Αφιερωμένη ολόψυχα στους γονείς μου και στο σύντροφο μου Γιάννη

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Αφιερωμένη ολόψυχα στους γονείς μου και στο σύντροφο μου Γιάννη"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΙΣΤΗΜΙΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΙΚΩΝ ΕΠΙΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΙΟΛΟΓΙΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΙΚΗΣ,, ΒΙΙΟΛΟΓΙΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μελέτη του ρόλου της πρωτεΐΐνης ΒΜ88 στον καθοριισμό της νευρωνιικής ταυτότητας των κυττάρων Διιδακτοριική διιατριιβή Γιιασεμή Κ.. Κουτμάνη Βιιολόγος ΕΛΛΗΝΙΙΚΟ ΙΙΝΣΤΙΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ ΤΜΗΜΑ ΒΙΙΟΧΗΜΕΙΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΙΟ ΚΥΤΤΑΡΙΙΚΗΣ ΚΑΙΙ ΜΟΡΙΙΑΚΗΣ ΝΕΥΡΟΒΙΙΟΛΟΓΙΙΑΣ Αθήνα 2006

2 UNIIVERSIITY OF PATRAS FACULTY OF APPLIIED SCIIENCES DEPARTMENT OF BIIOLOGY DIIVIISIION OF GENETIICS,, CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIIOLOGY Sttudy off tthe rrolle off BM88 prrotteiin iin tthe commiittmentt off celllls tto tthe neurronall iidenttiitty Ph..D.. Thesiis Yassemii K.. Kouttmanii Biiollogiistt HELLENIIC PASTEUR IINSTIITUTE DEPARTMENT OF BIIOCHEMIISTRY LABORATORY OF CELLULAR AND MOLECULAR NEUROBIIOLOGY Atthens 2006

3 Αφιερωμένη ολόψυχα στους γονείς μου και στο σύντροφο μου Γιάννη

4 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθ. Βασίλης Μαρμάρας, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αν. Καθ. Μαρία Λαμπροπούλου, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Ερευν. Α Ρεβέκκα Μάτσα, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθ. Γεώργιος Δημητριάδης, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Καθ. Φωτεινή Στυλιανοπούλου, Τµήµα Νοσηλευτικής, Πανεπιστήµιο Αθηνών Αν. Καθ. Μαρία Λαμπροπούλου, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αν. Καθ. Παναγιώτης Κατσώρης, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αν. Καθ. Αναστάσιος Μίντζας, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αν. Καθ. Παναγιώτης Γιομπρές, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών Αν. Καθ. Γεωργία Στεφάνου, Τµήµα Βιολογίας, Πανεπιστήµιο Πατρών

5 Πρόλογος Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας του τµήµατος Βιοχηµείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ κατά τη χρονική περίοδο , πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τον τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Θα ήθελα ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τον τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας που με υποδέχτηκε και μου παρείχε όλη την επιστημονική υποστήριξη καθώς και τις ερευνήτριες Ρεβέκκα Μάτσα και Δήμητρα Θωμαΐδου για την ουσιαστική τους επίβλεψη, συµβολή και καθοδήγηση σε όλη την πορεία της διατριβής αυτής. Ευχαριστώ επίσης τα µέλη της τριµελούς επιτροπής, τον Καθ. Βασίλη Μαρμάρα και την Αν. Καθ. Μαρία Λαμπροπούλου, που συνέβαλαν στην εκπόνηση της παρούσας διατριβής, με τις ουσιαστικές τους υποδείξεις αλλά και τον Αν. Καθ. Παναγιώτη Κατσώρη για τη συμπαράστασή του. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στους συναδέλφους και φίλους του τµήµατος Βιοχηµείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ για τη πολύπλευρη συµπαράσταση και το ενδιαφέρον τους. Ιδιαίτερα οφείλω να ευχαριστήσω τους συναδέλφους Μαρία Γαϊτάνου και Αλέξανδρο Λάβδα για τη πολύτιμη βοήθειά τους αλλά και τους Παναγιώτη Πολίτη, Όλγα Παπαδόδημα, Φλωρεντία Παπαστεφανάκη, Στάθη Μεϊντάνη, Ευφροσύνη Μπούτου και Φωτεινή Παπαγεωργίου που μου συμπαραστάθηκαν επιστημονικά και φιλικά όλ αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ επίσης την ερευνητική ομάδα της Dr. Magdalena Götz στο Ινστιτούτο Νευροβιολογίας Max-Plank του Μονάχου που με δέχτηκε τόσο φιλικά κατά τους καλοκαιρινούς μήνες του 2002 και ιδιαίτερα την ίδια τη Magdalena Götz, τον Paolo Malatesta και το Μichael Hack για την επιστημονική τους υποστήριξη. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στο οικογενειακό και φιλικό μου περιβάλλον που μου συμπαραστάθηκε και με στήριξε σε αυτήν την προσπάθεια.

6 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Περίληψη Abstract Σελίδες i iv 1.Εισαγωγή Γενικά Κυτταρική σύσταση του νευρικού συστήματος α. Λειτουργικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά των νευρικών κυττάρων β. Υποκατηγορίες των νευρικών κυττάρων γ. Προέλευση των νευρικών κυττάρων Δομή του νευρικού συστήματος α.Το κεντρικό νευρικό σύστημα β. Ο πρόσθιος εγκέφαλος γ. Ο φλοιός του πρόσθιου εγκεφάλου Ανάπτυξη του νευρικού συστήματος α. Ανάπτυξη του εγκεφάλου β. Ανάπτυξη του φλοιού του τελεγκεφάλου γ. Νευρογένεση και γλοιογένεση στο φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου γ.Α) Ενδογενείς νευρογενετικοί παράγοντες του φλοιού γ.Β) Ενδογενείς γλοιογενετικοί παράγοντες του φλοιού δ. Ο μηχανισμός της νευρογένεσης στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου (μηχανισμός «inside-out») δ.Α) Πολλαπλασιασμός και έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο δ.Β) Μετανάστευση σε καθορισμένες θέσεις του εγκεφαλικού φλοιού δ.Γ) Διαφοροποίηση των νευρώνων, επιμήκυνση αξόνων και σχηματισμός των συνάψεων ε. Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» και ο ρόλος τους στην ανάπτυξη του φλοιού του τελεγκεφάλου Η νευρογένεση στον ενήλικο εγκέφαλο Η πρωτεΐνη ΒΜ Στόχοι της παρούσας εργασίας Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Χημικά και βιολογικά αντιδραστήρια Εργαστηριακός εξοπλισμός α. Όργανα και συσκευές β. Μικροσκόπια και λογισμικά επεξεργασίας εικόνας Γυαλικά-πλαστικά Αντισώματα Πειραματόζωα Βακτηριακά στελέχη και πλασμιδιακοί φορείς Ιϊκοί φορείς Μέθοδοι Βιοχημικές μέθοδοι Απομόνωση μεμβρανικών κλασμάτων από ιστό Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford 3.1 (SIGMA) 49

7 Περιεχόμενα Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών σε κάθετο πήκτωμα ακρυλαμιδίου /bis-ακρυλαμιδίου, παρουσία θειϊκού δωδεκυλικού νατρίου (SDS), (SDS- PAGE, Laemli, 1970) Χρώση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Ανοσοχημικές μέθοδοι Ανοσοαποτύπωμα (western blotting) Ανοσοϊστοχημεία/ ανοσοφθορισμός (Immunohistochemistry / Immunofluorescence) Έγκλειση ιστών και κόψιμο λεπτών τομών α. Έγκλειση ιστών σε παραφίνη και κόψιμο λήψη τομών σε μικροτόμο β. Έγκλειση ιστών σε O.C.T. (BDH) και λήψη τομών σε κρυοστάτη Αποπαραφινοποίηση και ενυδάτωση των ιστών Επώαση των τομών με το ή τα πρωτοταγή αντισώματα Επώαση των τομών με το ή τα δευτεροταγή αντισώματα Τέλος της διαδικασίας χρώσης και επεξεργασία των τομών πριν τη παρατήρηση στο μικροσκόπιο Σήμανση μορίων DNA κατά τη φάση της αντιγραφής (φάση S) του κυτταρικού κύκλου Ιχνηθέτηση του DNA με το μοριακό ανάλογο της θυμιδίνης (Thy), βρωμο-2- δεοξυουριδίνη (BrdU) Ταυτόχρονη ιχνηθέτηση του DNA με τριτιωμένη θυμιδίνη ([ 3 H]-Thy) και βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) Σήμανση των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας με τη λιπόφιλη φθορίζουσα ουσία DiI In vivo υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας του πρόσθιου εγκεφάλου ποντικού με τη βοήθεια ρετροϊού Το σύστημα RCAS-tva α. Ο κύκλος της ζωής του ιού ARSV β. Η χρήση του RCAS και των ιών ARSV ως μέσο μεταφοράς γονιδίων γ. Τα διαγονιδιακά ποντίκια tv-a In vivo επιμόλυνση κυττάρων του εμβρυϊκού εγκεφάλου των ποντικών Gtv-a με τον ιό ARSV και η επώαση του ιού σ αυτά για μεγάλα χρονικά διαστήματα Μικροσκοπία Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας Πέψη DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση και καθαρισμός DNA από πηκτώματα αγαρόζης Με τη συστηματοποιημένη μέθοδο Gene clean II Kit (Bio 101 Inc.) Υποκλωνοποίηση μορίων DNA σε πλασμίδια φορείς Προετοιμασία των προς υποκλωνοποίηση μορίων DNA Σύνδεση του πλασμιδίου φορέα και του προς κλωνοποίηση DNA μορίου με Τ4 DNA λιγάση Καλλιέργεια Ε. coli Μετασχηματισμός καλλιεργειών E.coli με τη μέθοδο του θερμικού σοκ (heatshock) Προετοιμασία των κυττάρων Μετασχηματισμός με θερμικό σοκ Μέθοδοι απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων Απομόνωση μικρής ποσότητας DNA (mini-prep) Απομόνωση μεγάλης ποσότητας DNA (maxi-prep) Απομόνωση γενωμικού DNΑ από ιστούς Απομόνωση ολικού RNA από ιστούς Ηλεκτροφόρηση RNA Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR).86

8 Περιεχόμενα Ανάλυση της έκφρασης του ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο (mrna) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR πραγματικού χρόνου (Real-time-PCR) Διαλύματα Ρυθμιστικά διαλύματα Διαλύματα ηλεκτροφορητικής ανάλυσης πρωτεϊνών Διαλύματα ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών (Western blot) Διάλυμα χρώσης τομών με NBT/BCIP Θρεπτικά υλικά Διαλύματα απομόνωσης πλασμιδιακού DNA σε μικρή και μεγάλη κλίμακα Διαλύματα ανάλυσης RNA Παρασκευή φαινόλης Αποτελέσματα Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στον πρόσθιο εγκέφαλο του ποντικού και του αρουραίου σε πρώιμη εμβρυϊκή ηλικία ενώ η έκφρασή της αυξάνεται σε μεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε περιοχές διαφοροποιημένων νευρώνων αλλά και σε περιοχές έντονης νευρογενετικής δραστηριότητας του προσθίου εγκεφάλου του αρουραίου τόσο κατά την πρωτογενή όσο και κατά τη δευτερογενή νευρογένεση Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εντοπίζεται σε μεταμιτωτικούς νευρώνες που εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα NeuN (NeuN+) αλλά και σε πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα που δεν εκφράζουν τον παράγοντα NeuN (NeuN-) στον πρόσθιο εγκέφαλο του αρουραίου Η πρωτεΐνη ΒΜ88 δεν εντοπίζεται σε προγονικά κύτταρα γλοιοκυττάρων ή σε διαφοροποιημένα γλοιϊκά κύτταρα στον εμβρυϊκό και πρώιμο μεταγεννητικό εγκέφαλο του αρουραίου Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στα κύτταρα της VZ και SVZ του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου πριν την τελευταία τους μιτωτική διαίρεση Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε πολλαπλασιαζόμενα νευροβλαστικά κύτταρα σε περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση στις πρώιμες μεταγεννητικές ηλικίες Η πρωτεΐνη ΒΜ88 δεν εκφράζεται σε κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου κατά τη περίοδο της δευτερογενούς νευρογένεσης Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευροβλαστικά κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream, RMS) κατά τη διαδικασία της δευτερογενούς νευρογένεσης στον ενήλικο αρουραίο Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 συνδέεται με τις ασύμμετρες μιτωτικές νευρογενετικές διαιρέσεις των πρόδρομων κυττάρων στο νευροεπιθήλιο του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου και του ποντικού Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στον ενεργά πολλαπλασιαζόμενο πληθυσμό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου που εκφράζουν την πρωτεΐνη-μάρτυρα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων, νεστίνη Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι μειωμένη στον εγκεφαλικό φλοιό των ποντικών Sey/Sey, που φέρουν μεταλλαγμένο το γονίδιο Pax Ιn vivo υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του πρόσθιου εγκεφάλου ποντικού με τη βοήθεια του ρετροϊικού φορέα RCAS- Y και των διαγονιδιακών ποντικιών tv-a 134

9 Περιεχόμενα 4.Συζήτηση Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε διαιρούμενα πρόδρομα κύτταρα κατά την εμβρυογένεση Πιθανός ρόλος της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και τη νευρωνική διαφοροποίηση Η πρωτεΐνη ΒΜ88 κατά τη δευτερογενή νευρογένεση Βιβλιογραφία 147

10 Περίληψη Περίληψη Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων (μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο) ενώ το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου της προσανατολίζεται προς το κυτταρόπλασμα. Στο ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα. Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ανιχνεύεται κατά την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της αυξάνονται µε την ηλικία και παραµένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο. Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν τη δράση του μορίου με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης και της διαφοροποίησης των νευρώνων in vivo, έτσι ώστε να διερευνήσουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου των τρωκτικών. Αρχικά χαρτογραφήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο φλοιό του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18 και πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 καθώς και μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως είναι η κυκλίνη D1 (μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου) και το ανάλογο της θυμιδίνης, βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU), που ενσωματώνεται στο DNA κατά τη φάση της αντιγραφής του (φάση S του κυτταρικού κύκλου). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες, όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα στη κοιλιακή ζώνη του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού. Κατόπιν, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά την περίοδο της νευρογένεσης ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων ή αν εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του τελεγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν διπλές και τριπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 καθώς και έναντι νευρωνικών ή γλοιΐκών i

11 Περίληψη μαρτύρων, σε συνδυασμό με αντισώματα έναντι μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και όχι σε πολλαπλασιαζόμενα ή διαφοροποιημένα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε και σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου της «ακτινωτής γλοίας» που σύμφωνα με την τρέχουσα αντίληψη, αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18. Αργότερα μόνο, ένας υποπληθυσμός αυτών των κυττάρων αυτά θα αποτελέσει προδρόμους της γλοιϊκής γενεαλογίας, και συγκεκριμένα μετά τη 18 η εμβρυϊκή ημέρα έως και τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν συνδυαστικά πειράματα σήμανσης των πρόδρομων κυττάρων του εγκεφάλου με δύο διαφορετικούς μάρτυρες της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, με τα οποία έγινε εφικτή η παρακολούθηση in vivo, και για το διάστημα 12 και 24 ωρών, του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης μιας συγχρονισμένης ομάδας πολλαπλασιαζόμενων πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται κυρίως με τις τελικές ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις, η εμφάνιση των οποίων σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης στο φλοιό και την εμφάνιση των πρώτων μεταμιτωτικών νευρώνων. Έτσι, φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα νευρογενετικά κύτταρα προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 μελετήθηκε επίσης στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου όπου εντοπίστηκε, εκτός από τους ώριμους νευρώνες, και στα πρόδρομα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream, RMS) το οποίο αποτελεί τη μία από τις δύο περιοχές του εγκεφάλου όπου δημιουργούνται νέοι νευρώνες στο ενήλικο άτομο (δευτερογενής νευρογένεση). Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας στον εμβρυϊκό εγκέφαλο και συνδέει επιπλέον την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο εγκέφαλο. Τέλος, μελετήσαμε τόσο την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό ποντικών που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye (ποντίκια Sey/Sey). Στα ποντίκια αυτά δεν είναι λειτουργικό το γονίδιο Pax6 που είναι υπεύθυνο για την επαγωγή της νευρογένεσης στη ραχιαία περιοχή του τελεγκεφάλου. Έτσι, ο αριθμός των νευρώνων που παράγονται στο φλοιό αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών είναι ελαττωμένος στο μισό από αυτόν που συναντάμε στα ποντίκια άγριου τύπου. Όπως ii

12 Περίληψη αναμενόταν, παρατηρήθηκε ότι τόσο η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 είναι μειωμένα στα ποντίκια Sey/Sey. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 χαρακτηρίζει όλα τα στάδια της γενεαλογίας των νευρώνων από τα πρόδρομα εμβρυϊκά κύτταρα μέχρι τους ώριμους νευρώνες και επομένως, αποτελεί ένα νέο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας. Επιπλέον, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συγκεντρώνει τις απαραίτητες ιδιότητες που χαρακτηρίζουν ένα «νευρογενετικό παράγοντα». Συγκεκριμένα: α) εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας, β) δεν εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας, γ) εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα νευρώνων κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο ενήλικο άτομο και τέλος δ) η έκφρασή της μειώνεται σε ζώα που φέρουν μεταλλάξεις οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ελαττωματικής νευρογένεσης. Η κατανομή της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου καθώς και ο εντοπισμός της σε νευρικά βλαστικά κύτταρα του ενήλικου εγκεφάλου, η συσχέτιση της έκφρασης του μορίου με τις ασύμμετρες νευρογενετικές κυτταρικές διαιρέσεις καθώς και η χαρακτηριστική αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη μετάβαση των προγονικών κυττάρων σε διαφοροποιημένους νευρώνες, όλα συνηγορούν για τη συμμετοχή του μορίου στις διαδικασίες της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και τη διαφοροποίηση των νευρώνων in vivo. Οι παρατηρήσεις αυτές, όχι μόνον είναι συμβατές με προηγούμενα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά τον προσδιορισμό του ρόλου της πρωτεΐνης σε in vitro βιολογικά συστήματα, αλλά δημιουργεί ενδιαφέρουσες προοπτικές για την αξιοποίηση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών ή/και τραυματισμών του εγκεφάλου. iii

13 Abstract Abstract BM88 is a neuron-specific protein widely expressed in the cells of the mammalian central and peripheral nervous system. Its biochemical characterization revealed that it is an integral membrane protein, located at the membranes of intracellular organelles (mitochondria, endoplasmic reticulum) with the bulk of the protein facing towards the cytoplasm. In the adult central nervous system BM88 is expressed in neurons but it is not detected in glial cells. During development, BM88 is initially expressed at the onset of neurogenesis in the rat brain, its levels rise with age and remain high in the adult. In vitro functional studies of BM88 over-expression in neuroblastoma cells suggest that BM88 is implicated in cell cycle exit and the initiation of differentiation towards a neuronal phenotype. These findings prompted us to study the expression of BM88 during neurogenesis and neuronal differentiation in vivo in order to investigate its role in brain development. For this reason, we have chosen as a model of study the developing rodent telencephalon. Initially, we investigated the distribution of BM88 protein in the developing cortex. To this end, we performed double-labeling experiments in sections from developing rat brain at embryonic days E14 and E18 using antibodies to BM88 and markers of the cell cycle such as cyclin D1 (G2/M phase marker) and bromo-2- deoxyuridine (BrdU), a thymidine analogue that is incorporated in DNA during its replication (S phase marker). The findings from these experiments revealed that BM88 protein is expressed in differentiated neurons, as well as in actively proliferating progenitor cells of the developing cortex of the rat and the mouse. We next sought to investigate whether BM88 is expressed during neurogenesis specifically in progenitor cells of the neuronal or glial lineage of telencephalon. To this end we performed double and triple-labeling experiments with antibodies to BM88 and to markers of the neuronal or glial lineages, in combination with markers of the cell cycle. We observed that BM88 protein is expressed exclusively in neuronal progenitors, but not in the proliferating or differentiated cells of the glial lineage. The above results were also supported by the fact that BM88 protein was detected in neuroepithelial radial glial cells that are which constitute the majority of neuronal progenitors in the cortex during embryonic days E14-E18. A subpopulation of these cells will turn into glial progenitors only after embryonic day E18 and during the early postnatal period. Moreover, we developed an experimental protocol that allowed us to mark a cohort of progenitor cells that exit the cell cycle in synchrony, using two different iv

14 Abstract markers of the S phase of the cell cycle. Thus, we could observe in vivo, during a period of 12 to 24 hours, the migration and differentiation of a synchronized group of neural progenitor cells. The results from this experiment lead us to the conclusion that the expression of BM8 protein is associated with final asymmetric cell divisions that mark the onset of neurogenesis in the cortex and the generation of post-mitotic neurons. Thus, it appears that the expression of BM88 in neuronal progenitor cells drives them to exit from the cell cycle. BM88 protein expression was also detected in the adult rat brain, not only in mature neurons but also in precursor cells of the rostral migratory stream (RMS) which represents one of the two brain areas where new neurons are generated throughout life (secondary neurogenesis). This result is in accordance with our previous observations and additionally support that there is a correlation between BM88 expression and the process of neurogenesis in the adult brain. Finally, we investigated the expression of BM88 protein, as well as the transcriptional levels of BM88 gene in the developing cortex of Small eye mutant mice (Sey/Sey mice). These mice lack functional Pax6, a gene that is responsible for the induction of neurogenesis in the dorsal telencephalon. Thus, the number of neurons that are produced in the cortex of the mutant mice is reduced by half in comparison to that of the wild type mice. As expected, we observed reduced levels of expression both of BM88 protein and BM88 transcripts in the Sey/Sey mice. To conclude, the results of our study demonstrate that BM88 protein marks the neuronal lineage, all along from the stage of embryonic precursor cells to the stage of mature neurons, and for this reason it constitutes a new marker of the neuronal lineage. Furthermore, we showed that BM88 protein has all the characteristics that identify a molecule as a neurogenic factor. More specifically: a) it is expressed both in differentiated neurons and in actively proliferating cells of the neuronal lineage, b) it is absent in precursors of the glial lineage, c) it is present in adult neuronal precursors, and finally d) its expression is reduced in mutants with neurogenic defects. The expression pattern of BM88 during brain development, its presence in neural stem cells in the embryonic and adult brain, together with its association with asymmetric neuron-generating divisions and the characteristic elevation of BM88 expression upon transition of precursor cells to differentiated neurons, all point its involvement in the process of neurogenesis in vivo. These observations not only are in agreement with our previous experimental data regarding the role of BM88 in vitro, but also create interesting prospects for the development of BM88-based gene therapies for the treatment of neurodegenerative diseases and CNS trauma. v

15 Εισαγωγή 1.Εισαγωγή 1.1.Γενικά Το ανθρώπινο νευρικό σύστημα είναι το πιο πολύπλοκο φυσικό σύστημα που γνωρίζουμε μέχρι σήμερα. Η πολυπλοκότητά του οφείλεται καταρχήν στον μεγάλο αριθμό των κυττάρων που το αποτελούν (ο ανθρώπινος εγκέφαλος μόνο περιέχει ένα τρισεκατομμύριο νευρικά κύτταρα). Τα κύτταρα που απαρτίζουν το νευρικό σύστημα είναι πολύπλοκα σε μορφή και λειτουργία, ενώ παράλληλα συνδέονται και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους με πολλούς και διαφορετικούς τρόπους. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δισεκατομμυρίων αυτών κυττάρων είναι εξαιρετικά πολλές και ποικίλες. Ένας ακόμα σημαντικός παράγοντας που καθιστά το νευρικό σύστημα τόσο πολύπλοκο είναι οι διαρκείς, γρήγορες, δυναμικές αλλαγές των κυτταρικών αλληλεπιδράσεών του. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις μεταφράζονται μακροσκοπικά σε μια σειρά από βασικές λειτουργίες του ανθρώπου όπως είναι η αντίληψη και η καταχώρηση δεδομένων από το περιβάλλον, η κίνηση, η συμπεριφορά και η οποιαδήποτε αντίδραση σε ερεθίσματα συνειδητή ή ασυνείδητη αλλά και ο συντονισμός όλων των υπόλοιπων συστημάτων του ανθρώπινου σώματος. Το νευρικό σύστημα είναι όμως υπεύθυνο και για μια σειρά από πιο πολύπλοκες, «ανώτερες» όπως ονομάζονται λειτουργίες όπως η μνήμη, η μάθηση και ο λόγος. Το σύνολο των λειτουργιών αυτών διασφαλίζει την επιβίωση, την προσαρµογή και την αποτελεσµατικότερη διαβίωση ενός οργανισµού σε σχέση µε το εξωτερικό του περιβάλλον. Ερευνητές από διαφορετικούς επιστημονικούς χώρους και με διαφορετικά επιστημονικά μοντέλα και μεθόδους έχουν επιδοθεί στη μελέτη του νευρικού συστήματος. Παρ όλα αυτά η οργάνωσή του παραμένει σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστη ενώ η ικανότητά μας να αντιμετωπίζουμε ασθένειες του νευρικού συστήματος είναι εξαιρετικά περιορισμένη. Ό,τι γνωρίζουμε μέχρι σήμερα για το νευρικό σύστημα είναι το αποτέλεσμα αιώνων ανατομικής μελέτης, εμπειρικών και κλινικών παρατηρήσεων που έχουν αφετηρία στους αρχαίους χρόνους. Η μελέτη του νευρικού συστήματος γνώρισε μεγάλη ανάπτυξη στο δεύτερο μισό του 19ου αιώνα και έξαρση τις τελευταίες δεκαετίες όπου οι επιστήμονες χρησιμοποιούν νέες τεχνολογικές μεθόδους και προσεγγίσεις για την ανάπτυξη αυτού του πεδίου έρευνας. 1

16 Εισαγωγή 1.2.Κυτταρική σύσταση του νευρικού συστήματος Το νευρικό σύστηµα απαρτίζεται από δύο βασικές κατηγορίες κυττάρων: τους νευρώνες και τη γλοία. Οι δύο αυτές κύριες τάξεις κυττάρων διαχωρίζονται σε υποτάξεις που διαφέρουν μεταξύ τους στη δομή, στο βιοχημικό τους χαρακτήρα και στη λειτουργία τους. Οι νευρώνες αν και δεν είναι η πολυπληθέστερη κατηγορία κυττάρων του νευρικού συστήματος (αφού τα κύτταρα της γλοίας υπερτερούν σε αριθμό κατά δέκα φορές από τα νευρωνικά κύτταρα) είναι ωστόσο η καλύτερα μελετημένη, δεδομένου ότι η πολυπλοκότητα και οι χαρακτηριστικές ιδιότητες του νευρικού συστήματος οφείλονται σε μεγάλο βαθμό, στη δική τους λειτουργία. 1.2.α. Λειτουργικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά των νευρικών κυττάρων Λόγω της μορφολογίας τους, οι νευρώνες είναι κύτταρα υπεύθυνα για τη λήψη, την επεξεργασία και τη διαβίβαση πληροφοριών και ερεθισμάτων ενώ τα κύτταρα της γλοίας έχουν ως κύριο ρόλο τη μηχανική και τροφική υποστήριξη των νευρώνων αλλά και τη δημιουργία κατάλληλων συνθηκών περιβάλλοντος ώστε οι νευρώνες να μπορούν να επιτελούν καλύτερα τη λειτουργία τους. Όσον αφορά τώρα τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των νευρικών κυττάρων είναι κι αυτά ιδιαίτερα για κάθε μία από τις δύο κατηγορίες (νευρώνες και γλοία), και τέτοια ώστε να τους επιτρέπουν να επιτελέσουν καλύτερα το ρόλο τους. Οι νευρώνες αποτελούνται από τρία διακριτά μέρη: το σώμα, τον άξονα και τους δενδρίτες (Σχήμα 1). Εξωτερικά περιβάλλονται από την κυτταρική μεμβράνη η οποία με τις πρωτεΐνες της παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη λειτουργία των νευρώνων. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι η πρωτεϊνική σύσταση της κυτταρικής μεμβράνης ενός νευρώνα διαφέρει στο επίπεδο του σώματος, των δενδριτών και του άξονα. Το σώμα είναι το μεταβολικό κέντρο του κυττάρου και συνιστά το κεντρικό, σφαιρικό τμήμα του νευρώνα το οποίο περιλαμβάνει τον πυρήνα και άλλα κυτταρικά οργανίδια (μιτοχόνδρια, σύστημα Golgi, αδρό και λείο ενδοπλασματικό δίκτυο). Ο άξονας αποτελεί μία ειδική κυτταρική αποφυάδα που προεκβάλει από το σώμα, είναι μοναδικός για κάθε νευρώνα και μπορεί να εκταθεί σε πολύ μεγάλη απόσταση (το μήκος του μπορεί να φτάσει το ένα μέτρο). Μέσα στον άξονα δεν συντίθενται πρωτεΐνες αλλά μεταφέρονται κατά μήκος του από το σώμα μέσω μίας διαδικασίας που καλείται αξονική μεταφορά. Λόγω των μορφολογικών χαρακτηριστικών του, ο άξονας έχει την ικανότητα μεταφοράς μηνυμάτων σε µεγάλη απόσταση από το κυτταρικό σώμα, προς άλλους και πολλές φορές πολλαπλούς στόχους λόγω των πολυάριθµων διακλαδώσεων που φέρει στο άκρο του. Οι 2

17 Εισαγωγή διακλαδώσεις αυτές καταλήγουν σε εξειδικευμένες απολήξεις που ονομάζονται προσυναπτικές απολήξεις. Αυτές έρχονται σε επαφή με τις δεκτικές επιφάνειες ενός ή περισσοτέρων κυττάρων (κυρίως νευρώνων αλλά και μυϊκών κυττάρων) οι οποίες ονομάζονται μετασυναπτικές απολήξεις. Η προσυναπτική απόληξη μαζί με τη μετασυναπτική απόληξη και το διάστημα που τις χωρίζει (συναπτική σχισμή) αποτελούν τη σύναψη (Σχήμα 1). Έτσι το σήμα μεταδίδεται από ένα προσυναπτικό προς ένα μετασυναπτικό νευρώνα μέσω μίας ή περισσοτέρων συνάψεων. Οι συνάψεις στο νευρικό σύστημα των θηλαστικών είναι κατά κανόνα χημικές, δηλαδή από το σώμα του νευρώνα ξεκινά ένα ηλεκτρικό σήμα που φτάνει στη σύναψη μέσω του άξονα, εκεί μετατρέπεται σε χημικό με την έκλυση χημικών ουσιών από την προσυναπτική μεμβράνη, των νευροδιαβιβαστών. Κατόπιν οι νευροδιαβιβαστές δεσμεύονται από τη μετασυναπτική μεμβράνη και το χημικό σήμα μετατρέπεται και πάλι σε ηλεκτρικό στο κύτταρο-δέκτη. Όσον αφορά τέλος τους δενδρίτες, πρόκειται για λεπτές διακλαδιζόμενες αποφυάδες που προεκβάλλουν από το σώμα και διατρέχονται εσωτερικά από κυτταροσκελετικά στοιχεία και μιτοχόνδρια. Ρόλος τους είναι η «υποδοχή» χημικών σημάτων που φτάνουν εδώ μέσω των συνάψεων από τους άξονες άλλων νευρώνων και η μεταφορά των σημάτων αυτών στο σώμα. Σχ.1. Νευρώνας και σύναψη 3

18 Εισαγωγή Τα κύτταρα της γλοίας έχουν μορφολογικά χαρακτηριστικά που διαφέρουν ανάλογα με το είδος τους όπως θα δούμε παρακάτω. 1.2.β. Υποκατηγορίες των νευρικών κυττάρων Οι νευρώνες ταξινομούνται σε διάφορες κατηγορίες βάσει διαφόρων κριτηρίων. Τα κριτήρια αυτά είναι ο αριθμός των νευρικών τους απολήξεων, η μορφολογία των δενδριτών τους, το μήκος του άξονά τους, το είδος των κυττάρων με τα οποία δημιουργούν συνάψεις και τέλος το είδος των νευροδιαβιβαστών που εκλύουν στις συνάψεις τους. Έτσι, έχοντας ως κριτήριο τη μορφολογία τους, χαρακτηρίζουμε κάποιους νευρώνες ως πυραμιδικούς νευρώνες λόγω του πυραμιδικού σώματός τους και του μεγάλου μήκους του άξονά τους, ενώ με κριτήριο τις συνάψεις που δημιουργούν, διαχωρίζουμε τους νευρώνες σε διάμεσους νευρώνες και νευρώνες προβολής. Οι διάμεσοι νευρώνες είναι σχετικά μικροί και δημιουργούν συνδέσεις στην ίδια περιοχή του νευρικού συστήματος, ενώ οι νευρώνες προβολής διακρίνονται για το μεγάλο μήκος του άξονά τους και μπορούν να μεταφέρουν μηνύματα σε μακρινές αποστάσεις συνδέοντας έτσι διαφορετικές περιοχές του νευρικού συστήματος (π.χ. εγκεφαλικό φλοιό με υποθάλαμο). Ταυτόχρονα οι παραπάνω νευρώνες διαφέρουν μεταξύ τους και ως προς τους νευροδιαβιβαστές που εκλύουν στις συνάψεις τους έτσι οι διάμεσοι νευρώνες χρησιμοποιούν ως νευροδιαβιβαστή κυρίως το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) ενώ οι νευρώνες προβολής κυρίως το νευροδιαβιβαστή γλουταμινικό οξύ. Τα κύτταρα της γλοίας διαχωρίζονται σε δύο μεγάλες ομάδες ανάλογα με το αν παράγουν ή όχι μυελίνη. Η μυελίνη (ή μυελώδες έλυτρο) είναι σχηματισμός που περιβάλλει τον άξονα ενός νευρώνα εκτός από μερικά κενά διαστήματα που ονομάζονται κόμβοι του Ranvier (Σχήμα 2). Η μυελίνη δημιουργείται από την περιέλιξη της κυτταρικής μεμβράνης ενός μυελινοποιητικού κυττάρου γύρω από έναν άξονα (ένα μυελινοποιητικό κύτταρο μπορεί να τυλίξει με τη μεμβράνη του πάνω από 50 φορές έναν άξονα). Η μυελίνη λειτουργεί ως μονωτικό υλικό και διευκολύνει τη μεταφορά του ηλεκτρικού σήματος κατά μήκος του άξονα με μία διαδικασία που ονομάζεται αλματώδης αγωγή (salutatory conduction). Τα γλοιοκύτταρα που παράγουν μυελίνη είναι τα ολιγοδενδροκύττρα στο κεντρικό νευρικό σύστημα και τα μυελινοποιητικά κύτταρα Schwann στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Μία χαρακτηριστική διαφορά των δύο αυτών τύπων γλοιοκυττάρων είναι το ότι ένα μόνο ολιγοδενδροκύτταρο είναι ικανό να μυελινοποιήσει πολλούς νευρωνικούς άξονες, ενώ αντίθετα ένα κύτταρο Schwann μπορεί να μυελινοποιήσει μόνο έναν νευρωνικό άξονα. Η δεύτερη κατηγορία κυττάρων της γλοίας που δεν παράγει μυελίνη, περιλαμβάνει τα αστροκύτταρα στο κεντρικό νευρικό σύστημα και τα μη 4

19 Εισαγωγή μυελινοποιητικά κύτταρα Schwann στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Τα αστροκύτταρα είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος από τα υπόλοιπα κύτταρα της γλοίας και ο ρόλος τους δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί πλήρως. Μεταξύ άλλων πιστεύεται ότι ρυθμίζουν τη χημική σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας π.χ. την εξωκυττάρια συγκέντρωση καλίου, επηρεάζοντας έτσι τη λειτουργία των νευρώνων. Σχ.2. Μυελινοποιητικά ολιγοδεντροκύτταρα περιβάλλουν τον άξονα ενός νευρώνα Εκτός από τους νευρώνες και τη γλοία, στο νευρικό σύστημα συναντάμε και μη νευρικά κύτταρα όπως: α) τα κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων (επενδυματικά κύτταρα) και β) τα κύτταρα της μικρογλοίας τα οποία αποτελούν το 15% των κυττάρων του νευρικού συστήματος και τα οποία, επιτελώντας ρόλο φαγοκυττάρων, απομακρύνουν από το νευρικό ιστό τα κατεστραμμένα και νεκρά νευρικά κύτταρα. 1.2.γ. Προέλευση των νευρικών κυττάρων Τα κύτταρα του νευρικού συστήματος των θηλαστικών προκύπτουν σταδιακά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου από πολυδύναμα νευρικά βλαστικά κύτταρα (ΝΒΚ) από τα οποία στη συνέχεια προκύπτουν πρόδρομα κύτταρα (precursor cells) νευρώνων ή γλοίας (Σχήμα 3). Η διαδικασία αυτή έχει μελετηθεί τόσο in vitro (Μujtaba et al., 1999) όσο και in vivo (Kalyani et al., 1997, Rao & Mayer- Proschel, 1997). Τα ΝΒΚ διακρίνονται από την ικανότητα να αναπαράγουν τον εαυτό τους μέσω μίας έντονης πολλαπλασιαστικής δράσης και από την δυνατότητα διαφοροποίησής τους σε όλους τους κυτταρικούς τύπους του νευρικού συστήματος. 5

20 Εισαγωγή Σταδιακά η πολλαπλασιαστική δραστηριότητά τους περιορίζεται και τα ΝΒΚ διαφοροποιούνται σε προγονικά κύτταρα (progenitor cells) με πιο περιορισμένο δυναμικό διαφοροποίησης τα οποία τελικά είναι δεσμευμένα να παράγουν ένα συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο, δηλαδή νευρώνες ή γλοία (Temple and Qian, 1996, Rao, 1999, Desai and McConell, 2000, Reid et al., 1995, Mayer-Proschel et al., 1997). Η προγραμματισμένη αυτή διαδοχή κυτταρικών τύπων αποτελεί τη νευρωνική και γλοιϊκή γενεαλογία. Έτσι, οι ώριμοι νευρώνες προκύπτουν από νευρωνικά προγονικά κύτταρα μέσω μιας διαδικασίας που καλείται νευρογένεση ενώ τα γλοιοκύτταρα προκύπτουν από γλοιϊικά προγονικά κύτταρα μέσω μιας διαδικασίας που καλείται γλοιογένεση. Η νευρογένεση λαμβάνει χώρα πολύ νωρίς κατά την ανάπτυξη, προηγείται της γλοιογένεσης και η δημιουργία ώριμων νευρώνων ολοκληρώνεται κατά ένα μεγάλο μέρος κατά την εμβρυϊκή κιόλας ηλικία. Η διαδικασία της νευρογένεσης λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες και καλά χαρακτηρισμένες νευρογενετικές περιοχές του εμβρυϊκού νευρικού συστήματος που περιβάλλουν τις κοιλίες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού. Σχ.3. Τα στάδια της νευρωνικής και γλοιϊκής γενεαλογίας Η γλοιογένεση είναι αργή και προοδευτική διαδικασία διάρκειας αρκετών εβδομάδων και λαμβάνει χώρα ως επί το πλείστον μεταγεννητικά. Οι θέσεις όπου λαμβάνει χώρα η γλοιογένεση δεν είναι τόσο αυστηρά οριοθετημένες μέσα στο 6

21 Εισαγωγή νευρικό σύστημα. Επιπλέον τα αστροκύτταρα, τα ολιγοδενδροκύτταρα και τα κύτταρα Schwann που αποτελούν τις τρεις μεγάλες κατηγορίες γλοιοκυττάρων, θεωρείται ότι έχουν διαφορετική προέλευση, ότι προκύπτουν δηλαδή από διαφορετικά προγονικά κύτταρα αλλά και ότι η γένεσή τους διαφέρει τόσο χρονικά όσο και χωροταξικά Δομή του νευρικού συστήματος Αν και το νευρικό σύστημα έχει υποστεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης τις λιγότερες τροποποιήσεις από κάθε άλλο ιστό, ωστόσο η δομή του διαφέρει σημαντικά ανάλογα με την εξελικτική ομάδα όπου συναντάται. Επειδή το σύστημα της παρούσας μελέτης είναι τα θηλαστικά, θα επικεντρωθούμε στην περιγραφή της δομής του νευρικού συστήματος των θηλαστικών. Το νευρικό σύστημα των θηλαστικών διαιρείται στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και στο περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ). Το κεντρικό νευρικό σύστημα είναι το κέντρο λήψης και επεξεργασίας ερεθισμάτων αλλά και το κέντρο από το οποίο εξέρχονται εντολές προς την περιφέρεια. Το περιφερικό νευρικό σύστημα είναι υπεύθυνο για τη μεταφορά των ερεθισμάτων από την περιφέρεια στο κέντρο (ΚΝΣ) και από το κέντρο προς την περιφέρεια του σώματος. Ξεχωριστή λειτουργικά μονάδα του νευρικού συστήματος αποτελεί το αυτόνομο νευρικό σύστημα (ΑΝΣ) που ευθύνεται για τη ρύθμιση όλων των ακούσιων λειτουργιών του σώματος όπως η λειτουργία της καρδιάς, η συστολή και διαστολή των αρτηριών κτλ. 1.3.α. Το κεντρικό νευρικό σύστημα Το κεντρικό νευρικό σύστημα αποτελείται από τον εγκέφαλο και το νωτιαίο μυελό. Ο εγκέφαλος περιλαμβάνει με τη σειρά του πέντε διαφορετικές δομές που εμφανίζονται πολύ νωρίς κατά την ανάπτυξη (Σχήμα 4): τον τελεγκέφαλο (ημισφαίρια του εγκεφάλου), το διεγκέφαλο (θάλαμος, υποθάλαμος κτλ.), το μεσεγκέφαλο ή διάμεσο εγκέφαλο το ρομβεγκέφαλο (παρεγκεφαλίδα), και το μυελεγκέφαλο (προμήκης μυελός) που συνδέει τον εγκέφαλο με το νωτιαίο μυελό. Ο τελεγκέφαλος μαζί με το διεγκέφαλο αποκαλούνται και πρόσθιος εγκέφαλος. 7

22 Εισαγωγή Φυλογενετικά παρατηρείται μία ανάπτυξη του πρόσθιου εγκεφάλου σε σχέση με τα υπόλοιπα τμήματα έτσι ώστε όσο προχωράμε στην εξέλιξη τόσο ο πρόσθιος εγκέφαλος μεγαλώνει παραγκωνίζοντας τα υπόλοιπα μέρη. Στα θηλαστικά είναι χαρακτηριστική η εξαιρετικά μεγάλη ανάπτυξη του πρόσθιου εγκεφάλου σε σχέση με τον υπόλοιπο εγκέφαλο. Μάλιστα, σε ορισμένα θηλαστικά, λόγω της μεγάλης ανάπτυξης του πρόσθιου εγκεφάλου, τα εγκεφαλικά ημισφαίρια εκτοπίζουν όλες τις άλλες εγκεφαλικές δομές κάτω από αυτά, ενώ παράλληλα δημιουργούνται πτυχώσεις στην επιφάνειά τους προκειμένου να χωρέσουν μέσα στην κρανιακή κοιλότητα. Σχ.4. Σύγκριση της δομής του εγκεφάλου αρουραίου και ανθρώπου Ο εγκέφαλος αλλά και ο νωτιαίος μυελός είναι προστατευμένοι μέσα στην κρανιακή κοιλότητα και τη σπονδυλική στήλη αντίστοιχα. Προκειμένου να αποφευχθούν τραυματισμοί των οργάνων αυτών από την άμεση επαφή τους με τα οστά, περιβάλλονται από συνδετικό ιστό που σχηματίζει τρεις μήνιγγες. Από το οστό προς τον εγκέφαλο και το νωτιαίο μυελό συναντάμε τη σκληρή μήνιγγα που αποτελείται από σκληρό συνδετικό ιστό, την αραχνοειδή και τέλος τη χοριοειδή μήνιγγα (Σχήμα 5). Οι δύο τελευταίες είναι γεμάτες αιμοφόρα αγγεία που βοηθούν στην αιμάτωση του εγκέφαλου και του νωτιαίου μυελού. Μεταξύ της αραχνοειδούς και της χοριοειδούς μήνιγγας κυκλοφορεί το εγκεφαλονωτιαίο υγρό που βοηθά στη θρέψη των οργάνων αλλά και στην απορρόφηση των κραδασμών έτσι ώστε να αποφεύγονται οι τραυματισμοί του νευρικού ιστού. Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό 8

23 Εισαγωγή παράγεται μέσα σε μεγάλες κοιλότητες που διατρέχουν όλο το μήκος του εγκεφάλου και ονομάζονται κοιλίες (Σχήμα 5). Οι κοιλίες του εγκεφάλου είναι κατά την ανάπτυξη πέντε αλλά στο ενήλικο άτομο μένουν οι τέσσερις. Οι δύο μεγαλύτερες κοιλίες βρίσκονται μέσα στα ημισφαίρια του τελεγκεφάλου και ονομάζονται πλευρικές κοιλίες, η τρίτη βρίσκεται στο διεγκέφαλο και η τέταρτη στο μυελεγκέφαλο. Όλες οι κοιλίες επικοινωνούν μεταξύ τους αλλά και με τον χώρο μεταξύ αραχνοειδούς και χοριοειδούς μήνιγγας από ειδικά σημεία. Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό παράγεται από έναν ειδικό ιστό που ονομάζεται χοριακό πλέγμα. Σχ.5. Οι μήνιγγες και οι κοιλίες του εγκεφάλου των θηλαστικών Το χοριακό πλέγμα που είναι γεμάτο αγγεία παράγει με σταθερό ρυθμό το υγρό αυτό. Το υγρό γεμίζει τις κοιλίες και κυκλοφορεί γύρω από τον εγκέφαλο (μεταξύ αραχνοειδούς και χοριοειδούς μήνιγγας), τέλος απορροφάται από τα αγγεία των μηνίγγων και αναγεννάται από το χοριακό πλέγμα. 1.3.β. Ο πρόσθιος εγκέφαλος Ο πρόσθιος εγκέφαλος είναι το κέντρο της αντίληψης, της συνείδησης και των εκούσιων κινήσεων και αντιδράσεων. Καταλαμβάνει όπως είδαμε το μεγαλύτερο τμήμα του εγκεφάλου. Χωρίζεται σε δύο ημισφαίρια από μία βαθιά πτυχή της σκληρής μήνιγγας, ωστόσο τα ημισφαίρια επικοινωνούν στη βάση τους εξασφαλίζοντας έτσι συντονισμένη λειτουργία. Τα κύτταρα των ημισφαιρίων σχηματίζουν τη φαιά και τη λευκή ουσία. Η φαιά ουσία βρίσκεται στην επιφάνεια των ημισφαιρίων και αποτελεί μία πολύπλοκη δομή του πρόσθιου εγκεφάλου, τον εγκεφαλικό φλοιό. Αποτελείται κυρίως από τα σώματα μεγάλων νευρώνων προβολής, από μικρότερους διάμεσους νευρώνες με κοντές αποφυάδες καθώς και από τα αστροκύτταρα της φαιάς ουσίας. Η λευκή ουσία 9

24 Εισαγωγή βρίσκεται στο εσωτερικό των ημισφαιρίων και αποτελείται από τους μακριούς άξονες των νευρώνων προβολής, που συνδέουν διάφορα τμήματα του εγκεφάλου μεταξύ τους, περιβαλλόμενοι από ολιγοδενδροκύτταρα και συγκεκριμένη κατηγορία αστροκυττάρων της λευκής ουσίας. Μεταξύ των αξόνων παρεμβάλλεται συνδετικός ιστός. Μέσα στη λευκή ουσία βρίσκονται και περιοχές φαιάς ουσίας που ονομάζονται πυρήνες ή κέντρα του εγκεφάλου. 1.3.γ. Ο φλοιός του πρόσθιου εγκεφάλου Αναμφίβολα η πιο σημαντική δομή του προσθίου εγκεφάλου είναι ο φλοιός. Στο φλοιό εντοπίζονται τα κέντρα ελέγχου των εκούσιων κινήσεων, των αισθήσεων (ακοή, όραση, όσφρηση, αφή, γεύση), αλλά και όλες οι ανώτερες λειτουργίες του εγκεφάλου όπως η μνήμη, η κρίση, η μάθηση, η αντίληψη, το κέντρο του λόγου κτλ. Συνήθως η ανάπτυξη της επιφάνειας του πρόσθιου εγκεφάλου, δηλαδή του φλοιού, είναι τόσο μεγάλη ώστε να δημιουργούνται, όπως ήδη είδαμε, αύλακες. Οι τρεις πιο βαθειές αύλακες χωρίζουν το φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου σε τέσσερις λοβούς: το μετωπικό, το βρεγματικό, τον κροταφικό και τον ινιακό λοβό (Σχήμα 6). Σχ.6. Η δομή του φλοιού του πρόσθιου εγκεφάλου Η κυτταρική δομή του φλοιού του πρόσθιου εγκεφάλου είναι πολύπλοκη και διακρίνεται από μία χαρακτηριστική αρχιτεκτονική σύμφωνα με την οποία, στο ώριμο άτομο, τα σώματα των νευρώνων είναι τοποθετημένα σε έξι διακριτές στιβάδες, παράλληλες προς την επιφάνεια του εγκεφάλου (Σχήμα 6). Η στιβάδα Ι, μοριακή στιβάδα ή στιβάδα MZ (marginal zone) βρίσκεται ακριβώς κάτω από τη χοριοειδή μήνιγγα και αποτελείται από ελάχιστους νευρώνες μεγάλου μεγέθους, τους 10

25 Εισαγωγή νευρώνες Cajal-Retzius. Κάτω από τη στιβάδα Ι βρίσκονται οι στιβάδες ΙΙ (Εξωτερική κοκκιώδης στιβάδα), ΙΙΙ (Εξωτερική πυραμιδική στιβάδα), IV (Εσωτερική κοκκιώδης στιβάδα), V και VI (Εσωτερικές πυραμιδικές στιβάδες). Όλες εκτός από την Ι και την ΙV, αποτελούνται από μικρότερους ή μεγαλύτερους πυραμιδικούς νευρώνες που προβάλουν τους άξονές τους προς άλλες περιοχές του εγκεφάλου (π.χ. οι άξονες των νευρώνων της στιβάδας V προβάλουν στην περιοχή του θαλάμου). Η στιβάδα ΙV αποτελείται από μικρούς, στη πλειοψηφία μη πυραμιδικούς νευρώνες και από νευρικές ίνες μοιάζοντας έτσι σε μορφολογία με τη στιβάδα Ι. Ωστόσο τα όρια των στιβάδων αυτών δεν είναι αυστηρά καθορισμένα και οι άξονες ή οι δενδρίτες των κυττάρων μιας στιβάδας μπορεί να εντοπίζονται σε όλες τις υπόλοιπες στιβάδες. Επιπλέον, ανάλογα με τη περιοχή του φλοιού, η αρχιτεκτονική αυτή μπορεί να παρουσιάζει κάποιες διακυμάνσεις. Έτσι συναντάμε μία περιοχή όπου ο φλοιός αναδιπλώνεται εσωτερικά και διεισδύει μέσα στην πλευρική κοιλία σχηματίζοντας μία δομή που ονομάζεται ιππόκαμπος. Ο ιππόκαμπος εμφανίζει, αντί για τέσσερις, μόνο μία στιβάδα πυραμιδικών νευρώνων Ανάπτυξη του νευρικού συστήματος Στην αρχή της οντογένεσης το έμβρυο των θηλαστικών έχει τη μορφή ενός επίπεδου δίσκου που αποτελείται από τρεις στιβάδες κυττάρων, το ενδόδερμα, το μεσόδερμα και το εξώδερμα (Σχήμα 7). Κατά την ανάπτυξη, η κάθε στιβάδα κυττάρων δίνει γένεση και σε διαφορετικά όργανα. Έτσι, το εξώδερμα δίνει γένεση στο νευρικό σύστημα και στο δέρμα. Συγκεκριμένα το νευρικό σύστημα προέρχεται από ένα κεντρικό τμήμα του εξωδέρματος που ονομάζεται νευρική πλάκα η οποία δημιουργείται χάρη σε μοριακά μηνύματα που δέχεται από τις παρακείμενες μεσοδερμικές δομές. Η νευρική πλάκα σταδιακά εγκολπώνεται εσωτερικά και δημιουργεί κατά μήκος του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα του εμβρύου, τη νευρική αύλακα. Όταν η νευρική αύλακα κλείσει τόσο ώστε τα τοιχώματά της να συντηχθούν, τότε δημιουργείται ο νευρικός σωλήνας (Jacobson and Tam, 1982; Schoenwolf and Sheard, 1989). Ενας πληθυσµός κυττάρων που βρίσκεται στα όρια του νευρικού σωλήνα, διαχωρίζεται και σχηµατίζει ραχιαία µία νέα κυτταρική στοιβάδα, την νευρική ακρολοφία (Le Douarin, 1973). O νευρικός σωλήνας θα δώσει γένεση στο κεντρικό νευρικό σύστημα ενώ η νευρική ακρολοφία στο περιφερικό και στο αυτόνομο νευρικό σύστημα. 11

26 Εισαγωγή Σχ.7. Η δημιουργία του νευρικού σωλήνα 1.4.α. Ανάπτυξη του εγκεφάλου Από τη στιγμή που δημιουργείται ο νευρικός σωλήνας αρχίζει για το νευρικό σύστημα η διαδικασία της διαφοροποίησης. Το πρώτο στάδιο της διαφοροποίησης είναι η εμφάνιση τριών κυστιδίων στο πρόσθιο τμήμα του νευρικού σωλήνα που ονομάζονται πρωτογενή κύστίδια. Αυτά θα δώσουν γένεση σ ολόκληρο τον εγκέφαλο. Το πιο πρόσθιο κυστίδιο ονομάζεται αρχαιγκέφαλος, το δεύτερο μεσεγκέφαλος και το οπίσθιο κυστίδιο ονομάζεται ρομβεγκέφαλος (Σχήμα 8). Κατόπιν, στη περιοχή του αρχαιγκεφάλου δημιουργούνται νέα κυστίδια (δευτερογενή κυστίδια) και έτσι διαμορφώνεται ο πρόσθιος εγκέφαλος με τα δύο τελεγκεφαλικά ημισφαίρια και τον διεγκέφαλο. Ο διεγκέφαλος θα δώσει σταδιακά γένεση στις περιοχές του θαλάμου και του υποθαλάμου, ο ρομβεγκέφαλος στη παρεγκεφαλίδα ενώ ο υπόλοιπος νευρικός σωλήνας θα δώσει γένεση στο νωτιαίο μυελό. Σχ.8. Τα στάδια ανάπτυξης των περιοχών του εγκεφάλου 12

27 Εισαγωγή 1.4.β. Ανάπτυξη του φλοιού του τελεγκεφάλου Η διαίρεση του τελεγκεφάλου σε δύο ημισφαίρια οφείλεται σε μία δομή της ραχιαίας περιοχής του που ονομάζεται μέση γραμμή στην οποία παρατηρείται μεγάλο ποσοστό απόπτωσης και μικρό ποσοστό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σχέση με τον υπόλοιπο ιστό του τελεγκεφάλου που αναπτύσσεται ραγδαία (Harris et al., 1997). Κατά τη περίοδο της ανάπτυξης του πρόσθιου εγκεφάλου κάθε ημισφαίριο εμφανίζει μία πάχυνση στο εσωτερικό κοιλιακό τμήμα του, που αποκαλείται γαγγλιωνικό έπαρμα (gaglionic eminence, GE), (Σχήμα 9). Η δομή αυτή αποτελεί τον κοιλιακό τελεγκέφαλο ενώ το υπόλοιπο ημισφαίριο διατηρεί τη λεπτή μορφολογία του, που αποκαλείται φλοιϊκή πλάκα (cortical plate, CP), και αποτελεί τον ραχιαίο τελεγκέφαλο. Το γαγγλιωνικό έπαρμα διακρίνεται με τη σειρά του σε μέσο και πλευρικό γαγγλιωνικό έπαρμα (medial gaglionic eminence, MGE και lateral gaglionic eminence, LGE αντίστοιχα). Παράλληλα με τα παραπάνω γεγονότα λαμβάνει χώρα ο μηχανισμός σχηματισμού των νευρωνικών στιβάδων του φλοιού. Ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει μία σειρά από στάδια με αυστηρά καθορισμένη διαδοχή σύμφωνα με τα οποία οι νευρώνες που παράγονται πρώτοι μεταναστεύουν σε κατώτερες στιβάδες του φλοιού ενώ οι νευρώνες που παράγονται τελευταίοι καταλαμβάνουν τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού. Ο μηχανισμός αυτός ονομάζεται μηχανισμός «inside-out» και αναλύεται λεπτομερώς παρακάτω (κεφάλαιο 1.4.δ). Καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξής του ο φλοιός είναι εκτεθειμένος στην επίδραση μορίωνμηνυμάτων που εκκρίνονται από κάποιες ειδικές δομές του τελεγκεφάλου που ονομάζονται «οργανωτές» (Shimamura et al., 1997, Shimamura and Rubenstein, 1997). Οι «οργανωτές» του φλοιού του τελεγκεφάλου είναι: α) η πρόσθια νευρική ακμή (neural ridge) που εντοπίζεται στην πρόσθια μέση γραμμή, β) η επιφανειακή πλάκα (roof plate) που εντοπίζεται στη ραχιαία μέση γραμμή, γ) το φλοιϊκό χείλος (cortical hem) που βρίσκεται μεταξύ της ραχιαίας επιφάνειας της μέσης γραμμής και της κοιλιακής επιφάνειας του φλοιού και τέλος δ) άλλες δομές όπως η επιφάνεια του εξωδέρματος και κάποια μεσεγχυματικά στοιχεία που βρίσκονται μεταξύ τελεγκεφαλικού φλοιού και δέρματος και τα οποία θα μετατραπούν στις μήνιγγες που συναντάμε στο ενήλικο άτομο (Σχήμα 8). Κάθε οργανωτής παράγει και ένα αυξητικό παράγοντα ή μία οικογένεια αυξητικών παραγόντων. Έτσι η πρόσθια νευρική ακμή παράγει τον αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών Fgf8 (fibroblast growth factor 8), η επιφανειακή πλάκα παράγει τους μορφογενετικούς παράγοντες των οστών Bmps (bone morphogenic proteins) και το φλοιϊκό χείλος παράγει τους παράγοντες Wnts. 13

28 Εισαγωγή Οι παράγοντες αυτοί επιδρούν στον πληθυσμό αδιαφοροποίητων νευροβλαστικών κυττάρων που πολλαπλασιάζονται διαρκώς κατά μήκος της κοιλιακής επιφάνειας του τελεγκεφάλου σχηματίζοντας μία επιθηλιακή ζώνη που ονομάζεται κοιλιακή ζώνη (ventricular zone, VZ). Σχ.9. Οι «οργανωτές» του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου Επειδή από τα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης θα σχηματιστούν όλα τα είδη των νευρικών κυττάρων που απαντώνται στον ώριμο φλοιό (νευρώνες και γλοιοκύτταρα) είναι πολύ σημαντική η θέση αλλά και η χρονική στιγμή στην οποία τα διάφορα προγονικά κύτταρα εκτίθενται στους εκκρινόμενους παράγοντες των «οργανωτών» (Jessel and Sanes, 2000, Lee et al., 2000). 1.4.γ. Νευρογένεση και γλοιογένεση στο φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου Ο φλοιός αποτελεί την καλύτερα μελετημένη περιοχή του εγκεφάλου όσον αφορά τις αναπτυξιακές διαδικασίες. Από τα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης θα προκύψουν αρχικά οι νευρώνες (νευρογένεση) και στη συνέχεια τα γλοιοκύτταρα (γλοιογένεση), (Σχήμα 10, πάνω). Συγκεκριμένα, τα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης (VZ) πολλαπλασιάζονται διαρκώς και μετά από ένα αυστηρά καθορισμένο αριθμό μιτωτικών διαιρέσεων δίνουν γένεση σε νευρωνικά κύτταρα που δε θα πολλαπλασιαστούν ξανά (μεταμιτωτικοί νευρώνες). Οι πρώτοι μεταμιτωτικοί νευρώνες της κοιλιακής ζώνης μεταναστεύουν ραχιαία, στην επιφάνεια των τελεγκεφαλικών ημισφαιρίων σχηματίζοντας διαρκώς νέες δομές του αναπτυσσόμενου φλοιού. Παράλληλα με τη μετανάστευσή τους, τα κύτταρα αυτά 14

29 Εισαγωγή διαφοροποιούνται σταδιακά σε ώριμους νευρώνες. Η παραπάνω διαδικασία ονομάζεται νευρογένεση του φλοιού. Χρονικά η νευρογένεση ξεκινά πολύ νωρίς, στον φλοιό του αρουραίου από τη εμβρυϊκή ημέρα Ε12, κορυφώνεται κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε14-Ε16 και ο ρυθμός της μειώνεται αισθητά κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε18, προς το τέλος δηλαδή της εμβρυϊκής ζωής, οπότε και έχει δημιουργηθεί το μεγαλύτερο μέρος των νευρώνων του φλοιού (Caviness & Takahashi, 1995, Takahashi et al., 1996a,b). Η διαδικασία αυτή καλείται πρωτογενής νευρογένεση. Από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της κοιλιακής ζώνης όμως προκύπτει και μία δευτερογενής ζώνη προγονικών κυττάρων ραχιαία της κοιλιακής, η οποία ονομάζεται υποκοιλιακή ζώνη (subventricular zone, SVZ).H υποκοιλιακή ζώνη εμφανίζεται στους αρουραίους κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε14 και αποτελείται από αδιαφοροποίητα προγονικά κύτταρα που επίσης δίνουν γένεση σε νευρώνες. Η SVZ διατηρείται και μετά τη γέννηση του ζώου καθώς και στο ενήλικο άτομο και αποτελεί μία από τις δύο γνωστές περιοχές του εγκεφάλου όπου παράγονται νευρώνες καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του ατόμου. Η νευρογένεση που πραγματοποιείται μετά τη γέννηση και κατά το ενήλικο στάδιο καλείται δευτερογενής νευρογένεση και λαμβάνει χώρα κυρίως στο πρόσθιο μέρος της SVZ (anterior SVZ, asvz). Παράλληλα με τη δευτερογενή νευρογένεση, η SVZ έχει ένα επιπλέον ρόλο που σινίσταται στο να δώσει γένεση (κυρίως μεταγεννητικά) στον πληθυσμό των γλοιοκυττάρων του φλοιού. Συγκεκριμένα τα κύτταρα της SVZ κατά τις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες (Ε19 στον αρουραίο) αρχίζουν να παράγουν τα αστροκύτταρα του φλοιού. Η κορύφωση της δημιουργίας ώριμων αστροκυττάρων πραγματοποιείται κατά τη μεταγεννητική ημέρα Ρ0 έως Ρ2. Σε επόμενο στάδιο εμφανίζεται η δημιουργία ώριμων ολιγοδενδροκυττάρων, αφού αυτή κυριαρχεί στον πληθυσμό της SVZ πολύ αργότερα, κατά τη μεταγεννητική ημέρα Ρ14 (Parnavelas, 1999, Levison and Goldman, 1993, Zerlin et al., 1995). Η παραπάνω διαδικασία ονομάζεται γλοιογένεση του φλοιού. Έχει παρατηρηθεί ότι κύτταρα που προέρχονται από την ίδια περιοχή δίνουν γένεση πρώτα σε νευρώνες και μετά σε γλοιοκύτταρα (Σχήμα 10, Bertrand et al., 2002). Αυτό οφείλεται στο ότι με την πάροδο του χρόνου τα μοριακά σήματα που δέχονται τα κύτταρα των κοιλιακών περιοχών του τελεγκεφάλου αλλάζουν. Η αλλαγή αυτή στους εξωγενείς παράγοντες του φλοιού προκαλεί μία δεύτερη αλλαγή η οποία συνίσταται στην έκφραση συγκεκριμένων ενδογενών γονίδιων των πρόδρομων κυττάρων της κοιλιακής ζώνης (review: Bertrand et al., 2002) Καθώς λοιπόν η ανάπτυξη προχωρεί, τα πρόδρομα κύτταρα αλλάζουν «μοριακό χαρακτήρα», δεσμεύονται σταδιακά προς συγκεκριμένη γενεαλογία κυττάρων και αντιδρούν με διαφορετικό τρόπο σε εξωγενή ερεθίσματα (στα οποία δε 15

30 Εισαγωγή θα αντιδρούσαν ή θα αντιδρούσαν διαφορετικά κάποιες μέρες πριν) (Sauvageot & Stiles, 2002). Σχ.10. Οι διαδικασίες της νευρογένεσης και γλοιογένεσης στο φλοιό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης in vivo (πάνω) και σε in vitro σύστημα πρωτογενούς καλλιέργειας (κάτω) Έτσι οι μορφογενετικοί παράγοντες των οστών Bmp2 και Bmp4 επάγουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων της κοιλιακής και υποκοιλιακής ζώνης σε νευρώνες κατά τα αρχικά στάδια της νευρογένεσης (Li et al., 1998, Mabie et al., 1999), αλλά και σε αστροκύτταρα όταν εκκρίνονται στα πρώτα μεταγεννητικά στάδια (Gross and Mehler, 1996, Yanagisawa et al., 2001). Επομένως η ανταπόκριση των κυττάρων στους εξωγενείς αναπτυξιακούς παράγοντες εξαρτάται κάθε φορά από ενδογενείς παράγοντες η έκφραση των οποίων είναι αυστηρά καθορισμένη και αλλάζει με το χρόνο. 1.4.γ.Α) Ενδογενείς νευρογενετικοί παράγοντες του φλοιού Όσον αφορά τους ενδογενείς παράγοντες κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης σπουδαίο ρόλο παίζει ένας μικρός αριθμός μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας basic helix-loop-helix (bhlh) που κωδικοποιούνται από τα ονομαζόμενα «προνευρικά γονίδια» (proneural genes) επειδή η έκφρασή τους στα κύτταρα του εξωδέρματος στη Drosophila επάγει τη διαφοροποίησή τους σε νευρικά κύτταρα (Villares & Cabrera, 1987). Έχει βρεθεί ότι η έκφραση των «προνευρικών γονιδίων» είναι ικανή και αναγκαία συνθήκη για την έναρξη της διαφοροποίησης των κυττάρων της νευρωνικής γενεαλογίας (Bertrand et al., 2002), (Σχήμα 11). Έτσι, τα μοναδικά μέχρι τώρα γνωστά «προνευρικά γονίδια» που εκφράζονται στον τελεγκέφαλο των θηλαστικών, Ngn1 (Neurogenin 1), Ngn2 (Scardigli et al., 2001) και Mash1 (Fode et al., 2000) είναι υπεύθυνα για τη διαφοροποίηση των πρόδρομων νευρικών κυττάρων 16

31 Εισαγωγή σε συγκεκριμένους τύπους νευρώνων του τελεγκεφάλου. Θεωρείται ότι για τη νευρογένεση στο ραχιαίο μέρος του τελεγκεφάλου είναι απαραίτητη η έκφραση των γονιδίων Νgn1 και Ngn2 στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα, ενώ για τη νευρογένεση στο κοιλιακό μέρος του τελεγκεφάλου μόνο η έκφραση του Mash1. Ωστόσο, διαγονιδιακά ποντίκια που τους έλειπε το λειτουργικό γονίδιο Mash1 δεν εμφάνιζαν παντελή έλλειψη νευρογένεσης στο κοιλιακό τμήμα του τελεγκεφάλου, γεγονός που σημαίνει ότι εκτός από τα τρία προαναφερόμενα, εμπλέκονται κι άλλα γονίδια με νευρογενετική δράση στον τελεγκέφαλο των θηλαστικών. Σχ.11. Η δράση των «προνευρικών γονιδίων» κατά τη νευρογένεση και τη γλοιογένεση Η έκφραση των προνευρικών γονιδίων στο κύτταρο επάγει μία σειρά άλλων γεγονότων που οδηγούν στη νευρωνική διαφοροποίηση όπως η θετική ανάδρομη τροφοδότηση της έκφρασης του ίδιου του γονιδίου μέσα στο κύτταρο (Culi & Modolell, 1998), η επαγωγή της έκφρασης άλλων γονιδίων που επάγουν και συντηρούν το νευρωνικό φαινότυπο (Farah et al., 2000, Schwab et al., 2000, ), η καταστολή γονιδίων που επάγουν το γλοιϊκό φαινότυπο (Inoue et al. 2002, Vetter, 2001, Cai et al., 2000), η έξοδος των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο (Ohnuma et al., 2001), σε μερικές περιπτώσεις ο καθορισμός του είδους του νευρώνα που θα δημιουργηθεί από το πρόδρομο κύτταρο (Gowan et al., 2001) και τέλος η παρεμπόδιση της διαφοροποίησης των παρακείμενων κυττάρων μέσω της πρωτεΐνης Νοtch (Notch signaling) που αποτελεί και έναν από τους πιο χαρακτηριστικούς μηχανισμούς δράσης των «προνευρικών γονιδίων» (Σχήμα 11). 17

32 Εισαγωγή Συγκεκριμένα, τα «προνευρικά γονίδια» έχουν την ιδιότητα να επάγουν την έκφραση των πρωτεϊνών Delta και Serrate/Jagged της κυτταρικής μεμβράνης οι οποίες με τη σειρά τους αναγνωρίζουν ως υποδοχέα τους την πρωτεΐνη Νοtch της κυτταρικής μεμβράνης του διπλανού κυττάρου (Fehon et al., 1990, Lindsell et al., 1996). Η σύνδεση των Delta και Serrate/Jagged με την πρωτεΐνη Νοtch, ενεργοποιεί στο κύτταρο που εκφράζει την πρωτεΐνη Νοtch, την αναστολή της έκφρασης «προνευρικών γονιδίων». Ο μηχανισμός αυτός αποκαλείται «πλευρική παρεμπόδιση» (lateral inhibition) και έχει ως στόχο την ελεγχόμενη διαφοροποίηση των νευροβλαστικών κυττάρων, αποτρέποντας τη μαζική διαφοροποίησή τους (Bertrand et al., 2002). 1.4.γ.B) Ενδογενείς γλοιογενετικοί παράγοντες του φλοιού Όσον αφορά τη διαδικασία της γλοιογένεσης, αυτή πρέπει να διαχωριστεί στη διαδικασία δημιουργίας αστροκυττάρων και στη διαδικασία δημιουργίας ολιγοδενδροκυττάρων. Όσον αφορά τη διαδικασία δημιουργίας ώριμων αστροκυττάρων δεν έχουν βρεθεί μεταγραφικοί παράγοντες που να προάγουν τη γλοιογένεση ανάλογοι με τους bhlh παράγοντες που επάγουν τη νευρογένεση. Ωστόσο η παρουσία των παραγόντων bhlh φαίνεται να είναι καθοριστική για τη διαφοροποίηση των πρόδρομων νευρικών κυττάρων σε αστροκύτταρα. Έτσι, σε διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία λείπει το γονίδιο Ngn2 ή το γονίδιο Mash1 παρατηρείται, εκτός της μειωμένης νευρογένεσης, και μεγάλη αύξηση του αριθμού των αστροκυττάρων στο φλοιό του τελεγκεφάλου (Νieto et al ). Εξωγενείς παράγοντες που επάγουν την αστρογένεση όπως ο νευροτροφικός παράγοντας CNTF (ciliary neurotrophic factor) προκαλούν τη φωσφορυλίωση των μεταγραφικών παραγόντων STAT οι οποίοι δημιουργούν σύμπλοκα με τον μεταγραφικό συμπαράγοντα πρόσδεσης του CREB (CREB binding protein) CBP/p300 οπότε και ενεργοποιούν τη μεταγραφή γονιδίων που είναι χαρακτηριστικά των αστροκυττάρων (Νakashima et al., 1999a,b, Yanagisawa et al., 1999).Eπειδή η πρωτεΐνη Ngn1 πρέπει να προσδεθεί κι αυτή στον παράγοντα CBP/p300 για να δράσει, ανταγωνίζεται τον παράγοντα STAT (Sun et al., 2001).Έτσι, τα ενδοκυττάρια επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Ngn1 τα οποία αλλάζουν με τη πάροδο της ανάπτυξης του φλοιού, φαίνεται να παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην επιλογή της μοίρας του πρόδρομου κυττάρου. Με τον ίδιο τρόπο οι παράγοντες ΒΜΡ φωσφορυλιώνουν με τη σειρά τους μεταγραφικούς παράγοντες Smad που κάνουν κι αυτοί σύμπλοκα με τον παράγοντα CBP/p300 αλλά σε διαφορετική θέση από αυτή του STAT (Miyazono et al., 2000). Ανάλογα με το ποιες πρωτεΐνες είναι προσκολλημένες στο άλλο άκρο πρόσδεσης της CBP/p300 (η Ngn1 ή η STAT) 18

33 Εισαγωγή ενεργοποιούνται και διαφορετικά γονίδια. Έτσι εξηγείται το γεγονός ότι στην αρχή της ανάπτυξης του φλοιού, που τα επίπεδα της Ngn1 είναι υψηλά, οι παράγοντες ΒΜΡ προάγουν τη νευρογένεση ενώ λίγο πριν τη γέννηση, όπου τα επίπεδα της Ngn1 έχουν πέσει δραματικά, οι ίδιοι παράγοντες οδηγούν τα κύτταρα σε φαινότυπο αστροκυττάρων (Nakashima et al., 1999a,b). Τη γένεση αστροκυττάρων ακολουθεί όπως είδαμε η γένεση των ολιγοδενδροκυττάρων. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι γενεαλογικά τα προγονικά κύτταρα των ολιγοδενδροκυττάρων είναι πιο κοντά στα προγονικά κύτταρα των νευρώνων παρά σε αυτά των αστροκυττάρων (Tominaga et al., 2005, Parras et al., 2004). Η άποψη αυτή διαμορφώνεται από το γεγονός ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες Olig1 και Olig2 που προάγουν τη νευρογένεση κατά τη μέση εμβρυϊκή περίοδο, σε μεταγεννητικές ηλικίες είναι ικανοί και αναγκαίοι παράγοντες για τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων των ολιγοδενδροκυττάρων σε ώριμα ολιγοδενδροκύτταρα (Lu et al., 2001, Zhou et al, 2001).Κανένας δε από τους δύο παράγοντες δεν απαιτείται για την ωρίμανση των αστροκυττάρων (Lu et al., 2002, Zhou et al, 2002).H ικανότητα των παραγόντων Olig1 και Olig2 να προάγουν διαφορετική κυτταρική μοίρα ανάλογα με τη χρονική στιγμή της ανάπτυξης οφείλεται και πάλι στο συνδυασμό τους με τα επίπεδα έκφρασης άλλων ενδογενών παραγόντων στα κύτταρα που τους εκφράζουν. Τέλος εξωγενείς παράγοντες, όπως ο παράγοντας Shh (Sonic hedgehog), προκαλoύν έκφραση των πρωτεϊνων NG2 και O4 σε καλλιέργειες κυττάρων της κοιλιακής ζώνης. Οι πρωτεΐνες αυτές αποτελούν μάρτυρες των πρώτων σταδίων διαφοροποίησης των ολιγοδενδροκυττάρων και ως εκ τούτου η παρουσία του Shh θεωρείται καθοριστική για τη διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων του φλοιού σε ολιγοδενδροκύτταρα (Kondo et al., 2000, Qian et al., 2000). 1.4.δ. Ο μηχανισμός της νευρογένεσης στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου (μηχανισμός «inside-out») Ο φλοιός του εγκεφάλου αποτελεί μία εξαιρετικά πολύπλοκη κυτταρική δομή η οποία συγκροτείται από έξι διακριτές στιβάδες νευρώνων. Οι νευρώνες αυτοί περιβάλλονται από γλοιοκύτταρα και ανάλογα με τη στιβάδα στην οποία βρίσκονται δημιουργούν μέσω των συνάψεών τους διαφορετικά νευρωνικά δίκτυα με άλλες περιοχές του εγκεφάλου. Η δημιουργία της πολύπλοκης αυτής δομής οφείλεται στη διαδοχική έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο των προγονικών νευρωνικών κυττάρων της κοιλιακής ζώνης του φλοιού και στην ακτινωτή μετανάστευσή τους σε ανώτερες στιβάδες του φλοιού κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης, με βάση ένα μηχανισμό που, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, αποκαλείται μηχανισμός «inside-out». Σύμφωνα 19

34 Εισαγωγή με το μηχανισμό αυτό, μεταμιτωτικά κύτταρα που παράγονται νωρίς κατά τη νευρογένεση καταλαμβάνουν τις κατώτερες στιβάδες του φλοιού ενώ μεταμιτωτικά κύτταρα που παράγονται αργότερα από την κοιλιακή ζώνη καταλαμβάνουν τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (Aboitiz et al., 2001, Rakic, 1974), (Σχήμα 12). Ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει έναν αριθμό αυστηρά καθορισμένων σταδίων. Αρχικά, τα πρώτα μεταμιτωτικά κύτταρα της κοιλιακής ζώνης που θα γίνουν νευρώνες μεταναστεύουν ραχιαία, στην επιφάνεια των τελεγκεφαλικών ημισφαιρίων σχηματίζοντας μία πρώτη παροδική δομή του αναπτυσσόμενου φλοιού που ονομάζεται πρωτογενής φλοιϊκή πλάκα (pre-plate, PP). Η δομή αυτή διαχωρίζεται πολύ γρήγορα σε δύο νέες στιβάδες και συγκεκριμένα στη στιβάδα Ι (ή marginal zone, MZ) και μια δεύτερη παροδική δομή, την υποφλοιϊκή πλάκα (subplate, SP), (Rice & Curran, 2001). Η στιβάδα Ι αποτελείται από ειδικούς διάμεσους νευρώνες που αποκαλούνται κύτταρα Cajal-Retzius, είναι η μόνη στιβάδα που δεν υπακούει στον μηχανισμό «inside-out» αλλά είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για τη διαδικασία που θα ακολουθήσει. Τα κύτταρα Cajal-Retzius εκφράζουν το γονίδιο Emx2 (Μallamaci et al., 2000a,b) το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί την παραγωγή μιας εξωκυττάριας γλυκοπρωτεΐνης, της Reelin (Ogawa et al., 1995). Παραγόμενα από τα κύτταρα Cajal-Retzius, τα μόρια της Reelin συσσωρεύονται στη στιβάδα Ι και κάνουν σύμπλοκα μεταξύ τους δημιουργώντας ένα πλέγμα που λειτουργεί ως εμπόδιο για τη περαιτέρω μετανάστευση του επόμενου κύματος κυττάρων που θα φτάσουν εδώ από την κοιλιακή ζώνη (Curran & D Arcangelo, 1998). Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι ο μοριακός μηχανισμός στον οποίο οφείλεται η δημιουργία αυτών των εξειδικευμένων κυττάρων της στιβάδας Ι από τα αδιαφοροποίητα κύτταρα της VZ είναι η καταστολή του μεταγραφικού παράγοντα Foxg1 (πρώην Bf-1), (Hanashima et al., 2004). Δηλαδή, ενώ ο παράγοντας Foxg1 εκφράζεται από τα περισσότερα προγονικά κύτταρα του τελεγκεφάλου στο στάδιο αυτό της ανάπτυξης, καταστέλλεται στα προγονικά νευρωνικά κύτταρα που θα δώσουν γένεση στα κύτταρα Cajal-Retzius της στιβάδας Ι (Hanashima et al., 2004). Ένας δεύτερος παράγοντας που συμμετέχει στον καθορισμό της μοίρας των κυττάρων της VZ σε κύτταρα Cajal-Retzius αλλά και σε νευρώνες της δομής SP, είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Tbr1, του οποίου ο ρόλος δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως (Hevner et al., 2001). Μετά τη δημιουργία της στιβάδας Ι που αποτελείται όπως είδαμε από διάμεσους νευρώνες, η κοιλιακή ζώνη παράγει από τη στιγμή αυτή και μετά μόνο νευρώνες προβολής. Αυτό συμβαίνει γιατί σχεδόν όλοι οι διάμεσοι νευρώνες του φλοιού προέρχονται από το γαγγλιωνικό έπαρμα που βρίσκεται στη κοιλιακή περιοχή του τελεγκεφάλου, (η διαδικασία αυτή θα αναλυθεί στην παράγραφο «Μηχανισμοί 20

35 Εισαγωγή μετανάστευσης στο φλοιό»). Οι πρώτοι νευρώνες προβολής που εμφανίζονται στον φλοιό είναι οι νευρώνες των στιβάδων V και VI. Μελέτες δείχνουν ότι τα κύτταρα της VZ εξειδικεύονται σε κύτταρα των κατώτερων αυτών στιβάδων χάρη στην επαγωγή των γονιδίων Ngn1 και Ngn2 στα πρώτα στάδια της νευρογένεσης (Fode et al., 2000). Αποσιώπηση της έκφρασης ενός από τα δύο γονίδια κατά τα αρχικά νευρογενετκά στάδια προκαλεί μείωση των νευρώνων των κατώτερων στιβάδων και εμφάνιση πολύ μεγαλύτερου αριθμού ενδιάμεσων νευρώνων στο φλοιό πράγμα που σημαίνει ότι τα γονίδια Ngn1 και Ngn2 ευνοούν την ανάπτυξη των κατώτερων στιβάδων του φλοιού εις βάρος της νευρογένεσης του γαγγλιωνικού επάρματος (Fode et al., 2000). Είναι αξιοσημείωτο ότι αποσιώπηση της έκφρασης των γονιδίων Ngn1 και Ngn2 σε μετέπειτα νευρογενετκά στάδια δεν επηρεάζει τη δημιουργία των κατώτερων στιβάδων (Schuurmans et al., 2004). Επιπλέον για τη σωστή δομή των στιβάδων V και VI είναι απαραίτητη και η έκφραση των γονιδίων Tbr1 και Foxg1 που αναφέραμε παραπάνω. Σχ.12. Ο μηχανισμός νευρογένεσης «inside-out» στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου Ωστόσο, όπως και στην περίπτωση των γονιδίων Ngn1 και Ngn2, η έκφραση των Tbr1 και Foxg1 ρυθμίζεται χρονικά και είναι απαραίτητη μόνο στα αρχικά στάδια της νευρογένεσης (Campbell, 2005, Henver et al., 2001). 21

36 Εισαγωγή Αφού ολοκληρωθεί η δημιουργία των κατώτερων στιβάδων, ακολουθεί η γένεση και μετανάστευση των νευρώνων προβολής των ανώτερων στιβάδων (II, III και IV). Κατά την περίοδο αυτή της νευρογένεσης τα κύτταρα της VZ δημιουργούν όπως έχουμε ήδη αναφέρει μία δεύτερη ζώνη πολλαπλασιασμού ακριβώς πάνω από τη VZ η οποία ονομάζεται SVZ. Για τη δημιουργία των ανώτερων στιβάδων του φλοιού συμμετέχουν τώρα πια όχι μόνο τα κύτταρα της VZ αλλά και τα κύτταρα της SVZ (Tarabykin et al., 2001). Για τη δημιουργία της SVZ είναι απαραίτητη η ταυτόχρονη έκφραση δύο άλλων μεταγραφικών παραγόντων, του Pax6 και του Tlx1 (Tarabykin et al., 2001, Land and Monaghan, 2003, Schuurmans et al., 2004). Η απουσία αυτών των δύο γονιδίων οδηγεί σε μορφολογικές αλλαγές της SVZ και σε εξαφάνιση των ανώτερων στιβάδων του φλοιού. Από πρόσφατες μελέτες φαίνεται ότι οι δύο αυτοί παράγοντες αν και εκφράζονται σε όλα τα προγονικά κύτταρα της VZ και SVZ, είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων, όπως τα γονίδια Svet1 (Tarabykin et al., 2001), Cux2 (Nieto et al., 2004) και Satb2 (Britanova et al., 2005) τα οποία τελικά θα δώσουν στα κύτταρα της SVZ τη ταυτότητά τους. Με την έκφραση των παραπάνω γονιδίων τα κύτταρα της SVZ διαφοροποιούνται από αυτά της παρακείμενης VZ και δεχόμενα σήματα από το περιβάλλον του φλοιού (όπως είναι οι παράγοντες Wnts Fgf2 και Shh), (Viti et al., 2003) διαφοροποιούνται σε νευρώνες των ανώτερων στιβάδων του φλοιού ή, αργότερα κατά την ανάπτυξη, σε γλοιοκύτταρα (Noctor et al., 2004). Από τη περιγραφή του παραπάνω μηχανισμού νευρογένεσης διαφαίνεται ότι τα στάδια-κλειδιά στη ζωή ενός προγονικού κυττάρου της VZ μέχρι να πάρει την τελική και λειτουργική του θέση μέσα στον φλοιό του εγκεφάλου είναι α) ο πολλαπλασιασμός του στη ζώνη πολλαπλασιασμού και η έξοδος του σε κάποια χρονική στιγμή από τον κυτταρικό κύκλο, β) η μετανάστευσή του στην κατάλληλη θέση μέσα στο φλοιό, γ) η διαφοροποίησή του προς νευρωνικό φαινότυπο και η δημιουργία λειτουργικών συνάψεων με άλλους νευρώνες. 1.4.δ.Α) Πολλαπλασιασμός και έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο. Διάφορα δεδομένα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η μετάβαση των προγονικών κυττάρων από ένα αρχικό αδιαφοροποίητο στάδιο προς το στάδιο των διαφοροποιημένων νευρώνων είναι στενά συνδεδεμένη με την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο (Shu et al., 2006, Siegenthaler & Miller, 2005, Masai et al., 2005, Vernon et al., 2003, Cunningham et al., 2002). Ο κυτταρικός κύκλος χωρίζεται σε τέσσερις φάσεις, τη φάση G1, τη φάση S τη G2 και τέλος τη φάση της μίτωσης ή φάση Μ (Σχήμα 13), (Moorhead and Hsu, 1956, De Maertelaer & Galand, 1977). Η διάρκεια των φάσεων του κυτταρικού κύκλου 22

37 Εισαγωγή ποικίλει ανάλογα με το είδος του κυττάρου, πάντως η φάση G1 είναι γενικά η μεγαλύτερη σε διάρκεια φάση του κυτταρικού κύκλου, κατά την οποία το κύτταρο επιτελεί κανονικά τις μεταβολικές του λειτουργίες γι αυτό το λόγο σ αυτήν απαντάται η πλειοψηφία των κυττάρων (διαφοροποιημένων και μη) (Abraham et al., 1980, Hanks & Rao, 1980). Αν το κύτταρο πρόκειται να διαιρεθεί τότε υπάρχει ένα σημείο ελέγχου στη φάση G1 το οποίο αν ξεπεραστεί τότε το κύτταρο περνά στην επόμενη φάση του κυτταρικού κύκλου και υποχρεούται να περάσει όλα τα υπόλοιπα στάδια (γι αυτό και το σημείο αυτό ελέγχου ονομάζεται και «σημείο χωρίς επιστροφή» (Abraham et al., 1980). Ακολουθεί η συνθετική φάση S στην οποία πραγματοποιείται ο διπλασιασμός του DNA και ο μεταβολισμός αυξάνεται προκειμένου να συντεθούν όλα τα απαραίτητα μόρια (πρωτεΐνες, λιπίδια κτλ.) που θα εξυπηρετήσουν τη διαδικασία της μίτωσης. Ακολουθεί μία μικρή σε διάρκεια φάση, η φάση G2 όπου η προετοιμασία του κυττάρου ολοκληρώνεται και τέλος η μίτωση (φάση Μ) η οποία θα οδηγήσει στη δημιουργία δύο νέων θυγατρικών κυττάρων. Τα νέα αυτά κύτταρα έχουν την επιλογή ή να μπουν σε ένα καινούργιο κυτταρικό κύκλο ή να μη διαιρεθούν ξανά αλλά να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να παραμείνουν στη φάση G1 που τότε αποκαλείται φάση G0. Η διαδικασία αυτή ελέγχεται κυρίως από μία οικογένεια κινασών σερίνης/θρεονίνης που ονομάζονται CDKs (Cyclin-dependent Kinases) για τη δράση των οποίων είναι απαραίτητη η σύνδεσή τους με άλλες ειδικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες, τις κυκλίνες (cyclins), (Nurse, 2002, Sherr & Roberts, 2004). Το σύμπλοκο κυκλίνης-cdk είναι υπεύθυνο για τη φωσφορυλίωση άλλων υποστρωμάτων που συμμετέχουν σε στάδια-κλειδιά της διαδικασίας της κυτταρικής διαίρεσης. Σχ.13. O κυτταρικός κύκλος και η περιοδική έκφραση των κυκλινών 23

38 Εισαγωγή Η έκφραση των CDKs παραμένει σχετικά σταθερή καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου αντίθετα η έκφραση των διαφόρων κυκλινών περιορίζεται σε συγκεκριμένες φάσεις του, ούτως ώστε ο σχηματισμός του εκάστοτε συμπλόκου κυκλίνης-cdk να είναι συνάρτηση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (Nurse, 2002, Sherr & Roberts, 2004). Έτσι, η παρουσία της κυκλίνης Ε σηματοδοτεί την έναρξη και διατήρηση της φάσης αντιγραφής του DNA (φάση S), ενώ η παρουσία της κυκλίνης Β1 τη μετάβαση του κυττάρου από τη φάση G2 στη φάση της μίτωσης (φάση Μ), (Σχήμα 13). Στην αρχή της νευρογένεσης επικρατούν οι συμμετρικές κυτταρικές διαιρέσεις κατά τις οποίες από ένα μητρικό κύτταρο προκύπτουν δύο πανομοιότυπα θυγατρικά κύτταρα, κάτι που επιτρέπει την εκθετική αύξηση του αριθμού των προγονικών κυττάρων και την αύξηση του μεγέθους του φλοιού. Καθώς προχωρά η ανάπτυξη, έχουμε όπως είδαμε την εμφάνιση ασύμμετρων διαιρέσεων κατά τις οποίες δημιουργείται ένα κύτταρο που θα ξαναμπεί στον κυτταρικό κύκλο και θα επαναδιαιρεθεί και ένα μεταμιτωτικό κύτταρο που θα διαφοροποιηθεί σε νευρικό κύτταρο. Η παραπάνω διαδικασία ασύμμετρων διαιρέσεων κατά την ανάπτυξη του φλοιού επιτρέπει τη δημιουργία διαφοροποιημένων κυττάρων ενώ συγχρόνως διατηρείται ένας πληθυσμός προγονικών κυττάρων ο οποίος συμβάλλει στην περαιτέρω ανάπτυξη του μεγέθους του φλοιού. Η μετάβαση από το συμμετρικό προς τον ασύμμετρο τρόπο διαίρεσης θεωρείται ότι σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης (Noctor et al., 2004, Miyata et al., 2004, Cayouette & Raff, 2003, Chen and McConnell, 1995, Caviness & Takahashi, 1995). Στο τέλος του προηγούμενου κιόλας αιώνα είχε παρατηρηθεί ότι πολλά από τα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης προέβαλαν μία κυτταροπλασματική προεκβολή ινιδιακής μορφής προς την επιφάνεια του κυτταρικού φλοιού (Golgi, 1886). Τα κύτταρα αυτά χάρη στην ακτινωτή δομή που σχημάτιζαν στον αναπτυσσόμενο φλοιό αλλά και λόγω του ότι στον άνθρωπο και στον πίθηκο εκφράζουν την πρωτεΐνη GFAP (glial fibrilary acidic protein) που είναι μάρτυρας των ώριμων αστροκυττάρων, ονομάστηκαν από τον Rakic «ακτινωτή γλοία» (Rakic, 1971, 1972). Όπως αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο 1.4.ε, μέχρι πρόσφατα επικρατούσε η άποψη ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι νευρογλοιακά κύτταρα που χρησιμεύουν σαν ικρίωμα πάνω στο οποίο μεταναστεύουν οι μεταμιτωτικοί νευρώνες (Levitt et al., 1983, Voigt, 1989). Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι προγονικά κύτταρα που δίνουν γένεση σε νευρώνες (Malatesta et al., 2000a; Hartfuss et al. 2001; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001). 24

39 Εισαγωγή Είναι χαρακτηριστικό το γεγονός ότι κατά τη νευρογένεση τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας διαιρούνται πάντα ασύμμετρα υπό την έννοια της δημιουργίας δύο διαφορετικών μορφολογικά κυττάρων εκ των οποίων το ένα θα κληρονομήσει την κυτταροπλασματική προεκβολή ενώ το άλλο όχι (Σχήμα 13A, Β). Ωστόσο παρόμοιες κυτταροπλασματικές προεκβολές δεν έχουν μόνο τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» αλλά και άλλα νευροεπιθηλακά κύτταρα της VΖ που δεν έχουν αστρογλοιακά χαρακτηριστικά. Εκτός από τα διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά των θυγατρικών κυττάρων, οι ασύμμετρες διαιρέσεις στη κοιλιακή ζώνη χαρακτηρίζονται από το ότι α) πραγματοποιούνται από κύτταρα της VZ στα οποία υπάρχει ασύμμετρη ενδοκυττάρια κατανομή κάποιου παράγοντα (όπως συμβαίνει με τον παράγοντα Numb) με αποτελέσμα αυτός να κληρονομηθεί μόνο σε ένα από τα δύο θυγατρικά κύτταρα (Fishell & Kriegstein, 2003), (Σχήμα 14Γ) και από το ότι β) έχουν τον άξονά της μιτωτικής τους ατράκτου παράλληλα προς την επιφάνεια της πλευρικής κοιλίας (σχήμα 14A). Ανεξάρτητα όμως με τα κριτήρια που επιλέγονται κάθε φορά για τον καθορισμό των ασύμμετρων διαιρέσεων το αποτέλεσμα μιας τέτοιας διαίρεσης είναι πάντα η δημιουργία δύο κυττάρων με διαφορετική αναπτυξιακή μοίρα:το ένα κύτταρο θα είναι μεταμιτωτικό και το άλλο θα συνεχίσει να πολλαπλασιάζεται. Σχ.14. Συμμετρικές και ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις στη κοιλιακή ζώνη (VZ) Στο τέλος της νευρογένεσης ένας μεγάλος αριθμός προγονικών κυττάρων της SVZ αυτή τη φορά διαιρείται πάλι συμμετρικά για να δώσει όμως αυτή τη φορά γένεση σε δύο μεταμιτωτικούς θυγατρικούς νευρώνες (Qian et al., 2000). Κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης του φλοιού δηλαδή, παρατηρούμε το εξής φαινόμενο: Αρχικά οι διαιρέσεις στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο είναι μόνο συμμετρικές και δίνουν γένεση σε δύο αδιαφοροποίητα κύτταρα που θα συνεχίζουν να διαιρούνται. Μόλις δημιουργηθεί η κοιλιακή ζώνη του τελεγκεφάλου οι διαιρέσεις αρχίζουν και 25

40 Εισαγωγή γίνονται ασύμμετρες οπότε εμφανίζονται οι πρώτοι νευρώνες. Καθώς προχωρά η νευρογένεση υπερισχύουν οι ασύμμετρες διαιρέσεις μέχρι την εμφάνιση της υποκοιλιακής ζώνης οπότε αρχίζουν και πάλι να επικρατούν οι συμμετρικές διαιρέσεις όπου αυτή τη φορά δίνουν γένεση σε δύο μεταμιτωτικά κύτταρα. (Fishell & Kriegstein, 2003). Είναι χαρακτηριστικό το γεγονός ότι στους νευρώνες η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο αποτελεί μη αντιστρεπτή διαδικασία. Αφ ης στιγμής δηλαδή, ένα προγονικό κύτταρο στρατευμένο στη γενεαλογία των νευρώνων βγει από τον κυτταρικό κύκλο, δεν ξαναμπαίνει. Γενετικές μελέτες στη Drosophila οδήγησαν στην ταυτοποίηση ενός αριθμού γονιδίων που συνδέονται με τις ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις. Τέτοια γονίδια είναι το Glialcells-missing, το Prospero, το Numb, το Miranda (συνοδός του Numb), το Inscutable και το Notch, (Rhyu et al., 1994, Frise et al., 1996, Dye et al., 1998, Jones et al., 1995, Li et al., 1997, Shen et al., 1997,1998). Παρότι έχουν βρεθεί πρόσφατα ομόλογα αυτών των γονιδίων στα θηλαστικά, είναι ξεκάθαρο ότι η λειτουργία τους δεν είναι απαραίτητα συντηρημένη μεταξύ των διαφόρων ειδών. Έτσι, μελέτες δείχνουν ότι το Numb σχετίζεται στα θηλαστικά, σε αντίθεση με τη Drosophila, με τις ασύμμετρες διαιρέσεις και μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που καθορίζουν τη μοίρα των ασύμμετρα διαιρούμενων κυττάρων (Zhong et al., 1996,1997, Cayouette et al., 2001, Cayoutte and Raff, 2002, Shen et al., 2002). To γονίδιο PC3/Tis21 είναι επίσης μάρτυρας νευροεπιθηλιακών κυττάρων τα οποία βρίσκονται στη διαδικασία της μετάβασης από μία συμμετρική/πολλαπλασιαστική διαίρεση σε μία ασύμμετρη/νευρογενετική διαίρεση και η υπερέκφρασή του επάγει την ασύμμετρη διαίρεση στα προγονικά κύτταρα του φλοιού in vitro (Malatesta et al., 2000a,b). Μορφογενετικά γονίδια επίσης επηρεάζουν τον τρόπο διαίρεσης των προγονικών κυττάρων του φλοιού. Έτσι, έχει δειχθεί ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες Bf-1 και Emx2 ενισχύουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και υποκινούν τα πρόδρομα κύτταρα σε συμμετρικές κυτταρικές διαιρέσεις (Dou et al., 1999; Heins et al., 2001). Αντίστροφα, το γονίδιο Pax6, που μαζί με το Emx2 είναι, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, από τους πιο πρώιμους μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στον καθορισμό του ραχιαίου τελεγκεφάλου, υποκινεί τη νευρογένεση στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό (Heins et al., 2001, 2002). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι τα γονίδια PC3/Tis21, Emx2 και Pax6, επηρεάζουν όχι μόνο τον κυτταρικό κύκλο αλλά και τη νευρογένεση, και την αναλογία μεταξύ των συμμετρικά και ασύμμετρα διαιρούμενων κυττάρων. Παρόλ αυτά, ο μοριακός μηχανισμός που συνδέει τον κυτταρικό κύκλο με το είδος της κυτταρικής διαίρεσης και της νευρωνικής διαφοροποίησης παραμένει αδιευκρίνιστος. 26

41 Εισαγωγή 1.4.δ.Β) Μετανάστευση σε καθορισμένες θέσεις του εγκεφαλικού φλοιού. Μετά την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο τα προγονικά κύτταρα της VZ και SVZ μεταναστεύουν στις στιβάδες του φλοιού όπου και θα λάβουν τις τελικές τους θέσεις. Στη κοιλιακή ζώνη του φλοιού δημιουργούνται όπως είδαμε όλα τα είδη νευρώνων του φλοιού. Οι δύο κύριες κατηγορίες νευρώνων του φλοιού είναι: α) οι πυραμιδικοί νευρώνες που συνιστούν τον πληθυσμό των νευρώνων προβολής του φλοιού και οι οποίοι εκφράζουν το νευροδιαβιβαστή γλουταμινικό οξύ και β) οι διάμεσοι νευρώνες οι οποίοι εκφράζουν το νευροδιαβιβαστή GABA (Miller et al. 1985, Peduzzi, 1988). Σχ.15. Η ακτινωτή και η επιφανειακή μετανάστευση στον φλοιό του τελεγκεφάλου Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ενώ οι πυραμιδικοί νευρώνες του φλοιού παράγονται στο ραχιαίο τμήμα του τελεγκεφάλου, (Chan et al., 2001) σχεδόν όλοι οι διάμεσοι νευρώνες δεν παράγονται στο ραχιαίο αλλά στο κοιλιακό τμήμα του τελεγκεφάλου (Anderson et al., 1997, Lavdas et al., 1999), (Σχήμα 15). Το κοιλιακό αυτό τμήμα του τελεγκεφάλου αποκαλείται, όπως είδαμε σε προηγούμενη παράγραφο, γαγγλιωνικό έπαρμα (GE). Έτσι, οι πυραμιδικοί νευρώνες αρκεί να μεταναστεύσουν ακτινωτά προς τη ραχιαία επιφάνεια του φλοιού για να βρουν τη τελική τους θέση (ακτινωτή μετανάστευση radial migration ), ενώ αντίθετα οι διάμεσοι νευρώνες πρέπει να μεταναστεύσουν οριζόντια, με τροχιά παράλληλη προς τη ραχιαία επιφάνεια του φλοιού και να διανύσουν μία πολύ μεγαλύτερη απόσταση από αυτή που θα διανύσουν οι πυραμιδικοί νευρώνες, προκειμένου να εγκατασταθούν σε συγκεκριμένες στιβάδες του φλοιού (επιφανειακή μετανάστευση tangential migration), (Σχήμα 15). 27

42 Εισαγωγή Λόγω της άνισης απόστασης που έχουν να διανύσουν τα δύο αυτά είδη νευρώνων αναπτύσσουν κατά τη μετανάστευσή τους και διαφορετικές ταχύτητες. Έτσι, οι νευρώνες που μεταναστεύουν επιφανειακά κινούνται πιο γρήγορα (50μm/h), (Polleux et al., 2002, O Rourke et al., 1992) ενώ οι νευρώνες που μεταναστεύουν ακτινωτά είναι πιο αργοί (10μm/h), (Takahashi et al., 1996a,b). Ειδικότερα, οι διάμεσοι νευρώνες του φλοιού παράγονται κυρίως στο μέσο γαγγλιωνικό έπαρμα (ΜGE) και δευτερευόντως στο πλευρικό και ουραίο γαγγλιωνικό έπαρμα (LGE και CGE αντίστοιχα). Η έκφραση διαφόρων γονιδίων στα αδιαφοροποίητα κύτταρα της ΜGE όπως το Lhx6 καθορίζει τη μετανάστευση των κυττάρων προς το φλοιό (Αlifragis et al., 2004). Ωστόσο η διαδρομή που ακολουθούν τα κύτταρα της ΜGE προς τον φλοιό αλλάζει κατά την ανάπτυξη (Anderson et al., 2001, Ang et al., 2003). Έτσι, τα πρώτα κύτταρα που φεύγουν από την ΜGE κατευθύνονται προς το φλοιό μέσω της διάμεσης ζώνης (intermediate zone, IZ), (ζώνη που παρεμβάλλεται μεταξύ των ζωνών CP και VZ/SVZ του φλοιού), αλλά και της ζώνης ΜΖ. Όταν φτάσουν στο κατάλληλο σημείο του φλοιού αλλάζουν πορεία και μεταναστεύουν ακτινωτά μέχρι να βρουν τη τελική τους θέση μέσα στον φλοιό (Jimenez et al. 2002, Nadarajah et al., 2002). Τα κύτταρα που παράγονται αργότερα μεταναστεύουν στο φλοιό μέσω των ζωνών VZ και SVZ ενώ μερικά από αυτά τα κύτταρα παρατηρήθηκε ότι κατευθύνονται προς την επιφάνεια της πλευρικής κοιλίας και στη συνέχεια καταλήγουν στη τελική τους θέση μέσω ακτινωτής μετανάστευσης (Nadarajah, 2002), (Σχήμα 14). Όσον αφορά την ακτινωτή μετανάστευση, αυτή διακρίνεται σε δύο διαφορετικά είδη: την ακτινωτή μετατόπιση (radial translocation) και την ακτινωτή μετακίνηση (radial locomotion). Με ακτινωτή μετατόπιση μεταναστεύουν τα κύτταρα που διαθέτουν μία πολύ μακριά ακτινωτή κυτταροπλασματική προεκβολή που τα συνδέει με τη χοριοειδή μήνιγγα (Nadarajah et al., 2001, Morest, 1970 ) όπως είναι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Κατά τη μετανάστευση αυτή, το κύτταρο χάνει τη σύνδεσή του με την πλευρική κοιλία και μετατοπίζει το σώμα του προς τα πάνω, κρατώντας σταθερή τη σύνδεσή του με τη χοριοειδή μήνιγγα, έως ότου βρεθεί στην κατάλληλη θέση μέσα στο φλοιό. Αντίθετα, τα κύτταρα που πραγματοποιούν ακτινωτή μετακίνηση, δε διαθέτουν τόσο μακριά κυτταροπλασματική προεκβολή και κινούνται ελεύθερα πάνω στις ακτινωτές προεκβολές των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» του φλοιού διατηρώντας σταθερό το μήκος τους. Επιπλέον, τα κύτταρα που μεταναστεύουν με ακτινωτή μετακίνηση μετακινούνται πιο γρήγορα από αυτά που μεταναστεύουν με ακτινωτή μετατόπιση, ενώ δίνουν την εντύπωση ότι μετακινούνται με άλματα (αλματώδης μετανάστευση, saltarory migration), (Noctor, 2004, Hatten, 1999, Rakic, 1972). Κατά τα πρώτα στάδια της νευρογένεσης επικρατεί η ακτινωτή 28

43 Εισαγωγή μετατόπιση ενώ προς το τέλος της νευρογένεσης, όπου ο φλοιός έχει μεγαλώσει και η απόσταση πλευρικής κοιλίας χοριοειδούς μήνιγγας είναι πολύ μεγάλη, επικρατεί η ακτινωτή μετακίνηση (Nadarajah & Parnavelas, 2002, Nadarajah et al., 2003). Στην περίπτωση της ακτινωτής μετακίνησης έχει παρατηρηθεί με πειράματα time-lapse το φαινόμενο οι νευρώνες που μεταναστεύουν να κάνουν ενίοτε μία στάση 24 ωρών στην SVZ, κατόπιν να κατεβαίνουν ξανά προς τη VZ ( όπως συμβαίνει και στα τελευταία στάδια της επιφανειακής μετανάστευσης) και μετά, αφού πιθανόν πάρουν κάποιο ειδικό σήμα από τη ζώνη αυτή, να μεταναστεύουν κανονικά στη τελική τους θέση στο φλοιό (Noctor et al., 2004). Πιθανολογείται ότι αυτή η στάση των 24 ωρών στην SVZ εξυπηρετεί στο να καθυστερήσει τη μετανάστευση των πυραμιδικών νευρώνων προκειμένου να τους φτάσουν οι διάμεσοι νευρώνες που έρχονται από τη GE και να εγκατασταθούν συγχρονισμένα στις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (Kriegstein & Noctor, 2004). 1.4.δ.Γ) Διαφοροποίηση των νευρώνων, επιµήκυνση αξόνων και σχηµατισµός των συνάψεων. Η διαφοροποίηση των νευρώνων γίνεται εμφανής με την επιµήκυνση του νευράξονά τους. Ο νευράξονας πρέπει να επιμηκυνθεί για να εντοπίσει τα κατάλληλα κύτταρα στόχους με τα οποία ο νευρώνας θα συνδεθεί μέσω των συνάψεων και τα οποία πολλές φορές βρίσκονται σε ιδιαίτερα αποµακρυσµένη θέση. Η αρχική επιλογή της κατεύθυνσης προς την οποία θα επιμηκυνθεί ο νευράξονας καθορίζεται από ερεθίσµατα του περιβάλλοντα ιστού όπως είναι οι νευροτροφικοί παράγοντες (Campenot, 1979; Rogers et al., 1985; Lander 1987). Η καθοδήγηση ενός άξονα επιτελείται είτε από ίνες γλοιϊκών κυττάρων (π.χ. της «ακτινωτής γλοίας»), είτε από άξονες ήδη διαφοροποιηµένων νευρώνων. Η αλληλεπίδραση του αναπτυσσόµενου άξονα µε το περιβάλλον και η καθοδήγησή του µέσα από τα κατάλληλα µονοπάτια προς το κύτταρο στόχο, πραγµατοποιείται µέσω του αναπτυξιακού κώνου (growth cone) ο οποίος µεταφέρει τα ερεθίσµατα που δέχεται στο σώµα του νευρώνα (Jacobson and Huang, 1985). Έτσι κατά τη διαδρομή που διανύει ο νευράξονας σχηματίζονται σύμπλοκα πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας με πρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης του αναπτυξιακού κώνου. Τέτοια σύμπλοκα είναι τα semaphorin/plexin, slit/robo και ephrins/ephs τα οποία επηρεάζουν ενδοκυττάριους σηματοδοτικούς μηχανισμούς µε τελικούς στόχους στοιχεία του κυτταροσκελετού (Grunwald and Klein, 2002). Ένα επόμενο στάδιο διαφοροποίησης του νευρώνα είναι η σύνθεση και η έκκριση συγκεκριμένων νευροδιαβιβαστών, αλλά και η έκφραση συγκεκριµένων υποδοχέων στην περιοχή των συνάψεων. Τέλος ακολουθεί η δημιουργία των συνάψεων του νευρώνα με συγκεκριμένα κύτταρα στόχους και η δηµιουργία νευρωνικών δικτύων. Σημαντικό ρόλο στη δημιουργία των 29

44 Εισαγωγή συνάψεων θεωρείται ότι παίζει η εξαρτώμενη από το σύµπλοκο Ca2+/ calmodulin κινάση, (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase ΙI, CaMKII) η οποία εντοπίζεται σε όλες τις συνάψεις των αναπτυσσόμενων νευρώνων (Fink and Meyer, 2002). 1.4.ε. Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» και ο ρόλος τους στην ανάπτυξη του φλοιού του τελεγκεφάλου Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, μία ομάδα προγονικών κυττάρων του αναπτυσσόμενου φλοιού των οποίων το κυτταρικό σώμα βρίσκεται κοντά στην επιφάνεια της πλευρικής κοιλίας ενώ η ακτινωτή κυτταροπλασματική προεκβολή τους διατρέχει όλο το βάθος του εγκεφαλικού φλοιού από την κοιλία μέχρι τη χοριοειδή μήνιγγα. Διαμορφώνεται έτσι μία ακτινωτή κατασκευή, σαν ικρίωμα, στο φλοιό από κύτταρα που διατρέχουν όλο το βάθος των νευρωνικών στιβάδων. Τα προγονικά αυτά κύτταρα εκφράζουν πρωτεΐνες που απαντώνται στα ώριμα αστροκύτταρα και για το λόγο αυτό για πολύ καιρό επικρατούσε η άποψη ότι τα κύτταρα αυτά ήταν πρόδρομα γλοιϊκά κύτταρα (Levitt et al., 1983, Voight, 1989), πράγμα που καθιέρωσε και την ονομασία τους (κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας»), (Rakic, 1971). Πρόσφατα πειραματικά δεδομένα ωστόσο, συγκλίνουν στην άποψη ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι πρόδρομα κύτταρα που αρχικά, κατά την εμβρυϊκή ηλικία, διαφοροποιούνται σε νευρώνες, ενώ αργότερα, και ιδιαίτερα κατά τα πρώτα μετεμβρυϊκά στάδια, διαφοροποιούνται σε γλοιοκύτταρα (Malatesta et al., 2000a; Hartfuss et al. 2001; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001), (Σχήμα 16). Πριν την έναρξη της νευρογένεσης (πριν την εμβρυϊκή ημέρα Ε10 στο ποντίκι) τα κύτταρα του αναπτυσσόμενου φλοιού που πολλαπλασιάζονται με συμμετρικές διαιρέσεις είναι σε μεγάλο βαθμό αδιαφοροποίητα και ονομάζονται απλά «επιθηλιακά κύτταρα». Όταν διαμορφωθεί η κοιλιακή ζώνη και εμφανιστούν οι πρώτοι μεταμιτωτικοί νευρώνες (ημέρα E10 περίπου στο ποντίκι) τα επιθηλιακά κύτταρα του φλοιού αποκτούν νέα χαρακτηριστικά, όπως είναι η έκφραση της πρωτεΐνης των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού νεστίνη (nestin) και των μεταμεταφραστικών τροποποιήσεών της RC1 και RC2, και ονομάζονται «νευροεπιθηλιακά κύτταρα» (Misson et al., 1988, Mori et al., 2005). Λίγο αργότερα, κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε12 περίπου στο ποντίκι, εμφανίζονται μέσα στη νευροεπιθηλιακή ζώνη VZ, τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» (Anthony et al., 2004, Hartfuss et al., 2001), (Σχήμα 16). Τα κύτταρα αυτά διακρίνονται για το ότι εκφράζουν εκτός από νεστίνη, RC1, RC2 και άλλες χαρακτηριστικές πρωτεΐνες όπως GFAP, GLAST, BLBP, vimentin (Mori et al., 2005). Όσο προχωρά η διαδικασία της νευρογένεσης, τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» αντιπροσωπεύουν όλο και 30

45 Εισαγωγή μεγαλύτερο μέρος του νευροεπιθηλίου με αποκορύφωμα την ημέρα Ε14 οπότε και αποτελούν την πλειοψηφία του νευρογενετικού πληθυσμού της VZ (Malatesta et al., 2000a,b, Malatesta et al., 2003, Hartfuss et al., 2001, Mori et al., 2005). Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» παραμένουν στο φλοιό καθ όλη τη διάρκεια της νευρογένεσης. Ο ρόλος τους μάλιστα στη ανάπτυξη του φλοιού είναι πολλαπλός. Εκτός από τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των ίδιων προς τη γενεαλογία των νευρώνων, χρησιμεύουν και ως υπόστρωμα που υποβοηθά τους νέους νευρώνες κατά την ακτινωτή μετανάστευσή τους προς τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (Götz &Barde, 2005), (Σχήμα 16). Το πόσο πολύ συνδεδεμένη είναι η φύση των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» με την ακτινωτή δομή της που επιτρέπει μία τέτοια μετανάστευση, φαίνεται και από το γεγονός ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» όταν διαιρούνται δεν χάνουν την κυτταροπλασματική τους προεκβολή αλλά την κληρονομούν σε ένα από τα δύο θυγατρικά κύτταρα (Fishel & Kriegstein, 2003). Σχ.15. Η προέλευση και ο ρόλος ενός κυττάρου «ακτινωτής γλοίας» Με το τέλος της νευρογένεσης ο πληθυσμός των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» θα υποστεί μοριακές αλλαγές όπως η αναστολή της έκφρασης διαφόρων νευρογενετικών παραγόντων (π.χ. του παράγοντα Ρax6), και θα δώσει γένεση σε αστροκύτταρα (Noctor et al., 2004, Mori et al., 2005, Heins et al., 2002). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που εντοπίζονται στη ραχιαία πλευρά του τελεγκεφάλου διαφέρουν στη λειτουργία τους από τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που εντοπίζονται στην κοιλιακή πλευρά (γαγγλιωνικό έπαρμα). Συγκεκριμένα, η ραχιαία «ακτινωτή γλοία» διακρίνεται όπως είδαμε για το υψηλό νευρογενετικό της δυναμικό, ενώ η κοιλιακή «ακτινωτή γλοία» έχει κυρίως γλοιογενετικό ρόλο και ελάχιστα συμβάλλει στη διαδικασία της νευρογένεσης (Malatesta et al., 2003, Anthony et al., 2004). Καθοριστικό ρόλο σ 31

46 Εισαγωγή αυτή την εξειδίκευση στη λειτουργία των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» ανάλογα με τη θέση τους μέσα στον τελεγκέφαλο, φαίνεται να παίζει και πάλι ο παράγοντας Ρax6. Σε μεταλλαγμένα ποντίκια που υπολείπονται του λειτουργικού γονιδίου Ρax6, όπως είναι τα ποντίκια small eye (sey), τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» χάνουν το νευρογενετικό τους χαρακτήρα και ο ώριμος φλοιός έχει πολύ λιγότερους νευρώνες απ ότι ο φυσιολογικός φλοιός (Ηaubst et al., 2004, Heins et al., 2002). 1.5 Η νευρογένεση στον ενήλικο εγκέφαλο Η διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο φλοιό είναι πολύ σύνηθες φαινόμενο σε όλα τα σπονδυλωτά εκτός από την ομοταξία των θηλαστικών. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν η εκτεταμένη νευρογένεση που συναντάται στον μέσο εγκεφαλικό φλοιό της σαύρας (μια δομή που μοιάζει με τον ιππόκαμπο των θηλαστικών) μετά από τραυματισμό (Lopez-Garcia et al., 1992), η έντονη νευρογένεση που λαμβάνει χώρα στον αμφιβληστροειδή του χρυσόψαρου καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του (Hitchcock & Raymond, 1992) καθώς και η νευρογένεση που παρατηρείται στο φωνητικό κέντρο του φλοιού των ωδικών πτηνών (Alvarez- Buylla et al., 1998). Ωστόσο τέτοια εκτεταμένα φαινόμενα αναγέννησης των νευρώνων του εγκεφάλου δεν παρατηρούνται στα θηλαστικά γεγονός που σημαίνει ότι διάφοροι εξελικτικοί παράγοντες οδήγησαν τα θηλαστικά να χάσουν την ικανότητα ανάπλασης των νευρώνων του εγκεφάλου τους. Ευλόγως λοιπόν, θεωρούνταν για πολλά χρόνια (από την εποχή των πρώτων νευροεπιστημόνων) ότι η νευρογένεση στον φλοιό των θηλαστικών λαμβάνει χώρα μόνο κατά την εμβρυϊκή ηλικία και ότι «στον ενήλικο εγκέφαλο όλα μπορούν να πεθάνουν αλλά τίποτα δε γεννιέται» (Ramon y Cajal, 1888). O πρώτος που εντόπισε νευρογενετικά κύτταρα στον εγκέφαλο ήταν ο Joseph Altman (Altman & Das, 1965, Αltman, 1969) και τα αποτελέσματα των πειραμάτων του επιβεβαιώθηκαν πολύ αργότερα (Kaplan, 1981). Παρ όλ αυτά, λόγω απουσίας κατάλληλων ανοσοϊστοχημικών μαρτύρων για τους ώριμους νευρώνες δεν μπορούσαν να ταυτοποιήσουν τη φύση των κυττάρων που παράγονταν στο φλοιό και έτσι τα δεδομένα αυτά δεν έγιναν αποδεκτά (Emsley et al., 2005).To ζήτημα της νευρογένεσης στον ενήλικο εγκέφαλο επανήλθε στο επιστημονικό προσκήνιο όταν πρόδρομα κύτταρα που απομονώθηκαν από τον ενήλικο πρόσθιο εγκέφαλο έδωσαν γένεση σε νευρώνες in vitro (Reynolds & Weiss, 1992, Richards et al.,1992). 32

47 Εισαγωγή Σήμερα είναι γνωστό ότι στον ενήλικο εγκέφαλο των θηλαστικών πραγματοποιείται νευρογένεση καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους αλλά με αργούς ρυθμούς, στις εξής δύο περιοχές: α) στο πρόσθιο τμήμα της υποκοιλιακής ζώνης (asvz) και β) στην υποκοκκιώδη ζώνη (subgranular zone, SGZ) του οδοντωτού συνδέσμου (dentate gyrus, DG) του ιπποκάμπου (Lois & Alvarez-Buylla, 1993, Doetsch et al., 1999), (Σχήμα 17). Καθ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής, οι νευρώνες που παράγονται στην SVZ του ποντικού και του αρουραίου μεταναστεύουν πρόσθια προς τον οσφρητικό λοβό, διανύοντας μία μεγάλη απόσταση, μέσω του ραχιαίου μεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream, RMS) που συνδέει την υποκοιλιακή ζώνη (SVZ) με τον οσφρητικό λοβό (olfactory bulb, OB), (Lois & Alvarez-Buylla, 1994, Goldman, 1995, Doetsch et al., 1999), (Σχήμα 17). O τρόπος αυτός μετανάστευσης ο οποίος δεν περιλαμβάνει τη διαμεσολάβηση γλοιοκυττάρων, αποκαλείται αλυσιδωτή μετανάστευση (chain migration). Η παραπάνω διαδικασία προσομοιάζει με την επιφανειακή μετανάστευση των διάμεσων νευρώνων από τον κοιλιακό τελεγκέφαλο προς το φλοιό (Doetch, 1996). Σχ.17. Τα στάδια της νευρογένεσης στον ώριμο τελεγκέφαλο, οι νευρογεννητικές περιοχές (DG και asvz) και το ραχιαίο μεταναστευτικό τόξο (RMS). 33

48 Εισαγωγή Όταν οι μεταναστευτικοί αυτοί νευρώνες ξεκινούν από την SVZ βρίσκονται ακόμα σε πρώιμα στάδια διαφοροποίησης αλλά κατά την πορεία τους εκφράζουν πρωτεΐνες που θεωρούνται μάρτυρες νεαρών νευρώνων όπως η διπλοκορτίνη (doublecortin, DCX), η πολυσιαλυλιωµένη µορφή της πρωτεΐνης της κυτταρικής συνάφειας των νευρώνων (Polysialylated Neural Cell Adhesion Molecule, PSA- NCAM) και η β-iii-τουμπουλίνη (beta-iii-tubulin), (Yang et al., 2004, Fanarraga et al., 1999). Όταν εντέλει, τα κύτταρα αυτά φτάσουν στον προορισμό τους που είναι ο οσφρητικός λοβός, διαφοροποιούνται σε ώριμους διάμεσους νευρώνες και χάνουν κάποιους από αυτούς τους πρώιμους μάρτυρες. Τα κύτταρα που παράγονται στην περιοχή του οδοντωτού συνδέσμου (DG) του ιπποκάμπου μεταναστεύουν διανύοντας πολύ μικρή απόσταση μέσα στον ίδιο τον οδοντωτό σύνδεσμο για να πάρουν τη τελική λειτουργική τους θέση (Gage 2000), όπου διαφοροποιούνται κι αυτά σε διάμεσους νευρώνες (Rietze et al., 2000). Σχ.18. Η γενεαλογία των νευρώνων κατά τη νευρογένεση στον ώριμο τελεγκέφαλο [στις περιοχές DG (Α) και asvz(β) ]. 34

49 Εισαγωγή Φαίνεται ότι τα προγονικά κύτταρα που εντοπίζονται στις παραπάνω δύο νευρογενετικές περιοχές δεν έχουν ενδογενή χαρακτηριστικά που να καθορίζουν τη διαφοροποίησή τους σε νευρώνες της μιας ή της άλλης περιοχής αλλά η συμπεριφορά τους καθορίζεται σχεδόν αποκλειστικά από σήματα του περιβάλλοντος της περιοχής όπου παράγονται (Takahashi et al., 1998, Shihabuddin et al., 2000). Αυτό δείχνουν πειράματα μεταμόσχευσης των πρόδρομων κυττάρων που απομονώθηκαν από την περιοχή του ιπποκάμου, στη νευρογενετική περιοχή της SVZ, τα οποία υιοθέτησαν τη μοίρα των υπόλοιπων πρόδρομων κυττάρων της περιοχής στην οποία τοποθετήθηκαν, μετανάστευσαν δηλαδή προσθίως μέσω του RMS. Το ίδιο συνέβη με κύτταρα της SVZ τα οποία μεταμοσχεύθηκαν στη περιοχή του ιπποκάμου (Suhonen et al., 1996). Επιπλέον αν κύτταρα από την SVZ ή τον ιππόκαμπο μεταμοσχευθούν σε μη νευρογεννητικές περιοχές τα κύτταρα αυτά διαφοροποιούνται σε γλοιοκύτταρα και όχι σε νευρώνες (Emsley et al., 2005). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι νευρογενετικές περιοχές στον ενήλικο εγκεφαλικό φλοιό εμφανίζονται ως δομές με χαρακτηριστική αρχιτεκτονική που αποτελούνται από συγκεκριμένους τύπους πρόδρομων κυττάρων. Έτσι, στην περιοχή της πρόσθιας υποκοιλιακής ζώνης (asvz) εντοπίζονται ειδικά αστροκύτταρα με χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων - κύτταρα τύπου Β όπως έχει επικρατήσει να ονομάζονται (Lim & Alvarez-Buylla, 1999) - τα οποία δίνουν γένεση με πολύ αργό ρυθμό σε πρόδρομα κύτταρα τύπου C, που με τη σειρά τους πολλαπλασιάζονται με γρήγορο ρυθμό και από τα οποία τελικά προέρχονται τα νευροβλαστικά κύτταρα τύπου A τα οποία και μεταναστεύουν προς τον οσφρητικό λοβό, μέσω του μονοπατιού RMS, όπου θα διαφοροποιηθούν σε διάμεσους νευρώνες (Lim & Alvarez-Buylla, 1999), (Σχήμα 17 και 18Α). Αντίστοιχη αρχιτεκτονική παρατηρείται και στην υποκοκκιώδη ζώνη του οδοντωτού συνδέσμου του ιπποκάμπου, όπου αστροκύτταρα που συμπεριφέρονται ως βλαστικά κύτταρα δίνουν γένεση σε προγονικά κύτταρα τύπου D από τα οποία τελικά θα προκύψουν ώριμοι διάμεσοι νευρώνες (Alvarez Buylla & Lim, 2004), (Σχήμα 18B). Πιστεύεται ότι η νευρογένεση που συντελείται στις συγκεκριμένες θέσεις του εγκεφάλου στο ενήλικο άτομο επιτελείται από τον χαρακτηριστικό αυτό τύπο αστροκυττάρων που φέρει ιδιότητες ενήλικων βλαστικών κυττάρων. Ο ιδιαίτερος αυτός πληθυσμός αστροκυττάρων θεωρείται ότι έχει διττή σημασία για τη νευρογένεση στο ενήλικο άτομο λόγω του ότι αφενός παράγει αναπτυξιακούς παράγοντες που βοηθούν τα παρακείμενα κύτταρα να δώσουν γένεση σε νευρώνες, αφετέρου δε αποτελεί τον πληθυσμό των βλαστικών κυττάρων του ώριμου εγκεφάλου (Alvarez Buylla & Lim, 2004). 35

50 Εισαγωγή 1.6 Η πρωτεΐνη ΒΜ88 Η πρωτεΐνη ΒΜ88 ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά με τη βοήθεια µονοκλωνικού αντισώµατος σε εγκέφαλο χοίρου (Patsavoudi et al., 1989), στο εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Pasteur, όπου και εκπονήθηκε η παρούσα διατριβή. Πρόκειται για νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. Ομόλογες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν στο νευρικό σύστημα και άλλων θηλαστικών, όπως του μυός, του επίμυος, του κουνελιού, του χοίρου και του ανθρώπου (Gaitanou et al. 2001). O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική, μη γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη που αποτελείται από δύο όμοιες πεπτιδικές αλυσίδες μοριακού βάρους 22-23kD, ανάλογα με το είδος του ζώου, που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (Patsavoudi et al., 1991). Το μεγαλύτερο τμήμα της πρωτεΐνης, προς το άμινο-τελικό άκρο, βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα ενώ στο καρβόξυ-τελικό άκρο έχει εντοπιστεί διαμεμβρανική περιοχή 21 αμινοξικών καταλοίπων, που ακολουθείται από τρία θετικά φορτισμένα αμινοξέα (RKK, αργινίνηλυσίνη-λυσίνη) (Mamalaki et al. 1995; Gaitanou et al. 2001). Σε περιπτώσεις άλλων πρωτεϊνών, όπως στην οικογένεια των πρωτεϊνών Bcl-2, παρόμοια μοτίβα έχουν συσχετιστεί με τη μεταφορά και τον εντοπισμό της πρωτεΐνης στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και στο ενδοπλασματικό δίκτυο (Nguyen et al. 1993). H πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι πλούσια σε κατάλοιπα προλίνης, ενώ περιέχει επαναλαμβανόμενα μοτίβα PXXP (όπου P είναι προλίνη και X οποιοδήποτε άλλο αμινοξύ) (Gaitanou et al. 2001). Τέτοιες περιοχές έχουν εντοπιστεί σε πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος (Cohen et al. 1995; Pawson 1995) και πιστεύεται ότι αποτελούν θέσεις πρόσδεσης περιοχών SH3 (Src homology 3) (Yu et al. 1994; Kelekar and Thompson 1998). Μελέτες κατανομής της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου δείχνουν ότι η πρωτεΐνη αυτή εντοπίζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα του ώριμου εγκεφάλου. Μάλιστα, μελέτες στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δείχνουν ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων όπως είναι η εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και οι μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου (Patsavoudi et al., 1995). Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτείνης ΒΜ88 συµπίπτει µε την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου (εμβρυϊκή ημέρα Ε12) ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της 36

51 Εισαγωγή αυξάνονται µε την ηλικία και παραµένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο (Patsavoudi et al., 1995). Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε κύτταρα του νευροβλαστώματος έδειξαν ότι το γονίδιο ΒΜ88 επάγει τη μορφολογική και μοριακή τους διαφοροποίηση προς νευρωνικό φαινότυπο (Mamalaki et al., 1995; Boutou et al., 2000). Συγκεκριμένα, στο εργαστήριο πραγματοποιήθηκε η κλωνοποίηση του cdna του ΒΜ88 του χοίρου και η έκφρασή του στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος μυός Neuro2A (Ν2Α), (Mamalaki et al., 1995). Στα σταθερά μετασχηματισμένα με το cdna του ΒΜ88 κύτταρα (N2Α-ΒΜ88) παρατηρείται επαγωγή της διαφοροποίησής τους προς το νευρωνικό φαινότυπο τόσο σε μορφολογικό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο (Mamalaki et al. 1995). Επιπλέον, τα κύτταρα N2Α-ΒΜ88 εμφανίζουν μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού ενώ παράλληλα παρουσιάζουν μακριές εκφύσεις και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού (Georgopoulou et al., 2006). Από βιοχημική άποψη, οι παρατηρούμενες μεταβολές σχετίζονται με την επαγωγή πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τους διαφοροποιημένους νευρώνες, όπως είναι η νευροϊνιδιακή πρωτεΐνη NF (neurofilament) και η συναπτοφυσίνη (synaptophysin). Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα κύτταρα N2Α-ΒΜ88 εμφανίζουν διαφοροποιημένο κυτταρικό κύκλο όπως υποδεικνύεται από τη μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1, γεγονός που αποτελεί δείκτη της εξόδου των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο (Georgopoulou et al., 2006). Αντίστροφα, πειράματα in vitro αποσιώπησης του ΒΜ88 στα κύτταρα N2A με την τεχνική των si-rna (small interference RNA), έδειξαν ότι η παρεμπόδιση της έκφρασης του ΒΜ88 οδηγεί σε αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού και μειωμένη διαφοροποίηση (Politis & Matsas, αδημοσίευτα αποτελέσματα). 1.7 Στόχοι της παρούσας εργασίας Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 συμπίπτει αναπτυξιακά με την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου (εμβρυϊκή ημέρα Ε12) ενώ με ανοστοϊχημικές μεθόδους διαπιστώθηκε όπως είδαμε, η νευροειδική έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο κεντρικό νευρικό σύστημα του ενήλικου ατόμου. Επιπλέον λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 με την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησης των κυττάρων προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα 37

52 Εισαγωγή παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε το ρόλο της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαφοροποίηση των νευρώνων in vivo. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου που αποτελεί αντικείμενο εντατικής μελέτης των νευροεπιστημόνων. Συγκεκριμένα, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων του τελεγκεφάλου και αν διαθέτει τα χαρακτηριστικά εκείνα που χαρακτηρίζουν μία πρωτεΐνη ως «νευρογενετικό παράγοντα». Διερευνήσαμε δηλαδή, εάν η πρωτεΐνη ΒΜ88: α) εκφράζεται κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης σε πρόδρομα κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων, β) δεν εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας, γ) εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα νευρώνων κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο ενήλικο άτομο και τέλος δ) η έκφρασή της μειώνεται σε ζώα που φέρουν μεταλλάξεις οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ελαττωματικής νευρογένεσης. Για να διερευνήσουμε την ύπαρξη των παραπάνω νευρογενετικών ιδιοτήτων της πρωτείνης ΒΜ88, πραγματοποιήσαμε πειράματα διπλού και τριπλού ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντισώματα α) έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88, β) έναντι του μάρτυρα της φάσης S του κυτταρικού κύκλου BrdU ή έναντι της κυκλίνης Β1 που είναι μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου, και τέλος γ) αντισώματα έναντι μαρτύρων της νευρωνικής και γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και στους διαφοροποιημένους νευρώνες του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου «ακτινωτής γλοίας» που αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού. Επιπλέον, συνδυαστικά πειράματα σήμανσης των πρόδρομων κυττάρων με δύο διαφορετικούς μάρτυρες της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται με τις ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις, η εμφάνιση των οποίων σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης στο φλοιό και την εμφάνιση των πρώτων μεταμιτωτικών νευρώνων. Έτσι, φαίνεται ότι η επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα νευρογενετικά κύτταρα προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο. Σε συμφωνία με τις παραπάνω παρατηρήσεις έρχεται και η ανίχνευση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (RMS) κατά τη νευρογένεση στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου. Τέλος, μελετήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό ποντικών που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye (ποντίκια Sey/Sey). Στα 38

53 Εισαγωγή ποντίκια αυτά δεν είναι λειτουργικό το γονίδιο Pax6 που είναι υπεύθυνο για τη διαδικασία της νευρογένεσης στο ραχιαίο μέρος του τελεγκεφάλου (Hill et al., 1991). Έτσι, ο αριθμός των νευρώνων που παράγονται στον αναπτυσσόμενο φλοιό αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών είναι ελαττωμένος στο μισό από αυτόν που συναντάμε στα ποντίκια φυσικού τύπου (Heins et al., 2002). Όπως αναμενόταν, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι μειωμένη στα ποντίκια Sey/Sey. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συγκεντρώνει τις απαραίτητες ιδιότητες που χαρακτηρίζουν ένα «νευρογενετικό παράγοντα». Επιπλέον, τα αποτελέσματα της εργασίας μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 χαρακτηρίζει τη γενεαλογία των νευρώνων από τα πρόδρομα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα μέχρι τους ώριμους νευρώνες και επομένως αποτελεί ένα νέο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας. 39

54 Υλικά και Μέθοδοι 2.Υλικά και Μέθοδοι 2.1. Υλικά Χημικά και βιολογικά αντιδραστήρια Όλα τα διαλύματα παρασκευάστηκαν με δις-απεσταγμένο και απιονισμένο Η 2 Ο. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στις μοριακές μεθόδους αποστειρώθηκαν με υγρή αποστείρωση για 20 λεπτά, υπό πίεση 120lb/cm 2. Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας από τις εταιρίες Β.D.H. Chemicals Ltd., Fluka, SIGMA και Promega. Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο Bradford της εταιρείας SIGMA. Για τη σήμανση του DNA κατά το στάδιο της αντιγραφής των κυττάρων (φάση S του κυτταρικού κύκλου), χρησιμοποιήθηκε το χημικό ανάλογο της θυμίνης: 5- βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU), της εταιρείας SIGMA. Για τη σήμανση των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας χρησιμοποιήθηκε η λιπόφιλη φθορίζουσα ουσία1,1 -δι-οκταδεκυλο-3,3,3,3 -τετραμεθυλο-υπεχλωρική καρβοκυανίνη ( 1,1 -Dioctadecyl-3,3,3,3 -tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI) υπό τη μορφή μικρών κρυστάλλων, της εταιρείας Molecular Probes. Για τη μεταφορά πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Hybond C της εταιρείας Amersham. Οι αντικειμενοφόροι που χρησιμοποιήθηκαν για τη συλλογή τομών παραφίνης επεξεργάστηκαν με 3 -αμινο-προπυλ-τριεποξυ-σιλένιο (Tespa) της εταιρείας Sigma. Για τη μονιμοποίηση των ιστών, χρησιμοποιήθηκε η χημική ουσία Histochoice TM, της εταιρείας Anachem. Η παραφίνη που χρησιμοποιήθηκε για τον εγκλεισμό μονιμοποιημένων ιστών ήταν της εταιρείας Β.D.H. Chemicals Ltd. Ως υποστρώµατα της αλκαλικής φωσφατάσης χρησιμοποιήθηκαν τα: nitroblue tetrazolium (NBT) και brom-chlorindolyl-phosphate (BCIP) της εταιρείας Boehringer Manheim. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν των παρακάτω εταιρειών: DΝάση I της εταιρείας Promega MoMLV αντίστροφη μεταγραφάση (Superscript II της εταιρείας Roche) Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες ΕcoRI, XhoI, ClaI και NotI ήταν της εταιρείας New England Biolabs Ριβονουκλεάση Α (RNAse A) της εταιρείας Sigma 40

55 Υλικά και Μέθοδοι Αναστολέας ριβονουκλεασών RNAsin της εταιρείας Promega Πολυµεράσες RNA Sp6, T3, και Τ7 της εταιρείας Promega Λιγάση T4 της εταιρείας Μinotech Molecular Biology Products Πολυµεράση DNA, Taq των εταιρειών Μinotech Molecular Biology Products και MBI Fermentas Πρωτεϊνάση Κ της εταιρείας Promega Εναρκτήρια μόρια/εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR), της Real time RT-PCR και για τον προσδιορισµό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA (sequencing), ήταν της εταιρείας Minotech Molecular Biology Products, Ίδρυμα Τεχνολογίας Έρευνας, Ηράκλειο Κρήτης Ο προσδιορισµός της νουκλεοτιδικής ακολουθίας (sequencing) έγινε από την εταιρεία Microsynth, Switzerland Για τις εγχειρήσεις των ζώων χρησιμοποιήθηκαν: To αντι-ιϊκό υγρό υπό τη μορφή spray της εταιρείας Microzid Aντιξηραντικές σταγόνες ματιών σε μορφή gel Oculotect της εταιρείας Novartis Iσοτονικό διάλυμα NaCl της εταιρείας Bl BRAUN Yγρή κόλλα για τη στεγανοποίηση των ραμάτων της εταιρείας FLUKA Για τη νάρκωση των ζώων χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω ουσίες της εταιρείας Novartis έπειτα από ειδική άδεια της κρατικής επιτροπής φαρμάκων της Γερμανίας: Domitor, Dormicum, Fentanyl Hexal, Antisedan, Anexate, Narcanti-vet, Atipamezol, Flumazenil και Naloxon. Το ραδιενεργό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για τη σήμανση νουκλεϊκών οξέων είναι [ 3 H]-Thymidin (3μCi/gr, specific activity 60-80Ci/mM), σε μορφή υδατικού διαλύματος της εταιρείας Amersham International P.L.C. Για τις αυτοραδιογραφίες χρησιμοποιήθηκαν γαλάκτωμα σπινθηρισμού της εταιρείας KODAK, για την εμφάνιση των αυτοραδιογραφιών χρησιμοποιήθηκαν υγρά εμφάνισης της εταιρείας Kodak (LX24 Developer και AL4 Fixer) και για τη φωτογράφηση των πηκτωμάτων αγαρόζης φίλμ Polaroid 667. Ως θρεπτικά µέσα για τις βακτηριακές καλλιέργειες χρησιµοποιήθηκαν τα θρεπτικά υλικά: Bacto-tryptone, Bacto- yeast extract, και Bacto-agar της εταιρείας Difco Laboratories. Ως θρεπτικά µέσα για τις πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειες νευρώνων χρησιµοποιήθηκαν DMEM, SATO και FCS της εταιρείας Gibco. 41

56 Υλικά και Μέθοδοι Το αντιβιοτικό που χρησιµοποιήθηκε για τις βακτηριακές καλλιέργειες ήταν Αµπικιλλίνη της εταιρείας Bristol (διάλυµα συγκέντρωσης αποθέµατος: 100mg/ml σε Η 2 Ο, µοιρασµένο ανά µικρούς όγκους και διατηρηµένο στους -20 ο C και τελική συγκέντρωση στο θρεπτικό µέσο: 100µg/ml). Τα αντιβιοτικά που χρησιµοποιήθηκαν για τις πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειες νευρώνων ήταν Αµπικιλλίνη/Στρεπτομυκίνη της εταιρείας GIBCO. Το διάλυµα υδροβρωµιδίου της πολυλυσίνης-l (poly-l-lysine Hydrobromide) που χρησιμοποιήθηκε για την επίστρωση των καλυπτρίδων ήταν της εταιρείας Sigma Εργαστηριακός εξοπλισμός α. Όργανα και συσκευές Χρησιμοποιήθηκαν τα εξής όργανα και συσκευές: Φυγόκεντροι πάγκου της εταιρείας Beckman, µοντέλλο CPR και της εταιρείας Jouan, µοντέλλο CR412. Φυγόκεντρος Sorvall,της εταιρείας DuPont, µοντέλλο RC-5C, µε τις κεφαλές φυγοκέντρησης GS3, SS34, HB4. Επιτραπέζια µικροφυγόκεντρος, της εταιρείας Εppendorf. Συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης πηκτωµάτων ακρυλαµιδίου πρωτεϊνών της εταιρείας Biorad µοντέλλο Mini Protean II. Συσκευή για τη µεταφορά των πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη της εταιρείας Biorad µοντέλλο Mini Trans-Blot. Συσκευές οριζόντιας ηλεκτροφόρησης πηκτωµάτων αγαρόζης της εταιρείας BRL. Τροφοδοτικά LKB, Biorad, Pharmacia. Φωτόµετρο ορατής και υπεριώδους ακτινοβολίας LKB. Καταψύκτες -20 ο C και -70 ο C. Μικροτόμος και παλλόμενη μικροτόμος της εταιρείας Leica. Κρυοστάτης της εταιρείας Leica. Θερµικός κυκλοποιητής (συσκευή PCR) της εταιρείας MJ Research (µοντέλλο PTC-200). Φωτονικός κυκλοποιητής (συσκευή LightCycler) της εταιρείας Roche. 42

57 Υλικά και Μέθοδοι Μηχάνημα θερμικής όλκινσης γυάλινων βελονών και λείανσής τους της εταιρείας NARISHIGE, μοντέλο EG-44. Οπτικές ίνες λευκού φωτός της εταιρείας SCHOTT. Υδατόλουτρα. Μαγνητικός αναδευτήρας. Θερµαινόµενη πλάκα µε εύρος θερµοκρασίας 20 ο C -110 ο C, µε υποδοχείς για σωληνάρια τύπου eppendorf χωρητικότητας 1.5ml και για σωληνάρια τύπου falcon χωρητικότητας 15 ml της εταιρείας Thermoblock Scientific. Ηλεκτρονικό phµετρο SENTRON. Αυτόµατη φωτογραφική µηχανή Polaroid. Λάµπα εκποµπής υπεριώδους ακτινοβολίας µήκους κύµατος 302nm, για απεικόνηση νουκλεϊνικών οξέων σε πηκτώµατα αγαρόζης χρωσµένα µε βρωµιούχο αιθίδιο. Ηλεκτρονικός ζυγός. Ηλεκτρονικός µικροζυγός. Μηχανικές πιπέτες Gilson β. Μικροσκόπια και λογισμικά επεξεργασίας εικόνας Οι διπλές και τριπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού αναλύθηκαν σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Laser Scanning Microscope) της εταιρείας Leica, μοντέλο TCS-SP, εξοπλισμένο με λογισμικό τρισδιάστατης ανάλυσης (Leica 3D analyis software). Οι διπλές χρώσεις ανοσοϊστοχημείας με αλκαλική φωσφατάση και υπεροξειδάση, αναλυθηκαν σε φωτονικό μικροσκόπιο Zeiss-Axiophot, εξοπλισμένο με τη ψηφιακή κάμερα Leica DC-300 και με το λογισμικό Leica IM50 της εταιρείας Leica Γυαλικά Πλαστικά Χρησιµοποιήθηκαν: πλαστικά ακρορύγχια (tips) των εταιρειών Costar και Greiner. πλαστικά ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) της εταιρείας Sarstedt. πλαστικοί σωλήνες χωρητικότητας 1.5ml των εταιρειών Costar και Greiner. αποστειρωµένες πλαστικές πιππέτες των 1, 2, 5 και 10ml των εταιρειών Costar και Greiner. φλάσκες και τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας της εταιρείας Costar. 43

58 Υλικά και Μέθοδοι τρυβλία bacterial grade της εταιρείας VIVE. προαποστειρωµένοι δοκιµαστικοί σωλήνες µε βιδωτό πώµα όγκου 15 και 50ml των εταιρειών Falcon, Costar, Corning και Greiner. oμογενοποιητές DOUNCE διαφόρων μεγεθών. αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες της εταιρείας Surgipath και Brand. Σωλήνας φυσήματος (mouth tube) της εταιρείας Bl.BRAUN. Ράματα της εταιρείας ETHICON. Ολα τα γυαλικά και πλαστικά είδη που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αποστειρωµένα Αντισώµατα Το µονοκλωνικό αντίσωµα, έναντι του αντιγόνου ΒΜ88, έχει παραχθεί σε ποντίκια της φυλής Balb/c µετά από ανοσοποίηση µε αντιγόνο συναπτικές µεµβράνες από εγκέφαλο χοίρου (Patsavoudi et al. 1989). Ειδικό πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι του αντιγόνου ΒΜ88 παρασκευάστηκε µετά από ανοσοποίηση κουνελιού µε ανοσοκαθαρισµένο αντιγόνο ΒΜ88 από µεµβράνες εγκεφάλου χοίρου µε την βοήθεια του µονοκλωνικού αντισώµατος ΒΜ88 (Patsavoudi et al., 1991, 1995). Επιπλέον χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντισώµατα: μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι τoυ μεταγραφικού παράγοντα ώριμων νευρώνων ποντικού, NeuΝ από την εταιρεία Chemicon. πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της όξινης ινιδιακής πρωτείνης των γλοιοκυττάρων (Glial Fibrilary Acidic Protein, GFAP) από την εταιρεία DAKO. πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης NG2 των ολιγοδενδροκυττάρων, από την εταιρεία Chemicon. πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης των πρώιμων νευρικών κυττάρων νεστίνης (Nestin), ευγενική χορηγία της Dr. Dubois-Dalcq, Ιnstitut Pasteur, France. μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πολυσιαλυλιωµένης µορφής της πρωτεΐνης κυτταρικής συνάφειας των νευρώνων (Polysialic Acid Neural Cell Adhesion Molecule, PSA-NCAM), ευγενική χορηγία της Dr. G.Rougon, CNRS/INSERM, Marseille, France πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι τoυ μεταγραφικού παράγοντα-μιτωτικού μάρτυρα κυκλίνης Β1 (Cyclin B1 από την εταιρεία Santa-Cruz). μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης του ρετροϊικού καψιδίου gag1 από την εταιρεία Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa. 44

59 Υλικά και Μέθοδοι πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της φθορίζουσας πρωτεΐνης (Green Fluorescent Protein, GFP) από την εταιρεία Molecular Probes. μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας RC2 ευγενική χορηγία της Dr. M.Gotz, Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Munich, Germany). μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας GLAST, από την εταιρεία Chemicon. μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνης (5-bromo-2- deoxyuridine, BrdU), από την εταιρεία Harlan, Sera-Lab. μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης του κυτταροσκελετού α- τουμπουλίνης (α-tubulin), από την εταιρεία DAKO. Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα εξής: αντι-αντίσωμα έναντι της ανοσοσφαιρίνης του ποντικού, συνδεδεμένο με αλκαλική φωσφατάση) της εταιρείας Boehringer Mannheim. αντι-αντισώµατα έναντι της ανοσοσφαιρίνης του κουνελιού, του ποντικού και του αρουραίου, συνδεδεµένα µε βιοτίνη της εταιρείας Vector Laboratories. Τα παραπάνω αντισώματα συνδιάστηκαν με ακόλουθη προσθήκη αβιδίνης συνδεδεµένης µε υπεροξειδάση, της εταιρείας Vector Laboratories, ή με ακόλουθη προσθήκη στρεπταβιδίνης συνδεδεµένης µε τη φθορίζουσα ουσία Texas-Red της εταιρείας Αmersham. αντι-αντισώµατα έναντι της ανοσοσφαιρίνης του ποντικού, του αρουραίου και του κουνελιού, συνδεδεµένα µε φλουορεσκίνη (FITC) ή ροδαµίνη (TRITC) της εταιρείας Sigma. αντι-αντίσωµα έναντι της ανοσοσφαιρίνης IgG1 του κουνελιού, συνδεδεµένo µε φλουορεσκίνη (FITC). αντι-αντίσωμα έναντι της ανοσοσφαιρίνης του αρουραίου συνδεδεµένο µε τη φθορίζουσα ουσία Cy5 της εταιρείας Molecular Probes Πειραµατόζωα Για την αποµόνωση εγκεφάλων, χρησιµοποιήθηκαν: α) έμβρυα ηλικίας Ε14, Ε16, Ε18 ηµερών, νεογέννητα ηλικίας Ρ0, Ρ6 καθώς και ενήλικοι αρουραίοι της φυλής Wistar. β) έμβρυα ηλικίας Ε13, Ε16 καθώς και νεογέννητα ποντίκια ηλικίας Ρ0 και Ρ3 της φυλής Βalb/c. 45

60 Υλικά και Μέθοδοι γ) έμβρυα ηλικίας Ε14 των μεταλλαγμένων ποντικών sey/sey. To μεταλλαγμένο γονίδιο Small-eye (Sey) διατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ως γενετικό υπόβαθρο ποντίκια C57BL/6J X DBA/2J. Τα έμβρυα φυσικού τύπου και τα ομοζυγωτικά για το γονίδιο Sey έμβρυα Sey/Sey, προέκυψαν από διασταυρώσεις μεταξύ ετερόζυγων ποντικιών Sey/+. δ) έμβρυα ηλικίας Ε13, Ε16, Ε18 καθώς και νεογέννητα ποντίκια ηλικίας Ρ0 και Ρ3 των διαγονιδιακών ποντικιών Gtv-a. Τo διαγονίδιο Gtv-a διατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ως γενετικό υπόβαθρο ποντίκια C57BL/6 x FVB/N. Ως εμβρυϊκή ημέρα μηδέν (embryonic day, Ε0) θεωρήθηκε η ημέρα ανίχνευσης της κολπικής πλάκας, ενώ ως μετεμβρυϊκή ημέρα μηδέν (postnatal day, P0) θεωρήθηκε η ημέρα γέννησης του πειραματοζώου. Όλα τα έμβρυα απομονώθηκαν µετά από προγραµµατισµένη εγκυµοσύνη των θηλυκών πειραματοζώων. Τους αρουραίους της φυλής Wistar και τα ποντίκια της φυλής Βalb/c, τα προµήθευσε το τµήµα πειραµατοζώων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Τα ποντίκια sey/sey, FVB/N, C57BL/6J x DBA/2J τα προµήθευσε το τµήµα πειραµατοζώων του Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Munich, Germany. Τα ζώα εκτρέφονται σε συνθήκες σταθερής θερµοκρασίας 23 oc υπό την παρουσία τεχνητού φωτισµού συγκεκριµένης περιοδικότητας Βακτηριακά στελέχη και πλασµιδιακοί φορείς. Το βακτηριακο στέλεχος που χρησιµοποιήθηκε είναι το: HB101 (F-.(gpt-proA)62 leub6 glnv44 ara-14 galk2 lacy1.(mcrc-mrr) rpsl20(strr) xyl-5 mtl-1 reca13) της εταιρείας NE Biolabs, (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2 nd ed.). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.; Boyer, H. W, and Roulland Dussoix, D. (1969) J.Mol. Biol. 41, 459). Οι πλασµιδιακοί φορείς που χρησιµοποιήθηκαν είναι οι εξής: 1)Φαγεµίδιο pbluescript ΙΙ KS+ (σχήµα 19) της εταιρείας Stratagene. 2) Φαγεµίδιο pyig (σχήµα 20) κατασκευασμένο από τον W. Hively, στο εργαστήριο του Dr. H. E.Varmus, National Cancer Institute, Bethesda, USA, 1998 (ευγενική χορηγία του Dr. Η. Rohrer, Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Frankfurt, Germany). 46

61 Υλικά και Μέθοδοι Σχ. 19. Χάρτης του φαγεµιδίoυ pbluescript ΙΙ KS το οποίο προέρχεται από το πλασµίδιο puc 19. Διακρίνονται: (i) το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης µέσα στο οποίο υπάρχει η θέση πολλαπλής εισδοχής (polylinker), (ii)το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη (AP r ), (iii) το σηµείο έναρξης αντιγραφής του πλασµιδίου σε E.coli και (iv) oι θέσεις Τ3 και Τ7 που περιέχουν επιπλέον και τις αλληλουχίες πρόσδεσης των οµόνυµων βακτηριακών πολυµερασών αντίστοιχα. Σχ. 20. Χάρτης του φαγεµιδίoυ pyig το οποίο προέρχεται από το πλασµίδιο pbs-sk. Διακρίνονται: (i) η θέση πολλαπλής εισδοχής μέσα στην οποία έχουν εισαχθεί α) η αλληλουχία IRES ακολουθούμενη από το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein), (ii)το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη. Με βέλη απεικονίζονται οι θέσεις Τ3 και Τ7που περιέχουν τις αλληλουχίες πρόσδεσης των οµόνυµων βακτηριακών πολυµερασών αντίστοιχα. 47

62 Υλικά και Μέθοδοι Iϊκοί φορείς. Ο ιϊκός φορέας που χρησιµοποιήθηκε είναι ο ρετροϊός RCAS-Y (σχήµα 21) κατασκευασμένος στο εργαστήριο του Dr. S. Hughes, National Cancer Institute, Bethesda, USA, 1992 (ευγενική χορηγία του Dr. Η. Rohrer, Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Frankfurt, Γερμανία). Σχ. 21. Χάρτης του ιικού φορέα RCAS-Y το οποίο προέρχεται από το πλασµίδιο RCASBP(A) Steve Hughes et al., J.Virol, 1992, 66: ). Διακρίνονται: (i) οι μοναδικές θέσεις αναγνώρισης από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που έχουν τονιστεί με έντονο μαύρο (ii) η αλληλουχία gag, pol και env που είναι υπεύθυνες για την κωδικοποίηση των πρωτεϊνών του ρετροϊού (iii) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη.. 48

63 Υλικά και Μέθοδοι 2.2 Μέθοδοι Βιοχηµικές Μέθοδοι Αποµόνωση µεµβρανικών κλασµάτων από ιστό. Ο πρόσθιος εγκέφαλος αποµονώνεται απο τα ζώα και τοποθετείται σε διάλυµα PBS στους 4 o C. Κατόπιν ζυγίζεται και οµογενοποιείται σε πάγο µε οµογενοποιητή DOUNCE σύµφωνα µε την εξής αναλογία: 10ml διαλύµατος Tris-Cl ph 7.4 συγκέντρωσης 10mM ανά gr ιστού. Το οµογενοποίηµα φυγοκεντρείται στις στροφές ανά λεπτό, για 5 λεπτά, στους 4 oc. Το ίζηµα (P1) περιέχει υπολείµατα ιστού. Tο υπερκείµενο επαναφυγοκεντρείται στις στροφές ανά λεπτό, για 30 λεπτά, στους 4 o C. Το νέο ίζηµα (P2) που προκύπτει αποτελεί το κλάσµα των κυτταρικών µεµβρανών, το οποίο επαναδιαλύεται σε διάλυµα Tris-Cl ph 7.4 συγκέντρωσης 10mM, και προσδιορίζεται η συγκέντρωση των πρωτεϊνών που περιέχει µε τη µέθοδο 3.1 της Bradford (SIGMA). Φυλάσσεται στους -20 ο C. Η παρασκευή των μεμβρανικών κλασμάτων P2 μπορεί να πραγματοποιηθεί παρουσία αναστολέων των πρωτεασών, προσθέτοντας στο ρυθμιστικό διάλυμα Tris- HCl ph 7.4 που χρησιμοποιείται στην ομογενοποίηση, ένα μίγμα αυτών στις εξής συγκεντρώσεις: pepstatin: 0.5μg/ ml amastatin: 0.5μg/ ml aprotinin: 5units/ ml PMSF: 10-3 M antipain: 0.5μg /ml EDTA: 10-2 M Προσδιορισµός συγκέντρωσης πρωτεϊνών µε τη µέθοδο Βradford 3.1 (SIGMA). Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην εύρεση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών ενός αγνώστου δείγµατος µετά απο σύγκριση µε γνωστές συγκεντρώσεις της αλβουµίνης του ορού βοδιού (BSA). Αναλυτικώτερα η πορεία έχει ως εξής: 49

64 Υλικά και Μέθοδοι Αναµιγνύονται 100 µl διαλύµατος BSA γνωστών συγκεντρώσεων (0.4, 0.6, 1, 1.4 µg/µl), µε 3ml αντιδραστηρίου Bradford (Bradford reagent) και αντίστοιχα 100µl γνωστών αραιώσεων του άγνωστου δείγµατος (1:10, 1:50, 1:100) µε την ίδια ποσότητα του αντιδραστηρίου Bradford. Τα δείγµατα επωάζονται για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, ώστε να σχηµατιστούν ειδικά σύµπλοκα µε τα πρωτεϊνικά µόρια που περιέχονται στο διάλυµα. Τα σύµπλοκα αυτά απορροφούν σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος (595nm). Στη συνέχεια µετράται η απορρόφηση των πρωτεϊνικών συµπλόκων. Με δεδοµένο τις τιµές απορρόφησης των συµπλόκων της γνωστής ποσότητας της πρωτεΐνης BSA σχεδιάζεται µία πρότυπη καµπύλη, σύµφωνα µε την οποία υπολογίζεται η συγκέντρωση του άγνωστου δείγµατος Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών σε κάθετο πήκτωµα ακρυλαµιδίου/bis-ακρυλαµιδίου, παρουσία θειϊκού δωδεκυλικού νατρίου(sds), (SDS-PAGE, Laemli 1970). Με τη βοήθεια αυτής της µεθόδου διαχωρίζονται µε βάση το µέγεθός τους τα διάφορα πρωτεϊνικά µόρια που υπάρχουν στα κύτταρα ή στα υποκυτταρικά συστατικά ενός οργανισµού. Το θεϊκό δωδεκυλικό νάτριο (SDS) προσδένεται στα πρωτεϊνικά µόρια, τα αποδιαττάσει και τους προσδίδει αρνητικό φορτίο έτσι ώστε να µπορούν να διαχωριστούν µε βάση το µέγεθός τους και µόνο. Πρακτικά, για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες των µεµβρανών, ποσότητα 50µg διαλύµατος µεµβρανών (κλάσµα Ρ2) σε διάλυµα 0.1Μ Tris ph 7.4, διαλυτοποιείται µε 0.1% Triton X-100 σε θερµοκρασία δωµατίου για µισή ώρα. Το διάλυµα φυγοκεντρείται για 5 λεπτά σε στροφές ανά λεπτό και το υπερκείµενο (κυρίως διαµεµβρανικές πρωτεΐνες) αναµιγνύεται µε µισό όγκο διαλύµατος ηλεκτροφόρησης δείγµατος (SDS-loading buffer: 50mM Tris-Cl ph 6.8, 100mM dithiothreitol (DTT), 2% SDS (electrophoresis grade) 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol), συµπυκνωµένο 3 φορές. Επωάζεται για 5 λεπτά στους 100 o C ώστε να αποδιαταχθούν οι πρωτεΐνες και φορτώνεται σε πήκτωµα συγκέντρωσης πολυακρυλαµιδίου 12%). Εφαρµόζεται ηλεκτρικό πεδίο ώστε οι αρνητικά φορτισµένες, λόγω του SDS, πρωτεΐνες να µεταναστεύσουν προς τον θετικό πόλο. Η ηλεκτροφόρηση τερµατίζεται όταν η ενδεικτική χρωστική µπλέ της βρωµοφαινόλης που εµπεριέχεται στο διάλυµα ηλεκτροφόρησης των δειγµάτων, µεταναστεύσει στην άκρη του πηκτώµατος στον θετικό πόλο. 50

65 Υλικά και Μέθοδοι Χρώση των πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου Η χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250 έχει την ιδιότητα να προσδένεται επιλεκτικά στις πρωτεΐνες. Με τον τρόπο αυτό γίνεται εµφανής η θέση µετανάστευσης των πρωτεϊνών µέσα σε πήκτωµα ακρυλαµιδίου. Η διαδικασία περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωµα εµβαπτίζεται, για µία ώρα, σε διάλυµα χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250 συγκέντρωσης 2.5% σε ισοπροπανόλη 10% και οξικό οξύ 5%. Με το τρόπο αυτό, παράλληλα µε την χρώση τους οι πρωτεΐνες του πηκτώµατος µονιµοποιούνται στην θέση που µετανάστευσαν κατά την διάρκεια της ηλεκτροφόρησης και δεν διαχέονται µέσα στο πήκτωµα. Στη συνέχεια, το πήκτωµα αποχρωµατίζεται µε διάλυµα ισοπροπανόλης 10% και οξικού οξέος 5%, µε συνεχείς αλλαγές µέχρι να παραµείνει χρωστική προσδεδεµένη µόνο στις πρωτεΐνες του πηκτώµατος Ανοσοχηµικές Μέθοδοι Ανοσοτύπωµα (western blotting) Με την βοήθεια της µεθόδου αυτής ταυτοποιείται ένα πολυπεπτίδιο ή µία συγκεκριµένη µορφή του που έχει αρχικά διαχωριστεί µε SDS-PAGE. Ο προσδιορισµός γίνεται µε την βοήθεια µονοκλωνικών ή πολυκλωνικών αντισωµάτων που αναγνωρίζουν ειδικά το συγκεκριµένο πολυπεπτίδιο και προσδένονται σε αυτό. Ειδικότερα, πρωτεΐνες µετά από ανάλυση σε SDS-PAGE µεταφέρονται σε φύλλο νιτροκυτταρίνης (NC) µε τη βοήθεια ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης ρεύµατος 300mAmp που αναπτύσσεται σε διάλυµα το οποίο περιέχει 39mM Tris, 48mM Glycine, 0.037% SDS και 20% Μεθανόλης ph >=8,3. Η µεταφορά διαρκεί συνήθως για 1 εως 3 ώρες ανάλογα το πάχος του πηκτώµατος και το µέγεθος των πρωτεϊνών που επιθυµείται να µεταφερθούν, σε θερµοκρασία 4 ο C. Κατόπιν το φύλλο νιτροκυτταρίνης επωάζεται σε άπαχο γάλα 5% κ.β. σε TBS, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου ή µισή ώρα στους 37 o C, ώστε να δεσµευτούν οι µη ειδικές θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών πάνω στην NC από τις πρωτεΐνες του γάλακτος. Ακολουθούν 3 πλυσίµατα σε TBS και επώαση µε το κατάλληλο αντίσωµα αραιωµένο σε BSA 3% σε TBS. 51

66 Υλικά και Μέθοδοι Συγκεκριμένα έγινε επώαση με το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι του αντιγόνου ΒΜ88 σε αραίωση 1:200 και με το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης του κυτταροσκελετού α-τουμπουλίνης (α-tubulin) σε αραίωση 1:500. Ακολουθούν 3 πλυσίµατα µε διάλυµα BSA 0.3% σε TBS και επώαση µε το ανάλογο αντι-αντίσωµα. Συγκεκριμένα έγινε επώαση με τα αντι-αντισώµατα έναντι της ανοσοσφαιρίνης του κουνελιού και του ποντικού που ήταν συνδεδεµένα µε βιοτίνη. Τα παραπάνω αντισώματα συνδιάστηκαν με ακόλουθη προσθήκη αβιδίνης συνδεδεµένης µε υπεροξειδάση. Τελικά η θέση πρόσδεσης του πρώτου αντισώµατος ανιχνεύεται µε το υπόστρωµα της υπεροξειδάσης διαµινοβενζιδίνη (15µg/100ml TBS), χρησιµοποιώντας ίση ποσότητα NiCl σαν ενισχυτή της αντίδρασης. Η αντίδραση σταµατά µε H 2 O µετά απο τον επιθυµητό χρόνο επώασης Ανοσοϊστοχηµεία / ανοσοφθορισµός (Immunohistochemistry / Immunofluoresence) Η µέθοδος αυτή δίνει την δυνατότητα ανίχνευσης και εντόπισης της θέσης µιας πρωτεΐνης µέσα σε ιστούς και κύτταρα που την εκφράζουν. Χρησιµοποιώντας κατάλληλη τεχνολογία µπορεί να υπολογιστεί και η ποσότητα µίας συγκεκριµένης πρωτείνης. Υπάρχει επίσης η δυνατότητα σύγχρονης ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης παραπάνω της µίας πρωτεϊνών που εκφράζονται στον ίδιο ιστό ή κύτταρο. Για την ανίχνευση της έκφρασης µίας πρωτεΐνης σε έναν ιστό ακολουθείται η εξής διαδικασία: Έγκλειση ιστών και κόψιµο λεπτών τοµών α.Εγκλειση ιστών σε παραφίνη και λήψη τομών σε μικροτόμο Η µέθοδος αυτή µονιµοποιεί τον προς εξέταση ιστό διατηρώντας σε µεγάλο βαθµό την δοµή του και επιτρέπει την επίτευξη και την περαιτέρω ανάλυση τοµών πολύ λεπτού πάχους (έως τουλάχιστον 5µm) µε την βοήθεια ειδικού µηχανήµατος, του µικροτόµου παραφίνης. α) Προετοιµασία του ιστού για έγκλειση Για την καλύτερη διεκπεραίωση της συγκεκριµένης διαδικασίας προθερµαίνουµε στους 65 ο C για τουλάχιστον 16 ώρες όλα τα γυαλικά και τις λαβίδες που θα χρειαστούν καθώς και την απαραίτητη ποσότητα παραφίνης για να λιώσει. 52

67 Υλικά και Μέθοδοι Αφαιρείται προσεκτικά ο πρόσθιος εγκέφαλος και πλένεται µε 1x PBS που έχει θερμοκρασία 4 ο C. Μονιµοποιείται σε διάλυµα παραφορµαλδεϋδης 4% (PF) σε PBS ή στο μονιμοποιητικό διάλυμα Histochoice, για διάστηµα που ποικίλλει ανάλογα με το πάχος του απο 3 έως 16 ώρες. Η παρασκευή του διαλύµατος παραφορµαλδεϋδης (PF) 4% σε PBS πραγµατοποιείται ως εξής: Σε θερµαινόµενο µαγνητικό αναδευτήρα και µέσα σε απαγωγό, αναµιγνύεται 4% κ.β. PF σε PBS 1x. Το διάλυµα αναδεύεται για 1 ώρα στους 60 ο C. Προστίθενται λίγες σταγόνες ΝaOH, ώστε το διάλυµα να γίνει διαυγές και αφού ογκοµετρηθεί φιλτράρεται από Whatman 1M. Χωρίζεται ανά 50ml και φυλάσσεται στους 20 ο C. Ακολουθεί εκτεταµένο πλύσιµο του ιστού µε 1x PBS, ώστε να αποµακρυνθούν ενεργά υπολείµατα του µέσου µονιµοποίησης. β) Αφυδάτωση του ιστού Ακολουθεί σταδιακή αφυδάτωση του ιστού µε µια σειρά από διαδοχικές επωάσεις σε αυξανόµενες συγκεντρώσεις αιθανόλης (EtOH), ώστε να επιτραπεί στη συνέχεια η διείσδυση της παραφίνης. Η πορεία των επωάσεων είναι η εξής: EtOH 70% (x 2 φορές), RT, 30 λεπτά EtOH 85% (x 2 φορές), RT, 30 λεπτά EtOH 95% (x 2 φορές), RT, 30 λεπτά EtOH 100% (x 2 φορές), RT, 30 λεπτά Τα διαλύµατα αιθανόλης παρασκευάζονται φρέσκα, ώστε να µην τροποποιείται η συγκέντρωση της αιθανόλης λόγω εξάτµισης. Παράλληλα η λυωµένη παραφίνη φιλτράρεται µέσα από χαρτί χρωµατογραφίας Whatman 3M, ώστε να συγκρατηθούν τυχόν αδιάλυτα τµήµατα και σκουπίδια. Συγχρόνως προθερµαίνεται κατάλληλη ποσότητα ξυλενίου για το επόµενο στάδιο. Ο αφυδατωµένος ιστός επωάζεται στη συνέχεια 2 φορές µε 100% ξυλένιο, σε απαγωγό, για 20 λεπτά (RT). γ) Παραφινοποίηση του ιστού Ακολουθεί επώαση µε διάλυµα ξυλενίου / παραφίνης (1:1), στους 65 ο C για 45 λεπτά. Τελικά ο ιστός εµβαπτίζεται σε 100% παραφίνη (x 3) στους 65 ο C και επωάζεται για 20 λεπτά ανά εµβάπτιση. Η τελευταία επώαση µε την παραφίνη πραγµατοποιείται στο δοχείο όπου θα παραµείνει για να σχηµατιστεί το καλούπι ιστού-παραφίνης. 53

68 Υλικά και Μέθοδοι Οσο η παραφίνη είναι ακόµα υγρή, διευθετείται ο ιστός στο κέντρο του δοχείου και αφήνεται µετά το τέλος της τελευταίας 20λεπτης επώασης να στερεοποιηθεί σε θερµοκρασία δωµατίου (Ο/Ν). Τα καλούπια φυλλάσονται στους 4 ο C όπου διατηρούνται για αρκετό διάστηµα. (δ) Κόψιµο λεπτών τοµών του ιστού σε µικροτόµο παραφίνης. Πρώτο βήµα αυτού του σταδίου αποτελεί η επίστρωση των αντικειµενοφόρων πλακών πάνω στις οποίες θα τοποθετηθούν οι τοµές µε 3-aminopropyltriethoxysilane (Τespa). Η προεργασία αυτή εξασφαλίζει την προσκόλληση των τοµών παραφίνης του ιστού επάνω στις αντικειµενοφόρους και την παραµονή τους κατά την διάρκεια της επεξεργασίας που θα ακολουθήσει. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Οι αντικειµενοφόροι εµβαπτίζονται σε διάλυµα HCl 10% σε 70% EtOH και επωάζονται για 10 λεπτά, ώστε να διαλυθούν τυχόν πρωτεΐνες και λίπη. Ακολουθούν αρκετά πλυσίµατα µε H 2 O και επώαση σε ΕtOH 95% για 5 λεπτά. Στεγνώνονται στους 150 ο C (30 λεπτά έως 1 ώρα) και αφήνονται να κρυώσουν. Στη συνέχεια εµβαπτίζονται σε διάλυµα 2% TESPA σε ακετόνη. Ακολουθούν δύο πλυσίµατα µε ακετόνη (30 δευτερόλεπτα ανά πλύσιµο) και ένα µε H 2 O. Aπό το στάδιο εµβάπτισης σε TESPA, οι επωάσεις πραγµατοποιούνται σε απαγωγό λόγω της πτητικότητας των τοξικών ουσιών που χρησιµοποιούνται. Τέλος, οι αντικειµενοφόροι αφήνονται να στεγνώσουν Ο/Ν στους 37 ο C. Αναλυτικά, η πορεία κοπής των τοµών ακολουθεί τα παρακάτω βήµατα. Αρχικά ζεσταίνεται επιτραπέζια πλάκα µε στείρο τρυβλίο petri που περιέχει στείρο H 2 O του οποίου η θερµοκρασία ρυθµίζεται από τους 40 ο C - 43 ο C. Η τελική θερµοκρασία επιλέγεται ώστε οι τοµές παραφίνης να ξετυλίγονται µέσα στο H 2 O, αλλά να µην ξεκολλάνε από την περιβάλλουσα παραφίνη. Στη συνέχεια αποµακρύνεται από τα καλούπια ιστού-παραφίνης η περίσσεια της παραφίνης µε ζεστή λεπίδα νυστεριού ώστε να αποµείνει γύρω από τον ιστό παραφίνη σε σχήµα τραπεζίου. Το καλούπι ιστού-παραφίνης µε το επιθυµητό σχήµα, τοποθετείται για λίγο στους 4 ο C ώστε να ξαναγίνει σκληρό και συµπαγές µε αποτέλεσµα να κόβεται ευκολότερα και µε µεγαλύτερη ακρίβεια. Τελικά το επεξεργασµένο καλούπι τοποθετείται στην ειδική υποδοχή του µικροτόµου παραφίνης. Κόβονται 3-10 συνεχόµενες τοµές πάχους 5µm υπό τύπο κορδέλας. 54

69 Υλικά και Μέθοδοι Με τη βοήθεια ενός πινέλου µεταφέρονται προσεκτικά στο τρυβλίο µε το H 2 O, όπου ξετυλίγονται και στη συνέχεια τοποθετούνται, µε τη βοήθεια του πινέλου, στην επιστρωµένη µε TESPA αντικειµενοφόρο. Το υπόλοιπο καλούπι ιστού παραφίνης φυλάσσεται στους 4 ο C µέχρι να ξαναχρησιµοποιηθεί. Οι τοµές αφήνονται σε ειδικό στατώ να στεγνώσουν καλά στους 37 ο C Ο/Ν. Γενικά οι τομές του πρόσθιου εγκεφάλου που κόβονται μπορούν να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες ανάλογα με τον άξονα κατά τον οποίο τοποθετείται ο ιστός στο όργανο κοπής και αυτές είναι οι εξής: Α) Εγκάρσιες Β) Στεφανιαίες Γ) Οριζόντιες Ο κάθε άξονας και η ορολογία που αντιστοιχεί σ αυτόν φαίνονται παραστατικά στο παρακάτω σχήμα (σχήμα 22). Σχ. 22. Σχηματική απεικόνηση των διαφορετικών τομών στις οποίες μπορεί να κοπεί ένας εγκέφαλος ποντικού ανάλογα με τον προσανατολισμό τους ως προς τον τον οριζόντιο άξονα β.Έγκλειση ιστών σε Ο.C.T. (BDH) και λήψη τομών σε κρυοστάτη Επειδή η μονιμοποίηση των ιστών σε παραφορμαλδεϋδη και η παραφινοποίησή τους είναι μία διαδικασία που μπορεί να αλλοιώσει τις αντιγονικές ιδιότητες κάποιων πρωτεϊνών, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθεί μία εναλλακτική μέθοδος έγκλεισης των ιστών. Συγκεκριμένα οι ιστοί προσεκτικά αφαιρούνται και πλένονται µε 1x PBS που έχει θερμοκρασία 4 ο C, μετά τοποθετούνται σε ειδικές θήκες-καλούπια με τον κατάλληλο προσανατολισμό. 55

70 Υλικά και Μέθοδοι Έπειτα ο ιστός περιβάλλεται από την ειδική κόλλα Ο.C.T της εταιρείας BDH που έχει την ιδιότητα να βρίσκεται σε υγρή μορφή σε θερμοκρασία δματίου αλλά στερεοποιείται σε χαμηλές θερμοκρασίες (-4 ο C ). Το καλούπι ιστού-κόλλας τοποθετείται πάνω από ατμούς υγρού αζώτου (Ν 2 ) και έτσι ο ιστός στερεοποιείται μαζί με την κόλλα λόγω της πολύ χαμηλής θερμοκρασίας. Οι παγωμένοι μη μονιμοποιημένοι ιστοί μπορούν έτσι να αποθηκευτούν στους -80 ο C για μεγάλο χρονικό διάστημα. Το καλούπι ιστού - Ο.C.T. είναι σκληρό και συµπαγές µε αποτέλεσµα να κόβεται εύκολα και µε µεγάλη ακρίβεια όταν τοποθετηθεί στην ειδική υποδοχή του κρυοστάτη και σε θάλαμο που έχει σταθερή θερμοκρασία -20 ο C. Κόβονται 3-10 συνεχόµενες τοµές πάχους 12 µm. Οι τομές µεταφέρονται προσεκτικά σε ειδικές θετικά φορτισμένες αντικειµενοφόρους πλάκες. Το υπόλοιπο καλούπι ιστού παραφίνης φυλάσσεται στους -80 ο C µέχρι να ξαναχρησιµοποιηθεί. Οι τοµές αφήνονται σε ειδικό στατώ να στεγνώσουν καλά σε θερμοκρασία δωματίου και πρέπει να χρησιμοποιηθούν την ίδια μέρα για χρώσεις ανοσοφθορισμού Αποπαραφινοποίηση και ενυδάτωση των ιστών (το στάδιο αυτό δεν πραγματοποιείται για τους ιστούς που έχουν υποστεί έγκλειση σε Ο.C.T) Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με τις τομές του ιστού προθερμαίνονται στους 58 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί αποπαραφινοποίηση των ιστών μέσα σε ένα γυάλινο δοχείο με ξυλόλη όπου και παραμένουν για 30 λεπτά στους 58 ο C. Έπειτα οι ιστοί ενυδατώνονται σταδιακά με εμβάπτιση σε µια σειρά από διαδοχικές ελλατούµενες συγκεντρώσεις αιθανόλης (EtOH), ώστε να επιτραπεί στη συνέχεια η διείσδυση του υδατικού διαλύματος μέσα στους ιστούς. Η πορεία των επωάσεων είναι η εξής: EtOH 100 % (x 2 φορές), RT, 5 λεπτά EtOH 70 % (x 2 φορές), RT, 5 λεπτά EtOH 50 % (x 2 φορές), RT, 5 λεπτά EtOH 30 % (x 2 φορές), RT, 5 λεπτά PBS 1x, RT, 5 λεπτά 56

71 Υλικά και Μέθοδοι Επώαση των τομών με το ή τα πρωτοταγή αντισώματα Οι ιστοί αρχικά επαναμονιμοποιούνται είτε σε HISTOCHOICE, είτε σε 4% παραφορμαλδεϋδη (ανάλογα με την αρχική τους μονιμοποίηση) για 10min σε R.T. Ακολουθούν πλυσίματα σε PBS 1x, για 10min σε RT και υπό ελαφρά ανακίνηση. Οι ιστοί κατόπιν επωάζονται σε ζελατίνη ψαριού 0.2% κ.β. σε PBS, για 20 λεπτά σε θερµοκρασία 37 o C, ή σε 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας (normal goat serum, NGS) ανάλογα με το πείραμα ώστε να δεσµευτούν οι µη ειδικές θέσεις πρόσδεσης των πρωτοταγών αντισωμάτων πάνω στις τομές, από τη ζελατίνη. Πίνακας Α Πρωτοταγές αντίσωμα Αραίωση αντισώματος Διάλυμα επώασης Μονοκλωνικό 1:50 ζελατίνη 0.02 % αντι-βμ88 ποντικού Πολυκλωνικό αντι-bm88 κουνελιού 1:20 10% ΝGS, 0.1%Τriton X-100 Πολυκλωνικό 1:100 ζελατίνη 0.02 % αντι-gfap κουνελιού Πολυκλωνικό 1:100 ζελατίνη 0.02 % αντι-ng2 κουνελιού Πολυκλωνικό 1:50 ζελατίνη 0.02 % αντι-cyclin B1 κουνελιού Μονοκλωνικό αντι-glast ποντικού 1:500 10% ΝGS 0.1%Τriton X-100 Πολυκλωνικό 1:50 ζελατίνη 0.02 % αντι-nestin κουνελιού Μονοκλωνικό 1:100 ζελατίνη 0.02 % αντι NeuN ποντικού Μονοκλωνικό αντι-rc2 ποντικού 1:500 10% ΝGS 0.1%Τriton X-100 Μονοκλωνικό αντι-psa-νcam ποντικού 1:100 10% ΝGS 0.1%Τriton X-100 Ακολουθούν 3 πλυσίµατα 10 λεπτών σε PBS, υπό ελαφρά ανακίνηση και επώαση µε το ή τα κατάλληλα πρωτοταγή αντίσωµατα αραιωµένα σε ζελατίνη 0.02% 57

72 Υλικά και Μέθοδοι ή σε 10% NGS σε PBS στους 4 o C, O/N. Για την ανοσοϊστοχημική χρώση των τομών με ορισμένα αντισώματα είναι απαραίτητη η προσθήκη Triton X-100 στο διάλυμα επώασης. Επιπλέον, για την καλύτερη ανοσοϊστοχημική χρώση με ορισμένα αντισώματα, κάποιες τομές υποβλήθηκαν στη διαδικασία ζέσης με τη βοήθεια απλού φούρνου μικροκυμάτων έντασης 80Watt, για 5 λεπτά επί δύο φορές και με χρόνο παρεμβολής 10 λεπτά, ενώ καθόλη τη διαδικασία οι τομές είναι εμβαπτυσμένες σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος 0.01Μ, ph 6.0. Συγκεκριμένα, τα διαλύματα αραίωσης αλλά και οι συνδιασμοί των διαφόρων πρωτοταγών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται αναλυτικά στους πίνακες Α και Β αντίστοιχα. Πίνακας Β Συνδιασμός πρωτοταγών αντισωμάτων (Διπλές ταυτόχρονες χρώσεις) Πολυκλωνικό Μονοκλωνικό αντι-bm88 κουνελιού & αντι NeuN ποντικού Μονοκλωνικό Πολυκλωνικό αντι-βμ88 ποντικού & αντι-gfap κουνελιού Μονοκλωνικό Πολυκλωνικό αντι-βμ88 ποντικού & αντι-νg2 κουνελιού Μονοκλωνικό Πολυκλωνικό αντι-βμ88 ποντικού & αντι-cyclinb1 κουνελιού Πολυκλωνικό Μονοκλωνικό αντι-bm88 κουνελιού & αντι -RC2 ποντικού Πολυκλωνικό Μονοκλωνικό αντι-bm88 κουνελιού & αντι -GLAST ποντικού Πολυκλωνικό Μονοκλωνικό αντι-bm88 κουνελιού & αντι-psa-νcam ποντικού Μονοκλωνικό Πολυκλωνικό αντι-βμ88 ποντικού & αντι-nestin κουνελιού Ακολουθούν 3 πλυσίµατα µε διάλυµα PBS, 10min, RT υπό ελαφρά ανακίνηση.. 58

73 Υλικά και Μέθοδοι Επώαση των τομών με το ή τα δευτεροταγή αντισώματα Aκολουθεί επώαση µε το ανάλογο αντι-αντίσωµα το οποίο είναι συνδεδεµένο µε κατάλληλη φθορίζουσα ουσία, με αλκαλική φωσφατάση ή με βιοτίνη ανάλογα με το είδος του πειράματος και όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Η επώαση αυτή διαρκεί 2 ώρες σε RT και στο ίδιο διάλυμα επώασης με αυτό των πρωτοταγών αντισωμάτων. Ακολουθούν 3 πλυσίµατα µε διάλυµα PBS, 10min, RT υπό ελαφρά ανακίνηση. Στις τομές που έχει χρησιμοποιηθεί δευτεροταγές αντίσωμα συνδεδεμένο με βιοτίνη ακολουθεί και τρίτη επώαση των τομών με το ένζυμο υπεροξειδάση συνδεδεμένο με αβιδίνη. Η επώαση αυτή διαρκεί 1 ώρα σε RT και στο ίδιο διάλυμα επώασης με αυτό των πρωτοταγών αντισωμάτων σε συγκέντρωση 1:500. Ακολουθούν 3 πλυσίµατα µε διάλυµα PBS, 10min, RT υπό ελαφρά ανακίνηση Έτσι, η θέση πρόσδεσης του πρώτου αντισώµατος ανιχνεύεται είτε κατευθείαν με τη φθορίζουσα ουσία και την ανάλυση της εικόνας σε μικροσκόπιο φθορισμού, είτε με το υπόστρωμα της αλκαλικής φωσφατάσης ΝΒΤ/ΒCIP, είτε με το υπόστρωµα της υπεροξειδάσης διαµινοβενζαμιδίνη (DAB, 15 µg/100ml σεtbs με τη προσθήκη 0,03%κ.ο. Η 2 Ο 2 30%). Συγκεκριμένα οι αραιώσεις και οι συνδιασμοί των διαφόρων δευτεροταγών αντισωμάτων αναφέρονται αναλυτικά στον πίνακα Γ. Για να αποκλείσουμε τη πιθανότητα η ανοσοϊστοχημική χρώση να οφείλεται σε μη ειδική δέσμευση του δεύτερου αντισώματος σε άλλες πρωτεΐνες του ιστού ή στην αλληλεπίδραση των διαφόρων αντισωμάτων μεταξύ τους (όταν πρόκειται για διπλές ή τριπλές χρώσεις), χρησιμοποιούμε πάντα τη μία από τις τομές της αντικειμενοφόρου πλάκας για αρνητικό μάρτυρα. Η τoμή-αρνητικός μάρτυρας υπόκειται σε ολόκληρη τη διαδικασία χρώσης εκτός από αυτή της επώασης με το/τα πρωτοταγές/ή αντισώματα. 59

74 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας Γ Συνδιασμός πρωτοταγών αντισωμάτων αντι-bm88 κουνελιού & αντι- NeuN ποντικού αντι-βμ88 ποντικού & αντι-gfap κουνελιού αντι-βμ88 ποντικού & αντι- ΝG2 κουνελιού αντι-βμ88 ποντικού & αντι-cyclinb1 κουνελιού αντι-bm88 κουνελιού & αντι - RC2 ποντικού αντι-bm88 κουνελιού & αντι -GLAST ποντικού αντι-bm88 κουνελιού & αντι-psa-νcam ποντικού αντι-βμ88 ποντικού & αντι-nestin κουνελιού Συνδιασμός δευτεροταγών αντισωμάτων και οι αραιώσεις τους στο διάλυμα επώασης Αντι-ΙgGs κουνελιού-βιοτίνη (1:200) & Αντι- ΙgGs ποντικούαλκαλική φωσφατάση (1:200) Αντι-ΙgGs ποντικού-fitc (1:100) & Αντι-ΙgGs-κουνελιού-TRITC (1:100) Αντι-ΙgGs ποντικού-fitc (1:100) & Αντι-ΙgGs κουνελιού-tritc (1:100) Αντι-ΙgGs ποντικού-fitc (1:100) & Αντι- ΙgGs κουνελιού-tritc (1:100) Αντι-ΙgGs-κουνελιού-FITC (1:100) & Αντι-ΙgGs ποντικού-tritc (1:100) Αντι-ΙgGs-κουνελιού-FITC (1:100) & Αντι-ΙgGs ποντικού TRITC (1:100) Αντι-ΙgGs-κουνελιού-FITC (1:100) & Αντι-ΙgGs ποντικού-tritc (1:100) Αντι-ΙgGs ποντικού-fitc (1:100) & Αντι-ΙgGs κουνελιού-tritc (1:100) Τέλος της διαδικασίας χρώσης και επεξεργασία των τομών πριν τη παρατήρηση στο μικροσκόπιο Η αντίδραση σταµατά µε H 2 O µετά απο τον επιθυµητό χρόνο επώασης. Για να γίνει δυνατή η παρατήρηση των τομών στο μικροσκόπιο πρέπει να υποστούν και την ανάλογη επεξεργασία: α) Οι τοµές που έχουν επωαστεί με υπεροξειδάση ή με αλκαλική φωσφατάση, αφυδατώνονται με εμβάπτισή τους σε µια σειρά από διαδοχικές αυξανόµενες συγκεντρώσεις αιθανόλης (EtOH) και μία τελική εμβάπτιση σε ξυλόλη 100%. Κατόπιν επικαλύπτονται µε DPX, το οποίο διατηρεί την μορφολογία του ιστού και τη «ζωηρότητα» των χρωμάτων για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα. 60

75 Υλικά και Μέθοδοι Αφήνουμε τις τομές να στεγνώσουν για 30 λεπτά περίπου και μετά παρατηρούμε τη χρώση σε οπτικό μικροσκόπιο. β) Οι τοµές που έχουν επωαστεί με αντισώματα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες µοντάρονται µε CITIFLUOR, το οποίο διατηρεί την ένταση του φθορισμού σε υψηλά επίπεδα για μεγάλο χρονικό διάστημα υπό την προϋπόθεση ότι οι τομές διατηρούνται σκοτάδι και στους 4 o C. Αφήνουμε τις τομές να στεγνώσουν στο σκοτάδι για 30 λεπτά περίπου και μετά παρατηρούμε τη χρώση σε μικροσκόπιο φθορισμού, χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα φίλτρα Σήμανση μορίων DNA κατά τη φάση της αντιγραφής (φάση S) του κυτταρικού κύκλου Ιχνηθέτηση του DNA με το μοριακό ανάλογο της θυμιδίνης (Τhy), βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) Ο κυτταρικός κύκλος διαιρείται σε διάφορες φάσεις ανάλογα με τη μορφολογία και τις λειτουργίες του χρωμοσωμικού DNA. Στο σχήμα 23 φαίνεται μία διαγραμματική απεικόνηση των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Ως φάση S αποκαλείται η χρονική περίοδος σύνθεσης του DNA. Η διάρκεια της φάσης S είναι χαρακτηριστική για το ίδιο είδος κυττάρων και ελάχιστα επηρεάζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος. Συγκεκριμένα για τους πρώιμους νευρώνες η διάρκεια σύνθεσης του DNA διαρκεί 6 ώρες περίπου. Σχ. 23. Σχηματική απεικόνηση του κυτταρικού κύκλου 61

76 Υλικά και Μέθοδοι Ένας τρόπος να ξεχωρίσει κανείς κύτταρα που πολλαπλασιάζονται μέσα σε ένα πληθυσμό κυττάρων που έχουν σταματήσει να διαιρούνται, είναι να ιχνηθετήσει κανείς το DNA τους με βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) που είναι ανάλογο της θυμιδίνης. Το BrdU έχει την ιδιότητα να ενσωματώνεται στο DNA μόνο κατά τη διάρκει της φάσης S, ενώ μπορεί να ανιχνευτεί εύκολα με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων (αντι-brdu αντίσωμα). Για τη σήμανση και τη παρακολούθηση in vivo κυττάρων του προσθίου εγκεφάλου που βρίσκονται σε διαδικασία πολλαπλασιασμού, το BrdU μπορεί να χορηγηθεί στα ζώα με ενδοπεριτοναϊκή ένεση και να ανιχνευτεί με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους μετά από πολύ σύντομο ή πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα (μετά από λίγα λεπτά ή και μετά από πολλούς μήνες). Στα συγκεκριμένα πειράματα για τη σήμανση DNA σε αρουραίοες ηλικίας Ρ0 και Ρ6, χορηγείται BrdU σε τελική συγκέντρωση 50mg/kg ζώου σε PBS, ph 7.5 με ενδοπεριτοναϊκή ένεση στην κάτω κοιλιακή χώρα. Για να γίνει δυνατή η σήμανση DNA σε έμβρυα αρουραίων ηλικίας E14 και E18, το BrdU χορηγείται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση στα έγκυα θηλυκά άτομα και ενσωματώνεται στα έμβρυά τους μέσω του πλακούντα. Κατόπιν οι εγκέφαλοι αφαιρούνται από τα προς μελέτη ζώα είτε 1.5 ώρα είτε 4 μετά την ένεση με BrdU και υπόκεινται τις διαδικασίες της μονιμοποίησης, αφυδάτωσης και παραφινοποίησης όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να γίνει δυνατή η ανίχνευση του BrdU οι ιστοί αφού κοπούν σε στεφανιαίες τομές, αφυδατωθούν και επαναμονιμοποιηθούν όπως έχει ήδη περιγραφεί εκτενώς παραπάνω, υπόκεινται σε μία επώαση με 2N HCl, 0.1% Triton X-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτή η επώαση των τομών είναι απαραίτητη για την διείσδυση του αντι-brdu αντισώματος στον πυρήνα των κυττάρων. Ακολουθεί μία επώαση σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα εξισορόπησης βορικού οξέος 0.1M και δύο πλυσίματα των 5 λεπτών σε PBS υπό ελαφρά ανακίνηση. Κατόπιν οι τομές επωάζονται με αντί- BrdU αντίσωμα αρουραίου σε αραίωση 1:50 και η περίσσεια αντισώματος φεύγει με τρία πλυσίματα των 5 λεπτών υπό ελαφρά ανακίνηση. Ακολουθεί μία δεύτερη επώαση με αντι-αντίσωμα αρουραίου συνδεδεμένο με τη βιοτίνη σε αραίωση 1:200 και άλλα τρία πλυσίματα των 10 λεπτών υπό ελαφρά ανακίνηση. Τέλος οι τομές επωάζονται με στρεπταβιδίνη, συνδεδεμένη ομοιοπολικά με τη φθορίζουσα ουσία Texas red, σε αραίωση 1:100 και ξεπλένονται για άλλη μια φορά με τρία πλυσίματα με PBS των 10 λεπτών υπό ελαφρά ανακίνηση. 62

77 Υλικά και Μέθοδοι Για να γίνει δυνατή η παρατήρηση του BrdU, οι τομές μοντάρονται με CIFLUOR. Οι χρώσεις ανσοφθορισμού για BrdU συνδιάστηκαν με χρώσεις έναντι του αντιγόνου BM88 (διπλή χρώση ανοσοφθορισμού) ή έναντι του BM88 και της πρωτεΐνης nestin (τριπλή χρώση) ή έναντι της πρωτεΐνης BM88 και της πρωτεΐνης GFAP (τριπλή χρώση). Για τις διπλές και τριπλές αυτές χρώσεις χρειάστηκε να εφαρμοστεί ένα ειδικό πρωτόκολλο έτσι ώστε να μην χάνονται οι αντιγονικές ιδιότητες της πρωτεΐνης ΒΜ88 λόγω της επεξεργασίας στην οποία υπόκεινται οι τομές για την ανίχνευση του BrdU. Έτσι οι τομές πριν την επώασή τους με HCΙ, Triton X-100 και με βορικό οξύ επωάζονται πρώτα με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88, ή για τις τριπλές χρώσεις, με ένα μίγμα αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της nestin ή της GFAP. Ακολουθεί επώαση με τα κατάλληλα αντι-αντισώματα όπως φαίνεται στον πίνακα Δ και τέλος πραγματοποιείται η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του BrdU σύμφωνα με την προαναφερθείσα διαδικασία. Οι αραιώσεις των αντισωμάτων είναι ίδιες με αυτές που αναγράφονται στους δύο προηγούμενους πίνακες. Πίνακας Δ Είδος χρώσης ΒΜ88/ BrdU ΒΜ88/ Nestin/ BrdU ΒΜ88/ GFAP/ BrdU 3 ο αντίσωμα 4 ο αντίσωμα αντί-brdu αντιαντίσωμα αντίσωμα αρουραίου αρουραίουβιοτίνη αντί-brdu αντιαντίσωμα αντίσωμα αρουραίου αρουραίουβιοτίνη αντί- BrdU αντιαντίσωμα αντίσωμα αρουραίου αρουραίου- Cy5 (1:100) 1 ο αντίσωμα 2 ο αντίσωμα Επεξεργασία τομών αντι-βμ88 αντι-ιggs HCΙ, Triton ποντικού ποντικού-fitc X-100 και βορικό οξύ αντι-βμ88 αντι-ιggs HCΙ, Triton ποντικού & ποντικού-fitc X-100 και αντι-nestin & βορικό οξύ κουνελιού αντι-ιggs κουνελιού- TRITC αντι-βμ88 αντι-ιggs HCΙ, Triton ποντικού & ποντικού-fitc X-100 και αντι-gfap & βορικό οξύ κουνελιού αντι-ιggs- κουνελιού- TRITC 63

78 Υλικά και Μέθοδοι Το τέταρτο αντίσωμα διαδέχεται επώαση με στρεπταβιδίνη, συνδεδεμένη ομοιοπολικά με τη φθορίζουσα ουσία Texas red όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω και μοντάρισμα με CIFLUOR εκτός από τις τομές που υπόκεινται στην τριπλή χρώση ΒΜ88/ GFAP/ BrdU. Οι τομές ΒΜ88/ GFAP/ BrdU υπόκεινται κατευθείαν σε μοντάρισμα. Όπως και στις προηγούμενες ανοσοϊστοχημικές χρώσεις για να αποκλείσουμε τη πιθανότητα το σήμα να οφείλεται σε μη ειδική δέσμευση του δεύτερου αντισώματος σε άλλες πρωτεΐνες του ιστού ή στην αλληλεπίδραση των διαφόρων αντισωμάτων μεταξύ τους (όταν πρόκειται για διπλές ή τριπλές χρώσεις), χρησιμοποιούμε πάντα τη μία από τις τομές της αντικειμενοφόρου πλάκας για αρνητικό μάρτυρα. Η τoμή-αρνητικός μάρτυρας υπόκειται σε ολόκληρη τη διαδικασία χρώσης εκτός από αυτή της επώασης με το/τα πρωτοταγές/ή αντισώματα. Κατόπιν, οι τομές παρατηρούνται σε συνεστιακό μικροσκόπιο Ταυτόχρονη ιχνηθέτηση του DNA με τριτιωμένη θυμιδίνη ([ 3 Η]-Τhy) και βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ένας τρόπος να ξεχωρίσει κανείς μέσα σε έναν ιστό, κύτταρα που πολλαπλασιάζονται, είναι να ιχνηθετήσει κανείς το DNA τους με BrdU και να ακολουθήσει ανίχνευση με τη χρήση αντισώματος αντι-brdu. Ένας άλλος τρόπος είναι να ιχνηθετήσει το DNA των κυττάρων με τη ραδιενεργά σημασμένη μορφή της θυμιδίνης, τριτιωμένη θυμιδίνη [ 3 Η]-Τhy και να ακολουθήσει ανίχνευση με τη μέθοδο της αυτοραδιογραφίας. Η τριτιωμένη θυμιδίνη έχει ακριβώς τις ίδιες ιδιότητες με το BrdU, δηλαδή ενσωματώνεται στο DNA του κυττάρου μόνο κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου, μπορεί εύκολα να χορηγηθεί στα ζώα με ενδοπεριτοναϊκή ένεση και ανιχνεύεται ακόμα και μετά από πολύ μεγάλα χρονικά διαστήματα (πολλά χρόνια). Ο συνδιασμός των δύο τρόπων ιχνηθέτησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση μίας συγκεκριμένης ομάδας πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων μέσα σε ένα μεγαλύτερο πλήθος κυττάρων που διαιρούνται και τη μελέτη των βιοχημικών και κινητικών χαρακτηριστικών τους κατά τακτά χρονικά διαστήματα. Για να επιτευχθεί αυτό πραγματοποιείται αρχικά χορήγηση του BrdU οπότε και σημαίνονται όλα τα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου εκείνη τη στιγμή. Επειδή όμως το BrdU παραμένει στο περιβάλλον των κυττάρων μέχρι να προχωρήσουμε στη διαδικασία της ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσής του, όλα τα κύτταρα που θα περάσουν αργότερα από τη φάση S θα σημανθούν και αυτά. Αν θέλουμε να παρακολουθήσουμε την μετέπειτα πολλαπλασιαστική συμπεριφορά των 64

79 Υλικά και Μέθοδοι κυττάρων αυτών, δηλαδή αν αυτά θα διαρεθούν ή όχι, αυτό δεν είναι δυνατόν μόνο με τη χορήγηση του BrdU αφού τα αρχικά κύτταρα που σημάνθηκαν δε θα διακρίνονται από τα τελευταίως σημασμένα κύτταρα. Έτσι, δεν είναι δυνατό να διαπιστωθούν δεύτερες μιτωτικές διαιρέσεις μέσα στον ευρύτερο πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Όμως αν λίγες ώρες μετά τη χορήγηση BrdU, χορηγήσουμε και [ 3 H]-Thymidine τότε θα αποκτήσουμε έναν αρχικό πληθυσμό κυττάρων (πριν τη χορήγηση της [ 3 H]- Thymidine) που θα έχουν ενσωματώσει μόνο BrdU, ενώ όλα τα υπόλοιπα κύτταρα που θα περάσουν αργότερα από τη S φάση (μετά τη χορήγηση της [ 3 H]-Thymidine), θα ενσωματώσουν αναγκαστικά και BrdU και [ 3 H]-Thymidine. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται μία «ομάδα» κυττάρων σημασμένη μόνο με BrdU την οποία μπορούμε να παρακολουθούμε ανά πάσα στιγμή. Αν ο αρχικός αριθμός των σημασμένων με κυττάρων δεν αλλάξει, αυτό θα σημαίνει ότι τα κύτταρα δεν επαναδιαιρέθηκαν ενώ αν ο αριθμός αυξηθεί, αυτό θα οφείλεται στην είσοδο των κυττάρων σε ένα δεύτερο κυτταρικό κύκλο. Το πόσα από τα σημασμένα κύτταρα έχουν υποστεί και δεύτερη διάιρεση μπορεί να υπολογιστεί προσεγγιστικά (Takahashi et al., 1996). Στη προκειμένη περίπτωση η διπλή ιχνηθέτηση εφαρμόστηκε in vivo στα κύτταρα του προσθίου εγκεφάλου αρουραίου εμβρυϊκής ηλικίας με σκοπό τη μελέτη του κυτταρικού κύκλου των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στην περιοχή αυτή που εκφράζουν ΒΜ88. Πιο ειδικά, διερευνήθηκε αν τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα που εκφράζουν ΒΜ88 βρίσκονται στην τελευταία τους μιτωτική διαίρεση, λίγο πριν τη μετανάστευσή τους στις ανώτερες στιβάδες του φλοιού ή όχι. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν δύο θηλυκοί αρουραίοες, έγκυοι στην 16 η εμβρυϊκή ημέρα (Ε16). Και στους δύο χορηγείται BrdU ενδοπεριτοναϊκά όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Έπειτα από διάστημα δύο ωρών τους χορηγείται επιπλέον [ 3 H]-Thymidine (3µCi/gm, ειδικής ενεργότητας Ci/mM, Amersham). Η χορήγηση γίνεται όπως και στη περίπτωση του BrdU, με ενδοπεριτοναϊκή ένεση στην κάτω κοιλιακή χώρα του ζώου. Και το BrdU και η [ 3 H]-Thymidine περνάνε εύκολα μέσω του πλακούντα από τη μητέρα στο έμβρυο. Ο πρώτος αρουραίος θυσιάζεται 12 ώρες αργότερα. Έτσι από την αρχική ένεση μέχρι το θάνατό του μεσολαβεί διάστημα 14 ωρών κατά το οποίο τα κύτταρα που έχουν σημανθεί μόνο με BrdU έχουν προλάβει όλα να περάσουν από τη διαδικασία της μίτωσης μόνο μία φορά. Ο δεύτερος αρουραίος θυσιάζεται 24 ώρες αργότερα. Έτσι από την αρχική ένεση μέχρι το θάνατό του μεσολαβεί διάστημα 26 ωρών κατά το οποίο τα κύτταρα 65

80 Υλικά και Μέθοδοι που έχουν σημανθεί μόνο με BrdU ή θα έχουν προλάβει να υποστούν και δεύτερη μιτωτική διαίρεση (οπότε πρόκειται για ενεργώς πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα που βρίσκονται μακρυά από τη διαδικασία της τελικής διαφοροποίησής τους) ή θα έχουν σταματήσει στη φάση G0 χωρίς να έχουν υποστεί και δεύτερη μιτωτική διαίρεση (οπότε πρόκειται για κύτταρα που βρίσκονται στη διαδικασία της τελικής διαφοροποίησής τους). Κατόπιν οι εγκέφαλοι αφαιρούνται από τα έμβρυα και υπόκεινται στις διαδικασίες της μονιμοποίησης, αφυδάτωσης και παραφινοποίησης όπως περιγράφεται παραπάνω. Προκειμένου να εντοπίσουμε και να μελετήσουμε τα σημασμένα κύτταρα που εκφράζουν ΒΜ88 προχωρήσαμε πρώτα σε διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση έναντι του BrdU και της πρωτεΐνης ΒΜ88 ενώ ακολουθήθηκε αυτοραδιογραφία για τον εντοπισμό κόκκων της [ 3 H]-Thymidine. Για να επιτευχθεί αυτό ακολουθείται πρώτα η διαδικασία διπλής ανοσοϊστοχημικής χρώσης έναντι του BrdU και της πρωτεΐνης ΒΜ88 όπως ακριβώς περιγράφεται παραπάνω χωρίς όμως να προχωρήσουμε στο τελευταίο στάδιο του μονταρίσματος των τομών. Κατόπιν για να γίνει δυνατή η ανίχνευση της [ 3 H]-Thymidine οι τομές των κυττάρων εμβαπτίζονται σε υγρό σπινθηρισμού και παραμένουν στο σκοτάδι για 21 ημέρες. Ακολουθείται η διαδικασία μονιμοποίησης των ραδιενεργών κόκκων της [ 3 H]- Thymidine πάνω στον ιστό, με την εμβάπτιση των τομών σε κατάλληλο υγρό εμφάνισης και διαδοχικά ξεπλύματα των τομών σε απεσταγμένο νερό. Τέλος οι τομές μοντάρονται με CITIFLUOR όπως έχει περιγραφεί παραπάνω. Μετά από παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης εντοπίζονται και φωτογραφίζονται κύτταρα πάνω στα οποία είναι ορατοί κόκκοι [3H]-Thymidine. Κατόπιν από το ίδιο οπτικό πεδίο λαμβάνονται ψηφιακές φωτογραφίες φθορισμού έπειτα από σάρωση με λέιζερ, προκειμένου να αποτυπωθεί η κυτταρική έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του BrdU. Τέλος, οι φωτογραφίες που λήφθησαν επεξεργάζονται με κατάλληλο λογισμικό και βάσει των εικόνων που προκύπτουν ακολουθεί η καταμέτρηση και μελέτη των κυττάρων που είναι BrdU-θετικά/[ 3 H]-thyαρνητικά και που εκφράζουν ΒΜ88. Στην παραπάνω διαδικασία υποβάλλονται συνολικά 30 τομές από 6 διαφορετικούς εμβρυϊκούς εγκεφάλους (5 τομές/εγκέφαλο). Η διαδικασία επαναλαμβάνεται πανομοιότυπα και για τους δύο αρουραίοες. Το επί της εκατό ποσοστό των κυττάρων που εντοπίστηκαν να είναι σημασμένα μόνο με BrdU και εκφράζουν ΒΜ88, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ως 66

81 Υλικά και Μέθοδοι εκατό τοις εκατό τον συνολικό αριθμό των κυττάρων που ήταν σημασμένα μόνο με BrdU Σήμανση των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας με τη λιπόφιλη φθορίζουσα ουσία DiI Η ουσία DiI είναι μία φθορίζουσα ουσία με μήκος κύματος εκπομπής στην περιοχή των 565nm που έχει λιπόφιλα χαρακτηριστικά. Οι Honig και Hume παρατήρησαν το 1985 ότι η ουσία αυτή αποτελεί έναν πολύ καλό τρόπο ανίχνευσης κυττάρων για το αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα ενώ ταυτόχρονα δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα ή τις φυσιολογικές ιδιότητες των νευρικών κυττάρων. Αυτό συμβαίνει γιατί αν τοποθετηθεί ένας κρύσταλλος DiI στην επιφάνεια της μεμβράνης ενός κυττάρου, η φθορίζουσα ουσία θα διαχυθεί πολύ γρήγορα μέσα σε ολόκληρη τη διπλή φωσφολιπιδική στιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης και θα διαγράψει το κύτταρο περιμετρικά ενώ δεν θα διαχυθεί ούτε στο υδατικό κυτταρόπλασμα αλλά ούτε και στο υδατικό εξωκυττάριο περιβάλλον του κυττάρου. Έτσι, χρησιμοποιώντας τη φθορίζουσα ουσία DiI, μπορούμε να ξεχωρίσουμε τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας, μεταξύ των υπολοίπων κυττάρων του φλοιού του εγκεφάλου των θηλαστικών, λόγω της ιδιαίτερα επιμήκους κυτταρικής τους δομής χάρη στην οποία διατρέχουν όλο το πάχος του φλοιού, από τις κοιλίες του εγκεφάλου μέχρι τις μήνιγγες. Στα τρωκτικά τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας εντοπίζονται μόνο κατά την εμβρυϊκή ηλικία. Τα υπόλοιπα κύτταρα του φλοιού που είναι νευρώνες, γλοιϊκά κύτταρα και πολυδύναμα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, είναι πολύ μικρότερα σε μήκος και κανένα από αυτά δεν διατρέχει όλο το πάχος του εγκεφαλικού φλοιού. Έτσι αν στην επιφάνεια του φλοιού του εγκεφάλου αρουραίου σε εμβρυϊκή ηλικία, τοποθετηθεί η ουσία DiI, αναμένεται κάποια από τα κύτταρα της επιφάνειας που θα σημανθούν, να μεταφέρουν τη χρωστική διαμέσου της κυτταρικής τους μεμβράνης στην κοιλία. Τα κύτταρα αυτά θα είναι μόνο τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας. Συγκεκριμένα η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τη σήμανση των κυττάρων αυτών ήταν η εξής : Απομονώνονται τα εγκεφαλικά ημισφαίρια από έμβρυα αρουραίων ηλικίας Ε16. Κατόπιν τοποθετούνται σε κρύο ρυθμιστικό διάλυμα ΡΒS όπου και τους αφαιρούνται οι μήνιγγες υπό στερεοσκόπιο. 67

82 Υλικά και Μέθοδοι Οι μήνιγγες αφαιρούνται πολύ προσεκτικά έτσι ώστε να μην τραυματιστεί ο φλοιός, προκειμένου να γίνει εφικτή η επαφή της ουσίας DiI με τα κύτταρα του φλοιού. Έπειτα με τη βοήθεια ενός πολύ λεπτού πινέλου και υπό το στερεοσκόπιο, τοποθετούνται μικροκρύσταλλοι πάνω στην επιφάνεια του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Οι εγκέφαλοι πλένονται αρκετές φορές προσεκτικά σε κρύο DiI ώστε να απομακρυνθεί το μεγαλύτερο μέρος των κρυστάλλων DiI από την επιφάνεια του φλοιού. Κατόπιν οι εγκέφαλοι μονιμοποιούνται σε διάλυμα 4% παραφορμαλδεϋδης σε PBS για 4 ώρες στους 4 o C και τοποθετούνται πάλι σε κρύο PBS όπου και λαμβάνει χώρα η λήψη τομών με τη βοήθεια του παλλόμενου μικροτόμου. Ο ιστός κόβεται έτσι σε όλο το μήκος του σε στεφανιαίες τομές πάχους 150µm οι οποίες τοποθετούνται σε τρυβλίο petri με κρύο PBS. Μετά το τέλος της διαδικασίας αυτής οι τομές ελέγχονται στο ανάστροφο μικροσκόπιο φθορισμού και επιλέγονται μόνο τομές στις οποίες υπάρχει σήμανση με DiI που να καταλήγει στην κοιλία. Κάθε άλλη τομή που είτε δεν έχει χρώση μέχρι την κοιλία ή έχει χρώση στην κοιλία λόγω τραυματισμού του ιστού από τους μικροκρυστάλλους και όχι λόγω της διάχυσης της ουσίας από την επιφάνεια, απορρίπτεται. Οι επιλεχθείσες τομές υπόκεινται κατόπιν στη διαδικασία του ανοσοφθορισμού προκειμένου να εξεταστεί η έκφραση του ΒΜ88 στα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας. Συγκεκριμένα οι τομές επαναμονιμοποιούνται σε διάλυμα παραφορμαλδεϋδης 4% σε PBS για 10min σε R.T. Ακολουθούν πλυσίματα σε PBS 1x, για 10min σε RT και υπό ελαφρά ανακίνηση. Οι ιστοί κατόπιν επωάζονται σε ζελατίνη ψαριού 0.2% κ.β. σε PBS, για 20 λεπτά σε θερµοκρασία 37 o C ώστε να δεσµευτούν οι µη ειδικές θέσεις πρόσδεσης των πρωτοταγών αντισωμάτων πάνω στις τομές, από τη ζελατίνη. Ακολουθούν 3 πλυσίµατα 10 λεπτών σε PBS, υπό ελαφρά ανακίνηση και επώαση µε αντι-βμ88 μονοκλωνικό αντίσωµα σε συγκέντρωση 1:50. H επώαση του αντισώματος γίνεται σε διάλυμα ζελατίνης 0.02% και παρουσία Triton X-100 σε συγκέντρωση 0.1%. Η προσθήκη Triton X-100 στο διάλυμα επώασης είναι απαραίτητη προκειμένου να διεισδύσει το αντίσωμα σε όλος το πάχος της τομής 68

83 Υλικά και Μέθοδοι (150μm). Η επώαση γίνεται σε θερμοκρασία 4 o C, στο σκοτάδι για 16 ώρες και υπό ελαφρά ανακίνηση. Οι τομές κατόπιν ξεπλένονται όπως παραπάνω και επωάζονται με αντίαντίσωμα ποντικού συνδεδεμένο με την φθορίζουσα ουσία FITC σε αραίωση 1:200 και σε διάλυμα ζελατίνης 0.02%, παρουσία Triton X-100 σε συγκέντρωση 0.1%, για 3 ώρες σε R.T. Η περίσσεια αντισώματος φεύγει με τρία πλυσίματα των 10 λεπτών υπό ελαφρά ανακίνηση και οι τομές μοντάρονται με CIFLUOR. Η παρατήρηση των τομών γίνεται σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης ενώ χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό 3D analysis της Leica προκειμένου να γίνει εφικτή η τρισδιάστατη απεικόνιση ολόκληρων των κυττάρων της ακτινωτής γλοίας μέσα στον ιστό In vivo υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας του πρόσθιου εγκεφάλου ποντικού με τη βοήθεια ρετροϊού. Ένας από τους τρόπους να μελετήσει κανείς το ρόλο μιας πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα είδη κυττάρων είναι η υπερέκφρασή της στα κύτταρα αυτά. Για να πραγματοποιηθεί αυτό πρέπει να χρησιμοποιηθεί ο κατάλληλος φορέας για τη μεταφορά του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που μελετάται. Ένας από τους φορείς που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι κατάλληλα επιλεγμένοι ιοί που θα ενσωματώσουν αρχικά το προς μελέτη γονίδιο, θα επιμολύνουν ακολούθως τα κύτταρα στα οποία θέλουμε να υπερεκφράσουμε το γονίδιο, και τέλος θα παράγουν μέσα στα κύτταρα αυτά την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Στη συγκεκριμένη περίπτωση ο φορέας που χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ήταν ο προ-ρετροϊός RCAS-Y σε συνδυασμό με ένα ειδικό σύστημα επιμόλυνσης: τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας του προσθίου εγκεφάλου εμβρύων των διαγονιδιακών ποντικών tv-a. Έτσι δημιουργήθηκε ένα in vivo σύστημα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 με σύντομη διάρκεια εκτέλεσης, σε ένα συγκεκριμένο και καλά χαρακτηρισμένο είδος κυττάρων. Τα πειράματα αυτά έλαβαν χώρα στο Ινστιτούτο Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Munich, Germany, στο εργαστήριο της Dr. Magdalena Gotz. 69

84 Υλικά και Μέθοδοι To σύστημα RCAS- tva Για να κατανοήσουμε καλύτερα το πειραματικό σύστημα RCAS-tva που χρησιμοποιήσαμε είναι σκόπιμο να περιγράψουμε πρώτα κάποια χαρακτηριστικά του φορέα RCAS. Οι φορείς RCAS είναι μία απλή κατηγορία ρετροϊικών φορέων οι οποίοι απομονώθηκαν από τους ιούς των πτηνών ARSV (avian Rous sarcoma virus). Περισσότερες πληροφορίες για τον RCAS περιέχονται στην παρακάτω περιγραφή του κύκλου του ίδιου του ιού ARSV α. Ο κύκλος ζωής του ιού ARSV Ο κύκλος τoυ ΑRSV ακολουθεί όλους τους κανόνες που διέπουν τον πολλαπλασιασμό των ρετροϊών. Η ζωή του ξεκινά με την προσκόλλησή των γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου του στον κατάλληλο υποδοχέα της επιφάνειας του κυττάρου-ξενιστή (σχήμα 24). Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί στην σύντηξη της κυτταρικής μεμβράνης και του ιϊκού φακέλου. Σχ. 24. Σχηματική περιγραφή του κύκλου ζωής ενός ρετροϊού ARSV. Μετά τη σύντηξη το εσωτερικό του ιού βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα του κυττάρουξενιστή όπου το μονόκλωνο RNA του ιού μετατρέπεται σε δίκλωνο γραμμικό μόριο με τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής. Μετά τη δημιουργία του δίκλωνου DNA, αυτό μεταφέρεται από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα. Το ιϊκό DNA ορισμένων πιο πολύπλοκων ρετροϊών όπως ο HIV-1 έχει την ικανότητα να διαπερνά 70

85 Υλικά και Μέθοδοι την πυρηνική μεμβράνη, όμως οι απλοί ρετροϊικοί φορείς όπως ο RCAS δε μπορούν να διαπεράσουν την πυρηνική μεμβράνη. Έτσι η μόνη φάση στην οποία το DNA των απλών ρετροϊών μπορεί να ενσωματωθεί με το κυτταρικό DNA είναι στη φάση της μίτωσης του κυττάρου όπου η πυρηνική μεμβράνη αποσυντίθεται. Γι αυτό το λόγο ρετροϊοί όπως ο ARSV μπορούν να επιμολύνουν μόνο πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Μόλις το ιϊκό DNA αποκτήσει πρόσβαση στο DNA του κυττάρου λαμβάνει χώρα η ενσωμάτωση του ιϊκού DNA στο κυτταρικό γονιδίωμα. Σ αυτή τη φάση ο ρετροϊός λέμε ότι βρίσκεται στη φάση του προϊού. Η διαδικασία της ενσωμάτωσης είναι ειδική ως προς τις ιϊκές αλληλουχίες οι οποίες θα συμμετέχουν στην ενσωμάτωση αλλά μη ειδική ως προς τις αλληλουχίες του DNA του κυττάρου μεταξύ των οποίων θα γίνει η ενσωμάτωση. Το σημείο του γονιδιώματος του κυττάρου στο οποίο θα γίνει η ενσωμάτωση επηρεάζει την έκφραση του προϊού. Παρόλο που ο ιός διαθέτει δικό του υποκινητή, η ενεργότητά του εξαρτάται από τις παρακείμενες αλληλουχίες του κυττάρου-ξενιστή. Αντιστρόφως η ενσωμάτωση του προϊού μπορεί να επηρεάσει και την έκφραση των γονιδίων του κυττάρου. Συνήθως όμως λόγω του ότι τα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι διπλοειδή, αυτό δεν επηρεάζει το κύτταρο-ξενιστή. Εξαιτίας του ότι το ιϊκό DNA γίνεται ένα κομμάτι πλέον του κυτταρικού γονιδιώματος, η επιμόλυνση με τον ιό είναι μόνιμη. Τα επιμολυνθέντα κύτταρα αλλά και όλοι οι απόγονοί τους θα μεταφέρουν τα γονίδια του ιού.από τη στιγμή που ο προϊός έχει ενσωματωθεί στο DNA του κυττάρου, συμπεριφέρεται σαν ένα από τα γονίδια του κυττάρου. Για τους απλούς ρετροϊούς η έκφραση του ιϊκού τους γονιδιώματος βρίσκεται υπό τον πλήρη έλεγχο των κυτταρικών διαδικασιών. Το RNA μεταγράφεται από την RNA πολυμεράση τη μη εξαρτώμενη του DNA - του κυττάρου-ξενιστή. Υπάρχει μόνο ένα αρχικό μετάγραφο το οποίο εξέρχεται ολόκληρο έξω από τον πυρήνα και χρησιμεύει ταυτόχρονα και σα γενομικό RNA και σα μήνυμα για τις πολυπρωτεΐνες Gag και Gag-Pol. (Σχήμα 25). Κάποια μόρια RNA υπόκεινται στη διαδικασία της αποκοπής και επανένωσης (splicing) για να παράγουν το μήνυμα για την πρωτεΐνη Env, ενώ παράγεται και ένα δεύτερο μήνυμα μέσω splicing έτσι ώστε να εκφραστεί το oγκογονίδιο scr. Οι πρωτεΐνες Gag και Gag-Pol δημιουργούν μία πρωτεϊνική δομή στην κυτταρική μεμβράνη που περικλείει δύο αντίγραφα του ρετροϊικού γενομικού RNA και μερικά RNAs του κυττάρου-ξενιστή τα οποία θα χρησιμοποιήσει κατά την έναρξη της αντίστροφης μεταγραφής. Με την ανασυγκρότησή του ο ιός πιέζει προς τα έξω την κυτταρική μεμβράνη και παρασύρει μαζί του ένα κομμάτι της αλλά και την γλυκοπρωτεΐνη του φακέλου του. Κατά τη διάρκεια της αποκοπής του ιού από την κυτταρική μεμβράνη, οι πρωτεάση του ιού πέπτει τις πολυπρωτεΐνες Gag και Gag- Pol δημιουργώντας έτσι ένα νέο μολυσματικό ιό. 71

86 Υλικά και Μέθοδοι Σχ. 25. Η δομή και η λειτουργίες ενός ιού ΑRSV. Α) Το μέρος Α αναπαριστά έναν ώριμο ιό ΑRSV. Δεξιά αναφέρονται με συντομογραφία οι πρωτεΐνες του ώριμου ιού. Στο περίβλημα του ιού συναντώνται οι εξής πρωτεΐνες. TM: διαμεμβρανική πρωτεΐνη, SU: πρωτεΐνη επιφανείας, MA: πρωτεΐνη στιβάδας, CA: πρωτεΐνη καψιδίου, NC: πρωτεΐνη πυρηνικού καψιδίου. Το εσωτερικό του ιού περιέχει τα δύο γενομικά RNAs που ενώνονται στα 5 άκρα τους με δεσμούς υδρογόνου. Επίσης περιέχει την αντίστροφη μεταγραφάση(rt), την ιντεγκράση (IN), και την πρωτεάση (PR). Β) Το μέρος Β δείχνει διαγραμματικά τη σχέση μεταξύ του προϊικού DNA (RCAS), του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης, των ιϊκών RNAs και των πρωτεϊνών ενός ιού ΑRSV. Το ιϊκό γονιδίωμα διακρίνεται στα γονίδια gag, pol, env και src. Το παρακείμενο DNA του κυττάρου ξενιστή αναπαρίσταται σαν διπλή κυματοειδής γραμμή. Στην περίπτωση του ιού ARSV τα γονίδια gag και env βρίσκονται στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης, ενώ τα γονίδια pol και src σε διαφορετικό. Η RNA πολυμεράση - η μη εξαρτώμενη του DNA, μεταγράφει τον προϊό, δημιουργώντας έτσι ένα μόριο RNA που χρησιμεύει και ως ιϊκό γονιδίωμα και σαν μήνυμα για τις πολυπρωτεΐνες gag και gag-pol. Αυτό το RNA μεταφράζεται ολόκληρο σε ένα ποσοστό 5%. Παράλληλα όμως λαμβάνει χώρα μία μετατόπιση του πλαισίου ανάγνωσης που επιτρέπει στο ριβόσωμα να συνθέτει την πολυπρωτεΐνη gag-pol. Οι πρωτεΐνες gag και gag-pol μέσω της δράσης της πρωτεάσης του ιού PR, δίνουν γένεση σε όλες τις πρωτεΐνες που συναντάμε σε έναν ώριμο ιό. Ένα ποσοστό του αρχικού ιϊκού RNA υπόκεινται στη διαδικασία της αποκοπής και επανένωσης (splicing) μέσω κυτταρικών μηχανισμών για να δώσει τα mrnas των env και src. Το mrna env μεταφράζεται σε γλυκοπρωτεΐνη του φακέλου που πέπτεται από μία πρωτεάση του κυττάρου-ξενιστή σις πρωτεΐνες SU και TM. 72

87 Υλικά και Μέθοδοι β. Η χρήση του RCAS και των ιών ARSV ως μέσο μεταφοράς γονιδίων. Ο ρετροϊικός φορέας RCAS όπως περιγράψαμε παραπάνω φέρει και εκφράζει στα επιμολυνθέντα κύτταρα το ογκογονίδιο src. Η περιοχή του ρετροϊικού γονιδιώματος που κωδικοποιεί το ογκογονίδιο src δεν είναι απαραίτητη για την αντιγραφή και τον πολλαπλασιασμό του ιού. Έτσι το ογκογονίδιο αυτό μπορεί να αντικατασταθεί από μία συνθετική ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία που να περιέχει μία θέση αναγνώρισης από κάποια περιοριστική ενδονουκλεάση. Αν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει να υπερεκφράσουμε τοποθετηθεί μεταξύ δύο θέσεων αναγνώρισης της ίδιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης μπορούμε εύκολα να τοποθετήσουμε το νέο γονίδιο στη θέση του ογκογονιδίου src. Στη συγκεκριμένη περίπτωση στη θέση του src τοποθετήθηκε η συνθετική αλληλουχία που περιέχει θέση αναγνώρισης από την περιοριστική ενδονουκλεάση ClaI (έτσι δημιουργήθηκε ο RCAS-Y) ενώ στη θέση του ογκογονιδίου src τοποθετήθηκε το cdna του ΒΜ88 ποντικού. Ο νέος αυτός φορέας πακετάρεται μέσα στα γλυκοπρωτεϊνικά μόρια του φακέλου του ιού ARSV και είναι ικανός να επιμολύνει τα κατάλληλα κύτταρα-ξενιστές και να εκφράσει την πρωτεΐνη ΒΜ88 ποντικού γ. Τα διαγονιδιακά ποντίκια tv-a O ιός ARSV όπως αναφέρθηκε προηγουμένως είναι ένας ιός πτηνών και ως εκ τούτου μπορεί να επιμολύνει και να εκφραστεί μόνο σε κύτταρα πτηνών και όχι σε κύτταρα θηλαστικών. Αυτό συμβαίνει γιατί τα κύτταρα των θηλαστικών δε διαθέτουν τον κατάλληλο υποδοχέα στην κυτταρική τους μεμβράνη που θα αναγνωρίσει τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου του ιού και έτσι ο ιός δεν μπορεί καν να προσκολληθεί στο κύτταρο. Αυτό το εμπόδιο μπορεί να ξεπεραστεί με το να προκαλέσουμε την έκφραση του κατάλληλου υποδοχέα του ιού ARSV στα κύτταρα των θηλαστικών που μας ενδιαφέρει να επιμολύνουμε (Bates et al., 1993). Μία τέτοια στρατηγική οδήγησε στη δημιουργία των διαγονιδιακών ποντικών που εκφράζουν στα κύτταρά τους τον υποδοχέα tv-a που είναι ο υποδοχέας του γλυκοπρωτεϊνικού φακέλου. Το πλεονέκτημα αυτού του συστήματος είναι ότι έτσι η έκφραση του υποδοχέα μπορεί να κατευθυνθεί σε ένα συγκεκριμένο είδος κυττάρων και όχι σε όλα τα κύτταρα του ζώου. Αυτό συμβαίνει γιατί μπορούμε να τοποθετήσουμε το cdna του υποδοχέα tv-a μετά από έναν υποκινητή που θα ενεργοποιείται σε συγκεκριμένο είδος κυττάρων και σε συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο. Στη συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήσαμε τα διαγονιδιακά ποντίκια Gtv-a στα οποία η έκφραση του υποδοχέα tv-a βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή της πρωτεΐνης GFAP (Ε.C.Holland & H.E.Varmus, 1998).H πρωτεΐνη GFAP στα ποντίκια 73

88 Υλικά και Μέθοδοι εκφράζεται στα ώριμα αστροκύτταρα του ΚΝΣ αλλά και στα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας. Έτσι στα διαγονιδιακά ποντίκια Gtv-a τα μόνα κύτταρα που μπορούν να επιμολυνθούν με τον ARSV είναι ή τα ώριμα αστροκύτταρα ή τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας Ιn vivo επιμόλυνση κυττάρων του εμβρυϊκού εγκεφάλου των ποντικών Gtv-a με τον ιό ARSV και η επώαση του ιού σ αυτά, για μεγάλα χρονικά διαστήματα Προκειμένου να σημάνουμε τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας των εμβρύων ποντικών Gtv-a και να παρακολουθήσουμε την πορεία και την εξέλιξή τους σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν in vivo με τον ιό ARSV. Ιn vivo επιμόλυνση κυττάρων Χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά άτομα των διαγονιδιακών ποντικιών Gtv-a που έφεραν έμβρυα ηλικίας 13ης (Ε13), 16ης (Ε16), ή 18ης (Ε18) ημέρας μετά από διασταύρωσή τους με αρσενικά άτομα Gtv-a. Τα θηλυκά αυτά άτομα υπόκεινται σε νάρκωση με ένα μίγμα ναρκωτικών ουσιών που τους χορηγείται με υποδόρια ένεση στην κοιλιακή χώρα. Οι αναλογίες των ουσιών στο μίγμα είναι τέτοιες που να διατηρούν χαμηλό το μεταβολισμό του ζώου μέχρις ότου χορηγηθεί ένα μίγμα-αντίδοτο. Η σύσταση του μίγματος καθώς και οι αναλογίες των συστατικών του παραθέτονται στον πίνακα E. Πίνακας Ε Συστατικά Εμπορική Συγκέντρωση Συγκέντρωση ναρκωτικού ονομασία δραστικής ουσίας δραστικής ουσίας που μίγματος στην εμπορική πρέπει να χορηγηθεί (δραστική ουσία) συσκευασία (mg/ml) στο ποντίκι (mg/ml) Medetomidine Domitor Midazolam Dormicum Fentanyl Fentanyl Hexal Atipamezol Antisedan Flumacenil Anexate Naloxon Narcanti-vet

89 Υλικά και Μέθοδοι Το ζώο τοποθετείται κατόπιν σε ηλεκτρικά θερμαινόμενο στρώμα ώστε να αποφεύγονται τα συμπτώματα της υποθερμίας κατά τη διάρκεια της εγχειρήσεις. Η επιφάνεια των οφθαλμικών βολβών καλύπτεται με ένα ειδικό πήκτωμα ενυδάτωσης που βοηθά στην αποφυγή της αφυδάτωσής τους κατά την εγχείρηση. Κατόπιν το τριχωτό κάλυμμα του δέρματος στην κοιλιακή χώρα του ζώου αφαιρείται με απλό ξυραφάκι ξυρίσματος. Ο χώρος όπου λαμβάνει χώρα η εγχείρηση πρέπει να είναι καλά απολυμασμένος με διάλυμα αιθανόλης 70% και να έχει ψεκαστεί με ειδικό αντι-ϊκό σπρέι. Έπειτα πραγματοποιείται τομή στην κοιλιακή χώρα στο κέντρο και κατά μήκος του κατακόρυφου άξονα του ζώου μέχρι να είναι δυνατή η έξοδος των εμβρυϊκών σάκων της εγκύου. Πολύ προσεκτικά οι εμβρυϊκοί σάκοι βγαίνουν έξω από το σώμα της μητέρας και με τη βοήθεια μιας δέσμης λευκού φωτός φωτίζονται τα έμβρυα ένα προς ένα. Ο εμβρυϊκός σάκος, ο αμνιακός σάκος αλλά και οι ιστοί του εμβρύου είναι αρκετά διαφανείς ώστε να επιτρέπουν τη διέλευση του λευκού φωτός του οποίου η ένταση ρυθμίζεται με ένα ροοστάτη. Έτσι, φωτίζεται ο εγκέφαλος κάθε εμβρύου και τοποθετείται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να αποκαλύπτεται και να είναι προσβάσιμο το πρόσθιο τμήμα του τελεγκεφάλου. Τότε το έμβρυο ακινητοποιείται όσο το δυνατόν περισσότερο και με μία κατάλληλα λειανθείσα γυάλινη πιπέτα εμφυσάται στην κοιλία του εγκεφάλου του κάθε εμβρύου υγρό που περιέχει ιϊκά σωματίδια ARSV. Το υγρό αυτό περιέχει και μία κυανόχρωμη χρωστική που βοηθά στον εντοπισμό του ιού μέσα στην κοιλία του εγκεφάλου του ζώου και πιστοποιεί την επιτυχία της τοποθέτησης του ιού στον εμβρυϊκό εγκέφαλο. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για όλα τα έμβρυα που βρίσκονται μέσα στη μητέρα. Μετά το τέλος της τοποθέτησης του ιού στους εμβρυϊκούς εγκεφάλους, τα έμβρυα επανατοποθετούνται προσεκτικά στην κοιλιακή χώρα της εγκύου και η τομή του ενήλικου ζώου κλείνει με ένα έως δύο ράμματα. Τα ράμματα καλύπτονται με ένα κολλώδες υγρό, το Collodium που στερεοποιείται σχεδόν αμέσως και που εμποδίζει το ζώο να δαγκώσει και να καταστρέψει τα ράμματα του μετά την εγχείρηση. Κατόπιν στα ζώα χορηγείται το μίγμα-αντίδοτο που θα επαναφέρει το μεταβολισμό τους σε φυσιολογικά επίπεδα. 75

90 Υλικά και Μέθοδοι Μόλις τα ζώα συνέλθουν, τοποθετούνται για 24 ώρες σε ζεστό μέρος για να αποφευχθεί μετεγχειρητική υποθερμία και να γίνει πιο εύκολη η ανάρρωση τους. Μετά το πέρας των πρώτων 24 μετεγχειρητικών ωρών τα ζώα φυλάσσονται σε φυσιολογικές συνθήκες και είτε θυσιάζονται μετά από 2 μέρες για να εξεταστεί η δράση του ιού στα έμβρυα, ή αφήνονται να γεννήσουν οπότε θυσιάζονται τα νεογέννητα για να εξεταστεί η δράση του ιού σε πρώιμες μεταγεννητικές ηλικίες. Όλα τα έμβρυα και τα νεογέννητα υπόκεινται πριν την μελέτη τους σε έλεγχο του γονότυπου τους ως προς την έκφραση του διαγονιδίου Gtv-a.Aυτό γίνεται γιατί μόνο τα ομόζυγα ως προς το διαγονίδιο άτομα θα εξεταστούν περαιτέρω. Ο έλεγχος γίνεται με απομόνωση γενομικού DNA από τα έμβρυα και ακόλουθη PCR με ειδικά εναρκτήρια μόρια Μικροσκοπία Η παρατήρηση καθώς και η ανάλυση των διπλών και τριπλών χρώσεων ανοσοφθορισμού καθώς και των τριπλών χρώσεων ΒΜ88/ΒrdU/[ 3 Η]-Τhy, έγινε σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης της εταιρείας Leica, μοντέλο TCS SP (Leica TCS SP Confocal Laser Scanning Microscope). Το μικροσκόπιο είναι εξοπλισμένο με ειδικό πρόγραμμα τρισδιάστατης ανάλυσης εικόνας έτσι ώστε να είναι δυνατή η ηλεκτρονική «συρραφή» μιας σειράς αλλεπάλληλων συνεστιακών εικόνων που παίρνονται στην περιοχή του ιστού που μας ενδιαφέρει. Συγκεκριμένα, γίνεται πρώτα επιλογή της περιοχής του ιστού που θέλουμε να αναλύσουμε, κατόπιν η επιλεχθείσα περιοχή χωρίζεται ηλεκτρονικά σε τομές πάχους 0.5 ή 0.8µm ανάλογα με τον ιστό, οι ακτίνες του λέιζερ έπειτα σαρώνουν τον ιστό στο ύψος των παραπάνω τομών και τέλος με τη βοήθεια του ειδικού λογισμικού γίνεται οπτική ανασυγκρότηση της σαρωθείσας περιοχής του ιστού. Για να αποφευχθεί η επικάλυψη της εικόνας του φθορισμού που προέρχεται από διαφορετικά μήκη κύματος στην περίπτωση του διπλού ή τριπλού ανοσοφθορισμού, οι εικόνες για την κάθε χρώση προέκυψαν από την σάρωση κάθε φθορίζουσας ουσίας χωριστά ενώ ο οπτικός συνδυασμός των χρώσεων έγινε ηλεκτρονικά. Το λογισμικό Leica TCS SP μας παρείχε επιπλέον τη δυνατότητα λήψης εικόνων με ταυτόχρονη απεικόνηση της τρίτης διάστασής των τομών απεικόνηση κατά τον κατακόρυφο άξονα z (οrthogonal slicing). Οι διπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις που επιτεύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό δράσης της αλκαλικής φωσφατάσης και της υπεροξειδάσης, παρατηρήθηκαν σε φωτονικό μικροσκόπιο της εταιρείας Zeiss, μοντέλο Axiophot 76

91 Υλικά και Μέθοδοι (Zeiss-Axiophot optical photomicroscope) ενώ η λήψη των εικόνων έγινε με τη βοήθεια ψηφιακής κάμερας της εταιρείας Leica, μοντέλο DC-300. Τέλος η ανάλυση των εικόνων αυτών έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού ανάλυσης εικόνας IM50 της εταιρείας Leica Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας Πέψη DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Για την πέψη DNA μορίων με περιοριστικά ένζυμα ακολουθήθηκαν οι οδηγίες που αναγράφονται στα συνοδευτικά φυλλάδια των ενζύμων και χρησιμοποιήθηκαν τα ειδικά διαλύματα που συνοδεύουν κάθε ένζυμο. Κατά κανόνα γίνεται πέψη 1μg DNA με 3-5units ενζύμου στα 20μl συνολικού όγκου αντίδρασης Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Μόρια DNA μήκους Kb μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με το μοριακό τους βάρος σε 0.8-2% οριζόντια πηκτώματα αγαρόζης. Η περιεκτικότητα του πηκτώματος σε αγαρόζη είναι αντιστρόφως ανάλογη των μοριακών βαρών των μορίων DNA που πρόκειται να διαχωριστούν. Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται 1x ΤΒΕ ή 1x ΤΑΕ ( για παρασκευαστικά πηκτώματα αγαρόζης ), στα οποία προστίθεται 0.5 μg/ml βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr). Τα δείγματα DNA ηλεκτροφορούνται μετά από την προσθήκη ειδικού διαλύματος δείγματος (sample buffer 6x: 0.25% κ.β. μπλε της βρωμοφαινόλης και 40% κ.β. σακχαρόζης σε H 2 O), σε σταθερής έντασης ρεύμα 100mA. Εάν πρόκειται για γενωμικό DNA πριν την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα θερμαίνονται για 10 λεπτά στους 65 o C. Μετά την ηλεκτροφόρηση τα μόρια του DNA σχηματίζουν ζώνες διακριτές λόγω φθορισμού κατά την διάρκεια έκθεσης του πηκτώματος σε υπεριώδη ακτινοβολία μήκους κύματος 302nm, όπου και μπορούν να φωτογραφηθούν σε φιλμ Polaroid

92 Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση και καθαρισμός DNA από πηκτώματα αγαρόζης Με τη συστηματοποιημένη μέθοδο Gene clean II Kit (Bio 101 Inc.) Για την απομόνωση και τον καθαρισμό μορίων DNA από παρασκευαστικά πηκτώματα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε η συστηματοποιημένη μέθοδος Gene clean Gene clean II Kit (Bio 101 Inc.). Χρησιμοποιείται το υλικό glass milk, το οποίο αποτελείται από μικροσκοπικά σφαιρίδια πυριτίου σε υδατικό διάλυμα, και έχει την ικανότητα να προσδένει εκλεκτικά DNA σε υψηλές συγκεντρώσεις αλατιού. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η απομόνωση τμημάτων DNA από 500bp έως 15Κb. Το DNA πού απομονώνεται με την μέθοδο αυτή είναι αρκετά καθαρό για να χρησιμοποιηθεί για πέψη με περιοριστικά ένζυμα και για υποκλωνοποίηση με Τ4 λιγάση. Η διαδικασία είναι η εξής: Η ζώνη του DNA κόβεται από το παρασκευαστικό πήκτωμα αγαρόζης και ζυγίζεται. - Προστίθενται τρεις όγκοι 6M NaI σε σχέση με το βάρος. - Επώαση στους 55 ο C επί 5 λεπτά, ώσπου να διαλυθεί η αγαρόζη. - Προσθήκη 10μl glass milk. - Ανάδευση στους 4 C για 20 λεπτά. - Φυγοκέντρηση επί 5 sec σε g. - Αναδιάλυση και πλυσίματα των σφαιριδίων με παγωμένο διάλυμα Νew Wash. - Φυγοκέντρηση επί 5 sec σε g. - Πλυσίματα με διάλυμα Νew Wash. -Φυγοκέντρηση επί 5 sec σε g - Αναδιάλυση των σφαιριδίων σε κατάλληλο όγκο δις-απεσταγμένου νερού. - Επώαση στους 55 ο C για να γίνει η έκλουση του DNA από το σφαιρίδια. - Φυγοκέντρηση επί 1 λεπτό σε g. Στο υπερκείμενο βρίσκεται διαλυμένο το DNA. - Ελεγχος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης της συγκέντρωσης του απομονωμένου DNA Υποκλωνοποίηση μορίων DNA σε πλασμίδια φορείς Προετοιμασία των προς υποκλωνοποίηση μορίων DNA Διακρίνονται δύο διαφορετικές περιπτώσεις: 1. Το προς κλωνοποίηση DNA-μόριο και το πλασμίδιο έχουν συμπληρωματικά κολλώδη άκρα (cohesive ends). Η αναλογία του DNA-μορίου και του πλασμιδίου- 78

93 Υλικά και Μέθοδοι φορέα πρέπει να είναι 3:1. Χρειάζεται αποφωσφορυλίωση των άκρων του πλασμιδίουφορέα ειδικά αν έχουν κοπεί με το ίδιο περιοριστικό ένζυμο. 2. Το προς κλωνοποίηση DNA-μόριο και το πλασμίδιο-φορέας να έχουν κοπεί με διαφορετικά ένζυμα, με αποτέλεσμα να έχουν διαφορετικά άκρα. Για να γίνει σύνδεση των τμημάτων μεταξύ τους χρειάζεται τα κολλώδη άκρα να μετατραπούν σε αδρά (blunt ends). Το γέμισμα των κολλωδών άκρων και η μετατροπή τους σε αδρά γίνεται με τη χρήση του ενζύμου Klenow-DNA πολυμεράση: -Πέψη του DNA με το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού. -Προστίθενται στην αντίδραση 2.5U Klenow DNA πολυμεράσης και 4μl dntps 25mM. -Επώαση στους 25 C επί 15 λεπτά. -Απενεργοποίηση του ενζύμου στους 65 C για 10 λεπτά. -Στο πλασμίδιο-φορέα ακολουθεί αποφωσφορυλίωση με προσθήκη 1μl αλκαλικής φωσφατάσης και επώαση στους 37 C επί 1 ώρα Σύνδεση του πλασμιδίου φορέα και του πρός κλωνοποίηση DNA μορίου με Τ4 DNA λιγάση - Αναμιγνύονται 100 ng γραμμικού πλασμιδιακού DNA (linearized vector) με 20-80ng DNA από το κομμάτι του που πρόκειται να κλωνοποιηθεί (insert DNA). - Διεξάγεται η αντίδραση της λιγάσης σε τελικό όγκο 10μl προσθέτοντας διάλυμα λιγάσης μαζί με 1 unit ενζύμου Τ4 DNA λιγάσης. - Επίσης διεξάγονται δύο ακόμη παρόμοιες αντιδράσεις. Στην πρώτη δεν προστίθεται το DNA προς κλωνοποίηση και στην δεύτερη δεν προστίθεται λιγάση. Με την πρώτη ελέγχεται κατά πόσον έχει γίνει επανασύνδεση των άκρων του πλασμιδίου, και με τη δεύτερη εάν υπάρχει άκοπο πλασμίδιο. - Επωάση επί 16 ώρες στους 16 ο C. - Ελεγχος σε πήκτωμα αγαρόζης αν έγινε η αντίδραση χρησιμοποιώντας το μισό όγκο της αντίδρασης. - Η υπόλοιπη αντίδραση χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό του κατάλληλου βακτηριακού στελέχους Καλλιέργειες E. coli Τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή και τον πολλαπλασιασμό του πλασμιδιακού DNA είναι τα : HB101 και DH5A. Ως υλικό για την υγρή καλλιέργεια τους χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο υλικό καλλιέργειας Luria - Bertani Broth (LB). Για την καλλιέργειά τους σε τρυβλία Petri χρησιμοποιήθηκε το υλικό 79

94 Υλικά και Μέθοδοι Βacto- Agar (Difco). To Bacto-agar διαλύεται κατά την υγρή αποστείρωση. Πριν κρυώσει και πολυμεριστεί, στους ο C, προστίθεται το κατάλληλο αντιβιοτικό ανάλογα με το πλασμίδιο και το βακτηριακό στέλεχος που καλλιεργείται. Το υγρό θρεπτικό υλικό καθώς και τα τρυβλία μπορούν να διατηρηθούν στους 4 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Τα βακτηριακά στελέχη αναπτύσσονται στους 37 ο C σε θαλάμους σταθερής θερμοκρασίας. Για τις υγρές καλλιέργειες είναι απαραίτητη η συνεχής ανάδευση καθώς και ο καλός αερισμός. Για αποθήκευση για μεγαλύτερες περιόδους τα βακτήρια διατηρούνται στους -70 ο C στο κατάλληλο θρεπτικό μέσο, παρουσία 50% γλυκερόλης Mετασχηματισμός καλλιεργειών E.coli με τη μέθοδο του θερμικού σοκ (heat-shock) Προετοιμασία των κυττάρων. - Εμβολιάζονται 50ml L-broth με βακτήρια από μια μοναδική αποικία από τρυβλίο που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό ανάλογα με το βακτηριακό στέλεχος και καλλιεργούνται για ώρες υπό συνεχή ανάδευση μέσα σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας. - Εμβολιάζονται 500ml L-broth με 5ml της παραπάνω καλλιέργειας και η καλλιέργεια αφήνεται μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να είναι μεταξύ (αυξητική φάση). - Η καλλιέργεια τοποθετείται σε πάγο ώστε να κρυώσει όσο πιο γρήγορα γίνεται. Από αυτό το στάδιο και μετά είναι απαραίτητο τα κύτταρα να διατηρούνται στους 4 0 C. - Φυγοκέντρηση σε 4000g επί 15 λεπτά στους 4 0 C. - Επαναδιάλυση των βακτηρίων σε 250 ml κρύου στείρου διαλύματος 0.1Μ CaCl 2. - Επωάση στον πάγο για 30 λεπτά. - Φυγοκέντρηση σε 4000g επί 15 λεπτά στους 4 0 C. - Επαναδιάλυση των βακτηρίων σε 43ml κρύου στείρου διαλύματος 0.1Μ CaCl 2 και επωάση σε πάγο για 30 λεπτά. Η επώαση σε πάγο σε αυτό το στάδιο είναι προαιρετική και ο χρόνος ποικίλλει ανάλογα με το βακτηριακό στέλεχος. - Προστίθονται 7 ml στείρας γλυκερόλης 100% και ανακατεύονται με ήπιο τρόπο. - Τα βακτήρια μοιράζονται ανά 200μl σε φλόγα σε στείρους πλαστικούς σωλήνες του 1.5ml (eppendorf), οι οποίοι βρίσκονται τοποθετημένοι μέσα σε ξηρό πάγο και αιθανόλη, ώστε να εξασφαλιστεί το άμεσο πάγωμα των κυττάρων. - Τα βακτήρια φυλάσσονται στους C για μεγάλο χρονικό διάστημα. Με τη μέθοδο αυτή η ικανότητα των βακτηρίων για μετασχηματισμό κυμαίνεται από 5 x x 10 7 /μg DNA. Ο υπολογισμός της ικανότητας μετασχηματισμού μπορεί να βρεθεί εάν 80

95 Υλικά και Μέθοδοι ανταποκρίνεται στο παραπάνω εύρος με πειραματικό μετασχηματισμό των βακτηρίων με 1ng άκοπου πλασμιδίου Μετασχηματισμός με θερμικό σόκ - Ξεπάγωμα των βακτήριων από τους C μέσα σε πάγο. - Ανάμιξη όγκου 200μl βακτηρίων με το DNA. - Επώαση σε πάγο για 30 λεπτά. - Επώαση στους 42 0 C για 1 λεπτό. - Προσθήκη 2ml υλικού LB - Επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα. - Εμβολιασμός τρυβλίων που περιέχουν το κατάλληλο αντιβιοτικό με 200μl από το παραπάνω υλικό. - Επώαση για ώρες στους 37 0 C Mέθοδοι απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων Απομόνωση μικρής ποσότητας DNA (mini prep) - Εμβολιασμός 3ml υλικού LB από τυχαίες, μετασχηματισμένες αποικίες και επώαση στους 37 ο C για ώρες. - Φυγοκέντρηση των καλλιεργειών σε 4.000g ώστε να κατακρημνιστούν τα βακτήρια. - Επαναδιάλυση του ιζήματος σε 700μl διαλύματος STET. - Προστίθονται 75μl διαλύματος λυσοζύμης 10mg/ml και ακολουθεί βράσιμο για επί 1 λεπτό. - Φυγοκέντρηση σε g επί 10 λεπτά. - Αφαιρείται το ίζημα των μεμβρανών και προστίθεται ίσος όγκος κρύας ισοπροπανόλης. - Τα δείγματα τοποθετούνται στους C, για 45 λεπτά. - Φυγοκέντρηση σε g επί 10 λεπτά. - Πλύσιμο του ιζήματος με 70% αιθανόλη. - Επαναδιάλυση του ιζήματος σε 50μl H 2 O. -Το DNA είναι κατάλληλο για πέψη με περιοριστική ενδονουκλεάση Απομόνωση μεγάλης ποσότητας DNA (maxi prep) Για την παρασκευή μεγάλης ποσότητας καθαρού πλασμιδιακού DNA. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλκαλικής λύσης (Birnboim and Doly, 1979). 81

96 Υλικά και Μέθοδοι - Εμβολιασμός 20ml θρεπτικού υλικού καλλιέργειας με αμπικιλλίνη (100μg/ml) με μία αποικία από μετασχηματισμένα βακτήρια και επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C, για περίπου 16 ώρες. - Εμβολιασμός 1 lt θρεπτικού υλικού καλλιέργειας με αμπικιλλίνη με 10ml της παραπάνω καλλιέργειας και επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C για περίπου 16 ώρες. - Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας σε 3.500rpm για 15 λεπτά στους 4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, με κεφαλή GS3. - Αναδιάλυση του ιζήματος των βακτηριακών κυττάρων, υπό ισχυρή ανάδευση, σε 40ml Διαλύματος Ι και τοποθέτηση του εναιωρήματος σε πάγο (αναστολή των ενζυμικών αντιδράσεων). - Προσθήκη 200mg λυσοζύμης, ήπια ανάδευση και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. - Προσθήκη 80ml Διαλύματος ΙΙ (το διάλυμα ετοιμάζεται ακριβώς πριν από τη χρήση), ανάδευση και επώαση του μίγματος στον πάγο για 10 λεπτά (αποδιάταξη του DNA). - Προσθήκη 60ml Διαλύματος ΙΙΙ, ανάδευση και επώαση του μίγματος στον πάγο για 10 λεπτά. Το ίζημα των κυτταρικών υπολειμμάτων (μεμβρανικά θραύσματα, πρωτεΐνες, χρωμοσωμικό DNA και μεγαλομοριακό RNA) απομακρύνεται με φυγοκέντρηση σε rpm για 10 min στους 4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, με κεφαλή GS3. - Διήθηση του υπερκείμενου με υαλοβάμβακα και μεταφορά του σε καθαρό σωλήνα. - Κατακρήμνιση του πλασμιδιακού DNΑ με προσθήκη 0.6 όγκων ισοπροπανόλης, ανάδευση και επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. - Φυγοκέντρηση σε 5.000rpm για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε φυγόκεντρο Sorvall, με κεφαλή GS3. - Το ίζημα του DNA ξεπλένεται με 70% κ.ο. αιθανόλη και μετά την εξάχνωση του διαλύτη, αναδιαλύεται σε 15ml ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (10:10). - Το διάλυμα DNA μεταφέρεται σε σωλήνα Corex και προστίθεται ίσος όγκος (15ml) παγωμένου διαλύματος 5M LiCl. Ακολουθεί ανάδευση και φυγοκέντρηση σε rpm για 10 λεπτά στους 4 ο C σε φυγόκεντρο Sorvall, με κεφαλή SS34 (το LiCl κατακρημνίζει το μεγαλομοριακό RNA). - Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα Corex, προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης και το μίγμα αναδεύεται. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε rpm για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε φυγόκεντρο Sorvall, με κεφαλή SS34. 82

97 Υλικά και Μέθοδοι - Το ίζημα του DNA ξεπλένεται με 70% κ.ο. αιθανόλη και, μετά την εξάχνωση του διαλύτη, αναδιαλύεται σε 1 ml ΤΕ (1:0,1) που περιέχει πανκρεατική ριβονουκλεάση (RNase) (20μg/ml) απαλλαγμένη από δεοξυριβονουκλεάση (DNase). Aκολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. - Προστίθεται, στη συνέχεια, 1 ml διαλύματος NaCl 1,6 Μ που περιέχει 13% κ.β. πολυαιθυλενόγλυκόλη (PEG 8.000). Το μίγμα αναδεύεται και φυγοκεντρείται σε rpm για 5 λεπτά στους 4 ο C. - Το ίζημα αναδιαλύεται σε 800μl TE (1:0,1) και εκχυλίζεται με διάλυμα ίσου όγκου εξισορροπημένης φαινόλης σε 100mM Tris-HCl ph8. Ακολουθεί εκχύλιση με διάλυμα ίσου όγκου εξισορροπημένης φαινόλης σε 100mM Tris-HCl ph8 / χλωροφόρμιο σε αναλογία όγκων 1:1 και τέλος με χλωροφόρμιο. - Η υδατική φάση μεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα μικροφυγοκέντρου. Ακολουθεί κατακρήμνιση του DNA με προσθήκη διαλύματος οξικού αμμωνίου 10M (1/4 του όγκου) και δύο όγκων αιθανόλης σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά και φυγοκέντρηση σε rpm για 2 λεπτά στους 4 ο C. - Το πλασμιδιακό DNA (ίζημα) ξεπλένεται με 70% κ.ο. αιθανόλης. - Το πλασμιδιακό DNA αναδιαλύεται σε 500μl ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (1:0.1). -Η συγκέντρωση του DNA στο παρασκεύασμα προσδιορίζεται με φωτομέτρηση του δείγματος στα 260nm με βάση τη σχέση: 1 O.D. 260nm = 50μg/ ml διαλύματος. Η ποιοτική ανάλυση του δείγματος γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση γενωμικού DNA από ιστούς. Οι ιστοί που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για απομόνωση γενωμικού DNA ή ολικού RNA διατηρούνται στους 70 ο C. Η διαδικασία απομόνωσης γενωμικού DNA είναι η εξής: - Οι ιστοί κονιορτοποιούνται σε υγρό άζωτο. - Προστίθενται 10 όγκους διαλύματος STE σε σχέση με τον όγκο του κονιορτοποιημένου ιστού και - Προστίθεται διάλυμα SDS σε τελική συγκέντρωση 0.5%. - Ακολουθεί η προσθήκη πρωτεϊνάσης Κ σε τελική συγκέντρωση 100μg/ml και επώαση για 3 ώρες στους 55 ο C. - Εκχύλιση με ίσο όγκο μίγματος φαινόλης: χλωροφορμίου: ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1. Απαλό ανακάτεμα και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 3000g. Φυλάσσεται η υδατική φάση. 83

98 Υλικά και Μέθοδοι - Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι να εξαφανιστεί η άσπρη μεσόφαση. - Ακολουθεί μία εκχύλιση με ίσο όγκο χλωροφορμίου και φυγοκέντρηση. - Στην υδατική φάση που συλλέγεται γίνεται καταβύθιση του DNA με προσθήκη 0.1 του όγκου 3Μ οξικού νατρίου ph 5.2 και όγκοι παγωμένης αιθανόλης 100%. Ακολουθεί απαλό ανακάτεμα και στη φάση αυτή το DNA γίνεται ορατό. -Ακολουθεί "ψάρεμα" του DNA με πιπέτα pasteur, πλύσιμο με 70% αιθανόλη, στέγνωμα και επαναδιάλυση σε κατάλληλο όγκο διαλύματος ΤΕ 10:10. Η επαναδιάλυση γίνεται με απαλή ανάδευση για 12 ώρες στους 4 ο C. - Προσθήκη RNAse A σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml και επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες. - Προσθήκη SDS και πρωτεϊνάσης Κ σε τελική συγκέντρωση 0.5% και 100μg/ml αντίστοιχα και επώαση στους 55 ο C για 3 ώρες. - Ακολουθεί εκχύλιση του DNA όπως αναφέρθηκε παραπάνω. - Καταβύθιση με αιθανόλη όπως αναφέρθηκε παραπάνω. - Επαναδιάλυση σε κατάλληλο όγκο διαλύματος ΤΕ 1: Φωτομέτρηση στα 260nm και εύρεση της συγκέντρωσης DNA του δείγματος με βάση τη σχέση: 1 O.D. 260nm = 50μg DNA /ml διαλύματος. Καθαρά παρασκευάσματα DNA έχουν O.D. 260nm / O.D. 280nm = 1.8. Η ποιοτική ανάλυση του δείγματος γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε 0.8 % πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση ολικού RNA από ιστούς Η απομόνωση και ο χειρισμός του RNA απαιτούν στείρα γυαλικά και σωληνάρια, καθώς και την χρήση γαντιών, αφού το RNA είναι πολύ ευαίσθητο στη δράση των RNAσών. Τα κύτταρα ή οι ιστοί αφού συλλεχθούν παγώνονται αμέσως σε υγρό άζωτο και η διατήρηση τους γίνεται για μεγάλα χρονικά διαστήματα στους 70 ο C. Για την απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα ή ιστούς εφαρμόσθηκε η μέθοδος των Chomczynski et al. (1987). Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: Αποδιατακτικό διάλυμα D πλήρες: 4M Guanidinium thiocyanate 25mM κιτρικού νατρίου ph 7 0.5% απορρυπαντικό Sarcosyl 0.1M β-μερκαπτοαιθανόλη 84

99 Υλικά και Μέθοδοι Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται με θέρμανση των τριών πρώτων συστατικών του στους 65 ο C. Η μερκαπτοαιθανόλη προστίθεται στο τέλος. Μετά την προσθήκη της, το διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί στους 4 ο C για ένα μήνα περίπου, αλλιώς διατηρείται για τρείς μήνες σε θερμοκρασία δωματίου. Επίσης έαν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί σε ιστούς, πριν την ομογενοποίηση αυτών προστίθεται στο παραπάνω διάλυμα 0.33% κ.ο. του αντιδραστήριου anti-foam (Sigma). Αντιδραστήριο anti-foam (Sigma). Φαινόλη (κορεσμένη σε H 2 0) 2M οξικού νατρίου ph 4 Μίγμα χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης 49:1 ισοπροπανόλη 100% αιθανόλη 70% DEPC- H 2 O Η διαδικασία απομόνωσης είναι η εξής: - O ιστός ομογενοποιείται με πλήρες διάλυμα D, το οποίο προστίθεται σε αναλογία 1ml/ 100 mg ιστού. Η ομογενοποίηση διαρκεί μέχρι να μην διακρίνονται υπολείματα του ιστού. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται μέσα σε πάγο. - Προστίθενται τα παρακάτω με την σειρά που αναγράφονται. Οι ποσότητες που αναφέρονται αντιστοιχούν σε 1 ml διαλύματος D: 100μl 2M οξικού νατρίου 1ml Φαινόλης 200μl μίγματος χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης 49:1 - Ακολουθεί πολύ δυνατό ανακάτεμα σε συσκευή vortex, τουλάχιστον για 10 λεπτά. Το στάδιο αυτό είναι σημαντικό για την απομάκρυνση του γενωμικού DNA. - Επώαση σε πάγο για 15 λεπτά. - Φυγοκέντρηση στις 5000rpm για 30 λεπτά στους 4 ο C. - Συλλογή του υπερκείμενου και καταβύθιση του RNA με ίσο όγκο ισοπροπανόλης 100%, στους -20 ο C για 1 ώρα. - Φυγοκέντρηση και πλύσιμο του ιζήματος με 70% αιθανόλη, στέγνωμα και επαναδιάλυση σε 0.1% DEPC-H 2 O. - O προσδιορισμός της συγκέντρωσης του δείγματος γίνεται με φωτομέτρηση στα 260nm και βάσει της σχέσης: O.D 260nm = 40μg/ ml. 85

100 Υλικά και Μέθοδοι H καθαρότητα του δείγματος από προσμίξεις πρωτεϊνών ελέγχεται με τη φωτομέτρηση στα 280nm. Για καθαρό RNA ισχύει η σχέση: O.D 260nm / O.D 280nm = 2. Η ποιοτική ανάλυση του δείγματος πραγματοποιείται με ηλεκτροφόρηση του σε 1.2% πηκτώματος αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση RNA Το RNA ηλεκτροφορείται σε πηκτώματα αγαρόζης % μετά από την προσθήκη ειδικού διαλύματος δείγματος (sample buffer για RNA: σε 1.5ml αυτού περιέχονται 720μl φορμαμιδίου, 160μl 10 x MOPS, 260μl διαλύματος φορμαλδεϋδης 37%, 100μl γλυκερόλης και 0.1% w/v μπλε της βρωμοφαινόλης). Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται 1x ΤΒΕ που περιέχει 0.5μg/ ml EtBr Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιείται συνήθως για την ενίσχυση μιάς συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA, η οποία βρίσκεται ανάμεσα σε δύο περιοχές γνωστής αλληλουχίας. Στην αντίδραση χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτίδια ως εναρκτήρια μόρια για μία σειρά από συνθετικές αντιδράσεις, οι οποίες καταλύονται από μία DNA πολυμεράση, την Taq πολυμεράση, η οποία είναι ανθεκτική σε υψηλές θερμοκρασίες. Το κάθε ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό (i) με μία διαφορετική αλυσίδα της μήτρας DNA και (ii) με τη γειτονική αλληλουχία του προς ενίσχυση τμήματος DNA. Αρχικά, πραγματοποιείται αποδιάταξη της μήτρας DNA με θέρμανση. Το μίγμα της αντίδρασης, στη συνέχεια, ψύχεται σε θερμοκρασία, η οποία επιτρέπει την αναδιάταξη των εναρκτήριων μορίων με τις συμπληρωματικές αλυσίδες και τέλος, πραγματοποιείται επιμήκυνση των αναδιαταγμένων εναρκτήριων μορίων με την DNA πολυμεράση. Ο κύκλος της αποδιάταξης, αναδιάταξης και επιμήκυνσης επαναλαμβάνεται πολλές φορές και τα προϊόντα κάθε κύκλου χρησιμοποιούνται ως μήτρα DNA στους επόμενους κύκλους.το διάλυμα της αντίδρασης στο τέλος n κύκλων είναι δυνατόν να περιέχει θεωρητικά 2 n μόρια DNA, τα οποία είναι αντίγραφα της αλληλουχίας DNA που βρίσκεται ανάμεσα στα εναρκτήρια μόρια. Στη συγκεκριμένη περίπτωση η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο του γονότυπου των ποντικών στους οποίους χορηγήθηκε ο ιός ARSV ως προς την έκφραση του διαγονιδίου Gtv-a. Ο έλεγχος γίνεται με απομόνωση γενομικού DNA από τα προς εξέταση άτομα με τον τρόπο που περιγράφτηκε προηγουμένως. 86

101 Υλικά και Μέθοδοι Κατόπιν πραγματοποιείται η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται οι εκκινητές Gf και Gr που ενισχύουν ένα κομμάτι μεγέθους 420bp της περιοχής του διαγονιδίου Gtv-a. Εκκινητής Gf : 5 -gagtgttacccgcaggactgg- 3 Εκκινητής Gr : 5 -gagtcaggttccgtggtgagc- 3 Η αντίδραση πραγματοποιείται ως εξής: 2μl (40ng) DNA 2μl διαλύματος της Taq 2μl dntps, 2.5mM 0.4μl BSA, 5μg/ μl 1μl Gf, 10pmoles/ μl 1μl Gr, 10pmoles/ μl 7.6μl H 2 O 1μl Τaq πολυμεράση, 3units/μl Συνολικός όγκος της αντίδρασης 20μl. To πρόγραμμα στο οποίο πραγματοποιήθηκε η ενίσχυση της περιοχής είναι: o C για 5:00 λεπτά o C για 1:00 λεπτά o C για 1:00 λεπτά o C για 2:00 λεπτά 5. Επανάληψη των βημάτων 2 έως 4, 30 φορές o C για 10 λεπτά 7. 4 o C Ανάλυση της έκφρασης του ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο ( mrna ) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR πραγματικού χρόνου ( Real Time- PCR) Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η παρακολούθηση της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Στη συγκεκριμένη μέθοδο ένα ειδικό ολιγονουκλεοτίδιοανιχνευτής ιχνηθετείται στο 5 άκρο του με ένα φθορίζον μόριο-ανταποκριτή (reporter molecule) και στο 3 άκρο του με ένα μόριο-αποσβέστη (quencher molecule). Όταν κατά την PCR οι εκκινητές συνδέονται με την αλληλουχία-στόχο, τότε το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής καταστρέφεται από την DNA πολυμεράση, λόγω της ταυτόχρονης δράσης της ως 5-εξωνουκλεάση. Μέσω της δράσης αυτής απομακρύνεται το φθορίζον μόριο-ανταποκριτής από το μόριο-αποσβέστη με 87

102 Υλικά και Μέθοδοι αποτέλεσμα την παρουσία σήματος φθορισμού, το οποίο και αυξάνεται ανάλογα με την αρχική ποσότητα του DNA στο δείγμα. Ως μόριο-ανταποκριτής στη συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η 4,7,2,4,5,7 -εξαχλωρο-6-καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη (HEX). Η οργανολογία που χρησιμοποιήσαμε ήταν αυτή του LightCycler της Roche. Στο μηχάνημα αυτό η εκτέλεση της αντίδρασης PCR γίνεται σε γυάλινα τριχοειδή και ο παραγόμενος φθορισμός από κάθε αντίδραση παρακολουθείται σε τακτά χρονικά διαστήματα. Εκτός από το πλεονέκτημα της σημαντικής μείωσης του χρόνου για την ολοκλήρωση της αντίδρασης (30 κύκλοι σε 30 λεπτά) η τεχνολογία αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό των αρχικών DNA στόχων, μέσω υπολογισμού του κύκλου εκείνου όπου πρωτοεμφανίζεται ανιχνεύσιμο προϊόν (Ct, threshold cycle). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου BM88 και πραγματοποιήθηκε σε έμβρυα ποντικών ηλικίας Ε14 ομόζυγα για το διαγονίδιο sey (sey-sey) καθώς και σε έμβρυα ποντικών φυσικού τύπου (C57BL/6J x DBA/2J) της ίδιας ηλικίας. Τα έμβρυα απομονώνονται από τη μήτρα της μητέρας τους στο στερεοσκόπιο και με τη βοήθεια λαβίδων καθαρίζεται η περιοχή του φλοιού του πρόσθιου εγκεφάλου του εμβρύου, στην οποία θέλουμε να μελετήσουμε την έκφραση του ΒΜ88. Οι ιστοί μετά την απομάκρυνση τους φυλάσσονται στους 20 o C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση ολικού RNA. Η απομόνωση του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφτηκε προηγουμένως και τα δείγματα υπέστησαν κατεργασία με RQ1 -DNAse (Promega) σε 40mM Tris- HCl ph8.0, 10mM NaCl, 6mM MgCl 2, 10mM CaCl 2, για 15 λεπτά στους 37 o C πρίν την αντίστροφη μεταγραφή και την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης. H αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται ως εξής: Σε σωλήνα eppendorf προστίθεται το μίγμα της αντίδρασης: 1μg RNA 5μl 10 x διαλύματος της αντίστροφης μεταγραφάσης 10μl dntps, 2.5mM 2μl εκκινητή οligo (dt)12-18, 10pmoles/ μl xμl dd H 2 O μέχρι τελικό όγκο 48μl Το μίγμα επωάζεται για 10 λεπτά στους 65 o C. Στη συνέχεια προστίθεται στην αντίδραση 1μl RNAsin 1μl MoMLV αντίστροφη μεταγραφάση (Superscript II, Roche) Tελικός όγκος αντίδρασης: 50μl. Επώαση για 1 ώρα στους 37 o C. 88

103 Υλικά και Μέθοδοι Κατόπιν πραγματοποιείται η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real time-pcr) χρησιμοποιώντας όπως είπαμε την οργανολογία του LightCycler της Roche. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται οι εκκινητές BM88mf και BM88mr που ενισχύουν ένα κομμάτι μεγέθους 515 bp της περιοχής του ΒΜ88 cdna του ποντικού. Εκκινητής BM88mf : gccaaggcagatcctgtact Εκκινητής BM88mr: TgTTggACTCgTCCTCCTCT 89

104 Υλικά και Μέθοδοι ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Ρυθμιστικά διαλύματα PBS 10x (ph 7,4) NaCl Na 2 HPO 4 x(12h 2 O) KCl KH 2 PO 4 140mM 8mM 3mM 1.5mΜ TBS 10x (ph 7.4) Tris 0.5M NaCl 1.5M TBE 5x Tris - βορικό οξύ 0.9Μ EDTA (ph8) 20mΜ ΤΕ (10:10) Tris-HCl (ph8.0) EDTA (ph8.0) 10mM 10mM ΤΕ (10:1) Tris-HCl (ph 8.0) EDTA (ph 8.0) 10mM 1mM ΤΕ (10:0.1) Tris-HCl (ph 8.0) EDTA (ph 8.0) 1mM 0.1mM 10x ρυθμιστικό διάλυμα Taq DNA πολυμεράσης MgCl 2 15mM KCl 500mM Tris-HCl (ph8.3) 100mM 6x ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης δείγματος DNA (loading buffer) χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης 0.25% κ.β. σακχαρόζη 40% κ.β. 90

105 Υλικά και Μέθοδοι 5x ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης Tris-HCl (ph7.6) MgCl 2 ATP DTT PEG mM 50mM 5mM 5mM 25% κ.ο. Ρυθμιστικά διαλύµατα πέψης µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες 10x Tris-HCl (ph7.5) 100mM MgCl 2 100mM DTT 10mM NaCl xmm* * : Το x αντιστοιχεί σε διαφορετική συγκέντρωση NaCl ανάλογα τον τύπο του διαλύµατος. Low 0mM NaCl Medium 0.5M NaCl High 1M NaCl Διαλύµατα ηλεκτροφορητικής ανάλυσης πρωτεϊνών Διαλύματα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (SDS-PAGE): Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% ακρυλαμίδιο Ν,Ν-μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 29.2% κ.β. 0.8% κ.β. Πήκτωμα διαχωρισμού 12% διάλυμα ακρυλαμιδίου: (30%) 4% κ.ο. SDS 0.1% κ.β. Tris-HCl (ph8.8) 0.375M TEMED 0.05% κ.ο. υπερθειϊκό αμμώνιο (APS) 0.005% κ.β. 91

106 Υλικά και Μέθοδοι Πηκτώμα συμπύκνωσης 4% διάλυμα ακρυλαμιδίου (30%) 1.3% κ.ο. SDS 0.1% κ.β. Tris-HCl (ph6.8) 0.125M TEMED 0.1% κ.ο. υπερθειϊκό αμμώνιο (APS) 0.005% κ.β. Διάλυµα ηλεκτροφόρησης δείγµατος (SDS loading buffer) Tris-HCl (ph6.8) 50mM Γλυκερόλη 10% κ.ο. β-µερκαπτοαιθανόλη 0.4% κ.ο. (ή DTT 100mM) SDS 2% κ.β. Μπλέ της βρωµοφαινόλης 0.001% κ.β. 10x ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης Tris-HCl (ph8.7) 25mM SDS 0.1% κ.β. Γλυκίνη 192mM Διάλυµα χρώσης πηκτώματος ακρυλαμιδίου Coomassie Blue R % κ.β. Οξικό οξύ 5% κ.ο. Ισοπροπανόλη 10% κ.ο. Διάλυµα αποχρωµατισµού πηκτώματος ακρυλαμιδίου Οξικό οξύ 5% κ.ο. Ισοπροπανόλη 10% κ.ο Διαλύµατα ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών (western blot) Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς Tris-HCl (ph8.3) 39mM Γλυκίνη 48mM SDS 0.037% κ.β. Μεθανόλη 20% κ.ο. 92

107 Υλικά και Μέθοδοι Ponseau S Ponceau TCA 0.2% κ.β. 0.5% κ.ο. Διάλυµα µπλοκαρίσµατος TBS 1x Άπαχο γάλα 1-5% κ.β. Διάλυµα αραίωσης του αντισώµατος ΤBS 1x ΒSΑ (Αλβουμίνη ορού βοδιού) 10% κ.β. Διάλυµα εµφάνισης DAB TBS 1x DAB NiCl H 2 O % κ.β. 0.03% κ.β. 30% κ.ο Διάλυμα xρώσης τομών με NBT/BCIP Προηγείται εξισορρόπηση των τομών σε διάλυµα αντίδρασης της αλκαλικής φωσφατάσης (Detection Buffer) για 15 λεπτά: Διάλυµα αντίδρασης της αλκαλικής φωσφατάσης (Detection Buffer) Tris-HCl, ph mM NaCl 100mM MgCl 2 50mM Ακολουθεί η προσθήκη του δ/τος χρώσης: Διάλυμα xρώσης Σε 10ml διάλυµα αντίδρασης της αλκαλικής φωσφατάσης (Detection Buffer) προσθέτουμε 1) Από διάλυμα NBT 100mg/ ml σε 70% N N dimethylformamide : 45µl 2) Aπό διάλυμα BCIP 50mg/ ml σε 100% N N dimethylformamide: 35µl 93

108 Υλικά και Μέθοδοι Θρεπτικά Υλικά LB (Luria-Bertani) (ph 8) NaCl 1% κ.β. Bacto-tryptone 1% κ.β. Yeast-extract 0.5% κ.β. Για τη στερεή καλλιέργεια, χρησιμοποιώντας τρυβλία με το ίδιο υλικό και 1.5% κ.β. Bacto agar Διαλύματα απομόνωσης πλασμιδιακού DNA σε μικρή και μεγάλη κλίμακα STET σακχαρόζη Τriton-X100 EDTA (ph8) Tris-HCl (ph8) 8% κ.β. 0.5% κ.ο. 50mM 50mM Διάλυμα Ι γλυκόζη Tris-HCl (ph8) EDTA (ph8) 50mM 25mM 10mM Διάλυμα ΙΙ ΝaOH 0.2Ν SDS 1% κ.β Διάλυμα ΙΙΙ CH 3 COOK 5M CH 3 COOH 60% κ.ο. 11.5% κ.ο. 94

109 Υλικά και Μέθοδοι Διαλύµατα ανάλυσης RNA 2x NETS NaCl Tris-HCl (ph 7,5) EDTA (ph 8.0) SDS 200mM 20mM 1mM 1% κ.ο. 10x MOPS MOPS 0.2M CH 3 COONa 50mM EDTA 10mM Παρασκευή φαινόλης Για DNA Οι κρύσταλλοι της φαινόλης υγροποιούνται µε επώαση στους 65 ο C και προστίθεταιυδροξυκυνολίνη τελικής συγκέντρωσης 0.1%. Η χρωστική αυτή αποτελεί δείκτη του βαθµού οξείδωσης της φαινόλης (κίτρινο χρώµα: µή οξειδωµένη, πορτοκαλλοκόκκινο/καφέ: οξειδωµένη). Στη συνέχεια το διάλυµα εξισορροπείται αρχικά µε προσθήκη ίσου όγκου διαλύµατος Tris-HCl 0.5M (ph8.0) και ανάδευση για 15 λεπτά. Μετά τον διαχωρισµό των δύο φάσεων αφαιρείται η υδατική φάση (πάνω φάση) και προστίθεται ίσος όγκος διαλύµατος Tris-HCl 0.1M (ph8.0). Η ίδια διαδικασία επαναλαµβάνεται µέχρι το ph της υδατικής φάσης µετά τον διαχωρισµό να γίνει >7,8. Προστίθεται 1/10 του όγκου διάλυµα Tris-HCl 0.1M (ph8.0) και το διάλυµα της φαινόλης διατηρείται για 1 περίπου µήνα στους 4 ο C. Για RNA Αµέσως µετά την υγροποίηση των κρυστάλλων της φαινόλης και την προσθήκη υδροξυκυνολίνης προστίθεται ίσος όγκος H 2 O, ακολουθεί έντονη ανάδευση και το διάλυµα φυλάσσεται στους 4 ο C. 95

110 Αποτελέσματα 3. Αποτελέσματα Στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 in vivo έτσι ώστε να διαπιστώσουμε εάν το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης αυτής συνηγορεί με τη συμμετοχή της στις διαδικασίες διαφοροποίησης των νευρώνων, όπως προέκυψε από προηγούμενες μελέτες in vitro (Mamalaki et al., 1995, Boutou et al., 2000). Ειδικότερα, μελετήσαμε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πρόσθιο εγκέφαλο εμβρύων, νεογέννητων και ενήλικων τρωκτικών και συσχετίσαμε την έκφρασή της με χαρακτηριστικούς μάρτυρες της γενεαλογίας των νευρώνων και της γλοίας. Επίσης συσχετίσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με το είδος των κυτταρικών διαιρέσεων κατά τη νευρογένεση, συμμετρικών και ασύμμετρων, και διερευνήσαμε την έκφρασή της σε ποντικούς με νευρογενετικές μεταλλάξεις. Ακολουθεί αναλυτική περιγραφή των αποτελεσμάτων μας Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στον πρόσθιο εγκέφαλο του ποντικού και του αρουραίου σε πρώιμη εμβρυϊκή ηλικία ενώ η έκφρασή της αυξάνεται σε μεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης Παλιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται ευρέως στην πλασματική και στις ενδοκυττάριες μεμβράνες των ώριμων νευρώνων του εγκέφαλου του ενήλικου αρουραίου (Patsavoudi et al., 1995). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η έκφραση της πρωτεΐνης στον εγκέφαλο του αρουραίου ξεκινά από την εμβρυϊκή κιόλας ηλικία (Patsavoudi et al.,1995). Το γεγονός ότι η εμφάνισή της πρωτεΐνης εντοπίζεται νωρίς στον εγκέφαλο, μας οδήγησε να μελετήσουμε ακριβέστερα την έκφρασή της κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης του εγκεφάλου με σκοπό την περαιτέρω διαλεύκανση του ρόλου της. Για το λόγο αυτό επιλέξαμε να επικεντρωθούμε στον πρόσθιο εγκέφαλο του ποντικού και του αρουραίου τόσο από εμβρυϊκά όσο και από πρώιμα μεταγεννητικά στάδια της ανάπτυξης. Ο πρόσθιος εγκέφαλος είναι η περιοχή εκείνη του εγκεφάλου που αναπτύσσεται πρώτη κατά την οντογένεση. Τα στάδια στα οποία ξεκινά η διαδικασία γένεσης νευρώνων (νευρογένεση) στον πρόσθιο εγκέφαλο, όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο της Εισαγωγής, είναι οι εμβρυϊκές ημέρες Ε10-Ε12 για το ποντίκι και Ε11-Ε13 για τον αρουραίο. Η διαδικασία της νευρογένεσης επιταχύνεται εκθετικά με την πρόοδο της εμβρυϊκής ηλικίας για να φτάσουμε στις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες, δηλαδή τις εμβρυϊκές ημέρες Ε16-Ε17 για το ποντίκι και Ε18-Ε19 για τον αρουραίο όπου ολοκληρώνεται το πρώτο και μεγαλύτερο μέρος της νευρογένεσης (πρωτογενής νευρογένεση). Κατά τη μεταγεννητική ανάπτυξη καθώς και στο ενήλικο στάδιο, η νευρογένεση επιτελείται μόνο σε πολύ συγκεκριμένες 96

111 Αποτελέσματα περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου (δευτερογενής νευρογένεση) ενώ παράλληλα λαμβάνει χώρα η διαδικασία της ολοκλήρωσης της νευρωνικής διαφοροποίησης (Ρ0 έως Ρ3 για το ποντίκι και Ρ0 έως Ρ6 για τον αρουραίο), εκτός της παρεγκεφαλίδας όπου η ανάπτυξη ολοκληρώνεται μετά τη τρίτη μεταγεννητική εβδομάδα. Με βάση τα παραπάνω, επιλέξαμε να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης στον πρόσθιο εγκέφαλο σε ένα πρώιμο στάδιο νευρογένεσης (Ε13 για το ποντίκι, Ε14 για τον αρουραίο), σε ένα μεταγενέστερο στάδιο (Ε16 για τον αρουραίο) και σε ένα τελικό στάδιο της πρωτογενούς νευρογένεσης (Ε16 για το ποντίκι, Ε18 για τον αρουραίο). Εικόνα 1. Ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την ανάπτυξη του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου και του ποντικού. Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) μετά από ανάλυση με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, στο οποίο ανιχνεύεται η πρωτεΐνη ΒΜ88 σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα μεμβρανών του προσθίου εγκεφάλου αρουραίου (σχήμα 1.Α) και ποντικού (σχήμα 1Β) σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια (Ε14, Ε16, Ε18, Ρ0, Ρ6 για τον αρουραίο και Ε13, Ε16, Ρ0, Ρ3 για το ποντίκι). Η πρωτεΐνη ΒΜ88 ανιχνεύεται υπό αναγωγικές συνθήκες ως μία πολυπεπτιδική αλυσίδα ΜΒ: 23kDa. Η έκφραση της πρωτεΐνης μελετήθηκε επίσης και στα πρώτα μεταγεννητικά στάδια στα οποία λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση ενώ ολοκληρώνεται 97

112 Αποτελέσματα σταδιακά η διαφοροποίηση των νευρώνων του προσθίου εγκεφάλου (Ρ0 και Ρ3 για το ποντίκι και Ρ0 και Ρ6 για τον αρουραίο). Καταρχήν, από τους εγκεφάλους των παραπάνω ηλικιών απομονώθηκε το κλάσμα των μεμβρανικών πρωτεϊνών και πραγματοποιήθηκε ανίχνευση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 από τα πρώιμα κιόλας στάδια της νευρογένεσης τόσο στο ποντίκι όσο και στον αρουραίο (Ε13 για το ποντίκι, Ε14 για τον αρουραίο), ενώ φαίνεται καθαρά μία αύξηση της έκφρασής της καθώς προχωρά η διαδικασία γένεσης των νευρώνων. Τέλος στα μεταγεννητικά στάδια όπου η δημιουργία ώριμων, διαφοροποιημένων νευρώνων στον πρόσθιο εγκέφαλο έχει ολοκληρωθεί (Ρ3 για το ποντίκι και Ρ6 για τον αρουραίο) η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι υψηλή (Εικόνα 1) Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε περιοχές διαφοροποιημένων νευρώνων αλλά και σε περιοχές έντονης νευρογενετικής δραστηριότητας του προσθίου εγκεφάλου του αρουραίου τόσο κατά την πρωτογενή όσο και κατά τη δευτερογενή νευρογένεση Το αναπτυξιακό πρότυπο που παρουσιάζει η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πρόσθιο εγκέφαλο συμπίπτει χρονικά όπως είδαμε παραπάνω με τη διαδικασία της νευρογένεσης. Αυτό μας οδήγησε να χαρτογραφήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στις διάφορες περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου ως ένα πρώτο βήμα προκειμένου να διαλευκάνουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη. Για το σκοπό αυτό προχωρήσαμε στην ανίχνευση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε ιστολογικές τομές από διάφορες περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου και από διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης έγινε με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού, με τη βοήθεια μονοκλωνικού αντισώματος, καθώς και ανοσοκαθαρισμένου πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 του χοίρου. Η καθαρότητα και η ειδικότητα των αντισωμάτων αυτών για την πρωτεΐνη ΒΜ88 έχουν περιγραφεί παλιότερα (Patsavoudi et al., 1989, 1995). Οι τομές στο πρόσθιο εγκέφαλο του ζώου έγιναν όλες κατά τον εγκάρσιο άξονα κατά τον οποίο αποκαλύπτονται καλύτερα οι ζώνες νευρογένεσης. Zώνες πρωτογενούς νευρογένεσης είναι η κοιλιακή και υποκοιλιακή ζώνη (ventricular zone, VZ και subventricular zone, SVZ αντίστοιχα) καθώς και το γαγγλιωνικό έπαρμα (gaglionic eminence, GE). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι παραπάνω ζώνες συνιστούν τις νευροεπιθηλιακές περιοχές στις οποίες γίνεται έντονος πολλαπλασιασμός νευροβλαστικών κυττάρων. Τα κύτταρα των ζωνών αυτών σταματούν κάποια δεδομένη στιγμή τον πολλαπλασιασμό τους, 98

113 Αποτελέσματα μεταναστεύουν σε ανώτερες στιβάδες της φλοιϊκού πετάλου (cortical plate, CP), πρόδρομο σχηματισμό του φλοιού (cortex, CX), και δίνουν γένεση στους νευρώνες του εγκεφάλου (πρωτογενής νευρογένεση). Έτσι στις στιβάδες του φλοιού συναντάμε κατεξοχήν διαφοροποιημένους νευρώνες. Εικόνα 2. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πρόσθιο εγκέφαλο αρουραίου. Χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) έδειξε: α) στην εμβρυϊκή ηλικία Ε14, δηλαδή κατά την περίοδο της πρωτογενούς νευρογένεσης, έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 από τα κύτταρα των διαφοροποιημένων νευρώνων της φλοιϊκού πετάλου (CP) αλλά και από τα αδιαφοροποίητα κύτταρα των νευρογενετικών ζωνών VZ και SVZ (Eικόνα A). β) στην μεταγεννητική ημέρα Ρ6, δηλαδή κατά την περίοδο της δευτερογενούς νευρογένεσης, έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 από τα κύτταρα των διαφοροποιημένων νευρώνων (μικρά βέλη) αλλά και των αδιαφοροποίητων κυττάρων (μεγάλα βέλη) της περιοχής του οδοντωτού συνδέσμου (DG) του ιπποκάμπου (Hip) (Eικόνα B). CP (cortical plate) : φλοιϊκό πέταλο, DG (dentate gyrus): οδοντωτός σύνδεσμος, Hip (Hippocampus): Ιππόκαμπος, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, pia: χοριακή μήνιγγα SVZ (subventricular zone): υποκοιλιακή ζώνη. Κλίμακα: 100μm (A) και 40μm (Β). Οι ζώνες δευτερογενούς νευρογένεσης είναι πιο περιορισμένες και εντοπίζονται στη πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη (anterior subventricular zone, asvz) και στον οδοντωτό σύνδεσμο (dentate gyrus, DG) του ιπποκάμπου (hippocampus, HIP). Στις περιοχές αυτές συναντώνται πληθυσμοί νευροβλαστικών κυττάρων που διατηρούν την πολλαπλασιαστική τους δραστηριότητα ακόμα και μετά τη γέννηση του ζώου (κυρίως κατά τις πρώτες μεταγεννητικές ημέρες) αλλά και αργότερα στο ενήλικο άτομο. 99

114 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα του ανοσοεντοπισμού στις εμβρυϊκές ηλικίες (Ε14 και Ε18) όπου λαμβάνει χώρα η πρωτογενής νευρογένεση έδειξαν έντονη έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε όλη την περιοχή του φλοιϊκού πετάλου (cortical plate, CP), συμπεριλαμβανομένου και του νεοσχηματιζόμενου ιπποκάμπου, σε διαφοροποιημένους νευρώνες (εικόνα 2Α και Β). Επιπλέον, παρατηρήθηκε έντονη έκφραση και στις ζώνες πολλαπλασιασμού των προγονικών κυττάρων, δηλαδή στην κοιλιακή και στην υποκοιλιακή ζώνη του φλοιού (εικόνα 2Α). Στις μεταγεννητικές ηλικίες (Ρ0 και Ρ6) όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι έντονη σε όλες τις περιοχές του προσθίου εγκεφάλου όπου συναντάμε διαφοροποιημένους νευρώνες όπως ο ιππόκαμος (εικόνα 2Β). Επιπλέον, η πρωτεΐνη εκφράζεται και σε περιοχές όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση, δηλαδή στην πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη και στον οδοντωτό σύνδεσμο (dentate gyrus, DG) του ιπποκάμπου. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι λοιπόν έντονη όχι μόνο στις περιοχές διαφοροποιημένων νευρώνων αλλά και στις νευροεπιθηλιακές ζώνες έντονου πολλαπλασιασμού Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εντοπίζεται σε μεταμιτωτικούς νευρώνες που εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα NeuN (NeuN+) αλλά και σε πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα που δεν εκφράζουν τον παράγοντα NeuN (NeuN-) στον πρόσθιο εγκέφαλο του αρουραίου. Ο εντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε περιοχές έντονης πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας νευροβλαστικών κυττάρων μας οδήγησε να διερευνήσουμε το είδος των κυττάρων στα οποία εκφράζεται η πρωτεΐνη. Έτσι, εξετάστηκε κατ αρχήν αν τα κύτταρα που εκφράζουν την ΒΜ88 είναι μεταμιτωτικά κύτταρα ή πολλαπλασιαζόμενοι νευροβλάστες. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ο μεταγραφικός παράγοντας NeuN. Ο παράγοντας αυτός εκφράζεται από πολύ νωρίς (Ε10 στο ποντίκι) σε μεταμιτωτικούς νευρώνες. Έτσι η έκφραση του NeuN υποδηλώνει αν ένα κύτταρο έχει μπει στη μεταμιτωτική διαδικασία της διαφοροποίησης ή όχι. Πραγματοποιήθηκαν λοιπόν, διπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του μεταγραφικού παράγοντα NeuN σε στεφανιαίες τομές πρόσθιου εγκεφάλου αρουραίου σε μία ηλικία πρωτογενούς νευρογένεσης (Ε14) και σε μία ηλικία δευτερογενούς νευρογένεσης (Ρ6). 100

115 Αποτελέσματα Α) Ε18 Β) Ρ6 Β) Ρ6 Εικόνα 3. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε σχέση με τον πρώιμο νευρωνικό μάρτυρα ΝeuN στον πρόσθιο εγκέφαλο αρουραίου. Διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (καφέ χρώμα) και του μεταγραφικού παράγοντα ΝeuN (γαλάζιο χρώμα) έδειξε έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο κυτταρόπλασμα των διαφοροποιημένων ΝeuN+ νευρώνων της φλοιϊκού πετάλου (CP) την ημέρα Ε18 (Α, Α ) και του αναπτυσσόμενου φλοιού (CΧ) την ημέρα Ρ6 (Δ, Ε). Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι κυτταροπλασματική ενώ του μεταγραφικού παράγοντα ΝeuN πυρηνική (όπως φαίνεται καλύτερα στις εικόνες Α και Ε που αποτελούν μεγενθύσεις των περιοχών που έχουν σημειωθεί με μαύρο πλαίσιο στις εικόνες Α και Δ αντίστοιχα). Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται και στους αδιαφοροποίητους νευροβλάστες των περιοχών VZ, SVZ στην ηλικία Ε18 (Β) και asvz στην ηλικία Ρ6 (Ζ) όπου ο νευρωνικός μάρτυρας ΝeuN δεν εκφράζεται ακόμα. Στη φωτογραφία Γ φαίνεται σε μία μικρότερη μεγέθυνση η έκφραση των δύο μορίων σε όλο το εύρος του αναπτυσσόμενου φλοιού από την κοιλιακή ζώνη έως την τελευταία του στιβάδα. asvz (anterior subventricular zone): πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη, CP (cortical plate) : φλοιϊκό πέταλο, CX-V (cortex-layer V):φλοιός-στιβάδα V, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία. Κλίμακα: 40μm (A, B, Δ και Ζ) 10μm (A και Ε) και 2μm (Γ). 101

116 Αποτελέσματα Η πρωτεΐνη ΒΜ88 ανιχνεύτηκε στη περίπτωση αυτή με ειδικό αντι-αντίσωμα συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση, ενώ ο μεταγραφικός παράγοντας NeuN με αντι-αντίσωμα συζευγμένο με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση. Αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν τα υποστρώματα: διαµινοβενζαμιδίνη (DAB) για την ανίχνευση της πρωτεΐνης ΒΜ88 και ΝΒΤ/ΒCIP για την ανίχνευση του μεταγραφικού παράγοντα NeuN. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συνεντοπίζεται με τον μεταγραφικό παράγοντα NeuN σε μεταμιτωτικούς νευρώνες του φλοιϊκού πετάλου στην εμβρυϊκή ηλικία Ε14 και του αναπτυσσόμενου φλοιού στη μεταγεννητική ηλικία Ρ6 (εικόνα 3Α και 3Β αντίστοιχα). Επιπλέον όμως, σε αντίθεση με το νευρωνικό μάρτυρα NeuN, η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται και από κύτταρα των νευροβλαστικών περιοχών δηλαδή στις ζώνες VZ και SVZ κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14 και στις περιοχές asvz και HIP κατά τη μεταγεννητική ηλικία Ρ6. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενα πρόδρομα κύτταρα του εγκεφάλου τα οποία θα διαφοροποιηθούν αργότερα σε νευρώνες. Έτσι, φαίνεται ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88, σε αντίθεση με τον μεταγραφικό παράγοντα NeuN, πιθανόν να χαρακτηρίζει τα κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων πριν την έξοδο από τον κυτταρικό τους κύκλο και πριν τη διαφοροποίησή τους Η πρωτεΐνη ΒΜ88 δεν εντοπίζεται σε προγονικά κύτταρα γλοιοκυττάρων ή σε διαφοροποιημένα γλοιϊκά κύτταρα στον εμβρυϊκό και πρώιμο μεταγεννητικό εγκέφαλο του αρουραίου. Παλαιότερες ανοσοϊστοχημικές χρώσεις που είχαν πραγματοποιηθεί έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε επίπεδο φωτονικού και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, σε ενήλικο εγκέφαλο αλλά και σε πρωτογενείς καλλιέργειες εγκεφάλου αρουραίου ηλικίας Ε16 και Ε18, είχαν δείξει ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εντοπίζεται σε νευρώνες και όχι σε γλοιοκύτταρα του ΚΝΣ (Patsavoudi et al., 1995). Ωστόσο, επειδή τα αποτελέσματα που περιγράψαμε μέχρι τώρα δείχνουν έντονη έκφραση της ΒΜ88 στο νευροεπιθήλιο του εμβρυϊκού και πρώιμου μεταγεννητικού εγκεφάλου όπου τα κύτταρα είναι ακόμα αδιαφοροποίητα, ήταν αναγκαίο να ελεγχθεί αν η έκφραση του ΒΜ88 in vivo χαρακτηρίζει τα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας ή αν εκφράζεται αδιακρίτως και σε προγονικά κύτταρα γλοιοκυττάρων. Τα γλοιοκύτταρα του ΚΝΣ, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τα αστροκύτταρα και τα ολιγοδενδροκύτταρα. Και οι δύο κατηγορίες προέρχονται από πρόδρομα κύτταρα που εντοπίζονται τόσο στις περιοχές VZ και SVZ όσο και σε άλλες, μη καθορισμένες μέχρι σήμερα περιοχές του 102

117 Αποτελέσματα εγκεφάλου. Συγκεκριμένα τα αστροκύτταρα χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τα τύπου Ι αστροκύτταρα που προέρχονται από προγονικά κύτταρα που εκφράζουν από νωρίς την πρωτεΐνη GFAP και τα τύπου ΙΙ αστροκύτταρα που προέρχονται από μία κατηγορία προγονικών κυττάρων, τα Ο2Α κύτταρα τα οποία θα δώσουν γένεση όχι μόνο στα τύπου ΙΙ αστροκύτταρα, αλλά και στα ολιγοδενδροκύτταρα (review: Pfeiffer et al., 1993). Εικόνα 4. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε σχέση με τους μάρτυρες της γλοιϊκής γενεαλογίας NG2 και GFAP στον πρόσθιο εγκέφαλο αρουραίου. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και της πρωτεΐνης-μάρτυρα των προγονικών γλοιοκυττάρων Ο2Α, NG2 (κόκκινο) δείχνουν ότι η ΒΜ88 δεν εκφράζεται στα κύτταρα που θα δώσουν γένεση στα ολιγοδενδροκύτταρα και στα τύπου ΙΙ αστροκύτταρα. Επιπλέον, η πρωτεΐνη ΒΜ88 δεν εντοπίζεται στα κύτταρα που εκφράζουν GFAP (κόκκινο), (Ζ-Θ). Στις φωτογραφίες απεικονίζεται η περιοχή του γαγγλιωνικού επάρματος (gaglionic eminence, GE) κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε18 και τις μεταγεννητικές ημέρες Ρ0 και Ρ6. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν από συνεστιακό μικροσκόπιο. GE (ganglionic eminence): γαγγλιωνικό έπαρμα. Κλίμακα: 30μm 103

118 Αποτελέσματα Τα κύτταρα Ο2Α διακρίνονται από την έκφραση της πρωτεΐνης NG2 (review: Pfeiffer et al., 1993). Έτσι, ολόκληρος ο πληθυσμός των γλοιοκυττάρων προκύπτει από δύο είδη πρόδρομων κυττάρων, τα GFAP+ κύτταρα και τα NG2+ κύτταρα (ή Ο2Α κύτταρα). Η διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων προς γλοιοκύτταρα καθυστερεί χρονικά σε σχέση με τη νευρογένεση και αρχίζει τις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες (Ε18 για τον αρουραίο) για να ολοκληρωθεί τις πρώτες μεταγεννητικές εβδομάδες (Ρ10 για τον αρουραίο). Για να εξακριβώσουμε λοιπόν αν η έκφραση της ΒΜ88 περιορίζεται μόνο σε προγονικά κύτταρα νευρώνων, προχωρήσαμε σε διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού σε ιστολογικές τομές εγκεφάλου αρουραίου στις ηλικίες Ε18, Ρ0 και Ρ6, έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι των δύο μαρτύρων πρόδρομων γλοιοκυττάρων, GFAP και NG2. Οι εικόνες που προέκυψαν από τις χρώσεις αυτές δείχνουν καθαρά ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 δε συνεντοπίζεται με μάρτυρες της γλοιϊκής γενεαλογίας στα αναπτυξιακά στάδια του πρόσθιου εγκεφάλου που ελέχθησαν (Εικόνα 4). Το γεγονός αυτό μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 αποτελεί ειδικό πρώιμο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στα κύτταρα της VZ και SVZ του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου πριν την τελευταία τους μιτωτική διαίρεση. Διαπιστώσαμε προηγουμένως ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε αδιαφοροποίητα κύτταρα των νευροεπιθηλιακών ζωνών VZ και SVZ του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου που πιθανόν αποτελούν πρόδρομα κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων. Ωστόσο, δεν είναι φανερό αν τα κύτταρα στα οποία εκφράζεται η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι κύτταρα που συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται ή είναι μεταμιτωτικά κύτταρα που μόλις έχουν σταματήσει την πολλαπλασιαστική τους δραστηριότητα. Για να προσδιορίσουμε εάν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από κύτταρα που πολλαπλασιάζονται ενεργά, προσδιορίσαμε μιτωτικούς πληθυσμούς κυττάρων στη VZ και SVZ. Για τη σήμανση των κυττάρων αυτών χρησιμοποιήσαμε ένα ανάλογο της θυμιδίνης, τη βρωμο-δεοξυ-ουριδίνη (BrdU) η οποία ενσωματώνεται στο DNA του κυττάρου μόνο κατά τη φάση της αντιγραφής του (φάση S του κυτταρικού κύκλου) και άρα ανιχνεύεται μόνο σε κύτταρα που πολλαπλασιάζονται. Το BrdU χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά στις έγκυες που έφεραν έμβρυα 14 και 18 ημερών. Με τον τρόπο αυτό το BrdU ενσωματώνεται σε όλα τα κύτταρα των εμβρύων που διανύουν την φάση S του κυτταρικού τους κύκλου και άρα και στα κύτταρα των ζωνών VZ και SVZ του πρόσθιου εγκεφάλου τους. Τα ζώα θυσιάζονται 1.5 ή 4 ώρες μετά τη χορήγηση του BrdU, οι εγκέφαλοι των εμβρύων εγκλείονται σε 104

119 Αποτελέσματα παραφίνη και στεφανιαίες τομές αυτών αναλύονται με διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έναντι του BrdU και της πρωτεΐνης ΒΜ88 (Εικόνα 5Α-Γ). Τα κριτήρια με τα οποία επιλέχθηκαν οι χρόνοι των 1.5 και 4 ωρών, στους οποίους θυσιάστηκαν τα ζώα, βασίζονται στη διάρκεια των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Ειδικότερα, η διάρκεια των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα των ζωνών VZ και SVZ στις συγκεκριμένες εμβρυϊκές ηλικίες του αρουραίου (Ε14 και Ε16) έχουν μελετηθεί αναλυτικά από την ομάδα του Νowakovski (Takahashi et al., 1996a,b, review: Νowakovski 2002). Σύμφωνα με τις μελέτες αυτές η διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου είναι 4-5 ώρες ενώ η φάση που ακολουθεί και η οποία αποκαλείται φάση G2, διαρκεί ώρες περίπου. Τη φάση G2 ακολουθεί η φάση της μίτωσης (Μ) η οποία διαρκεί λίγο (40 λεπτά περίπου) και κατά την οποία το κύτταρο διαιρείται σε δύο νέα κύτταρα. Με δεδομένους τους παραπάνω χρόνους, στην 1.5 ώρα μετά την ένεση με BrdU, η πλειονότητα των σημασμένων κυττάρων θα βρίσκεται ή στην φάση S ή στη φάση G2 ανάλογα με το στάδιο της φάσης S στο οποίο βρίσκονταν όταν έγινε η ένεση (αρχή, μέση ή τέλος της φάσης S). Έτσι όλα τα κύτταρα που θα έχουν σημανθεί με BrdU, 1.5 ώρα μετά θα είναι προ-μιτωτικά κύτταρα και τα σώματά τους θα εντοπίζονται στις ζώνες VZ και SVZ όπου λαμβάνουν χώρα οι μιτωτικές διαδικασίες των νευροεπιθηλιακών κυττάρων. Στις 4 ώρες μετά την ένεση με BrdU ένας αριθμός κυττάρων που θα το έχουν ενσωματώσει θα βρίσκονται πάλι στη φάση S ή στη φάση G2, ωστόσο θα υπάρχουν και ορισμένα κύτταρα που θα έχουν προλάβει να εισέλθουν στη διαδικασία της μίτωσης αλλά και κάποια τα οποία θα έχουν προλάβει να την ολοκληρώσουν. Κύτταρα της τελευταίας αυτής κατηγορίας, είτε θα μπουν σε νέο κύκλο, και επομένως θα βρίσκονται στη φάση G1 παραμένοντας στις ζώνες πολλαπλασιασμού VZ και SVZ, είτε θα βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και θα μετατραπούν σε μεταμιτωτικά κύτταρα (φάση G0). Ως γνωστόν, τα κύτταρα αυτά αμέσως μετά την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο, κατά τη φάση G0, εγκαταλείπουν τις ζώνες VZ και SVZ και αρχίζουν να μεταναστεύουν, γι αυτό και τα σώματά τους εντοπίζονται σε στιβάδες του φλοιϊκού πετάλου όπου πραγματοποιείται η διαφοροποίησή τους προς νευρώνες. Τα αποτελέσματα από τις διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι 1.5 ώρα μετά την ένεση με BrdU, η πλειονότητα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων που έχουν σημανθεί με BrdU και άρα πολλαπλασιάζονται (ΒrdU+ κύτταρα) τόσο κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε14 (Εικόνα 5Α-Γ και 6Α) όσο και κατά την ημέρα Ε18 (Εικόνα 7Α και Β), εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (ΒΜ88+ κύτταρα). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι τα κύτταρα που έχουν σημανθεί με BrdU, εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 ενώ βρίσκονται σε διαδικασία ενεργού πολλαπλασιασμού και μάλιστα πριν τη μίτωση. 105

120 Αποτελέσματα Εικόνα 5. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε πολλαπλασιαζόμενα νευροεπιθηλιακά κύτταρα στον πρόσθιο εγκέφαλο αρουραίου ηλικίας Ε14. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (Εικόνα 5Α) και της βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης (BrdU), (Εικόνα 5Β) που ενσωματώνεται σε κύτταρα που βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Κάτω αριστερά περιγράφονται σχηματικά τα στάδια του κυτταρικού κύκλου ενώ με κόκκινο χρώμα σημαίνεται το στάδιο του κυτταρικού κύκλου που ανιχνεύεται. Μετά από 1.5 ώρα ενσωμάτωσης με BrdU σημαίνονται μόνο κύτταρα που διανύουν τις φάσεις S ή G2 και που θα προχωρήσουν σε κυτταρική διαίρεση. Στην εικόνα Γ φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 εντοπίζεται σε κύτταρα της κοιλιακής περιοχής (ventricular zone, VZ) που έχουν ενσωματώσει BrdU και άρα αποτελούν ενεργά πολλαπλασιαζόμενους νευροβλάστες. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη Κλίμακα: 30μm. 106

121 Αποτελέσματα Εικόνα 6. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων νευροβλαστικών κυττάρων του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου ηλικίας Ε14 με τη χρήση των μαρτύρων πολλαπλασιασμού BrdU και κυκλίνης B1. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και της βρωμοδεοξυ-ουριδίνης (BrdU, κόκκινο, Εικόνα 6Α και Β) ή της κυκλίνης B1 (κόκκινο, Εικόνα 6Γ). Στην αριστερή στήλη περιγράφονται σχηματικά τα στάδια του κυτταρικού κύκλου ενώ με κόκκινο χρώμα σημαίνεται το στάδιο του κυτταρικού κύκλου που ανιχνεύεται κάθε φορά στο εκάστοτε πείραμα. Έτσι στο πείραμα που φαίνεται στην εικόνα 6Α, το BrdU σημαίνει, μετά από 1.5 ώρα ενσωμάτωσης, κύτταρα που διανύουν τις φάσεις S ή G2 ενώ στο πείραμα που περιγράφεται στην εικόνα 6Β το BrdU σημαίνει, μετά από 4 ώρες ενσωμάτωσης, κύτταρα που διανύουν τις φάσεις S, G2 ή Μ αλλά και κάποια κύτταρα που έχουν διαιρεθεί και είτε έχουν ξαναμπεί στη φάση G1, είτε έχουν βγει από τον κυτταρικό κύκλο (μεταμιτωτικά κύτταρα, φάση G0). Τέλος στο πείραμα που περιγράφεται στην εικόνα 6Γ, με την ανίχνευση της κυκλίνης Β1, ανιχνεύονται κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο της μίτωσης (στάδιο Μ). Οι διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού στη δεξιά στήλη δείχνουν ότι 1.5 ώρα μετά την ενσωμάτωση BrdU (Εικόνα Α) ένα υψηλό ποσοστό πολλαπλασιαζόμενων νευροβλαστικών κυττάρων της κοιλιακής ζώνης (ventricular zone, VZ) εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88 ενώ βρίσκονται ακόμα στη φάση S ή στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου (ο συνεντοπισμός διακρίνεται με κίτρινο χρώμα, μικρά βέλη), ενώ ένας υποπληθυσμός των σημασμένων 107

122 Αποτελέσματα με BrdU κυττάρων της κοιλιακής ζώνης δεν εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κόκκινο, μεγάλα βέλη). Tέσσερις (4) ώρες μετά την ενσωμάτωση BrdU (Εικόνα Β) το μεγαλύτερο μέρος των σημασμένων με BrdU κυττάρων της κοιλιακής ζώνης, που αποτελούν στην πλειονότητά τους κύτταρα στην φάση S και στη φάση G2/Μ αλλά και κάποια κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G0/G1και μεταναστεύουν προς το φλοιό (CP), εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κίτρινο, μικρά βέλη), ενώ πάλι μία μικρή ομάδα των σημασμένων με BrdU κυττάρων της κοιλιακής ζώνης δεν εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κόκκινο, μεγάλα βέλη). Τέλος στην Εικόνα Γ φαίνεται ότι τα περισσότερα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης που εκφράζουν τη κυκλίνη Β1 και άρα βρίσκονται σε μιτωτικό στάδιο, εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κίτρινο, μικρά βέλη) ενώ ανιχνεύονται και κάποια μιτωτικά κύτταρα που δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κόκκινο, μεγάλα βέλη). Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. CP (cortical plate) : φλοιϊκό πέταλο, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, pia: χοριoειδής μήνιγγα, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη. Κλίμακα: 30μm. Ποσοτική ανάλυση των παραπάνω αποτελεσμάτων (Πίνακας 1) έδειξε ότι 1.5 ώρα μετά την ένεση με BrdU το 80±4% των προ-μιτωτικών κυττάρων εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 την ημέρα Ε14 ενώ το ποσοστό αυτό υπολογίζεται στο 75±4% την ημέρα Ε18. Τα ποσοστά αυτά δεν αλλάζουν σημαντικά 4 ώρες μετά την ένεση με BrdU, αφού κατά την ημέρα Ε14 το 75±2%, και στην ημέρα Ε18 το 72±5% των κυττάρων που πολλαπλασιάζονται εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η έκφραση της ΒΜ88 σε κύτταρα του νευροεπιθηλίου που δεν έχουν ολοκληρώσει την πολλαπλασιαστική τους δραστηριότητα, εφαρμόσαμε την τεχνική του διπλού ανοσοφθορισμού αυτή τη φορά έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι του μάρτυρα της μίτωσης, κυκλίνης Β1. Η κυκλίνη Β1 εκφράζεται κατά το τέλος της φάσης G2 και καθ όλη τη διάρκεια της μίτωσης. Έτσι διαπιστώθηκε ότι σε μεγάλο ποσοστό των μιτωτικών κυττάρων που εντοπίζονται στις ζώνες VZ και SVZ και αντιστοιχούν σε πολλαπλασιαζόμενους νευροβλάστες, ανιχνεύεται και η πρωτεΐνη ΒΜ88 τόσο κατά την ημέρα Ε14 όσο και κατά την ημέρα Ε18 (Εικόνα 6Γ και 7Γ αντίστοιχα). Επιπλέον δεν παρατηρήθηκε συνεντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της κυκλίνης Β1 σε μιτωτικά κύτταρα που εντοπίζονται σε άλλες μη νευρογενετικές ζώνες του προσθίου εγκεφάλου και που αντιστοιχούν πιθανά σε γλοιοβλαστικά κύτταρα (Εικόνα 7Α). Όσον αφορά τη χωροδιάταξη των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 παρατηρούμε ότι κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14 αυτά τα κύτταρα εντοπίζονται σε όλο το εύρος της φλοιϊκού πετάλου από την κοιλιακή επιφάνεια έως την εξωτερική επιφάνεια του φλοιού που καλύπτεται από τη χοριοειδή μήνιγγα (pia). Αυτό συμβαίνει γιατί ο πληθυσμός των νευροβλαστικών κυττάρων που πολλαπλασιάζονται στον πρόσθιο εγκέφαλο σ αυτή την ηλικία καλύπτει το μεγαλύτερο τμήμα του τελεγκεφάλου, ενώ ο νεοσχηματιζόμενος φλοιός (CP) αντιστοιχεί σε μια πολύ λεπτή επιφανειακή ζώνη (Εικόνες 5 και 6). Κατά την ηλικία 108

123 Αποτελέσματα Ε18 όπου οι ζώνες πολλαπλασιασμού των νευρώνων είναι μικρότερες και τα όριά τους ευδιάκριτα, ΒΜ88+ πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ανιχνεύθηκαν μόνο στις VZ και SVZ (εικόνα 7Β) και όχι στο φλοιϊκό πέταλο (CP) που είναι μη νευρογενετική περιοχή, (εικόνα 7Α) τόσο στις 1.5 όσο και στις 4 ώρες μετά την ενσωμάτωση του BrdU. Αυτές οι παρατηρήσεις ενισχύουν το γεγονός ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88, παράλληλα με την έκφρασή της από διαφοροποιημένους νευρώνες, εκφράζεται και σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας. 1.5 ώρα μετά τη χορήγηση BrdU 4 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU Εγκεφαλικό Γαγγλιωνικό Εγκεφαλικό Γαγγλιωνικό φλοϊκό πέταλο έπαρμα (GE) φλοϊκό πέταλο έπαρμα (GE) (CP) (CP) E14 80 ± 4% 69 ± 4% 75 ± 2% 69 ± 5% E18 75 ± 4% 75 ± 3% 72 ± 5% 72 ± 3% 1.5 ώρα μετά τη χορήγηση BrdU 4 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU Πρόσθια Ιππόκαμπος Πρόσθια Ιππόκαμπος κοιλιακή ζώνη (Hip) κοιλιακή ζώνη (Hip) (asvz) (asvz) P0 65 ± 2% 40 ± 1% 70 ± 1% 30 ± 5% P6 55 ± 5% 30 ± 1% 53 ± 5% 25 ± 3% Πίνακας 1. Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που εκφράζουν ΒΜ88 σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου στις ηλικίες Ε14, Ε18, Ρ0 και Ρ6 όπως προκύπτουν από τις διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης (BrdU) 1.5 ώρα και 4 ώρες μετά την χορήγησή της. Τα στοιχεία που αναφέρονται στον πίνακα βασίστηκαν σε μετρήσεις κυττάρων που πραγματοποιήθηκαν σε τρία ζώα συνολικά. Ο μέσος όρος υπολογίστηκε από μετρήσεις που έγιναν σε πέντε τομές ανά ζώο και σε τρεις διαφορετικές περιοχές για κάθε τομή. Οι διαφορές που υπολογίσθηκαν μεταξύ των τριών ζώων του εκάστοτε πειράματος δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Ρ>0.5). Οι διαφορές που παρατηρούνται στα ποσοστά των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 στις ηλικίες Ρ0 και Ρ6 είναι στατιστικά σημαντικές (Ρ<0.01), τόσο στον ιππόκαμπο (Hip) όσο και στην πρόσθια κοιλιακή περιοχή (asvz). Στατιστικά σημαντική (Ρ<0.01), είναι και η διαφορά που παρατηρείται μεταξύ των ηλικιών Ρ0 και Ρ6 για τoυς διαφορετικούς χρόνους ενσωμάτωσης του BrdU (1.5 και 4 ώρες). Στατιστική ανάλυση Τ-test των ποσοστών συνεντοπισμού της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του BrdU στις εμβρυϊκές ηλικίες Ε14 και Ε18, έδειξε ότι η μικρή μείωση που παρατηρείται στην ηλικία Ε18 δεν είναι στατιστικά σημαντική (Ρ>0.2). 109

124 Αποτελέσματα Εικόνα 7. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων νευροβλαστικών κυττάρων του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου ηλικίας Ε18 με τη χρήση των μαρτύρων πολλαπλασιασμού BrdU και κυκλίνης B1. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και της βρωμοδεοξυ-ουριδίνης (BrdU, κόκκινο, Εικόνα 7Α και Β) ή της κυκλίνης B1 (κόκκινο, Εικόνα 7Γ). Στην αριστερή στήλη περιγράφονται σχηματικά τα στάδια του κυτταρικού κύκλου, ενώ με κόκκινο χρώμα σημαίνεται το στάδιο του κυτταρικού κύκλου που ανιχνεύεται κάθε φορά στο εκάστοτε πείραμα. Έτσι στο πείραμα που περιγράφεται στην εικόνα 7Α και 7Β, το BrdU σημαίνει, μετά από 1.5 ώρα ενσωμάτωσης, κύτταρα που διανύουν τις φάσεις S ή G2 ενώ στην εικόνα 7Γ η κυκλίνη Β1, ανιχνεύει κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο της μίτωσης (στάδιο Μ). Οι διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού στη δεξιά στήλη δείχνουν ότι 1.5 ώρα μετά την ενσωμάτωση BrdU (Εικόνα 7Α ) δεν υπάρχει συνεντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του BrdU σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της φλοιϊκού πετάλου (CP) που αποτελεί μη νευροβλαστική περιοχή κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε18 (κόκκινο, μεγάλα βέλη). Αντίθετα στην περιοχή της κοιλιακής ζώνης (VZ) που είναι νευροβλαστική ζώνη με έντονη νευρογενετική δραστηριότητα κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε18, ένα υψηλό ποσοστό πολλαπλασιαζόμενων νευροβλαστών εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88 ενώ βρίσκονται ακόμα στη φάση S ή στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου (ο συνεντοπισμός διακρίνεται με κίτρινο χρώμα, μικρά βέλη). Τέλος, στην Εικόνα Γ φαίνεται ότι τα περισσότερα κύτταρα της κοιλιακής ζώνης στην ηλικία Ε18 που εκφράζουν τη κυκλίνη Β1 και άρα βρίσκονται σε μιτωτικό στάδιο, εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κίτρινο, μικρά βέλη) ενώ ανιχνεύονται και κάποια μιτωτικά κύτταρα που δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (κόκκινο, μεγάλα βέλη). Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. CP (cortical plate) : φλοιϊκό πέταλο, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, pia: χοριoειδής μήνιγγα, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη. Κλίμακα: 30μm. 110

125 Αποτελέσματα Παρόμοια αποτελέσματα πήραμε και στην περιοχή του γαγγλιωνικού επάρματος όπου κι εκεί παρατηρείται έντονη νευρογένεση. Εδώ τα ποσοστά των κυττάρων που έχουν σημανθεί με BrdU και εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι όπως φαίνεται και στον πίνακα 1, 69±4% και 67±3% για τη 1.5 και τις 4ώρες μετά την ένεση αντίστοιχα, στην ηλικία Ε14, ενώ στην ηλικία Ε18 τα αντίστοιχα ποσοστά είναι 69±5% και 72±3%. Παρότι τα ποσοστά στην περιοχή του γαγγλιωνικού επάρματος είναι λίγο χαμηλότερα από αυτά που υπολογίσθηκαν στις περιοχές VZ και SVZ του φλοιού, οι διαφορές δεν είναι στατιστικά σημαντικές (Ρ>0.5) Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε πολλαπλασιαζόμενα νευροβλαστικά κύτταρα σε περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση στις πρώιμες μεταγεννητικές ηλικίες. Κατά το αναπτυξιακό στάδιο της γέννησης το μεγαλύτερο μέρος της δημιουργίας νευρώνων στον εγκεφαλικό φλοιό έχει ολοκληρωθεί. Ωστόσο ένας μικρότερος πληθυσμός νευρώνων παράγεται μετά τη γέννηση του ζώου σε συγκεκριμένες θέσεις του φλοιού του εγκεφάλου κατά τη διάρκεια μίας διαδικασίας που ονομάζεται δευτερογενής νευρογένεση (Εισαγωγή). Κατά τη μεταγεννητική περίοδο, καθώς και στο ενήλικο ζώο, ως τέτοιες θέσεις παραγωγής νευρώνων χαρακτηρίζονται ο Ιππόκαμπος (Hip) και η πρόσθια κοιλιακή ζώνη (asvz). Είδαμε προηγουμένως ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά τις εμβρυϊκές ηλικίες Ε14 και Ε18, στις οποίες λαμβάνει χώρα η πρωτογενής νευρογένεση, από πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα των νευροεπιθηλιακών ζωνών VZ και SVZ του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου. Για να διερευνήσουμε την πιθανότητα συσχέτισης της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της δευτερογενούς νευρογένεσης, πραγματοποιήσαμε πειράματα ενσωμάτωσης BrdU σε αρουραίους με πρωτόκολλο ίδιο με αυτό της εμβρυϊκής περιόδου, αλλά αυτή τη φορά σε ηλικίες Ρ0 και Ρ6 (Εικόνες 8Α-Δ). Η ανάλυση των ζώων έγινε μετά από 1.5 ώρα ή 4 ώρες κατόπιν της ένεσης με BrdU. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όπως στις εμβρυϊκές ηλικίες έτσι και μεταγεννητικά, ένας πληθυσμός πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που εντοπίζεται στις νευρογενετικές ζώνες εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88. Το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στα οποία εντοπίζεται η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι μικρότερο στις μεταγεννητικές απ ότι στις εμβρυϊκές ηλικίες (Εικόνα 8 και Πίνακας 1). Έτσι την ημέρα της γέννησης του ζώου τα κύτταρα της πρόσθιας κοιλιακής ζώνης (asvz) που σημαίνονται με BrdU και εκφράζουν ΒΜ88 αντιπροσωπεύουν ποσοστό 65 ± 2% και 70 ± 1% του συνόλου των σημασμένων με BrdU κυττάρων στη 1.5 και στις 4 ώρες μετά την ένεση, αντίστοιχα. Τα ποσοστά των κυττάρων αυτών κατά τη 111

126 Αποτελέσματα μεταγεννητική ημέρα Ρ6 διαμορφώνονται σε 55 ± 5% και 53 ± 5% αντίστοιχα. Οσον αφορά την περιοχή του ιπποκάμπου (Hip) κατά την ημέρα της γέννησης ο πληθυσμός των κυττάρων που σημαίνονται με BrdU και εκφράζουν ΒΜ88 αντιπροσωπεύει ποσοστό 40 ± 1% και 30 ± 5% του συνόλου των σημασμένων με BrdU κυττάρων στη 1.5 και στις 4 ώρες μετά την ένεση, αντίστοιχα. Τα ποσοστά των κυττάρων αυτών κατά τη μεταγεννητική ημέρα Ρ6 διαμορφώνονται κατ αντιστοιχία σε 30 ± 6% και 25 ± 3%. Τα μικρότερα ποσοστά των σημασμένων με ΒrdU κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 στις μεταγεννητικές ηλικίες σε σχέση με τα ποσοστά που παρατηρούμε στα εμβρυϊκά στάδια ανάπτυξης του ζώου, βρίσκονται σε συμφωνία με την πιο περιορισμένη νευρογενετική δραστηριότητα των πρόδρομων κυττάρων του μεταγεννητικού πρόσθιου εγκεφάλου σε σχέση με αυτή του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου. Επιπλέον, παρατηρείται περαιτέρω μείωση μεταξύ του ποσοστού των σημασμένων με ΒrdU κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 που υπολογίζεται κατά την γέννηση (ημέρα Ρ0), και του ποσοστού των κυττάρων που υπολογίζεται στην μεταγεννητική ημέρα Ρ6. Η διαφορά μεταξύ των δύο ποσοστών είναι στατιστικά σημαντική (Ρ<0.01). Αυτή η ποσοστιαία μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο σύνολο των πολλαπλασιαζόμενων πρόδρομων κυττάρων του προσθίου εγκεφάλου συμπίπτει χρονικά με τη μετάβαση που παρατηρείται από τη νευρογένεση στη γλοιογένεση, η οποία υπερισχύει σημαντικά μετά τη γέννηση του ζώου. Όπως φαίνεται στην εικόνα 8Α και Β τα κύτταρα που έχουν σημανθεί με ΒrdU και εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88, τόσο 1.5 ώρα όσο και 4 ώρες μετά την ενσωμάτωση ΒrdU, εντοπίζονται είτε στην κοιλιακή περιοχή του ιπποκάμπου (εικόνα 8Α), είτε στην περιοχή της πρόσθιας υποκοιλιακής ζώνης (εικόνα 8Β). Είναι γνωστό ότι και στις δύο αυτές περιοχές εντοπίζονται αδιαφοροποίητα κύτταρα με μιτωτική δραστηριότητα τα οποία θα δώσουν γένεση σε νευρώνες. Στο ίδιο χρονικό διάστημα ενσωμάτωσης ΒrdU δεν εντοπίστηκαν κύτταρα που να έχουν σημανθεί με ΒrdU και να εκφράζουν ταυτόχρονα και την πρωτεΐνη ΒΜ88 σε περιοχές που δε λαμβάνει χώρα η διαδικασία της νευρογένεσης (όπως π.χ. ο φλοιός, εικόνα 8Γ). Επιπλέον, διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του δείκτη πολλαπλασιασμού, κυκλίνης B1 επιβεβαίωσαν ότι τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται στην περιοχή του φλοιού δεν εκφράζουν τη πρωτεΐνη ΒΜ88 (Εικόνα 8Δ). Αντίθετα, στις περιοχές αυτές (και ιδιαίτερα στο φλοιό) παρατηρείται μεγάλος αριθμός διαφοροποιημένων νευρώνων που δεν έχουν σημανθεί με ΒrdU και δεν εκφράζουν τη κυκλίνη D1, ενώ εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 (εικόνα 8Γ και Δ, αντίστοιχα). 112

127 Αποτελέσματα Εικόνα 8. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων νευρογενετικών και μη νευρογενετικών περιοχών του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου κατά τη περίοδο της δευτερογενούς νευρογένεσης (ηλικίες Ρ0 και Ρ6 ) με τη χρήση των δεικτών πολλαπλασιασμού BrdU και κυκλίνης B1. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και των μαρτύρων πολλαπλασιασμού βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης (BrdU, κόκκινο, Εικόνα 8Α, 8Β και 8Γ) και της κυκλίνης B1 (κόκκινο, Εικόνα 8Δ). Οι διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού δείχνουν ότι 1.5 ώρα και 4 ώρες μετά την ένεση με BrdU (Εικόνες 8Α και 8Β αντίστοιχα) υπάρχει συνεντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του BrdU σε ορισμένα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του Ιπποκάμπου (Hip) και της πρόσθιας υποκοιλιακής ζώνης (asvz) που αποτελούν δευτερογενείς νευροβλαστικές περιοχές κατά τη μεταγεννητική ημέρα Ρ6 (ο συνεντοπισμός διακρίνεται με κίτρινο χρώμα, μικρά βέλη). Ο συνεντοπισμός αυτός δηλώνει ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενα νευροβλαστικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της δευτερογενούς νευρογένεσης. Ωστόσο, στις περιοχές αυτές εντοπίζονται και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα που δεν εκφράζουν τη πρωτεΐνη ΒΜ88 και ανήκουν πιθανώς στο γλοιοβλαστικό πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που στην ηλικία αυτή αυξάνεται σημαντικά. Επιπλέον, σε περιοχές του πρόσθιου εγκεφάλου όπως είναι το φλοϊκό πέταλο (CP) όπου δε λαμβάνει χώρα δευτερογενής νευρογένεση, δεν παρατηρείται συνεντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 και των μαρτύρων πολλαπλασιασμού βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης (BrdU, κόκκινο, μικρά βέλη, Εικόνα 8Γ) και της κυκλίνης B1 (κόκκινο, μεγάλα βέλη, Εικόνα 8Δ). Τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται στις περιοχές αυτές στη συγκεκριμένη περίοδο ανάπτυξης του αρουραίου θα δώσουν γένεση σε κύτταρα της γλοίας και όχι σε νευρώνες. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. asvz (anterior subventricular zone): πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη, CP (cortical plate) : φλοϊκό πέταλο, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία. Κλίμακα: 40μm. 113

128 Αποτελέσματα 3.7. Η πρωτεΐνη ΒΜ88 δεν εκφράζεται σε κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου κατά τη περίοδο της δευτερογενούς νευρογένεσης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην Εισαγωγή, ο πρόσθιος εγκέφαλος αποτελείται από διαφορετικούς πληθυσμούς διαφοροποιημένων κυττάρων, τους νευρώνες και τα γλοιϊκά κύτταρα. Η δημιουργία των κυττάρων αυτών από προγονικά νευροβλαστικά και γλοιοβλαστικά κύτταρα αντίστοιχα, διαφέρει χρονικά. Έτσι κατά το τελευταίο τρίτο της εμβρυϊκής ζωής κυριαρχεί η διαδικασία της δημιουργίας νευρώνων στον εγκεφαλικό φλοιό η οποία και ολοκληρώνεται σχεδόν κατά το αναπτυξιακό στάδιο της γέννησης. Μεταγεννητικά λίγοι νευρώνες δημιουργούνται σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, ενώ η διαδικασία που σταδιακά υπερισχύει της νευρογένεσης είναι η γλοιογένεση. Ωστόσο, οι περιοχές παραγωγής νευρώνων και γλοιοκυττάρων συμπίπτουν εν μέρει, ενώ τα όρια των αδιαφοροποιήτων νευροβλαστικών και γλοιοβλαστικών κυττάρων δεν είναι διακριτά. Πολύ συχνά μάλιστα, συμβαίνει πρόδρομα κύτταρα μιας συγκεκριμένης περιοχής να είναι αρχικά νευρογενετικά ενώ σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια να μετατρέπονται σε γλοιογενετικά (Takahashi et al., 1995a,b, Tarabykin et al., 2001, Desai and McConnell, 2000, Noctor et al., 2004). Είδαμε προηγουμένως ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά τις μεταγεννητικές ηλικίες Ρ0 και Ρ6 στις περιοχές όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση. Επειδή όμως μεταγεννητικά στο επιθήλιο του πρόσθιου εγκεφάλου λαμβάνει χώρα και έντονη γλοιογένεση, ήταν αναγκαίο να ελεγχθεί αν η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του επιθηλίου αντιστοιχεί σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας ή αν κατανέμεται αδιακρίτως τόσο σε κύτταρα μη νευρωνικά, όσο και σε κύτταρα της αστρογλοιϊκής γενεαλογίας. Για το σκοπό αυτό διερευνήσαμε την κατανομή της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο κύριο σώμα της υποκοιλιακής ζώνης στο οποίο παρατηρείται έντονη γλοιογένεση, σε αντίθεση με την πρόσθια κοιλιακή ζώνη όπου κυριαρχεί η νευρογένεση. Εφαρμόζοντας τη τεχνική της χρώσης τριπλού ανοσοφθορισμού σε αρουραίο ηλικίας Ρ6, ανιχνεύσαμε ταυτόχρονα τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του επιθηλίου της κύριας υποκοιλιακής ζώνης (SVZ) με αντισώματα έναντι της ουσίας BrdU, 4 ώρες μετά την ένεσή του, την πρωτεΐνη ΒΜ88 και την πρωτεΐνη-μάρτυρα των αστρογλοιΐκών κυττάρων GFAP. Τα αποτελέσματα των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων έδειξαν ότι αν και η πρωτείνη ΒΜ88 εκφράζεται περιορισμένα σε κάποια πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (σημασμένα με BrdU) ωστόσο η έκφρασή της δε συμπίπτει με αυτή της πρωτεΐνης των αστροκυττάρων GFAP που στην περιοχή και στην ηλικία αυτή είναι πολύ έντονη (Εικόνα 9). Το εύρημα αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις μας στην 114

129 Αποτελέσματα πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη (asvz) όπου η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ήταν πολύ εκτεταμένη (Εικόνα 8). Τα παραπάνω ενισχύουν την υπόθεση ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 σχετίζεται με τη διαδικασία των νευρογενετικών διαδικασιών που λαμβάνουν χώρα στον πρόσθιο εγκέφαλο. Εικόνα 9. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των πολλαπλασιαζόμενων γλοιοβλαστικών κυττάρων μη νευρογενετικών περιοχών του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου κατά τη περίοδο της δευτερογενούς νευρογένεσης (μεταγεννητική ημέρα Ρ6) με τη χρήση του μάρτυρα πολλαπλασιασμού BrdU και του μαρτύρα των γλοιοβλαστικών κυττάρων GFAP. Τριπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο), του μάρτυρα πολλαπλασιασμού βρωμο-δεοξυ-ουριδίνης 4 ώρες μετά την χορήγησή του (BrdU, μπλε) και του μάρτυρα των γλοιοβλαστικών κυττάρων GFAP (κόκκινο). Σε αντίθεση με την πρόσθια υποκοιλιακή ζώνη (asvz) όπου ο συνεντοπισμός του μάρτυρα πολλαπλασιασμού BrdU και της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι σημαντικός (Εικόνα 8Α και 8Β), στην υπόλοιπη υποκοιλιακή ζώνη (SVZ) (Εικόνα 9) που στην ηλικία αυτή θεωρείται κυρίως γλοιογενετική περιοχή, ο συνεντοπισμός αυτός είναι πολύ περιορισμένος (ο συνεντοπισμός διακρίνεται με γαλάζιο χρώμα, μεγάλα βέλη). Επιπλέον εδώ δεν παρατηρείται συνεντοπισμός της πρωτεΐνης ΒΜ88 και του μάρτυρα των γλοιοβλαστικών κυττάρων GFAP. Ετσι υποθέτουμε ότι ο περιορισμένος αριθμός κυττάρων της περιοχής αυτής στα οποία συνεντοπίζεται η πρωτεΐνη ΒΜ88 με το BrdU αντικατοπτρίζει και τον μικρό πληθυσμό νευρογενετικών κυττάρων που συναντώνται στην περιοχή αυτή στην ηλικία Ρ6. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, SVZ (subventricular zone): υποκοιλιακή ζώνη. Κλίμακα: 40μm. 115

130 Αποτελέσματα 3.8. Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευροβλαστικά κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream, RMS) κατά τη διαδικασία της δευτερογενούς νευρογένεσης στον ενήλικο αρουραίο. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, αν και η διαδικασία της νευρογένεσης ολοκληρώνεται με τη γέννηση του ζώου ένας μικρός πληθυσμός νευρώνων εξακολουθεί να παράγεται σε όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής του ατόμου. Εκτενείς μελέτες στο ζήτημα της νευρογένεσης στο ενήλικο ζώο έχουν οδηγήσει σε παρατηρήσεις που βοηθούν στον εντοπισμό αλλά και στην ταυτοποίηση των νευρογενετικών κυττάρων που εξακολουθούν να πολλαπλασιάζονται κατά την ενήλικη περίοδο. Έτσι, γνωρίζουμε ότι τα νευροβλαστικά κύτταρα του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου κατά το ενήλικο στάδιο παράγονται στην πρόσθια κοιλιακή ζώνη (asvz) και μεταναστεύουν ακόμα πιο πρόσθια στην περιοχή του οσφρητιτικού λοβού όπου και βρίσκουν την τελική τους θέση (Lois & Alvarez-Buylla, 1994). Έτσι, τα νευροβλαστικά κύτταρα ακολουθούν μία μεγάλη και πολύ αυστηρά καθορισμένη διαδρομή που ονομάζεται πρόσθιο μεταναστευτικό τόξο (rostral migratory stream, RMS), (βλ. Εισαγωγή). Από μελέτες που έχουν προηγηθεί γνωρίζουμε ότι τα νευροβλαστικά κύτταρα που μεταναστεύουν κατά μήκος του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου μπορούν να ανιχνευτούν με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης της κυτταρικής μεμβράνης PSA-NCAM ( Cremer et al., 1994, Ono et al., 1994, Hu et al., 1996, Chazal et al., 2000 ). Προκειμένου να εξετάσουμε αν η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 συνδέεται με τα νευρογενετικά κύτταρα στον ενήλικο αρουραίο, πραγματοποιήσαμε πειράματα διπλών χρώσεων ανοσοφθορισμού σε διαμήκεις τομές του πρόσθιου εγκεφάλου του ενήλικου αρουραίου (όπου αποκαλύπτεται όλο το μήκος του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου, Εικόνα 10Α), έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της πρωτεΐνης PSA-NCAM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχει συνεντοπισμός των πρωτεϊνών ΒΜ88 και PSA-NCAM στα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (Εικόνα 10Β). Επομένως, τα νευρογενετικά κύτταρα του ενήλικου πρόσθιου εγκεφάλου που θα δώσουν γένεση σε νευρώνες εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ

131 Αποτελέσματα Εικόνα 10. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των νευροβλαστικών κυττάρων που μεταναστεύουν κατά μήκος του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream, RMS) στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου (μεταγεννητική ημέρα Ρ0) με τη χρήση του πρωτεϊνικού μάρτυρα PSA-NCAM. Αριστερά: Τμήμα διαμήκους τομής εγκεφάλου ποντικού όπου αποκαλύπτεται όλο το μήκος του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (φωτογραφία φωτονικού μικροσκοπίου), και κάτω στην ίδια τομή η έκφραση της πρωτεΐνης PSA-NCAM (φωτογραφία συνεστιακού μικροσκοπίου), (Chazal et al., 2000). Μέσα σε λευκό πλαίσιο υποδεικνύεται η περιοχή που απεικονίζεται στην εικόνα 10Β. Δεξιά: Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και του μάρτυρα των νευροβλαστικών κυττάρων του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου PSA- NCAM (κόκκινο) σε διαμήκεις τομές του πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου. Οι διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού δείχνουν συνεντοπισμό της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της πρωτεΐνης PSA-NCAM (ο συνεντοπισμός διακρίνεται με κίτρινο χρώμα, μεγάλα βέλη). Κατά την ενήλικη περίοδο η νευρογένεση στον πρόσθιο εγκέφαλο του ζώου είναι πλέον πολύ περιορισμένη ενώ ο μεγαλύτερος πληθυσμός νευρογενετικών κυττάρων κατά την περίοδο αυτή είναι τα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου που εκφράζουν την πρωτεΐνη PSA-NCAM. Φαίνεται λοιπόν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από τα νευροβλαστικά κύτταρα του προσθίου εγκεφάλου ακόμα και κατά τη διάρκεια της ενήλικής ζωής. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. cc (corpus callosum): ραβδωτό σώμα, lv (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, ob (olfactory bulb): οσφρητικός λοβός, RMS (rostral migratory stream): πρόσθιο μεταναστευτικό τόξο, st (striatum): ραβδωτό σώμα. Κλίμακα: 40μm. 117

132 Αποτελέσματα 3.9. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 συνδέεται με τις ασύμμετρες μιτωτικές νευρογενετικές διαιρέσεις των πρόδρομων κυττάρων στο νευροεπιθήλιο του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου. Όπως έχουμε αναφέρει στο κεφάλαιο της Εισαγωγής, η διαδικασία της νευρογένεσης στον πρόσθιο εγκέφαλο ξεκινά στον αρουραίο κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε11, επιταχύνεται εκθετικά και ολοκληρώνεται κατά το μεγαλύτερο μέρος της στις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες Ε18-Ε19 (πρωτογενής νευρογένεση). Η εκθετική αυτή αύξηση οφείλεται στο γεγονός ότι στις πρώτες μέρες της νευρογένεσης τα πρόδρομα νευροβλαστικά κύτταρα διαιρούνται συμμετρικά ως προς το είδος των θυγατρικών τους κυττάρων. Δηλαδή, ένα πρόδρομο νευροβλαστικό κύτταρο διαιρείται συμμετρικά σε δύο όμοια πρόδρομα θυγατρικά κύτταρα Ρ (Ρ: proliferative) που το καθένα με τη σειρά του θα μπει σε ένα νέο κύκλο πολλαπλασιασμού. Η συμμετρική αυτή διαίρεση καλείται Ρ-Ρ. Ωστόσο όσο προχωρά η διαδικασία της νευρογένεσης οι διαιρέσεις γίνονται ασύμμετρες δηλαδή ένα κύτταρο διαιρείται σε δύο διαφορετικά θυγατρικά κύτταρα εκ των οποίων το ένα θα συνεχίσει να διαιρείται (Ρ) ενώ το άλλο θα σταματήσει την πολλαπλασιαστική του δραστηριότητα, θα βγει από τον κυτταρικό κύκλο και θα διαφοροποιηθεί. Το τελευταίο αυτό κύτταρο που θα βγει από τον κυτταρικό κύκλο το ονομάζουμε «σιωπηλό» κύτταρο, Q (quiescent) και την ασύμμετρη διαίρεση τη συμβολίζουμε Ρ-Q. Οι διαιρέσεις Ρ-Q εξασφαλίζουν ότι αρκετά πρόδρομα κύτταρα θα παραμείνουν στο στάδιο του πολλαπλασιασμού ενώ παράλληλα παράγονται οι απαιτούμενοι νευρώνες. Με αυτόν τον τρόπο ελέγχεται το μέγεθος του εγκεφάλου καθώς και η παραγωγή του σωστού αριθμού νευρώνων. Στα τελευταία στάδια της νευρογένεσης, όταν πλέον τα κύτταρα του νευροεπιθηλίου πραγματοποιούν την τελευταία μιτωτική τους διαίρεση, διαιρούνται και πάλι συμμετρικά αλλά αυτή τη φορά δίνουν γένεση σε δύο «σιωπηλά» κύτταρα, Q, δηλαδή σε δύο νεαρούς νευρώνες (Takahashi et al., 1994, 1995a,b, 1996a,b).Tο είδος αυτό συμμετρικής διαίρεσης το ονομάζουμε Q-Q. Είναι φανερό ότι η μετάβαση των νευροεπιθηλιακών κυττάρων από την αρχική κατάσταση συμμετρικών Ρ-Ρ διαιρέσεων σε μία κατάσταση ασύμμετρων Ρ-Q διαιρέσεων, σηματοδοτεί και την εμφάνιση των πρώτων νεαρών νευρώνων (κύτταρα Q).In vivo πειράματα και μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της διάρκειας του κυτταρικού κύκλου των νευροεπιθηλιακών κύτταρων του εγκεφαλικού φλοιού στο έμβρυο του ποντικού, έδειξαν ότι στην εμβρυϊκή ημέρα Ε14-Ε15 (που αντιστοιχεί κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε16-Ε17 στον αρουραίο) επέρχεται στο νευροεπιθήλιο μία «κατάσταση ισορροπίας». Συγκεκριμένα ο αριθμός των «σιωπηλών» κυττάρων Q του νευροεπιθηλίου που εγκαταλείπουν τον κυτταρικό κύκλο ισούται τη χρονική αυτή περίοδο με τον αριθμό των «πολλαπλασιαζόμενων» κυττάρων Ρ του νευροεπιθηλίου 118

133 Αποτελέσματα που ξαναμπαίνουν σε ένα νέο κυτταρικό κύκλο (Takahashi et al., 1996a,b, Νοwakowski et al. 2002). Εικόνα 11. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε σχέση με τη μιτωτική δραστηριότητα του πληθυσμού των κυττάρων του νευροεπιθηλίου του πρόσθιου εγκεφάλου αρουραίου εμβρυϊκής ημέρας Ε16. Αριστερά: Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε (αναλυτική περιγραφή παρατίθεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Σύμφωνα με τη διαδικασία αυτή σημαίνεται μία ομάδα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που περνούν σχεδόν ταυτόχρονα από τη φάση S του κυτταρικού κύκλου (μέσα σε διάστημα δύο ωρών). Συγκεκριμένα σε αρουραίο ηλικίας Ε16 χορηγείται BrdU και έπειτα από δύο ώρες χορηγείται 3 H-Thy. Έτσι στο νευροεπιθήλιο του εγκεφάλου του αρουραίου σημαίνεται ένας πληθυσμός πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού του κύκλου μόνο με BrdU, ο οποίος αποτελεί την ομάδα κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- και η οποία ξεχωρίζει μέσα σε μία μεγαλύτερη ομάδα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που είναι σημασμένη διπλά με BrdU και [ 3 Η]- Τhy. Η ομάδα BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- αντιπροσωπεύει το σύνολο των «πολλαπλασιαζόμενων» Ρ και των «σιωπηλών» Q κυττάρων που θα προκύψουν από τη διαίρεση αυτή. Έτσι, τα κύτταρα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- έχουν τις παρακάτω πιθανές πορείες μετά από 24 ώρες: Η να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο (Q κύτταρα) και να μεταναστεύσουν στις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (CP και IZ) ή να διαιρεθούν ξανά (Ρ κύτταρα) παραμένοντας στη ζώνη του νευροεπιθηλίου (VZ και SVZ). Στο σχήμα αριστερά, τα Q κύτταρα αναφέρονται ως «ομάδα BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- στις στιβάδες CP+IZ» και τα Ρ κύτταρα ως «ομάδα BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- στις στιβάδες VZ+SVZ». Για να ξεχωρίσουμε τις δύο αυτές διαφορετικές ομάδες, παρακολουθήσαμε τα BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- κύτταρα 12 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU (όπου τα κύτταρα δεν έχουν προλάβει να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο), και 24 ώρες μετά (όπου τα κύτταρα έχουν ακολουθήσει μία από τις δύο πιθανές πορείες) και μετρήσαμε ξεχωριστά τα κύτταρα που εντοπίζονται στις ζώνές VZ και SVZ και ξεχωριστά τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στις ζώνες ΙΖ και CP. 119

134 Αποτελέσματα Δεξιά: Στεφανιαία τομή φλοιού αρουραίου 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU που υπέστη διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και του μάρτυρα της S φάσης BrdU (κόκκινο) σε συνδιασμό με αυτοραδιογραφία για τον δεύτερο μάρτυρα της φάσης S [ 3 Η]-Τhy (βιολετί) μετά την επεξεργασία της σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Ένας μεγάλος αριθμός τέτοιων τομών αναλύθηκαν (βλ. Πίνακα 2) για να υπολογιστεί το ποσοστό των κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88, στις ζώνες VZ και SVZ (κύτταρα Ρ) και στις ζώνες ΙΖ και CP (κύτταρα Q). Tα δύο λευκά πλαίσια στην εικόνα 11Α εστιάζουν σε κύτταρα της περιοχής CP και της περιοχής VZ+ SVZ που είναι διπλά ή τριπλά σημασμένα και φαίνονται σε μεγαλύτερη μεγέθυνση στις Εικόνες 11Β και 11Γ, αντίστοιχα. Τα βέλη δείχνουν κύτταρα BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 και επομένως είναι σημασμένα διπλά (συνεντοπισμός κόκκινου και πράσινου). Με αυτό τον τρόπο ξεχωρίζουν από έναν ευρύτερο πληθυσμό τριπλά σημασμένων κυττάρων (συνεντοπισμός κόκκινου, βιολετί και πράσινου). CP (cortical plate) : φλοιϊκό πέταλο, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη, IZ (intermediate zone): ενδιάμεση ζώνη. Κλίμακα: 40μm (Εικόνα 11Α), 20μm (Εικόνα 11Β και 11Γ). Από τα προηγούμενα πειράματά μας έγινε φανερό ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο από τα ενεργά πολλαπλασιαζόμενα νευροβλαστικά κύτταρα του επιθηλίου (κύτταρα Ρ) όσο και από τους διαφοροποιημένους νευρώνες («σιωπηλά» κύτταρα Q). Προχωρήσαμε λοιπόν στη διενέργεια πειραμάτων για να διαπιστώσουμε αν η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται ή όχι με κάποιο συγκεκριμένο είδος κυτταρικής διαίρεσης στο νευροεπιθήλιο (συμμετρική ή ασύμμετρη). Συγκεκριμένα διερευνήσαμε κατά πόσον η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται κυρίως με το στάδιο των συμμετρικών Q-Q διαιρέσεων ή αν παρατηρείται ήδη από το στάδιο όπου τα κύτταρα διαιρούνται ασύμμετρα με διαίρεση Ρ Q ή ακόμα και συμμετρικά με διαίρεση Ρ - Ρ. Για το σκοπό αυτό σχεδιάσαμε ένα σύνθετο πείραμα παρόμοιο με αυτό που πραγματοποίησαν για πρώτη φορά οι Takahashi et al. (1996a,b), όπως περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Ο σχεδιασμός του πειράματος αυτού είναι τέτοιος που μας επιτρέπει να σημάνουμε στον εγκέφαλο του αρουραίου ηλικίας Ε16, μία ομάδα κυττάρων που πολλαπλασιάζονται συγχρονισμένα κατά τη διάρκεια ενός χρονικού διαστήματος δύο ωρών. Αυτό επιτυγχάνεται ως εξής: Κύτταρα του εγκεφάλου που διανύουν τη φάση S του κυτταρικού κύκλου σημαίνονται με BrdU ενώ μετά από δύο ώρες χορηγείται ένας δεύτερος μάρτυρας της φάσης S, η τριτιωμένη θυμιδίνη [ 3Η ]-Τhy με τον οποίο σημαίνονται όλα τα υπόλοιπα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται στο νευροεπιθήλιο εκτός από αυτά που βγήκαν από τη φάση S του κυτταρικού κύκλου κατά το προηγούμενο δίωρο. Με τη διπλή αυτή σήμανση επιτυγχάνεται η ανίχνευση ενός πληθυσμού κυττάρων που διαιρούνται σχεδόν ταυτόχρονα μέσα σε διάστημα δύο 120

135 Αποτελέσματα ωρών. Η ομάδα αυτή η οποία έχει σημανθεί μόνο με BrdU χαρακτηρίζεται ως ομάδα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- και ξεχωρίζει ανάμεσα σε ένα μεγαλύτερο πληθυσμό πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων του νευροεπιθηλίου τα οποία έχουν σημανθεί διπλά με BrdU αλλά και με [ 3Η ]-Τhy και χαρακτηρίζονται ως ομάδα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy+. Σύμφωνα με τους Takahashi et al. (1994, 1996a,b) τα κύτταρα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhyαντιπροσωπεύουν το σύνολο των «πολλαπλασιαζόμενων» Ρ και των «σιωπηλών» Q κυττάρων που θα προκύψουν από τη συγκεκριμένη διαίρεση. Έτσι, τα κύτταρα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- έχουν τις παρακάτω πιθανές πορείες: Η μία πιθανότητα είναι να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο (Q κύτταρα) και να μεταναστεύσουν στις ανώτερες στιβάδες του φλοιού και η άλλη να διαιρεθούν ξανά (Ρ κύτταρα) παραμένοντας στη ζώνη του νευροεπιθηλίου (VZ και SVZ). Προκειμένου να ξεχωρίσουμε τα δύο διαφορετικά ως προς τη μοίρα τους είδη κυττάρων, παρακολουθήσαμε την ομάδα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- για 12 και 24 ώρες και κατόπιν μετρήσαμε ξεχωριστά τα κύτταρα της ομάδας αυτής που είχαν μεταναστεύσει από τη ζώνη του νευροεπιθηλίου και εντοπίζονταν στις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (Q κύτταρα) και ξεχωριστά τα κύτταρα που είχαν παραμείνει στις ζώνες του νευροεπιθηλίου VZ και SVZ (Ρ κύτταρα), (Εικόνα 11 και Πίνακας 2). Οι χρόνοι των 12 και 24 ωρών μετά τη χορήγηση του BrdU στους οποίους έγινε η καταμέτρηση των κυττάρων επιλέχτηκαν σύμφωνα με τις μετρήσεις των Takahashi et al. οι οποίοι έδειξαν ότι ένας ολόκληρος κυτταρικός κύκλος διαρκεί 15.5 περίπου ώρες για τα κύτταρα του νευροεπιθηλίου του εγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε16 (Takahashi et al. 1995a,b, 1996a,b). Έτσι, 12 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU η υπό παρακολούθηση ομάδα κυττάρων δε θα έχει διαιρεθεί για δεύτερη φορά και επομένως ο αριθμός των κυττάρων που την απαρτίζει παραμένει σταθερός ενώ 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα Ρ της ομάδας αυτής θα έχουν υποστεί νέα κυτταρική διαίρεση και θα έχουν διπλασιαστεί, αντίθετα με τα κύτταρα Q τα οποία θα διατηρούν σταθερό τον αριθμό τους. Με τον τρόπο αυτό μπορέσαμε με να υπολογίσουμε με ακρίβεια το κλάσμα των Ρ και Q κυττάρων της σημασμένης ομάδας BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy-, δεδομένου ότι σύμφωνα με τις μετρήσεις των Takahashi et al. 1996, 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU, βρήκαμε ότι το ποσοστό των κυττάρων που εγκαταλείπουν τον κυτταρικό κύκλο (κύτταρα Q) ισούται με το ποσοστό των κυττάρων που μπαίνουν σε ένα νέο κύκλο πολλαπλασιασμού (Ρ κύτταρα), (Πίνακας 2). Κατόπιν έπρεπε να υπολογιστεί ο αριθμός των κυττάρων από την ομάδα BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- (τόσο στον πληθυσμό Ρ όσο και στον πληθυσμό Q) που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88, στις 12 και στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU. Προκειμένου να εντοπίσουμε και να υπολογίσουμε τα σημασμένα κύτταρα που εκφράζουν ΒΜ88 προχωρήσαμε σε τριπλή χρώση έναντι του BrdU, της [3H]-Thymidine και του ΒΜ88 (Εικόνα 11, Πίνακας 2). 121

136 Αποτελέσματα Ομάδα κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy -, 12 ώρες, μετά τη χορήγηση BrdU (ν) Ομάδα κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy -, 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU (ν) Επί τοις εκατό (%) αύξηση από τις 12 στις 24 ώρες Ομάδα κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88, 12 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU (ν) Ομάδα κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88, 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU (ν) Επί τοις εκατό (%) αύξηση από τις 12 στις 24 ώρες Αριθμοί (ν) και επί τοις εκατό ποσοστά (%) κυττάρων Κύτταρα Ρ που εντοπίζονται στις ζώνες VZ +SVZ Κύτταρα Q που εντοπίζονται στις ζώνες IZ+CP Συνολικός αριθμός κυττάρων Ρ και Q Aναλογία των επί τοις εκατό ποσοστών των κυττάρων Ρ(%) : Q(%) ± ± : ± ± : ± 1 67 ± ± ± : ± ± : ± ± Πίνακας 2. Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των κυττάρων της ομάδας BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- (ομάδα κυττάρων που διαιρούνται σχεδόν ταυτόχρονα μέσα σε διάστημα δύο ωρών, θεωρούνται συγχρονισμένα και αντιπροσωπεύουν το συνολικό πληθυσμό κυττάρων Ρ και Q που θα προκύψουν από τη διαίρεση αυτή ), αλλά και του αριθμού των κυττάρων της ομάδας BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 στις ζώνες VZ +SVZ (κύτταρα Ρ) και στις ζώνες ΙΖ-CP (κύτταρα Q) του εγκεφάλου αρουραίου κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε16, 12 και 24 ώρες μετά την χορήγησή BrdU. Τα στοιχεία που αναφέρονται στον πίνακα βασίστηκαν σε μετρήσεις κυττάρων που πραγματοποιήθηκαν σε συνολικά έξι ζώα. Ο μέσος όρος υπολογίστηκε από μετρήσεις που έγιναν σε πέντε τομές ανά ζώο μετρώντας όλα τα κύτταρα της περιοχής του φλοιού για κάθε μία τομή. Οι διαφορές που υπάρχουν μεταξύ των έξι ζώων του εκάστοτε πειράματος δεν είναι στατιστικά σημαντικές (Ρ>0.5). Το επί τοις εκατό ποσοστό των κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 υπολογίστηκε από τον αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν σε κάθε εγκέφαλο ξεχωριστά τόσο στις 12 όσο και στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση BrdU.H αύξηση των κυττάρων Q που παρατηρείται στoν πληθυσμό BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- στις περιοχές ΙΖ και CP (67%) αλλά και στον πληθυσμό των κυττάρων BrdU+/ [ 3 Η]-Τhy- που εκφράζει την πρωτεΐνη ΒΜ88 στις περιοχές ΙΖ και CP (126%) είναι στατιστικά σημαντική (Ρ<0.05) για όλους τους εγκεφάλους που ελέγχθηκαν. 122

137 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στην ίδια αναλογία στους πληθυσμούς Ρ και Q της σημασμένης ομάδας BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- 24 ώρες μετά την έναρξη του πειράματος. Το γεγονός αυτό σημαίνει ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε κύτταρα του επιθηλίου που διαιρούνται ασύμμετρα δίνοντας γένεση σε ένα Ρ και ένα Q κύτταρο. Επιπλέον υπολογίστηκε ότι το ποσοστό των κυττάρων Q της σημασμένης ομάδας BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- που εκφράζουν ΒΜ88 και έχουν μεταναστεύσει προς τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού, αυξάνεται από τις 12 στις 24 ώρες κατά 126±2% ενώ το συνολικό ποσοστό των κυττάρων Q της σημασμένης ομάδας BrdU+/ [ 3Η ]-Τhy- (ανεξάρτητα από την έκφραση ή όχι της πρωτεΐνης ΒΜ88) αυξάνεται μόνο κατά 67±1%. Παρατηρείται δηλαδή ένας «εμπλουτισμός» της ομάδας Q σε κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 κατά το πέρας του πειράματος. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων από τα οποία προκύπτουν, μέσω ασύμμετρων διαιρέσεων, θυγατρικά κύτταρα που διαφοροποιούνται σε νευρώνες και μεταναστεύουν από την κοιλιακή και υποκοιλιακή ζώνη (VZ και SVZ) προς τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού. Έτσι, φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 συνδέεται με πρόδρομα κύτταρα που διαιρούνται ασύμμετρα και είναι πιθανόν να οδηγεί τα κύτταρα προς τέτοιες ασύμμετρες νευρογενετικές διαιρέσεις Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου και του ποντικού. Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι μία ομάδα πρόδρομων κυττάρων του φλοιού χαρακτηριστικής μορφολογίας, με το κυτταρικό τους σώμα να βρίσκεται στην κοιλιακή/ υποκοιλιακή ζώνη και τις εκφύσεις τους να διατρέχουν όλο το βάθος του εγκεφαλικού φλοιού από την κοιλία μέχρι την χοριoειδή μήνιγγα. Διαμορφώνουν έτσι μία ακτινωτή κατασκευή σαν ικρίωμα στο φλοιό από κύτταρα που διατρέχουν όλο το πλάτος των νευρωνικών στιβάδων (βλ. κεφάλαιο της Εισαγωγής). Στη χαρακτηριστική τους αυτή μορφολογία οφείλεται και το πρώτο συνθετικό της ονομασίας τους. Τα πρόδρομα αυτά κύτταρα εκφράζουν σε ορισμένες περιπτώσεις πρωτεΐνες που απαντώνται στα ώριμα αστροκύτταρα (που αποτελούν όπως έχουμε ήδη αναφέρει κύτταρα της γλοίας) και για το λόγο αυτό για πολύ καιρό επικρατούσε η άποψη ότι τα κύτταρα αυτά ήταν πρόδρομα γλοιϊκά κύτταρα, πράγμα που καθιέρωσε και την ονομασία τους (κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας»). Νεότερα πειραματικά δεδομένα ωστόσο, συγκλίνουν στην άποψη ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» δεν είναι πρόδρομα γλοιϊκά κύτταρα αλλά νευροεπιθηλιακά κύτταρα και ότι αποτελούν πληθυσμό ουσιαστικά ταυτόσημο με τα κύτταρα του νευροεπιθηλίου στον αναπτυσσόμενο φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου (Malatesta et al., 2000a; Hartfuss et 123

138 Αποτελέσματα al. 2001; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001). Δεδομένου λοιπόν ότι ο πληθυσμός των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» είναι ένας πληθυσμός πρόδρομων κυττάρων που θα δώσει γένεση σε νευρώνες κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στον φλοιό, θεωρήθηκε σημαντικό να εξεταστεί αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στα χαρακτηριστικής μορφολογίας κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Για την ταυτοποίηση των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» χρησιμοποιούνται συνήθως αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών RC2 και GLAST που είναι γνωστό ότι στην περιοχή του φλοιού εκφράζονται μόνο από τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Επειδή όμως τα αντισώματα που υπάρχουν διαθέσιμα αναγνωρίζουν μόνο τις πρωτεΐνες RC2 και GLAST του ποντικού, και δεδομένου ότι το σύστημα μελέτης μας ήταν ο αρουραίος, χρησιμοποιήσαμε αρχικά μία εναλλακτική πειραματική προσέγγιση προκειμένου να ταυτοποιήσουμε τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε τη πειραματική διαδικασία σήμανσης της «ακτινωτής γλοίας» όπως αυτή περιγράφεται από τους Malatesta et al., 2000a η οποία αναδεικνύει κύτταρα της ακτινωτής γλοίας με τη χαρακτηριστική τους μορφολογία (Εικόνα 12). Σύμφωνα με αυτή, κρύσταλλοι της λιπόφιλης φθορίζουσας ουσίας DiI τοποθετούνται στην επιφάνεια του εγκεφαλικού φλοιού αρουραίου εμβρυϊκής ημέρας Ε16 (ημέρα όπου η νευρογενετική δραστηριότητα είναι έντονη στο φλοιό του εγκεφάλου) αφού πρώτα αφαιρεθούν οι μήνιγγες (βλ. κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Έτσι, η χρωστική DiI σημαίνει κύτταρα που έχουν κυτταρικές απολήξεις στην επιφάνεια του φλοιού και (λόγω των λιπόφιλων ιδιοτήτων της) διαχέεται σε όλο το μήκος της φωσφολιπιδικής διπλοστιβάδας της κυτταρικής μεμβράνης του σημασμένου κυττάρου. Τα μόνα κύτταρα που τελικά σημαίνονται από την ουσία DiI είναι οι νευρώνες Cajal-Retzius της στιβάδας Ι του φλοιού και τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» τα ξεχωρίζουμε εύκολα από τη χαρακτηριστική μορφολογία τους γιατί είναι τα μόνα που το κυτταρικό τους σώμα βρίσκεται στην VZ/SVZ ενώ διατρέχουν ακτινωτά όλο το πάχος του φλοιού από την επιφάνεια (pial surface) ως την κοιλία. Έπειτα από τη σήμανση με DiI τα εγκεφαλικά ημισφαίρια κόβονται κατά τον στεφανιαίο άξονα σε τομές με τη βοήθεια παλλόμενης μικροτόμου (vibrotome) και υπόκεινται σε ανοσοϊστοχημική χρώση έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88. Κατόπιν γίνεται λήψη εικόνων με τη βοήθεια συνεστιακού μικροσκοπίου και ακολουθεί ψηφιακή αναδόμηση της τομής σε όλο της το πάχος προκειμένου να εντοπιστούν τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» σε όλο τους το μήκος, από την επιφάνεια του εγκεφαλικού φλοιού ως την κοιλία. Τα αποτελέσματα των χρώσεων έδειξαν ότι υπάρχει συνεντοπισμός μεταξύ της χρωστικής DiI και της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά 87% στα κύτταρα των οποίων τα σώματα εντοπίζονται στις ζώνες VZ και SVZ και έχουν τη 124

139 Αποτελέσματα χαρακτηριστική μορφολογία των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» (Εικόνα 12Γ). Εικόνα 12. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον πληθυσμό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου αρουραίου εμβρυϊκής ημέρας Ε16. Πάνω Αριστερά: Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε (αναλυτική περιγραφή παρατίθεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Σύμφωνα με αυτή τη διαδικασία, κρύσταλλοι της λιπόφιλης φθορίζουσας ουσίας DiI τοποθετούνται στην επιφάνεια του εγκεφαλικού φλοιού (pial surface, DiIp σήμανση) και σημαίνουν τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». (βλ. κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» είναι τα μόνα κύτταρα του φλοιού που το κυτταρικό τους σώμα βρίσκεται στη VZ/SVZ και οι εκφύσεις τους διατρέχουν ακτινωτά όλο το βάθος του φλοιού από την επιφάνεια μέχρι την κοιλία (lateral ventricle, LV). 125

140 Αποτελέσματα 12Α: Στεφανιαία τομή πάχους 150μm από φλοιό αρουραίου ηλικίας Ε16, μετά τη σήμανση με DiI. Στην εικόνα φαίνεται ένας αριθμός κυττάρων που έχουν σημανθεί με DiI και τα οποία εκτείνουν τις προεκβολές τους από την επιφάνεια του φλοιού (pia) ως την κοιλία (lateral ventricle, LV). Τα κύτταρα αυτά αποτελούν κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που η πλειοψηφία τους θα δώσει γένεση σε νευρώνες (βλ. Εισαγωγή και κείμενο). 12Β: Μεγέθυνση της περιοχής της τομής που περικλείεται στο λευκό πλαίσιο της εικόνας 12Α. Η τομή αυτή μετά τη σήμανση με DiI έχει υποστεί επιπλέον χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο). Τα βέλη δείχνουν συνεντοπισμό (κίτρινο) της χρωστικής DiI (κόκκινο) και της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». 12Γ: Μικρότερη περιοχή του φλοιού όπου μετά από σήμανση με DiI και χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88, φαίνεται ένα κύτταρο «ακτινωτής γλοίας» που εκφράζει στο σώμα του την πρωτεΐνη ΒΜ88 (μεγάλο βέλος) ενώ η κυτταροπλασματική του ακτινωτή προεκβολή εκτείνεται μέχρι το φλοιό (μικρά βέλη). 12Γ και Γ : Ορθογώνια οπτική διατομή της τομής 12Γ ως προς τον άξονα D-V (dorsal-ventral: ραχιαίο-κοιλιακό), (Εικόνα 12Γ ) και ως προς τον άξονα L-M (lateralmedial: πλευρικό-μέσο), (Εικόνα 12Γ ) που πραγματοποιήθηκε στο ύψος του κυτταρικού σώματος του κυττάρου της «ακτινωτής γλοίας» (βέλος) της εικόνας 12Γ προκειμένου να επαληθευτεί η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο συγκεκριμένο κυτταρικό σώμα. Όλες οι παραπάνω φωτογραφίες λήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. CP (cortical plate): φλοιϊκό πέταλο, D (dorsal), ραχιαία, DiIp (pial surface DiI labeling): σήμανση με DiI από την επιφάνεια του φλοιού, L (lateral): πλευρικός, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, Μ (medial): μέσος, pia: χοριoειδής μήνιγγα, V (ventral): κοιλιακός. Κλίμακα 100μm (Α και Β), 10μm (Γ, Γ και Γ ). Βέβαια στο παραπάνω ποσοστό συνεντοπισμού της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που έχουν σημανθεί με DiI, υπεισέρχεται μία αριθμητική παρέκκλιση από το πραγματικό ποσοστό που είναι μεγαλύτερο, λόγω κάποιου περιορισμού που επιβάλλει η ίδια η τεχνική. Συγκεκριμένα, κατά τη διαδικασία της ανοσοϊστοχημικής χρώσης, το αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 μπορεί να εισχωρήσει στην τομή του ιστού και να σημάνει κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη μέχρι βάθους 25μm περίπου από την κάθε επιφάνεια της τομής. Το πραγματικό όμως βάθος της τομής που λαμβάνεται με την παλλόμενη μικροτόμο είναι 150μm, γεγονός που σημαίνει ότι υπάρχει ένα ποσοστό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» που δεν «προσεγγίζεται» από το αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 ενώ προσμετρείται στο ποσοστό των κυττάρων «ακτινωτής γλοίας» που δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88. Επομένως, ο συνολικός πληθυσμός των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» του φλοιού του αρουραίου εκφράζει κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης την πρωτεΐνη ΒΜ88 σε ένα ποσοστό ίσο ή και μεγαλύτερο του 87%. Προκειμένου να ελέγξουμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται επίσης σε κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του ποντικού, πραγματοποιήσαμε στη συνέχεια διπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και των πρωτεϊνων RC2 ή GLAST που όπως έχουμε ήδη αναφέρει θεωρούνται πρωτεΐνες μάρτυρες για τα 126

141 Αποτελέσματα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του φλοιού (Misson et al., 1988; Edwards et al., 1990; Shibata et al., 1997). Τα αποτελέσματα των χρώσεων έδειξαν ευρύ συνεντοπισμό της πρωτεΐνης ΒΜ88 τόσο με την πρωτεΐνη RC2 όσο και με την πρωτεΐνη GLAST (Εικόνα 13), γεγονός που επιβεβαιώνει το ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του φλοιού. Εικόνα 13. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε σχέση με τους μάρτυρες των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» GLAST και RC2 στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου ποντικού εμβρυϊκής ημέρας Ε14.5. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και των πρωτεϊνών-μαρτύρων των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» GLAST (Εικόνες 13Α-Γ) και RC2 (Εικόνες 13Δ-ΣΤ), (κόκκινο). Οι χρώσεις δείχνουν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στο σώμα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου του ποντικού σε μία ηλικία (εμβρυϊκή ημέρα Ε14.5) που τα κύτταρα αυτά θα δώσουν στην πλειοψηφία τους γένεση νευρώνες. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη. Κλίμακα 40μm. Τα αποτελέσματα αυτά στο ποντίκι έρχονται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μελέτης της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια του ποντικού με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot), (Εικόνα 1). Στα αποτελέσματα της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot) φαίνεται ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 127

142 Αποτελέσματα εκφράζεται από τα πρώιμα κιόλας στάδια της νευρογένεσης τόσο για το ποντίκι όσο και για τον αρουραίο (Ε13 για το ποντίκι, Ε14 για τον αρουραίο) και η έκφρασή της αυξάνεται καθώς προχωρά η διαδικασία γένεσης των νευρώνων. Έτσι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που θεωρείται ο κυρίαρχος νευρογενετικός πληθυσμός του εγκεφαλικού φλοιού φαίνεται να συνδέεται άμεσα με τη μετάβαση των κυττάρων αυτών από μια αδιαφοροποίητη κατάσταση, σε μία κατάσταση ωρίμανσης προς το νευρωνικό φαινότυπο, τόσο στο ποντίκι όσο και στον αρουραίο Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στον ενεργά πολλαπλασιαζόμενο πληθυσμό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» του εμβρυϊκού πρόσθιου εγκεφάλου του αρουραίου που εκφράζουν την πρωτεΐνη-μάρτυρα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων, νεστίνη. Πρόσφατα πειραματικά δεδομένα από ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες (Malatesta et al., 2000a,b, Noctor et al., 2001), όπως και αποτελέσματα πειραμάτων παρακολούθησης των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» σε πραγματικό χρόνο (Μiyata et al., 2001, Noctor et al., 2001), υποστηρίζουν τη άποψη ότι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» πολλαπλασιάζονται και διαιρούνται σε δύο νέα κύτταρα διατηρώντας καθ όλη τη διαδικασία της μίτωσης το σώμα τους στη νευροεπιθηλιακή ζώνη πολλαπλασιασμού VZ και την κυτταροπλασματική τους προέκταση αμείωτη σε μήκος να φτάνει, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, μέχρι την επιφάνεια του φλοιού. Είναι επομένως αδύνατο να ξεχωρίσει κανείς μόνο από τη μορφολογία τους τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που πολλαπλασιάζονται ή που πρόκειται να πολλαπλασιαστούν, από αυτά που μόλις έχουν βγει από τον κυτταρικό κύκλο και πρόκειται να διαφοροποιηθούν σε μεταμιτωτικούς νευρώνες, χωρίς να περάσουν από άλλη κυτταρική διαίρεση. Προκειμένου να εξακριβώσουμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από την ομάδα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» που πολλαπλασιάζονται ή μόνο από μεταμιτωτικά κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας», εφαρμόσαμε την παρακάτω πειραματική διαδικασία. Χορηγήσαμε BrdU ενδοπεριτοναϊκά σε αρουραίους που έφεραν έμβρυα 14 ημερών έτσι ώστε να σημανθούν όλα τα κύτταρα των εμβρύων που πρόκειται να πολλαπλασιαστούν και άρα και τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας», το σώμα των οποίων εντοπίζεται στη ζώνη VZ του πρόσθιου εγκεφάλου. Τα ζώα θυσιάζονται δύο ώρες μετά τη χορήγηση του BrdU, οι εγκέφαλοι των εμβρύων απομονώνονται, εκλείνονται σε παραφίνη και τέλος κόβονται σε στεφανιαίες τομές οι οποίες αναλύονται με τριπλές χρώσεις ανοσοφθορισμού έναντι του BrdU, της πρωτεΐνης ΒΜ88 και της πρωτεΐνης 128

143 Αποτελέσματα μάρτυρα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων του φλοιού, συμπεριλαμβανομένων και των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας», νεστίνης (Li & Chopp, 1999) (Εικόνα 14). Εικόνα 14. Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που εκφράζουν την πρωτεΐνη μάρτυρα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων του φλοιού νεστίνη, στον πρόσθιο εγκέφαλο αρουραίου εμβρυϊκής ημέρας Ε14. Στις εικόνες 14Α και 14Β φαίνεται η διπλή χρώση ανοσοφθορισμού μιας τομής εγκεφάλου αρουραίου εμβρυϊκής ημέρας Ε14, έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και έναντι του μάρτυρα πολλαπλασιασμού BrdU (μπλε), (Εικόνα 14Α) και έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και της νεστίνης (κόκκινο), (Εικόνα 14Β). Στην εικόνα 14Γ φαίνεται η τριπλή χρώση της ίδιας τομής με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88, του BrdU και της νεστίνης. Οι χρώσεις δείχνουν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από πολλαπλασιαζόμενους νευροβλάστες της VZ (Εικόνα A, ο συνεντοπισμός γίνεται ορατός με το γαλάζιο χρώμα) στο σώμα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» που εκφράζουν την πρωτεΐνη νεστίνη (Εικόνα Β, ο συνεντοπισμός γίνεται ορατός με το κίτρινο χρώμα) αλλά όχι στις ακτινωτές προεκβολές των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» (κόκκινο χρώμα στις Εικόνες Β, Γ και Δ σε μεγαλύτερη μεγέθυνση όπως δείχνουν τα βελάκια. Στην εικόνα Γ φαίνονται πολλά κύτταρα της VZ που είναι τριπλά σημασμένα ενώ στην εικόνα Ε φαίνεται το σώμα ενός τέτοιου τριπλά σημασμένου κυττάρου σε μεγαλύτερη μεγέθυνση. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε πρόδρομα νευροεπιθηλιακά κύτταρα του φλοιού όπως είναι τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας», ενώ ακόμα πολλαπλασιάζονται. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. CP (cortical plate): φλοιϊκό πέταλο, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη, pia: χοριoειδής μήνιγγα. Κλίμακα 40μm (Eικόνες Α,Β και Γ), 10μm (Eικόνες Δ και Ε). 129

144 Αποτελέσματα Όπως έχουμε ήδη αναφέρει, στο χρονικό διάστημα των δύο ωρών που μεσολαβεί από τη χορήγηση του BrdU στα ζώα μέχρι να θυσιαστούν, τα κύτταρα τα οποία έχουν ενσωματώσει το BrdU δεν έχουν προλάβει να διαιρεθούν σε δύο νέα κύτταρα και έτσι είναι βέβαιο ότι στο διάστημα αυτό, ένα κύτταρο που σημαίνεται με BrdU αποτελεί ένα ενεργά πολλαπλασιαζόμενο κύτταρο. Όσον αφορά την πρωτεΐνη νεστίνη, αυτή χρησιμοποιήθηκε ως μέσο ταυτοποίησης των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» στον αρουραίο λόγω ασυμβατότητας της τεχνικής σήμανσης των νευροεπιθηλιακών κυττάρων με BrdU και της τεχνικής σήμανσης των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» με DiI. Παρόλο που η νεστίνη εκφράζεται και από νευροεπιθηλιακά κύτταρα που δεν ανήκουν στον πληθυσμό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» και επομένως δεν είναι τόσο ακριβής τρόπος ταυτοποίησης του πληθυσμού αυτού όσο η χρώση με DiI που περιγράφτηκε προηγουμένως, ωστόσο μας βοηθά να αναγνωρίσουμε με βεβαιότητα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» από την ακτινωτή μορφολογία τους. Τα αποτελέσματα των τριπλών χρώσεων έδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία (ποσοστό 97.2%) των κυττάρων που σημάνθηκαν με BrdU και εκφράζουν την πρωτεΐνη νεστίνη, εκφράζουν και την πρωτεΐνη ΒΜ88 (Εικόνα 14). Το γεγονός αυτό ενισχύει τα μέχρι τώρα αποτελέσματα που έδειχναν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα του φλοιού που θα δώσουν γένεση σε νευρώνες, πριν τη τελευταία τους μιτωτική διαίρεση Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 είναι μειωμένη στον εγκεφαλικό φλοιό των ποντικών Sey/Sey, που φέρουν μεταλλαγμένο το γονίδιο Pax6. Προκειμένου να διερευνήσουμε περαιτέρω τη σχέση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της νευρογένεσης in vivo, μελετήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στον εμβρυϊκό φλοιό των ποντικών Sey/Sey (που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye στο γονίδιο Pax6) σε σχέση με την έκφρασή της στον εμβρυϊκό φλοιό ποντικών άγριου τύπου. Το γονίδιο Ρax6 κωδικοποιεί τον ομοιοτικό μεταγραφικό παράγοντα Ρax6 του οποίου η έκφραση εντοπίζεται μόνο στο ραχιαίο τμήμα του νευροεπιθηλίου του τελεγκεφάλου στο ποντίκι, αρχίζει κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε8.5 (λίγο πριν την έναρξη της νευρογένεσης) και παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της δημιουργίας νευρώνων στο φλοιό. Τα ποντίκια που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye στο γονίδιο Pax6 (η οποία το καθιστά μη λειτουργικό), παρουσιάζουν διάφορες σοβαρές ανωμαλίες κατά την ανάπτυξη του τελεγκεφάλου τους σε βαθμό ώστε η μετάλλαξη να είναι θνησιγόνα και τα έμβρυα να πεθαίνουν πριν τη γέννησή τους (Tarabykin et al., 2001). 130

145 Αποτελέσματα 131

146 Αποτελέσματα Εικόνα 15. Σύγκριση της έκφρασης του γονιδίου ΒΜ88 στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου μεταξύ των διαγονιδιακών ποντικών Sey/Sey και των ποντικών φυσικού τύπου εμβρυϊκής ημέρας Ε14.5. Εικόνες 15Α-Λ: Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) και των πρωτεϊνών-μαρτύρων των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» GLAST (Εικόνες 15Α-ΣΤ) και RC2 (Εικόνες 15Ζ-Λ), (κόκκινο) στον εγκεφαλικό φλοιό των ποντικών φυσικού τύπου (wild type:wt, Εικόνες 15Α-Γ και 15Ζ-Θ) και των ποντικών Sey/Sey (Εικόνες 15Δ-ΣΤ και 15Ι-Λ). Οι χρώσεις δείχνουν ότι στο φλοιό των ποντικών άγριου τύπου η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται στο σώμα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε14.5. Στο φλοιό των ποντικών Sey/Sey της ίδιας ηλικίας, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 αλλάζει και ακολουθεί την μειωμένη και με κενά στη VZ έκφραση, των πρωτεϊνών της «ακτινωτής γλοίας» GLAST και RC2 (Εικόνες 15Δ, ΣΤ, Ι, Λ, όπου τα βελάκια δείχνουν κύτταρα της VZ στα οποία εκφράζεται η πρωτεΐνη ΒΜ88 και τα οποία βρίσκονται ανάμεσα σε μεγάλα κενά διαστήματα της VZ όπου δεν υπάρχει έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88). Επιπλέον, παρατηρείται έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε αποπροσανατολισμένους νευρώνες του αποδιοργανωμένου φλοιού των ποντικών Sey/Sey (Εικόνα Ι, μικρά βέλη). Εικόνες 15N-Ξ: Χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 (πράσινο) στην περιοχή της GE του εγκεφαλικού φλοιού των ποντικών φυσικού τύπου (wild type:wt, Εικόνα 15Ν) και των ποντικών Sey/Sey (Εικόνα 15Ξ) κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε14.5. Οι χρώσεις δείχνουν ότι στην περιοχή αυτή του φλοιού όπου δεν εκφράζεται το γονίδιο Pax6 και η νευρογένεση γίνεται κανονικά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 δεν αλλάζει. Εικόνα Μ: Διαγραμματική απεικόνιση των αποτελεσμάτων της έκφρασης του γονιδίου ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο, στο φλοιό των ποντικών Sey/Sey και στο φλοιό των ποντικών φυσικού τύπου ηλικίας Ε14.5, όπως αυτή υπολογίστηκε βάσει της τεχνικής real time RT-PCR. Το διάγραμμα απεικονίζει μείωση της έκφρασης του γονιδίου κατά πέντε φορές στο φλοιό ποντικών Sey/Sey σε σχέση με την έκφραση του γονιδίου στο φλοιό ποντικών φυσικού τύπου. Οι εικόνες 15A-Ξ ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. GE (gaglionic eminence): γαγγλιωνικό έπαρμα, LV (lateral ventricle): πλευρική κοιλία, VZ (ventricular zone): κοιλιακή ζώνη. Κλίμακα 40μm. Μεταξύ των ανωμαλιών που παρουσιάζουν τα ποντίκια Sey/Sey στον εγκεφαλικό φλοιό είναι οι σοβαρές μορφολογικές παρεκκλίσεις των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» από τον κανονικό φαινότυπο. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές προεκβολές των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» είναι προσανατολισμένες άτακτα στο φλοιό, χάνοντας τη χαρακτηριστική ακτινωτή δομή τους. Επιπλέον, τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» εμφανίζουν, εκτός από μορφολογικές, και λειτουργικές ανωμαλίες όπως μειωμένη νευρογενετική δραστηριότητα και αδυναμία στη ρύθμιση του κυτταρικού τους κύκλου (Gotz et al., 1998, Stoykova et al., 2000). Έτσι, λόγω της μειωμένης δημιουργίας νευρώνων από τον πληθυσμό των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» στο φλοιό, τα ποντίκια Sey/Sey καταλήγουν να έχουν στο τέλος της εμβρυϊκής τους ζωής, τους μισούς νευρώνες από τα ποντίκια φυσικού τύπου στην αντίστοιχη ηλικία (Heins et al., 2002). Χρησιμοποιήσαμε λοιπόν, τα ποντίκια Sey/Sey ως ένα in vivo σύστημα μελέτης της διαδικασίας της νευρογένεσης που εξαρτάται από τα κύτταρα της «ακτινωτής 132

147 Αποτελέσματα γλοίας» στον εγκεφαλικό φλοιό και να εξακριβώσουμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 σχετίζεται άμεσα με τη διαδικασία αυτή. Έτσι, συγκρίναμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του φλοιού στα ποντίκια Sey/Sey και στα ποντίκια φυσικού τύπου χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του διπλού ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι των των πρωτεϊνώνμαρτύρων των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» GLAST και RC2. Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού στα ποντίκια φυσικού τύπου δείχνουν, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται από κύτταρα της«ακτινωτής γλοίας» του φλοιού μαζί με τις πρωτεΐνες- μάρτυρες GLAST (Εικόνες 15Α-Γ) και RC2 (Εικόνες 15Ζ-Θ). Όσον αφορά τα ποντίκια Sey/sey, παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον το γεγονός ότι η εικόνα της έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 αλλάζει σημαντικά στο φλοιό. Συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 φαίνεται πολύ μειωμένη σε σχέση με αυτή στα ποντίκια φυσικού τύπου και μάλιστα φαίνεται να ακολουθεί την έκφραση των πρωτεϊνων της «ακτινωτής γλοίας» GLAST και RC2 (Εικόνες 15Δ-ΣΤ και 15Ι-Λ), αφήνοντας μεγάλα κενά στην νευροεπιθηλιακή ζώνη VZ (Εικόνες 15Δ, ΣΤ, Ι, Λ,). Επιπλέον, στα ποντίκια Sey/Sey, η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται έντονα σε μία υποομάδα νευρώνων με αποπροσανατολισμένη τοποθέτηση μέσα στο φλοιό (Εικόνα Ι, μικρά βέλη). Αντίθετα, στην περιοχή της GE στη κοιλιακή πλευρά του φλοιού όπου τα κύτταρα δεν εκφράζουν το γονίδιο Pax6 και επομένως η μετάλλαξη Small eye δεν επηρεάζει τη νευρογενετική δραστηριότητα όπως συμβαίνει στο ραχιαίο τελεγκέφαλο, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 δεν παρουσιάζει καμιά αλλαγή στα ποντίκια Sey/Sey σε σχέση με τα ποντίκια φυσικού τύπου (Εικόνα 15Ν, Ξ). Φαίνεται λοιπόν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 σχετίζεται άμεσα με τη νευρογενετική δραστηριότητα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» στον εγκεφαλικό φλοιό. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της έκφρασης του ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο (mrna) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής ακολουθούμενης από αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real time-rt- PCR) στον τελεγκεφαλικό φλοιό εμβρύων ποντικών Sey-Sey ηλικίας Ε14.5, καθώς και στο φλοιό εμβρύων ποντικών φυσικού τύπου της ίδιας ηλικίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο μειώνεται κατά πέντε φορές στον φλοιό των ποντικών Sey-Sey σε σχέση με αυτή που παρατηρείται στον φλοιό των ποντικών φυσικού τύπου (Εικόνα 15Μ). Τα παραπάνω αποτελέσματα οδηγούν στην υπόθεση ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Pax6 ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου ΒΜ88 σε μεταγραφικό επίπεδο άμεσα ή έμμεσα. Η παραπάνω υπόθεση καθιστά την πρωτεΐνη ΒΜ88 μία πρωτεΐνη-κλειδί που πιθανόν μεσολαβεί στην επίδραση του γονιδίου Pax6 στις νευρογενετικές διαδικασίες του εγκεφαλικού φλοιού. 133

148 Αποτελέσματα 3.13 Ιn vivo υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του πρόσθιου εγκεφάλου ποντικού με τη βοήθεια του ρετροϊικού φορέα RCAS-Y και των διαγονιδιακών ποντικιών tv-a. Προκειμένου να διερευνήσουμε εκτενέστερα το ρόλο της πρωτεΐνης ΒΜ88 στη διαδικασία της νευρογένεσης στον εμβρυϊκό εγκεφαλικό φλοιό in vivo, επιλέξαμε τη στρατηγική της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 ειδικά στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Με τον τρόπο αυτό θα διαπιστώναμε πιθανές διαφορές στη νευρογενετική δραστηριότητα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» με και χωρίς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε ως σύστημα υπερέκφρασης, το ρετροϊικό φορέα RCAS-Y σε συνδιασμό με τα διαγονιδιακά ποντίκια tv-a (λεπτομέρειες για το σύστημα αυτό αναφέρονται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Ο ρετροϊικός φορέας RCAS-Y χρησιμοποιήθηκε ως μέσο μεταφοράς του γονιδίου ΒΜ88. Ταυτόχρονα, κατασκευάστηκε και ένας δεύτερος ρετροϊικός φορέας RCAS-Y ο οποίος έφερε το γονίδιο αναφοράς GFP (Green Fluorescent Protein), (Green et al.,). Η κατασκευή των δύο αυτών φορέων φαίνεται διαγραμματικά στην εικόνα 16 ενώ κάποια από τα στάδια της δημιουργίας του πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική ομάδα του Dr. Η. Rohrer, Max-Plank Institut fur Neurobiologie, Frankfurt, Germany. O φορέας RCAS-Y απαντάται στον ιό των πτηνών ΑRSV και ως εκ τούτου δε μπορεί να επιμολύνει κύτταρα θηλαστικών. Ωστόσο, τα διαγονιδιακά ποντίκια Gtv-a εκφράζουν τον υποδοχέα tv-a του γλυκοπρωτεϊνικού φακέλου του ιού ARSV και πιο συγκεκριμένα το διαγονίδιο tv-a βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ανθρώπινης νευροϊνιδιακής πρωτεΐνης GFAP (hgfap) (Ε.C.Holland &H.E.Varmus, 1998). Έτσι, ο υποδοχέας tv-a εντοπίζεται μόνο στα κύτταρα που εκφράζουν την ανθρώπινη πρωτεΐνη GFAP.H πρωτεΐνη GFAP στα ποντίκια εκφράζεται στα ώριμα αστροκύτταρα του ΚΝΣ αλλά και στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» κατά την εμβρυϊκή ηλικία. Στα πρωτεύοντα η πρωτεΐνη GFAP διατηρεί την έκφρασή της στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» και κατά την ενήλικη ζωή του ατόμου. Όταν ο ιός ΑRSV χορηγηθεί στις πλευρικές κοιλίες του προσθίου εγκεφάλου εμβρύων των διαγονιδιακών ποντικών Gtv-a επιμολύνει μόνο τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Έτσι, το προς μεταφορά γονίδιο (ΒΜ88 ή GFP) εκφράζεται μόνο από τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας». Κατόπιν, μπορούμε να παρακολουθήσουμε την πορεία και την εξέλιξή των κυττάρων αυτών σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια και να διαπιστώσουμε αν η υπερέκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 επηρεάζει ή όχι τη συμπεριφορά και τη μοίρα των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας» και επομένως σε ποιο βαθμό εμπλέκεται στη διαδικασία της νευρογένεσης στον εγκεφαλικό φλοιό. 134

149 Αποτελέσματα Συγκεκριμένα, ο ιός ΑRSV με τον ιΐκό φορέα RCAS-Y που έφερε το γονίδιο ΒΜ88 ή GFP χορηγήθηκε με ένεση στις κοιλίες του εγκεφάλου εμβρύων ποντικών tva ηλικίας Ε13, Ε16 ή Ε18 ημερών, χωρίς να διακοπεί η εγκυμοσύνη. Ο ιός αφέθηκε να επιμολύνει τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του εγκεφάλου του εμβρύου για κάποιο χρονικό διάστημα (12 περίπου ώρες) και κατόπιν αφέθηκαν τα έμβρυα να αναπτυχθούν κανονικά στο σώμα της μητέρας τους για χρονικό διάστημα δύο ημερών, οπότε τα ζώα θυσιάζονται προκειμένου να εξεταστεί η δράση του ιού. Η επίδραση της έκφρασης του γονιδίου ΒΜ88 αξιολογείται με τον παρακάτω έμμεσο τρόπο: Τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που επιμολύνθηκαν με τον ιό, εκφράζουν τις πρωτεΐνες του γονιδιώματός του ιού και άρα και την γλυκοπρωτεΐνη του ιού gag (βλ.κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Παράλληλα όμως με τις πρωτεΐνες του ιού εκφράζουν και την πρωτεΐνη ΒΜ88 ή GFP. Έτσι, πραγματοποιούνται ανοσοϊστοχημικές χρώσεις έναντι της γλυκοπρωτεΐνης gag του ιού, προκειμένου να ανιχνευτούν έμμεσα μέσα στην περιοχή του φλοιού του εγκεφάλου τα κύτταρα που έχουν επιμολυνθεί με τον ιό και υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να ξεχωρίσουμε τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 λόγω του ιού από τα υπόλοιπα κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 ενδογενώς, σε φυσιολογικά επίπεδα. Η πρωτεΐνη GFP ανιχνεύεται άμεσα με ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας αντι-gfp αντίσωμα. Τα αποτελέσματα εντοπισμού των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον ιό που έφερε το γονίδιο GFP, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας στην παραπάνω διαδικασία, στο φλοιό του εγκεφάλου των ποντικών δύο μέρες μετά τη χορήγηση του ιού, επιβεβαίωσε και την επιτυχή επιμόλυνση των κυττάρων της «ακτινωτής γλοίας». Επιπλέον επιβεβαιώθηκε η βιωσιμότητα και η λειτουργικότητα των επιμολυνθέντων κυττάρων αφού αυτά εντοπίστηκαν σε ανώτερες στιβάδες του φλοιού πράγμα που σημαίνει ότι τα κύτταρα αυτά της «ακτινωτής γλοίας» είχαν ήδη εγκαταλείψει τη νευροεπιθηλιακή ζώνη VZ και μεταναστεύσει προς τον τελικό τους προορισμό (Εικόνα 17). Τα αποτελέσματα ωστόσο των χρώσεων δεν κατάφεραν να αποκαλύψουν τη μοίρα των κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 αφού το αντίσωμα έναντι της γλυκοπρωτεΐνης gag του ιού δεν αναγνωρίζει τον επίτοπό του κάτω από τις συνήθεις συνθήκες που πραγματοποιούνται οι ανοσοϊστοχημικές χρώσεις. Επιπλέον, επιμόλυνση των κυττάρων με τον ιό ΑRSV/hGFAP-ΒΜ88 δεν οδήγησε σε υψηλά επίπεδα υπερ-έκφρασης του γονιδίου ΒΜ88, έτσι ώστε να είναι δυνατός ο διαχωρισμός της υπερ-έκφρασης από την ενδογενή έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με αντι-βμ88 αντίσωμα. Δυστυχώς λοιπόν, η επιτυχής επιμόλυνση των κυττάρων από μόνη της δε μας βοηθά να καταλήξουμε σε συμπεράσματα όσον αφορά την τύχη των κυττάρων αυτών. Μία ενδεχομένη λύση, που πιθανόν να χρησιμοποιηθεί 135

150 Αποτελέσματα στο μέλλον, θεωρήθηκε η κατασκευή ενός νέου ιού φορέα RCAS-Y που να περιλαμβάνει αυτή τη φορά την πρωτεΐνη ΒΜ88 και την πρωτεΐνη GFP μαζί. Με αυτό τον τρόπο θα μπορούν να γίνουν ανιχνεύσιμα τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 μέσω ανοσοϊστοχημικών χρώσεων έναντι της πρωτεΐνης GFP. Εικόνα 16. Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας μεταφοράς των γονιδίων ΒΜ88 και GFP στα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» του τελεγκεφάλου των διαγονιδιακών ποντικών tv-a εμβρυϊκής ηλικίας Ε13, με τη βοήθεια του ιού ΑRSV. Εικόνα 16Α: Διαγραμματική περιγραφή της ενσωμάτωσης των γονιδίων ΒΜ88 και GFP στο γονιδίωμα του ρετροϊού ARSV, RCAS-Y.H ενσωμάτωση των γονιδίων έγινε μετά την περιοχή του υποκινητή των γονιδίων gag και env και έτσι ώστε τα γονίδια ΒΜ88 και GFP να βρίσκονται στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης με τα γονίδια gag και env. Αυτό σημαίνει ότι ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου gag ισοδυναμεί με έμμεση ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων ΒΜ88 και GFP. Εικόνα 16Β: Φωτογραφία ενός εμβρύου ποντικού ηλικίας Ε13 παρόμοιο με αυτό στο οποίο χορηγήθηκε ο ιός ARSV με τη χρήση τριχοειδούς πιπέτας και κατάλληλης μπλε χρωστικής στο εσωτερικό των κοιλιών του τελεγκεφάλου (βλ. κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι).. Εικόνα 16Γ: Σχηματική αναπαράσταση της πειραματικής διαδικασίας επιμόλυνσης του τελεγκεφάλου εμβρύου ποντικού tva που φέρει υποδοχείς του ιού ARSV, ηλικίας Ε13, με τον ιό ARSV (βλ. κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Το σχήμα παρουσιάζει τις δύο καταστάσεις του τελεγκεφάλου του εμβρύου, πριν (πάνω) και μετά (κάτω) την επιμόλυνση. 136

151 Αποτελέσματα Εικόνα 17. Κύτταρα στον φλοιό του πρόσθιου εγκεφάλου των διαγονιδιακών ποντικών tv-a εμβρυϊκής ημέρας Ε16 που έχουν επιμολυνθεί με τον ιό ARSV και εκφράζουν τη πρωτεΐνη GFP δύο μέρες μετά την επιμόλυνση. Χρώση ανοσοφθορισμού έναντι της πρωτεΐνης GFP (πράσινο) στον εγκεφαλικό φλοιό των ποντικών tv-a. Η χρώση εντοπίζει κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που επιμολύνθηκαν με τον ιό ARSV ο οποίος μεταφέρει το γονίδιο GFP. Δύο μέρες μετά την επιμόλυνση, κάποια από τα κύτταρα της «ακτινωτής γλοίας» που εκφράζουν την πρωτεΐνη GFP εγκαταλείπουν τη νευροεπιθηλιακή ζώνη VZ και μεταναστεύουν προς τις ανώτερες στιβάδες του φλοιού (βελάκια). Στην εικόνα 17Β φαίνεται σε μεγέθυνση ένα από τα κύτταρα που μετανάστευσαν και που περικλείεται στο λευκό πλαίσιο της εικόνας 17Α. Οι παραπάνω εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. CP (cortical plate): φλοιϊκό πέταλο, pia: χοριoειδής μήνιγγα. Κλίμακα 40μm (Eικόνα Α) και 10μm (Eικόνα Β).. 137

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΠΑΘΟΛΟΓΙA Γεώργιος Καρκαβέλας Καθηγητής Παθολογικής Ανατοµικής ΑΠΘ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΠΑΘΟΛΟΓΙA Γεώργιος Καρκαβέλας Καθηγητής Παθολογικής Ανατοµικής ΑΠΘ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΠΑΘΟΛΟΓΙA Γεώργιος Καρκαβέλας Καθηγητής Παθολογικής Ανατοµικής ΑΠΘ ΚΝΣ: πολυσύνθετο σύστηµα πολλές από τις λειτουργίες του αδιευκρίνιστες Πρώτες ανατοµικές µελέτες Αριστοτέλης και Γαληνός

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ Μ. ΠΑΥΛΙ ΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ Μ. ΠΑΥΛΙ ΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ Μ. ΠΑΥΛΙ ΗΣ Hράκλειο, εκέμβριος 2011 ΤΥΠΟΙ ΙΣΤΩΝ 1. Eπιθηλιακός Πολυεδρικά κύτταρα που είναι πάρα πολύ στενά συνδεδεμένα και φέρουν ελάχιστη μεσοκυττάρια ουσία 2. Συνδετικός Κύτταρα

Διαβάστε περισσότερα

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Page1 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Μαθητές: Ρουμπάνης Γιάννης και Οικονομίδης Αριστείδης Τάξη: Γ γυμνασίου Κερατέας Τμήμα: Γ 4 Οκτώβριος 2013 Page2 ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το νευρικό σύστημα μαζί

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Η τρίτη εβδομάδα (έναρξη) Περιλαμβάνει το σχηματισμό: της αρχικής γραμμής της νωτιαίας χορδής των τριών βλαστικών στιβάδων ή βλαστικά δέρματα (γαστριδίωση) Η τρίτη εβδομάδα

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Α Λυκείου Κεφ. 9. Νευρικό Σύστημα. Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων

Βιολογία Α Λυκείου Κεφ. 9. Νευρικό Σύστημα. Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων Βιολογία Α Λυκείου Κεφ. 9 Νευρικό Σύστημα Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων Νευρικό Σύστημα Το νευρικό σύστημα μαζί με το σύστημα των ενδοκρινών αδένων φροντίζουν να διατηρείται σταθερό το εσωτερικό

Διαβάστε περισσότερα

1. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα

1. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα 1. Κεντρικό Νευρικό Σύστημα 1.1. Νευρικό Σύστημα 1.1.1. Ανατομία του Νευρικού Συστήματος: Το νευρικό σύστημα αποτελείται από ένα κεντρικό και ένα περιφερικό τμήμα (πίνακας 1, σχήμα 1). (α) Το κεντρικό

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ Α. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ Α. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ Α Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας Ρόλος του νευρικού συστήματος Το νευρικό σύστημα (Ν.Σ.) ελέγχει, ρυθμίζει και συντονίζει όλες τις λειτουργίες του οργανισμού ανάλογα

Διαβάστε περισσότερα

Εγκέφαλος-Αισθητήρια Όργανα και Ορμόνες. Μαγδαληνή Γκέιτς Α Τάξη Γυμνάσιο Αμυγδαλεώνα

Εγκέφαλος-Αισθητήρια Όργανα και Ορμόνες. Μαγδαληνή Γκέιτς Α Τάξη Γυμνάσιο Αμυγδαλεώνα Εγκέφαλος-Αισθητήρια Όργανα και Ορμόνες O εγκέφαλος Ο εγκέφαλος είναι το κέντρο ελέγχου του σώματος μας και ελέγχει όλες τις ακούσιες και εκούσιες δραστηριότητες που γίνονται μέσα σε αυτό. Αποτελεί το

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΩΝΑΣ ( νευρικό κύτταρο ) x40 x40 Χρώση αιµατοξυλίνης-ηωσίνης Χρώση αργύρου

ΝΕΥΡΩΝΑΣ ( νευρικό κύτταρο ) x40 x40 Χρώση αιµατοξυλίνης-ηωσίνης Χρώση αργύρου ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Ντίνα Τηνιακού Aν. Καθηγήτρια Ιστολογίας-Εµβρυολογίας Mαρίνα Παλαιολόγου Βιολόγος Κεντρικό Νευρικό Σύστηµα (ΚΝΣ) Εγκέφαλος και νωτιαίος µυελός νευρικά κύτταρα µε τις αποφυάδες τους εξειδικευµένα

Διαβάστε περισσότερα

ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ (I)

ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ (I) ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ (I) Γιάννης Τσούγκος ΓΕΝΙΚΑ:...πολλούς αιώνες πριν μελετηθεί επιστημονικά ο ηλεκτρισμός οι άνθρωποι γνώριζαν

Διαβάστε περισσότερα

ΔΑΜΔΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ. Βιολογία A λυκείου. Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαριλένα Ζαρφτζιάν Σχολικό έτος:

ΔΑΜΔΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ. Βιολογία A λυκείου. Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαριλένα Ζαρφτζιάν Σχολικό έτος: ΔΑΜΔΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Βιολογία A λυκείου Υπεύθυνη καθηγήτρια: Μαριλένα Ζαρφτζιάν Σχολικό έτος: 2013-2014 Ένα αισθητικό σύστημα στα σπονδυλωτά αποτελείται από τρία βασικά μέρη: 1. Τους αισθητικούς υποδοχείς,

Διαβάστε περισσότερα

M.Sc. Bioinformatics and Neuroinformatics

M.Sc. Bioinformatics and Neuroinformatics M.Sc. Bioinformatics and Neuroinformatics Recording and Processing Brain Signals Μαρία Σαγιαδινού Ο ανθρώπινος εγκέφαλος Πιο πολύπλοκο δημιούργημα της φύσης Προιόν βιολογικής εξέλιξης εκατομμυρίων ετών

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΝΕΥΡΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ

Κεφάλαιο 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΝΕΥΡΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ Κεφάλαιο 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΝΕΥΡΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ 1.1. Εισαγωγή Ο ζωντανός οργανισµός έχει την ικανότητα να αντιδρά σε µεταβολές που συµβαίνουν στο περιβάλλον και στο εσωτερικό του. Οι µεταβολές αυτές ονοµάζονται

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θέμα: ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΜΟΝΙΜΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΙΣΤΩΝ Μέσος χρόνος πειράματος: 45 λεπτά Α. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ B. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ B. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΜΕΡΟΣ B Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής του οργανισμού μας Περιφερικό Νευρικό Σύστημα o Τα όργανα του ΠΝΣ είναι τα νεύρα. o Τα νεύρα αποτελούνται από δεσμίδες νευρικών αποφυάδων (μακριών δενδριτών

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων. Ηλιάνα Καρβουντζή Βιολόγος

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων. Ηλιάνα Καρβουντζή Βιολόγος ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Δομή και λειτουργία των νευρικών κυττάρων Ρόλος του νευρικού συστήματος Το νευρικό σύστημα μαζί με το σύστημα των ενδοκρινών αδένων συμβάλλουν στη διατήρηση σταθερού εσωτερικού περιβάλλοντος

Διαβάστε περισσότερα

3. Να συμπληρώσετε κατάλληλα τα μέρη από τα οποία αποτελείται ένας νευρώνας.

3. Να συμπληρώσετε κατάλληλα τα μέρη από τα οποία αποτελείται ένας νευρώνας. ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ 9 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ «ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ» ΜΕΡΟΣ Α: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΣΑ ΣΤΗΝ ΤΑΞΗ 1. Να συμπληρώσετε το παρακάτω διάγραμμα. 2. Ποιος είναι ο ρόλος του

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Επιλέξτε τη σωστή απάντηση στις παρακάτω προτάσεις: 1) Τα νευρογλοιακά κύτταρα δεν μπορούν: α. Να προμηθεύουν τους νευρώνες με θρεπτικά

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Επιλέξτε τη σωστή απάντηση στις παρακάτω προτάσεις: 1) Τα νευρογλοιακά κύτταρα δεν μπορούν: α. Να προμηθεύουν τους νευρώνες με θρεπτικά ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Επιλέξτε τη σωστή απάντηση στις παρακάτω προτάσεις: 1) Τα νευρογλοιακά κύτταρα δεν μπορούν: α. Να προμηθεύουν τους νευρώνες με θρεπτικά συστατικά και να απομακρύνουν τις άχρηστες ουσίες. β. Να

Διαβάστε περισσότερα

Νικολέττα Χαραλαμπάκη Ιατρός Βιοπαθολόγος

Νικολέττα Χαραλαμπάκη Ιατρός Βιοπαθολόγος Νικολέττα Χαραλαμπάκη Ιατρός Βιοπαθολόγος ΚΝΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΣ ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ Περιβάλλονται και στηρίζονται με τις εγκεφαλικές και νωτιαίες μήνιγγες μεταξύ των οποίων περικλείεται ο υπαραχνοειδής χώρος γεμάτος

Διαβάστε περισσότερα

ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΚΑΙ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ

ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΚΑΙ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ Πρότυπο Πειραματικό Σχολείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΚΑΙ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ Φασφαλής Νικηφόρος Από τι αποτελείται ΚΝΣ από τον εγκέφαλο και τον νωτιαίο μυελό ΠΝΣ από

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟ492: ΝΕΥΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΒΙΟ492: ΝΕΥΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΒΙΟ492: ΝΕΥΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Δρ. Κυριακή Σιδηροπούλου Λέκτορας Νευροφυσιολογίας Γραφείο: Γ316δ ΤΗΛ: 28103940871 (γραφείο) E- MAIL: sidirop@imbb.forth.gr Εισαγωγή Σιδηροπούλου - Νευροβιολογία 1 Δομή μαθήματος

Διαβάστε περισσότερα

9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ. Νευρώνες

9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ. Νευρώνες 9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το νευρικό σύστημα μαζί με το σύστημα των ενδοκρινών αδένων συμβάλλουν στη διατήρηση σταθερού εσωτερικού περιβάλλοντος (ομοιόσταση), ελέγχοντας και συντονίζοντας τις λειτουργίες των

Διαβάστε περισσότερα

Μετωπιαίο, Σφηνοειδές, Ηθμοειδές, Δακρυϊκό, Άνω γνάθος, Ζυγωματικό, Υπερώιο

Μετωπιαίο, Σφηνοειδές, Ηθμοειδές, Δακρυϊκό, Άνω γνάθος, Ζυγωματικό, Υπερώιο Μετωπιαίο, Σφηνοειδές, Ηθμοειδές, Δακρυϊκό, Άνω γνάθος, Ζυγωματικό, Υπερώιο Οφρύς Βλέφαρα Βλεφαρίδες Βλεφαρικοί και Σμηγματογόνοι αδένες των βλεφάρων Ανελκτήρας μυς του άνω βλεφάρου Σφιγκτήρας μυς των

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΑΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΜΥΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΑΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΜΥΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΑΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΜΥΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Σημειώσεις Ανατομίας - Φυσιολογίας Ι Σκοπός της λειτουργίας του νευρικού συστήματος Προσαρμόζει τις λειτουργίες του ανθρώπινου

Διαβάστε περισσότερα

Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων

Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων Διάµεσος Εγκέφαλος (Θάλαµος) Ελίζαµπεθ Τζόνσον Εργαστήριο Ανατοµίας Ιατρική Σχολή Στο εσωτερικό των ηµισφαιρίων υπάρχου πλάγιες κοιλίες λευκή ουσία Βασικά

Διαβάστε περισσότερα

Σύναψη µεταξύ της απόληξης του νευράξονα ενός νευρώνα και του δενδρίτη ενός άλλου νευρώνα.

Σύναψη µεταξύ της απόληξης του νευράξονα ενός νευρώνα και του δενδρίτη ενός άλλου νευρώνα. ΟΙ ΝΕΥΡΩΝΕΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΟΥΝ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΣΥΝΑΨΗΣ Άντα Μητσάκου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Πατρών Γνωρίζουµε ότι είµαστε ικανοί να εκτελούµε σύνθετες νοητικές διεργασίες εξαιτίας της

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία. Θετικής κατεύθυνσης. Β λυκείου. ΑΡΓΥΡΗΣ ΓΙΑΝΝΗΣ Βιολόγος 3 ο λύκ. ηλιούπολης

Βιολογία. Θετικής κατεύθυνσης. Β λυκείου. ΑΡΓΥΡΗΣ ΓΙΑΝΝΗΣ Βιολόγος 3 ο λύκ. ηλιούπολης Βιολογία Β λυκείου Θετικής κατεύθυνσης ΑΡΓΥΡΗΣ ΓΙΑΝΝΗΣ Βιολόγος 3 ο λύκ. ηλιούπολης 1. Εισαγωγή Το κύτταρο αποτελεί τη βασική δομική και λειτουργική μονάδα των οργανισμών. 1.1 Το κύτταρο. 3ο λύκ. ηλιούπολης

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 5ο ΜΕΡΟΣ Β ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ

ΜΑΘΗΜΑ 5ο ΜΕΡΟΣ Β ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ ΜΑΘΗΜΑ 5ο ΜΕΡΟΣ Β ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ Η παρεγκεφαλίδα βρίσκεται στον οπίσθιο κρανιακό βόθρο, πίσω από τη γέφυρα και τον προμήκη μυελό Αποτελείται από δύο ημισφαίρια που συνδέονται μεταξύ τους με

Διαβάστε περισσότερα

Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους.

Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Τι είναι τα βλαστικά κύτταρα? Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Είναι σε θέση να δρουν επισκευαστικά, αναδημιουργώντας

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 4ο ΜΕΡΟΣ Α ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ

ΜΑΘΗΜΑ 4ο ΜΕΡΟΣ Α ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ ΜΑΘΗΜΑ 4ο ΜΕΡΟΣ Α ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΚΝΣ) ΕΓΚΕΦΑΛΟΣ ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ ΝΩΤΙΑΙΟΣ ΜΥΕΛΟΣ Είναι το πιο ουραίο τμήμα του Κ.Ν.Σ. Εκτείνεται από τη βάση του κρανίου μέχρι τον 1 ο οσφυϊκό

Διαβάστε περισσότερα

ΜΗΤΡΙΚΟΣ ΘΗΛΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΧΡΙ ΚΑΙ 10 ΧΡΟΝΩΝ

ΜΗΤΡΙΚΟΣ ΘΗΛΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΧΡΙ ΚΑΙ 10 ΧΡΟΝΩΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ ΜΗΤΡΙΚΟΣ ΘΗΛΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΧΡΙ ΚΑΙ 10 ΧΡΟΝΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ονοματεπώνυμο Κεντούλλα Πέτρου Αριθμός Φοιτητικής Ταυτότητας 2008761539 Κύπρος

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Χωρίζεται σε Κεντρικό Νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και σε Περιφερικό Νευρικό Σύστημα.

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Χωρίζεται σε Κεντρικό Νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και σε Περιφερικό Νευρικό Σύστημα. 1 ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Για την ομαλή λειτουργία του ανθρωπίνου σώματος τα εκατομμύρια των κυττάρων που το αποτελούν θα πρέπει να συνεργάζονται αρμονικά μεταξύ τους. Ο συντονισμός και η ομαλή λειτουργία σε όλα

Διαβάστε περισσότερα

2 Ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΧΑΛΑΝΔΡΙΟΥ Α ΤΑΞΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο. Δ. Αρζουμανίδου

2 Ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΧΑΛΑΝΔΡΙΟΥ Α ΤΑΞΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο. Δ. Αρζουμανίδου 2 Ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΧΑΛΑΝΔΡΙΟΥ Α ΤΑΞΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο Δ. Αρζουμανίδου Το νευρικό σύστημα συνεργάζεται με τους ενδοκρινείς αδένες και μαζί ελέγχουν και συντονίζουν τις λειτουργίες των

Διαβάστε περισσότερα

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΩΜΑΤΙΚΕΣ ΑΙΣΘΗΣΕΙΣ

ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΩΜΑΤΙΚΕΣ ΑΙΣΘΗΣΕΙΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΩΜΑΤΙΚΕΣ ΑΙΣΘΗΣΕΙΣ ΑΙΣΘΗΤΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ (συγκεντρωμένοι ή διάσπαρτοι) ΝΕΥΡΙΚΕΣ ΟΔΟΙ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΣ ΦΛΟΙΟΣ Ειδικά κύτταρα - υποδοχείς, ευαίσθητα στις αλλαγές αυτές, είναι τα κύρια μέσα συλλογής

Διαβάστε περισσότερα

Σκοπός του μαθήματος είναι ο συνδυασμός των θεωρητικών και ποσοτικών τεχνικών με τις αντίστοιχες περιγραφικές. Κεφάλαιο 1: περιγράφονται οι βασικές

Σκοπός του μαθήματος είναι ο συνδυασμός των θεωρητικών και ποσοτικών τεχνικών με τις αντίστοιχες περιγραφικές. Κεφάλαιο 1: περιγράφονται οι βασικές Εισαγωγή Ασχολείται με τη μελέτη των ηλεκτρικών, η λ ε κ τ ρ ο μ α γ ν η τ ι κ ώ ν κ α ι μ α γ ν η τ ι κ ώ ν φαινομένων που εμφανίζονται στους βιολογικούς ιστούς. Το αντικείμενο του εμβιοηλεκτρομαγνητισμού

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 7ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ

ΜΑΘΗΜΑ 7ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΜΑΘΗΜΑ 7ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ Η ΛΕΥΚΗ ΟΥΣΙΑ ΤΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Η λευκή ουσία συντίθεται από εμύελες νευρικές ίνες διαφόρων διαμέτρων και νευρογλοία Οι νευρικές ίνες κατατάσσονται

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΥΔΩΝ ΤΕΦΑΑ/ΔΠΘ ΜΑΘΗΜΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΠΟΝΗΤΙΚΗΣ. ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής ΣΥΣΠΑΣΗΣ

ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΥΔΩΝ ΤΕΦΑΑ/ΔΠΘ ΜΑΘΗΜΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΠΟΝΗΤΙΚΗΣ. ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής ΣΥΣΠΑΣΗΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΥΔΩΝ ΤΕΦΑΑ/ΔΠΘ ΜΑΘΗΜΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΠΟΝΗΤΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής ΔΙΑΛΕΞΗ 3 - Η ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΜΥΪΚΗΣ ΣΥΣΠΑΣΗΣ Βιοχημεία των νευρομυϊκών

Διαβάστε περισσότερα

Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων. Μεταιχµιακό Σύστηµα

Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων. Μεταιχµιακό Σύστηµα Εσωτερική Κατασκευή των Εγκεφαλικών Ηµισφαιρίων Μεταιχµιακό Σύστηµα Στο εσωτερικό των ηµισφαιρίων υπάρχου πλάγιες κοιλίες λευκή ουσία Βασικά Γάγγλια µεταιχµιακό (στεφανιαίο) σύστηµα διάµεσος εγκέφαλος

Διαβάστε περισσότερα

Κυτταροαρχιτεκτονική Ελίζαµπεθ Τζόνσον Εργαστήριο Ανατοµίας Ιατρική Σχολή

Κυτταροαρχιτεκτονική Ελίζαµπεθ Τζόνσον Εργαστήριο Ανατοµίας Ιατρική Σχολή Κυτταροαρχιτεκτονική Ελίζαµπεθ Τζόνσον Εργαστήριο Ανατοµίας Ιατρική Σχολή Τελικός Εγκ Εγκεφαλικά ηµισφαίρια Διάµεσος εγκ & Βασικά γάγγλια Διαίρεση του ΚΝΣ Στέλεχος του εγκέφαλου Μέσος εγκ Γέφυρα Προµήκης

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ Νευρικό σύστημα (σύντομη θεωρία ερωτήσεις)

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ Νευρικό σύστημα (σύντομη θεωρία ερωτήσεις) ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Ιδιωτικό Γενικό Λύκειο Όνομα: Ημερομηνία:./ / ΤΑΞΗ : A Λυκείου ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ Νευρικό σύστημα (σύντομη θεωρία ερωτήσεις) ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ - ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ Συμβάλλουν

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 8ο ΜΕΡΟΣ Α ΑΙΜΑΤΟ-ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΣ ΦΡΑΓΜΟΣ

ΜΑΘΗΜΑ 8ο ΜΕΡΟΣ Α ΑΙΜΑΤΟ-ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΣ ΦΡΑΓΜΟΣ ΜΑΘΗΜΑ 8ο ΜΕΡΟΣ Α ΑΙΜΑΤΟ-ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΣ ΦΡΑΓΜΟΣ ΑΙΜΑΤΟ-ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΣ ΦΡΑΓΜΟΣ ΚΑΙ ΦΡΑΓΜΟΣ ΑΙΜΑΤΟΣΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟΥ ΥΓΡΟΥ Το ΚΝΣ για να λειτουργεί φυσιολογικά χρειάζεται πολύ σταθερό περιβάλλον Η σταθερότητα αυτή

Διαβάστε περισσότερα

Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους.

Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Βλαστικά κύτταρα: Αρχικά αδιαφοροποίητα κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ιστικά εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Είναι σε θέση να δρουν επισκευαστικά, αναδημιουργώντας κύτταρα

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. Κάντε κλικ για να επεξεργαστείτε τον υπότιτλο του υποδείγματος

ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ. Κάντε κλικ για να επεξεργαστείτε τον υπότιτλο του υποδείγματος ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Κάντε κλικ για να επεξεργαστείτε τον υπότιτλο του υποδείγματος ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το νευρικό σύστημα θέτει σε επικοινωνία τον οργανισμό μας με τον έξω κόσμο. Μοιάζει με τηλεφωνικό δίκτυο,

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Γ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΕΣ

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Γ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΕΣ ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Γ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΕΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΕΣ Ορίζουμε ως διαβιβαστή μια ουσία που απελευθερώνεται από έναν νευρώνα σε μια σύναψη και που επηρεάζει ένα άλλο κύτταρο, είτε έναν νευρώνα είτε ένα κύτταρο

Διαβάστε περισσότερα

Οργανοτυπικές Καλλιέργειες

Οργανοτυπικές Καλλιέργειες Οργανοτυπικές Καλλιέργειες Καθηγητής-Διευθυντής Βασίλης Γοργούλης Επ. Καθηγητής Ιωάννης Πατέρας Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας Ιατρική Σχολή Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Αθήνα,

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 6ο ΜΕΡΟΣ Β ΤΑ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΑ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΑ

ΜΑΘΗΜΑ 6ο ΜΕΡΟΣ Β ΤΑ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΑ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΑ ΜΑΘΗΜΑ 6ο ΜΕΡΟΣ Β ΤΑ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΑ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΑ ΤΑ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΑ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΑ Τα εγκεφαλικά ημισφαίρια διακρίνονται σε δεξιό και αριστερό Διαχωρίζονται μεταξύ τους με μια βαθιά σχισμή, την επιμήκη σχισμή Εντός

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Ιδιωτικό Γενικό Λύκειο Όνομα: Ημερομηνία:./04/2014 ΤΑΞΗ : A Λυκείου ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 1 ο ΘΕΜΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11: Ενδοκρινείς αδένες ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

ΕΚ ΗΛΩΣΗ ΕΝΗΜΕΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΟΥ ΣΤΙΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ. Πόλη Ηµεροµηνία Ώρα Αίθουσα ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ

ΕΚ ΗΛΩΣΗ ΕΝΗΜΕΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΟΥ ΣΤΙΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ. Πόλη Ηµεροµηνία Ώρα Αίθουσα ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΚ ΗΛΩΣΗ ΕΝΗΜΕΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΟΥ ΣΤΙΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Πόλη Ηµεροµηνία Ώρα Αίθουσα Σαλαµίνα 17 Μαρτίου 2012 09:30 πµ Κινηµατοθέατρο Ναυστάθµου

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Βασικές αρχές της μοριακής βιολογίας. Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση 1

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Βασικές αρχές της μοριακής βιολογίας. Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Βασικές αρχές της μοριακής βιολογίας Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση 1 ΕΙΚΟΝΑ 4.4 Η μεταφορά της γενετικής πληροφορίας μέσω του DNA. Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ

ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Εγκέφαλος Μεγάλη αιµάτωση, πολύ σηµαντική για την λειτουργία του Επικοινωνία µε το περιβάλλον Χρησιµοποιεί το 20% του Ο 2 και ως πηγή ενέργειας γλυκόζη Στις χειρουργικές επεµβάσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΠΑΓΩΜΕΝΩΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ

ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΠΑΓΩΜΕΝΩΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΠΑΓΩΜΕΝΩΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ Υπάρχουν Βλαστικά κύτταρα με διαφορετικές ιδιότητες: Τα Πολυδύναμα - Pluripotent Εμβρυονικά Βλαστικά κύτταρα - Embryonic Stem

Διαβάστε περισσότερα

Η Εμμονή της Μνήμης. The Persistence of Memory Salvador Dali

Η Εμμονή της Μνήμης. The Persistence of Memory Salvador Dali Η Εμμονή της Μνήμης The Persistence of Memory Salvador Dali 2 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΝΕΥΡΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 1. Ρόλος του νευρικού συστήματος Νευρικό σύστημα Το νευρικό σύστημα μαζί με το σύστημα των ενδοκρινών

Διαβάστε περισσότερα

Επανάληψη πριν τις εξετάσεις Καλό διάβασμα

Επανάληψη πριν τις εξετάσεις Καλό διάβασμα Επανάληψη πριν τις εξετάσεις Καλό διάβασμα 2013-2014 Θέματα πολλαπλής επιλογής Κύτταρα όμοια μορφολογικά και λειτουργικά αποτελούν α. ένα όργανο. β. ένα ιστό. γ. ένα οργανισμό. δ. ένα σύστημα οργάνων.

Διαβάστε περισσότερα

Συστήµατα Αισθήσεων Σωµατικές Αισθήσεις

Συστήµατα Αισθήσεων Σωµατικές Αισθήσεις Συστήµατα Αισθήσεων Σωµατικές Αισθήσεις ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Φλοιός (Ανώτερος Εγκέφαλος) Κατώτερος Εγκέφαλος Ειδικές Αισθήσεις Εν τω Βάθει Αισθητικότητα Επί πολλής Αισθητικότητα Χυµικά Ερεθίσµατα

Διαβάστε περισσότερα

Τι θα προτιμούσατε; Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32) 25/4/2012. Διάλεξη 5 Όραση και οπτική αντίληψη. Πέτρος Ρούσσος. Να περιγράψετε τι βλέπετε στην εικόνα;

Τι θα προτιμούσατε; Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32) 25/4/2012. Διάλεξη 5 Όραση και οπτική αντίληψη. Πέτρος Ρούσσος. Να περιγράψετε τι βλέπετε στην εικόνα; Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32) Διάλεξη 5 Όραση και οπτική αντίληψη Πέτρος Ρούσσος Να περιγράψετε τι βλέπετε στην εικόνα; Τι θα προτιμούσατε; Ή να αντιμετωπίσετε τον Γκάρι Κασπάροβ σε μια παρτίδα σκάκι; 1

Διαβάστε περισσότερα

9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ. Νευρώνες

9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΙΚΩΝ. Νευρώνες 9. ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το νευρικό σύστημα μαζί με το σύστημα των ενδοκρινών αδένων συμβάλλουν στη διατήρηση σταθερού εσωτερικού περιβάλλοντος (ομοιόσταση), ελέγχοντας και συντονίζοντας τις λειτουργίες των

Διαβάστε περισσότερα

AYΞΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ

AYΞΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ AYΞΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΤΩΝ Χ.Κ. ΚΙΤΣΑΚΗ 2008 1 Αντικείμενα της ενότητας Ορισμοί και έννοιες Σκοπός των διεργασιών της ανάπτυξης Πού και πώς πραγματοποιούνται

Διαβάστε περισσότερα

Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32)

Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32) Γνωστική Ψυχολογία Ι (ΨΧ32) Διάλεξη 3 Η φυσιολογία των γνωστικών διεργασιών Πέτρος Ρούσσος Η νευροψυχολογική βάση των γνωστικών διεργασιών Γνωστική νευροεπιστήμη: μελετάει τους τρόπους με τους οποίους

Διαβάστε περισσότερα

Εργαλεία Μοριακής Γενετικής

Εργαλεία Μοριακής Γενετικής Εργαλεία Μοριακής Γενετικής Αρχές Μοριακής κλωνοποίησης Τα περιοριστικά ένζυμα: αναγνωρίζουν αλληλουχίες (θέσεις περιορισμού). 2 τύποι ενζύμων: -Τύπος I = Κόβουν κοντά στη θέση περιορισμού -σπάνια χρησιμοποιούνται.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗ ΘΕΜΑ 1ο 1. Κυτταρική διαφοροποίηση ονομάζουμε: α. Την δομική κυρίως εξειδίκευση των συστημάτων β. Την δομική και λειτουργική εξειδίκευση των κυττάρων γ. Την λειτουργική εξειδίκευση

Διαβάστε περισσότερα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της...

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... Γενετική Μηχανική o Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές με τις οποίες μπορούμε να επεμβαίνουμε στο γενετικό υλικό των οργανισμών.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Α ΣΥΝΑΠΤΙΚΗ ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Α ΣΥΝΑΠΤΙΚΗ ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Α ΣΥΝΑΠΤΙΚΗ ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ Όπως συμβαίνει με τη συναπτική διαβίβαση στη νευρομυϊκή σύναψη, σε πολλές μορφές επικοινωνίας μεταξύ νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα παρεμβαίνουν άμεσα ελεγχόμενοι

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA 1. Η ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής επέτρεψε: α. την κατανόηση των μηχανισμών αντιγραφής του γενετικού υλικού β. την απομόνωση των πλασμιδίων από τα βακτήρια γ. την πραγματοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

1. Ανάπτυξη του νοραδρενεργικού συστήµατος στον VC και στον MC

1. Ανάπτυξη του νοραδρενεργικού συστήµατος στον VC και στον MC ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ιάφορα αντισώµατα, µεταξύ των οποίων και αντισώµατα εναντίον της DBH, έχουν χρησιµοποιηθεί για την in situ σήµανση και ανίχνευση των νοραδρενεργικών ινών. Μεγάλος αριθµός µελετών, ενδεικτικά

Διαβάστε περισσότερα

Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί

Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί Κατιόντα (φυγόκεντρα) δεµάτια Ελίζαµπεθ Τζόνσον Εργαστήριο Ανατοµίας Ιατρική Σχολή φυσιολογικά δεµάτια (κατά τον επιµήκη άξονα) έχουν κοινή έκφυση πορεία απόληξη λειτουργία

Διαβάστε περισσότερα

Δυνάμεις Starling. Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ. 03/10/2017

Δυνάμεις Starling. Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ. 03/10/2017 Δυνάμεις Starling Σωτήρης Ζαρογιάννης Επίκ. Καθηγητής Φυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Π.Θ. 03/10/2017 Φυσιολογία Συστημάτων Ακαδημαϊκό Ετος 2017-2018 Πιέσεις σε όλο το μήκος της συστημικής

Διαβάστε περισσότερα

Ερωτήσεις θεωρίας. 1ο Κεφάλαιο Από το κύτταρο στον οργανισμό

Ερωτήσεις θεωρίας. 1ο Κεφάλαιο Από το κύτταρο στον οργανισμό Ερωτήσεις θεωρίας 1ο Κεφάλαιο Από το κύτταρο στον οργανισμό 1. Ποια είναι τα βασικά είδη ιστών του ανθρώπινου οργανισμού; Τα βασικά είδη ιστών του ανθρώπινου οργανισμού είναι ο επιθηλιακός, ο μυικός, ο

Διαβάστε περισσότερα

Απ. Χατζηευθυμίου Αν Καθηγήτρια Ιατρικής Φυσιολογίας

Απ. Χατζηευθυμίου Αν Καθηγήτρια Ιατρικής Φυσιολογίας Απ. Χατζηευθυμίου Αν Καθηγήτρια Ιατρικής Φυσιολογίας Το 80% περίπου της γεύσης του φαγητού παρέχεται στην πραγματικότητα από την αίσθηση της όσφρησης. Η μυρωδιά μιας ουσίας σχετίζεται άμεσα με τη χημική

Διαβάστε περισσότερα

Έναρξη της μεταγραφής = μείωση του ρυθμού διαίρεσης

Έναρξη της μεταγραφής = μείωση του ρυθμού διαίρεσης Αυλάκωση vs Γαστριδίωση Αυλάκωση: απανωτές μιτωτικές διαιρέσεις που οδηγούν σε λογαριθμική αύξηση του αριθμού των κυττάρων αλλά χωρίς αύξηση του συνολικού όγκου του αναπτυσσόμενου εμβρύου Έναρξη της μεταγραφής

Διαβάστε περισσότερα

Φλωρεντία Παπαστεφανάκη, PhD

Φλωρεντία Παπαστεφανάκη, PhD Φλωρεντία Παπαστεφανάκη, PhD Ειδικός Λειτουργικός Επιστήμονας, βαθμίδας Δ Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Βασ. Σοφίας 127, 11521 Αθήνα 2106478837, fpapastefanaki@pasteur.gr

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ Επιβλέπων Καθηγητής: Δρ. Νίκος Μίτλεττον Η ΣΧΕΣΗ ΤΟΥ ΜΗΤΡΙΚΟΥ ΘΗΛΑΣΜΟΥ ΜΕ ΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΣΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ 2 ΣΤΗΝ ΠΑΙΔΙΚΗ ΗΛΙΚΙΑ Ονοματεπώνυμο: Ιωσηφίνα

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΣΤΟ 11 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ ΘΕΜΑ Β

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΣΤΟ 11 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ ΘΕΜΑ Β ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΣΤΟ 11 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ ΘΕΜΑ Β 1. Το σύστημα των ενδοκρινών αδένων είναι το ένα από τα δύο συστήματα του οργανισμού μας που συντονίζουν και

Διαβάστε περισσότερα

Κεντρικό νευρικό σύστημα. Το νευρικό σύστημα αποτελείται από ένα κεντρικό και ένα

Κεντρικό νευρικό σύστημα. Το νευρικό σύστημα αποτελείται από ένα κεντρικό και ένα Κεντρικό νευρικό σύστημα. Το νευρικό σύστημα αποτελείται από ένα κεντρικό και ένα περιφερικό τμήμα. Το κεντρικό τμήμα του νευρικού συστήματος ονομάζεται κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και αποτελείται από

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΣΤΟΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ. Ένα ταξίδι στις βασικές έννοιες βιολογίας...

ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΣΤΟΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ. Ένα ταξίδι στις βασικές έννοιες βιολογίας... ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΣΤΟΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ Ένα ταξίδι στις βασικές έννοιες βιολογίας... Κύτταρο Η βασική δομική και λειτουργική μονάδα που εκδηλώνει το φαινόμενο της ζωής. Πρώτος ο Βρετανός Robert Hooke το 1665 παρατηρώντας

Διαβάστε περισσότερα

ΙΪΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & Γενετικά Τροποποιημένα Κύτταρα

ΙΪΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & Γενετικά Τροποποιημένα Κύτταρα ΙΪΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & Γενετικά Τροποποιημένα Κύτταρα ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΙΩΝ 1. Οι ιοί είναι μικροοργανισμοί που προκαλούν ασθένειες σε ένα οργανισμό, μετά από μόλυνση των κυττάρων του 2. Είναι παρασιτικοί οργανισμοί

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Γ Γενικού Λυκείου Θετικής κατεύθυνσης. Κεφάλαιο 1α Το Γενετικό Υλικό

Βιολογία Γ Γενικού Λυκείου Θετικής κατεύθυνσης. Κεφάλαιο 1α Το Γενετικό Υλικό Βιολογία Γ Γενικού Λυκείου Θετικής κατεύθυνσης Κεφάλαιο 1α Το Γενετικό Υλικό Το DNA είναι το γενετικό υλικό Αρχικά οι επιστήμονες θεωρούσαν ότι οι πρωτεΐνες αποτελούσαν το γενετικό υλικό των οργανισμών.

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. δ Α4. β Α5. α 2 β 5 γ 6 δ 1 ε 3 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Διαβάστε περισσότερα

Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί. Ανιόντα (Κεντροµόλα) Δεµάτια

Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί. Ανιόντα (Κεντροµόλα) Δεµάτια Οι Κυριότερες Νευρικές Οδοί Ανιόντα (Κεντροµόλα) Δεµάτια φυσιολογικά δεµάτια (κατά τον επιµήκη άξονα) έχουν κοινή έκφυση πορεία απόληξη λειτουργία Κατιόντα (φυγόκεντρα) δεµάτια Ανιόντα (κεντροµόλα) δεµάτια

Διαβάστε περισσότερα

ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ Διακρίνονται σε: - Πρωτογενή και - Δευτερογενή Πρωτογενή είναι τα όργανα στα οποία γίνεται η ωρίμανση των κυττάρων του ανοσοποιητικού: - Θύμος

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΕΙ ΠΑΤΡΑΣ ΤΜΗΜΑ ΝΟΣΗΛΕΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑ I ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ : Γεράσιμος Π. Βανδώρος ΒΑΣΙΚΕΣ ΔΟΜΕΣ - ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ Οι βασικές δομές που εξετάζουμε στην ανατομία μπορούν ιεραρχικά να ταξινομηθούν ως εξής:

Διαβάστε περισσότερα

ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (STEM CELLS).

ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (STEM CELLS). ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (STEM CELLS). ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΣΤΕΦΑΝΙΔΗΣ Επικ. Καθηγητής Α ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ & ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΚΑΘ. Α. ΑΝΤΣΑΚΛΗΣ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ

Διαβάστε περισσότερα

Φύλλο Εργασίας 1. Δραστηριότητα 1. Χρόνος αντίδρασης Αφου παρακολουθείστε το video Εικόνα 1.

Φύλλο Εργασίας 1. Δραστηριότητα 1. Χρόνος αντίδρασης Αφου παρακολουθείστε το video Εικόνα 1. Φύλλο Εργασίας Φύλλο Εργασίας 1. Δραστηριότητα 1. Χρόνος αντίδρασης Αφου παρακολουθείστε το video Εικόνα 1. Επαναλάβετε την διαδικασία που είδατε με τον διπλανό σας στην ομάδα σας και προσπαθείστε να πιάσετε

Διαβάστε περισσότερα

Το μυϊκό σύστημα αποτελείται από τους μύες. Ο αριθμός των μυών του μυϊκού συστήματος ανέρχεται στους 637. Οι μύες είναι όργανα για τη σωματική

Το μυϊκό σύστημα αποτελείται από τους μύες. Ο αριθμός των μυών του μυϊκού συστήματος ανέρχεται στους 637. Οι μύες είναι όργανα για τη σωματική Μύες Το μυϊκό σύστημα αποτελείται από τους μύες. Ο αριθμός των μυών του μυϊκού συστήματος ανέρχεται στους 637. Οι μύες είναι όργανα για τη σωματική κινητικότητα, την σπλαχνική κινητικότητα και τη κυκλοφορία

Διαβάστε περισσότερα

Bιολογία γενικής παιδείας

Bιολογία γενικής παιδείας Bιολογία γενικής παιδείας Α1. 1. δ 2. α 3. β 4. δ ΘΕΜΑ Α Α2. ΟΛΑ ΚΑΠΟΙΑ Τοξίνες + Πλασματική μεμβράνη + Κυτταρικό τοίχωμα + Αποικίες + Κάψα + Πλασμίδια + Μαστίγια + Ριβοσώματα + Πυρηνοειδές + Ενδοσπόρια

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θέμα: ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΖΩΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ (άσκηση 4 του εργαστηριακού οδηγού) Μέσος χρόνος πειράματος: 45 λεπτά Α. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

Β. ΚΑΜΙΝΕΛΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα).

Β. ΚΑΜΙΝΕΛΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα). ΒΙΟΛΟΓΙΑ Είναι η επιστήμη που μελετά τους ζωντανούς οργανισμούς. (Αποτελούνται από ένα ή περισσότερα κύτταρα). Είδη οργανισμών Υπάρχουν δύο είδη οργανισμών: 1. Οι μονοκύτταροι, που ονομάζονται μικροοργανισμοί

Διαβάστε περισσότερα

Άγγελος Πάλλης Γ4 Γυμνασίου

Άγγελος Πάλλης Γ4 Γυμνασίου Άγγελος Πάλλης Γ4 Γυμνασίου Γυμνάσιο Κερατέας Ιανουάριος 2015 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Κεφάλαιο 1 ο : Τι είναι βλαστοκύτταρα; σελ. 3 Κεφάλαιο 2 ο : Είδη βλαστοκυττάρων σελ. 4 Κεφάλαιο 3 ο : Ύπαρξη βλαστοκυττάρων

Διαβάστε περισσότερα

ΓΡΑΠΤΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΑΪΟΥ - ΙΟΥΝΙΟΥ 2017

ΓΡΑΠΤΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΑΪΟΥ - ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 ΓΥΜΝΑΣΙΟ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣ ΣΧΟΛΙΚΗ ΧΡΟΝΙΑ 2016-2017 ΓΡΑΠΤΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΑΪΟΥ - ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΑΞΗ: Γ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 31/05 /2017 ΧΡΟΝΟΣ: 2 ΩΡΕΣ Βαθμός:.. Ολογράφως:.. Υπογραφή:.. ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ:

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ 1o ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ - ΓΗ_Α_ΒΙΟ_0_11207, 96ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ - ΓΗ_Α_ΒΙΟ_0_11303 Ι. Το σύστημα των ενδοκρινών αδένων είναι το ένα από τα δύο συστήματα του οργανισμού μας που συντονίζουν

Διαβάστε περισσότερα

Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Νευροεπιστήμες

Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Νευροεπιστήμες Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Νευροεπιστήμες Διπλωματική Εργασία «Μελέτη της επίδρασης της αποσιώπησης

Διαβάστε περισσότερα

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Καθώς η επιστημονική γνώση και κατανόηση αναπτύσσονται, ο μελλοντικός σχεδιασμός βιοτεχνολογικών προϊόντων περιορίζεται μόνο από τη φαντασία μας Βιοτεχνολογία

Διαβάστε περισσότερα

ΡΑΧΗ ΠΑΥΛΟΣ Γ. ΚΑΤΩΝΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΚΡΗΤΗΣ

ΡΑΧΗ ΠΑΥΛΟΣ Γ. ΚΑΤΩΝΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΚΡΗΤΗΣ ΡΑΧΗ ΠΑΥΛΟΣ Γ. ΚΑΤΩΝΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΚΡΗΤΗΣ ΡΑΧΗ Αποτελεί τον μυοσκελετικό άξονα στήριξης του κορμού με κύριο οστικό στοιχείο τους σπονδύλους και την παράλληλη συμβολή

Διαβάστε περισσότερα

Οπτική οδός. Έξω γονατώδες σώµα. Οπτική ακτινοβολία

Οπτική οδός. Έξω γονατώδες σώµα. Οπτική ακτινοβολία Όραση Γ Όραση Οπτική οδός Έξω γονατώδες σώµα Οπτική ακτινοβολία Οπτικό χίασµα: Οι ίνες από το ρινικό ηµιµόριο περνούν στην αντίπλευρη οπτική οδό ενώ τα κροταφικά ηµιµόρια δεν χιάζονται. Εποµένως κάθε οπτική

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 1: Βασικές αρχές ανατοµίας και οργάνωσης του νευρικού συστήµατος

Κεφάλαιο 1: Βασικές αρχές ανατοµίας και οργάνωσης του νευρικού συστήµατος Κεφάλαιο 1: Βασικές αρχές ανατοµίας και οργάνωσης του νευρικού συστήµατος Περίληψη Σε αυτό το πρώτο κεφάλαιο, θα παρουσιαστεί η βασική οργάνωση του νευρικού συστήµατος, δηλαδή ο διαχωρισµός σε κεντρικό

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑΣ ΖΑΡΦΤΖΙΑΝ Μ. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ - ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1. Διαφορές κλειστής και συνεχούς καλλιέργειας (θρεπτικά, απομάκρυνση, φάσεις μικροοργανισμών)

Διαβάστε περισσότερα

Επαγωγή και Οργάνωση του ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

Επαγωγή και Οργάνωση του ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Επαγωγή και Οργάνωση του ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΝΕΥΡΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ Το ανθρώπινο σώμα έχει 10x10 9 νευρώνες διαφόρων τύπων Κάθε νευρώνας Κάθε νευρώνας μπορεί να συμμετέχει σε 1.000 10.000 συνάψεις μέχρι και με

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 9ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ

ΜΑΘΗΜΑ 9ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΑΘΗΜΑ 9ο ΜΕΡΟΣ Α Η ΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Η ΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Ο εγκέφαλος αρδεύεται από : 1. Τις δύο έσω καρωτίδες και τους κλάδους τους 2. Τις δύο σπονδυλικές αρτηρίες και τους κλάδους τους Οι τέσσερις

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Β ΔΙΑΒΙΒΑΣΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΜΥΪΚΗ ΣΥΝΑΨΗ

ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Β ΔΙΑΒΙΒΑΣΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΜΥΪΚΗ ΣΥΝΑΨΗ ΜΑΘΗΜΑ 3ο ΜΕΡΟΣ Β ΔΙΑΒΙΒΑΣΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΜΥΪΚΗ ΣΥΝΑΨΗ Η νευρομυϊκή σύναψη αποτελεί ιδιαίτερη μορφή σύναψης μεταξύ του κινητικού νευρώνα και της σκελετικής μυϊκής ίνας Είναι ορατή με το οπτικό μικροσκόπιο Στην

Διαβάστε περισσότερα

Στέφανος Πατεράκης (Φυσικ/τής)

Στέφανος Πατεράκης (Φυσικ/τής) ΜΥΣ Οι μύες είναι όργανα του ανθρωπίνου σώματος. Σχηματίζονται από μυϊκό ιστό. Μαζί με τους τένοντες συμβάλουν στην κίνηση των οστών. Είδη των μυών Ο μυς της καρδιάς, Οι λείοι, και Οι γραμμωτοί. Ο μυς

Διαβάστε περισσότερα