ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΑΣΙΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΔΑΣΟΠΟΝΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΑΣΙΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΔΑΣΟΠΟΝΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ Μεταπτυχιακή Διατριβή του Μιαούλη Μιχαήλ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΒΑΛΚΑΝΙΚΗΣ Ή ΠΕΝΤΑΒΕΛΟΝΟΥ ΠΕΥΚΗΣ (Pinus peuce) ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ Επιβλέπων καθηγητής: Σκαλτσογιάννης Απόστολος ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες 1.Εισαγωγή 1.1 Δασική Γενετική 1.2 Γενετική βελτίωση 1.3 Πηγές Ποικιλότητας 1.4 Γενετική πληθυσµών 1.5 Θεώρηµα Hardy-Weindberg 1.6 Μέτρηση της γενετικής ποικιλότητας µε γενετικούς δείκτες Γενετικοί Δείκτες Μορφολογικοί δείκτες Βιοχηµικοί δείκτες Ι. Μονοτερπένια ΙΙ. Ισοένζυµα DNA δείκτες Ι. Πολυµορφισµοί Μήκους Περιοριστικού Τµήµατος (RFLPs) ΙΙ. Η Τεχνολογία της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυµεράσης (PCR) ΙΙΙ. Τυχαία Ενισχυµένο Πολυµορφικό DNA (RAPDs) ΙV. Πολυµορφισµοί Μήκους Ενισχυµένου Θραύσµατος (AFLPs) V. Επαναλήψεις Απλής Αλληλουχίας (SSRs) Το Είδος Pinus peuce Εξάπλωση του είδους Ταξινοµική και κοινά ονόµατα Μορφολογικά Χαρακτηριστικά Οικολογία και Βιολογικές απαιτήσεις του είδους Αναπαραγωγή 1

3 1.8.7 Οικονοµική Σηµασία Διατήρηση και προστασία Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας 2.Σκοπός της Eργασίας 3.Υλικά και Μέθοδοι 3.1 Συλλογή και προετοιµασία φυτικού υλικού 3.2 Αποµόνωση DNA 3.3 Ποσοτικοποίηση και ποιοτικός έλεγχος του DNA 3.4 Αντίδραση PCR i. Προετοιµασία του µίγµατος της αντίδρασης PCR ii. Βελτιστοποίηση της αντίδρασης iii. Ηλεκτροφόρηση iv. Ανάλυση γενετικών παραµέτρων και στατιστική ανάλυση 4.Αποτελέσµατα και Συζήτηση 5. Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία Παράρτηµα 1 Παράρτηµα 2 Παράρτηµα 3 2

4 Ευχαριστίες Με τη ολοκλήρωση αυτής της εµπειρίας στο Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτίωσης Δασοπονικών Ειδών θα ήθελα να ευχαριστήσω απο καρδιάς: Τον Καθηγητή Δασικής Γενετικής κ. Σκαλτσογιάννη Απόστολο και επιβλέποντα την µεταπτυχιακή µου διατριβή για την υπόδειξη του θέµατος τις παρεµβάσεις και τις υποδείξεις του. Την επίκουρο καθηγήτρια Μαρία Τσακτσίρα για την υπέροχη συνεργασία µας Τον Καθηγητή Δασικής Γενετικής κ. Φίλιππο Αραβανόπουλο για την βοήθεια και τη διαθεσιµότητα του. Όλα τα µέλη του Εργαστηρίου µας για τις όµορφες ώρες που περάσαµε µαζί και τις ατέλειωτες κουβέντες µας. Την οικογένεια που µου έχει συµπαρασταθεί σ αυτόν το δρόµο µε τεράστιες θυσίες. Τέλος θέλω να αφιερώσω το τέλος αυτού του δρόµου στον πατέρα µου. Πιστεύω πως αν ήταν µαζί µας θα ένιωθε περήφανος... 3

5 1. Εισαγωγή 4

6 1.1 Δασική Γενετική Δασική Γενετική καλείται ο κλάδος εκείνος της γενετικής επιστήµης που ασχολείται µε τα δασικά είδη. Είναι επιστήµη εξαιρετικής σηµασίας εξαιτίας, τόσο της µεγάλης κοινωνικοοικονοµικής σπουδαιότητας των δασών σε παγκόσµιο επίπεδο, όσο και της βιολογικής φύσης των δασικών δέντρων. Λόγω των τεράστιων µεγεθών τους αλλά και του µεγάλου χρόνου ζωής τους, η µελέτη γενετικών αρχών των δασικών δέντρων παρουσιάζει µεγάλες δυσκολίες. Ωστόσο η αξία της µελέτης της δασικής γενετικής πηγάζει ακριβώς από τη µοναδική βιολογική φύση των δασικών δέντρων, και γίνεται σηµαντική χάρη στη µεγάλη κοινωνική και οικονοµική σηµασία του δάσους.( White et al., 2007) 1.2 Γενετική βελτίωση Μία από της σηµαντικότερες εφαρµογές της δασικής γενετικής είναι η βελτίωση δασικών δέντρων. Με τον όρο αυτό εννοούµε την εφαρµογή των αρχών της Δασικής Γενετικής, στην ανάπτυξη βελτιωµένων ποικιλιών δασικών δέντρων ως προς την αυξηµένη παραγωγή σε ποσοτικό και ποιοτικό επίπεδο των προϊόντων συγκοµιδής. Οι διαδικασίες και οι δράσεις που απαρτίζουν αυτό που καλείται πρόγραµµα γενετικής βελτίωσης µπορούν να συνοψιστούν µε τη χρήση ενός µοντέλου που λέγεται βελτιωτικός κύκλος και αποδίδεται σχηµατικά παρακάτω: 5

7 Εικόνα 1:Σχηµατική απεικόνιση του βελτιωτικού κύκλου. από White et al. (2007) Στο παραπάνω σχήµα τονίζονται οι δύο βασικές έννοιες της γενετικής βελτίωσης αλλά και γενικά της δασικής γενετικής: Η έννοια της ποικιλότητας και η έννοια του πληθυσµού. Η ύπαρξη ποικιλότητας ή παραλλακτικότητας αποτελεί µάλιστα προϋπόθεση για οποιοδήποτε πρόγραµµα γενετικής βελτίωσης. 6

8 1.3 Πηγές Ποικιλότητας Η ποικιλότητα στα δέντρα αναφέρεται στα διαφορετικά εξωτερικά χαρακτηριστικά που έχει ένα δέντρο σε σχέση µε ένα άλλο. Η εξωτερική εµφάνιση ενός δέντρου καλείται φαινότυπος, ο οποίος περιλαµβάνει κάθε χαρακτηριστικό που µπορεί να µετρηθεί ή να παρατηρηθεί και είναι το αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης του περιβάλλοντος µε το γενετικό του δυναµικό. Για να τονίσουµε αυτήν την αλληλεπίδραση χρησιµοποιούµε την εξίσωση: V P = V G + V E + V GxE Όπου V P η συνολική φαινοτυπική παραλλακτικότητα, V G η παραλλακτικότητα που οφείλεται στο γενότυπο, V E η παραλλακτικότητα που οφείλεται στο περιβάλλον και V GxE η παραλλακτικότητα που οφείλεται στην αλληλεπίδραση γενοτύπου και περιβάλλοντος. Οι παράγοντες του περιβάλλοντος που επηρεάζουν το φαινότυπο είναι το κλίµα, το έδαφος, ο ανταγωνισµός, βιοτικοί παράγοντες, δασοκοµικοί χειρισµοί, υψόµετρο, κλίση του εδάφους. Ο γενότυπος των δέντρων είναι το σύνολο των γονιδίων που υπάρχουν στο γένωµα τους και ποικίλει µεταξύ γενών, το ειδών, προελεύσεων, συστάδων, δέντρων, ενώ ποικιλότητα παρατηρείται και µέσα στο δέντρο υπο τη έννοια της ετεροζυγωτίας. Η παραλλακτικότητα λοιπόν των δέντρων προέρχεται απο δύο πηγές: Η πρώτη είναι η επίδραση του περιβάλλοντος και η δεύτερη, οι διαφορετικοί γενότυποι δηλαδή η γενετική ποικιλότητα. Τα δέντρα στη φύση συγκροτούν πληθυσµούς. Ως πληθυσµός ορίζεται µια οµάδα οργανισµών του αυτού είδους που ζουν σε µια συγκεκριµένη 7

9 περιοχή τέτοιου µεγέθους, ώστε κάθε άτοµο να έχει τη δυνατότητα να διασταυρώνεται µε όλα τα άτοµα του είδους της ίδιας περιοχής. Γενικά, η γενετική ποικιλότητα εξετάζεται σε 3 επίπεδα: 1) Μεταξύ των δέντρων ενός είδους που ανήκουν στον ίδιο πληθυσµό ή συστάδα 2) Μεταξύ γεωγραφικών περιοχών ή θέσεων σε ένα είδος 3) Μεταξύ των ειδών Τα περισσότερα δασικά είδη χαρακτηρίζονται από σηµαντική γενετική ποικιλότητα, µέρος της οποίας µπορεί να εντοπισθεί σε ένα πληθυσµό και η οποία είναι ουσιώδης για τη µακροχρόνια επιβίωση καθώς παρέχει τη δυνατότητα προσαρµογής απέναντι στις περιβαλλοντικές αλλαγές. Ο ποσοτικός προσδιορισµός της γενετικής ποικιλότητας, που συµβάλει στην αξιολόγηση της εξελικτικής βιολογίας και του δυναµικού βελτίωσης ενός είδους, βασίζεται στη χρήση δυο βασικών κατηγοριών γνωρισµάτων: 1) Των ποσοτικών γνωρισµάτων που ελέγχονται από πολλές γονιδιακές θέσεις (πολυγονιδιακά γνωρίσµατα) 2) γνωρισµάτων που ελέγχονται από ένα γονίδιο (γενετικοί δείκτες) Παρόλο που τα ποσοτικά γνωρίσµατα έχουν µεγαλύτερο ενδιαφέρον λόγω της προσαρµοστικής και της πρακτικής τους σηµασίας, παρουσιάζουν δυσκολίες στη λεπτοµερή τους γενετική ανάλυση. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην αδυναµία που υπάρχει στον άµεσο ή ποσοτικό προσδιορισµό της έκφρασης των µεµονωµένων γονιδίων, καθώς και στην απαίτηση δοκιµών κοινού περιβάλλοντος που κρίνονται απαραίτητες για την αξιολόγηση της γενετικής επίδρασης στο φαινότυπο. Η χρήση γενετικών δεικτών επιτρέπει την ακριβέστερη εκτίµηση της γενετικής ποικιλότητας, σε σχέση µε τα ποσοτικά γνωρίσµατα, παρόλο που η συµµετοχή τους στον ορατό φαινότυπο είναι άγνωστη. Το γεγονός αυτό µπορεί να επισκιάσει την έννοια της ποικιλότητας σε αυτούς τους δείκτες. 8

10 Εξαιτίας του µεγάλου αριθµού των γονιδίων ενός µεµονωµένου ατόµου, τα εκτιµώµενα επίπεδα και τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας εξαρτώνται από τους ιδιαίτερους δείκτες ή τα ποσοτικά γνωρίσµατα που επιλέχθηκαν ως δείγµα του συνολικού γενοτύπου, µιας και αυτός µπορεί να χαρακτηριστεί µόνο εν µέρει από οποιαδήποτε οµάδα γενετικών δεικτών ή ποσοτικών γνωρισµάτων. Από τα παραπάνω συµπεραίνεται ότι για τον πλήρη χαρακτηρισµό των επιπέδων και των µοντέλων της γενετικής ποικιλότητας σε ένα είδος, καθώς και των εξελικτικών αιτιών τους, είναι απαραίτητη η µελέτη και των δυο κατηγοριών των γνωρισµάτων που αναφέρθηκαν. 1.4 Γενετική Πληθυσµών Για να µπορέσουµε να µελετήσουµε τη γενετική ποικιλότητα είναι απαραίτητο να µπορούµε να την µετρήσουµε ποσοτικά και να εκτιµήσουµε πως το µέγεθος αυτό, διανέµεται στα επίπεδα της. Η γενετική ποικιλότητα πρoέρχεται απο την ύπαρξη διάφορων αλληλοµόρφων σε διάφορους γονιδιακούς τόπους (Hartl,1987), άρα εξαρτάται απο τη γενετική δοµή των πληθυσµών. Ο κλάδος της Γενετικής που µελετά τη γενετική δοµή στους φυσικούς πληθυσµούς είναι η Γενετική Πληθυσµών και µε τον όρο γενετική δοµή εννοούµε τους τύπους και τις συχνότητες των αλληλόµορφων και των γενοτύπων µέσα στους πληθυσµούς (Nei, 1975). Ο κύριος στόχος της γενετικής των πληθυσµών είναι να περιγρα ψει τα πρότυπα της γενετικής ποικιλότητας και να κατανοήσει την προέλευση τους, τον λόγο της διατήρησης τους και το εξελικτικό νόηµα τους. (White et al., 2007) 1.5 Θεώρηµα Hardy-Weindberg Η πληθυσµιακή γενετική γεννήθηκε όταν οι Hardy και Weindberg ανεξάρτητα ο ένας απο τον άλλον διατύπωσαν το διάσηµο θεώρηµα - θεµέλιο της γενετικής θεωρίας της εξέλιξης - µε βάση το οποίο: υπο προυποθέσεις, µιά µοναδική γενιά τυχαίων συζεύξεων, εγκαθιδρύει διωνυµικές γενοτυπικές 9

11 συχνότητες, και στις επόµενες γενιές τόσο οι γενοτυπικές όσο και οι αλληλικές συχνότητες παραµένουν σταθερές. (Futuyma, 1986). Δηλαδή αν η αλληλικές συχνότητες για µια γονιδιακή θέση µε δύο αλληλόµορφα είναι p και q τότε οι γενοτυπικές συχνότητες θα είναι: p 2 και q 2 για του οµοζυγώτες και 2pq για τους ετεροζυγώτες. Αν ένας φυσικός πληθυσµός βρεθεί για έναν γονιδιακό τόπο να έχει γονοτυπικές συχνότητες που συγκλίνουν µε τις παραπάνω θεωρητικές συχνότητες τότε λέµε οτι ο γονιδιακός τόπος βρίσκεται σε ισορροπία Hardy - Weindberg (Futuyma, 1986) Οι υποθέσεις για να ισχύει το θεώρηµα Hardy-Weindberg είναι οι εξής: 1) Το µέγεθος ενός πληθυσµού είναι άπειρο ή πρακτικά άπειρο. Ένας πραγµατικός πληθυσµός όµως έχει πεπερασµένο µέγεθος και κατά συνέπεια υπόκειται στην επίδραση τυχαίων γεγονότων που µπορούν να επηρεάσουν τις συχνότητες των αλληλοµο ρφων απο γενιά σε γενιά. Το φαινόµενο ονοµάζεται γενετική παρέκκλιση ή γενετική εκτροπή (genetic drift). 2) Τα άτοµα συζεύγνυνται τυχαία µεταξύ τους και είναι δυνατές όλες οι συζεύξεις. Οι συζεύξεις ωστόσο σε ένα φυσικό πληθυσµό συχνά δεν είναι τυχαίες και αυτό έχει πολύ σηµαντικές συνέπειες. 3) Δεν υφίσταται φυσική επιλογή. Όλα τα αλληλόµορφα είναι εξίσου ικανά να παράγουν αντίγραφα τους δηλαδή ο ρυθµός εισάγωγης αλληλοµόρφων, µέσω των γαµετών, στη γονιδιακή δεξαµενή είναι ο ίδιος. Ως προέκταση αυτού, θεωρείται οτι ισχύει ο µενδελικός διαχωρισµός στους γαµέτες (1:1) 3) Δεν υπάρχει είσοδος νέων αλληλοµόρφων στον πληθυσµό. Υπάρχουν δύο δυνατές πηγές εισαγωγής νέων αλληλοµόρφων στον πληθυσµό: µετανάστευση γονιδίων από έναν άλλον πληθυσµό (γονιδιακή ροή) και µετάλλαξη (µετατροπή ενός αλληλοµόρφου σε ένα άλλο). Γενετική παρέκκλιση, επιλεκτικές συζεύξεις, φυσική επιλογή, γονιδιακή ροή και µεταλλάξεις είναι οι παράγοντες που αλλάζουν τη γενετική σύσταση των πληθυσµών και κατα συνέπεια οι αιτιές της γενετικής ποικιλότητας. 10

12 1.6 Μέτρηση της γενετικής ποικιλότητας µε γενετικούς δείκτες Τα βασικά στατιστικά δεδοµένα που χρησιµοποιούνται για να προσδιοριστεί ποσοτικά η γενετική ποικιλότητα µέσα στους πληθυσµούς είναι α) το ποσοστό των πολυµορφικών γοιδιακών θέσεων (P), β) Μέσος αριθµός αλληλοµόρφων ανα γονιδιακή θέση( Α/L ), γ) η µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία (He). Το ποσοστό πολυµορφικών γονιδιακών θέσεων ορίζεται ως το κλάσµα των πολυµορφικών γονιδιακών θέσεων προς το συνολικό αριθµό γονιδιακών θέσεων. Ως πολυµορφική λογίζεται µία θέση όταν η συχνότητα του συχνότερου αλληλόµορφου είναι µικρότερη απο 0.99 ή 0.95 (κριτήριο πολυµορφισµού 99% και 95% αντίστοιχα). Ο µέσος αριθµός αλληλοµόρφων υπολογίζεται απο τον τύπο Σm i / r όπου m i ο αριθµός των αλληλοµόρφων στη i-στη γονιδιακή θέση και r o συνολικός αριθµός αλληλοµόρφων. Η µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία είναι ο µέσος όρος της αναµενόµενης ετεροζυγωτίας για κάθε γονιδιακή θέση όπως αυτή υπολογίζεται απο το νόµο Hardy-Weindberg. Σε αντίθεση µε τις άλλες δύο µετρήσεις η µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία επηρεάζεται λίγο από το µέγεθος του δείγµατος και είναι το πιο ευρέως χρησιµοποιούµενο µέτρο της γενετικής ποικιλότητας µε βαση τους γενετικούς δείκτες Γενετικοί Δείκτες Η µελέτη της γενετικής σύστασης των πληθυσµών αλλά και γενικά η επιστήµη της γενετικής δεν θα ήταν δυνατή αν δεν είχαν αναπτυχθεί οι γενετικοί δείκτες. Ως γενετικό δείκτη ορίζουµε κάθε ορατό ή µε κάποιο τρόπο µετρήσιµο χαρακτήρα ο όποιος ελέγχεται από αλληλόλοµορφα, σε συγκεκριµένο γονιδιακό τόπο, που παρουσιάζουν µενδελική κληρονόµηση (White et al, 2007). Παρακάτω παρουσιάζονται οι διαφορετικές κατηγορίες γενετικών δεικτών: Μορφολογικοί δείκτες Οι πρώτοι γενετικοί δείκτες που χρησιµοποιήθηκαν. Πρόκειται για 11

13 µορφολογικά γνωρίσµατα, τα οποία ελέγχονται από αλληλόµορφα µιας µόνης γονιδιακής θέσης που προκαλούν τους διάφορους φαινοτύπους. Συνήθως ήταν σπάνιοι φαινότυποι που έδειχναν πως το γνώρισµα ελέγχεται από µια γονιδιακή θέση. Μεγάλο µειονέκτηµα είναι ο περιορισµένος αριθµός αυτών των δεικτών και η µειωµένη πολυµορφικότητά τους που έκανε επιτακτική την ανάγκη αναζήτησης νέων δεικτών Βιοχηµικοί δείκτες I. Μονοτερπένια Τα µονοτερπένια είναι µια οµάδα τερπενοειδών συστατικά των ρητινών και των αιθέριων ελαίων των φυτών. Πιθανόν παίζουν σηµαντικό ρόλο στη άµυνα κατά ασθενειών και εντόµων (Hanover, 1992) Οι διαφορετικές συγκεντρώσεις µονοτερπενίων στις ρητίνες και τα αιθέρια έλαια µπορούν να εκτιµηθούν µε αέρια χρωµατογραφία και είναι χρήσιµοι ως γενετικοί δείκτες. Έχουν χρησιµοποιηθεί κυρίως για ταξινοµικές και εξελικτικές µελέτες καθώς και σε κάποιο βαθµό για την εκτίµηση γεωγραφικής ποικιλότητας. Ωστόσο η χρήση τους παρουσιάζει δυσκολίες γιατί εµφανίζουν κάποιο βαθµό επικρατούς κληρονόµησης ενώ η έκφραση τους εξαρτάται πολλές φόρες από το περιβάλλον. (White et al., 2007) II. Ισοένζυµα Η ανακάλυψη του γεγονότος ότι αρκετά ένζυµα εµφάνιζαν ισοµορφές οι οποίες παρουσίαζαν διαφορές στην ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα, έδωσε ώθηση στη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας. Η µελέτη της γενετικής ποικιλότητας µε την ηλεκτροφόρηση των ενζύµων καθιερω θηκε µετά το 1960 (Harris, 1966; Lewontin and Hubby, 1966). Για πολύ καιρό υπήρξαν οι πιο σηµαντικοί δείκτες για τη µελέτη των δασικών ειδών. Τα βασικά πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι ότι είναι φθηνή, σε σχέση µε τις πιο σύγχρονες µεθόδους, είναι αρκετά γρήγορη, είναι εύκολη και δεν απαιτεί την ύπαρξη εξειδικευµένου εξοπλισµού. 12

14 Μειονέκτηµατα αυτής της κατηγορίας δεικτών είναι ότι ο αριθµός τους είναι περιορισµένος, πολλές φορές είναι µονοµορφικοί ή δεν µπορούµε να διακρίνουµε τις ισοµορφές. Για παράδειγµα υπάρχουν περιπτώσεις όπου αντικατάσταση αµινοξέων που όµως δεν επηρεάζουν το ηλεκτρικό φορτίο του πολυπεπτιδίου, δεν µπορούν να διακριθούν µε ηλεκτροφόρηση DNA δείκτες Η ανίχνευση γενετικής παραλλακτικότητας στο επίπεδο του DNA στάθηκε δυνατή µε την in vitro χρησιµοποίηση κυτταρικών ενζύµων που ενεργούν πάνω στη αλυσίδα του DNA µε διάφορους τρόπους. Η ανακάλυψη των περιοριστικών ενζύµων (ενδονουκλεάσες) τα οποία κόβουν την αλυσίδα του DNA σε συγκεκριµένα σηµεία που ορίζονται από την δυνατότητα του ενζύµου να αναγνωρίσει συγκεκριµένες ακολουθίες, συνήθως 4-6 βάσεων, καθώς και η ανακάλυψη της DNA πολυµεράσης του βακτηρίου Thermus aquaticus (Taq πολυµεράση), ικανής να λειτουργήσει σε πολύ υψηλές θερµοκρασίες, έδωσε στη µοριακή βιολογία τα εργαλεία εκείνα για την ανάπτυξη επαναστατικών τεχνικών. Ειδικά στην δεύτερη περίπτωση, η ανακάλυψη της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR) -που βασίζεται στην πολυµεράση Taq έδωσε την δυνατότητα να µπορεί να παραχθεί και εν συνεχεία να αναλυθεί µεγάλος αριθµός αντιγράφων από δυνητικά οποιαδήποτε περιοχή του γενώµατος. Έτσι µπορούµε να ξεχωρίσουµε τους µοριακούς δείκτες σε δύο κατηγορίες: Ι) Δείκτες που δεν βασίζονται στην PCR( RFLPs ) ΙΙ) Δείκτες που βασίζονται στην PCR(RAPDs, SSRs, SNPs). Υπάρχουν και δείκτες που ανήκουν και στις δυο παραπάνω κατηγορίες. (PCR- RFLP, AFLPs) 13

15 I. Πολυµορφισµοί Μήκους Περιοριστικού Τµήµατος (RFLPs) Η τεχνική βασίζεται στην κοπή του DNA µε περιοριστικά ενζυµα και κατά συνέπεια στη δηµιουργία πολλών επιµέρους τµηµάτων. Εν συνεχεία τα τµήµατα αυτά διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά µε βάση το µέγεθος τους και µεταφέρονται σε µεµβράνη κυτταρίνης κατά Southern (Southern, 1975). Τα τµήµατα που µας ενδιαφέρουν γίνονται ορατά µετά απο τον υβριδισµό τους µε ραδιενεργά σεσηµασµένο ιχνηλάτη (probe) και απεικόνιση σε κατάλληλο µηχάνηµα (Williams, 1989). Μειονεκτήµατα αυτής της µεθόδου αποτελούν η χρήση ραδιενέργειας και το υψηλό κόστος, ενώ ιδιαίτερα για τη ανάλυση πληθυσµών µειονέκτηµα αποτελεί και η σχετικά µεγάλη ποσότητα DNA που απαιτείται. Στα δασικά είδη έχουν χρησιµοποιηθεί δείκτες RFLPs σε φυλογενετικές µελέτες (Wagner et al.,1991, 1992; Tsumura et al., 1995), σε µελέτες ποικιλότητας (Ali et al., 1991; Strauss et al., 1993; Ponoy et al., 1994) και σε µελέτες κληρονόµησης οργανιδιακού DNA (White et al., 2007). Ανάλυση µε RFLP δείκτες γενωµικού DNA δασικών δέντρων έχει γίνει σε περιορισµένη έκταση ειδικά λόγω των δυσκολιών που παρουσιάζει το πολύ µεγάλο γένωµα των κωνοφόρων, ενώ ιχνηλάτες διαθέσιµοι υπάρχουν µόνο για λίγα δασικά είδη (κωνοφόρα, Populus spp., Eucalyptus spp) (White et al., 2007). II. Η Τεχνολογία της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυµεράσης (PCR) Οι µοριακοί δείκτες που ευρύτερα χρησιµοποιούνται σήµερα, βασίζονται στην τεχνολογία της PCR (Polymerase Chain Reaction), µέθοδος που ανακαλύφθηκε από τον Kerry Mullis µε σκοπό να πολλαπλασιάσει συγκεκριµένα τµήµατα DNA. H αρχή λειτουργίας της PCR στηρίζεται στο φαινόµενο της αντιγραφής του DNA µέσα στο ζωντανό κύτταρο. Κάθε µονή αλυσίδα DNA δηµιουργεί µια συµπληρωµατική της και µετά το πέρας ενός κύκλου δηµιουργούνται δύο πανοµοιότυπες διπλές αλυσίδες DNA. To 14

16 συνολικό DNA, δηλαδή του κυττάρου, πολλαπλασιάζεται επακριβώς. Η διαδικασία αυτή καταλύεται απο ένα ένζυµο, την DNA πολυµεράση το οποίο εκτός από τον πολυµερισµό ε χει και άλλες λειτουργίες όπως αυτή της επιδιόρθωσης σφαλµάτων. (Arnheim, 1990) Για την µέθοδος της PCR απαιτούνται εφτά βασικά συστατικά: 1) Θερµοανθεκτική DNA πολυµεράση : Πρόκειται για το ένζυµο που καταλύει την αντίδραση της σύνθεσης του DNA. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του είναι οτι διατηρεί την ενζυµατική του δραστηριότητα σε πολύ υψηλές θερµοκρασίες (95 ο C) και µετά απο διαδοχικούς κύκλους αυξοµείωσης της θερµοκρασίας. Σήµερα υπάρχει µια ευρεία επιλογή από θερµοανθεκτικά ένζυµα, µε πιό διαδεδοµένο στα ανά τον κόσµο εργαστήρια την πολυµεράση Τaq, η οποία παίρνει το όνοµά της απο το βακτήριο Thermus aquaticus από το οποίο αποµονώθηκε αρχικά. Αξίζει να σηµειωθεί οτι η πρώτη εφαρµογή της µεθόδου από τον Mullis (1986), χρησιµοποιούσε ως ένζυµο το Klenow fragment της Ε.coli το οποίο δεν είναι θερµοανθεκτικό και χρειαζόταν να προστεθεί εκ νέου στο µείγµα της αντίδρασης µετά απο κάθε κύκλο. 2) Ένα ζευγάρι ολιγονουκλεοτίδια που λειτουργούν ως εκκινητές για την σύνθεση του DNA. Η αλληλουχία τους βασίζεται στην περιοχή του DNA που θέλουµε να ενισχύσουµε. Για να σχεδιαστούν πρέπει να γνωρίζουµε την αλληλουχία του DNA στόχου. Ο σχεδιασµός τους είναι ο πιό κρίσιµος παράγοντας για την επιτυχία της PCR (Sambrook et al., 1989). 3) Τριφωσφορικά Δεσοξυκλεοσίδια (dntps): χρησιµοποιούνται συνήθως ίσες συγκεντρώσεις dgtp, datp, dctp, dttp. 4) Δισθενή κατιόντα: οι DNA πολυµεράσες λειτουργούν παρουσία δισθενών κατιόντων συνήθως Mg2+. 5) Ρυθµιστικό διάλυµα: χρησιµοποιείται Tris-HCl µε ph µεταξύ 8.3 και ) Μονοσθενή Ιόντα: ΚCl 7) DNA: σε ιδανικές συνθήκες αντίδρασης αρκεί µόνο ενα µόριο DNA (Li et al., 1990). Συνήθως χρησιµοποιούνται µερικές δεκάδες µόρια DNA στόχου. Η διαδικασία της αντίδρασης της PCR αποτελείται από τις εξής βασικές φάσεις: 1. Μετουσίωση (αποδιάταξη) του DNA µε τη χρήση υψηλής 15

17 θερµοκρασίας (95 C). Σε αυτή τη φάση διαχωρίζονται οι δύο συµπληρωµατικές αλυσίδες καθώς σπάζουν οι δέσµοι υδρογόνου µεταξύ των συµπληρωµατικών βάσεων. 2. Υβριδισµός των εκκινητών: οι εκκινητές υβριδίζουν µε την συµπληρωµατική περιοχή του DNA στόχου. Η θερµοκρασία αυτής της φάσης εξαρτάται απο την Τm του συγκεκριµένου εκκινητή. Η Τm είναι η θερµοκρασία κατά την οποία το µισό µήκος τµήµατος DNA βρίσκεται υβριδισµένο και εξαρτάται απο την αλληλουχία του. 3. Επιµήκυνση: χρησιµοποιώντας ως αρχικά τµήµατα τους εκκινητές η πολυµεράση συνθέτει τη συµπληρωµατική αλυσίδα του DNA στόχου. Η ιδανική θερµοκρασία για την Taq πολυµεράση είναι 72 C. Οι παραπάνω φάσεις αποτελούν έναν κύκλο PCR. Στο τέλος του ο κύκλος ξεκινάει απο την αρχή. Ο αριθµός των απαραίτητων κύκλων εξαρτάται απο την αρχική ποσότητα DNA και από την απόδοση της πολυµερισµός. Γενικά 30 κύκλοι είναι ικανοί να παράγουν 10 9 αντίγραφα DNA στόχου. Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται σχηµατικά η αντίδραση της PCR. Απεικονίζονται για ευκολία στην κατανόηση µόνο οι τρείς πρώτοι κύκλοι. Ο χρόνος διαρκείας κάθε κύκλου αποτελεί αντικείµενο της βελτιστοποίησης της αντίδρασης και εξαρτάται από πολλούς παράγοντες. 16

18 Εικόνα 2: Σχηµατική απεικόνιση της PCR. Από Alberts (2006) III. Πολυµορφισµοί Μήκους Ενισχυµένου Θραύσµατος (AFLPs) Μοριακοί δείκτες που προκύπτουν απο τον συνδυασµό της RFLPs τεχνικής µε την PCR. Βασίζεται στην ενίσχυση τµηµάτων DNA που έχουν προκύψει µε την κοπή γενωµικού DNA µε ένα ή περισσότερα περιοριστικά ένζυµα. Αφού το γενωµικό DNA κοπεί, µε τη χρήση προσαρµοστών (adaptors) δηµιουργούνται οι αλληλουχίες στα άκρα των τµηµάτων βάσει των οποίων σχεδιάζονται οι εκκινητές. Οι εκκινητές περιέχουν τις αλληλουχίες και των προσαρµοστών αλλά και της αλληλουχίας κοπής. Έτσι µε την PCR ενισχύονται επιλεκτικά τα τµήµατα στα οποία έχει έρθει εις πέρας η αντίδραση του µατίσµατος (ligation) των προσαρµοστών (Vos et al., 1995). Ο διαχωρισµός των ενισχυµένων τµηµάτων γίνεται σε πηκτή ακρυλαµιδίου και οι 17

19 ζώνες γίνονται ορατές µετά απο χρώση ασηµιού ή αυτοραδιογραφία. Από τη διαδικασία προκύπτουν δείκτες υψηλής επαναληψιµότητας για οποιοδήποτε οργανισµό χωρίς να χρειάζονται πληροφορίες για την αλληλουχία του γενώµατος µε πολύ υψηλό βαθµό πολυµορφισµού (Ulrich et al., 1999). Μειονέκτηµα αποτελεί το γεγονός ότι οι δείκτες είναι κυρίαρχοι (Ulrich et al., 1999). Σε έρευνα στην Pinus radiata, οι δείκτες AFLP έδειξαν τριπλάσιο βαθµό πολυµορφισµού σε σύγκριση µε τη µέθοδο RAPDs (Cato et al., 1999). IV. Επαναλήψεις Απλής Αλληλουχίας (SSRs). Οι SSR (µικροδορυφόροι) δείκτες βασίζονται στην ενίσχυση περιοχών του γενώµατος που αποτελούνται απο επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες 2-5 βάσεων. Οι δείκτες αυτοί αναπτύχθηκαν για πρώτη φορά για έρευνες του ανθρώπινου γονιδιώµατος (Weber & May, 1989) αλλά αργότερα βρέθηκε οτι είναι άφθονοι και στα φυτά (Morgante, 1993). Είναι δείκτες υψηλά πολυµορφικοί γεγονός που οφείλεται στο οτι στις συγεκριµένες περιοχές του γενώµατος είναι γενικά εύκολο να συσσωρευτούν µεταλλάξεις και έχουν µεγάλη επαναληψιµότητα Πλεονέκτηµα αποτελεί οτι παρουσιάζουν συγκυριαρχία στην κληρονόµηση. Τα χαρακτηριστικά αυτά τους κάνουν ίσως την καταλληλότερη επιλογή για µελέτες γενετικής ποικιλότητας. Μειονεκτήµατα αποτελούν το υψηλό σχετικά κόστος και το γεγονός οτι πρέπει να έχουµε πληροφορίες,σε επίπεδο αλληλουχίας, για το γένωµα του είδους που µελετάµε. Υπάρχουν διαθέσιµοι δείκτες SSR για αρκετά δασικά είδη όπως: Pinus radiata D.Don, Quercus spp., Pinus strobus L., Picea abies (L.) H.Karst (Glaubitz & Moran, 2000). V. Τυχαία Ενισχυµένο Πολυµορφικό DNA (RAPDs) Οι δείκτες RAPD εξελίχθηκαν παράλληλα απο τους Williams et al. (1990). Η µέθοδος χρησιµοποιεί, σε αντίθεση µε την κλασσική PCR, έναν µόνο ολιγονουκλεοτιδικό εκκινητή µικρότερου µήκους από ότι συνήθως (10µερή) και η αλληλουχία του είναι τυχαία. Αυτό σηµαίνει οτι η τεχνική αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί απευθείας σε ένα είδος χωρίς να χρειάζονται πληροφορίες 18

20 αλληλουχίας του γενώµατος του. Η µέθοδος βασίζεται στο ότι σε ένα µεγάλο ευκαρυωτικό γένωµα θα υπάρχουν, για µια τυχαία δεκαµερή ακολουθία βάσεων, αρκετές θέσεις συµπληρωµατικές της κατανεµηµένες σε όλο το DNA. Σε κάποιες περιπτώσεις δύο συµπληρωµατικές αλληλουχίες µε αντίθετο προσανατολισµό βρίσκονται αρκετά κοντά ώστε να λειτουργήσουν ως εκκινητές και να µπορεί να πραγµατοποιηθεί η ενίσχυση του ενδιάµεσου τµήµατος ( White et al., 2007). Όπως αναφέρθηκε για την RAPD-PCR χρησιµοποιείται ένας δεκαµερής εκκινητής µε ποσοστό % βάσεων GC. Για να µπορέσει να πραγµατοποιηθεί η αντίδραση πρέπει το µήκος του προς ενίσχυση τµήµατος να µην ξεπερνάει τις 4000 βάσεις. Από µια αντίδραση RAPD-PCR είναι δυνατό να προκύψουν 3 έως 20 προϊόντα διαφορετικού µήκους (Glaubitz & Moran in Young 2000). Τα προιόντα της PCR διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά σε πηκτή αγαρόζης και γίνονται ορατά µετά από βαφή κατάλληλη για νουκλεικά οξέα ( συνήθως EtBr ). Έτσι διακρίνονται στην πηκτή ζώνες διαφορετικού µεγέθους που είναι δυνατό να θεωρηθούν διαφορετικές γονιδιακές θέσεις. Η παρουσία µιας ζώνης συγκεκριµένου µεγέθους αντιστοιχεί στο αλληλόµορφο Α. Αντίθετα η απουσία αντιστοιχεί στο αλληλόµορφο 0. Σε ένα άτοµο οµοζυγωτικό ή ετεροζυγωτικό για το αλληλόµορφο Α είναι ορατή η συγκεκριµένη ζώνη, ενώ η ζώνη απουσιάζει µόνο στην περίπτωση οµοζυγωτικού ατόµου για το αλληλόµορφο 0. Αυτή η κυρίαρχη συµπεριφορά των συγκεκριµένων δεικτών (Lu et al., 1995) είναι ένα µειονέκτηµα που όµως όταν ο ιστός είναι απλοειδής απαλείφεται. Συγκεκριµένα για τα κωνοφόρα µπορεί να χρησιµοποιηθεί το ενδοσπέρµιο για την απλοειδή ανάλυση. Αυτό καθίσται δυνατό χάρη στην πολύ µικρή ποσότητα DNA (λιγότερο απο 10 ng/αντίδραση) που απαιτείται για τη µέθοδο. Από ένα απλοειδές ενδοσπέρµιο µπορεί να εξαχθεί ικανοποιητική ποσότητα DNA για µια σειρά αντιδράσεων. Η µέθοδος RAPD είναι απλή στην εφαρµογη της, έχει χαµηλό κόστος, είναι γρήγορη και δεν απαιτεί γνώσεις αλληλουχίας. Απο την άλλη πλευρά παρουσιάζει το µειονέκτηµα της κυριαρχίας ενώ ελέγχεται για την επαναληψιµότητά της µεταξύ εργαστηρίων. Πραγµατικά η ενίσχυση ειδικά των λιγότερο ισχυρών ζωνών εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό απο τις συνθήκες της αντίδρασης. Η µέθοδος εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την συγκέντρωση και 19

21 την καθαρότητα του DNA (Kubelik & Szabo, 1995) ενώ διαφορετικοί θερµοκυκλωτές, διαφορετικές συγκεντρώσεις ΚCl, Mg 2+, µεταβολές στη θερµοκρασία υβριδισµού των εκκινητών, ακόµα και Taq πολυµεράσες διαφορετικών εταιρειών είναι δυνατόν να επηρεάσουν τελικό αποτέλεσµα (Ellsworth et al., 1993). Ωστόσο αν έχει προηγηθεί προεπιλογή των καταλληλότερων εκκινητών, και οι συνθήκες της αντίδρασης επαναλαµβάνονται µε αρκετή ακρίβεια τότε η επαναληψιµότητα είναι αρκούντως υψηλή. Σε µελέτη για την επαναληψιµότητα της RAPD-PCR o Skov (1998), διαπίστωσε οτι τα αποτελέσµατα µεταξύ δύο εργαστηρίων µε τελείως διαφορετικό εξοπλισµό συµφωνούσαν κατά 93%. Οι δείκτες RAPDs έχουν χρησιµοποιηθεί ευρύτατα στα δασικά είδη: σε µελέτες γενετικής ποικιλότητας (Bucci & Menozzi, 1995; Szmidt et al Peng et al., 2003; Ghosn et al. 2000; Nkongolo & Gratton, 2001; Fazekas & Francis, 2000; Collignon et al. 2002), στην κατασκευή γενετικών χαρτών (Kya & Neale, 1995; Li & Yea, 2001; Plomion et al., 1995; Nelson et al., 1994; Nelson et al., 1993; Skov και Wellendorf, 1998; Sewell et al., 1999), στην πιστοποίηση κλώνων (Castiglione et al., 1993, Van de Ven & McNicol, 1995; Scheepers et al., 1997), σε φυλογενετικές µελέτες και σε µελέτες εξέλιξης των ειδών (Adams et al., 1993; Vicario et al., 1995; Aagaard et al., 1998; Wu et al., 1999), όπως επίσης και σε µελέτες για τον εντοπισµό γονιδίων δεικτών (Groover, 1994; Harfouche et al., 2000). 20

22 1.8.1 Το Είδος Pinus peuce Η Βαλκανική πεύκη ανακαλύφθηκε το 1839 από τον Γερµανό βοτανικό August Grisebach, στο βουνό Pelister στην περιοχή της F.Y.R.O.M. και ταξινοµήθηκε από τον ίδιο το 1844 ως νέο είδος µε το όνοµα Pinus peuce. Τα δείγµατα που βρήκε ο Grisebach ήταν σχετικά µικρά δέντρα- γύρω στα 10 µέτρα ύψος- και αυτό το µέγεθος αποδείχθηκε διαγνωστικό στοιχείο για την αναγνώριση του είδους. Σύµφωνα µε αυτόν τον ερευνητή, το τότε καινούργιο είδος, ήταν συγγενικό µε το πεύκο των Ιµαλάϊων Pinus wallichiana, και µπόρεσε εύκολα να διακριθεί από αυτό από τις πολύ µικρότερες και σκληρότερες βελόνες και τους κοντύτερους κώνους. Η Pinus peuce είναι πολύ παλιό είδος ενδηµικό της Βαλκανικής Χερσονήσου. Στον Vidakovic αναφέρεται ως λείψανο της περιόδου του Τριτογενούς (1991). Οι de Ferrè και Gaussen (1970, στον Vidakovic 1991) σχηµάτισαν την υπόθεση, µελετώντας τις κοτυληδόνες πεύκων, σύµφωνα µε την οποία την περίοδο πριν το Πλειστόκαινο υπήρχε ένα είδος P.monticola στην νοτιοδυτική Σιβηρία που θεωρούν ότι είναι κοινός πρόγονος των σηµερινών πενταβέλονων πεύκων, P.monticola της Βόρειας Αµερικής, P. peuce της Βαλκανικής, P. wallichiana των Ιµαλλαίων και P. dalatensis του νότιου Βιετνάµ. Τα παραπάνω σηµερινά είδη προέκυψαν από την µετανάστευση των απογόνων της αρχικής Σιβηρικής P. monticola εξαιτίας των παγετώνων. Είναι από τα ελάχιστα πενταβέλονα είδη πεύκης στην Ευρώπη µε ιδιαίτερη οικολογική, αισθητική και οικονοµική αξία παγκοσµίως και δεν είναι τυχαίο ότι από πολλούς ερευνητές θεωρείται ως ορεινός «θησαυρός» των Βαλκανίων. 21

23 1.8.2 Εξάπλωση του είδους Είναι ενδηµικό είδος της Βαλκανικής Χερσονήσου µε πολύ περιορισµένη φυσική εξάπλωση. Στη Βαλκανική χερσόνησο απαντάται στη Σερβία, στο Μαυροβούνιο, στην Αλβανία, στην Ελλάδα, στη Βουλγαρία και στο FYROM, σε υψόµετρα από 600µ έως 2200m (Fukarek,1950; Mirov, 1967; Popnicola et al., 1978; Jovanovic, 1986; Vidakovic, 1991; Alexandrov 1998). Εικόνα 3: Φυσική εξάπλωση της Pinus peuce. Από Fukarek (1970) Στη χώρα µας φύεται στη συνοριακή γραµµή µε την Βουλγαρία (οροσειρά Ροδόπης) και τη FYROM (όρος Βόρας). Το ανατολικό σύνορο εξάπλωσης της Βαλκανικής πεύκης, είναι τα Βουλγάρικα βουνά Rila, Pirin, Slavjanka η δυτική Ροδόπη και δυο ξεχωριστές τοποθεσίες στα βουνά Vitosa και Stara. Απαντάται επίσης σποραδικά στα βόρεια σύνορα της χώρας µας µε τα βαλκανικά σύνορα. 22

24 Στην F.Y.R.O.M, το είδος απαντάται στα βουνά Perister, Nidže, Kožuf, Korab, Rudoka και Šar Planina. Στο Μαυροβούνιο, στα όρη Zeletin και Koprivnik και στο Kosmet, στο Prokletije και στις πηγές του ποταµού Ibar. Επίσης έχει βρεθεί σε κάποια Αλβανικά βουνά ( Perim Dagh και Rile Dagh ) Τέλος ξεκινώντας από την Ελληνική επικράτεια και το Ν. Ξάνθης από τη θέση Γυφτόκαστρο-Κούλα, συγκροτεί µοναδικές συστάδες που διαχέονται και στη βουλγαρική επικράτεια γειτνιάζοντας µε τις περιοχές Smoljan, Haskovo και Karzali. Το είδος θεωρείται µοναδικό δείγµα φυσικής κληρονοµιάς, και έχει αναγνωριστεί ως σπάνιο ενδηµικό είδος παγκόσµια σύµφωνα µε την οδηγία 92/43/EEC. Ο βιότοπος του έχει ενταχθεί στο NATURA 2000 (Κωδικός NATURA GR OROS CHAIDOU-KOULA & GYRO KORYFES Ταξινοµική και κοινά ονόµατα Η Pinus peuce ανήκει στο υπογένος Strobus, τµήµα Strobus, υποτµήµα Strobi (Price et al., 1998). Όσον αφορά στην ταξινόµηση µέσα στο είδος, υπάρχουν κάποιες απόψεις ότι οι πληθυσµοί της Βουλγαρίας ανήκουν στη διαφορετική ποικιλία vermiculata Christ, επειδή διαφέρουν από τους πληθυσµούς των δυτικών Βαλκανίων λόγω των λεπτότερων και κοντύτερων βελονών και των µικρότερων κώνων (Cernjavski et al, 1959). Όµως, πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η ποικιλότητα των πληθυσµών της Βουλγαρίας ουσιαστικά αλληλοκαλύπτεται µε αυτή των πληθυσµών των δυτικών Βαλκανίων και η διάκριση ξεχωριστής ποικιλίας δεν είναι δυνατή µόνο µε την παρατήρηση (Dobrev, 1995). Στην αγγλική βιβλιογραφία, η Pinus peuce αναφέρεται ως «Macedonian Pine» ή «Balκan Pine» και µερικές φορές ως «Roumelian Pine». Στη Βουλγαρία ονοµάζεται «Byala mura», στην Ελλάδα «Βαλκανική Πεύκη» ή «Πενταβέλονος Πεύκη», στη Σερβία και στο FYROM «Molika», στη Γερµανία «Mazedonische Kiefer», στην Ιταλία «Pino dei Balcani», τη Γαλλία «Pins de Balkans» και στη Ρωσία «Sosna rumeliiskaya» ή «Sosna Balkanskaya». 23

25 1.8.4 Μορφολογικά Χαρακτηριστικά Η Pinus peuce είναι µεγάλο δέντρο ύψους m και στηθαία διάµετρο που φτάνει τα 150cm. Ο φλοιός που σε νεαρή ηλικία είναι απαλός και ασηµόγκριζος, γίνεται στη µέση ηλικία πιο σκούρος και τραχύς. Τα γέρικα δέντρα έχουν φλοιό µε χοντρές καφετιές τετράγωνες σχισµές. Οι βλαστοί είναι αρχικά πράσινοι, γκρι-καφέ στο τέλος του χρόνου, απαλοί και λείοι. Οι οφθαλµοί είναι καλυµµένοι µε ρετσίνι. Οι βελόνες είναι οργανωµένες ανά πέντε µε 5-10 cm µάκρος (συνήθως όχι πάνω από 7 cm), λεπτές µε πάχος 0,7-0,8 mm, µε χρώµα γυαλιστερό πράσινο στην εξωτερική πλευρά και µε άσπρες στοµατικές γραµµές στην εσωτερική επιφάνεια. Οι παρυφές τους είναι ελαφρώς πριονωτές. Οι βελόνες παραµένουν συνήθως για δυο χρόνια. Οι αρσενικοί κώνοι βρίσκονται στη βάση των νέων βλαστών ενώ οι θηλυκοί στην κορυφή των εκπτυσσόµενων βλαστών. Οι κώνοι συνήθως βρίσκονται στο ανώτερο τµήµα των δέντρων. Η επικονίαση ξεκινά τον Ιούνιο και οι σπόροι ωριµάζουν Σεπτέµβριο µε Οκτώβριο του επόµενου έτους. Οι κώνοι φύονται προς τα κάτω, έχουν µήκος cm, είναι κυλινδρικοί, ευθείς έως ελαφριά κυρτοί και µε ρητίνη. Τα βράκτια είναι συµπιεσµένα έως ελαφριά κυρτά και οι κώνοι είναι κλειστοί, η απόφυση είναι ελαφρώς στρογγυλεµένη µε πλάτος 20mm. Στην τυπική τους µορφή, οι κώνοι των ειδών πεύκης που ανήκουν στο τµήµα Strobus έχουν µίσχο. Στην Pinus peuce οι µίσχοι έχουν µήκος 1-2 cm, είναι γκρι και έχουν πάχος 6-8mm. Οι σπόροι είναι γκρι-καφέ, 7-8 mm µε ένα συµφυές πτερύγιο µήκους mm. 24

26 1.8.5 Οικολογία και Βιολογικές απαιτήσεις του είδους Η Βαλκανική πεύκη είναι είδος που ευδοκιµεί σε µεγάλα υψόµετρα ( µέτρων) και παρουσιάζει περιορισµένη εξάπλωση, συνήθως σε πυριτικά εδάφη, ενώ έχει αποδειχθεί εξαιρετικά ανθεκτικό σε διάφορες περιβαλλοντικές συνθήκες. Εντοπίζεται σε αµιγείς και µικτές συστάδες µε την ελάτη και την ερυθρελάτη. Είναι είδος σκιανθεκτικό και για την επιτυχή φύτρωση του απαιτούνται φαιά δασικά εδάφη. Όσον αφορά στις βιολογικές απαιτήσεις του είδους, αυτές παρουσιάζονται µικρότερες σε σχέση µε τα περισσότερα είδη πεύκων. Εντοπίζεται κυρίως σε τυπικές ορεινές θέσεις µε βόρεια έκθεση, σε πυριτικά και σπανιότερα σε ασβεστούχα εδάφη (Dimitrov, 1978; Jovanovic, 1986) και µπορεί να φύεται και να αναπτύσσεται ικανοποιητικά ακόµη και σε φτωχά πετρώδη εδάφη µιας και το ριζικό του σύστηµα είναι καλά προσαρµοσµένο ακόµη και σε αβαθή εδάφη ( Mickovski & Ennos, 2003). Ο Allan Mitchell (1996) αναφέρει ότι η ανάπτυξη του είδους είναι περίπου 18 ίντσες το χρόνο, τόσο σε βαθιά και γόνιµα όσο και σε φτωχά εδάφη. Η υγρασία του εδάφους φαίνεται να είναι ένας παράγοντας που δεν επηρεάζει το συγκεκριµένο είδος, γεγονός που αποδεικνύεται και από την οµαλή και φυσιολογική του ανάπτυξη ακόµη και σε περιοχές όπου δεν επιτυγχάνεται ικανοποιητική αποστράγγιση του εδάφους, όπου άλλα είδη δεν έχουν καταφέρει να επιβιώσουν. Αξιοσηµείωτη είναι και η ανθεκτικότητα του είδους στον παγετό και στις πολύ χαµηλές χειµερινές θερµοκρασίες, ακόµα και κάτω από τους -45 o C καθώς και στην έκθεση σε δυνατούς άνεµους. Το παραπάνω γεγονός αποδεικνύεται και από τις έρευνες που έγιναν από τους Panaytov (2007) και Panaytov & Yurukov (2007) οι οποίοι αναφέρουν ότι µπορεί να αντέξει ακόµα και σε χιονοστιβάδες. Οι περιοχές εξάπλωσης της Pinus peuce περιλαµβάνονται στις προστατευµένες ζώνες του NATURA 2000, δηλαδή σε περιοχές που βρίσκονται υπό καθεστώς προστασίας όπως είναι τα εθνικά και φυσικά 25

27 πάρκα. Τα δάση της Pinus peuce προσφέρουν καταφύγιο σε µια πληθώρα ζωντανών οργανισµών: ασπόνδυλα, θηλαστικά, πτηνά κ.ά. (Nikolov, 2007a; 2007b; 2009). Από όλα τα παραπάνω εύκολα συνάγεται το συµπέρασµα ότι το είδος αυτό είναι ικανό να ανταπεξέλθει σε όλες τις περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν βόρεια της Μεσογείου. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες καθώς και η κωνικόµορφη κόµη του, το καθιστούν ως ένα από τα καλύτερα καλλωπιστικά είδη σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες όπως είναι η Αγγλία (Lines, 1985) και η Φιλανδία (Jovanovic, 1986) καθώς και οι άλλες Σκανδιναβικές χώρες. Σε αυτές είναι γνωστό ως «Silkefyr» («Silk Pine») εξαιτίας του ασηµί χρώµατος της κόµης, και είναι αρκετά δηµοφιλές καλλωπιστικό σε πάρκα και µεγάλους κήπους. Όπως αναφέρθηκε το 1972, στο Συνέδριο για τα Κωνοφόρα, η Pinus peuce είναι «πέρα από κάθε αµφιβολία το πιο χρήσιµο καλλωπιστικό πενταβέλονο είδος» (Jonson,1993 όπως αναφέρεται σε conifers.org, n.d.). Παράλληλα µε την µεγάλη οικολογική πλαστικότητα της, η Pinus peuce φαίνεται ότι συνδυάζει και υψηλή ανθεκτικότητα σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Γενικά οι προσβολές που έχουνε εντοπιστεί από κάποια έντοµα, όπως το Dioryctria zimmermani στην Αµερική, και από κάποιους µύκητες όπως ο Ramichloridium pini στην Αγγλία, δε φαίνεται να είναι σηµαντικές και δεν έχουν σοβαρές συνέπειες στην υγεία των δέντρων του είδους. (Brown & Macaskill, 2005). Παράλληλα, η Βαλκανική πεύκη παρουσιάζει µεγάλη ανθεκτικότητα και στη φλυκταινώδη σκωρίαση των κωνοφόρων (Cronartium ribicola), ιδιότητα που παρατηρείται και σε άλλα ευρωπαϊκά και ασιατικά είδη λευκών πεύκων (subgenus Strobus). Πρόκειται για ένα µύκητα που εισήχθη κατά λάθος από την Ευρώπη στην Αµερική, όπου προκάλεσε µεγάλες ζηµιές και θνησιµότητα σε µεγάλες περιοχές στα τοπικά είδη (π.χ. Pinus strobus, Pinus monticola, Pinus lambertiana, Pinus albicaulis). Όλοι οι παραπάνω λόγοι που αναφέρθηκαν καθιστούν την Pinus peuce ιδανικό είδος για έρευνα όπου µε τη βοήθεια του υβριδισµού και των υπολοίπων µεθόδων γενετικής βελτίωσης µπορούν να ξεπεραστούν προβλήµατα υγείας και προσβολών σε ασθένειες, όλων των συγγενικών µε αυτή είδη (Blada, 2000; Sniezko et al. 2008). 26

28 1.8.6 Αναπαραγωγή H αναπαραγωγή του είδους γίνεται κατά κύριο λόγο µε σπόρους. Ο αριθµός των σπόρων που παράγονται σε µια ικανοποιητική χρονιά είναι αρκετός για την φυσική αναγέννηση του είδους, παρόλες τις απώλειες σε σπόρους που µπορεί να υπάρχουν, µιας και αυτοί αποτελούνε τροφή για διάφορα είδη όπως τα τρωκτικά και οι σκίουροι. Για την εκτέλεση αναδασώσεων µπορούν να χρησιµοποιηθούν σπορόφυτα που παράγονται στα φυτώρια. Στη περίπτωση αυτή το πρόβληµα που παρουσιάζεται είναι η µεγάλη ληθαργική περίοδος που παρουσιάζουν οι σπόροι της Pinus peuce χωρίς να είναι γνωστό ποια από τις 3 µορφές λήθαργου εντοπίζεται.. Ο ένδολήθαργος ελέγχεται από φυσιολογικούς παράγοντες εντός του εµβρύου, ο πάρα-λήθαργος από φυσιολογικούς παράγοντες εκτός του εµβρύου και ο οίκο-λήθαργος από παράγοντες του περιβάλλοντος. Στα δασικά φυτώρια η διακοπή του λήθαργου, εξασφαλίζεται κλασικά µε τη στρωµάτωση των σπόρων για µεγάλο χρονικό διάστηµα µε µια ψυχρή µεταχείριση 12 έως 20 εβδοµάδων στους 5 ο C που ακολουθείται από µια θερµή µεταχείριση 8 εβδοµάδων στους ο C (Dimitrov, 1978; Mason et al, 1995; Milev et al, 1999). Παράλληλα, στον πολλαπλασιασµό του είδους και την εγκατάσταση σποροπαραγωγών κήπων έχουν χρησιµοποιηθεί και οι µέθοδοι του βλαστικού πολλαπλασιασµού και κυρίως η τεχνική του εµβολιασµού µε αρκετά υψηλά ποσοστά επιβίωσης. Σηµειώθηκε µεγάλη επιτυχία στον εµβολιασµό µε υποκείµενα φυτά είτε Pinus peuce είτε Pinus sylvestris. 27

29 1.8.7 Οικονοµική Σηµασία Γενικά η Pinus peuce θεωρείται ένα είδος µε ιδιαίτερη οικονοµική αξία και ενδιαφέρον. Το γεγονός αυτό οφείλεται στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που παρουσιάζει το είδος και αναφέρθηκαν λεπτοµερώς παραπάνω, όπως είναι η αυξηµένη αντοχή σε δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες και βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες, καθώς και η αρκετά υψηλή αισθητική του αξία. Το ξύλο της Βαλκανικής πεύκης είναι ελαφρύ, µαλακό, ανθεκτικό και οµοιογενές, ιδιότητες οι όποιες το καθιστούν ιδανικό για διάφορες χρήσεις( Stefanoff & Ganchev, 1953). Εξαιτίας της υψηλής ανθεκτικότητα της, η Pinus peuce µπορεί επίσης να φύεται και σε χαµηλά υψόµετρα, όπου και µπορεί να αναπτύσσεται ικανοποιητικά. Έτσι µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ίδρυση φυτειών για την παραγωγή πολύτιµης ξυλείας ενώ παράλληλα, µε την εφαρµογή των µεθόδων βελτίωσης µπορεί να µειωθεί ο περίτροπος χρόνος Διατήρηση και προστασία Όλα τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της Pinus peuce καθώς και η περιορισµένη εξάπλωση της, καθιστούν επιτακτική την διατήρηση και την προστασία της. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η Pinus peuce αποτελεί το καταλληλότερο είδος για αναδασώσεις σε µεγάλα υψόµετρα µιας και είναι ένα από τα ανθεκτικότερα είδη σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες όπως είναι αυτές στα αλπικά δασοόρια. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από τα αποτελέσµατα των πειραµάτων που έγιναν κατά τη δεκαετία του 70 στη Βουλγαρία σε περιοχές µε µεγάλο υψόµετρο όπου και χρησιµοποιήθηκαν διάφορα είδη κωνοφόρων. Στα πειράµατα αυτά η Pinus peuce έδειξε υπεροχή απέναντι σε άλλα είδη όπως είναι Larix decidua, η Picea abies τo υβρίδιο P.Sylvestris x P.Mugo, καθώς και σε άλλα δασικά είδη που φύονται σε µεγάλα υψόµετρα. 28

30 Το µεγαλύτερο µέρος των πληθυσµών της Pinus peuce θεωρούνται ενδηµικοί, χωρίς να αποκλείεται και η ανθρωπογενής επίδραση (συνδυασµός δασικών πυρκαγιών και βόσκησης), αφού αυτοί φύονται σε περιοχές κοντά στα αλπικά δασοόρια οι οποίες ανακηρύχτηκαν προστατευόµενες τον 20 O αιώνα και λίγα πράγµατα είναι γνωστά για την ιστορία αυτών. Έτσι είναι πολύ πιθανό εξαιτίας των επιδράσεων αυτών οι πληθυσµοί αυτοί να παρουσιάζουν αποκλίσεις από την αναµενόµενη γενετική δοµή. Όσον αφορά στην πολιτική που πρέπει να ακολουθηθεί και η οποία θα έχει ως στόχο τη διατήρηση των γενετικών πόρων του είδους, είναι αναγκαία και απαραίτητη η εκτίµηση του µεγέθους του πληθυσµού του είδους. Όπως έχει αναφερθεί από τους Falconer & McKay (1996), υπάρχει άµεση σύνδεση µεταξύ µείωσης γενετικής ποικιλότητας και µείωσης του µεγέθους του πληθυσµού ενός είδους. Έτσι, όσο µικρότερο είναι το µέγεθος ενός πληθυσµού τόσο αυξάνεται το επίπεδο οµοµιξίας µέσα από τις γενιές (Falconer & McKay, 1996). Για τον λόγο αυτό κρίνονται απαραίτητοι οι χειρισµοί που θα έχουν ως στόχο τον έλεγχο της δοµής και του µεγέθους του πληθυσµού σε διάφορα χρονικά διαστήµατα ώστε να αποφευχθούν οι παράγοντες και οι επιδράσεις που θα έχουν ως αποτέλεσµα τη µείωση της φυσικής εξάπλωσης της Pinus peuce Ανασκόπηση της Βιβλιογραφίας Λόγω της µεγάλης οικονοµικής και οικολογικής αξίας της Βαλκανικής πεύκης, τις τελευταίες δεκαετίες παρουσιάζεται ένα όλο και αυξανόµενο ενδιαφέρον για τη βελτίωση του είδους. Παρόλα αυτά όµως και κυρίως λόγω της περιορισµένης εξάπλωσής της δεν υπάρχουν αρκετές µελέτες, σε σύγκριση µε άλλα είδη κωνοφόρων ειδών. Οι πρώτοι που ασχοληθήκαν µε τη γενετική ανάλυση του είδους ήταν οι Hagman & Mikola (1963), οι οποίοι µελέτησαν την ικανότητα και την συµπεριφορά του στις διασταυρώσεις. Οι γνώσεις πάνω στη γενετική του είδους µέχρι το 1978 αναφέρονται από τους Popnikola et al.(1978). Παράλληλα οι Petrovska & Stamenkov (1987) µελετώντας τον καρυότυπο του 29

31 είδους επιβεβαίωσαν το κλασσικό γένωµα των κωνοφόρων 2n=24 όπως και είναι και σε άλλα είδη πεύκων. Ο Dobrev κατά τη περίοδο µελέτησε την ποικιλότητα που υπήρχε στο ύψος και στη διάµετρο σε διαφορετικές προελεύσεις και οικογένειες από ελεύθερη επικονίαση εγκατεστηµένες σε ποικιλία περιβαλλόντων. Ανάλυσε συνολικά 13 πληθυσµούς µε σκοπό τον υπολογισµό της ποικιλότητας στο ύψος και στη διάµετρο και κατά πόσο αυτά τα χαρακτηριστικά ελέγχονται γενετικά, καθώς τον ορισµό της αποτελεσµατικότητας της τεχνητής επιλογής στη βελτίωση του είδους. Οι µορφολογικοί χαρακτήρες των βελόνων και των αναπαραγωγικών αοργάνων έδειξαν υψηλό βαθµό κληρονοµούµενης ποικιλότητας, ενώ η αύξηση σε ύψος ήταν καλύτερη στις προελεύσεις που βρίσκονται προς το κέντρο της εξάπλωσης του είδους και µειώνεται προς τις περιφερειακές προελεύσεις. Η καλύτερη αύξηση εντοπίστηκε στην προέλευση Razlog (Northern Pirin). Ο ίδιος ερευνητής σε µια σειρά µελετών (Dobrev, 1998, 1999, 2000a,b, 2002a,b, 2003, 2005 και 2007) υπολόγισε, µε βάση την ποικιλότητα µεταξύ των ατόµων (ηλικίας 13 ετών) εντός των οικογενειών, την κληρονοµικότητα της αύξησης σε ύψος και τη διάµετρο και τη βρήκε να κυµαίνεται µεταξύ 0, Το αναµενόµενο γενετικό κέρδος που θα προκύψει από την επιλογή µέσα στις προελεύσεις και µέσα στις οικογένειες, κυµαίνεται από 13% έως 50%, ποσοστό αρκετά ικανοποιητικό. Αργότερα στην ηλικία των 16 ετών, οι εκτιµήσεις της κληρονοµικότητας για την αύξησης σε ύψος κυµάνθηκαν από 0,38 έως 0,52 (κληρονόµηση στην οικογένεια) και από 0,13 έως 0,40 (κληρονόµηση στα άτοµα). Λόγω της υψηλής γενετικής σταθερότητας αποδεικνύεται ότι οι περιβαλλοντικές συνθήκες δεν έχουν σηµαντική επίδραση στην απόδοση της προέλευσης και της οικογένειας (Dobrev 1998, 1999). Έτσι µε βάση τα αποτελέσµατα του αυτά ο Dovrev (2005,2007) προτείνει την περαιτέρω επιλογή ως την καλύτερη στρατηγική για την γενετική βελτίωση του είδους. Όσον αφορά στη µελέτη των βιοχηµικών δεικτών, η πρώτη αναφορά γίνεται από τον Mirov (1967), πάνω στο τερεβινθέλαιο της Pinus peuce το οποίο περιέχει δυο διτερπένια. Το ένα δίνει άνυδρο µαλεϊκό προϊόν προσθήκης, και το άλλο που ονοµάστηκε σεµπρένιο, το οποίο εντοπίστηκε στα παλαιοβοτανικά αρχεία της Pinus peuce από την ανατολική Ασία. Από 30

32 την ύπαρξη του σεµπρένιου στην Pinus peuce µπορούµε να κατανοήσουµε τη διαδροµή µετανάστευσής της, από τα βόρεια, προς τα Βαλκάνια. Επιπλέον, ο Dobrev (1992), εντόπισε σηµαντικές διαφορές στη σύνθεση των µονοτερπενίων 3 πληθυσµών της Βουλγαρίας που προέρχονταν από τις κορυφές των βουνών Rila, Pirin και Stara Planina (Balkan Mountains). Ακόµη, οι Hennig et al. (1994), µελετώντας µε τη µέθοδο της πολυδιάστατης αεριοχρωµατογραφίας, τα αιθέρια έλαια που αποµονώθηκαν από βελόνες της Pinus peuce εντόπισαν α-πινένιο, β-πινένιο και καµφένιο ενώ τα οξυγονωµένα µονοτερπένια βρέθηκαν λίγα σε σύγκριση µε άλλα είδη κωνοφόρων. ΟΙ Zhelev et al. (2002), εφαρµόζοντας τη τεχνική των ισοενζύµων δούλεψαν σε 49 ανεξάρτητα άτοµα του είδους, συµπέραναν πως δεν υπάρχει σηµαντική απόκλιση από τον αναµενόµενο Μενδελικό διαχωρισµό σε όλα τα πολυµορφικά γονίδια που αφορούν τόσο τα δεδοµένα της δεξαµενής, όσο και τα διαχωριστικά αρχεία των µεµονωµένων δέντρων. Παρά το διαφορετικό επίπεδο σηµαντικότητας, τα κλάσµατα ανασυνδυασµού που υπολογίστηκαν ήταν αρκετά όµοια. Οι ανασυνδυαστικές τιµές δείχνουν αδύναµο δεσµό µεταξύ των δυο ζευγών γονιδίων. Οι Liston et al. (1999),στην προσπάθεια τους να ξεκαθαρίσουν τη ταξινόµηση του γένους, µελέτησαν το ριβοσωµικό DNA 47 ειδών πεύκης και κατέληξαν ότι η Pinus peuce έδειξε µεγαλύτερη συγγένεια µε δυο οµάδες ειδών: 1. Pinus krempfii (Βιετνάµ), Pinus pumila (Άπω Ανατολή), Pinus chiapensis (Μέξικο, Γουατεµάλα), Pinus parviflora (Κορέα, Ιαπωνία), Pinus kwangtungensis (Κίνα. Βιετνάµ). 2. Pinus lambertiana (USA, Μεξικό), Pinus wallichiana (Αφγανιστάν, Πακιστάν), Pinus strobus (Βορειανατολική Αµερική), Pinus ayacachuite (Μεξικό, Γουατεµάλα, USA), Pinus albicaulis (Καναδάς, USA), Pinus cembra (Άλπεις, Καρπάθια). Η συγγένεια µε την πρώτη οµάδα µπορεί να αµφισβητηθεί, ενώ µε τη δεύτερη οµάδα θεωρείται αναµενόµενη µιας και υπάρχουν πολλές πληροφορίες για τη συστηµατική συγγένεια σε αυτή την οµάδα ειδών, περιλαµβανόµενων πολλών διασταυρώσεων µεταξύ των ειδών. 31

33 Τέλος οι Bogunic et al. (2003) µελέτησαν το µέγεθος του γενώµατος σε 5 είδη πεύκης της Βαλκανικής χερσονήσου, µεταξύ των οποίων και η Pinus peuce. Το µέγεθος του γενώµατος της βρέθηκε το µεγαλύτερο σε µέγεθος (54,9 pg), σε σχέση µε τα υπόλοιπα υπό µελέτη είδη (P.sylvestris, P.nigra, P.mugo, P.heldreichii), κάτι που είναι αναµενόµενο και τυπικό για τα πενταβέλονα είδη πεύκης. 32

34 2. Σκοπός της Εργασίας Ο σκοπός της παρούσας διατριβής είναι: 1. O έλεγχος του µεντελικού διαχωρισµού των γονιδιακών θέσεων που προκύπτουν από γενετικούς δείκτες τυχαία ενισχυσµένου πολυµορφικού DNA (RAPD) 2. η ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας δυο ελληνικών φυσικών πληθυσµών Βαλκανικής πεύκης (P.peuce) µε την χρήση µοριακών δεικτών RAPD. 33

35 3. Υλικά και Μέθοδοι 34

36 3.1 Συλλογή και προετοιµασία φυτικού υλικού Για την έρευνα αυτή χρησιµοποιήθηκε υλικό από 2 φυσικούς Ελληνικούς πληθυσµούς Βαλκανικής Πεύκης προερχόµενους απο την Αριδαία και τη Ροδόπη. Από κάθε πληθυσµό αναλύθηκαν 10 δέντρα. Από κάθε δέντρο συλέχθησαν 8-10 ώριµοι κώνοι. Οι κώνοι για να ανοίξουν τοποθετήθηκαν για 2 µέρες σε φούρνο µε θερµοκρασία 37 o C. Μετά το άνοιγµα εξήχθησαν οι σπόροι και φυλάχθηκαν σε φακελάκια σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι να χρησιµοποιηθούν. Πριν τη χρησιµοποίηση τους οι σπόροι αποστειρώνονταν για την αποφυγή επιµολύνσεων κυρίως απο µύκητες ή άλλους µικροοργανισµούς, µε την εξής διαδικασία (Neal et al, 1967; Normand & Fortin, 1982) 1) Τοποθέτηση των σπόρων σε νερό για 1 ώρα. 2) Μεταφορά των σπόρων σε Η 2 Ο 2, παρουσία Tween-20 για την αποµάκρυνση λιπαρών ουσιών. Οι σπόροι αφήνονταν στο Η 2 Ο 2 για 15 λεπτά 3) Οι σπόροι ξεπλένονταν µε αποσταγµένο νερό. Μετά την αποστείρωση τοποθετούνταν σε τριβλία Petri πάνω σε υγρό διηθητικό χαρτί και αφήνονταν για µερικές µέρες ώστε να µαλακώσει το λίγο το περίβληµά τους και να εξαχθεί πιο εύκολα το ενδοσπέρµιο. Με τη βοήθεια αποστειρωµένης λαβίδας και νυστεριού, αποµακρύνονταν το σκληρό κέλυφος, πολύ προσεχτικά το περισπέρµιο κι το έµβρυο (διπλοειδείς ιστοί) και λαµβανόταν καθαρό το ενδοσπέρµιο (απλοειδής ιστός). Όποτε δεν ήταν δυνατό να γίνει απευθείας η αποµόνωση του DNA ο ιστός φυλασσόταν σε δοκιµαστικό σωλήνα Eppendorf 1.5 ml στους σε βαθειά κατάψυξη (-80 ο C). 35

37 3.2 Αποµόνωση DNA Για την εξαγωγή του DNA απο ενδοσπέρµια κωνοφόρων προτείνεται προηγούµενα η φύτρωση τους γιατί µε αυτόν τον τρόπο καταναλώνεται µέρος των λιπιδίων και πιθανώς των πολυσακχαριτών που επηρεάζουν την καθαρότητα του DNA (Skov, 1998). Για την µέθοδο RAPD η ποιότητα του DNA είναι ένας από τους πιο κρίσιµους παράγοντες σε ότι αφορά αξιοπιστία και επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων. Ωστόσο τα ενδοσπέρµια της P.peuce για τη φύτρωσή τους απαιτούν ειδική διαδικασία µηνών. Η δυσκολία αυτή υποχρεώνει να γίνει η αποµόνωση απο ιστό πλούσιο σε πολυσακχαρίτες και λιπίδια. Αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο CTAB κατάλληλο για την αποµάκρυνσή τους, µε βάση το πρωτόκολλο Tamsyn, et al.(2003) µε κάποιες τροποποιήσεις: 1) Θέρµανση του διαλύµατος CTAB ( 10 % w/v ) στους 65 ο C 2) Οµογενοποίηση του ιστού (µισό ενδοσπέρµιο περίπου 0.02 gr) σε 350 µl ΤΕ ( 100 mm Tris, 20 mm EDTA ) παρουσία ποσότητας gr PVP. 3) Πολύ καλό Vortex (για 1 λεπτό). Είναι πολύ σηµαντικό αυτό να γίνει πριν να προστεθεί το CTAB γιατί το τελευταίο λύει τις µεµβράνες των πυρήνων που προστατεύουν ακόµα το γενωµικό DNA απο το τεµαχισµό του κατά τη διάρκεια του ανατάραξης. Μετά την πρόσθεση του CTAB δεν ακολουθεί άλλο βήµα vortex και τα δείγµατα ανακινούνται µόνο µε το χέρι. 4) Προστίθενται 140µl διαλύµατος CTAB (10 % w/v) για τελική συγκέντρωση 2% w/v. 5) Προστίθενται 210 µl διαλύµατος NaCl (5M) για τελική συγκέντρωση 1.5Μ. 6) Προστίθενται 4 µl Proteinase K. 7) Επαφίεται για 1 ώρα στους 65 ο C σε υδατόλουτρο. Ανα τακτά χρονικά διαστήµατα ανακινούµε ελαφρά τα δείγµατα µε το χέρι. 8) Προστίθενται στα δείγµατα 350 µl χλωροφόρµιο:ισοαµυλικής αλκοόλης 36

38 (24:1) µαζί 350 µl φαινόλης και κάνουµε καλή ανάµιξη αναποδογυρίζοντας µερικές φορές τους δοκιµαστικούς σωλήνες µε το χέρι. 9) Φυγοκεντρούµε τα δείγµατα στις στροφές για δέκα λεπτά. 10) Το µείγµα διαχωρίζεται σε µια κατώτερη οργανική φάση και µία ανώτερη υδάτινη φάση (που περιέχει το DNA). Στην επιφάνεια επαφής των δύο φάσεων σχηµατίζεται λευκό στέρεο στρώµα. Λαµβάνουµε µε πιπέτα όσο µεγαλύτερη ποσότητα από την υδάτινη φάση προσέχοντας πολύ να µην ακουµπήσουµε το στέρεο στρώµα (περίπου 650 µl) και την µεταφέρουµε σε καθαρό δοκιµαστικό σωλήνα. Η οργανική φάση απορρίπτεται. 11) Ακολουθεί ένας ακόµα οργανικός διαχωρισµός προσθέτοντας έναν ίσο όγκο Χλωροφόρµιου Ισοαµυλικής. Επαναλαµβάνονται τα βήµατα 9,10. 12) Προσθέτουµε στο διάλυµα ένα ίσο όγκο κρύας ισοπροπανόλης (-20 ο C). Ανακινούµε το δείγµα χτυπώντας ελαφρά µε το χέρι. Αυτή είναι η φάση κατακρήµνισης του DNA που πολλές φορές είναι ορατό µε τη χαρακτηριστική µορφή της «µέδουσας». 13) Τα δείγµατα αφήνονται στους 4 ο C για µισή ώρα. 14) Φυγοκεντρούµε στις στροφές για 10 λεπτά. 15) Απορρίπτουµε το υπερκείµενο προσέχοντας να µη τραβήξουµε την παλέτα του DNA που τις περισσότερες φορές είναι ορατή 16) Ακολουθεί πλύση του DNA µε 400 µl κρύας αιθανόλης 70 % (- 20 ο C). Επαναλαµβάνονται τα βήµατα 14,15. 17) Αφήνονται τα δείγµατα σε θερµοκρασία δωµατίου ώστε να εξατµιστούν τα υπολείµµατα αιθανόλης. 18) Επαναδιαλύουµε το στέρεο DNA σε αποσταγµένο νερό (50 µl) και προσθέτουµε 1 µl RNAse A (10 mg/ml). 19) Tα δείγµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο στους 37 ο C για να δράσει η RNAse. 20) Τα δείγµατα φυλάσσονται στους -20 ο C Κατά την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου αξιολογήθηκε µια σειρά απο παράγοντες και πως επηρεάζεται από αυτούς η αποτελεσµατικότητα της διαδικασίας. Συγκεκριµένα: 37

39 Η αύξηση του χρόνου ανάδευσης στο vortex φαίνεται οτι αυξάνει τη συνολική συλλογή DNA. Τα δείγµατα πρέπει να αναδεύονται για τουλάχιστον ένα λεπτό. Η χρησιµοποίηση περισσότερου ιστού δεν αυξάνει όπως θα περίµενε κανείς τη συνολική συλλογή DNA. Όταν ο ιστός µειώθηκε στο µισό το συνολικό DNA βρέθηκε να είναι ακριβώς το ίδιο. Μια εξήγηση για αυτό µπορεί να είναι οτι λιγότερος ιστός οµογενοποιείται πιο αποτελεσµατικά. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα είναι ότι οι πολυσακχαρίτες, οι πρωτεΐνες και οι υπόλοιπες ουσίες µειώνονται και καθαρίζονται πιο αποτελεσµατικά. Τέλος σηµαντικό ρόλο φαίνεται ότι παίζει ο χρόνος για τον οποίο επαφίεται το δείγµα στους 65 C. Χρόνοι µεγαλύτεροι της µιας ώρας είναι πιθανό να αυξάνουν την απόδοση. 3.3 Ποσοτικοποίηση και ποιοτικός έλεγχος του DNA Η ποιότητα και η ποσότητα του DNA εκτιµήθηκαν: α) µε τη µέθοδο της φασµατοφωτοµέτρησης (Φασµατοφωτόµετρο Biomate 3). Μετράται η απορρόφηση απο το δείγµα, σε διαφορετικά µήκη κύµατος. Στα 260nm απορροφούν τα νουκλεικά οξέα, στα 280 nm οι πρωτεΐνες, στα 230 nm φαινολικά πολυσακχαρίτες άλλες οργανικές ουσίες. Η καθαρότητα του δείγµατος υπολογίζεται βάσει των λόγων των απορροφήσεων Α 260 /Α 280 : για επιµόλυνση απο πρωτεΐνες ( τιµή καθαρού DNA = 1.8 ) Α 260 /Α 230 : για επιµόλυνση απο φαινολικά και πολυσακχαρίτες (τιµή καθαρού DNA = 1.8 ) (Sambrook et al.,1989). Η διαδικασία περιλαµβάνει το αρχικό καλιµπράρισµα του µηχανήµατος µε ανάγνωση 1 ml αποσταγµένου νερού και στη συνέχεια πρόσθεση 1 µl DNA στο νερό και µέτρηση απορρόφησης στα διάφορα µήκη κύµατος (η αραίωση του αρχικού δείγµατος είναι 1 : 1000). β) µε τη µέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης 0.8% µετά από βαφή βρωµιούχου αιθιδίου. Χρησιµοποιήθηκε DNA γνωστών συγκεντρώσεων για τη σύγκριση. 38

40 Μετά τον έλεγχο των δειγµάτων βρέθηκε ότι το πρωτόκολλο ήταν αποτελεσµατικό. Η τελική συγκέντρωση του DNA βρέθηκε κατά µέσο όρο 50 ng µl -1. Οι τιµές Α 260 /Α 280, Α 260 /Α 230 βρέθηκαν µέσα στα αποδεκτά όρια. Η εξέταση σε πηκτή αγαρόζης του συνολικού DNA έδειξε οτι η εκτίµηση των συγκεντρώσεων µε την φασµατοφωτοµετρική µέθοδος ήταν ακριβείς. Τέλος η εικόνα της πηκτής έδειξε οτι τα µόρια του DNA έµειναν και δεν έσπασαν κατά τη διαδικασία. Φωτο 3.1 Ηλεκτροφόρηση γενωµικoύ DNA. Τα δείγµατα είναι συγκέντρωσης ng ml Αντίδραση PCR v. Προετοιµασία του µίγµατος της αντίδρασης PCR Για την αντίδραση της PCR χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια (σε παρένθεση οι αρχικές συγκεντρώσεις) : - Taq DNA Polymerase Kappa Biosystems (5 U ml -1 ) - PCR Buffer Kappa Biosystems (10X) - Mg 2+ Kappa Biosystems (25 mm) - dntps Invitrogen (20mM) - Δεκαµερείς εκκινητές της εταιρίας Operon (10 µm) - 5 ng γενωµικού DNA - H 2 O (αποσταγµένο-αποστειρωµένο) Δοκιµάστηκαν συνολικά 30 εκκινητές της εταιρίας Operon που άνηκαν στα σετ OPA,OPE,OPH. Οι εκκινητές παρελήφθησαν λυοφιλισµένοι και επαναδιαλύθηκαν σύµφωνα µε τις οδηγίες σε διάλυµα TE (10mM Tris, 1mM EDTA) έως τη συγκέντρωση των 100 µm. Με αυτή την συγκέντρωση 39

41 φυλάσσονταν στους -80 C. Τα διαλύµατα εργασίας των εκκινητών είχαν συγκέντρωση 10 µμ µετά απο αραίωση των διαλυµάτων φύλαξης 1:10. Τα υπόλοιπα αντιδραστήρια της αντίδρασης φυλάσσονταν στους -20ºC σε διαλύµατα εργασίας µε τις συγκεντρώσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Η Taq πολυµεράση προστίθετο στην αντίδραση, απευθείας απο την κατάψυξη. Το ρυθµιστικό διάλυµα, το Mg 2+ και τα dntps ξεπαγώνονταν και διατηρούνταν σε πάγο καθ όλη την προετοιµασία της αντίδρασης. Ειδικά τα dntps είναι ευαίσθητα στους πολλαπλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης. Προτείνεται για να µην επαναλαµβάνεται ο κύκλος παραπάνω απο δύο φορές, η φύλαξη τους σε µικρές ποσότητες ανάλογα µε τη χρήση (Sambrook et al., 1989) Το µείγµα προετοιµαζόταν κάτω από απαγωγό νηµατικής ροής ο οποίος έχει προηγουµένως καθαριστεί µε χλωρίνη εµπορίου και αποστειρωθεί µε ακτινοβολία U.V. µαζί µε τα πλαστικά αναλώσιµα και τις πιπέτες. Αρχικά προετοιµαζόταν το συνολικό µείγµα της αντίδρασης σε κατάλληλη ποσότητα έτσι ώστε τελικά να µοιραστεί ισόποσα σε σωληνάρια PCR. H προσθήκη του DNA σε κάθε σωληνάριο γινόταν στο τέλος. vi. Βελτιστοποίηση της αντίδρασης Για την βελτιστοποίηση της αντίδρασης χρησιµοποιήθηκαν απο 1 mm 3 mm Mg 2+ µε την συγκέντρωση των 2 mm να δίνει τους πιο ευκρινείς ζωνότυπους. Επίσης δοκιµάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις εκκινητών dntps και Taq πολυµεράσης και επιλέχθηκαν οι συγκεντρώσεις που ήταν σε θέση να δώσουν ικανοποιητική ποσότητα ευκρινών προϊόντων. Η ευκρίνεια των ζωνών έδειξε να επηρεάζεται σε µεγαλύτερο βαθµό, από την συγκέντρωση του DNΑ. Τα διαφορετικά πρότυπα ενίχυσης στις διάφορες συγκεντρώσεις είναι σε ικανοποιητικό βαθµό επαναλήψιµα. Σύµφωνα µε τους McClelland & Welsh (1994) το DNA όταν είναι υψηλής ποιότητας πρέπει να δίνει επαναλήψιµα προφίλ ενίσχυσης όταν διαφοροποιείται η συγκέντρωση του µέχρι και 2 τάξεις µεγέθους. Ωστόσο αυτό µπορεί να οφείλεται και στο ένζυµο που χρησιµοποιείται. Έχει παρατηρηθεί κάποια ευαισθησία στη 40

42 συγκέντρωση του DNA όταν χρησιµοποιείται η Taq polyrase (wild type) (Dassanayake and Samaranayake, 2003). Oι Doulis, Harfouche & Aravanopoulos (2000) και οι Dassanayake and Samaranayake (2003) χρησιµοποίησαν για την ενίσχυση το Stoffel fragment (τροποποιηµένη Τaq πολυµεράση) το οποίο έδειξε να µην επηρεάζεται από τη συγκέντρωση του DNA γεγονός που το κάνει καταλληλότερο ένζυµο για την µέθοδο RAPD. Στην φωτογραφία φαίνονται οι διαφορές στους ζωνότυπους για 4 διαφορετικές συγκεντρώσεις DNA: φωτ.3.2: Eνίσχυση 4 διαφορετικών αραιώσεων του ίδιου DNΑ. Απο αριστερά προς δεξιά10ng, 20ng, 50ng, 100ng, µάρτυρας 100bp Μετά από τις βελτιστοποιήσεις επιλέχτηκαν οι εξής συγκεντρώσεις για το µείγµα της PCR: 25 µl µείγµατος αντίδρασης περιέχουν 2,5 µl 10X Buffer, 2 mm Mg 2+, 200 µm dntps, 200 nm εκκινητή, 0.75 U Taq πολυµεράση, 5 ng DNA. Για την εκτέλεση του προγράµµατος PCR χρησιµοποιήθηκε o θερµοκυκλωτής Eppendorf Mastercycler ep Gradient S. To πρόγραµµα είναι αυτό που χρησιµοποιήθηκε απο τους Gomez et al., (2001) µε τροποποιήσεις: 1 κύκλος: 2 λεπτά στους 95 C, 1 λεπτό στους 42 C, 2 λεπτά στους 72 C, 4 κύκλοι: 45 δεύτερα στους 95 C, 1 λεπτό στους 42 C, 2 λεπτά στους 72 C, 30 κύκλοι:30 δεύτερα στους 95 C, 45 δεύτερα στους 41

43 36 C, 1.5 λεπτό 72 C. Ακολουθεί ένα τελευταίο στάδιο για 8 λεπτά στους 72 C και στη συνέχεια η θερµοκρασία κατεβαίνει στους 15 C µέχρι να βγουν τα δείγµατα από το µηχάνηµα. vii. Ηλεκτροφόρηση Η ανάλυση των προϊόντων του πολλαπλασιασµού έγινε σε οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% w.v και προσθήκη EtBr (0,5 µg/ml). Η ποσότητα που ηλεκτροφορήθηκε απο το κάθε δείγµα ήταν 8 µl προϊόντος µαζί µε 2 µl loading buffer 6X. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε συνεχή ηλεκτρική τάση 5 volt/cm, ενώ το διάλυµα ηλεκτροφόρησης ήταν TBE 0,5x (Tris 0,54% w.v, βορικό οξύ 0,275% w.v., 0,01 M EDTA). Για τον προσδιορισµό του µεγέθους προϊόντων της PCR, χρησιµοποιήθηκε σκάλα γνωστών µοριακών µεγεθών, Ladder 123 bp της Sigma (D5042). Ο προσδιορισµός του µεγέθους έγινε των τµηµάτων έγινε µε το πρόγραµµα DNAsize (Raghava, 1994). viii. Ανάλυση γενετικών παραµέτρων και στατιστική ανάλυση Στην παρούσα εργασία γίνεται για πρώτη φορά ανάλυση µε δείκτες RAPD δέντρων P.peuce. Καθώς οι δείκτες RAPD παρουσιάζουν κυριαρχία την έκφραση τους, η εκτίµηση γενετικών παραµέτρων ποικιλότητας µπορεί να γίνει έµµεσα. (Lynch & Milligan, 1994). Η χρήση αυτών των δεικτών σε µικρό δείγµα µπορεί να είναι επισφαλής καθώς προκύπτουν σηµαντικά µεγαλύτερες τιµές γενετικής ποικιλότητας από ότι µε συγκυρίαρχους δείκτες (Lynch & Milligan, 1994). Στα κωνοφόρα είναι δυνατόν οι δείκτες RAPD να χρησιµοποιηθούν για την ανάλυση ενδοσπερµίου ο οποίος είναι απλοειδής ιστός που προκύπτει ως µειωτικό προϊόν του µητρικού γενοτύπου. (Gomez et.al, 2001 Bucci & Menozzi, 1993). Αν υποτεθεί ότι ισχύει µεντελικός διαχωρισµός για µια γονιδιακή θέση κατά τη µείωση (1:1) είναι δυνατόν αναλύοντας ικανό αριθµών απλοειδών ενδοσπερµίων να καταλήξουµε στον µητρικό γενότυπο. 42

44 Καθώς δεν υπάρχει βιβλιογραφία για εφαρµογή RAPDs σε δέντρα P.peuce δοκιµάστηκε ο διαχωρισµός 40 µειωτικών προϊόντων (ενδοσπερµίων) από ένα δέντρο του πληθυσµού τη Αριδαίας µε έναν εκκινητή. Χρησιµοποιήθηκε το κριτήριο του χ 2 για τη σύγκριση µε τις αναµενόµενες,σύµφωνα µε µεντελικό διαχωρισµό, συχνότητες (1 : 1). Για το χ 2 χρησιµοποιήθηκε λογιστικό φύλλο Excel (Microsoft ). Για την εύρεση των γενοτύπων κάθε ατόµου καταγράφηκαν αποκλειστικά καθαροί και ισχυροί ζωνότυποι RAPD. Για να εκτιµηθεί η επαναληψιµότητα η κάθε αντίδραση επαναλαµβανόταν και δεύτερη φορά µε άλλο µείγµα αντίδρασης. Για κάθε δέντρο των δύο πληθυσµών αναλύθηκαν 7 απολειδή ενδοσπέρµια. Με αυτό το τρόπο στάθηκε δυνατό να βρεθεί ο γενότυπος του κάθε ατόµου για κάθε γονιδιακή θέση µε στατιστική ασφάλεια ( p= ) και να αναχθούν σε συγκυρίαρχοι οι δείκτες RAPD. Καταρτίστηκε πίνακας των γενοτύπων για κάθε πληθυσµό σε λογιστικό φύλλο Excel, οι γενότυποι εισήχθεισαν στο λογισµικό PopGene (Yeh et al., 1997) και ακολούθησε στατιστική ανάλυση. Εξαιρέθηκαν απο την ανάλυση σπάνια αλληλόµορφα (συχνότητα < 0.1) που βρέθηκαν µόνο στον ένα πληθυσµό για αποφυγή υπερεκτιµήσεων που σχετίζεται µε το µικρό δείγµα (Szmidt et al., 1996) Υπολογίστηκαν: Το ποσοστό πολυµορφικών θέσεων, ο µέσος αριθµός αλληλοµόρφων ανα γονιδιακή θέση, η µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία κατά Νei (1973), και η παρατηρούµενη ετεροζυγωτία για κάθε γονιδιακή θέση. Για την αξιολόγηση των σχέσεων µεταξύ των πληθυσµών εκτιµήθηκαν οι δείκτες οµοµιξίας κατα Wright ( Fis, Fit, Fst) και η γενετική απόσταση κατά Nei (1978). 43

45 4. Αποτελέσµατα και Συζήτηση 44

46 Από τους 30 εκκινητές που δοκιµάστηκαν επιλέχτηκαν 7 οι οποίοι έδωσαν καθαρές και επαναλήψιµες ζώνες. Συνολικά προέκυψαν 35 γονιδιακές θέσεις εκ των οποίων οι 14 πολυµορφικές (40%). Τα προϊόντα της PCR που καταγράφηκαν ως γονιδιακές θέσεις, όπως εκτιµήθηκαν από το πρόγραµµα DNAsize µε βάση την κινητικότητα µάρτυρα, ήταν µεγέθους από 400 βάσεις έως 2090 βάσεις. Συνήθως στα κωνοφόρα, τµήµατα αρκετά µεγαλύτερα από 2000 βάσεις ή µικρότερα από 300 δίνουν µη επαναλήψιµα πρότυπα (Leibengouth & Shogi, 1997), κάτι που επιβεβαιώνεται και στην παρούσα εργασία. Για τον έλεγχο του µεντελικού διαχωρισµού χρησιµοποιήθηκε ο εκκινητής OPA-07 που είχε τρείς πολυµορφικές θέσεις, στο δέντρο 8 του πληθυσµού της Αριδαίας που βρέθηκε ετεροζυγωτικό και για τις τρεις αυτές θέσεις. Έλεγχος µεντελικού διαχωρισµού Για τις τρείς πολυµορφικές γονιδιακές θέσεις που προέκυψαν για τον εκκινητή OPA07 µετρήθηκε ο αριθµός ενδοσπερµίων µε το αλληλόµορφο Α (παρουσία) για κάθε θέση. Το αλληλόµορφο Α βρέθηκε: για την γονιδιακή θέση OPA07-1 σε 21 ενδοσπέρµια, για τη γονιδιακή θεση ΟPΑ07-2 σε 17 ενδοσπέρµια ενώ για την γονιδιακή θέση OA07-3 σε 16 ενδοσπέρµια τα αποτελέσµατα συνοψίζονται στον πίνακα 1: Πίνακας 1: Ανάλυση µεντελικού διαχωρισµού Γον. Θέση (Α:0) obs (Α:0) exp χ2 p OPA072 25:15 20:20 2,5 0,114 OPA076 16:24 20:20 1,6 0,206 OPA078 17:23 20:20 0,9 0,340 45

47 Ο µεντελικός διαχωρισµός επιβεβαιώνεται για όλες τις γονιδιακές θέσεις που εξετάστηκαν. Ο µεντελικός διαχωρισµός των τµηµάτων RAPD έχει επιβεβαιωθεί σε άλλες εργασίες που αφορούν πεύκα και άλλα κωνοφόρα (Bucci & Menozzi, 1993;Lu et al., 1995; Gomez et al., 2002) Στους παρακάτω πίνακες παρουσιάζονται οι συχνότητες αλληλοµόρφων για κάθε θέση και πληθυσµό (πίνακας 2), οι παράµετροι της γενετικής ποικιλότητας (πίνακας 3) για κάθε πληθυσµό, οι γενοτυπικές συχνότητες για κάθε θέση και πληθυσµό (πίνακας 4), ο έλεγχος ισορροπίας Hardy- Weindberg (πίνακας 5). Οι πίνακες των γενότυπων για κάθε άτοµο και κάθε θέση παρουσιάζονται στο παράρτηµα 2. Πίνακας 2 : Συχνότητες αλληλοµόρφων για κάθε γονιδιακή θέση στους δύο πληθυσµούς. ΣΥΧΝΟΤΗΤΕΣ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΩΝ Αριδαία Ροδόπη ΓΟΝ.ΘΕΣΗ A B Α Β OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA OPA

48 OPA OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPH OPH OPH OPH OPH OPH OPH

49 Πίνακας 3: Παράµετροι γενετικής ποικιλότητας. Πληθυσµοί A/L P He Ho Αριδαία % Ροδόπη % Πίνακας 4 : Γενοτυπικές συχνότητες στους δυο πλυθησµούς. ΓΕΝΟΤΥΠΟΙ Αριδαία Ροδόπη Γον. θέση (Α.Α) (Α.Β) (Β.Β) (Α.Α) (Α.Β) (Β.Β) OPA OPA OPA OPA OPA OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPH OPH

50 Πίνακας 5 : Έλεγχος ισορροπίας Hardy-Weindberg. Αριδαία Ροδόπη Γον. θέση χ 2 p G 2 p χ 2 p G 2 p OPA OPA OPA OPA OPA OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPE OPH OPH Το ποσοστό πολυµορφικών γονιδιακών θέσεων (40%) για τους δύο πληθυσµούς είναι χαµηλό σχετικά µε τιµές RAPDs σε µεσογειακά κωνοφόρα. Gomez et al., 2001; Lucic et al., 2010). Σε έρευνα µε RAPDs στα συγγενικά είδη P.monticola και P. strobus η τιµή αυτή προέκυψε εξίσου χαµηλή για τη P. strobus και πολύ χαµηλότερη στη P. monticola (9%) (Mehes et al., 2007). Το αποτέλεσµα βρίσκεται σε συµφωνία µε τη ισοενζυµική ανάλυση των ίδιων πληθυσµών (Βαϊτσόπουλος, 2009) 49

51 Η µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία στους δύο πληθυσµούς ήταν για την Αριδαία και για την Ροδόπη, τιµές πρακτικά ισοδύναµες. Οι τιµές αυτές είναι σχετικά µικρές σε σύγκριση µε αυτές που συναντάµε σε άλλα κωνοφόρα (Szmidt et al.,1995, Gomez et al., 2001) µε µεγαλύτερη όµως εξάπλωση. Οι Rajora et al. (1998) µε ισοένζυµα στη P.strobus βρήκαν µέση αναµενόµενη ετεροζυγωτία Η ετεροζυγωτία που έδειξαν οι δύο πλήθυσµοι δικαιολογείται απ το γεγονός ότι πρόκειται για ακραίους πληθυσµούς και από το µικρό υλικό έρευνας. Σε έρευνα µε RAPD στην Pinus contorta subsp. Latifolia, οι Fazekas & Yeh, (2001) βρήκαν σε ακραίους πληθυσµούς πανοµοιότυπες τιµές. Επίσης τα αποτελέσµατα έίναι σε συµφωνία µε αυτά που έχουν βρεθεί για είδη µε παρόµοια εξέλιξη, όπως έδειξαν αλλοενζυµικές αναλύσεις στις πενταβέλονες Pinus walichiana (Lee, 1998) και Pinus sibirica (Politov, 2004). Ο Politov (2004), ανέλυσε µε ισοένζυµα πενταβέλονα πεύκα του τµήµατος Strobus και υποτµήµατος Cembrae (P.sibirica, P.koraiensis, P. cembra και P. pumila) κατέληξε σε µέσες τιµές Ηe που κυµαίνονταν από έως Η ανάλυση των πληθυσµών της παρούσας διατριβής µε ισοένζυµα έδειξε χαµηλότερες τιµές (Βαϊτσόπουλος, 2009). Αυτό είναι πιθανώς αναµενόµενο λόγω της µεγαλύτερης γενετικής ποικιλότητας που γενικά προκύπτει µε τους RAPD. Οι παρατηρούµενες ετεροζυγωτίες δεν παρουσίασαν διαφορές στα δείγµατα Αριδαίας και Ροδόπης βρέθηκαν όµως αρκετά µικρότερες από τις αναµενόµενες και στις δύο περιπτώσεις ( για την Αριδαία και 0,1057 για τη Ροδόπη). O έλεγχος ισορροπίας HW µε το κριτήριο του χ 2 έδειξε και για τα δύο δείγµατα οτι ισχύει η ισορροπία για το 85% των γονιδιακών θέσεων. Στο δείγµα της Αριδαίας δεν βρέθηκαν σε ισορροπία οι θέσεις OPA07-6 και OPE09-4, ενώ στο δείγµα της Ροδόπης δεν βρέθηκαν σε ισορροπία οι θέσεις OPA01-4 και OPE01-6. Tα αποτελέσµατα πιθανώς οφείλονται σε δειγµατοληπτικό σφάλµα. Πρέπει να σηµειωθεί ότι για µικρό µέγεθος δείγµατος οι εκτιµήσεις µε τα κριτήρια χ 2 και G 2 είναι επισφαλείς. Για τις γονιδιακές θέσεις που ήταν εκτός ισορροπίας έγινε έλεγχος µε το διωνυµικό τεστ και για τις θέσεις OPΑ07-6 OPE09-4 και OPE01-6 οι διαφορές δεν βρέθηκαν στατιστικά σηµαντικές, στην περίπτωση της θέσης OPΑ01-4 οι διαφορές παρέµειναν στατιστικά σηµαντικές (p= 0.02). 50

52 Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι συντελεστές οµοµιξίας κατα Wright: Πίνακας 6. Γον.Θέση Fis Fit Fst OPA OPA012 **** **** OPA013 **** **** OPA OPA071 **** **** OPA OPA073 **** **** OPA074 **** **** OPA075 **** **** OPA OPA077 **** **** OPA OPA079 **** **** OPE011 **** **** OPE OPE OPE014 **** **** OPE OPE OPE091 **** **** OPE092 **** **** OPE093 **** **** OPE

53 OPE095 **** **** OPE OPE052 **** **** OPE OPE054 **** **** OPH021 **** **** OPH022 **** **** OPH023 **** **** OPH OPH OPH042 **** **** OPH043 **** **** Η µέση τιµή Fis βρέθηκε , τιµή που δείχνει έλλειψη ετεροζύγωτων. Ο Politov & Krutovsky (2004) βρήκαν αντίθετα περίσσεια ετεροζυγωτών σε όλα τα πενταβέλονα που εξέτασαν. Περίσσεια ετεροζύγωτων βρήκαν και οι Rajora et al. (1998) στην P.strobus. Οι Ελληνικοί πληθυσµοί της P.peuce είναι το νοτιότερο άκρο της εξάπλωσης του είδους. Ως επί το πλείστον οι πληθυσµοί αυτοί αποτελούνται από ελάχιστα δέντρα, πολλές φορές µάλιστα αποµονωµένα άτοµα. Σε τέτοιες περιπτώσεις είναι αναµενόµενος υψηλότερος βαθµός οµοζυγωτίας. Μεγαλύτερες τιµές Fis παρατήρησαν και οι Fazekas & Yeh (2001) σε ακραίους πληθυσµούς για την Pinus contorta. Ο συντελεστής διαφοροποίησης Fst έχει µέση τιµή Αυτό σηµαίνει, ότι εφόσον τα αποτελέµατα επιβεβαιωθούν απο ανάλυση σε µεγαλύτερο δείγµα, ότι το µεγαλύτερο µέρος της γενετικής ποικιλότητας (91%) βρίσκεται µέσα στους πληθυσµούς ενώ ένα µικρό µέρος (9%) µεταξύ των πληθυσµών. Πρέπει να τονιστεί όµως ότι αυτό το ποσοστό δεν είναι ασήµαντο ειδικά αν συνυπολογίσουµε την µέτρια γενετική ποικιλότητα των πληθυσµών. 52

54 Η γενετική απόσταση κατά Nei βρέθηκε τιµή που επιβεβαιώνει τα ευρήµατα της ισοενζυµικής ανάλυσης (Βαϊτσοπουλος, 2009). Συµφώνα µε αυτή τη µελέτη οι πληθυσµοί της Ροδόπης και της Αριδαίας ανήκουν σε δύο ξεχωριστούς οικοτύπους δυτικά και ανατολικά του ποταµού Αξιού και επιβεβαιώνουν τα ευρήµατα και άλλων ερευνητών (Nikota & Stamenkov 1970). Οι Nikota & Stamenkov διέκριναν τις παραπάνω δύο υποπεριοχές εξάπλωσης και µε βάση αυτές,καθόρισαν την ποικιλία typica και vermiculata. 53

55 5. Συµπεράσµατα 1) Για πρώτη φορά η P.peuce αναλύθηκε µε µοριακούς δείκτες. Έγινε ανάλυση µενδελικού διαχωρισµού και αναλύθηκαν οι παράµετροι γενετικής ποικιλότητας ( P, A/L, He). 2) Απο την ανάλυση του παρόντος δείγµατος οι δύο πληθυσµοί Αριδαίας και Ροδόπης, δείχνουν να διατηρούν υψηλή γενετική ποικιλότητα και πιθανή αιτία είναι ότι το είδος αποτελεί λείψανο της πρώιµης εξελικτικής περιόδου του τριτογενούς. Τα αποτελέσµατα αυτά όµως πρέπει να επιβεβαιωθούν απο µεγαλύτερο δείγµα. 3) Με βάση το υλικό έρευνας οι πληθυσµοί δείχνουν την τάση να διαφοροποιούνται σηµαντικά µεταξύ τους, γεγονός που, αν επιβεβαιωθεί απο ανάλυση µεγαλύτερου δείγµατος, µπορεί να δικαιολογηθεί από την αποµόνωσή τους και την προέλευση τους Ανατολικά και Δυτικά της λεκάνης του ποταµού Αξιού. (Vidakovic, 1997). 54

56 Βιβλιογραφία Aagaard J. E., Krutovskii K. V. and S. H. Strauss, RAPDs and allozymes exhibit similar levels of diversity and differentiation among populations and races of Douglas fir. Heredity, 81, pp Adams R. P., Demeke T. and H. A. Abulfaith RAPD DNA Fingerprints and terpenoids - clues to past migrations of Juniperus in Arabia and East Africa. Theoretical and Applied Genetics 87, pp Alexandrov, A.H.,1998. Pinus peuce Grsb. In: Enzyklopedie der Holzgewaech-se. ECOMED, Landsberg, Germany, III(1), pp Ali, I.F., Neale, D. and Marshall, KA.,1991 Chloroplast DNA restriction fragment length polymorphism in Sequoia sempervirens D. Don Endl., Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco, Calo-cedrus decurrens (Torr.), and Firms taeda L. Theoretical and Applied Genetics 81, pp Arnheim N., White T., Rainey W.E., Aplication of PCR: organismal and population biology. Bioscience, 40(3), pp Blada, I.,2000. Genetic variation in blister-rust resistance and growth traits in Pinus strobus xp. peuce hybrid at age 17:(Experiment 2).Silvae Genetica, 49, pp Bogunic, F., Muratovic, E., Brown, S.C., Siljak-Yakovlev,S.,2003. Genome size and base composition of five Pinus species from the Balkan region. Plant Cell Reports,22(1), pp Brown, A., Macaskill, G.,2005. Shoot Diseases of Pine. Information note. Forestry Commission, Edinburg, 6pp. Bucci, G. and Menozzi, P.,1993. Segregation analysis of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Picea abies Karst. Molecular Ecology, 2, pp Bucci, G., Menozzi, P.,1995. Genetic variation of RAPD markers in a Picea abies Karst. Population. Heredity, 75, pp Castiglione S., Wang G., Damiani G., Bandi C., Bisoffi S. and F. Sala, RAPD fingerprints for identification and for taxonomic studies of elite poplar (Populus spp.) clones. Theoretical and Applied Genetics 87, pp

57 Cato S.A.; Corbett G.E.; Richardson T.E.,1999. Evaluation of AFLP for genetic mapping in Pinus radiata D. Don. Molecular Breeding, 5 (3), pp Cernjavski, P., Nedjalkov, S., Ploshtakova, L., Dimitrov, I.,1959.Trees and shrubs in the forests of Bulgaria. Sofia, Zemizdat (in Bulgarian). Collignon, A.M., Van de Sype, H. and Favre, J.M., Geographical variation in random amplified polymorphic DNA and quantitative traits in Norway spruce. Canadian Journal Of Forest Research, 32, pp Critchfield, W.B., Little, E.L.,1996. Geographic distribution of the pines in the world. USDA Miscellaneous Publication no.991. Washington,DC: US. Department of Agriculture. Crowley,T.M.,Muralitharan,M.S.,Stevenson,T.W.,2003.Isolating conifers DNA: A superior polysaccharide elimination method.plant Molecular Biology Reporter, 21, pp. 97a-97d. Dassanayake, R. S., Samaranayake L. P., Randomly Amplified Polymorphic DNA Fingerprinting In: Bartlett,J. M. S. and Stirling, D.ed.2003 Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition Totowa, NJ:Humana Press Inc Dimitrov, M.,1978. The Macedonian pine. S., Zemizdat(in Bulgarian). Dobrev, R.,1992. Monoterpene composition of the essential oil in some populations of Macedonian pine (Pinus peuce Grisb)in Bulgarian. Dovrev, R.,1992. Monoterpene composition of the essential oil in some populations of Macedonian pine { Pinus peuce Griseb} in Bulgaria [in Bulgarian with English summary].nauka za gorata,29 (2), pp (in Bulgarian with English summary) Dobrev, R.,1998. Variation, genotypic stability and family heritability of height growth in 6-year-old seedlings of Macedonian pine {Pinus peuce Grisb} in a series of half-sib progeny trial plantations. Nauka za gorata,35(1-2), pp (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,1999. Genotype-enviroment interactions of height growth of the Macedonian pine half-sib progeny trialat the age of 10 years. Nauka za gorata,36(3-4), pp.3-14 (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,2000a. Genetic parameters of the traits of reproductive materials of the Macedonian pine {Pinus peuce Grisb.}. in Bulgaria. Nauka za gorata,37(4), pp (in Bulgarian with English summary). 56

58 Dobrev, R.,2000b. Height growth and heritability of height growth of the Macedonian pine {Pinus peuce Grisb.}in half progeny trials at the age of 10 years. Nauka za gorata,37(1), pp (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,2002a. Genetic correlations ad predicted genetic gains in total height from selection of provenances of Pinus peuce Grisb. tested in trial plantations at the age of 10 years. Silva alcanica,2(1), pp Dobrev, R.,2002b. Height growth and genetic parameters of height growth at 13 years of progenies from rapresentative provances of the Macedonian pine {Pinus peuce Grisb.)in Bulgaria. Nauka za gorata,39(3-4), pp.1-17 (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,2003. Genetic parameters of the traits of 1 year-old progeny of Macedonian pine {Pinus peuce Grisb.}in a nursery test. In: Proc.Int.Sci.Conf."50 years University of Forestry", series Forestry, pp (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,2005. Genetic correlations and expected genetic gain of height growth of 13 year-old progenies of Macedonian pine {Pinus peuce Grisb.}tested in experimantal trials. Nauka za gorata,42(3), pp (in Bulgarian with English summary). Dobrev, R.,2007. Quantitative genetic studies of rapresentative provenances of Pinus peuce Grisb.in Bulgaria. Dr.Sc.thesis, Forest Research Institute, Sofia(in Bulgarian). Nauka za gorata,29(2), pp (in Bulgarian with English summary). Doulis A. G., Harfouche A. L., and F. A. Aravanopoulos,2000. Rapid high quality DNA isolation from Cypress (Cupressus semprevirens L.) Needles and optimization of the RAPD marker Technique. Plant Molecular Biology Reporter, 17, pp Ellsworth, D. L., Rittenhouse, K. D., and Honeycutt, R. L. (1993) Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. BioTechniques 14, pp Falconer, D.S., Mackay, T.F.C.,1996. Intoduction to quantitative genetics.4th ed. Longmann & Co, London. Fazekas, A.J. and Yeh, F.C., Random amplified polymorphic DNA diversity of marginal and central populations in Pinus contorta subsp. latifolia. Genome, 44, pp

59 Fukarek, P.,1950. The natural distribution of Pinuw peuce in Balkan penisula. Godišnjak Biološkog Instituta u Sarajevu. Futuyma,D.J.,1986.EvolutionaryBiology.2 nd ed.sunderland, Massachusetts:Sinauer Associates, Inc. Ghosn, E.M., Aravanopoulos, F.A. and Doulis, A.G., An investigation of provenance molecular variation in Cupressus sempervirens L., based on individual and bulk DNA analysis. In: Proc. 2nd Balkan Botanical Congress, Istanbul, Turkey, May 14-18, pp Glaubitz, J.C. and Moran, G.F., Genetic tools: The use of biochemical and molecular markers. In: Young, A., Booshier, D. and Boyle, T. (eds.) Forest Conservation Genetics: Principles and Practice. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO) Publishing, Collingwood, Victoria, Australia, pp Gomez A., Alia R. and M-A Bueno, Genetic diversity of Pinus halepensis Mill. Populations detected by RAPD loci. Annals Of Forest Science, 58, pp Gomez A., Aravanopoulos F. A., Bueno M. A. and R. Alia, Linkage of Random Amplified Polymorphic DNA Markers in Pinus halepensis MILL. Silvae Genetica, 47(5-6), pp Groover A., Devey M., Fiddler T., Lee J., Megraw R., Mitchell- Olds T., Sherman B., Vujcic S., Williams C. and D. Neale, Identification of 71quantitative trait loci influencing wood specific gravity in an outbred pedigree of loblolly pine. Genetics, 138, pp Hagman, M., Mikkola, L.,1963. Observations on cross-self-, and interspecific pollinations in Pinus peuce Griseb. Silvae Genetica, 12, pp Hanover,G.W.,1992.Applications of terpene analysis in forest genetics.new Forests 6, pp Harfouche A.L., Aravanopoulos F. A., Doulis A. G. and S. Xenopoulos, Identification of RAPD markers assosiated with crown form in Cupressus sempervirens by bulked segregant analysis. Forest Genetics 7(3), pp Harris,H.,1966.Enzyme polymorphisms in man.proceedings of the Royal Society of London,B164, pp

60 Hartl, D.Clark, A.,1997.Principles of population genetics.3rd ed. Sunderland, Massachusetts:Sinauer Associates, Inc. Henning, P.,Steinborn, A.,Engewald, W.,1994. Investigation on the composition pf Pinus peuce needle oil by GC-MS and GC-GC-MS.Chromatographia,38 (11-12), pp Johnson, H.,1993. The international Book of Trees. London: Mitchell Beazley. Jovanovic, B.,1986. Pinus peuce. In: Flora Srbije. Belgadre, Serbian Academy of Sciences and Arts. Kaya, Z. and Neale, D.B.,1995. Utility of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers for Linkage Mapping in Turkish Red Pine (Pinus brutia Ten.). Silvae Genetica, 44(2-3), pp Kubelik, A. R. and Szabo, L. J.,1995. High-GC primers are useful in RAPD analysis of fungi. Current Genetics, 28, pp Lee S. W.,, Choi W. Y., Norbub, L., Pradhanb R Genetic diversity and structure of blue pine (Pinus wallichiana Jackson) in Bhutan Forest ecology and management 105(1-3), pp Leibenguth,F.,Shoghi,F.,1998.Anlysis of random amplified polymorphic DNA markers in three conifer species. Journal of Molecular Biology, 27, pp Lewontin,R.C.Hubby,J.L.,1966.A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations,genetics, 54, pp Li, C., Yea, F.C Construction of a framework map in Pinus contorta subsp. latifolia using random amplified polymorphic DNA markers. Genome, 44, pp Lines, R.,1985. The Macedonian pine {Pinus peuce Grisebach)in the Balk ans and Great Britain. Forestry, 58(1), pp Liston, A.,Robinson, W.A., Pinero, D., Alvarez-Buylla, E.R.,1999: Phylogenetics of Pinus (Pinaceae) Based on Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Region Sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution,11(1), pp Lu,M.Z.,Szmidt,A.E.,Wang,X.R.,1995.Inheritance of RAPD fragments in haploid and diploid tissues of Pinus sylvestris(l.). Heredity,74 pp Lucic, A., Mladenovic-Drinic, S., Stavretovic N., Isayev V., Lavadinovic,V., Ljubinko, R., Novakovic M., 2010.Genetic Diversity Of Austrian Pine (Pinus 59

61 Nigra Arnold) populations in Serbia revealed by RAPD. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 62 (2), pp Lynch, M. and Milligan, B Analysis of population genetic structure with RAPD markers. Molecular Ecology, 3, pp Mason, W.L.,Negussie, G., Hollingsworth, M.K.,1995. Seed pretreatments and nursery regimes for raising Macedonian pine (Pine peuce Grisb).Forestry, 68(3), pp McClelland, M. Welsh, J 1994 DNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR. Genome Research, 4, pp. S59-S65 Mehes M. S., Nkongolo K. K., Michael P., 2007.Genetic analysis of Pinus strobus and Pinus monticola populations from Canada using ISSR and RAPD markers: development of genome-specific SCAR markers, Plant Systematics and Evolution, 267, pp Mickovski, S. B.,Ennos, A.R.,2003. Anchorage and asymmetry in the root system of Pinus peuce. Silva Fennica,37(2), pp Milev, M., Petkova, K., Alexandrov, P., Iliev, N.,1999. Seeds of conifers species. S., Univ., of Forestry Publ. House, 124pp. (in Bulgarian). Mirov, N.T.,1967.The genus Pinus. New York: Ronald Press. Library of congress catalog card number: Mitchell, A.,1996. The trees of Britain. Harper & Collins Publ. Morgante M., Olivieri A.M., 1993 PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics Τhe Plant Journal 3 (1), pp Mueller Ulrich G., L. LaReesa Wolfenbarger, 1999AFLP genotyping and fingerprinting.trends in Ecology & Evolution, 14(10), pp Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., and Erlich, H. (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 51, pp Neale, J.L.,Trappe J.M.,Lu K.C.Bollen,W.B.,1967.Sterilization of red alder seedcoats with hydrogen peroxide.forest Science, 13, pp Nei, M., Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 70(12)(I), pp Nei, M., Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 89, pp

62 Nei, M.,1975.Molecular Population genetics and Evolution, Amsterdam:North Holland Publishing Company. Nelson, C.D., Kubisiak, T.L., Stine, M. and Nance, W.L. (1994). A genetic linkage map of Longleaf Pine (Pinus palustris Mill.) based on random amplified polymorphic DNAs. Journal of Heredity, 85(6), pp Nelson, C.D., Nance, W.L. and Doudrick, R.L. (1993). A partial genetic linkage map of slash pine (Pinus elliottii Engelm. Var. elliottii) based on random amplified polymorphic DNAs. Theoretical and Applied Genetics, 87 (1-2), pp Nikolov, S. C.,2007a. Study on the habitat selection by birds in mature and overmature Macedonian pine Pinus peuce forests in the Pirin National park,bulgaria. Acrocephalus,28, pp Nikolov, S.C.,2007b.Density and community structure of breeding birds in Macedonian pine Pinus peuce forests in Bulgaria. Avocetta, 31, pp Nikolov, S.C.,2009. Effect of stand age on bird communities in late - successional Macedonian pine forests in Bulgaria. Forest Ecology and Management, 257, pp Nkongolo, K.K., Michael, P. and Gratton, W.S.,2001. Genetic variation in Pinus banksiana populations from Sudbury (Ontario, Canada) Region. Silvae Genetica, 52(2), pp Normand,P.,Fortin,J.A.,1982.Comparison of six surface sterilizing for aenic germination of Alnus crispa.(ait.)pursh.canadian Journal of Forest Research,12, pp Panayotov, M.P., Yurukov, S.,2007. Tree ring chronology from Pinus peuce in Pirin Mts and the possibilities to use it for climate analysis. Phytology in Balcanica,13(3), pp Panayotov, M.P.,2007. Determination of avalanche events by analysis of tree rings of Pinus peuce. Econological Engineering and Environmental Protection, 1, pp (in Bulgarian with English summary). Peng, S.L., Li, Q.F. Li, D., Wang, Z.F. and Wang, D.P., Genetic Diversity of Pinus massoniana Reveald by RAPD Markers. Silvae Genetica. 52(2), pp Petrovska, D., Stamenkov, M,1987. Karyotype analysis of Pinus peuce Griseb. Sumarsrvo,33(1), pp

63 Plomion, C., Bahrman, N., Durel, C.E. and O Malley, D.M., Genomic mapping in Pinus pinaster (maritime pine) using RAPD and protein markers. Heredity, 74, pp Politov, D.V., Krutovsky K.V., 2004, Phylogenetics, Genogeography and Hybrdization of Five-needle pines in Russia and Neighboring countries. USDA Forest Service Proceedings RMRS-P-32. Ponoy, B., Hong, Y.-P., Woods, J., Jaquish, B. and Carlson, J.,1994 Chloroplast DNA diversity of Douglas-fir in British Columbia. Canadian Journal of Forest Research, 24, pp Popnikola, N., Jovancevic, M.,Vidakovic, M.,1978. Genetics of Pinus peuce Gris. Annates Forestales 7/6, pp Price, R., Listen, A. and Strauss, S., Phylogeny and systematics of Pinus. In: Richardson, D.M. (ed) Ecology and Biogeography of Pinus. Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp Raghava G.P.S.,1994. Improved estimation of DNA fragment length from gel electrophoresis using a graphical method. Biotechniques 17, pp Rajora O. P.., DeVerno, L., Mosseler, A. and Innes D.J.,1998. Genetic diversity and population structure of disjunct Newfoundland and central Ontario populations of eastern white pine (Pinus strobus). Canadian Journal of Botany, 76, pp Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.,1989.Ιn Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3. Scheepers, D., Eloy, M.C. and Briquet, M., Use of RAPD patterns for clone verification and in studying provenance relationships in Norway spruce (Picea abies). Theoretical and Applied Genetics,94, pp Sewell, M.M., Sherman, B.K. and Neale, D.B., A consensus map for loblolly pine (Pinus taeda L.). I. Construction and integration of individual linkage maps from two outbred three-generation pedigrees. Genetics, 151, pp Skov E., Timing of DNA extraction from megagametophytes for PCR during initial steps of seedling development in Picea abies (L.) KARST. Silvae Genetica 47 (5-6), pp Skov, E., Are RAPD-markers Reproducible Between Different Laboratories? A case study of Picea abies (L.) Karst. Silvae Genetica, 47, pp

64 Skov, E. and Wellendorf, H., A partial linkage map of Picea abies clone V6470 based on recombination of RAPD- markers in haploid megagametophytes. Silvae Genetica, 47(5-6), pp Sniezko, R.A.,Kegley, A.J., Danchok, R.,2008. White pine blister rust resistance in North American, Asian and european species-results from artificial inoculation trials in Oregon. Annals of Forest Research,51(1), pp Southern,E.M.,1975.Detection of specific frequencies among DNA fragments separated by gel electrophoresis.journal of Molecular Biology 98(3), pp Stefanoff, B., Ganchev, A Dendrology. S., Zemizdat (in Bulgarian). Strauss, S.H., Hong, Y.-P. and Hipkins, V.D. (1993) High levels of population differentiation for mitochondrial DNA haplotypes in Pinus radiata, muricata, and attenuata. Theoretical and Applied Genetics 86, pp Szmidt,A.E.,Wang,X.R,Lu,M.Z.,1996.Empirical asseessment of allozyme and RAPD variation in Pinus sylvestris (L.) using haploid analysis. Heredity, 76, pp Tsumura, Y., Yoshimura, K., Tomaru, N. and Ohba, K. (1995) Molecular phylogeny of conifers using RFLP analysis of PCR-amplified specific chloroplast genes. Theoretical and Applied Genetics 91, pp Van De Ven, W.T.G. and McNicol, R.J. (1995). The use of RAPD markers for the identification of Sitka spruce (Picea sitchesis) clones. Heredity, 75, pp Vicario, F., Vendramin, G.G., Rossi, P., Lio, P. and Giannini, R. (1995). Allozyme, chloroplast DNA and RAPD markers for determining genetic relationships between Abies alba and the relic population of Abies nebrodensis. Theoretical and Applied Genetics, 90, pp Vidakovic, M.,1991. Conifers.Morphology and variation. Zagreb:Graficki Zavod Hrvatske.ISBN: Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23(21), pp Wagner, D., Sun, Z-X, Govindaraju, D.R. and Dancik, B. (1991b) Spatial patterns of chloroplast DNA and cone morphology variation within populations of a Finns banksian- sympatric region. The American Naturalist 138, pp

65 Wagner, D.B., Nance, W.L., Nelson, C.D., Li, T., Patel, R.N. and Govindaraju, D.R., 1992 Taxo- nomic patterns and inheritance of chloroplast DNA variation in a survey of Pinus echinata, Finns elliottii, Pinus palustris, and Pinus taeda. Canadian Journal of Forest Research 22(5), pp Weber, J.L., May, P.E Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction American Journal of Human Genetics 44(3), pp White,T. Adams,T. Neale,D.,2007. Forest Genetics, Oxfordshire:CABI Publishing. Williams, J. G., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., and Tingey, S. V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research,18, pp Williams, R.C.,1989.Restriction fragment lenght polymorphism.year Book of Physical Anthropology. Wu J., Krutovskii K.V. and S.H. Strauss, Nuclear DNA diversity, population differentiation, and phylogenetic relationships in the California closed- cone pines based on RAPD and allozyme markers. Genome, 42(5), pp Yeh F. C., Yang R. C. and T. Boyle, POPGENE v. 1.21: Software for Population Genetic Analysis. University of Alberta, Edmonton, 28 pp. Zhelev, P., Gomory, D.,Paule, L.,2002:Inheritance and linkage of allozymes in a Balcan epidemic, Pinus peuce Griseb. Journal of Heredity, 93, pp Βαϊτσόπουλος Α., 2009 Εκτίµηση της Ποικιλότητας των δασικών πληθυσµών της Βαλκανικής πευκης µε ισοενζυµικούς δείκτες (Pinus peuce). Μεταπτυχιακή διατριβή, Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. 64

66 Παράρτηµα 1 Εικόνα 1: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPA01. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. Εικόνα 2: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPA07. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. 65

67 Εικόνα 3: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPΕ01. Διάδροµοι 1-4 & 5-9 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου.διάδροµος 6 µάρτυρας 100 βάσεων. Εικόνα 4: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPΕ05. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. 66

68 Εικόνα 5: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPA09. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. Εικόνα 6: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPΗ02. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. 67

69 Εικόνα 7: Πολυµορφικές ζώνες RAPD του εκκινητή OPΗ04. Διάδροµος 1 µάρτυρας 123 βάσεων.διάδροµοι 2-8 απλοειδή DNA από ενδοσπέρµια ενός ατόµου. 68