ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Συστηματικοί δείκτες φλεγμονής σε περιοδοντικούς ασθενείς. Συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους και μικροβιολογικά ευρήματα μετά την εφαρμογή της αρχικής αιτιολογικής θεραπείας. Παναγιώτης Δ. Χατζησάββας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Οδοντιατρική Σχολή Εργαστήριο Προληπτικής Οδοντιατρικής Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων Θεσσαλονίκη 2006

2 Επιβλέπων Καθηγητής Α. Κωνσταντινίδης Διευθυντής Εργαστηρίου Προληπτικής Οδοντιατρικής, Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων

3 στους γονείς μου

4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη σελ. 1 Εισαγωγή..σελ. 2 Υλικά και μέθοδοι. σελ. 8 Αποτελέσματα. σελ. 15 Συζήτηση... σελ. 18 Βιβλιογραφία..σελ. 25 Ευχαριστίες.σελ. 33 Παράρτημα Ι (Πίνακες) σελ. 34 Παράρτημα ΙΙ (Εικόνες) σελ. 42

6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Πρόσφατα ευρήματα συνδέουν την περιοδοντική φλεγμονή με συστηματικές παθήσεις είτε μέσω λοιμογόνων χαρακτηριστικών του υποουλικού βιοϋμενίου είτε μέσω της επίδρασής της στην ανοσολογική απόκριση. ΣΚΟΠΟΣ: Η μελέτη της μεταβολής ανοσολογικών παραμέτρων στον ορό και η συσχέτιση με κλινικά και μικροβιολογικά ευρήματα. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Από είκοσι συστηματικά υγιή άτομα με χρόνια περιοδοντίτιδα έγινε λήψη υποουλικών μικροβιακών δειγμάτων και ορού πριν και έξι εβδομάδες μετά την αρχική αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας. Η τεχνική μοριακής βιολογίας «Checkerboard» DNA-DNA hybridization χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των P. gingivalis, T. forsythia και T. denticola, η τεχνική ανοσοαποτύπωσης «Checkerboard» Immunoblotting για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ΜΜP-8, IL-8, IL-1β, TNFα και IL-6 και νεφελομετρία για την CRP. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Μόνο η ΜΜP-8 παρουσίασε στατιστικά σημαντική μείωση (Wilcoxon signed ranks test, p<0.05) μετά τη θεραπεία. Οι IL-1β και TNFα εμφάνισαν σταθερή συνεχή συσχέτιση μεταξύ τους και με τα μικροβιολογικά ευρήματα πριν τη θεραπεία (Spearman s rank test, p< 0.05). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η περιοδοντική θεραπεία δεν επηρέασε τα επίπεδα των μεσολαβητών φλεγμονής στον ορό. Ωστόσο, μόρια- δείκτες ιστικής καταστροφής, όπως η MMP-8, μπορεί να χρησιμεύουν στη σύνδεση της περιοδοντικής φλεγμονής με συστηματικές επιδράσεις

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η περιοδοντική νόσος αποτελεί μια χρόνια φλεγμονώδη διαδικασία που προκύπτει ως απάντηση στη λοίμωξη από κυρίως Gram- αρνητικά βακτήρια που προέρχονται από το υποουλικό βιοϋμένιο. Τα κλινικά σημεία της νόσου περιλαμβάνουν φλεγμονή των ούλων, δημιουργία περιοδοντικών θυλάκων που προάγουν την ανάπτυξη αναερόβιων βακτηρίων και κατά συνέπεια εξέλκωση του επιθηλίου και καταστροφή του συνδετικού ιστού των ούλων, του περιρριζίου και του οστού που στο σύνολο τους αποτελούν τη στηρικτική συσκευή των δοντιών στη γνάθο. Ενώ ο αιτιολογικός ρόλος των βακτηρίων είχε από πολύ νωρίς ισχυρά τεκμηριωθεί in vitro και in vivo, η ολοκληρωμένη εικόνα της αιτιοπαθογένειας προήλθε από τη διαπίστωση της συμμετοχής της ανοσολογικής απάντησης στη διαμόρφωση της τελικής παθολογικής διαδικασίας (Page, 1995, Offenbacher, 1996). Την τελευταία δεκαετία αυξανόμενο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι αναφορές για τυχόν συστηματικές επιπλοκές χρόνιων και οξέων λοιμώξεων. Κοινά παθογόνα (π.χ Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Cytomegalovirus) έχουν συσχετιστεί με αθηροσκλήρωση και καρδιαγγειακές παθήσεις και η αντιμετώπισή τους φαίνεται να αποδίδει σημαντικά οφέλη στην πρόληψη σοβαρών συστηματικών προβλημάτων (Epstein και συν., 2000, Shah και συν., 2002). Παρότι ανεπαρκείς αποδείξεις υπάρχουν για τον ακριβή μηχανισμό, ένα ενδιαφέρον αν και υποθετικό μοντέλο βασίζεται στην αυξημένη συστηματική ανοσολογική απάντηση που προέρχεται από χρόνιες χαμηλής έντασης τοπικές λοιμώξεις (Libby και συν., 2002). Η περιοδοντίτιδα αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα χαμηλής έντασης χρόνιας φλεγμονής με μέτρια συστηματική ανοσιακή απάντηση. Ασθενείς με προχωρημένη νόσο εμφανίζουν διαταραχές στη συστηματική τους ομοιόσταση (Ebersole & Cappelli, 2000). Η θεωρητική κάλυψη του φαινόμενου εύκολα εξάγεται από την ίδια την παθογένεια της νόσου. Το φλεγμαίνον και εξελκωμένο επιθήλιο, το οποίο σε περιπτώσεις μη θεραπευμένης βαριάς μορφής περιοδοντίτιδας μπορεί να καταλαμβάνει μέχρι την, αρκετά σημαντική, έκταση των 44 cm 2 (Hujoel και συν., 2001), αποτελεί θύρα εισόδου στη κυκλοφορία βακτηρίων της μικροβιακής πλάκας. Η βακτηριαιμία στην περιοδοντίτιδα, ακόμα - 2 -

9 και μετά από απλή εξέταση, είναι παραδεκτή (Daly και συν., 2001), ενώ περιοπαθογόνα έχουν ανιχνευθεί και σε αθηρωματικές πλάκες (Harazthy και συν., 2000). Επιπρόσθετα, βακτηριακά συστατικά όπως πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος και ενδοτοξίνες, μπορούν να διασπαρθούν μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας (Geerts και συν., 2002). Σε απάντηση στη βακτηριαιμία και στα βακτηριακά αντιγόνα, αμυντικά κύτταρα όπως και κυτταρικά στοιχεία στους ιστούς- στόχους των αντιγόνων, μπορούν να παράγουν μεσολαβητές της φλεγμονής. Εξάλλου, και τοπικά παραγόμενοι ανοσιακοί παράγοντες όπως ιντερλευκίνη 1β (IL-1β), o παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α (TNF-α),η ιντερλευκίνη 6 (IL- 6), η ιντερλευκίνη 8 (IL- 8) μπορούν να εισέλθουν στην κυκλοφορία και να έχουν συστηματική δράση είτε άμεσα είτε μέσω επαγωγής της παραγωγής στοιχείων οξείας φάσης, όπως η C- αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), (Gemmel και συν., 1997, Kornman και συν., 1997). Κατά συνέπεια, η περιοδοντίτιδα έχει προταθεί ως έχουσα συνεργικά αιτιολογικό ή ρυθμιστικό ρόλο σε καρδιαγγειακές και εγκεφαλοαγγειακές παθήσεις (Mattilla και συν., 1989, Beck και συν.,1996, Morrison και συν., 1999, Wu και συν., 2000a), στο σακχαρώδη διαβήτη (Grossi & Genco 1998), σε αναπνευστικές παθήσεις (Hayes και συν., 1998) καθώς και σε επιπλοκές εγκυμοσύνης (Offenbacher και συν., 1996). Ωστόσο, υπάρχουν ακόμα σημαντικά ερωτηματικά όσον αφορά τη φύση και το βαθμό στον οποίο η επίδραση αυτή συμβαίνει (Joshipura και συν., 1996, Hujoel και συν., 2000, 2001a,b, Mattila και συν., 2000, Howel και συν.,2001). Στην προσπάθεια να διευκρινιστούν οι μηχανισμοί αλληλεπίδρασης και να θεμελιωθούν οι παραπάνω θεωρίες, επιχειρήθηκε η σύγκριση των επιπέδων ανοσιακών παραγόντων μεταξύ περιοδοντικά ασθενών και υγιών μαρτύρων. Ο μεγαλύτερος όγκος διασταυρωμένων ερευνών αφορά στα επίπεδα στον ορό της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP). Η CRP αποτελεί μια πρωτεΐνη οξείας φάσης με κύρια παραγωγή από τα ηπατοκύτταρα υπό την επίδραση διαφόρων κυτταροκινών και κυρίως της IL-6. H επιλογή της ως κύρια ουσία μελέτης οφείλεται στο ότι αυξημένα επίπεδα της (αν και κυμαινόμενα σε φυσιολογικό εύρος τιμών) θεωρούνται ως προγνωστικής αξίας για τη μελλοντική εμφάνιση καρδιαγγειακών παθήσεων (Libby και συν., 2002, Pearson και συν., 2003). Από τις πρώτες αναφορές διαπιστώθηκε η ύπαρξη αυξημένων επιπέδων CRP σε περιοδοντικούς ασθενείς σε σχέση με υγιείς καθώς και η συσχέτισή τους - 3 -

10 με την εξέλιξη της νόσου, όπως χαρακτηρίστηκε από τη συνεχιζόμενη απώλεια πρόσφυσης (Ebersole και συν., 1997). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από δύο Σουηδικές μελέτες αν και οι τιμές της CRP στους περιοδοντικά ασθενείς εμφανίζονται πολύ χαμηλότερες (Fredriksson και συν., 1999, Buhlin και συν., 2003). Η προσπάθεια, όμως, συσχέτισης με τη βαρύτητα της νόσου παρουσιάζει αντικρουόμενα αποτελέσματα καθώς οι Loos και συν., (2000) αναφέρουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ γενικευμένης και εντοπισμένης μορφής περιοδοντίτιδας, οι Craig και συν., (2003) συσχετίζουν τον αριθμό των περιοδοντικών βλαβών με τα επίπεδα της CRP ενώ οι Bizzarro και συν., (2005) δεν καταλήγουν σε στατιστικές διαφορές μεταξύ μέτριας και βαριάς μορφής της νόσου. Επιπλέον, υψηλά επίπεδα της CRP φαίνεται να συσχετίζονται με την αυξημένη παρουσία περιοπαθογόνων βακτηρίων στην υποουλική πλάκα (Noack και συν., 2001, Glurich και συν., 2002), ενώ μελέτη σε αντρικό πληθυσμό αναφέρει ισχυρή συσχέτιση της απώλειας φατνιακού οστού και των τιμών της CRP στον ορό (Saito και συν., 2003). Η ύπαρξη υψηλότερων μέσων τιμών της CRP σε περιοδοντικούς ασθενείς σε σχέση με υγιείς επιβεβαιώνεται, τέλος, και από μεγάλες επιδημιολογικές μελέτες στις Η.Π.Α (Slade και συν., 2000, Wu και συν., 2000) και στην Ιαπωνία (Wakai και συν., 1999, Takami και συν., 2003). Περιορισμένος αριθμός ερευνών αναφέρονται στα επίπεδα κυτταροκινών στο πλάσμα περιοδοντικών ασθενών και με μικρή ομοιογένεια αποτελεσμάτων. Οι Loos και συν., (2000) παρουσιάζουν υψηλότερα ποσοστά μετρήσιμης συγκέντρωσης IL-6 σε ασθενείς με χρόνια περιοδοντίτιδα σε σχέση με περιοδοντικά υγιείς, που μάλιστα εμφανίζει θετική συσχέτιση με την έκταση της νόσου. Παρόμοια, στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αναφέρουν και οι Buhlin και συν., (2003) σε ασθενείς με βαριάς μορφής χρόνια περιοδοντίτιδα σε σχέση με υγιείς μάρτυρες. Αντίθετα, στη μελέτη των Mengel και συν., (2002) οι ασθενείς με χρόνια περιοδοντίτιδα δεν εμφανίζουν διαφορές στα επίπεδα της IL-6 από τους υγιείς, ενώ στις περιπτώσεις με γενικευμένη επιθετική περιοδοντίτιδα υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά που συσχετίζεται με την έκταση της απώλειας πρόσφυσης. Στην ίδια μελέτη, τα επίπεδα IL-1β ήταν μετρήσιμα μόνο στα μισά από τα περιστατικά με επιθετική περιοδοντίτιδα και όχι σε αυτά με χρόνια. Επίσης, οι Yamazaki και συν., (2000) δεν παρατηρούν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις οριακές συγκεντρώσεις που ανιχνεύονται σε ασθενείς με χρόνια περιοδοντίτιδα για την IL-6 σε σύγκριση με υγιή περιοδοντικά άτομα - 4 -

11 αλλά ούτε για τον TNF-α, παρατήρηση που συμπίπτει με παλιότερη έρευνα ασθενών- μαρτύρων στην οποία τα επίπεδα του TNF-α δε διέφεραν μεταξύ των δύο ομάδων και δε συσχετίζονταν με καμία περιοδοντολογική κλινική παράμετρο (Meyle και συν., 1993). Εξαιτίας της μεγάλης πληθώρας παραγόντων που επενεργούν στη συστηματική εμφάνιση αυξημένων επιπέδων ανοσιακών μορίων, οι παραπάνω μελέτες ασθενών- μαρτύρων δεν κρίνονται ιδανικές για την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων όσον αφορά την εμπλοκή της περιοδοντικής νόσου. Ενισχυτικό της υπόθεση ότι η συστηματική αύξηση των παραγόντων αυτών οφείλεται στην περιοδοντική φλεγμονή, θα ήταν η μείωσή τους μετά την εφαρμογή περιοδοντικής θεραπείας (Mattila και συν., 2005). Τα αποτελέσματα, όμως, στις προοπτικές μελέτες παρέμβασης που μέχρι σήμερα έχουν διενεργηθεί εμφανίζονται αντικρουόμενα. Πρώτοι οι Ebersole και συν., (1997) σε μακροχρόνια μελέτη δύο ετών δεν παρατηρούν μείωση στα επίπεδα της CRP μετά τη μηχανική θεραπεία αλλά μόνο με τη συμπληρωματική χορήγηση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων και μάλιστα με τη μεγαλύτερη από τις μελετούμενες δόσεις (50, 15, 5 mg/ ημέρα). Αντίθετα οι Mattila και συν., (2002) αναφέρουν στατιστικά σημαντική μείωση στα επίπεδα της CRP μετά την αρχική φάση της θεραπείας, τόσο σε ασθενείς με μέτρια όσο και με βαριά μορφή περιοδοντίτιδας, η οποία φτάνει στο 50 % των αρχικών επιπέδων όταν η τιμή της CRP είναι μεγαλύτερη από 2mg/ l. Μελετώντας, τόσο τη μεταβολή της CRP όσο και τριών σημαντικών κυτταροκινών (IL-1, IL-6, TNF-α), οι Ide και συν., (2003) δεν μπόρεσαν να αποδείξουν στατιστικά σημαντική μεταβολή τους, έξι εβδομάδες μετά τη συντηρητική περιοδοντική θεραπεία, Ωστόσο, σε επανέλεγχο στους έξι μήνες οι D Aiuto και συν., (2003) πέτυχαν στατιστικά σημαντικά μείωση στα επίπεδα των μελετώμενων CRP και IL-6. Η ίδια ερευνητική ομάδα σε μετέπειτα μελέτη αξιολογεί την επίδραση της συντηρητικής θεραπείας με ή χωρίς τη συμπληρωματική τοπική χορήγηση αντιμικροβιακών (υδροχλωρική μινοκυκλίνη). Ενώ για τη CRP και οι δυο μορφές θεραπείας οδηγούν σε μείωση των επιπέδων της σε καπνιστές και μη, οι τιμές της IL-6 στους καπνιστές εμφανίζουν στατιστικά σημαντική μείωση μόνο με τη συνδυασμένη μηχανική και αντιμικροβιακή θεραπεία (D Aiuto και συν., 2005). Ανάλογα αποτελέσματα εμφανίζει και η έρευνα των Iwamoto και συν., (2003) για τις μεταβολές των CRP και IL-6 μετά από - 5 -

12 συνδυασμένη μηχανική και αντιμικροβιακή θεραπεία, σε δείγμα όμως περιοδοντικά ασθενών με επιβαρυντικούς συστηματικούς παράγοντες (πίεση, διαβήτη). Ωστόσο, οι Yamazaki και συν., (2005) εφαρμόζοντας πλήρη περιοδοντική θεραπεία (αρχική αιτιολογική και επανορθωτική φάση- χειρουργεία) δεν παρατήρησαν στατιστικά σημαντικές μεταβολές των επίπεδων της CRP, της IL-6 και του TNF-α στον ορό συστηματικά υγιών περιοδοντικών ασθενών. Τέλος, μόνο μία κλινική έρευνα σε ασθενείς με ταχέως εξελισσόμενη περιοδοντίτιδα αναφέρει υψηλά επίπεδα IL- 8, τα οποία ομαλοποιούνται μετά τη θεραπεία (Gainet και συν., 1998), ενώ σε in vitro μελέτη η παραγωγή της IL-8 από πολυμορφοπύρηνα φαίνεται να επηρεάζεται περισσότερο από το αν τα κύτταρα προέρχονται από καπνιστές πάρα από περιοδοντικούς ασθενείς (Fredriksson και συν., 2002). Έχει αναφερθεί ότι η περιοδοντική καταστροφή χαρακτηρίζεται από υπερβολική ανοσιακή απάντηση. Ένας από τους τρόπους με τους οποίους ο ξενιστής συμμετέχει στην ιστική καταστροφή είναι με την παραγωγή πρωτεασών που αποδομούν τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως οι μεταλλοπρωτεινάσες (MMP s). Ιδιαίτερα η παραγόμενη από τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα κολλαγενάση- 2 (MMP-8) έχει βρεθεί να σχετίζεται με έντονη φλεγμονή, βαθείς θυλάκους και μεγάλης έκτασης οστική απώλεια ενώ τα επίπεδά της στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής ελαττώνονται μετά την εφαρμογή κατάλληλης περιοδοντικής θεραπείας (Uitto και συν., 2003). Έχει ακόμα βρεθεί συσχέτιση της παρουσίας της MMP-8 στο σάλιο και στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής, ως αποτέλεσμα της διασποράς πολυμορφοπύρηνων ουδετερόφιλών από το τελευταίο (Sorsa και συν., 2004). Αυξημένα επίπεδα MMP-8 αναφέρονται και στη γενική κυκλοφορία (πλάσμα) σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα και οστεοαρθρίτιδα σε σχέση με υγιείς, τα οποία σχετίζονται με τα τοπικά επίπεδα της μετταλοπρωτεϊνάσης στο υγρό του αρθρικού θυλάκου (Tchetverikov και συν., 2004). Λόγω της κολλαγονολυτικής της δράσης η MMP-8 συνδέεται με ρήξη ασταθών αθηρωματικών πλακών (Molloy και συν., 2004), ενώ αυξημένες τιμές, επίσης συστηματικά, παρατηρούνται σε ασυμπτωματικούς ασθενείς με δημιουργία καρωτιδικών πλακών σε εξέλιξη σε σχέση με υγιείς μάρτυρες (Turu και συν., 2006). Παράλληλα, σε πρόσφατη μελέτη, η ζελατινάση MMP-9, η οποία έχει κοινή προέλευση με την MMP-8, εμφανίζεται σε υψηλότερα επίπεδα στον ορό ασθενών με περιοδοντίτιδα και συσχετίζεται με υπουλική ανίχνευση του κύριου - 6 -

13 περιοπαθογόνου P. gingivalis (Soder και συν., 2006). Τα στοιχεία αυτά επιτρέπουν την υπόθεση για παρουσία αυξημένων επιπέδων στον ορό της MMP- 8 και σε ασθενείς με περιοδοντική νόσο. ΣΚΟΠΟΣ της παρούσας προοπτικής μελέτης παρέμβασης, είναι η διερεύνηση των μεταβολών που μπορεί να επιφέρει η αρχική, αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας στα επίπεδα που έχουν στη συστηματική κυκλοφορία δείκτες της φλεγμονής όπως η πρωτεΐνη οξείας φάσης CRP και οι κυτταροκίνες IL-1β, IL-6, IL-8 και TNF-α καθώς και η πρωτεάση MMP- 8. Παράλληλα, ελέγχεται η ύπαρξη συσχέτισης των παραπάνω μορίων με τα κατεξοχήν περιοπαθογόνα αναερόβια βακτήρια του ερυθρού συμπλέγματος P. gingivalis, T. forsythia και T. denticola

14 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πληθυσμός μελέτης Η έρευνα εγκρίθηκε από τη Επιτροπή Δεοντολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης σύμφωνα με τις αρχές του κανονισμού δεοντολογίας της Επιτροπής Ερευνών του Α. Π. Θ, σχετικά με τις τυποποιημένες πρακτικές για Βιολογικές Έρευνες σε ανθρώπους. Ασθενείς που προσήλθαν στην μεταπτυχιακή κλινική του Εργαστηρίου Προληπτικής Οδοντιατρικής, Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων για θεραπεία περιοδοντικής νόσου, συμμετείχαν στην έρευνα μετά από γραπτή συγκατάθεσή τους. Οι ασθενείς έπρεπε να εμφανίζουν Χρόνια Γενικευμένη Περιοδοντίτιδα, διαγνωσμένη με κλινικά και ακτινογραφικά κριτήρια σύμφωνα με την τελευταία ταξινόμηση (Armitage 1999), να μην έχουν δεχθεί καμιάς μορφής περιοδοντική θεραπεία κατά τον τελευταίο χρόνο και να μην έχουν λάβει αντιμικροβιακή θεραπεία κατά το τελευταίο εξάμηνο. Επίσης, ασθενείς που έπασχαν από καρδιαγγειακές νόσους, σακχαρώδη διαβήτη, χρόνιες φλεγμονώδεις ή ανοσολογικές παθήσεις όπως αρθρίτιδα, γαστροεντερικές διαταραχές, βρογχίτιδες και άλλες χρόνιες λοιμώξεις του αναπνευστικού ή βρίσκονταν υπό συστηματική θεραπεία με αντι-φλεγμονώδη, κορτικοστεροειδή ή ανοσοκατασταλτικά κατά το τελευταίο εξάμηνο, δε συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Ο πληθυσμός μελέτης αποτελούνταν τελικά από 23 περιοδοντικούς ασθενείς. Κλινικές Διαδικασίες και Δειγματοληψία Κατά την πρώτη συνεδρία πραγματοποιήθηκε η λήψη γενικού ιατρικού και οδοντιατρικού ιστορικού που περιλάμβανε ερωτήσεις αναφορικά με τις προαναφερθείσες παθολογικές καταστάσεις, φαρμακευτικές αγωγές και οδοντιατρικές θεραπείες. Επίσης σημειώθηκε η κατανάλωση αλκοόλ και ο αριθμός των τσιγάρων σε περίπτωση καπνίσματος. Ακολούθησε καταγραφή των κλινικών δεικτών σε όλο το φραγμό, στους οποίους περιλαμβάνονταν το βάθος θυλάκου (PD), η υφίζηση (REC), η απώλεια πρόσφυσης (PAL), η αιμορραγία κατά την ανίχνευση (BOP) και η παρουσία ή απουσία της πλάκας. Οι μετρήσεις - 8 -

15 αφορούσαν 6 θέσεις σε κάθε δόντι εγγύς-παρειακά, παρειακά, άπω- παρειακά, εγγύς- γλωσσικά, γλωσσικά και άπω- γλωσσικά, πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση περιοδοντικής μήλης CP 11 (Hu-Friedy, USA). Στην ίδια συνεδρία ακολούθησε ακτινογραφικός έλεγχος, ετέθη η διάγνωση και αποφασίστηκε η συμμετοχή ή μη του ασθενή στην έρευνα. Μετά από διάστημα μιας εβδομάδας έγινε λήψη υποουλικής πλάκας. Μετά την απομάκρυνση της υπερουλικής πλάκας και τρυγίας, ακολούθησε απομόνωση του πεδίου με τολύπια βάμβακος και στέγνωμα με ριπή αέρος από αεροσύριγγα. Η λήψη υποουλικής πλάκας έγινε με αποστειρωμένα κοχλιάρια από εννιά προεπιλεγμένες θέσεις: τρεις με βάθος θυλάκου από 1-3 χιλ., τρεις με βάθος θυλάκου από 4-6 χιλ και τρεις με βάθος θυλάκου μεγαλύτερο από 6 χιλ. Το υλικό τοποθετήθηκε σε αποστειρωμένα, ελεύθερα δεσοξυριβουνοκλεασών και ριβουνοκλεασών φιαλίδια μικροφυγοκέντρησης που περιείχαν 200 uls ΤΕ και μετά την προσθήκη 200 uls NaOH, αποθηκεύτηκαν στους -20 C μέχρι την επεξεργασία τους. Στον ίδιο χρόνο πραγματοποιήθηκε και λήψη 10 ml περιφερικού αίματος σε σωληνίσκους χωρίς ηπαρίνη. Διαχωρίστηκε ο ορός με φυγοκέντρηση στα 1600g για 20min και αποθηκεύτηκε στους 80 C. Από τη δεύτερη συνεδρία ξεκίνησε η εφαρμογή της αρχικής, αιτιολογικής φάσης της περιοδοντικής θεραπείας που περιλάμβανε ενεργοποίηση στις διαδικασίες στοματικής υγιεινής (εκπαίδευση στο βούρτσισμα με τη μέθοδο Bass και στη χρήση μεσοδοντίων μέσων καθαρισμού) και υπερουλική- υπουλική αποτρύγωση με χρήση υπερήχων και εργαλείων χειρός υπό τοπική αναισθησία χωρίς χρονικούς περιορισμούς για κάθε συνεδρία. Μετά από 6 με 8 εβδομάδες από το πέρας της θεραπείας οι ασθενείς προσήλθαν για επανέλεγχο. Στη συνεδρία αυτή πραγματοποιήθηκαν λήψη περιφερικού αίματος, λήψη υποουλικής πλάκας από τις ίδιες θέσεις και καταγραφή των κλινικών δεικτών με τον ίδιο τρόπο και από τον ίδιο εξεταστή, όπως και οι αρχικές δειγματοληψίες και καταγραφές. Προσδιορισμός C- αντιδρώσας πρωτεΐνης Μετά από επαναφορά σε θερμοκρασία δωματίου, 300 μl από τον ορό χρειάστηκαν για τον προσδιορισμό της CRP με τη χρήση σωματιδίων λατέξ επικαλυμμένων με μονοκλωνικά αντί CRP αντισώματα. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης προσδιορίστηκε νεφελομετρικά στα 552nm σε αναλυτή Cobas Integra - 9 -

16 400. (Roche AG Diagnostics, Mannheim, Germany). Η τεχνική αυτή θεωρείται υψηλής ευαισθησίας (hs-crp), με χαμηλότερο όριο ανίχνευσης τα 0,085mg/ l και με επίπεδο διακύμανσης τιμών στον ίδιο κύκλο ανάλυσης μικρότερο του 1,8%. Μικροβιολογική ανάλυση με την τεχνική μοριακής βιολογίας «Checkerboard» DNA-DNA hybridization (Socransky και συν., 1994) Έπειτα από την επαναφορά τους σε θερμοκρασία δωματίου, τα μικροβιακά δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά έτσι ώστε να σπάσουν οι διπλές έλικες του DNA και προστέθηκαν 600 μl οξικού αμμωνίου 5Μ. Από το σύνολο των 1000 uιs, μετά από ανάδευση, μεταφέρθηκαν με πιπέτα τα 500 uιs στα ανοιχτά παράλληλα κανάλια υβριδισμού της συσκευής Minislot-60 (Immunetics, Cambridge, Mass), στην οποία είχε προηγουμένως τοποθετηθεί η θετικά φορτισμένη νάιλον μεμβράνη δέσμευσης νουκλεïκού οξέος (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN, USA). Το διάλυμα απορροφήθηκε από τη μεμβράνη και το νουκλεïκό οξύ (DNA) δεσμεύτηκε και μονιμοποιήθηκε στη μεμβράνη μετά από την επώασή της σε ξηρό κλίβανο στους 120 ºC για 30 λεπτά. Μετά τη μονιμοποίηση του DNA, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα 20xSSC (1x = 0,15M NaCl, 0,015M κιτρικό νάτριο, ph 7,0) για 5 λεπτά. Ο προϋβριδισμός της μεμβράνης έγινε στους 42ºC για 1 ώρα, σε διάλυμα προϋβριδισμού 50 uls που αποτελείται από 50% φορμαμίδη, 25% 20xSSC, 25% αποσταγμένο νερό, 0,5% w/v SDS, 0,1% w/v Lauryl Sulfate και 0,5% w/v καζεΐνη. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε στη συσκευή Miniblotter-45 (Immunnetics, Cambridge, Mass), που έχει κλειστά κάθετα κανάλια υβριδισμού. Ανιχνευτές DNA από ολόκληρο το χρωμόσωμα του βακτηρίου (whole genomic DNA probes), σεσημασμένοι με διγοξιγενίνη, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των μικροβιακών στελεχών. Κάθε ανιχνευτής τοποθετήθηκε σε διάλυμα υβριδισμού (διάλυμα προϋβριδισμού και 10% w/v dextran sulfate) σε αραίωση τέτοια, ώστε να επιτυγχάνεται συγκέντρωση DNA 20 μg/ ml και ακολούθησε έγχυση σε συγκεκριμένα κανάλια της συσκευής σε ποσότητα 170 uls. Όλο το σύστημα περιβλήθηκε με διαφανή μεμβράνη και τοποθετήθηκε σε σακούλα (Ziploc ), η οποία ασφαλίζεται, αφού πρώτα εμποτισμένο με λίγες σταγόνες νερού χαρτί χρησιμοποιήθηκε για να αποτραπεί η εξάτμιση από τα κανάλια. Ο υβριδισμός των μεμβρανών έγινε σε κινούμενο υδατόλουτρο στις 60 στροφές ανά λεπτό (rpm) και στους 42 ºC για περίοδο μιας νύχτας. Ακολούθησαν

17 4 δεκάλεπτες πλύσεις της μεμβράνης με ταχύτητα 60 rpm στο κινούμενο υδατόλουτρο στους 65ºC με διάλυμα Η 3 ΡΟ 4 (SDS 1%, 1mM EDTA, 20mM Na 2 HPO 4 ) για να απομακρυνθούν οι ανιχνευτές που είναι χαλαρά δεσμευμένοι. Για να αποφευχθεί η μη ειδική σύνδεση, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα μαλεϊκού οξέος με 1% καζεΐνη (100 mm μαλεϊκό οξύ, 150 mm NaCl, ph 7.5) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανίχνευση του συμπλέγματος βακτηρίουανιχνευτή με χημειοφωταύγεια έγινε μετά από επώαση με το παραπάνω διάλυμα μαλεïκού οξέος και αντί-διγοξιγενίνη σεσημασμένη με αλκαλική φωσφατάση σε αραίωση 1: για 30 λεπτά σε κινούμενο αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη εκπλύθηκε με διάλυμα μαλεϊκού οξέος (100 mm μαλεϊκό οξύ, 150 mm NaCl, ph 7.5) και τοποθετήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (100 mm Tris- HCl, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2, ph 9,5) για 5 λεπτά. Στη συνέχεια επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37ºC σε υπόστρωμα χημειοφωταύγειας CSPD (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN, USA) και εκτέθηκε σε αυτοραδιογραφούμενο ακτινογραφικό φιλμ. H αξιολόγηση του αριθμού των βακτηρίων στο κλινικό δείγμα έγινε με τη χρήση ειδικού λογισμικού που επιτρέπει μετά από δημιουργία καμπύλης αναφοράς την ποσοτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων και την αναφορά τους σε απόλυτους αριθμούς βακτηρίων (TotalLab 100 v.2005, Nonlinear Dynamics Inc.) Προσδιορισμός ανοσολογικών δεικτών με την τεχνική ανοσοαποτύπωσης «Checkerboard» Immunoblotting Επώαση των μονοκλωνικών αντισωμάτων, των αντιγόνων αναφοράς και των δειγμάτων σε μεμβράνες PVDF: Οι υδρόφοβες μεμβράνες υβριδισμού από PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciencences, Arlington Heights, IL) προϋγράνθηκαν σε μεθανόλη, εκπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και αφού εμβαπτίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης (coating buffer, 15mM ανθρακικό νάτριο, 35 mμ διττανθρακικό νάτριο, ph 9,6) για 10 λεπτά τοποθετήθηκαν στη συσκευή Miniblotter-60 (Immunetics, Cambridge, MΑ). Οι μεμβράνες επιστρώθηκαν με μείγμα μονοκλωνικών αντί-ανθρώπειων αντισωμάτων για τις IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, και MMP-8 (RnD Systems, Minneapolis, MN). Προκειμένου να δημιουργηθεί μια τυπική καμπύλη αναφοράς- σύγκρισης της έντασης των σημάτων με τα προς

18 μελέτη δείγματα, μίγμα από ανασυνδυασμένες ανθρώπινες IL-1β, TNFα, IL-6, IL- 8, και MMP-8 (RnD Systems, Minneapolis, MN), αραιώθηκάν διαδοχικά σε πέντε υποδιπλάσιες αραιώσεις με PBST. Το εύρος των αραιώσεων αντιστοιχεί σε pg, pg, pg, pg, 3, ng για τις IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, και MMP-8, αντίστοιχα. Το εύρος αυτό στηρίζεται στα επίπεδα των δοκιμασμένων αντιγόνων σύμφωνα με τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Τα προς μελέτη δείγματα ορού και τα δείγματα αναφοράς τοποθετήθηκαν στη μεμβράνη και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση το σύνολο των δειγμάτων αναρροφήθηκε από τα κανάλια της συσκευής, η οποία αποσυναρμολογήθηκε. Ακολούθως η μεμβράνη αφαιρέθηκε από τη συσκευή και εκπλύθηκε σε τρεις δεκάλεπτες πλύσεις με ΤBS-T [ 0,1% Τween 20 σε τρις αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα (20mM TRIZMA Base, 137 mm χλωριούχο νάτριο, ph 7,6)], πάνω σε επιτραπέζιο αναδευτήρα. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε για μία ώρα σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%, προκειμένου να επιτευχθεί εξουδετέρωση πιθανών μικροβιακών υπεροξειδασών. Μη ειδικά σημεία δέσμευσης αποκλείστηκαν κατόπιν δωδεκάωρης επώασης σε θερμοκρασία 4 ο C με 250ml διαλύματος TBS-T με 1% καζεϊνη Hammersten (VWR International Ltd, Poole, UK). Δέσμευση ενδογενούς βιοτίνης: Τα δείγματα πιθανόν να περιέχουν βιοτίνη που προέρχεται από βακτήρια. Η ενδογενής αυτή βιοτίνη μπορεί να αυξήσει σημαντικά τα μη ειδικά σήματα και για το λόγο αυτό δεσμεύεται με το σύστημα αβιδίνης/ βιοτίνης (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε 120ml ΤBS-T με 24 σταγόνες αβιδίνης και αναδεύτηκε για 15 λεπτά. Αφού εκπλύθηκε με τρεις δεκάλεπτες πλύσεις σε 250ml TBS-T, η δέσμευση ολοκληρώθηκε με ανάδευση για 30 λεπτά σε 120 ml διαλύμματος TBS-T με 24 σταγόνες βιοτίνης. Επώαση των βιοτινυλιωμένων αντισωμάτων ανίχνευσης: Έπειτα από τρεις νέες δεκάλεπτες πλύσεις σε 250ml TBS-T η μεμβράνη επανατοποθετήθηκε στη συσκευή Miniblotter-45, αυτή τη φορά κάθετα στην αρχική διεύθυνση. Αντί-ανθρώπινα, αίγειας προέλευσης αντισώματα συνδεδεμένα με βιοτίνη για τα αντιγόνα που εξετάζονται IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, MMP-8, αραιωμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (TBS-T με 1% καζεϊνη Hammersten), διοχετεύτηκαν με πιπέτα στα κανάλια του Miniblotter-45 σε τρεις διαφορετικές αραιώσεις για το καθένα. Μετά από 1 ώρα επώασης σε

19 θερμοκρασία δωματίου η μεμβράνη εκπλύθηκε με 500 ml TBS-T στο σύστημα Manifold (Immunetics, Cambridge, MA) και με τρεις διαδοχικές δεκάλεπτες πλύσεις με 250 ml TBS-T σε επιτραπέζιο αναδευτήρα. Δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με περοξειδάση: Περοξειδάση φυτικής προέλευσης δεσμευμένη σε στρεπταβιδίνη streptavidin conjugated horseradish peroxidase- (RnD, Minneapolis, MA) αραιώθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (1: 200) και η μεμβράνη επωάσθηκε με 120 ml από το αντιδραστήριο σε σφραγισμένη σακούλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στον αναδευτήρα. Η μεμβράνη εκπλύθηκε και πάλι με τρεις διαδοχικές δεκάλεπτες πλύσεις με 250 ml TBS-T. Ανίχνευση των σημάτων: Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας LumiGLO Reserve (KPL, Gaithersburg, MD) που περιέχει φωταυγές διάλυμα και ένα ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης. Ένα ευαίσθητο αυτοακτινογραφούμενο φιλμ (Hyperfilm, ECL, Amersham, Arlington Heights, IL) χρησιμοποιήθηκε για να αποτυπώσει την εκπομπή φωτός από την μεμβράνη. Το φιλμ εκτέθηκε για 1-3 ώρες (ανάλογα με την ανάπτυξη της τυπικής καμπύλης) και εμφανίστηκε σε σκοτεινό θάλαμο. Υπολογισμός των αντιγόνων: Τα φιλμ σαρώθηκαν σε επίπεδο σαρωτή (Epson 1640, Epson CA). Οι μονάδες οπτικής πυκνότητας καθορίστηκαν στο ίδιο φιλμ, τόσο για το μίγμα των αντιγόνων αναφοράς, όσο και για τα προς μελέτη αντιγόνα. Οι συγκεντρώσεις για τα εξεταζόμενα δείγματα εκτιμήθηκαν με βάση την τυπική καμπύλη, χρησιμοποιώντας λογαριθμική ανάλυση, και εκφράστηκαν σε pg/ mι με χρήση του λογισμικού που αναφέρθηκε για την ποσοτική εκτίμηση των βακτηρίων. Στατιστική Ανάλυση Για τη συνολική ανάλυση, από τα κλινικά και μικροβιολογικά δεδομένα υπολογίστηκαν καταρχήν οι μέσοι όροι για κάθε ασθενή και στη συνέχεια οι τελευταίοι χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του μέσου όρου του δείγματος, ξεχωριστά για τις δύο χρονικές στιγμές. Ειδική ανάλυση, προσδιορίζοντας το μέσο όρο με τον ίδιο τρόπο, έγινε για τα μικροβιολογικά ευρήματα από περιοδοντικούς θυλάκους με βάθος 4 χιλ. Οι ανοσολογικές παράμετροι προσδιορίστηκαν στη στατιστική ανάλυση με τη χρήση του μέσου όρου των τιμών κάθε ασθενή,

20 ξεχωριστά για τις δύο χρονικές στιγμές. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στα επίπεδα όλων των παραμέτρων (κλινικών, μικροβιολογικών και ανοσολογικών) μεταξύ των δύο χρονικών στιγμών, καθορίστηκε με τη χρήση του Wilcoxon rank test. Για τον προσδιορισμό του συντελεστή συσχέτισης μεταξύ των μέσων όρων των ανοσολογικών παραμέτρων και ανάμεσα στους μέσους όρους κλινικών, μικροβιολογικών και ανοσολογικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε το Spearman rank test. Η ύπαρξη των παραπάνω συσχετίσεων διερευνήθηκε στις χρονικές στιγμές της αρχικής δειγματοληψίας και του επανελέγχου καθώς και για τα επίπεδα των μεταβολών που επέφερε η αρχική αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας σε όλες τις εξεταζόμενες παραμέτρους. Οι παραπάνω αναλύσεις έγιναν με το στατιστικό πακέτο SPSS Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε p<

21 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα δεδομένα 20 ασθενών χρησιμοποιήθηκαν στις στατιστικές αναλύσεις των αποτελεσμάτων. Ένας ασθενής δεν προσήλθε στον επανέλεγχο και δύο ανάφεραν χρήση αντιβιοτικών κατά τη διάρκεια επούλωσης (6-8 εβδομάδες) για την αντιμετώπιση λοιμώξεων εκτός στοματικής κοιλότητας. Τα δημογραφικά στοιχεία του τελικού πληθυσμού μελέτης απεικονίζονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς έπασχαν από γενικευμένα προχωρημένη εντοπισμένα επιπλεγμένη χρόνια περιοδοντίτιδα, όπως γίνεται εμφανές και από τους μέσους όρους της πλήρους ενδοστοματικής καταγραφής κατά την αρχική εξέταση, της απώλεια πρόσφυσης 5.2 ± 1.2 χιλ, του βάθος θυλάκου 3.9 ± 0.6 χιλ και το υψηλό ποσοστό αιμορραγίας κατά την ανίχνευση 60 ± 26%. Η αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας οδήγησε σε σημαντική βελτίωση όλων των κλινικών παραμέτρων σε υψηλά στατιστικά σημαντικά επίπεδα (Wilcoxon signed ranks test, p= 0.001). Οι μέσοι όροι με τις τυπικές αποκλίσεις τους πριν και μετά τη θεραπεία παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Η κλινικά παρατηρούμενη βελτίωση επιβεβαιώθηκε και από τα μικροβιολογικά ευρήματα για τα τρία υπό εξέταση βακτήρια της υπουλικής χλωρίδας. Όλα τα μέλη του ερυθρού συμπλέγματος (P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική ποσοτική μείωση στον επανέλεγχο (Wilcoxon signed ranks test, p= 0.005, και αντίστοιχα, Πίνακας 3). Επιπλέον, ο αριθμός των βακτηρίων ενός είδους σχετίζονταν με τον αριθμό από κάθε ένα από τα άλλα δύο είδη τόσο στην αρχική δειγματοληψία όσο και στον επανέλεγχο (Spearman rank test, p< 0.01). Η ανά ζεύγος βακτηρίων συσχέτιση παρατηρήθηκε και για τις μεταβολές τους μετά την περιοδοντική θεραπεία (Spearman rank test, p< 0.01). Ο μέσος όρος των τιμών κάθε μικροβίου για τις τρεις κατηγορίες βάθους θυλάκου (αβαθείς, μέτριοι, βαθείς) δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τις κλινικές παραμέτρους σε καμία χρονική στιγμή (p> 0.05). Ωστόσο, η μείωση της απώλειας πρόσφυσης μετά την περιοδοντική θεραπεία φάνηκε να συσχετίζεται με το επίπεδο μείωσης του αριθμού για κάθε ένα από τα υποουλικά βακτήρια του ερυθρού συμπλέγματος που ανιχνεύτηκαν σε θέσεις με βάθος θυλάκου μεγαλύτερο ή ίσο με 4 χιλ. (Spearman rank test, p= 0.016, και

22 0.041 για τα P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia αντίστοιχα). (Πίνακες 4, 5 και 6). Σε οκτώ από τους είκοσι ασθενείς οι τιμές της CRP ανευρέθηκαν σε υψηλότερα από τα αναμενόμενα για υγιείς ενήλικες επίπεδα, σύμφωνα με το εγχειρίδιο περιγραφής της τεχνικής (νεφελομετρία). Η περιοδοντική θεραπεία οδήγησε σε πτώση των επιπέδων της CRP μόνο στους δέκα από τους είκοσι ασθενείς, με αποτέλεσμα η μείωση του μέσου όρου των τιμών της να μην αγγίζει στατιστικά σημαντικά επίπεδα (Wilcoxon signed ranks test, p= 0.364). Μη στατιστικά σημαντική επίδραση, στο χρονικό διάστημα των 6 εβδομάδων, είχε η θεραπεία και για τις τέσσερις μελετώμενες κυτταροκίνες, IL- 8, IL-1β, TNF-α και IL-6 (Wilcoxon signed ranks test, p= 0.203, 0.180, και αντίστοιχα). Αντίθετα, τα επίπεδα της μετταλοπρωτεϊνάσης 8 στον ορό εμφάνισαν στατιστικά σημαντική μείωση στον επανέλεγχο (Wilcoxon signed ranks test, p= 0.03). Οι μέσοι όροι με το τυπικό λάθος τους πριν και μετά τη θεραπεία παρουσιάζονται στον Πίνακα 7. Τόσο η CRP όσο και οι κυτταροκίνες δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με καμία κλινική παράμετρο για καμία από τις δύο μελετώμενες χρονικές στιγμές (Spearman rank test, p> 0.05). Επίσης, η μεταβολή τους δε συσχετίστηκε με τη μεταβολή των κλινικών δεικτών. Η MMP-8 παρουσίασε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το βάθος θυλάκου και την απώλεια πρόσφυσης πριν τη θεραπεία (Spearman rank test, p= 0.02 και αντίστοιχα) ενώ η διαφοροποίησή της μετά από αυτή σχετίζεται με τη μείωση στην απώλεια πρόσφυσης (Spearman rank test, p= 0.005). Ωστόσο, δεν παρουσιάστηκε ανάλογη συσχέτισή της με το μικροβιακό φορτίο των τριών υπουλικά ανιχνευόμενων βακτηρίων. Αντίθετα, μόνο η IL-1β και ο TNF-α εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με ένα τουλάχιστον από τα P. gingivalis, T. denticola, και T. forsythia στην αρχική δειγματοληψία ενώ ανάλογη συσχέτιση εμφανίζουν και οι διαφοροποιήσεις τους (Spearman rank test, p< 0.05). Η αναζήτηση συσχετίσεων μεταξύ των ουσιών που μελετήθηκαν στον ορό οδήγησε στα ακόλουθα ευρήματα. Οι CRP, IL-8 και IL-6 δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση (Spearman rank test, p> 0.05) με καμία από τις υπόλοιπες ουσίες τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία. Η MMP-8 στην αρχική δειγματοληψία παρουσίασε οριακή συσχέτιση με την IL-1β, η οποία δεν συνέχισε να υφίσταται μετά τη θεραπεία (Spearman rank test, p= 0.04). Αντίθετα, οι δύο

23 κύριες προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1β και TNF-α παρουσίασαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση τόσο για τη μεταβολή τους όσο και για τις δύο χρονικές στιγμές ελέγχου (Spearman rank test, p= και για τις τρεις συσχετίσεις). Το σύνολο των συσχετίσεων ανάμεσα στις ουσίες που μελετήθηκαν στον ορό και μεταξύ αυτών και των κλινικών και μικροβιολογικών ευρημάτων απεικονίζονται στους Πίνακες 8, 9 και 10 για τις δύο χρονικές στιγμές και τις διαφοροποιήσεις τους μετά τη θεραπεία, αντίστοιχα

24 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα ολοένα και αυξανόμενα ευρήματα για συμμετοχή χαμηλής έντασης χρόνιων φλεγμονών στην παθογένεια σοβαρών συστηματικών παθήσεων (θεωρία της εστιακής λοίμωξης), διατηρούν επίκαιρη την υπόθεση εμπλοκής και των περιοδοντικών νόσων στη διαδικασία αυτή ως συνεργικών παραγόντων ή παραγόντων κινδύνου. Η διαπιστωμένη έντονη μεταβολή της ανοσιακής απόκρισης στην περιοδοντική φλεγμονή σε τοπικό ιστικό επίπεδο ως απάντηση στη λοιμογόνο δράση του υποουλικού βιοϋμενίου, επιτρέπει την αναζήτηση τυχόν μεταβολών στους κύριους μεσολαβητές φλεγμονωδών διεργασιών σε συστηματικό επίπεδο και στους ασθενείς με περιοδοντική νόσο. Ενώ πολλές από τις μελέτες, κυρίως συγχρονικές, καταδεικνύουν την ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ περιοδοντίτιδας και συστηματικών παθήσεων βασιζόμενες και στα υψηλότερα επίπεδα συστηματικών δεικτών φλεγμονής που παρατηρούνται σε περιοδοντικούς ασθενείς σε σχέση με υγιείς, απουσιάζει η ομοιογένεια στα αποτελέσματα μελετών παρέμβασης που θα προσέφεραν πιο ασφαλείς και ισχυρούς συσχετισμούς (Loos, 2005). Στην παρούσα παρεμβατική μελέτη αξιολογήθηκε η επίδραση της αρχικής αιτιολογικής φάσης της περιοδοντικής θεραπείας σε έξι ουσίες στον ορό για τις οποίες βιολογικά και βιβλιογραφικά τεκμηριώνεται συνάφεια με μεταβολές του ανοσιακού μηχανισμού που επηρεάζουν νοσολογικές οντότητες. Η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) θεωρείται, σύμφωνα με πρόσφατο κοινό πόρισμα της Αμερικανικής Καρδιολογικής Εταιρείας (American Heart Association) και του Κέντρου για τον Έλεγχο Λοιμώξεων (Centers for Disease Control), ικανός δείκτης επικινδυνότητας (CRP< 1 mg/ L χαμηλού, 1-3 mg/ L μετρίου και >3 mg/ L υψηλού κινδύνου) για τη μελλοντική εμφάνιση καρδιαγγειακών παθήσεων σε κατά τα άλλα υγιή άτομα (Pearson και συν., 2003). Η ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) αποτελεί ισχυρή προφλεγμονώδη κυτταροκίνη που χαρακτηρίζεται ως κύριος ενδογενής πυρετογόνος παράγοντας με πρωταρχικό ρόλο στην εκδήλωση της αντίδρασης οξείας φάσης. Ταυτόχρονα εμφανίζει μεγάλη πλειοτροπική δράση επάγοντας την απελευθέρωση πλήθους κυτταροκινών και χημειοκινών, διαδραματίζοντας, άμεσα ή έμμεσα, ρυθμιστικό ρόλο στο μεταβολισμό του κολλαγόνου και συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, στη σύνθεση

25 λιπιδίων και παραγόντων πήξης, στη χημειοταξία αμυντικών κυττάρων και στη νευροαγωγιμότητα (Dinarello, 2001). Εμφανίζοντας σημαντική συνεργική δράση με την IL-1β, ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α (TNFα) θεωρείται ισχυρός χημειοτακτικός παράγοντας για τα μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, κύριος μεσολαβητής για την εκδήλωση σηπτικού σοκ, με ενεργό ρόλο στον οστικό ανασχηματισμό ενώ ενοχοποιείται στην παθογένεια πολλών αυτοάνοσων νοσημάτων (Aggarwal και συν., 2001). Η ιντερλευκίνη 6 (IL-6) είναι η κύρια κυτταροκίνη που επάγει την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης από τα ηπατοκύτταρα, συμμετέχει συνεργικά στην εκδήλωση της ανοσιακής απάντησης με την IL-1β και τον TNFα, ρυθμίζοντας κυρίως τη χυμική ανοσία, ενώ κατέχει σημαντικό ρόλο στην αιματοποίηση και στη λειτουργία των κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος (Matsuda και Hirano, 2001). Πιο συγκεκριμένη είναι η δράση της χημειοτακτικής ιντερλευκίνης 8 (IL-8) (χημειοκίνη) με κύριο ρόλο στην οξεία φλεγμονή καθώς προσελκύει και ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα (Iizasa και Matsushima, 2001). Τέλος, η επιλογή της μελέτης της μεταλλοπρωτεϊνάσης 8 (MMP-8) στον ορό οφείλεται σε πρόσφατα ευρήματα που αναφέρουν τόσο αυξημένα επίπεδά της σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα (Tchetverikov και συν., 2004), νόσο με παρόμοιους παθογενετικούς μηχανισμούς με την περιοδοντίτιδα όσο και εμπλοκή της στις διαδικασίες αθηρωμάτωσης (Turu και συν., 2006). Κατά την αρχική εξέταση μόνο το 25% των ασθενών εμφάνισαν τιμές CRP μεγαλύτερες των 5mg/ L (ανώτερο όριο φυσιολογικών τιμών του εργαστηρίου) ενώ λιγότεροι από τους μισούς (40%) εντάσσονταν στην κατηγορία υψηλού κινδύνου σύμφωνα με το πόρισμα των ΑΗΑ και CDC (CRP> 3 mg/ L), παρά τη σοβαρή μορφή της περιοδοντικής νόσου. Επιπλέον στις δύο αυτές υποομάδες η βαρύτητα της νόσου δεν διαφοροποιούνταν από αυτή του συνολικού πληθυσμού. Ο μέσος όρος των επιπέδων της CRP πριν την έναρξη της θεραπείας (3.16 mg/ L) στον πληθυσμό της παρούσας μελέτης παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με τις πρόσφατες εργασίες των Buhlin και συν., (2003), Yamazaki και συν., (2004) και Bizzarro και συν., (2005) (3.28, 3.17 και 3.12 mg/ L, αντίστοιχα) ενώ εμπίπτει με τα γενικότερα ευρήματα για τα επίπεδα της CRP σε ασθενείς με χρόνια περιοδοντίτιδα ( mg/ L). Για καμία χρονική στιγμή, η CRP δεν εμφάνισε συσχέτιση με καμία κλινική παράμετρο (βάθος θυλάκου, απώλεια πρόσφυσης και αιμορραγία κατά την ανίχνευση), γεγονός που

26 υποδηλώνει αδυναμία συσχέτισης με τη βαρύτητά της νόσου. Σε παρόμοια συμπεράσματα καταλήγουν και οι εργασίες των Ebersole και συν., (1997), Mattila και συν., (2002), Yamazaki και συν., (2005) και Bizzarro και συν., (2005) ενώ οι Buhlin και συν., (2003) βρίσκουν συσχέτιση μόνο με το βαθμό φλεγμονής των ούλων. Αντίθετα, οι Loos και συν., (2000) αναφέρουν συσχέτιση των επιπέδων της CRP με την έκταση της περιοδοντίτιδας (εντοπισμένη ή γενικευμένη), οι Noack και συν., (2001) συσχετίζουν τις τιμές της CRP με τη βαρύτητα της περιοδοντίτιδας χρησιμοποιώντας, όμως, ως ουδό απώλεια πρόσφυσης 3 χιλ. ενώ και οι Slade και συν., (2000), στην επιδημιολογική τους μελέτη, αναφέρουν στατιστικά υψηλότερες τιμές CRP σε ασθενείς που παρουσιάζουν βάθος θυλάκου 4 χιλ. σε περισσότερες από 10% των θέσεων. Πολύ πιθανόν, η αδυναμία συσχέτισης που παρατηρείται στην παρούσα μελέτη να οφείλεται στο ότι όλοι οι ασθενείς παρουσίαζαν γενικευμένη προχωρημένη μορφή της νόσου (περισσότερες από 30% των θέσεων με βάθος θυλάκου 4 χιλ.). Το παραπάνω εύρημα ενισχύεται και από την απουσία συσχέτισης της CRP με τις τιμές των περιοπαθογόνων βακτηρίων του ερυθρού συμπλέγματος που εξετάστηκαν τόσο συνολικά όσο και στην επιμέρους ανάλυση για τους μετρίου και μεγάλου βάθους θυλάκους. Στην περίπτωση αυτή η σύγκριση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα δεν είναι εφικτή, καθώς οι δύο εργασίες των Noack και συν., (2001) και Glurich και συν., (2002) αναφέρουν την ύπαρξη συσχέτισης χρησιμοποιώντας, όμως, ποιοτικά κριτήρια (παρουσία ενός, δύο ή περισσοτέρων βακτηρίων) σε αντίθεση με την ποσοτική ανίχνευση που εδώ χρησιμοποιήθηκε. Καμία από τις κυτταροκίνες που προσδιορίστηκαν στον ορό (IL-8, IL-1β, TNFα, IL-6) δεν εμφάνισε συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους πριν ή μετά την εφαρμογή της περιοδοντικής θεραπείας. Ομοίως, οι Forner και συν., (2006) μελετώντας την επίδραση της βακτηριαιμίας, που προκαλείται μετά από μηχανική περιοδοντική θεραπεία, στα επίπεδα και των τεσσάρων αυτών κυτταροκινών, αναφέρουν την έλλειψη συσχέτισης των τιμών τους πριν την έναρξη της θεραπείας με αυτές κλινικών παραμέτρων. Οι Mengel και συν., (2002) δεν ανιχνεύουν μετρήσιμες τιμές IL-1β στο πλάσμα ασθενών με χρόνια περιοδοντίτιδα, ενώ σχετίζουν τα επίπεδα της IL-6 με την απώλεια πρόσφυσης μόνο σε ασθενείς με γενικευμένη επιθετική και όχι χρόνια περιοδοντίτιδα. Τόσο ο Meyle, (1993) όσο και οι Iwamoto και συν., (2003) δεν ανευρίσκουν σχέση μεταξύ της βαρύτητας της περιοδοντικής φλεγμονής και των επιπέδων του TNFα. Τέλος,

27 οι Yamazaki και συν., (2005) σε ανάλογη με την παρούσα μελέτη παρατηρούν την έλλειψη συσχέτισης με κλινικές παραμέτρους τόσο για τον TNFα όσο και για την IL- 6. Από τη βιβλιογραφική ανασκόπηση δε γνωρίζουμε να υπάρχει προηγούμενη αναφορά για τη μελέτη της MMP-8 στον ορό περιοδοντικών ασθενών. Στην παρούσα έρευνα η MMP-8 ανιχνεύτηκε κατά την πρώτη δειγματοληψία σε σημαντικά επίπεδα στον ορό ( ng/ ml) και εμφάνισε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το βάθος θυλάκου και την απώλεια πρόσφυσης, υποδεικνύοντας πιθανή σχέση με τη βαρύτητα της νόσου. Η αρχική αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας οδήγησε σε σημαντική υποχώρηση της περιοδοντικής φλεγμονής, όπως καταδεικνύεται από την υψηλά στατιστικά σημαντική μείωση τόσο των κλινικών παραμέτρων όσο και του αριθμού των τριών παθογόνων βακτηρίων (P. gingivalis, T. forsythia και T. denticola) του υποουλικού βιοϋμενίου. Η επίδραση της θεραπείας της περιοδοντίτιδας στα επίπεδα των ανοσολογικών παραμέτρων στον ορό φαίνεται να συνδέεται αιτιολογικά μόνο με την ΜΜP-8, καθώς είναι η μόνη που εμφανίζει στατιστικά σημαντική μείωση στον επανέλεγχο των 6 εβδομάδων. Η τιμή της CRP παρουσίασε μείωση της τάξης των 0.5 mg/ L, χωρίς να πλησιάσει στατιστικά σημαντικά επίπεδα στο χρονικό διάστημα μελέτης. Για το ίδιο χρονικό διάστημα μη στατιστικά σημαντική επίδραση της συντηρητικής θεραπείας αναφέρουν και οι Ide και συν., (2003). Επιπρόσθετα, στις ίδιες παρατηρήσεις καταλήγουν και οι Yamazaki και συν., (2005) τρεις μήνες μετά την εφαρμογή πλήρους περιοδοντικής θεραπείας (ριζικές αποξέσεις και χειρουργεία). Οι D Aiuto και συν., (2004) επισημαίνουν την ύπαρξη στατιστικών διαφορών στις τιμές της CRP στους 6 μήνες και όχι στους δύο, ενώ σε μετέπειτα εργασία τους (D Aiuto και συν., 2005), στην οποία συγκρίνουν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις στην αρχική αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας (ριζικές αποξέσεις με ή χωρίς τη συμπληρωματική τοπική χορήγηση υδροχλωρικής μινοκυκλίνης), αναφέρουν στατιστικά σημαντική μείωση της CRP στους δύο μήνες, συγκρίνοντας όμως τις τιμές στον επανέλεγχο με αυτές μιας τρίτης αθεράπευτης ομάδαςελέγχου και όχι με αυτές που είχαν αρχικά οι δύο ομάδες που δεχτήκαν τη θεραπεία. Με επιφύλαξη πρέπει να γίνει η σύγκριση με τα αποτελέσματα της εργασίας των Iwamoto και συν., (2003) καθώς η μείωση της CRP παρατηρείται αφενός σε πληθυσμό μελέτης με υψηλό κίνδυνο για ανάπτυξη καρδιαγγειακών

28 παθήσεων (υψηλή πίεση, διαβήτης) και αφετέρου η συντηρητική θεραπεία περιλαμβάνει και τη χρήση τοπικών αντιμικροβιακών. Η χρήση αντιμικροβιακών (μετρονιδαζόλη), και μάλιστα με συστηματική χορήγηση, δυσχεραίνει την αξιολόγηση της οριακά στατιστικά σημαντικής μείωσης της τιμής της CRP και στην εργασία των Mattila και συν., (2002). Τέλος, στην πλέον μακροχρόνια μελέτη (2 χρόνια) των Ebersole και συν., (1997) η εφαρμογή της μηχανικής θεραπείας ανά εξάμηνο από μόνη της δεν κατάφερε να οδηγήσει σε στατιστικά σημαντική μεταβολή στα επίπεδα της CRP για καμία στιγμή ελέγχου, παρά μόνο στην περίπτωση που συνδυάζονταν με τη υψηλότερη δόση μη στεροειδούς αντιφλεγμονώδους σκευάσματος (50mg/ ημέρα φλουρβιπροφαίνης χορηγούμενη για 2 χρόνια) και μόνο στο τέλος της διετίας. Ανάλογη επίδραση είχε η περιοδοντική θεραπεία και στα επίπεδα και των τεσσάρων μελετώμενων κυτταροκινών με τη μεταβολή των τιμών τους να μην αγγίζει στατιστικά σημαντικά επίπεδα στο χρονικό διάστημα μελέτης. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με τις εργασίες των Ide και συν., (2003) για τις IL-1β, TNFα, IL- 6, των Iwamoto και συν., (2003) για τον TNFα και των Yamazaki και συν., (2005) για το ζεύγος των TNFα και IL-6. Στη μοναδική άλλη έρευνα που μελετά τα επίπεδα της IL-8 στον ορό περιοδοντικών ασθενών, η θεραπεία είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της (Gainet και συν., 1998) αλλά σε δείγμα ασθενών με ταχέως εξελισσόμενη περιοδοντίτιδα. Κατ αναλογία με τα αποτελέσματα τους για τη CRP και ακολουθώντας τη ίδια ανάλυση, οι D Auito και συν., (2004, 2005) είναι οι μόνοι που αναφέρουν υψηλά στατιστικά σημαντική μείωση της IL- 6 μετά την περιοδοντική θεραπεία. Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε για την ανεύρεση συσχετίσεων μεταξύ των ανοσολογικών παραμέτρων στον ορό. Η CRP (Πίνακες 8, 9, 10) δε συσχετίστηκε με καμιά από τις κυτταροκίνες, ούτε όπως ήταν αναμενόμενο με την MMP-8. Οι Ide και συν., (2003) αναφέρουν συσχέτιση της CRP με τον TNFα και την IL-6 αλλά όχι με την IL-1β ενώ η σχέση IL-6 και CRP παρατηρείται και από τους Buhlin και συν., (2003) και D Aiuto και συν., (2004). Ωστόσο, οι Iwamoto και συν., (2003) και Yamazaki και συν., (2005), παρότι μελετούν τη CRP σε συνδυασμό με τον TNFα και τις TNFα και IL-6 αντίστοιχα, δεν αναφέρουν αναλύσεις για την τυχόν ύπαρξη συσχετίσεων. Από τις πέντε ουσίες που ανιχνεύτηκαν με την νέα τεχνική ανοσοαποτύπωσης, η MMP-8 σχετίστηκε στην αρχική δειγματοληψία με την IL-1β

29 (Πίνακας 8), συσχέτιση που δε διατηρήθηκε στον επανέλεγχο και δεν παρατηρήθηκε για τις μεταβολές τους. Πιθανόν, το εύρημα αυτό να εξηγείται με την υπόθεση ότι η μείωση της MMP-8 μετά τη θεραπεία δεν οφείλεται στη μεταβολή της IL-1β, που είναι ένας από τους παράγοντες που επάγουν την παραγωγή της (Sorca και συν., 2004, Page & Offenbacher 1997), αλλά στη σημαντική μείωση στο υποουλικό βακτηριακό φορτίο, καθώς τα βακτηριακά προϊόντα αποτελούν εξίσου σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στην απελευθέρωσή της από πλήθος κυττάρων, αμυντικών και μη (Tervahartiala και συν., 2000). Επιπρόσθετα, στην ανάλυση αυτή εμφανίζεται σταθερή και στατιστικά σημαντική η συσχέτιση των κυτταροκινών IL-1β και TNFα τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία, όπως και για τα επίπεδα των μεταβολών τους (Πίνακες 8, 9, 10). Η σχέση αυτή είναι βιολογικά αποδεκτή. Οι κυτταροκίνες αυτές παράγονται και οι δυο κατά κύριο λόγο από μακροφάγα και μονοκύτταρα και σε μικρότερη έκταση από Τ και Β λεμφοκύτταρα και άλλα κύτταρα γεγονός που τονίζει την εμφάνιση τους σε κοινή φάση της ανοσολογικής απάντησης. Η απελευθέρωσή τους προκαλείται σε μεγάλο βαθμό μετά από έκθεση σε βακτηριακό ερέθισμα. Η ρύθμισή τους, εκτός από την άμεση σχέση καθώς η IL-1β επάγει τον TNFα, καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τους ίδιους αναστολείς (π.χ IL-10, IL-13, TGFβ) ενώ και οι δύο εμφανίζουν και αυτοκρινική δράση. Επιπλέον, όπως ήδη αναφέρθηκε εμφανίζουν συνεργική δράση στην εμφάνιση και εξέλιξη πολλών βιολογικών φαινομένων (Dinarello, 2000, Aggarwal και συν., 2000). Ενδιαφέρουσα, επίσης είναι και η συσχέτιση που εμφανίζουν οι κυτταροκίνες αυτές με τουλάχιστον ένα από τα τρία ισχυρά λοιμογόνα υποουλικά βακτήρια στην αρχική χρονική στιγμή και στη μελέτη των διαφοροποιήσεών τους, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή συσχέτισή τους με το πρωταρχικό αίτιο της περιοδοντικής φλεγμονής. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι η μελέτη ανοσολογικών παραγόντων συστηματικά και η αναζήτηση μεταβολών τους μετά τη θεραπεία μιας τοπικά εκδηλωμένης χρόνιας φλεγμονής, όπως η περιοδοντίτιδα, υπονομεύεται από την πλειάδα των επιδράσεων που δέχεται το ανοσιακό σύστημα. Παρά την αυστηρή επιλογή των κριτηρίων εισαγωγής που χρησιμοποιήθηκαν για τον πληθυσμό μελέτης, δεν μπορεί να αποκλειστεί με βεβαιότητα η παρουσία υποκλινικών λοιμώξεων ή και χρόνιων φλεγμονών που

30 συμβάλλουν στην ανοσολογική απόκριση χωρίς να επηρεάζονται ασφαλώς από την εφαρμογή της περιοδοντικής θεραπείας. Ακόμα και για περισσότερο ειδικούς δείκτες, όπως η CRP για τις καρδιαγγειακές παθήσεις, τα επίπεδά τους πιθανόν να επηρεάζονται από αναπτυσσόμενες, μη συμπτωματικές αθηροσκληρωτικές ή άλλες καταστάσεις (Armitage, 2000), δεδομένης και των συγγενών ηλικιακών ομάδων στις οποίες εκδηλώνονται τόσο η χρόνια περιοδοντίτιδα όσο και οι καρδιαγγειακές παθήσεις. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη δε φαίνεται να ενισχύει την υπόθεση για συμβολή της περιοδοντικής φλεγμονής στη διαμόρφωση της συστηματικής ανοσολογικής απόκρισης. Ωστόσο, η ύπαρξη κάποιας συσχέτισης δύο ισχυρών ανοσολογικών μεσολαβητών, των IL-1β και TNFα, με στοιχεία του υποουλικού βιοϋμενίου, η εφαρμογή της πρώτης μόνο φάσης της περιοδοντικής θεραπείας και το περιορισμένο χρονικό διάστημα για τον έλεγχο των διαφοροποιήσεων δεν επιτρέπει την εξαγωγή απόλυτων συμπερασμάτων. Επιπρόσθετα, ενθαρρυντικά είναι τα ευρήματα από τη μελέτη για συστηματική εμπλοκή ενός ισχυρά τεκμηριωμένου δείκτη της περιοδοντικής καταστροφής, της μετταλλοπρωτεϊνάσης- 8. Η σχεδίαση νέων μελετών παρέμβασης με εφαρμογή πλήρους περιοδοντικής θεραπείας και μακροχρόνια παρακολούθηση των μεταβολών της περιοδοντικής φλεγμονής θα επιτρέψει την ακριβή ερμηνεία της συμμετοχής των περιοδοντικών νόσων στη ρύθμιση μελετημένων και μη ανοσολογικών παραμέτρων που φαίνεται να σχετίζονται με τον κίνδυνο εκδήλωσης σημαντικών συστηματικών παθήσεων

31 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Aggarwal BB, Samanta A, Feldmann M. The immunoregulating cytokines: Tumor necrosis factor- α. In: Cytokine Reference. A compendium of cytokines and other mediators of host defence. Volume 1: LIGANDS, Editors: Oppenheim J.J & Feldmann M, 2001, Academic Press, pg: Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Ann Periodontol 1999; 4: 1-6. Armitage GC. Periodontal infections and cardiovascular disease how strong is the asspciation? Oral Diseases 2000;6: Beck JD., Garcia R, Heiss G, Vokonas PS. & Offenbacher S. Periodontal disease and cardiovascular disease. Journal of Periodontol 1996; 67: Bizzarro S, van der Velden U, Leivadaros E, et al. Markers of coagulation and fibrinolysis in periodontitis. J Dent Res 2005; 84 (Spec. Issue). Buhlin K, Gustafsson A, Pockley AG, Frostegaard J, Klinge B. Risk factors for cardiovascular disease in patients with periodontitis. Eur Heart J 2003; 24: Craig RG, Yip JK, So MK, Boylan RJ, Socransky SS, Haffajee AD. Relationship of destructive periodontal disease to the acute-phase response. J Periodontol 2003; 74: D'Aiuto F, Nibali L, Parkar M, Suvan J, Tonetti MS. Short-term effects of intensive periodontal therapy on serum inflammatory markers and cholesterol. J Dent Res 2005 Mar; 84(3): D'Aiuto F, Ready D, Tonetti MS. Periodontal disease and C-reactive proteinassociated cardiovascular risk. J Periodontal Res 2004 Aug; 39(4):

32 Daly CG, Mitchell DH, Highfield JE, Grossberg DE,Stewart D. Bacteremia due to periodontal probing: A clinical and microbiological investigation. J Periodontol 2001; 72: Dinarello CA. The immunoregulating cytokines: Interleukin- 1β. In: Cytokine Reference. A compendium of cytokines and other mediators of host defence. Volume 1: LIGANDS, Editors: Oppenheim J.J & Feldmann M, 2001, Academic Press, pg: Ebersole JL, Machen RL, Steffen MJ, Willmann DE. Systemic acute-phase reactants, C-reactive protein and haptoglobin in adult periodontitis. Clin Exp Immunol 1997; 107: Ebersole JL, Cappelli D. Acute- phase reactants in infections and inflammatory diseases. Periodontol ; 23: Epstein SE, Zhu J, Burnett MS, Zhou YF, Vercellotti G, Hajjar D. Infection and atherosclerosis: potential roles of pathogen burden and molecular mimicry. Arterioscler Thromb VAsc Biol 2000; 20: Fredriksson M, Bergstrom K, Asman B. IL-8 and TNF-a from peripheral neutrophils and acute- phase proteins in periodontits. Effect of cigarette smoking: a pilot study. J Clin Periodontol 2002; 29: Fredriksson M, Figueredo C, Gustafsson A, Bergstrom K, Asman B. Effect of periodontitis and smoking on blood leukocytes and acute-phase proteins. J Periodontol 1999; 70: Gainet, J., Chollet- Martin, S., Brion, M., Hakim, J., Gougerot- Pocidalo, M.-A., Elbim, C. Interleukin- 8 production by polymorphonuclear neytrophils in patients with rapidly progressive periodontitis: An amplifying loop of polymorphonuclear neutrophils activation. Laboratory Investigation 1998; 78:

33 Geerts SO, Nys M, De MP, et al. Systemic release of endotoxins induced by gentle mastication: Association with periodontitis severity. J Periodontol 2002; 73: Gemmell E, Marshall RI, Seymour GJ. Cytokines and prostaglandins in immune homeostasis and tissue destruction in periodontal disease. Periodontology ; 14: Glurich I, Grossi S, Albini B, et al. Systemic inflammation in cardiovascular and periodontal disease: Comparative study. Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9: Grossi, S. G. & Genco, R. J. Periodontal disease and diabetes mellitus: a twoway relationship. Annals of Periodontology 1998; 3: Haraszthy VI, Zambon JJ, Trevisan M, Zeid M, GencoRJ. Identification of periodontal pathogens in atheromatous plaques. J Periodontol 2000; 71: Hayes C, Sparrow D, Cohen M, Vokonas, PS. & Garcia RI. The association between alveolar bone loss and pulmonary function: the VA dental longitudinal study. Annals of Periodontology 1998; 3: Hujoel, PP, Drangsholt M, Spiekerman C & DeRouen T. Periodontal disease and coronary heart disease risk. Journal of the American Medical Association 2000; 284: Hujoel PP., Drangsholt M, Spiekerman C & DeRouen T. Periodontal disease and risk of coronary heart disease (letter). Journal of the American Medical Association 2001a; 285: Hujoel PP, Drangsholt M, Spiekerman C & DeRouen T. Examining the link between coronary heart disease and the elimination of chronic dental infections. Journal of the American Medical Association 2001b; 132:

34 Hujoel PP, White BA, Garcia RI, Listgarten MA. The dentogingival epithelial surface area revisited. J Periodontal Res 2001; 36: Ide M, Pc Partkin D, Coward PY, Crook M, LumbP, Wilson RF. Effect of treatment of chronic periodontitis on levels of serum markers of acute- phase inflammatory and vascular responses. J Clin Periodontol 2003; 30: Iizasa H & Matsushima K. The immunoregulating cytokines: Interleukin- 8. In: Cytokine Reference. A compendium of cytokines and other mediators of host defence. Volume 1: LIGANDS, Editors: Oppenheim J.J & Feldmann M, 2001, Academic Press, pg: Iwamoto Y, Nishimura F, Soga Y, Takeuchi K, Kurihara M, Takashiba S, Murayama Y. Antimicrobial periodontal treatment decreases serum C-reactive protein, tumor necrosis factor-alpha, but not adiponectin levels in patients with chronic periodontitis. J Periodontol Aug; 74(8): Joshipura, K. J., Rimm, E. B., Bouglass, C. W., Trichopoulos, D., Ascherio, A. & Willett, W. C. Poor oral health and coronary heart disease. J Dent Res 1996; 6: Libby P, Ridker PM, Maseri A. nflammation and atherosclerosis. Circulation 2002; 105: Loos BG. Systemic markers of inflammation in periodontitis. J Periodontol 2005; 76: Loos BG, Craandijk J, Hoek FJ, Wertheim-van Dillen PME, van der Velden U. Elevation of systemic markers related to cardiovascular diseases in the peripheral blood of periodontitis patients. J Periodontol 2000; 71: Matsuda T & Hirano T. The immunoregulating cytokines: Interleukin- 6. In: Cytokine Reference. A compendium of cytokines and other mediators of host

35 defence. Volume 1: LIGANDS, Editors: Oppenheim J.J & Feldmann M, 2001, Academic Press, pg: Mattilla KJ., Askainen S, Wolf J, Jousimies- Somer H, Valtonen V & Neiminen MS. Age, dental infections and coronary heart disease. J Dent Res 2000; 79: Mattilla KJ, Nieminen MS, Valtonen VV, Rasi VP, Kesaniemi YA, Syrjala SL, Jungell PS, Isoluoma M, Hietaniemi K, Jokinen M J. & Huttunen JK. Association between dental health and acute myocardial infarction. Br Med J 1989; 298: Mattila KJ, Pussinen PJ, Paju S. Dental infections and cardiovascular diseases: A review. J Periodontol 2005; 76: Mattila K, Vesanen M, Valtonen V, et al. Effect of treating periodontitis on C- reactive protein levels: A pilot study. BMC Infect Dis 2002; 2: Mengel R, Bacher M, Flores-De-Jacoby L. Interactions between stress, interleukin-1b, interleukin-6 and cortisol in periodontally diseased patients. J Clin Periodontol 2002; 29: Meyle J. Neutrophil chemotaxis and serum concentration of tumor-necrosisfactor-a (TNFa). J Periodontal Res 1993; 28: Molloy KJ, Thompson MM, Jones JL et al. Unstable carotid plaques exhibit raised matrix metalloproteinase- 8 activity, Circulation 2004; 20: Morrison HI, Ellison L.F & Taylor GW. Periodontal disease and risk of fatal coronary heart and cerebrovascular diseases. Journal of Cardiovascular Risk 1999; 6:

36 Noack B, Genco RJ, Trevisan M, Grossi S, Zambon JJ, De Nardin E. Periodontal infections contribute to elevated systemic C-reactive protein level. J Periodontol 2001; 72: Offenbacher S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol Nov; 1(1): Review. Offenbacher S, Katz V, Fertik G, Collins J, Boyd D, Maynor G, McKaig R. & Beck J. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. Journal of Periodontol 1996; 67 (suppl.): Page RC. Critical issues in periodontal research. J Dent Res 1995 Apr; 74 (4): Review. Page RC, Offenbacher S. Advances in the pathogenesis of periodontitis: summary of developments, clinical implications and future directions. Periodontol ; 14: Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW, Andersin JL, Cannon RO, Criqui M, et al. Markers of inflammation and cardiovascular disease : application to clinic and public health practice : a statement of healthcare professionals from the centers for disease control and prevention and the American Heart Association. Circulation 2003; 107: Saito T, Murakami M, Shimazaki Y, Oobayashi K, Matsumoto S, Koga T. Association between alveolar bone loss and elevated serum C-reactive protein in Japanese men. J Periodontol 2003; 74: Shah PK. Chronic infections and atherosclerosis/ thrombosis. Curr Atheroscler Rep 2002; 4: Socransky, S. S., Smith, C., Martin, L., Paster, B. J., Dewhirst, F. E. & Levin, A. E. "Checkerboard" DNA-DNA hybridization. BioTechniques 1994, 17:

37 Soder B, Airila Mansoon S, Soder P-O, Kari K, Meurman J. Levels of matrix mettaloproteinase- 8 and -9 with simultaneous presence of periodontal pathogens in gingival crevicular fluid as well as matrix mettaloproteinase- 9 and cholesterol in blood. J Periodont Res 2006; 41: Sorsa T, Tjadehane L, Salo T. Matrix mettaloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Dis 2004; 10: Takami Y, Nakagaki H, Morita I, et al. Blood test values and Community Periodontal Index scores in medical checkup recipients. J Periodontol 2003; 74: Tchetrericov I, Ronday KH, van El B, Kiers GC, Verzijl N, TeKoppele JM, Huizinga TW, DeGroot J, Hanemaaijer R. MMP profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2004; 63: Tervahartiala T, Pirila E, Ceponis A, Maisi P, Salo T, Tuter G, Kallio P, Tornwall J, Srinivas R, Konttinen Y, Sorsa T. The in vivo expression of the collagenolytic matrix metalloproteinases (MMP-2, -8, -13 and -14) and matrilysin (MMP-7) in adult and localized juvenile periodontitis. J Dent Res 2000; 79: Turu MM, Krupinski J, Catena E et al. Intraplaque MMP- 8 levels are increased in asymptomatic patients with carotid plaque progession on ultrasound. Atherosclerosis 2006 Jul; 187(1): Uitto VJ, Overall CM, Mc Culloch C. Proteolytic host cell enzymes in gingival crevicular fluid. Periodontol ; 31: Wakai K, Kawamura T, Umemura O, et al. Associations of medical status and physical fitness with periodontal disease. J Clin Periodontol 1999; 26: Wu T, Trevisan M, Genco RJ, Falkner KL, Dorn JP, Sempos CT. Examination of the relation between periodontal health status and cardiovascular risk factors:

38 Serum total and high density lipoprotein cholesterol, C-reactive protein, and plasma fibrinogen. Am J Epidemiol 2000; 151: Wu, T., Trevisan, M., Genco, R. J., Dorn, J. P., Falkner, K. L. & Sempos, C. T. Periodontal disease and risk of cerebrovascular disease. Archives of Internal Medicine 200a; 160: Yamazaki K, Honda T, Oda T, Ueki-Maruyama K, Nakajima T, Yoshie H, Seymour GJ. Effect of periodontal treatment on the C-reactive protein and proinflammatory cytokine levels in Japanese periodontitis patients. J Periodontal Res Feb; 40 (1):

39 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Στον καθηγητή κ. Α. Κωνσταντινίδη για την πολύτιμη συνδρομή και τη σταθερή υποστήριξη στην παρούσα ερευνητική προσπάθεια. Στην επίκουρο καθηγήτρια κ. Δ. Σακελλάρη για το συνεχές ενδιαφέρον και την αδιάκοπη στήριξη σε όλες τις φάσεις του παρόντος πονήματος. Χωρίς τη συμβολή της δε θα ήταν δυνατή η άρτια ολοκλήρωσή του. Στη μαθηματικό- στατιστικολόγο κ. Θ. Σλίνη για την πρόθυμη και άμεση διεκπεραίωση όλων των αναλύσεων. Τέλος, στους αγαπημένους συναδέλφους κ. A. Μπάκα και κ. I. Ιωαννίδη για την έμπρακτη συμπαράστασή τους

40 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I ΠΙΝΑΚΕΣ

41 Πίνακας 1. Δημογραφικά στοιχεία του πληθυσμού μελέτης. Πληθυσμός Μελέτης Ν= 20 Ηλικία Φύλο Κάπνισμα (Μέσος Όρος ± Τυπική Απόκλιση) Άρρεν Θήλυ Ναι Όχι 50,14 ± 8, Πίνακας 2. Μεταβολές των κλινικών δεικτών μετά την αρχική φάση της περιοδοντικής θεραπείας. Αρχικές Μετρήσεις στον Ν= 20 Μετρήσεις (Μέσος Όρος ± Επανέλεγχο (Μέσος Όρος ± P Value Τυπική Απόκλιση) Τυπική Απόκλιση) Βάθος Θυλάκων (PD) 3,94 ± 0, ± 0, Υφίζηση (Rec) 1,33 ± 0,85 1,75 ± 0, Απώλεια Πρόσφυσης (PAL) Αιμορραγία κατά την ανίχνευση (BoP) 5,26 ± 1,20 4,83 ± 1, ,60 ± 0,26 0,42 ± 0, Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

42 Πίνακας 3. Μεταβολές του αριθμού των υποουλικά ανιχνευόμενων βακτηρίων μετά την αρχική φάση της περιοδοντικής θεραπείας (συνολικά για τις 9 θέσεις). Αρχικό Μικροβιακό Μικροβιακό φορτίο Ν= 20 φορτίο στον Επανέλεγχο (Μέσος όρος ± (Μέσος όρος ± P Value τυπικό λάθος) τυπικό λάθος) P. gingivalis (x 10 5 ) ± ± B. forsythia (x 10 5 ) 7.60 ± ± T. denticola (x 10 5 ) 7.68 ± ± Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p< Πίνακας 4. Συσχέτιση των κλινικών παραμέτρων με τον μέσο όρο των υποουλικά ανιχνευόμενων βακτηρίων συνολικά για τις 9 θέσεις (total) και το μέσο όρο για τις θέσεις με βάθος θυλάκου μεγαλύτερο ή ίσο με 4 χιλ (PD 4), στην αρχική δειγματοληψία (baseline). Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values) P. g B. f T. d P. g B. f T. d (total) (total) (total) (PD 4) (PD 4) (PD 4) Βάθος Θυλάκων Απώλεια Πρόσφυσης Αιμορραγία κατά την ανίχνευση Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

43 Πίνακας 5. Συσχέτιση των κλινικών παραμέτρων με τον μέσο όρο των υποουλικά ανιχνευόμενων βακτηρίων συνολικά για τις 9 θέσεις (total) και το μέσο όρο για τις θέσεις με βάθος θυλάκου μεγαλύτερο ή ίσο με 4 χιλ (PD 4), στον επανέλεγχο (recall). Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values) P. g (total) B. f (total) T. d (total) P. g (PD 4) B. f (PD 4) T. d (PD 4) Βάθος Θυλάκων Απώλεια Πρόσφυσης Αιμορραγία κατά την ανίχνευση Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p< Πίνακας 6. Συσχέτιση των μεταβολών των κλινικών παραμέτρων με τις μεταβολές του αριθμού των υποουλικά ανιχνευόμενων βακτηρίων συνολικά για τις 9 θέσεις (total) και το μέσο όρο για τις θέσεις με βάθος θυλάκου μεγαλύτερο ή ίσο με 4 χιλ (PD 4). Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values). P. g (total) B. f (total) T. d (total) P. g (PD 4) B. f (PD 4) T. d (PD 4) Βάθος Θυλάκων 0,284 0,645 0,358 0,669 0,349 0,639 Απώλεια Πρόσφυσης 0,438 0,938 0,610 0,016 0,033 0,041 Αιμορραγία κατά την ανίχνευση 0,576 0,152 0,505 0,754 0,874 0,651 Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

44 Πίνακας 7. Μεταβολές των εξεταζόμενων στον ορό ουσιών μετά την αρχική φάση της περιοδοντικής θεραπείας. Ν= 20 CRP (mg/ L) MMP- 8 (ng/ ml) IL-8 (pg/ ml) IL-1β (pg/ ml) TNF-α (pg/ ml) IL-6 (pg/ ml) Αρχικές Μετρήσεις στον Μετρήσεις Επανέλεγχο (Μέσος Όρος ± (Μέσος Όρος ± P Value Τυπικό Λάθος) Τυπικό Λάθος) 3,15 ± 0,47 2,62 ± 0,46 0, ,48 ± 90,44 122,76 ± 49,97 0,003 77,39 ±38,41 47,66 ± 21,09 0,203 11,87 ± 9,09 4,75 ± 4,75 0,180 74,25 ± 31,34 87,45 ± 40,45 0,534 18,31 ± 10,43 21,81 ± 11,94 0,753 Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

45 Πίνακας 8. Συσχετίσεις των εξεταζόμενων στον ορό ανοσολογικών παραμέτρων μεταξύ τους και με τα κλινικά και μικροβιολογικά ευρήματα πριν την εφαρμογή περιοδοντικής θεραπείας (baseline). Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values). CRP MMP-8 IL-8 IL-1β TNFα IL-6 PD PAL BoP P.g (total) B.f (total) T.d (total) CRP ,054 0,450 0,954 0,335 0,871 0,299 0,344 0,315 0,642 0,798 MMP ,763 0,041 0,255 0,530 0,002 0,023 0, IL-8 0,054 0,763-0,111 0,542 0,210 0,780 0,827 0, IL-1β 0,450 0,041 0,111-0,000 0,632 0,718 0,581 0, TNF-α 0,954 0,255 0,542 0,000-0,105 0,599 0,323 0, IL-6 0,335 0,530 0,210 0,632 0,105-0,118 0,135 0, Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

46 Πίνακας 9. Συσχετίσεις των εξεταζόμενων στον ορό ανοσολογικών παραμέτρων μεταξύ τους και με τα κλινικά και μικροβιολογικά ευρήματα μετά την εφαρμογή περιοδοντικής θεραπείας (recall). Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values). CRP MMP-8 IL-8 IL-1β TNFα IL-6 PD PAL BoP P.g (total) B.f (total) T.d (total) CRP MMP IL IL-1β , TNF-α , IL Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

47 Πίνακας 10. Συσχετίσεις των εξεταζόμενων στον ανοσολογικών παραμέτρων ουσιών μεταξύ τους και με τα κλινικά και μικροβιολογικά ευρήματα όσον αφορά τα επίπεδα των μεταβολών τους από την επίδραση της περιοδοντικής θεραπείας. Οι τιμές στα κελιά απεικονίζουν τιμές στατιστικής σημαντικότητας (P Values). CRP MMP-8 IL-8 IL-1β TNFα IL-6 PD PAL BoP P.g (total) B.f (total) T.d (total) CRP - 0,259 0,371 0,858 0,341 0,237 0,669 0,517 0,717 0,360 0,059 0,193 MMP-8 0,259-0,510 0,118 0,622 0,175 0,125 0,005 0,018 0,411 0,068 0,694 IL-8 0,371 0,510-0,111 0,160 0,184 0,976 0,348 0,914 0,264 0,971 0,531 IL-1β 0,858 0,118 0,111-0, ,581 0,450 0,581 0,215 0,041 0,718 TNF-α 0,341 0,622 0,160 0,000-0,170 0,745 0,747 0,843 0,063 0,323 0,021 IL-6 0,237 0,175 0, , ,068 0,929 0,785 0,776 0,940 Επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<

48 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ ΕΙΚΟΝΕΣ (Τεχνική ανοσοαποτύπωσης Checkerboard Immunoblotting) 42

49 Εικόνα 1. Δημιουργία υποστρώματος σύνδεσης για τα δείγματα αναφοράς και τα κλινικά δείγματα Μονοκλωνικά Αντισώματα (MMP-8, IL-8, IL-1β, TNFα, IL-6) Minislot 60 Σύνδεση αντισωμάτων Αναρρόφησή τους Δέσμευση (0.5% καζεΐνη Hammersten για 1 ώρα) Μεμβράνη PVDF Πλαστικό Σφουγγαράκι Φόρτωση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (MMP-8, IL-8, IL-1β, TNFα, IL-6) και κλινικών δειγμάτων (150 ul σε PBST - 2ώρες επώαση σε θερμοκρασία δωματίου) 43

50 Εικόνα 2. Προσθήκη δευτερογενών αντισωμάτων (ανίχνευσης) Απελευθέρωση της Μεμβράνης Εξουδετέρωση Ενδογενούς βιοτίνης Miniblotter Μεμβράνη PVDF Πλαστικό Σφουγγαράκι Τοποθέτησης της μεμβράνης στο Miniblotter (κάθετα στην προηγούμενη φορά) Φόρτωση δευτερογενών αντισωμάτων (1 ώρα επώαση σε θερμοκρασία δωματίου) 44

51 Εικόνα 3. Παραγωγή σημάτων μετά από έκθεση σε υπόστρωμα χημειοφωταύγειας Αυτοραδιογραφούμενο φιλμ Y S S S S + E Y YY Φως Σύστημα χημειοφωταύγειας LumiGlo Περοξειδάση φυτικής προέλευσης συνδεδεμένη σε στρεπταβιδίνη Δευτερογενή αντισώματα συνδεδεμένα με βιοτίνη Ανασυδυασμένες πρωτεΐνες και κλινικά δείγματα Μονοκλωνικά Αντισώματα Μεμβράνη PVDF 45

52 Αραιώσεις δευτερογενών αντισωμάτων MMP- 8 1: : : Καμπύλη Αναφοράς I ΙΙ ΙΙΙ ΙV V VI Κλινικά δείγματα IL- 8 1: : : IL- 1β 1: : : 4000 TNFα 1: 100 1: 200 1: 400 IL- 6 1: 100 1: 200 1: