ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΟΧΗΣ, ΥΓΡΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΛΙΠΑΝΣΗΣ ΕΔΑΦΟΥΣ ΣΤΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΚΑΙ ΤΟ ΑΙΘΕΡΙΟ ΕΛΑΙΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ MELISSA OFFICINALIS

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗ ΕΚΜΕΤΑΛΛΕΥΣΗ ΑΥΤΟΦΥΩΝ ΦΥΤΩΝ (ΒΑΦ)» Διπλωματική Εργασία ΠΑΠΟΥΛΑΚΗΣ ΑΘ. ΧΡΙΣΤΟΔΟΥΛΟΣ Πτυχιούχος Βιολογίας ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΟΧΗΣ, ΥΓΡΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΛΙΠΑΝΣΗΣ ΕΔΑΦΟΥΣ ΣΤΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΚΑΙ ΤΟ ΑΙΘΕΡΙΟ ΕΛΑΙΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ MELISSA OFFICINALIS ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2011

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY POSTGRADUATE STUDIES PROGRAM CONSERVATION OF BIODIVERSITY AND SUSTAINABLE EXPLOITATION OF NATIVE PLANTS (BNP) Thesis CHRISTODOULOS ATH. PAPOULAKIS B.Sc. Biology THE EFFECT OF SEASON, SOIL MOISTURE AND FERTILIZER ON THE BIOMASS AND ESSENTIAL OIL OF CULTIVATED MELISSA OFFICINALIS PLANTS THESSALONIKI, 2011

3 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 3 Μαρτίου, 2011 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κουκ Κατερίνα-Μαργαρίτα 1, Αναπληρώτρια Ερευνήτρια, Κέντρο Γεωργικής Έρευνας Βόρειας Ελλάδας, ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. Λαναράς Θωμάς 1, Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ. Χανλίδου Ευφροσύνη, Λέκτορας, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ. 1 Επιβλέποντες «Η έγκριση της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας από το Τμήμα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2) i

4 DATE OF EXAMINATION 3 rd March, 2011 EXAMINATION COMMITTEE Catherine Margaret Cook 1, Associate Researcher, Agricultural Research Centre of Northern Greece, National Agricultural Research Foundation, Greece Thomas Lanaras 1, Professor, Department of Botany, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece Effie Hanlidou, Lecturer, Department of Botany, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece 1 Supervisors The endorsement of this Thesis by the School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki does not imply acceptance of the author s views (according to the Greek Law N. 5343/1932) ii

5 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 1 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 3 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αρωματικά φυτά και καλλιέργεια Melissa officinalis L. subsp. officinalis Melissa officinalis L. subsp. officinalis και αιθέρια έλαια Σκοπός ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υπόστρωμα ριζοβολίας μοσχευμάτων Ορμόνη ριζοβολίας Υπόστρωμα μεταφύτευσης μοσχευμάτων Οργανικό λίπασμα Biosol Φυτικό υλικό Δοχεία και λοιπά υλικά Αγενής αναπαραγωγή φυτών Melissa officinalis L. subsp. officinalis Μεταφύτευση φυταρίων και εγκλιματισμός Προετοιμασία πειραματικού αγροτεμαχίου Φύτευση φυτών στο πειραματικό αγροτεμάχιο Τοποθέτηση οργανικού λιπάσματος Biosol Μέτρηση της υγρασίας εδάφους Περιγραφή των πειραματικών συνθηκών Πείραμα με διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας Επίδραση της εποχής του έτους Μετεωρολογικά δεδομένα Συγκομιδή και αποξήρανση φυτικών δειγμάτων Μορφομετρία Εκτίμηση της περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο Στατιστική επεξεργασία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετεωρολογικά δεδομένα iii

6 3.2. Επίδραση συνθηκών καλλιέργειας Μορφομετρικά χαρακτηριστικά Αιθέριο έλαιο Επίδραση της εποχής του έτους Μορφομετρικά χαρακτηριστικά Αιθέριο έλαιο ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επίδραση συνθηκών καλλιέργειας Επίδραση της εποχής του έτους ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Αναρτημένες ανακοινώσεις σε επιστημονικά συνέδρια iv

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Θέλω από καρδιάς να ευχαριστήσω όλους αυτούς που βοήθησαν στην πραγματοποίηση της μεταπτυχιακής διπλωματικής μου εργασίας. Τους επιβλέποντές μου, κα Κατερίνα-Μαργαρίτα Κουκ, Αναπληρώτρια Ερευνήτρια στο Τμήμα Αρωματικών και Φαρμακευτικών Φυτών, του Κ.Γ.Ε.Β.Ε. του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. και κ. Θωμά Λαναρά, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. για την πολύτιμη στήριξη, την βοήθεια, την ανεξάντλητη υπομονή και τον χρόνο που αφιέρωσαν σε αυτήν την προσπάθεια. Για τις γνώσεις που μου προσέφεραν απλόχερα, τόσο κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας όσο και συνολικά στη διάρκεια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών. Ειδικά την κα Κατερίνα-Μαργαρίτα Κουκ, για την παραχώρηση των φωτογραφιών της παρούσας εργασίας από το προσωπικό της αρχείο. Την κα Ευφροσύνη Χανλίδου, Λέκτορα του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. η οποία με τιμά με τη συμμετοχή της στην Εξεταστική Επιτροπή. Τον κ. Στέφανο Σγαρδέλη, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. για τις χρήσιμες συμβουλές του όσον αφορά στην στατιστική επεξεργασία των δεδομένων. Την κα Ελένη Μαλούπα, Τακτική Ερευνήτρια του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. και διευθύντρια του Εργαστηρίου Προστασίας και Αξιοποίησης Αυτοφυών και Ανθοκομικών Ειδών για την φιλοξενία που μου παρείχε κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Το προσωπικό του Εργαστηρίου Προστασίας και Αξιοποίησης Αυτοφυών και Ανθοκομικών Ειδών για την καθημερινή συνδρομή σε πολλαπλά ζητήματα και ειδικά: την Αρετή Σακελλαρίου και Πόπη Κατσαρού, για τη βοήθεια στην προετοιμασία των μοσχευμάτων Melissa officinalis, τους Λευτέρη Βαλανά και Βασίλη Γκορλίτσα για την πολύτιμη συνδρομή στην προετοιμασία του πειραματικού αγροτεμαχίου. Επίσης, τους Ευριπίδη Μαλικά και Αλκιβιάδη Καραπατσιά πτυχιούχους του Τμήματος Φυτικής Παραγωγής του Α.Τ.Ε.Ι.Θ. για την βοήθεια στην προετοιμασία του πειραματικού αγροτεμαχίου. Το φίλο μου Χρήστο Χαριτόπουλο, Μηχανολόγο Μηχανικό, για την συνδρομή του στην αναζήτηση των μετεωρολογικών δεδομένων. Χωρίς τις γνώσεις του η αναζήτηση αυτή θα ήταν κατά πολύ δυσκολότερη. Όλους τους διδάσκοντες του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Διατήρηση της Βιοποικιλότητας και Αειφορική Εκμετάλλευση Αυτοφυών Φυτών» για τις γνώσεις που απλόχερα μου προσέφεραν, τις δεξιότητες που με βοήθησαν να αποκτήσω και για την συνολική εκπαίδευση που έλαβα από αυτούς κατά τη διάρκεια των μαθημάτων και όχι μόνο. Αγαθά που σίγουρα με βοήθησαν τόσο στο Π.Μ.Σ., όσο και στην καθημερινότητά μου. Τους συμφοιτητές μου Βούλα Γκίκα, Χρυσάνθη Κολοβού και Νικολέτα Σιμοπούλου για όλα όσα μου προσέφεραν αφειδώς όλον αυτό τον καιρό και που στάθηκαν πάντα δίπλα μου σε όσες δυσκολίες συνάντησα. Είναι σίγουρο ότι πλέον έχω αποκτήσει τρεις πολύ καλούς φίλους. 1

8 Στον αείμνηστο Δάσκαλο, Δημήτριο Μπαμπαλώνα, ο οποίος με μύησε στην επιστήμη της βιολογίας των φυτών. Στη Βάσω, για το ότι είναι εκεί όλα αυτά τα χρόνια. Στους γονείς μου για τη στήριξη, υλική και ηθική που μου έδωσαν όλα αυτά τα χρόνια, τόσο σε προπτυχιακό, όσο και σε μεταπτυχιακό επίπεδο. 2

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Φυτά Melissa officinalis L. subsp. officinalis αναπαράχθηκαν από μοσχεύματα με αγενή αναπαραγωγή και καλλιεργήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: Χαμηλή υγρασία εδάφους, απουσία λίπανσης εδάφους (υ), χαμηλή υγρασία εδάφους παρουσία λίπανσης (υλ), υψηλή υγρασία εδάφους, απουσία λίπανσης (Υ) και υψηλή υγρασία εδάφους, παρουσία λίπανσης (ΥΛ). Πραγματοποιήθηκε συγκομιδή στις αρχές Νοέμβρη 2009, και μετρήθηκαν η βιομάζα και μορφομετρικά χαρακτηριστικά και εκτιμήθηκε η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο στα φύλλα. Επίσης, πραγματοποιήθηκε συγκομιδή φυτών Melissa officinalis L. subsp. officinalis από διαφορετική καλλιέργεια με συχνότητα δύο δειγματοληψίες ανά μήνα από το Μάρτιο έως και τον Αύγουστο του Μετρήθηκαν μορφομετρικά χαρακτηριστικά και βιομάζα, και εκτιμήθηκε η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο στα επιμέρους τμήματα (φύλλα, βλαστοί και άνθη) κάθε φυτού. Η υγρασία εδάφους επηρέασε στατιστικά σημαντικά και θετικά το νωπό και ξηρό βάρος και το λόγο της βιομάζας βλαστών προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος, ενώ αντίστοιχα αρνητικά το λόγο της βιομάζας φύλλων προς βιομάζα βλαστών και το λόγο της βιομάζας φύλλων προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος. Η λίπανση εδάφους επηρέασε στατιστικά σημαντικά και θετικά το νωπό και ξηρό βάρος. Η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος, επηρεάστηκε στατιστικά σημαντικά και αρνητικά, από την υγρασία εδάφους, ενώ η περιεκτικότητα των φύλλων φαίνεται να επηρεάζεται θετικά από τη λίπανση εδάφους, όχι όμως σημαντικά. Τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν παρουσίασαν εποχική διακύμανση. Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του μήκους των βλαστών κατά το μήνα Απρίλιο, με επακόλουθη αύξηση του μέσου όρου του μήκους των μεσογονάτιων διαστημάτων, το οποίο αργότερα μειώθηκε. Ο λόγος νωπό προς ξηρό βάρος μειώθηκε σταθερά από το Μάρτιο μέχρι τον Αύγουστο. Για την ίδια χρονική περίοδο, η συμμετοχή της βιομάζας των φύλλων στο σύνολο της βιομάζας παρουσίασε φθίνουσα τάση, σε αντίθεση με την αντίστοιχη των βλαστών που παρουσίασε αύξουσα τάση. Η ανθοφορία ξεκίνησε στις αρχές του Ιουνίου. Τα φύλλα εμφάνισαν υψηλότερη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο από τους βλαστούς και τα άνθη, με μέγιστη τιμή στα τέλη του Ιουνίου, ενώ η υψηλότερη περιεκτικότητα του υπέργειου τμήματος σε αιθέριο έλαιο παρατηρήθηκε τον Μάιο. 3

10 ABSTRACT Melissa officinalis L. subsp. officinalis plants were produced from shoot cuttings and were field-cultivated under four different conditions: Low soil moisture, no fertilizer (υ), low soil moisture and fertilizer (υλ), high soil moisture, no fertilizer (Υ) and high soil moisture and fertilizer (ΥΛ). Plants were harvested at the beginning of November 2009 and the biomass and some morphometric characteristics were measured and the essential oil content of the leaves was determined. In addition, samples of Melissa officinalis L. subsp. officinalis plants were collected at two-week intervals from March to August 2009, from a separate cultivation. The biomass and some morphometric characteristics were measured and the essential oil content of the leaves, stems and flowers was determined. Soil moisture affected significantly and positively the fresh and dry weight of the plants, and also the ratio of the stem biomass to the total plant biomass (aerial parts). It affected significantly and negatively the ratio of leaf biomass to stem biomass and the ratio of leaf biomass to total plant biomass (aerial parts). Fertilizer affected significantly and positively plant fresh and dry weight. The essential oil content of the plant (aerial parts) was affected significantly and negatively by soil moisture, while leaf essential oil content appeared to be affected positively by fertilizer, but not significantly. In the seasonal samples, a marked stem elongation was observed in April, with an associated increase in the mean of inter-nodal distance which thereafter decreased. The ratio of fresh to dry weight decreased from March to August. Over the same period, the leaf biomass as a percentage of the total plant biomass (aerial parts) decreased and the corresponding percentage for the stems increased. Flowering started in early June. The leaf essential oil content was higher than that of the stems or the flowers, with a maximum value at the end of June. The essential oil content of the whole plant (aerial parts) was highest in May. 4

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Αρωματικά φυτά και καλλιέργεια Τα αρωματικά φυτά χαρακτηρίζονται από τα αιθέρια έλαια που παράγουν, στα οποία προσδίδουν και χαρακτηριστική οσμή. Τα αιθέρια έλαια είναι μίγματα ουσιών χαμηλού μοριακού βάρους, τα τερπενοειδή, τα οποία είναι οργανικές ενώσεις με 10 ή 15 άτομα άνθρακα οξυγονωμένα ή όχι (Vokou 2007). Τα αρωματικά φυτά παράγουν τα έλαια σε εξειδικευμένους ιστούς. Είναι φυτά ευρέως εξαπλωμένα σε όλον τον κόσμο και κατά κόρον ανήκουν στις οικογένειες Labiatae και Compositae, με κυριότερη στον ελληνικό χώρο την Labiatae. Τα συστατικά των αιθερίων ελαίων είναι αυτά που δίνουν και τις αντίστοιχες ιδιότητες στα έλαια και κατά συνέπεια στα φυτά που τα παράγουν. Τα αρωματικά φυτά της οικογένειας Labiatae χαρακτηρίζονται βάσει της περιεκτικότητάς τους σε αιθέριο έλαιο ως: φτωχά σε αιθέριο έλαιο (< 0,5 ml 100 g -1 DW), ενδιάμεσα σε αιθέριο έλαιο (0,5-2 ml 100 g -1 DW) και πλούσια σε αιθέριο έλαιο (> 2 ml 100 g -1 DW) (Kokkini & Vokou 1989). Τα αρωματικά φυτά παρουσιάζουν διακυμάνσεις στην ποσότητα του αιθερίου ελαίου που παράγουν, και οι οποίες αντικατοπτρίζονται είτε σε ποικιλότητα μεταξύ των διαφόρων τμημάτων του φυτού (άνθη, φύλλα, βλαστοί), είτε σε διαφορές ανάλογα της εποχής του έτους (εποχική ποικιλότητα). Εκτός από τη συλλογή αυτοφυών φυτών για την παραλαβή αιθερίων ελαίων, τα αρωματικά φυτά καλλιεργούνται ευρέως για τον ίδιο λόγο. Τα πλεονεκτήματα που παρουσιάζει μια καλλιέργεια είναι η επιλογή συγκεκριμένων φυτών με επιθυμητούς χαρακτήρες, αλλά επίσης και η δυνατότητα επιλογής κατάλληλων συνθηκών καλλιέργειας, ούτως ώστε να μεγιστοποιηθεί η απόδοση, τόσο βιομάζας, όσο και αιθερίου ελαίου. Τέλος, ένας ακόμη λόγος που προτιμάται μια καλλιέργεια, είναι και η προστασία των αυτοφυών πληθυσμών των φυτών από υπερβολική συλλογή ή και από μη ενδεδειγμένο τρόπο συλλογής, καθώς πολλά αρωματικά φυτά βρίσκονται σε καθεστώτα προστασίας. Μια συνηθισμένη πρακτική συλλογής αυτοφυών αρωματικών φυτών ήταν η εκρίζωση όλου του φυτικού ατόμου, αντί της συγκομιδής ορισμένου τμήματος. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε σε καλλιέργεια το taxon Melissa officinalis subsp. officinalis Melissa officinalis L. subsp. officinalis Το μελισσόχορτο ή μελισσοβότανο, Melissa officinalis subsp. officinalis (lemon balm) είναι φυτό της οικογένειας Labiatae (Lamiaceae). Το γένος Melissa περιλαμβάνει πέντε είδη που εξαπλώνονται στην Ευρασία, με κοινότερο το Melissa officinalis. Σύμφωνα με τον Fernandes (194) το M. officinalis είναι πολυετής πόα, με βλαστούς ανορθωμένους, διακλαδιζόμενους, μήκους cm, ελαφρώς τριχωτοί με αδενικές τρίχες ή χωρίς. Τα φύλλα του έχουν διαστάσεις 2-9 x 1,5-7 cm, ωοειδή έως ρομβοειδή, λίγο έως βαθιά οδοντωτά πλην της βάσης τους. Οι ταξιανθίες έχουν 4- άνθη, και βρακτίδια ωοειδή έως γραμμωτά χωρίς οδοντώσεις. Τα άνθη έχουν κάλυκα μήκους 7-9 mm, με μακριές αδενικές τρίχες, και τριγωνικούς οδόντες στο κάτω χείλος και στεφάνη μήκους 8-15 mm, χρώματος ανοιχτού κίτρινου που γίνεται κατά την ανάπτυξη λευκό. Τα σπέρματα έχουν διαστάσεις 1,5-2 mm. Η φυσική του 5

12 εξάπλωση είναι σε όλη την Ευρώπη εκτός των βόρειων περιοχών, στις οποίες βέβαια έχει εισαχθεί μέσω καλλιεργειών και έχει εγκλιματισθεί (Ηνωμένο Βασίλειο, Σουηδία και Κεντρική Ρωσία) (Fernandes 194). Στην Ελλάδα συναντώνται δύο υποείδη: το M. officinalis L. subsp. officinalis και το M. officinalis L. subsp. altissima (Sibth. & Sm.) Arcangeli. Οι διαφορές τους έγκεινται κυρίως στο μήκος του βλαστού (το πρώτο είναι μικρότερο), στην ύπαρξη ή όχι τριχώματος στην κάτω επιφάνεια των φύλλων (το πρώτο δεν έχει) και φυσικά στην οσμή που αναδύουν (το M. officinalis L. subsp. officinalis έχει οσμή λεμονιού, ενώ το M. officinalis L. subsp. altissima (Sibth. & Sm.) Arcangeli βαριά και άσχημη οσμή (fetid). Και τα δύο υποείδη φύονται σε σκιερά μέρη (Φωτογραφία 1.1), κυρίως σε μέρη με αρκετή υγρασία (Fernandes 194). Φωτογραφία 1.1. Αυτοφυής πληθυσμός Melissa officinalis subsp. officinalis στο άλσος του Αγίου Νικολάου Νάουσας, φυόμενος σε σκιερό μέρος σε πλατανόδασος τον Ιούλιο του Photograph 1.1. Wild population of Melissa officinalis subsp. officinalis plants growing in the wood of Agios Nikolaos (St Nicholas), Naousa, Greece, in the shade of a plane tree in July Melissa officinalis L. subsp. officinalis και αιθέρια έλαια Το Melissa officinalis L. subsp. officinalis χαρακτηρίζεται γενικά ως φτωχό σε αιθέρια έλαια. Τιμές που έχουν καταγραφεί φτάνουν ως τα 0,2 ml 100 g -1 DW (Mimica-Dukic et al. 2004). Τα κυριότερα συστατικά του αιθερίου ελαίου του M. officinalis L. subsp. officinalis είναι η νεράλη (neral), η γερανιάλη (geranial) και η σιτρονελλάλη (citronellal) (Sari & Ceylan 2002, Allahverdiyev et al. 2004, Mimica-Dukic et al. 2004, Topal et al. 2008). Το M. officinalis L. subsp. officinalis χρησιμοποιείται ως ρόφημα (αφέψημα φύλλων), ως πρόσθετο σε φαγητά και ποτά (Sari & Ceylan 2002, Mimica-Dukic et al. 2004, Topal et al. 2008), καθώς και σαν συστατικό σε καλλυντικά (Sari & Ceylan 2002). Επίσης, χρησιμοποιείται ενάντια στον πονοκέφαλο (Sari & Ceylan 2002, Mimica-

13 Dukic et al. 2004), σε γαστρεντερικές διαταραχές, σε διαταραχές της μνήμης και του ύπνου (Kennedy et al. 2004, Mimica-Dukic et al. 2004, Basta et al. 2005, Topal et al. 2008), ενώ χαρακτηρίζεται και από σπασμολυτική (Sari & Ceylan 2002, Sadraei et al. 2003, Basta et al. 2005) και αντικαταθλιπτική δράση (Sari & Ceylan 2002, Basta et al. 2005). Έχει, ακόμη, αναφερθεί αντιική δράση, ειδικά έναντι των ερπητο-ιών (Herpes Simplex Viruses-HSV) (Allahverdiyev et al. 2004, Schnitzler et al. 2008) Σκοπός Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση τρόπων καλλιέργειας του Melissa officinalis L. subsp. officinalis, οι οποίοι θα αποδώσουν υψηλή ποσότητα βιομάζας και αιθερίου ελαίου. Επιμέρους στόχοι της εργασίας είναι: Α. Η μελέτη της επίδρασης: υγρασίας εδάφους και οργανικού λιπάσματος Biosol και Β. Η μελέτη κατά τη διάρκεια του έτους στη βιομάζα, σε μορφομετρικά χαρακτηριστικά και στην περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο φυτών Melissa officinalis L. subsp. officinalis που αναπτύχθηκαν σε πειραματικές καλλιέργειες. Η μελέτη της εποχικής διακύμανσης της βιομάζας και του αιθερίου ελαίου στοχεύει στην εύρεση της αποδοτικότερης χρονικής περιόδου για την συγκομιδή του φυτού. 7

14 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Υπόστρωμα ριζοβολίας μοσχευμάτων Ως υπόστρωμα ριζοβολίας χρησιμοποιήθηκε Τύρφη και Περλίτης με αναλογία 1:3 (v/v). Η τύρφη που χρησιμοποιήθηκε ήταν τύπου Terrahum TS1, χωρίς προσθήκη θρεπτικών συστατικών. Παράγεται από την εταιρεία Klassman-Deilmann (Geeste, Germany) και εισάγεται και διανέμεται από την εταιρεία ΑΓΡΟΧΟΥΜ Α.Ε. (Αθήνα, Ελλάδα). Έχει τις εξής ιδιότητες: βαθμό αποσύνθεσης Η-Η8, ph 5,5-,5, αγωγιμότητα 40 ms m -1, περιεκτικότητα οργανικής ουσίας 85-95% (v/v) και ικανότητα κατακράτησης ύδατος 0-70% (v/v) του όγκου της. Ο περλίτης (ISOCON Α.Ε. Άγιος Ιωάννης Ρέντης, Αθήνα, Ελλάδα) έχει την ονομασία Perloflor με τα εξής χαρακτηριστικά: μέγεθος κόκκων 2-5 mm, ειδικό βάρος kg m -3 και με ικανότητα συγκράτησης ύδατος από L m Ορμόνη ριζοβολίας Η ορμόνη ριζοβολίας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ινδολυλοβουτυρικό οξύ συγκέντρωσης 0,2% (w/w), της εταιρείας Φυτοργκάν Α.Β.Ε.Ε. (Αθήνα, Ελλάδα) με την εμπορική ονομασία RADICIN. Η μορφή του σκευάσματος είναι σκόνη επίπασης Υπόστρωμα μεταφύτευσης μοσχευμάτων Ως υπόστρωμα μεταφύτευσης χρησιμοποιήθηκε εμπλουτισμένη τύρφη, χώμα, μίλη, ελαφρόπετρα (0-8 mm) και ελαφρόπετρα (5-8 mm) με αναλογία 1:1:0,5:0,25:0,25 (v/v). Η τύρφη που χρησιμοποιήθηκε ήταν τύπου Terrahum TS3, εμπλουτισμένη σε οργανική ουσία. Παράγεται από την εταιρεία Klasmann-Deilmann (Geeste, Germany) και εισάγεται και διανέμεται από την εταιρεία ΑΓΡΟΧΟΥΜ Α.Ε. (Αθήνα, Ελλάδα). Είναι μείγμα λευκής τύρφης (0-25 mm) µε βαθμό αποσύνθεσης Η3-Η και αργίλου με ειδικό βάρος 20 kg m -3. Το pη είναι, η ικανότητα κατακράτησης νερού 0-70% (v/v) του όγκου της και περιέχει λίπασμα σε συγκέντρωση 1 g L -1, συγκέντρωση σε άζωτο (Ν) 140 mg L -1, φώσφορο (της μορφής P 2 O 5 ) 10 mg L -1, κάλιο (της μορφής Κ 2 Ο) 180 mg L -1, μαγνήσιο 100 mg L -1 καθώς και όλα τα απαραίτητα ιχνοστοιχεία. Το χώμα προήλθε από παλαιά καλλιέργεια στην περιοχή των Βασιλικών (Νομός Θεσσαλονίκης). Η μίλη (αμμώδες υπόστρωμα από κοίτη ποταμού), προήλθε από τον ποταμό Αξιό (Νομός Θεσσαλονίκης). Η ελαφρόπετρα που χρησιμοποιήθηκε εξορύσσεται από τη ΛΑΒΑ Μεταλλευτική και Λατοµική Α.Ε. (Λυκόβρυση Αττικής, Ελλάδα) Αποτελείται από 72% (w/w) οξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) και από 13% (w/w) οξείδιο του αργιλίου (Al 2 O 3 ) και είναι αδρανές και ουδέτερο υλικό. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικής κοκκοµετρίας τύποι ελαφρόπετρας: ο ένας µε διάμετρο κόκκων από 0-8 mm, που έχει ειδικό βάρος 700 kg m -3 και υγρασία 19-25% (v/v) και ο δεύτερος µε διάμετρο κόκκων από 5-8 mm, που έχει ειδικό βάρος 50 kg m -3 και υγρασία 20-28% (v/v). 8

15 2.4. Οργανικό λίπασμα Biosol Χρησιμοποιήθηκε οργανικό λίπασμα που ήταν το Biosol. Παράγεται από την εταιρεία Sandoz GmbH (Kundl, Austria) και διανέμεται από την εταιρεία Intrachem Hellas Ltd. (Αθήνα, Ελλάδα). Είναι ένα λίπασμα αργής διάχυσης στο έδαφος και του οποίου τα θρεπτικά συστατικά γίνονται διαθέσιμα στο φυτό μέσω της δράσης συμβιωτικών μυκήτων. Πρόκειται για προϊόντα που προκύπτουν από τη δράση του μύκητα Penicillium chrysogenum σε υπόστρωμα από παραπροϊόντα αγροτικών καλλιεργειών. Διατίθεται σε μορφή κόκκων, με διάμετρο από 2- mm. Το περιεχόμενό του σε οργανική ουσία είναι 85% (w/v), ολικό οργανικό άζωτο -8%, φώσφορο (της μορφής P 2 O 5 ) 0,5% και κάλιο (της μορφής K 2 O) 0,5%. Ο λόγος άνθρακας προς άζωτο (C:N) ήταν : Φυτικό υλικό Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα από ένα μητρικό φυτό Melissa officinalis subsp. officinalis που συντηρείται σε καλλιέργεια σε πειραματικό αγροτεμάχιο στο Εργαστήριο Προστασίας και Αξιοποίησης Αυτοφυών και Ανθοκομικών Ειδών του Κ.Γ.Ε.Β.Ε. (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.). Το μητρικό φυτό συλλέχθηκε στα πλαίσια του προγράμματος ÉCLAIR (Biotechnology applications for plant regeneration, identification and certification aiming at the production of healthy propagation material and the industrial utilization of certain aromatic plants E.U.) από την Πελοπόννησο (κα Στέλλα Κοκκίνη, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.). 2.. Δοχεία και λοιπά υλικά Δίσκος ριζοβολίας 7 x θέσεων (31 x 52 cm εξωτερικές διαστάσεις) Γλάστρες όγκου 0,5 L και 2,5 L Σταλακτοφόροι σωλήνες με οπές άρδευσης κάθε 33 cm (συνολικό μήκος σωλήνων 132 m) Γεωΰφασμα (συνολικού εμβαδού 159 m 2 ) 2.7. Αγενής αναπαραγωγή φυτών Melissa officinalis L. subsp. officinalis Φυτά Melissa officinalis αναπαράχθηκαν αγενώς μέσω μοσχευμάτων, αναπτύχθηκαν σε γλάστρες και κατόπιν μεταφυτεύτηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πειραματικό αγροτεμάχιο. Μοσχεύματα μήκους 7-10 cm κόπηκαν (17/03/2009) από μητρικά φυτά Melissa officinalis. Σε κάθε μόσχευμα αφαιρέθηκαν τα φύλλα (πλην των 4 κορυφαίων) και κόπηκε ένα μικρό τμήμα βλαστού από τη βάση (μήκος περίπου 1 mm). Στη συνέχεια, το κατώτερο τμήμα του μοσχεύματος (μήκους 2-3 mm) εμβαπτίστηκε σε τριβλίο που περιείχε την σκόνη επίπασης (βλέπε 2.2) και κατόπιν το μόσχευμα τοποθετήθηκε στο δίσκο ριζοβολίας, που περιείχε το υπόστρωμα ριζοβολίας (Φωτογραφία 2.1). Ο δίσκος ριζοβολίας τοποθετήθηκε σε θάλαμο υδρονέφωσης με θερμοκρασία υποστρώματος 21 C και σχετική υγρασία 55% μέχρι τη ριζοβολία των μοσχευμάτων. 9

16 Φωτογραφία 2.1. Τοποθέτηση μοσχευμάτων Melissa officinalis σε δίσκο ριζοβολίας το Μάρτιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.1. Placing Melissa officinalis cuttings in rooting trays, March 2009 (Photograph: C. M. Cook) Μεταφύτευση φυταρίων και εγκλιματισμός Μόλις τα φυτάρια ριζοβόλησαν, μεταφυτεύτηκαν σε γλάστρες όγκου 0,5 L και μεταφέρθηκαν σε εξωτερικό χώρο υπό σκιά προκειμένου να αναπτυχθούν και να εγκλιματιστούν (10/04/2009) (Φωτογραφία 2.2). Ακολούθως, στις 11,, 13, 14/05/2009 έγινε μεταφύτευσή τους σε γλάστρες όγκου 2,5 L. Τέλος, τον Ιούνιο, τα ανεπτυγμένα πλέον φυτά φυτεύτηκαν στο πειραματικό αγροτεμάχιο. 10

17 Φωτογραφία 2.2. Μεταφύτευση ριζοβολημένων μοσχευμάτων Melissa officinalis σε γλάστρες 2,5 L τον Απρίλιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.2. Planting of rooted Melissa officinalis cuttings in pots 2.5 L, April 2009 (Photograph: C. M. Cook) Προετοιμασία πειραματικού αγροτεμαχίου Κατά μήκος του αγροτεμαχίου, μήκους 22 m (Φωτογραφία 2.3), απλώθηκαν σταλακτοφόροι σωλήνες οι οποίοι τροφοδοτούνταν από το αρδευτικό δίκτυο (Φωτογραφία 2.4). Συνολικά τοποθετήθηκαν τμήματα σωλήνων μήκους 22 m έκαστο, σε ευθείες γραμμές, με απόσταση μεταξύ τους 90 cm. Οι σωλήνες στερεώθηκαν στο έδαφος με χρήση πλαστικών στηριγμάτων. Ακολούθως, στα τμήματα εδάφους ανάμεσα στους σωλήνες και σε όλο το μήκος του αγροτεμαχίου απλώθηκε γεωΰφασμα. Το γεωΰφασμα στερεώθηκε στο έδαφος με χρήση μεταλλικών καρφιών. 11

18 Φωτογραφία 2.3. Το πειραματικό αγροτεμάχιο μετά το όργωμα και το φρεζάρισμα τον Απρίλιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.3. The experimental field after plowing and harrowing, April 2009 (Photograph: C. M. Cook). Φωτογραφία 2.4. Η διάταξη των σταλακτοφόρων σωλήνων στο πειραματικό αγροτεμάχιο το Μάιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.4. Irrigation system of the experimental field, May 2009 (Photograph: C. M. Cook).

19 2.10. Φύτευση φυτών στο πειραματικό αγροτεμάχιο Μετά την προετοιμασία του αγροτεμαχίου φυτεύτηκαν τα φυτά. Κάτω από κάθε οπή των σωλήνων ανοίχτηκαν με σκαπτικό εργαλείο τρύπες στο έδαφος, διαστάσεων περίπου όσο και οι γλάστρες όπου βρίσκονταν τα φυτά και εκεί φυτεύτηκαν τα φυτά μαζί με το υπόστρωμά τους (Φωτογραφίες 2.5 και 2.). Μετά την πάροδο λίγων ημερών εγκλιματισμού, ακολούθησε κλάδεμα των φυτών, αφήνοντας ανέπαφους βλαστούς μήκους 2-3 cm και λίγα φύλλα, ώστε όλα τα φυτά να ξεκινήσουν πάλι την ανάπτυξή τους από το ίδιο μέγεθος. Στο διάστημα εγκλιματισμού τους καθώς και για λίγες μέρες μετά το κλάδεμά τους, όλα τα φυτά ποτίζονταν με την ίδια ποσότητα νερού. Παράλληλα, λάμβανε χώρα και απομάκρυνση των ανεπιθύμητων φυτών (ζιζάνια) Φωτογραφία 2.5. Φύτευση φυτών Melissa officinalis στο πειραματικό αγροτεμάχιο τον Ιούνιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.5. Planting out Melissa officinalis plants in the experimental field, June 2009 (Photograph: C. M. Cook). Φωτογραφία 2.. Το πειραματικό αγροτεμάχιο μετά τη φύτευση των φυτών Melissa officinalis τον Ιούνιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.. The experimental field after planting of Melissa officinalis plants, June 2009 (Photograph: C. M. Cook). 13

20 2.11. Τοποθέτηση οργανικού λιπάσματος Biosol Μετά τον εγκλιματισμό τοποθετήθηκε το λίπασμα στο έδαφος δίπλα από κάθε φυτό (Φωτογραφία 2.7). Κάθε γραμμή φυτών χωρίστηκε σε τέσσερις ισομεγέθεις ομάδες, δύο από τις οποίες περιείχαν φυτά με λίπασμα και δύο φυτά χωρίς λίπασμα (δημιουργώντας 2 επαναλήψεις σε κάθε περίπτωση). Έτσι, και στις γραμμές φύτευσης τα μισά από τα φυτά είχαν λίπασμα και τα μισά όχι. Η ποσότητα του λιπάσματος που τοποθετήθηκε, υπολογίστηκε βάσει των τιμών που δίνει η εταιρεία παρασκευής του λιπάσματος για συγκεκριμένες εκτάσεις γης και καλλιέργειες, ανάγοντας τις τιμές αυτές στην παρούσα έκταση. Συγκεκριμένα, γύρω από κάθε φυτό, δημιουργήθηκε ένα νοητό τετράγωνο με μήκος πλευράς 33 cm και εμβαδού περίπου 0,1 m2. Σε αυτό το εμβαδό έγινε ο υπολογισμός της ποσότητας που προστέθηκε και η οποία ήταν 9,2 g. Φωτογραφία 2.7. Εφαρμογή του οργανικού λιπάσματος Biosol στα φυτά Melissa officinalis στο πειραματικό αγροτεμάχιο τον Ιούλιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.7. Application of the organic fertilizer Biosol around Melissa officinalis plants in the experimental field, July 2009 (Photograph: C. M. Cook). 2.. Μέτρηση της υγρασίας εδάφους Για τη μέτρηση της υγρασίας εδάφους χρησιμοποιήθηκε το όργανο ΗΗ2 Moisture Meter µε αισθητήρα Theta Probe τύπου ML2x, της Δelta Τ Devices (Cambridge, England). Το όργανο αυτό μετρά σχετική υγρασία (%) σε διάφορα υποστρώματα. Πριν τη μέτρηση της υγρασίας σε συγκεκριμένο υπόστρωμα, το όργανο χρειάζεται βαθμονόμηση, η οποία έγινε ως εξής: Σε γλάστρα όγκου 2,5 L (L) τοποθετήθηκε δείγμα εδάφους που προέρχεται από το πειραματικό αγροτεμάχιο και παροχετεύτηκε νερό μέχρι το σημείο αποστράγγισης. Κατόπιν το δείγμα ζυγίστηκε (WW). Με χρήση του αισθητήρα Theta Probe μετρήθηκε το υδατικό δυναμικό του δείγματος σε mv (VW). Ακολούθησε αποξήρανση του υγρού δείγματος εδάφους και ζύγισμα (W0). Μετρήθηκε το υδατικό δυναμικό στο αποξηραμένο δείγμα (V0). Υπολογίστηκαν οι 14

21 διηλεκτρικές σταθερές των δειγμάτων εδάφους πριν και μετά την αποξήρανση με τη χρήση της εξίσωσης ε = 1,1 + 4,44V (όπου V το υδατικό δυναμικό). Υπολογίστηκε η ογκομετρική περιεκτικότητα του νερού (θw) με χρήση της εξίσωσης θw = (WW - W0)/L. Τέλος υπολογίστηκαν οι παράμετροι α0 και α1 (Σύνθετος δείκτης διάθλασης-complex refractive index) με χρήση των εξισώσεων: α1 = ( εw) - ε0)/ θw και ε = α0 + α1. Με τον υπολογισμό των παραμέτρων αυτών, το ΗΗ2 Moisture Meter μπορεί να υπολογίσει τη σχετική υγρασία του υποστρώματος για το οποίο βαθμονομήθηκε (του εδάφους στο πειραματικό αγροτεμάχιο), βάσει της μέτρησης του υδατικού δυναμικού από τον αισθητήρα Theta Probe (Φωτογραφία 2.8). Ο όγκος νερού που χρειάστηκε για τον κορεσμό του υποστρώματος στο πειραματικό αγροτεμάχιο μετρήθηκε και κατόπιν μετρήθηκε επίσης και ο χρόνος που απαιτείται για να παροχετευτεί ο όγκος αυτός από τις οπές άρδευσης του σταλακτοφόρου σωλήνα. Η μέτρηση του χρόνου πλήρωσης έγινε σε τρία σημεία σε κάθε σωλήνα (στην πρώτη οπή, στη μεσαία και στην τελευταία) ώστε να βρεθεί εάν σε όλο το μήκος του σωλήνα υπάρχει σταθερή ροή νερού από τις οπές άρδευσης. Ο όγκος νερού που απαιτείται για τον κορεσμό του υποστρώματος ήταν 1 L και ο χρόνος που χρειαζόταν για να παροχετευτεί ο όγκος αυτός ήταν 3 min. Φωτογραφία 2.8. Μέτρηση του υδατικού δυναμικού του υποστρώματος στο πειραματικό αγροτεμάχιο με χρήση του οργάνου ΗΗ2 Moisture Meter (DeltaT, UK) τον Αύγουστο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.8. Measurement of soil water potential in the experimental field plot using an HH2 Moisture Meter (DeltaT, UK), August 2009 (Photograph: C. M. Cook). 15

22 2.13. Περιγραφή των πειραματικών συνθηκών Πείραμα με διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας Οι τέσσερις συνθήκες καλλιέργειας ήταν: υ: Χαμηλή υγρασία εδάφους υλ: Χαμηλή υγρασία εδάφους, παρουσία λιπάσματος Υ: Υψηλή υγρασία εδάφους ΥΛ: Υψηλή υγρασία εδάφους, παρουσία λιπάσματος Κάθε συνθήκη καλλιέργειας είχε 2 επαναλήψεις στο πειραματικό αγροτεμάχιο. Η τελική μορφή του πειραματικού αγροτεμαχίου, παριστάνεται παρακάτω (Γράφημα 2.1 και Φωτογραφίες 2.9 και 2.10).. Γράφημα 2.1. Σχεδιάγραμμα του πειραματικού αγροτεμαχίου, όπου φαίνονται οι διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (υ, χαμηλή και Υ υψηλή υγρασία εδάφους, Λ προσθήκη λιπάσματος), καθώς και οι δύο επαναλήψεις (90 φυτά ανά συνθήκη, 45 ανά επανάληψη). Figure 2.1. Experimental design of the field plot showing the different combinations of growth conditions (υ, low and Υ, high soil moisture, Λ addition of fertilizer) and replications (90 plants per cultivation condition, 45 per replication). 1

23 Φωτογραφία 2.9. Φυτά Melissa officinalis στο πειραματικό αγροτεμάχιο τον Αύγουστο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.9. Melissa officinalis plants in the experimental field, August 2009 (Photograph: C. M. Cook). Φωτογραφία Φυτά Melissa officinalis στο πειραματικό αγροτεμάχιο τον Οκτώβριο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph Melissa officinalis plants in the experimental field, October 2009 (Photograph: C. M. Cook). 17

24 Επίδραση της εποχής του έτους Χρησιμοποιήθηκε πειραματικό αγροτεμάχιο στο οποίο υπήρχε καλλιέργεια φυτών Melissa officinalis L. subsp. officinalis και εξετάστηκε η εποχική διακύμανση μορφομετρικών χαρακτηριστικών, βιομάζας και αιθερίου ελαίου των φυτών. Το πειραματικό αγροτεμάχιο είχε διαστάσεις 20 x 4 m, τα φυτά ήταν φυτεμένα σε γραμμές με απόσταση μεταξύ τους 33 cm και απόσταση μεταξύ των γραμμών 90 cm. Η άρδευση γινόταν με σταλακτοφόρους σωλήνες, με οπές ανά 33 cm. Στο χώρο μεταξύ των γραμμών, βρισκόταν απλωμένο και στερεωμένο με μεταλλικά καρφιά γεωΰφασμα (Φωτογραφία 2.11). Φωτογραφία Πειραματικό αγροτεμάχιο με καλλιέργεια Melissa officinalis L. subsp. officinalis που χρησιμοποιήθηκε για το εποχικό πείραμα, τον Απρίλιο του 2009 (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph Experimental field with Melissa officinalis L. subsp. officinalis plants in cultivation and used for the seasonal experiment, April 2009 (Photograph: C. M. Cook) Μετεωρολογικά δεδομένα Τα μετεωρολογικά δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν (θερμοκρασία αέρα και ύψος βροχόπτωσης) προέρχονται από το μετεωρολογικό σταθμό του διεθνούς αεροδρομίου της Θεσσαλονίκης ΜΑΚΕΔΟΝΙΑ (κωδικός International Civil Aviation Organization: LGTS). 18

25 2.15. Συγκομιδή και αποξήρανση φυτικών δειγμάτων Η συγκομιδή των δειγμάτων από τον πειραματικό αγρό έγινε μετά την πάροδο πέντε μηνών από τη φύτευσή τους. Κάθε δείγμα αποτελούνταν από το υπέργειο τμήμα του φυτού. Η συγκομιδή έγινε στις 22 και 23/10/2009. Στο εποχικό πείραμα, η συγκομιδή των δειγμάτων ξεκίνησε το Μάρτιο του 2009 και ολοκληρώθηκε τον Αύγουστο του Η συχνότητα δειγματοληψιών ήταν 2 δείγματα ανά μήνα. Η κοπή των φυτών γινόταν ακριβώς πάνω από την επιφάνεια του εδάφους. Από κάθε δείγμα, επιλέγονταν τυχαία 20 βλαστοί. Όλα τα δείγματα ζυγίζονταν για να μετρηθεί το νωπό βάρος και τοποθετούνταν σε σκιερό χώρο για αποξήρανση Μορφομετρία Αποξηραμένα δείγματα ζυγίστηκαν και μετρήθηκε το ξηρό βάρος τους (DW). Ακολούθησε χωρισμός των φύλλων από τους βλαστούς. Μετρήθηκε: Νωπό βάρος δείγματος Ξηρό βάρος δείγματος Ξηρό βάρος φύλλων δείγματος Ξηρό βάρος βλαστών δείγματος Ξηρό βάρος ανθέων δείγματος Μήκος βλαστού Αριθμός γονάτων ανά βλαστό Εκτίμηση της περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο Το αιθέριο έλαιο απομονώθηκε με τη μέθοδο της υδροαπόσταξης (Cook et al. 2007) για 2,5 h. Η συσκευή υδροαπόσταξης τύπου Clevenger που χρησιμοποιήθηκε φαίνεται στην Φωτογραφία 2.. Επειδή το Melissa officinalis είναι φυτό φτωχό σε αιθέριο έλαιο, χρησιμοποιήθηκε βιομάζα μεγαλύτερη από 50 g (μέγιστη τιμή 187 g) ξηρού βάρους προκειμένου να ληφθεί η μεγαλύτερη δυνατή ποσότητα αιθερίου ελαίου. Το υλικό που πρόκειται να αποσταχθεί τοποθετείται στη σφαιρική φιάλη, η οποία γεμίζεται με νερό ως τα 3/5 του όγκου της. Η φιάλη τοποθετείται σε μια εστία θέρμανσης και αφήνεται ώστε το περιεχόμενο να βράσει. Μετά από περίπου μισή ώρα, αρχίζει η εξάτμιση του νερού και των διαφόρων συστατικών του αιθερίου ελαίου. Οι ατμοί κατευθύνονται μέσω του γυάλινου σωλήνα που βρίσκεται πάνω από τη φιάλη προς τον ψυκτήρα, όπου και υγροποιούνται. Τα υγροποιημένα νερό και αιθέριο έλαιο, φτάνουν στο διαχωριστικό δοχείο όπου το τελευταίο σχηματίζει στιβάδα πάνω από το νερό. Μόλις τελειώσει η απόσταξη, ακολουθεί η απομάκρυνση του νερού και η κάθοδος της στιβάδας του αιθερίου ελαίου στον ογκομετρικό σωλήνα που βρίσκεται κάτω από το διαχωριστικό δοχείο. Αφού μετρηθεί η ποσότητα του αιθερίου ελαίου, γίνεται παραλαβή του. Το αιθέριο έλαιο φυλάσσεται σε θερμοκρασία -10 οc (Cook et al. 2007) στο σκοτάδι, προκειμένου να αποφευχθεί η αλλοίωσή του ελαίου. 19

26 Φωτογραφία 2.. Συσκευή υδροαπόσταξης τύπου Clevenger (Φωτογραφία: Κουκ, Κ. Μ.). Photograph 2.. Clevenger-type distillation apparatus used for hydro distillation of plant samples (Photograph: C. M. Cook) Στατιστική επεξεργασία Έγινε έλεγχος ομοιογένειας των δεδομένων χρησιμοποιώντας τη δοκιμή του LEVENE. Χρησιμοποιήθηκε ανάλυση Univariate ANOVA (Analysis of Variance), με επίπεδο σημαντικότητας 5% (SPSS, Έκδοση 13, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Η γραφική απεικόνιση της επίδρασης κάθε παράγοντα έγινε με χρήση θηκογραμμάτων (Boxplots ή Box & Whisker plots) (Γράφημα 2.2). Οι τρεις οριζόντιες γραμμές κάθε θηκογράμματος αντιστοιχούν στο 25, 50 (διάμεσος) και 75% των τιμών, ενώ οι κάθετες γραμμές που προεκτείνονται άνω και κάτω καταλήγουν στην μέγιστη και ελάχιστη μέτρηση αντίστοιχα. Με μαύρη κουκίδα ( ) συμβολίζονται οι ακραίες τιμές. 20

27 Γράφημα 2.2. Ένα τυπικό θηκόγραμμα. Figure 2.2. Diagram illustrating the components of a typical Box and Whisker plot 21

28 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Μετεωρολογικά δεδομένα Το ομβροθερμικό διάγραμμα για το έτος 2009 απεικονίζεται στο Γράφημα 3.1. Γράφημα 3.1. Μέση μηνιαία θερμοκρασία και μέση μηνιαία βροχόπτωση για το έτος 2009 στην περιοχή της πειραματικής καλλιέργειας. Figure 3.1. Mean monthly temperature and rainfall for the year 2009 in the area of the experimental field. Η μέγιστη ετήσια θερμοκρασία παρατηρήθηκε το μήνα Ιούλιο, ενώ αντίστοιχα τότε παρατηρήθηκε η ελάχιστη βροχόπτωση. 22

29 3.2. Επίδραση συνθηκών καλλιέργειας Μορφομετρικά χαρακτηριστικά Μετρήθηκε το νωπό βάρος του υπέργειου τμήματος των φυτών που συλλέχθηκαν από τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Συλλέχθηκαν φυτά από κάθε συνθήκη και από τις δύο επαναλήψεις. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα Γραφήματα 3.2, 3.3 και τον Πίνακα 3.1) Γράφημα 3.2. Νωπό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure 3.2. Fresh weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 23

30 Γράφημα 3.3. Νωπό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F = 7,035, Sig. = 0,015), (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους (F = 5,, Sig. = 0,034). (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure 3.3. Box and whisker plot of the fresh weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (Λ) (F = 7.035, Sig. = 0.015) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture (υ, Υ) (F = 5., Sig. = 0.034). (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.1. Νωπό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ, ± τυπική απόκλιση). Table 3.1. Fresh weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) 0 Λ 0+Λ 0 Λ 0+Λ 0 Λ Νωπό βάρος φυτού (g) (ΜΟ) 29,5 395,9 332,7 424,2 27,2 525,7 34,8 511, Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 2,7 202,2 157,2 172,8 238,8 225,2 147,9 243,1 24

31 Η υψηλότερη τιμή νωπού βάρους υπέργειου τμήματος εμφανίστηκε στα άτομα M. officinalis που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους και χωρίς λίπανση (Γράφημα 3.2 και Πίνακας 3.1). Σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση ANOVA το νωπό βάρος επηρεάζεται σημαντικά τόσο από την υγρασία εδάφους (Sig. = 0,015), όσο και από την λίπανση (Sig. = 0,034). Η επίδραση αυτή είναι θετική και στις δύο περιπτώσεις. Το ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος των φυτών που συλλέχθηκαν από τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας φαίνεται στα Γραφήματα 3.4, 3.5 και τον Πίνακα 3.2) Γράφημα 3.4. Ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure 3.4. Dry weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 25

32 Γράφημα 3.5. Ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F = 8,539, Sig. = 0,008), (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους (F = 4,818, Sig. = 0,04). (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure 3.5. Dry weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (F = 8.539, Sig. = 0.008) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture (F = 4.818, Sig. = 0.04). (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.2. Ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.2. Dry weight of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Σύνολο Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Σύνολο Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Ξηρό βάρος φυτού (g) (ΜΟ) 90,5 140,7 115, 157,0 205,0 181,0 3,7 172,8 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 23,9 2, 52,2 54,2 72,1 5,8 52,9 72, Η υψηλότερη τιμή ξηρού βάρους υπέργειου τμήματος παρατηρήθηκε στα άτομα M. officinalis που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, 2

33 ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους και χωρίς λίπανση (Γράφημα 3.4 και Πίνακας 3.2). Το ξηρό βάρος επηρεάζεται σημαντικά από την υγρασία εδάφους (Sig. = 0,008), αλλά και από την λίπανση (Sig. = 0,04) σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση ANOVA. Και στις δύο περιπτώσεις, η επίδραση των παραγόντων είναι θετική. Υπολογίστηκε ο λόγος νωπού προς ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος των φυτών που συλλέχθηκαν από τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (Γραφήματα 3., 3.7 και Πίνακας 3.3). Γράφημα 3.. Νωπό προς ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure 3.. Fresh to dry weight ratio of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 27

34 Γράφημα 3.7. Νωπό προς ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης, (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure 3.7. Fresh to dry weight ratio of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.3. Νωπό προς ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.3. Fresh to dry weight ratio of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Σύνολο Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Σύνολο Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Νωπό / ξηρό βάρος (ΜΟ) 3,01 2,82 2,91 2,73 3,03 2,88 2,87 2,93 Τυπική απόκλιση 0,17 0,47 0,35 0,0 0,10 0,44 0,45 0,34 Αριθμός δειγμάτων (n) Η υψηλότερη τιμή νωπού προς ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος παρατηρήθηκε στα άτομα M. officinalis που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και χωρίς λίπανση (Γράφημα 3. και Πίνακας 3.3). Ο λόγος νωπό προς ξηρό βάρος δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από την υγρασία εδάφους, αλλά ούτε και από την λίπανση σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση ANOVA. 28

35 Ο λόγος της βιομάζας των φύλλων προς τη βιομάζα των βλαστών καθώς και η βιομάζα των φύλλων ανά φυτό για τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας απεικονίζονται στα Γραφήματα 3.8, 3.9 και 3.10 και στους Πίνακες 3.4 και 3.5. Γράφημα 3.8. Βιομάζα φύλλων, προς βιομάζα βλαστών υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis, και ανά φυτό στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure 3.8. Ratio of leaf DW to stem DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) (grey bars) and leaf biomass (DW) per plant (black bars) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 29

36 Γράφημα 3.9. Βιομάζα φύλλων προς βιομάζα βλαστών υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F =,811, Sig. = 0,01), (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure 3.9. Ratio of leaf DW to stem DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (F =.811, Sig. = 0.01) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.4. Βιομάζα φύλλων προς βιομάζα βλαστών υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.4. Ratio of leaf DW to stem DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Βιομάζα φύλλων / βιομάζα βλαστών (ΜΟ) 2,0 2,30 2,18 1,4 1,47 1,4 1,7 1,88 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,58 1,13 0,8 0,38 0,3 0,35 0,5 0,91 30

37 Η υψηλότερη τιμή βιομάζας φύλλων προς βιομάζα βλαστών υπέργειου τμήματος παρατηρήθηκε στα άτομα που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους (ανεξάρτητα της λίπανσης, διότι οι τιμές είναι ίδιες στις δύο συνθήκες) (Γράφημα 3.8 και Πίνακας 3.4). Η βιομάζα φύλλων προς βιομάζα βλαστών επηρεάζεται σημαντικά από την υγρασία εδάφους (Sig. = 0,01) και συγκεκριμένα αρνητικά, ενώ η λίπανση εδάφους δεν επηρεάζει σημαντικά (ANOVA). Γράφημα Βιομάζα φύλλων ανά φυτό Melissa officinalis (υπέργειο τμήμα): (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης, (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure Leaf biomass (DW) per plant of Melissa officinalis (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.5. Βιομάζα φύλλων ανά φυτό Melissa officinalis (υπέργειο τμήμα) στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). 31

38 Table 3.5. Leaf biomass (DW) per plant of Melissa officinalis (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Βιομάζα φύλλων ανά φυτό (g) (ΜΟ) 58,99 98,0 78,53 92,43 1,4 107,04 75,71 109,85 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n),39 54,7 43,00 35,15 47,11 42,4 30,0 50,23 Η βιομάζα φύλλων ανά φυτό δείχνει να επηρεάζεται θετικά από την υγρασία εδάφους και από την λίπανση. Ωστόσο, η δοκιμή του Levene έδειξε ανομοιογένεια στη διακύμανση του χαρακτηριστικού αυτού. 32

39 Ο λόγος της βιομάζας των φύλλων και των βλαστών προς την ολική βιομάζα για τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας απεικονίζονται στα Γραφήματα και 3.13 και στους Πίνακες 3. και 3.7. Γράφημα Βιομάζα φύλλων ( ) και βιομάζα βλαστών ( ) προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος αντίστοιχα, φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure Ratio of leaf DW ( ) and stem DW ( ), respectively, to total DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 33

40 Γράφημα 3.. Βιομάζα φύλλων προς ολική βιομάζα, υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F = 9,133, Sig. = 0,00), (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure 3.. Ratio of leaf DW to total DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (F = 9.133, Sig. = 0.00) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.. Βιομάζα φύλλων προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.. Ratio of leaf DW to total DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ +Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Βιομάζα φύλλων / ολική βιομάζα (ΜΟ) 0, 0,7 0,7 0,59 0,59 0,59 0,2 0,3 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,0 0,09 0,07 0,0 0,0 0,0 0,07 0,08 34

41 Η υψηλότερη τιμή βιομάζας φύλλων προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος παρατηρήθηκε στα άτομα M. officinalis που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους ανεξάρτητα λίπανσης (οι δύο συνθήκες παρουσίασαν τις ίδιες τιμές) (Γράφημα 3.11 και Πίνακας 3.). Η υγρασία εδάφους φαίνεται να επιδρά στατιστικά σημαντικά στη βιομάζα φύλλων προς ολική βιομάζα (Sig. = 0,00) και συγκεκριμένα αρνητικά (ANOVA). Η λίπανση εδάφους δεν επηρεάζει σημαντικά (ANOVA). Γράφημα Βιομάζα βλαστών προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F = 9,133, Sig. = 0,00). (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure Ratio of stem DW to total DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (F = 9.133, Sig. = 0.00) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). 35

42 Πίνακας 3.7. Βιομάζα βλαστών προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.7. Ratio of stem DW to total DW of Melissa officinalis plants (aerial parts) growing under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Βιομάζα βλαστών / ολική βιομάζα (ΜΟ) 0,34 0,33 0,33 0,41 0,41 0,41 0,38 0,37 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,0 0,09 0,07 0,0 0,0 0,0 0,07 0,08 Η υψηλότερη τιμή βιομάζας βλαστών προς ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος παρατηρήθηκε στα άτομα M. officinalis που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους παρουσία λιπάσματος (Γράφημα 3.11 και Πίνακας 3.7). Η υγρασία εδάφους επιδρά στατιστικά σημαντικά στη βιομάζα βλαστών προς ολική βιομάζα (Sig. = 0,00) και η επίδραση αυτή είναι θετική (ANOVA). Η λίπανση εδάφους δεν επηρεάζει σημαντικά (ANOVA). 3

43 Αιθέριο έλαιο Εκτιμήθηκε η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων φυτών Melissa officinalis σε κάθε συνθήκη καλλιέργειας με υδροαπόσταξη. (Γραφήματα 3.14, 3.15 και Πίνακας 3.8). Γράφημα Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure Leaf essential oil content of Melissa officinalis plants grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 37

44 Γράφημα Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης, (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση, ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure Leaf essential oil content of Melissa officinalis plants grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.8. Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.8. Leaf essential oil content of Melissa officinalis plants grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Περιεκτικότητα φύλλων σε αιθέριο έλαιο (ml 100 g-1 DW) (ΜΟ) 0,14 0,1 0,15 0,14 0,18 0,1 0,14 0,17 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,05 0,05 0,05 0,0 0,04 0,05 0,05 0,04 38

45 Η περιεκτικότητα των φύλλων σε αιθέριο έλαιο ήταν υψηλότερη σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους απουσία λιπάσματος (Γράφημα 3.14 και Πίνακας 3.8). Ούτε η υγρασία εδάφους ούτε η λίπανση επηρεάζουν σημαντικά την περιεκτικότητα των φύλλων σε αιθέριο έλαιο (ANOVA). Εκτιμήθηκε η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος των φυτών Melissa officinalis για κάθε διαφορετική συνθήκη καλλιέργειας (Γραφήματα 3.1, 3.17 και Πίνακας 3.9). Γράφημα 3.1. Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure 3.1. Essential oil content of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values ± sd, n = ). 39

46 Γράφημα Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης (F = 7,44, Sig. = 0,0), (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure Essential oil content of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer (F = 7.44, Sig. = 0.0) and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας 3.9. Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table 3.9. Essential oil content of Melissa officinalis plants (aerial parts) grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Περιεκτικότητα υπέργειου τμήματος σε αιθέριο έλαιο (ml 100 g-1 DW) (ΜΟ) 0,0 0,03 0,04 0,038 0,04 0,042 0,052 0,054 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,02 0,015 0,020 0,020 0,018 0,019 0,02 0,018 40

47 Η περιεκτικότητα του υπέργειου τμήματος σε αιθέριο έλαιο ήταν υψηλότερη σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους και απουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους απουσία λιπάσματος (Γράφημα 3.1 και Πίνακας 3.9). Η στατιστική ανάλυση ANOVA έδειξε ότι η υγρασία εδάφους επιδρά στατιστικά σημαντικά (Sig. = 0,0) και αρνητικά στην περιεκτικότητα του υπέργειου τμήματος σε αιθέριο έλαιο. Η λίπανση εδάφους δεν επηρεάζει σημαντικά. Το ποσό του αιθερίου ελαίου ανά φυτό (ml) φαίνεται στα Γραφήματα 3.18, 3.19 και στον Πίνακα Γράφημα Ποσότητα αιθερίου ελαίου (ml) ανά φυτό Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (ΜΟ ± τυπική απόκλιση, n = ). Figure Essential oil yield (ml) per plant of Melissa officinalis grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd, n = ). 41

48 Γράφημα Ποσότητα αιθερίου ελαίου (ml) ανά φυτό Melissa officinalis: (α) στη χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους ανεξαρτήτως λίπανσης, (β) με (Λ) ή χωρίς (0) λίπανση ανεξαρτήτως υγρασίας εδάφους. (Οριζόντιες γραμμές των θηκογραμμάτων: 25, 50 και 75% του δείγματος, κάθετες: μέγιστη και ελάχιστη τιμή, : ακραίες τιμές, διακεκομμένη γραμμή: ΜΟ, n = ) Figure Essential oil yield (ml) per plant of Melissa officinalis plants grown in: (a) low (υ) and high (Υ) soil moisture, irrespective of fertilizer and (b) with (Λ) or without (0) fertilizer irrespective of soil moisture. (Horizontal lines of boxplot: 25th, 50th and 75th percentiles, whiskers: minimum and maximum values, : outlying values, dotted line: mean, n = ). Πίνακας Ποσότητα αιθερίου ελαίου ανά φυτό Melissa officinalis στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: χαμηλή (υ) και υψηλή (Υ) υγρασία εδάφους, λίπανση εδάφους (Λ) (Μέσος όρος: ΜΟ ± τυπική απόκλιση). Table Essential oil yield (ml) per plant of Melissa officinalis grown under different field cultivation conditions: Low (υ) and high (Υ) soil moisture, fertilizer (Λ) (Mean values, ± sd). Υγρασία εδάφους Χαμηλή (υ) Υψηλή (Υ) Χαμηλή + Υψηλή (υ + Υ) Λίπανση (χωρίς: 0, με: Λ) Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) 0+Λ Απουσία (0) Παρουσία (Λ) Ποσότητα αιθερίου ελαίου ανά φυτό (ml) (ΜΟ) 0,13 0,21 0,17 0,20 0,29 0,24 0,17 0,25 Τυπική απόκλιση Αριθμός δειγμάτων (n) 0,04 0,14 0,11 0,09 0,1 0,13 0,07 0,15 Η ποσότητα αιθερίου ελαίου ανά φυτό ήταν υψηλότερη σε φυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος, ενώ αντίστοιχα η χαμηλότερη 42

49 σε αυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους απουσία λιπάσματος (Γράφημα 3.18 και Πίνακας 3.10). Ούτε η υγρασία εδάφους ούτε η λίπανση επηρεάζουν σημαντικά την ποσότητα αιθερίου ελαίου ανά φυτό (ANOVA). 43

50 3.3. Επίδραση της εποχής του έτους Μορφομετρικά χαρακτηριστικά Ο μέσος όρος του μήκους των βλαστών και του αριθμού των γονάτων ανά βλαστό φαίνονται παρακάτω (Γράφημα 3.20) Γράφημα Μέσος όρος του μήκους βλαστών (cm) και του αριθμού γονάτων ανά βλαστό φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο 2009 (n = 20). Figure Mean stem length (cm) and mean number of nodes per stem of Melissa officinalis plants from March to August 2009 (n = 20). Το μήκος των βλαστών αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου, με μια σημαντική αύξηση κατά τη διάρκεια του μήνα Απριλίου. Αντίστοιχα, ο αριθμός των γονάτων αυξάνεται επίσης πραγματοποιώντας μια σημαντική αύξηση στις αρχές του μήνα Ιουνίου. 44

51 Ο μέσος όρος του μήκους των μεσογονάτιων διαστημάτων απεικονίζεται στο Γράφημα Γράφημα Μέσος όρος των μεσογονάτιων διαστημάτων ανά βλαστό φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο 2009 (n = 20). Figure Mean internodal distance of Melissa officinalis stems from March to August 2009 (n = 20). Ο μέσος όρος του μήκους των μεσογονάτιων διαστημάτων μειώνεται με την πάροδο του χρόνου. Εξαίρεση αποτελεί μια απότομη μεταβολή του μέσου όρου στα μέσα του μήνα Απριλίου, οπότε και παρατηρείται η μέγιστη τιμή, ενώ ακολούθως εξακολουθούν οι τιμές να μειώνονται ώσπου σταθεροποιούνται κατά την θερινή περίοδο. 45

52 Ο λόγος νωπού προς ξηρό βάρος απεικονίζεται στο Γράφημα Γράφημα Νωπό (FW) προς ξηρό βάρος (DW) του υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο Figure Fresh to dry weight ratio (FW/DW) of Melissa officinalis plants (aerial parts) from March to August Η υψηλότερη τιμή νωπού προς ξηρό βάρος παρατηρήθηκε στην πρώτη δειγματοληψία και ακολουθεί φθίνουσα πορεία, πραγματοποιώντας μια απότομη μεταβολή τον μήνα Ιούλιο. 4

53 Οι λόγοι βιομάζας κάθε τμήματος προς την ολική βιομάζα απεικονίζονται στο Γράφημα Γράφημα Αναλογία βιομάζας των φύλλων ( ), βλαστών ( ) και ανθέων ( ) προς την ολική βιομάζα υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο Figure Biomass of the leaves ( ), stems ( ) and flowers ( ) of Melissa officinalis plants expressed as a percentage of the total plant biomass (aerial parts) for the months March to August Η αναλογία της βιομάζας των φύλλων προς την ολική βιομάζα, είναι μεγαλύτερη κατά τους πρώτους δύο μήνες, ακολουθώντας φθίνουσα πορεία με την πάροδο του χρόνου. Το μήνα Αύγουστο παρατηρείται μια άνοδος της συμμετοχής (%) των φύλλων. Αντίθετα, η συμμετοχή (%) των βλαστών εμφανίζεται αύξουσα. Η ανθοφορία ξεκινάει στις αρχές του μήνα Ιουνίου, οπότε και εμφανίζονται για πρώτη φορά τα άνθη, η συμμετοχή (%) των οποίων στην ολική βιομάζα ακολουθεί αυξομείωση με την πάροδο του χρόνου. Η μέγιστη τιμή αναλογίας βιομάζας ανθέων προς την ολική βιομάζα παρατηρείται στα τέλη του μήνα Ιουλίου, ενώ στην ίδια δειγματοληψία εντοπίζεται και η χαμηλότερη τιμή της αναλογίας των φύλλων. 47

54 Η βιομάζα των φύλλων ανά βλαστό καθώς και η συνολική βιομάζα υπέργειου τμήματος (φύλλα, βλαστοί και άνθη) ανά βλαστό απεικονίζονται στο Γράφημα Γράφημα Βιομάζα φύλλων (DW) ανά βλαστό ( ) και βιομάζα υπέργειου τμήματος ( ) ανά βλαστό φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο Figure Leaf biomass (DW) per stem ( ) and total stem (leaves, stems and flowers) biomass (DW) ( ) of Melissa officinalis plants from March to August Η βιομάζα των φύλλων ανά βλαστό παρουσιάζει μια μεταβολή στις αρχές του μήνα Μαΐου και μετά ακολουθεί μια φθίνουσα πορεία, ενώ το μήνα Αύγουστο παρατηρείται πάλι μια μικρή άνοδος της βιομάζας των φύλλων ανά βλαστό. Παρόμοια πορεία ακολουθεί και η βιομάζα του υπέργειου τμήματος ανά βλαστό. 48

55 Αιθέριο έλαιο Η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων, βλαστών, ανθέων καθώς και όλου του υπέργειου τμήματος απεικονίζονται στο Γράφημα Γράφημα Περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (ml 100 g-1 DW) του υπέργειου τμήματος ( ) και των φύλλων ( ), βλαστών ( ) και ανθέων ( ) φυτών Melissa officinalis κατά τους μήνες Μάρτιο έως και Αύγουστο Figure Essential oil content (ml 100 g-1 DW) of the leaves ( ), stems ( ), flowers ( ) and all the aerial parts ( ) of Melissa officinalis plants from March to August Όπως φαίνεται στο Γράφημα 3.25, σταθερά υψηλότερη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο εμφανίζουν τα φύλλα σε όλους τους μήνες, ενώ αντίστοιχα οι βλαστοί την χαμηλότερη. Η υψηλότερη τιμή στο ολικό υπέργειο τμήμα εμφανίζεται στα τέλη Μαΐου. Επίσης, στα τέλη του μήνα Ιουλίου, παρατηρείται μια απότομη πτώση της περιεκτικότητας στα φύλλα, ενώ στην αμέσως επόμενη δειγματοληψία (αρχές Αυγούστου) παρατηρείται πάλι άνοδος και σε τιμή υψηλότερη από αυτές των προηγούμενων μηνών. 49

56 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. Επίδραση συνθηκών καλλιέργειας Το νωπό αλλά και το ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος φυτών Melissa officinalis επηρεάστηκαν σημαντικά τόσο από την υγρασία εδάφους, όσο και από την παρουσία λίπανσης. Οι εξεταζόμενοι παράγοντες άσκησαν θετική επίδραση και στις δύο περιπτώσεις. Παρόμοια θετική επίδραση της υγρασίας εδάφους στη βιομάζα φυτών αναφέρεται και σε άλλες εργασίες, όπου μείωση του ποσοστού υγρασίας σε φυτά Melissa officinalis σε πειραματική καλλιέργεια επέφερε μείωση της βιομάζας (Ozturk et al. 2004, Farahani et al. 2009). Σε παρόμοιες εργασίες σε άλλα είδη της οικογένειας Labiatae η υγρασία υποστρώματος επηρέασε ανάλογα τη βιομάζα του φυτού: στο Thymus zygis subsp. gracilis (Sotomayor et al. 2004) και αντίστοιχα στο Origanum vulgare (Azizi et al. 2009, Said-Al Ahl et al. 2009). Αναφορικά με την επίδραση της λίπανσης, η λίπανση με αζωτούχα λιπάσματα επηρεάζει θετικά τη βιομάζα σε φυτά Origanum vulgare σε πειραματική καλλιέργεια (Azizi et al. 2009, Said-Al Ahl et al. 2009). Η αναλογία νωπό προς ξηρό βάρος δεν επηρεάστηκε σημαντικά από κανέναν από τους δύο παράγοντες. Ο λόγος βιομάζας φύλλων προς βιομάζα βλαστών, φαίνεται να επηρεάζεται αρνητικά από την υγρασία, εμφανίζοντας χαμηλότερες τιμές σε υψηλά επίπεδα υγρασίας εδάφους, ενώ η λίπανση δεν έχει κάποια σημαντική επίδραση. Ίδια επίδραση δείχνει να ασκεί η υγρασία εδάφους και στην αναλογία της βιομάζας φύλλων προς την βιομάζα του υπέργειου τμήματος, όπου επίσης η υγρασία επιδρά αρνητικά. Η βιομάζα φύλλων ανά φυτό, όμως, δέχεται θετική επίδραση, αν και όχι σημαντική στατιστικά, από την υγρασία εδάφους. Πρακτικά, τα φυτά που αναπτύχθηκαν σε υψηλή υγρασία εδάφους, παράγουν αθροιστικά μεγαλύτερη βιομάζα φύλλων από ότι αυτά που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή υγρασία εδάφους. Αντίστοιχα, και η αναλογία της βιομάζας των βλαστών προς τη βιομάζα του υπέργειου τμήματος επηρεάζεται θετικά από την υγρασία. Η θετική επίδραση της υγρασίας στη βιομάζα των φύλλων, αλλά και των βλαστών, στο M. officinalis έχει αναφερθεί και σε άλλες εργασίες, όπου η μείωση της υγρασίας υποστρώματος στην πειραματική καλλιέργεια, και μάλιστα σε πειραματικές διατάξεις με περισσότερες από δύο επίπεδα υγρασίας όπως στην παρούσα εργασία, επηρέασε αρνητικά τις αντίστοιχες βιομάζες (Ozturk et al. 2004, Farahani et al. 2009). Η περιεκτικότητα των φύλλων σε αιθέριο έλαιο επηρεάζεται θετικά τόσο από την υγρασία εδάφους όσο και από τη χρήση του λιπάσματος, ωστόσο οι διαφορές αυτές δεν είναι στατιστικά σημαντικές σύμφωνα με την ανάλυση ANOVA. Παρατηρείται, λοιπόν, μια αντιστοιχία σε σχέση με την βιομάζα των φύλλων ανά φυτό, καθώς η υγρασία εδάφους επηρεάζει τόσο την βιομάζα όσο και την περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο, γεγονός που σημαίνει ότι η αυξημένη υγρασία ευνοεί την αύξηση της ποσότητας αιθερίου ελαίου. Αντίθετα από τα φύλλα, η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο εκφρασμένη για ολόκληρο το φυτό, επηρεάζεται αρνητικά από την υγρασία εδάφους, καθώς οι υψηλότερες περιεκτικότητες παρατηρούνται σε χαμηλή υγρασία εδάφους. Οι Ozturk et al. (2004) αναφέρουν ότι η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο ολόκληρου του φυτού Melissa officinalis αρχικά μειώνεται με την μείωση της υγρασίας αλλά μετά αυξάνεται και τελικά υπερβαίνει την αρχική τιμή στην μισή ποσότητα ύδατος. Αντίστοιχα, και σε άλλη εργασία, η μείωση της υγρασίας αυξάνει την περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (Farahani et al. 2009). Επίσης σε πειραματική 50

57 καλλιέργεια Thymus zygis subsp. gracilis φαίνεται να επιδρά αρνητικά η υγρασία στην περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (Sotomayor et al. 2004), ενώ ίδια επίδραση ασκείται από την υγρασία και σε φυτά Origanum vulgare (Azizi et al. 2009) και Satureja hortensis (Baher et al. 2002). Για τη λίπανση εδάφους, σε αναφορές για χρησιμοποίηση οργανικού λιπάσματος πλούσιου σε άζωτο (όχι όμως του Biosol) σε καλλιέργεια αρωματικών φυτών παρατηρείται επίσης μια άνοδος της περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο με τη χρήση του λιπάσματος: σε καλλιέργεια Thymus vulgaris L. με χρήση τεσσάρων επιπέδων λίπανσης με άζωτο παρατηρείται τον πρώτο χρόνο καλλιέργειας αύξηση της περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο με παράλληλη αύξηση της συγκέντρωσης του λιπάσματος (Baranauskiene et al. 2003), ενώ σε καλλιέργεια Origanum vulgare subsp. hirtum (Link) Ietswaart επίσης η προσθήκη λιπάσματος αυξάνει την περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (Sotiropoulou & Karamanos 2010). Παρόμοια επίδραση ασκεί η αύξηση της συγκέντρωσης του λιπάσματος σε καλλιέργεια Satureja hortensis (Baher et al. 2002). Παρομοίως με τα φύλλα, η ποσότητα αιθερίου ελαίου ανά φυτό, δηλαδή ο συνολικός όγκος (ml) ελαίου στο υπέργειο τμήμα του φυτού, παρουσιάζει την ίδια διακύμανση με την περιεκτικότητα. Και εδώ οι επιδράσεις των δύο παραγόντων δεν είναι σύμφωνα με την ανάλυση ANOVA στατιστικά σημαντικές. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας για την περιεκτικότητα του υπέργειου τμήματος των φυτών συμφωνούν με την άποψη ότι τα φυτά σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης παράγουν περισσότερο αιθέριο έλαιο (Ozturk et al. 2004, Azizi et al. 2009, Farahani et al. 2009). Στη συγκεκριμένη εργασία, όμως, μετρήθηκε ξεχωριστά και η περιεκτικότητα στα φύλλα, γιατί λήφθηκε υπόψη ότι τα φύλλα του M. officinalis είναι το τμήμα του φυτού που χρησιμοποιείται εμπορικά. Η υγρασία εδάφους επηρέασε τα περισσότερα χαρακτηριστικά που μετρήθηκαν, αντίθεση με τη λίπανση που επηρέασε σημαντικά μόνο την ολική βιομάζα. Από προαναφερθέντα, λοιπόν, προτείνεται στον καλλιεργητή που θα θελήσει καλλιεργήσει μελισσόχορτο, να επενδύσει σε αυξημένη υγρασία εδάφους συνδυασμό με λίπανση. σε τα να σε 4.2. Επίδραση της εποχής του έτους Το μήκος των βλαστών ακολουθεί μια αύξουσα πορεία με την πάροδο του χρόνου, με ελάχιστη τιμή στις 19/03/2009 και μέγιστη (~0 cm) στις 24/08/2009 (Γράφημα 3.20). Παρατηρείται ότι οι βλαστοί αυξάνουν συνεχώς σε μήκος κατά την διάρκεια ζωής των φυτών. Σε άλλες εργασίες (οι οποίες δεν μελετούν εποχική διακύμανση), έχουν καταγραφεί εύρη τιμών μήκους βλαστών: 4,47 cm έως 57,43 cm σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης και 39,87 cm έως 58,73 cm σε καταπόνηση αλατότητας (Ozturk et al. 2004) και 47,58 cm και 20,73 cm αντίστοιχα σε καλλιέργειες που παρουσιάζουν μεγάλη υψομετρική διαφορά (Sari & Ceylan 2002). Ο μέσος αριθμός γονάτων ανά βλαστό επίσης παρουσιάζει παρόμοια διακύμανση με χαμηλότερη τιμή στις 19/03/2009 και υψηλότερη στις 24/08/2009 (Γράφημα 3.20). Όσο αυξάνεται σε μήκος ο βλαστός, αυξάνονται και τα γόνατα, από όπου και εκφύονται οι κλάδοι, τα φύλλα και τα άνθη. 51

58 Εποχική διακύμανση, αλλά ακριβώς αντίθετη με τα προηγούμενα παρουσιάζουν και τα μεσογονάτια διαστήματα, με υψηλότερη τιμή στις 29/04/2009 και χαμηλότερη στις 1/07/2009 (Γράφημα 3.21). Ωστόσο οι τιμές μετά τις 1/07/2009, δεν παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές μεταξύ τους. Τα μεσογονάτια διαστήματα, με την αύξηση του μήκους του βλαστού, μειώνονται, καθώς εκφύονται νέοι κλάδοι και νέα φύλλα από νεοσχηματιζόμενα γόνατα. Η απότομη μεταβολή του μήκους που παρατηρείται στα τέλη του μήνα Απριλίου, οφείλεται στην ταυτόχρονη απότομη μεταβολή του ρυθμού αύξησης του μήκους των βλαστών, ενώ ο αριθμός γονάτων δεν ακολουθεί την ίδια μεταβολή. Κατά συνέπεια, το μήκος των φυτών αυξάνεται απότομα, χωρίς να δημιουργηθούν πολλά νέα γόνατα και έτσι μεγαλώνουν τα μεσογονάτια διαστήματα. Η μεγαλύτερη τιμή του λόγου νωπό προς ξηρό βάρος παρατηρείται στην πρώτη δειγματοληψία. Αυτό σημαίνει πρακτικά, ότι την περίοδο αυτή μετά την αποξήρανση απομένει πολύ μικρό ποσοστό ξηρού βάρους σε σχέση με τη βιομάζα που συλλέχθηκε. Πραγματικά, το Μάρτιο τα φυτά βρισκόντουσαν στην αρχή της ανάπτυξής τους μετά το πέρας της χειμερινής περιόδου, και κατά συνέπεια είχαν μικρούς και μη αποξυλωμένους βλαστούς, οι οποίοι στην ουσία δε συνεισφέρουν πολύ στην ξηρή βιομάζα. Όσο προχωράει η ανάπτυξη των φυτών με την πάροδο του χρόνου, ο λόγος αυτός μειώνεται σταδιακά. Καθώς τα φυτά αναπτύσσονται, οι βλαστοί αρχίζουν να αποξυλώνονται (κατά συνέπεια χάνουν υγρασία), συνεισφέροντας όλο και περισσότερο στο λόγο (στο οποίο συμμετείχαν κατά κύριο λόγο τα φύλλα. Οι χαμηλότερες τιμές παρατηρούνται το μήνα Αύγουστο, οπότε και τα φυτά είναι πλήρως ανεπτυγμένα, οι βλαστοί έχουν υποστεί ισχυρή αποξύλωση αλλά και πολλά φύλλα έχουν μαραθεί και πέσει από το φυτό. Από το μήνα Ιούνιο και έπειτα, συμμετοχή έχουν και τα άνθη. Πρακτικά, οι διαφορές αυτές σημαίνουν ότι με την πάροδο του χρόνου απαιτείται συγκομιδή όλο και λιγότερου νωπού βάρους για να επιτευχθεί το αντίστοιχο ξηρό. Εποχική διακύμανση εμφανίζεται επίσης και στην εκατοστιαία (%) συμμετοχή της βιομάζας των φύλλων προς την ολική βιομάζα. Οι μεγαλύτερες τιμές παρατηρούνται κατά τις πρώτες δειγματοληψίες και με την πάροδο του χρόνου ο λόγος φθίνει. Μια μικρή άνοδος παρατηρείται στην προτελευταία δειγματοληψία (10/08/2009). Η φθίνουσα αυτή πορεία της συμμετοχής των φύλλων στην ολική βιομάζα σημαίνει και μείωση της βιομάζας των φύλλων. Σε αντίθεση με τα φύλλα, η συμμετοχή (%) των βλαστών στην ολική βιομάζα αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου, σημειώνοντας τις μέγιστες τιμές της μετά τον μήνα Ιούλιο. Ήδη αναφέρθηκε ότι οι βλαστοί αποξυλώνονται με την πάροδο του χρόνου, και ταυτόχρονα αναπτύσσονται και ως προς το μήκος και ως προς το πάχος. Τα άνθη, εμφανίζονται για πρώτη φορά στις αρχές του Ιουνίου, οπότε και παρατηρείται η χαμηλότερη συμμετοχή τους στην ολική βιομάζα. Η συμμετοχή αυτή ακολουθεί μια αυξομείωση κατά τη διάρκεια των επόμενων δειγματοληψιών. Συνοψίζοντας στην συμμετοχή των επιμέρους τμημάτων του φυτού στην ολική βιομάζα, η καθεμιά από αυτές ακολουθεί αντίστοιχη εποχική διακύμανση. Στο τέλος του Ιουλίου, παρατηρείται εξαιτίας υψηλών θερμοκρασιών ένας μαρασμός των φυτών. Με την επάνοδο της θερμοκρασίας στα κανονικά επίπεδα, την οποία ακολούθησε και βροχόπτωση, παρατηρήθηκε έκπτυξη νέων κλάδων στα φυτά καθώς και απότομη ανάπτυξη νέων φύλλων. Σε αυτό το γεγονός οφείλεται και η άνοδος της 52

59 συμμετοχής των φύλλων στην ολική βιομάζα κατά την επόμενη δειγματοληψία καθώς και η πτώση της συμμετοχής των ανθέων και των βλαστών. Όσον αφορά στην περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο κάθε τμήματος, φαίνεται ότι τα φύλλα έχουν την μεγαλύτερη περιεκτικότητα. Την χαμηλότερη και συνεχώς φθίνουσα περιεκτικότητα έχουν οι βλαστοί. Η ολική περιεκτικότητα του φυτού, δηλαδή πρακτικά η ποσότητα του ελαίου εάν το φυτό αποσταζόταν χωρίς να διαχωριστεί, εμφανίζει ανάλογη διακύμανση με αυτή των φύλλων, σημειώνοντας την μέγιστη τιμή στις 29/05/2009. Τα φύλλα, όμως, σημειώνουν την μεγαλύτερη τιμή στις 10/08/2009 και την χαμηλότερη στις 27/07/2009. Ο λόγος αυτής της απότομης αλλαγής είναι ακριβώς ο ίδιος που επηρέασε και τη συμμετοχή των φύλλων στην ολική βιομάζα και αναφέρθηκε προηγουμένως: μεταβολές του καιρού, οι οποίες επηρέασαν την καλλιέργεια. Σε αντίστοιχη εργασία, οι Sari & Ceylan (2002) αναφέρουν πολύ μεγαλύτερες αποδόσεις σε δύο διαφορετικές καλλιέργειες οι οποίες όμως παρουσιάζουν μεγάλη υψομετρική διαφορά: 0,07% και 0,03%. Αναφορικά με την εποχική διακύμανση της περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο άλλων ειδών, φυτά Origanum marjorana σε καλλιέργεια εμφάνισαν την μέγιστη περιεκτικότητα (υπέργειο τμήμα) στη φάση πλήρους ανθοφορίας (πέντε μήνες μετά την φύτευσή τους) (Sellami et al. 2009), και φυτά Origanum syriacum εμφάνισαν την μέγιστη περιεκτικότητα το μήνα Ιούλιο (Toncer et al. 2010). 53

60 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η καλύτερη συνθήκη καλλιέργειας φυτών Melissa officinalis subsp. officinalis που απέδωσε την υψηλότερη βιομάζα και την υψηλότερη ποσότητα σε αιθέριο έλαιο (ml) ανά φυτό, ήταν η υψηλή υγρασία εδάφους και παρουσία λιπάσματος (ΥΛ). Η υγρασία και η λίπανση εδάφους επηρέασαν θετικά και σημαντικά τη βιομάζα (νωπό και ξηρό βάρος) των φυτών. Παρόλο που η περιεκτικότητα των φυτών σε αιθέριο έλαιο (ml 100 g-1 DW) επηρεάστηκε σημαντικά και αρνητικά από την υγρασία εδάφους, η συνολική απόδοση σε αιθέριο έλαιο ανά φυτό ήταν μεγαλύτερη. Επιπλέον, η περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο των φύλλων ήταν μεγαλύτερη στην ίδια συνθήκη (ΥΛ). Κατά συνέπεια, η συνθήκη (ΥΛ) είναι η καλύτερη, εφόσον βέβαια υπολογίσει κανείς και το επιπλέον κόστος για την αυξημένη υγρασία (πότισμα) αλλά και την αγορά του λιπάσματος. Η μελέτη της εποχικής διακύμανσης της βιομάζας και του αιθερίου ελαίου έδειξε ότι η μεγαλύτερη βιομάζα φύλλων παρατηρήθηκε στα τέλη του Απριλίου, και η υψηλότερη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο στα φύλλα στις αρχές του Ιουνίου. Κατά συνέπεια, η καλύτερη περίοδος συγκομιδής των φυτών είναι προς τα τέλη του Μαΐου (πριν από την άνθιση), όπου παρατηρείται και η μέγιστη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο του υπέργειου τμήματος του φυτού.. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Μέρος της εργασίας αυτής χρηματοδοτήθηκε από το 3ο Ειδικό Αναπτυξιακό Πρόγραμμα του Τοπικού Πόρου Ανάπτυξης Νομού Φλώρινας (Τίτλος Έργου: Πειραματική Καλλιέργεια Αυτοφυών Αρωματικών / Φαρμακευτικών Ειδών με Σκοπό τη Βελτιστοποίηση της Παραγωγής Ξηράς Δρόγης και των Αιθερίων Ελαίων. Φορέας Υλοποίησης: Εθνικό Ίδρυμα Αγροτικής Έρευνας. Επιστημονικώς Υπεύθυνη: Κατερίνα-Μαργαρίτα Κουκ). Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Κέντρο Γεωργικής Έρευνας Βόρειας Ελλάδας (Κ.Γ.Ε.Β.Ε.) του Εθνικού Ιδρύματος Αγροτικής Έρευνας (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.). 54

61 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Allahverdiyev, A., Duran, N., Ozguven, M. & Koltas, S. (2004) Antiviral activity of the volatile oils of Melissa officinalis L. against Herpes simplex virus type-2. Phytomedicine 11: Azizi, A., Yan, F. & Honermeier, B. (2009) Herbage yield, essential oil content and composition of three oregano (Origanum vulgare L.) populations as affected by soil moisture regimes and nitrogen supply. Ind Crops Prod 29: Baher, Z. F., Mirza, M., Ghorbanli, M. & Rezaii, M. B. (2002) The influence of water stress on plant height, herbal and essential oil yield and composition in Satureja hortensis L. Flavour Fragrance J 17: Baranauskiene, R., Venskutonis, P. R., Viškelis, P. & Dambrauskiene, E. (2003) Influence of nitrogen fertilizers on the yield and composition of Thyme (Thymus vulgaris). J Agric Food Chem 51: Basta, A., Tzakou, O. & Couladis, M. (2005) Composition of the leaves essential oil of Melissa officinalis s. l. from Greece. Flavour Fragrance J 20: Cook, C. M., Lanaras, T. & Kokkini, S. (2007) Essential oils of two Calamintha glandulosa (Req.) Bentham chemotypes in a wild population from Zakynthos, Greece. J Essent Oil Res 19: Farahani, H. A., Valadabadi, S. A., Daneshian, J. & Khalvati, M. A. (2009) Evaluation changing of essential oil of balm (Melissa officinalis L.) under water deficit stress conditions. J Med Plant Res 3: Fernandes R. (194) Melissa L. In Flora Europaea. Tutin T. G., Heywood V. H., Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M. & Webb D. A. (eds). Cambridge, United Kingdom, Cambridge University Press. Kennedy, D. O., Little, W. & Scholey, A. B. (2004) Attenuation of laboratory-induced stress in humans after acute administration of Melissa officinalis (lemon balm). Psychosom Med : Kokkini, S. & Vokou, D. (1989) Carvacrol-rich plants in Greece. Flavour Fragrance J 4: 1-7. Mimica-Dukic, N., Bozin, B., Sokovic, M. & Simin, N. (2004) Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) essential oil. J Agric Food Chem 52: Ozturk, A., Unlukara, A., Ipek, A. & Gurbuz, B. (2004) Effects of salt stress and water deficit on plant growth and essential oil content of lemon balm (Melissa officinalis L.). Pak J Bot 3: Sadraei, H., Ghannadi, A. & Malekshahi, K. (2003) Relaxant effect of essential oil of Melissa officinalis and citral on rat ileum contractions. Fitoterapia 74:

62 Said-Al Ahl, H. A. H., Omer, E. A. & Naguib, N. Y. (2009) Effect of water stress and nitrogen fertilizer on herb and essential oil of oregano. Int Agrophys 23: Sari, A. O. & Ceylan, A. (2002) Yield characteristics and essential oil composition of lemon balm (Melissa officinalis L.) grown in the Aegean region of Turkey. Turk J Agric For 2: Schnitzler, P., Schuhmacher, A., Astani, A. & Reichling, J. (2008) Melissa officinalis oil affects infectivity of enveloped herpesviruses. Phytomedicine 15: Sellami, I. H., Maamouri, E., Chahed, T., Wannes, W. A., Kchouk, M. E. & Marzouk, B. (2009) Effect of growth stage on the content and composition of the essential oil and phenolic fraction of sweet marjoram (Origanum majorana L.). Ind Crop Prod 30: Sotiropoulou, D. E. & Karamanos, A. J. (2010) Field studies of nitrogen application on growth and yield of Greek oregano (Origanum vulgare subsp. hirtum (Link) Ietswaart). Ind Crops Prod 32: Sotomayor, J. A., Martínez, R. M., García, A. J. & Jordán, M. J. (2004) Thymus zygis subsp. gracilis: Watering level effect on phytomass production and essential oil quality. J Agric Food Chem 52: Toncer, O., Karaman, S. & Diraz, E. (2010) An annual variation in essential oil composition of Origanum syriacum from Southeast Anatolia of Turkey. J Med Plant Res 4: Topal, U., Sasaki, M., Goto, M. & Otles, S. (2008) Chemical compositions and antioxidant properties of essential oils from nine species of Turkish plants obtained by supercritical carbon dioxide extraction and steam distillation. Int J Food Sci Nutr 59: Vokou, D. (2007) Allelochemicals, allelopathy and essential oils: A field in search of definitions and structure. Allelopathy J 19:

63 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 8.1. Αναρτημένες ανακοινώσεις σε επιστημονικά συνέδρια Παπουλάκης Χ., Κολοβού Χ., Λαναράς Θ., Μαλούπα Ε., Κουκ Κ.Μ Melissa officinalis σε πειραματική καλλιέργεια στον αγρό: Εποχική διακύμανση περιεκτικότητας σε αιθέριο έλαιο, βιομάζας και μορφομετρικών χαρακτηριστικών. Πρόγραμμα και Περιλήψεις, 11o Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Βοτανικής Εταρείας, Αθήνα, 8-11 Οκτωβρίου, σελ Παπουλάκης Χ., Κολοβού Χ., Λαναράς Θ., Μαλούπα Ε., Γρηγοριάδου Κ., Κοκκίνη Σ., Κουκ Κ.Μ Melissa officinalis L. σε πειραματικό αγροτεμάχιο κάτω από διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας: βιομάζα και αιθέριο έλαιο. Βιβλίο Περιλήψεων, 5ο Πανελλήνιο Συνέδριο Οικολογίας, Πάτρα, 7-10 Οκτωβρίου σελ

64 58

65 59

66 0

67 1

68 2

69 3