ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΩΝ ΓΠΜ ΠΛΖΡΟΦΟΡΗΚΖ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΕΩΖ ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ Ζ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ Χ ΤΦΖΛΖ ΑΠΟΓΟΖ ΒΗΟΜΟΡΗΑΚΖ ΑΝΑΛΤΖ ΣΖ ΜΖΥΑΝΗΚΖ ΚΤΣΣΑΡΟΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΧΝ

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΩΝ ΓΠΜ ΠΛΖΡΟΦΟΡΗΚΖ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΕΩΖ ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ Ζ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ Χ ΤΦΖΛΖ ΑΠΟΓΟΖ ΒΗΟΜΟΡΗΑΚΖ ΑΝΑΛΤΖ ΣΖ ΜΖΥΑΝΗΚΖ ΚΤΣΣΑΡΟΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΧΝ πονίδςκ-δοβέκζμξ Η. Βενκανδήξ Βζμθυβμξ ΠΑΣΡΑ, 2013

2

3 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΩΝ ΓΠΜ ΠΛΖΡΟΦΟΡΗΚΖ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΕΩΖ ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ Ζ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ Χ ΤΦΖΛΖ ΑΠΟΓΟΖ ΒΗΟΜΟΡΗΑΚΖ ΑΝΑΛΤΖ ΣΖ ΜΖΥΑΝΗΚΖ ΚΤΣΣΑΡΟΚΑΛΛΗΔΡΓΔΗΧΝ πονίδςκ-δοβέκζμξ Η. Βενκανδήξ Βζμθυβμξ A.M Σνζιεθήξ επζηνμπή: Κθάπα Μανία, ΗΣΔ / ΗΔΥΜΖ Λοβενμφ Εςή, Ηαηνζηή πμθή Π.Π. Μπεγενζάκμξ Ακαζηάζζμξ, Ηαηνζηή πμθή Π.Π. Μέθδ επηαιεθμφξ επζηνμπήξ: Καηζχνδξ Π.-Σι. Βζμθμβίαξ, Κμοηζμφημξ Π.-Σι. Υδιζηχκ Μδπακζηχκ, Μμζπμκάξ Ν.-Ηαηνζηή π., Σζαηαθίδδξ Αε. Σι. Μδπακζηχκ Ζ/Τ η Πθδνμθμνζηήξ ΠΑΣΡΑ, 2013

4

5 Πεξίιεςε Ζ πανμφζα ενβαζία απμηεθεί ιζα ζοκενβαζία ιεηαλφ ημο ενβαζηδνίμο Μεηααμθζηήξ Μδπακζηήξ ηαζ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ ζημ ΗΣΔ / ΗΔΥΜΖ ηαζ ηδξ θανιαημαζμιδπακίαξ Bayer. Ζ θανιαηεοηζηή αζμιδπακία ζηνέθεηαζ ζηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ ιε ηδ πνήζδ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ, ηαεχξ ηα ηφηηανα εδθαζηζηχκ πανέπμοκ ζοβηεηνζιέκα πθεμκεηηήιαηα ζηδκ πμζυηδηα ημο ηεθζημφ πνμσυκημξ. Απμηηά, θμζπυκ, ζδζαίηενμ εκδζαθένμκ δ ιεθέηδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ. Δπίζδξ, ημ οπάνπμκ ζφζηδια παναημθμφεδζδξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ζηδ αζμιδπακία ηνίκεηαζ θζβυηενμ εοαίζεδημ απυ ημ επζεοιδηυ. Μυκμ θίβεξ πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ θαιαάκμκηαζ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ακαγδημφκηαζ κέεξ ιέεμδμζ ιε ιεβαθφηενδ εοαζζεδζία, πμο εα ιπμνμφζακ κα εκζζπφζμοκ ηδκ οπάνπμοζα ενβαθεζμεήηδ παναημθμφεδζδξ. Ζ ιεθέηδ ημο ιεηααμθζζιμφ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, ημο πζμ άιεζα απμηνζκυιεκμο ηαζ δοκαιζηά ιεηαααθθυιεκμο επζπέδμο ηδξ ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ, είκαζ μ ζηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ. Με ηδ δοκαιζηή ακάθοζδ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ιε πνήζδ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ, απακηήεδηακ πμθθαπθά ενςηήιαηα πμο αθμνμφζακ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηοηηανμηαθθζενβεζχκ BHK (baby hamster kidney - κεθνζηά ηφηηανα κεμβκμφ πμζνζδίμο) πμο ήδδ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ θανιαημαζμιδπακία βζα ηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ. Έβζκε πνήζδ GC-MS ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ ζε δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ απυ ορδθήξ ηοηηανζηή ποηκυηδηαξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ ηδξ Bayer, ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ. Γείβιαηα ζοθθέπεδηακ, επίζδξ, απυ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ. ε ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ, δζάθμνμζ πανάβμκηεξ δζαθμνμπμζμφκηακ ηαζ επδνέαγακ, πενζζζυηενμ ή θζβυηενμ, ηδ θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Σέημζμζ ήηακ δ δθζηία ηδξ ηοηηανμηαθθζέβεζαξ, ημ ιέβεεμξ ημο αζμακηζδναζηήνα, ημ ph, δ εενιμηναζία, ημ δζαθοιέκμ μλοβυκμ ηαζ ημ ενεπηζηυ ιέζμ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ έδςζε απακηήζεζξ βφνς απυ ζοβηεηνζιέκεξ αθθαβέξ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηδξ ηάεε ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηαζ απμδείπηδηε ζζπονυ ηαζ εοαίζεδημ ενβαθείμ βζα ηδκ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ. Μεηααμθζηέξ αθθαβέξ πμο μθείθμκηαζ ζηδκ δθζηία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, ιεθεηχκηαζ πνχηδ θμνά ιε ηυζδ θεπημιένεζα. Γείπκεηαζ, επίζδξ, δ επίδναζδ ηςκ δζαηαναπχκ ηςκ παναβυκηςκ πμο δζαιμνθχκμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζηδ θοζζμθμβία ηςκ

6 ηοηηάνςκ ηαζ ηαηά πυζμ απμιαηνφκμοκ ηδκ ηοηηανμηαθθζένβεζα απυ ηδκ ακαιεκυιεκδ θοζζμθμβία. Όθα ηα παναπάκς είκαζ πμθφ ζδιακηζηά ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ηαζ εα ιπμνμφζακ κα μνίζμοκ ηδ ιεηααμθμιζηή ζακ έκα ενβαθείμ επζηφνςζδξ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηαζ ηδξ δζαδζηαζίαξ. Abstract The current work is a collaboration between Metabolic Engineering and Systems Biology laboratory at FOTH / ICE-HT and the pharmaceutical industry Bayer. Biopharmaceutical industry is directed to the production of therapeutic proteins with the use of mammalian cell cultures, as mammalian cells offer particular advantages on the quality of the final product. So, the study of mammalian cell culture physiology becomes very interesting. Additionally, the current cell culture monitoring toolbox in industry is less sensitive than desired. Only few prime variables are counted for the cell culture monitoring. For this reason, new and more sensitive methods that could enhance the current monitoring toolbox are under search. The study of the cell culture metabolism, the most directly responsive and dynamically changing level of the cellular function, is the purpose of the current study. With the dynamic analysis of the metabolic network using metabolomic analysis, multiple questions around the metabolic physiology of BHK (baby hamster kidney) mammalian cell cultures that are currently used in industry for the production of therapeutic proteins, have been answered. GC-MS metabolomic analysis on samples collected from Bayer s high cell density perfusion bioreactors, both laboratory and manufacturing scale ones, was applied. Samples were, also, collected from cell cultures in shake flasks. In three experimental processes, several factors that affect, more or less, the cell culture metabolic physiology, were varied. These factors were: cell culture age, size of the bioreactor, ph, temperature, dissolved oxygen and medium composition of the cell culture. Metabolomic analysis provided answers about particular changes of the cell culture metabolic physiology and was proven powerful and sensitive tool for Cell Culture Engineering. Metabolic differences depended on the cell culture age are studied for the first time in detail. It is, also, shown the effect of perturbations in parameters affecting the cell culture environment on the cellular physiology and how much these perturbations differentiate the expected physiology. This is very important in industrial Cell Culture Engineering, and could define metabolomics as a validation tool for the consistency of cell culture physiology and process.

7 Με αβηάθζαζε ηαζ ιίθδζε ρζεονζζηά ζημ αοηί ιμο. «Ξδιένςζε! Πνέπεζ κα παξ ζημ ενβαζηήνζμ.» Άκμζλα ηα ιάηζα ηαζ δεκ ήηακ εηεί, αθθά είπε δίηζμ. Δίπε λδιενχζεζ. Γζα ηδ ιδηένα ιμο Υνζζηίκα

8

9 Δπραξηζηίεο Όηακ λεηζκμφζε αοηή δ υιμνθδ πενζπέηεζα, μζ ημκηζκμί ιμο άκενςπμζ, αθθά ηαζ αοημί πμο είπακ ηδκ ειπεζνία ζημ πανεθευκ, ιε ζοιαμφθεοακ κα μπθζζηχ ιε οπμιμκή ηαζ επζιμκή. Γζαπίζηςζα υηζ αοηά ηα δφμ είκαζ απαναίηδηα, αθθά ζε αημθμοεμφκ ιυκα ημοξ υηακ είζαζ ζίβμονμξ υηζ αημθμοεείξ δνυιμοξ πμο εέθεζξ ηαζ κζχεεζξ βειάημξ απυ ηδκ ηαηεφεοκζδ πμο έπεζ πάνεζ δ γςή ζμο. ε ιζα δζαδνμιή ιε απμβμδηεφζεζξ ηαζ πανέξ, θφπεξ ηαζ εκεμοζζαζιμφξ, είπα ηδκ εοηαζνία κα απμημιίζς ειπεζνίεξ πμο δε θακηαγυιμοκ. Ήηακ ιζα δζαδνμιή πμο ιε δοκάιςζε, ιμο έδςζε ηδκ ανεηή ηδξ αοημηνζηζηήξ ηαζ, ζε ηάπμζεξ πενζπηχζεζξ, έκζςζα ηαζ ηδκ ακαβκχνζζδ. Ηδζαίηενα εοπάνζζημ ήηακ ημ υηζ είπα ηδκ ηφπδ κα βκςνίζς ακενχπμοξ πμο ηαευνζζακ ημκ ηνυπμ ζηέρδξ ιμο ηαζ ιμφ πάνζζακ ειπεζνίεξ πμο δε εα λεπάζς πμηέ. Πνχηα, εέθς κα εοπανζζηήζς εενιά ηδκ Καε. Κθάπα Μανία πμο πίζηερε ζε ιέκα ηαζ ιμο άκμζλε ηδκ πυνηα ζε έκα κέμ ηυζιμ πμο ιμο έιμζαγε πνζκ δζαθμνεηζηυξ. Σμκ ηυζιμ ηδξ ένεοκαξ. Φχκαγε, απυ ηδκ πνχηδ ζηζβιή, υηζ ιε εέθεζ «εφπθαζημ» βζα κα ιε εηπαζδεφζεζ ηαζ ηα ηαηάθενε ζε πμθφ ιεβάθμ ααειυ, αθμφ αεθηίςζα ηζξ ζηακυηδηέξ ιμο ζημ πείναια, ζηδκ αλζμθυβδζδ δεδμιέκςκ, ζηδκ πανμοζίαζδ ηδξ δμοθεζάξ ηαζ ζημ βνάρζιμ. Σα ζδιακηζηυηενα πμο παίνκς απυ αοηήκ είκαζ έκαξ κέμξ ηνυπμξ ηνζηζηήξ ζηέρδξ ζηδκ ένεοκα, δ ζηακυηδηα κα ακαβκςνίγς ηζξ πναβιαηζηέξ επζζηδιμκζηέξ αλίεξ ηαζ δ επζιμκή ζηδ θεπημιένεζα. Δοπανζζηχ, επίζδξ, ημκ παηένα ιμο Γζάκκδ ηαζ ημκ αδενθυ ιμο Μάκμ, πμο πμθθέξ θμνέξ ζηάεδηακ ζακ ζοκαζζεδιαηζημί μβηυθζεμζ δίπθα ιμο ηαζ «έααθακ πθάηδ» ζηζξ πνμζπάεεζέξ ιμο. Πανυιμζμ νυθμ έπαζλακ ιέθδ ηδξ μζημβέκεζάξ ιμο υπςξ δ εεία ιμο Βμφθα, αθθά ηαζ μζ οπυθμζπμζ (βζαβζά Ηςάκκα, Πενζηθήξ, Φχηδξ, Μζιή), ζε δφζημθεξ ζοβηονίεξ. Δοπανζζηχ ηα ιέθδ ηδξ ηνζιεθμφξ επζηνμπήξ, Καε. Λοβενμφ Εςή ηαζ Καε. Μπεγενζάκμ Ακαζηάζζμ, πμο ιμφ επέηνερακ κα λεηζκήζς αοηήκ ηδκ πμνεία. Δοπανζζηίεξ ζηα ιέθδ ηδξ επηαιεθμφξ επζηνμπήξ ηαζ ζδζαίηενα ζημκ Καε. Μμζπμκά Νζηυθαμ, μ μπμίμξ ήηακ ημκηά ζημ ενβαζηήνζμ ηαζ είπε πάκηα εφζημπεξ επζζηδιμκζηέξ παναηδνήζεζξ κα ηάκεζ. Θέθς κα εοπανζζηήζς ημοξ πμθφ ηαθμφξ ιμο θίθμοξ Μαηζάββμ πφνμ ηαζ Σζμθάημ ηαφνμ, πμο βκχνζζα ηαηά ηδ θμίηδζή ιμο ζημ ΓΠΜ Πθδνμθμνζηή

10 Δπζζηδιχκ Εςήξ. Δπίζδξ, ηζξ Κανφδδ Βαζζθζηή ηαζ Νηαή Αζηαηενίκδ, μζ μπμίεξ ανέεδηακ δίπθα ιμο ζηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδνμιήξ αοηήξ ηαζ ιε ζηήνζλακ, πζζηεφμκηαξ ζηδκ πνμζπάεεζα, αθθά ηαζ ημοξ ζηεκμφξ ιμο θίθμοξ Ακαζηάζζμ Γεςνβυπμοθμ, Ζθία Σμοθζάημ, Ζθία Γανβανυπμοθμ, Γεχνβζμ Βαζζθζηυπμοθμ ηαζ Αββεθζηή Φςιζάδδ. Σέθμξ, εέθς κα εοπανζζηήζς ημοξ πναβιαηζημφξ θίθμοξ ιμο απυ ημ ενβαζηήνζμ Μεηααμθζηήξ Μδπακζηήξ ηαζ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ, Υνζζημκίηδ Μάββα, Καηενίκα Βαζζθμπμφθμο, Γζμκοζία οιεςκίδδ, Κςκζηακηίκμ Γηνίκηγαθδ, Άνδ Σεθχκδ, Δθέκδ Καοηζά. Αηυια ημοξ Μακχθδ Παπαδδιδηνυπμοθμ, Γζμκοζία Κανφδδ, Κςκζηακηίκα Ηςακκίδδ, Νίηδ Λμαένδμο ηαζ υθδ ηδκ μιάδα. Όθμζ έηακακ ηδκ ηαεδιενζκυηδηα ζημ ενβαζηήνζμ εκδζαθένμοζα ηαζ εοπάνζζηδ. πφνμξ Η. Βενκανδήξ Νμέιανζμξ, 2013

11 1 Περιεχόμενα A. Θεςνδηζηυ ιένμξ... 7 A.1 Δζζαβςβή... 8 Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ηαζ ηνέπμκ ζφζηδια παναημθμφεδζδξ Ακηζηείιεκμ ενβαζίαξ ηαζ ιέεμδμζ πμο αημθμοεήεδηακ Πενζβναθή ηδξ ενβαζίαξ (εέζδξ) Α.2 Μεηααμθζζιυξ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ Κφνζα ιμκμπάηζα ιεηααμθζζιμφ άκεναηα Γθοημβθμοηαιζκυθοζδ Αενυαζα βθοηυθοζδ ακηί μλεζδςηζηήξ θςζθμνοθίςζδξ Πανάβμκηεξ πμο δζαιμνθχκμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Γζαθοιέκμ μλοβυκμ ph Θενιμηναζία Α.3 Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ Ακάπηολδ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ Γεκεηζηή ηαζ Μεηααμθζηή Μδπακζηή Βζμακηζδναζηήνεξ ηαζ θεζημονβία Λεζημονβία Σνέπμκ ζφζηδια παναημθμφεδζδξ Α.4 Μεηααμθμιζηή Ακάθοζδ Βήιαηα ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ οθθμβή ηαζ απμιυκςζδ δείβιαημξ Απμιυκςζδ ιεηααμθζηχκ Παναβχβζζδ ιεηααμθζηχκ... 47

12 2 Σεπκζηέξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ Δλαβςβή ιεηααμθζημφ πνμηφπμο - ηαοημπμίδζδ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ιεηααμθζηχκ παναβχβςκ Απμιάηνοκζδ ιδ-ειπζζηεφζζιςκ δεδμιέκςκ Κακμκζημπμίδζδ Πμθοπαναιεηνζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ Δλαβςβή ζοιπεναζιάηςκ πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ B. ηυπμξ Γ. Τθζηά ηαζ ιέεμδμζ Πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Λεζημονβία αζμακηζδναζηήνα ηαζ παναημθμφεδζδ Μεηααμθμιζηή ακάθοζδ οθθμβή δείβιαημξ Δηπφθζζδ ιεηααμθζηχκ ηαζ παναβχβζζδ Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Μέηνδζδ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ηαζ ηακμκζημπμίδζδ Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Πμθοπαναιεηνζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ Ακαηαηαζηεοή ιεηααμθζημφ δζηηφμο Γ. Απμηεθέζιαηα Ακαηαηαζηεοή ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηοηηάνςκ ΒΖΚ... 84

13 3 Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ηαεενή αζμθμβζηή δζαδζηαζία Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ακαβκςνίγεζ ηδκ αθθαβή ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ Μεηααμθζηέξ αθθαβέξ ακελάνηδηεξ ημο ιεβέεμοξ ημο αζμακηζδναζηήνα Ο αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήναξ πμο εηηίκδζε ηαηά ηδκ ηεθζηή θάζδ θηάκεζ ζηδκ ακαιεκυιεκδ ηαηάζηαζδ θοζζμθμβίαξ Μεηααμθζηέξ ιεηααάζεζξ απυ θάζδ ζε θάζδ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Δλέηαζδ ηςκ δφμ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ απυ ημζκμφ Ακάδεζλδ ιεηααμθζημφ πνμηφπμο ιεηάααζδξ απυ ηδκ ανπζηή ζηδ ιέζδ θάζδ φβηνζζδ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ιε αέθηζζηεξ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ ζηδ ιέζδ θάζδ Δπίδναζδ ημο πανάβμκηα εενιμηναζία Βζμακηζδναζηήναξ L10: Ζ θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ επακένπεηαζ Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο φβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ Δ. ογήηδζδ Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Γεκζηή ζφκμρδ ηαζ ιεθθμκηζηέξ ηαηεοεφκζεζξ Δ. Βζαθζμβναθία Σ. Πανάνηδια

14 4

15 5 Σχήματα πήια Α. 1 Πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ ζηδ αζμιδπακία ζήιενα πήια Α. 2 Κφνζα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα πήια Α. 3 πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ πήια Α. 4 ηάδζα ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ πήια Α. 5 Υνςιαημβνάθδια ηαζ θάζια ιάγαξ πήια Α. 6 Αθβυνζειμζ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ πήια Γ. 1 Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ πήια Γ. 2 Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πήια Γ. 3 Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο πήια Γ. 4 Βήιαηα GC-MS ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ πήια Γ. 1 Ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηοηηάνςκ ΒΖΚ πήια Γ. 2 Ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηοηηάνςκ ΒΖΚ ιε ιεηνμφιεκμοξ ιεηααμθίηεξ πήια Γ. 3 Γναθήιαηα πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ πήια Γ. 4 Πείναια 1 HCL, PCA πήια Γ. 5 Πείναια 2 HCL, PCA πήια Γ. 6 Ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιεηαλφ ανπζηήξ ηαζ ιέζδξ θάζδξ πήια Γ. 7 Ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιεηαλφ ιέζδξ ηαζ ηεθζηήξ θάζδξ πήια Γ. 8 φβηνζζδ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ1 ηαζ Σ πήια Γ. 9 φβηνζζδ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ1 ηαζ Σ πήια Γ. 10 Πανάβμκηαξ Θενιμηναζία (Σ) πήια Γ. 11 Ακάθοζδ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ L πήια Γ. 12 φβηνζζδ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ Α, Β, C, D ηαζ E

16 6 Πίνακες Πίκαηαξ 1: Xαναηηδνζζηζημί ιεηααμθίηεξ ημο πδιζηά πνμηαεμνζζιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ ΒΖΚ απυ ηδ Bayer Πίκαηαξ 2: Απαναίηδηα ηαζ ιδ- απαναίηδηα αιζκμλέα ζε ηφηηανα εδθαζηζηχκ Πίκαηαξ 3: Γείπκμκηαζ μζ ημζκμί ιεηααμθίηεξ ηςκ ηνζχκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ ηαζ μζ εθάπζζηεξ-ιέβζζηεξ ζπεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημοξ Πίκαηαξ 4: Κθάζια ιεηααμθήξ (ζπεηζηή ζοβηέκηνςζδ ιεηααμθίηδ ζηδκ ανπζηή θάζδ / ιέζδ θάζδ) ηςκ ιεηααμθζηχκ ηαζ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ Πίκαηαξ 5: Κθάζια ιεηααμθήξ (ζπεηζηή ζοβηέκηνςζδ ιεηααμθίηδ ζηδκ ανπζηή θάζδ / ιέζδ θάζδ) ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ ζηα δείβιαηα L10_T7 ηαζ L11_T

17 A. Θεσξεηηθό κέξνο 7

18 8 A.1 Δζζαβςβή ε ιζα επμπή πμο δ θανιαηεοηζηή αζμιδπακία ανίζηεηαζ ζε μζημκμιζηή άκεδζδ, ηα ζφβπνμκα επζηεφβιαηα ηδξ αζμθμβζηήξ ένεοκαξ ανίζημκηαζ ζημ επίηεκηνμ ημοξ εκδζαθένμκημξ. Ζ πνήζδ ηδξ κέαξ βκχζδξ απυ ηδ αζμιδπακία απμηηά, πένα απυ ημ ζαηνζηυ, ηαζ μζημκμιζηυ εκδζαθένμκ. Έκαξ πμθθά οπμζπυιεκμξ ημιέαξ είκαζ δ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ, υπμο ηφηηανα ηαθθζενβμφκηαζ οπυ εθεβπυιεκεξ ζοκεήηεξ, χζηε κα απμδχζμοκ εεναπεοηζηέξ πνςηεΐκεξ. Ζ έθθεζρδ ζοβηεηνζιέκςκ πνςηεσκχκ απυ μιάδεξ ημο πθδεοζιμφ είκαζ δοκαηυ, ηχνα πζα, κα ηαθοθεεί απυ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ. Ζ αζμιδπακία έπεζ πνμπςνήζεζ ζηδκ παναβςβή ηέημζςκ ζηεοαζιάηςκ πμο αθμνμφκ αηυια ηαζ ζε πνςηεΐκεξ πμο ηζξ πνεζάγμκηαζ ιζηνέξ πθδεοζιζαηέξ μιάδεξ. Ζ αζμθμβζηή ένεοκα ηα ηεθεοηαία πνυκζα, ιε ηδ αμήεεζα ηςκ ηεπκμθμβζηχκ ελεθίλεςκ, ηαεχξ ηαζ ηδξ ζοιιεημπήξ ηδξ Πθδνμθμνζηήξ επζζηήιδξ, έπεζ πάνεζ ιζα κέα ζηνμθή. Ζ οζηδιζηή Βζμθμβία είκαζ ημ κέμ πεδίμ πμο ακαθένεηαζ ζηδκ πμζμηζηή ακάθοζδ ηςκ δοκαιζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ ηςκ δζαθυνςκ ζοζηαηζηχκ εκυξ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ ζημπεφεζ ζηδκ ηαηακυδζδ ηδξ ζοιπενζθμνάξ ημο ζοζηήιαημξ μθζζηζηά (Hood & Galas, 2003; Wang et al, 2010). Σα πεζναιαηζηά δεδμιέκα ζοκμδεφμκηαζ απυ ιαεδιαηζηέξ ιμκηεθμπμζήζεζξ ηαζ πνμζμιμζχζεζξ (Kitano, 2002b; igoutsos & Stephanopoulos, 2007). Σαοηυπνμκα βίκεηαζ ακάπηολδ αθβμνίειςκ βζα ηδ δζαπείνζζδ ηςκ ζδζαζηενμηήηςκ ηςκ αζμθμβζηχκ δεδμιέκςκ, υπςξ ηαζ εθανιμβή ιεευδςκ ζηαηζζηζηήξ βζα ηδ δζαπείνζζδ ημο ιεβάθμο υβημο ημοξ. ηδκ ακάπηολδ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ ζοκεηέθεζε δ επακάζηαζδ ηςκ μιζηχκ ηεπκμθμβζχκ (Kitano, 2002a; Klapa & Quackenbush, 2003), υπμο έβζκε δοκαηή δ ιεθέηδ ηςκ δζαθυνςκ επζπέδςκ ηδξ ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ μθζζηζηά ηαζ ιε πεζνάιαηα ορδθήξ απυδμζδξ, δδθαδή ιε ιζηνυ ανπζηυ δείβια, χζηε κα πνμηφπημοκ μθζζηζηά δεδμιέκα. Έηζζ, ιεθεηάιε ημ βμκζδίςια, ημ πνςηεΐκςια, ημ ιεηααυθςια, ηζξ πνςηεσκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ, ηζξ ιεηααμθζηέξ νμέξ ηαζ ηάκμοιε θυβμ βζα βςκζδζςιαηζηή, πνςηεσκςιαηζηή, ιεηααμθμιζηή, interactomics, fluxomics, ακηίζημζπα.

19 9 Αοηέξ μζ πνμζεββίζεζξ ιάξ επζηνέπμοκ κα λεθεφβμοιε απυ ηδ ιεθέηδ ζοβηεηνζιέκςκ ζημζπείςκ ηδξ ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ ηαζ κα ιεθεημφιε εονφηενα πεδία. Ζ ακηίθδρδ υηζ ημ ηφηηανμ, αθθά ηαζ μ ζζηυξ, ημ υνβακμ, μ μνβακζζιυξ, απμηεθμφκηαζ απυ ζημζπεία ηα μπμία αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ ζε έκα δίηηομ αθθδθεπζδνάζεςκ αμδεά ζηδκ ηαηακυδζδ υηζ ηοπμφζεξ αθθαβέξ ή δζαηαναπέξ επδνεάγμοκ υθμ ημ ζφζηδια ζε ιζα αθοζίδα ακηζδνάζεςκ. Απυ ημ ζφκμθμ ηςκ ζημζπείςκ ηαζ αθθδθεπζδνάζεςκ πνμηφπηεζ έκα ζφζηδια υπμο εκέπμκηαζ ζδζυηδηεξ πμο δε θαίκμκηαζ ηιδιαηζηά, αθθά ιυκμ ιεηά ημ ζοκδοαζιυ, ηδκ αθθδθεπίδναζδ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο ζοζηήιαημξ (ακαδουιεκεξ ζδζυηδηεξ). Δδχ ανίζηεηαζ μ ζηυπμξ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ πμο είκαζ δ ηαηακυδζδ ηδξ θεζημονβίαξ ημο ζοζηήιαημξ ζα ζφκμθμ ηαζ υπζ ηςκ επζιένμοξ παναηηδνζζηζηχκ ηαζ ιυκμ. Έκα απυ ηα πζμ δοκαιζηά επίπεδα ηδξ ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ είκαζ μ ιεηααμθζζιυξ, μ μπμίμξ ακαθένεηαζ ζημ ζφκμθμ ηςκ αζμπδιζηχκ ακηζδνάζεςκ πμο ζοιααίκμοκ ζημ ηφηηανμ βζα ηδ ιεηαθμνά εκένβεζαξ ηαζ άκεναηα, χζηε κα παναπεμφκ ιαηνμιυνζα απαναίηδηα βζα ηδ θεζημονβία ημο ηοηηάνμο. Όπςξ ηάεε επίπεδμ ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ, μ ιεηααμθζζιυξ δε δνα αοηυκμια ηαζ ακελάνηδηα, αθθά ανίζηεηαζ ζε αθθδθεπίδναζδ ιε ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ ηαζ ηζξ πνςηεσκζηέξ θεζημονβίεξ, υπςξ ηαζ ιε ημ ελςηοηηανζηυ πενζαάθθμκ. Ο ιεηααμθζζιυξ είκαζ δοκαιζηυξ ηαζ, ζε έκα ααειυ, αοημνοειίγεηαζ. Δίκαζ ημ πνχημ επίπεδμ πμο επδνεάγεηαζ απυ ημ πενζαάθθμκ ημο ηοηηάνμο, βζαηί είκαζ ζε εέζδ κα ακηζθαιαάκεηαζ εθθείρεζξ ή πθεμκάζιαηα ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ, αθθαβέξ ζημ ph ηαζ ηδ εενιμηναζία. Ζ ιεηααμθμιζηή είκαζ ιζα απυ ηζξ μιζηέξ ακαθφζεζξ πμο επζηνέπεζ ηδκ μθζζηζηή πνμζέββζζδ ημο ιεηααμθζζιμφ, ηαεχξ αθμνά ζηδκ ορδθήξ απυδμζδξ ακάθοζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ ηαηάζηαζδξ εκυξ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ιε αάζδ ηδκ ηαοηυπνμκδ ιέηνδζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ υθςκ ηςκ εθεφεενςκ, ιζηνχκ, ιεηααμθζηχκ (Fiehn et al, 2000; Kanani et al, 2008; oessner et al, 2000). Μζθχκηαξ βζα ιεηααμθίηεξ εκκμμφιε ηα ακηζδνχκηα ή πνμσυκηα ημο ιεηααμθζζιμφ, πμο εθέβπεηαζ απυ ηα έκγοια, ηα μπμία απμηεθμφκ ημοξ ηαηαθφηεξ ηςκ αζμπδιζηχκ ακηζδνάζεςκ. Καεχξ ημζηάγμοιε ηα δζάθμνα επίπεδα θεζημονβίαξ ημο ηοηηάνμο αθέπμοιε ημ DNA κα εθέβπεζ ηδκ παναβςβή NA ιεηαβνάθςκ ηαζ ηδκ παναβςβή πνςηεσκχκ. Οζ πνςηεΐκεξ (έκγοια) ηαεμνίγμοκ ημ ιεηααμθζηυ δίηηομ ημ μπμίμ απμηνίκεηαζ ζε ενεείζιαηα ημο πενζαάθθμκημξ άιεζα ηαζ δοκαιζηά. Οζ απμηνίζεζξ αοηέξ ιεηααζαάγμκηαζ ζηαδζαηά

20 10 ηαζ ζηα άθθα επίπεδα θεζημονβίαξ ηαζ, έηζζ, αθέπμοιε ημ ιεηααμθζζιυ κα επδνεάγεζ ηαζ κα επδνεάγεηαζ απυ ηα δζάθμνα επίπεδα. Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ηαζ ηνέπμκ ζφζηδια παναημθμφεδζδξ Ζ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ αθμνά ζηδ πνήζδ γςζηχκ ηοηηάνςκ ηαζ, ηονίςξ, ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ βζα ηδκ παναβςβή ειπμνζηά εηιεηαθθεφζζιςκ αζμθμβζηχκ ηαζ θανιαηεοηζηχκ πνμσυκηςκ, υπςξ ειαυθζα, ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα, μνιυκεξ, αζηαιίκεξ, ζμφξ ηαζ ηαθθοκηζηά (Arden & Betenbaugh, 2004; Zhang et al, 2010). Σα ηφηηανα εδθαζηζηχκ πνμηζιχκηαζ, ηονίςξ, βζα ηδκ παναβςβή πμθφπθμηςκ εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ, επεζδή πανέπμοκ ηδκ απαναίηδηδ ακαδίπθςζδ ηαζ ηζξ ιεηαιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ, πςνίξ κα απαζημφκ πεναζηένς επελενβαζία βζα κα απμδχζμοκ ημ ηεθζηυ πνμσυκ (Hu & Aunins, 1997). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ ζε ανζζημπμζδιέκεξ ζοκεήηεξ βζα ηδκ παναβςβή ημο πνμζδμηχιεκμο πνμσυκημξ, έπεζ ζοβηεηνζιέκεξ απαζηήζεζξ ηαζ απμηεθεί ιεβαθφηενδ πνυηθδζδ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ααηηδνίςκ ή ιοηήηςκ. Έηζζ, δ Mδπακζηή Kοηηανμηαθθζενβεζχκ ζε αζμιδπακζηή ηθίιαηα ααζίγεηαζ ηαζ ζπεηίγεηαζ ιε ηζξ ελεθίλεζξ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ. Αοηυ είκαζ βεβμκυξ βζαηί μ ηαεμνζζιυξ α) ηςκ αέθηζζηςκ ζοκεδηχκ αφλδζδξ ηαζ α) ηδξ ηαηαθθήθςξ ηνμπμπμζδιέκδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ βζα κα ηαεζενςεεί ιζα δζαδζηαζία ηαθθζένβεζαξ ζε αζμακηζδναζηήνα πμο κα παναηηδνίγεηαζ απυ ορδθή απυδμζδ ηαζ πμζυηδηα, αθθά ηαζ απυ ζπεηζηά παιδθυ ηυζημξ, είκαζ έκαξ ααζζηυξ ζηυπμξ βζα ηδ αζμιδπακία, δ μπμία ανίζηεηαζ ηάης απυ ιυκζιδ μζημκμιζηή πίεζδ ηαζ ακηαβςκζζιυ ζε ζοκδοαζιυ ιε αοζηδνέξ πνμδζαβναθέξ βζα ζηαεενή πμζυηδηα πνμσυκημξ ζε αζθοηηζηά πνμκζηά πενζεχνζα. ηαεενή δζαδζηαζία ηοηηανμηαθθζένβεζαξ αθθδθμζοκεπάβεηαζ ζηαεενή πμζυηδηα πνμσυκημξ. ε αοηυ ημ πθαίζζμ, δ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ πνεζάγεηαζ ηδκ ενβαθεζμεήηδ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ βζα αηνζαή ηαζ εοαίζεδηδ παναημθμφεδζδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Σα ενβαθεία αοηά ιπμνμφκ κα πανέπμοκ ηζξ εββοήζεζξ βζα ζηαεενή δζαδζηαζία παναβςβήξ, πμο απμδίδεζ πνμσυκηα

21 11 ζοβηεηνζιέκδξ πμζυηδηαξ, ακελάνηδηα απυ ημ ιέβεεμξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Δπζπθέμκ, μζ ακαθοηζηέξ ηαζ οπμθμβζζηζηέξ ιέεμδμζ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ, ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ζηδ ζοβηέκηνςζδ δεδμιέκςκ θοζζμθμβίαξ, ηα μπμία, ηαηυπζκ ηαηάθθδθδξ ακάθοζδξ, ιπμνμφκ κα αμδεήζμοκ ζημκ ηαεμνζζιυ ηαηάθθδθςκ ζηυπςκ βεκεηζηήξ ηνμπμπμίδζδξ, χζηε κα εκζζποεεί δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ δ πμζυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ. Οζ ηφνζμζ αζμακηζδναζηήνεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ είκαζ μζ αζμακηζδναζηήνεξ δζαθείπμκημξ ένβμο ηαζ μζ ορδθήξ ποηκυηδηαξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. Ζ πανμφζα ενβαζία πναβιαηεφεηαζ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. Αοηή ηδ ζηζβιή, μζ ιεηνήζεζξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ (πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ) ζηδ αζμιδπακία πενζθαιαάκμοκ ιενζηέξ ηφνζεξ ιεηααθδηέξ, υπςξ ημ νοειυ αφλδζδξ, ημ νοειυ ηαηακάθςζδξ ημο οπμζηνχιαημξ, ημ νοειυ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ, ηδκ πμζυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ πμο πανάβεηαζ ηαζ ημοξ εζδζημφξ νοειμφξ ηςκ παναπάκς ιεηααθδηχκ (πήια Α.1) (Goudar et al, 2009). Έπεζ δεζπηεί υηζ οπάνπεζ ζδιακηζηή δζαηφιακζδ ηςκ πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ πμο ακηακαηθάηαζ ζηζξ πνμαθέρεζξ ηςκ εζδζηχκ νοειχκ. Αοηυ ημ παναβυιεκμ ζθάθια ιεζχκεζ ηδκ εοαζζεδζία ημο ζοκυθμο ηςκ ιεηνήζεςκ, χζηε κα ακαβκςνίγμκηαζ ιζηνέξ αθθαβέξ ζηδ θοζζμθμβία ηαζ μζ μπμίεξ εα ιπμνμφζακ κα πνμεζδμπμζήζμοκ βζα πζεακέξ ανκδηζηέξ επζπηχζεζξ ζηδκ πμζυηδηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ, ηαη επέηηαζδ ζε αοηήκ ημο πνμσυκημξ. Δπζπθέμκ, ημ ηνέπμκ ζφκμθμ ιεηνήζεςκ θαιαάκεζ οπ υρζκ ζοβηεηνζιέκα ηιήιαηα ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηαζ δε δίκεζ ηδκ ακάθοζδ εκυξ εηηεηαιέκμο πάνηδ ηδξ ιεηααμθζηήξ εκενβυηδηαξ, αθθά έκα πενζμνζζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ. Πένα απυ ημ πναηηζηυ πνυαθδια ηδξ ιδ ακίπκεοζδξ υθςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ αθθαβχκ οπάνπεζ ηαζ ημ ααζζηυ πνυαθδια ηδξ εθθζπμφξ ηαηακυδζδξ ηδξ αζμθμβζηήξ δοκαιζηήξ ηαζ, ηαη επέηηαζδ, ηδξ επανημφξ ιεθέηδξ ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ. Τπυ αοηυ ημ πνίζια, είκαζ απμδεηηυ πζα, υηζ δ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ζηδ αζμιδπακία εα ιπμνμφζε κα επςθεθδεεί απυ οπμθμβζζηζηέξ ηαζ ακαθοηζηέξ ιεευδμοξ πμο εα επέηνεπακ ιζα μθζζηζηή υρδ ηδξ εκενβυηδηαξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ιε ζηυπμ ηδκ ελαβςβή αζμθμβζηχκ ζοιπεναζιάηςκ (Cuperlovic-Culf et al, 2010; Khoo & Al- ubeai, 2007; Lim et al, 2010; Zamboni & Sauer, 2009).

22 12 φιθςκα ιε αοηήκ ηδκ άπμρδ, εεςνείηαζ υηζ δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ιπμνεί κα πανέπεζ ιζα πζμ εηηεηαιέκδ πνμμπηζηή ηδξ ηοηηανζηήξ ιεηααμθζηήξ ηαηάζηαζδξ απυ ημ ζφκμθμ ηςκ πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ πμο ακαθένεδηε. Σα ιεηααμθζηά πνυηοπα, εηηεηαιέκμο ανζειμφ ιεηααμθζηχκ, ακαιέκεηαζ κα πανέπμοκ ιεβαθφηενδ εοαζζεδζία ζηδκ ακίπκεοζδ ηςκ αθθαβχκ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ. ε ενβαζηδνζαηή ηθίιαηα, δ ιεηααμθμιζηή έπεζ πνδζζιμπμζδεεί βζα ημ παναηηδνζζιυ ηοηηάνςκ (Chinese hamster ovary), ανπζηά απυ ιεηααμθίηεξ ημο ενεπηζημφ ιέζμο (Chong et. al, 2011; Bradley et. al, 2010) ηαζ πζμ πνυζθαηα βζα εκδμηοηηανζημφξ ιεηααμθίηεξ (Selvarasu et. al, 2012; Dietmair et. al, 2012). Σμ ενβαζηήνζυ ιαξ πανμοζίαζε ηδκ πνχηδ ενβαζία ιεηααμθζηήξ πνμηοπμπμίδζδξ ηοηηάνςκ BHK (κεθνζηά ηφηηανα κεμβκμφ πμζνζδίμο - baby hamster kidney) πμο είπακ ζοθθεπεεί απυ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ ιε πνήζδ Υνςιαημβναθίαξ Αενίςκ Φαζιαημιεηνίαξ Μάγαξ (GC MS, Gas Chromatography Mass Spectrometry). Ζ ιεθέηδ αοηή έδςζε ζζπονέξ εκδείλεζξ υηζ δ ιεηααμθμιζηή ιπμνεί κα απμδεζπηεί πνήζζιδ ζηδκ ακίπκεοζδ ιζηνχκ ιεηααμθζηχκ αθθαβχκ πμο δε εα ήηακ δοκαηυ κα ακζπκεοεμφκ απυ ημ οπάνπμκ ζφκμθμ πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ. glucose glucose biomass biomass lactate glutamine biomass lactate glutamine biomass πήια Α. 1 Πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ ζηδ αζμιδπακία ζήιενα. Σμ ζφκμθμ ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ πενζθαιαάκεζ ημ νοειυ αφλδζδξ, ημ νοειυ ηαηακάθςζδξ ημο οπμζηνχιαημξ, ημ νοειυ παναβςβήξ ημο βαθαηηζημφ μλέμξ ηαζ ηδκ πμζυηδηα ηδξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ. ε ζφβηνζζδ ιε ηδκ πμθοπθμηυηδηα ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο, μζ ιεηνήζεζξ αοηέξ πανέπμοκ έκακ ιζηνυ ανζειυ αζζεδηήνςκ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηαζ έπμοκ ζακ απμηέθεζια ηδκ παναηήνδζδ εκυξ πενζμνζζιέκμο ιεηααμθζημφ δζηηφμο.

23 13 Ακηζηείιεκμ ενβαζίαξ ηαζ ιέεμδμζ πμο αημθμοεήεδηακ Με αάζδ ηα παναπάκς, εθανιυζηδηε ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ζε ηοηηανζηή ζεζνά εδθαζηζηχκ πμο πνδζζιμπμζμφηακ ήδδ βζα ηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ. ηδκ πανμφζα ενβαζία, ημ οπυ ιεθέηδ ζφζηδια ήηακ ηφηηανα BHK ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ, ορδθήξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ, ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ, αθθά ηαζ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ. ε ιζα ζοκενβαζία ιε ημ ηιήια HealthCare ηδξ Bayer ημο San Francisco, λδνή αζμιάγα ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ απμζηεθθυηακ βζα ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ, εκδμηοηηανζηά, ιε Υνςιαημβναθία Αενίςκ Φαζιαημζημπία Μάγαξ (GC- MS) ζημ ενβαζηήνζμ Μεηααμθζηήξ Μδπακζηήξ ηαζ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ. Οζ αεακαημπμζδιέκεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηαηάβμκηαζ απυ ηαπέςξ αολακυιεκα ηφηηανα. Ο ιεηααμθζζιυξ ηέημζςκ ηοηηάνςκ παναηηδνίγεηαζ απυ ιεβάθδ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ ηαζ αενυαζα βθοηυθοζδ (Warburg et. al, 1927). Δίκαζ μ ιεηααμθζζιυξ πμο ζοκακηάηαζ ζε ηανηζκζηά ηφηηανα. Σα ηφηηανα ΒΖΚ δε εα ιπμνμφζακ κα απμηεθμφκ ελαίνεζδ ηαζ πάκς ζε αοηή ηδ αάζδ πνέπεζ κα ιεθεηδεμφκ. Με μδδβυ ηδκ πνμδβμφιεκδ δμοθεζά ζημ ενβαζηήνζμ (Chrysanthopoulos et. al, 2010) ηαζ ιε αάζδ ηα πνμακαθενεέκηα, ζηυπμξ ήηακ λα απνζαθεληζηεί ε ρξεζηκόηεηα ηεο κεηαβνινκηθήο ζηελ αλάιπζε θαη παξαθνινύζεζε ηεο κεηαβνιηθήο θπζηνινγίαο ησλ θπηηαξνθαιιηεξγεηώλ βηνκεραληθήο θιίκαθαο πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη γηα ηελ παξαγσγή ζεξαπεπηηθώλ πξσηετλώλ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα: - Να ιεθεηδεεί μθζζηζηά μ ιεηααμθζζιυξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ ηοηηάνςκ (BHK) ηαζ κα ακαηαηαζηεοαζηεί ημ ιεηααμθζηυ δίηηομ ημο ηφνζμο ιεηααμθζζιμφ ημοξ, ιε αάζδ ημκ πμκηζηυ (Mus musculus), χζηε κα οπάνπεζ έημζιδ πθαηθυνια ιεθέηδξ. - Να αλζμθμβδεεί ζε πμζμ ααειυ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα πμο πνμηφπημοκ απυ ηδ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ, είκαζ εοαίζεδηα ζηζξ αθθαβέξ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. - Να δζενεοκδεεί ακ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα είκαζ εοαίζεδηα ζε δζαηαναπέξ ημο πενζαάθθμκημξ αφλδζδξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Πανάβμκηεξ πμο

24 14 ηαεμνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ είκαζ ημ ph, ημ δζαθοιέκμ μλοβυκμ, δ εενιμηναζία ηαζ μ ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ. - Να ιεθεηδεεί δ αθθαβή ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ υηακ ημ οπυζηνςια ιεηααάθθεηαζ ςξ πνμξ ηδ ζφζηαζδ ζοβηεηνζιέκςκ ιμκμζαηπανζηχκ (βθοηυγδ-ιακκυγδ). - Να αλζμθμβδεμφκ μζ ιεηααμθέξ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ, έπμκηαξ ηαηά κμο υηζ δ αεακαημπμζδιέκδ ηοηηανζηή ζεζνά ΒΖΚ δζαεέηεζ ηανηζκζηυ ιεηααμθζζιυ. ηα πθαίζζα ηδξ πνμζπάεεζαξ κα ηαηακμήζμοιε μθζζηζηά ηα δίηηοα ημο ιεηααμθζζιμφ οπάνπμοκ δζάθμνεξ ιέεμδμζ πμο ιπμνμφκ κα ζοιαάθμοκ. Τπάνπεζ ημ πθεμκέηηδια υηζ ηα ιεηααμθζηά δίηηοα είκαζ βκςζηά, ςξ πνμξ ηδ δμιή ημοξ, εδχ ηαζ ανηεηέξ δεηαεηίεξ ηαζ εθάπζζηα έπμοκ κα πνμζηεεμφκ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ εζηυκαξ ηςκ δζηηφςκ ηςκ αζμπδιζηχκ ακηζδνάζεςκ ζε πθεζάδα μνβακζζιχκ. Ζ δμιή ηςκ δζηηφςκ, υιςξ, δεκ ανηεί βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ εκυξ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ. Ζ ιεηααμθζηή ηαηάζηαζδ ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ δεκ είκαζ δοκαηυ κα πνμζδζμνζζηεί απ εοεείαξ απυ ημ βμκυηοπμ, ημ πνυηοπμ έηθναζδξ ή ημ δίηηομ πνςηεσκζηχκ αθθδθεπζδνάζεςκ ηαζ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιεηααμθζηχκ. Ο ιεηααμθζζιυξ νοειίγεηαζ απυ ημπζημφξ ιδπακζζιμφξ (Stephanopoulos, 1998). Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ (ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ) πνμζθένεζ ηδ δοκαηυηδηα θήρδξ ημο απμηοπχιαημξ ημο ιεηααμθζζιμφ ιζα δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή, βζαηί ημ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ ζοβηεκηνχζεςκ πμο θαιαάκεηαζ, επδνεάγεζ ηαζ επδνεάγεηαζ απυ ηδκ in vivo ιεηααμθζηή εκενβυηδηα. Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ, πναβιαημπμζήεδηακ δφμ ακελάνηδηα πεζνάιαηα, υπμο ηαζ ζηα δφμ οπήνπακ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ακαπηοβιέκεξ ζε ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ. ηδκ πνχηδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ακαπηφπεδηακ απυ ημζκυ θζαθίδζμ, πνμενπυιεκμ απυ ζηαεενή ηνάπεγα ηοηηάνςκ, δφμ αζμακηζδναζηήνεξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ ηαζ απυ ηφηηανα πνμενπυιεκα απυ αοημφξ, δφμ αζμακηζδναζηήνεξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ. ηδ δεφηενδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία, ακαπηφπεδηε έκαξ αζμακηζδναζηήναξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ ηαζ, απυ ηφηηανα πμο ζοθθέπεδηακ απυ αοηυκ, δφμ αζμακηζδναζηήνεξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ

25 15 ζε δζαθμνεηζηά πνμκζηά ζδιεία. Κφηηανα ζοθθέπεδηακ ζε δζάθμνα πνμκζηά ζδιεία ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ οπμαθήεδηακ ζε ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ. Ζ επίδναζδ παναβυκηςκ πμο ηαεμνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ αφλδζδξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ιεθεηήεδηε ιε έκα εονφ πείναια, υπμο απυ θζαθίδζμ ηδξ ηνάπεγαξ ηοηηάνςκ ακαπηφπεδηε αζμακηζδναζηήναξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πέκηε ιζηνυηενμζ, ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ. ε αοημφξ ημοξ πέκηε αζμακηζδναζηήνεξ εθανιυζηδηακ δζάθμνμζ ζοκδοαζιμί αολμιεζχζεςκ ηςκ ηζιχκ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ παναβυκηςκ (ph, δζαθοιέκμ μλοβυκμ, εενιμηναζία, ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ) ζε ζπέζδ ιε ηζξ ανζζημπμζδιέκεξ ζοκεήηεξ ηδξ αζμιδπακίαξ ηαζ ζε πμζηίθα πνμκζηά ζδιεία. Γείβιαηα ζοθθέπεδηακ απυ ηάεε ζοκδοαζιυ βζα ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ. Ζ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο ενεπηζημφ οθζημφ έβζκε ιε πεζνάιαηα ζηα μπμία ηαθθζενβήεδηακ ηφηηανα BHK ζε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ιμκμζαηπανζηχκ (βθοηυγδ-ιακκυγδ) ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ. Σα ηφηηανα ζοθθέπεδηακ βζα ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ. Δπίζδξ, πναβιαημπμζήεδηε πνμζπάεεζα ακαηαηαζηεοήξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηςκ ηοηηάνςκ BHK, ααζζγυιεκμ ζημ δίηηομ ημο ηφνζμο ιεηααμθζζιμφ ημο M.musculus. Έβζκε ακαγήηδζδ ζε ιεηααμθζηέξ αάζεζξ δεδμιέκςκ ηαζ αζαθζμεήηεξ πμο είκαζ πνμζαάζζιεξ απυ ημ δζαδίηηομ, αθθά ηαζ αζαθζμβναθζηή ακαγήηδζδ βζα κα απακηδεμφκ ζδιακηζηά ενςηήιαηα ηαζ κα ζοιπθδνςεμφκ ηεκά. Σμ ιεηααμθζηυ δίηηομ πμο ακαηαηαζηεοάζηδηε, πνδζζιμπμζήεδηε, ζηδ ζοκέπεζα, βζα ηδκ ελαβςβή αζμθμβζηχκ ζοιπεναζιάηςκ ζηα πεζνάιαηα πμο ακαθένεδηακ, ζημ ηεθεοηαίμ ηαζ πζμ ζδιακηζηυ ιένμξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ιζαξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ. Πενζβναθή ηδξ ενβαζίαξ (εέζδξ) Ζ ενβαζία δμιείηαζ ζε 5 εκυηδηεξ: Δλόηεηα Α: Θεσξεηηθό κέξνο Πενζηθείεζ ημ εεςνδηζηυ οπυααενμ ηδξ ενβαζίαξ ηαζ απμηεθείηαζ απυ 4 οπμεκυηδηεξ:

26 16 - Δζζαβςβή: Πενζβνάθεηαζ ιε θίβα θυβζα δ ζδιενζκή πναβιαηζηυηδηα ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ζηδ αζμιδπακία, μζ δοκαηυηδηεξ ηδξ ζφβπνμκδξ αζμθμβζηήξ ένεοκαξ ηαζ πανμοζζάγεηαζ μ ζημπυξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ. - Μεηααμθζζιυξ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ: Πενζβνάθεηαζ μ ιεηααμθζζιυξ πμο παναηηδνίγεζ ηζξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ εδθαζηζηχκ ιε έιθαζδ ζημκ ηανηζκζηυ ιεηααμθζζιυ πμο ακαιέκεηαζ κα πανμοζζάγμοκ μζ αεάκαηεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ. - Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ: Γίκεηαζ απυδμζδ ηδξ πναβιαηζηυηδηαξ ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ ζηδ αζμιδπακία βζα ηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ ηαζ πενζβνάθμκηαζ μζ αζμακηζδναζηήνεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ημ ζημπυ αοηυ, ιε έιθαζδ ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. - Μεηααμθμιζηή ακάθοζδ: Γίκεηαζ ακαθμνά ζηδ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ηαζ ηζξ ιεευδμοξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ. Γίκεηαζ έιθαζδ ζηδ Υνςιαημβναθία Αενίςκ Φαζιαημζημπία Μάγαξ (GC-MS) ηαζ πενζβνάθμκηαζ ηα ζηάδζα ιζαξ μθμηθδνςιέκδξ δζαδζηαζίαξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ. Δλόηεηα Β: ηόρνο Πενζβνάθεηαζ μ βεκζηυξ ζηυπμξ ηδξ ενβαζίαξ ηαζ επζιένμοξ ζηυπμζ πμο ημκ μθμηθδνχκμοκ. Δλόηεηα Γ: Τιηθά θαη κέζνδνη Δίκαζ δ εκυηδηα ζηδκ μπμία πενζβνάθεηαζ μ ηνυπμξ δζελαβςβήξ ηςκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ ηαζ ηδξ ακαηαηαζηεοήξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο. Απμδίδμκηαζ μζ πεζναιαηζημί ζπεδζαζιμί, ηα πνςηυημθθα ηςκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ, υπςξ εηηεθέζηδηακ ηαζ μ ηνυπμξ επελενβαζίαξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ηαζ ηςκ δεδμιέκςκ. Δλόηεηα Γ: Απνηειέζκαηα Γίκεηαζ πανμοζίαζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ. Ζ εκυηδηα αθμνά ζηδκ ακαηαηαζηεοή ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηαζ ηδκ πανμοζίαζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηςκ ηνζχκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ πμο εηηεθέζηδηακ. Πανμοζζάγμκηαζ βναθήιαηα ηαζ ζπήιαηα πμο πνμέηορακ ηαζ βίκεηαζ ιζηνυξ ζπμθζαζιυξ πάκς ζε αοηά.

27 17 Δλόηεηα Δ: πδήηεζε Ακαθφμκηαζ ηαζ ζογδημφκηαζ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ, ζπμθζάγμκηαζ ηαζ πανμοζζάγμκηαζ ηα ζοιπενάζιαηα ηαζ πζεακμί ιεθθμκηζημί ζηυπμζ. Σ. Βηβιηνγξαθία Παναηίεεκηαζ μζ αζαθζμβναθζηέξ ακαθμνέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηαζ αμήεδζακ ζηδκ ηαηεφεοκζδ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ. Δ. Παξάξηεκα Διθακίγμκηαζ πίκαηεξ πμο αμδεμφκ ζηδκ ηαηακυδζδ ηδξ ενβαζίαξ

28 18 Α.2 Μεηααμθζζιυξ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ Σα ηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ πνδζζιμπμζμφκηαζ απυ ηδ θανιαηεοηζηή αζμιδπακία βζα ηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ βζα πενζζζυηενμ απυ είημζζ πνυκζα. Ζ πνήζδ ημοξ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ, βζα ημ ζημπυ αοηυ, βίκεηαζ βζαηί πνμζθένμοκ ημ πθεμκέηηδια ηδξ ζςζηήξ ακαδίπθςζδξ ηαζ εκαθθαηηζηήξ ζοκανιμβήξ (ιάηζζια) ημο ηεθζημφ πνμσυκημξ, υπςξ ηαζ ηδξ ηαηάθθδθδξ βθοημζοθίςζδξ. Σα δφμ παναπάκς πθεμκεηηήιαηα δεκ ηα πνμζδίδμοκ μζ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ ή ιοηήηςκ, πανά ημ βεβμκυξ υηζ είκαζ πζμ εφημθα ηαθθζενβήζζια ηφηηανα, αθθά ηαζ εφημθα ζημκ ιεηαζπδιαηζζιυ ημοξ. Δπζπνυζεεηα, μζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ πανέπμοκ έκα ζπεηζηά εοημθυπνδζημ αζμθμβζηυ ζφζηδια, ζε ενβαζηδνζαηυ επίπεδμ, βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ζδζμηήηςκ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ εδθαζηζηχκ ζε ηοηηανζηυ επίπεδμ. Έκαξ ααζζηυξ πανάβμκηαξ δοζημθίαξ, αηυια, ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ εδθαζηζηχκ είκαζ ηαζ δ εκδμηοηηανζηή πμθοπθμηυηδηά ημοξ. Ζ ηαηακυδζδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ημοξ είκαζ απαναίηδηδ βζα κα πεηφπεζ μ ενεοκδηήξ ζηαεενυηδηα ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ ορδθή πμζυηδηα ημο ηεθζημφ παναβυιεκμο πνμσυκημξ. Ζ ηαθφηενδ βκχζδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ, δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα κα ζπεδζαζηεί ημ πςξ ηαζ ιε πμζα βμκίδζα εα ιεηαζπδιαηζζηεί δ ζεζνά, χζηε δ ηοηηανμηαθθζένβεζα κα απμηηήζεζ ορδθή αζςζζιυηδηα, εονφηενμ πνυκμ γςήξ, ιεβάθδ ηοηηανζηή ποηκυηδηα ηαζ ακεεηηζηυηδηα. Αηυια, βίκεηαζ ζςζηυξ ζπεδζαζιυξ ημο ενεπηζημφ ιέζμο πμο πνέπεζ κα πνδζζιμπμζδεεί, αθθά ηαζ ηςκ παναβυκηςκ πμο παναηηδνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ αφλδζδξ ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ. Ζ ηαηακυδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βίκεηαζ επζαεαθδιέκδ, ηαεχξ μ ιεηααμθζζιυξ είκαζ ημ πνχημ ηαζ δοκαιζηυηενμ επίπεδμ απυηνζζδξ εκυξ ηοηηάνμο ζηα ελςηενζηά ενεείζιαηα. Γζα ημ θυβμ αοηυ, μ ιεηααμθζζιυξ εκδζαθένεζ άιεζα βζα γδηήιαηα πνυζθδρδξ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ απυ ημ ενεπηζηυ ιέζμ, έηηνζζδξ ιεηααμθζηχκ πμο εκδέπεηαζ κα επδνεάζμοκ ηδκ ηοηηανμηαθθζένβεζα ηαζ δοκαιζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ θυβς αθθαβήξ ημο ελςηοηηανζημφ πενζαάθθμκημξ.

29 19 Ζ ζδιαζία ημο ιεηααμθζζιμφ θαίκεηαζ απυ ημ εκηοπςζζαηυ βεβμκυξ υηζ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ εδθαζηζηχκ ιεηααάθθμκηαζ μοζζαζηζηά υηακ ημ ανπζηυ μιμζμζηαηζηυ πενζαάθθμκ εκυξ ζζημφ, πμο ακήηεζ ζε έκα πμθοηφηηανμ μνβακζζιυ, βίκεζ ζηνεζμβυκμ μδδβχκηαξ ζε βεκεηζηέξ αθθαβέξ πμο πνμζδίδμοκ ηοηηανζηή αεακαζία ηαζ ηαηαθήβμκηαξ, ίζςξ, αηυια ηαζ ζε ιζα αεάκαηδ ηοηηανζηή ζεζνά. Δίκαζ παναδεηηυ υηζ μζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ, πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ενβαζηδνζαηά, δζαεέημοκ ιεηααμθζζιυ πμο είκαζ θακενά απμνοειζζιέκμξ (Mulukutla et al, 2010). Δίκαζ ιεηααμθζζιυξ ηοηηάνςκ πμο έπμοκ λεθφβεζ ζε ιεβάθμ ααειυ ηδξ δζαηοηηανζηήξ ζδιαημδυηδζδξ ηαζ ζημπυ έπμοκ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδκ αφλδζδ. Οζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ έπμοκ ςξ ααζζηέξ πδβέξ άκεναηα ηαζ εκένβεζαξ ηδ βθοηυγδ ηαζ ηδ βθμοηαιίκδ. Σα δφμ αοηά ιυνζα πανέπμοκ πνυδνμια ιυνζα πμο απαζημφκηαζ βζα κα θεζημονβήζμοκ ηα αζμζοκεεηζηά ηαζ ηα ιμκμπάηζα παναβςβήξ εκένβεζαξ ζημ ηφηηανμ. Ζ αολδιέκδ θεζημονβία ηςκ ιεηααμθζηχκ ιμκμπαηζχκ ηδξ βθοηυθοζδξ ηαζ ηδξ βθμοηαιζκυθοζδξ (βθοημβθμοηαιζκυθοζδ) έπεζ ημ ιεζμκέηηδια ηδξ παναβςβήξ ιεβάθςκ πμζμηήηςκ βαθαηηζημφ μλέμξ ηαζ αιιςκίμο, πμο, ηαηά πενίπηςζδ, εκδέπεηαζ κα δδιζμονβήζμοκ ημλζηυ πενζαάθθμκ ηαζ κα ακαζηείθμοκ ηδκ αφλδζδ ηαζ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηςκ ηοηηάνςκ. Δίκαζ έκαξ ιεηααμθζζιυξ πμο παναηηδνίγεζ ηα ηανηζκζηά ηφηηανα ηαζ ζημκ μπμίμ εα εζηζάζμοιε ζηδ ζοκέπεζα. Ο ααζζηυξ ιεηααμθζηυξ ημνιυξ πμο εα ιπμνμφζε κα πενζβνάρεζ ζε αδνέξ βναιιέξ ημ ιεηααμθζζιυ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ κα ιαξ αμδεήζεζ κα ιμκηεθμπμζήζμοιε ηαζ κα ηαηακμήζμοιε ηδ ιεηααμθζηή ζοιπενζθμνά ηςκ ηοηηάνςκ απμηεθείηαζ απυ ηα ιμκμπάηζα: βθοηυθοζδ, βθμοηαιζκυθοζδ, ιεηαθμνά βθοηυγδξ ηαζ βθμοηαιίκδξ εκηυξ ημο ηοηηάνμο, ιεηαθμνά αιζκμλέςκ, ηφηθμξ ημ ηζηνζημφ μλέμξ, ηφηθμξ μονίαξ, ιμκμπάηζ θςζθμνζηχκ πεκημγχκ ηαζ μλεζδςηζηή θςζθμνοθίςζδ. Θα ακαθενεμφιε ζηα πενζζζυηενα απυ ηα ιμκμπάηζα αοηά ηαζ εα εζηζάζμοιε ηαζ ζε ιεθέηεξ πμο έπμοκ πναβιαημπμζδεεί ζηα ηφηηανα BHK ηα μπμία είκαζ ηαζ ηα ηφηηανα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηα πεζνάιαηά ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ.

30 20 Κφνζα ιμκμπάηζα ιεηααμθζζιμφ άκεναηα Ζ ηφνζα πδβή άκεναηα βζα ημ ηφηηανμ είκαζ δ βθοηυγδ. Ζ ιεηαθμνά ηδξ βθοηυγδξ εκηυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ εδθαζηζηχκ βίκεηαζ απυ ζοβηεηνζιέκμοξ ιεηαθμνείξ πάκς ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ (δζαιειανακζημφξ), βζαηί δ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ δεκ είκαζ δζαπεναηή απυ ηδ βθοηυγδ πμο είκαζ έκαξ πμθζηυξ ιεηααμθίηδξ. Ζ ιεηαθμνά ελανηάηαζ απυ ηδ δζααάειζζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ελςηοηηανζηά ηαζ εκδμηοηηανζηά. Ζ βθοηυγδ θςζθμνοθζχκεηαζ ηαπφηαηα απυ ηζξ ελμηζκάζεξ ιυθζξ ιπεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ, βζα ημ θυβμ αοηυ, δ νμή έπεζ ηαηεφεοκζδ, ζπεδυκ πάκηα, πνμξ ημ εζςηενζηυ ημο ηοηηάνμο. Έπμοκ ακαηαθοθεεί έλζ ιεηαθμνείξ ηδξ βθοηυγδξ, ιε ζδιακηζηυηενμ ημκ SLC2A1 (GLUT1), μ μπμίμξ εηθνάγεηαζ ζε υθμοξ ημοξ ζζημφξ ζε ζοβηεηνζιέκα επίπεδα (Pessin & Bell, 1992). Τπάνπμοκ αηυια μζ SLC2A2, SLC2A3, SLC2A4, SLC2A5, SLC2A7 μζ μπμίμζ έπμοκ ζπεηζηά ιζηνέξ δζαθμνέξ ζηδ δμιή ημοξ, ειθακίγμκηαζ ζε δζάθμνμοξ ζζημφξ ηαζ πανμοζζάγμοκ ζοβηεηνζιέκδ ζοββέκεζα πνμξ ηδ βθοηυγδ (Carruthers, 1990; Craik & Elliott, 1979; Gould et al, 1991; Thorens & Mueckler, 2010). Ζ βθοηυγδ πμο πνμζθαιαάκεηαζ απυ ημ ηφηηανμ αημθμοεεί ηδ γιπθνιπηηθή πνξεία ηονίςξ, εκχ έκα ιζηνυ πμζμζηυ αημθμοεεί ημ ιμκμπάηζ ηςκ θςζθμνζηχκ πεκημγχκ (4-21%) ακάθμβα ιε ηζξ ακάβηεξ ημο ηοηηάνμο βζα ηδκ ακηζβναθή ηαζ ηδ ιεηαβναθή (Bonarius et al, 2001; Jan et al, 1997; Mancuso et al, 1994; Zupke & Stephanopoulos, 1995). Ζ βθοημθοηζηή πμνεία θαίκεηαζ ζημ πήια Α.2 ηαζ λεηζκά απυ ηδκ 6 - θςζθμνζηή βθοηυγδ βζα κα ηαηαθήλεζ ζηδκ παναβςβή πονμζηαθοθζημφ μλέμξ. Δκενβεζαηά, δ γιπθόιπζε ηαηακαθχκεζ δφμ ιυνζα ATP ηαζ απμδίδεζ ηέζζενα ιυνζα ATP ηαζ δφμ ιυνζα NADH. ε ηαηαζηάζεζξ έθθεζρδξ βθοηυγδξ, ημ ηφηηανμ ιπμνεί κα ηνμθμδμηήζεζ ηδ βθοημθοηζηή πμνεία απυ ηδκ απμζημδυιδζδ βθοημβυκμο ή απυ άθθμοξ ιμκμζαηπανίηεξ (π.π. θνμοηηυγδ). Σα νοειζζηζηά έκγοια ηδξ βθοηυθοζδξ είκαζ δ ελμηζκάζδ, δ θςζθμθνμοηημηζκάζδ ηαζ δ ηζκάζδ ημο πονμζηαθοθζημφ μλέμξ. Ζ ελμηζκάζδ είκαζ ημ έκγοιμ πμο ιεηαηνέπεζ ηδκ βθοηυγδ ζε 6 θςζθμνζηή βθοηυγδ. Ροειίγεηαζ αθθμζηενζηά απυ ηδκ 6 θςζθμνζηή βθοηυγδ δ μπμία, ακ παναπεεί ζε ιεβάθεξ

31 21 πμζυηδηεξ ακαζηέθθεζ ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο. Ζ θςζθμθνμοηημηζκάζδ ηαηαθφεζ ηδκ παναβςβή 1,6 δζθςζθμνζηήξ θνμοηηυγδξ απυ 6 θςζθμνζηή θνμοηηυγδ ηαζ είκαζ έκα έκγοιμ πμο νοειίγεηαζ ιε πμθθαπθμφξ ηνυπμοξ. Αθθμζηενζηή νφειζζδ βίκεηαζ απυ ATP, ΑΜP ηαζ ηζηνζηυ μλφ, ίζςξ ηαζ βαθαηηζηυ μλφ (Stryer, 1988). Ζ 1,6 δζθςζθμνζηή θνμοηηυγδ ακαζηέθθεζ ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο, επίζδξ, ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ. Δίκαζ, αηυια, ημ έκγοιμ πμο είκαζ εοαίζεδημ ζε αθθαβέξ ημο εκδμηοηηανζημφ ph ηαζ δ θεζημονβζηυηδηά ημο ιεζχκεηαζ ζε πζεακή πηχζδ ημο ph. Ζ ηζκάζδ ημο πονμζηαθοθζημφ ηαηαθφεζ ηδκ παναβςβή πονμζηαθοθζημφ μλέμξ απυ θςζθμεκμθμπονμζηαθοθζηυ μλφ. Σμ έκγοιμ νοειίγεηαζ εεηζηά απυ 1,6-δζθςζθμνζηή θνμοηηυγδ ηαζ ακαζηέθθεηαζ απυ ηζκάζεξ ηονμζίκδξ (Stryer, 1988). ηα ηφηηανα εδθαζηζηχκ, δ αολδιέκδ βθοημθοηζηή νμή ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ παναβςβή ιεβάθςκ πμζμηήηςκ βαθαηηζημφ μλέμξ αηυια ηαζ ζε αενυαζεξ ζοκεήηεξ. Μζηνυ πμζμζηυ εζζένπεηαζ ζημκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ. Σα ηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ ηοηηάνςκ πμζηίθμοκ ςξ πνμξ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ ζοιπενζθμνά, ακάθμβα ιε ηζξ ακάβηεξ πμο έπμοκ ηαζ ημ νυθμ πμο εα επζηεθέζμοκ. ημοξ πμθοηφηηανμοξ αοημφξ μνβακζζιμφξ, ηα ενεπηζηά ζοζηαηζηά είκαζ, ηαηά αάζδ, άθεμκα ηαζ ηα ηφηηανα δε ανίζημκηαζ ζε έθθεζρδ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ. Ο ζοκδεέζηενμξ ιεηααμθζηυξ ηφπμξ βζα ηα ηφηηανα ηςκ δζαθυνςκ ζζηχκ είκαζ κα δζαηδνμφκ έκα νοειυ ηαηακάθςζδξ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ ζηακυ βζα κα ηα δζαηδνεί ζηδ γςή, κα ιδ πνεζάγεηαζ κα αολδεμφκ ηαζ κα δζαζνεεμφκ ηαζ κα πανάβμοκ επανηή εκένβεζα βζα κα επζηεθέζμοκ ηζξ ηοηηανζηέξ θεζημονβίεξ. Δίκαζ έκαξ ιεηααμθζζιυξ υπμο δ πνμζθαιαακυιεκδ βθοηυγδ μδδβείηαζ ζηδκ παναβςβή ημο πονμζηαθοθζημφ μλέμξ ηαζ ζημ ιμκμπάηζ ημο ηφηθμο ημο ηζηνζημφ μλέμξ ηαζ ηδξ μλεζδςηζηήξ θςζθμνοθίςζδξ ζηδ ζοκέπεζα, ιε ιζηνή παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ. ε πενζπηχζεζξ υπμο ηα ηφηηανα πνέπεζ ηαπφηαηα κα αολήζμοκ ημ ιέβεευξ ημοξ ηαζ κα δζαζνεεμφκ, υπςξ ζε απμηνίζεζξ ηοηηάνςκ ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ, ηα ηφηηανα οζμεεημφκ έκακ άθθμ ιεηααμθζζιυ πμο ηα αμδεάεζ ζημ ακαπηολζαηυ πνυηοπμ ηδξ αφλδζδξ. Καηακαθχκμοκ ζε ιεβαθφηενμ νοειυ βθοηυγδ ηαζ ενεπηζηά ζοζηαηζηά, ηδκ μπμία μδδβμφκ ζε ιεβάθδ πμζυηδηα παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ. Αοηυ ζοιααίκεζ ηαζ ζε πενζπηχζεζξ οπμλείαξ (ακαενυαζα βθοηυθοζδ) (Metallo & Vander Heiden, 2013; Vander Heiden et al, 2009).

32 22 Δίκαζ βκςζηυ απυ ημκ Otto Warburg απυ ημ 1925, υηζ ηα ηανηζκζηά ηφηηανα ιεηααμθίγμοκ βθοηυγδ ζε βαθαηηζηυ μλφ, πνάβια ημ μπμίμ ακαθένεηαζ ςξ αενυαζα βθοηυθοζδ, βζαηί πναβιαημπμζείηαζ αηυια ηαζ ζε ζοκεήηεξ υπμο ημ μλοβυκμ είκαζ επανηέξ βζα ηα ηφηηανα (Warburg, 1956; Warburg et al, 1927). Σμ ίδζμ θαζκυιεκμ παναηδνείηαζ, υπςξ ήηακ ακαιεκυιεκμ, ηαζ ζηζξ αεάκαηεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηζξ μπμίεξ ηζξ ακηζθαιαακυιαζηε ςξ ηφηηανα ιε ηανηζκζηή ζοιπενζθμνά. πήια Α. 2 Κφνζα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα. Γείπκμκηαζ ηα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα ημο ιεηααμθζζιμφ ημο άκεναηα. Αοηά είκαζ δ βθοηυθοζδ, ημ ιμκμπάηζ ηςκ θςζθςνζηχκ πεκημγχκ ηαζ δ βθμοηαιζκυθοζδ ςξ ααζζηυ ιμκμπάηζ ακαπθήνςζδξ ζημκ ηανηζκζηυ ιεηααμθζζιυ πμο παναηηδνίγεηαζ απυ απυ ιεβάθο παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ αηυια ηαζ ζε ζοκεήηεξ αθεμκίαξ μλοβυκμο. Δπυιεκεξ παναηδνήζεζξ ημο ίδζμο ενεοκδηή, είπακ δείλεζ υηζ ηα ηανηζκζηά ηφηηανα αθμιμζχκμοκ ιεβάθεξ πμζυηδηεξ βθοηυγδξ ηαζ ζε ιεβάθδ ηαπφηδηα, ζε ζφβηνζζδ ιε ηα δζαθμνμπμζδιέκα ηφηηανα απυ ηα μπμία πνμένπμκηαζ. Παν υθμ πμο αοηέξ μζ παναηδνήζεζξ, ανπζηά, πναβιαημπμζήεδηακ ζε ζοιπαβείξ υβημοξ, έδςζακ ημ έκαοζια βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηαηά ηδκ ηοηηανζηή αφλδζδ. Ο θυβμξ πμο ηα αολακυιεκα ηφηηανα οζμεεημφκ ηέημζα ζοιπενζθμνά είκαζ

33 23 βζαηί ημοξ δίκεζ ηάπμζα πθεμκεηηήιαηα υπςξ δ οπμζηήνζλδ ηςκ αζμζοκεεηζηχκ μδχκ, δ δζαηήνδζδ ημο μλεζδμακαβςβζημφ δοκαιζημφ ηαζ ηδξ εκένβεζαξ. Δπζπνυζεεηα, έκαξ ηέημζμξ αοηυκμιμξ ιεηααμθζζιυξ ζδιαημδμηεί ηδκ έκανλδ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ ζε άθθα επίπεδα ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ. Σμ κνλνπάηη ησλ θσζθνξηθώλ πεληνδώλ (Pentose Phosphate Pathway) πανέπεζ ακαβςβζηή δφκαιδ ζηδ ιμνθή NADPH ζημ ηφηηανμ ηαζ απμδίδεζ πνυδνμια ιυνζα βζα ηδκ αζμζφκεεζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ. Δκχ ημ NADH πμο πανάβεηαζ πνδζζιμπμζείηαζ, ηονίςξ, βζα ημ ζπδιαηζζιυ ATP απυ ηδκ ακαπκεοζηζηή αθοζίδα, ημ NADPH πνδζζιεφεζ ζα δυηδξ δθεηηνμκίςκ ζηζξ ακαβςβζηέξ αζμζοκεεηζηέξ ακηζδνάζεζξ (Stryer, 1988). Δίκαζ ιμκμπάηζ πμο μδδβεί ζηδκ παναβςβή κμοηθεμηζδίςκ. Σμ NADPH πανάβεηαζ υηακ δ 6 - θςζθμνζηή βθοηυγδ μλεζδςεεί ζε 5-θςζθμνζηή νζαυγδ. Οζ ακηζδνάζεζξ ημο ιμκμπαηζμφ ζοιααίκμοκ ζημ ηοηηανυπθαζια. Ο θύθινο ηνπ θηηξηθνύ νμένο (TCA cycle) έπεζ ημ νυθμ κα πανάβεζ εκένβεζα ζηδ ιμνθή ημο ATP ιέζς ηδξ μλείδςζδξ εκχζεςκ ημο άκεναηα. Ο νυθμξ ημο είκαζ, ηονίςξ, δζηηυξ: πανάβεζ ιυνζα ηα μπμία είκαζ πνυδνμια ιμκμπαηζχκ ημο ακααμθζζιμφ ημο ηοηηάνμο ηαζ δίκεζ ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηδξ ηοηηανζηήξ εκένβεζαξ. Έπεζ επίζδξ ημ νυθμ κα ελζζμννμπεί ημοξ νοειμφξ βθοηυθοζδξ ηαζ βθμοηαιζκυθοζδξ (Stryer, 1988). Σμ πονμζηαθοθζηυ μλφ πμο έπεζ παναπεεί απυ ηδ βθοημθοηζηή πμνεία, ιεηαηνάπεηαζ ζε αηέηοθμ-coa. Σμ πνχημ αήια είκαζ δ ιδ ακηζζηνεπηή ακηίδναζδ ηδξ απμηαναμλοθίςζδξ ημο πονμζηαθοθζημφ μλέμξ ζε αηέηοθμ-coa, ιέζς ηδξ πονμζηαθοθζηήξ αθοδνμβμκάζδξ. Σα ηφηηανα πανάβμοκ αηέηοθμ-coa ηαζ ιέζς ηδξ απμζημδυιδζδξ αιζκμλέςκ υπςξ δ ηονμζίκδ, δ θοζίκδ, δ θεοηίκδ ηαζ δ ζζμθεοηίκδ. Σμ αηέηοθμ-coa εζζένπεηαζ ζηδκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ πμο παναηηδνίγεηαζ απυ ηζξ ακηζδνάζεζξ πμο θαίκμκηαζ ζημ ζπήια Α.2. Οζ ακηζδνάζεζξ ημο ηφηθμο ημο ηζηνζημφ μλέμξ, υπςξ ηαζ δ ιεηαηνμπή ημο πονμζηαθοθζημφ ζε αηέηοθμ-coa ζοιααίκμοκ ιέζα ζηδκ ιζημπμκδνζαηή ιήηνα. Γζα ηάεε ιυνζμ NADH πμο πανάβεηαζ απμδίδμκηαζ ηνία ιυνζα ATP ιέζς ηδξ ιεηαθμνάξ ηςκ δθεηηνμκίςκ ζημ O 2 ηαζ δφμ ιυνζα ATP βζα ηάεε FADH 2. Ο ηφηθμξ νοειίγεηαζ απυ ηζξ ακάβηεξ ημο ηοηηάνμο βζα ATP. Όηακ ηα NAD + ηαζ FAD βίκμοκ ανηεηά, έπμοιε έκα πνχημ ζήια υηζ πνεζάγεηαζ κα αολδεεί ημ εκενβεζαηυ

34 24 θμνηίμ. Έκα ζδιείμ εθέβπμο είκαζ δ ηζηνζηή ζοκεάζδ υπμο ακαζηέθθεηαζ αθθμζηενζηά απυ ATP. Δπίζδξ, δ ζζμηζηνζηή αθοδνμβμκάζδ δζεβείνεηαζ αθθμζηενζηά απυ ADP, NAD + ηαζ ζζμηζηνζηυ ηαζ ακαζηέθθεηαζ απυ NADH ηαζ ATP. Αηυια, δ α- ηεημβθμοηανζηή αθοδνμβμκάζδ ακαζηέθθεηαζ απυ δθέηηνοθμ-coa ηαζ ιεβάθεξ πμζυηδηεξ ATP. Ο ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ πανάβεζ NADH ημ μπμίμ μδδβείηαζ ζηδκ ακαπκεοζηζηή αθοζίδα βζα κα απμδχζεζ 3 ιυνζα ATP, ιέζς ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ μλεζδςηζηήξ θςζθμνοθίςζδξ πμο ζοκηεθείηαζ ζηδ ιήηνα ηςκ ιζημπμκδνίςκ. 36 ιυνζα ΑΣΡ πανάβμκηαζ ζοκμθζηά υηακ έκα ιυνζμ βθοηυγδξ αημθμοεήζεζ ηδ βθοημθοηζηή πμνεία, ημκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ ηαζ απμδμιδεεί πθήνςξ ζε CO 2 ηαζ Ζ 2 Ο. Σμ βεβμκυξ υηζ δ ζζμηζηνζηή αθοδνμβμκάζδ δε θεζημονβεί ζε ηαηαζηάζεζξ οπμλείαξ (ακαενυαζα βθοηυθοζδ) αθθά ηαζ ηαηά ηδκ αενυαζα βθοηυθοζδ είπε ζδιεζςεεί ηαζ απυ ημκ ίδζμ ημ Warburg (Wise et al, 2011). Έηζζ μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ δεκ μθμηθδνχκεηαζ ηαζ δ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ αολάκεηαζ. Δίκαζ ηάηζ πμο μθείθεηαζ ζε εζςηενζηή νφειζζδ ηαζ δεκ απμδίδεηαζ ζε ζοβηεηνζιέκεξ ιεηαθθάλεζξ. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ υηζ ημ ΓΔ ηδξ ακηίδναζδξ είκαζ ανκδηζηυ. Υαναηηδνζζηζηυ ημο ηανηζκζημφ ιεηααμθζζιμφ είκαζ δ γινπηακηλόιπζε, δδθαδή δ ιεηαηνμπή ηδξ βθμοηαιίκδξ ζε βθμοηαιζηυ μλφ. Ζ βθμοηαιίκδ ανίζηεηαζ ζε ιεβάθεξ ζοβηεκηνχζεζξ ζηα ενεπηζηά ιέζα ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ηαζ ζε αοηήκ απμδίδεηαζ δ ιεβάθδ παναβςβή ζυκηςκ αιιςκίμο. Ζ ιεηαθμνά ηδξ βθμοηαιίκδξ εκηυξ ημο ηοηηάνμο βίκεηαζ απυ ηακάθζα-ιεηαθμνείξ πμο δεκ είκαζ εζδζηά ηδξ βθμοηαιίκδξ, αθθά ηαζ άθθςκ αιζκμλέςκ. Δίκαζ δφμ ηαηδβμνζχκ: Na + - ελανηχιεκα ηαζ Na + - ιδ ελανηχιεκα (Bode, 2001). Σμ πνχημ αήια ζημ ιεηααμθζζιυ ηδξ βθμοηαιίκδξ είκαζ δ ιεηαηνμπή ηδξ ζε βθμοηαιζηυ μλφ απυ ηδ βθμοηαιζκάζδ πάκς ζηδ ιζημπμκδνζαηή ιειανάκδ. Αημθμοεμφκ δφμ πζεακά αήιαηα: είηε δ ιεηαηνμπή ημο βθμοηαιζημφ ζε α ηεημβθμοηανζηυ μλφ ηαζ δ εζζαβςβή ζημκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ απυ αοηυ ημ ζδιείμ είηε βίκεηαζ ηνακζαιίκςζδ απυ ηδκ αζπανηζηή ηνακζαιζκάζδ βζα ηδκ παναβςβή αζπανηζημφ μλέμξ ή απυ ηδκ ηνακζαιζκάζδ ηδξ αθακίκδξ βζα ηδκ παναβςβή αθακίκδξ. Μεβάθδ πμζυηδηα ημο παναβχιεκμο ιδθζημφ μλέμξ μδεφεζ ζηδκ ακαπθήνςζδ ημο πονμζηαθοθζημφ μλέμξ ιέζς ηδξ ελαβςβήξ ημο ιδθζημφ ζημ ηοηηανυπθαζια.

35 25 Δίκαζ, θμζπυκ, δ αδοκαιία ημο ηανηζκζημφ ηοηηάνμο κα ηνμθμδμηήζεζ ημκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ, πμο ηαεζζηά ηδ βθμοηαιζκυθοζδ ααζζηυ ιμκμπάηζ ακαπθήνςζδξ ημοξ ηφηθμο. Αοηυξ μ νυθμξ δεκ απμδίδεηαζ ζηδ βθμοηαιζκυθοζδ ζε άθθεξ ζοκεήηεξ υπμο μ νυθμξ ηδξ είκαζ δ παναβςβή βθμοηαιζημφ ηαζ, ζηδ ζοκέπεζα, άθθςκ αιζκμλέςκ, αθθά ηαζ αιιςκίαξ. Σα ηφηηανα εδθαζηζηχκ δε ιπμνμφκ κα πανάλμοκ υθα ηα ακηλνμέα. Γζα ημ θυβμ αοηυ, ηα ηεθεοηαία πςνίγμκηαζ ζε απαναίηδηα ηαζ ιδ απαναίηδηα. ηδκ πνχηδ ηαηδβμνία ακήημοκ ηα: ανβζκίκδ, ζζηζδίκδ, ζζμθεοηίκδ, θεοηίκδ, θοζίκδ, ιεεζμκίκδ, θαζκοθαθακίκδ, ενεμκίκδ, ηνοπημθάκδ ηαζ ααθίκδ. ηδ δεφηενδ ηαηδβμνία έπμοιε ηα: αθακίκδ, αζπαναβίκδ, αζπανηζηυ μλφ, ηοζηεΐκδ, βθμοηαιζηυ μλφ, βθμοηαιίκδ, βθοηίκδ, πνμθίκδ, ζενίκδ ηαζ ηονμζίκδ (Stryer, 1988). Σμ βεβμκυξ αοηυ ακαβηάγεζ κα οπάνπμοκ ζημ ενεπηζηυ οθζηυ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ υθα ηα απαναίηδηα αιζκμλέα. ε ακηίεεηδ πενίπηςζδ ημ ηφηηανμ μδδβείηαζ ζε ηοηηανζηυ εάκαημ (Lambert & Pirt, 1975). Δζδζημί, εκενβμελανηχιεκμζ οπμδμπείξ, αθθά ηαζ παεδηζημί οπμδμπείξ αμδεμφκ ζηδ ιεηαθμνά ηςκ αιζκμλέςκ εκηυξ ηςκ ηοηηάνςκ (Duval et al, 1991). Σα αιζκμλέα ιπμνμφκ κα ηαηδβμνζμπμζδεμφκ ηαζ ςξ πνμξ ημ νοειυ ηαηακάθςζδξ ή παναβςβήξ ημοξ. ηδκ πνχηδ ηαηδβμνία ακήημοκ δ ααθίκδ, δ ζζμθεοηίκδ, δ θεοηίκδ, δ θοζίκδ ηαζ δ ηοζηεΐκδ, ηα μπμία ηαηακαθχκμκηαζ ζε ιεβάθμοξ νοειμφξ. ηδ δεφηενδ ακήημοκ υζα ηαηακαθχκμκηαζ ζε παιδθμφξ ηαζ ζηαεενμφξ νοειμφξ, υπςξ δ ενεμκίκδ, δ ανβζκίκδ, δ θαζκοθαθακίκδ, δ ζενίκδ, δ ζζηζδίκδ, δ ιεεζμκίκδ ηαζ δ βθοηίκδ. ηδκ ηνίηδ ακήημοκ υζα πανάβμκηαζ, ηάης απυ δίαθμνεξ ζοκεήηεξ θοζζμθμβίαξ ηαζ ηοηηανζηέξ ηαηαζηάζεζξ, υπςξ δ αθακίκδ, δ πνμθίκδ, δ αζπαναβίκδ ηαζ ημ βθμοηαιζηυ μλφ (Franek & Sramkova, 1997; Sanfeliu et al, 1996). Όηακ δ αθακίκδ εηηνίκεηαζ ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ, έπμοιε ηδκ έκδεζλδ υηζ μ ιεηααμθζζιυξ ηδξ βθμοηαιίκδξ είκαζ ζδζαίηενα εκενβυξ. Έπεζ δεζπηεί υηζ αηυια ηαζ ημ 40% ηδξ εηηνζκυιεκδξ αθακίκδξ ιπμνεί κα πνμένπεηαζ απυ ηδ βθμοηαιίκδ (Lazo, 1981).

36 26 Γθοημβθμοηαιζκυθοζδ Όπςξ είδαιε, ηα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα ηδξ βθοηυθοζδξ ηαζ ηδξ βθμοηαιζκυθοζδξ ζοκακηζμφκηαζ ηαζ αθθδθμεπζηαθφπημκηαζ. Ζ βθοηυγδ ηαζ δ βθμοηαιίκδ είκαζ ηα δφμ ααζζηά ενεπηζηά ζοζηαηζηά ημο ηοηηάνμο. Ζ ζπέζδ ηςκ νοειχκ αθμιμίςζήξ ημοξ απυ ημ ηφηηανμ βίκεηαζ πμθθέξ θμνέξ ελανηχιεκδ, ακάθμβα ιε ηζξ ζοκεήηεξ. Έπεζ εκδζαθένμκ ημ ηζ έπμοκ δείλεζ ιεθέηεξ ζε αεακαημπμζδιέκεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ υηζ ζοιααίκεζ υηακ έκα απυ ηα δφμ ενεπηζηά ζημζπεία θηάκμοκ ζε παιδθή ζοβηέκηνςζδ δ μπμία βίκεηαζ πενζμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ. Ζ βθοηυγδ εα ανπίζεζ κα αολάκεηαζ υζμ ηδκ αολάκμοιε ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, ιέπνζ κα θηάζεζ ζε έκα ζδιείμ ημνεζιμφ. Αοηυ πμο ζοιααίκεζ είκαζ κα αολάκεηαζ ηαζ δ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ ημ μπμίμ αολάκεζ ηδ ζοβηέκηνςζή ημο, πνμενπυιεκμ ηαζ απυ ηδ βθμοηαιίκδ. Ζ παναδμπή είκαζ υηζ υηακ δ βθοηυγδ ηαζ δ βθμοηαιίκδ ανίζημκηαζ ζε επίπεδα ιεβαθφηενα απυ ημ κα βίκμοκ πενζμνζζηζηά, δ πνυζθδρδ ηδξ βθμοηαιίκδξ δεκ επδνεάγεηαζ απυ αοηήκ ηδξ βθοηυγδξ (Sanfeliu et al, 1996). Όηακ, υιςξ, ηα επίπεδα ηδξ βθοηυγδξ βίκμοκ πενζμνζζηζηά ηαζ δ βθμοηαιίκδ ανίζηεηαζ ζε αθεμκία, ανπίγεζ ηαζ αολάκεηαζ μ νοειυξ πνυζθδρδξ ηδξ ηεθεοηαίαξ ηαζ ημ ηφηηανμ ζηδνίγεζ ηδκ παναβςβή εκένβεζαξ ζηδ βθμοηαιζκυθοζδ (Vriezen & van Dijken, 1998). ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ έπεζ δεζπηεί υηζ ζοβηεηνζιέκα αιζκμλέα πανάβμκηαζ ακηί κα ηαηακαθχκμκηαζ ηαζ, ιεηά απυ ιεθέηδ έηθναζδξ ηςκ ειπθεηυιεκςκ εκγφιςκ, δείπηδηε υηζ βζα κα ζοιαεί αοηυ, αολάκμκηαζ μζ ηζκδηζηέξ ηςκ εκγφιςκ ηαζ υπζ δ έηθναζή ημοξ. ηδκ πενίπηςζδ πμο δ βθμοηαιίκδ βίκεηαζ μ πενζμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ, μζ νοειμί ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ηαζ βθμοηαιίκδξ αημθμοεμφκ πανάθθδθδ πμνεία ηαζ είηε αολάκμκηαζ υηακ αολήζμοιε ηδ βθμοηαιίκδ είηε ιεζχκμκηαζ υηακ ζοιαεί ημ ακηίεεημ (Miller et al, 1989; Schmid & Keller, 1992; Vriezen et al, 1997). Έπεζ δεζπηεί υηζ δ επίδναζδ ηςκ δφμ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ είκαζ ζπεηζηά δζαθμνεηζηή υηακ έπμοιε κα ηάκμοιε ιε ζοκεπείξ ηαθθζένβεζεξ. Αοηυ πμο θαίκεηαζ είκαζ υηζ ηα ηφηηανα πεηοπαίκμοκ ιεβαθφηενδ αφλδζδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ηαθθζένβεζεξ δζαθείπμκημξ ηαζ διζδζαθείπμκημξ ένβμο, εκχ δ βθοηυθοζδ ηαζ δ βθμοηαιζκυθοζδ είκαζ ιεζςιέκεξ ηαζ πανάβεηαζ θζβυηενμ βαθαηηζηυ μλφ ηαζ αιιχκζμ (Altamirano et al, 2001; Europa et al, 2000).

37 27 Μπμνεί κα ζοιπενάκεζ ηακείξ απυ ηδκ πενίενβδ ζζμννμπία βθοηυγδξ βθμοηαιίκδξ, ηδκ ορδθή πνμζανιμζηζηυηδηα ημο ηοηηανζημφ ιεηααμθζζιμφ ακάθμβα ιε ηζξ δζάθμνεξ ζοκεήηεξ πμο πνμηφπημοκ ηαζ ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ ηδ δζαθμνεηζηυηδηα ζηδ ζφζηαζδ ηςκ ενεπηζηχκ ιέζςκ. Έπεζ, επίζδξ, δεζπηεί ηαζ δ ιεηααμθζηή ικήιδ ηςκ ηοηηάνςκ. Κφηηανα πμο ακαπηφπεδηακ ζε αζμακηζδναζηήνα διζδζαθείπμκημξ ένβμο ηαζ ηαηυπζκ ζε ζοκεπείξ ηαθθζένβεζεξ είπακ πμθφ πζμ απμηεθεζιαηζηυ ιεηααμθζζιυ απυ αοηά πμο είπακ ηαθθζενβδεεί ζε αζμακηζδναζηήνα δζαθείπμκημξ ένβμο ηαζ ηαηυπζκ πέναζακ ζε ζοκεπή ηαθθζένβεζα (Europa et al, 2000). Με αοηυ ημ πανάδεζβια θαίκεηαζ δ πνμζανιμζηζηυηδηα ηςκ ίδζςκ ηοηηάνςκ ζε δζαθμνεηζηέξ ζηαεενέξ ηαηαζηάζεζξ (steady states). Αενυαζα βθοηυθοζδ ακηί μλεζδςηζηήξ θςζθμνοθίςζδξ Γζα κα παναπεμφκ δφμ ηφηηανα απυ ηδ ιίηςζδ εκυξ ηοηηάνμο πμο πμθθαπθαζζάγεηαζ, αοηυ ημ ηφηηανμ πνέπεζ κα ακαπαναβάβεζ υθα ημ ηοηηανζηυ ημο πενζεπυιεκμ. Αοηυ ζδιαίκεζ έκα ιεβάθμ ανζειυ κμοηθεμηζδίςκ, αιζκμλέςκ ηαζ θζπζδίςκ. Καηά ηδκ αφλδζδ δ βθοηυγδ πνέπεζ κα πανάλεζ αζμιάγα ηαζ ATP. Ζ ζφκεεζδ ημο παθιζηζημφ μλέμξ, βζα πανάδεζβια, πνυδνμιμ ζοζηαηζηυ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ, απαζηεί 7 ιυνζα ΑΣΡ, 16 άκεναηεξ απυ μηηχ ιυνζα αηέηοθμ- CoA ηαζ 28 δθεηηνυκζα απυ 14 ιυνζα NADPH. Έκα ιυνζμ βθοηυγδξ δίκεζ 36 ιυνζα ATP ακ πνμπςνήζεζ ιέπνζ ηδκ μλεζδςηζηή θςζθμνοθίςζδ ή 30 ATP ηαζ 2 NADPH ακ παναηάιρεζ πνμξ ημ ιμκμπάηζ ηςκ θςζθμνζηχκ πεκημγχκ. Άνα ιπμνεί κα ηαθφρεζ 5 θμνέξ αοηήκ ηδκ ακάβηδ βζα ATP βζα παναβςβή παθιζηζημφ μλέμξ, αθθά πνεζάγμκηαζ 7 ιυνζα βθοηυγδξ βζα ημ απαζημφιεκμ ΝΑDPH, πςνίξ κα οπμθμβίγμοιε ηδκ παναβςβή αηέηοθμ-coa. Δίκαζ θακενυ υηζ μ ιεηααμθζζιυξ ιέζς μλεζδςηζηήξ θςζθμνοθίςζδξ δεκ είκαζ ζηακυξ κα ηαθφρεζ ηζξ ακάβηεξ ζφκεεζδξ ιαηνμιμνίςκ (Vander Heiden et al, 2009). Σίεεκηαζ ηα ενςηήιαηα ημο πςξ ημ ηφηηανμ ακηζθαιαάκεηαζ ημ πχξ πνέπεζ κα ηάκεζ αοηή ηδ ιεηάααζδ ηαζ βζαηί μ ιεηααμθζζιυξ ιεηαααίκεζ ζε ηυζμ ιεβάθδ ηαζ ακαβηαζηζηή παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ. Σμ ααζζηυηενμ ενχηδια είκαζ αηυ ηδ ζφκεεζδξ ηςκ δφμ πνμδβμφιεκςκ βζα ηδκ ηαηακυδζδ ημο βζαηί ηα ηανηζκζηά ηφηηανα

38 28 ιεηαααίκμοκ ζε δζαθμνεηζηυ ιεηααμθζζιυ. Τπάνπμοκ δζάθμνεξ εεςνίεξ ημο βζαηί ζοιααίκεζ αοηυ. Ακαθένεηαζ υηζ ιε ημκ ηνυπμ αοηυ ηα ηφηηανα πνμζπαεμφκ κα ελζζμννμπήζμοκ ημ μλεζδμακαβςβζηυ ημοξ δοκαιζηυ. Ζ βθοηυθοζδ ζε αοημφξ ημοξ νοειμφξ πανάβεζ NADH ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ, ημ μπμίμ εα πνέπεζ κα ακαπθδνχκεηαζ ζε NAD + χζηε ημ ιμκμπάηζ ηδξ βθοηυθοζδξ κα παναιέκεζ θεζημονβζηυ (Cairns et al, 2011; Icard et al, 2012). Τπυ ηακμκζηέξ ζοκεήηεξ, δ ακαπθήνςζδ ημο NAD + ζοιααίκεζ εκηυξ ημο ιζημπμκδνίμο. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ ιζημπμκδνζαηή ιειανάκδ είκαζ αδζαπέναηδ απυ ημ NADH ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοζηήιαηα ακηαθθαβχκ βζα κα βίκεζ έιιεζα ζημ ιζημπυκδνζμ ηαζ κα μθμηθδνςεεί δ μλείδςζή ημο ιέζς ηδξ ακαπκεοζηζηή αθοζίδαξ (Chiarugi et al, 2012). Σέημζα είκαζ ηδξ 3 - θςζθμνζηήξ βθοηενυθδξ, ημο ιδθζημφ αζπανηζημφ ηαζ ημο ιδθζημφ ηζηνζημφ (Locasale & Cantley, 2011). Σμ ενχηδια είκαζ ζε πμζμ ααειυ ιπμνμφκ αοηά ηα ζοζηήιαηα κα ελοπδνεηήζμοκ ηζξ ακάβηεξ ημο ηοηηάνμο ηαζ ακ απυ ηάπμζμ ζδιείμ ημνεζιμφ ημοξ ηαζ έπεζηα, δ βαθαηηζηή αθοδνμβμκάζδ είκαζ αοηή πμο ακαθαιαάκεζ αοηυ ημ νυθμ πμο μδδβεί ηαζ ζηδκ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ. Ζ εζηυκα πμο έπμοιε βζα ημ ιεηααμθζζιυ είκαζ υηζ είκαζ αοηυκμιμξ ηαζ αοημδζμνεχκεηαζ. Δίκαζ έκα ζφζηδια μιμζυζηαζδξ υπμο έκαξ πονήκαξ ζηαεενχκ εκγφιςκ επζηνέπεζ ζημ ηφηηανμ κα ακηαπμηνζεεί ζε έκα εφνμξ πενζααθθμκηζηχκ ενεεζζιάηςκ. ε ηφηηανα πμο πνέπεζ κα πμθθαπθαζζαζημφκ, ημ ζήια δίκεηαζ απυ αολδηζημφξ πανάβμκηεξ. ηα ηανηζκζηά ηφηηανα αοηυ δεκ οθίζηαηαζ ζα βεβμκυξ ηαζ δ αθθαβή ζηδκ έηθναζδ βμκζδίςκ πμο μδδβμφκ ζε ιεηααμθζζιυ αφλδζδξ δε ιπμνεί κα μθείθεηαζ πανά ιυκμ ζε ζοζζχνεοζδ ιεηαθθάλεςκ (Vander Heiden et al, 2009). Φαίκεηαζ ηαζ εδχ υηζ δ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ είκαζ μ ηαθφηενμξ δνυιμξ βζα κα αθμιμζςεεί μ άκεναηαξ ζε αζμιάγα, πνάβια ημ μπμίμ εοκμεί ηδκ ηοηηανζηή δζαίνεζδ. Γεκ πνέπεζ κα πανααθέπμοιε ημ νυθμ ηδξ βθμοηαιίκδξ ζηδκ παναβςβή αζμιάγαξ ηαεχξ είκαζ έκα ιυνζμ ημ μπμίμ ηαηακαθχκεηαζ ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ απυ ηζξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ, ιαγί ιε ηδ βθοηυγδ ηαζ επακαηνμθμδμηεί ημκ ηφηθμ ημο ηζηνζημφ μλέμξ βζα ηδκ επανηή παναβςβή μλαθμαηεηζημφ μλευξ ηαζ ηζηνζημφ μλέμξ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ θζπανχκ μλέςκ. Μαγί ιε ηδ βθοηυγδ είκαζ ημ ιυνζμ πμο εοκμεί ηδκ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ, ηαεχξ δ ηαηααμθζηή ημο μδυξ ηαηαθήβεζ, επίζδξ, ζηδ βαθαηηζηή αθοδνμβμκάζδ.

39 29 Ζ ζφκεεζδ ηςκ επζηναηέζηενςκ εεςνζχκ ιαξ οπμδεζηκφεζ υηζ ηα ηφηηανα πμο πμθθαπθαζζάγμκηαζ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ, έπμοκ πνμβναιιαηζζηεί κα ηαηακαθχκμοκ ιεβάθεξ πμζυηδηεξ βθοηυγδξ ηαζ βθμοηαιίκδξ ηαζ κα πανάβμοκ βαθαηηζηυ μλφ. Αοηυξ είκαζ μ ηνυπμξ κα ζοκδοάζμοκ ηδκ ηαπφηαηδ παναβςβή ιαηνμιμνίςκ βζα κα αολήζμοκ ηδ αζμιάγα ημοξ ηαζ κα νοειίζμοκ ηαοηυπνμκα ημ μλεζδμακαβςβζηυ ημοξ δοκαιζηυ. Τπάνπμοκ ηαζ ιμκηέθα ακάθοζδξ ιεηααμθζηχκ δζηηφςκ πμο δείπκμοκ βζαηί έκαξ ηέημζμξ ιεηααμθζζιυξ είκαζ πνμηζιδηαίμξ (Vazquez et al, 2010). Πανάβμκηεξ πμο δζαιμνθχκμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Οζ ηφνζμζ πανάβμκηεξ πμο ηαεμνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ ιζαξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ είκαζ ημ πμζμζηυ ημο δζαθοιέκμο μλοβυκμο, ημ pζ ηαζ δ εενιμηναζία (Goudar, 2006). Γηαιπκέλν νμπγόλν Σμ μλοβυκμ είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ παναβςβή εκένβεζαξ, αθμφ είκαζ μ ηεθζηυξ οπμδμπέαξ δθεηηνμκίςκ ζηδ ιζημπμκδνζαηή ακαπκεοζηζηή αθοζίδα. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ημ μλοβυκμ είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδκ παναβςβή εθεφεενςκ νζγχκ πμο πνμηαθμφκ αθάαεξ ζημ DNA, ηζξ πνςηεΐκεξ ηαζ ηα θζπίδζα. Ζ ηφνζα παναδμπή είκαζ υηζ δζαθμνεηζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ απμηνίκμκηαζ ιε δζαθμνεηζηυ ηνυπμ ζηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο δζαθοιέκμο μλοβυκμο (ΓΟ - DO). Δπίζδξ, μ ιεηααμθζζιυξ δεκ επδνεάγεηαζ δναιαηζηά ιεηαλφ ζοβηεκηνχζεςκ 10% ηαζ 100%. Οζ εοκμσηυηενεξ ηζιέξ είκαζ ιεηαλφ 40% ηαζ 60%. ε δζαθμνεηζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ηαζ ηφπμοξ αζμακηζδναζηήνςκ έπεζ ιεθεηδεεί δ επίδναζδ ημο δζαθοιέκμο μλοβυκμο. Παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ιυκμ υηακ ημ DO έπεθηε ηάης απυ 5% ημνεζιμφ αένα. Συηε παναβυηακ πενζζζυηενμ βαθαηηζηυ μλφ (Heidemann et al, 1998; Zupke et al, 1995). Δπίζδξ, ηάης απυ 1%

40 30 παναηδνείηαζ ιεβάθδ πηχζδ ζηδκ ηαηακάθςζδ βθμοηαιίκδξ ηαζ ηδκ παναβςβή αιιςκίαξ. Οζ αθθαβέξ ζημ ιεηααμθζζιυ ηδξ βθμοηαιίκδξ ζοζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ πηχζδ ηδξ παναβςβήξ αζμιάγαξ ηαζ ηδκ έηηνζζδ βθμοηαιζκζημφ μλέμξ ζημ ιέζμ. Οζ Gomez et al. εηηέθεζακ έκα πείναια (Design of Experiment) DOE υπμο δ εενιμηναζία, ημ ph, ημ DO ηαζ οδνμθοηζημί πανάβμκηεξ ιεηααάθθμκηακ ζε δζάθμνμοξ ζοκδοαζιμφξ (Gomez et al, 2010). Γε δζαπζζηχεδηακ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ υηακ ιεηαααθθυηακ ημ DO, εηηυξ απυ ηδκ αολδιέκδ παναβςβή βθμοηαεζυκδξ ζε επίπεδα ημνεζιμφ πάκς απυ 5%. ε άθθδ ενβαζία ηαηάθενακ κα ιεηνήζμοκ ημ νοειυ ηαηακάθςζδξ μλοβυκμο. Μεηαλφ άθθςκ, πνδζζιμπμίδζακ ηφηηανα BHK ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ (Jorjani & Ozturk, 1999). Ο νοειυξ ηαηακάθςζδξ μλοβυκμο δεκ επδνεάγεηαζ απυ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ μ ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ ηαηακάθςζδξ ελανηάηαζ απυ ημ πμζα ηοηηανζηή ζεζνά πνδζζιμπμζείηαζ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ πηχζδ 1 o C πνμηάθεζε 10% ιείςζδ ζημκ ηοηηανμεζδζηυ νοειυ ηαηακάθςζδξ μλοβυκμο. Οζ Ozturk & Palsson έδεζλακ υηζ οανζδςιαηζηά ηφηηανα ζε ηαθθζένβεζεξ ζοκεπμφξ νμήξ δε ιεηααάθμοκ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ εκενβυηδηα ζε DO εφνμοξ 5 100% (Ozturk & Palsson, 1990). Κάης απυ 5% δ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ αολάκεηαζ ηαζ ηα ηφηηανα πνμζπαεμφκ κα ηαηακαθχζμοκ υζδ πενζζζυηενδ βθοηυγδ ιπμνμφκ. Οζ Jan et al. πνδζζιμπμίδζακ οανζδςιαηζηά ηφηηανα πμκηζημφ χζηε κα ιεθεηήζμοκ ηζ αοημί ηζξ ιεηααμθέξ ζημκ ημνεζιυ ημο DO (Jan et al, 1997). Ζ ηοηηανζηή αφλδζδ έπεθηε υζμ ημ DO αολακυηακ πάκς απυ 50%, θυβς ημο αολδιέκμο μλεζδςηζημφ ζηνεξ, δ ηαηακάθςζδ βθοηυγδξ έπεθηε, επίζδξ, ηαζ μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ ήηακ θζβυηενμ εκενβυξ. Σα ακηζμλεζδςηζηά έκγοια αφλακακ ηδκ εκενβυηδηά ημοξ. ph Σμ ph ζηζξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ, ζοκήεςξ, ζοβηναηείηαζ ζε μοδέηενεξ ηζιέξ, πανυθμ πμο ημ ζδακζηυ ph βζα ζςζηή αφλδζδ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ελανηάηαζ απυ ημ είδμξ ηδξ ζεζνάξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ.

41 31 Μεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ μζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεηααάθθμοκ ηαζ κα πνμζανιυγμοκ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ εκενβυηδηα ζε ιζηνέξ αθθαβέξ ημο ph, αθθά, βεκζηά δ ιείςζδ ημο ph πνμηαθεί ηαζ ιείςζδ ημο νοειμφ ηδξ ηοηηανζηήξ αφλδζδξ (McQueen & Bailey, 1990; oos & Boron, 1981). Αοηυ μθείθεηαζ ζημ νυθμ πμο έπεζ δ θςζθμθνμοηημηζκάζδ, έκα έκγοιμ πμο ελανηάηαζ ηαζ νοειίγεηαζ απυ ημ ph (Stryer, 1988). Τρδθά επίπεδα Ζ + ηάκμοκ ηδ νμή ημο άκεναηα ιέζς ηδξ βθοημθοηζηήξ πμνείαξ κα ιεζχκεηαζ ηαζ κα πανάβεηαζ θζβυηενμ βαθαηηζηυ μλφ. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ υηζ υηακ μ νοειυξ ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ιεζχκεηαζ, ζε ζοκεήηεξ ιεζςιέκμο ph, δ ηαηακάθςζδ ηδξ βθμοηαιίκδξ παναιέκεζ ζηαεενή. Θεξκνθξαζία Ζ εενιμηναζία είκαζ, επίζδξ, πμθφ ηνίζζιμξ πανάβμκηαξ βζα ηδκ απυδμζδ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ (Goudar, 2006). Δίκαζ ηαζ δ εενιμηναζία έκαξ πανάβμκηαξ πμο μ νυθμξ πμο εα δζαδναιαηίζεζ ελανηάηαζ απυ ημ είδμξ ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ πμο ηαθθζενβείηαζ. Οζ 37 μ C είκαζ ιζα ηζιή πμο εεςνείηαζ θοζζμθμβζηή. Ζ βεκζηή παναδμπή είκαζ υηζ δ πηχζδ ηδξ εενιμηναζίαξ νίπκεζ ημ νοειυ αφλδζδξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ (ao & Engelberg, 1965; Watanabe & Okada, 1967). Ζ παναβςβζηυηδηα ζε πνςηεΐκδ πέθηεζ, ακ ηαζ έπμοκ παναηδνδεεί ηαζ ιδ αθθαβιέκεξ θοζζμθμβίεξ αθθά ηαζ ακηίζηνμθεξ. Οζ ιεηααμθζημί νοειμί ηαζ δ αφλδζδ πέθημοκ υηακ δ εενιμηναζία ιεζχκεηαζ. Αοηυ ζοκδέεηαζ ιε ηδκ ηαοηυπνμκδ παναιμκή πμθθχκ ηοηηάνςκ ζηδ θάζδ G0/G1 ηαζ ιείςζδ αοηχκ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ S (Jenkins & Hovey, 1993). Υαναηηδνζζηζηή είκαζ ιεθέηδ ζε BHK ηφηηανα ζε ηαθθζένβεζα δζαθείπμκημξ ένβμο, υπμο μ νοειυξ αφλδζδξ ιεζχεδηε 25% υηακ δ εενιμηναζία έπεζε ζημοξ 33 μ C απυ ημοξ 37 μ C. ηδκ ίδζα ιεθέηδ παναηδνείηαζ πηχζδ ημο νοειμφ ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ηαζ δ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ (Weidemann et al, 1994). Έπεζ ηαοημπμζδεεί ζοζπέηζζδ ηδξ ηζιήξ ηδξ εενιμηναζίαξ ιε ημ νοειυ πνυζθδρδξ μλοβυκμο απυ ηδκ ηοηηανμηαθθζένβεζα. Ξεηζκχκηαξ απυ εενιμηναζία 37 μ C, ηάεε πηχζδ εκυξ ααειμφ ιεζχκεζ ημ νοειυ αοηυ ηαηά 10% ηαζ ιζα ηάλδ ιεβέεμοξ ηάης απυ ημοξ 15 μ C (Chuppa et al, 1997).

42 32 Οζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ ειθακίγμοκ απμνοειζζιέκμ ιεηααμθζζιυ, υπςξ είκαζ ακαιεκυιεκμ απυ ηδκ ηανηζκζηή θοζζμθμβία ημοξ. Ζ βθοηυθοζδ ειθακίγεζ ιεβάθμοξ νοειμφξ, εκχ μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ ηαζ δ μλεζδςηζηή θςζθμνοθίςζδ είκαζ ειθακχξ ηαηαζηαθιέκα. Αοηή δ ηαηάζηαζδ μδδβεί ζε ιεβάθδ παναβςβή βαθαηηζημφ μλέμξ, υπςξ έπεζ πενζβναθεί απυ ημ Warburg. Πανάβμκηεξ υπςξ ημ pζ, δ εενιμηναζία ηαζ ημ δζαθοιέκμ μλοβυκμ (DO) ηνμπμπμζμφκ ημ ιεηααμθζζιυ ηςκ ηοηηάνςκ, ζε ιζηνυ ή ιεβάθμ ααειυ ακάθμβα ιε ημ είδμξ ημοξ. Δίκαζ παναηηδνζζηζηή δ ζηνμθή ηδξ επζζηδιμκζηήξ ημζκυηδηαξ ζημ ιεηααμθζζιυ ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ απυ ημ 2009 ηαζ έπεζηα. Τπάνπμοκ ηα εκδζαθένμκηα ενςηήιαηα ηδξ νφειζζδξ ημο ιεηααμθζζιμφ ηςκ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ, ηαεχξ ηαζ ημο ηνυπμο πμο εα ιπμνμφζε κα ακαζηναθεί έκαξ ηέημζμξ ιεηααμθζζιυξ. Δπίζδξ, παναηηδνζζηζηυξ είκαζ ηαζ μ ηνυπμξ πμο ιεθεημφκηακ μζ αεάκαηoπμζδιέκεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ. Γε θαιαάκμκηακ ηαηά κμο υηζ απμηεθμφζακ ηαπέςξ αολακυιεκα ηφηηανα, αθθά ακηζιεηςπίγμκηακ απυ ημοξ ενεοκδηέξ ζακ ηφηηανα εδθαζηζηχκ, ιε υηζ αοηυ ζδιαίκεζ βζα ηδκ πμθοπθμηυηδηα ηαζ ηδ δζαιενζζιαημπμίδζδ εκυξ εοηανοςηζημφ ηοηηάνμο.

43 33 Α.3 Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ Ζ πνχηδ εεναπεοηζηή πνςηεΐκδ απυ ακαζοκδοαζιέκα ηφηηανα εδθαζηζηχκ πμο ελαζθάθζζε έβηνζζδ βζα εζζαβςβή ζηδκ αβμνά ήηακ δ tpa (tissue plasminogen activator, Genentech) (Lubiniecki, 1998). ηζξ ιένεξ ιαξ πενίπμο ημ 70% ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ θανιαηεοηζηχκ πνμσυκηςκ πνμένπμκηαζ απυ ηφηηανα εδθαζηζηχκ. Ζ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ ηαζ δ ηεπκμθμβία πάκς ζημκ ημιέα έπεζ πανμοζζάζεζ ιεβάθδ πνυμδμ ηαηά ηζξ ηεθεοηαίεξ ηνεζξ δεηαεηίεξ. Γζάθμνα επζζηδιμκζηά πεδία έπμοκ ζοιαάθεζ ζε αοηήκ ηδκ ελέθζλδ, υπςξ δ Βζμθμβία Κοηηάνμο, δ Γεκεηζηή ηαζ Μεηααμθζηή Μδπακζηή, δ Πνςηεσκζηή Υδιεία, δ Γμκζδζςιαηζηή ηαζ μζ μιζηέξ ηεπκμθμβίεξ ηαζ δ Υδιζηή Μδπακζηή. Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ είκαζ ημ επζζηδιμκζηυ πεδίμ πμο αζπμθείηαζ ιε ηδκ παναβςβή εκυξ ανζειμφ ζδιακηζηχκ, ιεβάθμο ιεβέεμοξ, πμθφπθμηςκ ηαζ βθοημζοθζςιέκςκ πνςηεσκχκ απυ γςζηά ηφηηανα (ηονίςξ εδθαζηζηά) (Das, 2001). Σα πνμσυκηα ηδξ Μδπακζηήξ Κοηηανμηαθθζενβεζχκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζα θάνιαηα ζε αζεέκεζεξ υπςξ ηανηίκμξ, ζζηέξ ιμθφκζεζξ, ηθδνμκμιζηέξ ακςιαθίεξ ηαζ πνυκζεξ αζεέκεζεξ. Σα πνμσυκηα απμδεζηκφμκηαζ αζθαθή, απμηεθεζιαηζηά ηαζ μζημκμιζηά. Μενζηά πνμσυκηα έπμοκ γήηδζδ πάκς απυ 500 ηζθά ημ πνυκμ ηαζ έπμοκ ηφηθμ ενβαζζχκ δφμ δζζεηαημιιονίςκ δμθθανίςκ (Ozturk, 2006). Έκα ιεβάθμ άθια ήηακ δ απμδμπή ηςκ αεακαημπμζδιέκςκ ηοηηανζηχκ ζεζνχκ ςξ νοειζζηζηά ιέζα. Οζ αεάκαηεξ, ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ιπμνμφκ κα αολάκμκηαζ αεκάςξ, έπμοκ ιζηνυηενεξ ακάβηεξ βζα ηδκ αφλδζή ημοξ ηαζ ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ ζε εκαζςνήιαηα, πνάβια πμο είκαζ ηαζ ημ ιεβαθφηενμ πθεμκέηηδιά ημοξ (Ozturk, 2006). Σμ ηεθεοηαίμ ήηακ πμο επέηνερε ηδκ άκμδμ ζε επίπεδμ υβημο ηαθθζένβεζαξ ηαζ ηδκ αφλδζδ ζε αζμακηζδναζηήνεξ, ηάηζ πμο πνμζέββζγε ηζξ ζδζαίηενα απμδεηηέξ ιζηνμαζαηέξ ηαθθζένβεζεξ. Ζ ακάπηολδ ηδξ Γεκεηζηήξ ηαζ Μεηααμθζηήξ Μδπακζηήξ ηαζ δ πνήζδ ηδξ ηεπκμθμβίαξ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA έηακακ δοκαηή ηδκ παναβςβή εκυξ ζηακμφ ανζειμφ πνμσυκηςκ απυ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ. Έκαξ ανζειυξ θμνέςκ

44 34 πνδζζιμπμζμφκηαζ ζε ιζα ιεβάθδ πμζηζθία ηοηηανζηχκ ζεζνχκ βζα ηδκ παναβςβή αοημφζζςκ ή ηνμπμπμζδιέκςκ ακενχπζκςκ πνςηεσκχκ. Ζ ιδπακζηή ζημ δοκαιζηυ ημο ηοηηάνμο επέηνερε ηδκ ηνμπμπμίδζδ ηςκ πνςηεσκζηχκ πνμσυκηςκ, χζηε κα επζηεοπεεί ζηαεενυηδηα, απμηεθεζιαηζηυηδηα ηαζ αζμθμβζηή εκενβυηδηα. Ζ Βζμθμβία Κοηηάνμο ηαζ δ Βζμπδιζηή Μδπακζηή, ζε ιζα ζηεκή ζοκενβαζία, έδςζακ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ ιε ελαζνεηζηή παναβςβζηυηδηα, πμο ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ ζε ορδθήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ ηαζ ζε πμθφ ιεβάθδ ηοηηανζηή ζοβηέκηνςζδ. Ζ δζαδζηαζία έπεζ βίκεζ νμοηίκα, έπεζ ακέαεζ επίπεδμ παναβςβήξ ηαζ ηα ηφηηανα ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ ιε ζηαεενυηδηα αηυια ηαζ ζε αζμακηζδναζηήνεξ ηςκ θίηνςκ. Πνυμδμζ έπμοκ ζδιεζςεεί ζηδκ ελέθζλδ ηςκ ενεπηζηχκ οθζηχκ ηαζ ζηζξ ηεπκζηέξ ηαηαηνάηδζδξ ηαζ ακαηφηθςζδξ ηςκ ηοηηάνςκ, βεβμκυηα πμο μδδβμφκ ζηζξ πμθφ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηοηηάνςκ ζημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα. Δπζπνυζεεηα, ημ ηυζημξ ηδξ δζαδζηαζίαξ έπεζ ιεζςεεί ζδιακηζηά απυ ηδκ ελάθεζρδ ημο μνμφ ηαζ άθθςκ, ορδθμφ ηυζημοξ πνςηεσκχκ απυ ημ ενεπηζηυ ιέζμ. Αοηή ηδ ζηζβιή πνδζζιμπμζμφκηαζ πδιζηά ηαεμνζζιέκα ενεπηζηά ιέζα, πνάβια πμο εκζζπφεζ ηδκ αζθάθεζα ηαζ ηδκ αλζμπζζηία ηδξ παναβςβήξ αζμθμβζηχκ πνμσυκηςκ (Ozturk 2006). Σέθμξ, δ ζφβπνμκδ ηεπκμθμβία δζαεέηεζ ιεευδμοξ απμηεθεζιαηζημφ δζαπςνζζιμφ, ηαεανζζιμφ ηαζ απεκενβμπμίδζδξ ηςκ ζχκ πμο δίκμοκ απμηεθεζιαηζηά, ηαεανά ηαζ αζθαθή ηεθζηά πνμσυκηα (Petricciani, 1995). Οζ παιδθήξ ηθίιαηαξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ έδςζακ ηανπμφξ ζε ενεοκδηζηυ επίπεδμ, ζηδκ ηαηακυδζδ ηοηηανζηχκ δζενβαζζχκ, αθθά ηαζ ζε δζαβκςζηζημφξ ζημπμφξ. Γζα κα ηαθοθεμφκ μζ απαζηήζεζξ ζε ειαυθζα ηαζ εεναπεοηζηέξ πνςηεΐκεξ, υιςξ, πνεζάγμκηαζ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ορδθήξ ηθίιαηαξ. Μενζηά απυ ηα πνμσυκηα αοηά έπμοκ ιεβάθδ γήηδζδ πμο βζα κα ηαθοθεεί απαζηείηαζ παναβςβή πζθίςκ ηζθχκ ημ πνυκμ (π.π. ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα). Αοηυ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιυκμ ζε αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ (ιέπνζ 20 ηυκμοξ) ιε απμηεθεζιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ πμο πανάβμοκ ανηεηά ηζθά ηδ ιένα (Das, 2001; Lubiniecki, 1998). Οζ ηοθζκδνζηέξ θζάθεξ, μζ θθάζηεξ Σ ηαζ μζ δζζημεζδείξ δζαζπμνείξ πνδζζιμπμζμφκηαζ αηυιδ ζηδκ ακααάειζζδ (scale - up) ηςκ ηαθθζενβεζχκ. ε ζφβηνζζδ ιε ηζξ ηαθθζένβεζεξ ζε εκαζχνδια, ηα ζοζηήιαηα πμο ελανηχκηαζ απυ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ είκαζ πζμ δφζημθμ κα ακαααειζζημφκ βζαηί μ θυβμξ επζθάκεζα πνμξ υβημ, βίκεηαζ ιζηνυηενμξ ζε ιεβαθφηενεξ ηθίιαηεξ (Wurm, 2004).

45 35 Ζ απμδμπή ηςκ ζοκεπχκ ηοηηανζηχκ ζεζνχκ έηακε δοκαηή ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ ηοηηάνςκ ζε εκαζςνήιαηα ζε ιεβάθδξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ. Οζ ζοκεπείξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ είκαζ αζςνμφιεκα ηφηηανα πμο ιπμνμφκ κα ακαηζκδεμφκ ηαζ κα πνμζθάαμοκ αένα ιέζα ζε αζμακηζδναζηήνεξ. Όιςξ, ημ κα ηαθθζενβήζεζξ ηφηηανα ζε αζμακηζδναζηήνεξ δεκ ήηακ απθή δζαδζηαζία. Οζ αολδιέκεξ απαζηήζεζξ ηςκ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ απαζημφζακ ηαθυ ηαεμνζζιυ ηςκ ζδακζηχκ ζοκεδηχκ ηαθθζένβεζαξ ηαζ θεζημονβίαξ. Μεηά απυ πνυκζεξ πνμζπάεεζεξ ηαεμνζζιμφ πνμέηορακ μζ αέθηζζηεξ ζοκεήηεξ ακαηίκδζδξ, ελαενζζιμφ ηαζ ζφζηαζδξ ενεπηζημφ οθζημφ. ηζξ ιένεξ ιαξ, ηα ηφηηανα ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ ζε αζμακηζδναζηήνεξ ιεβέεμοξ είημζζ ηυκςκ ηαζ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ, ηδξ ηάλδξ ηςκ 50 * 10 6 ηοηηάνςκ / ml, βζα πμθθμφξ ιήκεξ ζοκεπυιεκα (Wurm, 2004). Ακάπηολδ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ Ζ παναβςβή ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ απυ γςζηέξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ λεηζκά απυ ηδκ ηαηαζηεοή ιζαξ ηαηάθθδθδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ. Ζ επζθμβή ημο ζοζηήιαημξ έηθναζδξ ηαζ ημο ηνυπμο έηθναζδξ ελανηάηαζ απυ ηδ θφζδ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο πνέπεζ κα εηθναζηεί, ηδκ πμζυηδηα ημο οθζημφ πμο απαζηείηαζ ηαζ ημ πνμκζηυ μνίγμκηα εκηυξ ημο μπμίμο πνέπεζ κα οπάνπεζ ζηαεενή παναβςβή. Σα ζοζηήιαηα έηθναζδξ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ πνμηζιχκηαζ βζα ηδκ παναβςβή ιεβάθςκ ηαζ βθοημζοθζςιέκςκ πνςηεσκχκ (Ozturk, 2006). Γζα ηθζκζηή ή ειπμνζηή παναβςβή πνμσυκημξ απαζημφκηαζ ζοζηήιαηα έηθναζδξ ζηακά βζα ζοκεπή έηθναζδ πνμσυκημξ ηαζ βζα παναηεηαιέκεξ πνμκζηέξ πενζυδμοξ. Σμ DNA πμο πενζέπεζ ημ βμκίδζμ ηδξ πνςηεΐκδξ πμο πνέπεζ κα παναπεεί, πνέπεζ κα εκζςιαηςεεί ζημ ηφηηανμ λεκζζηή ιε ηνυπμ πμο κα ελαζθαθίγεζ ζηαεενή παναβςβή πνμσυκημξ. Πένα απυ ηδκ ζζπφ ημο οπμηζκδηή, δ ζοπκυηδηα ηδξ εκζςιάηςζδξ ημο ηιήιαημξ ημο DNA ζημ πνςιυζςια (ανζειυξ ακηζβνάθςκ - copy number), υπςξ ηαζ δ εέζδ εκζςιάηςζδξ είκαζ μζ πζμ ζδιακηζημί πανάβμκηεξ ηαεμνζζιμφ ηςκ επζπέδςκ έηθναζδξ. Δίκαζ απαναίηδημ κα ελαηνζαςεεί ακ δ αθθδθμοπία έπεζ εκζςιαηςεεί ζε πνςιυζςια ημο ηοηηάνμο, χζηε κα παναιείκεζ εηεί ηαζ κα πμθθαπθαζζάγεηαζ ιαγί ιε ημ οπυθμζπμ DNA (Ozturk, 2006). Αοηυ επζηοβπάκεηαζ ιε ηδκ εζζαβςβή ηαζ αθθδθμοπίαξ πμο πενζέπεζ βμκίδζμ δείηηδ. Σα

46 36 ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα ηαθθζενβμφκηαζ ηαζ επζθέβμκηαζ υζα έπμοκ ημ βμκίδζμ δείηηδ (Wurm, 2004). Τπάνπμοκ δζάθμνα ηφηηανα εδθαζηζηχκ ζηακά κα δχζμοκ ορδθά επίπεδα έηθναζδξ ακαζοκδοαζιέκςκ πνςηεσκχκ ηαζ είκαζ ηαηάθθδθα βζα παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ. Κοηηανζηέξ ζεζνέξ πμο πνμένπμκηαζ απυ ηνςηηζηά, υπςξ ηα ηφηηανα (chinese hamster ovary), ηα ηφηηανα BHK (baby hamster kidney), ηα ηφηηανα HEK (human embryo kidney) ηαζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ θειθχιαημξ, υπςξ μζ NS0, SP2 ηαζ YB2 είκαζ αοηέξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ πζμ ζοπκά. Πανυθα αοηά, υπμζα ηοηηανζηή ζεζνά ηαζ ακ πνδζζιμπμζδεεί, πνέπεζ κα οπμζηδνίγεζ ορδθή παναβςβή πνμσυκημξ βζα ανηεημφξ ιήκεξ ηαθθζένβεζαξ, κα ιπμνεί κα ακαααειζζηεί ζε ιεβάθμοξ υβημοξ ( L) ηαζ κα είκαζ ζηακή κα δζαηδνήζεζ ορδθή ηοηηανζηή αζςζζιυηδηα ηαζ ποηκυηδηα (>5*10 6 ηφηηανα / ml βζα αζμακηζδναζηήνεξ δζαθείπμκημξ ένβμο, >10 8 ηφηηανα / ml βζα αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ), κα πανέπεζ ηαηάθθδθεξ ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ ηαζ κα ιδκ επδνεάγεηαζ εφημθα απυ ηοπυκηεξ πανάβμκηεξ, ηονίςξ ζμφξ (Ozturk 2006). Οζ πενζζζυηενεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ παναβςβή αζμθανιαηεοηζηχκ πνμσυκηςκ, είκαζ ζηακέξ βζα ορδθά επίπεδα έηθναζδξ πνςηεσκχκ, ηδξ ηάλδξ ηςκ pg/ηφηηανμ/διένα. Πναηηζηά, ιυκμ ζηδκ παναβςβή ιμκμηθςκζηχκ ακηζζςιάηςκ λεπενκζέηαζ ημ θνάβια ηςκ 10 pg/ηφηηανμ/διένα. Γζάθμνα ζοιαάκηα ηαηά ηδ ιεηαβναθή, ιεηάθναζδ ή ιεηέπεζηα ζηάδζα ηνμπμπμζήζεςκ πενζμνίγμοκ ηδκ ηοηηανμεζδζηή παναβςβζηυηδηα. Γζα πμθθά ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα, δ πνςηεσκζηή έηηνζζδ ακηζζημζπεί ζηα επίπεδα παναβςβήξ mna ιέπνζ ηαζ παναβςβζηυηδηεξ ηδξ ηάλδξ ηςκ 50 pg/ηφηηανμ/διένα. Όιςξ, ζε άθθεξ ηαηδβμνίεξ πνςηεσκχκ, υπςξ πμθοιενζηέξ (multimeric), ορδθά βθοημζοθζςιέκμζ αολδηζημί πανάβμκηεξ ηαζ fusion πνςηεΐκεξ, μζ ιεηα-ιεηαθναζηζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ ηαζ δ πνςηεσκζηή ακαδίπθςζδ είκαζ ηα πνχηα πενζμνζζηζηά αήιαηα (Shen, 2006). Οζ ηθχκμζ πμο ακζπκεφμκηαζ κα έπμοκ ορδθή εζδζηή παναβςβζηυηδηα ή έηθναζδ mna, επεηηείκμκηαζ ζε πθάηεξ ηαθθζένβεζαξ ζζηχκ (tissue culture plates), ιέπνζ κα παναπεμφκ ανηεηά ηφηηανα χζηε κα ακαπηοπεεί ιζα ηαθθζένβεζα ζε εκαζχνδια. Ζ πνςηανπζηή ζηέρδ πνέπεζ κα είκαζ δ ζηαεενυηδηα ηαζ δ ζοιααηυηδηα ηςκ ζοκεδηχκ, χζηε ηα ηφηηανα κα αολδεμφκ ηαζ κα ακαπηοπεμφκ ζε αζμιδπακζηέξ ζοκεήηεξ. Καηά ηδ δζάνηεζα αοηήξ ηδξ δζαδζηαζίαξ, είκαζ ζδιακηζηυ κα δζαηδνείηαζ δ ηαθθζένβεζα ζε

47 37 ορδθά επίπεδα ηοηηανζηή ποηκυηδηαξ ηαζ κα παναημθμοεείηαζ δ αφλδζδ ηαζ δ αζςζζιυηδηα, ζηεκά, ηονίςξ ζηζξ πνχηεξ ανηεηέξ ακαηαθθζένβεζεξ (passages). Οζ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα αζμιδπακζημφξ ηαζ ειπμνζημφξ ζημπμφξ πνέπεζ κα είκαζ ζηακέξ κα αολάκμκηαζ ηαζ απμοζία μνμφ ή πνςηεσκχκ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ. Έπμοκ αημθμοεδεεί ιέεμδμζ επζιυθοκζδξ ηαζ επζθμβήξ ζεζνχκ πμο πθδνμφκ ηζξ παναπάκς απαζηήζεζξ. Σμ ενεπηζηυ ιέζμ ειπθμοηίγεηαζ ιε αολδηζημφξ πανάβμκηεξ, θζπίδζα, αζηαιίκεξ, ζπκμζημζπεία χζηε κα δζαζθαθζζημφκ μζ ζοκεήηεξ αφλδζδξ ηςκ ηοηηάνςκ (Shen 2006). Μυθζξ ηα ηφηηανα πνμζανιμζημφκ ζε ακάπηολδ ζε εκαζχνδια ηαζ απμοζία μνμφ, ηυηε είκαζ ζηακά κα πνδζζιμπμζδεμφκ ζε ιεβάθδξ ηθίιαηαξ δζαδζηαζίεξ ηαθθζένβεζαξ. Γεκεηζηή ηαζ Μεηααμθζηή Μδπακζηή Μζα απυ ηζξ πζμ αλζμζδιείςηεξ ελεθίλεζξ ηα ηεθεοηαία πνυκζα είκαζ δ εθανιμβή ιεευδςκ Γεκεηζηήξ ηαζ Μεηααμθζηήξ Μδπακζηήξ, χζηε ιε θμβζηυ ηαζ επζεοιδηυ ηνυπμ κα ηνμπμπμζδεμφκ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ εδθαζηζηχκ ηαζ κα βίκμοκ πζμ εφπνδζηα ζηδ δζαδζηαζία παναβςβήξ εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ. Έκα ηέημζμ πανάδεζβια αθμνά ζηδκ πενζμπή ημο εθέβπμο ηδξ βθοημζοθίςζδξ. Έπεζ δεζπηεί υηζ πμθθέξ ακηζδνάζεζξ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ βθοημζοθίςζδξ επδνεάγμκηαζ απυ πανάβμκηεξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, ηδκ επζθμβή ημο ηοηηάνμο λεκζζηή ηαζ εζδζηά παναηηδνζζηζηά ηάεε πνςηεΐκδξ, βεβμκυηα πμο μδδβμφκ ζηδκ παναβςβή ιμνίςκ ιε ανηεηέξ δζαθμνμπμζήζεζξ ηαζ ιεζςιέκδ, ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ, αζμθμβζηή εκενβυηδηα (Goochee et al, 1991). Έκα ηθαζζηυ πανάδεζβια ηδξ εθανιμβήξ ηδξ ηεπκμθμβίαξ ημο ακαζοκδοαζιέκμο DNA ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ είκαζ δ εζζαβςβή βμκζδίςκ βθοημηνακζθεναζχκ, χζηε κα εκζζποεεί δ ιεηαθμνά βθοηακχκ ηαζ κα ελαζθαθζζηεί αολδιέκδ βθοημζοθίςζδ (Weikert et al, 1999). Έκαξ άθθμξ ημιέαξ ζηυπεοζδξ είκαζ μ πεζνζζιυξ ημο ηεκηνζημφ ιεηααμθζζιμφ ηαζ δ εθαπζζημπμίδζδ ηδξ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ. Ζ οπενέηθναζδ ηδξ πονμζηαθοθζηήξ ηαναμλοθάζδξ ζε ηφηηανα BHK έπεζ αμδεήζεζ πνμξ αοηήκ ηδκ ηαηεφεοκζδ (Irani et al, 1999). Σμ ίδζμ ηαζ δ ιενζηή αδνακμπμίδζδ ηδξ βαθαηηζηήξ αθοδνμβμκάζδξ (Chen et al, 2001).

48 38 Αηυια, βίκμκηαζ πνμζπάεεζεξ εθέβπμο ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο ηαζ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ απυπηςζδξ, χζηε ηα ηφηηανα κα παναιέκμοκ ζε θάζδ αφλδζδξ ηαζ, ηαη επέηηαζδ πνςηεσκμζφκεεζδξ (Fussenegger et al, 1998; Miller et al, 1988). Βζμακηζδναζηήνεξ ηαζ θεζημονβία Οζ αζμακηζδναζηήνεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηα πεζνάιαηα ηδξ πανμφζαξ δμοθεζάξ, ήηακ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. Ο αζμακηζδναζηήναξ δζαπυηζζδξ είκαζ ζοκεπμφξ νμήξ, υπμο οπάνπεζ ιζα νμή ενεπηζημφ ιέζμο πνμξ ημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα ηαζ ιζα ζοκεπήξ ζοθθμβή ημο πνδζζιμπμζδιέκμο ιέζμο, εκχ υθα ή έκα πμζμζηυ ηςκ ηοηηάνςκ επζζηνέθμοκ ζημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα ιεηά ηδκ έλμδυ ημοξ απυ ηδκ ελςηενζηή νμή. Έηζζ δ δίμδμξ έλς απυ ημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα πενζέπεζ θίβα ή ηαευθμο ηφηηανα (Goudar et al, 2009). Οζ δζαθείπμκημξ ηαζ, ηονίςξ, μζ διζ-δζαθείπμκημξ ένβμο αζμακηζδναζηήνεξ πνμηζιχκηαζ βζα ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ιεηαζπδιαηζζιέκςκ ααηηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ, επίζδξ, ζηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ. Σα ηφηηανα εδθαζηζηχκ ηαθθζενβμφκηαζ ζε αζμακηζδναζηήνεξ διζδζαθείπμκημξ ένβμο ηαζ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. Οζ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ πνμζθένμοκ ζοβηεηνζιέκα πθεμκεηηήιαηα, αθθά έπμοκ ηαζ ιεζμκεηηήιαηα. Σα πθεμκεηηήιαηα: - Σα ιεηααμθζηά παναπνμσυκηα (δδθαδή ημ βαθαηηζηυ μλφ, δ αιιςκία) απμαάθθμκηαζ ελαζηίαξ ηδξ ζοκεπμφξ εζζνμήξ θνέζημο ενεπηζημφ ιέζμο ηαζ εηνμήξ πνδζζιμπμζδιέκμο ιέζμο. - Ζ ζοκεπήξ εηνμή επζηνέπεζ ηδκ εφημθδ ζοθθμβή ηδξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ. - Ο ανβυξ νοειυξ δζπθαζζαζιμφ ηςκ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ ηάκεζ ηδκ ακαηφηθςζδ ηςκ ηοηηάνςκ απμηεθεζιαηζηυηενδ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ. - Σα εκενβά ηαζ παναβςβζηά ηφηηανα εδθαζηζηχκ ζημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα ανίζημκηαζ ζε ιεβαθφηενδ ποηκυηδηα απυ υηζ ζε έκα αζμακηζδναζηήνα διζδζαθείπμκημξ ένβμο. Ζ πνςηεσκμζφκεεζδ είκαζ ακάθμβδ

49 39 ημο ανζειμφ ηςκ γςκηακχκ ηοηηάνςκ, έηζζ δ ιεβαθφηενδ ηοηηανζηή ποηκυηδηα έπεζ ζακ απμηέθεζια ιεβαθφηενμ νοειυ παναβςβήξ. - Ο ιζηνυξ πνυκμξ παναιμκήξ ηδξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ εκηυξ ημο ζχιαημξ ημο αζμακηζδναζηήνα, εθαπζζημπμζεί ηδκ έηεεζδ ζε απμδζαηαηηζηά έκγοια (πνςηεάζεξ, ζζαθζδάζεξ) πμο απεθεοεενχκμκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ απυ ηα κεηνά ηφηηανα. Απυ ηδκ άθθδ πθεονά: - Δθάπζζηεξ θανιαηεοηζηέξ αζμιδπακίεξ έπμοκ ηδκ ειπεζνία πμο απαζηείηαζ βζα ημοξ δφζπνδζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. - Ζ δζαδζηαζία ηδξ ηαθθζένβεζαξ δζανηεί πενζζζυηενμ (ιήκεξ) ηαζ, ελαζηίαξ αοημφ, ημ ηυζημξ θεζημονβίαξ είκαζ ορδθυ. Ζ ιεβαθφηενδ δζάνηεζα ίζςξ, κα απμδεζηκφεηαζ πθεμκέηηδια, εκ ηέθεζ, θυβς ηδξ ιεβαθφηενδξ πμζυηδηαξ ηδξ ηεθζηχξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ. Λεηηνπξγία Οζ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ παναηηδνίγμκηαζ απυ ζοκεπή εζζνμή θνέζημο ενεπηζημφ ιέζμο ηαζ ζοκεπή εηνμή πνδζζιμπμζδιέκμο ιέζμο, εκχ ηα ηφηηανα, ιενζηχξ ή μθζηχξ, ακαηοηθχκμκηαζ ηαζ επζζηνέθμοκ ζημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα.. Σμ νεφια εηνμήξ ημο αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ έπεζ ιζηνή ή ιδδεκζηή ζοβηέκηνςζδ ηοηηάνςκ ηαζ αοηή είκαζ δ ααζζηή δζαθμνά ημο αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ ηαζ ημο αζμακηζδναζηήνα ζοκεπμφξ νμήξ (πδιμζηάηδ).

50 40 πήια Α. 3 πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ. Υαναηηδνζζηζηή είκαζ δ ζοζηεοή ακαηφηθςζδξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο επζζηνέθεζ ηφηηανα ζημ ηφνζμ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα. Ο αζμακηζδναζηήναξ δζαπυηζζδξ έπεζ δφμ νεφιαηα εζζνμήξ ηαζ δφμ νεφιαηα εηνμήξ (πήια Α.3). Σα νεφιαηα εζζνμήξ είκαζ ημ νεφια ημο ενεπηζημφ ιέζμο (F) ηαζ ημ νεφια πμο λεηζκά απυ ηδ ζοζηεοή ακαηφηθςζδξ ηαζ ηαηαθήβεζ ζημ ηονίςξ ζχια (F p ). Σα νεφιαηα εηνμήξ είκαζ ημ νεφια πμο λεηζκά απυ ημ ηονίςξ ζχια ηαζ ηαηαθήβεζ ζηδ ζοζηεοή ακαηφηθςζδξ (F + F p - F d ) ηαζ ημ νεφια απμαμθήξ ηοηηάνςκ (F d ). Ζ ηοηηανζηή ποηκυηδηα ημο αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ παναιέκεζ ζηαεενή ηαζ ζδζαίηενα ορδθή. Αοηυ επζηοβπάκεηαζ απυ ηδ ζοκεπή παναημθμφεδζδ ηδξ ηοηηανζηήξ αφλδζδξ ηαζ απυ έκα ζοκδοαζιυ ηδξ απμαμθήξ ηοηηάνςκ απυ ημ νεφια ζοθθμβήξ F Ζ (ιδ εθεβπυιεκμ) ηαζ απυ ημ νεφια απμαμθήξ ηοηηάνςκ (εθεβπυιεκμ). Απυ ηδ δζαδζηαζία αοηή επζηοβπάκεηαζ ορδθή αζςζζιυηδηα ζημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα (πάκς απυ 98%) ηαζ ορδθή ηοηηανζηή ποηκυηδηα ( ) ηδξ ηάλδξ ηςκ 10 9 ηοηηάνςκ / L. Μζα παναηηδνζζηζηή ιεηααθδηή ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ δζαπυηζζδξ είκαζ μ ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ (Cell Specific Perfusion ate CSP), μ μπμίμξ παναιέκεζ ζηαεενυξ ηαζ ζζμφηαζ ιε: ( )

51 41 Ο ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ είκαζ ζημζπείμ ημο ζοζηήιαημξ παναημθμφεδζδξ ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ ηδξ Bayer. Ακηζπνμζςπεφεζ ημκ υβημ ενεπηζημφ ιέζμο πμο δίκεηαζ ζε έκα ηφηηανμ ζηδ δζάνηεζα ιζαξ διέναξ. Σμ βεβμκυξ ηδξ ζηαεενυηδηαξ ημο ηοηηανμεζδζημφ νοειμφ δζαπυηζζδξ επζηνέπεζ ηδκ οπυεεζδ υηζ ηα ηφηηανα παναιέκμοκ ζε πανυιμζα ηαηάζηαζδ θοζζμθμβίαξ, πςνίξ κα οπάνπμοκ ιεηααμθζηέξ αθθαβέξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ παναβςβήξ. Αοηή δ οπυεεζδ ελεηάγεηαζ ζηεκά ζηδκ πανμφζα ενβαζία ηαζ εθέβπεηαζ δ μνευηδηά ηδξ. Ζ ηαθθζένβεζα ζε έκα αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ πνέπεζ κα δζαηδνήζεζ ηδκ ζζμννμπία ιεηαλφ ηδξ αφλδζδξ ηαζ ηςκ απμααθθυιεκςκ ηοηηάνςκ. Μεβάθεξ δζαηοιάκζεζξ ηδξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ ιπμνμφκ κα ζοιαμφκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ παναβςβήξ. Ζ δζαδζηαζία εθέβπεηαζ ζοκεπχξ απυ ηδκ αηυθμοεδ ελίζςζδ: : ηοηηανζηή ποηκυηδηα εκηυξ ημο αζμακηζδναζηήνα ι: νοειυξ αφλδζδξ : νοειυξ δζαπυηζζδξ : ζοθθεβυιεκα ηφηηανα : νοειυξ απμαμθήξ ηοηηάνςκ V: υβημξ αζμακηζδναζηήνα Ακ οπμεέζμοιε υηζ δ ηαηάζηαζδ είκαζ ζηαεενή, ηυηε δ ελίζςζδ βίκεηαζ:

52 42 Σνέπμκ ζφζηδια παναημθμφεδζδξ Ζ παναημθμφεδζδ ιζαξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζε αζμακηζδναζηήνα δζαπυηζζδξ ζε αζμιδπακζηή ηθίιαηα, βίκεηαζ απυ έκα ζφκμθμ δεδμιέκςκ πμο ζοθθέβεηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ. Κονίςξ ιεηνχκηαζ μ νοειυξ ηαηακάθςζδξ οπμζηνχιαημξ (βθοηυγδ, βθμοηαιίκδ), μ νοειυξ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ, μ νοειυξ παναβςβήξ αιιςκίαξ, μ νοειυξ αφλδζδξ ηςκ ηοηηάνςκ, δ ηοηηανζηή αζςζζιυηδηα ηαζ δ πμζυηδηα ηδξ πνςηεΐκδξ. Αοηέξ μζ πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ ειθακίγμοκ ιεβάθεξ δζαηοιάκζεζξ, μζ μπμίεξ επεηηείκμκηαζ υηακ οπμθμβίγμκηαζ μζ εζδζημί νοειμί ηςκ πέκηε πνχηςκ απυ αοηέξ (Goudar et al, 2009). Γζα κα εκζζποεεί ημ ζφκμθμ παναημθμφεδζδξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ πνεζάγεηαζ πνμζέββζζδ ηδξ εκδμηοηηανζηήξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ. Μζα πνμζέββζζδ εα ήηακ δ ακάθοζδ ιεηααμθζηχκ νμχκ. Έπμοκ πνμηαεεί θφζεζξ πνμξ αοηήκ ηδκ ηαηεφεοκζδ (Vallino & Stephanopoulos, 1993; Varma & Palsson, 1994; Wiechert, 2001), αθθά ημοααθμφκ ημ ιεζμκέηηδια υηζ μζ ιεηνήζεζξ βίκμκηαζ έλς απυ ηδ βναιιή παναβςβήξ (off-line). Απυ ηζξ ιεηνήζεζξ πμο ακαθένεδηακ υηζ πενζθαιαάκμκηαζ ζημ ηθαζζηυ ζφκμθμ παναημθμφεδζδξ έπεζ βίκεζ απυπεζνα κα πνμζδζμνζζημφκ μζ ηφνζεξ ιεηααμθζηέξ νμέξ ζε ιζα διζ-πμζμηζηή ακάθοζδ ηοηηανζηχκ νμχκ (Goudar et al, 2006). Σμ ζδιακηζηυ ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ ααζίγεηαζ ζε ιεηνήζεζξ πμο βίκμκηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηαζ οπμθμβίγμκηαζ αοηυιαηα απυ αθβμνίειμοξ πμο ακζπκεφμοκ ηοπμφζεξ απμηθίζεζξ ηαζ πνμεζδμπμζμφκ, χζηε κα θδθεμφκ ηα απαναίηδηα ιέηνα. Σμ ιεζμκέηηδια ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ ζημοξ οπμθμβζζιμφξ ηςκ ιεηααμθζηχκ νμχκ ηθδνμκμιμφκηαζ ηα πνμαθήιαηα ηςκ δζαηοιάκζεςκ ηςκ ιαηνμζημπζηχκ πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ. Δπίζδξ, είκαζ ζογδηήζζιμ ακ μζ ιεηνήζεζξ αοηέξ έπμοκ ηδκ απαναίηδηδ εοαζζεδζία κα απμδχζμοκ ιζηνέξ αθθαβέξ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ, πμο εκδέπεηαζ κα είκαζ ζδιακηζηέξ.

53 43 Α.4 Μεηααμθμιζηή Ακάθοζδ Ζ ιεηααμθμιζηή ακαθένεηαζ ζηδκ ορδθήξ απυδμζδξ ακάθοζδ ημο ιεηααμθζζιμφ εκυξ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ ζηδνίγεηαζ ζηδκ ηαοηυπνμκδ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ εθεφεενςκ ιεηααμθζηχκ (Klapa, 2010). Σμ πνυηοπμ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ (ιεηααμθζηυ πνυηοπμ) επδνεάγεζ ηαζ επδνεάγεηαζ απυ ηδ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ, βζα ημ θυβμ αοηυ, ιπμνεί κα απμηεθέζεζ ημ ιεηααμθζηυ απμηφπςια ιζαξ δεδμιέκδξ ζηζβιήξ. Ζ πνήζδ ημο υνμο «ιεηααυθςια» ακαθένεηαζ ζημ ζφκμθμ ηςκ ιεηααμθζηχκ εκυξ δεδμιέκμο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ είκαζ ακηίζημζπμ ηςκ υνςκ βμκζδίςια, ιεηαβνάθςια, πνςηείκςια υηακ ακαθενυιαζηε ζε βμκίδζα, ιεηάβναθα ηαζ πνςηεΐκεξ, ακηίζημζπα. Οζ οπυθμζπεξ μιζηέξ ακαθφζεζξ δεκ απμηαθφπημοκ ηδκ επίδναζδ ιζαξ αθθαβήξ ζηδ θεζημονβία ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ, ζημ ααειυ πμο ημ ηάκεζ δ ιεηααμθμιζηή. Δίκαζ δφζημθμ κα πνμζδζμνίζεζ ηακείξ πςξ ιζα αθθαβή ζηδ ζοβηέκηνςζδ ημο mna εκυξ ζοβηεηνζιέκμο βμκζδίμο, επδνεάγεζ ηδ αζμθμβζηή ηαηάζηαζδ (Fiehn et al, 2000). Οζ ιεηααμθίηεξ έπμοκ έκα πμθφ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ θεζημονβία ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ, ηαεχξ είκαζ ηα δμιζηά ζημζπεία άθθςκ αζμθμβζηχκ ιμνίςκ ηαζ ηοηηανζηχκ δμιχκ (πνςηεΐκεξ, DNA, NA, ηοηηανζηυ ημίπςια, θζπίδζα, ιειανάκεξ), αθθά απμηεθμφκ ηαζ θεζημονβζηά ζημζπεία ημο ιεηααμθζζιμφ ηαζ είκαζ απαναίηδημζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ γςήξ (π.π. ATP). Αηυια, παίγμοκ έκα πμθφ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ηοηηανζηή νφειζζδ ηαζ ηδ ιεηαβςβή ζήιαημξ. Οζ πνχηεξ ηαζ αηανζαίεξ απμηνίζεζξ ζηζξ πενζααθθμκηζηέξ δζαηαναπέξ, έπμοκ ακηίηηοπμ ζημ ιεηααμθζζιυ, πνςηανπζηά. Σα πθεμκεηηήιαηα ηδξ ιεηααμθμιζηήξ, ζε ζφβηνζζδ ιε ηζξ άθθεξ μιζηέξ ακαθφζεζξ, είκαζ δ εββφηδηα ζημ θαζκυηοπμ (Patti et al, 2012) ηαζ δ βνήβμνδ παναηήνδζδ ηςκ αθθαβχκ πμο πνμηαθμφκ μζ πενζααθθμκηζημί πανάβμκηεξ. Δπζπθέμκ, ημ ηυζημξ ακά πείναια είκαζ παιδθυ, ακ ημ ζοβηνίκμοιε ιε άθθεξ μθζζηζηέξ ακαθφζεζξ. Δλαζηίαξ ηδξ πμθοπθμηυηδηαξ ημο ιεηααμθχιαημξ, ιζα ηεπκζηή ακάθοζδξ δεκ είκαζ ζηακή απυ ιυκδ ηδξ κα ηαθφρεζ ημ εφνμξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο αζμθμβζημφ

54 44 ζοζηήιαημξ. Γοζηοπχξ, μζ ιεηααμθίηεξ έπμοκ εηηεηαιέκδ δζαθμνμπμίδζδ (αιζκμλέα, θζπίδζα, μνβακζηά μλέα, κμοηθεμηίδζα) ζηα άημια ηαζ ηζξ οπμμιάδεξ, ζοβηνζηζηά ιε ημκ ηχδζηα ηςκ ηεζζάνςκ βναιιάηςκ (βεκεηζηυ ηχδζηα) ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ ηαζ ημκ ηχδζηα ηςκ είημζζ βναιιάηςκ ηδξ πεπηζδζηήξ αθοζίδαξ (Fiehn, 2002). Ζ αθθδθεπίδναζδ ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ιε ημ πενζαάθθμκ ιεηααάθεζ δοκαιζηά ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ ηδκ ηαπφηδηα ηςκ αζμπδιζηχκ ακηζδνάζεςκ, έηζζ χζηε μ ιεηααμθζζιυξ κα πνμζανιυγεηαζ ζηζξ εηάζημηε ζοκεήηεξ. Έηζζ, αοηυ πμο εκδζαθένεζ είκαζ δ ακηίθδρδ ηδξ δοκαιζηήξ ηαηάζηαζδξ ημο ιεηααμθζζιμφ ημο οπυ ιεθέηδ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ. ηδκ δοκαιζηή ακάθοζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ δζηηφςκ εθανιυγμκηαζ δ ακάθοζδ ιεηααμθζηχκ νμχκ (metabolic flux analysis) (Klapa, 2001), δ ακάθοζδ ζζμννμπίαξ νμήξ (flux balance analysis) ηαζ, θοζζηά, δ ιεηααμθμιζηή. Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ (ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ) πνμζθένεζ ηδ δοκαηυηδηα θήρδξ ημο απμηοπχιαημξ ημο ιεηααμθζζιμφ ιζα δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή. Ζ ιεηααμθμιζηή δεκ απαζηεί ηδκ πθήνδ δμιή ημ ιεηααμθζημφ δζηηφμο, αηυια ηαζ υηακ αοηή οπάνπεζ, ηαζ ιπμνεί κα εθανιμζηεί ηαζ ζε πανμδζηέξ ιεηααμθζηέξ ηαηαζηάζεζξ. Οζ ιεηααμθζηέξ νμέξ είκαζ αοηέξ πμο επδνεάγμοκ ηαζ επδνεάγμκηαζ απυ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ εθεφεενςκ ιεηααμθζηχκ, έηζζ ημ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ δίκεζ εζηυκα ηδξ ιεηααμθζηήξ ηαηάζηαζδξ ημο ζοζηήιαημξ (Klapa, 2010). Με αοηυ ημ πθεμκέηηδια είκαζ δοκαηυ κα έπμοιε άπμρδ βζα ηδ ιεηααμθζηή ηαηάζηαζδ ηδ δεδμιέκδ ζηζβιή ηαζ κα πνμπςνήζμοιε ζε δοκαιζηή ακάθοζδ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο. Ζ ζπέζδ ηςκ νμχκ ιε ηζξ ιεηααμθζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ δεκ είκαζ άιεζδ ηαζ, δοζηοπχξ, δε ιπμνμφιε κα ηάκμοιε ακάθοζδ ιεηααμθζηχκ νμχκ πνδζζιμπμζχκηαξ ιυκμ ημ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ. Πνμθακχξ δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ απμηεθεί ακαπυζπαζημ ημιιάηζ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ, αθμφ παναηηδνίγεηαζ ζακ ορδθήξ απυδμζδξ (highthroughput) ηαζ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ (large scale). Ο υνμξ «ορδθήξ απυδμζδξ» ζδιαίκεζ υηζ απαζηείηαζ ιζηνυ δείβια βζα ηδκ παναβςβή ιεβάθδξ πμζυηδηαξ δεδμιέκςκ (ιεβάθδ ηθίιαηα). Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ημ βεβμκυξ υηζ απμηεθεί ιζα πμζμηζηή ακάθοζδ πμο ηα δεδμιέκα ηδξ πνίγμοκ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ.

55 45 Βήιαηα ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ είκαζ ιζα πμθοαδιαηζηή δζαδζηαζία. Δίκαζ ζδιαηζηυ κα ακαθενεεί υηζ λεηζκά απυ έκα αζμθμβζηυ ενχηδια πμο αθμνά ζε ζοβηεηνζιέκμ αζμθμβζηυ ζφζηδια ηαζ ηαηαθήβεζ ζε αζμθμβζηά απμηεθέζιαηα ηαζ ελαβςβή ζοιπεναζιάηςκ. Σα εκδζάιεζα αήιαηα πενζθαιαάκμοκ ζηάδζα απμιυκςζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ, πνήζδ ιεευδςκ ακαθοηζηήξ πδιείαξ, αζμζηαηζζηζηή επελενβαζία ηαζ πνήζδ αθβμνίειςκ αζμπθδνμθμνζηήξ, αθθά ηαζ πνήζδ αζμθμβζηχκ αζαθζμεδηχκ ηαζ αάζεςκ δεδμιέκςκ. Σα ζηάδζα ιζαξ μθμηθδνςιέκδξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ είκαζ: ζοθθμβή ηαζ απμιυκςζδ ημο αζμθμβζημφ δείβιαημξ ιε ηενιαηζζιυ ηδξ εκγοιζηήξ δνάζδξ απμιυκςζδ εθεφεενςκ ιεηααμθζηχκ απυ ημ αζμθμβζηυ δείβια παναβχβζζδ ηςκ απμιμκςιέκςκ ιεηααμθζηχκ (ηονίςξ βζα GC-MS) ελαβςβή ιεηααμθζημφ πνμηφπμο ακαβκχνζζδ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ημνοθχκ πμο ακηζζημζπμφκ ζε ιεηααμθίηεξ απυ ηα πνςιαημβναθήιαηα πμο πνμέηορακ απμιάηνοκζδ ιδ ειπζζηεφζζιςκ δεδμιέκςκ ηαζ ηακμκζημπμίδζδ πμθοπαναιεηνζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ζηα ηεθζηά δεδμιέκα ελαβςβή ζοιπεναζιάηςκ πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηδ ζοκέπεζα πεννζβνάθμκηαζ ηα παναπάκς αήιαηα ιε έιθαζδ ζηδ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ Υνςιαημβναθίαξ Αενίςκ Φαζιαημιεηνίαξ Μάγαξ (GC- MS), πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ πανμφζα ενβαζία.

56 46 πήια Α. 4 ηάδζα ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ. Ζ ιεηααμθμιζηή είκαζ ιζα πμθοαδιαηζηή δζαδζηαζία, δ μπμία λεηζκά απυ ημ αζμθμβζηυ ενχηδια ηαζ ηαηαθήβεζ ζηδκ ελαβςβή αζμθμβζηχκ ζοιπεναζιάηςκ. πιινγή θαη απνκόλσζε δείγκαηνο Δίκαζ έκα ζδιακηζηυ ζηάδζμ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαεχξ ημ δείβια πνέπεζ κα ζοθθεπεεί ιε ηνυπμ πμο δε εα απνδζηεοεεί. Άζπδιμξ πεζνζζιυξ ημο δείβιαημξ εκδέπεηαζ κα πνμηαθέζεζ απχθεζα ιεηααμθζηχκ αθθά ηαζ εκενβμπμίδζδ ημο ιεηααμθζζιμφ ηαζ ιδ απμδεηηυ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ. Δίκαζ ζδιακηζηυ κα ελαζθαθζζηεί υηζ υθα ηα δείβιαηα εα έπμοκ αηνζαχξ ημκ ίδζμ πεζνζζιυ βζα κα είκαζ ζοβηνίζζια. Δπίζδξ, μ ιεηααμθζζιυξ είκαζ ακάβηδ κα ζηαιαηήζεζ ιε ηδ δζαημπή ηδξ εκγοιζηήξ δνάζδξ. Ακ δεκ ελαζθαθζζηεί ηάηζ ηέημζμ δεκ είκαζ δοκαηυ κα οπμζηδνζπεεί υηζ ημ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ απμηεθεί ιεηααμθζηυ απμηφπςια ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηδ πνμκζηή ζηζβιή πμο είκαζ επζεοιδηυ κα ιεθεηδεεί. Οζ ηνυπμζ πμο επζηοβπάκεηαζ ηάηζ ηέημζμ είκαζ ιε άκμδμ ηδξ εενιμηναζίαξ ημο δείβιαημξ βζα ηδκ απμδζάηαλδ ηςκ πνςηεσκχκ, αθθά ηαζ ιε πνήζδ ιεεακυθδξ βζα ηδκ ηαηαηνήικζζή ημοξ. Ζ απμεήηεοζδ ηςκ δεζβιάηςκ πνέπεζ κα πναβιαημπμζείηαζ ζε παιδθή εενιμηναζία υπμο μ ιεηααμθζζιυξ είκαζ υζμ ημ δοκαηυ πζμ ακεκενβυξ.

57 47 ηδκ πανμφζα ενβαζία, οθζηυ απυ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ υπμο ηαθθζενβμφκηαζ ηφηηανα BHK, ζοθθέβεηαζ απυ ημ αζμακηζδναζηήνα, αθθά ηαζ απυ ηζξ θζάθεξ ακαηίκδζδξ. Σα δείβιαηα οπυηεζκηαζ θοβμηεκηνήζεζξ, ιεημοζίςζδ πνςηεσκχκ, λήνακζδ ηαζ απμεήηεοζδ (Chrysanthopoulos et al, 2010; Vernardis et al, 2013). Απνκόλσζε κεηαβνιηηώλ Ζ απμιυκςζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ βίκεηαζ ιε πνήζδ δζαθοηχκ ζημοξ μπμίμοξ μζ εθεφεενμζ ιεηααμθίηεξ δζαθφμκηαζ. Γζα ημοξ πμθζημφξ ιεηααμθίηεξ πνδζζιμπμζμφκηαζ, ζοκήεςξ, δζάθμνεξ ακαθμβίεξ ιεεακυθδξ ηαζ κενμφ, εκχ βζα ημοξ ιδ πμθζημφξ ιεηααμθίηεξ είκαζ ζοπκή δ πνήζδ πθςνμθμνιίμο. Φοβμηεκηνήζεζξ απμιαηνφκμοκ ηα ιαηνμιυνζα ηαζ ηα ηοηηανζηά ηαηάθμζπα ηαζ ημ δείβια ηςκ ιεηααμθζηχκ λδναίκεηαζ ζε ακηθία ηεκμφ ηαζ ημ ίγδια απμεδηεφεηαζ. Παξαγώγηζε κεηαβνιηηώλ Υαναηηδνζζηζηυ ηαζ απαναίηδημ ζηάδζμ ηδξ ακάθοζδξ ιε πνήζδ πνςιαημβναθίαξ αενίςκ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ (GC-MS) είκαζ αοηυ ηδξ παναβχβζζδξ. Οζ πενζζζυηενμζ ιεηααμθίηεξ δεκ είκαζ πηδηζημί ηαζ εενιζηά ζηαεενμί βζα κα ακαθοεμφκ απυ ημκ πνςιαημβνάθμ αενίςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πνεζάγεηαζ κα πνδζζιμπμζδεμφκ πανάβμκηεξ παναβχβζζδξ, ηαηάθθδθμζ βζα ηζξ μιάδεξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο είκαζ επζεοιδηυ κα ακαθοεμφκ. Σμ ζηάδζμ ηδξ παναβχβζζδξ πνμζεέηεζ πνμαθήιαηα ηαζ απμηθίζεζξ πμο πνέπεζ κα θαιαάκμκηαζ οπ υρζκ πνζκ ηδκ ελαβςβή ηςκ ηεθζηχκ δεδμιέκςκ (Kanani et al, 2008; Kanani & Klapa, 2007). Ζ δοζημθία ανίζηεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ παναβχβζζδ ιπμνεί κα επδνεάζεζ ηάεε μιάδα ιεηααμθζηχκ ιε δζαθμνεηζηυ ηνυπμ ηαζ κα δχζεζ, ζε ηάπμζεξ πενζπηχζεζ, πενζζζυηενα απυ έκα πανάβςβα. Δίκαζ, επίζδξ, ζδιακηζηυ μζ πανάβμκηεξ παναβχβζζδξ κα ανίζημκηαζ ζε αθεμκία, χζηε υθμζ μζ ιεηααμθίηεξ κα παναβςβζζημφκ ηαζ ηα ιεηνμφιεκα ιυνζα κα είκαζ ακάθμβα ημο δείβιαημξ.

58 48 Ζ πζμ ζοκδεζζιέκδ δζαδζηαζία παναβχβζζδξ βζα GC MS πενζθαιαάκεζ ημοξ πανάβμκηεξ παναβχβζζδξ ιε ιεεμλίιδ (methoxime) ηαζ ηνζιεεοθ-πονίηζμ (trimethylsilyl - TMS). Ζ ιεηαηνμπή ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηα ιεεμλζιζηά ηαζ ηα TMS πανάβςβά ημοξ πενζθαιαάκεζ δφμ ακηζδνάζεζξ. Καηά ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ, ακηζδνά δ οδνμπθςνζηή ιεεμλο-αιίκδ, δζαθοιέκδ ζε πονζδίκδ, ιε ημ ίγδια ηςκ ιεηααμθζηχκ ηαζ ηάεε ηεημκμιάδα (-C=O) ιεηαηνέπεηαζ ζηδκ πζμ ζηαεενή ηαζ ιδ πμθζηή ιεεμλο μιάδα (MEOX, -C=N-O-CH 3 ). Μεηά ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ, πνμζηίεεηαζ μ πανάβμκηαξ ζζθοθίςζδξ (N-mehtyl-trimethylsilyl-trifluoroacetamide - MSTFA) βζα ηδκ παναβςβή πζμ πηδηζηχκ, ιδ πμθζηχκ ηαζ ζηαεενχκ TMS παναβχβςκ. Ζ παναβςβή ηςκ ηεθεοηαίςκ πενζθαιαάκεζ ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ηςκ εκενβχκ αηυιςκ οδνμβυκμο (-Ζ) ηςκ οδνμλοθμιάδςκ, ηαναμλοθμιάδςκ ηαζ αιζκμιάδςκ (-ΟΖ, - COOH, -NH 2 ) απυ TMS μιάδεξ (-Si(CH 3 ) 3 ). Ζ απαναίηδηδ δζαδζηαζία ηδξ παναβχβζζδξ ηαηδβμνζμπμζεί ημοξ ιεηααμθίηεξ ζε ηνεζξ ηαηδβμνίεξ. ηδκ πνχηδ ηαηδβμνία ακήημοκ μζ ιεηααμθίηεξ πμο δζαεέημοκ οδνμλοθμιάδεξ (-OH) ή/ηαζ ηαναμλοθμιάδεξ (-COOH) ηαζ δίκμοκ έκα ιυκμ TMS πανάβςβμ. ηδ δεφηενδ ηαηδβμνία ακήημοκ μζ ιεηααμθίηεξ πμο δζαεέημοκ ηεημκμιάδα (-C=O), πένα πυ οδνμλοθμιάδεξ ή ηαναμλοθμιάδεξ. Οζ ιεηααμθίηεξ αοημί, ηαηά ηδκ ακηίδναζδ ηδξ ιεεμλζιίςζδξ, ηάκμοκ δφμ πανάθθδθεξ ακηζδνάζεζξ ηαζ πανάβμκηαζ δφμ βεςιεηνζηά ζζμιενή. ηδκ ηνίηδ ηαηδβμνία ανίζημκηαζ μζ ιεηααμθίηεξ πμο δζαεέημοκ αιζκμιάδα (-NH 2 ). Σα πνςηυκζα ηδξ αιζκμιάδαξ ακηζδνμφκ δζαδμπζηά ηαζ πζμ ανβά, ζοβηνζηζηά ιε αοηά ηςκ ηαναμλοθμιάδςκ ηαζ ηςκ οδνμλοθμιάδςκ. Πνζκ μθμηθδνςεεί δ δζαδζηαζία παναβχβζζδξ, εκδέπεηαζ κα οπάνπμοκ πμθθαπθά πανάβςβα βζα ηάεε ιεηααμθίηδ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ηαηδβμνίαξ, ηαεχξ πνμπςνάεζ δζαδμπζηά, πνςηυκζμ ιε πνςηυκζμ. Γζαδζηαζίεξ παναβχβζζδξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ηαζ ιε άθθεξ ηεπκζηέξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ, αθθά δεκ ηνίκεηαζ ζηυπζιμ κα πενζβναθμφκ βζαηί δεκ αθμνμφκ ζημ ακηζηείιεκμ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ.

59 49 Σερληθέο κεηαβνινκηθήο αλάιπζεο Γζα ηδκ ακάθοζδ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί πμθθέξ ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ, υπςξ δ πνςιαημβναθία αενίςκ (GC) ηαζ οβνχκ (LC) ζε ζοκδοαζιυ ιε θαζιαημιεηνία ιάγαξ (MS), δθεηηνμθυνδζδ ηνζπμεζδχκ (CE) MS, θαζιαημζημπία πονδκζημφ ιαβκδηζημφ ζοκημκζζιμφ (NM) ηαζ aman, δθεηηνμπδιζημί ακζπκεοηέξ ηαζ απεοεείαξ έκεζδ ζε θαζιαημιεηνία ιάγαξ. Απυ αοηέξ, έπμοκ επζηναηήζεζ μζ πνςιαημβναθζηέξ ιέεμδμζ ζε ζοκδοαζιυ ιε θαζιαημιεηνία ιάγαξ ηαζ δ NM. Οζ ιεηααμθίηεξ είκαζ ιζα εονεία μιάδα ηαζ δε ιμζνάγμκηαζ πμθθά ημζκά παναηηδνζζηζηά, πνάβια πμο δεκ επζηνέπεζ ζε ηάπμζα απυ ηζξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ κα ηαθφρεζ υθμ ημ εφνμξ ηδξ. Γζα κα βίκεζ αοηυ πνεζάγεηαζ ζοκδοαζιυξ ηςκ ηεπκζηχκ πμο ακαθένεδηακ. Ζ θαζκαηνζθνπία ππξεληθνύ καγλεηηθνύ ζπληνληζκνύ (NM), ηαζ ηονίςξ δ 1 Ζ ΝΜ, πνμηζιάηαζ απυ ιεβάθδ ιενίδα ενεοκδηχκ, ηαεχξ είκαζ βνήβμνδ ηαζ απθή ηαζ έπεζ, ςξ ηχνα, πνδζζιμπμζδεεί ζε πθδεχνα αζμθμβζηχκ ζοζηδιάηςκ (Kim et al, 2011). Ζ εοαζζεδζία ηδξ πθαηθυνιαξ είκαζ ιζηνυηενδ απυ αοηή πμο δίκμοκ πθαηθυνιεξ θαζιαημζημπίαξ ιάγαξ (MS). Έπμοκ βίκεζ ακαθμνέξ ηαζ βζα ηδ πνήζδ ηδξ ζηδκ παναημθμφεδζδ ηαζ ημ παναηηδνζζιυ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ (Cuperlovic- Culf et al, 2010; Khoo & Al-ubeai, 2007). Σμ ιεβάθμ πθεμκέηηδια ηδξ NM είκαζ δ απθή παναζηεοή ημο δείβιαημξ ηαζ βίκεηαζ βνήβμνα πςνίξ κα ηαηαζηνέθεζ ημ δείβια. Δπίζδξ, είκαζ εφημθδ δ πμζμηζημπμίδζδ, ηαεχξ δ έκηαζδ ημο ζήιαημξ είκαζ εοεέςξ ακάθμβδ ηδξ βναιιμιμνζαηήξ ζοβηέκηνςζδξ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ είκαζ δοκαηυ κα ελαπεεί ζοιπέναζια βζα ηδκ απυθοηδ πμζυηδηα εκυξ ιεηααμθίηδ. Αηυια, πανέπεζ ακαθοηζηέξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδ δμιή εκυξ ιμνίμο ηαζ ηζξ ζηενεμπδιζηέξ ημο ζδζυηδηεξ (Seger & Sturm, 2007). Ζ ρξσκαηνγξαθία πγξώλ (LC), ηαζ εζδζηυηενα δ ορδθήξ απυδμζδξ πνςιαημβναθία οβνχκ (HPLC), είκαζ ιζα χνζιδ ηεπκζηή πμο ζοκδοάγεζ ορδθή ακάθοζδ ηαζ ακαθοηζηή εοεθζλία. Σμ ααζζηυ πθεμκέηηδια ηδξ ηεπκζηήξ είκαζ ημ υηζ δε πνεζάγεηαζ παναβχβζζδ ηςκ ιμνίςκ, υπςξ ζηδ πνςιαημβναθία αενίςκ (GC). Υνδζζιμπμζείηαζ πμθφ ζηζξ ιεηααμθμιζηέξ εθανιμβέξ θυβς ηδξ ορδθήξ εοαζζεδζίαξ

60 50 ηδξ ηαζ ημο εφνμοξ πμθζηυηδηαξ ηαζ ιμνζαημφ αάνμοξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο είκαζ ζηακή κα ακζπκεφζεζ. Καηά ηδκ ηεθεοηαία δεηαεηία, έπμοκ οπάνπεζ ελεθίλεζξ ηαζ αεθηζχζεζξ ζηζξ εθανιμβέξ ηδξ ηεπκζηήξ ηαζ μ ζμκζζιυξ ιε δθεηηνμρελαζιυ (ESI) έπμοκ αολήζεζ ηδκ επακαθδρζιυηδηα ηςκ πεζναιάηςκ. Δπίζδξ, δ οπεν ορδθήξ απυδμζδξ οβνή πνςιαημβναθία (UPLC) MS έπεζ αολήζεζ ηδκ ακαθοηζηή ζηακυηδηα (Wilson et al, 2005), ηαεχξ δίκεζ αηνίαεζα ιάγαξ ιζηνυηενδ απυ 5 ppm. Σμ εφνμξ ηςκ ημνοθχκ, πμο είκαζ ηδξ ηάλδξ ηςκ 1-7 δεοηενμθέπηςκ απαζηεί βνήβμνμοξ νοειμφξ ακάηηδζδξ ηαζ πνυκμοξ ζάνςζδξ. Ζ ηεπκμθμβία time-of-flight (TOF) ζε ζοκδοαζιυ ιε δζάθμνμοξ ηφπμοξ MS (ηεηνάπμθμ, ζμκηζηή παβίδα, βναιιζηυ ηεηνάπμθμ) έπμοκ ζοιαάθεζ ζε αοηυ ημ ζημπυ (Dunn et al, 2008; Kamleh et al, 2008; Zelena et al, 2009). Ζ ρξσκαηνγξαθία αεξίσλ (GC), ιε πνήζδ ηνζπμεζδχκ ζηδθχκ, πανέπεζ ηδκ ηαηάθθδθδ πνςιαημβναθζηή ακάθοζδ, ιε εφνμξ ημνοθχκ ηδξ ηάλδξ ηςκ 2 5 δεοηενμθέπηςκ ηαζ ακαπαναβςβίζζιμ πνυκμ ηαηαηνάηδζδξ (Dunn et al, 2005). Σμ ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ είκαζ υηζ ιπμνεί κα ιεηνήζεζ ιυκμ πηδηζημφξ ηαζ εενιζηά ακεεηηζημφξ ιεηααμθίηεξ ή αοημφξ πμο ιπμνμφκ κα απμηηήζμοκ αοηά ηα παναηηδνζζηζηά ιέζς ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ παναβχβζζδξ. Ζ πνςιαημβναθία αενίςκ πανέπεζ δζαπςνζζιυ ιεηααμθζηχκ ιε ιεβέεδ Da ηαζ πενζθαιαάκεζ έκα εφνμξ ζπεηζηά πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ, υπςξ ηα αιζκμλέα, ηα μνβακζηά μλέα, μζ αιίκεξ ηαζ ηα ζάηπανα. Γζα ηδ θαζιαημιεηνία πνδζζιμπμζμφκηαζ ακαθοηέξ ιάγαξ TOF, ηεηνάπμθα ηαζ ζμκηζηέξ παβίδεξ. Ο ιδπακζζιυξ ημο ζμκζζιμφ δθεηηνμκίςκ (ΔΗ) είκαζ μ πζμ δζαδεδμιέκμξ, ακ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ηαζ πδιζηυξ ζμκζζιυξ. Ζ ακαπαναβςβζζζιυηδηα ηςκ πνυκςκ ηαηαηνάηδζδξ ηαζ ημο ζμκζζιμφ δθεηηνμκίςκ επζηνέπμοκ ηδ δδιζμονβία αζαθζμεδηχκ βζα ηδκ αηνζαή ακίπκεοζδ ηαζ ηαοημπμίδζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ. ε επυιεκδ εκυηδηα εα πενζβναθεί ακαθοηζηά δ θεζημονβία ηδξ πθαηθυνιαξ πμο πνδζζιμπμζμφιε. Ακαθοηζηυηενα, ημ GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) είκαζ μ ζοκδοαζιυξ δφμ ακαθοηζηχκ ηεπκζηχκ, υπμο δ πνχηδ (gas chromatography πνςιαημβναθία αενίςκ) δζαπςνίγεζ ηα ιυνζα ζημ πνυκμ ηαζ δ δεφηενδ (θαζιαημιεηνία ιάγαξ mass spectrometry) πανέπεζ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηάεε ιμνίμο.

61 51 Σμ υνβακμ αοηυ ελαζθαθίγεζ ημ πνμκζηυ δζαπςνζζιυ ηςκ ιμνίςκ εκυξ δείβιαημξ. Ζ ανπή ημο είκαζ δ ανπζηή ελαένςζδ ημο δείβιαημξ ζε είζμδμ ιε ορδθή εενιμηναζία (δεζβιαημθήπηδξ) ηαζ δζαπςνζζιυξ ηςκ ιμνίςκ απυ ηδ ζηήθδ δζαπςνζζιμφ. Αημθμοεεί ζοζηεοή ακίπκεοζδξ ηςκ ιμνίςκ πμο έπμοκ δζαπςνζζηεί ηαζ εηθμφμκηαζ ζηαδζαηά απυ ηδ ζηήθδ. Βαζζηυ παναηηδνζζηζηυ είκαζ ημ θένμκ αένζμ, ημ μπμίμ είκαζ αδνακέξ (He, ηονίςξ, ή N 2 ή Ζ 2 ) ηαζ ζπνχπκεζ ηα πηδηζηά ιυνζα ηαηά ιήημξ ηδξ ζηήθδξ. Ζ ζηήθδ δζαπςνζζιμφ πενζέπεζ ιζα επέκδοζδ ζηαεενήξ θάζδξ. Ο δζαπςνζζιυξ ηςκ ιμνίςκ ηαεμνίγεηαζ απυ ηδκ ηαηακμιή ηάεε ιμνίμο ιεηαλφ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ (θένμκ αένζμ) ηαζ ηδξ ζηαεενήξ θάζδξ. Έκα ιυνζμ ημ μπμίμ λμδεφεζ θίβμ πνυκμ ηαηαηναημφιεκμ απυ ηδ ζηαεενή θάζδ, εηθμφεηαζ βνήβμνα. Τπάνπμοκ δζάθμνμζ ηνυπμζ βζα ηδκ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ, ιε ηζξ split ηαζ splitless εκέζεζξ κα πνδζζιμπμζμφκηαζ πενζζζυηενμ. ηδκ split εζζαβςβή δείβιαημξ, ημ δείβια πμο εκίεηαζ, ελαηιίγεηαζ ζηδ νμή ημο θένμκημξ αενίμο ζε ορδθή εενιμηναζία ηαζ ιυκμ έκα ιένμξ ημο δείβιαημξ ηαζ ημο δζαθφηδ ιεηαθένεηαζ ζηδ ζηήθδ. Σμ οπυθμζπμ ιένμξ απμννίπηεηαζ. Έηζζ βίκεηαζ ακαθμνά βζα ακαθμβία split 10:1,, 50:1, 100:1 πμο οπμθμβίγεηαζ απυ ημκ ηφπμ: ηδ splitless εζζαβςβή δείβιαημξ, απθά δ ααθαίδα απυννζρδξ ημο δεζβιαημθήπηδ είκαζ ηθεζζηή ηαζ δεκ επζηνέπεζ κα παεεί πμζυηδηα απυ ημ δείβια πμο εκίεηαζ ηαζ ελαηιίγεηαζ. Ο δζαπςνζζιυξ ηςκ ιμνίςκ, υπςξ ακαθένεδηε, βίκεηαζ ζηδ εενιαζκυιεκδ ζηήθδ πνςιαημβναθίαξ. Ζ ζηήθδ πενζέπεζ έκα θεπηυ ζηνχια ιδ πηδηζηήξ πδιζηήξ έκςζδξ πμο ηαθφπηεζ ηα ημζπχιαηά ηδξ. Σα ιυνζα ηαηαηναημφκηαζ επζθεηηζηά πενζζζυηενμ ή θζβυηενμ πνυκμ ιε αάζδ ημ ζπήια ηαζ ημ ιμνζαηυ ημοξ αάνμξ ηαζ έηζζ δζαπςνίγμκηαζ. Ζ εενιμηναζία ακεααίκεζ ζηαδζαηά ηαζ θηάκεζ ιέπνζ ημοξ 350 μ C, χζηε ακ ιπμνέζμοκ κα δζαηνέλμοκ ηδ ζηήθδ ηαζ ιυνζα ηα μπμία έπμοκ ορδθυ ζδιείμ αναζιμφ ηαζ ηαηαηναημφκηαζ πζμ ζεεκανά. Έκα ααζζηυ ιεζμκέηηδια ημο GC είκαζ μ πενζμνζζιυξ ημο ζε ιυνζα ηα μπμία είκαζ πηδηζηά ηαζ εενιζηά ζηαεενά κα οπμζημφκ αοηέξ ηζξ εενιμηναζίεξ. Οζ πενζζζυηενεξ ζηήθεξ βεκζηήξ πνήζδξ επεκδφμκηαζ ιε dimethylsiloxanes ή 5%phenyl/95%dimethylsiloxane.

62 52 Ζ ζηήθδ ημο GC ελένπεηαζ απυ ημ θμφνκμ πμο ηδ εενιαίκεζ ηαζ εζζένπεηαζ ζημ θαζιαημβνάθμ ιάγαξ ιέζς ηδξ βναιιήξ ιεηαθμνάξ (transfer line). Σμ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ είκαζ έκα υνβακμ πμο ιεηνά ημ θυβμ ιάγαξ πνμξ θμνηίμ (m/z) ηδξ αένζαξ θάζδξ ηςκ ζυκηςκ ηαζ πανέπεζ ιζα ιέηνδζδ ηδξ αθεμκίαξ ηάεε ζυκημξ. ημ GC-MS ημ θμνηίμ είκαζ πάκημηε 1, έηζζ δ ηθίιαηα ιέηνδζδξ είκαζ ζε Dalton ή ζε αημιζηέξ ιμκάδεξ ιάγαξ (atomic mass units - amu). Σα ιυνζα πμο εζζένπμκηαζ απυ ηδ ζηήθδ ζημ θαζιαημβνάθμ ιάγαξ, ζμκίγμκηαζ. Δίκαζ ημ απαναίηδημ ζηάδζμ πμο επζηνέπεζ ηδκ ακάθοζή ημοξ απυ ημ θαζιαημβνάθμ ιάγαξ. Ο ζμκηζζιυξ είκαζ είηε πδιζηυξ είηε, ζοκδεέζηενα, ζμκηζζιυξ δθεηηνμκίςκ. Καηά ημκ ζμκηζζιυ δθεηηνμκίςκ, δέζιδ δθεηηνμκίςκ απυ ζοβηεηνζιέκδ πδβή (filament) αμιαανδίγεζ ιε δθεηηνυκζα ηα ιυνζα πμο ελένπμκηαζ ζε ζεζνά απυ ηδ ζηήθδ. Ζ ηαπφηδηα πνυζηνμοζδξ ηςκ δθεηηνμκίςκ πάκς ζηα ιυνζα, δζαζπά ηα ηεθεοηαία ζε ζοβηεηνζιέκα ζυκηα ιε ζοβηεηνζιέκεξ ακαθμβίεξ. Σα ζυκηα αοηά, ζηδ ζοκέπεζα, επζηαπφκμκηαζ απυ ιαβκδηζηυ πεδίμ ηαζ μδδβμφκηαζ ζε πνυζηνμοζδ ζημκ πμθθαπθαζζαζηή ακζπκεοηή υπμο ημ ζήια ημοξ εκζζπφεηαζ. Με αοηυκ ημκ ηνυπμ πνμηφπηεζ ζοβηεηνζιέκμ θάζια ζυκηςκ βζα ηάεε ιυνζμ πμο ελένπεηαζ απυ ηδ ζηήθδ ηαζ αοηυ είκαζ πμο δίκεζ ηδκ αολδιέκδ δοκαηυηδηα ηαοημπμίδζδξ ηςκ ιμνίςκ πμο πανέπεζ ημ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ. Ο ακαθοηήξ ιάγαξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηζξ ακάβηεξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ είκαζ ηφπμο ηεηνάπμθδξ ζμκηζηήξ παβίδαξ. Δίκαζ ημ ηνζζδζάζηαημ ακάθμβμ ημο βναιιζημφ ηεηνάπμθμο. Δθανιυγεηαζ δθεηηνμιαβκδηζηυ πεδίμ ζε ηνεζξ δζαζηάζεζξ ηαζ ηα ζυκηα παβζδεφμκηαζ κα δζαβνάθμοκ πανάθθδθεξ ηνμπζέξ εκηυξ ημο ηεηναπυθμο. Αοηή δ δζαιυνθςζδ έπεζ ζοβηεηνζιέκα πθεμκεηηήιαηα υπςξ: α) ορδθή εοαζζεδζία, α) ιδπακζηή απθυηδηα ζηακή βζα ορδθή απυδμζδ, β) ορδθή ακάθοζδ. Βαζζηά πθεμκεηηήιαηα ηδξ ηεπκζηήξ GC-MS, είκαζ δ ορδθή εοαζζεδζία ηαζ μ ηαθυξ δζαπςνζζιυξ ηςκ ιεηααμθζηχκ, δ ακαπαναβςβζζζιυηδηα ηαζ δ αηνίαεζα ηςκ πνςιαημβναθδιάηςκ, δ φπανλδ πθμφζζςκ αζαθζμεδηχκ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ημνοθχκ. Ηδζαίηενα ααζζηυ πθεμκέηηδια είκαζ υηζ ηα ιμνζαηά αάνδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηα μπμία εζηζάγεζ δ ηεπκζηή είκαζ αοηά ημο πνςημβεκμφξ ιεηααμθζζιμφ ημο άκεναηα. Σα ιεζμκεηηήιαηα ηδξ ηεπκζηήξ αθμνμφκ ζηδ δζαδζηαζία παναβχβζζδξ πμο ακαθένεδηε κςνίηενα.

63 53 Δμαγσγή κεηαβνιηθνύ πξνηύπνπ - ηαπηνπνίεζε θαη πνζνηηθνπνίεζε κεηαβνιηθώλ παξαγώγσλ Δζηζάγμκηαξ ζε ηεπκζηέξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ, ηα ζμκηζηά εναφζιαηα πμο πνμηφπημοκ ιζα δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή ηαζ ιεηνμφκηαζ απυ ημκ ακζπκεοηή ημο θαζιαημιέηνμο ιάγαξ, πνμζηίεεκηαζ απυ ζοβηεηνζιέκμοξ αθβμνίειμξ ηαζ πνμζδίδμοκ ημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ πνςιαημβνάθδια πμο θαίκεηαζ ζημ ζπήια Α.5. έηζζ ελάβμκηαζ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα απυ ηάεε δείβια. Δζδζηυηενα, ιεηά ηδ δζέθεοζδ ημο δείβιαημξ απυ ημ GC MS, ελάβεηαζ έκα πνςιαημβνάθδια ημ μπμίμ απμηεθεί ηα ακεπελένβαζηα δεδμιέκα. Σμ πνςιαημβνάθδια είκαζ ιζα βναιιή ζηδκ πμνεία ημο πνυκμο ηδξ πνςιαημβναθίαξ, υπμο ιεηνμφκηαζ ηα ιυνζα πμο ειπενζέπεζ ημ δείβια πμο ακαθφεηαζ. Κάεε ημνοθή ηδξ ζοκεπμφξ αοηήξ βναιιήξ ζδιαίκεζ αφλδζδ ηςκ ιεηνμφιεκςκ ζυκηςκ, πνάβια πμο ζοκεπάβεηαζ ιζα πδιζηή έκςζδ πμο ελένπεηαζ εηείκδ ηδ ζηζβιή απυ ηδ ζηήθδ πνςιαημβναθίαξ ηαζ ηαηαιεηνάηαζ, έπεζηα απυ ζμκηζζιυ ηδξ. Ζ δζαδζηαζία πνμπςνά ιε ελαβςβή ηζιχκ απυ ηα πνςιαημβναθήιαηα πμο έπμοκ πνμηφρεζ. Κάεε ημνοθή ακηζζημζπεί ζε έκα ή πενζζζυηενα πανάβςβα ιεηααμθζηχκ. Δπζθέβεηαζ έκα παναηηδνζζηζηυ ζυκ απυ ημ θάζια ιάγαξ, βζα ηάεε ημνοθή ημ μπμίμ ηαοημπμζεί ημ ιεηααμθζηυ πανάβςβμ ηαζ πμο, υηακ επζθεβεί, δ ημνοθή πμο απμιμκχκεηαζ βζα κα πμζμηζημπμζδεεί ημ ειααδυ ηδξ, είκαζ ακηζπνμζςπεοηζηή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο ιεηααμθίηδ. ε ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ ηδξ βναιιήξ ημο πνςιαημβναθήιαημξ απμηοπχκεηαζ μ ζοκμθζηυξ ανζειυξ ηςκ ηαηαιεηνμφιεκςκ ζυκηςκ ηδ δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή. Κάεε ιεηααμθίηδξ παναηηδνίγεηαζ απυ ζοβηεηνζιέκμ πνυηοπμ εναφζδξ ηαηά ημκ ζμκζζιυ, ημ μπμίμ δεκ αθθάγεζ. Έηζζ ηάεε ιεηααμθίηδξ ιπμνεί κα ηαοημπμζδεεί απυ ζοβηεηνζιέκα παναηηδνζζηζηά ζυκηα (θάζια ιάγαξ) πμο πανάβμκηαζ ηαηά ημκ ζμκζζιυ ημο. ηδκ ηαοημπμίδζδ, ζδιακηζηυ νυθμ παίγεζ ηαζ μ πνυκμξ ζοβηνάηδζδξ (retention time) ηδξ έκςζδξ απυ ηδ ζηήθδ πνςιαημβναθίαξ, μ μπμίμξ είκαζ παναηηδνζζηζηυξ βζα ηάεε έκςζδ, θυβς ημο ζπήιαημξ ηαζ ημο ιμνζαημφ αάνμοξ ηδξ, υπςξ ακαθένεδηε. Έηζζ, μ ζοκδοαζιυξ πνυκμο ζοβηνάηδζδξ ηαζ θάζιαημξ ιάγαξ δίκεζ ηδ ζςζηή ηαοημπμήζδ ηδξ πδιζηήξ έκςζδξ ιεηααμθζημφ παναβχβμο πμο ακηζζημζπεί ζε

64 54 δεδμιέκδ ημνοθή ημο πνςιαημβναθήιαημξ. Ζ επζθμβή ημο πζμ παναηηδνζζηζημφ ζυκημξ βζα ηάεε ημνοθή, ιαξ δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα κα πμζμηζημπμζμφιε ιυκμ υζα ζοβηεηνζιέκα ζυκηα πνμηφπημοκ απυ ηδ εναφζδ ημο ιεηααμθίηδ ηαζ, βζα ημ θυβμ αοηυ, επζθέβμοιε ζυκ ημ μπμίμ είκαζ ακηζπνμζςπεοηζηυ ηδξ πμζυηδηαξ ημο ιεηααμθίηδ ζημ δείβια. Ζ πμζμηζημπμίδζδ βίκεηαζ ιε ηδ ιέηνδζδ ημο ειααδμφ ηδξ ημνοθήξ. Α Β πήια Α. 5 Υνςιαημβνάθδια ηαζ θάζια ιάγαξ. Α) Έκα πνςιαημβνάθδια υπςξ πνμηφπηεζ απυ πνςιαημβνάθμ αενίςκ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ ηαζ Β) ιζα ημνοθή υπμο έπεζ ιεηνδεεί ημ ειααδυ ηδξ (ανζζηενά) ηαζ ημ θάζια ιάγαξ πμο ακηζζημζπεί ζηδκ ημνοθή (δελζά) Απνκάθξπλζε κε-εκπηζηεύζηκσλ δεδνκέλσλ Καλνληθνπνίεζε ε αοηυ ημ ζηάδζμ ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ βίκεηαζ δ επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ, χζηε κα οπάνλμοκ ζηδκ ηεθζηή ημοξ ιμνθή ηαζ κα είκαζ επανηή βζα ηδκ ζηαηζζηζηή επελενβαζία. Σα δεδμιέκα εθέβπμκηαζ βζα ηδ ζηαεενυηδηα, ηδκ πμζυηδηα ηαζ ηδκ αηνίαεζα ηςκ ιεηνήζεςκ. Γίκεηαζ έθεβπμξ ηαζ απμιαηνφκμκηαζ εθθζπή δεδμιέκα ηαζ δεδμιέκα πμο είκαζ αιθίαμθδξ πμζυηδηαξ (ιδ-ειπζζηεφζζια δεδμιέκα). Ζ ηακμκζημπμίδζδ ηςκ δεδμιέκςκ είκαζ απαναίηδηδ. Με ηδ δζαδζηαζία ηδξ ηακμκζημπμίδζδξ δε ιεηααάθθμκηαζ ηα δεδμιέκα ζε ααειυ πμο δε εα είκαζ ακηίζημζπα ηςκ ανπζηχκ ηζιχκ, αθθά ελαθείθμκηαζ ακζζμννμπίεξ πμο πνμηφπημοκ απυ ηζξ

65 55 πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ αθθά ηαζ δζαθμνμπμζήζεζξ ιεηαλφ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ πμο εηηεθέζηδηακ ιε δζαθμνεηζηυ ηνυπμ ηαζ πνέπεζ κα ηαηαζημφκ ζοβηνίζζιεξ. Ο ζηυπμξ ηδξ ηακμκζημπμίδζδξ είκαζ κα ελαθείρεζ ηζξ πεζναιαηζηέξ δζαθμνέξ ηαζ κα αθήζεζ κα ζοβηνίκμκηαζ ιυκμ μζ αζμθμβζηέξ δζαθμνέξ ζε ιζα ζφβηνζζδ δεζβιάηςκ, μζ μπμίεξ είκαζ ημ γδημφιεκμ. Έζης υηζ οπάνπεζ δ Μέηνδζδ Α ηαζ δ Μέηνδζδ Β δφμ δζαθμνεηζηχκ αζμθμβζηχκ δεζβιάηςκ. Ζ αζμθμβζηή ημοξ δζαθμνά δίκεηαζ απυ ημκ ηφπμ: Ο ζηυπμξ ηδξ ηακμκζημπμίδζδξ είκαζ κα ηαηαζηήζεζ ημ Γ πεζνάιαημξ = 0. Ζ ηακμκζημπμίδζδ ιπμνεί κα εθανιμζηεί ηαηά ηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία, αθθά ηαζ ιε ιαεδιαηζηυ ηνυπμ ζηζξ ηζιέξ ηςκ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ. Σα ιδ-ειπζζηεφζζια δεδμιέκα δδιζμονβμφκ πνμαθήιαηα ηαζ αθθμζχκμοκ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ζηαηζζηζηήξ επελενβαζίαξ ηςκ δεδμιέκςκ, μπυηε δ απμιάηνοκζή ημοξ ηνίκεηαζ ακαβηαία. Σέημζα είκαζ: - μζ πμθφ ιζηνέξ ή πμθφ ιεβάθεξ ηζιέξ, μζ μπμίεξ ιπμνμφκ κα ηαεμνίζμοκ ημ απμηέθεζια ζε έκακ αθβυνζειμ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ - μζ ιδ-ζοκεπχξ ιεηνμφιεκμζ ιεηααμθίηεξ, δδθαδή ιεηααμθίηεξ πμο άθθμηε ιεηνμφκηαζ επανηχξ ηαζ άθθμηε δίκμοκ αηαευνζζηεξ ημνοθέξ θυβς ζοκέηθμοζδξ ιε άθθμ ιυνζμ ή αζηάεεζαξ ημο ίδζμο ημο ιμνίμο - ιεηααμθίηεξ βζα ημοξ μπμίμοξ οπάνπεζ δ ααεααζυηδηα υηζ πνμηφπημοκ ηαζ απυ ηδ ιυκζιδ θάζδ ηδξ ζηήθδξ πνςιαημβναθίαξ (bleeding) ηαζ δε ιπμνεί κα πνμζδζμνζζηεί ημ πμζμζηυ ημο ιεηααμθίηδ πμο πνμένπεηαζ απυ ημ δείβια - βεκζηά, μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ ημ Γ πεζνάιαημξ 0 ηαζ δεκ είκαζ δοκαηυ κα πνμζδζμνζζηεί δ ηζιή ημο Έκα πνχημ ζηάδζμ ηακμκζημπμίδζδξ ηαζ ελζζμννυπδζδξ ηςκ δεδμιέκςκ είκαζ ιε ηδ πνήζδ εζςηενζημφ πνμηφπμο. Έπεζ πνμεπζθεβεί ιζα πδιζηή έκςζδ (νζαζηυθδ) πμο δεκ ακηζζημζπεί ζε ιεηααμθίηδ ηαζ δε ιεηααάθθεηαζ απυ ηζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ. Αοηή πνμζηίεεηαζ ζημ ιίβια ηςκ ιεηααμθζηχκ ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ απμιυκςζδξ ημοξ ηαζ είκαζ ακάθμβδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο δείβιαημξ ηοηηάνςκ (αζμιάγαξ) πμο πνδζζιμπμζείηαζ. Ζ ιέηνδζδ ηδξ ημνοθήξ ημο εζςηενζημφ πνμηφπμο ηαζ δ δζαίνεζδ

66 56 ηςκ ηζιχκ ηςκ ιεηααμθζηχκ ιε αοηήκ ηδκ ηζιή, ηακμκζημπμζεί ηαζ ηάκεζ ζοβηνίζζια ηα δεδμιέκα, ηαεχξ πνμηφπημοκ μζ ζπεηζηέξ ηζιέξ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ. Σμ πεζναιαηζηυ ζηάδζμ πμο δζμπεηεφεζ ηζξ πενζζζυηενεξ αζημπίεξ ηαζ ηδ ιεβαθφηενδ αζηάεεζα ζηα δεδμιέκα, είκαζ αοηυ ηδξ παναβχβζζδξ. Οζ ηαηδβμνίεξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο ακαθένεδηακ, πνεζάγμκηαζ δζαθμνεηζηυ ααειυ επελενβαζίαξ. Σα δεδμιέκα ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο ακήημοκ ζηδκ πνχηδ ηαηδβμνία δε πνίγμοκ πενζζζυηενδξ επελενβαζίαξ βζαηί δίκμοκ ιυκμ έκα πανάβςβμ πμο ακηζζημζπεί απεοεείαξ ζημ ιεηααμθίηδ. Σα πανάβςβα ηδξ δεφηενδξ ηαηδβμνίαξ είκαζ δφμ, αθθά ημ πθεμκέηηδια πμο οπάνπεζ είκαζ υηζ δίκμοκ ζηαεενή ακαθμβία πάκημηε, μπυηε επζθέβμκηαζ ηα δεδμιέκα ημο εκυξ παναβχβμο ζακ ακηίζημζπα ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο ιεηααμθίηδ. Ζ ζηαεενή αοηή ακαθμβία απμηεθεί, ηαοηυπνμκα, αλζυπζζημ ηνζηήνζμ ιδ ιεηααμθήξ ηςκ ζοκεδηχκ ιέηνδζδξ απυ ημ πνςιαημβνάθμ αενίςκ. Σα δεδμιέκα ηςκ παναβχβςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηδξ ηνίηδξ ηαηδβμνίαξ είκαζ αοηά πμο επζδέπμκηαζ ηδξ πενζζζυηενδξ επελενβαζίαξ. Όπςξ ακαθένεδηε, ηα πμθθαπθά πανάβςβα πμο δίκεζ αοηή δ ηαηδβμνία ιεηααμθζηχκ δεκ είκαζ ακηζπνμζςπεοηζηά ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο απμιμκςιέκμο ιεηααμθίηδ. Οζ πμθθαπθέξ ιεηνήζεζξ πνέπεζ κα ζοιπενζθδθεμφκ ζε ιζα ηεθζηή πμζμηζημπμίδζδ ακάθμβα ιε ηδ ζοιιεημπή ημοξ ζηδκ ακηζπνμζχπεοζδ ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ. Οζ Kanani & Klapa (2008) έπμοκ πνμηείκεζ ζοβηεηνζιέκμ αθβυνζειμ, μ μπμίμξ πνδζζιμπμζήεδηε, χζηε κα πνμηφρεζ έκα ζηαειζζιέκμ άενμζζια (weighted summation) ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ παναβχβςκ. Πνιππαξακεηξηθή ζηαηηζηηθή αλάιπζε Ζ ιεηααμθμιζηή ηαζ άθθεξ μιζηέξ ακαθφζεζξ απμδίδμοκ ιεβάθα παηέηα δεδμιέκςκ υπμο πενζζζυηενα απυ έκα ιυνζμ ιεηνχκηαζ ζε πμθθέξ δζαθμνεηζηέξ ζοκεήηεξ. Ζ πμθοπαναιεηνζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ είκαζ δ ηαοηυπνμκδ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ πενζζζυηενςκ ηδξ ιζαξ ιεηααθδηχκ. Σμ ηφνζμ ενχηδια ζηδ ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ είκαζ ημ πςξ μ ιεηααμθζζιυξ ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ιεηααάθθεηαζ ηαεχξ ιεηααάθθμκηαζ μζ ζοκεήηεξ. Με ηδ πνήζδ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ βίκεηαζ δοκαηή δ μιαδμπμίδζδ ηςκ υιμζςκ

67 57 ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ, αθθά ηαζ δ ηαοημπμίδζδ ιεηααμθζηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεηααθήεδηε ζδιακηζηά ιεηαλφ δφμ αζμθμβζηχκ ηαηαζηάζεςκ. Ζ πμθοπαναιεηνζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ επζηνέπεζ ηδκ μπηζηή ζφβηνζζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ, ηάηζ πμο είκαζ πμθφ ζδιακηζηυ βζα ηδκ ελαβςβή αζμθμβζηχκ ζοιπεναζιάηςκ. Οζ αθβυνζειμζ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ ιεηααμθμιζηχκ δεδμιέκςκ ήηακ δ ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ (hierarchical clustering - HCl), δ ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (principal component analysis PCA) ηαζ δ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (significant analysis of microarrays - SAM). ημ πχνμ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ, οπάνπεζ N ανζειυξ πνμηφπςκ (εκέζεζξ ζημ GC - MS) ηαζ M ανζειυ ιεηααμθζηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ έπεζ πμζμηζημπμζδεεί. Τπάνπμοκ δζάθμνεξ ιέεμδμζ ιέηνδζδξ ηδξ απυζηαζδξ, d ij ιεηαλφ ηςκ δφμ δζακοζιάηςκ, i ηαζ j. Οζ ηακυκεξ πμο ζζπφμοκ βζα ηάεε ιεηνζηή απυζηαζδξ είκαζ (Quackenbush, 2001): - Ζ απυζηαζδ πνέπεζ κα είκαζ εεηζηή, d ij 0 - Ζ απυζηαζδ πνέπεζ κα είκαζ ζοιιεηνζηή, d ij = d ji - Έκα ακηζηείιεκμ έπεζ ιδδεκζηή απυζηαζδ απυ ημκ εαοηυ ημο, d ii = 0 - Μεηαλφ ηνζχκ ακηζηεζιέκςκ, i, j, k, ζζπφεζ μ ηακυκαξ ημο ηνζβχκμο, d ik d ij + d jk Ζ πενζζζυηενμ πνδζζιμπμζμφιεκδ ιεηνζηή είκαζ δ Δοηθείδεζα απυζηαζδ, ιζα βεκίηεοζδ ημο Ποεαβμνείμο Θεςνήιαημξ. Γίκεηαζ απυ ημκ ηφπμ:, υπμο x i ηαζ y i είκαζ μζ ηζιέξ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ x ηαζ y ζηδκ έκεζδ i ηαζ n είκαζ μ ανζειυξ ηςκ εκέζεςκ. Ζ απυζηαζδ Manhattan είκαζ ανηεηά υιμζα ιε ηδκ Δοηθείδεζα ηαζ δίκεηαζ απυ ημκ ηφπμ:. Μζα άθθδ ιέεμδμξ πμο ιεηνά ηδκ μιμζυηδηα ζημ ζπήια ιεηαλφ δφμ ακηζηεζιέκςκ είκαζ δ οζπέηζζδ Pearson. Τπυθμβίγεηαζ απυ ημκ ηφπμ

68 58 ( ) ( ) υπμο ( ). Σμ m offset είκαζ ηαεμνζζιέκμ ζημ ιέζμ ηςκ m παναηδνήζεςκ, ημ Φ m είκαζ, έηζζ, δ ηοπζηή απυηθζζδ ηςκ m ηαζ S(x,y) είκαζ μ ζοκηεθεζηή ηδξ οζπέηζζδξ Pearson ηςκ x ηαζ y. Ζ ηεξαξρηθή ζπζηαδνπνίεζε πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ πανυιμζςκ πνμηφπςκ (patterns) ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ή ηςκ ιεηααμθζηχκ. Ζ ζδέα είκαζ υηζ ηα δζακφζιαηα (πνυηοπα δεζβιάηςκ ή ιεηααμθζηχκ) ιε ηδ ιζηνυηενδ απυζηαζδ εα ζοζηαδμπμζδεμφκ. Τπάνπμοκ δζάθμνμζ ηνυπμζ ζοζηαδμπμίδζδξ ηαζ, βζα ημ θυβμ αοηυ, δζαηνίκεηαζ ζε δζαπςνζζηζηυ ή ζοβηεκηνςηζηυ, ζενανπζηυ ή ιδ ζενανπζηυ, επζαθεπυιεκμ ή ιδ επζαθεπυιεκμ (Sturn et al, 2002). Ο ζοβηεκηνςηζηυξ, ζενανπζηυξ αθβυνζειμξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε δδθχκεζ υηζ οπμεέηεζ υηζ υθα ηα δζακφζιαηα είκαζ ιμκαδζαία ιέθδ ηαζ ζηαδζαηά ζοβπςκεφμκηαζ ζε ζοζηάδεξ πενζζζυηενςκ ιεθχκ, χζηε πνμηφπηεζ έκαξ αολακυιεκμξ ανζειυξ ειθςθεοιέκςκ ζοζηάδςκ. Δίκαζ, επίζδξ, ιδ επζαθεπυιεκμξ, πνάβια πμο ζδιαίκεζ υηζ ημ απμηέθεζια δεκ είκαζ απυ ηδκ ανπή ηαεμδδβμφιεκμ απυ οπάνπμοζα αζμθμβζηή ή πεζναιαηζηή πθδνμθμνία. Κάεε αθβυνζειμξ πνέπεζ κα οπμθμβίγεζ ηδκ απυζηαζδ ιεηαλφ δφμ ακηζηεζιέκςκ, χζηε κα ηα ημπμεεηεί ζε ζοζηάδεξ. Έηζζ, είκαζ ζδιακηζηυ κα ηαεμνζζηεί δ ηαηάθθδθδ ιεηνζηή απυζηαζδξ, δ μπμία εα ηάκεζ ηδκ ηαθφηενδ ζοζηαδμπμίδζδ ηςκ ακηζηεζιέκςκ ιε αάζδ ηα αζμθμβζηά ενςηήιαηα.

69 59 Α PC1: 30.50% PC2: 18.73% PC3: 12.53% Β πήια Α. 6 Αθβυνζειμζ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ. Α) ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ (HCl) ηαζ μ ακηίζημζπμξ εενιζηυξ πάνηδξ (heatmap) ηαζ Β) βνάθδια ακάθοζδξ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PCA) Σα πμθοδζάζηαηα παηέηα δεδμιέκςκ ειπενζέπμοκ έκα ααζζηυ πνυαθδια: μζ ιεηααθδηέξ ηθεζδζά πμο ελδβμφκ ηαζ δζηαζμθμβμφκ ηζξ δζαθμνέξ ηςκ παναηδνήζεςκ είκαζ δφζημθμ κα ηαοημπμζδεμφκ. Με ηδκ αλάιπζε θύξησλ ζπληζησζώλ (PCA), επζπεζνείηαζ δ απθμπμίδζδ ηαζ δ μπηζημπμίδζδ ημο πμθφπθμημο ζοκυθμο δεδμιέκςκ (aychaudhuri et al, 2000). Απυ ηζξ m παναηδνήζεζξ ηαζ ηζξ n ιεηααθδηέξ, δ PCA πνμζπαεεί κα ιεζχζεζ ηζξ πμθθέξ δζαζηάζεζξ ζε r ιεηααθδηέξ, υπμο r < n. Οζ κέεξ r ιεηααθδηέξ είκαζ μζ ηφνζεξ ζοκζζηχζεξ. Πνμηφπηεζ έκαξ πίκαηαξ δεδμιέκςκ υπμο ηάεε ζηήθδ ακηζζημζπεί ζε ιία έκεζδ ζημ GC MS ηαζ ηάεε βναιιή ακηζζημζπεί ζηδ ζοβηέκηνςζδ εκυξ ιεηααμθίηδ ζε υθεξ ηζξ εκέζεζξ. a it είκαζ δ i στη ζοβηέκηνςζδ ημο ιεηααμθίηδ ζηδκ έκεζδ t. Δίκαζ δοκαηυ κα εεςνδεμφκ μζ ιεηααμθίηεξ ή μζ εκέζεζξ ςξ ιεηααθδηέξ. Όηακ μζ ιεηααμθίηεξ είκαζ ιεηααθδηέξ, δδιζμονβείηαζ έκα ζφκμθμ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ ιεηααμθζηχκ ιε ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο ιπμνμφκ ηαθφηενα κα δζηαζμθμβήζμοκ ηαζ κα ελδβήζμοκ ηζξ απμηνίζεζξ ηςκ εκέζεςκ. Ακηίζημζπα, υηακ μζ εκέζεζξ είκαζ μζ ιεηααθδηέξ, δδιζμονβείηαζ έκα ζφκμθμ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ εκέζεςκ πμο οπμδεζηκφεζ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ πεζναιαηζηχκ ζοκεδηχκ πμο ιπμνμφκ κα ελδβήζμοκ ηαθφηενα ηδ ζοιπενζθμνά ηςκ ιεηααμθζηχκ. Γδιζμονβείηαζ έκαξ πίκαηαξ ζοκδζαηφιακζδξ A, n x n, χζηε κα οπμθμβζζημφκ μζ n ζδζμηζιέξ ηαζ ηα ακηίζημζπα ζδζμδζακφζιαηα. Σα ζδζμδζακφζιαηα είκαζ μζ ηφνζεξ

70 60 ζοκζζηχζεξ. Ζ PCA πνμαάθεζ ημκ ιεηααμθίηδ (ή ηδκ έκεζδ) i ηαηά ιήημξ ημο άλμκα ηδξ j στης ηφνζαξ ζοκζζηχζαξ. Ζ πνμαμθή ηαεμνίγεηαζ απυ ημκ ηφπμ: v tj είκαζ μ t στος ζοκηεθεζηήξ βζα ηδκ j στη ηφνζα ζοκζζηχζα ηαζ A είκαζ ηα δεδμιέκα πμο εηθνάγμκηαζ ζε ηφνζεξ ζοκζζηχζεξ. V είκαζ έκαξ μνεμηακμκζηυξ πίκαηαξ ηαζ A δ πενζζηνμθή ηςκ δεδμιέκςκ ζε έκα κέμ πχνμ υπμο μζ ηφνζεξ ζοκζζηχζεξ είκαζ μζ κέμζ άλμκεξ. Κάεε ζοκζζηχζα έπεζ ιζα δζαηφιακζδ πμο εηθνάγεηαζ απυ ηδκ ακηίζημζπδ ζδζμηζιή. Σα ζδζμδζακφζιαηα (ηφνζεξ ζοκζζηχζεξ) ιε ιεβάθεξ ζδζμηζιέξ είκαζ αοηά πμο ειπενζέπμοκ ηδκ πενζζζυηενδ πθδνμθμνία απυ ηα δεδμιέκα (aychaudhuri et al, 2000). Μπμνεί κα θακηαζηεί ηακείξ υηζ ακ οπήνπε έκα κέθμξ ζδιείςκ ηαζ ιπμνμφζε κα πενζζηναθεί ηαηά αμφθδζδ, εα ήηακ πζεακυ κα ανεεμφκ ηάπμζεξ βςκζέξ απυ ηζξ μπμίεξ εα ήηακ δοκαηυ κα θακεί ηαθφηενα ηζξ μιαδμπμζήζεζξ ηςκ ζδιείςκ (δεδμιέκςκ). Ζ PCA ανίζηεζ αοηέξ ηζξ βςκίεξ ιε ηδ ιεβαθφηενδ δζαπςνζζηζηή δοκαηυηδηα (Quackenbush, 2001). Ζ αλάιπζε ζεκαληηθόηεηαο κηθξνζπζηνηρηώλ (SAM) είκαζ ιζα ιέεμδμξ πμο πανέπεζ ηδ δοκαηυηδηα κα ηαοημπμζδεμφκ μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ έπεζ ιεηααθδεεί ζδιακηζηά ιεηαλφ δφμ πεζναιαηζηχκ ηαηαζηάζεςκ. Δθανιυγεηαζ, ηονίςξ, ζε δεδμιέκα ιεηαβναθζηήξ πνμηοπμπμίδζδξ, αθθά ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ηαζ ζε άθθα μιζηά παηέηα δεδμιέκςκ, επίζδξ. Ζ SAM ζηδνίγεηαζ ζημ t-test ηαζ οπάνπεζ δ ανπζηή οπυεεζδ υηζ ηα δεδμιέκα αημθμοεμφκ ηακμκζηέξ ηαηακμιέξ (Tusher et al, 2001). Ακ οπμηεεεί υηζ οπάνπμοκ n 1 ηαζ n 2 παναηδνήζεζξ ημο ιεηααμθίηδ i ζηζξ ηαηαζηάζεζξ x ηαζ y, οπμθμβίγεηαζ δ ζπεηζηή δζαθμνά ζηδ ζοβηέκηνςζδ ημο ιεηααμθίηδ d(i). Σμ επυιεκμ αήια είκαζ δ ηαηάηαλδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζφιθςκα ιε ημ d(i). d(1) είκαζ δ ιεβαθφηενδ ζπεηζηή δζαθμνά, d(2) είκαζ δ δεφηενδ ιεβαθφηενδ ζπεηζηή δζαθμνά ηαζ d(i) είκαζ δ i ζηδ ιεβαθφηενδ ζπεηζηή δζαθμνά. Σαοηυπνμκα, πνμηφπηεζ έκα δεφηενμ ιεβάθμ ζφκμθμ δεδμιέκςκ, ημ μπμίμ πνμένπεηαζ απυ ηοπαίμ ακαζοκδοαζιυ ηαζ ακαηάηεια ηςκ δεδμιέκςκ. Γζα ηάεε ακαζοκδοαζιυ οπμθμβίγεηαζ έκα d p (i) ηαζ πνμηφπηεζ ιζα δεφηενδ ηαηάηαλδ, υπςξ βζα ημ d(i). Ζ ακαιεκυιεκδ αοηή

71 61 ζπεηζηή δζαθμνά ζοκοπμθμβίγεζ υθμοξ ημοξ N ακαζοκδοαζιμφξ ηαζ οπμθμβίγεηαζ απυ ημκ ηφπμ:. Γζα ηδκ πθεζμκυηδηα ηςκ ιεηααμθζηχκ ακαιέκεηαζ υηζ d(i) d E (i) ηαζ αοηυ ιπμνεί κα θακεί ζε έκα βνάθδια δζαζπμνάξ ημο d(i) πνμξ ημ d E (i). Κάπμζμζ απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ υιςξ, δεκ ηαηακέιμκηαζ πάκς ζηδκ εοεεία d(i) = d E (i). Δηείκμζ μζ ιεηααμθίηεξ πμο οπενααίκμοκ έκα πνμηαεμνζζιέκμ υνζμ Γ μνίγμκηαζ ςξ εεηζηά ή ανκδηζηά ζδιακηζηά ιεηαααθθυιεκμζ (Tusher et al, 2001). Δμαγσγή ζπκπεξαζκάησλ πάλσ ζην αλαθαηαζθεπαζκέλν κεηαβνιηθό δίθηπν Σμ ηεθζηυ ζηάδζμ ηδξ ακάθοζδξ είκαζ ηαζ ημ πζμ ζδιακηζηυ. Δίκαζ ημ ζηάδζμ υπμο ελάβμκηαζ ηα ηεθζηά ζοιπενάζιαηα βζα ημ αζμθμβζηυ ζφζηδια πμο ιεθεηάηαζ ηαζ δ ιεηααμθζηή ημο θοζζμθμβία. Οζ αθβυνζειμζ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ηαηά ημ ζηάδζμ ηδξ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ, πνμζθένμοκ ηάπμζα μπηζημπμίδζδ ηαζ ιζα βκχζδ βζα ηδ νμπή ημο ιεηααμθζζιμφ ιεηαλφ ηςκ πεζναιαηζηχκ ηαηαζηάζεςκ. Όιςξ, ημ υθμ εβπείνδια δε ιπμνεί κα δχζεζ ζαθή αζμθμβζηά απμηεθέζιαηα ηαζ κα επεηηείκεζ ηδ αζμθμβζηή ζηέρδ ηαζ βκχζδ, ακ δεκ οπάνπεζ εη ηςκ πνμηένςκ άπμρδ ηδξ δμιήξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο, ημ μπμίμ παναηηδνίγεζ ημ αζμθμβζηυ ζφζηδια ημο πεζνάιαημξ. Ζ αημθμοεμφιεκδ ηαηηζηή είκαζ δ ακαηαηαζηεοή εκυξ ιεηααμθζημφ δζηηφμ πμο, ιε αάζδ ηδκ οπάνπμοζα βκχζδ, πνμζμιμζάγεζ ηαζ απμδίδεζ ζε ιεβάθμ ααειυ ημκ ηφνζμ ιεηααμθζζιυ άκεναηα ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ πμο ιαξ απαζπμθεί. Αθμφ αοηυ βίκεζ ιε πνήζδ αζαθζμβναθζηχκ δεδμιέκςκ, αθθά, ηονίςξ, ιε πνήζδ αζαθζμεδηχκ ηαζ αάζεςκ δεδμιέκςκ υπςξ δ KEGG ηαζ δ MetaCyc, οπάνπεζ ιζα ζαθέζηενδ ηαηακυδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θεζημονβίαξ. Οζ κέεξ μιζηέξ ηεπκμθμβίεξ δίκμοκ ηδ δοκαηυηδηα ακάθοζδξ ιεβάθμο υβημο δεδμιέκςκ πμο πνμηφπημοκ απυ θίβα πεζνάιαηα. Σα πμθθά αοηά δεδμιέκα, ηα μπμία δεκ είκαζ ακελάνηδηεξ ιεηνήζεζξ, αθθά ιεηνήζεζξ πμο αθθδθμεπδνεάγμκηαζ, είκαζ

72 62 δφζημθμ κα βίκμοκ ηαηακμδηά απυ ημκ ενεοκδηή, πανά ιυκμ ακ ηα δεζ απυ ηδκ μπηζηή εκυξ δζηηφμο, υπμο απμηοπχκμκηαζ αοηέξ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ. Ζ ακαηαηαζηεοή αζμθμβζηχκ δζηηφςκ είκαζ ιζα επίπμκδ ηαζ δζαδζηαζία ηαζ απμηεθεί έκακ απυ ημοξ ηφνζμοξ ζηυπμοξ ηδξ οζηδιζηήξ Βζμθμβίαξ (Oberhardt et al, 2009; Vo et al, 2004). Ζ πανημβνάθδζδ ηδξ οπάνπμοζαξ βκχζδξ πάκς ζε έκα δίηηομ αμδεάεζ ζηδκ ηαηακυδζδ ηαζ ηδκ ακαηάθορδ κέςκ αθθδθεπζδνάζεςκ. Σμ ιεηααμθζηυ δίηηομ είκαζ εκδζαθένμκ βζαηί είκαζ ημ πζμ πθήνεξ ηαζ αλζυπζζημ δίηηομ, ζε ζπέζδ ιε ηα οπυθμζπα αζμθμβζηά δίηηοα, βζαηί ααζίγεηαζ ζε πμθθέξ δεηαεηίεξ ένεοκαξ αζμπδιζηχκ (Ma & Goryanin, 2008). Δπίζδξ, έπεζ ηδκ ζδζυηδηα υηζ ιπμνεί κα μθμηθδνχζεζ πεζναιαηζηά δεδμιέκα απυ δζάθμνα επίπεδα ηοηηανζηήξ θεζημονβίαξ (βμκζδίςια, πνςηεΐκςια, ιεηαβνάθςια, ιεηααυθςια). Σμ ηονζυηενμ πθεμκέηηδια είκαζ υηζ μζ ιεηααμθίηεξ είκαζ υ,ηζ πθδζζέζηενμ ζημ θαζκυηοπμ εκυξ αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ. Καηά ηδκ ηεθεοηαία δεηαεηία έπεζ βίκεζ ιεβάθδ πνμζπάεεζα απυ ηδκ επζζηδιμκζηή ημζκυηδηα ζηδκ ηαηεφεοκζδ ακαηαηαζηεοήξ ιεηααμθζηχκ δζηηφςκ δζαθυνςκ μνβακζζιχκ ηαζ ηοηηανζηχκ ζεζνχκ, ιε αάζδ ημ βμκζδίςια ηαζ ηδκ απμηνοπημβνάθδζδ ηάεε μνβακζζιμφ. Οζ ααζζημί ζηυπμζ πμο έπμοκ κα ηαθοθεμφκ είκαζ: α) δ ηάθορδ ηςκ ορδθήξ απυδμζδξ ηεπκμθμβζχκ ζηδκ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ, α) δ ηαεμδήβδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ ιδπακζηήξ, β) δ ηαεμδήβδζδ ηςκ ακαηαθφρεςκ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ανπζηή οπυεεζδ, δ) δ ακαηάθορδ ζοζπεηίζεςκ ιεηαλφ δζαθυνςκ μνβακζζιχκ ηαζ ε) δ απμζαθήκζζδ ηςκ ζδζμηήηςκ ημο δζηηφμο (Oberhardt et al, 2009). Σμ επυιεκμ αήια είκαζ μ πνςιαηζζιυξ ηςκ ιεηααμθζηχκ, πάκς ζημ δίηηομ, ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεηααάθθεηαζ ζδιακηζηά, απυ ηδ ιζα πεζναιαηζηή ηαηάζηαζδ θοζζμθμβίαξ ζηδκ άθθδ. Αοηυξ μ πνςιαηζζιυξ αμδεά αηυια πενζζζυηενμ ζηδκ μπηζημπμίδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ, χζηε μ ενεοκδηήξ κα ιπμνέζεζ κα ηεθαθαζμπμζήζεζ ηα πεζναιαηζηά απμηεθέζιαηα ηαζ κα απμηηήζεζ μθμηθδνςιέκδ άπμρδ ηδξ ιεηααμθήξ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ, παναηηδνίγμκηαξ ζοβηεηνζιέκα ιεηαααθθυιεκα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα.

73 B. ηόρνο 63

74 64 Ο ζηυπμξ ηδξ ενβαζίαξ είκαζ λα απνζαθεληζηεί ε ρξεζηκόηεηα ηεο κεηαβνινκηθήο σο πςειήο απόδνζεο βηνκνξηαθή αλάιπζε ζηε Μεραληθή Κπηηαξνθαιιηεξγεηώλ. Μπμνεί δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ κα απμηεθέζεζ έκα ενβαθείμ πμο εα ιπμνμφζε κα εκζζπφζεζ απμηεθεζιαηζηά ηδκ ενβαθεζμεήηδ ηδξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζηδκ παναημθμφεδζδ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ ζε αζμακηζδναζηήνεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ παναζηεοή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ, αηυια ηαζ ζημ επίπεδμ ηδξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ; Θα δχζεζ ιεβαθφηενδ πθδνμθμνία απυ ημ οπάνπμκ ζφκμθμ πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ; Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ηα παναπάκς ελεηάγμκηαζ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ΒΖΚ (baby hamster kidney) ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ ηαζ θζάθεξ ακαηίκδζδξ ηαζ βίκεηαζ πνήζδ ιεηααμθμιζηήξ Υνςιαημβναθίαξ Αενίςκ Φαζιαημιεηνίαξ Μάγαξ (GC-MS). Γζα ημοξ παναπάκς ζημπμφξ, πναβιαημπμζμφκηαζ δζαδμπζηά: - Ανζζημπμίδζδ ημο πεζναιαηζημφ πνςημηυθμο GC-MS ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ δεζβιάηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ πνμενπυιεκα απυ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ ηαζ θζάθεξ ακαηίκδζδξ ζηδνζγυιεκμζ ζηδκ πνχηδ πνμζπάεεζα ημο ενβαζηδνίμο (Chrysanthopoulos et al, 2010). - Ακαηαηαζηεοή ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ ιε αάζδ, ηονίςξ, ημ βμκζδίςια ημο Μ.musculus, χζηε κα βίκεζ ηαηακμδηή δ δοκαιζηή ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ κα είκαζ δοκαηυ κα αλζμθμβδεμφκ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πεζναιάηςκ πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ δίηηομ. - Αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. - Μεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ιεηααμθχκ ηςκ ηζιχκ παναβυκηςκ πμο δζαιμνθχκμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ, υπςξ ημ ph, ημ δζαθοιέκμ μλοβυκμ, δ εενιμηναζία ηαζ μ ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ (CSP). - Παναηήνδζδ αθθαβχκ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ΒΖΚ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ, υηακ ιεηααάθθεηαζ δ ζφζηαζδ ιμκμζαηπανζηχκ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ.

75 Γ. Τιηθά θαη κέζνδνη 65

76 66 Πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ ηδκ εκυηδηα αοηή πενζβνάθεηαζ μ ηνυπμξ δζελαβςβήξ ηςκ ηνζχκ ηφνζςκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ. Γίκμκηαζ δζαδμπζηά, ιε αάζδ ημ πνυκμ δζελαβςβήξ ημοξ ηαζ είκαζ ηα ελήξ: α) πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ, α) πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, β) πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο. Πείξακα θπηηαξηθήο ειηθίαο πεδζάζηδηακ δφμ ακελάνηδηα πεζνάιαηα βζα κα αλζμθμβδεεί δ εθανιμβή ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ζηδ ιεθέηδ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ, ζα ζοκάνηδζδ ημο ιεβέεμοξ ημο αζμακηζδναζηήνα ηαζ ημο πνυκμο ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ (πήια Γ.1). ηδκ πνχηδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία (πείναια 1 experiment 1) έβζκε απυρολδ ηςκ θζαθζδίςκ Α ηαζ Β, απυ ηδκ ίδζα ηνάπεγα ηοηηάνςκ BHK, ηαζ ακαπηφπεδηακ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ. Όηακ επζηεφπεδηε έκαξ ζηακμπμζδηζηυξ ανζειυξ ηοηηάνςκ, ηα ηφηηανα ήηακ δζαεέζζια βζα κα εκεεμφκ ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ, L5 ηαζ L6. Γείβιαηα απυ ημοξ L5 ηαζ L6 πνδζζιμπμζήεδηακ βζα κα ακαπηοπεμφκ, ακηίζημζπα, μζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ Μ3 ηαζ Μ4. οθθέπεδηακ δείβιαηα βζα ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ απυ ηδκ ανπζηή (έκα δείβια απυ ηάεε ηαθθζένβεζα), ηδ ιέζδ (έκα δείβια απυ ηάεε ηαθθζένβεζα) ηαζ ηεθζηή πνμκζηή θάζδ (έκα δείβια απυ ηάεε αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ ηαθθζένβεζα). Καζ μζ δφμ πεζναιαηζηέξ πμνείεξ (θζαθίδζμ Α, L5, M3 ηαζ θζαθίδζμ Β, L6, M4) δζεκενβήεδηακ ιε πανυιμζμ ηνυπμ ηαζ οπήνπε ιία πνμξ ιία ακηζζημίπζζδ ιεηαλφ ηςκ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνςκ. ηδ δεφηενδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία (πείναια 2 experiment 2) πνδζζιμπμζήεδηε ημ θζαθίδζμ C απυ ηδκ ίδζα ηνάπεγα ηοηηάνςκ ημο πεζνάιαημξ 1, ημ μπμίμ μδήβδζε ζηδκ ακάπηολδ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ L7. Ζ ααζζηή δζαθμνά ιε ημ πείναια 1 είκαζ υηζ μζ δφμ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ (M5a ηαζ M5b), πμο ακαπηφπεδηακ απυ ημκ L7, εκέεδηακ ζε δφμ

77 67 δζαθμνεηζηά πνμκζηά ζδιεία, ημ πνχημ ζηδκ ανπζηή ηαζ ημ δεφηενμ ζηδκ ηεθζηή θάζδ ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ. Έηζζ, ηάεε αθθαβή ζηδ θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ ηςκ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνςκ εα ιπμνεί κα αλζμθμβδεεί ζοβηνζηζηά ιεηαλφ ηςκ πεζναιάηςκ 1 ηαζ 2. οθθέπεδηακ δείβιαηα βζα ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ απυ ημοξ ηνεζξ αζμακηζδναζηήνεξ ηαηά ηδκ ανπζηή (έκα δείβια), ηδ ιέζδ (έκα δείβια απυ δφμ πνμκζηά ζδιεία) ηαζ ηεθζηή θάζδ (έκα δείβια) ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαθθζένβεζαξ. Σμ πείναια 2 πναβιαημπμζήεδηε ζε δζαθμνεηζηή διενμιδκία απυ ημ πείναια 1 ηαζ μζ δφμ δζαδζηαζίεξ είκαζ ακελάνηδηεξ. πήια Γ. 1 Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ (Α) ημο πεζνάιαημξ 1 ηαζ (Β) ημο πεζνάιαημξ 2 απυ ηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία βζα ηδκ ηοηηανζηή δθζηία. ημ ηάης ιένμξ ηδξ εζηυκαξ, θαίκμκηαζ μζ ηοηηανζηέξ δθζηίεξ ηαηά ηζξ μπμίεξ πναβιαημπμζήεδηακ μζ εκέζεζξ ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ηαζ μζ δεζβιαημθδρίεξ, ζπεηζηά ιε ηζξ ηνεζξ θάζεζξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαθθζένβεζαξ.

78 68 Πείξακα δηαηαξαρώλ πεξηβάιινληνο θπηηαξνθαιιηέξγεηαο Γζα κα ιεθεηδεεί δ επίπηςζδ ηςκ αθθαβχκ ζε πενζααθθμκηζημφξ πανάβμκηεξ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηοηηανμηαθθζενβεζχκ BHK, πναβιαημπμζήεδηε έκα ιεβάθμ πείναια ιε θεζημονβία επηά αζμακηζδναζηήνςκ. Δζδζηυηενα, απμρφπεδηε έκα θζαθίδζμ απυ ηδκ ηνάπεγα ηοηηάνςκ πμο ακαθέναιε ηαζ ζημ πνμδβμφιεκμ πείναια ηαζ παναηηδνίγεηαζ βζα ηδ ζηαεενυηδηά ηδξ. Σα ηφηηανα ΒΖΚ ημο θζαθζδίμο ακαπηφπεδηακ ζε αζμακηζδναζηήνα ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ (L8) ηαζ ηφηηανα απυ αοηυκ ζοθθέπεδηακ βζα κα ακαπηοπεμφκ ζημ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνα M6. Κφηηανα απυ ημκ Μ6 ζοθθέπεδηακ βζα κα ηαθθζενβδεμφκ ζε πέκηε αζμακηζδναζηήνεξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ, ημοξ L9, L10, L11, L12 ηαζ L13. Όθμζ μζ αζμακηζδναζηήνεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ, ορδθήξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ. Ζ δζαδζηαζία ηαθθζένβεζαξ παναηηδνίγεηαζ απυ ζοβηεηνζιέκεξ ηζιέξ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ παναβυκηςκ (ph, δζαθοιέκμ μλοβυκμ-do, εενιμηναζία-t, ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ-csp), μζ μπμίεξ νοειίγμκηαζ χζηε κα παναιέκμοκ ζηαεενέξ ηαζ κα πανέπμοκ ιέβζζηδ παναβςβζηυηδηα ηαζ πμζυηδηα παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ. ε αοηήκ ηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε (πήια Γ.2), ζε ηάεε αζμακηζδναζηήνα ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ (πθδκ ημο L8), μζ ηζιέξ ηςκ παναιέηνςκ ιεηααάθθμκηακ ζε δζάθμνμοξ ζοκδοαζιμφξ ζε ζοβηεηνζιέκα πνμκζηά ζδιεία. Κάεε ζοκδοαζιυξ αθθαβιέκςκ ηζιχκ δζανημφζε ίδζμ πνμκζηυ δζάζηδια. οθθεβυηακ δείβια ζε ζοβηεηνζιέκα πνμκζηά ζδιεία ιεηά ηδκ εηηίκδζδ ηάεε δζαηαναπήξ, χζηε κα επζηναπεί ζηα ηφηηανα κα πνμζανιμζημφκ ζημ κέμ πενζαάθθμκ. Οζ αθθαβέξ ζημοξ πενζααθθμκηζημφξ πανάβμκηεξ δεκ ήηακ ιεβάθεξ ζε ηαιία πενίπηςζδ ηαζ δεκ οπήνλακ αηναίεξ ηζιέξ.

79 69 ph DO (%) T ( o C) CSP decreased standard conditions increased πήια Γ. 2 Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ηδξ πεζναιαηζηήξ δζαδζηαζίαξ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ δζαηαναπχκ. Γείπκεηαζ δ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ζημ ζφκμθμ ηαζ θαίκεηαζ δ δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε ζημκ ηάεε αζμακηζδναζηήνα, λεπςνζζηά. ημ ηάης ιένμξ ηδξ εζηυκαξ, θαίκμκηαζ μζ ηοηηανζηέξ δθζηίεξ ηαηά ηζξ μπμίεξ πναβιαημπμζήεδηακ μζ εκέζεζξ ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ηαζ μζ δεζβιαημθδρίεξ, ζπεηζηά ιε ηζξ ηνεζξ θάζεζξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαθθζένβεζαξ.

80 70 Ζ ζεζνά ηςκ δζαηαναπχκ είπε, βζα ηάεε αζμακηζδναζηήνα, λεπςνζζηά, ςξ ελήξ (πήια Γ.2): L9 αζμακηζδναζηήναξ: δ δζαδζηαζία λεηζκά ιε ηζξ ανπζηέξ (αέθηζζηεξ) ζοκεήηεξ ηαζ αημθμοεμφκ δφμ δζαηαναπέξ. Ζ πνχηδ δζαηαναπή παναηηδνίγεηαζ απυ ιείςζδ ζε ph, DO, T ηαζ CSP ηαζ δ ιυκδ δζαθμνά ιε ηδ δεφηενδ δζαηαναπή είκαζ μ αολδιέκμξ CSP ηδξ ηεθεοηαίαξ. L10 αζμακηζδναζηήναξ: δ δζαδζηαζία λεηζκά ιε ηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ, αημθμοεμφκ δφμ δζαηαναπέξ, δ ηαθθζένβεζα επζζηνέθεζ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ δ δζαδζηαζία ηεθεζχκεζ ιε ιζα ηεθεοηαία δζαηαναπή. Ζ δζαδζηαζία ημο L10 παναηηδνίγεηαζ, ηονίςξ, απυ ημ αολδιέκμ ph ζε υθεξ ηζξ δζαηαναπέξ. Ζ πνχηδ δζαηαναπή παναηηδνίγεηαζ απυ πηχζδ ηζιχκ ζε DO, T ηαζ CSP ηαζ δ ιυκδ δζαθμνά ιε ηδ δεφηενδ δζαηαναπή είκαζ μ αολδιέκμξ CSP ηδξ ηεθεοηαίαξ. ηδκ ηνίηδ δζαηαναπή, ημ DO ηαζ δ T είκαζ αολδιέκα, εκχ μ CSP ιεζςιέκμξ. L11 αζμακηζδναζηήναξ: δ δζαδζηαζία λεηζκά ιε ηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ, αημθμοεμφκ δφμ δζαηαναπέξ ηαζ δ ηοηηανμηαθθζένβεζα επζζηνέθεζ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ ζηδ ιέζδ θάζδ. Σα επυιεκα αήιαηα ηδξ δζαδζηαζίαξ είκαζ άθθεξ δφμ αθθαβέξ ηαζ, ηεθζηά, μ αζμακηζδναζηήναξ επζζηνέθεζ, άθθδ ιζα θμνά, ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ, ζηδκ ηεθζηή θάζδ. Ζ υθδ δζαδζηαζία παναηηδνίγεηαζ απυ ιεζςιέκμ ph. Οζ πνχηεξ δφμ δζαηαναπέξ παναηηδνίγμκηαζ απυ ιεζςιέκα DO ηαζ T, εκχ ζηδκ ηνίηδ ηαζ ηέηανηδ δζαηαναπή ημ DO είκαζ αολδιέκμ. Ο CSP είκαζ ιεζςιέκμξ ζηδκ πνχηδ ηαζ ηνίηδ δζαηαναπή ηαζ αολδιέκμξ ζηδ δεφηενδ ηαζ ηέηανηδ. L12 αζμακηζδναζηήναξ: δ δζαδζηαζία λεηζκά, επίζδξ, ιε ηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ πμο αημθμοεμφκηαζ απυ δφμ δζαηαναπέξ. Οζ δζαηαναπέξ παναηηδνίγμκηαζ απυ αολδιέκμ ph ηαζ Σα ηαζ ιεζςιέκμ DO. Ζ ιυκδ δζάηνζζδ πμο βίκεηαζ ιεηαλφ ηςκ δφμ δζαηαναπχκ είκαζ ζηδκ ηζιή ημο CSP, μ μπμίμξ είκαζ ιεζςιέκμξ ζηδκ πνχηδ δζαηαναπή ηαζ αολδιέκμξ ζηδ δεφηενδ. L13 αζμακηζδναζηήναξ: μ αζμακηζδναζηήναξ L13 ειαμθζάζεδηε ιε ηφηηανα ηαηά ηδ ιέζδ θάζδ ηδξ δθζηίαξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ αοηή είκαζ ιζα ααζζηή δζαθμνά ημο ζε ζφβηνζζδ ιε ημοξ άθθμοξ ηέζζενζξ αζμακηζδναζηήνεξ. ε αοηυ ημ πνμκζηυ ζδιείμ, δ ηαθθζένβεζα ανζζηυηακ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ, ζηδ ζοκέπεζα, αημθμφεδζακ ηνεζξ δζαηαναπέξ, μζ μπμίεξ παναηηδνίγμκηακ απυ ιεζςιέκμ ph ηαζ T. Ζ πνχηδ ηαζ δ

81 71 δεφηενδ δζαηαναπή είπακ αολδιέκμ DO, εκχ δ ηνίηδ ιεζςιέκμ. Ο CSP ήηακ αολδιέκμξ ζηδ δεφηενδ ηαζ ηδκ ηνίηδ δζαηαναπή, εκχ ήηακ ιεζςιέκμξ ζηδκ πνχηδ. Πείξακα δηαθνξνπνηεκέλνπ ζξεπηηθνύ κέζνπ Κάηζ πμο απαζπμθεί ηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ είκαζ δ απμδμηζηυηδηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ βθοημζοθίςζδξ ηαζ δ ζζμννμπία αοηήξ ιε ηδκ εκενβυηδηα ημο ηεκηνζημφ ιεηααμθζζιμφ. Γζα κα ιεθεηδεεί μ νυθμξ ηςκ ακαθμβζχκ ιεηαλφ δζαθυνςκ ιμκμζαηπανζηχκ, ιεηααμθζηχκ δδθαδή, πμο πνμζηίεεκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, ζπεδζάζηδηε έκα πείναια ζε ηαθθζένβεζεξ ζε θζάθεξ (θθάζηεξ) ακαηίκδζδξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, απυ δείβια αζμακηζδναζηήνα ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ (L14) ακαπηφπεδηε ηαθθζένβεζα ζε θζάθδ ακαηίκδζδξ ιέπνζ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ 0.25 x 10 6 ηοηηάνςκ / ml. Απυ αοηήκ ακαπηφπεδηακ πέκηε ηαθθζένβεζεξ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ ιε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ ιμκμζαηπανζηχκ (πήια Γ.3). ηζξ θζάθεξ απυ Α ςξ Δ, δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ βθοηυγδξ αολακυηακ ζηαδζαηά απυ ημ Α ιέπνζ ημ Δ. Ζ υθδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ζηζξ θζάθεξ είπε δζάνηεζα ηνζχκ εαδμιάδςκ ηαζ ζοθθέπεδηε δείβια ηοηηάνςκ ζημ ηέθμξ ηάεε εαδμιάδαξ, απυ ηάεε θζάθδ. Πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ηα δείβιαηα ηςκ D ηδξ πνχηδξ εαδμιάδαξ ηαζ ηςκ C ηαζ E ηδξ ηνίηδξ, ηνίεδηακ αηαηάθθδθα βζα εηπφθζζδ. Γείβιαηα απμεδηεοιέκα βζα πακ εκδεπυιεκμ, ζηάθεδηακ βζα ακαπθήνςζδ. Tα δείβιαηα ακαπθήνςζδξ ακαθφεδηακ ιε ημζκυ δείβια απυ ηα παθαζυηενα βζα κα δίκεηαζ δ δοκαηυηδηα ιαεδιαηζηήξ ηακμκζημπμίδζδξ ηαζ δ πεζναιαηζηή πναηηζηή πανέιεζκε δ ίδζα, ζημ πθαίζζμ ημο δοκαημφ.

82 πήια Γ. 3 Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο. πδιαηζηή ακαπανάζηαζδ ηδξ πεζναιαηζηήξ δζαδζηαζίαξ ημο δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο. Γείπκεηαζ δ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ζημ ζφκμθμ. 72

83 73 Λεζημονβία αζμακηζδναζηήνα ηαζ παναημθμφεδζδ Όθμζ μζ αζμακηζδναζηήνεξ, ζηα πεζναιάηςκ υπμο πνδζζιμπμζήεδηακ αζμακηζδναζηήνεξ, ειαμθζάζεδηακ ιε ανπζηή ζοβηέκηνςζδ ηοηηάνςκ 1 x 10 6 ηφηηανα / ml ηαζ ηα ηφηηανα αθέεδηακ κα θηάζμοκ ιζα ζηαεενή ηαηάζηαζδ ιε ζοβηέκηνςζδ 20 x 10 6 ηφηηανα / ml, δ μπμία επζηοβπάκεηαζ εκηυξ 6-8 διενχκ. Αοηή δ ζοβηέκηνςζδ παναιέκεζ ζηαεενή ιε αοηυιαηδ απχθεζα ηοηηάνςκ απυ ημ ζχια ημο αζμακηζδναζηήνα. Ζ εενιμηναζία ημο αζμακηζδναζηήνα, δ ζοβηέκηνςζδ ημο δζαθοιέκμο μλοβυκμο (DO) ηαζ ημ ph δζαηδνήεδηακ ζηαεενά ζημοξ 35.5 μ C, 50% ημνεζιυ αένα ηαζ 6.8, ακηίζημζπα, ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ημο πεζνάιαημξ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. Καεδιενζκά, ζημ πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ, ζοθθέβμκηακ δείβιαηα απυ ηάεε αζμακηζδναζηήνα βζα ακάθοζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ ηαζ αζςζζιυηδηαξ απυ ημ ζφζηδια CEDEX (Innovatis, Bielefeld, Germany). Αοηά ηα δείβιαηα θοβμηεκηνμφκηακ (Beckman Colter, Fullerton, CA, USA) ηαζ ηα οπενηείιεκα ακαθφμκηακ, χζηε κα ιεηνδεμφκ ζοβηεκηνχζεζξ ζοβηεηνζιέκςκ ιεηααμθζηχκ. Μεηνμφκηακ δ βθοηυγδ, ημ βαθαηηζηυ μλφ, δ βθμοηαιίκδ ηαζ ημ βθμοηαιζηυ μλφ απυ ημκ ακαθοηή YSI model 2700 (Yellow Sprints Instruments, Yellow Springs, OH, USA), εκχ δ αιιςκία ιεηνμφηακ απυ ημκ ακαθοηή Ektachem DT60 (Eastman Kodak, ochester, NY, USA). Σμ ph ηαζ ημ DO ιεηνμφκηακ, ζε πναβιαηζηυ πνυκμ, ιε πνήζδ ακαδζπθμφιεκςκ δθεηηνμδίςκ (Metler-Toledo Inc., Columbus,OH, USA) ηαζ δ αηνίαεζα ηςκ ιεηνήζεςκ πζζημπμζμφηακ ιέζς ακάθοζδξ ζε ακαθοηή apidlab 248 blood gas (Bayer HealthCare, Tarrytown, NY, USA). Σμ ίδζμ υνβακμ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ιέηνδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ δζαθοιέκμο CO 2. Μεηνήζεζξ ζε πναβιαηζηυ πνυκμ, έβζκακ βζα ηδκ ηοηηανζηή ποηκυηδηα ιέζς ακαδζπθμφιεκμο ακζπκεοηή μπηζηήξ ποηκυηδηαξ (Aquasant Messtechnik, Bubendorf, Switzerland), νοειζζιέκμ απυ ιεηνήζεζξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ απυ ημ ζφζηδια CEDEX. Οζ ιαηνμζημπζηέξ αοηέξ ηζιέξ δεκ πανμοζζάγμκηαζ ζε αοηήκ ηδκ ενβαζία, πανά ιυκμ ηάπμζα βναθήιαηα απυ αοηέξ ζημ πείναια ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ.

84 74 Μεηααμθμιζηή ακάθοζδ ημ πήια Γ.4 θαίκμκηαζ ηα αήιαηα ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ πμο αημθμοεήεδηακ, ηα μπμία πενζβνάθμκηαζ ζε αοηήκ ηδκ εκυηδηα. πήια Γ. 4 Βήιαηα GC-MS ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ. Γείπκμκηαζ ηα αήιαηα πμο αημθμοεήεδηακ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ ζηα πεζνάιαηα αοηήξ ηδξ ενβαζίαξ. πιινγή δείγκαηνο Σα δείβιαηα ζοθθέβμκηαζ απυ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ή ηζξ θζάθεξ ζε πάβμ ηαζ θοβμηεκηνμφκηαζ ζε ροπυιεκδ θοβυηεκηνμ. Μεηά ηδ θοβμηέκηνδζδ, αθαζνείηαζ ημ οπενηείιεκμ ηαζ ημ ίγδια ηοηηάνςκ λεπθέκεηαζ ιε παβςιέκμ δζάθοια PBS (phosphate buffered saline). Σμ ίγδια ηοηηάνςκ ημπμεεηείηαζ βζα 15 min ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 70 C βζα κα ακαζηαθεί μ ιεηααμθζζιυξ, αθμφ ηα έκγοια ιεημοζζχκμκηαζ ζε αοηή ηδ εενιμηναζία. Σμ ίγδια λδναίκεηαζ ζηαδζαηά ζημοξ 70 C βζα 24 h ηαζ απμεδηεφεηαζ ζημοξ -80 μ C.

85 75 Δθρύιηζε κεηαβνιηηώλ θαη παξαγώγηζε Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ημ πείναια 1, ημ λδνυ ίγδια ιεηααμθζηχκ ηάεε δείβιαημξ απμιμκχεδηε απυ 150 mg λδνήξ αζμιάγαξ, ιε εηπφθζζδ ζε ιεεακυθδ / κενυ. ημ δείβια πνμζηέεδηακ ζακ εζςηενζηά πνυηοπα 7.5 ιg νζαζηυθδξ ηαζ 15 ιg [U- 13 C] βθοηυγδξ. Οζ ιεηααμθίηεξ παναβςβίζηδηακ ζηα (Meo x )TMS-πανάβςβά ημοξ ηαηυπζκ ακηίδναζδξ ιε 200ιL απυ δζάθοια 20mg/mL οδνμπθςνζηήξ ιεεμλοαιίκδξ ζε πονζδίκδ βζα 90min, αημθμοεμφιεκδ απυ ακηίδναζδ ιε 400ιL MSTFA βζα ημοθάπζζημκ 6h ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (Kanani et al, 2008; Kanani & Klapa, 2007). ημ πείναια 2, ημ μπμίμ πναβιαημπμζήεδηε ζε άθθδ διενμιδκία απυ ημ πείναια 1, ημ ίγδια πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ απμιμκχεδηε δφμ θμνέξ απυ ηάεε δείβια ηαζ ζε αοηυ πνμζηέεδηακ 7.5 ιg απυ ηάεε εζςηενζηυ πνυηοπμ. Με αοηυ ημκ ηνυπμ, δ ζηαεενυηδηα ηςκ ιεηααμθμιζηχκ δεδμιέκςκ πζζημπμζείηαζ ηαθφηενα. Σα δφμ πεζναιαηζηά ακηίβναθα (replicates) ηα μκμιάζαιε a ηαζ b. Σα λδνά ζγήιαηα ιεηααμθζηχκ πμο πνμέηορακ, παναβςβίζηδηακ ιε 150ιL απυ δζάθοια 20mg/mL οδνμπθςνζηήξ ιεεμλοαιίκδξ ζε πονζδίκδ ηαζ ιε 300ιL MSTFA. Σμ πνςηυημθθμ, ζηα οπυθμζπα ζδιεία ημο, πανέιεζκε ίδζμ ιε αοηυ ημο πεζνάιαημξ 1. Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Σμ λδνυ ίγδια ιεηααμθζηχκ ηάεε δείβιαημξ απμιμκχεδηε απυ 75 mg λδνήξ αζμιάγαξ, ιε εηπφθζζδ ζε ιεεακυθδ / κενυ. ημ δείβια πνμζηέεδηακ ζακ εζςηενζηά πνυηοπα 7.5 ιg νζαζηυθδξ ηαζ 15 ιg [U- 13 C] βθοηυγδξ. Οζ ιεηααμθίηεξ παναβςβίζηδηακ ζηα (Meo x )TMS-πανάβςβά ημοξ ηαηυπζκ ακηίδναζδξ ιε 150ιL απυ δζάθοια 20mg/mL οδνμπθςνζηήξ ιεεμλοαιίκδξ ζε πονζδίκδ βζα 90min, αημθμοεμφιεκδ απυ ακηίδναζδ ιε 300ιL MSTFA βζα ημοθάπζζημκ 6h ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Απυ ηάεε δείβια πήναιε, υπςξ ηαζ ζημ δεφηενμ πείναια ημο πνμδβμφιεκμο ηεθαθαίμο, δφμ θμνέξ ίγδια ιεηααμθζηχκ χζηε κα έπμοιε απυ δφμ πεζναιαηζηά ακηίβναθα (replicates), a ηαζ b.

86 76 Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Ζ δζαδζηαζία ηδξ απμιυκςζδξ ηαζ παναβχβζζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμπχνδζε αηνζαχξ υπςξ ηαζ ζημ πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Υνδζζιμπμζήεδηακ ίδζεξ πμζυηδηεξ αζμιάγαξ ηαζ παναβυκηςκ παναβχβζζδξ. Καζ ζε αοηυ ημ πείναια πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ ακηίβναθα (replicates) απυ ημ ηάεε δείβια, ηα a ηαζ b. Μέηξεζε κεηαβνιηθώλ πξνηύπσλ θαη θαλνληθνπνίεζε Σμ ιεηααμθζηυ πνυηοπμ ηάεε δείβιαημξ ιεηνήεδηε ημοθάπζζημκ ηνεζξ θμνέξ ιε πνήζδ Saturn 2000 GC-(ion trap)ms (Varian Inc.). Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Ζ ακαβκχνζζδ ηςκ ημνοθχκ ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ ζημ πείναια 1 απέδςζε 144 ημνοθέξ παναηηδνζζηζηχκ ζυκηςκ πμο ακηζζημζπμφκ ζε ιεηααμθίηεξ βκςζηήξ πδιζηήξ ηαηδβμνίαξ, εκχ ζημ πείναια 2 ακαβκςνίζηδηακ ηαζ πμζμηζημπμζήεδηακ 127. ηδ ζοκέπεζα, πζζημπμζήεδηε υηζ υθα ηα πνυηοπα πνμέηορακ ηάης απυ ηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ ακάθοζδξ απυ ημ GC-MS. Αοηυ ααζίζηδηε ζημ θυβμ ηςκ δφμ ημνοθχκ πμο δίκεζ δ [U- 13 C] βθοηυγδ, μ μπμίμξ πνέπεζ κα ιέκεζ ζηαεενυξ. Αημθμφεδζε μ οπμθμβζζιυξ ηςκ ζπεηζηχκ επζθακεζχκ (ειααδχκ) ημνοθχκ (relative peak areas PAs) ηαηυπζκ ηδξ δζαίνεζδξ ηδξ ηζιήξ ηάεε πμζμηζημπμζδιέκδξ ημνοθήξ ιε ηδ ιέηνδζδ ηδξ ημνοθήξ ηδξ νζαζηυθδξ ιε παναηηδνζζηζηυ ζυκ ημ 217. Αηυια, οπμθμβίζηδηε δ ζοβηεκηνςηζηή ηζιή ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο ακήημοκ ζηδκ ηνίηδ ηαηδβμνία ηαζ δίκμοκ πμθθαπθά πανάβςβα (Kanani & Klapa, 2007). ημ πείναια 1, ηα αάνδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζ αοηυ ημ αήια, ηαεμνίζηδηακ απυ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ19 απυ ημ αζμακηζδναζηήνα Μ4, ηαζ βζα ημ πείναια 2, απυ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ12 ημο αζμακηζδναζηήνα L7 (ακηίβναθμ a). ). Σα πνςιαημβναθήιαηα μκμιάγμκηαζ ιε αάζδ ημ αζμακηζδναζηήνα απυ ημκ μπμίμ πνμένπεηαζ ημ δείβια, ημ πνμκζηυ ζδιείμ ζοθθμβήξ, ημ ακηίβναθμ (a ή b) ηαζ ημκ ανζειυ ηδξ ηαηά ζεζνά έκεζδξ (π.π. Μ5a_T10_aInj2). ημ πείναια 1 δεκ οπάνπμοκ ακηίβναθα.

87 77 Οζ ιεηααμθίηεξ πμο πενζείπακ αιζκμιάδεξ ηαζ, βζα ημοξ μπμίμοξ δεκ ήηακ δοκαηυ κα οπμθμβζζημφκ ηα αάνδ, ελαζνέεδηακ απυ ηδκ ακάθοζδ. Αοημί ήηακ ημ βθμοηαιζκζηυ μλφ βζα ημ πείναια 1 ηαζ δ μνκζείκδ βζα ημ πείναια 2. Γζα ηδ ααθίκδ, ηα αάνδ οπμθμβίζηδηακ απυ ηα δφμ πζμ άθεμκα πανάβςβα ηα μπμία απμηεθμφζακ πάκς απυ ημ 95% ηδξ ζοκμθζηήξ ιέηνδζδξ βζα ημ ζοβηεηνζιέκμ ιεηααμθίηδ. Σέθμξ, α) μζ ιζηνυηενεξ ημνοθέξ απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ πμο πενζέπμοκ ηεημκμιάδεξ, α) μζ ημνοθέξ πμο ακηζζημζπμφκ ζε άβκςζημοξ ιεηααμθίηεξ μζ μπμίμζ δζαεέημοκ αιζκμιάδα, β) μζ ημνοθέξ πμο i) παναηηδνίγμκηαζ ςξ ηαηάθμζπα ηδξ παναβχβζζδξ ή ii) ειθακίγμοκ ημνοθέξ πμο ζοκεπίγμκηαζ βζα πμθφ (ιεβάθμ carry over) ή iii) δεκ ιεηνμφκηαζ ιε ζηαεενυ ηνυπμ ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ή ηςκ εκέζεςκ ημο ίδζμο δείβιαημξ ή iv) ειθακίγμοκ ιεβάθδ δζαηφιακζδ ιεηαλφ ηςκ εκέζεςκ, αθαζνμφκηαζ απυ ηα ηεθζηά δεδμιέκα. Δπζπθέμκ, ηα πνυηοπα ηςκ: έκεζδ 1 ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ T9 ημο αζμακηζδναζηήνα M3, έκεζδ 6 ηαζ 8 ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ T19 ημο αζμακηζδναζηήνα M4, έκεζδ 1 ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ17 ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ L7 ηαζ M5b (ακηίβναθμ α) ηαζ ηα ακηίβναθα α ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ10 ημο αζμακηζδναζηήνα L7, ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ12 ημο αζμακηζδναζηήνα M5a ηαζ ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ T17 ημο αζμακηζδναζηήνα M5b, αθαζνέεδηακ απυ ηδκ ακάθοζδ, ηαεχξ αφλακακ ζδιακηζηά ηδ απυηθζζδ ιεηαλφ ηςκ εκέζεςκ ζηα ακηίζημζπα δείβιαηα. Μεηά ηδκ ηακμκζημπμίδζδ ηαζ ημ θζθηνάνζζια, δ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ πνμπχνδζε ιε α) 40 πνυηοπα απυ 62 (41 βκςζημί) ιεηααμθίηεξ βζα ημ πείναια 1 ηαζ α) 30 πνυηοπα απυ 68 (45 βκςζημί) ιεηααμθίηεξ βζα ημ πείναια 2. Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Ζ ακαβκχνζζδ ηςκ ημνοθχκ ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ απέδςζε 156 ημνοθέξ παναηηδνζζηζηχκ ζυκηςκ πμο ακηζζημζπμφκ ζε ιεηααμθίηεξ βκςζηήξ πδιζηήξ ηαηδβμνίαξ. Πζζημπμζήεδηε υηζ υθα ηα πνυηοπα πνμέηορακ ηάης απυ ηζξ ίδζεξ ζοκεήηεξ ακάθοζδξ απυ ημ GC-MS. Αοηυ ααζίζηδηε ζημ θυβμ ηςκ δφμ ημνοθχκ πμο δίκεζ δ [U- 13 C] βθοηυγδ, υπςξ ηαζ ζημ πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. Αημθμφεδζε μ οπμθμβζζιυξ ηςκ ζπεηζηχκ επζθακεζχκ (ειααδχκ) ημνοθχκ (relative peak areas PAs) ηαηυπζκ ηδξ δζαίνεζδξ ηδξ ηζιήξ ηάεε πμζμηζημπμζδιέκδξ ημνοθήξ ιε ηδ ιέηνδζδ ηδξ ημνοθήξ ηδξ νζαζηυθδξ ιε παναηηδνζζηζηυ ζυκ ημ 217. Αηυια,

88 78 οπμθμβίζηδηε δ ζοβηεκηνςηζηή ηζιή ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο ακήημοκ ζηδκ ηνίηδ ηαηδβμνία ηαζ δίκμοκ πμθθαπθά πανάβςβα. Όπςξ ηαζ ζηζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ ημο πεζνάιαημξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ, πνδζζιμπμζήεδηε ζοβηεηνζιέκμ πνςιαημβνάθδια, απυ ημο μπμίμο ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα πνμέηορακ ηα αάνδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδ ζοβηεκηνςηζηή πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηδξ ηνίηδξ ηαηδβμνίαξ. Σα αάνδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζ αοηυ ημ αήια, ηαεμνίζηδηακ απυ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ηδξ πνμκζηήξ ζηζβιήξ Σ6 απυ ημ αζμακηζδναζηήνα L11 (ακηίβναθμ b). ιεηααμθζηχκ ηαηδβμνίαξ 3 ήηακ απυ δείβια ηδξ θζάθδξ Α ηδξ ηνίηδξ εαδμιάδαξ (ακηίβναθμ b). Σα πνςιαημβναθήιαηα μκμιάγμκηαζ ιε αάζδ ημ αζμακηζδναζηήνα απυ ημκ μπμίμ πνμένπεηαζ ημ δείβια, ημ πνμκζηυ ζδιείμ ζοθθμβήξ, ημ ακηίβναθμ (a ή b) ηαζ ημκ ανζειυ ηδξ ηαηά ζεζνά έκεζδξ (π.π. L10_T7_aInj2). Σμ πνυεεια ref πνμζηίεεηαζ ζημ υκμια ηςκ πνςιαημβναθδιάηςκ πμο αθμνμφκ ζε δείβιαηα πμο ηαηά ηδ ζοθθμβή ημοξ μζ ζοκεήηεξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ήηακ μζ ανπζηέξ (αέθηζζηεξ). Οζ ιεηααμθίηεξ πμο πενζείπακ αιζκμιάδεξ ηαζ, απυ ημοξ μπμίμοξ ιυκμ έκα πανάβςβμ παναηδνήεδηε ήηακ μζ πνμθίκδ, μοναηίθδ, GABA, θοζίκδ, ηοζηεΐκδ, ιεεζμκίκδ, ηνοπημθάκδ ηαζ α-αθακίκδ. Σέθμξ, α) μζ ιζηνυηενεξ ημνοθέξ απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ πμο πενζέπμοκ ηεημκμιάδεξ, α) μζ ημνοθέξ πμο ακηζζημζπμφκ ζε άβκςζημοξ ιεηααμθίηεξ μζ μπμίμζ δζαεέημοκ αιζκμιάδα, β) μζ ημνοθέξ πμο i) παναηηδνίγμκηαζ ςξ ηαηάθμζπα ηδξ παναβχβζζδξ ή ii) ειθακίγμοκ ημνοθέξ πμο ζοκεπίγμκηαζ βζα πμθφ (ιεβάθμ carry over) ή iii) δεκ ιεηνμφκηαζ ιε ζηαεενυ ηνυπμ ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ή ηςκ εκέζεςκ ημο ίδζμο δείβιαημξ ή iv) ειθακίγμοκ ιεβάθδ δζαηφιακζδ ιεηαλφ ηςκ εκέζεςκ, αθαζνμφκηαζ απυ ηα ηεθζηά δεδμιέκα. Δπζπθέμκ, ηα πνυηοπα ηςκ L9_Σ1_b, L12_Σ4_ainj1, L9_Σ3_b, L9_Σ2_bInj1, L11_Σ6_aInj5, L11_Σ6_aInj7_ref, L11_Σ6_b_ref, L12_Σ5_b αθαζνέεδηακ απυ ηδκ ακάθοζδ, ηαεχξ αφλακακ ζδιακηζηά ηδ απυηθζζδ ιεηαλφ ηςκ εκέζεςκ ζηα ακηίζημζπα δείβιαηα. Μεηά ηδκ ηακμκζημπμίδζδ ηαζ ημ θζθηνάνζζια, δ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ πνμπχνδζε ιε 120 πνυηοπα απυ 85 (54 βκςζημί) ιεηααμθίηεξ.

89 79 Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Ζ ακάθοζδ ζημκ πνςιαημβνάθμ αενίςκ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ έβζκε ιε ημκ ηνυπμ ηςκ πνμδβμφιεκςκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ. Ζ ακαβκχνζζδ ηςκ ημνοθχκ ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ απέδςζε 66 ημνοθέξ παναηηδνζζηζηχκ ζυκηςκ πμο ακηζζημζπμφκ ζε ιεηααμθίηεξ βκςζηήξ πδιζηήξ ηαηδβμνίαξ. Σμ πνςιαημβνάθδια πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα κα πνμηφρμοκ ηα αάνδ βζα ηδ ζοβηεκηνςηζηή πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηαηδβμνίαξ 3, ήηακ απυ δείβια ηδξ θζάθδξ Α ηδξ ηνίηδξ εαδμιάδαξ (ακηίβναθμ b). Σα πνςιαημβναθήιαηα μκμιάγμκηαζ ιε αάζδ ηδ θζάθδ απυ ηδκ μπμία πνμένπεηαζ ημ δείβια, ηδκ εαδμιάδα ζοθθμβήξ, ημ ακηίβναθμ (a ή b) ηαζ ημκ ανζειυ ηδξ ηαηά ζεζνά έκεζδξ (π.π. C_week1_aInj2). Οζ ιεηααμθίηεξ πμο πενζείπακ αιζκμιάδεξ ηαζ, απυ ημοξ μπμίμοξ ιυκμ έκα πανάβςβμ παναηδνήεδηε ήηακ μζ α-αθακίκδ, πνμθίκδ, μοναηίθδ, ζενίκδ, μιμζενίκδ, GABA, ιεεζμκίκδ, αζπαναβίκδ ηαζ αζπανηζηυ μλφ. Σέθμξ, α) μζ ιζηνυηενεξ ημνοθέξ απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ πμο πενζέπμοκ ηεημκμιάδεξ, α) μζ ημνοθέξ πμο ακηζζημζπμφκ ζε άβκςζημοξ ιεηααμθίηεξ μζ μπμίμζ δζαεέημοκ αιζκμιάδα, β) μζ ημνοθέξ πμο i) παναηηδνίγμκηαζ ςξ ηαηάθμζπα ηδξ παναβχβζζδξ ή ii) ειθακίγμοκ ημνοθέξ πμο ζοκεπίγμκηαζ βζα πμθφ (ιεβάθμ carry over) ή iii) δεκ ιεηνμφκηαζ ιε ζηαεενυ ηνυπμ ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ή ηςκ εκέζεςκ ημο ίδζμο δείβιαημξ ή iv) ειθακίγμοκ ιεβάθδ δζαηφιακζδ ιεηαλφ ηςκ εκέζεςκ, αθαζνμφκηαζ απυ ηα ηεθζηά δεδμιέκα. Μεηά ηδκ ηακμκζημπμίδζδ ηαζ ημ θζθηνάνζζια, δ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ πνμπχνδζε ιε 105 πνυηοπα απυ 54 (45 βκςζημί) ιεηααμθίηεξ.

90 80 Πνιππαξακεηξηθή ζηαηηζηηθή αλάιπζε Καηά ηδ δζελαβςβή ηςκ ηνζχκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ, ιεηνήεδηακ δζαηυζζεξ ημνοθέξ πμο ακηζζημζπμφκ ζε ιεηααμθίηεξ. Οζ ηαοημπμζδιέκεξ ημνοθέξ ήηακ 88 εκχ μζ άβκςζηεξ 112. Απυ ηζξ ηαοημπμζδιέκεξ ημνοθέξ 34 ακηζζημζπμφκ ζηδκ ηαηδβμνία 1, 9 ζηδκ ηαηδβμνία 2 ηαζ 45 ζηδκ ηαηδβμνία 3. Όθμζ μζ αθβυνζειμζ πμθοπαναιεηνζηήξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ααζίζηδηακ ζε πνμηοπμπμζδιέκεξ ζπεηζηέξ επζθάκεζεξ ημνοθχκ (PAs). Πμθθέξ απυ ηζξ ακαθφζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε πνμηοπμπμζδιέκα ιεηααμθμιζηά δεδμιέκα (standardized data) πμο πνμηφπνμοκ απυ ημκ ηφπμ: υπμο δ πνμηοπμπμζδιέκδ ηζιή ημο ιεηααμθίηδ Μ ζημ πνςιαημβνάθδια j, δ ανπζηή ηζιή ημο ιεηααμθίηδ Μ ζημ πνςιαημβνάθδια j, δ ιέζδ ηζιή ημο ιεηααμθίηδ Μ απυ υθα ηα πνςιαημβναθήιαηα ηαζ ηδξ ηζιήξ ημο ιεηααμθίηδ Μ απυ υθα ηα πνςιαημβναθήιαηα. δ ηοπζηή απυηθζζδ Δθανιυζηδηακ αθβυνζειμζ ζενανπζηήξ ζοζηαδμπμίδζδξ (HCl) ιε πνήζδ Δοηθείδεζαξ απυζηαζδξ, ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PCA) ηαζ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM). Υνδζζιμπμζήεδηε ημ θμβζζιζηυ ΣΜ4 ΜΔV βζα ηδκ εθανιμβή αοηχκ ηςκ αθβμνίειςκ. Οζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ αολάκεηαζ ή ιεζχκεηαζ ζδιακηζηά ζε έκα δείβια ζοβηνζηζηά ιε έκα άθθμ εα ακαθένμκηαζ ζα εεηζηά ζδιακηζημί ηαζ ανκδηζηά ζδιακηζημί, ακηίζημζπα. Όθεξ μζ ακαθφζεζξ SAM πναβιαημπμζήεδηακ πνδζζιμπμζχκηαξ έκα υνζμ ζδιακηζηυηδηαξ (δ), ηδ ιζηνυηενδ ηζιή πμο ακηζζημζπμφζε ζε ιδδεκζηυ ιέζμ νοειυ παναβςβήξ ζθάθιαημξ (FD). Σα απμηεθέζιαηα ηδξ SAM ειθακίγμκηαζ ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ υπμο μζ ζδιακηζηά ιεηαααθθυιεκμζ ιεηααμθίηεξ απεζημκίγμκηαζ ιε δζάθμνμοξ πνςιαηζζιμφξ.

91 81 Αλαθαηαζθεπή κεηαβνιηθνύ δηθηύνπ Γζα θυβμοξ πμο ακαθένεδηακ ζε πνμδβμφιεκμ ηεθάθαζμ ηαζ αθμνμφκ ζηδκ ηαηακυδζδ, ηεθαθαζμπμίδζδ ηδξ βκχζδξ ηαζ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πμο πνμέηορακ απυ ηζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ, ακαηαηαζηεοάζηδηε ιένμξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ημο πμκηζημφ (Mus musculus). Ο μνβακζζιυξ αοηυξ επζθέπεδηε βζαηί βζα ηα ηφηηανα BHK δεκ οπάνπεζ αθθδθμφπζζδ ημο βμκζδζχιαημξ, ιέπνζ ζηζβιήξ, ηαζ ηα ηφηηανα πνμένπμκηαζ απυ ημ πμζνίδζμ Mesocricetus auratus (Syrian hamster), μνβακζζιυ ημκηζκυ ελεθζηηζηά ζημκ πμκηζηυ, υπμο έπεζ πναβιαημπμζδεεί μθμηθδνςιέκδ δμοθεζά. ημκ πμκηζηυ, ακηίεεηα, οπάνπεζ πθήνδξ αθθδθμφπζζδ ημο βμκζδζχιαημξ ημο (Waterston et al, 2002) ηαζ ηαοημπμίδζδ ηςκ εκγφιςκ πμο νοειίγμοκ ηζξ αζμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ, ηαεχξ απμηεθεί έκακ μνβακζζιυ ιμκηέθμ πμο πνμζεθηφεζ ημ εκδζαθένμκ ηδξ επζζηδιμκζηήξ ημζκυηδηαξ. Με αάζδ ημκ πμκηζηυ, πναβιαημπμζήεδηε, πνυζθαηα, πνμζπάεεζα αθθδθμφπζζδξ ημο βμκζδζχιαημξ ημο πμζνζδίμο (Xu et al, 2011). Ζ πνμζπάεεζα πμο έβζκε αθμνά ζε ακηζδνάζεζξ ημο ηφνζμο ιεηααμθζζιμφ ημο άκεναηα, ηαεχξ αοηυ είκαζ ημ ζδιακηζηυηενμ ηιήια ημο ιεηααμθζζιμφ πμο ηαεμνίγεζ ηδ νμπή ημο οπυθμζπμο ιένμοξ. Δίκαζ επανηέξ ηιήια βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηςκ ιεηααάζεςκ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ημο αζμθμβζημφ ζοζηήιαημξ. Υνδζζιμπμζήεδηε πθδνμθμνία απυ ηζξ αζαθζμεήηεξ KEGG (Kanehisa et al, 2012), MetaCyc (Caspi et al, 2012), EXPASY (Artimo et al, 2012), cho.org (Sigurdsson et al, 2010), αθθά ηαζ αζαθζμβναθζηέξ ακαθμνέξ.

92 82

93 Γ. Απνηειέζκαηα 83

94 84 Ακαηαηαζηεοή ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηοηηάνςκ ΒΖΚ Ζ μιμζυηδηα ηςκ βμκζδζςιάηςκ ημο πμκηζημφ ηαζ ημο πμζνζδίμο επζηνέπεζ ηδ πνήζδ ημο πανημβναθδιέκμο βμκζδζχιαημξ ημο πνχημο βζα ηδκ ελαβςβή αζθαθχκ ζοιπεναζιάηςκ ζε ηφηηανα πμο πνμένπμκηαζ απυ πμζνίδζα, υπςξ ηα BHK ηαζ ηα. Οζ δφμ αοηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ πνδζζιμπμζμφκηαζ εονέςξ ζηδ θανιαημαζμιδπακία. Έηζζ, έπεζ ήδδ βίκεζ μθμηθδνςιέκδ απυπεζνα ακαηαηαζηεοήξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ημο πμκηζημφ, ααζζγυιεκδ ζηδκ μθζηή αθθδθμφπζζδ ημο βμκζδζχιαηυξ ημο ηαζ ζε ακενχπζκα δεδμιέκα (Sigurdsson et al, 2010), αθθά ηαζ ζηνμθή ζημ βμκζδίςια ημο πμζνζδίμο ηαζ ηςκ ηοηηάνςκ (Hammond et al, 2012; Lewis et al, 2013; Xu et al, 2011). ηα ηφηηανα ΒΖΚ δεκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ηάηζ ηέημζμ, αθθά μζ παναπάκς ενβαζίεξ δίκμοκ ηδ δοκαηυηδηα αζθαθχκ ζοβηνίζεςκ ηαζ παναδμπχκ βζα ηδκ ακαηαηαζηεοή ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ. Έηζζ, ηαηά ηδκ πνμζπάεεζα ακαηαηαζηεοήξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ, δυεδηε δ δοκαηυηδηα ηαηακυδζδξ ημο ηεκηνζημφ ιεηααμθζζιμφ ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ. Ζ ηαηακυδζδ αοηή ααζίζηδηε ζηδκ παναδμπή υηζ ηα ηφηηανα αημθμοεμφκ ιεηααμθζζιυ αφλδζδξ (θαζκυιεκμ Warburg), υπςξ ηάεε αεάκαηδ ηοηηανζηή ζεζνά. Σμ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ πμο πνμέηορε, ζοκέααθε ζηδκ μπηζημπμίδζδ ημο ιεηααμθζζιμφ ηαζ, ηαη επέηηαζδ, ζηδκ εοημθυηενδ ηαζ αζθαθέζηενδ ελαβςβή ζοιπεναζιάηςκ απυ ηα ιεηααμθμιζηά απμηεθέζιαηα. Σμ ιεηααμθζηυ δίηηομ πμο πνμέηορε πενζθαιαάκεζ 102 αζμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ (Πίκαηαξ ΠΒ - Πανάνηδια). Δίκαζ δ πνχηδ θμνά πμο βίκεηαζ δ ακαηαηαζηεοή ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο ηςκ ηοηηάνςκ BHK, ιε βκχιμκα ημκ ηανηζκζηυ ιεηααμθζζιυ. Ζ υθδ δζαδζηαζία ακαηαηαζηεοήξ ημο δζηηφμο αμδεάεζ, εηηυξ ηςκ άθθςκ, ηαζ ενεοκδηζηά, αθμφ βίκεηαζ ηηήια ημο ενεοκδηή δ δμιή ζηδκ μπμία ζηδνίγεηαζ δ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηαζ ακηζθαιαάκεηαζ ηδ δοκαιζηή ημο οπάνπμκημξ ιεηααμθζημφ ζοζηήιαημξ. Ζ δζαδζηαζία λεηίκδζε απυ ηα ηφνζα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα, υπςξ δ βθοηυθοζδ, μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ, μ ηφηθμξ ηδξ μονίαξ, δ βθμοηαιζκυθοζδ ηαζ πνμπχνδζε

95 85 βφνς απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ πμο ιαξ αθμνμφκ ηαζ ιπμνμφιε κα ακζπκεφζμοιε, ηαοημπμζήζμοιε ηαζ κα πμζμηζημπμζήζμοιε, πμθθμφξ απυ αοημφξ. Ζ ηαθθζένβεζα ηςκ ηοηηάνςκ BHK βίκεηαζ ζε πδιζηά πνμηαεμνζζιέκμ ενεπηζηυ ιέζμ, ημ μπμίμ έπεζ ανζζημπμζδεεί ιε ηδκ ειπεζνία ηαζ ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο. Υαναηηδνζζηζημί ιεηααμθίηεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 1. Μεηαβνιίηεο πνπ πεξηέρνληαη ζην ζξεπηηθό κέζν alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, glycine, myoinositol, thymidine, glucose, mannose, pyruvate, ethanolamine, ethanolamine-p Πίκαηαξ 1: Xαναηηδνζζηζημί ιεηααμθίηεξ ημο πδιζηά πνμηαεμνζζιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ ηοηηάνςκ ΒΖΚ απυ ηδ Bayer Όπςξ θαίκεηαζ ζημκ Πίκαηα 1, ζημ ενεπηζηυ ιέζμ πενζθαιαάκμκηαζ υθα ηα αιζκμλέα, αθμφ μ ηφνζμξ ζηυπμξ είκαζ δ πνςηεσκμζφκεεζδ. Γκςνίγμοιε υηζ ζηα εδθαζηζηά, πμθθά απυ ηα αιζκμλέα δεκ πανάβμκηαζ ηαζ ημ ηφηηανμ είκαζ οπμπνεςιέκμ κα ηα πνμζθαιαάκεζ απυ ημ ελςηοηηανζηυ ημο πενζαάθθμκ. ημκ Πίκαηα 2 θαίκμκηαζ πμζα αιζκμλέα είκαζ απαναίηδηα ηαζ πμζα υπζ, ιζαξ ηαζ ιπμνμφκ κα παναπεμφκ. Πενζθαιαάκεηαζ, επίζδξ, ιακκυγδ, ιμκμζαηπανίηδξ ζδιακηζηυξ βζα ηδ βθοημζοθίςζδ, αθθά ηαζ αζεακμθαιίκδ ηαζ ιομσκμζζηυθδ, ιεηααμθίηεξ πμο εοκμμφκ ηδκ παναβςβή ιειανακχκ, αθμφ είκαζ πνυδνμια ιυνζα θςζθμθζπζδίςκ.

96 86 Απαξαίηεηα histidine isoleucine leucine lysine methionine Ακηλνμέα Με-Απαξαίηεηα alanine arginine aspartate cysteine glutamate Πίκαηαξ 2: Απαναίηδηα ηαζ ιδαπαναίηδηα αιζκμλέα ζε ηφηηανα εδθαζηζηχκ valine glutamine # threonine tryptophan phelylalanine glycine proline serine tyrosine # asparagine # αιζκμλέα πμο εεςνμφκηαζ απαναίηδηα ζε ζοβηεηνζιέκεξ ζοκεήηεξ, αθμφ δ πμζυηδηα πμο πανάβεηαζ δεκ είκαζ ανηεηή ηo πήια Γ.1 θαίκεηαζ ημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ ηαζ ζημκ εηηεηαιέκμ Πίκαηα ΠΒ δ ζεζνά ηςκ ακηζδνάζεςκ πμο πενζθήθεδηακ ζε αοηυ, υπςξ ακαθένμκηαζ ανζειδιέκεξ ζημκ πίκαηα. ημ πήια Γ.2 πανμοζζάγεηαζ αηνζαχξ ημ ίδζμ ιεηααμθζηυ δίηηομ, αθθά ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ δζαηνίκμκηαζ μζ ιεηααμθίηεξ μζ μπμίμζ ιπμνμφκ κα ακαβκςνζζημφκ ζε έκα GC-MS πνςιαημβνάθδια, ηαεχξ ηαζ ιεηααμθίηεξ πμο πενζέπμκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ.

97 πήια Γ. 1 Ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηοηηάνςκ ΒΖΚ. Με βαθάγζα αέθδ θαίκμκηαζ μζ αζμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ πμο ηαηαθφμκηαζ απυ έκγοια πμο δεκ έπμοκ ακαβκςνζζηεί ζηζξ ακαθμνέξ πμο πνδζζιμπμζήζαιε, αθθά μζ ακηζδνάζεζξ εκδέπεηαζ κα είκαζ εκενβέξ. 87

98 88 πήια Γ. 2 Ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηοηηάνςκ ΒΖΚ ιε ιεηνμφιεκμοξ ιεηααμθίηεξ. ημ δίηηομ δζαηνίκμκηαζ ηοηθςιέκμζ μζ ιεηααμθίηεξ πμο ηαοημπμζμφκηαζ ζε έκα πνςιαημβνάθδια GC-MS. Σα ηυηηζκα αέθδ οπμδεζηκφμοκ ημοξ ιεηααμθίηεξ πμο ειπενζέπμκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ.

99 89 Πείναια ηοηηανζηήξ δθζηίαξ Έπεζ δεζπηεί υηζ δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ηαζ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα είκαζ ζε εέζδ κα πανέπμοκ ιζα εονεία άπμρδ ηδξ ιεηααμθζηήξ ηαηάζηαζδξ ημο ηοηηάνμο, δίκμκηαξ πθδνμθμνίεξ βζα δεηάδεξ ή εηαημκηάδεξ ιεηααμθίηεξ ζε πμθθαπθά ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα, πςνίξ κα εζηζάγμοκ ζε εθάπζζημοξ ηυιαμοξ ημο ιεηααμθζημφ δζηηφμο (Chrysanthopoulos et al, 2010; Kanani et al, 2008). ηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ, δ ιεηααμθμιζηή έπεζ πνδζζιμπμζδεεί πνυζθαηα βζα ημ παναηηδνζζιυ ηοηηάνςκ, ηονίςξ ζε θζάθεξ ακαηίκδζδξ ηαζ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ δζαθείπμκημξ ηαζ διζδζαθείπμκημξ ένβμο αζμακηζδναζηήνεξ (Quek et al, 2010). Ο παναηηδνζζιυξ αθμνμφζε ανπζηά ζημ ιέζμ ηαθθζένβεζαξ (Bradley et al, 2010; Chong et al, 2009; Chong et al, 2010; Chong et al, 2011) ηαζ, πνυζθαηα, ημοξ ιεηααμθίηεξ εκδμηοηηανζηά (Dietmair et al, 2012; Selvarasu et al, 2012). Σμ ενβαζηήνζυ ιαξ (Chrysanthopoulos et al, 2010) πανμοζίαζε ημκ πνχημ παναηηδνζζιυ ηοηηάνςκ BHK ιε ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ. Ζ ενβαζία αοηή πανείπε ζημζπεία υηζ δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ιε GC-MS είκαζ ανηεηά πζμ εοαίζεδηδ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ, ζοβηνζηζηά ιε ημοξ παναδμζζαημφξ ηνυπμοξ παναημθμφεδζδξ. Ζ ενβαζία πμο πανμοζζάγεηαζ ζημ ηνέπμκ ηεθάθαζμ (Vernardis et al, 2013) ζηδνίγεηαζ ζηα πνμδβμφιεκα απμηεθέζιαηα ηαζ βίκεηαζ πνήζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ πνμηοπμπμίδζδξ βζα ημ παναηηδνζζιυ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ ηδξ ηοηηανζηήξ θοζζμθμβίαξ ζε αάεμξ πνυκμο ηαζ αθμνά ζε ηοηηανμηαθζένβεζεξ BHK ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ, ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ. Σα ηφηηανα πνμένπμκηαζ απυ ζοβηεηνζιέκδ αζαθζμεήηδ ηοηηάνςκ. Γείβιαηα ζοθθέπεδηακ απυ ηδκ ανπζηή, ηδ ιέζδ ηαζ ηδκ ηεθζηή θάζδ ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ. Σα ιεηααμθμιζηά απμηεθέζιαηα έδςζακ πνήζζια ηεπκμθμβζηά ηαζ αζμθμβζηά ζοιπενάζιαηα ηαζ επέηηεζκακ ηδ βκχζδ ιαξ πάκς ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ εδθαζηζηχκ.

100 90 ηαεενή αζμθμβζηή δζαδζηαζία Σα πνμκζηά πνυηοπα ηδξ αζςζζιυηδηαξ ηαζ ποηκυηδηαξ ηςκ ηοηηάνςκ, ημο νοειμφ αφλδζδξ, ημο εζδζημφ νοειμφ ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ηαζ ημο εζδζημφ νοειμφ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ δείπκμκηαζ ζημ πήια Γ.3 βζα υθμοξ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ημο πεζνάιαημξ. Ζ ποηκυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ ζε υθμοξ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ήηακ εθεβπυιεκδ ηαζ ζηαεενή ζηζξ ηζιέξ ζηυπμοξ πμο ηίεεκηαζ, ιε ιμκαδζηή ελαίνεζδ ημ αζμακηζδναζηήνα L7 ζηδκ ηεθζηή θάζδ, υπμο δ ηζιή επδνεάζηδηε απυ ηδ δεζβιαημθδρία βζα ηδκ εηηίκδζδ ημο αζμακηζδναζηήνα M5b. Ζ αζςζζιυηδηα ήηακ πάκηα ιεβαθφηενδ ημο 95%, εκχ μ νοειυξ αφλδζδξ πανέιεζκε ζπεηζηά ζηαεενυξ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ ζε υθμοξ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ. Παναηδνήεδηε ιζα ιζηνή ηάζδ αφλδζδξ βζα ημοξ εζδζημφξ νοειμφξ ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ηαζ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ υζμ αολακυηακ δ ηοηηανζηή δθζηία. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ υηζ μ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήναξ M5b, μ μπμίμξ εηηίκδζε ηαηά ηδκ ηεθζηή θάζδ ημο L7 (πήια Γ.1), έθηαζε νοειυ αφλδζδξ ηαζ παναηηδνζζηζηά θοζζμθμβίαξ πανυιμζα ιε αοηά ηςκ M3 ηαζ M4 ζηδκ ηεθζηή θάζδ. Γεκζηυηενα, ηα δεδμιέκα ημο ζπήιαημξ Γ.3 δείπκμοκ ζηαεενυηδηα ηδξ ηνάπεγαξ ηοηηάνςκ ηαζ ηδξ αζμθμβζηήξ δζαδζηαζίαξ ηαζ ζηα δφμ πεζνάιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ. Δπζπθέμκ, οπήνλακ ιεηνήζεζξ ηδξ πμζυηδηαξ ημο παναβυιεκμο πνμσυκημξ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηςκ δζαδζηαζζχκ, ηαζ ζημοξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ αθθά ηαζ ζημοξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ. Δκχ παναηδνήεδηε ιζα ιζηνή ηαζ ακαιεκυιεκδ απυηθζζδ ζηζξ ιεηνήζεζξ, αοηή δεκ ελανηζυηακ μφηε απυ ημ πνμκζηυ ζδιείμ ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ μφηε απυ ημ ιέβεεμξ ημο αζμακηζδναζηήνα ηαζ, ζε ηάεε πενίπηςζδ, πθδνμφκηακ ηα ηνζηήνζα πμζυηδηαξ ημο πνμσυκημξ. Ζ παναβςβή ηδξ πνςηεΐκδξ πανέιεζκε ζπεηζηά ζηαεενή ζε υθδ ηδκ ηαθθζενβδηζηή δζαδζηαζία. Κάπμζα ιμνθμθμβζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ ηοηηάνςκ υπςξ ημ ιέβεεμξ ηαζ μ ααειυξ ζοζζςιάηςζδξ έδεζλακ απμηθίζεζξ ιεηνήζεςκ ιζηνυηενεξ ημο 15%, πνάβια πμο ημκίγεζ ηδ ζηαεενυηδηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ δζαπυηζζδξ.

101 ΑΡΧΙΚΘ ΜΕΘ ΣΕΛΙΚΘ A ΑΡΧΙΚΘ ΜΕΘ ΣΕΛΙΚΘ B 91 Ειδικόσ Ρυκμόσ Παραγωγισ Γαλακτικοφ Οξζοσ (pmol/κφτταρο-d) Ειδικόσ Ρυκμόσ Κατανάλωςθσ Γλυκόηθσ (pmol/κφτταρο-d) Πυκνότθτα Ηωντανών Κυττάρων (10 6 κφτταρα/ml) Ρυκμόσ αφξθςθσ (1/d) Βιωςιμότθτα Κυτταροκαλλιζργειασ (%) Κυτταρικι θλικία Κυτταρικι θλικία πήια Γ. 3 Γναθήιαηα πνςημβεκχκ ιεηνήζεςκ. Απυ ηα βναθήιαηα δε θαίκεηαζ κα οπάνπμοκ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ απμηθίζεζξ ζε ηαιία απυ ηζξ θάζεζξ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ.

102 92 Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ακαβκςνίγεζ ηδκ αθθαβή ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ Δθανιυζηδηε ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ βζα κα εκζζποεμφκ ηαζ κα αλζμθμβδεμφκ απμδμηζηυηενα μζ πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ πμο θαίκμκηαζ ζημ πήια Γ.3. Δζδζηή έιθαζδ δυεδηε ζημ ακ δ πζμ εηηεηαιέκδ εζηυκα πμο δίκεζ δ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ βζα ημ ιεηααμθζζιυ εα ιπμνμφζε κα απμηαθφρεζ ιζηνέξ ιεηααμθέξ ζηδ θοζζμθμβία ηαηά ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο, μζ μπμίεξ εκδέπεηαζ κα ιδκ απμηαθφπημκηαζ απυ ηδ ιέηνδζδ ηςκ ηφνζςκ ιεηααθδηχκ. ημ πείναια 1, ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ηδξ ανπζηήξ ηαζ ηδξ ιέζδξ θάζδξ πνμέηορακ απυ δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ απυ ιεηααμθίηεξ ηαζ ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ, εκχ δείβιαηα ηδξ ηεθζηήξ θάζδξ ζοθθέπεδηακ ιυκμ απυ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ. Ζ ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ Δοηθείδεζαξ απυζηαζδξ έδεζλε ζαθή δζαπςνζζιυ ηςκ πνμηφπςκ αάζεζ ηςκ ηνζχκ θάζεςκ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ (πήια Γ.4). Σμ ζενανπζηυ δέκηνμ ηαηδβμνζμπμίδζε ηα πνυηοπα ζε δφμ ηθάδμοξ: μ ανζζηενυξ ηθάδμξ δζαπςνίγεζ ηα πνυηοπα ηδξ ιέζδξ θάζδξ απυ αοηά ηςκ άθθςκ δφμ θάζεςκ, εκχ ζημ δελζυ ηθάδμ οπάνπεζ ιζα δζάηνζζδ ιεηαλφ ηςκ πνμηφπςκ ηδξ ανπζηήξ (ανζζηενυξ οπμηθάδμξ) ηαζ ηδξ ηεθζηήξ (δελζυξ οπμηθάδμξ) θάζδξ. Αοηυξ μ ζαθήξ δζαπςνζζιυξ ιεηαλφ ηςκ ηνζχκ θάζεςκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζε υθμοξ ημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ηαζ δ ιεβάθδ μιμζυηδηα ιεηαλφ ηςκ πνμηφπςκ ηδξ ανπζηήξ ηαζ ηδξ ηεθζηήξ θάζδξ, θαίκμκηαζ ηαζ ζημ βνάθδια ηδξ ακάθοζδξ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PCA). Απυ ημ εενιζηυ πίκαηα (heatmap), ιπμνεί κα αβεζ ημ ζοιπέναζια υηζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ πενζζζυηενςκ απυ ημοξ 62 πμθζημφξ ιεηααμθίηεξ ήηακ παιδθυηενεξ ζηδ ιέζδ θάζδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ άθθεξ δφμ θάζεζξ. Γζα κα ζοζπεηζζηεί δ ιείςζδ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ιε ιείςζδ ζηδκ ηοηηανζηή ιεηααμθζηή εκενβυηδηα, εα πνέπεζ κα θδθεεί οπ υρζκ ηαζ δ ζφζηαζδ ημο ενεπηζημφ ιέζμο ζηδκ ακάθοζδ. Δίκαζ εκδζαθένμκ υηζ, εκχ δ ορδθή ζοβηέκηνςζδ ηςκ πενζζζυηενςκ εκδμηοηηανζηχκ πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ ζηδκ ηεθζηή θάζδ είκαζ ζηαεενή ιε ηδκ αολδηζηή ηάζδ ηςκ εζδζηχκ νοειχκ ηαηακάθςζδξ βθοηυγδξ ηαζ παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ απυ ηδκ ανπζηή ζηδκ ηεθζηή θάζδ, δ δζαθμνά ζηδ θοζζμθμβία

103 93 ιεηαλφ ηδξ ιέζδξ ηαζ ηςκ άθθςκ δφμ θάζεςκ παναηδνείηαζ ιυκμ ζηα ιεηααμθζηά πνυηοπα. Αοηυ ηαηαδεζηκφεζ ηδκ ζηακυηδηα ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ κα πανέπεζ ιζα εονφηενδ ηαζ ηαθφηενδ εζηυκα ημο ιεηααμθζημφ θαζκμηφπμο, εκζζπφμκηαξ ηζξ παναηδνήζεζξ απυ ηζξ ιεηνήζεζξ ηςκ ηφνζςκ ιεηααθδηχκ. Ζ δεζβιαημθδρία ζημ πείναια 2 ήηακ πανυιμζα ιε αοηή ημο πεζνάιαημξ 1, ιε ελαζνέζεζξ υηζ ζημ πείναια 2 ζοθθέπηδηακ δφμ δείβιαηα απυ δφμ δζαθμνεηζηά πνμκζηά ζδιεία ηδξ ιέζδξ θάζδ ηαζ ζοθθέπηδηακ δείβιαηα ηαζ απυ ημοξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνεξ ζηδκ ηεθζηή θάζδ. ηδκ ηεθζηή θάζδ, μ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήναξ (M5b) δεκ είκαζ μ ίδζμξ ιε αοηυκ ηςκ δφμ πνμδβμφιεκςκ θάζεςκ (M5a). Όιμζα ιε ημ πείναια 1, ημ ζενανπζηυ δέκηνμ είπε δφμ ηφνζμοξ ηθάδμοξ, ημκ ανζζηενυ, πμο πενζθάιαακε πνυηοπα ιε παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ ιεηααμθζηχκ ζοβηνζηζηά ιε ημ δελζυ ηθάδμ, εκχ μ ηεθεοηαίμξ πενζθάιαακε δφμ οπμηθάδμοξ. Ακ δμφιε ηα πνυηοπα ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ ιειμκςιέκα, παναηδνμφιε ηδκ ίδζα ιεηααμθζηή ιεηάααζδ ιεηαλφ ηςκ θάζεςκ, πμο είδαιε ηαζ ζημ πείναια 1. Δπζπθέμκ, δ ζοζηαδμπμίδζδ ηςκ πνμηφπςκ ημο αζμακηζδναζηήνα L7 απμηάθορακ ιζα ηαπφηενδ ιεηάααζδ ιεηαλφ θάζεςκ ζηδ ζοβηεηνζιέκδ ηοηηανμηαθθζένβεζα (πήια Γ.5). Σα πνυηοπα ημο πνμκζημφ ζδιείμο Σ7 (ανπζηή θάζδ) ακηζζημζπμφκ ζημ ιεηααμθζζιυ ηδξ ιέζδξ θάζδξ ηαζ αοηά ημο πνμκζημφ ζδιείμο T12 (ιέζδ θάζδ) είκαζ πανυιμζα ιε αοηά πμο έπμοκ ιεηααμθζζιυ ηεθζηήξ θάζδξ. οκμπηζηά, δ ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ ήηακ ζηακή κα ακζπκεφζεζ ιεηααάζεζξ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηαθθζένβεζαξ ηαζ έδεζλε υηζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ εκδμηοηηανζηχκ πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ ζηδ ιέζδ θάζδ είκαζ παιδθυηενεξ απυ αοηέξ ηδξ ανπζηήξ ηαζ ηεθζηήξ θάζδξ. Ζ παναηήνδζδ ίδζςκ ιεηααάζεςκ θοζζμθμβίαξ ζε δφμ ακελάνηδηα πεζνάιαηα πμο πενζείπακ θζαθίδζα πνμενπυιεκα απυ ηδκ ίδζα ηνάπεγα ηοηηάνςκ, οπμβνάιιζζε ηδ ζηαεενυηδηα ηδξ ηεθεοηαίαξ ηαζ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Δπζπνυζεεηα, δ ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ πανέπεζ ιεηααμθζηή «οπμβναθή» βζα ηζξ ζοβηεηνζιέκεξ ιεηααμθζηέξ ιεηααάζεζξ, πνάβια ημ μπμίμ δεκ ήηακ δοκαηυ κα βίκεζ απυ ηζξ ιεηνήζεζξ ηςκ ηφνζςκ ιεηααθδηχκ. Ζ οπμβναθή αοηή επέηνερε ηδκ ακαβκχνζζδ ηδξ πναβιαηζηήξ θάζδξ ζηδκ μπμία ανζζηυηακ δ ηοηηανμηαθθζένβεζα L7. Σα απμηεθέζιαηα απμδεζηκφμοκ ηδ πνδζζιυηδηα ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ζακ εοαίζεδημ ενβαθείμ παναημθμφεδζδξ ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ.

104 πήια Γ. 4 Πείναια 1 HCL, PCA. HCl (A) ηαζ PCA (B) ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ημο πεζνάιαημξ 1. Ζ ανπζηή, ιέζδ ηαζ ηεθζηή θάζδ δείπκμκηαζ ιε ηίηνζκμ ιςα ηαζ βαθάγζμ πνχια, ακηίζημζπα. 94

105 95 Μζςη φάςη Αρχική φάςη Τελική φάςη πήια Γ. 5 Πείναια 2 HCL, PCA. HCl (A) ηαζ PCA (B) ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ημο πεζνάιαημξ 2. Ζ ανπζηή, ιέζδ ηαζ ηεθζηή θάζδ δείπκμκηαζ ιε ηίηνζκμ ιςα ηαζ βαθάγζμ πνχια, ακηίζημζπα.

106 96 Μεηααμθζηέξ αθθαβέξ ακελάνηδηεξ ημο ιεβέεμοξ ημο αζμακηζδναζηήνα. Ζ ιμκηεθμπμίδζδ ζε ιζηνυηενμ ιέβεεμξ είκαζ ααζζηυ παναηηδνζζηζηυ ηδξ ελέθζλδξ ιζα δζαδζηαζίαξ ηαζ ζηδνίγεηαζ, ηονίςξ, ζε ζοβηνίζεζξ δεδμιέκςκ ηφνζςκ ιεηααθδηχκ. Οζ πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ πμο θαίκμκηαζ ζημ πήια Γ.3, δείπκμοκ μιμζυηδηα ιεηαλφ ηςκ ενβαζηδνζαηήξ ηαζ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνςκ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ, ιε παναηδνμφιεκδ ιεβαθφηενδ ζπεηζηά απυηθζζδ ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ. Με ηδ πνήζδ ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ηαζ ηδξ ηαθφηενδξ εζηυκαξ ηδξ θοζζμθμβίαξ πμο ιπμνεί κα δχζεζ, ιπμνμφιε κα πζζημπμζήζμοιε ηδ ζηαεενυηδηα ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεβεεχκ ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ. Πναβιαηζηά, δ ζενανπζηή μιαδμπμίδζδ ηαζ δ ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ, ηαζ ζηα δφμ πεζνάιαηα, έδεζλακ υηζ, βζα μπμζαδήπμηε δζαδζηαζία ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα ζοβηέκηνςζδξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ θάζεςκ, ζοζηαδμπμζμφκηαζ ακά θάζδ. διεζχκμοιε υηζ ηα πνυηοπα ηςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ7 ηαζ Σ12 ημο αζμακηζδναζηήνα L7 εεςνμφκηαζ ιέζδξ ηαζ ηεθζηήξ θάζδξ, ακηίζημζπα. Έηζζ, δ ιεηααμθζηή πνμηοπμπμίδζδ πανείπε μνεμβχκζα (ζηζξ πνςημβεκείξ ιεηνήζεζξ) ζημζπεία υηζ μζ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ πμο ελεηάζηδηακ ζηδκ πανμφζα ενβαζία, αημθμφεδζακ ηζξ ίδζεξ αθθαβέξ ζηδ θοζζμθμβία ημοξ ηαηά ηδκ αφλδζδ ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ηαζ ζε αοηυ δεκ έπαζλε ζδιακηζηυ νυθμ ημ ιέβεεμξ ημο αζμακηζδναζηήνα. Ο αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήναξ πμο εηηίκδζε ηαηά ηδκ ηεθζηή θάζδ θηάκεζ ζηδκ ακαιεκυιεκδ ηαηάζηαζδ θοζζμθμβίαξ Δπεζδή μ αζμακηζδναζηήναξ M5b εηηίκδζε ιε ηφηηανα πμο πάνεδηακ απυ ημκ L7 ηαηά ηδκ ηεθζηή θάζδ, ήηακ εκδζαθένμκ κα δμφιε ακ έθηαζε ζηδκ ηαηάζηαζδ θοζζμθμβίαξ πμο πενζιέκαιε, δδθαδή αοηή ηδξ ηεθζηήξ θάζδξ. Ζ ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ ηαζ δ ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ έδεζλακ υηζ ηα ιεηααμθζηά

107 97 πνυηοπα ηςκ L7 ηαζ M5b ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ17 είκαζ πανυιμζα ηαζ αημθμοεμφκ ηδκ «οπμβναθή» ηδξ ηεθζηήξ θάζδξ. Αοηυ ημ απμηέθεζια δείπκεζ υηζ μ πνυκμξ πμο πέναζακ ηα ηφηηανα εκηυξ ημο αζμακηζδναζηήνα L7 πνζκ κα εκεεμφκ ζημκ M5b δεκ επδνεάγεζ ζε ιεβάθμ ααειυ ηδ θοζζμθμβία ημοξ. Αοηυ ημ απμηέθεζια εκζζπφεζ ηα πνμδβμφιεκα πμο έδεζπκακ ιζηνυ νυθμ ημο ιεβέεμοξ ημο αζμακηζδναζηήνα ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Μεηααμθζηέξ ιεηααάζεζξ απυ θάζδ ζε θάζδ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ Ζ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM) ιεηαλφ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ηςκ δζαθμνεηζηχκ θάζεςκ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζηα πεζνάιαηα 1 ηαζ 2, πνδζζιμπμζήεδηε βζα κα ανεεμφκ μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεηααθήεδηε ζδιακηζηά ηαηά ηδ ιεηάααζδ απυ ηδ ιζα θάζδ ζηδκ άθθδ. Σα πήιαηα Γ.6 ηαζ Γ.7 δείπκμοκ, ακηίζημζπα, ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεηάααζδξ απυ ηδκ ανπζηή ζηδ ιέζδ θάζδ ηαζ απυ ηδ ιέζδ ζηδκ ηεθζηή ηαζ βζα ηα δφμ πεζνάιαηα, πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ ημο πμκηζημφ. Σα πνυηοπα ηςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ7 ηαζ Σ12 ημο πεζνάιαημξ 2, έπμοκ εεςνδεεί ιέζδξ ηαζ ηεθζηήξ θάζδξ, ακηίζημζπα. Ζ ιεηάααζδ απυ ηδκ ανπζηή ζηδ ιέζδ θάζδ ζοιααίκεζ ιε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ εκδζαιέζςκ ημο ηφηθμο ημο ηζηνζημφ μλέμξ (TCA cycle), ηδξ βθοηυγδξ ή ιεηααμθζηχκ ηδξ βθοηυγδξ (gluconate) ηαζ πνυδνμιςκ ηςκ βθοηενμθζπζδίςκ (glycerol 3P ηαζ βθοηενυθδ) ηαζ θςζθμθζπζδίςκ (ιομσκμζζηυθδ). ηδ ιεηάααζδ απυ ηδ ιέζδ ζηδκ ηεθζηή θάζδ αθέπμοιε ηδκ ακηίεεηδ νμπή ημο ιεηααμθζζιμφ ζημοξ παναπάκς ιεηααμθίηεξ. Δπζπνυζεεηα, παναηδνήεδηε αφλδζδ ζε ηάπμζα ανςιαηζηά ηαζ ιδ αιζκμλέα αιζκμλέα (ααθίκδ ηαζ ζζμθεοηίκδ) ηαζ ζημκ ηφηθμ ηδξ μονίαξ (μνκζείκδ). Σμ βεβμκυξ υηζ ημ ενεπηζηυ ιέζμ πμο πνδζζιμπμζείηαζ είκαζ πθμφζζμ ζε ενεπηζηά ζοζηαηζηά, ηάκεζ δφζημθμ κα απακηδεεί ακ ηα ηφηηανα ζηδκ ηεθζηή θάζδ αολάκμοκ ηδ ζοβηέκηνςζδ ζε πμθθμφξ ιεηααμθίηεξ θυβς ηδξ αολδιέκδξ πνυζθδρδξ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ ή ακ βίκεηαζ ηαθφηενδ δζαπείνζζδ πνμξ ηδ ηαηεφεοκζδ ηδξ εκίζποζδξ ημο νοειμφ αφλδζδξ. Τπάνπεζ αηυια ημ εκδεπυιεκμ,

108 98 θυβς πνμπςνδιέκδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ, ηα ηφηηανα κα έπμοκ ανπίζεζ κα απμζημδμιμφκ ηα μνβακίδζα ηαζ ηα ιαηνμιυνζά ημοξ ιε ιεβαθφηενμοξ νοειμφξ. Υνήζδ ζδιαζιέκςκ ιμνίςκ αημθμοεμφιεκδ απυ ακάθοζδ ημο ιεηααμθζημφ πνμηφπμο εκδμηοηηανζηά ηαζ ελςηοηηανζηά εα ιπμνμφζε κα απακηήζεζ ζημοξ παναπάκς πνμαθδιαηζζιμφξ.

109 99 A Β πήια Γ. 6 Ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιεηαλφ ανπζηήξ ηαζ ιέζδξ θάζδξ. Γείπκμκηαζ μζ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηδκ ηεθζηή ζε ζφβηνζζδ ιε ηδ ιέζδ θάζδ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζημ πείναια 1 (Α) ηαζ ζημ πείναια 2 (Β). Με πνάζζκμ πνχια θαίκμκηαζ μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ ζδ ζοβηέκηνςζδ ιεζχεδηε ζδιακηζηά ηαζ ιε ηυηηζκμ αοημί ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ αολήεδηε.

110 100 A Β πήια Γ. 7 Ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιεηαλφ ιέζδξ ηαζ ηεθζηήξ θάζδξ. Γείπκμκηαζ μζ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηδκ ηεθζηή ζε ζφβηνζζδ ιε ηδ ιέζδ θάζδ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζημ πείναια 1 (Α) ηαζ ζημ πείναια 2 (Β). Με πνάζζκμ πνχια θαίκμκηαζ μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ ζδ ζοβηέκηνςζδ ιεζχεδηε ζδιακηζηά ηαζ ιε ηυηηζκμ αοημί ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ αολήεδηε.

111 101 Πείναια δζαηαναπχκ πενζαάθθμκημξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ Ζ ιαηνμπνυκζα ειπεζνία ηδξ πνήζδξ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ βζα ηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ, έπεζ μδδβήζεζ ζηδ νφειζζδ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ ζοκεδηχκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζηζξ αέθηζζηεξ ηζιέξ ημοξ. Ζ αζμιδπακζηή πναηηζηή έπεζ, ηαηά αάζδ, μδδβδεεί ζε αοηυ ημ απμηέθεζια, ειπεζνζηά. Παν υθδ αοηή ηδ βκχζδ ηαζ ηδκ ειπεζνία, πάκημηε οπάνπεζ ημ εκδεπυιεκμ ηάπμζα αζημπία ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ κα ιεηααάθθεζ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ιε απνυαθεπηεξ, ηζξ πενζζζυηενεξ θμνέξ, επζπηχζεζξ ζηδκ παναβςβζηή απυδμζδ ηαζ ηδ θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, είκαζ ζδιακηζηυ κα ιεθεηδεεί δ επίπηςζδ ηέημζςκ ιεηααμθχκ ζε επίπεδμ θοζζμθμβίαξ. Πανάιεηνμζ πμο ηαεμνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ είκαζ ημ ph, δ εενιμηναζία (Σ), δ ζοβηέκηνςζδ ημο δζαθοιέκμο μλοβυκμο (DO) ηαζ μ ηοηηανμεζδζηυξ νοειυξ δζαπυηζζδξ (CSP) ζημοξ αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ ορδθήξ ηοηηανζηήξ ποηκυηδηαξ, υπςξ ζηδκ πενίπηςζή ιαξ. Σμ ph πνέπεζ κα δζαηδνείηαζ ημκηά ζηα μοδέηενα επίπεδα ηαζ δ αέθηζζηδ ηζιή ελανηάηαζ απυ ηδκ ηοηηανζηή ζεζνά πμο πνδζζιμπμζείηαζ. Σμ O 2 είκαζ απαναίηδημ βζα ηδκ παναβςβή εκένβεζαξ, ζακ ηεθζηυξ οπμδμπέαξ ηδξ ακαπκεοζηζηήξ αθοζίδαξ, εκχ ορδθά επίπεδα DO πνμηαθμφκ μλεζδςηζηυ ζηνεξ ηαζ παναβςβή εθεφεενςκ νζγχκ δ εενιμηναζία είκαζ ζδιακηζηή βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηαζ ηδκ εκενβυηδηα εκγφιςκ ηαζ νοειίγεηαζ ημκηά ζημοξ 37 o C. Ο CSP ηαεμνίγεζ ημκ ανζειυ ηςκ ηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ ζημ αζμακηζδναζηήνα, έκα βεβμκυξ πμο ιπμνεί κα επδνεάζεζ ημ ιζηνμπενζαάθθμκ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ημ ιεηααμθζζιυ ημοξ. Γζα ημοξ παναπάκς πανάβμκηεξ, πμο ηαεμνίγμοκ ημ πενζαάθθμκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ οπάνπμοκ ζοβηεηνζιέκεξ αέθηζζηεξ ηζιέξ. Τπάνπεζ έκα εφνμξ ηζιχκ βφνς απυ ηζξ αέθηζζηεξ, ζημ μπμίμ ιπμνεί κα ηοιαίκμκηαζ μζ ηζιέξ αοηχκ ηςκ παναβυκηςκ. Όηακ μζ ηζιέξ οπεναμφκ αοηά ηα υνζα, ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ηαθθζενβδηζηήξ δζαδζηαζίαξ, ηυηε αολάκεηαζ μ ζηεπηζηζζιυξ βζα ηδκ πμζυηδηα ημο παναβυιεκμο πνμσυκημξ. Ο πνυκμξ ηαζ ημ ιέβεεμξ ηδξ απυηθζζδξ ηδξ ηζιήξ απυ ηδ

112 102 αέθηζζηδ είκαζ πμο ηαεμνίγμοκ ηαζ ημ ιέβεεμξ ηδξ επίπηςζδξ πμο έπεζ επέθεεζ ζηδ θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ. ε έκα πείναια ιεβάθδξ ηθίιαηαξ, έβζκε πνμζπάεεζα κα ιεθεηδεμφκ μζ επζπηχζεζξ πμο επζθένμοκ δζάθμνεξ αολμιεζχζεζξ (δζαηαναπέξ) ηςκ πενζααθθμκηζηχκ παναβυκηςκ ζηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Δπζθέπεδηε κα εθανιμζημφκ δζάθμνμζ ζοκδοαζιμί δζαηαναπχκ ζε ιζα δζαδζηαζία Design of Experiment (DOE), βζαηί ημ ηυζημξ ιεθέηδξ ηάεε δζαηαναπήξ λεπςνζζηά είκαζ ιεβάθμ. Οζ ζοκδοαζιμί ηςκ δζαηαναπχκ έβζκακ ιε ηνυπμ πμο κα ηαθφπηεζ υθμ ημ εφνμξ ηςκ ηοπαίςκ ζοκδοαζιχκ ηαζ κα είκαζ δοκαηυ κα ελαπεμφκ ζοιπενάζιαηα βζα ηάεε έκακ απυ πανάβμκηα. Απυ έκακ αζμιδπακζηήξ ηθίιαηαξ αζμακηζδναζηήνα, ακαπηφπεδηακ πέκηε αζμακηζδναζηήνεξ ενβαζηδνζαηήξ ηθίιαηαξ. Γζάθμνμζ ζοκδοαζιμί ηζιχκ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ παναβυκηςκ πμο ακαθέναιε, εθανιυζηδηακ ακά ηαηηά δζαζηήιαηα ηαζ ζοθθέπεδηακ δείβιαηα απυ ηάεε πενίπηςζδ Ζ ιεηααμθμιζηή απμδείπηδηε ανηεηά εοαίζεδηδ αηυια ηαζ κα πενζβνάρεζ δζαθμνέξ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ πνμενπυιεκεξ απυ ηδκ ηοηηανζηή δθζηία, υπςξ δείπηδηε ζημ πνμδβμφιεκμ ηεθάθαζμ (Vernardis et al, 2013). Με αοηυ ημ ζηεπηζηυ απμθαζίζηδηε αοηή δ εηηεηαιέκδ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ηαζ δ ακάθοζή ημο ιεηααμθζζιμφ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ ιε πνήζδ ιεηααμθμιζηήξ GC-MS, ιζαξ ηαζ δείπκεζ κα είκαζ δ πθέμκ ηαηάθθδθδ ακαθοηζηή πθαηθυνια βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηέημζςκ δεζβιάηςκ. Ζ ζοβηεηνζιέκδ πνμζπάεεζα έδεζλε λακά ηδ δφκαιδ ηδξ ιεηααμθμιζηήξ ιε πνήζδ GC MS ζηδ Μδπακζηή Κοηηανμηαθθζενβεζχκ. Σα απμηεθέζιαηα δείπκμοκ ιε πμζμ ηνυπμ μζ ζοκδοαζιμί ηςκ δζαηαναπχκ ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ημ ιεηααμθζζιυ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ.

113 103 Δλέηαζδ ηςκ δφμ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ απυ ημζκμφ Οζ ιεηααμθζηέξ δζαθμνέξ πμο παναηδνήεδηακ ιεηαλφ ηςκ θάζεςκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ έπνεπε κα επζαεααζςεμφκ ηαζ ιεηαλφ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ημο πεζνάιαημξ δζαηαναπχκ ημο πενζαάθθμκημξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Σα δείβιαηα ηςκ μπμίςκ ηα ιεηααμθζηά πνυηοπα εα ιπμνμφζακ κα απακηήζμοκ ζημ ενχηδια ημο ακ μζ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ θάζεςκ υκηςξ ζζπφμοκ, είκαζ αοηά ιεηαλφ ηςκ ζδιείςκ T1 ηαζ Σ9. Σα πνμκζηά ζδιεία αοηά ανίζημκηαζ ζηδκ ανπζηή ηαζ ιέζδ θάζδ, ακηίζημζπα, ηαζ ηα ηφηηανα δεκ έπμοκ οπμζηεί ηαιία πενζααθθμκηζηή δζαηαναπή, ιε ιυκδ επζννμή αοηή ηδξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. Ζ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM) έδεζλε υηζ δ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα ημο ζδιείμο Σ9, ημ μπμίμ ακήηεζ ζε ιέζδ θάζδ πνμκζηά, είκαζ παιδθυηενδ απυ αοηή ημο ζδιείμο Σ1. Αοηυ ήηακ ηαζ ημ ακαιεκυιεκμ απμηέθεζια ιε αάζδ ηα απμηεθέζιαηα ημο πεζνάιαημξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. Απεζηυκζζδ ζημ ιεηααμθζηυ δίηηομ δείπκεζ ζοβηεηνζιέκα ιεηααμθζηά ιμκμπάηζα ιε ιεζςιέκδ εκενβυηδηα. Σέημζα είκαζ δ παναβςβή θςζθμθζπζδίςκ ηαζ βθοηενμθζπζδίςκ, δ ζφκεεζδ κμοηθεμηζδίςκ, μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ, δ βθμοηαιζκυθοζδ, μ ηφηθμξ ηδξ μονίαξ. Δπίζδξ, θαίκεηαζ ιείςζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ζαηπάνςκ ηαζ αιζκμλέςκ, αθθά ηαζ ημο βαθαηηζημφ μλέμξ. Όπςξ έπεζ δεζπηεί απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ημο πεζνάιαημξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ, ηαηά ηδ ιεηάααζδ απυ ηδκ ανπζηή ζηδ ιέζδ θάζδ, ηα παναπάκς ιμκμπάηζα έπμοκ θακεί κα ιεζχκμοκ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ εκενβυηδηα, είηε ζημ πνχημ είηε ζημ δεφηενμ πείναια.

114 πήια Γ. 8 φβηνζζδ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ1 ηαζ Σ9. Απεζηυκζζδ ζημ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεηααάθθεηαζ ζδιακηζηά ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ9 ζε ζφβηνζζδ ιε ημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ1. Με πνάζζκμ πνχια μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεζχκεηαζ ηαζ ιε ηυηηζκμ πνχια αοηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ αολάκεηαζ. 104

115 105 Αλάδεημε κεηαβνιηθνύ πξνηύπνπ κεηάβαζεο από ηελ αξρηθή ζηε κέζε θάζε Αημθμοεείηαζ ιζα απυπεζνα κα ακηζθδθεμφιε απυ ηζξ ζπεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηδ ιεηααμθή ζηδ θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ. Σα δεδμιέκα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ, πνμένπμκηαζ απυ ηζξ δφμ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ ημο πεζνάιαημξ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ ηαζ απυ ηα πνυηοπα ηςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ1 ηαζ Σ9 ημο πεζνάιαημξ δζαηαναπήξ πενζααθθμκηoξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ. Ζ ηαηάζηαζδ ημο GC-MS είκαζ ιενζηχξ δζαθμνεηζηή ηαηά ηδ δζάνηεζα ηάεε πεζναιαηζηήξ δζαδζηαζίαξ, αθθά ηαζ μζ ιεηααμθίηεξ πμο είκαζ δοκαηυ κα πμζμηζημπμζδεμφκ ηάεε θμνά εκδέπεηαζ κα δζαθένμοκ, αθμφ ημ πείναια αεθηζχκεηαζ δζανηχξ. Γζα ημοξ παναπάκς θυβμοξ, δ πνμζπάεεζα ελαβςβήξ εκυξ ιεηααμθζημφ πνμηφπμο ιεηάααζδξ απυ ηδκ ανπζηή θάζδ ζηδ ιέζδ, ζηδνίπεδηε ζημοξ ημζκμφξ πμζμηζημπμζήζζιμοξ ιεηααμθίηεξ ηςκ ηνζχκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ. ημκ Πίκαηα 3 αθέπμοιε ημοξ ημζκμφξ αοημφξ ιεηααμθίηεξ ηαζ ηα υνζα ζηα μπμία ηζκμφκηαζ μζ ζπεηζηέξ ημοξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ, ζε ανπζηή ηαζ ιέζδ θάζδ. ημκ Πίκαηα 4 θαίκεηαζ ημ ηθάζια ιεηααμθήξ (fold change) ηδξ ζπεηζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηάεε ιεηααμθίηδ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ. Παναηδνείηαζ υηζ ειθακίγμκηαζ ιεηααμθίηεξ ιε ζαθή ηάζδ ιείςζδξ ζηδ ιέζδ θάζδ, υπςξ ηονμζίκδ, θςζθμνζηή αζεακμθαιίκδ, αζεακμθαιίκδ, αζπανηζηυ μλφ, ααθίκδ, ζενίκδ, ζζμθεοηίκδ, αθακίκδ, 2-οδνμλο-βθμοηανζηυ μλφ, δθεηηνζηυ μλφ, βθοηενυθδ, 3-θςζθμνζηή βθοηενυθδ, ηνοπημθάκδ ηαζ ημ πονμζηαθοθζηυ μλφ ημ μπμίμ έπεζ ζαθή ηάζδ αφλδζδξ.

116 106 Μεταβολίτεσ Αρχικι Φάςθ Μζςθ Φάςθ tyrosine ethanolamine ph. phenylalanine myoinositol threonine aspartate Πίκαηαξ 3: Γείπκμκηαζ μζ ημζκμί ιεηααμθίηεξ ηςκ ηνζχκ πεζναιαηζηχκ δζαδζηαζζχκ ηαζ μζ εθάπζζηεξ-ιέβζζηεξ ζπεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημοξ pyruvate valine ethanolamine serine isoleucine alanine citrate malate erythritol aminomalonic acid H-glutarate succinate glycerol P-glycerate lactate glycerol-3p glycerol ph.der sorbitol fumarate uracil uridine homoserine glycolate myoinositol ph tryptophan urea

117 107 Μεταβολίτεσ tyrosine ethanolamine ph. phenylalanine myoinositol threonine aspartate pyruvate valine ethanolamine Πείραμα Διαταραχών περιβάλλοντοσ Πείραμα κυτταρικισ θλικίασ Πείραμα Πείραμα Πίκαηαξ 4: Κθάζια ιεηααμθήξ (ζπεηζηή ζοβηέκηνςζδ ιεηααμθίηδ ζηδκ ανπζηή θάζδ / ιέζδ θάζδ) ηςκ ιεηααμθζηχκ ηαζ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ serine isoleucine alanine citrate malate erythritol aminomalonic acid H-glutarate succinate glycerol P-glycerate lactate glycerol-3p glycerol ph.der sorbitol fumarate uracil uridine homoserine glycolate myoinositol ph tryptophan urea

118 108 ύγθξηζε κεηαβνιηθώλ πξνηύπσλ κε βέιηηζηεο πεξηβαιινληηθέο ζπλζήθεο ζηε κέζε θάζε Ζ ακάβηδ κα απακηδεεί ημ ενχηδια ακ δ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηςκ ηοηηάνςκ ΒΖΚ επζζηνέθεζ ζηδκ ανπζηή ηαηάζηαζδ ιεηά ηδκ απμηαηάζηαζδ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ παναβυκηςκ ζηζξ αέθηζζηεξ ηζιέξ ζε δείβιαηα ιέζδξ θάζδξ ιπμνεί κα απακηδεεί απυ ηζξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ L10 ηαζ L11 ζηα πνμκζηά ζδιεία Σ7 ηαζ Σ6. Ζ ανπζηή εεχνδζδ υηζ δ ηοηηανζηή δθζηία επζδνά ιυκζια ηαζ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ, μδδβεί ζηδ ζηέρδ υηζ βζα κα δζαπζζηςεεί δ επζζηνμθή ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ζηδκ ακαιεκυιεκδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία, πνέπεζ δ ηοηηανμηαθθζένβεζα κα παναηηδνίγεηαζ απυ ηδ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηδξ θάζδξ ζηδκ μπμία ανίζηεηαζ πνμκζηά ημ δείβια πμο ζοθθέβεηαζ. ημκ Πίκαηα 5 παναηδνείηαζ δ ζφβηνζζδ ηςκ ηθαζιάηςκ ιεηααμθήξ ηςκ ιεηααμθζηχκ, υπςξ ιεηνήεδηακ ζηα δείβιαηα L10_T7 ηαζ L11_T6. Απυ ηζξ ηζιέξ αοηέξ ιπμνεί κα δζαπζζηςεεί υηζ δ ιεηααμθζηή θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ L10 απμηαείζηαηαζ ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ7, εκχ αοηή ηδξ L11 υπζ. Ζ παναηήνδζδ υηζ ημ ηθάζια είκαζ ακχηενμ ηδξ ιμκάδαξ ζημοξ πενζζζυηενμοξ ιεηααμθίηεξ ζημ δείβια ημο αζμακηζδναζηήνα L10, υπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ, αθθά ηαηχηενμ ηδξ ιμκάδαξ ζημκ L11, ζηδνίγεζ ηα παναπάκς. Ζ επίδναζδ ηδξ ιείςζδξ ημο ph ιμζάγεζ ζζπονυηενδ απυ ηδκ αφλδζή ημο, ζε αοημφξ ημοξ ζοκδοαζιμφξ δζαηαναπχκ. Ζ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM) δείπκεζ ζημ δίηηομ ημο πήιαημξ Γ.9 υηζ δ εκενβυηδηα ηςκ ιμκμπαηζχκ παναβςβήξ βθοηενμθζπζδίςκ, θςζθμθζπζδίςκ, κμοηθεμηζδίςκ, μονίαξ ηαζ ηάπμζεξ ζοβηεκηνχζεζξ αιζκμλέςκ ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ7 ζε ζπέζδ ιε ημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ1 ηςκ δεζβιάηςκ ημο αζμακηζδναζηήνα L10, είκαζ παναπθήζζα ηδξ ιεηάααζδξ πμο παναηδνείηαζ ζηδ ιεηάααζδ απυ ηδκ ανπζηή ζηδ ιέζδ θάζδ. Ζ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο πονμζηαθοθζημφ μλέμξ ζηα δίηηοα ηςκ εζηυκςκ 1 ηαζ 2 πνέπεζ κα ζδιεζςεεί, βζαηί ίζςξ απμηεθεί ιζα έκδεζλδ ηδξ άολδζδξ ηδξ δελαιεκήξ ημο ζοβηεηνζιέκμο ιεηααμθίηδ ηαηά ηδ ιεηάααζδ αοηή, πνάβια πμο δείπκεζ ηδκ αθθαβή αοηή ημο ιεηααμθζζιμφ, ηαεχξ ημ πονμζηαθοθζηυ μλφ απμηεθεί ημιαζηυ ιεηααμθίηδ ιεηαλφ βθοηυθοζδξ, ηφηθμο ηζηνζημφ μλέμξ, παναβςβήξ βαθαηηζημφ μλέμξ, αθθά ηαζ δείηηδξ αφλδζδξ ακηζδνάζεςκ ακαπθήνςζδξ.

119 109 Μεταβολίτεσ tyrosine ethanolamine ph. phenylalanine myoinositol threonine aspartate pyruvate valine ethanolamine serine isoleucine alanine citrate malate erythritol aminomalonic acid 2H-glutarate succinate glycerol 3P-glycerate lactate glycerol-3p glycerol ph.der. sorbitol fumarate uracil uridine homoserine glycolate myoinositol ph. tryptophan urea Πείραμα Διατ. Περιβάλλοντοσ Πείραμα κυτταρικισ θλικίασ Πείραμα 1 Πείραμα L10_T L11_T Πίκαηαξ 5: Κθάζια ιεηααμθήξ (ζπεηζηή ζοβηέκηνςζδ ιεηααμθίηδ ζηδκ ανπζηή θάζδ / ιέζδ θάζδ) ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηζξ ηνεζξ πεζναιαηζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ ζηα δείβιαηα L10_T7 ηαζ L11_T6

120 πήια Γ. 9 φβηνζζδ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ1 ηαζ Σ7. Απεζηυκζζδ ζημ ιεηααμθζηυ δίηηομ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεηααάθθεηαζ ζδιακηζηά ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ7 ζε ζφβηνζζδ ιε ημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ1 ζηα δείβιαηα ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ L10. Με πνάζζκμ πνχια μζ ιεηααμθίηεξ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ ιεζχκεηαζ ηαζ ιε ηυηηζκμ πνχια αοηχκ ηςκ μπμίςκ δ ζοβηέκηνςζδ αολάκεηαζ. 110

121 111 Δπίδναζδ ημο πανάβμκηα εενιμηναζία Μζα ημκηζκή ιαηζά ζηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ L10 ηαζ L12 απμηαθφπηεζ πμθθά ημζκά ζηα πνμκζηά ζδιεία Σ1, Σ4 ηαζ Σ5. ημ πνμκζηυ ζδιείμ T1 μζ ζοκεήηεξ είκαζ μζ ανπζηέξ, εκχ ζηα ζδιεία Σ4 ηαζ Σ5 ημ ιυκμ δζαθμνεηζηυ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ είκαζ δ εενιμηναζία, δ μπμία ζημ αζμακηζδναζηήνα L10 είκαζ ιεζςιέκδ ηαζ ζημκ L12 αολδιέκδ. Σα ph ηαζ DO είκαζ αολδιέκα ηαζ ιεζςιέκα, ακηίζημζπα, εκχ μ CSP ιεζχκεηαζ ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ4 ηαζ αολάκεηαζ ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ5 ηαζ ζημοξ δφμ αζμακηζδναζηήνεξ. Απυ ηα παναπάκς, ιπμνμφιε κα εέζμοιε ημ ενχηδια ηδξ επίδναζδξ ηδξ εενιμηναζίαξ ζε αοημφξ ημοξ ζοκδοαζιμφξ ζοκεδηχκ, πμο είκαζ μ ιμκαδζηυξ πανάβμκηαξ πμο δζαθμνμπμζείηαζ ζηζξ δφμ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ, μζ μπμίεξ είκαζ άιεζα ζοβηνίζζιεξ. Ζ ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ (HCl) ηαζ δ ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PCA) δείπκμοκ ηδκ μιμζυηδηα ηδξ ιεηααμθζηήξ θοζζμθμβίαξ ηςκ δφμ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ, απυ ηδκ ζοζηαδμπμίδζδ ηαζ μιαδμπμίδζδ ηςκ ιεηααμθζηχκ πνμηφπςκ ημο πνμκζημφ ζδιείμο Σ1. Δίκαζ έκα ακαιεκυιεκμ ηαζ, ηαοηυπνμκα, ζδιακηζηυ απμηέθεζια πμο επζαεααζχκεζ ηδ ζηαεενυηδηα ηδξ δζαδζηαζίαξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ υηακ μζ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ δε ιεηααάθθμκηαζ ηαζ δ ηοηηανζηή δθζηία είκαζ υιμζα. Ακηίεεηα, ηα πνυηοπα ηςκ δφμ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ, ζηα πνμκζηά ζδιεία Σ4 ηαζ Σ5, παναεέημκηαζ εηαηένςεεκ ηςκ πνμηφπςκ ημο πνμκζημφ ζδιείμο Σ1, ηαζ ζηδκ PCA ηαζ ζημ HCl. Αοηυ ημ απμηέθεζια δείπκεζ ηδκ ακηίεεηδ επίδναζδ ηδξ αφλδζδξ ηαζ ιείςζδξ ηδξ εενιμηναζίαξ ζημ ιεηααμθζζιυ ηςκ ηοηηάνςκ ζηα πνμκζηά ζδιεία Σ4 ηαζ Σ5. Ζ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ιπμνεί κα απμηοπχζεζ παναηηδνζζηζηά αοηήκ ηδ δζαθμνμπμίδζδ. Ζ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM) έδεζλε υηζ μ ιεηααμθζζιυξ ηςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ Σ4 ηαζ Σ5 ζηδ ηοηηανμηαθθζένβεζα L12, υπμο δ εενιμηναζία είκαζ αολδιέκδ, ανίζηεηαζ ζε πμθφ παιδθυηενα επίπεδα ζε ζφβηνζζδ ιε αοηυκ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ L10, πνάβια πμο θαίκεηαζ ηαεανά ηαζ απυ ημ εενιζηυ πάνηδ (πήια Γ.10).

122 112 β) Ιεραρχικι υςταδοποίθςθ (HCl) Μετρική απόςταςησ: Ευκλείδεια Standardized elative Peak Areas (stpas) L10 T1 L12 α) φγκριςθ ςυνκθκών των βιοαντιδραςτιρων L10 και L12 γ) Ανάλυςθ Κφριων υνιςτωςών (PCA) πήια Γ. 10 Πανάβμκηαξ Θενιμηναζία (Σ). οβηνζζδ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ L10 ηαζ L12. α) φβηνζζδ ηςκ δζαδζηαζζχκ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηςκ αζμακηζδναζηήνςκ L10 ηαζ L12, α) ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ, β) ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ ηαζ δ) ιεηααμθίηεξ ιε ζδιακηζηά ιεηαααθθυιεκδ ζοβηέκηνςζδ ιεηαλφ πνμκζηχκ ζδιείςκ πμο απεζημκίγμκηαζ πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ (αθ. επυιεκδ ζεθίδα). Με πνάζζκμ πνχια μζ ιεηααμθίηεξ ιε ιεζςιέκδ ζοβηέκηνςζδ ηαζ ηυηηζκμ αοημί ιε αολδιέκδ. L10-T4 L12-T4 L10-T5 T1 L12-T5 Μείωςθ κερμοκραςίασ (Σ) Αφξθςθ κερμοκραςίασ (Σ) PC1: 27.7% PC2: 21.8% PC3: 20.4%

123 113 δ) Ανάλυςθ θμαντικότθτασ Μικροςυςτοιχιών (SAM) πάνω ςτο Ανακαταςκευαςμζνο Μεταβολικό Δίκτυο Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτην κυτταροκαλλιζργεια L12 ςε ςφγκριςη με την κυτταροκαλλιζργεια L10, ςτο χρονικό ςημείο Σ4 Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτην κυτταροκαλλιζργεια L12 ςε ςφγκριςη με την κυτταροκαλλιζργεια L10, ςτο χρονικό ςημείο Σ5

124 114 Βζμακηζδναζηήναξ L10: Ζ θοζζμθμβία ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ επακένπεηαζ Απυ ηδκ ζενανπζηή μιαδμπμίδζδ (HCL) ηαζ ηδκ ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PCA), παναηδνμφιε, παναηηδνζζηζηά υηζ μ ιεηααμθζζιυξ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ επζζηνέθεζ ζηδκ ανπζηή ηαηάζηαζδ ιεηά ηζξ δφμ πνχηεξ δζαηαναπέξ, πανά ημ βεβμκυξ υηζ ανίζημκηαζ ζε άθθδ θάζδ ηοηηανζηήξ δθζηίαξ. Αοηυ θαίκεηαζ απυ ηδκ λεηάεανδ μιαδμπμίδζδ ηςκ πνμηφπςκ απυ ηα δείβιαηα πμο ανίζημκηαζ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ. Οζ δομ πνχηεξ δζαηαναπέξ πμο παναηηδνίγμκηαζ απυ αφλδζδ ηςκ ph, DO ηαζ Σ έπμοκ, επίζδξ, πανυιμζα ιεηααμθζηά πνυηοπα ιε ημ CSP κα έπεζ λακά ιζηνυ δζαπςνζζηζηυ νυθμ. Ο εενιζηυξ πάνηδξ δείπκεζ υηζ ηα ηφηηανα ηςκ δφμ πνχηςκ δζαηαναπχκ παναηηδνίγμκηαζ απυ αολδιέκδ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα ζε ζφβηνζζδ ιε αοηά πμο ακήημοκ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ. Σμ ακηίεεημ, αηνζαχξ παναηδνμφιε βζα ηα πνυηοπα ηδξ ηνίηδξ δζαηαναπήξ, απυ ηα μπμία ηαηαθαααίκμοιε υηζ δ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ είκαζ ιεζςιέκδ. Ζ ακηίεεζδ αοηή απμηοπχκεηαζ πμθφ παναηηδνζζηζηά ζηo βνάθδια ηδξ PCA, υπμο ηα πνυηοπα ηδξ ηνίηδξ δζαηαναπήξ ανίζημκηαζ απέκακηζ απυ αοηά ηςκ δφμ πνχηςκ ιε ηα πνυηοπα πμο ακήημοκ ζηα δείβιαηα ηςκ ανπζηχκ ζοκεδηχκ κα ανίζημκηαζ ζηδ ιέζδ. Όθεξ μζ δζαηαναπέξ παναηηδνίγμκηαζ απυ αολδιέκμ ph. Μεηά ηζξ δφμ πνχηεξ δζαηαναπέξ ηαζ, αθμφ μζ πενζααθθμκηζηέξ πανάιεηνμζ νοειζζημφκ λακά ζηζξ ανπζηέξ ηζιέξ, δ ηοηηανμηαθθζένβεζα ηαηαθένκεζ κα ακαηηήζεζ ηδκ ανπζηή ιεηααμθζηή θοζζμθμβία. Απυ αοηυ ηαηαθαααίκμοιε υηζ δ αφλδζδ ζημ ph δεκ επζθένεζ ιυκζια ηαζ ιδ ακηζζηνεπηά απμηεθέζιαηα ζημ ιεηααμθζζιυ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ είκαζ ιζηνυηενδξ ζδιαζίαξ απυ ημ ζοκδοαζιυ αθθαβχκ ηςκ DO ηαζ Σ, υπμο δ αφλδζδ ή δ ιείςζή ημοξ επζθένεζ ακηίζηνμθα απμηεθέζιαηα ζημ ιεηααμθζζιυ, αθθά υπζ ιυκζια. Ζ αφλδζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ ιεηααμθζηχκ ιεηά ηδκ πνχηδ δζαηαναπή είκαζ ειθακήξ ηαζ ζηδκ ακάθοζδ ζδιακηζηυηδηαξ ιζηνμζοζημζπζχκ (SAM). ημ ιεηααμθζηυ δίηηομ παναηδνμφιε ιεβάθμ ιένμξ ηςκ ιεηααμθζηχκ κα αολάκμκηαζ ζημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ4 ζε ζφβηνζζδ ιε ημ Σ1. Αοηυ, ίζςξ, ιπμνεί κα ελδβδεεί απυ ημ πενζααθθμκηζηυ ζηνεξ ημ μπμίμ εκδέπεηαζ κα ακαβηάγεζ ηα ηφηηανα κα πνμζθάαμοκ ιεηααμθίηεξ απυ ημ ενεπηζηυ ιέζμ. Κοηηανζημί ιδπακζζιμί, υπςξ δ αοημθαβία ηαζ δ

125 115 εκδμηφηηςζδ, ιπμνεί κα έπμοκ εκενβμπμζδεεί, επίζδξ, ζε αοηή ηδ θάζδ, ιε ζηυπμ κα ηαθοθεμφκ μζ αολδιέκεξ ιεηααμθζηέξ ακάβηεξ ηςκ ηοηηάνςκ. Ζ δεφηενδ δζαηαναπή δε δείπκεζ κα επδνεάγεζ ζδζαίηενα ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιεηααμθζηχκ. ημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ5 έπμοιε ιεζςιέκμοξ ημοξ ιεηααμθίηεξ ιομζκμζζηυθδ ηαζ ηζηνζηυ μλφ (παναβςβή θζπζδίςκ) ηαζ αολδιέκμοξ ημοξ βθοηενυθδ ηαζ μοναηίθδ. ημ πνμκζηυ ζδιείμ Σ7, δ ηοηηανμηαθθζένβεζα επζζηνέθεζ ζηζξ ανπζηέξ ζοκεήηεξ. Σα ηφηηανα ιεζχκμοκ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηα ηακμκζηά επίπεδα, πμο εζηάγμοιε υηζ είκαζ αοηά ημο πνμκζημφ ζδιείμο Σ1. Θα ιπμνμφζαιε κα ζζπονζζημφιε υηζ μζ ζοκδοαζιμί ηςκ δφμ πνχηςκ δζαηαναπχκ (Σ4, Σ5), εοκμμφκ ηδκ ηοηηανζηή αφλδζδ, ηαεχξ δ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα ηςκ ιμκμπαηζχκ ηδξ βθοηυθοζδξ, βθμοηαιζκυθοζδξ ηαζ αζμζφκεεζδξ ιαηνμιμνίςκ, είκαζ ορδθυηενδ. Μεηά ηδκ ηεθεοηαία δζαηαναπή (Σ10), δ ιεηααμθζηή εκενβυηδηα θηάκεζ ζε πμθφ παιδθά επίπεδα. Σα ηφηηανα είκαζ θακενά ζηνεζανζζιέκα ηαζ ιεζχκμοκ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ. Ζ ηοηηανζηή αφλδζδ ηαζ μ δζπθαζζαζιυξ δεκ εοκμμφκηαζ ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ ηαζ μ ζοκδοαζιυξ αολδιέκςκ ph, DO ηαζ Σ είκαζ ζδζαίηενα ζηνεζμβυκμξ.

126 116 T4 T5 T1 & T7 T10 α) Ιεραρχικι υςταδοποίθςθ (HCl) Μετρική απόςταςησ: Ευκλείδεια Standardized elative Peak Areas (stpas) πήια Γ. 11 Ακάθοζδ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ L10. α) ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ, α) ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ ηαζ β) ιεηααμθίηεξ ιε ζδιακηζηά ιεηαααθθυιεκδ ζοβηέκηνςζδ ιεηαλφ πνμκζηχκ ζδιείςκ πμο απεζημκίγμκηαζ πάκς ζημ ακαηαηαζηεοαζιέκμ ιεηααμθζηυ δίηηομ (αθ. επυιεκεξ δφμ ζεθίδεξ). Με πνάζζκμ πνχια μζ ιεηααμθίηεξ ιε ιεζςιέκδ ζοβηέκηνςζδ ηαζ ιε ηυηηζκμ αοημί ιε αολδιέκδ. β) Ανάλυςθ Κφριων υνιςτωςών (PCA) T4 T1 & T7 T5 T10 PC1: 36.8% PC2: 29.6% PC3: 10.7%

127 γ) Ανάλυςθ θμαντικότθτασ Μικροςυςτοιχιών (SAM) πάνω ςτο Ανακαταςκευαςμζνο Μεταβολικό Δίκτυο 117 Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτο χρονικό ςημείο Σ4 ςε ςφγκριςη με το χρονικό ςημείο Σ1 Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτο χρονικό ςημείο Σ5 ςε ςφγκριςη με το χρονικό ςημείο Σ4

128 118 Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτο χρονικό ςημείο Σ7 ςε ςφγκριςη με το χρονικό ςημείο Σ5 Μεταβολίτεσ των οποίων η ςυγκζντρωςη μεταβλήθηκε ςημαντικά ςτο χρονικό ςημείο Σ10 ςε ςφγκριςη με το χρονικό ςημείο Σ7

129 119 Πείναια δζαθμνμπμζδιέκμο ενεπηζημφ ιέζμο Σμ ενεπηζηυ ιέζμ ηδξ ηοηηανμηαθθζένβεζαξ είκαζ ηαεμνζζιέκμ ηαζ εθεβπυιεκμ ηαζ έπεζ πνμηφρεζ ιεηά απυ πμθφπνμκδ ειπεζνία πάκς ζηδκ ηαθθζένβεζα ηοηηάνςκ BHK βζα παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ ζε αζμακηζδναζηήνεξ δζαπυηζζδξ. Δίκαζ εζδζηά ζπεδζαζιέκμ χζηε κα πανέπεζ ηα δμιζηά οθζηά πμο πνεζάγεηαζ ημ ηφηηανμ βζα ηδκ πνςηεσκμζφκεεζδ ηαζ ηδ ζςζηή βθοημζοθίςζδ, πνάβια πμθφ ζδιακηζηυ ζηδκ παναβςβή εεναπεοηζηχκ πνςηεσκχκ ιε πνήζδ ηοηηάνςκ εδθαζηζηχκ, ιζαξ ηαζ είκαζ έκαξ απυ ημοξ ηφνζμοξ θυβμοξ πμο πνμηζιχκηαζ απυ ηα πνμηανοςηζηά ηφηηανα. Αηυια, ημ ενεπηζηυ ιέζμ είκαζ ζπεδζαζιέκμ κα εοκμεί ηδκ αφλδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε επζεοιδηυ νοειυ, χζηε ημ παναβυιεκμ πνμσυκ κα είκαζ υζμ ημ δοκαηυκ πενζζζυηενμ ηαζ, ηαοηυπνμκα, πμζμηζηά απμδεηηυ. οιπεναζιαηζηά, ημ ενεπηζηυ ιέζμ είκαζ ζπεδζαζιέκμ χζηε κα εοκμεί ηδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ ηδξ πμζυηδηαξ ηδξ παναβυιεκδξ πνςηεΐκδξ. Ζ βθοημζοθίςζδ είκαζ ιζα δζαδζηαζία δ μπμία επδνεάγεηαζ άιεζα απυ πανάβμκηεξ υπςξ ημ ph, δ εενιμηναζία, ημ δζαθοιέκμ μλοβυκμ, δ ηοηηανζηή δθζηία ηαζ δ ζφζηαζδ ημο ενεπηζημφ ιέζμο. Δίκαζ ζδιακηζηυ, θμζπυκ, κα δμφιε πςξ επδνεάγεηαζ μ ιεηααμθζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ιε δζαθμνεηζηή ζφζηαζδ ενεπηζημφ ιέζμο, ιζαξ ηαζ μζ οπυθμζπμζ πανάβμκηεξ ελεηάζηδηακ εκδεθεπχξ. Ζ βθοημζοθίςζδ ζοιααίκεζ υηακ έκαξ μθζβμζαηπανίηδξ πνμζημθθάηαζ ζε ιζα πμθοπεπηζδζηή, αθοζίδα ηαζ είκαζ ιζα δζαδζηαζία πμο ιπμνεί κα επδνεάζεζ πάνα πμθφ ηδ θεζημονβζηυηδηα ιζαξ πνςηεΐκδξ. Σα ζάηπανα πμο απανηίγμοκ ημοξ μθζβμζαηπανίηεξ είκαζ ηα βθοηυγδ, ιακκυγδ, βαθαηηυγδ, θμοηυγδ ηαζ λοθυγδ, ςξ επί ημ πθείζημκ. Ζ βθοηυγδ είκαζ, ιαγί ιε ηδ βθμοηαιίκδ, ηα δφμ ααζζηά ζοζηαηζηά πμο ηάκμοκ ηδκ ηοηηανζηή ιδπακή κα θεζημονβεί. Ζ βθοημθοηζηή πμνεία είκαζ αοηή πμο πανέπεζ δμιζηά ζοζηαηζηά ηαζ εκένβεζα ζημ ηφηηανμ ιε ηδ δζάζπαζδ ηδξ βθοηυγδξ ζε ιζηνυηενα ιυνζα. πεδζάζηδηε, θμζπυκ, ιζα πεζναιαηζηή δζαδζηαζία ηαηά ηδκ μπμία δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ ιμκμζαηπανζηχκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, ζε ηαθθζένβεζεξ

130 120 ηοηηάνςκ BHK. Με πνήζδ GC-MS ιεηααμθμιζηήξ ακάθοζδξ, ελεηάζηδηε δ δζαθμνμπμίδζδ ημο ιεηααμθζζιμφ αοηχκ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ. οβηνζηζηή ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ ΒΖΚ δζαθμνμπμζδιέκςκ ενεπηζηχκ ιέζςκ δεκ έπεζ ακαθενεεί ςξ ηχνα. φβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ Ζ επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ έδεζλε υηζ, ηαεχξ αολάκεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ βθοηυγδξ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ εκδμηοηηανζηχκ ιεηααμθζηχκ αολάκεηαζ επίζδξ. ημ εενιζηυ πάνηδ ημο πήιαημξ Γ.12, παναηδνμφιε ημ πνάζζκμ πνχια ζηα πνυηοπα ηςκ ιεηααμθζηχκ ηςκ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ Α ηαζ Β, πζμ ζημφνμ πνχια ζηα πνυηοπα ηδξ C ηαζ ηυηηζκμ πνχια ζηα πνυηοπα ηςκ D ηαζ Δ. Δίκαζ πνμθακέξ υηζ ηαεχξ δ βθοηυγδ αολάκεηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ, ηα ηφηηανα ανίζημοκ ηδκ ηφνζα αοηή πδβή άκεναηα ζε ιεβαθφηενδ αθεμκία ηαζ αολάκμοκ ηζξ ιεηααμθζηέξ ημοξ νμέξ ηαεχξ ηαζ ηζξ απμεήηεξ ηςκ ιεηααμθζηχκ. Ζ αφλδζδ πμθθχκ αιζκμλέςκ δείπκεζ αολδιέκεξ ακάβηεξ πνςηεσκμζφκεεζδξ, πνάβια πμο ελακαβηάγεζ ηα ηφηηανα κα πνμζθάαμοκ απαναίηδηα αιζκμλέα απυ ημ ενεπηζηυ ιέζμ. Πνμθακχξ δ βθοηυθοζδ ηαζ μ ηφηθμξ ημο ηζηνζημφ μλέμξ ανίζημκηαζ ζε ιεβαθφηενα επίπεδα, επίζδξ, υπςξ θαίκεηαζ απυ ημοξ ιεηααμθίηεξ ηςκ ιμκμπαηζχκ αοηχκ. Δίκαζ παναηηδνζζηζηυ απυ ημ HCl αθθά ηαζ απυ ημ βνάθδια ηδξ PCA, υηζ ηα πνυηοπα ηςκ δεζβιάηςκ πμο εηποθίζηδηακ ηαζ ακαθφεδηακ ζε άθθδ πνμκζηή ζηζβιή (D_week1, C_week3, E_week3), ειθακίγμοκ απμηθίζεζξ απυ ηα οπυθμζπα. Ζ ηακμκζημπμίδζδ δεκ απέδςζε ηα ακαιεκυιεκα. Σμ πεζναιαηζηυ ζθάθια, ίζςξ απμδεζηκφεηαζ ιεβάθμ ζηδ ζοβηεηνζιέκδ πενίπηςζδ. Οζ ζπεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ δεζβιάηςκ Δ_week2, B_week1 δείπκμοκ κα απμηθίκμοκ, επίζδξ.

131 121 α) Ιεραρχικι υςταδοποίθςθ (HCl) Μετρική απόςταςησ: Ευκλείδεια Standardized elative Peak Areas (stpas) πήια Γ. 12 φβηνζζδ ηοηηανμηαθθζενβεζχκ Α, Β, C, D ηαζ E. α) ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ, α) ακάθοζδ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ β) Ανάλυςθ Κφριων υνιςτωςών (PCA) Α B C B_week1 C_week3 D_week1 PC1: 45.7% PC2: 25.6% PC3: 9.03% E_week2