ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ: ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΕΣ

Transcript

1 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ: ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΕΣ Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Ph.D. Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών

2 ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ Μορφολογία Δομή-Σύσταση Τοπολογία Προέλευση Λειτουργία (οξειδωτική φωσφορυλίωση κ.ά.) Σχέση Δομής και Λειτουργίας Κυτταρικός θάνατος 2

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Generating energy (ATP) Creating ROS (reactive oxygen species) Regulating apoptosis Buffering calcium 1. Although mitochondria are present in every cell, they are found in high concentrations in the muscle cells that require more energy. 2. Ιmportant to maintain proper concentration of calcium ions within the various compartments of the cell 3. They play an important role in the process of programmed cell death. Unwanted and excess cells are pruned away during the development of an organism. The process is known as apoptosis. Abnormal cell death due to mitochondrial dysfunction can affect the function of the organ. ΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΡΑΤΟΥΝ ΤΑ ΜΥΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ (παραγωγή ΑΤΡ) ΚΑΙ ΤΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ (εμπλέκονται στην ΑΠΟΠΤΩΣΗ) 3

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενέργεια: Διατήρηση ζωής σύνθεση μακρομορίων (πρωτεϊνών DNA, RNA, πολυσακχαριτών, λιπιδίων κ.ά.) κίνηση μαστιγίων και βλεφαρίδων σύσπαση μυϊκών κυττάρων πολυμερισμός ινιδίων κυτταρικού σκελετού ενεργή μεταφορά ιόντων και ρυθμιστικών μορίων μέσω των μεμβρανών ενδοκύτωση και έκκριση ενζυμική κατάλυση κ.ά. Mit: Δεσμεύουν ενέργεια από τις τροφές (ενέργεια αποθηκευμένη στα βιομόρια τροφών) Σταθμοί παραγωγής ενέργειας του κυττάρου (Σταδιακή απελευθέρωση αποθηκευμένης ενέργειας) 4

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενέργεια: Εξελικτική διαδικασία (παραγωγή/χρήση): ΑΤΡ υδρόλυση ADP + P + 34 Kj (ενέργεια) ATP + H 2 O Τριφωσφορική αδενοσίνη ΑΤΡ: Κυτταρικό «καύσιμο», βραχυπρόθεσμη βιολογική «μπαταρία», ενεργειακό «νόμισμα» (10δις μόρια/ cell lifetime ευκαρυωτικά κύτταρα) 5

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Aναπνοή: 1. Φυσιολογική λειτουργία πνευμόνων, πρόσληψη Ο2 και αποβολή CO2 2. Φυσιολογική λειτουργία κυττάρων, οξείδωση των τροφών για την παραγωγή ενέργειας Αερόβια αναπνοή: Δημιουργία ΑΤΡ παρουσία Ο 2 -Οξειδωτικός παράγοντας, άριστος δέκτης e - (αληθινή αναπνοή) Αναερόβια αναπνοή: Δέκτες e - άλλα μόρια, εκτός Ο 2 (πχ. Fumarate), με χαμηλότερο αναγωγικό δυναμικό vs. Ο 2 παράγεται λιγότερη ενέργεια από κάθε μόριο που οξειδώνεται- ΛΙΓΟΤΕΡΟ ΑΠΟΔΟΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΑ Αερόβια αναπνοή: Ξεκινά στο cyt (glycolysis) Ολοκληρώνεται στο mit Αναερόβια αναπνοή: Ξεκινά στο cyt (glycolysis) Ολοκληρώνεται στο cyt 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αερόβια αναπνοή, κύκλος Krebs, οξειδωτική φωσφορυλίωση: θεμελιακές κυτταρικές λειτουργίες και διεξάγονται στο μιτοχόνδριο 7

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Φυτικά κύτταρα Αναπνοή + Φωτοσύνθεση: CO2 + ATP γλυκόζη Χλωροπλάστες: η ηλιακή ενέργεια παγιδεύεται και χρησιμοποιείται για την παραγωγή ΑΤΡ και NADPH, ενώ ταυτόχρονα γίνεται φωτόλυση του νερού και παράγεται οξυγόνο. Με την αναγωγική δύναμη του NADPH και την ενέργεια του ΑΤΡ, το CO 2 αφομοιώνεται και παράγεται γλυκόζη με μια σειρά αντιδράσεων που είναι γνωστές, ως κύκλος του Calvin. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιστορική διαδρομή: 1886, Altmann, συστατικά του κυττάρου (πράσινο του Janus, φωτονικό μικροσκόπιο) 1898, Benda, «μιτοχόνδριο» 1904, Meves, μιτοχόνδρια στα φυτικά κύτταρα 1934, Bensley και Hoerr, απομόνωση με υπερφυγοκέντρηση Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο 1952,G. Ρalade (ΟsO4), Κ.R. Ρorter, F. Sjostrand, κατανόηση βιοχημικών μηχανισμών, συσχέτιση δομής και λειτουργίας. PALADE George. The fine structure of mitochondria. Anat Rec Nov; 114(3):

10 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ 18-20% του συνολικού κυτταροπλασματικού όγκου του ευκαρυωτικού κυττάρου Aριθμός: στο συκώτι στη γιγάντια αμοιβάδα Chaοs chaοs στα ωοκύτταρα αμφιβίων 22% 11% 1% 66% νερό πρωτείνες λιπίδια νουκλεοτίδια και ιόντα 10

11 ΠΟΣΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Το 40% περίπου του cyt των μυϊκών κυττάρων της καρδιάς στον άνθρωπο καταλαμβάνεται από mit 11

12 ΚΑΤΑΝΟΜΗ Πολλά και μεγάλα σε κύτταρα που καταναλώνουν μεγάλα ποσά ενέργειας Σε θέσεις έντονης μεταβολικής δραστηριότητας η κατανομή των μιτοχονδρίων μέσα στα κύτταρα ακολουθεί σε πολλές περιπτώσεις την κατανομή των μικροσωληνίσκων (κινούμενες αλυσίδες, ανοσοφθορισμός, όχι παθητική μετακίνηση διαμέσου cyt ροής) Ομοιόμορφη ή πιο συγκεντρωτική κατανομή Αλλάζουν σχήμα και θέση ή παραμένουν μόνιμα σε συγκεκριμένες κυτταρικές περιοχές. Συνδέονται με άλλα κυτταρικά οργανίδια πχ. Yπεροξυσώματα Σε κύτταρα με έντονη πρωτεϊνοσύνθεση περιβάλλονται από ΕΔ 12

13 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Κύτταρα Θηλαστικών: Το σχήμα τους δεν είναι σταθερό (συνήθως είναι επίμηκες αλλαντοειδές ή σκωληκόμορφο) και οι διαστάσεις τους είναι 0,3-1 μm σε διάμετρο με 1-10 μm σε μήκος. (Σφαιρικό, ελικοειδές, αστεροειδές κλπ) Το σχήμα και το μέγεθος των μιτοχονδρίων ποικίλει ανάλογα με τον τύπο και τη μεταβολική κατάσταση και τις συγκεκριμένες λειτουργικές ανάγκες των κυττάρων, π.χ. περιβάλλουν το αξόνημα των μαστιγίων των σπερματοζωαρίων και έχουν κυλινδρική μορφή. διαρκής κίνηση και αλλαγή σχήματος (μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων και μικροκινηματογράφηση) 13

14 ΚΑΤΑΝΟΜΗ Κατά τη μίτωση: συγκεντρώνονται κοντά στη μιτωτική άτρακτο Στο τέλος της κυτταρικής διαίρεσης κατανέμονται σχεδόν εξίσου στα θυγατρικά κύτταρα Mitochondrial morphology is coordinated with the cell cycle. During metaphase, in which condensed chromosomes align in the middle of the cell, mitotic kinase Aurora A phosphorylates RALA, which relocalizes to mitochondria. This encourages the formation of a complex consisting of phosphorylated RALA, RALBP1and cyclin B CDK1 on mitochondria, and mediates the phosphorylation of DRP1. Finally, oligomeric DRP1 wraps around the mitochondrial surface and mitochondrial division ensues. (Υamano and Youle, Nature Cell Biology 13:1026, 2011) 14

15 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ 15 (*) essential for the optimal function of numerous enzymes that are involved in mitochondrial energy metabolism

16 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Εξωτερική μεμβράνη: διαπερατή στα περισσότερα μικρά μόρια και ιόντα, ΑΤΡ, ADP περιέχει οξειδωτικά ένζυμα (πχ. μονοαμινοξειδάση ΜAΟ) περιέχει «πρωτεΐνες μεταφοράς» που επιτρέπουν τη διέλευση μορίων με Μ.Β daltοns ή μικρότερο: πορίνες = σχηματίζουν υδρόφιλους διαύλους σε σχήμα βαρελιού περιέχει ένζυμα μετατροπής λιπιδικών μορίων που χρησιμοποιούνται στο mit χυμό. Εσωτερική μεμβράνη: ΜΟΝΟ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΗ ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΜΟΡΙΩΝ Υψηλού βαθμού εκλεκτική διαπερατότητα: ελεύθερα περνούν μόνο μόρια νερού (O2, CO2) και μερικά μόρια λιπαρών οξέων, αντίθετα, μόρια και ιόντα όπως τα NADH, ADΡ, AΤΡ, Κ+, Na+, Cl ΝΟ3, σάκχαρα, NAD+ NADΡ+ μπορούν και περνούν μόνο με τη βοήθεια πρωτεϊνών αντίθετης μεταφοράς Αρκετά ένζυμα του κύκλου του Κrebs (π.χ. ηλεκτρική αφυδρογονάση), της αναπνευστικής αλυσίδας (κυτοχρώματα b, c1, c, a, a3) και της σύνθεσης ΑΤΡ (F1, F0) 16

17 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Εξωτερική μεμβράνη Α. Μετά από απομόνωση και αρνητική χρώση. Κρυσταλλική δομή συστατικών (αμυδρά). Β. Επανασυγκρότηση με Η.Υ: κατανομή και μέγεθος μορίων Γ. Περίθλαση με ακτίνες Laser της δομής της Εικ. Α: ύπαρξη κρυσταλικότητας (συμμετρικές κηλίδες/βέλη) 17

18 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Εσωτερική μεμβράνη Αρνητική χρώση. Μισχωτά σφαιρίδια διαμέτρου 90A (βέλος) X Ένζυμα σύνθεσης ΑΤΡ Η κατανομή και ο αριθμός των πτυχώσεων αυξάνει σε περιπτώσεις αυξημένου ρυθμού οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Πρωτόζωα: σχηματίζει σωληνίσκους Κύτταρα ανώτερων ζώων: επιμηκυσμένα κυστίδια Μοιάζει με τη σύσταση της πλασματικής μεμβράνης βακτηρίων από την οποία πιθανολογείται ότι προέρχεται 18

19 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Μιτοχονδριακός χυμός ή μήτρα -MATRIX κοκκιώδης περιοχή που περικλείεται από τις πτυχώσεις εσωτερικής μεμβράνης Κοκκία ασβεστίου Ένζυμα (πχ. πυροσταφυλική αφυδρογονάση, κύκλου Krebs, οξείδωσης λιπαρών οξέων κλπ) DNA RNA ριβοσώματα 19

20 mtdna: Γενετικό υλικό mit μικρό ποσοστό του συνόλου του DNA του κυττάρου (1-2% στα ζωικά κύτταρα) Κυκλικό. Χωρίς ιστόνες (δεν οργανώνεται σε νουκλεοσώματα) Χωρίς εσώνια. Μικρού μήκους μη-κωδικές περιοχές Η αντιγραφή του γίνεται σε όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου κι όχι μόνο κατά τη φάση S Στα mit δεν υπάρχουν συστήματα επιδιόρθωσης DNA υψηλός ρυθμός μεταλλακτικότητας μεταβιβάζεται μητρικά (μόνο τα mit του ωαρίου χρησιμοποιούνται κατά την εμβρυογένεση) κωδικοποιεί για rrna, trna, mrnas για σύνθεση πρωτεϊνών στα mit ριβοσώματα 20

21 Γενετικό υλικό mit Αυτή η σύνθεση δεν επαρκεί για λειτουργικές/δομικές ανάγκες mit εισαγωγή μορίων από το cyt (πχ. κυτοχρωμική οξειδάση 13 υπομονάδες: 10 υπομονάδες συντίθενται στα cyt ριβοσώματα και 3 υπομονάδες στα mit) ΗΜΙΑΥΤΟΝΟΜΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ: διαθέτουν ανεξάρτητο γενετικό σύστημα αλλά είναι μερικώς ανεξάρτητα από τον πυρήνα καθώς το DNA τους δεν περιέχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για τη σύνθεση των συστατικών τους 21

22 Γενετικό υλικό mit mtdna: Μικρό μέγεθος Πολλαπλά αντίγραφα Παρουσία ROS στο mit Απουσία επιδιορθωτικών μηχανισμών Συσσώρευση λειτουργικά σημαντικών μεταλλαγών στο mtdna Υπεύθυνες για γενετικά νοσήματα στον άνθρωπο Μητρική κληρονομικότητα Συμπτωματολογία: ανάλογη % μεταλλαγμένων μορίων mtdna που περνούν στους απογόνους 50 σημειακές μεταλλαγές 100 ελλείψεις διαταραχής λειτουργικότητας mit Ενεργειακά απαιτητικοί ιστοί: καρδιά, μυς, νεφροί, εγκέφαλος 22

23 Γενετικό υλικό mit Μεταλλαγές σε ένζυμα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Σύνδρομο MELAS*.μυς Σύνδρομο MERRF*..εγκεφαλική αταξία, μυοπάθεια Σύνδρομο Leigh*..εγκεφαλοπάθεια, μυοπάθεια Χρόνια εξωτερική οφθαλμοπληγία του Leber (LHON)..μεγάλης έκτασης έλλειψη στο mtdna..πτώση βλεφάρων, εγκεφαλική αταξία, καρδιακή ανεπάρκεια, διαβήτη, αμφιβληστροειδοπάθεια Κληρονομική οπτική νευροπάθεια*..αιφνίδια τύφλωση Ρευματικά αυτοάνοσα νοσήματα (αυτοάνοση ηπατίτιδα, οξεία αυτοάνοση μυοκαρδίτιδα, προοδευτική συστηματική σκλήρυνση κλπ) 23

24 Γενετικό υλικό mit Οι πρωτεΐνες που διεκπεραιώνουν την έκφραση του mit γονιδιώματος εισάγονται από το Cyt Είναι διαφορετικές από αυτές που χρησιμοποιούνται στην έκφραση του πυρηνικού γονιδιώματος 24

25 Πρωτεΐνες mit Μιτοχονδριακές πρωτεΐνες 1) Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες των mit συντίθενται από ριβοσώματα της εσωτερικής mit μεμβράνης και ενσωματώνονται εκεί συν-μτφρ 2) Η μεταφορά πρωτεϊνών από το cyt στο mit γίνεται μετα-μτφρ: πρωτεΐνες μοριακοίσυνοδοί, πεπτίδια-στόχευσης, μεμβρανικές πρωτεΐνες υποδοχείς-σύμπλοκα Holt et al. Plant Methods :8 25

26 Βιογένεση mit Χρόνος ημιζωής mit 6-7 ημέρες Προέρχονται πάντα από προϋπάρχοντα οργανίδια (με διαίρεση) ( de novo σύνθεση ΛΥΣ και Υ) Αύξηση του όγκου και διαίρεση με διχοτόμηση Πειράματα με τριτιωμένη θυμιδίνη σε διάφορους χρόνους επώασης: οι αυτοραδιογραφικοί κόκκοι λιγοστεύουν ανά mit αλλά υπάρχουν πάνω από κάθε mit 26

27 (TMHMATIKH) ΕΝΔΟΣΥΜΒΙΩΤΙΚΗ ΘΕΩΡΙΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Προέλευση mit 1. Παράγονται από προϋπάρχοντα οργανίδια 2. Κυκλικό DNA όπως οι προκαρυωτικοί οργανισμοί και ομοιότητες στα γονίδια 3. Η σύσταση της εσωτερικής μεμβράνης μοιάζει με την πλασματική μεμβράνη των βακτηρίων 4. Η πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή mit μοιάζει με αυτήν των προκαρυωτικών οργανισμών 5. To αερόβιο βακτήριο Paracoccus denitrificans διαθέτει αλυσίδα μεταφοράς e- παρόμοια με του mit 6. Στη γιγαντιαία αμοιβάδα Pelomyxa palustris απουσιάζουν τα mit αλλά υπάρχουν αναπνευστικά ενδοσυμβιωτικά βακτήρια Προήλθαν συμβιωτικά: το mit προέκυψε με ενδοκυττάρωση ενός αερόβιου βακτηρίου από ένα αρχέγονο προκρυωτικό κύτταρο ξενιστή που δε χρησιμοποιούσε αποτελεσματικά το Ο2 πριν από τουλάχιστον 1δις χρόνια Πρώτο αρχέγονο αερόβιο ευκαρυωτικό κύτταρο 27

28 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1. Διάσπαση των τροφών σε μακρομόρια και ακολούθως σε απλά μόρια Όλα τα κύτταρα χρειάζονται συνεχώς παροχή γλυκόζης (ειδικά ο νευρικός ιστός). εισαγωγή στο μιτοχόνδριο Μιτοχ. χυμός Αcyl-CoA Τα πιο πολλά από τα άλλα θρεπτικά συστατικά μπορούν να μετατραπούν σε γλυκόζη (ή ανάλογα της) για την παραγωγή ΑΤΡ 28

29 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1. Διάσπαση των τροφών σε μακρομόρια και ακολούθως σε απλά μόρια 2. Σχηματισμός ενδιάμεσων καταβολισμού στα κύτταρα (ακετυλο-συνένζυμο Α, ΑΤΡ, NADH) πυροσταφυλικό Αcyl-CoA mit 3. Οξείδωση ακετυλο-συνένζυμου Α (παραγωγή CO2, H2O, NADH) και σχηματισμός ΑΤΡ μέσω της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων 29

30 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Παραγωγή ενέργειας με το μηχανισμό της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης: 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) από οξείδωση λιπαρών οξέων ή από μετατροπή πυροσταφυλικού. 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs: σχηματισμός 3x NADH, 1x FADH 2 και 1x GΤΡ. 3. Μεταφορά των ηλεκτρονίων που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τελικά στο Ο2, με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση). 4. Φωσφορυλίωση, δηλαδή παραγωγή AΤΡ από ADΡ και Ρi με είσοδο πρωτονίων στο μιτοχονδριακό χυμό διαμέσου της ΑΤΡ-συνθετάσης (ή F 0 F 1 ΑΤΡάσης). 30

31 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Κύριες μεταβολικές διεργασίες που επιτελούνται στα mit: Κύκλος του Krebs Mεταφορά e- Oξειδωτική φωσφορυλίωση ΜΗΤΡΑ ΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Οι μεταβολικές διεργασίες δε γίνονται τυχαία μέσα στο mit αλλά σε καθορισμένους χώρους: φυσική και λειτουργική διαμερισματοποίηση 31

32 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) από (1 α ) τη γλυκόλυση, (1β) την οξείδωση λιπαρών οξέων (1γ) το μεταβολισμό των πρωτεϊνών πυροσταφυλική αφυδρογονάση: πολύπλοκο ένζυμο, μεγέθους μεγαλύτερου από ένα ριβόσωμα, βρίσκεται στον μιτοχονδριακό χυμό ακετυλο-συνένζυμο Α: προέρχεται από μεταβολισμό γλυκόζης, λιπών, πρωτεϊνών 32

33 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1β. Μεταβολισμός λιπαρών οξέων Ο μεταβολισμός των λιπαρών οξέων ξεκινάει με το σχηματισμό ακυλο-συνενζύμου Α*. Αυτό μεταφέρεται στο μιτοχόνδριο μέσω της βιοχημικής οδού της ακυλο-καρνιτίνης και διασπάται σε ακετυλο-συνένζυμο Α με διαδοχικούς κύκλους β-οξείδωσης στο χυμό του μιτοχονδρίου 33

34 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ β-οξείδωση λιπαρών οξέων Γίνεται στο μιτοχονδριακό χυμό η είσοδος από το κυτταρόπλασμα διευκολύνεται με ειδικά διαμεμβρανικά μόρια της εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης σε κάθε κύκλο αποικοδομούνται 2 άτομα άνθρακα με ταυτόχρονη παραγωγή ακετυλοσυνένζυμου A, ενός μορίου NADH και FADH 2 34

35 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Λιπαρά οξέα και παραγωγή ενέργειας στα μιτοχόνδρια 1. Η οξείδωση των λιπαρών οξέων δημιουργεί πολλή περισσότερη ενέργεια από ότι ίση ποσότητα γλυκόζης πχ. η οξείδωση ενός μορίου παλμιτικού οξέος, με 16 άτομα άνθρακα, παράγει στο μιτοχόνδριο 131 μόρια ΑΤΡ 2. Υπάρχουν καλύτερες αποθήκες λιπών σε σχέση με αποθήκες γλυκόζης Τα αποθηκευμένα λίπη σε έναν οργανισμό φτάνουν για διατήρησή του στη ζωή επί ένα μήνα περίπου, ενώ το αποθηκευμένο γλυκογόνο (πχ. ηπατικά κύτταρα) επαρκεί μόλις για 1 μέρα) Τα ενεργειακά αποθέματα της γλυκόζης εξαντλούνται πολύ γρήγορα. Με την πάροδο του χρόνου η κύρια πηγή ενέργειας είναι η οξείδωση των λιπαρών οξέων. 35

36 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ (1γ) οι πρωτεΐνες και τα ελεύθερα αα μετατρέπονται με τρανσαμίνωση, οξειδωτική απαμίνωση κά μεταβολικές οδούς σε acetyl CoA (ή άλλα ενδιάμεσα μεταβολικά προϊόντα του κύκλου του Krebs) Το παραγόμενο acetyl CoA από τη β-οξείδωση, τη γλυκόλυση και το μεταβολισμό των πρωτεϊνών χρησιμοποιείται στη συνέχεια για τον κύκλο του Κrebs Κύκλος του Krebs: μεταβολική οδός στην οποία συγκλίνουν όλες οι κύριες καταβολικές οδοί του κυττάρου 36

37 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs και σχηματισμός CO2, 3 μορίων NADH, 1 μορίου FADH 2 και 1 μορίου GΤΡ Γίνεται στο μιτοχονδριακό χυμό CH 3 CΟΟH (ως ακετυλο-συνένζυμο Α) + 2H 2 Ο + 3NAD+ + FAD 2CΟ 2 + 3NADH + FADH 2 1. οξείδωση των ακετυλομάδων σε CΟ 2 2. ένα μόριο GΤΡ 3. μόρια NADH και FADH 2 : Ανηγμένα συνένζυμα: φορείς υδρογονοκατιόντων Η+ και ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας, τα οποία μεταφέρονται στην αναπνευστική αλυσίδα. 37

38 Krebs reactions transfer energy from the progressive oxidation of substrates to two types of energy carriers, NAD and FAD ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs και σχηματισμός 3 μορίων NADH, 1 μορίου FADH 2 και 1 μορίου GΤΡ οξαλοξικό κιτρική συνθετάση κιτρικό ακονιτάση ισοκιτρικό α-κετογλουταρικό ηλεκτρυλο CoA αποακυλίωση ηλεκτρικό οξυ ηλεκτρική αφυδρογονάση φουμαρικό φουμαράση μαλεϊκό μαλεϊκή αφυδρογονάση οξαλοξικό NADH, FADH 2 : δίνουν τα e - τους στην αναπνευστική αλυσίδα Αναγωγή Ο 2 σε Η 2 Ο Διαφορά [Η+] Ενεργοποίηση ΑΤΡάσης F 0 F 1 Παραγωγή ΑΤΡ 38

39 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 39

40 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 40

41 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 3. Μεταφορά των ηλεκτρονίων e- που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση). 41

42 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ CoQ: ΜΒ daltons (ουμπικινόνη) Κυτόχρωμα C ΜΒ 13kDa (περιφερική πρωτεΐνη) Ι: υπομονάδες ΜΒ 10 6 daltons ΙΙ: 4 υπομονάδες ΜΒ 132kDa ΙΙΙ: 9-11 υπομονάδες ΜΒ 560kDa ΙV: υπομονάδες ΜΒ 200kDa Αίμη, Fe, Cu 42

43 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Τα συστατικά της αναπνευστικής αλυσίδας εμφανίζουν διάχυση στο επίπεδο της μεμβράνης (~10 12 cm 2 /sec) (κυτόχρωμα c με διάχυση φωσφολιπιδίων, cm 2 /sec) Τα ένζυμα μπορούν να μεταβιβάζουν ηλεκτρόνια με ρυθμό ~1 ηλεκτρόνιο/20 msec 43

44 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Η αναγωγή του O 2 σε H 2 O δημιουργεί τη διαφορά συγκέντρωσης H + που ενεργοποιεί την ΑΤΡάση Μιτοχ. χυμός Μεταφορά των ηλεκτρονίων που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση). (Αυτά τα Η+ του ενδιάμεσου χώρου θα επαν-εισέλθουν στο μιτοχονδριακό χυμό στο επόμενο στάδιο διαμέσου της ΑΤΡ-συνθετάσης, Μέσω αυτής της ροής παράγεται AΤΡ από ADΡ και Ρi)). 44

45 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Ροή ηλεκτρονίων εγκαθίδρυση ηλεκτροχημικής διαβάθμισης μεταξύ μιτοχονδριακού χυμού και ενδιάμεσου χώρου ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Αναπνευστική αλυσίδα: σύστημα συζευγμένων οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων: τα ηλεκτρόνια μετακινούνται αυθόρμητα από ζεύγος ουσιών με χαμηλό οξειδο-αναγωγικό δυναμικό και μικρή συγγένεια για τα ηλεκτρόνια, προς ζεύγος ουσιών με υψηλό οξειδο-αναγωγικό δυναμικό και μεγάλη συγγένεια με τα ηλεκτρόνια. Στην πορεία αυτή συμβαίνει μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας, ικανής για τη σύνθεση αρκετών μορίων ΑΤΡ. 45

46 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Η μεταφορά των ηλεκτρονίων αρχίζει με τη συμμετοχή του συμπλόκου της NADH αφυδρογονάσης, όπου το ιόν υδριδίου (Η: ) αποβάλλεται από το NADH και αποδίδει ένα πρωτόνιο και δύο ηλεκτρόνια. Στη συνέχεια τα ηλεκτρόνια περνούν από μια ομάδα φλαβίνης που συνδέεται με το σύμπλοκο και από τα κέντρα σιδήρου-θείου για να καταλήξουν στην ουμπικινόνη. Επίσης, τα ηλεκτρόνια μπορούν να μπουν στην αναπνευστική αλυσίδα μέσω του FADH 2 και του συμπλόκου ΙΙ της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης, που αποδίδουν τα ηλεκτρόνια στην ουμπικινόνη. Το μικρό αυτό υδρόφοβο, ευδιάλυτο στη μεμβράνη μόριο αποδίδει τα ηλεκτρόνια στο σύμπλοκο των κυτοχρωμάτων b-c1, όπου ο φορέας των ηλεκτρονίων είναι πλέον το άτομο του σιδήρου που περιέχεται στα μόρια της αίμης. Το κυτόχρωμα παραλαμβάνει τα ηλεκτρόνια και τα μεταφέρει στην κυτοχρωμική οξειδάση. 46

47 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Τέσσερα ηλεκτρόνια από το κυτόχρωμα c και τέσσερα πρωτόνια που λαμβάνονται από το υδάτινο περιβάλλον μεταφέρονται σε ένα μόριο Ο 2 σχηματίζοντας δύο μόρια νερού. Κατά τη διαδικασία αυτή προκαλούνται αλλοστερικές μεταβολές στη στερεοδιάταξη του ενζύμου με αποτέλεσμα από μια πλευρική ιμιδαζολική ομάδα της επιφάνειας της οξειδάσης, να αντλούνται 4 πρωτόνια από το μιτοχονδριακό χυμό προς το διαμεμβρανικό χώρο δημιουργώντας την ηλεκτροχημική διαβάθμιση των πρωτονίων. 47

48 Κυτοχρωμική οξειδάση ΙV: υπομονάδες ΜΒ 200kDa Αίμη, Fe, Cu Η υπομονάδα Ι του ενεργού κέντρου του ενζύμου περιέχει ένα μόριο αίμης α, ένα μόριο αίμης α 3 και ιόν χαλκού που αποτελεί το κέντρο αντίδρασης με το οξυγόνο. Η υπομονάδα ΙΙ περιέχει το ιόν χαλκού, που δέχεται τα ηλεκτρόνια από το μόριο της αίμης του κυτοχρώματος c. 48

49 Κυτοχρωμική οξειδάση Περισσότερο από 95% του Ο2 που αναπνέουμε υφίσταται μία ενορχηστρωμένη αναγωγή σε νερό, σε μία αντίδραση που καταλύεται από την κυτοχρωμική οξειδάση του συμπλέγματος IV της ΑΑ: O 2 + 4e - + 4H + 2H 2 O Η κυτοχρωμική οξειδάση είναι ο τελικός αποδέκτης e- στην ΑΑ. ουσίες που αναστέλλουν τη δράση της ΚΟ (π.χ. CO) είναι πολύ τοξικές O κύριος ρόλος του Ο2 για όλους τους αερόβιους οργανισμούς είναι η λειτουργία του ως συλλέκτης/αποθήκη e- 49

50 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ 10 πρωτόνια μεταφέρονται διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης για κάθε ζευγάρι e- που μεταφέρεται από το NADH στο Ο 2 6 πρωτόνια μεταφέρονται διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης για κάθε ζευγάρι e- που μεταφέρεται από το FADH 2 στο Ο 2 1. διαβάθμιση ph: ph μιτοχονδριακού χυμού = 8.0 ph του διαμεμβρανικού χώρου = διαμεμβρανικό δυναμικό στις δύο πλευρές της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης: συσσώρευση q- στην πλευρά της μεμβράνης που βλέπει το μιτοχονδριακό χυμό και q+ στην πλευρά προς το διαμεμβρανικό χώρο. 50

51 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ 51

52 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Τα e- της αναπνευστικής αλυσίδας προκαλούν με την ενέργειά τους την έξοδο πρωτονίων, τα οποία με τη σειρά τους οδηγούν την F 0 F 1 AΤΡάση σε παραγωγή AΤΡ. Για κάθε ζευγάρι ηλεκτρονίων του NADH παράγονται 3 μόρια AΤΡ, ενώ δύο τέτοια μόρια παράγονται από το ζευγάρι ηλεκτρονίων του FADH 2. 52

53 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Τόσο τα μιτοχόνδρια, όσο και οι χλωροπλάστες αλλά και τα βακτήρια, χρησιμοποιούν τον ίδιο μηχανισμό (χημειώσμωση) που αρχίζει με ηλεκτρόνια υψηλής ενέργειας, που συντελούν στη δημιουργία της ηλεκτροχημικής διαβάθμισης των πρωτονίων και ολοκληρώνεται με τη σύνθεση του ΑΤΡ. 53

54 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Electron Transport Chain 54

55 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Παραγωγή ενέργειας με το μηχανισμό της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης: 4. Φωσφορυλίωση, δηλαδή παραγωγή AΤΡ από ADΡ και Ρi με είσοδο πρωτονίων στο μιτοχονδριακό χυμό διαμέσου της ΑΤΡ-συνθετάσης (ή F 0 F 1 ΑΤΡάσης). 55

56 56

57 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΤΡάση ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Parsons Fernadez-Moran, 1963 Παρατηρήθηκαν μικρά σφαιρίδια διαμέτρου 90 Α κολλημένα σε θραύσματα μιτοχονδριακών μεμβρανών Α. αρνητική χρώση εσωτερικής μεμβράνης- «μισχωτά σφαιρίδια» 90 Α Β. Απομονωμένα κυστίδια εσ.μιτοχ.μεμβρανών με «μισχωτά σφαιρίδια» (Racker, υπέρηχοι) ικανότητα για: μεταφορά e- και φωσφορυλίωση Γ. Απομόνωση σφαιριδίων με θρυψίνη/κλάσμα μεμβρανών Ικανότητα για: μεταφορά e- αλλά όχι φωσφορυλίωση (Fo) Υπόλοιπο κλάσμα: ένζυμα το σπουδαιότερο: συντελεστής καθίζησης F1 (υδρόλυση ΑΤΡ) 57

58 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΤΡάση ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ F1: υδρόλυση ΑΤΡ Λειτουργική ΑΤΡάση: F 1 κλάσμα + μεμβράνες με F 0 κλάσμα ΑΤΡάση F 1 F 0 : ΜΒ 500kDa 15% των πρωτεϊνών εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης Παρόμοια δομή/οργάνωση σε χλωροπλάστες/βακτήρια αντίγραφα/μιτοχόνδριο ηπατικού κυττάρου reverse itself and hydrolyze ATP to pump ions against an electrochemical gradient σύνθεση ΑΤΡ υδρόλυση ΑΤΡ μεταφορά e- 58

59 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ αποτελείται από δύο διακριτά τμήματα: α) μεμβρανικό = F 0, απαρτίζεται από τρεις τύπους πρωτεϊνικών υπομονάδων, a, b c, σε αναλογίες 1:2:12 και β) προεξέχον =F 1 τμήμα, απαρτίζεται από πέντε διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες, α, β, γ, δ και ε σε αναλογία 3:3:1:1:1. F 0 : υπομονάδες a, b (μίσχος που εκτείνεται προς την F1) και c Υπάρχουν και δύο έως πέντε επιπλέον πεπτίδια με άγνωστη λειτουργία. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες δημιουργούν ένα διαμεμβρανικό δίαυλο διαμέσου του οποίου περνούν τα πρωτόνια προς την F 1. 3α + 3β σφαιρική δομή με διάμετρο 12 nm, που ενώνεται με το σύμπλεγμα της F 0, μέσω των πρωτεϊνικών υπομονάδων γ (διαπερνά όλο το σύστημα), δ και ε (στέλεχος). Καταλυτικές υπομονάδες σύνθεσης ΑΤΡ: μία σε κάθε β υπομονάδα 59

60 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ 60

61 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Το σύμπλεγμα της ATP συνθετάσης είναι ένα μοριακός κινητήρας! Η ομάδα c/γ/ε περιστρέφεται (μοτέρ) σε σχέση με την ομάδα a/b/δ/α/β (η οποία είναι ακινητοποιημένη, στάτωρ) Ο κινητήρας τίθεται σε κίνηση από τη μεταφορά Η+ τα οποία διέρχονται από τον ενδιάμεσο χώρο στο matrix (χυμός) (chemiosmotic force) διαμέσου του πόρου Η+ του συμπλέγματος c. Η περιστροφή της υπομονάδας γ (που βρίσκεται σε επαφή με τις α/β) προκαλεί διαδοχικές αλλαγές στη στεροδιαμόρφωση του αυμπλόκου α/β με αποτέλεσμα την ενεργότητα σύνθεσης ATP (στην υπομονάδα β) 61

62 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα α3β3: Τα τρία σύμπλοκα α/β είναι πανομοιότυπα μεταξύ τους αλλά μπορούν να βρίσκονται σε 3 διαφορετικές καταστάσεις στερεοδιαμόρφωσης: 1. Open / Ανοιχτή: Χαμηλή συγγένεια σύνδεσης ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΑΝΕΝΕΡΓΗ 2. Loose /Χαλαρή: Χαλαρή σύνδεση ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΑΝΕΝΕΡΓΗ 3. Tight /ΣΦΙΧΤΗ: Υψηλή συγγένεια σύνδεσης ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΕΝΕΡΓΗ Η στεροδιαμόρφωση των 3 συμπλόκων α/β του «στάτωρα» καθορίζονται από τις ασύμμετρες αλληλεπιδράσεις τους με το «μοτέρ» (c, γ, ε) και αλλάζουν με κυκλικό, διαδοχικό τρόπο: Για να σχηματιστεί ένα μόριο ΑΤΡ απαιτείται η διέλευση 3Η+ μέσα από το δίαυλο ΑΤP synthase 62

63 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Ηλεκτροχημική σύζευξη προτάθηκε το 1961 από τον Ρeter Μitchell εξηγεί την παραγωγή AΤΡ με κινητήρια δύναμη τη διαφορά ph που δημιουργείται από τη μεταφορά ηλεκτρονίων. Απόδειξη: πείραμα στο ροδοβακτήριο Halοbacterium halοbium. Η πλασματική μεμβράνη βακτηρίου με τη βοήθεια μιας πρωτεΐνης (βακτηριοροδοψίνη) και την επίδραση φωτός, δημιουργεί μεγάλη συγκέντρωση Η + στο κυτταρόπλασμα. Aν γίνει σύζευξη των Η + αυτών με F 0 F 1 AΤΡάση από μιτοχόνδρια, παρατηρείται άμεση σύνθεση AΤΡ από ADΡ και Ρi. 63

64 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Χωρίς τα μιτοχόνδρια: τα ζωικά κύτταρα θα εξαρτιόνταν από τη γλυκόλυση για να παράγουν τα απαιτούμενα ποσά AΤΡ. Η γλυκόλυση είναι πολύ λιγότερο αποδοτική ενεργειακά σε σχέση με την οξειδωτική φωσφορυλίωση 2 vs. 36 mol ATP/ mol glucose 64

65 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Η διάσπαση ενός μορίου γλυκόζης, μέσω (i) γλυκόλυσης, (ii) κύκλου του Krebs και (iii) οξειδωτικής φωσφορυλίωσης 36 μόρια ΑΤΡ: Γλυκόζη + 36ΑDΡ + 36Ρi + 36Η + + 6Ο 2 6CΟ ΑΤΡ + 42Η 2 Ο Το καθαρό ενεργειακό κέρδος είναι περίπου 30 μόρια ΑΤΡ δεδομένης της ενεργειακής απώλειας για τη μεταφορά των μορίων ΑΤΡ από το μιτοχόνδριο στο κυτταρόπλασμα 65

66 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Τα μόρια AΤΡ που παράγονται διαπερνούν την εσωτερική και την εξωτερική μεμβράνη με αντίστοιχη είσοδο ADΡ. πρωτεΐνες αντίθετης μεταφοράς 1. HPO4 - OH 2. Μεταφορέας ΑΤΡ-ADP: διμερής πρωτεΐνη, ΜΒ 30 kda για την κάθε υπομονάδα, 10-15% των πρωτεϊνών της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης (από τις πιο άφθονες μιτοχονδριακές πρωτεΐνες) 66

67 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ σύνθεση ΑΤΡ vs. υδρόλυση ΑΤΡ Η συνθετάση ΑΤΡ έχει τη δυνατότητα να λειτουργεί και ως αντλία μεταφοράς Η+ αντίθετα από το ηλεκτροχημικό δυναμικό (κατανάλωση ενέγειας/υδρόλυση ΑΤΡ) Σε κάθε κύτταρο ενός οργανισμού κάθε μόριο AΤΡ υφίσταται αντιστρεπτή φωσφορυλίωση - υδρόλυση αρκετές χιλιάδες φορές την ημέρα. 67

68 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Αντιστρεπτή σύζευξη Σε ορισμένα βακτήρια (που αναπτύσσονται τόσο σε αερόβιες όσο και σε αναερόβιες συνθήκες) η λειτουργία του ενζύμου εξαρτάται από την παρουσία Ο2: Έλλειψη Ο2: το ένζυμο λειτουργεί ως αντλία μεταφοράς Η+ προς τον εξωκυττάριο χώρο έτσι ώστε να δημιουργείται κατάλληλη διαβάθμιση Η+ και να μπορεί το βακτήριο να εισάγει τις απαραίτητες θρεπτικές ουσίες. Διπλή λειτουργία: αντιστρεπτή σύζευξη 68

69 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ εκτός από τη σύνθεση ΑΤΡ: Θερμογένεση Η διαβάθμιση των πρωτονίων που δημιουργείται με τη διαμετακίνηση των e- μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή θερμότητας: Μεταβολική θερμογένεση Σε νεογέννητα (που δεν καλύπτονται από τρίχωμα), σε διαχειμάζοντα ζώα, σε ζώα που διαβιώνουν σε ψυχρά περιβάλλοντα (cold stress) Σε ορισμένα κύτταρα λιπώδους ιστού με μεγάλη διαπερατότητα mit σε Η+ και θερμογενίνη (διαμεμβρανική αντλία Η+) 69

70 1. Reactions that remove free energy are oxidation reactions; reactions that add free energy are reduction reactions 2. Enzymes facilitate oxidation and reduction reactions at the same time, by transferring free energy from one molecule to another; some energy is always lost in such transfers 3. Locations: Krebs reactions take place in the matrix; electron transport takes place on the inner membrane; (a gradient is maintained across the inner membrane); ATP synthesis takes place in the matrix as protons cross the inner membrane from the intermembrane space 4. Krebs reactions transfer energy from the progressive oxidation of substrates to two types of energy carriers, NAD and FAD 5. Energy carriers donate electrons and free energy to the electron transport system (ETS) 6. Electron transport always proceeds as fast as energy is removed from the gradient and cannot take place without pumping protons out of the matrix 7. electron transport is driven by the proximity of reduced and oxidized carriers, facilitating exchange of electrons and free energy 8. Oxygen consumption results from electron transport and does not require ATP synthesis 9. Protons entering the matrix through ATP synthase do not reduce oxygen ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 10. Proton pumping produces a chemiosmotic gradient that in turn restricts the rate of electron transport. The most important process that achieves the gradient is ATP synthesis 11. ATP synthase is not part of the electron transport system (ETS) 70

71 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Μιτοχόνδρια: calcium sensors and regulators, storage tanks of calcium ions Στο κυτοσόλιο η [Ca 2+ ] πρέπει να διατηρείται <10-7 Μ καθώς το μόριο αυτό είναι κρίσιμος ρυθμιστής πολλών κυτταρικών λειτουργιών Mitochondrial Ca 2+ uptake and release is central: 1. for the regulation of cellular Ca 2+ homeostasis 2. for the regulation of intramitochondrial enzymes concerned with the utilization of oxidizable substrates energy metabolism 3. excess Ca 2+ accumulation by mitochondria is a common event in the process of cell death, by both necrosis and apoptosis Το ηλεκτροχημικό δυναμικό χρησιμοποιείται επιπλέον για τη ρύθμιση της συγκέντρωσης του Ca 2+ στο κυτοσόλιο. Ca 2+ sequestration: άντληση Ca 2+ από το κυτταρόπλασμα στο μιτοχονδριακό χυμό 71

72 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ All membrane enclosed organelles (with the notable exception of nucleus and peroxisomes that appear to be in rapid, passive, equilibrium with the cytosol) are endowed with mechanisms that allow an energydependent Ca 2+ accumulation and a release dependent on the cation concentration gradient between the organelle lumen and the cytosol. Uptake mechanism: Ca 2+ pumps (i.e. enzymes that utilize ATP hydrolysis to drive Ca 2+ accumulation into the organelle lumen) Release channels: are controlled by different second messengers and allow channel opening* and Ca 2+ efflux into the cytoplasm (eg. phosphatidylinositols). 72

73 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Mitochondrial Ca 2+ accumulation and release: 1. do not need ATP for uptake 2. they utilize gated channels for Ca 2+ uptake and exchangers (Na + or H + /Ca 2+ exchangers) for release The driving force for Ca 2+ accumulation in the mitochondrial matrix is the membrane potential (negative inside) (ΔΨ) across the inner membrane The exchangers use the concentration gradient of Ca 2+, H + and Na + across the inner membrane to cause the release of Ca 2+ back into the cytosol maintenance of a low matrix Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ]) in resting cells and a rapid Ca 2+ accumulation by the organelle when cytosolic Ca 2+ is elevated during activation. Εισαγωγή Ca 2+ στο κυτοσόλιο παραγωγής ΑΤΡ (η διαφορά [Η + ] θα χρησιμοποιηθεί για άντληση των ιόντων Ca 2+ μέσα στα μιτοχόνδρια) (Putney and Thomas Curr Biol 16:R812, 2006) 73

74 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Components of the mitochondrial Ca 2+ homeostatic machinery MCU (mit Ca uptake), a gated Ca 2+ selective, ion channel, uniporter, 40kDa mncx (Na + /Ca 2+ exchanger) mhcx (H + /Ca 2+ exchanger) the electron transport chain complex, building up the electrical driving force for accumulation Patron et al., Journal of Biological Chemistry 288:10750, 2013 Main features of the MCU according to De Stefani et al (A, Nature 476:336, 2011) and Baughman et al (B Nature 476:341): MCU has two transmembrane domains (TM1 and 2) that spans the inner mitochondrial membrane (IMM) with the N- and C-termini facing the intermembrane space (IMS), according to (A) or the matrix (B). When reconstituted in lipid bylayers, MCU can mediate a Ca 2+ current (A). MICU1 that is reported to physically interact with MCU is also shown in (B). MCU most likely oligomerizes in the IMM, and evidence from De Stefani et al suggests that it forms a tetramer. 74

75 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Apoptosis (programmed cell death, PCD): αρχικά περιγράφηκε μορφολογικά αργότερα: μοριακά μονοπάτια Φυσιολογικός μηχανισμός ανάπτυξης και λειτουργίας ιστών (50% νευρικών κυττάρων πριν την τελική διαμόρφωση νευρικών δομών, 95% λεμφοκυττάρων κατά την ανάπτυξη/ωρίμανση ανοσολογικού συστήματος κλπ) 75

76 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία (σε όλα τα μετάζωα, φυτά και ζώα, νηματώδη C. elegans-άνθρωπος) Όχι κυτταρική λύση- Φαγοκυττάρωση αποπτωτικών κυττάτων από μακροφάγα προστασία παρακείμενων ιστών, κυττάρων από φλεγμονή Πότε συμβαίνει: αναπτυξιακά ελαττωματικά κύτταρα, κύτταρα που δεν εξυπηρετούν πια κάποιο σκοπό, περίσσειες κυττάρων, κύτταρα με διαταραχή κυτταρικού κύκλου, προσβεβλημένα από ιούς, μετά από χημειοθεραπεία κλπ Κρίσιμο ρόλο σε: ανάπτυξη, καρκίνο, φυσιολογική γήρανση και ασθένειες γήρατος πχ. Alzheimer s disease Στα mit βρίσκονται όλα τα απαραίτητα συστατικά για την έναρξη της απόπτωσης (cytc, κασπάσες, Bcl-2 κλπ) Συμμετέχουν στον κυτταρικό θάνατο 76

77 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Προγραμματισμένος Κυτταρικός Θάνατος Απόπτωση Τύπος Ι Αυτοφαγικός Κυτταρικός Θάνατος Τύπος ΙΙ Παράπτωση Έντοση* και 9 ακόμα τύποι Νεκρόπτωση Τύπος ΙΙΙ Νέκρωση Accidental Cell Death Αναπτυξιακά ελεγχόμενη διαδικασία Μικρός αριθμός κυττάρων ή ομάδες κυττάρων Ανέπαφη Κυτταρική Μεμβράνη Διαδοχή γεγονότων που απαιτεί την ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων Το κυτταρόπλασμα πακετάρεται σε αποπτωτικά σωμάτια Φαινομενικά ανεξέλεγκτος θάνατος Συνήθως οσμωτική διόγκωση και διάρρηξη της πλασματικής μεμβράνης και των οργανιδίων, το περιεχόμενο των οποίων διαχέεται στο εξωκυττάριο περιβάλλον προκαλώντας φλεγμονή Απαιτεί κατανάλωση ενέργειας (ATP) Δε δημιουργείται Φλεγμονή (*) Εntosis: cellular cannibalism (lymphoblasts) 77

78 Νέκρωση Accidental Cell Death irreversible injury to the cell Cell membranes swell and become permeable. Water influx Lytic enzymes destroy the cellular contents the cellular contents leak out into the intercellular space inflammatory response 78

79 Apoptosis in response to developmental or environmental cues or physiological damage detected by the cell's internal surveillance network Apoptotic death occurs in two phases: During the latent phase (λανθάνουσα), the cell looks morphologically normal but is actively making preparations for death. The execution phase (εκτελεστική) is characterized by a series of dramatic structural and biochemical changes that culminate in the fragmentation of the cell into membraneenclosed apoptotic bodies. Activities that cause cells to undergo apoptosis are said to be pro-apoptotic. Activities that protect cells from apoptosis are said to be anti-apoptotic. 79

80 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ γενικά χαρακτηριστικά Κυτταρική συρρίκνωση Blebbing κυτταρικής μεμβράνης Εξωτερίκευση PS Συμπύκνωση πυρήνα Θραύση DNA/συμπύκνωση χρωματίνης Αποπόλωση μιτοχονδρίων Ενεργοποίηση κασπασών Αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού Αποπτωτικά σωμάτια 80

81 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ 81

82 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Επάγεται διαμέσου 2 κύριων μονοπατιών: 1. Εμπλέκει τα Μιτοχόνδρια (εσωτερικό μονοπάτι-μιτοχονδριακό) DNA, mit damage, απουσία θρεπτικών ή σημάτων επιβίωσης, UV, χημικά κλπ 2. cell surface receptors: ενεργοποίηση υποδοχέων-θανάτου (εξωτερικό μονοπάτιμεμβρανικό) (πχ. cytotoxic T lymphocytes, έλεγχος πληθυσμού ανοσοποιητικών κυττάρων ) 1,2: Ενεργοποίηση κασπασών (τελεστές ΚΘ) (aspartate-specific cysteine proteases that are expressed as pro-enzymes) PS και «πέψη» αποπτωτικών κυττάρων από γειτονικά κύτταρα ή φαγοκύτταρα (αποφυγή κυτταρικής λύσης φλεγμονής) 82

83 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ κασπάσες Οι κασπάσες συνιστούν μια εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεασών, που διακρίνονται από την παρουσία κυστεϊνης στο ενεργό τους κέντρο και την υψηλή συγγένεια σύνδεσης με κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος στα υποστρώματα στόχους. 14 διαφορετικές κασπάσες στα θηλαστικά Εναρκτήριες κασπάσες: κασπάση -2, -8, -9 και -10. Ενεργοποιούν τις: Κασπάσες τελεστές: -3, Πρωτεόλυση λαμινών, επιδιορθωτικά ένζυμα DNA, κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες Θραύση DNA (caspase-activated Dnase (CAD), Normally inactive complex with the inhibitor of CAD (ICAD). During apoptosis ICAD is cleaved by casp3) Ρύθμιση ενεργότητας κασπασών από: ενδογενείς αναστολείς (πχ. members of the Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP) family) 83

84 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Ενεργοποίηση: με πρωτεολυτική θραύση ΑΝΕΝΕΡΓΟΣ ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗ κασπάσες ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ p20 ΠΕΡΙΟΧΗ p10 ΠΕΡΙΟΧΗ Asp Asp ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΤΡΟ ΑΥΤΟΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΣΕ ΘΕΣΗ Asp ΕΡΕΘΙΣΜΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ ΤΕΤΡΑΜΕΡΗΣ ENEΡΓΟΣ ΚΑΣΠΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗ 84

85 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ εξωτερικό μονοπάτι-μεμβρανικό Η ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΟΥ FASL ΣΤΟΝ ΥΠΟΔΟΧΕΑ FAS ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΗΝ ΣΤΡΑΤΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗΣ-8 ΣΤΟ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ, ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ ΤΟΝ ΕΝΔΙΑΜΕΣΟ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΗ FADD 85

86 intrinsic, mitochondria-mediated pathway Mitochondrial-mediated apoptosis Stimuli: Bax, UV, DNA damage, oxidants, chemotherapies, Ca2+ overload and ceramide OMM permeabilization release of mitochondrial apoptogenic factors (Cyto c, AIF, Smac/Diablo) from the IMS into the cytosol. The released Cyto c and Apaf-1 form the apoptosome together with procaspase-9, triggering caspase-9 activation which cleaves effector caspases, such as caspase-3. The effector caspases cleave cellular substrates and are responsible for destroying the cell from within, as well as bringing about the formation of apoptotic bodies. The extrinsic apoptotic pathway can activate the mitochondria-mediated intrinsic apoptotic pathway when caspase-8 cleaves Bid. Truncated Bid translocates to the mitochondria and activate the intrinsic apoptotic pathway. The pro-apoptotic molecule, AIF, also released from the mitochondria, is cleaved by calpains and/or cathepsins and translocates to the nucleus, leading to chromatin condensation. Smac/Diablo that is also released from the mitochondria, interacts with IAPs 86 (Inhibitor of Apoptosis Proteins), inhibitors of caspases.

87 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Αύξηση διαπερατότητας της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης («μεταβατικός πόρος» comprised of the matrix protein cyclophilin D, the inner mitochondrial membrane protein ANT, and the outer mitochondrial membrane protein voltage dependent anion channel (VDAC) - Mitochondrial Apoptosis Channel 1. Απώλεια κλίσης Η+ που δημιουργείται από την αναπνευστική αλυσίδα (αποσύζευξη οξειδωτικής φωσφορυλίωσης) 2. Είσοδος νερού στο μιτοχονδριακό χυμό και «φούσκωμα» μιτοχονδρίων 3. Ελευθέρωση αποπτωτικών πρωτεινών στο κυτοσόλιο Bax (κυτόχρωμα c, apoptosis inducing factor AIF, endonuclease G (DNA fragmentation, chromosomal condensation) Voltage- Dependent Anion Channel Mitochondrial Apoptosis Channel mitochondrial Permeability Transition Pore 87

88 BAX/BAK ARE RESPONSIBLE FOR MITOCHONDRIAL PERMEABILIZATION Bax is present in the cytosol as an inactive monomer in healthy cells Apoptotic stimulus induces Bax translocation to the outer mitochondrial membrane At the membrane, Bax oligomerizes and forms pores Facilitate MOMP release of cyt c, SMAC Activation of BAK by tbid Apoptosis animation 88