούς κινδύνους για κάποιο τρόφιμο από το σχηματισμό τοξίνης του Cl. botulinum. Στηριζόμενοι στις αρχές της μοντελοποίησης της αλλοίωσης των τροφίμων και της συνεχούς παρακολούθησης του χρόνου και της θερμοκρασίας, οι Giannakourou et al. (2001) ανέπτυξαν ένα σύστημα διαχείρισης της ψυκτικής αλυσίδας. Στη μελέτη αυτή, τα κινητικά μοντέλα ανάπτυξης του ειδικού αλλοιογόνου μικροοργανισμού (specific spoilage microorganism, SSO), η διακύμανση του αρχικού επιπέδου επιμόλυνσης του προϊόντος με τον μικροοργανισμό αυτό, και η παρακολούθηση και καταγραφή του χρόνο - θερμοκρασιακού ιστορικού, συνδυάστηκαν στην ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού συστήματος λήψης αποφάσεων, του λεγόμενου Shelf Life Decision System, στη διαχείριση της ψυκτικής αλυσίδας των τροφίμων, με απώτερο στόχο τη βελτιστοποίηση της ποιότητας των τελικών προϊόντων (Koutsoumanis et al., 2002). Ενδεχομένως, η περισσότερο ολοκληρωμένη προσέγγιση είναι αυτή του συστήματος SMAS (Safety Monitoring and Assurance System) που αναπτύχθηκε για τα συντηρούμενα υπό ψύξη προϊόντα τροφίμων από τους Koutsoumanis et al. (2005). Η αρχή στην οποία βασίζεται το σύστημα SMAS είναι ένας συνδυασμός των μαθηματικών μοντέλων που περιγράφουν τους κοινά εμφανιζόμενους στο κρέας μικροοργανισμούς και την απόκριση ενός κατάλληλου χρόνο-θερμοκρασιακού ολοκληρωτή (TTI) που ολοκληρώνει το 73

108 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή θερμοκρασιακό ιστορικό του προϊόντος όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η απόκριση του ΤΤΙ σχετίζεται με τη μικροβιολογική ποιοτική κατάσταση του τροφίμου μέσω της συλλογής πληροφοριών σε προκαθορισμένα σημεία της ψυκτικής αλυσίδας. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του συστήματος SMAS, διεξήχθη ένας μεγάλος αριθμός από διαφορετικά σενάρια συντήρησης στην ψυκτική αλυσίδα, μέσω της τεχνικής προσομοίωσης Monte Carlo. Οι προβλέψεις των διαφορετικών προφίλ συντήρησης συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα του παραδοσιακού συστήματος διανομής FIFO (first in - first out), σύμφωνα με το οποίο τα προϊόντα που έχουν παραχθεί παλαιότερα ή εισέρχονται πρώτα σε κάποιο χώρο αποθήκευσης είναι αυτά που αποδεσμεύονται πρώτα. Το μοντέλο προσομοίωσης Monte Carlo περιλαμβάνει κατανομές πιθανοτήτων για ποικίλες συνθήκες συντήρησης και επεξεργασίας του κρέατος πριν την κατανάλωσή του και τα αποτελέσματα που δίνει είναι επίσης μια κατανομή πιθανότητας του αριθμού των παθογόνων βακτηρίων τη στιγμή της κατανάλωσης του προϊόντος και της πιθανότητας πρόκλησης κάποιας ασθένειας από τα εν λόγω βακτήρια. Τα αποτελέσματα της προσομοίωσης για τον κίνδυνο λιστερίωσης παρουσίασαν μια μετατόπιση της κατανομής SMAS συγκριτικά με την κατανομή FIFO, υποδεικνύοντας μικρότερη πιθανότητα εμφάνισης της ασθένειας και σημαντική μείωση αυτής στις μονάδες υψηλού κινδύνου κατά τη διακίνηση του προϊόντος στην ψυκτική αλυσίδα εξαγωγών. Επίσης, σε ότι αφορά την κατανομή της εναπομένουσας διάρκειας ζωής στους 0 C, το ποσοστό των μη αποδεκτών προϊόντων μειώθηκε από 12.5 σε 4.3 % (Koutsoumanis et al., 2005). Άξιο αναφοράς αποτελεί το γεγονός ότι τα αποτελέσματα για κάθε θερμοκρασιακό προφίλ μπορούν να αξιοποιηθούν τόσο προς όφελος της δημόσιας υγείας όσο και στην εκτίμηση της διάρκειας ζωής των προϊόντων. Επίσης, αν και το σύστημα αυτό αναπτύχθηκε για προϊόντα κρέατος, ωστόσο σύμφωνα με τους συγγραφείς της εν λόγω μελέτης μπορεί να εφαρμοστεί αξιόπιστα για οποιοδήποτε προϊόν στην ψυκτική αλυσίδα. Η τεχνολογία που επιλέγεται να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της θερμοκρασίας των τροφίμων κατά τη διανομή τους, αμφιρρέπει τα τελευταία χρόνια, μεταξύ της χρήσης χημικών, φυσικών ή ηλεκτρονικών θερμοκρασιακών καταγραφέων με τους τελευταίους να κερδίζουν ολοένα και μεγαλύτερο έδαφος στις επιλογές. Ωστόσο, υπάρχουν πιθανοί περιορισμοί σχετικά με την ανάκτηση των αποτελεσμάτων αν οι καταγραφείς χρησιμοποιούνται στις μεταφορές των προϊόντων με πλοία και όχι στην παρακολούθηση μιας διεργασίας σε μια σταθερή τοποθεσία. Για παράδειγμα, είναι πιθανή η εσκεμμένη ορισμένες φορές μη επιστροφή των καταγραφέων με συνέπειες την απώλεια όλων των πληροφοριών που έχουν συλλεχθεί, την αναδρομική ανάλυση των 74

109 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση μικροβιολογικών επιπτώσεων που έχει ένα θερμοκρασιακό προφίλ, και την χειρωνακτική εξέταση όλων των αναφορών προόδου κατά την πορεία των φορτίων στην αλυσίδα τροφοδοσίας (McMeekin, 2007). Ορισμένα από τα προβλήματα αυτά έχουν λυθεί τα τελευταία χρόνια με την εφαρμογή της τεχνολογίας ταυτοποίησης μέσω ραδιοσυχνοτήτων (Radio Frequency Identification, RFID), ενός συστήματος ασύρματης αναγνώρισης αντικειμένων, προς αντικατάσταση του barcode. Στην ταινία ή ετικέτα RFID (tag) είναι αποθηκευμένος ο σειριακός αριθμός του αντικειμένου και οποιαδήποτε άλλη πληροφορία είναι απαραίτητη για την αναγνώριση του αντικειμένου, ενώ επιπλέον μπορεί να προγραμματίζεται εξ αποστάσεως και να καταγράφει ή να παρακολουθεί τη θερμοκρασία του προϊόντος στο οποίο είναι προσκολλημένο (Montanari, 2008). Πολλά υποσχόμενη καινοτομία αποτελεί επίσης, η τεχνολογία ασύρματων δικτύων, όπως αυτή του συστήματος Smart Trace TM. Πρόκειται για αφαιρούμενες ετικέτες κατάλληλων αισθητήρων οι οποίες τοποθετούνται σε μεμονωμένες παλέτες με φορτία κρέατος που καταγράφουν και στέλνουν μέσω ασύρματου δικτύου πληροφορίες σχετικές με τη θερμοκρασία, το χρόνο, την ταυτότητα των προϊόντων και την τοποθεσία, σε έναν εξωτερικό δέκτη (server), ο οποίος μεταβιβάζει στη συνέχεια στον προμηθευτή μέσω ηλεκτρονικού ταχυδρομείου ή κινητού τηλεφώνου τις αντίστοιχες αναφορές ή τις πιθανές επείγουσες προειδοποιήσεις, όταν κάποια θερμοκρασία ξεπεραστεί για μεγάλο χρονικό διάστημα, υποδηλώνοντας κακομεταχείριση του τροφίμου και συμβάλλοντας αξιόπιστα στην ιχνηλασιμότητα του προϊόντος (McMeekin, 2007). Αναμφίβολα, η πλέον καταλληλότερη και χαμηλού κόστους μέθοδος παρακολούθησης των θερμοκρασιακών συνθηκών σε επίπεδο μονάδας προϊόντος κατά τη διάρκεια της διακίνησής του στην αλυσίδα διανομής που να πληροφορεί ταυτόχρονα και για την εναπομένουσα διάρκεια ζωής του τροφίμου, είναι οι Χρόνο-Θερμοκρασιακοί Δείκτες ή Ολοκληρωτές (Time Temperature Indicators or Integrators, TTI). Στις παραγράφους που ακολουθούν γίνεται εκτενής αναφορά στη φιλοσοφία ανάπτυξης των ΤΤΙ ως αποτελεσματικά εργαλεία στην παρακολούθηση της ποιότητας των τροφίμων αφού ένα από τα αντικείμενα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη ενός προτύπου μικροβιακού χρονοθερμοκρασιακού δείκτη για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη. 75

110 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 2.6 Χρόνο-θερμοκρασιακοί Δείκτες ή Ολοκληρωτές (Time Temperature Indicators or Integrators) Η σύγχρονη προσέγγιση των υπό ανάπτυξη συστημάτων διασφάλισης ποιότητας, τόσο από πλευράς των παραγωγών όσο και από πλευράς καταναλωτών, εστιάζεται στην πρόληψη μέσω της καταγραφής και ελέγχου των κρίσιμων παραμέτρων των τροφίμων σε όλο τον κύκλο της ζωής τους από την παραγωγή ως την τελική χρήση τους (Koutsoumanis et al., 2005). Με τη θερμοκρασία να αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα που καθορίζει το ρυθμό υποβάθμισης ενός τροφίμου, και άρα την τελική ποιότητα του προϊόντος, ένα αποτελεσματικό σύστημα διασφάλισης της ποιότητας και της ασφάλειας, όπως αυτό ορίζεται από τις αρχές της Ορθής Βιομηχανικής Πρακτικής (Good Manufacturing Practices) και Ορθής Υγιεινής Πρακτικής (Good Hygiene Practices), καθιστά ως κεντρικό στόχο την καταγραφή και τον έλεγχο της κρίσιμης αυτής παραμέτρου σε όλη την αλυσίδα (Taoukis και Labuza, 2003, Taoukis, 2001). Ο στόχος αυτός μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση των Χρόνο-θερμοκρασιακών Δεικτών ή Ολοκληρωτών. Οι χρόνο-θερμοκρασιακοί δείκτες είναι απλές, χαμηλού κόστους μικροσυσκευές, που με σήμα μία μη αντιστρεπτή και εύκολα μετρήσιμη αλλαγή, η οποία εξαρτάται από το χρόνο και τη θερμοκρασία είναι δυνατό να περιγράψουν με ακρίβεια το θερμοκρασιακό ιστορικό και κατά συνέπεια την ποιοτική κατάσταση του τροφίμου που συνοδεύουν (Taoukis και Labuza, 1989a). Η κατάλληλη χρήση των ΤΤΙ μπορεί να συμβάλει στον αποτελεσματικό ποιοτικό έλεγχο της ψυκτικής αλυσίδας εντοπίζοντας τα προβληματικά σημεία που υπάρχουν, και διορθώνοντας ταυτόχρονα τις αδυναμίες όπου αυτό κρίνεται απαραίτητο. Βοηθούν επίσης στον προγραμματισμό της διαχείρισης του συστήματος αποθήκευσης και διανομής των προϊόντων, αποδεσμεύοντας προς τα σημεία λιανικής πώλησης, πρώτα τις μονάδες των προϊόντων που βρίσκονται προς το τέλος της διάρκειας ζωής, μειώνοντας τις απώλειες από το κόστος των απορριπτόμενων λόγω αλλοίωσης τροφίμων. Τέλος, μπορούν να λειτουργήσουν συμπληρωματικά ή να αντικαταστήσουν την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, ως μια νέου τύπου δυναμική ημερομηνία λήξης, παρέχοντας πληροφορίες για την εναπομένουσα διάρκεια ζωής των προϊόντων και διασφαλίζοντας ότι ο καταναλωτής θα αγοράσει προϊόντα συγκεκριμένης ποιότητας (Taoukis και Labuza, 1989a,b, 2003). Απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή των ΤΤΙ είναι η συστηματική μελέτη και η κινητική μοντελοποίηση της επίδρασης της θερμοκρασίας στον προσδιορισμό της διάρκειας ζωής. Στηριζόμενοι σε αξιόπιστα μοντέλα για την εκτίμηση της διάρκειας 76

111 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση ζωής των προϊόντων τροφίμων, και των κινητικών των αποκρίσεων του ΤΤΙ, είναι δυνατή η παρακολούθηση, η καταγραφή και η μετάφραση της θερμοκρασιακής επίδρασης, από το στάδιο της παραγωγής ως τη στιγμή που το προϊόν θα φτάσει στο τραπέζι του καταναλωτή (Taoukis και Labuza, 2003). Η αποτελεσματικότητα και η αξιοπιστία ενός ΤΤΙ εξαρτάται από τα κινητικά χαρακτηριστικά της απόκρισής του και πόσο καλά η θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού εμφάνισης ή μεταβολής της απόκρισης αυτής προσεγγίζει την επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση της ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου (χημικής, φυσικής ή φυσικοχημικής φύσης) Ταξινόμηση των ΤΤΙ Η αρχή λειτουργίας των ΤΤΙ στηρίζεται σε κάποια μηχανική, χημική, ηλεκτροχημική, ενζυμική ή μικροβιολογική μη αντιστρεπτή μεταβολή η οποία εκφράζεται ως μια ορατή απόκριση, με τη μορφή κάποιας μηχανικής παραμόρφωσης, ή μετακίνηση κάποιας οπτικής ένδειξης, ή εμφάνισης - αλλαγής χρώματος. Ο ρυθμός της μεταβαλλόμενης απόκρισης επηρεάζεται από τη θερμοκρασία σημειώνοντας μεγαλύτερες τιμές για τις υψηλότερες θερμοκρασίες. Η ορατή απόκριση υποδεικνύει τη συνολική έκθεση του ΤΤΙ στις συνθήκες συντήρησης. Η έκταση στην οποία ανταποκρίνεται η απόκριση του ΤΤΙ στο πραγματικό χρόνο-θερμοκρασιακό ιστορικό εξαρτάται από τον τύπο του δείκτη και τις φυσικοχημικές αρχές στις οποίες στηρίζεται η λειτουργία του. Συνεπώς, οι χρόνο - θερμοκρασιακοί δείκτες διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τη λειτουργικότητά τους, δηλαδή τις πληροφορίες που καταγράφουν και παρέχουν, ή βάσει της αρχής στην οποία στηρίζεται η λειτουργία τους. Η επικρατέστερη από τις ταξινομήσεις που έχουν γίνει κατά καιρούς, είναι αυτή που προτάθηκε από τον Taoukis (2001) και παρουσιάζεται ως ακολούθως: α) Δείκτες Κρίσιμης Θερμοκρασίας (Critical Temperature Indicators, CTI). Πρόκειται για δείκτες που καταγράφουν την έκθεση πάνω ή κάτω από μία θερμοκρασία αναφοράς. Οι δείκτες αυτοί περιλαμβάνουν το στοιχείο του χρόνου, ωστόσο δε φανερώνουν το ιστορικό της έκθεσης πάνω από την κρίσιμη θερμοκρασία, παρά μόνο υποδεικνύουν το γεγονός ότι το προϊόν έχει εκτεθεί σε μια ανεπιθύμητη θερμοκρασία για ένα χρονικό διάστημα αρκετό ώστε να προκληθεί μια κρίσιμη αλλαγή που επηρεάζει την ποιότητα ή την ασφάλεια του προϊόντος. Για παράδειγμα, η μη αντιστρεπτή αλλοίωση της υφής που συμβαίνει κατά την απόψυξη ψυγμένων προϊόντων ή κατά την κατάψυξη των φρέσκων ή ψυγμένων τροφίμων ή ακόμη και η μετουσίωση μιας σημαντικής πρωτεΐνης κατά τη θέρμανση του τροφίμου πάνω από μια κρίσιμη θερμοκρασία, αποτελούν 77

112 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή παραδείγματα πιθανής εφαρμογής αυτού του τύπου των θερμοκρασιακών δεικτών. β) Ολοκληρωτές Κρίσιμης Θερμοκρασίας /Χρόνου (Critical Temperature/Time Integrators, CTTI). Οι δείκτες αυτοί συνοδεύονται από κάποια απόκριση που αντικατοπτρίζει τη συνολική χρόνο-θερμοκρασιακή έκθεση του προϊόντος πάνω από μία κρίσιμη θερμοκρασία αναφοράς. Η απόκρισή τους μπορεί επίσης να μεταφραστεί σε ισοδύναμο χρόνο έκθεσης αποκλειστικά στην κρίσιμη θερμοκρασία. Χρησιμεύουν σημαντικά στην υπόδειξη προβλημάτων στην αλυσίδα διανομής και ιδιαιτέρως για τα προϊόντα στα οποία οι κύριες αντιδράσεις που σχετίζονται με την ποιότητα και ασφάλεια, ξεκινούν να συμβαίνουν με ρυθμό που μπορεί να μετρηθεί πάνω από μια κρίσιμη θερμοκρασία (π.χ. η μικροβιακή ανάπτυξη και ενζυμική δραστηριότητα αναστέλλονται κάτω από την κρίσιμη θερμοκρασία). γ) Χρόνο-θερμοκρασιακοί Ολοκληρωτές ή Δείκτες (ΤΤΙ). Οι δείκτες ΤΤΙ δίνουν μία συνεχή, θερμοκρασιακά εξαρτώμενη απόκριση καθ όλη τη διάρκεια του ιστορικού του προϊόντος. Ολοκληρώνουν με μια μόνο μέτρηση το συνολικό χρόνο-θερμοκρασιακό ιστορικό και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες της μέσης θερμοκρασίας που επικρατεί κατά τη διακίνηση, και είναι πιθανό να συσχετιστούν με συνεχείς θερμοκρασιακά εξαρτώμενες αντιδράσεις απώλειας της ποιότητας των τροφίμων. Αυτός ο τύπος δεικτών θα αποτελέσει και το αντικείμενο στην παρούσα βιβλιογραφική ανασκόπηση. Λαμβάνοντας ως κριτήριο για την ταξινόμησή τους την αρχή στην οποία στηρίζεται η λειτουργία τους μπορούν να διακριθούν σε χημικούς, ενζυμικούς, μηχανικούς, πολυμερισμού, φωτοχημικούς, ηλεκτροχημικούς, διάχυσης ή βιολογικούς-μικροβιακούς δείκτες (Taoukis, 2001) Χαρακτηριστικά ενός αποτελεσματικού ΤΤΙ Η αποτελεσματικότητα ενός ΤΤΙ προϋποθέτει ότι ο δείκτης είναι ικανός να δείχνει μία συνεχή αλλαγή, ο ρυθμός της οποίας αυξάνεται με τη θερμοκρασία και ο οποίος δεν αντιστρέφεται όταν η θερμοκρασία μειώνεται (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003). Μεγάλος είναι επίσης και ο αριθμός των επιθυμητών φυσικών ιδιοτήτων για έναν επιτυχημένο δείκτη. Αναλυτικότερα, ένας ιδανικός ΤΤΙ πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003): 1. Να εμφανίζει μία συνεχή, χρονο-θερμοκρασιακά εξαρτώμενη αλλαγή. 2. Η αλλαγή να εκφράζεται ως μία απόκριση εύκολα μετρήσιμη και μη αντιστρεπτή. 78

113 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση 3. Η αλλαγή αυτή να μιμείται ή να μπορεί να συσχετιστεί με το βαθμό ποιοτικής αλλοίωσης του τροφίμου και την εναπομένουσα διάρκεια ζωής του. 4. Να είναι αξιόπιστος και να δίνει σταθερές αποκρίσεις όταν εκτίθεται στις ίδιες θερμοκρασιακές συνθήκες. 5. Να έχει χαμηλό κόστος. 6. Να είναι ευέλικτος, έτσι ώστε οι διαφορετικές μορφές του να μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορα θερμοκρασιακά διαστήματα (π.χ. ψύξη, κατάψυξη, θερμοκρασία δωματίου) με χρήσιμες περιόδους απόκρισης από μερικές μέρες μέχρι και περισσότερο από ένα χρόνο. 7. Να είναι μικρός, εύκολα προσαρμόσιμος ως τμήμα της συσκευασίας του τροφίμου και συμβατός με μια διεργασία συσκευασίας υψηλής ταχύτητας. 8. Να έχει μεγάλη διάρκεια ζωής πριν την ενεργοποίηση και να ενεργοποιείται εύκολα. 9. Να μην επηρεάζεται από τις υπόλοιπες περιβαλλοντικές συνθήκες πέραν της θερμοκρασίας, όπως το φως, ρυπαντές του αέρα και σχετική υγρασία (RH). 10. Να είναι ανθεκτικός σε φυσιολογικές μηχανικές καταπονήσεις χωρίς να επηρεάζεται η απόκρισή του. 11. Να είναι μη τοξικός και στην απίθανη περίπτωση επαφής του με το τρόφιμο να μην περικλείει κινδύνους. 12. Να είναι σε θέση να μεταφέρει με απλό και ξεκάθαρο τρόπο το μήνυμα στον καταναλωτή ή σε οποιονδήποτε άλλον ενδιαφερόμενο. 13. Η απόκρισή του να είναι οπτικά κατανοητή και να μπορεί να μετρηθεί εύκολα από ηλεκτρονικές συσκευές έτσι ώστε οι πληροφορίες να λαμβάνονται, να αποθηκεύονται και να μεταδίδονται εύκολα και γρήγορα. Όπως είναι κατανοητό, είναι πολύ δύσκολο κάποιος ΤΤΙ να ικανοποιεί σε απόλυτο βαθμό όλες τις προϋποθέσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Ωστόσο, οι ΤΤΙ που έχουν αναπτυχθεί μέχρι στιγμής και που χρησιμοποιούνται σε διάφορες εφαρμογές ή επιστημονικές μελέτες πληρούν αρκετά από τα χαρακτηριστικά αυτά και η χρησιμοποίησή τους κρίθηκε επιτυχής. Στη συνέχεια θα περιγραφούν σύντομα οι χρόνο-θερμοκρασιακοί δείκτες που είναι διαθέσιμοι στην αγορά και ορισμένες από τις περιπτώσεις εφαρμογής τους στην ποιοτική εκτίμηση διαφόρων προϊόντων Παραδείγματα διαθέσιμων εμπορικών ΤΤΙ προτύπων Ένας μεγάλος αριθμός από εμπορικούς πρότυπους χρονοθερμοκρασιακούς δείκτες έχει 79

114 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αναπτυχθεί. Η συνήθης λειτουργία αυτών όπως καταγράφεται στη βιβλιογραφία βασίζεται σε i) αρχές μοριακής διάχυσης, ii) αντιδράσεις πολυμερισμού iii) ενζυμικές μεταβολές iv) μικροβιακές μεταβολές (Kerry et al., 2006, Taoukis και Labuza 2003, Taoukis 2001) Δείκτες μοριακής διάχυσης Η εταιρία 3Μ Co, ανέπτυξε το δείκτη 3M Monitor και το δείκτη Freshness Check, με αρχή λειτουργίας τη μοριακή διάχυση. Στον πρώτο δείκτη συμβαίνει μοριακή διάχυση ενός χρωματισμένου εστέρα πάνω σε ένα πορώδες φυτίλι. Η μετατόπιση της διαχεόμενης ουσίας γίνεται ορατή μέσω ανοιγμάτων κατά μήκος του φυτιλιού ή μετράται σε κατάλληλη κλίμακα όταν όλο το μήκος του φυτιλιού είναι ορατό. Η διάχυση αρχίζει την εξέλιξή της όταν η θερμοκρασία συντήρησης του προϊόντος ξεπεράσει τη θερμοκρασία τήξης του εστέρα, οπότε μεταβάλλοντας τον τύπο και τη συγκέντρωση του εστέρα είναι δυνατή η επίτευξη διαφορετικών σημείων τήξεως. Ο δείκτης αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε ως ένας CTTI, όταν η κρίσιμη θερμοκρασία είναι ίδια με το σημείο τήξεως του εστέρα, είτε ως ένας ΤΤΙ αν το σημείο τήξεως είναι χαμηλότερο από το θερμοκρασιακό εύρος στο οποίο συνήθως συντηρείται το τρόφιμο. Όμοια, στο δείκτη Freshness Check, ένα ιξωδοελαστικό υλικό μεταναστεύει μέσω διάχυσης σε κάποια πορώδη μήτρα που ανακλά το φως προκαλώντας σταδιακά μια ορατή και θερμοκρασιακά εξαρτώμενη αύξηση της διαπερατότητας του πορώδους υλικού στο φως. Ο ρυθμός μεταβολής της απόκρισης και η θερμοκρασιακή εξάρτηση ελέγχεται από τη σύνθεση του πορώδους υλικού, τη συγκέντρωση του πολυμερούς που διαχέεται και τη θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης αυτού, οπότε και μπορεί να ρυθμιστεί στο επιθυμητό επίπεδο. Το εν λόγω ΤΤΙ ενεργοποιείται κατά την προσκόλληση των δύο υλικών, τα οποία πριν τη χρήση τους μπορούν να αποθηκεύονται ξεχωριστά για μεγάλο χρονικά διάστημα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003) Δείκτες βασιζόμενοι στον πολυμερισμό Οι δείκτες της εταιρίας Lifelines Inc., (Lifelines Technology Inc., Morris Palins, NJ, USA) Lifelines Fresh-Check και Freshness Monitor, βασίζουν τη λειτουργία τους σε αντιδράσεις πολυμερισμού. Η συγκεκριμένη αντίδραση που εξαρτάται από τη θερμοκρασία συμβαίνει σε δις-υποκατεστημένους κρυστάλλους διακετυλενίου οι οποίοι πολυμερίζονται σε ένα πολυμερές σκούρου χρώματος. Κατά τον πολυμερισμό, διατηρείται η κρυσταλλική δομή του μονομερούς, ενώ οι κρύσταλλοι του πολυμερούς παραμένουν ενωμένοι σε μια αλυσίδα διατηρώντας τη μονοδιάστατη φύση τους σε ότι αφορά τις οπτικές τους ιδιότητες. 80

115 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Ως απόκριση του ΤΤΙ, λαμβάνεται η μεταβολή του χρώματος που μετράται με τη μείωση της διάθλασης του φωτός. Ο δείκτης Freshness Monitor, αποτελείται από ένα ορθογώνιο κομμάτι συνενωμένων φύλλων χαρτιού το μπροστινό μέρος του οποίου περιλαμβάνει μια ταινία που φέρει λεπτή επικάλυψη από το άχρωμο μονομερές του διακετυλενίου και δύο barcodes, ένα για το προϊόν και ένα για την αναγνώριση του μοντέλου του δείκτη. Η διάθλαση του Freshness Monitor μπορεί να μετρηθεί με σάρωση μέσω μιας οπτικής συσκευής που λειτουργεί με laser, και το αποτέλεσμα της σάρωσης αποθηκεύεται σε μια φορητή συσκευή, προμήθεια της εταιρίας που παράγει το ΤΤΙ. Ο δεύτερος τύπος δείκτη, Freshcheck, που έχει σχεδιαστεί κατάλληλα για τους καταναλωτές είναι στρόγγυλος και το χρώμα του ενεργού κέντρου συγκρίνεται με το χρώμα αναφοράς ενός περιβάλλοντος δακτυλίου. Τα συνενωμένα φύλλα φέρουν κίτρινο ή κόκκινο χρώμα με αποτέλεσμα η μεταβολή της απόκρισης του δείκτη να εμφανίζεται ως μεταβολή από το διαφανές στο μαύρο. Η απόκριση του FreshCheck μπορεί να αξιολογηθεί σε σύγκριση με το δακτύλιο αναφοράς, κατά τη μέτρηση με ένα φορητό χρωματόμετρο ή ένα οπτικό πυκνόμετρο. Πριν τη χρήση τους, οι δείκτες που ενεργοποιούνται τη στιγμή της παραγωγής, πρέπει να αποθηκεύονται σε βαθιά κατάψυξη, όπου οι αλλαγές συμβαίνουν με πολύ αργό ρυθμό (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003) Ενζυμικοί Δείκτες Οι χρονο-θερμοκρασιακοί δείκτες της εταιρίας VITSAB (VITSAB Α. Β, Malmö, Sweden) είναι ενζυμικοί δείκτες. Οι Vitsab ΤΤΙ μεταβάλλουν το χρώμα τους εξαιτίας της πτώσης του ph που συμβαίνει μέσω μιας ελεγχόμενης ενζυμικής υδρόλυσης ενός υποστρώματος που περιέχει κάποιο λιπίδιο. Ο δείκτης, που έχει τη μορφή μιας πλαστικής μικροθήκης, αποτελούμενη από δύο διαφορετικά τμήματα (θαλάμους) κατάλληλα διαχωρισμένα με ένα διάφραγμα, περιέχει πριν την ενεργοποίηση στο ένα τμήμα το υδατικό διάλυμα ενός λιπολυτικού ενζύμου, όπως η παγκρεατική λιπάση, και στο άλλο το υπόστρωμα, που περιέχει το λιπίδιο (εστέρας-γλυκερόλης) προσροφημένο σε κάποιο κονιοποιημένο φορέα PVC. Το υπόστρωμα βρίσκεται σε διασπορά σε μίγμα κάποιας υδατικής και γλυκερολικής φάσης, ενώ στο ίδιο αιώρημα υπάρχει και ένας δείκτης ph. Κατά την ενεργοποίηση, το διάφραγμα που χωρίζει τους δύο μικροθαλάμους διαρρηγνύεται με την εφαρμογή μικρής μηχανικής πίεσης, οπότε υπόστρωμα και ένζυμο αναμιγνύονται. Η υδρόλυση του υποστρώματος συντελεί στην παραγωγή ενός οργανικού οξέος και οδηγεί στη σταδιακή πτώση του ph που στη συνέχεια μεταβάλλει το χρώμα του χημικού δείκτη από το αρχικό πράσινο στο τελικό ανοιχτό κίτρινο. Τα χρώματα αναφοράς 81

116 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή στην αρχή και στο τέλος της αντίδρασης, είναι εκτυπωμένα γύρω από το παράθυρο στο οποίο γίνεται η οπτική παρατήρηση για ευκολότερη αναγνώριση της χρωματικής μεταβολής. Η συνεχής μεταβολή του χρώματος του δείκτη μπορεί να παρακολουθηθεί επίσης ενόργανα με χρήση κάποιου χρωματόμετρου. Ο συνδυασμός διαφορετικών τύπων ενζύμων, υποστρωμάτων και συγκεντρώσεων αυτών δίνει τη δυνατότητα παραγωγής ποικίλων δεικτών με διαφορετικές αποκρίσεις και θερμοκρασιακή εξάρτηση, και άρα δεικτών με διαφορετική διάρκεια ζωής (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003). Ένας νέος τύπος ενζυμικού ΤΤΙ που αναπτύχθηκε πρόσφατα στηρίχτηκε στην ενζυμική υδρόλυση του αμύλου από μια α-αμυλάση (Yan et al., 2007) Μικροβιακοί Δείκτες Παρά το πλήθος των διαφορετικών τύπων δεικτών που κυκλοφόρησαν κατά καιρούς στο εμπόριο, η επικράτηση των ηλεκτρονικών συσκευών καταγραφής του θερμοκρασιακού ιστορικού, που περιγράφηκαν προηγουμένως (RFID συστήματα και ηλεκτρονικοί καταγραφείς data loggers), έναντι των χημικών και φυσικών δεικτών οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι η αρχή λειτουργίας αυτού του είδους χρόνο-θερμοκρασιακών δεικτών ενίοτε στηρίζεται σε κινητικές αντιδράσεων μη βιολογικής φύσης. Συγκεκριμένα, οι δείκτες που έχουν περιγραφεί μέχρι στιγμής στηρίζουν τη λειτουργία τους σε αντιδράσεις διάχυσης, πολυμερισμού, χημικές ή ενζυμικές μεταβολές, σε μια προσπάθεια προσομοίωσης μιας εντελώς διαφορετικής διεργασίας, όπως αυτής της μικροβιολογικής αλλοίωσης των τροφίμων. Η ιδέα για ανάπτυξη ενός μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη που να βασίζεται στη μικροβιακή ανάπτυξη και το μεταβολισμό, περιγράφοντας με τον τρόπο αυτό την πραγματική αιτία της μικροβιολογικής αλλοίωσης των τροφίμων, θα μπορούσε να οδηγήσει στην παραγωγή ενός περισσότερο αξιόπιστου χρόνο-θερμοκρασιακού δείκτη. Οι McMeekin και Ross (1996a) ήταν οι πρώτοι που εστίασαν στη δυναμική ανάπτυξης βιολογικών δεικτών (bioindicators). Στην πρώτη αυτή προσέγγιση ανέφεραν χαρακτηριστικά ότι για την επιλογή ενός τέτοιου βιολογικού δείκτη στις μελέτες εκτίμησης της διάρκειας ζωής των τροφίμων, ο μικροοργανισμός που θα συμμετέχει στο βιολογικό δείκτη πρέπει να παρουσιάζει τα ίδια θερμοκρασιακά χαρακτηριστικά (θερμοκρασιακή ευαισθησία) με τον ειδικό αλλοιογόνο οργανισμό, και θα μπορούσε να είναι είτε ο ίδιος ο οργανισμός που προκαλεί την αλλοίωση ή κάποιος άλλος σχετικός με το τρόφιμο οργανισμός, στην περίπτωση που υπάρχει ενδεχόμενο επιμόλυνσης του προϊόντος. Η ιδέα για την ανάπτυξη ενός τέτοιου μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη με αρχή λειτουργίας του τη μικροβιακή ανάπτυξη και το μεταβολισμό, αποτέλεσε ένα από τα 82

117 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αντικείμενα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Πιο συγκεκριμένα, ο μικροβιακός ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στηρίχτηκε στη μεταβολική δραστηριότητα ενός γαλακτικού βακτηρίου που κατά την ανάπτυξή του στο κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα, παράγει γαλακτικό οξύ και προκαλεί την πτώση του ph του υποστρώματος, η οποία μεταφράζεται σε αλλαγή του χρώματος ενός χημικού δείκτη που επίσης έχει προστεθεί στο σύστημα, από κόκκινο σε κίτρινο. Η κινητική της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ εξετάστηκε ισόθερμα και κάτω από δυναμικές συνθήκες συντήρησης χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα μαθηματικά μοντέλα. Επιπλέον, το ΤΤΙ που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε για τη δυνατότητα εφαρμογής του στην παρακολούθηση της αλλοίωσης βοδινού κιμά συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα. Παράλληλα, με τη μελέτη της παρούσας διδακτορικής διατριβής, η γαλλική εταιρία Cryolog (Cryolog S.A., Quimper, Brittany, France) έχοντας την ίδια ιδέα προχώρησε στην ανάπτυξη δυο εμπορικών τύπων βιολογικών δεικτών, των Traceo και eo. Ο πρώτος δείκτης, αποτελεί ουσιαστικά μια μπλε ετικέτα προσκολλημένη στο πακέτο του προϊόντος στην οποία βρίσκεται παγιδευμένο ένα μίγμα στελεχών γαλακτικών βακτηρίων. Αρχικά, η ετικέτα τοποθετείται πάνω στο γραμμικό κωδικό (barcode) του υπό ψύξη προϊόντος και ανάλογα με το προφίλ θερμοκρασίας χρόνου στο οποίο υποβάλλεται η συσκευασία, ο δείκτης Traceo ανταποκρίνεται με μια διπλή απόκριση: αρχικά το χρώμα του δείκτη αλλάζει από μπλε σε ροζ, ενώ ακολουθεί μια αντίδραση κατά την οποία ο διαφανής barcode μετατρέπεται σε αδιαφανή όταν το προϊόν δεν μπορεί πλέον να καταναλωθεί, εξαιτίας των κρίσιμων κακομεταχειρίσεων που έχει υποστεί το προϊόν ή όταν έχει φτάσει στην ημερομηνία λήξης του. Οι δύο αλλεπάλληλες μεταβολές εξαρτώνται από την οξίνιση του μέσου ανάπτυξης του ΤΤΙ λόγω της ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στις εκάστοτε συνθήκες συντήρησης (Ellouze et al., 2008). Το δεύτερο προϊόν έχει σχεδιαστεί να συνοδεύει τα πακέτα λιανικής πώλησης κάποιου τύπου σάντουιτς, όπου μια ετικέτα που απεικονίζει ένα λουλούδι αλλάζει χρώμα από πράσινο σε κίτρινο δηλώνοντας ότι το προϊόν είναι φρέσκο ή ότι έχει φτάσει στο τέλος της διάρκειας ζωής του, αντίστοιχα. Οι δείκτες της Cryolog αποτελούν καινοτομία στη συσκευασία τροφίμων χρησιμοποιώντας όλη τη διαθέσιμη τεχνογνωσία γύρω από την ποσοτική μικροβιολογία και την ανάπτυξη των χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών, και ουσιαστικά αποτελούν απόδειξη της δυνατότητας εφαρμογής των μικροβιακών χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των υπό ψύξη προϊόντων. Οι αρχικές προσδοκίες σχετικά με τις δυνατότητες των ΤΤΙ να συμβάλλουν ουσιαστικά στη βελτίωση του συστήματος διακίνησης των τροφίμων στην ψυκτική αλυσίδα και την 83

118 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ποιότητα ή ασφάλεια των τροφίμων απέχουν σημαντικά από τη μέχρι τώρα πορεία εφαρμογής τους. Οι κύριοι λόγοι για την απροθυμία των παραγωγών να υιοθετήσουν τους ΤΤΙ είναι το κόστος, η αξιοπιστία και η δυνατότητα εφαρμογής τους. Το κόστος των ΤΤΙ έχει εκτιμηθεί στο εύρος των $ ανά μονάδα δείκτη (Taoukis και Labuza, 2003) και δε φαίνεται να αποτελεί εμπόδιο στην χρήση των ΤΤΙ. Η μειωμένη αξιοπιστία για τους χρονο-θερμοκρασιακούς δείκτες ξεκινά από την αρχή εμφάνισης των εμπορικών ΤΤΙ προτύπων και οφείλεται μερικώς στην έλλειψη επαρκών δεδομένων τόσο από τις διάφορες μελέτες όσο και από τους ίδιους τους προμηθευτές. Οι αρχικές συζητήσεις περί υποχρεωτικής χρήσης των ΤΤΙ, πριν την πλήρη κατανόηση των εννοιών γύρω από την ανάπτυξή τους και την απόδειξη της αξιοπιστίας τους, είχε ως αποτέλεσμα την αρνητική στάση των βιομηχανιών, βλάπτοντας ουσιαστικά την εφαρμογή τους. Τα σύγχρονα ΤΤΙ συστήματα έχουν επιτύχει υψηλά στάνταρ παραγωγής και διασφάλισης ποιότητας παρέχοντας αξιόπιστες και επαναλαμβανόμενες αποκρίσεις σύμφωνα με τις υπάρχουσες προδιαγραφές (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003). Το σημαντικότερο εμπόδιο στη χρήση των ΤΤΙ ήταν η δυνατότητα εφαρμογής τους. Οι αρχικές μελέτες παρουσιάστηκαν αναποτελεσματικές στην καθιέρωση μιας ξεκάθαρης μεθοδολογίας σχετικά με το πως η απόκριση του ΤΤΙ μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην εκτίμηση της ποιότητας του τροφίμου. Η αρχική προσέγγιση που εστίαστηκε στην εύρεση μιας γενικευμένης σχέσης μεταξύ της θερμοκρασίας και της ποιότητας του τροφίμου για κάποιες γενικές κατηγορίες προϊόντων τροφίμων αποδείχτηκε ανεπαρκής, αφού ακόμη και τρόφιμα παρόμοιου τύπου διέφεραν σημαντικά σε ότι αφορά τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της ποιοτικής τους υποβάθμισης. Η χρήση κινητικών μοντέλων μεγάλης ακρίβειας που να περιγράφουν πλήρως την απώλεια της διάρκειας ζωής ενός συστήματος τροφίμου είναι αναγκαία (Taoukis και Labuza, 2003). Είναι γενικώς αποδεκτό ότι προκειμένου να εφαρμοστεί επιτυχώς ένας ΤΤΙ σε κάποιο τρόφιμο απαραίτητη προϋπόθεση είναι η απόκριση του ΤΤΙ να αντικατοπτρίζει την απώλεια της ποιότητας του τροφίμου, σε όλες τις θερμοκρασίες. Συνεπώς, είναι αναγκαίο η ενέργεια ενεργοποίησης (Ε α ), ενδεικτική της θερμοκρασιακής ευαισθησίας της απόκρισης του ΤΤΙ, να είναι παρόμοια με την ενέργεια ενεργοποίησης της απώλειας της ποιότητας των τροφίμων, και το σημείο λήξης του ΤΤΙ να συμπίπτει με το τέλος της εμπορικής διάρκειας ζωής του τροφίμου. Η προσέγγιση αυτή, αν και είναι εφικτή, θα μπορούσε να χαρακτηριστεί μη πρακτική, αφού απαιτεί την εξέταση απεριόριστου αριθμού διαφορετικών προτύπων ΤΤΙ. Αντί της ανάπτυξης ενός ΤΤΙ που να μιμείται απόλυτα την υποβάθμιση της ποιότητας ενός τροφίμου, η χρήση ενός γενικευμένου σχήματος 84

119 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση εφαρμογής των ΤΤΙ, που να μεταφράζει την απόκρισή τους στην κατάσταση στην οποία βρίσκεται το τρόφιμο, κρίνεται περισσότερο αποτελεσματική. Στην περίπτωση αυτή, απαιτείται η συστηματική μελέτη της κινητικής τόσο της διαδικασίας ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου όσο και της απόκρισης του ΤΤΙ (Taoukis και Labuza, 2003, Taoukis, 2001). Η πρόοδος στον τομέα των μαθηματικών μοντέλων κάνει εφικτή την εφαρμογή αυτής της μεθόδου. Αυτή η προσέγγιση της μοντελοποίησης της κινητικής και η μεθοδολογία εφαρμογής των ΤΤΙ στον έλεγχο της ποιότητας των τροφίμων περιγράφεται εκτενώς σε μια ανασκόπηση από τον Taoukis (2001) κι έχει χρησιμοποιηθεί στην αριστοποίηση της διαχείρισης της ψυκτικής αλυσίδας για προϊόντα ιχθυηρών και κρέατος, όπως έχει ήδη αναφερθεί (Giannakourou et al., 2005, 2001, Koutsoumanis et al., 2005, Taoukis et al., 1999) Αρχές εφαρμογής των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών Η κινητική μοντελοποίηση της ποιότητας ενός τροφίμου έχει αναλυθεί διεξοδικά σε προηγούμενες παραγράφους αυτής της βιβλιογραφικής ανασκόπησης. Επίσης, στην παράγραφο έγινε αναφορά στον τρόπο εκτίμησης της συνάρτησης ποιότητας υπό μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ολοκλήρωσης της θερμοκρασιακής συνάρτησης (εξ ) ή χρησιμοποιώντας την έννοια της δραστικής θερμοκρασίας T eff, ως τη σταθερή θερμοκρασία στην οποία η συντήρηση του τροφίμου για ορισμένο χρόνο προκαλεί την ίδια μεταβολή στην ποιότητα με αυτή που συμβαίνει κατά τη συντήρηση του ίδιου τροφίμου στη μεταβλητή θερμοκρασιακή κατανομή. Η ίδια κινητική προσέγγιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μοντελοποίηση της μετρούμενης μεταβολής στην απόκριση του ΤΤΙ. Η απόκριση ενός ΤΤΙ είναι το αποτέλεσμα μιας φυσικοχημικής ή βιολογικής μεταβολής, η οποία επίσης εξαρτάται από τις χρονο-θερμοκρασιακές συνθήκες (Taoukis, 2001). Αν Χ η μετρήσιμη απόκριση του ΤΤΙ, τότε η μεταβολή της απόκρισης αυτής στην πορεία του χρόνου μπορεί να οριστεί από μια συνάρτηση απόκρισης F(X) ως εξής: F( X ) = k t (2.67) I Αν η θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού μεταβολής της απόκρισης, k I, ακολουθεί την κινητική Arrhenius, η συνάρτηση της απόκρισης παίρνει την ακόλουθη μορφή: - E a I F X k It k I t ref 1 1 ( ) = = exp (2.68) R T T ref όπου k I ref είναι η σταθερά του ρυθμού μεταβολής της απόκρισης στη θερμοκρασία 85

120 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αναφοράς T ref, και Ε αι η ενέργεια ενεργοποίησης της απόκρισης. Όμοια, για την περιγραφή της απόκρισης του ΤΤΙ σε κάποιο μεταβαλλόμενο προφίλ θερμοκρασίας-χρόνου μπορεί να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος ολοκλήρωσης, καθώς και η προσέγγιση της δραστικής θερμοκρασίας που έχουν ήδη αναφερθεί για τη συνάρτηση ποιότητας ενός τροφίμου (παράγραφος 2.5.2). Για ένα δείκτη που εκτίθεται στο ίδιο θερμοκρασιακό προφίλ, Τ(t), με το προϊόν του τροφίμου, η συνάρτηση της απόκρισης μπορεί να εκφραστεί τροποποιώντας αντίστοιχα τις εξισώσεις 2.64 και 2.66, ως ακολούθως: t t Ea I 1 1 F( X ) k I ( T () t ) dt k I ref dt R T t T t = = exp (2.69) 0 0 ( ) ref F( X ) t = k I ref E exp R a T 1 eff (TTI) 1 T ref t (2.70) Στηριζόμενοι στις παραπάνω εξισώσεις, οι Taoukis και Labuza (1989a) ανέπτυξαν ένα σχήμα εφαρμογής των ΤΤΙ το οποίο επιτρέπει τον υπολογισμό της τιμής του παράγοντα ποιότητας Α, οποιαδήποτε χρονική στιγμή t, μέσω της μετρούμενης μεταβολής της απόκρισης του ΤΤΙ την ίδια χρονική στιγμή, όπως εικονίζεται στο Σχήμα 2.6. Από τη μετρούμενη τιμή Χ του ΤΤΙ τη χρονική στιγμή t είναι δυνατός ο υπολογισμός της τιμής της συνάρτησης απόκρισης, και λύνοντας την εξίσωση 2.70 μπορεί να εκτιμηθεί η τιμή της δραστικής θερμοκρασίας T eff. Αν το ΤΤΙ και η διεργασία υποβάθμισης της ποιότητας του τροφίμου έχουν παρόμοια θερμοκρασιακή ευαισθησία, γεγονός που μεταφράζεται σε διαφοροποίηση των ενεργειών ενεργοποίησης μικρότερη των 25 kj/mol, η ίδια δραστική θερμοκρασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το προϊόν τροφίμου. Στη συνέχεια, γνωρίζοντας την Τ eff και τις λοιπές κινητικές παραμέτρους της αντίδρασης απώλειας ποιότητας, μπορεί να υπολογιστεί η τιμή της συνάρτησης ποιότητας από την εξίσωση 2.66, και άρα η τιμή του δείκτη ποιότητας Α t. Η γνώση της τιμής του ποιοτικού δείκτη Α υποδεικνύει την έκταση της ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου, ενώ ταυτόχρονα επιτρέπει την εκτίμηση της εναπομένουσας διάρκειας ζωής σε οποιαδήποτε μέση θερμοκρασία (Taoukis και Labuza, 1989a, Taoukis, 2001). Για την εφαρμογή της συστηματικής αυτής προσέγγισης που αναπτύχθηκε, είναι αναγκαίος ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών της απόκρισης των διαφορετικών τύπων ΤΤΙ, δηλαδή της έκφρασης F(X), και των τιμών k I και E α, διεξάγοντας τα απαραίτητα κινητικά πειράματα. Σημαντική παραδοχή για να ισχύσουν όλα τα παραπάνω είναι η ενέργεια ενεργοποίησης που εκφράζει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου να είναι ίδια με τη ενέργεια ενεργοποίησης που περιγράφει τη 86

121 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση μεταβολή της απόκρισης του ΤΤΙ, οπότε και η δραστική θερμοκρασία του τροφίμου ισοδυναμεί με τη δραστική θερμοκρασία του ΤΤΙ (Taoukis, 2001). μέτρηση ΤΤΙ k I ref συνάρτηση απόκρισης Teff (TTI) Χt E a I F(Χ)t E α (τροφίμου) Ε α (ΤΤΙ) Ποιότητα Τροφίμου (Α)t συνάρτηση ποιότητας f(a)t k Α ref E a ok Teff (τροφίμου) Teff (TTI) Σχήμα 2.6. Σχηματική απεικόνιση της συστηματικής προσέγγισης για την εφαρμογή των ΤΤΙ ως δείκτες ποιότητας (Πηγή: Taoukis, 2001) Εφαρμογές των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών H προσέγγιση της μοντελοποίησης της κινητικής απόκρισης των ΤΤΙ και του σχήματος εφαρμογής των ΤΤΙ ως δείκτες ποιότητας, όπως έχει ήδη αναφερθεί, χρησιμοποιήθηκε στην αριστοποίηση της διαχείρισης της ψυκτικής αλυσίδας για προϊόντα ιχθυηρών και κρέατος σε αρκετές μελέτες (Giannakourou et al., 2005, 2001, Koutsoumanis et al., 2005, Taoukis et al., 1999). Οι χρονοθερμοκρασιακοί δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί επίσης στην αξιολόγηση της ποιότητας διαφόρων κατηγοριών τροφίμων, όπως τα κατεψυγμένα λαχανικά (Giannakourou και Taoukis, 2003a, 2002), τα γαλακτοκομικά προϊόντα (Fu et al., 1991), το κρέας ή τα πουλερικά (Labuza και Fu, 1995, Smolander et al., 2004), αλλά και τα φρέσκα προϊόντα θαλασσινών (Mendoza et al., 2004), ή και φρέσκα μανιτάρια (Bobelyn et al., 2006) Μελλοντικές τάσεις για τη χρήση των Χρονο-θερμοκρασιακών δεικτών Οι χρονο-θερμοκρασιακοί δείκτες αναμένεται να έχουν ένα καλύτερο μέλλον και ευρύτερη εφαρμογή στον έλεγχο της διακίνησης των προϊόντων, όταν το σύνολο των δυνατοτήτων που παρέχουν γίνει απόλυτα κατανοητό από τη βιομηχανία τροφίμων. Η πρόοδος σε ότι αφορά την ποικιλία, την αξιοπιστία και την ευελιξία των ΤΤΙ, αλλά και τον 87

122 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή καλύτερο προσδιορισμό της διάρκειας ζωής των προϊόντων τροφίμων, θα επιτρέψει την επιτυχή εφαρμογή των εργαλείων αριστοποίησης της ψυκτικής αλυσίδας όπως το σύστημα λήψης αποφάσεων SLDS (Shelf Life Decision System). Επίσης, η τεχνολογία ανάπτυξης των ΤΤΙ εστιασμένη στην ποσοτική ανάλυση της επικινδυνότητας των τροφίμων, θα επιτρέψει τη μελέτη και ανάπτυξη ενός συστήματος που βασίζεται στα ΤΤΙ και το οποίο μαζί με την ποιότητα θα επιβεβαιώνει και την ασφάλεια της ψυκτικής αλυσίδας, όπως συμβαίνει με το σύστημα SMAS (Safety Monitoring and Assurance System) (Taoukis και Labuza, 2003). Τέλος, η εμπορική αξιοποίηση των υπό ανάπτυξη μικροβιακών χρονοθερμοκρασιακών δεικτών αναμένεται να δώσει νέα ώθηση στην εφαρμογή απόλυτα αξιόπιστων ΤΤΙ στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των υπό ψύξη τροφίμων. Κάτι τέτοιο φαίνεται εφικτό περισσότερο από ποτέ, δεδομένης της ευρείας αποδοχής των προϊόντων βιολογικών δεικτών της εταιρίας Cryolog. 2.7 Ποιοτική υποβάθμιση τροφίμων εξαιτίας της μη ενζυμικής αμαύρωσης Η μη ενζυμική αμαύρωση (Nonenzymatic browning, NEB) είναι μια από τις πιο διαδεδομένες χημικές αντιδράσεις που συμβαίνουν στα τρόφιμα. Τα προϊόντα που υφίστανται μη ενζυμική αμαύρωση παρουσιάζουν μια χρωματική υποβάθμιση με κυρίαρχο τον καστανό χρωματισμό του τροφίμου. Η ίδια αντίδραση μπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύμητο άρωμα και χρώμα, ή ακόμη και σε μεταβολές της υφής των προϊόντων και απώλεια της θρεπτικής αξίας (π.χ. απώλεια λυσίνης) των τροφίμων. Υπάρχει πλήθος διαφορετικών υποστρωμάτων και επιμέρους χημικών αντιδράσεων που εμπλέκονται στη μη ενζυμική αμαύρωση. Μεταξύ άλλων συγκαταλέγονται η οξείδωση του ασκορβικού οξέος σε εσπεριδοειδή φρούτα και χυμούς, η οποία προκαλεί την απώλεια της βιταμίνης C και την ακόλουθη αμαύρωση των φρούτων, η καραμελοποίηση των σακχάρων, κατά την εκτεταμένη έκθεσή τους σε υψηλές θερμοκρασίες, και η αμαύρωση τύπου Maillard που συμβαίνει μεταξύ των αναγωγικών σακχάρων και των ελεύθερων αμινομάδων σε αφυδατωμένα τρόφιμα με συνέπεια τη δημιουργία ανεπιθύμητου χρώματος και αρώματος. Η αμαύρωση τύπου Maillard που συμβαίνει κυρίως σε αφυδατωμένα και μέσης περιεκτικότητας σε υγρασία τρόφιμα ευθύνεται για πολλές δυσμενείς επιδράσεις στις ιδιότητες των τροφίμων. Για παράδειγμα, σε αφυδατωμένες πατάτες σχηματίζονται ανεπιθύμητες οσμές και χρώμα. Όμοια, δημιουργεί προβλήματα διαλυτότητας στην αφυδατωμένη σκόνη γάλακτος και απώλεια της θρεπτικής αξίας του προϊόντος (Labuza και Baisier, 1992). Συγκεκριμένα, η απώλεια της θρεπτικής αξίας έγκειται στην καταστροφή ή 88

123 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση τη βιολογική αδρανοποίηση σημαντικών βασικών αμινοξέων όπως η λυσίνη και τρυπτοφάνη ή την αδρανοποίηση πολλών γλυκολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων και την αλληλεπίδραση αυτών με ιόντα μετάλλων (Friedman, 1996). Αναφορές επίσης έχουν γίνει για το σχηματισμό μεταλλαξιογόνων συστατικών (προϊόντα της αντίδρασης Maillard) σε αντιδιαστολή με τα επίσης αναφερόμενα αντιοξειδωτικά προϊόντα της αντίδρασης. Εντούτοις, η αντίδραση Maillard αποτέλεσε σημαντικό εργαλείο στη βιομηχανία τροφίμων συμβάλλοντας στη βελτίωση της εμφάνισης και γεύσης ψημένων - μαγειρευμένων προϊόντων, ιδιαίτερα κατά την εφαρμογή επεξεργασιών παραδοσιακού τύπου, όπως είναι το ψήσιμο του καφέ, του ψωμιού και το μαγείρεμα του κρέατος (Martins et al., 2001) Χημεία της αντίδρασης Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η χημεία γύρω από τις αντιδράσεις Maillard είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη. Περιλαμβάνει ένα ολόκληρο πλέγμα χημικών αντιδράσεων, το γενικό σχήμα του οποίου αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από το Hodge (1953). Ο Hodge απεικόνισε τα επιμέρους μονοπάτια της αντίδρασης (Σχήμα 2.7) και διέκρινε τις αντιδράσεις σε τρία επιμέρους στάδια, όπως δίνονται παρακάτω: 1 ο Στάδιο: Αρχικό στάδιο (άχρωμα συστατικά που δεν απορροφούν στην περιοχή του UV). Α. Συμπύκνωση σακχάρων-αμινοξέων Β. Μετάθεση Amadori 2 ο Στάδιο: Ενδιάμεσο στάδιο (άχρωμα ή κίτρινου χρώματος συστατικά, με έντονη απορρόφηση κοντά στην περιοχή UV). Γ. Αφυδάτωση σακχάρων Δ. Διάσπαση σακχάρων Ε. Αποικοδόμηση αμινοξέων 3 ο Στάδιο: Τελικό στάδιο (έντονα χρωματισμένα συστατικά) ΣΤ. Συμπύκνωση αλδολών Ζ. Πολυμερισμός αλδεϋδών-αμινοξέων, σχηματισμός ετεροκυκλικών αζωτούχων συστατικών Στο πρώτο στάδιο η αντίδραση συνοψίζεται στη συνένωση της καρβονυλικής ομάδας του αναγωγικού σακχάρου με την ελεύθερη αμινομάδα του αμινοξέος ή της πρωτεΐνης με παράλληλη απώλεια ενός mole νερού. Η Ν-υποκατεστημένη γλυκοζυλαμίνη που σχηματίζεται υπεισέρχεται στην μη αντιστρεπτή μετάθεση Amadori στην περίπτωση των 89

124 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ασκορβικό οξύ Αναγωγικά σάκχαρα + Αμινοξέα Βάση Schiff + Η 2 Ο 1-αμινο-1δεοξυ-2-κετόζη -3 H 2 O -2 H 2 O Προϊόντα συμπύκνωσης + αμινοξέα Βάση Schiff της υδροξυμέθυλοφουρφουράλης ή φουρφουράλης υδροξυμέθυλοφουρφουράλης ή φουρφουράλης + αμινο συστατικά Ρεδουκτόνες + αμινο συστατικά + αμινο συστατικά Αποικοδόμηση Strecker + αμινο συστατικά Πολυμερή κίτρινου καφέ χρώματος Σχήμα 2.7. Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων Maillard όπως αναπτύχθηκε από τον Hodge (1953). αλδοζών ή τη μετάθεση Heyn για τις κετόζες. Η μετάθεση Amadori αφορά την ισομερίωση της Ν-υποκατεστημένης αλδοζυλαμίνης σε 1-αμινο-1-δεοξυ-2-κετόζη, ενώ η μετάθεση Heyn μεταβάλει την κετόζη σε 2-αμινο-2-δεοξυαλδόζη. Σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ο σχηματισμός των προϊόντων της μετάθεσης Amadori διεξάγεται με αργό ρυθμό, άλλωστε απαιτείται η παρουσία του αναγωγικού σακχάρου στην μορφή της ανοιχτής αλυσίδας για την έναρξη της αντίδρασης. Οι Hodge και Rist (1953) έδειξαν πως το υδροξύλιο στον C-2 μιας αλδόζης είναι σημαντικό για την παραγωγή σημαντικής ποσότητας μελανού χρωματισμού, αλλά και ότι μπλοκάροντας το στάδιο της μετάθεσης Amadori σταματά εντελώς ο σχηματισμός των μελανών χρωστικών. Κατά τη θέρμανση, τα προϊόντα της μετάθεσης Amadori υπόκεινται αφυδάτωση και διάσπαση και παράγουν άχρωμες ρεδουκτόνες καθώς και φθορίζουσες ενώσεις κάποιες από τις οποίες μπορεί να είναι επίσης έγχρωμες. Το δεύτερο ή ενδιάμεσο στάδιο περιλαμβάνει την απομάκρυνση της αμινομάδας από το σύνθετο παράγωγο και οι προκύπτουσες ενώσεις είναι συστατικά που αντιδρούν 90

125 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση εντονότερα. Ορισμένα από αυτά τα φθορίζοντα συστατικά και κάποιες μελανές χρωστικές είναι δυνατό να σχηματιστούν, σε μικρές όμως συγκεντρώσεις. Οι τρεις οδοί αποικοδόμησης της 1-αμινο-1-δεοξυ-2-κετόζης είναι η αφυδάτωση του τμήματος του σακχάρου, η διάσπασή του και η αποικοδόμηση Strecker που υφίσταται το τμήμα της αμινομάδας (Hodge, 1953). Υπάρχουν δύο τύποι αντιδράσεων αφυδάτωσης των Ν-παραγώγων των αναγωγικών σακχάρων, που εξαρτώνται από το ph του συστήματος. Σε όξινες συνθήκες τα Ν- παράγωγα των σακχάρων βρίσκονται στην πρωτονιομένη τους μορφή, και η ενολοποίηση που εμπλέκει το άτομο του C-1 ευνοεί την παραγωγή 1,2-εναμινόλης. Η αφυδάτωση και κυκλοποίηση παράγουν υδροξυ-μεθυλοφουρφουράλη (από τις εξόζες) ή φουρφουράλη (από τις πεντόζες) με την πιθανότητα της αναγέννησης του αμινοξέος. Σε αλκαλικό περιβάλλον η ενολοποίηση που εμπλέκει το άτομο του C-3 ευνοεί την παραγωγή 2,3- ενδιόλης. Η αλυσίδα του σακχάρου αφυδατώνεται, με την απώλεια δύο μορίων νερού, και σχηματίζεται ρεδουκτόνη. Η ύπαρξη συζυγών ακόρεστων δεσμών είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση της ρεδουκτόνης. Η δεύτερη αντίδραση που συμβαίνει στα προϊόντα της μετάθεσης Amadori είναι η διάσπαση του τμήματος του σακχάρου. Ο αποδεκτός μηχανισμός που ευθύνεται για τη διάσπαση αυτή είναι ο αντίστροφος της συμπύκνωσης των αλδολών. Οι αμίνες καταλύουν την αντίδραση αυτή όπως συμβαίνει και κατά τη συμπύκνωση των αλδολών. Τα παραγόμενα προϊόντα είναι αλδόλες, πολυμερή ελεύθερα αμινών και ελεύθερα αμινικά συστατικά. Η τρίτη και τελευταία αντίδραση που μπορεί να συμβεί στα προϊόντα της μετάθεσης Amadori είναι η αποικοδόμηση Strecker. Η αντίδραση αυτή λαμβάνει χώρα μεταξύ μιας ρεδουκτόνης και ενός α-αμινοξέος και ελευθερώνει διοξείδιο του άνθρακα προς σχηματισμό μιας αλδεΰδης με έναν άνθρακα λιγότερο από το αρχικό αμινοξύ. Η παραγωγή CO 2 παραλληλίζει την παραγωγή αλδεΰδης και το σχηματισμό χρώματος. Οι αλδεΰδες που σχηματίζονται από την αντίδραση Strecker αποτελούν πηγή αμαύρωσης επειδή μπορούν να συμπυκνωθούν μεταξύ τους, με άλλα τμήματα των σακχάρων, με φουρφουράλες ή άλλα προϊόντα αφυδάτωσης προς σχηματισμό χρωστικών καφέ χρωματισμού. Ωστόσο, το μονοπάτι αυτό είναι περισσότερο γνωστό ως πηγή σχηματισμού ουσιών που προσδίδουν δυσάρεστο άρωμα στην αντίδραση Maillard, παρά για την παραγωγή έγχρωμων ενώσεων. Το τελευταίο στάδιο της αντίδρασης είναι αυτό που ευθύνεται για τη μεγαλύτερη παραγωγή χρώματος. Κυρίαρχες αντιδράσεις θεωρούνται η συμπύκνωση των αλδολών, ο πολυμερισμός αλδεϋδών-αμινών, και ο σχηματισμός των ετεροκυκλικών αζωτούχων 91

126 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ουσιών όπως οι πυρόλες, οι ημιδαζόλες, οι πυριδίνες και οι πυραζίνες. Η χημεία στο στάδιο αυτό είναι εξαιρετικά πολύπλοκη αλλά είναι γνωστό πως παράγονται ουσίες διαλυτές και αδιάλυτες στο νερό που καλούνται μελανοϊδίνες (Reynolds, 1963). Οι μελανοϊδίνες ποικίλουν ως προς το μοριακό βάρος και περιέχουν πολλές διακριτές χρωμοφόρες ουσίες. Όσον αφορά στις αντιδράσεις καραμελοποίησης, αυτές συμβαίνουν κατά τη θέρμανση υδατανθράκων, ιδιαίτερα της σακχαρόζης αλλά και των αναγωγικών σακχάρων, απουσία αζωτούχων συστατικών. Η αντίδραση διευκολύνεται από την παρουσία μικρών ποσοτήτων οξέων και διαφόρων αλάτων. Η θερμόλυση προκαλεί κατά κύριο λόγο την αφυδάτωση του μορίου του σακχάρου και την εισαγωγή σ αυτό διπλών δεσμών ή στο σχηματισμό άνυδρων δακτυλίων. Οι διπλοί δεσμοί συμβάλλουν στη δημιουργία ακόρεστων δακτυλίων, όπως οι φουράνες, ενώ οι συζυγείς διπλοί δεσμοί απορροφούν στο ορατό φάσμα. Συχνά οι ακόρεστοι δακτύλιοι συμπυκνώνονται σε πολυμερή παράγοντας επιθυμητά χρώματα. Οι διάφοροι καταλύτες επιταχύνουν το ρυθμό της αντίδρασης και χρησιμοποιούνται συχνά για να στρέψουν την αντίδραση προς συγκεκριμένους τύπους χρώματος καραμέλας, με διαφορετικές διαλυτότητες και οξύτητες (BeMiller και Whistler, 1996). Το καστανό χρώμα καραμέλας που παράγεται κατά τη θέρμανση ενός διαλύματος γλυκόζης και διθειώδους αμμωνίου χρησιμοποιείται σε αναψυκτικά τύπου κόλα και άλλα όξινα αναψυκτικά, στα ψημένα προϊόντα, στα σιρόπια, τις καραμέλες, τις τροφές κατοικιδίων ζώων και αρτυματικές ύλες. Το όξινο άλας καταλύει τη σχάση του γλυκοζιτικού δεσμού της σακχαρόζης και το ιόν αμμωνίου μπορεί να συμμετάσχει στη μετάθεση Amadori. Χρώμα καραμέλας (καστανοκόκκινο χρώμα) παράγεται και κατά τη θέρμανση ζάχαρης, απουσία αλάτων αμμωνίου, αλλά περιέχει κολλοειδή σωματίδια ελαφρώς αρνητικά φορτισμένα με ph διαλύματος 3-4. Συνήθως χρησιμοποιείται στη βιομηχανία μπύρας και την παραγωγή άλλων αλκοολούχων ποτών. Οι χρωστικές καραμέλας της μη ενζυμικής αμαύρωσης είναι μακρομόρια με πολύπλοκες ποικίλες και άγνωστες δομές, και ουσιαστικά είναι αυτά που σχηματίζουν τα κολλοειδή συστήματα (BeMiller και Whistler, 1996) Παράγοντες που επηρεάζουν την αντίδραση Maillard Μεταξύ των παραγόντων που επηρεάζουν την αντίδραση Maillard είναι ο τύπος του αμινοξέος και του σακχάρου, το ph και η κατάσταση στην οποία βρίσκεται ο διαλύτης του συστήματος, η αναλογία σακχάρου προς αμινοξύ, και η θερμοκρασία. Στην προσπάθεια σύγκρισης των διαθέσιμων στη βιβλιογραφία κινητικών δεδομένων σχετικά με την απώλεια σακχάρων ή αμινοξέων, σχηματισμό ενδιάμεσων προϊόντων, ή την παραγωγή συστατικών 92

127 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση καστανού χρώματος, τα οποία αναδεικνύουν ταυτόχρονα και τις επιδράσεις των διαφόρων παραγόντων στην αντίδραση Maillard, τα προβλήματα που συνήθως ανακύπτουν αφορούν το διαφορετικό τρόπο έκφρασης των αποτελεσμάτων της μελέτης του φαινομένου από τους διάφορους ερευνητές. Ορισμένοι εκφράζουν τα δεδομένα τους ως συγκεντρώσεις των αντίστοιχων σακχάρων ή αμινοξέων, ενώ άλλοι παραθέτουν το σχηματισμό καφέ χρωστικών, καταγράφοντας την οπτική πυκνότητα ως συνάρτηση του χρόνου, με αποτέλεσμα να υπάρχει ένα εύρος στους αναφερόμενους ρυθμούς αμαύρωσης (Labuza και Baisier, 1992). Πράγματι, πολλές μέθοδοι έχουν προταθεί κατά καιρούς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ανάπτυξης των σχηματιζόμενων συστατικών καφέ χρώματος, συμπεριλαμβανομένου των μετρήσεων χρώματος, αλλά και των χημικών αναλύσεων για αντιδρώντα ή προϊόντα της αντίδρασης. Έτσι, για παράδειγμα, η οπτική μεταβολή του χρώματος των διαφόρων προϊόντων φρούτων έχει συχνά περιγραφεί με την καταγραφή των χρωματικών συνιστωσών CIE-Lab (Burdurlu και Karadeniz, 2003, Garza et al., 1999, Ibarz et al., 1999, 2000). Οι φασματοφωτομετρικές μετρήσεις και ειδικότερα οι μετρήσεις, απορρόφησης στα 420 nm, είναι η πλέον κοινή μέθοδος για την ανίχνευση των συστατικών καφέ χρώματος (Labuza και Baisier, 1992), ενώ ο σχηματισμός της 5- υδροξυμεθυλοφουρφουράλης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως δείκτης για την καταγραφή των προϊόντων ενδιάμεσου σταδίου (Bozkurt et al., 1999, Burdurlu και Karadeniz, 2003, Cohen et al., 1998, Garza et al., 1999, Ibarz et al., 1999, 2000, Rattanathanalerk et al., 2005). Τέλος, μετρήσεις φθορισμού έχουν επίσης αναφερθεί στη βιβλιογραφία ως δείκτης υποβάθμισης της ποιότητας του χυμού μήλου κατά τη θερμική επεξεργασία (Cohen et al., 1998). Γενικά για τη σωστή σύγκριση των πειραματικών δεδομένων διαφόρων μελετών πρέπει να αναφέρονται όσο το δυνατό περισσότερες πληροφορίες για τη μετρούμενη απόκριση και αυτές να ανάγονται ανά μονάδα συγκέντρωσης των σακχάρων ή των αμινοξέων που συμμετέχουν κάθε φορά στην αντίδραση Τύπος αμινοξέος Η λυσίνη θεωρείται συχνά ως το περισσότερο ενεργό αμινοξύ εξαιτίας των δύο ενεργών της αμινομάδων ή της ε-νη 2 όταν το αμινοξύ απαντά ως δομικό στοιχείο σε πρωτεϊνες ή πεπτίδια (O Brien και Morrissey, 1989). Σε μια άλλη μελέτη όπου εξετάστηκε η επίδραση του τύπου του αμινοξέος (9 διαφορετικά ελεύθερα αμινοξέα που υπάρχουν στο χυμό πορτοκαλιού και άλλους χυμούς) στην έκταση της μη ενζυμικής αμαύρωσης μίγματος D-γλυκόζης-αμινοξέος σε μοριακή αναλογία 1:1 κατά τη θέρμανση στους 65 C, η 93

128 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή εντονότερη ανάπτυξη χρώματος προκλήθηκε από την L-αργινίνη και το 4-αμινοβουτυρικό οξύ, ακολουθούμενη από τη γλυκίνη, αλανίνη, σερίνη, και L-προλίνη (Wolfrorm et al., 1974). Κατά την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας από τους Labuza και Baisier (1992), απoδείχθηκε σημαντική έλλειψη δεδομένων σχετικά με την πραγματική δραστηριότητα που παρουσιάζουν οι διάφοροι τύποι αμινοξέων και ειδικότερα κατά τη συντήρηση των τροφίμων. Παρόμοια συμπεράσματα ισχύουν και για τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών σε ότι αφορά την αντίδραση Maillard. Η αμαύρωση των πρωτεϊνών θεωρείται ότι σχετίζεται με τη συγκέντρωση των ε-αμινομάδων της λυσίνης, την ύπαρξη άλλων πιθανών αζωτούχων ενεργών ομάδων, όπως η ιστιδίνη και η τρυπτοφάνη, και τον αριθμό των αμινοτελικών ομάδων που επίσης εξαρτάται από το μοριακό βάρος (Labuza και Baisier, 1992) Τύπος σακχάρου Σε ότι αφορά τα αναγωγικά σάκχαρα που λαμβάνουν μέρος στην αντίδραση Maillard, η δραστηριότητά τους ορίζεται από τη συγκέντρωση αυτών που βρίσκονται στην άκυκλη μορφή (ή στη μορφή ευθείας αλυσίδας), αφού είναι οι μόνες που μπορούν να αντιδράσουν μαζί με τις ελεύθερες ομάδες αλδοζών και εξοζών. Κατά γενική ομολογία, οι πεντόζες παρουσιάζονται περισσότερο ενεργές από τις εξόζες, και η αμαύρωση είναι ταχύτερη όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της άκυκλης μορφής των σακχάρων στο διάλυμα. Η επίδραση της δομής των σακχάρων μελετήθηκε από τον ίδιο το Maillard, ο οποίος κατέληξε πως ο ρυθμός αμαύρωσης των σακχάρων μειώνεται ακολουθώντας τη σειρά: D- ξυλόζη > L-αραβινόζη > εξόζες > δισακχαρίτες (Whistler και Daniel, 1985) ph Από τη στιγμή που τα διάφορα στάδια της αντίδρασης καταλύονται σε όξινο ή βασικό περιβάλλον, είναι επόμενο το ph να παίζει καθοριστικό ρόλο στην κινητική της μηενζυμικής αμαύρωσης. Η δραστηριότητα των σακχάρων και των αμινομάδων επηρεάζεται από το ph. Η μορφή ανοιχτής αλυσίδας των σακχάρων και η μη πρωτονιομένη μορφή των αμινομάδων, που θεωρούνται και οι πιο ενεργές, ευνοούνται σε αυξημένες τιμές ph του συστήματος (Martins et al., 2001). Γενικά, ο ρυθμός της αμαύρωσης και η απώλεια των βασικών συστατικών της αντίδρασης αυξάνεται με την αύξηση του ph ως την τιμή 10, ενώ ελάχιστη αμαύρωση παρατηρείται σε ph κάτω του 6, κυρίως λόγω της πρωτονίωσης της ΝΗ 2. Εξετάζοντας καθένα από τα συστατικά ξεχωριστά στο αρχικό στάδιο της αντίδρασης Maillard, όσο χαμηλότερο είναι το ph, τόσο περισσότερο πρωτονιομένη εμφανίζεται μια 94

129 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αμινομάδα στην κατάσταση ισορροπίας, και άρα τόσο λιγότερο αναμένεται να αντιδράσει αυτή με κάποιο σάκχαρο. Η ισορροπία αυτή εξαρτάται από το ph και το pk α της αμινικής ομάδας, που ορίζεται ως η τιμή ph όπου το 50% της αμινομάδας βρίσκεται στην πρωτονιομένη μορφή (Martins et al., 2001). Τα pk α των αμινικών ομάδων είναι 9.6, και 9.44 για τη γλυκίνη, τη λυσίνη και την τρυπτοφάνη, αντίστοιχα. Για τα περισσότερα τρόφιμα, που το ph βρίσκεται συνήθως κάτω του 6, το ποσοστό της μη πρωτονιομένης αμινοομάδας είναι μικρότερο από 0.02% (Labuza και Baisier, 1992). Συνεπώς, ο αναμενόμενος ρυθμός αμαύρωσης είναι μικρός για τα περισσότερα προϊόντα τροφίμων. Επιπλέον, επειδή ορισμένα από τα ακόλουθα βήματα στην αντίδραση καταλύονται σε περιβάλλον όξινο, κι επειδή υπάρχουν δύο ανταγωνιστικοί μηχανισμοί, περιμένει κανείς την εμφάνιση ενός μέγιστου της αντίδρασης σε κάποιες τιμές ph καθώς αυτό αυξάνεται. Σύμφωνα με τους Ashoor και Zent (1984), οι οποίοι μελέτησαν τη αμαύρωση σε διαλύματα αμινοξέων σακχάρων σε εύρος ph 6-12, ανέφεραν πως το μέγιστο του ρυθμού της αντίδρασης συμβαίνει σε ph 10, ενώ δήλωσαν επίσης ότι σε προκαταρτικές μελέτες που είχαν διεξάγει, δεν ανιχνεύθηκε αμαύρωση σε τιμές ph μικρότερες του 6, κατά τη θέρμανση των ίδιων διαλυμάτων σε υψηλή θερμοκρασία για μικρό χρονικό διάστημα. Ωστόσο, οι Labuza και Saltmarch (1981b), κατά τη μελέτη παρατεταμένης αποθήκευσης σκόνης γάλακτος σε διάφορα περιβάλλοντα α w παρατήρησαν σημαντική αμαύρωση του εν λόγω προϊόντος, παρότι το αρχικό ph του τροφίμου πριν την ξήρανση ήταν μικρότερο του 6. Σχετικά με την αύξηση του ποσοστού της άκυκλης μορφής των αναγωγικών σακχάρων καθώς το ph αυξάνεται, αυτό συμβαίνει κατά τρεις φορές περισσότερο στο εύρος τιμών ph μεταξύ 6.5 και 7.5 για όλα τα σάκχαρα, και άρα μεγαλύτερη ποσότητα του αναγωγικού σακχάρου είναι διαθέσιμη να αντιδράσει (Labuza και Baisier, 1992) Αναλογία σακχάρου αμινοξέος Οι O Brien και Morrissey (1989) εξέφρασαν την άποψη ότι είναι γενικώς αποδεκτό πως μια περίσσεια του αναγωγικού σακχάρου, έναντι του εμπλεκόμενου στην αντίδραση αμινοξέος, επιταχύνει το ρυθμό της Maillard αμαύρωσης, δίνοντας μια ερμηνεία ότι υπάρχουν κάποιες μηχανιστικές διαφοροποιήσεις σχετικά με την καταστροφή του σακχάρου συγκριτικά με αυτή του αμινοξέος, χωρίς όμως να εξηγούν περαιτέρω τι εννοούν με αυτό. Κρίσιμης σημασίας επίσης αποτελεί το γεγονός ότι κατά τη σύγκριση των πειραματικών δεδομένων μη ενζυμικής αμαύρωσης πρέπει να εκτιμούνται οι απόλυτες συγκεντρώσεις όπως και η αναλογία μεταξύ αμινοξέος και σακχάρου, για την ασφαλή και σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων (Labuza και Baisier, 1992). Διατηρώντας σταθερή τη 95

130 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μοριακή αναλογία σακχάρου / αμινοξέος και αυξάνοντας τις απόλυτες συγκεντρώσεις των δύο συστατικών, οι Baisier και Labuza (1992) απέδειξαν πως ο ρυθμός αμαύρωσης αυξάνεται, υποδεικνύοντας πως η μοριακή αναλογία των αντιδρώντων συστατικών δεν αποτελεί ασφαλή δείκτη εκτίμησης της επίδρασης στο ρυθμό της αντίδρασης. Όπως αναμένονταν ο ρυθμός αμαύρωσης αυξήθηκε με την προσθήκη κάποιας ποσότητας οποιουδήποτε εκ των συστατικών, αφού αυξάνεται η πιθανότητα τα αντιδρώντα συστατικά να αλληλεπιδράσουν στο διάλυμα και τελικά να αντιδράσουν. Αυτό συμβαίνει μέχρι τη στιγμή που η μοριακή αναλογία θα είναι τόσο μεγάλη (ή μικρή) ώστε το συστατικό με τη μικρότερη συγκέντρωση να γίνει περιοριστικός παράγοντας. Η αύξηση των συγκεντρώσεων των αντιδρώντων συστατικών, διατηρώντας σταθερή τη μοριακή τους αναλογία, δε συνέβαλε στην αναλογική αύξηση της σταθεράς του ρυθμού της αντίδρασης σε όλο το εύρος των εξεταζόμενων συγκεντρώσεων, κάνοντας σαφές πως η ερμηνεία της μεταβολής του ρυθμού αμαύρωσης είναι πολύπλοκο ζήτημα και δεν εξαρτάται απλά και μόνο από τα απόλυτα επίπεδα σακχάρου και αμινοξέος στο υδατικό διάλυμα Κατάσταση διαλύτη Ο σχηματισμός της άκυκλης μορφής των σακχάρων περιλαμβάνει τη μεταφορά τριών ηλεκτρονίων και τριών πρωτονίων. Γι αυτό, η φύση του διαλύτη, όσον αφορά στις διηλεκτρικές του ιδιότητες και το ιξώδες του, επηρεάζει το ρυθμό μεταφοράς των πρωτονίων, και άρα τον πολυστροφισμό και τη συγκέντρωση της άκυκλης μορφής στην ισορροπία των διαφόρων ισομερών και τις εξαρτώμενες από αυτήν χημικές αντιδράσεις. Επιπλέον, η επίδραση της κατάστασης στην οποία βρίσκεται το νερό, όπως αυτή χαρακτηρίζεται από τη θερμοδυναμική διαθεσιμότητά του ή διαφορετικά την ενεργότητα του νερού, α w, στο ρυθμό της αμαύρωσης ή της απώλειας κάποιου από τα αντιδρώντα συστατικά έχει μελετηθεί επανειλημμένως σε συστήματα μειωμένης περιεκτικότητας σε υγρασία. Κατά την απεικόνιση του ρυθμού αμαύρωσης ως συνάρτηση της α w, η εμφάνιση του γνωστού ελαχίστου-μεγίστου έχει αποτυπωθεί σε πολλές μελέτες (Labuza και Saltmarch, 1981b), όπως φαίνεται και στο Σχήμα 2.5. Γενικά ο ρυθμός αμαύρωσης αυξάνεται από την ξηρά κατάσταση σε ένα μέγιστο σε τιμές α w μεταξύ , κι έπειτα μειώνεται και πάλι σε υψηλότερες τιμές ενεργότητας νερού. Η διαλυτότητα των στερών συστατικών περιορίζεται κάτω από τη μονοστοιβάδα εξαιτίας της υψηλής ενέργειας δέσμευσης του νερού και της υαλώδους κατάστασης που σχηματίζεται σ αυτά τα επίπεδα υγρασίας (Levine και Slade, 1989). Όταν η ενεργότητα του νερού αυξηθεί, τα διαλυτά συστατικά γίνονται περισσότερο ευκίνητα καθώς το νερό είναι λιγότερο δεσμευμένο, και το 96

131 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση σύστημα εισέρχεται στην ελαστοπλαστική κατάσταση. Σε χαμηλές τιμές α w το νερό δεσμεύεται στενά στις επιφάνειες με τις πολικές ομάδες μέσω δεσμών υδρογόνου και κατά συνέπεια δεν διατίθεται να αντιδράσει στο διάλυμα. Το κρίσιμο σημείο σχετίζεται με την τιμή της μονοστοιβάδας BET, που συνήθως απαντάται σε τιμές ενεργότητας νερού μεταξύ για τα περισσότερα τρόφιμα. Σε υψηλότερα α w, τα υδρόφιλα στερεά μπορούν να διαλυθούν και γίνονται περισσότερο ευκίνητα. Ωστόσο, ο ρυθμός αμαύρωσης μειώνεται και πάλι σε υψηλότερες τιμές ενεργότητας νερού, πιθανώς εξαιτίας της αυξημένης αραίωσης στη συγκέντρωση των διαλυτών στερεών συστατικών της αντίδρασης (Eichner και Karel, 1972). Επιπλέον, το νερό μπορεί να καθυστερήσει το ρυθμό της αρχικής αντίδρασης της γλυκοζυλαμίνης με βάση την αρχή δράσης των μαζών, από τη στιγμή που το νερό αποτελεί ταυτόχρονα και προϊόν της αντίδρασης. Αντίθετα, είναι δυνατό να ευνοήσει τις επερχόμενες στην αντίδραση αμαύρωσης αντιδράσεις απαμίνωσης για το σχηματισμό φουρφουράλης και υδροξυμέθυλοφουρφουράλης (Reynolds 1963). Ωστόσο, σε ότι αφορά τη συνολική αντίδραση, υγρά και στερεά συστήματα τροφίμων που περιείχαν γλυκερόλη εμφάνισαν μεγαλύτερους ρυθμούς αμαύρωσης από τους αναμενόμενους σε εύρος α w 0-0.5, με τα αντίστοιχα μέγιστα να παρατηρούνται μεταξύ 0.41 και 0.55, υποδεικνύοντας την επίδραση μιας διαθέσιμης υγρής φάσης που επιτρέπει την αντίδραση σε χαμηλότερες τιμές α w λόγω κινητοποίησης των συστατικών της αντίδρασης (η γλυκερόλη δρα ως πλαστικοποιητής αυξάνοντας τη μοριακή κινητικότητα των αντιδρώντων). Από τη στιγμή που η γλυκερόλη βρίσκεται στην υγρή φάση στις θερμοκρασίες που εξετάζονται, τα σάκχαρα και τα αμινοξέα μπορούν να διαλυθούν σε αυτή, οπότε κάποιος υψηλότερος ρυθμός αμαύρωσης παρατηρείται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις νερού (Eichner και Karel, 1972) Θερμοκρασία Όπως συμβαίνει και με τις υπόλοιπες χημικές αντιδράσεις, ο ρυθμός αμαύρωσης αυξάνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Επειδή όμως η αντίδραση Maillard αποτελείται από πλήθος επιμέρους σταδίων, το καθένα από αυτά με πιθανή διαφορετική θερμοκρασιακή ευαισθησία, εξαρτάται κατά κύριο λόγο από την εφαρμοζόμενη θερμοκρασία και επομένως επηρεάζει διαφορετικά το συνολικό μονοπάτι της αντίδρασης. Συνεπώς, κινητικά δεδομένα σε χαμηλές σχετικά θερμοκρασίες, C, δεν είναι άμεσα συγκρίσιμα με αυτά που αφορούν την ίδια αντίδραση στους C. Επιπλέον, η θερμοκρασία μπορεί να επηρεάσει τη δραστηκότητα των αντιδρώντων. Για παράδειγμα, η 97

132 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή θερμοκρασία αυξάνει τη συγκέντρωση της ενεργής μορφής του σακχάρου, που όπως έχει αναφερθεί είναι η ανοιχτή αλυσίδα, ενώ ταυτόχρονα μεταβάλλει το ρυθμό πολυστροφισμού των σακχάρων (Van Boekel, 2001). Η θερμοκρασιακή εξάρτηση της αντίδρασης Maillard έχει περιγραφεί επιτυχώς από πολλούς ερευνητές κάνοντας χρήση της κινητικής προσέγγισης Arrhenius (εξίσωση 2.37), σύμφωνα με την οποία η σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης σχετίζεται εκθετικά με το αντίστροφο της απόλυτης θερμοκρασίας. Σε μια ανασκόπηση σχετική με την κινητική της αντίδρασης Maillard αναδείχτηκε ότι για τα ξηρά τρόφιμα η ενέργεια ενργοποίησης, E α, της μη ενζυμικής αμαύρωσης ποικίλει ανάλογα με τον τύπο του τροφίμου και ότι οι τιμές E α αυξάνονται με τη μείωση της α w του τροφίμου (Labuza και Saltmarch, 1981b). Οι ενέργειες ενεργοποίησης της αντίδρασης Maillard για διάφορα αποξηραμένα τρόφιμα κυμαίνεται μεταξύ 16 και 30 kcal/mole (Labuza και Baisier, 1992) Κινητική της αντίδρασης Maillard Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία στις περισσότερες, σχετικές με την κινητική της αντίδρασης Maillard, μελέτες χρησιμοποιείται η απλή κινητική προσέγγιση κατά την οποία μετράται η απώλεια των αντιδρώντων συστατικών (σακχάρων, αμινοξέων, υπολειμματικών αμινοξέων στις πρωτεΐνες) ή ο σχηματισμός προϊόντων (προϊόντα της μετάθεσης Amadori, HMF, κλπ.). Η διαδικασία περιλαμβάνει την προσαρμογή μιας μαθηματικής εξίσωσης στα πειραματικά δεδομένα, και την περιγραφή των μεταβολών που παρατηρούνται στην πορεία του χρόνου ως μια αντίδραση μηδενικής, πρώτης ή δεύτερης τάξης (λεπτομέρειες έχουν αναφερθεί στην ενότητα 2.2 Αρχές κινητικής υποβάθμισης της ποιότητας των τροφίμων ). Είναι σημαντικό να κατανοήσει κανείς πως η εφαρμογή της απλής κινητικής προσέγγισης, που αναφέρθηκε προηγουμένως, ενδείκνυται για τις απλές αντιδράσεις. Η τάξη μιας αντίδρασης αποτελεί μια παράμετρο σύμφωνα με την οποία περιγράφεται με μαθηματικό τρόπο η εξάρτηση μιας μεταβλητής από το χρόνο ή τη συγκέντρωση, χωρίς απαραίτητα να πληροφορεί για το μηχανισμό μιας αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή είναι κατάλληλη στη μοντελοποίηση της διάρκειας ζωής ή για παράδειγμα στην περιγραφή της αδρανοποίησης των ενζύμων κατά την επεξεργασία, αλλά όχι για την κατανόηση και την ερμηνεία των χημικών μεταβολών και των μηχανισμών που εμπλέκονται σ αυτές. Σε μια πολύπλοκη σειρά αντιδράσεων, όπως στην περίπτωση της αντίδρασης Maillard, είναι γνωστό πως η παρατηρούμενη σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης αντανακλά ένα συνδυασμό από ρυθμούς στοιχειωδών και απλών αντιδράσεων. Αν στόχος της μελέτης 98

133 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση είναι η λεπτομερέστερη ερμηνεία μιας συγκεκριμένης αντίδρασης από αυτές που συμβαίνουν, αναγκαία κρίνεται η υιοθέτηση ενός μηχανισμού της αντίδρασης (Martins et al., 2001). Πρόκειται για μια άλλη προσέγγιση στην κινητική μοντελοποίησης, και όταν μπορεί κανείς να αναλύσει και να μοντελοποιήσει περισσότερα από ένα συστατικά ταυτόχρονα, η προσέγγιση αυτή παίρνει τη μορφή της πολυπαραγοντικής μοντελοποίησης (Van Boekel, 1996). Σε αυτή την περίπτωση θα πρέπει να ακολουθούνται τα επόμενα βήματα (Martins et al., 2001): Προσδιορισμός των κυριότερων αντιδρώντων συστατικών και προϊόντων και υπολογισμός του αντίστοιχου ισοζυγίου μάζας Προσδιορισμός των συστατικών που αποτελούν συν-προϊόντα του ίδιου σταδίου της αντίδρασης Διαφοροποίηση μεταξύ των πρωτογενών και δευτερογενών οδών της αντίδρασης Προσδιορισμός των κρίσιμων παραμέτρων επεξεργασίας (ph, θερμοκρασία, κλπ.) Προσδιορισμός της επίδρασης των συγκεντρώσεων των αντιδρώντων Υιοθέτηση Πρόταση για ένα πρότυπο μηχανισμό του συνολικού δικτύου της αντίδρασης που να βασίζεται στα στοιχειώδη και επιμέρους στάδια της αντίδρασης Εξέταση του μηχανισμού που προτάθηκε. Η διαδικασία αυτή ακολουθήθηκε από τους Martins et al. (2001), σε μια μελέτη ανασκόπησης για την αντίδραση Maillard στα τρόφιμα με τις συνακόλουθες εκδοχές κατά την κινητική μοντελοποίηση αυτής. Στη συγκεκριμένη μελέτη αναλύονται διεξοδικά τα επιμέρους μονοπάτια της αντίδρασης (πρωτογενείς και δευτερογενείς αντιδράσεις), η επίδραση των παραγόντων θερμοκρασία και ph, η σκιαγράφηση του μηχανισμού της αντίδρασης καθώς και οι πρακτικές που ακολουθήθηκαν στην ανάπτυξη του μοντέλου, αποτελούμενου από πλήθος διαφορικών εξισώσεων για κάθε στάδιο στο συνολικό δίκτυο των αντιδράσεων Maillard, όπως και η λύση αυτών με αριθμητική ολοκλήρωση και χρήση κατάλληλων αλγορίθμων Μη ενζυμική μελάνωση προϊόντων τροφίμων μέσης και χαμηλής περιεκτικότητας σε υγρασία Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, άξια έρευνας κρίθηκε η μελέτη των χημικών μεταβολών που συμβαίνουν σε δύο προϊόντα τροφίμων (το συμπυκνωμένο χυμό μήλου και το μέλι) που παρουσιάζουν μικροβιακή σταθερότητα λόγω της χαμηλής περιεχόμενης υγρασίας ή / και της θερμικής επεξεργασίας που υφίστανται. Τα εν λόγω συστήματα 99

134 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή τροφίμων αν και έχουν μακρά διάρκεια ζωής, εν τούτοις παρουσιάζουν υποβάθμιση και απώλεια των ποιοτικών τους χαρακτηριστικών σε βάθος χρόνου, ή και γρηγορότερα στην περίπτωση της εφαρμογής θερμικής επεξεργασίας, προκαλώντας τη δυσαρέσκεια του καταναλωτή που τελικά τα απορρίπτει. Τέτοιου είδους προβλήματα συχνά αποδίδονται στις αντιδράσεις μη ενζυμικής αμαύρωσης στις οποίες εμπλέκεται η καραμελοποίηση, η οξειδωτική αποικοδόμηση του ασκορβικού οξέος και ο σχηματισμός προϊόντων της αντίδρασης Maillard. Η αντίδραση Maillard, που συμβαίνει μεταξύ των α-αμινομάδων και των αναγωγικών σακχάρων, θεωρείται ως η σημαντικότερη αιτία αμαύρωσης σε συμπυκνωμένα συστήματα τροφίμων (Toribio και Lozano, 1984). Η αμαύρωση οφειλόμενη στην αντίδραση Maillard είναι επιθυμητή κατά την επεξεργασία ορισμένων τροφίμων, όπως στη βιομηχανία παραγωγής καφέ, τσαγιού, μπύρας και κατά το ψήσιμο του ψωμιού, βελτιώνοντας το χρώμα, το άρωμα και τη γεύση τους (Carabasa-Giribet και Ibarz-Ribas, 2000, Martins et al., 2001). Αντιθέτως, είναι ανεπιθύμητη σε συμπυκνωμένα, μέσης περιεκτικότητας σε υγρασία και ξηρά τρόφιμα, επειδή μεταξύ άλλων προκαλεί απώλειες θρεπτικών συστατικών (π.χ. λυσίνης), ή σχηματισμό ανεπιθύμητων ουσιών, π.χ. φουρφουράλης και 5-υδροξυμεθυλο-φουρφουράλης (HMF, hydroxymethylfurfural) και τελικά το σχηματισμό χρωστικών κίτρινου ή καφέ χρώματος (Buedo et al., 2001, Labuza και Baisier, 1992, Martins et al., 2001). Η μεταβολή του χρώματος των δύο αυτών συστημάτων τροφίμων, εξαιτίας της ανάπτυξης συστατικών μελανού / καφέ χρωματισμού υιοθετήθηκε ως ο καταλληλότερος δείκτης για την καταγραφή της απώλειας της ποιότητάς τους κατά την θερμική επεξεργασία. Η πολυπλοκότητα της αντίδρασης Maillard, αποτελούμενη από πολλές παράλληλες και αλλεπάλληλες αντιδράσεις με ποικίλα προϊόντα, δυσκολεύει εξαιρετικά στη μελέτη του φαινομένου και ειδικότερα στην εύρεση μιας απλής αναλυτικής χημικής μεθόδου που θα μπορούσε επαρκώς να περιγράψει το σύνολο της διεργασίας. Η πιο κοινή μέθοδος για την περιγραφή της αμαύρωσης είναι η αξιολόγηση της ανάπτυξης χρώματος ως συνάρτηση του χρόνου και η έκφρασή της με όρους κινητικής της αντίδρασης, όπως για παράδειγμα χρησιμοποιώντας τη σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης. Πολλές έρευνες αναφέρουν πως η εμφάνιση καφέ χρωστικών περιγράφεται από τις κινητικές μηδενικής ή πρώτης τάξης (Cohen et al., 1994, Stamp και Labuza, 1983, Toribio και Lozano, 1986). Σημαντική παράμετρος που επιδρά έντονα στην κινητική αμαύρωσης είναι η θερμοκρασία, ενώ το χημικό περιβάλλον ενός συστήματος τροφίμου, συμπεριλαμβανομένου της α w, του ph, και της χημικής σύστασης, επηρεάζει επίσης δραστικά την κινητική της αντίδρασης (Carabasa- Giribet και Ibarz-Ribas, 2000). Ο ρυθμός αμαύρωσης επηρεάζεται έντονα από 100

135 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως είναι η θερμοκρασία και η ενεργότητα νερού. Σε ότι αφορά την περιεκτικότητα σε υγρασία, ο ρυθμός αμαύρωσης αυξάνεται, για προϊόντα που βρίσκονται στην ξηρά κατάσταση, ξεκινώντας από την κρίσιμη τιμή ενεργότητας νερού α w για τα περισσότερα τρόφιμα, ως ένα μέγιστο ενεργότητας νερού σε επίπεδο α w , και ακολούθως μειώνεται σε υψηλότερες τιμές ενεργότητας νερού ως αποτέλεσμα της αραίωσης των αντιδρώντων συστατικών (Labuza και Baisier, 1992). Ακολούθως δίνονται γενικές πηροφορίες που σχετίζονται με τη χημική σύσταση των δυο προϊόντων (χυμός μήλου και μέλι) και τη μη ενζυμική αμαύρωση αυτών, τα οποία αποτέλεσαν και αντικείμενα μελέτης της παρούσας διατριβής Χυμός μήλου Η μη ενζυμική αμαύρωση αποτελεί έναν από τους κυριότερους λόγους υποβάθμισης της ποιότητας των συμπυκνωμένων χυμών φρούτων αφού η ενζυμική αμαύρωση περιορίζεται μέσω της θερμικής επεξεργασίας στην οποία υπόκεινται τέτοιου είδους προϊόντα. Ο συμπυκνωμένος χυμός μήλου αποτελεί ένα από τα προϊόντα αυτά. Παρασκευάζεται κατά την συνήθη διαδικασία παραγωγής του χυμού μήλου στο τελευταίο στάδιο της οποίας γίνεται συμπύκνωση υπό κενό χρησιμοποιώντας υπέρθερμο ατμό (Toribio και Lozano, 1984). Εναλλακτικά, η συμπύκνωση μπορεί να γίνει με εξάτμιση σε χαμηλή θερμοκρασία με ταυτόχρονη εφαρμογή χαμηλής πίεσης (Burdurlu και Karadeniz, 2003). Τα προηγούμενα στάδια της όλης επεξεργασίας περιλαμβάνουν πλύσιμο και διαλογή των φρούτων, σύνθλιψη και πίεση για την εκχύλιση του χυμού, ενζυμική αδρανοποίηση με εφαρμογή θέρμανσης (~ 90 C), ενζυμική υδρόλυση του εκχυλίσματος για διάσπαση των πηκτινών, διαύγαση με μπετονίτη ή ζελατίνη και διήθηση για απομάκρυνση του ιζήματος (Burdurlu και Karadeniz, 2003, Toribio και Lozano, 1984). Η ακόλουθη συμπύκνωση καταλήγει σε χυμό με υψηλή συγκέντρωση διαλυτών στερεών συστατικών (75-70 Bx). Ο συμπυκνωμένος χυμός μήλου αποτελεί ένα ιδιαίτερο σταθερό σύστημα από μικροβιολογικής πλευράς και προκειμένου να μετατραπεί στο εμπορικό παρασκεύασμα του χυμού αραιώνεται εκ νέου σε τελική συγκέντρωση διαλυτών στερεών ~11.5 Bx. Η σύσταση του συμπυκνωμένου χυμού μήλου αποτέλεσε το αντικείμενο μιας μελέτης που διήρκησε τρία έτη και αφορούσε το χαρακτηρισμό της χημικής σύστασης 92 δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου που παρασκευάστηκαν εμπορικώς στις Η.Π.Α. (Elkins et al., 1996). Στον Πίνακα 2.2 παρουσιάζονται συνοπτικά οι μέσοι όροι τριετίας ορισμένων από τις χημικές ουσίες που αναλύθηκαν. Στον ίδιο Πίνακα παρατίθονται οι συγκεντρώσεις των αμινοξέων για τα δείγματα που αναλύθηκαν την τρίτη χρονιά μόνον. 101

136 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Πίνακας 2.2. Χημική σύσταση 92 εμπορικών δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου. Χημική ουσία Ελαχ. Μεγ. Μέσος όρος S.D. α C.V. (%) β Αριθμός Δειγμάτων Brix Τέφρα ph Τιτλοδοτ. Οξύτητα Σάκχαρα % Σουκρόζη Γλυκόζη Φρουκτόζη Σορβιτόλη Οργανικά Οξέα % Κιτρικό Ισοκιτρικό Μηλικό Φουμαρικό (ppm) Μεταλ. στοιχεία (mg/100g) Na K Ca Mg Mn Fe Cu Al < Zn P Cl Πολυφαινόλες (ppm) HMF Ιχνη Καφεϊκό οξύ Κατεχίνη Χλωρογενικό οξύ Α p-κουμαρίνη Επικατεχίνη Δ.Α. γ Φερουλικό οξύ Δ.Α Αμινοξέα (mg/100g) Ασπαρτικό οξύ Θρεονίνη Σερίνη Ασπαραγίνη Γλουταμικό οξύ Γλουταμίνη < Προλίνη Γλυκίνη Αλανίνη Βαλίνη Μεθιονίνη Ισολευκίνη Λευκίνη Τυροσίνη Φαινυλαλανίνη Λυσίνη Ιστιδίνη Αργινίνη α S.D.:Τυπική απόκλιση, β C.V.: Συντελεστής παραλλακτικότητας, γ Δ.Α.: Δεν ανιχνεύτηκε, Οι τιμές αναφέρονται σε κανικοποιημένη συγκέντρωση διαλυτών στερεών 11.5 Bx. Πηγή: Elkins et al.,

137 Διδακτορική Διατριβή 2. Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Μέλι Το μέλι είναι τρόφιμο υψηλής διατροφικής αξίας και σημαντικό συμπλήρωμα διατροφής με πολλές λειτουργικές και θεραπευτικές ιδιότητες, κυρίως εξαιτίας της πλούσιας σύνθεσής του σε απαραίτητα αμινοξέα, ιχνοστοιχεία, βιταμίνες, και άλλα βιοενεργά συστατικά. Ενδεικτικά η μέση σύσταση του μελιού είναι κατά το μεγαλύτερο ποσοστό υδατάνθρακες, εκ των οποίων περίπου 37% φρουκτόζη, 30% γλυκόζη, 8% μαλτόζη, 2% σουκρόζη και 2% άλλα σάκχαρα. Περιέχει επίσης νερό περίπου σε ποσοστό 16-17%, και πλήθος άλλων συστατικών όπως οργανικά οξέα, ένζυμα, μεταλλικά στοιχεία, λιπίδια, βιταμίνες, πτητικά συστατικά κλπ. Σημαντικές παράμετροι που καθορίζουν την ποιότητα του μελιού είναι τα χημικά, ρεολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Κατά τη συντήρηση του, το μέλι υπόκειται σταδιακά σε αμαύρωση ως συνέπεια των αντιδράσεων Maillard, της καραμελοποίησης της φρουκτόζης ή λόγω της αντίδρασης των πολυφαινολών που υπάρχουν στο μέλι με τα υπάρχοντα σε αυτό άλατα σιδήρου (Lynn et al., 1939). O ρυθμός της αμαύρωσης σχετίζεται με τη σύσταση του μελιού και τη θερμοκρασία συντήρησης (White, 1978). Παρόμοιες απώλειες στην ποιότητα του μελιού αποδίδονται επίσης στη θέρμανση του, απαραίτητο στάδιο στις διαδικασίες εκχύλισης και συσκευασίας του προϊόντος. Το μέλι υποβάλλεται συνήθως σε θερμική επεξεργασία με σκοπό τη μείωση της τάσης του να κρυσταλλώνει ή απλώς στοχεύοντας στην καθυστέρηση της κρυστάλλωσής του, αλλά και για την παρεμπόδιση της ανάπτυξης της υπάρχουσας μικροχλωρίδας με την οποία ενδεχομένως έχει επιμολυνθεί το προϊόν (Fallico et al., 2004, Tosi et al., 2002, Turkmen et al., 2006). Η κρυστάλλωση του μελιού και η μικροβιακή ζύμωση είναι φαινόμενα που σχετίζονται στενά με τις διεργασίες αλλοίωσής του. Τα κρυσταλλωμένα μέλια συνήθως παρουσιάζουν απώλεια στην ομοιογένειά τους, ενώ η συνύπαρξη υγρής και κρυσταλλικής φάσης συμβάλλει στην αύξηση της ενεργότητας του νερού επιτρέποντας την ανάπτυξη των ενδογενών οσμόφιλων ζυμών στην πλούσια σε γλυκόζη και φρουκτόζη υγρή φάση (Chirife et al., 2006, Tosi et al., 2002). Η θέρμανση του μελιού διεξάγεται με δύο διαφορετικούς τρόπους: α) διατηρώντας το προϊόν σε θαλάμους όπου διοχετεύεται και κυκλοφορεί αέρας στη θερμοκρασία των C για 4-7 ημέρες, ή βυθίζοντας σε ζεστό νερό, κατάλληλα τύμπανα που περιέχουν το προϊόν (Fallico et al., 2004). Στη βιβλιογραφία, η έκταση της θερμικής επεξεργασίας του μελιού σχετίζεται συνήθως με τη συγκέντρωση της περιεχόμενης σε αυτό 5-υδροξυμέθυλο-φουρφουράλης (HMF) και την ενεργότητα του ενζύμου διαστάση. Οι δύο αυτοί δείκτες ποιότητας, θεωρούνται ότι αντικατοπτρίζουν αξιόπιστα 103

138 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή το θερμικό ιστορικό του προϊόντος (Bath και Singh, 1999, Fallico et al., 2004, Mendes et al., 1998, Moreira et al., 2007, Tosi et al., 2002, 2008, White 1994). Ωστόσο, το χρώμα του μελιού αποτελεί συνήθως το κύριο χαρακτηριστικό που καθορίζει την αποδοχή του από τον καταναλωτή, καθώς και ένα πρακτικό εργαλείο εκτίμησης της ποιότητας και κατά συνέπεια της τιμής του, στην παγκόσμια αγορά (Gonzales et al., 1999). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή τα δύο συστήματα τροφίμων που εξετάστηκαν (συμπυκνωμένος χυμός μήλου και μέλι) αραιώθηκαν κατάλληλα σε διάφορα επίπεδα ενεργότητας νερού προκειμένου να μελετηθεί και η ταυτόχρονη επίδραση του παράγοντα α w στην έκταση της προκαλούμενης αμαύρωσης. Η κινητική μελέτη του φαινομένου στηρίχτηκε στην ανάπτυξη ενός εμπειρικού κινητικού μοντέλου που περιγράφει ταυτόχρονα τη θερμοκρασιακή ευαισθησία και την επίδραση της α w (ή της περιεχόμενης συγκέντρωσης διαλυτών στερεών) στη μεταβολή της έντασης του χρώματος των δύο προϊόντων τροφίμων (ως ποιοτική μεταβλητή απόκρισης υιοθετήθηκε ο σχηματισμός χρώματος στα δύο συστήματα), τόσο σε ισόθερμες όσο και σε μεταβαλλόμενες συνθήκες θέρμανσης. 104

139 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η μεθοδολογία που υιοθετήθηκε στην παρούσα διατριβή για την παρακολούθηση της ποιότητας συστημάτων τροφίμων με χρήση της κινητικής, αφορά δυο ξεχωριστές κατηγορίες ποιοτικής υποβάθμισης. Η πρώτη περιλαμβάνει την ποιοτική υποβάθμιση συστημάτων τροφίμων μέσης ή υψηλής περιεκτικότητας σε υγρασία κατά τη θέρμανση τους, με κύρια αιτία υποβάθμισης την αντίδραση μη ενζυμικής αμαύρωσης. Αντικείμενο της μελέτης αυτής αποτέλεσε η μεταβολή στο χρώμα κατά τη θέρμανση α) συμπυκνωμάτων χυμού μήλου και β) μελιού όπως και των αραιωμένων σε νερό διαλυμάτων αυτού, ως δύο περιπτώσεις ρευστών προϊόντων με μέση ενεργότητα νερού τα οποία υποβαθμίζονται εξαιτίας της μη ενζυμικής αμαύρωσης. Η δεύτερη κατηγορία ποιοτικής υποβάθμισης που διερευνήθηκε αφορά τη μικροβιολογική αλλοίωση τροφίμων και με αφορμή αυτόν τον τύπο απώλειας της ποιότητας αναπτύχθηκε ένας μικροβιακός χρονοθερμοκρασιακός δείκτης (Time Temperature Indicator, TTI) η εφαρμογή του οποίου αξιολογήθηκε κατά την μικροβιολογική αλλοίωση φρέσκου βοδινού κρέατος συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα. Συνεπώς, στο κεφάλαιο αυτό θα παρατεθούν εκτενώς τα υλικά και οι μέθοδοι που υιοθετήθηκαν για τις δύο αυτές κατηγορίες ξεχωριστά, χάριν καλύτερης κατανόησης του πειραματικού σχεδιασμού και της μεθοδολογίας που ακολουθήθηκε. 3.1 Μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης προϊόντων τροφίμων μέσης και υψηλής περιεκτικότητας σε υγρασία Υλικά Ως πρώτη ύλη για τη μελέτη αυτή, χρησιμοποιήθηκε ένα εμπορικό σκεύασμα συμπυκνωμένου χυμού μήλου με αρχικό επίπεδο ενεργότητας νερού, α w, 0.740, και συγκέντρωση στερεών 70 Bx, ευγενική προσφορά μιας ελληνικής βιομηχανίας 105

140 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή επεξεργασίας χυμών. Το εν λόγω σκεύασμα συντηρήθηκε στην κατάψυξη (<-20 C) καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Το προϊόν αυτό αποτέλεσε το μητρικό συμπυκνωμένο διάλυμα χυμού από το οποίο παρασκευάσθηκαν όλα τα δείγματα των μεταχειρίσεων που εξετάστηκαν στη μελέτη αυτή. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε σορβιτόλη της εταιρίας Sigma- Aldrich Co. (Gillingham, Dorset) για την παραγωγή δειγμάτων με διαφορετικά επίπεδα ενεργότητας νερού. Επιπλέον, αντικείμενο μελέτης αποτέλεσε και το μέλι από άνθη πορτοκαλιάς προερχόμενο από τη γεωγραφική περιοχή της Σπάρτης, με α w Το προϊόν αυτό επιλέχτηκε μεταξύ άλλων για την αυξημένη συγκέντρωσή του σε διαλυτά στερεά, γεγονός που θα επέτρεπε επίσης και στην παραγωγή αραιωμένων με νερό δειγμάτων μελιού σε ένα μεγάλο εύρος επιπέδων α w. Ο συγκεκριμένος τύπος μελιού έφερε επίσης ανοιχτό κιτρινωπό χρωματισμό. Συνεπώς, το προϊόν αυτό προσέφερε πολλά πλεονεκτήματα σε ότι αφορά τη δυνατότητα μελέτης της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης και τη διερεύνηση της επίδρασης της θερμοκρασίας και της ενεργότητας του νερού στο ρυθμό της αντίδρασης, στην περιοχή διακύμανσης της α w όπου συνήθως παρατηρείται το μέγιστο του ρυθμού της αντίδρασης για τα εξαιρετικά συμπυκνωμένα συστήματα, δηλαδή σε τιμές ενεργότητας νερού κοντά στο 0.7. Για την προετοιμασία όλων των αραιωμένων διαλυμάτων - αιωρημάτων χρησιμοποιήθηκε διπλά απεσταγμένο νερό Προετοιμασία δειγμάτων Δείγματα συμπυκνωμένου χυμού μήλου Το αρχικό συμπύκνωμα χυμού μήλου εξερχόμενο από την κατάψυξη αφέθηκε να εξισορροπηθεί σε θερμοκρασία δωματίου κι ακολούθως, είτε αραιώθηκε σε διαφορετικές αναλογίες με απεσταγμένο νερό είτε αναμίχθηκε κατάλληλα με διαλύματα σορβιτόλης νερού διαφόρων συγκεντρώσεων (η χρήση διαφορετικής συγκέντρωσης διαλυμάτων σορβιτόλης ή η προσθήκη νερού συνέβαλλε στη διαφοροποίηση της ενεργότητας νερού των τελικών μιγμάτων που παρήχθησαν) ώστε να παρασκευασθούν συνολικά δέκα (10) διαλύματα χυμού μήλου στα ακόλουθα επίπεδα α w : 0.74, 0.82, 0.87, 0.93 και Αυτές οι δύο ομάδες διαλυμάτων διέφεραν ως προς την αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων σακχάρων αλλά όχι ως προς την α w. Στην πρώτη ομάδα διαλυμάτων (που παρασκευάστηκε έπειτα από αραίωση με απεσταγμένο νερό), τα αντιδρώντα σάκχαρα συμμετείχαν στο εύρος των 70 με Bx, ακολουθώντας αντίστοιχα το εύρος ενεργότητας νερού που 106

141 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι μόλις αναφέρθηκε. Ωστόσο, η δεύτερη ομάδα διαλυμάτων χυμού (που παρήχθησαν μετά από ανάμιξη του συμπυκνωμένου χυμού με κατάλληλες ποσότητες διαλυμάτων σορβιτόλης νερού, διατηρώντας σταθερή την αναλογία όγκου των αναμίξιμων ρευστών σταθερή), είχε την ίδια αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων, σταθερή στα Bx για όλα τα διαλύματα. Η χρήση της σορβιτόλης, ως ένα οσμωτικά ενεργό συστατικό το οποίο όμως δεν αντιδρά κατά Maillard όπως τα λοιπά ανάγοντα σάκχαρα, έδωσε τη δυνατότητα αξιολόγησης της επίδρασης της α w στην ανάπτυξη μελανών χρωματισμένων ουσιών, ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών Αραιωμένα συστήματα μελιού Το αρχικό δείγμα μελιού (α w 0.54) αναμίχθηκε προσεχτικά με τις κατάλληλες ποσότητες απεσταγμένου νερού για την παρασκευή αραιωμένων συστημάτων που διέφεραν ως προς τη συγκέντρωση σε στερεά συστατικά και τα επίπεδα ενεργότητας νερού. Πιο συγκεκριμένα, οι τελικές τιμές α w που επιτεύχθηκαν πέραν της αρχικής 0.54 ήταν 0.70, 0.87 και Μετρήσεις α w, υγρασίας και ph Η μέτρηση της ενεργότητας του νερού, α w, όλων των δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου και αραιωμένων διαλυμάτων μελιού τόσο κατά την έναρξη όσο και κατά τη λήξη της θερμικής επεξεργασίας, έγινε με τη χρήση του μετρητή ενεργότητας νερού, α w meter (Aqualab, Model series 3TE, Decagon Devices Incorporation, Pullman Washington) στους 20 C. Η μέτρηση της περιεχόμενης υγρασίας στο μητρικό δείγμα μελιού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη σχέση μεταξύ του μετρούμενου δείκτη διάθλασης στη θερμοκρασία των 20 C και της συγκέντρωσης του νερού (AOAC, 1990). Το ph των δειγμάτων χυμού μήλου καθώς και των αραιωμένων διαλυμάτων αυτού μετρήθηκε με Microprocessor ph meter (ph 211, Hanna Instruments) στους 25 C. Το ph του αρχικού συμπυκνωμένου χυμού μήλου με α w 0.74 ήταν 3.81 και αυξήθηκε ελαφρώς κατά τη σταδιακή αραίωσή του στα τελικά επίπεδα ενεργότητας νερού 0.82, 0.87, 0.93 και 0.99 σε 3.83, και 4.0, αντίστοιχα. Η μεταβολή αυτή του ph δε θεωρήθηκε σημαντική και συνεπώς ο παράγοντας αυτός δεν κρίθηκε άξιο να διερευνηθεί περαιτέρω για την επίδρασή του στη μη ενζυμική αμαύρωση του χυμού. Το ph του μελιού εκτιμήθηκε 3.80, ενώ το αντίστοιχο ph των αραιωμένων διαλυμάτων αυτού δε μετρήθηκε, θεωρώντας 107

142 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή πως οι αναμενόμενες μικρές διαφοροποιήσεις δεν επιδρούν σημαντικά στην κινητική της μη ενζυμικής αμαύρωσής του εν λόγω συστήματος Ισόθερμη θέρμανση και φασματοφωτομετρικές μετρήσεις Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Τα δέκα δείγματα χυμού μήλου, που διέφεραν ως προς την α w ή/και τη συγκέντρωση των αντιδρώντων σακχάρων τοποθετήθηκαν σε ερμητικά κλειστούς δοκιμαστικούς σωλήνες και θερμάνθηκαν υπό ισόθερμες συνθήκες στους 60, 70, 80 και 90 C σε υψηλής ακρίβειας κλιβάνους (±0.2 C) (model MIR 153, Sanyo Electric Co., Ora-Gun, Gunma, Japan). Δύο επαναλήψεις για καθένα συνδυασμό θερμοκρασίας και α w λαμβάνονταν σε κάθε δειγματοληψία. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δοκιμαστικοί σωλήνες αποσύρονταν από τους κλιβάνους εφαρμογής της θερμικής επεξεργασίας, ψύχονταν ταχέως σε πάγο και αποθηκεύονταν στην κατάψυξη μέχρι τη στιγμή της ανάλυσής τους. Όλα τα δείγματα συμπυκνωμένου χυμού μήλου αραιώθηκαν στα Bx πριν την ανάλυση, περιεκτικότητα στερεών στο επίπεδο όπου συνήθως αραιώνεται ο εμπορικός χυμός πριν την αποδέσμευσή του στην αγορά. Η έκταση του σχηματισμού χρωστικών μελανού χρώματος εκτιμήθηκε φασματοφωτομετρικά με φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ορατού (UV-Vis spectrophotometer, SP-8001 UV-Vis, Metertech Inc.) μετρώντας την απορρόφηση σε κυψελίδα των 10 mm έναντι του νερού στα 420 nm ως συνάρτηση του χρόνου. Όλα τα δείγματα αραιώθηκαν εκ νέου, όπου αυτό κρίθηκε απαραίτητο, για την καταγραφή μετρήσεων απορρόφησης στο εύρος μονάδων, προς ικανοποίηση της απαίτησης για ύπαρξη γραμμικότητας μεταξύ των καταγραφούμενων απορροφήσεων και της συγκέντρωσης χρωμοφόρων ουσιών, σύμφωνα με το νόμο των Lambert-Beer. Συνεπώς, προέκυψαν συολικά ογδόντα (80) καμπύλες απορρόφησης - χρόνου (τέσσερα επίπεδα εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας, πέντε επίπεδα α w, δύο ομάδες διαλυμάτων και δύο επαναλήψεις για καθένα από τους παραπάνω συνδυασμούς) για την περιγραφή της κινητικής της μη ενζυμικής αμαύρωσης των δειγμάτων του χυμού μήλου. Επιπλέον, σε ανεξάρτητα πειράματα από αυτά που περιγράφηκαν προηγουμένως, τρία νέα δείγματα χυμού μήλου με ενδιάμεσα επίπεδα α w 0.74, 0.85, και 0.96, προετοιμάστηκαν με αραίωση του μητρικού συμπυκνωμένου χυμού μήλου με απεσταγμένο νερό, και θερμάνθηκαν ισόθερμα στους 65, 75, και 85 C. Η κινητική σχηματισμού χρωμοφόρων ουσιών μελανού χρωματισμού εκτιμήθηκε για άλλη μια φορά μετρώντας την απορρόφηση στα 420 nm. Τα δεδομένα που προέκυψαν από αυτό το ανεξάρτητο πείραμα 108

143 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν στην αξιολόγηση του μοντέλου. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν εκτεταμένοι χρόνοι θερμικής επεξεργασίας των δειγμάτων, που υπερβαίνουν τα συνήθη πραγματοποιούμενα πρωτόκολλα θέρμανσης που είθισται να εφαρμόζονται κατά τις διεργασίες της παστερίωσης-αποστείρωσης. Ωστόσο, η πρακτική αυτή κρίθηκε απαραίτητη για την απόκτηση μιας περισσότερο ολοκληρωμένης περιγραφής της κινητικής της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης κάτω από ένα μεγαλύτερο εύρος συνθηκών θερμικής καταπόνησης χρόνου των δειγμάτων Περίπτωση μελιού Αντίστοιχη μεθοδολογία ακολουθήθηκε και στην περίπτωση της θερμικής επεξεργασίας του μελιού. Τα τέσσερα στο σύνολό τους διαφορετικά αραιωμένα δείγματα μελιού θερμάνθηκαν σε ηπιότερες συνθήκες σε σχέση με το χυμό μήλου (50, 60, 70, 80 C). Η έκταση της μη ενζυμικής αμαύρωσης εκτιμήθηκε και πάλι μετρώντας την απορρόφηση στα 420 nm, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, μετά την εφαρμογή των παρακάτω πρακτικών που κρίθηκαν απαραίτητες για την παραλαβή διαυγών διαλυμάτων-αιωρημάτων και την ορθή μέτρηση της απορρόφησής τους. Στα δείγματα αραιωμένου μελιού προστέθηκε η κατάλληλη ποσότητα απεσταγμένου νερού προκειμένου να επιτευχθεί κοινή για όλα τα δείγματα συγκέντρωση υγρασίας (τιμή α w 0.97), και ακολούθησε φυγοκέντρησή τους (10 min, 10,000 g). Επίσης, πριν τη μέτρηση της απορρόφησης των αιωρημάτων ελέγχθηκε η πιθανή ανάγκη εκ νέου αραίωσής τους, για την καταγραφή ορθών μετρήσεων απορρόφησης στα όρια δυναμικότητας του φασματοφωτομέτρου (μονάδες απορρόφησης 0-1.8). Ο συνδυασμός των διαφορετικών επιπέδων ενεργότητας νερού και εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας και η επανάληψη εις διπλούν των πειραματικών μεταχειρίσεων που προέκυψαν, έδωσε τριάντα δύο (32) διαφορετικές καμπύλες απορρόφησης χρόνου οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη του μοντέλου κινητικής της μη ενζυμικής αμαύρωσης κατά τη θέρμανση του μελιού Ανάπτυξη κινητικών μοντέλων Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Τα πειραματικά δεδομένα από τις 80 καμπύλες απορρόφησης-χρόνου προσαρμόστηκαν σε πέντε πρωτογενή κινητικά μοντέλα κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου Table Curve 2D software (v4, SPSS Inc), σύμφωνα με τις ακόλουθες εξισώσεις: το μοντέλο ψευδο-μηδενικής τάξης, 109

144 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή A = A 0 + kt (3.1) το μοντέλο ψευδο-πρώτης τάξης, A = A 0 exp( kt) (3.2) το παραβολικό μοντέλο (Buedo et al., 2001), ( A k ) 2 A = + (3.3) 0 t το μοντέλο weibull, β A = A + ( A Amax )exp[ ( kt) ] (3.4) max και το λογιστικό μοντέλο, 0 Amax A0 A = A0 + (3.5) 1+ exp[ k( t t i )] όπου Α είναι η μέτρηση της απορρόφησης στα 420 nm τη χρονική στιγμή t, A 0 είναι η αρχική απορρόφηση κατά την έναρξη του πειράματος (t=0) στο ίδιο μήκος κύματος, k είναι η σταθερά του ρυθμού αμαύρωσης (h -1 ), A max είναι η μέγιστη απορρόφηση, β είναι μια σταθερά που σχετίζεται με το σχήμα της καμπύλης στο μοντέλο weibull (εξ. 3.4), και t i είναι ο χρόνος (σε h) στον οποίο παρατηρείται το ήμισυ της μέγιστης απορρόφησης στο λογιστικό μοντέλο (εξ. 3.5). Οι εκτιμήσεις των σταθερών του ρυθμού της αντίδρασης (k) και άλλων παραμέτρων των μοντέλων προσαρμόστηκαν ακολούθως σε δευτερογενή μοντέλα. Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά μοντέλα που περιγράφουν τα μεμονωμένα και συνδυασμένα αποτελέσματα της επίδρασης της θερμοκρασίας και της α w στις τιμές του k, τα οποία και αξιολογήθηκαν συγκριτικά. Ένα από τα δευτερογενή μοντέλα είναι το ακόλουθο τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius: lnk = ln k ref + d( α w α w ref Eα ) R 1 1 T T ref (3.6) όπου Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία (Κ), Ε α είναι η ενέργεια ενεργοποίησης (kj/mol), R είναι η παγκόσμια σταθερά των αερίων (8.314 J/mol K), T ref είναι η θερμοκρασία αναφοράς (373 Κ ή 100 C), α w ref είναι η ενεργότητα νερού στη θερμοκρασία αναφοράς, ίση με 1, k ref η σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης (h -1 ) στη θερμοκρασία αναφοράς και την α w αναφοράς, και d είναι μια σταθερά που εκφράζει την επίδραση της α w στο ρυθμό k. Ένα άλλο μοντέλο που εξετάστηκε είναι το βασισμένο στη γενική εξίσωση Belehradek μοντέλο, το οποίο συνήθως χρησιμοποιείται για την περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης των βιολογικών ρυθμών ανάπτυξης. Εδώ, το συγκεκριμένο μοντέλο αποτυπώνει αντίστοιχα, την εξάρτηση του ρυθμού της μη ενζυμικής αμαύρωσης από τη θερμοκρασία 110

145 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι και την α w, ως ακολούθως: k = b( T T α α (3.7) min ) w max w όπου Τ είναι η θερμοκρασία ( C), T min και α w max είναι οι εκτιμούμενες παράμετροι που εκφράζουν τις θεωρητικές συνθήκες ελάχιστης θερμοκρασίας και μέγιστης ενεργότητας νερού (α w =1) στις οποίες μπορεί να παρατηρηθεί η μη ενζυμική αμαύρωση, ενώ η παράμετρος b είναι μια σταθερά. Τέλος, έγινε προσαρμογή των δεδομένων και σε δύο δευτερογενή μοντέλα τα οποία και έδωσαν τη δυνατότητα εκτίμησης των τιμών k ή της τετραγωνικής ρίζας των τιμών k ( k ), σύμφωνα με την πολυωνυμική εξίσωση που δίνεται παρακάτω: 2 2 Y = α + ( α T) + ( α α ) + ( α T α ) + ( α T ) + ( α ) (3.8) w 4 w 5 6 αw όπου τη θέση του όρου Υ παίρνει αντίστοιχα μία από τις προαναφερθείσες μεταβλητές (k ή k ), Τ είναι η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία ( C), και α 1 ως α 6 οι εκτιμούμενοι συντελεστές των εξισώσεων. Τα ίδια δευτερογενή μοντέλα προσαρμόστηκαν επίσης και σε άλλες παραμέτρους που εξήχθησαν από τα πρωτογενή μοντέλα όπως αυτή της μέγιστης απορρόφησης, A max, και του χρόνου t i στην περίπτωση του λογιστικού μοντέλου. Η τροποποιημένη εξίσωση Arrhenius, και οι πολυωνυμικές εξισώσεις για τις παραμέτρους A max, lna max, t i, και lnt i εξετάστηκαν για άλλη μια φορά ως προς τη δυνατότητα περιγραφής των μεμονωμένων και συνδυασμένων επιδράσεων της θερμοκρασίας και της α w (εξ. 3.6 και 3.8) στις παραμέτρους αυτές. Η προσαρμογή των δευτερογενών μοντέλων (εξ ) στα δεδομένα έγινε με τη μέθοδο της ανάλυσης παραλλακτικότητας κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου TableCurve ΤΜ 3D (v3, SPSS Inc.). Εφαρμόζοντας την ανάλυση παλινδρόμησης εκτιμήθηκαν οι τιμές F όλων των όρων παραμέτρων των εξισώσεων και τελικά προσδιορίστηκαν οι στατιστικώς σημαντικοί όροι αυτών Περίπτωση μελιού Στην περίπτωση της μοντελοποίησης της κινητικής μη ενζυμικής αμαύρωσης του μελιού, ακολουθήθηκε η ίδια μεθοδολογία που μόλις περιγράφηκε για την κινητική σχηματισμού χρωστικών μελανού χρώματος στα συμπυκνώματα χυμού μήλου. Έχοντας καταλήξει, από τη μελέτη του συμπυκνωμένου χυμού μήλου, πως μεταξύ των πέντε πρωτογενών κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν η λογιστική εξίσωση ήταν αυτή που περιέγραψε καλύτερα τη μη ενζυμική αμαύρωση στα δείγματα του χυμού, το ίδιο μοντέλο υιοθετήθηκε και για την περιγραφή της επίδρασης της θέρμανσης στο χρώμα των 111

146 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή δειγμάτων μελιού. Έτσι, με τη βοήθεια του λογισμικού πακέτου Table Curve 2D software (v4, SPSS Inc) οι 32 καμπύλες απορρόφησης χρόνου προσαρμόστηκαν σε μια τροποποιημένη μορφή της λογιστικής εξίσωσης η οποία παρουσιάζεται ως εξής: A = A 1+ A max 0 Amax (3.9) 1 exp( kt) όπου Α είναι η μετρούμενη απορρόφηση στα 420 nm τη χρονική στιγμή t, Α 0 είναι η αρχική απορρόφηση κατά την έναρξη του πειράματος (t=0) στο ίδιο μήκος κύματος, k είναι η σταθερά του ρυθμού αμαύρωσης (h -1 ), και A max είναι η μέγιστη απορρόφηση. Οι τιμές των παραμέτρων που συμμετέχουν στη λογιστική εξίσωση προσδιορίστηκαν, και στη συνέχεια προσαρμόστηκαν στα δευτερογενή μοντέλα (εξ ) όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οπότε και εξετάστηκε η επίδραση, μεμονωμένα ή και σε συνδυασμό, της εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας και της α w στις παραμέτρους k και Α max. Η μέθοδος της ανάλυσης παλινδρόμησης και το λογισμικό πακέτο TableCurve TM 3D software (v3, SPSS Inc.) χρησιμοποιήθηκαν, ενώ οι στατιστικώς σημαντικές παράμετροι των εξισώσεων προσδιορίστηκαν αφού προηγουμένως απαλείφθηκαν σταδιακά οι στατιστικώς μη σημαντικοί όροι, όπως προέκυψε από τον έλεγχο, για τους όρους αυτούς, της τιμής του στατιστικού F. Εκτός από τα δευτερογενή μοντέλα που έχουν ήδη αναφερθεί, το μοντέλο WLF (Williams et al., 1955), εξετάστηκε επίσης ως ένας εναλλακτικός τρόπος περιγραφής της θερμοκρασιακής εξάρτησης της σταθεράς του ρυθμού της μη ενζυμικής αμαύρωσης, k: kg C1 log = k C2 + ( T Tg ) ( T T ) g (3.10) όπου T g είναι η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης, k είναι ο ρυθμός της αντίδρασης στη θερμοκρασία Τ, k g είναι η σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης στο Τ g, και C 1 και C 2 είναι σταθερές της εξίσωσης WLF. Το μοντέλο προσαρμόστηκε στα πειραματικά δεδομένα σε μια προσπάθεια εφαρμογής του στο εύρος θερμοκρασιών που εξετάστηκαν στη μελέτη αυτή (50-80 C), αρκετά μακριά από το T g των δειγμάτων μελιού Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) Η περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης των ρυθμών της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και στα αραιωμένα διαλύματα αυτού από το μοντέλο WLF, απαιτεί τον προσδιορισμό των θερμοκρασιών υαλώδους μετάπτωσης (glass transition temperatures, T g ) όλων των δειγμάτων του μελιού. Οι τιμές T g προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της διαφορικής 112

147 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι θερμιδομετρίας σάρωσης, DSC, στο θερμιδόμετρο PL DSC-Gold (Polymer Labs. Ltd, Epsom, UK). Η βαθμονόμηση της ροής θερμότητας έγινε χρησιμοποιώντας ως αναφορά τη γνωστή ενθαλπία τήξης του ινδίου (καθαρότητα %), ενώ η βαθμονόμηση της θερμοκρασίας έγινε με κυκλοεξάνιο, δωδεκάνιο, και οκτάνιο. Μικροποσότητες από το μητρικό διάλυμα μελιού και τα αραιωμένα διαλύματα αυτού ( mg) σφραγίστηκαν ερμητικά σε καψύλλια από ανοξείδωτο ατσάλι και η σάρωσή τους στο θερμιδόμετρο έγινε κάτω από συνεχή ροή ξηρού αερίου N 2 προς απομάκρυνση της συμπυκνούμενης υγρασίας. Αρχικά τα καψύλλια θερμάνθηκαν από τους +20 ως +60 C με ρυθμό θέρμανσης 5 C min -1 για να διασφαλιστεί η τήξη όλων των πιθανών κρυστάλλων και την επίτευξη της επιθυμητής θερμοδυναμικής ισορροπίας. Τα δείγματα στη συνέχεια ψύχθηκαν ταχύτατα με υγρό άζωτο στους -100 C και επαναθερμάνθηκαν στους +50 C, με ρυθμό θέρμανσης 5 C min 1. Το T g προσδιορίστηκε ως η θερμοκρασία κατά την έναρξη (onset) της παρατηρούμενης σταδιακής μείωσης (μετάπτωσης) στη συνάρτηση της ροής θερμότητας, όπως αυτή απεικονίζεται σε ένα τυπικό θερμόγραμμα DSC, κατά τη δεύτερη σάρωση. Ωστόσο, η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό του T g του μητρικού δείγματος του μελιού και των αραιωμένων του διαλυμάτων, παρουσίασε μια αδυναμία κατά την εκτίμηση του T g των μεταχειρίσεων με επίπεδα α w μεγαλύτερα από Για τα δείγματα αυτά ο υπολογισμός των T g βασίστηκε στη μαθηματική σχέση που συνδέει το T g και την περιεχόμενη στο υπό εξέταση σύστημα υγρασία, όπως αυτή περιγράφεται από την εξίσωση Gordon-Taylor (Gordon και Taylor, 1952). Προκειμένου να αποκτηθούν επαρκή ζεύγη δεδομένων συγκεντρώσεων υγρασίας και T g για την εφαρμογή του μοντέλου Gordon Taylor, που θα επέτρεπε στη συνέχεια την επέκταση των δεδομένων και τον υπολογισμό του T g των μεταχειρίσεων που δεν μπορούσαν να προσδιοριστούν πειραματικά, δημιουργήθηκαν νέα δείγματα διαλυμάτων μελιού, με διαφορετική συγκέντρωση υγρασίας και άρα διαφορετικά επίπεδα α w από αυτά των αιωρημάτων μελιού που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της θερμικής επεξεργασίας, τα οποία και σαρώθηκαν στο θερμιδόμετρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Πιο συγκεκριμένα, το μητρικό δείγμα μελιού (περιεχόμενη υγρασία 15.5 % όπως προσδιορίστηκε μετρώντας το δείκτη διάθλασης) είτε αραιώθηκε με νερό σε ενδιάμεσα επίπεδα υγρασίας (23.2%, 34.2%, 38.9% με αντίστοιχες τιμές α w 0.65, 0.77, 0.80), ή συμπυκνώθηκε υπό κενό σε χαμηλότερα επίπεδα περιεχόμενης υγρασίας (13.8%, 14.7%, 15.2% και αντίστοιχες τιμές α w 0.50, 0.52, 0.53). Η εξάρτηση της θερμοκρασίας υαλώδους μετάπτωσης από την υγρασία περιγράφεται από το μοντέλο Gordon Taylor ως εξής: 113

148 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή T w T + k' w T 1 g1 2 g2 g = (3.11) w1 + k' w2 όπου T g είναι η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης του δείγματος, T g1 και T g2 είναι οι θερμοκρασίες υαλώδους μετάπτωσης των στερεών (δείγμα με μηδενική περιεχόμενη υγρασία) και του νερού, αντίστοιχα, w 1 και w 2 είναι τα κλάσματα βάρους των στερεών και του νερού, αντίστοιχα, και k μία εμπειρική σταθερά. Οι εκτιμούμενες πειραματικές τιμές T g προσαρμόστηκαν στην παραπάνω εξίσωση χρησιμοποιώντας το λογισμικό Table Curve 2D software, ακολούθησε αριστοποίηση των παραμέτρων k και T g1, ενώ για τον όρο T g2 που αναφέρεται στο νερό υιοθετήθηκε η τιμή -138 C (135 K) (Sugisaki et al., 1968). Στη συνέχεια, οι άγνωστες τιμές T g των δειγμάτων μελιού με α w 0.87 και 0.97 υπολογίστηκαν ως λύσεις της εξίσωσης Αξιολόγηση των κινητικών μοντέλων Περίπτωση συμπυκνωμένου χυμού μήλου Τα δευτερογενή μαθηματικά μοντέλα, τα οποία ανέδειξαν τη σταθερά του ρυθμού k, ως τη σημαντικότερη παράμετρο που καθορίζει την πορεία της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο συμπυκνωμένο χυμό μήλου, αξιολογήθηκαν συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες από τα μοντέλα τιμές των ρυθμών της αμαύρωσης με αυτές που προέκυψαν έπειτα από παρατηρήσεις σε ανεξάρτητα πειράματα, σε τρεις διαφορετικές εφαρμοζόμενες θερμοκρασίες επεξεργασίας (65, 75, 85 C) και επίπεδα α w (0.74, 0.85, 0.96). Τέλος, το γενικευμένο μοντέλο που αναπτύχθηκε από τα πειραματικά δεδομένα κατά τη θέρμανση των δειγμάτων του χυμού στις ισόθερμες συνθήκες, αξιολογήθηκε έναντι μετρούμενων τιμών σχηματισμού χρωμοφόρων ουσιών συμπυκνωμάτων του χυμού μετά από θερμική επεξεργασία αυτού κάτω από μη ισόθερμες συνθήκες και δυναμικά πρωτόκολλα θέρμανσης κατά τα οποία η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία μεταβάλλονταν περιοδικά μεταξύ των 65 και 85 C. Τα αυξομειούμενα πρωτόκολλα θερμοκρασίας χρόνου που εφαρμόστηκαν καταγράφηκαν λεπτομερώς χρησιμοποιώντας έναν θερμοκρασιακό καταγραφέα δεδομένων (Hobo U12 Stainless Temp Data Logger, Onset Computers Corporation, southern MA USA) και το συνοδευόμενο λογισμικό (Hoboware TM software, v2) Περίπτωση μελιού Ομοίως, η αξιολόγηση του μοντέλου που περιγράφει τη μη ενζυμική αμαύρωση στο μέλι έγινε συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες τιμές των παραμέτρων των δευτερογενών 114

149 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι μοντέλων που αναπτύχθηκαν, με τις πραγματικές τιμές αυτών των παραμέτρων που προσδιορίστηκαν πειραματικά σε δύο νέες εφαρμοζόμενες θερμοκρασίες (65, 75 C) και επίπεδα α w (0.80, 0.90), διαφορετικά από τα ήδη αναφερθέντα, και τα οποία συμμετείχαν αρχικά στην ανάπτυξη των μοντέλων. Επίσης, τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν κατά τη μελέτη της εφαρμογής θερμότητας κάτω από ισόθερμες συνθήκες, αξιολογήθηκαν ως προς την προβλεπόμενη ισχύ τους σε μεταβαλλόμενες-δυναμικές συνθήκες θέρμανσης. Στο στάδιο αυτό η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία μεταβάλλονταν περιοδικά από τους 55 στους 75 C. Πιο συγκεκριμένα δύο διαφορετικά πρωτόκολλα θέρμανσης μελετήθηκαν. Στο πρώτο, τα δείγματα μελιού θερμάνθηκαν για 12 h στους 55 και 12 h στους 75 C, ενώ στο δεύτερο η θέρμανση αφορούσε παραμονή των δειγμάτων για 12 h στους 55, 6 h στους 65 και 6 h στους 75 C. Τα χρόνο-θερμοκρασιακά δεδομένα των εφαρμοζόμενων προφίλ καταγράφηκαν και πάλι με τη βοήθεια των ίδιων καταγραφέων που χρησιμοποιήθηκαν και προηγουμένως στην περίπτωση του χυμού μήλου. 3.2 Ανάπτυξη και αξιολόγηση ενός μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη Στη μελέτη ανάπτυξης ενός μικροβιακού χρονοθερμοκρασιακού δείκτη, βασικός στόχος ήταν ο σχεδιασμός ενός συστήματος το οποίο να περιγράφει ικανοποιητικά ή να προσομοιάζει σε μεγάλο βαθμό την πραγματική διεργασία της ποιοτικής υποβάθμισης φρέσκων προϊόντων τροφίμων, δηλαδή τη μικροβιακή αλλοίωση. Δεδομένου, ότι η αλλοίωση φρέσκου κρέατος συσκευασμένου υπό κενό ή τροποποιημένη ατμόσφαιρα, οφείλεται στα γαλακτικά βακτήρια, η ανάπτυξη ενός μικροβιακού ΤΤΙ που θα χρησιμοποιούνταν σε μια τέτοια περίπτωση, αποτέλεσε αντικείμενο της μελέτης αυτής. Συγκεκριμένα, αναζητήθηκε το κατάλληλο στέλεχος γαλακτικού βακτηρίου το οποίο κατά την ανάπτυξη και μεταβολική του δραστηριότητα σε κάποιο θρεπτικό υπόστρωμα προκαλεί τη σταδιακή πτώση του ph στο μέσο ανάπτυξης λόγω της παραγωγής γαλακτικού οξέος, μεταβολή η οποία γίνεται οπτικώς ορατή από τη μη αντιστρεπτή αλλαγή στο χρώμα ενός χημικού δείκτη που επίσης συμμετέχει στο σύστημα. Αρχικά διερευνήθηκαν τα πιθανά δομικά συστατικά του συστήματος ΤΤΙ, και στη συνέχεια μελετήθηκε η σχέση μεταξύ της απόκρισης του ΤΤΙ (χρωματική αλλαγή) και της μικροβιακής ανάπτυξης και μεταβολικής δραστηριότητας (κατανάλωση γλυκόζης, παραγωγή γαλακτικού οξέος, μείωση του ph). 115

150 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Επιπρόσθετα, εξετάστηκε η θερμοκρασιακή εξάρτηση της κινητικής του ΤΤΙ σε ισόθερμες συνθήκες συντήρησης και ακολούθησε η μοντελοποίησή της, ενώ παράλληλα διερευνήθηκε και η επίδραση του αρχικού επιπέδου εμβολίου στο σημείο λήξης του ΤΤΙ. Τέλος, το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε ως προς τη δυνατότητα εφαρμογής του σε φρέσκο αλεσμένο βοδινό κρέας συσκευασμένο υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα κατά την παράλληλη συντήρηση των δύο συστημάτων τόσο κάτω από ισόθερμες όσο και δυναμικές συνθήκες συντήρησης, προσομοιάζοντας τις έντονες διακυμάνσεις που παρατηρούνται στην ψυκτική αλυσίδα. Τα υλικά και η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε περιγράφονται αναλυτικά στη συνέχεια Διερεύνηση των δομικών συστατικών του μικροβιακού ΤΤΙ Στελέχη μικροοργανισμών Εννέα (9) διαφορετικά στελέχη γαλακτικών βακτηρίων, που προηγουμένως είχαν απομονωθεί από αλλαντικά ή προϊόντα κρέατος και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν ως προς το είδος τους, εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν το ph του υποστρώματος, του υπό ανάπτυξη μοντέλου συστήματος ΤΤΙ. Ειδικότερα, μελετήθηκαν τρία στελέχη Lactobacillus sakei (στελέχη LQC 1051, LQC 1086, LQC 1089), δύο στελέχη του είδους Lactobacillus curvatus (στελέχη L30.5, L3.8), δύο στελέχη του είδους Lactobacillus plantarum (στελέχη R30.3, R20.1) και δύο στελέχη του είδους Lactobacillus paracasei (στελέχη Q30.2, Q20.3). Τα στελέχη L. sakei ήταν ευγενική χορηγία του Καθηγητή κ. Ε. Δροσινού και του Εργαστηρίου Υγιεινής και Ποιοτικού Ελέγχου Τροφίμων (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών), ενώ τα λοιπά στελέχη προσφέρθηκαν ευγενικά από τους Καθηγητές κ. Ε. Λιτοπούλου και κ. Ν. Τζανετάκη και την τράπεζα συλλογής γαλακτικών βακτηρίων που διαθέτουν στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων (Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ.) Προετοιμασία εμβολίου Τα στελέχη γαλακτικών βακτηρίων που αναφέρθηκαν συντηρούνταν σε συνθήκες κατάψυξης (-30 C) σε μίγμα MRS broth και γλυκερόλης (70:30 v/v). Ποσότητα 0.01 ml αιωρήματος από τα υπό μελέτη στελέχη μεταφέρθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες σε δοκιμαστικούς σωλήνες με 10 ml MRS broth (Merck, Darmstadt, Germany), ακολούθησε επώαση στους 30 C για 24 h. Οι ανανεωμένες καλλιέργειες μικροοργανισμών ελέγχθηκαν ως προς την καθαρότητά τους με την τεχνική του streaking σε τριβλύα με MRS agar, και εκ νέου επώαση στους 30 C για h. Η ομοιομορφία στη μορφολογία των ανεπτυγμένων 116

151 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι αποικιών καθώς και η χρώση Gram σε συνδυασμό με τη μικροσκοπική εξέταση που ακολούθησε, επιβεβαίωσαν την καθαρότητα των υποψήφιων για χρήση καλλιεργειών. Στη συνέχεια, και για κάθε μια από τις πειραματικές δοκιμές που ακολούθησαν η διαδικασία προετοιμασίας του εμβολίου είχε ως ακολούθως: 0.01 ml από το αιώρημα των καθαρών καλλιεργειών της κατάψυξης εμβολιάστηκε ασηπτικά σε δοκιμαστικούς σωλήνες με 10 ml MRS broth και επωάστηκε στους 30 C για 24 h. Οι ανανεωμένες καλλιέργειες των μικροβιακών κυττάρων που αποτελούν και το πειραματικό εμβόλιο έφεραν συγκέντρωση μικροβιακών κυττάρων της τάξης των CFU/ml. Όλο το περιεχόμενο των δοκιμαστικών σωλήνων μεταφέρθηκε ασηπτικά σε αποστειρωμένους σωλήνες φυγοκέντρου και φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (4 C, 6,000 g, 20 min) (ALC refrigerated centrifuge model PK120R, ALC International Srl., Italy). Το υπερκείμενο υγρό απομακρύνθηκε ενώ το ίζημα των κυττάρων επαναιωρήθηκε στον ίδιο σωλήνα φυγοκέντρου με προσθήκη 10 ml αποστειρωμένου διαλύματος πεπτόνης 0.1% σε νερό και αλάτι (NaCl, 0.85%, w/v) και κατάλληλη ανακίνηση στο vortex για το ξέπλυμα των κυττάρων από το υγρό υπόστρωμα. Ακολούθησε δεύτερη φυγοκέντρηση και μετά η εκ νέου απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού. Η παραπάνω διαδικασία της προσθήκης 10 ml διαλύματος πεπτόνης 0.1% σε νερό και αλάτι επαναλήφθηκε για άλλη μια φορά για την παραλαβή του τελικού αιωρήματος εμβολίου. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με κατάλληλες αραιώσεις του αιωρήματος αυτού και εμβολιασμό του τελικού μέσου ανάπτυξης. Στις περισσότερες από τις πειραματικές δοκιμές το αρχικό επίπεδο εμβολίου στο μέσο ανάπτυξης ρυθμίστηκε σε 10 2 CFU/ml, ωστόσο υπήρξαν και πειράματα όπου το αρχικό επίπεδο εμβολίου διαφοροποιήθηκε από CFU /ml Προετοιμασία μικροβιολογικών υποστρωμάτων Τα υποστρώματα που μελετήθηκαν ως πιθανά θρεπτικά μέσα ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στο υπό ανάπτυξη μικροβιακό σύστημα ΤΤΙ ήταν: Nutrient Broth, NB (Merck, Darmstadt, Germany) εμπλουτισμένο με διάφορα επίπεδα προστιθέμενης γλυκόζης ( % w/v), saline διάλυμα (0.1% w/v proteose peptone και 0.85% NaCl w/v) επίσης εμπλουτισμένο σε διάφορα επίπεδα προστιθέμενης γλυκόζης, Tryptone Soy Broth, TSB (Merck, Darmstadt, Germany) και MRS broth (Merck, Darmstadt, Germany). Επίσης, σε κάποιες περιπτώσεις στο βασικό υπόστρωμα προστέθηκε και εκχύλισμα ζυμών (Yeast extract, Merck, Darmstadt, Germany) σε διάφορες συγκεντρώσεις, για εμπλουτισμό του με επιπλέον πηγής πρωτεΐνης και περισσότερα αμινοξέα, απαραίτητα στοιχεία για την ανάπτυξη των κυττάρων των μικροοργανισμών. Κατάλληλες ποσότητες από τα παραπάνω 117

152 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή υγρά μέσα ανάπτυξης παρασκευάστηκαν και αποστειρώθηκαν αφού πρώτα ρυθμίστηκε το ph τους στο 6.5 πριν την αποστείρωση. Επίσης, εξετάστηκε MRS broth με αρχικό ph 5.7 πριν την αποστείρωση, το οποίο και αποτελεί το φυσιολογικό ph που φέρει το διάλυμα αμέσως μετά την διάλυσή του σε απεσταγμένο νερό Χημικοί χρωματικοί δείκτες Εξετάστηκαν επτά συνολικά διαφορετικοί χημικοί δείκτες ή μίγματα αυτών που παρουσιάζουν μεταβολή χρώματος στην περιοχή ph (περιοχή ph στην οποία συμβαίνει και η μείωση του ph του υποστρώματος προκαλούμενη από την ανάπτυξη του μικροοργανισμού). Ο Πίνακας 3.1 αναφέρει αναλυτικά τα είδη των χημικών δεικτών που εξετάστηκαν καθώς και το εύρος αλλαγής ph και χρώματος για τον καθένα. Οι χημικοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich Co., (Gillingham, Dorset, UK). Ανάλογα με τις ιδιότητες διαλυτότητας των παραπάνω χημικών ενώσεων παρασκευάστηκαν διαλύματα χημικών δεικτών σε συγκεντρώσεις και διαλύτες έτσι ώστε τα τελικά διαλύματα να είναι απόλυτα διαυγή και χωρίς αιωρούμενα κολλοειδή σωματίδια. Στην περίπτωση που οι χημικοί δείκτες επρόκειτο να προστεθούν στο υπόστρωμα ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων, η απαιτούμενη ποσότητα του διαλύματος των χρωματικών δεικτών διηθούνταν υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα από φίλτρο με μέγεθος πόρων 0.45 μm σε αποστειρωμένο περιέκτη για την απομάκρυνση των μικροβιακών κυττάρων του διαλύματος. Η διαδικασία αυτή γνωστή ως ψυχρή αποστείρωση (ή μικροδιήθηση) ήταν απαραίτητη για την αποφυγή επιμολύνσεων του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης των υπό μελέτη μικροοργανισμών αφού η αποστείρωση των διαλυμάτων δεικτών με την καθιερωμένη μέθοδο κρίθηκε ακατάλληλη για τη σταθερότητα και ευαισθησία των ενώσεων αυτών. Πίνακας 3.1. Χημικοί δείκτες, εύρος ph στο οποίο συμβαίνει η χρωματική αλλαγή και μεταβολή του χρώματός τους στο εύρος αυτό. Χημικός δείκτης Εύρος Χρώμα αλλαγής ph Αλκαλική περιοχή Όξινη περιοχή Methyl red (MR) Κίτρινο κόκκινο Chlorophenol red (CPR) Ιώδες κίτρινο Bromocresol purple (BCP) Πορφυρό κίτρινο Bromocresol green + Chlorophenol red (BCG + CPR) Μπλε ιώδες κιτρινοπράσινο Resazurin Ιώδες πορτοκαλί Alizarin Κόκκινο κίτρινο p-nitrophenol Κίτρινο άχρωμο 118

153 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι Προετοιμασία δειγμάτων Κατά την έναρξη της κάθε πειραματικής δοκιμής 0.1 ml από την κατάλληλη αραίωση του αιωρήματος εμβολίου μεταφέρθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες σε φιάλες με το αποστειρωμένο μέσο ανάπτυξης που άλλοτε περιείχε κατάλληλη ποσότητα του χρωματικού δείκτη και άλλοτε όχι (δείγματα μάρτυρες για τη διερεύνηση πιθανής ανασταλτικής δράσης των χημικών δεικτών στην ανάπτυξη των εμβολιασθέντων μικροοργανισμών). Οι φιάλες συντηρήθηκαν κάτω από ελεγχόμενες ισόθερμες συνθήκες ψύξης (0-20 C) σε υψηλής ακρίβειας επωαστικούς κλιβάνους (Sanyo MIR 153, Sanyo MIR 253,Sanyo Electric, Ora- Gun, Japan). Η θερμοκρασία των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της συντήρησης ελέγχονταν σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση ηλεκτρονικών καταγραφέων θερμοκρασίας (cox tracer, Cox Technologies, Belmont, NC, USA). Δείγματα λαμβάνονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα ώστε να είναι επιτρεπτή η κινητική ανάλυση της μικροβιακής ανάπτυξης, της πτώσης του ph και της μεταβολής του χρώματος. Κάθε πειραματική δοκιμή διεξάγονταν πάντα σε δύο επαναλήψεις Μικροβιολογικές αναλύσεις Ανά τακτά χρονικά διαστήματα δείγματα του 1 ml από την κάθε φιάλη μεταφέρθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες σε υδατικό διάλυμα πεπτόνης 0.1 % w/v (εμπλουτισμένο με 0.85% w/v NaCl), και έπειτα από διαδοχικές αραιώσεις ποσότητα του 0.1 ml από την κατάλληλη αραίωση (τρεις επαναλήψεις) εμβολιάσθηκε και απλώθηκε σε τριβλύα με MRS agar (εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων). Τα τριβλύα επωάστηκαν στους 30 C για 72 h και τελικά έγινε η καταμέτρηση των σχηματισθέντων στα τριβλύα αποικιών. Ο πληθυσμός των μικροβιακών κυττάρων κάθε δεδομένη χρονική στιγμή υπολογίστηκε ως ο μέσος όρων των τριών επαναλήψεων της κάθε αραίωσης Μετρήσεις ph Ποσότητες των 5-10 ml από την κάθε φιάλη μεταφέρθηκαν ασηπτικά σε πλαστικούς περιέκτες όπου έγινε και η μέτρηση ph με βύθιση του ηλεκτροδίου στο υγρό μέσο ανάπτυξης (Microprocessor ph meter, ph 211, Hanna Instruments) στους 25 C Μετρήσεις χρώματος Το χρώμα του μοντέλου συστήματος (μικροοργανισμός, θρεπτικό υπόστρωμα, χημικός δείκτης) κατά την πορεία της συντήρησής του αναλύθηκε με χρωματόμετρο (Chroma Meter CR-410, Konica Minolta Sensing Inc., Japan), αφού πρώτα βαθμονομήθηκε με την 119

154 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή τυπική λευκή πλάκα που συνοδεύει το όργανο μέτρησης. Συγκεκριμένα, καταγράφηκαν οι χρωματικές παράμετροι L*, φωτεινότητα ενδεικτική για το πόσο σκοτεινό ή ανοιχτό στο χρώμα είναι το δείγμα (κυμαίνεται από 0: μαύρο ως 100:λευκό), a* μέτρηση για το πράσινο και το κόκκινο (-60 ως +60, αντίστοιχα ), b*, ωχρότητα, βαθμός μέτρησης για το γαλάζιο ή κίτρινο (κυμαίνεται από -60 ως +60, αντίστοιχα). Στο τέλος των μικροβιολογικών αναλύσεων και της μέτρησης του ph, ποσότητα ml από το υγρό μέσο ανάπτυξης μεταφέρθηκε σε τριβλύα συγκεκριμένης διαμέτρου. Η κεφαλή του οργάνου βυθίστηκε στο προς μέτρηση υγρό υπόστρωμα και η μέτρηση έγινε παίρνοντας δύο συνεχόμενες καταγραφές (επαναλήψεις) των συνιστωσών χρώματος για κάθε πειραματική δοκιμή. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλες οι μετρήσεις έγιναν με τα τριβλύα τοποθετημένα πάνω στη λευκή συμπαγή πλάκα βαθμονόμησης του οργάνου ώστε η επίδραση του φόντου κατά την ανάλυση να είναι κοινή για όλες τις μετρήσεις. Οι καταγραφόμενες μετρήσεις συναρτήσει του χρόνου εκφράστηκαν είτε ως απόλυτες τιμές L*, a*, b*, είτε ως συνολική χρωματική μεταβολή ΔΕ, όπως αποδίδεται από την εξίσωση: Δ Ε = ( L * L * b (3.12) ) + ( α * α * 0 ) + ( b * * 0 ) όπου L* 0, α* 0 και b* 0 αποτελούν τις τιμές των χρωματικών παραμέτρων στην έναρξη του πειράματος (χρόνος t =0). Παράλληλα με τις μετρήσεις του χρωματόμετρου λαμβάνονταν και εικόνες με χρήση ψηφιακής κάμερας (Sony, Cyber-shot DSC-S60 digital still camera, Japan) για την πραγματική οπτική απεικόνιση των χρωματικών μεταβολών του μοντέλου συστήματος που συνέβησαν κατά την πορεία συντήρησής του στις εκάστοτε πειραματικές συνθήκες Μελέτη φάσματος απορρόφησης χημικών δεικτών Οι χημικοί δείκτες και η δυνατότητα αυτών να μεταβάλουν αιφνιδίως το χρώμα του υποστρώματος ανάπτυξης των μικροοργανισμών κατά την πορεία της συντήρησης εξετάστηκε φασματοφωτομετρικά. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν διαλύματα ΝΒ (Nutrient Broth) διαφορετικού ph ( ) με την προσθήκη γαλακτικού οξέος. Στα ίδια διαλύματα προστέθηκε 1% v/v από όλους τους υπό μελέτη χημικούς δείκτες, οπότε και δημιουργήθηκαν ομάδες διαλυμάτων με σταδιακώς μειούμενο ph και αντίστοιχη κλιμακωτή μεταβολή στο χρώμα. Για καθένα από τα διαλύματα αυτά λήφθηκε το φάσμα απορρόφησης, δηλαδή καταγράφηκε η μεταβολή της απορρόφησης Α ως συνάρτηση του μήκους κύματος στην περιοχή του ορατού ( nm) όπου απορροφούν όλες οι έγχρωμες ενώσεις. Επειδή όμως κάθε έγχρωμη ένωση διαφορετικού χρώματος απορροφά σε διαφορετικά μήκη κύματος, το αποτέλεσμα αυτό αποτυπώνεται ως αλλαγή του μήκους 120

155 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι κύματος στο οποίο παρατηρείται και η μέγιστη απορρόφηση. Συνεπώς, μια καλή χρωματική μεταβολή ενός χημικού δείκτη αναμένεται να συνοδεύεται και από έντονη μεταβολή στο φάσμα απορρόφησης, και αυτό αποτέλεσε ένα ακόμη κριτήριο επιλογής του καταλληλότερου χημικού δείκτη Ανάπτυξη του μικροβιακού συστήματος ΤΤΙ Προετοιμασία του τελικού συστήματος μικροβιακού δείκτη Η προηγούμενη ενδελεχής διερεύνηση των δομικών συστατικών του ΤΤΙ κατέληξε στην υιοθέτηση του βακτηριακού στέλεχους L. sakei (LQC 1089) ως το καταλληλότερο σε ότι αφορά την ικανότητά του να μειώνει βαθμιαία το ph διαφόρων μέσων ανάπτυξης που μελετήθηκαν. Το θρεπτικό υπόστρωμα Nutrient broth εμπλουτισμένο με γλυκόζη (2% w/v) (Merck, Darmstadt, Germany) και εκχύλισμα ζυμών (Yeast extract) (0.5% w/v) (Merck, Darmstadt, Germany) αποδείχτηκε ως το καταλληλότερο μέσο ανάπτυξης που επιτρέπει ικανοποιητική μικροβιακή ανάπτυξη και δραστηριότητα, ενώ το ερυθρό της χλωροφαινόλης (chlorophenol red) (διάλυμα συγκέντρωσης 0.2 % w/v σε Μ NaOH), επιλέχτηκε ως ο καταλληλότερος χημικός δείκτης που προκαλεί εμφανή και διακριτή μη αντιστρεπτή χρωματική μεταβολή του υποστρώματος από τον αρχικό κόκκινο σε πορτοκαλί και τελικά κίτρινο χρωματισμό (σημείο λήξης), αντικατοπτρίζοντας τη σταδιακή μείωση του ph λόγω της βακτηριακής ανάπτυξης, χωρίς να μεταβολίζεται ο ίδιος από το μικροβιακό στέλεχος. Για την προετοιμασία των δειγμάτων του τελικού συστήματος ΤΤΙ, τα συστατικά του υποστρώματος διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και αφού έγινε ρύθμιση του ph στο με χρήση 1M HCl, το μίγμα μοιράστηκε σε ποσότητες των 200 ml σε ερμητικά σφραγισμένα μπουκάλια και αποστειρώθηκε (121 C, 15 min). Το διάλυμα του χημικού δείκτη αποστειρώθηκε με διήθηση (ψυχρή αποστείρωση) και προστέθηκε ασηπτικά σε συγκέντρωση 1.5% v/v στο αποστειρωμένο μέσο ανάπτυξης πριν τον εμβολιασμό του με το στέλεχος του L. sakei, ώστε να διαπιστωθεί και οπτικώς η προκαλούμενη από την ανάπτυξή του μικροοργανισμού πτώση του ph και αλλαγή του χρώματος του υποστρώματος. Το εμβόλιο του L. sakei προετοιμάστηκε όπως έχει ήδη περιγραφεί ( Προετοιμασία εμβολίου). Στις περισσότερες πειραματικές δοκιμές το αρχικό επίπεδο εμβολίου ρυθμίστηκε σε 10 2 CFU/ml, ωστόσο υπήρξαν και πειράματα όπου η αρχική συγκέντρωση των κυττάρων ρυθμίστηκε κλιμακωτά από CFU /ml. 121

156 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Η απόκριση του ΤΤΙ εξετάστηκε ισόθερμα σε πέντε διαφορετικές θερμοκρασίες συντήρησης (0, 4, 8, 12 και 16 C) σε υψηλής ακρίβειας (± 0,2 C) επωαστικούς κλιβάνους (MIR 153 και MIR 253, Sanyo Electric, Oragun, Japan) με αρχικό επίπεδο εμβολίου 2 log CFU/ml. Η θερμοκρασία των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της συντήρησης ελέγχονταν σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση ηλεκτρονικών καταγραφέων θερμοκρασίας (Cox Tracer, Cox Technologies, Belmont, NC, USA). Δείγματα εξετάστηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα για την ανάλυση της κινητικής της μικροβιακής ανάπτυξης, της πτώσης του ph, της παραγωγής μεταβολιτών και της ανάπτυξης του χρώματος. Επιπρόσθετα, εξετάστηκαν δείγματα χωρίς την παρουσία του χημικού δείκτη τα οποία και χρησιμοποιήθηκαν στην κινητική ανάλυση των φυσικοχημικών παραμέτρων του συστήματος ΤΤΙ (προσδιορισμό της συγκέντρωσης των εναπομενόντων σακχάρων και του παραγόμενου γαλακτικού οξέος) όπως περιγράφεται ακολούθως. Κάθε πειραματική δοκιμή διεξάγονταν πάντα σε δύο επαναλήψεις Μικροβιολογικές αναλύσεις Ανά τακτά χρονικά διαστήματα δείγματα του υγρού υποστρώματος από κάθε θερμοκρασία συντήρησης αναλύθηκαν ως προς τον πληθυσμό των αναπτυσσόμενων κυττάρων του γαλακτικού βακτηρίου σε MRS άγαρ, ακολουθώντας τη μεθοδολογία που περιγράφηκε προηγουμένως Φυσικοχημικές αναλύσεις Ποσότητες δειγμάτων των 10 ml από την κάθε πειραματική δοκιμή μεταφέρθηκαν ασηπτικά σε πλαστικούς περιέκτες για τη μέτρηση ph, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Κατά τη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας συντήρησης στις κινητικές παραμέτρους του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ, πέραν των μικροβιολογικών αναλύσεων, της μέτρησης του ph, και των μεταβολών του χρώματος, στα δείγματα που δεν περιείχαν το χημικό δείκτη προσδιορίστηκε επίσης η περιεχόμενη συγκέντρωση γλυκόζης (ως πηγή ενέργειας του συστήματος) και η παραγόμενη ποσότητα οργανικών οξέων (κυρίως γαλακτικού οξέος) κατά την πορεία της συντήρησης. Τα δείγματα αυτά φυγοκεντρήθηκαν υπό ψύξη (4 C, 6000 g, 20 min) προς απόκτηση δειγμάτων ελευθέρων κυττάρων και αναλύθηκαν ως ακολούθως: Προσδιορισμός γλυκόζης Ο προσδιορισμός της γλυκόζης έγινε φασματοφωτομετρικά με ενζυμική μέθοδο. Απαραίτητη ήταν η δημιουργία πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιώντας διάλυμα α-d- 122

157 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι glucose σε συγκέντρωση 625 mg/100 ml (stock διάλυμα). Tο διάλυμα αφέθηκε σε ηρεμία για 2 ώρες ώστε να επέλθει ισορροπία (πολυστροφισμός) μεταξύ των δύο ισομερών α-, και β-d-glucose. Από το stock διάλυμα παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα με συγκεντρώσεις 62, 125, 250, 500 μg/ml. Τα διαλύματα παρασκευάσθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα οξικού νατρίου (sodium acetate buffer, 50mM, ph: 4.0). Ποσότητα 200 μl από τα πρότυπα διαλύματα μεταφέρθηκε σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες (εις διπλούν). Επίσης, σε μικρό σωλήνα μεταφέρθηκαν 200 μl sodium acetate buffer (50mM, ph 4.0) για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. Η πρότυπη καμπύλη που δημιουργήθηκε μετρά ποσότητες γλυκόζης στο εύρος μg. Τα άγνωστα προς μέτρηση δείγματα αραιώθηκαν κατάλληλα ανάλογα με την αναμενόμενη συγκέντρωση γλυκόζης στο υγρό υπόστρωμα με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα οξικού νατρίου (sodium acetate buffer, 50mM, ph: 4.0) ώστε να εμπίπτουν στο εύρος προσδιορισμού που ορίζεται από την πρότυπη καμπύλη. Ποσότητες των 200 μl ή μικρότερες (0.1 ml/100 μl) μεταφέρθηκαν σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες εις διπλούν, σημειώνοντας ταυτόχρονα τον όγκο του αραιωμένου δείγματος που χρησιμοποιήθηκε. Ο όγκος αυτός συμπληρώθηκε μέχρι τα 200 μl με το ίδιο buffer. Παράλληλα, ποσότητα από το θρεπτικό μέσο ανάπτυξης που δεν είχε εμβολιασθεί αλλά είχε αποστειρωθεί και περιείχε την ίδια ακριβώς αρχική ποσότητα γλυκόζης και επιπλέον είχε υποστεί αραίωση στον ίδιο βαθμό με τα δείγματα, χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης του υγρού της ζύμωσης στα 500nm. Σε αυτό το δείγμα δεν προστέθηκε το αντιδραστήριο με το μίγμα των ενζύμων και της χρωστικής, οπότε και αποτέλεσε το διάλυμα μάρτυρα του οποίου η απορρόφηση αφαιρέθηκε από αυτήν των άγνωστων χρωμοφόρων δειγμάτων. Η ανάλυση έγινε με προσθήκη 3 ml από το μίγμα των διαλυμάτων Α (80 ml, 8 mg (ca U) glucose oxidase, 2 mg (ca 300 U) horse-radish peroxidase και 20 mg 4-aminoantipyrine διαλύθηκαν σε 80 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου sodium acetate buffer 0.2M, ph 7.0 (το διάλυμα αυτό παρασκευάστηκε την ίδια ημέρα της ανάλυσης των δειγμάτων) και Β (20 ml, υδατικό διάλυμα 0.11Μ p- hydroxybenzoic acid, του οποίου το ph είχε ρυθμιστεί στο 7.0 με NaOH) στους μικρούς σωλήνες (με τα 200 μl) των πρότυπων και των αγνώστων δειγμάτων. Ακολούθησε ανάδευση σε Vortex και επώαση στους 37 C για 12 min (ακριβώς). Κατά την εκτέλεση της αντίδρασης παρήχθηκε ρόδινο χρωμοφόρο προϊόν του οποίου η απορρόφηση μετρήθηκε στα 500 nm (φασματοφωτόμετρο SP-8001 UV-VIS, Metertech Inc.). Το μίγμα των διαλυμάτων Α και Β είχε τοποθετηθεί προηγουμένως σε υδατόλουτρο στους 37 o C, ώστε να εξισορροπηθεί η θερμοκρασία του. 123

158 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Προσδιορισμός γαλακτικού οξέος με HPLC Ο προσδιορισμός του γαλακτικού οξέος των δειγμάτων έγινε με σύστημα Υγρής Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) με χρήση στήλης ανιοντικής έκλουσης (anion exclusion column) διαστάσεων mm (Alltech Associates Inc., Deerfield, IL). Ο εξοπλισμός περιλάμβανε επίσης αντλία Marathon IV HPLC pump (Rigas Lab, Thessaloniki, Greece), ένα χειροκίνητο εισαγωγέα με κυψελίδα (loop) όγκου 10 ml, έναν ανιχνευτή υπεριώδους UV 6000 LP detector (Spectra SYSTEM, Finningan Mat, Thermo Separation Products, San Jose, USA) και μεμονωμένο φούρνο για τη θέρμανση της στήλης. Πραγματοποιήθηκε ισοκρατικός διαχωρισμός με ρυθμό ροής 0.6 ml/min στους 65 C και κινητή φάση αραιό διάλυμα θειικού οξέος Ν H 2 SO 4, που προηγουμένως είχε διηθηθεί από ηθμό naylon μεγέθους πόρων 0.45 μm (nylon filter, Alltech Associates Inc.). Οι μετρήσεις ελήφθησαν μέσω ενός ανιχνευτή υπεριώδους/ορατού (UV/Visible detector) ρυθμισμένο στα 220 nm. Πέντε (5) ml δείγματος εκχυλίστηκαν με μίγμα νερού ακετονυτριλίου καθαρότητος HPLC (Sigma-Aldrich Ltd, Athens, Greece) (1:4, 15 ml), μετά από φυγοκέντρηση για 15 min στις 4000 rpm, Tο εκχύλισμα διηθήθηκε μέσω ενός nylon ηθμού διαμέτρου πόρων 0.2 μm (nylon filter, Alltech Associates Inc.) πριν την εισαγωγή του στη στήλη. Η ανάλυση του κάθε δείγματος έγινε εις διπλούν και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος δύο επαναλήψεων. Παράλληλα, πρότυπα διαλύματα γαλακτικού οξέος (Sigma-Aldrich Ltd) σε μίγμα νερού ακετονιτριλίου (1:4 v/v) σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν για τη βαθμονόμηση της στήλης και την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης ποσοτικοποίησης των άγνωστων δειγμάτων Μετρήσεις χρώματος Η κινητική της ανάπτυξης χρώματος στο μοντέλο σύστημα ΤΤΙ (μικροοργανισμός, θρεπτικό υπόστρωμα, χημικός δείκτης) κατά την πορεία της συντήρήσης του αναλύθηκε με χρωματόμετρο όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως, και η παρατηρούμενη μεταβολή στο χρώμα του ΤΤΙ ως συνάρτηση του χρόνου εκφράστηκε ως συνολική χρωματική μεταβολή ΔΕ, σύμφωνα με την εξ Μαθηματική περιγραφή του συστήματος Οι παρατηρούμενες μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές του συστήματος ΤΤΙ κάτω από τις προκαθορισμένες ισόθερμες συνθήκες συντήρησης περιγράφηκαν με ένα σύστημα διαφορικών εξισώσεων. Οι διαφορικές εξισώσεις ολοκληρώθηκαν με την τεχνική 124

159 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι ολοκλήρωσης Euler και το λογισμικό Scientist (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT). Οι αρχικές εκτιμήσεις των παραμέτρων προσδιορίστηκαν μετά από προσεχτική αλλαγή αυτών και την οπτική σύγκριση των πειραματικών δεδομένων και των προβλεπόμενων εκτιμήσεων μετά την προσομοίωση. Στη συνέχεια οι αρχικές εκτιμήσεις των παραμέτρων αριστοποιήθηκαν με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Η μικροβιολογική ανάπτυξη περιγράφηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη λογιστική εξίσωση. Όταν ο χρόνος t (h) ήταν μικρότερος ή ίσος με τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής (Lag phase, (h)), τότε dn t Lag, = 0 (3.13) dt ενώ όταν ο χρόνος ήταν μεγαλύτερος από τη φάση προσαρμογής, τότε t dn N Lag N dt N, = μ max 1 (3.14) > max όπου Ν είναι ο πληθυσμός (CFU/ml), μ max είναι ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ), και N max είναι ο μέγιστος πληθυσμός (CFU/ml) του L. sakei όπως αυτός εκτιμάται από το μοντέλο. Η κατανάλωση γλυκόζης περιγράφηκε από το μοντέλο διατήρησης της ενέργειας του Pirt (1965): dg 1 dn = mg N (3.15) dt Y dt G όπου G είναι η συγκέντρωση της υπολειπόμενης γλυκόζης (mmol), Y G είναι ο συντελεστής απόδοσης κυττάρων ανά μονάδα καταναλισκόμενης γλυκόζης (cell yield coefficient, CFU/mmol καταναλισκόμενης γλυκόζης) και m G ο συντελεστής διατήρησης της γλυκόζης (maintenance coefficient, mmol γλυκόζης/ CFU / h). Το παραγόμενο γαλακτικό οξύ μπορεί να προσδιοριστεί από την κατανάλωση γλυκόζης όπως περιγράφηκε από τους Leroy και De Vuyst (1999): dl dg = YL (3.16) dt dt όπου L είναι το γαλακτικό οξύ (mmol) και Y L είναι ο συντελεστής απόδοσης για την μετατροπή της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ (mmol παραγόμενου γαλακτικού οξέος / mmol καταναλισκόμενης γλυκόζης). Η πτώση του ph μοντελοποιήθηκε ως συνάρτηση των μεταβολών στη συγκέντρωση των πρωτονίων και του αδιάστατου γαλακτικού οξέος, ΗΑ, έχοντας ως βάση το μοντέλο που παρουσιάστηκε από τους Breidt και Fleming (1998): 125

160 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή dp dt P a 1 HA P (3.17) = max όπου α είναι ένας συντελεστής, P είναι συγκέντρωση των πρωτονίων και P max είναι η προβλεπόμενη μέγιστη συγκέντρωση πρωτονίων ή διαφορετικά το ελάχιστο τελικό ph του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ. Στην εξίσωση 3.17, ο όρος ΗΑ για το αδιάστατο γαλακτικό οξύ μπορεί να αντικατασταθεί από την εξίσωση Henderson Hasselbalch ως εξής: A HA = pka ph (3.18) όπου Α - είναι το διιστάμενο γαλακτικό οξύ και η σταθερά διάστασης pk a του γαλακτικού οξέος έχει την τιμή Επιπλέον, η μεταβολή στη χρωματική συνάρτηση ΔΕ περιγράφηκε από την τεσσάρων παραμέτρων λογιστική εξίσωση χρησιμοποιώντας το λογισμικό πρόγραμμα Table Curve 2D (version 4, SPSS Inc.) όπως δίνεται παρακάτω: ΔE = ΔE min ΔEmax ΔEmin + 1+ exp[ μ Δ E ( t ti )] (3.19) όπου ΔΕ min είναι η αρχική τιμή της παραμέτρου ΔΕ (ελάχιστη τιμή) τη χρονική στιγμή μηδέν (t=0), ΔΕ max είναι η μέγιστη τιμή ΔΕ όπως εκτιμάται από το μοντέλο, μ ΔΕ είναι ο μέγιστος ρυθμός κατά την ανάπτυξη / αύξηση της παραμέτρου ΔΕ με την πάροδο του χρόνου, t είναι ο χρόνος (h), και t i είναι ο χρόνος (h) κατά τον οποίο παρατηρείται η επίτευξη του 50% της τιμής της παραμέτρου ΔΕ max. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση τόσο του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του L. sakei, μ max, όσο και του αντιστρόφου του χρόνου στον οποίο παρατηρείται το σημείο λήξης του ΤΤΙ (1/end point) (ΔΕ=20) περιγράφηκε από το μοντέλο Arrhenius: lnz = ln Z ref Eα R 1 1 T T ref (3.20) όπου Ζ είναι ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης του L. sakei ή το αντίστροφο κλάσμα του χρόνου στον οποίο παρατηρείται το σημείο λήξης του ΤΤΙ, Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία (Kelvin), Ζ ref είναι ο ρυθμός στη θερμοκρασία αναφοράς (h -1 ), E α είναι η ενέργεια ενεργοποίησης (kj/mol K), R είναι η παγκόσμια σταθερά των αερίων, και T ref η θερμοκρασία αναφοράς (273 Κ). 126

161 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι Ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η επίδραση του διαφορετικού αρχικού επιπέδου εμβολίου στην απόκριση του συστήματος ΤΤΙ στη σταθερή θερμοκρασία συντήρησης των 8 C, ώστε να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του σημείου λήξης του ΤΤΙ και της αρχικής συγκέντρωσης του μικροοργανισμού με την οποία εμβολιάζεται το σύστημα. Ο L. sakei εμβολιάστηκε στο υπόστρωμα του ΤΤΙ σε διάφορα επίπεδα (1, 3, 5 και 6 log 10 CFU/ml), ενώ η λοιπή πειραματική διαδικασία διεξήχθη καθ όμοιο τρόπο με την περιγραφή που προηγήθηκε Αξιολόγηση του ΤΤΙ σε φρέσκο βοδινό κιμά συσκευασμένο υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα (Modified Atmosphere Packed, MAP) Προετοιμασία δειγμάτων βοδινού κιμά Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε φρέσκος βοδινός κιμάς με φυσιολογικό ph ( ), προμήθεια ενός τοπικού κρεοπωλείου. Το αλεσμένο κρέας χωρίστηκε σε μερίδες των 100 και 50 g για τη διεξαγωγή των μικροβιολογικών αναλύσεων και της οργανοληπτικής αξιολόγησης, αντίστοιχα, και τοποθετήθηκε σε πλαστικά δισκία, όπου διοχετεύθηκε τροποποιημένη ατμόσφαιρα αερίων αποτελούμενη από 60% CO 2-20% O 2-20% N 2. Τα δισκία στη συνέχεια κλείστηκαν σε μεμβράνη πολυεθυλενίου χαμηλής διαπερατότητας. Τα δείγματα αυτά συντηρήθηκαν κάτω από ισόθερμες συνθήκες ψύξης (0, 5, 10 και 15 o C) ή μεταβαλλόμενες συνθήκες σε υψηλής ακρίβειας (±0.2 o C) ψυγειοκλιβάνους (model MIR 153, Sanyo Electric Co., Ora-Gun, Gunma, Japan). Για τον πειραματισμό σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης, χρησιμοποιήθηκαν δύο προφίλ μη ισόθερμων χαμηλών θερμοκρασιών συντήρησης, σε μια προσπάθεια προσομοίωσης των συνεχώς μεταβαλλόμενων ακραίων συνθηκών που παρατηρούνται στην ψυκτική αλυσίδα. Το πρώτο πρωτόκολλο συντήρησης αφορούσε έναν περιοδικώς επαναλαμβανόμενο κύκλο 24 h που περιλάμβανε συντήρηση για 18 h στους 5 C και 6 h στους 15 C, ενώ το δεύτερο προφίλ περιλάμβανε αποθήκευση για 24 h στους 0 C, ακολουθούμενη από μια απότομη αλλαγή της θερμοκρασίας για 6 h στους 15 C και τελικά για άλλες 12 h στους 10 C. Η θερμοκρασία των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της συντήρησης καταγράφονταν με τη χρήση συσκευών ηλεκτρονικών καταγραφέων (Cox Tracer, Cox Technologies, Belmont, NC). Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, δύο πακέτα του συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα (MAP) προϊόντος κρέατος από κάθε θερμοκρασιακό περιβάλλον συντήρησης 127

162 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αναλύονταν. Μετρήσεις που αφορούσαν τη μικροβιακή ανάπτυξη, τις μεταβολές του ph και την πορεία των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του προϊόντος ως συνάρτηση του χρόνου συντήρησης επέτρεψαν την ολοκληρωμένη κινητική μελέτη της μικροβιολογικής αλλοίωσης του εν λόγω τροφίμου σε ισόθερμες και μεταβαλλόμενες συνθήκες συντήρησης. Όλα τα πειράματα αλλοίωσης του αλεσμένου βοδινού κρέατος διεξήχθησαν εις διπλούν Μικροβιολογικές αναλύσεις στο βοδινό κιμά MAP Δείγματα κιμαδοποιημένου κρέατος των 25g ζυγίστηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες προστέθηκαν σε υδατικό διάλυμα πεπτόνης 0.1 % w/v (εμπλουτισμένο με αλάτι, NaCl 0.85% w/v), και ομογενοποιήθηκαν σε stomacher (Bug Mixer 400, Interscience, France) για 60 sec σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Έπειτα από κατάλληλες διαδοχικές δεκαδικές αραιώσεις σε υδατικό διάλυμα πεπτόνης 0.1 % w/v (εμπλουτισμένο με 0.85% w/v NaCl), δείγματα του 1 ml ή 0.1 ml από την κατάλληλη αραίωση εμβολιάσθηκαν και απλώθηκαν με επίστρωση ή ενσωμάτωση στα αντίστοιχα θρεπτικά υποστρώματα για την ανίχνευση και καταμέτρηση: α) της συνολικής αερόβιας μικροχλωρίδας (TVC, Total viable count) σε Plate Count Agar (PCA, Merck, Darmstadt, Germany), η επώαση έγινε στους 25 C για 72h, β) του Brochothrix thermosphacta σε STAA medium εμπλουτισμένο με θειική στρεπτομυκίνη, οξικό θάλλιο και κυκλοεξαμίδιο (acetodione), το υπόστρωμα αυτό παρασκευάστηκε συνθετικά στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας τα βασικά συστατικά του, η επώαση έγινε στους 25 C για 72 h, γ) των γαλακτικών βακτηρίων (Lactic acid bacteria, LAB) σε Man Rogosa Sharpe agar (MRS agar, Merck, Darmstadt, Germany),. τα τριβλύα επικαλύφθηκαν με δεύτερο στρώμα από το ίδιο υλικό και επωάστηκαν στους 25 C για 96 h, δ) των ψευδομονάδων (Pseudomonas spp.) σε CFC agar (ctrimide-fucidin cephaloridine, Oxoid CM559 εμπλουτισμένο με το εκλεκτικό συστατικό SR 103E, Basingstoke, UK), η επώαση έγινε στους 25 C για 48 h, και ε) των εντεροβακτηρίων (Enterobacteriaceae) σε Violet Red Bile Dextrose Agar (VRBGA, Merck, Darmstadt, Germany), τα τριβλύα επικαλύφθηκαν με δεύτερο στρώμα από το ίδιο υλικό και επωάστηκαν στους 37 C για 24 h. Όλα τα τριβλύα εξετάστηκαν οπτικώς για την ύπαρξη τυπικής μορφής αποικιών και μορφολογικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται με το κάθε μέσο ανάπτυξης. Επιπρόσθετα, η εκλεκτικότητα του κάθε μέσου ανάπτυξης εξετάστηκε περιοδικά με χρώση Gram και μικροσκοπική εξέταση των παρασκευασθέντων αιωρημάτων, επιλέγοντας τυχαίες αποικίες οι οποίες είχαν προηγουμένως αναπτυχθεί σε όλα τα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης. Επίσης, μετρήσεις του ph έγιναν στους ίδιους χρόνους δειγματοληψίας βυθίζοντας το γυάλινο ηλεκτρόδιο του οργάνου στο ομογενοποιημένο δείγμα αλεσμένου κιμά μετά το 128

163 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι πέρας των μικροβιολογικών αναλύσεων Μέτρηση σύστασης αερίων Η ανάλυση της σύστασης των αερίων στο διάκενο των συσκευασιών αλεσμένου βοδινού κρέατος έγινε με τη συσκευή Gaspace 2 gas analyzer (Gaspace 2, Madderlake scientific Ltd, UK). Συσκευασίες μάρτυρες, στις οποίες διοχετεύθηκε η ίδια ατμόσφαιρα αερίων και σφραγίστηκαν χωρίς την παρουσία των μερίδων κρέατος, και οι οποίες συντηρήθηκαν στις ίδιες συνθήκες ψύξης με τα πακέτα που περιείχαν το προϊόν, αναλύθηκαν επίσης καθ όλη τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, στην ίδια συσκευή. Αυτό εξυπηρέτησε τη διερεύνηση πιθανών μεταβολών της σύστασης των αερίων στην πορεία της συντήρησης αλλά και της επίδρασης του προϊόντος κρέατος στη δέσμευση μέρους της τροποποιημένης ατμόσφαιρας (διαλυτοποίηση των αερίων του μίγματος στην επιφάνεια του προϊόντος) Οργανοληπτική αξιολόγηση Η οργανοληπτική αξιολόγηση του βοδινού κιμά MAP κατά τη διάρκεια της συντήρησης έγινε από μια πενταμελή ομάδα δοκιμαστών που ανήκαν στο προσωπικό του εργαστηρίου και οι οποίοι κλήθηκαν να εκτιμήσουν την εμφάνιση, την οσμή και γεύση των νωπών και μαγειρεμένων δειγμάτων. Οι ίδιοι εκπαιδευμένοι δοκιμαστές συμμετείχαν σε κάθε οργανοληπτική δοκιμή και όλοι αγνοούσαν την ταυτότητα του προϊόντος που εξέταζαν κάθε φορά (τυφλό τεστ). Η οργανοληπτική αξιολόγηση έγινε κάτω από τεχνητό φωτισμό και η θερμοκρασία του συσκευασμένου προϊόντος προσέγγιζε την θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση το νωπό προϊόν καλύφθηκε με αλουμινόχαρτο και ψήθηκε σε φούρνο στους 180 C για 30 min. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην εκτίμηση του χρώματος του νωπού κρέατος και της οσμής και γεύσης του μαγειρεμένου προϊόντος. Οι κριτές εκτίμησαν και κατέγραψαν την οσμή και γεύση των δειγμάτων σε κατάλληλες φόρμες με περιγραφικούς όρους που ανταποκρίνονταν στην οργανοληπτική εξέλιξη της ποιοτικής υποβάθμισης του προϊόντος (Taoukis et al., 1999). Συγκεκριμένα, υιοθετήθηκε ένα απλό σύστημα αξιολόγησης τριών σημείων (Dalgaard et al., 1993, Taoukis et al., 1999). Καθένα από τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά βαθμολογήθηκε σε μια συνεχόμενη ηδονική κλίμακα από το 0 ως το 3, όπου το 0 αντιστοιχεί στο υψηλότερο σκορ ποιότητας, 1 δίνεται στο αποδεκτό προϊόν, το 2 αποτελεί το όριο γα την αποδοχή του προϊόντος ή το σημείο απόρριψης και το 3 αντιπροσωπεύει το μη αποδεκτό προϊόν. 129

164 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Μέτρηση της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ Προκειμένου να ελεγχθεί η δυνατότητα εφαρμογής του ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην απεικόνιση της μικροβιολογικής αλλοίωσης που λαμβάνει χώρα στο βοδινό κιμά MAP, δείγματα του μικροβιακού ΤΤΙ που παρασκευάσθηκαν με τη μεθοδολογία που περιγράφηκε προηγουμένως συντηρήθηκαν τόσο ισόθερμα (0, 5, 8, 10, 12, και 15 C) όσο και κάτω από τα ίδια δυναμικά πρωτόκολλα ψύξης με τα δείγματα κρέατος. Το στέλεχος του L. sakei εμβολιάσθηκε στο μέσο ανάπτυξης σε συγκέντρωση κυττάρων 10 4 CFU/ml, επίπεδο που ταυτίζεται με τον αρχικό πληθυσμό των γαλακτικών βακτηρίων, όπως αυτός καταμετρήθηκε στο βοδινό κιμά. Σε τακτά χρονικά διαστήματα γίνονταν καταμέτρηση της ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων, ενώ επίσης καταγράφονταν η πτώση του ph και η μεταβολή του χρώματος, επιτρέποντας την κινητική μελέτη του μικροβιακού ΤΤΙ. Η ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων στα δείγματα του ΤΤΙ εξετάστηκε κατά τα γνωστά, σε MRS άγαρ, ενώ παράλληλα μετρήθηκε και το ph του μέσου ανάπτυξης. Η ευδιάκριτη μη αντιστρεπτή μεταβολή στο χρώμα του ΤΤΙ από το αρχικό κόκκινο στο τελικό κίτρινο (σημείο λήξης) αποτέλεσε την μεταβαλλόμενη μετρούμενη απόκριση η οποία προσδιορίστηκε με χρωματόμετρο. Οι καταγραφόμενες μετρήσεις εκφράστηκαν και πάλι ως συνολική χρωματική μεταβολή, ΔΕ, ενώ η εξέλιξη της εν λόγω μεταβλητής ως συνάρτηση του χρόνου περιγράφηκε από το λογιστικό μοντέλο (εξίσωση 3.19) Ανάλυση δεδομένων Τα δεδομένα ανάπτυξης όλων των αλλοιογόνων μικροοργανισμών που εξετάστηκαν στο προϊόν κρέατος και των γαλακτικών βακτηρίων στο μικροβιακό ΤΤΙ μοντελοποιήθηκαν ως συνάρτηση του χρόνου συντήρησης χρησιμοποιώντας το μοντέλο των Baranyi και Roberts (1994). Το αυθεντικό μοντέλο δίνει μια μοναδική λύση για τις στατικές περιπτώσεις (όταν οι παράμετροι του μοντέλου δεν εξαρτώνται από το χρόνο), η οποία περιγράφει το φυσικό λογάριθμο της συγκέντρωσης των κυττάρων y(t)=ln x(t) σύμφωνα με την εξίσωση που ακολουθεί: y( t) = y mμ ( ) 1 e maxa t 1 + μ max A( t) ln 1+ m( y ) (3.21) m e max 0 0 y όπου μ max είναι ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης του πληθυσμού των κυττάρων, y max είναι ο φυσικός λογάριθμος της μέγιστης συγκέντρωσης του πληθυσμού, y 0 είναι ο φυσικός λογάριθμος της αρχικής συγκέντρωσης κυττάρων, m είναι μια παράμετρος που σχετίζεται με την κυρτότητα της καμπύλης ανάπτυξης και χαρακτηρίζει τη μετάβαση από την 130

165 Διδακτορική Διατριβή 3 Υλικά και Μέθοδοι εκθετική φάση στη φάση προσαρμογής και Α(t) είναι η συγκέντρωση του περιοριστικού παράγοντα, η οποία μεταβάλλεται με το χρόνο σύμφωνα με την εξίσωση: 1 A( t) = t + μ max ln(e μ max t 0 + e h + e μ max t h 0 ) (3.22) όπου h 0 είναι μια παράμετρος που χαρακτηρίζει το έργο προσαρμογής που απαιτείται ώστε τα κύτταρα να προσαρμοστούν στο νέο περιβάλλον (Baranyi και Roberts 1994). Για την προσαρμογή των δεδομένων στο μοντέλο αυτό χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πρόγραμμα DMFit του Ινστιτούτου IFR (Institute of Food Research, Reading, UK) το οποίο προσφέρθηκε από τον Δρ. J. Baranyi. Με τον τρόπο αυτό προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ max και της φάσης προσαρμογής (lag phase). Η θερμοκρασιακή εξάρτηση α) του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στο βοδινό κρέας MAP, β) του μ max του L. sakei στο ΤΤΙ, γ) του μέγιστου ρυθμού με τον οποίο μεταβάλλεται η συνάρτηση της συνολικής χρωματικής μεταβολής ΔΕ στο ΤΤΙ, μ ΔΕ, και δ) του αντιστρόφου της παραμέτρου ti (1/t i ), που εμπλέκεται στην ίδια συνάρτηση της απόκρισης ΔΕ, περιγράφηκε από την εξίσωση Arrhenius (εξίσωση 3.20) Σχεδιασμός της εμπορικής μορφής του μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη Μια πρώτη προσέγγιση στο σχεδιασμό της εμπορικής μορφής του μικροβιακού ΤΤΙ ήταν η ακόλουθη: Μια αποστειρωμένη πλαστική μικροθήκη διαχωρισμένη με ένα διάφραγμα σε δύο θαλάμους πληρώθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες στο ένα τμήμα της με τη λυοφιλιωμένη καλλιέργεια του L. sakei και στο άλλο με 0.1 ml του υγρού υποστρώματος συμπεριλαμβανομένου του χημικού δείκτη. Η θήκη σφραγίστηκε ερμητικά με θερμική συγκόλληση στα δύο άκρα της και αποθηκεύτηκε ως την ενεργοποίησή της που επιτυγχάνεται με θραύση του διαχωριστικού διαφράγματος των δύο τμημάτων ασκώντας μικρή μηχανική πίεση. 131

166 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 132

167 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στο κεφάλαιο αυτό της διδακτορικής διατριβής θα αναφερθούν αναλυτικά όλα τα αποτελέσματα - ευρήματα που συλλέχτηκαν κατά την παρακολούθηση της ποιότητας συστημάτων τροφίμων που υποβαθμίζονται τόσο εξαιτίας χημικών μεταβολών όσο και λόγω της μικροβιακής αλλοίωσης. Θα ακολουθηθεί κι εδώ ο διαχωρισμός των ενοτήτων που υιοθετήθηκε και στο προηγούμενο κεφάλαιο και θα γίνει εκτενής συζήτηση για τα αποτελέσματα της κάθε μελέτης χωριστά. 4.1 Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διαφέρουν στην ενεργότητα νερού κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θέρμανσης Στη μελέτη αυτή, η μη ενζυμική αμαύρωση θερμαινόμενων συμπυκνωμάτων του χυμού μήλου που διαφοροποιούνται ως προς την α w, περιγράφηκε κάνοντας χρήση των κινητικών μοντέλων. Τα κύρια αντικείμενα ήταν: α) η αξιολόγηση της επίδρασης των αντιδρώντων συστατικών και της α w στην κινητική αμαύρωσης, β) η ανάπτυξη ενός κινητικού μοντέλου ικανού να περιγράψει την έκταση της αμαύρωσης ως συνάρτηση του χρόνου, της θερμοκρασίας και της α w κάτω από ισόθερμες συνθήκες θέρμανσης, και γ) η διερεύνηση της δυνατότητας εφαρμογής του μοντέλου που προέκυψε από τα πειραματικά δεδομένα κατά τη θέρμανση του συστήματος σε σταθερές συνθήκες, στην πρόβλεψη της πραγματικής αμαύρωσης του χυμού μήλου κατά τη μη-ισόθερμη θέρμανση αυτού κάτω από χρονοθερμοκρασιακά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα επεξεργασίας Μεταβολές απορρόφησης κατά την ισόθερμη θέρμανση του χυμού μήλου Η μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 420 nm, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς στη μη ενζυμική αμαύρωση χυμών φρούτων ως μια γρήγορη και εύκολη μέθοδος προσδιορισμού της έκτασης της αντίδρασης (Bozkurt et al., 1999, Burdurlu και Karadeniz, 2003, Cohen et al., 1998, Garza et al., 1999, Ibarz et al., 1999, Johnson et al., 1995, Koca et 133

168 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή al., 2003, Manso et al., 2001, Nagy et al., 1990, Rattanathanalerk et al., 2005, Toribio και Lozano 1984). Κατά την ισόθερμη θερμική επεξεργασία, όλα τα δείγματα χυμού μήλου σταδιακά υπέστησαν αμαύρωση, παράλληλα με το σχηματισμό μελανών χρωμοφόρων ουσιών, όπως καταγράφηκε από την αύξηση της απορρόφησης κατά τη διάρκεια της θέρμανσης. Σε ότι αφορά τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της κινητικής της μη ενζυμικής αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου, το Σχήμα 4.1 αναδεικνύει την έντονη επίδραση που έχει η αύξηση της εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας στο ρυθμό ανάπτυξης χρώματος. Η επίδραση της θερμοκρασίας ήταν παρόμοια για διαλύματα που είχαν την ίδια (Σχήμα 4.1α) ή διαφορετική αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων (Σχήμα 4.1β), και το αποτέλεσμα αυτό ήταν εντονότερο και πιο εμφανές στη δεύτερη περίπτωση. Από την άλλη, εξετάζοντας την επίδραση της α w στην κινητική της μη ενζυμικής αμαύρωσης σημειώθηκαν κάποιες ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις. Τα διαλύματα με την ίδια αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων (Σχήμα 4.2α και 4.2β) έδωσαν παρόμοιες καμπύλες κινητικής αμαύρωσης, ανεξάρτητα από τη διαφοροποίησή τους ως προς την ενεργότητα του νερού, δηλαδή, η επίδραση της α w στην ομάδα διαλυμάτων όπου ενσωματώθηκε σορβιτόλη δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (P > 0.05). Αντιθέτως, τα συμπυκνώματα του χυμού που αραιώθηκαν με νερό εμφάνισαν υψηλότερες σταθερές ρυθμού αμαύρωσης, καθώς μειώνονταν η ενεργότητα νερού (Σχήμα 4.2γ και 4.2δ). Αυτή η κλασική συμπεριφορά της ενίσχυσης του σχηματισμού χρωμοφόρων ουσιών μελανού χρωματισμού σε συμπυκνωμένα συστήματα έχει αναφερθεί και από άλλους ερευνητές (Baisier και Labuza, 1992). Οι Toribio και Lozano (1984), μελετώντας τη μη ενζυμική αμαύρωση συμπυκνωμάτων χυμού μήλου, ανέφεραν εντονότερη ανάπτυξη χρώματος με αύξηση του περιεχομένου των στερεών συστατικών στα συμπυκνώματα (από 65 σε 70 και τελικά 75 Bx) ή / και με μείωση της ενεργότητας νερού σε όλες τις θερμοκρασίες που εξετάστηκαν. Οι ίδιοι ερευνητές σε μεταγενέστερη μελέτη (Toribio και Lozano, 1986) κατέληξαν πως ο ρυθμός της αντίδρασης αμαύρωσης διαυγούς χυμού μήλου, εξαρτάται μεταξύ άλλων παραγόντων και από τα διαλυτά στερεά και κυρίως από τη συνολική συγκέντρωση σε αμινοξέα. Αντίστοιχα, υψηλότερες τιμές για τις σταθερές των ρυθμών μη ενζυμικής αμαύρωσης σε θερμαινόμενο χυμό πορτοκαλιού με αύξηση της συγκέντρωσης στερεών αναφέρθηκαν και από τους Johnson et al. (1995). Η ενεργότητα του νερού αναφέρεται συχνά ως ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τους ρυθμούς της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης. Το ερώτημα βέβαια που εγείρεται είναι αν αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται αποκλειστικά στην ενεργότητα νερού ή είναι περισσότερο συνέπεια της συγκέντρωσης συστατικών και της διάχυσης αυτών στο 134

169 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση υπό εξέταση σύστημα κάθε φορά. Γενικά, ο ρυθμός αμαύρωσης αυξάνεται από την ξηρή (αφυδατωμένη) κατάσταση σε μια μέγιστη τιμή σε επίπεδα α w μεταξύ κι έπειτα μειώνεται και πάλι σε υψηλότερες τιμές ενεργότητας νερού (Labuza και Baisier, 1992). Η διαλυτότητα (μοριακή κινητικότητα) των περιεχόμενων σε ένα σύστημα συστατικών περιορίζεται έντονα στην περιοχή κάτω από τη μονοστιβάδα εξαιτίας της υψηλής ενέργειας δέσμευσης και της υαλώδους κατάστασης που επικρατεί εκεί (Levine και Slade, 1989). Όταν η ενεργότητα νερού αυξάνεται, τα διαλυτά συστατικά γίνονται περισσότερο ευκίνητα, μπορούν να διαλυθούν, κι αφού και το νερό παρουσιάζει μια μεγαλύτερη κινητικότητα, το σύστημα εισέρχεται στη θερμοπλαστική κατάσταση, συμβάλλοντας σε μεγαλύτερους ρυθμούς της αντίδρασης (Labuza και Baisier, 1992). Ο ρυθμός της αμαύρωσης μειώνεται και πάλι σε υψηλότερα α w ( ), πιθανώς εξαιτίας της αραίωσης της συγκέντρωσης των διαλυτών στερών (Eichner και Karel, 1972). Πρόκειται για το ίδιο μέγιστο που συχνά παρατηρείται στο κοινό διάγραμμα απεικόνισης του ρυθμού της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης ως συνάρτηση της ενεργότητας νερού. Στην παρούσα μελέτη τα επίπεδα της α w που εξετάστηκαν δεν ήταν αρκετά χαμηλά ώστε να επιβεβαιωθεί ξεκάθαρα το συνήθως παρατηρούμενο μέγιστο και η τάση της μείωσης του ρυθμού της αντίδρασης σε χαμηλότερα α w. Abs (420nm) α w C 70 C 80 C 90 C α A (Abs 420 nm) α w C 70 C 80 C 90 C β Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα 4.1. Καμπύλες απορρόφησης χρόνου της κινητικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου με παραπλήσιο α w αλλά διαφορετική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων κατά τη θέρμανση σε διάφορες θερμοκρασίες: (α) συμπύκνωμα χυμού που έχει αραιωθεί στο αναφερόμενο επίπεδο α w με την προσθήκη σορβιτόλης, (β) συμπύκνωμα χυμού που έχει αραιωθεί με νερό στο αναφερόμενο επίπεδο α w. 135

170 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Abs (420nm) α C Abs (420 nm) γ C Χρόνος (h) Χρόνος (h) Abs (420nm) β C Abs (420 nm) δ C Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα 4.2. Καμπύλες απορρόφησης χρόνου της κινητικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διαφέρουν ως προς την α w και έχουν την ίδια (α, β) ή διαφορετική (γ, δ) αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων κατά τη θέρμανσή τους στους 70 και 90 C. Η διαπίστωση ότι δεν υπήρξε σημαντική εξάρτηση του ρυθμού της αμαύρωσης από την α w, όταν η αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων σακχάρων παρέμεινε σταθερή στα Bx (Σχήμα 4.2α και 4.2β), εξηγεί κατά κάποιο τρόπο την έντονη αμαύρωση που συνήθως συμβαίνει σε συμπυκνωμένους χυμούς συγκριτικά με την έκταση του ίδιου φαινομένου σε αραιωμένα συστήματα. Συνεπώς, η διαφοροποίηση αυτή μπορεί να αποδοθεί κατά κύριο λόγο στην αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών παρά στη μειωμένη τιμή ενεργότητας του νερού, κοντά στην περιοχή όπου συνήθως εμφανίζεται το μέγιστο των ρυθμών αμαύρωσης. Καταλήγοντας, φαίνεται πως η μάζα του νερού και όχι η α w είναι αυτό που θα έπρεπε να σχετίζεται με το ρυθμό της αντίδρασης. Στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξαν επίσης οι Shierwin και Labuza (2003) που μελέτησαν τη μη ενζυμική αμαύρωση σε 136

171 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση αφυδατωμένες σκόνες που διέφεραν ως προς την α w και τη συγκέντρωση υγροσκοπικών ουσιών (γλυκερόλης, σορβιτόλης). Τα δείγματα που περιείχαν σορβιτόλη ως υγροσκοπική ουσία παρουσίασαν ρυθμούς μη ενζυμικής αμαύρωσης όμοιους με τα συστήματα ελεύθερα υγροσκοπικών ουσιών, ενώ αυτά που περιείχαν γλυκερόλη εμφάνισαν μεγαλύτερους ρυθμούς αντίδρασης σε όλο το εύρος α w και της περιεχόμενης υγρασίας ( ) που εξετάστηκε. Οι αποκρίσεις για τα συστήματα που περιείχαν γλυκερόλη αποδόθηκαν στην υψηλότερη μοριακή κινητικότητα της συγκεκριμένης ουσίας, συγκριτικά με αυτή της σορβιτόλης. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία με τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, αφού τα διαλύματα χυμού μήλου με σορβιτόλη σε όλες τις συγκεντρώσεις έδειξαν όμοια αύξηση της απορρόφησης (Σχήμα 4.2α και 4.2β) με τα διαλύματα που είχαν την ίδια αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων συστατικών αλλά δεν περιείχαν σορβιτόλη και παρασκευάστηκαν έπειτα από αραίωση με απεσταγμένο νερό (καμπύλες με το μοτίβο ρόμβου στο Σχήμα 4.2γ και 4.2δ). Συνεπώς παρά τον έντονα ιξώδη χαρακτήρα που προσδίδει η σορβιτόλη κατά την προσθήκη της σε μεγάλες ποσότητες σε ένα υδατικό διάλυμα, η συνολική κινητικότητα των αντιδρώντων συστατικών στο σύστημα είναι αρκετά υψηλή ώστε να επιτρέπεται η διενέργεια της αντίδρασης της αμαύρωσης με τον ίδιο ρυθμό Ανάπτυξη του μοντέλου Προσαρμογή των πρωτογενών μοντέλων και σύγκριση αυτών Τα πειραματικά δεδομένα από 80 καμπύλες απορρόφησης χρόνου προσαρμόστηκαν σε πέντε πρωτογενή κινητικά μοντέλα όπως περιγράφηκε αναλυτικά στην παράγραφο (εξ ). Προηγούμενες μελέτες πάνω στη μη ενζυμική αμαύρωση ανέδειξαν πως η συγκεκριμένη αντίδραση περιγράφεται ικανοποιητικά είτε από το κινητικό μοντέλο μηδενικής (Bozkurt et al., 1999 Burdurlu και Karadeniz, 2003, Ibarz et al., 1999, Koca et al., 2003, Peterson et al., 1994, Rattanathanalerk et al., 2005, Shierwin και Labuza, 2003) ή πρώτης τάξης (Garza et al., 1999, Johnson et al., 1995, Toribio και Lozano, 1984, 1986), με σχετικά μικρές στατιστικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δύο μοντέλων. Ένα παραβολικό κινητικό μοντέλο εφαρμόστηκε επίσης από τους Buedo et al. (2001). Οι περισσότεροι ερευνητές προτείνουν τη μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης με το μοντέλο μηδενικής τάξης μετά από την πάροδο κάποιας φάσης προσαρμογής, η διάρκεια της οποίας εξαρτάται από τις πειραματικές συνθήκες, όπως ο χρόνος και η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία (Van Boekel, 2001). Αντιθέτως, αυτοί που υποστηρίζουν πως οι μεταβολές 137

172 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή στην απορρόφηση ακολουθούν κινητική πρώτης τάξης σημειώνουν ότι η προσαρμογή του συγκεκριμένου μοντέλου βελτιώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης των αντιδρώντων συστατικών (Johnson et al., 1995). Ωστόσο, κάποιοι ερευνητές προτείνουν πως η πραγματική τάξη των αντιδράσεων μη ενζυμικής αμαύρωσης βρίσκεται πιθανώς μεταξύ του βαθμού μηδέν και ένα (Nagy et al., 1990, Petriella et al., 1985). Άρα, η τάξη της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης είναι ένα αμφιλεγόμενο θέμα. Η παρούσα μελέτη προσπαθώντας να συμβάλλει στην απόκτηση μιας πιο ολοκληρωμένης εικόνας σχετικά με την κινητική της αντίδρασης αυτής, διερεύνησε την εκτεταμένη θερμική επεξεργασία συμπυκνωμάτων χυμού μήλου προσαρμόζοντας τα πειραματικά δεδομένα σε πέντε κινητικά μοντέλα. Γενικά, η αύξηση της απορρόφησης με την πάροδο του χρόνου αποτυπώνεται σε μια σιγμοειδή καμπύλη. Για πολλούς τύπους καμπυλών ανάπτυξης, ο ρυθμός ανάπτυξης αυξάνεται σταθερά μέχρι μια μέγιστη τιμή πριν ξεκινήσει η μείωσή του στο μηδέν (Seber και Wild, 1989), όπου και παρατηρείται η εμφάνιση κάποιου μέγιστου επιπέδου ή του ονομαζόμενου πλατό για την καταγραφούμενη παράμετρο απόκρισης. Αυτή η συμπεριφορά μπορεί να περιγραφεί ικανοποιητικά από τα ονομαζόμενα σιγμοειδή μοντέλα. Το Σχήμα 4.3 εικονίζει τη γραφική σύγκριση των πέντε κινητικών μοντέλων που προσαρμόστηκαν σε μια αντιπροσωπευτική καμπύλη απορρόφησης χρόνου. Είναι προφανές, πως η καλύτερη προσαρμογή επιτυγχάνεται από τη λογιστική εξίσωση και το μοντέλο weibull, όπως αποτυπώνονται με τις γραμμές 4 και 3, αντίστοιχα. Τα μοντέλα αυτά είναι τα μόνα που περιλαμβάνουν τον όρο της μέγιστης απορρόφησης (A max ) που παρατηρείται σε εκτεταμένους χρόνους θερμικής επεξεργασίας. Η φυσική σημασία της παραμέτρου Α max ανταποκρίνεται σε ένα μέγιστο βαθμό αμαύρωσης του χυμού, ως συνέπεια της κατανάλωσης των διαλυτών ουσιών ή / και την αποσύνθεση των σχηματιζόμενων χρωμοφόρων ουσιών, συντελώντας σταδιακά στην αποτροπή περαιτέρω αύξησης της απορρόφησης. Προκειμένου να συγκριθεί και στατιστικώς η καταλληλότητα προσαρμογής των πέντε κινητικών μοντέλων στις 80 καμπύλες απορρόφησης χρόνου, χρησιμοποιήθηκε η διαφορά των υπολοίπων των μέσων τετραγώνων (residual mean squares, rms), δηλαδή των υπολοίπων των αθροισμάτων τετραγώνων διαιρεμένη με τους βαθμούς ελευθερίας (residual sum of squares/degrees of freedom) όλων των υπό δοκιμή μοντέλων. Η μέθοδος αυτή έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί κατά την επιλογή μικροβιακών κινητικών μοντέλων αδρανοποίησης από τους Koutsoumanis et al. (1999). Η γραφική σύγκριση των διαφορών των rms μεταξύ των μοντέλων μηδενικής και πρώτης τάξης και του μοντέλου weibull ανά ζεύγη με το μηδενικό, το παραβολικό και το λογιστικό μοντέλο δίνεται στο Σχήμα 4.4. Οι 138

173 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση μέγιστοι ρυθμοί αμαύρωσης όπως αυτοί εκτιμήθηκαν από το μοντέλο μηδενικής τάξης (Σχ. 4.4α) και το μοντέλο weibull (Σχ. 4.4β-δ), παρουσιάζονται αντίστοιχα στον άξονα x. Τα σημεία των δεδομένων που βρίσκονται κάτω από τους οριζόντιους άξονες αντιπροσωπεύουν τις περιπτώσεις όπου η προσαρμογή του πρώτου μοντέλου (στη διαφορά των rms στον άξονα y) ήταν καλύτερη από αυτήν του δεύτερου. Είναι φανερό πως για τη λογιστική εξίσωση παρατηρήθηκαν οι μικρότερες τιμές στα υπολείμματα των μέσων τετραγώνων για τις περισσότερες από τις 80 περιπτώσεις που εξετάστηκαν, οπότε και το μοντέλο αυτό θεωρήθηκε ως το καταλληλότερο στην περιγραφή της μεταβολής του χρώματος κατά τη θερμική επεξεργασία των διαλυμάτων χυμού μήλου C - a w Abs (420 nm) μηδενικής τάξης 2. πρώτης τάξης 3. μοντέλο webull 4. λογιστικό μοντέλο 5. παραβολικό μοντέλο Χρόνος (h) Σχήμα 4.3. Γραφική σύγκριση των πέντε κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν (γραμμές) κατά την προσαρμογή τους στα πειραματικά δεδομένα (σύμβολα) μιας αντιπροσωπευτικής καμπύλης σχηματισμού χρωμοφόρων ουσιών κίτρινου-καφέ χρωματισμού σε χυμό μήλου με α w 0.99 που θερμάνθηκε ισόθερμα στους 80 C Περιγραφή της εξάρτησης των παραμέτρων k και A max από τη θερμοκρασία και την α w με δευτερογενή μοντέλα Δεδομένου ότι η μη ενζυμική αμαύρωση των διαλυμάτων χυμού μήλου με την ίδια αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων σακχάρων δεν επηρεάζεται αποκλειστικά από την ενεργότητα του νερού, αναπτύχθηκαν δευτερογενή μοντέλα που περιγράφουν την εξάρτηση των παραμέτρων k και A max μόνο για τα δείγματα χυμού που αραιώθηκαν με νερό. Τα δείγματα 139

174 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αυτά διέφεραν τόσο ως προς την ενεργότητα του νερού όσο και ως προς την αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων σακχάρων. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης αρχικά μοντελοποιήθηκε με χρήση μιας τροποποιημένης εξίσωσης Arrhenius (εξ. 3.6). Οι γραμμές τάσης-παλινδρόμησης που αντιστοιχούν στις καμπύλες Arrhenius (Σχήμα 4.5) για όλα τα επίπεδα ενεργότητας νερού ήταν παράλληλες, γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη ενός στατιστικώς αμετάβλητου - σταθερού όρου που περιγράφει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση των σταθερών της αντίδρασης, αυτόν της ενέργειας ενεργοποίησης, Ε α. Οι παράλληλες καμπύλες Arrhenius δείχνουν επίσης ότι η θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού της αντίδρασης δεν επηρεάζεται σημαντικά από την α w. Η επίδραση της α w στο ρυθμό της αντίδρασης αμαύρωσης εκφράστηκε από μια σταθερά d (εξ. 3.6) που περιγράφει την εκθετική αύξηση του ρυθμού της αμαύρωσης καθώς η ενεργότητα νερού μειώνεται. Το προτεινόμενο τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius, 3 α 3 β rms μηδενικής- rms πρώτης τάξης rms weibull- rms μηδενικής k μηδενικής τάξης γ k weibull δ rms weibull- rms παραβολικό rms λογιστικό- rms weibull k weibull Σχήμα 4.4 Σύγκριση καλής προσαρμογής των πέντε κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν, κάνοντας χρήση της διαφοράς των υπολοίπων των μέσων τετραγώνων (rms) μεταξύ των κινητικών μοντέλων μηδενικής και πρώτης τάξης (α), και σύγκριση του μοντέλου weibull με το μοντέλο μηδενικής τάξης (β), το παραβολικό μοντέλο (γ) και το λογιστικό μοντέλο (δ) k weibull 140

175 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση περιγράφει ταυτόχρονα την εξάρτηση του ρυθμού της αντίδρασης αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου από τη θερμοκρασία και την α w, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.6α και 4.6β, αντίστοιχα lnk (h -1 ) E E E E-04 1/T-1/T ref (K) Σχήμα 4.5. Καμπύλες Arrhenius που εικονίζουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού της μη-ενζυμικής αμαύρωσης (k) συμπυκνωμάτων χυμού μήλου με διαφορετική α w. k (h -1 ) 0.15 α Θερμοκρασία ( C) k (h -1 ) α w β Σχήμα 4.6. Επίδραση της θερμοκρασίας (α), και της ενεργότητας του νερού (β), στη σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης. Οι γραμμές στα δύο σχήματα παρουσιάζουν τις προβλεπόμενες τιμές του ρυθμού της αντίδρασης σε σταθερά επίπεδα α w (α) ή θερμοκρασιακές συνθήκες (β). 141

176 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Η συνδυασμένη δράση της θερμοκρασίας και της α w στο ρυθμό αμαύρωσης του χυμού μήλου διερευνήθηκε εκτιμώντας τις παραμέτρους των εξισώσεων των δευτερογενών μοντέλων (εξ ), δηλαδή των εξισώσεων Arrhenius, και Belehradek και των πολυωνυμικών μοντέλων όπως αυτές συνοπτικά αναγράφονται στον Πίνακα 4.1. Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε μικρότερες τιμές του συντελεστή προσδιορισμού, R 2, για την εξίσωση Arrhenius σε σύγκριση με τις τιμές του R 2 για τα πολυωνυμικά μοντέλα. Ωστόσο, η πρώτη εξίσωση παρουσιάζεται περισσότερο εφαρμόσιμη έχοντας ταυτόχρονα μεγαλύτερη θεωρητική βαρύτητα αφού επιτρέπει την έκφραση της θερμοκρασιακής ευαισθησίας της μη ενζυμικής αμαύρωσης από τον προσδιοριζόμενο όρο ενέργεια ενεργοποίησης, Ε α, καθώς και την εκτίμηση του ρυθμού της αντίδρασης σε κάποιες συνθήκες αναφοράς. Η εφαρμογή του μοντέλου Belehradek έδωσε τη δυνατότητα εκτίμησης της ελάχιστης θερμοκρασίας στην οποία είναι δυνατό να λάβει μέρος η μη ενζυμική αμαύρωση των συμπυκνωμάτων του χυμού μήλου στους 44.4 C, τιμή που θεωρείται μάλλον μη πραγματική. Αντίθετα, τα πολυωνυμικά μοντέλα έδωσαν μεν μεγαλύτερη ακρίβεια λόγω της προσθήκης μιας επιπλέον παραμέτρου πέραν αυτών που συμμετέχουν στις εξισώσεις Arrhenius και Belehradek, αλλά καμιά από τις παραμέτρους των διωνύμων δεν μπορεί να χαρακτηριστεί ως διευκρινιστική και επιπλέον καμιά από αυτές δεν παρέχει κάποια πρακτική πληροφορία σχετικά με τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ρυθμού της μη ενζυμικής αμαύρωσης. Η εκτιμούμενη τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης κατά το σχηματισμό χρωμοφόρων ουσιών μελανού χρώματος στα συμπυκνώματα του χυμού μήλου, υπολογίστηκε από το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius σε 67.0 kj/mol (Πίνακας 4.1), τιμή που βρίσκεται στο εύρος των kj/mol, όπως έχει συχνά καταγραφεί στη βιβλιογραφία (Labuza και Baisier, 1992). Επίσης, οι τιμές Ε α που εκτιμήθηκαν από τους Ibarz et al. (1999, 2000) για την απορρόφηση σε μήκος κύματος 420 nm (Α 420 ) θερμικώς επεξεργασμένου πουρέ αχλαδιού και μήλου ήταν αντίστοιχα 62.8 και 75.9 kj/mol. Οι Manso et al. (2001) ανέφεραν ότι η ενέργεια ενεργοποίησης κατά την αμαύρωση του χυμού πορτοκαλιού ήταν 65.8 kj/mol και οι Toribio και Lozano (1984) έδωσαν τιμές ενέργειας ενεργοποίησης μεταξύ 69.0 και 83.7 kj/mol για την μη ενζυμική αμαύρωση του χυμού μήλου κατά την αποθήκευσή του. Οι Johnson et al. (1995) κατέγραψαν ενέργειες ενεργοποίησης μεταξύ kj/mol για την αμαύρωση του ορού χυμού πορτοκαλιού και τέλος, οι Burdurlu και Karadeniz (2003) εκτίμησαν τιμές Ε α μέσα στο εύρος kj/mol. Ωστόσο, υπάρχουν κι άλλοι ερευνητές που έχουν αναφερθεί σε υψηλότερες τιμές Ε α, π.χ kj/mol (Bozkurt et al., 1999), 135 ή / και 148 kj/mol (Garza et al., 1999) και kj/mol 142

177 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση (Koca et al., 2003) για βρασμένο χυμό σταφυλιού, πουρέ ροδάκινου και συμπυκνώματα χυμού εσπεριδοειδών, αντίστοιχα. Η ευρεία διαφοροποίηση που απαντάται στη βιβλιογραφία όσον αφορά στην εκτίμηση των ενεργειών ενεργοποίησης εξαρτάται από τις ιδιαίτερες πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται κάθε φορά, καθώς και από την επίδραση αυτών στο μηχανισμό της αντίδρασης (Van Boekel, 2001). Πίνακας 4.1. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±, P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τεσσάρων δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου (k) από τη θερμοκρασία και την α w. Τύπος εξίσωσης Παράμετρος R 2 α Εκτιμούμενη τιμή CL(±) β πολυωνυμική k α P>0.05 γ (εξίσωση 3.8) α α α α α 6 P>0.05 πολυωνυμική (εξίσωση 3.8) Belehradek k (εξίσωση 3.7) k α P>0.05 α α α α P>0.05 α 6 b T min ( C) α w max Arrhenius lnk k ref (h -1 ) (εξίσωση 3.6) E α (kj/mol) d α Συντελεστής προσδιορισμού β ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) γ P > 0.05 υποδηλώνει πως η παράμετρος δε βρέθηκε στατιστικώς σημαντική σε επίπεδο σημαντικότητας 95%. Δευτερογενή μοντέλα αναπτύχθηκαν επίσης για την παράμετρο που εκφράζει τη φαινομενική μέγιστη απορρόφηση Α max και παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.2, μαζί με τα στατιστικά στοιχεία και τους εκτιμούμενους συντελεστές των παραμέτρων των εξισώσεων. Η πολυωνυμική εξίσωση που αποτυπώνει τη μεταβολή του φυσικού λογαρίθμου της μέγιστης απορρόφησης, ln A max, ως συνάρτηση της θερμοκρασίας και της α w επιλέχτηκε ως το καταλληλότερο μοντέλο για την περιγραφή της μέγιστης απορρόφησης που επιτυγχάνεται κατά τη μη ενζυμική αμαύρωση των συμπυκνωμάτων του χυμού μήλου. Η πρόβλεψη του ln A max σε διάφορους συνδυασμούς α w και θερμοκρασιών επεξεργασίας εικονίζεται στο Σχήμα 4.7. Όσο περισσότερο συμπυκνωμένος ήταν ο χυμός μήλου 143

178 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή (χαμηλές τιμές α w ) και όσο υψηλότερη η θερμοκρασία εφαρμογής, τόσο πιο σκούρο κατέληξε το χρώμα του χυμού, φτάνοντας ένα μέγιστο στη χαμηλότερη τιμή ενέργειας ενεργοποίησης και την υψηλότερη θερμοκρασία που εξετάστηκε ln (A max ) ln (Amax) Temperature ( C) 75 Θερμοκρασία ( C) α w a w 0.75 Σχήμα 4.7. Καμπύλη πρόβλεψης της επιφάνειας που εικονίζει την εξάρτηση της μέγιστης στο πλατό απορρόφησης, A max, ως συνάρτηση της θερμοκρασίας και της α w. Τα σημεία και οι ράβδοι στην εικονιζόμενη επιφάνεια αποτελούν την πρόβλεψη και τα αντίστοιχα εύρη της πρόβλεψης της απόκρισης ln (A max ) για κάθε συνδυασμό θερμοκρασίας και α w. Επιπλέον, στην περίπτωση της παραμέτρου t i, το δευτέρου βαθμού πολυωνυμικό μοντέλο που περιγράφει την εξάρτηση του φυσικού λογαρίθμου του t i από τη θερμοκρασία και την α w αποδείχτηκε το καταλληλότερο μεταξύ των υπολοίπων που εξετάστηκαν (Πίνακας 4.2). Όπως αναμένονταν, η παράμετρος Α 0 του λογιστικού μοντέλου δεν επηρεάστηκε ούτε από τη θερμοκρασία ούτε από την α w σε κανένα από τα δείγματα χυμού μήλου (P > 0.05), από τη στιγμή που όλα τα δείγματα αραιώθηκαν πρώτα στην ίδια συγκέντρωση στερεών συστατικών (11.65 Bx) πριν την ανάλυση τους φασματοφωτομετρικά Αξιολόγηση του μοντέλου κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θερμικής επεξεργασίας. Η δυνατότητα εφαρμογής των μοντέλων που αναπτύχθηκαν εκτιμήθηκε συγκρίνοντας τους προβλεπόμενους ρυθμούς αμαύρωσης που προέκυψαν από τα τέσσερα δευτερογενή μοντέλα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή (εξ ) με τους πραγματικούς 144

179 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση ρυθμούς αμαύρωσης που καταγράφηκαν κατά τον πειραματισμό σε ανεξάρτητα πειράματα κατά την θέρμανση σε ισόθερμες συνθήκες (Σχήμα 4.8). Το μοντέλο Arrhenius παρουσίασε τις μικρότερες διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων από το μοντέλο τιμών των σταθερών του ρυθμού αντίδρασης, και το μεγαλύτερο ποσοστό των διαφορών βρέθηκε στο εύρος του 5% (Σχήμα 4.8α). Αντίθετα το μοντέλο Belehradek ήταν λιγότερο ικανοποιητικό (Σχήμα 4.8β), ενώ τα πολυωνυμικά μοντέλα ανέδειξαν την ύπαρξη συστηματικών διαφοροποιήσεων μεταξύ των προβλεπόμενων και παρατηρούμενων τιμών (Σχήματα 4.8γ και 4.8δ). Πίνακας 4.2. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±. P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τριών δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της μέγιστης απορρόφησης, Α max, και της παραμέτρου t i του λογιστικού μοντέλου από τη θερμοκρασία και την α w κατά τη θέρμανση των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου. Τύπος εξίσωσης Παράμετρος R 2 α Εκτιμούμενη τιμή CL(±) β πολυωνυμική A max α (εξίσωση 3.8) α α α α α πολυωνυμική ln(a max ) (εξίσωση 3.8) Arrhenius ln(a max ) (εξίσωση 3.6) α α α α α α 6 A max ref E α (kj/mol) d πολυωνυμική ln(t i ) α 1 P>0.05 γ (εξίσωση 3.8) α α α α α 6 P>0.05 α Συντελεστής προσδιορισμού ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) γ P > 0.05 υποδηλώνει πως η παράμετρος δε βρέθηκε στατιστικώς σημαντική σε επίπεδο σημαντικότητας 95%. Επιπρόσθετα, μια άλλη σύγκριση των ρυθμών αμαύρωσης, όπως αυτοί υπολογίζονται από την εξίσωση Arrhenius και αυτών που καταγράφηκαν σε όλους τους πειραματικούς συνδυασμούς που εξετάστηκαν, ανέδειξε ικανοποιητική συμφωνία μεταξύ τους. Πράγματι, 145

180 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή η γραφική απεικόνιση των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων τιμών ρυθμού αμαύρωσης ως ζεύγη τιμών (x,y) απέδειξε πως υπάρχουν ελάχιστες μεταξύ τους διαφοροποιήσεις αφού όλα τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο διάγραμμα αναπτύσσονται πολύ κοντά στη διαγώνιο, η οποία αντιπροσωπεύει ταυτόσημες τιμές των δύο παραμέτρων (Σχήμα 4.9). Συνεπώς, το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius αποδείχτηκε ως το καταλληλότερο για την περιγραφή της εξάρτησης του ρυθμού της μη ενζυμικής αμαύρωσης από τη θερμοκρασία και την ενεργότητα νερού. (kπαρατ - kπροβ)/ kπαρατ x α Arrhenius (kπαρατ - kπροβ)/ kπαρατ x β Belehradek (kπαρατ - kπροβ)/ kπαρατ x k παρατ (h -1 ) γ πολυωνυμικό k k παρατ (h -1 ) (kπαρατ - kπροβ)/ kπαρατ x k παρατ (h -1 ) δ πολυωνυμικό k παρατ (h -1 ) Σχήμα 4.8. Επί τοις εκατό (%) διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων (k παρατ ) σε ανεξάρτητα πειράματα και των προβλεπόμενων (k προβ ), όπως εκτιμήθηκαν από τα τέσσερα δευτερογενή μοντέλα που εξετάστηκαν, τιμών των ρυθμών αμαύρωσης (k) των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου. Στη βιομηχανία τροφίμων, η θερμική επεξεργασία κατά την παραγωγική διαδικασία περιλαμβάνει συχνά την εφαρμογή ποικίλων πρωτοκόλλων χρόνου - θερμοκρασίας, τα οποία επηρεάζουν σημαντικά τα τελικά ποιοτικά χαρακτηριστικά των προϊόντων. Προκειμένου να προβλεφθεί καλύτερα η ποιοτική υποβάθμιση των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου, όλη η μεθοδολογία της μοντελοποίησης της κινητικής της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης που περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκε συνολικά κατά την παρά- 146

181 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση k προβ (h -1 ) k παρατ (h -1 ) Σχήμα 4.9. Απεικόνιση των προβλεπόμενων τιμών του ρυθμού αμαύρωσης του χυμού μήλου (k προβ ) (χρησιμοποιώντας το μοντέλο Arrhenius) ως συνάρτηση των αντίστοιχων παρατηρούμενων τιμών (k παρατ ) κατά τη θέρμανση σε ποικίλους συνδυασμούς θερμοκρασίας και α w. Τα ανοιχτά σύμβολα αντιπροσωπεύουν τους ρυθμούς αμαύρωσης που καταγράφηκαν κατά το πρώτο στάδιο του πειραματικού σχεδιασμού εφαρμόζοντας θερμική επεξεργασία κάτω από ισόθερμες συνθήκες και τα κλειστά σύμβολα τις τιμές των σταθερών της αντίδρασης αμαύρωσης που προέκυψαν στα λεγόμενα ανεξάρτητα πειράματα. κολούθηση και καταγραφή της αύξησης της απορρόφησης που συμβαίνει κατά τη θερμική επεξεργασία του ίδιου συστήματος, κάτω από μεταβαλλόμενες συνθήκες. Μία αποδεκτή μέθοδος προσέγγισης που έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως στην ποσοτική μικροβιολογία με σκοπό την πρόβλεψη της μικροβιακής ανάπτυξης σε συστήματα που συντηρούνται κάτω από μεταβαλλόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες, περιλαμβάνει τη διαίρεση του χρονο-θερμοκρασιακού ιστορικού σε μικρά διαστήματα θερμοκρασίας χρόνου για τα οποία θεωρείται ότι η θερμοκρασία παραμένει σταθερή (Fu και Labuza, 1993, Koutsoumanis, 2001). Βασιζόμενοι στο πλαίσιο αυτό, η αύξηση της απορρόφησης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου σε κυμαινόμενες θερμοκρασίες επεξεργασίας προβλέφθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε από τον Koutsoumanis (2001) μετά από κατάλληλες τροποποιήσεις ως ακολούθως: Στο χρόνο t=dt 1 η απορρόφηση Α t1 υπολογίζεται από το λογιστικό μοντέλο ως A A + A 1 exp ( k ) max t1 t 1 = Amax t1 1 1dt1 Στο επόμενο χρονικό διάστημα, t = dt 2 0 A max t exp 2 t At 1 ( k ) t 2 = Amax t2 d 2 A 147

182 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή και στο χρόνο t = dt i A ti A ti= A t max + ( ) max i1 1 exp kidti (4.1) At( i-1) Επιπλέον, υιοθετήθηκε η ακόλουθη συνθήκη: A max ti A = At max ti ( i 1) αν A max ti A t( i 1) αν Amax A ( 1) ti t i όπου dt i (i = 1, 2, 3, κλπ.) είναι ένα μικρό, θεωρητικώς σταθερό ως προς τη θερμοκρασία, χρονικό διάστημα, A 0 είναι η αρχική απορρόφηση τη χρονική στιγμή της έναρξης του πειράματος, A ti είναι η εκτίμηση της απορρόφησης για το χρονικό διάστημα dt i, A max ti είναι η μέγιστη τιμή απορρόφησης όπως υπολογίζεται από το δευτερογενές μοντέλο για τη θερμοκρασία που αντιστοιχεί στο εν λόγω χρονικό διάστημα dt i, και k i είναι η σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης στη θερμοκρασία κατά την οποία διαρκεί το χρονικό διάστημα dt i, όπως εκτιμάται από το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius. Η ικανότητα του δυναμικού μοντέλου που αναπτύχθηκε να προβλέπει τη μη ενζυμική αμαύρωση των συμπυκνωμάτων του χυμού μήλου κάτω από μη ισόθερμες (δυναμικές) συνθήκες θερμικής επεξεργασίας, επίσης αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες καμπύλες ανάπτυξης απορρόφησης (εξ. 4.1) έναντι των πραγματικών δεδομένων αμαύρωσης που πραγματοποιήθηκαν σε τέσσερα πειράματα τα οποία περιλάμβαναν διακυμάνσεις στην εφαρμοζόμενη θερμοκρασία. Αρχικά, εφαρμόστηκαν δύο σενάρια παρατεταμένης θέρμανσης σε θερμοκρασιακά προφίλ με περιοδικά μεταβαλλόμενες αλλαγές στη θερμοκρασία, κατά τα οποία ο συμπυκνωμένος χυμός μήλου θερμάνθηκε για 12 ώρες στους 65 C και 12 ώρες στους 85 C (Σχήμα 4.10) ή για 12 ώρες στους 65 C, 6 ώρες στους 75 C και 6 ώρες στους 85 C (Σχήμα 4.11). Και στις δύο περιπτώσεις το δυναμικό μοντέλο που αναπτύχθηκε παρουσιάστηκε ικανό να περιγράψει με καλή ακρίβεια την αύξηση της απορρόφησης που παρατηρείται κατά τη μη ενζυμική αμαύρωση του συμπυκνωμένου χυμού μήλου στα μεταβαλλόμενα θερμοκρασιακά προφίλ που υιοθετήθηκαν. Τα τελευταία δύο πρωτόκολλα αφορούσαν θερμική επεξεργασία του χυμού μήλου είτε για 2 ώρες στους 65 C, 2 ώρες στους 75 C και 2 ώρες στους 85 C (Σχήμα 4.12) ή 3 ώρες στους 65 C και 3 ώρες στους 85 C (Σχήμα 4.13) (συνολική διάρκεια εφαρμοζόμενης θέρμανσης 6 ώρες). Σχετικά καλή συμφωνία παρατηρήθηκε μεταξύ των πραγματικών δεδομένων αμαύρωσης και αυτών που προέκυψαν από την πρόβλεψη του μοντέλου, και για το δυναμικό πρωτόκολλο θέρμανσης μικρής διάρκειας. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει πως η 148

183 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση πρόβλεψη της μη ενζυμικής αμαύρωσης είναι επίσης εφικτή στις θερμικές επεξεργασίες που προσομοιάζουν την πραγματική διεργασία της παστερίωσης των χυμών φρούτων Abs (420 nm) Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) 60 Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.865) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 65 C και 12 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Abs (420 nm) Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) 60 Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμής) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.865) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 65 C, 6 ώρες στους 75 C και 6 ώρες στους 85 C (β). Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας. Ανακεφαλαιώνοντας, η κύρια συνεισφορά της μελέτης αυτής είναι η πλήρης κινητική ανάλυση του φαινομένου της μη ενζυμικής αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων του χυμού μήλου τόσο κάτω από ισόθερμες όσο και υπό δυναμικές συνθήκες θέρμανσης, όπου οι μεμο- 149

184 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Abs (420 nm) Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) 60 Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμές) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.740) που θερμάνθηκε για 2 ώρες στους 65 C, 2 ώρες στους 75 C και 2 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Abs (420 nm) Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) 60 Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμές) αμαύρωσης συμπυκνώματος χυμού μήλου (α w 0.740) που θερμάνθηκε για 3 ώρες στους 65 C και 3 ώρες στους 85 C. Οι διακεκομμένες γραμμές εικονίζουν τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας. νωμένες και συνδυασμένες δράσεις των παραγόντων θερμοκρασία και ενεργότητα νερού διερευνήθηκαν ενδελεχώς. Όπως αναμένονταν, η εφαρμοζόμενη θερμοκρασία κατά την επεξεργασία, επηρέασε δραστικά τις κινητικές αμαύρωσης για τα συμπυκνώματα του χυμού που είχαν είτε την ίδια είτε διαφορετική αρχική συγκέντρωση σακχάρων. Ωστόσο, η αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων συστατικών, και όχι αποκλειστικά η α w, είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη μελανού χρωματισμού στο χυμό. Η μοντελοποίηση των 150

185 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση κινητικών δεδομένων ανέδειξε πως το λογιστικό μοντέλο περιγράφει καλύτερα το σχηματισμό ουσιών μελανού χρώματος στα συμπυκνώματα του χυμού μήλου. Επιπλέον, η εφαρμοζόμενη τροποποιημένη εξίσωση Arrhenius που εκφράζει την εξάρτηση του ρυθμού της αντίδρασης από τη θερμοκρασία και την α w, κατέστη ικανή να προβλέψει με αρκετά καλή ακρίβεια τη σταθερά του ρυθμού της αντίδρασης, υπολογίζοντας τιμές της εν λόγω κινητικής παραμέτρου, όμοιες με τις παρατηρούμενες τιμές των ρυθμών της αντίδρασης σε ανεξάρτητα πειράματα. Το συνολικό ανασχηματισμένο δυναμικό λογιστικό μοντέλο που αναπτύχθηκε προέβλεψε ικανοποιητικά την έκταση της μη-ενζυμικής αμαύρωσης θερμικώς επεξεργασμένου χυμού μήλου κάτω από δυναμικά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα θέρμανσης. 151

186 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 4.2 Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και αραιωμένα συστήματα μελιού που υποβάλλονται σε ισόθερμα και δυναμικά πρωτόκολλα θέρμανσης Το μέλι είναι τρόφιμο υψηλής διατροφικής αξίας και σημαντικό συμπλήρωμα διατροφής με πολλές λειτουργικές και θεραπευτικές ιδιότητες, κυρίως εξαιτίας της πλούσιας σύνθεσής του σε απαραίτητα αμινοξέα, ιχνοστοιχεία, βιταμίνες, και άλλα βιοενεργά συστατικά. Σημαντικές παράμετροι που καθορίζουν την ποιότητα του μελιού είναι τα χημικά, ρεολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Κατά τη συντήρηση του, το μέλι υπόκειται σταδιακά σε αμαύρωση ως συνέπεια των αντιδράσεων Maillard, της καραμελοποίησης της φρουκτόζης ή λόγω της αντίδρασης των πολυφαινολών που υπάρχουν στο μέλι με τα υπάρχοντα σε αυτό άλατα σιδήρου (Lynn et al., 1939). O ρυθμός της αμαύρωσης σχετίζεται με τη σύσταση του μελιού και τη θερμοκρασία συντήρησης (White, 1978). Παρόμοιες απώλειες στην ποιότητα του μελιού αποδίδονται επίσης στη θέρμανση του, απαραίτητο στάδιο στις διαδικασίες εκχύλισης και συσκευασίας του προϊόντος. Το μέλι υποβάλλεται συνήθως σε θερμική επεξεργασία με σκοπό τη μείωση της τάσης του να κρυσταλλώνει ή απλώς στοχεύοντας στην καθυστέρηση της κρυστάλλωσής του, αλλά και για την παρεμπόδιση της ανάπτυξης της υπάρχουσας μικροχλωρίδας με την οποία ενδεχομένως έχει επιμολυνθεί το προϊόν (Fallico et al., 2004, Tosi et al., 2002, Turkmen et al., 2006). Η κρυστάλλωση του μελιού και η μικροβιακή ζύμωση είναι φαινόμενα που σχετίζονται στενά με τις διεργασίες αλλοίωσής του. Τα κρυσταλλωμένα μέλια συνήθως παρουσιάζουν απώλεια στην ομοιογένειά τους, ενώ η συνύπαρξη υγρής και κρυσταλλικής φάσης συμβάλλει στην αύξηση της ενεργότητας του νερού επιτρέποντας την ανάπτυξη των ενδογενών οσμόφιλων ζυμών στην πλούσια σε γλυκόζη και φρουκτόζη υγρή φάση (Chirife et al., 2006, Tosi et al., 2002). Η θέρμανση του μελιού διεξάγεται με δύο διαφορετικούς τρόπους: α) διατηρώντας το προϊόν σε θαλάμους όπου διοχετεύεται και κυκλοφορεί αέρας στη θερμοκρασία των C για 4-7 ημέρες, ή βυθίζοντας σε ζεστό νερό, κατάλληλα τύμπανα που περιέχουν το προϊόν (Fallico et al., 2004). Στη βιβλιογραφία, η έκταση της θερμικής επεξεργασίας του μελιού σχετίζεται συνήθως με τη συγκέντρωση της περιεχόμενης σε αυτό 5-υδροξυμέθυλοφουρφουράλης (HMF) και την ενεργότητα του ενζύμου διαστάση. Οι δύο αυτοί δείκτες ποιότητας, θεωρούνται ότι αντικατοπτρίζουν αξιόπιστα το θερμικό ιστορικό του προϊόντος (Bath και Singh, 1999, Fallico et al., 2004, Mendes et al., 1998, Moreira et al., 2007, Tosi et 152

187 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση al., 2002, 2008, White 1994). Ωστόσο, το χρώμα του μελιού αποτελεί συνήθως το κύριο χαρακτηριστικό που καθορίζει την αποδοχή του από τον καταναλωτή, καθώς και ένα πρακτικό εργαλείο εκτίμησης της ποιότητας και κατά συνέπεια της τιμής του, στην παγκόσμια αγορά (Gonzales et al., 1999). Συνεπώς, η αμαύρωση όπως καταγράφεται από τις μετρούμενες τιμές απορρόφησης, χρησιμοποιήθηκε εδώ ως δείκτης για τον προσδιορισμό των σχηματιζόμενων χρωστικών μελανού χρωματισμού του μελιού κατά τη θέρμανσή του. Στην παρούσα μελέτη ένα φυσικό δείγμα μελιού αραιώθηκε κατάλληλα με νερό στο εύρος ενεργότητας νερού , και η προσέγγιση της κινητικής μοντελοποίησης που αναπτύχθηκε προηγουμένως για το χυμό μήλου, χρησιμοποιήθηκε κι εδώ για την εκτίμηση της έκτασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο θερμαινόμενο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού Σχηματισμός μελανών χρωμοφόρων ουσιών κατά την ισόθερμη θέρμανση του μελιού και των αραιωμένων αιωρημάτων αυτού Η θέρμανση του μελιού και των αραιωμένων δειγμάτων του σε ισόθερμες συνθήκες συντέλεσε στην αύξηση της απορρόφησής τους ως αποτέλεσμα του σχηματισμού μελανών χρωμοφόρων ουσιών. Η καταγραφή της απορρόφησης έχει χρησιμοποιηθεί πολλές φορές στο παρελθόν κατά τη μελέτη της επίδρασης της παρατεταμένης θέρμανσης στο χρώμα του μελιού (Turkmen et al., 2006) ή της έκτασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης σε χυμούς φρούτων, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Η επίδραση της θερμοκρασίας στη μη ενζυμική αμαύρωση του μελιού φαίνεται στο Σχήμα 4.14, όπου η τελική ανάπτυξη του χρώματος στο μέλι ήταν περισσότερο διακριτή για το μητρικό δείγμα μελιού ακολουθούμενη κατά μειούμενη σειρά από τα δείγματα μελιού με ολοένα και μεγαλύτερο βαθμό αραίωσης ή τιμή α w. Αντίθετα, η ισόθερμη θέρμανση για τα δείγματα που διέφεραν ως προς την α w συνέβαλλε στην κατά πολύ μικρότερη μεταβολή της καταγραφούμενης απορρόφησης (Σχήμα 4.15). Συγκεκριμένα, η αύξηση της απορρόφησης ήταν μάλλον αμελητέα για τη θέρμανση στους 50 ή / και 60 C, μικρή στους 70 C, και αξιοσημείωτη στους 80 C. Παρόμοιες τιμές απορρόφησης έχουν σημειωθεί και από άλλο ερευνητή κατά τη θέρμανση ενός δείγματος μελιού στους 50, 60, και 70 C (Turkmen et al., 2006). Συνεπώς, ο σχηματισμός χρωμοφόρων ουσιών καφέ - μελανού χρώματος παρουσιάζεται περισσότερο έντονος στα συμπυκνωμένα δείγματα λόγω της μεγαλύτερης συγκέντρωσης σε αυτά αντιδρώντων συστατικών, όπως έχει διαπιστωθεί να συμβαίνει και σε άλλα υγρά μοντέλα συστήματα (Baisier και Labuza, 1992), σε συμπυκνώματα χυμού μήλου (Toribio και 153

188 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Lozano, 1984, Vaikousi et al., 2008a) και χυμού πορτοκαλιού (Johnson et al., 1995). A (Abs 420 nm) α w C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) α w C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) Χρόνος (h) α w C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) Χρόνος (h) α w C 60 C 70 C 80 C Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα Επίδραση της θερμοκρασίας στις καμπύλες απορρόφησης χρόνου που περιγράφουν την κινητική μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού με διαφορετική α w κατά την ισόθερμη θέρμανση τους σε διάφορες θερμοκρασίες. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα α w που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή για τα δείγματα μελιού βρίσκονταν στο εύρος τιμών όπου συνήθως παρατηρείται ο μέγιστος ρυθμός αμαύρωσης, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν συνεχή μείωση των σταθερών των ρυθμών αντίδρασης με την αύξηση της α w των δειγμάτων στο εύρος τιμών από 0.54 ως Στην περίπτωση αυτή, το αποτέλεσμα της αραίωσης στη συγκέντρωση των διαλυτών στερεών στο μέλι κυριαρχεί έναντι της πιθανής απώλειας της κινητικότητας των αντιδρώντων συστατικών που λαμβάνει χώρα σε αρκετά χαμηλά επίπεδα ενεργότητας νερού και η οποία θα παρεμπόδιζε την αντίδραση μεταξύ των αντιδρώντων μορίων, όπως συμβαίνει στα κονιοποιημένα συστήματα (σκόνες) και στα συστήματα τροφίμων που 154

189 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση βρίσκονται στην υαλώδη κατάσταση. Εξάλλου, σε κάποιες μελέτες αναφέρεται ότι το μέγιστο του ρυθμού της αντίδρασης ανέρχεται σε επίπεδα ενεργότητας νερού μεταξύ (Labuza και Baisier, 1992) ή σε ακόμη χαμηλότερα επίπεδα μεταξύ 0.41 και 0.55, σε υγρά αλλά και στερεά συστήματα που περιέχουν γλυκερόλη, υποδηλώνοντας ότι στα συστήματα αυτά υπάρχει διαθέσιμη μια υγρή φάση που επιτρέπει στα σάκχαρα και τα αμινοξέα να διαλυθούν και να αντιδράσουν μεταξύ τους, οδηγώντας στην επίτευξη υψηλότερων ρυθμών της αντίδρασης σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις νερού (Eichner και Karel, 1972) C C A (Abs 420 nm) A (Abs 420 nm) Χρόνος (h) Χρόνος (h) C C A (Abs 420 nm) A (Abs 420 nm) Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα Επίδραση της ενεργότητας νερού στις καμπύλες απορρόφησης χρόνου που περιγράφουν την κινητική μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού κατά την ισόθερμη θέρμανσή τους στους 50, 60, 70 και 80 C. 155

190 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ανάπτυξη του μοντέλου Προσαρμογή του πρωτογενούς λογιστικού μοντέλου Τα δεδομένα από τριάντα δύο καμπύλες μεταβολής της απορρόφησης ως συνάρτηση του χρόνου, προσαρμόστηκαν στο λογιστικό μοντέλο (εξ. 3.9). Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην προηγούμενη μελέτη της ενζυμικής αμαύρωσης του συμπυκνωμένου χυμού μήλου, η λογιστική εξίσωση αναδείχτηκε η καταλληλότερη μεταξύ των υπολοίπων τεσσάρων κινητικών μοντέλων που εξετάστηκαν για την περιγραφή του φαινομένου. Άλλωστε, φαίνεται και στα Σχήματα 4.14 και 4.15, ότι η μεταβολή της απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου, ακολουθεί ένα σιγμοειδές μοτίβο στις περισσότερες των περιπτώσεων, γεγονός που υποδεικνύει πως η κατάλληλη εξίσωση που θα περιγράφει καλύτερα τα δεδομένα απορρόφησης χρόνου πρέπει να περιέχει έναν όρο που να σχετίζεται με το μέγιστο επίπεδο της καταγραφούμενης παραμέτρου, δηλαδή το A max. Ο όρος αυτός υπάρχει στη λογιστική εξίσωση, οπότε το συγκεκριμένο μοντέλο υιοθετήθηκε επιτυχώς και στην παρούσα μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης κατά τη θερμική επεξεργασία των συστημάτων μελιού. Οι γραμμές στα Σχήματα 4.14 και 4.15 παρουσιάζουν την προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων απορρόφησης - χρόνου στη λογιστική εξίσωση, και φαίνεται να αποδεικνύουν γραφικώς την καλή προσαρμογή του επιλεγμένου κινητικού μοντέλου Προσαρμογή των δευτερογενών μοντέλων στις παραμέτρους k και A max που εξήχθησαν από το πρωτογενές μοντέλο Η συνδυασμένη δράση της θερμοκρασίας και της α w στις τιμές των παραμέτρων k και A max, όπως αυτές εκτιμήθηκαν από το πρωτογενές μοντέλο, διερευνήθηκε προσαρμόζοντας σε αυτές τα δευτερογενή μοντέλα που περιγράφηκαν αναλυτικά στην παράγραφο (εξ ). Η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης μοντελοποιήθηκε με τη βοήθεια της τροποποιημένης εξίσωσης Arrhenius (εξ. 3.6) και παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.16α. Οι παράλληλες καμπύλες Arrhenius οδήγησαν στο συμπέρασμα πως η θερμοκρασιακή εξάρτηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης ήταν παρόμοια για όλα τα δείγματα μελιού, ανεξάρτητα από το επίπεδο ενεργότητας νερού αυτών, και συνεπώς μπορεί να περιγραφεί από μια και μόνο σταθερή παράμετρο, αυτήν της ενέργειας ενεργοποίησης Ε α. Η επίδραση της α w στο ρυθμό της αντίδρασης (Σχήμα 4.16β) περιγράφηκε από τη σταθερά d που συμμετέχει στην τροποποιημένη εξίσωση Arrhenius, και αντιπροσωπεύει την εκθετική μείωση που παρατηρείται στις σταθερές των ρυθμών αμαύρωσης καθώς η α w αυξάνεται. Συνεπώς, το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius, 156

191 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση εκφράζει τη συνδυασμένη επίδραση της θερμοκρασίας και της α w στο ρυθμό της αντίδρασης αμαύρωσης του μελιού και των αραιωμένων συστημάτων αυτού α lnk (h -1 ) E E E E-04 1/T-1/T ref (K) 0.04 β 0.03 k (h -1 ) C 60 C 70 C 80 C α w Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση των σταθερών του ρυθμού της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης (k) δειγμάτων μελιού που διαφέρουν ως προς την α w (α), και επίδραση της ενεργότητας του νερού στις σταθερές των ρυθμών της αντίδρασης (β). Οι γραμμές και στα δύο σχήματα παρουσιάζουν τις προβλεπόμενες τιμές των ρυθμών της αντίδρασης στα αντίστοιχα αμετάβλητα επίπεδα α w (α) και τις αντίστοιχες σταθερές θερμοκρασιακές συνθήκες (β). Επιπρόσθετα, η εξάρτηση των σταθερών αμαύρωσης από τη θερμοκρασία και την α w περιγράφηκε και από άλλα δευτερογενή μοντέλα, όπως η εξίσωση Belehradek (εξ. 3.7) και το πολυωνυμικό μοντέλο, θέτοντας ως εξεταζόμενες ανεξάρτητες μεταβλητές τους όρους k και lnk (εξ. 3.8). Οι τιμές των εκτιμούμενων συντελεστών όλων των δευτερογενών μοντέλων που εξετάστηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.3. Όπως διαπιστώνεται για όλες τις εξισώσεις υπολογίστηκαν παρόμοιες τιμές του συντελεστή προσδιορισμού (R 2 ) στο 157

192 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή εύρος Αξίζει να σημειωθεί, πως τα μοντέλα Arrhenius και Belehradek είναι περισσότερο εφαρμόσιμα σε σύγκριση με τα υπόλοιπα δευτερογενή μοντέλα. Σε ότι αφορά το πρώτο, η θερμοκρασιακή ευαισθησία της μη ενζυμικής αμαύρωσης, όπως αυτή περιγράφεται από την προσδιοριζόμενη τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης, καθώς και ο υπολογισμός του ρυθμού της αμαύρωσης στις συνθήκες αναφοράς, αποτελούν σημαντικές πληροφορίες. Εναλλακτικά, η εφαρμογή της εξίσωσης Belehradek επιτρέπει την εκτίμηση της θεωρητικής ελάχιστης θερμοκρασίας στην οποία συμβαίνει η αντίδραση, η οποία και υπολογίστηκε σε 9.4 C. Τα πολυωνυμικά μοντέλα παρουσίασαν μεν ικανοποιητική ακρίβεια, εντούτοις, καμιά από τις εμπλεκόμενες παραμέτρους δεν δύναται να παρέχει επιπλέον πληροφορίες πρακτικού περιεχομένου για την επίδραση της θερμοκρασίας ή / και της α w στους ρυθμούς της αντίδρασης αμαύρωσης. Πίνακας 4.3. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±, P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των τεσσάρων δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού αμαύρωσης των δειγμάτων μελιού (k), από τη θερμοκρασία και την α w. Τύπος εξίσωσης Παράμετρος R 2 α Εκτιμούμενη τιμή CL(+/-) β Πολυωνυμική k α P>0.05 γ (εξίσωση 3.8) α Arrhenius k ref (h -1 ) (εξίσωση 3.6) E α (kj mol -1 ) d α Συντελεστής προσδιορισμού β ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) γ P > 0.05 υποδηλώνει πως η παράμετρος δε βρέθηκε στατιστικώς σημαντική σε επίπεδο σημαντικότητας 95%. α 3 α 4 P>0.05 P>0.05 α α 6 P>0.05 Πολυωνυμική ln(k) α (εξίσωση 3.8) α α 3 α 4 P>0.05 P>0.05 α α Belehradek b (εξίσωση 3.7) T min α w max Η τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης που υπολογίστηκε από το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius ήταν 34.8 kj/mol, κατά πολύ χαμηλότερη από την τιμή 122 kj/mol που αφορά 158

193 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση στο σχηματισμό χρωμοφόρων ουσιών ενός δείγματος μελιού σε μια άλλη μελέτη (Turkmen et al., 2006). Δυστυχώς, περιορισμένα είναι τα διαθέσιμα στη βιβλιογραφία δεδομένα, σχετικά με τη θερμοκρασιακή ευαισθησία της εν λόγω διεργασίας ποιοτικής υποβάθμισης του μελιού. Συνεπώς, η ενέργεια ενεργοποίησης που υπολογίστηκε στη μελέτη αυτή μπορεί να συγκριθεί μόνο με τιμές E α άλλων συμπυκνωμένων συστημάτων τροφίμων όπως είναι οι χυμοί και o πουρές φρούτων, όπου οι προσδιοριζόμενες τιμές ενεργειών ενεργοποίησης κυμαίνονται στο εύρος kj/mol (Bozkurt et al., 1999, Burdurlu και Karadeniz, 2003, Garza et al., 1999, Johnson et al., 1995, Koca et al., 2003, Labuza και Baisier, 1992, Manso et al., 2001, Vaikousi et al., 2008a). Γενικά, η αντίδραση της αμαύρωσης στο μέλι αποδείχτηκε λιγότερο ευαίσθητη στην αύξηση της εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας σε σύγκριση με τη συνήθη μη ενζυμική αμαύρωση σε χυμούς σταφυλιού, πορτοκαλιού και μήλου, πιθανώς εξαιτίας της διαφορετικής σύστασης των αμινοξέων και σακχάρων στο μέλι ή ακόμη και λόγω των διακυμάνσεων στη θερμική ευαισθησία των αντιδρώντων που υπάρχουν στο σύστημα αυτό (Turkmen et al., 2006). Οι τιμές της μέγιστης απορρόφησης, A max, όπως εκτιμήθηκαν από τη λογιστική εξίσωση, προσαρμόστηκαν επίσης στα ίδια δευτερογενή μοντέλα. Οι προσδιοριζόμενοι συντελεστές των εξισώσεων και τα στατιστικά δεδομένα που προέκυψαν από την προσαρμογή των υπό εξέταση μοντέλων δίνονται στον Πίνακα 4.4. Η πολυωνυμική εξίσωση του φυσικού λογαρίθμου του A max, lna max, που περιγράφει τη μεταβολή της μέγιστης απορρόφησης ως συνάρτηση της θερμοκρασίας και της α w εμφάνισε τον υψηλότερο συντελεστή προσδιορισμού (R 2 : 0.978). Ωστόσο, η τροποποιημένη εξίσωση Arrhenius ήταν αυτή που επιλέχτηκε να χρησιμοποιηθεί τελικά στην ανάπτυξη του ολοκληρωμένου και ανασχηματισμένου μοντέλου, λόγω της καλύτερης προσαρμογής της στα πειραματικά δεδομένα της μη ενζυμικής αμαύρωσης του μελιού κατά τη θερμική επεξεργασία σε δυναμικά μεταβαλλόμενες συνθήκες θέρμανσης (η αξιολόγηση του τελικού μοντέλου που αναπτύχθηκε παρουσιάζεται στη συνέχεια). Τέλος, σε ότι αφορά την απορρόφηση όλων των δειγμάτων μελιού κατά την έναρξη του πειράματος, Α 0, φάνηκε να είναι ανεξάρτητη τόσο της θερμοκρασίας όσο και των επιπέδων ενεργότητας νερού που εξετάστηκαν στη μελέτη αυτή (P>0.05) Προσαρμογή του μοντέλου WLF στις σταθερές των ρυθμών μη ενζυμικής αμαύρωσης Η εξάρτηση των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης από τη θερμοκρασία περιγράφηκε επίσης από το μοντέλο WLF (εξ. 3.10). Η εξίσωση αυτή αξιολογήθηκε ως μια εναλλακτική 159

194 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Πίνακας 4.4. Εκτιμούμενες τιμές, όρια εμπιστοσύνης (CL±. P<0.05) και στατιστικά στοιχεία για τις παραμέτρους των δευτερογενών μοντέλων που περιγράφουν την εξάρτηση της μέγιστης απορρόφησης, Α max του λογιστικού μοντέλου, από τη θερμοκρασία και την α w, κατά τη θέρμανση των δειγμάτων μελιού. Τύπος εξίσωσης Παράμετρος R 2 α Εκτιμούμενη τιμή CL(+/-) β Πολυωνυμική A max α α α α α P>0.05 γ Arrhenius A max ref E α (kj mol -1 ) d α Συντελεστής προσδιορισμού β ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) γ P > 0.05 υποδηλώνει πως η παράμετρος δε βρέθηκε στατιστικώς σημαντική σε επίπεδο σημαντικότητας 95%. α 6 Πολυωνυμική ln(a max ) α 1 P>0.05 α α α α α 6 προσέγγιση στη μοντελοποίηση της θερμοκρασιακής εξάρτησης των μηχανικών και διηλεκτρικών χαλαρώσεων που συμβαίνουν στην πλαστική κατάσταση, όπου και εικάζεται πως το μοντέλο Arrhenius είναι θεωρητικώς μη εφαρμόσιμο (Williams et al., 1955). Επίσης, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η κινητική WLF είναι δυνατό να περιγράψει την εξάρτηση από τη θερμοκρασία των ρυθμών των χημικών αντιδράσεων σε άμορφα συστήματα που συντηρούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης (Slade et al., 1989). Έτσι, τόσο η δυνατότητα εφαρμογής του μοντέλου WLF, όσο και η θεωρία της υαλώδους μετάπτωσης έχουν μελετηθεί σε πλήθος μελετών με σκοπό να περιγράψουν φαινόμενα όπως η απώλεια της βιταμίνης C σε κατεψυγμένα πράσινα λαχανικά (Giannakourou και Taoukis, 2003b) ή μοντέλα συστήματα (Biliaderis et al., 1999), και η συνδυασμένη δράση της υγρασίας και θερμοκρασίας στους ρυθμούς της μη ενζυμικής αμαύρωσης αποξηραμένων συστημάτων τροφίμων (Buera και Karel, 1993, Karmas et al., 1992). Στην παρούσα μελέτη, η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης των δειγμάτων μελιού θεωρήθηκε ως η θερμοκρασία αναφοράς, κάτω από την οποία οι ρυθμοί αμαύρωσης είναι πολύ αργοί, ενώ πάνω από αυτήν οι ρυθμοί αμαύρωσης ελέγχονται κατά κύριο λόγο από τη διαφορά μεταξύ της εφαρμοζόμενης κατά τη θέρμανση θερμοκρασίας 160

195 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση και του T g, (T-T g ). Στο Σχήμα 4.17 παρουσιάζονται τα θερμογράμματα DSC διαφόρων αραιωμένων συστημάτων μελιού με διαφορετική α w. Ως θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης, υιοθετήθηκε η θερμοκρασία κατά την έναρξη (onset) της παρατηρούμενης σταδιακής μείωσης (μετάπτωσης) στην ειδική ροή θερμότητας, ή διαφορετικά η θερμοκρασία στην οποία συμβαίνει η έναρξη της παρατηρούμενης ενδόθερμης μετάπτωσης στη βασική γραμμή (baseline) ενός τυπικού θερμογράμματος DSC. Το T g του μητρικού δείγματος μελιού βρέθηκε C, τιμή που βρίσκεται στο εύρος -38 ως -44 C, που έχει επανειλημμένως καταγραφεί στη βιβλιογραφία, ως περιοχή θερμοκρασιών στην οποία εμπίπτει το Τ g και άλλων δειγμάτων μελιού με περιεκτικότητα σε υγρασία μεταξύ 14.6 και 16 %, ενώ η υγρασία του υπό μελέτη δείγματος μελιού προσδιορίστηκε ομοίως μέσα στα όρια συγκεντρώσεων που μόλις αναφέρθηκαν (15.5 % w/w). Επιπλέον, τιμές T g δειγμάτων μελιού σε ανάλογα θερμοκρασιακά εύρη μεταξύ και C και ή -43 C έχουν προσδιοριστεί και από άλλους ερευνητές χωρίς όμως να δίνονται πληροφορίες για τις αντίστοιχες τιμές της περιεχόμενης υγρασίας στα δείγματα αυτά (Ahmed et al., 2007, Kantor et al., 1999, Recondo et al., 2006). Αυξάνοντας τη συγκέντρωση υγρασίας, παρατηρήθηκε μια μετατόπιση του T g των αραιωμένων συστημάτων μελιού σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (Σχήμα 4.17). Έτσι, το T g μειώθηκε σημαντικά από σε C καθώς η α w των δειγμάτων μελιού αυξήθηκε από 0.54 σε Η τάση αυτή της πτώσης του Τ g σε αραιωμένα συστήματα μελιού έχει παρατηρηθεί επίσης από τους Kantor et al. (1999) και τους Lazaridou et al. (2004), και αποδόθηκε στην πλαστικοποιητική επίδραση του νερού στα διαλυτά στερεά του μελιού. Σε όλα τα δείγματα του μελιού, και μετά την παρατηρούμενη υαλώδη μετάπτωση, σημειώθηκε μια εξώθερμη κορυφή, περισσότερο διακριτή στα δείγματα με υψηλή συγκέντρωση υγρασίας, υποδηλώνοντας την κρυστάλλωση του υπάρχοντος ελεύθερου - αδέσμευτου νερού στο μητρικό δείγμα μελιού. Πιο συγκεκριμένα, το νερό που δεν καταψύχθηκε, ως συνέπεια της εφαρμοζόμενης ταχείας ψύξης με υγρό άζωτο, κρυστάλλωσε στο στάδιο της θέρμανσης, σημειώνοντας την παρατηρούμενη εξώθερμη κορυφή (Rahman, 2006). Η εξώθερμη κορυφή και η ακόλουθη ενδόθερμη τήξης των κρυστάλλων του ελεύθερου νερού του δείγματος έχει παρατηρηθεί και κατά τη σάρωση στο DSC μιγμάτων μελιού / νερού που περιείχαν μέλι σε ποσοστό 80 %, ή λιγότερο (Kantor et al., 1999). Όπως αναμένονταν, κατά την έντονη πτώση του T g σε υψηλές συγκεντρώσεις υγρασίας, σημειώθηκε αδυναμία με το διαθέσιμο εξοπλισμό να προσδιοριστεί πειραματικά η θερμο- 161

196 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ενδοθερμική ροή θερμότητας (mwatts) Ενδοθερμική ροή θερμότητας (mwatts) T g : T g : T g : mwatt T g : T g : T g : T g : T g : a w : 0.50 a w : 0.52 a w : Θερμοκρασία ( C) a w : 0.54 a w : 0.65 a w : 0.70 a w : 0.78 a w : mwatt Θερμοκρασία ( C) Σχήμα Θερμογραφήμματα DSC για το μέλι, τα αραιωμένα και συμπυκνωμένα (ένθετο γράφημα) συστήματα μελιού με διαφορετική ενεργότητα νερού. Η θερμοκρασία έναρξης της υαλώδους μετάπτωσης, T g, εικονίζεται ως το σημείο τομής των εφαπτόμενων γραμμών σε κάθε καμπύλη θερμικής σάρωσης. κρασία υαλώδους μετάπτωσης στα δείγματα μελιού που αραιώθηκαν σε επίπεδα α w 0.87 και Για το λόγο αυτό παρασκευάστηκαν συστήματα μελιού περισσότερο συμπυκνωμένα (οι εκτιμήσεις των T g τους δίνεται στο ένθετο του Σχήματος 4.17) και το σύνολο των δεδομένων Τ g κλάσμα βάρους του περιεχόμενου νερού, προσαρμόστηκαν στο εμπειρικό μοντέλο Gordon -Taylor (G-T, εξ. 3.11), επιτρέποντας έτσι την εκτίμηση των παραμέτρων του μοντέλου. Η σχέση μεταξύ Τ g και περιεχόμενου στα δείγματα νερού περιγράφηκε με μεγάλη ακρίβεια (R 2 = 0.99) από το μοντέλο G-T, ενώ η γραφική 162

197 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση απεικόνιση της σχέσης αυτής δίνεται στο Σχήμα Η παράμετρος k υπολογίστηκε 1.76, ενώ το T g1 για τα στερεά συστατικά του μελιού βρέθηκε K. Η εκτιμούμενη από το μοντέλο τιμή του T g1 παρουσιάζεται χαμηλότερη από τα αναφερόμενα από τον Fennema (1996) T g των απολύτως αφυδατωμένων σακχάρων (π.χ. γλυκόζης, φρουκτόζης), και πιθανώς αντανακλά την έλλειψη ικανοποιητικού αριθμού δεδομένων στο εύρος τιμών της παραμέτρου w 2 μεταξύ 0.0 και 0.1, τα οποία και επηρεάζουν σημαντικά τη μορφή της καμπύλης απεικόνισης του μοντέλου G-T, συντελώντας στον προσδιορισμό μικρότερης τιμής για το T g1 των στερεών του μελιού. Ακολούθως, οι τιμές της θερμοκρασίας υαλώδους μετάπτωσης των άγνωστων αραιωμένων συστημάτων μελιού με επίπεδα α w 0.87 και 0.97 υπολογίστηκαν ως και C, αντίστοιχα (Πίνακας 4.5). Το μοντέλο G-T αποτελεί πολύτιμο εργαλείο πρόβλεψης του T g καθώς και προσδιορισμού του T g1, το οποίο δεν μπορεί να εκτιμηθεί πειραματικά μια και είναι αδύνατη η απομάκρυνση του ισχυρά δεσμευμένου νερού από ένα σύστημα τροφίμου, και στην περίπτωσή μας από τα στερεά του μελιού (Lazaridou et al., 2004) συμπυκνωμένο μέλι αραιωμένο μέλι εκτιμούμενα Tg (G-T) Tg (K) Κλάσμα βάρους νερού (w 2 ) Σχήμα Σχέση θερμοκρασίας υαλώδους μετάπτωσης και περιεχόμενης υγρασίας στο μέλι και τα αραιωμένα ή συμπυκνωμένα συστήματα αυτού. Η γραμμή παριστάνει την καμπύλη Gordon Taylor όπως αυτή προέκυψε από τα πειραματικά δεδομένα προσδιορισμού των T g των δειγμάτων που αναλύθηκαν στο DSC. Οι σταθερές των ρυθμών της αντίδρασης προσαρμόστηκαν στο μοντέλο WLF με στόχο να διερευνηθεί η χρήση του στην περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης της αμαύρωσης του μελιού στις θερμοκρασιακές συνθήκες που εφαρμόστηκαν στη μελέτη αυτή, δηλαδή κατά την θέρμανση στους C. Σύμφωνα με τους Nelson και Labuza (1994), προκειμένου να εδραιωθεί η δυνατότητα εφαρμογής του μοντέλου WLF, 163

198 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή συνηθίζεται στη βιβλιογραφία να χρησιμοποιούνται οι παγκόσμιες σταθερές universal constants για τους συντελεστές C 1 και C 2 της εξίσωσης WLF, όπως αυτές έχουν υπολογιστεί για διάφορα συνθετικά πολυμερή από τους ίδιους τους εμπνευστές της, Williams et al. (1955), σε και 51.6, αντίστοιχα. Ωστόσο, οι ίδιοι ερευνητές συμβουλεύουν ενάντια στη χρήση των παγκόσμιων αυτών σταθερών τιμών, επειδή κάτι τέτοιο μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη εκτίμηση της παραμέτρου T g, και προτείνουν οι σταθερές αυτές να αφήνονται ελεύθερες προς διαφοροποίηση με στόχο την απόκτηση ενός περισσότερο αξιόπιστου συμπεράσματος σχετικά με τη δυνατότητα εφαρμογής του συγκεκριμένου μοντέλου. Για τους λόγους αυτούς, στην παρούσα μελέτη, εφαρμόστηκε η δεύτερη εναλλακτική μέθοδος προσαρμογής της εξίσωσης WLF, κατά την οποία χρησιμοποιήθηκαν οι πειραματικώς προσδιοριζόμενες τιμές T g αλλά και οι τιμές των σταθερών των ρυθμών της αντίδρασης όπως προέκυψαν κατά τη θερμική επεξεργασία του μελιού. Oι Nelson και Labuza (1994), περιγράφοντας την προσέγγιση αυτή, αναφέρουν πως αρχικά γίνεται μια υπόθεση πως η σχέση WLF περιγράφει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της υπό μελέτη αντίδρασης κι έπειτα οι άγνωστες παράμετροι k, C 1 και C 2 αριστοποιούνται, με αποτέλεσμα οι εκτιμήσεις που προκύπτουν γι αυτές να βρίσκονται συνήθως αρκετά κοντά στις πραγματικές. Οι τιμές των συντελεστών C 1 και C 2 υπολογίστηκαν στο εύρος και Κ, αντίστοιχα (Πίνακας 4.5), κοντά στις μέσες τιμές των συντελεστών της εξίσωσης WLF που έχουν συχνά καταγραφεί στη βιβλιογραφία σε σχετικές με την επιστήμη των τροφίμων μελέτες (Buera και Karel, 1993, Nelson και Labuza, 1994). Επιπλέον, οι τιμές του συντελεστή C 1 διαφοροποιήθηκαν με την περιεχόμενη υγρασία στα δείγματα μελιού (αυξήθηκαν με την αύξηση της υγρασίας), συμφωνώντας με τα ευρήματα μιας άλλης μελέτης στην οποία διερευνήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής της εξίσωσης WLF στην περιγραφή της επίδρασης του T g στα δεδομένα των ρυθμών μη ενζυμικής αμαύρωσης που συλλέχτηκαν βιβλιογραφικά (Buera και Karel, 1993). Η καλή προσαρμογή των προβλεπόμενων από την εξίσωση WLF τιμών των ρυθμών αμαύρωσης k στα πειραματικά κινητικά δεδομένα αποδεικνύεται πρακτικά κατά την απεικόνιση του λογαρίθμου του αντιστρόφου του μετρούμενου ρυθμού αμαύρωσης, log(1/k), ως συνάρτηση του όρου T-T g, όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.19, για καθένα από τα συστήματα μελιού που εξετάστηκαν. Πράγματι, οι τιμές των συντελεστών προσδιορισμού κατά την προσαρμογή του μοντέλου WLF κυμάνθηκαν σε υψηλές τιμές (R 2 = ), ωστόσο, το βασικό μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ότι κυρίως υποθέτει παρά αποδεικνύει ότι το μοντέλο εφαρμόζεται στο συγκεκριμένο σύστημα (Nelson και Labuza 1994). 164

199 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση Πίνακας 4.5. Θερμοκρασίες υαλώδους μετάπτωσης των δειγμάτων μελιού και εκτιμούμενες παράμετροι του μοντέλου WLF. α w Υγρασία (g/100 g) T g, K ( C) Σταθερές WLF β πειρ. δεδομένα DSC C 1 C 2 R 2 Δείγματα (-42.74) (-65.29) α (-92.37) α ( ) α εκτιμούμενες τιμές T g όπως προέκυψαν από την εμπειρική εξίσωση Gordon-Taylor. β σταθερές WLF όπως προέκυψαν από την ομώνυμη εξίσωση χρησιμοποιώντας τις πειραματικώς προσδιοριζόμενες στο DSC, τιμές T g log (1/k) (h) aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw T-T g ( C) Σχήμα Θερμοκρασιακή εξάρτηση των σταθερών του ρυθμού αμαύρωσης του μελιού σύμφωνα με την κινητική θεωρία WLF, κάνοντας χρήση των πειραματικών τιμών T g που προσδιορίστηκαν στο DSC και αφήνοντας τους συντελεστές της εξίσωσης να μεταβάλλονται ελεύθερα Αξιολόγηση του μοντέλου σε ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θέρμανσης Η αξιολόγηση όλων των δευτερογενών μοντέλων (Arrhenius, Belehradek, και πολυωνυμικά μοντέλα) που μελετήθηκαν, έγινε συγκρίνοντας τους προβλεπόμενους από τα μοντέλα ρυθμούς αμαύρωσης με αυτούς που παρατηρήθηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα κατά τη θέρμανση αραιωμένων δειγμάτων μελιού με ενεργότητα νερού 0.80 και 0.90, σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (65 και 75 C) από αυτές που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη των μοντέλων. Όλα τα υπό εξέταση μοντέλα εμφάνισαν παρόμοιες διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων τιμών ρυθμών αμαύρωσης και όλες οι προβλέψεις βρέθηκαν να εμπίπτουν στο εύρος του 10% (Σχήμα 4.20). Συνεπώς, υπήρξε δυσκολία στην επιλογή ενός και μοναδικού δευτερογενούς μοντέλου για την 165

200 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή περιγραφή των συνδυασμένων και μεμονωμένων επιδράσεων της θερμοκρασίας και της α w στους ρυθμούς αμαύρωσης των δειγμάτων μελιού. Από την άλλη, η εφαρμογή μιας σύγκρισης διαφορετικού τύπου, μεταξύ των ρυθμών αμαύρωσης που προβλέφθηκαν και εκτιμήθηκαν από τα μοντέλα Arrhenius και WLF και αυτών που παρατηρήθηκαν σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς των πειραματικών μεταχειρίσεων που διεξήχθησαν, ανέδειξε ικανοποιητική ταύτιση τιμών, όπως αποδεικνύεται από τις πολύ μικρές τιμές (κοντά στο μηδέν) που έλαβαν τα υπολείμματα (residuals) και των δύο μοντέλων, και τη διασπορά όλων των εικονιζόμενων σημείων πάνω στη διαγώνιο (Σχήμα 4.21α και 4.21β). (kπαρ - kπροβ)/ kπαρ x 100 (kπαρ - kπροβ)/ kπαρ x Arrhenius k παρ Πολυωνυμικό k k παρ (kπαρ - kπροβ)/ kπαρ x 100 (kπαρ - kπροβ)/ kπαρ x 100 Σχήμα Επί τοις εκατό (%) διαφορές μεταξύ των παρατηρούμενων (k παρατ ) και των προβλεπόμενων (k προβ ) τιμών των ρυθμών αμαύρωσης κατά τη θέρμανση δειγμάτων μελιού όπως αυτοί εκτιμήθηκαν από τα τέσσερα δευτερογενή μοντέλα που εξετάστηκαν. Τα κλειστά σύμβολα αντιπροσωπεύουν τιμές των ρυθμών αμαύρωσης k, σε ανεξάρτητα πειράματα, ενώ τα ανοιχτά σύμβολα το σύνολο των τιμών k όλων των πειραματικών μεταχειρίσεων που μελετήθηκαν Belehrade k k παρ Πολυωνυμικό ln(k) k παρ Δεδομένου ότι i) τα δείγματα μελιού υποβλήθηκαν σε θερμική επεξεργασία υπό συνθήκες θερμοκρασίας κατά πολύ μεγαλύτερες από το T g (Τ>Τ g +100 C), όπου συνήθως εφαρμόζεται η κινητική Arrhenius (Slade και Levine, 1991), ii) σε κανένα δείγμα μελιού δεν παρατηρήθηκαν φαινόμενα περιορισμού της μοριακής διάχυσης των συστατικών που να παρεμποδίζουν την αντίδραση αμαύρωσης, και συνεπώς να απαιτείται η εφαρμογή της θεωρίας WLF (Williams et al., 1955), και iii) η μέθοδος που αναπτύχθηκε για την 166

201 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση εφαρμογή του μοντέλου WLF, όπως έχει ήδη αναφερθεί, κυρίως υποθέτει παρά αποδεικνύει την δυνατότητα εφαρμογής της στην περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης των ρυθμών μη ενζυμικής αμαύρωσης (Nelson και Labuza, 1994), θεωρήθηκε ότι η προσέγγιση της κινητικής Arrhenius είναι η καταλληλότερη στην έκφραση της επίδρασης της θερμοκρασίας στη σταθερά του ρυθμού αμαύρωσης. Επίσης, το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius, λαμβάνει υπόψη του, και συνεπώς εκτιμά ταυτόχρονα, και την επίδραση της ενεργότητας του νερού, ενώ η τιμή ενέργειας ενεργοποίησης που δύναται να υπολογίσει μας πληροφορεί επίσης και για τη θερμοκρασιακή ευαισθησία που παρουσιάζει το μέλι όσον αφορά στο φαινόμενο της μη ενζυμικής αμαύρωσης. Τέλος, τα κινητικά μοντέλα που υιοθετήθηκαν στη μελέτη αυτή, αξιολογήθηκαν κάτω από δυναμικές συνθήκες θέρμανσης με στόχο την ανάδειξη πιθανών διαφοροποιήσεων στην απόκριση της αμαύρωσης και άρα στην τελική ποιότητα του μελιού, λόγω των συνεχώς μεταβαλλόμενων προφίλ χρόνου και θερμοκρασίας που συνήθως απαντώνται στη βιομηχανία τροφίμων. Στο πλαίσιο αυτό εφαρμόστηκε και πάλι η προσέγγιση που ακολουθήθηκε και στη μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου κάτω από δυναμικά πρωτόκολλα θέρμανσης (Vaikousi et al., 2008a). Συγκεκριμένα, το χρονοθερμοκρασιακό ιστορικό της θερμικής επεξεργασίας διαιρέθηκε σε μικρά διαστήματα χρόνου, για τα οποία θεωρήθηκε ότι η θερμοκρασία παρέμεινε σταθερή, και ακολούθως η πρόβλεψη για τη μεταβολή της απορρόφησης του μελιού στο χρόνο t=dt i έγινε από την εξίσωση 4.1, υιοθετώντας και πάλι την ίδια συνθήκη για την τιμή της μέγιστης απορρόφησης. Το τελικό ανασχηματισμένο μοντέλο που αναπτύχθηκε ελέγχθηκε ως προς τη δυνατότητα εφαρμογής του στην πρόβλεψη της αμαύρωσης του μελιού σε μη ισόθερμες συνθήκες θέρμανσης, συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες από το μοντέλο τιμές απορρόφησης με αυτές που προσδιορίστηκαν κατά τη θερμική του επεξεργασία σε δύο μεταβαλλόμενα θερμοκρασιακά σενάρια. Στο πρώτο προφίλ θέρμανσης, το μητρικό δείγμα μελιού θερμάνθηκε για 12 h στους 55 C και 12 h στους 75 C (Σχήμα 4.22), ενώ στο δεύτερο η εφαρμοζόμενη θερμική επεξεργασία περιελάμβανε θέρμανση για 12 h στους 55 C, 6 h στους 65 C και 6h στους 75 C (Σχήμα 4.23). Στην πρώτη περίπτωση, ταύτιση διαπιστώθηκε μεταξύ των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων από το λογιστικό μοντέλο καμπυλών μεταβολής απορρόφησης για τις πρώτες 50 h της θέρμανσης, ενώ στη συνέχεια ακολούθησε μια ευδιάκριτη απόκλιση των δύο εικονιζόμενων καμπυλών (Σχήμα 4.22). Αναλυτικότερα, το δυναμικό λογιστικό μοντέλο υπολόγισε χαμηλότερες τιμές απορρόφησης από αυτές που μετρήθηκαν πειραματικά. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης και κατά το δεύτερο πρωτόκολλο θέρμανσης. Ωστόσο, η διαφορά 167

202 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μεταξύ της αναφερόμενης απόκλισης μεταξύ της καμπύλης πρόβλεψης, που έδωσε κατά τη λύση του το ανασχηματισμένο μοντέλο, και των πειραματικών δεδομένων απορρόφησης, κατά το δεύτερο πρωτόκολλο θέρμανσης, συνέβη σε μεταγενέστερο χρόνο, και πιο συγκεκριμένα μετά από 90 h θέρμανσης (Σχήμα 4.23). Εντούτοις, και στις δύο περιπτώσεις, οι παρατηρούμενες πειραματικές τιμές απορρόφησης βρέθηκαν μέσα στα όρια εμπιστοσύνης των γραμμών πρόβλεψης, και ειδικότερα πλησιέστερα στην άνω καμπύλη πρόβλεψης (διακεκομμένες γραμμές στα Σχήματα 4.22 και 4.23). Η παρατηρούμενη απόκλιση καθυστέρηση στην πρόβλεψη των τιμών απορρόφησης παρατηρήθηκε για πρώ α μοντέλο Arrhenius k προβ (h -1 ) β μοντέλο WLF aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw 0.97 aw 0.80 aw k παρατ (h -1 ) k προβ (h -1 ) aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw k παρατ (h -1 ) Σχήμα Καμπύλη προβλεπόμενων (k προβ ) έναντι παρατηρούμενων (k παρατ ) τιμών των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης κατά τη θέρμανσή τους κάτω από διάφορα πρωτόκολλα θερμοκρασίας και α w κάνοντας χρήση του τροποποιημένου μοντέλου Arrhenius (α) και του μοντέλου WLF (β). Τα ανοιχτά σύμβολα και στα δύο Σχήματα παριστάνουν τις σταθερές των ρυθμών αμαύρωσης που προέκυψαν κατά το πρώτο στάδιο του πειραματικού σχεδιασμού και την εφαρμογή ισόθερμων συνθηκών θέρμανσης, και τα κλειστά σύμβολα τις αντίστοιχες σταθερές k όπως προέκυψαν από τη διεξαγωγή των ανεξάρτητων πειραμάτων (α). 168

203 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση Abs 420 nm Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης στο μέλι (α w 0.54) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 55 και 12 ώρες στους 75 C. Οι πλατιές διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα επί 95% όρια εμπιστοσύνης της καμπύλης πρόβλεψης της απορρόφησης, ενώ η λεπτή διακεκομμένη γραμμή εικονίζει τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας Abs 420 nm Θερμοκρασία ( C) Χρόνος (h) 50 Σχήμα Σύγκριση μεταξύ παρατηρούμενης (σημεία) και προβλεπόμενης (γραμμή) αμαύρωσης στο μέλι (α w 0.54) που θερμάνθηκε κάτω από περιοδικώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας για 12 ώρες στους 55, 6 h στους 65 και 6 ώρες στους 75 C. Οι πλατιές διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα επί 95% όρια εμπιστοσύνης της καμπύλης πρόβλεψης της απορρόφησης, ενώ η λεπτή διακεκομμένη γραμμή εικονίζει τις διακυμάνσεις της θερμοκρασίας. τη φορά κατά το στάδιο εφαρμογής του χαμηλού επιπέδου θερμοκρασίας (στάδιο θέρμανσης στους 55 C), μετά από 50 και 90 h θέρμανσης, αντίστοιχα, για τα δύο 169

204 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή πρωτόκολλα που εξετάστηκαν. Το φαινόμενο αυτό μπορεί πιθανώς να αποδοθεί σε μια πιθανή αδυναμία του ανασχηματισμένου μοντέλου να προβλέψει με ακρίβεια τις τιμές A max στο χρόνο t=t i, και τις συγκεκριμένες συνθήκες που επικρατούν στο στάδιο θέρμανσης στους 55 C, παρότι, η ίδια συνθήκη που υιοθετήθηκε εδώ για την απόκριση της παραμέτρου A max και η οποία συμμετέχει ενεργά στο δυναμικό μοντέλο, είχε αποδειχτεί επιτυχημένη στη μελέτη πρόβλεψης της μη ενζυμικής αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου σε δυναμικές συνθήκες θέρμανσης (Vaikousi et al., 2008). Μια δεύτερη αιτία που ενδεχομένως προκαλεί την εσφαλμένη πρόβλεψη στην εκτίμηση της αμαύρωσης στο μέλι, είναι η μικρή ακρίβεια του δευτερογενούς μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της παραμέτρου A max, οπότε το παραγόμενο σφάλμα, αναπαράγεται και βαθμιαία συσσωρεύεται, προκαλώντας σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των προβλεπόμενων και παρατηρούμενων τιμών απορρόφησης σε εκτεταμένους χρόνους εφαρμογής του πειραματισμού. Συμπερασματικά, στην παρούσα ολοκληρωμένη μελέτη της μη ενζυμικής αμαύρωσης του μελιού και των αραιωμένων συστημάτων αυτού, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της θερμοκρασίας και της α w ή καλύτερα της συγκέντρωσης αντιδρώντων συστατικών στην ανάπτυξη μελανού χρωματισμού. Το λογιστικό μοντέλο που εφαρμόστηκε περιέγραψε ικανοποιητικά το σχηματισμό μελανών χρωστικών κατά τη θέρμανση των δειγμάτων μελιού, ενώ το μοντέλο Arrhenius εξέφρασε την εξάρτηση των σταθερών του ρυθμού αμαύρωσης από τη θερμοκρασία και την α w, παρά το γεγονός ότι και το αντίστοιχο μοντέλο WLF προσαρμόστηκε επίσης ικανοποιητικά στους παρατηρούμενους ρυθμούς αμαύρωσης σε συνθήκες επεξεργασίας πολύ μακριά από την περιοχή στην οποία παρατηρείται το T g των αντίστοιχων δειγμάτων του μελιού. Τέλος, το ολοκληρωμένο δυναμικό μοντέλο προέβλεψε ικανοποιητικά τη μεταβολή της απορρόφησης του μελιού κάτω από δυναμικές συνθήκες θέρμανσης, ενώ οι παρατηρούμενες αποκλίσεις μεταξύ των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων από το μοντέλο τιμών απορρόφησης σε εκτεταμένους χρόνους θέρμανσης βρέθηκαν να εμπίπτουν στο εύρος των ορίων εμπιστοσύνης των γραμμών πρόβλεψης. 170

205 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση 4.3 Ανάπτυξη ενός μικροβιακού Χρονοθερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη. Σημαντική παράμετρος ποιότητας για τα τρόφιμα αποτελεί επίσης και η μικροβιακή τους σταθερότητα, η οποία και καθορίζει την ασφαλή κατανάλωσή τους. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών ειδικά στα φρέσκα προϊόντα που συντηρούνται υπό ψύξη αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα ποιοτικής υποβάθμισης καθώς προκαλεί μη αντιστρεπτές μεταβολές στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των προϊόντων, καθιστώντας τα μη αποδεκτά από τον καταναλωτή. Συνεπώς, η μελέτη ενός συστήματος τροφίμου από μικροβιακής πλευράς, ως αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, κρίθηκε αναγκαία για την απόκτηση μιας πιο ολοκληρωμένης εικόνας σε ότι αφορά την παρακολούθηση της ποιότητας των τροφίμων. Λαμβάνοντας μάλιστα υπόψη, την τάση που διέπει ένα σύγχρονο σύστημα διασφάλισης ποιότητας να προλαμβάνει τη μόλυνση και αλλοίωση, εφαρμόζοντας συνεχή παρακολούθηση, καταγραφή και έλεγχο όλων των κρίσιμων παραμέτρων (με σημαντικότερη τη συμβολή της θερμοκρασίας συντήρησης) καθ όλη τη διάρκεια ζωής του προϊόντος, επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός νέου τύπου χρονοθερμοκρασιακού δείκτη (Time Temperature Indicator, TTI) που να στηρίζεται στη μικροβιακή ανάπτυξη και το μεταβολισμό. Το εν λόγω μικροβιακό ΤΤΙ μπορεί να καταγράφει και να αποτυπώνει τη συνολική επίδραση του θερμοκρασιακού ιστορικού στην ποιότητα των προϊόντων που συνοδεύει μέσω μιας εύκολα μετρήσιμης και ευδιάκριτης χρωματικής μεταβολής ενός χημικού δείκτη, που συμβαίνει κατά την πτώση του ph εξαιτίας της παραγωγής γαλακτικού οξέος ως αποτέλεσμα της μεταβολικής δραστηριότητας ενός γαλακτικού βακτηρίου σε κάποιο κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα. Κατ αυτόν τον τρόπο, η κινητική της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ σχετίζεται άμεσα με την ποιοτική υποβάθμιση ενός προϊόντος λόγω της προκαλούμενης σ αυτό αλλοίωσης από τα γαλακτικά βακτήρια. Αντικείμενα λοιπόν της μελέτης αποτέλεσαν τόσο η διερεύνηση των δομικών συστατικών του TTI (βακτηριακό στέλεχος, υπόστρωμα ανάπτυξης, χημικός δείκτης) και η ανάπτυξή του, όσο και της σχέσης μεταξύ της απόκρισης του ΤΤΙ και της μεταβολικής δραστηριότητας του βακτηριακού στελέχους, καθώς επίσης και η κινητική του υπό ανάπτυξη συστήματος και η δυνατότητα ρύθμισης του σημείου λήξης του. 171

206 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Επιλογή των δομικών συστατικών του ΤΤΙ Επιλογή μικροοργανισμού Η επιλογή του καταλληλότερου μικροοργανισμού για το υπό ανάπτυξη σύστημα ΤΤΙ, εστιάστηκε κατά κύριο λόγο σε δύο βασικές ιδιότητες που θα χαρακτήριζαν το βακτηριακό στέλεχος: α) να προκαλεί ικανοποιητική πτώση του ph του υποστρώματος στο οποίο αναπτύσσεται κατά την πορεία της συντήρησης του συστήματος ΤΤΙ και β) να αναπτύσσεται σε αρκετά υψηλά πληθυσμιακά επίπεδα, αντίστοιχα των επιπέδων που παρατηρούνται κατά την αλλοίωση των πραγματικών τροφίμων από την υπεύθυνη ενδογενή μικροχλωρίδα, δηλαδή σε συγκεντρώσεις CFU/ml ή g προϊόντος, αντίστοιχα. Τα Σχήματα 4.24, 4.25 και 4.26 απεικονίζουν τη δυνατότητα των 9 υπό αξιολόγηση στελεχών γαλακτικών βακτηρίων να μειώνουν το ph του υποστρώματος κατά την ανάπτυξή τους σε θερμοκρασία συντήρησης 10 C. Χαμηλότερες τελικές τιμές ph στο τέλος του χρόνου συντήρησης επιτεύχθηκαν από το Lb. sakei LQC 1089 ακολουθούμενο από τα στελέχη του Lb. curvatus (L30.5 και L3.8). Αντίστοιχα, εντονότερη και ταχύτερη αύξηση του μικροβιακού πληθυσμού παρατηρήθηκε από το ίδιο στέλεχος του Lb. sakei LQC 1089, έπειτα από τα στελέχη των Lb. curvatus και Lb. plantarum, ενώ η ανάπτυξη των στελεχών του Lb. paracasei υπολείπονταν σημαντικά, ιδιαίτερα σε ότι αφορά τη συγκέντρωση των μικροβιακών κυττάρων στη στατική φάση κατά το τέλος του χρόνου συντήρησης. Συνεπώς, το στέλεχος του Lb. sakei (LQC 1089) και εκείνο του Lb. curvatus (L3.8), έδειξαν τα καλύτερα χαρακτηριστικά στα δύο αρχικά κριτήρια που τέθηκαν. log cfu/ml Lb. sakei LQC Χρόνος (ημέρες) α ph Σχήμα Μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) στο υπόστρωμα Nutrient broth (εμπλουτισμένο με % (α) και με % w/v γλυκόζη (β)) και μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) του Lb. sakei LQC 1089 στο ίδιο υπόστρωμα κατά τη συντήρησή του στους 10 C. log cfu/ml Lb. sakei LQC 1089 β Χρόνος (ημέρες) ph 172

207 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση Lb. sakei Lb. curvatus ph LQC 1051 LQC 1086 LQC 1089 ph L30.5 L Χρόνος (ημέρες) 6.5 Lb. plantarum Lb. paracasei ph ph Χρόνος (ημέρες) 5 R Q R Q Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή του ph του υποστρώματος (NB εμπλουτισμένο με 1% w/v γλυκόζη) κατά τη συντήρηση στους 10 C από διάφορα στελέχη γαλακτικών βακτηρίων. Το αρχικό επίπεδο εμβολίου είναι 10 2 CFU/ml Επιλογή υποστρώματος Σε ότι αφορά την επιλογή του υποστρώματος η αναζήτηση επικεντρώθηκε στην εύρεση ενός απλού στη σύνθεσή του υποστρώματος, χωρίς ιδιαίτερα έντονο χρώμα ώστε να μπορεί να προστεθεί σ αυτό κάποιος χημικός δείκτης που θα έδινε τη δυνατότητα εμφανούς αλλαγής χρώματος κατά την πτώση του ph. Το ΝΒ είναι ένα κίτρινο ανοιχτόχρωμο υπόστρωμα, το saline ένα εντελώς άχρωμο και διαυγές μέσο ανάπτυξης ενώ το TSB και το MRS είναι αρκετά σκουρόχρωμα υλικά. Στο Σχήμα 4.24, που έχει ήδη παρουσιαστεί, δίνεται η μικροβιακή ανάπτυξη του Lb. sakei LQC 1089 και η μεταβολή του ph σε ΝΒ εμπλουτισμένο με διάφορα επίπεδα γλυκόζης (0.05-2% w/w). Η συγκέντρωση της γλυκόζης δε φαίνεται να επιδρά σημαντικά στην κινητική ανάπτυξης του μικροοργανισμού 173

208 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή και την πτώση του ph του υποστρώματος. Με μια προσεκτικότερη παρατήρηση του Σχήματος 4.24β φαίνεται πως ο μικροοργανισμός παρουσίασε διφασική μορφή ανάπτυξης ανεξάρτητα από την περιεχόμενη στο υπόστρωμα γλυκόζη, γεγονός που θα δημιουργούσε πρόβλημα στην μετέπειτα μοντελοποίηση της μικροβιακής ανάπτυξης. Η συμπεριφορά αυτή επαναλήφθηκε και σε επόμενα πειράματα, οπότε κρίθηκε αναγκαία η διερεύνηση της συμπεριφοράς του ίδιου μικροοργανισμού και σε άλλα υποστρώματα ή και η χρήση άλλων μικροοργανισμών Lb. curvatus 7 Lb. plantarum 6 6 log cfu/ml L30.5 L3.8 log cfu/ml R30.3 R Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) 8 7 Lb. paracasei 6 log cfu/ml 5 4 Q Q Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη διαφόρων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων σε ΝΒ (εμπλουτισμένο με 0.25 % w/v γλυκόζη) κατά τη συντήρηση στους 10 C. Πράγματι, στο σύνολο των πειραματικών δοκιμών που διεξήχθησαν (Σχήματα 4.27, 4.28, 4.29) καλύτερη μικροβιακή ανάπτυξη παρατηρήθηκε από το Lb. sakei LQC 1089 στα υποστρώματα MRS και TSB, με αρχικό ph Στο υπόστρωμα ΝΒ παρατηρήθηκε κατ επανάληψη η διφασική μορφή ανάπτυξης του ίδιου μικροοργανισμού (Σχήματα 4.27α, 4.28β, 4.29β), ενώ στο θρεπτικό μέσο Saline δεν αναπτύχθηκε ικανοποιητικά κανένα από τα γαλακτικά βακτήρια που εξετάστηκαν. Επίσης, τα στελέχη των δύο άλλων ειδών γαλακτι- 174

209 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση α β log cfu/ml ph 5.5 log cfu/ml ph 3 2 Lb. sakei 1089 NB Lb. sakei 1089 Saline Χρόνος (ημέρες) 4.5 Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη και μεταβολή του ph του Lb. sakei LQC 1089 σε ΝΒ (α) και Saline (β) εμπλουτισμένα με 1% w/v γλυκόζη στους 10 C. ph ph NB TSB MRS Saline Χρόνος (ημέρες) Lb. curvatus 3.8 NB TSB MRS Saline Lb. sakei Χρόνος (ημέρες) α γ log cfu/ml log cfu/ml Σχήμα Μεταβολή του ph (α) και μικροβιακή ανάπτυξη (β) των Lb. sakei LQC 1089 και Lb. curvatus L3.8 (γ, δ) σε διάφορα υποστρώματα κατά τη συντήρηση στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα μέσα ανάπτυξης είναι 2% w/v και το εμβόλιο των μικροοργανισμών 10 2 cfu/ml Χρόνος (ημέρες) Lb. sakei 1089 NB TSB MRS Saline Χρόνος (ημέρες) Lb. curvatus 3.8 NB TSB MRS Saline Χρόνος (ημέρες) β δ

210 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ph Lb sakei 1089 NB TSB MRS 6.3 MRS 5.6 log cfu/ml β Lb sakei 1089 NB TSB MRS 6.3 MRS Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) ph γ Lb curvatus L3.8 NB TSB MRS 6.3 MRS 5.6 log cfu/ml δ Lb curvatus L3.8 NB TSB MRS 6.3 MRS Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Lb plantarum R Lb plantarum R20.1 ph ε NB TSB MRS 6.3 MRS 5.6 log cfu/ml στ NB TSB MRS 6.3 MRS Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή του ph και μικροβιακή ανάπτυξη διαφόρων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων σε διάφορα υποστρώματα κατά τη συντήρηση στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα μέσα ανάπτυξης είναι 2% w/v και το εμβόλιο των μικροοργανισμών CFU/ml. κών βακτηρίων (Lb. curvatus και Lb. plantarum) δεν έδωσαν επαρκή πτώση του ph των θρεπτικών μέσων ανάπτυξης όταν εμβολιάστηκαν τόσο σε σχετικά χαμηλή αρχική συγκέντρωση (10 2 ) (Σχήμα 4.28) όσο και σε υψηλότερο αρχικό πληθυσμιακό επίπεδο (10 5 cfu/ml) (Σχήμα 4.29). Ωστόσο, δεδομένης της σκούρας απόχρωσης των υλικών MRS και TSB, τα οποία δε δίνουν τη δυνατότητα μεταβολής του χρώματός τους με την προσθήκη 176

211 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση δείκτη (η αντίστοιχη συζήτηση θα γίνει στη συνέχεια), επιχειρήθηκε ο εμπλουτισμός του NB με εκχύλισμα ζύμης (Yeast Extract, YE) σε συγκέντρωση 0.5 % w/v, ως πρόσθετη πηγή αμινοξέων απαραίτητων για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Πράγματι, ο εμπλουτισμός τόσο του NB όσο και του TSB με ΥΕ έλυσε το πρόβλημα της διφασικής μορφής ανάπτυξης του Lb. sakei LQC 1089 (Σχήμα 4.30). Συνεπώς, το καλύτερο υποψήφιο υπόστρωμα για την εφαρμογή του στην ανάπτυξη του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ είναι το ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract και γλυκόζη σε συγκεντρώσεις 0.5 και 2% w/v, αντίστοιχα. log cfu/ml α NB+YE(0.5%) Χρόνος (ημέρες) ph Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) του Lb. sakei LQC 1089 σε ΝΒ (α) και TSB (β) εμπλουτισμένα με 0.5% Yeast extract (YE) στους 10 C. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης είναι 2% w/v και στα δύο θρεπτικά μέσα ανάπτυξης. log cfu/ml β TSB+YE(0.5%) Χρόνος (ημέρες) ph Επιλογή χημικού δείκτη Τα κύρια χαρακτηριστικά ιδιότητες του κατάλληλου για την ανάπτυξη του συστήματος ΤΤΙ χημικού δείκτη είναι να μπορεί να προστεθεί στο υπόστρωμα ανάπτυξης του μικροοργανισμού χωρίς να αποτρέπει την ανάπτυξη του τελευταίου και να προκαλεί εμφανή, μη αντιστρεπτή μεταβολή στο χρώμα του υποστρώματος στο εύρος μείωσης του ph που προκαλείται από την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Οι καλύτερες χρωματικές μεταβολές όπως αυτές αποτυπώθηκαν από τις εικόνες διαλυμάτων διαφορετικών συγκεντρώσεων γαλακτικού οξέος, άρα και τιμών ph στα οποία προστέθηκαν οι υπό μελέτη χημικοί δείκτες, παρατηρήθηκαν από το Methyl red (MR), το Chlorophenol red (CPR) και το μίγμα Bromocresol green και Chlorophenol red (BCG+CPR) (Σχήμα 4.31). Στο Σχήμα 4.32 δίνονται οι μεταβολές των χρωματικών παραμέτρων L, a, b των ίδιων διαλυμάτων ως συνάρτηση του ph. Σε όμοια συμπεράσματα κατέληξε και η μελέτη του φάσματος απορρόφησης των ίδιων διαλυμάτων στην περιοχή του ορατού (Σχήμα 4.33), 177

212 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή όπου απότομη μεταβολή της κλίσης της καμπύλης λ max σημειώθηκε στις ομάδες διαλυμάτων στις οποίες προστέθηκαν οι χημικοί δείκτες MR, CPR και το μίγμα BCG+CPR. α β γ δ ε στ ζ Σχήμα Μεταβολή χρώματος διαλυμάτων διαφορετικής συγκέντρωσης γαλακτικού οξέος και διαφορετικού ph σε ΝΒ στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v δείκτη: α) Methyl red (MR), β) Chlorophenol red (CPR), γ) Bromocresol purple (BCP), δ) μίγματος Bromocresol green Chlorophenol red (BCG+CPR), ε) resazurin, στ) alizarin, ζ) p-nitrophenol. 178

213 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση L L L L L a b Methyl red ph ph L a b Bromocresol purple ph L a b L a b Resazurin p-nitrophenol ph a, b a, b a, b a, b L L L Σχήμα Χρωματικές συνιστώσες L, a, b, ως συνάρτηση του ph διαλυμάτων γαλακτικού οξέος σε ΝΒ στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v των χημικών δεικτών: methyl red, chlorophenol red, Bromocresol purple, μίγματος Bromocresol green και chlorophenol red, resazurin, alizarin και p- nitrophenol L a b Chlorophenol red ph L a b BCG+CPR ph 90 7 Alizarin L a b ph a, b a, b a, b 179

214 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή λmax λmax λmax Methyl red λmax Abs ph Bromocresol purple ph Resazurin λmax1 Abs ph λmax1 Abs Abs Abs Abs ph Σχήμα Μεταβολή του μήκους κύματος στο οποίο παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση (λ max, ανοιχτά σύμβολα) σειράς διαλυμάτων γαλακτικού οξέος διαφορετικού ph σε NB στα οποία έχει προστεθεί 1% v/v των χημικών δεικτών methyl red, chlorophenol red, Bromocresol purple, μίγματος Bromocresol green και chlorophenol red και resazurin και η παρατηρούμενη μέγιστη Απορρόφηση (Abs, κλειστά σύμβολα) στο συγκεκριμένο μήκος κύματος. Η απότομη μεταβολή στην κλίση της καμπύλης λ max υποδεικνύει διαφοροποίηση της χημικής ένωσης που απορροφά και άρα μεταβολή του χρώματος του χημικού δείκτη στο συγκεκριμένο ph. Η λήψη του φάσματος απορρόφησης έγινε με βαθμιαία μεταβολή του μήκους κύματος στην περιοχή του ορατού ( nm). λmax λmax Chlorophenol red BCG+CPR λmax1 Abs ph λmax1 Abs Abs Abs Από τις τρεις αυτές επιλογές η αλλαγή από κίτρινο σε πορτοκαλί και τελικά σε κόκκινο χρωματισμό που προκαλείται από το MR κρίθηκε άξια περαιτέρω έρευνας. Το MR επέτρεψε την ανάπτυξη του Lb. sakei LQC 1089 και την πτώση του ph τόσο στο ΝΒ 180

215 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση (Σχήματα 4.34 και 4.35) όσο και στα θρεπτικά μέσα TSB και MRS σε συνθήκες συντήρησης 10 και 20 C (Σχήμα 4.36). ph α μάρτυρας MR Χρόνος (ημέρες) log cfu/ml Σχήμα Μεταβολή του ph του υποστρώματος (ΝΒ εμπλουτισμένο με 0.25% γλυκόζη) (α) και της μικροβιακής ανάπτυξης (β) του Lb. sakei LQC 1089 κατά τη συντήρηση στους 10 C απουσία (μάρτυρας, ανοιχτά σύμβολα) και παρουσία (κλειστά σύμβολα) του χημικού δείκτη Methyl red (MR, διάλυμα 0.04% w/v) σε συγκέντρωση 1% v/v. Οι καμπύλες αποτελούν το μέσο όρο τριών επαναλήψεων β μάρτυρας MR Χρόνος (ημέρες) log cfu/ml a*, b* a* b* L* L* 3 α -2 β Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (α) και η αντίστοιχη μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ (β) κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με 0.25 % w/v γλυκόζη, δείκτης: methyl red, (MR, διάλυμα 0.04% w/v) σε συγκέντρωση 1% v/v) Χρόνος (ημέρες)

216 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή log cfu/ml NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% 10 C Χρόνος (ημέρες) ph log cfu/ml Σχήμα Μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ στους 10 και 20 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) C NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% Χρόνος (ημέρες) ph Ωστόσο, σε ότι αφορά την οπτική μεταβολή του χρώματος του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ, αυτή ήταν αισθητή και εμφανής οπτικά μόνο στο ΝΒ και όχι στο TSB και MRS (Σχήματα 4.37 και 4.38), πιθανώς εξαιτίας της εν γένει σκουρόχρωμης φύσης των υλικών αυτών και της έντονης ανάπτυξης του μικροοργανισμού που παρατηρείται και η οποία προκαλεί έντονο θόλωμα των υποστρωμάτων και ενός είδους δέσμευσης της προστιθέμενης χρωστικής από τα κύτταρα του μικροοργανισμού, ιδιαίτερα στην υψηλή θερμοκρασία συντήρησης των 20 C (Σχήμα 4.38). Οι μετρήσεις των συνιστωσών χρώματος με το χρωματόμετρο βρέθηκαν σε απόλυτη συμφωνία με τις οπτικές παρατηρήσεις, ιδιαίτερα σε ότι αφορά τη μεταβολή της χρωματικής παραμέτρου a*, ενδεικτική της ανάπτυξης κόκκινου χρωματισμού (η παράμετρος παίρνει θετικές τιμές) κατά την πορεία της συντήρησης του συστήματος ΤΤΙ. Στα Σχήματα 4.39 και 4.40 η μεταβολή της παραμέτρου a* ήταν εμφανής μόνο στην περίπτωση που το υπόστρωμα ανάπτυξης του μικροοργανισμού ήταν το ΝΒ, σε αντίθεση με αυτές των TSB και MRS όπου η μεταβολή ήταν ηπιότερη ή και ανύπαρκτη στους 10 (Σχήμα 4.39) και 20 C (Σχήμα 4.40), αντίστοιχα. Άξιο σχολιασμού είναι επίσης το γεγονός ότι στην υψηλή θερμοκρασία συντήρησης των 20 C, στις φιάλες με το υπόστρωμα NB, οι οποίες ήταν και οι μόνες που ανέπτυξαν κόκκινο χρώμα, ο χρωματισμός αυτός αλλοιώθηκε κατά την πορεία της συντήρησης ανεξάρτητα από το ph του μέσου που εξακολουθούσε να παραμένει χαμηλό. Όμοια, η χρωματική παράμετρος a* μετά από την υψηλή τιμή που έλαβε την 3η ημέρα συντήρησης άρχισε να μειώνεται (Σχήμα 4.40), υποδεικνύοντας μια πιθανή απώλεια σταθερότητας του χρωματικού δείκτη. 182

217 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d Σχήμα Οπτική απεικόνιση της μεταβολής του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ σε διάφορα υποστρώματα κατά την πορεία ανάπτυξης του μικροοργανισμού Lb. sakei LQC 1089 στους 10 C (0-10η ημέρα). Σε κάθε εικόνα οι δυο πρώτες φιάλες αριστερά έχουν ΝΒ, οι δυο μεσαίες TSB και οι δυο δεξιά MRS. Σε όλες τις φιάλες έχει προστεθεί 3% v/v διαλύματος δείκτη MR 0.04% w/v. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα υποστρώματα ρυθμίστηκε στο 2% w/v. 183

218 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d Σχήμα Οπτική απεικόνιση της μεταβολής του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ σε διάφορα υποστρώματα κατά την πορεία ανάπτυξης (0-10d) του μικροοργανισμού Lb. sakei LQC 1089 στους 20 C. Σε κάθε εικόνα οι δυο πρώτες φιάλες αριστερά έχουν ΝΒ, οι δυο μεσαίες TSB και οι δυο δεξιά MRS. Σε όλες τις φιάλες έχει προστεθεί 3% v/v διαλύματος δείκτη MR 0.04% w/v. Η αρχική συγκέντρωση γλυκόζης σε όλα τα υποστρώματα ρυθμίστηκε στο 2% w/v. 184

219 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση L* 80 NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% a* 5 0 b* Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C. (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v από διάλυμα 0.04 % w/v) NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% 15 L* 80 NB+MR 3% TSB+MR 3% MRS+MR 3% a* 5 0 b* Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 20 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ, TSB, ή MRS όλα με συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκέντρωση 3% v/v από διάλυμα 0.04 % w/v). Ακολούθησαν πειραματικές δοκιμές όπου εξετάστηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη MR στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την πτώση του ph του συστήματος ΤΤΙ, στα εμπλουτισμένα με Yeast Extract, θρεπτικά μέσα ΝΒ και TSB (Σχήματα 4.41 και 4.42). Καμιά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ του μάρτυρα (σύστημα ΤΤΙ χωρίς την προσθήκη διαλύματος δείκτη) και των πειραματικών δοκιμών που περιείχαν MR ακόμα και σε συγκέντρωση 30% v/v (διαλύματος 0.04% w/v). Η οπτική χρωματική μεταβολή του συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού ήταν ευδιάκριτη για το σύστημα με ΝΒ, ιδιαίτερα καθώς αυξάνονταν η συγκέντρωση του προστιθέμενου δείκτη (Σχήμα 4.43). Σε αντίθεση, στο σύστημα του ΤΤΙ με TSB, όπου προστέθηκαν οι ίδιες συγκεντρώσεις δείκτη MR (1, 3, 5%), δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη του αναμενόμενου κόκκινου χρωματισμού (Σχήμα 4.44). Σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα αυτά βρέθηκαν οι μετρήσεις των χρωματικών παραμέτρων L*, a*, b* όπως απεικονίζονται στα Σχήματα 4.45 και Αναφορικά με την εξασθένιση 185

220 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή log cfu/ml της έντασης του χρώματος κατά την πορεία της συντήρησης, αυτή εξακολούθησε να είναι υπαρκτή, ανεξαρτήτως συγκέντρωσης του προστιθέμενου δείκτη. Συνεπώς, η απώλεια στην ένταση του χρώματος οφείλεται μάλλον σε αστάθεια της εν λόγω χημικής ένωσης στις συνθήκες συντήρησης παρά στην ύπαρξη ικανοποιητικής συγκέντρωσης δείκτη στο σύστημα (τιμές χρωματικής παραμέτρου a* στο Σχήμα 4.47, όπου η συγκέντρωση του δείκτη φτάνει το 30% v/v) NB+YE-0%MR NB+YE-1%MR NB+YE-3%MR NB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) ph Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ αριστερά και TSB δεξιά εμπλουτισμένα με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v). log cfu/ml TSB+YE-0%MR TSB+YE-1%MR TSB+YE-3%MR TSB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) ph log cfu/ml %MR 10%MR 20%MR 30%MR Χρόνος (ημέρες) ph Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης χημικού δείκτη ΜR στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0.04 % w/v). 186

221 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση log cfu/ml log cfu/ml log cfu/ml log cfu/ml NB+YE-0%MR Χρόνος (ημέρες) NB+YE-3%MR Χρόνος (ημέρες) 10%MR Χρόνος (ημέρες) 30%MR Χρόνος (ημέρες) log cfu/ml log cfu/ml log cfu/ml NB+YE-1%MR Χρόνος (ημέρες) NB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) 20%MR Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στην οπτική μεταβολή του χρώματος του συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 5, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0.04 % w/v). 187

222 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή log cfu/ml log cfu/ml TSB+YE-0%MR Χρόνος (ημέρες) TSB+YE-3%MR Χρόνος (ημέρες) log cfu/ml log cfu/ml Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στην οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: TSB εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v) TSB+YE-1%MR Χρόνος (ημέρες) TSB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) L* a* b* NB+YE-0%MR NB+YE-1%MR NB+YE-3%MR NB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0,5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0,04 % w/v). 188

223 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση L* TSB+YE-0%MR TSB+YE-1%MR TSB+YE-3%MR TSB+YE-5%MR Χρόνος (ημέρες) a* Χρόνος (ημέρες) b* Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Methyl red στη μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: TSB εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 1, 3 και 5% v/v διαλύματος 0.04 % w/v). L* a* b* %MR 10%MR 20%MR 30%MR Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0,5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: MR σε συγκεντρώσεις 0, 10, 20 και 30% v/v διαλύματος 0,04 % w/v). Ένα νέο μοντέλο σύστημα ΤΤΙ, με χρήση του χημικού δείκτη CPR (Chlorophenol Red) στη συνέχεια αναπτύχθηκε και συγκρίθηκε με αυτό του MR που ήδη περιγράφηκε. Ο νέος χημικός δείκτης προστέθηκε σε συγκεντρώσεις 5, 10 και 20% v/v (διάλυμα δείκτη 0.04% w/v CPR σε NaOH Μ) σε ΝΒ εμπλουτισμένο με ΥΕ. Το CPR σε συγκέντρωση ίση ή μικρότερη του 10% v/v, δεν επηρέασε σημαντικά τη μικροβιακή ανάπτυξη και τη μεταβολή του ph του νέου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (Σχήμα 4.48). Επιπλέον, στις συγκεντρώσεις αυτές προκάλεσε ικανοποιητική οπτική χρωματική αλλαγή του υποστρώματος από ιώδες κόκκινο σε κίτρινο χρωματισμό (Σχήμα 4.49). Η μεταβολή αυτή ήταν μη αντιστρεπτή κατά την πορεία συντήρησης του συστήματος (οι τιμές των χρωματικών συνιστωσών a* και b* παρέμειναν σταθερές μετά την 5 η ημέρα σχηματίζοντας πλατό (Σχήμα 4.50). Η συγκέντρωση όμως 20% v/v ανέστειλε την ανάπτυξη του Lb. sakei LQC 1089, το ph του υποστρώματος δεν μειώθηκε ικανοποιητικά, 189

224 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή log cfu/ml %CPR 5%CPR 10%CPR 20%CPR Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης και του χημικού δείκτη CPR στη μικροβιακή ανάπτυξη (κλειστά σύμβολα) και μεταβολή του ph (ανοιχτά σύμβολα) μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης Chlorophenol red, CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M. log cfu/ml log cfu/ml %CPR Χρόνος (ημέρες) 10%CPR Χρόνος (ημέρες) log cfu/ml log cfu/ml Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του χημικού δείκτη Chlorophenol red στην οπτική μεταβολή του χρώματος συστήματος ΤΤΙ κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M) ph 5%CPR Χρόνος (ημέρες) 20%CPR Χρόνος (ημέρες) 190

225 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση L* a* b* %CPR 5%CPR 10%CPR 20%CPR Χρόνος (ημέρες) Χρόνος (ημέρες) Σχήμα Μεταβολή των χρωματικών παραμέτρων του μοντέλου συστήματος ΤΤΙ κατά την πορεία συντήρησής του στους 10 C (μικροοργανισμός: Lb. sakei LQC 1089, υπόστρωμα: ΝΒ εμπλουτισμένο με Yeast Extract (YE 0.5 % w/v) και αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 2 % w/v, χημικός δείκτης: CPR σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20 % v/v διαλύματος 0.04 % w/v CPR σε NaOH M) Χρόνος (ημέρες) οπότε και δε συνέβη ποτέ η επιθυμητή χρωματική αλλαγή. Κατά συνέπεια ο δείκτης αυτός σε συγκέντρωση 7.5% v/v υιοθετήθηκε ως η ιδανική χημική ένωση για τη χρήση της στην ανάπτυξη του ΤΤΙ. Ανακεφαλαιώνοντας, ως τελικά δομικά συστατικά του υπό ανάπτυξη του ΤΤΙ επιλέχτηκαν ο μικροοργανισμός Lactobacillus sakei, το υπόστρωμα Nutrient broth εμπλουτισμένο με Yeast extract και γλυκόζη σε συγκεντρώσεις 0.5 και 2 % w/v, αντίστοιχα, και ο χημικός δείκτης Chlorophenol red. Το διάλυμα του χημικού δείκτη (0.04 % w/v σε NaOH Μ) προστίθεται σε συγκέντρωση 7.5 % v/v στο αποστειρωμένο μέσο ανάπτυξης. Εναλλακτικά, το αρχικό διάλυμα του χημικού δείκτη παρασκευάστηκε σε μια περισσότερο συμπυκνωμένη μορφή (0.2 % w/v σε NaOH Μ) και προστέθηκε στο υπόστρωμα του ΤΤΙ σε συγκέντρωση 1.5 % v/v Περιγραφή του συστήματος ΤΤΙ. Έχοντας, λοιπόν, ορίσει τα δομικά συστατικά του μικροβιακού ΤΤΙ ακολούθησε η περιγραφή του συνόλου των μεταβολών που συμβαίνουν σ αυτό κατά τη συντήρησή του. Για παράδειγμα, στο Σχήμα 4.51 παρουσιάζονται οι μεταβολές που συμβαίνουν κατά τη συντήρηση του ΤΤΙ στους 8 C, και πιο συγκεκριμένα η βακτηριακή ανάπτυξη, η πτώση του ph, η κατανάλωση γλυκόζης, η παραγωγή γαλακτικού οξέος και η ανάπτυξη του χρώματος, όπως αυτή περιγράφεται από τη μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ. Αξίζει να σημειωθεί πως η παρουσία του χημικού δείκτη σε συγκέντρωση 1.5% (v/v) στο μέσο ανάπτυξης δεν επηρέασε καθόλου την κινητική ανάπτυξης του L. sakei αλλά ούτε και τα προφίλ πτώσης του ph (Σχήμα 4.48). Ο πληθυσμός του L. sakei σχετίστηκε στενά με 191

226 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή C Ν LAB έγχρωμα τετραγωνίδια Ε ph Ε log CFU/ml γαλακτικό οξύ (mm) γαλακτικό οξύ γλυκόζη Χρόνος (h) γλυκόζη (G-G0) (mm) ph Χρόνος (h) Σχήμα Μικροβιολογικές, φυσικοχημικές μεταβολές, και μεταβολές χρώματος που συμβαίνουν στο σύστημα ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 8 C. Τα σημεία που απεικονίζουν τα δεδομένα στην καμπύλη ΔΕ έχουν αντικατασταθεί με έγχρωμα τετραγωνίδια τα οποία παρουσιάζουν το χρώμα του συστήματος ΤΤΙ στους αντίστοιχους χρόνους δειγματοληψίας. την κατανάλωση της γλυκόζης και την παραγωγή γαλακτικού οξέος (ένθετο στο Σχήμα 4.51), προκαλώντας την πτώση του ph και τη σταδιακή αλλαγή του χρώματος από το αρχικό κόκκινο (χαμηλές τιμές της παραμέτρου ΔΕ) σε πορτοκαλί και έπειτα στο τελικό κίτρινο χρώμα (υψηλές τιμές ΔΕ όταν ο πληθυσμός των γαλακτικών προσεγγίζει τα μέγιστα επίπεδα του πληθυσμού, N max ). Η ευδιάκριτη οπτική μεταβολή του χρώματος του υποστρώματος στον τελικό κίτρινο χρωματισμό καταγράφηκε όταν η απόκριση της παραμέτρου ΔΕ έλαβε την τιμή 20, οπότε η χρονική αυτή στιγμή υιοθετήθηκε ως το σημείο λήξης του συστήματος ΤΤΙ. Το ph του μέσου ανάπτυξης στο σημείο λήξης ήταν κοντά στο 5.2. Ο χρόνος στον οποίο σημειώνεται το σημείο λήξης συμπίπτει με πληθυσμό του L. sakei στο υπόστρωμα, της τάξης των CFU/ml. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, όταν ο πληθυσμός των μικροοργανισμών σ ένα τρόφιμο φτάσει στη συγκέντρωση αυτή θεωρείται ότι αγγίζει το επίπεδο αλλοίωσης ή διαφορετικά ότι η συγκέντρωση αυτή σχετίζεται με το τέλος της διάρκειας ζωής πολλών προϊόντων τροφίμων που αλλοιώνονται είτε από τα γαλακτικά βακτήρια είτε από άλλες ομάδες βακτηρίων (Dalgaard, 2003, Devlieghere et al., 2000a, Korkeala et al., 1987, Koutsoumanis et al., 2002, 2000, Mataragas et al., 2006, Smolander et al., 2004, Taoukis et al., 1999, Vermeiren et al., 2004). Η εκτιμούμενη τιμή

227 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση του συντελεστή παραλλακτικότητας στις αποκρίσεις του ΤΤΙ (επαναλαμβανόμενοι προσδιορισμοί της συνάρτησης ΔΕ), 15.2%, συγκλίνει με την παραλλακτικότητα που παρατηρείται κατά την ανάπτυξη των αλλοιογόνων στα τρόφιμα οργανισμών (Koutsoumanis et al., 2006, 2002, και Koutsoumanis και Nychas, 2000) Θερμοκρασιακή εξάρτηση της απόκρισης του ΤΤΙ Τα δεδομένα των μικροβιολογικών και φυσικοχημικών μεταβολών του ΤΤΙ, σε όλες τις ισόθερμες συνθήκες συντήρησης που μελετήθηκαν, καθώς και οι προβλεπόμενες από το μοντέλο καμπύλες, με χρήση των διαφορικών εξισώσεων , παρουσιάζονται στο Σχήμα Οι ίδιες εξισώσεις επέτρεψαν παράλληλα και την εκτίμηση όλων των παραμέτρων του μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε. Γενικά, υπήρξε αρκετά καλή συμφωνία των πειραματικών δεδομένων (σύμβολα στο Σχήμα 4.52) και των προβλέψεων του μοντέλου (γραμμές στο Σχήμα 4.52) των μικροβιακών και φυσικοχημικών αποκρίσεων. Ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών, μ max, αυξήθηκε με τη θερμοκρασία και η θερμοκρασιακή αυτή εξάρτηση περιγράφηκε ικανοποιητικά από την εξίσωση Arrhenius (εξίσωση 3.20). Η παράμετρος Υ G, επίσης αυξήθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας συντήρησης, ενώ ο συντελεστής διατήρησης m G δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη θερμοκρασία συντήρησης (4-16 C) του ΤΤΙ (Πίνακας 4.6). Oι εκτιμήσεις της παραμέτρου Υ L ήταν 1.6, 2.75 και 2.6 mmol γαλακτικού οξέος ανά mmol καταναλισκόμενης γλυκόζης στους 8, 12, και 16 C, αντίστοιχα (Πίνακας 4.6), δηλώνοντας την ομοζυμωτική δραστηριότητα του L. sakei σ αυτές τις συνθήκες. Θεωρητικά, κατά την κατανάλωση ενός mol γλυκόζης παράγονται 2 mol γαλακτικού οξέος και 2 mol ATP, ενώ συνήθως η μετατροπή της πηγής του άνθρακα (με τη μορφή σακχάρου) στο τελικό προϊόν συμβαίνει με συντελεστή μετατροπής 0.9, ποσοστό που δικαιολογεί την απορρόφηση μέρους του άνθρακα που προέρχεται από την πηγή σακχάρου στη διεργασία σχηματισμού βιομάζας (Axelsson, 1993). Ωστόσο, για τη σύνθεση του κυτταρικού υλικού κυρίως υπεύθυνες θεωρούνται οι αζωτούχες οργανικές ενώσεις (Cocaign-Bousquet et al., 1996). Αντίθετα, οι υπολογιζόμενες τιμές της παραμέτρου Υ L για τους 0 και 4 C ήταν 0.55 και 1 mmol γαλακτικού οξέος / mmol γλυκόζης, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας πιθανή ετεροζυμωτική δραστηριότητα για το συγκεκριμένο μικροοργανισμό στις περιπτώσεις ανάπτυξής του κάτω από μη ευνοϊκές χαμηλές θερμοκρασίες. Παρ όλα αυτά, κατά την ανάλυση του υγρού της ζύμωσης με χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), δεν ανιχνεύθηκε η παρουσία άλλων οργανικών οξέων όπως για παράδειγμα του οξικού οξέος, 193

228 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 16 0 C C 0 log (CFU/ml), γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) log (CFU/ml), γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) Χρόνος (h) Χρόνος (h) 16 8 C C 0 log (CFU/ml), γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) log (CFU/ml), γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) Χρόνος (h) Χρόνος (h) log (CFU/ml), γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη 16 C γλυκόζη (G-G 0)(mM) Χρόνος (h) Σχήμα Μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές που συμβαίνουν στο σύστημα ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του ισόθερμα στους 0, 4, 8, 12 και 16 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του μοντέλου στις πειραματικές εκτιμήσεις. 194

229 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση Πίνακας 4.6. Εκτιμούμενες παράμετροι για τις εξισώσεις α Θερμοκρασία ( C) μ max (h -1 ) Lag time (h) N max (CFU/ml) Y G (CFU/mmol glu.) (10 7 ) m G (mmol glu./cfu/h) (10-9 ) Y L (mmol LA / mmol glu.) α Lag time: διάρκεια της φάσης προσαρμογής, glu: γλυκόζη, LA: γαλακτικό οξύ, α: συντελεστής στην εξίσωση 3.17 α (10-5) Ελάχιστο ph 195

230 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή παρά μόνον του γαλακτικού οξέος, γεγονός που ενισχύει την άποψη πως ο L. sakei ακόμη και όταν αναπτύσσεται σε χαμηλές θερμοκρασίες συντήρησης διατηρεί την ομοζυμωτική του δράση. Προφανώς, στο δυσμενές αυτό περιβάλλον ο μικροοργανισμός χρησιμοποιεί επιπλέον γλυκόζη για το σχηματισμό των δομικών συστατικών του κυττάρου. Επιπλέον διερεύνηση της ανάπτυξης του συγκεκριμένου στελέχους του L. sakei σε χαμηλές θερμοκρασίες συντήρησης είναι απαραίτητη για την πληρέστερη υποστήριξη της άποψης αυτής. Η ακόλουθη συζήτηση εστιάζει στους πιθανούς φυσιολογικούς μηχανισμούς των μικροβιακών αποκρίσεων που παρατηρήθηκαν στις κρίσιμες χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες συντήρησης σε μια προσπάθεια να κατανοηθούν καλύτερα οι παράμετροι του μοντέλου που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Μειούμενες τιμές του συντελεστή Υ G δείχνουν πως κάποια ενέργεια χρησιμοποιείται σταδιακά για λειτουργίες που δε σχετίζονται με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Το συμπέρασμα αυτό υποστηρίζεται και από προηγούμενες αναφορές σχετικά με παρατηρούμενες αυξημένες απαιτήσεις σε ATP, απαραίτητες για τις επιπρόσθετες λειτουργίες συντήρησης του κυττάρου (π.χ. η διατήρηση του ισοζυγίου των πρωτονίων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, η μετακίνηση μακρομορίων όπως το mrna, και η σύνθεση επιπρόσθετων πρωτεϊνών θα μπορούσαν να μειώσουν σημαντικά τη διαθεσιμότητα του ATP που χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη) (Rao et al., 2004). Αυτές οι μεταβολικές δραστηριότητες είναι άμεσα εξαρτώμενες από το ρυθμό ανάπτυξης (Nielsen et al., 1991). Σε χαμηλούς ρυθμούς ανάπτυξης ο σχηματισμός της βιομάζας γίνεται ενεργειακά περισσότερο δαπανηρός (π.χ. το ποσοστό των πρωτεϊνών στα κύτταρα είναι μεγαλύτερο), συντελώντας στη μείωση του συντελεστή απόδοσης (Konopka, 2000). Συνεπώς, το συνολικό κόστος διατήρησης της ενέργειας αποτελεί ένα σημαντικό μέρος της συνολικής χρησιμοποιούμενης ενέργειας (Pirt, 1965). Ο μέγιστος πληθυσμός του μικροοργανισμού, Ν max, όπως προβλέφθηκε από το μοντέλο παρέμεινε σταθερός και σχεδόν ανεξάρτητος της θερμοκρασίας συντήρησης με μια μέση τιμή 8.20 ± 0.67 log 10 CFU/ml (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση). Ωστόσο, η τιμή πρόβλεψης για το μέγιστο πληθυσμό Ν max του L. sakei στους 0 C ήταν 6.8 log 10 CFU/ml, κατά πολύ μικρότερη από αυτές που καταγράφηκαν για τις λοιπές θερμοκρασίες συντήρησης ( λογαριθμικές μονάδες). Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με το μικρό ρυθμό ανάπτυξης ή/και το συντελεστή Y G, συντελώντας σε μικρή παραγωγή γαλακτικού οξέος, γεγονός που δικαιολογεί μερικώς την υψηλή τιμή του συντελεστή m G που σημειώθηκε για την κρίσιμη θερμοκρασία συντήρησης των 0 C. Η κινητική της ανάπτυξης χρώματος του ΤΤΙ, όπως αυτή εκφράζεται από τη χρωματική 196

231 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση συνάρτηση ΔΕ, δίνεται στο Σχήμα Οι σιγμοειδείς καμπύλες ΔΕ-χρόνου σε όλες τις θερμοκρασίες που εξετάστηκαν προσαρμόστηκαν ικανοποιητικά στο μοντέλο της λογιστικής εξίσωσης (Σχήμα 4.53). Η χρωματική μεταβολή του ΤΤΙ συνέβη τη στιγμή που το ph του μέσου μειώθηκε στην τιμή που παρατηρείται η χρωματική μεταβολή του χημικού δείκτη σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Το σημείο λήξης του ΤΤΙ (χρόνος στον οποίο η συνάρτηση ΔΕ φάνει την τιμή 20) μειώθηκε με αύξηση της θερμοκρασίας. Το σημείο λήξης εκτιμήθηκε σε 640, 269, 113, 78.4 και 61.1 ώρες στους 0, 4, 8, 12, και 16 C, αντίστοιχα. Η καμπύλη Arrhenius που περιγράφει την επίδραση της θερμοκρασίας στο σημείο λήξης του ΤΤΙ εικονίζεται στο Σχήμα 4.54 (R 2 = 0.946), με μια εκτιμούμενη ενέργεια ενεργοποίησης, Ε α, της τάξης των 97.7 kj/mol. Η τιμή αυτή είναι συγκρίσιμη των τιμών Ε α άλλων διαθέσιμων μη-μικροβιακών χρονοθερμοκρασιακών δεικτών όπως (i) ενός πρόσφατα προτεινόμενου ενζυμικού ΤΤΙ βασισμένου στο ένζυμο της αμυλάσης (Yan et al., 2008), (ii) των TTI της εταιρίας Lifelines, και ειδικότερα του δείκτη Freshness Monitor και του δείκτη Fresh-Check τύπου A6 με τιμές Ε α 86.0 και 83.6 kj.mol, αντίστοιχα (Taoukis και Labuza, 1989a, Taoukis et al., 1999), (iii) των δεικτών της MonitorMark με τιμές Ε α να κυμαίνονται στο εύρος kj/mol (Shimoni et al., 2001) και τέλος, (iv) των ενζυμικών ΤΤΙ της εταιρίας Vitsab και πιο συγκεκριμένα των τύπων M και S με τιμές Ε α 68.7 και kj/mol, αντίστοιχα (Taoukis et al., 1999) Ε C 4 C 8 C 12 C 16 C Χρόνος (h) Σχήμα Ανάπτυξη της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ κατά την ισόθερμη συντήρηση του συστήματος ΤΤΙ στους 0, 4, 8, 12 και 16 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του λογιστικού μοντέλου σ αυτά. 197

232 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή ln (μmax), ln (1/TTI End Point) (h -1 ) μ max TTI End Point /T-1/T ref (x10-4 ) (K) Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του μικροοργανισμού, μ max, και του αντιστρόφου του χρόνου στον οποίο σημειώνεται το σημείο λήξης του συστήματος ΤΤΙ. Το βασικότερο ίσως πλεονέκτημα του υπό ανάπτυξη μικροβιακού ΤΤΙ, συγκριτικά με τα υπόλοιπα διαθέσιμα μη μικροβιακά είδη, είναι ότι η απόκρισή του (χρωματική μεταβολή) αποτελεί το αποτέλεσμα μιας διεργασίας που προσομοιάζει τον πραγματικό μηχανισμό ποιοτικής υποβάθμισης (μικροβιακή αλλοίωση) πολλών τροφίμων (McMeekin και Ross, 1996a). Πράγματι, η απόκριση του υπό ανάπτυξη μικροβιακού ΤΤΙ σχετίζεται άρρηκτα με τη συγκέντρωση του εμβολιασμένου στο σύστημα μικροοργανισμού και μάλιστα καθ όμοιο τρόπο με αυτό που συνδέει τη μικροβιακή ανάπτυξη και την πτώση του ph (Σχήμα 4.55α και β), ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία συντήρησης. Είναι ευρέως γνωστό πως η διάρκεια ζωής των περισσότερων πρωτεϊνoύχων τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη σχετίζεται με την ανάπτυξη και τη μικροβιακή δραστηριότητα του ειδικού αλλοιογόνου μικροοργανισμού (specific spoilage organism, SSO) που ορίζεται ως το κύριο κλάσμα της συνολικής μικροχλωρίδας που ευθύνεται για την αλλοίωση. Η οργανοληπτική απόρριψη των προϊόντων αυτών παρατηρείται όταν ο ειδικός αλλοιογόνος μικροοργανισμός αγγίξει ένα συγκεκριμένο επίπεδο πληθυσμού που ονομάζεται επίπεδο αλλοίωσης (Koutsoumanis et al., 2006, 2002, Koutsoumanis και Nychas, 2000). Για παράδειγμα, η απώλεια ποιότητας των περισσότερων υπό ψύξη προϊόντων κρέατος συσκευασμένων υπό κενό ή υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας οφείλεται στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα (παραγωγή οξέος) των γαλακτικών βακτηρίων με συνέπεια τη δημιουργία μιας μη αποδεκτής όξινης / υπόξινης γεύσης ή οσμής τυριού όταν ο πληθυσμός των μικροοργανισμών πλησιάσει το επίπεδο των CFU/g (Borch et al., 1996, Devlieghere et al., 1998b, 2000a, Korkeala 198

233 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση α β 4.8 Ε C 4 C 8 C 12 C 16 C ph C 4 C 8 C 12 C 16 C Log CFU/ml Log CFU/ml Σχήμα Σχέση μεταξύ του πληθυσμού του L. sakei και της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (α) και του ph (β) του υπό ανάπτυξη συστήματος ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 0, 4, 8, 12 και 16 C. et al., 1987, Mataragas et al., 2006, Nychas et al., 2008, Samelis et al., 2000). Άξιο αναφοράς, είναι επίσης και το γεγονός ότι το συγκεκριμένο είδος της ομάδας των γαλακτικών βακτηρίων, ο L. sakei, που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα έρευνα, βρέθηκε να είναι το πλέον κυρίαρχο στη μικροχλωρίδα αλλοίωσης τέτοιων προϊόντων, σε διάφορες μελέτες (Devlieghere et al., 1998b, 2000a, Samelis et al., 2000). Επομένως, η διεργασία αλλοίωσης που μόλις περιγράφηκε, μοιάζει πολύ με τις αρχές στις οποίες στηρίζεται το ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη, και ειδικότερα στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα του L. sakei, ενώ ο χρόνος στον οποίο σημειώθηκε το σημείο λήξης του ΤΤΙ συμπίπτει με τη χρονική στιγμή κατά την οποία ο πληθυσμός του εν λόγω μικροοργανισμού στο μέσο του συστήματος αγγίζει τους 7-8 δεκαδικούς λογάριθμους CFU/ml σε όλες τις θερμοκρασίες που εξετάστηκαν. Επιπλέον, οι παράλληλες καμπύλες Arrhenius του σημείου λήξης του ΤΤΙ (end point) και του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης (μ max ) του L sakei, δείχνουν πως η θερμοκρασιακή εξάρτηση της μικροβιακής ανάπτυξης και της απόκρισης του ΤΤΙ είναι παρόμοιες (Σχήμα 4.54). Η εκτιμούμενη τιμή της ενέργειας ενεργοποίησης E α του μ max για τον L. sakei ήταν kj/mol και βρίσκεται πολύ κοντά στην τιμή της E α για το σημείο λήξης του (97.7 kj/mol). Τα αποτελέσματα των μελετών για την επίδραση της θερμοκρασίας στην απόκριση του ΤΤΙ δείχνουν πως οι ιδιότητες του υπό ανάπτυξη ΤΤΙ ταυτίζονται με την κινητική της ποιοτικής υποβάθμισης προϊόντων τροφίμων όπου η αλλοίωσή τους προκαλείται από τα γαλακτικά βακτήρια. Πράγματι, οι 199

234 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή εκτιμούμενες για την απόκριση του ΤΤΙ τιμές Ε α, είναι παρόμοιες με τις τιμές ενέργειας ενεργοποίησης που καταγράφονται για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων σε ποικίλα προϊόντα τροφίμων (Koutsoumanis et al., 2006, 2000). Επιπλέον, ενέργειες ενεργοποίησης που διαφέρουν από αυτές του υπό ανάπτυξη συστήματος ΤΤΙ στο εύρος των ±30 kj/mol, έχουν συχνά αναφερθεί στη βιβλιογραφία για την περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης της ανάπτυξης άλλων αλλοιογόνων βακτηρίων ή παθογόνων μικροοργανισμών σε πολλά προϊόντα τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη, όπως της Listeria monocytogenes σε μαγειρεμένα λουκάνικα φρανκφούρτης (Diez-Gonzalez et al., 2007), των ψευδομονάδων, της Shewanella putrefaciens, και των εντεροβακτηρίων σε ψάρια και κρέας (Koutsoumanis et al., 2006, 2002, 2000, Taoukis et al., 1999) Ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ Σύμφωνα με τον Taoukis (2001) υπάρχουν δύο απαραίτητες προϋποθέσεις για την επιτυχή εφαρμογή ενός ΤΤΙ: (i) Η Ε α της απόκρισης του συστήματος ΤΤΙ πρέπει να ισούται με την Ε α της απώλειας της ποιότητας του προϊόντος, και (ii) το σημείο λήξης του ΤΤΙ θα πρέπει να αντιστοιχεί στη λήξη της διάρκειας ζωής του προϊόντος σε μια θερμοκρασία αναφοράς. Σε ότι αφορά το πρώτο κριτήριο, αποδείχτηκε πως η Ε α του προτεινόμενου ΤΤΙ βρίσκεται πολύ κοντά σ αυτήν της ποιοτικής υποβάθμισης για τα προϊόντα που αλλοιώνονται από τα γαλακτικά βακτήρια ή άλλα βακτήρια με όμοια κινητική συμπεριφορά ή αλλοιογόνο δράση. Εξετάζοντας τη δεύτερη προϋπόθεση, το σύστημα του ΤΤΙ όπως έχει ήδη παρουσιαστεί μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της ποιότητας προϊόντων τροφίμων με διάρκεια ζωής ενός μήνα στους 0 C (το σημείο λήξης στους 0 C είναι 27 ημέρες). Ωστόσο, η διάρκεια ζωής των τροφίμων μπορεί να ποικίλει σημαντικά εξαρτώμενη από διάφορους παράγοντες όπως είναι το αρχικό επίπεδο μόλυνσης από τον ειδικό αλλοιογόνο οργανισμό (SSO), το ph, την ενεργότητα του νερού και την τυχόν παρουσία στο τρόφιμο διαφόρων αντιμικροβιακών ουσιών, κλπ (Koutsoumanis et al., 2006, 2002, 2000, Koutsoumanis και Nychas, 2000). Συνεπώς, ένα αποτελεσματικό σύστημα ΤΤΙ θα πρέπει να παρέχει την δυνατότητα εύκολης ρύθμισης του σημείου λήξης του, ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του υπό ενδιαφέροντος προϊόντος. Τα δομικά συστατικά του υπό ανάπτυξη ΤΤΙ επιτρέπουν την ταύτιση του σημείου λήξης με τη διάρκεια ζωής ενός συγκεκριμένου προϊόντος προσομοιάζοντας απλά το περιβάλλον του τροφίμου. Θα μπορούσε για παράδειγμα, να προστεθεί στο υπόστρωμα του ΤΤΙ μια αντιμικροβιακή ουσία στην ίδια συγκέντρωση με αυτή που συνήθως 200

235 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση ενσωματώνεται σε ένα τρόφιμο, η ακόμα να ρυθμιστεί η ενεργότητα του νερού του υποστρώματος του ΤΤΙ με προσθήκη οσμωτικά ενεργών συστατικών (πολυόλες ή ηλεκτρολύτες) προκειμένου να προσεγγίσει αυτήν του τροφίμου. Σε κάθε περίπτωση, ο σκοπός είναι να δημιουργηθεί ένα περιβάλλον στο σύστημα του ΤΤΙ που να προσεγγίζει όσο το δυνατό καλύτερα εκείνο του τροφίμου, προκειμένου να επιτευχθεί παρόμοια μικροβιακή ανάπτυξη και στα δύο συστήματα. Είναι επίσης άξιο λόγου να αναφερθεί ότι παρά τις διαφορές στη σύσταση των μέσων ανάπτυξης δεν αναμένεται σημαντική διαφοροποίηση στην ενέργεια ενεργοποίησης του συστήματος (Koutsoumanis et al., 2006, 2000). Μια εναλλακτική προσέγγιση στη ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ είναι η μεταβολή του επιπέδου με το οποίο εμβολιάζεται το βακτηριακό στέλεχος στο σύστημα. Σε αυτή τη βάση, εξετάστηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης του L. sakei ( CFU/ml) στην απόκριση του ΤΤΙ στη σταθερή θερμοκρασία των 8 C. Όπως αναμένονταν με την αύξηση του αρχικού επιπέδου του εμβολίου, ο μικροοργανισμός φτάνει τη μέγιστη βακτηριακή συγκέντρωση σε συντομότερο χρόνο, όπως επίσης γρηγορότερα είναι και τα προφίλ πτώσης του ph (Σχήμα 4.56α) και συντομότερα τα σημεία λήξης (Σχήμα 4.56β). Πιο συγκεκριμένα, τα σημεία λήξης εκτιμήθηκαν σε 6, 4.9, 3.3 και 3 ημέρες με αρχικά επίπεδα εμβολίου 10 1,, 10 3, 10 5, και 10 6 CFU/ml, αντίστοιχα. Μια αρνητική γραμμική συσχέτιση ανιχνεύθηκε μεταξύ του αρχικού επιπέδου του μικροοργανισμού με το οποίο εμβολιάζεται το σύστημα και του σημείου λήξης του ΤΤΙ (Σχήμα 4.56γ). Αυτή η σχέση υποδεικνύει ολοφάνερα τη δυνατότητα εύκολης ρύθμισης του σημείου λήξης του ΤΤΙ σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του προϊόντος τροφίμου που ενδιαφέρει κάθε φορά, χρησιμοποιώντας το κατάλληλο επίπεδο εμβολίου του L. sakei στο υπόστρωμα του ΤΤΙ Αξιολόγηση του μοντέλου των διαφορικών εξισώσεων Οι ίδιες πειραματικές δοκιμές που διεξήχθησαν για τη διερεύνηση της δυνατότητας ρύθμισης του σημείου λήξης του ΤΤΙ (μεταβολές στις μικροβιολογικές και φυσικοχημικές παραμέτρους του ΤΤΙ σε μια σταθερή θερμοκρασία συντήρησης, 8 C, διαφοροποιώντας μόνο το αρχικό επίπεδο εμβολίου), χρησιμοποιήθηκαν και για την αξιολόγηση του συστήματος διαφορικών εξισώσεων που εφαρμόστηκε κατά την ανάπτυξη του μοντέλου που περιγράφει την κινητική της θερμοκρασιακής εξάρτησης της απόκρισης του ΤΤΙ. Στο Σχήμα 4.57 παρουσιάζεται η σύγκριση των πραγματικών μικροβιολογικών και φυσικοχημι- 201

236 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Log CFU/ml α ^1 10^ ^5 10^ Χρόνος (h) β ph 20 Ε ^1 10^3 10^5 10^ Χρόνος για το σημείο λήξης (h) γ Χρόνος (h) y = x R 2 = Log CFU/ml Σχήμα Επίδραση του αρχικού επιπέδου εμβολίου στην κινητική της μικροβιακής ανάπτυξης (κλειστά σύμβολα) και της πτώσης του ph (ανοιχτά σύμβολα) (α), στις τιμές της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (β), και στα σημεία λήξης (γ) του συστήματος ΤΤΙ κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 8 C. 202

237 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση κών αποκρίσεων (σύμβολα στο Σχήμα 4.57) έναντι των προβλέψεων του μοντέλου (γραμμές στο Σχήμα 4.57) για τα τέσσερα επίπεδα του εμβολιασμένου στο σύστημα μικροοργανισμού που εξετάστηκαν. Αρκετά καλή συμφωνία παρατηρήθηκε μεταξύ των πειραματικών δεδομένων και των εκτιμήσεων του μοντέλου για τις περισσότερες από τις περιπτώσεις. Ωστόσο, μικρές αποκλίσεις μεταξύ των παρατηρούμενων και προβλεπόμενων από το μοντέλο τιμών σημειώθηκαν για τις εκτιμήσεις της συγκέντρωσης υπολειμματικής γλυκόζης και του παραγόμενου γαλακτικού οξέος, στις περιπτώσεις που το μικροβιακό ΤΤΙ εμβολιάσθηκε με 10 5 και 10 6 CFU/ml του L. sakei, 16 εμβόλιο: εμβόλιο: log CFU/ml, γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) log CFU/ml, γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) Χρόνος (h) Χρόνος (h) 16 εμβόλιο: εμβόλιο: log CFU/ml, γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) log CFU/ml, γαλακτικό οξύ (mm), ph Ν LAB γαλακτικό οξύ ph γλυκόζη γλυκόζη (G-G 0)(mM) Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα Μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές που συμβαίνουν, στο εμβολιασμένο με διαφορετικά αρχικά επίπεδα του μικροοργανισμού, σύστημα ΤΤΙ, κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 8 C. Τα σύμβολα παριστάνουν τα παρατηρούμενα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές τις προβλέψεις του μοντέλου. 203

238 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή οι οποίες όμως δεν επηρέασαν ούτε την καμπύλη πρόβλεψης της μικροβιακής ανάπτυξης ούτε αυτήν της πτώσης του ph, οπότε και θεωρήθηκε ότι δεν επιδρούν στην αποτελεσματικότητα του μοντέλου. Συμπερασματικά, το πρότυπο μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη στηρίζεται στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα ενός στελέχους γαλακτικού βακτηρίου, του Lactobacillus sakei. Η ενέργεια ενεργοποίησης του ΤΤΙ εκτιμήθηκε σε kj/mol, ενώ το σημείο λήξης του μπορεί να ρυθμιστεί ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του προϊόντος τροφίμου στόχου, μεταβάλλοντας είτε το υπόστρωμα ανάπτυξης του ΤΤΙ ή το αρχικό επίπεδο εμβολίου του L. sakei. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το προτεινόμενο ΤΤΙ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την παρακολούθηση της διάρκειας ζωής κατά τη διανομή και συντήρηση των υπό ψύξη προϊόντων τροφίμων που αλλοιώνονται από την ανάπτυξη και τη μεταβολική δραστηριότητα γαλακτικών βακτηρίων (όπως συμβαίνει στην περίπτωση βοδινού κρέατος συσκευασμένου σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας), ή άλλων βακτηρίων που παρουσιάζουν παρόμοια κινητική συμπεριφορά και αλλοιογόνο δράση. Επιπλέον, μικροβιακά ΤΤΙ που στοχεύουν σε άλλες κατηγορίες προϊόντων τροφίμων χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο για κάθε τρόφιμο ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό σε συνδυασμό με το κατάλληλο μέσο ανάπτυξης και ένα αντίστοιχο χημικό δείκτη, μπορούν επίσης να αναπτυχθούν, βασισμένα πάντα στις αρχές που παρουσιάστηκαν στην παρούσα μελέτη. Ωστόσο, σε κάθε περίπτωση η δυνατότητα εφαρμογής του ΤΤΙ ως δείκτη ποιότητας ενός τροφίμου απαιτεί τη συστηματική μελέτη της κινητικής τόσο της αλλοίωσης του προϊόντος όσο και των αποκρίσεων του ΤΤΙ, τόσο κάτω από στατικές όσο και υπό μεταβαλλόμενες (δυναμικές) συνθήκες ψύξης. Έτσι λοιπόν το επόμενο αντικείμενο στην παρούσα διατριβή ήταν η εφαρμογή του μικροβιακού ΤΤΙ που αναπτύχθηκε, στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής αλλοίωσης αλεσμένου βοδινού κρέατος συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα, και η διαπίστωση της δυνατότητας χρήσης του συγκεκριμένου ΤΤΙ στην αποτύπωση της διάρκειας ζωής του εν λόγω προϊόντος. 204

239 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση 4.4 Εφαρμογή του μικροβιακού Χρονο-θερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) στην παρακολούθηση της αλλοίωσης συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα αλεσμένου βοδινού κρέατος Η μέθοδος της συσκευασίας των προϊόντων σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (Modified Atmosphere Packaging, MAP) εφαρμόζεται εκτενώς στη βιομηχανία κρέατος, ως μια αποτελεσματική τεχνική στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής των προϊόντων κρέατος. Η παρουσία του CO 2 στο διάκενο των συσκευασιών τροποποιημένης ατμόσφαιρας παρεμποδίζει τη μικροβιακή ανάπτυξη των περιεχόμενων σε αυτές κρεατοσκευασμάτων. Η επικρατούσα μικροχλωρίδα σε τέτοια προϊόντα περιλαμβάνει συνήθως ομάδες βακτηρίων, με μειωμένη δυναμική αλλοίωσης (κυρίως γαλακτικά βακτήρια και το είδος Br. thermosphacta), συμβάλλοντας στην παράταση της διάρκειας ζωής τους (Koutsoumanis et al., 2008). Η αλλοίωση που προκαλείται από τα βακτήρια αυτά προσδίδει χαρακτηριστική υπόξινη ή όξινη οσμή και γεύση στα προϊόντα, καθώς επίσης και οσμή τυριού σε κάποιες περιπτώσεις, εξαιτίας της μετατροπής της μεταβολιζόμενης γλυκόζης σε οργανικά οξέα (Borch et al., 1996, Nychas και Drosinos, 1999). Τα γαλακτικά βακτήρια έχουν αναφερθεί συχνά στη βιβλιογραφία ως η κύρια αιτία αλλοίωσης σε προϊόντα κρέατος συσκευασμένα υπό κενό ή τροποποιημένη ατμόσφαιρα (Borch et al., 1996, Devlieghere et al., 1998b, Devlieghere et al., 2000a, Guerrero και Chabela, 1999, Koutsoumanis et al., 2008, Nychas και Drosinos, 1999, Nychas et al., 2008, Mataragas et al., 2006, Samelis et al., 2000). Η πιθανή λοιπόν χρήση, του βασιζόμενου στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα του γαλακτικού βακτηρίου L. sakei, ΤΤΙ, θα μπορούσε να συμβάλλει αποτελεσματικά στη συνεχή καταγραφή του θερμοκρασιακού ιστορικού των συσκευασμένων σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα κρεατοσκευασμάτων, σε επίπεδο μονάδας προϊόντος, καθ όλη τη διάρκεια της διανομής τους, που συντηρούνται σε έντονα κυμαινόμενες συνθήκες της ψυκτικής αλυσίδας. Προκειμένου να διασφαλιστεί η επιτυχής εφαρμογή του ΤΤΙ στο συγκεκριμένο προϊόν, απαραίτητη, εκτός από τη γνώση της κινητικής απόκρισης του ΤΤΙ, είναι και η σύγκριση αυτής με την κινητική της θερμοκρασιακής εξάρτησης της διάρκειας ζωής του τροφίμου. Επίσης, η κινητική της απόκρισης του ΤΤΙ πρέπει να σχετίζεται άμεσα με τη διεργασία της ποιοτικής υποβάθμισης του τροφίμου (Taoukis, 2001, Taoukis και Labuza, 2003). Ως συνέχεια λοιπόν της ανάπτυξης του μικροβιακού ΤΤΙ που μόλις περιγράφηκε, η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο την εξέταση της αξιοπιστίας του μικροβιακού ΤΤΙ κατά την εφαρμογή του στην εκτίμηση της αλλοίωσης αλεσμένου βοδινού κρέατος MAP σε ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες 205

240 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή συντήρησης που προσομοιάζουν τις συνθήκες που επικρατούν στην ψυκτική αλυσίδα, εξετάζοντας ταυτόχρονα τόσο την κινητική της αλλοιογόνου χλωρίδας ποιότητας των δειγμάτων βοδινού κρέατος MAP όσο και του μικροβιακού ΤΤΙ, παράλληλα με την εκτίμηση της διάρκειας ζωής στο εν λόγω προϊόν Αλλοίωση του αλεσμένου βοδινού κρέατος MAP Τα πειραματικά δεδομένα ανάπτυξης των διαφορετικών ειδών βακτηρίων της φυσικής μικροχλωρίδας του βοδινού κρέατος συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα, κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 0-15 C, δίνονται στο Σχήμα Είναι φανερό ότι τα γαλακτικά βακτήρια αντιπροσωπεύουν το κυρίαρχο κομμάτι της συνολικής φυσικής μικροχλωρίδας του αλεσμένου κρέατος MAP. Ξεκινώντας από ένα αρχικό επίπεδο 10 4 CFU/g στο φρέσκο κρέας, φτάνουν σε υψηλούς πληθυσμούς των CFU/g κατά το τέλος της περιόδου συντήρησης. Η επικράτηση των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και τα προϊόντα του στις πλούσιες σε CO 2 ατμόσφαιρες, έχει αναφερθεί επανειλημμένως στη βιβλιογραφία (Borch et al., 1996, Devlieghere et al., 1998b, Devlieghere et al., 2000a, Guerrero και Chabela, 1999, Luño et al., 2000, Nychas και Drosinos, 1999, Nychas et al., 2008, Patsias et al., 2006, Patsias et al., 2008, Samelis et al., 2000, Soldatou et al., 2009, Sørheim et al., 1997). Η τροποποιημένη ατμόσφαιρα που εφαρμόστηκε σ αυτή τη μελέτη παρεμπόδισε μερικώς την ανάπτυξη των ψευδομονάδων που άγγιξαν μέτρια επίπεδα πληθυσμών ( CFU/g στους 0 και 5 C, αντίστοιχα), συμφωνώντας με προηγούμενες αναφορές σε μελέτες αλλοίωσης προϊόντων MAP (Drosinos και Board, 1995, Gill, 1996b, Patsias et al., 2006, Patsias et al., 2008, Soldatou et al., 2009). Εν τούτοις, σε μελέτες συντήρησης κρέατος υπό αερόβιες συνθήκες ψύξης, οι ψευδομονάδες θεωρούνται οι κύριοι μικροοργανισμοί αλλοίωσης (Koutsoumanis et al., 2006, Koutsoumanis et al., 2008, Nychas και Drosinos, 1999, Nychas et al., 2008) εξαιτίας της γρήγορης ανάπτυξής τους σε επίπεδα πληθυσμού CFU/g. Αντίθετα με τις ψευδομονάδες, η ανάπτυξη του B. thermosphactα επηρεάστηκε ελάχιστα από την εφαρμοζόμενη τροποποιημένη ατμόσφαιρα, φτάνοντας πληθυσμούς των 5.4 και 6.8 λογαρίθμων κατά την ισόθερμη συντήρηση του προϊόντος στο εύρος των 0 15 C, επιβεβαιώνοντας ότι μαζί με τα γαλακτικά βακτήρια αποτελούν την χλωρίδα των προαιρετικά αναερόβιων ομάδων μικροοργανισμών των οποίων η ανάπτυξη ευνοείται σε προϊόντα MAP (Drosinos και Board, 1995, Guerrero και Chabela, 1999, Hansen και Bautista, 1999, Nychas και Drosinos, 1999, Nychas et al., 2008, Soldatou et al., 2009). Τέλος, η ομάδα των εντεροβακτηρίων 206

241 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα συγκεντρώσεων της τάξης των log 10 CFU/g κατά την συντήρηση του προϊόντος στους 0 C, αλλά εμφάνισε αυξημένα πληθυσμιακά επίπεδα (μέχρι και CFU/g) και αυξανόμενους ρυθμούς ανάπτυξης, στο εύρος θερμοκρασιών συντήρησης των 5-15 C. Ωστόσο, με εξαίρεση τη θερμοκρασία των 15 C, οι υπολογιζόμενοι μέγιστοι ειδικοί ρυθμοί ανάπτυξης των εντεροβακτηρίων σε όλες τις υπόλοιπες θερμοκρασίες συντήρησης αποδείχτηκαν οι χαμηλότεροι μεταξύ αυτών που προσδιορίστηκαν για τις λοιπές ομάδες βακτηρίων. Log CFU/g Log CFU/g PCA CFC STAA MRS VRBG Χρόνος (h) 0 C Χρόνος (h) 10 C PCA CFC STAA MRS VRBG Log CFU/g Log CFU/g PCA CFC STAA MRS VRBG PCA CFC STAA MRS VRBG Χρόνος (h) 5 C Χρόνος (h) 15 Σχήμα Ανάπτυξη της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας στο βοδινό κιμά MAP κατά την ισόθερμη συντήρησή του στους 0, 5, 10 και 15 C. Βακτήρια που αναπτύχθηκαν στα αντίστοιχα υποστρώματα: PCA για τη συνολική αερόβια μικροχλωρίδα, CFC για τις ψευδομονάδες, STAA για το Brochothrix thermosphacta, MRS για τα γαλακτικά βακτήρια, VRBG για τα ενεροβακτήρια. Οι καμπύλες ανάπτυξης αποτελούν το μέσο όρο δύο επαναλήψεων. Τα δεδομένα ανάπτυξης των ομάδων των βακτηρίων που μελετήθηκαν προσαρμόστηκαν στο πρωτογενές μοντέλο ανάπτυξης των Baranyi και Roberts (1994) (εξ και 3.22), οπότε και εκτιμήθηκαν οι κινητικές παράμετροι του μοντέλου, και πιο συγκεκριμένα η αρχική συγκέντρωση των κυττάρων, N min, οι μέγιστοι ειδικοί ρυθμοί ανάπτυξης, μ max (h -1 ), 207

242 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή η διάρκεια της φάσης προσαρμογής, lag phase (h), και η μέγιστη συγκέντρωση του βακτηριακού πληθυσμού, N max (CFU/g). Η θερμοκρασία συντήρησης επηρέασε σημαντικά το μικροβιακό ρυθμό ανάπτυξης. Οι εκτιμούμενες από το πρωτογενές μοντέλο τιμές μ max, προσαρμόστηκαν ακολούθως στην εξίσωση Arrhenius (εξ. 3.20), και η θερμοκρασιακή ευαισθησία των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης εκφράστηκε από την παράμετρο της ενέργειας ενεργοποίησης, Ε α. Οι τιμές Ε α όπως και οι μέγιστοι ειδικοί ρυθμοί ανάπτυξης στη θερμοκρασία αναφοράς, μ ref, όλων των μικροοργανισμών που μελετήθηκαν κατά την αλλοίωση του βοδινού κιμά MAP παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.7. Ωστόσο, η θερμοκρασία συντήρησης δε φαίνεται ότι είχε σημαντική επίδραση στη μέγιστη συγκέντρωση των κυττάρων των αναπτυσσόμενων ομάδων βακτηρίων. Οι τιμές της παραμέτρου αυτής παρέμειναν σχετικά αμετάβλητες για τα γαλακτικά βακτήρια, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης που εξετάστηκαν και ο μέσος όρος αυτών εκτιμήθηκε σε 7.36 ± 0.33 log 10 CFU/g (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση). Πίνακας 4.7. Παράμετροι και στατιστικά στοιχεία κατά την εφαρμογή του μοντέλου Arrhenius και την περιγραφή της επίδραση της θερμοκρασίας στο μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης της αλλοιογόνου μικροχλωρίδας στο αλεσμένο βοδινό κρέας MAP. Ομάδα μικροοργανισμών Εκτιμούμενη παράμετρος ± CL α E α (kj/mol) μ ref (h -1 ) R 2 Ψευδομονάδες 77.84± ± B.thermosphacta ± ± Εντεροβακτήρια ± ± Γαλακτικά βακτήρια ± ± a ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) Η οργανοληπτική εξέταση του βοδινού κιμά MAP διεξήχθη παράλληλα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις. Τα αποτελέσματα της αξιολόγησης (βαθμολογίας) των δειγμάτων κρέατος στην πορεία συντήρησής τους σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης παρουσιάζονται συνολικά στο Σχήμα Ο μέσος όρος της βαθμολογίας που έδωσε το σύνολο των δοκιμαστών συσχετίστηκε γραμμικά με το χρόνο συντήρησης, και ως διάρκεια ζωής των προϊόντων αυτών ορίστηκε ο χρόνος στον οποίο η καμπύλη της γραμμικής παλινδρόμησης, η οποία περιγράφει τη μεταβολή στο οργανοληπτικό σκορ, τέμνει την παράλληλη στον άξονα x, ευθεία γραμμή που αντιστοιχεί σε τιμή βαθμολογίας 2 (σκορ κατά την οργανοληπτική απόρριψη του προϊόντος). Όπως αναμένονταν η διάρκεια ζωής του βοδινού κρέατος μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας συντήρησης από ± 15.8 h (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) στους 0 C σε 41.4 ± 0.6 h στους 15 C 208

243 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση (Πίνακας 4.8). Το πρωτογενές μοντέλο χρησιμοποιήθηκε και πάλι για τον υπολογισμό του επιπέδου του πληθυσμού των βακτηρίων τη χρονική στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης του προϊόντος θέτοντας χρόνο t, ίσο με τη διάρκεια ζωής. Οι τιμές των πληθυσμών των μικροοργανισμών που συνθέτουν τη χλωρίδα αλλοίωσης κατά το χρόνο λήξης της διάρκειας ζωής (N s ) (Πίνακας 4.8), ανέδειξαν πως τα γαλακτικά βακτήρια ήταν οι κυρίαρχοι μικροοργανισμοί με πληθυσμό που έφτανε κατά μέσο όρο στο επίπεδο των 7.08 ± 0.34 log 10 CFU/g (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) για όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Παρόμοια επίπεδα πληθυσμών στο τέλος της διάρκειας ζωής έχουν καταγραφεί και για άλλα προϊόντα κρέατος συσκευασμένα υπό κενό ή τροποποιημένες ατμόσφαιρες, που αλλοιώνονται από τα γαλακτικά βακτήρια (Borch et al., 1996, Devlieghere et al., 1998b, Devlieghere et al., 2000a, Fernández-López et al., 2008, Korkeala et al., 1987, Koutsoumanis et al., 2005, Mataragas et al., 2006, Nychas et al., 2008, Samelis et al., 2000). Οι μέσοι όροι των επιπέδων πληθυσμού των υπολοίπων βακτηρίων για όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης, τη χρονική στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης υπολογίστηκαν σε 6.21 ± 0.45, 5.23 ± 0.36, 4.54 ± 0.96 log 10 CFU/g για το B. thermosphacta, τις ψευδομονάδες και τα εντεροβακτήρια, αντίστοιχα, τιμές αρκετά μικρότερες από το επίπεδο που σημειώθηκε για τα γαλακτικά βακτήρια Βαθμολογία C 5 C 10 C 15 C Χρόνος (h) Σχήμα Μέσος όρος βαθμολογίας κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση του βοδινού κιμά MAP κατά τη συντήρησή του στους 0, 5, 10 και 15 C (σημεία) και γραμμές τάσεις που περιγράφουν τη μεταβολή του σκορ της οργανοληπτικής αξιολόγησης ως συνάρτηση του χρόνου συντήρησης. Το κάθε σημείο αποτελεί το μέσο όρο της βαθμολογίας των πέντε εξεταστών ενώ η οριζόντια δικεκομμένη γραμμή απεικονίζει το όριο στη βαθμολογία που σηματοδοτεί την οργανοληπτική απόρριψη του προϊόντος. 209

244 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Η μικροβιακή ανάπτυξη και η μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων στο υπό μελέτη προϊόν, συνέβαλλε σημαντικά στη σύνθεση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων του, κατά την τελική φάση απόρριψής του. Χαρακτηριστική στο μη αποδεκτό προϊόν ήταν η όξινη ή υπόξινη γεύση και δριμεία οσμή, ενώ επίσης σε μερικές περιπτώσεις αναφέρθηκε η ανίχνευση οσμής και γεύσης τυριού, προς το τέλος της διάρκειας συντήρησης. Αυτά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά συμφωνούν με τη μεταβολή που παρατηρήθηκε στο ph των δειγμάτων κρέατος, οι τιμές του οποίου μειώθηκαν από το αρχικό στο τελικό σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Τα παραπάνω αποτελέσματα, σε συνδυασμό με την επικράτηση των γαλακτικών βακτηρίων τη στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης υποδεικνύουν ότι αυτή η ομάδα βακτηρίων αποτελεί τον ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό (specific spoilage organism, SSO) στο συσκευασμένο υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα βοδινό κιμά, είναι δηλαδή το κλάσμα της συνολικής μικροχλωρίδας που κυρίως ευθύνεται για την αλλοίωση του προϊόντος. Αναφορά στην ικανότητα των γαλακτικών βακτηρίων να προκαλούν αλλοίωση σε προϊόντα MAP έχει γίνει και σε άλλες μελέτες (Gill, 1996b). Το γένος Lactobacillus spp. έχει ταυτοποιηθεί ως ο κυρίαρχος μικροοργανισμός στα προϊόντα κρέατος MAP εξαιτίας της ταχύτερης ανάπτυξής τους σε σχέση με τους μικροοργανισμούς ανταγωνιστές. Στα προϊόντα αυτά, τα γαλακτικά βακτήρια επιβιώνουν και αναπτύσσονται ταχύτατα, ανεξάρτητα από τη χαμηλή τιμή του ph που πιθανώς παρατηρείται στα τρόφιμα αυτά και την παρουσία αντιμικροβιακών ουσιών όπως το γαλακτικό οξύ, το H 2 O 2 και τα διάφορα αντιβιοτικά. Για την ανάπτυξή τους, τα γαλακτικά βακτήρια χρησιμοποιούν κατά κύριο λόγο τη γλυκόζη, και παράγουν οργανικά οξέα, κυρίως γαλακτικό οξύ, ή ακόμη και οξικό και φορμικό οξύ, ανάλογα με την ομοζυμωτική ή ετεροζυμωτική φύση των ειδών του κάθε γένους και τις συνθήκες που επικρατούν κατά την ανάπτυξή τους (Borch et al., 1996, Nychas και Drosinos, 1999). Πίνακας 4.8. Εκτίμηση της διάρκειας ζωής του βοδινού κιμά MAP κατά την ισόθερμη συντήρησή του σε διάφορες θερμοκρασίες, και επίπεδα των αλλοιογόνων μικροοργανισμών στο ίδιο προϊόν κατά τη στιγμή της οργανοληπτικής απόρριψης. Θερμοκρασία Διάρκεια ζωής Μέσος όρος N α s (log CFU/g) ± SD β ( C) (h) CFC STAA VRBG MRS ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.05 α Πληθυσμός των αλλοιογόνων βακτηρίων στα αντίστοιχα θρεπτικά υποστρώματα: ψευδομονάδες σε CFC, B. thermosphacta σε STAA, Εντεροβακτήρια σε VRBG, Γαλακτικά βακτήρια σε MRS. β τυπική απόκλιση 210

245 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση Σύγκριση της αλλοίωσης του βοδινού κιμά MAP και της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ. Δεδομένης της επικράτησης των γαλακτικών βακτηρίων κατά την αλλοίωση του βοδινού κιμά MAP, το επόμενο βήμα στη μελέτη αυτή αφορούσε τη διερεύνηση της πιθανής χρήσης του μικροβιακού TTI στην παρακολούθηση της ποιοτικής υποβάθμισης του προϊόντος αυτού. Η σύγκριση μεταξύ της ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στο βοδινό κιμά και του L. sakei στο ΤΤΙ, σε συνδυασμό με τις λοιπές μεταβολές των φυσικοχημικών παραμέτρων του ΤΤΙ (μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ και του ph) που λαμβάνουν χώρα κατά την ισόθερμη συντήρησή του στις ίδιες συνθήκες με αυτές του προϊόντος MAP, παρουσιάζονται στο Σχήμα Επιπλέον, η δυνατότητα να ρυθμιστεί η αρχική συγκέντρωση με την οποία εμβολιάζεται το στέλεχος του L. sakei στο υπόστρωμα του μικροβιακού ΤΤΙ, κοντά στο αρχικό επίπεδο των καταμετρούμενων στο ωμό κρέας γαλακτικών βακτηρίων (δηλαδή σε 10 4 CFU/g), επέτρεψε την ορθότερη σύγκριση των καμπυλών ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στα δύο συστήματα, έχοντας κοινό αρχικό επίπεδο επιμόλυνσης. Όπως αποδείχτηκε, υπήρξε αρκετά καλή συμφωνία των καμπυλών ανάπτυξης των υπεύθυνων για την αλλοίωση γαλακτικών βακτηρίων στο προϊόν MAP, και του L. sakei στο μικροβιακό ΤΤΙ, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης που μελετήθηκαν. Οι μικρές διαφοροποιήσεις που παρατηρήθηκαν στον τελικό, μέγιστο πληθυσμό των γαλακτικών βακτηρίων, N max, σε κάποιες θερμοκρασίες (0 και 10 C, Σχήμα 4.60), οφείλονται στην ελάχιστα μεγαλύτερη αρχική συγκέντρωση του L. sakei στο σύστημα του ΤΤΙ αλλά και στην αναμενόμενη διαφοροποίηση που συνήθως παρατηρείται μεταξύ της ανάπτυξης των μικροοργανισμών σε εργαστηριακά θρεπτικά μέσα και σε πραγματικά τρόφιμα. Αντίθετα, οι παρατηρούμενοι ρυθμοί των καμπυλών μικροβιακής ανάπτυξης (κλίσεις των αποτυπωμένων στο Σχήμα 4.60 καμπυλών μικροβιακής ανάπτυξης) ήταν παρόμοιοι και στα δύο συστήματα. Η ανάπτυξη του L. sakei στο ΤΤΙ, και η ακόλουθη παραγωγή γαλακτικού οξέος συνέβαλαν στη σταδιακή πτώση του ph του θρεπτικού υποστρώματος, που με τη σειρά της οδήγησε στη μη αντιστρεπτή χρωματική μεταβολή του εμπεριεχόμενου στο σύστημα χημικού δείκτη από το αρχικό κόκκινο σε πορτοκαλί και τελικά κίτρινο χρωματισμό. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των παρατηρούμενων μεταβολών στο χρώμα του ΤΤΙ δίνεται στο Σχήμα 4.61, όπου παράλληλα με τα πειραματικά δεδομένα που συνθέτουν την καμπύλη ανάπτυξης της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ, παρουσιάζονται και οι χρωματικές αποχρώσεις του συστήματος ΤΤΙ στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές δειγματο- 211

246 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ε log CFU/ml C N LAB κρέας N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ ph Ε log CFU/ml C N LAB κρέας N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ ph Χρόνος (h) Χρόνος (h) Ε log CFU/ml C N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ ph Ε log CFU/ml C N LAB κρέας N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ ph Χρόνος (h) Χρόνος (h) Ε log CFU/ml C N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ Χρόνος (h) ph Ε Σχήμα Ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ, καθώς και μεταβολές στο ph και τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ του συστήματος ΤΤΙ, κατά την ισόθερμη συντήρησή του σε διάφορες θερμοκρασίες log CFU/ml C N LAB κρέας N LAB ΤΤΙ Ε ph ΤΤΙ Χρόνος (h) ph ληψίας, κατά τη συντήρησή του στους 15 C. Η μεταβολή στο χρώμα του ΤΤΙ συνέβη σε τιμές ph του μέσου ανάπτυξης κοντά στο 5.3. Το σημείο λήξης του ΤΤΙ (end point), χρονική στιγμή κατά την οποία συμβαίνει η διακριτή μεταβολή του χρώματος (ή διαφορετικά ο χρόνος που απαιτείται ώστε η συνάρτηση ΔΕ να λάβει την τιμή 20, όπως 212

247 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση ορίστηκε νωρίτερα στη μελέτη ανάπτυξης του μικροβιακού ΤΤΙ), σημειώθηκε σε πληθυσμούς γαλακτικών βακτηρίων της τάξης των CFU/ml ή /g στο TTI και το προϊόν βοδινού κρέατος, συμπίπτοντας με το επίπεδο αλλοίωσης λόγω ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων, και συνεπώς με τη λήξη της διάρκειας ζωής του προϊόντος. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε, συγκρίνοντας την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων και τη μεταβολή στην απόκριση του ΤΤΙ σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης των δύο συστημάτων (Σχήμα 4.60) C Ε Log CFU/ml ή /g N LAB κρέας Ν L sakei ΤΤΙ Ε ph TTI ph Χρόνος (h) Σχήμα Ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ κατά τη συντήρησή του στους 15 C, καθώς και μεταβολές στο ph και το χρώμα (ΔΕ) του συστήματος ΤΤΙ στην ίδια θερμοκρασία. Τα σημεία των πειραματικών δεδομένων στην καμπύλη μεταβολής της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ έχουν αντικατασταθεί από έγχρωμα τετραγωνίδια που αντιπροσωπεύουν το χρώμα του ΤΤΙ στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές της δειγματοληψίας. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης, μ max, των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το ΤΤΙ, όπως περιγράφηκε από την εξίσωση Arrhenius, ήταν παρόμοια στα δύο συστήματα, με εφάμιλλες τιμές ενέργειας ενεργοποίησης που υπολογίστηκαν σε και kj/mol, αντίστοιχα (Πίνακας 4.9). Συγκρίσιμες τιμές Ε α, με αυτές που μόλις αναφέρθηκαν, έχουν βρεθεί για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων σε διάφορα προϊόντα τροφίμων (Koutsoumanis et al., 2000, Koutsoumanis et al., 2006). Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν ακόμη περισσότερο την αξιοπιστία του μικροβιακού ΤΤΙ στην περιγραφή του φαινομένου της αλλοίωσης του βοδινού κιμά MAP κατά την ισόθερμη συντήρησή του σε συνθήκες ψύξης μεταξύ 0 και 15 C. 213

248 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Πίνακας 4.9. Παράμετροι και στατιστικά στοιχεία κατά την εφαρμογή του μοντέλου Arrhenius για την περιγραφή της επίδρασης της θερμοκρασίας στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων που αναπτύσσονται στο βοδινό κιμά MAP ή το ΤΤΙ, και στο ρυθμό που παρατηρείται κατά τη μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ, ή στο αντίστροφο της παραμέτρου t i (1/t i ), όρος που εμπεριέχεται στην ίδια συνάρτηση περιγραφής της αλλαγής του χρώματος στο μικροβιακό ΤΤΙ. Παράμετρος μ ref, 1/t i ref (h -1 ) Ε α (kj/mol) CL α (±) R 2 μ max LAB κρέας μ max LAB ΤΤΙ μ ΔΕ /t i ΔΕ α ± 95% όρια εμπιστοσύνης (confidence limits) Άξια ιδιαίτερης αναφοράς, είναι η δυνατότητα ρύθμισης της αρχικής συγκέντρωσης του μικροοργανισμού με την οποία εμβολιάζεται το μέσο ανάπτυξης του ΤΤΙ. Ως γνωστόν, το αρχικό επίπεδο επιμόλυνσης ενός τροφίμου από τον ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό (SSO), μαζί με άλλους παράγοντες όπως το ph, η ενεργότητα νερού και η παρουσία αντιμικροβιακών ουσιών, επηρεάζουν έντονα τη διάρκεια ζωής του προϊόντος σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία (Koutsoumanis et al., 2000, Koutsoumanis και Nychas, 2000, Koutsoumanis et al., 2002, Koutsoumanis et al., 2006). Η αυξημένη αρχική συγκέντρωση του SSO σ ένα τρόφιμο, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της διάρκειας ζωής του, αφού ουσιαστικά μειώνεται ο απαιτούμενος από αυτόν τον μικροοργανισμό χρόνος για να φτάσει το επίπεδο αλλοίωσης. Συνεπώς, μεταβάλλοντας το αρχικό επίπεδο με το οποίο εμβολιάζεται ο L. sakei, είναι εφικτή η ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ, καθιστώντας το ένα πολύτιμο εργαλείο στη συνεχή καταγραφή και παρακολούθηση της εναπομένουσας διάρκειας ζωής του τροφίμου που ενδιαφέρει κάθε φορά (Vaikousi et al., 2008b) Η επίδραση της θερμοκρασίας στη μεταβολή του χρώματος του ΤΤΙ, όπως εκφράστηκε από τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ, παρουσιάζεται στο Σχήμα Τα πειραματικά δεδομένα της απόκρισης του ΤΤΙ, κατά την προσαρμογή τους στο λογιστικό μοντέλο, παρουσίασαν καλή συμφωνία με τις προβλεπόμενες από το μοντέλο μεταβολές στη συνάρτηση ΔΕ σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης (γραμμές στο Σχήμα 4.62). Η διαδικασία προσαρμογής των πειραματικών δεδομένων μεταβολής χρώματος στη λογιστική εξίσωση, επέτρεψε επίσης την εκτίμηση των παραμέτρων του μοντέλου (δηλαδή του ΔE min, ΔE max, μ ΔΕ, t i ΔE ). Οι μεταβολές στο χρώμα του ΤΤΙ συνέβησαν σε τιμές ph , στο σημείο που παρατηρείται η συνήθης αλλαγή του χρώματος στον περιεχόμενο στο σύστημα χημικό δείκτη, σε όλες τις συνθήκες συντήρησης. Αυξάνοντας τη θερμοκρασία συντήρησης παρατηρήθηκε μείωση του απαιτούμενου χρόνου για την αλλαγή του χρώματος στο ΤΤΙ, και άρα συντομότερα σημεία λήξης (χρόνος στον οποίο η απόκριση του 214

249 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση ΔΕ φτάνει την τιμή 20). Ό όρος σημείο λήξης του ΤΤΙ χρησιμοποιήθηκε στην προηγούμενη μελέτη ανάπτυξης του μικροβιακού ΤΤΙ για την περιγραφή της θερμοκρασιακής εξάρτησης της απόκρισης του ΤΤΙ (Παράγραφος 4.3). Ωστόσο, στην παρούσα φάση η επίδραση της θερμοκρασίας περιγράφηκε υιοθετώντας τις παραμέτρους της κινητικής ανάπτυξης χρώματος που συμμετέχουν στην εξίσωση έκφρασης της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ, δηλαδή τους όρους μ ΔΕ και 1/t i ΔΕ. Η εφαρμογή της εξίσωσης Arrhenius, στις παραμέτρους αυτές παρουσιάζεται στο Σχήμα Οι εκτιμήσεις των E α ήταν και kj/mol (Πίνακας 4.9) για το ρυθμό μεταβολής της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (μ ΔΕ ) και 1/t i ΔΕ, αντίστοιχα, και βρίσκονται στο εύρος των τιμών ενέργειας ενεργοποίησης που φέρουν άλλοι μη-μικροβιακοί χρονοθερμοκρασιακοί δείκτες σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (Shimoni et al., 2001, Taoukis και Labuza, 1989, Taoukis et al., 1999, Yan et al., 2008) E C 5 C 8 C 10 C 12 C 15 C Χρόνος (h) Σχήμα Μεταβολή της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ κατά την ισόθερμη συντήρηση του συστήματος ΤΤΙ στους 0, 5, 8, 10, 12 και 15 C. Τα σημεία δηλώνουν τα πειραματικά δεδομένα και οι γραμμές την προσαρμογή του λογιστικού μοντέλου σ αυτά. Οι παράλληλες καμπύλες Arrhenius που δείχνουν τη μεταβολή των ρυθμών ανάπτυξης (μ max ) των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το ΤΤΙ ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, σε συνδυασμό με τις καμπύλες μεταβολής των παραμέτρων απόκρισης του ΤΤΙ, υποδηλώνουν όμοια θερμοκρασιακή εξάρτηση τόσο της αλλοίωσης που συμβαίνει στο βοδινό κιμά MAP όσο και των αποκρίσεων του ΤΤΙ. Οι σχεδόν ταυτόσημες τιμές Ε α που παρατηρήθηκαν για τις αποκρίσεις του ΤΤΙ και την ποιοτική υποβάθμιση του προϊόντος κρέατος (Πίνακας 4.9) ενθαρρύνουν την πιθανή εφαρμογή του μικροβιακού ΤΤΙ στην παρακολούθηση της διάρκειας ζωής του βοδινού κιμά MAP. Η επιτυχής εφαρμογή του ΤΤΙ 215

250 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή που αναπτύχθηκε, ενισχύεται επιπλέον από το γεγονός ότι το σημείο λήξης του ΤΤΙ σχετίζεται άμεσα με τη λήξη της διάρκειας ζωής του προϊόντος, όπως έχει ήδη αναφερθεί. 0 ln(μmax), ln(μ Ε), ln(1/ti Ε) (h -1 ) μmax κρέας μmax TTI μ Ε 1/ti Ε /T-1/T ref (x 10-4 ) (K) Σχήμα Καμπύλες Arrhenius που περιγράφουν τη θερμοκρασιακή εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης, μ max, των γαλακτικών βακτηρίων στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ και θερμοκρασιακή εξάρτηση του μέγιστου ρυθμού που παρατηρείται στην καμπύλη μεταβολής της συνάρτησης ΔΕ, και του αντιστρόφου της παραμέτρου ti (1/t i ), που επίσης συμμετέχει στην λογιστική εξίσωση έκφρασης της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ Αξιολόγηση της δυνατότητα εφαρμογής του μικροβιακού ΤΤΙ σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης. Η δυνατότητα εφαρμογής του μικροβιακού ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην περιγραφή της αλλοίωσης του βοδινού κιμά MAP αξιολογήθηκε περαιτέρω κάτω από μεταβαλλόμενες συνθήκες μη ισόθερμης συντήρησης, προσομοιάζοντας τα πραγματικά θερμοκρασιακά προφίλ που επικρατούν στην αλυσίδα διανομής των υπό ψύξη συντηρούμενων προϊόντων. Δείγματα βοδινού κιμά συσκευασμένου υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα και δείγματα του ΤΤΙ συντηρήθηκαν ταυτόχρονα σε δυναμικά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα ψύξης. Η ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων στο προϊόν κρέατος και οι παρατηρούμενες μεταβολές κατά την παράλληλη συντήρηση του ΤΤΙ φαίνονται στο Σχήμα Και στα δύο σενάρια διακύμανσης της θερμοκρασίας συντήρησης, τα γαλακτικά βακτήρια ξεκινώντας από ένα αρχικό επίπεδο επιμόλυνσης (στο ωμό βοδινό κρέας) της τάξης των CFU/g, αναπτύχθηκαν σε υψηλά επίπεδα προκαλώντας την αλλοίωση του προϊόντος, με χαρακτηριστική όξινη ή υπόξινη γεύση, και όμοια οργανοληπτικά χαρακτηριστικά με 216

251 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση αυτά που αναφέρθηκαν από τους δοκιμαστές κατά την αλλοίωση του ίδιου προϊόντος σε ισόθερμες συνθήκες ψύξης. Η λήξη της διάρκειας ζωής, όπως εκτιμήθηκε από το μέσο όρο της βαθμολογίας που δόθηκε στα δείγματα κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση, σημειώθηκε μετά από συντήρηση για 101 h στο πρώτο κυμαινόμενο θερμοκρασιακό προφίλ ψύξης, και 114 h στο δεύτερο πρωτόκολλο συντήρησης. Αυτοί οι χρόνοι οργανοληπτικής απόρριψης του προϊόντος, ταυτίζονται και στις δύο περιπτώσεις με επίπεδα πληθυσμού των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας της τάξης των 7 log 10 CFU/g. Τα γαλακτικά βακτήρια, και ειδικότερα ο εμβολιασμένος L. sakei στο ΤΤΙ ακολούθησε στενά την ανάπτυξη του ειδικού αλλοιογόνου μικροοργανισμού (SSO) στο βοδινό κιμά MAP, για το μεγαλύτερο χρόνο της περιόδου συντήρησης. Ωστόσο, υψηλότεροι σχετικά πληθυσμοί επιτεύχθηκαν από τα αναπτυσσόμενα στο ΤΤΙ γαλακτικά βακτήρια σε σύγκριση με την αντίστοιχη ανάπτυξή τους στο κρέας, πιθανώς εξαιτίας της έλλειψης ανταγωνισμού για τα ίδια θρεπτικά συστατικά, στο πρώτο σύστημα. Η παρατηρούμενη απόκλιση στις καμπύλες ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το ΤΤΙ, ήταν περισσότερο εμφανής στο δεύτερο πρωτόκολλο ψύξης που εφαρμόστηκε (Σχήμα 4.64β). Εντούτοις, η μη αντιστρεπτή αλλαγή στο χρώμα του ΤΤΙ (ΔΕ=20) συνέβη όταν τα γαλακτικά βακτήρια άγγιξαν το επίπεδο αλλοίωσης (δηλαδή 7 log 10 CFU/g). Συνεπώς, το μικροβιακό ΤΤΙ φαίνεται να μπορεί να εφαρμοστεί στο προϊόν κρέατος MAP που μελετήθηκε και να περιγράψει με ακρίβεια την αλλοίωσή του ακόμη και σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης, αντιπροσωπευτικές των πραγματικών συνθηκών ψύξης στην αλυσίδα διανομής. Συμπερασματικά, οι αποκρίσεις του μικροβιακού ΤΤΙ αντικατοπτρίζοντας την ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα του επιλεγέντος μικροβίου στο σύστημα ΤΤΙ, μπορούν να συσχετιστούν άμεσα με τη μικροβιακή αλλοίωση των τροφίμων. Αυτή η ιδιότητα σε συνδυασμό με τη δυνατότητα ρύθμισης του σημείου λήξης στο μικροβιακό ΤΤΙ, αποτελούν μοναδικά χαρακτηριστικά που καθιστούν το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε σημαντικό και αποτελεσματικό εργαλείο στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των προϊόντων κρέατος συσκευασμένων σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας αλλά και των προϊόντων που κατά κύριο λόγο αλλοιώνονται από τα γαλακτικά βακτήρια ή άλλα βακτήρια με όμοιες κινητικές αποκρίσεις και δυναμική αλλοίωσης. Το μικροβιακό ΤΤΙ μπορεί αποτελεσματικά να μεταφράσει το θερμοκρασιακό ιστορικό έκθεσης ενός προϊόντος κατά τη διάρκεια διανομής του, σε μια εύκολα αναγνώσιμη από τον καταναλωτή μεταβολή χρώματος. Όταν μάλιστα είναι δυνατό να προσκολληθεί σε μεμονωμένες μονάδες συσκευασιών, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με την ένδειξη ανάλωση πριν ως μια δυναμική ένδειξη της ημερομηνίας 217

252 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή λήξης του προϊόντος. Κάτι τέτοιο, δυνητικά επίσης προσφέρει σε έναν αποτελεσματικότερο έλεγχο της θερμοκρασίας στο στάδιο της διανομής και συντήρησης των προϊόντων. Επιπρόσθετα, οι πληροφορίες που παρέχονται από το μικροβιακό ΤΤΙ σχετικά με την ενα α Log CFU/g or /ml, ph Ν LAB κρέας Ν L.sakei TTI ph TTI Ε Θερμοκρασία ( C) Ε Χρόνος (h) Log CFU/g or /ml, ph β LAB κρέας Ν L.sakei TTI ph TTI Ε Θερμοκρασία ( C) Ε Χρόνος (h) 0 0 Σχήμα Σύγκριση της ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων (LAB) στο βοδινό κιμά MAP και το ΤΤΙ, σε συνδυασμό με τις μεταβολές στο ph και τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ του μικροβιακού ΤΤΙ κατά τη συντήρησή τους στις ίδιες περιοδικά μεταβαλλόμενες θερμοκρασίες ψύξης. Το πρώτο πρωτόκολλο ψύξης περιλάμβανε έναν περιοδικώς επαναλαμβανόμενο 24-ωρο κύκλο αποτελούμενο από ψύξη για 18 h στους 5 και 6 h στους 15 C (α), και το δεύτερο συντήρηση για 24 h στους 0, 6h στους 15 και 12 h στους 10 C (β). 218

253 Διδακτορική Διατριβή 4. Αποτελέσματα και Συζήτηση πομένουσα διάρκεια ζωής σε οποιοδήποτε σημείο της ψυκτικής αλυσίδας, μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην αριστοποίηση των πραγματοποιούμενων ελέγχων κατά τη διανομή, αλλά και τη βελτιστοποίηση του συστήματος διαχείρισης των αποθεμάτων, συμβάλλοντας ενεργά στη μείωση των χαρακτηρισμένων ως ακατάλληλα για κατανάλωση προϊόντων, όπως έχει συμβεί επανειλημμένως σε άλλες μελέτες στις οποίες διαφορετικού τύπου μημικροβιακά ΤΤΙ εφαρμόστηκαν σε προϊόντα ιχθυηρών και κρέατος (Giannakourou et al., 2001, Giannakourou et al., 2005, Koutsoumanis et al., 2005, Tsironi et al., 2008). 4.4 Σχεδιασμός της εμπορικής μορφής του χρονοθερμοκρασιακού δείκτη Επιπλέον έρευνα είναι αναγκαία για την μετατροπή του προτύπου ΤΤΙ που παρουσιάστηκε στη μελέτη αυτή σε εμπορικό προϊόν. Στην εμπορική του μορφή το ΤΤΙ θα πρέπει να είναι μικρού μεγέθους και να ενσωματώνεται εύκολα ως μέρος της συσκευασίας του τροφίμου, να είναι συμβατό με τη συνήθη υψηλής ταχύτητας διαδικασία συσκευασίας, να είναι ανθεκτικό στις φυσιολογικές μηχανικές καταπονήσεις, να ενεργοποιείται εύκολα, και να έχει μακρά διάρκεια ζωής πριν την ενεργοποίησή του. Σε πρώτη προσέγγιση, η εμπορική μορφή του μικροβιακού ΤΤΙ στην μελέτη αυτή βασίστηκε στην ύπαρξη δύο διαχωρισμένων τμημάτων σε μορφή μιας πλαστικής μικροθήκης που περιείχε στο ένα τμήμα τη μικροβιακή καλλιέργεια (σε λυοφιλιωμένη μορφή) και στο άλλο, το μέσο ανάπτυξης μαζί με το χημικό δείκτη (Σχήμα 4.65α). Η ενεργοποίηση του ΤΤΙ γίνεται με θραύση του διαχωριστικού διαφράγματος των δύο τμημάτων με την άσκηση μικρής μηχανικής πίεσης (Σχήμα 4.65β), οπότε και αναμιγνύονται τα περιεχόμενα των δύο μικροθαλάμων. Η έναρξη της ανάπτυξης και του μεταβολισμού του μικροοργανισμού συνοδεύεται από τη σταδιακή μεταβολή του χρώματος του υποστρώματος, και συγκεκριμένα από το αρχικό κόκκινο (Σχήμα 4.65γ) στο τελικό κίτρινο (Σχήμα 4.65δ) όταν η συγκέντρωση των γαλακτικών βακτηρίων είχε φτάσει στο επίπεδο αλλοίωσης των 10 7 cfu/ml. Η μικροσυσκευή αυτή προσκολλώμενη στη συσκευασία μπορεί να συνοδεύει το προϊόν καθ όλη την πορεία της συντήρησης διακίνησής του, οπότε είναι δυνατό να περιγράψει με ακρίβεια το θερμοκρασιακό ιστορικό και επομένως την ποιότητα του τροφίμου ανά πάσα χρονική στιγμή. Επιπλέον, ένας τέτοιος σχεδιασμός (με διακριτούς χώρους υποδοχής του υποστρώματος δείκτη και της καλλιέργειας) επιτρέπει την εύκολη ενεργοποίηση του ΤΤΙ, και την επίτευξη μακράς διάρκειας ζωής αυτού πριν την ενεργοποίησή του, χωρίς την ανάγκη συντήρησής του υπό ψύξη ή κατάψυξη. 219

254 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή α β γ δ Σχήμα Εμπορική μορφή πρότυπου μικροβιακού ΤΤΙ, πριν την ενεργοποίηση (α), κατά την ενεργοποίηση (β), στην αρχή της ενεργοποίησης (γ) και κατά το σημείο λήξης (δ). Μια άλλη προσέγγιση θα μπορούσε να αφορά την εξ αρχής, άμεση λυοφιλίωση του αρχικού υποστρώματος του ΤΤΙ παρουσία του χημικού δείκτη, εμβολιασμένου με την κατάλληλη συγκέντρωση του μικροοργανισμού. Κατά συνέπεια το ένα τμήμα της πλαστικής μικροθήκης θα μπορούσε να πληρωθεί με την κατάλληλη ποσότητα (σε μάζα) όλων των συστατικών του μικροβιακού ΤΤΙ, ενώ το άλλο με την κατάλληλη ποσότητα νερού (μέσο για τη διαλυτοποίηση αυτών των συστατικών). Στην περίπτωση αυτή ο μη ενεργοποιημένος μικροβιακός χρονοθερμοκρασιακός δείκτης θα είναι αρχικά διαφανής, ενώ το αρχικό κόκκινο χρώμα του θα εμφανίζεται στο στάδιο της ενεργοποίησής του, οπότε και η ανάμιξη των συστατικών του υποστρώματος του μικροβιακού ΤΤΙ με το νερό θα σηματοδοτεί με τον κόκκινο χρωματισμό την έναρξη καταγραφής του χρονοθερμοκρασιακού ιστορικού του προϊόντος που θα συνοδεύει. Ταυτόχρονα, στην περίπτωση αυτή θα είναι επίσης ευκολότερη η παραγωγή μικροβιακών ΤΤΙ με διαφορετική αρχική συγκέντρωση του εμβολιασμένου στελέχους του L. sakei, και άρα διαφορετικά σημεία λήξης, με απώτερο στόχο αυτά να συνοδεύουν τρόφιμα με αντίστοιχη διάρκεια ζωής. 220

255 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις 5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ Στην παρούσα διατριβή, αναπτύχθηκαν διάφορες κινητικές προσεγγίσεις με στόχο την παρακολούθηση της ποιότητας των τροφίμων όπως αυτή επηρεάζεται τόσο από χημικές όσο και από μικροβιολογικές μεταβολές. Αρχικά εξετάστηκε η ποιοτική υποβάθμιση που υφίστανται τρόφιμα μέσης και υψηλής περιεκτικότητας σε υγρασία εξαιτίας της εφαρμοζόμενης θερμικής επεξεργασίας, και πιο συγκεκριμένα ως αποτέλεσμα των αντιδράσεων μη ενζυμικής αμαύρωσης. Η μελέτη είχε ως αντικείμενο τη διερεύνηση της κινητικής μεταβολής του χρώματος α) συμπυκνωμάτων χυμού μήλου και β) του μελιού και των αραιωμένων συστημάτων αυτού, ως δύο αντιπροσωπευτικά συστήματα τροφίμων που κατά τη θέρμανσή τους (σε ισόθερμες ή δυναμικές συνθήκες) υποβαθμίζονται ποιοτικά λόγω των αντιδράσεων μη ενζυμικής αμαύρωσης. Σε δεύτερη φάση, και προκειμένου να αποκτηθεί μια πληρέστερη εικόνα σχετικά με τη χρήση της κινητικής, καθώς και το πως αυτή εφαρμόζεται πρακτικά στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας ή της προκαλούμενης από τα βακτήρια αλλοίωσης των τροφίμων, αναπτύχθηκε ένας καινοτόμος τύπος μικροβιακού χρονοθερμοκρασιακού δείκτη (Time Temperature Indicator, ΤΤΙ). Η λειτουργία του εν λόγω ΤΤΙ στηρίχτηκε στη μικροβιακή δραστηριότητα και το μεταβολισμό ενός στελέχους γαλακτικού βακτηρίου που κατά την ανάπτυξή του σε κάποιο υπόστρωμα μπορεί να μεταβάλλει το χρώμα ενός χημικού δείκτη, εξαιτίας της πτώσης του ph, ως αποτέλεσμα του παραγόμενου στο ίδιο μέσο γαλακτικού οξέος. Αντικείμενα της μελέτης αποτέλεσαν: α) η συσχέτιση της μικροβιακής ανάπτυξης και των παραμέτρων του μεταβολισμού με τις ιδιότητες του ΤΤΙ, β) η επίδραση της θερμοκρασίας στην κινητική του ΤΤΙ κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες συντήρησης, και γ) η αξιολόγηση του ΤΤΙ σε επιλεγμένες κατηγορίες τροφίμων, όπως τα προϊόντα κρέατος συσκευασμένα σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας. Τα πιο σημαντικά ευρήματα κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής συνοψίζονται ως εξής: 221

256 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διαφέρουν στην ενεργότητα νερού κάτω από ισόθερμες και δυναμικές συνθήκες θέρμανσης. Η μέτρηση της απορρόφησης στο μήκος κύματος 420 nm, των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου που διέφεραν ως προς τη συγκέντρωση στερεών συστατικών ή / και την α w, αποτέλεσε ικανοποιητική μέθοδο προσέγγισης της παρακολούθησης των μεταβολών που συμβαίνουν στο θερμαινόμενο σύστημα, εξαιτίας της μη ενζυμικής αμαύρωσης και τον αντίστοιχο σχηματισμό χρωμοφόρων ουσιών κίτρινου - μελανού χρώματος. Η δημιουργία δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου που διέφεραν ως προς την ενεργότητα νερού (α w ), αλλά είχαν σταθερή αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών, επιτεύχθηκε με ανάμιξη του αρχικού συμπυκνωμένου δείγματος χυμού μήλου με διαλύματα σορβιτόλης (αδρανούς πολυόλης όσον αφορά τη συμμετοχή της σε αντιδράσεις μη ενζυμικής αμαύρωσης), διαφορετικής συγκέντρωσης στην περιεχόμενη υγροσκοπική ουσία. Η μεθοδολογία αυτή έδωσε τη δυνατότητα διερεύνησης της μεμονωμένης επίδρασης του παράγοντα α w στην κινητική της μη ενζυμικής αμαύρωσης, καθώς και της σύγκρισης της επίδρασης του παράγοντα αυτού σε σχέση με την επίδραση της διαφορετικής αρχικής συγκέντρωσης διαλυτών αντιδρώντων συστατικών, στην εξέλιξη του ίδιου φαινομένου. Έντονη παρουσιάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στην κινητική της μη ενζυμικής αμαύρωσης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου, τόσο στα δείγματα που έφεραν την ίδια όσο και σ αυτά που διέφεραν ως προς την αρχική συγκέντρωση αντιδρώντων συστατικών. Όπως αναμένονταν όμως, το αποτέλεσμα της εφαρμοζόμενης θέρμανσης ήταν εντονότερο στην περίπτωση δειγμάτων χυμού μήλου που διέφεραν στην αρχική συγκέντρωση διαλυτών αντιδρώντων στερεών. Αντίθετη συμπεριφορά σημειώθηκε, εξετάζοντας την μεμονωμένη επίδραση της ενεργότητας νερού στη μεταβολή της απορρόφησης των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου. Συγκεκριμένα, στα δείγματα που παρασκευάστηκαν με ενσωμάτωση σορβιτόλης, η επίδραση του παράγοντα α w δεν ήταν στατιστικώς σημαντική. Ωστόσο, για τη δεύτερη κατηγορία διαλυμάτων που επίσης διαφοροποιούνταν στο εξεταζόμενο εύρος ενεργότητας νερού, και που ταυτόχρονα διέφεραν ως προς την αρχική συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών, σημειώθηκε ταχύτερη μεταβολή της καταγραφούμενης απορρόφησης (Α 420 ) κατά τη θέρμανσή τους σε μια σταθερή θερμοκρασία, καθώς η α w των διαλυμάτων μειώνονταν, ή αντίστροφα, παρατηρήθηκε μείωση των ρυθμών αμαύρωσης με αύξηση της α w των δειγμάτων χυμού μήλου, εξαιτίας 222

257 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις της επερχόμενης αραίωσης της συγκέντρωσης των διαλυτών σε αυτά στερεών. Συνεπώς, αν και η ενεργότητα νερού αναφέρεται συχνά ως ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τους ρυθμούς της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν πως οι παρατηρούμενοι υψηλοί ρυθμοί της αντίδρασης μη ενζυμικής αμαύρωσης στο εύρος τιμών ενεργότητας νερού αποδίδονται κατά κύριο λόγο στην αυξημένη συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών του συστήματος, παρά στη μειωμένη τιμή ενεργότητας του νερού. Άρα η μάζα του νερού, και όχι αυτή καθ αυτή η ενεργότητα νερού (α w ), είναι αυτή που σχετίζεται με το ρυθμό της αντίδρασης. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη και κατά τη μοντελοποίηση της κινητικής της μη ενζυμικής αμαύρωσης, χρησιμοποιήθηκε ο παράγοντας α w, και όχι η περιεχόμενη συγκέντρωση των διαλυτών αντιδρώντων στερεών στο σύστημα, αφού τα διαγράμματα μεταβολής των ρυθμών της αντίδρασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης είναι σύνηθες να απεικονίζονται ως συνάρτηση της ενεργότητας νερού. Τα επίπεδα της α w των δειγμάτων συμπυκνωμένου χυμού μήλου που εξετάστηκαν εδώ, δεν ήταν αρκετά χαμηλά ώστε να επιβεβαιωθεί ξεκάθαρα το συνήθως παρατηρούμενο μέγιστο και η τάση της μείωσης του ρυθμού της αντίδρασης σε τιμές α w χαμηλότερες από 0.7, λόγω της σταδιακής μείωσης της κινητικότητας των διαλυτών στερεών και του νερού σε ολοένα και χαμηλότερα επίπεδα α w. Η μοντελοποίηση των κινητικών δεδομένων κατά τη θέρμανση των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου, ανέδειξε τη λογιστική εξίσωση ως την καταλληλότερη εμπειρική εξίσωση να περιγράψει την αντίδραση μη ενζυμικής αμαύρωσης στο σύστημα, μεταξύ των πέντε διαφορετικών πρωτογενών μοντέλων που εξετάστηκαν. Η εξίσωση αυτή κατάφερε να συμπεριλάβει την περιγραφή των μεταβολών της απορρόφησης (Α 420 ) τόσο στους αρχικούς χρόνους εφαρμογής της επεξεργασίας (φάση προσαρμογής), όσο και κατά την τελευταία φάση της θέρμανσης όπου και αποτυπώνεται ένα μέγιστο επίπεδο αμαύρωσης του χυμού. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών της αντίδρασης αμαύρωσης εκφράστηκε ικανοποιητικά από το τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius, που επίσης περιγράφει και την παράλληλη επίδραση του παράγοντα α w στη μεταβολή των ρυθμών της αντίδρασης. Η θερμοκρασιακή ευαισθησία των ρυθμών της αντίδρασης αποτυπώθηκε από την εκτίμηση της τιμής ενέργειας ενεργοποίησης που υπολογίστηκε σε 67.0 kj/mol, κοινή για όλα τα δείγματα συμπυκνωμένου χυμού μήλου, ανεξαρτήτως α w, ενώ η επίδραση της ενεργότητας του νερού εκφράστηκε από μια σταθερά d που περιγράφει την εκθετική αύξηση του ρυθμού της αμαύρωσης καθώς η ενεργότητα νερού μειώνεται. Τα λοιπά δευτερογενή 223

258 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μοντέλα που εξετάστηκαν (Belehradek, και πολυωνυμικά μοντέλα) παρουσίασαν ικανοποιητικά υψηλές τιμές συντελεστών προσδιορισμού (R 2 ), ωστόσο, στερούνται παροχής πρακτικών πληροφοριών σχετικά με τη θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών αμαύρωσης. Στα ίδια συμπεράσματα της πολύ επιτυχούς εφαρμογής του τροποποιημένου μοντέλου Arrhenius, κατέληξε και η αξιολόγηση του δευτερογενούς αυτού μοντέλου το οποίο κατέστη ικανό να προβλέπει με πολύ καλή ακρίβεια, ρυθμούς αμαύρωσης πολύ κοντά στις παρατηρούμενες τιμές της παραμέτρου αυτής όπως προέκυψαν σε ανεξάρτητα πειράματα. Η επίδραση της θερμοκρασίας και της α w στις άλλες παραμέτρους του λογιστικού μοντέλου (Α max και t i ) εκφράστηκε με τα δευτέρου βαθμού πολυωνυμικά μοντέλα των φυσικών λογαρίθμων των παραπάνω παραμέτρων, ενώ η παράμετρος Α 0 φάνηκε να παραμένει σταθερή, ανεξάρτητα από την εφαρμοζόμενη θερμοκρασία και την ενεργότητα του νερού της κάθε μεταχείρισης. Έχοντας διερευνήσει όλες τις πιθανές επιδράσεις των παραγόντων θερμοκρασία και α w στις παραμέτρους του κινητικού λογιστικού μοντέλου σε ισόθερμες συνθήκες, τα δευτερογενή μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή του νέου ανασχηματισμένου μοντέλου, το οποίο θα μπορούσε να αξιολογήσει το ενδεχόμενο περιγραφής ή και πρόβλεψης της έκτασης της μη ενζυμικής αμαύρωσης σε θερμικά επεξεργασμένο χυμό μήλου κάτω από δυναμικά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα θέρμανσης. Κάνοντας την απλή παραδοχή ότι η θερμοκρασία παραμένει σταθερή για πολύ μικρά διαστήματα χρόνου στα οποία διαιρείται το χρονοθερμοκρασιακό ιστορικό της εφαρμοζόμενης επεξεργασίας, το ανασχηματισμένο μοντέλο προέβλεψε με επιτυχία τη μεταβολή της απορρόφησης του συμπυκνωμένου χυμού μήλου συγκριτικά με την μετρούμενη αύξηση της απορρόφησης (Α 420 ) που παρατηρήθηκε στα μεταβαλλόμενα θερμοκρασιακά προφίλ που υιοθετήθηκαν. Κινητική μοντελοποίηση της μη ενζυμικής αμαύρωσης στο μέλι και αραιωμένα συστήματα μελιού που υποβάλλονται σε ισόθερμα και δυναμικά πρωτόκολλα θέρμανσης. Το μέλι αποτελεί ένα αρκετά συμπυκνωμένο και ετερογενές ως προς τη σύσταση (σάκχαρα, αμινοξέα, κ.α.) σύστημα, και κατατάσσεται στην κατηγορία των πραγματικών τροφίμων μέσης υγρασίας, που υπόκεινται σε αμαύρωση κατά τη συντήρησή τους εξαιτίας των αντιδράσεων μη ενζυμικής αμαύρωσης, προκαλώντας σημαντικές απώλειες στην ποιότητά του. Οι απώλειες αυτές είναι εντονότερες στην περίπτωση της θέρμανσης του κατά τις διεργασίες εκχύλισης ή συσκευασίας, που ταυτόχρονα στοχεύουν στη μείωση της τάσης που παρουσιάζει το προϊόν να κρυσταλλώνει ή και στην αναστολή ανάπτυξης της 224

259 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις ενδογενούς στο προϊόν μικροχλωρίδας. Θεωρώντας ότι το χρώμα του μελιού αντιπροσωπεύει το κυριότερο ποιοτικό χαρακτηριστικό που καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την αποδοχή του από τον καταναλωτή, οι παρατηρούμενες μεταβολές στην τιμή απορρόφησης (Α 420 ) κατά την προκαλούμενη από τη θέρμανση αμαύρωση του προϊόντος, υιοθετήθηκαν και σ αυτή τη μελέτη ως δείκτης της ποιοτικής υποβάθμισης στο μέλι και τα αραιωμένα με νερό διαλύματα αυτού. Η θέρμανση του μελιού και των αραιωμένων δειγμάτων του σε ισόθερμες συνθήκες συνέβαλλε στην αύξηση της απορρόφησής τους (Α 420 ) ως αποτέλεσμα του σχηματισμού μελανών χρωμοφόρων ουσιών. Η επίδραση της θερμοκρασίας ήταν εντονότερη για το μητρικό δείγμα μελιού με χαμηλή ενεργότητα νερού (0.54), και παρουσιάστηκε ολοένα και ασθενέστερη για τα αντίστοιχα αραιωμένα δείγματα αυτού, εξαιτίας της μεγαλύτερης αραίωσης στη συγκέντρωση των αντιδρώντων συστατικών. Αντίθετα, η επίδραση της α w στη μεταβολή του χρώματος των δειγμάτων μελιού, ήταν αμελητέα κατά την ισόθερμη θέρμανση στις χαμηλές θερμοκρασίες εφαρμογής των 50 και 60 C, μικρή στους 70 C και αρκετά έντονη στους 80 C. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα α w που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή για τα δείγματα μελιού βρίσκονταν στο εύρος τιμών όπου συνήθως παρατηρείται ο μέγιστος ρυθμός αμαύρωσης, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης εμφάνισαν συνεχή μείωση των σταθερών των ρυθμών αντίδρασης με αύξηση της α w των δειγμάτων στο εύρος τιμών από 0.54 ως 0.97, υποδεικνύοντας πως στο εν λόγω σύστημα δεν παρατηρείται απώλεια της κινητικότητας των αντιδρώντων μορίων, όπως συμβαίνει σε τρόφιμα (κυρίως κονιοποιημένα συστήματα) που βρίσκονται στην υαλώδη κατάσταση. Άλλωστε, ο προσδιορισμός της θερμοκρασίας υαλώδους μετάπτωσης με τη μέθοδο της διαφορικής θερμιδομετρίας (DSC) ανέδειξε πολύ χαμηλότερες τιμές Τ g (<0 C) από αυτές που υιοθετήθηκαν για τη θερμική επεξεργασία του προϊόντος. Η υιοθέτηση της λογιστικής εξίσωσης κατά τη μοντελοποίηση των κινητικών δεδομένων αμαύρωσης στο μέλι και τα αραιωμένα συστήματα αυτού αποδείχτηκε κι εδώ επιτυχής επιλογή στην περιγραφή του φαινομένου. Η συνδυασμένη δράση της εφαρμοζόμενης θερμοκρασίας και της α w στις σταθερές των ρυθμών αμαύρωσης περιγράφηκε ικανοποιητικά από το δευτερογενές τροποποιημένο μοντέλο Arrhenius. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών αμαύρωσης ήταν και σε αυτήν την περίπτωση ανεξάρτητη από την ενεργότητα του νερού των υπό μελέτη δειγμάτων μελιού. Η κοινή ενέργεια ενεργοποίησης για όλα τα δείγματα υπολογίστηκε σε 34.8 kj/mol, κατά πολύ 225

260 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή μικρότερη αυτής που προσδιορίστηκε για τα συμπυκνώματα του χυμού μήλου, υποδεικνύοντας μικρότερη θερμοκρασιακή ευαισθησία του μελιού στην επιβαλλόμενη θέρμανση. Καλή προσαρμογή των εκτιμούμενων ρυθμών αμαύρωσης έγινε και από άλλα δευτερογενή μοντέλα (Belehradek και πολυωνυμικά μοντέλα), τα οποία όμως δεν χρησιμοποιήθηκαν για τους λόγους που ήδη έχουν αναφερθεί. Από τα δευτερογενή μοντέλα που εξετάστηκαν για την επίδραση της θερμοκρασίας και της α w στη μέγιστη απορρόφηση A max, η τροποποιημένη εξίσωση Arrhenius, ήταν αυτή που επιλέχτηκε να χρησιμοποιηθεί τελικά στην ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου και ανασχηματισμένου μοντέλου, που να ανταποκρίνεται επιτυχώς στην πρόβλεψη χρωματικών μεταβολών σε δυναμικά μεταβαλλόμενες συνθήκες θέρμανσης του μελιού. Καινοτομία στην παρούσα μελέτη αποτέλεσε η διερεύνηση της δυνατότητας περιγραφής της επίδρασης της θερμοκρασίας στις σταθερές του ρυθμού της αντίδρασης αμαύρωσης από το μοντέλο WLF, που δύναται να περιγράψει τη θερμοκρασιακή εξάρτηση των ρυθμών χημικών αντιδράσεων σε άμορφα συστήματα που συντηρούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης. Οι θερμοκρασίες υαλώδους μετάπτωσης, απαραίτητες για την εφαρμογή της εξίσωσης WLF, προσδιορίστηκαν επιτυχώς με χρήση της μεθοδολογίας DSC για τα περισσότερα από τα αραιωμένα δείγματα μελιού. Ωστόσο, για τα πολύ αραιωμένα συστήματα με α w 0.87 και 0.97, παρουσιάστηκε αδυναμία της συγκεκριμένης τεχνικής να προσδιορίσει Τ g μικρότερα από τη θερμοκρασία των -100 C, τα οποία και υπολογίστηκαν έμμεσα κάνοντας χρήση της μαθηματικής λύσης, μετά από προσαρμογή των δεδομένων T g κλάσματος βάρους νερού, στην εμπειρική εξίσωση Gordon-Taylor. Η τελική προσαρμογή των προβλεπόμενων από την εξίσωση WLF τιμών των ρυθμών αμαύρωσης k στα πειραματικά κινητικά δεδομένα, που συλλέχτηκαν για το εύρος των θερμοκρασιών εφαρμογής της υπό μελέτη θερμικής επεξεργασίας, αποδείχτηκε αρκετά ικανοποιητική. Η αξιολόγηση των μοντέλων Arrhenius και WLF να προβλέπουν τους ρυθμούς αμαύρωσης, κατά τη θέρμανση του μελιού και των αραιωμένων δειγμάτων αυτού, υλοποιήθηκε συγκρίνοντας τις προβλεπόμενες τιμές των σταθερών αμαύρωσης και αυτών που παρατηρήθηκαν σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς των πειραματικών μεταχειρίσεων που διεξήχθησαν, και ανέδειξε ικανοποιητική ταύτιση των εκτιμούμενων και παρατηρούμενων τιμών. Εντούτοις, παρά την καλή προσαρμογή και των δύο μοντέλων, η προσέγγιση της κινητικής Arrhenius θεωρήθηκε καταλληλότερη για την έκφραση της 226

261 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις επίδρασης της θερμοκρασίας στη σταθερά του ρυθμού αμαύρωσης, αφού η θερμική επεξεργασία των δειγμάτων μελιού έλαβε χώρα σε συνθήκες πολύ μακριά από το από το T g των δειγμάτων (Τ>Τ g +100 C), όπου συνήθως εφαρμόζεται η κινητική Arrhenius, και επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν φαινόμενα περιορισμού της διάχυσης των συστατικών που να παρεμποδίζουν την αντίδραση αμαύρωσης, και συνεπώς να ενδείκνυται η εφαρμογή της θεωρίας WLF. Η τελική αξιολόγηση των κινητικών μοντέλων που επιλέχθηκαν, πραγματοποιήθηκε σε δυναμικές, μεταβαλλόμενες συνθήκες θέρμανσης, κατά τις οποίες οι πραγματοποιούμενες μεταβολές στην απορρόφηση (Α 420 ) του μελιού συγκρίθηκαν με αυτές που προέβλεψε το συνολικό ανασχηματισμένο δυναμικό μοντέλο, ακολουθώντας την εφαρμογή της ίδιας μεθοδολογίας που υιοθετήθηκε και στην περίπτωση των συμπυκνωμάτων χυμού μήλου. Μικρές αποκλίσεις μεταξύ των προβλεπόμενων από το δυναμικό λογιστικό μοντέλο και των παρατηρούμενων καμπυλών μεταβολής της απορρόφησης παρατηρήθηκαν και στα δύο πρωτόκολλα θέρμανσης που υιοθετήθηκαν, μετά από κάποιο χρόνο εφαρμογής των περιοδικώς μεταβαλλόμενων κύκλων θέρμανσης. Το δυναμικό λογιστικό μοντέλο ουσιαστικά προέβλεψε χαμηλότερες μεταβολές της απορρόφησης του μελιού σε σύγκριση με αυτές που εκτιμήθηκαν πειραματικά. Το φαινόμενο αυτό αποδόθηκε είτε σε πιθανή αδυναμία του ανασχηματισμένου μοντέλου να προβλέψει με ακρίβεια τις τιμές A max, σύμφωνα με την παραδοχή της συγκεκριμένης συνθήκης που υιοθετήθηκε για την εκτίμηση της παραμέτρου A max στο δυναμικό μοντέλο, ή στη μικρή ακρίβεια του δευτερογενούς μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της παραμέτρου A max και την παραγωγή σφάλματος που αναπαράγεται και βαθμιαία συσσωρεύεται, οδηγώντας τελικά σε σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των προβλεπόμενων και παρατηρούμενων τιμών απορρόφησης σε εκτεταμένους χρόνους εφαρμογής του πειραματισμού. Ωστόσο, και στις δύο περιπτώσεις των εξεταζόμενων προφίλ μεταβολής θερμοκρασίας, οι παρατηρούμενες πειραματικές τιμές απορρόφησης βρέθηκαν μέσα στα όρια εμπιστοσύνης των γραμμών πρόβλεψης, αποδεικνύοντας πως το κινητικό μοντέλο που αναπτύχθηκε μπορεί να εφαρμοστεί στην πρόβλεψη της εκτίμησης μεταβολών στην απορρόφηση (Α 420 ) του μελιού κατά τη θερμική του επεξεργασία σε συνεχώς μεταβαλλόμενα προφίλ θερμοκρασίας χρόνου που απαντώνται στη βιομηχανία. 227

262 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ανάπτυξη ενός μικροβιακού Χρονοθερμοκαρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας τροφίμων που συντηρούνται υπό ψύξη. Η εκτεταμένη μελέτη που αφορούσε την επιλογή των δομικών συστατικών του υπό ανάπτυξη συστήματος ΤΤΙ κατέληξε στα ακόλουθα ευρήματα που αποτέλεσαν και τη βάση δημιουργίας του μικροβιακού ΤΤΙ: Το βακτηριακό στέλεχος L. sakei υιοθετήθηκε ως ο καταλληλότερος μικροοργανισμός μεταξύ άλλων υποψηφίων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων που εξετάστηκαν, βάσει της ικανότητάς του να προκαλεί ικανοποιητική πτώση του ph του υποστρώματος στο οποίο αναπτύσσεται και τον πληθυσμό του να φτάνει σε υψηλά επίπεδα αντίστοιχα εκείνων που σημειώνονται κατά την αλλοίωση των τροφίμων. Το υπόστρωμα Nutrient broth, εμπλουτισμένο με γλυκόζη και εκχύλισμα ζυμών σε συγκεντρώσεις 2 και 0.5 % w/v, αντίστοιχα, επιλέχτηκε ως το καταλληλότερο μέσο ανάπτυξης του μικροοργανισμού στο σύστημα ΤΤΙ, του οποίου η σύνθεση βοηθά στην ικανοποιητική ανάπτυξη του L. sakei (χωρίς την εμφάνιση διφασικής ανάπτυξης), ενώ το ανοιχτό κίτρινο χρώμα του επιτρέπει την ευδιάκριτη και μη αντιστρεπτή μεταβολή του χρώματός του, κατά την ενσωμάτωση του χημικού δείκτη στο σύστημα. Ο χημικός δείκτης chlorophenol red, θεωρήθηκε ο ιδανικός χρωματικός δείκτης ο οποίος κατά την ενσωμάτωσή του στο μέσο ανάπτυξης του ΤΤΙ σε συγκέντρωση 1.5 % v/v (διαλύματος δείκτη 0.2 % w/v σε NaOH Μ) επιτρέπει κατά πρώτον την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και ακολούθως τη μεταβολή του χρώματος του υποστρώματος από το αρχικό κόκκινο στο τελικό κίτρινο χρωματισμό, κατά την πτώση του ph εξαιτίας της μεταβολικής δραστηριότητας του στελέχους L. sakei. Ο πληθυσμός του L. sakei σχετίστηκε στενά με την κατανάλωση της γλυκόζης και την παραγωγή γαλακτικού οξέος, προκαλώντας την πτώση του ph και τη σταδιακή αλλαγή του χρώματος του συστήματος από το αρχικό κόκκινο σε πορτοκαλί και έπειτα στο τελικό κίτρινο χρώμα τη στιγμή που ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων προσεγγίζει τα μέγιστα επίπεδα του πληθυσμού, N max. Η χρωματική συνάρτηση ΔΕ περιέγραψε ικανοποιητικά την προκαλούμενη μεταβολή στο χρώμα του συστήματος ΤΤΙ. Τα δεδομένα απόκρισης της συγκεκριμένης παραμέτρου ως συνάρτηση του χρόνου ακολούθησαν μια σιγμοειδή καμπύλη ανάπτυξης που εκφράστηκε επιτυχώς από τη λογιστική εξίσωση. Το χρώμα του ΤΤΙ ξεκινώντας από το αρχικό κόκκινο (μηδενικές ή χαμηλές τιμές της συνάρτησης ΔΕ) σταδιακά μετατράπηκε σε πορτοκαλί και τελικά κίτρινο (υψηλές τιμές ΔΕ, όταν ο πληθυσμός των γαλακτικών 228

263 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις προσεγγίζει τα μέγιστα επίπεδα του πληθυσμού, N max ). Η ευδιάκριτη οπτική μεταβολή του χρώματος του υποστρώματος στον τελικό κίτρινο χρωματισμό καταγράφηκε τη στιγμή που το ph του μέσου μειώθηκε στην τιμή που παρατηρείται η χρωματική μεταβολή του χημικού δείκτη σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Στη δεδομένη χρονική στιγμή η απόκριση της παραμέτρου ΔΕ έλαβε την τιμή 20, και ο χρόνος αυτός υιοθετήθηκε ως σημείο λήξης (end point) του ΤΤΙ. Το σημείο λήξης του ΤΤΙ μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας, και εκτιμήθηκε σε 640, 269, 113, 78.4 και 61.1 ώρες κατά τη συντήρηση του ΤΤΙ στους 0, 4, 8, 12, και 16 C, αντίστοιχα. Η θερμοκρασιακή εξάρτηση του σημείου λήξης του ΤΤΙ περιγράφηκε ικανοποιητικά από την εξίσωση Arrhenius, και η αντίστοιχη ενέργεια ενεργοποίησης για τη μεταβολή αυτή προσδιορίστηκε σε 97.7 kj/mol. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το γεγονός ότι οι χρόνοι στους οποίους σημειώθηκαν τα αντίστοιχα σημεία λήξης του ΤΤΙ ταυτίστηκαν με τη χρονική στιγμή κατά την οποία ο πληθυσμός του εν λόγω μικροοργανισμού στο υπόστρωμα του συστήματος αγγίζει τους 7-8 δεκαδικούς λογάριθμους CFU/ml σε όλες τις θερμοκρασίες που εξετάστηκαν. Οι μικροβιολογικές και φυσικοχημικές μεταβολές που συμβαίνουν στο μικροβιακό σύστημα ΤΤΙ περιγράφηκαν επιτυχώς από το σύστημα διαφορικών εξισώσεων που υιοθετήθηκε, και το οποίο επέτρεψε επίσης την εκτίμηση όλων των άγνωστων παραμέτρων του μοντέλου. Γενικά, υπήρξε αρκετά καλή συμφωνία των πειραματικών δεδομένων και των προβλέψεων του μοντέλου όσον αφορά στις μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αποκρίσεις του δείκτη. Στο ίδιο συμπέρασμα ταύτισης των πειραματικών δεδομένων και των εκτιμήσεων του μοντέλου κατέληξε και η αξιολόγηση του μοντέλου, χρησιμοποιώντας τις πειραματικές δοκιμές που διεξήχθησαν για τη διερεύνηση της δυνατότητας ρύθμισης του σημείου λήξης του ΤΤΙ κατά τη συντήρηση του ΤΤΙ σε μια σταθερή θερμοκρασία συντήρησης, και διαφοροποιώντας μόνο το αρχικό επίπεδο εμβολίου. Ο μέγιστος πληθυσμός του μικροοργανισμού Ν max όπως προβλέφθηκε από το μοντέλο, παρέμεινε σταθερός και σχεδόν ανεξάρτητος της θερμοκρασίας συντήρησης με μια μέση τιμή 8.20 log 10 CFU/ml. Αντίθετα, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών, μ max, αυξήθηκε με τη θερμοκρασία, και η θερμοκρασιακή αυτή εξάρτηση περιγράφηκε ικανοποιητικά από την εξίσωση Arrhenius. Η ενέργεια ενεργοποίησης προσδιορίστηκε kj/mol, τιμή πολύ κοντά στην τιμή της Ε α που υπολογίστηκε για το σημείο λήξης του ΤΤΙ. Συνεπώς, η θερμοκρασιακή εξάρτηση της μικροβιακής ανάπτυξης και της απόκρισης του ΤΤΙ ήταν παρόμοιες. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η απώλεια ποιότητας των περισσότερων 229

264 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή υπό ψύξη προϊόντων κρέατος συσκευασμένων υπό κενό ή υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας οφείλεται στην ανάπτυξη και μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων, θα μπορούσαμε να υποστηρίξουμε ότι η ανάπτυξη του L. sakei προσομοιάζει την κινητική της ποιοτικής υποβάθμισης τέτοιων προϊόντων, ικανοποιώντας κατ αυτόν τον τρόπο μια από τις βασικές προϋποθέσεις επιτυχούς εφαρμογής ενός ΤΤΙ, σύμφωνα με την οποία η Ε α της απόκρισης του ΤΤΙ πρέπει να ισούται με την Ε α της απώλειας της ποιότητας του προϊόντος. Σε ότι αφορά την επόμενη σημαντική προϋπόθεση για την εφαρμογή του ΤΤΙ, η οποία σχετίζεται με την ανάγκη, το σημείο λήξης του ΤΤΙ να είναι αντίστοιχο του τέλους της διάρκειας ζωής του προϊόντος σε μια θερμοκρασία αναφοράς, αναζητήθηκε ένας τρόπος εύκολης ρύθμισης του σημείου λήξης του, ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του υπό ενδιαφέροντος προϊόντος. Σε αυτή τη βάση, εξετάστηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης του L. sakei ( CFU/ml) στην απόκριση του ΤΤΙ στη σταθερή θερμοκρασία των 8 C. Με την αύξηση του αρχικού επιπέδου του εμβολίου, ο μικροοργανισμός έφτασε τη μέγιστη βακτηριακή συγκέντρωση σε συντομότερο χρόνο, τα προφίλ πτώσης του ph ήταν γρηγορότερα ενώ το σημείο λήξης σημειώθηκε συντομότερα. Το αρχικό επίπεδο εμβολίου και το σημείο λήξης του ΤΤΙ συνδέθηκαν με μια αρνητική γραμμική συσχέτιση. Συνεπώς, η εύκολη ρύθμιση του σημείου λήξης του ΤΤΙ σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας το κατάλληλο επίπεδο εμβολίου του L. sakei στο υπόστρωμα του ΤΤΙ, ανάλογα με τη διάρκεια ζωής του προϊόντος που ενδιαφέρει κάθε φορά. Εναλλακτικά, το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε δίνει επίσης τη δυνατότητα εφαρμογής σε άλλες κατηγορίες τροφίμων, μεταβάλλοντας απλά τα δομικά συστατικά του, με σκοπό την προσομοίωση του περιβάλλοντος του τροφίμου στόχου, και την ταύτιση του σημείου λήξης του νέου ΤΤΙ με τη διάρκεια ζωής του συγκεκριμένου προϊόντος. Με στόχο λοιπόν, την επίτευξη παρόμοιας μικροβιακής ανάπτυξης και στα δύο συστήματα, λύσεις θα μπορούσαν να δοθούν με την προσθήκη στο ΤΤΙ μιας κατάλληλης μικροβιακής ουσίας σε συγκέντρωση όμοια με αυτή που προστίθεται στο τρόφιμο ή ακόμα και ρυθμίζοντας την α w του υποστρώματος του ΤΤΙ με την προσθήκη οσμωτικά ενεργών συστατικών (πολυόλες ή ηλεκτρολύτες) προκειμένου η ενεργότητα του νερού να προσεγγίσει αυτήν του τροφίμου. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν ότι το προτεινόμενο ΤΤΙ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα αποτελεσματικό εργαλείο για τη συνεχή παρακολούθηση της 230

265 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις διάρκειας ζωής των υπό ψύξη προϊόντων τροφίμων που αλλοιώνονται από την ανάπτυξη και τη μεταβολική δραστηριότητα γαλακτικών βακτηρίων, ή άλλων βακτηρίων που παρουσιάζουν παρόμοια κινητική συμπεριφορά και αλλοιογόνο δράση. Μικροβιακά ΤΤΙ που στοχεύουν σε άλλες κατηγορίες προϊόντων τροφίμων μπορούν επίσης να αναπτυχθούν, εφαρμόζοντας την ίδια μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο για κάθε τρόφιμο ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό σε συνδυασμό με το κατάλληλο μέσο ανάπτυξης και ένα αντίστοιχο χημικό δείκτη. Ωστόσο, η συστηματική μελέτη της κινητικής τόσο της αλλοίωσης του προϊόντος όσο και των αποκρίσεων του ΤΤΙ υπό στατικές και μεταβαλλόμενες (δυναμικές) συνθήκες ψύξης, είναι απαραίτητη σε κάθε περίπτωση για τη δυνατότητα ανάπτυξης και εφαρμογής αυτού του είδους των ΤΤΙ ως δεικτών ποιότητας των τροφίμων. Εφαρμογή του μικροβιακού Χρονοθερμοκρασιακού Δείκτη (ΤΤΙ) στην παρακολούθηση της αλλοίωσης συσκευασμένου σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα βοδινού κιμά Αρχικά, η μελέτη αλλοίωσης βοδινού κιμά συσκευασμένου σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (MAP) κατά τη συντήρησή του υπό ψύξη (0-15 C), ανέδειξε τα γαλακτικά βακτήρια ως τον ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό, μεταξύ των λοιπών βακτηρίων της ενδογενούς μικροχλωρίδας του συγκεκριμένου προϊόντος, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης που εξετάστηκαν. Η πλούσια σε CO 2 ατμόσφαιρα, παρεμπόδισε μερικώς την ανάπτυξη των ψευδομονάδων που άγγιξαν μέτρια επίπεδα πληθυσμών, ενώ επηρέασε ελάχιστα την ανάπτυξη του B. thermosphacta, επιβεβαιώνοντας ότι το συγκεκριμένο είδος μαζί με τα γαλακτικά βακτήρια, αποτελούν την κύρια χλωρίδα των προαιρετικά αναερόβιων ομάδων μικροοργανισμών των οποίων η ανάπτυξη ευνοείται σε προϊόντα MAP. Η ομάδα των εντεροβακτηρίων παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα συγκεντρώσεων κατά την συντήρηση του προϊόντος στους 0 C, αλλά εμφάνισε αυξημένα πληθυσμιακά επίπεδα και αυξανόμενους ρυθμούς ανάπτυξης, στο εύρος θερμοκρασιών συντήρησης των 5-15 C, πάντα όμως χαμηλότεροι από αυτούς που προσδιορίστηκαν για τις λοιπές ομάδες βακτηρίων. Τα πειραματικά δεδομένα ανάπτυξης των ομάδων των βακτηρίων που μελετήθηκαν προσαρμόστηκαν επιτυχώς στο πρωτογενές μοντέλο ανάπτυξης των Baranyi και Roberts, και οι εκτιμηθείσες τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου ελέγχθηκαν ως προς τη θερμοκρασιακή τους εξάρτηση κατά τη συντήρηση του προϊόντος MAP. Η θερμοκρασία συντήρησης επηρέασε σημαντικά το μικροβιακό ρυθμό ανάπτυξης. Με την εξίσωση 231

266 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Arrhenius η ενέργεια ενεργοποίησης για τη μεταβολή των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης, μ max, των γαλακτικών βακτηρίων προσδιορίστηκε σε kj/mol. Ωστόσο, η θερμοκρασία συντήρησης δεν είχε σημαντική επίδραση στη μέγιστη συγκέντρωση των κυττάρων των αναπτυσσόμενων ομάδων βακτηρίων. Οι τιμές της παραμέτρου αυτής παρέμειναν σχετικά αμετάβλητες για τα γαλακτικά βακτήρια, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης που εξετάστηκαν, και ο μέσος όρος αυτών εκτιμήθηκε σε 7.36 log 10 CFU/g. Η οργανοληπτική αξιολόγηση των προϊόντων, που διεξήχθη παράλληλα με τη μικροβιολογική ανάλυση των δειγμάτων, συνέβαλλε στην εκτίμηση της διάρκειας ζωής του βοδινού κρέατος, όπως προέκυψε και ανιχνεύθηκε, από το πάνελ δοκιμαστών, σε αντιστοιχία με την παρατηρούμενη μεταβολή στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Η διάρκεια ζωής του βοδινού κρέατος μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας συντήρησης, ενώ η εκτίμηση των πληθυσμών των μικροοργανισμών που συνθέτουν τη χλωρίδα αλλοίωσης κατά το χρόνο λήξης της διάρκειας ζωής (N s ), κατέληξε πως τα γαλακτικά βακτήρια ήταν οι κυρίαρχοι μικροοργανισμοί, με πληθυσμό που έφτανε κατά μέσο όρο στο επίπεδο των 7.08 log 10 CFU/g (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) για όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Χαρακτηριστική για το μη αποδεκτό προϊόν ήταν η όξινη ή υπόξινη γεύση και δριμεία οσμή, ενώ επίσης σε μερικές περιπτώσεις αναφέρθηκε η ανίχνευση οσμής και γεύσης τυριού, προς το τέλος της διάρκειας συντήρησης. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν το γεγονός πως τα γαλακτικά βακτήρια αποτελούν τον ειδικό αλλοιογόνο μικροοργανισμό στο συσκευασμένο υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα βοδινό κιμά, αφού επιβιώνουν και αναπτύσσονται ταχύτερα από την ανταγωνιστική χλωρίδα, ανεξαρτήτως της παρουσίας, σε τέτοιου είδους τρόφιμα, αντιμικροβιακών ουσιών η χαμηλής τιμής ph ως αποτέλεσμα της δικής τους μεταβολικής δραστηριότητας. Κατά τη σύγκριση της αλλοίωσης που ανιχνεύθηκε στο βοδινό κιμά MAP και της απόκρισης του μικροβιακού ΤΤΙ που αναπτύχθηκε στην προηγούμενη μελέτη, παρατηρήθηκε ικανοποιητική ταύτιση των καμπυλών ανάπτυξης των υπεύθυνων για την αλλοίωση γαλακτικών βακτηρίων στο προϊόν κρέατος και αυτής του L. sakei στο υπόστρωμα του ΤΤΙ, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης, αποτέλεσμα στο οποίο συνέβαλλε σημαντικά η δυνατότητα ρύθμισης της αρχικής συγκέντρωσης του μικροοργανισμού στο σύστημα του μικροβιακού ΤΤΙ. Οι διαφοροποιήσεις που παρατηρήθηκαν στον τελικό, μέγιστο πληθυσμό των γαλακτικών βακτηρίων, N max, σε κάποιες θερμοκρασίες, αποδόθηκαν στην καλύτερη προσαρμογή και ανάπτυξη των 232

267 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις μικροοργανισμών σε εργαστηριακά θρεπτικά μέσα, συγκριτικά με την αντίστοιχη ανάπτυξή τους σε πραγματικά τρόφιμα. Η ανάπτυξη του L. sakei στο ΤΤΙ συνέβαλε στη σταδιακή πτώση του ph του θρεπτικού υποστρώματος, και την ακόλουθη μη αντιστρεπτή χρωματική μεταβολή του εμπεριεχόμενου στο σύστημα χημικού δείκτη από το αρχικό κόκκινο σε πορτοκαλί και τελικά κίτρινο χρώμα. Η μεταβολή αυτή συνέβη σε τιμές ph του μέσου ανάπτυξης κοντά στο 5.3. Το σημείο λήξης του ΤΤΙ (end point), χρονική στιγμή κατά την οποία συμβαίνει η διακριτή μεταβολή του χρώματος, σημειώθηκε σε πληθυσμούς γαλακτικών βακτηρίων της τάξης των CFU/ml ή /g τόσο στο TTI όσο και στο προϊόν βοδινού κρέατος, συμπίπτοντας με το επίπεδο αλλοίωσης λόγω ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων, και συνεπώς με τη λήξη της διάρκειας ζωής του προϊόντος, σε όλες τις θερμοκρασίες συντήρησης. Όπως αναμένονταν, η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης, μ max, των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το ΤΤΙ, όπως περιγράφηκε από την εξίσωση Arrhenius, ήταν παρόμοια στα δύο συστήματα, και οι τιμές ενέργειας ενεργοποίησης υπολογίστηκαν σε και kj/mol, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, η επίδραση της θερμοκρασίας στη μεταβολή του χρώματος του ΤΤΙ, όπως αυτή περιγράφεται από τη χρωματική συνάρτηση ΔΕ ανέδειξε συντομότερα σημεία λήξης του μικροβιακού ΤΤΙ με αύξηση της θερμοκρασίας συντήρησης. Προσαρμόζοντας τις παραμέτρους της κινητικής ανάπτυξης χρώματος που συμμετέχουν στη λογιστική εξίσωση, η οποία περιγράφει τη μεταβολή της χρωματικής απόκρισης ΔΕ ως συνάρτηση του χρόνου, και ειδικότερα τους όρους μ ΔΕ και 1/t i ΔΕ, στην εξίσωση Arrhenius, έγινε δυνατή η εκτίμηση των ενεργειών ενεργοποίησης. Οι τιμές E α, ήταν και kj/mol για το ρυθμό μεταβολής της χρωματικής συνάρτησης ΔΕ (μ ΔΕ ) και 1/t i ΔΕ, αντίστοιχα. Οι καμπύλες Arrhenius, που δείχνουν τη μεταβολή των ρυθμών ανάπτυξης (μ max ) των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας και το ΤΤΙ ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, καθώς και οι καμπύλες μεταβολής των παραμέτρων απόκρισης του ΤΤΙ, παρουσιάστηκαν παράλληλες μεταξύ τους. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει όμοια θερμοκρασιακή ευαισθησία τόσο της αλλοίωσης που συμβαίνει στο βοδινό κιμά MAP όσο και των αποκρίσεων του ΤΤΙ, ενθαρρύνοντας την πιθανή εφαρμογή του μικροβιακού ΤΤΙ στην παρακολούθηση της διάρκειας ζωής του βοδινού κιμά MAP. Η επιτυχής εφαρμογή του μικροβιακού ΤΤΙ που 233

268 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή αναπτύχθηκε, ενισχύθηκε επιπλέον, από το γεγονός ότι τα σημεία λήξης του ΤΤΙ σχετίστηκαν άμεσα με τη λήξη της διάρκειας ζωής του προϊόντος. Η παράλληλη συντήρηση του βοδινού κιμά MAP και του μικροβιακού ΤΤΙ σε δύο διαφορετικά, δυναμικά μεταβαλλόμενα πρωτόκολλα ψύξης, έδωσε τη δυνατότητα αξιολόγησης της ενδεχόμενης εφαρμογής του ΤΤΙ σε συνθήκες που προσομοιάζουν την επικρατούσα κατάσταση στην πραγματική ψυκτική αλυσίδα. Τα γαλακτικά βακτήρια ξεκινώντας από ένα αρχικό επίπεδο επιμόλυνσης (στο ωμό βοδινό κρέας) της τάξης των CFU/g, αναπτύχθηκαν σε υψηλά επίπεδα, προκαλώντας την αλλοίωση του προϊόντος και τελικά την απόρριψή του από την ομάδα δοκιμαστών (λήξη της διάρκειας ζωής) σε χρόνους όπου τα επίπεδα των πληθυσμών των γαλακτικών βακτηρίων στο κρέας έφταναν τους 7 log 10 CFU/g. Αντίστοιχα, ο εμβολιασμένος στο σύστημα ΤΤΙ L. sakei ακολούθησε στενά την ανάπτυξη του ειδικού αλλοιογόνου μικροοργανισμού (SSO) στο βοδινό κιμά MAP, για το μεγαλύτερο χρόνο της περιόδου συντήρησης, αν και παρατηρήθηκαν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις πληθυσμού των αναπτυσσόμενων στο ΤΤΙ γαλακτικών βακτηρίων, σε σχέση με το προϊόν κρέατος. Ωστόσο, ανεξάρτητα από το γεγονός αυτό, η μη αντιστρεπτή αλλαγή στο χρώμα του ΤΤΙ (ΔΕ=20) συνέβη όταν τα γαλακτικά βακτήρια άγγιξαν το επίπεδο αλλοίωσης στο βοδινό κιμά (δηλαδή τους 7 log 10 CFU/g), κάνοντας σαφές πως κατά την εφαρμογή του μικροβιακού ΤΤΙ στο προϊόν κρέατος MAP που μελετήθηκε, είναι δυνατή η ακριβής περιγραφή της αλλοίωσης σε δυναμικές συνθήκες συντήρησης, αντιπροσωπευτικές των πραγματικών συνθηκών ψύξης στην αλυσίδα διανομής. Η ανάπτυξη και η μεταβολική δραστηριότητα στο σύστημα ΤΤΙ σε συνδυασμό με τη δυνατότητα ρύθμισης του σημείου λήξης του, καθιστούν το μικροβιακό ΤΤΙ που αναπτύχθηκε, ένα πολύτιμο και αξιόπιστο εργαλείο στην παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των προϊόντων κρέατος MAP, αλλά και των προϊόντων που κατά κύριο λόγο αλλοιώνονται από τα γαλακτικά βακτήρια. Η απόκριση του ΤΤΙ, με τη μορφή μιας εύκολα αναγνώσιμης από τον καταναλωτή μεταβολής στο χρώμα του, όπως αυτής που συμβαίνει στο μικροβιακό σύστημα που παρουσιάστηκε, ουσιαστικά αντικατοπτρίζει τις θερμοκρασιακές συνθήκες στις οποίες εκτίθεται ένα προϊόν καθ όλη τη διάρκεια του κύκλου ζωής του, και τη συνολική διαδρομή που αυτό ακολουθεί στην αλυσίδα διανομής του. Στην περίπτωση που ο χρονο-θερμοκρασιακός δείκτης, στην εμπορική του μορφή, 234

269 Διδακτορική Διατριβή 5. Συμπεράσματα και Προτάσεις προσκολληθεί σε κάθε μια μονάδα συσκευασίας χωριστά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τη ένδειξη ανάλωση πριν ως μια δυναμική ένδειξη της ημερομηνίας λήξης του προϊόντος, προσφέροντας ταυτόχρονα έναν αποτελεσματικό έλεγχο της θερμοκρασίας σε όλα τα κρίσιμα σημεία κατά τη διανομή αυτών των προϊόντων. Επιπρόσθετα, οι πληροφορίες που παρέχονται από το μικροβιακό ΤΤΙ σχετικά με την εναπομένουσα διάρκεια ζωής σε οποιοδήποτε σημείο της ψυκτικής αλυσίδας, μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην αριστοποίηση των πραγματοποιούμενων ελέγχων κατά τη διανομή αλλά και τη βελτιστοποίηση του συστήματος διαχείρισης των προς διακίνηση αποθεμάτων, συμβάλλοντας ενεργά στη μείωση των χαρακτηρισμένων ως ακατάλληλα για κατανάλωση προϊόντων και συνεπώς στη μείωση των ζημιών και άρα του συνολικού κόστους του προϊόντος. Η προσέγγιση της ανάπτυξης του μικροβιακού αυτού ΤΤΙ μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί και στο πεδίο της ασφάλειας των τροφίμων. Άξιο περαιτέρω έρευνας αποτελεί η δυνατότητα εφαρμογής του εν λόγω μικροβιακού ΤΤΙ στην παρακολούθηση της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών σε διάφορα τρόφιμα. Κάτι τέτοιο μπορεί να επιχειρηθεί συγκρίνοντας την κινητική ανάπτυξης του L. sakei στο ΤΤΙ με την κινητική της ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών, όπως η L. monocytogenes, σε έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα, και στην περίπτωση που η θερμοκρασιακή εξάρτηση των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης των δύο μικροοργανισμών μοιάζουν και επίσης ταυτίζονται με το ρυθμό της απόκρισης του ΤΤΙ (χρωματική μεταβολή), το ΤΤΙ θα αποτελέσει ένα αξιόπιστο μέσο για την παρακολούθηση της ασφάλειας των τροφίμων. Επιπλέον, η απλή σύνθεση του μέσου ανάπτυξης του ΤΤΙ δημιουργεί τις κατάλληλες προϋποθέσεις ώστε με την κατάλληλη τροποποίησή του, είτε μεταβάλλοντας την α w ή προσθέτοντας μικρές ποσότητες αντιμικροβιακών ουσιών, η κινητική της ανάπτυξης του L. sakei στο νέο ΤΤΙ να προσομοιάζει την κινητική ανάπτυξης του παθογόνου μικροοργανισμού στόχου στο τρόφιμο του οποίου η ασφάλεια μελετάται. Με τον τρόπο αυτό το ΤΤΙ μπορεί να καταστεί πολύτιμο εργαλείο στην παρακολούθηση ή και τήρηση των μικροβιολογικών κριτηρίων που έχουν θεσπιστεί σύμφωνα με τον κανονισμό 2073/2005 της Ευρωπαϊκής Ένωσης σχετικά με τα μικροβιολογικά κριτήρια για τα τρόφιμα. 235

270 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή 236

271 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adams, M. R., Little, C. L., & Easter, M. C. (1991). Modelling the effect of ph, acidulant and temperature on the growth rate of Yersinia enterocolitica. Journal of Applied Microbiology, 71(1), Ahmed, J., Prabhu, S. T., Raghavan, G. S. V., & Ngadi, M. (2007). Physico-chemical, rheological, calorimetric and dielectric behavior of selected Indian honey. Journal of Food Engineering, 79(4), Anderson, W. A., McClure, P. J., Baird-Parker, A. C., & Cole, M. B. (1996). The application of a log-logistic model to describe the thermal inactivation of Clostridium botulinum 213B at temperatures below C. Journal of Applied Bacteriology, 80, Anon. (2007). Foodborne illness in the refrigerator. Food safety news New Zealand FoodWorks, AOAC (1990). In K. Helrich (Ed.), Official Μethods of Αnalysis (15 th edn). Arlington, VA: Association of Official Analytical Chemists. Ashoor, S. H., & Zent, J. B. (1984). Maillard browning of common amino acids and sugars. Journal of Food Science, 49(4), Axelsson, L. T. (1993). Lactic acid bacteria: Classification and physiology: Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong. Azevedo, I., Regalo, M., Mena, C., Almeida, G., Carneiro, L., Teixeira, P., Hogg, T., & Gibbs, P. A. (2005). Incidence of Listeria spp. in domestic refrigerators in Portugal. Food Control, 16(2), Baisier, W. M., & Labuza, T. P. (1992). Maillard browning kinetics in a liquid model system. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(5), Bakalis, S., Giannakourou, M. C., & Taoukis, P. S. (2003). Effect of domestic storage and cooking conditions on the risk distribution in ready to cook meat products. In 9th International Congress on Engineering and Food (ICEF9) Montpellier: 7 11 March,

272 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Baker, D. A., & Genigeorgis, C. (1993). Predictive modeling in Clostridium botulinum. In A. H. W. Hauschild, & K. L. Dodds (Eds.), Ecology and Control in Foods (pp ). New York: Marcel Dekker. Baranyi, J., Ross, T., McMeekin, T. A., & Roberts, T. A. (1996). Effects of parameterization on the performance of empirical models used in predictive microbiology. Food Microbiology, 13(1), Baranyi, J., Robinson, T. P., Kaloti, A., & Mackey, B. M. (1995). Predicting growth of Brochothrix thermosphacta at changing temperature. International Journal of Food Microbiology, 27(1), Baranyi, J., Roberts, T. A., & McClure, P. (1993). A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 10(1), Baranyi, J., & Roberts, T. A. (1994). A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. International Journal of Food Microbiology, 23(3-4), Bath, P. K., & Singh, N. (2000). A research note: chemical changes in Helianthus annuus and Eucalyptus lanceolatus honey during storage. Journal of Food Quality, 23(4), Bazin, M. J., & Prosser, J. I. (1992). Modelling microbial ecosystems. Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement, 73, 89s-95s. Bell, N., & Labuza, T. P. (1994). Influence of the low-moisture state on ph and its implication for reaction kinetics. Journal of Food Engineering, 22(1-4), Bell, N., & Labuza, T. P. (1991). Aspartame degradation kinetics as affected by ph in intermediate and low moisture food systems. Journal of Food Science, 56(1), BeMiller, J. N., & Whistler, R. L. (1996). Carbohydrates. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (pp ). New York, USA: Marcel Dekker Inc. Bernaerts, K., Dens, E., Vereecken, K., Geeraerd, A., Devlieghere, F., Debevere, J., & Van Impe, J. F. (2004). Modeling microbial dynamics under time-varying conditions. In R. C. McKellar, & X. Lu (Eds.), Modeling Microbial Responses in Foods (pp ). Boca Raton, FLorida, USA: CRC Press. Biliaderis, C. G., Swan, R. S., & Arvanitoyannis, I. (1999). Physicochemical properties of commercial starch hydrolyzates in the frozen state. Food Chemistry, 64(4), Blackburn, C. D. W., Curtis, L. M., Humpheson, L., Billon, C., & McClure, P. J. (1997). Development of thermal inactivation models for Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 with temperature, ph and NaCl as controlling factors. International Journal of Food Microbiology, 38(1),

273 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Blackburn, C. W., Curtis, L. M., Humpheson, L., Billon, C., & McClure, P. J. (1997). Development of thermal inactivation models for Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 with temperature, ph and NaCl as controlling factors. International Journal of Food Microbiology, 38(1), Bobelyn, E., Hertog, M. L. A. T. M., & Nicolaï, B. M. (2006). Applicability of an enzymatic time temperature integrator as a quality indicator for mushrooms in the distribution chain. Postharvest Biology and Technology, 42(1), Bøgh-Sorensen, L. (1980). Product temperatures in chilled cabinets. In Proceedings of the 26th European Meeting of Meat Research Workers (paper No. N-22) Colorado Springs. Borch, E., Kant-Muermans, M. L., & Blixt, Y. (1996). Bacterial spoilage of meat and cured meat products. International Journal of Food Microbiology, 33(1), Bozkurt, H., Gögüş, F., & Eren, S. (1999). Nonenzymic browning reactions in boiled grape juice and its models during storage. Food Chemistry, 64(1), Breen, A., Brock, S., Crawford, K., Docherty, M., Drummond, G., Gill, L., Lawton, S., Mankarious, V., Oustayiannis, A., Rushworth, G., & Kerr, K. G. (2006). The refrigerator safari an educational tool for undergraduate students learning about the microbiological safety of food. British Food Journal, 108(6), Breidt, F., & Fleming, H. (1998). Modeling of the competitive growth of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Applied and Environmental Microbiology, 64(9), Brocklehurst, T. (2004). Challenge of food and environment. In R. C. McKellar, & X. Lu (Eds.), Modeling Microbial Responses in Foods (pp ). Boca Raton, FLorida, USA: CRS Press. Buchanan, R. L., & Golden, M. H. (1998). Interactions between ph and mallic acid concentration on the inactivation of Listeria monocytogenes. Journal of Food Safety, 18(1), Buchanan, R. L., & Golden, M. H. (1994). Interaction of citric acid concentration and ph on the kinetics of Listeria monocytogenes inactivation. Journal of Food Protection, 57(7), Buchanan, R. L., Golden, M. H., Whiting, R. C., Phillips, J. G., & Smith, J. L. (1994). Non-thermal inactivation models for Listeria monocytogenes. Journal of Food Science, 59(1), Buchanan, R. L., Golden, M. H., & Phillips, J. G. (1997). Expanded models for the non-thermal inactivation of Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, 82(5), Buchanan, R. L., Whiting, R. C., & Damert, W. C. (1997). When is simple good enough: a comparison of the Gompertz, Baranyi, and three-phase linear models for fitting bacterial growth curves, Food Microbiology, 14(4),

274 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Buchanan, R. L., & Golden, M. H. (1995). Model for the non-thermal inactivation of Listeria monocytogenes in a reduced oxygen environment. Food Microbiology, 12, Buchanan, R. L. (1993). Developing and distributing user-friendly application software. Journal of Industrial Microbiology, 12(3-5), Buchanan, R. L., & Klawitter, L. A. (1992). The effect of incubation temperature, initial ph, and sodium chloride on the growth kinetics of Escherichia coli O157:H7. Food Microbiology, 9(3), Buchanan, R. L. (1993). Predictive food microbiology. Trends in Food Science & Technology, 4(1), Buedo, A. P., Elustondo, M. P., & Urbicain, M. J. (2001). Amino acid loss in peach juice concentrate during storage. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 1(4), Buera, M. D. P., & Karel, M. (1993). Αpplication of the WLF equation to describe the combined effects of moisture and temperature on nonenzymatic browning rates in food systems. Journal of Food Processing and Preservation, 17, Burdurlu, S. H., & Karadeniz, F. (2003). Effect of storage on nonenzymatic browning of apple juice concentrates. Food Chemistry, 80(1), Carabasa-Giribet, M., & Ibarz-Ribas, A. (2000). Kinetics of colour development in aqueous glucose systems at high temperatures. Journal of Food Engineering, 44(3), Chandler, R. E., & McMeekin, T. A. (1985). Temperature function integration and the prediction of the shelf-life of milk. Australian Journal of Dairy Technology, 40, Chirife, J., Zamora, M. C., & Motto, A. (2006). The correlation between water activity and % moisture in honey: Fundamental aspects and application to Argentine honeys. Journal of Food Engineering, 72(3), Clive, W. B., & McClure, P. J. (2002). Foodborne pathogens: Hazards, risk analysis and control. Cambridge, U.K.: Woodhead Publishing. Cocaign-Bousquet, M., Garrigues, C., Loubière, P., & Lindley, N. D. (1996). Physiology of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis. Antonie Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 70, Cohen, E., Birk, Y., Mannheim, C. H., & Saguy, I. S. (1994). Kinetic parameter estimation for quality change during continuous thermal processing of grapefruit juice. Journal of Food Science, 59(1), Cohen, E., Birk, Y., Mannheim, C. H., & Saguy, I. S. (1998). A rapid method to monitor quality of apple juice during thermal processing. Lebensmittel-Wissenschaft und-technologie, 31(7-8), 240

275 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Cole, M. B., Davies, K. W., Munro, G., Holyoak, C. D., & Kilsby, D. C. (1993). A vitalistic model to describe the thermal inactivation of Listeria monocytogenes. Journal of Industrial Microbiology, 12(3), Dainty, R. H., & Mackey, B. M. (1992). The relationship between the phenotypic properties of bacteria from chill-stored meat and spoilage processes. Journal of Applied Microbiology, 73(s21), 103S-114S. Dalgaard, P. (2003). Fish Spoilage of Seafood. In Benjamin Caballero (Ed.), Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (pp ). Oxford: Academic Press. Dalgaard, P., Mejlholm, O., & Huss, H. H. (1997). Application of an iterative approach for development of a microbial model predicting the shelf-life of packed fish. International Journal of Food Microbiology, 38(2-3), Dalgaard, P. (1995). Modelling of microbial activity and prediction of shelf life for packed fresh fish. International Journal of Food Microbiology, 26(3), Dalgaard, P., Gram, L., & Huss, H. H. (1993). Spoilage and shelf-life of cod fillets packed in vacuum or modified atmospheres. International Journal of Food Microbiology, 19(4), Daniels, J. A., Krishnamurth, R., & Rizvi, S. H. (1985). A review of effects of carbon dioxide on microbial growth and beef quality. Journal of Food Protection, 45, Daniels, R. W. (1998). Home food safety. Food Technology, 52(2), Davey, K. R. (1994). Modelling the combined effect of temperature and ph on the rate coefficient for bacterial growth. International Journal of Food Microbiology, 23(3-4), Davey, K. R. (1991). Applicability of the Davey linear Arrhenius predictive model to the lag phase of microbial growth. Journal of Applied Bacteriology, 70, Davey, K. R. (1989). A predictive model for combined temperature and water activity on microbial growth during the growth phase. Journal of Applied Bacteriology, 67, Davies, K. W. (1993). Design of experiments for predictive microbial modelling. Journal of Industrial Microbiology, 12, Delignette-Muller, M. L., Rosso, L., & Flandrois, J. P. (1995). Accuracy of microbial growth predictions with square root and polynomial models. International Journal of Food Microbiology, 27(2-3), Devlieghere, F., Geeraerd, A. H., Versyck, K. J., Vandewaetere, B., Van Impe, J., & Debevere, J. (2001). Growth of Listeria monocytogenes in modified atmosphere packed cooked meat 241

276 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή products: a predictive model. Food Microbiology, 18(1), Devlieghere, F., Geeraerd, A. H., Versyck, K. J., Bernaert, H., Van Impe, J. F., & Debevere, J. (2000a). Shelf life of modified atmosphere packed cooked meat products: addition of Na-lactate as a fourth shelf life determinative factor in a model and product validation. International Journal of Food Microbiology, 58(1-2), Devlieghere, F., Lefevere, I., Magnin, A., & Debevere, J. (2000b). Growth of Aeromonas hydrophila in modified-atmosphere-packed cooked meat products. Food Microbiology, 17(2), Devlieghere, F., Debevere, J., & Van Impe, J. (1998a). Concentration of carbon dioxide in the waterphase as a parameter to model the effect of a modified atmosphere on microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 43(1-2), Devlieghere, F., Debevere, J., & Van Impe, J. (1998b). Effect of dissolved carbon dioxide and temperature on the growth of Lactobacillus sake in modified atmospheres. International Journal of Food Microbiology, 41(3), Devlieghere, F., Vermeiren, L., & Debevere, J. (2004). New preservation technologies: Possibilities and limitations. International Dairy Journal, 14(4), Diez-Gonzalez, F., Belina, D., Labuza, T. P., & Pal, A. (2007). Modeling the growth of Listeria monocytogenes based on a time to detect model in culture media and frankfurters. International Journal of Food Microbiology, 113(3), Drosinos, E. H., & Board, R. G. (1995). A survey of minced lamb packaged in modified atmospheres. Fleischwirtschaft, 3, Duffy, G., Ellison, A., Anderson, W., Cole, M., & Stewart, G. (1995). Use of bioluminescence to model the thermal inactivation of Salmonella typhimurium in the presence of a competitive microflora. Applied and Environmental Microbiology, 61(9), Eichner, K., & Karel, M. (1972). The influence of water content and water activity on the sugaramino browning reaction in model systems under various conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20(2), Elkins, E. R., Matthys, A., Lyon, R., & Huang, C. J. (1996). Characterization of commercially produced apple juice concentrate. Journal of Food Composition and Analysis, 9(1), Ellouze, M., Pichaud, M., Bonaiti, C., Coroller, L., Couvert, O., Thuault, D., & Vaillant, R. (2008). Modelling ph evolution and lactic acid production in the growth medium of a lactic acid bacterium: Application to set a biological TTI. International Journal of Food Microbiology, 128(1), Enfors, S. O., & Molin, G. (1981). The influence of temperature on the growth inhibitory effect of 242

277 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία carbon dioxide on Pseudomonas fragi and Bacillus cereus. Canadian Journal of Microbiology, 27(1), Evans, J. A., Stanton, J. I., Russell, S. L., & James, S. J. (1991). Consumer handling of chilled foods: A survey of time and temperature conditions. London: MAFF Publications, PB Fallico, B., Zappalà, M., Arena, E., & Verzera, A. (2004). Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys. Food Chemistry, 85(2), Feeney, R. E., & Whitaker, J. R. (1982). The maillard rection and its prevention. In J. P. Cerry (Ed.), Food Protein Deterioration, Mechanisms and Functionality (pp ). Washington: ACS Symposium Series 206, ACS. Fennema, O. R. (1996). Water and ice. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (pp ). New York: Marcel Dekker Inc. Fennema, O. R., & Tannenbaum, S. R. (1996). Introduction to food chemistry. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (pp. 1-15). New York: Marcel Dekker Inc. Fernández, P. S., George, S. M., Sills, C. C., & Peck, M. W. (1997). Predictive model of the effect of CO 2, ph, temperature and NaCl on the growth of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology, 37(1), Fernández-López, J., Sayas-Barberá, E., Muñoz, T., Sendra, E., Navarro, C., & Pérez-Alvarez, J. A. (2008). Effect of packaging conditions on shelf-life of ostrich steaks. Meat Science, 78(1-2), Flynn, O. M. J., Blair, I., & McDowell, D. (1992). The efficiency and consumer operation of domestic refrigerators. International Journal of Refrigeration, 15(5), Friedman, M. (1996). Food browning and its prevention: An overview. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(3), Fu, B., & Labuza, T. P. (1993). Shelf-life prediction: theory and application. Food Control, 4(3), Fu, B., & Labuza, T. P. (1992). Considerations for the application of time-temperature integrators in food distribution. Journal of Food Distribution Research, 23(1), Fu, B., Taoukis, P. S., & Labuza, T. P. (1991). Predictive microbiology for monitoring spoilage of dairy products with Time-Temperature Integrators. Journal of Food Science, 56(5), Gac, A. (2002). Refrigerated transport: what's new? International Journal of Refrigeration, 25(5), Garza, S., Ibarz, A., Pagán, J., & Giner, J. (1999). Non-enzymatic browning in peach puree during 243

278 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή heating. Food Research International, 32(5), Geeraerd, A. H., Valdramidis, V. P., Devlieghere, F., Bernaert, H., Debevere, J., & Van Impe, J. F. (2004). Development of a novel approach for secondary modelling in predictive microbiology: incorporation of microbiological knowledge in black box polynomial modelling. International Journal of Food Microbiology, 91(3), Ghebrehewet, S., & Stevenson, L. (2003). Effectiveness of home-based food storage training: A community development approach. International Journal of Environmental Health Research, 13, s169-s174. Giannakourou, M. C., Koutsoumanis, K., Nychas, G. J. E., & Taoukis, P. S. (2005). Field evaluation of the application of time temperature integrators for monitoring fish quality in the chill chain. International Journal of Food Microbiology, 102(3), Giannakourou, M. C., & Taoukis, P. S. (2003a). Application of a TTI-based distribution management system for quality optimization of frozen vegetables at the consumer end. Journal of Food Science, 68(1), Giannakourou, M. C., & Taoukis, P. S. (2003b). Kinetic modelling of vitamin C loss in frozen green vegetables under variable storage conditions. Food Chemistry, 83(1), Giannakourou, M. C., & Taoukis, P. S. (2002). Systematic application of Time Temperature Integrators as tools for control of frozen vegetable quality. Journal of Food Science, 67(6), Giannakourou, M. C., Koutsoumanis, K., Nychas, G. J. E., & Taoukis, P. S. (2001). Development and assessement of an intelligent shelf life decision system for quality optimisation of the food chill chain. Journal of Food Protection, 64, Gibson, A. M., Bratchell, N., & Roberts, T. A. (1987). The effect of sodium chloride and temperature on the rate and extent of growth of Clostridium botulinum type A in pasteurized pork slurry. Journal of Applied Microbiology, 62(6), Gill, C. O., Jones, T., LeBlanc, D. I., Rahn, K., Campbell, S., Holley, R. A., Stark, R., & Houde, A. (2002). Temperatures and ages of packs of beef displayed at stores in Canada. Meat Science, 62(2), Gill, C. O. (1996a). Cold storage temperatures fluctuations and predicting microbial growth. Journal of Food Protection, 59, Gill, C. O. (1996b). Extending the storage life of raw chilled meats. Meat Science, 43(S1), Gill, C. O., & Phillips, D. M. (1993). The efficiency of storage during distant continental transportation of beef sides and quarters. Food Research International, 26(4),

279 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Gill, C. O., & Jones, T. (1992a). Assessment of the hygienic efficiencies of two commercial processes for cooling pig carcass, Food Microbiology, 9(4), Gill, C. O., & Jones, S. D. M. (1992b). Evaluation of a commercial process for collection and cooling of beef offals by a temperature function integration technique. International Journal of Food Microbiology, 15(1-2), Gill, C. O., Harrison, J. C. L., & Phillips, D. M. (1991a). Use of a temperature function integration technique to assess the hygienic adequacy of a beef carcass cooling process. Food Microbiology, 8(2), Gill, C. O., Jones, S. D. M., & Tong, A. K. W. (1991b). Application of a temperature function integration technique to assess the hygienic adequacy of a process for spray chilling beef carcasses. Journal of Food Protection, 54, Gonzales, A. P., Burin, L., & Buera, M. d. P. (1999). Color changes during storage of honeys in relation to their composition and initial color. Food Research International, 32(3), Gordon, M., & Taylor, J. S. (1952). Ideal copolymers and the second-order transitions of synthetic rubbers. I. Non-crystalline copolymers. Journal of Applied Chemistry, 2, Greer, G. G., Gill, C. O., & Dilts, B. D. (1994). Evaluation of the bacteriological consequences of the temperature regimes experienced by fresh chilled meat during retail display. Food Research International, 27(4), Guerrero, I., & Chabela, L. P. (1999). Meat and poultry / Spoilage of cooked meats and meat products. In Richard K. Robinson (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (pp ). Oxford: Elsevier. Hansen, K. M. J., & Bautista, D. A. (1999). Spoilage problems / Problems caused by bacteria. In R. K. Robinson (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (pp ). Oxford: Elsevier. Hartel, R. W. (1993). Controlling sugar crystallization in food products. Food Technology, 47, Heitzer, A., Kohler, H. P., Reichert, P., & Hamer, G. (1991). Utility of phenomenological models for describing temperature dependence of bacterial growth. Applied and Environmental Microbiology, 57(9), Hirvi, Y., Griffiths, M. W., McKellar, R. C., & Modler, H. W. (1996). Linear-transform and nonlinear modelling of bovine milk catalase inactivation in a high-temperature short-time pasteurizer. Food Research International, 29(1), Hodge, J. E. (1953). Dehydrated foods, chemistry of browning reactions in model systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1(15),

280 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Hodge, J. E., & Rist, C. E. (1953). The Amadori rearrangement under new conditions and its significance for non-enzymatic browning reactions 2. Journal of the American Chemical Society, 75(2), Holmer, B. (1984). Properties and stability of aspartame. Food Technology, 38, Ibarz, A., Pagán, J., & Garza, S. (2000). Kinetic models of non-enzymatic browning in apple puree. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80(8), Ibarz, A., Pagán, J., & Garza, S. (1999). Kinetic models for colour changes in pear puree during heating at relatively high temperatures. Journal of Food Engineering, 39(4), IIR (2008). RFID technologies for cold chain applications. In 4th Informatory Note on Refrigeration and Food Paris, France: International Institute of Refrigeration. James, S. (2003). Chilled storage / attainment of chilled conditions. In Benjamin Caballero (Ed.), Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (pp ). Oxford: Academic Press. James, S. (1996). The chill chain from carcass to consumer. Meat Science, 43(S1), James, S. J., Evans, J., & James, C. (2008). A review of the performance of domestic refrigerators. Journal of Food Engineering, 87(1), James, S. J. (1999). Food refrigeration and thermal processing at Langford, UK: 32 years of research. Trans IChemE, 77(3), James, S. J., & Evans, J. (1992). Consumer handling of chilled foods: Temperature performance. International Journal of Refrigeration, 15(5), Jeremiah, L. E. (2001). Packaging alternatives to deliver fresh meats using short- or long-term distribution. Food Research International, 34(9), Johnson, J. R., Braddock, R. J., & Chen, C. S. (1995). Kinetics of ascorbic acid loss and nonenzymatic browning in orange juice serum: experimental rate constants. Journal of Food Science, 60(3), Johnson, A. E., Donkin, A. J. M., Morgan, K., Lilley, J. M., Neale, R. J., & Page, R. M. (1998). Food safety knowledge and practice among elderly people living at home. Journal of Epidemiology and Community Health, 52, Jones, J. E., Walker, S. J., Sutherland, J. P., Peck, M. W., & Little, C. L. (1994). Mathematical modelling of the growth, survival and death of Yersinia enterocolitica. International Journal of Food Microbiology, 23(3-4), Jones, M. V. (1989). Modified atmospheres. In G. M. Gould (Ed.), Mechanisms of Action of Food Preservation Procedures (pp ). London: Elsevier Applied Science. 246

281 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Juneja, V. K., Marmer, B. S., Phillips, J. G., & Miller, A. J. (1995). Influence of the intrinsic properties of food on thermal inacttvation of spores of nonproteolytic Clostridium botulinum: development of a predictive model. Journal of Food Safety, 15(4), Kantor, Z., Pitsi, G., & Thoen, J. (1999). Glass transition temperature of honey as a function of water content as determined by differential scanning calorimetry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(6), Karmas, R., Buera, M. P., & Karel, M. (1992). Effect of glass transition on rates of nonenzymatic browning in food systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(5), Katz, E. E., & Labuza, T. P. (1981). Effect of water activity on sensory crispness and mechanical deformation of snack food products. Journal of Food Science, 46, Kennedy, J., Jackson, V., Blair, I. S., McDowell, D. A., Cowan, C., & Bolton, D. J. (2005). Food safety knowledge of consumers and the microbiological and temperature status of their refrigerators. Journal of Food Protection, 68(7), Kerry, J. P., O Grady, M. N., & Hogan, S. A. (2006). Past, current and potential utilisation of active and intelligent packaging systems for meat and muscle-based products: A review. Meat Science, 74(1), Koca, N.,.Burdurlu, S. H., & Karadeniz, F. (2003). Kinetics of nonenzymatic browning reaction in citrus juice concentrates during storage. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 27(6), Konopka, A. (2000). Microbial physiological state at low growth rate in natural and engineered ecosystems. Current Opinion in Microbiology, 3(3), Korkeala, H., Lindroth, S., Ahvenainen, R., & Alanko, T. (1987). Interrelationship between microbial numbers and other parameters in the spoilage of vacuum-packed cooked ring sausages. International Journal of Food Microbiology, 5(4), Koutsoumanis, K., Stamatiou, A., Skandamis, P., & Nychas, G. J. E. (2006). Development of a microbial model for the combined effect of temperature and ph on spoilage of ground meat, and validation of the model under dynamic temperature conditions. Applied and Environmental Microbiology, 72(1), Koutsoumanis, K., Taoukis, P. S., & Nychas, G. J. E. (2005). Development of a safety monitoring and assurance system for chilled food products. International Journal of Food Microbiology, 100(1-3), Koutsoumanis, K., Giannakourou, M. C., Taoukis, P. S., & Nychas, G. J. E. (2002). Application of shelf life decision system (SLDS) to marine cultured fish quality. International Journal of Food 247

282 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Microbiology, 73(2-3), Koutsoumanis, K. (2001). Predictive modeling of the shelf life of fish under nonisothermal conditions. Applied and Environmental Microbiology, 67(4), Koutsoumanis, K., Lambropoulou, K., & Nychas, G. J. E. (1999). A predictive model for the nonthermal inactivation of Salmonella enteritidis in a food model system supplemented with a natural antimicrobial. International Journal of Food Microbiology, 49(1-2), Koutsoumanis, K. P., Stamatiou, A. P., Drosinos, E. H., & Nychas, G. J. E. (2008). Control of spoilage microorganisms in minced pork by a self-developed modified atmosphere induced by the respiratory activity of meat microflora. Food Microbiology, 25(7), Koutsoumanis, K. P., Taoukis, P. S., Drosinos, E. H., & Nychas, G. J. E. (2000). Applicability of an Arrhenius model for the combined effect of temperature and CO 2 packaging on the spoilage microflora of fish. Applied and Environmental Microbiology, 66(8), Koutsoumanis, K., & Nychas, G. J. E. (2000). Application of a systematic experimental procedure to develop a microbial model for rapid fish shelf life predictions. International Journal of Food Microbiology, 60(2-3), Krist, K. A., Ross, T., & McMeekin, T. A. (1998). Final optical density and growth rate; effects of temperature and NaCl differ from acidity. International Journal of Food Microbiology, 43(3), Labuza, T. P., & Hyman, C. R. (1998). Moisture migration and control in multi-domain foods. Trends in Food Science & Technology, 9(2), Labuza, T. P., & Fu, B. (1995). Use of time/temperature integrators, predictive microbiology, and related technologies for assessing the extent and impact of temperature abuse on meat and poultry products. Journal of Food Safety, 15(3), Labuza, T. P., & Fu, B. (1993). Growth kinetics for shelf-life prediction: Theory and practice. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 12(3), Labuza, T. P., & Baisier, W. M. (1992). The kinetics of nonezymatic browning. In H. G. Schwartzberg, & R. W. Hartel (Eds.), Physical Chemistry of Foods (pp ). New York: Marcel Dekker. Labuza, T. P., & Riboh, D. (1982). Theory and application of Arrhenius kinetics to the prediction of nutrient losses in foods. Food Technology, 36, Labuza, T. P., & Saltmarch, M. (1981a). The non-enzymatic browning reaction as affected by water in foods. In L. B. Rockland, & G. F. Stewart (Eds.), Water Activity Influences in Food Quality (pp ): Academic Press. 248

283 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Labuza, T. P., & Saltmarch, M. (1981b). Kinetics of browning and protein quality loss in whey powders during steady state and non-steady state storage conditions. Journal of Food Science, 47(1), 92-96,113. Labuza, T. P., & Contreras-Medellin, R. (1981). Prediction of moisture protection requirements for foods. Cereal Foods World, 26, Labuza.T.P., & Ragnarsson, J. O. (1985). Kinetic history effect on lipid oxidation of metyl linoleatein model system. Journal of Food Science, 50(1), Laguerre, O., Derens, E., & Palagos, B. (2002). Study of domestic refrigerator temperature and analysis of factors affecting temperature: A French survey. International Journal of Refrigeration, 25, Lambert, A. D., Smith, J. P., & Dodds, K. L. (1991). Shelf life extension and microbiological safety of fresh meat - a review. Food Microbiology, 8(4), Lazaridou, A., Biliaderis, C. G., Bacandritsos, N., & Sabatini, A. G. (2004). Composition, thermal and rheological behaviour of selected Greek honeys. Journal of Food Engineering, 64(1), Leroy, F., & De Vuyst, L. (1999). Temperature and ph conditions that prevail during fermentation of sausages are optimal for production of the antilisterial bacteriocin sakacin K. Applied and Environmental Microbiology, 65(3), Levine, H., & Slade, L. (1989). A food polymer science approach to the particle of cryostabilization technology. Comments on Agriculture and Food Chemistry, 1(6), Linton, R. H., Carter, W. H., Pierson, M. D., Hackney, C. R., & Eifert, J. D. (1996). Use of a modified Gompertz equation to predict the effects of temperature, ph, and NaCl on the inactivation of Listeria monocytogenes Scott A heated in infant formula. Journal of Food Protection, 59(1), Linton, R. H., Carter, W. H., Pierson, M. D., & Hackney, C. R. (1995). Use of a modified Gompertz equation to model nonlinear survival curves for Listeria monocytogenes Scott A. Journal of Food Protection 58(9), Little, C. L., Adams, M. R., Anderson, W. A., & Cole, M. B. (1994). Application of a log-logistic model to describe the survival of Yersinia enterocolitica at sub-optima ph and temperature. International Journal of Food Microbiology, 22(1), Lowry, P. D., Gill, C. O., & Pham, Q. T. (1989). A quantitative method of determining the hygienic efficiency of meat thawing processes. Food Australia, 41, Luño, M., Roncalés, P., Djenane, D., & Beltrán, J. A. (2000). Beef shelf life in low O 2 and high CO 2 atmospheres containing different low CO concentrations. Meat Science, 55(4),

284 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Lynn, E. G., Englis, D. T., & Milum, V. G. (1936). Effect of processing and storage on composition and color of honey. Food Research, 1, Manso, M. C., Oliveira, F. A. R., Oliveira, J. C., & Frías, J. M. (2001). Modelling ascorbic acid thermal degradation and browning in orange juice under aerobic conditions. International Journal of Food Science and Technology, 36(3), Martins, S. I. F. S., Jongen, W. M. F., & van Boekel, M. A. J. S. (2001). A review of Maillard reaction in food and implications to kinetic modelling. Trends in Food Science & Technology, 11(9-10), Mataragas, M., Drosinos, E. H., Vaidanis, A., & Metaxopoulos, I. (2006). Development of a predictive model for spoilage of cooked cured meat products and its validation under constant and dynamic temperature storage conditions. Journal of Food Science, 71(6), M157-M167. McClure, P. J., Beaumont, A. L., Sutherland, J. P., & Roberts, T. A. (1997). Predictive modelling of growth of Listeria monocytogenes. The effects on growth of NaCl, ph, storage temperature and NaNO 2. International Journal of Food Microbiology, 34(3), McDonald, K., & Sun, D. (1999). Predictive food microbiology for the meat industry: a review. International Journal of Food Microbiology, 52(1-2), McKellar, R. C., & Lu, X. (2004). Modeling microbial responses in food. Boca Raton, Florida, USA: CRC Press. McKellar, R. C. (2001). Development of a dynamic continuous-discrete-continuous model describing the lag phase of individual bacterial cells. Journal of Applied Microbiology, 90(3), McKellar, R. C. (1997). A heterogeneous population model for the analysis of bacterial growth kinetics. International Journal of Food Microbiology, 36(2-3), McKellar, R. C., Modler, H. W., Couture, H., Hughes, A., Mayers, P., Gleeson, T., & Ross, W. H. (1994). Predictive modeling of alkaline phosphatase inactivation in a high-temperature shorttime pasteurizer. Journal of Food Protection, 57(5), McMeekin, T. A. (2007). Predictive microbiology: Quantitative science delivering quantifiable benefits to the meat industry and other food industries. Meat Science, 77(1), McMeekin, T. A., & Ross, T. (1996a). Shelf life prediction: status and future possibilities. International Journal of Food Microbiology, 33(1), McMeekin, T. A., & Ross, T. (1996b). Modeling applications. Journal of Food Protection, 59(3S), McMeekin, T. A., Ross, T., & Olley, J. (1992). Application of predictive microbiology to assure the 250

285 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία quality and safety of fish and fish products. International Journal of Food Microbiology, 15(1-2), McMeekin, T. A., Chandler, R. E., Doe, P. E., Garland, C. D., Olley, J., Putro, S., & Ratkowsky, D. A. (1987). Model for combined effect of temperature and salt concentration/water activity on the growth rate of Staphylococcus xylosus. Journal of Applied Microbiology, 62(6), McMillin, K. W. (2008). Where is MAP Going? A review and future potential of modified atmosphere packaging for meat. Meat Science, 80(1), 43-65,. Mendes, E., Brojo Proença, E., Ferreira, I. M. P. L. V. O., & Ferreira, M. A. (1998). Quality evaluation of Portuguese honey. Carbohydrate Polymers, 37(3), Mendoza, T. F., Welt, B. A., Otwell, S., Teixeira, A. A., Kristonsson, H., & Balaban, M. O. (2004). Kinetic parameter estimation of time-temperature integrators intended for use with packaged fresh seafood. Journal of Food Science, 69(3), Miles, D. W., Ross, T., Olley, J., & McMeekin, T. A. (1997). Development and evaluation of a predictive model for the effect of temperature and water activity on the growth rate of Vibrio parahaemolyticus. International Journal of Food Microbiology, 38(2-3), Mizrahi, S., Labuza, T. P., & Karel, M. (1970). Computer aided predictions of food storage stability. Journal of Food Science, 35, Moats, W. A., Dabrah, R., & Edwards, V. M. (1971). Interpretation of nonlogarithmic survivor curves of heated bacteria. Journal of Food Science, 36(3), Monod, J. (1949). The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology, 3(1), Montanari, R. (2008). Cold chain tracking: a managerial perspective. Trends in Food Science & Technology, 19(8), Moreira, R. F. A., De Maria, C. A. B., Pietroluongo, M., & Trugo, L. C. (2007). Chemical changes in the non-volatile fraction of Brazilian honeys during storage under tropical conditions. Food Chemistry, 104(3), Nagy, S., Lee, H., Rouseff, R. L., & Lin, J. C. C. (1990). Nonenzymic browning of commercially canned and bottled grapefruit juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38(2), Nelson, K. A., & Labuza, T. P. (1994). Water activity and food polymer science: Implications of state on Arrhenius and WLF models in predicting shelf life. Journal of Food Engineering, 22(1-4), Nelson, K. A., & Labuza, T. P. (1993). Glass transition theory and the texture of cereal foods. In J. M. V. Blanshard, & P. J. Lillford (Eds.), The Glassy State in Foods (pp ). Nottingham: 251

286 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή University Press. Nielsen, J., Nikolajsen, K., & Villadsen, J. (1991). Structured modeling of a microbial system: II. Experimental verification of a structures lactic acid fermentation model. Biotechnology and Bioengineering, 38, Notermans, S., Dufrenne, J., Teunis, P., Beumer, R., Te Giffel, M., & Peeters Weem, P. (1997). A risk assessment study of Bacillus cereus present in pasteurized milk. Food Microbiology, 14(2), Nychas, G. E., Skandamis, P. N., Tassou, C. C., & Koutsoumanis, K. P. (2008). Meat spoilage during distribution. Meat Science, 78(1-2), Nychas, G. E., & Drosinos, E. H. (1999). Meat and poultry Spoilage of meat. In Richard K. Robinson (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (pp ). Oxford: Elsevier. O Brien, G. D. (1997). Domestic refrigerator air temperatures and the public s awareness of refrigerator use. International Journal of Environmental Health Research, 7, O'Brien, J., & Morrissey, P. A. (1989). Nutritional and toxicological aspects of the Maillard browning reaction in foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 28(3), O'Connor-Shaw, R. E., & Reyes, V. G. (1999). Chilled storage of foods Use of modifiedatmosphere packaging. In Richard K. Robinson (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (pp ). Oxford: Elsevier. Patsias, A., Badeka, A. V., Savvaidis, I. N., & Kontominas, M. G. (2008). Combined effect of freeze chilling and MAP on quality parameters of raw chicken fillets. Food Microbiology, 25(4), Patsias, A., Chouliara, I., Badeka, A., Savvaidis, I. N., & Kontominas, M. G. (2006). Shelf-life of a chilled precooked chicken product stored in air and under modified atmospheres: microbiological, chemical, sensory attributes. Food Microbiology, 23(5), Patterson, M. F., & Kilpatrick, D. J. (1998). The combined effect of high hydrostatic pressure and mild heat on inactivation of pathogens in milk and poultry. Journal of Food Protection, 61(4), Peleg, M. (1997). Modeling microbial populations with the original and modified versions of the continuous and discrete logistic equations. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37, Peleg, M., & Mannheim, C. H. (1977). The mechanism of caking of powdered onion. Journal of Food Processing and Preservation, 1, Peterson, B. I., Tong, C., Ho, C., & Welt, B. A. (1994). Effect of moisture content on maillard 252

287 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία browning kinetics of a model system during microwave heating. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42(9), Petriella, C., Resnik, S. L., Lozano, R. D., & Chirife, J. (1985). Kinetics of deteriorative reactions in model food systems of high water activity: color changes due to nonenzymatic browning. Journal of Food Science, 50(3), Phillips, J. D., & Griffiths, M. W. (1987). The relation between temperature and growth of bacteria in dairy products. Food Microbiology, 4(2), Pin, C., Baranyi, J., & de Fernando, G. G. (2000). Predictive model for the growth of Yersinia enterocolitica under modified atmospheres. Journal of Applied Microbiology, 88(3), Pirt, S. J. (1965). The maintenance energy of bacteria in growing cultures. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 163(991), Powers, J. J., Lukaszewicz, W., Wheeler, R., & Dornseifer, T. P. (1965). Chemical and microbial activity rates under square-wave and sinusoidal temperature fluctuations. Journal of Food Science, 30(3), Pruitt, K. M., & Kamau, D. N. (1993). Mathematical models of bacterial growth, inhibition and death under stress conditions. Journal of Industrial Microbiology, 12, Quast, D. G., & Karel, M. (1972). Computer simulation of storage life of foods undergoing spoilage by two interactive mechanisms. Journal of Food Science, 37(5), Rahman, M. S. (2006). State diagram of foods: Its potential use in food processing and product stability. Trends in Food Science & Technology, 17(3), Rao, M. S., Pintado, J., Stevens, W. F., & Guyot, J. P. (2004). Kinetic growth parameters of different amylolytic and non-amylolytic Lactobacillus strains under various salt and ph conditions. Bioresource Technology, 94(3), Ratkowsky, D. A. (2004). Model fitting and uncertainty. In R. C. McKellar, & X. Lu, (Eds.) Modelling Microbial Responses in Foods (pp ). Boca Raton, Florida, USA: CRC Press. Ratkowsky, D. A., Ross, T., Macario, N., Dommett, T. W., & Kamperman, L. (1996). Choosing probability distributions for modelling generation time variability. Journal of Applied Bacteriology, 80(2), Ratkowsky, D. A., & Ross, T. (1995). Modelling the bacterial growth/no growth interface. Letters in Applied Microbiology, 20(1), Ratkowsky, D. A., Lowry, R. K., McMeekin, T. A., Stokes, A. N., & Chandler, R. E. (1983). Model for bacterial culture growth rate throughout the entire biokinetic temperature range. Journal of Bacteriology, 154(3),

288 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., & Ball, A. (1982). Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology, 149(1), 1-5. Rattanathanalerk, M., Chiewchan, N., & Srichumpoung, W. (2005). Effect of thermal processing on the quality loss of pineapple juice. Journal of Food Engineering, 66(2), Recondo, M. P., Elizalde, B. E., & Buera, M. P. (2006). Modeling temperature dependence of honey viscosity and of related supersaturated model carbohydrate systems. Journal of Food Engineering, 77(1), Reichel, M. P., Phillips, D. M., Jones, R., & Gill, C. O. (1991). Assessment of the hygienic adequacy of a commercial hot boning process for beef by a temperature function integration technique. International Journal of Food Microbiology, 14(1), Reynolds, T. M. (1963). Chemistry of Non-enzymic browning I. The reaction between aldoses and amines. Advances in Food Research, 12, Roos, Y., & Karel, M. (1991). Water and molecular weight effects on glass transitions in amorphous carbohydrates and carbohydrate solutions. Journal of Food Science, 56(6), Rose, S. A., Steadman, S., & Brunskill, R. (1990). A temperature survey of domestic refrigerators. CCFRA Technical Memorandum, No 577. Ross, T., & Dalgaard, P. (2004). Secondary models. In R. C. McKellar, & X. Lu (Eds.), Modeling Microbial Responses in Foods (pp ). Boca Raton, FLorida, USA: CRC Press. Ross, T., McMeekin, T. A., & Baranyi, J. (1999). Predictive microbiology and food safety. In Richard K. Robinson (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (pp ). Oxford: Elsevier. Ross, T., & McMeekin, T. A. (1995). Predictive microbiology and HACCP. In Anonymous Advances in meat research: HACCP in meat, poultry and fish processing 10 (pp ). UK: Chapman and Hall. Ross, T., & McMeekin, T. A. (1994). Predictive microbiology. International Journal of Food Microbiology, 23(3-4), Ross, T. (1996). Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology. Journal of Applied Bacteriology, 81, Ross, T. (1993). Belehradek-type models. Journal of Industrial Microbiology, 12, Ross, T., Neumeyer, K., Kamperman, N. L., & McMeekin, T. A. (1993). In defense of predictive microbiology. Australian Microbiology, 7, Ross, W. H., Couture, H., Hughes, A., Mayers, P., Gleeson, T., & McKellar, R. C. (1998). A non- 254

289 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία linear random coefficient model for the destruction of Enterococcus faeciumin a hightemperature short-time pasteurizer. Food Microbiology, 15(6), Samelis, J., Kakouri, A., & Rementzis, J. (2000). Selective effect of the product type and the packaging conditions on the species of lactic acid bacteria dominating the spoilage microbial association of cooked meats at 4 C. Food Microbiology, 17(3), Sauvageot, F., & Blond, G. (1991). Effect of water activity on crispness of breakfast cereals. Journal of Texture Studies, 22(4), Schoolfield, R. M., Sharpe, P. J. H., & Magnuson, C. E. (1981). Non-linear regression of biological temperature-dependent rate models based on absolute reaction-rate theory. Journal of Theoretical Biology, 88(4), Seber, G. A. F., & Wild, C. J. (1989). Growth models. In Anonymous Nonlinear Regression (pp ). New York: John Willey & Sons. Sergelidis, D., Abrahim, A., Sarimvei, A., Panoulis, C., Karaioannoglou, P., & Genigeorgi, C. (1997). Temperature distribution and prevalence of Listeria spp. in domestic, retail and industrial refrigerators in Greece. International Journal of Food Microbiology, 34, Sharpe, P. J. H., & DeMichele, D. W. (1977). Reaction kinetics of poikilotherm development. Journal of Theoretical Biology, 64(4), Shierwin, C. P., & Labuza, T. P. (2003). Role of moisture in Maillard browning reaction rate in intermediate moisture foods: comparing solvent phase and matrix properties. Journal of Food Science, 68(2), Shimoni, E., Anderson, E. M., & Labuza, T. P. (2001). Reliability of time temperature indicators under temperature abuse. Journal of Food Science, 66(9), Simon, I., Labuza, T. P., & Karel, M. (1971). Computer aided predictions of food storage stability: oxidative deterioration of a shrimp product. Journal of Food Science, 36(2), Skinner, G. E., & Larkin, J. W. (1998). Conservative prediction of time to Clostridium botulinum toxin formation for use with time-temperature indicators to ensure the safety of foods. Journal of Food Protection, 61(9), Skinner, G. E., Larkin, J. W., & Rhodehamel, E. J. (1994). Mathematical modeling of microbial growth: a review. Journal of Food Safety, 14(3), Slade, L., Levine, H., & Finley, J. (1989). Protein-water interactions: Water as a plasticizer of gluten and other protein polymers. In R. Phillips, & J. Finley (Eds.), Protein Quality and the Effects of Processing (pp ). New York, USA: Marcel Dekker. Slade, L., & Levine, H. (1991). Beyond water activity: recent advances based on an alternative 255

290 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή approach to the assessment of food quality and safety. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 30(2-3), Smolander, M., Alakomi, H., Ritvanen, T., Vainionpää, J., & Ahvenainen, R. (2004). Monitoring of the quality of modified atmosphere packaged broiler chicken cuts stored in different temperature conditions. A. Time temperature indicators as quality-indicating tools. Food Control, 15(3), Soldatou, N., Nerantzaki, A., Kontominas, M. G., & Savvaidis, I. N. (2009). Physicochemical and microbiological changes of Souvlaki A Greek delicacy lamb meat product: Evaluation of shelf-life using microbial, colour and lipid oxidation parameters. Food Chemistry, 113(1), Sørheim, O., Erlandsen, T., Nissen, H., Lea, P., & Høyem, T. (1997). Effects of modified atmosphere storage on colour and microbiological shelf life of normal and pale, soft and exudative pork. Meat Science, 47(1-2), Spencer, R., & Baines, C. R. (1967). The effect of temperature on the spoilage of wet white fish. I. Storage at constant temperature between -1 and 25 C. Food Technology, 18, Stamp, J. A., & Labuza, T. P. (1983). Kinetics of the Maillard reaction between aspartame and glucose in solution at high temperatures. Journal of Food Science, 48(2), Stannard, C. J., Williams, A. P., & Gibbs, P. A. (1985). Temperature/growth relationships for psychrotrophic food-spoilage bacteria. Food Microbiology, 2(2), Sugisaki, M., Suga, H., & Seki, S. (1968). Calorimetric study of the glassy state IV. Heat capacities of glassy water and cubic ice. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 41, Sutherland, J. P., Bayliss, A. J., Braxton, D. S., & Beaumont, A. L. (1997). Predictive modelling of Escherichia coli O157:H7: Inclusion of carbon dioxide as a fourth factor in a pre-existing model. International Journal of Food Microbiology, 37(2-3), Sutherland, J. P., Aherne, A., & Beaumont, A. L. (1996). Preparation and validation of a growth model for Bacillus cereus: the effects of temperature, ph, sodium chloride and carbon dioxide. International Journal of Food Microbiology, 30(3), Taoukis, P. S., Giannakourou, M. C., Koutsoumanis, K., & Bakalis, S. (2005). Modelling the effect of house hold chilled storage conditions on the risk distribution in meat products. In 3rd international symposium on applications of modelling, as an innovative technology in the Agri- Food Chain. Leuven, Belgium. Taoukis, P. S., & Labuza, T. P. (2003). Time-temperature indicators (TTIs). In R. Ahvenainen, (Ed.), Novel Food Packaging Techniques, (pp ). Cambridge, UK: Woodhead Publishing Ltd. 256

291 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Taoukis, P. S. (2001). Modelling the use of time-temperature indicators in distribution and stock rotation. In L.M.M. Tijskens, M.L.A.T.M. Hertog, & B.M. Nicolaï (Eds.), Food Process Modelling (pp ). Washington DC, USA: CRC Press. Taoukis, P. S., Koutsoumanis, K., & Nychas, G. J. E. (1999). Use of time temperature integrators and predictive modelling for shelf life control of chilled fish under dynamic storage conditions. International Journal of Food Microbiology, 53(1), Taoukis, P. S., & Labuza, T. P. (1996). Summary: Integrative concepts. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (pp ). New York: Marcel Dekker Inc. Taoukis, P. S., & Labuza, T. P. (1989a). Applicability of time-temperature indicators as shelf life monitors of food products. Journal of Food Science, 54(4), Taoukis, P. S., & Labuza, T. P. (1989b). Reliability of time-temperature indicators as food quality monitors under nonisothermal conditions. Journal of Food Science, 54(4), Terpstra, M. J., Steenbekkers, L. P. A., de Maetelaere, N. C. M., & Nijhuis, S. (2005). Food storage and disposal: Consumer practices and knowledge. British Food Journal, 107(7), Tolstoy, A. (1991). Practical monitoring of the chill chain. International Journal of Food Microbiology, 13(3), Toribio, J. L., & Lozano, J. Ε. (1986). Heat induced browning of clarified apple juice at high temperatures. Journal of Food Science, 51(1), ,179. Toribio, J. L., & Lozano, J. E. (1984). Nonezymatic browning in apple juice concentrate during storage. Journal of Food Science, 49(3), Tosi, E., Martinet, R., Ortega, M., Lucero, H., & Ré, E. (2008). Honey diastase activity modified by heating. Food Chemistry, 106(3), Tosi, E., Ciappini, M., Ré, E., & Lucero, H. (2002). Honey thermal treatment effects on hydroxymethylfurfural content. Food Chemistry, 77(1), Tsironi, T., Gogou, E., Velliou, E., & Taoukis, P. S. (2008). Application and validation of the TTI based chill chain management system SMAS (Safety Monitoring and Assurance System) on shelf life optimization of vacuum packed chilled tuna. International Journal of Food Microbiology, 128(1), Tsoubeli, M., & Labuza, T. P. (1991). Accelerated kinetic study of aspartame degradation in the neutral ph range. Journal of Food Science, 56(6), Turkmen, N., Sari, F., Poyrazoglu, E. S., & Velioglu, Y. S. (2006). Effects of prolonged heating on antioxidant activity and colour of honey. Food Chemistry, 95(4),

292 Βαϊκούση Χαρίκλεια Διδακτορική Διατριβή Vaikousi, H., Koutsoumanis, K., & Biliaderis, C. G. (2008a). Kinetic modelling of non-enzymatic browning of apple juice concentrates differing in water activity under isothermal and dynamic heating conditions. Food Chemistry, 107(2), Vaikousi, H., Biliaderis, C. G., & Koutsoumanis, K. P. (2008b). Development of a microbial Time/Temperature Indicator prototype for monitoring the microbiological quality of chilled foods. Applied and Environmental Microbiology, 74(10), Valík, L., & Piecková, E. (2001). Growth modelling of heat-resistant fungi: the effect of water activity. International Journal of Food Microbiology, 63(1-2), van Boekel, M. A. J. S. (2001). Kinetic aspects of the Maillard reaction: a critical review. Nahrung/Food, 45(3), van Boekel, M. A. J. S. (1996). Statistical aspects of kinetic modeling for food science problems. Journal of Food Science, 61(3), Van Garde, S. J., & Woodburne, M. J. (1987). Food discard practices of households. Journal of the American Dietetic Association, 87, Van Impe, J. F., Nicolai, B. M., Martens, T., De Baerdemaeker, J., & Vandewalle, J. (1992). Dynamic mathematical model to predict microbial growth and inactivation during food processing. Applied and Environmental Microbiology, 58(9), Van Impe, J. F., Nicolaï, B. M., Schellekens, M., Martens, T., & De Baerdemaeker, J. (1995). Predictive microbiology in a dynamic environment: a system theory approach. International Journal of Food Microbiology, 25(3), Vermeiren, L., Devlieghere, F., & Debevere, J. (2004). Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for the biopreservation of cooked meat products. International Journal of Food Microbiology, 96(2), Wells, J. H., & Singh, R. P. (1989). A quality based inventory issue policy for perishable foods. Journal of Food Processing and Preservation, 12(4), Whistler, R. L., & Daniels, J. R. (1985). Carbohydrates. In O. R. Fennema (Ed.), Food Chemistry (pp ). New York: Marcel Dekker Inc. White Jr., J. W. (1978). Honey. In C.O. Chichester (Ed.), Advances in Food Research, v24 (pp ): Academic Press. White, J. (1994). The role of HMF and diastase in honey quality evaluation. Bee world, 75(3), Whiting, R. C., Sackitey, S., Calderone, S., Morely, K., & Phillips, J. G. (1996). Model for the survival of Staphylococcus aureus in nongrowth environments. International Journal of Food 258

293 Διδακτορική Διατριβή 6. Βιβλιογραφία Microbiology, 31(1-3), Whiting, R. C., & Buchanan, R. L. (1994). Microbial modeling. Food Technology, 48(6), Whiting, R. C. (1993). Modeling bacterial survival in unfavorable environments. Journal of Industrial Microbiology, 12(3-5), Whiting, R. C., & Buchanan, R. L. (1993). A classification of models for predictive microbiology. Food Microbiology, 10(2), Williams, M. L., Landel, R. F., & Ferry, J. D. (1955). The Temperature dependence of Relaxation Mechanisms in amorphous polymers and other glass-forming liquids. Journal of the American Chemical Society, 77(14), Wimptheimer, L., Altman, N. S., & Hotchkiss, J. H. (1990). Growth of Listeria monocytogenes Scott A, serotype 4 and competitive spoilage organisms in raw chicken packaged under modified atmospheres and in air. International Journal of Food Microbiology, 11(3-4), Wolfrom, M. L., Kashimura, N., & Horton, D. (1974). Detection of Maillard browning reaction products as trimethylsilyl derivatives by gas-liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 22(5), Worsfold, D., & Griffith, C. (1997). Food safety behaviour in the home. British Food Journal, 93(3), Yan, S., Huawei, C., Limin, Z., Fazheng, R., Luda, Z., & Hengtao, Z. (2008). Development and characterization of a new amylase type time temperature indicator. Food Control, 19(3), Zamora, M. C., & Zaritzky, N. E. (1985). Modeling of microbial growth in refrigerated packaged beef. Journal of Food Science, 50(4), Zwietering, M. H., Rombouts, F. M., & Van 't Riet, K. (1993). Some aspects of modelling microbial quality of food. Food Control, 4(2), Zwietering, M. H., de Koos, J. T., Hasenack, B. E., de Witt, J. C., & van't Riet, K. (1991). Modeling of bacterial growth as a function of temperature. Applied and Environmental Microbiology, 57(4), Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., & Van t Riet, K. (1990). Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology, 56(6), Ξανθιάκος, Κ. (2006). Ανάπτυξη εργαλείων και συλλογή / ανάλυση δεδομένων για τον προσδιορισμό επικινδυνότητας της L. monocytogenes σε παστεριωμένο γάλα σε συνθήκες της ελληνικής ψυκτικής αλυσίδας. Μεταπτυχιακή διατριβή. 259

294

295 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Κατάλογος δημοσιεύσεων 1. Vaikousi, H., Koutsoumanis, K., and Biliaderis, C.G., Kinetic modelling of nonenzymatic browning of apple juice concentrates differing in water activity under isothermal and dynamic heating conditions. Food Chemistry, 107, Vaikousi, H., Biliaderis, C.G., and Koutsoumanis, K.P., Development of a Microbial Time/Temperature Indicator Prototype for Monitoring the Microbiological Quality of Chilled Foods. Applied and Environmental Microbiology, 74, Vaikousi, H., Koutsoumanis, K., and Biliaderis, C.G., Kinetic modelling of nonenzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (in press). 4. Vaikousi, H., Biliaderis, C.G., and Koutsoumanis, K.P., Applicability of a microbial Time Temperature Indicator (TTI) for monitoring spoilage of modified atmosphere packed minced meat. International Journal of Food Microbiology (in press).

296

297 Παρουσιάσεις σε συνέδρια 1. Vaikousi, H., Koutsoumanis K. and Biliaderis C.G Kinetic modelling of non enzymatic browning of apple juice concentrates differing in water activity under variable heating conditions. ICBF-2006, 2 nd International Congress on Bioprocesses in Food Industries, June, Rio, Patras, Greece (oral presentation). 2. Vaikousi, H., Koutsoumanis K., and Biliaderis C.G Kinetic Model Development As A Prediction Tool For The Study οf Non Enzymatic Browning During Heating Of Apple Juice Concentrates And Honey Differing In Water Activity, 5 th International Congress on Food Technology, 9-11 Μarch, Thessaloniki, Greece (poster). 3. Vaikousi, H., Biliaderis, C.G., and Koutsoumanis, K Development of a Microbial Time Temperature Indicator (TTI) for Monitoring Microbiological Quality of Foods, 5 th ICPMF, International Conference Predictive Modelling in Foods, September, Athens, Greece (oral presentation). 4. Βαϊκούση, Χ., Μπιλιαδέρης, Κ., Κουτσουμανής, Κ Ανάπτυξη ενός μικροβιακού χρονοθερμοκρασιακού δείκτη (Time Temperature Ιndicator, TTI) για την παρακολούθηση της ποιότητας των τροφίμων 1 o Πανελλήνιο Συνέδριο Συσκευασίας Τροφίμων & Ποτών, Μαρτίου Αθήνα, Ελλάδα (προφορική παρουσίαση). 2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο ΔΕΔΥΤ, Σύγχρονες Διατροφικές Προκλήσεις στην Ποιότητα και Ασφάλεια των Τροφίμων, 6-8 Ιουνίου, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα (προφορική παρουσίαση). 22 ο Συνέδριο Ενόπλων Δυνάμεων, 6-9 Νοεμβρίου, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα (προφορική παρουσίαση). 5. Βαϊκούση, Χ., Μπιλιαδέρης, Κ., Κουτσουμανής, Κ Ανάπτυξη ενός μικροβιακού χρονοθερμοκρασιακού δείκτη (Time Temperature Ιndicator, TTI) για την παρακολούθηση της ποιότητας προϊόντων νωπού κρέατος, 1 ο Πανελλήνιο Συνέδριο για το κρεας και τα προϊοντα του «από το στάβλο στο πιάτο» Οκτωβρίου 2008, Πειραιάς, Ελλάδα (προφορική παρουσίαση). 6. Βαϊκούση, Χ., Μπιλιαδέρης, Κ., Κουτσουμανής, Κ. Ανάπτυξη ενός προτύπου μικροβιακού χρονο-θερμοκρασιακού δείκτη (Time Temperature Ιndicator, TTI) για την παρακολούθηση της μικροβιολογικής ποιότητας των τροφίμων Ιδρυμα Αριστείδης Δασκαλόπουλος, 2 ο Διεθνές Συνέδριο Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής 2 ος Διεθνής Διαγωνισμός Ερευνητικών Εργασιών σε θέματα: Α/ Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Ασφάλειας Τροφίμων Β/ Επιστήμης Διατροφής Διατροφής και Υγείας, 9 Απριλίου 2009, Αθήνα, 2 ο Βραβείο Α Ενότητας.

298

299 Δημοσιευμένες Εργασίες

300

301 Available online at Food Chemistry 107 (2008) Food Chemistry Kinetic modelling of non-enzymatic browning of apple juice concentrates differing in water activity under isothermal and dynamic heating conditions Hariklia Vaikousi a, Konstantinos Koutsoumanis b, Costas G. Biliaderis a, * a Laboratory of Food Chemistry and Biochemistry, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, P.O. Box 256, Aristotle University, Thessaloniki, Greece b Laboratory of Food Hygiene and Microbiology, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki, Greece Received 16 July 2007; received in revised form 30 July 2007; accepted 27 August 2007 Abstract The kinetics of non-enzymatic browning in apple juice concentrates were investigated. The effect of a w (in the range of ) and/ or reactant concentration on brown pigment formation was monitored under isothermal heat treatment at four temperatures (60, 70, 80 and 90 C) in apple juice solutions having either the same or different concentrations of reactant solutes. The extent of the Maillard reaction was evaluated by spectrophotometric measurements at 420 nm (A 420 ). The absorbance time curves were fitted to five different kinetic models (zero and first order, weibull, logistic and the parabolic model) and estimates of browning rate constants and other model parameters were obtained. Regression analysis revealed that the logistic model was the most appropriate for describing browning in apple juice. The initial reactant concentration, but not water activity, had a significant effect on the colour change of apple juice. The processing temperature also had a strong impact on browning kinetics. Secondary models, expressing the dependence of the best fitted primary model parameters on temperature and a w, were further developed and validated by comparing the predicted model parameters with the values observed in independent isothermal experiments. Finally, the derived model was further evaluated against the observed browning responses of apple juice under dynamic heating conditions, underlining the applicability of the developed model as a practical prediction tool for the study of non-enzymatic browning. Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Apple juice; Kinetic modelling; Non-enzymatic browning; Effect of a w ; Reactant concentration; Dynamic conditions 1. Introduction * Corresponding author. Tel.: /471467; fax: address: biliader@agro.auth.gr (C.G. Biliaderis). Thermal processing is commonly practised to extend the shelf life of fruit products. However, heating processes can affect the quality of product, leading to consumer dissatisfaction (Rattanathanalerk, Chiewchan, & Srichumpoung, 2005). Such problems are often attributed to non-enzymatic browning reactions that involve caramelization, ascorbic acid degradation and formation of Maillard reaction products. The Maillard reaction taking place between a-amino groups and reducing sugars is the most important cause of browning in apple juice (Toribio & Lozano, 1984). Maillard browning may be desirable during processing of some food products, as in the manufacture of coffee, tea, beer and bread baking, since it improves colour, aroma, and flavour (Carabasa-Giribet & Ibarz-Ribas, 2000; Eskin, 1990; Martins, Jongen, & van Boekel, 2001). On the other hand, it may be undesirable in concentrated, intermediate moisture and dried foods, since maximum reaction rate occurs at water activities of (Eskin, 1990). In addition, it causes loss of nutrients (e.g lysine), formation of undesirable compounds, e.g. furfural and 5-hydroxymethylfurfural /$ - see front matter Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi: /j.foodchem

302 786 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) (HMF), and finally brown pigment formation (Buedo, Elustondo, & Urbicain, 2001; Labuza & Baiser, 1992; Martins et al., 2001). Several methods have been suggested for quantifying the development of browning components, including both colour measurements and chemical analysis. Visual colour change of fruit products has often been described by recording the CIE-Lab colour indices (Burdurlu & Karadeniz, 2003; Garza, Ibarz, Pagan, & Giner, 1999; Ibarz, Pagan, & Garza, 1999; Ibarz, Pagan, & Garza, 2000). Spectrophotometric measurements, and in particular absorbance at 420 nm, is the most common method for brown pigment detection (Labuza & Baiser, 1992), while the formation of 5-hydroxymethylfurfural has been widely used as an indicator to monitor intermediate stage products (Bozkurt, Gogus, & Eren, 1999; Burdurlu & Karadeniz, 2003; Cohen, Birk, Mannheim, & Saguy, 1998; Garza et al., 1999; Ibarz et al., 1999; Ibarz et al., 2000; Rattanathanalerk et al., 2005). Finally, fluorescence measurements have also been reported in the literature as a quality deterioration index of apple juice during thermal processing (Cohen et al., 1998). The complexity of Maillard reaction, consisting of many parallel and consecutive reactions with various components, reveals a great difficulty in studying the phenomenon by means of a simple analytical chemical method that would adequately describe the whole process. The most common method for characterizing browning is the measurement of colour development as a function of time and its expression in terms of kinetics of the reaction, which is described by the reaction rate constant. Many researchers have reported the appearance of brown pigments as following either zero order or first order kinetics (Cohen, Birk, Mannheim, & Saguy, 1994; Stamp & Labuza, 1983; Toribio & Lozano, 1986). An important aspect is also to know the effect of temperature on browning kinetics and how the chemical environment of a food system, including water activity, ph and chemical composition, affects the kinetics of the reaction (Carabasa-Giribet & Ibarz-Ribas, 2000). Browning rate is strongly influenced by environmental factors, such as temperature and water activity. With respect to moisture content, the accepted scenario is that the rate of browning increases from the dry state, starting at a critical a w of for most foods, to a maximum at water activity of and then decreases at higher water activities as a result of dilution of the reactant species (Labuza & Baiser, 1992). Although many researchers have claimed that browning rate is not simply related to water activity, but rather to the amount of water and its state (degree of binding) in a particular system, no studies have dealt with the individual effect of a w in liquid systems under a fixed concentration of reactant solutes. In this study, kinetic modelling was used to investigate non-enzymatic browning of heated apple juice concentrates in preparations having either the same or different initial reactant concentrations in the same range of water activity variation. The main objectives were: (a) to evaluate the effect of reactant solutes and a w on the kinetics of browning, (b) to develop a kinetic model able to describe the extent of browning as a function of time, temperature and a w under isothermal heating conditions and (c) to determine whether the model developed using data derived from steady state heating conditions could be applied to predict actual browning of apple juice under non-isothermal heating with fluctuating temperature-time processing protocols. 2. Materials and methods 2.1. Sample preparation A commercial apple juice concentrate (a w 0.740, 70 Bx) was offered by a Greek juice processing firm and kept in the freezer ( 20 C) for the entire experimental time period. This product was the concentrated parent solution for all sample preparations used in this study. Sorbitol was purchased from Sigma Aldrich Co. (Gillingham, Dorset). The initial apple juice concentrate, warmed first to room temperature, was either diluted with distilled water or mixed with sorbitol solutions (the variation of sorbitol concentration led to variations in the water activity of the solutions produced) to obtain ten (10) solutions of apple juice in the same range of a w levels (0.74, 0.82, 0.87, 0.93 and 0.99). These two groups of solutions differed in the initial concentration of reactant sugars. In the first group of juice solutions (prepared after dilution with distilled water), the reactant sugars content varied from 70 to Bx, following, respectively, the above mentioned water activity range. However, the second group of juice solutions (those where the concentrated juice was mixed with appropriate portions of sorbitol water solutions, keeping the volume ratio of the mixed liquids constant) had the same concentration of reactant sugars, starting with an initial diluted juice system fixed at Bx. The use of sorbitol as a non-reacting humectant allowed evaluation of the a w effect on brown colour development independently of reactant concentration. Water activity measurements (a w ) of all samples at initial and final treatment times were made using a water activity meter (Aqualab, Model series 3TE, Decagon Devices Incorporation, Pullman, Washington) at 20 C Isothermal heating and spectrophotometric measurements The ten apple juice preparations, differing in a w and/or concentration of reactant sugars, were placed in hermetically sealed glass test tubes and heated isothermally at 60, 70, 80 or 90 C. At each sampling time, two replications at every temperature and a w combination were conducted. At proper time intervals, the tubes were withdrawn, rapidly cooled on ice and stored in the freezer until the time of analysis. All concentrated apple juice samples were diluted to Bx (solid contents at the level of commercial

303 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) reconstituted juice) prior to analysis. The extent of brown pigment formation was evaluated spectrophotometrically on a UV Vis spectrophotometer (SP-8001 UV Vis, Metertech Inc.) by measuring the absorbance in 10 mm cells against water at 420 nm as a function of time. All samples were further diluted, when necessary, to obtain reliable absorbance readings in the range of units, to satisfy the linearity requirement between absorbance readings and concentration of colorants, according to Beer s law. Thus, eighty (80) absorbance time curves were derived for the description of non-enzymatic browning (NEB) kinetics of apple juice samples. In addition, in an independent experiment, three apple juice samples with a w levels of 0.74, 0.85 and 0.96, prepared by dilution of the concentrated apple juice with distilled water, were heated isothermally at 65, 75 or 85 C. The kinetics of brown pigment formation, as absorbance measurements at 420 nm, were again followed. The data obtained from this independent experiment were used for the validation of the model. It is important to mention that, although the long treatment times used in this study are rather excessive for actual food processing protocols, they are useful for getting a complete kinetic description of the browning reaction Model development The data from 80 absorbance time curves (four heating temperatures, five a w levels, two groups of solutions and two replications for each of the above combinations) were fitted to five different primary kinetic models, using the TableCurve TM 2D software (v4, SPSS Inc.) according to the following equations: the pseudo zero order model, A ¼ A 0 þ kt ð1þ the pseudo first order model, A ¼ A 0 expðktþ the parabolic model (Buedo et al., 2001), pffiffiffiffiffi 2 A ¼ þ kt ð3þ A 0 the weibull model, A ¼ A max þða 0 A max Þ exp½ ðktþ b Š ð4þ and the logistic model, A max A 0 A ¼ A 0 þ ð5þ 1 þ exp½ kðt t i ÞŠ where A is the absorbance measured at 420 nm at time t, A 0 is the initial absorbance (t = 0) at the same wavelength, k is the browning rate constant (h 1 ), A max is the maximum absorbance, b is the shape constant in the weibull model (Eq. (4)) and t i is the time (in h) when half of the maximum absorbance is reached in the logistic model (Eq. (5)). The estimates of browning reaction rate constants (k) and other model parameters were then fitted to secondary ð2þ models. Four different models describing the individual and combined effects of temperature and a w on k were used and comparatively evaluated. One of the models was the following modified Arrhenius model: ln k ¼ ln k ref þ dða w a w ref Þ E a R 1 T 1 T ref where T is the absolute temperature (K), E a is the activation energy (kj/mol), R is the universal gas constant (8.314 J/mol K), T ref is the reference temperature (373 K or 100 C), a w ref is the reference water activity equal to 1, k ref is the rate constant value (h 1 ) at reference temperature and reference a w and d is a constant expressing the effect of water activity on k. Another model, based on the general Belehradek equation for biological growth rate, and here expressing temperature and a w dependence of the non-enzymatic browning rate constant, given by the following equation, was examined: p ffiffi k p ¼ bðt T min Þ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi a w max a w where T is the temperature ( C), T min and a w max are estimated parameters expressing the theoretical minimum temperature and maximum a w for browning to commence, while b represents a constant. Finally, two quadratic response surface models fitted either estimated k values or the square root of k values, as expressed by the polynomial equations given below: k ¼ a 1 þða 2 T Þþða 3 a w Þþða 4 T a w Þ þða 5 T 2 Þþða 6 a 2 w pffiffi Þ k ¼ a1 þða 2 T Þþða 3 a w Þ þða 4 T a w Þþða 5 T 2 Þþða 6 a 2 w Þ where T is the heating temperature ( C), and a 1 through a 6 are estimated coefficients. Secondary models were also fitted to other parameters derived from the primary models, such as maximum absorbance A max and t i in the case of the logistic model. The modified Arrhenius model and the polynomial equations of A max,lna max, t i,andlnt i were again tested for expressing the individual and combined effects of temperature and a w (Eqs. (6) and (8)) on these parameters. TableCurve TM 3D software (v3, SPSS Inc.) was used for fitting of the secondary models (Eqs. (6) (9)) and analysis of variance. The statistically significant parameters of the models were determined by stepwise regression analysis (F-value) Model validation The obtained secondary mathematical models describing the rate constant, k, as the most important parameter were validated by comparing predicted browning rate constants with values observed in independent experiments at ð6þ ð7þ ð8þ ð9þ

304 788 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) three different heating temperatures (65, 75, 85 C) and a w levels (0.74, 0.85, 0.96). Finally, the general model derived from the experimental data was validated against measured brown pigment formation under non-isothermal heating conditions using different dynamic temperature scenarios of periodic temperature changes from 65 to 85 C. The fluctuating time temperature protocols studied here were recorded using a Hobo U12 Stainless Temp Data Logger (Onset Computers Corporation, southern MA USA) and the accompanied Hoboware TM software (version2). 3. Results and discussion 3.1. Absorbance evolution under isothermal heating conditions Absorbance at 420 nm has generally been used to determine non-enzymatic browning in fruit juices as a quick and easy method for monitoring the extent of the reaction (Bozkurt et al., 1999; Burdurlu & Karadeniz, 2003; Cohen et al., 1998; Garza et al., 1999; Ibarz et al., 1999; Johnson, Braddock, & Chen, 1995; Koca, Burdurlu, & Karadeniz, 2003; Manso, Oliveira, Oliveira, & Frias, 2001; Nagy, Lee, Rouseff, & Lin, 1990; Rattanathanalerk et al., 2005; Toribio & Lozano, 1984). Isothermal heating of all apple juice samples progressively resulted in juice darkening and formation of brown pigments as recorded by the absorbance evolution during the heating period. With respect to temperature dependence of NEB kinetics of apple juice concentrates, Fig. 1 reveals the strong impact of increasing the processing temperature on the rate of colour development. The temperature effect was similar for solutions having either the same (Fig. 1a) or different initial concentrations of reactant sugars (Fig. 1b), with the latter case being the more pronounced. On the other hand, regarding the effect of a w on NEB reaction kinetics, some interesting observations were made. Solutions with the same initial concentration of reactant sugars (Fig. 2a and b), gave similar browning kinetic plots, regardless of their differences in water activity; the effect of a w for the group of solutions with incorporated sorbitol was not statistically significant (P > 0.05). In contrast, the juice concentrates diluted with water exhibited higher browning rate constants with decreasing water activity (Fig. 2c and d). This classic behaviour of brown pigment formation enhancement of concentrated systems has also been reported by other researchers (Baisier & Labuza, 1992). Toribio and Lozano (1984), investigating non-enzymatic browning of apple juice concentrates, reported advanced colour development with increasing solid content (from 65 to 70 and finally 75 Bx) and/or decreasing water activity at all storage temperatures tested. The same authors in a later study (Toribio & Lozano, 1986) found that the browning reaction rate of clarified apple juice depended, among other factors on soluble solids, and critically on the total amino acid content. Comparable, higher rate constants for non-enzymatic browning in heated orange juice and orange juice serum with increasing solid concentration were reported by Johnson et al. (1995). Water activity is frequently mentioned as an important factor affecting non-enzymatic browning reaction rates. The question is whether or not this is a specific effect of water activity, or more an effect of concentration and diffusion. In general, the rate of browning increases from the dry state to a maximum at a water activity of and then decreases at higher water activities (Labuza & Baiser, 1992). Solute mobility is limited below the monolayer due to the higher binding energy and the glassy state that forms (Levine & Slade, 1989). When the water activity is increased, the solutes become more mobile, they can a Abs (420nm) a w C 70 C 80 C 90 C b Abs (420 nm) a w C 70 C 80 C 90 C Time (h) Time (h) Fig. 1. Absorbance time plots of browning kinetics for apple juice concentrates of similar a w but varying in reactant sugar concentration at different heating temperatures: (a) diluted juice concentrate adjusted to the denoted a w level with the addition of sorbitol; (b) juice concentrate diluted with distilled water to the denoted a w.

305 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) a Abs (420nm) C c Abs (420 nm) C 5 5 b Abs (420nm) Time (h) C d Abs (420 nm) Time (h) C Time (h) Time (h) Fig. 2. Absorbance time plots of browning kinetics for apple juice concentrates differing in a w and having the same (a,b) or different (c,d) initial concentration of reactant sugars upon heating at 70 and 90 C. dissolve, water is more mobile and the system enters a rubbery state, giving increased rate constants (Labuza & Baiser, 1992). The rate of browning decreases again at higher water activities ( ), probably due to the increased dilution effect on solute concentration (Eichner & Karel, 1972). This explains the maximum often observed when the rate of non-enzymatic browning reaction is plotted as a function of water activity. In the present study, the levels of a w were not low enough to clearly confirm the trend of decline in the reaction rate. Returning to the lack of dependence of browning reaction rates on water activity when the initial concentration of reactant sugars was constant at Bx (Fig. 2a and b), this finding indicates the enhanced browning phenomenon in concentrated juice as compared to a diluted system; this can be mainly attributed to the higher initial concentration of sugars rather than the decreased value of water activity, reaching the region where the maximum of browning rates usually occurs. Thus, it is the mass of water rather than the a w, that should correlate with reaction rate, as reported by Shierwin and Labuza (2003). In the latter study, the non-enzymatic browning of powders varying in water activity and humectant content (glycerol, sorbitol) was studied. The samples containing sorbitol as humectant gave NEB rates similar to a system free of humectant, whereas samples containing glycerol showed greater reaction rates over the entire a w and moisture content range studied ( ); the responses for the glycerol-containing system were attributed to the higher molecular mobility of this humectant than of sorbitol. Those results were in agreement with the findings of the present study, since apple juice solutions with incorporated sorbitol, at any concentration, showed absorbance evolution (Fig. 2a and b) similar to solutions of the same reactant concentration but without added sorbitol, as produced by dilution with distilled water (curves with diamond patterns in Fig. 2c and d). Thus, despite the strong viscosifying effect of sorbitol, when added in large proportion to the aqueous solution, the overall mobility of reactants in the system is high enough for browning to occur at the same rate.

306 790 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) Model development Abs at 420 nm C - a w Comparison of the fitting of primary models Experimental data from a total of 80 absorbance time curves were fitted to the five primary kinetic models, as given in Section 2.3 (Eqs. (1) (5)). Previous studies of the non-enzymatic browning have revealed that this reaction fits either zero order (Bozkurt et al., 1999; Burdurlu & Karadeniz, 2003; Ibarz et al., 1999; Koca et al., 2003; Peterson, Tong, Ho, & Welt, 1994; Rattanathanalerk et al., 2005; Shierwin & Labuza, 2003), or first order (Garza et al., 1999; Johnson et al., 1995; Toribio & Lozano, 1984, 1986) kinetic models, with relatively small statistical differences between the two types. A parabolic kinetic model has also been applied by Buedo et al. (2001). Most authors tend to model non-enzymatic browning as a zero order reaction after some induction period, which depends on experimental conditions such as time and temperature (Van Boekel, 2001). By contrast, those who propose first order kinetics for the absorbance variation, claim that the fit of this model improves with increasing reactant concentration (Johnson et al., 1995). However, some researchers have suggested that the true order of non-enzymatic browning reactions may be between zero and one (Nagy et al., 1990; Petriella, Resnik, Lozano, & Chirife, 1985). Thus, since the reaction order of non-enzymatic browning is a debatable issue, this study attempted to obtain complete kinetic information concerning an extended heat treatment of apple juice concentrates by fitting five different kinetic models. The increase of absorbance over time followed a sigmoidal pattern. For many types of growth curves, the growth rate steadily increases to a maximum value before it starts to decline to zero (Seber & Wild, 1989), where a maximum or plateau level for the recorded parameter is reached. This behaviour can be described by the so-called sigmoidal models. Fig. 3 illustrates a graphical comparison of the five kinetic models fitted to a representative absorbance time plot. It is obvious that the best fits were obtained by the logistic and weibull equations, as given by lines 4 and 3, respectively. These models are the only ones that can incorporate the maximum absorbance (A max ) reached at extended heating times. The physical meaning of A max reflects a maximum browning potential of juice as a result of reactant solute(s) consumption and/or decomposition of brown pigments formed, progressively leading to no further increases in absorbance. In order to statistically compare the goodness of fit of the five kinetic models to the 80 absorbance time curves, the difference in residual mean squares (rms = residual sum of squares/degrees of freedom) of all model fittings was used as has been previously done for microbial inactivation kinetic models by Koutsoumanis, Lambropoulou, and Nychas (1999). A graphical comparison of the residual mean square differences between zero and first order models and weibull in pairs with zero, parabolic and logistic models is illustrated in Fig. 4. The maximum browning rate constants, as calculated by the zero order model (Fig. 4a) and the weibull model (Fig. 4b d), are presented on the x-axes, respectively. The points below the horizontal axis represent cases where the fit of the first equation type is better than is the second. It is thus clear that the logistic equation had lower residual mean square values in most of the 80 cases examined and thus it was considered as the most appropriate model for describing colour development during thermal processing of the apple juice solutions Secondary models describing temperature and water activity dependence of the k and A max parameters Since a w on its own did not significantly affect the NEB of apple juice solutions when the same initial concentration of reactant sugars was present, secondary models describing the temperature and a w dependence of the k and A max were developed only for samples diluted with water; these differed in water activity as well as in the initial concentration of reactant sugars. The temperature dependence of browning reaction rates was first modelled by using a modified Arrhenius equation. The parallel positions of the regression lines in the Arrhenius plots (Fig. 5) at all water activity levels, as expressed by a statistically invariant E a, also led to the conclusion that the temperature dependence of the browning rate is not significantly affected by the a w. The effect of a w on browning rate was expressed by the constant d (Eq. (6)), which, in other words, describes an exponential increase in browning rate as the water activity decreases. The proposed modified Arrhenius type model (Eq. (6)) describes both temperature and water activity dependence of browning reaction rate of apple juice concentrates, as shown in Fig. 6a and b, respectively zero order 2. first order 3. webull 4. logistic 5. parabolic Time (h) Fig. 3. Graphical comparison of the five kinetic models tested (lines) for fitting the experimental data (symbols) of a respective brown pigment formation curve; apple juice with a w of 0.99 heated isothermally at 80 C.

307 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) a 3 b rms zero - rms first rms weibull- rms zero k zero k weibull c 0.4 d rms weibull - rms parabolic rms logistic- rms weibull k weibull k weibull Fig. 4. Comparison of the goodness of fit of the five kinetic models tested, using the difference in the residual mean square, difference between zero and first order kinetic models (a), and comparison of weibull and zero (b), parabolic (c) and logistic models (d). The points bellow the horizontal axes, represent those cases where the fit of the first model was better than the second (rms difference of y-axis). In order to describe the combined effect of temperature and a w on the browning rate of apple juice the parameters of the Arrhenius equation, Belehradek and polynomial models (Eqs. (7) (9)) were evaluated and are shown in Table 1. Statistics showed lower r 2 values for the Arrhenius than for the polynomial models; the former equation is more theoretically applicable, allowing the expression of the temperature sensitivity of NEB in terms of the estimated E a (activation energy) parameter and the rate under reference conditions. The application of the Belehradek type of model, revealed that non-enzymatic browning of apple juice concentrates occurs at a projected minimum temperature of 44.4 C, a value that is likely not realistic. In contrast, the polynomial models gave a slightly improved precision, which was achieved by the addition of one extra parameter beyond those included in the Arrhenius or Belehradek equations. However, none of the four parameters of the quadratic polynomials is interpretable and they do not provide any practical information concerning the temperature dependence of the browning reaction rate. The estimate of activation energy, 67.0 kj/mol, as calculated by the modified Arrhenius model (Table 1) for the brown pigment formation of apple juice concentrates, is in the range of kj/mol reported in the literature (Labuza & Baiser, 1992). Estimated E a values of 62.8 and 75.9 kj/mol were given by Ibarz et al. (1999, 2000) for the A 420 of thermally treated pear and apple puree, respectively. Manso et al. (2001) reported an E a of 65.8 kj/mol for browning of orange juice and Toribio and Lozano (1984) gave E a values between 69.0 and 83.7 kj/mol for NEB of an apple juice during storage. Johnson et al.

308 792 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) lnk (h -1 ) E E E E-04 1/T-1/T ref (K) Fig. 5. Arrhenius plots describing the temperature dependence of nonenzymatic browning rate constant (k) of apple juice concentrates differing in a w. (1995) have found activation energies of kj/mol for browning of orange juice serum, and finally Burdurlu and Karadeniz (2003) gave E a values in the range of kj/mol. However, others have reported higher values, e.g kj/mol (Bozkurt et al., 1999), 135 and/or 148 kj/mol (Garza et al., 1999) and kj/ mol (Koca et al., 2003) for boiled grape juice, peach puree and citrus juice concentrates, respectively. This broad variation in activation energies reported in the literature depends on the specific experimental conditions used and their influence on the reaction mechanism (Van Boekel, 2001). Secondary models developed for the parameters expressing the apparent maximum absorbance A max are presented in Table 2, along with the statistics and estimated coefficients of the model parameters. The polynomial equation, expressing the natural logarithm of A max as a function of temperature and a w, was chosen as the most preferable for describing maximum absorbance reached during NEB of apple juice concentrates. The prediction for ln A max at various combinations of a w and processing temperatures is illustrated in Fig. 7. The more concentrated the apple juice (low a w values) and the higher the temperature, the darker was the final juice, reaching a maximum at the lowest water activity value and the highest temperature tested. Furthermore, in the case of the t i parameter the quadratic model, describing the temperature and water activity dependence of the natural logarithm of t i, was the most applicable of the models (data not shown). As was expected, the logistic model parameter A 0 was neither affected by temperature nor by the water activity of any apple juice preparation (P > 0.05), since all samples were first diluted to the same solids level (11.65 Bx) prior to analysis Model validation under isothermal and dynamic heating conditions The applicability of the derived models was evaluated by comparing the browning rates predicted, using the four different models tested in this study (Eqs. (6) (9)) and the actual reaction rates observed in independent experiments of isothermal heating (Fig. 8). The Arrhenius model exhibited the smallest difference between the observed and predicted values of reaction rate constants, with most of the predictions falling in the 5% range (Fig. 8a). In contrast, the Belehradek model was less satisfactory, while the polynomial models revealed systematic deviations between the predicted and observed values. Additionally, another comparison of browning rates, as predicted by the Arrhenius a k (h -1 ) Temperature ( C) b k (h -1 ) a w Fig. 6. Effect of temperature (a) and water activity (b) on non-enzymatic browning reaction rate constant; lines in both figures represent the predicted values of rate constants at fixed a w levels (a) or temperature conditions (b).

309 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) Table 1 Estimated values, confidence limits (CL±, P < 0.05) and statistics for the coefficients of four secondary models describing the dependence of browning reaction rate constant (k) on temperature and a w Equation type Parameter R 2 a Estimated value CL(±) b Polynomial k a P > 0.05 c a a a a a 6 P > 0.05 Polynomial pffiffi k a P > 0.05 a a a a a 6 P > 0.05 Belehradek b T min ( C) a w max Arrhenius k ref (h 1 ) E a (kj/mol) d a Coefficient of determination. b ±95% Confidence limit. c P > 0.05 indicates that the parameter was not significant at the 95% level. Table 2 Estimated values, confidence limits (CL±) and statistics for the coefficients of three secondary models describing the dependence of A max on temperature and a w Equation type Parameter A max model, and the observed reaction rates for all conducted experiments, revealed a satisfactory agreement by the spread of all data points close to the diagonal (Fig. 9). Thus, the modified Arrhenius model was proved to be the most applicable for describing the temperature and R 2 a Estimated value CL(±) b Polynomial A max a a a a a a Polynomial ln(a max ) a a a a a a Arrhenius A max ref E a (kj/mol) d a Coefficient of determination. b ±95% Confidence limit. Fig. 7. Prediction surface plot showing the plateau absorbance, A max,as affected by temperature and a w ; points and bars represent prediction and 95% prediction intervals, respectively, of the response ln(a max ) for a given temperature and a w combination. water activity dependence of non-enzymatic browning reaction rate. In the food industry, thermal processing in the production chain usually involves varying time temperature protocols which significantly affect the final quality characteristics of the food products. In order to better predict the quality deterioration of apple juice concentrates, all the previously discussed kinetic modelling was employed to monitor the absorbance evolution of NEB under nonisothermal heating conditions. In the field of predictive microbiology, an accepted relevant approach used to predict the microbial growth under fluctuating temperature scenarios is to divide the time temperature history into short assumed constant temperature/time intervals (Fu & Labuza, 1993; Koutsoumanis, 2001). In this context, the absorbance evolution of apple juice concentrates at fluctuating temperatures was predicted using the method described by Koutsoumanis (2001) which was modified as follows: At time t =dt 1. A t1 ¼ A max t1 1 þ A max t1 A 0 1 exp ð k 1 dt 1 Þ At the subsequent time interval, t =dt 2 A t2 ¼ A max t2 1 þ A max t2 1 exp ð k 2 dt 2 Þ A t1 and at time t =dt i A ti ¼ A max ti 1 þ A max ti 1 exp ð k i dt i Þ ð10þ A tði 1Þ Additionally the following conditions were assumed: A ti ¼ A ti if A max ti > A tði 1Þ A tði 1Þ if A max ti < A tði 1Þ where dt i (i = 1, 2, 3, etc.) is a short assumed constant temperature time interval, A 0 is the initial absorbance

310 794 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) Arrhenius Belehradek (k obs - k prd )/ k obs x (k obs - k prd )/ k obs x k obs k obs Polynomial k Polynomial k (k obs - k prd )/ k obs x (k obs - k prd )/ k obs x k obs k obs Fig. 8. Percent deviations between the observed (k obs ) in the independent experiments and predicted (k prd ) values of browning rates (k) of apple juice as estimated with the four tested secondary models. measurement at time zero, A ti is the absorbance estimation at a time interval dt i, A max ti is the maximum absorbance value calculated by the secondary model at the temperature corresponding to the time interval dt i,andk i is the reaction rate constant at the temperature during dt i, as estimated by the modified Arrhenius equation. The ability of the derived dynamic model to predict nonenzymatic browning of apple juice concentrates under nonisothermal heating conditions, was evaluated by comparing the predicted absorbance evolution curves (Eq. (10)) to actual browning data obtained from four experiments involving fluctuations of storage temperatures. At first, two prolonged heating temperature profile scenarios of periodic temperature changes were studied, where the apple juice concentrate was heated for 12 h at 65 C and 12 h at 85 C (Fig. 10a) or 12 h at 65, 6 h at 75 and 6 h at 85 C (Fig. 10b). In both cases the reconstructed dynamic logistic model was able to predict in good agreement, the absorbance evolution of NEB of apple juice concentrate for the non-isothermal heating protocol. The last two proto- k prd k obs 0.15 Fig. 9. Plot of predicted (k prd ) (using Arrhenius model) versus observed (k obs ) values of apple juice browning reaction rates heated under various combinations of temperature and a w ; open symbols represent browning rate constants obtained in the first stage of the experimental design assuming isothermal heating conditions and the closed symbols those of independent experiments.

311 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) a a Abs at 420 nm b Abs at 420 nm Time (h) Time (h) Fig. 10. Comparison between observed (points) and predicted (line) browning of apple juice (a w 0.865) heated under periodically changing temperature profiles for 12 h at 65 and 12 h at 85 C (a) and 12 h at 65, 6 h at 75 and 6 h at 85 C (b); dotted lines depict the temperature fluctuations. cols involved thermal treatment of apple juice for either 2 h at 65 C, 2 h at 75 C and 2 h at 85 C (Fig. 11a) or 3 h at 65 C and 3 h at 85 C(Fig. 11b) (total heating time of 6 h). A fairly good agreement between the actual browning values and those predicted by the model was also evident in the short time dynamic heating protocol, indicating that prediction of non-enzymatic browning is also possible in thermal treatments resembling the actual pasteurization process. 4. Conclusions The main contribution of this paper is a complete kinetic assessment of the non-enzymatic browning phenomenon of apple juice concentrates under both isothermal and dynamic heating conditions, where the individual and combined effects of temperature and water activity have been investigated. The processing temperature had a strong impact on browning kinetics for juice concentrates having both the same and different initial concentration of reactant sugars. The initial reactant concentration, and not the a w itself, seems to have a significant effect on colour development. Modelling of the kinetic data revealed that the logistic model was the most appropriate for describing Temperature ( C) Temperature ( C) Abs at 420 nm b Abs at 420 nm colour development in apple juice concentrates. Moreover, the applied modified Arrhenius equation for the dependence of browning reaction rate on temperature and a w was suitable for predicting the rate constant, providing values in close agreement with the observed reaction rates in independent experiments. The overall derived dynamic logistic model satisfactorily predicted NEB of thermally processed apple juice with dynamic heating protocols. Acknowledgement This work was carried out under the financial support of the Greek State Scholarships Foundation (IKY) (scholarship granted to H. Vaikousi). References Time (h) 60 6 Baisier, W. M., & Labuza, T. P. (1992). Maillard browning kinetics in a liquid model system. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, Bozkurt, H., Gogus, F., & Eren, S. (1999). Nonenzymic browning reactions in boiled grape juice and its models during storage. Food Chemistry, 64, Time (h) Fig. 11. Comparison between observed (points) and predicted (line) browning of apple juice (a w 0.74) heated for 2 h at 65, 2 h at 75 and 2 h at 85 C (a) and for 3 h at 65 and 3 h at 85 C (b); dotted lines depict the temperature fluctuations. 4 5 Temperature ( C) Temperature ( C)

312 796 H. Vaikousi et al. / Food Chemistry 107 (2008) Buedo, A. P., Elustondo, M. P., & Urbicain, M. J. (2001). Amino acid loss in peach juice concentrate during storage. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 1, Burdurlu, H. S., & Karadeniz, F. (2003). Effect of storage on nonenzymatic browning of apple juice concentrates. Food Chemistry, 80, Carabasa-Giribet, M., & Ibarz-Ribas, A. (2000). Kinetics of colour development in aqueous glucose systems at high temperatures. Journal of Food Engineering, 44, Cohen, E., Birk, Y., Mannheim, C. H., & Saguy, S. I. (1994). Kinetic parameter estimation for quality change during continuous thermal processing of grapefruit juice. Journal of Food Science, 59(1), Cohen, E., Birk, Y., Mannheim, C. H., & Saguy, S. I. (1998). A rapid method to monitor quality of apple thermal processing. Lebensmittel- Wissenschaft und-technologie, 31, Eichner, K., & Karel, M. (1972). The influence of water content and water activity on the sugar amino browning reaction in model systems under various conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20(2), Eskin, N. A. M. (1990). Biochemistry of food processing: Browning reactions in foods. In Biochemistry of foods (pp ). London: Academic Press. Fu, B., & Labuza, T. P. (1993). Shelf life prediction: Theory and application. Food Control, 4, Garza, S., Ibarz, A., Pagan, J., & Giner, J. (1999). Non-enzymatic browning in peach purree during heating. Food Research International, 32, Ibarz, A., Pagan, J., & Garza, S. (1999). Kinetic models of colour changes in pear puree during heating at relatively high temperatures. Journal of Food Engineering, 39, Ibarz, A., Pagan, J., & Garza, S. (2000). Kinetic models of non-enzymatic browning in apple puree. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80, Johnson, J. R., Braddock, R. J., & Chen, C. S. (1995). Kinetics of ascorbic acid loss and nonenzymatic browning in orange juice serum: experimental rate constants. Journal of Food Science, 60(3), Koca, N., Burdurlu, S., & Karadeniz, F. (2003). Kinetics of nonenzymatic browning reaction in citrus juice concentrates during storage. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 27, Koutsoumanis, K. (2001). Predictive modeling of shelf life of fish under non-isothermal conditions. Applied and Environmental Microbiology, 67(4), Koutsoumanis, K., Lambropoulou, K., & Nychas, G-J. E. (1999). A predictive model for the non-thermal inactivation of Salmonella enteritidis in a food model system supplemented with a natural antimicrobial. International Journal of Food microbiology, 49, Labuza, T. P., & Baiser, W. M. (1992). The kinetics of nonezymatic browning. In H. G. Schwartzberg & R. W. Hartel (Eds.), Physical chemistry of foods (pp ). New York: Marcel Dekker. Levine, H., & Slade, L. (1989). A food polymer science approach to the practice of cryostabilization technology. Comments on Agriculture and Food Chemistry, 1(6), Manso, M. C., Oliveira, F. A. R., Oliveira, J. C., & Frias, J. M. (2001). Modelling ascorbic acid thermal degradation and browning in orange juice under aerobic conditions. International Journal of Food Science and Technology, 36, Martins, S. I. F. S., Jongen, W. M. F., & van Boekel, M. A. J. S. (2001). A review of Maillard reaction in food and implications to kinetic modeling. Trends in Food Science and Technology, 11, Nagy, S., Lee, H., Rouseff, R. L., & Lin, J. C. C. (1990). Nonenzymic browning of commercially canned and bottled grapefruit juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 38(2), Peterson, B. I., Tong, C.-H., Ho, C.-T., & Welt, B. A. (1994). Effect of moisture content on Maillard browning kinetics of a model system during microwave heating. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, Petriella, C., Resnik, S. L., Lozano, R. D., & Chirife, J. (1985). Kinetics of deteriorative reactions in model food systems of high water activity: color changes due to nonenzymatic browning. Journal of Food Science, 50(3), Rattanathanalerk, M., Chiewchan, N., & Srichumpoung, W. (2005). Effect of thermal processing on the quality loss of pineapple juice. Journal of Food Engineering, 66, Seber, G. A. F., & Wild, C. J. (1989). Growth models. In Nonlinear regression (pp ). New York: John Willey & Sons. Shierwin, C. P., & Labuza, T. P. (2003). Role of moisture in Maillard browning reaction rate in intermediate moisture foods: comparing solvent phase and matrix properties. Journal of Food Science, 68(2), Stamp, J. A., & Labuza, T. P. (1983). Kinetics of the Maillard reaction between aspartame and glucose in solution at high temperatures. Journal of Food Science, 48(2), Toribio, J. L., & Lozano, J. E. (1984). Nonezymatic browning in apple juice concentrate during storage. Journal of Food Science, 49(3), Toribio, J. L., & Lozano, J. E. (1986). Heat induced browning of clarified apple juice at high temperatures. Journal of Food Science, 51(1), , 179. Van Boekel, M. A. J. S. (2001). Kinetic aspects of the Maillard reaction: a critical review. Nahrung/Food, 45(3),

313 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 2008, p Vol. 74, No /08/$ doi: /aem Copyright 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Development of a Microbial Time/Temperature Indicator Prototype for Monitoring the Microbiological Quality of Chilled Foods Hariklia Vaikousi, 1 Costas G. Biliaderis, 1 and Konstantinos P. Koutsoumanis 2 * Laboratory of Food Chemistry & Biochemistry, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki, Greece, 1 and Laboratory of Food Hygiene & Microbiology, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki, Greece 2 Received 3 December 2007/Accepted 28 February 2008 A time/temperature indicator (TTI) system based on the growth and metabolic activity of a Lactobacillus sakei strain was developed for monitoring food quality throughout the chilled-food chain. In the designed system, an irreversible color change of a chemical chromatic indicator (from red to yellow) progressively occurs due to the ph decline that results from microbial growth and metabolism in a selected medium. The relation of the TTI response (color change) to the growth and metabolic activity (glucose consumption, lactic acid production, ph decrease) of L. sakei was studied. In addition, the temperature dependence of the TTI kinetics was investigated isothermally in the range of 0 to 16 C and modeled with a system of differential equations. At all temperatures tested, the ph and color changes of the TTI system followed closely the growth of L. sakei, with the endpoint (the time at which a distinct visual color change to the final yellow was observed) of the TTI coinciding with a population level of 10 7 to 10 8 CFU/ml. The endpoint decreased from 27 days at 0 C to 2.5 days at 16 C, yielding an activation energy of 97.7 kj/mol, which was very close to the activation energy of the L. sakei growth rate in the TTI substrate (103.2 kj/mol). Furthermore, experiments conducted on the effect of the inoculum level showed a negative linear relationship between the level of L. sakei inoculated in the system medium and the endpoint of the TTI. For example, the endpoint at 8 C ranged from 6 to 2 days for inoculum levels of 10 1 and 10 6 CFU/ml, respectively. This relationship allows the easy adjustment of the TTI endpoint at a certain temperature according to the shelf life of the food product of concern by using an appropriate inoculum level of L. sakei. The microbial TTI prototype developed in the present study could be used as an effective tool for monitoring shelf life during the distribution and storage of food products that are spoiled primarily by lactic acid bacteria or other bacteria exhibiting similar kinetic responses and spoilage potentials. Apart from the low cost, the main advantage of the proposed TTI is that its response closely matches the loss of the quality of a food product by simulating the microbial spoilage process in particular environments. A modern quality and safety assurance system should prevent contamination through the monitoring, recording, and controlling of critical parameters during a product s entire life cycle, which includes the postprocessing phase and extends over the time of use by the final consumer (20). Since temperature is the parameter that predominantly determines the shelf life and final quality and safety of food products after their processing according to Good Manufacturing Practices and Good Hygiene Practices, monitoring and recording the temperature conditions during distribution and storage are of crucial importance (40, 41). Time/temperature indicators or integrators (TTIs) are used as cost-effective and user-friendly devices to monitor, record, and translate the overall effect of temperature history on food quality in the chill chain down to a product unit level (15, 41, 42). Depending on the working principle, TTI systems are classified as chemical, physicochemical, or biological systems, with their integrated time-/temperature-dependent change being manifested as an irreversible * Corresponding author. Mailing address: Aristotle University of Thessaloniki, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Thessaloniki, Greece Phone and fax: E- mail: kkoutsou@agro.auth.gr. Published ahead of print on 7 March visible color development, a movement toward a color change, or a mechanical change in consistency. In general, a requirement that the TTI response matches the loss in the quality of the food must be fulfilled for the successful application of TTIs to food products. It is thus necessary that the activation energy (E ), indicating the temperature sensitivity of the TTI response, is similar to the E of the food quality loss and that the TTI endpoint should coincide with the end of a product s shelf life. In this context, the applicability of a particular TTI as a quality indicator requires a systematic kinetic study of both the food product s deterioration and the TTI response (40, 41). This kinetic modeling approach and the methodology for applying TTI to food quality monitoring has been extensively reviewed by Taoukis (41) and has been applied to the optimization of the chill chain management of fish and meat products in many studies (15, 16, 20, 43). TTIs have also been applied in evaluations of the quality of various food products, including frozen vegetables (13, 14), dairy products (12), meat and poultry (26, 39), fresh seafood (32), and fresh mushrooms (3). A large number of commercial TTI prototypes have been developed, and their operation/function, as reviewed in the literature (17, 40, 41), is based on the principles of (i) molecular diffusion (e.g., of either a dyed ester along a porous wick as determined with the 3M MonitorMark indicator or 3242

314 VOL. 74, 2008 MICROBIAL TTI FOR MONITORING QUALITY OF CHILLED FOODS 3243 a viscoelastic material that migrates into a diffusively lightreflective porous matrix, progressively causing a visual temperature-dependent increase in the light transmission of the porous material as determined with the Freshness Check indicator [both indicators are produced by the 3M Co., St. Paul, MN]); (ii) polymerization reactions (temperature-dependent polymerization reactions in which disubstituted diacetylene crystals polymerize into a highly colored polymer, as determined with, e.g., the Lifelines Fresh-Check and Freshness Monitor indicators [Lifelines Inc., Morris Plains, NJ]); (iii) enzymatic changes (decreases in ph via controlled enzymatic hydrolysis of a lipid substrate, leading to a color change in the indicator, e.g., the Vitsab TTI [Vitsab A.B., Malmö, Sweden]); and (iv) microbial changes (the acidification of the TTI medium by selected lactic acid bacteria, which induces a color change in the indicator, e.g., the Cryolog TTIs [Cryolog S.A., Quimper, France]). Moreover, a new enzymatic-type TTI was recently developed based on the enzymatic hydrolysis of starch by an a-amylase (46). Among all TTI types, the microbial TTI edges out the others in that its TTI response is directly related to microbial food spoilage, as it reflects the bacterial growth and metabolism that occurs in the TTI system itself. To date, three types of commercial microbial TTIs, Traceo, Traceo restauration, and eo, which are based on the growth and metabolic activities of patent microbial strains, have been developed by Cryolog (Cryolog S.A., Quimper, France). However, details of the kinetic properties (e.g., the E and endpoint options) of these TTIs are not available. In the present study, a microbially based TTI system was developed to monitor and record food quality during distribution and storage. In the proposed system, the irreversible color development that the TTI manifests is due to the color change of a chemical chromatic indicator which occurs upon ph decrease as a result of Lactobacillus sakei growth and metabolism in a selected substrate (growth medium). The objectives of this work were (i) to evaluate the relation between the TTI response (color change) and the growth and metabolic activity (glucose consumption, lactic acid production, ph decrease) of L. sakei in the TTI substrate, (ii) to study and model the kinetics of the TTI system as a function of temperature, and (iii) to investigate our ability to adjust the TTI endpoint by changing the inoculum level of L. sakei. MATERIALS AND METHODS Preparation of the TTI system. A thorough preliminary study was carried out to identify/select an appropriate combination of the structural components of the developed TTI system, i.e., the proper bacterial strain, the substrate medium, and the chemical chromatic indicator. An L. sakei strain isolated from meat (kindly provided by E. Drosinos, Laboratory of Food Quality Control and Hygiene, Agricultural University of Athens) was selected as the choice microorganism among nine lactic acid bacterium strains, i.e., three L. sakei strains, two Lactobacillus curvatus strains, two Lactobacillus plantarum strains, and two Lactobacillus paracasei strains, based on its ability to substantially reduce the phs of several growth media tested. The substrate media tested were nutrient broth (Merck, Darmstadt, Germany), saline (0.1% [wt/vol] proteose peptone and 0.85% [wt/vol] NaCl), tryptone soy broth (Merck), and MRS broth (Merck) at several levels of added glucose and yeast extract. In all of the above-mentioned liquid growth media, the ph was adjusted to 6.4 or 6.5 before sterilization. A total of seven different chemical indicators or mixtures were examined, namely, methyl red, chlorophenol red, bromocresol purple, a mixture of bromocresol green and chlorophenol red, resazurin, alizarin, and p-nitrophenol. For the selection of the chemical indicator, the basic characteristics taken into consideration were, first, whether it permitted microbial growth and, second, whether it exhibited an intense, distinct, and irreversible color change during the drop in the ph of the medium in which it was added. Nutrient broth enriched with glucose and yeast extract was identified as the most appropriate growth medium for adequate microbial growth and activity, while chlorophenol red was chosen as the chemical indicator because it leads to an irreversible color change from red to orange and finally to yellow (the endpoint), reflecting the progressive ph decline upon bacterial growth, and is not metabolized by the chosen microbial strain. Stock cultures of L. sakei were kept frozen (at 30 C) in MRS broth supplemented with 20% glycerol. Regeneration of the cultures involved transferring 10 l of the stock culture into 10 ml of MRS broth (Merck, Darmstadt, Germany) and incubating it at 30 C for 24 h. The cultures regenerated in MRS broth (the estimated concentration of microbial cells ranged from 10 8 to 10 9 CFU/ml) were centrifuged (4 C, 6,000 g, 20 min) (ALC refrigerated centrifuge model PK120R; ALC International Srl., Italy), and after the discard of the supernatant, the precipitated cells were transferred to 10 ml of quarter-strength Ringer s solution and centrifuged again (4 C, 6,000 g, 20 min). This washing procedure was repeated twice. The resulting final culture suspension was properly diluted (decimal dilutions in quarter-strength Ringer s solution), and a portion of the appropriate dilution was inoculated into the final growth medium in order to achieve the desired inoculum level. For the experiments on the effect of temperature on the TTI response, the initial inoculum level in the growth medium was adjusted to 10 2 CFU/ml, whereas for the study of the effect of inoculum size, the inoculum level used ranged between 10 1 and 10 6 CFU/ml. As the substrate of the TTI system, nutrient broth (Merck, Darmstadt, Germany) was mixed with 0.5% (wt/vol) yeast extract (Merck, Darmstadt, Germany) and 2% (wt/vol) glucose (Merck, Darmstadt, Germany) and dissolved in distilled water. The liquid substrate was subsequently adjusted to a ph of 6.4 to 6.5 with 1 M HCl and then divided into 200-ml portions in screw-cap bottles and sterilized (121 C, 15 min). A chlorophenol red (Sigma-Aldrich Co., Gillingham, Dorset, United Kingdom) solution (0.2% [wt/vol] in M NaOH) was prepared, filter sterilized, and aseptically added at a concentration of 1.5% (vol/vol) into the sterilized growth medium prior to inoculation in order to examine the ability of the selected microorganism to develop the desired ph-induced chromatic change. The response of the TTI system was tested isothermally at five different storage temperatures (0, 4, 8, 12, 16 C) using high-precision ( 0.2 C), lowtemperature incubators (models MIR 153 and MIR 253; Sanyo Electric, Oragun, Japan) at a fixed initial inoculum level of 2 log CFU/ml. The precise temperature history of the samples during storage was recorded with the aid of electronic temperature recorders (Cox Tracer; Cox Technologies, Belmont, NC); duplicate samples were stored at each temperature tested. The samples were tested at appropriate time intervals to allow for efficient kinetic analysis of microbial growth and for ph and color change. In addition, replicates of samples inoculated into the same growth medium but without the chemical chromatic indicator were prepared for the physicochemical kinetic analysis of the TTI system (determination of the residual glucose concentration and the lactic acid produced) as described below; all these tests were repeated twice. Microbiological analysis. Samples for the TTI system for each storage temperature were analyzed at different time intervals. Portions of 1 ml of the liquid medium were aseptically transferred to 9 ml of sterile quarter-strength Ringer s solution. Decimal dilutions in the same Ringer s solution were prepared, and triplicates (0.1-ml samples) of the appropriate dilutions were spread on MRS agar (Merck, Darmstadt, Germany) plates for the enumeration of viable counts after incubation at 30 C for 72 h. The plates were also examined visually for typical colony types and morphological characteristics associated with MRS agar growth medium. In addition, the selectivity of the medium was checked routinely by Gram staining and microscopic examination of smears prepared from randomly selected colonies obtained from the MRS agar plates to check for possible contamination. Physicochemical analysis. The phs of 10-ml sample portions were measured using a microprocessor ph meter, ph 211 (Hanna Instruments, Romania). Inoculated samples that did not contain the chromatic chemical indicator were centrifuged (4 C, 6000 g, 20 min) in order to obtain cell-free samples, needed for the measurements of glucose and lactic acid. The residual glucose concentration was determined spectrophotometrically (SP-8001 UV-VIS; Metertech Inc.) based on an enzymatic method using the glucose oxidase-peroxidase system coupled with a dye chromophore (4-amino-antipyrine) according to Biliaderis et al. (2). The produced lactic acid was assayed by a high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a 300-mm by 7.5-mm anionexclusion column (Alltech Associates Inc., Deerfield, IL), a Marathon IV HPLC

315 3244 VAIKOUSI ET AL. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. pump (Rigas Labs, Thessaloniki, Greece), a manual 10-ml loop injector, a UV 6000 LP detector (SpectraSystem Finnigan MAT; Thermo Separation Products, San Jose, CA), and an insulated column oven, as described by Kristo et al. (25). Isocratic separation with a flow rate of 0.6 ml/min at 65 C and N H 2 SO 4 as a mobile phase, filtered through a 0.45-mm nylon filter (Alltech Associates Inc.), was employed. Measurements were carried out via a UV visible-light detector operated at 220 nm. A cell-free sample of 5 ml was centrifuged for 15 min at 4,000 rpm with a mixture of HPLC-grade water and acetonitrile (1:4, 15 ml; Sigma-Aldrich Ltd., Athens, Greece), and the extracts were filtered through a 0.2-mm nylon filter (Alltech Associates Inc.). Analysis was performed in duplicate batches, and the results reported are the means from two replicates. Standard solutions of lactic acid (Sigma-Aldrich Ltd.) in a mixture of water and acetonitrile (1:4, vol/vol) at several concentrations were used for column calibration. Color measurements. The kinetics of the color evolution of the model TTI system (microorganism, growth medium, and chemical indicator) was assessed using a hand-held colorimeter (chroma meter CR-410; Konica Minolta Sensing Inc., Japan) to determine the counterimmunoelectrophoresis color space coordinates L*, a*, and b*. The colorimeter was calibrated against a standard white reference tile. Samples of ml were transferred to a clear petri dish and placed over the white reference tile, and color measurements were recorded in duplicate for each experimental trial by immersing the instrument s head in the colored liquid medium. The color change of the TTI system was expressed as the index of total color change, E (in arbitrary units), as follows: E L* L* 0 2 a* a* 0 2 b* b* 0 2 (1) with L* 0, a* 0, and b* 0 being the counterimmunoelectrophoresis color values at time zero. Modeling procedure. The microbial and physicochemical changes occurring during the storage of the TTI system under the specified isothermal conditions were described via a series of differential equations. The differential equations were integrated by using the Euler integration technique with Scientist software (MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT). Initial parameter estimates were obtained by the manual iterations of changing the parameters and the visual comparison of predicted and experimental results after simulation. The initial estimates were then optimized by the least-squares method. Microbial growth was modeled using the following logistic equations. When time (t [h]) was less than or equal to the duration of the lag phase (h), dn 0 (2) dt and when time was longer than the lag phase (h), dn dt max 1 N (3) N max N where N is the population (CFU/ml), max is the maximum specific growth rate (h 1 ), and N max is the maximum population (CFU/ml) of L. sakei as estimated by the model. Glucose consumption was described by the maintenance energy model of Pirt (35): dg dt 1 dn Y G dt m GN (4) where G is the residual glucose concentration (mmol), Y G is the cell yield coefficient for glucose consumption (CFU/mmol of glucose consumed), and m G is the maintenance coefficient for glucose (mmol of glucose/cfu/hour). Lactic acid production can be calculated by the consumption of glucose as described by Leroy and De Vuyst (29): dl dt Y dg L (5) dt where L is lactic acid (mmol) and Y L is a yield coefficient for the conversion of glucose to lactic acid (mmol of lactic acid/mmol of glucose). The ph decrease was modeled in terms of changes in proton concentration and as a function of the concentration of undissociated lactic acid, HA, onthe basis of the model presented by Breidt and Fleming (5): dp a 1 P (6) dt P max HA where a is a coefficient, P is the concentration of protons, and P max is the predicted maximum concentration of protons or, in other words, the minimum final ph of the model TTI system. In equation 6, the term HA for undissociated lactic acid can be replaced by the Henderson-Hasselbalch equation, specifically, HA 1 10 ph (7) pka ) where A is the concentration of dissociated lactic acid and the pk a of lactic acid is In addition, the change in the chromaticity value, E, was modeled by the four-parameter logistic equation using the Table Curve 2D software (version 4; SPSS Inc.), as follows: E max E min E E min (8) 1 exp E t t i where E min is the initial value (minimum value) at time zero, E max is the maximum E value as estimated by the model, exp indicates exponential, E is the maximum rate for E evolution, t is measured in hours, and t i is the time (hours) when half of the E max is attained. The temperature dependence of both the max of L. sakei and the reciprocal of the time at which the endpoint of the TTI ( E 20) is reached was modeled using the Arrhenius model: ln Y ln Y ref E R 1 T 1 T ref (9) where Y is the max of L. sakei or the reciprocal of the amount of time to the endpoint of the TTI process, T is the absolute temperature (Kelvin), Y ref is the rate at the reference temperature (h 1 ), the E is in kj/mol K, R is the universal gas constant, and T ref is the reference temperature (273 K). Adjustment of the endpoint of the TTI system. The effect of different inoculum levels on the response of the TTI system at 8 C was studied in order to relate the endpoint of the TTI process with the initial level of the inoculated microorganism. L. sakei was inoculated in the TTI substrate at various levels (1, 3, 5, and 6 log CFU/ml), and the experiments were carried out based on the procedures described above. A RESULTS AND DISCUSSION Description of the TTI system. We first defined the developed microbial TTI system, which consists of an L. sakei strain grown in nutrient broth enriched with glucose and yeast extract and also dyed with the chlorophenol red. Figure 1 shows the changes in the level of microbial growth, ph (decrease), glucose consumption, the production of lactic acid, and the evolution of the chromaticity value ( ) monitored throughout the storage of the TTI system at 8 C. It is worth mentioning that the presence of the chromatic indicator in the substrate medium did not affect at all the growth kinetics of L. sakei (data not shown). Thus, samples containing chlorophenol red, when the dye solution was added at the specific concentration of 1.5% (vol/vol), exhibited no inhibitory effect on the growth of the bacterial population and ph decline profiles similar to those of preparations lacking the incorporated chromatic indicator. The population of L. sakei was strongly related to glucose consumption and lactic acid production (inset in Fig. 1), leading to a ph drop and an irreversible change in the color of the system from the initial red (low values) to orange and then to the final yellow (high E values at populations close to N max ; data points in the evolution curve were replaced with colored squares representing the respective colors of the TTI system at the indicated time points). The distinct visual color change to the final yellow was obtained when the E response reached a value of 20, and that time was adopted as the endpoint of the TTI system. The ph of the medium at the endpoint was close to 5.2. The time at which the endpoint was reached coincided with an L. sakei population of 10 7 to 10 8

316 VOL. 74, 2008 MICROBIAL TTI FOR MONITORING QUALITY OF CHILLED FOODS 3245 FIG. 1. Microbiological, physicochemical, and color changes occurring in the TTI system stored at 8 C; data points in the curve are replaced with colored squares representing the color of the TTI system at the indicated times. CFU/ml in the substrate. The latter microbial concentration has been either reported as the spoilage level or related to the end of the shelf lives of many food products spoiled by lactic acid bacteria or other bacterial groups (7, 9, 19, 22, 23, 30, 39, 43, 45). With respect to the variation in color of the TTI system, repeated experiments to determine values throughout the course of the culture s growth (initial inoculum level, 10 2 CFU/ml) showed a mean value of 15.2% for the coefficients of variation for all sampling time intervals. The observed variation in the TTI responses is similar to the variation observed in the growth of spoilage organisms in foods (21 23). Temperature dependence of the TTI response. The experimental data describing the kinetics of the TTI system, i.e., both the microbial and the physicochemical changes, under all isothermal storage conditions tested are shown in Fig. 2, along with those predicted by the model curves according to differential equations 2 through 7, which also allowed for the estimation of all model parameters. As shown in Fig. 2, there is a good agreement between the observed data (symbols in Fig. 2) and the model predictions (lines in Fig. 2) of the microbial and physicochemical attributes. The max of the microorganism increased with the temperature, and such temperature dependence is well described by the Arrhenius equation (equation 9). The Y G also increased with the storage temperature of the TTI, while the maintenance coefficient m G was not significantly affected by increasing the temperature from 4 to 16 C (Table 1). However, a higher value for m G ( mmol of glucose/cfu/hour) was observed at 0 C. Increased values of the m G with increasing storage temperature conditions from 10 to 35 or even 45 C have been repeatedly reported in the literature (11, 27 29, 44), in contrast with the reported decreasing values of Y G with increasing storage temperature from 20 to 45 C (11, 29, 44). The above-mentioned temperature ranges represent the optimum temperature conditions for the growth of bacterial strains, and thus, the observed deviations from this trend in this study may be attributed to the lower storage temperatures examined in the present work. Moreover, the estimates of the Y L were 1.6, 2.75, and 2.6 mmol of lactic acid per mmol of glucose at 8, 12, and 16 C, respectively (Table 1), implying a homofermentative response of L. sakei under these conditions. Theoretically, 2 mol of lactate and 2 mol of ATP are formed per mol of glucose used, while a conversion factor of 0.9 from the sugar carbon to end product is common and probably reflects the assimilation of the sugar carbon into the biomass (1). However, it is well known that nitrogen-containing organic matter is mainly responsible for the synthesis of cell material (6). The calculated Y L values at 0 and 4 C were 0.55 and 1 mmol of lactic acid/mmol of glucose, respectively, indicating a potential heterofermentative route for this microorganism when it is grown at unfavorable, low temperatures. However, no additional organic acids, like acetic acid, were detected in the fermentation medium by HPLC analysis, further supporting the view that L. sakei grown under storage conditions with low temperatures has a homofermentative nature. Apparently, in such an abusive environment, L. sakei seems to use some extra glucose for building up cell material, but further research focusing on the growth of the L. sakei strain under storage conditions with low temperatures is required for supporting this notion. The following discussion focuses on the potential physiological mechanisms of the microbial responses observed under the critical low-storage-temperature conditions in an attempt to explain the estimated model parameters reported above. Decreasing values of Y G indicate that energy is being progressively used for functions other than growth, and this conclusion is supported by previous reports on increased ATP requirements for additional cell maintenance functions (e.g., the maintenance of proton gradients across the cell membrane, the turnover of macromolecules such as mrna, and the synthesis of additional proteins could all decrease ATP availability for growth) (36). These metabolic functions are reported to be

317 3246 VAIKOUSI ET AL. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. FIG. 2. Microbiological and physicochemical changes occurring in the TTI system stored isothermally at 0, 4, 8, 12, and 16 C. Points depict observed experimental data, and solid lines are the model fittings. strongly growth rate dependent (33). At low growth rates, biomass formation becomes energetically more expensive (e.g., higher protein content of cells), resulting in yield decreases (18); as a result, the maintenance energy expenditures constitute a significant portion of the total energy utilization (35). The N max of the microorganism as predicted by the model was found to be constant and almost temperature independent, with an average value of log 10 CFU/ml (mean standard deviation). However, the predicted N max of L. sakei at 0 C was 6.8 log 10 CFU/ml, a value that is much lower than those obtained for the rest of the storage temperatures studied (8.25 to 8.35 log units). This finding is in agreement with the

318 VOL. 74, 2008 MICROBIAL TTI FOR MONITORING QUALITY OF CHILLED FOODS 3247 Temp ( o C) max (h 1 ) Lag time (h) N max (CFU/ml) TABLE 1. Estimated parameters for equations 2 to 7 a Y G (CFU/mmol of glu) (10 7 ) m G (mmol of glu/cfu/h) (10 9 ) Y L (mmol of LA/mmol of glu) a (10 5 ) a glu, glucose; LA, lactic acid; a, a coefficient in equation 6. Minimum ph low growth rate and/or Y G, resulting in limited lactic acid production, which also justifies in some way the high m G observed under such critical storage conditions (0 C). The kinetics of the color evolution of the TTI system, as expressed by the chromaticity value E, is shown in Fig. 3. The sigmoid patterns of E-time curves at all studied temperatures were well fitted by the logistic model equation (Fig. 3). The color change of the TTI system occurred when the medium ph was decreased to the point of the chromatic indicator color change, under all storage conditions. The endpoint of the TTI system (the time at which the reached the value of 20) decreased with increasing storage temperature; i.e., the endpoint of the TTI was estimated to be 640, 269, 113, 78.4, and 61.1 h at 0, 4, 8, 12, and 16 C, respectively. The Arrhenius plot for the effect of temperature on the TTI endpoint is shown in Fig. 4 (R ). The estimated value of the E was 97.7 kj/mol. This value is close to that of the E of other available nonmicrobial TTIs, such as (i) an amylase-type TTI recently introduced by Yan et al. (46), with E in the range of to 113 kj/mol; (ii) the TTIs by Lifelines, i.e., the Freshness Monitor indicator and the Fresh-Check type A6 indicator, with reported E values of 86.0 kj/mol and 83.6 kj/mol, respectively (42, 43); (iii) the indicators of MonitorMark, with E values ranging from 96.3 to kj/mol (38); and finally, (iv) the enzymatic TTIs of Vitsab types M and S, with E values of 68.7 and kj/mol, respectively (43). The main advantage of the developed microbial TTI, compared to other available nonmicrobial TTIs, is that its response (color change) is a result of a process simulating the actual quality loss process (microbial spoilage) of many foods (31). It is well known that the shelf lives of most chilled high-protein foods are linked to the growth and metabolic activities of the specific spoilage organisms (SSO; the fraction of the total microflora responsible for spoilage); indeed, the sensory rejection of such products is observed when the SSO reach a certain population level called the spoilage level (21 23). For example, the quality loss of most chilled meat products packed under vacuum or modified-atmosphere conditions is based on the growth and metabolic activities (acid production) of lactic acid bacteria, which result in an unacceptable sour/acidic/ cheesy odor when the bacterial population approaches the level of 10 7 to 10 8 CFU/g (4, 8, 9, 19, 30, 34, 37). It is also worth noting that the specific dominance of the L. sakei group in the spoilage microbial flora of these products has been demonstrated in several studies (8, 9, 37). The above-mentioned spoilage mode closely resembles the principles of the TTI developed in the present work, in which the color change is based on the growth and metabolic activity of L. sakei, while the time at which the TTI endpoint is reached coincides with an L. sakei population in the system medium of 10 7 to 10 8 CFU/ml at all temperatures tested. The parallel Arrhenius plots obtained for the TTI endpoint and the max of L. sakei (R ) indeed demonstrate the same temperature dependence between microbial growth and the TTI response (Fig. 4). The estimated value for the E of L. sakei s max was kj/mol, which is very close to the E of the TTI endpoint (97.7 kj/mol). The results from the studies of the effect of temperature on FIG. 3. Evolution of the chromaticity response ( ) upon storage of the TTI system isothermally at 0, 4, 8, 12, and 16 C. Points depict experimental data, and solid lines are the logistic model fittings. FIG. 4. Arrhenius plots describing the temperature dependence of the max and the time at which the endpoint of the TTI system is reached.

319 3248 VAIKOUSI ET AL. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. the TTI response indicate that the properties of the developed system match the kinetics of the loss of the quality of food products spoiled by lactic acid bacteria. Indeed, the E values estimated for the TTI responses are similar to the E values reported for the growth of lactic acid bacteria in various food products (21, 24). In addition, E values differing from those of the TTI system by an amount in the range of 30 kj/mol have often been reported in the literature for the temperature dependence of the growth of other spoilage bacteria or pathogens in various chilled food products, e.g., Listeria monocytogenes in cooked frankfurters (10), pseudomonads, Shewanella putrefaciens, and Enterobacteriaceae in fish and meat (21, 22, 24, 43). Endpoint adjustment of the TTI. Additional studies were performed in order to investigate potential methods for the adjustment of the endpoint of the developed TTI system. According to Taoukis (41), there are two strict requirements that determine the successful application of a TTI: (i) the E of the TTI response must equal the E of the loss of the quality of the food product, and (ii) the endpoint of the TTI should correspond to the end of the product s shelf life at a chosen reference temperature. For the first requirement, it has been shown that the E of the proposed TTI system is very close to that of the loss in quality for products spoiled by lactic acid bacteria or other bacteria with the same kinetic behavior and spoilage potential. Regarding the second requirement, the TTI system, as it has been presented above, can be used for monitoring the quality of food products with a shelf life of about 1 month at 0 C (the endpoint at 0 C is 27 days). However, the shelf life of food at a certain temperature can vary significantly depending on various factors, such as the initial contamination level of SSO, ph, water activity, and the presence of antimicrobials, etc. (21 24). Thus, an effective TTI system should provide the ability to easily adjust the endpoint according to the shelf life of the product of concern. The structural components of the proposed TTI system also allow for matching the endpoint with the shelf life of a certain product by simply simulating the food environment. For example, an antimicrobial present in the food could be added at the same concentration in the TTI substrate, or the water activity of the TTI substrate can be adjusted by humectants to match that of the food. In all cases, the aim is to establish an environment in the TTI system as close as possible to that of the food matrix in order to achieve the same microbial growth in both systems. It needs to be noted that such changes in the TTI substrate will affect microbial growth and thus alter the endpoint at a certain temperature. It is also of interest to note that no significant effects on the E are expected as a result of compositional changes in the growth media (21, 24). An alternative approach for the adjustment of the TTI endpoint is to change the level of the bacterial strain inoculated into the system. In this context, the effect of different initial concentrations of L. sakei (10 1 to 10 6 CFU/ml) on the response of the TTI at 8 C was examined. As expected, when the inoculum level was increased, the microorganism reached the maximum bacterial concentration at shorter times, also leading to faster ph decline profiles (Fig. 5a) and shorter endpoints (Fig. 5b). In particular, the endpoints were 6, 4.9, 3.3, and 2 days at inoculum levels of 10 1,10 3,10 5, and 10 6 CFU/ml, respectively. A similar effect of the initial microbial level has also been FIG. 5. Effects of the initial inoculum level on the kinetics of microbial growth (filled symbols) and ph decline profiles (open symbols) (a), the chromaticity values (b), and the endpoints (c) of the TTI system stored at 8 C. observed for the shelf lives of foods (22, 24); increasing the initial contamination level of the SSO results in a shorter shelf life since the time required for the SSO to reach the spoilage level decreases. A negative linear relationship between the level of L. sakei inoculated into the system substrate and the endpoint of the TTI was, in fact, noted (Fig. 5c). Such a relationship points to the ability of easily adjusting the TTI endpoint at a certain temperature according to the shelf life of the food product of concern by using an appropriate inoculum level of L. sakei in the TTI substrate. Further research is needed to transform the TTI prototype presented in this study into a commercial TTI product. A commercial TTI should be small, easily integrated as part of the food package, compatible with a high-speed packaging

320 VOL. 74, 2008 MICROBIAL TTI FOR MONITORING QUALITY OF CHILLED FOODS 3249 process, resistant to normal mechanical abuse, and easily activated, and it should have a long shelf life before activation. The commercial form of the microbial TTI could be based on two separate compartments in the form of a plastic minipouch containing the microbial culture (freeze-dried, spray-dried, or microencapsulated) and another containing the growth medium with the chromatic indicator. The user would be able to activate the TTI by mechanically breaking the barrier that separates the two compartments. This design allows for an easy activation and a long shelf life of the TTI before activation, without the need for refrigeration or freezer storage. Conclusions. The microbial TTI prototype developed in the present study is based on the growth and metabolic activity of a Lactobacillus sakei strain. The activation energy of the TTI is kj/mol, while the endpoint at a certain temperature can be further adjusted according to the shelf life of the food product of concern by altering the TTI growth substrate or varying the inoculum level of L. sakei. The results indicated that the proposed TTI could be used as an effective tool for monitoring shelf life during the distribution and storage of food products that spoil by the growth and metabolic activity of lactic acid bacteria or other bacteria exhibiting a similar kinetic behavior and spoilage potential. In addition, based on the principles presented in this work, microbial TTIs targeting any other specific food products can be developed using the SSO of the food of interest in combination with an appropriate growth medium and an appropriate chromatic indicator. However, in any case, the applicability of the TTI as a quality indicator of a specific food commodity would require systematic kinetic studies of both food product spoilage and the respective TTI responses. ACKNOWLEDGMENTS This research was in part supported by the General Secretary for Research and Technology, Greek Ministry of Development (PENED 03151), and by the EU Framework VI program Food Quality and Safety (acronym: ProSafeBeef Food-CT ). We acknowledge E. Drosinos and the Laboratory of Food Quality Control and Hygiene (Agricultural University of Athens) for kindly offering the Lactobacillus sakei strain used in this study. REFERENCES 1. Axelsson, L. T Lactic acid bacteria: classification and physiology, p In S. Salminen and A. Von Wright (ed.), Lactic acid bacteria. Marcel Dekker, Inc., New York, NY. 2. Biliaderis, C. G., D. R. Grant, and J. R. Vose Structural characterization of legume starches. I. Studies on amylose, amylopectin, and beta-limit dextrins. Cereal Chem. 58: Bobelyn, E., M. L. A. T. M. Hertog, and B. M. Nicolaï Applicability of an enzymatic time-temperature-integrator as a quality indicator for mushrooms in the distribution chain. Postharv. Biol. Technol. 42: Borch, E., M. L. Kant-Muermans, and Y. Blixt Bacterial spoilage of meat and cured meat products. Int. J. Food Microbiol. 33: Breidt, F., and H. Fleming Modeling of the competitive growth of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Appl. Environ. Microbiol. 64: Cocaign-Bousquet, M., C. Garrigues, P. Loubiere, and N. D. Lindley Physiology of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis. Antonie van Leeuwenhoek 70: Dalgaard, P FISH/spoilage of seafood, p In B. Caballero (ed.), Encyclopedia of food sciences and nutrition. Academic Press, Oxford, United Kingdom. 8. Devlieghere, F., J. Debevere, and J. VanImpe Effect of dissolved carbon dioxide and temperature on the growth of Lactobacillus sake in modified atmospheres. Int. J. Food Microbiol. 41: Devlieghere, F., A. H. Geeraerd, K. J. Versyck, H. Bernaert, J. F. VanImpe, and J. Debevere Shelf life of modified atmosphere packed cooked meat products: addition of Na-lactate as a fourth shelf life determinative factor in a model and product validation. Int. J. Food Microbiol. 58: Diez-Gonzalez, F., D. Belina, T. P. Labuza, and A. Pal Modeling the growth of Listeria monocytogenes based on a time to detect model in culture media and frankfurters. Int. J. Food Microbiol. 113: Drosinos, E. H., M. Mataragas, and J. Metaxopoulos Modeling of growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides E131. Meat Sci. 74: Fu, B., P. S. Taoukis, and T. P. Labuza Predictive microbiology for monitoring spoilage of dairy products with time-temperature integrators. J. Food Sci. 56: Giannakourou, M. C., and P. S. Taoukis Application of a TTI-based distribution management system for quality optimization of frozen vegetables at the consumer end. J. Food Sci. 68: Giannakourou, M. C., and P. S. Taoukis Systematic application of time temperature integrators as tools for control of frozen vegetable quality. J. Food Sci. 67: Giannakourou, M. C., K. Koutsoumanis, G. J. E. Nychas, and P. S. Taoukis Field evaluation of the application of time temperature integrators for monitoring fish quality in the chill chain. Int. J. Food Microbiol. 102: Giannakourou, M. C., K. Koutsoumanis, G. J. E. Nychas, and P. S. Taoukis Development and assessment of an intelligent shelf life decision system for quality optimization of the food chill chain. J. Food Prot. 64: Kerry, J. P., M. N. O Grady, and S. A. Hogan Past, current and potential utilization of active and intelligent packaging systems for meat and muscle-based products: a review. Meat Sci. 74: Konopka, A Microbial physiological state at low growth rate in natural and engineered ecosystems. Curr. Opin. Microbiol. 3: Korkeala, H., S. Lindroth, R. Ahvenainen, and T. Alanko Interrelationship between microbial numbers and other parameters in the spoilage of vacuum-packed cooked ring sausages. Int. J. Food Microbiol. 5: Koutsoumanis, K., P. S. Taoukis, and G. J. E. Nychas Development of a safety monitoring and assurance system for chilled food products. Int. J. Food Microbiol. 100: Koutsoumanis, K., A. Stamatiou, P. Skandamis, and G. J. E. Nychas Development of a microbial model for the combined effect of temperature and ph on spoilage of ground meat, and validation of the model under dynamic temperature conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72: Koutsoumanis, K., M. C. Giannakourou, P. S. Taoukis, and G. J. E. Nychas Application of shelf life decision system (SLDS) to marine cultured fish quality. Int. J. Food Microbiol. 73: Koutsoumanis, K., and G. J. E. Nychas Application of a systematic experimental procedure to develop a microbial model for rapid fish shelf life predictions. Int. J. Food Microbiol. 60: Koutsoumanis, K., P. Taoukis, E. Drosinos, and G. J. E. Nychas Applicability of an Arrhenius model for the combined effect of temperature and CO 2 packaging on the spoilage microflora of fish. Appl. Environ. Microbiol. 66: Kristo, E., C. G. Biliaderis, and N. Tzanetakis Modeling of rheological, microbiological and acidification properties of a fermented milk product containing a probiotic strain of Lactobacillus paracasei. Int. Dairy J. 13: Labuza, T. P., and B. Fu Use of time/temperature integrators, predictive microbiology, and related technologies for assessing the extent and impact of temperature abuse on meat and poultry products. J. Food Saf. 15: Lejeune, R., R. Callewaert, K. Crabbe, and L. De Vuyst Modeling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation. J. Appl. Microbiol. 84: Leroy, F., and L. De Vuyst Bacteriocin production by Enterococcus faecium RZS C5 is cell density limited and occurs in the very early growth phase. Int. J. Food Microbiol. 72: Leroy, F., and L. De Vuyst Temperature and ph conditions that prevail during fermentation of sausages are optimal for production of the antilisterial bacteriocin sakacin K. Appl. Environ. Microbiol. 65: Mataragas, M., E. H. Drosinos, A. Vaidanis, and I. Metaxopoulos Development of a predictive model for spoilage of cooked cured meat products and its validation under constant and dynamic temperature storage conditions. J. Food Sci. 71:M157 M McMeekin, T. A., and T. Ross Shelf life prediction: status and future possibilities. Int. J. Food Microbiol. 33: Mendoza, T. F., B. A. Welt, S. Otwell, A. A. Teixeira, H. Kristonsson, and M. O. Balaban Kinetic parameter estimation of time-temperature integrators intended for use with packaged fresh seafood. J. Food Sci. 69: Nielsen, J., K. Nikolajsen, and J. Villadsen Structured modeling of a microbial system: II. Experimental verification of a structured lactic acid fermentation model. Biotechnol. Bioeng. 38: Nychas, G. J. E., P. Skandamis, C. Tassou, and K. Koutsoumanis Meat spoilage during distribution. Meat Sci. doi: /j.meatsci Pirt, S. J The maintenance energy of bacteria in growing cultures. Proc. R. Soc. Lond. B 163: Rao, M. S., J. Pintado, W. F. Stevens, and J. P. Guyot Kinetic growth

321 3250 VAIKOUSI ET AL. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. parameters of different amylolytic and non-amylolytic Lactobacillus strains under various salt and ph conditions. Bioresour. Technol. 94: Samelis, J., A. Kakouri, and J. Rementzis Selective effect of the product type and the packaging conditions on the species of lactic acid bacteria dominating the spoilage microbial association of cooked meats at 4 C. Food Microbiol. 17: Shimoni, E., E. M. Anderson, and T. P. Labuza Reliability of time temperature indicators under temperature abuse. J. Food Sci. 66: Smolander, M., H. Alakomi, T. Ritvanen, J. Vainionpää, and R. Ahvenainen Monitoring of the quality of modified atmosphere packaged broiler chicken cuts stored in different temperature conditions. A. Time-temperature indicators as quality-indicating tools. Food Control 15: Taoukis, P., and T. P. Labuza Time-temperature indicators (TTIs), p In R. Ahvenainen (ed.), Novel food packaging techniques. Woodhead Publishing Ltd., Cambridge, United Kingdom. 41. Taoukis, P. S Modeling the use of time-temperature indicators in distribution and stock rotation, p In L. M. M. Tijkskens, M. L. A. T. M. Hertog, and B. M. Nicolaï (ed.), Food process modeling. CRC Press, Washington, DC. 42. Taoukis, P. S., and T. P. Labuza Applicability of time-temperature indicators as shelf life monitors of food products. J. Food Sci. 54: Taoukis, P. S., K. Koutsoumanis, and G. J. E. Nychas Use of timetemperature integrators and predictive modeling for shelf life control of chilled fish under dynamic storage conditions. Int. J. Food Microbiol. 53: Van den Berghe, E., G. Skourtas, E. Tsakalidou, and L. De Vuyst Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 produces the lantibiotic, macedocin, at temperature and ph conditions that prevail during cheese manufacture. Int. J. Food Microbiol. 107: Vermeiren, L., F. Devlieghere, and J. Debevere Evaluation of meat born lactic acid bacteria as protective cultures for the biopreservation of cooked meat products. Int. J. Food Microbiol. 96: Yan, S., C. Huawei, Z. Limin, R. Fazheng, Z. Luda, and Z. Hengtao Development and characterization of a new amylase type time-temperature indicator. Food Control. doi: /j.foodcont :27.

322

323 ARTICLE IN PRESS Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx Contents lists available at ScienceDirect Journal of Food Engineering journal homepage: Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols Hariklia Vaikousi a, Konstantinos Koutsoumanis b, Costas G. Biliaderis a, * a Laboratory of Food Chemistry and Biochemistry, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki , Greece b Laboratory of Food Hygiene and Microbiology, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki , Greece article info abstract Article history: Received 29 November 2008 Received in revised form 2 June 2009 Accepted 10 June 2009 Available online xxxx Keywords: Honey Non-enzymatic browning Kinetic modelling WLF model Dynamic heating conditions The kinetics of non-enzymatic browning (NEB) in honey and diluted honey systems was investigated. The effect of a w (in the range of ) on brown pigment formation in honey and its diluted solutions, differing in the concentration of reactant solutes was monitored upon heating at four temperatures (50, 60, 70 and 80 C). The progression of the Maillard reaction was followed by spectrophotometric measurements at 420 nm (A 420 ) and the absorbance time curves were fitted to the logistic model. The processing temperature and water activity, or the initial reactant concentration, had a significant impact on browning kinetics and the color change of honey. Secondary models, expressing the dependence of the best fitted primary model parameters on temperature and a w, were further developed. In addition, an alternative method of expressing the temperature dependence of browning rate constants using the WLF kinetic formalism, based on the glass transition temperature, T g, was applied. The main secondary models were validated by comparing the predicted model parameters with those obtained from isothermal experiments. Finally, the derived kinetic model was further evaluated against the observed browning responses of honey under dynamic heating conditions to examine the applicability of the developed model over fluctuating temperature time protocols. Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Honey, is the natural sweet product made by bees from nectars of blossoms or from honeydew. It contains a complex mixture of carbohydrates, mainly glucose and fructose as well as other minor sugars such as trehalose and elizitose (Mendes et al., 1998). Other minor constituents include organic acids, lactones, amino acids, minerals, vitamins, enzymes, pollen, wax and pigments are present (Fallico et al., 2004). Many constituents of honey exhibit biological activity, making this product an important dietary supplement with significant nutritional and medicinal benefits. The chemical composition and the rheological and sensory characteristics are important determinants of honey quality. Often, chemical composition (e.g. ratio of fructose to glucose) and particularly analysis of volatiles are used to characterize honey samples from different botanical origins, to judge their authenticity, or to reveal their crystallization tendency (Anklam, 1998; Mendes et al., 1998; Abu-Tarboush et al., 1993). Amongst others, quality factors include the diastase activity of honey and the content of 5-hydroxymethylfurfural (HMF), as indices of aging or thermal history of the product * Corresponding author. Address: Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki , P.O. Box 235, Greece. Tel./fax: address: biliader@agro.auth.gr (C.G. Biliaderis). (Bath and Singh, 2000; Fallico et al., 2004; Mendes et al., 1998; Moreira et al., 2007; Tosi et al., 2002, 2008; White, 1994). Moreover, the rheological behavior of honey has received considerable attention from storage, handling and processing point of view (Ahmed et al., 2007; Lazaridou et al., 2004; Recondo et al., 2006; Sopade et al., 2002; White, 1978). The color of honey is another factor determining its price and consumer acceptability on the world market (Gonzales et al., 1999). Darkening of honey may occur during storage as a result of the Maillard reactions, fructose caramelization or due to reaction of polyphenols with ferrous salts (Lynn et al., 1936). The rate of darkening has been related to honey composition and storage temperature (White, 1978). Similar quality losses are attributed to heating of honey during extraction or packaging processes, where a reduced viscosity is required for processing. Generally, honey is subjected to thermal treatments in order to modify its tendency to crystallization or delay its appearance as well as to prevent growth of the existing microbial flora that usually contaminates the raw product (Fallico et al., 2004; Tosi et al., 2002; Turkmen et al., 2006). Honey heating is usually carried out in two different ways: storage in air ventilated chambers at C for 4 7 days or by immersion of honey drums into hot water (Fallico et al., 2004). The thermal treatment of honey results in non-enzymatic browning (NEB), including Maillard reaction and formation of HMF (Ibarz et al., 2000). The extent of heat treatment in honey has been widely /$ - see front matter Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi: /j.jfoodeng Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

324 ARTICLE IN PRESS 2 H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx Nomenclature a 1 constant (polynomial equation) a 2 a 6 coefficients (polynomial equation) a w water activity a w ref water activity at reference temperature a w max maximum a w A absorbance value A 0 absorbance at time t =0 A max maximum absorbance A max ref maximum absorbance at reference temperature b constant (Belehradek equation) C 1, C 2 coefficients of WLF equation d constant (modified Arrhenius equation) E a activation energy (J mol 1 ) HMF 5-hydroxymethylfurfural k browning rate constant (h 1 ) k ref browning rate constant at reference temperature (h 1 ) k g browning rate constant at glass transition temperature (h 1 ) k 0 constant (Gordon Taylor equation) NEB non-enzymatic browning R universal gas constant (8.314 J mol 1 K 1 ) R 2 coefficient of determination t time (h) T temperature ( C, K) T g glass transition temperature T g1 glass transition of dry samples T g2 glass transition of glassy water w 1 weight fraction of dry solids weight fraction of water w 2 related to the HMF content; the latter has been proposed as a reliable indicator of the thermal history of the product (White, 1994). In the present study, color development, as expressed by absorbance values, was used as an index for brown pigment formation in honey due to thermal treatment. A native honey sample was properly diluted over the water activity range of , and the extent of NEB in the heated preparations was followed using the kinetic modelling approach described earlier by Vaikousi et al. (2008). The effects of time, temperature and water activity on browning were evaluated by a kinetic model, while the temperature and water activity dependence of browning rate constants were examined either by a modified Arrhenius model or by taking into account the glass transition temperature, according to the WLF formalism. Finally, the model developed was tested for its applicability in predicting honey browning under dynamic temperature time processing protocols. 2. Materials and methods 2.1. Experimental design and sample preparation Four different water activity levels (0.54, 0.70, 0.87 and 0.97) and four processing temperatures (50, 60, 70 and 80 C) were adopted to examine the effect of temperature and water activity on the kinetics of NEB honey in honey and to develop a reliable prediction model. The effects of both temperature and a w on the kinetic responses were subsequently evaluated by several secondary model equations. Orange blossom floral honey (a w 0.54) produced in Southern Greece, region of Sparti, was kindly offered by a local producer. This product was chosen among others for its increased solids content which allows for creation of diluted honey preparations with a wide range of a w levels. This type of honey also has a very light color and thus offers the chance to examine the NEB reaction kinetics as a function of temperature and water activity, including the region where the observed maximum reaction rate usually occurs (i.e. highly concentrated systems, a w 0.70). Thus, the native honey sample (a w 0.54) was mixed with appropriate portions of double distilled water to obtain three diluted systems differing in their solids concentration and a w levels, i.e. 0.70, 0.87, Water activity measurements (a w ) of all samples at initial and final treatment times were made using a water activity meter (Aqualab, Model series 3TE, Decagon Devices Incorporation, Pullman, Washington) at 20 C. The moisture content of the native honey sample was calculated using the relationship between refractive index measured at 20 C with refractometer, and water content (AOAC, 1990) Isothermal heating and spectrophotometric measurements The four (in total) honey preparations were placed into hermetically sealed glass test tubes in duplicate, and heated under controlled isothermal conditions (50, 60, 70, 80 C) in high precision (±0.2 C) incubators (model MIR 153; Sanyo Electric Co., Ora-Gun, Gunma, Japan). Samples were taken at appropriate time intervals to allow for efficient kinetic analysis of the NEB data. Tubes were withdrawn, rapidly cooled on ice and stored at the freezer until the time of analysis. The extent of brown pigment formation was evaluated spectrophotometrically on a UV Vis spectrophotometer (SP-8001 UV Vis, Metertech Inc.) against water at 420 nm. Honey preparations were first diluted to the solids concentration of the most diluted preparation, (a w value 0.97) with distilled water and then centrifuged for 10 min at 10,000g (ALC refrigerated centrifuge model PK120R; ALC International Srl., Italy) prior to the spectrophotometric measurements. Thirty-two (32) absorbance time curves (4 honey preparations 4 testing temperatures 2 replications for each treatment) were thus derived and used for model development of the non-enzymatic browning kinetics for honey. For analysis, all samples were further diluted, when necessary, to obtain reliable absorbance readings in the range of units, and to comply with the specifications of the spectrophotometer used; i.e. satisfying the linearity requirement between absorbance readings and concentration of colorants, according to the Beer s law Model development The method of kinetic model development used for the description of NEB occurring in all honey preparations has been previously reported in detail by Vaikousi et al. (2008). In that study, the logistic equation was reported to be the more appropriate in describing the non-enzymatic browning of apple juice concentrates among five different primary models tested, and thus was adopted in the present work for the expression of NEB in honey preparations. The logistic model was fitted to all 32 absorbance time curves using the TableCurve TM 2D software (v4, SPSS Inc.) as described by the following equation: A ¼ A max 1 þð Amax A 0 1Þ expð ktþ where, A is the absorbance at 420 nm at time t, A 0 is the initial absorbance (t = 0) at the same wavelength, k is the browning rate constant (h 1 ) and A max is the maximum absorbance. ð1þ Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

325 ARTICLE IN PRESS H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx 3 Table 1 Secondary models used to describe the dependence of browning reaction rate constants on temperature and a w during heating of honey preparations under isothermal conditions. Models Equations Model parameters Secondary models Modified Arrhenius ln k ¼ ln k ref þ dða w a w ref Þ Ea 1 R T 1 T ref Eq. (2) E a : Activation energy (J mol 1 ) R: Gas constant (8.314 J mol 1 K 1 ) ln A max ¼ ln A max ref þ dða w a w ref Þ Ea 1 R T 1 T ref Eq. (3) T: Temperature (K) d: Constant T ref : 373 K (100 C) a w ref : 1 k ref : k at T = T ref and a w = a w ref Belehradek pffiffiffi pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi k ¼ bt ð Tmin Þ a wmax a w Eq. (4) b: Constant T min : Minimum temperature ( C) a w max : Maximum a w Polynomial Y ¼ a 1 þða 2 TÞþða 3 a wþþða 4 T a wþþða 5 T 2 Þþða 6 a 2 w Þ Eq. (5) Y: k, lnk, A max, lna max a 1 : Constant a 2 a 6 : Coefficients The estimates of browning reaction rate constants (k) and other model parameters were then fitted to secondary models, describing the individual and combined effects of temperature and a w on k and A max, using analysis of variance and the TableCurve TM 3D software (v3, SPSS Inc.), Table 1 (Eqs. (2) (5)). The statistically significant parameters of the models were determined by stepwise regression analysis (F-value). Except for the above mentioned secondary models, the temperature dependence of NEB rate constant, k, was modelled using the WLF model (Williams et al., 1955) log k g k ¼ C 1ðT T g Þ C 2 þðt T g Þ where T g is the glass transition temperature, k is the reaction rate at temperature T, k g is the reaction rate at T g, and C 1 and C 2 are the WLF constants. The model was fitted to experimental data using the TableCurve 2D software. This attempt aimed to examine the potential applicability of the WLF model in the temperature range (50 80 C) adopted in this study which is far above the T g of honey preparations Differential scanning calorimetry The values of T g were determined by differential scanning calorimetry, using a PL DSC-gold calorimeter (Polymer Labs. Ltd., Epsom, UK), according to Biliaderis et al. (1999a). The native honey sample and diluted preparations were hermetically sealed into stainless steel pans (40 45 mg) and analyzed in the calorimeter under continuous flow of dry N 2 gas to avoid moisture condensation in the cell. First, the pans were heated from +20 to +60 C at a heating rate of 5 C min 1 to ensure complete melting of any crystals existing in the raw materials and reach the desired thermodynamic equilibrium. The samples were then quenched-cooled with liquid N 2 to 100 C and reheated to 50 C at a heating rate of 5 C min 1. The T g was obtained from the second heating scan as the onset temperature of the step-like decrease in the heat flow function. Experimentation dealing with the T g determination of native honey and its diluted systems revealed a weakness in estimation of the T g for diluted honey preparations at a w levels above For these samples, evaluation of the T g s was based on extrapolation of the T g versus water content as described by the Gordon Taylor model (Gordon and Taylor, 1952). More specifically, the native honey sample (moisture content 15.5% as determined by refractometry) was either diluted with water at intermediate moisture content levels (23.2%, 34.2%, 38.9%, with respective a w values ð6þ of 0.65, 0.77, 0.80) or concentrated under vacuum at even lower moisture contents (13.8%, 14.7%, 15.2%, with respective a w values of 0.50, 0.52, 0.53). This procedure allowed for the description of the effect of moisture on glass transition temperature using the empirical Gordon Taylor model (Gordon and Taylor, 1952) T g ¼ w 1T g1 þ k 0 w 2 T g2 w 1 þ k 0 w 2 where, T g1 is the glass transition temperature of the sample at zero moisture content, w 1 is the weight fraction of dry solids, T g2 is the glass transition temperature for glassy water, w 2 is the weight fraction of water and k 0 is a constant. The estimated experimental values of T g were fitted to the above equation and with the aid of TableCurve 2D software, optimization for the parameters k 0 and T g1 was performed, while the value of 138 C (135 K), according to Sugisaki et al. (1968), was used for the T g2 of glassy water; subsequently, the unknown T g values of honey preparations with a w 0.87 and 0.97 were calculated using the Eq. (7) Model validation For validation of the model describing the NEB in honey, secondary mathematical models were employed by comparing the predicted model parameters with the values observed in independent experiments at two different temperatures (65, 75 C) and a w levels (0.80, 0.90). Finally, the general models derived from the experimental data were validated against measured brown pigment formation under non-isothermal heating conditions using different dynamic temperature scenarios of periodic temperature changes from 55 to 75 C. Two separate heating protocols were examined. The first involved heating for 12 h at 55 C and 12 h at 75 C, while the second heating 12 h at 55, 6 h at 65 and 6 h at 75 C. The fluctuating time temperature protocols examined in this context were electronically recorded using a Hobo U12 Stainless Temp Data Logger (Onset Computers Corporation, southern MA USA) and the Hoboware TM software (version 2). 3. Results and discussion 3.1. Brown pigment formation during isothermal heating of honey preparations The formation of brown pigments by recording absorbance values has been previously used to examine the effect of prolonged ð7þ Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

326 ARTICLE IN PRESS 4 H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx heating on color of honey (Turkmen et al., 2006) or to determine the extent of NEB in fruit juices (Bozkurt et al., 1999; Burdurlu and Karadeniz, 2003; Cohen et al., 1998; Garza et al., 1999; Ibarz et al., 1999; Johnson et al., 1995; Koca et al., 2003; Manso et al., 2001; Nagy et al., 1990; Rattanathanalerk et al., 2005; Toribio and Lozano, 1984; Vaikousi et al., 2008). The effect of temperature on NEB of honey preparations is shown in Fig. 1. The strong impact of increasing the heating temperature on the final color development was more pronounced for the native honey sample, followed in a descending order, by honey preparations with increasing degree of dilution or a w levels. In contrast, on isothermal heating, samples differing in water activity showed a less intense effect in absorbance evolution (Fig. 2); the increase in absorbance was rather negligible for heating at 50 and/or 60 C, smaller at 70 C, but very pronounced at 80 C, as previously reported by Turkmen et al. (2006). These results confirmed that pigment formation is enhanced in concentrated samples, due to higher reactant concentration, coinciding with other reports on liquid model systems (Baisier and Labuza, 1992), apple juice concentrates (Toribio and Lozano, 1984; Vaikousi et al., 2008) and orange juice (Johnson et al., 1995). Despite the fact that the levels of a w used in the present study for honey preparations were in the range where the maximum browning reaction rate usually occurs, the findings demonstrated a continuous decline in rate constants within the water activity range of 0.54 and In this case, the dilution effect of solute concentration of honey is more predominant than the possible mobility loss of solutes taking place at low water activity levels that would restrain reactant molecules to react, as in the case of powders and glassy foods Model development Fitting primary models The sets of thirty two absorbance evolution plots as a function of time were fitted to the logistic kinetic model (Eq. 1). A similar study dealing with NEB of apple juice concentrates, revealed that the kinetic data of 80 absorbance time curves were better described by the logistic model, compared to the other four models tested i.e. the pseudo-zero and pseudo-first order models, the weibull and parabolic models (Vaikousi et al., 2008). As shown in Figs. 1 and 2, the absorbance evolution over time, followed a sigmoid pattern in most of the cases, which implies that an appropriate equation should include a term related to the maximum level of the recorded parameter, which is the term A max. This parameter is included in the logistic equation and thus this model was successfully adopted in the present study to describe the NEB occurring in honey upon heat treatment. The lines presenting the fits of the logistic equation to the respective absorbance time plots in Figs. 1 and 2 serve as a graphical proof for the goodness of fit of the selected kinetic model Fitting secondary models on the k and A max parameters derived by the primary model The combined effects of temperature and water activity on k and A max parameters, estimated by the logistic model, was analyzed by fitting the secondary models given in Table 1. The temperature dependence of browning reaction rates was modelled by a modified Arrhenius equation (Eq. 2). The parallel Arrhenius plots of all honey preparations, regardless of their water activity level (Fig. 3a), led to the conclusion that the temperature dependence A (Abs 420 nm) aw C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) aw C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) Time (h) aw C 60 C 70 C 80 C A (Abs 420 nm) Time (h) aw C 60 C 70 C 80 C Time (h) Time (h) Fig. 1. Temperature effect on the absorbance time kinetic plots describing browning of honey and its diluted systems differing in a w. Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

327 ARTICLE IN PRESS H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx C C A (Abs 420 nm) A (Abs 420 nm) Time (h) Time (h) C C A (Abs 420 nm) A (Abs 420 nm) Time (h) Time (h) Fig. 2. Effect of water activity on the absorbance time plots describing the browning kinetics of honey and its diluted systems heated isothermally at 50, 60, 70 and 80 C. of NEB of all samples was similar, and thus could be adequately expressed by the statistically invariant parameter of activation energy, E a. The effect of a w on reaction rate (shown in Fig. 3b) was described by the constant parameter, d, introduced in the Arrhenius equation (Table 1), which represents the exponential decrease in the rate constants as a w increases. Consequently, the modified Arrhenius model expresses the combined effects of both temperature and water activity on browning reaction rate of honey and diluted honey systems. For the temperature and a w dependence of browning rate constants in honey, other models based on the general Belehradek equation (Eq. 4) and the polynomial model, with k and lnk as responses (Eq. 5), were also examined. The estimated coefficient values and statistics for all secondary models tested (Table 2) showed similar R 2 values ( ) for all equations. It should be noted that among all models tested the most applicable are those of Arrhenius and Belehradek. In the first, the temperature sensitivity of NEB reaction, as expressed by the estimated E a value, as well as the calculated rate constant at reference conditions, are both important information. Alternatively, the application of Belehradek equation allowed for the estimation of 9.4 C as the theoretical minimum temperature for the reaction. The polynomial models also gave adequate precision but none of the included parameters provide any further information about the effects of temperature and/or a w on browning reaction rates. The apparent activation energy of 34.8 kj mol 1, obtained by the modified Arrhenius equation, was lower than the value of 122 kj mol 1, calculated for brown pigment formation in another honey sample (Turkmen et al., 2006). The activation energy calculated in this work can be compared with E a values of other concentrated liquid food systems, such as juices and purees with reported activation energies within the range of kj mol 1 (Bozkurt et al., 1999; Burdurlu and Karadeniz, 2003; Garza et al., 1999; Johnson et al., 1995; Koca et al., 2003; Labuza and Baisier, 1992; Manso et al., 2001; Vaikousi et al., 2008). The browning reaction in honey proved to be less sensitive to temperature increase compared to usual non-enzymatic browning in grape, orange or apple juices, probably due to different contents of amino acids and reducing sugars present in honey or even to variations in thermal sensitivity of the reactants in this system (Turkmen et al., 2006). The obtained estimates for the maximum absorbance at equilibrium, A max, from the logistic model, were also fitted to the secondary models listed in Table 1. The calculated coefficients of the respective model parameters and the statistics derived are given in Table 3. The polynomial equation of natural logarithm of A max, lna max, as a function of temperature and a w, exhibited the highest coefficient of determination (R 2 = 0.978). Nevertheless, the modified Arrhenius model was used in the final model since it fitted better than the others the experimental data of NEB of honey during the thermal treatment under dynamic heating conditions (the validation of the overall model is presented below). Finally, the estimated values for the absorbance of all honey preparations at zero time, A 0, was independent on both temperature and water activity level (P > 0.05) WLF modelling of browning reaction rates The temperature dependence of honey browning reaction rates was also described using the WLF model. This equation was evaluated as an alternative approach for modelling the temperature dependence of mechanical and dielectric relaxations within the Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

328 ARTICLE IN PRESS 6 H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx lnk (h -1 ) -3.0 a E E E E-04 1/T-1/T ref (K) 0.04 b Table 3 Estimated values, confidence limits (CL±, P < 0.05) and statistics for the coefficients of three secondary models describing the dependence of maximum absorbance (A max ) on temperature and a w. Equation type Parameter R 2a Estimated value CL(+/ ) b Polynomial A max a a a a a a 6 P > 0.05 Polynomial lna max a P > 0.05 a a a a a Arrhenius A max ref E a (kj mol 1 ) d a b Coefficient of determination. ±95% confident limits. k (h -1 ) C 60 C 70 C 80 C a w Fig. 3. Arrhenius plots describing the temperature dependence of non-enzymatic browning rate constants (k) of honey preparations differing in a w (a) and the effect of water activity on non-enzymatic browning reaction rate constants (b); lines in both figures represent the predicted values of rate constants at fixed a w levels (a) or temperature conditions (b). Table 2 Estimated values, confidence limits (CL±, P < 0.05) and statistics for the coefficients of four secondary models describing the dependence of browning reaction rate constant (k) on temperature and a w. Equation type Parameter R 2a Estimated value CL(+/ ) b Polynomial k a P > 0.05 a a 3 P > 0.05 a 4 P > 0.05 a a 6 P > 0.05 Polynomial lnk a a a 3 P > 0.05 a 4 P > 0.05 a a Belehradek b T min a w max Arrhenius k ref (h 1 ) E a (kj mol 1 ) d a b Coefficient of determination. ±95% confident limits. rubbery state, where it is assumed that the Arrhenius model is not theoretically applicable (Williams et al., 1955). It has been recommended in the literature that the WLF kinetics may also describe the temperature dependence of chemical reaction rates within amorphous matrices, above their glass transition temperature (Slade et al., 1989). Thus, the applicability of WLF model and the glass transition theory has been examined in a number of studies to describe the temperature sensitivity of vitamin C loss in frozen green vegetables (Giannakourou and Taoukis, 2003) or model aqueous starch hydrolyzates in the frozen state (Biliaderis et al., 1999b) as well as the combined effects of moisture and temperature on non-enzymatic browning rates in dried food systems (Buera and Karel, 1993; Karmas et al., 1992). In this study, the T g of honey preparations was considered as a reference temperature, below which the browning reaction rates are very low, while above it, the difference between processing temperatures and T g (T T g ) was assumed to govern the browning rate in honey. DSC thermograms of several honey preparations differing in their water activity level are shown in Fig. 4. The glass transition temperature was taken as the onset of the change in specific heat flow; i.e. endothermic shift in the baseline on the DSC scan plots. The T g of the native honey sample was estimated at 42.7 C, falling within the range of T g values from 38 to 44 C previously reported in the literature for other honey samples, with moisture contents varying among 14.6% and 16%, (Lazaridou et al., 2004; Sopade et al., 2002) and similar to the moisture content of the honey sample used in this study. Moreover, other researchers have also determined the T g of honey samples in an analogous temperature range ( to C and 42.5 or 43 C) without reporting their moisture contents (Ahmed et al., 2007; Kantor et al., 1999; Recondo et al., 2006). With increasing moisture content, a shift in the T g of the diluted systems at lower temperatures was observed (Fig. 4); the T g decreased significantly from to C as the a w level of honey preparations increased from 0.54 to This trend of T g decline in diluted honey samples has previously been reported by Kantor et al. (1999) and Lazaridou et al. (2004) and was attributed to the plasticizing effect of water on honey solids. For all honey preparations, the presence of an exothermic peak after the glass transition was observed which was more pronounced in samples with high moisture content, indicating water crystallization due to the presence of free water in these materials; i.e. freezable water that had remained unfrozen due to hindered crystallization as a result of fast cooling with liquid nitrogen, crystallizes upon warming, yielding an exothermic Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

329 ARTICLE IN PRESS H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx 7 Endothermic Heat Flow (mwatts) Endothermic Heat Flow (mwatts) T g : T g : T g : mwatt T g : T g : T g : T g : T g : a w : 0.50 a w : 0.52 a w : Temperature ( C) a w : 0.54 a w : 0.65 a w : 0.70 a w : 0.78 Tg (K) log (1/k) (h) a concentrated honey diluted honey estimated Tg for diluted honey Water weight fraction (w 2 ) b aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw 0.97 a w : mwatt Temperature ( C) Fig. 4. DSC thermal scans for honey, honey diluted preparations and honey concentrated samples (inset figure) differing in water activity levels; the position of the onset temperature considered as glass transition is depicted by the cross point of the two tangent lines in each thermal scan. enthalpy relaxation peak (Rahman, 2006). This exothermic transition and the subsequent ice melting endotherm, associated to the free water of the sample, have been previously noted onto DSC scans of honey/water mixtures, containing less or than 80% honey (Kantor et al., 1999). The large depression of T g at even high moisture contents brought about some difficulties in the determination of the glass transition temperature of honey preparations diluted at a w levels of 0.87 and 0.97 by DSC. Therefore, more concentrated honey systems were prepared (their T g estimates are shown in inset of Fig. 4) and all data sets of T g water fraction contents were fitted to the empirical G T model (Eq. 7), allowing for the calculation of all model parameters. The relationship between T g and water content, as expressed by the G T model, is graphically presented in Fig. 5a (R 2 = 0.99). The constant k 0 parameter was estimated 1.76, while T g1, (i.e. the glass transition temperature for honey dry solids) was found K. The estimated value for T g1 by the model is below the reported T g s for the dry sugars (e.g. glucose, fructose; Fennema, 1996) and most likely reflects the lack of experimental data in the w 2 range of for the G T plots. Subsequently, the T g values of the unknown samples were calculated at and C for honey preparations with a w levels 0.87 and 0.97, respectively (Table 4). Indeed, the G T model is a useful tool for the prediction of T g, as well as for the determination of T g1 which T-Tg ( C) Fig. 5. Glass transition and moisture content relationship for honey and its diluted or concentrated samples; the solid line gives the Gordon Taylor plot derived by the DSC experimental data of glass transition temperature determinations (a), and the temperature dependence of honey browning rate constants according to the WLF formalism using the DSC experimentally determined T g values and allowing coefficients to vary (b). can not be measured experimentally since it is impossible to remove the strongly bound water from a food system and in particular from honey solids (Lazaridou et al., 2004). The browning rate constants of the four honey preparations were fitted to the WLF model (Eq. 6) to examine its applicability to describe the temperature dependence of honey browning at the heating temperatures between 50 and 80 C. According to Nelson and Labuza (1994), it is quite common in the literature to use the universal values for the coefficients C 1 and C 2, being and 51.6, respectively, calculated for different synthetic polymers by Williams et al. (1955). However, even the authors of the WLF equation adviced against the use of these universal constants, since this could lead to erroneous estimations of T g, and suggest that these constants should be allowed to vary in order to obtain a more realistic proof for the applicability of this model. As described by Nelson and Labuza (1994), it is first assumed that the WLF relationship describes the temperature dependence of the reaction rate and then the unknown parameters k g, C 1 and C 2 are optimized, resulting in estimated values quite close to actual ones. In this context, the calculated coefficients C 1 and C 2 were in the range of and K, respectively (Table 4), close to the average WLF constants often cited in the food science literature (Buera and Karel, 1993; Nelson and Labuza, 1994). Moreover, the values of the calculated C 1 coefficient varied with moisture content (i.e. increased with increasing moisture), coinciding with the findings of another study where the applicability of the WLF equation in describing the effect of T g on data of NEB rates derived from the lit- Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

330 ARTICLE IN PRESS 8 H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx Table 4 Glass transition temperatures of honey preparations and estimated parameters of the WLF model. a w Moisture content (g/100 g) T g,k( C) experimental data from DSC WLF constants b C 1 C 2 R 2 Samples ( 42.74) ( 65.29) a ( 92.37) a ( ) a b Estimated T g values using the empirical Gordon Taylor equation. WLF constants determined by the WLF model using the T g experimental data derived from DSC. erature was investigated (Buera and Karel, 1993). The good fittings of the predicted by the WLF equation k values to experimental kinetic data, shown as plots of log(1/k) versus T T g in Fig. 5b (R 2 = ), served as another typical proof for the applicability of the WLF model. However, the main disadvantage in this approach is that it assumes rather than proves the applicability of the WLF model (Nelson and Labuza, 1994) Model validation under isothermal and dynamic heating conditions The applicability of the Arrhenius, Belehradek and polynomial models (Eqs. (2) (5) in Table 1) were evaluated by comparing the browning rates predicted by the use of these equations with the actual reaction rates observed in independent experiments k prd (h -1 ) k prd (h -1 ) a b modified Arrhenius model WLF model aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw 0.97 aw 0.80 aw k obs (h -1 ) aw 0.54 aw 0.70 aw 0.87 aw 0.97 upon heating diluted honey preparations (a w 0.80 and 0.90) at different temperatures (65 and 75 C) than those used for the model development. All models revealed similar differences between the observed and predicted values of the rate constants and the predictions fell within the 10% range (data not shown). Consequently, a difficulty appeared in choosing a single model as the most applicable to describe the combined effects of temperature and a w on browning reaction rates. Furthermore, another comparison of browning rates, as predicted by the Arrhenius and the WLF models and the observed reaction rates for the conducted experiments, revealed a satisfactory agreement, with the residuals of both models being close to zero (the spread of all data points were all close to the diagonal) (Fig. 6a and b). In order to support a kind of preference for applying one model over the other the following considerations were taken into account: In this study, (i) honey preparations were heat treated at temperatures far above the T g, (T > T g C) where Arrhenius kinetics usually apply (Slade and Levine, 1991), (ii) browning reaction of all honey samples is not characterized as a diffusion limited process, which could demand the application of the WLF theory (Williams et al., 1955), and (iii) the adoption of the WLF model often assumes but does not prove its applicability to describe temperature dependence of browning reaction rates (Nelson and Labuza, 1994). Thus, the Arrhenius approach was deemed more appropriate to express the effect of temperature on the browning rate constants; the modified Arrhenius model can also take into account the water activity effect, further to providing information on the temperature sensitivity of the browning phenomenon in honey, as reflected in the calculated activation energy value. The established kinetic models were finally validated under dynamic heating conditions, in order to reveal potential effects of varying time temperature protocols, usually encountered on thermal processing or storage, on the final quality of honey-based products. In this context, the approach developed by Vaikousi et al. (2008) for the description of NEB of apple juice concentrates under non-isothermal heating was adopted. According to this treatment, the time temperature history of a treatment is divided into short time intervals for which temperature is assumed constant. Thus, the change in absorbance for honey and its diluted preparations under fluctuating temperatures is predicted as follows: At time t ¼ dt 1 A t1 ¼ A max t1 1 þ A max t1 1 expð k 1 dt 1 Þ A k obs (h -1 ) Fig. 6. Plot of predicted (k prd ) versus observed (k obs ) values of honey browning reaction rates heated under various protocols of temperature and a w, using the modified Arrhenius (a) or the WLF (b) model; open symbols in both figures represent browning rate constants obtained in the first stage of the experimental design assuming isothermal heating conditions and the closed symbols in the upper figure those of independent experiments. At the subsequent time interval;t ¼ dt 2 A t2 ¼ A max t2 1 þ A max t2 1 expð k 2 dt 2 Þ A t1 and at time t ¼ dt i A ti ¼ A max ti 1 þ A max ti 1 expð k i dt i Þ A tði 1Þ Additionally; the following conditions were assumed : A max ti ¼ A max ti if A max ti ia tði 1Þ A tði 1Þ if A max ti ha tði 1Þ ð8þ Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

331 ARTICLE IN PRESS H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx 9 where dt i (i = 1, 2, 3, etc.) is a short time interval assuming constant temperature, A 0 is the initial absorbance measurement at time zero, A ti is the absorbance value at a time interval dt i, A max ti is the maximum absorbance calculated by the secondary model at the temperature corresponding to the time interval dt i, k i is the reaction rate constant at the temperature during dt i, as estimated by the modified Arrhenius equation. The derived dynamic model and its applicability in predicting browning of honey under non-isothermal heating conditions, was evaluated by comparing the predicted by the model and the experimental absorbance values obtained during heat treatment at fluctuating temperature scenarios. In the first temperature profile the native honey sample was heated for 12 h at 55 C and then for 12 h at 75 C (Fig. 7a), while in the second the applied heat treatment was for 12 h at 55, 6 h at 65 and 6 h at 75 C (Fig. 7b). In the first case, a reasonable agreement between the observed and predicted by the dynamic logistic model absorbance evolution curve was revealed for the first 50 h of heating, followed by a distinct deviation in two plotted curves (Fig. 7a). In particular, the dynamic logistic model provided lower absorbance values than those experimentally obtained. Similar results were also observed for the second heating protocol (Fig. 7b); however, smaller differences were noted between the predicted data and the recorded values compared to the first case (Fig. 7a). Nevertheless, in both cases the observed absorbance experimental data were found within the confidence limits of the prediction lines, and more precisely closer to the upper confidence prediction line (dotted lines in Fig. 7a and b). The observed predicted by the logistic dynamic model delay in absorbance values were first noted in the down temperature shifts (heating step at 55 C). The presence of such deviations after heat treatment of honey for 50 and 90 h, respectively, under the two protocols examined, may be attributed to the following reasons. The first one could be a weakness in the constructed dynamic model to predict accurately the A max values at time t = t i, under the specific condition made at the low temperature heating step (55 C); it is worth here to note that the same assumption for the A max response, used in the dynamic model, has worked properly in a previous study on NEB of an apple juice concentrate under nonisothermal heating scenarios (Vaikousi et al., 2008). The second reason causing a false prediction in estimating honey browning may be the low accuracy of the secondary model used for the determination of the A max parameter, producing an error, whose a Abs at 420 nm Temperature ( C) Time (h) 1.0 b Abs at 420 nm Temperature ( C) Time (h) Fig. 7. Comparison between observed (points) and predicted (solid line) browning of honey (a w 0.54) heated under periodically changing temperature profiles for 12 h at 55 and 12 h at 75 C (a) and 12 h at 55, 6 h at 65 and 6 h at 75 C (b); dotted lines in both figures represent the 95% confidents limits of the predicted absorbance curve. Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

332 ARTICLE IN PRESS 10 H. Vaikousi et al. / Journal of Food Engineering xxx (2009) xxx xxx cumulative effect progressively leads to significant deviations between the predicted and the observed absorbance values over prolonged heating. 4. Conclusions A complete kinetic study of the non-enzymatic browning reaction in honey and its diluted preparations under isothermal and dynamic heating conditions has been conducted. The individual and combined effects of temperature and water activity with respect to reactant concentration on color development of honey were revealed. The logistic model was suitable to follow the brown pigment formation in honey. The applied modified Arrhenius described well the temperature and a w dependence of browning rate constants, despite the fact that the WLF model also fitted satisfactorily the observed reaction rates at processing temperatures far away from the T g of honey and its diluted samples. Finally, the overall derived dynamic logistic model predicted adequately the absorbance evolution of honey subjected to dynamic heating protocols, with the observed deviations between the experimental and predicted by the model absorbance values over prolonged heating, falling within the confidence limits of the prediction functions. Acknowledgements This work was carried out under the financial support of the Greek State Scholarships Foundation (IKY) (scholarship granted to H. Vaikousi). References Abu-Tarboush, H.M., Al-Kahtani, H.A., El-Sarrage, M.S., Floral-type identification and quality evaluation of some honey types. Food Chemistry 46 (1), Ahmed, J., Prabhu, S.T., Raghavan, G.S.V., Ngadi, M., Physico-chemical, rheological, calorimetric and dielectric behavior of selected Indian honey. Journal of Food Engineering 79 (4), Anklam, E., A review of the analytical methods to determine the geographical and botanical origin of honey. Food Chemistry 63 (4), AOAC, In: Helrich, K. (Ed.), Official methods of analysis, 15th ed., Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA. Baisier, W.M., Labuza, T.P., Maillard browning kinetics in a liquid model system. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40 (5), Bath, P.K., Singh, N., A research note. Chemical changes in Helianthus annuus and Eucalyptus lanceolatus honey during storage. Journal of Food Quality 23 (4), Biliaderis, C.G., Lazaridou, A., Arvanitoyannis, I., 1999a. Glass transition and physical properties of polyol-plasticized pullulan-starch blends at low moisture. Carbohydrate Polymers 40, Biliaderis, C.G., Swan, R.S., Arvanitoyannis, I., 1999b. Physicochemical properties of commercial starch hydrolyzates in the frozen state. Food Chemistry 64, Bozkurt, H., Gogus, F., Eren, S., Nonenzymic browning reactions in boiled grape juice and its models during storage. Food Chemistry 64 (1), Buera, V.D.P., Karel, V., Application of the WLF equation to describe the combined effects of moisture and temperature on nonenzymatic browning rates in food systems. Journal of Food Processing and Preservation 17, Burdurlu, S.H., Karadeniz, F., Effect of storage on nonenzymatic browning of apple juice concentrates. Food Chemistry 80 (1), Cohen, E., Birk, Y., Mannheim, C.H., Saguy, I.S., A rapid method to monitor quality of apple juice during thermal processing. Lebensmittel-Wissenschaft und-technologie 31 (7 8), Fallico, B., Zappalà, M., Arena, E., Verzera, A., Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys. Food Chemistry 85 (2), Fennema, O.R., Water and ice. In: Fennema, O.R. (Ed.), Food Chemistry. Marcel Dekker, New York, pp Garza, S., Ibarz, A., Pagán, J., Giner, J., Non-enzymatic browning in peach puree during heating. Food Research International 32 (5), Giannakourou, M.C., Taoukis, P.S., Kinetic modelling of vitamin C loss in frozen green vegetables under variable storage conditions. Food Chemistry 83 (1), Gonzales, A.P., Burin, L., Buera, M.D.P., Color changes during storage of honeys in relation to their composition and initial color. Food Research International 32 (3), Gordon, M., Taylor, J.S., Ideal copolymers and the second-order transitions of synthetic rubbers. I. Non-crystalline copolymers. Journal of Applied Chemistry 2, Ibarz, A., Pagán, J., Garza, S., Kinetic models for color changes in pear puree during heating at relatively high temperatures. Journal of Food Engineering 39 (4), Ibarz, A., Pagán, J., Garza, S., Kinetic models of non-enzymatic browning in apple puree. Journal of the Science of Food and Agriculture 80 (8), Johnson, J., Braddock, R.J., Chen, C.S., Kinetics of ascorbic acid loss and nonenzymatic browning in orange juice serum: experimental rate constants. Journal of Food Science 60 (3), Kantor, Z., Pitsi, G., Thoen, J., Glass transition temperature of honey as a function of water content as determined by differential scanning calorimetry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47 (6), Karmas, R., Buera, M.P., Karel, M., Effect of glass transition on rates of nonenzymatic browning in food systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40 (5), Koca, N., Burdurlu, S.H., Karadeniz, F., Kinetics of nonenzymatic browning reaction in citrus juice concentrates during storage. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 27 (6), Labuza, T.P., Baisier, W.M., The kinetics of nonenzymatic browning. In: Schwartzberg, H.G., Hartel, R.W. (Eds.), Physical Chemistry of Foods. Marcel Dekker, New York, pp Lazaridou, A., Biliaderis, C.G., Bacandritsos, N., Sabatini, A.G., Composition, thermal and rheological behavior of selected Greek honeys. Journal of Food Engineering 64 (1), Lynn, E.G., Englis, D.T., Milum, V.G., Effect of processing and storage on composition and color of honey. Food Research 1, Manso, M.C., Oliveira, F.A.R., Oliveira, J.C., Frías, J.M., Modelling ascorbic acid thermal degradation and browning in orange juice under aerobic conditions. International Journal of Food Science and Technology 36 (3), Mendes, E., Brojo Proença, E., Ferreira, I.M.P.L.V.O., Ferreira, M.A., Quality evaluation of Portuguese honey. Carbohydrate Polymers 37 (3), Moreira, R.F.A., De Maria, C.A.B., Pietroluongo, M., Trugo, L.C., Chemical changes in the non-volatile fraction of Brazilian honeys during storage under tropical conditions. Food Chemistry 104 (3), Nagy, S., Lee, H., Rouseff, R.L., Lin, J.C.C., Nonenzymic browning of commercially canned and bottled grapefruit juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38 (2), Nelson, K.A., Labuza, T.P., Water activity and food polymer science: implications of state on Arrhenius and WLF models in predicting shelf life. Journal of Food Engineering 22 (1 4), Rahman, M.S., State diagram of foods: its potential use in food processing and product stability. Trends in Food Science and Technology 17 (3), Rattanathanalerk, M., Chiewchan, N., Srichumpoung, W., Effect of thermal processing on the quality loss of pineapple juice. Journal of Food Engineering 66 (2), Recondo, M.P., Elizalde, B.E., Buera, M.P., Modeling temperature dependence of honey viscosity and of related supersaturated model carbohydrate systems. Journal of Food Engineering 77 (1), Slade, L., Levine, H., Beyond water activity: recent advances based on an alternative approach to the assessment of food quality and safety. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 30 (2 3), Slade, L., Levine, H., Finley, J., Protein water interactions: water as a plasticizer of gluten and other protein polymers. In: Phillips, R., Finley, J. (Eds.), Protein Quality and the Effects of Processing. Marcel Dekker, New York, pp Sopade, P.A., Halley, P., Bhandari, B., D Arcy, B., Doebler, C., Caffin, N., Application of the Williams Landel Ferry model to the viscosity temperature relationship of Australian honeys. Journal of Food Engineering 56 (1), Sugisaki, M., Suga, H., Seki, S., Calorimetric study of the glassy state IV. Heat capacities of glassy water and cubic ice. Bulletin of the Chemical Society of Japan 41, Toribio, J.L., Lozano, J.E., Nonenzymatic browning in apple juice concentrate during storage. Journal of Food Science 49 (3), Tosi, E., Ciappini, M., Ré, E., Lucero, H., Honey thermal treatment effects on hydroxymethylfurfural content. Food Chemistry 77 (1), Tosi, E., Martinet, R., Ortega, M., Lucero, H., Ré, E., Honey diastase activity modified by heating. Food Chemistry 106 (3), Turkmen, N., Sari, F., Poyrazoglu, E.S., Velioglu, Y.S., Effects of prolonged heating on antioxidant activity and color of honey. Food Chemistry 95 (4), Vaikousi, H., Koutsoumanis, K., Biliaderis, C.G., Kinetic modelling of nonenzymatic browning of apple juice concentrates differing in water activity under isothermal and dynamic heating conditions. Food Chemistry 107 (2), White, J.W., Honey. Advances in Food Research 24, White, J.W., The role of HMF and diastase in honey quality evaluation. Bee World 75 (3), Williams, M.L., Landel, R.F., Ferry, J.D., The temperature dependence of relaxation mechanisms in amorphous polymers and other glass-forming liquids. Journal of the American Chemical Society 77 (14), Please cite this article in press as: Vaikousi, H., et al. Kinetic modelling of non-enzymatic browning in honey and diluted honey systems subjected to isothermal and dynamic heating protocols. Journal of Food Engineering (2009), doi: /j.jfoodeng

333 FOOD-04789; No of Pages 7 ARTICLE IN PRESS International Journal of Food Microbiology xxx (2009) xxx xxx Contents lists available at ScienceDirect International Journal of Food Microbiology journal homepage: Applicability of a microbial Time Temperature Indicator (TTI) for monitoring spoilage of modified atmosphere packed minced meat Hariklia Vaikousi a, Costas G. Biliaderis a, Konstantinos P. Koutsoumanis b, a Laboratory of Food Chemistry & Biochemistry, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki, Greece b Laboratory of Food Hygiene & Microbiology, Department of Food Science and Technology, School of Agriculture, Aristotle University, Thessaloniki, , Greece article info abstract Article history: Received 29 January 2009 Received in revised form 18 May 2009 Accepted 29 May 2009 Available online xxxx Keywords: Time Temperature Indicators (TTI) Microbial TTI MAP beef spoilage Lactic acid bacteria Shelf life Dynamic conditions The applicability of a microbial Time Temperature Indicator (TTI) prototype, based on the growth and metabolic activity of a Lactobacillus sakei strain developed in a previous study, in monitoring quality of modified atmosphere packed (MAP) minced beef was evaluated at conditions simulating the chill chain. At all storage temperatures examined (0, 5, 10, 15 C), the results showed that lactic acid bacteria (LAB) were the dominant bacteria and can be used as a good spoilage index of MAP minced beef. The end of product's shelf life as revealed by the sensory evaluation coincided with a LAB population level of 7 log 10 CFU/g. For all temperatures tested, the growth of L. sakei in the TTI resembled closely the growth of LAB in the meat product, with similar temperature dependence of the μ max and thus similar activation energy values calculated as and kj/mol, for the two systems, respectively. In addition, the end point of TTI colour change coincided with the time of sensory rejection point of the beef product during its storage under isothermal chilled temperature conditions. The estimated activation energy, E α, values obtained for parameters related to the response of ΔE (total colour change of the TTI) describing the kinetics of colour change of the TTI during isothermal storage (i.e. the maximum specific rate of ΔΕ evolution curve, μ ΔΕ, and also the reciprocal of t i, time at which half of the maximum ΔΕ is reached), were and kj/mol, respectively. Finally, the application of the microbial TTI in monitoring the quality deterioration of MAP minced beef due to spoilage was further evaluated under dynamic conditions of storage, using two separate low temperature periodic changing scenarios, resembling the actual conditions occurring in the distribution chill chain. The results showed that the end point of TTI, after storage at those fluctuating temperature conditions, was noted very close to the end of product's sensorial shelf life. This finding points to the applicability of the developed microbial TTI as a valuable tool for monitoring the quality status during distribution and storage of chilled meat products, which are spoiled by lactic acid bacteria or other bacteria exhibiting similar kinetic responses and spoilage potential Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Corresponding author. Tel./fax: address: kkoutsou@agro.auth.gr (K.P. Koutsoumanis). Nowadays, the food industry is promoting the development of new technologies trying to meet consumers' expectations for food products of improved safety and sensory quality. Consumers also desire foods of increased functional and nutritional properties combined with extended shelf life, as well as products containing fewer calories and additives which additionally offer convenience (Nychas et al., 2008; Taoukis, 2001; Taoukis and Labuza, 2003). In this context, the development and application of structured quality and safety assurance systems based on prevention through monitoring, recording and controlling of critical parameters during the entire life cycle of the products, seems to be a prerequisite (Koutsoumanis et al., 2005; Taoukis, 2001). Unlike other parameters affecting food quality (e.g. ph, water activity, redox potential, gas composition), temperature of chilled products may vary extensively during transportation, retail and domestic storage, and often deviates from the recommended storage conditions, affecting greatly the shelf life of foods. Thus, a cost effective way to monitor the temperature conditions of individual food products throughout distribution is required to indicate their real safety and quality. Time Temperature Indicators (TTI) could potentially fulfill the above requirement (Taoukis and Labuza, 2003). A TTI based system provides data and information on the timetemperature history down to the product unit level, allowing for the determination of product quality at any point of the chill chain, and is shown by an easily measurable time and temperature dependent change (Taoukis et al., 1999). In order to ensure that the adopted TTI matches the quality loss of the food, systematic kinetic modeling of the effect of temperature on the shelf life of the chilled product as well as a complete kinetic study of the TTI response is required (Taoukis, 2001; Taoukis and Labuza, 2003). In particular, the activation energy (E α ), indicating the temperature sensitivity of the TTI response, /$ see front matter 2009 Elsevier B.V. All rights reserved. doi: /j.ijfoodmicro Please cite this article as: Vaikousi, H., et al., Applicability of a microbial Time Temperature Indicator (TTI) for monitoring spoilage of modified atmosphere packed minced meat, International Journal of Food Microbiology (2009), doi: /j.ijfoodmicro

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ της Χαρίκλειας Βαϊκούση, Γεωπόνου με τίτλο: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή διατριβή

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Πτυχιακή διατριβή ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΓΩΓΗΣ ΤΩΝ ΟΞΕΙΔΙΩΝ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ (NO X

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή διατριβή

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Πτυχιακή διατριβή ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΓΩΓΗΣ ΝΙΤΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΝΙΤΡΩΔΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΣΕ ΝΕΡΟ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

ΠΟΩΤΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΤΝΑΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΩΝ

ΠΟΩΤΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΤΝΑΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΩΝ ΡΙΣΤΟΤΕΩΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΟΕΣΣΑΩΟΝΙΚΗΣ ΠΟΩΤΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΣΚΕΤΑΣΤΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΤΝΑΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΩΝ Γεωργία N. Γεωργίου Διπλ. Μηχανολόγος Μηχανικός A.Π.O. ΙΖΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 11 η : Χημική ισορροπία. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής.

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 11 η : Χημική ισορροπία. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 11 η : Χημική ισορροπία Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Η Κατάσταση Ισορροπίας 2 Πολλές αντιδράσεις δεν πραγματοποιούνται

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 10 η : Χημική κινητική. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής.

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 10 η : Χημική κινητική. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 10 η : Χημική κινητική Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Ταχύτητες Αντίδρασης 2 Ως ταχύτητα αντίδρασης ορίζεται είτε η αύξηση

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΡΜΙΚΗ ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

ΘΕΡΜΙΚΗ ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΘΕΡΜΙΚΗ ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 1. Εισαγωγή Η θέρμανση είναι μια μορφή επεξεργασίας, ίσως η πιο ευρέως διαδεδομένη, που χρησιμοποιείται για να θανατώσει ή αδρανοποιήσει τους μικροοργανισμούς (βλαστικές

Διαβάστε περισσότερα

iii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος

iii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος iii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος xi 1 Αντικείμενα των Πιθανοτήτων και της Στατιστικής 1 1.1 Πιθανοτικά Πρότυπα και Αντικείμενο των Πιθανοτήτων, 1 1.2 Αντικείμενο της Στατιστικής, 3 1.3 Ο Ρόλος των Πιθανοτήτων

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΣΦΑΛΙΣΗ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΟΥ ΕΜΠ. Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ

ΔΙΑΣΦΑΛΙΣΗ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΟΥ ΕΜΠ. Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ ΔΙΑΣΦΑΛΙΣΗ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΟΥ ΕΜΠ Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ Π. Ταούκης, Αν. Καθ. ΕΜΠ Κ. Τζιά, Καθ. ΕΜΠ, Β. Ωραιοπούλου, Καθ. ΕΜΠ Ποιότητα

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕΘΑΝΙΟΥ ΠΡΟΣ ΔΙΟΞΕΙΔΙΟ ΤΟΥ ΑΝΘΡΑΚΑ Βασιλική

Διαβάστε περισσότερα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Ενότητα 11: Εξωγενείς Παράγοντες Θερμοκρασία, 2ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Γεώργιος - Ιωάννης Νύχας Ευστάθιος Πανάγου Μαθησιακοί Στόχοι

Διαβάστε περισσότερα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Ενότητα 10: Ενδογενείς Παράγοντες Δυναμικό Οξειδοαναγωγής Θρεπτικά Συστατικά, 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Γεώργιος - Ιωάννης Νύχας Ευστάθιος

Διαβάστε περισσότερα

Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu

Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu Από τον Δρ. Φρ. Γαΐτη* για το foodbites.eu Η μικροβιακή αύξηση μπορεί να επηρεάζεται από διάφορους ενδογενείς (εσωτερικούς) και εξωγενείς (εξωτερικούς) παράγοντες. Η αξιολόγηση αυτών των παραγόντων είναι

Διαβάστε περισσότερα

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ. ΠΡΟΛΟΓΟΣ... vii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... ix ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... xv. Κεφάλαιο 1 ΓΕΝΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ. ΠΡΟΛΟΓΟΣ... vii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... ix ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... xv. Κεφάλαιο 1 ΓΕΝΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... vii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... ix ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... xv Κεφάλαιο 1 ΓΕΝΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΑΠΟ ΤΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ 1.1 Πίνακες, κατανομές, ιστογράμματα... 1 1.2 Πυκνότητα πιθανότητας, καμπύλη συχνοτήτων... 5 1.3

Διαβάστε περισσότερα

Λίγα λόγια για τους συγγραφείς 16 Πρόλογος 17

Λίγα λόγια για τους συγγραφείς 16 Πρόλογος 17 Περιεχόμενα Λίγα λόγια για τους συγγραφείς 16 Πρόλογος 17 1 Εισαγωγή 21 1.1 Γιατί χρησιμοποιούμε τη στατιστική; 21 1.2 Τι είναι η στατιστική; 22 1.3 Περισσότερα για την επαγωγική στατιστική 23 1.4 Τρεις

Διαβάστε περισσότερα

Πείραμα 2 Αν αντίθετα, στο δοχείο εισαχθούν 20 mol ΗΙ στους 440 ºC, τότε το ΗΙ διασπάται σύμφωνα με τη χημική εξίσωση: 2ΗΙ(g) H 2 (g) + I 2 (g)

Πείραμα 2 Αν αντίθετα, στο δοχείο εισαχθούν 20 mol ΗΙ στους 440 ºC, τότε το ΗΙ διασπάται σύμφωνα με τη χημική εξίσωση: 2ΗΙ(g) H 2 (g) + I 2 (g) Α. Θεωρητικό μέρος Άσκηση 5 η Μελέτη Χημικής Ισορροπίας Αρχή Le Chatelier Μονόδρομες αμφίδρομες αντιδράσεις Πολλές χημικές αντιδράσεις οδηγούνται, κάτω από κατάλληλες συνθήκες, σε κατάσταση ισορροπίας

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Αφυδάτωση Γενικά Ως αφυδάτωση χαρακτηρίζεται η μέθοδος συντήρησης που στηρίζεται στην απομάκρυνση νερού από τα τρόφιμα, έτσι ώστε η υγρασία τους να μειωθεί σε πολύ χαμηλά επίπεδα και

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΦΕΡΟΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΣΕ ΒΑΝΙΛΙΚΟ ΟΞΥ ΚΑΙ ΒΑΝΙΛΙΝΗ ΑΠΟ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΧΥΜΟΥ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

Εγχειρίδιο Χρήσης - TTIFCv1.0

Εγχειρίδιο Χρήσης - TTIFCv1.0 Εγχειρίδιο Χρήσης - TTIFCv1.0 TTI Response - F-value Calculator (TTIFCv1.0) Λογισµικό συσχέτισης της απόκρισης ενζυµικών Χρονοθερµοκρασιακών Ολοκληρωτών µε το αποτέλεσµα θερµικών διεργασιάν τροφίµων Το

Διαβάστε περισσότερα

Θρεπτικές ύλες Τρόφιµα - Τροφή

Θρεπτικές ύλες Τρόφιµα - Τροφή ΧΗΜΕΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 1 Θρεπτικές ύλες Τι καλούµε θρεπτικές ύλες; Ποιες είναι; Τρόφιµα Τι καλούµε τρόφιµο; Χηµεία Τροφίµων Θρεπτικές ύλες Τρόφιµα - Τροφή Προϋπόθεση για να χαρακτηριστεί ένα προϊόν τρόφιµο; 2

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑ ΙΙ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑ ΙΙ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑ ΙΙ Ταχύτητα αντίδρασης και παράγοντες που την επηρεάζουν Διδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. Β. Μελισσάς, Λέκτορας Θ. Λαζαρίδης Άδειες Χρήσης Το παρόν

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΟΥ ΣΤΕΛΛΑ ΣΤΑΥΡΙΝΟΥ Λεμεσός 2016 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Φασματοφωτομετρία

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Φασματοφωτομετρία 1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Φασματοφωτομετρία Ιωάννης Πούλιος Αθανάσιος Κούρας Ευαγγελία Μανώλη ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ 54124

Διαβάστε περισσότερα

ΙΣΟΖΥΓΙΑ ΜΑΖΑΣ ΚΑΙ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ

ΙΣΟΖΥΓΙΑ ΜΑΖΑΣ ΚΑΙ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ ΙΣΟΖΥΓΙΑ ΜΑΖΑΣ ΚΑΙ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ Τυπική Βιοδιεργασία Μαθηματικό μοντέλο Μαθηματικό μοντέλο ή προσομοίωμα ενός συστήματος ονομάζουμε ένα σύνολο σχέσεων μεταξύ των μεταβλητών του συστήματος που ενδιαφέρουν.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΜΠΕΙΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΚΑΙ ΣΕ ΑΛΛΕΣ ΧΩΡΕΣ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΗΣ

ΕΜΠΕΙΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΚΑΙ ΣΕ ΑΛΛΕΣ ΧΩΡΕΣ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΗΣ Ι [1+31 \Ι 111 ΝΙ \ε. \(t ΤΜΗΜΑ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΜΠΕΙΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΔΑΠΑΝΩΝ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΚΑΙ ΣΕ ΑΛΛΕΣ ΧΩΡΕΣ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΗΣ ΛΑΜΠΡΕΛΛΗ ΔΗΜΗΤΡΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Διαβάστε περισσότερα

Συσκευασία Τροφίμων. Ενότητα 2: Υπολογισμός του Χρόνου Ζωής και οι Παράγοντες που τον Επηρεάζουν, 2ΔΩ

Συσκευασία Τροφίμων. Ενότητα 2: Υπολογισμός του Χρόνου Ζωής και οι Παράγοντες που τον Επηρεάζουν, 2ΔΩ Συσκευασία Τροφίμων Ενότητα 2: Υπολογισμός του Χρόνου Ζωής και οι Παράγοντες που τον Επηρεάζουν, 2ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκων: Αντώνιος Καναβούρας Μαθησιακοί Στόχοι

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Τι είναι οι καλλιέργειες μικροοργανισμών; Τι είναι το θρεπτικό υλικό; Ποια είναι τα είδη του θρεπτικού υλικού και τι είναι το καθένα;

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Τι είναι οι καλλιέργειες μικροοργανισμών; Τι είναι το θρεπτικό υλικό; Ποια είναι τα είδη του θρεπτικού υλικού και τι είναι το καθένα; ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Τι είναι οι καλλιέργειες μικροοργανισμών; Καλλιέργεια είναι η διαδικασία ανάπτυξης μικροοργανισμών με διάφορους τεχνητούς τρόπους στο εργαστήριο ή σε βιομηχανικό επίπεδο. Με τη δημιουργία καλλιεργειών

Διαβάστε περισσότερα

Γαλακτοκομία. Ενότητα 4: Θερμική Επεξεργασία Γάλακτος (1/2), 1.5ΔΩ. Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου

Γαλακτοκομία. Ενότητα 4: Θερμική Επεξεργασία Γάλακτος (1/2), 1.5ΔΩ. Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Γαλακτοκομία Ενότητα 4: Θερμική Επεξεργασία Γάλακτος (1/2), 1.5ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Καμιναρίδης Στέλιος, Καθηγητής Μοάτσου Γκόλφω, Eπ. Καθηγήτρια Μαθησιακοί

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ:Κ.Κεραμάρης ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ:Κ.Κεραμάρης ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ:Κ.Κεραμάρης ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Κωνσταντίνος Ρίζος Γιάννης Ρουμπάνης Βιοτεχνολογία με την ευρεία έννοια είναι η χρήση ζωντανών

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή εργασία

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Πτυχιακή εργασία ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Πτυχιακή εργασία ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΥΠΟΒΑΘΜΙΣΗΣ ΤΟΥ ΥΔΡΟΒΙΟΤΟΠΟΥ ΤΗΣ ΑΛΥΚΗΣ ΛΑΡΝΑΚΑΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΑΠΟΡΡΟΗ

Διαβάστε περισσότερα

Εργαστηριακό Τετράδιο (Laboratory Notebook, Lab-book)

Εργαστηριακό Τετράδιο (Laboratory Notebook, Lab-book) Εργαστηριακό Τετράδιο (Laboratory Notebook, Lab-book) Σημαντικότητα Εργαστηριακού Τετραδίου Το εργαστηριακό τετράδιο θα πρέπει να αποτελεί την αμέσως επόμενη πιο σημαντική προτεραιότητα κάθε πειραματικού

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΣΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΙΙΙ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΑ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ

ΦΥΣΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΙΙΙ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΑ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑΣ Γραφείο 211 Επίκουρος Καθηγητής: Δ. Τσιπλακίδης Τηλ.: 2310 997766 e mail: dtsiplak@chem.auth.gr url:

Διαβάστε περισσότερα

Πρώτες ύλες. Πιθανοί κίνδυνοι σε όλα τα στάδια της παραγωγής. Καθορισµός πιθανότητας επιβίωσης µικροοργανισµών. Εκτίµηση επικινδυνότητας

Πρώτες ύλες. Πιθανοί κίνδυνοι σε όλα τα στάδια της παραγωγής. Καθορισµός πιθανότητας επιβίωσης µικροοργανισµών. Εκτίµηση επικινδυνότητας 1 ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ HACCP Αρχή 1η: Προσδιορισµός των πιθανών κινδύνων που σχετίζονται µε την παραγωγή τροφίµων σε όλα τα στάδια, από την ανάπτυξη και τη συγκοµιδή των πρώτων υλών, την παραγωγική διαδικασία, την

Διαβάστε περισσότερα

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Ενότητα 6: Συνεχής Καλλιέργεια (Continuous Culture)(4/5), 2ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Διδάσκων: Δρ. Σεραφείμ Παπανικολαου Μαθησιακοί Στόχοι Ημισυνεχής τροφοδοτούμενη

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑΣ Γραφείο 211 Επίκουρος Καθηγητής: Δ. Τσιπλακίδης Τηλ.: 2310 997766 e mail: dtsiplak@chem.auth.gr url:

Διαβάστε περισσότερα

Σήµερα οι εξελίξεις στην Επιστήµη και στην Τεχνολογία δίνουν τη

Σήµερα οι εξελίξεις στην Επιστήµη και στην Τεχνολογία δίνουν τη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7ο: ΑΡΧΕΣ & ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Συνδυασµός ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ & ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ Προσφέρει τη δυνατότητα χρησιµοποίησης των ζωντανών οργανισµών για την παραγωγή χρήσιµων προϊόντων 1 Οι ζωντανοί οργανισµοί

Διαβάστε περισσότερα

ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ

ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΒΡΩΣΙΜΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ 180 160 140 120.-. 100 d 80 60 40 20 300 400

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437

ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437 Κ. Κόντη, Δ. Μαμμά, Δ. Κέκος Σχολή Χημικών

Διαβάστε περισσότερα

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. Ενότητα ε. Κινητική των Ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. Ενότητα ε. Κινητική των Ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ Ενότητα ε Κινητική των Ενζύμων ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Μέρος Α Γενικές παρατηρήσεις για την κινητική ενζυμικών αντιδράσεων Ορισμοί Για

Διαβάστε περισσότερα

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Η απαρίθμηση του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Η απαρίθμηση του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Η απαρίθμηση του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα Όλγα Παπαδοπούλου Πασχαλίτσα Τρυφινοπούλου - Αναστάσιος Σταματίου Τρόποι

Διαβάστε περισσότερα

ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ. Εισαγωγή. 3.1 Γενικά για τη χημική κινητική και τη χημική αντίδραση - Ταχύτητα αντίδρασης

ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ. Εισαγωγή. 3.1 Γενικά για τη χημική κινητική και τη χημική αντίδραση - Ταχύτητα αντίδρασης 3 ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ 3 ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ Εισαγωγή Στην μέχρι τώρα γνωριμία μας με τη χημεία υπάρχει μια «σημαντική απουσία»: ο χρόνος... Είναι λοιπόν «καιρός» να μπει και ο χρόνος ως παράμετρος στη μελέτη ενός

Διαβάστε περισσότερα

ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ. Μαντώ Κυριακού 2015

ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ. Μαντώ Κυριακού 2015 ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Μαντώ Κυριακού 2015 Μικροβιακή αύξηση Σε καθαρές καλλιέργειες: η σύνθεση των μακρομορίων ενός μο εξαρτάται από τον ρυθμό που αυξάνεται και τη φύση των συνθηκών αύξησης (π.χ. την επίδραση

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΑΡΤΕΜΙΣΙΝΙΝΗΣ ΜΕ ΑΙΜΙΝΗ ΚΑΙ ΑΙΜΑΤΙΝΗ ΜΕΣΩ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ ΥΠΕΡΥΘΡΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

Διατύπωση μαθηματικών εκφράσεων για τη περιγραφή του εγγενούς ρυθμού των χημικών αντιδράσεων.

Διατύπωση μαθηματικών εκφράσεων για τη περιγραφή του εγγενούς ρυθμού των χημικών αντιδράσεων. 25/9/27 Εισαγωγή Διατύπωση μαθηματικών εκφράσεων για τη περιγραφή του εγγενούς ρυθμού των χημικών αντιδράσεων. Οι ρυθμοί δεν μπορούν να μετρηθούν απευθείας => συγκεντρώσεις των αντιδρώντων και των προϊόντων

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΧΑΛΚΙΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΜΕ ΒΙΟ- ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ

Διαβάστε περισσότερα

Η βιολογική κατάλυση παρουσιάζει παρουσιάζει ορισμένες ορισμένες ιδιαιτερότητες ιδιαιτερότητες σε

Η βιολογική κατάλυση παρουσιάζει παρουσιάζει ορισμένες ορισμένες ιδιαιτερότητες ιδιαιτερότητες σε Η βιολογική κατάλυση παρουσιάζει ορισμένες ιδιαιτερότητες σε σχέση με τη μη βιολογική που οφείλονται στη φύση των βιοκαταλυτών Οι ιδιαιτερότητες αυτές πρέπει να παίρνονται σοβαρά υπ όψη κατά το σχεδιασμό

Διαβάστε περισσότερα

Αξιοποίηση Φυσικών Αντιοξειδωτικών στην Εκτροφή των Αγροτικών

Αξιοποίηση Φυσικών Αντιοξειδωτικών στην Εκτροφή των Αγροτικών Ζώων για Παραγωγή Προϊόντων Ποιότητας» 1 Αξιοποίηση Φυσικών Αντιοξειδωτικών στην Εκτροφή των Αγροτικών Ζώων για Παραγωγή Προϊόντων Ποιότητας Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εργαστήριο Ζωοτεχνίας MIS 380231

Διαβάστε περισσότερα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Εργαστήριο

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Εργαστήριο Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Εργαστήριο Ενότητα 3: Η Απαρίθμηση του Μικροβιακού Πληθυσμού στα Τρόφιμα, 1.5ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Ευστάθιος Ζ. Πανάγου Πασχαλίτσα

Διαβάστε περισσότερα

Αρχές Επεξεργασίας Τροφίμων

Αρχές Επεξεργασίας Τροφίμων Αρχές Επεξεργασίας Τροφίμων Κατάψυξη τροφίμων Κατάψυξη Απομάκρυνση θερμότητας από ένα προϊόν με αποτέλεσμα την μείωση της θερμοκρασίας του κάτω από το σημείο πήξης. Ως μέθοδος συντήρησης βασίζεται: Στην

Διαβάστε περισσότερα

Στις εξισώσεις σχεδιασμού υπεισέρχεται ο ρυθμός της αντίδρασης. Επομένως, είναι βασικό να γνωρίζουμε την έκφραση που περιγράφει το ρυθμό.

Στις εξισώσεις σχεδιασμού υπεισέρχεται ο ρυθμός της αντίδρασης. Επομένως, είναι βασικό να γνωρίζουμε την έκφραση που περιγράφει το ρυθμό. Βασικές Εξισώσεις Σχεδιασμού (ΣΔΟΥΚΟΣ 2-, 2-) t = n i dn i V n i R και V = n i dn i t n i R Στις εξισώσεις σχεδιασμού υπεισέρχεται ο ρυθμός της αντίδρασης. Επομένως, είναι βασικό να γνωρίζουμε την έκφραση

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ

ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΘΕΡΜΙΚΗΣ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Μαρία Γιαννακούρου ΤΕΙ Αθηνών, Σχολή Τεχνολογίας Τροφίμων και Διατροφής, Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Νικόλαος Γ. Στοφόρος Γεωπονικό

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή. Κεφάλαιο 2: Η Βιολογία των Ιών

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή. Κεφάλαιο 2: Η Βιολογία των Ιών Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή 1.1 Μικροοργανισμοί, Μικροβιολογία και Μικροβιολόγοι... 19 1.1.1 Μικροοργανισμοί... 19 1.1.2 Μικροβιολογία... 20 1.1.3 Μικροβιολόγοι... 21 1.2 Σύντομη Ιστορική Εξέλιξη της Μικροβιολογίας...

Διαβάστε περισσότερα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Ενότητα 10: Ενδογενείς Παράγοντες Δυναμικό Οξειδοαναγωγής Θρεπτικά Συστατικά, 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Γεώργιος - Ιωάννης Νύχας Ευστάθιος

Διαβάστε περισσότερα

ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΩΝ

ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΩΝ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΩΝ Τύποι ιδανικών βιοαντιδραστήρων Τρόποι λειτουργίας αναδευόμενων βιοαντιδραστήρων Το πρόβλημα του σχεδιασμού Ο βιοχημικός μηχανικός καλείται να επιλέξει: τον τύπο βιοαντιδραστήρα

Διαβάστε περισσότερα

ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΕΚΠΟΝΗΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΩΝ

ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΕΚΠΟΝΗΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΩΝ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΕΚΠΟΝΗΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΩΝ Σύμφωνα με το άρθρο 9 του Ν.3685/08 - Απόφαση της Γ.Σ.Ε.Σ. του Τμήματος Φαρμακευτικής του Ε.Κ.Π.Α., Συνεδρίασης της 22-11-2016 1. Αρμόδια όργανα

Διαβάστε περισσότερα

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΥΡΕΣΗΣ ΤΩΝ ΡΥΘΜΩΝ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΥΡΕΣΗΣ ΤΩΝ ΡΥΘΜΩΝ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΥΡΕΣΗΣ ΤΩΝ ΡΥΘΜΩΝ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Οποιοδήποτε είδος αντιδραστήρα με γνωστό τρόπο ανάμειξης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της κινητικής καταλυτικών αντιδράσεων.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΟΡΓΑΝΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Οδηγός Συγγραφής Εργαστηριακών Αναφορών

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΟΡΓΑΝΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Οδηγός Συγγραφής Εργαστηριακών Αναφορών ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΟΡΓΑΝΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Οδηγός Συγγραφής Εργαστηριακών Αναφορών Βασιλεία Ι. Σινάνογλου Ειρήνη Φ. Στρατή Παναγιώτης Ζουμπουλάκης Σωτήρης Μπρατάκος Εξώφυλλο Εργαστηριακό Τμήμα (ημέρα ώρα)

Διαβάστε περισσότερα

Συντάκτης: Τζαμτζής Αθανάσιος Σελίδα 1

Συντάκτης: Τζαμτζής Αθανάσιος Σελίδα 1 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 3 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΧΗΜΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Υπολογισμός της περιεκτικότητας του ξιδιού σε οξικό οξύ με την κλασική μέθοδο. ΣΧΟΛΕΙΟ 1 ο ΓΕΛ ΑΜΠΕΛΟΚΗΠΩΝ ΤΜΗΜΑ Γ θετ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Αναλυτική Μέθοδος- Αναλυτικό Πρόβλημα. Ανάλυση, Προσδιορισμός και Μέτρηση. Πρωτόκολλο. Ευαισθησία Μεθόδου. Εκλεκτικότητα. Όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD).

Διαβάστε περισσότερα

(1) v = k[a] a [B] b [C] c, (2) - RT

(1) v = k[a] a [B] b [C] c, (2) - RT Χηµική Κινητική Αντικείµενο της Χηµικής Κινητικής είναι η µελέτη της ταχύτητας µιας αντιδράσεως, ο καθορισµός των παραγόντων που την επηρεάζουν και η εύρεση ποσοτικής έκφρασης για τον κάθε παράγοντα, δηλ.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Θεωρία - Πείραμα Μετρήσεις - Σφάλματα

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Θεωρία - Πείραμα Μετρήσεις - Σφάλματα ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Θεωρία - Πείραμα Μετρήσεις - Σφάλματα ΟΜΑΔΑ:RADIOACTIVITY Τα μέλη της ομάδας μας: Γιώργος Παπαδόγιαννης Γεράσιμος Κουτσοτόλης Νώντας Καμαρίδης Κωνσταντίνος Πούτος Παναγιώτης Ξανθάκος

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΕΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ. 5o Εργαστήριο ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Συσχέτιση μεταξύ Εa & z-value

ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΕΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ. 5o Εργαστήριο ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Συσχέτιση μεταξύ Εa & z-value ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΕΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 5o Εργαστήριο ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Συσχέτιση μεταξύ Εa & z-value Ενέργεια Ενεργοποιήσεως (E a ) Εa = η ελάχιστη ποσότητα ενέργειας που απαιτείται για να ξεκινήσει μια

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ: ΠΟΤΕΝΣΙΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ph ΚΑΙ ΠΕΧΑΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΙΤΛΟΔΟΤΗΣΕΙΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ: ΠΟΤΕΝΣΙΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ph ΚΑΙ ΠΕΧΑΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΙΤΛΟΔΟΤΗΣΕΙΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑΣ Γραφείο 11 Επίκουρος Καθηγητής: Δ. Τσιπλακίδης Τηλ.: 310 997766 e mail: dtsiplak@chem.auth.gr url:

Διαβάστε περισσότερα

Συντάκτης: Τζαμτζής Αθανάσιος Σελίδα 1

Συντάκτης: Τζαμτζής Αθανάσιος Σελίδα 1 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 3 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΧΗΜΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Υπολογισμός της περιεκτικότητας του ξιδιού σε οξικό οξύ με την κλασική μέθοδο. ΣΧΟΛΕΙΟ 1 ο ΓΕΛ ΑΜΠΕΛΟΚΗΠΩΝ ΤΜΗΜΑ Γ θετ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ενζυμική αμαύρωση. Η ενζυμική αμαύρωση είναι το μαύρισμα τις μελανίνες

ενζυμική αμαύρωση. Η ενζυμική αμαύρωση είναι το μαύρισμα τις μελανίνες Ενζυμική αμαύρωση Όταν καθαρίζουμε ή κόβουμε λαχανικά και φρούτα συμβαίνουν μια σειρά αντιδράσεων που μεταβάλουν το χρώμα της σάρκας τους σε σκούρο. Αυτές οι μεταβολές ονομάζονται ενζυμική αμαύρωση. Η

Διαβάστε περισσότερα

Ομογενή Χημικά Συστήματα

Ομογενή Χημικά Συστήματα Ομογενή Χημικά Συστήματα 1. Πειραματικός Προσδιορισμός Τάξης Αντιδράσεων 2. Συνεχείς Αντιδραστήρες (Ι) Πειραματική Μελέτη Ρυθμού Αντίδρασης Μέθοδοι Λήψης και Ερμηνείας Δεδομένων (ΙΙ) Τύποι Συνεχών Αντιδραστήρων:

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΛΕΤΗ ΣΥΜΠΑΓΩΝ ΕΝΑΛΛΑΚΤΩΝ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ

ΜΕΛΕΤΗ ΣΥΜΠΑΓΩΝ ΕΝΑΛΛΑΚΤΩΝ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΜΑΡΙΑΣ Ν. ΠΑΝΤΖΑΛΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΜΗΧΑΝΙΚΟΥ Α.Π.Θ. ΜΕΛΕΤΗ ΣΥΜΠΑΓΩΝ ΕΝΑΛΛΑΚΤΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Ενότητα 5: Στοιχεία Βιοχημικής Μηχανικής (1/2), 1.5ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Διδάσκων: Δρ. Σεραφείμ Παπανικολαου Μαθησιακοί Στόχοι Μικροβιακή κινητική (συνέχεια)

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΟΙΚΗΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ. ΕΝΟΤΗΤΑ 4η ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΖΗΤΗΣΗΣ

ΔΙΟΙΚΗΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ. ΕΝΟΤΗΤΑ 4η ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΖΗΤΗΣΗΣ ΤΕΙ ΚΡΗΤΗΣ ΣΧΟΛΗ ΔΙΟΙΚΗΣΗΣ ΚΑΙ ΟΙΚΟΝΟΜΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΟΙΚΗΣΗΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΩΝ ΔΙΟΙΚΗΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΟΤΗΤΑ 4η ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΖΗΤΗΣΗΣ ΓΙΑΝΝΗΣ ΦΑΝΟΥΡΓΙΑΚΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΣΥΝΕΡΓΑΤΗΣ ΤΕΙ ΚΡΗΤΗΣ ΔΟΜΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗΣ 1. Εισαγωγή

Διαβάστε περισσότερα

Άσκηση 1 : Μικροβιακή κινητική (Τρόποι μέτρησης βιοκαταλυτών)

Άσκηση 1 : Μικροβιακή κινητική (Τρόποι μέτρησης βιοκαταλυτών) ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Καθηγητής Βασίλης Σπηλιώτης Εργαστήριο Βιομηχανικής Μικροβιολογίας Άσκηση : Μικροβιακή κινητική (Τρόποι μέτρησης βιοκαταλυτών) Σκοπός Άσκησης Σκοπός της άσκησης αυτής, είναι

Διαβάστε περισσότερα

Χαρακτηρισμός και μοντέλα τρανζίστορ λεπτών υμενίων βιομηχανικής παραγωγής: Τεχνολογία μικροκρυσταλλικού πυριτίου χαμηλής θερμοκρασίας

Χαρακτηρισμός και μοντέλα τρανζίστορ λεπτών υμενίων βιομηχανικής παραγωγής: Τεχνολογία μικροκρυσταλλικού πυριτίου χαμηλής θερμοκρασίας Χαρακτηρισμός και μοντέλα τρανζίστορ λεπτών υμενίων βιομηχανικής παραγωγής: Τεχνολογία μικροκρυσταλλικού πυριτίου χαμηλής θερμοκρασίας Υποψήφιος Διδάκτορας: Α. Χατζόπουλος Περίληψη Οι τελευταίες εξελίξεις

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ: «Μέτρηση Ηλεκτρικών Χαρακτηριστικών Πολυουρεθανικών και Εποδειδικών Ρητινών»

ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ: «Μέτρηση Ηλεκτρικών Χαρακτηριστικών Πολυουρεθανικών και Εποδειδικών Ρητινών» ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΤΕΛΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ: «Μέτρηση Ηλεκτρικών Χαρακτηριστικών Πολυουρεθανικών και Εποδειδικών Ρητινών» Στα πλαίσια της σύμβασης ανάθεσης

Διαβάστε περισσότερα

Κανόνες ασφαλείας-βασικοί μικροβιολογικοί χειρισμοί-συγκεντρώσεις διαλυμάτων Παναγούλιας Ιωάννης, MSc,PhD

Κανόνες ασφαλείας-βασικοί μικροβιολογικοί χειρισμοί-συγκεντρώσεις διαλυμάτων Παναγούλιας Ιωάννης, MSc,PhD Άσκηση «Κανόνες ασφαλείας-βασικοί μικροβιολογικοί χειρισμοί-συγκεντρώσεις διαλυμάτων» Eρωτήσεις Αυτοαξιολόγησης 1. Σε 380gr Η 2 Ο προσθέτουμε 20gr NaOH και προκύπτει διάλυμα όγκου 320mL. To % w/w του διαλύματος

Διαβάστε περισσότερα

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. παράδοση β. Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. παράδοση β. Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ παράδοση β Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας S E P Μέτρηση

Διαβάστε περισσότερα

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΝΟΜΩΝ ΤΩΝ ΑΕΡΙΩΝ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΛΥΚΕΙΩΝ

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΝΟΜΩΝ ΤΩΝ ΑΕΡΙΩΝ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΛΥΚΕΙΩΝ 550 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΝΟΜΩΝ ΤΩΝ ΑΕΡΙΩΝ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΛΥΚΕΙΩΝ Καλογερόπουλος Νίκος Χημικός, Επιμορφωτής Ενδοσχολικής Επιμόρφωσης nkaloger@sch.gr Γάτσιος Γιάννης Φυσικός, Υπεύθυνος

Διαβάστε περισσότερα

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων

Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Αρχές Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Ενότητα 5: Στοιχεία Βιοχημικής Μηχανικής (1/2), 1.5ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Διδάσκων: Δρ. Σεραφείμ Παπανικολαου Μαθησιακοί Στόχοι Μικροβιακή κινητική (συνέχεια)

Διαβάστε περισσότερα

1 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ

1 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΑΕΙ ΠΕΙΡΑΙΑ ΤΤ ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ Τ.Ε. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΤΩΝ ΡΕΥΣΤΩΝ Σκοπός της άσκησης 1 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ Σκοπός αυτής της άσκησης είναι η εξοικείωση των σπουδαστών με τα σφάλματα που

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΑ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΚΟΛΛΙΝΤΖΑ. Ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής. Συντάκτης: Δημήτριος Κρέτσης

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΑ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΚΟΛΛΙΝΤΖΑ. Ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής. Συντάκτης: Δημήτριος Κρέτσης ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΑ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΚΟΛΛΙΝΤΖΑ Ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής Συντάκτης: Δημήτριος Κρέτσης 1. Ο κλάδος της περιγραφικής Στατιστικής: α. Ασχολείται με την επεξεργασία των δεδομένων και την ανάλυση

Διαβάστε περισσότερα

OΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΕΛΙΑ. Θανάσης Κερασιώτης Χημικός Μηχανικός Ε.Μ.Π. Διευθυντής Παραγωγής ΓΑΙΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Α.Β.Ε.Ε.

OΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΕΛΙΑ. Θανάσης Κερασιώτης Χημικός Μηχανικός Ε.Μ.Π. Διευθυντής Παραγωγής ΓΑΙΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Α.Β.Ε.Ε. OΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΕΛΙΑ Θανάσης Κερασιώτης Χημικός Μηχανικός Ε.Μ.Π. Διευθυντής Παραγωγής ΓΑΙΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Α.Β.Ε.Ε. Σύντομη παρουσίαση της GAEA Η GAEA είναι μια Ελληνική εταιρεία

Διαβάστε περισσότερα

7. Βιοτεχνολογία. α) η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών στο θρεπτικό υλικό, β) το ph, γ) το Ο 2 και δ) η θερμοκρασία.

7. Βιοτεχνολογία. α) η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών στο θρεπτικό υλικό, β) το ph, γ) το Ο 2 και δ) η θερμοκρασία. 7. Βιοτεχνολογία Εισαγωγή Τι είναι η Βιοτεχνολογία; Η Βιοτεχνολογία αποτελεί συνδυασμό επιστήμης και τεχνολογίας. Ειδικότερα εφαρμόζει τις γνώσεις που έχουν αποκτηθεί για τις βιολογικές λειτουργίες των

Διαβάστε περισσότερα

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΞΙΔΙΟΥ ΣΕ ΟΞΙΚΟ ΟΞΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΙΚΗΣ ΛΗΨΗΣ ΚΑΙ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ MultiLog

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΞΙΔΙΟΥ ΣΕ ΟΞΙΚΟ ΟΞΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΙΚΗΣ ΛΗΨΗΣ ΚΑΙ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ MultiLog ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΞΙΔΙΟΥ ΣΕ ΟΞΙΚΟ ΟΞΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΙΚΗΣ ΛΗΨΗΣ ΚΑΙ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ MultiLog Αντωνίου Κωνσταντίνος ΠΕ04-02 (χημικός) ΓΕ.Λ Ζωσιμαίας Σχολής Ιωαννίνων. Το

Διαβάστε περισσότερα

Φυσική ΜΕΤΑΛΛΟΥΡΓΙΑ. Ενότητα 4: Θερμοδυναμική και Κινητική της Δομής. Γρηγόρης Ν. Χαϊδεμενόπουλος Πολυτεχνική Σχολή Μηχανολόγων Μηχανικών

Φυσική ΜΕΤΑΛΛΟΥΡΓΙΑ. Ενότητα 4: Θερμοδυναμική και Κινητική της Δομής. Γρηγόρης Ν. Χαϊδεμενόπουλος Πολυτεχνική Σχολή Μηχανολόγων Μηχανικών Φυσική ΜΕΤΑΛΛΟΥΡΓΙΑ Ενότητα 4: Θερμοδυναμική και Κινητική της Δομής Γρηγόρης Ν. Χαϊδεμενόπουλος Πολυτεχνική Σχολή Μηχανολόγων Μηχανικών Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης

Διαβάστε περισσότερα

Ταχύτητα χημικών αντιδράσεων

Ταχύτητα χημικών αντιδράσεων Ταχύτητα χημικών αντιδράσεων Η στιγμιαία ταχύτητα μιας αντίδρασης είναι η κλίση της εφαπτομένης στη γραφική παράσταση της συγκέντρωσης ως προς το χρόνο. Για αρνητικές κλίσεις, το πρόσημο αλλάζει, έτσι

Διαβάστε περισσότερα

ΓΕΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ (CALIBRATION CURVE TECHNIQUE)

ΓΕΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ (CALIBRATION CURVE TECHNIQUE) ΓΕΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Σχεδόν στο σύνολό τους οι ενόργανες τεχνικές παρέχουν τη μέτρηση μιας φυσικής ή φυσικοχημικής παραμέτρου Ρ η οποία συνδέεται άμεσα η έμμεσα με την

Διαβάστε περισσότερα

ΑΣΚΗΣΗ 8 Η. ΕΝΖΥΜΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ. Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων

ΑΣΚΗΣΗ 8 Η. ΕΝΖΥΜΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ. Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων ΑΣΚΗΣΗ 8 Η. ΕΝΖΥΜΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων ΕΝΖΥΜΑ ΖΥΜΩΣΗ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ Το κλειδί της φύσης για τη ζωή - κινούν τα πάντα,

Διαβάστε περισσότερα

ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΓΕΝΙΚΑ. Σύντομη αναφορά στον όρο «Χημική κινητική» ΠΩΣ ΟΔΗΓΟΥΜΑΣΤΕ ΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΩΝΤΑ

ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΓΕΝΙΚΑ. Σύντομη αναφορά στον όρο «Χημική κινητική» ΠΩΣ ΟΔΗΓΟΥΜΑΣΤΕ ΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΩΝΤΑ ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΓΕΝΙΚΑ Σύντομη αναφορά στον όρο «Χημική κινητική» ΠΩΣ ΟΔΗΓΟΥΜΑΣΤΕ ΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΩΝΤΑ Α] ΘΕΩΡΙΑ ΣΥΓΚΡΟΥΣΕΩΝ Arrhenius Για να αντιδράσουν δυο μόρια πρέπει να συγκρουστούν αποτελεσματικά, δηλαδή

Διαβάστε περισσότερα

Γραπτή Εξέταση Περιόδου Φεβρουαρίου 2011 για τα Τμήματα Ε.Τ.Τ. και Γ.Β. στη Στατιστική 25/02/2011

Γραπτή Εξέταση Περιόδου Φεβρουαρίου 2011 για τα Τμήματα Ε.Τ.Τ. και Γ.Β. στη Στατιστική 25/02/2011 Εργαστήριο Μαθηματικών & Στατιστικής Γραπτή Εξέταση Περιόδου Φεβρουαρίου για τα Τμήματα Ε.Τ.Τ. και Γ.Β. στη Στατιστική 5//. [] Η ποσότητα, έστω Χ, ενός συντηρητικού που περιέχεται σε φιάλες αναψυκτικού

Διαβάστε περισσότερα

Ακαδημαϊκό έτος ΘΕΜΑ 1. Η κινητική εξίσωση της αντίδρασης Α + Β = Γ είναι: r = k[a] α [B] β

Ακαδημαϊκό έτος ΘΕΜΑ 1. Η κινητική εξίσωση της αντίδρασης Α + Β = Γ είναι: r = k[a] α [B] β Ακαδημαϊκό έτος 4-5 ΘΕΜΑ Η κινητική εξίσωση της αντίδρασης Α + Β = Γ είναι: r = [] α [B] β Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των αρχικών ταχυτήτων βρήκαμε ότι η αντίδραση είναι δεύτερης τάξης ως προς Α και πρώτης

Διαβάστε περισσότερα

Περιεχόμενα. Λίγα λόγια για τους συγγραφείς

Περιεχόμενα. Λίγα λόγια για τους συγγραφείς Περιεχόμενα Λίγα λόγια για τους συγγραφείς xii Εισαγωγή xiii 1 Συναρτήσεις 1 1.1 Ανασκόπηση των συναρτήσεων 1 1.2 Παράσταση συναρτήσεων 12 1.3 Τριγωνομετρικές συναρτήσεις 26 Ασκήσεις επανάληψης 34 2 Όρια

Διαβάστε περισσότερα

ΧΥΜΟΣ - Μέτρηση οξύτητας - Προσδιορισμός σακχάρων. 3 η Εργαστηριακή Άσκηση Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων

ΧΥΜΟΣ - Μέτρηση οξύτητας - Προσδιορισμός σακχάρων. 3 η Εργαστηριακή Άσκηση Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων ΧΥΜΟΣ - Μέτρηση οξύτητας - Προσδιορισμός σακχάρων 3 η Εργαστηριακή Άσκηση Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων Παρασκευή χυμού Στύψιμο νωπών φρούτων, όπως: Εσπεριδοειδή Μήλα Σταφύλια Βύσσινα Μίγματα

Διαβάστε περισσότερα

Γ. Πειραματισμός Βιομετρία

Γ. Πειραματισμός Βιομετρία Γενικά Συσχέτιση και Συμμεταβολή Όταν σε ένα πείραμα παραλλάσουν ταυτόχρονα δύο μεταβλητές, τότε ενδιαφέρει να διερευνηθεί εάν και πως οι αλλαγές στη μία μεταβλητή σχετίζονται με τις αλλαγές στην άλλη.

Διαβάστε περισσότερα

Μεταπτυχιακή διατριβή

Μεταπτυχιακή διατριβή ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Μεταπτυχιακή διατριβή ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΥΠΡΙΑΚΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΥΤΟΣΥΜΠΥΚΝΟΥΜΕΝΟΥ ΣΚΥΡΟΔΕΜΑΤΟΣ Τσατσάκης Νικόλαος

Διαβάστε περισσότερα

9 η ΑΣΚΗΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

9 η ΑΣΚΗΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΑI ΠΕΙΡΑΙΑ(ΤΤ) ΣΤΕΦ ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ-ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΕ ΕΡΓ. ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ 9 η ΑΣΚΗΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΝΟΜΟΣ STFAN - BOLTZMANN Σκοπός της άσκησης H μελέτη του μηχανισμού μεταφοράς θερμότητας

Διαβάστε περισσότερα

Ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη μέτρηση in vitro πεπτικότητας σιτηρεσίων μεσογειακών ειδών ψαριών Εκτίμηση της διατροφικής αξίας και του ρυθμού αύξησης

Ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη μέτρηση in vitro πεπτικότητας σιτηρεσίων μεσογειακών ειδών ψαριών Εκτίμηση της διατροφικής αξίας και του ρυθμού αύξησης Ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη μέτρηση in vitro πεπτικότητας σιτηρεσίων μεσογειακών ειδών ψαριών Εκτίμηση της διατροφικής αξίας και του ρυθμού αύξησης i ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Α. ΜΟΥΤΟΥ (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ)

Διαβάστε περισσότερα

5. ΤΟ ΓΕΝΙΚΟ ΓΡΑΜΜΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ (GENERAL LINEAR MODEL) 5.1 Εναλλακτικά μοντέλα του απλού γραμμικού μοντέλου: Το εκθετικό μοντέλο

5. ΤΟ ΓΕΝΙΚΟ ΓΡΑΜΜΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ (GENERAL LINEAR MODEL) 5.1 Εναλλακτικά μοντέλα του απλού γραμμικού μοντέλου: Το εκθετικό μοντέλο 5. ΤΟ ΓΕΝΙΚΟ ΓΡΑΜΜΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ (GENERAL LINEAR MODEL) 5.1 Εναλλακτικά μοντέλα του απλού γραμμικού μοντέλου: Το εκθετικό μοντέλο Ένα εναλλακτικό μοντέλο της απλής γραμμικής παλινδρόμησης (που χρησιμοποιήθηκε

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Οι μικροοργανισμοί είναι αναπόσπαστο τμήμα τόσο της ιστορίας του κόσμου μας όσο και της κοινωνικής εξέλιξης του ανθρώπου Βιοτεχνολογία o Ο όρος Βιοτεχνολογία χρησιμοποιήθηκε

Διαβάστε περισσότερα

Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ. Κωνσταντίνα Τζιά

Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ. Κωνσταντίνα Τζιά Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ Κωνσταντίνα Τζιά ΠΕΡΙΛΗΨΗ Συντήρηση φρούτων ή λαχανικών με χρήση εδώδιμων μεμβρανών σε συνδυασμό με ψύξη ή/και συσκευασία ΜΑΡ Προϊόντα:

Διαβάστε περισσότερα

Περιεχόμενα. Κεφάλαιο 1 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΣΥΝΤΕΤΑΓΜΕΝΩΝ ΣΕ ΜΙΑ ΕΥΘΕΙΑ... 13 1.1 Οι συντεταγμένες ενός σημείου...13 1.2 Απόλυτη τιμή...14

Περιεχόμενα. Κεφάλαιο 1 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΣΥΝΤΕΤΑΓΜΕΝΩΝ ΣΕ ΜΙΑ ΕΥΘΕΙΑ... 13 1.1 Οι συντεταγμένες ενός σημείου...13 1.2 Απόλυτη τιμή...14 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 1 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΣΥΝΤΕΤΑΓΜΕΝΩΝ ΣΕ ΜΙΑ ΕΥΘΕΙΑ... 13 1.1 Οι συντεταγμένες ενός σημείου...13 1.2 Απόλυτη τιμή...14 Κεφάλαιο 2 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΣΥΝΤΕΤΑΓΜΕΝΩΝ ΣΕ ΕΝΑ ΕΠΙΠΕΔΟ 20 2.1 Οι συντεταγμένες

Διαβάστε περισσότερα

4.3 Δραστηριότητα: Θεώρημα Fermat

4.3 Δραστηριότητα: Θεώρημα Fermat 4.3 Δραστηριότητα: Θεώρημα Fermat Θέμα της δραστηριότητας Η δραστηριότητα αυτή εισάγει το Θεώρημα Fermat και στη συνέχεια την απόδειξή του. Ακολούθως εξετάζεται η χρήση του στον εντοπισμό πιθανών τοπικών

Διαβάστε περισσότερα