Καθαρισμός και χαρακτηρισμός πρωτεινών. Βασικές αρχές και μεθοδολογία

Transcript

1 Καθαρισμός και χαρακτηρισμός πρωτεινών Βασικές αρχές και μεθοδολογία

2 Καθαρισμός πρωτεινών Μέθοδοι διαλυτοποίησης πρωτεϊνών Μηχανικές διαδικασίες διάρρηξης κυττάρων Μεμβρανικές πρωτείνες Χρωματογραφικός διαχωρισμός πρωτεϊνών Ανάλυση πρωτεϊνών Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών

3 Γενική επισκόπηση καθαρισμού πρωτεϊνών Κυτταρική λύση Διαλυτό κλάσμα Αδιάλυτο κλάσμα Χρωματογραφικός καθαρισμός Διαφορική κλασμάτωση Διαλυτοποίηση ή απόρριψη Μέγεθος- φορτίο- συγγένεια κλπ Χρωματογραφικός καθαρισμός

4 Mέθοδοι διαλυτοποίησης πρωτεϊνών 1 ο στάδιο είναι η μεταφορά των πρωτεϊνών σε διάλυμα Εάν η πρωτείνη είναι στο κυτταρόπλασμα πρέπει να σπάσουμε- ανοίξουμε τα κύτταρα. Για ζωϊκά κύτταρα η ρήξη μπορεί εύκολα να γίνει με ωσμωτική λύση (υποτονικό διάλυμα) παρουσία μη πολικών απορρυπαντικών. Για κύτταρα με κυτταρικό τοίχωμα (βακτήρια, φυτά) πρέπει να χρησιμοποιήσουμε άλλες μεθόδους. Για βακτήρια, η λυσοζύμη είναι η λύση διότι επιλεκτικά αποικοδομεί το βακτηριακό τοίχωμα. Η χρήση απορρυπαντικών ή οργανικών διαλυτών πρέπει να γίνει πολύ προσεκτιά διότι μπορεί να αποδιατάξει ή απενεργοποιήση κάποιες πρωτείνες.

5 Μηχανικές διαδικασίες για τη ρήξη κυττάρων Μίξερ υψηλής ταχύτητας Ομογενοποιητές διαφόρων τύπων Γαλλική πρέσσα Υάλινα σφαιρίδια- άμμος θαλάσσης Το κυτταρικό εκχύλισμα είτε φιλτράρεται ή φυγοκεντρείται.

6 Mηχανικές διαδικασίες εκχύλισης πρωτεϊνών

7 Πρωτείνες που είναι συστατικά μεμβρανών ή υποκυτταρικών οργανιδίων. Απομονώνουμε τις μεμβράνες/υποκυτταρικά οργανίδια από το υπόλοιπο κυτταρικό υλικό Συνήθως γίνεται με διαφορική φυγοκέντρηση με τη χρήση αδρανών υλικών που σχηματίζουν κλήση πυκνότητας ή μαξιλάρια πυκνότητας για να αυξηθεί η διακριτικότητα της διαδικασίας.

8 Διαλυτότητα πρωτεϊνών- 1 Οι πρωτείνες έχουν διάφορες ομάδες που ιονίζονται (διαφορετικά pk s) Σε ένα ph χαρακτηριστικό για κάθε πρωτείνη ο αριθμός των θετικών και των αρνητικών φορτίων είναι ακριβώς ο ίδιος. Η πρωτείνη έχει συνολικά μηδενικό φορτίο και όχι δεν έχει φορτίο. Το ph αυτό αντιστοιχεί στο ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτείνης pi (isoelectric point, pi). Στο pi οι πρωτείες έχουν μηδενικό συνολικό φορτίο και δεν μετακινούνται σε κάποιο ηλεκτρικό πεδίο. Η διαλυτότητα μιας πρωτείνης εξαρτάται λοιπόν από το pη και στο pi είναι η ελάχιστη.

9 Διαλυτότητα πρωτεϊνών- 2 Οι πολλαπλές πλάγιες ομάδες των αμινοξικών καταλοίπων των πρωτεϊνών επηρεάζουν την διαλυτότητά τους Η διαλυτότητα των πρωτεϊνών εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση των ιόντων στο διάλυμα, από την πολικότητα του διαλύτη, το ph, την θερμοκρασία και πολλούς άλλους παράγοντες. Σε συγκεκριμένες συνθήκες ενώ κάποιες πρωτείνες είναι διαλυτές κάποιες άλλες δεν είναι. Είναι μια ιδιότητα που την αξιοποιούμαι στα πρώτα στάδια καθαρισμού πρωτεϊνών. «Salkng out» or «salkng in» είναι διαδικασίες που βασίζονται στην ιοντική ισχύ.

10 Διαλυτότητα πρωτεϊνών- 3 Η διαλυτότητα μιας πρωτείνης σε δεδομένη ιοντική ισχύ εξαρτάται από την ιοντική ισχύ και το τύπο των ιόντων. Η διαλυτότητα μιας πρωτείνης σε χαμηλή ιοντική ισχύ γενικά αυξάνει με την αύξηση της της συγκέντρωσης άλατος. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται «salkng in». Οσο αυξάνεται η συγκέντρωση των επιπλέον ιόντων επικαλύπτουν πιο αποτελεσματικά τα πρωτεϊνικά μόρια αυξάνοντας την προσβασιμότητα στο νερό και ως εκ τούτου την διαλυτότητα της πρωτείνης. Σε υψηλή ιονική ισχύ η διαλυτότητες πρωτεϊνών και άλλων βιομορίων συνήθως μειώνεται. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται «salkng out» και είναι αποτέλεσμα του ανταγωνισμού μεταξύ των ιόντων και των συστατικών του διαλύτη που επηρεάζουν την επαφή της πρωτείνης με το διάλυμα.

11 Διαλυτότητα πρωτεϊνών- 4 Η πλέον χρησιμοποιούμενη μέθοδος σε διαδικασίες καθαρισμού πρωτεϊνών είναι η salkng out Ρυθμίζοντας τη συγκέντρωση άλατος σε διάλυμα πρωτεϊνών λίγο πριν το σημείο αδιαλυτότητας της πρωτείνης στόχος, πολλές άλλες πρωτείνες ίσως απομακρυνθουν από το διάλυμα. Οι πρωτείνες αυτές εύκολα απομακρύνονται με φυγοκέντρηση. Διαφορική καθίζηση με θειϊκό αμμώνιο. Προσοχή: τα ιόντα I -, ClO 4-, SCN -, Li +, Mg 2+, Ca 2 + και Ba + αυξάνουν τη διαλυτότητα πρωτεϊνών παρά τις διαλυτοποιούν µε τη διαδικασία του «salting out», αλλά υφίστανται και ο κίνδυνος αποδιάταξης πρωτεϊνών.

12 Διαλυτότητα πρωτεϊνών- 4 Μια πρωτείνη σε ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο δεν είναι αντικείμενο της διαδικασίας «salkng in». Όσο το ph απομακρύνεται από το pi της πρωτείνης το καθαρό φορτίο της πρωτείνης αυξάνεται και είναι ευκολώτερη η διαδικασία salkng in. Τα άλατα αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γειτονικών μορίων που πιθανόν να βοηθούν στη δημιουργία συσσωμάτων και ιζημάτων (aggregakon and precipitakon). Tα pi s των πρωτεϊνών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαδικασία καθίζησης πρωτεϊνών.

13 Συγκεντρωτικός πίνακας διαφορικής διαλυτότητας πρωτεϊνών στη διαδικασία καθαρισμού Ammonium Sulfate (% saturated) Sample A Activity assay (units) Units/A

14 Διαλυτότητα διαφορετικών πρωτεϊνών σε θειϊκό αμμώνιο συναρτήσει της ιοντικής ισχύος.

15 Διαλυτότητα της b- lactoglobin σε σχέση με το ph σε διαφορετικές συγκεντρώσεις NaCl.

16 Διαλυτότηα της caboxy- hemoglobin στο pi της σε σχέση με την ιοντική ισχύ.

17 Ιοντική ισχύ Ιοντική ισχή (I) = ½ Σ 2 C i = μοριακή συγκέντρωση ιόντων Z i = φορτίο ιόντων 1Μ NaCl 1Μ CaCl 2 ½[1*(+1) 2 +1*(- 1) 2 ]=1 ½[1*(+2) 2 +2*(- 1) 2 ]=3

18 Σταθεροποίηση πρωτεϊνών ph (όχι ακραία) Θερμοκρασία Αναστολείς πρωτεασών Αναστολή πιθανής ανάπτυξης βακτηρίων (συνήθως χρησιμοποιείται sodium azide). Ταχύτητα Σωστός προγραμματισμός Χρήση σταθεροποιητικών παραγόντων

19 Δοκιμασίες ταυτοποίησης πρωτεϊνών Κατά τη διάρκεια μιας διαδικασίας καθαρισμού πρέπει να είμαστε σε θέση άμμεσα και γρήγορα να ταυτοποιήσουμε την υπάρξη της πρωτείνης στόχου στα διάφορα στάδια. Απαιτείται η χρήση εύκολων, γρήγορων και επαναλήψιμων τεχνικών, χαμηλού κόστους. Ενδεικτικά: Φασματοσκοπία Ενζυμική ενεργότητα Ανοσολογικές αντιδράσεις (ELISA,Western) Μοριακό βάρος Βιολογική δραστικότητα Χρήση Τags σε ανασυνδιασμένες πρωτείνες Χρήση υβριδιακών συστημάτων σε ανασυνδιασμένες πρωτείνες

20 Τι πρέπει να παρακολουθούμε κατά τη διάρκεια μιας διαδικασίας καθαρισμού πρωτεϊνών Σε επίπεδο πρωτείνης Συνολικός όγκος πρωτεϊνών Συγκέντρωση πρωτεϊνών Ενεργότητα πρωτεϊνών (βιολογική, ενζυμική κλπ) Άλλες βασικές παράμετροι % απόδοση σε κάθε στάδιο Ειδική ενεργότητα της πρωτείνης στόχου (units/mg πρωτείνης) Βαθμός εμπλουτισμού (πχ. 3.5 φορές καθαρότερη) Σχεδιάζοντας μια διαδικασία καθαρισμού πρέπει να λάβουμε υπόψην μας μια ισορροπία πολλών παραγόντων

21 Σύνοψη των αρχικών σταδίων καθαρισμού μιας πρωτείνης Επιλογή πηγής πρωτείνς Διαλυτοποίηση πρωτεϊνών Σταθεροποίηση πρωτεϊνών Ειδικές δοκιμασίες εντοπισμού της πρωτείνης στόχου Ενζυμική ενεργότητας, ανοσολογική ενεργότητα Φυσικά χαρακτηριστικά (ΜΒ, φάσματα κλπ) Βιολογική ενεργότητα Οι δοκιμασίες πρέπει να είναι: Ειδικές Γρήγορες Ευαίσθητες Ποσοτικές

22 Συγκεντρωτικός πίνακας ιδιοτήτων πρωτεϊνών και διαδικασιών καθαρισμού Ιδιότητα Διαδικασία Διαλυτότητα 1. Salkng in 2. Salkng out Φορτίο Ion exchange chromatography Electrophoresis 3. Isoelectric focusing Πολικότητα Adsorpkon chromatography Paper chromatography 3. Reverse- phase chromatography 4. Hydrophobic interackon chromatography Mοριακό μέγεθος Dialysis Gel electrophoresis Gel filtrakon chromatography Ultracentrifugakon Ειδική αλληλεπίδραση 1. Affinity chromatography

23 Καθαρισμός πρωτεινών Βάσει διαλυτότητας Βάσει φορτίου Βάσει μεγέθους Βάσει βιολογικής συγγένειας Βάσει υδροφοβικότητας Μετά από γενετική τροποποίηση κλπ κλπ.

24 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει φορτίου. Στήλες (κολώνες) Oι στήλες χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής έχουν διάφορα ονόματα: DEAE, Q (+) CM, SP (- ) Η φύση του αδρανούς υποστρώματος παίζει καθοριστικό ρόλο στη διακριτικότητα της χρωματογραφίας

25 Διαχωρισμός πρωτεινών με βάση το φορτίο Ποιό είναι το φορτίο πρωτεϊνών σε διάφορα ph?

26 Ποιό είναι το φορτίο πρωτεϊνών σε διάφορα ph?

27 Διαχωρισμός πρωτεινών με βάση το φορτίο IEC σε αρνητικά φορτισμένη στήλη

28 Διαχωρισμός πρωτεινών με βάση το φορτίο

29 Συσκευή δημιουργίας βαθμίδωσης άλατος Page 135 c = c 2 - (c 2 - c 1 )f

30 Διαχωρισμός βάσει των ηλεκτρικών ιδιοτήτων μιας πρωτείνης σε διάλυμα Χρωματογραφία ιονοανταλλαγής (IEC)

31 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Gel filtrakon chromatography

32 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους (ΜΒ- σύμπλοκα)

33 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους (ΜΒ- σύμπλοκα) size Molecular mass (daltons) 10,000 30, ,000

34 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους (ΜΒ- σύμπλοκα) ροή

39 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους OD260nm Volume (ml)

40 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους Page 138

41 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους logmb R f

42 Υλικά χρωματογραφίας μοριακής διήθησης Page 138

43 Χρωματογραφία χάρτου

44 Page 139 Διαπύδιση

45 Διαχωρισμός πρωτεινών με βάση το μέγεθος σε τεχνητό πεδίο βαρύτητας

46 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει υδροφοβικότητας Υδρόφοβη χρωματογραφία (Hydrophobic Interackon Chromatography HIC)

47 Υδρόφοβη Xρωματογραφία (ΗΙC)

48 Υδρόφοβη Xρωματογραφία (ΗΙC)

49 Διαχωρισμός βάσει της συγγενείας μιας πρωτείνης πρός άλλα βιομόρια Χρωματογραφία εκ συγγενείας (ΑC) Η συγγένεια μιας πρωτείνης πρός άλλα βιομόρια DNA, RNA, ειδικές αλληλουχίες και των δύο. Πρωτείνη: αντίσωμα- αντιγόνο, Αλληλεπιδράσεις πρωτεινών. Σάκχαρα: πρωτείνες που αλληλεπιδρούν με σάκχαρα ή περιοχές πρωτεινών (ConA, Cellulose, Chikn ) Μεταβολίτες ή συνένζυμα Χρωστικές

50 Χρωματογραφία εκ συγγενείας α: προσρόφηση

51 Χρωματογραφία εκ συγγενείας β: έκλουση

52 Οργανολογία

53 Οργανολογία

54 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους Για να επιτευχθεί σωστός διαχωρισμός πρέπει οι πρωτείνες να αποδιαταχθούν και να αναχθούν. Η γενική αποδιάταξη γίνεται παρουσία του απορρυπαντικού SDS και θερμοκρασίας (100 0 C). Η χρήση του αναγωγικού παράγοντα β- μερκαπτοαιθανόλης σκοπό έχει να σπάσει τις δισουλφιδικές γέφυρες. Η αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση SDS χρησιμοποιείται στην ανάλυση πολυπεπτιδικών αλυσίδων.

55 Sodium dodecyl sulfate (SDS) Φυσική πρωτείνη N Θέρµανση + Αναγωγικός παράγοντας + SDS - C Αποδιατεταγµένη πρωτείνη πλήρως καλυµµένη µε SDS

56 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση- οργανολογία

57 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση- οργανολογία

58 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση σε αποδιάταξη

59 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους logmb R f

60 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους- πρόβλημα Ένα πρωτεϊνικό δείγμα αναλύθηκε με χρωματογραφία μοριακής διήθησης και έδωσε μια μοναδική κορυφή που αντιστοιχεί σε μοριακό βάρος 160 kda. Το ίδιο δείγμα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS και β- μερκατοαιθανόλης και τα αποτελέσματα μας έδωσα 2 ζώνες με μοριακό βάρος 60 kda και 50 kda. Ζητούμενο: Ποιά είναι η πολυπεπτιδική σύσταση της πρωτείνης.

61 Διαχωρισμός πρωτεινών βάσει μεγέθους- απάντηση Η πρωτείνη έχει συνολικό μοριακό βάρος 160 kda. Η ανάλυση με αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση μας έδωσε 2 ζώνες 50 και 60 kda. 2x60+50=170 (- ) 2x50+60=160 σωστό

62 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων: πρώτη διάσταση=ισοηλεκτρική εστίαση

63 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων: δεύτερη διάσταση=μοριακό βάρος

64 Ανάλυση πρωτεινών με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων: 2D- IEF- SDS/PAGE

65 Page 150 Figure 6-27 Two- dimensional (2D) gel electrophoresis.

66 Ισοηλεκτρικά σημεία διαφόρων γνωστών πρωτεϊνών

67 Σύνοψη σταδίων καθαρισμού πρωτεινών

68 Δομική ανάλυση πρωτεινών Η αρχιτεκτονική των πρωτεϊνών μπορεί να αναλυθεί με την βοήθεια πολλών βιοφυσικών τεχνικών Ανάλυση κρυστάλλων με ακτίνες- Χ. Ανάλυση με NMR Ανάλυση με CD Ανάλυση με FTIR Microcalorimetry RAMAN spectroscopy...

69 Κρυσταλλοποίηση

70 Προσδιορισμός της 3D- δομής πρωτεϊνών Πηγή ακτίνων-χ Πρωτεϊνικός κρύσταλλος Υπολογιστικές µέθοδοι Περιθλασίγραµµα Δοµικό µοντέλλο Ηλεκτρονιακή πυκνότητα

71 Αποτύπωση περίθλασης ακτίνων- Χ

72 Xάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας

73 Xάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας