ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005 ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ Ν ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ Σ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ Σ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS (Lmc.), ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥ ΣΕ ΡΥΠΟΓΟΝΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ. ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΚΑΘΙΕΡΩΣΗ ΝΕΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ ΡΩΝ ΡΥΠΑΝΣΗΣ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005 ΣΤΕΦΑΝΟΣ ΝΤΑΪΛΙΑΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS (Lmc.), ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΟΥ ΣΕ ΡΥΠΟΓΟΝΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ. ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΚΑΘΙΕΡΩΣΗ ΝΕΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ ΡΥΠΑΝΣΗΣ. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF ZOOLOGY LABORATORY OF ANIMAL PHYSIOLOGY STEFANOS DAILIANIS EVALUATION OF BIOCHEMICAL PARAMETERS AND SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS INDUCED IN TISSUES OF MUSSEL MYTILUS GALLOPROVINCIALIS (LMC.), AFTER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL POLLUTANTS. ESTABLISHMENT OF A NEW BIOMARKER OF ENVIRONMENTAL POLLUTION. DOCTORATE THESIS THESSALONIKI 2005

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13 I ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΕΡΟΣ Α Ρύπανση των υδάτων και άνθρωπος. 1 Ι. ΒΙΟΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ 2 1. Χρησιµοποίηση ειδών του γένους Mytilus ως οργανισµών-βιοενδεικτών σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης Περιβαλλοντικοί παράγοντες που επηρεάζουν τα ίθυρα Μαλάκια Βιοπαρακολούθηση και χρησιµοποίηση Βιοµαρτύρων. 7 ΙΙ. ΘΕΡΜΑΪΚΟΣ ΚΟΛΠΟΣ. ΟΡΓΑΝΙΚΟΙ ΚΑΙ ΑΝΟΡΓΑΝΟΙ ΡΥΠΑΝΤΕΣ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ M YTILU S GALLOPROVINCIALIS Θερµαϊκός κόλπος και γεωγραφικά χαρακτηριστικά Συσσώρευση βαρέων µετάλλων σε ιστούς του είδους Mytilus galloprovincialis.επίπεδα βαρέων µετάλλων σε άτοµα από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου Συσσώρευση οργανικών ρυπαντών σε ιστούς του είδους Mytilus galloprovincialis.τιµές οργανικών ρυπαντών σε άτοµα από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. 12 ΙΙΙ. ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΒΑΡΕΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ) Ενζυµική δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE). 16 ΜΕΡΟΣ Β Ι. Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ. ΕΠΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος Πρωτεΐνες-υποδοχείς Υποδοχείς συζευγµένοι µε κανάλια ιόντων (Ion-channel receptors) Υποδοχείς συζευγµένοι µε ένζυµα (Enzym e-linked receptors) Υποδοχείς συζευγµένοι µε G πρωτεϊνες (G-protein-coupled receptors) Αδρενεργικοί υποδοχείς Ενδοκυτταρικοί υποδοχείς εύτεροι αγγελιοφόροι (second messengers).ο ρόλος του ca M P Πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες Πρωτεϊνική κινάση C Πολυπλοκότητα των σηµατοδοτικών µηχανισµών,ενίσχυση του σήµατος και εξειδίκευση της κυτταρικής απόκρισης Αντλία ανταλλαγής ιόντων Νa + H +. 26

14 II 3. ραστικές µορφές οξυγόνου (R eactive O xygen Species-ROS).Κυτταρικές επιπτώσεις τους και συµµετοχή τους σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος Το κάδµιο και ο ρόλος του σε µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος Βιοχηµικές και γενοτοξικές επιπτώσεις του καδµίου Ο ρυθµιστικός ρόλος του καδµίου στην επαγωγή µηνύµατος. 34 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΕΡΟΣ Α ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΩΝ ΜΥ ΙΩΝ. 1. Συλλογή ατόµων από το πεδίο Έκθεση ατόµων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου Έκθεση ατόµων σε οργανικούς ρυπαντές 40 ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 1. Προσδιορισµός των επιπέδων των µεταλλοθειονινών (ΜΤ).Φωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός των σουλφυδρυλοµάδων (-SH )µε χρήση αντιδραστηρίων Ellm an Πρακτική εκτίµηση της µεθόδου Προετοιµασία των δειγµάτων Κατακρήµνιση µε αιθανόλη Επαναιώρηση του εµπλουτισµένου µε ΜΤ κλάσµατος Ανάλυση DTNB (αντίδραση Ellman)- Πρότυπη καµπύλη γλουταθειόνης Υπολογισµός και ερµηνεία των αποτελεσµάτων-καταγραφή της πρότυπης καµπύλης Προσδιορισµός της ενζυµικής δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)σε ιστούς του µυδιού Mytilus galloprovincialis Πρακτική εκτίµηση της µεθόδου Προσδιορισµός της συνολικής ενζυµικής δραστικότητας (Ellman, 1961) Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης (BCA method, Sorensen and Brodbeck,1976) Έκφραση της ενζυµικής δραστικότητας Πιθανά σφάλµατα στις µετρήσεις- Κατάσταση των δειγµάτων Μέτρηση του κυκλικού ΑΜΡ (ca M P) Εκτίµηση της µεθόδου µέτρησης µε τη χρήση ραδιοσηµασµένου ca M P Προετοιµασία των δειγµάτων µέτρησης Αντιδραστήρια 49

15 III 3.4 Προετοιµασία πρότυπων διαλυµάτων Πειραµατικό πρωτόκολλο µέτρησης Προσδιορισµός της συγκέντρωσης των µετάλλων 50 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ε ΟΜΕΝΩΝ 51 ΜΕΡΟΣ Β. ΕΚΘΕΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ 1. Συλλογή ατόµων και διατήρησή τους Αποµόνωση κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Εκτίµηση της βλάβης του γενετικού υλικού µε τη χρήση της µεθόδου των κοµητών (Cometassay/Alkaline singlecellgellelectrophoresis) Μέτρηση δραστικότητας της κασπάσης Εκτίµηση της µεθόδου Έκθεση αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα και µέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης Κατασκευή πρότυπης καµπύλης Προσδιορισµός πρωτεΐνης 69 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 1. Προσδιορισµός του ενδοκυτταρικού ph ΜΕΡΟΣ Α. (ph i) 55 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ 2. Προσδιορισµός της εισροής ιόντων νατρίου (Na + ) 57 ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΣΤΟ ΜΥ Ι MYTILU S GALLOPROVINCIALIS,ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ 3. Προσδιορισµός της ενζυµικής δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) 58 ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ.ΚΑΘΙΕΡΩΣΗ ΝΕΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ ΡΥΠΑΝΣΗΣ 1. Μελέτη πεδίου Προσδιορισµός ελεύθερων ριζών ειγµατοληπτική περίοδος Προσδιορισµός σουπεροξειδικών ριζών (Ο - 2 ) Επίπεδα µεταλλοθειονινών ραστικότητα Προσδιορισµός δραστικών µορφών ακετυλχολινεστεράσης (AChE) 75 οξυγόνου (ROS) Συγκέντρωση ca M P Προσδιορισµός ca M P Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου

16 IV Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία του Οκτωβρίου Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος) Συγκεντρώσεις µετάλλων σε ιστούς του µυδιού κατά την δειγµατοληπτική περίοδο 2001 (Ιούνιος-Οκτώβριος) ειγµατοληπτική περίοδος Επίπεδα µεταλλοθειονινών ραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης (AChE) Συγκέντρωση ca M P Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία κάθε δειγµατοληπτικής περιόδου Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του έτους 2002 και 2003 (Ιούνιος και Οκτώβριος) Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς µυδιών από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών περιόδων (Ιούνιος και Οκτώβριος) Εκτίµηση των επιπέδων των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος Οκτώβριος 2003) Εκτίµηση συγγένειας των σταθµών δειγµατοληψίας µε χρήση βιοµαρτύρων Εργαστηριακή µελέτη 2.1 Έκθεση µυδιών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου Επίπεδα ΜΤ Μέτρηση ca M P Σχέση ΜΤ και ca M P,µετά από έκθεση σε κάδµιο Έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές Επίπεδα ΜΤ ραστικότητα A ChE Μέτρηση ca M P Ανάλυση συσχέτισης µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ, AChE και ca M P),µετά από έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές 127

17 V ΜΕΡΟΣ Β. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ MYTILU S GALLOPROVINCIALIS. 1. Επίδραση του καδµίου στην εισροή ιόντων Na + και στη µεταβολή του ph i σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα Επίδραση του καδµίου στη δραστικότητα της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) Επίδραση αγωνιστών των α- και β- αδρενεργικών υποδοχέων στη µεταβολή του ph iκαι στη δραστικότητα της ΡΚ Παραγωγή δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση σε κάδµιο Εκτίµηση της βλάβης του γενετικού υλικού σε αποµονωµένα κύτταρα,µετά από έκθεση σε κάδµιο Προσδιορισµός της συγκέντρωσης του ca M P,µετά από έκθεση κυττάρων πεπτικού αδένα σε κάδµιο Παραγωγή δραστικών µορφών οξυγόνου και βλάβη του γενετικού υλικού σε κύτταρα πεπτικού αδένα µε υψηλά επίπεδα ca M P (IBM X-treated cells) Προσδιορισµός της δραστικότητας της κασπάσης-3 σε κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση σε κάδµιο 159 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΡΟΣ Α. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΣΤΟ ΜΥ Ι M YTILU S GALLOPROVINCIALIS, ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ. ΚΑΘΙΈΡΩΣΗ ΝΈΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΎΡΩΝ ΡΎΠΑΝΣΗΣ. 1. ΜΕΛΕΤΗ ΠΕ ΙΟΥ 1.1 ΕΠΙΠΕ Α ΤΩΝ ΜΤ ΚΑΙ ΤΩΝ ΒΑΡΕΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ A ChE ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΤΟΥ ca M P ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 2.1 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΩΝ ΜΤ ΚΑΙ ΤΟΥ ca M P ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΟΥ ca M P ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΤ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ ΣΤΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ AChE ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ.O ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P ΩΣ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΑ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ,ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ

18 VI ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ-ΒΙΟ ΕΙΚΤΗ M YTILUS G ALLO PRO VIN CIALIS 174 ΜΕΡΟΣ Β. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILU S GALLOPROVINCIALIS. 1. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΟΥ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (ph i)και ΣΤΗΝ ΕΙΣΡΟΗ ΙΟΝΤΩΝ ΝΑΤΡΙΟΥ (Νa + ).Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ C ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ (ΡΚ).Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ C ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΩΝ Α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΣΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΕΠΑΓΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΚΑ ΜΙΟ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS)ΚΑΙ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAG M EN TS)ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILU S GALLOPROVINCIALIS, ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAG M EN TS)ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILU S GALLOPROVINCIALIS, ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ Ο ΡOΛΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚHΣ ΚΙΝAΣΗΣ C (PK C)ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓH ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAG M EN TS)ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚYΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟY Α EΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟY M YTILU S GALLOPROVINCIALIS, ΜΕΤA ΑΠO EΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚA ΜΙΟ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P ΣΕ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAG M EN TS) ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ

19 VII 9. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ Α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAG M EN TS)ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILU S GALLOPROVINCIALIS, ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. 192 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 197 SU M M A R Y 199 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 201 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 265 1) ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΟΥΣΙΕΣ 265 2) ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ 267 3) ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ 268 4) ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ ) ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ) ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ

20 8

21 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το ταξίδι τελείωσε... Μετά από µια πορεία τεσσάρων ετών στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του Τοµέα Ζωολογίας, γεµάτη επιτυχίες, χαρές και λύπες, ατελείωτες ώρες σκληρής δουλειάς και αναζήτησης,έφτασε το τέλος και της δικής µου διδακτορικής διατριβής. Και τώρα που ο προορισµός είναι κοντά,δεν βγαίνει µιλιά...δεν βγαίνει λέξη. Σε τέτοιες στιγµές,δύσκολα βγαίνουν λόγια µε τα οποία θα µπορούσα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου σε άτοµα που στάθηκαν δίπλα µου,καθ όλη τη διάρκεια του ταξιδιού.παρ όλα αυτά,µέσα από έντονα συναισθήµατα και συγκίνηση,νιώθω την ανάγκη να εκφράσω τις ευχαριστίες µου σε ανθρώπους που πίστεψαν σε εµένα και µε γέµιζαν µε κουράγιο για την ολοκλήρωση αυτής της πορείας. Ένα θερµό ευχαριστώ στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τοµέα Ζωολογίας Μάρθα Καλογιάννη- ηµητριάδη που µε επέλεξε και µε εµπιστεύτηκε να συµµετάσχω ως ερευνητής στο Ευρωπαϊκό Ερευνητικό Πρόγραµµα µε την επωνυµία «BEEP» (Biological Effects of Environm ental Pollution in M arine Coastal Ecosystem s-βιολογικές επιπτώσεις της περιβαλλοντικής ρύπανσης σε θαλάσσια παράκτια οικοσυστήµατα).οφείλω να οµολογήσω ότι η αφοσοίωση και η αγάπη της στη δουλειά της,καθώς και η εµπιστοσύνη και η εκτίµηση που έδειξε στο πρόσωπό µου,αποτέλεσαν τα κύρια εφόδια που συνέδεσαν την ερευνητική µου πορεία,τη συνέπεια και τη µεθοδικότητα της δουλειάς µου,έτσι ώστε να φέρω εις πέρας το έργο µου µε τον καλύτερο δυνατό τρόπο.πάνω από όλα όµως και πέρα από κάθε έννοια στιγνής επαγγελµατικής εξάρτησης, την ευχαριστώ γιατί είναι Άνθρωπος! Γιατί στάθηκε δίπλα µου σε δύσκολες στιγµές,γιατί ο λόγος και οι συµβουλές της µε κράτησαν όρθιο,όταν ήµουν έτοιµος να καταρρεύσω.την ευχαριστώ θερµά. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα τον Καθηγητή του Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας κ. Βασίλειο ηµητριάδη για την αµέριστη συµπαράσταση,τις συµβουλές και την καθοδήγηση που µου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής µου.οι εύστοχες παρατηρήσεις του και η συνεχής παρουσία του στο πλευρό µου συνέβαλαν σηµαντικά στην διεκπεραίωση του έργου µου,καθώς και στη συγγραφή των επιστηµονικών εργασιών. Θερµές ευχές θα ήθελα να εκφράσω στον Επίκουρο Καθηγητή του Τοµέα Ζωολογίας κ.αθανάσιο Παπαδόπουλο,για τις συµβουλές του,την εµπιστοσύνη του στις δυνάµεις µου,καθώς και την αµέριστη συµπαράστασή του,καθ όλη τη διάρκεια

22 ΠΡΟΛΟΓΟΣ του ερευνητικού µου έργου.τον ευχαριστώ επίσης για τις εύστοχες παρατηρήσεις και την καθοδήγησή του για τη συγγραφή αυτού του κειµένου. Ένα µεγάλο ευχαριστώ στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τοµέα Βιολογικών Επιστηµών και Προληπτικής Ιατρικής,της Ιατρικής Σχολής κ.γεώργιο Κολιάκο,ο οποίος, µαζί µε την οµάδα του, στάθηκε αρωγός και συνέβαλε ουσιαστικά στην ολοκλήρωση του έργου µου.ένα µεγάλο ευχαριστώ που µε «ανέχτηκαν» και µε εµπιστεύτηκαν στο χώρο τους,που µε αγκάλιασαν και µε σεβάστηκαν σαν µέλος της οµάδας τους. Θα ήταν µεγάλη µου παράλειψη να µην εκφράσω ένα µεγάλο ευχαριστώ στην «Μάνα» µου, ιδάκτορα του Τµήµατος κ. Λίνα οµουχτσίδου για την αµέριστη συµπαράσταση και τη βοήθειά της στα πρώτα µου εργαστηριακά βήµατα. Ένα µεγάλο ευχαριστώ για τις πολύτιµες συµβουλές της,για το χαµόγελό της και την εµπιστοσύνη που έδειξε προς το πρόσωπό µου. Επίσης,ευχαριστώ την υποψήφιο διδάκτορα Ελένη Ραφτοπούλου τόσο για τη συνεργασία µας,όσο και για την ιδιαίτερη φιλία που µας συνδέει µετά από τόσα χρόνια στον ίδιο χώρο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, κ. Αναστασία Κουβάτση, τον Αναπληρωτή καθηγητή του Τοµέα Βοτανικής, κ. Γεώργιο Νικολαϊδη, τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τοµέα Ζωολογίας, κ. Βασίλειο Μιχαηλίδη και τις ερευνητικές τους οµάδες, για τη βοήθειά τους και την προσφορά υλικοτεχνικού εξοπλισµού κατά την εκτέλεση µέρους των εργαστηριακών πειραµάτων. Ένα µεγάλο ευχαριστώ στους φίλους µου που...µε ανέχονται τόσα χρόνια! Τους ευχαριστώ για τη συµπαράστασή τους και την κατανόηση που δείξανε όλα αυτά τα χρόνια των επίπονων προσπαθειών µου,δείχνοντας πως ακόµα υπάρχει κάτι που µπορεί κανείς να πιστεύει...η φιλία. Άφησα στο τέλος την οικογένειά µου... Το µεγαλύτερο µέρος της καρδιάς και του µυαλού µου βρίσκονται κοντά τους... Χωρίς την αγάπη και την ηθική συµπαράστασή τους,δεν θα µπορούσα να τελειώσω αυτό το ταξίδι.τους ευχαριστώ για την υποµονή τους και τους ζητώ ένα µεγάλο συγνώµη για την απουσία µου όλο αυτό το χρονικό διάστηµα, ακόµα και σε περιόδους που όλες οι οικογένειες ήταν µαζί.ένα µεγάλο ευχαριστώ στον πατέρα µου Νίκο,που µου έδειξε,µε τον τρόπο του,τον δρόµο της γνώσης και της µάθησης.

23 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ένα µεγάλο ευχαριστώ στην µητέρα µου Μαρία,που νοερά ήταν πάντα µαζί µου, αισθανόµενη τις αγωνίες και τις προσπάθειές µου.τους ευχαριστώ θερµά...

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΜΕΡΟΣ Α Ρύπανση των υδάτων και άνθρωπος: Το νερό,µετά τον αέρα,αποτελεί το πλέον αναντικατάστατο φυσικό αγαθό. Παρ όλη τη σπουδαιότητά του, ο άνθρωπος µε την όλο και µεγαλύτερη δραστηριότητά του ευθύνεται για την αυξανόµενη διοχέτευση ρυπογόνων παραγόντων σε κάθε µορφής υδάτινη δεξαµενή. Η ρύπανση των υδάτων και ειδικότερα των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων,όπως είναι ο Θερµαϊκός κόλπος,έχει ως άµεση συνέπεια τον υποβιβασµό της ποιότητάς τους,ενώ παράλληλα τα καθιστά ακατάλληλα για τους οργανισµούς που ζουν σε αυτά. Η ρύπανση των θαλάσσιων υδάτων ξεκινά από την αστική και βιοµηχανική δραστηριότητα.αστικά λύµατα που καταλήγουν µέσω των αγωγών αποχέτευσης στα θαλάσσια οικοσυστήµατα περιέχουν παραπροϊόντα του ανθρώπινου µεταβολισµού και διάφορες ουσίες καθηµερινής χρήσης, όπως απορρυπαντικά, προϊόντα καθαρισµού κ.α.η αυξανόµενη βιοµηχανική δραστηριότητα του ανθρώπου οδηγεί σε διοχέτευση διαφόρων χηµικών ενώσεων στα παράκτια θαλάσσια οικοσυστήµατα. Ουσίες όπως βαρέα µέταλλα,οργανικοί διαλύτες,πετρελαιοειδή,καθώς και διάφορα εντοµοκτόνα και παρασιτοκτόνα µπορούν να περάσουν στα υδάτινα οικοσυστήµατα, προκαλώντας σοβαρές διαταραχές στην ισορροπία τους, καθώς και στη ζωή των υδρόβιων οργανισµών.έχει διαπιστωθεί ότι 1500 νέες χηµικές ενώσεις διοχετεύονται κάθε χρόνο στο περιβάλλον εµπλουτίζοντας τους είδη γνωστούς ρυπογόνους παράγοντες (Steinberg και συν., 1994). Οι περιβαλλοντικοί ρυπαντές ανήκουν σε διάφορες κατηγορίες που περιλαµβάνουν βαρέα µέταλλα, πολυαρωµατικούς υδρογονάνθρακες (PAHs), πολυχλωριωµένα δυφαινύλια (PCBs), διοξίνες, διβενζοφουράνια, οργανοµεταλλικά στοιχεία, νιτρο-αρωµατικές ενώσεις, οργανοχλωρίνες κ.α.(sheeham,1999;livingstone,1993).

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2 Ι. ΒΙΟΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ. Από τις αρχές τις δεκαετίας του 70 άρχισε να εφαρµόζεται η παρακολούθηση των επιπτώσεων της ρύπανσης σε ζωντανούς οργανισµούς (Βιοπαρακολούθηση).Η βιοπαρακολούθηση (biom onitoring),σχετίζεται µε την ανάπτυξη τεχνικών µέτρησης της συγκέντρωσης των οργανικών και ανόργανων ρυπαντών σε ιστούς ζωντανών οργανισµών, αλλά και τεχνικών µε τις οποίες εκτιµώνται και καταγράφονται οι βιολογικές τους επιπτώσεις στους οργανισµούς. Η παθητική ή ενεργητική βιοπαρακολούθηση,µε την ανάλυση ιστών από κατάλληλους οργανισµούς,για τον εντοπισµό διαφόρων ρυπαντών,η µελέτη των αλλαγών της φυσιολογίας ή/και της συµπεριφοράς των οργανισµών µε τη χρήση αυτόµατων συστηµάτων, η χρήση βιολογικών προσδιορισµών στο εργαστήριο ή στο πεδίο για την εκτίµηση της τοξικότητας του νερού,η χρησιµοποίηση ανοσολογικών µεθόδων για την εκτίµηση και µέτρηση χηµικών στοιχείων,καθώς και η χρησιµοποίηση δεικτών ποικιλότητας για την εκτίµηση του βαθµού αλλαγής των περιβαλλοντικών συνθηκών,αποτελούν εργαλεία που χρησιµοποιούνται στα πλαίσια βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης (NRC,1980;NCM R,1997). 1. Χρησιµοποίηση ειδών του γένους Mytilus ως οργανισµών-βιοενδεικτών σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης. Η βιοπαρακολούθηση επιτυγχάνεται µε τη χρησιµοποίηση ζωντανών οργανισµών που χαρακτηρίζονται ως βιοενδείκτες (bioindicators). Θαλάσσια σπονδυλωτά (Ιχθύες),Καρκινοειδή και Μαλάκια (Γαστερόποδα) χρησιµοποιούνται κυρίως ως βιοενδείκτες παρακολούθησης της ρύπανσης. Τα Ψάρια, λόγω του κόστους και της ευαισθησίας τους σε δευτερογενείς παράγοντες δεν χρησιµοποιούνται σε κλίµακα ανάλογη µε αυτή των Μαλακίων,όπως τα στρείδια,οι πεταλίδες και ειδικότερα τα µύδια. Τα ίθυρα Μαλάκια αποτελούν µια οµάδα ασπόνδυλων που είναι ευρέως εξαπλωµένα και µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε ευρεία κλίµακα ως βιοενδείκτες της θαλάσσιας ρύπανσης.είδη του γένους Mytilus χρησιµοποιούνται ευρύτατα τόσο σε εργαστηριακό επίπεδο, όσο και στο πεδίο (Μussel Watch Programmes)για την εκτίµηση διαφόρων ρυπογόνων παραγόντων (Goldberg,1986;Bayne,1989). Το είδος Mytilus galloprovincialis (Βασίλειο: Anim alia, Φύλο: Mollusca, Κλάση:Bivalvia,Υπόκλαση:Pteriom orphia,τάξη:lam ellibranchia) αποτελεί µέλος ενός γένους που πρωτοεµφανίστηκε πριν από 1-2 εκατοµµύρια χρόνια (Seed,1976)

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3 και παρουσίαζει ευρεία κατανοµή τόσο στο Βόρειο όσο και στο Νότιο ηµισφαίριο. Το γένος Mytilus περιλαµβάνει επιπλέον τα είδη Μ. edulis, M.trossulus και M. californianus (Gosling,1992),(Εικόνες 1 και 2).Τα είδη του γένους Mytilus είναι πλευρικά πιεσµένοι, αιωρηµατοφάγοι οργανισµοί. Μετακινούνται ελάχιστα, σχηµατίζοντας µεγάλους πληθυσµούς και ζουν προσκολληµένοι σε στερεό υπόστρωµα, π.χ., πέτρες, βράχια, κλπ. Πρόκειται για εδώδιµα είδη, τα οποία καλλιεργούνται σε ευρεία κλίµακα. Το είδος Mytilus galloprovincialis αποτελεί αντικείµενο περιβαλλοντικής και εργαστηριακής µελέτης.το γεγονός ότι τα µύδια είναι φθηνά και µπορούν να µεταφερθούν και να διατηρηθούν εύκολα στο εργαστήριο, τα καθιστούν κατάλληλα για χρησιµοποίησή τους σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης θαλάσσιων οικοσυστηµάτων. Τα µύδια είναι ευρύαλοι οργανισµοί,προσαρµοσµένοι στους παλιρροιακούς ρυθµούς,µε δυνατότητα συσσώρευσης στους ιστούς τους πληθώρας τοξικών ουσιών, σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από τις αντίστοιχες του θαλασσινού νερού.η γνώση της φυσιολογίας και της συµπεριφοράς τους,σε συνδυασµό µε την µελέτη τους σε γενετικό και βιοχηµικό επίπεδο, δίνει τη δυνατότητα στους ερευνητές να προχωρήσουν σε διαπιστώσεις που σχετίζονται µε την κατάσταση του θαλάσσιου οικοσυστήµατος, καθώς και τις επιπτώσεις διαφόρων ουσιών, που αποτελούν ρυπαντές του περιβάλλοντος,στους οργανισµούς (M oore, 1985; Amiard και συν., 1986;Cossa,1989;Krishnakum arκαι συν.,1994;viarengo και συν.,1997;regoli, 1998;Lafontaine και συν.,2000). Συµπερασµατικά,τα χαρακτηριστικά των ίθυρων Μαλακίων και ειδικότερα των µυδιών που τα καθιστούν κατάλληλους βιοενδείκτες συνοψίζονται στα παρακάτω σηµεία (N RC,1980;Phillips,1980;W iddow s,1985;farrigton και συν., 1987): Τα µύδια αποτελούν κυρίαρχα και ευρέως εξαπλωµένα είδη σε όλο τον κόσµο. εν έχουν δυνατότητα µετανάστευσης από µια περιοχή, µε αποτέλεσµα να αποτελούν αντιπροσωπευτικούς οργανισµούς των φυσικοχηµικών και περιβαλλοντικών παραµέτρων της εκάστοτε περιοχής. Παρουσιάζουν µεγάλη αντοχή σε πολλούς περιβαλλοντικούς ρυπαντές. Η ικανότητά τους να φιλτράρουν τεράστιες ποσότητες νερού τα καθιστούν αποδέκτες µεγάλων ποσοτήτων ρυπογόνων παραγόντων που µπορούν να συσσωρευθούν στους διάφορους ιστούς.ο προσδιορισµός των ρυπαντών στους

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4 ιστούς τους µπορεί να δώσει µια σαφή εικόνα της ρύπανσης στην ευρύτερη περιοχή. Συγκριτικά µε τους Ιχθύες και τα Καρκινοειδή,οι ιστοί των ίθυρων Μαλακίων εµφανίζουν χαµηλό επίπεδο ενζυµικής δραστικότητας των συστηµάτων που µπορούν να µεταβολίζουν ρυπαντές (π.χ.,αρωµατικοί υδρογονάνθρακες,pcbs). Οι συγκεντρώσεις των ρυπαντών στους ιστούς απεικονίζουν το βαθµό ρύπανσης του περιβάλλοντος.η µέτρηση των τοξικών ουσιών στους ιστούς των ίθυρων Μαλακίων παρέχει πληροφορίες σχετικά µε τη βιολογική διαθεσιµότητα των ρυπογόνων παραγόντων,στοιχεία που δεν είναι πάντα εµφανή,όταν οι µετρήσεις γίνονται στο νερό και ειδικότερα στα αιωρούµενα σωµατίδια ή στα ιζήµατα. Οι πληθυσµοί των µυδιών είναι σταθεροί, µε αποτέλεσµα να υπάρχει η δυνατότητα επαναλαµβανόµενων δειγµατοληψιών και µακροχρόνιας παρακολούθησης του υδάτινου περιβάλλοντος. Υπάρχει η δυνατότητα µεταφοράς και διατήρησης πληθυσµών σε περιοχές ελέγχου της υδάτινης ρύπανσης. Επιπλέον,αποτελούν διατροφική πηγή του ανθρώπου.το γεγονός αυτό καθιστά επιτακτική την ανάγκη ελέγχου του υδάτινου χώρου της καλλιέργειας.

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 Εικόνα 1. Γεωγραφική κατανοµή των ειδών του γένους Mytilus, σύµφωνα µε µορφολογικά ή/και γενετικά δεδοµένα (Gosling,1992). Το είδος Mytilis galloprovincilais εντοπίζεται κατά µήκος των ακτών της Μεσογείου,καθώς και σε περιοχές µε ίδιο γεωγραφικό µήκος ( υτικές περιοχές των ΗΠΑ και Ανατολικές περιοχές της Ασιατικής ηπείρου). Picture 1. Geographical distribution of the different species of Mytilus based on evidence from morphological and/or genetic data (Gosling, 1992). Mytilus galloprovincialis species found in the Mediterranean Sea as wellas in regions with similargeographicaldata (W estside ofthe USA and Εast side ofasia). Εικόνα 2.Ανατοµία του είδους Mytilus galloprovincialis. 1. Βράγχια, 2. Πρόσθιος προσαγωγός µύς,3.ποδίσκος,4.πεπτικός αδένας,5. Σπλαχνικός ιστός, 6. Σύµπλοκο µανδύας/γoνάδες (από M engoli,1998). Picture 2.M.galloprovincialis anatom y. 1.Gills;2.Posterioradductormuscle;3. Foot; 4. Digestive gland; 5. Visceral mass;6.mantle/gonad system (adjusted by M engoli,1998).

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Περιβαλλοντικοί παράγοντες που επηρεάζουν τα ίθυρα Μαλάκια: Υπάρχουν διάφοροι περιβαλλοντικοί παράγοντες που µπορούν να επηρεάσουν τη φυσιολογία και συµπεριφορά των ίθυρων Μαλακίων.Πρόκειται για παράγοντες γενικού stress που µπορούν να επηρεάσουν το ρυθµό αύξησης και πρόσληψης τροφής,τον αναπαραγωγικό κύκλο και γενικά τη συµπεριφορά του οργανισµού. Αβιοτικοί παράγοντες,όπως η αλατότητα,η θερµοκρασία του νερού,καθώς και η έκθεση των ατόµων στην ατµόσφαιρα,µπορεί να επηρεάσουν το φυσιολογικό ρυθµό ανάπτυξης των ίθυρων Μαλακίων, καθώς και την απόκρισή τους σε διάφορους ρυπογόνους παράγοντες (Philips,1976;Cossa και συν.,1979;davies και Pirie,1980).Για παράδειγµα,η έκθεση των πληθυσµών της παραλιακής ζώνης στην ατµόσφαιρα,µπορεί να επηρεάσει το µεταβολισµό των οργανισµών,αυξάνοντας την αναερόβια αναπνοή και µεταβάλλοντας τη συµπεριφορά τους,τη φυσιολογική τους οµοιόσταση,αλλά και τη δράση των ενζύµων στα κύτταρά τους.επιπλεόν,αυξηµένη αλατότητα οδηγεί το ζώο στην υιοθέτηση µιας οµοιοστατικής συµπεριφοράς µε την οποία θα επιτύχει την όσο το δυνατό καλύτερη προσαρµογή του στις αλλαγές του περιβάλλοντος.ως αποτέλεσµα,παρατηρείται µείωση του χρόνου ανοίγµατος του κελύφους,έτσι ώστε να µπορεί να γίνεται οµαλά η εξισορρόπηση του εσωτερικού περιβάλλοντος και του υδάτινου µέσου. Με αυτό τον τρόπο διατηρείται η οµοιόσταση των κυττάρων και οι ενεργειακές τους απαιτήσεις καλύπτονται µε αναερόβιες διαδικασίες. Παρόµοιες αποκρίσεις τόσο σε επίπεδο φυσιολογίας και συµπεριφοράς του οργανισµού,όσο και σε κυτταρικό επίπεδο παρατηρούνται κατά τη µεταβολή του ph του υδάτινου µέσου (Philips,1976;Davies και Pirie,1980). Επιπλέον, συνθήκες έντονου συνωστισµού µειώνουν τη βιωσιµότητα των ατόµων και θεωρείται παράγοντας stress για τα άτοµα και τον πληθυσµό των Μαλακίων.Λόγω του αυξηµένου ανταγωνισµού για εύρεση τροφής,οι οργανισµοί αναγκάζονται να φιλτράρουν µεγάλες ποσότητες νερού, µε αποτέλεσµα να παρατηρείται αυξηµένος ρυθµός πρόσληψης ρυπαντών.επιπλέον,το µέγεθος των ίθυρων Μαλακίων µειώνεται και ο αναπαραγωγικός τους κύκλος µεταβάλλεται ως αποτέλεσµα του έντονου συνωστισµού, ο οποίος µειώνει σηµαντικά το ποσό της τροφής που προσλαµβάνεται.επίσης,διάφοροι βιοτικοί παράγοντες,όπως η ηλικία, το βάρος του µαλακού ιστού, το µέγεθος (παράγοντες ανάπτυξης), καθώς και η περίοδος της γαµετογένεσης, µπορεί να επηρεάσουν το φυσιολογικό ρυθµό ανάπτυξης των ίθυρων Μαλακίων, καθώς και την απόκρισή τους σε διάφορους ρυπογόνους παράγοντες (Philips,1976;Cossa και συν.,1979;davies και Pirie,1980).

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 2. Βιοπαρακολούθηση και χρησιµοποίηση Βιοµαρτύρων. Τα τελευταία χρόνια σηµαντικό προβάδισµα στην προσπάθεια βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης έχει αποκτήσει η χρήση βιολογικών παραµέτρων που χαρακτηρίζονται ως «δείκτες στρες» (stress indices)ή βιοµάρτυρες (biom arkers), (Bayne, 1989; Gray, 1992). Η παρατήρηση και µέτρηση κάθε µεταβολής που γίνεται σε µοριακό, βιοχηµικό και κυτταρικό επίπεδο, καθώς και µεταβολές σε επίπεδο φυσιολογίας και συµπεριφοράς ενός οργανισµού που έχει εκτεθεί ή εκτίθεται σε τουλάχιστον ένα ρυπογόνο παράγοντα, µπορεί να χαρακτηριστεί ως βιοµάρτυρας (Adams,1990;Roy και H anninen,1993;fishelson, 1995;Lagadic και συν.,1997;breslerκαι συν.,1999;fishelson και συν.,1999). Η χρήση βιοµαρτύρων προϋποθέτει την ύπαρξη ορισµένων κριτηρίων,όπως η επαναληψιµότητα,η ευαισθησία και η εξειδικευµένη δράση του,ο σύντοµος χρόνος απόκρισης και η ικανότητά του να επανέρχεται στα φυσιολογικά του επίπεδα,µετά τη δράση του (αναστρεψιµότητα),το µεγάλο εύρος των ειδών στα οποία εµφανίζεται,η ευκολία εφαρµογής και το χαµηλό κόστος χρησιµοποίησής του,σε συνδυασµό µε έγκυρα αποτελέσµατα. Με άλλα λόγια, οι βιοµάρτυρες χρησιµοποιούνται ως εργαλεία έγκαιρης προειδοποίησης και πρόβλεψης των επιπτώσεων της ρύπανσης (M ccarthy και Shugart,1990;H uggertκαι συν.,1992). Οι βιοµάρτυρες που χρησιµοποιούνται διακρίνονται σε δυο κατηγορίες,σε βιοµάρτυρες γενικού stress και σε βιοµάρτυρες ειδικού stress.η ταυτόχρονη µελέτη βιοµαρτύρων γενικού και ειδικού stress,σε συνδυασµό µε τη γνώση της φυσιολογίας του εκάστοτε οργανισµού και του οικοσυστήµατός του,αλλά και η συσχέτιση µεταξύ τους, δίνουν µια ικανοποιητική εικόνα των επιπτώσεων των διαφόρων ρυπαντών στους οργανισµούς και ταυτόχρονα προσφέρουν και µια σαφή εικόνα της κατάστασης του περιβάλλοντος,από άποψη ρύπανσης. Οι βιοµάρτυρες γενικού stress συνιστούν αποκρίσεις σε µια οµάδα ρυπαντών, χωρίς να προσδιορίζεται ακριβώς η φύση τους,σε αντίθεση µε τους βιοµάρτυρες ειδικού stress,όπου ο προσδιορισµός τους σχετίζεται µε έκθεση των οργανισµών σε συγκεκριµένες οµάδες ρυπαντών.στην πρώτη κατηγορία ανήκει ο προσδιορισµός της σταθερότητας της λυσοσωµικής µεµβράνης,(lysosom almembrane stability,lm S) των πεπτικών λυσοσωµάτων και η συχνότητα εµφάνισης των µικροπυρήνων (M icronuclei frequency assay m ethod).στην κατηγορία των βιοµαρτύρων ειδικού stress µπορεί να συµπεριληφθούν ο προσδιορισµός των µεταλλοθειονινών (ΜΤ),

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8 πρωτεΐνες που επάγονται κυρίως µετά την έκθεση σε βαρέα µέταλλα και ο προσδιορισµός της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE), µετά την επίδραση οργανικών ρυπαντών.στα ίθυρα Μαλάκια και συγκεκριµένα στο είδος Mytilus galloprovincialis χρησιµοποιούνται ευρύτατα ως βιοµάρτυρες της ρύπανσης τόσο η δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE),όσο και η συγκέντρωση των µεταλλοθειονινών (ΜΤ),που αναλύονται παρακάτω.

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 ΙΙ. ΘΕΡΜΑΪΚΟΣ ΚΟΛΠΟΣ. ΟΡΓΑΝΙΚΟΙ ΚΑΙ ΑΝΟΡΓΑΝΟΙ ΡΥΠΑΝΤΕΣ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS. 1. Θερµαϊκός κόλπος και γεωγραφικά χαρακτηριστικά. Κλειστά θαλάσσια οικοσυστήµατα εµφανίζουν έκδηλα φαινόµενα ρύπανσης, λόγω της αύξησης οργανικών και ανόργανων ρύπων.ο Θερµαϊκός κόλπος αποτελεί ένα κλειστό θαλάσσιο οικοσύστηµα στο Β τµήµα του Αιγαίου πελάγους (Εικόνα 3). Η επικοινωνία µε το Αιγαίο πέλαγος περιορίζεται από το µακρύ (170 χλµ)και στενό (περίπου 50 χλµ)στόµιο του κόλπου,καθώς και από την ασθενή παλιρροιακή ροή των νερών. Εικόνα 3.Φωτογραφία από δορυφόρο του Θερµαϊκού κόλπου.με κόκκινο διακρίνονται οι αγροτικές εκτάσεις στις περιοχές εκβολής των ποταµών Αλιάκµονα,Λουδία και Αξιού,ενώ µε µπλε χρώµα φαίνονται οι αστικές περιοχές. Picture 3. Satelite photograph of Thermaikos gulf. Red colour represents agriculture areas along Aliakm onas,loudias and Aksios rivers,while blue colourrepresents urban areas.

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 10 Ο Θερµαϊκός κόλπος αποτελεί τελικό αποδέκτη ρυπογόνων παραγόντων, λόγω της επίδρασης που δέχεται από αστικούς ρύπους της πόλης της Θεσσαλονίκης (πληθυσµός 1.1 εκατοµµύρια),της βιοµηχανικής δραστηριότητας και της ύπαρξης τόσο του λιµανιού,όσο και των φερτών υλικών που διοχετεύονται στον κόλπο,µέσω των τριών µεγάλων ποταµών που εκβάλλουν στην Ν πλευρά (Αλιάκµονας,Λουδίας και Αξιός). Η χηµική ανάλυση του πλήθους των τοξικών ουσιών (>4000 τοξικές ουσίες) των νερών του Θερµαϊκού κόλπου µπορεί να δώσει µια εικόνα της ρύπανσης και αποτελεί µια τεχνική µελέτης και παρακολούθησης του θαλάσσιου οικοσυστήµατος (chem ical m onitoring), αν και υπάρχουν διάφοροι φυσικοί και βιολογικοί παράµετροι,όπως το φαινόµενο της «άνθισης» του φυτοπλαγκτού,τα αιωρούµενα σωµατίδια, καθώς και η µετακίνηση των οργανισµών, οι οποίοι µπορούν να επηρεάσουν τα εξαγόµενα αποτελέσµατα (NRC,1980;EKTHE,1997). 2. Συσσώρευση βαρέων µετάλλων σε ιστούς του είδους Mytilus galloprovincialis. Επίπεδα βαρέων µετάλλων σε άτοµα από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Τα µέταλλα βρίσκονται σε αυξηµένες συγκεντρώσεις στα νερά και στα ιζήµατα παράκτιων και εκβολικών περιοχών, ειδικότερα σε περιοχές όπως δέλτα ποταµών και περιοχές εναπόθεσης βιοµηχανικών αποβλήτων. ιακρίνουµε δυο µεγάλες κατηγορίες µετάλλων, ανάλογα µε τη βιολογική τους σηµασία, τα απαραίτητα (essential,πχ.,ψευδάργυρος και χαλκός) και τα µη-απαραίτητα (nonessential,π.χ.,κάδµιο,αρσενικό,υδράργυρος,µόλυβδος).τα απαραίτητα µέταλλα συµµετέχουν στην ενεργοποίηση µεταλλοπρωτεϊνών, πρωτεϊνών στρες, στη µεταφορά οξυγόνου,καθώς και σε πολλές αναγωγικές και άλλες διαδικασίες του οργανισµού.μικρές συγκεντρώσεις των απαραίτητων µετάλλων,όπως Zn και Cu, είναι απαραίτητες για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, µιας και έχουν αναπτυχθεί ειδικοί µηχανισµοί για την πρόσληψη και µεταφορά τους στους ιστούς (Nicaise και συν.,1989;nott,1991).τα µη-απαραίτητα µέταλλα δεν έχουν κάποιο συγκεκριµένο βιολογικό ρόλο.αντίθετα,παρουσιάζουν µεγάλη τοξικότητα,ακόµα και σε µικρές συγκεντρώσεις (Rainbow, 1993). Η αντιµετώπιση των τοξικών επιπτώσεων των µη-απαραίτητων µετάλλων από τους οργανισµούς γίνεται µε διαδικασίες συσσώρευσης των µετάλλων σε µη τοξικές µορφές,µέσω της σύνδεσής τους µε οργανικές χειλικές ενώσεις ή το σχηµατισµό συµπλόκων µε ανόργανα υλικά

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11 σε µορφή ιζηµάτων (Simkiss και Taylor, 1989; Viarengo, 1989; Depledge και Rainbow, 1990). Τα µη-απαραίτητα µέταλλα συναγωνίζονται µε τα απαραίτητα µέταλλα στις θέσεις σύνδεσης των τελευταίων,µε αποτέλεσµα την αντικατάστασή τους και την εµφάνιση πολλών βλαβερών επιπτώσεων στον µεταβολισµό των οργανισµών (Hartwig,1998). Μέταλλα όπως Zn, Cu,Cd,Ag,Al, Fe, Mn,Ni, Pb, U,Hg προέρχονται κυρίως από τη βιοµηχανική δραστηριότητα του ανθρώπου.τα µέταλλα βρίσκονται διαλυµένα στο υδάτινο µέσο µε τη µορφή ελεύθερων ιόντων, ανόργανων και οργανικών συµπλόκων.η βιοσυσσώρευσή τους βασίζεται στη χηµική µορφή,στο ρυθµό και στο µηχανισµό πρόσληψης. Για την πλειοψηφία των µετάλλων, η πρόσληψη είναι ανάλογη της συγκέντρωσής τους στο υδάτινο περιβάλλον (Goldberg, 1980;Depledge και Rainbow,1990). Τα θαλάσσια Μαλάκια (µύδια,στρείδια,χτένια και σαλιγκάρια)µπορούν να συσσωρεύσουν υψηλές συγκεντρώσεις µετάλλων στους ιστούς τους (Goldberg,1980; 1986;Phillips,1980;Rainbow,1992;1993).Η συσσώρευση των µεταλλικών ιόντων στους ιστούς των οργανισµών επηρεάζεται από πολλούς περιβαλλοντικούς παράγοντες,όπως το µέγεθος των ζώων,η ηλικία,το φύλο,ο ρυθµός αύξησης,η αναπαραγωγική δραστηριότητα, η εποχικότητα, το ύψος της υδάτινης στήλης, η αλατότητα,αλλά και η παρουσία άλλων ρυπαντών στο περιβάλλον (Boyden,1977; Cossa και συν.,1980). Ο πεπτικός αδένας είναι ο κύριος ιστός εναπόθεσης και αποθήκευσης µετάλλων (Depledge και Rainbow,1990)και οργανικών ρυπαντών (Syasina και συν., 1997). Η πρόσληψη των µετάλλων µπορεί να γίνει µε παθητική µεταφορά, µε διάχυση µεταλλικών ιόντων ή συµπλόκων µετάλλων (Simkiss και Taylor, 1989; Viarengo,1989),καθώς και µε ανταλλαγή µε ανόργανα ιόντα,ενδοκύτωση και µε τη διαδικασία της πινοκύτωσης οργανοµεταλλικών συµπλόκων (Depledge και Rainbow, 1990; Endo και συν., 1998; 2000). Ο πεπτικός αδένας διαθέτει ένα πλούσιο λυσοσωµικό δίκτυο,στο οποίο επιτελείται ο µεταβολισµός των οργανικών ρυπαντών και η αποτοξίνωση του οργανισµού (M oore, 1985; Viarengo και συν., 1987; D om ouhtsidou και Dimitriadis,2001;Pisoniκαι συν.,2004). Χηµικές αναλύσεις τόσο σε ιζήµατα, όσο και στο σώµα των ίθυρων Μαλακίων,όπως µύδια του είδους Myilus galloprovincialis που χρησιµοποιούνται ως βιοενδείκτες της θαλάσσιας ρύπανσης,έχουν δείξει αυξηµένη συσσώρευση βαρέων µετάλλων.συγκεκριµένα, οι συγκεντρώσεις των βαρέων µετάλλων σε άτοµα που

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 12 συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου είναι αρκετά αυξηµένες σε περιοχές της υτικής πλευράς,κοντά στη βιοµηχανική ζώνη της Θεσσαλονίκης, στην περιοχή του λιµανιού,καθώς και στις περιοχές όπου εκβάλλουν οι µεγάλοι ποταµοί της περιοχής (A nagnostou και συν.,1997;1998;v outsinou-taliadouriκαι συν., 1998). Σύµφωνα µε πρόσφατα δεδοµένα, οι τιµές των µετάλλων που µετρήθηκαν στο σώµα µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου κυµαίνονται από 1.02 ως 5.17 ppm για το χρώµιο (Cr),4.46 ως 6.11 ppm για το χαλκό (Cu),9.68 ως ppm για το µαγγάνιο (M n),1.47 ως 9.78 ppm για το νικέλιο (Ni),0.97 ως 2.16 ppm για το µόλυβδο (Pb)και 40 ως 101 ppm για τον ψευδάργυρο (Zn),µε τις υψηλότερες τιµές να διαπιστώνονται σε περιοχές της υτικής πλευράς του κόλπου (Catsikiκαι συν.,2001). 3. Συσσώρευση οργανικών ρυπαντών σε ιστούς του είδους Mytilus galloprovincialis. Τιµές οργανικών ρυπαντών σε άτοµα από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Οι περισσότεροι οργανικοί ρυπαντές παρουσιάζουν λιπόφιλο χαρακτήρα (Cossarini-D unier και συν.,1987) και αυξηµένο ρυθµό συσσώρευσης στους ιστούς των οργανισµών (La Rocca και συν., 1991). Η µικρή υδατοδιαλυτότητα των περισσοτέρων οργανικών ρυπαντών,η µη-βιοδιάσπασή τους,καθώς και η αδυναµία αποµάκρυνσής τους από τους ιστούς,αποτελούν κύριους παράγοντες τοξικότητας για τους οργανισµούς. Τα ίθυρα Μαλάκια και ειδικότερα το είδος M.galloprovincialis έχει γίνει αντικείµενο πολλών µελετών, λόγω της ικανότητας συσσώρευσης οργανικών ρυπαντών στους ιστούς του (Contardi και συν., 1979; Κilikidis και συν., 1981; Satsm adjis και V outsinou, 1983; Satsm adjis και Gabrielides, 1983; Picer και συν., 1985;Najdec και B azulic,1988;picer και Picer,1994;Granby και Spliid,1995).Το είδος Mytilus galloprovincialis λόγω της τροφοληπτικής του ικανότητας µπορεί και συσσωρεύει µεγάλες ποσότητες οργανικών ουσιών στους ιστούς του, πολύ µεγαλύτερες από αυτές που βρίσκονται στο περιβάλλον (Shugart και συν., 1992; Dellingerκαι συν.,1994;stien και συν.,1998;cajaraville και συν.,2000;viarengo και συν.,2000). Οι συγκεντρώσεις των πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων (PA H s) που µετρήθηκαν σε περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου κυµαίνονται από ως ppb στο σώµα µυδιών και ως ppb στα ιζήµατα,µε τις υψηλότερες τιµές

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13 να εντοπίζονται στα Ανατολικό τµήµα (περιοχή Περαίας),(Catsikiκαι συν.,2001). Τα οργανοχλωριωµένα παράγωγα στο σώµα µυδιών κυµαίνονται από 18.2 ως 84 ppb µε αυξανόµενες τιµές στο Ανατολικό τµήµα του κόλπου (περιοχή Περαίας) και µειωµένες τιµές στην περιοχή του Αγγελοχωρίου.Επιπλέον,έχει αναφερθεί η ύπαρξη εντοµοκτόνων και PCBs στα νερά του Θερµαϊκού κόλπου (Albanis και συν.,1994; Kam arianos και Kilikidis, 1997;Hatzianestis και συν.,2000;kam arianos και συν., 2002).

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 14 ΙΙΙ. ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΒΑΡΕΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ. 1. Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ). Οι Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ) αποτελούν µια οµάδα πρωτεϊνών χαµηλού µοριακού βάρους (6-7 kd a), πλούσιες σε κυστεϊνη. Βρίσκονται κυρίως στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων όπου και συνδέονται µε µεταλλικά ιόντα. Η οικογένεια των ΜΤ έχει αναφερθεί σε όλους τους οργανισµούς,τόσο σε σπονδυλωτά (θηλαστικά, ιχθύες, αµφίβια, ερπετά, πτηνά) και ασπόνδυλα (εχινόδερµα, καρκινοειδή,έντοµα και µαλάκια),όσο και σε ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς µικροοργανισµούς (Hamer,1986;Kagiκαι Kojima,1987;Engelκαι Brouw er,1989; Ranser,1990). Οι ιδιότητες και η φύση των ΜΤ υποδηλώνουν διττή λειτουργία τόσο σε επίπεδο διατήρησης της οµοιόστασης, όσο και σε επίπεδο αποτοξίνωσης του οργανισµού από τις βλαβερές επιπτώσεις των βαρέων µετάλλων (Squibb και συν., 1974,Roesijadi1992,Viarengo και Nott,1993).Ειδικότερα,οι ΜΤ συµµετέχουν στο µεταβολισµό των απαραίτητων µετάλλων του οργανισµού,zn και Cu,ενώ παίρνουν µέρος στην αποτοξίνωση των κυττάρων τόσο από τα ενδογενή µέταλλα,όσο και από µέταλλα τα οποία θεωρούνται επιβλαβή για τον οργανισµό,όπως το κάδµιο (Cd),ο µόλυβδος (Pb),ο υδράργυρος (Hg)κ.α.(Foulkes,1982;Cousins,1985;Hamer,1986; Engelκαι Brouw er,1987; Brouw er και συν.,1989).μελέτες πολλών ερευνητικών οµάδων υποστηρίζουν το ρόλο των ΜΤ ως µεταλοπρωτεΐνες-δότες µεταλλικών ιόντων Zn, και πιθανό Cu, σε σηµαντικές διαδικασίες του οργανισµού, όπως ο µεταβολισµός των νουκλεϊκών οξέων, η πρωτεϊνοσύνθεση, η ανάπτυξη και η αναγέννηση τραυµατισµένων ιστών (Ohtake και συν.,1978;brady και Webb,1981; Danielson και συν.,1982;cousins,1985).επίσης,οι ΜΤ φαίνεται να διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο σε καταστάσεις stress, όπως το κρύο, η ζέστη, και η επίδραση χηµικών ουσιών (Oh και συν.,1978),καθώς και στην αντιοξειδωτική άµυνα του οργανισµού,λόγω της ικανότητάς τους να δεσµεύονται µε ελεύθερες ρίζες (Bakka και συν.,1982;thornally και Vasak,1985). Η επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ µπορεί να επιτευχθεί από ένα µεγάλο αριθµό παραγόντων,µε κυριότερους τα µέταλλα Cd,Cu,Zn,Hg,Co,Ni,Bi,Ag (Bracken και Klaassen, 1987), ενώ σηµαντική αύξηση της σύνθεσης των ΜΤ πραγµατοποιείται µετά από επίδραση γλυκοκορτικοειδών (Cousins, 1985; Karin,

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ),προγεστερόνης (Brem ner και συν.,1981),κατεχολαµινών (Brady και Helvig, 1984), γλουκαγόνου (DiSilvestro και Cousins, 1984), ιντερλευκίνων (Cousins και Leinart, 1988) και ιντερφερονών (Friedm an και Stark, 1985). Άλλοι παράγοντες, όπως η θερµοκρασία,ο αναπαραγωγικός κύκλος (Serra και συν.,1999),η ηλικία και το µέγεθος των οργανισµών,µπορεί να επηρεάσουν την επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ (Viarengo και συν.,1997;m ouneyrac και συν.,1998;2001;rotchellκαι συν., 2001). Οι περισσότεροι οργανισµοί διαθέτουν δύο κύριες µορφές ΜΤ,µια µονοµερή που αποτελείται από 72 αµινοξέα µε 21 κυστεΐνες,και µια διµερή µε 71 αµινοξέα, στην οποία έχει γίνει µετατόπιση της 6 ης κυστεΐνης από τη θέση 23 στη θέση 22,ενώ υπάρχει και µια επιπρόσθετη κυστεΐνη στη θέση 55.Και οι δύο µορφές φαίνεται να ρυθµίζονται στο επίπεδο της µεταγραφής,από βαρέα µέταλλα (π.χ.,cu,cd,zn), γλυκοκορτικοειδή και κυτοκίνες (Richards και συν.,1984;hamer,1986;sadhu και Gedamu,1988;W aalkes και Goering,1990). Οι ΜΤ έχουν βρεθεί σε διάφορους ιστούς θαλάσσιων ασπόνδυλων,όπως στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και τον µανδύα των µυδιών (Bebianno και Langston, 1992;Livingston και Pipe,1992;Viarengo και συν.,1997).η παρουσία Cd-ΜΤ και γενικότερα η επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ σε ίθυρα Μαλάκια από µέταλλα,όπως το Cd,Cu,Hg έχουν αναφερθεί από πολλές ερευνητικές οµάδες (Noelκαι Lam bot, 1976; Talbotκαι Magee,1978;Noelκαι Lam bot,1980; Viarengo και συν.,1980; K ohler και Riisgard,1982;Langston και Zhou,1986; Roesijadi,1992;Pavicic και συν.,1993).η ανίχνευση 9 ισοµορφών,σε µονοµερή και διµερή µορφή (George, 1979;Frankenne και συν.,1980;frazierκαι συν.,1985),καθώς και η ακολουθία των αµινοξέων τους (M ackay και συν.,1993)µαρτυρούν τη σηµασία των ΜΤ στα ίθυρα Μαλάκια. Η εφαρµογή µεθόδων προσδιορισµού των επιπέδων των ΜΤ ως βιοµάρτυρα έκθεσης σε βαρέα µέταλλα τόσο σε µύδια, όσο και σε άλλους θαλάσσιους οργανισµούς βρίσκει µεγάλη αποδοχή και χρησιµοποιείται σε πολλά ερευνητικά προγράµµατα σε όλο τον κόσµο (Roesijadi1992,Langston και συν.,1998,rotchell και συν.,2001).μελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης,αναφέρονται στη σχέση µεταξύ των επιπέδων των µετάλλων στο περιβάλλον και των επιπέδων των ΜΤ τόσο σε Ιχθύες (Hamilton και Mehrle,1986),όσο και σε θαλάσσια ασπόνδυλα (Roesijadi,1981).Σε γενικές γραµµές,οι ΜΤ χρησιµοποιούνται ως βιοµάρτυρες της έκθεσης των οργανισµών σε βαρέα µέταλλα,ιδιαίτερα σε έντονα επιβαρηµένες µε

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 16 βαρέα µέταλλα βιοµηχανικές περιοχές (Lobel και Payne, 1987; Carpene και συν., 1993;Viarengo και συν.,1997,lafontaine και συν.,2000). 2. Ενζυµική δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE). Μεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων που µεταβάλλονται σηµαντικά,στους ιστούς των ζώων που εκτίθενται σε περιβάλλον έντονα επιβαρυµένο µε ρύπους,είναι η δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE). Μελέτες σχετικά µε τη χρησιµότητα του συγκεκριµένου ενζύµου ως βιοµάρτυρα της θαλάσσιας ρύπανσης έδειξαν πως η δραστικότητα της AChE αναστέλλεται σε άτοµα τα οποία εκτίθενται σε περιβάλλον πλούσιο σε οργανοφωσφορικά, παράγωγα του πετρελαίου, εντοµοκτόνα κλπ., ουσίες που αποτελούν σηµαντικούς ρυπαντές σε γλυκά και αλµυρά νερά (Weiss και Gakstatter,1964; Weiss, 1965; William s και Sova,1966; Holland και συν.,1967; Zincklκαι συν.,1987;bocquene και συν.,1990;day και Scott,1990;M oulton και συν.,1996;payne και συν.,1996;v arela και A ugspurger, 1996;Stien και συν.,1998;luo και συν.,1999;w ogram και συν.,2001).επίσης, βαρέα µέταλλα µπορούν να επηρεάσουν τη δραστικότητα του ενζύµου,σύµφωνα µε έρευνες που έγιναν τόσο σε Ιχθύες (Payne και συν., 1996), όσο και σε ίθυρα Μαλάκια (Najimiκαι συν.,1997;hamza-chaffaiκαι συν.,1998). Λόγω της µικρής διάρκειας ζωής των οργανοφωσφορικών προϊόντων στο θαλάσσιο περιβάλλον (Barron και W oodburn, 1995), ο προσδιορισµός των επιπτώσεών τους στους οργανισµούς µέσω της εκτίµησης της αναστολής των χολινεστερασών (ChEs)και ειδικότερα των AChEs,αποτελεί σηµαντικό εργαλείο στην προσπάθεια βιοπαρακολούθησης του περιβάλλοντος.το ιεθνές Εργαστήριο Μελέτης των Βιολογικών Επιπτώσεων (International Workshop on Biological Effects) έδειξε την αποτελεσµατικότητα της χρησιµοποίησης της µεθόδου προσδιορισµού της δραστικότητας της AChE σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης, µε τη χρήση του οργανισµού βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis (UNEP,1993;1997;UNEP/RAM OGE,1999). H AChE ανήκει σε µια µεγάλη οµάδα εστερασών, που ονοµάζονται χολινεστεράσες (ChEs).Η οµάδα των ChEs περιλαµβάνει τις ακετυλχολινεστεράσες (AChEs),τις βουτυριλχολινεστεράσες (ΒChEs),(Valbonesiκαι συν.,2003) και µια τρίτη κατηγορία,τις καρβοξυλεστεράσες (CbEs)ή αλιεστεράσες,(escartin και Porte, 1997).ChEs ανιχνεύτηκαν στο σώµα σπονδυλωτών,σε ιστούς και στην αιµόλεµφο Μαλακίων και Εντόµων, καθώς και σε ιστούς Ερπετών (Bockendahlκαι Muller,

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ; Voigtm ann και Uhlenbruck, 1971; Kumar και Elliot, 1973). Στα ίθυρα Μαλάκια,και συγκεκριµένα στο µύδι Mytilus galloprovincialis, η AChE αφθονεί στην αιµόλεµφο, στα βράγχια και στον πεπτικό αδένα, ενώ η BChE και η CbE µετρήθηκαν κυρίως στον πεπτικό αδένα. Η AChE και η ΒChE αποτελούν µία οµάδα εστερασών, συνδεδεµένων στην επιφάνεια των χολινεργικών περιοχών,και είναι σηµαντικές για τη µεταβίβαση των νευρικών ώσεων στις νευροµυϊκές συνάψεις (W alkerκαι Thom pson,1991).η AChE καταλύει την υδρόλυση της ακετυλχολίνης,ενώ η ΒChE καταλύει την υδρόλυση της βουτυρυλχολίνης (Luo και συν.,1999).οι CbE (ή αλιεστεράσες)έχει αναφερθεί ότι ευθύνονται για την υδρόλυση µεγάλου εύρους εξωγενών και ενδογενών παραγόντων, που θα µπορούσαν να αναστείλλουν τη δραστικότητα των AChE και ΒChE. Συγκεκριµένα, οι CbE προκαλούν άµεση υδρόλυση των εστερικών οµάδων των AChE και ΒChE στις οποίες δεσµεύονται οι οργανοφωσφορικές ουσίες,µειώνοντας παράλληλα την ικανότητα των τελευταίων να αναστέλλουν τη δραστικότητα των AChE και ΒChE (Jokanovic και συν.,1996). Στα ίθυρα Μαλάκια, ο ρόλος της AChE που βρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στην αιµόλεµφο, δεν είναι ακόµα πλήρως αποσαφηνισµένος (Von W achtendonk και N eef,1979).αρκετά δεδοµένα αναφέρουν την ικανότητά της να υδρολύει την ακετυλχολίνη. Η δράση της AChE πάνω στην ακετυλχολίνη της αιµολέµφου φαίνεται να είναι πολύ σηµαντική, µιας και η παρουσία της ακετυλχολίνης σε άλλα όργανα του σώµατος είναι επιβλαβής (Engelhard και συν., 1967; A ugustinsson, 1971; Herz και K aplan, 1973; V on W achtendonk και Neef, 1979).

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 18 ΜΕΡΟΣ Β Ι. Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ. ΕΠΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ. Για τα περισσότερα ρυθµιστικά µόρια, η σύνδεσή τους µε µεµβρανικούς υποδοχείς,συνοδεύεται από µια σύνθετη σειρά γεγονότων,που περιλαµβάνει την µετατροπή του εξωκυτταρικού ερεθίσµατος σε ενδοκυτταρικό σήµα, την ενεργοποίηση µιας σειράς µεταβολών σε ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν σε µονοπάτια µετάδοσης σήµατος και τελικά την επίδρασή τους στη λειτουργία του κυττάρου. Εξωκυτταρικά ρυθµιστικά µόρια ασκούν την επίδρασή τους στα κύτταρα µέσω της επέµβασης τους σε οδούς µεταγωγής σηµάτων.μέσα από αυτές τις οδούς, µια ρυθµιστική ουσία (πρώτος αγγελιοφόρος-first m essenger) που δεσµεύεται στον µεµβρανικό της υποδοχέα προκαλεί µια κυτταρική απόκριση, αλλάζοντας τη δραστικότητα συγκεκριµένων πρωτεϊνών του κυττάρου. Ουσίες όπως η ορµόνη αδρεναλίνη,νευροδιαβιβαστές,αυξητικοί παράγοντες και κυτοκίνες,βαρέα µέταλλα και οργανοφωσφορικές ενώσεις,µπορεί να δράσουν ως πρώτοι µηνύτορες και να επάγουν την έναρξη οδών µεταγωγής σήµατος, µετά τη σύνδεσή τους σε µεµβρανικούς υποδοχείς (Gomperts και συν.,2002).το κύριο µόριο που µελετάται στην παρούσα µελέτη και λαµβάνει µέρος σε µονοπάτια µεταγωγής µηνύµατος είναι η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,η οποία αναλύεται παρακάτω. 1. Μονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Η γνώση που διαθέτουµε για τη δράση βιολογικών µορίων, καθώς και εξωκυτταρικών παραγόντων στους σηµατοδοτικούς µηχανισµούς του κυττάρου προήλθε αρχικά από µελέτες του EarlW.Sutherland (1971),που του απέδωσαν το βραβείο Νόµπελ. Η διαδικασία της επαγωγής σηµατοδοτικού µηχανισµού περιλαµβάνει τρία στάδια:της υποδοχής (reception),της µεταγωγής (transduction) και της κυτταρικής απόκρισης (response),(σχήµα 1). Στάδιο υποδοχής:η υποδοχή περιλαµβάνει την ανίχνευση του κυττάρου-στόχου από το σηµατοδοτικό µόριο και την πρόσδεσή του σε µια πρωτεΐνη της πλασµατικής µεµβράνης (πρωτεΐνη-υποδοχέας). Στάδιο µεταγωγής: Η πρόσδεση του σηµατοδοτικού µορίου στην πρωτεΐνηυποδοχέα επιφέρει µερική αλλαγή της δοµής της πρωτεΐνης,επάγωντας το στάδιο της

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 19 µεταγωγής. Το στάδιο αυτό περιλαµβάνει τη µετατροπή του εξωκυτταρικού ερεθίσµατος σε ενδοκυτταρικό σήµα, το οποίο µπορεί να οδηγήσει σε µια εξειδικευµένη κυτταρική απόκριση. Η µεταγωγή µπορεί να γίνει άµεσα (µε τη µεσολάβηση ενός βήµατος), αλλα τις περισσότερες περιπτώσεις απαιτεί µια αλληλουχία µεταβολών σε ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που αποτελούν ένα µονοπάτι µεταγωγής σήµατος. Εξωκυττάριος χώρος Κυτταρόπλασµα Πλασµατική µεµβράνη ΥΠΟ ΟΧΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ Πρωτεϊνη-υποδοχέας Ενεργοποίηση κυτταρικών αποκρίσεων Μονοπάτι µεταγωγής σήµατος Σηµατοδοτικό µόριο Σχήµα 1. ιαδικασία επαγωγής σηµατοδοτικού µηχανισµού, µετά την πρόσδεση σηµατοδοτικού µορίου σε ειδικές πρωτεΐνες-υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης του κυττάρου. Schem e 1. Signal transduction process after binding of signaling m olecule to plasma membrane protein-ligand. Στάδιο απόκρισης: Στο τρίτο στάδιο, το επαγώµενο µήνυµα οδηγεί σε µια εξειδικευµένη κυτταρική απόκριση. Η απόκριση µπορεί να είναι κάθε εµφανής ενδοκυτταρική δραστηριότητα, όπως η καταλυτική ικανότητα ενός ενζύµου, η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού,η ενεργοποίηση και έκφραση γονιδίων του πυρήνα,κ.α.η σηµατοδοτική διαδικασία διασφαλίζει την κατάλληλη απόκριση του κυττάρου,την κατάλληλη στιγµή και τη συνεργασία του αποκρινόµενου κυττάρου µε τα υπόλοιπα κύτταρα του οργανισµού (Cam bellκαι συν.,1999). 1.1 Πρωτεΐνες-υποδοχείς: Τα περισσότερα σηµατοδοτικά µόρια είναι υδατοδιαλυτά και πολύ µεγάλα για να περάσουν ελεύθερα µέσω της πλασµατικής µεµβράνης. Γι αυτό το λόγο, δεσµεύονται σε ειδικές περιοχές πρωτεϊνών-υποδοχέων της πλασµατικής µεµβράνης,

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 20 οι οποίοι µεταφέρουν το µήνυµα στο εσωτερικό του κυττάρου.υπάρχουν τρεις τύποι πρωτεϊνών-υποδοχέων της πλασµατικής µεµβράνης (Nishizuka, 1992), ενώ έχουν αναφερθεί και πρωτεϊνικοί υποδοχείς στο εσωτερικό του κυττάρου (Cambellκαι συν., 1999). Παρακάτω αναφέρονται περιληπτικά τα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνώνυποδοχέων της πλασµατικής µεµβράνης,καθώς και των ενδοκυτταρικών υποδοχέων Υποδοχείς συζευγµένοι µε κανάλια ιόντων (Ion-channelreceptors): Βρίσκονται κατά κύριο λόγο στις συνάψεις και ενεργοποιούνται από νευροδιαβιβαστές,ελέγχοντας το άνοιγµα και το κλείσιµο των καναλιών και κατά συνέπεια τη διαπερατότητα της µεµβράνης σε ιόντα. Σε αυτή την κατηγορία συµπεριλαµβάνεται ο υποδοχέας της ακετυλχολίνης,νικοτινικοί υποδοχείς,κλπ.,(jan και Jan,1989;Krueger,1989;M ontal,1990) Υποδοχείς συζευγµένοι µε ένζυµα (Enzyme-linked receptors): Πρόκειται για µια αρκετά ετερογενή κατηγορία διαµεµβρανικών υποδοχέων, στην εξωκυτταρική περιοχή των οποίων συνδέεται ο µηνύτορας, ενώ η κυτταροπλασµατική περιοχή τους είτε σχετίζεται άµεσα µε κάποιο ένζυµο, είτε διαθέτει η ίδια ενζυµική δραστικότητα.οι υποδοχείς της κινάσης της τυροσίνης είναι πρωτεΐνες µε ενδογενή δραστικότητα. Όταν αυτές οι πρωτεΐνες δεσµευτούν µε ρυθµιστικά µόρια στην εξωκυτταρική τους περιοχή, ενεργοποιείται η κινάση της τυροσίνης και φωσφορυλιώνει άλλες πρωτεΐνες στο εσωτερικό του κυττάρου (W aterfield,1989;yuen και Garbers,1992;Fantiκαι συν.,1993) Υποδοχείς συζευγµένοι µε G πρωτεϊνες (G-protein-coupled receptors): Οι υποδοχείς αυτής της κατηγορίας, µέσω της σύνδεσής τους µε τις ετεροτριµερείς πρωτεΐνες G, οι οποίες δεσµεύουν και υδρολύουν µόρια τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP),ρυθµίζουν έµµεσα τη δράση πρωτεϊνών-στόχων στην κυτταρική µεµβράνη,όπως διάφορα ένζυµα και κανάλια ιόντων. Οι ετεροτριµερείς G-πρωτεΐνες αποτελούνται από τρεις υποµονάδες,τις α,β και γ.οι µεγαλύτερες (39-46 kd a) είναι οι α-υποµονάδες,οι οποίες περιέχουν την περιοχή δέσµευσης του νουκλεοτιδίου της γουανίνης (GDP και GTP).Οι β-(35-36 kd a) και γ- ( 8kD a) υποµονάδες σχηµατίζουν ένα σταθερό σύµπλεγµα (βγ), το οποίο προσκολλάται στην πλασµατική µεµβράνη των κυττάρων. Οι G-πρωτεΐνες, ανάλογα µε την α-υποµονάδα που διαθέτουν διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες,τις

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 21 G s,g i,g q και G 12,οι οποίες απαντούν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους (Πίνακας 1).Οι G s -πρωτεΐνες φαίνεται να σχετίζονται µε την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης (ΑC),καθώς και των καναλιών Ca +2,ενώ οι G ī πρωτεΐνες αναστέλλουν τη δράση της AC και των καναλιών Ca +2 και K +.Οι G q -πρωτεΐνες σχετίζονται µε την ενεργοποίηση άλλων µεµβρανικών πρωτεϊνών,όπως τη φωσφολιπάση C (PLC),ενώ οι G 12 -πρωτεΐνες βρίσκονται σε στενή επαφή µε την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (Sterweiss,1996). Πίνακας 1. Συνοπτική απεικόνιση των G-πρωτεϊνών, των α-υποµονάδων τους, καθώς και των µεµβρανικών πρωτεϊνών και των σηµατοδοτικών µορίων που ρυθµίζονται από τη δράση τους. Table 1.G-proteins classification,α-subunits members,as w ellas m em brane-bound protein effector regulation and signaltransduction molecules. G-πρωτεΐνες α-υποµονάδες M εµβρανική πρωτεΐνη εύτερος µηνύτορας G s α s AC, δίαυλοι Ca +2 ca M P, Ca +2 α olf AC ca M P G i G q G 12 α i1 AC ca M P α i2,α i3 δίαυλοι K + Μεµβρανικό δυναµικό ( ) α ο δίαυλοι Ca +2 Ca +2 α t1,α τ2 cg M P-PD E cg M P α gust? α z? α q,α 11 PLC IP 3,DAG α 14 PLC IP 3 α 15,α 16 PLC IP 3 α 12 Αντλία Na + /H + α 13 Ca +2 Παρόµοια, οι α-υποµονάδες ρυθµίζουν κυρίως τη δραστικότητα της AC και των διαύλων/καναλιών Ca +2, ενώ το σύµπλοκο των βγ-υποµονάδων φαίνεται να σχετίζεται περισσότερο µε τη ρύθµιση της δραστικότητας της PLC β,η οποία διασπά τη 4,5 -διφωσφορική φωσφατιδυλoϊνοσιτόλη σε 1,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ 3 ) και διγλυκερίδιο, καθώς και των PLA 2 και PLD, οι οποίες συµµετέχουν στην απελευθέρωση λιπαρών οξέων και αραχιδονικού οξέος από φωσφολιπίδια της µεµβράνης.επιπλέον,οι α-υποµονάδες βρέθηκε ότι συµβάλλουν στη διάσπαση της φωσφατιδυλοχολίνης σε χολίνη και φωσφατιδικό οξύ,τη ρύθµιση της δράσης των καναλιών K +,καθώς και την ενεργοποίηση της κινάσης της φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης- 3 (Brow n και Birnbaum er,1990; Lam b και Pugh,1992; Linder και Gilman,1992;

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 22 Clapham και Neer,1993; Sm rcka και Sternw eiss, 1993; Tang και Gilman,1992; Jahangeerκαι Rodbell,1993). Τα µέλη των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων αποτελούνται από 8 διαµεµβρανικές έλικες, µε 22 έως 28 αµινοξέα, τα οποία είναι κυρίως υδρόφοβα (Gomperts και συν., 2002). Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν οι αδρενεργικοί υποδοχείς,µε τους οποίους ασχολείται η παρούσα εργασία Αδρενεργικοί υποδοχείς: Οι υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης που αποτελούν φυσικούς στόχους των κατεχολαµινών αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη, καθώς και των συµπαθητικοµιµητικών ουσιών φαινυλεφρίνη και ισοπρετερενόλη/ισοπρεναλίνη, ονοµάζονται αδρενεργικοί υποδοχείς. Έχουν βρεθεί σε µεγάλο πλήθος ιστών και κυτταρικών τύπων και διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τους α- (οι οποίοι διακρίνονται περεταίρω σε α 1 -,µε τρεις υποτύπους α 1Α -,α 1Β - και α 1D - και α 2 -,µε τρεις υποτύπους α 2Α -,α 2Β - και α 2C -) και β- (µε τρεις υποτύπους β 1 -,β 2 - και β 3 -) αδρενεργικούς υποδοχείς (Zhong και Minnem an, 1999; Strosberg, 2000; Rockman και συν.,2002).οι αδρενεργικοί υποδοχείς διαφοροποιούνται,κατά κύριο λόγο,από την µοριακή τους δοµή,καθώς και από την ικανότητά τους να συνδέονται επιλεκτικά µε ουσίες αγωνιστές (ισοπρεναλίνη και φαινυλεφρίνη,κ.α) και ανταγωνιστές τους (προπρανολόλη,µετοπρολόλη,γιοχιµπίνη,πραζοσίνη,κ.α.),(h anoune,1990).οι α 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς δεσµεύονται κυρίως µε G q -πρωτεΐνες και ενεργοποιούν την PLC,µέσω της οποίας επάγεται σηµατοδοτικός µηχανισµός που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της PK C (Graham et al., 1996). Οι α 2 - αδρενεργικοί υποδοχείς συνδέονται µε G ī πρωτεΐνες και αναστέλλουν τη δραστικότητα της AC,ενώ οι β- αδρενεργικoί υποδοχείς συνδέονται κυρίως µε G s -πρωτεΐνες, συµβάλλοντας στην ενεργοποίηση της AC και την αύξηση των επιπέδων του ca M P (Zhong και M innem an,1999;m ichelottiκαι συν.,2000;lefkow itz etal.,2002) Ενδοκυτταρικοί υποδοχείς: Εκτός από τις πρωτεΐνες-υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης,υπάρχουν και πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασµα και στον πυρήνα του κυττάρου.για τη σύνδεση του σηµατοδοτικού µορίου µε έναν ενδοκυτταρικό υποδοχέα απαιτείται η είσοδος του µορίου στον ενδοκυτταρικό χώρο.χηµικοί µηνύτορες,όπως στεροειδείς ορµόνες, π.χ.,τεστοστερόνη,θυρεοειδικές ορµόνες,το µόριο ΝΟ κλπ.,µπορεί να αντιδράσουν

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 23 µε ενδοκυτταρικούς υποδοχείς και να επάγουν σηµατοδοτικά µονοπάτια που οδηγούν σε ενεργοποίηση γονιδίων του πυρήνα (Cambellκαι συν.,1999). 1.2 εύτεροι αγγελιοφόροι (second m essengers).ο ρόλος του cam P: Ουσίες που δρουν ως διαµεσολαβητές µεταξύ των σηµάτων που προέρχονται από την κυτταρική µεµβράνη και των τελικών αποδεκτών του σήµατος,ονοµάζονται δεύτεροι αγγελιοφόροι (second messengers).τέτοιες ουσίες είναι το ca M P,το GM P, ιόντα ασβεστίου (Ca ++ ), η τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP 3 ) και διγλυκερίδια ή διακυλογλυκερόλες (Gomperts και συν.,2002). Το κυκλικό ΑΜΡ (3,5 -κυκλική µονοφωσφορική αδενοσίνη - ca M P) συντίθεται από ΑΤΡ µε την καταλυτική µεσολάβηση της αδενυλικής κυκλάσης,ενώ η υδρόλυσή του καταλύεται από φωσφοδιεστεράσες (ca M P-PD Es).Η πρόσδεση του σηµατοδοτικού µορίου στην πρωτεΐνη-υποδοχέα προκαλεί την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης που βρίσκεται στην πλασµατική µεµβράνη,η οποία καταλύει την µετατροπή του ΑΤΡ σε ca M P.Μια µεγάλη ποικιλία σχετικών πρωτεϊνών είναι ευαίσθητες στην κυτταροπλασµατική συγκέντρωση του ca M P. Έχει αναφερθεί η δράση του σε αµυντικούς µηχανισµούς του οργανισµού (Plautκαι συν.,1980),στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση (Boynton και Whitfield, 1983) και γενικότερα σε µηχανισµούς που παίρνουν µέρος στον µεταβολισµό του οργανισµού (Exton,1980),ενώ θεωρείται ως ο κύριος διαµεσολαβητής στο γλυκολυτικό µονοπάτι που επάγεται µετά την επίδραση των κατεχολαµινών σε θαλάσσιους οργανισµούς (Fabbriκαι συν.,1998).η αύξηση του ca M P οδηγεί στην επαγωγή σηµατοδοτικής οδού,µε την ενεργοποίηση µιας πρωτεϊνικής κινάσης (πρωτεϊνική κινάση Α),η οποία µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στο µηχανισµό της κυτταρικής απόκρισης. 1.3 Πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες: Είναι γνωστό ότι η µετατροπή του εξωκυτταρικού ερεθίσµατος σε ενδοκυτταρικό σήµα και η επαγωγή σηµατοδοτικού µονοπατιού περιλαµβάνει α)την πρόσδεση του σηµατοδοτικού µορίου στον πρωτεϊνικό υποδοχέα,β)τη µεταβολή της δοµής του υποδοχέα και γ) την ενεργοποίηση µιας σειράς µεταβολών στις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν στο µονοπάτι µεταγωγής του σήµατος. Συχνά,οι αλλαγές στη δοµή των πρωτεϊνών πραγµατοποιούνται µε τη διαδικασία της φωσφορυλίωσης,µέσω της οποίας ρυθµίζεται η δραστικότητά τους.η ενεργή µορφή

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 24 των πρωτεϊνών προκύπτει µετά από την προσθήκη µιας ή περισσοτέρων φωσφορικών οµάδων.τα ένζυµα που µεταφέρουν φωσφορικές οµάδες στην πρωτεΐνη ονοµάζονται πρωτεϊνικές κινάσες. Η προσθήκη φωσφορικών οµάδων συχνά οδηγεί στην µετατροπή µιας ανενεργής πρωτεΐνης στην ενεργή της µορφή, αν και µπορεί να συµβεί και το αντίθετο.η αποµάκρυνση των φωσφορικών οµάδων από την πρωτεΐνη και η µετατροπή της σε ανενεργή µορφή, ονοµάζεται αποφωσφορυλίωση και πραγµατοποιείται µε την επίδραση ειδικών ενζύµων,που ονοµάζονται πρωτεϊνικές φωσφατάσες. Η κατάσταση φωσφορυλίωσης µιας πρωτεΐνης εξαρτάται από την ισορροπία µεταξύ της δραστικότητας της κινάσης που τη φωσφορυλιώνει και της φωσφατάσης που την αποφωσφορυλιώνει. Έχουν αναφερθεί πέντε κύριες οδοί µεταγωγής σηµάτων που περιλαµβάνουν: 1)πρωτεϊνικές κινάσες A (PK A ),εξαρτώµενες από το κυκλικό AM P,2)πρωτεϊνικές κινάσες G (PK G ), εξαρτώµενες από το κυκλικό GM P,3) πρωτεϊνικές κινάσες C (PKC),εξαρτώµενες από διγλυκερίδιο και ιόντα ασβεστίου (Ca +2 ),4)εξειδικευµένες (M LCK)ή πολυδύναµες πρωτεϊνικές κινάσες (CaM Iα,Ιβ,ΙΙ,ΙV),εξαρτώµενες από το σύµπλοκο Ca +2 -καλµοδουλίνη (κινάσες CaM ) και 5) πρωτεϊνικές κινάσες Σερίνης/Θρεονίνης (Cohen, 1992; Shulman, 1993). Μεταξύ των κινασών, η πρωτεϊνική κινάση C (PK C), η οποία µελετάται έµµεσα στην παρούσα διατριβή, παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση ζωτικών λειτουργιών του κυττάρου και γι αυτό το λόγο θα αναπτυχθεί ιδιαίτερα Πρωτεϊνική κινάση C: Οι πρωτεϊνικές κινάσες της κατηγορίας C (PK C)ενεργοποιούνται από ιόντα Ca ++ και διγλυκερίδια,καθώς και από ορισµένα προϊόντα διάσπασης µεµβρανικών φωσφολιπιδίων (Takai και συν., 1979; Kishimoto και συν., 1980). Σε ένα µη διεγερµένο κύτταρο,µεγάλο µέρος της PK C απαντά στο κυτταρόπλασµα σε ανενεργή µορφή.όταν αυξάνεται η κυτταροπλασµατική συγκέντρωση των ιόντων Ca ++,τα ιόντα δεσµεύονται στην PKC, µε αποτέλεσµα την πρόσδεσή της στην εσωτερική επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης, όπου µπορεί να ενεργοποιηθεί από το διγλυκερίδιο που παράγεται από την υδρόλυση της 4,5 -διφωσφορικής φωσφατιδυλoϊνοσιτόλης σε ΙΡ 3 (Toker και συν., 1994). Η µεµβρανική φωσφατιδυλοσερίνη είναι επίσης ένας ισχυρός ενεργοποιητής της PK C, από τη στιγµή που το ένζυµο έχει προσδεθεί στην κυτταρική µεµβράνη (Sando και Chertihin, 1996). Βραδεία και µεγάλης διάρκειας ενεργοποίηση της PK C προκαλείται από

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 25 ελεύθερα λιπαρά οξέα,λυσολεκιθίνη και διγλυκερίδια,τα οποία απελευθερώνονται µε τη δράση των φωσφολιπασών A 2 και D στην φωσφατιδυλοχολίνη (Berne και Levy,1996). Επίσης, η άµεση ενεργοποίηση της PK C προκαλείται από τη δράση ορισµένων ογκοπαράγωγων λιπόφιλων ουσιών, ιδιαίτερα των φωσβολεστέρων (Crom bie και συν.,1968).το γεγονός αυτό διεγείρει έντονα την κυτταρική διαίρεση σε πολλούς κυτταρικούς τύπους και µετατρέπει φυσιολογικά κύτταρα, µε ελεγχόµενες αναπτυξιακές ιδιότητες, σε µετασχηµατισµένα κύτταρα τα οποία προσοµοιάζουν, ως προς την ανεξέλεγκτη ανάπτυξη, µε κύτταρα όγκου. Άλλα ρυθµιστικά µόρια, όπως αυξητικοί παράγοντες, ορµόνες και νευροδιαβιβαστές, µπορεί να επηρεάσουν τη δράση των PKCs, καθορίζοντας κυτταρικές αποκρίσεις (O hno και συν.,1987). Η δράση της PK C έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται σε σηµαντικό βαθµό µε την ρύθµιση της δράσης διαµεµβρανικών µορίων που παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανταλλαγή ιόντων µεταξύ του εξωκυττάριου και ενδοκυττάριου χώρου.σύµφωνα µε µελέτες πολλών ερευνητικών οµάδων, η PK C φαίνεται να σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + σε ποικιλία κυτταρικών τύπων (Grinstein και συν., 1985; Incerpi και συν., 1994; Kaloyianni και συν., 2001; Bourikas και συν.,2003). 1.4 Πολυπλοκότητα των σηµατοδοτικών µηχανισµών,ενίσχυση του σήµατος και εξειδίκευση της κυτταρικής απόκρισης: Πολύπλοκοι ενζυµικοί µηχανισµοί ελέγχουν,εξειδικεύουν και ενισχύουν την κυτταρική απόκριση.ο αριθµός των ενεργών προϊόντων,σε κάθε καταλυτικό βήµα, είναι πολύ µεγαλύτερος από τον αριθµό των µορίων του προηγούµενου βήµατος του σηµατοδοτικού µονοπατιού.η πρόσδεση του εξωκυτταρικού µορίου στην πρωτεΐνηυποδοχέα της πλασµατικής µεµβράνης προκαλεί την παραγωγή µεγάλου αριθµού µορίων, µε αποτέλεσµα την ενίσχυση του ενδοκυτταρικού σήµατος και την τροποποίηση της εξειδικευµένης τελικής κυτταρικής απόκρισης. Για παράδειγµα, κάθε µόριο αδενυλικής κυκλάσης καταλύει την µετατροπή πολλών µορίων ca M P,τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α.Κάθε µόριο ΡΚΑ φωσφορυλιώνει πολύ περισσότερα µόρια της επόµενης κινάσης κ.ο.κ., µέχρι την κυτταρική απόκριση (Campellκαι συν.,1999).

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αντλία ανταλλαγής ιόντων Νa + H +. Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (ΝΗΕ) αποτελεί ένα διαµεµβρανικό σύστηµα ανταλλαγής ιόντων νατρίου (Na + )µε ενδοκυτταρικά ιόντα υδρογόνου (H + ή πρωτόνια),σε στοιχειοµετρική αναλογία 1:1. Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (ΝΗΕ) πρωτοπεριγράφθηκε το 1976, από τον Murer και συν., και έκτοτε έχει αναφερθεί σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα που έχουν µελετηθεί (Mahnesmith και Aronson,1983;Grinstein και συν.,1989;w akabayashiκαι συν.,1997;fliegel και Frohlich,1993).Η ύπαρξη δοµών ανάλογων µε αυτή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + αναφέρθηκε και σε ασπόνδυλους οργανισµούς (Zange και συν., 1990; Willoughby και συν., 1999; Giannakou και Dow, 2001). Επιπρόσθετα, σε ασπόνδυλους οργανισµούς,έχει αναφερθεί η ύπαρξη δοµών ανάλογων µε αυτή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + που σχετίζονται µε την ανταλλαγή ιόντων σε στοιχειοµετρική αναλογία 2:1 (ανταλλακτής 2N a + /H + ),(Ahearn και συν.,1994). Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + φαίνεται ότι είναι ο κύριος ρυθµιστικός παράγοντας της ενδοκυτταρικής τιµής του ph (ph i),καθώς και της ρύθµισης του κυτταρικού όγκου (M oolenaar και συν.,1983;cala,1983a;cala, 1983b;Bianchini και Pouyssegur, 1994). Επίσης φαίνεται πως η αντλία µπορεί να συµµετέχει σε διάφορα σηµατοδοτικά µονοπάτια µέσα στο κύτταρο,µιας και η µεταβολή του ph i σχετίζεται µε την µεταγωγή σήµατος,σύµφωνα µε τον Incerpi και συν.(1996).η συµµετοχή της αντλίας σε µηχανισµούς που σχετίζονται µε τη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου,καθώς και µε φαινόµενα νεοπλασίας και απόπτωσης (Fliegerκαι Frohlich,1993;Liκαι Eastman,1995;Rebollo και συν.,1995;perez-sala και συν., 1995;Tsao και συν.,1996)την καθιστά ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα ως προς την µελέτη της συµµετοχής της σε µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος που επάγονται από διάφορους παράγοντες. Υπάρχουν επτά ισοµορφές της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (ΝΗΕ1-7), µε την ισοµορφή ΝΗΕ-1,να απαντάται σε όλους τους κυτταρικούς τύπους (Sardet και συν.,1989; Orlow ski και συν.,1992).η ισοµορφή ΝΗΕ-1 ευθύνεται για την διατήρηση της ενδοκυτταρικής τιµής του ph (ph i).η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + διαθέτει δυο ξεχωριστά τµήµατα,ένα αµινοτελικό (Ν-τελικό άκρο)υδρόφοβο τµήµα που αποτελείται από διαµεµβρανικά µικρότερα τµήµατα, 500 αµινοξέων το καθένα και ένα καρβοξυτελικό (C-τελικό άκρο)υδρόφιλο τµήµα µε 300 αµινοξέα (Εικόνα 4). Βασικό χαρακτηριστικό αυτής της αντλίας αποτελεί η αλλοστερική ενεργοποίησή της από ενδοκυτταρικά πρωτόνια, σε µία θέση

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 27 διαφορετική από τη θέση όπου γίνεται η ανταλλαγή των ιόντων.το αµινοτελικό διαµεµβρανικό τµήµα είναι απαραίτητο για την κατάλυση της διαδικασίας ιοντοανταλλαγής και το καρβοξυτελικό τµήµα είναι υπεύθυνο για τον προσδιορισµό της φυσιολογική ενδοκυτταρικής τιµής ph (ph i),(w akabayashiκαι συν.,1992). ιάφοροι παράγοντες,όπως αυξητικοί και ογκογόνοι,ορµόνες (Grinstein και συν.,1989;ceolotto και συν.,1997;kaloyianniκαι συν.,1997;k onstantinou-tegou και συν.,2001; Bourikas και συν.,2003),κυτοκίνες και αυξηµένες συγκεντρώσεις γλυκόζης (Zange και συν.,1990;grinstein και συν.,1992;tse και συν.,1993;ciriolo και συν.,1997;kaloyianniκαι συν.,1997;rutherford και συν.,1997;sauvage και συν.,2000;kaloyianniκαι Giagtzoglou,2000;Kaloyianniκαι συν.,2001;koliakos και συν., 2004), αλλά και χρόνια έκθεση των κυττάρων σε εξωκυτταρικό όξινο περιβάλλον (Horie και συν., 1990), µπορεί να επηρεάσουν τη δραστικότητα της αντλίας. Επιπλέον, φυσικοί παράγοντες, όπως αλλαγές του κυτταρικού όγκου, αποτελούν κύριους ρυθµιστές της δραστικότητας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (Green και συν.,1988). Η φωσφορυλίωση της αντλίας φαίνεται να οδηγεί στην ενεργοποίησή της (Sardetκαι συν.,1990;1991;bianchiniκαι συν.,1991).οι πρωτεϊνικές κινάσες έχει αναφερθεί ότι ευθύνονται για τη φωσφορυλίωση της αντλίας. ιάφοροι αγωνιστές της PKC διεγείρουν τη δραστικότητα των ισοµορφών ΝΗΕ-1 και ΝΗΕ-2,αλλά δεν επηρεάζουν την ισοµορφή ΝΗΕ-3 (Tse και συν., 1993). Οµοίως, οι ca M P- εξαρτώµενες κινάσες παρουσιάζουν διττή συµπεριφορά, όσο αφορά την ενεργοποίηση των διαφόρων ισοµορφών της αντλίας (για περισσότερες λεπτοµέρειες δες Fliegel και Frohlich, 1993). Επίσης, τα ιόντα ασβεστίου (Ca +2 ) αποτελούν σηµαντικούς ρυθµιστές της δράσης της αντλίας Na + /H +, πιθανό µέσω ενός µονοπατιού µεταγωγής µηνύµατος που περιλαµβάνει την πρωτεϊνική κινάση που εξαρτάται από το σύµπλοκο Ca +2 -καλµοδουλίνης (Grinstein και Wieczorek,1994). H NHE-1 αναστέλλεται σηµαντικά από ένα διουρητικό παράγοντα, το αµιλορίδιο,καθώς και από 5 -άµινο-παράγωγα του αµιλοριδίου.η ικανότητα του αµιλοριδίου και των παραγώγων του να αναστέλλουν τη δράση της αντλίας,φαίνεται να σχετίζεται µε την ικανότητα αυτών των ουσιών να ανταγωνίζονται µε τα ιόντα νατρίου για τη θέση δέσµευσης στο εξωκυτταρικό τµήµα της αντλίας (Benos,1988). H θέση σύνδεσης του αµιλοριδίου φαίνεται να βρίσκεται στο αµινοτελικό τµήµα της αντλίας (Εικόνα 4), µιας και αποµάκρυνση ολόκληρου του κυτταροπλασµατικού

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 28 τµήµατός της δεν αλλάζει την ευαισθησία της αντλίας στο συγκεκριµένο παράγοντα (W akabayashiκαι συν.,1992). Εικόνα 4. Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, όπου φαίνεται το αµινοτελικό άκρο, το οποίο αποτελείται από διαµεµβρανικά τµήµατα 500 αµινοξέων και το καρβοξυτελικό άκρο που αποτελείται από 300 αµινοξέα. Στο σχήµα διακρίνονται οι εξωκυτταρικές θέσεις δέσµευσης των αναστολέων της αντλίας (inhibitor binding site), καθώς και οι θέσεις που είναι ευαίσθητες στις µεταβολές της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων H + (H-sensor).Στο καρβοξυτελικό τµήµα της αντλίας διακρίνονται οι θέσεις φωσφορυλίωσης της αντλίας (-Ρ),που οδηγεί στην ενεργοποίησή της (τροποποιηµένη από Karm azyn και συν.,2001). Picture 4.Function oftransm em brane Na + /H + exchanger,with the am ino-tailregion,including transm em brane dom ains w ith 500 am ino acids and intracellular HOOC-tailregion,consisted by 300 am ino acids. Inhibitor binding sites in the extracellular dom ain of the exchanger as w ells as the intracellularh + -sensor dom ain were also obtained.in the HOOC-tailregion,the phosphorylation sites ofthe exchangerwere obtained,whose role is the activation ofthe exchanger(adjusted by Karm azyn et al.,2001) Παρά το γεγονός ότι η ικανότητα της αντλίας να ανταλλάσει ιόντα H + µε εξωκυτταρικά ιόντα Na +, αποτελεί µια διαδικασία που πραγµατοποιείται χωρίς κατανάλωση ενέργειας,υπάρχουν αρκετά βιβλιογραφικά δεδοµένα που υποστηρίζουν το αντίθετο. ιαδικασίες που οδηγούν σε µείωση των ενεργειακών αποθεµάτων, σχετίζονται µε µείωση της δραστικότητας της αντλίας σε πολλούς κυτταρικούς τύπους (Casselκαι συν.,1986;demaurex και Grinstein,1994;K apus και συν.,1994; Demaurex και συν.,1997;w akabayashiκαι συν.,1997),πιθανό µέσω της µείωσης της ευαισθησίας του ενδοκυτταρικού τµήµατος της αντλίας στις µεταβολές των συγκεντρώσεων των ιόντων Η + (W akabayashiκαι συν.,1997).

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 29 Η επίδραση των βαρέων µετάλλων στη δράση της αντλίας επιβεβαιώθηκε πρόσφατα µέσα από µελέτες των Villela και συν.(1999),ενώ η παρούσα µελέτη αναφέρεται για πρώτη φορά στη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε σηµατοδοτικούς µηχανισµούς που επάγονται σε κύτταρα µυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis,µετα την έκθεσή τους σε κάδµιο. 3. ραστικές µορφές οξυγόνου (Reactive O xygen Species-ROS).Κυτταρικές επιπτώσεις τους και συµµετοχή τους σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Κάθε µόριο, το οποίο µπορεί να φέρει ένα ή περισσότερα αζευγάρωτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική ηλεκτρονική στιβάδα του (τροχιακό δυναµικό),µπορεί να θεωρηθεί ως ελεύθερη ρίζα.στην κατηγορία των ελεύθερων ριζών ανήκουν και οι δραστικές µορφές οξυγόνου (Reactive oxygen species/ros)οι οποίες περιλαµβάνουν µόρια,όπως το H 2 O 2 και ιόντα OCl -,ONO - 2,OH -,O - 2,καθώς και ρίζες,όπως ȮH.Οι υδροξυλικές ρίζες µάλιστα,είναι τα πιο δραστικά οξειδωτικά παράγωγα (W inrow και συν.,1993;ames και συν.,1993). Οι ROS µπορεί να δηµιουργηθούν ως αποτέλεσµα φυσιολογικών µεταβολικών διαδικασίων του κυττάρου. Στα κύτταρα θηλαστικών έχουν βρεθεί πέντε διαφορετικοί οδοί,µέσω των οποίων παράγονται ROS ως αποτέλεσµα: α)της φυσιολογικής αερόβιας αναπνευστικής διαδικασίας που πραγµατοποιείται στα µιτοχόνδρια, β) της φαγοκυττάρωσης, κατά την οποία παράγονται ρίζες οξυγόνου και H 2 O 2, συµµετέχοντας στην καταπολέµηση βακτηρίων και ιών, γ) της διάσπασης λιπαρών οξέων στα υπεροξειδιοσωµάτια και της διάσπασης µεµβρανικών δοµών,συµπεριλαµβανοµένης της κυτταρικής µεµβράνης, δ)της δράσης του κυτοχρώµατος Ρ450 που δρα ενάντια σε χηµικά προϊόντα και ε) της ενεργοποίησης της οξειδάσης NAD(P)H (Ames και συν.,1993; Bastian και Hibbs,1994;Finkel,1998;Suh και συν.,1999;d upuy και συν.,1999;geisztκαι συν.,2000). Οι παράγοντες που ευθύνονται για την παραγωγή ROS µπορούν να διαχωριστούν σε εξωτερικούς παράγοντες,όπως η υπεριώδης ακτινοβολία,χηµικές ενώσεις, το οξειδωτικό στρες, και σε εσωτερικούς παράγοντες, στους οποίους συγκαταλέγονται αυξητικοί παράγοντες,ορµόνες και κυτοκίνες (Sundarsen και συν., 1995;Griendling και συν.,1994;rahman και συν.,1998).

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 30 Το οξυγόνο αποτελεί το κύριο µόριο παραγωγής ROS (Ames και συν.,1993; Winrow και συν.,1993;cadenas,1995;fridovich,1998;inoue και συν.,1999).οι ρίζες του σουπεροξειδίου (Ο - 2 )που παράγονται από την αναπνευστική αλυσίδα των µιτοχονδρίων,λαµβάνουν µέρος ως υπόστρωµα,στην παραγωγή επιπλέον ελεύθερων ριζών σύµφωνα µε τις ακόλουθες αντιδράσεις του σχήµατος 2: Ο Η + SOD H 2 O 2 + Ο 2 (1) Ο H 2 O 2 Cu 2+ /Fe 3+ Ο 2 + OH - + ȮH (2) Ο NO. ONO 2 - (3) Σχήµα 2. Παραγωγή των κυριότερων δραστικών µορφών οξυγόνου, µέσω αντιδράσεων που λαµβάνουν µέρος οι ρίζες Ο 2 -.Παράγωγα ελεύθερων ριζών,όπως το H 2 O 2,ρίζες υδροξυλίου (OH - και. ΟΗ),καθώς και νιτρικές ρίζες (ONO 2 - ),παράγονται είτε µε την αντίδραση των Ο 2 - µε πρωτόνια,µε την καταλυτική διαµεσολάβηση της υπεροξειδικής δισµουτάσης (SO D ),(αντίδραση 1),είτε µέσω της αντίδρασης που περιλαµβάνει την καταλυτική συµµετοχή ιόντων χαλκού και σιδήρου (αντίδραση Haber-W eiss) και την παραγωγή OH - και. ΟΗ,(αντίδραση 2),καθώς και τη δηµιουργία νιτρικών υπεροξειδίων µέσω της αντίδρασης των Ο 2 - µε νιτρικά ιόντα (αντίδραση 3), (Cadenas, 1995; Fridovich,1998;Inoue και συν.,1999). Scem e 2. ROS production. H 2 O 2 is formed by means ofο 2 - dism utation catalyzed by superoxide dism utase (SO D ),(reaction 1).Hydroxylradicals (OH - και. ΟΗ)Iform ed via H aber-w eiss reaction, which catalyzed by copperand iron ions (reaction 2).Peroxinitrite (ONO 2 - )is formed by the reaction of Ο 2 - ions with nitric oxide radicals (NO. ),(Cadenas,1995;Fridovich,1998;Inoue etal.,1999). Μικρές συγκεντρώσεις ROS συµµετέχουν σε φυσιολογικές διαδικασίες του κυττάρου,όπως ο έλεγχος του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και παίζουν σηµαντικό ρόλο ως µόρια αγγελιοφόροι σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος (Finkel,1998;Irani, 2000).Πολλά βιβλιογραφικά δεδοµένα υποστηρίζουν την παραπάνω άποψη,όπως σηµατοδοτικοί οδοί στις οποίες συµµετέχουν τόσο η ΙΡ 3,όσο και ιόντα Ca +2,ως δεύτεροι αγγελιοφόροι,(gibson και συν.,1998).επίσης,έχει αναφερθεί η ρυθµιστική δράση των H 2 O 2 και Ο - 2 πάνω σε ιοντικούς διαύλους Ca +2 και στις αντλίες Νa + /Ca +2, Ca +2 -ATPase,Na + /K + -ATPase (Freedm an και Crapo,1982;Krugeja και συν.,1990), αλλά και η µεγάλη ευαισθησία που παρουσιάζει η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε συνθήκες οξειδωτικού στρες (Xie και συν.,1990).πολλές µελέτες αναφέρονται στο ρόλο του H 2 O 2 ως ρυθµιστικό µόριο της δράσης διαφόρων κινασών, όπως MAPK,ERK,JN K, p38, IKK,cA M P-εξαρτώµενες κινάσες,κλπ.,(kharbanda και συν., 1995; D eova και συν., 1998; Abe και Berk, 1999; Adler και συν., 1999b;

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 31 Migliaccio και συν.,1999;yoshizum iκαι συν.,2000).επιπλέον,τo H 2 O 2 ευθύνεται για την έκφραση των πρωτο-ογκογονιδίων,c-myc και c-fos,µέσω ενεργοποίησης της PKC (Rao και Berk,1992). Αν και ο µηχανισµός, µέσω του οποίου οι ROS συµµετέχουν σε σηµατοδοτικές οδούς δεν είναι πλήρης κατανοητός, πιστεύεται ότι µπορεί να δράσουν, α) είτε µε άµεσο τρόπο πάνω σε σηµατοδοτικά µόρια, β) είτε µεταβάλλοντας τη σύσταση των κυτταρικών µεµβρανών και κατ επέκταση τη δοµή των µεµβρανικών πρωτεϊνών-υποδοχέων, γ) είτε µεταβάλλοντας την απόκριση µορίων πλούσιων σε κυστεΐνη, που συµµετέχουν σε σηµατοδοτικά µονοπάτια (Habelhah και Ze ev Ronai,2001). Αυξηµένες συγκεντρώσεις ROS ευθύνονται για την πρόκληση κυτταρικών βλαβών και ογκογενέσεων (W inrow και συν., 1993; Ames και συν., 1993). Η οξειδωτική βλάβη που επέρχεται στο κύτταρο από την παραγωγή ROS µπορεί να οδηγήσει σε αποπτωτικά φαινόµενα,ενώ υπάρχουν αναφορές που συσχετίζουν την παραγωγή ελεύθερων ριζών µε αναστολή των επιδιορθωτικών ενζύµων που είναι υπεύθυνα για την ακεραιότητα του γενετικού υλικού στο εσωτερικό του πυρήνα (H iguchiκαι M atsukaw a,1997). Η άµυνα των κυττάρων έναντι των επιβλαβών επιπτώσεων των ROS συνίσταται στην κινητοποίηση διαφόρων αντιοξειδωτικών µηχανισµών που περιλαµβάνουν τη συµµετοχή αντιοξειδωτικών ενζύµων, όπως η υπεροξειδική δισµουτάση (SO D ),(Σχήµα 2).Άλλα αντιοξειδωτικά ένζυµα που διαθέτει το κύτταρο είναι η καταλάση,η υπεροξειδάση και η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης,καθώς και διάφορα µόρια,όπως η α-τοκοφερόλη ή βιταµίνη Ε,που προστατεύει τα λιπαρά οξέα των κυτταρικών µεµβρανών από τη δράση των ROS,η γλουταθειόνη,το ουρικό οξύ που υπάρχει στα ερπετά και στα πτηνά,και η βιταµίνη C που χαρακτηρίζεται από αντιοξειδωτική δράση (για περισσότερες πληροφορίες δες Hermes-Lima και συν., 2001). Η φυσιολογική άµυνα των οργανισµών και ειδικότερα των κυττάρων είναι πολύ σηµαντική µιας και η αδυναµία τους να ανταπεξέλθουν στον αντιοξειδωτικό τους ρόλο µπορεί να αποβεί µοιραία. Ο έλεγχος των παραγόµενων ROS παίζει σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής ανάπτυξης και λειτουργίας των κυττάρων (Irani,2000),ενώ διαδικασίες που σχετίζονται µε αδυναµία αντιµετώπισής τους µπορεί να οδηγήσουν σε διαταραχές τόσο σε βιοχηµικό,όσο και σε γενετικό

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 32 επίπεδο προκαλώντας ακόµη και το θάνατό τους (Pow is και συν.,1995; Jacobson, 1996;Tan και συν.,1998b). 4. Το κάδµιο και ο ρόλος του σε µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος. Το κάδµιο ανήκει στην οµάδα των βαρέων µετάλλων και αντιπροσωπεύει ένα σηµαντικό τοξικό παράγοντα περιβαλλοντικής ρύπανσης,µε σηµαντικές επιπτώσεις στους θαλάσσιους οργανισµούς (Σχήµα 3). Η πρόσληψη του καδµίου πραγµατοποιείται µέσω της τροφοληπτικής οδού που περιλαµβάνει τη διήθηση µεγάλων ποσοτήτων νερού από τα βράγχια. Το κάδµιο συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων, όπου και δηµιουργεί σύµπλεγµα µε ειδικές µεταλλοπρωτεΐνες (µεταλλοθειονίνες), µε αποτέλεσµα την αδρανοποίηση του µετάλλου και την προστασία του κυττάρου (Belcheva και συν.,1988).η συµµετοχή του καδµίου στην διαταραχή της φυσιολογικής οµοιόστασης των κυττάρων γίνεται εµφανής µέσω των επιδράσεων που ασκεί σε βιοχηµικό και γενετικό επίπεδο. 4.1 Βιοχηµικές και γενοτοξικές επιπτώσεις του καδµίου: Το κάδµιο έχει αναφερθεί ότι µπορεί να προκαλέσει οξειδωτικές βλάβες,όπως την παραγωγή ελεύθερων ριζών και την αναστολή της αντιοξειδωτικής άµυνας του κύτταρου, γεγονός που συχνά µπορεί να οδηγήσει στην απαρχή διαταραχών της ακεραιότητας του γενετικού υλικού,τη λιπιδιακή υπεροξείδωση των µεµβρανών του κυττάρου και την αναστολή της δραστικότητας των ενζύµων (Stacey και συν.,1980; K unim oto και M iura, 1988; Zhong και συν., 1990; G upta και Chandra, 1991; Winston, 1991; Chelom in και Tiurin, 1992; Stohs και Bagchi,1995; Maloney και συν., 1996; Shimizu και συν., 1997; Hartwig, 1998; Ramirez και συν., 1999; Figueiredo-Pereira και συν.,2002;regoliκαι συν.,2004).συγκεκριµένα,µπορεί να επιδρά στη δραστικότητα ορισµένων ενζύµων του αντιοξειδωτικού συστήµατος του κυττάρου (Bompartκαι συν.,1991;strubeltκαι συν.,1996),διαφόρων ενζύµων του µεταβολισµού της γλυκόζης (Soengas και συν.,1996),καθώς και στη διαδικασία βιοσύνθεσης των λιπαρών οξέων (Steiberκαι K okot,1980).

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 33 Τοξικός παράγοντας Πρόσδεση σε µεµβρανικό υποδοχέα Κυτταρικός µεταβολισµός Βιοχηµικές διαταραχές ιαταραχές φυσιολογίας κυττάρου Κυτταρικός θάνατος Βιοχηµική προσαρµογή Θάνατος του οργανισµού Προσαρµογή του κυττάρου Τροποποίηση DNA (Μεταλλάξεις ) Μορφολογικές προσαρµογές κυττάρων και ιστών Καρκινογένεση Προσαρµογή οργανισµού Σχήµα 3. ιαγραµµατική απεικόνιση των επιπτώσεων των τοξικών παραγόντων σε βιοχηµικό και γενετικό επίπεδο (τροποποιηµένη από Hinton και συν.,1992). Schem e 3.Representation oftoxicants effects on biochem icaland genetic level(adjusted by Hinton et al.,1992). Έχει αναφερθεί πως το κάδµιο µπορεί να επιδρά σε πολλούς επιµέρους τοµείς της κυτταρικής λειτουργίας,όπως στην έκφραση διαφόρων γονιδίων του γενετικού υλικού (Tsangaris και συν.,2002),στη δοµή των µιτοχονδρίων (Koizum i και συν., 1994), ενώ υπάρχουν δεδοµένα που εµπλέκουν το κάδµιο σε διαδικασίες που επηρεάζουν τη φυσιολογική οµοιόσταση του κυττάρου, όπως στη διατήρηση της συγκέντρωσης ασβεστίου (Ca +2 )και των µεταλλικών ιόντων,όπως τα ιόντα Ζn +2,που είναι σηµαντικά για το κύτταρο (Hinkle και συν.,1987;palmiter,1994).επίσης,το κάδµιο έχει αναφερθεί να εµπλέκεται µε διαδικασίες κυτταρικής διαίρεσης και

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 34 κυτταρικής διαφοροποίησης,καθώς και σε φαινόµενα απόπτωσης (Bisova και συν., 2003;Jia και συν.,2002;waisberg και συν.,2003;yang και συν.,2004). 4.2 Ο ρυθµιστικός ρόλος του καδµίου στην επαγωγή µηνύµατος: Πρόσφατα δεδοµένα αποδεικνύουν τη συµµετοχή βαρέων µετάλλων στην επαγωγή µηχανισµών µετάδοσης µηνυµάτων σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, όπως κύτταρα ινοβλαστών και ηπατοκύτταρα (Hansson,1996;Risso-de Faverney και συν., 2001; Watjen και συν., 2001). Οι Adams και συν. (2002) αναφέρουν χαρακτηριστικά πως το κάδµιο µπορεί να επάγει σηµατοδοτικό µηχανισµό που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PK C),της κινάσης της τυροσίνης, καθώς και της κινάσης ΙΙ της καζεΐνης. Η συµµετοχή των ιόντων ασβεστίου (Ca +2 ) στο µηχανισµό µεταγωγής σήµατος που επάγεται σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού M.galloprovincialis, µετά από έκθεσή τους σε κάδµιο πιθανολογείται,µιας και υπάρχουν δεδοµένα που αποδεικνύουν την εµπλοκή του µετάλλου στην αύξηση της συγκέντρωσης του ασβεστίου σε κύτταρα των βραγχίων (Viarengo και συν.,1993). Είναι γενικά παραδεκτό,ότι υπάρχουν λίγα δεδοµένα που να σχετίζονται µε το ρόλο και την επίδραση των βαρέων µετάλλων, όπως είναι ο υδράργυρος, ο ψευδάργυρος και το κάδµιο σε µεταβολικά µονοπάτια του οργανισµού (Laiκαι Blass, 1984;Canesiκαι συν.,1998,2001;huang και Tao,2001;Viselina και Lukyanova, 2002).Οι Almeyda και συν.(2001) ασχολήθηκαν µε τη µελέτη του σε θαλάσσιους οργανισµούς,ενώ οι ερευνητικές οµάδες των Watjen (Watjen και συν.,2001),και Fabbri (Fabbri και συν., 2003) µελέτησαν τις επιπτώσεις του καδµίου στο γλυκολυτικό µονοπάτι κυττάρων θαλάσσιων οργανισµών. Ελάχιστα δεδοµένα υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία, όσο αφορά τις αλληλεπιδράσεις βαρέων µετάλλων µε κυτταρικούς υποδοχείς θαλάσσιων οργανισµών. Επιπλέον, δεν υπάρχουν δεδοµένα για τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε σηµατοδοτικούς µηχανισµούς, µετά από επίδραση βαρέων µετάλλων σε κύτταρα ασπονδύλων. Μόλις πρόσφατα, ο Villela και συν. (1999) αναφέρθηκαν στις επιπτώσεις του καδµίου στη δραστικότητα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε ηπατοκύτταρα του χελιού.στα ίθυρα Μαλάκια,και ειδικότερα στα µύδια, δεν υπάρχουν δεδοµένα σχετικά µε τη ρύθµιση της συγκεκριµένης αντλίας ανταλλαγής ιόντων.η ικανότητα του καδµίου να προκαλεί

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 35 κυτταρικές αποκρίσεις,µέσω της ενεργοποίησης οδών µεταγωγής σήµατος,αποτελεί ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης της παρούσας εργασίας.

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 36 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εκτίµηση βιοχηµικών παραµέτρων του πεπτικού αδένα, των βραγχίων, της αιµολέµφου και του συµπλόκου µανδύα/γονάδων,µυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis ως βιοµαρτύρων της ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου. Γι αυτό το σκοπό µύδια συλλέχθηκαν από επιλεγµένους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, κατά τη διάρκεια 3 ετών ( ).Η αξιολόγηση των βιοχηµικών παραµέτρων ως βιοµάρτυρες συνιστά,κατά την αντίληψή µας,µια νέα περιβαλλοντική προσέγγιση για τον Ελληνικό χώρο.οι βιοµάρτυρες που εκτιµήθηκαν ήταν:α)τα επίπεδα των µεταλλοθειονινών (ΜΤ)στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια, αλλά και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και β) η δραστικότητα της ακετυλχολινεστεράσης (AChE)στον πεπτικό αδένα,τα βράγχια, στην αιµόλεµφο και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες.επιπλέον,κατά τη διάρκεια του πρώτου χρόνου, πραγµατοποιήθηκε ποσοτική εκτίµηση των συγκεντρώσεων του ψευδαργύρου (Zn),του χαλκού (Cu),του καδµίου (Cd)και του µολύβδου (Pb),στους ιστούς µυδιών που συλλέχθηκαν από επιλεγµένες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στον Στρυµονικό κόλπο. Επίσης,σκοπός αυτής της µελέτης ήταν η διερεύνηση στατιστικά σηµαντικών συσχετίσεων µεταξύ των βιοµαρτύρων,µε τελικό στόχο τη διευκρίνηση του ρόλου που θα µπορούσε να διαδραµατίσει ο καθένας σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης υδάτινων οικοσυστηµάτων. Εκτός από την εκτίµηση καθιερωµένων βιοχηµικών βιοµαρτύρων, πραγµατοποιήθηκε και µελέτη για την εισαγωγή νέων βιοµαρτύρων. Γι αυτό το σκοπό, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της 3,5 -κυκλικής µονοφωσφορικής αδενοσίνης (ca M P), στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των µυδιών που συλλέχθηκαν από τον Θερµαϊκό κόλπο,κατά τη διάρκεια της τριετούς βιοπαρακολούθησης. Επιπλέον, για την περαιτέρω µελέτη και αξιολόγηση του ca M P ως βιοµάρτυρα,πραγµατοποιήθηκαν εργαστηριακές µελέτες που περιλαµβάνουν: Εργαστηριακή έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές, καθώς και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου. Συσχέτιση των µεταβολών του ca M P µε τα επίπεδα των καθιερωµένων βιοµαρτύρων ΜΤ και AChE.

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 37 Ένας ακόµη σηµαντικός στόχος της παρούσας εργασίας είναι η κατανόηση του µηχανισµού πρόκλησης τοξικών επιπτώσεων από το κάδµιο στους οργανισµούς, µετά από έκθεσή τους σε µικροµοριακές ποσότητες του µετάλλου.το κάδµιο ανήκει στην οµάδα των βαρέων µετάλλων και αντιπροσωπεύει ένα σηµαντικό τοξικό περιβαλλοντικό παράγοντα, µε σηµαντικές επιπτώσεις στους θαλάσσιους οργανισµούς.έχει αναφερθεί ότι το κάδµιο επιδρά σε πολλούς επιµέρους τοµείς της κυτταρικής λειτουργίας,σε διαδικασίες που επηρεάζουν τη φυσιολογική οµοιόσταση του κυττάρου και εµπλέκεται σε φαινόµενα κυτταρικής διαίρεσης και κυτταρικής διαφοροποίησης,καθώς και σε διαταραχές της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού. Προκειµένου να ερευνηθεί η ακολουθία των γεγονότων που επάγονται ενδοκυτταρικά από το κάδµιο,µελετήθηκε ένας σηµαντικός ανταλλάκτης ιόντων Na + και H +.Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + παίζει πρωταρχικό ρόλο στη ρύθµιση της ενδοκυτταρικής τιµής του ph (ph i) και λαµβάνει µέρος στο σηµατοδοτικό µηχανισµό του κυττάρου.επιπλέον,το γλυκολυτικό ρυθµιστικό ένζυµο ΡΚ,καθώς και η πρωτεϊνική κινάση C (PK C)είναι δυο παράγοντες,των οποίων η συµµετοχή µελετήθηκε στο σηµατοδοτικό µονοπάτι που επάγεται από το κάδµιο. Επιπλέον, µελετήθηκε η διέγερση των υποδοχέων που εµπλέκονται στις µελετούµενες αποκρίσεις από το κάδµιο, όπως είναι οι α 1 -, α 2 -, β- και β 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς.παράλληλα,κρίθηκε σκόπιµη η µελέτη των µηχανισµών παραγωγής δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS),οι διαταραχές της ακεραιότητας του γενετικού υλικού που επάγονται µετά από την επίδραση του καδµίου,καθώς και ο ρόλος που διαδραµατίζουν τόσο η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,όσο και οι αδρενεργικοί υποδοχείς στην πρόκληση των παραπάνω επιπτώσεων του µετάλλου. Τα αποτελέσµατα του Β µέρους της εργασίας αυτής, ελπίζουµε ότι θα συµβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση των µηχανισµών που οδηγούν σε διαταραχές της φυσιολογίας των κυττάρων των υδρόβιων οργανισµών, όταν εκτίθενται σε ρυπαντές,όπως το κάδµιο.

61 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 38 ΜΕΡΟΣ Α: ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΩΝ ΜΥ ΙΩΝ 1. Συλλογή ατόµων από το πεδίο: Άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis συλλέχθηκαν από πέντε περιοχές (σταθµοί δειγµατοληψίας) κατά µήκος του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την περιοχή της Ολυµπιάδας (καλλιεργούµενος πληθυσµός), που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο (Εικόνα 5).Οι περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,από τις οποίες συλλέχθηκαν άτοµα περιλαµβάνουν την περιοχή του Αγγελοχωρίου (καλλιεργούµενος πληθυσµός ατόµων)και την περιοχή της Περαίας (άτοµα φυσικού πληθυσµού), που βρίσκονται στην Ανατολική πλευρά του κόλπου, ένα φυσικό πληθυσµό,στη Βορειοδυτική πλευρά του Θερµαϊκού κόλπου,κοντά στην έξοδο της µονάδας βιολογικού καθαρισµού του Καλοχωρίου, µε τον κωδικό Αντλιοστάσιο, καθώς και περιοχές που βρίσκονται στη υτική πλευρά του κόλπου, όπως την περιοχή της Χαλάστρας (καλλιεργούµενος πληθυσµός ατόµων) και τα Κύµινα (καλλιεργούµενος πληθυσµός ατόµων), (Εικόνα 5). Οι δειγµατοληψίες πραγµατοποιήθηκαν τους µήνες Ιούνιο και Οκτώβριο,για µια περίοδο 3 ετών ( ) και περιελάµβαναν την συλλογή ατόµων από τους σταθµούς δειγµατοληψίας, την άµεση µεταφορά τους στο εργαστήριο,τη συλλογή των ιστών (πεπτικός αδένας, βράγχια,σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και αιµόλεµφος)και την προετοιµασία τους για τον προσδιορισµό των διαφόρων βιοχηµικών παραµέτρων.

62 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 39 Εικόνα 5. Χάρτης του Θερµαϊκού κόλπου µε τις περιοχές δειγµατοληψίας. 1: Αγγελοχώρι (καλλιεργούµενος πληθυσµός),2: Περαία (φυσικός πληθυσµός),3: Αγωγός/Αντλιοστάσιο (φυσικός πληθυσµός κοντά στην έξοδο των αποβλήτων στην περιοχή του Καλοχωρίου), 4: Χαλάστρα (καλλιεργούµενος πληθυσµός), 5: Κύµινα (καλλιεργούµενος πληθυσµός), 6: Ολυµπιάδα (καλλιεργούµενος πληθυσµός στην περιοχή του Στρυµονικού κόλπου). Picture 5. M ap of Thermaikos G ulf show ing the sam pling stations. 1: A ggelochorion (cultured population);2:peraia (naturalpopulation);3:outlettube (naturalpopulation nearthe form erexitofthe wastew ater treatmentplant tube of Kalohori);4:Halastra (cultured population);5:kimina (cultured population);6:olym piada (cultured population in Strym onikos Gulf). 2. Έκθεση ατόµων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου: Η µεταβολή των επιπέδων του ca M P που παρατηρήθηκαν ως αποτέλεσµα της έκθεσης των οργανισµών σε διάφορους ανόργανους ρυπαντές του περιβάλλοντος, οδήγησε στην εργαστηριακή µελέτη του φαινοµένου. Παράλληλα µε τον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων του ca M P,µελετήθηκαν και τα επίπεδα των ΜΤ, µετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου. Άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis συλλέχθηκαν από την περιοχή ΝΑΟ της Καλαµαριάς (Θεσσαλονίκη)και µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο,όπου και τοποθετήθηκαν σε ενυδρεία µε φιλτραρισµένο και αεριζόµενο νερό (αλατότητα ο / οο και θερµοκρασία ο C). Τα άτοµα παρέµειναν για 15 ηµέρες στο εργαστήριο,µε καθηµερινή αλλαγή νερού και χωρίς την προσθήκη τροφής,έτσι ώστε να προσαρµοστούν στις συνθήκες του εργαστηρίου. Στη συνέχεια, τα µύδια

63 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 40 χωρίστηκαν σε 3 οµάδες των 20 ατόµων και µεταφέρθηκαν σε ξεχωριστά ενυδρεία.η 1 η οµάδα χρησιµοποιήθηκε ως οµάδα αναφοράς (control),ενώ η 2 η και 3 η οµάδα ζώων εκτέθηκαν σε 1,10 και 100 µgr/ltκαδµίου αντίστοιχα για 9 ηµέρες.το νερό (10 lt/ενυδρείο)άλλαζε καθηµερινά µε νέα προσθήκη του µετάλλου.κατά τη διάρκεια της έκθεσης συλλέχθηκαν ζώα και από τις 3 οµάδες στις 3,6 και 9 ηµέρες έκθεσης και ακολούθησε επεξεργασία των ιστών (αιµόλεµφος,πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες) για τον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων των επιπέδων των ΜΤ και του ca M P. 3. Έκθεση ατόµων σε οργανικούς ρυπαντές: Άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο και τοποθετήθηκαν σε ενυδρεία (30 άτοµα/ενυδρείο),όπου και παρέµειναν για να προσαρµοστούν σε συνθήκες εργαστηρίου για 15 µέρες.στη συνέχεια,ακολούθησε έκθεση των ατόµων σε οργανικούς ρυπαντές για 15 µέρες, µε σκοπό τον προσδιορισµό των επιπέδων των ΜΤ,της ενζυµικής δραστικότητας της AChE και των συγκεντρώσεων του ca M P σε διάφορους ιστούς των ατόµων. Συγκεκριµένα,σε τρεις οµάδες ζώων (30 άτοµα/ενυδρείο)έγινε επίδραση µε µίγµα πολυκυκλικών αρωµατικών υδρογονανθράκων (0.3 mgr/ltpahs:ανθρακένιο, φαινανθρένιο και ναφθαλένιο σε αναλογία 1:1:1,διαλυµένα σε ακετόνη 100 µgr/lt), 0.3 m gr/lt 2.4-dichlorophenoxyacetic acid/ 2.4-D και 0.3 m gr/lt λινδάνιο (γεξαχλωροκυκλοεξάνιο/γ-hch) αντίστοιχα για 15 µέρες. Ως οµάδες αναφοράς χρησιµοποιήθηκαν µία οµάδα ζώων στην οποία δεν έγινε καµία έκθεση και µία οµάδα ζώων στην οποία χορηγούσαµε ακετόνη (100µgr/lt)καθ όλη τη διάρκεια της έκθεσης.μετά το τέλος της έκθεσης,ιστοί από 10 ζώα κάθε οµάδας ετοιµάστηκαν για προσδιορισµό των βιοχηµικών παραµέτρων.

64 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 41 ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 1. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΟΘΕΙΟΝΙΝΩΝ (ΜΤ). ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΣΟΥΛΦΥ ΡΥΛΟΜΑ ΩΝ (-SH ) ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Ellman. 1.1 Πρακτική εκτίµηση της µεθόδου: Έχουν αναφερθεί διάφορες τεχνικές µέτρησης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ), όπως η µέθοδος χρωµατογραφίας στήλης,η πολαρογραφική µέθοδος ανάλυσης, η µέθοδος ατοµικής απορρόφησης, η µέθοδος προσδιορισµού του mrna,κλπ., οι οποίες απαιτούν εξελιγµένο εξοπλισµό και αρκετό χρόνο για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων (Sw apan και συν.,1991; Kay και συν.,1991).στη συγκεκριµένη µελέτη,για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης των µεταλλοθειονινών (ΜΤ)στους ιστούς των µυδιών χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος ποσοτικής ανάκτησης των ΜΤ µε τη χρήση RNA. Πρόκειται για µια ευαίσθητη, µη-χρονοβόρα και φθηνή µέθοδο, συγκριτικά µε άλλες µεθόδους,που στηρίζεται στο φωτοµετρικό προσδιορισµό των σουλφυδρυλοµάδων (-SH ) των ΜΤ (οι ΜΤ διαθέτουν υψηλό ποσοστό σουλφυδρυλοµάδων, 20-30%, συγκριτικά µε τα επίπεδα που εµφανίζουν άλλες πρωτεΐνες), (Viarengo και συν., 1996) και χρησιµοποιείται ευρύτατα από πολλά ερευνητικά εργαστήρια σε χώρες της Μεσογείου (Viarengo και συν.,1996, 1997; UNEP/RAM OGE,1997,1999). Τα δείγµατα αρχικά κατεργάζονται µε 0.01% β-µερκαπτοαιθανόλη, πριν ακολουθήσει ο προσδιορισµός των ΜΤ µε τη χρήση του αντιδραστηρίου δι-θειο-διςνιτροβενζοϊκό οξύ (DTNB). Χρησιµοποιήθηκε ο κλασµατικός διαχωρισµός αιθανόλης/χλωροφορµίου, ο οποίος επιτρέπει τη διάσπαση και αποµάκρυνση των διαλυτών ριζών,µικρού µοριακού βάρους,οι οποίες µπορούν να παρέµβουν στον προσδιορισµό των ΜΤ. Κατά τη διάρκεια του διαχωρισµού µε τη χρήση της αιθανόλης, η προσθήκη ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) σαν βοηθητικό διάλυµα κατακρήµνισης,καθώς και οξέος (HCl37% ),είναι ικανή να επιτρέψει µια ποσοτική ανάκτηση των ΜΤ.Ένα τελικό πλύσιµο των δειγµάτων επιτρέπει την αποµάκρυνση των ανεπιθύµητων ριζών, παραγόντων που βρίσκονται πάνω στην κυτταρική µεµβράνη (γλουταθειόνη,κυστεΐνες,κλπ.),καθώς και ριζών που προστέθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράµατος, π.χ., β-µερκαπτοαιθανόλη. Τα σφαιρίδια των

65 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 42 συγκεντρωµένων ΜΤ αιωρούνται µέσα σε διάλυµα NaCl0.25M,όπου προστίθενται HClκαι EDTA (έτσι ώστε να αποµακρυνθούν τα κατιόντα βαρεών µετάλλων που βρίσκονται ακόµη δεσµευµένα µε τις ΜΤ). Στη συνέχεια, ακολουθεί προσθήκη γνωστής συγκέντρωσης του αντιδραστηρίου DTNB µέσα σε ένα ισχυρό ιονικό µέσο, για την ολοκληρωτική µετουσίωση των ΜΤ. Η αντίδραση των οµάδων SH γίνεται στοιχειοµετρικά µε το DTNB µε ταυτόχρονη παραγωγή ΤΝΒ, ενός κιτρινόχρωµου συστατικού που παρουσιάζει µέγιστη απορρόφηση σε µήκος κύµατος 412 nm. Μια βαθµονοµηµένη πρότυπη καµπύλη γλουταθειόνης χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό των ΜΤ στους ιστούς των µυδιών. 1.2 Προετοιµασία των δειγµάτων: Ο πεπτικός ιστός,τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες συλλέγονται και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί.μίγµα 1 gr κάθε ιστού,από 10 τουλάχιστον ζώα,ζυγίζεται και ακολουθεί οµογενοποίηση µε τη χρήση οµογενοποιητή (γυάλινου ή από τεφλόν), σε 3 όγκους διαλύµατος 0.5Μ Sucrose-20m M TRIS, ph = 8.6 (διάλυµα οµογενοποίησης),που περιέχει επιπρόσθετα 0.01% β-µερκαπτοαιθανόλη, PM SF (1.5 µl/ml)και λουπεπτίνη (3 µl/ml). Ακολουθεί φυγοκέντρηση του οµογενοποιήµατος στις στροφές για 20 λεπτά στους 4 ο C.Μετά τη φυγοκέντρηση των δειγµάτων,ακολουθεί συλλογή του υπερκειµένου,το οποίο µπορεί να διατηρηθεί στους -85 ο C,µέχρι τον προσδιορισµό των ΜΤ. 1.3 Κατακρήµνιση µε αιθανόλη: Χρησιµοποιώντας ψυχρή αιθανόλη (-20 ο C)κατακρηµνίζονται οι πρωτεΐνες υψηλού µοριακού βάρους που υπάρχουν στο υπερκείµενο,µετά τη φυγοκέντρηση του οµογενοποιήµατος.συγκεκριµένα,σε 1 mlαπό το υπερκείµενο προστίθεται 1.05 ml ψυχρής αιθανόλης και 80 µl χλωροφορµίου. Ακολουθεί ανάδευση για µερικά δευτερόλεπτα και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές για 10 λεπτά,στους 4 ο C.Στη συνέχεια το υπερκείµενο συλλέγεται και υπολογίζεται ο όγκος του. Ακολουθεί προσθήκη 40 µl HCl 37% και 10 µl RNA (1m g/10µl) και τριπλάσιος όγκος ψυχρής αιθανόλης. Μετά από παραµονή 1 ώρας στους 20 ο C ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές για 10 λεπτά. Το υπερκείµενο αποµακρύνεται και το ίζηµα πλένεται µε διάλυµα οµογενοποίησης που περιέχει 87%

66 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 43 αιθανόλη,1% χλωροφόρµιο και 12% διάλυµα οµογενοποίησης,χωρίς την προσθήκη β-µερκαπτοαιθανόλης, PM SF και λουπεπτίνης. Στη συνέχεια, ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 6000 στροφές και συλλογή του ιζήµατος.το ίζηµα που παραµένει υφίσταται ξήρανση µε αέριο άζωτο για περίπου 10 λεπτά. 1.4 Επαναιώρηση του εµπλουτισµένου µε ΜΤ κλάσµατος: Στα αποξηραµένα δείγµατα προστίθεται 150 µl ΝaC l0.25μ και 150 µlηcl 1Ν-EDTA 4m M (διάλυµα αποσταθεροποίησης), (Πίνακας 2). Ακολουθεί επαναιώρηση των δειγµάτων µε τη χρησιµοποίηση γυάλινης ράβδου. 1.5 Ανάλυση DTNB (Αντίδραση Ellm an)-πρότυπη καµπύλη γλουταθειόνης: Ετοιµάζεται φρέσκο διάλυµα γλουταθειόνης (GSH)συγκέντρωσης 1 m gr/ml σε 0.25Μ NaClκαι φυλάσσεται στον πάγο.ακριβώς πριν την ανάλυση ετοιµάζεται φρέσκο διάλυµα DTNB 0.43 m Μ (7.14 m g/42 m l0.2 Μ φωσφορικού διαλύµατος, ph =8, που περιέχει 2Μ NaCl. (Το φωσφορικό διάλυµα ετοιµάζεται από stock διάλυµα 200 m l Na 2 ΗPO 4 0.2Μ, 200 m l NaΗ 2 PO 4 0.2M, 1 lt NaCl 2M. Τα φωσφορικά άλατα αραιώνονται στο διάλυµα NaCl2M ).Μετά την προετοιµασία των δειγµάτων ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 3000 στροφές για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Τα δείγµατα για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης και τον προσδιορισµό των δειγµάτων ετοιµάζονται σύµφωνα µε τον Πίνακα 2. Ακολουθεί µέτρηση της απορρόφησης, (ABS 412 ), σε µήκος κύµατος 412 nm. Μετά από το φωτοµετρικό προσδιορισµό των δειγµάτων ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά σε σκοτάδι και τα δείγµατα φωτοµετρούνται ξανά. Με αυτό τον τρόπο ελαχιστοποιούνται πιθανά σφάλµατα στις µετρήσεις που οφείλονται στην έλλειψη ικανού χρόνου για την ανάπτυξη του φθορισµού. Πίνακας 2.Κατασκευή πρότυπης καµπύλης γλουταθειόνης και προετοιµασία µέτρησης των άγνωστων δειγµάτων. Table 2.Calibration curve ofglutathione (G SH)and unknow n sam ples preparation. GSH 0.25 Μ NaCl 1Ν HCl ιάλυµα V τελ 4m Μ EDTA DTNB είγµατα µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml Τυφλό µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 7.2 nm ol/ml 10 µl 140 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 14.4 nm ol/ml 20µl 130 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 28.8 nm ol/ml 40µl 110 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml 57.6 nm ol/ml 80µl 70 µl 150 µl 4.2 ml 4.5 ml

67 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ Υπολογισµός και ερµηνεία των αποτελεσµάτων-καταγραφή της πρότυπης καµπύλης: Εκφράζουµε την πρότυπη καµπύλη της γλουταθειόνης σε nm ol/ml. Σχεδιάζουµε την καλύτερη ευθεία που περνάει από τα σηµεία της πρότυπης καµπύλης της γλουταθειόνης. ABS GSH 412 = ε[-sh ] όπου: ABS GSH 412,(OD 412 ),είναι η οπτική πυκνότητα των δειγµάτων της γλουταθειόνης σε µήκος κύµατος 412 nm, ε, (OD 412 /nm ol/ml), είναι µια σταθερά που αντιπροσωπεύει το συντελεστή της γλουταθειόνης, [-SH ], (nm ol/ml), αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση των σουλφυδρυλοµάδων στα δείγµατα της γλουταθειόνης. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό των ΜΤ οι τιµές της απορρόφησης των δειγµάτων παρεµβάλλονται στην πρότυπη καµπύλη και στη συνέχεια υπολογίζεται η συγκέντρωση των σουλφυδρυλοµάδων που περιέχονται στα δείγµατα, όπως παρουσιάζονται από τον άξονα Χ του διαγράµµατος.λαµβάνοντας υπόψη µας τα µοριακά χαρακτηριστικά των ΜΤ των µυδιών (M ackay και συν., 1993), όπου ο αριθµός των µορίων κυστεΐνης είναι 21,το µοριακό βάρος 8600 Da,ο τελικός όγκος της αντίδρασης DTNB (4.5 m l),η συγκέντρωση των ΜΤ στο µύδι (ng/g κ.β ιστού) µπορεί να υπολογιστεί από τον παρακάτω τύπο: [χ/21] όπου, χ (nm ol/ml), αντιπροσωπεύει τις τιµές του άξονα Χ που προέρχονται από την παρεµβολή των τιµών απορρόφησης στην πρότυπη καµπύλη.

68 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗΣ (ΑChE) ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS. 2.1 Πρακτική εκτίµηση της µεθόδου: Ο Ellman (1961) ανέπτυξε µια µέθοδο µε την οποία µπορεί να µετρηθεί η δραστικότητα της ΑChE µε τη χρήση µικροπλακών.με τη χρήση ακετυλθειοχολίνης (ACTC)ως ειδικό υπόστρωµα,η µέθοδος αυτή βασίζεται στην αύξηση του κίτρινου χρώµατος που παράγεται από τη θειοχολίνη,όταν αυτή αντιδρά µε τα ιόντα DTNB. (ένζυµο AChE) ACTC θειοχολίνη + οξικό οξύ Θειοχολίνη + DTNB κίτρινο χρώµα 2.2 Προσδιορισµός της συνολικής ενζυµικής δραστικότητας (Ellm an,1961): Για την εξαγωγή και προσδιορισµό της ενζυµικής δραστικότητας χρησιµοποιήθηκε 1 gr από τον κάθε ιστό (πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες).ο ιστός οµογενοποιείται µε τετραπλάσιο όγκο διαλύµατος 0.1M TRIS/HCl+ 0.1% TRITON X 100,pH 7,για περίπου sec µε τη χρησιµοποίηση οµογενοποιητή Ultra Turrax.Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις g για 20 λεπτά. Το υπερκείµενο µπορεί να διατηρηθεί στους 85 ο C και να χρησιµοποιηθεί ως πηγή του ενζύµου. Για την µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας της αιµολέµφου,περίπου 1 ml αιµολέµφου συλλέγεται µε τη χρήση αποστειρωµένης σύριγγας από τον οπίσθιο προσαγωγό µύ κάθε ζώου (Εικόνα 6)και φυγοκεντρείται στις g για 10 λεπτά. Το υπερκείµενο συλλέγεται και µπορεί να διατηρηθεί στους -85 ο C για χρονικό διάστηµα µικρότερο της µιας ηµέρας, πριν ακολουθήσει ο προσδιορισµός της δραστικότητας του ενζύµου *. * Ο προσδιορισµός της ενζυµικής δραστικότητας στην αιµόλεµφο πρέπει να γίνεται το ταχύτερο δυνατό,γιατί µετρήσεις του ενζύµου µετά από µεγάλης διάρκειας διατήρησής της,έδειξαν σηµαντική µείωση της δραστικότητας της AChE.

69 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 46 Εικόνα 6. Συλλογή αιµολέµφου από τον οπίσθιο προσαγωγό µυ του µυδιού µε τη χρήση αποστειρωµένης σύριγγας. Picture 6. H aem olym ph collection from the posterior adductor muscle of the m usselwith sterile syringe. Η µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας γίνεται µε χρησιµοποίηση µικροπλάκας 96 οπών.σε κάθε οπή προστίθεται 10 µlυπερκειµένου,170 µl0.1m TRIS/HCl+ 0.1% TRITO N X 100,pH 7,20 µldtnb (DTNB διαλυµένο σε 0.1Μ TRIS/HCl, ph 8,τελικής συγκέντρωσης 0.53 mm)και ακριβώς πριν από τη µέτρηση προστίθενται 5 µlactc 2.8 m M.Η µέτρηση της δραστικότητας γίνεται σε µήκος κύµατος 412 nm,όπου λαµβάνεται η αλλαγή της οπτικής πυκνότητας κάθε 1 λεπτό για περισσότερο από 4 λεπτά. 2.3 Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης,(bca method,sorensen and Brodbeck,1976): Για την µέτρηση της ποσότητας της πρωτεΐνης χρησιµοποιείται η µέθοδος BCA (bicinchoninic acid) που πρότειναν οι Sorensen και Brodbeck (1986).Για την µέτρηση της πρωτεΐνης ετοιµάζεται πρότυπη καµπύλη της πρωτεΐνης αλβουµίνης (bovine serum alboum in,bsa),σύµφωνα µε τον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης σε άγνωστα δείγµατα µε κατασκευή πρότυπης καµπύλης. Table 3.Calibration curve with the use ofbovine-serum alboum in (BSA)fordetermination ofprotein concentration in unknow n sam ples. Ν ο eppendorf µlbsa(2m g/ml) ml2d H 2 O C τελ (µg/ml)

70 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 47 Ποσότητα 20 µl από κάθε πρότυπο δείγµα µεταφέρεται σε διαφορετικά πηγαδάκια µιας πλάκας ELISA (96 οπών).ακολουθεί προσθήκη 180 µlαπό το µίγµα των αντιδραστηρίων Α και Β (για τη σύσταση των αντιδραστηρίων Α και Β δες Παράρτηµα). Προηγούµενα έχουµε ετοιµάσει διάλυµα των αντιδραστηρίων που περιέχει 50 µέρη από το Α και 1 µέρος από το Β.Τα άγνωστα δείγµατα που πρόκειται να µετρηθούν και να υπολογιστούν µε την πρότυπη καµπύλη,προετοιµάζονται µε τον ίδιο τρόπο,όπως και τα πρότυπα δείγµατα που περιγράφηκαν,δηλ.,προσθήκη 3-5 µl δείγµατος σε κάθε πηγαδάκι,180 µlαπό το αντιδραστήριο BCA και 2dH 2 O,µέχρι τα 200 µl. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C και µέτρηση την οπτικής απορρόφησης σε µήκος κύµατος 570 nm.από την πρότυπη καµπύλη (OD 570 -µg/ml) υπολογίζεται η ποσότητα της πρωτεΐνης που περιέχεται στα άγνωστα δείγµατα. 2.4 Έκφραση της ενζυµικής δραστικότητας: Η ειδική δραστικότητα (specific activity) εκφράζεται σε nm ol ακετυλθειοχολίνης (ACTC)που υδρολύεται ανα λεπτό ανα mgrπρωτεΐνης (nm ol ACTC/min/mg protein).σύµφωνα µε µελέτες της δραστικότητας του ενζύµου στα βράγχια του είδους Mytilus galloprovincialis, που πραγµατοποιήθηκαν από τους Galgani και Bocquene (1988) και µε τη σύµφωνη γνώµη των ερευνητών, καθιερώθηκε η έκφραση της ενζυµικής δραστικότητας της AChE σε nm ol, λαµβάνοντας υπόψη πως 1 ενζυµική µονάδα ισοδυναµεί µε τη µεταβολή της οπτικής απορρόφησης κατά (1U = O D ). Πρόκειται για µια παραδοχή που βασίζεται στις µελέτες των ερευνητών σχετικά µε τη µεταβολή της οπτικής απορρόφησης που προκύπτει µε τη συγκεκριµένη µέθοδο χρησιµοποίησης του αντιδραστηρίου DTNB και προτείνεται σε µελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης µε τη χρήση του συγκεκριµένου οργανισµού βιο-ενδείκτη (UNEP/RAM OGE, 1993). Ο υπολογισµός της ενζυµικής δραστικότητας γίνεται σύµφωνα µε τον παρακάτω τύπο: O. D / nm ) min (412 [ ] protein όπου, 1.OD η µεταβολή της οπτικής απορρόφησης που ισούται µε την υδρόλυση 75 nm olactc (nm ol/min/mg protein),

71 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 48 [protein]:η συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε mgr. Γνωρίζοντας την ποσότητα της πρωτεΐνης που περιέχεται σε 20 µlδείγµατος υπολογίζεται η ενζυµική δραστικότητα ανα mg πρωτεΐνης ανα λεπτό (U/mgrprotein). Η ενζυµική δραστικότητα εκφράζεται σε nm ol/min/mg πρωτεΐνης, µε πολλαπλασιασµό της OD/min/mg πρωτεΐνης, µε τον συντελεστή 75 δηλ., την ποσότητα σε nm olτης ακετυλθειοχολίνης που υδρολύεται (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) από την αλλαγή της οπτικής απορρόφησης κατά µία µονάδα. 2.5 Πιθανά σφάλµατα στις µετρήσεις -Κατάσταση των δειγµάτων: Μεταβολές στη δραστικότητα της AChE µπορεί να προκληθούν κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, αλλά συγκρινόµενες µε πολλές άλλες ενζυµικές δραστικότητες είναι ασήµαντες. Επιπλέον, οι µετρήσεις πραγµατοποιούνται σε πληθυσµούς καθορισµένης ηλικίας και σεξουαλικής ωριµότητας, συγκεκριµένου µεγέθους, ενώ οι δειγµατοληψίες πραγµατοποιούνται µέσα σε σύντοµο χρονικό διάστηµα που δεν ξεπερνά τις 10 ηµέρες. Όλα τα δείγµατα αναλύονται την ίδια χρονική στιγµή. 3. ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΚΥΚΛΙΚΟΥ AM P (ca M P). 3.1 Εκτίµηση της µεθόδου µέτρησης µε τη χρήση ραδιοσηµασµένου cam P: Για τη συγκέντρωση του ca M P στα δείγµατα των ιστών χρησιµοποιείται ραδιοσηµασµένο µόριο ca M P (Amersham kit, [8-3 Η]-adenosine 3-5 cyclic phosphate im m unoassay kit). Η µέθοδος µέτρησης της συγκέντρωσης του ca M P στους ιστούς των µυδιών,στηρίζεται στον ανταγωνισµό µεταξύ του µη-σηµασµένου µορίου ca M P και συγκεκριµένης ποσότητας (0.5 µci/ml) του σηµασµένου µορίου ([8-3 Η]-adenosine 3-5 cyclic phosphate nucleotide)για τη σύνδεσή του σε πρωτεΐνη που χαρακτηρίζεται από µεγάλη ικανότητα σύνδεσης µε το µόριο του ca M P. Η συγκέντρωση του σηµασµένου συµπλόκου ca M P-πρωτεΐνης είναι αντιστρόφως ανάλογη µε τη συγκέντρωση του µη-σηµασµένου ca M P του δείγµατος. Ο διαχωρισµός του δεσµευµένου στην πρωτεΐνη ca M P από το µη-δεσµευµένο ca M P επιτυγχάνεται µε την απορρόφηση του ελεύθερου ca M P σε ειδικό υλικό απορρόφησης (charcoal reagent), το οποίο και αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση. Μέρος του υπερκειµένου συλλέγεται προς µέτρηση και η συγκέντρωση του µησηµασµένου ca M P υπολογίζεται µε τη βοήθεια πρότυπης καµπύλης (εύρος συγκέντρωσης ca M P: 0-16 pm ol ca M P/δείγµα µέτρησης). Το όριο ανίχνευσης

72 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 49 υπολογίζεται στα 0.05 pm ol ca M P, ενώ η επαναληψιµότητα της συγκεκριµένης µεθόδου κυµαίνεται µεταξύ 95 και 100%. 3.2 Προετοιµασία των δειγµάτων µέτρησης: Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του ca M P, άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis µεταφέρονται στο εργαστήριο και ακολουθεί εξαγωγή των ιστών που θα χρησιµοποιηθούν για τον προσδιορισµό του ca M P. Από κάθε ζώο συλλέγεται ο πεπτικός αδένας, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες. Συνολικά 1 gr ιστού από τουλάχιστο 3 ζώα οµογενοποιείται µε τριπλάσιο όγκο διαλύµατος EDTA 4m M,pH 7.5,για την αποφυγή διάσπασης του ca M P.Ακολουθεί βρασµός του οµογενοποιήµατος για 5 λεπτά και φυγοκέντρηση των δειγµάτων σε g, για 5 λεπτά, στους 4 o C. Το υπερκείµενο ψύχεται στους -85 ο C και διατηρείται µέχρι τον προσδιορισµό του ca M P. 3.3 Αντιδραστήρια: Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται για τη µέτρηση του ca M P είναι τα παρακάτω: Αντιδραστήριο 1: ιάλυµα Tris-EDTA (0.05Μ ΤRΙS-4m M EDTA,pH =7.5). Αντιδραστήριο 2:Πρωτεΐνη σύνδεσης (Binding protein) Αντιδραστήριο 3:Ανιχνευτής ca M P [8-3 H ca M P] Αντιδραστήριο 4:Πρότυπο διάλυµα ca M P (standard ca M P) Αντιδραστήριο 5:Υλικό απορρόφησης (charcoalreagent) 3.4 Προετοιµασία πρότυπων διαλυµάτων: Ετοιµάζονται διαφορετικές συγκεντρώσεις πρότυπων διαλυµάτων ca M P. Μαζί µε το αρχικό διάλυµα ετοιµάζονται συνολικά 5 διαλύµατα από τα οποία τα 50 µlθα δώσουν συγκεντρώσεις 16,8,4,2 και 1 pm oles αντίστοιχα. 3.5 Πειραµατικό πρωτόκολλο µέτρησης: Τοποθετούνται δυο σειρές µε 14 σωληνάκια φυγοκέντρησης η κάθε µια,σε υδατόλουτρο µε νερό ( 0 ο C). Τα σωληνάκια πρέπει να σηµανθούν και να τοποθετηθούν σύµφωνα µε τον Πίνακα 4.Ακολουθεί προετοιµασία των δειγµάτων.

73 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 50 Μετά την ετοιµασία των δειγµάτων ακολουθεί ανάδευση για 5 sec και παραµονή σε θερµοκρασία 2-8 ο C για 2 ώρες.aκολουθεί προσθήκη 100 µlαπό το αντιδραστήριο 5 σε κάθε δείγµα και φυγοκέντρηση στις στροφές για 20 λεπτά, για να καθιζάνει το υλικό.χωρίς να αναταράξουµε το ίζηµα,200 µlυπερκειµένου µεταφέρονται σε ατοµικά σωληνάκια κατάλληλα για µέτρηση και προσθέτουµε 3 ml υγρό σπινθηρισµού (scintillation liquid). Ο προσδιορισµός του ca M P πραγµατοποιείται µε τη χρήση προγράµµατος ( 3 Η- software) σε όργανο µέτρησης υγρού σπινθηρισµού (β-counter LKB 1209, Rackbeta).Συνίσταται η συνολική αρίθµηση να υπολογίζεται έχοντας υπόψη µας την µέτρηση σκέτου του αντιδραστηρίου 3 διαλυµένου σε 1 mlνερού. Πίνακας 4.Πρωτόκολλο εργασίας για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του ca M P. Table 4.Protocollm atrix forthe determ ination ofca M P concentration. Ν ο Tris/ED TA (µl) Πρότυπα (µl) Sam ples (µl) [8-3 H ca M P] (µl) Πρωτεΐνη (µl) 1, Τυφλό 3, Μηδενισµός 5, pm ol 7, pm ol 9, pm ol 11, pm ol 13, pm ol 15,κλπ Άγνωστα 4. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ. Ο πεπτικός αδένας, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες συλλέγονται και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί. 1 gr κάθε ιστού, από 10 τουλάχιστο ζώα, κόβεται σε µικρά κοµµάτια και ξηραίνεται για 48 ώρες σε θερµοκρασία 110 ο C.Ακολουθεί µέτρηση της ξηρής µάζας και προσθήκη HNO 3 75%, έτσι ώστε να καλύπτεται εντελώς ο αποξηραµένος ιστός.ο όγκος του οξέος που προστίθεται είναι: ξηρό βάρος ιστού x 20,για τον πεπτικό αδένα και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και ξηρό βάρος ιστού x 10,για τα βράγχια. Στη συνέχεια,ο ιστός παραµένει µέσα στο οξύ για 24 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια ακολουθεί βρασµός µέχρι εξάτµισης του οξέος. Το

74 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 51 στερεό υπόλειµµα που αποµένει αραιώνεται µε 5 mlhno 3 0.5%.Μετά από διήθηση του δείγµατος σε κατάλληλο διηθητικό χαρτί τα δείγµατα ετοιµάζονται για µέτρηση των συγκεντρώσεων των µετάλλων µε όργανο ατοµικής απορρόφησης (Perkin Ellmer 2380). Οι συγκεντρώσεις των µετάλλων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων µε τη µέθοδο της ατοµικής απορρόφησης συγκρίθηκαν µε υλικό αναφοράς (Reference M aterial for Trace M etals from dogfish m uscle/dorm-2, NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA).Από τα αποτελέσµατα προκύπτει ταύτιση των µετρήσεων του οργάνου µε τις τιµές των πρότυπων δειγµάτων σε ποσοστό 90-97%. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ε ΟΜΕΝΩΝ Η εξαγωγή των στατιστικών διαφορών και οι συσχετίσεις των βιοχηµικών παραµέτρων πραγµατοποιήθηκαν µε χρησιµοποίηση του στατιστικού πακέτου STA TISTICA (STA TISTICA statisticalpackage,microsoftco.auth,greece). Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων της δραστικότητας της AChE, της συγκέντρωσης των ΜΤ, καθώς και του ca M P στους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από το πεδίο,κάθε δειγµατοληπτική περίοδο από τις διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού και Στρυµονικού κόλπου,αλλά και από την εργαστηριακή έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές και στο κάδµιο, αναλύθηκαν µε χρήση µηπαραµετρικής στατιστικής µεθόδου (non-param etric statistics,m ann-w hitney U-test, P<0.05).Τα απολέσµατα των ΜΤ (µgr/gr υγρού βάρους) εκφράζονται ως ο µέσος όρος ± η τυπική απόκλιση (Μ.Ο. ± SD ) από 4 διαφορετικές µετρήσεις. Τα αποτελέσµατα της ενζυµικής δραστικότητας της A ChE (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο.± SD πέντε διαφορετικών µετρήσεων.τα αποτελέσµατα για το ca M P (pm ol ca M P/gr υγρού βάρους) εκφράζονται ως οι Μ.Ο. ± SD τεσσάρων διαφορετικών µετρήσεων.σε κάθε µέτρηση χρησιµοποιήθηκε ιστός από 3 τουλάχιστο ζώα. Η στατιστική ανάλυση των συγκεντρώσεων των µετάλλων στους ιστούς ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της δειγµατοληψίας του 2001 πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση στατιστικής µεθόδου t-testγια ανεξάρτητα δείγµατα (t-test for independent sam ples, P<0.05).Τα αποτελέσµατα των βαρέων µετάλλων εκφράζονται ως οι Μ.Ο.± SD (ng/g ξηρού βάρους ιστού για τα µέταλλα Cd και Pb

75 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 52 και µg/g ξηρού βάρους ιστού για τα µέταλλα Zn και Cu) από 2 διαφορετικές µετρήσεις.σε κάθε µέτρηση χρησιµοποιήθηκε ιστός από 10 τουλάχιστο ζώα. Η εποχική διακύµανση των παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς ατόµων από κάθε περιοχή δειγµατοληψίας αναλύθηκε µε χρήση µεθόδου ANOVA (D uncan s test, P<0.05). Οι συσχετίσεις (αρνητικές και θετικές) µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση της στατιστικής µεθόδου απλής γραµµικής συσχέτισης (Correlation m atrices, Pearson test,p<0.05),ενώ για την οµαδοποίηση των παραµέτρων και των περιοχών, ανάλογα µε το βαθµό συγγένειας,χρησιµοποιήθηκε ανάλυση οµαδοποίησης (Clusteranalysis,P<0.05).

76 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 53 ΜΕΡΟΣ Β: ΕΚΘΕΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ Η µελέτη περιλαµβάνει έκθεση αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis σε κάδµιο, µε κύριο στόχο τη µελέτη των µονοπατιών µετάδοσης µηνύµατος που επάγονται από το µέταλλο.ο πεπτικός αδένας των µυδιών χρησιµοποιείται ευρύτατα ως πειραµατικό µοντέλο, λόγω της σηµαντικότητάς του ως κύριος ιστός συσσώρευσης ρυπογόνων παραγόντων και αποτοξίνωσης του οργανισµού (D epledge και Rainbow, 1990; Syasina και συν., 1997). Στην παρούσα µελέτη, χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα πεπτικού αδένα για τη διερεύνηση των σηµατοδοτικών µηχανισµών που επάγονται µετά την έκθεσή τους σε τοξικούς παράγοντες,όπως το κάδµιο.ιδιαίτερη σηµασία δίνεται για πρώτη φόρα στο ρόλο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και στο ρόλο της PK C και του ca M P, σε σηµατοδοτικούς µηχανισµούς που επάγωνται από το κάδµιο. 1. Συλλογή ατόµων και διατήρησή τους: Άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis συλλέχθηκαν από την περιοχή του Ναυτικού Οµίλου Καλαµαριάς που βρίσκεται στην Ανατολική πλευρά του Θερµαϊκού κόλπου.η συγκεκριµένη περιοχή επιλέχθηκε µε βάση το µικρό βαθµό επιβάρυνσής της µε βαρέα µέταλλα και ειδικότερα µε τα χαµηλά επίπεδα καδµίου που µετρήθηκαν στους ιστούς µυδιών.μελέτες της συγκέντρωσης του καδµίου σε µύδια της συγκεκριµένης περιοχής έδειξαν πως η συγκέντρωση του συγκεκριµένου µετάλλου στον πεπτικό αδένα των µυδιών είναι κατά πολύ µικρότερη (27-52 ng/g ξηρού βάρους) από τις τιµές που αναφέρονται στον ίδιο ιστό ατόµων που συλλέχθηκαν από άλλες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου (D om ouhtsidou και συν., 2004). Επιπλέον, η συγκέντρωση του µετάλλου που µετρήθηκε είναι 40 φορές περίπου χαµηλότερη από ανάλογες µετρήσεις που πραγµατοποιήθηκαν από τους Amiard και συν.(1986),οι οποίοι προσδιόρισαν τη συγκέντρωση του καδµίου σε µύδια από µη-ρυπασµένες περιοχές.εποµένως,τα ζώα της συγκεκριµένης περιοχής δεν βρίσκονται κάτω από την επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων καδµίου. Άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο και τοποθετήθηκαν σε ενυδρεία µε φιλτραρισµένο θαλασσινό νερό (αλατότητα 35-40, θερµοκρασία 15 ο C, 20 άτοµα/10lt θαλασσινό νερό, προσθήκη φρέσκου θαλασσινού νερού κάθε 2 µέρες),όπου και παρέµειναν για 7 ηµέρες,χωρίς χορήγηση

77 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 54 τροφής,προκειµένου να προσαρµοστούν στις εργαστηριακές συνθήκες.οι ποσότητες του µετάλλου που χρησιµοποιήθηκαν στη συγκεκριµένη εργαστηριακή µελέτη κυµαίνονται από 0.05 εως 500 µmol/lt,µε τη χαµηλότερη τιµή να πλησιάζει αυτή που µετρήθηκε σε δείγµατα από το Θερµαϊκό κόλπο (EKΘΕ,1997). 2. Αποµόνωση κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού: Οι πεπτικοί αδένες 4 ζώων τεµαχίζονται σε µικρά κοµµάτια και πλένονται µε διάλυµα που δεν περιέχει ασβέστιο και µαγνήσιο (διάλυµα CM FS 1000 m O sm :20 m M H EPES,500 m M N acl,12.5 m M K Cl,5 m M EDTA,pH =7.3).Ο ιστός αφού στεγνώσει σε διηθητικό χαρτί,µεταφέρεται σε 15 mlδιαλύµατος CM FS που περιέχει 0.01 % κολλαγενάση.ακολουθεί διαχωρισµός µε ελαφρά ανάδευση στους 15 ο C για 60 λεπτά. Το διαχωρισµένο κυτταρικό αιώρηµα φιλτράρεται διαµέσω φίλτρων διαµέτρου 250-και 60-µm αντίστοιχα,και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 100 g για 10 λεπτά στους 4 ο C.Το ίζηµα (πακεταρισµένα κύτταρα)επαναιωρείται σε φυσιολογικό αλατούχο διάλυµα (διάλυµα PS,1100 mosm:20 mm H EPES,436 mm NaCl,10 mm KCl,10 mm CaCl 2,53 m M M gso 4,pH =7.3) και φυγοκεντρείται σε 100 g για 10 λεπτά. Τα τελικά ιζήµατα επαναιωρούνται σε αποστειρωµένο θρεπτικό διάλυµα Leibovitz L-15 (το διάλυµα είναι εµπλουτισµένο µε 350 m Μ NaCl,7 mm KCl,4 mm CaCl 2,8 mm MgSO 4,40 mm MgCl 2,pH =7.3,1% gentam ycin και 1% penicillin). Η βιοσιµότητα των κυττάρων εξετάζεται µε χρώση Eοσίνης και υπολογίζεται περίπου 83%. Η βιοσιµότητα, µετά από έκθεση των κυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου ( µμ) υπολογίστηκε στο 98%. Έκθεση των κυττάρων σε συγκέντρωση καδµίου µεγαλύτερη από 500 µμ,προκαλεί αύξηση της θνησιµότητας των κυττάρων σε ποσοστό µεγαλύτερο από 50%. Το αιώρηµα των κυττάρων διατηρείται σε θερµοκρασία 15 ο C και χρησιµοποιείται για την πειραµατική διαδικασία τουλάχιστον 3 ώρες µετά από το διαχωρισµό.

78 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 55 ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 1. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (ph i). Ο προσδιορισµός της ενδοκυτταρικής τιµής ph (ph i) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis πραγµατοποιήθηκε µε τροποποίηση της µεθόδου που προτάθηκε από τους Incerpi και συν. (1996) και περιλαµβάνει τη χρήση της φθοριζουσας ουσίας 2, 7 - bis (carboxylethyl)-5(6)- carboxyfluorescein tetra-acetoxym ethylester (BCECF/AM ; A pplichem. Inc.) που χαρακτηρίζεται από µεγάλη λιποδιαλυτότητα και διαπερατότητα της πλασµατικής µεµβράνης, ενώ διασπάται από τις ενδοκυτταρικές εστεράσες και παραµένει εγκλωβισµένη στο εσωτερικό του κυττάρου. Συγκεκριµένα,1 m lκυτταρικού αιωρήµατος (σε διάλυµα PS στο οποίο έχει προστεθεί 10 m M glucose), επωάζεται µε BCECF/AM για 45 λεπτά σε απόλυτο σκοτάδι ( 1-2 µg BCECF/AM /10 6 κύτταρα).ο όγκος της προστιθέµενης ποσότητας της φθορίζουσας ουσίας υπολογίζεται κάθε φορά, µετά από καταµέτρηση των κυττάρων στο κυτταρικό αιώρηµα.ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 100xg για 5 λεπτά και πλύσιµο (x3)των κυττάρων για την αποµάκρυνση της εξωκυττάριας φθορίζουσας ουσίας.μετά την τελική φυγοκέντρηση,τα κύτταρα αιωρούνται σε διάλυµα PS ( 2-3 x10 6 κύτταρα/3 m l) και µεταφέρονται σε υδατόλουτρο στους 20 ο C,όπου και παραµένουν για περίπου 2 ώρες. Το αιώρηµα των κυττάρων εκτίθεται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2 (0.05 µμ,5 µμ,50 µμ και 500 µμ),ή/και σε 10 nm phorbol-12-myristate-13- acetate (PM A :ενεργοποιητής της πρωτεϊνικής κινάσης C),σε 5.5 nm adrenalin (Lepinephrine: αγωνιστής των α- και β- αδρενεργικών υποδοχέων), σε 1 µμ isoprenaline-hcl (αγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων), σε 1 µμ phenylephrine-hcl(pe: αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων), σε 20 nm calphostin C (calph C από το Cladosporium cladosporioides:ειδικός αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης C), σε 1 µμ prazosin (ανταγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων), σε 1 µμ metoprolol-tatrate (ανταγωνιστής των β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων), σε 10 µμ propranolol-hcl (ανταγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων) και σε 20 nm ethyl-n-isopropyl-am iloride (EIPA : ειδικός αναστολέας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + ). Η αλλαγή του φθορισµού παρακολουθείται κατά τη διάρκεια της επίδρασης των διαφόρων ουσιών µε ειδικό φασµατοφωτόµετρο (Perkin Elmer, LS 50B

79 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 56 Fluorescence) υπό συνεχή ελαφρά ανάδευση και σε σταθερή θερµοκρασία 20 ο C.Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως η τιµή φθορισµού που προκύπτει από την αναλογία της απορρόφησης στο ph -ευαίσθητο µήκος κύµατος 495 nm και στο ph -αδρανές µήκος κύµατος 440 nm,µε σταθερό το µήκος αποβολής (530 nm ). Μετά το τέλος κάθε µέτρησης ακολουθεί κατασκευή πρότυπης καµπύλης για την αντιστοίχιση των τιµών φθορισµού που προκύπτουν από τις µετρήσεις και της αντίστοιχης τιµής ph i των δειγµάτων ( ιάγραµµα 1).Η κατασκευή της πρότυπης καµπύλης φθορισµού-ph iγίνεται σύµφωνα µε τη µέθοδο που προτάθηκε από τους Thom as και συν. (1979), µε τη χρήση του ιονοφόρου πολυαιθέρα νιγερισίνη. Η νιγερισίνη έχει την ικανότητα να ανταλλάσει ιόντα K + µε ιόντα Η + διαµέσου της πλασµατικής µεµβράνης, µέχρι να επιτευχθεί εξισορρόπηση της ενδοκυτταρικής τιµής ph µε αυτή του εξωκυττάριου µέσου. Για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης, τα κύτταρα αιωρούνται σε διαλύµατα µε διαφορετική τιµή ph,τα οποία είναι κατά σειρά τα παρακάτω:30 mm MES (ph =6),30 m M H EPES (ph =6.5),30 m M M O PS (ph =7) και 30 m M TRIS (ph =8).Όλα τα διαλύµατα περιέχουν 440 mm KClκαι 1 mm MgCl Fluorescence ratio 495/440 nm y = x R 2 = phi ιάγραµµα 1.Τυπική µορφή πρότυπης καµπύλης φθορισµού-ph i,µετά από επίδραση της ιονοφόρου ουσίας νιγερισίνης (6.7 m M ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Figure 1. A typical calibration curve after incubation of isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis with ionophore nigericin (6.7 m M).

80 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 57 Τα κύτταρα επωάζονται µε νιγερισίνη (τελική συγκέντρωση 6.7 m M ) για 5 λεπτά και ακολουθεί µέτρηση του φθορισµού στους 20 ο C.Τα δείγµατα µετρώνται σε µήκος κύµατος (excitation) 440 nm και (excitation) 495 nm,µε σταθερό το µήκος αποβολής (em ission) 530 nm, έτσι ώστε να πάρουµε το λόγο 495/440 nm για να κατασκευάσουµε την πρότυπη καµπύλη του λόγου 495/440 nm προς την αντίστοιχη τιµή ph i ( ιάγραµµα 1).Η αντίστοιχη πρότυπη καµπύλη που προκύπτει µετά από χρησιµοποίηση κυττάρων που είχαν προηγουµένως εκτεθεί στο µέταλλο δεν διαφέρει από την καµπύλη που προκύπτει µετά από χρησιµοποίηση κυττάρων που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο. Η τιµή του ph iστα αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα υπολογίστηκε σε 7.4 ± 0.01.Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων εκφράζονται ως ο Μ.Ο.± SD των τιµών ph iπου προκύπτουν από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητες µετρήσεις. 2. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΙΣΡΟΗΣ ΙΟΝΤΩΝ ΝΑΤΡΙΟΥ (Νa + ). H εισροή ιόντων Νa + σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis πραγµατοποιήθηκε µε τροποποίηση της µεθόδου που περιγράφθηκε από τους Sauage και συν. (2000), Bourikas και συν. (2003) και στηρίζεται στη χρήση σηµασµένου Νa [ 22 Na]. Μετά τη διαδικασία της αποµόνωσης,το κυτταρικό αιώρηµα φυγοκεντρείται στις 1000 στροφές για 5 λεπτά και τα κύτταρα πλένονται (x4) µε διάλυµα 10 m M TRIS/M ES,pH =6,που περιέχει 446 m M K Cl,53 m M M gso 4,35 m M sucrose,10 mm glucose,0.1 m M ouabain και τελικά ακολουθεί αιώρηση και προ-επώαση των κυττάρων για 20 λεπτά σε διάλυµα 10 mm TRIS/MES,pH =6,ή σε διάλυµα 10 mm TRIS/M O PS,pH =8. Και στα δυο παραπάνω διαλύµατα έχει προστεθεί m M 4.4-diisothiocyanatostilbene-2.2-disulfonic acid (DIDS: αναστολέας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Cl - /HCO - 3 ), 0.4 m M 6-ethοxyzolam ide (αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης),για την αποφυγή διαταραχών του ph i,καθώς και 0.01 mm bum etanide (αναστολέας του συµµεταφορέα Na-K-2Cl - )για την αποφυγή µεταφοράς ιόντων Νa +. Μετά την προ-επώαση,ακολουθεί πλύση στις 1000 στροφές για 5 λεπτά.στη συνέχεια,τα κύτταρα αιωρούνται σε διάλυµα 10 m M TRIS/M O PS,pH =8,ή σε 20 mm TRIS/M ES,pH =6, που περιέχουν 436 m M N acl, 53 m M M gso 4, 35 m M sucrose,10 mm glucose,0.1 mm ouabain (αναστολέας της αντλίας Νa +,έτσι ώστε να

81 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 58 αποφευχθεί µετακίνηση των ιόντων Νa + ),1 m M iodoacetic acid (αναστολέας της γλυκόλυσης στο στάδιο που καταλύεται από την δεϋδρογονάση της γλυκερυναλδεΰδης), m M D IDS, 0.4 m M 6-ethοxyzolam ide, 0.01 m M bum etanide, και 6 m g/ml antimycin A. Τέλος, σε κάθε κυτταρικό αιώρηµα προσθέτουµε σηµασµένο Νa [ 22 Na],(3.7 kbq/δείγµα)και τα ανάλογα υποστρώµατα. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης, το κυτταρικό αιώρηµα συλλέγεται και τοποθετείται σε eppendorfτο οποίο περιέχει 85 µlαπό το διάλυµα επώασης,πάνω στο οποίο στιβάζουµε sucrose 30% και 200 µldibutylphthalate (C 11 H 22 O 4 :d=1.04 gr/ml).ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές για 1 λεπτό,για το διαχωρισµό του υπερκειµένου διαλύµατος από τα κυτταρικό ίζηµα.στη συνέχεια,10 µlαπό το υπερκείµενο µεταφέρεται για µέτρηση (εξωκυτταρικό Na + ). Το υπόλοιπο υπερκείµενο,καθώς και το dibutyl phthalate αποµακρύνονται προσεκτικά και στο διάλυµα µε τα πακεταρισµένα κύτταρα προσθέτουµε 100 µlpca 30 %.Ακολουθεί έντονη ανάδευση για τη λύση των κυττάρων και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές. Το κυτταρικό αιώρηµα µεταφέρεται σε σωληνάκι µέτρησης που περιέχουν 3 m l υγρό σπινθηρισµού (scintillation liquid) και ακολουθεί µέτρηση (ενδοκυτταρικό Na + ).H δραστικότητα του σηµασµένου Na µετράται για 10 λεπτά στον µετρητή υγρού σπινθηρισµού (β-counter LK B 1209, Rackbeta). Η εισροή ιόντων Na + εκφράζεται σε µmol/hr//10 6 κύτταρα.η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του νατρίου που µετρήθηκε σε κύτταρα που επωάστηκαν σε διάλυµα 10 m M TRIS/M O PS,pH =8,αντιπροσωπεύει τη συνολική (παθητική και ενεργητική)εισροή ιόντων στα κύτταρα,ενώ η συγκέντρωση του νατρίου που µετρήθηκε σε κύτταρα που επωάστηκαν σε διάλυµα 20 m M TRIS/M ES,pH =6, αντιπροσωπεύει την παθητική εισροή ιόντων στα κύτταρα.η διαφορά µεταξύ των δυο εισροών αντιπροσωπεύει την εισροή ιόντων Νa +,µέσω της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (Delva και συν., 1993;Sauvage και συν.,2000). 3. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ (ΡΚ). Σε 1 m l κυτταρικού αιωρήµατος ( 10 6 κύτταρα/ml) επιδρούµε µε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2 ( µμ),καθώς και µε διάφορες ουσίες για 30 λεπτά.η µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας γίνεται σε δείγµατα κυττάρων, τόσο πριν την έκθεση (χρόνος 0),όσο και µετά την έκθεση των κυττάρων 30 λεπτά.

82 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 59 Το κυτταρικό αιώρηµα φυγοκεντρείται στις 100 g για 5 λεπτά.ακολουθεί πλύσιµο των κυττάρων µε θρεπτικό διάλυµα L-15 και φυγοκέντρηση στις 100 g για 5 λεπτά. Το ίζηµα αντιπροσωπεύει τα πακεταρισµένα κύτταρα τα οποία λύονται µε την προσθήκη διαλύµατος λύσης (διάλυµα 20 m M Imidazole/HCl, ph =7.2, συµπληρωµένο µε 10 m M EG TA, 10 m M ED TA,0.1 m M phenyl-m ethyl-sulfonylfluoride/pm SF,15 m M β-mercaptoethanol).στη συνέχεια ακολουθεί σπάσιµο των κυτταρικών µεµβρανών µε χρήση υπερήχων (M S E Sonicator)και φυγοκέντρηση των δειγµάτων στις στροφές για 30 λεπτά στους 4 ο C.Το υπερκείµενο συλλέγεται και περνάει διαµέσου στήλης Sephadex G -25 που περιέχει διάλυµα 40 m M Imidazole/HClpH = 7.1,συµπληρωµένο µε 5 mm EDTA,15 mm β-mercaptoethanol και 20 % glycerol,για την αποµάκρυνση των χαµηλού µοριακού βάρους µεταβολιτών (Helmerhost και Stokes, 1980). Οι στήλες φυγοκεντρούνται για 1 λεπτό και το φιλτραρισµένο υπερκείµενο (τελικού όγκου µl)χρησιµοποιείται ως πηγή του ενζύµου. Η δραστικότητα της ΡΚ προσδιορίζεται φωτοµετρικά,σύµφωνα µε τη µέθοδο που προτάθηκε από τους Ward και συν. (1969). Συγκεκριµένος όγκος δείγµατος προστίθεται σε διάλυµα 20 mm Imidazole/HCl,pH = 7.2,συµπληρωµένο µε 2 mm ADP, 5 m M M gc l 2, 20 m M K Cl, 0.15 mm NADH, 1.5 m M φωσφοενολπυροσταφυλικό οξύ (PEP) και 1U /mlldh.ακολουθεί µέτρηση της δραστικότητας της ΡΚ σε µήκος κύµατος 340 nm για 5 λεπτά.μικρός όγκος (50 µl) του κάθε δείγµατος συλλέγεται για µέτρηση της πρωτεΐνης που γίνεται µε χρήση της µεθόδου BCA (bicinchoninic acid)και ορού αλβουµίνης ως υλικό αναφοράς (bovine serum album in),σύµφωνα µε τη µέθοδο που πρότειναν οι Sorensen και Brodbeck (1986). Η ενζυµική δραστικότητα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± την τυπική απόκλιση τουλάχιστον 7 ανεξάρτητων πειραµάτων και εκφράζεται ως η % διαφορά της δραστικότητας σε σύγκριση µε τη δραστικότητα των κυττάρων αναφοράς που υπολογίστηκε σε 5.23 ± 1.04 nm ol/min/mg πρωτεΐνης, που κυµαίνεται µέσα στο εύρος που µετρήθηκε στον ίδιο κυτταρικό τύπο από τους Canesiκαι συν.(1999). 4. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ. 4.1 Προσδιορισµός σουπεροξειδικών ριζών (Ο - 2 ): Ο προσδιορισµός των σουπεροξειδικών ριζών σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis γίνεται µε τροποποίηση της

83 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 60 µεθόδου ενδοκυτταρικής ανίχνευσης Ο - 2 που περιγράφτηκε από τους Pipe και συν. (1995). Η µέθοδος βασίζεται στη σύνδεση της ουσίας ανιχνευτή ΝΒΤ (nitroblue tetrazolium )µε τις Ο - 2 που παράγονται στο εσωτερικό του κυττάρου και την αναγωγή της σε ένα αδιάλυτο προϊόν µε έντονο µπλε χρώµα (blue formazan). Σύµφωνα µε τη µέθοδο,το κυτταρικό αιώρηµα (περίπου 10 6 κύτταρα/ml) επωάζεται µε διάφορες ουσίες για 30 λεπτά.συγκεκριµένα,τα κύτταρα επωάζονται µε χλωριούχο κάδµιο (CdCl 2 )συγκέντρωσης 50 µmol/l(διαλυµένο σε PS διάλυµα), καθώς και σε διάφορες ουσίες που αποτελούν αγωνιστές των αδρενεργικών υποδοχέων,όπως φαινυλεφρίνη (Phenylephrine-HCl) συγκέντρωσης 1 µmol/l,(α 1 - αδρενεργικός αγωνιστής) και ισοπρεναλίνη (Isoprenaline-HCl) συγκέντρωσης 1 µmol/l.παράλληλα,το κυτταρικό αιώρηµα επωάζεται µε διάφορους ανταγωνιστές των αδρενεργικών υποδοχέων, όπως πραζοσίνη (prazosin-hcl) συγκέντρωσης 1 µmol/l,γιοχιµπίνη (yοhimbine-hcl) συγκέντρωσης 0.1 µmol/l,(ανταγωνιστής των α 2 - αδρενεργικών υποδοχέων),προπρανολόλη (propranolol-hcl) συγκέντρωσης 10 µmol/l και µετοπρολόλη (metoprolol-hcl) συγκέντρωσης 1 µmol/l, αλλά και µε ουσίες που αποτελούν ειδικούς αναστολείς της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + και της πρωτεϊνικής κινάσης C (PK C),(EIPA 20 nm ol/lκαι calphostin C 20 nm ol/l αντίστοιχα). Τα κύτταρα επωάζονται τόσο µε κάθε ανταγωνιστή ή αναστολέα χωριστά,όσο και µαζί µε το µέταλλο. Μετά την επώαση,ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές για 5 λεπτά στους 10 ο C και επαναιώρηση των κυττάρων σε διάλυµα TBS (TRIS/HCl0.05 M + 2% N acl,ph = 7.6).Ακολουθεί προσθήκη ΝΒΤ (1 m g/ml)τόσο στα κύτταρα που επωάστηκαν,όσο και σε κύτταρα αναφοράς και επώαση για 2 ώρες στους 20 ο C σε απόλυτο σκοτάδι.παράλληλα µε την προσθήκη της ουσίας ανιχνευτή σε όλα τα δείγµατα,χρησιµοποιείται αιώρηµα κυττάρων αναφοράς που περιέχει εκτός από την ουσία ανιχνευτή και υπεροξειδική δισµουτάση (SOD 300 U/ml),ως αντιοξειδωτικό ένζυµο.ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές για 3 λεπτά και πλύσιµο (x2) των κυττάρων µε διάλυµα ΤBS για την αποµάκρυνση των υπολειµµάτων ΝΒΤ από τα κύτταρα.μετά το τελικό πλύσιµο,τα κύτταρα επωάζονται σε καθαρή µεθανόλη για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια φυγοκεντρούνται για µερικά δευτερόλεπτα σε 300 g.ακολουθεί αποµάκρυνση του υπερκειµένου και παραµονή των δειγµάτων για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου,προκειµένου να στεγνώσουν από τα υπολείµµατα της µεθανόλης.ακολουθεί προσθήκη διαλύµατος ΚΟΗ 2 Μ και DM SO, για τη διαλυτοποίηση των δειγµάτων και επώαση για 30 λεπτά. Ο

84 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 61 προσδιορισµός των Ο 2 - πραγµατοποιείται µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης της αναγµένης ουσίας σε µήκος κύµατος 620 nm. 4.2 Προσδιορισµός δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS): Παράλληλα µε τον προσδιορισµό των Ο - 2,πραγµατοποιήθηκε προσδιορισµός των επιπέδων των ROS σε κύτταρα πεπτικού αδένα των µυδιών,µετά από έκθεσή τους στο µέταλλο. O προσδιορισµός των ROS σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, πραγµατοποιήθηκε σύµφωνα µε τη µέθοδο που περιγράφηκε από τους Rosenkranz και συν.(1992)και τη χρησιµοποίηση της φθορίζουσας ουσίας DCFH-DA (2.7-dichlorodihydrofluorescein diacetate). Η ουσία DCFH-DA είναι ένα µη-πολικό µόριο το οποίο διασπάται σε ένα µη-φθορίζων παράγωγο (DCFH)υπό την δράση εστερασών του κυττάρου στο οποίο εισέρχεται.το παράγωγο DCFH είναι µεµβρανικά µη-διαπερατό µόριο,το οποίο οξειδώνεται υπό την επίδραση διαφόρων υπεροξειδασών στο εσωτερικό του κυττάρου,στο τελικό φθορίζων προϊόν 2,7-dichlorofluorescein/DCF (Bass και συν., 1983; Szeida και., 1984).Αν και το παραπάνω µόριο είναι ευαίσθητο στο H 2 O 2 και στις υδροξυλικές ρίζες, δεν παρουσιάζει εξειδίκευση στην ανίχνευση αποκλειστικά των παραπάνω µορίων.αντίθετα,η συγκεκριµένη µέθοδος θεωρείται ιδανική για τον προσδιορισµό των συνολικών αλλαγών στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS, µιας και έχει αναφερθεί η µέτρηση του τελικού προϊόντος DCF,απουσία H 2 O 2 ((Ischiropoulos και συν.,1999;royallκαι Ischiropoulos,1993;Rota και συν.,1999a;1999b). Συµφώνα µε τη µέθοδο,κυτταρικό αιώρηµα (10 6 κύτταρα/mlφυσιολογικού διαλύµατος PS)επωάζεται για 10 λεπτά στους 20 ο C σε απόλυτο σκοτάδι µε την ουσία DCFH-DA (5 µg/ml).μετά την επώαση,τα κύτταρα πλένονται (x2)µε διάλυµα PS και στη συνέχεια ακολουθεί επαναιώρηση των κυττάρων στο παραπάνω διάλυµα.τα κύτταρα επωάζονται για 30 λεπτά µε CdCl 2 50 µmol/l,καθώς και µε τους αναστολείς της αντλίας Νa + /H + και της PK C (EIPA 20 nm ol/l και calphostin C 20 nm ol/l αντίστοιχα).τα κύτταρα επωάζονται µε κάθε αναστολέα χωριστά,αλλά και µε την παρουσία του µετάλλου.επίσης,κύτταρα επωάζονται για 30 λεπτά µε forskolin 0.01 mmol/l, έναν ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης που ευθύνεται για την βιοσύνθεση του ca M P (Barberκαι G oka,1985).η έκθεση µε τις παραπάνω ουσίες πραγµατοποιείται παράλληλα και σε κύτταρα τα οποία κατεργάστηκαν, κατά τη διάρκεια της αποµόνωσής τους, µε 3-isobutyl-1-methyl-2,6(1H,3H )-purinedione

85 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 62 (IBM X)0.05 m m ol/l,ουσία που αναστέλλει τη δράση των φωσφοδιεστερασών που ευθύνονται για τη διάσπαση του ca M P (Haimo,1998). Μετά την έκθεση ακολουθεί πλύσιµο των κυττάρων (x2) µε διάλυµα TBS (φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές για 5 λεπτά),προσθήκη 1 m lδιαλύµατος TBS + 1% SD S και επώαση για 10 λεπτά για τη λύση των κυττάρων.η συγκέντρωση των ROS προσδιορίζεται σε φθοριζοφωτόµετρο Perkin ElmerLS 50B,ως ο λόγος του µήκους διέγερσης 495 nm προς το µήκος εκποµπής 525 nm της φθορίζουσας ουσίας. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως η % διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς ( ± 64.82/mg πρωτεΐνης)και είναι οι Μ.Ο.± SD τουλάχιστον 6 ανεξάρτητων πειραµάτων. 5. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ca M P. Για την µέτρηση του ca M P σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα ακολουθήθηκε η διαδικασία αποµόνωσης κυττάρων που περιγράφηκε παραπάνω (Υλικά και Μεθοδοι, σελ. 54), µε τη διαφορά ότι τα κύτταρα διατηρούνται σε θρεπτικό διάλυµα Leibovitz L-15,το οποίο περιέχει 4 m m ol/ledta.τα κύτταρα διατηρούνται στο θρεπτικό διάλυµα τουλάχιστον για 2 ώρες,πριν την έναρξη των επωάσεων. Σύµφωνα µε το πειραµατικό σκέλος,περίπου 2x10 6 κύτταρα (σε διάλυµα L- 15) επωάζονται µε CdCl 2 50 µmol/lγια 30 και 60 λεπτά,καθώς και µε διάφορες ουσίες,όπως EIPA 20 nm ol/l,propranolol-hcl10 µm ol/l,m etoprolol-hcl1 µm ol/l, yohimbine-hcl0.1 µmol/lκαι prazosin 1 µmol/l,είτε κάθε µια χωριστά είτε µαζί µε το µέταλλο.επιπλέον,κύτταρα επωάζονται µε 0.05 m m ol/libm X,καθώς και 0.01 mmol/l φορσκολίνης (forskolin). Μετά το τέλος της έκθεσης, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 1000 στροφές για 5 λεπτά και επαναιωρούνται σε διάλυµα ED TA 4 m m ol/l, ph = 7.5. Ακολουθεί βρασµός των δειγµάτων για 5 λεπτά και φυγοκέντρηση στις g για 5 λεπτά.το υπερκείµενο χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό του ca M P µε τη µέθοδο που περιγράφηκε αναλυτικά παραπάνω (παράγραφος 3 από Μέρος Α).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD τουλάχιστο 4 ανεξάρτητων πειραµάτων και εκφράζονται ως pm olca M P/mg πρωτεΐνης.

86 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΩΝ ΚΟΜΗΤΩΝ (COM ET ASSAY/ ALKALINE SINGLE-CELL GEL ELECTROPHORESIS). Για τον προσδιορισµό της βλάβης του γενετικού υλικού χρησιµοποιήθηκε η τεχνική ανάλυσης Κοµητών (Cometassay/Alkaline Single CellGelElectrophoresis) υπό αλκαλικές συνθήκες (ph >12)που αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Singh και συν.(1988).η µέθοδος χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό των µονόκλωνων κοµµατιών DNA (single strand breaks/ssbs) που εµφανίζονται µετά τη διάσπαση του γενετικού υλικού.η εµφάνιση SSBs αντιπροσωπεύει διαταραχή της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού και χαρακτηρίζεται ως βλάβη του DNA (DNA dam age). Σύµφωνα µε τη µέθοδο, αντικειµενοφόροι που είχαν προηγουµένως τοποθετηθεί στην κατάψυξη,καλύπτονται µε 200 µl 0,5% ΝΜΡ (normalmelting pointagaroze) αγαρόζης σε διάλυµα PBS (135 m m ol/lnacl,2.5 mmol/lkcl,ph = 7.4).Οι αντικειµενοφόροι καλύπτονται µε καλυπτρίδα και διατηρούνται σε σκοτεινό µέρος,στους 4 ο C,µέχρι να χρησιµοποιηθούν. Η διαδικασία έκθεσης των κυττάρων τόσο στο µέταλλο, όσο και στις διάφορες ουσίες είναι όµοια µε αυτή που περιγράφτηκε παραπάνω.συγκεκριµένα, αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα επωάζονται για 30 λεπτά µε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2 (0.05,5,50 και 500 µmol/l),καθώς και µε το µέταλλο µαζί µε EIPA 20 nm ol/l,propranolol-hcl10 µmol//l,calphostin C 20 nm ol/l,metoprolol1 µmol/l,prazosin 1 µmol/lκαι yohimbine 1 µmol/lαντίστοιχα.επίσης,τα κύτταρα επωάζονται µε διαφορετικές συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης (1,50,100 µmol/l)για 30 λεπτά.παρόµοια διαδικασία ακολουθείται και στην περίπτωση κυττάρων που έχουν προ-επωαστεί,κατά τη διάρκεια της αποµόνωσής τους,µε IBM X 0.05 m m ol/l,τα οποία εκθέτουµε στο µέταλλο είτε µόνο του είτε µαζί µε EIPA 20 nm ol/l και forskolin 0,01 mmol/l. Μετά το τέλος κάθε έκθεσης,20 µlκυτταρικού αιωρήµατος αναµιγνύονται µε 80 µl 0,5% LM P (low m elting point agarose) αγαρόζης σε διάλυµα PS και στη συνέχεια µεταφέρονται µε πιπέττα σε αντικειµενοφόρο πλάκα που είναι καλυµµένη µε NM P αγαρόζη. Ακολουθεί τοποθέτηση καλυπτρίδας και µεταφορά των αντικειµενοφόρων σε γυάλινη πλάκα που βρίσκεται πάνω σε πάγο, όπου και

87 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 64 παραµένουν για να στερεοποιηθεί η αγαρόζη για 10 λεπτά.ακολουθεί αποµάκρυνση της καλυπτρίδας και οι αντικειµενοφόροι εµβαπτίζονται σε διάλυµα λύσης (2.5 Μ NaCl,100 m m ol/ledta,10 m m ol/ltris,10% D M SO,1% TRITO N X 100,1% sodium sarcosinate,ph = 10),όπου και παραµένουν για 1 ώρα στους 4 ο C σε σκοτεινό µέρος,προκειµένου να αποµακρυνθούν οι κυτταρικές πρωτεΐνες.στη συνέχεια,οι πλάκες πλένονται µε απεσταγµένο νερό και τοποθετούνται σε συσκευή ηλεκτροφόρησης που περιέχει ηλεκτροφορητικό διάλυµα (0.075 Μ NaOH,1m M EDTA, ph >12), όπου και παραµένουν για 20 λεπτά, προκειµένου να γίνει η αποδιάταξη του γενετικού υλικού.ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε 25 V (1V /cm,300 ma)για 10 λεπτά σε θερµοκρασία 4 ο C. Τέλος οι πλάκες αποµακρύνονται και πλένονται για 5 λεπτά µε διάλυµα εξουδετέρωσης (0.4 M TRIS,pH = 7.5).Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης έχουµε αποµόνωση των πυρήνων πάνω στην αντικειµενοφόρο. Για την εκτίµηση της βλάβης του γενετικού υλικού,ακολουθεί µικροσκοπική παρατήρηση των πλακών, όπου διακρίνεται το γενετικό υλικό των πυρήνων,το οποίο βάφεται µε προσθήκη 50 µl βρωµιούχου αιθιδίου (20 µg/ml). Συγκεκριµένα,οι πυρήνες εξετάζονται σε ανάστροφο µικροσκόπιο φθορισµού και σε µεγέθυνση 200Χ (Zeiss axovert inverted fluorescent microscope και W ANG epifluorescence m icroscope, W ANG BioM edical, The Netherlands). Οι πυρήνες εµφανίζονται ως κοµήτες,όπου την ουρά αποτελούν τα θραύσµατα,ενώ την κεφαλή το άθικτο γενετικό υλικό (Εικόνα 7). Επιπλέον, τα αποτελέσµατα αναλύονται µε τη χρησιµοποίηση ειδικού προγράµµατος (Kinetic image analysis,cambridge,uk),σε Η/Υ (Psimadas και συν., 2004),το οποίο έχει τη δυνατότητα να δίνει διάφορα στοιχεία για κάθε κοµήτη,όπως το ποσοστό του γενετικού υλικού στην ουρά ή την κεφαλή και το µήκος της ουράς (Ινστιτούτο Βιολογίας,ΕΚΕΦΕ ηµόκριτος,αθήνα). Σε κάθε πλάκα αναλύονται τουλάχιστον 250 κοµήτες.τα αποτελέσµατα από 4 διαφορετικά πειράµατα οµαδοποιούνται και ταξινοµούνται σε 5 διαφορετικές κλάσεις (0-4),ανάλογα µε το ποσοστό βλάβης του γενετικού υλικού,σύµφωνα µε τα κριτήρια που θεσπίστηκαν από τους A nderson και συν. (1994).Συγκεκριµένα, η κλάση 0 αντιπροσωπεύει τους κοµήτες στους οποίους το ποσοστό βλάβης του γενετικού υλικού, δηλαδή το ποσοστό του γενετικού υλικού, το οποίο µετά το θρυµµατισµό του έχει µεταναστεύσει στην ουρά δεν ξεπερνά το 5% του συνολικού ποσού του γενετικού υλικού.με ανάλογο τρόπο,στην κλάση 1 ανήκουν οι κοµήτες

88 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 65 µε ποσοστό βλάβης 5-20%,στην κλάση 2 οι κοµήτες µε ποσοστό βλάβης 20-40%, στην κλάση 3 οι κοµήτες µε ποσοστό βλάβης 40-75% και η κλάση 4 στην οποία οι κοµήτες έχουν υποστεί ανεπανόρθωτη βλάβη του γενετικού υλικού σε ποσοστό µεγαλύτερο από 75% του συνολικού ποσού (Εικόνα 8). Εικόνα 7.Πυρήνας σε σχήµα κοµήτη,όπως προκύπτει µετά από ηλεκτροφόρηση µε τη µέθοδο com et assay.στην φωτογραφία διακρίνονται η κεφαλή του κοµήτη,που αποτελείται από το άθικτο γενετικό υλικό,καθώς και η ουρά που αποτελείται από το θρυµµατισµένο γενετικό υλικό (DNA fragm ents).το χαρακτηριστικό σχήµα κοµήτη προκύπτει καθώς τα κοµµάτια του γενετικού υλικού που έχουν υποστεί θρυµµατισµό µετακινούνται προς το θετικό πόλο της ηλεκτροφορητικής συσκευής, λόγω του αρνητικού τους φορτίου (φωτ.σ.νταϊλιάνης). Picture 7. Cometshaped nuclei after alkaline single-cellgel electrophoresis (com et assay).in this photo,the head of the DNA (un-fragm entdna),as w ellas the tailof the com et(the tailof DNA) consisted with DNA fragm ents,was observed. The characteristic com etshape ofdna is the resultof DNA damage.dna fragm ents w ere m oving to the anode of electrophoretical m achine (photo by Dailianis S).

89 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 66 Κλάση 0 Κλάση 1 Κλάση 2 Κλάση 3 Κλάση 4 Εικόνα 8. Φωτογραφίες από ανάστροφο µικροσκόπιο φθορισµού, στις οποίες διακρίνονται οι 5 κλάσεις κοµητών.κάθε κλάση αντιπροσωπεύει διαφορετικό ποσοστό βλάβης του DNA (A nderson και συν.,1994).k λάση 0 (ποσοστό βλάβης <5% );Kλάση 1 (ποσοστό βλάβης 5-20% );K λάση 2 (ποσοστό βλάβης 20-40% );K λάση 3 (ποσοστό βλάβης 40-75% );K λάσης 4 (ποσοστό βλάβης >75% ),(φωτ.σ. Νταϊλιάνης). Η ανάλυση των εικόνων και το ποσοστό βλάβης του γενετικού υλικού πραγµατοποιήθηκε µε το πρόγραµµα Kinetic image analysis του εργαστηρίου Επιδιορθωτικών µηχανισµών DNA,Ινστιτούτο Βιολογίας,ΕΚΕΦΕ ηµόκριτος,αθήνα. Picture 8.Photos from inverted fluorescence m icroscope w ith each of 5 class of com ets.each class represents different level of DNA damage/dna in the tail (Anderson et al.1994).class 0 (DNA dam age <5% );class 1 (DNA dam age 5-20% );class 2 (DNA dam age 20-40% );class 3 (DNA dam age 40-75% );class 4 (DNA damage >75%),(photo by D ailianis S).Cometanalysis and D N A dam age determination w as m ade by kinetic im age analysis system (DNA Repair Laboratory, Institute of Biology,NCSR Democritos,Agia Paraskevi,Athens ,Greece)

90 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 67 Τα επίπεδα βλάβης του γενετικού υλικού εκφράζονται ως το % ποσοστό του γενετικού υλικού που αντιστοιχεί στην ουρά του κοµήτη (% DNA in the tail).τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD τουλάχιστον 4 διαφορετικών πειραµάτων. 7. ΜΕΤΡΗΣΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ Εκτίµηση της µεθόδου: Η ενεργοποίηση µιας οµάδας πρωτεασών, που ονοµάζονται κασπάσες, ευθύνεται για την επαγωγή αποπτωτικών φαινοµένων σε κύτταρα θηλαστικών,ενώ σηµαντικό ενδιαφέρον αποκτά ο ρόλος που διαδραµατίζουν και σε άλλα είδη οργανισµών,όπως οι θαλάσσιοι οργανισµοί.η φωτοµετρική µέθοδος µέτρησης της ενζυµικής δραστικότητας της κασπάσης (Chemicon s C aspase-3 Colorimetric A ssay Kit) αποτελεί µια απλή και αξιόπιστη µέθοδο προσδιορισµού της δραστικότητας, µέσω της αναγνώρισης της ακολουθίας DEVD. Η µέθοδος στηρίζεται στην φωτοµετρική ανίχνευση της χρωµοφόρου ουσίας p-nitroaniline (pn A ),µετά από τη διάσπασή της µέσω της επίδρασης του συστατικού DEVD-pNA.Η ελεύθερη pna µπορεί να προσδιοριστεί µε τη χρήση φωτόµετρου σε µήκος κύµατος 405 nm. Συγκριτική µελέτη της απορρόφησης της pna σε ένα δείγµα το οποίο εκτέθηκε σε κάποιον αποπτωτικό παράγοντα, σε σχέση µε την απορρόφηση σε ένα δείγµα αναφοράς,επιτρέπει τον προσδιορισµό της αύξησης της ενζυµικής δραστικότητας της κασπάσης Έκθεση αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα και µέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης-3: Περίπου 2x10 6 κύτταρα/mlσε θρεπτικό διάλυµα,εκτίθενται σε διαφορετικούς παράγοντες,π.χ.,κάδµιο,για διάφορες χρονικές περιόδους.ταυτόχρονα,διαθέτουµε και κύτταρα αναφοράς για τις αντίστοιχες χρονικές περιόδους έκθεσης. Αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,σε θρεπτικό διάλυµα L-15 εκτίθενται σε CdCl 2 (50 µmol/l)για διάφορες χρονικές περιόδους (30,180,300 λεπτά και 24 ώρες).ταυτόχρονα,κύτταρα στα οποία έχουµε επιδράσει µε IBM X (0.05 m m ol/l), επωάζονται για 30 και 300 λεπτά, καθώς και για χρονικό διάστηµα 24 ώρες, παρουσία ή απουσία µετάλλου.τα αποτελέσµατα που προκύπτουν εκφράζονται ως το ποσοστό (%)της δραστικότητας της κασπάσης σε σχέση µε τη δραστικότητα σε κύτταρα αναφοράς.η τιµή των κυττάρων αναφοράς,µετά από 30 λεπτά επώαση,

91 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 68 είναι ± µmolpna/mg πρωτεΐνης και αντιπροσωπεύουν το Μ.Ο.± SD τεσσάρων διαφορετικών πειραµάτων. Μετά το τέλος της έκθεσης,τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 1000 στροφές για 10 λεπτά.το υπερκείµενο αποµακρύνεται και το ίζηµα των κυττάρων αιωρείται σε 500 µlδιαλύµατος λύσης [R eagent1:1x Lysis Buffer,(500 µl5x Lysis Buffer+ 2 m l2dh 2 O)].Ακολουθεί επώαση για 15 λεπτά στον πάγο και φυγοκέντρηση στις στροφές, για 5 λεπτά, στους 4 ο C. Το υπερκείµενο µεταφέρεται σε νέα σωληνάκια και τοποθετείται στον πάγο.τα δείγµατα µπορεί να καταψυχθούν στους - 85 ο C,µέχρι να µετρηθούν.παράλληλα,δείγµα 40 µlσυλλέγεται για προσδιορισµό της πρωτεΐνης µε τη µέθοδο BCA. Για τον προσδιορισµό της κασπάσης-3 χρησιµοποιούµε πλάκα 96 οπών και ετοιµάζουµε τα δείγµατα σύµφωνα µε τον Πίνακα 5. Μετά την προετοιµασία των οπών ακολουθεί επώαση για 2 ώρες στους 37 ο C,σε απόλυτο σκοτάδι και στη συνέχεια µέτρηση των δειγµάτων σε µήκος κύµατος 405 nm. Η αύξηση της δραστικότητας της κασπάσης µπορεί να προσδιοριστεί µέσω της σύγκρισης της οπτικής απορρόφησης των δειγµάτων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µε την απορρόφηση των δειγµάτων αναφοράς. Πίνακας 5.Προετοιµασία δειγµάτων για µέτρηση της δραστικότητας της κασπάσης-3.οι ποσότητες εκφράζονται σε µl. Table 5. Preparation ofsam ples forcaspase-3 activity m easurem ent.the quantities are represented in µl. Μίγµα διαλυµάτων είγµα 5X Assay διάλυµα Caspase-3 δείγµατα Αναστολέας 2dH 2 O Caspase-3 υπόστρωµα Συνολικός όγκος Τυφλό διαλύµατος Τυφλό πρότυπης κασπάσης είγµατα προς ανάλυση είγµατα προς ανάλυση + αναστολέας * * Η προσθήκη του αναστολέα είναι προαιρετική,στην περίπτωση που θέλουµε να γίνει έλεγχος της ύπαρξης κασπάσης στα δείγµατα. Σε αυτή την περίπτωση η προσθήκη του αναστολέα ακολουθεί επώαση για 10 λεπτά και στη συνέχεια προστίθεται το υπόστρωµα της κασπάσης-3.

92 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 69 Για τον τελικό υπολογισµό της οπτικής απορρόφησης αφαιρούµε τις τιµές των τυφλών από όλα τα δείγµατα. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε nm ol/hr/mg πρωτεΐνης,λαµβάνοντας υπόψη µας πως 1 ενζυµική µονάδα (1 U ) ισούται µε την ποσότητα της κασπάσης-3 που διασπά 1 nm oldevd-pn A στους 37 ο C ανά ώρα (hr). 7.3 Κατασκευή πρότυπης καµπύλης: Ετοιµάζουµε πρότυπη καµπύλη pn A διαφορετικών συγκεντρώσεων 1m M - 10µΜ.Συγκεκριµένα,προσθέτουµε 200 µlpn A 1 mm σε µια οπή πλάκας 96 οπών και µεταφέρουµε 100 µlστην επόµενη οπή της πλάκας,στην οποία έχουµε προσθέσει 100 µl1χ A ssay Buffer[R eagent2:1x Assay Buffer,(1000 µl5x Assay Buffer+ 4 ml2dh 2 O)].Ακολουθούν διαδοχικές αραιώσεις,έτσι ώστε να έχουµε διαφορετικές συγκεντρώσεις pn A (Πίνακας 6).Ακολουθεί µέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε µήκος κύµατος 405 nm. Πίνακας 6.Κατασκευή πρότυπης καµπύλης Table 6.Preparation ofstandard curve. C τελική ,5 31,25 15,62 7,8 Τυφλό [µμ] pn A Χ A ssay buffer Για τον προσδιορισµό της δραστικότητας της κασπάσης-3,χρησιµοποιήθηκε χρωµατογραφική µέθοδος ανίχνευσης µε τη χρήση µικροπλακών Elisa (C aspase-3 Colorimetric A ssay K it, Chemicon Int.). Σύγκριση των επιπέδων της ουσίας που προκύπτει σε ένα αποπτωτικό δείγµα µε την ποσότητα ενός δείγµατος που δεν έχει υποστεί αποπτωτικά φαινόµενα, επιτρέπει την εκτίµηση της δραστικότητας της κασπάσης ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ. Για τον υπολογισµό της ποσότητας της πρωτεΐνης χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος BCA (Bicinchoninic acid assay) µε τη χρήση αλβουµίνης BSA ως πρότυπο (Sorensen και Brodbeck,1986).

93 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 70 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ. Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων της δραστικότητας της ΡΚ, της µεταβολής της ενδοκυτταρικής τιµής ph (ph i),της εισροής ιόντων Na +,των ελεύθερων ριζών, της δραστικότητας της κασπάσης-3, καθώς και του ca M P χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο Graphpad Instat2 Software,και η στατιστική µέθοδος D unnet s test,p<0.01).για την ανάλυση των στατιστικών διαφορών µεταξύ των διαφορετικών ποσοστών βλάβης του γενετικού υλικού χρησιµοποιήθηκε ανάλυση one way ANOVA,P<0.01 και η µέθοδος Tukey (Τukey test,p<0.01).

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 71 ΜΕΡΟΣ Α ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΤΟΥ ΘΕΡΜΑΪΚΟΥ ΚΟΛΠΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ. ΚΑΘΙΕΡΩΣΗ ΝΕΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ ΡΥΠΑΝΣΗΣ. 1. Μελέτη πεδίου 1.1 ειγµατοληπτική περίοδος Κατά τη διάρκεια του έτους 2001 συλλέχθηκαν άτοµα του είδους Mytilus galloprovincialis από πέντε περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο και χρησιµοποιήθηκε ως περιοχή αναφοράς (Εικόνα 9). Συγκεκριµένα, κατά τις δειγµατοληψίες του Ιουνίου και Οκτωβρίου,συλλέχθηκαν άτοµα από την Ανατολική πλευρά του κόλπου,όπως την περιοχή του Αγγελοχωρίου (µήκος κελύφους 6.48 ± 0.49cm και 6.27 ± 0.75cm για τον Ιούνιο και τον Οκτώβριο αντίστοιχα) και την περιοχή της Περαίας (µήκος κελύφους 4.03 ± 0.24cm και 3.85 ± 0.4cm ), από τη Βορειοδυτική πλευρά του Θερµαϊκού κόλπου,όπως την περιοχή του Αντλιοστασίου (µήκος κελύφους 4.5 ± 0.1cm και 5.76 ± 0.46cm ),που βρίσκεται στο εσωτερικό του κόλπου,καθώς από τη υτική πλευρά του κόλπου,όπως την περιοχή της Χαλάστρας (µήκος κελύφους 6.92 ± 0.43cm και 6.86 ± 0.61cm )και τα Κύµινα (µήκος κελύφους 6.64 ± 0.79cm και 4.7 ± 0.47cm ).Από την περιοχή της Ολυµπιάδας,στο Στρυµονικό κόλπο,συλλέχθηκαν άτοµα καλλιέργειας,µήκους κελύφους 5.12 ± 0.21cm και 6.31 ± 0.33cm Επίπεδα µεταλλοθειονινών (ΜΤ): Πεπτικός αδένας Κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου παρατηρήθηκαν αυξηµένα επίπεδα ΜΤ στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν από σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,συγκριτικά µε τα επίπεδα των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα των µυδιών από το σταθµό της Ολυµπιάδας.Ειδικότερα στον πεπτικό αδένα ατόµων που συλλέχθηκαν από την περιοχή του Αντλιοστασίου,η συγκέντρωση των ΜΤ βρέθηκε αρκετά αυξηµένη ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού),συγκριτικά µε τη συγκέντρωση που µετρήθηκε στις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού και ιδιαίτερα µε την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού). Εξαίρεση αποτέλεσε η περιοχή των Κυµίνων ( υτική πλευρά του Θερµαϊκού

95 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 72 κόλπου),όπου οι ΜΤ στον πεπτικό αδένα των ατόµων βρέθηκαν σχεδόν στα ίδια επίπεδα ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού) µε αυτά της Ολυµπιάδας, ( ιάγραµµα 2). 600 ΜΤ (πεπτικός αδένας) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 400 µgr/gr ιστού Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 2. Συγκέντρωση ΜΤ στον πεπτικό αδένα των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια του έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος). Τα απολέσµατα είναι οι µέσοι όροι και η τυπική απόκλιση (Μ.Ο.± SD ) και εκφράζονται ως µgr/gr υγρού βάρους ιστού. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 2. M Ts content in the digestive gland of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, O utlet tube, H alastra and K im ina) along the gulf of Therm aikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October 2001.The results are expressed as m eans (µgr/gr wetweight)± S.D.Significantdifferences between pairs ofm ean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test, P<0.05). Ανάλογα µε τα αποτελέσµατα του Ιουνίου,κυµάνθηκαν και τα επίπεδα των ΜΤ κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του Οκτωβρίου. Συγκεκριµένα, αυξηµένα επίπεδα ΜΤ παρατηρήθηκαν στον πεπτικό αδένα ατόµων που συλλέχθηκαν από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στον ιστό ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού),( ιάγραµµα 2).Στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή των Κυµίνων µετρήθηκαν οι υψηλότερες τιµές ΜΤ ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού),

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 73 σε σχέση µε τις τιµές που µετρήθηκαν στις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Βράγχια Ο προσδιορισµός των επιπέδων των ΜΤ στα βράγχια έδειξε παρόµοια διακύµανση µε αυτή που µετρήθηκε στον πεπτικό αδένα. Συγκεκριµένα,κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου, υψηλότερες τιµές ΜΤ µετρήθηκαν σε άτοµα που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και χαµηλότερες τιµές στα βράγχια ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 3) ΜΤ (βράγχια) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα µgr/gr ιστού Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 3.Συγκέντρωση ΜΤ στα βράγχια των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια του έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως µgr/grυγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,utest(p<0.05). Figure 3.MTs contentin the gills ofm ussels Mytilus galloprovincialis collected from differentstations (A ggelochorion, Peraia, Outlet tube, Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and Olym piada, a reference station located in the G ulf of Strym onikos in June and O ctober The results are expressed as m eans (µgr/gr w etw eight) ± S.D.Significantdifferences betw een pairs of m ean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Στα βράγχια ατόµων από την περιοχή του Αντλιοστασίου, όπως και στον πεπτικό αδένα,µετρήθηκαν οι υψηλότερες τιµές ΜΤ ( ± µg/g υγρού

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 74 βάρους ιστού), ενώ στα άτοµα της Ολυµπιάδας παρατηρήθηκαν οι µικρότερες συγκεντρώσεις ΜΤ ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού). Τον Οκτώβριο,ο προσδιορισµός των επιπέδων των ΜΤ στα βράγχια έδειξε αυξηµένα επίπεδα ΜΤ σε άτοµα που συλλέχθηκαν από τις Ανατολικές περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου (Αγγελοχώρι, Περαία), καθώς και από την περιοχή της Χαλάστρας,συγκριτικά µε τα χαµηλά επίπεδα που µετρήθηκαν στα βράγχια ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 3). Σύµπλοκο µανδύας/γονάδες Κατά τη διάρκεια της δειγµατοληπτικής περιόδου του Ιουνίου 2001 πραγµατοποιήθηκε µέτρηση της συγκέντρωσης των ΜΤ στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ( ιάγραµµα 4). ΜΤ (µανδύας/γονάδες) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα µr/gr ιστού Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 4. Συγκέντρωση ΜΤ στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα ((σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια του έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως µgr/grυγρού βάρους ιστού. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 4.M Ts content in the m antle/gonad com plex of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations (A ggelochorion,peraia,o utlettube,h alastra and K im ina) along the gulf of Therm aikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October 2001.The results are expressed as m eans (µgr/gr wetweight)± S.D.Significantdifferences between pairs ofm ean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test, P<0.05).

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 75 Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων έδειξαν σηµαντική αύξηση των συγκεντρώσεων των ΜΤ στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από τις περιοχές του Θερµαϊκού,µε την υψηλότερη τιµή να παρατηρείται στον ιστό ατόµων από την περιοχή των Κυµίνων ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού),ενώ εξαίρεση αποτελεί η περιοχή του Αγγελοχωρίου (73.05 ± µg/g υγρού βάρους ιστού), όπου δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στον ιστό ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού),( ιάγραµµα 4). Τον Οκτώβριο,σηµαντικά αυξηµένες τιµές ΜΤ µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων που συλλέχθηκαν από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,σε σχέση µε την Ολυµπιάδα. Οι υψηλότερες τιµές µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού)και της Χαλάστρας ( ± µg/g υγρού βάρους ιστού), ενώ σε άτοµα από την περιοχή της Περαίας δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στο συγκεκριµένο ιστό ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ± 11 µg/g και ± µg/g υγρού βάρους ιστού, αντίστοιχα),( ιάγραµµα 4) ραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης (AChE): Αιµόλεµφος Η ενζυµική δραστικότητα της AChE που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο ατόµων που συλλέχθηκαν από σταθµούς στο εσωτερικό του Θερµαϊκού κόλπου,κατά τη διάρκεια του Ιουνίου, βρέθηκε να είναι σηµαντικά µικρότερη, συγκριτικά µε τη δραστικότητα στην αιµόλεµφο ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης).οι µικρότερες τιµές παρατηρήθηκαν στην αιµόλεµφο ατόµων που συλλέχθηκαν από την περιοχή του Αντλιοστασίου (36.6 ± 0.75 nm ol/min/mg πρωτεΐνης)που βρίσκεται στο εσωτερικό (Β πλευρά)του Θερµαϊκού κόλπου ( ιάγραµµα 5). Η ενζυµική δραστικότητα της AChE που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο ατόµων που συλλέχθηκαν τον Οκτώβριο,έδωσε αντίθετα αποτελέσµατα,συγκριτικά µε τα αποτελέσµατα του Ιουνίου.Συγκεκριµένα,η ενζυµική δραστικότητα που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο ατόµων από τις υτικές περιοχές του κόλπου (Χαλάστρα και Κύµινα) παρουσιάζεται σηµαντικά αυξηµένη ( ± και ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης αντίστοιχα),συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 76 σε άτοµα από περιοχές της Ανατολικής πλευράς του κόλπου (Αγγελοχώρι,Περαία), αλλά και από την Ολυµπιάδα ( ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης), ( ιάγραµµα 5). nm ol/m in/m g πρωτεϊνης AChE (Αιµόλεµφος) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 0 Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 5. Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος). Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται ως nm ol/min/mg πρωτεΐνης.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 5. A C he activity in the haem olym ph of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations along the gulfoftherm aikos and Olym piada,a reference station located in the Gulf ofstrym onikos in June and October2001.The results are expressed as means (nm ol/min/mg protein)± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Πεπτικός αδένας Ανάλογο πρότυπο µε αυτό που παρατηρήθηκε στην αιµόλεµφο διαπιστώθηκε στον πεπτικό αδένα,κατά τη διάρκεια της δειγµατοληψίας του Ιουνίου.Υψηλές τιµές δραστικότητας της AChE παρατηρήθηκαν στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας (30.6 ± 4.84 nm ol/min/mg πρωτεΐνης), ενώ σηµαντική αναστολή της δραστικότητας παρατηρήθηκε στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή του Αντλιοστασίου (9.6 ± 1.62 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),συγκριτικά µε τις υπόλοιπες περιοχές του κόλπου ( ιάγραµµα 6). Την περίοδο του Οκτωβρίου,στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή της Χαλάστρας και των Κυµίνων µετρήθηκαν οι υψηλότερες τιµές AChE,συγκριτικά µε τις τιµές στον ιστό ατόµων από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου και της Περαίας

100 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 77 ( ιάγραµµα 6).Συγκεκριµένα,άτοµα από την Περαία έδειξαν τη µικρότερη ενζυµική δραστικότητα ( ± 1.65 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),σε σχέση µε τις τιµές που µετρήθηκαν στον ιστό ατόµων από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού,αλλά και από την περιοχή της Ολυµπιάδας (28.87 ± 7.72 nm ol/min/mg πρωτεΐνης), ( ιάγραµµα 6). nm ol/m in/m g πρωτεϊνης AChE (πεπτικός αδένας) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 0 Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 6. Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στον πεπτικό αδένα των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος). Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται ως nm ol/min/mg πρωτεΐνης.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 6.AChE activity in the digestive gland of mussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations along the gulfoftherm aikos and Olym piada,a reference station located in the Gulf ofstrym onikos in June and October2001.The results are expressed as means (nm ol/min/mg protein)± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Βράγχια Μελετώντας τη δραστικότητα της AChE στα βράγχια, παρατηρούµε αυξηµένα επίπεδα σε άτοµα από την περιοχή των Κυµίνων ( ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης),κατά τη διάρκεια του Ιουνίου,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε άτοµα από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού,αλλά και από την Ολυµπιάδα (67.65 ± 2.7 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),( ιάγραµµα 7). Την περίοδο του Οκτωβρίου, παρατηρήθηκαν ακριβώς τα αντίθετα αποτελέσµατα στην περιοχή των Κυµίνων. Η AChE παρουσιάζει σηµαντική αναστολή,συγκριτικά µε τα επίπεδά της στα βράγχια ατόµων που συλλέχθηκαν από

101 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 78 τα Κύµινα κατά τον Ιούνιο,( ιάγραµµα 7).Είναι αξιοσηµείωτο να τονίσουµε πως στα βράγχια ατόµων από την περιοχή των Κυµίνων µετρήθηκε η µικρότερη δραστικότητα της AChE (13.12 ± 5.47 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),κάτι που έρχεται σε αντίθεση µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε,τη συγκεκριµένη περίοδο,στον πεπτικό αδένα και την αιµόλεµφο, ( ιάγραµµα 5,6). Τον Οκτώβριο, η δραστικότητα του ενζύµου που µετρήθηκε στα βράγχια έδειξε σηµαντική αύξηση σε άτοµα που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Χαλάστρας (185.7 ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης),συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στο συγκεκριµένο ιστό ατόµων από τις υπόλοιπες περιοχές δειγµατοληψίας. AChE (βράγχια) nm ol/m in/mg πρωτεϊνης Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 0 Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 7. Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στα βράγχια των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος). Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται ως nm ol/min/mg πρωτεΐνης.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 7. AChE activity in the gills of mussels M ytilus galloprovincialis collected from different stations along the gulf of Thermaikos and O lym piada, a reference station located in the G ulf of Strym onikos in June and October 2001.The results are expressed as m eans (nm ol/min/mg protein)± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Σύµπλοκο µανδύας/γονάδες Κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου,η ενζυµική δραστικότητα της AChE που µετρήθηκε στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων που συλλέχθηκαν από την περιοχή του Αντλιοστασίου παρουσίασε σηµαντική αναστολή (3.41 ± 0.6

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 79 nm ol/min/mg πρωτεΐνης), συγκριτικά µε τη δραστικότητα σε άτοµα από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (10.65 ± 0.93 nm ol/min/mg πρωτεΐνης), ( ιάγραµµα 8). Τον Οκτώβριο,µετρήθηκαν υψηλότερες τιµές δραστικότητας,σε σύγκριση µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στον ιστό ατόµων,κατά τη διάρκεια του Ιουνίου. Συγκεκριµένα,η ενζυµική δραστικότητα της AChE στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, ατόµων από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου και της Χαλάστρας βρέθηκε σηµαντικά αυξηµένη (26.02 ± 5.93 και ± 5.25 nm ol/min/mg πρωτεΐνης αντίστοιχα), συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στον ίδιο ιστό από άτοµα άλλων περιοχών του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και από την Ολυµπιάδα (18 ± 6.1 nm ol/min/mg πρωτεΐνης)( ιάγραµµα 8). AChE (µανδύας/γονάδες) nm ol/m in/mg πρωτεϊνης Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 8.Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος). Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται ως nm ol/min/mg πρωτεΐνης.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-w hitney,u-test(p<0.05). Figure 8.AChE activity in the mantle/gonad com plex of m ussels Mytilus galloprovincialis collected from differentstations along the gulfofthermaikos and Olym piada,a reference station located in the Gulf of Strym onikos in June and O ctober The results are expressed as m eans (nm ol/min/mg protein) ± S.D. Significant differences betw een pairs of m ean values are indicated in the upper triangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγκέντρωση cam P: Πεπτικός αδένας Από τις µετρήσεις της συγκέντρωσης του ca M P στον πεπτικό αδένα ατόµων από τις διάφορες περιοχές δειγµατοληψίας, κατά τη διάρκεια του Ιουνίου, παρατηρήθηκαν αυξηµένες τιµές ca M P στα άτοµα από τη Χαλάστρα ( ± pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού),τα Κύµινα (84.92 ± 6 pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού), καθώς και από την Περαία (97.44 ± 3.42 pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού), ενώ άτοµα από την περιοχή του Αντλιοστασίου έδωσαν τις µικρότερες τιµές (40.20 ± 6.57 pm olca M P/gr υγρού βάρους ιστού),συγκριτικά µε τις τιµές στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα (71.73 ± 7.74 pm ol ca M P/grυγρού βάρους ιστού),( ιάγραµµα 9). pm olca M P/gr ιστού ca M P (πεπτικός αδένας) Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 0 Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 9. Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στον πεπτικό αδένα των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 9.cA M P concentrations in the digestive gland of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations (A ggelochorion,peraia,o utlettube,h alastra and K im ina) along the gulf of Therm aikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October 2001.The results are expressed as m eans (pm olca M P/gr w ettissue) ± S.D.Significant differences between pairs ofmean values are indicated in the uppertriangularmatrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Κατά τη δειγµατοληψία του Οκτωβρίου, τα επίπεδα του ca M P παρουσιάζονται ιδιαίτερα αυξηµένα σε άτοµα από το Αγγελοχώρι (73.93 ± 3 pm ol

104 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 81 ca M P/gr υγρού βάρους ιστού) και την Περαία (69.99 ± 3 pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού) και ιδιαίτερα µειωµένα σε άτοµα από τη Χαλάστρα ( ± 3.03 pm olca M P/grυγρού βάρους ιστού) και τα Κύµινα (13.40 ± 2 pm olca M P/grυγρού βάρους ιστού), συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα (36.39 ± pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού) ( ιάγραµµα 9). Βράγχια Τον Ιούνιο, η µέτρηση των επιπέδων του ca M P στα βράγχια έδειξε σηµαντικά υψηλότερες τιµές στα βράγχια ατόµων από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, συγκριτικά µε τις τιµές σε άτοµα από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 10). Εξαίρεση αποτελεί η περιοχή του Αγγελοχωρίου (Ανατολική πλευρά του Θερµαϊκού κόλπου),όπου παρατηρήθηκαν σηµαντικά χαµηλότερες τιµές ca M P στα βράγχια σε σχέση µε όλες τις άλλες περιοχές του κόλπου,αλλά και από την Ολυµπιάδα. ca M P (βράγχια) pm olca M P/gr ιστού Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 10.Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στα βράγχια των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών, σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 10. ca M P concentrations in the gills of mussels M ytilus galloprovincialis collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, O utlet tube, H alastra and K im ina) along the gulf of Therm aikos and O lym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober 2001.The results are expressed as m eans (pm olca M P/gr w ettissue) ± S.D.Significant differences between pairs ofmean values are indicated in the uppertriangularmatrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 82 Τον Οκτώβριο,η µελέτη του ca M P έδειξε αυξηµένες τιµές σε άτοµα από τις Ανατολικές περιοχές του Θερµαϊκού (Αγγελοχώρι και Περαία) και λιγότερο αυξηµένες σε άτοµα από τις υτικές περιοχές (Χαλάστρα και Κύµινα),σε σχέση µε τις τιµές που βρέθηκαν σε άτοµα από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 10). Σύµπλοκο µανδύας/γονάδες Τον Ιούνιο, τα επίπεδα του ca M P που µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου βρέθηκαν να είναι σηµαντικά µεγαλύτερα από τα επίπεδα του ca M P σε άτοµα που συλλέχθηκαν από την περιοχή αναφοράς ( ιάγραµµα 11). Συγκεκριµένα, διαπιστώθηκε σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P σε άτοµα από την περιοχή του Αντλιοστασίου ( ± pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού). Αυξηµένα επίπεδα παρατηρήθηκαν και στην περιοχή της Περαίας ( ιάγραµµα 11). ca M P (µανδύας/γονάδες) pm olca M P/gr ιστού Ολυµπιάδα Αγγελοχώρι Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα 0 Ιούνιος Οκτώβριος ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 11. Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος), κατά τη διάρκεια του δειγµατοληπτικού έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,utest(p<0.05). Figure 11.cA M P concentrations in the m antle/gonad com plex of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations (Aggelochorion,Peraia,Outlettube,Halastra and Kimina) along the gulfofthermaikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October The results are expressed as m eans (pm ol ca M P/gr wettissue) ± S.D.Significant differences betw een pairs of m ean values are indicated in the upper triangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

106 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 83 Τον Οκτώβριο, οι µεγαλύτερες τιµές παρατηρήθηκαν σε άτοµα από το Αγγελοχώρι και την Περαία ( ± και ± pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού αντίστοιχα), ενώ σηµαντικά µικρότερες ήταν οι τιµές που µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες από τις περιοχές της υτικής πλευράς του κόλπου (Χαλάστρα και Κύµινα), σε σχέση µε την τιµή στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ± pm ol ca M P/grυγρού βάρους ιστού),( ιάγραµµα 11) Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου 2001: Λαµβάνοντας υπόψη µας τις τιµές των βιοχηµικών παραµέτρων (AChE,MT και ca M P)που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό (αιµόλεµφος,πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες), κατά τη διάρκεια της δειγµατοληψίας του Ιουνίου, µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντικές συσχετίσεις µεταξύ τους. Συγκεκριµένα, από την ανάλυση των δεδοµένων µας (Pearson test,sta TISTICA M icrosoftco., Greece),διαπιστώθηκε σηµαντική θετική συσχέτιση µεταξύ των ΜΤ στα βράγχια και στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= 0.85), ενώ σηµαντική αρνητική συσχέτιση διαπιστώθηκε µεταξύ των ΜΤ στα βράγχια και της ενζυµικής δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο (r= -0.88).Παρόµοια απόκριση διαπιστώνεται µεταξύ της ενζυµικής δραστικότητας της AChE στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και της συγκέντρωσης του ca M P στον ίδιο ιστό (r= -0.91). Συµπερασµατικά, από τη δειγµατοληψία του Ιουνίου διαπιστώνεται σηµαντική αρνητική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες τόσο µε τη δραστικότητα της AChE (r= -0.81),όσο και µε τη συγκέντρωση του ca M P στους ιστούς (r= -0.61). Ανάλογες συσχετίσεις προκύπτουν και στην περίπτωση που ληφθούν και οι τιµές της AChE που µετρήθηκαν στην αιµόλεµφο (r= και r= ,για τη σχέση ΜΤ AChE και MT ca M P αντίστοιχα) Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία του Οκτωβρίου 2001: Η ανάλυση των τιµών και των διακυµάνσεων που παρατηρούνται από περιοχή σε περιοχή έδειξε σηµαντική θετική συσχέτιση µεταξύ της ενζυµικής δραστικότητας

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84 της AChE στα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= 0.87). Θετική συσχέτιση εµφανίζει η συγκέντρωση του ca M P στα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= 0.97),αλλά και η συγκέντρωση του ca M P στα βράγχια και στον πεπτικό αδένα (r= 0.82). Λαµβάνοντας υπόψη µας τις τιµές των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν σε όλους τους ιστούς των ατόµων, διαπιστώνεται µια σηµαντική αρνητική συσχέτιση µεταξύ της απόκρισης των ΜΤ και της συγκέντρωσης του ca M P (r= -0.59) Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του έτους 2001 (Ιούνιος και Οκτώβριος): Από την ανάλυση των βιοχηµικών παραµέτρων και των διακυµάνσεων που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών περιόδων του έτους 2001, διαπιστώθηκαν σηµαντικές συσχετίσεις, αναφορικά µε την απόκριση των µελετούµενων παραµέτρων, ως αποτέλεσµα της επίδρασης διαφορετικών περιβαλλοντικών παραγόντων και ρυπαντών. Συγκεκριµένα, παρατηρήθηκε σηµαντική θετική συσχέτιση των ΜΤ τόσο στα βράγχια,όσο και στον πεπτικό αδένα (r= 0.85). Το ίδιο πρότυπο απόκρισης εµφανίζεται µεταξύ των βραγχίων και του συµπλόκου µανδύας/γονάδες όσο αφορά τις διακυµάνσεις των ΜΤ (r= 0.85),αλλά και µεταξύ του πεπτικού αδένα και της αιµολέµφου,όσο αφορά τη διακύµανση της δραστικότητας της AChE (r= 0.86). Αντίθετα, σηµαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται µεταξύ της δραστικότητας της AChE στον πεπτικό αδένα και της συγκέντρωσης του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= -0.74). Γενικότερα, µπορεί να διαπιστωθεί µια σηµαντική αρνητική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων (πεπτικός αδένας, βράγχια, σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και αιµόλεµφος) µε την ενζυµική δραστικότητα της AChE,καθώς και µε τα επίπεδα του ca M P.Συγκεκριµένα,αύξηση των επιπέδων των ΜΤ σχετίζεται µε σηµαντική αναστολή της δραστικότητας της AChE (r= -0.41),καθώς και σηµαντική µείωση των επιπέδων του ca M P (r= -0.53) στους ιστούς των ατόµων που µελετούνται.

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγκεντρώσεις µετάλλων σε ιστούς του µυδιού κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο 2001 (Ιούνιος-Οκτώβριος): Κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών που πραγµατοποιήθηκαν το έτος 2001 µετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις τεσσάρων βαρέων µετάλλων στον πεπτικό αδένα,τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των ατόµων που συλλέχθηκαν από τους διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, αλλά και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο.συγκεκριµένα,µετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις του καδµίου (Cd),ψευδαργύρου (Zn),µολύβδου (Pb)και χαλκού (Cu),(Πίνακας 7). Κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου 2001, σηµαντική συσσώρευση του Cd παρατηρήθηκε στα βράγχια των ατόµων από την περιοχή των Κυµίνων (71 ± 0.2 ng/g ξ.β), συγκριτικά µε τη συγκέντρωση του µετάλλου που µετρήθηκε στα βράγχια ατόµων από τις υπόλοιπες περιοχές δειγµατοληψίας.σηµαντική ήταν η συσσώρευση του µετάλλου στον πεπτικό αδένα ατόµων από τις περιοχές των Κυµίνων (40.1 ± 3.8 ng/g ξ.β),ενώ τον Οκτώβριο του ίδιου έτους,άτοµα από τη Χαλάστρα (42 ± 2.8 ng/g ξ.β)και τα Κύµινα (52.9 ± 2.3 ng/g ξ.β)έδειξαν σηµαντικά αυξηµένες συγκεντρώσεις του µετάλλου,συγκριτικά µε τη συγκέντρωση στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας.Στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,σηµαντική συσσώρευση Cd παρατηρήθηκε σε άτοµα από την περιοχή της Περαίας (6.9 ± 0.6 ng/g ξ.β)και της Χαλάστρας (9.6 ± 0.5 ng/g ξ.β),συγκριτικά µε άτοµα από την περιοχή αναφοράς (4.2 ± 0.07 ng/g ξ.β). Οι συγκεντρώσεις του Pb στον πεπτικό αδένα ατόµων που συλλέχθηκαν από την περιοχή του Αγγελοχωρίου (82.8 ± 3.8 ng/g ξ.β),του Αντλιοστασίου (162.3 ± 17.4 ng/g ξ.β)και της Χαλάστρας (97.9 ± 6.9 ng/g ξ.β),κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου, βρέθηκαν σηµαντικά υψηλότερες σε σχέση µε τις συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στον ίδιο ιστό ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας (58.7 ± 11.7 ng/g ξ.β).οι συγκεντρώσεις του µετάλλου στα βράγχια ατόµων από τις παραπάνω περιοχές, καθώς και από την περιοχή των Κυµίνων, κυµάνθηκαν σε σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα,συγκριτικά µε τα επίπεδα του µετάλλου που µετρήθηκαν σε άτοµα από την Ολυµπιάδα,κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου,φαινόµενο που δεν παρατηρήθηκε κατά τη δειγµατοληψία του Οκτωβρίου,κατά την οποία τα επίπεδα του µετάλλου στα βράγχια ατόµων από την Ολυµπιάδα βρέθηκαν σηµαντικά χαµηλότερα (Πίνακας 7). Η συσσώρευση του µετάλλου στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,βρέθηκε σηµαντικά χαµηλή σε άτοµα από την περιοχή της Περαίας (23 ± 8.9 ng/g ξ.β),κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου,ενώ υψηλή συσσώρευση

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 86 παρατηρήθηκε στον ίδιο ιστό ατόµων από το Αγγελοχώρι (74.5 ± 2.8 ng/g ξ.β),την Περαία (74.2 ± 0.8 ng/g ξ.β)και τα Κύµινα (54.4 ± 0.3 ng/g ξ.β),συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε άτοµα από την Ολυµπιάδα (31.5 ± 2.3 ng/g ξ.β) τον Οκτώβριο. Τον Ιούνιο 2001, η συγκέντρωση του Cu στα βράγχια βρέθηκε σηµαντικά αυξηµένη σε άτοµα από την περιοχή της Περαίας (20.7 ± 1.1 µg/g ξ.β), του Αγγελοχωρίου (16 ± 0.8 µg/g ξ.β),του Αντλιοστασίου (35.1 ± 1.4 µg/g ξ.β)και των Κυµίνων (18.4 ± 2.2 µg/g ξ.β),καθώς και σε άτοµα από την Περαία (9 ± µg/g ξ.β),τη Χαλάστρα (6.8 ± 0.6 µg/g ξ.β)και τα Κύµινα (8.3 ± 0.2 µg/g ξ.β),κατά τη δειγµατοληψία του Οκτωβρίου.Στον πεπτικό αδένα, σηµαντική συσσώρευση του µετάλλου παρατηρήθηκε σε άτοµα από την περιοχή των Κυµίνων (28.8 ± 1.1 µg/g ξ.β),κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου. Κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου, παρατηρήθηκαν σηµαντικές συγκεντρώσεις Zn στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από τις περιοχές της Περαίας (66.6 ± 0.3 µg/g ξ.β)και του Αγγελοχωρίου (89.4 ± 6 µg/g ξ.β),σε σχέση µε τη συγκέντρωση του µετάλλου που µετρήθηκε σε άτοµα από την περιοχή της Ολυµπιάδας (42.7 ± 3 µg/g ξ.β). Τον Οκτώβριο, σηµαντική συσσώρευση παρατηρήθηκε στον πεπτικό αδένα των ατόµων από τη περιοχή των Κυµίνων (223.3 ± 7.5 µg/g ξ.β),στα βράγχια ατόµων από τη Χαλάστρα (303.1 ± 2.8 µg/g ξ.β)και τα Κύµινα (290.6 ± 7.3 µg/g ξ.β),καθώς και στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες σε άτοµα από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου (96 ± 0.21 µg/g ξ.β)και των Κυµίνων (110.6 ± 1.6 µg/g ξ.β),συγκριτικά µε τις συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στους αντίστοιχους ιστούς ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας (Πίνακας 7). Εκτιµώντας την εποχική διακύµανση των συγκεντρώσεων των µετάλλων στους ιστούς των ατόµων,διαπιστώνεται µια σηµαντική αύξηση των επιπέδων του Cu και του Pb σε όλους τους ιστούς την περίοδο του Ιουνίου,καθώς και αυξηµένες συγκεντρώσεις Cd στον πεπτικό αδένα και στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες τον Οκτώβριο. Από την εκτίµηση των επιπέδων των µετάλλων µεταξύ των ιστών (ANOVA, D uncan s test, P<0.05) διαπιστώνονται µεγαλύτερες συγκεντρώσεις µετάλλων στον πεπτικό αδένα και στα βράγχια σε σχέση µε τις συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες.η συσσώρευση του Zn ακολουθεί τη σειρά βράγχια<πεπτικός αδένας<σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και στις 2 δειγµατοληπτικές περιόδους, πρότυπο που ακολουθεί και ο Pb κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου.

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 87 Πίνακας 7 Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων των βαρέων µετάλλων (Cd,Pb, Cu & Zn) στον πεπτικό αδένα (DG), τα βράγχια (Gills) και το σύστηµα µανδύας/γονάδες (M /G) ατόµων που συλλέχθηκαν από τους διάφορους σταθµούς δειγµατοληψίας στο Θερµαϊκό κόλπο,καθώς και από την Ολυµπιάδα,που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του Ιουνίου και Οκτωβρίου Table 7.Determination ofheavy metalcontent(cd,pb,cu & Zn)in the digestive gland (D G ),the gills and the m antle/gonad com plex (M/G)of m ussels collected from different stations along Therm aikos Gulfand Olimpiada located in the GulfofStrym onikos,in June and October2001. ΙΟΥΝΙΟΣ 2001 Cd (ngr/gr ξηρού βάρους ιστού) Pb (ngr/grξηρού βάρους ιστού) DG Gills M /G DG Gills M /G ΟΛΥΜΠΙΑ Α 27.5 ± ± ± ± ± ± 5.2 ΑΓΓΕΛΟΧΩΡΙ 36.0 ± 1.1 * 23.2 ± ± ± 3.8 * ± 14.8 * 40.1 ± 11.5 ΠΕΡΑΙΑ 37.1 ± ± ± 0.6 * 63.9 ± ± 16.7 * 23.0 ± 8.9 * ΑΓΩΓΟΣ 29.5 ± ± ± ± 17.4 * ± ± 4.3 ΧΑΛΑΣΤΡΑ 33.2 ± ± ± 0.5 * 97.9 ± 6.9 * ± 9.1 * 53.7 ± 6.4 ΚΥΜΙΝΑ 40.1 ± 3.8 * 71.0 ± 0.2 * 16 ± 3.8 * 88.9 ± ± 23.3 * 83.2 ± 7.7 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ Cd Pb 2001 (ngr/gr ξηρού βάρους ιστού) (ngr/gr ξηρού βάρους ιστού) DG Gills M /G DG Gills M /G ΟΛΥΜΠΙΑ Α 34.3 ± ± ± ± ± ± 2.3 ΑΓΓΕΛΟΧΩΡΙ 52.5 ± ± ± ± ± 13.9 * 74.5 ± 2.8 * ΠΕΡΑΙΑ 32.0 ± ± ± ± ± 7.6 * 74.2 ± 0.8 * ΑΓΩΓΟΣ ΧΑΛΑΣΤΡΑ 42.0 ± 2.8 * 39.0 ± ± ± ± 12.4 * 47.7 ± 10.4 ΚΥΜΙΝΑ 52.9 ± 2.3 * 46.2 ± ± ± ± 1.7 * 54.4 ± 0.3 * ΙΟΥΝΙΟΣ 2001 Cu (µgr/gr ξηρού βάρους ιστού ) Zn (µgr/gr ξηρού βάρους ιστού ) DG Gills M /G DG Gills M /G ΟΛΥΜΠΙΑ Α 10.8 ± ± ± ± ± ± 3 ΑΓΓΕΛΟΧΩΡΙ 10.9 ± ± 0.8 * 10.9 ± ± ± ± 6 * ΠΕΡΑΙΑ 10.5 ± ± 1.1 * 3.9 ± 0.2 * 67.2 ± ± ± 0.3 * ΑΓΩΓΟΣ 17.3 ± ± 1.4 * 7.0 ± ± ± ± 24 ΧΑΛΑΣΤΡΑ 11.7 ± ± ± 0.9 * ± ± ± 0.7 ΚΥΜΙΝΑ 28.8 ± 1.1 * 18.4 ± 2.2 * 6.9 ±0.004 * 79.2 ± ± 83 * 46.0 ± 23.3 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ Cu Zn 2001 (µgr/gr ξηρού βάρους ιστού ) (µgr/gr ξηρού βάρους ιστού ) DG Gills M /G DG Gills M /G ΟΛΥΜΠΙΑ Α 10.6 ± ± ± ± ± ± 0.60 ΑΓΓΕΛΟΧΩΡΙ 10.1 ± ± ± ± ± ± 0.2 * ΠΕΡΑΙΑ 7.4 ± 0.04 * 9.0 ± * 4.5 ± ± 0.5 * ± ± 4 * ΑΓΩΓΟΣ ΧΑΛΑΣΤΡΑ 7.5 ± 0.4 * 6.8 ± 0.6 * 4.7 ± ± ± 2.8 * 69.0 ± 0.00 ΚΥΜΙΝΑ 10.2 ± ± 0.2 * 2.7 ± ± 7.5 * ± 7.3 * ± 1.6 * Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως οι Μ.Ο.± SD από δυο ανεξάρτητες µετρήσεις.για κάθε µέτρηση χρησιµοποιήθηκαν 10 άτοµα.οι τιµές εκφράζονται σε ngr/gr ξηρού βάρους ιστού για το Cd & Pb και σε µgr/grξηρού βάρους ιστού για το Cu & Zn.Τα αστεράκια δείχνουν σηµαντική στατιστική διαφορά των συγκεντρώσεων των µετάλλων (t-test,p<0,05) που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό,σε σχέση µε τις συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στον ίδιο ιστό ατόµων από την περιοχή αναφοράς (Ολυµπιάδα). The results are m ean ± SD from two different m easurem ents. For each m easurem ent a pool of 10 animals was used.the values ofcu and Zn are expressed in µgr/grdry weight,while the values ofcd and Pb are expressed in ngr/gr dry w eight of tissue. A sterisks indicated statistical significant differences ofeach station com pared to the reference station (t-test,p<0.05).data from Outlettube are m issing in O ctober2001.

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ειγµατοληπτική περίοδος Η µελέτη των βιοχηµικών παραµέτρων σε ιστούς µυδιών µε σκοπό την εκτίµηση της ρύπανσης, συνεχίστηκε και την επόµενη διετία Συγκεκριµένα,κατά τη διάρκεια του Ιουνίου και Οκτωβρίου,της διετίας , πραγµατοποιήθηκαν δειγµατοληψίες ατόµων του είδους Mytilus galloprovincialis από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου (Αγγελοχώρι,Περαία,Αντλιοστάσιο,Χαλάστρα και Κύµινα),καθώς και από την περιοχή της Ολυµπιάδας (Εικόνα 9).Από το µέγεθος των ατόµων που συλλέχθηκαν κάθε περίοδο ( Πίνακα 8), µπορεί να διαπιστωθεί µικρότερο µέγεθος ατόµων που προέρχονται από φυσικούς πληθυσµούς (Περαία, Αντιοστάσιο), συγκριτικά µε το µέγεθος ατόµων από καλλιεργούµενες περιοχές (Ολυµπιάδα,Αγγελοχώρι,Χαλάστρα και Κύµινα). Πίνακας 8.Μέγεθος των ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους Ιουνίου και Οκτωβρίου των ετών 2002 και 2003,από τις διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο.οι τιµές (cm ) είναι οι Μ.Ο ± SD από την µέτρηση τουλάχιστο 30 ατόµων που συλλέχθηκαν κάθε δειγµατοληπτική περίοδο. Table 8.M ussel s celllength collected from differentstations along Therm aikos Gulfand Olim piada, located in Strym onikos G ulf during (sam pling periods of June and O ctober).the results (expressed as centimeters) are m eans ± SD from atleast30 m ussels collected from each station each sam pling period. ειγµατοληπτική περίοδος Ιούνιος Οκτώβριος Ιούνιος Οκτώβριος Ολυµπιάδα 5.47 ± ± ± ± 0.2 (καλλ/µενος πληθυσµός) Αγγελοχώρι 6.8 ± ± ± ± 0.67 (καλλ/µενος πληθυσµός) Περαία 4.61 ± ± ± ± 0.19 (φυσικός πληθυσµός) Αντλιοστάσιο 4.4 ± ± ± ± 0.17 (φυσικός πληθυσµός) Χαλάστρα 6.11 ± ± ± ± 0.25 (καλλ/µενος πληθυσµός) Κύµινα (καλλ/µενος πληθυσµός) 7.41 ± ± ± ± 0.63

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίπεδα µεταλλοθειονινών: Πεπτικός αδένας Τα επίπεδα των ΜΤ στον πεπτικό αδένα ατόµων που συλλέχθηκαν από περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,έδειξαν σηµαντική διαφοροποίηση,συγκριτικά µε τα επίπεδα της µεταλλοπρωτεΐνης στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 12).Συγκεκριµένα,οι τιµές των ΜΤ στον πεπτικό αδένα µυδιών που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Ολυµπιάδας ήταν σταθερά µικρότερες, σε σχέση µε τις τιµές σε άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. MT (πεπτικός αδένας) µgr/gr ιστού Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 12. Συγκέντρωση ΜΤ στον πεπτικό αδένα µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως µgr/grυγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 12. MT content in the digestive gland of mussels collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, Outlet tube, Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and O lym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober2002 and 2003, (forsam pling station representation see RESU LTS,par.1:Field study,diagram s 2-11).The results are expressed as m eans (µgr/gr wetweight)± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, άτοµα από την Περαία και το Αντλιοστάσιο έδωσαν τις µεγαλύτερες τιµές ΜΤ στον πεπτικό αδένα τους, ενώ σηµαντικές διαφοροποιήσεις παρουσιάζονται στον πεπτικό αδένα ατόµων από περιοχές της υτικής πλευράς του κόλπου (Χαλάστρα και Κύµινα).

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 90 Οι τιµές των ΜΤ σε κάθε δειγµατοληπτική περίοδο κυµάνθηκαν στα ίδια επίπεδα, συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του προηγούµενου έτους (Ιούνιος και Οκτώβριος 2001),µε εξαίρεση την περίοδο του Οκτωβρίου 2002,κατά την οποία διαπιστώθηκε σηµαντική αύξηση των ΜΤ στον πεπτικό αδένα ατόµων από όλες τις περιοχές δειγµατοληψίας ( ιαγράµµατα 2 και 12). Βράγχια Από την µέτρηση των επιπέδων ΜΤ στα βράγχια ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους Ιουνίου και Οκτωβρίου των ετών 2002 και 2003, µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντικά αυξηµένα επίπεδα ΜΤ στον ιστό ατόµων από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, σε σχέση µε την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 13). ΜΤ (βράγχια) µgr/gr ιστού Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 13.Συγκέντρωση ΜΤ στα βράγχια µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος), (για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως µgr/gr υγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 13.MT contentin the gills ofm ussels collected from differentstations (Aggelochorion,Peraia, Outlet tube,halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and O lym piada,a reference station located in the G ulf of Strym onikos in June and O ctober 2002 and 2003 (for sam pling station representation see RESU LTS,par.1:Field study,diagram s 2-11).The results are expressed as m eans (µgr/gr wetweight)± S.D.Significant differences between pairs ofmean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 91 Ειδικότερα, στα βράγχια ατόµων που προέρχονται από την Περαία εµφανίζονται αυξηµένες συγκεντρώσεις ΜΤ, συγκριτικά µε τις τιµές στον ιστό ατόµων από την Ολυµπιάδα. Περιοχές από την Ανατολική πλευρά του κόλπου (Αγγελοχώρι, Περαία) εµφάνισαν σταθερά µεγαλύτερες τιµές ΜΤ στα βράγχια ατόµων, σε σχέση µε την Ολυµπιάδα, ενώ σε άτοµα από περιοχές της υτικής πλευράς (Χαλάστρα και Κύµινα)παρουσιάστηκαν σηµαντικές διαφοροποιήσεις όσο αφορά τις συγκεντρώσεις των ΜΤ στα βράγχια. Στα βράγχια ατόµων από τη Χαλάστρα παρατηρήθηκαν σηµαντικά υψηλές τιµές ΜΤ την περίοδο του Οκτωβρίου 2002 και Ιουνίου 2003, ενώ σε άτοµα από τα Κύµινα παρατηρήθηκαν σχετικά παρόµοια επίπεδα της µεταλλοπρωτεΐνης, µε αυτά που µετρήθηκαν στα βράγχια ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 13) ραστικότητα ακετυλχολινεστεράσης (AChE): Αιµόλεµφος Η δραστικότητα της AChE που µετρήθηκε στην αιµόλεφο ατόµων από τις περιοχές δειγµατοληψίας, έδειξε σηµαντική αναστολή, κυρίως σε άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου ( ιάγραµµα 14). Άτοµα από το Αντλιοστάσιο έδειξαν τη µεγαλύτερη αναστολή της δραστικότητας της AChE,ενώ σηµαντική αναστολή της δραστικότητας,µε αρκετές διακυµάνσεις,µετρήθηκε στην αιµόλεµφο ατόµων από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού,συγκριτικά µε άτοµα από την Ολυµπιάδα. Αξιοσηµείωτη είναι η εποχική διακύµανση που παρατηρήθηκε στη δραστικότητα της AChE.Συγκεκριµένα,κατά τις δειγµατοληψίες του 2002 και 2003 µετρήθηκαν υψηλότερες τιµές ενζυµικής δραστικότητας της AChE τον Ιούνιο, συγκριτικά µε τις αντίστοιχες τιµές του Οκτωβρίου, σε αντίθεση µε την εποχική διακύµανση που παρατηρήθηκε κατά το δειγµατοληπτικό έτος 2001 ( ιαγράµµατα 2 και 14). Πεπτικός αδένας Η δραστικότητα της AChE στον πεπτικό αδένα φαίνεται να αναστέλλεται σηµαντικά σε άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,σε σχέση µε άτοµα από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 15).Εξαίρεση αποτελούν άτοµα από την περιοχή των Κυµίνων, στα οποία παρατηρήθηκαν παρόµοια επίπεδα ενζυµικής δραστικότητας,συγκριτικά µε την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 15).

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 92 Βράγχια Ανάλογο πρότυπο µε αυτό που παρατηρήθηκε στον πεπτικό αδένα διαπιστώνεται από τη µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας της AChE στα βράγχια ( ιάγραµµα 16). 800 AChE (αιµόλεµφος) nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 14.Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται nm ol/min/mg πρωτεΐνης. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,utest(p<0.05). Figure 14.AChE activity in the haem olym ph of mussels collected from differentstations along the gulfofthermaikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October 2002 and 2003 (for sam pling station representation see RESU LTS, par. 1: Field study, Diagram s 2-11). The results are expressed as m eans (nm ol/min/mg protein) ± S.D.Significant differences between pairs of m ean values are indicated in the upper triangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Συγκεκριµένα,άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,µε εξαίρεση της περιοχή των Κυµίνων, παρουσίασαν σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας τον Ιούνιο και Οκτώβριο του έτους 2002, ενώ στις επόµενες δειγµατοληπτικές περιόδους (Ιούνιος και Οκτώβριος 2003), παρατηρήθηκε σηµαντική ανάκαµψη της δραστικότητας στα βράγχια ατόµων από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, εκτός από άτοµα των Κυµίνων, στα οποία διαπιστώθηκαν µειωµένες τιµές ενζυµικής δραστικότητας ( ιάγραµµα 16).

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 93 AChE (πεπτικός αδένας) nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 15.Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στον πεπτικό αδένα µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται nm ol/min/mg πρωτεΐνης. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,utest(p<0.05). Figure 15.AChE activity in the digestive gland ofmussels collected from differentstations along the gulfofthermaikos and Olym piada,a reference station located in the GulfofStrym onikos in June and October 2002 and 2003 (for sam pling station representation see RESU LTS, par. 1: Field study, Diagram s 2-11). The results are expressed as m eans (nm ol/min/mg protein) ± S.D.Significant differences between pairs of m ean values are indicated in the upper triangular matrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

117 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 94 AChE (βράγχια) nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 16.Μέτρηση της δραστικότητας της AChE στα βράγχια µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα απολέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται nm ol/min/mg πρωτεΐνης. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,utest(p<0.05). Figure 16. A ChE activity in the gills of m ussels collected from differentstations along the gulf of Therm aikos and O lym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober 2002 and 2003 (forsam pling station representation see RESU LTS,par.1:Field study,d iagram s 2-11). The results are expressed as m eans (nm oles/min/mg protein) ± S.D.Significant differences between pairs of mean values are indicated in the upper triangular matrix by asterisks (Mann-Whitney U -test, P<0.05).

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγκέντρωση cam P: Πεπτικός αδένας Σε δείγµατα που συλλέχθηκαν κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου 2002,τα επίπεδα του ca M P στον πεπτικό αδένα ατόµων,κατά κύριο λόγο από την περιοχή της Περαίας και κατά δεύτερο λόγο των Κυµίνων και του Αγγελοχωρίου,κυµάνθηκαν σε χαµηλά επίπεδα,συγκριτικά µε τις τιµές του ca M P στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα,το Αντλιοστάσιο και τη Χαλάστρα ( ιάγραµµα 17). ca M P (πεπτικός αδένας) pm olca M P/gr ιστού Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 17.Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στον πεπτικό αδένα µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κόλπο κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ. 1: Μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11). Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών, σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 17.cA M P concentrations in the digestive gland of m ussels collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, Outlet tube, Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and Olym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober (for sam pling station representation see R ESU LTS, par.1: Field study, Diagram s 2-11).The results are expressed as means (pm olca M P/gr wettissue) ± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Αντίθετα, τον Οκτώβριο 2002, διαπιστώθηκε σηµαντική µείωση των συγκεντρώσεων του ca M P σε άτοµα από την Ολυµπιάδα, καθώς και σηµαντική αύξηση των συγκεντρώσεων στον πεπτικό αδένα ατόµων από το Αγγελοχώρι. Η συγκέντρωση του ca M P εµφανίζει βαθµιαία αύξηση,καθώς προχωράµε από την

119 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 96 Περαία (Ανατολική πλευρά) προς τις περιοχές της υτικής πλευράς του κόλπου ( ιάγραµµα 17). Κατά την περίοδο του Ιουνίου 2003, τα επίπεδα του ca M P στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα βρέθηκαν παρόµοια µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε άτοµα από την Χαλάστρα,ενώ σηµαντικά υψηλότερα βρέθηκαν τα επίπεδα του ca M P σε άτοµα από τα Κύµινα. Τις µικρότερες τιµές παρουσίασαν άτοµα από το Αγγελοχώρι,την Περαία και το Αντλιοστάσιο,συγκριτικά µε τις τιµές που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 17). Τον Οκτώβριο 2003,διαπιστώθηκε αυξηµένη συγκέντρωση ca M P σε περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,µε εξαίρεση το Αγγελοχώρι,σε σχέση µε τη συγκέντρωση του ca M P που µετρήθηκε στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα,στον οποίο η συγκέντρωση κυµάνθηκε σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά του Οκτωβρίου 2002 ( ιάγραµµα 17). Βράγχια Άτοµα από την περιοχή των Κυµίνων,του Αγγελοχωρίου και της Περαίας έδωσαν τις χαµηλότερες τιµές ca M P στα βράγχια,συγκριτικά µε τις τιµές στα άτοµα από το Αντλιοστάσιο και τη Χαλάστρα,καθώς και από την Ολυµπιάδα,κατά τη διάρκεια του Ιουνίου 2002 ( ιάγραµµα 18).Αντίθετα,τον Οκτώβριο 2002, άτοµα από τα Κύµινα, το Αγγελοχώρι και την Περαία έδωσαν τις µεγαλύτερες συγκεντρώσεις ca M P στα βράγχια, σε σχέση µε τις τιµές που µετρήθηκαν στα βράγχια ατόµων από την Ολυµπιάδα,ενώ άτοµα από το Αντλιοστάσιο παρουσίασαν τις χαµηλότερες τιµές ca M P ( ιάγραµµα 18). Τον Ιούνιο 2003,η συγκέντρωση του ca M P βρέθηκε σηµαντικά υψηλότερη σε άτοµα από το Αντλιοστάσιο και σε παρόµοια επίπεδα σε όλες τις άλλες περιοχές, µε εξαίρεση τη σηµαντικά µειωµένη συγκέντρωση ca M P στα βράγχια ατόµων από την περιοχή της Περαίας ( ιάγραµµα 18).Αντίθετα,τον Οκτώβριο 2003 τα επίπεδα του ca M P στα βράγχια ατόµων από την Ολυµπιάδα βρέθηκαν σηµαντικά χαµηλότερα,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στα βράγχια ατόµων από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις µετρήθηκαν στα βράγχια ατόµων από την περιοχή των Κυµίνων και του Αντλιοστασίου,ενώ οι χαµηλότερες µετρήθηκαν σε άτοµα από το Αγγελοχώρι και τη Χαλάστρα ( ιάγραµµα 18).

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 97 ca M P (βράγχια) pm olca M P/gr ιστού Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 18. Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στα βράγχια µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση Mann- Whitney,U-test(P<0.05). Figure 18. ca M P concentrations in the gills of mussels collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, Outlet tube, Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and Olym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober (for sam pling station representation see R ESU LTS, par.1: Field study, Diagram s 2-11).The results are expressed as means (pm olca M P/gr wettissue) ± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Σύµπλοκο µανδύας/γονάδες Οι τιµές του ca M P που µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου 2002,κυµάνθηκαν σε υψηλά επίπεδα στις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, µε εξαίρεση τα Κύµινα που παρατηρήθηκαν οι χαµηλότερες τιµές,συγκριτικά µε τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού,αλλά και την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 19). Παρόµοια, τον Οκτώβριο 2002, άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, µε εξαίρεση άτοµα από το Αντλιοστάσιο, παρουσίασαν σηµαντικά υψηλότερες τιµές,συγκριτικά µε τις τιµές που µετρήθηκαν σε άτοµα από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 19). Κατά τη διάρκεια του Ιουνίου 2003,σηµαντικά χαµηλότερες συγκεντρώσεις ca M P βρέθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ατόµων από το Αγγελοχώρι,την Περαία και τη Χαλάστρα,ενώ άτοµα από το Αντλιοστάσιο και τα Κύµινα έδωσαν

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 98 σηµαντικά υψηλότερες τιµές ca M P σε σχέση µε τις αντίστοιχες τιµές σε άτοµα από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 19). ca M P (µανδύας/γονάδες) pm olca M P/gr ιστού Ιούνιος 02 Οκτώβριος 02 Ιούνιος 03 Οκτώβριος 03 ειγµατοληπτική περίοδος ιάγραµµα 19.Μέτρηση των επιπέδων του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες που συλλέχθηκαν από διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, καθώς και την Ολυµπιάδα (σταθµός ελέγχου, Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των ετών (Ιούνιος και Οκτώβριος),(για απεικόνιση περιοχών δες ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ παρ.1:μελέτη πεδίου, ιαγράµµατα 2-11).Τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο.± SD και εκφράζονται ως pm ol ca M P/gr υγρού βάρους ιστού.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση Mann- Whitney,U-test(P<0.05). Figure 19. ca M P concentrations in the m antle/gonad of m ussels collected from different stations (A ggelochorion, Peraia, Outlet tube, Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and Olym piada,a reference station located in the G ulfofstrym onikos in June and O ctober (for sam pling station representation see R ESU LTS, par.1: Field study, Diagram s 2-11).The results are expressed as means (pm olca M P/gr wettissue) ± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Τον Οκτώβριο 2003, οι συγκεντρώσεις του ca M P ατόµων από την Ολυµπιάδα βρέθηκαν σηµαντικά µικρότερες,συγκριτικά µε τις συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στο συγκεκριµένο ιστό ατόµων από τις διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου.οι υψηλότερες τιµές εµφανίζονται σε άτοµα από τα Κύµινα και το Αγγελοχώρι,ενώ οι χαµηλότερες στην περιοχή της Περαίας ( ιάγραµµα 19).

122 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σχέση µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη δειγµατοληψία κάθε δειγµατοληπτικής περιόδου: Από τη µελέτη των τιµών και των διακυµάνσεων των βιοχηµικών παραµέτρων στους διάφορους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τη δειγµατοληπτική περίοδο του Ιουνίου 2002,προκύπτει σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων του ca M P στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών (r= 0.93),ενώ σηµαντική αρνητική συσχέτιση εµφανίζεται µεταξύ της ενζυµικής δραστικότητας της AChE που µετρήθηκε στα βράγχια και της συγκέντρωσης του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= -0.95). Τον Ιούνιο 2003, σηµαντική θετική συσχέτιση διαπιστώνεται µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια (r= 0.86),της δραστικότητας της AChE στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια (r= 0.91),καθώς και της AChE στην αιµόλεµφο τόσο µε τα βράγχια (r= 0.88),όσο και µε τον πεπτικό αδένα (r= 0.97). Σηµαντική είναι η αρνητική συσχέτιση που εµφανίζεται µεταξύ των συγκεντρώσεων των ΜΤ στα βράγχια και της δραστικότητας της AChE που µετρήθηκε στον ίδιο ιστό (r= -0.85). Από τη µελέτη των τιµών που µετρήθηκαν στους ιστούς και των διακυµάνσεων που παρατηρήθηκαν µεταξύ των διαφόρων δειγµατοληπτικών περιοχών διαπιστώνονται σηµαντικές συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων,κατά τη δειγµατοληψία του Ιουνίου 2003.Σηµαντική θετική συσχέτιση διαπιστώνεται µεταξύ της δραστικότητας της AChE που µετρήθηκε στα βράγχια και στην αιµόλεµφο (r= 0.86).Λαµβάνοντας υπόψη µας τις τιµές στους δυο βασικούς ιστούς (βράγχια και πεπτικός αδένας)διαπιστώνουµε σηµαντική αρνητική συσχέτιση µεταξύ των ΜΤ και της ενζυµικής δραστικότητας (r= -0.78). Από την δειγµατοληψία του Οκτωβρίου 2003 προέκυψε σηµαντική θετική συσχέτιση των τιµών του ca M P που µετρήθηκαν στα βράγχια και τον πεπτικό αδένα (r= 0.89),ενώ σηµαντική αρνητική συσχέτιση διαπιστώνεται µεταξύ των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια και της δραστικότητας της AChE στους δυο ιστούς (r= -0.85).

123 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του έτους 2002 και 2003 (Ιούνιος και Οκτώβριος): Από την ανάλυση των αποτελεσµάτων που προκύπτουν για τις βιοχηµικές παραµέτρους στους διάφορους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια και των δυο δειγµατοληπτικών περιόδων του έτους 2002, προέκυψαν σηµαντικές συσχετίσεις τόσο της απόκρισης της κάθε βιοχηµικής παραµέτρου στους ιστούς µέτρησης, όσο και της απόκρισης των διαφορετικών παραµέτρων που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό. Συγκεκριµένα, σηµαντική θετική συσχέτιση διαπιστώνεται µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια (r= 0.86),της δραστικότητας της AChE στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια (r= 0.59),καθώς και των επιπέδων του ca M P που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα τόσο µε τα βράγχια, όσο και µε το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= 0.86 και 0.61 αντίστοιχα).σηµαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και της δραστικότητας της AChE τόσο στον πεπτικό αδένα (r= -0.58),όσο και στα βράγχια (r= -0.66). Παρόµοια αρνητική συσχέτιση παρατηρείται µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στα βράγχια και της ενζυµικής δραστικότητας της AChE τόσο στην αιµόλεµφο (r= -0.58),όσο και στον πεπτικό αδένα (r= -0.63)και τα βράγχια (r= -0.75). Από την ανάλυση των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων από τους διάφορους σταθµούς δειγµατοληψίας κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του Ιουνίου και Οκτωβρίου του έτους 2003, η ενζυµική δραστικότητα που µετρήθηκε στον πεπτικό αδένα παρουσίασε σηµαντική συσχέτιση µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στα βράγχια (r= 0.64).Περισσότερο σηµαντικές συσχετίσεις διαπιστώνονται µεταξύ της δραστικότητας που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο σε σχέση µε τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια (r= και αντίστοιχα). Λαµβάνοντας υπόψη µας τις τιµές στους δυο κύριους ιστούς µελέτης (πεπτικός αδένας και βράγχια)διαπιστώνεται σηµαντική αρνητική συσχέτιση µεταξύ των ΜΤ και της AChE τόσο κατά τις δειγµατοληπτικές περιόδους του 2002,όσο και του 2003 (r= και r= αντίστοιχα).

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς µυδιών από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών περιόδων (Ιούνιος και Οκτώβριος). Η χρησιµοποίηση των συγκεκριµένων βιοχηµικών παραµέτρων ως βιοµάρτυρες της θαλάσσιας ρύπανσης και η µελέτη των αποκρίσεών τους στους ιστούς που επιλέχτηκαν προς µελέτη µπορεί να δώσει χρήσιµα συµπεράσµατα,όσο αφορά την απόκριση των οργανισµών σε συνθήκες περιβαλλοντικού stress. Συγκεκριµένα,από την µελέτη των τιµών και των διακυµάνσεων που παρουσιάζουν οι βιοχηµικοί παράµετροι στους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από κάθε σταθµό δειγµατοληψίας στο Θερµαϊκό κόλπο, αλλά και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο, διαπιστώθηκαν σηµαντικές συσχετίσεις που ισχυροποιούν την επιλογή τους ως αξιόπιστα εργαλεία παρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Για την στατιστική ανάλυση (Pearson test, P<0.05; Statistica package, MicrosoftCo.,Greece)επιλέχτηκαν οι µέσοι όροι που προκύπτουν σε κάθε ιστό των ατόµων,από κάθε σταθµό δειγµατοληψίας,κάθε δειγµατοληπτικής περιόδου. Από τα αποτελέσµατα που προέκυψαν, διαπιστώνεται µια σηµαντική συσχέτιση των επιπέδων των ΜΤ (r= 0.86),αλλά και της ενζυµικής δραστικότητας της AChE (r= 0.94)στον πεπτικό αδένα και στα βράγχια.η δραστικότητα της AChE στην αιµόλεµφο παρουσιάζει παρόµοια απόκριση µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε τόσο στον πεπτικό αδένα,όσο και στα βράγχια (r= 0.88 και 0.92 αντίστοιχα). Οι µεταβολές των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα φαίνεται να σχετίζονται σηµαντικά µε την ενζυµική δραστικότητα της AChE που µετρήθηκε στον συγκεκριµένο ιστό (r= -0.91),(Γράφηµα 1α),ενώ παρόµοια συσχέτιση παρατηρήθηκε και στα βράγχια (r= -0.94), (Γράφηµα 1β). Οι ΜΤ στα βράγχια παρουσιάζουν σηµαντική αρνητική συσχέτιση µε την ενζυµική δραστικότητα στον ίδιο ιστό (r= ). Η µέτρηση των συγκεντρώσεων του ca M P στον πεπτικό αδένα,τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες αποσκοπεί στην ανάλυση των αποτελεσµάτων και στην εξαγωγή χρήσιµων συµπερασµάτων,όσο αφορά τη χρησιµότητα του ca M P ως βιοµάρτυρα της θαλάσσια ρύπανσης.για τη συγκεκριµένη µελέτη,εκτός από την µέτρηση των επιπέδων του ca M P στους διάφορους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν κάθε δειγµατοληπτική περίοδο και την ανάλυση των στατιστικών διαφορών που προέκυψαν µεταξύ των ιστών των ατόµων για κάθε δειγµατοληπτικό

125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 102 σταθµό,σηµαντική κρίθηκε η συσχέτιση των τιµών του ca M P µε τις τιµές τόσο των ΜΤ, όσο και της δραστικότητας της AChE που θεωρούνται καθιερωµένοι βιοµάρτυρες της θαλάσσιας ρύπανσης. α Πεπτικός αδένας AChE r = ΜΤ β Βράγχια AChE r = MT Γράφηµα 1.Συντελεστής συσχέτισης µεταξύ της δραστικότητας της AChE και των επιπέδων των ΜΤ α:στον πεπτικό αδένα και β:στα βράγχια µυδιών,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών της περιόδου (Ν=6 για τις 6 δειγµατοληψίες Ιούνιος και Οκτώβριος,της δειγµατοληπτικής περιόδου ). G raph 1.Correlation coefficients betw een the AChE activity and MT contentvariables tested in a:the digestive gland and b:the gills of m ussels during sam pling period from June 2001 to O ctober 2003 (N=6 forsix sam pling seasons during June and October, ).

126 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 103 Η ενζυµική δραστικότητα της AChE στην αιµόλεµφο,τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των ατόµων που συλλέχθηκαν από τους διάφορους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα (Στρυµονικός κόλπου),σχετίζεται σηµαντικά µε τις συγκεντρώσεις του ca M P που µετρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των ατόµων από τις αντίστοιχες περιοχές,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος Οκτώβριος 2003).Συγκεκριµένα,η δραστικότητα της AChE στην αιµόλεµφο σχετίζεται αρνητικά µε τα επίπεδα του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= -0.96),(Γράφηµα 2). ca M P µανδύας/γονάδες r = AChE αιµόλεµφος Γράφηµα 2.Συντελεστής συσχέτισης µεταξύ της δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο και των επιπέδων του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών της περιόδου (Ν=6 για τις 6 δειγµατοληψίες Ιούνιος και Οκτώβριος,της δειγµατοληπτικής περιόδου ). Graph 2.Correlation coefficientbetween the AChE activity in the haem olym ph and ca M P contentin the mantle/gonad com plex variables tested ofm ussels Mytilus galloprovincialis during sam pling period from June 2001 to October2003 (N=6 forsix sam pling seasons during June and October, ). Παρόµοια συσχέτιση εµφανίζεται µεταξύ της δραστικότητας του ενζύµου στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια µε τα επίπεδα του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= και αντίστοιχα),(γραφήµατα 3α και 3β).Σηµαντική είναι επίσης η συσχέτιση των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα και των επιπέδων του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (r= 0.86),(Γράφηµα 4).

127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 104 α ca M P µανδύας/γονάδες r = AChE πεπτικός αδένας β ca M P µανδύας/γονάδες r = AChE βράγχια Γράφηµα 3.Συντελεστής συσχέτισης µεταξύ της δραστικότητας της AChE α:στον πεπτικό αδένα και β:στα βράγχια και των επιπέδων του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών της περιόδου (Ν=6 για τις 6 δειγµατοληψίες Ιούνιος και Οκτώβριος,της δειγµατοληπτικής περιόδου ). G raph 3.Correlation coefficientbetween the AChE activity in a:the digestive gland and b:the gills with ca M P contentin the m antle/gonad com plex variables tested of m ussels during sam pling period from June 2001 to October2003 (N=6 forsix sam pling seasons during June and October, ).

128 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 105 ca M P µανδύας/γονάδες r = MT πεπτικός αδένας Γράφηµα 4. Συντελεστής συσχέτισης µεταξύ των επιπέδων του MT στον πεπτικό αδένα και του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών της περιόδου (Ν=6 για τις 6 δειγµατοληψίες Ιούνιος και Οκτώβριος,της δειγµατοληπτικής περιόδου ). G raph 4.Correlation coefficient betw een the M T in the digestive gland and ca M P content in the mantle/gonad com plex variables tested of m ussels M ytilus galloprovincialis during sam pling period from June 2001 to October2003 (N=6 forsix sam pling seasons during June and October, ). Οι παραπάνω συσχετίσεις των ήδη καθιερωµένων βιοµαρτύρων µε τα επίπεδα του ca M P µπορεί να αποτελέσουν αξιοσηµείωτο δεδοµένο στην προσπάθεια καθιέρωσης νέων βιοχηµικών παραµέτρων ως βιοµάρτυρες για την εκτίµηση της θαλάσσιας ρύπανσης.τα επίπεδα του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και η απόκριση του συγκεκριµένου µορίου στους διάφορους περιβαλλοντικούς ρυπαντές, αποτελεί σηµαντικό δεδοµένο που ισχυροποιεί τη χρησιµότητα µέτρησης των συγκεντρώσεων του µορίου στο συγκεκριµένο ιστό ως απόδειξη ύπαρξης και επίδρασης ρυπογόνων ουσιών στη φυσιολογία των οργανισµών.

129 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εκτίµηση των επιπέδων των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος Οκτώβριος 2003). Τα αποτελέσµατα που προκύπτουν από την µέτρηση των ΜΤ, της δραστικότητας της AChE,καθώς και του ca M P στους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από κάθε σταθµό κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών,έδειξαν να σχετίζονται σηµαντικά µε την κατάσταση του κάθε σταθµού όσο αφορά τα επίπεδα ρύπανσης. Σε αυτή την προσπάθεια συνυπολογίζονται οι µέσοι όροι κάθε παραµέτρου που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό ατόµων που προέρχονται από κάθε σταθµό του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας (Στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών περιόδων (Ιούνιος 2001-Οκτώβριος 2003). AChE (αιµόλεµφος) 500 nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 20. Μέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών ετών Τα αποτελέσµατα εκφράζουν τη διακύµανση των τιµών για κάθε σταθµό,κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος & Οκτώβριος)κάθε έτους,για κάθε ιστό.οι τιµές (nm ol/min/mg πρωτεΐνης)είναι οι Μ.Ο.± SD (Ν=6) για κάθε σταθµό.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών, σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 20.AChE activity in the haem olym ph of mussels collected from differentstations along the gulf of Thermaikos and O lym piada, a reference station located in the G ulf of Strym onikos during sam plings from 2001 to 2003.The results are expressed as m eans values from allsam pling periods (N=6), (nm ol/min/mg protein) ± S.D.Significant differences between pairs of m ean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Από τη στατιστική ανάλυση (M ann-whitney U -test, P<0.05) του εύρους τιµών της δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο ατόµων από κάθε σταθµό δειγµατοληψίας, προκύπτει σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας σε άτοµα από την περιοχή του Αντλιοστάσιου, συγκριτικά µε τα επίπεδα που

130 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 107 παρατηρούνται τόσο σε άτοµα από την Ολυµπιάδα, όσο και σε άτοµα από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου,της Περαίας και της Χαλάστρας ( ιάγραµµα 20). α AChE (πεπτικός αδένας) 45 nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα β AChE (βράγχια) 160 nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 21.Μέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας της AChE α:στον πεπτικό αδένα και β:στα βράγχια µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών ετών Τα αποτελέσµατα εκφράζουν τη διακύµανση των τιµών για κάθε σταθµό, κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος & Οκτώβριος) κάθε έτους,για κάθε ιστό.οι τιµές (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο. ± SD (Ν=6) για κάθε σταθµό. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση M ann-whitney,u-test(p<0.05). Figure 21.AChE activity in a:the digestive gland and b:the gills,ofmussels collected from different stations along the gulf of Thermaikos and O lym piada, a reference station located in the G ulf of Strym onikos during sam plings from 2001 to 2003.The results are expressed as means values from all sam pling periods (N=6),(nm ol/min/mg protein)± S.D.Significantdifferences betw een pairs of mean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05).

131 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 108 Παρόµοια αναστολή της AChE παρατηρείται στον πεπτικό αδένα ατόµων από την περιοχή του Αντλιοστάσιου και της Περαίας,σε σχέση µε άτοµα από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 21α),ενώ ανάλογα αποτελέσµατα προκύπτουν για τη δραστικότητα της AChE στα βράγχια ατόµων από το Αντλιοστάσιο,σε σχέση µε άτοµα από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 21β).Γενικά,µπορούµε να διαπιστώσουµε µια σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας της AChE και στους τρεις ιστούς µέτρησης σε άτοµα από την περιοχή του Αντλιοστάσιου,συγκριτικά µε τους υπόλοιπους σταθµούς δειγµατοληψίας ( ιάγραµµα 22). AChE (πεπτικός αδένας,βράγχια και αιµόλεµφος) 300 nm ol/m in/m g πρωτεϊνης Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 22.Ενζυµική δραστικότητα της AChE στα άτοµα που συλλέχθηκαν από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου και της Ολυµπιάδας (σταθµός ελέγχου,στρυµονικός κόλπος),κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών των τριών δειγµατοληπτικών ετών Τα αποτελέσµατα εκφράζουν το Μ.Ο.των τιµών που µετρήθηκαν τόσο στην αιµόλεµφο, όσο και στους κύριους ιστούς µέτρησης (πεπτικός αδένας & βράγχια),κατά τις µετρήσεις του Ιουνίου και Οκτωβρίου,κάθε έτους.οι τιµές (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο.± SD (Ν=6) για κάθε σταθµό.τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση Mann- Whitney,U-test,P<0.05). Figure 22. A ChE concerning pooled values obtained in digestive gland, gills & haem olym ph of m ussels M ytilus galloprovincialis collected from differentstations (Aggelochorion,Peraia,Outlettube, Halastra and Kimina)along the gulfof Thermaikos and Olym piada,a reference station located in the Gulfof Strym onikos during sam plings from 2001 to 2003.The results are expressed as means values from allsam pling periods (N=6),(nm ol/min/mg protein)± S.D.Significantdifferences between pairs of mean values are indicated in the upper triangular matrix by asterisks, (Mann-Whitney U -test, P<0.05). Από τη στατιστική ανάλυση των επιπέδων των ΜΤ στους ιστούς ατόµων από τις περιοχές δειγµατοληψίας προκύπτουν σηµαντικά αυξηµένα επίπεδα στον πεπτικό αδένα ατόµων από το Αγγελοχώρι και την Περαία (Ανατολική πλευρά),καθώς και από το Αντλιοστάσιο (Β πλευρά),σε σχέση µε τα µειωµένα επίπεδα τιµών που προκύπτουν στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα ( ιάγραµµα 23α).

132 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 109 α MT (πεπτικός αδένας) µgr/gr ιστού Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα β MT (βράγχια) µgr/gr ιστού Ολυµπιάδα Αγγελοχώριο Περαία Αντλιοστάσιο Χαλάστρα Κύµινα ιάγραµµα 23.Συγκέντρωση των ΜΤ α.στον πεπτικό αδένα και β.τα βράγχια των µυδιών Mytilus galloprovincialis που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των τριών δειγµατοληπτικών ετών Τα αποτελέσµατα εκφράζουν τη διακύµανση των τιµών για κάθε σταθµό, κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Ιούνιος & Οκτώβριος) κάθε έτους,για κάθε ιστό.οι τιµές (µgr/gr υγρού βάρους ιστού) είναι οι Μ.Ο. ± SD (Ν=6) για κάθε σταθµό και κάθε ιστό. Τα αστεράκια στα τρίγωνα εκφράζουν στατιστικές διαφορές µεταξύ των σταθµών,σύµφωνα µε την στατιστική ανάλυση Mann- Whitney,U-test,P<0.05). Figure 23.M T contentin a;the digestive gland and b;the gills of m ussel Mytilus galloprovincialis collected from differentstations (Aggelochorion,Peraia,Outlettube,Halastra and K imina) along the gulf of Thermaikos and O lym piada, a reference station located in the G ulf of Strym onikos during sam plings from 2001 to 2003.The results are expressed as m eans values from allsam pling periods (N=6),(µgr/grwetweight)± S.D.Significantdifferences betw een pairs ofmean values are indicated in the uppertriangularm atrix by asterisks (M ann-w hitney U-test,P<0.05). Ανάλογη µελέτη των επιπέδων των ΜΤ στα βράγχια έδειξε σηµαντικά αυξηµένα επίπεδα ΜΤ σε άτοµα από το Αντλιοστάσιο, σε σχέση µε άτοµα που προέρχονται από την περιοχή της Ολυµπιάδας ( ιάγραµµα 23β).

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 110 Από τα εξαγόµενα αποτελέσµατα µπορεί να διαπιστωθεί σηµαντική περιβαλλοντική επιβάρυνση στο εσωτερικό του Θερµαϊκού κόλπου (Β πλευρά, Αντλιοστάσιο),αλλά και στην Ανατολική πλευρά του κόλπου (περιοχή Περαίας). Περιοχές που βρίσκονται προς την έξοδο του κόλπου τόσο στη υτική,όσο και στην Ανατολική πλευρά του κόλπου, παρουσιάζουν σηµαντικές διακυµάνσεις, αλλά µε µικρότερη επιβάρυνση συγκριτικά µε το εσωτερικό του κόλπου. 1.5 Εκτίµηση συγγένειας των σταθµών δειγµατοληψίας µε χρήση βιοµαρτύρων. Από την ανάλυση των τιµών των βιοχηµικών παραµέτρων που µετρήθηκαν στους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου και από την Ολυµπιάδα, προκύπτουν σηµαντικά στοιχεία που σχετίζονται µε τη διαφοροποίηση των περιοχών. Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε στατιστική ανάλυση ClusterAnalysis (Statistica package,microsoft Co.,Greece) µε την οποία διαπιστώνεται η συγγένεια των σταθµών δειγµατοληψίας, µε βάση τις µετρήσιµες τιµές κάθε παραµέτρου. Συγκεκριµένα, από τα εξαγόµενα αποτελέσµατα διαπιστώνεται σηµαντική διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας,σε σχέση µε τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, µε βάση τις τιµές των ΜΤ στον πεπτικό αδένα των ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών (Γράφηµα 5α). Από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,σηµαντική διαφοροποίηση παρατηρείται στην περιοχή της Περαίας και του Αντλιοστάσιου, σε σχέση µε τις υπόλοιπες περιοχές του κόλπου. Η παραπάνω διαφοροποίηση είναι πιο εµφανής αν ληφθούν υπόψη οι τιµές που µετρήθηκαν και στους δυο κύριους ιστούς µέτρησης των ΜΤ (πεπτικός αδένας και βράγχια), (Γράφηµα 5β). Από την µελέτη της δραστικότητας της AChE που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο των ατόµων, διαπιστώνεται σηµαντική διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,αλλά και των περιοχών του Αντλιοστάσιου και της Περαίας,συγκριτικά µε τους υπόλοιπους σταθµούς του κόλπου (Γράφηµα 6α).Τα αποτελέσµατα είναι παρόµοια στην περίπτωση του πεπτικού αδένα (Γράφηµα 6β).

134 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 111 α MT (πεπτικός αδένας) Περ Αντλ Κύµ Χαλ Αγγελ Ολυµπ β ΜΤ (πεπτικός αδένας και βράγχια) Περ Αντλ Κύµ Χαλ Αγγελ Ολυµπ Γράφηµα 5. ιαφοροποίηση των σταθµών σύµφωνα µε τις συγκεντρώσεις των ΜΤ που µετρήθηκαν α: στον πεπτικό αδένα και β:στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια,µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών ετών (Ιούνιος & Οκτώβριος). Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση δενδρογράµµατος (cluster analysis, Statistica software package). G raph 5.Relationships between stations concerning the values ofmt in a:the digestive gland and b: both digestive gland and gills, of m ussels as they w ere occurred after cluster analysis (Statistica software).forthe determination ofthe results,allthe values obtained in the digestive gland ofanimals in each station collected during sam pling periods (June and October)were puttogether.

135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 112 α AChE (αιµόλεµφος) Αντλ Κύµ Χαλ Περ Αγγελ Ολυµπ β AChE (πεπτικός αδένας) Αντλ Περ Αγγελ Κύµ Χαλ Ολυµπ Γράφηµα 6. ιαφοροποίηση των σταθµών σύµφωνα µε την δραστικότητα της AChE α: στην αιµόλεµφο και β: στον πεπτικό αδένα, µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών ετών (Ιούνιος & Οκτώβριος). Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση δενδρογράµµατος (clusteranalysis,statistica software package). G raph 6.Relationships between stations concerning values of AChE activity in a:the haem olym ph and b:the digestive gland ofm ussels as they were occurred afterclusteranalysis (Statistica software). For the determination of the results, allthe values obtained in the haem olym ph of animals in each station collected during sam pling periods (June and October)were puttogether.

136 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 113 Από τις µετρήσεις τόσο των επιπέδων των ΜΤ, όσο και της ενζυµικής δραστικότητας στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των ατόµων από κάθε σταθµό δειγµατοληψίας διαπιστώνεται σηµαντική διαφοροποίηση της Ολυµπιάδας από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου, ενώ στο εσωτερικό του Θερµαϊκού, σαφή διαφοροποίηση παρουσιάζεται µεταξύ των περιοχών της Περαίας και του Αντλιοστάσιου από τους υπόλοιπους σταθµούς του κόλπου (Γράφηµα 7).Παρόµοια διαφοροποίηση των σταθµών προκύπτει στην περίπτωση που ληφθούν οι τιµές και των τριών παραµέτρων (ΜΤ,AChE και ca M P)που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα, µε σηµαντική διαφοροποίηση της Περαίας και του Αντλιοστάσιου από τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού, αλλά και της Ολυµπιάδας από όλες τις περιοχές του Θερµαϊκού (Γράφηµα 8). ΜΤ και AChE (πεπτικός αδένας και βράγχια) Περ Αντλ Κύµ Χαλ Αγγελ Ολυµπ Γράφηµα 7. ιαφοροποίηση των σταθµών σύµφωνα µε την δραστικότητα της AChE και τη συγκέντρωση των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών ετών (Ιούνιος & Οκτώβριος). Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση δενδρογράµµατος (cluster analysis, Statistica software package). G raph 7.Relationships between stations concerning pooled values of MT and AChE activity in the digestive gland and the gills ofm ussels as occurred after cluster analysis (Statistica software).forthe determination ofthe results,allthe values foreach param eter,in each tissue ofanimals in each station collected during sam pling periods (June and October)were puttogether.

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 114 ΜΤ,AChE και ca M P (πεπτικός αδένας) Περ Αντλ Χαλ Κύµ Αγγελ Ολυµπ Γράφηµα 8. ιαφοροποίηση των σταθµών σύµφωνα µε τη δραστικότητα της AChE,τη συγκέντρωση των ΜΤ και τη συγκέντρωση του ca M P στον πεπτικό αδένα των µυδιών που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών ετών (Ιούνιος & Οκτώβριος). Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση δενδρογράµµατος (cluster analysis, Statistica software package). G raph 8.Relationships between stations concerning pooled values ofmt,ache and ca M P contentin the digestive gland of mussels as occurred after cluster analysis (Statistica software). For the determination of the results, allthe values for each param eter of animals in each station collected during sam pling periods (June and October)were puttogether. Γενικά,µπορεί να διαπιστωθεί µια διαφοροποίηση του Αντλιοστάσιου από όλες τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου.οι περιοχές που βρίσκονται στην Ανατολική πλευρά του κόλπου (Αγγελοχώρι και Περαία) εµφανίζουν µεγαλύτερη συγγένεια µε την περιοχή της Χαλάστρας και των Κυµίνων που βρίσκονται στη υτική πλευρά του κόλπου, αν και η περιοχή της Περαίας δείχνει σηµαντική επιβάρυνση, παρόµοια µε αυτή του Αντλιοστάσιου, συγκριτικά µε τις υπόλοιπες περιοχές,όπως προκύπτει από ανάλυση των επιµέρους παραµέτρων στους διάφορους ιστούς (Γράφηµα 9).

138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 115 ΜΤ,AChE και ca M P (πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες) Αντλ Κύµ Χαλ Περ Αγγελ Ολυµπ Γράφηµα 9. ιαφοροποίηση των σταθµών σύµφωνα µε τη δραστικότητα της AChE,τη συγκέντρωση των ΜΤ και τη συγκέντρωση του ca M P που µετρήθηκαν σε όλους τους ιστούς (πεπτικός αδένας, βράγχια & σύµπλοκο µανδύας/γονάδες) ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληπτικών ετών (Ιούνιος & Οκτώβριος). Για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε ανάλυση δενδρογράµµατος (clusteranalysis,statistica software package). G raph 9.Relationships between stations concerning pooled values ofmt,ache and ca M P contentin the digestive gland, the gills and the m antle/gonad com plex of m ussels as occurred after cluster analysis (Statistica software).forthe determination ofthe results,allthe values foreach param eter,in each tissue of anim als in each station collected during sam pling periods (June and October) were puttogether.

139 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εργαστηριακή µελέτη: 2.1 Έκθεση µυδιών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου Επίπεδα ΜΤ: Μετά από έκθεση µυδιών για 9 ηµέρες, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου (1,10 και 100 µg/l),προέκυψε σηµαντική αύξηση των επιπέδων των ΜΤ σε όλους τους ιστούς (πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες). control Cd 1 µgr/lt ΜΤ (πεπτικός αδένας) µgr ΜΤ/gr ιστού Cd 10 µgr/lt Cd 100 µgr/lt ιάρκεια έκθεσης (ηµέρες) ιάγραµµα 24. Επίπεδα των ΜΤ στον πεπτικό αδένα µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου για χρονικό διάστηµα 3, 6 και 9 ηµερών. Τα αποτελέσµατα (µg/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο.± SD,4 διαφορετικών µετρήσεων.οι αριθµοί συµβολίζουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των ΜΤ που µετρήθηκαν σε άτοµα 1:ελέγχου (control),καθώς και σε άτοµα που εκτέθηκαν σε 2:1 µg/l,3:10 µg/lκαι 4:100 µg/lµετάλλου,για 3,6 και 9 ηµέρες,µετά από στατιστική ανάλυση (M ann-whitney U-test,P<0,05). Figure 24.MT levels in the digestive gland ofmussels exposed to differentconcentrations ofcadm ium for 3, 6 and 9 days. The results (µg/g w et weight of tissue) are m eans ± SD from 4 differents m easurem ents.n um bers represents statisticaldifferences betw een M T values obtained in 1: control animals,as wellin animals exposed to 2:1 µg/lof metal;3:10 µg/lofmetaland 4:100 µg/lofmetal, for3,6 and 9 days,as occurred afterstatisticalanalysis (M ann-w hitney U-test,P<0,05). Τα επίπεδα των ΜΤ που µετρήθηκαν στους ιστούς, πριν την έναρξη της έκθεσης (χρόνος 0)δεν έδειξαν µεταβολή,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας,σε άτοµα που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο.στον πεπτικό αδένα των µυδιών,οι ΜΤ εµφάνισαν σηµαντική αύξηση από την τρίτη κιόλας µέρα έκθεσης σε 10 και 100 µg/lµετάλλου,ενώ σηµαντική αύξηση των ΜΤ παρατηρήθηκε σε δείγµατα που εκτέθηκαν και στις τρεις συγκεντρώσεις για

140 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ και 9 ηµέρες ( ιάγραµµα 24),σε σχέση µε τα επίπεδα των ΜΤ στον ιστό ατόµων που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο τις αντίστοιχες χρονικές περιόδους. Παρόµοια αύξηση των επιπέδων των ΜΤ παρατηρήθηκε στα βράγχια ατόµων που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου για 3,6 και 9 ηµέρες.τα επίπεδα των ΜΤ παρουσιάζουν ποσοτική αύξηση,µετά από έκθεση για 6 ηµέρες σε 1,10 και 100 µg/lµετάλλου ( ιάγραµµα 25α).Ανάλογη αύξηση παρατηρήθηκε και στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες ( ιάγραµµα 25β). µgr ΜΤ/gr ιστού α ΜΤ (βράγχια) µgr MT/gr ιστού β ΜΤ (µανδύας/γονάδες) ιάρκεια έκθεσης (ηµέρες) ιάρκεια έκθεσης (ηµέρες) ιάγραµµα 25.Επίπεδα των ΜΤ α:στα βράγχια και β:στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου για χρονικό διάστηµα 3, 6 και 9 ηµερών. Τα αποτελέσµατα (µg/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο.± SD,4 διαφορετικών µετρήσεων.οι αριθµοί συµβολίζουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των ΜΤ που µετρήθηκαν σε άτοµα 1: ελέγχου (control),καθώς και σε άτοµα που εκτέθηκαν σε 2:1 µg/l,3:10 µg/lκαι 4:100 µg/lµετάλλου,για 3,6 και 9 ηµέρες,µετά από στατιστική ανάλυση (M ann-whitney U-test,P<0,05). Figure 25.MT levels in a:the gills and b:the mantle/gonad com plex ofm ussels exposed to different concentrations ofcadm ium for3,6 and 9 days.the results (µg/g wetweightoftissue)are m eans ± SD from 4 differentm easurem ents.numbers represents statisticaldifferences between MT values obtained in 1:controlanimals,as wellin animals exposed to 2:1 µg/lofmetal;3:10 µg/lofmetaland 4:100 µg/lofm etal,for3,6 and 9 days,as occurred afterstatisticalanalysis (M ann-w hitney U-test,P<0,05) Μέτρηση cam P: Τα επίπεδα του ca M P που µετρήθηκαν στους ιστούς ατόµων, µετά την περίοδο του εγκλιµατισµού τους στο εργαστήριο,βρέθηκαν σηµαντικά υψηλότερα σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν µετά από την έναρξη και κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας.συγκεκριµένα,στον πεπτικό αδένα ατόµων ελέγχου που µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο η φυσιολογική συγκέντρωση του ca M P βρέθηκε

141 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ± 2.79 pm olca M P/g,στα βράγχια βρέθηκε ± 1.37 pm olca M P/g,ενώ στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες η συγκέντρωση του ca M P µετρήθηκε ± pm ol ca M P/g υγρού βάρους ιστού. Η παραµονή των µυδιών σε συνθήκες εργαστηρίου φαίνεται ότι επηρέασε τα επίπεδα και τη φυσιολογία των ατόµων,µε αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση των επιπέδων του ca M P και στους 3 ιστούς µελέτης. pm olca M P/g ιστού α control cadm ium 10 µg/l cadm ium 100 µg/l cam P (πεπτικός αδένας) pm olca M P/g ιστού β cam P (βράγχια) περίοδος έκθεσης (ηµέρες) περίοδος έκθεσης (ηµέρες) ιάγραµµα 26. Συγκέντρωση του ca M P α: στον πεπτικό αδένα και β: στα βράγχια,µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου για χρονικό διάστηµα 3, 6 και 9 ηµερών. Τα αποτελέσµατα (pm olca M P/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο.± SD,4 διαφορετικών µετρήσεων. Οι αριθµοί συµβολίζουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των τιµών που µετρήθηκαν σε άτοµα 1: ελέγχου (control),καθώς και σε άτοµα που εκτέθηκαν σε 2:10 µg/lκαι 3:100 µg/lµετάλλου,για 3,6 και 9 ηµέρες,µετά από στατιστική ανάλυση (M ann-whitney U-test,P<0,05). Figure 26. ca M P levels in a: the digestive gland and b: the gills of m ussels exposed to different concentrations of cadm ium for3,6 and 9 days.the results (pm olca M P/g wetweightof tissue) are m eans ± SD from 4 differentm easurem ents.numbers represents statisticaldifferences between ca M P values obtained in 1:controlanim als,as wellin anim als exposed to 2:10 µg/lofm etaland 3:100 µg/l ofm etal,for3,6 and 9 days,as occurred afterstatisticalanalysis (M ann-w hitney U-test,P<0,05). Η µέτρηση του ca M P µετά από έκθεσή τους σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου, φαίνεται να επηρεάζεται σηµαντικά από την παρουσία του µετάλλου. Συγκεκριµένα, η έκθεση τους σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2 (10µg/l και 100µg/l),είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P στους ιστούς, συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στους ιστούς ατόµων που χρησιµοποιήθηκαν ως άτοµα ελέγχου, καθ όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας ( ιαγράµµατα 26α,26β και 27).Στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια µυδιών που εκτέθηκαν για 9 ηµέρες στο µέταλλο,τα επίπεδα του ca M P έδειξαν

142 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 119 σηµαντική αύξηση, σε σχέση µε τα επίπεδα στους αντίστοιχους ιστούς ατόµων ελέγχου ( ιαγράµµατα 26α,26β),ενώ στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες η αύξηση της συγκέντρωσης του ca M P φαίνεται να σχετίζεται ποσοτικά µε τη συγκέντρωση του µετάλλου ( ιάγραµµα 27). ca M P (µανδύας/γονάδες) pm olca M P/g ιστού περίοδος έκθεσης (ηµέρες) ιάγραµµα 27.Συγκέντρωση του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου για χρονικό διάστηµα 3, 6 και 9 ηµερών.τα αποτελέσµατα (pm ol ca M P/g υγρού βάρους ιστού) είναι οι Μ.Ο.± SD,4 διαφορετικών µετρήσεων.οι αριθµοί συµβολίζουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές των τιµών που µετρήθηκαν σε άτοµα 1: ελέγχου (control),καθώς και σε άτοµα που εκτέθηκαν σε 2:10 µg/lκαι 3:100 µg/lµετάλλου,για 3,6 και 9 ηµέρες,µετά από στατιστική ανάλυση (M ann-whitney U-test,P<0,05). Figure 27.cA M P levels in the mantle/gonad com plex of mussels exposed to differentconcentrations ofcadm ium for3,6 and 9 days.the results (pm olca M P/g wetweightoftissue)are means ± SD from 4 differentmeasurem ents.numbers represents statisticaldifferences between ca M P values obtained in 1:controlanimals,as wellin animals exposed to 2:10 µg/lofmetaland 3:100 µg/lofmetal,for 3,6 and 9 days,as occurred afterstatisticalanalysis (M ann-w hitney U-test,P<0,05) Σχέση ΜΤ και cam P,µετά από έκθεση σε κάδµιο: Η ανάλυση συσχέτισης (correlation m atrices, Pearson test,p<0.05),µεταξύ της συγκέντρωσης των ΜΤ και των επιπέδων του ca M P στους ιστούς, έδειξε σηµαντική απόκριση του ca M P στο συγκεκριµένο µέταλλο. Από τη συσχέτιση των τιµών ΜΤ που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα,τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,µε τις τιµές ca M P στους αντίστοιχους ιστούς ατόµων ελέγχου και ατόµων που εκτέθηκαν σε 10 µg/lκαδµίου,διαπιστώθηκε σηµαντική θετική συσχέτιση µεταξύ της απόκρισης του ca M P και των επιπέδων των ΜΤ (Πίνακας 9). Συγκεκριµένα, οι ΜΤ που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό (πεπτικός αδένας,βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες),σχετίζονται θετικά µε τα επίπεδα

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 120 του ca M P που προσδιορίστηκαν στους παραπάνω ιστούς (r= 0.90, r= 0.96 και r= 0.97 αντίστοιχα).παρόµοια σχέση παρουσιάζεται µεταξύ των ΜΤ και των επιπέδων του ca M P σε ιστούς ατόµων ελέγχου και ατόµων που εκτέθηκαν σε 100µg/l µετάλλου (Πίνακας 9).Τα επίπεδα του ca M P που βρέθηκαν στον πεπτικό αδένα και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, παρουσιάζουν σηµαντική θετική συσχέτιση µε τα επίπεδα των ΜΤ στον πεπτικό αδένα,ενώ σηµαντική συσχέτιση παρατηρείται µεταξύ των ΜΤ και του ca M P στα βράγχια (r= 0.82). Πίνακας 9.Ανάλυση συσχέτισης µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ και ca M P) στους ιστούς ατόµων ελέγχου και ατόµων που εκτέθηκαν σε κάδµιο τελικής συγκέντρωσης α:10 µg/lκαι β:100 µg/l. Table 9.Correlation coefficients between biochem icalparam eters (M T and ca M P)m easured in tissues ofcontrolmussels and mussels exposed to cadm ium atfinalconcentration ofa:10µg/land b:100µg/l. α MT DG M T G M T M/G cam P DG cam P G cam P M/G MT DG MT G MT M/G ca M P DG ca M P G ca M P M/G β MT DG M T G M T M/G cam P DG cam P G cam P M/G MT DG MT G MT M/G ca M P DG ca M P G ca M P M/G ΜΤ DG:ΜΤ πεπτικού αδένα,μτ G:ΜΤ βραγχίων,μτ M /G:ΜΤ συµπλόκου µανδύας/γονάδες, ca M P D G : επίπεδα ca M P στον πεπτικό αδένα,ca M P G : επίπεδα ca M P στα βράγχια,ca M P M/G: επίπεδα ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες. Με διαφορετικό χρώµα (κόκκινο) παρουσιάζονται οι σηµαντικές συσχετίσεις που προέκυψαν από την στατιστική ανάλυση των τιµών (correlation matrices,pearson test,p<0.05,ν=6). ΜΤ DG:ΜΤ in digestive gland, ΜΤ G:ΜΤ in gills; ΜΤ M/G:ΜΤ in m antle/gonad com plex; ca M P DG:cA M P levels in digestive gland;ca M P G:cA M P levels in gills;ca M P M/G:cA M P levels in mantle/gonad com plex.differentcolour (red) represents significantly correlations am ong param eters as occurred afterstatisticalanalysis (correlation m atrices,pearson test,p<0.05,ν=6). Λαµβάνοντας υπόψη µας όλες τις τιµές στους ιστούς που µελετήθηκαν,τόσο στα άτοµα που χρησιµοποιήθηκαν ως άτοµα ελέγχου, όσο και στα άτοµα που εκτέθηκαν και στις δυο συγκεντρώσεις του µετάλλου,µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντική αύξηση των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα ατόµων, µε ταυτόχρονη αύξηση των συγκεντρώσεων του ca M P (r= 0.85). Ανάλογη σχέση παρουσιάζεται και µεταξύ των ΜΤ και των επιπέδων του ca M P στα βράγχια (r=

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ).Τα επίπεδα του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες παρουσιάζουν ανάλογη διακύµανση µε αυτή των βραγχίων,χωρίς να υπάρχει σηµαντική συσχέτιση µε τα επίπεδα των ΜΤ που µετρήθηκαν στο συγκεκριµένο ιστό (r= 0.55),(Πίνακας 10). Πίνακας 10.Ανάλυση συσχέτισης µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ και ca M P)στους ιστούς ατόµων ελέγχου και ατόµων που εκτέθηκαν και στις δυο συγκεντρώσεις καδµίου (10 µg/lκαι 100 µg/l). Table 10. Correlation coefficients between biochem ical param eters (M T and ca M P) m easured in tissues of control m ussels and m ussels exposed to tw o concentrations of cadm ium (10µg/l and 100µg/l). MT DG M T G M T M/G cam P DG cam P G cam P M/G MT DG MT G MT M/G ca M P DG ca M P G ca M P M/G ΜΤ DG:ΜΤ πεπτικού αδένα,μτ G:ΜΤ βραγχίων,μτ M /G:ΜΤ συµπλόκου µανδύας/γονάδες, ca M P D G : επίπεδα ca M P στον πεπτικό αδένα,ca M P G : επίπεδα ca M P στα βράγχια,ca M P M/G: επίπεδα ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες. Με διαφορετικό χρώµα (κόκκινο) παρουσιάζονται οι σηµαντικές συσχετίσεις που προέκυψαν από την στατιστική ανάλυση των τιµών (correlation matrices,pearson test,p<0.05,ν=9). ΜΤ DG:ΜΤ in digestive gland, ΜΤ G:ΜΤ in gills; ΜΤ M/G:ΜΤ in m antle/gonad com plex; ca M P DG:cA M P levels in digestive gland;ca M P G:cA M P levels in gills;ca M P M/G:cA M P levels in mantle/gonad com plex.differentcolour (red) represents significantly correlations am ong param eters as occurred afterstatisticalanalysis (correlation m atrices,pearson test,p<0.05,ν=9).

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές Επίπεδα ΜΤ: Από τη µέτρηση των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων,διαπιστώθηκε σηµαντική απόκρισή τους µετά από έκθεση των ατόµων σε διαφορετικούς οργανικούς ρυπαντές.κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας, οι ΜΤ στον πεπτικό αδένα των ατόµων ελέγχου κυµάνθηκαν σε παρόµοια επίπεδα ( ± µg MT/g υγρού βάρους ιστού στην έναρξη της έκθεσης και ± µg MT/g υγρού βάρους ιστού µετά το τέλος της έκθεσης των 15 ηµερών),ενώ στα βράγχια παρατηρήθηκε σηµαντική πτώση ( ± 8.96 µg MT/g υγρού βάρους ιστού,στην έναρξη της έκθεσης και ± 8.15 MT/g υγρού βάρους ιστού,µετά το τέλος της έκθεσης των 15 ηµερών). Πίνακας 11. Συγκέντρωση ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων,µετά από έκθεση σε διαφορετικούς οργανικούς ρυπαντές για 15 ηµέρες. Table 11. MT content in the digestive gland and the gills of m ussels exposed to different organic pollutants for15 days. Πεπτικός αδένας 0.3 mg/lpah s 0.3 mg/l2.4-d 0.3 mg/llindane Control( ± 25.86) γ ± 7.62 *,β A cetone 100 µg/l(313 ± 10) γ ±29.91 *,α ± *,α,β Βράγχια 0.3 mg/lpah s 0.3 mg/l2.4-d 0.3 mg/llindane Control( ± 8.15) ± 0.34 *,α A cetone 100 µg/l( ± 17.56) ± *,β ± *,α,β Τα αποτελέσµατα (µg MT/g υγρού βάρους ιστού) είναι οι Μ.Ο.± SD 3 διαφορετικών µετρήσεων.για κάθε µέτρηση χρησιµοποιήθηκε ιστός από 10 ζώα.τα αστεράκια υποδηλώνουν σηµαντική διαφορά µεταξύ των τιµών ΜΤ που µετρήθηκαν στους ιστούς ατόµων που εκτέθηκαν σε κάθε οργανική ουσία µε την αντίστοιχη οµάδα ελέγχου.οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη υποδηλώνουν σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (M ann-whitney U-testanalysis,P<0.05). The results (µg M T/g w et tissue) are m eans ± SD of 3 independent m easurem ents. In each m easurem ent, tissue of 10 animals w as used. Asterisks denote significant difference from the respective control value.values thatshare the sam e letter indicates significantdifference from each other(m ann-w hitney U-testanalysis,P<0.05). Στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων που εκτέθηκαν τόσο στο µίγµα των πολυκυκλικών αρωµατικών ενώσεων (PA H s), όσο και στο 2.4-D και το Λινδάνιο,οι ΜΤ παρουσίασαν σηµαντική αύξηση,συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε άτοµα αναφοράς και σε άτοµα που εκτέθηκαν στον διαλυτικό παράγοντα των οργανικών (ακετόνη 100 µg/l).οι υψηλότερες τιµές ΜΤ µετρήθηκαν

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 123 σε άτοµα που εκτέθηκαν στο λινδάνιο,ενώ άτοµα που εκτέθηκαν στο 2.4-D και το µίγµα των PA H s φαίνεται να προκαλούν παρόµοια αύξηση των επιπέδων των ΜΤ και στους δύο ιστούς µελέτης (Πίνακας 11) ραστικότητα AChE: Η µέτρηση της AChE στην αιµόλεµφο,τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων που εκτέθηκαν σε διαφορετικούς ρυπαντές,έδειξε σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας και στους 3 ιστούς. Πίνακας 12. ραστικότητα της AChE στην αιµόλεµφο,τον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων, µετά από έκθεση σε διαφορετικούς οργανικούς ρυπαντές για 15 ηµέρες. Table 12.AChE activity in the haem olym ph,the digestive gland and the gills of mussels exposed to differentorganic pollutants for15 days. Αιµόλεµφος 0.3 mg/lpa H s 0.3 mg/l2.4-d 0.3 mg/llindane Control( ± 44.74) ± *,β A cetone 100 µg/l(423.2 ± 75.4 ) ± *,α ± *,α,β Πεπτικός αδένας 0.3 mg/lpa H s 0.3 mg/l2.4-d 0.3 mg/llindane Control(27.8 ± 3.06) γ ± 0.82 *,α A cetone 100 µg/l(34.51 ± 2.16) γ ± 1.7 *,α,β 15.3 ± 1.3 *,β Βράγχια 0.3 mg/lpa H s 0.3 mg/l2.4-d 0.3 mg/llindane Control(47.02 ± 1.1) ± 3.97 *,α,β A cetone 100 µg/l(45.36 ± 2.67) ± 2.96 *,α ± 2.01 *,β Τα αποτελέσµατα (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο.± SD 3 διαφορετικών µετρήσεων.για κάθε µέτρηση χρησιµοποιήθηκε ιστός από 10 ζώα.τα αστεράκια υποδηλώνουν σηµαντική διαφορά µεταξύ των τιµών AChE που µετρήθηκαν στους ιστούς ατόµων που εκτέθηκαν σε κάθε οργανική ουσία µε την αντίστοιχη οµάδα ελέγχου.οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη υποδηλώνουν σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (M ann-w hitney U-testanalysis,P<0.05). The results (nm ol/min/mg protein) are m eans ± SD of 3 independent measurem ents. In each m easurem ent, tissue of 10 animals w as used. Asterisks denote significant difference from the respective control value.values thatshare the sam e letter indicates significantdifference from each other(m ann-w hitney U-testanalysis,P<0.05). Κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας, οι τιµές της AChE στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των ατόµων ελέγχου κυµάνθηκαν σε παρόµοια επίπεδα,ενώ η ενζυµική δραστικότητα µειώθηκε αισθητά στην αιµόλεµφο ατόµων µετά από 15 ηµέρες,συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στην αιµόλεµφο

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 124 κατά την έναρξη της πειραµατικής διαδικασίας ( ± 7.54 nm ol/min/mg πρωτεΐνης κατά την έναρξη και ± nm ol/min/mg πρωτεΐνης µετά την έκθεση των 15 ηµερών). Άτοµα που εκτέθηκαν στο µίγµα των PA H s παρουσίασαν σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας σε όλους τους ιστούς, συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε σε άτοµα που εκτέθηκαν στην ακετόνη, ενώ µεγαλύτερη αναστολή της AChE παρατηρήθηκε σε άτοµα που εκτέθηκαν στο λινδάνιο. Άτοµα που εκτέθηκαν στο 2.4-D έδειξαν σηµαντική αναστολή της δραστικότητας της AChE σε όλους τους ιστούς,συγκριτικά µε τη δραστικότητα των ιστών ατόµων αναφοράς (Πίνακας 12) Μέτρηση ca M P: Παράλληλα µε τον προσδιορισµό των επιπέδων των ΜΤ και της δραστικότητας της AChE,πραγµατοποιήθηκε µέτρηση της συγκέντρωσης του ca M P στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, ατόµων που εκτέθηκαν στους διάφορους οργανικούς ρυπαντές.είναι αξιοσηµείωτο να αναφερθεί η ευαισθησία του συγκεκριµένου µορίου,µιας και κατά τη διάρκεια των 15 ηµερών έκθεσης παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση των επιπέδων του ca M P σε όλους τους ιστούς µέτρησης,σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στους ιστούς,πριν την έναρξη της πειραµατικής διαδικασίας (χρόνος 0),(Πίνακας 13). Πίνακας 13.Συγκέντρωση του ca M P στους ιστούς ατόµων ελέγχου στις 0 ηµέρες και 15 ηµέρες. Table 13.cA M P contentin the tissues ofunexposed mussels (controlanimals)at0 and 15 days. 0 ηµέρες 15 ηµέρες Πεπτικός αδένας ± α ± 5.36 α Βράγχια ± β ± 7.60 β Μανδύας/γονάδες ± 8.95 γ ± 2.74 γ Οι τιµές (pm olca M P/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο ± SD από 3 διαφορετικές µετρήσεις.για κάθε µέτρηση, χρησιµοποιήθηκε ιστός από 10 ζώα. Οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη υποδηλώνουν σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (M ann-whitney U-testanalysis,P<0.05). The results (pm olca M P/g w ettissue) are m eans ± SD from 3 independent measurem ents. In each m easurem ent,tissue of 10 anim als w as used. Values thatshare the sam e letter indicates significant difference from each other(m ann-w hitney U-testanalysis,P<0.05). Από τα αποτελέσµατα προκύπτει σηµαντική διαφοροποίηση των ιστών, σχετικά µε την απόκριση του ca M P στους οργανικούς ρυπαντές. Από τον

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 125 προσδιορισµό της συγκέντρωσης του ca M P µετά από έκθεση 15 ηµερών, παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, σε άτοµα που εκτέθηκαν σε 0.3 m g/l Λινδάνιο, συγκριτικά µε τη συγκέντρωση του ca M P που µετρήθηκε στον ίδιο ιστό ατόµων αναφοράς, αλλά και ατόµων που εκτέθηκαν σε ακετόνη ( ιάγραµµα 28α).Ανάλογα αποτελέσµατα προκύπτουν και στον πεπτικό αδένα ατόµων που εκτέθηκαν στη συγκεκριµένη ουσία,ενώ σηµαντική µείωση των επιπέδων του ca M P παρατηρήθηκε στα βράγχια ( ιαγράµµατα 28α και 29). Έκθεση των ατόµων σε µίγµα PA H s έδωσε αυξηµένες τιµές ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,σε σχέση µε τις αντίστοιχες τιµές σε άτοµα αναφοράς, ενώ δεν παρατηρήθηκε σηµαντική διαφορά των επιπέδων του ca M P, σε σχέση µε άτοµα που εκτέθηκαν σε ακετόνη ( ιάγραµµα 28β).Άτοµα τα οποία εκτέθηκαν σε 2.4-D παρουσίασαν σηµαντικά αυξηµένα επίπεδα ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και στον πεπτικό αδένα,σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε άτοµα ελέγχου, ενώ µειωµένες τιµές µετρήθηκαν στα βράγχια, συγκριτικά µε τις αντίστοιχες τιµές ατόµων ελέγχου ( ιαγράµµατα 28α,28β και 29). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα,µπορούµε να διαπιστώσουµε διαφορετική απόκριση των ιστών στους διάφορους οργανικούς ρυπαντές που χρησιµοποιήθηκαν στη συγκεκριµένη πειραµατική διαδικασία. Συγκεκριµένα, η οργανική ρύπανση φαίνεται ότι αυξάνει τη συγκέντρωση του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, ενώ µικρότερη αύξηση παρατηρείται στον πεπτικό αδένα. Αντίθετα, τα βράγχια φαίνεται να παρουσιάζουν διαφορετική απόκριση των επιπέδων του ca M P µετά από την επίδραση οργανικών ρυπαντών.

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 126 α ca M P πεπτικός αδένας 100 pm olca M P/g στού control acetone PAHs 2,4-D Lindane β ca M P (µανδύας/γονάδες) pm olca M P/g ιστού control acetone PAHs 2,4-D Lindane ιάγραµµα 28. Συγκέντρωση του ca M P α: στον πεπτικό αδένα και β: στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικούς οργανικούς ρυπαντές,για 15 ηµέρες.τα αποτελέσµατα (pm olca M P/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο.± SD,3 διαφορετικών µετρήσεων. Οι αστερίσκοι συµβολίζουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των τιµών που µετρήθηκαν σε κάθε ιστό, µετά από την επίδραση των οργανικών ουσιών (M ann-whitney U-test,P<0,05). Figure 28.cA M P levels in a:digestive gland and b:the mantle/gonad com plex ofm ussels exposed to differentorganic pollutants for15 days.the results (pm olca M P/g wetweightoftissue) are means ± SD from 3 differentm easurem ents.asterisks in the triangularm atrix representstatistically significant differences betw een ca M P values obtained in each tissue of animals exposed to different organic pollutants (M ann-w hitney U-test,P<0,05).

150 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 127 ca M P (βράγχια) pm olca M P/g ιστού control acetone PAHs 2,4-D Lindane ιάγραµµα 29. Συγκέντρωση του ca M P στα βράγχια µυδιών που εκτέθηκαν σε διαφορετικούς οργανικούς ρυπαντές,για 15 ηµέρες.τα αποτελέσµατα (pm olca M P/g υγρού βάρους ιστού)είναι οι Μ.Ο.± SD,3 διαφορετικών µετρήσεων.οι αστερίσκοι συµβολίζουν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των τιµών που µετρήθηκαν στον συγκεκριµένο ιστό, µετά από την επίδραση των οργανικών ουσιών (M ann-w hitney U-test,P<0,05). Figure 29.cA M P levels in the gills ofmussels exposed to differentorganic pollutants for15 days.the results (pm olca M P/g wetweightoftissue) are m eans ± SD from 3 differentm easurem ents.asterisks in the triangularmatrix representstatistically significantdifferences betw een ca M P values obtained in tissue ofanim als exposed to differentorganic pollutants (M ann-w hitney U-test,P<0,05) Ανάλυση συσχέτισης µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ, AChE και cam P),µετά από έκθεση µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές: Η ανάλυση συσχέτισης (correlation m atrices, Pearson test,p<0.05),µεταξύ της συγκέντρωσης των ΜΤ, της δραστικότητας της AChE και των επιπέδων του ca M P που προσδιορίστηκαν στους ιστούς ατόµων που εκτέθηκαν στις διαφορετικές οµάδες οργανικών ρυπαντών,έδειξε σηµαντικές συσχετίσεις µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (Πίνακας 14). Η αύξηση των επιπέδων των ΜΤ τόσο στον πεπτικό αδένα, όσο και στα βράγχια σχετίζεται σηµαντικά µε την αναστολή της δραστικότητας της AChE που παρατηρείται στους ιστούς ατόµων που εκτίθονται σε οργανικούς ρυπαντές (r= -0.95). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της ανάλυσης, παρατηρείται παρόµοια απόκριση των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια ατόµων που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρυπαντές (r = 0.98), ενώ ανάλογα αποτελέσµατα προκύπτουν από τη συσχέτιση των τιµών της δραστικότητας της AChE στην αιµόλεµφο τόσο µε τον πεπτικό αδένα (r= 0.88),όσο και µε τα βράγχια (r= 0.9).Συγκρίνοντας την µεταβολή

151 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 128 των επιπέδων των ΜΤ και της ενζυµικής δραστικότητας στους διάφορους ιστούς µέτρησης,µπορούµε να παρατηρήσουµε µια σηµαντική απόκριση των βιοχηµικών παραµέτρων,ως αποτέλεσµα της επίδρασης των οργανικών ρυπαντών.συγκεκριµένα, οι υψηλές τιµές ΜΤ στον πεπτικό αδένα ατόµων που εκτέθηκαν στους οργανικούς ρυπαντές σχετίζονται σηµαντικά µε την αναστολή της δραστικότητας της AChE τόσο στον συγκεκριµένο ιστό (r = -0.93),όσο και στην αιµόλεµφο (r = -0.97) και τα βράγχια (r= -0.86).Παρόµοια αποτελέσµατα προκύπτουν ανάµεσα στα επίπεδα των ΜΤ στα βράγχια και τη δραστικότητα της AChE στο συγκεκριµένο ιστό (r= -0.89), αλλά και την αιµόλεµφο και (r= -0.98),(Πίνακας 14). Πίνακας 14.Ανάλυση συσχέτισης µεταξύ των βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ,AChE και ca M P)στους ιστούς ατόµων ελέγχου και ατόµων που εκτέθηκαν στις διαφορετικές οµάδες οργανικών ουσιών (0.3 mg/lpa H s,0.3 mg/l2.4-d και 0.3 mg/llindane). Table 14.Correlation coefficients between biochem icalparam eters (M T,AChE and ca M P)measured in tissues ofcontrolm ussels and mussels exposed to three groups oforganics. MT DG M T G AChE H AChE DG AChE G cam P DG cam P G cam P M/G MT DG MT G AChE H AChE DG AChE G ca M P DG ca M P G ca M P M/G 1 ΜΤ DG:ΜΤ πεπτικού αδένα,μτ G:ΜΤ βραγχίων,ache H:AChE στην αιµόλεµφο,ache DG: AChE στον πεπτικό αδένα,ache G:AChE στα βράγχια,ca M P DG:επίπεδα ca M P στον πεπτικό αδένα, ca M P G : επίπεδα ca M P στα βράγχια, camp M/G: επίπεδα ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες.με διαφορετικό χρώµα (κόκκινο) παρουσιάζονται οι σηµαντικές συσχετίσεις που προέκυψαν από την στατιστική ανάλυση των τιµών (correlation matrices,pearson test,p<0.05,ν=5). ΜΤ DG:ΜΤ in digestive gland,μτ G:ΜΤ in gills; AChE H:AChE activity in the haem olym ph; AChE DG:AChE in the digestive gland;ache G:AChE activity in the gills; ca M P D G :ca M P levels in digestive gland;ca M P G:cA M P levels in gills;ca M P M/G:cA M P levels in mantle/gonad com plex. Different colour (red) represents significantly correlations am ong param eters as occurred afterstatisticalanalysis (correlation m atrices,pearson test,p<0.05,ν=5). Από την ανάλυση συσχέτισης µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντικές συσχετίσεις µεταξύ των γνωστών βιοχηµικών παραµέτρων (ΜΤ και AChE)µε την απόκριση του ca M P, ως αποτέλεσµα της έκθεσης των ατόµων σε οργανικούς ρυπαντές.σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της ανάλυσης,διαπιστώνεται σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ και του ca M P στον πεπτικό αδένα (r = 0.94). Ανάλογα αποτελέσµατα προκύπτουν µεταξύ των επιπέδων του ca M P που

152 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 129 µετρήθηκαν στον παραπάνω ιστό και των επιπέδων ΜΤ στα βράγχια ατόµων,µετά από έκθεσή τους σε διαφορετικές οµάδες οργανικών ρυπαντών (r= 0.98). Η δραστικότητα της AChE στους ιστούς ατόµων φαίνεται ότι σχετίζεται αρνητικά µε τα επίπεδα του ca M P. Σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας στα βράγχια και στην αιµόλεµφο ατόµων που εκτέθηκαν σε οργανικούς ρυπαντές,σχετίζεται µε σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P στον πεπτικό αδένα των ατόµων (r = και r = αντίστοιχα),(πίνακας 14). Σηµαντικά υψηλή συσχέτιση προκύπτει µεταξύ της ενζυµικής δραστικότητας της AChE και των επιπέδων του ca M P στον πεπτικό αδένα, χωρίς να µπορούµε να διαπιστώσουµε στατιστική διαφορά µεταξύ των µελετούµενων παραµέτρων (Pearson test,p<0.05).

153 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 130 ΜΕΡΟΣ Β ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΚΑ ΜΙΟ, ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS: 1. Επίδραση του καδµίου στην εισροή ιόντων Na + και στη µεταβολή της ενδοκυτταρικής τιµής ph (ph i)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα: Από τα αποτελέσµατα προκύπτει σηµαντική µεταβολή της ενδοκυτταρικής τιµής του ph (ph i),µετά από την επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων καδµίου ( ιάγραµµα 30).Συγκεκριµένα,µετά από έκθεση των κυττάρων για 30 λεπτά σε συγκέντρωση CdCl 2 50 µμ παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση του ph i(7.49 ± 0.01), σε σχέση µε κύτταρα τα οποία δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο (7.4 ± 0.004). 7,49 control Cd 0,05 µμ Cd 5 µμ Cd 50 µμ *a,b * a,b phi 7,45 Cd 500 µμ * * * *a *a 7,41 7, χρόνος (min) ιάγραµµα 30.Μεταβολή του ενδοκυτταρικού ph (ph i) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovinicalis,µετά από έκθεση των κυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2.Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ιστός από 4 ζώα.ο αστερίσκος * αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µε τα κύτταρα αναφοράς την αντίστοιχη χρονική στιγµή.οι τιµές µε το ίδιο γράµµα ως εκθέτη ( a, b ) αντιπροσωπεύουν σηµαντική διαφορά µεταξύ τους τη συγκεκριµένη χρονική στιγµή,(d unnet s test,p<0.01). Figure 30. The effect of different concentrations of cadm ium on intracellular ph (ph i) in isolated digestive gland cells of M ytilus galloprovincialis. Values are m eans ± SD of atleast7 independent experiments.in each experiment,the tissue offouranimals was used.* Indicates significantdifference aftercadm ium treatmentfrom the controlvalue atthe respective time point.values thatshare the sam e letter ( a,b )are statistically significantdifferentfrom each otheratthe sam e time point,(d unnet s test, P<0.01).

154 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 131 Η αύξηση του ph iγίνεται αντιληπτή από τα πρώτα κιόλας λεπτά της έκθεσης και συνεχίζεται µέχρι και το τέλος της επίδρασης (30 λεπτά),όπου και παρατηρείται η µέγιστη τιµή.σηµαντική αύξηση της τιµής του ph i,αλλά µικρότερη συγκριτικά µε την αύξηση που προέκυψε µετά από την επίδραση του µετάλλου σε συγκέντρωση 50 µμ,παρατηρήθηκε µετά από έκθεση των κυττάρων σε CdCl 2 5 και 500 µμ,ενώ µικρή µεταβολή της τιµής του ph iπαρατηρήθηκε µετά από έκθεση των κυττάρων σε CdCl µμ. Λαµβάνοντας υπόψη µας τα αποτελέσµατα την επίδρασης των διαφορετικών συγκεντρώσεων του µετάλλου, επιλέξαµε να συνεχίσουµε την πειραµατική µας διαδικασία µε τη συγκέντρωση του µετάλλου που δίνει την µεγαλύτερη µεταβολή του ph i. Η συγκέντρωση 50 µμ του µετάλλου έχει χρησιµοποιηθεί και σε άλλες µελέτες που εµπλέκουν το µέταλλο σε σηµατοδικούς µηχανισµούς (Canesiκαι συν.,1998). Παράλληλα µε τη µελέτη της µεταβολής του ph i, πραγµατοποιήθηκε προσδιορισµός του ρυθµού εισροής ιόντων νατρίου (Na + ).Συγκεκριµένα,κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν σε CdCl 2 (50 µμ)έδειξαν σηµαντική αύξηση του ρυθµού εισροής ιόντων Na + ( ιάγραµµα 31).Ο ρυθµός πρόσληψης ιόντων Na + σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο (2967 µmol/hr/10 6 κύτταρα) είναι σηµαντικά αυξηµένος, συγκριτικά µε το ρυθµό πρόσληψης ιόντων Na + σε κύτταρα αναφοράς (1074 µmol/hr/10 6 κύτταρα).το τελευταίο δεδοµένο,σε συνδυασµό µε την αύξηση της τιµής ph i που παρατηρείται µετά την επίδραση του µετάλλου, δείχνει την ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + στα κύτταρα,µετά από έκθεσή τους στο µέταλλο. Για την περεταίτω επιβεβαίωση του παραπάνω συµπεράσµατος, κρίθηκε σκόπιµη η αναστολή της αντλίας µε τη χρησιµοποίηση κατάλληλου αναστολέα και τη µελέτη τόσο των µεταβολών της τιµής του ph i,όσο και της µεταβολής του ρυθµού πρόσληψης ιόντων Na + σε κύτταρα στα οποία επιδρούµε µε CdCl 2 (50 µμ). Συγκεκριµένα,για την αναστολή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H +,κύτταρα πεπτικού αδένα προ-επωάστηκαν για 15 λεπτά µε EIPA (ethyl-n-isopropylam iloride),τελικής συγκένρωσης 20 nm και στη συνέχεια επωάστηκαν µε το µέταλλο για 30 λεπτά. Από τα αποτελέσµατα που προέκυψαν τόσο για την τιµή του ph i,όσο και για το ρυθµό εισροής ιόντων Na + µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο και στο ΕΙΡΑ,διαπιστώθηκε σηµαντική αναστολή τόσο στην αύξηση της τιµής του ph i,όσο και στο ρυθµό εισροής ιόντων Na + ( ιάγραµµα 31,Πίνακας 15).

155 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ,5 * Na influx (µm ol/hr/m illion of cells) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 control Cd Cd + EIPA Cd + Calphostin C Cd + Propranolole ιάγραµµα 31. Επίδραση του καδµίου και διαφόρων παραγόντων στην εισροή ιόντων Νa + (µmol Na + /hr/10-6 κύτταρα)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά µε CdCl 2 50 µμ,αλλά και µε το µέταλλο µαζί είτε µε ΕΙΡΑ 20 nm (ειδικός αναστολέας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + ),είτε µε calphostin C 20 nm (ειδικός αναστολέας της PK C),είτε µε propranolol10 µμ (ανταγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων).τα αποτελέσµατα είναι οι Μ.Ο. ± S.D.από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκε ιστός από 4 ζώα.ο αστερίσκος * αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο,µε τα κύτταρα αναφοράς,ενώ ο σταυρός αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε παράγοντα,µε τα κύτταρα που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο (D unnet s test,p<0.01). Figure 31. Effect of cadm ium and various effectors on N a + influx (µmol/hr/10-6 cells) in isolated digestive gland cells ofm ytilus gallopovincialis.cells were treated for30 m in eitherwith cadm ium at 50 µμ or cadm ium + EIPA 20 nm (a selective inhibitor of Νa + /H + exchanger), or cadm ium + calphostin C 20 nm (a specific inhibitor of PK C),or cadm ium + propranolol10µμ (a β-adrenergic antagonist).values are m eans ± SD of at least 4 independent experiments. In each experiment,the tissue of four anim als w as used. * Indicates significant difference betw een control value and that observed after metal treatment; Indicates significant difference between the value obtained after cadm ium treatm entand thatobtained aftercadm ium + effectortreatm ent,(dunnet s test,p<0.01). Εκτός από την αντλία ανταλλαγής ιόντων Νa + /H +, υπάρχουν και άλλα συστήµατα µεταφοράς, όπως η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + (sodium pum p),ο ανταλλάκτης Νa + /Ca ++,η αντλία Na/K-ATPase,καθώς και ο συµµεταφορέας Na-K- 2Cl -, που παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεταφορά ιόντων Na + διαµέσου της µεµβράνης των κυττάρων (Skou,1988).Τα παραπάνω συστήµατα ανταλλαγής ιόντων αναστέλλονται κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας (δες Υλικά και

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 133 Μέθοδοι).Επιπλέον,πειράµατα έδειξαν πως η αναστολή της αντλίας Cl - /HCO - 3 και της καρβονικής ανυδράσης,µε τη χρησιµοποίηση του αναστολέα της (DIDS)δεν φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο στην αύξηση του ph iπου παρατηρείται µετά από επίδραση του µετάλλου. Πίνακας 15.Μεταβολές του ενδοκυτταρικού ph (ph i)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα που επωάστηκαν για 30 λεπτά µε CdCl 2 (50 µμ) µαζί µε διάφορους ανταγωνιστές και µε ΕΙΡΑ. Τα αποτελέσµατα συγκρίνονται τόσο µε κύτταρα τα οποία δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο, όσο και µε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε κάθε ανταγωνιστή και µε ΕΙΡΑ χωριστά. Table 15.Changes ofintracellularph (ph i)in isolated digestive gland cells after30 m in incubation of cells with CdCl 2 (50 µμ)plus various antagonists oreipa and after incubation ofthe cells with each antagonistoreipa alone. ph i 0 min 30 min ph i Controlcells 7.4 ± ± a CdCl 2 50 µμ 7.4 ± ± a CdCl 2 50 µμ + EIPA 20 nm 7.4 ± ± EIPA 20 nm 7.4 ± ± CdCl 2 50 µμ + Propranolol10 µμ 7.4 ± ± Propranolol10 µμ 7.4 ± ± CdCl 2 50 µμ + Prazosin 1 µμ 7.4 ± ± Prazosin 1 µμ 7.4 ± ± CdCl 2 50 µμ + Metoprolol1 µμ 7.4 ± ± Metoprolol1 µμ 7.4 ± ± Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D.των τιµών που προέκυψαν από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη αντιπροσωπεύουν σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ τους, όπως προκύπτει µετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (D unnet s test,p<0,01).οι τιµές του ph iκυττάρων τα οποία επωάστηκαν µε το µέταλλο διαφέρουν σηµαντικά από τις τιµές του ph iσε κύτταρα που επωάστηκαν µε το µέταλλο µαζί µε κάθε ανταγωνιστή,αλλά και σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε κάθε ανταγωνιστή χωριστά (D unnet s test,p<0.01). Values are m eans ± SD ofatleast7 differentexperiments.values thatshare the sam e letter indicate statistically significant difference from each other (Dunnet s test,p<0.01).the value obtained after treatm entwith cadm ium alone is significantly differentfrom allvalues obtained in the presence of antagonistoreipa alone and antagonists oreipa togetherwith cadm ium (Dunnet s test,p<0.01). Πρόσφατες µελέτες σε κύτταρα σπονδυλωτών έδειξαν πως η ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + µπορεί να γίνει µέσω της πρωτεϊνικής κινάσης C (PK C),(Kaloyianniκαι συν.,2001;bourikas και συν.,2003).

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 134 phi 7,53 7,51 7,49 7,47 7,45 7,43 7,41 control Cd PMA Cd + Calphostin C * * * * * * * * * * 7,39 7,37 * 7, χρόνος (min) ιάγραµµα 32.Μεταβολή του ενδοκυτταρικού ph (ph i) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, µετά από έκθεση των κυττάρων σε κάδµιο και διάφορους παράγοντες.τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά τόσο µε CdCl 2 50 µμ,όσο και µε PM A 10 nm (ενεργοποιητής της PK C),αλλά και µε το µέταλλο µαζί µε calphostin C 20 nm (ειδικός αναστολέας της PK C).Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ιστός από 4 ζώα.ο αστερίσκος * αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο ή στο PM A συγκριτικά µε τα κύτταρα αναφοράς την αντίστοιχη χρονική στιγµή,(d unnet s test,p<0.01). Figure 32.The effectof cadm ium 50 µμ and/or various effectors on ph iofisolated digestive gland cells ofmytilus galloprovincialis.cells were treated for 30 min eitherwith cadm ium 50 µμ or PM A 10 nm (a potentactivator of PK C)alone,or cadm ium together with calphostin C 20 nm (a specific inhibitorofpk C).Values are means ± SD ofatleast7 independentexperiments.in each experiment, the tissue of fouranimals was used.* Indicates significantdifference between the values obtained after treatmentof the cells with cadm ium or with PM A and the control value atthe respective time point, (Dunnet s test,p<0.01). Λαµβάνοντας υπόψη µας το ρόλο που παίζει η PK C σε σηµατοδοτικούς µηχανισµούς, κρίθηκε σκόπιµο να µελετηθεί το ενδεχόµενο η ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (µεταβολές που συντελούνται τόσο στο ενδοκυτταρικό ph,όσο και στο ρυθµό εισροής ιόντων Na + )να γίνεται µέσω της PK C. Γι αυτό τον σκοπό έγινε έκθεση των κυττάρων για 30 λεπτά σε έναν φορβολαστέρα,pm A 10 nm,που ενεργοποιεί την PK C και µελετήθηκε η µεταβολή του ph i. Τα αποτελέσµατα της έκθεσης των κυττάρων στη συγκεκριµένη ουσία ήταν ανάλογα

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 135 µε αυτά του µετάλλου,γεγονός που δείχνει πως το κάδµιο µπορεί να επάγει την ενεργοποίηση της PK C και της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + ( ιάγραµµα 32). Επίσης, κύτταρα προ-επωάστηκαν µε calphostin C (20 nm ),που αποτελεί έναν ισχυρό αναστολέα της PK C και µελετήθηκε η αλλαγή του ph i,καθώς και η εισροή ιόντων Na +,µετά την προσθήκη του µετάλλου.τα αποτελέσµατα της έκθεσης έδειξαν σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του µετάλλου τόσο στη µεταβολή του ph i,όσο και στο ρυθµό εισροής ιόντων Νa +,γεγονός που αποδεικνύει την ενεργό συµµετοχή της PKC στη διαδικασία ενεργοποίησης της αντλίας Na + /H + ( ιαγράµµατα 31 και 32). Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός πως η αναστολή των β-αδρενεργικών υποδοχέων,µε χρησιµοποίηση propranolol 10 µμ,ανέστειλε σηµαντικά τη δράση του µετάλλου τόσο στην τιµή του ph i,όσο και στην αύξηση της εισροής ιόντων Na + ( ιάγραµµα 31,Πίνακας 15).Ανάλογα αποτελέσµατα προκύπτουν και µετά από προεπώαση των κυττάρων µε ανταγωνιστές των β 1 - και α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων (metoprolol1 µμ και prazosin 1 µμ αντίστοιχα),(πίνακας 15).Τα αποτελέσµατα αυτά οδηγούν στο συµπέρασµα πως το κάδµιο πιθανό να επιδρά µέσω των αδρενεργικών υποδοχέων, επάγοντας σηµατοδοτικό µηχανισµό στον οποίο συµµετέχει η PK C, καθώς και η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. 2. Επίδραση του καδµίου στη δραστικότητα της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ): Εκτός από τη µελέτη των επιπτώσεων του καδµίου στο ενδοκυτταρικό ph (ph i)και στο ρυθµό εισροής ιόντων Na +,προχωρήσαµε στη µελέτη των επιπτώσεων του µετάλλου στη δραστικότητα της πυροσταφυλικής κινάσης (PΚ),που αποτελεί κύριο ρυθµιστικό ένζυµο του γλυκολυτικού µονοπατιού. Πειράµατα έκθεσης αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου (0.05,5,50 και 500 µμ)για 30 λεπτά,έδειξαν σηµαντική αύξηση της ενζυµικής δραστικότητας (Πίνακας 16). Συγκεκριµένα,κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο έδειξαν σηµαντική αύξηση της δραστικότητας της ΡΚ,µε τη µέγιστη τιµή να παρατηρείται µετά από έκθεση σε τελική συγκέντρωση µετάλλου 50 µμ (11.69 ± 2.08 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),ενώ σηµαντικά υψηλή ήταν και η δραστικότητα που µετρήθηκε µετά από έκθεση σε CdCl 2 τελικής συγκέντρωσης 500 µμ (8 ± 1.75 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 136 συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mg πρωτεΐνης). Πίνακας 16. Μεταβολή της δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση των κυττάρων για 30 λεπτά σε διαφορετικές συγκεντρώσεις CdCl 2. Table 16 EffectofCdCl 2 (50 µμ)on pyruvate kinase (PK )activity aftertreatmentofisolated digestive gland cells for30 min with differentconcentrations ofcdcl 2. % δραστικότητα της ΡΚ Controlcells ± CdCl µμ ± b CdCl 2 50 µμ ± a CdCl µμ ± a,b Το 100% της ενζυµικής δραστικότητας αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα των κυττάρων αναφοράς (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgrπρωτεΐνης).οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς) είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. Ο εκθέτης a αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο, µε τα κύτταρα αναφοράς, ενώ ο εκθέτης b αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των τιµών της ενζυµικής δραστικότητας των κυττάρων που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου, µε τη δραστικότητα σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε συγκέντρωση 50 µμ,για 30 λεπτά (Dunnet s test,p<0.01). 100% represents enzym e activity in the absence ofcdcl 2 (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgrprotein).values (% ofcontrolvalue)are means ± SD ofatleast7 independentexperiments.in each experiment,tissue from four animals w as used. a Indicates significantdifference betw een treated cells and the control cells; b Indicates significantdifference betw een cells treated with differentconcentrations ofcadm ium com pared to cells treated with cadm ium 50 µμ for30 m in (Dunnet s test,p<0.01). Έκθεση των κυττάρων σε CdCl 2 συγκέντρωσης 0.05 µμ δεν έδειξε σηµαντική αύξηση της δραστικότητας της ΡΚ (6.07 ± 1.23 nm ol/min/mg πρωτεΐνης),συγκριτικά µε τη δραστικότητα του ενζύµου σε κύτταρα ελέγχου (Πίνακας 16 και 17). Η δραστικότητα της ΡΚ σε κύτταρα που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο,κυµάνθηκε σε παρόµοια επίπεδα κατά τη χρονική διάρκεια των 30 λεπτών. Η επαγωγή της δραστικότητας της ΡΚ σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα των µυδιών µετά από έκθεση σε κάδµιο,σε συνδυασµό µε τις επιπτώσεις του µετάλλου τόσο στην αλλαγή της ενδοκυτταρικής τιµής ph µέσω της ενεργοποίησης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, όσο και στην επαγωγή σηµατοδοτικού µηχανισµού που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της PK C, µας οδήγησε στην περεταίρω µελέτη του πιθανού ρόλου που διαδραµατίζουν οι παραπάνω παράγοντες στο γλυκολυτικό µονοπάτι.προς αυτή την κατεύθυνση,κρίθηκε αναγκαία η µελέτη του ρόλου τόσο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, όσο και της PK C στη µεταβολή της δραστικότητας του γλυκολυτικού ενζύµου, µετά από έκθεση των

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 137 κυττάρων στο µέταλλο. Γι αυτό το σκοπό χρησιµοποιήθηκαν ουσίες που αναστέλλουν τη δράση της PK C και της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,αλλά και ουσίες που ενεργοποιούν την PK C. Πίνακας 17. Μεταβολή της δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα µετά από έκθεση των κυττάρων σε CdCl 2 (50 µμ),για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Table 17. Effect of CdCl 2 (50 µμ) on pyruvate kinase (PK ) activity after treatmentof isolated digestive gland cells fordifferentperiods oftim e. Time (min) % δραστικότητα της ΡΚ ± ± b ± 3.14 a,b ± 6.22 a,b ± 5.61 a,b ± a Το 100% της ενζυµικής δραστικότητας αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα των κυττάρων αναφοράς (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgrπρωτεΐνης).οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς) είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. Ο εκθέτης a αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο, µε τα κύτταρα αναφοράς, ενώ ο εκθέτης b αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των τιµών της ενζυµικής δραστικότητας των κυττάρων που εκτέθηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους,µε τη δραστικότητα σε κύτταρα που εκτέθηκαν στο µέταλλο για 30 λεπτά (D unnet s test,p<0.01). 100% represents enzym e activity in the absence of (50 µμ) CdCl 2 (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgr protein).values (% ofcontrolvalue)are means ± SD ofatleast7 independentexperiments.in each experiment,tissue from fouranimals was used. a Indicates significantdifference betw een treated cells and the controlcells; b Indicates significantdifference betw een cells treated for differentperiods of time com pared to cells treated with cadm ium for30 min (D unnet s test,p<0.01) Ενεργοποίηση της PK C,µετά από έκθεση κυττάρων για 30 λεπτά σε PM A (10 nm ),οδήγησε σε σηµαντική αύξηση της δραστικότητας της ΡΚ,σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά του µετάλλου,ενώ ταυτόχρονη έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο και στον ενεργοποιητή της PK C έδειξε συνεργητική δράση (Πίνακας 18). Αναστολή της PK C,τόσο µε χρήση staurosporine,τελικής συγκέντρωσης 20 nm, (αντιβιοτικό ΑΜ-2282, από τον µύκητα Streptom yces sp., που αποτελεί αναστολέα της PK C),όσο και µε τη χρήση calphostin C,ίδιας συγκέντρωσης,(ειδικό αναστολέα της PK C),οδήγησε σε σηµαντική µείωση της ενζυµικής δραστικότητας µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο, συγκριτικά µε τα επίπεδα της δραστικότητας που µετρήθηκαν σε κύτταρα που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο (Πίνακας 19). Παρόµοια αναστολή παρατηρήθηκε µετά από προ-επώαση των

161 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 138 κυττάρων µε ανταγωνιστές των α 1 -,β-και β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (prazosin 1 µμ,propranolol10 µμ και metoprolol1 µμ αντίστοιχα),(πίνακας 19). Πίνακας 18. Μεταβολή της δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση των κυττάρων σε CdCl 2 (50 µμ),σε διάφορους αγωνιστές και σε ΡΜΑ. Table 18.Effectofcadm ium,various agonists and PM A on pyruvate kinase (PK )activity of isolated digestive gland cells. % δραστικότητα της ΡΚ Controlcells ± CdCl 2 50 µμ ± a,b,c,d,e,f,g PM A 10 nm ± a,h CdCl 2 50 µμ + PM A 10 nm ± a,b,h Adrenalin 5,5 nm ± a,c,i CdCl 2 50 µμ + A drenalin 5.5 nm ± d,i Isoprenaline 1 µμ ± e CdCl 2 50 µμ + Isoprenaline 1 µμ ± f Phenylephrine 1 µμ ± a,k CdCl 2 50 µμ + Phenylephrine 1 µμ ± a,g,k Το 100% της ενζυµικής δραστικότητας αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα των κυττάρων αναφοράς (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgrπρωτεΐνης).οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς) είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. Ο εκθέτης a αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στις διάφορες ουσίες,µε τα κύτταρα αναφοράς.οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους (D unnet s test,p<0.01). 100% represents enzym e activity in the absence ofcdcl 2 (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgrprotein).values (% of controlvalue)are means ± SD ofatleast7 independentexperiments.in each experiment,tissue from four animals w as used. a Indicates significant difference between treated cells and the control cells; V alues that share the sam e letter are significantly different from each other,(d unnet s test, P<0,01). Για τη µελέτη του ρόλου της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στην επαγωγή της ενζυµικής δραστικότητας, χρησιµοποιήθηκαν τόσο ο ειδικός αναστολέας της αντλίας (ΕΙΡΑ 20 nm ),όσο και ο αναστολέας άλλων µεταφορέων νατρίου (αµιλορίδιο 10 µμ). Από τα αποτελέσµατα της έκθεσης κυττάρων στο µέταλλο,αφού προηγουµένως είχαν προ-επωαστεί µε τους αναστολείς,προκύπτει σηµαντική αναστολή της δραστικότητας της ΡΚ,σε σχέση µε τα αυξηµένα επίπεδα δραστικότητας που µετρήθηκαν σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο, απουσία των αναστολέων ( ιάγραµµα 33).

162 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 139 Πίνακας 19. Μεταβολή της δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση των κυττάρων για 30 λεπτά σε CdCl 2 (50 µμ) µαζί µε διάφορους ανταγωνιστές.τα αποτελέσµατα συγκρίνονται τόσο µε κύτταρα τα οποία δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο,όσο και µε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε κάθε ανταγωνιστή χωριστά. Table 19.Pyruvate kinase (PK )activity aftertreatm entofisolated digestive gland cells w ith different antagonists alone or together with CdCl 2 (50 µμ).values com pared to either control cells or cells treated with each antagonistalone. ραστικότητα της ΡΚ (nm ol/min/mg πρωτεΐνης) Control(30 min) ± CdCl 2 50 µμ ± a CdCl 2 50 µμ + Prazosin 1 µμ ± b CdCl 2 50 µμ + Metoprolol1 µμ ± a CdCl 2 50 µμ + Propranolol10 µμ ± CdCl 2 50 µμ + Staurosporine 20 nm ± a,b CdCl 2 50 µμ + Calphostin C 20 nm ± Prazosin 1 µμ ± Metoprolol1 µμ ± Propranolol10 µμ ± Staurosporine 20 nm ± Calphostin C 20 nm ± Οι τιµές(nm ol/min/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα.όλες οι τιµές διαφέρουν σηµαντικά από την τιµή των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο (D unnet s test, P<01). Ο εκθέτης a αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στις διάφορες ουσίες, µε τα κύτταρα αναφοράς,ενώ ο εκθέτης b αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των τιµών της ενζυµικής δραστικότητας των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε ανταγωνιστή, µε τις αντίστοιχες τιµές των κυττάρων που εκτέθηκαν σε κάθε ανταγωνιστή χωριστά (Dunnet s test, P<0.01). Values (nm ol/min/mg protein)are means ± SD of atleast7 independentexperiments.allvalues are significantly different from those obtained after treatm ent with cadm ium alone (Dunnet s test P<0.01). a Indicates significantdifference between values obtained from treated cells and the control value; b Indicates significant difference betw een cells treated w ith cadm ium plus each antagonist value and cells treated with each antagonistalone,(d unnet s test,p<0,01).

163 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ * PK activity (% of controlvalues) control C d C d + EIPA Cd + Am iloride ιάγραµµα 33.Επίδραση του καδµίου,καθώς και των αναστολέων της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H +,στη δραστικότητα της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά µε το µέταλλο, καθώς και µε το µέταλλο µαζί µε ΕΙΡΑ 20 nm (ειδικό αναστολέα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + )και µε am iloride 10 µμ (αναστολέα των περισσότερων συστηµάτων µεταφοράς ιόντων Νa + της πλασµατικής µεµβράνης των κυττάρων).το 100% της ενζυµικής δραστικότητας αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα των κυττάρων αναφοράς (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mgr πρωτεΐνης). Οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς)είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα.ο αστερίσκος * αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο,µε τα κύτταρα αναφοράς,ενώ ο σταυρός αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε παράγοντα,µε τα κύτταρα που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο (Dunnet s test,p<0.01). Figure 33.Effectof cadm ium alone and cadm ium together w ith N H E inhibitors on PK activity of isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis. Cells w ere treated fro 30 m in either with cadm ium 50 µμ alone or with cadm ium together with EIPA 20 nm (a specific inhibitor of Νa + /H + exchanger)or cadm ium together with am iloride 10 µμ (an inhibitor of mostplasma membrane N a + transport system s. 100% represents enzym e activity in the absence of cadm ium (5.23 ± 1.04 nm ol/min/mg protein).the results (expressed as % PK activity of controlvalue)are mean ± SD ofat least 7 independent experiments. In each experiment,tissue from 4 animals w as used. * Indicates significant difference betw een the value after cadm ium treatmentand the control value; Indicates significantdifference between the values after cadm ium treatmenttogether with those observed after cadm ium togetherw ith the inhibitors,(d unnet s test,p<0.01). Η έκθεση των κυττάρων σε κάθε αναστολέα χωριστά,δεν παρουσίασε καµία µεταβολή της ενζυµικής δραστικότητας, συγκριτικά µε τη δραστικότητα που µετρήθηκε σε κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 19).

164 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση αγωνιστών των α-και β-αδρενεργικών υποδοχέων στη µεταβολή του ph iκαι στη δραστικότητα της ΡΚ: Εκτός από τις επιπτώσεις του µετάλλου στη µεταβολή του ph i και στη δραστικότητα της ΡΚ, προχωρήσαµε στη µελέτη του ρόλου των α- και β- αδρενεργικών υποδοχέων. Συγκεκριµένα, αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα εκτέθηκαν για 30 λεπτά σε µια σειρά ουσιών που αποτελούν αγωνιστές των α-και β- αδρενεργικών υποδοχέων και στη συνέχεια προσδιορίστηκε η µεταβολή του ph iκαι η δραστικότητα της ΡΚ.Επίδραση αδρεναλίνης,τελικής συγκέντρωση 5.5 nm,ενός αγωνιστή των α-και β-αδρενεργικών υποδοχέων,οδήγησε σε σηµαντική αύξηση του ph i,σε επίπεδα σηµαντικά υψηλότερα,σε σχέση µε αυτά που µετρήθηκαν µετά την έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο (Πίνακας 20).Ανάλογη αύξηση παρατηρήθηκε και στη δραστικότητα της ΡΚ (Πίνακας 18). Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός που παρατηρήθηκε µετά από ταυτόχρονη έκθεση των κυττάρων στην ορµόνη και το µέταλλο,κατά την οποία το ph iτων κυττάρων,παρ όλο που αυξήθηκε σηµαντικά σε σχέση µε την τιµή των κυττάρων αναφοράς, κυµάνθηκε σε χαµηλότερα επίπεδα, συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στην περίπτωση που τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κάθε ουσία χωριστά (Πίνακας 20). Παρόµοια αποτελέσµατα προέκυψαν και µετά την µέτρηση της δραστικότητας της ΡΚ, γεγονός που υποδηλώνει µια συνεργητική δράση του µετάλλου και της ορµόνης (Πίνακας 18). Έκθεση των κυττάρων σε isoprenaline 1 µμ,αγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων, καθώς και σε phenylephrine 1 µμ, αγωνιστή των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων,προκάλεσε σηµαντική αύξηση του ph iκαι της ενζυµικής δραστικότητας (Πίνακας 18 και 20).Η µέγιστη επίδραση των ουσιών τόσο στην τιµή του ph i,όσο και στη δραστικότητα του ενζύµου,παρατηρήθηκε µετά από 15 λεπτά έκθεσης,ενώ ακολούθησε µια µικρή,αλλά σηµαντικά αυξηµένη,µείωση της τιµής ph i,συγκριτικά µε τις τιµές που µετρήθηκαν στα κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 18 και 20).Από τα εξαγόµενα αποτελέσµατα µπορούµε να διαπιστώσουµε συνεργητική δράση µεταξύ των ορµονών και του µετάλλου τόσο στη µεταβολή του ph i, όσο και στη δραστικότητα της ΡΚ.

165 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 142 Πίνακας 20.Μεταβολή του ενδοκυτταρικού ph (ph i)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση των κυττάρων σε CdCl 2 (50 µμ) µαζί µε διάφορους αγωνιστές των αδρενεργικών υποδοχέων,καθώς και ΡΜΑ. Table 20.Effect of CdCl 2 (50 µμ),different agonists of adrenergic receptors and PM A on ph i of isolated digestive gland cells. ph i (0 min) (30 min) ph i Controlcells 7.4 ± ± CdCl 2 50 µμ 7.4 ± ± a CdCl 2 50 µμ + A drenalin 5.5 nm 7.4 ± ± a,c Adrenalin 5,5 nm 7.4 ± ± a,b CdCl 2 50 µμ + Isoprenaline 1 µμ 7.4 ± ± a,c Isoprenaline 1 µμ 7.4 ± ± a CdCl 2 50 µμ + Phenylephrine 1 µμ 7.4 ± ± a,c Phenylephrine 1 µμ 7.4 ± ± a CdCl 2 50 µμ + PM A 10 nm 7.4 ± ± a,c PM A 10 nm 7.4 ± ± a,b Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D. από τουλάχιστον 7 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα.ο εκθέτης a αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στις διάφορες ουσίες και των κυττάρων αναφοράς. Ο εκθέτης b αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε αγωνιστή και των κυττάρων που εκτέθηκαν αντίστοιχα σε κάθε αγωνιστή χωριστά ή στο ΡΜΑ.Ο εκθέτης c αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε αγωνιστή και των κυττάρων που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο,όπως προκύπτει µετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (D unnet s test,p<0.01). Values are m eans ± SD ofatleast7 independentexperim ents. In each experim ent,tissue from four animals was used. a Indicates significantdifference betw een treated cells and controlcells; b Indicates significant difference between values from cells incubated w ith cadm ium plus each agonist and the value from cells incubated with each agonistorpm A alone; c Indicates significantdifference between values from cells incubated w ith cadm ium plus each of the agonists and those from cells incubated with cadm ium alone,(dunnet s test,p<0.01) Επιπλέον,η συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H + στην επαγωγή της δραστικότητας της ΡΚ φαίνεται να ενισχύεται και από τη σηµαντική συσχέτιση που παρατηρείται µεταξύ της κινητικής συµπεριφοράς της ενδοκυτταρικής τιµής ph και της δραστικότητας της ΡΚ,κατά τη διάρκεια έκθεσης των κυττάρων στο µέταλλο ( ιάγραµµα 34).

166 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 143 7, ,5 7,48 7,46 r=0,86 κινητική της ΡΚ κινητική phi phi 7,44 7, % PK activity 7,4 7,38 4 7,36 2 7, time (m in) ιάγραµµα 34.Συσχετισµός µεταξύ της ενζυµικής δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) και της µεταβολής του ενδοκυτταρικού ph (ph i) που οφείλονται στην ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H +,µετά την έκθεση κυττάρων σε κάδµιο 50 µμ.η ανάλυση Pearson test (correlation m atrices),έδειξε σηµαντική συσχέτιση της απόκρισης της αντλίας και της ΡΚ (r=0.86), γεγονός που ενισχύει το ρόλο και τη συµµετοχή τους στο µονοπάτι µετάδοσης µηνύµατος που επάγεται µετά την επίδραση του µετάλλου. Figure 34.Correlation between PK activity and ph ielevation via Νa + /H + exchanger activation,after treatm entofthe isolated digestive gland cells ofm ytilus galloprovincialis w ith cadm ium (Pearson t- test, P<0.05),. The strong correlation (r=0.86) between these two param eters m ay indicate the im portantrole and the participation ofboth PK and the exchangerin the signalpathw ay induced after heavy m etaltreatm entofthe cells.

167 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παραγωγή δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση σε κάδµιο: Για τον προσδιορισµό των παραγόµενων δραστικών µορφών οξυγόνου, επιλέχθηκε η µελέτη των σουπεροξειδικών ριζών (Ο - 2 )που παράγονται,µετά από την επίδραση του καδµίου σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού. Η συγκεκριµένη επιλογή έγινε λόγω της συµµετοχής του οξυγόνου και των ριζών του σε όλες τις αντιδράσεις που οδηγούν στην δηµιουργία όλων των υπόλοιπων δραστικών µορφών οξυγόνου (H 2 O 2, OH -, OH. και HNO - 2 ), (Hermes-Lima και συν., 2001). Επιπλέον,οι µεταβολές των παραγόµενων ROS µελετήθηκαν σε συνδυασµό µε την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, την PK C καθώς και του ca M P, λόγω της συµµετοχής τους σε σηµατοδοτικούς µηχανισµούς του κυττάρου (Adler και συν., 1999). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης, κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν για 30 λεπτά σε CdCl 2 (50 µmol/l)παρουσίασαν σηµαντική αύξηση των επιπέδων Ο - 2, συγκριτικά µε κύτταρα αναφοράς ( ιάγραµµα 35). Επιπλέον, σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε το αντιοξειδωτικό ένζυµο της υπεροξειδικής δισµουτάσης (SOD), προσδιορίστηκαν παρόµοια επίπεδα Ο - 2 µε αυτά που µετρήθηκαν σε κύτταρα αναφοράς ( ιάγραµµα 35). Το γεγονός αυτό δείχνει µια ασήµαντη επιβάρυνση των κυττάρων σε ROS,ενώ αποδίδει τη σηµαντική αύξηση των παραγόµενων δραστικών µορφών οξυγόνου στην παρουσία του µετάλλου. Συγκεκριµένα,παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης των ROS σε κύτταρα που εκτέθηκαν στο µέταλλο ( ± /mg πρωτεΐνης), συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε κύτταρα αναφοράς ( ± 64.82/mg πρωτεΐνης),( ιάγραµµα 36,Πίνακας 21).

168 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ * ** 140 % of controlvalue control control+ SOD Cd Cd + EIPA Cd + calphostin C ιάγραµµα 35.Παραγωγή σουπεροξειδικών ριζών (Ȯ 2 - ) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεση σε κάδµιο.κύτταρα εκτίθενται για 30 λεπτά σε CdCl 2 (50 µmol/l) µαζί ή χωρίς την παρουσία αναστολέα της αντλίας Na + /H + (EIPA 20 nm ol/l) ή αναστολέα της PK C (calphostin C 20 nm ol/l).οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς) είναι οι M.O ± S.D. από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. * υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων αναφοράς και των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο. ** υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που επωάστηκαν µε SO D και των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο. υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε αναστολέα,µε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο (Dunnet s test, P<0.01). Figure 35. Superoxide anion (Ȯ 2 - ) production in isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis after treatmentwith cadm ium and various effectors. Cells w ere treated for 30 m in with CdCl 2 50 µμ alone orcadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA (a selective inhibitorofna + /H + exchanger) or cadm ium 50 µμ + 20 nm calphostin C (a specific inhibitor of protein kinase C).Values (% of controlvalue)are means ± SD ofatleast6 independentexperiments.in each experiment,the tissue of four animals w as used. * indicate significant difference between the controlvalue and thatobtained after cadm ium treatment;** indicate significantdifference between the control+ SO D value and that obtained after cadm ium treatment; indicate significant difference between value obtained after cadm ium treatm entand thatobtained aftercadm ium + effectortreatm ent(dunnet s test,p<0.01).

169 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ * % ofcontrolvalue ** ** 40 0 control Cd Cd + EIPA Cd + calphostin C ιάγραµµα 36. Παραγωγή ROS σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεση σε κάδµιο.κύτταρα εκτίθενται για 30 λεπτά σε CdCl 2 (50 µmol/l) µαζί ή χωρίς την παρουσία αναστολέα της αντλίας Na + /H + (EIPA 20 nm ol/l)ή αναστολέα της PK C (calphostin C 20 nm ol/l).οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς)είναι οι Μ.Ο ± S.D. από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράµατα. Το 100% αντιστοιχεί στον λόγο 495/525 φθορισµού/mg πρωτεϊνης των κυττάρων αναφοράς ( ± 64.82/mg ofπρωτεΐνης). Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. * υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων αναφοράς και των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο. ** υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων αναφοράς και των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο, µετά από την επίδραση του αναστολέα. υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο µαζί µε κάθε αναστολέα και των κυττάρων που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο (D unnet s test,p<0.01). Figure 36.ROS production in isolated digestive gland cells ofmytilus galloprovincialis aftertreatment with cadm ium and various effectors. Cells w ere treated for 30 m in w ith cadm ium 50 µμ alone or cadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA ;or cadm ium 50 µμ + 20 nm calphostin C.Values (% of control value) are means ± SD ofatleast6 independentexperiments.100% represents 495/525 fluorescence ratio in the absence ofcadm ium ( ± 64.82/mg ofprotein).in each experiment,the tissue offour anim als w as used. * indicate significant difference betw een control value and that observed after cadm ium treatment; ** indicate significant difference between the control + SO D value and that obtained after cadm ium + effector treatment; indicates significant difference between the value obtained aftercadm ium treatm entw ith thatobtained aftercadm ium + effectortreatm ent(d unnet s test, P<0.01).

170 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 147 Πίνακας 21. Παραγωγή ROS σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα κύτταρα επωάζονται σε φυσιολογικό διάλυµα PS χωρίς ή µε την παρουσία αναστολέα της διάσπασης του ca M P (IBM X 0.05 mmol/l)και στη συνέχεια εκτίθενται στο µέταλλο µε ή χωρίς την παρουσία EIPA (20 nm ol/l)ή ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης που συµβάλλει στη βιοσύνθεση του ca M P (forskolin 0.01 mmol/l). Table 21.ROS production in isolated digestive gland cells suspensions of Mytilus galloprovincialis. Cells, incubated either in physiological saline buffer (PS) or in PS + IBM X (an inhibitor of ca M P breakdow n),were treated with cadm ium 50 µμ or cadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA orforskolin 0.01 mm (a potentactivatorofadenylate cyclase and the biosynthesis ofca M P). Κύτταρα χωρίς ΙΒΜΧ Κύτταρα,παρουσία IB M X 0.05 mm Control ± a,b ± f,g CdCl 2 50 µμ ± a,c,d ± h,i,f CdCl 2 50 µμ + EIPA 20 nm ± b,c,e ± j,h,g Forskolin 0.01 mm ± d,e ± j,i Οι τιµές (ο λόγος 495/525 φθορισµού/mg πρωτεΐνης ) είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα,χρησιµοποιήθηκε ο ιστός 4 ατόµων. Σε κάθε στήλη,οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη αντιπροσωπεύουν σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ τους, όπως προκύπτει µετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (D unnet s test,p<0.01). Values (495/525 nm fluorescence ratio/mg protein) are m eans ± SD of at least 6 independent experiments.in each experiment,the tissue of four animals was used.values,in each colum n,that share the sam e letter indicate statistically significant difference from each other (Dunnet s test, P<0.01). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν πως η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + παίζει σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία παραγωγής δραστικών µορφών οξυγόνου, µετά από την επίδραση του µετάλλου. Συγκεκριµένα, σε κύτταρα στα οποία ανεστάλλει η δράση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, µε τη - χρησιµοποίηση ΕΙΡΑ (20 nm ol/l),διαπιστώθηκαν σηµαντικά µικρότερα επίπεδα Ο 2 και ROS,µετά από έκθεση σε CdCl 2 (50 µmol/l),συγκριτικά µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο,απουσία του αναστολέα ( ιαγράµµατα 35 και 36).Ανάλογη έκθεση κυττάρων στα οποία ανεστάλλει η δράση της PK C µε χρησιµοποίηση calphostin C (20 nm ol/l),έδειξε σηµαντική µείωση των επιπέδων τόσο των Ο - 2,όσο και των ROS ( ιαγράµµατα 35 και 36).Η παρουσία του κάθε αναστολέα χωριστά, χωρίς την παρουσία του µετάλλου, δεν παρουσίασε σηµαντική µεταβολή των δραστικών µορφών οξυγόνου,σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν στα κύτταρα αναφοράς. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης ( ιαγράµµατα 35 και 36), η παρουσία του µετάλλου σχετίζεται µε την αύξηση της δραστικότητας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,πιθανό µέσω της συµµετοχής της σε µονοπάτι µεταγωγής µηνύµατος στο οποίο συµµετέχει η PK C (Dailianis και Kaloyianni,2004).

171 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 148 Σε προηγούµενα πειράµατα δείξαµε τη σχέση που υπάρχει µεταξύ των αδρενεργικού-τύπου υποδοχέων της µεµβράνης των κυττάρων του πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis µε το µέταλλο.η ικανότητα του µετάλλου να επάγει τη σύνθεση ROS,µελετήθηκε µέσω της δυνατότητάς του να συνδέεται ή να αλληλεπιδρά µε υποδοχείς της κυτταρικής µεµβράνης που σχετίζονται µε οδούς µεταγωγής µηνυµάτων του κυττάρου. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του καδµίου στην παραγωγή Ο - 2,σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν στο µέταλλο, παρουσία είτε ενός ανταγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων (propranolol 10 µmol/l),είτε των β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (metoprolol 1 µμ), (Πίνακας 22).Παρόµοια αναστολή των επιπτώσεων του µετάλλου παρατηρείται µετά από αναστολή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, µε χρησιµοποίηση prazosin (1 µmol/l), αλλά και των α 2 -αδρενεργικών υποδοχεών, µε yohimbine (0.1 µmol/l), (Πίνακας 22).Η παρουσία κάθε ανταγωνιστή των αδρενεργικών υποδοχέων,χωρίς την παρουσία του µετάλλου,δεν έδωσε σηµαντικές διαφορές στην παραγωγή Ο - 2 σε σχέση µε τα κύτταρα αναφοράς. Από τα εξαγώµενα αποτελέσµατα µπορεί να διαπιστωθεί ένας σηµαντικός ρόλος των αδρενεργικών υποδοχέων στην επαγωγή σηµατοδοτικών µηχανισµών σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεσής τους στο µέταλλο.το παραπάνω συµπέρασµα ενισχύεται ακόµα περισσότερο,αν λάβουµε υπόψη µας την επίδραση διαφόρων ουσιών-αγωνιστών των αδρενεργικών υποδοχέων στην παραγωγή σουπεροξειδικών ριζών. Συγκεκριµένα, έκθεση κυττάρων σε phenylephrine (1 µmol/l),µιας ορµόνης-αγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, έδειξε σηµαντική αύξηση των παραγόµενων Ο - 2,σε επίπεδα σηµαντικά υψηλότερα από αυτά που προκύπτουν µετά από την επίδραση του µετάλλου. Παρόµοια αποτελέσµατα προκύπτουν µετά από έκθεση των κυττάρων σε isoprenaline (1 µmol/l),ενός αγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων (Πίνακας 22).

172 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 149 Πίνακας 22.Παραγωγή σουπεροξειδικών ριζών (Ȯ 2 - )σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, µετά από έκθεση σε κάδµιο και διάφορους αγωνιστές και ανταγωνιστές.κύτταρα εκτίθενται για 30 λεπτά σε CdCl 2 (50 µmol/l) σε συνδυασµό µε διάφορους ανταγωνιστές είτε των β-και β 1 -(propranolol10 µmol/lκαι metoprolol1 µmol/l),είτε των α 1 -και α 2 - (prazosin 1 µmol/l και yohimbine 0.1 µmol/l) αδρενεργικών υποδοχέων, καθώς και σε διάφορους αγωνιστές των α 1 -(phenylephrine 1 µmol/l)και β-(isoprenaline 1 µmol/l)αδρενεργικών υποδοχέων. Table 22. Superoxide anion (Ȯ 2 - ) production in isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis after treatmentwith cadm ium and differenteffectors.cells were treated for30 min with cadm ium 50 µμ or cadm ium 50 µμ together with propranolol 10 µμ (a β- adrenergic antagonist),orwith metoprolol1 µμ,(a β 1 -adrenergic antagonist),orcadm ium 50 µμ togetherwith prazosin 1 µμ (a peripheral α 1 -adrenergic antagonist),or w ith yohimbine 0.1 µμ,(a α 2 -adrenergic antagonist),or 1 µμ phenylephrine (a α 1 -adrenergic agonist) or 1 µμ isoprenaline (a β-adrenergic agonist). % απόκλιση από κύτταρα αναφοράς Control ± Control& SO D ± CdCl 2 50 µμ ± 5.96 a,b CdCl 2 50 µμ + propranolol10 µμ ± c CdCl 2 50 µμ + metoprolol1 µμ ± 7.8 c CdCl 2 50 µμ + prazosin 1 µμ ± 3.42 c CdCl 2 50 µμ + yohimbine 0.1 µμ ± 9.6 c Phenylephrine 1 µμ ± a,b Isoprenaline 1 µμ ± a,b Οι τιµές (% διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς)είναι οι M.O ± S.D.από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκαν ιστοί από 4 ζώα. Οι τιµές µε τον εκθέτη a παρουσιάζουν σηµαντική στατιστική διαφορά σε σχέση µε την τιµή κυττάρων αναφοράς.οι τιµές µε τον εκθέτη b παρουσιάζουν σηµαντική στατιστική διαφορά σε σχέση µε την τιµή κυττάρων που επωάστηκαν µε το αντιοξειδωτικό ένζυµο SOD.Οι τιµές µε τον εκθέτη c παρουσιάζουν σηµαντική διαφορά σε σχέση µε την τιµή κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο (Dunnet s test,p<0.01). Values (% of controlvalue)are means ± SD ofatleast6 independentexperiments.in each experiment, the tissue of4 animals was used.values labelled with a indicate significantdifference with the control value. Values labelled w ith b indicate significant difference w ith the control + SO D value.values labelled w ith c indicate significant difference w ith the value obtained in cells treated w ith cadm ium (Dunnet s test,p<0.01). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης,η αλληλεπίδραση των α 1 - και α 2 - αδρενεργικών υποδοχέων µε το µέταλλο,φαίνεται να συνεισφέρει σε µεγαλύτερο βαθµό στην παραγωγή δραστικών µορφών οξυγόνου,σε σχέση µε τη συνεισφορά των β-και β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων στην επαγωγή του φαινοµένου, µετά από την επίδραση του µετάλλου. 5. Εκτίµηση της βλάβης του γενετικού υλικού σε αποµονωµένα κύτταρα,µετά από έκθεση σε κάδµιο: Για τη µελέτη των γενοτοξικών επιπτώσεων του καδµίου σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος των Κοµητών (Comet assay-ssg E). Η ανάλυση των αποτελεσµάτων έδειξε µικρή

173 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 150 συχνότητα εµφάνισης µονόκλωνων τµηµάτων DNA,η οποία συνεπάγεται µειωµένη βλάβη του γενετικού υλικού (DNA)σε κύτταρα αναφοράς, σε επίπεδα παρόµοια αυτών που αναφέρονται από άλλους ερευνητές που χρησιµοποίησαν τη συγκεκριµένη µέθοδο εκτίµησης της βλάβης του DNA (Bihariκαι συν.,1990;herbertκαι Zahn, 1990;Mitchelmore και συν.,1998). Σύµφωνα µε τα εξαγώµενα αποτελέσµατα,κύτταρα που εκτέθηκαν για 30 λεπτά σε CdCl 2,τελικής συγκέντρωσης 50 µmol/l,έδειξαν σηµαντική αύξηση της βλάβης του DNA (% βλάβη του γενετικού υλικού/% DNA in tail:29.82 ± 5.658),σε σχέση µε τη βλάβη που µετρήθηκε σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε µικρότερες συγκεντρώσεις του µετάλλου,αλλά και µε κύτταρα αναφοράς (% DNA in tail:2.86 ± 1.114),(Πίνακας 23, ιάγραµµα 37) * * % DNA in tail , [µm] ιάγραµµα 37. Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων του καδµίου στην πρόκληση βλαβών του γενετικού υλικού κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D.από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράµατα.σε κάθε πείραµα,χρησιµοποιήθηκε ο ιστός 4 ατόµων και αναλύθηκαν τουλάχιστον 250 κοµήτες. * υποδηλώνει σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ των κυττάρων αναφοράς και των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο.(tukey test,p<0.01). Figure 37.The effect of different concentrations of cadm ium on D N A dam age of isolated digestive gland cells ofm ytilus galloprovincialis.values are m eans ± SD ofatleast4 independentexperim ents. In each experiment,the tissue offouranimals was used and 250 com ets perincubation perslide were analyzed. * indicate significant difference betw een control value and that observed after cadm ium treatm ent;(tukey test,p<0.01).

174 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 151 Λαµβάνοντας υπόψη µας τις γενοτοξικές επιπτώσεις του µετάλλου,κρίθηκε σκόπιµο να µελετήσουµε τη συµµετοχή του σηµατοδοτικού µηχανισµού στην πρόκληση γενετικών βλαβών σε κύτταρα που εκτίθενται στο µέταλλο. Πίνακας 23.Εκτίµηση της βλάβης του DNA (ποσοστό του DNA στην ουρά των κοµητών-% DNA in tail) σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα κύτταρα επωάζονται σε φυσιολογικό διάλυµα PS χωρίς ή µε την παρουσία αναστολέα της διάσπασης του ca M P (IBM X 0.05 mmol/l)και στη συνέχεια εκτίθενται στο µέταλλο µε ή χωρίς την παρουσία EIPA (20 nm ol/l) ή ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης που συµβάλλει στη βιοσύνθεση του ca M P (forskolin 0.01 m m ol/l). Table 23. Results of the single cell gel electrophoresis (com et assay) expressed in terms ofthe percentage ofdna in the com ettail(% DNA in tail)ofisolated digestive gland cells suspensions of Mytilus galloprovincialis.cells,incubated eitherin physiologicalsaline buffer (PS)orin PS + IBM X (an inhibitor of ca M P breakdow n) were treated w ith cadm ium 50 µμ or cadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA orforskolin 0.01 mm (a potentactivatorofadenylate cyclase and the biosynthesis ofca M P). Ποσοστό βλάβης του DNA (% DNA in tail) Κύτταρα χωρίς IB M X Κύτταρα,παρουσία IB M X 0.05 mm Control 2.86 ± a,b,e ± f CdCl 2 50 µμ ± b,c,d ± g CdCl 2 50 µμ + EIPA 20 nm 8.21 ± c,e ± f,g Forskolin 0.01 mm ± 4.83 a,d ± Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D. από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ο ιστός 4 ατόµων και αναλύθηκαν τουλάχιστον 250 κοµήτες. Σε κάθε στήλη,οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη αντιπροσωπεύουν σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ τους, όπως προκύπτει µετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (Tukey test,p<0.01). Values are m eans ± SD ofatleast4 independentexperim ents.in each experim ent,the tissue offour animals w as used and w as analyzed at least 250 com ets per incubation.values thatshare the sam e letterindicate statistically significantdifference from each other(tukey test,p<0.01). Για τη µελέτη της συµµετοχής του σηµατοδοτικού µονοπατιού που επάγεται από το µέταλλο στην πρόκληση γενετικών βλαβών,χρησιµοποιήθηκε ο αναστολέας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Νa + /H +,ΕΙΡΑ.Η εκτίµηση της βλάβης του DNA σε κύτταρα στα οποία αναστείλαµε τη δράση της αντλίας µε τη χρησιµοποίηση ΕΙΡΑ (20 nm ol/l)έδειξε σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του µετάλλου ((% DNA in tail:8.21 ± 2.293),(Πίνακας 23).Τα αποτελέσµατα της επίδρασης του αναστολέα της αντλίας,στοιχειοθετούν ένα σηµαντικό προστατευτικό ρόλο της αντλίας σε κύτταρα που εκτίθενται σε κάδµιο.

175 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 152 Πίνακας 24.Εκτίµηση της βλάβης του DNA (ποσοστό του DNA στην ουρά των κοµητών-% DNA in tail)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεση κυττάρων στο µέταλλο µε ή χωρίς την παρουσία EIPA (20 nm ol/l),calphostin C (20 nm ol/l),καθώς και ανταγωνιστών των β-(propranolol1 µmol/l),β 1 -(metoprolol1 µmol/l),α 1 -(prazosin 1 µmol/l)και α 2 -(yohimbine 1 µmol/l)αδρενεργικών υποδοχέων. Table 24. Results of the single cell gel electrophoresis (com et assay) expressed in terms ofthe percentage ofdna in the com ettail(% DNA in tail)ofisolated digestive gland cells suspensions of Mytilus galloprovincialis exposed to cadm ium 50 µμ alone or cadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA (a selective inhibitorofna + /H + exchanger)orcadm ium 50 µμ + 20 nm calphostin C (a specific inhibitor of protein kinase C) or cadm ium 50 µμ µμ yohimbine (an antagonist of α 2 - adrenergic receptors),orcadm ium 50 µμ + 1 µμ metoprololorcadm ium 50 µμ + 10 µμ propranolol. Ποσοστό βλάβης του DNA (% DNA in tail) control 2.86 ± CdCl 2 50 µμ ± a CdCl 2 50 µμ + EIPA 20 nm 8.21 ± b CdCl 2 50 µμ + Calphostin C 20 nm ± a,b CdCl 2 50 µμ + Propranolol 10 µm ± a,b CdCl 2 50 µμ + Metoprolol1 µμ ± a,b CdCl 2 50 µμ + Yohimbine 0.1 µm 8.04 ± b CdCl 2 50 µμ + Prazosin 1 µm 7.35 ± b Οι τιµές είναι οι M.O ± S.D. από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ο ιστός 4 ατόµων και αναλύθηκαν τουλάχιστον 250 κοµήτες. Οι τιµές µε εκθέτη a παρουσιάζουν σηµαντική διαφορά µε την τιµή των κυττάρων αναφοράς. Οι τιµές µε εκθέτη b παρουσιάζουν σηµαντική διαφορά µε την τιµή κυτάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο (Tukey test, P<0.01). Values are m eans ± SD ofatleast4 independentexperim ents.in each experim ent,the tissue offour animals was used and was analyzed atleast250 com ets perincubation.values labelled with a indicate significantdifference with the controlvalue.values labelled with b indicate significantdifference with the value obtained in cells treated with cadm ium (Tukey test,p<0.01). Η πιθανή συµµετοχή της αντλίας στο µονοπάτι µεταγωγής µηνύµατος στο οποίο συµµετέχει η PK C (Dailianis και Kaloyianni, 2004) φαίνεται από τα αποτελέσµατα που προκύπτουν µετά από µελέτη των επιπέδων των γενετικών βλαβών σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο,µετά από αναστολή της δράσης της PK C (Πίνακας 24).Συγκεκριµένα,κύτταρα στα οποία επιδράσαµε µε calphostin C (20 nm ol/l)και στη συνέχεια εκτέθηκαν στο µέταλλο,παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση των επαγόµενων γενετικών βλαβών (% DNA in tail: ± 3.837), συγκριτικά µε τη βλάβη του DNA που προκαλείται µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο (% DNA in tail: ± 5.658), γεγονός που µας οδηγεί στο συµπέρασµα ότι υπάρχει µια πιθανή συσχέτιση του σηµατοδοτικού µονοπατιού στο οποίο συµµετέχει η PK C µε την πρόκληση γενετικών βλαβών που παρατηρείται µετά από έκθεση κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis σε κάδµιο.

176 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 153 Η παρουσία ανταγωνιστών των α 1 -, α 2 - και των β-, β 1 - αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί σηµαντική αναστροφή των επιπτώσεων του µετάλλου (Πίνακας 24).Συγκεκρικένα,κύτταρα στα οποία ανεστάλλει η δράση είτε των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (προ-επώαση των κυττάρων µε prazosin 1 µmol/l), είτε των α 2 - αδρενεργικών υποδοχέων (προ-επώαση των κυττάρων µε yohimbine 0.1 µmol/l),οι επιπτώσεις του καδµίου στο DNA µειώθηκαν σηµαντικά.παρόµοια αποτελέσµατα προκύπτουν σε κύτταρα τα οποία προ-επωάστηκαν µε ανταγωνιστές των β- (propranolol 10 µmol/l) και β 1 - (metoprolol 1 µmol/l) αδρενεργικών υποδοχέων (Πίνακας 24).Η έκθεση των κυττάρων σε κάθε ουσία χωριστά,χωρίς την παρουσία του µετάλλου, δεν έδειξε σηµαντικές αλλαγές στα επίπεδα βλάβης του DNA, συγκριτικά µε τα κύτταρα αναφοράς. Η συµµετοχή των αδρενεργικών υποδοχέων στην πρόκληση γενετικών βλαβών ενισχύεται ακόµα περισσότερο από τα αποτελέσµατα της δράσης διάφορων ουσιών-αγωνιστών των αδρενεργικών υποδοχέων.συγκεκριµένα,κύτταρα τα οποία επωάστηκαν για 30 λεπτά µε διαφορετικές συγκεντρώσεις ενός αγωνιστή των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων (phenylephrine) έδειξαν µια ποσοτική αύξηση των επιπέδων βλάβης του DNA,συγκριτικά µε κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 25). Είναι αξιοσηµείωτο το γεγονός πως κύτταρα τα οποία προ-επωάστηκαν τόσο µε EIPA,όσο και µε τους ανταγωνιστές των α 1 - και α 2 - αδρενεργικών υποδοχέων (prazosin και yohimbine αντίστοιχα), παρουσίασαν σηµαντική µείωση των επιπτώσεων του µετάλλου, σε επίπεδα σηµαντικά χαµηλότερα, συγκριτικά µε τα επίπεδα δράσης των β-και β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων,γεγονός που µπορεί να µας οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι υπάρχει διαφορετική ευαισθησία των α-αδρενεργικών υποδοχέων σε σχέση µε τους β-αδρενεργικούς υποδοχείς στο µέταλλο και ιδιαίτερα στο µηχανισµό πρόκλησης γενετικών βλαβών που προκαλείται από το µέταλλο σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis.

177 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 154 Πίνακας 25.Εκτίµηση της βλάβης του DNA (ποσοστό του DNA στην ουρά των κοµητών-% DNA in tail)σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεση κυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις φαινυλεφρίνης (phenylephrine 1,50 και 100 µmol/l). Table 25. Results of the single cell gel electrophoresis (com et assay) expressed in terms ofthe percentage ofdna in the com ettail(% DNA in tail)ofisolated digestive gland cells suspensions of Mytilus galloprovincialis exposed to different concentration of phenylephrine (PE: 1, 50 and 100 µmol/l). Ποσοστό βλάβης του DNA (% DNA in tail) control 2.86 ± CdCl 2 50 µμ ± a Phenylephrine 1 µμ ± a,b Phenylephrine 50 µμ ± a,b Phenylephrine 100 µμ ± a Οι τιµές είναι οι Μ.Ο ± S.D. από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράµατα. Σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ο ιστός 4 ατόµων και αναλύθηκαν τουλάχιστον 250 κοµήτες. Οι τιµές µε τον ίδιο εκθέτη αντιπροσωπεύουν σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ τους, όπως προκύπτει µετά από στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων (Tukey test,p<0.01). Values are m eans ± SD ofatleast4 independentexperim ents.in each experim ent,the tissue offour animals w as used and w as analyzed at least 250 com ets per incubation.values thatshare the sam e letterindicate statistically significantdifference from each other(tukey test,p<0.01). 6. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης του ca M P,µετά από έκθεση κυττάρων πεπτικού αδένα σε κάδµιο: Σύµφωνα µε βιβλιογραφικά δεδοµένα, η επαγωγή της δραστικότητας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + µπορεί να επιτευχθεί µέσω της αύξησης των επιπέδων του ca M P (Borgese και συν., 1992). Η συµµετοχή του ca M P στην ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων µας οδήγησε στη µελέτη των επιπτώσεων του µετάλλου στα επίπεδα του ca M P,καθώς και τη σχέση του µε την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα αποτελέσµατα έδειξαν πως κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν σε κάδµιο παρουσίασαν αυξηµένες συγκεντρώσεις ca M P, συγκριτικά µε κύτταρα αναφοράς ( ιάγραµµα 38).Συγκεκριµένα,µετά από έκθεση των κυττάρων για 60 λεπτά σε CdCl 2 (50 µmol/l),διαπιστώθηκε σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του ca M P (14.18 ± 1.31 pm olca M P/mg πρωτεΐνης),µε τη µέγιστη τιµή να παρατηρείται µετά από 30 λεπτά έκθεσης (19 ± 3.43 pm ol ca M P/mg πρωτεΐνης), συγκριτικά µε τα επίπεδα του ca M P σε κύτταρα αναφοράς (7.35 ± 1.24 pm olca M P/mg πρωτεΐνης).

178 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ a,c,d,f 20 control cadm ium pm olca M P/m g protein a,b d,g b,c,g,h f,h exposure period (m in) ιάγραµµα 38. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης του ca M P σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, µετά από έκθεση σε κάδµιο για 30 και 60 λεπτά.τα αποτελέσµατα (pm ol ca M P/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο ± S.D. τουλάχιστον 4 ανεξάρτητων πειραµάτων. Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκε ιστός από 8 άτοµα. Οι τιµές µε το ίδιο γράµµα παρουσιάζουν σηµαντική στατιστική διαφορά µεταξύ τους (D unnet s test,p<0.01). Figure 38.Time course ofintracellularca M P concentration aftertreatmentofisolated digestive gland cells w ith cadm ium chloride (50 µm )for 30 and 60 m in.the results (pm ol ca M P/mg protein) are m eans ± SD s ofatleast4 experiments.in each experiment,the tissue of 8 animals was used.values thatshare the sam e letter indicate statistically significantdifference from each other (D unnet s test, P<0.01). Η παρουσία ανταγωνιστών τόσο των α 1 -, α 2 -, όσο και των β-, β 1 - αδρενεργικών υποδοχέων,έδειξε σηµαντική µείωση των επιπτώσεων του µετάλλου στα επίπεδα του ca M P (Πίνακας 26).Από τα αποτελέσµατα της µελέτης µπορούµε να διαπιστώσουµε πως οι β-, β 1 - αδρενεργικοί υποδοχείς είναι περισσότερο αποτελεσµατικοί στην αναστροφή των επιπτώσεων του µετάλλου,συγκριτικά µε τους α 1 -και α 2 -αδρενεργικούς υποδοχείς,γεγονός που αποδεικνύεται µέσω των επιπέδων του ca M P σε κύτταρα τα οποία προ-επωάστηκαν µε κάθε ανταγωνιστή,πριν την έκθεσή τους στο µέταλλο (Πίνακας 26).Έκθεση των κυττάρων σε κάθε ανταγωνιστή δεν έδειξε σηµαντικές διαφορές των επιπέδων του ca M P, σε σχέση µε τα επίπεδα που µετρήθηκαν σε κύτταρα αναφοράς. Η παρουσία αναστολέων τόσο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,όσο και της πρωτεϊνικής κινάσης C (PK C), µείωσε σηµαντικά τις επιπτώσεις του

179 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 156 µετάλλου στη σύνθεση του ca M P (Πίνακας 26). Σε κύτταρα τα οποία προεπωάστηκαν για 15 λεπτά µε ΕΙΡΑ (20 nm ol/l)παρατηρήθηκε πλήρης αναστολή της δράσης του µετάλλου, όσο αφορά τη συγκέντρωση του ca M P, ενώ έκθεση των κυττάρων µόνο στον αναστολέα της αντλίας δεν έδειξε να επηρεάζει τα επίπεδα του ca M P. Πίνακας 26.Προσδιορισµός της συγκέντρωσης του ca M P σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα, µετά από έκθεσή τους σε κάδµιο ή σε κάδµιο 50 µμ µαζί είτε µε EIPA 20 nm (επιλεκτικός αναστολέας της αντλίας Na + /H + ),είτε µε calphostin C 20 nm (ειδικός αναστολέας της PK C),είτε µε prazosin 1 µm (περιφερικός ανταγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων),είτε µε yohimbine 0.1 µm (α 2 -αδρενεγικός ανταγωνιστής),είτε µε metoprolol1 µμ (β 1 -αδρενεργικός ανταγωνιστής),είτε µε propranolol 10 µμ (β-αδρενεργικός ανταγωνιστής),είτε µε forskolin 0.01 m M (ενεργοποιητής της αδενυλικής κυκλάσης και της βιοσύνθεσης του ca M P),είτε µε IBM X 0.05 m M (αναστολέα της διάσπασης του ca M P). Table 26. Intracellular ca M P concentration after treatmentof isolated digestive gland cells w ith cadm ium 50 µμ alone orcadm ium 50 µμ + 20 nm EIPA (a selective inhibitorofna + /H + exchanger) orcadm ium 50 µμ + 1 µm prazosin (a peripheralα 1 -adrenergic antagonist)orcadm ium 50 µμ µm yohimbine (a α 2 -adrenergic antagonist),orcadm ium 50 µμ + 1 µμ metoprolol(a β 1 -adrenergic antagonist)orcadm ium 50 µμ + 10 µμ propranolol(a β-adrenergic antagonist) or cadm ium mm forskolin (a potentactivator of adenylate cyclase and the biosynthesis of ca M P)or cadm ium mm IBM X (an inhibitorofca M P breakdow n). Συγκέντρωση ca M P (pm olca M P/mg πρωτεϊνης) control 7.35 ± 1.24 CdCl 2 50 µμ ± 3.43 a Control+ IB M X 0.05 mm ± 2.30 a,b Control+ forskolin 0.01 mm ± 1.67 a,b CdCl 2 50 µμ + EIPA 20 nm 4.70 ± 0.94 b CdCl 2 50 µμ + prazosin 1 µμ ± 1.00 a,b CdCl 2 50 µμ + yohimbine 0.1 µμ 9.85 ± 1.51 b CdCl 2 50 µμ + propranolol10 µm 2.67 ± 0.69 a,b CdCl 2 50 µμ + metoprolol1 µμ 4.73 ± 1.03 b CdCl 2 50 µμ + calphostin C 20 nm ± 1.71 a,b Τα αποτελέσµατα (pm ol ca M P/mg πρωτεΐνης) είναι οι Μ.Ο ± S.D.τουλάχιστο 4 ανεξάρτητων πειραµάτων. Σε κάθε πείραµα χρησιµοποιήθηκε ιστός από 8 ζώα. Οι τιµές µε εκθέτη a αντιπροσωπεύουν σηµαντική διαφορά από την τιµή των κυττάρων αναφοράς.οι τιµές µε εκθέτη b αντιπροσωπεύουν σηµαντική διαφορά συγκριτικά µε την τιµή των κυττάρων που εκτέθηκαν στο µέταλλο (Dunnet s test,p<0.01). The results (pm olca M P/mg protein)are m eans ± SD s ofatleast4 experiments.in each experiment, the tissue of8 animals was used.values labelled with a indicate significantdifference with the control value.values labelled with b indicate significantdifference with the value obtained in cells treated with cadm ium (Dunnet s test,p<0.01). Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός πως µετά από την αναστολή της PK C, παρουσία calphostin C (20 nm ol/l),διαπιστώθηκε µια σχετικά µικρή,αλλά σηµαντική αναστολή της δράσης του καδµίου στη σύνθεση του ca M P,συγκριτικά µε τα επίπεδα του ca M P που µετρήθηκαν µετά από έκθεση των κυττάρων µόνο στο µέταλλο (Πίνακας 26).

180 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παραγωγή δραστικών µορφών οξυγόνου και βλάβη του DNA σε κύτταρα πεπτικού αδένα µε υψηλά επίπεδα ca M P (κύτταρα επεξεργασµένα µε IB M X ): Στη συνέχεια,προχωρήσαµε στον προσδιορισµό της συγκέντρωσης των ROS και στη µελέτη των γενοτοξικών επιπτώσεων (βλάβη του DNA)που προκαλούνται σε κύτταρα στα οποία επιδράσαµε κατά τη διάρκεια της αποµόνωσής τους µε ένα µηειδικό αναστολέα των φωσφοδιεστερασών (IBM X 0.05 mmol/l),οι οποίες ευθύνονται για τη διάσπαση του ca M P. Παρουσία του συγκεκριµένου αναστολέα των φωσφοδιεστερασών έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της συγκέντρωσης του ca M P (Πίνακας 26). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα,σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε IBM X (0.05 m m ol/l) διαπιστώθηκε σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης των ROS, συγκριτικά µε κύτταρα τα οποία δεν επωάστηκαν µε τη συγκεκριµένη ουσία (Πίνακας 21, D unnet s test,p<0.05),ενώ παρουσία του µετάλλου,παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης των ROS τόσο σε κύτταρα τα οποία προεπωάστηκαν µε IBM X,όσο και σε κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 21).Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι κύτταρα στα οποία επιδράσαµε µε τη συγκεκριµένη ουσία, προκειµένου να διατηρήσουµε αυξηµένα επίπεδα ca M P, καθώς και µε ΕIPA (20 nm ol/l) για την αναστολή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, παρουσίασαν σηµαντική µείωση στην παραγωγή ROS,µετά από την έκθεσή τους στο µέταλλο, συγκριτικά µε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο,απουσία του αναστολέα (Πίνακας 21).Η αναστολή της δραστικότητας της αντλίας,πριν την επίδραση του µετάλλου, σε κύτταρα µε αυξηµένα επίπεδα ca M P, προκάλεσε δραστική µείωση στην παραγωγή ROS (68% ),σε σχέση µε τη µείωση που προκαλεί η αναστολή της αντλίας σε κύτταρα µε φυσιολογικά επίπεδα ca M P (37% ), ( ιάγραµµα 20). Σε κύτταρα τα οποία προ-επωάστηκαν µε IBM X (0.05 m m ol/l) και εκτέθηκαν για 30 λεπτά σε forskolin (0.01 m m ol/l),έναν ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης και κατ επέκταση της βιοσύνθεσης του ca M P (Barber και G oka, 1985) δεν διαπιστώθηκε σηµαντική παραγωγή ROS. Παρά το γεγονός ότι οι υψηλές τιµές του ca M P δεν φαίνεται να προκαλούν σηµαντική επαγωγή ROS στα κύτταρα, τα υψηλά επίπεδα ca M P πιθανό να σχετίζονται µε µηχανισµούς που συµµετέχουν στη διαταραχή της ακεραιότητας του

181 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 158 DNA κυττάρων πεπτικού αδένα,που εκτίθενται στο µέταλλο.συγκεκριµένα,κύτταρα που επωάστηκαν µε IBM X,έδειξαν σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P, καθώς και σηµαντική βλάβη του DNA,συγκριτικά µε κύτταρα που δεν εκτέθηκαν στο συγκεκριµένο παράγοντα (Πίνακες 23 και 26). Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν τόσο σε ΙΒΜΧ-κύτταρα,όσο και σε κύτταρα που δεν επωάστηκαν µε ΙΒΜΧ,µετά από έκθεσής τους σε forskolin (0.01 m M ),(Πίνακες 23 και 26).Η παρουσία του ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης δεν φαίνεται να δρα συνεργατικά µε τον αναστολέα των φωσφοδιεστερασών,όσο αφορά την ικανότητα διαταραχής της ακεραιότητας του DNA.Οι επιπτώσεις του καδµίου στο DNA, µειωνονται σηµαντικά µετά από αναστολή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και στις δύο οµάδες κυττάρων (Πίνακας 23),γεγονός που επιβεβαιώνει το σηµαντικό ρόλο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στο σηµατοδοτικό µονοπάτι.

182 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσδιορισµός της δραστικότητας της κασπάσης-3 σε κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεση σε κάδµιο: Η πρόκληση γενετικών βλαβών που διαπιστώνεται σε κύτταρα που εκτίθενται σε κάδµιο, πιθανό να σχετίζεται µε την ικανότητα του µετάλλου να επάγει αποπτωτικά φαινόµενα. Η ικανότητα του µετάλλου στην επαγωγή αποπτωτικών φαινοµένων, µέσω της ενεργοποίησης του µονοπατιού στο οποίο συµµετέχουν οι κασπάσες µελετήθηκε µε προσδιορισµό της δραστικότητας της κασπάσης-3,η οποία αποτελεί κύρια πρωτεάση του αποπτωτικού µηχανισµού (Hartley και συν., 1994; Wolvetang και συν.,1994; Mignotte και Vayssiere, 2001).Συγκεκριµένα,κύτταρα πεπτικού αδένα εκτέθηκαν για 30 λεπτά,3,5 και 24 ώρες σε CdCl 2 (50 µmol/l)και προσδιορίστηκε η δραστικότητα της πρωτεάσης, µε χρησιµοποίηση της p- νιτροανιλίνης (p-na). Για την σωστή εκτίµηση της µεθόδου,καθώς και των αποτελεσµάτων µας, χρησιµοποιήθηκαν, ως µάρτυρες, καρκινικά κύτταρα Hep-2, τα οποία όταν επωάστηκαν µε τον αναστολέα της αντλίας Na + /H +,ΕΙΡΑ (2 µmol/l) για 3 ώρες ( ιάγραµµα 39)οδηγήθηκαν σε απόπτωση.τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν απουσία δραστικότητας της κασπάσης-3 σε κύτταρα που εκτέθηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους στο µέταλλο,συγκριτικά µε τη δραστικότητα σε κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 27). Παρόµοια αποτελέσµατα προέκυψαν, µετά από επώαση των κυττάρων µε IBM X 0.05 mmol/l. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, µπορούµε να συµπεράνουµε πως η επαγωγή γενετικών βλαβών σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, µετά από επίδραση καδµίου, δεν σχετίζεται µε την ενεργοποίηση αποπτωτικού µηχανισµού που συµµετέχει η κασπάση-3.

183 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ * % caspase activity Hep-2 cells + EIPA 2 µμ control cadm ium IBM X cells ιάγραµµα 39. Προσδιορισµός της δραστικότητας της κασπάσης-3 σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα,µετά από έκθεσής τους σε χλωριούχο κάδµιο και σε ΙΒΜΧ 0.05 mmol/lγια χρονικό διάστηµα 3 ωρών. Τα αποτελέσµατα συγκρίνονται τόσο µε κύτταρα αναφοράς όσο και µε τη δραστικότητα της κασπάσης-3 που µετρήθηκε σε αποπτωτικά καρκινικά κύτταρα Hep-2,µετά από τη χρήση ΕΙΡΑ (2µmol/l),(αποτελέσµατα του εργαστηρίου µας προς δηµοσίευση).οι τιµές (% διαφορά της δραστικότητας της κασπάσης-3,σε σχέση µε κύτταρα αναφοράς)είναι οι Μ.Ο ± S.D.τουλάχιστο 4 ανεξάρτητων πειραµάτων.η % δραστικότητα της κασπάσης-3 σε κύτταρα αναφοράς (100% caspase activity) αντιστοιχεί σε ± µmolpna/mg πρωτεΐνης.σε κάθε πείραµα,χρησιµοποιήθηκε ιστός 8 ζώων. Το σύµβολο * αντιπροσωπεύει σηµαντική διαφορά µεταξύ της δραστικότητας της κασπάσης-3 σε αποπτωτικά καρκινικά κύτταρα H ep-2 και των αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα που εκτέθηκαν σε κάθε παράγοντα χωριστά (Dunnet s test,p<0.01). Figure 39.% caspase-3 activation in digestive gland cells treated eitherwith cadm ium chloride orwith IBM X 0.05 mmol/lfor 3 hours.forpositive control ofcaspase-3 activation,hep-2 cells treated with EIPA (2 µmol/l) for 3 hours, were used, (subm itted results from our laboratory). The results (% caspase-3 activity ofcontrolvalue)are means ± SD s ofatleast4 experiments.100% caspase-3 activity corresponds to ± µmolpn A /mg protein ofthe controlcells.in each experiment,the tissue of8 animals was used.* indicate significantdifference betw een caspase-3 activation obtained in Hep-2 cells in relation to caspase-3 activity in digestive gland cells,after treatmentwith cadm ium oribm X (Dunnet s test,p<0.01).

184 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 161 Πίνακας 27.Προσδιορισµός της δραστικότητας της κασπάσης-3 σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Τα κύτταρα επωάζονται απουσία ή παρουσία του αναστολέα της διάσπασης του ca M P (ΙΒΜΧ 0.05 m m ol/l) µε χλωριούχο κάδµιο, τελικής συγκέντρωσης 50 µmol/l,για χρονική περίοδο 30 min και 24 ωρών. Table 27. Determination of caspase-3 activity in isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis.cells treated with orwithout0.05 mmol/libm X (an inhibitorofca M P breakdow n), were incubated with cadm ium 50 µμ for30 min and 24 hours. % δραστικότητα της κασπάσης-3 Κύτταρα χωρίς ΙΒΜΧ Κύτταρα,παρουσία IB M X 0.05 mm Control30 min ± ± 8.98 Control24 hr ± ± 7.25 CdCl 2 50 µμ 30 min ± ± 5.97 CdCl 2 50 µμ 24 hr ± ± Οι τιµές (% διαφορά της δραστικότητας της κασπάσης-3,σε σχέση µε κύτταρα αναφοράς) είναι οι M.O ± S.D.τουλάχιστο 4 ανεξάρτητων πειραµάτων.η % δραστικότητα της κασπάσης-3 σε κύτταρα αναφοράς (100% caspase activity) αντιστοιχεί σε ± µmolpna/mg πρωτεΐνης.σε κάθε πείραµα, χρησιµοποιήθηκε ιστός 8 ζώων. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων δεν έδειξε σηµαντική διαφορά µεταξύ των δειγµάτων (D unnet s test,p<0.01). Values (% caspase-3 activity) are m eans± SD s of 4 different experiments (control value of pna cleavage is ± µmolpn A /mg protein).in each experiment,the tissue ofeightanimals was used.from the statisticalanalysis,no significantdifference between sam ples was obtained (Dunnet s test,p<0.01).

185 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 162 ΜΕΡΟΣ Α: ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ ΣΤΟ ΘΕΡΜΑΪΚΟ ΚΟΛΠΟ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ. ΚΑΘΙΕΡΩΣΗ ΝΕΩΝ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΩΝ ΡΥΠΑΝΣΗΣ. 1. ΜΕΛΕΤΗ ΠΕ ΙΟΥ Στα πλαίσια βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης µε τον οργανισµό/βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis, χρησιµοποιήθηκαν οι βιοµάρτυρες ΜΤ και η δραστικότητα της AChE. Επίσης, έγινε προσδιορισµός των βαρεών µετάλλων Zn,Cd,Pb,Cu,σε ιστούς των µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου,καθώς και από την Ολυµπιάδα που βρίσκεται στο Στρυµονικό κόλπο. Παράλληλα, έγινε µια προσπάθεια για την καθιέρωση νέων βιοµαρτύρων,όπως του ca M P. 1.1 ΕΠΙΠΕ Α ΤΩΝ ΜΤ ΚΑΙ ΤΩΝ ΒΑΡΕΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ. Οι ΜΤ έχουν χρησιµοποιηθεί ως βιοµάρτυρες για την εκτίµηση της παρουσίας βαρέων µετάλλων και άλλων ρυπογόνων παραγόντων στα νερά που διαβιούν οι οργανισµοί (Carpene και συν., 1983; Lobel και Payne, 1987; Viarengo και συν., 1997;Lafontaine και συν.,2000).μέταλλα όπως τα Cu,Zn,Cd και Hg σχετίζονται άµεσα µε την επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ (Viarengo και συν., 1980, 1985; Carpene και συν.,1983; Engelκαι Roesijadi,1987; Viarengo, 1989; Lem oine και συν., 2000), ενώ η επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ από το Pb παραµένει αδιευκρίνιστη (Raspor και Pavicic, 1991).Μικρές συγκεντρώσεις µετάλλων (όπως 0.08 mg/lcu,0.02 m g/lcd,0.6 mg/lzn),µπορούν να επάγουν τη σύνθεση ΜΤ σε διάφορους ιστούς,όπως στα βράγχια και στον πεπτικό αδένα µυδιών (Viarengo και συν.,1980;1997;bordin και συν.,1997;geretκαι Cosson,2002).Στο είδος Mytilus edulis έχουν βρεθεί δυο ισοµορφές ΜΤ οι οποίες επάγονται ως αποτέλεσµα έκθεσης των οργανισµών σε διαφορετικές κατηγορίες µετάλλων.συγκεκριµένα η µονοµερής ισοµορφή των ΜΤ (ΜΤ-10) σχετίζεται µε την αποθήκευση και διαθεσιµότητα των απαραίτητων µετάλλων (essential metals), όπως τα µέταλλα Zn και Cu, που χρησιµοποιούνται σε διάφορες µεταβολικές διαδικασίες του οργανισµού, ενώ η διµερής ισοµορφή των ΜΤ (ΜΤ-20),επάγεται µετά από την έκθεση του οργανισµού σε µη-απαραίτητα µέταλλα, όπως είναι το Cd, προσφέροντας προστασία του οργανισµού από τις τοξικές επιδράσεις του µετάλλου (Roesijadi,1994;Lem oine και

186 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 163 συν.,2000).η επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ στα ίθυρα Μαλάκια από µέταλλα, όπως το Cd,Cu,και ο Hg αποτέλεσε αντικείµενο µελέτης πολλών ερευνητών (Noel- Lam bot,1976;v iarengo και συν.,1980;k ohlerκαι Riisgard,1982;Roesijadi,1992; Pavicic και συν., 1993). Εκτός από τα µέταλλα, άλλοι παράγοντες όπως η θερµοκρασία, η αναπαραγωγική διαδικασία, η ηλικία και το µέγεθος των ζώων, µπορεί να επηρεάζουν τη σύνθεση των ΜΤ (Viarengo και συν.,1997;mouneyrac και συν.,1998,2001;c osson,2000;rotchellκαι συν.,2001). Τα αποτελέσµατα της µελέτης µας έδειξαν σηµαντικά αυξηµένα επίπεδα ΜΤ στον πεπτικό αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, συγκριτικά µε τους υπόλοιπους ιστούς (βράγχια και σύµπλοκο µανδύας/γονάδες). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα,οι διαφορές µεταξύ των ιστών πιθανό να οφείλονται τόσο σε διαφορές στο µεταβολισµό των πρωτεϊνών,όσο και στο υψηλό πρωτεϊνικό περιεχόµενο του πεπτικού αδένα (Legras και συν., 2000).Οι τιµές των ΜΤ στον πεπτικό αδένα είναι αυξηµένες σε σχέση µε τις τιµές που αναφέρθηκαν σε άλλες µελέτες (Viarengo και συν.,1997; Petrovitc και συν.,2001),ενώ οι συγκεντρώσεις που µετρήθηκαν στα βράγχια είναι παρόµοιες µε αυτές που αναφέρονται από τους Viarengo και συν. (1997).Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά µας,οι υψηλές συγκεντρώσεις των Zn και Cu στον πεπτικό αδένα,πιθανό να προκαλούν την επαγωγή της σύνθεσης της ΜΤ-10 ισοµορφής.σε ανάλογα συµπεράσµατα οδηγήθηκαν οι Lem oine και συν.(2000),σε µελέτες που έγιναν στο είδος Mytilus edulis, αλλά και µελέτες άλλων ερευνητικών οµάδων (Bebianno και Langston, 1991; Pedersen και συν.,1997; Legras και συν., 2000). Από τις µετρήσεις των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των ατόµων από κάθε σταθµό δειγµατοληψίας, διαπιστώνεται σηµαντική διαφοροποίηση του σταθµού της Ολυµπιάδας από τους σταθµούς του Θερµαϊκού κόλπου,ενώ στο εσωτερικό του κόλπου,σαφή διαφοροποίηση παρουσιάζεται µεταξύ των περιοχών της Περαίας και του Αντλιοστάσιου και των υπολοίπων σταθµών ( ιαγράµµατα 2, 3, 12, 13, 23α, 23β, Γραφήµατα 5α και 5β). Συγκεκριµένα, τα επίπεδα των ΜΤ βρέθηκαν σηµαντικά αυξηµένα στον πεπτικό αδένα ατόµων που προέρχονται από τις περιοχές του Αγγελοχωρίου και της Περαίας (Ανατολική πλευρά), καθώς και του Αντλιοστάσιου (Β πλευρά), σε σχέση µε τα µειωµένα επίπεδα τιµών που προκύπτουν στον πεπτικό αδένα ατόµων από την Ολυµπιάδα. Επίσης,τα επίπεδα των ΜΤ στα βράγχια βρέθηκαν σηµαντικά αυξηµένα σε άτοµα

187 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 164 από το Αντλιοστάσιο,σε σχέση µε άτοµα που προέρχονται από την περιοχή της Ολυµπιάδας. Η σηµασία του πεπτικού αδένα ως κύριου αποθηκευτικού ιστού των µετάλλων, Cu και Zn, αναγνωρίστηκε αρχικά από τον Bryan (1968) και επαληθεύτηκε από µεταγενέστερες µελέτες (Canliκαι Furness,1993;Legras και συν., 2000).Στα ίθυρα Μαλάκια,αυξηµένες τιµές µετάλλων ανιχνεύονται επίσης στα βράγχια (Cunningham,1979;Robinson και Ryan,1986;Bigas και συν.,1997;regoli, 1998)και στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες (M anly και George,1977;Hemelraad και Herwig,1988).Οι συγκεντρώσεις του Cu και του Zn στον πεπτικό αδένα και στα βράγχια των µυδιών που συλλέχθηκαν από τις διάφορες περιοχές του κόλπου (Πίνακας 7),βρίσκονται στα ίδια επίπεδα µε αυτά που µετρήθηκαν σε άτοµα από ιδιαίτερα επιβαρυµένες περιοχές (Regoliκαι Orlando,1994a;Regoli,1998).Παρ όλα αυτά, οι συγκεντρώσεις των µετάλλων στους ιστούς είναι αρκετά µειωµένες σε σύγκριση µε τα ανώτερα επιτρεπτά όρια που θεσπίστηκαν από τον Reilly (1991)και την Ευρωπαϊκή Ένωση (1995), αλλά και από µετρήσεις του Ωκεανογραφικού Ινστιτούτου στην ίδια γεωγραφική περιοχή (1997). Οι διακυµάνσεις στα επίπεδα των µετάλλων στους ιστούς των οργανισµών µπορεί να οφείλονται τόσο στο µέγεθος και την ηλικία των οργανισµών (Boyden και συν.,1977; Cossa και συν.,1980; Boalch και συν.,1981; Amiard και συν.,1986; Regoliκαι Orlando,1994b),όσο και στην αναγεννητική ικανότητα των σωληναρίων του πεπτικού αδένα, που επηρεάζουν τη συγκέντρωση των µετάλλων και κατ επέκταση την επαγωγή των ΜΤ (Regoli και Orlando, 1994a). Επίσης η αναπαραγωγική περίοδος µπορεί να επηρεάσει τη συγκέντρωση των µετάλλων και την κατανοµή τους στους διάφορους ιστούς.επιπλέον,η απόπλυση των εδαφών και η είσοδος µετάλλων στα υδάτινα οικοσυστήµατα παράκτιων περιοχών, µπορεί να επηρεάσει τις συγκεντρώσεις των µετάλλων τόσο στην υδάτινη µάζα,όσο και στους ιστούς των οργανισµών που τα προσλαµβάνουν. Η εποχικές αλλαγές µπορούν να επηρεάσουν τη συσσώρευση των µετάλλων στους ιστούς των µυδιών.μέταλλα,όπως ο Cu και ο Pb,παρουσιάζουν αυξηµένες συγκεντρώσεις κατά το τέλος των χειµερινών µηνών και την αρχή της άνοιξης,ενώ µικρότερες συγκεντρώσεις παρατηρούνται κατά την καλοκαιρινή και φθινοπωρινή περίοδο. Τα αποτελέσµατα της µελέτης µας για τα µέταλλα Cu, Pb και Zn συµφωνούν µε µελέτες άλλων ερευνητικών οµάδων (Amiard και συν.,1986;regoli

188 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 165 και Orlando, 1994a; Bordin και συν., 1997), ενώ οι συγκεντρώσεις του Cd παρουσιάζουν αντίθετη διακύµανση σε σχέση µε αυτές των παραπάνω µετάλλων. Τα αποτελέσµατα δείχνουν µια σηµαντική επιβάρυνση του Θερµαϊκού κόλπου σε µέταλλα, συγκριτικά µε την εικόνα που παρουσιάζει ο Στρυµονικός κόλπος (Πίνακας 7).Η παραπάνω άποψη υποστηρίζεται και από δεδοµένα χηµικής ανάλυσης των νερών (Zaxariadis και Stratis,1995),βιοχηµικής αναλύσης σε ιστούς µυδιών από τις συγκεκριµένες περιοχές (Dailianis και συν.,2003; K oukouzika και Dimitriadis, 2001), αλλά και από τις µετρήσεις των επιπέδων των µετάλλων που πραγµατοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του 2001 (D om ouhtsidou και συν.,2004). Στην παρούσα µελέτη,η αδυναµία συσχέτισης των επιπέδων των µετάλλων µε τα επίπεδα των ΜΤ που προσδιορίστηκαν στους ιστούς των µυδιών, οδηγεί στη διαπίστωση πως οι διακυµάνσεις των ΜΤ στους οργανισµούς δεν ακολουθούν τις διακυµάνσεις των βαρέων µετάλλων στον κόλπο.επιπλέον,η ανάλυση συσχέτισης δεν έδειξε σηµαντική σχέση µεταξύ του µεγέθους των ατόµων που συλλέχθηκαν από τις διάφορες περιοχές και των επιπέδων των ΜΤ που µετρήθηκαν στους διάφορους ιστούς.τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης είναι σε συµφωνία µε τα δεδοµένα µελετών πάνω στο είδος Pachygrapsus m am oratus, τα οποία δείχνουν πως οι διακυµάνσεις των ΜΤ σχετίζονται περισσότερο µε αλλαγές του µεταβολικού ρυθµού των πρωτεϊνών του οργανισµού παρά µε αλλαγές της συσσώρευσης µετάλλων στον οργανισµό (Legras και συν.,2000).παρ όλα αυτά,η σηµαντική συσχέτιση των ΜΤ µε καθιερωµένους βιοµάρτυρες,όπως η σταθερότητα της λυσοσωµικής µεµβράνης (Lysosom al Membrane Stability - LM S), καθώς και η AChE,καταδεικνύουν τη χρησιµότητα των ΜΤ στην εκτίµηση της περιβαλλοντικής επιβάρυνσης του Θερµαϊκού κόλπου µε ρυπογόνους παράγοντες,όπως τα µέταλλα (D om ouhtsidou και συν.,2004). 1.2 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ AChE. Σύµφωνα µε βιβλιογραφικά δεδοµένα,η ενζυµική δραστικότητα της AChE αναστέλλεται στους ιστούς θαλάσσιων οργανισµών, λόγω της παρουσίας οργανοφωσφορικών και οργανικών προϊόντων (Weiss και Gakstatter,1964; Weiss, 1965; William και Sova, 1966; Holland και συν., 1967; Zinckl και συν., 1987; Galgani και Bocquene, 1988; Day και Scot, 1990; Devi και Fingerman,1995; Amiard-Triquetκαι συν.,1998),καθώς και βαρέων µετάλλων (Payne και συν.,1996;

189 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 166 Naijmiκαι συν.,1997;h am za-chaffai και συν.,1998).τα µέταλλα έχει βρεθεί ότι µπορούν να προκαλέσουν τόσο αναστολή,όσο και αύξηση της δραστικότητας του συγκεκριµένου ενζύµου στους ιστούς των οργανισµών (Eichhom και συν.,1969). Πολλές µελέτες έχουν αποδείξει τη χρησιµότητα µέτρησης του συγκεκριµένου ενζύµου σε ασπόνδυλα, ως αξιόπιστου βιοµάρτυρα τόσο σε παράκτια οικοσυστήµατα, όσο και σε γλυκά νερά (M oulton και συν., 1996; Varela και A ugspurger,1996;stien και συν., 1998). Η τιµή της δραστικότητας της AChE έδειξε µια σαφή διαφοροποίηση στους µελετούµενους ιστούς. Συγκεκριµένα, µεγαλύτερες τιµές δραστικότητας παρατηρήθηκαν στην αιµόλεµφο,σε σχέση µε τη δραστικότητα στα βράγχια και στον πεπτικό αδένα ( ιαγράµµατα 5-7, 14-16). Οι µικρότερες τιµές δραστικότητας βρέθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες.τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης συµφωνούν µε προηγούµενες µελέτες στις οποίες παρατηρήθηκαν αυξηµένα επίπεδα ενζυµικής δραστικότητας στο ηπατοπάγκρεας και στα βράγχια,σε σύγκριση µε το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και τον προσαγωγό µύ των µυδιών του ίδιου είδους (Najimiκαι συν., 1997). Άλλες µελέτες αναφέρουν µέγιστη δραστικότητα των εστερασών στο ηπατοπάγκρεας του ίδιου οργανισµού (Ozretic και Krainovitz- Ozretic,1992).Στο είδος Perna viridis οι υψηλότερες τιµές ενζυµικής δραστικότητας της AChE βρέθηκαν στο ηπατοπάγκρεας και στους µύς και οι µικρότερες στα βράγχια, ενώ υψηλές τιµές µετρήθηκαν στα βράγχια του είδους Mytilus edulis (Bocquene και συν.,1990). Η AChE υδρολύει την ακετυλχολίνη που παράγεται στις νευροµυϊκές συνάψεις (Luo και συν.,1999),ενώ ο ρόλος της στην αιµόλεµφο δεν είναι πλήρως διευκρινισµένος.η παρουσία του ενζύµου στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών πιθανό να σχετίζονται µε τη µεταφορά των νευρικών ώσεων (Walker και Tom pson, 1991; Najimiκαι συν., 1997). Η µελέτη του µηχανισµού µετάδοσης νευρικών ώσεων µέσω χολινεργικών υποδοχέων στο περιφερικό νευρικό σύστηµα των Μαλακίων δεν είναι ακόµα κατανοητή,έτσι ώστε να προκύψουν περισσότερα δεδοµένα για το ρόλο του συγκεκριµένου ενζύµου (Heyerκαι συν.,1973;mercerκαι McGregor,1982). Σύµφωνα λοιπόν µε τα αποτελέσµατά µας, διαπιστώνεται σηµαντική αναστολή της ενζυµικής δραστικότητας της AChE σε άτοµα από την περιοχή του Αντλιοστάσιου και της Περαίας,( ιάγραµµα 22),ενώ άτοµα από την Ολυµπιάδα, καθώς και από περιοχές της υτικής πλευράς του κόλπου (Χαλάστρα και Κύµινα)

190 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 167 δείχνουν αρκετά αυξηµένες τιµές της AChE ( ιαγράµµατα 21 και 22).Εποµένως,ως προς τη ρύπανση µε οργανικές ενώσεις και οργανοφωσφορικά προϊόντα, θα µπορούσαµε να συµπεράνουµε ότι οι περιοχές της Περαίας και του Αντλιοστάσιου είναι σηµαντικά επιβαρυµένες,συγκριτικά µε τις υπόλοιπες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Από τα αποτελέσµατα των δειγµατοληψιών και από τις συσχετίσεις που απορρέουν από τη στατιστική ανάλυση,µπορούµε να συµπεράνουµε πως η µέθοδος προσδιορισµού της δραστικότητας της AChE είναι χρήσιµη, ως βιοµάρτυρας της θαλάσσιας ρύπανσης (Γραφήµατα 1-3).Συγκεκριµένα,η δραστικότητα της AChE τόσο στην αιµόλεµφο, όσο και στον πεπτικό αδένα και τα βράγχια των µυδιών, µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση της επιβάρυνσης των περιοχών του Θερµαϊκού κόλπου από οργανικούς ρυπαντές,ενώ δεν είναι γνωστή η συνεισφορά των µετάλλων στη διαµόρφωση της δραστικότητας της AChE. Κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του έτους 2001, υψηλότερες τιµές ενζυµικής δραστικότητας παρατηρήθηκαν κατά τον Οκτώβριο, σε σχέση µε την περίοδο του Ιουνίου 2001, ενώ κατά την περίοδο των δειγµατοληψιών που ακολούθησαν, στα επόµενα δύο χρόνια, παρατηρήθηκε το αντίθετο πρότυπο ενζυµικής διακύµανσης. Εποχικές διακυµάνσεις της δραστικότητας της A ChE σε ίθυρα Μαλάκια έχουν αναφερθεί και από άλλους ερευνητές (Najimiκαι συν.,1997; Dellaliκαι συν.,2001),ενώ ασήµαντες εποχικές διαφορές παρατηρήθηκαν σε Ιχθύες (Stien και συν., 1998). Η εποχική διακύµανση της ενζυµικής δραστικότητας που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια των δειγµατοληψιών του Ιουνίου και Οκτωβρίου του έτους 2001, πιθανό να οφείλεται σε διάφορους περιβαλλοντικούς/φυσικούς παράγοντες,όπως η θερµοκρασία (Dellaliκαι συν., 2001),το µέγεθος των ζώων (Varela και Augpurger, 1966), αλλά και στην εποχική παρουσία ρυπογόνων παραγόντων στα νερά.η πτώση της θερµοκρασίας των νερών του Θερµαϊκού κόλπου κατά τον µήνα Οκτώβριο σε σχέση µε την καλοκαιρινή περίοδο (από 18 ο C σε 14 ο C), πιθανό να παίζει σηµαντικό ρόλο στη διακύµανση των επιπέδων της ενζυµικής δραστικότητας. 1.3 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕ ΩΝ ΤΟΥ ca M P. Λίγα βιβλιογραφικά δεδοµένα σχετίζονται µε το ρόλο που διαδραµατίζει το ca M P σε θαλάσσιους οργανισµούς. Στους Ιχθύες, το ca M P αποτελεί το κύριο διαµεσολαβητικό µόριο στο µονοπάτι µετάδοσης σήµατος,στο οποίο συµµετέχει η

191 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 168 ΡΚΑ και οδηγεί σε αύξηση της γλυκολυτικής διαδικασίας (Fabbriκαι συν.,1998). Επίσης, στους Ιχθύες έχει αναφερθεί πως το ca M P µπορεί να επηρεάζει τη δραστικότητα των οσφρητικών νευρώνων (M iyam oto και συν.,1992),καθώς και τη µετάδοση µηνυµάτων στο κεντρικό όργανο της γεύσης (Caprio και συν.,1993).σε ιστούς των ίθυρων Μαλακίων,το ca M P συµµετέχει ως δεύτερος µηνύτορας στην ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών που παίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση µεταβολικών µονοπατιών του κυττάρου (Fernandez και συν., 1998). Επίσης, µεταβολές των επιπέδων του ca M P παρατηρούνται κατά τη διάρκεια ανοξικών συνθηκών (M acd onald και Storey,1999),ενώ αλλαγές στα επίπεδα του ca M P έχει αναφερθεί ότι ρυθµίζουν τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης σε αιµοκύτταρα της αιµολέµφου µυδιών (Chen και Bayne,1995). Στην παρούσα µελέτη,προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις του ca M P στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες των µυδιών που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου. Οι τιµές αυτές συγκρίθηκαν µε τιµές του ca M P που µετρήθηκαν σε µύδια που συλλέχθηκαν από την Ολυµπιάδα, που βρίσκεται στο Στρυµονικό και χρησιµοποιήθηκε ως σταθµός αναφοράς. Τα αποτελέσµατα έδειξαν χαµηλά επίπεδα ca M P σε άτοµα που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Ολυµπιάδας,σε σχέση µε τα αυξηµένα επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε άτοµα από τις περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου.η αύξηση των επιπέδων του ca M P πιθανό να σχετίζεται µε αύξηση της σύνθεσης της αδενυλικής κυκλάσης,ή µε αναστολή της φωσφοδιεστεράσης του ca M P, µιας και έχει αναφερθεί ότι η παρουσία ρυπογόνων παραγόντων µπορεί να προκαλέσει αλλαγές στη δραστικότητα των παραπάνω ενζύµων (Pareschiκαι συν.,1997). Οι εποχικές διακυµάνσεις του ca M P,που προέκυψαν από τα αποτελέσµατά µας, πιθανό να σχετίζονται µε τον αναπαραγωγικό κύκλο των οργανισµών. Συγκεκριµένα,υψηλότερες τιµές βρέθηκαν στους ιστούς ατόµων που συλλέχθηκαν κατά τους καλοκαιρινούς µήνες (Ιούνιος)σε σχέση µε τα άτοµα που συλλέχθηκαν τη χειµερινή περίοδο.παρόµοιες διακυµάνσεις του ca M P παρατήρησαν οι Enrich και συν.(2002),οι οποίοι αναφέρουν µεταβολές της συγκέντρωσης του µορίου στους ιστούς του είδους Mytilus galloprovincialis, ως αποτέλεσµα του αναπαραγωγικού κύκλου των πληθυσµών. Παρ όλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που πιθανό να σχετίζονται µε τις εποχικές αλλαγές του ca M P σε κάθε ιστό των ατόµων.

192 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 169 Τα αποτελέσµατα της συγκεκριµένης µελέτης οδηγούν στο συµπέρασµα πως τα αυξηµένα επίπεδα του ca M P στους ιστούς των ατόµων που συλλέχθηκαν από τις διάφορες περιοχές του Θερµαϊκού κόλπου, συγκριτικά µε τις τιµές στους ιστούς ατόµων από την Ολυµπιάδα,πιθανό να αποδίδονται στα αυξηµένα επίπεδα ρύπανσης του Θερµαϊκού κόλπου, συγκριτικά µε το Στρυµονικό κόλπο. Οι σηµαντικές συσχετίσεις που παρατηρούνται τόσο µεταξύ της δραστικότητας της AChE στους διάφορους ιστούς και του ca M P, ειδικότερα στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,όσο και των επιπέδων των ΜΤ και του ca M P στον ίδιο ιστό,ενισχύουν το παραπάνω συµπέρασµα (Γραφήµατα 3 και 4). Επίσης, από τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης,καθώς και από δεδοµένα χηµικής ανάλυσης που αφορούν την κατάσταση του Θερµαϊκού κόλπου,µπορούµε να συµπεράνουµε πως η συγκέντρωση του ca M P, ιδιαίτερα στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες µπορεί να αποτελέσει χρήσιµο εργαλείο βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης. Περεταίρω εργαστηριακές µελέτες των επιπέδων του νουκλεοτιδίου,µετά από έκθεση των οργανισµών σε ανόργανους και οργανικούς ρυπαντές,κρίνονται απαραίτητες για την ενίσχυση του ρόλου του ca M P ως βιοµάρτυρα της θαλάσσιας ρύπανσης και αναφέρονται παρακάτω.

193 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Στο πλαίσιο της εκτίµησης των επιπτώσεων της ρύπανσης σε θαλάσσια οικοσυστήµατα,µε τη χρήση του οργανισµού-βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis, καθώς και την καθιέρωση νέων βιοµαρτύρων,κρίθηκε ενδιαφέρον η µελέτη των βιοχηµικών παραµέτρων ΜΤ,AChE και ca M P, µετά από την έκθεση ατόµων σε ανόργανους και οργανικούς ρυπαντές. Οι συσχετίσεις µεταξύ των γνωστών βιοµαρτύρων,μτ και AChE,µε τις τιµές του ca M P αποσκοπεί στη µελέτη του ρόλου που µπορεί να διαδραµατίσει το ca M P ως βιοµάρτυρας. 2.1 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΩΝ ΜΤ ΚΑΙ ΤΟΥ ca M P ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ. Από τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης,µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντική αύξηση των επιπέδων των ΜΤ στον πεπτικό αδένα,τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες,ατόµων που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις καδµίου ( ιαγράµµατα 24,25α,25β).Παρόµοια αποτελέσµατα προκύπτουν και σε προγενέστερες µελέτες τόσο στο ίδιο είδος,όσο και σε άλλα είδη ίθυρων Μαλακίων (Roesijadiκαι Klerks,1989;Roesijadiκαι συν.,1991,1995;bebianno και συν.,1993; Gnassia-Barelli,1995). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν για πρώτη φορά ότι η συγκέντρωση του ca M P στους ιστούς των ατόµων αυξάνεται,µετά από έκθεση στο µέταλλο.συγκεκριµένα,τα επίπεδα του ca M P που µετρήθηκαν στον πεπτικό αδένα, τα βράγχια και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, βρέθηκαν σηµαντικά αυξηµένα, συγκριτικά µε τα επίπεδα σε άτοµα που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο ( ιαγράµµατα 26α,26β,27).Τα αποτελέσµατά µας φαίνεται να συµφωνούν µε παρόµοιες µελέτες σε Ιχθύες,οι οποίες αναφέρουν σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P, µετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του µετάλλου (Forrest και συν.,1997). Επίσης,in vivo εργαστηριακή έκθεση ψαριών σε κάδµιο έδειξε σηµαντική αύξηση των επιπέδων της κορτιζόλης στο πλάσµα του αίµατος,η οποία αποδίδεται στην επαγωγή ενός σηµατοδοτικού µονοπατιού µε τη συµµετοχή του ca M P (Fu και συν., 1990;Pratap και W endelaar Bonga,1990;Bleau και συν.,1996;h ontela και συν., 1996).Ανάλογες µελέτες σε ιστούς σπονδυλωτών αναφέρουν σηµαντική µεταβολή των επιπέδων του ca M P σε ιστούς οργανισµών που εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις του µετάλλου (Cook και συν., 1985; Lundberg και συν., 1987; Faurskov και Bjerregaard, 1997). Η ανασταλτική δράση του καδµίου στη

194 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 171 δραστικότητα των φωσφοδιεστερασών (W atjen και συν., 2001), καθώς και η ικανότητά του να επάγει τη δράση της αδενυλικής κυκλάσης έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές (Cook και συν., 1985; Flik και συν., 1987; Faurskov και Bjerregaard,1997;Forrest και συν.,1997) και πιθανό να σχετίζεται µε την αύξηση των επιπέδων του ca M P στους ιστούς των ίθυρων Μαλακίων. Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού της συγκέντρωσης του ca M P συσχετίζονται σηµαντικά µε τη συγκεντρώση των ΜΤ (Πίνακες 9 και 10). Είναι γνωστό ότι η επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ σχετίζεται µε την ενεργοποίηση ενός σηµατοδοτικού µηχανισµού στον οποίο συµµετέχουν µονοπάτια δράσης κινασών, όπως η πρωτεϊνική κινάση C, µέσω της µεταβολής της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων Ca +2 (A ndrew s,2000;larochelle και συν.,2001;saydam και συν.,2002).από τα αποτελέσµατα της µελέτης µας προκύπτει σηµαντική αύξηση των συγκεντρώσεων του ca M P, µετά από επίδραση του καδµίου. Εποµένως, ο µηχανισµός επαγωγής των ΜΤ και του ca M P, µετά την επίδραση του καδµίου, πιθανά να ακολουθεί ή να συζεύγνονται µε το ίδιο σηµατοδοτικό µονοπάτι.με την παραπάνω άποψη συµφωνούν και προηγούµενες µελέτες που υποστηρίζουν τη συµµετοχή του ca M P σε σηµατοδοτικο µηχανισµό ενεργοποίησης των γονιδίων που ευθύνονται για την παραγωγή των µεταλλοπρωτεϊνών (M eraliκαι συν.,1975;nebes και συν.,1988;pallaufκαι συν.,1995;adams και συν.,2002). 2.2 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΟΥ ca M P ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΤ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά µας,µετά από έκθεση των ατόµων σε Λινδάνιο παρατηρήθηκαν υψηλές τιµές του ca M P στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και στον πεπτικό αδένα, σε σχέση µε τα άτοµα ελέγχου ( ιαγράµµατα 28α,β). Επιπλέον, αυξηµένα επίπεδα ca M P, χωρίς να υπάρχει στατιστικά σηµαντική διαφορά, συγκριτικά µε τα άτοµα ελέγχου,παρατηρήθηκαν στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και στον πεπτικό αδένα ατόµων που εκτέθηκαν στο µίγµα των ΡΑΗς και στο 2,4-D ( ιαγράµµατα 28α,β).Η αύξηση των επιπέδων του ca M P που παρατηρήθηκε στον πεπτικό αδένα και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες, συµφωνεί µε προηγούµενες µελέτες,µετά από έκθεση σε οργανικούς ρυπαντές (Antures-Madeira και Madeira 1985;Lopez-Aparicio και συν.,1994;crisw ellκαι Loch-Caruso 1995;Pareschiκαι συν.,1997;evanson και Van DerKraak 2001;Duchiron και συν.,2002).αντίθετα, στα βράγχια ατόµων που εκτέθηκαν σε όλους τους οργανικούς ρυπαντές που

195 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 172 χρησιµοποιήθηκαν, διαπιστώθηκε σηµαντική µείωση των επιπέδων του ca M P ( ιάγραµµα 29). Από τα αποτελέσµατα της εργαστηριακής έκθεσης µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές,µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντική διαφοροποίηση µεταξύ των ιστών, όσο αφορά τις µεταβολές της συγκέντρωσης του ca M P ( ιαγράµµατα 28α,28β,29, Πίνακας 13).Η διαφοροποίηση που εµφανίζουν οι ιστοί των µυδιών,όσο αφορά τον τρόπο απόκρισής τους µετά από έκθεση σε οργανικούς ρυπαντές,έχει αναφερθεί και σε άλλες µελέτες (Playle, 1998; Lionetto και συν.,2001; Ericson και συν.,2002; Skarphethinsdottirκαι συν.,2003).οι µεταβολές των επιπέδων του ca M P πιθανό να αποτελούν ένα προσαρµοστικό µηχανισµό των ιστών απέναντι στους περιβαλλοντικούς ρυπογόνους παράγοντες (Pareschi και συν.,1997).επιπλέον,τα αυξηµένα επίπεδα του ca M P, µετά από την έκθεση των ζώων σε οργανικούς ρυπαντές,πιθανό να οφείλονται στην ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης ή την αναστολή των φωσφοδιεστερασών που επάγονται από την αυξηµένη παραγωγή ελεύθερων ριζών στους ιστούς (Crough και Roberts,1985). Ο ρόλος των µεταλλοθειονινών (MT)ως ειδικού βιοµάρτυρα,αποκλειστικά των βαρέων µετάλλων, παραµένει ένα µεγάλο ερωτηµατικό, µιας και υπάρχουν αρκετές αναφορές που υποστηρίζουν την επαγωγή των συγκεκριµένων µεταλλοπρωτεϊνών και από άλλους παράγοντες,εκτός από τα βαρέα µέταλλα,όπως οι συνθήκες υποξίας, το θερµικό στρες, η επίδραση αλκυλικών και οξειδωτικών παραγόντων,η υπεριώδης και η ιονίζουσα ακτινοβολία,η παρουσία φωρβολεστέρων και γλυκοκορτικοειδών (Durnam και Palmitter,1984;Hamer,1986;Garretκαι συν., 1992; Rim oldi και συν., 1992; Sato και Brem ner, 1993; Kelly και συν., 1997). Επιπλέον,έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές η επαγωγή των ΜΤ από ελεύθερες ρίζες και υπεροξείδια (Baraboi και Petrina, 2003), καθώς και από οργανικούς ρυπαντές (Sandvik και συν.,1997;h am za-chaffaiκαι συν.,1998;hamza-chaffaiκαι συν., 1998; Mosleh και συν., 2003). Η ικανότητα των οργανικών ρυπαντών να επάγουν τη σύνθεση των ΜΤ,πιθανό να σχετίζεται µε την πρόκληση οξειδωτικού στρες,µέσω της δηµιουργίας ελεύθερων ριζών (Livingstone και συν.,1990;almeida και συν.,1997, Kepley και συν.,2003; Mosleh και συν.,2003; Kepley και συν., 2003).Φαίνεται ότι αυτές οι πρωτεΐνες,εκτός από την ικανότητά τους να δεσµεύουν βαρέα µέταλλα,µε κύριο σκοπό την αναστολή της τοξικής τους δράσης,µπορούν να διαδραµατίσουν εξίσου σηµαντικό ρόλο στην αντιοξειδωτική άµυνα των ίθυρων

196 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 173 Μαλακίων (Bauman και συν.,1991;bebbiano και Langston,1992;Sato και Brem ner, 1993;Roesijadi,1996;Cosson,2000;Isaniκαι συν.,2000;viarengo και συν.,2000). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης συµφωνούν µε τα παραπάνω δεδοµένα,µιας και διαπιστώθηκε σηµαντική επαγωγή ΜΤ στους ιστούς ατόµων που εκτέθηκαν σε διάφορους οργανικούς ρυπαντές (Πίνακας 11).Οι Crough και Roberts (1985),έδειξαν πως το Λινδάνιο µπορεί να µεταβάλλει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ασβεστίου,προκαλώντας την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C,µέσω της φωσφολιπάσης C.Θα µπορούσαµε εποµένως να συµπεράνουµε πως η επαγωγή των ΜΤ και του ca M P,µετά από έκθεση των µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές,όπως το Λινδάνιο,µπορεί να ρυθµίζεται µέσω της ενεργοποίησης σηµατοδοτικού µονοπατιού στο οποίο συµµετέχει η PK C. 2.3 ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΑΝΤΩΝ ΣΤΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ AChE ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΜΥ ΙΩΝ.O ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης συµφωνούν µε τη γενικά αποδεκτή άποψη ότι η δράση των οργανικών και οργανοφωσφορικών συστατικών έχει ώς αποτέλεσµα την αναστολή της δραστικότητας της AChE,µιας και έκθεση ατόµων σε Λινδάνιο,2,4-D,αλλά και σε µίγµα των PA H s,προκάλεσε σηµαντική αναστολή της δραστικότητας του ενζύµου σε όλους τους ιστούς που µελετήθηκαν (Πίνακας 12).Η αναστολή της δραστικότητας της AChE από οργανικούς ρυπαντές έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές (Weiss και Gakstatter,1964;Holland και συν.,1967;zincklκαι συν., 1987; Day και Scott, 1990; Bhattacharya, 2000). Ανάλογες διαπιστώσεις προκύπτουν και από προηγούµενες µελέτες, σχετικά µε τις επιπτώσεις των συγκεκριµένων οργανικών ρυπαντών στη δραστικότητα του ενζύµου (M unoz-blanco και συν.,1985;romeo και συν.,1997;gruber και M unn 1998;Hamza-Chaffaiκαι συν.,1998). Παρ όλη την έλλειψη βιβλιογραφικών δεδοµένων,σχετικά µε τη σύνδεση της AChE και του ca M P σε ιστούς µυδιών,τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης µας οδηγούν στο συµπέρασµα ότι το ca M P πιθανό να συµµετέχει στη ρύθµιση της δραστικότητας της AChE (Πίνακας 14).Τα αποτελέσµατα της µελέτης µας δείχνουν µια σηµαντική σχέση µεταξύ της αναστολής της δραστικότητας της AChE και της αύξησης των επιπέδων του ca M P σε ιστούς µυδιών που εκτέθηκαν σε οργανικούς ρυπαντές,γεγονός που ενισχύει το ρόλο του ca M P ως βιοµάρτυρα.η παραπάνω

197 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 174 άποψη ενισχύεται από προηγούµενες µελέτες,σύµφωνα µε τις οποίες η γονιδιακή ρύθµιση της έκφρασης της AChE βρίσκεται υπό τον έλεγχο σηµατοδοτικού µηχανισµού,στον οποίο συµµετέχει το ca M P (Fontaine και συν., 1987; Choiκαι συν.,1998;joy και συν.,2003;rossiκαι συν.,2003). Η αναστολή της δραστικότητας της AChE οφείλεται στη δέσµευση των οργανικών ρυπαντών σε µια υδροξυλοµάδα του αµινοξέος της σερίνης που αποτελεί κύρια θέση σύνδεσης της ακετυλχολίνης στο µόριο της AChE.Η σύνδεση του οργανικού ρυπαντή έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή της ικανότητας υδρόλυσης της ακετυλχολίνης από την AChE (W alkerκαι συν.,2001).η αναστολή της υδρολυτικής ικανότητας της AChE, µετά από έκθεση των µυδιών σε οργανικούς ρυπαντές, προκαλεί σηµαντική συσσώρευση ακετυλχολίνης. Σε ανάλογα συµπεράσµατα κατέληξαν και οι Joy and Albertson (1987),µετά από έκθεση ψαριών σε Λινδάνιο.Η αύξηση της συγκέντρωσης της ακετυλχολίνης πιθανό να προκαλεί αύξηση της σύνθεσης του ca M P, το οποίο µέσω σηµατοδοτικού µηχανισµού, στον οποίο συµµετέχει η ΡΚΑ (Choi και συν., 2000) και µια ca M P-εξαρτόµενη πρωτεΐνη σύνδεσης (CREB), (Wan και συν., 2000), οδηγεί σε αύξηση της σύνθεσης νέων µορίων AChE (Jiang και συν.,2003).παρόµοιες διαπιστώσεις προκύπτουν και από άλλες µελέτες σε ιστούς οργανισµών που εκτέθηκαν σε οργανικούς ρυπαντές, οι οποίες αναφέρουν επαγωγή της σύνθεσης του ca M P, που πιθανό να προκαλεί επαγωγή της δράσης της AChE (Bodnaryk,1976;Ilan και Yaron 1980;Taylor,1985; Choiκαι συν.,2000;wan και συν.,2000). 3. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P ΩΣ ΒΙΟΜΑΡΤΥΡΑ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ, ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ-ΒΙΟΕΝ ΕΙΚΤΗ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS. Από τα αποτελέσµατα της µελέτης πεδίου,αλλά και από την εργαστηριακή έκθεση µυδιών σε ρυπαντές,διαπιστώνεται για πρώτη φορά µια σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων των ΜΤ και του ca M P, καθώς και της δραστικότητας της AChE µε τα επίπεδα του ca M P, στον πεπτικό αδένα και το σύµπλοκο µανδύας/γονάδες.η αύξηση των επιπέδων του ca M P που παρατηρήθηκε µετά από την έκθεση σε ρυπαντές,φαίνεται να σχετίζεται µε την επαγωγή της σύνθεσης των ΜΤ,καθώς και µε την αναστολή της AChE.Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν για πρώτη φορά την απόκριση του ca M P σε ρυπαντές,όπως βαρέα µέταλλα και οργανικές ουσίες.επίσης,η εργαστηριακή µελέτη έδειξε ότι το ca M P συµµετέχει

198 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 175 σε µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος που επάγονται από ρυπαντές,όπως τα βαρέα µέταλλα.επιπρόσθετες µελέτες θα µπορούσαν να δώσουν περισσότερες πληροφορίες για τους παράγοντες που µπορούν επιπλέον να ευθύνονται για την επαγωγή της σύνθεσης του ca M P και να ενισχύουν ακόµη περισσότερο το ρόλο του ως χρήσιµο εργαλείο βιοπαρακολούθησης, µε χρήση του οργανισµού βιοενδείκτη Mytilus galloprovincialis.

199 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 176 ΜΕΡΟΣ Β: ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ MYTILU S GALLOPROVINCIALIS. Είναι γενικά γνωστό πως οι οργανισµοί διαθέτουν µηχανισµούς µε τους οποίους διατηρούν σταθερές τις συνθήκες και τις µεταβολικές διαδικασίες στους ιστούς τους, ανεξάρτητα από τυχόν αλλαγές του εξωτερικού περιβάλλοντος. Η ικανότητα διατήρησης αυτής της οµοιόστασης δεν επιτυγχάνεται πάντα,λόγω της ύπαρξης και επίδρασης πολλών εξωτερικών παραγόντων που απειλούν τη φυσιολογική λειτουργία των οργανισµών.ανάµεσα στους εξωτερικούς παράγοντες που αποτελούν απειλή για τους οργανισµούς είναι και οι ρυπογόνοι παράγοντες. Μεταξύ αυτών είναι τα βαρέα µέταλλα,που λόγω της τοξικότητας και της ικανότητας να συσσωρεύονται σε µεγάλες ποσότητες στο εσωτερικό των οργανισµών αποτελούν κύριους ρυπαντές,τόσο των χερσαίων όσο και των υδάτινων οικοσυστηµάτων. Στην παρούσα εργασία, µελετήθηκαν οι επιπτώσεις του καδµίου στο σηµατοδοτικό µηχανισµό που επάγεται σε κύτταρα που αποµονώθηκαν από τον πεπτικό αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Η επίδραση του καδµίου µελετάται σε σχέση µε την αλληλεπίδρασή του µε την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na +/ H +,µε τους αδρενεργικούς υποδοχείς,καθώς και µε ρυθµιστικούς παράγοντες που συµµετέχουν σε οδούς µετάδοσης σήµατος,όπως η πρωτεϊνική κινάση C και το ca M P. 1. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΟΥ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ph (ph i)και ΣΤΗΝ ΕΙΣΡΟΗ ΙΟΝΤΩΝ ΝΑΤΡΙΟΥ (Νa + ).Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ C. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας έρευνας, µικροµοριακές συγκεντρώσεις του καδµίου επιδρούν στη µεταβολή της φυσιολογικής ενδοκυτταρικής τιµής του ph (ph i),σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis.συγκριµένα,έκθεση κυττάρων σε CdCl 2 τελικής συγκέντρωσης 50 µμ,προκαλεί σηµαντική αύξηση της τιµής του ενδοκυτταρικού ph (ph i),συγκριτικά µε την τιµή που αναφέρθηκε σε κύτταρα που δεν εκτέθηκαν στο µέταλλο (κύτταρα αναφοράς),( ιάγραµµα 30,Πίνακας 15).Η συγκέντρωση αυτή του µετάλλου έδωσε τις υψηλότερες τιµές ph i,µιας και έκθεση των κυττάρων σε µικρότερες (0.05 µμ,5 µμ) και µεγαλύτερες συγκεντρώσεις (500 µμ) έδωσε µικρότερες µεταβολές της

200 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 177 τιµής του ph i ( ιάγραµµα 30). Τα αποτελέσµατά µας συµφωνούν µε αυτά των Villela και συν. (1999), οι οποίοι αναφέρουν ότι το κάδµιο µεταβάλλει τη διαπερατότητα της µεµβράνης σε ιόντα H +,σε ηπατοκύτταρα χελιού. Επιπλέον,κύτταρα τα οποία εκτίθενται σε CdCl 2 τελικής συγκέντρωσης 50 µμ έδειξαν σηµαντική αύξηση του ρυθµού εισροής ιόντων Na +,συγκριτικά µε τα κύτταρα αναφοράς ( ιάγραµµα 31).Η αύξηση του ρυθµού εισροής ιόντων Na + σε συνδυασµό µε την αύξηση της τιµής του ph i που παρατηρήθηκε σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, µετά από έκθεσή τους σε κάδµιο,αποτελεί ένδειξη της ενεργοποίησης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Εκτός από την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,η µεταφορά ιόντων νατρίου επιτυγχάνεται και από άλλους ανταλλάκτες,όπως η αντλία νατρίου,ο ανταλλάκτης Νa + /K + -ΑΤΡase, καθώς και ο συµµεταφορέας Na-K-2Cl -. Οι συγκεκριµένοι ανταλλάκτες αναστέλλονται κατά την πειραµατική διαδικασία (δες Υλικά και Μέθοδοι),αποδεικνύοντας τον ενεργό ρόλο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στη ρύθµιση της εισροής των ιόντων Na + και τη ρύθµιση της τιµής του ph i των κυττάρων που εκτίθενται σε κάδµιο.ο ανταλλάκτης Νa + /Ca +2,ο οποίος σχετίζεται µε την ανταλλαγή ιόντων Νa + µε ιόντα Ca +2,επίσης αναστέλλεται από το κάδµιο,λόγω της αυξηµένης συγγένειάς του µε την κρυσταλλική δοµή του ασβεστίου (Sm ith και συν., 1987). Από τα παραπάνω επιβεβαιώνεται η σηµαντική ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά την επίδραση του καδµίου. Για την περεταίρω επιβεβαίωση της ενεργοποίησης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + από το κάδµιο,προχωρήσαµε στη χρήση του ειδικού αναστολέα της συγκεκριµένης αντλίας.γι αυτό το σκοπό χρησιµοποιήθηκε η ουσία 5-(Ν-ethyl-Nisopropyl)-am iloride, ή ΕΙΡΑ, που αποτελεί ένα αναστολέα της, ο οποίος ανταγωνίζεται µε τα ιόντα Na + για την σύνδεσή τους στην αντλία (Clark και Limbird, 1991). Από τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης, διαπιστώθηκε σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του µετάλλου τόσο στην ενδοκυτταρική τιµή του ph,όσο και στο ρυθµό εισροής ιόντων Νa +, σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν µε ΕΙΡΑ τελικής συγκέντρωσης 20 nm,µαζί µε κάδµιο 50 µμ (Πίνακας 15, ιάγραµµα 31). Το γεγονός αυτό µας οδηγεί στο συµπέρασµα πως στα κύτταρα του πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis ενεργοποιείται µια ευαίσθητη σε παράγωγα του αµιλοριδίου αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,µετά την έκθεση στο µέταλλο.

201 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 178 Στη συνέχεια,κρίθηκε σκόπιµο να µελετήσουµε το σηµατοδοτικό µονοπάτι που επάγεται στα κύτταρα µετά την επίδραση του καδµίου. Συγκεκριµένα, µελετήσαµε την πιθανή συµµετοχή της πρωτεϊνικής κινάσης C. Η επώαση των κυττάρων µε το φωρβολεστέρα PM A (10 nm ), ισχυρού ενεργοποιητή της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC),έδωσε σηµαντική αύξηση της τιµής ph i,ενώ επώαση των κυττάρων µε έναν ειδικό αναστολέα της πρωτεϊνικής κινάσης C (calphostin C, τελικής συγκέντρωσης 20 nm ),µαζί µε το µέταλλο,έδειξε σηµαντική µείωση της τιµής ph i,συγκριτικά µε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο ( ιάγραµµα 32).Συµπερασµατικά,µετά από έκθεση κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis σε κάδµιο,µπορούµε να διαπιστώσουµε σηµαντική ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και της PK C,καθώς και σύζευξη των δύο αυτών αποκρίσεων. 2. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ (ΡΚ). Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ C. Υπάρχουν ελάχιστα βιβλιογραφικά δεδοµένα που να σχετίζονται µε τις επιπτώσεις των βαρέων µετάλλων στη δραστικότητα ενζύµων που συµµετέχουν στο γλυκολυτικό µονοπάτι (Canesiκαι συν.,1998;2000a;2001).τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν πως το κάδµιο προκάλεσε σηµαντική αύξηση της δραστικότητας της πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ),κύριου ρυθµιστικού ενζύµου της γλυκολυτικής οδού,σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. (Πίνακας 16, ιάγραµµα 33).Τα αποτελέσµατά µας συµφωνούν µε άλλες µελέτες που αφορούν την επίδραση άλλων παραγόντων, όπως του ψευδαργύρου, της ινσουλίνης και αυξητικών παραγόντων, στη δραστικότητα της ΡΚ, σε κύτταρα πεπτικού αδένα µυδιών (Canesiκαι συν.,1997;1999;2000b;2001). Επιπρόσθετα, επώαση των κυττάρων µε αµιλορίδιο, καθώς και µε το παράγωγο του αµιλοριδίου,ειρα,µαζί µε το µέταλλο,έδειξε σηµαντική µείωση της δραστικότητας της ΡΚ ( ιάγραµµα 33).Είναι γνωστό ότι το αµιλορίδιο αναστέλλει τα περισσότερα µεµβρανικά συστήµατα µεταφοράς ιόντων Νa +,όπως τα επιθηλιακά κανάλια Νa +,την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,καθώς και την αντλία Νa + /Ca +2+ (Frelin και συν.,1988;kleym an και Cragoe,1988).Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της ΡΚ µετά από την επίδραση του καδµίου πιθανό να επιτυγχάνεται µετά από την ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,ή

202 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 179 ότι η ενεργοποίηση της ΡΚ οφείλεται στις αλλαγές του ph i,που είναι αποτέλεσµα της ενεργοποίησης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +.Εποµένως,µπορούµε να υποθέσουµε ότι το σηµατοδοτικό µονοπάτι που επάγεται µετά από την έκθεση των κυττάρων σε κάδµιο,οδηγεί στην ενεργοποίηση τόσο της ΡΚ,όσο και της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,ή ότι η επαγωγή της ΡΚ οφείλεται στην ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Για το χαρακτηρισµό του σηµατοδοτικού µονοπατιού που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ΡΚ σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού,µετά την έκθεσή τους στο κάδµιο,ερευνήθηκαν οι επιπτώσεις της σταυροσπορίνης,της καλφοστίνης C και του φωρβολεστέρα ΡΜΑ,στη δραστικότητα της ΡΚ.Τα αποτελέσµατά µας δείχνουν µια σηµαντική σχέση µεταξύ της πρωτεϊνικής κινάσης C και της δραστικότητας της ΡΚ σε κύτταρα που εκτίθενται στο κάδµιο. Τα αποτελέσµατα της έκθεσης των κυττάρων τόσο σε ΡΜΑ, όσο και στους αναστολείς της PKC, δείχνουν πως η σηµατοδοτική οδός που επάγεται µετά την επίδραση του καδµίου και στην οποία συµµετέχει η PK C, συνδέεται τόσο µε την ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,όσο και µε την ΡΚ (Πίνακας 19).Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης συµφωνούν µε προηγούµενες µελέτες,οι οποίες αναφέρουν πως το κάδµιο µπορεί να επάγει σηµατοδοτικούς µηχανισµούς,µέσω της ενεργοποίησης της ΡΚC, της κινάσης της τυροσίνης,καθώς και της κινάσης ΙΙ της καζεΐνης (Adams και συν., 2002).Επιπλέον,µετά από έκθεση σε κάδµιο,έχει αναφερθεί η αύξηση των ιόντων Ca +2, σε κύτταρα βραγχίων του είδους Mytilus sp. (Viarengo και συν., 1993). Ανάλογη δράση αναφέρθηκε στην περίπτωση και άλλων βαρέων µετάλλων,όπως ο ψευδάργυρος,ο οποίος αυξάνει τη δραστικότητα γλυκολυτικών ενζύµων,µέσω ενός µονοπατιού που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της κινάσης της τυροσίνης, ενώ µέταλλα όπως ο υδράργυρος και ο χαλκός,σχετίζονται µε την µετάδοση µηνύµατος µέσω µονοπατιού που συµµετέχουν ιόντα Ca +2 ως δεύτεροι µηνύτορες,σε πεπτικά κύτταρα του µυδιού Mytilus galloprovincialis (Canesiκαι συν.,2000a;2001). 3. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΩΝ Α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΣΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΕΠΑΓΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΚΑ ΜΙΟ. Η επαγωγή σηµατοδοτικής οδού (µε τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και της ΡΚC) σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά την έκθεσή τους σε κάδµιο,µας οδηγεί στην υπόθεση πως το µέταλλο πιθανό να εµφανίζει ανάλογη δράση µε αυτή των ορµονών.γι αυτό το λόγο,

203 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 180 προχωρήσαµε στη µελέτη των επιπτώσεων των αδρενεργικών αγωνιστών,τόσο στην µεταβολή του ph i,όσο και στη δραστικότητα της ΡΚ. Σε κύτταρα που εκτέθηκαν για 30 λεπτά σε αδρεναλίνη (ουσία αγωνιστής των α-και β-αδρενεργικών υποδοχέων)και ισοπρεναλίνη (β-αδρενεργικός αγωνιστής), διαπιστώθηκαν σηµαντικά υψηλότερες τιµές ph i και δραστικότητας της ΡΚ, συγκριτικά µε τα κύτταρα αναφοράς (Πίνακας 18 και 20). Ανάλογη αύξηση της δραστικότητας της ΡΚ και της τιµής του ph i αναφέρθηκε σε ερυθροκύτταρα βατράχου και ανθρώπου,µετά την επίδραση αδρεναλίνης (Kaloyianniκαι συν.,1997; Kaloyianniκαι Giagtzoglou 2000;Bourikas και συν.,2003).επιπρόσθετα,η δράση του µετάλλου µελετήθηκε µε τη χρησιµοποίηση ανταγωνιστών των αδρενεργικών υποδοχέων.τα αποτελέσµατά µας έδειξαν ότι µετά από επώαση των κυττάρων µε τον ανταγωνιστή των β-αδρενεργικών υποδοχέων, προπρανολόλη, προκλήθηκε σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του καδµίου (Πίνακας 19).Παρόµοια είναι τα αποτελέσµατα που προκύπτουν µετά από επώαση των κυττάρων µε ανταγωνιστές τόσο των α 1 -, όσο και των β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (prazosin 1 µμ και metoprolol 1 µμ αντίστοιχα), γεγονός που δηλώνει την ύπαρξη αδρενεργικών υποδοχέων στα κύτταρα πεπτικού αδένα των µυδιών και την αλληλεπίδρασή τους µε το κάδµιο για την επαγωγή σηµατοδοτικών µηχανισµών. Τα εξαγόµενα αποτελέσµατα, µας οδηγούν στην υπόθεση πως το κάδµιο πιθανό να επάγει µονοπάτι µετάδοσης σήµατος,µέσω της αλληλεπίδρασής του µε τους α 1 -,β-και β 1 -αδρενεργικούς υποδοχείς στα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Η χρησιµοποίηση αδρενεργικών ανταγωνιστών επιβεβαίωσε την παρουσία αδρενεργικών υποδοχέων που πιθανό να αλληλεπιδρούν µε το κάδµιο. Η παρουσία αδρενεργικών υποδοχέων αναφέρεται και από τους Lacoste και συν.(2001),οι οποίοι έδειξαν την επαγωγή κυτταρικών αποκρίσεων µετά από έκθεση σε αδρεναλίνη κυττάρων στρειδιού. Συµπερασµατικά, σε συνθήκες stress, τα κύτταρα υιοθετούν στρατηγικές διατήρησης της ενδοκυτταρικής τους οµοιόστασης και δοµής. Εφόσον η ενεργοποίηση ή/και η αναστολή της PK C ενεργοποιεί ή/και αναστέλλει τόσο την αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,όσο και τη δραστικότητα της ΡΚ,είναι λογικό να υποθέσουµε ότι το κάδµιο αλληλεπιδρά µε τους β-, β 1 - και α 1 - αδρενεργικούς υποδοχείς και προκαλεί την ενεργοποίηση της ΡΚ και της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +, µέσω της ενεργοποίησης της PK C. Άµεση συνέπεια της αυξηµένης δραστικότητας της ΡΚ είναι η αύξηση του ρυθµού γλυκόλυσης,ως απόκριση του

204 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 181 κυττάρου στις αυξηµένες ενεργειακές απαιτήσεις που δηµιουργούνται κατά τη διάρκεια συνθηκών stress. Η αύξηση της γλυκόλυσης έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση των παραγόµενων πρωτονίων (Η + )τα οποία µεταφέρονται στο εξωτερικό του κυττάρου µέσω της ενεργοποιηµένης αντλίας ανταλλαγής Na + /H +. Από την άλλη µεριά, είναι αξιοσηµείωτο ότι όταν η αντλία ανταλλαγής ιόντων αναστέλλεται, παρατηρείται µείωση της δραστικότητας της ΡΚ, γεγονός που υποδηλώνει τη «σύνδεση» των δύο πρωτεϊνών.εποµένως,τα αποτελέσµατά µας προτείνουν ότι είτε το κάδµιο επιδρά στην PKC και στην ΡΚ, µέσω της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,είτε ότι η ενεργοποίηση της ΡΚ οφείλεται σε αλλαγές της ενδοκυτταρικής τιµής ph (ph i)που προκαλεί η δραστικότητα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Εφόσον η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + ρυθµίζεται από ένα πλήθος διεγερτών, θα µπορούσαµε να συµπεράνουµε ότι συνεισφέρει στην «ευαίσθητη» ρύθµιση διαφόρων ενδοκυτταρικών µονοπατιών µετάδοσης σήµατος σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. 4. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) ΚΑΙ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAGM ENTS) ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS,ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. Οι δραστικές µορφές οξυγόνου (ROS) έχουν σοβαρές επιπτώσεις στη φυσιολογική λειτουργία των βιολογικών συστηµάτων. Συγκεκριµένα, οι ROS προκαλούν υπεροξείδωση των λιπιδίων της κυτταρικής µεµβράνης, αλλά και των άλλων µεµβρανικών δοµών του κυττάρου, µετουσίωση πρωτεϊνών,αδρανοποίηση ενζύµων, καθώς και αλλοίωση της γενετικής σύστασης, µέσω της οξείδωσης νουκλεϊκών οξέων και πυριµιδίνων στο εσωτερικό του πυρήνα (Kasaiκαι συν.,1986; Livingstone,1993;H iguchiκαι M atsuw aka,1997;w inston και Giulio,1999). Η παρουσία των ROS µπορεί να επηρεάσει την πορεία του κυτταρικού κύκλου (Σχήµα 4).Χαµηλές συγκεντρώσεις ROS συµβάλλουν στην προώθηση της κυτταρικής διαίρεσης και της φυσιολογικής ανάπτυξης του κυττάρου (Davies,2000; Martindale και Holbrook, 2002), µέσω σηµατοδοτικών οδών ρύθµισης του κυτταρικού κύκλου,στις οποίες συµµετέχουν πλήθος πρωτεϊνικών κινασών,όπως κινάσες RTK,PK C,PLCγ1,Src και M A PK s (Boonstra και Post,2004).Αντίθετα,

205 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 182 αυξηµένες συγκεντρώσεις ROS,ευθύνονται για την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης του DNA,οπότε ο κυτταρικός κύκλος «αιχµαλωτίζεται» στα στάδια G 1 /S ή/και G 2 /Μ.Σε αυτό το σηµείο,η επιτυχηµένη επιδιόρθωση των βλαβών του DNA θα καθορίσει την µετέπειτα πορεία του κυττάρου. Αυξηµένη βλάβη του γενετικού υλικού δεν συνεπάγεται απαραίτητα και αποπτωτική διαδικασία. Αυξηµένη επιδιορθωτική ικανότητα µπορεί να οδηγήσει στα επόµενα στάδια του κυτταρικού κύκλου,ενώ αναστολή της επιδιορθωτικής ικανότητας ή ανεπανόρθωτες βλάβες του DNA µπορεί να οδηγήσουν σε αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης και πρόκληση αποπτωτικών φαινοµένων (Higuchi και M atsukaw a, 1997; Thorn και συν., 2001; Chung και συν.,2002;zhang και συν.,2003;boonstra και Post2004). Αποδιοργάνωση DNA- Βλάβη DNA Υψηλές συγκεντρώσεις ROS G 1/S,G 2 /M Χαµηλές συγκεντρώσεις ROS Απόπτωση Οξειδωτική βλάβη DNA Αναστολή επιδιορθωτικών µηχανισµών,πρόκληση ανεπανόρθωτων βλαβών του DNA Επιδιόρθωση βλαβών Κυτταρική διαίρεση Σχήµα 4. Επίδραση των ROS στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis,µετά από έκθεσή τους σε κάδµιο. Schem e 4.Possible effects ofros production in the cellcycle progression ofisolated digestive gland cells ofm ytilus galloprovincialis,aftertreatm entwith cadm ium. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν πως µικροµοριακές συγκεντρώσεις (50 µmol/l)καδµίου προκαλούν αύξηση των παραγόµενων ROS σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Η αύξηση των ROS, µετά από την επίδραση του καδµίου µπορεί να αποδοθεί τόσο στην αναστολή ενός µεγάλου αριθµού αντιοξειδωτικών ενζύµων του κυττάρου,όπως η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης,η καταλάση και η υπεροξειδική δισµουτάση,όσο και στη µείωση της ποσότητας της γλουταθειόνης που αποτελεί τον κυριότερο αντιοξειδωτικό παράγοντα του κυττάρου (W aisberg και συν.,2003).ένας άλλος πιθανός µηχανισµός που µπορεί

206 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 183 να εξηγήσει την παραγωγή ROS, µετά την επίδραση του µετάλλου είναι η αντικατάσταση µεταλλικών ιόντων σιδήρου και χαλκού από διάφορες ενδοκυτταρικές περιοχές (κυτταροπλασµατικές και µεµβρανικές πρωτεΐνες)και η απελευθέρωσή τους στον ενδοκυτταρικό χώρο,µε αποτέλεσµα να συµβάλλουν στην παραγωγή ελεύθερων ριζών, συµµετέχοντας καταλυτικά σε αντιδράσεις παραγωγής ROS (αντίδραση Fenton).Επιπρόσθετα,έχει αναφερθεί η παραγωγή ROS,µέσω της διαταραχής του µιτοχονδριακού µεµβρανικού δυναµικού (Pourahm ad και O Brien,2000). Οι τοξικές επιπτώσεις του µετάλλου γίνονται ακόµα πιο εµφανείς,αν λάβουµε υπόψη µας την αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού κυττάρων που εκτέθηκαν σε ίδιες συγκεντρώσεις καδµίου (Πίνακας 23 και 24, ιάγραµµα 37). Είναι σηµαντικό το γεγονός πως οι κυτταροτοξικές επιπτώσεις του µετάλλου γίνονται άµεσα αντιληπτές. Σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατά µας, υπάρχουν αναφορές που αποδεικνύουν το ρόλο του καδµίου στην αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού που γίνεται αντιληπτή µέσω της εµφάνισης µονόκλωνων κοµµατιών DNA (Single Strand Breaks/SSBs),(O chiκαι Ohsaw a,1983;coogan και συν.,1992;h assoun και Stohs, 1996;Misra και συν.,1998;pruskiκαι Dixon,2002). Η ταυτόχρονη αύξηση των ROS και των γενετικών βλαβών σε κύτταρα που εκτίθενται στο µέταλλο µας οδηγεί στο συµπέρασµα πως τα δυο γεγονότα πιθανό να σχετίζονται µεταξύ τους.οι Zhong και συν.(1990)αναφέρουν πως το κάδµιο,εκτός από την άµεση επίδρασή του, πιθανό να εµπλέκεται έµµεσα στη διαταραχή της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού,µέσω της επαγωγής ελεύθερων ριζών, ενώ οι Walkerκαι συν.(1994)έδειξαν πως η θραυσµατοποίηση του γενετικού υλικού σχετίζεται µε την παραγωγή σουπεροξειδικών ριζών και την αδυναµία αντιµετώπισής τους από τους αντιοξειδωτικούς µηχανισµούς του κυττάρου,µιας και αναστέλλεται σηµαντικά ο µηχανισµός δράσης της γλουταθειόνης, που αποτελεί σηµαντικό αντιοξειδωτικό παράγοντα των κυττάρων.η µείωση της αντιοξειδωτικής άµυνας του κυττάρου,µε την ταυτόχρονη αύξηση των ROS,µπορεί να εξηγήσει τη σηµαντική βλάβη του γενετικού υλικού που παρατηρείται σε κύτταρα που εκτίθενται σε κάδµιο (W aisberg και συν.,2003). Εν κατακλείδι, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν ότι το κάδµιο επάγει τόσο τη σύνθεση ROS,όσο και την εµφάνιση µονόκλωνων κοµµατιών γενετικού υλικού σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Οι ROS που παράγονται µετά από την επίδραση του καδµίου φαίνεται ότι ευθύνονται

207 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 184 για την εµφάνιση µονόκλωνων κοµµατιών DNA. Η πιθανή συµµετοχή σηµατοδοτικού µηχανισµού,µε την εµπλοκή της PKC και της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στην παραγωγή ελεύθερων ριζών και στη διαταραχή της ακεραιότητας του γενετικού υλικού,αποτελεί αντικείµενο µελέτης και αναλύεται παρακάτω. 5. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Na + /H + ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAGM ENTS) ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS,ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. Τα αποτελέσµατά µας έδειξαν τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + σε κυτταρικές αποκρίσεις,όπως το οξειδωτικό stress και η αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού,µετά από έκθεση κυττάρων στο µέταλλο,που αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία.συγκεκριµένα, κύτταρα που εκτέθηκαν σε κάδµιο,αφού προηγουµένως ανεστάλλει η δράση της αντλίας µε τη χρησιµοποίηση ΕΙΡΑ,έδειξαν σηµαντική µείωση των Ο - 2 και ROS,σε σχέση µε τα αυξηµένα επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που εκτέθηκαν µόνο στο µέταλλο ( ιαγράµµατα 35 και 36).Από τα αποτελέσµατα φαίνεται πως η αντλία παίζει σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή ROS.Ο σηµαντικός ρόλος της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,µετά την επίδραση του καδµίου,αποδεικνύεται και από τη µείωση των επιπτώσεων του καδµίου στη δοµική ακεραιότητα του γενετικού υλικού, µετά από αναστολή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων µε χρήση ΕΙΡΑ,(Πίνακες 23 και 24). Τα αποτελέσµατά µας,δείχνουν για πρώτη φορά τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στην παραγωγή ROS και στην πρόκληση γενετικών διαταραχών σε ασπόνδυλα.είναι λογικό να υποθέσουµε πως το κάδµιο πιθανό να προκαλεί την παραγωγή ελεύθερων ριζών,καθώς και βλάβη του γενετικού υλικού, µέσω ενός µηχανισµού που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της αντλίας Na + /H + στα κύτταρα του πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis.

208 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ C (PKC)ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAGM ENTS) ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS,ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. Στην προσπάθεια να κατανοήσουµε ορισµένες πτυχές του σηµατοδοτικού µηχανισµού που επάγεται κατά τη διάρκεια έκθεσης των κυττάρων στο µέταλλο, προχωρήσαµε στη µελέτη του µονοπατιού µεταγωγής µηνύµατος που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PK C). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν τη συµµετοχή της PK C στο σηµατοδοτικό µονοπάτι που επάγεται από το κάδµιο.συγκεκριµένα,σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν σε κάδµιο, αφού προηγουµένως ανεστάλλει η δράση της PK C, διαπιστώθηκε σηµαντική µείωση των επιπτώσεων του µετάλλου, τόσο στην παραγωγή Ο - 2 και ROS και στη σύνθεση του ca M P,όσο και στην αποσταθεροποίηση της δοµής του γενετικού υλικού (Πίνακες 24 και 26, ιαγράµµατα 35 και 36).Τα αποτελέσµατά µας συµφωνούν µε προγενέστερες µελέτες,σύµφωνα µε τις οποίες η ενεργοποίηση της PK C επάγει την παραγωγή ROS,µέσω µηχανισµών δράσης των οξειδασών NAD(P)H (Arum ugam και συν.,2000).υπάρχει η πιθανότητα η PK C να εµπλέκεται στο µηχανισµό παραγωγής ROS και στην πρόκληση γενετικών διαταραχών σε κύτταρα που εκτίθενται στο κάδµιο,χωρίς ακόµα να είναι γνωστός ο τρόπος και ο µηχανισµός δράσης και µεταφοράς του µηνύµατος στον πυρήνα. Οι Nemoto και συν. (2000) και Klann και συν. (1998) αναφέρουν πως η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS συνεισφέρει στη ρύθµιση της δραστικότητας της PKC.Παράλληλα,τα υδρο-υπεροξείδια που παράγονται κατά της υπεροξείδωση των µεµβρανικών λιπιδίων,µια διαδικασία που συµβαίνει κατά την επίδραση βαρέων µετάλλων, όπως είναι το κάδµιο, µπορεί αναπόφευκτα να συµβάλλουν στην ενεργοποίηση της PKC σε πολλούς κυτταρικούς τύπους (Shearman και συν.,1989; Bellκαι Burns,1991).Επιπλέον,σύµφωνα µε τους Higuchiκαι Matsukaw a (1999),η ενεργοποίηση της PK C πιθανό να παίζει ρόλο στη θραυσµατοποίηση του γενετικού υλικού που προκαλείται µέσω των ενδογενώς παραγόµενων ελεύθερων ριζών,ως αποτέλεσµα της υπεροξείδωσης των λιπιδίων των µεµβρανικών δοµών. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης συµφωνούν µε άλλες µελέτες (Kaloyianniκαι συν.,2001;bourikas και συν.,2003),οι οποίες δείχνουν επίσης τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και της PK C στο µονοπάτι

209 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 186 µετάδοσης σήµατος,που επάγεται από το κάδµιο.σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά µας, µπορούµε να συµπεράνουµε πως το κάδµιο πιθανό να προκαλεί υπεροξείδωση των µεµβρανικών λιπιδίων και την παραγωγή ROS,µέσω της επαγωγής ενός µονοπατιού µεταγωγής µηνύµατος στο οποίο κύριο ρόλο παίζει η ενεργοποίηση της PK C και η ταυτόχρονη αύξηση της δραστικότητας της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Παρακάτω,κρίθηκε ενδιαφέρουσα η µελέτη των επιπτώσεων του µετάλλου σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού,µε κύριο στόχο τη µελέτη της ικανότητας του µετάλλου να επάγει τη σύνθεση του ca M P, καθώς και την πιθανότητα το ca M P να εµπλέκεται σε σηµατοδοτικό µονοπάτι που ευθύνεται για την παραγωγή ROS και την πρόκληση διαταραχών της ακεραιότητας του γενετικού υλικού.

210 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ca M P ΣΕ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAGM ENTS)ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. Τα αποτελέσµατα της µελέτης µας έδειξαν ότι το κάδµιο µπορεί να αλληλεπιδρά µε αδρενεργικούς υποδοχείς.στη συνέχεια,εφόσον το ca M P αυξάνεται µετά την ενεργοποίηση των αδρενεργικών υποδοχέων,προχωρήσαµε στην µελέτη της συµµετοχής του ca M P στην οδό µετάδοσης σήµατος,που επάγεται από το κάδµιο. Από τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης διαπιστώνεται σηµαντική αύξηση των επιπέδων του ca M P σε κύτταρα που εκτίθενται στο µέταλλο, γεγονός που αναφέρεται και από άλλους ερευνητές που χρησιµοποίησαν παρόµοιες συγκεντρώσεις του µετάλλου ( µμ)σε άλλους οργανισµούς (Cook και συν., 1985;Forrestκαι συν.,1997).τα αποτελέσµατά µας δείχνουν διαφορετική απόκριση των αδρενεργικών υποδοχέων στην επαγωγή του νουκλεοτιδίου, µε µεγαλύτερη ευαισθησία να παρατηρείται στους β- αδρενεργικούς υποδοχείς,συγκριτικά µε την ευαισθησία που εµφανίζουν οι α- τύπου αδρενεργικοί υποδοχείς. Εποµένως, θα µπορούσαµε να προτείνουµε ότι η αλληλεπίδραση του καδµίου,κατά κύριο λόγο,µε τους β-και β 1 -και,κατά δεύτερο λόγο,µε τους α 1 -και α 2 -αδρενεργικούς υποδοχείς, οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων του ca M P και στην επαγωγή µονοπατιού µεταγωγής µηνύµατος,πιθανό µέσω της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ)σε κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι η αναστολή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,µείωσε σηµαντικά τα επίπεδα του ca M P (Πίνακας 26).Το γεγονός αυτό ενισχύει το ρόλο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στο σηµατοδοτικό µονοπάτι που επάγεται από το κάδµιο. Παρόµοια, µετά από αναστολή της PK C, παρατηρήθηκε µείωση των επιπτώσεων του µετάλλου στο ca M P, γεγονός που υποδηλώνει την αλληλεπίδραση των σηµατοδοτικών µονοπατιών όπου συµµετέχει η PKC,µε αυτό της ΡΚΑ.Με άλλα λόγια,λαµβάνοντας υπόψη µας το σηµαντικό ρόλο του ca M P στην ενεργοποίηση της ΡΚΑ,µπορούµε να υποθέσουµε ότι εκτός από την ενεργοποίηση της PK C,µπορεί να ενεργοποιείται επιπλέον και η ΡΚΑ ή ότι στο µονοπάτι µετάδοσης σήµατος στο οποίο συµµετέχει το ca M P να συµµετέχει και η PKC. Η άποψη αυτή υποστηρίζεται και από άλλους ερευνητές που αναφέρουν σηµαντική σχέση της πρωτεϊνικής κινάσης C µε το ca M P (Yamashita και συν.,1988; Bourikas και συν., 2003). Επιπλέον, τα παραπάνω συµφωνούν µε προηγούµενα

211 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 188 δεδοµένα,τα οποία δείχνουν τη στενή σχέση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + µε το ca M P- ΡΚΑ εξαρτόµενο σηµατοδοτικό µονοπάτι,καθώς και από µελέτες που δείχνουν πως η συγκεκριµένη αντλία αποκρίνεται σε αγωνιστές τόσο της ΡΚΑ,όσο και της PK C (Borgese και συν.,1992). Τα αποτελέσµατά µας δείχνουν ότι η επαγωγή της σύνθεσης του ca M P σε κύτταρα τα οποία εκτέθηκαν στο µέταλλο,δεν φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή ROS.Πράγµατι,φαίνεται λογικό να προτείνουµε ότι η παρουσία του ca M P παίζει προστατευτικό ρόλο ενάντια στη γένεση ROS,µετά από έκθεση σε κάδµιο (Πίνακας 21),πιθανό µέσω της επαγωγής της σύνθεσης των γονιδίων της GSH.Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε προηγούµενες µελέτες που αναφέρονται στον προστατευτικό ρόλο που διαδραµατίζει το ca M P ενάντια στην παραγωγή ROS (Keller και συν.,1998;k ohda και Gemba,2001).Το γεγονός πως η αναστολή της αντλίας στα παραπάνω κύτταρα µείωσε σηµαντικά τα επίπεδα των ROS (Πίνακας 21),υποστηρίζει τη συµµετοχή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + στην επαγωγή των ROS.Εποµένως,φαίνεται πως κύτταρα που διατηρούν αυξηµένα επίπεδα ca M P, παρουσιάζουν µεγαλύτερη ικανότητα διατήρησης χαµηλών συγκεντρώσεων ROS, ειδικά όταν αναστέλλεται η δράση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Σε αντίθεση µε το ρόλο του ca M P στην παραγωγή ROS,η συµµετοχή του στο µηχανισµό διαταραχής της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού φαίνεται να είναι σηµαντική (Πίνακας 23).Αυτό φαίνεται από το υψηλό ποσοστό εµφάνισης µονόκλωνων κοµµατιών γενετικού υλικού που παρατηρήθηκε σε κύτταρα µε υψηλές συγκεντρώσεις ca M P,γεγονός που οδηγεί στην υπόθεση πως το ca M P σχετίζεται µε την εκδήλωση γενοτοξικών φαινοµένων.η παρουσία του ca M P µαζί µε το µέταλλο δεν φαίνεται να αυξάνει περισσότερο τη βλάβη του DNA (Πίνακας 23). Από τα αποτελέσµατα µπορούµε να συµπεράνουµε πως η επαγωγή του ca M P,µετά από την επίδραση του µετάλλου,παρ όλο που δεν σχετίζεται µε την παραγωγή ελεύθερων ριζών, συµβάλλει στην πρόκληση διαταραχών της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού, πιθανό µέσω ενός σηµατοδοτικού µηχανισµού, στον οποίο δεν συµµετέχουν οι ROS.Είναι αξιοσηµείωτο το γεγονός πως η αναστολή της δράσης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + προκαλεί µείωση τόσο της σύνθεσης του ca M P, όσο και των γενοτοξικών φαινοµένων του µετάλλου σε κύτταρα µε αυξηµένα ή φυσιολογικά επίπεδα ca M P,αποδεικνύοντας µε αυτό τον τρόπο,τη συµµετοχή της αντλίας στην επαγωγή σηµατοδοτικών µηχανισµών, µετά από την έκθεση των κυττάρων σε κάδµιο.

212 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΚΑ ΜΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ-3. Το γενετικό υλικό (DNA) των κυττάρων αποτελεί συχνά στόχο πολλών τοξικών παραγόντων. Ανεπανόρθωτες βλάβες του γενετικού υλικου µπορεί να οδηγήσουν το κύτταρο στην υιοθέτιση µιας στρατηγικής µε την οποία οδηγείται σε θάνατο (προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος),µια διαδικασία που ονοµάζεται απόπτωση (Corcoran και συν.,1994; H abeebu και συν.,1998).η διαδικασία της απόπτωσης µπορεί να επαχθεί µέσω του οξειδωτικού stress και εκφράζεται µε το θρυµµατισµό του γενετικού υλικού και την αναστολή της επιδιορθωτικής ικανότητας των ενζύµων του κυττάρου από την αύξηση των παραγόµενων ελεύθερων ριζών (Higuchi και Matsukaw a, 1997).Στα σπονδυλωτά,το κάδµιο µπορεί να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε ένα µεγάλο αριθµό κυτταρικών τύπων που µελετήθηκαν (Li και συν., 2000; Pourahm ad και O Brien 2000; Robertson και Orrenius 2000;De La Fuente και συν.,2002;watjen και συν.,2002;aidy και συν., 2003; Shih και συν., 2004), µέσω της ενεργοποίησης ενός µονοπατιού που περιλαµβάνει τη διαταραχή της ιοντικής ισορροπίας της µιτοχονδριακής µεµβράνης, την απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c και τη δηµιουργία του αποπτωτικού σωµατίου (Leistκαι Nicotera,1997;Mignotte και V ayssiere,1998;huttenbrennerκαι συν., 2003). Το αποπτωτικό σωµάτιο σχηµατίζεται από τη σύνδεση του κυτοχρώµατος c µε τον παράγοντα apaf-1 και την πρώϊµη µορφή της κασπάσης-9 (προ-κασπάση 9),µε κύριο στόχο την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (Hartley και συν., 1994; Wolvetang και συν., 1994; Mignotte και Vayssiere, 2001). Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 οδηγεί στην αποσταθεροποίηση της δοµής του γενετικού υλικού και την έναρξη διάφορων κυτταρικών αντιδράσεων που συµµετέχουν στην αποπτωτική διαδικασία (Sokolova και συν.,2004). Ρυπογόνοι παράγοντες, όπως τα βαρέα µέταλλα, µπορεί να επάγουν αποπτωτική διαδικασία ή να οδηγήσουν στη διαδικασία της νέκρωσης τόσο σε σπονδυλωτά, όσο και σε ασπόνδυλα, µέσω της διαταραχής της οµοιόστασης (Brousseau και συν., 2000; Li και συν., 2000; Pourahm ad και O Brien, 2000; Robertson και Orrenius,2000;Sauve και συν.,2000a,b;micic και συν.,2001;de La Founte και συν.,2002;sung και συν.,2003). Παρ όλη τη γνώση που υπάρχει σχετικά µε τις γενοτοξικές επιπτώσεις των βαρέων µετάλλων σε θαλάσσιους οργανισµούς (για περισσότερες πληροφορίες δες

213 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 190 Ochiκαι Ohsawa,1983; A very και συν.,1996; Misra και συν.,1998; Pruski και Dixon, 2002), λίγα βιβλιογραφικά δεδοµένα αναφέρονται στη συµµετοχή του καδµίου ως αποπτωτικού παράγοντα σε κυτταρικούς τύπους ασπονδύλων οργανισµών. Συγκεκριµένα, αποµονωµένα κύτταρα βραγχίων του µυδιού Mytilus edulis δείχνουν µειωµένη ευαισθησία στην πρόκληση αποπτωτικού µηχανισµού, µέσω των παραγόµενων ελεύθερων ριζών, µετά από έκθεσή τους σε µη-τοξικές συγκεντρώσεις καδµίου (1.8 µmol/l),πιθανό µέσω της επαγωγής µεταλλοθειονινών ή άλλων αντιοξειδωτικών ενζύµων (Pruskiκαι Dixon,2002).Μελέτες σε αιµοκύτταρα ίθυρων Μαλακίων έδειξαν πως έκθεση σε αυξηµένες συγκεντρώσεις µετάλλων, όπως ο ψευδάργυρος, ο χαλκός και το κάδµιο µειώνουν τη βιοσιµότητα των κυττάρων (Brousseau και συν., 2000; Sauve και συν., 2000a,b), ενώ έκθεση αιµοκυττάρων του είδους Crassostrea virginica σε κάδµιο,έχει ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση των φαινοµένων που χαρακτηρίζουν διαδικασίες όπως η απόπτωση και η νέκρωση. Τα αποτελέσµατά µας έδειξαν αύξηση της συχνότητας εµφάνισης µονόκλωνων κοµµατιών DNA (SSBs) σε κύτταρα που εκτέθηκαν στο κάδµιο,και µας οδήγησαν στη µελέτη της πιθανής συµµετοχής αποπτωτικού µηχανισµού που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3.εν αντιθέσει µε το ρόλο τους στα σπονδυλωτά, η ενεργοποίηση και συµµετοχή της οικογένειας των κασπασών σε διαδικασίες απόπτωσης στα ασπόνδυλα,αποτελεί έντονο αντικείµενο µελέτης,µιας και δεν υπάρχουν αρκετά δεδοµένα που να υποστηρίζουν τη σηµαντικότητα των κασπασών σε φαινόµενα απόπτωσης σε ασπόνδυλους οργανισµούς. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δεν έδειξαν ενεργοποίηση των κασπασών,µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο.η µελέτη των γενοτοξικών επιπτώσεων του καδµίου, µέσω της επαγωγής αποπτωτικού µηχανισµού που περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3,έδειξε απουσία των συγκεκριµένων πρωτεασών από τον παραπάνω µηχανισµό,ενώ υψηλές συγκεντρώσεις ca M P δεν φαίνεται να επηρεάζουν τη δραστικότητα της κασπάσης-3 ( ιάγραµµα 39,Πίνακας 27).Τα δεδοµένα της παρούσας µελέτης φαίνεται να συµφωνούν µε προηγούµενες µελέτες σε ασπόνδυλους οργανισµούς,όπως ίθυρα,έντοµα και Νηµατόδεις,που υποστηρίζουν την πιθανή ενεργοποίηση ενός αποπτωτικού µηχανισµού,στον οποίο δεν συµµετέχει η κασπάση-3. Είναι πιθανό να συµβαίνει µετατόπιση της φωσφατιδυλ-σερίνης στην εξωτερική επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης, που αποτελεί διαγνωστικό δείκτη της αποπτωτικής διαδικασίας,χωρίς τη συµµετοχή της

214 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 191 παραπάνω κασπάσης (Varkey και συν.,1999;zimmerm ann και συν.,2002;claveria και Torres,2003;Sokolova και συν.,2004). Η απόκριση των κυττάρων που εκτίθενται στο κάδµιο δεν είναι ακόµα πλήρως κατανοητή, µιας και υπάρχουν αρκετά δεδοµένα που υποστηρίζουν τόσο την πρόκληση αποπτωτικών φαινοµένων,όσο και την αύξηση της κυτταρικής διαίρεσης (Corcoran και συν.,1994;h abeebu και συν.,1998;jia και συν.,2002;bisova και συν.,2003;waisberg και συν.,2003;yang και συν.,2004).εξάλλου,η ενεργοποίηση της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + έχει συσχετιστεί µε την επαγωγή της κυτταρικής διαίρεσης, ενώ η αναστολή της δράσης της µε το φαινόµενο της απόπτωσης (G rinstein και συν.,1989;rotin και συν.,1989;sw allow και συν.,1991; Shrode και συν.,1997;lang και συν.,2000a,b;rich και συν.,2000;putney και συν., 2002).Παρ όλα τα δεδοµένα,σύµφωνα µε τα οποία η διαδικασία της απόπτωσης µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε ή χωρίς τη διαµεσολάβηση του µονοπατιού δράσης των κασπασών (M cconkey,1996;mccarthy και συν.,1997;sarin και συν.,1997),η επαγωγή αποπτωτικών φαινοµένων σε κύτταρα ίθυρων Μαλακίων,καθώς και η συµµετοχή άλλων µηχανισµών σε φαινόµενα απόπτωσης παραµένει ακόµα άγνωστη. Από τα αποτελέσµατα της έκθεσης κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού σε κάδµιο προκύπτουν δεδοµένα που θα µπορούσαν να σχετίζονται τόσο µε φαινόµενα κυτταρικής διαίρεσης,όσο και µε φαινόµενα απόπτωσης.η συµµετοχή της αντλίας και της PKC στην αύξηση της δραστικότητας της ΡΚ,πιθανό να αποτελεί ένδειξη α) των αυξηµένων ενεργειακών απαιτήσεων κατά τη διαδικασία διπλασιασµού του DNA (A saoka και συν.,1992;putney και Burber,2003),β)των αυξηµένων ενεργειακών απαιτήσεων του κυττάρου,κατά τη διαδικασία επιδιόρθωσης βλαβών του DNA,γ) αλλά και των αυξηµένων ενεργειακών απαιτήσεων κατά τη διαδικασία της απόπτωσης (M ills και συν.,1985;flieger και Frohlih,1993).Επιπλέον,η αυξηµένη σύνθεση του ca M P έχει συσχετιστεί µε αύξηση της γλυκόλυσης και της παραγωγής ενέργειας (Fabbri και συν., 1998), αλλά και µε την επαγωγή αποπτωτικών φαινοµένων,µέσω σηµατοδοτικής οδού που συµµετέχει η ΡΚΑ (Cho-Chung και συν., 1997; Srivastava και συν.,1998; Iwai-Kanaiκαι συν., 1999).Οι µηχανισµοί που πιθανό να διαφοροποιούν τις παραπάνω πορείες και να ορίζουν την «τύχη» των κυττάρων δεν είναι ακόµα πλήρως κατανοητοί.

215 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ Α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ROS ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΚΟΜΜΑΤΙΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA FRAGM ENTS) ΣΕ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΠΤΙΚΟΥ Α ΕΝΑ ΤΟΥ ΜΥ ΙΟΥ M YTILUS GALLOPROVINCIALIS,ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΚΑ ΜΙΟ. Η πιθανότητα δράσης του καδµίου µέσω της αλληλεπίδρασής του µε αδρενεργικούς υποδοχείς της κυτταρικής µεµβράνης (Lacoste και συν., 2001; Dailianis και Kaloyianni, 2004) και η επαγωγή της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + (Dailianis και Kaloyianni,2004) µας οδήγησε στη µελέτη του ρόλου των υποδοχέων στη διαδικασία παραγωγής ROS.Παράλληλα,µελετήθηκε η συµµετοχή του ca M P ως δεύτερου αγγελιοφόρου σε µονοπάτι µετάδοσης σήµατος το οποίο συµµετέχει στην πρόκληση των παραπάνω φαινοµένων, σε µια προσπάθεια να ερευνήσουµε τη συµµετοχή και άλλων σηµατοδοτικών µηχανισµών που επάγονται µετά από έκθεση των κυττάρων στο κάδµιο. Έκθεση των κυττάρων σε φαινυλεφρίνη,προκάλεσε σηµαντική αύξηση των ROS,γεγονός που ενισχύεται ακόµα περισσότερο µετά από την αναστολή των α 1 - αδρενεργικών υποδοχέων,µε χρήση του ανταγωνιστή τους,prazosin (Πίνακας 22). Τα αποτελέσµατά µας έρχονται σε συµφωνιά µε τη µελέτη των Sand και συν.(2003), σύµφωνα µε την οποία η ενεργοποίηση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων οδηγεί στην επαγωγή της σύνθεσης ROS, µέσω της ενεργοποίησης της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + και της δράσης του συστήµατος της οξειδάσης NADH/NADPH. Επιπλέον,χρησιµοποίηση ανταγωνιστών των α 2 -και β-,β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων προκάλεσε σηµαντική αναστολή των επιπτώσεων του καδµίου στην παραγωγή ROS (Πίνακας 22). Οµοίως, η συχνότητα εµφάνισης µονόκλωνων κοµµατιών DNA σε κύτταρα που εκτέθηκαν στο µέταλλο, φαίνεται να µειώνεται σηµαντικά, µετά τη χρήση ανταγωνιστών των α 1 -, α 2 -,β-και β 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Πίνακας 24). Τα αποτελέσµατα δείχνουν πως η αλληλεπίδραση του καδµίου µε τους αδρενεργικούς υποδοχείς επηρεάζει την παραγωγή ROS και την ακεραιότητα του γενετικού υλικού. Το παραπάνω συµπέρασµα έρχονται σε συµφωνία µε προηγούµενες µελέτες που αναφέρονται στην επαγωγή stress,µέσω των α-και β-αδρενεργικών υποδοχέων σε αιµοκύτταρα του στρειδιού C rassostrea gigas (Lacoste και συν.,2001). Τα αποτελέσµατα της έκθεσης των κυττάρων του πεπτικού αδένα του µυδιού σε µικροµοριακές ποσότητες καδµίου, δείχνουν ότι το κάδµιο επάγει την

216 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 193 αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού,µέσω της αλληλεπίδρασής του µε τους α-και β-τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς (Σχήµα 5). α 1-,α 2- Κάδµιο αντλία Na + /H + PKC ROS Αποδιοργάνωση DNA β-,β 1- ca M P Σχήµα 5.Αλληλεπίδραση του καδµίου µε αδρενεργικούς υποδοχείς,προκαλεί κυτταρικές αποκρίσεις σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis.η αποδιοργάνωση του DNA (εµφάνιση µονόκλωνων κοµµατιών γενετικού υλικού),πιθανό µέσω των παραγόµενων ROS, µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο, φαίνεται να σχετίζεται µε σηµατοδοτική οδό που επάγεται πρωτίστως µετά την αλληλεπίδραση του µετάλλου µε τους α 1 - και α 2 - αδρενεργικούς υποδοχείς και δευτερευόντως µε την αλληλεπίδραση του µετάλλου µε τους β- αδρενεργικού τύπου υποδοχείς,ενώ η αύξηση που παρατηρείται στα επίπεδα του ca M P φαίνεται να σχετίζεται µε την έναρξη σηµατοδοτικής οδού που επάγεται πρωτίστως µετά την αλληλεπίδραση του µετάλλου µε τους β-τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς και δευτερευόντως µε τους α-τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς.και τα δυο σηµατοδοτικά µονοπάτια που σχετίζονται µε την πρόκληση γενετικών βλαβών βρίσκονται υπό τον αυστηρό ρυθµιστικό έλεγχο της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H +. Schem e 5. Cadmium interaction w ith adrenergic receptors causes cellular responses in isolated digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis. More specifically, cadm ium after interaction primarily w ith α 1 -,α 2 - and also w ith β-,β 1 - adrenergic receptors, leads to D N A dam age via R O S production.cadmium,after interaction m ainly with β-and β 1 -adrenergic receptors,could also cause the induction of ca M P-PKA or PK C signaltransduction pathw ay which could play an im portantrole in the induction ofthe apoptotic process,like DNA dam age,via orindependently ofros production. Each m echanism is underna + /H + exchangerregulation ability. Παράλληλα, παρατηρείται µια διαφοροποίηση της ενεργοποίησης των α- και β- αδρενεργικών υποδοχέων.συγκεκριµένα,η διαταραχή της δοµικής ακεραιότητας του γενετικού υλικού,πιθανό µέσω των παραγόµενων ROS που προκαλείται µετά από έκθεση των κυττάρων στο µέταλλο,φαίνεται να σχετίζεται µε σηµατοδοτική οδό που επάγεται πρωτίστως µετά την αλληλεπίδραση του µετάλλου µε τους α 1 - και α 2 - αδρενεργικούς υποδοχείς και δευτερευόντως µε την αλληλεπίδραση του µετάλλου µε τους β- τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς (ROS-εξαρτόµενο µονοπάτι), ενώ η

217 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 194 αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού,πιθανά χωρίς τη συµµετοχή των ROS ή µε τη σύγχρονη παραγωγή λιγότερων ROS,συζεύγνεται µε την αύξηση που παρατηρείται στα επίπεδα του ca M P και φαίνεται να σχετίζεται µε την έναρξη σηµατοδοτικής οδού που επάγεται µετά την αλληλεπίδραση του µετάλλου πρωτίστως µε τους β- τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς και δευτερευόντως µε τους α-τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς.με άλλα λόγια,τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το κάδµιο επάγει την ίδια απόκριση (αποδιοργάνωση του γενετικού υλικού), µέσω διαφορετικών σηµατοδοτικών µονοπατιών.στο ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι,το κάδµιο αλλλεπιδρά περισσότερο µε τους α-αδρενεργικούς υποδοχείς και παρατηρείται µεγάλη αύξηση των ελεύθερων ριζών,ενώ στο άλλο σηµατοδοτικό µονοπάτι,το κάδµιο αλληλεπιδρά περισσότερο µε τους β-αδρενεργικούς υποδοχείς και προκαλεί αύξηση του ca M P, πιθανά µε µικρότερη παραγωγή ROS.Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H +,φαίνεται να διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση και των δυο σηµατοδοτικών µονοπατιών.επίσης, η PKC φαίνεται να συµµετέχει και στα δύο σηµατοδοτικά µονοπάτια.είναι εποµένως πιθανό τα δυο σηµατοδοτικά µονοπάτια που επάγονται από τους διαφορετικού τύπου αδρενεργικούς υποδοχείς και οδηγούν στην διατάραξη της ακεραιότητας του γενετικού υλικού να αλληλεπιδρούν (Σχήµα 5). Εν κατακλείδι,το κάδµιο επάγει σηµατοδοτικά µονοπάτια,στα οποία η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + φαίνεται να διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν ότι εφόσον η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + ρυθµίζεται από ένα πλήθος δραστικών ουσιών, θα µπορούσαµε να συµπεράνουµε ότι συνεισφέρει στην «ευαίσθητη» ρύθµιση πολλών ενδοκυτταρικών µονοπατιών µετάδοσης σήµατος στα κύτταρα του πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis.

218 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 195 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Συνοψίζοντας τα αποτελέσµατα του Α και Β µέρους της παρούσας µελέτης, µπορούµε να εξάγουµε πολύτιµα συµπεράσµατα, σχετικά µε την επαγωγή σηµατοδοτικών µηχανισµών σε κύτταρα και ιστούς µυδιών που εκτίθενται σε ρυπογόνους παράγοντες (οργανικούς ρυπαντές και βαρέα µέταλλα,όπως το κάδµιο). Οι βιοµάρτυρες ΜΤ και AChE που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία έδειξαν να αποτελούν αξιόπιστα εργαλεία και µπορεί να χρησιµοποιηθούν σε προγράµµατα βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης.επιπλέον,η µελέτη του ca M P ως βιοµάρτυρα,έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσµατα.η συγκέντρωση του ca M P, κατά κύριο λόγο στο σύµπλοκο µανδύας/γονάδες και κατά δεύτερο λόγο στον πεπτικό αδένα µυδιών, είναι αυξηµένη τόσο σε ζώα που συλλέχθηκαν από ρυπασµένες περιοχές,όσο και σε ζώα που εκτέθηκαν σε κάδµιο,αλλά και οργανικές ενώσεις. Σχήµα 6. Σχηµατική απεικόνιση των σηµατοδοτικών µηχανισµών που επάγονται, καθώς και των τελικών αποκρίσεων,σε αποµονωµένα κύτταρα πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis µετά από έκθεση σε κάδµιο. Schem e 6.Schem atic representation ofsignaltransduction pathw ays and cellularresponses occurred in isolated digestive gland cells ofm usselm ytilus galloprovincialis,aftertreatm entw ith cadm ium. Επιπλέον,τα αποτελέσµατα της έκθεσης αποµονωµένων κυττάρων πεπτικού αδένα του µυδιού Mytilus galloprovincialis σε κάδµιο, βοήθησαν στην καλύτερη