PapilloCheck. Οδηγίες χρήσης IVD

Transcript

1 HPV DNA-Chip Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Mάıς 2015 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

2 ΓΛΩΣΣΑΡΙΟ ΣΥΜΒΟΛΩΝ! el Αποθηκεύεται στα σκοτεινά το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ερεθιστικό HPV κωδικός DNA-Chip παρτίδας Σημαντική υπόδειξη en Store in the dark Use by Consult Instructions For Use Catalog Number In Vitro Dianostic Medical Device Manufacturer Temperature limitation Contents suffi cient for <n> tests Irritant Batch code Important Note de Im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalognummer Hersteller In-Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l abri de la lumière Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffi sant pour <n> tests irritant N o de lot Note importante es it pt nl Conservar en un lugar oscuro Nota importante Conservare al buio A utilizar preferiblemente antes de Da utilizzare entro e non oltre Antes de usar, lea las instrucciones Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Nota importante Conservar A utilizar Antes de PapilloCheck num local preferívelmente as inst- usar, leia escuro go antes de ruções Número de catálo- Número de catálogo Fabricante Produttore Fabricante Aviso importante Donker Tenminste Gebruik- Catalo- bewaren houdbaar saanwij- gusnum- tot zing lezen mer Fabrikant Producto medicinal de diagnóstica in vitro Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Producto medicinal de diagnóstica in vitro In vitro diagnostisch medisch product Limitação de temperatura Limitación de temperatura Contenido sufi ciente para <n> ensayos Limitazione temperatura Contenuto sufficiente per test <n> Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests irritante Irritante irritante Irriterend Código de lote Codice del lotto Código do lote Lot nummer Belangrijke opmerking da Opbevares mørkt Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test Lokalirriterende Lotnummer Vigtig henvisning sv pl no Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag Viktigt meddelande Przechowywa ć w ciemności Termin zydatności ΑΝΑΦ Läs bruksanvisningen före Przed użyciem przeczytać instrukcję Tillverkare Producent Διαγνωστικό κιτ για användning τύπου 6, 11, 16, 18, 31, apparatur 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, τον προσδιορισμό του nostisk γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα Katalognummer In vitromedicinsk doag- Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Produkt yw Ograniczenie temperatury Για διαγνωστική χρήση in vitro Oppbeva- holdbar til Les katalog- produsent in vitro-di- μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου res mørkt bruksanvisning før bruk nummer Temperatur-begränsning agnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning Innehållet räcker till <n> tester Zawartość wystarcza na <n> testów Innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterande Lot nummer drażniący Kod partii Ważne Αναθεώρηση: BQ irriterende batch nr. Viktig merknad tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı Katalog numarası Üretici fi rma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması Greiner okuyun Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0) İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Parti kodu Önemli Not 2

3 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΙΤ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ, ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΟ... HPV DNA-Chip6 3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ ΟΔΗΓΙΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενδεδειγμένη χρήση Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το Αρχή της δοκιμής Σχεδίαση του τσιπ DNA Διάταξη του τσιπ Μάρτυρες επάνω στο τσιπ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΡΟΗ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΤΟΥ PAPILLOCHECK Γενικές οδηγίες Διαχωρισμός αιθουσών Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Αποτροπή μόλυνσης Οδηγίες για το χειρισμό των τσιπ DNA Γενικές προφυλάξεις Ασφάλεια κατά την εργασία ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΟΥ PAPILLOCHECK Συλλογή δειγμάτων και εξαγωγή DNA Συλλογή δειγμάτων Εξαγωγή DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου...21 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων Κατεργασία (HPV) τύπου Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης 6, 11, 16, 18, 31, 33, (UNG) 35, 39, , 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, , 66, Προετοιμασία 68, 70, 73, 82 αντίδρασης σε τραχηλικά PCR...23 δείγματα 8.3 Υβριδισμός και πλύση...25 ΑΝΑΦ Παρασκευή και προετοιμασία...25 Για διαγνωστική Υβριδισμός χρήση...27 in vitro Αναθεώρηση: BQ μόνο από Πλύση εξειδικευμένο και στέγνωμα προσωπικό...29 εργαστηρίου 8.4 Σάρωση και αξιολόγηση του τσιπ...31 Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

4 9. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΟΥ PAPILLOCHECK HPV DNA-Chip 11.1 Αναλυτική απόδοση του Αναλυτική ευαισθησία Αναλυτική ειδικότητα τύποι HPV Αναλυτική ειδικότητα Οργανισμοί μη-hpv Επαναληψιμότητα Αναπαραγωγιμότητα Ευρωστία Κλινική απόδοση του ΣΥΝΤΟΜΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ PAPILLOCHECK Αίθουσα 2: PCR - Προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης Αίθουσα 2: PCR - Προσθήκη εκχυλισμένου DNA / αντίδραση PCR Αίθουσα 3: Υβριδισμός - Προετοιμασία / Αντίδραση υβριδισμού Αίθουσα 3: Πλύση και στέγνωμα / Σάρωση και αξιολόγηση...44 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

5 1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΙΤ Κιτ δοκιμασίας 1 Περιεχόμενο Ποσότητα PCR MasterMix Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών, 5 x 12 Διατάξεις 5 x PCR MasterMix 2 5 x 300 µl 1 x Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών με 5 τσιπ 3 HPV DNA-Chip 5 x 12 Διατάξεις Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού Συμπ. BUF A Συμπ. BUF Β 2 x Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού 2 x συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Α 2 x συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος B 2 x µl 2 x 40 ml 1 x 15 ml 1 Ένα κιτ δοκιμασίας επαρκεί για την ανάλυση 60 δειγμάτων. 2 Περιέχει όλα τα στοιχεία που απαιτούνται για την PCR εκτός από Πολυμεράση Taq DNA και Ουρακίλη-Ν-γλυκοσυλάση. 3 Ένα τσιπ περιέχει 12 μικροδιατάξεις. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

6 2. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ, ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΟ Το συνιστάται για χρήση σε συνδυασμό με τα αναγραφόμενα αναλώσιμα, τον εξοπλισμό και το υλικό και μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Αναλώσιμα Greiner Bio-One Αρ. Κατ. HPV Ποσότητα DNA-Chip Κιτ δοκιμασίας Κιτ δοκιμασίας για 60 αντιδράσεις Κιτ εξαγωγής DNA / Παρασκευή με μία στήλη ocheck Κιτ δοκιμασίας για 50 παρασκευές Αποστειρωμένα ρύγχη φίλτρου μικροπιπέτας ελεύθερα από DNase 1 Ρύγχη φίλτρου 0,5-10 µl Ρύγχη φίλτρου 0,5-20 µl Ρύγχη φίλτρου µl Ρύγχη φίλτρου µl Ρύγχη φίλτρου µl /960 96/960 96/960 96/960 60/600 Σωληνάρια αντίδρασης ελεύθερα από DNase Σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml Σωληνάριο αντίδρασης 0,2 ml 2 8 x 0,2 ml ταινίες PCR Ταινίες καπακιού για 8 x 0,2 ml ταινίες PCR / / / /1250 σωληνάριο πολυπροπυλενίου 50 ml /450 Πλαστικές πιπέτες για αυτόματη πιπέτα Πιπέτα 10 ml Πιπέτα 25 ml Πιπέτα 50 ml 760,180 ή 607, ,180 ή 760, ,180 ή 768,160 1/200 1/200 1/200 1 Ορισμένα από τα αναφερόμενα μεγέθη ρυγχών είναι προαιρετικά ανάλογα με τις διαθέσιμες μικροπιπέτες. 2 Κατ' αρχήν, συνιστάται η χρήση ταινιών PCR 8 σωληναρίων. Τα σωληνάρια μίας αντίδρασης (0,2 ml) είναι προαιρετικά εάν δεν υπάρχουν διαθέσιμες ταινίες. 3 Απαιτείται μόνο εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη φυγοκέντριση αντικειμενοφόρων πλακών. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

7 Εξοπλισμός Greiner Bio-One Αρ. Κατ. Ποσότητα CheckScanner TM Βασικό λογισμικό CheckReport TM Software Προσθήκη λογισμικού CheckReport TM Υπολογιστής για το CheckScanner και το λογισμικό CheckReport TM Software HPV DNA-Chip Θάλαμος υβριδισμού με θήκη αντικειμενοφόρων πλακών ocheck Λαβή για θήκη αντικειμενοφόρων πλακών Πλαίσιο πλύσης ocheck Απαιτούμενα ένζυμα Πολυμεράση Taq: Πολυμεράση DNA HotStarTaq 5 U/µl (Qiagen, , , , ) Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση: Ουρακίλη-DNA γλυκοσυλάση 1 U/µl (Fermentas, Αρ. EN0361, Αρ. EN0362) Πρόσθετα απαιτούμενα αναλώσιμα Νερό βαθμού PCR Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Γάντια μιας χρήσης Πρόσθετος απαιτούμενος εξοπλισμός Μικροφυγόκεντρος για σωληνάρια αντίδρασης 1,5 και 2 ml Φυγόκεντρος για σωληνάρια πολυπροπυλενίου 50 ml (π.χ. BeckmanCoulter, Φυγόκεντρος Allegra X-22, Ρότορας σταθερής γωνίας C0650) ή φυγόκεντρος αντικειμενοφόρων πλακών (π.χ. Labnet: Slide Spinner, VWR International: Galaxy MiniArray Centrifuge) Μικροφυγόκεντρος για μονά σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml ή ταινίες PCR 8 σωληναρίων (π.χ. Labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge) Συσκευή θερμικού κύκλου PCR: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) ή Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH). Υδατόλουτρο (50 C) Μικροπιπέτες (διαφορετικά εύρη από µl) Πολυπιπέτα Οδηγίες 8 καναλιών (εύρος: χρήσης 5-50 µl), π.χ. Brand Transferpette -8 (Brand) Αυτόματη πιπέτα για γυάλινες και πλαστικές πιπέτες Αναδευτήρας τύπου Vortex Στατώ για διάφορα σωληνάρια αντίδρασης Πρόσθετο απαιτούμενο υλικό Υπολογιστής (για τις απαιτήσεις συστήματος ανατρέξτε στις του CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport TM Software) 4 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των Για τη διαδικασία πλύσης του PapilloCheck θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, απαιτούνται τρία πλαίσια πλύσης ocheck 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43,. 5 Απαιτείται μόνο σε συνδυασμό με το είδος με Αρ. Κατ /55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

8 3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ Η μεταφορά του κιτ δοκιμασίας λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Παρόλα αυτά, το κιτ πρέπει να φυλάσσεται αμέσως μετά την παραλαβή στους 4-8 C και θα πρέπει να προστατεύεται από το φως. Εφόσον φυλάσσεται σωστά, το κιτ δοκιμασίας και τα στοιχεία του μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι την υποδεικνυόμενη ημερομηνία λήξης. Επιπλέον, HPV DNA-Chip υπό αυτές τις συνθήκες η διάρκεια ζωής του δεν αποκλίνει από την ημερομηνία λήξης όταν ανοιχτεί το κιτ και τα στοιχεία του για πρώτη φορά. 4. ΟΔΗΓΙΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Το κιτ δοκιμασίας προορίζεται μόνο για εργαστηριακή χρήση, όχι για φαρμακευτικούς, οικιακούς ή άλλους σκοπούς. Να φοράτε πάντα κατάλληλη εργαστηριακή ρόμπα, αναλώσιμα γάντια και προστατευτικά γυαλιά και να ακολουθείτε τις οδηγίες ασφαλείας που δίνονται σε αυτή την ενότητα. Τα ακόλουθα στοιχεία του κιτ δοκιμασίας περιέχουν επιβλαβείς ή επικίνδυνες ουσίες. Στοιχείο κιτ Επικίνδυνες ουσίες (Ποσότητα) Ταξινόμηση σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 Εικονόγραμμα και προειδοποιητική λέξη GHS Δηλώσεις επικινδυνότητας και προφυλάξεων Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού Θειοκυανική γουανιδίνη (20-60%) Αρ. CAS (κατηγορία 3) Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων Δωδεκυλοθειικό (HPV) τύπου ερεθισμός 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, H31540, 42, 43, 44/55, Προκαλεί 45, ερεθισμό 51, 52, του δέρματος 53, 56, 58, 59, 66, νάτριο 68, (< 70, 20%) 73, του 82 δέρματος σε τραχηλικά δείγματα H318 Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού Αρ. CAS ΑΝΑΦ οξεία τοξικότητα, από του στόματος, (κατηγορία 4), οξεία τοξικότητα, διά της εισπνοής, (κατηγορία 4), χρόνια τοξικότητα για το υδάτινο περιβάλλον, διάβρωση του δέρματος (κατηγορία 1c) (κατηγορία 2), σοβαρή οφθαλμική βλάβη, ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ Για διαγνωστική χρήση (κατηγορία in vitro 1) μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305+P351+ P338 Συμπληρωματικές πληροφορίες κινδύνου (ΕΕ): EUH032 P280 P305+P351+ P338 Επιβλαβές σε περίπτωση κατάποσης Επιβλαβές σε περίπτωση εισπνοής Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμικές βλάβες Επιβλαβές για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις Να αποφεύγεται η ελευθέρωση στο περιβάλλον Να φοράτε προστατευτικά γάντια/ προστατευτικά ενδύματα/μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/το πρόσωπο ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύντε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Καλέστε αμέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό Σε επαφή με οξέα ελευθερώνονται πολύ τοξικά αέρια Προκαλεί σοβαρή οφθαλμική βλάβη Να φοράτε προστατευτικά γάντια/ μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/το πρόσωπο Αναθεώρηση: BQ ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύντε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε Μπορείτε να λάβετε Greiner την τρέχουσα Bio-One GmbH έκδοση του Δελτίου δεδομένων ασφαλείας για αυτό το προϊόν από το δικτυακό τόπο Maybachstr. της Greiner 2 Bio-One: Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

9 5. ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Μετά την πλύση και το στέγνωμα του τσιπ του, μπορείτε να απορρίψετε τα διαλύματα πλύσης I, II και III χωρίς ειδικές προφυλάξεις. Απορρίπτετε το χρησιμοποιημένο τσιπ, τα μη χρησιμοποιημένα στοιχεία του κιτ, καθώς και το μη χρησιμοποιημένο μείγμα υβριδισμού με τα χημικά εργαστηριακά απόβλητα. Τηρείτε όλους τους εθνικούς, κρατικούς και HPV DNA-Chip τοπικούς κανονισμούς σχετικά με την απόρριψη. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

10 6. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η επίμονη λοίμωξη από τον καρκινογόνο ανθρώπινο ιό των θηλωμάτων (HPV) βρίσκεται σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις στον καρκίνο του τραχήλου τη δεύτερη συνηθέστερη μορφή καρκίνου σε γυναίκες σε όλο τον κόσμο. 1 Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότεροι από 100 τύποι του HPV, εκ των οποίων 40 τύποι περίπου είναι σεξουαλικά μεταδιδόμενοι και μολύνουν τη γεννητική HPV DNA-Chip βλεννογόνο. Οι τραχηλικοί τύποι του HPV ταξινομούνται τόσο στην ομάδα υψηλού κινδύνου (HPV υψηλού κινδύνου, hrhpv) όσο και χαμηλού κινδύνου (HPV χαμηλού κινδύνου, lrhpv). Ενώ οι τύποι HPV υψηλού κινδύνου συσχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου, οι τύποι HPV χαμηλού κινδύνου προκαλούν κυρίως καλοήθεις γεννητικούς σπίλους. 2 Ωστόσο, ακόμα και μέσα στην ομάδα υψηλού κινδύνου, ο σχετικός κίνδυνος για την ανάπτυξη καρκίνου ή τραχηλικών ενδοεπιθηλιακών βλαβών (CIN) εξαρτάται από τον τύπο. 3 Περίπου 70 % του συνόλου των περιστατικών καρκίνου του τραχήλου συνδέονται με επίμονη λοίμωξη από τον HPV 16 ή 18. Οι πιο κυρίαρχοι τύποι χαμηλού κινδύνου είναι οι HPV 6 και 11. Με βάση την σχεδόν απόλυτη αιτιολογική σύνδεση μεταξύ του καρκινογόνου HPV και του καρκίνου του τραχήλου, η εξέταση για hrhpv μελετάται πλέον για πρωτογενή προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου Ενδεδειγμένη χρήση Το είναι ένα διαγνωστικό κιτ και προορίζεται για χρήση στην ποιοτική ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου 24 τύπων του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων σε παρασκευές DNA από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα. Το κιτ προορίζεται για χρήση μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Το πληροί τις προϋποθέσεις της Οδηγίας για τα ιατροτεχνολογικά βοηθήματα που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση (98/79/ΕΚ) κι επομένως, φέρει το σύμβολο συμβατότητας "CE". Οποιοδήποτε διαγνωστικό αποτέλεσμα παράγεται με τη χρήση του θα πρέπει να ερμηνεύεται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 6.2 Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το Το επιτρέπει την ταυτοποίηση 18 τύπων υψηλού κινδύνου κινδύνου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) (Πίνακας 1). και 6 τύπων χαμηλού Πίνακας 1: Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των HPV θηλωμάτων 31 (HPV) τύπου 52 6, 11, HPV 16, 68 18, 31, 33, 35, HPV 39, 40 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα HPV 33 HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV ΑΝΑΦ HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV Για 39 διαγνωστική HPV χρήση 58 in vitro HPV 82 HPV 44 / HPV 55* μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου * Το δεν επιτρέπει διαφοροποίηση μεταξύ του HPV 44 και του HPV 55. Αναθεώρηση: BQ Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1): Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specificimplications in cervical neoplasia. Greiner Bio-One GmbH Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Maybachstr. Guidelines for human papillomavirus Frickenhausen DNA test requirements Germany for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. Τηλέφωνο: 124(3): (0) Fax +49 (0)

11 6.3 Αρχή της δοκιμής Το είναι ένα κιτ δοκιμασίας που βασίζεται σε μικροδιάταξη για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου ενός κλάσματος του γονιδίου E1 του γονιδιώματος του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV). Η διαδικασία δοκιμής συνοψίζεται στην Εικόνα 1. HPV DNA-Chip Πριν από την ανάλυση, πρέπει να εκτελεστεί εξαγωγή DNA από ένα δείγμα τραχηλικού επιχρίσματος. Η συλλογή δειγμάτων και η εξαγωγή DNA δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας. Διατίθενται επίσης ειδικά προϊόντα για τη συλλογή δείγματος (Κιτ Συλλογής ) και εξαγωγή DNA (ocheck Κιτ εξαγωγής DNA) από την Greiner Bio- One και μπορείτε να τα προμηθευτείτε ξεχωριστά (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Μετά από την εξαγωγή του ιικού και ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA από ένα τραχηλικό δείγμα, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 ενισχύεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) παρουσία ενός σετ HPV-ειδικών υγρών πλήρωσης. Στην ίδια αντίδραση, ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου μονού αντιγράφου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) ενισχύεται για την παρακολούθηση της παρουσίας ανθρώπινου υλικού δείγματος στο τραχηλικό δείγμα (μάρτυρας δείγματος) και ένας εσωτερικός εκχυλισμένος μάρτυρας που βρίσκεται στο PCR MasterMix ενισχύεται για την παρακολούθηση της απόδοσης του PCR (μάρτυρας PCR). Επιπλέον, το PCR MasterMix περιέχει dutp. Συνεπώς, μπορεί να εξαλειφθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR μέσω της χρήσης κατεργασίας Ουρακίλης-Ν-γλυκοσυλάσης (UNG) (βλ. κεφάλαιο 8.2.2). Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR υβριδοποιούνται σε ειδικούς ανιχνευτές DNA και σε μάρτυρες σε τσιπ που είναι συνδεδεμένα στην επιφάνεια του τσιπ του. Κάθε τσιπ περιέχει 12 DNA-μικροδιατάξεις, που επιτρέπουν ταυτόχρονη ανάλυση 12 τραχηλικών δειγμάτων. Κατά τον υβριδισμό, το δεσμευμένο DNA επισημαίνεται με φθορισμό και το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. Η αποτελεσματικότητα του υβριδισμού παρακολουθείται (μάρτυρας υβριδισμού). Τέλος, το τσιπ PapilloCheck σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται αυτόματα χρησιμοποιώντας το CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport TM Software, αντίστοιχα (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Το CheckScanner TM είναι ένας δίχρωμος σαρωτής λέιζερ (μήκη κύματος διέγερσης 532 nm και 635 nm), που επιτρέπει την ανίχνευση του σήματος φθορισμού που παράγεται από την παρουσία των HPV-ειδικών προϊόντων ενίσχυσης καθώς και των μαρτύρων (βλ. κεφάλαιο 6.4.2). Το λογισμικό CheckReport TM Software επιτρέπει την οπτικοποίηση, ανάλυση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων και εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές τόσο των ανιχνευμένων τύπων HPV όσο και των μαρτύρων σε μια λεπτομερή αναφορά. Η αναφορά Διαγνωστικό υποδεικνύει κιτ για με τον σαφήνεια προσδιορισμό την παρουσία του γονότυπου ή απουσία του ενός ανθρώπινου ή περισσότερων ιού των από τους 24 τύπους θηλωμάτων HPV που (HPV) είναι τύπου ανιχνεύσιμοι 6, 11, 16, και 18, οι περιεκτικοί 31, 33, 35, 39, μάρτυρες 40, 42, επάνω 43, 44/55, στο 45, τσιπ 51, καθιστούν 52, 53, 56, την ανάλυση 58, εξαιρετικά 59, 66, 68, αξιόπιστη. 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

12 1. Αντίδραση PCR HPV DNA-Chip 2. Υβριδοποίηση 3. Πλύση και στέγνωμα ή 4. Σάρωση και ανάλυση Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro Αναθεώρηση: BQ Εικόνα μόνο 1:Διαδικασία από εξειδικευμένο δοκιμής PapilloCheck προσωπικό εργαστηρίου 1. Αντίδραση PCR: Μετά από την εξαγωγή DNA, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 και κλάσματα δύο στόχων μαρτύρων ενισχύονται με PCR. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ενίσχυσης υβριδοποιούνται σε συμπληρωματικούς ανιχνευτές DNA στο τσιπ. 2. Υβριδοποίηση: Κάθε τύπος HPV ανιχνεύεται από έναν ειδικό ανιχνευτή DNA που υπάρχει σε πέντε αντίγραφα. Κατά τον υβριδισμό εισάγεται η σήμανση φθορισμού. 3. Πλύση και στέγνωμα: Το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. 4. Σάρωση και ανάλυση: Greiner Το τσιπ Bio-One PapilloCheck GmbH σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται χρησιμοποιώντας το CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport Maybachstr. TM Software Δημιουργείται Frickenhausen μια αναφορά Germany που υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων Τηλέφωνο: από τους τύπους (0) 7022 HPV που μπορούν Fax +49 να (0) ανιχνευτούν

13 6.4 Σχεδίαση του τσιπ DNA Διάταξη του τσιπ Κάθε τσιπ περιέχει 12 μικροδιατάξεις που καθορίζονται ως βοθρίο A1 - B6. Κάθε μικροδιάταξη αποτελείται από 28 διαφορετικούς ανιχνευτές και πλαισιώνεται από HPV DNA-Chip υπερυψωμένο χείλος. Κάθε ανιχνευτής εναποτίθεται σε κηλίδες σε πέντε αντίγραφα. Η διάταξη της μικροδιάταξης απεικονίζεται στην Εικόνα 2 και οι μάρτυρες επάνω στο τσιπ επεξηγούνται περαιτέρω στο Κεφάλαιο μάρτυρας προσανατολισμού Μάρτυρας PCR α) β) κόκκινο κανάλι (635 nm) πράσινο κανάλι (532 nm) γ) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 μάρτυρας υβριδισμού μάρτυρας προσανατολισμού HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 μάρτυρας υβριδισμού HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 μάρτυρας δείγματος Μάρτυρας PCR HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 μάρτυρας δείγματος Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα Εικόνα 2: Σχεδίαση του τσιπ α) Σχηματική ΑΝΑΦ. αναπαράσταση του τσιπ. β) και γ) Εικόνες που εμφανίζονται από το λογισμικό CheckReport TM Software για τα δύο διαφορετικά μήκη κύματος διέγερσης που χρησιμοποιούνται για σάρωση (β) κόκκινο Για κανάλι: διαγνωστική 635 nm, γ) πράσινο χρήση κανάλι: in vitro 532 nm) και σχηματικές αναπαραστάσεις της διάταξης Αναθεώρηση: μικροδιατάξεων BQ του PapilloCheck μόνο. Οι ειδικοί ανιχνευτές τύπου HPV και οι μάρτυρες επάνω στο τσιπ υποδεικνύονται. από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

14 6.4.2 Μάρτυρες επάνω στο τσιπ Η σχεδίαση του τσιπ DNA του ενσωματώνουν περιεκτικούς μάρτυρες επάνω στο τσιπ. Πολλά συστήματα ελέγχου παρακολουθούν όλα τα κρίσιμα βήματα τόσο της δοκιμής όσο και της επεξεργασίας του τσιπ, συμπεριλαμβανομένης της ποιότητας δείγματος και της εξαγωγής DNA (μάρτυρας δείγματος), της ποιότητας της αντίδρασης PCR (μάρτυρας PCR), της αποτελεσματικότητας του υβριδισμού (μάρτυρας υβριδισμού), καθώς και της ομοιογένειας κηλίδων και της ποιότητας HPV DNA-Chip εκτύπωσης (μάρτυρας προσανατολισμού και μάρτυρας εκτύπωσης). Εκτός από την παρουσία ή απουσία των τύπων HPV, το λογισμικό CheckReport Software εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές των μαρτύρων και τους ανιχνευμένους τύπους HPV σε μια λεπτομερή αναφορά. Για τη μέτρηση των διαφόρων μαρτύρων χρησιμοποιούνται και τα δύο μήκη κύματος διέγερσης του CheckScanner. Για το μάρτυρα της απόδοσης της δοκιμής (μάρτυρας δείγματος και PCR), χρησιμοποιείται το κόκκινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 635 nm), ενώ η ποιότητα του υβριδισμού και του τσιπ (μάρτυρας υβριδισμού, προσανατολισμού και εκτύπωσης) αποτιμάται στο πράσινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 532 nm). Μάρτυρας δείγματος Το παρακολουθεί την ποιότητα του δείγματος ή/και την εξαγωγή DNA ενισχύοντας ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) μονού αντιγράφου. Εάν υπάρχει ανθρώπινο DNA σε επαρκή ποσότητα στο DNA που έχει εξαχθεί από τραχηλικό δείγμα, παράγεται ένα σήμα φθορισμού στις κηλίδες του μάρτυρα δείγματος. Εάν δεν προκύψει καμία ή ανεπαρκής ενίσχυση ADAT1, το λογισμικό CheckReport Software θα υποδείξει ότι ο μάρτυρας δείγματος "απέτυχε" και πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση ως συνέπεια της ύπαρξης ανεπαρκούς ποσότητας κυττάρων στο τραχηλικό δείγμα ή/και ανεπαρκούς απόδοσης εξαγωγής (βλ. Κεφάλαιο 9). Μάρτυρας PCR Το παρακολουθεί επίσης την ποιότητα της αντίδρασης PCR. Η ενίσχυση ενός εσωτερικού εκχυλισμένου μάρτυρα που υπάρχει στο PCR MasterMix παράγει ένα σήμα στις κηλίδες μάρτυρα PCR που βρίσκονται στο τσιπ. Η ποιότητα της αντίδρασης ενίσχυσης αποτιμάται επίσης αυτόματα από το λογισμικό CheckReport Software. Εάν η απόδοση PCR είναι χαμηλότερη από ένα προκαθορισμένο κατώφλι, το λογισμικό CheckReport Software υποδεικνύει ότι ο μάρτυρας PCR "απέτυχε" και πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση (βλ. Κεφάλαιο 9). Εάν η ποσότητα DNA του HPV στο δείγμα είναι πολύ υψηλή, το σήμα φθορισμού των κηλίδων μάρτυρα PCR μπορεί να είναι χαμηλό ή ακόμα και να απουσιάζει λόγω ανταγωνισμού κατά την αντίδραση PCR. Σε αυτή την περίπτωση, το σήμα φθορισμού για έναν τουλάχιστον HPV-ειδικό ανιχνευτή πρέπει να υπερβαίνει ένα προκαθορισμένο κατώφλι, προκειμένου θα θεωρηθεί έγκυρη η δοκιμασία. Μάρτυρας υβριδισμού Το PapilloCheck Διαγνωστικό παρακολουθεί την αποτελεσματικότητα του υβριδισμού μέσω της χρήσης ενός κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των ανιχνευτή θηλωμάτων με σήμανση (HPV) φθορισμού τύπου 6, 11, που 16, βρίσκεται 18, 31, 33, μέσα 35, 39, στο 40, Ρυθμιστικό 42, 43, 44/55, διάλυμα 45, 51, υβριδισμού 52, 53, 56, του PapilloCheck 58, 59, 66,, το 68, οποίο 70, 73, υβριδοποιεί 82 σε τραχηλικά τις ειδικές δείγματα αλληλουχίες DNA στο τσιπ του. Μια επαρκής αποτελεσματικότητα υβριδισμού οδηγεί σε σήματα φθορισμού σε κάθε κηλίδα διάταξης. Τα αποτελέσματα ΑΝΑΦ. 465 πέντε 060κηλίδων μάρτυρα υβριδισμού στο τσιπ του αποτιμούνται επίσης από το λογισμικό CheckReport TM Software. Για διαγνωστική χρήση in vitro Αναθεώρηση: BQ μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Μάρτυρας προσανατολισμού και εκτύπωσης Οι κηλίδες μάρτυρα προσανατολισμού του τσιπ παράγουν σήματα φθορισμού ανεξάρτητα από την αποτελεσματικότητα της διεργασίας υβριδισμού. Αυτές οι κηλίδες χρησιμοποιούνται από το λογισμικό CheckReport TM Software ως σημεία καθοδήγησης για σωστό εντοπισμό των κηλίδων, που αποτελεί προαπαιτούμενο για τη σωστή ανάλυση των σημάτων. Επιπλέον, η ποιότητα της διεργασίας Greiner Bio-One GmbH εκτύπωσης παρακολουθείται από την παρουσία ενός πράσινου σήματος φθορισμού σε κάθε κηλίδα του Maybachstr Frickenhausen Germany τσιπ (μάρτυρας εκτύπωσης). Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

15 7. ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΡΟΗ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΤΟΥ PAPILLOCHECK 7.1 Γενικές οδηγίες Εάν στο εργαστήριο υλοποιούνται οι τρέχουσες χρησιμοποιούμενες τεχνικές αιχμής στη μοριακή βιολογία, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι παρακάτω οδηγίες ώστε να διασφαλίζεται τόσο η HPV DNA-Chip μέγιστη ασφάλεια για το εργαστηριακό προσωπικό όσο και αποτελέσματα υψηλής ποιότητας. Η εκτέλεση τεχνικών μοριακής βιολογίας όπως η εξαγωγή DNA, η ενίσχυση και η ανίχνευση των προϊόντων ενίσχυσης απαιτούν κατάλληλα εξειδικευμένο προσωπικό. Επιπλέον, απαιτείται σαφής και καλά δομημένη ροή εργασιών ώστε να αποτρέπονται εσφαλμένα αποτελέσματα, όπως αυτά που προκύπτουν λόγω εξασθένισης ή μόλυνσης του DNA από τα προϊόντα ενίσχυσης. Για να διασφαλιστεί αυτό, απαιτείται ο διαχωρισμός των χώρων εξαγωγής, ενίσχυσης και ανίχνευσης, όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο 7.2. Κάθε χώρος πρέπει να είναι εξοπλισμένος με ξεχωριστό εξοπλισμό, αναλώσιμα, εργαστηριακές ρόμπες και γάντια. Μην μεταφέρετε ποτέ εργαστηριακές ρόμπες, γάντια ή εξοπλισμό από τον ένα ξεχωριστό χώρο στον άλλο. 7.2 Διαχωρισμός αιθουσών Η Εικόνα 3 απεικονίζει ένα παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο μπορεί να διαχωριστεί το εργαστήριο σε τρεις ευδιάκριτες περιοχές. Η μια περιοχή χρησιμοποιείται μόνο για την εξαγωγή DNA, η άλλη για την προετοιμασία και την εκτέλεση αντιδράσεων PCR και η τελευταία για τον υβριδισμό και την ανάλυση. Κάθε αίθουσα χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την εφαρμογή ή την τεχνική που υποδεικνύεται, προκειμένου να αποτρέπεται η μόλυνση των δειγμάτων. Η χρήση χρωματικού κώδικα θα μπορούσε να είναι ωφέλιμη στην αποφυγή τυχαίας μεταφοράς εξοπλισμού και αναλωσίμων από τη μία περιοχή στην άλλη. Αίθουσα 1 Αίθουσα 2 Αίθουσα 3 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα Εικόνα 3: Διαχωρισμός αιθουσών Αίθουσα ΑΝΑΦ. 1: Ολόκληρη η διαδικασία εξαγωγής DNA πρέπει να εκτελείται σε αυτή την αίθουσα. Αίθουσα 2: Μέσα σε αυτή την αίθουσα, προετοιμάζεται και διαιρείται σε κλάσματα το μείγμα αντίδρασης για την αντίδραση PCR (ιδανικά κάτω από απαγωγό PCR). Η προσθήκη των δειγμάτων DNA που έχουν εξαχθεί στην Για διαγνωστική χρήση in vitro Αναθεώρηση: αίθουσα 1 πρέπει BQ να διενεργηθεί σε ξεχωριστό χώρο μέσα στην αίθουσα 2. Αίθουσα μόνο 3: Στην από τρίτη εξειδικευμένο αίθουσα του εργαστηρίου προσωπικό πραγματοποιούνται εργαστηρίου η αντίδραση υβριδισμού, τα βήματα πλύσης Απρίλιος και το 2011 στέγνωμα του τσιπ. Επιπλέον, το CheckScanner TM σε συνδυασμό με το λογισμικό CheckReport TM Software χρησιμοποιείται για την τελική ανάλυση της δοκιμής.! Δεν πρέπει να γίνεται ανταλλαγή εξοπλισμού ή αναλωσίμων μεταξύ των αιθουσών και των χώρων του εργαστηρίου. Συνεπώς, η ύπαρξη πολλαπλού εξοπλισμού και αναλωσίμων είναι απαραίτητη και θα πρέπει να λαμβάνεται Greiner υπόψη Bio-One κατά τον GmbH εξοπλισμό του εργαστηρίου. Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

16 7.3 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Αποτροπή μόλυνσης Σε όλη τη διάρκεια της διαδικασίας το προσωπικό πρέπει να φορά εργαστηριακές ρόμπες, ενώ για κάθε αίθουσα του εργαστηρίου απαιτούνται διαφορετικές εργαστηριακές ρόμπες. HPV DNA-Chip Το προσωπικό πρέπει να φορά γάντια σε κάθε βήμα της ανάλυσης και να τα αλλάζει συχνά, ιδιαίτερα κατά την εξαγωγή DNA. Το περιβάλλον εργασίας πρέπει να απολυμαίνεται με κατάλληλο διάλυμα καθαρισμού. Μην αγγίζετε ποτέ το εσωτερικό του καπακιού του σωληναρίου αντίδρασης. Για να αποφύγετε τη διασταυρούμενη επιμόλυνση, πρέπει να ανοίγετε μόνο ένα σωληνάριο κάθε φορά. Πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα ρύγχη φίλτρου μικροπιπέτας με συγκράτηση αερολυμάτων (ελεύθερα από DNase, RNase και ανθρώπινο DNA). Τα ρύγχη πιπέτας πρέπει να αντικαθίστανται πάντα μεταξύ των μεταφορών υγρού Οδηγίες για το χειρισμό των τσιπ DNA Τα τσιπ DNA θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε ένα περιβάλλον χωρίς σκόνη. Πρέπει να αποτρέπεται η εναπόθεση σκόνης και άλλων σωματιδίων στην επιφάνεια του τσιπ. Μην αγγίζετε τη ζώνη υβριδισμού στην επιφάνεια του τσιπ. Μόνο η επισημασμένη πλευρά του τσιπ προορίζεται για υβριδισμό. Μη χρησιμοποιείτε οποιουσδήποτε μαρκαδόρους για την ταυτοποίηση των τσιπ DNA, επειδή προκαλούν μη ειδικό φθορισμό στο τσιπ. Οι διατάξεις DNA προορίζονται για μία μόνο χρήση. Τα υβριδοποιημένα τσιπ δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ξανά. Φυλάσσετε τα μη χρησιμοποιημένα τσιπ στην αρχική συσκευασία μέσα στον ασκό αποστολής με φερμουάρ που περιέχει αφυγραντικό υλικό Γενικές προφυλάξεις Αυτό το κιτ προορίζεται αποκλειστικά και μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση και θα πρέπει να χρησιμοποιείται από προσωπικό που έχει καταρτιστεί στην in vitro διαγνωστική εργαστηριακή πρακτική. Κατά την άφιξή του, ελέγξτε τα στοιχεία του κιτ για βλάβη. Εάν ένα από τα περιεχόμενα είναι κατεστραμμένο (π.χ. οι φιάλες ρυθμιστικού διαλύματος), επικοινωνήστε με τον διανομέα της Greiner Bio-One της περιοχής σας. Μην χρησιμοποιείτε κατεστραμμένα περιεχόμενα του κιτ, καθώς η χρήση τους ενδέχεται να οδηγήσει σε κακή απόδοση του κιτ. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου μετά από την ημερομηνία λήξης. του ανθρώπινου ιού των Μην θηλωμάτων χρησιμοποιείτε (HPV) αντιδραστήρια τύπου 6, 11, που 16, 18, έχουν 31, λήξει. 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, Μην 58, αναμειγνύετε 59, 66, 68, 70, αντιδραστήρια 73, 82 σε τραχηλικά από διαφορετικές δείγματαπαρτίδες. Χρησιμοποιείτε μόνο τα αντιδραστήρια/τον εξοπλισμό που παρέχονται και συνιστώνται από τον ΑΝΑΦ κατασκευαστή. Θα Για πρέπει διαγνωστική να εκτελείτε χρήση τακτικά in vitro βαθμονόμηση/συντήρηση για τις μικροπιπέτες, Αναθεώρηση: το υδατόλουτρο BQ και μόνο το θερμικό από εξειδικευμένο μπλοκ. προσωπικό εργαστηρίου Η αναρρόφηση με πιπέτα μικρής ποσότητας υγρού της κλίμακας μικρολίτρων αποτελεί πρόκληση. Συνεπώς, απαιτείται προσοχή ώστε η αναρρόφηση με την πιπέτα να γίνεται όσο το δυνατόν με μεγαλύτερη ακρίβεια. Για την αποφυγή μικροβιακής μόλυνσης των αντιδραστηρίων, απαιτείται προσοχή κατά την αφαίρεση κλασμάτων Greiner από Bio-One τα σωληνάρια GmbH αντιδραστηρίων. Όλα τα βήματα Maybachstr. φυγοκέντρισης θα πρέπει Frickenhausen να διεξάγονται Germanyσε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C). Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

17 7.3.4 Ασφάλεια κατά την εργασία Να είστε προσεκτικοί κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων που περιέχουν δυνητικά μολυσματικά ανθρώπινα υλικά. Για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου μόλυνσης από δυνητικά μολυσματικό υλικό, συνιστάται να εργάζεστε υπό συνθήκες θαλάμου νηματικής ροής, μέχρι την ολοκλήρωση της λύσης των δειγμάτων. Να χειρίζεστε και να απορρίπτετε όλα τα βιολογικά δείγματα, όπως εάν υπήρχε πιθανότητα μετάδοσης μολυσματικών παραγόντων. HPV DNA-Chip Ποτέ μην αναρροφάτε με πιπέτα τα διαλύματα με το στόμα. Μην τρώτε, μην πίνετε, μην καπνίζετε και μην χρησιμοποιείτε καλλυντικά στους χώρους εργασίας. Αποφεύγετε την άμεση επαφή με τα βιολογικά δείγματα καθώς και την εκτόξευση ή τον ψεκασμό των δειγμάτων. Να φοράτε πάντα εργαστηριακή ρόμπα, γάντια και γυαλιά ασφαλείας κατά την εργασία με ανθρώπινα δείγματα. Πλένετε τα χέρια σας προσεκτικά μετά από το χειρισμό των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

18 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΟΥ Το παρακάτω κεφάλαιο περιγράφει λεπτομερώς τα διαφορετικά βήματα εργασίας που οδηγούν τελικά στη δημιουργία μιας λεπτομερούς αναφοράς, που υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων από τους 24 τύπους HPV που μπορούν να ανιχνευτούν σε κάθε τραχηλικό δείγμα που αναλύεται. Η Εικόνα 4 εμφανίζει μια επισκόπηση των διαφόρων απαραίτητων βημάτων εργασίας. Επίσης, υποδεικνύει το αντίστοιχο υπο-κεφάλαιο που περιγράφει το συγκεκριμένο βήμα δοκιμής. Τα βήματα εργασίας πρέπει να εκτελούνται με τη σειρά που περιγράφεται σε αυτό το κεφάλαιο. Κάθε συγκεκριμένο πρακτικό βήμα υποδεικνύεται με ένα μπλε βέλος.! Η συλλογή δειγμάτων, η εξαγωγή DNA και η ανάλυση με το λογισμικό CheckReport TM Software δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας Συνεπώς, η περιγραφή αυτών των βημάτων εργασίας συνοψίζεται σε αυτό το κεφάλαιο. Για πιο λεπτομερείς πληροφορίες, ανατρέξτε στις αντίστοιχες, π.χ. από το Κιτ συλλογής το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck και το λογισμικό CheckReport TM Software. 8.1 Συλλογή δειγμάτων και εξαγωγή DNA Συλλογή δειγμάτων Η συλλογή δειγμάτων δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας. Διατίθεται επίσης ειδικό κιτ συλλογής για τραχηλικά δείγματα (Κιτ συλλογής ) από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Το έχει επικυρωθεί με χρήση DNA που παρασκευάστηκε με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν με ένα από τα παρακάτω συστήματα ή μέσα συλλογής: Κιτ συλλογής (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) STM TM (Qiagen, Hilden, Germany) Easyfix (Labonord, Templemars, France) Cyt-All (Alphapath, Mauguio, France). Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα μέσα μεταφοράς ή τα συστήματα εξαγωγής DNA, επικοινωνήστε με τον τοπικό διανομέα της Greiner Bio-One ή συμβουλευτείτε το δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: 18

19 Κεφάλαιο Εξαγωγή DNA Κεφάλαιο 8.2 PCR Κεφάλαιο Υβριδισμός Κεφάλαιο Πλύση και στέγνωμα or Κεφάλαιο 8.4. Σάρωση και αξιολόγηση Εικόνα 4: Επισκόπηση των διαφόρων βημάτων εργασίας του 19

20 8.1.2 Εξαγωγή DNA Η εξαγωγή DNA δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας. Η εξαγωγή DNA πριν από την ανάλυση του πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck, το οποίο διατίθεται επίσης από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Ακολουθήστε προσεκτικά τις όταν χρησιμοποιείτε το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Για εξαγωγή DNA με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck, πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα δείγματος 250 µl. Δείγματα ανθρώπινου τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέγονται με το Κιτ συλλογής (Greiner Bio-One, Αρ. Κατ ) σε μέσο συλλογής PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) μπορούν να υποβληθούν απευθείας σε επεξεργασία. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) πρέπει να υποβάλλονται σε πλύση πριν από τη χρήση: φυγοκεντρίστε 250 µl του δείγματος για 5 λεπτά στα g και επανεναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής STM TM (Qiagen, Hilden, Germany) πρέπει να αραιωθούν: χρησιμοποιήστε 100 µl του δείγματος και προσθέστε 150 µl αποσταγμένο νερό. Η ποσότητα 250 µl του αραιωμένου δείγματος μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Γενικά, εάν το δείγμα του κολπικού επιχρίσματος φαίνεται να είναι υπερβολικά συμπυκνωμένο και ήδη συσσωματωμένο, το δείγμα πρέπει να αραιωθεί και να ομογενοποιηθεί πριν από την έναρξη της εξαγωγής DNA! Τα δείγματα κολπικού επιχρίσματος που είναι υπερβολικά αραιά και στα οποία δεν υπάρχουν ορατά κύτταρα πρέπει να συμπυκνώνονται, προκειμένου να επιτευχθεί υψηλότερος αριθμός κυττάρων για εξαγωγή DNA: φυγοκεντρίστε μέχρι 1000 µl του δείγματος για 5 λεπτά στα g και επανεναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck.! Αυτό το βήμα συγκέντρωσης είναι κατάλληλο μόνο για δείγματα τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέχθηκαν με το Κιτ συλλογής σε μέσο συλλογής PreservCyt ή σε μέσο συλλογής SurepathTM. Εάν χρησιμοποιήθηκε το μέσο συλλογής STM TM δεν είναι δυνατή η συγκέντρωση με φυγοκέντριση. 20

21 8.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει εξαιρετικά μικρές ποσότητες DNA. Πρέπει να τηρούνται ειδικές προφυλάξεις προκειμένου να αποφεύγεται μόλυνση της αντίδρασης (βλ. Κεφάλαιο 7). Απαιτείται Πολυμεράση HotStarTaq και Ουρακίλη-Ν-γλυκοσυλάση, αλλά δεν παρέχονται με το κιτ δοκιμασίας και πρέπει να τα προμηθευτείτε χωριστά (βλ. Κεφάλαιο 2).! Το Κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας Πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen και Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση από την Fermentas (βλ. πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτών των ενζύμων είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου Το κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί με τις ακόλουθες συσκευές θερμικού κύκλου: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).! Η χρήση μιας από τις συσκευές θερμικού κύκλου που αναφέρονται παραπάνω είναι απολύτως απαραίτητη για την επίτευξη της καθιερωμένης απόδοσης. Το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου για την PCR του συνοψίζεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Πρόγραμμα θερμικού κύκλου της PCR του Χρόνος Θερμ. C Αρ. κύκλων 20 λεπτά 37 C 1 15 λεπτά 95 C 1 30 δευτερόλεπτα 25 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 30 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Κράτηση 10 C Επιπλέον, πρέπει να ρυθμιστούν οι ακόλουθες παράμετροι εκτέλεσης για κάθε συσκευή θερμικού κύκλου. Για μια περιγραφή του τρόπου ρύθμισης αυτών των παραμέτρων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης της αντίστοιχης συσκευής θερμικού κύκλου. Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl, την ταχύτητα ράμπας σε "9600" και χρησιμοποιήστε θερμοκρασία καλύμματος 103 C. Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) Χρησιμοποιήστε το εργαλείο Μετατροπής μεθόδου της Συσκευής θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti για εισαγωγή στο πρόγραμμα PCR του και επιλέξτε τη λειτουργία "9600 Emulation Mode" (Λειτουργία προσομοίωσης 9600). Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl και τη θερμοκρασία του καλύμματος στους 103 C. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Χρησιμοποιήστε το προ-προγραμματισμένο πρόγραμμα PCR του PapilloCheck. js το οποίο παρέχεται μαζί με τη συσκευή θερμικού κύκλου. Συνήθως μπορείτε να ανοίξετε το 21

22 πρόγραμμα από την ακόλουθη διαδρομή: local/scripts/greinerbioone/papillocheck.js Κατεργασία Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης (UNG) 5 Το PCR MasterMix περιέχει dutp που ενσωματώνεται στα προϊόντα ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της PCR του, καθιστώντας τα προϊόντα PCR ευαίσθητα σε εξασθένιση από την UNG. Η UNG διασπά το προϊόν της PCR σε σημεία που έχει ενσωματωθεί υπόλειμμα deoxyuridylate. Τα διασπασμένα προϊόντα PCR δεν θα ενισχυθούν σε επόμενη αντίδραση. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια κατεργασία UNG για την εξάλειψη της επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR. 6 Αραιώστε την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση 1:200 σε νερό βαθμού PCR. Χρησιμοποιήστε μια νέα αραίωση UNG για κάθε προετοιμασία αντίδρασης PCR του (βλ. Κεφάλαιο 8.2.3). Μην επαναχρησιμοποιείτε το αραιωμένο UNG. Αναμίξτε προσεκτικά την αραίωση UNG με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Η αρχική συγκέντρωση της Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης είναι 1 U/µl. Κατά συνέπεια, η συγκέντρωση της αραίωσης είναι 0,005 U/µl.! Το Κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση από την Fermentas (βλ. Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση. Προσθέστε 1 µl από αυτή την αραίωση σε κάθε αντίδραση PCR (βλ. Κεφάλαιο 8.2.3, Πίνακας 3). Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για να εξαλειφθεί η επιμόλυνση μεταφοράς της PCR. Φροντίστε να μην χρησιμοποιήσετε διάλυμα UNG με υψηλότερη συγκέντρωση, καθώς αυτό μπορεί να έχει αρνητικό αποτέλεσμα στην απόδοση της PCR και να οδηγήσει σε μειωμένη ευαισθησία του. Γενικά, για κατεργασία UNG, το μείγμα αντίδρασης PCR επωάζεται για 20 λεπτά στους 37 C. Συνεπώς, το UNG αδρανοποιείται με ένα πρόσθετο βήμα επώασης διάρκειας 15 λεπτών στους 95 C. Αυτά τα δύο βήματα ενσωματώνονται ήδη στην PCR του και αντιστοιχούν στα πρώτα δύο βήματα του προγράμματος της συσκευής θερμικού κύκλου (βλ. Πίνακα 2). Στο δεύτερο βήμα (15 λεπτά στους 95 C) προκύπτει τόσο η αδρανοποίηση της Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης όσο και η ενεργοποίηση Το ενσωματωμένο της Πολυμεράσης σύστημα UNG του HotStarTaq PCR του.! εξαλείφει μόνο τη μόλυνση μεταφοράς με προϊόντα PCR από προηγούμενες αντιδράσεις PCR. Δεν μπορούν να εξαλειφθούν άλλες μολύνσεις, που προκύπτουν για παράδειγμα κατά τη διάρκεια της παρασκευής δειγμάτων, εξαγωγής DNA ή προσθήκης εκχυλίσματος PCR. Συνεπώς, είναι απαραίτητο να τηρούνται οι οδηγίες και οι ειδικές προφυλάξεις για την πρόληψη μόλυνσης που περιγράφονται στο Κεφάλαιο 7. 5 Η προμήθεια του PapilloCheck συνοδεύεται από περιορισμένη άδεια χρήσης σύμφωνα με τους Αριθμούς Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας Η.Π.Α. 5,035,996, 5,683,896, 5,945,313, 6,287,823 και 6,518,026 και τα αντίστοιχα ξένα διπλώματα ευρεσιτεχνίας. 6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, ,

23 8.2.3 Προετοιμασία αντίδρασης PCR Με εξαίρεση την Πολυμεράση HotStarTaq και την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση, το PCR MasterMix περιέχει ήδη όλα τα στοιχεία για την εκτέλεση της αντίδρασης PCR (ρυθμιστικό διάλυμα PCR, MgCl 2, dntp, υγρά πλήρωσης, εκχυλισμένο μάρτυρα PCR).! Το κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας Πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen (βλ. Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση. Η προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης εκτελείται ιδανικά σε προστατευόμενο περιβάλλον, π.χ. απαγωγός PCR, για την αποφυγή αντίδρασης μόλυνσης. Προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης (που αποτελείται από PCR MasterMix, Πολυμεράση HotStarTaq και Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση) για την απαιτούμενη ποσότητα των αντιδράσεων PCR όπως περιγράφεται στον Πίνακα 3. Για να αναλύσετε πολλαπλά δείγματα, το μείγμα αντίδρασης θα πρέπει να παρασκευαστεί σε μια πατρίδα (στην ποσότητα που απαιτείται για όλες τις αναλύσεις). Για να ρυθμίσετε τις διακυμάνσεις όγκου κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, συνιστάται να αυξήσετε τον αριθμό αντιδράσεων (n) κατά 1 για κάθε τσιπ (=n+1), π.χ. παρασκευάστε έναν όγκο μείγματος αντίδρασης για 13 αντιδράσεις ενίσχυσης εάν πρόκειται να δοκιμαστούν 12 δείγματα (βλ. Πίνακα 3). Χρησιμοποιείτε πάντα ένα φιαλίδιο MasterMix για τις αντιδράσεις ενός τσιπ.! Συνιστάται να συμπεριλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας για κάθε παρτίδα PCR MasterMix που παρασκευάζεται. Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης DNA του κατάλληλου κιτ εξαγωγής DNA ή νερό βαθμού PCR. Αναμίξτε καλά το μείγμα αντίδρασης με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Διαιρέστε το μείγμα αντίδρασης σε κλάσματα αναρροφώντας με πιπέτα 21 µl του μείγματος αντίδρασης για κάθε αντίδραση PCR σε ένα σωληνάριο αντίδρασης PCR 0,2 ml λεπτού τοιχώματος. Διενεργήστε προσθήκη του εκχυλισμένου DNA σε ξεχωριστό χώρο εργασίας, στη συνέχεια προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης (βλ. Κεφάλαιο 7.2). Προσθέστε 5 µl DNA εξαγωγής σε κάθε αντίδραση PCR και αναμίξτε με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωσης αρκετές φορές. Ο συνολικός όγκος μίας αντίδρασης PCR είναι 26 µl. Τοποθετήστε τα σωληνάρια αντίδρασης στη συσκευή θερμικού κύκλου και ξεκινήστε την αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου που περιγράφεται στο Κεφάλαιο (Πίνακας 2).! Μετά από την ολοκλήρωση της PCR, τα προϊόντα ενίσχυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αμέσως για υβριδισμό ή να φυλάσσονται σε σκοτεινό μέρος στους -20 C για μία εβδομάδα. 23

24 Πίνακας 3: Προετοιμασία της αντίδρασης PCR 1 αντίδραση 13 αντιδράσεις (1 τσιπ) 26 αντιδράσεις (2 τσιπ) 39 αντιδράσεις (3 τσιπ) 52 αντιδράσεις (4 τσιπ) PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl Πολυμεράση HotStarTaq (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση (Αραίωση 1:200, 0,005 U/µl) Συνολικός όγκος πριν από την προσθήκη του δείγματος DNA DNA εξαγωγής από το τραχηλικό δείγμα (εκχυλισμένο DNA) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl 5 µl Συνολικός όγκος ανά αντίδραση 26 µl 24

25 8.3 Υβριδισμός και πλύση Παρασκευή και προετοιμασία Ο υβριδισμός πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). Αρχίστε με τις απαραίτητες παρασκευές για τον υβριδισμό και τα βήματα πλύσης 30 λεπτά τουλάχιστον πριν από την έναρξη της διαδικασίας υβριδισμού. Για να διαλύσετε δυνητικά ιζήματα στα ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού και πλύσης, εκθέστε τα σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) για 30 λεπτά και αναμίξτε καλά πριν από τη χρήση. Η φύλαξη του κιτ δοκιμασίας στους 4-8 C ενδέχεται να οδηγήσει σε ίζημα του SDS στο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού και το Ρυθμιστικό διάλυμα Β. Αφήστε τα διαλύματα να εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια περιδινήστε το σωληνάριο ή αναδεύστε τη φιάλη μέχρι να διαλυθούν τυχόν ιζήματα. Προετοιμάστε το Θάλαμο υβριδισμού ocheck : Τοποθετήστε μια νέα υγρή χάρτινη πετσέτα μέσα στο Θάλαμο υβριδισμού και κλείστε το κάλυμμα για να δημιουργηθεί μια ατμόσφαιρα κορεσμένη από υγρασία. Για αποφυγή εξάτμισης του μικρού όγκου χρησιμοποιημένου μείγματος υβριδισμού επάνω στο τσιπ, η εκτέλεση του υβριδισμού πρέπει να διενεργηθεί σε ατμόσφαιρα με κορεσμό υγρασίας. Διατίθεται ειδικός Θάλαμος υβριδισμού για την ανάλυση από την Greiner Bio-One (βλ. Κεφάλαιο 2). Επωάστε την απαιτούμενη ποσότητα τσιπ στον προετοιμασμένο Θάλαμο υβριδισμού σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) για 10 λεπτά τουλάχιστον.! Η μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών του Θαλάμου υβριδισμού περιέχει μόνον ένα μαγνήτη στο ένα από τα δύο άκρα. Εάν πρόκειται να υβριδοποιηθούν παράλληλα λιγότερα από τέσσερα τσιπ, φροντίστε να πληρώσετε τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών με τσιπ από την αντίθετη πλευρά του μαγνήτη. Διαφορετικά, τα τσιπ δεν θα καλυφτούν με υγρό κατά τη διαδικασία πλύσης. Παρασκευάστε τα διαλύματα πλύσης I, II και III σύμφωνα με τις παρακάτω οδηγίες. Προετοιμασία των διαλυμάτων πλύσης I, II και III: Προετοιμάστε το μείγμα διαλύματος πλύσης για τα διαλύματα πλύσης I, II και III που είναι κατάλληλα για τον αριθμό τσιπ του που θα αναλυθούν, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Διαιρέστε τρεις ίσες ποσότητες του μείγματος διαλύματος πλύσης σε τρία ξεχωριστά Πλαίσια πλύσης ocheck και επισημάνετέ τα ως διάλυμα πλύσης I, II και III. Ελέγξτε ότι το πλαίσιο πλύσης ocheck περιέχει μια χαραγμένη κλίμακα, που υποδεικνύει τη σωστή ποσότητα διαλύματος πλύσης που απαιτείται για μέχρι 4 τσιπ. Χρησιμοποιήστε αυτή την κλίμακα για να ελέγξετε την ποιότητα του ρυθμιστικού διαλύματος. Προθερμάνετε το διάλυμα πλύσης II στους 50 C σε ένα υδατόλουτρο με ελεγχόμενη θερμοκρασία για 20 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. Βεβαιωθείτε ότι το επίπεδο πλήρωσης του υδατόλουτρου ισούται με το επίπεδο πλήρωσης του διαλύματος πλύσης II. 25

26 Πίνακας 4: Προετοιμασία του μείγματος διαλύματος πλύσης Οι όγκοι που συνοψίζονται σε αυτό τον πίνακα επαρκούν και για τα τρία βήματα πλύσης (διαλύματα πλύσης I, II και III) για τον υποδεικνυόμενο αριθμό τσιπ. Αριθμός τσιπ Στοιχεία Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Α 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Β 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Συνολικός όγκος 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml! Μην επαναχρησιμοποιείτε ποτέ τα διαλύματα πλύσης επειδή αυτό μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση του εκπλυμένου προϊόντος PCR το οποίο μπορεί δυνητικά να παρεμβληθεί με τα αποτελέσματα του. Χρησιμοποιείτε νέα διαλύματα πλύσης για κάθε δοκιμή. Το παρασκευασμένο μείγμα διαλύματος πλύσης μπορεί να φυλάσσεται για διάστημα μέχρι μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου. Ελέγξτε εάν έχει προκύψει ίζημα του SDS. Εάν υπάρχει, θερμάνετε το μείγμα διαλύματος πλύσης μέχρι να διαλυθεί το ίζημα και εξισορροπήστε ξανά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προετοιμαστείτε για το επόμενο πείραμα υβριδισμού. 26

27 8.3.2 Υβριδισμός Ο υβριδισμός πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). Τα κύρια βήματα εργασίας για τον υβριδισμό των προϊόντων PCR της αντίδρασης PCR του στο τσιπ απεικονίζονται στην Εικόνα 5. Αναμίξτε τα προϊόντα PCR πριν από τη χρήση. Περιδινήστε σύντομα. Εάν τα προϊόντα PCR φυλάσσονταν στους -20 C μέχρι τον υβριδισμό, αποψύξτε πρώτα τα προϊόντα PCR πριν από την ανάμιξη και στη συνέχεια προχωρήστε όπως περιγράφεται. Περιδινήστε το Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού πριν από τη χρήση. Περιδινήστε σύντομα. Αναμίξτε 30 µl από το Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού σε ένα νέο σωληνάριο αντίδρασης μιας ταινίας PCR 8x με 5 µl από το προϊόν PCR με ανάδευση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Περιδινήστε σύντομα. Μεταφέρετε 25 µl από το μείγμα υβριδισμού σε κάθε βοθρίο τσιπ χρησιμοποιώντας έξι κανάλια μιας πολυκάναλης πιπέτας. Αποφεύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα! Συνιστάται να επεξεργάζεστε έξι δείγματα παράλληλα χρησιμοποιώντας μια πολυπιπέτα 8 καναλιών και ταινίες PCR 8x (βλ. Εικόνα 5). Αυτό αυξάνει την αποτελεσματικότητα χειρισμού, την ταχύτητα και κατά συνέπεια μειώνει τον κίνδυνο εξάτμισης. Η χρήση πολυπιπέτας είναι υποχρεωτική εάν πρόκειται να υποβάλετε σε επεξεργασία αμέσως περισσότερες από μία αντικειμενοφόρους πλάκες, προκειμένου να επιτευχθεί ο σωστός χρόνος υβριδισμού. Εάν είναι δυνατόν, υβριδοποιήστε και τα 12 βοθρία του τσιπ. Σε περίπτωση επεξεργασίας λιγότερων από 12 δειγμάτων, αφήστε κενά τα βοθρία που δεν χρησιμοποιούνται. Τα μη χρησιμοποιημένα βοθρία σε ένα τσιπ που έχει υποβληθεί σε επεξεργασία δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μελλοντικά δείγματα.! Να χειρίζεστε το τσιπ με προσοχή ώστε να αποφεύγονται κηλίδες του μείγματος υβριδισμού. Οι κηλίδες μπορεί να οδηγήσουν σε διασταυρούμενη επιμόλυνση των δειγμάτων και σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Επωάστε το τσιπ για 15 λεπτά ακριβώς σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) μέσα στον προετοιμασμένο Θάλαμο υβριδισμού σε σκοτεινή, κορεσμένη από υγρασία ατμόσφαιρα. Προσέξτε ώστε να μην μετακινήσετε το Θάλαμο υβριδισμού κατά τη διάρκεια του υβριδισμού.! Μην αλλάζετε ποτέ το χρόνο επώασης ή τη θερμοκρασία της αντίδρασης υβριδισμού, επειδή αυτό μπορεί να προκαλέσει απώλεια της έντασης του σήματος φθορισμού ή αύξηση του μη ειδικού φθορισμού. Μην εκθέτετε τα υβριδοποιημένα τσιπ σε απευθείας φως του ηλίου. 27

28 Προετοιμάστε κορεσμένη από υγρασία ατμόσφαιρα στο Θάλαμο υβριδισμού. Επωάστε την απαιτούμενη ποσότητα τσιπ στο Θάλαμο υβριδισμού σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) (βλ. Κεφάλαιο 8.3.1). Αναμίξτε 30 µl από το Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού σε ένα σωληνάριο αντίδρασης 0,2 ml μιας ταινίας PCR με 5 µl του προϊόντος PCR. Αναμίξτε καλά. Μεταφέρετε 25 µl από το μείγμα υβριδισμού σε κάθε βοθρίο του τσιπ του χρησιμοποιώντας μια πολυκάναλη πιπέτα. Κλείστε το Θάλαμο υβριδισμού και επωάστε το τσιπ για 15 λεπτά ακριβώς σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). Εικόνα 5: Βήματα εργασίας της διαδικασίας υβριδισμού 28

29 8.3.3 Πλύση και στέγνωμα Ο ειδικός εξοπλισμός που παρέχεται από την Greiner Bio-One επιτρέπει την παράλληλη πλύση μέχρι τεσσάρων τσιπ (βλ. Κεφάλαιο 2). Ο επιπλέον εξοπλισμός που απαιτείται για την επεξεργασία των τσιπ αποτελείται από τρία Πλαίσια πλύσης ocheck και μια λαβή για τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών του Θαλάμου υβριδισμού. Τα διάφορα βήματα εργασίας απεικονίζονται στην Εικόνα 6. Αφαιρέστε προσεκτικά τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών που περιέχει τις υβριδοποιημένες αντικειμενοφόρους πλάκες από το Θάλαμο υβριδισμού. Τοποθετήστε τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών που περιέχει τις αντικειμενοφόρους πλάκες απευθείας στο Πλαίσιο πλύσης ocheck που περιέχει το διάλυμα πλύσης I. Βεβαιωθείτε ότι η μαγνητική πλευρά είναι προς τα επάνω. Συνδέστε τη Λαβή του ocheck στη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών και ξεκινήστε το πρώτο από τα τρία βήματα πλύσης. Πλύνετε το τσιπ σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) σε διάλυμα πλύσης I μετακινώντας το γρήγορα επάνω-κάτω για 10 δευτερόλεπτα. Οι διατάξεις πρέπει να παραμένουν διαρκώς καλυμμένες με διάλυμα πλύσης. Πλύνετε το τσιπ για 60 δευτερόλεπτα σε διάλυμα πλύσης II στους 50 C μετακινώντας έντονα τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών επάνω και κάτω. Πλύνετε το τσιπ σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) σε διάλυμα πλύσης III μετακινώντας το γρήγορα επάνω-κάτω για 10 δευτερόλεπτα. Αμέσως, αφαιρέστε τυχόν υγρό από την επιφάνεια του τσιπ με φυγοκέντριση. Εάν χρησιμοποιείτε ειδικό φυγόκεντρο για μικροδιατάξεις, φυγοκεντρίστε για 1 λεπτό. Εάν χρησιμοποιείτε φυγόκεντρο που εφαρμόζεται για σωληνάρια 50 ml, τοποθετήστε κάθε πλυμένο τσιπ σε ένα σωληνάριο 50 ml και φυγοκεντρίστε σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά στα 500 g. Το τσιπ είναι τώρα έτοιμο για σάρωση και θα πρέπει να σαρωθεί αμέσως. Για καθαρισμό των Πλαισίων πλύσης του ocheck, εκπλύνετε αρκετές φορές με νερό μετά από κάθε ολοκληρωμένη διαδικασία πλύσης και στεγνώματος. 29

30 Πρώτο βήμα πλύσης Αφαιρέστε προσεκτικά τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρου πλάκας από το Θάλαμο υβριδισμού. Τοποθετήστε γρήγορα τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών μέσα στο Πλαίσιο πλύσης του ocheck με το διάλυμα πλύσης I Συνδέστε τη Λαβή του ocheck Πλύνετε το ή τα τσιπ σε διάλυμα πλύσης I σε θερμοκρασία δωματίου για 10 δευτερόλεπτα κουνώντας τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών πάνω και κάτω Δεύτερο βήμα πλύσης Πλύνετε το ή τα τσιπ σε διάλυμα πλύσης II σε υδατόλουτρο 50 C για 60 δευτερόλεπτα κουνώντας τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών πάνω και κάτω. Τρίτο βήμα πλύσης Πλύνετε το ή τα τσιπ σε διάλυμα πλύσης III σε θερμοκρασία δωματίου για 10 δευτερόλεπτα κουνώντας τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών πάνω και κάτω Στέγνωμα Αφαιρέστε αμέσως τυχόν υγρό από την επιφάνεια των τσιπ με φυγοκέντριση ή 3 λεπτά 500 g 1 λεπτό μέγιστη ταχύτητα Εικόνα 6: Βήματα εργασίας της διαδικασίας πλύσης Διαφορετικά βήματα πλύσης και διαδικασία στεγνώματος πριν από την ανάλυση του τσιπ με το CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport TM Software. 30

31 8.4 Σάρωση και αξιολόγηση του τσιπ Τοποθετήστε το ή τα τσιπ στο CheckScanner TM και προχωρήστε με τη σάρωση όπως περιγράφεται λεπτομερώς στον Οδηγό Χρήσης του λογισμικού CheckReport TM Software. Για περισσότερες λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την εγκατάσταση του CheckScanner TM και του λογισμικού CheckReport TM Software, καθώς και τις απαιτήσεις του συστήματος υπολογιστή, συμβουλευτείτε τις αντίστοιχες Οδηγίες Χρήσης του CheckScanner TM και του λογισμικού CheckReport TM Software. Όταν αναλύονται δεδομένα με τη χρήση του λογισμικού CheckReport TM Software, βεβαιωθείτε ότι η έκδοση του λογισμικού CheckReport TM Software που είναι εγκατεστημένο στον υπολογιστή σας αντιστοιχεί στην έκδοση που υποδεικνύεται στο τρέχον κιτ του που χρησιμοποιείται. Εάν δεν αντιστοιχούν οι εκδόσεις, ενημερώστε το λογισμικό CheckReport TM Software. Λήψη της πιο πρόσφατης έκδοσης λογισμικού μπορεί να πραγματοποιηθεί από το δικτυακό τόπο της Greiner Bio- One: 31

32 9. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ Εάν προκύψει ένα από τα παρακάτω μηνύματα σφάλματος κατά τη διάρκεια της σάρωσης τσιπ ή εάν αποτύχει η ανάλυση εξ' αιτίας των ειδικών μαρτύρων που βρίσκονται επάνω στο τσιπ, προχωρήστε όπως περιγράφεται παρακάτω. Εάν έχετε ερωτήσεις ή αντιμετωπίζετε δυσκολίες κατά τη χρήση του επικοινωνήσετε με τον τοπικό διανομέα της Greiner Bio-One. HPV DNA-Chip ΠΡΟΒΛΗΜΑ και αιτία Σχόλια και προτάσεις ΜΗΝΥΜΑ ΣΦΑΛΜΑΤΟΣ "COULD NOT READ BARCODE" (ΑΔΥΝΑΤΗ Η ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΡΑΜΜΩΤΟΥ ΚΩΔΙΚΑ) Κατεστραμμένος γραμμωτός κώδικας Ελέγξτε τον γραμμωτό κώδικα για αλλοίωση. Καταχωρίστε χειροκίνητα το γραμμωτό κώδικα όταν εμφανιστεί το κατάλληλο παράθυρο. Το τσιπ δεν φορτώθηκε σωστά Ελέγξτε τον προσανατολισμό του τσιπ και σαρώστε με το σωστό προσανατολισμό. ΜΗΝΥΜΑ ΣΦΑΛΜΑΤΟΣ "MISSING SPOTS" (ΕΛΛΙΠΕΙΣ ΚΗΛΙΔΕΣ), ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑ ΕΚΤΥΠΩΣΗΣ Η ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Σκόνη στο τσιπ Επαναλάβετε τον υβριδισμό του προϊόντος ή των προϊόντων PCR σε άλλο τσιπ. Σχηματισμός φυσαλίδων αέρα κατά τη μεταφορά υγρού στο τσιπ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ Εσφαλμένη θερμοκρασία διαλύματος πλύσης II Εσφαλμένη θερμοκρασία υδατόλουτρου Λάθος προετοιμασία του μείγματος υβριδισμού Επαναλάβετε τον υβριδισμό του προϊόντος ή των προϊόντων PCR σε άλλο τσιπ. Αναρροφήστε με πιπέτα προσεκτικά για αποφυγή του σχηματισμού φυσαλίδων αέρα. Το δεύτερο βήμα πλύσης πρέπει να εκτελεστεί στους 50 C. Βεβαιωθείτε ότι το διάλυμα πλύσης II έχει θερμανθεί στους 50 C. Το δεύτερο βήμα πλύσης πρέπει να εκτελεστεί στους 50 C. Ελέγξτε τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου. Βεβαιωθείτε ότι το υδατόλουτρο έχει ρυθμιστεί σε θερμοκρασία 50 C. Εάν είναι απαραίτητο, επιβεβαιώστε τη θερμοκρασία χρησιμοποιώντας θερμόμετρο. Επαναλάβετε την προετοιμασία του μείγματος υβριδισμού με τους σωστούς όγκους και υβριδοποιήστε τα προϊόντα PCR σε άλλο τσιπ. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

33 ΠΡΟΒΛΗΜΑ και αιτία Σχόλια και προτάσεις ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑ PCR Καμία προσθήκη Πολυμεράσης DNA HotStarTaq στο MasterMix Προσθήκη Πολυμεράσης DNA HotStarTaq που δεν λειτουργεί σωστά στο MasterMix Προσθήκη μη αραιωμένης Ουρακίλης- N-γλυκοσυλάσης στο MasterMix Ανεπαρκής ανάμειξη του μείγματος αντίδρασης Υπάρχουν αναστολείς PCR στο δείγμα Ο υβριδισμός εκτελέστηκε χωρίς την προσθήκη του προϊόντος PCR Επαναλάβετε την ανάλυση αρχίζοντας με την προετοιμασία της αντίδρασης PCR. HPV DNA-Chip Επαναλάβετε την ανάλυση αρχίζοντας με την προετοιμασία της αντίδρασης PCR. Επαναλάβετε την ανάλυση αρχίζοντας με την προετοιμασία της αντίδρασης PCR Επαναλάβετε την ανάλυση αρχίζοντας με την προετοιμασία της αντίδρασης PCR. Φροντίστε να ανακατέψετε καλά το μείγμα αντίδρασης. Επαναλάβετε την εξαγωγή DNA και την ανάλυση. Επαναλάβετε τον υβριδισμό. Ανεπαρκής ανάμειξη του Μείγματος υβριδισμού Επαναλάβετε τον υβριδισμό. Προβλήματα με τη συσκευή θερμικού κύκλου ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Καμία προσθήκη δείγματος DNA στην αντίδραση PCR Αποτυχία προετοιμασίας DNA Ανεπαρκές υλικό δείγματος ΔΕΝ ΑΠΕΤΥΧΑΝ ΟΙ ΜΑΡΤΥΡΕΣ PCR Η/ ΚΑΙ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΑΛΛΑ ΕΜΦΑΝΙΖΕΤΑΙ ΤΙΜΗ SNR 0 Ελέγξτε την απόδοση της συσκευής θερμικού κύκλου και το σωστό προγραμματισμό της συσκευής θερμικού κύκλου (βήματα PCR, ράμπα θέρμανσης, όγκος). Προσοχή: Χρησιμοποιήστε τη συσκευή θερμικού κύκλου Συστήματος PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) ή τη συσκευή Θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) σε συνδυασμό με το. Επαναλάβετε την ανάλυση αρχίζοντας με την προετοιμασία της αντίδρασης PCR. Επαναλάβετε την εξαγωγή DNA. Η συλλογή δείγματος απέτυχε. Το δείγμα είναι πολύ διάφανο. Συγκεντρώστε το δείγμα σύμφωνα με την περιγραφή στο Κεφάλαιο 9.1 και επαναλάβετε την εξαγωγή DNA ή τη συλλογή δείγματος. Αυτό το αποτέλεσμα θεωρείται έγκυρο εάν το λογισμικό CheckReport TM Software ανιχνεύσει τουλάχιστον ένα τύπο HPV στο δείγμα με σήμα υψηλότερο από ένα καθορισμένο κατώφλι. Ο μάρτυρας δείγματος ή/και PCR μπορεί στη συνέχεια να εμφανίσει χαμηλά σήματα φθορισμού ή ακόμα και απουσία τους, λόγω ανταγωνισμού κατά τη διάρκεια της PCR. 10. ΤΕΧΝΙΚΗ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα Η Greiner Bio-One διαθέτει τμήμα τεχνικής υποστήριξης που είναι επανδρωμένο από έμπειρους επιστήμονες ΑΝΑΦ. με 465 εκτεταμένη 060 πρακτική και θεωρητική εμπειρία στη μοριακή βιολογία και τα προϊόντα ocheck. Εάν έχετε ερωτήσεις ή αντιμετωπίσετε δυσκολίες αναφορικά με τα προϊόντα ocheck, Για διαγνωστική χρήση in vitro Αναθεώρηση: BQ επικοινωνήστε με τον τοπικό διανομέα της Greiner Bio-One. μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

34 11. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΟΥ PAPILLOCHECK 11.1 Αναλυτική απόδοση του Αναλυτική ευαισθησία HPV DNA-Chip Το όριο ανίχνευσης (LOD) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πλασμίδια αναφοράς για κάθε ανιχνεύσιμο τύπο HPV που περιέχει την περιοχή E1 την οποία στοχεύει το. Τα LOD συνοψίζονται στον Πίνακα 8. Πίνακας 8: Όρια ανίχνευσης για τους ανιχνεύσιμους τύπους HPV Γονότυπος HPV Αντίγραφα / αντίδραση pg/ml** HPV 6 30* 0,052 HPV * 0,26 HPV 16 50* 0,086 HPV * 0,516 HPV * 0,522 HPV * 0,519 HPV * 1,29 HPV 39 30* 0,052 HPV 40 30* 0,052 HPV 42 30* 0,052 HPV * 0,175 HPV 44 30* 0,052 HPV 45 50* 0,087 HPV 51 30* 0,051 HPV * 0,174 HPV 53 30* 0,052 HPV 56 30* 0,052 HPV * 0,255 HPV 59 50* 0,087 HPV Διαγνωστικό 66 κιτ 100* για τον προσδιορισμό 0,171 του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, HPV 68 30* 0,052 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα HPV 70 30* 0,052 ΑΝΑΦ HPV * 0,338 HPV Για 82 διαγνωστική 30* χρήση in vitro 0,052 Αναθεώρηση: BQ μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου * Η επικυρωμένη συγκέντρωση κάθε πλασμιδίου αναφοράς του HPV παρασκευάστηκε σε 2 ανεξάρτητες σειρές αραίωσης και μετρήθηκε σε 3 επαναλήψεις της συγκέντρωσης που εξετάστηκε (δηλ. 6 επαναλήψεις συνολικά ανά συγκέντρωση). Επιπλέον, κάθε δοκιμασία περιείχε 10 ng ανθρώπινου DNA. Στην περίπτωση μιας διακύμανσης στα επικυρωμένα δεδομένα, οι συγκεντρώσεις του συγκεκριμένου πλασμιδίου αυξήθηκαν ή μειώθηκαν και δοκιμάστηκαν ξανά (6 επαναλήψεις από 2 ανεξάρτητες σειρές αραίωσης). Το όριο ανίχνευσης ήταν η χαμηλότερη συγκέντρωση, στην οποία και οι 6 επαναλήψεις Greiner είχαν θετικό Bio-One αποτέλεσμα. GmbH ** Απευθείας ανάλυση, Maybachstr. χωρίς να ληφθεί υπόψη Frickenhausen η προετοιμασία DNA. Germany Η ποσότητα αναφέρεται στο HPV-DNA που περιέχεται στο πλασμίδιο. Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

35 Αναλυτική ειδικότητα τύποι HPV Πλασμίδια αναφοράς για τους αναγραφόμενους τύπους HPV δοκιμάστηκαν με 2,12 x 10 6 αντίγραφα/ αντίδραση PCR. HPV 6b, HPV 11, HPV 13, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, DNA-Chip HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 74, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85, HPV 91. Ανιχνεύτηκαν οι ακόλουθοι διασταυρούμενοι υβριδισμοί: Ο HPV 55 αποδίδει ένα σήμα στον ανιχνευτή HPV 44. Κατά συνέπεια, το λογισμικό CheckReport TM Software εμφανίζει ένα συνδυασμένο αποτέλεσμα HPV 44/HPV 55. Ο HPV 13 μπορεί να παρουσιάσει διασταυρούμενη αντίδραση με τον ανιχνευτή HPV 11 αλλά δεν οδηγεί σε ψευδώς θετικό σήμα, επειδή ο HPV 13 δεν υπάρχει στα τραχηλικά δείγματα Αναλυτική ειδικότητα Οργανισμοί μη-hpv Οι ακόλουθοι οργανισμοί Μη-HPV έχουν δοκιμαστεί με το (5-10 ng γονιδιωματικό DNA). Δεν ανιχνεύτηκαν θετικά σήματα. Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffi i, Actinobacillus actinomycetemcomitans Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifi dobacterium adolescentis, Bifi dobacterium breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium diffi cile, Clostridium perfringens, Eikenella corrodens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus faecali, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Hafnia alvei, Kingella denitrifi cans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum, Morganella morganii, Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae, Neisseria elongata, Neisseria gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus Οδηγίες micros, Porphyromonas χρήσης gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fl uorescens, Pseudomonas fl uorescens, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus constellatus, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythensis (πρώην: Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum, Veillonella parvula. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

36 11.2 Επαναληψιμότητα Για την αποτίμηση της επαναληψιμότητας της δοκιμασίας αναλύθηκαν πέντε δείγματα με το, το κάθε ένα από τα οποία περιείχε τρία διαφορετικά πρότυπα αναφοράς του HPV καθώς και ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA. Οι αριθμοί αντιγράφων των διαφόρων στόχων HPV που υπήρχαν στα δείγματα ποίκιλαν, καθώς και το υπόβαθρο του ανθρώπινου DNA (βλ. Πίνακα 9). Κάθε HPV DNA-Chip δείγμα αναλύθηκε με το σε πέντε ανεξάρτητα αντίγραφα. Τα αντίγραφα δοκιμάστηκαν από τον ίδιο τεχνικό εντός τριών ημερών. Πίνακας 9: Σύνθεση των δειγμάτων για δοκιμή επαναληψιμότητας Αναγνωριστικό δείγματος Τύπος HPV Ποσότητα εκχυλισμένου DNA Όριο ανίχνευσης x φορές δείγμα 1 HPV 16 HPV 18 HPV 31 ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA 180 αντίγραφα αντίγραφα αντίγραφα 1 ng δείγμα 2 HPV 16 HPV 18 HPV 31 ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA 180 αντίγραφα αντίγραφα αντίγραφα 5 ng δείγμα 3 HPV 16 HPV 18 HPV 45 ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA δείγμα 4 HPV 16 HPV 18 HPV 45 ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA αντίγραφα 450 αντίγραφα 300 αντίγραφα 5 ng αντίγραφα αντίγραφα αντίγραφα 2,5 ng δείγμα 5 HPV 18 HPV 31 HPV 45 ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA 4,500 αντίγραφα 500 αντίγραφα 90 αντίγραφα 2,5 ng Ανιχνεύτηκαν οι σωστοί τρεις τύποι HPV και για τα πέντε δείγματα και για κάθε επαναλαμβανόμενη ανάλυση, ενώ η ανάλυση ήταν αρνητική για τον τύπο που δεν συμπεριλήφθηκε. Συνεπώς, 75 από τα 75 μεμονωμένα αποτελέσματα δοκιμής (5 δείγματα x 5 αντίγραφα x 4 διαφορετικά εκχυλίσματα HPV που χρησιμοποιήθηκαν) ήταν σωστά. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

37 11.3 Αναπαραγωγιμότητα Η αναπαραγωγιμότητα για το κιτ δοκιμής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 22 κλινικά δείγματα (βλ. Πίνακα 10) με συγκεντρώσεις HPV που πλησιάζουν το όριο ανίχνευσης. Ο προσδιορισμός διενεργήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο, με ταυτόσημο υλικό δείγματος, από διαφορετικό προσωπικό και σε διαφορετικά εργαστήρια με διαφορετικά όργανα. Τα αποτελέσματα HPV DNA-Chip κρίθηκαν σύμφωνα για τα θετικά δείγματα, εάν ανιχνεύτηκαν ταυτόσημοι τύποι HPV σε μονές ή διπλές λοιμώξεις ή εάν ανιχνεύτηκαν δύο ή τρεις ταυτόσημοι τύποι HPV σε πολλαπλή λοίμωξη με τρεις ή τέσσερις τύπους, αντίστοιχα. Πίνακας 10: Αποτελέσματα δοκιμής αναπαραγωγιμότητας Αρ. δείγματος Αποτέλεσμα Εργαστηρίου 1 Αποτέλεσμα Εργαστηρίου 2 Ταύτιση 1 HPV 33 HPV HPV 35 HPV αρνητικό αρνητικό + 4 HPV 45 HPV HPV 51, HPV 52 HPV 51, HPV HPV 51, HPV 56 HPV 51, HPV HPV 16, HPV 39, HPV 68 HPV 16, HPV 39, HPV 68, HPV HPV 39, HPV 68 HPV 39, HPV HPV 16 HPV αρνητικό αρνητικό + 11 HPV 56, HPV 44/55 HPV 56, HPV 44/ αρνητικό αρνητικό + 13 HPV 11, HPV 18, HPV 56 HPV 11, HPV 18, HPV HPV 51, HPV 44/55 HPV 51, HPV 44/ HPV 53, HPV 58, HPV 43 HPV 53, HPV 58, HPV 68, HPV αρνητικό αρνητικό + 17 HPV 16 HPV HPV 16 HPV 16 + Διαγνωστικό 19 κιτ για τον HPV προσδιορισμό 45 του γονότυπου HPV του 45 ανθρώπινου ιού των + θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 2059, 66, 68, 70, 73, 82 HPV σε τραχηλικά 16 δείγματα HPV HPV 53, HPV 58 HPV 53, HPV 58 + ΑΝΑΦ HPV31 HPV 31 + Για διαγνωστική χρήση in vitro Αναθεώρηση: BQ μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Προέκυψαν σύμφωνα αποτελέσματα για όλα τα κλινικά δείγματα. Σήματα πρόσθετων τύπων ανιχνεύτηκαν στο Εργαστήριο 2 επειδή τα δείγματα πολλαπλής λοίμωξης 7 (HPV 82) και 15 (HPV 68) ξεπερνούσαν λίγο το καθορισμένο κατώφλι και τα μη σύμφωνα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν ως μη προβληματικά. Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

38 11.4 Ευρωστία Για να αξιολογηθεί η ευρωστία του συστήματος δοκιμής μελετήθηκαν οι διακυμάνσεις των παρακάτω παραμέτρων: Θερμοκρασία υβριδισμού Χρόνος υβριδισμού Θερμοκρασία πλύσης Χρόνος πλύσης HPV DNA-Chip Όλες οι δοκιμές εκτελέστηκαν σε 3 αντίγραφα με υψηλές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος (πλασμίδιο αναφοράς HPV 1 ng ή περίπου 200 x 10 6 αντίγραφα ανά δείγμα). Το εύρος των τιμών παραμέτρων που προσδιορίστηκε και στο οποίο είναι δυνατή μια εύρωστη ανίχνευση του HPV με το συνοψίζονται στον Πίνακα 11. Πίνακας 11: Ευρωστία του Παράμετρος Εύρος Θερμοκρασία υβριδισμού ºC Χρόνος υβριδισμού λεπτά Θερμοκρασία πλύσης ºC Χρόνος πλύσης 1ο βήμα πλύσης δευτερόλεπτα 2ο βήμα πλύσης δευτερόλεπτα 3ο βήμα πλύσης δευτερόλεπτα Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Maybachstr Frickenhausen Germany Τηλέφωνο: +49 (0) Fax +49 (0)

39 11.5 Κλινική απόδοση του Για τον προσδιορισμό της κλινικής απόδοσης της δοκιμής αναφορικά με την κλινική ευαισθησία και ειδικότητα, εκτελέστηκε μια συγκριτική μελέτη χρησιμοποιώντας το και τη δοκιμή GP5+/6+-PCR EIA. 7 Για αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν δείγματα από αντιπροσωπευτικές γυναίκες με φυσιολογική κυτταρολογία (ομάδα μαρτύρων) ηλικίας άνω των 40 ετών (μέση ηλικία 49 HPV DNA-Chip έτη, εύρος ηλικιών 40 έως 60 έτη) και 192 αντιπροσωπευτικές γυναίκες (μέση ηλικία 34 έτη, εύρος ηλικιών 30 έως 60 έτη) με ιστολογικά επιβεβαιωμένες βλάβες CIN3+ (ομάδα περιστατικού). Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη συλλέχθηκαν αρχικά κατά το γύρο γραμμής αναφοράς από γυναίκες που ανήκαν στην ομάδα παρέμβασης της βασισμένης στο πληθυσμό τυχαιοποιημένης-ελεγχόμενης δοκιμής υλοποίησης POBASCAM. 8 Μετά από τον περιορισμό των αναλύσεων στους 14 τύπους hrhpv τους οποίους στοχεύει το GP5+/6+-PCR-EIA, το κατέδειξε κλινική ευαισθησία για CIN3 ίση με 95,8 % (184/192, 95 % CI 92,8-98,8) και κλινική ειδικότητα για CIN2 ίση με 96,7 % (95 % CI 95,7-97,7). Συγκριτικά, αυτές οι τιμές ήταν 96,4 % (185/192, 95 % CI: 93,9-98,9) και 97,7 % (95 % CI: 96,9-98,5), αντίστοιχα, για το GP5+6+-PCR-EIA (βλ. Πίνακα 5 και 6). Πίνακας 5: Σύγκριση των αποτελεσμάτων του (14 τύποι hr HPV) και του GP5+/6+ PCR-EIA, στρωματοποιημένα σύμφωνα με τους μάρτυρες και τα περιστατικά. (14 τύποι hr HPV) Μάρτυρες - + σύνολο Περιστατικά - + σύνολο GP5+/6+-PCR/EIA Σύνολο (96,5 %) 18 (1,3 %) (97,7 %) 4 (2,1 %) 3 (1,6 %) 7 (3,6 %) 4 (0,3 %) 29 (2,0 %) 36 (2,3 %) 4 (2,1 %) 181 (94,3 %) 185 (96,4 %) (96,7 %) 47 (3,3 %) (4,2 %) 184 (95,8 %) 192 Πίνακας 6: Κλινική ευαισθησία και ειδικότητα του και του GP5+/6+-PCR-EIA (αποτελέσματα για έναν ή περισσότερους από τους 14 τύπους hr HPV, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ή 68). 14 hrhpv GP5+/6+ Κλινική ευαισθησία για CIN3 95,8 % 96,4 % Κλινική ειδικότητα 96,7 % 97,7 % για CIN2 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Σύγκριση της κλινικής απόδοσης της ανίχνευσης του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων του με την GP5+/6+-PCR- ανοσοενζυμική δοκιμή σε τραχηλικό προσυμπτωματικό έλεγχο βασισμένο στον πληθυσμό. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, Pol RP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol Mar;48(3): Epub 2009 Dec Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Greiner Bio-One GmbH Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer POBASCAM, a population-based Maybachstr. 2 randomized Frickenhausen controlled trial Germany for implementation of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods Τηλέφωνο: and +49 baseline (0) 7022 data of 44,102 Fax women. +49 (0) Int J. Cancer :

40 Για την αξιολόγηση του επιπολασμού των τύπων HPV που ανιχνεύονται από το, ελέγχθηκαν τραχηλικά επιχρίσματα 881 γυναικών. 9 Όλα τα τραχηλικά επιχρίσματα συλλέχθηκαν σε μέσο συλλογής STM TM (Qiagen, Hilden, Germany). Ο συνηθέστερος τύπος ήταν ο τύπος HPV 16 με ρυθμό ανίχνευσης 19,4 %. Οι επόμενοι συχνότεροι τύποι ήταν οι HPV 31, HPV 39, HPV 51 και HPV 52. Ο επιπολασμός για όλους τους ανιχνεύσιμους τύπους εμφανίζεται στον Πίνακα 7. HPV DNA-Chip Πίνακας 7: Ειδικός κατά τύπο επιπολασμός των τύπων HPV που ανιχνεύονται από το Γονότυπος HPV Επιπολασμός κατά το HPV 16 19,40 % HPV 31 14,40 % HPV 39 9,30 % HPV 51 9,10 % HPV 52 7,50 % HPV 56 7,40 % HPV 58 6,10 % HPV 53 6,10 % HPV 42 5,80 % HPV 66 5,90 % HPV 68 5,60 % HPV 45 4,50 % HPV 33 4,40 % HPV 18 4,00 % HPV 70 4,10 % Οδηγίες HPV 44/55 χρήσης 3,10 % HPV 59 2,50 % HPV 82 1,90 % HPV 35 1,60 % HPV 73 1,50 % HPV 43 0,80 % Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των HPV 6 0,60 % θηλωμάτων (HPV) τύπου 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, HPV 59, 66, 11 68, 70, 73, 82 σε 0,60 τραχηλικά % δείγματα ΑΝΑΦ. HPV ,40 % Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ Greiner Bio-One GmbH Αξιολόγηση της απόδοσης της νέας δοκιμής προσδιορισμού γονότυπου HPV συγκριτικά με δύο άλλα συστήματα προσδιορισμού Maybachstr. γονότυπου και της Frickenhausen δοκιμής HC2. Schopp Germany B, Holz B, Zago M, Stubenrauch F, Petry KU, Kjaer SK, Iftner T. J Med Virol. Τηλέφωνο: 2010 Apr;82(4): (0) Fax +49 (0)

41 12. ΣΥΝΤΟΜΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ PAPILLOCHECK 12.1 Αίθουσα 2: PCR - Προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης PCR Αίθουσα 2 ΣΥ Αραιώστε την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση 1:200 σε νερό βαθμού PCR Αναμίξτε προσεκτικά την αραίωση UNG Παρασκευάστε το μείγμα αντίδρασης για την απαιτούμενη ποσότητα των αντιδράσεων PCR PCR MasterMix Πολυμεράση HotStar Taq (5 U/µl) Ουρακίλη-Nγλυκοσυλάση (Αραίωση 1:200, 0,005 U/µl) Συνολικός όγκος πριν από την προσθήκη δείγματος DNA 1 αντίδραση 13 αντιδράσεις (1 τσιπ) Αναμίξτε προσεκτικά το μείγμα αντίδρασης 26 αντιδράσεις (2 τσιπ) 39 αντιδράσεις (3 τσιπ) 52 αντιδράσεις (4 τσιπ) 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl Διαιρέστε σε κλάσματα το μείγμα αντίδρασης: προσθέστε 21 µl από το μείγμα αντίδρασης για κάθε αντίδραση PCR σε ένα σωληνάριο αντίδρασης PCR 0,2 ml μιας ταινίας PCR ΝΤ Ο Ρ Τ Π Ρ Ο Τ Ο Κ Ο ΛΛΟ 41

42 12.2 Αίθουσα 2: PCR - Προσθήκη εκχυλισμένου DNA / αντίδραση PCR PCR Αίθουσα 2 Προσθέστε 5 µl εκχυλισμένου DNA για κάθε αντίδραση PCR Αναμίξτε καλά Ξεκινήστε την αντίδραση PCR με το προετοιμασμένο πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου Χρόνος Θερμ. C Αρ. κύκλων ΣΥ ΝΤ Ο Ρ Τ 20 λεπτά 37 C 1 15 λεπτά 95 C 1 30 δευτερόλεπτα 25 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 30 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C Κράτηση 10 C Π Ρ Ο Τ Ο Κ Ο ΛΛΟ 42

43 12.3 Αίθουσα 3: Υβριδισμός - Προετοιμασία / Αντίδραση υβριδισμού Υβριδισμός και πλύση Αίθουσα 3! Αρχίστε τις προετοιμασίες τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τον υβριδισμό. Αραιώστε δυνητικά ιζήματα στα ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού και πλύσης και αναμίξτε καλά Προετοιμάστε το μείγμα διαλύματος πλύσης για τον αριθμό των τσιπ που θα αναλυθεί. Διαιρέστε σε κλάσματα το μείγμα διαλύματος πλύσης σε τρία Πλαίσια πλύσης ocheck Προθερμάνετε το διάλυμα πλύσης II σε ένα υδατόλουτρο στους 50 C Επωάστε τον αριθμό των τσιπ που θα αναλυθεί στον προετοιμασμένο Θάλαμο υβριδισμού σε θερμοκρασία δωματίου Αναμίξτε τα προϊόντα PCR και περιδινήστε σύντομα Αριθμός τσιπ Στοιχεία Αποσταγμένο/απιονισμένο νερό 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Ρυθμιστικό διάλυμα Α 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Ρυθμιστικό διάλυμα B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Συνολικός όγκος 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Αναμίξτε το Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού και περιδινήστε σύντομα Αναμίξτε 30 µl από το Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού του με 5 µl από το προϊόν PCR Αναμίξτε καλά και περιδινήστε σύντομα Μεταφέρετε 25 µl από το μείγμα υβριδισμού σε κάθε βοθρίο του τσιπ του χρησιμοποιώντας μια πολυκάναλη πιπέτα Αποφεύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων αέρα Επωάστε το τσιπ για 15 λεπτά ακριβώς σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) ΣΥ ΝΤ Ο Ρ Τ Π Ρ Ο Τ Ο Κ Ο ΛΛΟ 43

44 12.4 Αίθουσα 3: Πλύση και στέγνωμα / Σάρωση και αξιολόγηση Υβριδισμός και πλύση Αίθουσα 3 Αφαιρέστε τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρου πλάκας από το Θάλαμο υβριδισμού Τοποθετήστε τη μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών μέσα στο Πλαίσιο πλύσης του ocheck με το διάλυμα πλύσης I Συνδέστε τη Λαβή του ocheck Πλύνετε το ή τα τσιπ σε διάλυμα πλύσης I σε θερμοκρασία δωματίου για 10 δευτερόλεπτα Πλύνετε το ή τα τσιπ σε προθερμασμένο διάλυμα πλύσης ΙI σε υδατόλουτρο στους 50 C για 60 δευτερόλεπτα ΣΥ ΝΤ Ο Ρ Τ Πλύνετε το ή τα τσιπ σε διάλυμα πλύσης ΙΙI σε θερμοκρασία δωματίου για 10 δευτερόλεπτα Π Αφαιρέστε τυχόν υγρό από την επιφάνεια του τσιπ με φυγοκέντριση 3 λεπτά 500 g ή 1 λεπτό μέγιστη ταχύτητα Ρ Ο Τ Σαρώστε το ή τα τσιπ με το CheckScanner TM Εκτελέστε σάρωση και ανάλυση όπως περιγράφεται στον Οδηγό Χρήσης του λογισμικού CheckReport TM Software Δημιουργήστε αναφορές Ο Κ Ο ΛΛΟ 44