ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ BLAKESLEA TRISPORA ΣΕ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ. ΜΑΝΤΖΟΥΡΙ ΟΥ ΦΑΝΗ ΧΗΜΙΚΟΣ-M.Sc. in Food Biotechnology

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ βκαροτενιου ΑΠΟ ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ BLAKESLEA TRISPORA ΣΕ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΝΤΖΟΥΡΙ ΟΥ ΦΑΝΗ ΧΗΜΙΚΟΣM.Sc. in Food Biotechnology ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Τριαντάφυλλος Ρουκάς ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Τριαντάφυλλος Ρουκάς, Καθηγητής Παρθένα ΚοτζεκίδουΡουκά, Καθηγήτρια Μαρία ΛιακοπούλουΚυριακίδου, Καθηγήτρια Αικατερίνη ΤζαβέλλαΚλωνάρη, Καθηγήτρια ηµήτριος Κυριακίδης, Καθηγητής Χρήστος Παναγιωτίδης, Αναπλ. Καθηγητής Μαρία Γαλιώτου, Αναπλ. Καθηγήτρια ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

2

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η δυνατότητα βελτίωσης της απόδοσης και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το µύκητα Blakeslea trispora. Για το σκοπό αυτό, οι ζυµωτικές διεργασίες έγιναν σε ανακινούµενες φιάλες και σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε ασυνεχή ζύµωση βυθού και σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε ασυνεχή ζύµωση µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος. Στο αρχικό στάδιο της µελέτης αναπτύχθηκε µία βελτιωµένη µέθοδος ανάκτησης του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora. Το υγρό της ζύµωσης θερµαίνονταν στους C για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν σε 5.000g για 20 λεπτά. Ακολουθούσε έκπλυση του µυκηλίου µε αποσταγµένο νερό και φυγοκέντρηση του υγρού σε 5.000g για 20 λεπτά. Η εκχύλιση του βκαροτένιου έγινε µε προσθήκη 100 ml αλκοόλης/g ξηρού βάρους βιοµάζας σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm, σε θερµοκρασία 30 0 C. Το βκαροτένιο αποµακρύνονταν πλήρως από τα κύτταρα του µικροοργανισµού µετά από 3 διαδοχικές εκχυλίσεις. Το µεγαλύτερο ποσοστό του εκχυλισµένου βκαροτένιου παραλήφθηκε µετά το τέλος της πρώτης εκχύλισης (75,94%), ενώ η απόδοση της δεύτερης και τρίτης εκχύλισης ήταν σηµαντικά µικρότερες (16,62% και 7,44%, αντίστοιχα). Κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε επίπεδο κωνικών φιαλών µελετήθηκε η επίδραση του εµβολίου, της θερµοκρασίας, του ph, του φυσικού φωτός, της πηγής άνθρακα και αζώτου, των επιφανειοδραστικών ουσιών, των φυτικών ελαίων, των ακόρεστων λιπαρών οξέων, του αντιοξειδωτικού και διαφόρων πρόδροµων ουσιών και ενεργοποιητών στις κινητικές παραµέτρους της ζυµωτικής διεργασίας. Οι παράµετροι αυτοί ήταν η συγκέντρωση του βκαροτένιου, της βιοµάζας, των υπολειµµατικών σακχάρων και το ph του υγρού της ζύµωσης. Η µεγαλύτερη απόδοση της χρωστικής παρατηρήθηκε στο υπόστρωµα παραγωγής (ph 7,0) που εµβολιάστηκε µε ένα κοµµάτι άγαρ από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trispora, την 8 η ηµέρα της ζύµωσης στους 26 0 C και παρουσία φυσικού φωτός σε όλη τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η αντικατάσταση της γλυκόζης µε σακχαρόζη, άµυλο και γλυκερόλη µείωσαν την παραγωγή του βκαροτένιου, ενώ ο εµπλουτισµός του υποστρώµατος µε καλαµποκάλευρο, υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας ή στερεά

4 υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης οδήγησε σε µικρή αύξηση της χρωστικής. Αντίθετα, η προσθήκη γλυκόζης, εκχυλίσµατος καλαµποκιού, Span 20, Tween 80, ελαιόλαδου, βαµβακέλαιου, σογιέλαιου, ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης και αντιοξειδωτικού (βουτυλιωµένο υδροξυτολουόλιο, BHT) αύξησαν σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η µεταβολή της µορφολογίας του µικροοργανισµού µέσω ειδικού προγράµµατος µορφοµετρίας σε σχέση µε τη σύσταση του υποστρώµατος. Κατά τη διάρκεια του βιολογικού κύκλου του B. trispora ο θαλλός του µύκητα διαφοροποιείται σε βλαστικό και αναπαραγωγικό τµήµα. Το βλαστικό τµήµα βρίσκεται µε τη µορφή άθικτων µυκηλιακών υφών, µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων, ενώ επί του αναπαραγωγικού τµήµατος εµφανίζονται τα γαµετάγεια που φέρουν τα όργανα αναπαραγωγής (γαµέτες), από τα οποία µε συγχώνευση γενετικής ουσίας των πυρήνων τους προκύπτουν τα ζυγοσπόρια. Τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης έδειξαν ότι στο άριστο υπόστρωµα παραγωγής του βκαροτένιου το µεγαλύτερο ποσοστό της ξηρής βιοµάζας του µικροοργανισµού αντιστοιχούσε σε ζυγοσπόρια (79,84%), ενώ το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν πολύ χαµηλό. Η ολοκλήρωση της έρευνας για τη βελτιστοποίηση των παραµέτρων της ζυµωτικής διεργασίας σε επίπεδο κωνικών φιαλών, πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση στατιστικού µοντέλου πρόβλεψης, το οποίο βασίζεται στη µεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης. Με το παραπάνω µοντέλο ερµηνεύτηκαν σε ικανοποιητικό βαθµό οι επιδράσεις του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης και του αντιοξειδωτικού στη συγκέντρωση του βκαροτένιου και καθορίστηκε ο συνδυασµός των τιµών της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος (17,15 g/l), της κηροζίνης (39,25 g/l) και του αντιοξειδωτικού (9,04 g/l) του υποστρώµατος παραγωγής, ο οποίος επιτυγχάνει τη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (2,82g/l). Οι πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν από τις προαναφερθείσες πειραµατικές δοκιµές χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση ζυµώσεων στο επίπεδο του εργαστηριακού βιοαντιδραστήρα. Μελετήθηκε η επίδραση του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης, του αντιοξειδωτικού και του ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora και στη µορφολογία του µικροοργανισµού σε ασυνεχή ζύµωση. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η προσθήκη λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης ή αντιοξειδωτικού δεν

5 βελτίωσαν την απόδοση της χρωστικής, ενώ ευνόησαν το σχηµατισµό µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων. Επιπλέον, η συνεργιστική δράση του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού επέφερε µικρή αύξηση στην παραγωγή του βκαροτένιου. Η µεγαλύτερη παραγωγή του βκαροτένιου (1,57 g/l) παρατηρήθηκε µε τον εµπλουτισµό του υποστρώµατος µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου, βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό (BHT). Στο άριστο υπόστρωµα παραγωγής βκαροτένιου το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών, των κενών κυττάρων, των εκφυλισµένων κυττάρων και των ζυγοσπορίων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας ήταν 16,0%, 13,52%, 1,60% και 51,46%, αντίστοιχα. Η µελέτη για τη βελτίωση της αποτελεσµατικότητας της ασυνεχούς ζύµωσης σε ζυµωτήρα ανάδευσης συνεχίστηκε µε τη διερεύνηση της επίδρασης της ταχύτητας ανάδευσης του υποστρώµατος και της παροχής αέρα στο ζυµωτήρα στην παραγωγή του βκαροτένιου και στη µορφολογία του µικροοργανισµού. Βρέθηκε ότι οι παραπάνω παράγοντες επιδρούν σηµαντικά στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου, στη βιοµάζα και στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας. Με την προσαρµογή στατιστικού µοντέλου πρόβλεψης ερµηνεύτηκαν σε ικανοποιητικό βαθµό οι επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης και της παροχής αέρα στις παραπάνω παραµέτρους της ζυµωτικής διεργασίας και καθορίστηκε ο συνδυασµός των άριστων τιµών τους, ο οποίος τις επιτυγχάνει. Η µέγιστη τιµή της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (1,57 g/l) επιτεύχθηκε σε χαµηλές τιµές ταχύτητας ανάδευσης (150 rpm) και υψηλές τιµές παροχής αέρα (1,50 vvm), ενώ οι µέγιστες τιµές της παραγωγικότητας της χρωστικής (0,079 g/l.d) και της συγκέντρωσης της βιοµάζας (24,7 g/l) παρατηρήθηκαν σε υψηλές τιµές ταχύτητας ανάδευσης και παροχής αέρα (500 rpm, 1,29 vvm και 500 rpm, 1,43 vvm, αντίστοιχα). Επιπλέον, η µέγιστη τιµή του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (0,33 s 1 ) παρατηρήθηκε σε ταχύτητα ανάδευσης 500 rpm και παροχή αέρα 1,47 vvm. Η µορφολογία του µικροοργανισµού επηρεάζονταν σηµαντικά από την ταχύτητα ανάδευσης και την παροχή αέρα. Όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν µε υψηλή παροχή αέρα και χαµηλή ταχύτητα ανάδευσης ευνοούνταν ο σχηµατισµός µεγάλου αριθµού ζυγοσπορίων µε µέτριο µέγεθος, ενώ σε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης του υποστρώµατος ευνοούνταν ο σχηµατισµός µικρού αριθµού ζυγοσπορίων µε µεγάλο µέγεθος. Επίσης, η ανάπτυξη του µικροοργανισµού

6 σε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης ευνοούσε το σχηµατισµό µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων. Στο τελικό στάδιο της εργασίας διερευνήθηκε η δυνατότητα παραγωγής του βκαροτένιου µε τη µέθοδο της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος. Μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου έναρξης, της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας του ζυµωτήρα µε νέο υπόστρωµα καθώς και της σύστασης των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας στην παραγωγή βκαροτένιου. Η µέγιστη συγκέντρωση της χρωστικής (82,5 mg/l) επιτεύχθηκε όταν προστίθενταν συνεχώς στο ζυµωτήρα νέο υπόστρωµα από την αρχή της ζύµωσης, που περιείχε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα φυτικών ελαίων και χαµηλές συγκεντρώσεις αυξητικών παραγόντων (πρωτεϊνική πηγή αζώτου, βιταµίνες και ιχνοστοιχεία) µε ρυθµό παροχής 4,2 ml/h. Η µορφοµετρική ανάλυση των κυττάρων του µικροοργανισµού έδειξε ότι στο παραπάνω σύστηµα ζύµωσης ευνοείται ο σχηµατισµός υψηλών ποσοστών µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του Η 2 O 2 και της επαγωγής της δράσης των ελευθέρων ριζών στις παραπάνω συνθήκες που πιθανόν να προκαλούν αναστολή της δράσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου, καταστροφή της δοµής του κυτταρικού DNA και άλλες κυτταροτοξικές δράσεις. Τα παραπάνω δεδοµένα δείχνουν ότι το σύστηµα των ανακινούµενων φιαλών είναι το πλέον αποτελεσµατικό σύστηµα για την παραγωγή του βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora. Το σύστηµα της ασυνεχούς ζύµωσης έδωσε καλύτερα αποτελέσµατα ως προς τις βασικές παραµέτρους της ζύµωσης, σε σχέση µε το σύστηµα της ασυνεχούς ζύµωσης µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος.

7 SUMMARY In the present study the production of βcarotene from synthetic medium by mated cultures of B. trispora in submerged fermentation was investigated. For this purpose different fermentation systems were used such as shake flasks and stirred tank reactor (batch and fedbatch culture). At the beginning stage of this study an improved method for the extraction of βcarotene from B. trispora was developed. The fermentation broth was steamed at C for 20 min. βcarotene was removed from the biomass by extraction with absolute ethanol at a ratio of 1:100 at 30 0 C for 2 h in a rotary shaker incubator at 300 rpm. The carotenoid pigment was completely removed from the cells after three repeated extractions. The removal of βcarotene from B. trispora was higher during the first stage (75,94%), whereas in the second and third stage it was very low (16,62% και 7,44%, respectively). The effect of inoculum, temperature, ph, light, carbon and nitrogen source, nonionic surfactants, natural oils, fatty acids, inducers, precursors and antioxidant on βcarotene production by B. trispora in shake flask culture was investigated. The highest concentration of βcarotene was obtained in the medium (ph 7.0) inoculated with one loop of each culture after 8 days of fermentation, at 26 0 C, in the presence of daylight. Sucrose, starch and glycerol did not improve the production of β carotene, while corn meal, soy protein acid hydrolysate and distiller s solubles slightly increased the production of the pigment. On the other hand, glucose, corn steep liquor, Span 20, Tween 80, olive oil, soybean oil, cottonseed oil, oleic and linoleic acid, kerosene and antioxidant (butylated hydroxytoluene, BHT), significantly increased the production of βcarotene. Also, a semiautomated image analysis system was used to examine the relationship between morphological changes of the fungus and the composition of the production medium. B. trispora is a microfungus with a lifecycle involving hyphae (intact hyphae, vacuolated and evacuated cells and degenerated hyphae), zygophores and zygospores in submerged culture. As indicated from the results of the morphometric analysis, in the best production medium the growing mycelium was composed primarily of zygospores (79,84%), whereas the concentration of intact hyphae, vacuolated and evacuated cells and degenerated hyphae were very low. A central composite design was employed to

8 determine the maximum βcarotene production at optimum values for the process variables (linoleic acid, kerosene and antioxidant). The fit of the model was found to be good. Linoleic acid, kerosene and antioxidant had a strong linear effect on β carotene production. The concentration of βcarotene was significantly affected by linoleic acidkerosene and linoleic acidantioxidant interactions as well as by the negative quadratic effects of these variables. The interaction among keroseneantioxidant had no significant linear effect. The maximum βcarotene concentration (2.82 g/l) was obtained at concentrations of linoleic acid (17.15 g/l), kerosene (39.25 g/l) and antioxidant (9.04 g/l). The effect of linoleic acid, kerosene, antioxidant and a mixture of natural oils (olive oil, soybean oil, and cottonseed oil) on the production of βcarotene by B. trispora and the morphological characteristics of the fungus in a stirred tank reactor were investigated. The mixture of linoleic acid and antioxidant improved slightly the production of βcarotene, while the addition of linoleic acid, kerosene or antioxidant alone to the medium had an inhibiting effect on βcarotene production. The addition to the medium of a mixture of natural oils and antioxidant increased significantly the concentration of the pigment. B. trispora formed hyphae, zygophores and zygospores during βcarotene production. Morphology of the fungus was studied during growth in submerged culture in a stirred tank reactor under different compositions of the production medium using an image analysis system. Zygospores are the morphological forms, which are responsible for pigment production. Maximum β carotene concentration (1,57 g/l) was obtained in culture grown in medium supplemented with 10,0 g/l each one of olive oil, soybean oil, cottonseed oil and 2,5 g/l of antioxidant. In this case, the morphological characteristics of B. trispora recorded showed intact hyphae, evacuated cells, degenerated hyphae and zygospores in percentages of about 16,0%, 13,52%, 1,60% και 51,46%, respectively, in the biomass dry weight. The effect of aeration rate and agitation speed on βcarotene production and morphology of B. trispora in a stirred tank reactor was investigated. Both aeration and agitation significantly affected βcarotene concentration, productivity, biomass and the volumetric mass transfer coefficient (K L a). The highest βcarotene concentration (1.57 g/l) was obtained at low impeller speed (150 rpm) and high aeration rate (1.5 vvm). Also, maximum productivity (0.079 g/ld) and biomass dry weight (24.7 g/l) were achieved at high agitation speed and aeration rate (500 rpm,

9 1.29 vvm and 500 rpm, 1,43 vvm, respectively). The highest value of K L a (0.33 s 1 ) was observed at high agitation speed (500 rpm) and high aeration rate (1.47 vvm). The experiments were arranged according to a central composite statistical design. Response surface methodology was used to describe the effect of impeller speed and aeration rate on the most important fermentation parameters. In all cases, the fit of the model was found to be good. All fermentation parameters (except biomass concentration) were strongly affected by the interactions among the operation variables. βcarotene concentration and productivity were significantly influenced by the aeration, agitation, and by the positive or negative quadratic effect of the aeration rate. Biomass concentration was principally related to the aeration rate, agitation speed, and the positive or negative quadratic effect of the impeller speed and aeration rate, respectively. Finally, the volumetric mass transfer coefficient was characterized by the significant effect of the agitation speed, while the aeration rate had a small effect on K L a. Microscopic examination showed that at high aeration rate (1.5 vvm) and low agitation speed (150 rpm) was observed a great number of zygospores with long diameter, while at high aeration rate and agitation speed (1.5 vvm, 500 rpm) a small number of zygospores with extremely wide diameter were observed. At intermediate values of aeration rate and impeller speed (1.0 vvm, 325 rpm) was observed a common number of zygospores with average diameter. The maximum concentration of βcarotene (1.57 g/l) was observed at the same conditions where the highest percentage of zygospores in the biomass dry weight were observed. At the final stage of this study the potential of fedbatch culture as fermentation system for βcarotene production from a chemically defined medium by B. trispora was investigated. The effect of the feeding medium composition, time of addition of feeding medium, feeding rate and fermentation system on the production of βcarotene was studied. Also, a semiautomatic image analysis system was used to determine the morphology of the microorganism, and a correlation between morphology of the fungi and the concentration of the pigment was proposed. The maximum βcarotene concentration (82,5 mg/l) was obtained using the best batch medium found in previous experiments and the feeding medium containing natural oils at concentration 1% of each one and low concentration of growth factors (amino acids, vitamins and minerals) at feeding rate of 4,2 ml/h from the beginning of the fermentation. High percentages of vacuolated hyphae, evacuated cells and degenerated hyphae of the microorganism were observed during the fermentation.

10 This was due to the formation of high amount of reactive oxygen species (e.g. superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical) under conditions of exogenous oxidative stress, by exposure of the microorganism to high dissolved oxygen concentration. These oxidants have a detrimental function in the microorganism mediating damage of cellular membranes and enzymes, DNA damage, mutagenesis and inhibition of membrane transport processes. The above results showed that shake flask culture was the best fermentation system for the production of βcarotene from synthetic medium by B. trispora. Further investigation should focus on the improvement of βcarotene production under batch and fedbatch conditions in a larger fermentation scale.

11 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Επεξεργασίας και Μηχανικής Τροφίµων του Τοµέα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Την επίβλεψη της διατριβής είχε ο Καθηγητής του Τµήµατος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κ. Τριαντάφυλλος Ρουκάς, τον οποίο ευχαριστώ θερµά για την καθοδήγηση και την ενθάρρυνση που µου παρείχε καθώς και για τις πολύτιµες ιδέες και συµβουλές του κατά την εκπόνηση και τη συγγραφή της εργασίας αυτής. Η συµµετοχή του στην πραγµατοποίηση της διατριβής ήταν καταλυτική αφού συνέβαλλε σηµαντικά στην επίλυση τόσο επιστηµονικών όσο και άλλων προβληµάτων µε σκοπό την επικέντρωση µου στην έρευνα. Ιδιαίτερα ευχαριστώ το µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής µου επιτροπής κ. Παρθένα ΚοτζεκίδουΡουκά, Καθηγήτρια του Τµήµατος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, για την ενεργή, συνεχή και ανεκτίµητη συµµετοχή της σε όλες τις φάσεις διεξαγωγής αυτής της εργασίας καθώς και για το έντονο ενδιαφέρον της, το οποίο αναβάθµισε και διευκόλυνε την παρούσα εργασία. Επίσης, ευχαριστώ το µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής µου επιτροπής κ. Μαρία ΛιακοπούλουΚυριακίδου, Καθηγήτρια του Τµήµατος Χηµικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, για τις πολύτιµες συµβουλές και παρατηρήσεις κατά τη διεξαγωγή αυτής της εργασίας. Τις ευχαριστίες µου θέλω να εκφράσω στον κ. ηµήτρη Κυριακίδη, Καθηγητή του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, για τις πολύτιµες συµβουλές του. Επίσης, ευχαριστώ όλους τους µεταπτυχιακούς φοιτητές του Εργαστηρίου Επεξεργασίας και Μηχανικής Τροφίµων και του Εργαστηρίου Υγιεινής και Μικροβιολογίας Τροφίµων του Τοµέα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, για την υποστήριξη τους κατά τη διάρκεια της διατριβής.

12

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ... σελ. VIII ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ... XII ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ... XX ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΩΝ ΕΡΓΑΣΙΩΝ... XXIV ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Μικροοργανισµοί που Χρησιµοποιούνται για την Παραγωγή βκαροτένιου Μύκητες Ζύµες Βακτήρια Άλγη Ιστοκαλλιέργειες Βιοσύνθεση βκαροτένιου Γενετική Τροποποίηση Μικροοργανισµών που Χρησιµοποιούνται για την Παραγωγή βκαροτένιου aπαράγοντες που Επηρεάζουν την Παραγωγή βκαροτένιου Θρεπτικά Συστατικά και Ιχνοστοιχεία Επιφανειοδραστικές Ουσίες και Αντιοξειδωτικά Ενεργοποιητές Αναστολείς ph Θερµοκρασία Ακτινοβολία I

14 2.4.8 Χρόνος Ζύµωσης Αερισµός και Ανάδευση Μέθοδοι Ζύµωσης που Χρησιµοποιούνται για την Παραγωγή βκαροτένιου Ασυνεχής Ζύµωση Βυθού Ανακινούµενες Φιάλες Ζυµωτήρας µε Σύστηµα Ανάδευσης Βιοαντιδραστήρας Στήλης Ασυνεχής Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος aΑνάκτηση και Καθαρισµός του βκαροτένιου aΕµπορική Αξιολόγηση της Παραγωγής βκαροτένιου µε αααμικροοργανισµούς ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Στελέχη Μικροοργανισµών που Χρησιµοποιήθηκαν για την Παραγωγή βκαροτένιου Περιγραφή Στελεχών ιατήρηση Στελεχών Βελτιστοποίηση της Εκχύλισης του βκαροτένιου από τα Κύτταρα του B. trispora Ανάπτυξη Εµβολίου Υπόστρωµα Παραγωγής και Συνθήκες Ζύµωσης Μέθοδοι Εκχύλισης Κατεργασία του Υγρού Ζύµωσης πριν την Εκχύλιση του βκαροτένιου Παραγωγή βκαροτένιου απo Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ανακινούµενες Κωνικές Φιάλες Ανάπτυξη Εµβολίου Επίδραση των Παραγόντων της Ζύµωσης στην Παραγωγή βκαροτένιου Συγκέντρωση Εµβολίου Αρχικό ph Θερµοκρασία II

15 Χρόνος Φωτισµός Σύσταση του Υποστρώµατος Πηγή Άνθρακα Πηγή Αζώτου Επιφανειοδραστικές Ουσίες και Αντιοξειδωτικά Φυτικά Έλαια και Ακόρεστα Λιπαρά Οξέα Πρόδροµες Ουσίες και Ενεργοποιητές Αναλυτικοί Προσδιορισµοί Προσδιορισµός Βιοµάζας Προσδιορισµός Σακχάρων Προσδιορισµός ph Προσδιορισµός βκαροτένιου Προσδιορισµός Υπεροξειδίου του Υδρογόνου Ανάπτυξη Μαθηµατικού Μοντέλου Πολλαπλής Παλινδρόµησης µε τη Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης Πειραµατικός Σχεδιασµός Συλλογή εδοµένων Ανάλυση εδοµένων και Μαθηµατική Περιγραφή Αξιολόγηση του Μοντέλου Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας Περιγραφή του Συστήµατος που Χρησιµοποιήθηκε για τη Ψηφιακή Απεικόνηση και Επεξεργασία της Εικόνας Βασικές Παράµετροι της Μορφοµετρικής Ανάλυσης της Ψηφιακής Εικόνας Παραγωγή βκαροτένιου από Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης Περιγραφή της Συσκευής Προετοιµασία του Υποστρώµατος και Συνθήκες Καλλιέργειας του Μικροοργανισµού Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος στην Παραγωγή βκαροτένιου III

16 3.4.4 Επίδραση του Αερισµού και της Ανάδευσης στην Παραγωγή βκαροτένιου ψΠροσδιορισµός Συγκέντρωσης και Παραγωγικότητας βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, Η 2 Ο 2, ph, ιαλυτού Οξυγόνου και Κατανάλωσης Σακχάρων Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε αψηφιακή Ανάλυση Εικόνας Ανάπτυξη Μαθηµατικών Μοντέλων Πολλαπλής Παλινδρόµηση µε τη Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης Πειραµατικός Σχεδιασµός Συλλογή εδοµένων Ανάλυση εδοµένων και Μαθηµατική Περιγραφή Αξιολόγηση του Μοντέλου Παραγωγή βκαροτένιου από Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος σε Ζυµωτήρα Αναδεύσεως Περιγραφή της Συσκευής Συνθήκες Ανάπτυξης Μικροοργανισµού και Αρχή Λειτουργίας της Ασυνεχούς Ζύµωσης Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος ααΠροσδιορισµός Συγκέντρωσης και Παραγωγικότητας βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, Η 2 Ο 2, ph, ιαλυτού Οξυγόνου και Κατανάλωσης Σακχάρων Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Βελτιστοποίηση της Εκχύλισης του βκαροτένιου από τα Κύτταρα του B. trispora Επίδραση του Χρόνου Επίδραση της Θερµοκρασίας IV

17 4.1.3 Επίδραση της Συγκέντρωσης της Αιθανόλης και της Αναλογίας Όγκου Αιθανόλης/Ξηρού Βάρους Βιοµάζας Επίδραση των ιαδοχικών Εκχυλίσεων Επίδραση της Κατεργασίας του Υγρού της Ζύµωσης Παραγωγή βκαροτένιου απo Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ανακινούµενες Κωνικές Φιάλες Επίδραση του Εµβολίου στην Παραγωγή του βκαροτένιου και στη Μορφολογία του B. trispora Μεταβολή των Κινητικών Παραµέτρων της Ζύµωσης µε το Χρόνο Επίδραση της Θερµοκρασίας στις Κινητικές Παραµέτρους της Ζύµωσης Επίδραση του Αρχικού ph του Υποστρώµατος στις Κινητικές Παραµέτρους της Ζύµωσης Επίδραση του Φυσικού Φωτός στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση της Πηγής Άνθρακα στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση της Πηγής Αζώτου στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση των Επιφανειοδραστικών Ουσιών στη Μορφολογία του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση των Φυτικών Ελαίων στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση των Ακόρεστων Λιπαρών Οξέων στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση του Αντιοξειδωτικού στην Παραγωγή του βκαροτένιου Επίδραση των Ενεργοποιητών στην Παραγωγή βκαροτένιου Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος στη Μορφολογία του B. trispora Βελτιστοποίηση της Παραγωγής βκαροτένιου σε Ανακινούµενες Κωνικές Φιάλες V

18 4.3 Παραγωγή βκαροτένιου απo Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης Επίδραση του Λινελαϊκού Οξέος και του Αντιοξειδωτικού στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Επίδραση της Κηροζίνης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Επίδραση των Φυτικών Ελαίων, του Αντιοξειδωτικού και της Κηροζίνης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora και της Παραγωγής βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης µε ιαφορετικά Υποστρώµατα Επίδραση του Ρυθµού Παροχής Αέρα και της Ταχύτητας Ανάδευσης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την Παραγωγή βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης µε ιαφορετικές Συνθήκες Αερισµού και Ανάδευσης Βελτιστοποίηση των Συνθηκών Αερισµού και Ανάδευσης για την Παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης Παραγωγή βκαροτένιου από Συνθετικό Υπόστρωµα µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης Επίδραση του Χρόνου Έναρξης Τροφοδοσίας στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης VI

19 4.4.2 Επίδραση του Ρυθµού Ροής του Υποστρώµατος Τροφοδοσίας στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του διαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Επίδραση της Μεθόδου Τροφοδοσίας του Ζυµωτήρα στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος Τροφοδοσίας στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την Παραγωγή βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ VII

20 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ σελ. Πίνακας 1.1 Περιεκτικότητα ορισµένων φρούτων και λαχανικών σε βκαροτένιο... 2 Πίνακας Επίπεδα τιµών των παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν στον πειραµατικό σχεδιασµό του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου Πίνακας Πειραµατικός σχεδιασµός και τιµές της µεταβλητής απόκρισης (συγκέντρωση βκαροτένιου) που µετρήθηκαν στις διαφορετικές δοκιµές του πειραµατικού σχεδιασµού Πίνακας Γεωµετρικές παράµετροι της µελέτης των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες µε ψηφιακή ανάλυση εικόνας Πίνακας Γεωµετρικές παράµετροι της µελέτης των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora σε ζυµωτήρα αναδεύσεως µε ψηφιακή ανάλυση εικόνας Πίνακας Επίπεδα τιµών των παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν στο πειραµατικό σχεδιασµό του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου, την παραγωγικότητα, τη βιοµάζα και τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας Πίνακας Πειραµατικός σχεδιασµός και τιµές των µεταβλητών απόκρισης που µετρήθηκαν στις διαφορετικές δοκιµές του πειραµατικού σχεδιασµού Πίνακας Επίδραση της κατεργασίας του υγρού της ζύµωσης στην αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trisporα (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας) VIII

21 Πίνακας Επίδραση της πηγής άνθρακα στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση της πηγής αζώτου στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Σύσταση εκχυλίσµατος καλαµποκιού Πίνακας Επίδραση των επιφανειοδραστικών ουσιών στη µορφολογία του B. trispora και στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση των φυτικών ελαίων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση του µίγµατος των φυτικών ελαίων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση των ακόρεστων λιπαρών οξέων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση του αντιοξειδωτικού στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Επίδραση διαφόρων ουσιών στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες) Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας υποστρώµατα µε διαφορετική σύσταση (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας) Πίνακα Ανάλυση διακύµανσης για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου IX

22 Πίνακας Εκτίµηση των µερικών συντελεστών του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου Πίνακας Προβλεπόµενη (prd) και παρατηρούµενη (obs) µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας συνθετικό υπόστρωµα που έχει εµπλουτιστεί µε τον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης και του αντιοξειδωτικού Πίνακας Μελέτη κινητικών παραµέτρων της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, µορφολογικών δοµών και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας) Πίνακας Μελέτη κινητικών παραµέτρων της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας) Πίνακα Ανάλυση διακύµανσης για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (A), της παραγωγικότητας (B), της βιοµάζας ξηρό βάρος (C) και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (D) Πίνακας Εκτίµηση των µερικών συντελεστών του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού για τη συγκέντρωση του β καροτένιου (A), την παραγωγικότητα (B), τη βιοµάζα ξηρό βάρος (C) και τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας (D) X

23 Πίνακας Προβλεπόµενες (prd) και παρατηρούµενες (obs) µέγιστες τιµές της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora στους άριστους προβλεπόµενους συνδυασµούς της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης Πίνακας Σύσταση των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα αναδεύσεως Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας και διαφορετικές µεθόδους και ρυθµούς τροφοδοσίας (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, µορφολογικών δοµών και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας) Πίνακας Μελέτη κινητικών παραµέτρων της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας και διαφορετικές µεθόδους και ρυθµούς τροφοδοσίας Πίνακας Βασικές παράµετροι της ζυµωτικής διεργασίας για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora από συνθετικό υπόστρωµα σε διαφορετικά συστήµατα ζύµωσης XI

24 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ σελ. Σχήµα Απεικόνηση των σταδίων σχηµατισµού του ζυγοσπορίου κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora. a) ύο µυκηλιακοί βραχίονες που προέρχονται από τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού πλησιάζουν και εφάπτονται, b) πυκνό πρωτόπλασµα και πυρήνες συγκεντρώνονται σε σηµεία επαφής και τα γαµετάγγεια στα άκρα των προγαµεταγγείων χωρίζονται από τον υπόλοιπο θαλλό µε διαφράγµατα, c) σχηµατισµός του ζυγωτού κατά τη συγχώνευση πυρήνων των δύο γαµεταγγείων, d) ο ζυγωτός αποκτά παχιά τοιχώµατα και µετατρέπεται σε ζυγοσπόριο... 9 Σχήµα οµή των διαφορετικών µορφών τρισπορικού οξέος, προορµονών, αποτρισπορόλης και αποτρισπορίνης. Τρισπορικό οξύa: X = H, H (1), Τρισπορικό οξύb: X = O (2), Τρισπορικό οξύc: X = H, OH (3), 4 ιυδροµεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος (4), Μεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος (5), Τρισπορόλη (6), Τρισπορίνη (7), Αποτρισπορόλη (8), Αποτρισπορίνη (9) (στις ενώσεις 4, 5, 6, 7, 8 και 9 Χ: Ο ή Η και ΟΗ) Σχήµα Μεταβολισµός των προορµονών και σχηµατισµός του τρισπορικού οξέος κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του B. trispora. Η σύνθεση διαφορετικών προορµονών στα αντίθετα φύλα του µικροοργανισµού οφείλεται στο διαφορετικό είδος µετατροπής της pros µεθυλικής οµάδας του C1 της 4διυδροτρισπορίνης σε κάθε στέλεχος. Η µεθυλοµάδα είτε δεν µεταβάλλεται (τρισπορίνη) είτε οξειδώνεται σε πρωτοταγή αλκοόλη (τρισπορόλη) στο () στέλεχος και οξειδώνεται σε καρβοξυλοµάδα που στη συνέχεια εστεροποιείται στο (+) στελέχος. ενζυµική αντίδραση, διάχυση των προορµονών του ενός στελέχους στο εσωτερικό των κυττάρων στελέχους του αντίθετου φύλου Σχήµα Βιοσύνθεση βκαροτένιου Σχήµα Στάδια παραγωγής βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora. Υπόστρωµα 1: Potato dextrose agar (PDA). Υπόστρωµα 2 (g/l): Εκχύλισµα καλαµποκιού 70,0, άµυλο καλαµποκιού 50,0, υδροχλωρική θειαµίνη 0,01, KH 2 PO 4 0,5, MgSO 4. H 2 0 0,1. Υπόστρωµα 3 (g/l): ιαλυτό υπόλειµµα απόσταξης αλκοόλης 70,0, άµυλο καλαµποκιού 60,0, σογιάλευρο 30,0, βαµβακέλαιο 30,0, αντιοξειδωτικό 0,3, MgSO 4. H 2 0 0,2, υδροχλωρική θειαµίνη 0,5, υδραζίδιο του 4πυριδινοκαρβοξυλικού XII

25 οξέος 0,6, κηροζίνη 20,0, ph 6,3. Το υπόστρωµα αποστειρώνεται στους 121 ο C για 55 λεπτά (η κηροζίνη και το υδραζίδιο του 4πυριδινοκαρβοξυλικού οξέος αποστειρώνονται ξεχωριστά µε διήθηση). Μετά 48 ώρες από την αρχή της ζύµωσης προστίθεται στο ζύµωτήρα 1,0 g/l βιονόνη και 5,0 g/l κηροζίνη. Η γλυκόζη προστίθεται συνεχώς στο ζυµωτήρα και η συνολική ποσότητα της γλυκόζης που χρησιµοποιείται σε όλη τη διάρκεια της ζύµωσης είναι 42,0 g/l Σχήµα Ανάκτηση και καθαρισµός βκαροτένιου από το B. trispora Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό των σακχάρων Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό του βκαροτένιου Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό του Η 2 Ο Σχήµα Ζυµωτήρας ανάδευσης που χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το µύκητα B. trispora Σχήµα Προσδιορισµός του K L a µε τη δυναµική µέθοδο Σχήµα Προσδιορισµός του K L a µε τη δυναµική µέθοδο (Η κλίση της ευθείας ισούται µε 1/K L a) Σχήµα Επίδραση του χρόνου στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη:εξάνιο (1:1), ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C) Σχήµα Επίδραση της θερµοκρασίας στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη:εξάνιο (1:1) ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της αιθανόλης στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C, αριθµός διαδοχικών εκχυλίσεων 3, 100 ml διαλύτη/g ξηρού βάρους βιοµάζας) Σχήµα Επίδραση της αναλογίας του όγκου της αιθανόλης προς το ξηρό βάρος της βιοµάζας του B. trispora στην εκχύλιση του βκαροτένιου (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C, αριθµός διαδοχικών εκχυλίσεων 3) Σχήµα Επίδραση των διαδοχικών εκχυλίσεων στην αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. XIII

26 αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη:εξάνιο (1:1), ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης η άριστη για κάθε εκχυλιστικό µέσο όπως φαίνεται στο σχήµα 4.1.2) Σχήµα Ανάπτυξη του B. trispora και παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,, : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε κύτταρα του στελέχους 14271, και µίγµα των παραπάνω στελεχών, αντίστοιχα.,, : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 1,0 %, 2,5 %, και 5,0 % (v/v) από το κάθε ένα στέλεχος που αναπτύχθηκαν χωριστά σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, αντίστοιχα. : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 5,0 % (v/v) µίγµα των και που έχουν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες. (Υπόστρωµα παραγωγής, g/l: γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm) Σχήµα Μεταβολή των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα, ph (Υπόστρωµα παραγωγής και συνθήκες της ζύµωσης όπως στο Σχήµα 4.2.1) Σχήµα Επίδραση της θερµοκρασίας στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες.,,, : 24, 26, 28 και 30 0 C, αντίστοιχα. (Υπόστρωµα παραγωγής όπως στο σχήµα Αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm) Σχήµα Επίδραση του αρχικού ph του υποστρώµατος στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες.,,,,,, : αρχικό ph 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 και 11,0, αντίστοιχα. (Υπόστρωµα παραγωγής όπως στο σχήµα Θερµοκρασία 26 0 C, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm) Σχήµα Επίδραση του φωτισµού στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,,, και,,, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Η ζύµωση έγινε : και παρουσία φωτός, και απουσία φωτός, και τις 3 πρώτες ηµέρες XIV

27 απουσία φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες παρουσία φωτός, και τις 3 πρώτες ηµέρες παρουσία φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες απουσία φωτός. (Υπόστρωµα παραγωγής και συνθήκες της ζύµωσης όπως στο Σχήµα 4.2.1) Σχήµα Επίδραση της συνεργιστικής δράσης του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες., και, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Στο βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στον Πίνακα προστέθηκε: και αντιοξειδωτικό 10,0 g/l, και µίγµα λινελαϊκού οξέος και αντιοξειδωτικού (20,0 και 10,0 g/l, αντίστοιχα) Σχήµα Επίδραση της συνεργιστικής δράσης του λινελαϊκού οξέος και της κηροζίνης στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,, και,, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Στο βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στον Πίνακα προστέθηκε: και µίγµα λινελαϊκού οξέος 20,0 g/l και αντιοξειδωτικού 10,0 g/l, και κηροζίνη 40,0 g/l, και µίγµα λινελαϊκού οξέος 20,0 g/l, αντιοξειδωτικού 10,0 g/l και κηροζίνης 40,0 g/l Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις του λινελαϊκού οξέος (Χ 1 ), της κηροζίνης (Χ 2 ) και του αντιοξειδωτικού (Χ 3 ) στη συγκέντρωση του βκαροτένιου Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος και κηροζίνης (Συγκέντρωση αντιοξειδωτικού 9,04 g/l) Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωση του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος και αντιοξειδωτικού (Συγκέντρωση κηροζίνης 39,25 g/l) Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κηροζίνης και αντιοξειδωτικού (Συγκέντρωση λινελαϊκού οξέος 17,15 g/l) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού οξέος στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, : λινελαϊκό οξύ 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού XV

28 οξέος στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, και,,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού οξέος στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, και,,, : διαλυτό οξυγόνο και ph σε συγκεντρώσεις 190 λινελαϊκού οξέος 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα... Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό εµπλουτίστηκε µε κηροζίνη 5,0 g/l (a) και 10,0 g/l (b) την 3η ηµέρα της ζύµωσης και 5,0 g/l την 6η ηµέρα της ζύµωσης (c). βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα. προσθήκη κηροζίνης στο υπόστρωµα Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό εµπλουτίστηκε µε κηροζίνη 5,0 g/l (a) και 10,0 g/l (b) την 3η ηµέρα της ζύµωσης και 5,0 g/l την 6η ηµέρα της ζύµωσης (c). διαλυτό οξυγόνο, ph. προσθήκη κηροζίνης στο υπόστρωµα Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και των φυτικών ελαίων στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, : ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης των φυτικών ελαίων και του αντιοξειδωτικού στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c: Βασικό υπόστρωµα που XVI

29 περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, και,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση του αντιοξειδωτικού και των φυτικών ελαίων στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, και,, : διαλυτό οξυγόνο και ph σε συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. To βασικό υπόστρωµα που περιείχε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό και 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου εµπλουτίστηκε µε 5,0 g/l κηροζίνη την 3 η ηµέρα της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα διαλυτό οξυγόνο, ph Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d, e: 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, : 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d, e : 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, και,,,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συνθήκες αερισµού 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα... Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, 227 c, d, e : 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, και,,,, : ph και συγκέντρωση διαλυτού οξυγόνου σε συνθήκες αερισµού ί XVII

30 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στη συγκέντρωση του βκαροτένιου Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στη συγκέντρωση της βιοµάζας Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της παραγωγικότητας του βκαροτένιου σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της βιοµάζας ξηρό βάρος σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού Σχήµα Επίδραση του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h µετά την 2η ηµέρα της ζύµωσης και από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1, έναρξη τροφοδοσίας) Σχήµα Επίδραση του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h µετά την 2η ηµέρα της ζύµωσης και από την αρχή της ζύµωσης, XVIII

31 αντίστοιχα. c: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1, έναρξη τροφοδοσίας) Σχήµα Επίδραση της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας (υπόστρωµα τροφοδοσίας 3) στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 και 8,4 ml/h από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2, προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας 3) Σχήµα Επίδραση της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας (υπόστρωµα τροφοδοσίας 3) στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 και 8,4 ml/h από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2, προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας 3) Σχήµα Επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d: υπόστρωµα τροφοδοσίας 4, 5, 6 και 7, αντίστοιχα. Ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2) Σχήµα Επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d: υπόστρωµα τροφοδοσίας 4, 5, 6 και 7, αντίστοιχα. Ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2) Σχήµα Βιοσύνθεση του H 2 O 2 κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ανακινούµενες κωνικές φιάλες (a), σε ζυµωτήρα ανάδευσης (b) και σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης (c). and συγκέντρωση H 2 O 2 στη βιοµάζα και στο υγρό της ζύµωσης, αντίστοιχα XIX

32 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ σελ. Εικόνα Φωτογραφία ζυµωτήρα ανάδευσης που χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή βκαροτένιου µε το µύκητα B. trispora Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες (µονάδα µήκους 50 µm). a, b, c: το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε κύτταρα του στελέχους 14271, και µίγµα των παραπάνω στελεχών, αντίστοιχα. d, e: το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 2,5% (v/v) από το κάθε ένα στέλεχος που αναπτύχθηκαν χωριστά σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες και 5% (v/v) µίγµα των και που αναπτύχθηκαν µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, αντίστοιχα Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας υποστρώµατα µε διαφορετική σύσταση (µονάδα µήκους 50 µm). a, b: το βασικό υπόστρωµα εµπλουτίστηκε µε 3,0% και 5,0% γλυκόζη, αντίστοιχα. c: Το βασικό υπόστρωµα (χωρίς Span 20 και Tween 80) εµπλουτίστηκε µε 5,0% γλυκόζη και 8,0% εκχύλισµα καλαµποκιού. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0% γλυκόζη και 8,0% εκχύλισµα καλαµποκιού εµπλουτίστηκε µε 0,25% αντιοξειδωτικό (d), 3,0% ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 0,25% αντιοξειδωτικό (e), 2,0% λινελαϊκό οξύ και 0,25% αντιοξειδωτικό (f), 4,0% κηροζίνη (g) και 2,0% λινελαίκό οξύ, 4,0% κηροζίνη και 1,0% αντιοξειδωτικό (h). (Βασικό υπόστρωµα όπως περιγράφεται στον Πίνακα ) Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: b, c, d: Υπόστρωµα παραγωγής 1, 2, 3 και 4, αντίστοιχα (όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1) XX

33 Εικόνα Απεικόνιση των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 6 µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης την 4 η ηµέρα της ζύµωσης. (Υπόστρωµα παραγωγής 6 όπως περιγράφεται στον Πίνακα 4.3.1, µονάδα µήκους 50 µm) Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 7. b: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 8, 9, 10, 11 και 12. (Υποστρώµατα 7, 8, 9, 10, 11 και 12 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1) Εικόνα Απεικόνιση εκφυλισµένων κυττάρων (α) και µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων (b) του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 14 (4 η ηµέρα ζύµωσης) και 15 (16 η ηµέρα ζύµωσης), αντίστοιχα, µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. (Υποστρώµατα 14 και 15 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1, µονάδα µήκους 50 µm) Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a, b: Ζυγοφόροι (2 η ηµέρα ζύµωσης) και ζυγοσπόρια (20 η ηµέρα ζύµωσης), αντίστοιχα, του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 20. c, d: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 17, 23, αντίστοιχα, την 20 η ηµέρα της ζύµωσης. e, f: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα, εκφυλισµένα κύτταρα και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 22 και 24 αντίστοιχα, την 20 η ηµέρα της ζύµωσης. (Υποστρώµατα 17, 20, 22, 23 και 24 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1) XXI

34 Εικόνα Απεικόνιση των των ζυγοσπορίων, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα παραγωγής 2, 3, 7, 13 και 25 στο τέλος της ζύµωσης. (Υποστρώµατα 2, 3, 7, 13 και 25 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1) Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: 1,0 vvm150 rpm, b: 1,0 vvm500 rpm, c: 2,0 vvm150 rpm, d: 2,0 vvm500 rpm, e: 1,0 vvm700 rpm, f: 2,0 rpm700 rpm και g: 0,5 vvm 150 rpm Εικόνα Απεικόνιση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a: 0,5 vvm 0 rpm ή 0 vvm150 rpm, b: 2,0 vvm0 rpm, c: 0 vvm700 rpm (µονάδα µήκους 50 µm) Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (12 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1). b, c: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora (4 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h και του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 µε ρυθµό 4,2 ml/h, αντίστοιχα, από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1 και 2, αντίστοιχα). d: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (4 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4 µε ρυθµό 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). e: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora (10 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη XXII

35 του υποστρώµατος τροφοδοσίας 5 ή 6 µε ρυθµό 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). f: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (20 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε την προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). (Υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.4.1) XXIII

36 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΩΝ ΕΡΓΑΣΙΩΝ 1. Roukas, T., Mantzouridou, F. (2001) An improved method for extraction of βcarotene from Blakeslea trispora. Applied Biochemistry and Biotechnology 90: Mantzouridou, F., Roukas, T., Kotzekidou, P. (2002) Effect of the aeration rate and agitation speed on βcarotene production and morphology of Blakeslea trispora in a stirred tank reactor: mathematical modeling. Biochemical Engineering Journal 10: Mantzouridou, F., Roukas, T., Kotzekidou, P. (2002) Optimization of βcarotene production from synthetic medium by Blakeslea trispora in a stirred tank reactor and relationship between morphological changes and pigment formation. Food Biotechnology 16: Mantzouridou, F., Roukas, T., Kotzekidou, P., Liakopoulou, M. (2002) Optimization of βcarotene production from synthetic medium by Blakeslea trispora: A mathematical modeling. Applied Biochemistry and Biotechnology 101: XXIV

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το βκαροτένιο ή προβιταµίνη Α είναι µία λιποδιαλυτή χρωστική (κίτρινο ως πορτοκαλί χρώµα) πολύ διαδεδοµένη στη φύση. Βρίσκεται κυρίως στους φυτικούς και ζωϊκούς ιστούς και για πρώτη φορά αποµονώθηκε από το καρότο (Daucus carota) σε κρυσταλλική µορφή (Wackenroder 1831). Απαντάται σε µεγάλο αριθµό φρέσκων φρούτων και λαχανικών (καρότα, γλυκοπατάτες, ροδάκινα, τοµάτες, κ.λ.π.) µε τη µορφή transισοµερούς, ενώ δεν συντίθεται στα ζώα. Από τα φυτικά µέρη της τροφής των ζώων µεταφέρεται στα λιπίδια του αίµατος, του γάλακτος και των αυγών. Η περιεκτικότητα ορισµένων τροφίµων φυτικής προέλευσης σε βκαροτένιο αναφέρεται στον Πίνακα 1.1. Η χηµική δοµή του βκαροτένιου έγινε γνωστή από τον Karrer το 1930 (Malmström και Anderson 2001). Είναι ένας πολυακόρεστος υδρογονάνθρακας (πολυένιο) που περιέχει 40 άτοµα άνθρακα και αποτελείται από µία πολυενική αλυσίδα µε εννιά trans(e) διπλούς δεσµούς, στα άκρα της οποίας συνδέονται δύο δακτύλιοι βιονόνης (Mathews και Van Holde 1996). alltransβκαροτένιο Η µακριά ανθρακική αλυσίδα µε τους διπλούς συζυγιακούς δεσµούς είναι υπεύθυνη για το χρώµα του βκαροτένιου (Vetter 1971). Το 1919 µελετήθηκε η δράση του βκαροτένιου ως προβιταµίνη Α (Steenbock 1919). ιάφορες µελέτες έδειξαν ότι το µόριο του διασπάται σε δύο µόρια βιταµίνης Α στη βλεννώδη µεµβράνη του εντέρου (Mathews και Van Holde 1996, Omaye και συν. 1997). Η βιταµίνη Α αποθηκεύεται στο συκώτι σαν ρετινυλεστέρας και έχει µεγάλη διατροφική αξία. Σήµερα, το βκαροτένιο θεωρείται η κύρια πρόδροµη ένωση της βιταµίνης Α. 1

38 Πίνακας 1.1 Περιεκτικότητα ορισµένων φρούτων και λαχανικών σε βκαροτένιο (Mangels και συν. 1993). Είδος Τροφίµου α βκαροτένιο (mg /100 g τροφίµου) Είδος Τροφίµου α βκαροτένιο (mg /100 g τροφίµου) Καρότο 6,6 Μάγκο 2,9 Γλυκοπατάτα 5,9 Πεπόνι 2,0 Λάχανο 5,3 Βερίκοκο 1,6 Μαϊντανός 5,1 Κεράσι 0,6 Σπανάκι 4,9 Ροδάκινο 0,5 Πράσο 3,5 Τοµάτα 0,5 Ραδίκι 2,0 Καρπούζι 0,4 Μπρόκολο 1,5 αµάσκηνο 0,2 Σπαράγγι 0,5 Μήλο 0,1 Πάπρικα 0,5 Πορτοκάλι 0,1 α Η περιεκτικότητα των φρούτων και λαχανικών σε βκαροτένιο εξαρτάται από την ποικιλία και το βαθµό ωρίµανσης τους. Το βκαροτένιο, λόγω της βιταµινικής του δράσης, χρησιµοποιείται ως συµπλήρωµα της ανθρώπινης διατροφής και ως πρόσθετο στις ζωοτροφές. Επιπλέον, βρίσκει εφαρµογή ως χρωστική για την ενίσχυση του χρώµατος τροφίµων και ποτών (βούτυρο, µαργαρίνη, µαγειρικά λίπη, αναψυκτικά κ.λ.π.), ως αντιοξειδωτικό στα κονσερβοποιηµένα τρόφιµα (Ciegler και συν. 1963a, Boskou 1989, Hui 1992, Kim και συν. 1997a) και ως κύριο συστατικό στην παρασκευή καλλυντικών (Leung και Foster 1996). Τα τελευταία χρόνια χρησιµοποιείται και στη φαρµακευτική βιοµηχανία. Στις αρχές της δεκαετίας του `80 διαπιστώθηκε η δράση του σαν βιολογικό αντιοξειδωτικό µέσω του µηχανισµού των ελευθέρων ριζών (Burton και Ingold 1984, Di Mascio και συν. 1990, Packer 1992, Edge και συν. 1997). ιάφορες έρευνες έδειξαν ότι µπορεί να µειώσει τον κίνδυνο εµφάνισης καρκίνου, καρδιακών παθήσεων, καταρράκτη, αρτηριοσκλήρωσης και άλλων σοβαρών παθήσεων (Byers και Perry 1992, Lepage και συν. 1996, Burri 1997, Omaye και συν. 1997). Τέλος, ενισχύει τη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήµατος και καθυστερεί τη διαδικασία γήρανσης των κυττάρων (Chew 1993, Snodderly 1995). 2

39 Το βκαροτένιο παραλαµβάνεται µε εκχύλιση από φυσικά προϊόντα, ενώ παράγεται τόσο µε χηµικές µεθόδους όσο και µε τη χρησιµοποίηση µικροοργανισµών. Το συνθετικό βκαροτένιο παρασκευάστηκε για πρώτη φορά τo 1950 από τους Karrer και Milas, ενώ από το 1954 άρχισε η βιοµηχανική παραγωγή της χρωστικής και η εµπορική της εκµετάλλευση (Hui 1992). Στα τέλη του 1970 η ετήσια παγκόσµια παραγωγή βκαροτένιου ανερχόταν περίπου στους 27 τόνους, ενώ σήµερα το ύψος παραγωγής ξεπερνάει τους 100 τόνους ετησίως και µόνο το 10,0% παραλαµβάνεται από φυσικά προϊόντα (Baets και συν. 2002). Σύµφωνα µε τα στοιχεία της Εθνικής Στατιστικής Υπηρεσίας για το 2002, στην Ελλάδα οι εισαγωγές καροτενοειδών που χρησιµοποιούνται κυρίως ως χρωστικές στη βιοµηχανία τροφίµων ανέρχονται σε 1 τόνο περίπου. Τα τελευταία χρόνια, λόγω της αυξανόµενης ζήτησης του βκαροτένιου και του υψηλού κόστους των υλικών που χρησιµοποιούνται για τη χηµική του σύνθεση, η παραγωγή του µε τη χρήση µικροοργανισµών αποτελεί βασικό αντικείµενο έρευνας σε παγκόσµιο επίπεδο. Ωστόσο, η βιοτεχνολογική παραγωγή της χρωστικής σε βιοµηχανική κλίµακα απαιτεί τη χρήση µικροοργανισµών µε ικανότητα παραγωγής υψηλής συγκέντρωσης προϊόντος, χαµηλού κόστους υποστρωµάτων και αποτελεσµατικών και οικονοµικών τεχνικών ανάκτησης και καθαρισµού του βκαροτένιου. Για την παραγωγή βκαροτένιου σε πειραµατική κλίµακα χρησιµοποιήθηκαν διάφορα στελέχη βακτηρίων, ζυµών, µυκήτων καθώς και φύκη (Ciegler 1965, CerdaOlmedo 1985). Οι περισσότεροι από τους µικροοργανισµούς που µελετήθηκαν παρήγαν χαµηλές συγκεντρώσεις της χρωστικής (4,050,0 mg/l) όταν καλλιεργούνταν τόσο σε συνθετικά υποστρώµατα όσο και σε υποπροϊόντα γεωργικών βιοµηχανιών (Ciegler 1965). Οι Barnett και συν. (1956) παρατήρησαν ότι όταν στελέχη αντίθετου φύλου του µύκητα Choanephora cucurbitarum καλλιεργούνταν µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα η παραγωγικότητα σε προβιταµίνη Α ήταν αυξηµένη (1520 φορές µεγαλύτερη), έναντι του κάθε στελέχους χωριστά. Οι Hesseltine και Anderson (1957) και οι Prieto και συν. (1964) που µελέτησαν την παραγωγικότητα του βκαροτένιου από στελέχη της οικογένειας Choanephoraceae όπως Choanephora conjuncta, Blakeslea circinans και Blakeslea trispora βρήκαν ότι σε όλες τις περιπτώσεις οι καλλιέργειες κατά την εγγενή αναπαραγωγή παρήγαν περισσότερο βκαροτένιο από κάθε ένα στέλεχος χωριστά. Η µεγαλύτερη ποσότητα 3

40 της χρωστικής (1000,0 mg/l) παρήχθηκε µε µίγµα των (+) και () στελεχών του µύκητα Blakeslea trispora (Atkinson και Mavituna 1985). Σήµερα, η βιοµηχανική παραγωγή του βκαροτένιου γίνεται µε το µύκητα B. trispora που αναπτύσσεται σε συνθετικό υπόστρωµα σε ζυµωτήρες ανάδευσης και µε τα φύκη Dunaliella saline και Dunaliella bardawil, τα οποία καλλιεργούνται σε λίµνες µε αλµυρό νερό (Ninet και Renaut 1979, Borowitzka και Borowitzka 1988, CerdaOlmedo 1989, Benemann 1990, Vandamme 1992, Baets και συν. 2002). Το µεγαλύτερο ποσοστό του συνολικού βκαροτένιου από το B. trispora απαντάται µε τη µορφή alltransισοµερούς (75,095,0%) (Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1963b, Dholakia και Modi 1984), σε αντίθεση µε τα φύκη που παράγουν ισοµοριακό µίγµα alltrans και 9cisβκαροτένιου (BenAmotz και Avron 1983, 1990, BenAmotz και συν. 1988a,b, 1989). Στη δεύτερη περίπτωση, αν και η συνολική ποσότητα της παραγόµενης προβιταµίνης Α είναι µεγάλη, η βιολογική της δράση είναι µειωµένη λόγω του 9cis ισοµερούς που είναι λιγότερο ενεργό (Zechmeister 1962, Πανέρας 1995). Επίσης, η εφαρµογή της µεθόδου παραγωγής της χρωστικής από φύκη περιορίζεται σε χώρες όπου επικρατούν κατάλληλες κλιµατολογικές συνθήκες και υπάρχουν µεγάλες εκτάσεις αλµυρών λιµνών όπως στην Αυσταλία, στη Ρωσία, στο Ισραήλ, στην Ισπανία, στη Χιλή και στην Κίνα (Shlomai και συν. 1991, Vandamme 1992, Baets και συν. 2002). Τα υποστρώµατα που χρησιµοποιήθηκαν για την παραγωγή του β καροτένιου είναι συνήθως συνθετικά υποστρώµατα που περιλαµβάνουν γλυκόζη, σακχαρόζη, άµυλο (Ciegler και συν. 1959a, Costa και συν. 1987, Yun και συν. 1990), κελλοβιόζη (Dholakia και Modi 1982), γλυκερόλη (Martelli και συν. 1992), διαφορετικά είδη δηµητριακών (βρώµη, σιτάρι, κριθάρι, καλαµπόκι, ρύζι, σίκαλη κ.λ.π) και προϊόντα σόγιας (σογιάλευρο κ.λ.π) (Ciegler και συν. 1959a), φυτικά έλαια, λίπη, ακόρεστα λιπαρά οξέα, κηροζίνη, επιφανειοδραστικές ουσίες, αντιοξειδωτικά, πρόδροµες ουσίες και ενεργοποιητές (Mackinney και συν. 1953, Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1959b, 1961, 1962, 1963a,b, Ciegler 1965, Ninet και συν. 1969, Ninet και Renaut 1979, Elsava και συν. 1974, Feofilova και Kudryavtseva 1974, Desai και συν. 1975, Feofilova και Arbuzov 1975, Feofilova και Bekhtereva 1976, Galasko και συν. 1976, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977, Dandekar και συν. 1980, Yakovleva και συν. 1980, Mehta και συν. 1981, Feofilova και συν. 1982, Govind και συν. 1982, Dholakia και Modi 1983, 1984, Atkinson και Mavituna 1985, CerdaOlmedo και Hüttermann 1986, Kim και 4

41 συν. 1997a,b, Jeong και συν. 2001, Mantzouridou και συν. 2002a). Επίσης, έχουν χρησιµοποιηθεί πειραµατικά και υποπροϊόντα διαφόρων γεωργικών βιοµηχανιών, όπως τυρόγαλα (Lampila και συν. 1985a,b, Fregova 1994), συµπυκνωµένο γλεύκος σταφυλιών (Buzzini και Martini 1999, Buzzini 2000), εκχύλισµα σακχάρων από σακχαροκάλαµο (Martelli και συν. 1990) και µελάσσα (Bhosale και Gadre 2001a, Goksungur και συν. 2002). Σε όλες τις παραπάνω µελέτες η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου ήταν σχετικά χαµηλή (4,01000,0 mg/l). Επιπλέον, στις περισσότερες από τις προηγούµενες ερευνητικές εργασίες η παραγωγή βκαροτένιου έγινε σε ανακινούµενες φιάλες, ενώ ελάχιστες µελέτες αναφέρονται στη χρήση βιοαντιδραστήρων τόσο σε εργαστηριακό, όσο και σε πιλοτικό επίπεδο (Ciegler και συν. 1963b, Ninet και Renaut 1979, Costa και συν. 1987, Shlomai και συν. 1991, Kim και συν. 1999, Bhosale και Gadre 2001a, Mantzouridou και συν. 2002b,c). Παρόλο που η απόδοση και η παραγωγικότητα των διαφόρων µεθόδων ζύµωσης εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τη µορφολογία της καλλιέργειας (Cox και συν. 1998), δεν έχει γίνει µέχρι σήµερα επαρκής διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των µορφολογικών χαρακτηριστικών των µικροοργανισµών µε την παραγωγή του βκαροτένιου. Σκοπός της εργασίας ήταν η αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε τη χρησιµοποίηση του µύκητα B. trispora. Για την υλοποίηση του παραπάνω σκοπού έγινε βελτιστοποίηση της εκχύλισης του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού, διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή βκαροτένιου σε ανακινούµενες φιάλες και σε ζυµωτήρα ανάδευσης, βελτιστοποίηση των διεργασιών παραγωγής της χρωστικής στα παραπάνω συστήµατα ζύµωσης µε ανάπτυξη µαθηµατικών µοντέλων σε εργαστηριακή κλίµακα, µελέτη της παραγωγής της χρωστικής σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης και συσχέτιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora µε την παραγωγή του προϊόντος. 5

42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Μύκητες Από τους µύκητες εκείνος που χρησιµοποιείται συνήθως για την παραγωγή βκαροτένιου είναι ο Blakeslea trispora. Το κυριότερο πλεονέκτηµα που παρουσιάζει ο B. trispora είναι η ικανότητα του να δίνει αυξηµένες αποδόσεις βκαροτένιου κατά τη σύζευξη στελεχών αντίθετου φύλου του µικροοργανισµού, έναντι του κάθε στελέχους χωριστά. Ο B. trispora κατατάσσεται στους ζυγοµύκητες και ανήκει στην τάξη Mucorales και στην οικογένεια Choanephoraceae. Θεωρείται ένα από τα αρχικά είδη µυκήτων που αποµονώθηκαν από το έδαφος (Ciegler και συν. 1959a). Το βλαστικό τµήµα του θαλλού του αποτελείται από κοινοκύτταρο µυκήλιο που φέρει διαφράγµατα στη βάση των οργάνων αναπαραγωγής (Κοτζεκίδου 1993, Τζαβέλλα 1996). Στην κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού το ποσοστό των λιπιδίων είναι µεγαλύτερο από αυτό των πρωτεϊνών. Τα λιπιδικά συστατικά της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού είναι κυρίως ουδέτερα λιπίδια, από τα οποία το µεγαλύτερο ποσοστό είναι µονο και τριακυλογλυκερόλες, στερόλες και υδρογονάνθρακες, ενώ περιέχονται και πολικά λιπίδια όπως φωσφολιπίδια (κυρίως φωσφατιδυλοχολίνη, φωσφατιδυλοαιθανολαµίνη και φωσφατιδυλοσερίνη) και γλυκολιπίδια (Konova και συν. 1991). Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι στη µεµβράνη του B. trispora περιέχονται γλυκολιπίδια µε φαινολική οµάδα, τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί σε ορισµένα µόνο βακτήρια, ενώ δεν βρίσκονται στις κυτταρικές µεµβράνες άλλων µυκήτων (Konova και συν. 1991, Tkachevskaya και συν. 1993). Συγκεκριµένα, αναφέρεται ότι στη µεµβράνη του µικροοργανισµού απαντάται µίγµα ισοµερών γλυκολιπιδίων µε φαινολική οµάδα µε γενικό τύπο GalOGalOC 6 H 3 R 1 (R 2 OCOR 3 ), όπου R 1 = H, CH 3, C 2 H 5, R 2 = CH 2, C 2 H 4, R 3 = λιπαρά οξέα µε 1317 άτοµα άνθρακα, Gal = γαλακτόζη (Tkachevskaya και συν. 1993). Το κυτταρικό τοίχωµα του B. trispora αποτελείται από χιτίνη και χιτοζάνη που περιβάλλουν το 6

43 κύτταρο µε µορφή ινιδίων, γύρω από τα οποία υπάρχουν µόρια πολυγλυκουρονικού οξέος, γλυκουρονοµαννοπρωτεϊνών και πολυφωσφατιδίων (Gooday 1995, Deacon 1997). Στο B. trispora διακρίνουµε την αγενή και την εγγενή αναπαραγωγή που οδηγούν, αντίστοιχα, στην παραγωγή αγενών ή εγγενών σπορίων. Κατά την αναπαραγωγή, αγενή ή εγγενή, ο θαλλός διαφοροποιείται σε βλαστικό και αναπαραγωγικό τµήµα. Επί του αναπαραγωγικού τµήµατος εµφανίζονται τα όργανα αναπαραγωγής, ενώ το βλαστικό τµήµα συνεχίζει τις φυσιολογικές λειτουργίες του µικροοργανισµού κυριότερη από τις οποίες είναι η θρέψη (Τζαβέλλα 1996). Κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora τα αναπαραγωγικά όργανα των δύο φύλων αναπτύσσονται σε διαφορετικούς θαλλούς (χαρακτηρίζονται ως ((+) και ()) και γι αυτό το λόγο ο µικροοργανισµός ονοµάζεται ετερόθαλλος (heterothallic). Τα στελέχη αντίθετου φύλου του B. trispora παρουσιάζουν αρκετές µορφολογικές, φυσιολογικές και βιοχηµικές διαφορές (Feofilova και συν. 1997a,b). Σε υγρό υπόστρωµα ανάπτυξης, τα (+) στελέχη του µικροοργανισµού σχηµατίζουν µυκηλιακές υφές µε εξογκώµατα που περιέχουν κοκκώδες πρωτόπλασµα, ενώ οι µυκηλιακές υφές των () στελεχών έχουν οµοιόµορφο πλάτος σε όλο το µήκος τους χωρίς την παρουσία εξογκωµάτων και εµφανίζουν µεγάλο αριθµό διακλαδώσεων. Επίσης, τα (+) στελέχη περιέχουν µεγαλύτερο ποσοστό χιτοζάνης στο κυτταρικό τους τοίχωµα και σχηµατίζουν περισσότερα αγενή σπόρια, έναντι των () στελεχών. Τα (+) και () σπόρια παρουσιάζουν διαφορές στη σύσταση τους, όπως στην περιεκτικότητα τους σε ουδέτερα λιπίδια και φωσφατιδυλοινοσιτόλη (τα (+) σπόρια περιέχουν κατά 15,020,0% περισσότερο ουδέτερα λιπίδια και λιγότερο φωσφατιδυλοινοσιτόλη, συγκριτικά µε τα () σπόρια). Η ανάπτυξη των (+) και () στελεχών του B. trispora διαφέρει σηµαντικά ανάλογα µε τη σύσταση του υποστρώµατος. Έχει βρεθεί ότι η άριστη αναλογία άνθρακα προς άζωτο (C/N) στο υπόστρωµα ανάπτυξης των () στελεχών είναι 30 µέρη διαθέσιµου άνθρακα προς 1 µέρος διαθέσιµου αζώτου, σε αντίθεση µε τα (+) στελέχη που αναπτύσσονται καλύτερα σε υπόστρωµα εµπλουτισµένο µε άζωτο (C/N ίση µε 3:1). Επιπλέον, τα (+) στελέχη του µικροοργανισµού δεν µεταβολίζουν το άµυλο, ενώ τα () στελέχη έχουν την ικανότητα να συνθέτουν αµυλολυτικά ένζυµα για την υδρόλυση του αµύλου. Παράλληλα, τα () στελέχη παράγουν φωσφορυλάσες µε 3 φορές µεγαλύτερη δραστικότητα, έναντι των αντίστοιχων ενζύµων των (+) στελεχών. Τα στελέχη αντίθετου φύλου του B. trispora παρουσιάζουν διαφορές και όσον αφορά τους µηχανισµούς που διαθέτουν για την προσαρµογή τους σε υψηλές 7

44 θερµοκρασίες και στην παρουσία φωτός. Έχει βρεθεί ότι τα (+) στελέχη παρουσιάζουν µεγαλύτερη θερµοανθεκτικότητα από τα () στελέχη, ενώ η φωτεινή ακτινοβολία αυξάνει σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου από τα () στελέχη, σε αντίθεση µε τα (+) στελέχη που παρουσιάζουν µειωµένη απόδοση του βκαροτένιου. Επιπλέον, η προσθήκη τρισπορικού οξέος στο υπόστρωµα ευνοεί σε µεγάλο βαθµό την παραγωγή βκαροτένιου στα κύτταρα των () στελεχών, ενώ µειώνει την παραγωγικότητα της χρωστικής στα (+) στελέχη. Ο B. trispora αναπαράγεται αγενώς µε σποριαγγειοσπόρια που παράγονται µέσα σε κλειστά µεµβρανώδη όργανα, τα σποριάγγεια, τα οποία φέρονται πάνω σε βραχίονες που ονοµάζονται σποριαγγειοφόροι (Κοτζεκίδου 1993, Τζαβέλλα 1996, Deacon 1997). Τα σποριάγγεια διαλύονται και ελευθερώνουν απλανοσπόρια (Τζαβέλλα 1996). Η εγγενής αναπαραγωγή του µικροοργανισµού προϋποθέτει συγχώνευση γενετικής ουσίας δύο πυρήνων αντίθετου φύλου (Cain 1972, Mistry 1977, Τζαβέλλα 1996, Deacon 1997). Τα κύτταρα των οποίων οι πυρήνες συγχωνεύονται κατά τον εγγενή πολλαπλασιασµό είναι αδιαφοροποίητα απλά κύτταρα µυκηλιακών υφών και αποτελούν τα αναπαραγωγικά όργανα του µικροοργανισµού. Κατά την εγγενή αναπαραγωγή δύο µυκηλιακοί βραχίονες που προέρχονται από τους (+) και () θαλλούς πλησιάζουν και εφάπτονται. Καθώς ο θαλλός είναι κοινοκύτταρος, πυκνό πρωτόπλασµα και πυρήνες συγκεντρώνονται σε σηµεία επαφής και τα δύο άκρα χωρίζονται από τον υπόλοιπο θαλλό µε διαφράγµατα. Τα δύο αυτά ακραία κύτταρα αποτελούν τα γαµετάγγεια, ενώ οι υφές που φέρουν τα γαµετάγγεια ονοµάζονται προγαµετάγγεια. Το κυτταρικό τοίχωµα µεταξύ των δύο γαµεταγγείων διαλύεται και οι περιεχόµενοι πυρήνες συγχωνεύονται σε ζεύγη. Οι µη γονιµοποιηµένοι πυρήνες εκφυλίζονται ενώ από τη συγχώνευση των δύο µορφολογικά όµοιων γαµεταγγειακών κυττάρων προκύπτει ο ζυγωτός που αποκτώντας παχιά τοιχώµατα µετατρέπεται σε ζυγοσπόριο. Τα ζυγοσπόρια είναι σφαιρικά, σκούρου χρώµατος και φέρουν επάρµατα. Το ζυγοσπόριο αποσπάται από το θαλλό διατηρώντας τµήµα του ενός ή των δύο προγαµεταγγείων που ονοµάζεται κύτταρο ανάρτησης (suspensor cell). Με τη µορφή των ζυγοσπορίων ο µύκητας διατηρείται επί µακρόν στο έδαφος. Τα στάδια σχηµατισµού του ζυγοσπορίου φαίνονται στο Σχήµα

45 a b c d Σχήµα Απεικόνηση των σταδίων σχηµατισµού του ζυγοσπορίου κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora. a) ύο µυκηλιακοί βραχίονες που προέρχονται από τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού πλησιάζουν και εφάπτονται, b) πυκνό πρωτόπλασµα και πυρήνες συγκεντρώνονται σε σηµεία επαφής και τα γαµετάγγεια στα άκρα των προγαµεταγγείων χωρίζονται από τον υπόλοιπο θαλλό µε διαφράγµατα, c) σχηµατισµός του ζυγωτού κατά τη συγχώνευση πυρήνων των δύο γαµεταγγείων, d) ο ζυγωτός αποκτά παχιά τοιχώµατα και µετατρέπεται σε ζυγοσπόριο (Deacon 1997). 9

46 Το ζυγοσπόριο βλασταίνει σε σποριάγγειο ή σε µυκηλιακή υφή. Λίγο πριν τη βλάστηση, οι διπλοειδείς πυρήνες υφίστανται µείωση και ο καθένας δίνει τέσσερεις απλοειδείς. Όσα αναφέρθηκαν παραπάνω αφορούν τους µορφολογικούς χαρακτήρες της διαδικασίας της εγγενούς αναπαραγωγής του B. trispora. Υπάρχουν όµως και βιοχηµικές διεργασίες που συµβαίνουν κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού, όπως η σύνθεση ουσιών που παίζουν ρόλο φυλετικών ορµονών (Machlis 1966). Οι φυλετικές ορµόνες που παράγονται διεγείρουν την εγγενή αναπαραγωγή του µικροοργανισµού και την παραγωγή βκαροτένιου στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας (Thomas και συν. 1967, Sutter και Rafelson 1968, van den Ende 1968, Feofilova και συν. 1994, Deacon 1997, Baets και συν. 2002). Τα (+) και () στελέχη του B. trispora παράγουν ουσίες πρόδροµες των φυλετικών ορµονών (προορµόνες), οι οποίες είναι πτητικές, µικρού µοριακού βάρους και έχουν παρόµοια χηµική δοµή (Nabeta και συν. 1980, Sutter και Zawodny 1984, Deacon 1997). Τα (+) στελέχη συνθέτουν ως κύριες προορµόνες τις ενώσεις 4διυδροµεθυλεστέρα και µεθυλεστέρα του τρισπορικού οξέος, ενώ τα () στελέχη συνθέτουν ως κύριες προορµόνες τρισπορόλη και τρισπορίνη (Bu Lock και συν. 1972, 1974, Nieuwenhuis και van den Ende 1975, Prisbylla και συν. 1979, Sutter και Whitaker 1981, Takabe και White 1983) (Σχήµα 2.1.2). Αναφέρεται ότι τα (+) στελέχη του B. trispora, παρόλο που έχουν την ικανότητα να συνθέτουν τρισπορόλη και τρισπορίνη, ενεργοποιούν ένα µηχανισµό αδρανοποίησης των ενώσεων αυτών µε αφαίρεση τριών ατόµων άνθρακα από τις πλευρικές αλυσίδες τους (Sutter και Whitaker 1981). Οι Sutter και Zawodny (1984) βρήκαν ότι, µέσω του παραπάνω µηχανισµού, στα κύτταρα του (+) στελέχους του µικροοργανισµού η τρισπορόλη και η τρισπορίνη αποικοδοµούνται, αντίστοιχα, σε αποτρισπορόλη και αποτρισπορίνη, οι οποίες δεν αποτελούν πρόδροµες ενώσεις των φυλετικών ορµονών (Σχήµα 2.1.2). Τα στελέχη αντίθετου φύλου του B. trispora, όταν αναπτύσσονται χωριστά, δεν είναι ικανά να µετατρέψουν τις προορµόνες που παράγουν σε δραστικές ορµόνες. Αυτό πιθανόν οφείλεται στο ότι τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού συνθέτουν ορισµένα µόνο από τα ένζυµα που απαιτούνται για αυτή τη διεργασία (Nieuwenhuis και van den Ende 1975, Sutter 1977, Deacon 1997). Κατά τη συγχώνευση του γενετικού υλικού των πυρήνων κυττάρων των δύο στελεχών πραγµατοποιείται διάχυση των προορµονών του ενός στελέχους στο εσωτερικό των κυττάρων στελέχους του αντίθετου φύλου και 10

47 µετατροπή τους σε τρισπορικό οξύ (παράγεται µίγµα 2% A, 15% B και 83% C µορφών τρισπορικού οξέος µε ορµονική δράση) (Σχήµα 2.1.2) µέσω των συµπληρωµατικών ενζυµικών συστηµάτων των δύο στελεχών (Werkman και van den Ende 1973, Sutter και συν. 1974, 1989, Sutter και Jelinek 1983, Gooday 1995, Bacigaluppo και συν. 1996, Czempinski και συν. 1996, Deacon 1997). Μία άλλη εξήγηση του µηχανισµού ρύθµισης της σύνθεσης του τρισπορικού οξέος αναφέρει ότι τα (+) και () στελέχη του B. trispora πιθανόν διαθέτουν όλα τα γονίδια που είναι απαραίτητα για τη σύνθεση του τρισπορικού οξέος, όµως από τα γονίδια αυτά ορισµένα ή όλα βρίσκονται σε καταστολή κατά την αγενή αναπαραγωγή του µικροοργανισµού, µε αποτέλεσµα την ελάχιστη ή µηδενική απόδοση τρισπορικού οξέος από κάθε ένα στέλεχος χωριστά. Κατά την εγγενή αναπαραγωγή αίρεται η καταστολή της έκφρασης των γονιδίων και επάγεται η παραγωγή τρισπορικού οξέος στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας (Bu Lock και συν. 1973, Bu Lock 1976, Sutter και συν. 1973). Ο µεταβολισµός των προορµονών και η σύνθεση του τρισπορικού οξέος κατά τη σύζευξη των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trispora περιγράφεται στο Σχήµα

48 Ο OH X X COOH COOCH 3 (1), (2), (3) (4) O O X X COOCH 3 (5) CH 2 OH (6) Ο O X OH O (7) CH 2 OH (8) OH (9) Σχήµα οµή των διαφορετικών µορφών τρισπορικού οξέος, προορµονών, αποτρισπορόλης και αποτρισπορίνης. Τρισπορικό οξύa: X = H, H (1), Τρισπορικό οξύb: X = O (2), Τρισπορικό οξύc: X = H, OH (3), 4 ιυδροµεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος (4), Μεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος (5), Τρισπορόλη (6), Τρισπορίνη (7), Αποτρισπορόλη (8), Αποτρισπορίνη (9) (στις ενώσεις 4, 5, 6, 7, 8 και 9 Χ: Ο ή Η και ΟΗ) (Sutter και Zawodny 1984). 12

49 (+) B. trispora () B. trispora βκαροτένιο Ρετινάλη 4 ιυδροτρισπορίνη 4 ιυδροµεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος Μεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος βκαροτένιο Ρετινάλη 4 ιυδροτρισπορίνη Τρισπορίνη Τρισπορόλη Τρισπορίνη Τρισπορόλη Τρισπορικό οξύ 4 ιυδροµεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος Μεθυλεστέρας του τρισπορικού οξέος Τρισπορικό οξύ Σχήµα Μεταβολισµός των προορµονών και σχηµατισµός του τρισπορικού οξέος κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του B. trispora. Η σύνθεση διαφορετικών προορµονών στα αντίθετα φύλα του µικροοργανισµού οφείλεται στο διαφορετικό είδος µετατροπής της pros µεθυλικής οµάδας του C1 της 4διυδροτρισπορίνης σε κάθε στέλεχος. Η µεθυλοµάδα είτε δεν µεταβάλλεται (τρισπορίνη) είτε οξειδώνεται σε πρωτοταγή αλκοόλη (τρισπορόλη) στο () στέλεχος και οξειδώνεται σε καρβοξυλοµάδα που στη συνέχεια εστεροποιείται στο (+) στελέχος. ενζυµική αντίδραση, διάχυση των προορµονών του ενός στελέχους στο εσωτερικό των κυττάρων στελέχους του αντίθετου φύλου (Sutter και συν. 1989). 13

50 Κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora οι ποσότητες των προορµονών και των φυλετικών ορµονών (µίγµα A, B και C µορφών τρισπορικού οξέος) που παράγονται αρχικά είναι µικρές, όµως το σχηµατισµένο τρισπορικό οξύ ρυθµίζει την παραγωγή του ενεργοποιώντας την εκ νέου σύνθεση του (Feofilova και συν. 1994, Deacon 1997). Όσον αφορά το µηχανισµό επαγωγής της σύνθεσης του τρισπορικού οξέος έχει βρεθεί ότι το τρισπορικό οξύ αυξάνει σηµαντικά τα επίπεδα του ενδοκυτταρικού κυκλικού AMP (camp), το οποίο διεγείρει την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις προορµόνες, οπότε σχηµατίζονται µεγαλύτερες ποσότητων προορµονών και περισσότερο τρισπορικό οξύ στο εσωτερικό των κυττάρων της συζευγµένης καλλιέργειας (Govind και Modi 1981). Το τρισπορικό οξύ παίζει σηµαντικό ρόλο στο βιολογικό κύκλο του B. trispora διεγείροντας το σχηµατισµό γαµεταγγείων (χηµειοτροπισµός), µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της πλασµογαµίας και της καρυογαµίας (Nabeta και συν. 1980, Sutter και συν. 1989, Deacon 1997). Επίσης, η αυξηµένη παραγωγικότητα του B. trispora σε βκαροτένιο κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού οφείλεται στη δράση του τρισπορικού οξέος ως επαγωγέα της σύνθεσης της χρωστικής (Sutter και Whitaker 1981, Feofilova και συν. 1994, 1997a,b, Deacon 1997). Τα ένζυµα που παίρνουν µέρος στη βιοσύνθεση του βκαροτένιου είναι επαγώγιµα και το τρισπορικό οξύ επάγει την εκ νέου (de novo) σύνθεση ενός ή περισσότερων από αυτά (Feofilova και συν. 1976). Αναφέρεται ότι τα ένζυµα που επάγει το τρισπορικό οξύ υπεισέρχονται στη µετατροπή του 5φωσφοµεβαλονικού οξέος σε πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο για το σχηµατισµό ισοπρενοειδούς οµάδας, η οποία αποτελεί τη δοµική µονάδα του µορίου του βκαροτένιου (Feofilova και συν. 1976, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977). Η επαγωγή της σύνθεσης των ενζύµων της βιοσυνθετικής πορείας του βκαροτένιου κατά τη σύζευξη κυττάρων των (+) και () στελεχών του B. trispora αποδίδεται στην ενεργοποίηση της σύνθεσης µίας ουδέτερης µεµβρανικής σερινοπρωτεάσης (MW ) από το τρισπορικό οξύ, η οποία αναστέλλει τη δράση της κατασταλτικής ρυθµιστικής πρωτείνης (IP) που παρεµποδίζει την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τα παραπάνω ένζυµα. Αναφέρεται ότι πιθανόν να λαµβάνει χώρα τροποποίηση της δοµής της κατασταλτικής πρωτείνης και µετατροπή της σε ενεργοποιητή της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου (Thomas και συν. 1967, Govind και συν. 1981, Mehta και συν. 1981). Μετά από πειράµατα µε αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης (ακτινοµυκίνη D και κυκλοεξιµίδιο) βρέθηκε ότι 14

51 το τρισπορικό οξύ ρυθµίζει την έκφραση του γονιδίου της σερινοπρωτεάσης στο επίπεδο της µετάφρασης (Feofilova και συν. 1976, Desai και Modi 1977). Παράλληλα, η σύνθεση τρισπορικού οξέος κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora επιφέρει αύξηση της περιεκτικότητας του κυτταρικού τοιχώµατος του µυκηλίου της συζευγµένης καλλιέργειας σε πρωτεϊνικό υλικό, έναντι της αντίστοιχης περιεκτικότητας του κυτταρικού τοιχώµατος του µυκηλίου των (+) και () στελεχών, όταν αυτά αναπτύσσονται χωριστά. Αυτό οφείλεται στην ενεργοποίηση της σύνθεσης των ενζύµων της βιοσυνθετικής πορείας του βκαροτένιου από το τρισπορικό οξύ. Αντίθετα, η περιεκτικότητα του κυτταρικού τοιχώµατος του µυκηλίου της συζευγµένης καλλιέργειας σε χιτίνη δεν διαφέρει από αυτή του µυκηλίου του κάθε ενός στελέχους (Feofilova και συν. 1977). Η ενεργοποίηση της βιοσυνθετικής πορείας του βκαροτένιου στο µύκητα B. trispora κατά την εγγενή αναπαραγωγή του µικροοργανισµού επηρεάζει σηµαντικά τις κύριες βιοχηµικές διεργασίες του µικροοργανισµού. Η σύνθεση του βκαροτένιου κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού συνοδεύεται µε την ενεργοποίηση ενζύµων της γλυκολυτικής οδού, ενώ κατά τη διάρκεια της ζύµωσης και την παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας βκαροτένιου η δραστικότητα των ενζύµων της µεταβολικής οδού των φωσφορικών πεντοζών µειώνεται σηµαντικά. Συγκεκριµένα, αναφέρεται ότι στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trispora η αλδολάση επάγεται σε µεγάλο βαθµό, ενώ µειώνεται σηµαντικά η δραστικότητα της αφυδρογονάσης της 6φωσφορικής γλυκόζης µετά από 72 ώρες ζύµωσης (Feofilova και Pivovarova 1976). Η λειτουργία της γλυκόλυσης είναι απαραίτητη για τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου, αφού ο µικροοργανισµός παράγει µόρια ATP, τα οποία χρησιµοποιούνται για τη σύνθεση µεγαλύτερης ποσότητας χρωστικής (Feofilova και Pivovarova 1976, Reshamwala και Modi 1985). Παράλληλα, στη συζευγµένη καλλιέργεια που παράγει µεγάλες ποσότητες βκαροτένιου παρατηρείται 56 φορές µειωµένη αναπνευστική δραστηριότητα που συσχετίζεται µε µειωµένη παραγωγή κυτοχρώµατος c, b και a, µειωµένη δραστικότητα καταλάσης και αυξηµένη συγκέντρωση µη αιµικού σιδήρου, έναντι της ίδιας καλλιέργειας πριν αρχίσει η φάση παραγωγής της χρωστικής ή άλλων καλλιεργειών που παράγουν µικρότερες ποσότητες της χρωστικής (Feofilova και Pivovarova 1976). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι κατά τη σύζευξη των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού η παραγωγή βκαροτένιου συνοδεύεται µε σηµαντική µείωση της απόδοσης 15

52 κυτταροπλασµατικής πρωτείνης και της περιεκτικότητας του µυκηλίου σε SH οµάδες, διόγκωση του µυκηλίου µε σύγχρονη αύξηση του πάχους του κυτταρικού του τοιχώµατος και µεταβολές σε διάφορες κυτταροπλασµατικές δοµές όπως µείωση του µεγέθους των ενδοπτυχώσεων των µιτοχονδρίων (Feofilova και Kudryavtseva 1974, Feofilova και Pivovarova 1976). Εκτός από το B. trispora και ζυγοµύκητες της τάξης Mucorales (οικογένεια Choanephoraceae) που ανήκουν σε άλλα γένη έχουν την ικανότητα να συνθέτουν βκαροτένιο, όπως Choanephora, Mucor, Parasitella, Phycomyces, και Pilaria (Mackinney και συν. 1953, Barnett και συν. 1956, Prieto και συν. 1964, Ciegler 1965, Murillo και συν. 1978, Govind και CerdaOlmedo 1986, Bejarano και συν. 1988, Baets και συν. 2002). Τα στελέχη αυτά δεν χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία λόγω του ότι παράγουν πολύ χαµηλές συγκεντρώσεις χρωστικής. Επιπλέον, έχει αναφερθεί η ικανότητα ορισµένων ασκοµυκήτων, βασιδοµυκήτων και ατελών µυκήτων να παράγουν συγχρόνως µίγµα διαφορετικών καροτενοειδών, από τα οποία το ποσοστό του παραγόµενου βκαροτένιου είναι πολύ µικρό (Ciegler 1965) Ζύµες Εκτός από τους µύκητες και ορισµένα στελέχη ζυµών έχουν την ικανότητα να συνθέτουν βκαροτένιο. Τα στελέχη αυτά ανήκουν στα γένη Rhodotorula, Rhodosporidium, Phaffia και Sporobolomyces (Nelis και DeLeenheer 1991, Martelli και συν. 1992). Τα υποστρώµατα που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή βκαροτένιου από τις ζύµες είναι συνήθως συνθετικά υποστρώµατα γλυκόζης που περιέχουν ορισµένα ιχνοστοιχεία και αζωτούχες ουσίες. Χαρακτηριστικό της ζύµωσης είναι ότι παράγονται και άλλα καροτενοειδή (ασταξανθίνη, γκαροτένιο, φυτοφλουένιο κ.ά.), το είδος και η συγκέντρωση των οποίων εξαρτάται από τις συνθήκες της ζύµωσης και από το στέλεχος που χρησιµοποιείται (Simpson και συν. 1964, Ciegler 1965, Andrewes και συν. 1976, Nam και συν 1988, Perrier και συν. 1995). Τα είδη R. glutinis, R. lactosa, R. flava, R. gracilis, R. pallida, R. aurantiaca και R. sannieli παράγουν τις υψηλότερες συγκεντρώσεις βκαροτένιου, έναντι των άλλων ζυµών που έχουν χρησιµοποιηθεί σε πειραµατική κλίµακα για την παραγωγή της χρωστικής, όταν καλλιεργούνται σε συνθετικά υποστρώµατα που περιέχουν γλυκόζη, σακχαρόζη ή γλυκερόλη (Peterson και συν. 1954, Ciegler 1965, Costa και συν. 1987, Atkinson και Mavituna 1985, Nam και συν. 1988, Martelli και συν. 1992). Επίσης, έχουν χρησιµοποιηθεί υποπροϊόντα διαφόρων γεωργικών 16

53 βιοµηχανιών, όπως συµπυκνωµένος µούστος σταφυλιού, εκχύλισµα σακχάρων από σακχαροκάλαµο, µελάσσα τεύτλων, εκχύλισµα από αλεύρι σόγιας και εκχύλισµα από αλεύρι καλαµποκιού για την παραγωγή της χρωστικής από τη ζύµη R. glutinis (Martelli και συν. 1990, Buzzini και Martini 1999, Buzzini 2000). Τέλος, έχει αναφερθεί η παραγωγή βκαροτένιου µε συγκαλλιέργεια των ζυµών R. glutinis και Debaryomyces castelli σε σιρόπι καλαµποκιού (Buzzini 2001) καθώς και η παραγωγή της χρωστικής από αλεύρι καλαµποκιού µε ζύµωση αρχικά µε το µύκητα Aspergillus niger Q72 και στη συνέχεια µε τη ζύµη R. glutinis (Chen και Zutong 1999). Σε όλες τις προηγούµενες περιπτώσεις η συγκέντρωση της παραγόµενης χρωστικής δεν ήταν µεγαλύτερη από 7,5 mg/l. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι οι ζύµες µειονεκτούν έναντι των µυκήτων όσον αφορά την ικανότητα τους να παράγουν υψηλές συγκεντρώσεις βκαροτένιου. Μέχρι σήµερα δέν έχουν αναφερθεί στελέχη ζυµών, τα οποία να µπορούν να χρησιµοποιηθούν για τη βιοµηχανική παραγωγή του βκαροτένιου Βακτήρια Τα βακτήρια του γένους Mycobacterium και τα είδη Erwinia herbicola, Erwinia uredevora, Agrobacterium auratiacum και Algaligenes sp. Strain PC1 έχουν την ικανότητα να συνθέτουν µίγµα βκαροτένιου, γκαροτένιου, φυτοένιου, λυκοπένιου, ασταξανθίνης, ζεαξανθίνης, βκρυπτοξανθίνης και άλλων καροτενοειδών (Ciegler 1965, Atkinson και Mavituna 1985, Misawa και συν. 1990, Sandmann και συν. 1990). Ωστόσο, τα βακτήρια αυτά δεν χρησιµοποιούνται για την παραγωγή βκαροτένιου λόγω του ότι παράγουν πολύ χαµηλές συγκεντρώσεις της χρωστικής. Το κύριο πλεονέκτηµα τους είναι ότι διαθέτουν τα γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυµα, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου. Τα τελευταία χρόνια, µε τη βοήθεια της γενετικής µηχανικής, έχουν γίνει επιτυχηµένες προσπάθειες εισαγωγής και έκφρασης των γονιδίων αυτών σε άλλα βακτήρια (Escherichia coli, Zymomonas mobilis) και ζύµες (Saccharomyces cerevisiae, Candita utilis), κατασκευάζοντας έτσι στελέχη µικροοργανισµών µε µεγάλη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο (Sandmann και συν. 1990, Misawa και συν. 1991, Sandmann 1994, Misawa και Shimada 1998, Miura και συν. 1998, Sandmann και συν. 1999, SchmidtDannert 2000). 17

54 2.1.4 Φύκη Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί µία οικονοµική βιολογική διεργασία παραγωγής βκαροτένιου από τα φύκη Dunalliella salina και Dunaliella bardawil. Τα φύκη αυτά έχουν την ικανότητα να συνθέτουν µεγάλη ποσότητα χρωστικής όταν καλλιεργούνται σε λίµνες µε αλµυρό νερό. Έχει αναφερθεί ότι το παραγόµενο βκαροτένιο ανέρχεται σε 14,0% του ξηρού βάρους του φύκους, ενώ συγχρόνως παράγεται µίγµα άλλων καροτενοειδών (ακαροτένιο, ζεαξανθίνη, κρυπτοξανθίνη κ. ά.), γλυκερόλη (30,0% του ξηρού βάρους του φύκους) και µονοκυτταρική πρωτείνη υψηλής προστιθέµενης αξίας (BenAmotz 1980, BenAmotz και Avron 1983, Borowitzka και συν. 1984, Fabregas και Herrero 1985, Borowitzka και Borowitzka 1988, Benemann 1990, Vandamme 1992, Baets και συν. 2002). Το κύριο µειονέκτηµα της µεθόδου αυτής είναι ότι η εφαρµογή της σε βιοµηχανική κλίµακα περιορίζεται σε χώρες όπου επικρατούν κατάλληλες κλιµατολογικές συνθήκες και υπάρχουν µεγάλες εκτάσεις αναλλοίωτων αλµυρών λιµνών όπως στην Αυστραλία, στη Ρωσία, στο Ισραήλ, στην Ισπανία, στη Χιλή και στην Κίνα (Shlomai και συν. 1991, Vandamme 1992, Baets και συν. 2002). Η Αυστραλία αποτελεί σε παγκόσµια κλίµακα τη χώρα µε τη µεγαλύτερη παραγωγή βκαροτένιου από τα φύκη D. salina και D. bardawil, τα οποία καλλιεργούνται σε µεγάλες (πάνω από 150 m µήκος) και βαθιές (2030 cm βάθος) λίµνες µε περιεκτικότητα σε NaCl που κυµαίνεται µεταξύ 20,025,0% (Borowitzka 1991, Baets και συν. 2002). Επίσης, το παραγόµενο βκαροτένιο από τα φύκη παρουσιάζει µειωµένη διατροφική αξία κατά 50,0%, συγκρινόµενο µε την προβιταµίνη Α που παράγεται από το µύκητα B. trispora. Αυτό οφείλεται στο ότι τα φύκη συνθέτουν ισοµοριακό µίγµα alltrans και 9cisισοµερών του βκαροτένιου, οπότε παρόλο που η συνολική ποσότητα της προβιταµίνης Α είναι µεγάλη, η βιολογική της δράση είναι µειωµένη λόγω του 9cisβκαροτένιου που είναι λιγότερο ενεργό (Zechmeister 1962, BenAmotz και Avron 1983, 1990, BenAmotz και συν. 1988a,b, 1989). Εντούτις, πρόσφατες µελέτες αναφέρουν ότι το 9cisβκαροτένιο µπορεί να ισοµεριστεί σχεδόν εξ ολοκλήρου σε alltransβκαροτένιο στο έντερο του ανθρώπινου οργανισµού (Parker 1996). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει τη δυνατότητα χρησιµοποίησης του 9cisβκαροτένιου ως εξίσου καλή πηγή βιταµίνης Α στην ανθρώπινη διατροφή, σε σύγκριση µε τη δράση του alltransβκαροτένιου ως προβιταµίνη Α. Σε εργαστηριακή κλίµακα, µελετήθηκαν διαφορετικά φύκη για την ικανότητα τους να συνθέτουν βκαροτένιο. Τα φύκη 18

55 αυτά ανήκουν στις διαιρέσεις Bacillariophyta, Chlorophyta, Chrysophta, Cyanophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Pyrrophyta, Phaeophyta, Rhodophyta και Xanthophyta και έχει βρεθεί ότι παράγουν µίγµα καροτενοειδών µε επικρατέστερο συστατικό το βκαροτένιο, εκτός από τα φύκη της διαίρεσης Cryptophyta, από τα οποία παράγεται σε µεγαλύτερη ποσότητα ακαροτένιο (Ciegler 1965, Atkinson και Mavituna 1985, Borowitzka και Borowitzka 1988, De la Noue και de Pauw 1988, Benemann 1990, Kobayashi και συν. 1993). Το είδος D. salina παρουσιάζει την υψηλότερη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο, έναντι όλων των άλλων ειδών που έχουν µελετηθεί σε πειραµατική κλίµακα. Έχει βρεθεί ότι παράγει βκαροτένιο (189,0 mg/l) σε ζύµωση βυθού υπό την επίδραση φωτός έντασης 40 W/m 2 (Borowitzka και συν. 1984, Hosotani και Kitaoka 1984, Frohlich και συν. 1984, BenAmotz και Avron 1990, Yamaoka και συν. 1994, Enes και Saraiva 1996, Wilson και συν. 1997). Επίσης, έχει µελετηθεί η παραγωγή της χρωστικής µε τη χρήση ακινητοποιηµένων κυττάρων D. saline σε αλγινικό ασβέστιο (Leach και συν. 1998). Τα είδη Euglena gracilis, D. tertiolecta και Ochromonas danica έχουν χρησιµοποιηθεί για την παραγωγή µίγµατος βκαροτένιου, βιταµίνης C και βιταµίνης Ε από συνθετικό υπόστρωµα γλυκόζης µε ζύµωση βυθού (Takeyama και συν. 1996). Από αυτά, το είδος E. gracilis παράγει τις µεγαλύτερες ποσότητες βκαροτένιου (71,0 mg/l), βιταµίνης C (86,5 mg/l) και βιταµίνης Ε (30,1 mg/l) Ιστοκαλλιέργειες Εκτός από τη χρήση µικροοργανισµών, για την παραγωγή βκαροτένιου έχουν αναπτυχθεί και τεχνικές ιστοκαλλιέργειας φυτικών κυττάρων. Σε πειραµατικό επίπεδο έχει αναφερθεί η παραγωγή του βκαροτένιου µε καλλιέργεια κυτταρικών γραµµών του είδους Daucus carota (wild carrot) από συνθετικό υπόστρωµα σακχαρόζης, όµως η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου ήταν πολύ χαµηλή (Ciegler 1965, Simon 1993, Yun και συν. 1990). Τα τελευταία χρόνια, η εφαρµογή των τεχνικών αυτών έχει επεκταθεί στη χρήση κυττάρων γενετικά βελτιωµένων φυτών µε υψηλή παραγωγικότητα σε βκαροτένιο και παρουσιάζει µεγάλο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον (Simon 1993, Ye και συν. 2000). Παρ όλα αυτά, η παραγωγή βκαροτένιου από καλλιέργεια φυτικών κυττάρων δεν βρίσκει ακόµη βιοµηχανική εφαρµογή. 19

56 2.2 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Για τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου από τους µικροοργανισµούς χρησιµοποιείται το ακετυλοσυνένζυµο Α, το οποίο προέρχεται από το µεταβολισµό των υδατανθράκων, λιποειδών και πρωτεϊνών (Γεωργάτσος 1993). Η βιοσυνθετική πορεία του βκαροτένιου χωρίζεται σε δύο στάδια: α) σχηµατισµός του αρχικού πολυισοπρενοειδούς µε 40 άτοµα άνθρακα και β) µετατροπή του C 40 µορίου σε βκαροτένιο (Ciegler 1965, Feofilova και Kudryavtseva 1974, Hui 1992). Η βιοσύνθεση του βκαροτένιου περιγράφεται στο Σχήµα Στο πρώτο στάδιο της σύνθεσης του βκαροτένιου, η σειρά των αντιδράσεων για τη δόµηση του ανθρακικού σκελετού από σαράντα άτοµα άνθρακα αρχίζει µε τη συµπύκνωση δύο µορίων ακετυλοσυνενζύµου Α µε το ένζυµο ακετυλοcoacακετυλοτρανσφεράση (1) για τη δηµιουργία ενός µορίου ακετοακετυλοσυνενζύµου Α, το οποίο στη συνέχεια αντιδρά µε ένα ακόµη µόριο ακετυλοσυνενζύµου Α και µετατρέπεται σε 3υδροξυ3µεθυλογλουταρυλοσυνένζυµο Α (HMGCoA) µε µία ειδική συνθετάση (HMGCoA ένζυµο συµπυκνώσεως) (2). Το 3υδροξυ3µεθυλογλουταρυλοσυνένζυµο Α αποτελεί το πρώτο σηµαντικό ενδιάµεσο προϊόν στη βιοσύνθεση του βκαροτένιου (Γεωργάτσος 1993). Στη συνέχεια, το παράγωγο αυτό ανάγεται σε µεβαλονικό οξύ (MVA) µε το ένζυµο ρεδουκτάση του 3υδροξυ 3µεθυλογλουταρυλοσυνενζύµου Α (3) και τη χρησιµοποίηση δύο µορίων συνενζύµου NADPH 2 για κάθε µόριο HMGCoA που ανάγεται. Το µεβαλονικό οξύ µετατρέπεται σε πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο (IPP) µε τρεις διαδοχικές αντιδράσεις στις οποίες συµµετέχει το ATP. Οι αντιδράσεις αυτές συµπεριλαµβάνουν 2 αλληλοδιάδοχες φωσφορυλιώσεις του µεβαλονικού οξέος σε 5φωσφοµεβαλονικό οξύ (MVAP) και στη συνέχεια σε 5πυροφωσφοµεβαλονικό οξύ (MVAPP) µε τα ένζυµα µεβαλονική κινάση (4) και φωσφοµεβαλονική κινάση (5), αντίστοιχα, ενώ στο τελευταίο στάδιο η αποµάκρυνση του CO 2 από το 5 πυροφωσφοµεβαλονικό οξύ για τη δηµιουργία του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου συµβαίνει µε σύγχρονη υδρόλυση του ATP προς ADP και P i και η αντίδραση καταλύεται από την ολιγοφωσφοµεβαλονική ανυδροκαρβοξυλάση (6) (Hui 1992, Γεωργάτσος 1993, Stryer 1988). Το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο αποτελεί την πρώτη βιολογική ένωση που σχηµατίζεται κατά τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου που περιέχει τα πέντε άτοµα άνθρακα του ισοπρενίου (Γεωργάτσος 1993). Στη συνέχεια, το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο ισοµεριώνεται από µία ειδική ισοµεράση (7) προς πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο (DMAPP). Η 20

57 αντίδραση αυτή είναι αντιστρεπτή και στην κατάσταση ισορροπίας το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο βρίσκεται σε ποσοστό 7,0% (Ciegler 1965). Αυτές οι ισοµερείς οµάδες µε πέντε άτοµα άνθρακα συµπυκνώνονται για το σχηµατισµό µίας χηµικής ένωσης µε 10 άτοµα άνθρακα: ένα αλλυλικό καρβοκατιόν που σχηµατίζεται από το πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο προσβάλλεται από το πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο για να σχηµατισθεί το πυροφωσφορικό γερανύλλιο (GPP). Στη συνέχεια, το ίδιο είδος αντίδρασης επαναλαµβάνεται και το πυροφωσφορικό γερανύλλιο µετατρέπεται σε ένα αλλυλικό καρβοκατιόν, το οποίο επίσης προσβάλλεται από ένα πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο. Η ένωση που σχηµατίζεται και η οποία περιέχει 15 άτοµα άνθρακα ονοµάζεται πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο (FPP), ενώ η προσβολή τέταρτου µορίου πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου στο αλλυλικό καρβοκατιόν του πυροφωσφορικού φαρνεσυλίου οδηγεί στο σχηµατισµό του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (GGPP) µε ανθρακική αλυσίδα από 20 άτοµα άνθρακα. Η δηµιουργία των παραπάνω πυροφωσφορικών πολυϊσοπρενυλίων καταλύεται από διάφορα ένζυµα γνωστά ως πρενυλτρανσφεράσες (8, 9, 10) που έχουν εξειδίκευση ως προς το µέγεθος της πολυϊσοπρενοειδούς αλυσίδας (Γεωργάτσος 1993). Η βιοσύνθεση του βκαροτένιου προχωρεί µέσω του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου που δύο µόρια συµπυκνώνονται για να δώσουν φυτοένιο, ένα πολυϊσοπρενοειδές µε 40 άτοµα άνθρακα, µε το ένζυµο συνθετάση του φυτοένιου (11) (Ciegler 1965, Atkinson και Mavituna1985, Hui 1992, Γεωργάτσος 1993). Ορισµένοι ερευνητές αναφέρουν ότι πιθανόν, η πρώτη C 40 ένωση που σχηµατίζεται κατά τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου είναι το τετραυδροφυτοένιο, από το οποίο µε αφυδάτωση προκύπτει το φυτοένιο (Porter και Lincoln 1950, Ciegler 1965). Στο επόµενο στάδιο της βιοσυνθετικής πορείας, το φυτοένιο µετατρέπεται σε λυκοπένιο µέσω τεσσάρων διαδοχικών σταδίων αποκορεσµού µε ενδιάµεσα προϊόντα το φυτοφλουένιο, ζκαροτένιο και νευροσπορένιο και στη συνέχεια από το λυκοπένιο προκύπτει το βκαροτένιο µέσω δύο διαδοχικών κυκλοποιήσεων µε ενδιάµεσο προϊόν το γκαροτένιο (Porter και Lincoln 1950). Οι παραπάνω αντιδράσεις καταλύονται από ένα πολυενζυµικό σύστηµα που αποτελείται από τέσσερα µόρια δεσατουράσης (12) και δύο µόρια κυκλάσης (13) (Mehta και CerdaOlmedo 1995). Κατά τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου, µετά το στάδιο σχηµατισµού του νευροσπορένιου ακολουθείται µία διακλαδισµένη πορεία, η οποία οδηγεί στη δηµιουργία λυκοπένιου, βζεακαροτένιου και αζεακαροτένιου. Το βζεακαροτένιο, ανάλογα µε 21

58 το λυκοπένιο, οδηγεί στη σύνθεση του βκαροτένιου, ενώ από το αζεακαροτένιο προκύπτει το ακαροτένιο (Ciegler 1965, Hui 1992). Πολλοί µικροοργανισµοί, εκτός από καροτένια, έχουν την ικανότητα να συνθέτουν και διάφορες ξανθοφύλλες (βκρυπτοξανθίνη, λουτείνη, ζεαξανθίνη, ασταξανθίνη), οι οποίες προκύπτουν από οξυγόνωση των καροτενίων µε υδροξυλάσες και οξυγονάσες που ενσωµατώνουν άτοµα οξυγόνου και ολόκληρα µόρια οξυγόνου, αντίστοιχα, σε διπλούς δεσµούς των καροτενίων (Ciegler 1965, Atkinson και Mavituna 1985, Hui 1992, Γεωργάτσος 1993). Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η οξυγόνωση του βκαροτένιου µε το ένζυµο υδροξυλάση του βκαροτένιου (14) για το σχηµατισµό της ζεαξανθίνης (Misawa και Shimada 1998). Από το σύνολο των καροτενίων που παράγει ο B. trispora το βκαροτένιο αντιστοιχεί σε ποσοστό 97,0%, ενώ µόνο το 3,0% είναι µίγµα άλλων καροτενίων µε κύριο συστατικό το γκαροτένιο (JECFA 2001). Το παραγόµενο βκαροτένιο απαντάται µε τη µορφή alltrans και 9cisισοµερούς. Το µεγαλύτερο ποσοστό αντιστοιχεί σε alltransβκαροτένιο και κυµαίνεται µεταξύ 75,095,0% ανάλογα µε τις συνθήκες της ζύµωσης και το στέλεχος του µικροοργανισµού (Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1963a,b, Dholakia και Modi 1984, JECFA 2001). 22

59 Ακετυλοσυνένζυµο Α 1 2x Ακετοακετυλοσυνένζυµο Α 2 Ακετυλοσυνένζυµο Α 3Υδροξυ3µεθυλογλουταρυλοσυνένζυµο Α 3 Μεβαλονικό οξύ 2 NADPH + 2 H + 2 NADP + ATP 4 ADP 5Φωσφοµεβαλονικό οξύ 5 ATP ADP 5Πυροφωσφοµεβαλονικό οξύ 6 ATP ADP + P i + CO 2 Πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο 7 Πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο 8 Πυροφωσφορικό γερανύλιο 9 Πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο 10 Πυροφωσφορικό γερανυλγερανύλιο 2x 11 Φυτοένιο 12 Φυτοφλουένιο 12 ζκαροτένιο 12 Νευροσπορένιο 12 Λυκοπένιο βζεακαροτένιο α Ζεακαροτένιο 13 γκαροτένιο δκαροτένιο 13 βκαροτένιο ακαροτένιο [Ο] 14 Ζεαξανθίνη Λουτείνη Σχήµα Βιοσύνθεση βκαροτένιου (Ninet and Renaut 1979). 23

60 2.3 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Για τη µετάλλαξη στο µύκητα B. trispora µε σκοπό την αύξηση της παραγωγικότητας του µικροοργανισµού σε βκαροτένιο δεν έχουν γίνει πολλές µελέτες. Έχει αναφερθεί µικρός αριθµός µεταλλαγµένων στελεχών του B. trispora, σε ορισµένα από τα οποία παρατηρείται µειωµένη ικανότητα εγγενούς αναπαραγωγής και φαινοτυπικές διαφορές στο χρώµα του µυκηλίου τους, σε σύγκριση µε τα φυσικά στελέχη. Αυτές οι φαινοτυπικές µεταβολές οφείλονται στη βιοσύνθεση διαφορετικών τελικών προϊόντων από τα µεταλλαγµένα στελέχη (Khrabrova και Zhdanov 1979). Για τη µετάλλαξη του B. trispora έχουν χρησιµοποιηθεί περισσότερο η υπεριώδης ακτινοβολία και τα αλκυλιωτικά µέσα όπως η χηµική ένωση Νµεθυλο ΝνιτροΝνιτροζογουανιδίνη (Mehta και CerdaOlmedo 1995). Η παραπάνω ένωση επιδρά επί του DNA και το µεγαλύτερο µέρος των µεταλλάξεων που προκαλεί είναι µετατοπίσεις GCTA (Τσιφτσόγλου 1993). Έχει αναφερθεί ότι τα σπόρια του B. trispora είναι πιο ανθεκτικά στα µεταλλαξιγόνα και ειδικότερα στα αλκυλιωτικά µέσα, έναντι των άλλων µυκήτων της τάξης Mucorales, λόγω του µεγαλύτερου αριθµού πυρήνων ανά σπόριο του B. trispora (Heisenberg και CerdaOlmedo 1968, Mehta και CerdaOlmedo 1995). Τα µεταλλαγµένα στελέχη που προέκυψαν µε την επίδραση φυσικών ή χηµικών παραγόντων στα (+) και () φυσικά στελέχη του B. trispora παρουσιάζουν κοινές ιδιότητες και αποτελούνται από µίγµα επιθυµητών και ανεπιθύµητων στελεχών. Η επιλογή των µεταλλαγµένων στελεχών βασίστηκε στη φαινοτυπική έκφραση της µετάλλαξης. Έχουν αποµονωθεί τρείς διαφορετικοί τύποι µεταλλαγµένων στελεχών, τα οποία διαφοροποιούνται µεταξύ τους αλλά και µε το φυσικό στέλεχος (µυκήλιο µε κίτρινο ως πορτοκαλί χρώµα) ανάλογα µε το χρώµα του µυκηλίου τους και διακρίνονται σε: α) στελέχη µε λευκό µυκήλιο, β) στελέχη µε κόκκινο µυκήλιο και γ) στελέχη µε µυκήλιο έντονου πορτοκαλί χρώµατος (Mehta και CerdaOlmedo 1995). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, κατά τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου τόσο από φυσικά όσο και από µεταλλαγµένα στελέχη µικροοργανισµών το φυτοένιο µετατρέπεται σε λυκοπένιο και στη συνέχεια από το λυκοπένιο προκύπτει το βκαροτένιο µε τη δράση ενός πολυενζυµικού συστήµατος που αποτελείται από τέσσερα µόρια δεσατουράσης και δύο µόρια κυκλάσης. Από τα στελέχη µε λευκό µυκήλιο που αποµονώθηκαν µερικά δεν είχαν την ικανότητα να παράγουν καροτενοειδείς ουσίες λόγω ανωµαλιών που προκλήθηκαν στη λειτουργία 24

61 των αρχικών σταδίων της βιοσυνθετικής πορείας τους από µεταλλάξεις δοµικών γονιδίων ή από µεταλλάξεις που έγιναν σε ρυθµιστικά γονίδια. Επίσης, αποµονώθηκαν µεταλλαγµένα στελέχη µε λευκό µυκήλιο, τα οποία παρήγαν υψηλές συγκεντρώσεις φυτοένιου λόγω µετάλλαξης στο γονίδιο της δεσατουράσης του φυτοένιου που υπεισέρχεται στον αποκορεσµό του φυτοένιου σε λυκοπένιο. Τα στελέχη µε κόκκινο µυκήλιο παρουσίαζαν υψηλή παραγωγικότητα σε λυκοπένιο υποδηλώνοντας µετάλλαξη του γονιδίου που κωδικοποιεί την κυκλάση του λυκοπένιου, η οποία καταλύει τις αντιδράσεις κυκλοποίησης του λυκοπένιου σε βκαροτένιο. Τέλος, αποµονώθηκαν µεταλλαγµένα στελέχη του B. trispora µε µυκήλιο έντονου πορτοκαλί χρώµατος, τα οποία παρήγαν αυξηµένες συγκεντρώσεις τόσο βκαροτένιου όσο και των άλλων ενδιάµεσων προϊόντων της βιοσύνθεσης της χρωστικής κατά 36 φορές περισσότερο απ ότι τα φυσικά στελέχη. Το κύριο µειονέκτηµα των γενετικά βελτιωµένων στελεχών του µικροοργανισµού είναι ότι σχηµατίζουν λίγα ή καθόλου σπόρια. Επιπλέον, η παραγωγικότητα σε βκαροτένιο των µεταλλαγµένων στελεχών του B. trispora που έχουν αποµονωθεί µέχρι σήµερα δεν είναι σηµαντικά µεγαλύτερη απ ότι των φυσικών στελεχών. Μεταλλαγµένα στελέχη του Phycomyces blakesleeanus, τα οποία παράγουν υψηλότερες συγκεντρώσεις βκαροτένιου, έναντι των φυσικών στελεχών, έχουν αποµονωθεί από πολλούς ερευνητές. Ανεφέρεται ότι η σύνθεση βκαροτένιου στα κύτταρα φυσικών στελεχών του P. blakesleeanus ρυθµίζεται από το ίδιο το προϊόν µέσω του φαινοµένου της ανάδροµης αναστολής, κατά το οποίο διακόπτεται η βιοσυνθετική πορεία του βκαροτένιου όταν συσσωρεύεται µεγάλη ποσότητα της χρωστικής στα κύτταρα του µικροοργανισµού (Eslava και CerdaOlmedo 1974, Eslava και συν. 1974, Bejarano και συν. 1988). Οι Murillo και CerdaOlmedo (1976) βρήκαν ότι το προϊόν ps της έκφρασης του γονιδίου cars του P. blakesleeanus, παρουσία επαρκούς ποσότητας βκαροτένιου, αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν ένα ή περισσότερα από τα αρχικά ένζυµα της βιοσύνθεσης της χρωστικής. Έχουν αποµονωθεί γενετικά βελτιωµένα στελέχη του P. blakesleeanus, τα οποία παρουσιάζουν αυξηµένη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο (µέχρι και 1000 φορές παραπάνω), έναντι των φυσικών στελεχών, µετά από µετάλλαξη στο γονίδιο cars µε την επίδραση ΝµεθυλοΝνιτροΝνιτροζογουανιδίνης στα φυσικά στελέχη του µικροοργανισµού (Murillo και CerdaOlmedo 1976, Murillo και συν. 1978, Bejarano και συν. 1988). Ωστόσο, τα παραπάνω µεταλλαγµένα στελέχη δεν µπορούν να αναπαραχθούν εγγενώς. Πρόσφατα, αποµονώθηκαν άλλα µεταλλαγµένα στελέχη 25

62 του P. blakesleeanus, στα οποία απουσιάζει το φαινόµενο της ανάδροµης αναστολής της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου και τα οποία διατηρούν την ικανότητα τους να αναπαράγονται εγγενώς (Mehta και συν. 1997). Οι ζύµες R. glutinis και Phaffia rhodozyma παρουσιάζουν µεγάλο εµπορικό ενδιαφέρον όσον αφορά τη χρησιµοποίηση τους για την παραγωγή βκαροτένιου (Nelis και DeLeenheer 1991). Τα φυσικά στελέχη του είδους R. glutinis παράγουν µίγµα διαφορετικών καροτενοειδών, από τα οποία το ποσοστό του παραγόµενου βκαροτένιου είναι πολύ µικρό. Το µειονέκτηµα αυτό έγινε η αιτία να ερευνηθεί το κατά πόσο µπορούν µε γενετική βελτίωση τα αρχικά στελέχη να αποκτήσουν µεγαλύτερη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο. Οι Bhosale και Gadre (2001b) βρήκαν ότι στελέχη του R. glutinis που υπέστησαν µετάλλαξη µε UV ακτινοβολία παρήγαν 76 φορές περισσότερο βκαροτένιο απ ότι το φυσικό στέλεχος όταν καλλιεργούνταν σε συνθετικό υπόστρωµα γλυκόζης, ενώ περαιτέρω αύξηση του βκαροτένιου (κατά 2 φορές) από το µεταλλαγµένο στέλεχος παρατηρήθηκε όταν κατά την προετοιµασία του υποστρώµατος παραγωγής χρησιµοποιήθηκε θαλασσινό νερό. Επίσης, τα φυσικά στελέχη του είδους P. rhodozyma παράγουν µίγµα καροτενοειδών µε κύριο συστατικό την ασταξανθίνη (Andrewes και συν. 1976, Girard και συν. 1994). Έχουν αποµονωθεί γενετικά τροποποιηµένα στελέχη της P. rhodozyma, τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα τους να συνθέτουν την οξυγονάση που υπεισέρχεται στη µετατροπή του βκαροτένιου σε ασταξανθίνη και παράγουν βκαροτένιο σε συγκεντρώσεις πολύ µεγαλύτερες απ ότι τα φυσικά στελέχη (Girard και συν. 1994). Εκτός από τη µεταλλαξιγένεση µικροοργανισµών ώστε να αποκτήσουν µεγαλύτερη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο, πολλές µελέτες έχουν γίνει όσον αφορά την εισαγωγή και την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυµα της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου σε φυσικά στελέχη µικροοργανισµών που δεν έχουν την ικανότητα να συνθέτουν τη χρωστική, ώστε να κατασκευαστούν νέα στελέχη µε υψηλή παραγωγικότητα σε βκαροτένιο. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η µεταφορά συµπλέγµατος crt γονιδίων (crt E, crt B, crt I, crt Y), τα οποία αποµονώθηκαν από το γονιδίωµα των βακτηρίων Erwinia herbicola και Erwinia uredevora, σε κύτταρα Escherichia coli (Sandmann και συν. 1990, Sandmann 1994, Albrecht και συν. 1997, Misawa και Shimada 1998, SchmidtDannert 2000). Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν τα ένζυµα συνθάση του πυροφωσφορικού γερανυλγερανύλιου (crt E), συνθάση του φυτοένιου (crt B), δεσατουράση του φυτοένιου (crt I) και κυκλάση του λυκοπένιου (crt Y) (Misawa και συν. 1990, Misawa και Shimada 26

63 1998). Το πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο (FPP) αποτελεί το πρώτο υπόστρωµα της δράσης των παραπάνω ενζύµων κατά τη βιοσυνθετική πορεία του βκαροτένιου στα βακτήρια του γένους Erwinia. Η E. coli αποτελεί καλό ξενιστή για την παραγωγή βκαροτένιου λόγω του ότι παράγει ισοπρενοειδείς ενώσεις (δολιχόλες, κινόνες) για τις ανάγκες του κυτταρικού της τοιχώµατος µε πρόδροµη ουσία το πυροφωσφορικό φαρνεσύλιο. Άρα η ροή του C θα µπορούσε να κατευθυνθεί µερικώς προς βκαροτένιο µε την εισαγωγή των crt γονιδίων. Χρησιµοποιώντας το φορέα της E. coli pacyc184 (Rose 1988) κατασκευάστηκε το πλασµίδιο paccar16 crtx που φέρει τα γονίδια crt E, crt B, crt I, crt Y. Το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο µεταφέρθηκε στην E. coli και το µετασχηµατισµένο πλέον στέλεχος E. coli JM 101 µπορούσε να παράγει βκαροτένιο (Misawa και Shimada 1998). Όταν στο µετασχηµατισµένο στέλεχος E. coli JM 101 µεταφέρθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί την ισοµεράση του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου (ipi) από τη ζύµη P. rhodozyma που παράγει ασταξανθίνη ή το πράσινο φύκος Heamatococcus pluvialis, τα νέα στελέχη E. coli µπορούσαν να παράγουν 10 φορές περισσότερο βκαροτένιο απο τα βακτήρια του γένους Erwinia (Misawa και Shimada 1998). Επίσης, έχει αναφερθεί η µεταφορά των crt γονιδίων της E. uredevora στα είδη Zymomonas mobilis και Agrobacterium tumefaciens (Misawa και συν. 1991). Ωστόσο, τα βακτήρια αυτά παρουσίαζαν χαµηλότερη παραγωγικότητα σε βκαροτένιο από τα ανασυνδυασµένα στελέχη E. coli. Ακόµα, µελετήθηκε η παραγωγή βκαροτένιου από ανασυνδυασµένα στελέχη ζυµών µετά από µεταφορά γενετικού υλικού στα φυσικά στελέχη. Τα φυσικά στελέχη των ζυµών Saccharomyces cerevisiae και Candita utilis δεν έχουν την ικανότητα να παράγουν βκαροτένιο, ενώ παράγουν εργοστερόλη ως κύριο ισοπρενοειδές. Όµοια µε την E. coli, το FPP που σχηµατίζεται στα κύτταρα των παραπάνω ζυµών θα µπορούσε να κατευθυνθεί µερικώς προς το σχηµατισµό βκαροτένιου µε την εισαγωγή των crt γονιδίων των βακτηρίων του γένους Erwinia. Οι Misawa και Shimada (1998) κατασκεύασαν ένα ανασυνδυασµένο στέλεχος ζύµης από το S. cerevisiae R7 µε τη µεταφορά του πλασµιδίου Y5143 που περιείχε τα crt γονίδια του E. uredevora. Το νέο στέλεχος παρήγε 103 µg βκαροτένιο/g ξηρού βάρους βιοµάζας µε λίγους ενδιάµεσους µεταβολίτες. Επίσης, έχει αναφερθεί η επιτυχηµένη αποµόνωση µετασχηµατισµένων στελεχών S. cerevisiae, τα οποία έχουν την ικανότητα να παράγουν βκαροτένιο µε µεταφορά στο φυσικό στέλεχος των crt γονιδίων του E. herbicola (Ausich και συν 1991). Πρόσφατα παρήχθηκε βκαροτένιο 400 µg/g ξηρού βάρους βιοµάζας 27

64 µετασχηµατισµένου στελέχους της ζύµης C. utilis, το οποίο προέκυψε από µεταφορά των γονιδίων crt E, crt B, crt I και crt Y στο φυσικό στέλεχος της ζύµης C. utilis (Misawa και Shimada 1998). Οι αποδόσεις σε βκαροτένιο των µικροοργανισµών που αναφέρθηκαν παραπάνω και αποµονώθηκαν µετά από µετάλλαξη ή µεταφορά γενετικού υλικού στα φυσικά στελέχη είναι σηµαντικά µικρότερες από τις αποδόσεις σε βκαροτένιο του µύκητα B. trispora µετά από σύζευξη φυσικών στελεχών αντίθετου φύλου του µικροοργανισµού. 2.4 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Θρεπτικά Συστατικά και Ιχνοστοιχεία Πηγή άνθρακα 1. Υδατάνθρακες Η κυριότερη πηγή άνθρακα που χρησιµοποιείται για την παραγωγή βκαροτένιου είναι η γλυκόζη. Η αρχική συγκέντρωση της γλυκόζης παίζει σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora. Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης στο υπόστρωµα παραγωγής προκαλεί καταστολή της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού (catabolite repression). Οι Dholakia και Modi (1982) αντικατέστησαν τη γλυκόζη µε κελλοβιόζη ως συνολική πηγή άνθρακα. Σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε αύξηση του παραγόµενου βκαροτένιου µε σύγχρονη παραγωγή σηµαντικής ποσότητας εξωκυτταρικής βγλυκοσιδάσης από το B. trispora. Η αύξηση της παραγωγής της χρωστικής οφειλόταν στο χαµηλό ρυθµό αποικοδόµησης της κελλοβιόζης σε ελεύθερα µόρια γλυκόζης λόγω της µειωµένης δραστικότητας της βγλυκοσιδάσης στις συνθήκες θερµοκρασίας και ph της ζύµωσης (θερµοκρασία 28 0 C, ph 8,0), αφού η µέγιστη δράση του ενζύµου παρατηρείται στους 50 0 C και σε ph 5,0. Η παρουσία χαµηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στο υπόστρωµα δεν ήταν ικανή να καταστείλει τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου. Οι Dandekar και συν. (1980) αναφέρουν ότι η παραγωγή χαµηλής συγκέντρωσης βκαροτένιου σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης οφείλεται πιθανόν στην ανενεργοποίηση της µεβαλονικής κινάσης (MVA). Συγκεκριµένα, αναφέρεται ότι η δραστικότητα του παραπάνω ενζύµου µειώνεται σηµαντικά µε την αύξηση της περιεκτικότητας του υποστρώµατος σε γλυκόζη από 0,2 Μ σε 0,3 Μ. Πολλές µελέτες σε βακτήρια και 28

65 θηλαστικά έδειξαν ότι εξωγενές κυκλικό AMP είναι δυνατόν να αναστρέψει την καταστολή που προέρχεται από τη γλυκόζη διεγείροντας την έναρξη της µεταγραφής οπερονίων που υπόκεινται σε καταστολή από τον καταβολίτη αυτό. Οι Dandekar και συν. (1980) που µελέτησαν την επίδραση του κυκλικού AMP στην παραγωγή βκαροτένιου από συζευγµένα στελέχη αντίθετου φύλου του µύκητα B. trispora αναφέρουν ότι η προσθήκη 1,0 mm κυκλικού AMP σε υπόστρωµα που περιέχει 0,2 και 0,3 Μ γλυκόζη αυξάνει την παραγωγή βκαροτένιου και ότι η θετική επίδραση του κυκλικού AMP είναι πιο έντονη σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης. Ειδικότερα, όπως προαναφέρθηκε, η προσθήκη κυκλικού AMP ευνοεί τη σύνθεση τρισπορικού οξέος στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας, το οποίο µε τη σειρά του ενεργοποιεί τη MVA, οπότε αυξάνεται η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιο. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι, όµοια µε το τρισπορικό οξύ, το κυκλικό AMP επάγει εκτός από την παραγωγή βκαροτένιου και την εγγενή αναπαραγωγή του µικροοργανισµού µε το σχηµατισµό ζυγοσπορίων. Οι Ciegler και συν. (1959a) που µελέτησαν την επίδραση διαφόρων πηγών άνθρακα στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora, βρήκαν ότι παραγόταν µικρές ποσότητες βκαροτένιου όταν χρησιµοποιούταν ως υπόστρωµα σακχαρόζη, δεξτρίνη, φρουκτόζη, άµυλο ή µαλτόζη. Αντίθετα, η σακχαρόζη είναι η προτιµούµενη πηγή άνθρακα για την παραγωγή βκαροτένιου τόσο από τη ζύµη R. glutinis όσο και από καλλιέργεια κυττάρων του είδους Daucus carota. Έχει βρεθεί ότι η άριστη συγκέντρωση σακχαρόζης για την παραγωγή της χρωστικής από τα είδη R. glutinis και Daucus carota κυµαίνεται µεταξύ 22,025,0 g/l και 30,050,0 g/l, αντίστοιχα (Costa και συν. 1987, Yun και συν. 1990). Ψηλότερη συγκέντρωση σακχάρων οδηγεί σε µεγάλη συγκέντρωση σακχάρων που δεν ζυµώνονται στο υπόστρωµα παραγωγής βκαροτένιου από τα παραπάνω είδη (Yun και συν. 1990). Επίσης, µελετήθηκε η χρησιµοποίηση διαφορετικών ειδών δηµητριακών (σιτάρι, κριθάρι, αραβόσιτος, σίκαλη, ρύζι) και προϊόντων σόγιας ως εναλλακτικές πηγές άνθρακα για την ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου από το µικροοργανισµό (Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1959a). Από τις µελέτες αυτές βρέθηκε ότι τα παραπάνω συστατικά επιδρούν θετικά τόσο στη µικροβιακή ανάπτυξη όσο και στην παραγωγή βκαροτένιου και ότι η µεγαλύτερη ποσότητα χρωστικής παράγεται µε την προσθήκη στο υπόστρωµα σογιάλευρου (Ciegler και συν. 1959a). Στα πλαίσια της έρευνας για τη χρησιµοποίηση παραπροϊόντων βιοµηχανιών χαµηλού κόστους ως υποστρώµατα παραγωγής βκαροτένιου, µελετήθηκε η ζύµωση 29

66 του ορού του γάλακτος από το B. trispora (Lampila και συν. 1985a,b). Ο ορός του γάλακτος είναι παραπροϊόν της βιοµηχανίας παρασκευής τυριών και αποτελείται από νερό, λακτόζη (4,05,0 %, w/v), πρωτείνες, βιταµίνες και µεταλλικά άλατα (Roukas και Kotzekidou 1998). Ένα µέρος του ορού του γάλακτος υφίσταται υπερδιήθηση για την παραγωγή των πρωτεϊνών. Μέσω της διαδικασίας αυτής παράγονται µεγάλες ποσότητες διηθήµατος, το οποίο περιέχει κυρίως λακτόζη και χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα για τη βιοµηχανική παραγωγή ενός µεγάλου αριθµού βιοτεχνολογικών προϊόντων. Οι Lampila και συν. (1985a) χρησιµοποίησαν το διήθηµα αυτό για την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora. Επειδή όµως η περιεκτικότητα του διηθήµατος σε πρωτείνη είναι πολύ µικρή (0,05 %, w/w), ήταν αναγκαία, για την καλή ανάπτυξη του µικροοργανισµού, η προσθήκη στο διήθηµα πριν τη ζύµωση θρεπτικών συστατικών πλούσια σε οργανικό ή ανόργανο άζωτο. Επίσης, έχει αναφερθεί η παραγωγή της χρωστικής από ορό του γάλακτος, στον οποίο έχει εφαρµοστεί πριν τη ζύµωση αφυδάτωση και το προϊόν που προκύπτει αποτελεί πλούσια πηγή άνθρακα και πρωτείνης, αφού περιέχει 61,0 % (w/w) λακτόζη και 11,0 % (w/w) πρωτείνη (Lampila και συν. 1985a). Εκτός από τον ορό του γάλακτος, για την παραγωγή βκαροτένιου έχει χρησιµοποιηθεί και η µελάσσα. Η µελάσσα είναι παραπροιόν των βιοµηχανιών παραγωγής της ζάχαρης. Πρόκειται για το τελικό σιρόπι φυγοκέντρησης, το οποίο είναι χαµηλής καθαρότητας ώστε να µην είναι οικονοµικά συµφέρουσα η κρυστάλλωση του. Περιέχει εκτός από σακχαρόζη και όλα τα άλλα συστατικά των τεύτλων, τα οποία δεν αποµακρύνονται κατά τη διαδικασία καθαρισµού του χυµού, τα διαλυτά συστατικά που προστίθενται κατά την παραγωγή της ζάχαρης και τα προϊόντα αποικοδόµησης που δηµιουργούνται στα διάφορα στάδια παραγωγής (McGinnis 1971). Οι Goksungur και συν. (2002) χρησιµοποίησαν τη µελάσσα για ζύµωση από το B. trispora µε σκοπό την παραγωγή βκαροτένιου. Στην περίπτωση αυτή ήταν αναγκαία η υδρόλυση της σακχαρόζης της µελάσσας µε κατεργασία του υποστρώµατος µε ιµβερτάση πριν τη ζύµωση, αφού έχει βρεθεί ότι ο µικροοργανισµός δεν καταβολίζει τη σακχαρόζη (Mantzouridou και συν. 2002a). Για την αύξηση της παραγωγικότητας του προϊόντος προστέθηκαν στο υπόστρωµα της µελάσσας και διάφοροι ενεργοποιητές της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου, όπως λινελαϊκό οξύ και κηροζίνη (Ciegler και συν. 1959b, 1962, Mantzouridou και συν. 2002a). Σε πρόσφατες µελέτες έγιναν προσπάθειες για τη γενετική βελτίωση στελεχών της ζύµης R. glutinis ώστε να αυξηθεί η παραγωγικότητα τους σε 30

67 βκαροτένιο από τη ζύµωση της µελάσσας (Bhosale και Garde 2001a). Επίσης, η ζύµη R. glutinis χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή βκαροτένιου από εκχύλισµα σακχάρων από σακχαροκάλαµο (Martelli και συν. 1990) και από συµπυκνωµένο γλεύκος σταφυλιών (Buzzin 2000). 2. Φυτικά έλαια και λιπίδια Τα φυτικά έλαια παίζουν σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora. Προκαταρκτικές µελέτες αναφέρουν ότι η προσθήκη στο υπόστρωµα µίγµατος σογιέλαιου και βαµβακέλαιου διπλασιάζει τη συγκέντρωση του βκαροτένιου (Anderson και συν. 1958). Οι Ciegler και συν. (1959b) που µελέτησαν σε µεγαλύτερη έκταση την επίδραση διαφορετικών ειδών φυτικών ελαίων στην παραγωγή της χρωστικής, βρήκαν ότι τα καταλληλότερα φυτικά έλαια για την αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου είναι αυτά που περιέχουν µεγάλες ποσότητες ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος όπως το σογιέλαιο και το βαµβακέλαιο. Το λινέλαιο και άλλα φυτικά έλαια µε υψηλή περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (µόρια µε τρεις ή περισσότερους διπλούς δεσµούς) προκαλούν µικρή αύξηση στην παραγωγικότητα της χρωστικής. Σε υψηλές συγκεντρώσεις φυτικών ελαίων παρατηρείται µεγαλύτερη ανάπτυξη του µικροοργανισµού, ενώ σε χαµηλές συγκεντρώσεις ευνοείται η παραγωγή βκαροτένιου. Η άριστη συγκέντρωση του σογιέλαιου ή του βαµβακέλαιου για την παραγωγή της χρωστικής αντιστοιχεί σε 4,0% (w/v). Οι ίδιοι ερευνητές µελέτησαν την επίδραση των ελεύθερων λιπαρών οξέων στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή του βκαροτένιου. Αναφέρεται ότι η µεγαλύτερη αύξηση της συγκέντρωσης της χρωστικής παρατηρήθηκε µε την προσθήκη στο υπόστρωµα ελαϊκού οξέος ή µίγµατος ακόρεστων λιπαρών οξέων µε διπλούς συζυγιακούς δεσµούς, µε κύριο συστατικό το λινελαϊκό οξύ, επιβεβαιώνοντας έτσι τα παραπάνω αποτελέσµατα σχετικά µε τη θετική επίδραση του σογιέλαιου και του βαµβακέλαιου στην παραγωγή βκαροτένιου. Σηµαντική αύξηση της χρωστικής παρατηρήθηκε και µε την προσθήκη στο υπόστρωµα του µεθυλεστέρα του ελαϊκού οξέος. Αντίθετα, η ανάπτυξη του B. trispora σε υπόστρωµα που περιείχε τα παραπάνω ακόρεστα λιπαρά οξέα δεν ήταν εξίσου µεγάλη µε τη µικροβιακή ανάπτυξη που παρατηρήθηκε παρουσία των φυτικών ελαίων. Επίσης, τα κορεσµένα λιπαρά οξέα, όπως το στεατικό οξύ και το παλµιτικό οξύ, και τα ουδέτερα λίπη τριεσταρίνη και τριπαλµιτίνη δεν επηρέασαν σηµαντικά την απόδοση του βκαροτένιου (Ciegler και 31

68 συν. 1959b). Εκτός από τα φυτικά έλαια και τα λιπαρά οξέα µελετήθηκε η επίδραση της γλυκερόλης, διαφόρων αλειφατικών αλκοολών µικρού µοριακού βάρους και του σκουαλένιου στη µικροβιακή ανάπτυξη και την παραγωγή της χρωστικής. Έχει βρεθεί ότι η γλυκερόλη δεν αυξάνει σηµαντικά τη συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου από το B. trispora, παρά το ότι έχει αναφερθεί η χρησιµοποίηση της ως καλή πηγή άνθρακα για την παραγωγή της χρωστικής από τη ζύµη R. lactosa (Ciegler και συν. 1959b, Martelli και συν. 1992). Η προσθήκη της µεθανόλης, της αιθανόλης, της προπανόλης ή της βουτανόλης αναστέλλουν την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή βκαροτένιου (Ciegler και συν. 1959b). Επιπλέον, αναφέρεται η τοξική δράση του σκουαλένιου στην ανάπτυξη του B. trispora (Ciegler και συν. 1959b). 3. Υδρογονάνθρακες Η προσθήκη nαλκανίων σε συνθετικό υπόστρωµα ανάπτυξης του B. trispora που περιέχει γλυκόζη αυξάνει σηµαντικά τη σύνθεση λιπιδίων και πρωτεϊνών από το µικροοργανισµό. Οι Yakovleva και συν. (1981) αναφέρουν ότι ο χρόνος προσθήκης του nδεκαοκτάνιου στο υπόστρωµα επηρεάζει σηµαντικά το ποσοστό λιπιδίων και πρωτεϊνών που προέρχονται από το µεταβολισµό του. Έχει βρεθεί ότι όταν το n δεκαοκτάνιο προστίθεται στην αρχή της ζύµωσης το µεγαλύτερο ποσοστό λιπιδίων και πρωτεϊνών προέρχεται από το µεταβολισµό της γλυκόζης, ενώ η µεγαλύτερη µεταβολική δραστηριότητα του B. trispora για το nαλκάνιο και η παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας λιπιδίων και πρωτεϊνών από το µικροοργανισµό πραγµατοποιείται µε την προσθήκη του nδεκαοκτάνιου µετά 72 ώρες από την αρχή της ζύµωσης, όπου η συγκέντρωση της γλυκόζης στο υπόστρωµα έχει µειωθεί σηµαντικά. Ανεξάρτητα από το χρόνο προσθήκης του nαλκανίου, τα προϊόντα µεταβολισµού του είναι κυρίως λιπίδια, από τα οποία το µεγαλύτερο ποσοστό αντιστοιχεί σε φωσφολιπίδια και µονογλυκερίδια, και λιγότερο σε πρωτείνες (Bekhtereva και συν. 1972). Επίσης, µελετήθηκε η επίδραση της κηροζίνης στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora. Αναφέρεται ότι η προσθήκη κηροζίνης σε αναλογία 1:1 µε τα λιπαρά οξέα αυξάνει την παραγωγή βκαροτένιου όταν προστίθεται στο υπόστρωµα τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, ενώ η προσθήκη της κηροζίνης στην αρχή της ζύµωσης αναστέλλει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή της χρωστικής (Ciegler και συν. 1962). Αν και δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί πλήρως σε τι οφείλεται η επαγωγική δράση της κηροζίνης, αναφέρεται 32

69 ότι πιθανόν να δηµιουργεί ενδοκυτταρικούς χώρους αποθήκευσης µεγαλύτερης ποσότητας λιποδιαλυτού βκαροτένιου. Πηγή αζώτου Το άζωτο που χρησιµοποιείται συνήθως για την ανάπτυξη του B. trispora προστίθεται στο θρεπτικό υπόστρωµα µε τη µορφή εκχυλίσµατος ζύµης, υδρολυµένης καζείνης και Lασπαραγίνης. Επιπρόσθετα, έχει αναφερθεί η χρησιµοποίηση και άλλων πρωτεϊνικών αζωτούχων ενώσεων, όπως εκχύλισµα καλαµποκιού, υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας, διαλυτό υπόλειµµα απόσταξης αλκοόλης µετά τη ζύµωση καλαµποκιού, βαµβακάλευρο και σογιάλευρο, οι οποίες είναι πλούσιες σε αµινοξέα, βιταµίνες, διάφορα ιχνοστοιχεία και ανόργανα συστατικά (Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1963b, Ninet και Renaut 1979). Οι µελέτες έδειξαν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης των παραπάνω υλικών στο υπόστρωµα, όταν αυτά χρησιµοποιούνται µεµονωµένα ή σε συνδυασµό, ευνοούν τόσο την ανάπτυξη του µικροοργανισµού όσο και τη σύνθεση του βκαροτένιου. Επίσης, µελετήθηκε η επίδραση διαφόρων πηγών αζώτου ζωικής προέλευσης, όπως εκχύλισµα βοδινού κρέατος και πεπτόνη ζωικής προέλευσης και ανόργανων αλάτων, όπως (NH 4 ) 2 SO 4, στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου. Αναφέρεται ότι οι πηγές αζώτου ζωικής προέλευσης ήταν ανασταλτικές τόσο για τη µικροβιακή ανάπτυξη όσο και για την παραγωγή της χρωστικής. Επιπλέον, τα ανόργανα άλατα ενώ αύξησαν σηµαντικά το ξηρό βάρος της βιοµάζας του µικροοργανισµού, ήταν ανασταλτικά για τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου όταν χρησιµοποιούνταν σε υψηλές συγκεντρώσεις (Ciegler και συν. 1959a). Ανόργανα συστατικά και ιχνοστοιχεία Ο φώσφορος επιδρά σηµαντικά στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora. Αν και είναι γνωστό ότι η σύνθεση των περισσότερων δευτερογενών µεταβολιτών αναστέλλεται σε υψηλή συγκέντρωση φωσφόρου, έχει βρεθεί ότι η προσθήκη φωσφόρου σε συγκεντρώσεις µεταξύ 0,011,0% (w/v) επάγει τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trispora (Dholakia και Modi 1983, 1984). Η αύξηση της συγκέντρωσης του φωσφόρου από 0,01 % σε 1,0 % (w/v) αυξάνει την απόδοση της χρωστικής κατά 4,65 φορές, ενώ δεν επηρεάζει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Ψηλότερες συγκεντρώσεις φωσφόρου εµποδίζουν τόσο τη µικροβιακή ανάπτυξη όσο και την 33

70 παραγωγή βκαροτένιου. Όσον αφορά το µηχανισµό επαγωγής της σύνθεσης ορισµένων δευτερογενών µεταβολιτών από το φώσφορο, έχει βρεθεί ότι υψηλές συγκεντρώσεις του τελευταίου προκαλούν καταστολή των ενζύµων που είναι υπεύθυνα για τη διάσπαση φωσφοεστερικών δεσµών των φωσφορυλιωµένων ενδιάµεσων ενώσεων της βιοσύνθεσης των δευτερογενών µεταβολιτών (Martin 1977). Αντίθετα, σε υποστρώµατα, τα οποία δεν περιέχουν καθόλου ή περιέχουν µικρές συγκεντρώσεις φωσφόρου ενεργοποιείται η δράση των φωσφατασών, οι οποίες υδρολύουν τις φωσφορυλιωµένες ενδοκυτταρικές ενώσεις, µε αποτέλεσµα την απελευθέρωση µορίων ορθοφωσφορικού (P i ) και πυροφωσφορικού (PP i ) (Metzenberg 1979). Έχει βρεθεί ότι οι φωσφατάσες αναστέλλουν τη βιοσύνθεση του σκουαλένιου και των στερολών σε νεοπλαστικά κύτταρα (Gore και Popjack 1962) και ιστούς των όρχεων (Nightingale και συν. 1967) και του βκαροτένιου στα κύτταρα του B. trispora (Dholakia και Modi 1984), του P. blakesleeanus (Desai και συν. 1973) και τους ιστούς του µάγκο (Mangifera indica) (Matoo και συν. 1968). Όπως προαναφέρθηκε, κατά τη βιοσυνθετική πορεία του βκαροτένιου σχηµατίζεται ένας µεγάλος αριθµός φωσφορυλοενδιάµεσων ενώσεων, οι οποίες είναι απαραίτητες για τη βιοσύνθεση της χρωστικής. Η προσθήκη υψηλών συγκεντρώσεων φωσφόρου στο υπόστρωµα, µε τη µορφή του KH 2 PO 4, οδηγεί σε συσσώρευση µεγάλης ποσότητας ανόργανου φωσφόρου στο εσωτερικό των κυττάρων του B. trispora, µε αποτέλεσµα την ανάδροµη αναστολή ή καταστολή της δράσης των ενδοκυτταρικών φωσφατασών και τη σηµαντική αύξηση της απόδοσης της χρωστικής από το µικροοργανισµό (Dholakia και Modi 1984). Επιπλέον, ο φώσφορος επηρεάζει σηµαντικά τα βιοχηµικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora (Konova και συν. 1987, Goncharova και συν. 1996). Αναφέρεται ότι, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης φωσφόρου, τα κύτταρα του µικροοργανισµού περιέχουν οµοιογενές πρωτόπλασµα, ευδιάκριτους πυρήνες και πυρηνίσκους, καλά οργανωµένο ενδοπλασµατικό δίκτυο και µίγµα µικρών και µεγάλων µιτοχονδρίων µε πολλές ή λίγες πτυχώσεις, αντίστοιχα. Η έλλειψη φωσφόρου από το υπόστρωµα ανάπτυξης του µικροοργανισµού µεταβάλλει το είδος των λιπιδίων στην κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού αυξάνοντας το ποσοστό των γλυκολιπιδίων και µειώνοντας το ποσοστό των φωσφολιπιδίων. Επίσης, αυξάνει το ποσοστό των πολυσακχαριτών στο κυτταρικό τοίχωµα του µικροοργανισµού, χωρίς να µεταβάλλει την περιεκτικότητα της χιτίνης σε αυτό, µε αποτέλεσµα την αύξηση του πάχους του κυτταρικού τοιχώµατος του µικροοργανισµού. Σηµαντική µείωση παρατηρείται στο 34

71 ρυθµό ανάπτυξης του µικροοργανισµού και σχηµατισµού σπορίων. Επιπρόσθετα, η παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora επηρεάζεται σηµαντικά από ορισµένα ιχνοστοιχεία, όπως Fe 2+, Mg 2+ και Cu 2+. Έχει βρεθεί ότι όταν προστίθενται στο υπόστρωµα τα παραπάνω ιχνοστοιχεία σε χαµηλές συγκεντρώσεις αυξάνεται η συγκέντρωση της χρωστικής. Συγκεκριµένα, η προσθήκη FeSO 4 (10 3 M) και MgSO 4 (10 7 M) αυξάνει την απόδοση του βκαροτένιου κατά 1,4 και 1,7 φορές, αντίστοιχα, ενώ τη µεγαλύτερη θετική επίδραση παρουσιάζουν τα ιόντα Cu 2+, τα οποία επιφέρουν αύξηση της παραγωγής της χρωστικής κατά 2,2 φορές όταν προστίθενται σε συγκέντρωση 10 8 M µε τη µορφή του CuSO 4 (Govind και συν. 1982). Επιπλέον, παρουσία ιόντων Cu 2+ παρατηρείται αύξηση του ρυθµού ανάπτυξης του B. trispora µε σύγχρονη αύξηση του ρυθµού κατανάλωσης της γλυκόζης και του P i από το µικροοργανισµό. Επίσης, αναφέρεται ότι η προσθήκη 10 8 M CuSO 4 αυξάνει κατά δύο φορές τη σύνθεση του τρισπορικού οξέος και τη δραστικότητα της MVA στα κύτταρα του µικροοργανισµού. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην αύξηση του ρυθµού κατανάλωσης της γλυκόζης παρουσία Cu 2+, οπότε ευνοείται η σύνθεση µεγαλύτερης ποσότητας τρισπορικού οξέος στα κύτταρα του B. trispora σε χαµηλές συγκεντρώσεις του καταβολίτη. Το τρισπορικό οξύ επάγει τη δράση της MVA για τη σύνθεση µεγαλύτερης συγκέντρωσης βκαροτένιου (Govind και συν. 1982). Η προσθήκη των ZnSO 4, CoSO 4, MnSO 4, Na 2 SO 4, K 2 SO 4 και CaSO 4 σε συγκεντρώσεις Μ δεν ευνοούν την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora (Govind και συν. 1982). Βιταµίνες Η υδροχλωρική θειαµίνη (B 1 ) αποτελεί ένα σηµαντικό αυξητικό παράγοντα (growth factor) στην ανάπτυξη του B. trispora. Η βιταµίνη αυτή προστίθεται στο υπόστρωµα συνήθως σε ελεύθερη µορφή. Επίσης, περιέχεται στις περισσότερες πρωτεϊνικές αζωτούχες πηγές που αναφέρθηκαν παραπάνω, όπως το εκχύλισµα καλαµποκιού και το βαµβακάλευρο, µαζί µε άλλες βιταµίνες όπως τη βιοτίνη, τη ριβοφλαβίνη, το νικοτινικό οξύ, το φολικό οξύ και το παντοθενικό οξύ (Stanbury και συν. 1995). Οι Ninet και συν. (1969) αναφέρουν ότι η προσθήκη νικοτιναµίδιου (B 3 ) στο υπόστρωµα δεν επηρεάζει την απόδοση του βκαροτένιου. Αντίθετα, η βιοτίνη αυξάνει σηµαντικά τη συγκέντρωση της παραγόµενης χρωστικής τόσο από το B. trispora όσο και από το P. Blakesleeanus (Desai και συν. 1975). Όπως είναι γνωστό, η βιοτίνη αποτελεί την προσθετική οµάδα διαφόρων ενζύµων που 35

72 καταλύουν την καθήλωση του CO 2 σε οργανικές ενώσεις (Γεωργάτσος 1993). Στα ένζυµα αυτά η βιοτίνη είναι δεσµευµένη µέσω της εαµινοµάδας ενός ειδικού καταλοίπου λυσίνης µε έναν αµιδικό δεσµό και έχει την ικανότητα να δεσµεύει CO 2 και να το αποδίδει σε αντιδράσεις καρβοξυλίωσης (Γεωργάτσος 1993, Stryer 1995). Στην περίπτωση της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου από τα στελέχη B. trispora και P. blakesleeanus, το HMGCoA, το οποίο αποτελεί µία σηµαντική ενδιάµεση ένωση της κύριας βιοσυνθετικής πορείας της χρωστικής από το ακετυλοσυνένζυµο Α, σχηµατίζεται και από το µεταβολισµό της λευκίνης µε µία σειρά αντιδράσεων που συµπεριλαµβάνουν τη µεταφορά CO 2 στο βµεθυλοκροτωνυλοσυνένζυµο Α µε το ένζυµο καρβοξυλάση του βµεθυλοκροτωνυλοσυνενζύµου Α για τη σύνθεση του βµεθυλογλουτακονυλοσυνενζύµου Α. Από το τελευταίο µε την προσθήκη νερού προκύπτει το HMGCoA (Ciegler 1965, Desai και συν. 1975). Η καρβοξυλάση του βµεθυλοκροτωνυλοσυνενζύµου Α χρησιµοποιεί για την καταλυτική της ενέργεια τη βιοτίνη. Η προσθήκη βιοτίνης στο υπόστρωµα παραγωγής της χρωστικής επάγει τη δράση του ενζύµου µε αποτέλεσµα τη σύνθεση µεγαλύτερης ποσότητας HMG CoA, άρα και µεγαλύτερης συγκέντρωσης βκαροτένιου από τους µικροοργανισµούς. Η λευκίνη και η βιοτίνη αποτελούν κύρια συστατικά του εκχυλίσµατος καλαµποκιού και του βαµβακάλευρου (Stanbury και συν. 1995). Επίσης, η βιταµίνη Α ευνοεί την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora και το P. blakesleeanus. Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη βιταµίνης Α σε συγκέντρωση 0,18 mm αυξάνει κατά 23 φορές την ποσότητα του παραγόµενου βκαροτένιου στη συζευγµένη καλλιέργεια του B. trispora και σε συγκέντρωση 0,75 mm αυξάνει κατά 10 φορές τη συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου στη συζευγµένη καλλιέργεια του P. blakesleeanus (Feofilova και Bekhtereva 1976, Dandekar και συν. 1980, Govind και CerdaOlmedo 1986). Επιπλέον, αναφέρεται ότι η θετική επίδραση της ρετινόλης στην παραγωγή της χρωστικής από το B. trispora ευνοείται παρουσία σογιέλαιου στο υπόστρωµα πιθανόν λόγω του ότι το σογιέλαιο: α) σταθεροποιεί το µόριο της βιταµίνης Α και β) εξασφαλίζει την πλήρη και γρήγορη διείσδυση του µορίου της βιταµίνης Α στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού (Feofilova και Bekhtereva 1976). Έχει βρεθεί ότι, όµοια µε τη δράση του τρισπορικού οξέος, η βιταµίνη Α ενεργοποιεί τη σύνθεση ενζύµων που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση του βκαροτένιου (Feofilova και Bekhtereva 1976). 36

73 2.4.2 Επιφανειοδραστικές Ουσίες και Αντιοξειδωτικά Η µορφολογία του µυκηλίου του B. trisporα παίζει σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή βκαροτένιου. Έχει βρεθεί ότι η µορφολογία του µικροοργανισµού σε υγρό υπόστρωµα επηρεάζεται από την παρουσία µηιοντικών επιφανειοδραστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές εµποδίζουν το σχηµατισµό συσσωµατωµάτων µυκηλιακών υφών του µικροοργανισµού και ευνοούν τη διασπορά του µυκηλίου στο υγρό της ζύµωσης. Για το σκοπό αυτό, οι Anderson και συν. (1958) χρησιµοποίησαν την ουσία 4(1,1,3,3τετραµεθυλοβουτυλο)φαινυλοπολυαιθυλενογλυκόλη (Triton X 100), η οποία όµως είναι τοξική για την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή της χρωστικής. Άλλες επιφανειοδραστικές ουσίες που µελετήθηκαν είναι οι ενώσεις µονολαυρική σορβιτάνη (Span 20), µονοπαλµιτική σορβιτάνη (Span 40), µονοστεατική σορβιτάνη (Span 60), µονοελαϊκή σορβιτάνη (Span 80), τριελαϊκή σορβιτάνη (Span 85), µονολαυρική πολυοξυαιθυλενοσορβιτάνη (Tween 20) και µονοελαϊκή πολυοξυαιθυλενοσορβιτάνη (Tween 80), από τις οποίες η πιο αποτελεσµατική είναι το Span 20 (Kim και συν. 1996, 1997a,b, 1999, Jeong και συν. 2001). Παρουσία του Span 20 µειώνεται ο ρυθµός σχηµατισµού και το µήκος των µυκηλιακών υφών οπότε επιτυγχάνεται πλήρη διασπορά του µυκηλίου στο υγρό της ζύµωσης χωρίς τη δηµιουργία συσσωµατωµάτων ή σβόλων των υφών (Jeong και συν. 2001). Η διασπορά του µυκηλίου στο υγρό της ζύµωσης ευνοεί τη µεγαλύτερη ανάπτυξη του µικροοργανισµού λόγω καλύτερης διάχυσης των θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου στο εσωτερικό του µυκηλίου, έναντι των περιορισµένων φαινοµένων διάχυσης που συµβαίνουν στα εσωτερικά τµήµατα των µυκηλιακών συσσωµατωµάτων. Επίσης, η καλύτερη µεταφορά µάζας διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης ενισχύεται µε την αύξηση της διαπερατότητας της µεµβράνης από την επιφανειοδραστική ουσία Span 20 (Kobayashi και συν. 1973, Kim και συν. 1997a,b, 1999). Παράλληλα µε τη µεγάλη ανάπτυξη του µικοοργανισµού σηµειώνεται σηµαντική αύξηση της απόδοσης του τρισπορικού οξέος λόγω καλύτερης διάχυσης των προορµονών στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trisporα, οπότε αυξάνεται η παραγωγή βκαροτένιου κατά 1015 φορές (Kim και συν. 1997a,b). Η προσθήκη αντιοξειδωτικού στο υπόστρωµα παραγωγής βκαροτένιου έχει βρεθεί ότι ενισχύει τη σταθερότητα του µορίου της χρωστικής στο εσωτερικό των κυττάρων του B. trisporα. Οι Ciegler και συν. (1961) που µελέτησαν την επίδραση διαφόρων αντιοξειδωτικών στη σταθερότητα του µορίου του βκαροτένιου, βρήκαν 37

74 ότι η προσθήκη των ουσιών 6αιθοξυ2,2,4τριµεθυλο1,2διυδροκινολίνης (Santoquin) ή βουτυλιωµένου υδροξυτολουόλιου (BHT) σε συγκέντρωση 0,25% (w/v) εξασφαλίζει σε µεγάλο βαθµό τη σταθερότητα της χρωστικής. Αναφέρεται ότι οι ουσίες αυτές εισέρχονται στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού και διαλύονται στα λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης που αποτελούν τους αποθηκευτικούς χώρους του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου, µε αποτέλεσµα να προστατεύουν τη χρωστική από ενζυµατική αυτοξείδωση Ενεργοποιητές Ένας µεγάλος αριθµός ενεργοποιητών της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου έχει χρησιµοποιηθεί για την αύξηση της παραγωγής της χρωστικής από το B. trispora. Οι Anderson και συν. (1958) που µελέτησαν πρώτοι την επίδραση της βιονόνης στην παραγωγή βκαροτένιου στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας των (+) και () στελεχών του B. trispora, βρήκαν ότι όταν η ουσία αυτή προστίθεται σε συγκέντρωση 0,1% (w/v) σε υπόστρωµα που περιέχει φυτικά έλαια και επιφανειοδραστικές ουσίες αυξάνει σηµαντικά τη συγκέντρωση της χρωστικής. Αναφέρεται ότι ο χρόνος προσθήκης της βιονόνης στο υπόστρωµα επηρεάζει σηµαντικά τόσο την ανάπτυξη του µικροοργανισµού όσο και την παραγωγή της χρωστικής. Επίσης, αναφέρεται ότι η προσθήκη της βιονόνης στην αρχή της ζύµωσης καταστέλλει την ανάπτυξη του B. trispora, ενώ η µέγιστη αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου (κατά 10 φορές) από τη βιονόνη επιτυγχάνεται µε την προσθήκη της ουσίας τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (Ciegler και συν. 1959a,b, 1963b, Ciegler 1965, Ninet και Renaut 1979, Atkinson και Mavituna 1985). Όµοια µε τη βιονόνη και η αιονόνη διεγείρει την παραγωγή της χρωστικής από το µικροοργανισµό χωρίς να µεταβάλλει τη δοµή του τελικού προϊόντος (95% alltransβκαροτένιο) (Ciegler και συν. 1959b). Επιπλέον, αναφέρεται η θετική επίδραση της α και βιονόνης στην παραγωγή βκαροτένιου από το P. blakesleeanus (Mackinney και συν. 1953). Για την εξήγηση του µηχανισµού δράσης της βιονόνης στη σύνθεση του βκαροτένιου, αρχικά διατυπώθηκε η άποψη ότι το βκαροτένιο αποκτά τους δύο δακτύλιους που αποτελούν τα ακραία τµήµατα του µορίου του από τη βιονόνη (Ciegler και συν. 1959b). Όσον αφορά τη δράση της αιονόνης, οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν την πιθανή διάσπαση του µορίου της και συµµετοχή τµηµάτων αυτού στο µόριο του βκαροτένιου. Μελέτες µε αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης τόσο στο στάδιο της µεταγραφής (κυκλοεξιµίδιο) όσο και στο στάδιο της µετάφρασης 38

75 (ακτινοµυκίνη D) απέδειξαν ότι η α και η βιονόνη επάγουν τη σύνθεση ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου (Feofilova και Arbuzov 1975). Συγκεκριµένα, βρέθηκε ότι η βιονόνη και το τρισπορικό οξύ ανταγωνίζονται µεταζύ τους για την επαγωγή της σύνθεσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων που υπεισέρχονται στη µετατροπή του 5φωσφοµεβαλονικού οξέος σε πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο (Rao και Modi 1977). Όπως και στην περίπτωση της δράσης του τρισπορικού οξέος, η επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων των παραπάνω ενζύµων παρουσία της βιονόνης εµπλέκει την αναστολή της δράσης της πρωτείνης καταστολέα IP, η οποία εµποδίζει τη µεταγραφή τους. Ο καταστολέας IP µετατρέπεται σε ενεργοποιητή µε τη δράση µίας ουδέτερης µεµβρανικής σερινοπρωτεάσης, τη σύνθεση της οποίας επάγει η βιονόνη στο επίπεδο της µετάφρασης (Mehta και συν. 1981). Πολλοί ερευνητές που µελέτησαν την επίδραση διαφόρων ουσιών παρόµοιας δοµής µε το µόριο του τρισπορικού οξέος στην παραγωγή βκαροτένιου από τη σύζευξη (+) και () κυττάρων του B. trisporα, βρήκαν ότι παράγεται περισσότερη χρωστική όταν προστίθεται στο υπόστρωµα τρισπορικό οξύ, αψισικό οξύ (ABA), βιονόνη, αιονόνη και βιταµίνη Α, ενώ δεν επηρεάζεται η ανάπτυξη του µικροοργανισµού, εκτός από τις περιπτώσεις που χρησιµοποιείται α ή βιονόνη (Dandekar και συν. 1980, Mehta και συν. 1981). Όλες οι ουσίες αυξάνουν την παραγωγή της χρωστικής µέσω του ίδιου µηχανισµού, όπως αυτός περιγράφηκε παραπάνω για το τρισπορικό οξύ (Dandekar και συν. 1980, Mehta και συν. 1981). Η προσθήκη C 13 δικετονών και C 15 κετοξέων ευνοεί τη λιπογένεση παρά τη σύνθεση βκαροτένιου (Yakovleva και συν. 1980). Το υψηλό κόστος της α και βιονόνης έγινε η αιτία να µελετηθούν άλλες φθηνότερες ουσίες για το αν µπορούν να αντικαταστήσουν τις ιονόνες όσον αφορά τη δράση τους ως ενεργοποιητές της σύνθεσης του βκαροτένιου. Αναφέρεται ότι το διµεθυλοφορµαµίδιο, το αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος, το υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και το 2,6,6τριµεθυλο1ακετυλοκυκλοεξένιο αυξάνουν εξίσου σηµαντικά µε την α και βιονόνη την απόδοση του βκαροτένιου, ενώ παρουσιάζουν συνεργιστική δράση µε τις ιονόνες στην αύξηση της παραγωγής της χρωστικής (Ninet και συν. 1969, Ninet και Renaut 1979, Atkinson και Mavituna 1985). Επίσης, αναφέρεται η αντικατάσταση της α και βιονόνης µε φτηνά υποπροϊόντα της επεξεργασίας εσπεριδοειδών όπως πολτό και πούλπα εσπεριδοειδών και λάδι από τη συµπίεση καρπών των εσπεριδοειδών (Ciegler και συν. 1963a, Ciegler 1965). Οι Desai και Modi (1977) βρήκαν ότι η πενικιλλίνη 39

76 αυξάνει σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trisporα. Η επαγωγική δράση της πενικιλλίνης στην απόδοση της χρωστικής συνδέεται µε: α) την αύξηση της δραστικότητας της µεβαλονικής κινάσης και β) τη µείωση του βαθµού αποικοδόµησης του σχηµατισµένου βκαροτένιου σε άλλα προϊόντα. Επιπρόσθετα, αναφέρεται η ενεργοποίηση της παραγωγής βκαροτένιου µε την εφαρµογή οξειδωτικού στρες στο περιβάλλον ανάπτυξης του B. trisporα και παραγωγής της χρωστικής µε την προσθήκη Η 2 Ο 2. Βρέθηκε ότι η άριστη συγκέντρωση του Η 2 Ο 2 στο υπόστρωµα παραγωγής της χρωστικής είναι 10 µμ, ενώ υψηλότερη συγκέντρωση της ουσίας αυτής έχει ως αποτέλεσµα την καταστροφή των κυττάρων της συζευγµένης καλλιέργειας των (+) και () στελεχών του B. trisporα (Jeong και συν. 1999) Αναστολείς Ορισµένες ουσίες επιδρούν σε ένζυµα της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου και καταστέλλουν την παραγωγή της χρωστικής. Συγκεκριµένα, βρέθηκε ότι η προσθήκη ορισµένων αµινών στο υπόστρωµα, µε δραστικότερη τη N,NδιαιθυλοN[2(4 χλωροφαινυλοθειο)αιθυλο]αµίνη (CPTA), έχει ως αποτέλεσµα τη συσσώρευση κυρίως λυκοπένιου και λιγότερο γκαροτένιου και παράλληλα τη σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του παραγόµενου βκαροτένιου στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trisporα (Ninet και συν. 1969, Hsu και Yokoyama 1972, Hsu και συν. 1974). Η αύξηση της ποσότητας της CPTA στο υπόστρωµα ( ppm) αυξάνει τη συγκέντρωση του παραγόµενου λυκοπένιου, ενώ η απόδοση του γ και β καροτένιου παραµένει σε πολύ χαµηλά επίπεδα. Αυτό οφείλεται στο ότι ο µηχανισµός δράσης της CPTA συµπεριλαµβάνει τόσο την αναστολή της δράσης του ενζύµου που υπεισέρχεται στην κυκλοποίηση του λυκοπένιου σε βκαροτένιο όσο και την επαγωγή της σύνθεσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του λυκοπένιου. Επιπλέον, η νικοτίνη αναστέλλει την παραγωγή βκαροτένιου και τρισπορικού οξέος στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας στελεχών αντίθετου φύλου του B. trisporα (Galasko και συν. 1976). Η κυκλοεξιµίνη και η ακτινοµυκίνη D βρέθηκε ότι καταστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση στα κύτταρα του B. trisporα στο επίπεδο της µεταγραφής και της µετάφρασης, αντίστοιχα, ενώ η κυκλοεξιµίνη επηρεάζει αρνητικά και την ανάπτυξη του µικροοργανισµού (µείωση κατά 20,0 25,0%) (Feofilova και συν. 1976, Desai και Modi 1977, Tereshina και Feofilova 40

77 1981). Επίσης, αναφέρεται ότι η κυκλοεξιµίνη µεταβάλλει τη σύσταση των πολυσακχαριτών στο κυτταρικό τοίχωµα του µικροοργανισµού µειώνοντας το ποσοστό των ουδέτερων πολυσακχαριτών κατά 30,0%, ενώ η περιεκτικότητα της χιτίνης παραµένει σταθερή (Tereshina και Feofilova 1981). Επιπρόσθετα, αναφέρεται η κατασταλτική δράση του N[[(4χλωροφαινυλο)αµινο]καρβονυλο]2 6διφθοριοβενζαµίδιου (dimilin) τόσο στην ανάπτυξη του B. trisporα (δεν εµποδίζει τη σύνθεση της χιτίνης) όσο και στην παραγωγή βκαροτένιου. Παρουσία επιφανειοδραστικών ουσιών, το µόριο της παραπάνω ουσίας διεισδύει στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού και αναστέλλει τη δράση ενζύµων της βιοσύνθεσης της χρωστικής. Η κατασταλτική δράση του N[[(4 χλωροφαινυλο)αµινο]καρβονυλο]26διφθοριοβενζαµίδιου βρέθηκε ότι οφείλεται στον υποκατεστηµένο δακτύλιο του βενζένιου µε δύο άτοµα φθορίου που περιέχεται στο µόριο του (Feofilova και συν. 1982) ph Το αρχικό ph του υποστρώµατος παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του B. trisporα και στην παραγωγή βκαροτένιου. Οι Kim και συν. (1996) που µελέτησαν την επίδραση του αρχικού ph συνθετικού υποστρώµατος που περιέχει γλυκόζη, πρωτεϊνικής φύσης αζωτούχες ενώσεις και ανόργανα άλατα στην παραγωγή βκαροτένιου, βρήκαν ότι η αλκαλικότητα του υγρού της ζύµωσης (ph 1011) ευνοεί την απόδοση της χρωστικής. Συγκεκριµένα, βρέθηκε µία µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου σε αρχικό ph 10, όπου και η ανάπτυξη του µικροοργανισµού ήταν µεγάλη. Τιµές ph χαµηλότερες του 10 (ph 49) έδιναν χαµηλότερη συγκέντρωση χρωστικής, ενώ σε ακραίες χαµηλές ή ψηλές τιµές ph (ph 2 ή 12) αναστέλλονταν η ανάπτυξη του µικροοργανισµού και η παραγωγή βκαροτένιου. Γενικά, σε πολλές µελέτες για την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trisporα το αρχικό ph του συνθετικού υποστρώµατος ρυθµίζεται µεταξύ 6,26,5 (Ciegler και συν. 1959a,b, 1963a,b, Ciegler 1965, Ninet και συν. 1969, Ninet και Renaut 1979, Desai και Modi 1977), ενώ οι Jeong και συν. (1999, 2001) αναφέρουν ως αρχικό ph του συνθετικού υποστρώµατος παραγωγής της χρωστικής το ph 5,5. 41

78 2.4.6 Θερµοκρασία Η άριστη θερµοκρασία για την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trisporα κυµαίνεται µεταξύ C. Οι Ciegler και συν. (1963a) που µελέτησαν την επίδραση της θερµοκρασίας στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trisporα, βρήκαν µέγιστη συγκέντρωση της χρωστικής σε θερµοκρασία 26 0 C. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι σε θερµοκρασία µεγαλύτερη των 28 0 C παρατηρείται απότοµη µείωση της απόδοσης της χρωστικής που οφείλεται στη µείωση της παραγωγικότητας του B. trisporα ή στην καταστροφή του µορίου του παραγόµενου βκαροτένιου στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού. Όσον αφορά τη θερµοανθεκτικότητα του B. trisporα, έχει βρεθεί ότι τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού διαθέτουν διαφορετικούς µηχανισµούς προσαρµογής σε υψηλές θερµοκρασίες και ότι τα (+) στελέχη είναι πιο θερµοανθεκτικά από τα () στελέχη. Οι Feofilova και συν. (1994) βρήκαν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης της ινοσιτόλης που συνοδεύεται µε µείωση της συγκέντρωσης της τρεχαλόζης στο µυκήλιο του B. trisporα αποτελεί µέρος του µηχανισµού του µικροοργανισµού για την προσαρµογή του σε υψηλές θερµοκρασίες και όσο µεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της ινοσιτόλης τόσο πιο µεγάλη θερµοανθεκτικότητα παρουσιάζει ο µικροοργανισµός. Κατά την αγενή αναπαραγωγή του B. trisporα, η θερµοκρασία επηρεάζει το είδος των σπορίων που σχηµατίζονται από τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού. Αναφέρεται ότι σε θερµοκρασία C τα (+) και () στελέχη του µικροοργανισµού σχηµατίζουν στυλοσπόρια (stylospores) µετά από ανάπτυξη 10 ηµερών (Tereshina και Feofilova 1995). Σε θερµοκρασία C τα στελέχη αντίθετου φύλου του µικροοργανισµού σχηµατίζουν σποριαγγειοσπόρια, ενώ περίπου ίσες ποσότητες των δύο µορφών των σπορίων (στυλοσπόρια και σποριαγγειοσπόρια) σχηµατίζονται από τα (+) και () στελέχη σε 28 0 C (Tereshina και Feofiliva 1995). Τα στυλοσπόρια και τα σποριαγγειοσπόρια διαφέρουν µεταξύ τους στη σύσταση των υδρογονανάνθρακων που περιέχουν και στη θερµοανθεκτικότητα τους (Tereshina και συν. 1996). Βρέθηκε ότι τα στυλοσπόρια των (+) και () στελεχών περιέχουν µεγάλη ποσότητα τρεχαλόζης και λιγότερο γλυκόζης. Επίσης, τα στυλοσπόρια των () στελεχών περιέχουν µεγάλες ποσότητες ινοσιτόλης, έναντι των σποριαγγειοσπορίων των () στελεχών και των στυλοσπορίων και σποριαγγειοσπορίων των (+) στελεχών που δεν περιέχουν καθόλου ινοσιτόλη. Η αυξηµένη θερµοανθεκτικότητα των στυλοσπορίων, έναντι της αντίστοιχης των 42

79 σποριαγγειοσπορίων των () στελεχών, οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα τους σε ινοσιτόλη (Tereshina και συν. 1996). Επιπλέον, η τρεχαλόζη ευνοεί τη θερµοανθεκτικότητα των σπορίων των (+) στελεχών. Έχει βρεθεί ότι τα στυλοσπόρια και τα σποριαγγειοσπόρια των στελεχών θετικού φύλου διαφέρουν σηµαντικά ως προς τη θερµοανθεκτικότητα τους µε πιο θερµοανθεκτικά τα στυλοσπόρια, τα οποία περιέχουν µεγάλη ποσότητα τρεχαλόζης (Tereshina και συν. 1996). Τα στυλοσπόρια και τα σποριαγγειοσπόρια των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trisporα βλασταίνουν και δίνουν µυκήλιο µε διαφορετική παραγωγικότητα σε βκαροτένιο. Αναφέρεται ότι η αύξηση της θερµοκρασίας ( C) ευνοεί στα στυλοσπόρια το σχηµατισµό ενεργών ειδών οξυγόνου που δεσµεύονται µε ένζυµα της βιοσυνθετικής πορείας του βκαροτένιου και τα αδρανοποιούν, οπότε το τραυµατισµένο µυκήλιο που αναπτύσσεται από την εκβλάστηση των στυλοσπορίων παρουσιάζει µειωµένη παραγωγικότητα στη χρωστική, έναντι της αντίστοιχης του µυκηλίου από τα σποριαγγειοσπόρια (Tereshina και συν. 1996) Ακτινοβολία Το φως επάγει τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου στους βιολογικούς οργανισµούς. Αναφέρεται ότι η έκθεση κυττάρων του Neurospora crassa σε ακτινοβολία αυξάνει τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής συνθετάσης του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (κατά 7 φορές), µε αποτέλεσµα την αύξηση της απόδοσης της χρωστικής (Lampilla και συν. 1985b). Επιπλέον, αναφέρεται η παραγωγή βκαροτένιου από το είδος Dunalliella salina σε ζύµωση βυθού υπό την επίδραση φωτός (Enes και Saraiva 1996, Wilson και συν. 1997, Leach και συν. 1998). Η διάρκεια της φωτοπεριόδου (δηλ. η σχετική διάρκεια ηµέρας και νύκτας) επηρεάζει σηµαντικά την απόδοση του βκαροτένιου (Tereshina και συν. 1993). Αναφέρεται ότι η συνεχής έκθεση των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού σε φωτεινή ακτινοβολία αναστέλλει τη διεργασία σχηµατισµού σπορίων από τα παραπάνω στελέχη. Η µεγαλύτερη αύξηση της παραγωγής της χρωστικής (κατά 3 φορές) παρατηρείται όταν το υπόστρωµα εµβολιάζεται µε µίγµα αιωρήµατος (+) και () σπορίων, ο σχηµατισµός των οποίων έγινε τις πρώτες 2 ηµέρες απουσία φωτός και τις υπόλοιπες 4 ηµέρες παρουσία φωτός έντασης 1,7 W/m 2. Επίσης, οι Lampilla και συν. (1985b) που µελέτησαν την επίδραση του φωτός στην παραγωγή βκαροτένιου από τυρόγαλα µε σύζευξη των στελεχών B. trisporα NRRL 2895 και NRRL 2896, βρήκαν ότι η παραγωγή της χρωστικής αυξάνεται σηµαντικά όταν 43

80 επιδρά στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας φωτεινή ακτινοβολία σε όλη τη διάρκεια της ζύµωσης. Τα (+) σπόρια του B. trisporα είναι ανθεκτικότερα των () σπορίων του µικροοργανισµού στην έκθεση τους στη φωτεινή ακτινοβολία, ενώ η επαγωγή της σύνθεσης βκαροτένιου από το φως είναι πιο έντονη στο µυκήλιο που αναπτύσσεται από τα () φωτισµένα σπόρια του µικροοργανισµού (Feofilova και συν. 1993, Tereshina και συν. 1993). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η περιεκτικότητα των λιπιδίων στις µεµβράνες των (+) και () σπορίων που σχηµατίζονται υπό τη επίδραση του φωτός αυξάνεται κατά 1,2 και 1,8 φορές, αντίστοιχα (Feofilova και συν. 1993). Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι στις µεµβράνες των σπορίων των στελεχών αντίθετου φύλου αυξάνονται κυρίως οι στερόλες και τα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ενώ παράλληλα µειώνεται η περιεκτικότητα των τριακυλογλυκερολών και αυξάνεται ο βαθµός ακορεστότητας των λιπιδίων, λόγω αύξησης του ποσοστού C 18:2 στα µόρια αυτών. Συγκεκριµένα, αναφέρεται η αύξηση του λινελαϊκού οξέος κατά 1,5 και 2,0 φορές στα φωσφολιπίδια των (+) και () σπορίων, αντίστοιχα. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι το φως αυξάνει την παραγωγή του βκαροτένιου στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας των (+) και () στελεχών του B. trisporα. Η χρησιµοποίηση όµως της φωτεινής ακτινοβολίας στη βιοµηχανική παραγωγή του βκαροτένιου δεν βρίσκει εφαρµογή λόγω του υψηλού κόστους των µηχανηµάτων που απαιτούνται Χρόνος Ζύµωσης Η διάρκεια της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου εξαρτάται από το στέλεχος του µικροοργανισµού που θα χρησιµοποιηθεί, το υπόστρωµα παραγωγής και από τις συνθήκες που γίνεται η ζύµωση. Σε ζύµωση βυθού ο χρόνος που χρειάζεται για να παρατηρηθεί η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου είναι 38 ηµέρες. Οι Ciegler και συν. (1963b) που µελέτησαν την επίδραση του χρόνου ζύµωσης στην παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα σε ζυµωτήρα ανάδευσης, βρήκαν ότι η παραγωγή βκαροτένιου άρχιζε τη 2 η ηµέρα και η µέγιστη συγκέντρωση παρατηρούνταν την 4 η ηµέρα της ζύµωσης µετά από την οποία µειωνόταν. Παρ όλο που η διάρκεια της ζύµωσης επηρεάζει σηµαντικά το κόστος της βιοµηχανικής παραγωγής της χρωστικής, δεν έχουν γίνει µέχρι σήµερα µελέτες για τη µείωση του χρόνου ζύµωσης µε σκόπο την αύξηση της παραγωγικότητας της µεθόδου και τη µείωση του κόστους της βιοµηχανικής παραγωγής της χρωστικής. 44

81 2.4.9 Αερισµός και Ανάδευση Οι ζυµώσεις για την παραγωγή βκαροτένιου είναι αερόβιες και γι αυτό το λόγο χρειάζονται την παροχή οξυγόνου. Το οξυγόνο διοχετεύεται στο υγρό της ζύµωσης κυρίως µε τη µορφή αέρα. Μέχρι σήµερα έχουν χρησιµοποιηθεί δύο µέθοδοι µε τις οποίες γίνεται ο αερισµός του υποστρώµατος: α) ζύµωση βυθού µε ανακινούµενες φιάλες, όπου το οξυγόνο διαχέεται στο υγρό της ζύµωσης µε την παλινδροµική κίνηση των φιαλών και β) ζύµωση βυθού µε ζυµωτήρα ανάδευσης, όπου ο αέρας που εισέρχεται από τη βάση του ζυµωτήρα αναµειγνύεται µε το υγρό της ζύµωσης µε τη βοήθεια ενός αναδευτήρα. Σε εργαστηριακή κλίµακα, η παραγωγή βκαροτένιου από το B. trisporα γίνεται κυρίως σε ανακινούµενες φιάλες, ενώ λίγες µελέτες έχουν γίνει σχετικά µε την παραγωγή της χρωστικής σε ζυµωτήρες ανάδευσης. Οι Ciegler και συν. (1963a) που µελέτησαν την επίδραση του αερισµού και της ανάδευσης στην παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρες ανάδευσης, βρήκαν ότι οι άριστες τιµές του ρυθµού παροχής αέρα στο ζυµωτήρα και της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης κυµαίνονται µεταξύ 0,500,75 vvm (λίτρα αέρα ανά λίτρο υποστρώµατος ανά λεπτό) και rpm (στροφές ανά λεπτό), αντίστοιχα. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι σε υψηλότερες τιµές παροχής αέρα ή χαµηλότερες τιµές ταχύτητας ανάδευσης µειώνεται σηµαντικά η απόδοση της χρωστικής. Πολύ αργότερα, οι Kim και συν. (1999) βρήκαν µία µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε ταχύτητα ανάδευσης 350 rpm και συγκέντρωση διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης 50,0%. Σε βιοµηχανική κλίµακα, το βκαροτένιο παράγεται σε ζυµωτήρες ανάδευσης χωρητικότητας 800 λίτρων µε παροχή αέρα 1,3 vvm και ταχύτητα ανάδευσης 210 rpm (Ninet και Renaut 1979, Baets και συν. 2002). 45

82 2.5 ΜΕΘΟ ΟΙ ΖΥΜΩΣΗΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ Β ΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Ασυνεχής Ζύµωση Βυθού Οι περισσότερες µελέτες για την παραγωγή βκαροτένιου αναφέρονται σε ζυµωτικές διεργασίες που εκτελούνται µε ασυνεχή ζύµωση βυθού (batch fermentation ή batch culture), κατά την οποία ο µικροοργανισµός αναπτύσσεται σε ένα κλειστό σύστηµα καλλιέργειας, όπου το θρεπτικό υπόστρωµα δεν ανανεώνεται και τα µικροβιακά κύτταρα είναι εκτεθηµένα σε ένα συνεχώς µεταβαλλόµενο περιβάλλον (Ρουκάς 1995, Stanbury και συν. 1995). Σε ερευνητικό επίπεδο, η παραγωγή της χρωστικής µε ασυνεχή ζύµωση βυθού γίνεται κυρίως σε ανακινούµενες φιάλες, ενώ περιορισµένη έρευνα έγινε σχετικά µε τη µελέτη των παραµέτρων που επηρεάζουν την απόδοση του βκαροτένιου σε ζυµωτήρες ανάδευσης και βιοαντιδραστήρες στήλης. Επίσης, αναφέρεται η παραγωγή βκαροτένιου από το είδος D. salina υπό την επίδραση του φωτός σε βιοαντιδραστήρα που αποτελείται από µία πολυκαρβονική πλάκα διαµόρφωσης φύλλου, από τη βάση της οποίας εισέρχεται αέρας και στη µία πλευρά της υπάρχει φωτεινή πηγή που εκπέµπει φωτόνια µε ροή 500 µmol/m 2 s 1 (Wilson και συν. 1997) και σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες (Enes και Saraiva 1996). Επιπλέον, οι Leach και συν. (1998) αναφέρουν την παραγωγή βκαροτένιου µε τη χρήση ακινητοποιηµένων κυττάρων του είδους D. salina, τα οποία παγιδεύονται σε αλγινικό ασβέστιο. Οι ερευνητές αυτοί κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι κατά τη διάρκεια της ξήρανσης κυττάρων του D. salina που είναι ακινητοποιηµένα σε αλγινικό ασβέστιο αυξάνεται σηµαντικά η σταθερότητα του βκαροτένιου που βρίσκεται στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού Ανακινούµενες φιάλες Ένας ορισµένος όγκος υποστρώµατος (ίσος µε το 1/5 του συνολικού όγκου του δοχείου) αποστειρώνεται στους C για 15 λεπτά. Το υπόστρωµα µετά τη ψύξη εµβολιάζεται µε 10,0 % (v/v) µίγµα (+) και () στελεχών του B. trisporα που έχουν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 3 ηµέρες. Στη συνέχεια οι φιάλες επωάζονται στους 26 0 C για 46 ηµέρες σε παλινδροµητή ανακίνησης µε ταχύτητα ανάδευσης περίπου 200 rpm. Oι Kim και συν. (1999) βρήκαν ότι η αύξηση του όγκου του υποστρώµατος (10150 ml) σε φιάλες χωρητικότητας 250 ml 46

83 συνοδεύεται µε σηµαντική µείωση της ανάπτυξης του B. trisporα και της απόδοσης του βκαροτένιου Ζυµωτήρας µε σύστηµα ανάδευσης Οι ζυµωτήρες ανάδευσης (fermentors) χρησιµοποιήθηκαν για πρώτη φορά στη βιοµηχανία το 1930 για την παραγωγή πιεστής ζύµης. Από τότε άρχισαν να χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία για την παραγωγή και άλλων προϊόντων λόγω των µεγάλων αποδόσεων σε σχέση µε άλλες µεθόδους ζυµώσεων. Οι ζυµωτήρες ανάδευσης που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή προϊόντων σε εργαστηριακή κλίµακα έχουν συνήθως χωρητικότητα 110 λίτρα, ενώ αυτοί που χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία έχουν χωρητικότητα λίτρα. Γενικά, ο όγκος του υποστρώµατος που προστίθεται στο ζυµωτήρα πρέπει να είναι 60,070,0% του όγκου του δοχείου ζύµωσης (Ρουκάς 1995). Τα κυριότερα µέρη από τα οποία αποτελείται ένας ζυµωτήρας ανάδευσης δίνονται στο Σχήµα Για την παραγωγή βκαροτένιου το υπόστρωµα µε τα θρεπτικά συστατικά µετά την αποστείρωση προστίθεται στο ζυµωτήρα και στη συνέχεια εµβολιάζεται µε µίγµα (+) και () στελεχών του B. trisporα που έχουν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 3 ηµέρες. Η θερµοκρασία επώασης είναι C και η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου παρατηρείται µετά από 36 ηµέρες. Μετά το τέλος της ζύµωσης, το µυκήλιο διαχωρίζεται από το υγρό µε φυγοκέντρηση ή µε διήθηση και ακολουθούν διάφορα στάδια για την παραλαβή της χρωστικής. Μία άλλη µέθοδος που αναφέρεται για την παραγωγή βκαροτένιου µε τα στελέχη R. glutinis και R. lactosa σε ζυµωτήρα ανάδευσης περιλαµβάνει δύο φάσεις. Στη 1 η φάση χρησιµοποιείται ως υπόστρωµα σακχαρόζη και διάφορα άλλα θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη του µικροοργανισµού για 20 ώρες και στη 2 η φάση διαχωρίζονται τα κύτταρα του µικροοργανισµού και επαναφέρονται στο ζυµωτήρα όπου προστίθεται ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου ph 7,0 που περιέχει 10,0 g/l γλυκόζη ή σακχαρόζη χωρίς άλλα θρεπτικά συστατικά (Costa και συν. 1987, Martelli και συν. 1990, 1992). Η ζύµωση διαρκεί 24 ώρες, τα κύτταρα διαχωρίζονται από το υγρό µε φυγοκέντρηση ή µε διήθηση και ακολουθεί η παραλαβή της χρωστικής. Επιπλέον, έχει αναφερθεί η παραγωγή βκαροτένιου µε συγκαλλιέργεια των ζυµών R. glutinis και D. castelli σε σιρόπι καλαµποκιού µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (Buzzini 2001). 47

84 Βιοαντιδραστήρας στήλης Ο βιοαντιδραστήρας στήλης αποτελείται από µία επιµήκη γυάλινη στήλη, στην οποία η ανάδευση του υποστρώµατος δεν γίνεται µε τη χρησιµοποίηση µηχανικού αναδευτήρα αλλά µε διοχέτευση αποστειρωµένου αέρα από τη βάση της στήλης (Ρουκάς 1995). Τα κυριότερα πλεονεκτήµατα του βιοαντιδραστήρα στήλης είναι το χαµηλό κόστος κατασκευής, η ευκολία της λειτουργίας και ο υψηλός ρυθµός µεταφοράς µάζας. Επίσης, το κόστος λειτουργίας είναι συγκριτικά πολύ χαµηλότερο του αντίστοιχου κόστους των ζυµωτήρων ανάδευσης, στους οποίους καταναλώνεται µεγάλη ενέργεια για την ανάδευση του υποστρώµατος και χρησιµοποιούνται συστήµατα ψύξης για την αποµάκρυνση της θερµότητας που παράγεται µε την έντονη ανάδευση και τον αερισµό του υποστρώµατος (Ρουκάς 1995, Roukas και Mantzouridou 2001, Goksungur και συν. 2003). Οι Goksungur και συν. (2003) παρήγαν αυξηµένες ποσότητες βκαροτένιου µε το B. trisporα από µελάσσα µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε βιοαντιδραστήρα στήλης, έναντι της αντίστοιχης παραγωγής της χρωστικής σε ανακινούµενες φιάλες (Goksungur και συν. 2002) Ασυνεχής Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος Η ασυνεχής ζύµωση µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος (Fed batch culture) είναι µία µέθοδος ζύµωσης, όπου µετά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε ασυνεχή ζύµωση βυθού προστίθεται συνεχώς στο ζυµωτήρα νέο υπόστρωµα µέχρι να γεµίσει πλήρως ο ζυµωτήρας (Ρουκάς 1995, Stanbury και συν. 1995). Παραλλαγές αυτής της µεθόδου είναι οι παρακάτω περιπτώσεις: α) το υπόστρωµα προστίθεται στο ζυµωτήρα κατά παρτίδες (ορισµένος όγκος υποστρώµατος σε τακτικά χρονικά διαστήµατα) µέχρις ότου να γεµίσει ο ζυµωτήρας και β) το υπόστρωµα προστίθεται συνεχώς στο ζυµωτήρα µέχρι να γεµίσει ο ζυµωτήρας, στη συνέχεια αποµακρύνεται ένας ορισµένος όγκος υποστρώµατος και προστίθεται στο ζυµωτήρα συνεχώς ίσος όγκος υποστρώµατος που αφαιρέθηκε, µέχρι να γεµίσει ο ζυµωτήρας. Στην τελευταία περίπτωση η ζύµωση ονοµάζεται επαναλαµβανόµενη ασυνεχή ζύµωση µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος (repeated Fed batch culture) (Ρουκάς 1995). Κατά την ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος ο όγκος του υποστρώµατος µέσα στο ζυµωτήρα δεν παραµένει σταθερός και ο ειδικός ρυθµός ανάπτυξης µεταβάλλεται σε όλη τη διάρκεια της ζύµωσης (Ρουκάς 1995, Stanbury και συν. 1995). Το κυριότερο πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι η καλύτερη αξιοποίηση των σακχάρων σε σχέση µε τις άλλες µεθόδους ζύµωσης, ώστε σε όλη τη 48

85 διάρκεια της ζύµωσης η συγκέντρωση του υποστρώµατος να διατηρείται σε χαµηλά επίπεδα. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να διατηρούνται καλύτερα οι συνθήκες αερισµού του υποστρώµατος και αποφεύγεται η ανασταλτική επίδραση ενός ή περισσότερων συστατικών του υποστρώµατος στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού (Ρουκάς 1995). Ωστόσο, η µελέτη της παραγωγής βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος είναι πολύ περιορισµένη. Οι Kim και συν. (1999) βρήκαν ότι η παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trisporα αυξάνεται σηµαντικά µε την προσθήκη γλυκόζης στο ζυµωτήρα σε τακτικά χρονικά διαστήµατα, ώστε η συγκέντρωση του σακχάρου στο ζυµωτήρα να διατηρείται σε σταθερά επίπεδα (20,070,0 g/l). Επίσης, αναφέρεται η χρησιµοποίηση της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος για την παραγωγή βκαροτένιου µε συγκαλλιέργεια των ζυµών R. glutinis και D. castelli σε σιρόπι καλαµποκιού (Buzzini 2001) και µε το είδος D. salina σε θαλασσινό νερό που εµπλουτίζεται µε θρεπτικά συστατικά (Yamaoka και συν. 1994). 49

86 2.6 ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Τα κυριότερα στάδια της παραγωγής βκαροτένιου απο συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trisporα σε βιοµηχανική κλίµακα δίνονται στο Σχήµα B. trispora NRRL 2456 (+) B. trispora NRRL 2457 () Στερεή καλλιέργεια του B. trispora NRRL 2456 (+) Στερεή καλλιέργεια του B. trispora NRRL 2457 () α) Τα στελέχη αναπτύσσονται σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα (1) στους 27 ο C για 7 ηµέρες. Υγρή καλλιέργεια του B. trispora NRRL 2456 (+) Υγρή καλλιέργεια του B. trispora NRRL 2457 () β) Τα στελέχη καλλιεργούνται ξεχωριστά σε παλινδροµητή ανακίνησης σε κωνικές φιάλες χωρητικότητας 2 λίτρων που περιέχουν 400 ml υπόστρωµα (2) στους 26 ο C για 2 ηµέρες. Μίξη υγρών καλλιεργειών (+) και () στελεχών του B. trispora Παραγωγή βκαροτένιου από τη συζευγµένη καλλιέργεια (+) και () στελεχών του B. trispora γ) Οι υγρές καλλιέργειες (β) µεταφέρονται µαζί σε ζυµωτήρα ανάδευσης χωρητικότητας 170 λίτρων που περιέχει 120 λίτρα υπόστρωµα (2) που εµβολιάζεται µε 400 ml από κάθε καλλιέργεια. Η παροχή του αέρα είναι 1,1 vvm, η ταχύτητα ανάδευσης του υποστρώµατος 170 rpm, η θερµοκρασία 26 ο C και ο χρόνος επώασης 40 ώρες. δ) Παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης χωρητικότητας 800 λίτρων που περιέχει 320 λίτρα υπόστρωµα (3) που εµβολιάζεται µε 32 λίτρα από το µίγµα των (+) και () στελεχών του B. trispora Η παροχή του αέρα είναι 1,3 vvm, η ταχύτητα ανάδευσης του υποστρώµατος 210 rpm, η θερµοκρασία 26 ο C και ο χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες. Σχήµα Στάδια παραγωγής βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora. Υπόστρωµα 1: Potato dextrose agar (PDA). Υπόστρωµα 2 (g/l): Εκχύλισµα καλαµποκιού 70,0, άµυλο καλαµποκιού 50,0, υδροχλωρική θειαµίνη 0,01, KH 2 PO 4 0,5, MgSO 4. H 2 0 0,1. Υπόστρωµα 3 (g/l): ιαλυτό υπόλειµµα απόσταξης αλκοόλης 70,0, άµυλο καλαµποκιού 60,0, σογιάλευρο 30,0, βαµβακέλαιο 30,0, αντιοξειδωτικό 0,3, MgSO 4. H 2 0 0,2, υδροχλωρική θειαµίνη 0,5, υδραζίδιο του 4πυριδινοκαρβοξυλικού οξέος 0,6, κηροζίνη 20,0, ph 6,3. Το υπόστρωµα αποστειρώνεται στους 121 ο C για 55 λεπτά (η κηροζίνη και το υδραζίδιο του 4 πυριδινοκαρβοξυλικού οξέος αποστειρώνονται ξεχωριστά µε διήθηση). Μετά 48 ώρες από την αρχή της ζύµωσης προστίθεται στο ζύµωτήρα 1,0 g/l βιονόνη και 5,0 g/l κηροζίνη. Η γλυκόζη προστίθεται συνεχώς στο ζυµωτήρα και η συνολική ποσότητα της γλυκόζης που χρησιµοποιείται σε όλη τη διάρκεια της ζύµωσης είναι 42,0 g/l (Niger και Renaut 1979). 50

87 Η σύνθεση του βκαροτένιου γίνεται µέσα στα κύτταρα του µικροοργανισµού. Τα κυριότερα στάδια των διεργασιών ανάκτησης του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού και καθαρισµού της χρωστικής δίνονται στο Σχήµα Μετά το τέλος της ζύµωσης, το υγρό της ζύµωσης φυγοκεντρείται για την αποµάκρυνση των κυττάρων από το υγρό. Τα κύτταρα ξηραίνονται υπό κενό στους 5055 ο C για 1620 ώρες όπου λαµβάνεται το ακατέργαστο βκαροτένιο που χρησιµοποιείται σαν πρόσθετο στις ζωοτροφές. Το καθαρό βκαροτένιο λαµβάνεται µε ενυδάτωση των κυττάρων του µικροοργανισµού µε µεθανόλη και στη συνέχεια εκχύλιση του βκαροτένιου µε µεθυλενοχλωρίδιο. Το υγρό συµπυκνώνεται στους 35 ο C υπό κενό όπου λαµβάνονται κρύσταλλοι βκαροτένιου και στη συνέχεια προστίθεται ακετόνη και ακολουθεί διήθηση όπου λαµβάνονται ακατέργαστοι κρύσταλλοι βκαροτένιου. Οι κρύσταλλοι διαλύονται σε χλωροφόρµιο, το διάλυµα συµπυκνώνεται υπό κενό και κρυσταλλώνεται στους 20 ο C απουσία φωτός µε συνεχή διοχέτευση αζώτου και προσθήκη αλκοόλης. Οι κρύσταλλοι διαλύονται σε µείγµα βενζολίουαλκοόλης (αναλογία 1:1,4), το διάλυµα κρυσταλλώνεται και στη συνέχεια διηθείται όπου λαµβάνονται καθαροί κρύσταλλοι βκαροτένιου που ξηραίνονται και λαµβάνεται το βκαροτένιο σε καθαρή µορφή. 51

88 Υγρό ζύµωσης Φυγοκέντρηση Υγρό (αποµακρύνεται) Μυκήλιο Ξήρανση Ενυδάτωση Ακατέργαστο βκαροτένιο Εκχύλιση Συµπύκνωση Κρυστάλλωση Επαναδιάλυση, Συµπύκνωση, Κρυστάλλωση Καθαρό βκαροτένιο Σχήµα Ανάκτηση και καθαρισµός βκαροτένιου από το B. trispora (Niger και Renaut 1979). 52

89 2.7 ΕΜΠΟΡΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΜΕ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Η παραγωγή βκαροτένιου µε τη χρήση µικροοργανισµών αποτελεί βασικό αντικείµενο έρευνας σε παγκόσµιο επίπεδο λόγω της αυξανόµενης ζήτησης του και του υψηλού κόστους των υλικών που χρησιµοποιούνται για τη χηµική του σύνθεση. Ωστόσο, η απόκτηση συγκριτικού πλεονεκτήµατος χαµηλότερου κόστους της βιοτεχνολογικής παραγωγής βκαροτένιου, έναντι της παραγωγής της συνθετικής µορφής του προϊόντος, σε µία εξόχως ανταγωνιστική αγορά απαιτεί τη χρήση µικροοργανισµών µε µεγάλη ικανότητα παραγωγής, χαµηλού κόστους υποστρωµάτων και οικονοµικών τεχνικών ανάκτησης και καθαρισµού του προϊόντος. Επιπλέον, είναι απαραίτητη η εξασφάλιση της σταθερότητας του βκαροτένιου για µεγάλο χρόνο αποθήκευσης του. Οι Ciegler και συν. (1961) βρήκαν ότι η προσθήκη αντιοξειδωτικού κατά τη διάρκεια της ζύµωσης στο υπόστρωµα παραγωγής ή µετά το τέλος της ζύµωσης στη µάζα των αφυδατωµένων κυττάρων που περιέχουν το ακατέργαστο βκαροτένιο αυξάνει σηµαντικά το χρόνο αποθήκευσης του προϊόντος χωρίς την ποιοτική του υποβάθµιση. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν την αύξηση της σταθερότητας του ακατέργαστου βκαροτένιου που αποθηκεύεται, υπό υγρή µορφή, ως εναιώρηµα κυττάρων του µικροοργανισµού που περιέχουν το ακατέργαστο βκαροτένιο σε φυτικά έλαια, σε περιβάλλον ελεγχόµενης ατµόσφαιρας ή σε συσκευασία κενού. Η χαµηλή αποδοχή των βιοτεχνολογικών προϊόντων από τους καταναλωτές περιορίζει σηµαντικά την εµπορική τους εκµετάλλευση. Η αύξηση της ζήτησης των βιοτεχνολογικών προϊόντων απαιτεί την καλύτερη ενηµέρωση των καταναλωτών ώστε τα προϊόντα αυτά να αποτελούν όλο και περισσότερο µια ξεχωριστή και συνειδητή επιλογή. 53

90 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 3.1 ΣΤΕΛΕΧΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ Περιγραφή Στελεχών Τα στελέχη που χρησιµοποιήθηκαν για την παραγωγή του βκαροτένιου ήταν του ετερόθαλλου µύκητα B. trispora (ATCC και ATCC 14272), τα οποία προέρχονταν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα των δύο στελεχών είναι αντίθετου φύλου (χαρακτηρίζεται ως (+) για το ATCC και () για το ATCC 14272). Οι πυρήνες κυττάρων αντίθετου φύλου των παραπάνω στελεχών συγχωνεύονται κατά την εγγενή αναπαραγωγή του B. trispora. Η χρωστική που παράγεται από τα δύο στελέχη είναι το βκαροτένιο µε τη µορφή alltransισοµερούς ιατήρηση Στελεχών Τα στελέχη, µετά την παραλαβή τους και σύµφωνα µε την τεχνική που εφαρµόζεται από την ATCC αναπτύχθηκαν αρχικά σε Rabbit food άγαρ στους 26 0 C για 4 ηµέρες και στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκαν σε ζωµό Rabbit food στους 26 0 C για 3 ηµέρες. Στο τέλος της επώασης το υγρό της καλλιέργειας κάθε στελέχους φυγοκεντρήθηκε και τα µυκήλια τοποθετήθηκαν σε ειδικά φιαλίδια, όπου λυοφιλιώθηκαν. Τα στελέχη του B. trispora διατηρούνταν σε λυοφιλιωµένη µορφή στους 4 0 C και σε κάθε πείραµα γινόταν χρήση νέας λυοφιλιωµένης καλλιέργειας. Η παρασκευή των παραπάνω θρεπτικών υλικών έγινε ως εξής: υόµιση g Rabbit food σε µορφή σβόλων (commercial pellets) διαλύονται σε 100 ml αποσταγµένου νερού και το διάλυµα θερµαίνεται για 30 λεπτά. Στη συνέχεια αφήνεται σε ηρεµία για 30 λεπτά και ο ζωµός παραλαµβάνεται µετά από την αποµάκρυνση της καθιζάνουσας ύλης µε διήθηση του διαλύµατος µέσω γάζας. Το Rabbit food άγαρ παρασκευάζεται µε προσθήκη 1,5% (w/v) άγαρ (Scharlau, 7490) στο ζωµό. Το ph στα παραπάνω θρεπτικά υλικά ρυθµιζόταν στο 6,0 µε 1Ν ΝaΟΗ (Sigma, S0899). 54

91 3.2 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΤΟΥ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠΟ ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ B. TRISPORA Ανάπτυξη Εµβολίου Η ανάπτυξη του εµβολίου γινόταν µε την προσθήκη 0,5 ml αποστειρωµένου αποσταγµένου νερού σε κάθε φιαλίδιο λυοφιλίωσης. Από αυτό, ποσότητα 0,1 ml επιστρώνονταν στην επιφάνεια υποστρώµατος Potato dextrose άγαρ (PDA, Scharlau, 1483) σε τρυβλία Petri για την ανάπτυξη του εµβολίου. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 26 0 C για 3 ηµέρες και χρησιµοποιούταν για τον εµβολιασµό του υποστρώµατος παραγωγής Υπόστρωµα Παραγωγής και Συνθήκες Ζύµωσης H παραγωγή βκαροτένιου γινόταν µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer και όγκου 500 ml, οι οποίες περιείχαν 100 ml συνθετικού υποστρώµατος (βασικό υπόστρωµα) µε την παρακάτω σύσταση (g/l): γλυκόζη (Duchefa, G0802) 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού (Βιαµύλ, Θεσσαλονίκη) 80,0, υδρολυµένη καζείνη (Sigma, C0501) 2,0, εκχύλισµα ζύµης (Scharlau, 07079) 1,0, Lασπαραγίνη (Scharlau, AS0015) 2,0, KH 2 PO 4 (Merck, ) 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 (Merck, ) 0,5, Span 20 (Sigma, S6635) 10,0, Tween 80 (Scharlau, TN0080) 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη (Sigma, T4625) 5,0 (mg/l). To ph του υποστρώµατος ρυθµιζόταν στο 7,0 µε 1Ν NaOH και οι φιάλες αποστειρώνονταν στους C για 15 λεπτά. Στη συνέχεια οι φιάλες ψύχονταν και εµβολιάζονταν µε µίγµα κυττάρων των καλλιεργειών ATCC και ATCC 14272, οι οποίες αναπτύσσονταν µε τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Για τον εµβολιασµό των φιαλών, από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των δύο στελεχών µεταφερόταν σε κάθε φιάλη ένα κοµµάτι άγαρ 1 cm 2 που έφερε κύτταρα του µικροοργανισµού. Η ζύµωση για την παραγωγή βκαροτένιου γινόταν σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης (LabLine, Melrose Park, IL), στα 200 rpm, για 10 ηµέρες και σε θερµοκρασία 26 0 C Μέθοδοι Εκχύλισης Μετά το τέλος της ζύµωσης συλλέγονταν το µυκήλιο της συζευγµένης καλλιέργειας των (+) και () στελεχών του B. trispora µε φυγοκέντρηση ορισµένου όγκου υγρού της ζύµωσης (50 ml) στα 5.000g για 20 λεπτά σε φυγόκεντρο τύπου Sigma 315. Ακολουθούσε έκπλυση του µυκηλίου µε αποσταγµένο νερό και 55

92 φυγοκέντρηση του υγρού στα 5.000g για 20 λεπτά. Η διαδικασία έκπλυσης του µυκηλίου επαναλαµβανόταν µέχρι το υπερκείµενο υγρό µετά τη φυγοκέντρηση να είναι άχρωµο. Το µυκήλιο ξηραίνονταν στους 50 0 C υπό κενό µέχρι σταθερού βάρους και κονιοποιούνταν µε γουδί. Το αποξηραµένο µυκήλιο µετά τη λειοτρίβηση χρησιµοποιούταν για την εκχύλιση του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου. Για την επιλογή των άριστων συνθηκών εκχύλισης της χρωστικής δοκιµάστηκαν οι εξής µέθοδοι εκχύλισης: Μέθοδος Α: Εκχύλιση σε σταθερή θερµοκρασία µεταβάλλοντας το χρόνο εκχύλισης Για την εκχύλιση της χρωστικής από τα κύτταρα του B. trispora χρησιµοποιούταν οι εξής διαλύτες: α) αιθανόλη (Merck, ), β) µεθανόλη (Merck, ), γ) ακετόνη (Merck, ), δ) πετρελαϊκός αιθέρας (Merck, ), ε) εξάνιο (Merck, ), στ) µίγµα µεθανόληςεξανίου (1:1), ζ) ισοπροπυλική αλκοόλη (Sigma, Ι0398) και η) οξικός αιθυλεστέρας (Merck, ). Το εκχυλιστικό µέσο προστίθενταν σε αναλογία 1,0% (100 ml διαλύτη ανά g ξηρού βάρους βιοµάζας). Η εκχύλιση του βκαροτένιου γινόταν σε παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm, σε θερµοκρασία 30 0 C και για χρόνο 30, 60, 90, 120, ή 150 λεπτά. Σε όλες τις περιπτώσεις µετά το τέλος της εκχύλισης το µείγµα κυττάρων και εκχυλιστικού υγρού φυγοκεντρούνταν στα g για 10 λεπτά και στο υπερκείµενο υγρό προσδιοριζόταν η συγκέντρωση του εκχυλισµένου βκαροτένιου (mg βκαροτένιου/100 ml εκχυλιστικού µέσου) µε µέτρηση της έντασης του κίτρινου χρώµατος στα 450 nm µε φασµατοφωτόµετρο τύπου Jenway Η πρότυπη καµπύλη (συγκέντρωσης βκαροτένιουαπορρόφησης) δίνεται στο Σχήµα Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων. Μέθοδος Β: Εκχύλιση για σταθερό χρόνο µεταβάλλοντας τη θερµοκρασία εκχύλισης Η εκχύλιση του βκαροτένιου γινόταν σε διαφορετικές θερµοκρασίες (30, 35, 40, 45 ή 50 0 C), για χρόνο 2 ώρες, σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm. Τα είδη και η ποσότητα των εκχυλιστικών µέσων που χρησιµοποιούταν και ο τρόπος υπολογισµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου στο διαλύτη εκχύλισης ήταν όµοια µε αυτά που περιγράφονται στη Μέθοδο Α εκτός 56

93 από την περίπτωση του πετρελαϊκού αιθέρα, όπου χρησιµοποιούταν ακετόνη και πετρελαϊκός αιθέρας. Στην περίπτωση αυτή η βιοµάζα αρχικά αναµειγνύονταν µε ακετόνη (100 ml διαλύτη/g ξηρού βάρους βιοµάζας) και ακολουθούσε εκχύλιση στις θερµοκρασίες που προαναφέρθηκαν για χρόνο 2 ώρες. Στη συνέχεια, το µείγµα κυττάρων και εκχυλιστικού υγρού φυγοκεντρούνταν στα g για 10 λεπτά και το υπερκείµενο υγρό µεταφέρονταν σε διαχωριστικό χωνί όπου αναµειγνύονταν µε ίσο όγκο πετρελαϊκού αιθέρα. Μετά από καλή ανάµιξη του µείγµατος ακετόνηςπετρελαϊκού αιθέρα γινόταν διαχωρισµός των δύο φάσεων µε προσθήκη στο µείγµα µισής σε όγκο ποσότητας αποσταγµένου νερού. Η επάνω στοιβάδα του πετρελαϊκού αιθέρα διαχωρίζονταν και στη συνέχεια εκπλένονταν µε ίση ποσότητα αποσταγµένου νερού. Η διαδικασία έκπλυσης της στοιβάδας του πετρελαϊκού αιθέρα επαναλαµβάνονταν 2 φορές και ακολουθούσε προσθήκη 25,0% (w/v) Na 2 SO 4 (Merck, ). Το µείγµα αφήνονταν στους 4 0 C για χρόνο 1 ώρα και στη συνέχεια διηθούνταν µέσω ηθµού Whatman No 541. Στο διήθηµα προσδιοριζόταν η συγκέντρωση του εκχυλισµένου βκαροτένιου κατά όµοιο τρόπο µε αυτόν που περιγράφεται στη Μέθοδο Α. Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων. Μέθοδος Γ: ιαδοχικές εκχυλίσεις Η εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora γινόταν µε διαφορετικούς διαλύτες (τα είδη και η ποσότητα των διαλυτών εκχύλισης που χρησιµοποιούταν περιγράφονται στη Μέθοδο Α), σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm, για χρόνο 2 ώρες και σε θερµοκρασία εκχύλισης την άριστη για κάθε ένα εκχυλιστικό µέσο όπως φαίνεται στο Σχήµα Μετά το τέλος της εκχύλισης το µείγµα κυττάρων και εκχυλιστικού υγρού φυγοκεντρούνταν στα g για 10 λεπτά και στο υπερκείµενο υγρό προσδιοριζόταν η συγκέντρωση του εκχυλισµένου βκαροτένιου όπως περιγράφεται στη Μέθοδο Α. Το κυτταρικό ίζηµα αναµειγνύονταν µε καθαρό διαλύτη (100 ml διαλύτη/g ξηρού βάρους βιοµάζας) για την εκχύλιση του εναποµένοντος ενδοκυτταρικού βκαροτένιου. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαµβάνονταν µέχρι πλήρους αποχρωµατισµού των κυττάρων και το συνολικό βκαροτένιο που εκχυλιζόταν από τα κύτταρα του µικροοργανισµού υπολογίζονταν µε άθροιση όλων των ποσοτήτων του βκαροτένιου που λαµβάνονταν στις επιµέρους εκχυλίσεις. Όλα 57

94 τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων Κατεργασία του Υγρού Ζύµωσης πριν την Εκχύλιση του βκαροτένιου Για την αύξηση του ποσοστού αποµάκρυνσης του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού το υγρό της ζύµωσης, πριν τη διαδικασία της εκχύλισης, κατεργάστηκε µε τις εξής µεθόδους: Μέθοδος Α Ορισµένος όγκος υγρού της ζύµωσης (50 ml) θερµαινόταν στους C για 15, 30 ή 60 λεπτά ή θερµαινόταν στους C για 15 λεπτά. Στη συνέχεια το υγρό επεξεργαζόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μέθοδος Β Ορισµένος όγκος υγρού της ζύµωσης (50 ml) θερµαινόταν στους C για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν στα 5000g για 20 λεπτά. Το µυκήλιο µετά τη φυγοκέντρηση ξεπλένονταν µε αποσταγµένο νερό και το υγρό φυγοκεντρούνταν στα 5000g για 20 λεπτά. Η διαδικασία έκπλυσης του µυκηλίου επαναλαµβανόταν µέχρι το υπερκείµενο υγρό µετά τη φυγοκέντρηση να είναι άχρωµο. Μετά την κατεργασία του υγρού της ζύµωσης µε τη µέθοδο Α ή Β γινόταν εκχύλιση της χρωστικής µε προσθήκη 100 ml αιθανόλης/g ξηρού βάρους βιοµάζας, σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm, σε θερµοκρασία 30 0 C και για χρόνο 2 ώρες. Η χρωστική αποµακρυνόταν πλήρως από τα κύτταρα του µικροοργανισµού µετά από 3 διαδοχικές εκχυλίσεις και η συνολική ποσότητα του εκχυλισµένου βκαροτένιου προσδιοριζόταν κατά όµοιο τρόπο µε αυτόν που περιγράφεται στη Μέθοδος Γ (παράγραφος 3.2.3). Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων. 58

95 3.3 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠO ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΝΑΚΙΝΟΥΜΕΝΕΣ ΚΩΝΙΚΕΣ ΦΙΑΛΕΣ Ανάπτυξη Εµβολίου Σε κάθε φιαλίδιο λυοφιλιωµένης καλλιέργειας των στελεχών και αρχικά προστίθενταν 0,5 ml αποστειρωµένου αποσταγµένου νερού. Από αυτό, ποσότητα 0,1 ml επιστρώνονταν στην επιφάνεια υποστρώµατος Potato dextrose άγαρ σε τρυβλία Petri για την ανάπτυξη κάθε ένα στελέχους χωριστά. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 26 0 C για 3 ηµέρες. Στη συνέχεια, από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των δύο στελεχών µεταφέρονταν ένα κοµµάτι άγαρ 1 cm 2 που έφερε τα κύτταρα του κάθε στελέχους σε κωνική φιάλη των 500 ml ή σε διαφορετικές κωνικές φιάλες που εµβολιάζονταν ξεχωριστά µε το κάθε ένα στέλεχος. Οι φιάλες περιείχαν 100 ml συνθετικού υποστρώµατος της ακόλουθης σύστασης (g/l): γλυκόζη 30,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 5,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, L ασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 (mg/l) (ph 7,0). Η ανάπτυξη των διαφορετικών τύπων εµβολίου γινόταν σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 200 rpm, για 2 ηµέρες και σε θερµοκρασία 26 0 C Επίδραση των Παραγόντων της Ζύµωσης στην Παραγωγή βκαροτένιου Σε αυτή τη σειρά των πειραµάτων µελετήθηκε η επίδραση των διαφορετικών παραµέτρων της ασυνεχής ζύµωσης βυθού στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή του προϊόντος, σε ανακινούµενες κωνικές φιάλες. Η προετοιµασία του βασικού υποστρώµατος παραγωγής της χρωστικής γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων Συγκέντρωση εµβολίου Οι κωνικές φιάλες που περιείχαν 100 ml του υποστρώµατος παραγωγής (ph 7,0) εµβολιάζονταν µε: α) ένα κοµµάτι άγαρ 1 cm 2 από το τρυβλίο καλλιέργειας των ή 14272, β) ένα κοµµάτι άγαρ 1 cm 2 από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των και 14272, γ) 1,0%, 2,5% και 5,0% (v/v) από κάθε µία υγρή καλλιέργεια των και που είχαν αναπτυχθεί χωριστά σε συνθετικό υπόστρωµα για 3 ηµέρες και δ) 5,0% (v/v) υγρής καλλιέργειας µίγµατος κυττάρων του και που είχαν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 3 ηµέρες. Οι 59

96 συνθήκες ανάπτυξης των διαφορετικών τύπων εµβολίου και παραγωγής β καροτένιου ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο και 3.2.2, αντίστοιχα Αρχικό ph Το αρχικό ph του υποστρώµατος παραγωγής ρυθµιζόταν σε διαφορετικές τιµές (5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, ή 11,0). Η καλλιέργεια εµβολιασµού και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Θερµοκρασία Η θερµοκρασία επώασης των καλλιεργειών για την παραγωγή της χρωστικής ρυθµιζόταν σε διαφορετικές τιµές (24, 26, 28, ή 30 0 C). Η καλλιέργεια εµβολιασµού και οι συνθήκες της ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Χρόνος Κάθε 12 ώρες τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης και κάθε 48 ώρες τις υπόλοιπες 8 ηµέρες της ζύµωσης αποµακρυνόταν µία φιάλη από τον παλινδροµητή ανακίνησης και στο υγρό της ζύµωσης προσδιοριζόταν η βιοµάζα, το βκαροτένιο, η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων και το ph. Ο προσδιορισµός των παραπάνω κινητικών παραµέτρων γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Η καλλιέργεια εµβολιασµού και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Φωτισµός Η ανάπτυξη του B. trispora και η παραγωγή βκαροτένιου κατά τη διάρκεια της ζύµωσης γινόταν: α) παρουσία φυσικού φωτός, β) απουσία φυσικού φωτός, γ) τις 3 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης απουσία φυσικού φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες παρουσία φυσικού φωτός και δ) τις 3 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης παρουσία φυσικού φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες απουσία φυσικού φωτός. Η ζύµωση απουσία φυσικού φωτός γινόταν σε σκοτεινό δωµάτιο, ενώ παρουσία φυσικού φωτός γινόταν µε έκθεση των καλλιεργειών στο περιβάλλον. Η καλλιέργεια εµβολιασµού και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο

97 3.3.3 Σύσταση του Υποστρώµατος Σε αυτή τη σειρά των πειραµάτων µελετήθηκε η βελτίωση της παραγωγής β καροτένιου µε τον εµπλουτισµό του υποστρώµατος µε διαφορετικά συστατικά. Το βασικό υπόστρωµα παραγωγής που χρησιµοποιήθηκε είχε την παρακάτω σύσταση (g/l): γλυκόζη 50,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l (ph 7,0). Η καλλιέργεια εµβολιασµού του υποστρώµατος και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των τριών επαναλήψεων Πηγή άνθρακα Το βασικό υπόστρωµα παραγωγής (χωρίς γλυκόζη) εµπλουτιζόταν µε 30,0, 50,0 ή 70,0 g/l γλυκόζης, ή σακχαρόζης (Merck, ), ή αµύλου (Merck, ), ή γλυκερόλης (Merck, ) Πηγή αζώτου Το βασικό υπόστρωµα παραγωγής εµπλουτιζόταν µε 50,0, 80,0 ή 100,0 g/l εκχυλίσµατος καλαµποκιού, ή καλαµποκάλευρου (Sigma, C6304), ή υδρολυµένης πρωτείνης σόγιας (Sigma, S1674), ή στερεών υπολειµµάτων απόσταξης αλκοόλης (Sigma, D9643), ή 5,0, 10,0 ή 15,0 g/l NH 4 NO 3 (Merck, ), ή (NH 4 ) 2 SO 4 (Merck, ) Επιφανειοδραστικές ουσίες και αντιοξειδωτικά Στο βασικό υπόστρωµα παραγωγής (χωρίς Span 20 και Tween 80) προσθέτονταν 5,0, 10,0, 15,0 ή 20,0 g/l Span 20, 0,5, 1,0, 1,5 ή 2,0 g/l Tween 80 ή µίγµα 10,0 g/l Span 20 και 1,0 g/l Tween 80. Η δράση του αντιοξειδωτικού στη σταθερότητα του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου µελετήθηκε µε την προσθήκη 2,5, 5,0, 10,0, 15,0 ή 20,0 g/l βουτυλιωµένου υδροξυτολουόλιου (BHT, Sigma, B1378) στο βασικό υπόστρωµα, το οποίο είχε εµπλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκού οξέος (Sigma, L1626). 61

98 Φυτικά έλαια και ακόρεστα λιπαρά οξέα Το βασικό υπόστρωµα παραγωγής που περιείχε 2,5 g/l BHT εµπλουτιζόταν µε 10,0, 30,0 ή 50,0 g/l ελαιόλαδου (Sigma, O1500), ή σογιέλαιου (Sigma, S7381), ή βαµβακέλαιου (Sigma, O7767), ή καλαµποκέλαιου (Sigma, C8267), ή ηλιέλαιου (Sigma, S5007), ή σουσαµέλαιου (Sigma, S3547), ή αραχιδέλαιου (Sigma, P 2144), ή 30,0 g/l µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου σε αναλογία 1:1:1, ή 30,0 g/l µίγµατος ελαιόλαδουβαµβακέλαιου, ή ελαιόλαδουσογιέλαιου, ή βαµβακέλαιουσογιέλαιου, ή βαµβακέλαιουελαιόλαδου, ή σογιέλαιουβαµβακέλαιου, ή σογιέλαιουελαιόλαδου σε αναλογία 1:2, ή 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 ή 50,0 g/l ελαϊκού οξέος (Merck, ), ή λινελαϊκού οξέος, ή λινολενικού οξέος (ICN, ) Πρόδροµες ουσίες και ενεργοποιητές Η επαγωγή της σύνθεσης ενός προϊόντος επιτυγχάνεται τόσο µε την προσθήκη στο υπόστρωµα πρόδροµων ουσιών του επιθυµητού προϊόντος, οι οποίες µετατρέπονται απευθείας στο προϊόν αυτό, όσο και µε την προσθήκη ενεργοποιητών που επάγουν τη σύνθεση ή τη δραστικότητα των ενζύµων που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση του προϊόντος. Με σκοπό την αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου µελετήθηκε η πιθανή δράση διαφόρων χηµικών ουσιών ως επαγωγείς της σύνθεσης του βκαροτένιου. Οι ουσίες που µελετήθηκαν ήταν οι εξής: αιονόνη (Sigma, I3384), βιονόνη (Sigma, I6381), κηροζίνη (Aldrich, 32,9460), διµεθυλοφορµαµίδιο (Aldrich, D15,8550), κυκλοεξάνιο (Sharlau, Ci0031), κυκλοεξανόνη (Sharlau, Ci0050), 2,2,6τριµεθυλοκυκλοεξανόνη (Aldrich, T7,573 6), υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος (Sigma, I3377) και αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος (Sigma, S9381). Οι ουσίες αυτές προστίθονταν σε διάφορες συγκεντρώσεις σε διαφορετικές κωνικές φιάλες που περιείχαν 100 ml βασικού υποστρώµατος παραγωγής βκαροτένιου, το οποίο είχε εµπλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκού οξέος και 2,5 g/l BHT. Οι παραπάνω ουσίες αποστειρώνονταν ξεχωριστά από το υπόλοιπο υπόστρωµα µε διήθηση και η προσθήκη τους γινόταν τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης Αναλυτικοί Προσδιορισµοί Προσδιορισµός βιοµάζας Τόσο κατά τη διάρκεια της ζύµωσης όσο και στο τέλος της ζυµωτικής διεργασίας προσδιοριζόταν το ξηρό βάρος της βιοµάζας της συζευγµένης 62

99 καλλιέργειας των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trispora ως εξής: Από το υγρό της ζύµωσης που περιέχονταν σε κάθε φιάλη αποµακρύνονταν 10 ml, τα οποία µεταφέρονταν σε προξηραµένο και προζυγισµένο γυάλινο φυγοκεντρικό σωλήνα και φυγοκεντρούνταν στα 5.000g για 20 λεπτά. Το µυκήλιο που συλλέγονταν ξεπλένονταν µε 50 ml αποσταγµένου νερού και το υγρό φυγοκεντρούνταν στα 5.000g για 20 λεπτά. Ο σωλήνας µε το µυκήλιο ξηραίνονταν στους C µέχρι σταθερού βάρους. Στη συνέχεια τοποθετούνταν σε ξηραντήρα για 30 λεπτά και ζυγίζονταν. Το ξηρό βάρος της βιοµάζας υπολογιζόταν από τη διαφορά του βάρους σωλήνα και βιοµάζας µείον το βάρος του σωλήνα και εκφραζόταν σαν ξηρό βάρος βιοµάζας/l υποστρώµατος. Το υπερκείµενο υγρό που λαµβανόταν µετά τη φυγοκέντρηση 10 ml υγρού της ζύµωσης χρησιµοποιούταν για τον προσδιορισµό των σακχάρων, ενώ στο εναποµένων υγρό της ζύµωσης (90 ml) προσδιοριζόταν το ph και η συγκέντρωση του βκαροτένιου Προσδιορισµός σακχάρων Στo υγρό της ζύµωσης προσδιοριζόταν η περιεκτικότητα σε ολικά σάκχαρα σύµφωνα µε τη µέθοδο των Dubois και συν. (1956). Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην αντίδραση της φαινόλης µε το πυκνό H 2 SO 4 και τα σάκχαρα και στο σχηµατισµό συµπλόκων, τα οποία απορροφούν στα 490 nm. Για τον προσδιορισµό των σακχάρων, 2 ml κατάλληλα αραιωµένου µε αποσταγµένο νερό υγρού της ζύµωσης, από το οποίο είχε αποµακρυνθεί το µυκήλιο και 1 ml διαλύµατος φαινόλης 1,0% (w/v) (Merck, ) µεταφέρονταν αρχικά σε δοκιµαστικό σωλήνα διαστάσεων 20 Χ 160 mm. Στη συνέχεια προστίθονταν γρήγορα 5 ml πυκνού θειικού οξέος (Scharlau, Ac2067) χωρίς να έλθουν σε επαφή µε τα τοιχώµατα του σωλήνα. Μετά από παρέλευση 15 λεπτών το περιεχόµενο του σωλήνα αναµειγνύονταν σε κυκλοµείκτη (Scientific Industries Inc., Model K550 GE) και ο σωλήνας τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας C για 15 λεπτά. Τελικά, µετριούνταν η απορρόφηση του έγχρωµου διαλύµατος στα 490 nm (µέγιστο απορρόφησης των έγχρωµων προϊόντων της αντίδρασης µε τα φουρανικά παράγωγα που σχηµατίζονται από τις εξόζες και τις µεθυλιωµένες εξόζες και είναι σταθερά για αρκετές ώρες) (Jenway 6300). Η µέτρηση γινόταν ως προς το µάρτυρα που περιείχε 2 ml αποσταγµένου νερού, φαινόλη και H 2 SO 4, όπως περιγράφεται παραπάνω. Παράλληλα, η µέθοδος εφαρµοζόταν και σε πρότυπα διαλύµατα γλυκόζης γνωστής συγκέντρωσης (0, 50,0, 100,0, 150,0, 200,0 και 250,0 µg/2 ml) 63

100 προκειµένου να καταστεί δυνατή η έκφραση των αποτελεσµάτων µε τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς (Σχήµα 3.3.1). Ο προσδιορισµός γινόταν εις τριπλούν για κάθε δείγµα και το αποτέλεσµα αποτελούσε το µέσο όρο των τιµών των τριών µετρήσεων. Το αποτέλεσµα εκφράζονταν σαν g σακχάρων/l υποστρώµατος Προσδιορισµός ph Το ph του υγρού της ζύµωσης προσδιοριζόταν µε πεχάµετρο τύπου Jenway 370, µε την εµβάπτιση του ηλεκροδίου του πεχαµέτρου στο υγρό της ζύµωσης Προσδιορισµός βκαροτένιου Μετά την αποµάκρυνση ορισµένου όγκου υγρού της ζύµωσης (10 ml) από τη φιάλη για τον προσδιορισµό της βιοµάζας και των σακχάρων, το υπόλοιπο υγρό (όγκου 90 ml που περιείχε το µυκήλιο και το υγρό της ζύµωσης) θερµαινόταν στους C για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν στα 5000 g για 20 λεπτά. Το µυκήλιο που συλλέγονταν ξεπλένονταν µε αποσταγµένο νερό και το υγρό φυγοκεντρούνταν στα 5.000g για 20 λεπτά. Η διαδικασία έκπλυσης του µυκηλίου επαναλαµβανόταν µέχρι το υπερκείµενο υγρό µετά τη φυγοκέντρηση να είναι άχρωµο. Στη συνέχεια γινόταν εκχύλιση του προϊόντος µε ανάµειξη του µυκηλίου µε αιθανόλη σε αναλογία 100 ml αιθανόλης/g ξηρού βάρους µυκηλίου εντός εσµυρισµένης κωνικής φιάλης. Η εκχύλιση γινόταν σε θερµοστατούµενο παλινδροµητή ανακίνησης, στα 300 rpm, σε θερµοκρασία 30 0 C και για χρόνο 2 ώρες. Για την πλήρη αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού γινόταν 3 διαδοχικές εκχυλίσεις µε τρόπο όµοιο µε αυτόν που περιγράφεται στη Μέθοδο Γ της παραγράφου Μετά το τέλος κάθε εκχύλισης το µείγµα κυττάρων και εκχυλιστικού υγρού φυγοκεντρούνταν στα g για 10 λεπτά και στο υπερκείµενο υγρό, µετά από κατάλληλη αραίωση µε απόλυτη αιθανόλη, προσδιοριζόταν η συγκέντρωση του βκαροτένιου µε µέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm (Jenway 6300). Η µέτρηση γινόταν ως προς την απόλυτη αιθανόλη, ενώ παράλληλα µετριούνταν η απορρόφηση πρότυπων διαλυµάτων αιθανόλης γνωστής περιεκτικότητας σε καθαρό alltransβκαροτένιο (Sigma, C 9759) (0, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 και 5,0 mg alltransβκαροτένιο/100 ml αιθανόλης) προκειµένου να καταστεί δυνατή η έκφραση των αποτελεσµάτων µε τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς (Σχήµα 3.3.2). Για τον προσδιορισµό του συνολικού βκαροτένιου που εκχυλίζονταν από το µυκήλιο αθροίζονταν οι ποσότητες του 64

101 βκαροτένιου που λαµβάνονταν από κάθε µία εκχύλιση. Το αποτέλεσµα εκφράζονταν σε mg βκαροτένιου/l υποστρώµατος Προσδιορισµός υπεροξειδίου του υδρογόνου Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου στο υγρό της ζύµωσης και στα κύτταρα του µικροοργανισµού έγινε σύµφωνα µε τη µέθοδο των Jiang και συν. (1990). Αρχή της µεθόδου Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή σίδηρο µε υπεροξείδιο του υδρογόνου παρουσία καταλύτη σορβιτόλης σε όξινες συνθήκες και το σχηµατισµό έγχρωµου συµπλόκου µεταξύ του τρισθενούς κατιόντος σιδήρου (Fe +3 ) και του δείκτη xylenol orange, που απορροφά στα 560 nm. ιαλύµατα 1. ιαλύονται 25 mmole Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 (Merck, ) σε 2,5 Μ H 2 SO 4 µέχρι τελικού όγκου 1000 ml. 2. ιαλύονται 100 mmole σορβιτόλης (Merck, ) και 125 µmole xylenol orange (Scharlau AN0090) σε αποσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου 1000 ml. 3. Αναµειγνύονται 1 µέρος 1 µε 100 µέρη 2. Πειραµατική διαδικασία Για τον προσδιορισµό υπεροξειδίου του υδρογόνου στο υγρό της ζύµωσης, 1 ml κατάλληλα αραιωµένου µε αποσταγµένο νερό υγρού της ζύµωσης, από το οποίο είχε αποµακρυνθεί το µυκήλιο και 10 ml διαλύµατος 3 µεταφέρονταν σε δοκιµαστικό σωλήνα και αναµειγνύονταν σε κυκλοµείκτη (Scientific Industries Inc., Model K550GE). Ο σωλήνας παρέµενε σε θερµοκρασία περιβάλλοντος για 30 λεπτά και στη συνέχεια µετριούνταν η απορρόφηση του διαλύµατος στα 560 nm. Ο µάρτυρας περιείχε 1 ml αποσταγµένου νερού και 10 ml διαλύµατος 3, όπως περιγράφεται παραπάνω. Παράλληλα, η µέθοδος εφαρµοζόταν και σε πρότυπα διαλύµατα υπεροξειδίου του υδρογόνου (Riedelde Haën, 31642) γνωστής συγκέντρωσης (0, 10,0, 20,0, 30,0, 40,0 και 50,0 µμ) προκειµένου να καταστεί δυνατή η έκφραση των αποτελεσµάτων µε τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς (Σχήµα 65

102 3.3.3). Ο προσδιορισµός γινόταν εις τριπλούν για κάθε δείγµα και το αποτέλεσµα αποτελούσε το µέσο όρο των τιµών των τριών µετρήσεων. Το αποτέλεσµα εκφράζονταν σαν µμ υπεροξειδίου του υδρογόνου. Για τον προσδιορισµό του υπεροξειδίου του υδρογόνου στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού, µετά τη φυγοκέντρηση του υποστρώµατος στα 5000 g για 20 λεπτά, το µυκήλιο ξεπλένονταν µε αποσταγµένο νερό και το υγρό φυγοκεντρούνταν στα 5.000g για 20 λεπτά. Η διαδικασία έκπλυσης του µυκηλίου επαναλαµβανόταν µέχρι το υπερκείµενο υγρό µετά τη φυγοκέντρηση να είναι άχρωµο. Στη συνέχεια 0,8 g του µυκηλίου αναµειγνυόταν µε 5 ml αποσταγµένο νερό και µεταφέρονταν σ ένα πλαστικό υποδοχέα που ήταν τοποθετηµένος σε µεγαλύτερο δοχείο που περιείχε πάγο. Η θραύση των κυττάρων για την απελευθέρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου γινόταν µε συσκευή υπερήχων τύπου UP 200s για 50 λεπτά. Το µείγµα κυττάρων και εκχυλιστικού υγρού φυγοκεντρούνταν στα g για 10 λεπτά και στο υπερκείµενο υγρό, µετά από κατάλληλη αραίωση µε αποσταγµένο νερό, προσδιοριζόταν η συγκέντρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο προσδιορισµός γινόταν εις τριπλούν για κάθε δείγµα και το αποτέλεσµα αποτελούσε το µέσο όρο των τιµών των τριών µετρήσεων. Το αποτέλεσµα εκφράζονταν σαν µmole υπεροξειδίου του υδρογόνου/g ξηρού βάρους βιοµάζας. 66

103 1,0 0,8 Α490 nm 0,6 0,4 0,2 0, Γλυκόζη (µg / 2 ml) Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό των σακχάρων. 67

104 1,0 0,8 Á 450 nm 0,6 0,4 0,2 0, alltransâêáñïôýíéï (mg /100m láéèáíüëçò) Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό του βκαροτένιου 68

105 1,0 0,8 Α 560 nm 0,6 0,4 0,2 0, H (µm) Σχήµα Πρότυπη καµπύλη για τον προσδιορισµό του Η 2 Ο 2 69

106 3.3.5 Ανάπτυξη Μαθηµατικού Μοντέλου Πολλαπλής Παλινδρόµησης µε τη Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης Η βελτιστοποίηση της σύνθεσης του υποστρώµατος, µε στόχο την αύξηση της παραγωγής βκαροτένιου από το B. trispora σε επίπεδο κωνικών φιαλών, πραγµατοποιήθηκε µε την ανάπτυξη και την κατανόηση ενός µοντέλου πρόβλεψης µε τη µεθοδολογία της επιφάνειας απόκρισης (Response Surface Methodology). Ο βασικός στόχος ήταν να συσχετιστεί η παραγωγή βκαροτένιου µε τα επίπεδα ενός αριθµού εισαγωγικών µεταβλητών, που την επηρεάζουν, σε µια συγκεκριµένη περιοχή ενδιαφέροντος. Η επιλογή της παραπάνω µεθοδολογίας στηρίχθηκε στο γεγονός ότι η εφαρµογή της προσφέρει ένα πρακτικό τρόπο µελέτης πολλαπλών µεταβλητών και επιτρέπει τη διερεύνηση των κύριων και των τετραγωνικών παραγοντικών επιδράσεων, καθώς και των αλληλεπιδράσεων πρώτου βαθµού, µε την εκτέλεση λιγότερων πειραµατικών δοκιµών σε σχέση µε τα πλήρη πολυπαραγοντικά µοντέλα. Συνήθως, όταν η παραγοντική ανάλυση περιλαµβάνει ποσοτικές µεταβλητές και αποσκοπεί στο σχεδιασµό επιφάνειας απόκρισης, τότε αυτή µπορεί να περιγραφεί, κατά προσέγγιση, από ένα δευτέρου βαθµού µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης. Η προσέγγιση αυτή οφείλεται στο γεγονός ότι οι κύριες και οι δευτέρου βαθµού παραγοντικές επιδράσεις περιγράφουν ικανοποιητικά την απόκριση, ενώ οι τρίτου βαθµού ή υψηλότερες επιδράσεις κρίνονται συνήθως ως µη σηµαντικές (Neter και συν. 1996). Τα διάφορα στάδια που ακολουθήθηκαν για την ανάπτυξη και την κατανόηση του µαθηµατικού µοντέλου είναι τα εξής: α) Πειραµατικός Σχεδιασµός β) Συλλογή εδοµένων γ) Ανάλυση εδοµένων και Μαθηµατική Περιγραφή δ) Αξιολόγηση του Μοντέλου Πειραµατικός σχεδιασµός Για την εκτίµηση της άριστης παραγωγής βκαροτένιου χρησιµοποιήθηκε ένας κατάλληλος πειραµατικός σχεδιασµός, ο Σύνθετος Κεντρικός Σχεδιασµός (Central Composite Response Surface Design), για την προσαρµογή επιφάνειας δευτέρου βαθµού. Κατά το σχεδιασµό των πειραµάτων που πραγµατοποιήθηκαν για τη συλλογή των δεδοµένων πάνω στα οποία βασίστηκε το µοντέλο πρόβλεψης, ελήφθησαν υπόψη οι παρακάτω παράγοντες: 70

107 Ανεξάρτητες µεταβλητές του µοντέλου Η επιλογή των ανεξάρτητων (independent) µεταβλητών του µοντέλου έγινε µε βάση το βαθµό σηµαντικότητας της επίδρασης τους στην εξαρτηµένη µεταβλητή του µοντέλου καθώς και στο αν υπάρχουν ή όχι αλληλεπιδράσεις µεταξύ τους. Επίσης, προσδιορίστηκε το διάστηµα στο οποίο εκτείνονταν οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών, ώστε να αποδίδεται µία µέγιστη (ή ελάχιστη) απόκριση και η γεωµετρία της επιφάνειας απόκρισης κοντά στη µέγιστη (ή ελάχιστη) τιµή. Τα αποτελέσµατα των προκαταρκτικών πειραµάτων που περιγράφονται στις παραγράφους , , , και χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη µοντέλου για την επίδραση των παραγόντων Λινελαϊκό οξύ (Χ 1 ), Κηροζίνη (Χ 2 ) και Αντιοξειδωτικό (Χ 3 ) στην παραγωγή βκαροτένιου. Για κάθε παράγοντα χρησιµοποιήθηκαν πέντε πειραµατικά επίπεδα µε τις κωδικοποιηµένες τιµές: a, 1, 0, +1, +a, όπου a=2 n/4, n=αριθµός των παραγόντων, το 0 αντιστοιχεί στο κεντρικό σηµείο (center point) και τα 1, +1 αντιστοιχούν στην κατώτερη και ανώτερη τιµή κάθε παράγοντα, αντίστοιχα, που ορίστηκαν µε βάση τα παραπάνω προκαταρκτικά πειράµατα (Πίνακας 3.3.1). Οι πραγµατικές τιµές των παραγόντων υπολογίστηκαν µε τη χρήση της εξίσωσης: Ανώτερη τιµή + Κατώτερη τιµή Πραγµατική τιµή 2 Κωδικοποιιηµένη τιµή = (1) Ανώτερη τιµή Κατώτερη τιµή 2 Ο σύνθετος κεντρικός σχεδιασµός περιελάµβανε 20 πειραµατικές δοκιµές: 8 πειράµατα σε ακραίες τιµές των παραγόντων (Χ 1, Χ 2, Χ 3 ) = (±1, ±1, ±1) (corner point), 6 πειράµατα σε τιµές όλων των παραγόντων εκτός ενός να αντιστοιχούν στο κεντρικό επίπεδο (Χ 1, Χ 2, Χ 3 ) = (±a, 0, 0), (0, ±a, 0) ή (0, 0, ±a) (star or axial point) και 6 επαναλήψεις σε τιµές των παραγόντων να αντιστοιχούν στο κεντρικό επίπεδο (Χ 1, Χ 2, Χ 3 ) = (0, 0, 0) (Πίνακας 3.3.2). 71

108 Εξαρτηµένη µεταβλητή του µοντέλου Η εξαρτηµένη (dependent) µεταβλητή ή απόκριση (response) σχετίστηκε µε τη συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου (g /l υποστρώµατος) Συλλογή δεδοµένων Σε όλα τα πειράµατα η καλλιέργεια εµβολιασµού ήταν όµοια µε αυτή που περιγράφεται στην παράγραφο και οι συνθήκες παραγωγής βκαροτένιου ήταν: ταχύτητα παλινδρόµησης 200 rpm, χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες και θερµοκρασία ζύµωσης 26 0 C. Το υπόστρωµα παραγωγής ήταν το βασικό υπόστρωµα, η σύσταση του οποίου περιγράφεται στην παράγραφο 3.2.2, το οποίο εµπλουτιζόταν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης και αντιοξειδωτικού σε κάθε µία δοκιµή του πειραµατικού σχεδιασµού (Πίνακας 3.3.2). Η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου σε όλα τα πειράµατα προσδιοριζόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Ανάλυση δεδοµένων και µαθηµατική περιγραφή Μετά τη συλλογή και καταγραφή των δεδοµένων, αυτά χρησιµοποιήθηκαν για τη δηµιουργία µαθηµατικού µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού: Υ=β ο +β 1 X 1 +β 2 X 2 +β 3 X 3 +β 11 X 2 1 +β 22 X 2 2 +β 33 X 2 3 +β 12 X 1 X 2 +β 13 X 1 X 3 +β 23 X 2 X 3 (2) όπου: Y είναι η εξαρτηµένη µεταβλητή, Χ 1, Χ 2 και Χ 3 είναι οι κωδικοποιηµένες τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών και β ο, β 1, β 2, β 3, β 11, β 22, β 33, β 12, β 13, β 23 είναι οι άγνωστες παράµετροι (µερικοί συντελεστές πολλαπλής παλινδρόµησης) που εκτιµήθηκαν. Η παράµετρος β ο αναφέρεται ως σταθερά του µοντέλου. Η ανάλυση και συσχέτιση των πειραµατικών δεδοµένων, προκειµένου να εκτιµηθούν οι κύριες και τετραγωνικές επιδράσεις των παραγόντων Χ 1, Χ 2 και Χ 3 στην απόκριση Υ καθώς και οι αλληλεπιδράσεις πρώτου βαθµού µεταξύ των Χ 1, Χ 2 και Χ 3, βασίστηκε στην τεχνική της ανάλυσης παλινδρόµησης µε τη χρήση του στατιστικού λογισµικού Minitab Statistical Software, version 13.1 (Minitab Inc. 2000). Βάση του προγράµµατος αυτού εκτιµήθηκαν οι τιµές των παραµέτρων β ο, β 1, β 2, β 3, β 11, β 22, β 33, β 12, β 13, β 23 που προσαρµόζουν καλύτερα το µοντέλο στα δεδοµένα αυτά. Επίσης, εκτιµήθηκαν οι τιµές του στατιστικού t (tratio) και της 72

109 πιθανότητας (pvalue) του ελέγχου σηµαντικότητας για κάθε µεταβλητή, οι οποίες αποτελούν µέτρο σηµαντικότητας των µερικών συντελεστών της πολλαπλής παλινδρόµησης των µεταβλητών που υπεισέρχονταν στο µοντέλο, ώστε να εξασφαλιστεί η εισαγωγή στην εξίσωση (2) των στατιστικά σηµαντικών µεταβλητών. Ως επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας ορίστηκε το 5% (p<0,05) Αξιολόγηση του µοντέλου Η αξιολόγηση είναι πολύ σηµαντικό στάδιο στη διαδικασία δηµιουργίας χρήσιµων µοντέλων πρόβλεψης. Τα βασικά κριτήρια που ελήφθησαν υπόψη για τον έλεγχο συνολικά του µοντέλου είναι: α) η ακρίβεια της προσαρµογής του µοντέλου στα δεδοµένα µας, β) η τιµή του σφάλµατος προσαρµογής (lack of fit) που οφείλεται είτε σε παράλειψη µεταβλητών είτε σε χρήση µεταβλητών που δεν σχετίζονται µε την παραγωγή βκαροτένιου, γ) η ικανότητα να προβλέπει το µοντέλο συνδυασµούς παραγόντων που δεν έχουν εξεταστεί, δ) οι παράµετροι να έχουν βιολογικό νόηµα και ρεαλιστικές τιµές. Η επιλογή της τελικής εξίσωσης για την περιγραφή της σχέσης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου µε τις µεταβλητές X 1, X 2 και Χ 3 έγινε έτσι, ώστε να εξασφαλίζει αυτή υψηλή τιµή του συντελεστή πολλαπλού προσδιορισµού R 2 (όσο πιο κοντά προς τη µονάδα βρίσκεται η τιµή του R 2, τόσο πιο καλή είναι η προσαρµογή της παλινδρόµησης), χαµηλή τιµή της πιθανότητας (pvalue) του ελέγχου ολικής σηµαντικότητας του µοντέλου (p<0,05), χωρίς σφάλµατα προσαρµογής και να παρέχει συµπεράσµατα που να µην έρχονται σε αντίθεση µε τις επικρατούσες αντιλήψεις και τη λογική. Μετά την επιλογή του καλύτερου µοντέλου έγινε πρόβλεψη του συνδυασµού των άριστων τιµών των X 1, X 2 και Χ 3 εντός του εύρους του διαστήµατος των µεταβλητών, ο οποίος επιτυγχάνει τη µέγιστη τιµή της απόκρισης, µε τη χρήση της εξίσωσης (Neter και συν. 1996): Xs = 1/2B 1 b * (3) όπου: β 11 β 12 /2 β 13 /2 B = β 12 /2 β 22 β 23 /2 b * = β 13 /2 β 23 /2 β 33 β 1 β 2 β 3 73

110 Η λύση της εξίσωσης (3) αντιστοιχεί στο συνδυασµό των τιµών των παραγόντων που επιτυγχάνουν τη µέγιστη τιµή της απόκρισης, µόνο όταν η επιφάνεια απόκρισης έχει τη µορφή λοφίσκου. Στη συνέχεια το µοντέλο αξιολογήθηκε κάτω από πραγµατκές συνθήκες. Το πείραµα αξιολόγησης του µοντέλου έγινε στον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό τιµών των παραγόντων Χ 1 (17.15 g/l), Χ 2 (39.25 g/l) και Χ 3 (9.04 g/l) που δίνουν τη µέγιστη συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου και η παρατηρούµενη τιµή συγκρίθηκε µε την προβλεπόµενη µέγιστη τιµή της συγκέντρωσης της χρωστικής. Στο πείραµα αξιολόγησης του µοντέλου η καλλιέργεια εµβολιασµού, η σύσταση του υποστρώµατος παραγωγής και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του παραγόµενου βκαροτένιου έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο

111 Πίνακας Επίπεδα τιµών των παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν στον πειραµατικό σχεδιασµό του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου. Μεταβλητή Παράγοντας Κωδικοποιηµένη τιµή a a Πραγµατική τιµή X 1 Λινελαϊκό οξύ, (g/l) 13,18 20,00 30,00 40,00 46,82 X 2 Κηροζίνη, (g/l) 13,18 20,00 30,00 40,00 46,82 X 3 Αντιοξειδωτικό, (g/l) 6,59 10,00 15,00 20,00 23,40 75

112 Πίνακας Πειραµατικός σχεδιασµός και τιµές της µεταβλητής απόκρισης (συγκέντρωση βκαροτένιου) που µετρήθηκαν στις διαφορετικές δοκιµές του πειραµατικού σχεδιασµού. οκιµή Λινελαϊκό οξύ (g/l) Κηροζίνη (g/l) Αντιοξειδωτικό (g/l) βκαροτένιο (g/l) 1 20,00 40,00 10,00 2, ,00 13,18 15,00 0, ,82 30,00 15,00 1, ,00 20,00 20,00 0, ,00 30,00 15,00 2, ,00 20,00 20,00 0, ,00 46,82 15,00 2, ,00 40,00 20,00 1, ,00 30,00 15,00 2, ,00 30,00 15,00 2, ,00 20,00 10,00 1, ,18 30,00 15,00 1, ,00 40,00 10,00 1, ,00 30,00 15,00 2, ,00 30,00 15,00 2, ,00 30,00 15,00 2, ,00 40,00 20,00 1, ,00 30,00 6,59 2, ,00 30,00 23,40 0, ,00 20,00 10,00 1,20 76

113 3.3.6 Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας Για τη µελέτη των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora, προκειµένου να εκτιµηθεί η επίδραση της µορφολογίας του µικροοργανισµού στην παραγωγή ενδοκυτταρικού βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες, γινόταν παρατήρηση και ψηφιακή ανάλυση εικόνων του ζωντανού υλικού. Προετοιµασία παρασκευάσµατος Το υγρό της ζύµωσης (µυκήλιο και υπόστρωµα) αραιώνονταν κατάλληλα µε διάλυµα σακχαρόζης 20% (w/v) ώστε η τελική συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού στο υγρό να κυµαίνεται µεταξύ 1,01,5 g/l (Paul και συν. 1992). Στη συνέχεια, στο κέντρο της αντικειµενοφόρου πλάκας τοποθετούνταν 10 3 ml του αραιωµένου υγρού της ζύµωσης µε κρίκο εµβολιασµού και το υγρό καλύπτονταν µε καθαρή καλυπτρίδα και πιέζονταν ελαφρά ώστε η στοιβάδα του υγρού µεταξύ των δύο πλακών να είναι λεπτή Περιγραφή του συστήµατος που χρησιµοποιήθηκε για τη ψηφιακή απεικόνηση και επεξεργασία της εικόνας Οι εικόνες των καλλιεργειών των (+) και () στελεχών του B. trispora και της συζευγµένης καλλιέργειας των στελεχών αντίθετου φύλου του µικροοργανισµού, µετά από παρατήρηση µε µικροσκόπιο αντιθετικής φάσης (Nikon E 200, USA) που έκανε συνολική µεγέθυνση 100 και 200 φορές, καταγράφονταν µε βιντεοκάµερα (JVC) υψηλής ανάλυσης που ήταν προσαρµοσµένη στο µικροσκόπιο. Η ψηφιοποίηση των εικόνων µε χρήση βιντεοκάµερας γίνεται ως εξής: Η βιντεοκάµερα σαρώνει τις εικόνες που φωτίζονται από µία φωτεινή πηγή που είναι ενσωµατωµένη στη βάση του µικροσκοπίου, και µέσω του φωτοηλεκτρικού ανιχνευτή (CCD) µετατρέπει την ανακλώµενη φωτεινότητα σε ηλεκτρικό ρεύµα. Το παραγόµενο ηλεκτρικό ρεύµα είναι αναλογικό σήµα, δηλαδή σήµα συνεχές και δυσδιάστατο. Για να µπορέσει να υποστεί ψηφιακή επεξεργασία πρέπει να ψηφιοποιηθεί, δηλαδή να µετατραπεί σε ψηφιακό σήµα που είναι σήµα διακριτό και δυσδιάστατο. Αυτό γίνεται από τον ψηφιοποιητή εικόνας (frame grabber) που περιέχει έναν µετατροπέα του αναλογικού σήµατος (Analogical) σε ψηφιακό (Digital) [A/D converter]. Το προκύπτον ψηφιακό σήµα στη συνέχεια φέρονταν στον προσωπικό υπολογιστή, µε τον οποίο είναι εφοδιασµένο το σύστηµα ψηφιοποίησης και οι εικόνες 77

114 επεξεργάζονταν µε τη χρήση του ειδικού προγράµµατος µορφοµετρίας Matrox Inspector version 3.0 (Matrox Electronic System Ltd., Canada). Κατά την επεξεργασία των ψηφιακών εικόνων διαστάσεων 768x568 εικονοστοιχείων (pixels), µε ειδικό σύστηµα µακροεντολών, γινόταν: α) µετατροπή της εικόνας σε διαβάθµιση του γκρι (0 256), β) κατωφλίωση (thresholding) στο ιστόγραµµα κατανοµής των επιπέδων του γκρι (gray level) στην εικόνα, ώστε να επιτευχθεί ο ηµιτονισµός της (halftoning), δηλαδή η µετατροπή όλων των ενδιάµεσων αποχρώσεων του γκρι είτε σε απόλυτο λευκό, είτε σε απόλυτο µαύρο, οπότε η εικόνα τελικά να µετατραπεί σε µια απόλυτα ασπρόµαυρη, δυαδική (binary) εικόνα, γ) φιλτράρισµα (filtering) του θορύβου καταγραφής ή µετάδοσης, δ) βαθµονόµηση του φωτισµού της εικόνας, ε) βελτίωση της αντίθεσης της εικόνας (contrast enhancement), στ) αποθήκευση της εικόνας (storage) Βασικές παράµετροι της µορφοµετρικής ανάλυσης της ψηφιακής εικόνας Η ψηφιακή ανάλυση των επεξεργασµένων και βελτιωµένων εικόνων έδινε τη δυνατότητα επακριβούς γνώσης των αντικειµένων που αναπαριστά κάθε εικόνα καθώς και του περιβάλλοντός της (backround) και επίσης τη δυνατότητα αριθµητικών και γεωµετρικών υπολογισµών των αντικειµένων της εικόνας. Για τη µελέτη της µορφολογίας του µικροοργανισµού γινόταν µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού σε 5 δείγµατα, στα οποία χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικοί τύποι εµβολίου (Πίνακας 4.2.1) και σε 9 δείγµατα, στα οποία χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής βκαροτένιου (Πίνακας ). Τα παραπάνω αντικείµενα διακρίνονταν µεταξύ τους µε βάση τις αποχρώσεις του γκρί και το σχήµα τους. Οι γεωµετρικές παράµετροι που υπολογίζονταν για τα αντικείµενα αυτά περιγράφονται στον Πίνακα (Paul και συν. 1992). Στην κάθε εικόνα γινόταν αυτόµατη µέτρηση της περιµέτρου και του εµβαδού των διαφορετικών αντικειµένων µέσω του ειδικού προγράµµατος µορφοµετρίας Matrox Inspector. Με βάση τις µετρήσεις αυτές υπολογίζονταν µε ειδικές εξισώσεις: α) η κυκλικότητα (C) κάθε αντικειµένου, β) η ισοδύναµη διάµετρος (d zs ) των σχηµατισµένων ζυγοσπορίων, γ) το µήκος και το µέσο πλάτος των κυλινδρικών ή επιµηκών αντικειµένων (L h, d h ) και δ) ο όγκος των σφαιρικών (V zs ) και κυλινδρικών ή επιµηκών αντικειµένων (V h ). Το σχήµα των ζυγοσπορίων θεωρούνταν σφαιρικό (κυκλικότητα < 1,3), ενώ των µυκηλιακών υφών κυλινδρικό ή 78

115 επίµηκες (1,3 κυκλικότητα < 2,0). Από κάθε περίπτωση γινόταν µορφοµετρικές αναλύσεις των αντικειµένων σε 50 εικόνες που κατέγραφαν διαφορετικές περιοχές του µυκηλίου του υγρού της ζύµωσης στη µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου και τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι ο µέσος όρος όλων των επαναλήψεων. Στη συνέχεια, για κάθε δείγµα υπολογίζονταν ο συνολικός όγκος των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων και το ποσοστό επί τις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια και κενά κύτταρα), των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο ξηρό βάρος της βιοµάζας µε βάση την τιµή του συνολικού ξηρού βάρους της βιοµάζας του µυκηλίου και της πυκνότητας του δείγµατος (Paul και Thomas 1998). Το ποσοστό των εκφυλισµένων κυττάρων στο ξηρό βάρος της βιοµάζας υπολογίζονταν µε αφαίρεση του αντίστοιχου ποσοστού των άθικτων µυκηλιακών υφών, µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου από το 100. Τα αποτελέσµατα των µορφοµετρικών αναλύσεων των δειγµάτων περιγράφονται στους Πίνακες και

116 Πίνακας Γεωµετρικές παράµετροι της µελέτης των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες µε ψηφιακή ανάλυση εικόνας (Paul και συν. 1992). Παράµετρος Μαθηµατική Απεικόνηση Μονάδα Μέτρησης Εφαρµογή Περίµετρος (P) Αρίθµηση των εικονοστοιχείων κατά µήκος της περιφέρειας του αντικειµένου µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (P h ), ζυγοσπόρια (P zs ) Εµβαδόν (A) Αρίθµηση των εικονοστοιχείων σε όλη την επιφάνεια του αντικειµένου µm x µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (A h ), ζυγοσπόρια (A zs ) Κυκλικότητα (C) C = P 2 /4πA Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα), ζυγοσπόρια Ισοδύναµη διάµετρος (d zs ) d zs =(4A/π) 1/2 µm Ζυγοσπόρια Μήκος (L) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα L=[P+(P 2 16A) 1/2 ]/4 µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (L h ) Μέσο πλάτος (d) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα d=[p(p 2 16A) 1/2 ]/4 µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (d h ) Όγκος (V zs ) για σφαιρικά αντικείµενα V zs = (π d z 3 )/6 µm 3 Ζυγοσπόρια Όγκος (V) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα V = (π d A)/4 µm 3 Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (V h ) 80

117 3.4 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠO ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΣΥΝΕΧΗ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ ΣΕ ΖΥΜΩΤΗΡΑ ΑΝΑ ΕΥΣΗΣ Περιγραφή της Συσκευής Η σειρά αυτή των πειραµάτων πραγµατοποιήθηκε σε ζυµωτήρα ανάδευσης (Νew Brunswick Scientific, Discovery, Series 100, UK) (Εικόνα 3.4.1), ο οποίος αποτελείται από τα παρακάτω τµήµατα: 1) ένα γυάλινο κυλινδρικό δοχείο που η πάνω βάση του αποτελείται από µεταλλική πλάκα κατασκευασµένη από ανοξείδωτο χάλυβα, 2) έναν αναδευτήρα (agitator), γ) έναν κινητήρα και 4) δύο µεταλλικά κάθετα ελάσµατα (Baffles) (Σχήµα 3.4.1). Ο ζυµωτήρας φέρει επίσης σύστηµα αυτόµατου ελέγχου της ταχύτητας περιστροφής του άξονα ανάδευσης, της θερµοκρασίας, του ph, του διαλυτού οξυγόνου και του σχηµατισµού αφρού κατά τη διάρκεια της ζύµωσης. οχείο ζύµωσης Το δοχείο της ζύµωσης είναι κατασκευασµένο από γυαλί µε παχύ τοίχωµα, µε αναλογία ύψους / διάµετρο (H/D) ίσο µε 2,1, χωρητικότητας 5 λίτρων και µέγιστο όγκο υποστρώµατος (maximum working volume) 4,2 λίτρων. Η πάνω βάση του δοχείου της ζύµωσης αποτελείται από µεταλλική πλάκα κατασκευασµένη από ανοξείδωτο χάλυβα, η οποία φέρει οπές για την προσθήκη του υποστρώµατος, διαφόρων οξέων ή αλκάλεων, της αντιαφριστικής ουσίας, εισόδου και εξόδου του αέρα και του νερού ψύξης και παραλαβή του προϊόντος. Το δοχείο της ζύµωσης προσαρµόζεται σε µεταλλική βάση. Αναδευτήρας Ο αναδευτήρας φέρει άξονα από ανοξείδωτο χάλυβα κατά µήκος του οποίου είναι τοποθετηµένες σε απόσταση 5 και 10 cm, αντίστοιχα, από τη βάση του δοχείου 2 φτερωτές, οι οποίες έχουν τη µορφή µεταλλικού δίσκου (διάµετρος 5,0 cm) µε αµφίπλευρα πτερύγια που προεξέχουν από αυτόν (µήκος 2,0 cm, πλάτος 1,5 cm). Ο άξονας διέρχεται από το κέντρο της πάνω µεταλλικής πλάκας του ζυµωτήρα και συνδέεται µε τον κινητήρα, ο οποίος προσαρµόζεται σε ειδική βάση της µεταλλικής πλάκας, και φτάνει µέχρι το σηµείο από το οποίο εισέρχεται ο αέρας στο ζυµωτήρα. Ο αέρας διέρχεται από σωλήνα που φέρει οπές και βρίσκεται κάτω από τον αναδευτήρα σε απόσταση 3 cm από τη βάση του δοχείου. Ο αέρας προσκρούει στο 81

118 άκρο του αναδευτήρα και µε τη βοήθεια των πτερυγίων της φτερωτής διοχετεύεται στο υγρό της ζύµωσης. Για την αποτελεσµατικότερη ανάδευση και αερισµό του υποστρώµατος τοποθετούνται µέσα στο δοχείο δύο κάθετα µεταλλικά ελάσµατα, τα οποία λειτουργούν ως ανακλαστήρες. Έλεγχος ταχύτητας περιστροφής του άξονα ανάδευσης, θερµοκρασίας, ph, διαλυτού οξυγόνου και σχηµατισµού αφρού Ο ζυµωτήρας είναι εξοπλισµένος µε ελεγκτές για τη ρύθµιση της ταχύτητας περιστροφής του άξονα ανάδευσης, της θερµοκρασίας, του ph, του διαλυτού οξυγόνου και του σχηµατισµού αφρού. Για τον έλεγχο της θερµοκρασίας ο ζυµωτήρας φέρει µία ηλεκτρική αντίσταση που θερµαίνει το υγρό και ένα θερµοζεύγος που δίνει τη θερµοκρασία του υγρού. Η ηλεκτρική αντίσταση και το θερµοζεύγος συνδέονται µε ένα αυτόµατο σύστηµα ρύθµισης της επιθυµητής θερµοκρασίας που ενεργοποιεί είτε τη λειτουργία της ηλεκτρικής αντίστασης, είτε την κυκλοφορία νερού βρύσης µέσα σε έναν ελικοειδή σωλήνα που φέρει ο ζυµωτήρας, για τη θέρµανση ή τη ψύξη του υγρού της ζύµωσης, αντίστοιχα. Η µέτρηση του ph του υγρού της ζύµωσης γίνεται µε ηλεκτρόδιο τύπου Mettler Toledo 405DPASSCK8S/22S, το οποίο συνδέεται µε ένα αυτόµατο σύστηµα ρύθµισης του ph του υγρού. Στην περίπτωση που είναι επιθυµητή η διατήρηση του ph σε σταθερή τιµή κατά τη διάρκεια της ζύµωσης, το αυτόµατο σύστηµα ρύθµισης του ph ενεργοποιεί περισταλτικές αντλίες για την προσθήκη οξέος ή βάσεως στο υγρό της ζύµωσης. Η βαθµονόµηση του συστήµατος καταγραφής του ph γινόταν µε τη χρήση ρυθµιστικών διαλυµάτων µε ph 4,0 (WTW, ) και 7,0 (WTW, ) πριν από την αποστείρωση του ηλεκτροδίου µε ατµό, η οποία γίνεται µαζί µε το ζυµωτήρα. Η µέτρηση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου γίνεται µε το πολαρογραφικό ηλεκτρόδιο οξυγόνου τύπου Mettler Toledo InPro6110/220/S/N, του οποίου η άνοδος και η κάθοδος αποτελούνται από άργυρο και λευκόχρυσο αντίστοιχα, ενώ σαν ηλεκτρολύτης χρησιµοποιείται διάλυµα χλωριούχου καλίου. Το ηλεκτρόδιο εµβαπτίζεται στο υγρό της ζύµωσης και δίνει την επί τοις εκατό περιεκτικότητα του υγρού της ζύµωσης σε διαλυτό οξυγόνο κατά τη διάρκεια της ζύµωσης. Η βαθµονόµηση του συστήµατος καταγραφής του διαλυτού οξυγόνου γινόταν µε τη χρήση πρότυπων αερίων (καθαρό Ο 2 για το 100% και Ν 2 για το 0%) πριν από την αποστείρωση του ηλεκτροδίου µε ατµό, η οποία γίνεται µαζί µε το ζυµωτήρα. Ο έλεγχος του αφρού γίνεται µε µία µεταλλική ράβδο από ανοξείδωτο 82

119 χάλυβα που καλύπτεται µε µονωτικό υλικό (εκτός από την άκρη) και τοποθετείται στο ζυµωτήρα πάνω από την επιφάνεια του υγρού. Όταν ο αφρός έρθει σε επαφή µε την άκρη της ράβδου δηµιουργείται ηλεκτρικό ρεύµα δια µέσου της ράβδου και ενεργοποιείται η περισταλτική αντλία που προσθέτει στο ζυµωτήρα αντιαφριστική ουσία. 83

120 Εικόνα Φωτογραφία του ζυµωτήρα ανάδευσης που χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή βκαροτένιου µε το µύκητα B. trispora. 84

121 Είσοδος αέρα Σύστηµα δειγµατοληψίας Βάση κινητήρα Είσοδοι οξέος, βάσης Σύστηµα ανάδευσης Είσοδος νερού Βάση Έξοδος νερού Σχήµα Ζυµωτήρας ανάδευσης που χρησιµοποιήθηκε για την παραγωγή β καροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το µύκητα B. trispora. 85

122 3.4.2 Προετοιµασία του Υποστρώµατος και Συνθήκες Καλλιέργειας του Μικροοργανισµού Για την παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης χρησιµοποιούνταν 3 l συνθετικού υποστρώµατος (βασικό υπόστρωµα) µε την παρακάτω σύσταση (g/l): γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 5,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 (mg/l). To ph του υποστρώµατος ρυθµιζόταν στο 7,0 µε 20Ν NaOH και το υπόστρωµα προστίθενταν στο δοχείο της ζύµωσης. Μετά τη βαθµονόµηση των ηλεκτροδίων ph και οξυγόνου και την προσαρµογή τους στο ζυµωτήρα, το όλο σύστηµα µεταφέρονταν σε θάλαµο αποστείρωσης, όπου αποστειρώνονταν στους C για 25 λεπτά. Το υπόστρωµα εµβολιάζονταν µε µίγµα κυττάρων των καλλιεργειών και του B. trispora, οι οποίες αναπτυσσόταν µε τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Για τον εµβολιασµό του υποστρώµατος, από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των δύο στελεχών µεταφέρονταν στο ζυµωτήρα 30 κοµµάτια άγαρ 1 cm 2 που έφεραν κύτταρα του µικροοργανισµού. Η ζύµωση γινόταν σε θερµοκρασία 26 0 C, ρυθµό παροχής αέρα 1,5 vvm και ταχύτητα ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης 150 rpm. Τις πρώτες 24 ώρες η δηµιουργία αφρού ελέγχονταν µε την προσθήκη αντιαφριστικής ουσίας (Antifoam A, Sigma, A5758) Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος στην Παραγωγή βκαροτένιου Για τη µελέτη της επίδρασης της σύστασης του υποστρώµατος στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχής ζύµωσης βυθού για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης το βασικό υπόστρωµα παραγωγής που περιγράφεται στην παράγραφο εµπλουτίζονταν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις φυτικών ελαίων (ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου), λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης, αντιοξειδωτικού (BHT), ή µιγµάτων των ουσιών αυτών. Η κηροζίνη αποστειρώνονταν ξεχωριστά από το υπόλοιπο υπόστρωµα και η προσθήκη της γινόταν την 3 η ή την 6 η ηµέρα της ζύµωσης. Σε κάθε περίπτωση η καλλιέργεια εµβολιασµού του υποστρώµατος και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν δύο φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των δύο επαναλήψεων. 86

123 3.4.4 Επίδραση του Αερισµού και της Ανάδευσης στην Παραγωγή βκαροτένιου Η επίδραση του ρυθµού παροχής αέρα και της ταχύτητα ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης µελετήθηκε στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Ο ρυθµός παροχής αέρα και η ταχύτητα ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης ρυθµιζόταν σε διαφορετικές τιµές (0, 0,5, 1,0, 1,5 ή 2,0 vvm και 0, 150, 325 ή 700 rpm, αντίστοιχα). Σε κάθε περίπτωση χρησιµοποιούνταν 3 l συνθετικού υποστρώµατος µε την παρακάτω σύσταση (g/l): γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, ελαιόλαδο 10,0, σογιέλαιο 10,0, βαµβακέλαιο 10,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 5,0, Tween 80 1,0, BHT 2,5, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 (mg/l). To ph του υποστρώµατος ρυθµιζόταν στο 7,0 µε 20Ν NaOH. Η προετοιµασία του συστήµατος ζύµωσης, η καλλιέργεια εµβολιασµού του υποστρώµατος και η θερµοκρασία ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν δύο φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των δύο επαναλήψεων Προσδιορισµός Συγκέντρωσης και Παραγωγικότητας βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, Η 2 Ο 2, ph, ιαλυτού Οξυγόνου και Κατανάλωσης Σακχάρων Κατά τη διάρκεια της ζύµωσης και σε τακτά χρονικά διαστήµατα (κάθε 12 ώρες µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και κάθε 48 ώρες µετά τη 2 η ηµέρα και µέχρι το τέλος της ζύµωσης) αποµακρύνονταν από το ζυµωτήρα 50 ml του υγρού της ζύµωσης, µέσω του συστήµατος δειγµατοληψίας που φέρει ο ζυµωτήρας. Στο δείγµα προσδιορίζονταν η συγκέντρωση και η παραγωγικότητα του βκαροτένιου, η βιοµάζα, τα σάκχαρα, το Η 2 Ο 2, το ph, το διαλυτό οξυγόνο και η κατανάλωση σακχάρων. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του βκαροτένιου γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Η παραγωγικότητα του βκαροτένιου εκφράζονταν σε mg/l.d. Ο προσδιορισµός της βιοµάζας, των σακχάρων και του Η γινόταν όπως περιγράφεται στις παραγράφους , και αντίστοιχα. Η µέτρηση του ph και της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου (% του κορεσµένου) στο υγρό της ζύµωσης γινόταν αυτόµατα µε τα αντίστοιχα ηλεκτρόδια που φέρει ο ζυµωτήρας, ενώ η κατανάλωση σακχάρων εκφράζονταν σε g σακχάρων που καταναλώθηκαν/100 g αρχικών σακχάρων. 87

124 3.4.6 Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας Για τη µελέτη των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora, προκειµένου να εκτιµηθεί η επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος και των συνθηκών αερισµού και ανάδευσης στη µορφολογία του µικροοργανισµού σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης, γινόταν παρατήρηση και ψηφιακή ανάλυση εικόνων του ζωντανού υλικού. Η προετοιµασία του παρασκευάσµατος γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Το σύστηµα που χρησιµοποιούνταν για τη ψηφιακή απεικόνηση και επεξεργασία της εικόνας ήταν το ίδιο µε αυτό που περιγράφεται στην παράγραφο Επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος στη µορφολογία του µικροοργανισµού Για τη µελέτη της επίδρασης της σύστασης του υποστρώµατος στη µορφολογία του µικροοργανισµού γινόταν µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού σε 25 δείγµατα στα οποία χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής (Πίνακας 4.3.1). Οι γεωµετρικές παράµετροι που υπολογίζονταν για τα παραπάνω αντικείµενα περιγράφονται στον Πίνακα (Paul και συν. 1992) και µετρούνταν µε τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Το σχήµα των ζυγοσπορίων θεωρούνταν σφαιρικό (κυκλικότητα < 1,3), ενώ των ζυγοφόρων και των µυκηλιακών υφών κυλινδρικό ή επίµηκες (1,3 κυκλικότητα < 2,0). Για κάθε περίπτωση γινόταν µορφοµετρικές αναλύσεις των αντικειµένων κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας σε ορισµένα χρονικά διαστήµατα (τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, στη µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου και την τελευταία ηµέρα της ζύµωσης) και κάθε φορά µελετούνταν 50 εικόνες που κατέγραφαν διαφορετικές περιοχές του µυκηλίου του υγρού της ζύµωσης. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι ο µέσος όρος όλων των επαναλήψεων. Στη συνέχεια, για κάθε δείγµα υπολογίζονταν ο συνολικός όγκος των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων και το ποσοστό επί τις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα), των ζυγοφόρων, των 88

125 ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο ξηρό βάρος της βιοµάζας µε βάση τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Τα αποτελέσµατα των µορφοµετρικών αναλύσεων των δειγµάτων περιγράφονται στον Πίνακα Επίδραση του αερισµού και της ανάδευσης στη µορφολογία του µικροοργανισµού Για τη µελέτη της επίδρασης του ρυθµού παροχής αέρα και της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης στη µορφολογία του µικροοργανισµού γινόταν µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού σε 25 δείγµατα στα οποία χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης (Πίνακας 4.3.3). Οι γεωµετρικές παράµετροι που υπολογίζονταν για τα παραπάνω αντικείµενα περιγράφονται στον Πίνακα (Paul και συν. 1992) και υπολογίζονταν µε τον τρόπο που περιγράφετε στην παράγραφο Το σχήµα των ζυγοσπορίων θεωρούνταν σφαιρικό (κυκλικότητα < 1,3), ενώ των µυκηλιακών υφών κυλινδρικό ή επίµηκες (1,3 κυκλικότητα < 2,0). Από κάθε περίπτωση γινόταν µορφοµετρικές αναλύσεις των αντικειµένων σε 50 εικόνες που κατέγραφαν διαφορετικές περιοχές του µυκηλίου του υγρού της ζύµωσης στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου και τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι ο µέσος όρος όλων των επαναλήψεων. Στη συνέχεια, για κάθε δείγµα υπολογίζονταν ο συνολικός όγκος των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων και το ποσοστό επί τις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα), των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο ξηρό βάρος της βιοµάζας µε βάση τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Τα αποτελέσµατα των µορφοµετρικών αναλύσεων των δειγµάτων περιγράφονται στον Πίνακα

126 Πίνακας Γεωµετρικές παράµετροι της µελέτης των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε ψηφιακή ανάλυση εικόνας (Paul και συν. 1992). Παράµετρος Μαθηµατική Απεικόνηση Μονάδα µέτρησης Εφαρµογή Περίµετρος (P) Αρίθµηση των εικονοστοιχείων κατά µήκος της περιφέρειας του αντικειµένου µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (P h ), ζυγοφόροι (P zp), ζυγοσπόρια (P zs ) Εµβαδόν (A) Αρίθµηση των εικονοστοιχείων σε όλη την επιφάνεια του αντικειµένου µm x µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (A h ), ζυγοφόροι (A zp), ζυγοσπόρια (A zs ) Κυκλικότητα (C) C = P 2 /4πA Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα), ζυγοφόροι, ζυγοσπόρια Ισοδύναµη διάµετρος (d zs ) d zs =(4A/π) 1/2 µm Ζυγοσπόρια Μήκος (L) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα L=[P+(P 2 16A) 1/2 ]/4 µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (L h ), ζυγοφόροι (L zp ) Μέσο πλάτος (d) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα d=[p(p 2 16A) 1/2 ]/4 µm Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (d h ), ζυγοφόροι (d zp ) Όγκος (V zs ) για σφαιρικά αντικείµενα V zs = (π d z 3 )/6 µm 3 Ζυγοσπόρια Όγκος (V) για κυλινδρικά ή επιµήκη αντικείµενα V = (π d A)/4 µm 3 Μυκηλιακές υφές (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα) (V h ), ζυγοφόροι (V zp ) 90

127 3.4.7 Ανάπτυξη Μαθηµατικών Μοντέλων Πολλαπλής Παλινδρόµησης µε τη Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης Η βελτιστοποίηση των συνθηκών αερισµού και ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης, µε στόχο την καλή ανάπτυξη του B. trispora και την υψηλή απόδοση του προϊόντος σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης, πραγµατοποιήθηκε µε την ανάπτυξη και την κατανόηση µοντέλων πρόβλεψης µε τη µεθοδολογία της επιφάνειας απόκρισης (Response Surface Methodology). Η µεθοδολογία αυτή και οι δυνατότητες εφαρµογής της περιγράφονται στην παράγραφο Τα διάφορα στάδια που ακολουθήθηκαν για την ανάπτυξη και την κατανόηση των µαθηµατικών µοντέλων είναι τα εξής: α) Πειραµατικός Σχεδιασµός β) Συλλογή εδοµένων γ) Ανάλυση εδοµένων και Μαθηµατική Περιγραφή δ) Αξιολόγηση των Μοντέλων Πειραµατικός σχεδιασµός Για την εκτίµηση της βέλτιστης συγκέντρωσης και παραγωγικότητας του βκαροτένιου και της µέγιστης ανάπτυξης του µικροοργανισµού χρησιµοποιήθηκε ο Σύνθετος Κεντρικός Σχεδιασµός µε α = 1 (FaceCentered Composite Response Surface Design), για την προσαρµογή επιφάνειας δευτέρου βαθµού. Κατά το σχεδιασµό των πειραµάτων που πραγµατοποιήθηκαν για τη συλλογή των δεδοµένων πάνω στα οποία βασίστηκαν τα µοντέλα πρόβλεψης, ελήφθησαν υπόψη οι παρακάτω παράγοντες: Ανεξάρτητες µεταβλητές των µοντέλων Η επιλογή των ανεξάρτητων µεταβλητών των µοντέλων και του διαστήµατος στο οποίο εκτείνονταν οι τιµές των µεταβλητών αυτών έγινε µε βάση τα κριτήρια που περιγράφονται στην παράγραφο Τα αποτελέσµατα των προκαταρκτικών πειραµάτων που περιγράφονται στην παράγραφο χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη µοντέλων για την επίδραση των παραγόντων Ταχύτητα ανάδευσης (Χ 1 ) και Αερισµός (Χ 2 ) στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή βκαροτένιου. Για κάθε παράγοντα χρησιµοποιήθηκαν τρία πειραµατικά επίπεδα µε τις κωδικοποιηµένες τιµές: 1, 0, +1, όπου το 0 αντιστοιχεί στο κεντρικό σηµείο (center point) και τα 1, 91

128 +1 αντιστοιχούν στην κατώτερη και ανώτερη τιµή κάθε παράγοντα, αντίστοιχα, που ορίστηκαν µε βάση τα παραπάνω προκαταρκτικά πειράµατα (Πίνακας 3.4.2). Οι πραγµατικές τιµές των παραγόντων υπολογίστηκαν µε τη χρήση της εξίσωσης (1) που περιγράφεται στην παράγραφο Ο σύνθετος κεντρικός σχεδιασµός περιελάµβανε 12 πειραµατικές δοκιµές: 4 πειράµατα σε ακραίες τιµές των παραγόντων (Χ 1, Χ 2 ) = (±1, ±1) (corner point), 4 πειράµατα σε τιµή του ενός από τους δύο παράγοντες να αντιστοιχεί στο κεντρικό επίπεδο (Χ 1, Χ 2 ) = (±1, 0) και (Χ 1, Χ 2 ) = (0, ±1) (star or axial point) και 4 επαναλήψεις σε τιµές και των δύο παραγόντων να αντιστοιχούν στο κεντρικό επίπεδο (Χ 1, Χ 2 ) = (0, 0) (Πίνακας 3.4.3). Εξαρτηµένες µεταβλητές των µοντέλων Οι εξαρτηµένες µεταβλητές που επιλέχθηκαν για να µελετηθεί η µεταβλητότητα τους σε σχέση µε τις µεταβολές των ανεξάρτητων µεταβλητών Χ 1 και Χ 2 ήταν οι εξής: 1) συγκέντρωση βκαροτένιου (Υ 1 ) (mg βκαροτένιου/l υποστρώµατος), 2) παραγωγικότητα βκαροτένιου (Υ 2 ) (mg βκαροτένιου/l υποστρώµατος/ηµέρα), 3) συγκέντρωση βιοµάζας του µικροοργανισµού (Υ 3 ) (g ξηρού βάρους βιοµάζας/l υποστρώµατος) και 4) ογκοµετρικός συντελεστής µεταφοράς µάζας (Υ 4 ) (s 1 ) Συλλογή δεδοµένων Σε όλα τα πειράµατα η σύσταση του υποστρώµατος παραγωγής του β καροτένιου, η καλλιέργεια εµβολιασµού και η θερµοκρασία ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο 3.4.4, ενώ οι τιµές της ταχύτητας ανάδευσης και του αερισµού του υγρού της ζύµωσης ήταν διαφορετικές σε κάθε µία δοκιµή του πειραµατικού σχεδιασµού (Πίνακας 3.4.3). Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας του β καροτένιου και της βιοµάζας του µικροοργανισµού γινόταν σε όλα τα πειράµατα όπως περιγράφεται στην παράγραφο Ο ογκοµετρικός συντελεστής µεταφοράς µάζας (K La ) προσδιορίζονταν µε τη δυναµική µέθοδο (Stanbury και συν. 1995). Ο προσδιορισµός του K La µε τη µέθοδο αυτή στηρίζεται στη µέτρηση του διαλυτού οξυγόνου µε το ηλεκρόδιο οξυγόνου που φέρει ο ζυµωτήρας σε µικρό χρονικό διάστηµα. Η µέθοδος περιελάµβανε δύο στάδια (Σχήµα 3.4.2). Στο πρώτο στάδιο 92

129 (τµήµα ΑΒ) δεν διοχετευόταν αέρας στο ζυµωτήρα, το υπόστρωµα εµβολιάζονταν µε την καλλιέργεια και αναδεύονταν µε ορισµένη ταχύτητα (150, 325 ή 500 rpm) µε ταυτόχρονη διοχεύτευση αζώτου στο ελεύθερο τµήµα του ζυµωτήρα. Στο δεύτερο στάδιο (τµήµα BC, όταν η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου (C L ) µειωνόταν σηµαντικά µέχρι το σηµείο Β) διοχετευόταν αέρας (0,5, 1,0 ή 1,5 vvm) από τη βάση του ζυµωτήρα µέχρις ότου η C L φτάσει στο σηµείο Α. Η αύξηση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου που παρατηρείται στο τµήµα BC ισούται µε τη διαφορά της µεταφοράς οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης και της πρόσληψης του οξυγόνου από την καλλιέργεια. Η διαφορά αυτή εκφράζεται από την εξίσωση: dc L dt = K La (C * C L ) XQO 2 (4) όπου: dc L dt η µεταβολή της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου σε χρόνο dt, Χ η συγκέντρωση της βιοµάζας ξηρό βάρος (g/l), QO 2 ο ειδικός ρυθµός πρόσληψης οξυγόνου ανά g βιοµάζας στη µονάδα του χρόνου (mmoles οξυγόνου/g βιοµάζας/h) και C * η συγκέντρωση κορεσµένου διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης. Όταν το υγρό της ζύµωσης είναι κορεσµένο µε αέρα, η πίεση του οξυγόνου που εισέρχεται στο ζυµωτήρα είναι 1 atm και η θερµοκρασία του υγρού της ζύµωσης είναι 30 0 C, η C * ισούται µε 2,3 x 10 4 mol/l. Ο όρος XQO 2 ορίζεται από την κλίση της ευθείας ΑΒ του σχήµατος Η εξίσωση (4) γράφεται µε την παρακάτω µορφή: 1 dc L C L = ( + XQO 2 ) + C* (5) K La dt Η γραφική παράσταση της εξίσωσης (5) δίνεται στο Σχήµα Από το Σχήµα φαίνεται ότι η γραφική παράσταση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου µε τον dc L όρο + XQO 2 είναι ευθεία γραµµή η κλίση της οποίας ισούται µε 1/K La. dt 93

130 Ανάλυση δεδοµένων και µαθηµατική περιγραφή Μετά τη συλλογή και καταγραφή των δεδοµένων, αυτά χρησιµοποιήθηκαν για τη δηµιουργία τεσσάρων µαθηµατικών µοντέλων πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού µε γενικό τύπο: Υ=β ο +β 1 X 1 +β 2 X 2 + β 11 X 2 1 +β 22 X β 12 X 1 X 2 (6) όπου: Y είναι η εξαρτηµένη µεταβλητή Χ 1 και Χ 2 είναι οι κωδικοποιηµένες τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών και β ο, β 1, β 2, β 11, β 22, β 12 είναι οι άγνωστες παράµετροι (µερικοί συντελεστές πολλαπλής παλινδρόµησης) που εκτιµήθηκαν. Η παράµετρος β ο αναφέρεται ως σταθερά του µοντέλου. Η ανάλυση και συσχέτιση των πειραµατικών δεδοµένων, προκειµένου να εκτιµηθούν οι κύριες και τετραγωνικές επιδράσεις των παραγόντων Χ 1 και Χ 2 στις αποκρίσεις Υ 1, Υ 2, Υ 3 και Υ 4 καθώς και οι αλληλεπιδράσεις πρώτου βαθµού µεταξύ των Χ 1 και Χ 2, βασίστηκε στην τεχνική της ανάλυσης παλινδρόµησης µε τη χρήση του στατιστικού λογισµικού Minitab Statistical Software, version 13.1 (Minitab Inc. 2000). Βάση του προγράµµατος αυτού εκτιµήθηκαν για κάθε µοντέλο οι τιµές των παραµέτρων β ο, β 1, β 2, β 11, β 22, β 12 που προσαρµόζουν καλύτερα το µοντέλο στα δεδοµένα αυτά και οι τιµές του στατιστικού t (tratio) και της πιθανότητας (pvalue) του ελέγχου σηµαντικότητας για κάθε µεταβλητή, οι οποίες αποτελούν µέτρο σηµαντικότητας των µερικών συντελεστών της πολλαπλής παλινδρόµησης των µεταβλητών που υπεισέρχονταν στο µοντέλο, ώστε να εξασφαλιστεί για κάθε µοντέλο η εισαγωγή στην εξίσωση (6) των στατιστικά σηµαντικών µεταβλητών. Ως επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας ορίστηκε το 5% (p<0,05) Αξιολόγηση του µοντέλου Η αξιολόγηση των µοντέλων που δηµιουργήθηκαν και η επιλογή των τελικών εξισώσεων για την περιγραφή των σχέσεων της συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου, της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας µε τις µεταβλητές X 1 και X 2 έγινε µε βάση τα κριτήρια που αναφέρονται στην παράγραφο Μετά την επιλογή των καλύτερων µοντέλων έγινε πρόβλεψη των συνδυασµών των άριστων τιµών των X 1 και X 2 εντός του 94

131 εύρους του διαστήµατος των µεταβλητών, οι οποίοι επιτυγχάνουν τη µέγιστη τιµή κάθε µίας απόκρισης, µε τη χρήση ειδικού συστήµατος µακροεντολών (Response Optimizer) του στατιστικού λογισµικού Minitab Statistical Software, version 13.1 (Minitab Inc. 2000). Στη συνέχεια τα µοντέλα αξιολογήθηκαν κάτω από πραγµατκές συνθήκες. Τα πειράµατα αξιολόγησης των µοντέλων έγιναν στον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό τιµών των παραγόντων Χ 1 και Χ 2 που δίνουν τη µέγιστη τιµή της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (Χ 1 =150 rpm, X 2 =1,50 vvm), της παραγωγικότητας του βκαροτένιου (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,29 vvm), της συγκέντρωσης της βιοµάζας (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,43 vvm), ή του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,47 vvm) και οι παρατηρούµενες τιµές συγκρίθηκαν µε τις προβλεπόµενες µέγιστες τιµές των παραπάνω αποκρίσεων. Στα πειράµατα αξιολόγησης των µοντέλων η καλλιέργεια εµβολιασµού, η σύσταση του υποστρώµατος παραγωγής και οι συνθήκες ζύµωσης ήταν όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου και της βιοµάζας του µικροοργανισµού γινόταν σε όλα τα πειράµατα όπως περιγράφεται στην παράγραφο 3.4.5, ενώ ο προσδιορισµός του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο

132 Πίνακας Επίπεδα τιµών των παραγόντων που χρησιµοποιήθηκαν στο πειραµατικό σχεδιασµό του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου, την παραγωγικότητα, τη βιοµάζα και τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας. Μεταβλητή Παράγοντας Κωδικοποιηµένη τιµή Πραγµατική τιµή X 1 Ταχύτητα ανάδευσης (rpm) X 2 Αερισµός (vvm) 0,5 1,0 1,5 96

133 Πίνακας Πειραµατικός σχεδιασµός και τιµές των µεταβλητών απόκρισης που µετρήθηκαν στις διαφορετικές δοκιµές του πειραµατικού σχεδιασµού. Ογκοµετρικός Ταχύτητα Βιοµάζα ξηρό συντελεστής οκιµή ανάδευσης Αερισµός βκαροτένιο Παραγωγικότητα βάρος µεταφοράς µάζας (rpm) (vvm) (mg/l) (mg/ld) (g/l) (s 1 ) ,5 13,0 2,17 7,65 0, ,5 363,0 57,95 22,70 0, ,5 1567,7 79,50 9,04 0, ,5 298,1 74,53 25,11 0, ,5 245,7 30,71 10,65 0, ,5 921,4 76,78 11,48 0, ,0 600,0 41,38 8,76 0, ,0 303,6 82,00 26,38 0, ,0 358,5 63,00 11,97 0, ,0 430,0 58,00 12,70 0, ,0 358,5 63,00 11,97 0, ,0 430,0 58,00 12,70 0,060 97

134 A C C L B Χρόνος Σχήµα Προσδιορισµός του K La µε τη δυναµική µέθοδο (Stanbury και Whitaker 1984) 98

135 Κλίση = 1/K La C L dc L + XQO 2 dt Σχήµα Προσδιορισµός του K La µε τη δυναµική µέθοδο. Η κλίση της ευθείας ισούται µε 1/K La (Stanbury και Whitaker 1984). 99

136 3.5 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠO ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΣΥΝΕΧΗ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ ΜΕ ΣΥΝΕΧΗ ΠΡΟΘΗΚΗ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΕ ΖΥΜΩΤΗΡΑ ΑΝΑ ΕΥΣΗΣ Περιγραφή της Συσκευής Στις πειραµατικές δοκιµές που πραγµατοποιήθηκαν για την παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος (Fedbatch cultute) χρησιµοποιήθηκε ο ζυµωτήρας ανάδευσης που περιγράφεται στην παράγραφο Επιπλέον, το σύστηµα της ασυνεχούς ζύµωσης µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος περιελάµβανε ένα δοχείο όγκου 5 λίτρων, το οποίο περιείχε 1 ή 2 λίτρα συνθετικού υποστρώµατος υπό συνεχή ανάδευση που προστίθονταν κατά τη διάρκεια της ζύµωσης στο δοχείο του ζυµωτήρα. Η προσθήκη του υποστρώµατος γινόταν συνεχώς ή σε τακτικά χρονικά διαστήµατα κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας µε τη χρήση περισταλτικής αντλίας (Watson Marlow, 101U), η οποία τροφοδοτούσε το ζυµωτήρα µε σταθερή ροή µέσω αποστειρωµένων σωλήνων σιλικόνης Συνθήκες Ανάπτυξης Μικροοργανισµού και Αρχή Λειτουργίας της Ασυνεχούς Ζύµωσης Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος Για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης στο δοχείο του ζυµωτήρα προστίθενταν κάθε φορά 2 ή 3 λίτρα συνθετικού υποστρώµατος (υπόστρωµα ανάπτυξης) και µετά την αποστείρωση του ζυµωτήρα µαζί µε το υπόστρωµα ακολουθούσε ο εµβολιασµός, ο οποίος γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μετά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε ασυνεχή ζύµωση σε συνθήκες όµοιες µε αυτές που περιγράφονται στην παράγραφο (µέχρις ότου παρατηρηθεί η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας) ή από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας ξεκινούσε η προσθήκη στο ζυµωτήρα νέου υποστρώµατος (υπόστρωµα τροφοδοσίας). Κατά τη διάρκεια της ζύµωσης µε τη µέθοδο αυτή ο όγκος του υποστρώµατος µέσα στο ζυµωτήρα συνεχώς αυξανόταν και η προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας συνεχιζόταν µέχρις ότου πληρωθεί ο ζυµωτήρας µε 4 λίτρα υποστρώµατος. Σε όλα τα πειράµατα που αφορούσαν στη µελέτη της παραγωγής βκαροτένιου µε την παραπάνω µέθοδο το αρχικό ph των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας ρυθµιζόταν στο 7,0 µε 20Ν ΝaΟΗ και οι 100

137 συνθήκες της ζυµωτικής διεργασίας ήταν: θερµοκρασία επώασης 26 0 C, ρυθµός παροχής αέρα 1,5 vvm και ταχύτητα ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης 150 rpm. Οι παράµετροι που µελετήθηκαν στην παραγωγή βκαροτένιου και στη βιοµάζα ήταν: α) η σύσταση των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας (τα διαφορετικά υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας που χρησιµοποιήθηκαν περιγράφονται στον Πίνακας 4.4.1), β) ο χρόνος έναρξης τροφοδοσίας του ζυµωτήρα (η τροφοδοσία ξεκινούσε µετά τη δεύτερη µέρα ζύµωσης ή από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας) και γ) ο ρυθµός τροφοδοσίας του υποστρώµατος (συνεχής προσθήκη του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα µε ρυθµό ροής F=3,5, 4,2 ή 8,4 ml/h ή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας στο ζυµωτήρα κατά παρτίδες όπου 667 ml του υποστρώµατος προστίθενταν τη 2 η, 8 η και 14 η ηµέρα της ζύµωσης). Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν δύο φορές και τα τελικά αποτελέσµατα είναι ο µέσος όρος των δύο επαναλήψεων Προσδιορισµός Συγκέντρωσης και Παραγωγικότητας βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, Η 2 Ο 2, ph, ιαλυτού Οξυγόνου και Κατανάλωσης Σακχάρων Η δειγµατοληψία γινόταν κατά τρόπο όµοιο µε αυτόν που περιγράφεται στην παράγραφο και στο δείγµα προσδιοριζόταν η συγκέντρωση και η παραγωγικότητα του βκαροτένιου, η βιοµάζα, τα σάκχαρα, το Η 2 Ο 2, το ph, το διαλυτό οξυγόνο και η κατανάλωση σακχάρων. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της βιοµάζας, των σακχάρων και του Η 2 Ο 2 γινόταν όπως περιγράφεται στις παραγράφους , , και αντίστοιχα, ενώ ο προσδιορισµός της παραγωγικότητας του βκαροτένιου, του ph, της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης και της κατανάλωσης σακχάρων γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora µε Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας Για τη µελέτη των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora, προκειµένου να εκτιµηθεί η επίδραση της σύστασης των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας, του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας και της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας στη µορφολογία του µικροοργανισµού, γινόταν παρατήρηση και ψηφιακή ανάλυση εικόνων του ζωντανού υλικού. Η προετοιµασία του παρασκευάσµατος γινόταν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Το σύστηµα 101

138 που χρησιµοποιούνταν για τη ψηφιακή απεικόνηση και επεξεργασία της εικόνας ήταν το ίδιο µε αυτό που περιγράφεται στην παράγραφο Επίδραση της σύστασης των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας, του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας και της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας στη µορφολογία του µικροοργανισµού Για τη µελέτη της επίδρασης των παραπάνω παραγόντων στη µορφολογία του µικροοργανισµού γινόταν µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού σε 10 δείγµατα στα οποία χρησιµοποιήθηκαν διαφορετικά υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας και διαφορετικοί χρόνοι έναρξης και ρυθµοί τροφοδοσίας του ζυµωτήρα (Πίνακας 4.4.2). Οι γεωµετρικές παράµετροι που υπολογίζονταν για τα παραπάνω αντικείµενα περιγράφονται στον Πίνακα (Paul και συν. 1992) και µετρούνταν µε τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Το σχήµα των ζυγοσπορίων θεωρούνταν σφαιρικό (κυκλικότητα < 1,3), ενώ των ζυγοφόρων και των µυκηλιακών υφών κυλινδρικό ή επιµήκη (1,3 κυκλικότητα < 2,0). Για κάθε περίπτωση γινόταν µορφοµετρικές αναλύσεις των αντικειµένων κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας σε ορισµένα χρονικά διαστήµατα (τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, στη µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου και την τελευταία ηµέρα της ζύµωσης) και κάθε φορά µελετούνταν 50 εικόνες που κατέγραφαν διαφορετικές περιοχές του µυκηλίου του υγρού της ζύµωσης. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι ο µέσος όρος όλων των επαναλήψεων. Στη συνέχεια, για κάθε δείγµα υπολογίζονταν ο συνολικός όγκος των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων και το ποσοστό επί τις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα), των ζυγοφόρων, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο ξηρό βάρος της βιοµάζας µε βάση τον τρόπο που περιγράφεται στην παράγραφο Τα αποτελέσµατα των µορφοµετρικών αναλύσεων των δειγµάτων περιγράφονται στον Πίνακα

139 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΤΟΥ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠΟ ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ B. TRISPORA Η εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα των µικροοργανισµών αποτελεί ένα πολύ σηµαντικό στάδιο των διεργασιών ανάκτησης της χρωστικής. Οι µέθοδοι που αναφέρονται στη βιβλιογραφία και χρησιµοποιούνται για την εκχύλιση του βκαροτένιου από κύτταρα µυκήτων, ζυµών, βακτηρίων και από φύκη διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους όσον αφορά το είδος και την ποσότητα του εκχυλιστικού µέσου, τις συνθήκες της εκχύλισης και την προκατεργασία της βιοµάζας του µικροοργανισµού (Peterson και συν. 1954, Anderson και συν. 1958, Ninet και συν. 1969, Ootaki και συν. 1973, Sandmann και συν. 1990, Yun και συν. 1990, Shlomai και συν. 1991, Girard και συν. 1994, Kalampoukas και Devrakos 1996, Kim και συν. 1996, Albrecht και συν. 1997, Wilson και συν. 1997, Leach και συν. 1998, Bhosale και Gadre 2001a). Όµως, κανένας από τους παραπάνω ερευνητές δεν εξέτασε λεπτοµερώς το φαινόµενο της εκχύλισης της χρωστικής από το µικροοργανισµό. Προκειµένου να βελτιστοποιηθεί η µέθοδος εκχύλισης του βκαροτένιου από τα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trispora µε σκοπό την πλήρη παραλαβή της χρωστικής σε µικρό χρόνο, πραγµατοποιήθηκε µια σειρά πειραµατικών δοκιµών στα πλαίσια των οποίων: α) µελετήθηκαν διάφοροι οργανικοί διαλύτες και συνδυασµοί αυτών ως προς την εκχυλιστική τους ικανότητα, β) διερευνήθηκαν οι βέλτιστες πειραµατικές συνθήκες κατά τη διεργασία της εκχύλισης, όπως ο χρόνος και η θερµοκρασία και γ) µελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών µεθόδων προκατεργασίας των κυττάρων του µικροοργανισµού στην απόδοση της εκχύλισης του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου Επίδραση του Χρόνου Η επίδραση του χρόνου της εκχυλιστικής διαδικασίας στην αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora χρησιµοποιώντας διαφορετικά 103

140 εκχυλιστικά µέσα δίνεται στο Σχήµα Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.1.1, η ποσότητα του βκαροτένιου που εκχυλίζονταν αυξανόταν µε την αύξηση του χρόνου εκχύλισης µέχρι 2 ώρες. Η θετική επίδραση της επιµήκυνσης του χρόνου εκχύλισης µέχρι 2 ώρες στην ποσοτική παραλαβή της χρωστικής από τα κύτταρα του µικροοργανισµού παρατηρήθηκε σε όλους τους οργανικούς διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν. Περαιτέρω συνέχιση της εκχύλισης δεν ευνοούσε την αποµάκρυνση µεγαλύτερης ποσότητας ενδοκυτταρικού βκαροτένιου, ανεξάρτητα από το διαλύτη εκχύλισης που χρησιµοποιούταν. Αυτό οφείλεται στη µείωση της εκχυλιστικής ικανότητας των διαλυτών εκχύλισης κατά τη διάρκεια της εκχύλισης λόγω µείωσης της καθαρότητας τους (ο αριθµός των µορίων του διαλύτη σε ορισµένο όγκο του διαλύµατος είναι µικρότερος από τον αριθµό των µορίων του διαλύτη σε ίσο όγκο καθαρού διαλύτη). Σε όλες τις περιπτώσεις, µετά το τέλος της διεργασίας εκχύλισης για δύο ώρες διαπιστώθηκε µη πλήρης αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού (το µυκήλιο δεν είχε τελείως αποχρωµατιστεί). Από το Σχήµα φαίνεται ότι η απόδοση της εκχύλισης εξαρτάται από τη φύση του εκχυλιστικού µέσου. Η µέγιστη ποσότητα του βκαροτένιου (57,94 mg/l) εκχυλίστηκε από τα κύτταρα του µικροοργανισµού στην περίπτωση που χρησιµοποιήθηκε ως εκχυλιστικό µέσο η αιθανόλη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η αιθανόλη διαπερνά εύκολα την κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού λόγω του µικρού µορίου της. Όταν η εκχύλιση έγινε µε ισοπροπυλική αλκοόλη, ακετόνη, οξικό αιθυλεστέρα, ισοµοριακό µίγµα µεθανόληςεξανίου, µεθανόλη, πετρελαϊκό αιθέρα, ή εξάνιο, παρατηρήθηκε µείωση του ποσοστού του εκχυλισµένου βκαροτένιου κατά 17,16, 45,20, 56,85, 65,70, 67,20, 70,30, και 71,90 %, αντίστοιχα. Στις περιπτώσεις αυτές το µεγαλύτερο ποσοστό του παραγόµενου βκαροτένιου παρέµενε διαλυµένο στα λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού λόγω της µικρής εκχυλιστικής ικανότητας των παραπάνω διαλυτών. Η αιθανόλη έχει χρησιµοποιηθεί για την εκχύλιση του β καροτένιου από ακινητοποιηµένα κύτταρα D. saline σε αλγινικό ασβέστιο (Leach και συν. 1998). Οι Kim και συν. (1996) παρέλαβαν 43,0 mg βκαροτένιου/l υποστρώµατος µετά από πλήρη αποχρωµατισµό των κυττάρων του B. trispora 14271, όταν χρησιµοποίησαν ως εκχυλιστικό µέσο µείγµα µεθανόληςεξανίου (1:1, v/v). Στην περίπτωση αυτή, η αυξηµένη απόδοση της εκχύλισης οφείλεται στο γεγονός ότι το βκαροτένιο εκχυλίζεται ευκολότερα από κύτταρα µησυζευγµένης καλλιέργειας του B. trispora, σε αντίθεση µε την εκχύλιση της χρωστικής από 104

141 κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του µικροοργανισµού, στα οποία το ενδοκυτταρικό βκαροτένιο είναι συσσωρευµένο στα σηµεία συγχώνευσης των γαµεταγγειακών κυττάρων από τα οποία προκύπτει ο ζυγωτής µε παχιά τοιχώµατα (Τζαβέλλα 1996, Deacon 1997). 105

142 60 50 âêáñïôýíéï (mg/l) ñüíïò (ëåð ôü) Σχήµα Επίδραση του χρόνου στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη : εξάνιο (1:1), ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C). 106

143 4.1.2 Επίδραση της Θερµοκρασίας Στο Σχήµα απεικονίζεται η επίδραση της θερµοκρασίας στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. Η αύξηση της θερµοκρασίας επηρεάζει θετικά ή αρνητικά και σε διαφορετικό βαθµό την απόδοση της εκχύλισης ανάλογα µε το είδος του εκχυλιστικού µέσου που χρησιµοποιείται. Από το Σχήµα φαίνεται ότι η εκχυλιστική ικανότητα της µεθανόλης αυξήθηκε σηµαντικά µε την αύξηση της θερµοκρασίας από 30 0 C έως 50 0 C (46,0 mg/l έναντι 18,98 mg/l). Αυτό οφείλεται στην καλύτερη διάχυση των µορίων της µεθανόλης στην κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού. Για την ίδια αύξηση της θερµοκρασίας, το ποσοστό του βκαροτένιου που εκχυλίστηκε µε αιθανόλη και ισοπροπυλική αλκοόλη µειώθηκε ελαφρώς κατά 7,84% και 5,56%, αντίστοιχα. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στη µείωση των δυνάµεων (ασθενείς δυνάµεις Van der Waals) που αναπτύσσονται µεταξύ του πολικού µορίου της αιθανόλης ή της ισοπροπυλικής αλκοόλης και του µη πολικού µορίου του βκαροτένιου, µε συνέπεια τη µείωση της διαλυτότητας της χρωστικής στους παραπάνω διαλύτες. Στις περιπτώσεις που η εκχύλιση έγινε µε ακετόνη (µε ή χωρίς τη διαδοχική µεταφορά του εκχυλισµένου βκαροτένιου στη φάση του πετρελαϊκού αιθέρα), η αύξηση της θερµοκρασίας έως 40 0 C ευνόησε την εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού, ενώ σε υψηλότερες θερµοκρασίες ( C) η ποσότητα του εκχυλισµένου βκαροτένιου παρέµεινε σταθερή. Στην εκχύλιση του βκαροτένιου µε εξάνιο ή µίγµα µεθανόληςεξανίου η επίδραση της θερµοκρασίας µεταξύ C δεν ήταν σηµαντική (µικρή αύξηση), ενώ περαιτέρω αύξηση της θερµοκρασίας µέχρι 50 0 C αύξησε την ποσότητα του βκαροτένιου που αποµακρύνθηκε από τα κύτταρα του B. trispora κατά 44,77% και 12,54%, αντίστοιχα. Παρ όλο που η αύξηση της θερµοκρασίας διευκόλυνε τη διάχυση των µορίων της ακετόνης, του εξανίου και του µίγµατος µεθανόληςεξανίου στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού και την εκχύλιση του βκαροτένιου, σε όλες τις περιπτώσεις το ποσό του βκαροτένιου που εκχυλίζονταν δεν ήταν µεγαλύτερο από το εκχυλισµένο βκαροτένιο στην περίπτωση που χρησιµοποιήθηκε ως διαλύτης εκχύλισης η αιθανόλη. Τέλος, η απόδοση της εκχύλισης του βκαροτένιου µε οξικό αιθυλεστέρα δεν επηρεάστηκε σηµαντικά (µικρή αύξηση) µε την αύξηση της θερµοκρασίας από 30 0 C έως 50 0 C. Σε όλες τις περιπτώσεις, όταν η εκχύλιση πραγµατοποιήθηκε σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες από 50 0 C, παρατηρήθηκε µη αποτελεσµατική αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα 107

144 κύτταρα του µικροοργανισµού. Οι Shlomai και συν. (1991) που µελέτησαν την παραγωγή βκαροτένιου από το µύκητα Phycomyces blakesleeanus, ανάκτησαν βκαροτένιο σε ποσότητα 10 mg/l από τα κύτταρα του µικροοργανισµού µετά από εκχύλιση µε µίγµα µεθανόληςεξανίου (1:1, v/v) στους 50 0 C για 2 ώρες. Οι Sandmann και συν. (1990) και Albrecht και συν. (1997) που µελέτησαν την παραγωγή καροτενοειδών από µεταλλαγµένα στελέχη E. coli χρησιµοποίησαν ως διαλύτες εκχύλισης µεθανόλη που περιείχε 6% KOH και ακετόνη, αντίστοιχα. Στην πρώτη περίπτωση η εκχύλιση γινόταν στους 65 0 C για 20 λεπτά, ενώ στη δεύτερη περίπτωση γινόταν στους 50 0 C για 20 λεπτά. Η ποσότητα του βκαροτένιου που εκχυλίζονταν και στις δύο περιπτώσεις ήταν πολύ µικρή (110,0120,0 µg/g ξηρού βάρους βιοµάζας). Οι παραπάνω διαφορές ως προς την ποσοτική παραλαβή του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora, του P. blakesleeanus και των µεταλλαγµένων στελεχών E. coli οφείλονται κυρίως στη διαφορετική ικανότητα παραγωγής βκαροτένιου από το κάθε ένα στέλεχος. Από τα παραπάνω αποτελέσµατα προκύπτει ότι η µεθανόλη είναι ένας εξίσου καλός διαλύτης µε την αιθανόλη για την εκχύλιση του βκαροτένιου όταν αυτή λαµβάνει χώρα στους 50 0 C για δύο ώρες. Ωστόσο, η εκχύλιση της χρωστικής µε αιθανόλη στους 30 0 C για 2 ώρες είναι η πλέον αποδοτική. Επίσης, η χαµηλή θερµοκρασία (30 0 C) κατά την εκχυλιστική διαδικασία µε αιθανόλη εξασφαλίζει τη σταθερότητα του µορίου του βκαροτένιου και µειώνει το κόστος της διεργασίας. 108

145 60 50 âêáñïôýíéï (m g/l) È åñìïêñáóßá ( 0 C) Σχήµα Επίδραση της θερµοκρασίας στην εκχύλιση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη:εξάνιο (1:1) ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες). 109

146 4.1.3 Επίδραση της Συγκέντρωσης της Αιθανόλης και της Αναλογίας Όγκου Αιθανόλης/Ξηρού Βάρους Βιοµάζας Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η αιθανόλη αποτελεί το καλύτερο εκχυλιστικό µέσο για την παραλαβή του βκαροτένιου. ύο σηµαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν σε µεγάλο βαθµό την απόδοση της εκχύλισης είναι η συγκέντρωση της αιθανόλης και η αναλογία όγκου αιθανόλης/ξηρού βάρους βιοµάζας του µικροοργανισµού. Στην παρούσα εργασία συγκρίθηκε η εκχυλιστική ικανότητα των υδατικών διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης 20%, 40%, 60%, 80% και της απόλυτης αιθανόλης (95% αλκοόλη) και µελετήθηκε η επίδραση της αναλογίας ml αιθανόλης/g ξηρού βάρους βιοµάζας (20:1, 40:1, 60:1, 80:1 και 100:1) στην απόδοση της εκχύλισης. Σε όλες τις περιπτώσεις, η εκχύλιση γινόταν στους 30 0 C για 2 ώρες. Η καµπύλη που φαίνεται στο Σχήµα απεικονίζει το εκχυλισµένο βκαροτένιο (mg/l υποστρώµατος) σε σχέση µε τη συγκέντρωση της αιθανόλης και στο Σχήµα φαίνεται η ποσότητα της χρωστικής που εκχυλίστηκε σε σχέση µε την αναλογία του όγκου της αιθανόλης προς το ξηρό βάρος της βιοµάζας. Από τα Σχήµατα φαίνεται ότι η µέγιστη ποσότητα του βκαροτένιου εκχυλίζονταν στην περίπτωση που χρησιµοποιούταν ως εκχυλιστικό µέσο απόλυτη αιθυλική αλκοόλη σε αναλογία 100 ml διαλύτη ανά g ξηρού βάρους βιοµάζας. Η µείωση της ποσότητας του εκχυλισµένου βκαροτένιου που παρατηρήθηκε µε τη µείωση της περιεκτικότητας του διαλύτη εκχύλισης σε αιθυλική αλκοόλη οφείλεται στην αύξηση της πολικότητας του διαλύτη εκχύλισης, η οποία επιφέρει µείωση της διαλυτότητας του µη πολικού µορίου του βκαροτένιου σε αυτόν. Αντίθετα, η αύξηση του ποσοστού εκχύλισης του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου µε την αύξηση του όγκου της αιθανόλης µέχρι 100 ml ανά g ξηρού βάρους βιοµάζας οφείλεται στην αύξηση των ορίων κορεσµού του διαλύτη εκχύλισης σε βκαροτένιο. Η χρησιµοποίηση µεγαλύτερης ποσότητας αιθανόλης δεν ευνόησε την παραλαβή µεγαλύτερης ποσότητας ενδοκυτταρικού βκαροτένιου. 110

147 60 40 âêáñïôýíéï (m g/l) Áéèáíüëç (%,v/v) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της αιθανόλης στην εκχύλιση του β καροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C, αριθµός διαδοχικών εκχυλίσεων 3, 100 ml διαλύτη/g ξηρού βάρους βιοµάζας). 111

148 60 40 âêáñïôýíéï (m g/l) m láéèáíüëçò /g âéïìüæáò îçñü âüñïò Σχήµα Επίδραση της αναλογίας του όγκου της αιθανόλης προς το ξηρό βάρος της βιοµάζας του B. trispora στην εκχύλιση του βκαροτένιου (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης 30 0 C, αριθµός διαδοχικών εκχυλίσεων 3). 112

149 4.1.4 Επίδραση των ιαδοχικών Εκχυλίσεων Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, µετά το τέλος της εκχυλιστικής διεργασίας (διάρκειας 2 ωρών) τα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας του µικροοργανισµού δεν είχαν αποχρωµατιστεί τελείως, ανεξάρτητα από το είδος του εκχυλιστικού µέσου και τη θερµοκρασία εκχύλισης. Αυτό οφείλεται στη µη πλήρη αποµάκρυνση του παραγόµενου βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Προκειµένου να εκχυλιστεί όλη η ποσότητα του βκαροτένιου δοκιµάστηκαν περισσότερες από µία διαδοχικές εκχυλίσεις της χρωστικής επαναλαµβάνοντας κάθε φορά τη διαδικασία εκχύλισης µε καθαρές ποσότητες οργανικών διαλυτών. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.1.5, η µέγιστη αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού επιτεύχθηκε µε αιθανόλη µετά από τρεις διαδοχικές εκχυλίσεις. Μετά το τέλος και της τρίτης εκχύλισης η συνολική ποσότητα της χρωστικής που παραλήφθηκε ήταν 76,3 mg/l. Το µεγαλύτερο ποσοστό του εκχυλισµένου βκαροτένιου παραλήφθηκε µετά το τέλος της πρώτης εκχύλισης (75,94 %). Η απόδοση της δεύτερης και τρίτης εκχύλισης ήταν σηµαντικά µικρότερες (16,62 % και 7,44 %, αντίστοιχα), ενώ η ποσότητα του βκαροτένιου που παραλήφθηκε από την τέταρτη εκχύλιση ήταν αµελητέα (0,35%). Στις περιπτώσεις που οι διαδοχικές εκχυλίσεις έγιναν µε ισοπροπυλική αλκοόλη, ακετόνη, οξικό αιθυλεστέρα, ισοµοριακό µίγµα µεθανόληςεξανίου, µεθανόλη, πετρελαϊκό αιθέρα, ή εξάνιο, παρατηρήθηκε αύξηση του συνολικού βκαροτένιου που εκχυλίστηκε, σε σχέση µε την ποσότητα της χρωστικής που παραλήφθηκε από την πρώτη εκχύλιση. Ωστόσο, σε όλες τις περιπτώσεις, η συνολική ποσότητα του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου που εκχυλίστηκε ήταν µικρότερη από την αντίστοιχη µε αιθανόλη. Γενικά, για όλα τα εκχυλιστικά µέσα που χρησιµοποιήθηκαν, ο ρυθµός παραλαβής της χρωστικής από τα κύτταρα του µικροοργανισµού ήταν µεγαλύτερος στο πρώτο στάδιο της εκχυλιστικής διαδικασίας, έναντι των άλλων σταδίων (δεύτερη, τρίτη και τέταρτη εκχύλιση). 113

150 80 60 âêáñïôýíéï (m g/l) Åê õëßóåéò Σχήµα Επίδραση των διαδοχικών εκχυλίσεων στην αποµάκρυνση του β καροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora µε διαφορετικούς διαλύτες εκχύλισης. αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, µεθανόλη:εξάνιο (1:1), ισοπροπυλική αλκοόλη, οξικός αιθυλεστέρας (Χρόνος εκχύλισης 2 ώρες, θερµοκρασία εκχύλισης η άριστη για κάθε εκχυλιστικό µέσο όπως φαίνεται στο σχήµα 4.1.2). 114

151 4.1.5 Επίδραση της Κατεργασίας του Υγρού της Ζύµωσης Με σκοπό να αποµακρύνουµε περισσότερη ποσότητα χρωστικής από τα κύτταρα του µικροοργανισµού µελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών µεθόδων προκατεργασίας του υγρού της ζύµωσης (µυκήλιο και υπόστρωµα) στην απόδοση της εκχύλισης. Τα αποτελέσµατα φαίνονται στον Πίνακα και δείχνουν ότι η κατεργασία του υγρού της ζύµωσης ευνοεί την απόδοση της εκχύλισης. Η ποσότητα του βκαροτένιου που εκχυλίζονταν από το αποξηραµένο µυκήλιο χωρίς προηγούµενη κατεργασία του υγρού της ζύµωσης ήταν χαµηλή, σε σύγκριση µε την απόδοση της εκχύλισης της χρωστικής µετά από προκατεργασία του υγρού της ζύµωσης µε θέρµανση (εκτός από την περίπτωση που το υγρό της ζύµωσης είχε θερµανθεί στους C για 60 λεπτά). Η ποσοτική παραλαβή του βκαροτένιου αυξάνονταν µε την αύξηση του χρόνου θέρµανσης του υγρού της ζύµωσης από 15 σε 30 λεπτά, ενώ περαιτέρω αύξηση του χρόνου θέρµανσης µέχρι 60 λεπτά προκαλούσε µείωση της ποσότητας του βκαροτένιου που εκχυλίζονταν από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην οξείδωση της χρωστικής µετά από παρατεταµένη θέρµανση του υγρού της ζύµωσης. Η αύξηση της θερµοκρασίας της θερµικής κατεργασίας από 100 σε C ευνόησε την εκχύλιση του βκαροτένιου. Η µέγιστη ποσότητα του βκαροτένιου (225,2 mg/l) παραλήφθηκε µετά από κατεργασία του υγρού της ζύµωσης στους C για 15 λεπτά και εκχύλιση της χρωστικής από τα κύτταρα του µικροοργανισµού που δεν είχαν προξηρανθεί, µε αιθανόλη στους 30 0 C για 2 ώρες. Μετά το τέλος της εκχυλιστικής διαδικασίας, τα κύτταρα του µικροοργανισµού είχαν πλήρως αποχρωµατιστεί. Η µέθοδος αυτή αυξάνει την ποσότητα του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου που λαµβάνεται µε τη διεργασία της εκχύλισης, έναντι των άλλων µεθόδων κατεργασίας του υγρού της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στους παρακάτω λόγους: α) αποφεύγεται η οξείδωση της χρωστικής κατά τη διαδικασία της ξήρανσης της βιοµάζας πριν την εκχύλιση, β) αδρανοποιούνται τα ένζυµα που είναι υπεύθυνα για την οξείδωση του βκαροτένιου και γ) αυξάνεται η διαπερατότητα της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού µε αποτέλεσµα την καλύτερη διείσδυση του εκχυλιστικού µέσου στο εσωτερικό των κυττάρων και την πλήρη εκχύλιση του βκαροτένιου. Στις περισσότερες µεθόδους που αναφέρονται στη βιβλιογραφία η βιοµάζα των µικροοργανισµών πριν τη διαδικασία της εκχύλισης αφυδατώνεται µε λυοφιλίωση ή ξήρανση υπό κενό στους C, ώστε να αποφευχθεί η παρεµπόδιση της πλήρους επαφής του οργανικού διαλύτη µε τα κύτταρα από την ύπαρξη υγρασίας (Anderson 115

152 και συν. 1958, Sandmann και συν. 1990, Girard και συν. 1994, Kim και συν. 1996, Albrecht και συν. 1997). Η διαδικασία αφυδάτωσης των κυττάρων των µικροοργανισµών τόσο µε τη µέθοδο της λυοφιλίωσης όσο και µε τη µέθοδο της ξήρανσης υπό κενό είναι χρονοβόρα (1848 ώρες). Επιπλέον, από τα αποτελέσµατα του Πίνακα φαίνεται ότι τα ίχνη υγρασίας που παραµένουν στα κύτταρα του µικροοργανισµού µετά τη διήθηση του υγρού της ζύµωσης υπό κενό δεν µειώνουν την εκχυλιστική δράση της αιθανόλης. Οι Leach και συν. (1998) αναφέρουν ότι η αφυδάτωση των κόκκων πηκτής αλγινικού ασβεστίου που περιείχαν κύτταρα του D. salinα µε ακετόνη, πριν την εκχύλιση του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου µε αιθανόλη, µειώνει την απόδοση της εκχύλισης. Γενικά, τα αποτελέσµατα της µελέτης αυτής δείχνουν ότι η αύξηση της απόδοσης της εκχύλισης του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora συνδέεται µε την κατεργασία του υγρού της ζύµωσης πριν την εκχύλιση της χρωστικής. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται διάφορες µέθοδοι κατεργασίας κυττάρων µικροοργανισµών και ιστοκαλλιεργειών πριν την εκχύλιση καροτενοειδών από αυτά. Οι Peterson και συν. (1954) κατεργάστηκαν τα κύτταρα ζυµών µε διάλυµα HCL 6N και θέρµανση µέχρι βρασµού, οι Yun και συν. (1990) κατεργάστηκαν τους ιστούς των κυττάρων D. carota µε υπερήχους και οι Gigard και συν. (1994) κατεργάστηκαν τα κύτταρα της ζύµης P. rhodozyma µε διµεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις η ποσοτική παραλαβή του βκαροτένιου ήταν πολύ µικρή (42,89532,0 µg/g ξηρού βάρους βιοµάζας). Αυτό οφείλεται κυρίως στη µειωµένη ικανότητα παραγωγής βκαροτένιου από τα στελέχη αυτά. 116

153 Πίνακας Επίδραση της κατεργασίας του υγρού της ζύµωσης στην αποµάκρυνση του βκαροτένιου από τα κύτταρα του B. trisporα (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Κατεργασία βκαροτένιο (mg/l) 1. Φυγοκέντρηση του υγρού της ζύµωσης σε 5000 g για 20 λεπτά, ξέπλυµα της βιοµάζας µε απoσταγµένο νερό, ξήρανση υπό κενό στους C και εκχύλιση του βκαροτένιου µε αιθανόλη 76,3 ± 2,90 2. Θέρµανση του υγρού της ζύµωσης στους C για 15 λεπτά και στη συνέχεια κατεργασία όπως στην περίπτωση 1 82,5 ± 3,30 3. Θέρµανση του υγρού της ζύµωσης στους C για 30 λεπτά και στη συνέχεια κατεργασία όπως στην περίπτωση 1 109,0 ± 4,36 4. Θέρµανση του υγρού της ζύµωσης στους C για 60 λεπτά και στη συνέχεια κατεργασία όπως στην περίπτωση 1 62,5 ± 2,50 5. Θέρµανση του υγρού της ζύµωσης στους C για 15 λεπτά και στη συνέχεια κατεργασία όπως στην περίπτωση 1 6. Θέρµανση του υγρού της ζύµωσης στους C για 15 λεπτά, φυγοκέντρηση του υγρού της ζύµωσης σε 5000 g για 20 λεπτά, ξέπλυµα της βιοµάζας µε απoσταγµένο νερό και εκχύλιση της χρωστικής µε αιθανόλη 152,0 ± 6,08 225,2 ± 9,01 117

154 4.2 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠO ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΝΑΚΙΝΟΥΜΕΝΕΣ ΚΩΝΙΚΕΣ ΦΙΑΛΕΣ Επίδραση του Εµβολίου στην Παραγωγή του βκαροτένιου και στη Μορφολογία του B. trisporα Η επίδραση του τύπου του εµβολίου στην παραγωγή βκαροτένιου από το µικροοργανισµό δίνεται στο Σχήµα Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.2.1, η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης στο βασικό υπόστρωµα παραγωγής (παράγραφος 3.2.2) που είχε εµβολιαστεί µε ένα κοµµάτι άγαρ 1 cm 2 από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των και Ακόµα, φαίνεται ότι όταν το βασικό υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 1,0%, 2,5% και 5,0% (v/v) από κάθε µία υγρή καλλιέργεια των και που είχαν αναπτυχθεί χωριστά σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώθηκε σε 90,0, 104,3, και 95,0 mg/l, αντίστοιχα. Η µείωση της παραγωγής βκαροτένιου που παρατηρήθηκε στις παραπάνω περιπτώσεις πιθανόν να οφείλεται στη µείωση της ικανότητας των δύο στελεχών να αναπαράγονται εγγενώς, λόγω της µειωµένης ικανότητας τους να σχηµατίζουν λειτουργικά αναπαραγωγικά όργανα στους θαλλούς τους (µείωση της σεξουαλικής λειτουργίας και γονιµότητας των στελεχών), όταν ανακαλλιεργούνται χωριστά σε υγρό υπόστρωµα πριν τη σύζευξη τους στο υπόστρωµα παραγωγής της χρωστικής. Η παραπάνω υπόθεση υποστηρίζεται από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης των κυττάρων της συζευγµένης καλλιέργειας του µικροοργανισµού στο υπόστρωµα παραγωγής, που φαίνονται στον Πίνακα Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.2.1, στο υπόστρωµα που είχε εµβολιαστεί µε 2,5% (v/v) από κάθε µία υγρή καλλιέργεια των και που είχαν αναπτυχθεί χωριστά σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, ο µικροοργανισµός τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου (0,53% ξηρού βάρους βιοµάζας) βρισκόταν κυρίως µε τη µορφή άθικτων µυκηλιακών υφών (65,56% ξηρού βάρους βιοµάζας), ενώ µόνο το 11,25% του ξηρού βάρους της βιοµάζας του µικροοργανισµού αντιστοιχούσε σε ζυγοσπόρια (Εικόνα 4.2.1d). Όταν το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε ένα κοµµάτι άγαρ από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των και η συγκέντρωση των ζυγοσπορίων και του παραγόµενου ενδοκυτταρικού βκαροτένιου αυξήθηκε σηµαντικά (22,17% και 0,81 % ξηρού βάρους βιοµάζας, αντίστοιχα), ενώ το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών έµεινε σχεδόν αµετάβλητο (69,30% ξηρού βάρους βιοµάζας) (Εικόνα 4.2.1c). Επίσης, από τον Πίνακα φαίνεται ότι το ποσοστό των 118

155 µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων στην περίπτωση αυτή παρουσίασε σηµαντική µείωση κατά 59,04%, 72,57% και 88,81%, αντίστοιχα, έναντι του ποσοστού των αντίστοιχων µορφών των µυκηλιακών υφών του µικροοργανισµού στην περίπτωση της ανάπτυξης των δύο στελεχών χωριστά σε υγρό υπόστρωµα πριν τη σύζευξη τους στο υπόστρωµα παραγωγής. Η µειωµένη εµφάνιση κυττάρων µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων στην πρώτη περίπτωση αποδίδεται στην ικανότητα του µικροοργανισµού να συνεχίσει τη µεταβολική του δραστηριότητα µέσω της εγγενούς αναπαραγωγής όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης στο υπόστρωµα είναι περιορισµένη (6,1 g/l µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης) (Σχήµα 4.2.2). Αντίθετα, στη δεύτερη περίπτωση, ο µικροοργανισµός παρουσιάζει µειωµένη ικανότητα εγγενούς αναπαραγωγής και σε συνθήκες περιορισµένης συγκέντρωσης γλυκόζης (µετά τη 2 η ηµέρα ζύµωσης) εµφανίζει προοδευτική µείωση της µεταβολικής του δραστηριότητας, δυσλειτουργία των βιολογικών µεµβρανών των κυττάρων, απουσία της διαµερισµατοποίησης στο εσωτερικό τους και δηµιουργία υποκυτταρικών θέσεων µε κενοτόπια, µε αποτέλεσµα τη σταδιακή εκφύλιση και καταστροφή των κυττάρων. Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώθηκε ακόµα περισσότερο (10,0 mg/l έναντι 225,2 mg/l) όταν χρησιµοποιήθηκε ως εµβόλιο 5,0% (v/v) υγρή καλλιέργεια µίγµατος κυττάρων του και που είχαν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες (premating). Σε αυτή την περίπτωση, τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας του µικροοργανισµού ήταν 52,45% (Πίνακας 4.2.1). Επίσης, η συγκέντρωση των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου που µετρήθηκε ήταν πολύ χαµηλό (0,32% και 0,21% ξηρού βάρους βιοµάζας, αντίστοιχα), ενώ παρατηρήθηκε υψηλό ποσοστό κυττάρων µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων (25,44%, 7,85% και 13,73% ξηρού βάρους βιοµάζας, αντίστοιχα) (Πίνακας 4.2.1, Εικόνα 4.2.1e). Τα παραπάνω αποτελέσµατα µπορούν να αποδοθούν στην αλλαγή της φυσιολογίας του µικροοργανισµού όσον αφορά την εγγενή αναπαραγωγή λόγω της χρονικής επιµήκυνσης της φάσης της πλασµογαµίας των (+) και () γαµετών κατά την συνύπαρξη των δύο στελεχών σε περιβάλλον µε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης αρχικά στο υπόστρωµα ανάπτυξης και µετά στο υπόστρωµα παραγωγής. H αλλαγή της φυσιολογίας του µικροοργανισµού πιθανόν να οφείλεται σε µεταλλαγή της γενετικής ουσίας των πυρήνων κυττάρων που παίζουν το ρόλο 119

156 γαµετών µε µεταφορά πυρήνων διαφορετικής γενετικής σύστασης µεταξύ των κυττάρων των µυκηλιακών υφών και µιτωτική αναπαραγωγή των µεταλλαγµένων πυρήνων. Η µείωση της παραγωγής βκαροτένιου µε τη χρησιµοποίηση ως εµβολίου µίγµα κυττάρων της συζευγµένης καλλιέργειας του B. trispora έχει αναφερθεί στο παρελθόν από τους Ciegler και συν. (1963). Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.2.1, στις περιπτώσεις που το βασικό υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε ένα κοµµάτι άγαρ από το τρυβλίο καλλιέργειας των ή η συγκέντρωση του βκαροτένιου ήταν χαµηλή (26,7 και 30,0 mg/l, αντίστοιχα). Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε τα αποτελέσµατα άλλων ερευνητών που αναφέρουν ότι κατά τη σύζευξη στελεχών αντίθετου φίλου του B. trispora η παραγωγή του βκαροτένιου αυξάνεται σηµαντικά (Thomas και συν. 1967, Sutter και Rafelson 1968, van den Ende 1968, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977, Govind και Modi 1981, Govind και συν. 1981, Feofilova και συν. 1994, Deacon 1997, Baets και συν. 2000). Αυτό οφείλεται στη σύνθεση του τρισπορικού οξέος κατά τη σύζευξη πυρήνων κυττάρων των (+) και () στελεχών του µικροοργανισµού, το οποίο επάγει την εκ νέου (de novo) σύνθεση ενός ή περισσότερων από τα ένζυµα που υπεισέρχονται στη µετατροπή του 5 φωσφοµεβαλονικού οξέος σε πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο για το σχηµατισµό ισοπρενοειδούς οµάδας, η οποία αποτελεί τη δοµική µονάδα του µορίου του βκαροτένιου (Feofilova και συν. 1976, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977). Όπως ήταν αναµενόµενο, στις περιπτώσεις που το υπόστρωµα παραγωγής εµβολιάστηκε µε ένα κοµµάτι άγαρ από το τρυβλίο καλλιέργειας των ή δεν σχηµατίστηκαν ζυγοσπόρια (Εικόνα 4.2.1a,b). Επίσης, η συγκέντρωση των άθικτων µυκηλιακών υφών, κυττάρων µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων τη χρονική στιγµή της µέγιστης συγκέντρωσης βκαροτέτιου στην πρώτη περίπτωση ήταν 42,62%, 28,50%, 8,21% και 20,55% του ξηρού βάρους της βιοµάζας, αντίστοιχα, ενώ στη δεύτερη περίπτωση ήταν 54,39%, 20,20%, 6,84% και 18,42% του ξηρού βάρους της βιοµάζας του µικροοργανισµού, αντίστοιχα (Πίνακας 4.2.1). Η συνολική συγκέντρωση των κυττάρων µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων και στις δύο περιπτώσεις ήταν υψηλή (περίπου το 50% του ξηρού βάρους της βιοµάζας) λόγω της αναστολής της µεταβολικής δραστηριότητας του µικροοργανισµού από την περιορισµένη συγκέντρωση γλυκόζης στο υπόστρωµα µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (Σχήµα 4.2.2), µε συνέπεια την προοδευτική καταστροφή των κυττάρων του µικροοργανισµού. 120

157 H µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας του B. trispora παρατηρήθηκε όταν χρησιµοποιήθηκε ως εµβόλιο ένα κοµµάτι άγαρ από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των και (27,84 g/l) (Σχήµα 4.2.1). Στις περιπτώσεις που το βασικό υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 1,0%, 2,5% και 5,0% (v/v) από κάθε µία υγρή καλλιέργεια των και που είχαν αναπτυχθεί χωριστά σε συνθετικό υπόστρωµα ή µε 5,0% (v/v) υγρής καλλιέργειας µίγµατος κυττάρων του και που είχαν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα, παρατηρήθηκε µείωση της βιοµάζας κατά 64,03, 35,25, 37,41, και 74,82%, αντίστοιχα, λόγω της µειωµένης δραστικότητας των κυττάρων του µικροοργανισµού. Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι η συγκέντρωση της βιοµάζας που σχηµατίστηκε όταν κάθε ένα στέλεχος καλλιεργούνταν χωριστά στο υπόστρωµα παραγωγής ήταν µικρότερη (21,3 g/l για τον και 20,0 g/l για τον 14272) από τη βιοµάζα της συζευγµένης καλλιέργειας των δύο στελεχών (27,84 g/l). 121

158 250 a âêáñïôýíéï (mg/l) b 24 ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) ñüíïò (þ ñåò) Σχήµα Ανάπτυξη του B. trispora και παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,, : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε κύτταρα του στελέχους 14271, 14272, και µίγµα των παραπάνω στελεχών, αντίστοιχα.,, : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 1,0 %, 2,5 %, και 5,0 % (v/v) από το κάθε ένα στέλεχος που αναπτύχθηκαν χωριστά σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, αντίστοιχα. : το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 5,0 % (v/v) µίγµα των και που έχουν αναπτυχθεί µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες. (Υπόστρωµα παραγωγής, g/l: γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm). 122

159 Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της Το υπόστρωµα παραγωγής a εµβολιάστηκε : βκαροτένιο Άθικτες µυκηλιακές υφές Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια Κενά κύτταρα Εκφυλισµένα κύτταρα Ζυγοσπόρια B. trispora ,12 42,62 28,50 8,21 20,55 B. trispora ,15 54,39 20,20 6,84 18,42 B. trispora ,81 69,30 5,87 1,55 0,30 22,17 2,5 % (v/v) από κάθε ένα στέλεχος που αναπτύχθηκαν χωριστά σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες 0,53 65,56 14,33 5,65 2,68 11,25 5 % (v/v) µίγµα των δύο στελεχών που αναπτύχθηκαν µαζί σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες 0,21 52,45 25,44 7,85 13,73 0,32 βιοµάζας). a Υπόστρωµα παραγωγής και συνθήκες ζύµωσης όπως στο σχήµα

160 a b c d e Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες (µονάδα µήκους 50 µm). a, b, c: το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε κύτταρα του στελέχους 14271, και µίγµα των παραπάνω στελεχών, αντίστοιχα. d, e: το υπόστρωµα εµβολιάστηκε µε 2,5% (v/v) από το κάθε ένα στέλεχος που αναπτύχθηκαν χωριστά σε υγρό υπόστρωµα για 2 ηµέρες και 5% (v/v) µίγµα των και που αναπτύχθηκαν µαζί σε συνθετικό υπόστρωµα για 2 ηµέρες, αντίστοιχα. 124

161 4.2.2 Μεταβολή των Κινητικών Παραµέτρων της Ζύµωσης µε το Χρόνο Για τη µελέτη της ανάπτυξης του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου σε σχέση µε το χρόνο ζύµωσης το βασικό υπόστρωµα (παράγραφος 3.2.2) εµβολιάστηκε µε ένα κοµµάτι άγαρ από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των στελεχών και Τα αποτελέσµατα δίνονται στο Σχήµα Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.2.2, η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού αυξανόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης, ενώ στη συνέχεια διατηρούνταν σταθερή µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας ήταν 27,84 g/l. Η παραγωγή βκαροτένιου άρχιζε µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, όταν η βιοµάζα του µικροοργανισµού παρέµενε σταθερή και η συγκέντρωση της γλυκόζης στο υπόστρωµα µειωνόταν σηµαντικά (Σχήµα 4.2.2). Σε συνθήκες περιορισµένης συγκέντρωσης γλυκόζης ο µικροοργανισµός διανύει το εγγενές στάδιο του βιολογικού του κύκλου, µέσω του οποίου επάγεται η παραγωγή βκαροτένιου (Deacon 1997). Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης. Στη συνέχεια, το βκαροτένιο µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Η απώλεια σε βκαροτένιο που παρατηρήθηκε µετά την 8 η ηµέρα της ζύµωσης οφείλεται στην οξείδωση της χρωστικής από το µικροοργανισµό (Ciegler και συν. 1961). Σε προηγούµενες µελέτες για την παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora σε ανακινούµενες κωνικές φιάλες, ο χρόνος της ζύµωσης κυµαίνονταν µεταξύ 38 ηµερών ανάλογα µε το στέλεχος του µικροοργανισµού που χρησιµοποιόταν και τη σύσταση του υποστρώµατος (Ciegler και συν. 1959a,b, 1962, Kim και συν. 1996, 1997a, Jeong και συν. 1999). Όπως ήταν αναµενόµενο, η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν κατά τη διάρκεια της ζύµωσης λόγω της παραγωγής της βιοµάζας και του βκαροτένιου. Τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης τα σάκχαρα του υποστρώµατος µειωνόταν σηµαντικά (από 50,0 g/l σε 6,1 g/l), ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων επιβραδύνονταν µέχρι την 8 η ηµέρα της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στη µεγάλη ανάπτυξη της βιοµάζας κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Μετά την 8 η ηµέρα της ζύµωσης, η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων στο υπόστρωµα σταθεροποιούνταν µέχρι τη 10 η ηµέρα. Στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης κατανάλωση των αρχικών σακχάρων του υποστρώµατος από το µικροοργανισµό (93,6%) (Σχήµα 4.2.2). 125

162 Το ph του υποστρώµατος µειωνόταν κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζύµωσης από 7,0 σε 6,3, λόγω της παραγωγής οργανικών οξέων από το µεταβολισµό της γλυκόζης µέσω του κύκλου του Krebs στη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης. Στη συνέχεια παρατηρήθηκε αύξηση της τιµής του ph έως 7,5 στο τέλος της ζύµωσης (Σχήµα 4.2.2). Η αύξηση αυτή πιθανόν να οφείλεται στην απαµίνωση των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού από το µικροοργανισµό και την παραγωγή αµµωνίας. 126

163 âêáñïôýíéï (m g/l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò,õðïëåéììáôéêü óüê áñá (g/l) ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Μεταβολή των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα, ph. (Υπόστρωµα παραγωγής και συνθήκες της ζύµωσης όπως στο Σχήµα 4.2.1). 127

164 4.2.3 Επίδραση της Θερµοκρασίας στις Κινητικές Παραµέτρους της Ζύµωσης Η επίδραση της θερµοκρασίας στην παραγωγή του βκαροτένιου δίνεται στο Σχήµα Η υψηλότερη συγκέντρωση του βκαροτένιου παρατηρήθηκε µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης στη θερµοκρασία των 26 0 C, ενώ στην περίπτωση των ζυµώσεων στη θερµοκρασία των 24, 28 και 30 0 C η συγκέντρωση του βκαροτένιου εµφανίστηκε µικρότερη κατά 11,2, 45,12 και 61,99%, αντίστοιχα. Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε εκείνα των Ciegler και συν. (1963a) που µελέτησαν την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora NRRL 2456 και NRRL Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι σε θερµοκρασία µεγαλύτερη των 28 0 C παρατηρείται απότοµη µείωση της απόδοσης του βκαροτένιου. Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις περιπτώσεις η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού αυξανόταν µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, µετά την οποία διατηρούνταν σταθερή µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (27,9 g/l) παρατηρήθηκε σε θερµοκρασία 26 0 C, ενώ η συγκέντρωση της βιοµάζας που παρατηρήθηκε σε θερµοκρασία 24, 28 και 30 0 C ήταν 25,5, 18,5 και 15,6 g/l, αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια των ζυµώσεων στους 24, 26, 28 και 30 0 C η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν συνεχώς και όταν επιτεύχθηκε η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου το ποσοστό των σακχάρων που καταναλώθηκαν ήταν 91,6%, 93,6%, 87,4% και 84,8%, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.2.3, σε όλες τις περιπτώσεις το ph του υποστρώµατος µειωνόταν κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού και στη συνέχεια αυξανόταν ελαφρώς µέχρι τη 10 η ηµέρα της ζύµωσης. Από τα παραπάνω δεδοµένα φαίνεται ότι η άριστη θερµοκρασία παραγωγής βκαροτένιου είναι η θερµοκρασία των 26 0 C, όπου όλες οι παράµετροι της ζυµωτικής διεργασίας εµφανίζουν τη µέγιστη τιµή τους. Η αύξηση της θερµοκρασίας στους 28 και 30 0 C έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της µέγιστης συγκέντρωσης του βκαροτένιου. Το αποτέλεσµα αυτό ερµηνεύεται µε βάση το γεγονός ότι η αύξηση της θερµοκρασίας ευνοεί την παραγωγή στυλοσπορίων κατά τη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού και το σχηµατισµό ενεργών ειδών οξυγόνου σε αυτά, που δεσµεύονται µε ένζυµα της βιοσυνθετικής πορείας του βκαροτένιου και τα αδρανοποιούν. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα το µυκήλιο που αναπτύσσεται από την εκβλάστηση των στυλοσπορίων να παρουσιάζει µειωµένη παραγωγικότητα στη 128

165 χρωστική (Tereshina και συν. 1996). Η µείωση της θερµοκρασίας σε 24 0 C προκαλεί µικρή µείωση της µέγιστης συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της ανάπτυξης του µικροοργανισµού και της κατανάλωσης των σακχάρων. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στη µείωση του ρυθµού των βιοχηµικών αντιδράσεων στα κύτταρα του µικροοργανισµού µε τη µείωση της θερµοκρασίας. 129

166 âêáñïôýíéï (mg/l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) ph 250 a b c d ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της θερµοκρασίας στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες.,,, : 24, 26, 28 και 30 0 C, αντίστοιχα. (Υπόστρωµα παραγωγής όπως στο σχήµα Αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm). 130

167 4.2.4 Επίδραση του Αρχικού ph του Υποστρώµατος στις Κινητικές Παραµέτρους της Ζύµωσης Για τη µελέτη της επίδρασης του αρχικού ph στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora, πραγµατοποιήθηκαν ασυνεχείς ζυµώσεις σε κωνικές φιάλες που περιείχαν υπόστρωµα (παράγραφος 3.2.2) µε διαφορετικές τιµές ph (5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 και 11,0). Η µεταβολή της συγκέντρωσης του παραγόµενου β καροτένιου, της βιοµάζας του µικροοργανισµού, των σακχάρων και του ph του υποστρώµατος κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας παρουσιάζεται στο Σχήµα Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.2.4, η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης στο υπόστρωµα (παράγραφος 3.2.2) µε αρχικό ph 7,0. Η παραγωγή βκαροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά αυξηµένη µε την αύξηση του ph του υποστρώµατος από 5,0 σε 7,0, παρέµενε σε σταθερά επίπεδα σε τιµές ph µεταξύ 7,08,0, ενώ περαιτέρω αύξηση του ph επέφερε σηµαντική µείωση στη συγκέντρωση της παραγόµενης χρωστικής. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στην αύξηση της δραστικότητας ενός ή περισσοτέρων ενζύµων που είναι υπεύθυνα για τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου, στην περίπτωση που η ζύµωση γινόταν σε υπόστρωµα µε αρχικό ph 7,0. Επιπλέον, η βιοµάζα του µικροοργανισµού αυξανόταν σηµαντικά µε την αύξηση του αρχικού ph του υποστρώµατος από 5,0 σε 7,0 (27,84 g/l έναντι 19,01 g/l), ενώ παρέµενε σχεδόν σταθερή µε περαιτέρω αύξηση του ph σε 9,0. Όταν το ph του υποστρώµατος αυξανόταν σε 10,0 και 11,0, η βιοµάζα του µικροοργανισµού µειωνόταν κατά 28,16% και 46,12%, αντίστοιχα. Τα αποτελέµατα αυτά έρχονται σε αντίθεση µε τα αποτελέσµατα των Martelli και συν. (1992) και Kim και συν. (1996) που βρήκαν ως άριστη τιµή του αρχικού ph του υποστρώµατος για την παραγωγή βκαροτένιου από τα στελέχη Rhodotorula lactosa and B. trispora ATCC το 5,0 και 10,0, αντίστοιχα. Οι Kim και οι συν. (1997a) αναφέρουν ότι σε τιµές ph χαµηλότερες του 10 (ph 49) η συγκέντρωση της χρωστικής ήταν χαµηλή, ενώ σε ακραίες χαµηλές ή ψηλές τιµές ph (ph 2 ή 12) αναστέλλονταν η ανάπτυξη του µικροοργανισµού και η παραγωγή βκαροτένιου. Οι παραπάνω διαφορές µπορεί να οφείλονται σε διάφορους παράγοντες, όπως η διαφορετική σύσταση του υποστρώµατος, το διαφορετικό στέλεχος του µικροοργανισµού και άλλες φυσικοχηµικές παράµετροι που καθορίζουν τη διεργασία της ζύµωσης. 131

168 Η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν συνεχώς κατά τη διάρκεια της ζύµωσης. Στα υποστρώµατα µε ph 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 και 11,0 το ποσοστό των σακχάρων που καταναλώθηκαν ήταν 82,0%, 87,0%, 93,6%, 91,6%, 88,0%, 84,0% και 80,0%, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναµενόµενο, σε όλες τις περιπτώσεις το ph του υποστρώµατος µειωνόταν κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης. Στη συνέχεια το ph εµφάνιζε µικρή αύξηση µέχρι το τέλος της ζύµωσης. 132

169 250 a âêáñïôýíéï (mg/l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) b ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) ph 0 50 c d ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση του αρχικού ph του υποστρώµατος στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες.,,,,,, : αρχικό ph 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 και 11,0, αντίστοιχα. (Υπόστρωµα παραγωγής όπως στο σχήµα Θερµοκρασία 26 0 C, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm). 133

170 4.2.5 Επίδραση του Φυσικού Φωτός στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Για τη µελέτη της επίδρασης του φωτός στην ανάπτυξη του B. trispora και στην παραγωγή βκαροτένιου πραγµατοποιήθηκαν ασυνεχείς ζυµώσεις σε κωνικές φιάλες στις παρακάτω συνθήκες: α) παρουσία φυσικού φωτός, β) απουσία φυσικού φωτός, γ) τις 3 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης απουσία φυσικού φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες παρουσία φυσικού φωτός και δ) τις 3 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης παρουσία φυσικού φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες απουσία φυσικού φωτός. Η µεταβολή της συγκέντρωσης του παραγόµενου βκαροτένιου και της βιοµάζας του µικροοργανισµού κατά τη διάρκεια των ζυµωτικών διεργασιών παρουσιάζεται στο Σχήµα Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.2.5, η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε µετά απο 8 ηµέρες ζύµωσης στην περίπτωση που η παραγωγή βκαροτένιου γινόταν παρουσία φυσικού φωτός σε όλη τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Όταν τις πρώτες 3 ηµέρες η ζύµωση γινόταν παρουσία φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες η ζύµωση γινόταν στο σκοτάδι ή το αντίστροφο, η συγκέντρωση του βκαροτένιο µειωνόταν κατά 31,17% και 62,25%, αντίστοιχα. Επιπλέον, φαίνεται ότι η παραγωγή βκαροτένιου µειώθηκε σηµαντικά (55,6 mg/l έναντι 225,2 mg/l) όταν οι κωνικές φιάλες παρέµεναν στο σκοτάδι σε όλη τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Η επαγωγική δράση του φυσικού φωτός στην απόδοση του βκαροτένιου συνδέεται µε την αύξηση των επιπέδων της ενδοκυτταρικής συνθετάσης του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου, η οποία καταλύει ένα από τα πιο βασικά στάδια της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού: την προσβολή ενός µορίου πυροφωσφορικού γερανυλίου στο αλλυλικό καρβοκατιόν του πυροφωσφωρικού φαρνεσυλίου που οδηγεί στο σχηµατισµό του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου µε ανθρακική αλυσίδα από 20 άτοµα άνθρακα. Επιπλέον, το φυσικό φως αυξάνει το ρυθµό των βιοχηµικών αντιδράσεων που λαµβάνουν χώρα για τη βιοσύνθεση της χρωστικής (Lampilla και συν. 1985b). Ο ρυθµιστικός ρόλος της φωτεινής ακτινοβολίας στη βιοσύνθεση του βκαροτένιου έχει µελετηθεί παλιότερα από τους Lampilla και συν. (1985b), Tereshina και συν. (1993) και Enes και Saraiva (1996). Η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού στην περίπτωση που η ζύµωση γινόταν σε όλη τη διάρκεια παρουσία φωτός ήταν 27,84 g/l. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.2.5, η ανάπτυξη του µικροοργανισµού δεν επηρεάστηκε στην 134

171 περίπτωση που η ζύµωση γινόταν στο σκοτάδι µετά την 5 η ηµέρα της ζύµωσης (27,6 g/l). Αντίθετα, στις περιπτώσεις που οι κωνικές φιάλες παρέµεναν στο σκοτάδι καθ όλη τη διάρκεια ή µόνο τις πρώτες 3 ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας, η βιοµάζα του µικροοργανισµού µειώθηκε σε 14,0 g/l και 15,6 g/l, αντίστοιχα (Σχήµα 4.2.5). 135

172 âêáñïôýíéï (m g/l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση του φωτισµού στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,,, και,,, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Η ζύµωση έγινε : και παρουσία φωτός, και απουσία φωτός, και τις 3 πρώτες ηµέρες απουσία φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες παρουσία φωτός, και τις 3 πρώτες ηµέρες παρουσία φωτός και τις υπόλοιπες 5 ηµέρες απουσία φωτός. (Υπόστρωµα παραγωγής και συνθήκες της ζύµωσης όπως στο Σχήµα 4.2.1). 136

173 4.2.6 Επίδραση της Πηγής Άνθρακα στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Στην πραγµατοποίηση ασυνεχών ζυµώσεων το είδος και η συγκέντρωση της χρησιµοποιούµενης πηγής άνθρακα αποτελούν µερικούς από τους πιο βασικούς παράγοντες, οι οποίοι καθορίζουν την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή του προϊόντος. Για να µελετηθεί η επίδραση της πηγής άνθρακα στις βασικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora από συνθετικό υπόστρωµα πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές σε κωνικές φιάλες, οι οποίες περιείχαν το βασικό υπόστρωµα παραγωγής βκαροτένιου (όπως περιγράφεται στην παράγραφο χωρίς γλυκόζη) που εµπλουτιζόταν µε 30,0, 50,0 και 70,0 g/l γλυκόζη, σακχαρόζη, άµυλο ή γλυκερόλη. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.2.2, η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξήθηκε παράλληλα µε την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκόζης του υποστρώµατος έως 50,0 g/l, ενώ µειώθηκε στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 70,0 g/l. Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (63,2 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης στο υπόστρωµα µε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 50,0 g/l, ενώ στην περίπτωση των υποστρωµάτων µε συγκέντρωση γλυκόζης 30,0 και 70,0 g/l η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώθηκε κατά 51,1% και 59,5 %, αντίστοιχα. Η χαµηλή παραγωγή βκαροτένιου σε συγκεντρώσεις γλυκόζης µεγαλύτερες από 50,0 g/l οφείλεται στην ανενεργοποίηση της µεβαλονικής κινάσης (MVA), η οποία καταλύει την αντίδραση φωσφορυλίωσης του µεβαλονικού οξέος σε 5 πυροφωσφοµεβαλονικό οξύ που λαµβάνει χώρα κατά τη βιοσυνθετική πορεία του β καροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού. Τα παραπάνω αποτελέσµατα συµφωνούν µε αυτά των Dandekar και συν. (1980), οι οποίοι αναφέρουν ότι η δραστικότητα του παραπάνω ενζύµου και η σύνθεση του βκαροτένιου και του τρισπορικού οξέος µειώνονται σηµαντικά µε την αύξηση της περιεκτικότητας του υποστρώµατος σε γλυκόζη από 0,2 Μ σε 0,3 Μ. Αντίθετα, η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού αυξανόταν παράλληλα µε την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης στο υπόστρωµα από 30,0 g/l σε 70,0 g/l. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι δεν υπάρχει αναλογική σχέση της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του παραγόµενου βκαροτένιου. Η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκόζης στο υπόστρωµα από 30,0 g/l σε 50,0 g/l δεν επηρέασε τη συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων στο 137

174 υπόστρωµα µετά το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας, ενώ στην περίπτωση της καλλιέργειας που αναπτύχθηκε σε υπόστρωµα µε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 70,0 g/l, η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων εµφανιζόταν αυξηµένη. Αυτό οφείλεται στην αδυναµία του µικροοργανισµού να µεταβολίζει υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης λόγω της συσσώρευσης στο υπόστρωµα µεγάλης ποσότητας CO 2, µε αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η περαιτέρω συνέχιση της ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Η κυτταροτοξική δράση του CO 2 σχετίζεται µε τη διαταραχή της φυσιολογικής λειτουργίας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού και των µηχανισµών µεταφοράς ιόντων µέσα και έξω από αυτή, λόγω της ανταγωνιστικής δράσης του CO 2 και των πρωτεϊνών στην αλληλεπίδραση µε τα λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης (Dixon και Kell 1989). Τα αποτελέσµατα του Πίνακα δείχνουν ότι η αντικατάσταση της γλυκόζης µε σακχαρόζη, άµυλο ή γλυκερόλη σε συγκεντρώσεις 30,0, 50,0 και 70,0 g/l είχε ως αποτέλεσµα την αναστολή της ανάπυξης του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου. Αυτό οφείλεται στην αδυναµία του µικροοργανισµού να µεταβολίσει τα παραπάνω σάκχαρα. Όπως ήταν αναµενόµενο, σε όλες τις περιπτώσεις η συγκέντρωση των υπολειµατικών σακχάρων στο υπόστρωµα ήταν υψηλή. 138

175 Πίνακας Επίδραση της πηγής άνθρακα στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα a µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Γλυκόζη (g/l) Σακχαρόζη (g/l) Άµυλο (g/l) Γλυκερόλη (g/l) βκαροτένιο (mg/l) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) Υπολειµµατικά σάκχαρα (g/l) 30,0 0,0 0,0 0,0 30,9 ± 1,24 5,10 ± 0,26 5,5 ± 0,28 50,0 0,0 0,0 0,0 63,2 ± 3,16 9,40 ± 0,47 6,7 ± 0,25 70,0 0,0 0,0 0,0 25,6 ± 1,28 14,00 ± 0,70 11,5 ± 0,56 0,0 30,0 0,0 0,0 1,35 ± 0,04 30,0 ± 0,90 0,0 50,0 0,0 0,0 1,33 ± 0,04 50,0 ± 1,50 0,0 70,0 0,0 0,0 1,31 ± 0,04 70,0 ± 2,10 0,0 0,0 30,0 0,0 1,32 ± 0,04 30,0 ± 0,84 0,0 0,0 50,0 0,0 1,36 ± 0,04 50,0 ± 1,65 0,0 0,0 70,0 0,0 1,34 ± 0,04 70,0 ± 2,17 0,0 0,0 0,0 30,0 1,35 ± 0,04 0,0 0,0 0,0 50,0 1,33 ± 0,04 0,0 0,0 0,0 70,0 1,30 ± 0,04 a (g/l) : Πηγή άνθρακα, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 139

176 4.2.7 Επίδραση της Πηγής Αζώτου στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Με σκοπό την αύξηση της παραγωγικότητας του βκαροτένιου πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές σε κωνικές φιάλες, οι οποίες περιείχαν υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε διαφορετικές πηγές αζώτου, όπως εκχύλισµα καλαµποκιού, καλαµποκάλευρο, υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας, στερεά υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης, NH 4 NO 3 ή (NH 4 ) 2 SO 4. Από τα αποτελέσµατα του Πίνακα φαίνεται ότι οι πηγές αζώτου που χρησιµοποιήθηκαν επηρεάζουν µε διαφορετικό τρόπο την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή βκαροτένιου. Στις περιπτώσεις των καλλιεργειών που αναπτύχθηκαν σε υπόστρωµα εµπλουτισµένο µε εκχύλισµα καλαµποκιού, καλαµποκάλευρο, υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας και στερεά υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης, παρατηρήθηκε αύξηση της απόδοσης του β καροτένιου. Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 80,0 g/l εκχυλίσµατος καλαµποκιού. Στις περιπτώσεις εµπλουτισµού του υποστρώµατος µε 80,0 g/l καλαµποκάλευρο, 50,0 g/l υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας ή 50,0 g/l στερεά υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης, η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου ήταν 92,6, 90,0 και 93,5 mg/l, αντίστοιχα. Περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης των παραπάνω πρωτεϊνικών αζωτούχων ενώσεων στο υπόστρωµα δεν ευνόησε την παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας βκαροτένιου. Επίσης, από τον Πίνακα φαίνεται ότι τα ανόργανα άλατα NH 4 NO 3 και (NH 4 ) 2 SO 4 αναστέλλουν τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου. Τα παραπάνω αποτελέσµατα έρχονται σε συµφωνία µε άλλες έρευνες που έχουν ανακοινωθεί σχετικά µε την επαγωγική δράση του εκχυλίσµατος καλαµποκιού, της υδρολυµένης πρωτείνης σόγιας, του διαλυτού υπολείµµατος απόσταξης αλκοόλης µετά τη ζύµωση καλαµποκιού, του βαµβακάλευρου και του σογιάλευρου στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora (Anderson και συν. 1958, Ciegler και συν. 1963b, Ninet και Renaut 1979). Επίσης, οι Ciegler και συν. (1959a) βρήκαν ότι η προσθήκη 30,0 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, στο υπόστρωµα ευνοούσε την ανάπτυξη του µικροοργανισµού, ενώ προκαλούσε αναστολή της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου. Η αύξηση του βκαροτένιου που παρατηρήθηκε παρουσία των πρωτεϊνικών αζωτούχων αλάτων που αναφέρθηκαν παραπάνω και κυρίως του εκχυλίσµατος καλαµποκιού οφείλεται στη διαφορετική σύσταση του υποστρώµατος. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.2.4, το εκχύλισµα καλαµποκιού είναι πολύ καλή πηγή 140

177 φωσφόρου, σιδήρου, χαλκού, ασβεστίου και άλλων ιχνοστοιχείων και ανόργανων συστατικών. Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη ανόργανου φωσφόρου στο υπόστρωµα οδηγεί σε συσσώρευση αυτού στο εσωτερικό των κυττάρων του B. trispora, µε αποτέλεσµα την ανάδροµη αναστολή ή καταστολή της δράσης των ενδοκυτταρικών φωσφατασών που είναι υπεύθυνα για τη διάσπαση φωσφοεστερικών δεσµών των φωσφορυλιωµένων ενδιάµεσων ενώσεων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου και τη σηµαντική αύξηση της απόδοσης της χρωστικής από το µικροοργανισµό (Dholakia και Modi 1984). Επίσης, οι Govind και συν. (1982) αναφέρουν ότι η συγκέντρωση της χρωστικής αυξάνεται σηµαντικά όταν προσθέτονται στο υπόστρωµα Fe 2+, Mg 2+ και Cu 2+. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι η προσθήκη Cu 2+ αυξάνει κατά δύο φορές τη σύνθεση του τρισπορικού οξέος και τη δραστικότητα της MVA στα κύτταρα του µικροοργανισµού λόγω της αύξησης του ρυθµού κατανάλωσης της γλυκόζης παρουσία Cu 2+. Επιπλέον, από τον Πίνακα φαίνεται ότι το εκχύλισµα καλαµποκιού είναι πλούσιο σε βιοτίνη και λευκίνη. Στην περίπτωση της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου από τα στελέχη B. trispora και P. blakesleeanus, το HMGCoA, το οποίο αποτελεί µία σηµαντική ενδιάµεση ένωση της κύριας βιοσυνθετικής πορείας της χρωστικής από το ακετυλοσυνένζυµο Α, µπορεί να σχηµατιστεί και από το µεταβολισµό της λευκίνης µε µία σειρά αντιδράσεων που συµπεριλαµβάνουν τη µεταφορά CO 2 στο βµεθυλοκροτωνυλοσυνένζυµο Α µε το ένζυµο καρβοξυλάση του βµεθυλοκροτωνυλοσυνενζύµου Α για τη σύνθεση του β µεθυλογλουτακονυλοσυνενζύµου Α. Από το τελευταίο µε την προσθήκη νερού προκύπτει το HMGCoA (Ciegler 1965, Desai και συν. 1975). Η καρβοξυλάση του βµεθυλοκροτωνυλοσυνενζύµου Α χρησιµοποιεί για την καταλυτική της ενέργεια τη βιοτίνη. Η προσθήκη βιοτίνης στο υπόστρωµα παραγωγής επάγει τη δράση του παραπάνω ενζύµου µε αποτέλεσµα τη σύνθεση µεγαλύτερης ποσότητας HMGCoA, άρα και περισσότερου βκαροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού (Desai και συν. 1975). Σε όλες τις περιπτώσεις των διαφορετικών πηγών αζώτου που προστέθηκαν στο υπόστρωµα, η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού εµφανιζόταν σηµαντικά αυξηµένη (Πίνακας 4.2.3). Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (32,5 g/l) παρατηρήθηκε στο υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 50,0 g/l στερεά υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης. Στις περιπτώσεις που στο υπόστρωµα προστέθηκε 80,0 g/l καλαµποκάλευρο, υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας ή εκχύλισµα καλαµποκιού και 15,0 g/l NH 4 NO 3 ή 5,0 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, η συγκέντρωση της 141

178 βιοµάζας αυξήθηκε κατά 67,8%, 68,7%, 67,4%, 48,94% και 18,3 %, αντίστοιχα, έναντι της βιοµάζας του µικροοργανισµού που αναπτύχθηκε απουσία των παραπάνω ουσιών. Επιπλέον, περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης τους δεν ευνόησε το σχηµατισµό περισσότερης βιοµάζας. Η µεγάλη ανάπτυξη του µικροοργανισµού που παρατηρήθηκε από την προσθήκη καλαµποκάλευρου, υδρολυµένης πρωτείνης σόγιας και εκχυλίσµατος καλαµποκιού οφείλεται στους αυξητικούς παράγοντες που περιέχονται στα παραπάνω υποστρώµατα όπως αµινοξέα, βιταµίνες, διάφορα ιχνοστοιχεία και ανόργανα συστατικά. 142

179 Πίνακας Επίδραση της πηγής αζώτου στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Πηγή αζώτου (g/l) Ποσότητα αζώτου (g/l) βκαροτένιο (mg/l) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) Υπολειµµατικά σάκχαρα (g/l) Βασικό υπόστρωµα a 0,7 63,2 ± 3,16 9,4 ± 0,47 6,7 ± 0,25 Εκχύλισµα καλαµποκιού 50,0 2,0 100,5 ± 4,00 25,6 ± 0,77 4,5 ± 0,14 80,0 3,2 225,2 ± 9,01 28,8 ± 0,85 3,6 ± 0,14 100,0 4,0 108,4 ± 4,34 28,5 ± 0,86 4,1 ± 0,12 Καλαµποκάλευρο 50,0 0,8 76,0 ± 3,04 26,2 ± 0,79 4,1 ± 0,21 80,0 1,3 92,6 ± 3,71 29,2 ± 0,88 3,7 ± 0,19 100,0 1,6 33,4 ± 1,34 28,8 ± 0,86 4,5 ± 0,14 Υδρολυµένη πρωτείνη σόγιας 50,0 6,3 90,0 ± 3,60 28,0 ± 0,84 3,5 ± 0,17 80,0 10,1 70,5 ± 2,82 30,0 ± 0,90 2,7 ± 0,14 100,0 12,6 65,2 ± 2,61 29,5 ± 0,89 3,0 ± 0,15 Στερεά υπολείµµατα απόσταξης αλκοόλης 50,0 2,1 93,5 ± 3,74 32,5 ± 0,98 2,5 ± 0,13 80,0 3,4 81,0 ± 3,24 30,1 ± 0,90 2,7 ± 0,14 100,0 4,2 72,6 ± 2,91 30,0 ± 0,75 2,7 ± 0,14 NH 4 NO 3 5,0 1,8 23,5 ± 0,94 10,7 ± 0,32 5,4 ± 0,15 10,0 3,5 20,7 ± 0,83 12,6 ± 0,38 4,5 ± 0,52 15,0 5,3 13,8 ± 0,55 14,0 ± 0,42 4,0 ± 0,52 (NH 4 ) 2 SO 4 5,0 1,1 56,0 ± 2,24 11,5 ± 0,29 4,9 ± 0,25 10,0 2,1 45,2 ± 1,81 7,9 ± 0,19 7,0 ± 0,35 15,0 3,2 28,0 ± 1,12 6,4 ± 0,16 10,2 ± 0,51 a (g/l) : Γλυκόζη 50,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 143

180 Πίνακας Σύσταση εκχυλίσµατος καλαµποκιού (Stanbury και συν. 1995). Συνολικά στερεά (%, w/v) 51,0 Συνολική οξύτητα (εκφρασµένη σε % γαλακτικό οξύ, w/v) 15,0 Ανάγοντα σάκχαρα (%, w/v) 12,4 Συνολικό άζωτο (%, w/v) 4,0 Αµινοξέα (% του συνολικού αζώτου) Αλανίνη 25,0 Αργινίνη 8,0 Γλουταµινικό οξύ 8,0 Λευκίνη 6,0 Προλίνη 5,0 Ισολευκίνη 3,5 Θρεονίνη 3,5 Βαλίνη 3,5 Φαινυλαλανίνη 2,0 Μεθειονίνη 1,0 Κυστείνη 1,0 Τέφρα (%, w/v) 1,3 Ιχνοστοιχεία (% της συνολικής τέφρας) Κάλιο 20,0 Φώσφορος 0,995,0 Νάτριο 0,31,0 Μαγνήσιο 0,0030,3 Σίδηρος 0,010,3 Χαλκός 0,010,3 Ασβέστιο Ψευδάργυρος 0,0030,08 Μόλυβδος Άργυρος 0,0010,003 Χρώµιο Βιταµίνες (µg/g) Ανευρίνη 41,049,0 Βιοτίνη 0,340,38 Παντοθενικό ασβέστιο 14,521,5 Φολικό οξύ 0,260,6 Νικοτιναµίδιο 30,040,0 Ριβοφλαβίνη 3,94,7 144

181 4.2.8 Επίδραση των Επιφανειοδραστικών Ουσιών στη Μορφολογία του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Η επίδραση των επιφανειοδραστικών ουσιών στην παραγωγή του β καροτένιου και στη µορφολογία του µικροοργανισµού δίνεται στον Πίνακα Η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξανόταν µε την αύξηση της συγκέντρωσης του Span 20 έως 10,0 g/l, ενώ σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις η παραγωγή της χρωστικής µειωνόταν ελαφρώς. Επιπλέον, η προσθήκη της παραπάνω ουσίας στο υπόστρωµα επηρέασε σηµαντικά τη µορφολογία του µικροοργανισµού. Συγκεκριµένα, στην περίπτωση που το υπόστρωµα δεν περιείχε Span 20 ο µικροοργανισµός σχηµάτιζε ένα άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών (clump of mycelium), σε αντίθεση µε το µυκήλιο του µικροοργανισµού που αναπτύχθηκε σε υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l ή 10,0 g/l Span 20, το οποίο είχε τη µορφή συµπαγών σβόλων (pellets) ή βρισκόταν σε πλήρη διασπορά (dispersed mycelium) στο υγρό της ζύµωσης, αντίστοιχα. Αντίθετα, στο υπόστρωµα που εµπλουτίστηκε µε Tween 80, αύξηση της συγκέντρωσης της παραπάνω ουσίας µέχρι 1,0 g/l επέφερε µικρή αύξηση στη συγκέντρωση του βκαροτένιου (72,3 mg/l έναντι 61,4 mg/l), ενώ δεν επηρέασε τη µορφολογία του µικροοργανισµού. Η µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου (225,2 mg/l) παρατηρήθηκε όταν προστέθηκε στο υπόστρωµα µίγµα 10,0 g/l Span 20 και 1,0 g/l Tween 80. Στην περίπτωση αυτή, παρατηρήθηκε πλήρη διασπορά του µυκηλίου στο υγρό της ζύµωσης. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (28,8 g/l) και κατανάλωση των αρχικών σακχάρων (92,8%) εµφανιζόταν στο υπόστρωµα που προστίθονταν µίγµα 10,0 g/l Span 20 και 1,0 g/l Tween 80, ενώ σε όλες τις άλλες περιπτώσεις που το υπόστρωµα εµπλουτίζονταν µε κάθε µία επιφανειοδραστική ουσία ξεχωριστά (διαφορετικές συγκεντρώσεις Span 20 ή Tween 80) παρατηρήθηκε µείωση των παραπάνω παραµέτρων της ζυµωτικής διεργασίας (Πίνακας 4.2.5). Τα παραπάνω αποτελέσµατα συµφωνούν µε τα αποτελέσµατα άλλων ερευνητικών εργασιών που αναφέρουν την επαγωγική δράση των παραπάνω επιφανειοδραστικών ουσιών Span 20 και Tween 80 στην παραγωγή βκαροτένιου (Anderson και συν. 1958, Kim και συν. 1996, 1997a,b, 1999, Jeong και συν. 2001). Η σηµαντική αύξηση της ανάπτυξης του µικροοργανισµού και της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου οφείλεται στην καλύτερη διασπορά του µυκηλίου στο υγρό της ζύµωσης, που έχει ως αποτέλεσµα την καλύτερη διάχυση των θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου στο εσωτερικό του µυκηλίου, έναντι των περιορισµένων 145

182 φαινοµένων διάχυσης που συµβαίνουν στα εσωτερικά τµήµατα των µυκηλιακών συσσωµατωµάτων που σχηµατίζονται στο υπόστρωµα που δεν περιέχει Span 20. Οι Jeong και συν. (2001) που µελέτησαν την επίδραση του Span 20 στη µορφολογία του µικροοργανισµού βρήκαν ότι µειώνεται ο ρυθµός σχηµατισµού, το µήκος και οι διακλαδώσεις των µυκηλιακών υφών και επιτυγχάνεται πλήρης διασπορά του µυκηλίου στο υγρό υπόστρωµα, χωρίς τη δηµιουργία συσσωµατωµάτων ή σβόλων των υφών. Επίσης, η καλύτερη µεταφορά µάζας διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης ενισχύεται µε την αύξηση της διαπερατότητας της µεµβράνης από τις ουσίες Span 20 και Tween 80 (Kobayashi και συν. 1973, Kim και συν. 1997a,b, 1999). Οι Kim και συν. (1997b) βρήκαν ότι όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που περιείχε 10,0 g/l Span 20 η απόδοση του τρισπορικού οξέος αυξανόταν κατά 18 φορές, έναντι της αντίστοιχης σε υπόστρωµα χωρίς Span 20. Οι ίδιοι ερευνητές λαµβάνοντας υπόψη την αύξηση της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού από το Span 20 αποδίδουν το γεγονός στην καλύτερη διάχυση των προορµονών στα κύτταρα του B. trisporα, µε αποτέλεσµα την επαγωγή της σύνθεσης του τρισπορικού οξέος, οπότε και του βκαροτένιου (Kim και συν. 1997b). Παρόλο που ο µηχανισµός δράσης του Span 20 στην αύξηση της παραγωγής βκαροτένιου δεν έχει πλήρως εξηγηθεί, οι Jeong και συν. (2001) αναφέρουν ότι η αύξηση της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης παρουσία της παραπάνω ουσίας ευνοεί τη διάχυση του οξυγόνου στο εσωτερικό των κυττάρων και επιφέρει αύξηση του οξειδωτικού στρες στο µικροοργανισµό, το οποίο µέχρι κάποιο όριο επάγει τη βιοσύνθεση του βκαροτένιου (Jeong και συν. 1999). 146

183 Πίνακας Επίδραση των επιφανειοδραστικών ουσιών στη µορφολογία του B. trispora και στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Επιφανειοδραστική ουσία (g/l) Μορφολογία βκαροτένιο (mg/l) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) Υπολειµµατικά σάκχαρα (g/l) Βασικό υπόστρωµα a Άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών 55,7 ± 1,67 12,6 ± 0,25 15,2 ± 0,61 Span 20 5,0 Συµπαγής σβόλοι µυκηλιακών υφών 101,5 ± 3,05 20,3 ± 0,41 8,6 ± 0,34 10,0 Οµοιογενές αιώρηµα µυκηλιακών υφών 150,0 ± 4,50 26,8 ± 0,54 3,9 ± 0,16 15,0 Οµοιογενές αιώρηµα µυκηλιακών υφών 123,6 ± 3,71 25,9 ± 0,52 4,5 ± 0,18 20,0 Οµοιογενές αιώρηµα µυκηλιακών υφών 92,3 ± 2,77 23,6 ± 0,47 4,8 ± 0,19 Tween 80 0,5 Άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών 61,4 ± 1,84 14,2 ± 0,28 10,4 ± 0,42 1,0 Άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών 72,3 ± 2,17 15,1 ± 0,30 9,5 ± 0,38 1,5 Άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών 69,5 ± 2,09 14,5 ± 0,29 10,1 ± 0,40 2,0 Άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών 64,1 ± 1,92 13,8 ± 0,28 12,8 ± 0,51 Span 20 10,0 Οµοιογενές αιώρηµα + Tween 80 1,0 µυκηλιακών υφών 225,2 ± 9,01 28,8 ± 0,85 3,6 ± 0,14 a (g/l): Γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 147

184 4.2.9 Επίδραση των Φυτικών Ελαίων στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Προκειµένου να µελετηθεί η επίδραση των φυτικών ελαίων στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή του βκαροτένιου, µίγµα κυττάρων των στελεχών αντίθετου φύλου αναπτύχθηκαν σε υποστρώµατα τα οποία περιείχαν διαφορετικά είδη φυτικών ελαίων και µίγµατα αυτών. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στους Πίνακες και Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.2.6, σε όλες τις περιπτώσεις η προσθήκη των φυτικών ελαίων στο υπόστρωµα ευνόησε την παραγωγή βκαροτένιου. Η υψηλότερη συγκέντρωση του βκαροτένιου (871,7 mg/l) παρατηρήθηκε στην περίπτωση που προστέθηκε στο υπόστρωµα 30,0 g/l βαµβακέλαιο, ενώ όταν προστέθηκαν 30,0 g/l ελαιόλαδο ή σογιέλαιο η συγκέντρωση της χρωστικής ήταν 858,6 mg/l και 765,6 mg/l, αντίστοιχα. Επίσης, η αύξηση της απόδοσης του β καροτένιου εµφανιζόταν µικρότερη στις περιπτώσεις που προστέθηκε καλαµποκέλαιο, σουσαµέλαιο, ηλιέλαιο ή αραχιδέλαιο σε συγκέντρωση 10,0 g/l (455,4, 504,6, 480,7 και 474,3 mg/l, αντίστοιχα). Περαιτέρω αύξηση των παραπάνω ελαίων στο υπόστρωµα δεν ευνόησε την παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας β καροτένιου. Σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση της βιοµάζας αυξανόταν παράλληλα µε την αύξηση της συγκέντρωσης των φυτικών ελαίων στο υπόστρωµα (Πίνακας 4.2.6). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα φυτικά έλαια αποτελούν πολύ καλή πηγή άνθρακα και ενέργειας για την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού (49,9 g/l) παρατηρήθηκε στην περίπτωση που προστέθηκε στο υπόστρωµα 50,0 g/l βαµβακέλαιο. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του Πίνακα 4.2.7, όταν προσθέτονταν 30,0 g/l µίγµα ελαιόλαδου, βαµβακέλαιου και σογιέλαιου σε αναλογία 1:1:1 η συγκέντρωση του βκαροτένιου εµφανιζόταν ελαφρώς αυξηµένη (924,4 mg/l), έναντι της αντίστοιχης στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στα υποστρώµατα που περιείχαν µόνο ελαιόλαδο, βαµβακέλαιο ή σογιέλαιο. Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν σε υποστρώµατα που περιείχαν 30,0 g/l µίγµα των παραπάνω φυτικών ελαίων ανά δύο σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10,020,0 g/l), το ποσοστό αύξησης της απόδοσης του βκαροτένιου ήταν µειωµένο (το ποσοστό µείωσης κυµαίνονταν µεταξύ 15,39% 24,23%). Ανεξάρτητα από τη σύσταση του µίγµατος των φυτικών ελαίων που προστέθηκε στο υπόστρωµα, σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε σηµαντική 148

185 αύξηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού. Η µεγαλύτερη συγκέντρωση της βιοµάζας (50,9 g/l) παρατηρήθηκε όταν προστέθηκε στο υπόστρωµα 30,0 g/l µίγµα σογιέλαιου και βαµβακέλαιου σε αναλoγία 1:2. Σε όλες τις περιπτώσεις που προαναφέρθηκαν παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης κατανάλωση των αρχικών σακχαρών του υποστρώµατος από το µικροοργανισµό, αφού η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων µετά το τέλος της ζύµωσης κυµαίνονταν µεταξύ 3,05,3 g/l (Πίνακες ). Η αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου παρουσία των παραπάνω φυτικών ελαίων και µιγµάτων αυτών οφείλεται κυρίως στην υψηλή περιεκτικότητα τους σε ελαϊκό και λινελαϊκό οξύ. Ο µηχανισµός δράσης του ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος στην επαγωγή της σύνθεσης του βκαροτένιου βασίζεται στην αύξηση των επιπέδων ακετυλοcoa, το οποίο αποτελεί την πρόδροµη ένωση του βκαροτένιου, από το µεταβολισµό των παραπάνω λιπαρών οξέων και στην απόκτηση τµηµάτων της ανθρακικής αλυσίδας µε διπλούς δεσµούς του µορίου του βκαροτένιου από αυτά. Οι Anderson και συν. (1958) βρήκαν ότι η παραγωγή βκαροτένιου διπλασιάζεται (40,0 mg/l έναντι 19,8 mg/l) όταν η καλλιέργεια αναπτύσσεται σε υπόστρωµα που περιέχει 40,0 g/l ισοµοριακό µίγµα σογιέλαιου και βαµβακέλαιου. Επίσης, οι Ciegler και συν. (1959b) που µελέτησαν την επίδραση διαφορετικών ειδών φυτικών ελαίων στην παραγωγή της χρωστικής, βρήκαν ότι τα καταλληλότερα φυτικά έλαια για την αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου είναι αυτά που περιέχουν µεγάλες ποσότητες ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος όπως το σογιέλαιο και το βαµβακέλαιο. Οι ίδιοι ερευνητές βρήκαν µέγιστη συγκέντρωση της χρωστικής (338,9 mg/l) στο υπόστρωµα που περιείχε 40,0 g/l βαµβακέλαιο, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ευνοήθηκε η ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Οι παραπάνω διαφορές όσον αφορά την ποσότητα του παραγόµενου βκαροτένιου µπορούν να ερµηνευτούν ως αποτέλεσµα της διαφορετικής σύστασης του υποστρώµατος και των διαφορετικών στελεχών του µικροοργανισµού που χρησιµοποιήθηκαν. 149

186 Πίνακας Επίδραση των φυτικών ελαίων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Βιοµάζα Υπολειµµατικά Φυτικό έλαιο βκαροτένιο ξηρό βάρος σάκχαρα (g/l) (mg/l) (g/l) (g/l) Βασικό υπόστρωµα a 225,2 ± 9,01 28,8 ± 0,85 3,6 ± 0,14 Ελαιόλαδο b 10,0 736,2 ± 29,45 32,3 ± 0,81 5,3 ± 0,11 30,0 858,6 ± 25,76 45,5 ± 1,14 4,2 ± 0,08 50,0 750,7 ± 22,52 56,2 ± 1,41 4,1 ± 0,08 Βαµβακέλαιο b 10,0 757,9 ± 22,74 41,5 ± 1,25 4,5 ± 0,09 30,0 871,7 ± 26,15 48,2 ± 1,21 3,2 ± 0,06 50,0 786,4 ± 23,59 59,9 ± 1,49 3,0 ± 0,06 Σογιέλαιο b 10,0 690,6 ± 17,27 40,0 ± 1,00 4,3 ± 0,09 30,0 765,6 ± 22,97 47,4 ± 1,42 3,3 ± 0,07 50,0 680,2 ± 20,41 58,3 ± 1,46 3,0 ± 0,06 Καλαµποκέλαιο b 10,0 455,4 ± 13,66 31,4 ± 0,94 3,5 ± 0,07 30,0 385,0 ± 11,55 35,7 ± 1,07 3,3 ± 0,06 50,0 205,2 ± 8,21 46,9 ± 1,17 3,1 ± 0,09 Ηλιέλαιο b 10,0 504,6 ± 15,14 30,5 ± 0,92 3,8 ± 0,08 30,0 358,1 ± 10,74 33,2 ± 0,99 3,5 ± 0,07 50,0 155,4 ± 6,22 44,3 ± 1,11 3,1 ± 0,06 Σουσαµέλαιο b 10,0 480,7 ± 11,23 29,6 ± 0,89 4,2 ± 0,08 30,0 353,6 ± 10,61 31,6 ± 0,79 3,9 ± 0,08 50,0 188,9 ± 7,56 42,9 ± 1,07 3,5 ± 0,07 Αραχιδέλαιο b 10,0 474,3 ± 18,97 29,1 ± 0,73 4,5 ± 0,09 30,0 337,6 ± 10,13 30,5 ± 0,92 4,2 ± 0,08 50,0 165,4 ± 8,27 41,3 ± 1,03 3,9 ± 0,07 a (g/l) : Γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. b Προσθήκη αντιοξειδωτικού 2,5 g/l. 150

187 Πίνακας Επίδραση του µίγµατος των φυτικών ελαίων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Βιοµάζα ξηρό Υπολειµµατικά Μίγµα φυτικών ελαίων βκαροτένιο βάρος σάκχαρα (g/l) (mg/l) (g/l) (g/l) Βασικό υπόστρωµα a 225,2 ± 9,01 28,8 ± 0,85 3,6 ± 0,14 Ελαιόλαδο 10,0 + Σογιέλαιο 10,0 + Βαµβακέλαιο b 10,0 924,4 ± 36,98 48,4 ± 1,21 3,7 ± 0,09 Ελαιόλαδο 10,0 + Βαµβακέλαιο b 20,0 752,7 ± 30,11 49,8 ± 1,25 3,3 ± 0,08 Ελαιόλαδο 10,0 + Σογιέλαιο b 20,0 728,5 ± 29,14 47,5 ± 1,19 3,7 ± 0,09 Βαµβακέλαιο 10,0 + Σογιέλαιο b 20,0 745,0 ± 22,35 48,8 ± 1,22 5,3 ± 1,60 Βαµβακέλαιο 10,0 + Ελαιόλαδο b 20,0 715,7 ± 21,47 47,9 ± 1,20 4,0 ± 0,10 Σογιέλαιο 10,0 + Βαµβακέλαιο b 20,0 782,1 ± 31,28 50,9 ± 1,27 4,0 ± 0,10 Σογιέλαιο 10,0 + Ελαιόλαδο b 20,0 700,4 ± 21,00 45,3 ± 1,13 4,0 ± 0,10 a Σύσταση υποστρώµατος και συνθήκες της ζύµωσης όπως στον Πίνακα b Προσθήκη αντιοξειδωτικού 2,5 g/l. 151

188 Επίδραση των Ακόρεστων Λιπαρών Οξέων στην Ανάπτυξη του B. trispora και στην Παραγωγή βκαροτένιου Με βάση τα παραπάνω αποτελέσµατα, τα οποία αποδεικνύουν την επαγωγική δράση των φυτικών ελαίων που περιέχουν µεγάλες ποσότητες ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος στην παραγωγή βκαροτένιου από το B. trispora, πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές για να µελετηθεί η επίδραση της προσθήκης ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή βκαροτένιου. Τα αποτελέσµατα της παραπάνω µελέτης παρουσιάζονται στον Πίνακα Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.2.8, η αύξηση της συγκέντρωσης του ελαϊκού οξέος στο υπόστρωµα από 10,0 g/l έως 40,0 g/l είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του βκαροτένιου, ενώ σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις ελαϊκού οξέος παρατηρήθηκε µείωση των παραπάνω παραµέτρων της ζυµωτικής διεργασίας. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (41,0 g/l) και του βκαροτένιου (848,3 mg/l) παρατηρήθηκε όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα, στο οποίο είχαν προστεθεί 40,0 g/l ελαϊκό οξύ. Επίσης, φαίνεται ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος από 10,0 g/l σε 20,0 g/l αύξησε την απόδοση του βκαροτένιου από 500,0 σε 1322,0 mg/l. Περαιτέρω αύξηση της περιεκτικότητας του υποστρώµατος σε λινελαϊκό οξύ έως 50,0 g/l µείωσε την απόδοση του βκαροτένιου σε 550,0 mg/l. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στο σχηµατισµό τοξικών προϊόντων αυτοξείδωσης του λινελαϊκού οξέος (υδρουπεροξείδια και προϊόντα αποικοδόµησης τους, όπως κορεσµένες και ακόρεστες αλδεΰδες και κετόνες) που αναστέλλουν τη δράση ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου. Αντίθετα, η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού αυξανόταν παράλληλα µε την αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος έως 40,0 g/l, ενώ σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις η βιοµάζα εµφανιζόταν ελαφρώς µειωµένη. Τα αποτελέσµατα αυτά έρχονται σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα των Ciegler και συν. (1959b) που παρατήρησαν σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου µε την προσθήκη στο υπόστρωµα ελαϊκού οξέος ή µίγµατος ακόρεστων λιπαρών οξέων µε διπλούς συζυγιακούς δεσµούς, µε κύριο συστατικό το λινελαϊκό οξύ, σε αντίθεση µε τις περιπτώσεις που είχαν προστεθεί κορεσµένα λιπαρά οξέα, όπως το στεατικό οξύ και το παλµιτικό οξύ, ουδέτερα λίπη όπως η τριεσταρίνη και η τριπαλµιτίνη και πολυακόρεστα λιπαρά 152

189 οξέα (µόρια µε τρεις ή περισσότερους διπλούς δεσµούς), τα οποία ευνόησαν σε µικρότερο βαθµό την απόδοση του βκαροτένιου. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του Πίνακα η επαγωγική δράση του λινελαϊκού οξέος στην παραγωγή βκαροτένιου είναι µεγαλύτερη της αντίστοιχης του ελαϊκού οξεός. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στην παρουσία διπλών συζυγιακών δεσµών στο µόριο του λινελαϊκού οξέος που ευνοούν το σχηµατισµό της µακριάς ανθρακικής αλυσίδας µε τους διπλούς συζυγιακούς δεσµούς στο µόριο του β καροτένιου, έναντι του µορίου του ελαϊκού οξέος που είναι ένα µονοακόρεστο λιπαρό οξύ. Συγκρίνοντας τα αποτελέσµατα των Πινάκων και παρατηρούµε ότι η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου είναι περίπου η ίδια στα υποστρώµατα που έχουν εµπλουτιστεί µε 10,0 g/l ελαιόλαδο ή 40,0 g/l ελαϊκό οξύ (858,6 mg/l έναντι 848,3 mg/l). Η αυξηµένη ικανότητα του ελαιόλαδου να επάγει τη σύνθεση της χρωστικής, έναντι της αντίστοιχης του ελαϊκού οξέος (για την ίδια αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου απαιτούνταν περίπου 1,3 φορές µεγαλύτερη ποσότητα ελαϊκού οξέος, σε σύγκριση µε την απαιτούµενη ποσότητα ελαιόλαδου) µπορεί να αποδοθεί στη σύσταση του ελαιόλαδου, το οποίο περιέχει µίγµα ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος. Αντίθετα, στις καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε υπόστρωµα που περιέχει 30,0 g/l βαµβακέλαιο ή σογιέλαιο, η παραγωγή του β καροτένιου εµφανίζεται µειωµένη, συγκριτικά µε την παραγωγή της χρωστικής σε υπόστρωµα που έχει εµπλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ. Το αποτέλεσµα αυτό ερµηνεύεται µε βάση το γεγονός ότι στο βαµβακέλαιο και στο σογιέλαιο η περιεκτικότητα του λινελαϊκού οξέος στο σύνολο των λιπαρών οξέων είναι 53,8% (w/w) και 51,0% (w/w), αντίστοιχα (Boskou 1989). Τα υπόλοιπα λιπαρά οξέα στο βαµβακέλαιο είναι κορεσµένα λιπαρά οξέα και ελαϊκό οξύ και στο σογιέλαιο είναι κορεσµένα λιπαρά οξέα, ελαϊκό οξύ και λινολενικό οξύ, από τα οποία µόνο το ελαϊκό οξύ ευνοεί σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου. Επίσης, η ανάπτυξη του µικροοργανισµού στα υποστρώµατα που περιέχουν ελαϊκό και λινελαϊκό οξύ δεν είναι εξίσου µεγάλη µε τη µικροβιακή ανάπτυξη που παρατηρείται παρουσία ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα παραπάνω φυτικά έλαια περιέχουν και άλλους αυξητικούς παράγοντες εκτός από λιπαρά οξέα, όπως υδρογονάνθρακες και βιταµίνες, οι οποίοι ευνοούν την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. 153

190 Πίνακας Επίδραση των ακόρεστων λιπαρών οξέων στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Βιοµάζα Υπολειµµατικά Ακόρεστο λιπαρό οξύ βκαροτένιο ξηρό βάρος σάκχαρα (g/l) (mg/l) (g/l) (g/l) Βασικό υπόστρωµα a 225,2 ± 9,01 28,8 ± 0,85 3,6 ± 0,14 Ελαϊκό οξύ b 10,0 275,0 ± 11,00 29,3 ± 0,88 4,5 ± 0,18 20,0 382,5 ± 15,30 34,7 ± 1,04 5,2 ± 0,21 30,0 591,6 ± 23,66 37,9 ± 1,14 5,4 ± 0,22 40,0 848,3 ± 33,93 41,0 ± 1,23 5,7 ± 0,23 50,0 594,1 ± 23,76 38,0 ± 1,14 5,3 ± 0,21 Λινελαϊκό οξύ b 10,0 500,0 ± 20,00 30,4 ± 0,85 5,4 ± 0,22 20,0 1322,0 ± 52,88 35,8 ± 1,07 5,5 ± 0,22 30,0 1064,1 ± 42,56 39,3 ± 1,18 5,6 ± 0,23 40,0 750,0 ± 30,00 42,7 ± 1,28 5,7 ± 0,23 50,0 550,0 ± 22,00 40,8 ± 1,22 5,2 ± 0,21 a Σύσταση υποστρώµατος και συνθήκες της ζύµωσης όπως στον Πίνακα b Προσθήκη αντιοξειδωτικού 2,5 g/l. 154

191 Επίδραση του Αντιοξειδωτικού στην Παραγωγή του βκαροτένιου Με σκοπό την αύξηση της σταθερότητας του βκαροτένιου στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού κατά τη διάρκεια της ζύµωσης, πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές σε κωνικές φιάλες για να µελετηθεί η επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων αντιοξειδωτικού (BHT) στη συγκέντρωση του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου. Από τα αποτελέσµατα του Πίνακα φαίνεται ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού από 2,5 g/l έως 10,0 g/l σε υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, ενώ η βιοµάζα του µικροοργανισµού και το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων παρέµενε σε σταθερά επίπεδα. Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (1950,0 mg/l) παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που περιείχε 10,0 g/l αντιοξειδωτικό, ενώ στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που περιείχε 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ, χωρίς την παρουσία αντιοξειδωτικού, η συγκέντρωση του βκαροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένη (κατά 51,25%). Επίσης, σε συγκεντρώσεις του αντιοξειδωτικού µεγαλύτερες από 10,0 g/l η συγκέντρωση του βκαροτένιου και της βιοµάζας του µικροοργανισµού και η κατανάλωση των σακχάρων του υποστρώµατος µειωνόταν σηµαντικά. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην αντιµικροβιακή δράση που εµφανίζει το BHT, όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Ο µηχανισµός δράσης του αντιοξειδωτικού στη σταθερότητα του β καροτένιου οφείλεται στη διάλυση του αντιοξειδωτικού στα λιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης που αποτελούν τους αποθηκευτικούς χώρους του βκαροτένιου, µε αποτέλεσµα να προστατεύει τη χρωστική από την οξείδωση. Οι Ciegler και συν. (1961) που µελέτησαν την επίδραση διαφόρων αντιοξειδωτικών στη σταθερότητα του µορίου του βκαροτένιου, βρήκαν ότι η προσθήκη των ουσιών 6αιθοξυ2,2,4 τριµεθυλο1,2διυδροκινολίνης (Santoquin) ή βουτυλιωµένου υδροξυτολουόλιου (BHT) σε συγκέντρωση 0,25 % (w/v) εξασφαλίζει σε µεγάλο βαθµό τη σταθερότητα της χρωστικής. Οι διαφορές ως προς την άριστη συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού στο υπόστρωµα, µπορούν να ερµηνευτούν ως αποτέλεσµα της διαφορετικής συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της διαφορετικής χηµικής σύστασης του υποστρώµατος και των διαφορετικών στελεχών που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή της χρωστικής. 155

192 Η συνεργιστική δράση του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στη συγκέντρωση του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου περιγράφονται στο Σχήµα Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα, στο οποίο είχε προστεθεί 10,0 g/l αντιοξειδωτικό, χωρίς την παρουσία λιπαρής ουσίας, παρατηρήθηκε αναστολή τόσο της ανάπτυξης του µικροοργανισµού όσο και της σύνθεσης του βκαροτένιου. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στη διατάραξη της ισορροπίας και της φυσιολογικής λειτουργίας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού λόγω της αντίδρασης του αντιοξειδωτικού µε τα δοµικά συστατικά της κυτταρικής µεµβράνης (λιπίδια και πρωτείνες), µε αποτέλεσµα την υπερβολική διαρροή µεταβολιτών και ενζύµων από το κύτταρο και τελικά τη θανάτωση του µικροοργανισµού. Τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης του µικροοργανισµού που σχολιάζονται στην παράγραφο (Πίνακας ) δείχνουν ότι το ποσοστό των κατεστραµµένων κυττάρων της συζευγµένης καλλιέργειας αυξάνεται σηµαντικά στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτύσσεται σε υπόστρωµα που περιέχει αντιοξειδωτικό χωρίς την παρουσία λιπαρής φάσης. Αντίθετα, στην περίπτωση που στο υπόστρωµα προστέθηκε µίγµα 20,0 g/l λινελαϊκού οξέος και 10,0 g/l αντιοξειδωτικού η συγκέντρωση του β καροτένιου και της βιοµάζας εµφανιζόταν σηµαντικά αυξηµένη (1950,0 mg/l και 36,2 g/l, αντίστοιχα). Όσον αφορά τη δράση του λινελαϊκού οξέος στη µείωση της αντιµικροβιακής δράσης του BHT, αυτό µπορεί να αποδοθεί σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται µεταξύ του λινελαϊκού οξέος και του BHT. Η παρεµπόδιση της αντιµικροβιακής δράσης των φαινολικών αντιοξειδωτικών από τα λίπη και τις πρωτείνες έχει αναφερθεί στο παρελθόν από πολλούς ερευνητές (Rico Munoz and Davidson 1983, Shelef και συν. 1984, Tassou and Nychas, 1994). Επίσης, η συνεργιστική δράση του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στην αύξηση της σταθερότητας της χρωστικής βασίζεται στη µεγάλη διαλυτοποίηση του αντιοξειδωτικού στο λινελαϊκό οξύ, έναντι της χαµηλής διαλυτότητας του στο νερό, µε αποτέλεσµα την καλύτερη διάχυση του µορίου του αντιοξειδωτικού στο εσωτερικό της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού και την αύξηση της δραστικότητας του. 156

193 Πίνακας Επίδραση του αντιοξειδωτικού στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Βιοµάζα Υπολειµµατικά Αντιοξειδωτικό βκαροτένιο ξηρό βάρος σάκχαρα (g/l) (mg/l) (g/l) (g/l) Βασικό Υπόστρωµα a 950,6 ± 38,03 35,4 ± 1,06 6,2 ± 0,25 2,5 1322,0 ± 52,88 35,8 ± 1,07 5,5 ± 0,22 5,0 1520,0 ± 60,80 36,0 ± 1,08 5,3 ± 0,21 10,0 1950,0 ± 78,00 36,2 ± 1,09 5,1 ± 0,20 15,0 792,5 ± 31,70 27,6 ± 0,83 8,5 ± 0,34 20,0 348,2 ± 13,93 12,3 ± 0,37 10,2 ± 0,41 a (g/l) : Γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, λινελαϊκό οξύ 20,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 157

194 âêáñïôýíéï (m g /l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g /l) ñüíïò (ç ì Ýñ åò) Σχήµα Επίδραση της συνεργιστικής δράσης του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες., και, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Στο βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στον Πίνακα προστέθηκε: και αντιοξειδωτικό 10,0 g/l, και µίγµα λινελαϊκού οξέος και αντιοξειδωτικού (20,0 και 10,0 g/l, αντίστοιχα). 158

195 Επίδραση των Ενεργοποιητών στην Παραγωγή βκαροτένιου Με δεδοµένο ότι τα ένζυµα που παίρνουν µέρος στη βιοσύνθεση του β καροτένιου είναι επαγόµενα (Feofilova και συν. 1976) και ότι το τρισπορικό οξύ επάγει την εκ νέου σύνθεση ενός ή περισσότερων από αυτά (Feofilova και συν. 1976, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977), πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές σε επίπεδο κωνικών φιαλών για να µελετηθεί η επίδραση της προσθήκης διαφόρων ουσιών παρόµοιας δοµής µε το µόριο του τρισπορικού οξέος στην ενεργοποίηση της σύνθεσης του βκαροτένιου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα , στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν σε υποστρώµατα που είχαν προστεθεί αιονόνη, βιονόνη, διµεθυλοφορµαµίδιο, κυκλοεξάνιο, κυκλοεξανόνη, 2,2,6τριµεθυλοκυκλοεξανόνη, υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος σε συγκεντρώσεις από 1,0 g/l έως 3,0 g/l, η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένη, έναντι της αντίστοιχης που αναπτυσσόταν απουσία των παραπάνω ουσιών. Το ποσοστό µείωσης που παρατηρήθηκε κυµαίνονταν µεταξύ 38,46% 94,94%, ανάλογα µε το είδος της ουσίας και τη συγκέντρωση της στο υπόστρωµα. Τα αποτελέσµατα αυτά έρχονται σε αντίθεση µε τα αποτελέσµατα άλλων ερευνητών που µελέτησαν την επίδραση των παραπάνω ουσιών και βρήκαν ότι αυξάνουν σηµαντικά την παραγωγή της χρωστικής από το B. trisporα. Οι Anderson και συν. (1958), Ciegler και συν. (1959a,b, 1963b), Ciegler (1965) και Ninet και Renaut (1979) βρήκαν ότι η προσθήκη 0,1% (w/v) βιονόνης στο υπόστρωµα αυξάνει την απόδοση του βκαροτένιου κατά 10 φορές. Επίσης, έχει βρεθεί ότι όµοια µε τη β ιονόνη και η αιονόνη διεγείρει την παραγωγή της χρωστικής από το µικροοργανισµό χωρίς να µεταβάλλει τη δοµή του τελικού προϊόντος (Ciegler και συν. 1959b). Οι Ninet και συν. (1969) και Atkinson και Mavituna (1985) βρήκαν ότι το διµεθυλοφορµαµίδιο, το αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος, το υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και το 2,6,6τριµεθυλο1ακετυλοκυκλοεξένιο σε συγκέντρωση 0,1% (w/v) αυξάνουν εξίσου σηµαντικά µε την α και βιονόνη την απόδοση του βκαροτένιου, ενώ παρουσιάζουν συνεργιστική δράση µε τις ιονόνες στην επαγωγή της παραγωγής της χρωστικής. Η διαφορά των αποτελεσµάτων της παρούσας εργασίας µε τα αποτελέσµατα των άλλων ερευνητών µπορεί να αποδοθεί στα διαφορετικά στελέχη, στο διαφορετικό σύστηµα ζύµωσης και στη διαφορετική χηµική σύσταση των υποστρωµάτων που χρησιµοποιήθηκαν για την παραγωγή του βκαροτένιου. Στην παρούσα εργασία, στην περίπτωση της καλλιέργειας που 159

196 αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα, το οποίο είχε επλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 10,0 g/l αντιοξειδωτικό, η υψηλή συγκέντρωση του βκαροτένιου που παρατηρείται (1950,0 mg/l) φανερώνει τη σύνθεση µεγάλης ποσότητας τρισπορικού οξέος κατά τη σύζευξη κυττάρων των στελεχών αντίθετου του µικροοργανισµού, το οποίο επάγει την παραγωγή της χρωστικής. Σε αυτή την περίπτωση, η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης τρισπορικού οξέος στα κύτταρα του µικροοργανισµού αναστέλλει την επαγωγική δράση των ουσιών αιονόνη, βιονόνη, διµεθυλοφορµαµίδιο, κυκλοεξάνιο, κυκλοεξανόνη, 2,2,6τριµεθυλοκυκλοεξανόνη, υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος που προσθέτονται στο υπόστρωµα µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, αφού το τρισπορικό οξύ δρά ανταγωνιστικά µε τις παραπάνω ενώσεις για την επαγωγή της σύνθεσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων που υπεισέρχονται στη µετατροπή του 5 φωσφοµεβαλονικού οξέος σε πυροφωσφορικό διµεθυλαλλύλιο (Rao και Modi 1977). Όπως και στην περίπτωση της δράσης του τρισπορικού οξέος, η επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων των παραπάνω ενζύµων παρουσία των ουσιών αιονόνη, β ιονόνη, διµεθυλοφορµαµίδιο, κυκλοεξάνιο, κυκλοεξανόνη, 2,2,6τριµεθυλοκυκλοεξανόνη, υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος εµπλέκει την αναστολή της δράσης της πρωτείνης καταστολέα IP, η οποία εµποδίζει τη µεταγραφή τους. Ο καταστολέας IP µετατρέπεται σε ενεργοποιητή µε τη δράση µίας ουδέτερης µεµβρανικής σερινοπρωτεάσης, τη σύνθεση της οποίας επάγουν οι ουσίες που προαναφέρθηκαν στο επίπεδο της µετάφρασης (Mehta και συν. 1981). Οι Rao και Modi (1977) που µελέτησαν την επίδραση της προσθήκης βιονόνης στην παραγωγή βκαροτένιου στα κύτταρα του B. trispora () που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε υψηλή συγκέντρωση τρισπορικού οξέος παρατήρησαν ότι η επαγωγική δράση της βιονόνης παρεµποδιζόταν από την ύπαρξη του τρισπορικού οξέος σε υψηλές συγκεντρώσεις στο υπόστρωµα. Αντίθετα, στις περιπτώσεις που η προσθήκη των ουσιών αιονόνη, βιονόνη, διµεθυλοφορµαµίδιο, κυκλοεξάνιο, κυκλοεξανόνη, 2,2,6τριµεθυλοκυκλοεξανόνη, υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος και αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος ευνοούσε την απόδοση του βκαροτένιου, είτε χρησιµοποιόταν µόνο το () στέλεχος του µικροοργανισµού, οπότε δεν παράγονταν καθόλου τρισπορικό οξύ, είτε η σύσταση του υποστρώµατος δεν ευνοούσε την εγγενή αναπαραγωγή των στελεχών αντίθετου φύλου του µικροοργανισµού και τη σύνθεση τρισπορικού οξέος. Οι Feofilova και Arbuzov (1975) βρήκαν ότι η επαγωγική δράση της βιονόνης αυξανόταν σηµαντικά (κατά τρείς φορές) στην 160

197 περίπτωση που µίγµα κυττάρων των (+) και () στελεχών του B. trispora αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που δεν περιείχε πηγή αζώτου (depleted medium), έναντι της αντίστοιχης σε πλήρες υπόστρωµα ανάπτυξης (fullvalued medium). Από τα αποτελέσµατα του Πίνακα φαίνεται ότι σε όλες τις περιπτώσεις η συγκέντρωση της βιοµάζας και το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων παρέµεναν σε σταθερά επίπεδα λόγω της προσθήκης των ουσιών τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, όταν έχει ολοκληρωθεί η φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Επίσης, η προσθήκη κηροζίνης στο υπόστρωµα αύξησε σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου από το µικροοργανισµό. Συγκεκριµένα, η αύξηση της συγκέντρωση της κηροζίνης από 10,0 g/l έως 40,0 g/l είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου και της βιοµάζας, ενώ σε συγκεντρώσεις µεγαλύτερες από 40,0 g/l παρατηρήθηκε µείωση των παραπάνω παραµέτρων της ζυµωτικής διεργασίας. Οι µέγιστες τιµές της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (2870,0 mg/l) και της βιοµάζας (42,0 g/l) εµφανίζονται στην περίπτωση που στο υπόστρωµα προστίθεται 40,0 g/l κηροζίνης (Πίνακας ). Η επαγωγική δράση της κηροζίνης µπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι δηµιουργεί νέους ενδοκυτταρικούς χώρους αποθήκευσης του βκαροτένιου, ώστε να ευνοείται η µεγαλύτερη παραγωγή της χρωστικής στο εσωτερικό των κυττάρων του µικροοργανισµού. Επιπλέον, αυξάνει τη διαπερατότητα της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού µε αποτέλεσµα την καλύτερη διάχυση των θρεπτικών συστατικών και των ενεργοποιητών της σύνθεσης του βκαροτένιου και του τρισπορικού οξέος στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας. Στο Σχήµα φαίνεται η συνεργιστική δράση του λινελαϊκού οξέος και της κηροζίνης στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή β καροτένιου. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.2.7, στην περίπτωση που η κηροζίνη προστέθηκε µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης σε υπόστρωµα που δεν είχε εµπλουτιστεί µε λινελαϊκό οξύ και αντιοξειδωτικό, παρατηρήθηκε αναστολή της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου και µείωση του ξηρού βάρους της βιοµάζας. Αυτό πιθανόν οφείλεται στο γεγονός ότι στην κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού η κηροζίνη συναγωνίζεται τις πρωτείνες στην αλληλεπίδραση µε τα λιπίδια προκαλώντας εξασθένιση ή καταστροφή των συστηµάτων που ελέγχουν τη διαπερατότητα της κυτταρικής µεµβράνης, µε αποτέλεσµα να παρατηρείται απελευθέρωση ενδοκυτταρικών συστατικών και τελικά να επέλθει θανάτωση του µικροοργανισµού. 161

198 Η παραπάνω υπόθεση υποστηρίζεται από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης του µικροοργανισµού που σχολιάζονται στην παράγραφο (Πίνακας ). Η τοξικότητα της κηροζίνης στην ανάπτυξη στελεχών της τάξης Mucorales έχει αναφερθεί και παλιότερα από τους Wemedo και συν. (2002). Αντίθετα, η επαγωγή της σύνθεσης του βκαροτένιου και της ανάπτυξης του µικροοργανισµού σε υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ, 10,0 g/l αντιοξειδωτικό και 40,0 g/l κηροζίνη πιθανόν οφείλεται στην παρεµπόδιση της αντιµικροβιακής δράσης της κηροζίνης από το λινελαϊκό οξύ λόγω των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων που αναπτυσσόταν µεταξύ των µορίων του λινελαϊκού οξέος και της κηροζίνης. Τα παραπάνω αποτελέσµατα έρχονται σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα των Ciegler και συν. (1962), οι οποίοι µελέτησαν την επίδραση της κηροζίνης στην παραγωγή β καροτένιου και βρήκαν ότι η προσθήκη κηροζίνης σε αναλογία 1:1 µε τα λιπαρά οξέα στο υπόστρωµα αυξάνει την παραγωγή βκαροτένιου. Οι παραπάνω διαφορές ως προς την άριστη αναλογία λινελαϊκού οξέος/κηροζίνης στο υπόστρωµα µπορούν να αποδοθούν στο διαφορετικό στέλεχος και στη διαφορετική χηµική σύσταση του υποστρώµατος που χρησιµοποιήθηκαν για την παραγωγή του βκαροτένιου. 162

199 Πίνακας Επίδραση διαφόρων ουσιών στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες. (Χρόνος ζύµωσης 8 ηµέρες). Πρόσθετη ουσία a (g/l) Βιοµάζα Υπολειµµατικά βκαροτένιο ξηρό βάρος σάκχαρα (mg/l) (g/l) (g/l) Βασικό υπόστρωµα b 1950,0 ± 78,00 36,2±1,09 5,1± 0,20 αιονόνη 1,0 2,0 3,0 517,8 ± 20,71 225,4 ± 9,02 98,7 ± 3,95 35,8 ± 1,07 34,4 ± 1,03 33,6 ± 1,01 5,2 ± 0,21 5,3 ± 0,21 5,5 ± 0,22 βιονόνη 1,0 2,0 3,0 585,6 ± 23,42 271,6 ± 10,86 130,7 ± 5,23 34,5 ± 1,04 33,9 ± 1,02 31,3 ± 0,94 5,3 ± 0,24 5,6 ± 0,25 5,7 ± 0,23 Κηροζίνη 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 2029,5 ± 81, ,0 ± 89, ,0 ± 98, ,0 ± 114, ,0 ± 70,00 40,5 ± 1,22 41,1 ± 1,23 41,5 ± 1,25 42,0 ± 1,26 39,5 ± 1,19 5,3 ± 0,21 5,4 ± 0,22 5,7 ± 0,23 5,9 ± 0,24 6,2 ± 0,25 ιµεθυλοφορµαµίδιο 1,0 367,5 ± 14,70 31,3 ± 0,94 5,6 ± 0,22 2,0 285,4 ± 11,40 30,8 ± 0,92 6,1 ± 0,24 3,0 150,2 ± 6,01 30,6 ± 0,92 6,3 ± 0,25 Κυκλοεξάνιο 1,0 473,6 ± 18,94 31,8 ± 0,95 5,3 ± 0,21 2,0 355,6 ± 14,22 31,5 ± 0,95 5,7 ± 0,23 3,0 208,2 ± 8,33 30,7 ± 0,92 6,2 ± 0,25 Κυκλοεξανόνη 1,0 715,0 ± 28,60 32,3 ± 0,97 6,1 ± 0,27 2,0 430,4 ± 17,22 31,5 ± 0,95 6,3 ± 0,28 3,0 265,5 ± 10,62 30,8 ± 0,92 6,5 ± 0,29 2,2,6Τριµεθυλοκυκλοεξανόνη 1,0 2,0 850,5 ± 34,02 720,6 ± 28,82 33,6 ± 1,01 32,2 ± 0,97 6,0 ± 0,24 6,3 ± 0,25 3,0 540,3 ± 21,61 31,6 ± 0,95 6,5 ± 0,29 Υδραζίδιο του ισονικοτινικού οξέος 1,0 2,0 1180,0 ± 47,20 920,3 ± 36,82 32,5 ± 0,98 31,5 ± 0,95 6,2 ± 0,25 6,4 ± 0,26 3,0 650,0 ± 26,00 30,4 ± 0,91 6,5 ± 0,29 Αζίδιο του ηλεκτρικού οξέος 1,0 3,0 5,0 1200,0 ± 48, ,0 ± 42,00 864,4 ± 34,58 35,5 ± 1,07 33,4 ± 1,00 32,3 ± 0,97 5,3 ± 0,21 5,7 ± 0,26 6,0 ± 0,27 a Η προσθήκη της ουσίας στο υπόστρωµα έγινε τη 2η ηµέρα της ζύµωσης b (g/l) : Γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, λινελαϊκό οξύ 20,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, αντιοξειδωτικό 10,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 163

200 âêáñïôýíéï (m g/l) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της συνεργιστικής δράσης του λινελαϊκού οξέος και της κηροζίνης, στην ανάπτυξη του B. trispora και την παραγωγή βκαροτένιου σε κωνικές φιάλες.,, και,, : βκαροτένιο και βιοµάζα ξηρό βάρος, αντίστοιχα. Στο βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στον Πίνακα προστέθηκε: και µίγµα λινελαϊκού οξέος 20,0 g/l και αντιοξειδωτικού 10,0 g/l, και κηροζίνη 40,0 g/l, και µίγµα λινελαϊκού οξέος 20,0 g/l, αντιοξειδωτικού 10,0 g/l και κηροζίνης 40,0 g/l. 164

201 Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος στη Μορφολογία του B. trispora Για τη µελέτη της επίδρασης της σύστασης του υποστρώµατος στη µορφολογία του B. trispora έγινε µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού που αναπτυσσόταν σε υποστρώµατα µε διαφορετική χηµική σύσταση, τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής β καροτένιου. Τα ποσοστά επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών (άθικτες µυκηλιακές υφές, µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα), των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας του µικροοργανισµού που υπολογίστηκαν για κάθε περίπτωση παρουσιάζονται στον Πίνακα Όπως φαίνεται στον Πίνακα , όταν ο µικροοργανισµός καλλιεργούνταν σε υπόστρωµα µε χαµηλή συγκέντρωση γλυκόζης (30,0 g/l), την 8 η ηµέρα της ζύµωσης (µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου) το αναπτυγµένο µυκήλιο αποτελούνταν κυρίως από άθικτες µυκηλιακές υφές (71,73% ξηρού βάρους βιοµάζας), ενώ το ποσοστό των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν 13,60%, 6,40% και 1,82%, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα ζυγοσπόρια που σχηµατίστηκαν και το βκαροτένιο που παρήχθηκε αντιστοιχούσαν σε ποσοστό 5,91% και 0,54% του συνολικού ξηρού βάρους της βιοµάζας, αντίστοιχα (Εικόνα 4.2.2a). Επίσης, φαίνεται ότι η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης στο υπόστρωµα από 30,0 g/l σε 50,0 g/l ευνόησε το σχηµατισµό ζυγοσπορίων (14,78% έναντι 5,91%) και την παραγωγή βκαροτένιου από το µικροοργανισµό (0,67% έναντι 0,54%), ενώ το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών αυξήθηκε ελαφρώς (76,22% έναντι 71,73%) (Πίνακας , Εικόνα 4.2.2b). Αντίθετα, παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων σε 6,24%, 1,76% και 0,33%, αντίστοιχα. Η εµφάνιση υψηλoύ ποσοστού κατεστραµµένων κυττάρων της καλλιέργειας σε χαµηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης οφείλεται στην ανεπαρκή προσθήκη γλυκόζης στο υπόστρωµα. Η έλλειψη διαθέσιµης πηγής άνθρακα και ενεργειακών αποθεµάτων µειώνει τις µεταβολικές δραστηριότητες του µικροοργανισµού, µε αποτέλεσµα την αδυναµία αυτού για συνέχιση της ανάπτυξης του και αύξηση των κυττάρων του, ενώ τα γηραιότερα κύτταρα καταστρέφονται µε συνέπεια την εµφάνιση µεγάλου αριθµού κυττάρων µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων στο τέλος της ζύµωσης. 165

202 Επιπλέον, o εµπλουτισµός του υποστρώµατος µε πρόσθετη πηγή αζώτου µε τη µορφή 80,0 g/l εκχυλίσµατος καλαµποκιού αύξησε τη συγκέντρωση των ζυγοσπορίων και του βκαροτένιου σε 22,17% και 0,81%, αντίστοιχα (Πίνακας , Εικόνα 4.2.1c). Αυτό το γεγονός µπορεί να αποδοθεί στην επαγωγική δράση του εκχυλίσµατος καλαµποκιού στη σύνθεση του βκαροτένιου και του τρισπορικού οξέος, το οποίο µε τη σειρά του επάγει την εγγενή αναπαραγωγή του µικροοργανισµού και την παραγωγή µεγαλύτερης ποσότητας βκαροτένιου. Σε αυτήν την περίπτωση τα ποσοστά των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών παρέµειναν σε σταθερά επίπεδα (µικρή µείωση), συγκριτικά µε τα αντίστοιχα ποσοστά στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν απουσία του εκχυλίσµατος καλαµποκιού (Πίνακας ). Στον Πίνακα φαίνεται ότι όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που δεν περιείχε τις επιφανειοδραστικές ουσίες Span 20 και Tween 80 η συγκέντρωση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των ζυγοσπορίων και του β καροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά χαµηλή (22,77%, 1,95% και 0,44%, αντίστοιχα). Αντίθετα, τα ποσοστά των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων αυξήθηκαν σηµαντικά, έναντι των αντίστοιχων ποσοστών στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν παρουσία των ουσιών Span 20 και Tween 80 (Πίνακας , Εικόνα 4.2.2c). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι απουσία των παραπάνω ουσιών ο µικροοργανισµός σχηµατίζει άµορφο συσσωµάτωµα µυκηλιακών υφών, σε αντίθεση µε την πλήρη διασπορά του µυκηλίου κατά την ανάπτυξη του σε υπόστρωµα µε Span 20 και Tween 80. Στο εσωτερικό των άµορφων µυκηλιακών συσσωµατωµάτων τα φαινόµενα διάχυσης των θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου είναι πολύ περιορισµένα, µε αποτέλεσµα τη µείωση του µεταβολισµού του µικροοργανισµού και την αδυναµία του για ανάπτυξη και αύξηση των κυττάρων του. Τα αποτελέσµατα µας συµφωνούν µε τους Kim και συν. (1997a) που αναφέρουν ότι στο εσωτερικό των άµορφων συσσωµατωµάτων του µικροοργανισµού το µεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων είναι νεκρά κύτταρα. Επιπλέον, η σηµαντική αύξηση της απόδοσης του βκαροτένιου και του ποσοστού των ζυγοσπορίων που παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε Span 20 και Tween 80 οφείλεται στην αύξηση της απόδοσης του τρισπορικού οξέος λόγω της αύξησης της διαπερατότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού και την καλύτερη διάχυση των προορµονών στα κύτταρα της συζευγµένης καλλιέργειας (Kim και συν. 1997b). 166

203 Στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που περιείχε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό χωρίς την παρουσία λιπαρής φάσης, το µεγαλύτερο ποσοστό του µυκηλίου εµφανιζόταν µε τη µορφή µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια (35,45%) (Πίνακας , Εικόνα 4.2.2d). Επίσης, το ποσοστό των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν υψηλό (28,52% και 10,48%, αντίστοιχα), σε αντίθεση µε το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου που ήταν πολύ χαµηλό (22,02%, 3,05% και 0,48%, αντίστοιχα). Τα παραπάνω αποτελέσµατα αποδίδονται στην τοξική δράση του αντιοξειδωτικού απουσία λιπαρής φάσης στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή της χρωστικής λόγω της διατάραξης της λειτουργίας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού µε συνέπεια την καταστροφή των κυττάρων. Αντίθετα, όπως φαίνεται στον Πίνακα , στις περιπτώσεις που το υπόστρωµα περιείχε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό και 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα φυτικών ελαίων (ελαιόλαδο, σογιέλαιο και βαµβακέλαιο) ή 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ, η συνεργιστική δράση του αντιοξειδωτικού µε τη λιπαρή φάση ευνόησε σε µεγάλο βαθµό το σχηµατισµό ζυγοσπορίων και την παραγωγή βκαροτένιου. Η µεγαλύτερη συγκέντρωση των ζυγοσπορίων (58,67%) και του βκαροτένιου (3,5%) παρατηρήθηκε στη δεύτερη περίπτωση (Εικόνα 4.2.2f). Όταν προσθέτονταν στο υπόστρωµα φυτικά έλαια το µεγαλύτερο ποσοστό του αναπτυγµένου µυκηλίου αποτελούνταν από άθικτες µυκηλιακές υφές (56,24%), ενώ το ποσοστό των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιο ήταν 36,95% και 2,23%, αντίστοιχα (Εικόνα 4.2.2e). Η επαγωγή της βλαστικής ανάπτυξης του µικροοργανισµού παρουσία των φυτικών ελαίων οφείλεται στους αυξητικούς παράγοντες που περιέχονται στα φυτικά έλαια, εκτός από το λινελαϊκό οξύ. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων εµφανιζόταν και στις δύο περιπτώσεις σηµαντικά χαµηλές (Πίνακας ). Η προσθήκη της κηροζίνης σε υπόστρωµα που δεν περιέχει λιπαρή φάση καταστέλλει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού µε συνέπεια την καταστροφή των κυττάρων του. Σε αυτή την περίπτωση όλη σχεδόν η µάζα του µυκηλίου εµφανιζόταν µε τη µορφή µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια (48,21%), κενών κυττάρων (30,69%) και εκχυλισµένων κυττάρων (18,36%), ενώ το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών, των ζυγοσπορίων και του βκαροτένιου ήταν αµελητέο (1,05%, 1,27% και 0,42%, αντίστοιχα) (Πίνακας , Εικόνα 4.2.2g). 167

204 Από τον Πίνακα φαίνεται ότι η µέγιστη συγκέντρωση των ζυγοσπορίων και του βκαροτένιου παρατηρήθηκε στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 50,0 g/l γλυκόζη, 80,0 g/l εκχύλισµα καλαµποκιού, 20,0 g/l λινελαϊκό οξύ, 40,0 g/l κηροζίνη και 10,0 g/l αντιοξειδωτικό (Εικόνα 4.2.2h). Σε αυτή την περίπτωση, το µεγαλύτερο ποσοστό της ξηρής βιοµάζας του µικροοργανισµού αντιστοιχούσε σε ζυγοσπόρια (79,84%) και το ποσοστό του βκαροτένιου (5,90%) ήταν σηµαντικά µεγαλύτερο, έναντι όλων των άλλων περιπτώσεων που αναφέρθηκαν παραπάνω. Αυτό οφείλεται κυρίως στην επαγωγή της εγγενούς αναπαραγωγής και της σύνθεσης του β καροτένιου από κάθε ένα συστατικό του υποστρώµατος χωριστά, σε συνδυασµό µε τη συνεργιστική επαγωγική τους δράση στους παραπάνω παράγοντες. Επίσης, φαίνεται ότι σε αυτή την περίπτωση το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων στο συνολικό ξηρό βάρος του µυκηλίου της καλλιέργειας ήταν πολύ χαµηλό. 168

205 Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας υποστρώµατα µε διαφορετική σύσταση (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας). Σύσταση (%, w/v) βκαροτένιο Άθικτες µυκηλιακές υφές Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια Κενά κύτταρα Εκφυλισµένα κύτταρα Ζυγοσπόρια Βασικό υπόστρωµα (B) a + 3,0 % γλυκόζη 0,54 71,73 13,60 6,40 1,82 5,91 Β + 5,0 % γλυκόζη 0,67 76,22 6,24 1,76 0,33 14,78 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού 0,81 69,30 5,87 1,55 0,30 22,17 Β (χωρίς Span 20 και Tween 80) + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού 0,44 22,77 35,35 23,67 15,82 1,95 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού + 0,25 % αντιοξειδωτικό 0,48 22,02 35,45 28,52 10,48 3,05 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού + 1,0 % ελαιόλαδο + 1,0 % σογιέλαιο + 1,0 % βαµβακέλαιο + 0,25 % αντιοξειδωτικό 2,23 56,24 3,28 1,12 0,18 36,95 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού + 2,0 % λινελαϊκό οξύ + 0,25 % αντιοξειδωτικό 3,50 34,84 2,05 0,84 0,10 58,67 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού + 4,0 % κηροζίνη 0,42 1,27 48,21 30,69 18,36 1,05 Β + 5,0 % γλυκόζη + 8,0 % εκχύλισµα καλαµποκιού + 2,0 % λινελαϊκό οξύ + 4,0 % κηροζίνη + 1,0 % αντιοξειδωτικό 5,90 12,42 1,25 0,53 0,06 79,84 a (g/l): υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. Θερµοκρασία 26 0 C, αρχικό ph υποστρώµατος 7, ταχύτητα ανακίνησης 200 rpm. 169

206 a b c d e f g h Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας υποστρώµατα µε διαφορετική σύσταση (µονάδα µήκους 50 µm). a, b: το βασικό υπόστρωµα εµπλουτίστηκε µε 3,0% και 5,0% γλυκόζη, αντίστοιχα. c: Το βασικό υπόστρωµα (χωρίς Span 20 και Tween 80) εµπλουτίστηκε µε 5,0% γλυκόζη και 8,0% εκχύλισµα καλαµποκιού. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0% γλυκόζη και 8,0% εκχύλισµα καλαµποκιού εµπλουτίστηκε µε 0,25% αντιοξειδωτικό (d), 3,0% ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 0,25% αντιοξειδωτικό (e), 2,0% λινελαϊκό οξύ και 0,25% αντιοξειδωτικό (f), 4,0% κηροζίνη (g) και 2,0% λινελαίκό οξύ, 4,0% κηροζίνη και 1,0% αντιοξειδωτικό (h). (Βασικό υπόστρωµα όπως περιγράφεται στον Πίνακα ). 170

207 Βελτιστοποίηση της Παραγωγής βκαροτένιου σε Ανακινούµενες Κωνικές Φιάλες. Η βελτιστοποίηση διαφόρων διαδικασιών µε τη µεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης αποτελεί κοινή πρακτική στη βιοτεχνολογία. Ωστόσο, το παραπάνω στατιστικό µοντέλο πρόβλεψης µπορεί να εφαρµοστεί αποτελεσµατικά όταν έχει αναγνωριστεί το εύρος των βέλτιστων τιµών µέσα στο οποίο θα λειτουργήσει µία συγκεκριµένη διαδικασία. Τότε, τα δεδοµένα των πειραµατικών δοκιµών του µοντέλου χρησιµοποιούνται για να περιγραφεί η απόκριση της υπό εξέταση µεταβλητής, µέσω µιας πολυωνυµικής εξίσωσης δευτέρου βαθµού και καθορίζεται µετά από µαθηµατική επεξεργασία ο συνδυασµός των άριστων τιµών των παραγόντων που επιδρούν στη µεταβλητή. Με βάση τις παραπάνω πληροφορίες και σε συνδυασµό µε τα αποτελέσµατα των πειραµατικών δοκιµών που περιγράφονται στις ενότητες , και επιλέχθηκε το εύρος των τιµών (Πίνακας 3.3.1) του λινελαϊκού οξέος (Χ 1 ), της κηροζίνης (Χ 2 ) και του αντιοξειδωτικού (Χ 3 ). Η ανάλυση διακύµανσης (ANOVA) για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (Πίνακας ) παρέχει πληροφορίες για την επάρκεια του µοντέλου, ως εξής: α) αν ο λόγος F για το µοντέλο είναι στατιστικώς σηµαντικός σε επίπεδο 5% και η τιµή της πιθανότητας (pvalue) του ελέγχου ολικής σηµαντικότητας του µοντέλου είναι χαµηλή (p<0,05), τότε το µοντέλο θεωρείται έγκυρο και ικανό να ερµηνεύσει την παραλλακτικότητα της απόκρισης, β) αν ο λόγος F για το σφάλµα προσαρµογής, το οποίο οφείλεται είτε σε παράλειψη µεταβλητών είτε σε χρήση µεταβλητών που δεν σχετίζονται µε την παραγωγή βκαροτένιου, είναι στατιστικώς σηµαντικός, τότε θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί ένα πολυπλοκότερο µοντέλο, στο οποίο θα περιλαµβάνονται υψηλότερου βαθµού παραγοντικές επιδράσεις (Box και συν. 1978, Neter και συν. 1996). Σύµφωνα µε τον Πίνακα , η υψηλή τιµή του συντελεστή προσδιορισµού R 2 δείχνει ότι οι όροι του µοντέλου (γραµµικές κύριες επιδράσεις, αλληλεπιδράσεις, τετραγωνικές κύριες επιδράσεις) ερµηνεύουν το 99,0 % της συνολικής διασποράς της µεταβλητής (συγκέντρωση βκαροτένιου). Επιπλέον, ο λόγος F για την παλινδρόµηση είναι στατιστικώς σηµαντικός σε επίπεδο 5% (p<0,05), ενώ ο λόγος F για το σφάλµα προσαρµογής δεν είναι στατιστικώς 171

208 σηµαντικός στο ίδιο επίπεδο (p>0,05). Άρα, το µοντέλο κρίνεται ότι µπορεί να ερµηνεύσει ικανοποιητικά τις επιδράσεις των τριών παραγόντων (λινελαϊκό οξύ, κηροζίνη, αντιοξειδωτικό) στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ανακινούµενες κωνικές φιάλες. Για την περιγραφή του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού χρησιµοποιήθηκε η παρακάτω µαθηµατική σχέση: 2 Y = 2,3922 0,2545 Χ 1 + 0,3733 Χ 2 0,4247 Χ 3 0,2874 Χ 1 0,3245 Χ 2 2 0,3315 Χ 2 3 0,0888 Χ 1 Χ 2 + 0,2212 Χ 1 Χ 3 (7) όπου Y είναι η εξαρτηµένη µεταβλητή και Χ 1, Χ 2, Χ 3 είναι οι κωδικοποιηµένες τιµές (από a έως +a) των ανεξάρτητων µεταβλητών (Πίνακας 3.3.1). Λαµβάνοντας υπ όψιν τα δεδοµένα του Πίνακα , όπου παρουσιάζονται οι εκτιµώµενοι συντελεστές του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης για την παραγωγή β καροτένιου, η εξίσωση (2) απλοποιήθηκε στη µορφή της εξίσωσης (7), µε την εξάλειψη του όρου Χ 2 Χ 3 που δεν ήταν στατιστικώς σηµαντικός. Στο διάγραµµα Pareto των τυποποιηµένων επιδράσεων (Pareto chart of the standardized effects) (Σχήµα 4.2.8) απεικονίζονται τα απόλυτα µεγέθη και η στατιστική σηµαντικότητα των κύριων γραµµικών επιδράσεων, των αλληλεπιδράσεων και των κύριων τετραγωνικών επιδράσεων των παραγόντων που µελετήθηκαν, στη µεταβλητή Y. Η κάθετη γραµµή στις στήλες του διαγράµµατος Pareto αντιστοιχεί στο ελάχιστο σηµαντικό µέγεθος των επιδράσεων (επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας 5%) και κάθε µία επίδραση µε µέγεθος που εκτείνεται πέρα από αυτή τη γραµµή θεωρείται στατιστικώς σηµαντική. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.2.8, υπάρχει ισχυρή θετική γραµµική συσχέτιση µεταξύ της κηροζίνης και της µεταβλητής Y, η οποία αποδίδεται στην επαγωγική δράση της κηροζίνης παρουσία του λινελαϊκού οξέος στη βιοσύνθεση του βκαροτένιου. Αντίθετα, το λινελαϊκό οξύ και το αντιοξειδωτικό εµφανίζουν σηµαντική αρνητική γραµµική επίδραση στη µεταβλητή Y. Το µέγεθος της αρνητικής επίδρασης του αντιοξειδωτικού στη συγκέντρωση του βκαροτένιου εµφανίζεται διπλάσιο του αντίστοιχου του λινελαϊκού οξέος λόγω της ισχυρής αντιµικροβιακής δράσης του πρώτου όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Επίσης, το λινελαϊκό οξύ, η κηροζίνη και το αντιοξειδωτικό έχουν παρόµοιου µεγέθους στατιστικώς σηµαντική αρνητική τετραγωνική επίδραση στη συγκέντρωση του βκαροτένιου. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώνεται, όταν οι 172

209 συγκεντρώσεις των τριών παραγόντων προσεγγίζουν τις µέγιστες τιµές τους λόγω της τοξικής δράσης που εµφανίζουν οι παραπάνω παράγοντες πάνω από ένα ορισµένο επίπεδο τιµών τους (Πίνακας 3.3.1). Επιπλέον, εµφανίζεται σηµαντική θετική αλληλεπίδραση του λινελαϊκού οξέος µε το αντιοξειδωτικό στη συγκέντρωση του βκαροτένιου λόγω της συνεργιστικής δράσης των δύο παραγόντων στην αύξηση της απόδοσης της χρωστικής. Αντίθετα, η µικρή αρνητική αλληλεπίδραση του λινελαϊκού οξέος µε την κηροζίνη στη µεταβλητή Y φανερώνει ότι η συνεργιστική δράση των παραπάνω παραγόντων στην αύξηση της συγκέντρωσης του β καροτένιου ευνοείται σε τιµές της κηροζίνης και του λινελαϊκού οξέος που βρίσκονται κοντά στο ανώτερο και κατώτερο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών τους, αντίστοιχα. Τέλος η αλληλεπίδραση της κηροζίνης µε το αντιοξειδωτικό δεν εµφανίζεται στατιστικώς σηµαντική και γι αυτό το λόγο δεν περιλαµβάνεται στην εξίσωση (7). Στα Σχήµατα 4.2.9, και παρουσιάζονται οι τρισδιάστατες απεικονίσεις της απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου για κάθε ζεύγος παραγόντων µε τον τρίτο παράγοντα να διατηρείται σταθερός στην άριστη τιµή του. Στο Σχήµα φαίνεται ότι η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξάνει µε την αύξηση της συγκέντρωσης της κηροζίνης και ότι πλησιάζει τη µέγιστη τιµή της όταν η συγκέντρωση της κηροζίνης λαµβάνει τιµές που βρίσκονται στο ανώτερο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών της. Για την ίδια συγκέντρωση της κηροζίνης, η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώνεται σηµαντικά, όταν η συγκέντρωση του λινελαϊκού οξέος µεταβάλλεται από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα ανώτερα. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην αναστολή της δράσης ενός ή περισσότερων ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου σε συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος µεγαλύτερες από 20,0 g/l λόγω του σχηµατισµού µεγάλης ποσότητας τοξικών προϊόντων αυτοξείδωσης του λιπαρού οξέος. Το Σχήµα δείχνει ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα ανώτερα µειώνει εξίσου σηµαντικά µε το λινελαϊκό οξύ τη συγκέντρωση του β καροτένιου, η οποία πλησιάζει τη µέγιστη τιµή της όταν η συγκέντρωση των παραπάνω παραγόντων λαµβάνουν τιµές που βρίσκονται στο κατώτερο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών τους. Επιπρόσθετα, στο Σχήµα φαίνεται ότι για την ίδια συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού, η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξάνεται συγχρόνως µε την αύξηση της συγκέντρωσης της κηροζίνης έως το επίπεδο των ανώτερων τιµών της και κατόπιν µειώνεται. 173

210 Οι επιφάνειες απόκρισης που απεικονίζονται στα παραπάνω σχήµατα έχουν τη µορφή λοφίσκου (Σχήµα 4.2.9, και ), διαθέτουν ένα µοναδικό µέγιστο απόκρισης και περιγράφονται από την πολυωνυµική εξίσωση: 2 Y = β 0 + β 1 C L + β 2 C K + β 3 C A + β 11 C L + β 22 C 2 K + β 33 C 2 A + β 12 C L C K + β 13 C L C A + β 23 C K C A (8), όπου Y είναι η εκτίµηση της πραγµατικής τιµής της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (g/l), C L, C K και C A είναι οι πραγµατικές τιµές της συγκέντρωσης του λινελαϊκού oξέος (g/l), της συγκέντρωσης της κηροζίνης (g/l) και της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού (g/l), αντίστοιχα και β ο, β 1, β 2, β 3, β 11, β 22, β 33, β 12, β 13, β 23 είναι οι µερικοί συντελεστές της πολυωνυµικής εξίσωσης που εκτιµήθηκαν εφαρµόζοντας την τεχνική της ανάλυσης παλινδρόµησης χρησιµοποιώντας τις πραγµατικές τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών. Μετά την εκτίµηση των συντελεστών της εξίσωσης (8) και την εξάλειψη του όρου C K C A που δεν ήταν στατιστικώς σηµαντικός, αυτή απλοποιήθηκε στη µορφή: 2 Y = 3, ,107 C L + 0,253 C K + 0,168 C A 0,003 C L 0,003 C 2 2 K 0,013 C A 0,001 C L C K + 0,004 C L C A (9) Ο προσδιορισµός του συνδυασµού των τιµών των παραγόντων, ο οποίος επιτυγχάνει τη µέγιστη τιµή της απόκρισης, γίνεται µε τη χρήση της εξίσωσης (3) (παρ ): Xs = 1/2B 1 b * (3) όπου: β 11 β 12 /2 β 13 /2 β 1 β 12 /2 β 22 β 23 /2 B = b * = και β 13 /2 β 23 /2 β 33 β 3 β 2 β ο, β 1, β 2, β 3, β 11, β 22, β 33, β 12, β 13, β 23 είναι οι συντελεστές της πολυωνυµικής εξίσωσης (8). Μεταφέροντας τον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό τιµών των παραγόντων C L, C K και C A στην εξίσωση (9) και λύνοντας ως προς Υ προσδιορίζουµε την τιµή του µέγιστου της απόκρισης (Neter και συν. 1996). Μετά την εκτέλεση της παραπάνω µαθηµατικής επεξεργασίας προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του λινελαϊκού οξέος (C L = g/l), της κηροζίνης (C K = g/l) και του 174

211 αντιοξειδωτικού (C A = 9.04 g/l). Ο συνδυασµός των παραπάνω επιτυγχάνει τη µέγιστη παραγωγή του βκαροτένιου (2.88 g/l) από συνθετικό υπόστρωµα µε το B. trispora σε ανακινούµενες κωνικές φιάλες. Η παραπάνω πρόβλεψη για τη µέγιστη παραγωγή του βκαροτένιου που υπολογίστηκε µε την εξίσωση (9) βρέθηκε να είναι πολύ κοντά στην παραγωγή β καροτένιου που παρατηρήθηκε στο ανεξάρτητα απο το µοντέλο πείραµα που πραγµατοποιήθηκε στον άριστο συνδυασµό των τιµών των παραγόντων C L, C K και C A που αναφέρεται παραπάνω. Η διαφορά µεταξύ της παρατηρούµενης και της προβλεπόµενης συγκέντρωσης του παραγόµενου βκαροτένιου ήταν µικρότερη από 5% (Πίνακας ). 175

212 Πίνακα Ανάλυση διακύµανσης για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου. Πηγή Άθροισµα µεταβλητότητας β.ε. a τετραγώνων Μέσο τετράγωνο F b P R 2 = 0,990 Παλινδρόµηση Γραµµική Τετραγωνική 9 9, , ,67 0, , , ,68 0, , , ,67 0,000 Αλληλεπίδραση 3 0, , ,65 0,000 Υπόλειµµα 10 0, ,00974 Έλλειψη προσαρµογής 5 0, , ,47 0,785 Πειραµατικό σφάλµα 5 0, ,01323 Σύνολο 19 9,44912 a Βαθµοί ελευθερίας b Οι τιµές του F είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% 176

213 Πίνακας Εκτίµηση των µερικών συντελεστών του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού για τη συγκέντρωση του β καροτένιου. Όρος Συντελεστής T a P Σταθερά 2, ,427 0,000 Λινελαϊκό οξύ 0,2545 9,531 0,000 Κηροζίνη 0, ,979 0,000 Αντιοξειδωτικό 0, ,087 0,000 Λινελαϊκό οξύ x Λινελαϊκό οξύ 0, ,052 0,000 Κηροζίνη x Κηροζίνη 0, ,480 0,000 Αντιοξειδωτικό x Αντιοξειδωτικό 0, ,752 0,000 Λινελαϊκό οξύ x Κηροζίνη 0,0888 2,543 0,029 Λινελαϊκό οξύ x Αντιοξειδωτικό 0,2212 6,340 0,000 Κηροζίνη x Αντιοξειδωτικό 0,0187 0,537 0,603 a Οι τιµές του T είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% 177

214 p=0,05 (3)X3(L) 16,0874 (2)X2(L) 13,97878 X3(Q) 12,7523 X2(Q) 12,4803 X1(Q) 11,0524 (1)X1(L) 9, Lby3L 6, Lby2L 2, Lby3L 0, Εκτίµηση επίδρασης Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις του λινελαϊκού οξέος (Χ 1 ), της κηροζίνης (Χ 2 ) και του αντιοξειδωτικού (Χ 3 ) στη συγκέντρωση του β καροτένιου. 178

215 3,0 2,0 âêáñïôýíéï (g/l) 1,0 0,0 10,0 20,0 Ëéíåëáúêü ïîý (g/l) 30,0 40,0 50,0 20,0 10,0 50,0 40,0 30,0 Êçñïæßíç (g/l) Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος και κηροζίνης. (Συγκέντρωση αντιοξειδωτικού 9,04 g/l). 179

216 3,0 2,0 âêáñïôýíéï (g/l) 1,0 0,0 10,0 20,0 Ëéíåëáúêü ïîý (g/l) 30,0 40,0 50,0 5,0 15,0 25,0 Áíôéïîåéäùôéêü (g/l) Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωση του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος και αντιοξειδωτικού. (Συγκέντρωση κηροζίνης 39,25 g/l). 180

217 3,0 2,0 1,0 âêáñïôýíéï (g/l) 0,0 1,0 25,0 2,0 10,0 20,0 Êçñïæßíç (g/l) 30,0 40,0 50,0 5,0 15,0 Áíôéïîåéäùôéêü (g/l) Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κηροζίνης και αντιοξειδωτικού. (Συγκέντρωση λινελαϊκού οξέος 17,15 g/l). 181

218 Πίνακας Προβλεπόµενη (prd) και παρατηρούµενη (obs) µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες χρησιµοποιώντας συνθετικό υπόστρωµα που έχει εµπλουτιστεί µε τον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης και του αντιοξειδωτικού. Σύσταση (g/l) B a + 17,15 g/l λινελαϊκό οξύ + βκαροτένιο prd b (g/l) βκαροτένιο obs c (g/l) 39,25 g/l κηροζίνη + 2,880 2,815 9, 04 g/l αντιοξειδωτικό a (g/l): γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζείνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 (mg/l). b µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου προβλεπόµενη από την εξίσωση (9). c µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου µετά από 8 ηµέρες ζύµωσης. 182

219 4.3 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠO ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΣΥΝΕΧΗ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ ΣΕ ΖΥΜΩΤΗΡΑ ΑΝΑ ΕΥΣΗΣ Η κλιµάκωση των ζυµώσεων απαιτεί τη χρήση συγκεκριµένης µεθοδολογίας και κατάλληλων τεχνικών, οι οποίες αποβλέπουν στη µεταφορά σε επίπεδο παραγωγής των ζυµωτικών διεργασιών, που έχουν αναπτυχθεί σε µικρότερο επίπεδο. Κατά τη διαδικασία αυτή συχνά απαιτείται επαναπροσδιορισµός των συνθηκών µιας ζυµωτικής διεργασίας µέσω της άντλησης πρόσθετων πληροφοριών από το προηγούµενο επίπεδο εφαρµογής. Στην παρούσα µελέτη, οι πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν από τις προαναφερθείσες πειραµατικές δοκιµές, οι οποίες έγιναν σε επίπεδο κωνικών φιαλών και αφορούσαν τον προσδιορισµό των κατάλληλων συνθηκών της ζύµωσης και τη βελτιστοποίηση της σύστασης του υποστρώµατος, χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση ζυµώσεων στο επίπεδο του εργαστηριακού βιοαντιδραστήρα Επίδραση του Λινελαϊκού Οξέος και του Αντιοξειδωτικού στη Συγκέντρωση β Καροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Η επίδραση του λινελαϊκού οξέος, του αντιοξειδωτικού και η αλληλεπίδραση τους στη συγκέντρωση του βκαροτένιου, της βιοµάζας, των υπολειµµατικών σακχάρων, του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης παρουσιάζονται στα Σχήµατα 4.3.1, και Για τη µελέτη της επίδρασης των παραπάνω ουσιών στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης, το βασικό υπόστρωµα παραγωγής που περιγράφεται στην παράγραφο εµπλουτιζόταν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος, αντιοξειδωτικού, ή µιγµάτων των ουσιών αυτών. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.3.1a,b, όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό η συγκέντρωση του βκαροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά αυξηµένη, συγκριτικά µε την παραγωγή της χρωστικής απουσία των παραπάνω ουσιών (340,0 mg/l έναντι 45,7 mg/l). Σε αυτή την περίπτωση, η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξανόταν µε την αύξηση του χρόνου ζύµωσης µέχρι τη 14 η ηµέρα και στη συνέχεια µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Η απώλεια της χρωστικής µετά τη 14 η ηµέρα της ζύµωσης πιθανόν να οφείλεται στην οξείδωση του βκαροτένιου 183

220 από το µικροοργανισµό σε εποξείδια και άλλες ισοµερείς ενώσεις (Ciegler και συν. 1961, Chichester και Mcfeeters 1971). Περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος σε 10,0 g/l και 15,0 g/l στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό είχε ως αποτέλεσµα την παραγωγή 96,5 και 55,8 mg βκαροτένιου/l υποστρώµατος, αντίστοιχα, την 6 η ηµέρα της ζύµωσης, ενώ στη συνέχεια η συγκέντρωση της χρωστικής µειωνόταν µέχρι τη 10 η ηµέρα της ζύµωσης (Σχήµα 4.3.1b). Η σηµαντική µείωση της παραγωγής του βκαροτένιου και της διάρκειας της ζυµωτικής διεργασίας που παρατηρήθηκε µε την αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος από 5,0 g/l έως 15,0 g/l µπορεί να αποδοθεί στην τοξική δράση των προϊόντων αυτοξείδωσης του λινελαϊκού οξέος. Η υπεροξείδωση της λιπιδικής αλυσίδας σαν αποτέλεσµα αλληλεπίδρασης µε µοριακό οξυγόνο στις έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης στο ζυµωτήρα µπορεί να δηµιουργήσει ρίζες από λιπιδικά υδροξύλια, οξείδια και υπεροξείδια (Swern 1964, Nawar 1996). Η επαγωγή της δράσης των ελευθέρων ριζών στις παραπάνω συνθήκες πιθανόν προκαλεί αναστολή της δράσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του β καροτένιου, καταστροφή της δοµής του κυτταρικού DNA και άλλες κυτταροτοξικές δράσεις. Επιπλέον, η αύξηση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού από 2,5 g/l σε 5,0 g/l στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 5,0 g/l, 10,0 g/l ή 15,0 g/l λινελαϊκό οξύ οδήγησε σε σηµαντική µείωση της παραγωγής βκαροτένιου κατά 94,55%, 73,44% και 57,86%, αντίστοιχα. Σε αυτές τις περιπτώσεις η µέγιστη παραγωγή της χρωστικής παρατηρήθηκε την 4 η ηµέρα της ζύµωσης και κατόπιν µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας (Σχήµα 4.3.1b,c). Η τοξική δράση του αντιοξειδωτικού σε συγκέντρωση 5,0 g/l στην παραγωγή βκαροτένιου στο ζυµωτήρα ανάδευσης, σε αντίθεση µε την αύξηση της παραγωγής της χρωστικής µε την προσθήκη της ίδιας συγκέντρωσης αντιοξειδωτικού στο σύστηµα των κωνικών φιαλών, πιθανόν να οφείλεται στις έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης στο ζυµωτήρα, οι οποίες ευνοούν την καλύτερη διάχυση και τη συσσώρευση υψηλής συγκέντρωσης αντιοξειδωτικού στο εσωτερικό των κυττάρων, µε αποτέλεσµα την καταστολή των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού (Tassou και Nychas 1994). Όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε λινελαϊκό οξύ ή αντιοξειδωτικό σε συγκεντρώσεις που κυµαίνονταν µεταξύ 5,015,0 g/l και 2,55,0 g/l, αντίστοιχα, παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης καταστολή της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου (Σχήµα 4.3.1ac). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι υπάρχει συνεργιστική 184

221 επαγωγική δράση του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στην παραγωγή β καροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης, η οποία αποδίδεται στην προστασία του λινελαϊκού οξέος από οξείδωση παρουσία αντιοξειδωτικού.ιολογιθήκες υ Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα αυξανόταν µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια παρέµενε σε σταθερά επίπεδα µέχρι τη µέγιστη παραγωγή του βκαροτένιου. Όταν το βασικό υπόστρωµα εµπλουτιζόταν µε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό και 5,0, 10,0 ή 15,0 g/l λινελαϊκό οξύ, η συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού ήταν 7,9, 9,2 και 9,9 g/l, αντίστοιχα (Σχήµα 4.3.2b). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος από 5,0 g/l σε 15,0 g/l ευνοεί την ανάπτυξη του µικροοργανισµού, ενώ προκαλεί µείωση της παραγωγής του βκαροτένιου. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι στην πρώτη φάση της ζυµωτικής διεργασίας (growth phase), κατά την οποία αυξάνεται κυρίως η βιοµάζα του µικροοργανισµού, υπάρχει ισορροπία ανάµεσα στις ελεύθερες ρίζες που σχηµατίζονται και την αντιοξειδωτική άµυνα του µικροοργανισµού. Αντίθετα, στη δεύτερη φάση (production phase), κατά την οποία παράγεται το βκαροτένιο, η ισορροπία αυτή διαταράσσεται, µε συνέπεια την αδρανοποίηση των ενζύµων της βιοσύνθεσης του β καροτένιου και την καταστολή της βιοσύνθεσης της χρωστικής από την επαγωγή της δράσης των ελευθέρων ριζών. Σε µεγαλύτερη συγκέντρωση αντιοξειδωτικού (5,0 g/l) η βιοµάζα εµφανιζόταν µειωµένη, λόγω της τοξικής δράσης του αντιοξειδωτικού στη φυσιολογική λειτουργία της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις (Σχήµα 4.3.2c). Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 5,0, 10,0 και 15,0 g/l λινελαϊκού οξέος, χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικού, παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης της βιοµάζας κατά 18,57%, 35,71% και 50,0%, αντίστοιχα, λόγω της κυτταροτοξικής δράσης των προϊόντων οξείδωσης του λινελαϊκού οξέος (Σχήµα 4.3.2a). Επιπλέον, στις περιπτώσεις που στο βασικό υπόστρωµα προστέθηκε 2,5 g/l και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, χωρίς την προσθήκη λιπαρής φάσης, η συγκέντρωση της βιοµάζας ήταν πολύ µικρή (2,1 g/l). Αυτό µπορεί να αποδοθεί στη διατάραξη της ισορροπίας και της φυσιολογικής λειτουργίας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού από το αντιοξειδωτικό απουσία λιπαρής φάσης στο υπόστρωµα (Σχήµα 4.3.2b,c) (Tassou και Nychas 1994). Σε όλες τις περιπτώσεις, µετά τη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου η βιοµάζα του 185

222 µικροοργανισµού µειωνόταν ελαφρώς. Επιπροσθέτως, κατά τη διάρκεια της ζύµωσης παρατηρήθηκε σχηµατισµός υποκυτταρικών θέσεων µε κενοτόπια και σταδιακή εκφύλιση και καταστροφή των κυττάρων του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.3.2). Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.3.2, σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν κατά τη διάρκεια της ζύµωσης λόγω της αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου. Τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης η συγκέντρωση των σακχάρων στο υπόστρωµα µειωνόταν σηµαντικά, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων επιβραδύνονταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στη µεγάλη ανάπτυξη της βιοµάζας κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου παρατηρήθηκε υψηλό ποσοστό κατανάλωσης των αρχικών σακχάρων του υποστρώµατος από το µικροοργανισµό (70,0%95,8%), εκτός από τις περιπτώσεις που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που είχε προστεθεί 2,5 g/l και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό απουσία λιπαρής φάσης (14%,0) (Σχήµα 4.3.2b, c). Όπως ήταν αναµενόµενο, στις περιπτώσεις που η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων στο υπόστρωµα ήταν υψηλή, η ανάπτυξη του µικροοργανισµού και η παραγωγή βκαροτένιου ήταν πολύ χαµηλή. Η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού (12,035,0% του κορεσµένου), τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας, λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού (Σχήµα 4.3.3). Στις καλλιέργειες που παρατηρήθηκε µικρή ανάπτυξη η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης ήταν υψηλή (92% του κορεσµένου), λόγω του χαµηλού ρυθµού µεταβολισµού του µικροοργανισµού και πρόσληψης οξυγόνου από τα κύτταρα (Σχήµα 4.3.2b, c). Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης όπου συνεχίζονταν οι µεταβολικές δραστηριότητες του µικροοργανισµού και επάγονταν η παραγωγή βκαροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα. Η ελάχιστη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου αντιστοιχούσε στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση, λόγω του µεγάλου ποσοστού γηρασµένων και κατεστραµµένων κυττάρων της καλλιέργειας (Πίνακας 4.3.2). 186

223 Σε όλες τις περιπτώσεις, το ph του υγρού της ζύµωσης µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης, λόγω της παραγωγής οργανικών οξέων από το µεταβολισµό της γλυκόζης στη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και κυµαίνονταν µεταξύ 5,26,7. Η µεγαλύτερη πτώση του ph παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες που παρουσίαζαν τη µεγαλύτερη ανάπτυξη (Σχήµα 4.3.3). Στη συνέχεια, το ph αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Η αύξηση αυτή πιθανόν οφείλεται στην απαµίνωση των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού από το µικροοργανισµό και την παραγωγή αµµωνίας. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι το λινελαϊκό οξύ και το αντιοξειδωτικό σε συγκεντρώσεις 5,0 g/l και 2,5 g/l, αντίστοιχα, αυξάνουν σηµαντικά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. 187

224 50 a âêáñïôýíéï (mg/l) 350 b c ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού οξέος στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, : λινελαϊκό οξύ 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα. 188

225 25 a ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) b ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) 10 c ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού οξέος στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, και,,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα. 189

226 100 a 8 Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b c ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση του αντιοξειδωτικού και του λινελαϊκού οξέος στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,,, και,,, : διαλυτό οξυγόνο και ph σε συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος 0, 5,0, 10,0 και 15,0 g/l, αντίστοιχα. 190

227 4.3.2 Επίδραση της Κηροζίνης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Η επίδραση της κηροζίνης στη συγκέντρωση του βκαροτένιου, της βιοµάζας, των υπολειµµατικών σακχάρων, του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης παρουσιάζονται στα Σχήµατα και Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.3.4, η προσθήκη 5,0 g/l και 10,0 g/l κηροζίνης στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση της παραγωγής βκαροτένιου. Η µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου (110,0 mg/l) παρατηρήθηκε στην περίπτωση που η προσθήκη 5,0 g/l κηροζίνης στο υπόστρωµα έγινε την 6 η ηµέρα της ζύµωσης (Σχήµα c ). Σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα αυξανόταν µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια παρέµενε σε σταθερά επίπεδα µέχρι τη χρονική στιγµή της προσθήκης της κηροζίνης. Κατόπιν, η συγκέντρωση της βιοµάζας παρουσίαζε συνεχή µείωση µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Επιπλέον, µετά την προσθήκη της κηροζίνης στο υπόστρωµα παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των υποκυτταρικών θέσεων µε κενοτόπια και του ρυθµού εκφύλισης και καταστροφής των κυττάρων του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.3.2). Η κυτταροτοξική δράση της κηροζίνης και η αναστολή της παραγωγής της χρωστικής µπορεί να αποδοθεί στις έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης που επικρατούν στο ζυµωτήρα, οι οποίες διευκολύνουν τη διάχυση της κηροζίνης στα κύτταρα του µικροοργανισµού. Η αύξηση του ρυθµού µεταφοράς της κηροζίνης από το υγρό στα κύτταρα και η συσσώρευση υψηλής συγκέντρωσης αυτής στο εσωτερικό τους επιφέρει καταστροφή της ακεραιότητας της κυτταρικής µεµβράνης και αδρανοποίηση των ενζύµων της βιοσύνθεσης του β καροτένιου (Wemedo και συν. 2002). Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης λόγω της αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων επιβραδύνονταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Επίσης, το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων στις περιπτώσεις που στο υπόστρωµα είχε προστεθεί 5,0 g/l και 10,0 g/l κηροζίνη την 3 η ηµέρα της ζύµωσης µειώθηκε κατά 23,28% και 17,46%, έναντι του αντίστοιχου ποσοστού στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα απουσία κηροζίνης. Αυτό οφείλεται στην αναστολή των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού, λόγω της τοξικής δράσης της κηροζίνης. Αντίθετα, στην περίπτωση που η κηροζίνη προσθέτονταν στο υπόστρωµα την 6 η 191

228 ηµέρα της ζύµωσης το ποσοστό των υπολειµµατικών σακχάρων δεν µεταβλήθηκε σηµαντικά (Σχήµα 4.3.4c). Αυτό αποδίδεται στην κατανάλωση υψηλού ποσοστού σακχάρων από το µικροοργανισµό µέχρι την 6 η ηµέρα της ζύµωσης. Η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού (Σχήµα 4.3.5). Μετά τη φάση αυτή, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα µέχρι τη χρονική στιγµή της προσθήκης της κηροζίνης (3 η ή 6 η ηµέρα). Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση µέχρι το τέλος της ζύµωσης, που οφείλονταν στη γήρανση των κυττάρων (Σχήµα 4.3.5). Σε όλες τις περιπτώσεις, το ph του υγρού της ζύµωσης µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (Σχήµα 4.3.5). Στη συνέχεια, το ph αυξανόταν ελαφρώς µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι η προσθήκη του µίγµατος λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης και αντιοξειδωτικού στο υπόστρωµα δεν ευνόησε την παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης, σε αντίθεση µε τη σηµαντική αύξηση της απόδοσης της χρωστικής παρουσία των παραπάνω ουσιών στο σύστηµα των κωνικών φιαλών (παράγραφος ). Οι παραπάνω διαφορές µπορούν να αποδοθούν στις διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης του υποστρώµατος στα διαφορετικά συστήµατα ζύµωσης που επηρεάζουν σηµαντικά τόσο την ανάπτυξη του µικροοργανισµού όσο και την παραγωγή της χρωστικής. Όπως προαναφέρθηκε, οι έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης στο ζυµωτήρα ευνοούν το σχηµατισµό µεγάλης ποσότητας προϊόντων οξείδωσης του λινελαϊκού οξέος και µεγάλου αριθµού ελευθέρων ριζών µε τοξική δράση στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην παραγωγή της χρωστικής. Επίσης, η υψηλή ανάδευση και ο έντονος αερισµός διευκολύνουν τη διάχυση των µορίων του αντιοξειδωτικού και της κηροζίνης στο εσωτερικό των κυττάρων, µε αποτέλεσµα τη συσσώρευση υψηλών συγκεντρώσεων των παραπάνω ουσιών στα κύτταρα και την αναστολή των βασικών µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού και της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου από αυτές. Επιπλέον, η υψηλή συγκέντρωση διαλυτού οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης σε ζυµωτήρα ανάδευσης έχει ως αποτέλεσµα τη συνεχή 192

229 έκθεση του µικροοργανισµού σε υψηλά επίπεδα οξειδωτικού στρες, το οποίο µπορεί να επιφέρει καταστροφή ή λειτουργική αδρανοποίηση του γενετικού υλικού του µικροοργανισµού, καταστροφή των συστατικών της κυτταρικής µεµβράνης του και αδρανοποίηση των ενζύµων (Jeong και συν. 1999). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι το άριστο υπόστρωµα για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε κωνικές φιάλες δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την παραγωγή της χρωστικής από το µικροοργανισµό στο ζυµωτήρα ανάδευσης. 193

230 50 a âêáñïôýíéï (m g/l) 0 50 b ÂéïìÜæá îçñü âüñïò, ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) 125 c ñüíïò (çìýñåò) 0 Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό εµπλουτίστηκε µε κηροζίνη 5,0 g/l (a) και 10,0 g/l (b) την 3η ηµέρα της ζύµωσης και 5,0 g/l την 6η ηµέρα της ζύµωσης (c). βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα. προσθήκη κηροζίνης στο υπόστρωµα. 194

231 100 a Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b c ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Το βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό εµπλουτίστηκε µε κηροζίνη 5,0 g/l (a) και 10,0 g/l (b) την 3η ηµέρα της ζύµωσης και 5,0 g/l την 6η ηµέρα της ζύµωσης (c). διαλυτό οξυγόνο, ph. προσθήκη κηροζίνης στο υπόστρωµα. 195

232 4.3.3 Επίδραση των Φυτικών Ελαίων, του Αντιοξειδωτικού και της Κηροζίνης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Με σκοπό την αύξηση της παραγωγής βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης, το λινελαϊκό οξύ αντικαταστάθηκε από τα φυτικά έλαια ελαιόλαδο, σογιέλαιο και βαµβακέλαιο, τα οποία είναι πλούσια σε ακόρεστα λιπαρά οξέα. Για τη µελέτη της επίδρασης των παραπάνω φυτικών ελαίων στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην απόδοση του βκαροτένιου, πραγµατοποιήθηκαν ασυνεχείς ζυµώσεις σε ζυµωτήρα ανάδευσης χρησιµοποιώντας το βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στην παράγραφο 3.4.2, το οποίο εµπλουτίστηκε µε διαφορετικές συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου (15,0 g/l, 30,0 g/l και 45,0 g/l). Επίσης, µελετήθηκε η συνεργιστική δράση των φυτικών ελαίων, του αντιοξειδωτικού και της κηροζίνης στην παραγωγή της χρωστικής. Τα αποτελέσµατα της παραπάνω µελέτης παρουσιάζονται στα Σχήµατα 4.3.6, 4.3.7, και Όπως φαίνεται στο Σχήµα 4.3.6α, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 15,0 g/l, 30,0 g/l και 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου, η συγκέντρωση του παραγόµενου βκαροτένιου εµφανιζόταν αυξηµένη, έναντι της αντίστοιχης µε ζύµωση του βασικού υποστρώµατος χωρίς την προσθήκη φυτικών ελαίων (45,7 mg/l) (Σχήµα 4.3.1a). Η υψηλότερη συγκέντρωση του βκαροτένιου (760,0 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 20 ηµέρες ζύµωσης στο υπόστρωµα που περιείχε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα των παραπάνω φυτικών ελαίων, ενώ στην περίπτωση των υποστρωµάτων µε συγκέντρωση ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0 g/l και 45,0 g/l η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώθηκε κατά 23,58% και 49,29%, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στο Σχήµα 4.3.6b,c δείχνουν ότι υπάρχει επαγωγική συνεργιστική δράση των φυτικών ελαίων και του αντιοξειδωτικού στην παραγωγή βκαροτένιου. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.3.6b, η προσθήκη 2,5 g/l αντιοξειδωτικού στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 15,0 g/l, 30,0 g/l και 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου αύξησε την παραγωγή της χρωστικής κατά 45,09%, 51,52% και 49,23%, αντίστοιχα. Αντίθετα, η αύξηση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού από 2,5 g/l σε 5,0 g/l στα παραπάνω υποστρώµατα επέφερε σηµαντική µείωση της παραγωγής βκαροτένιου σε 630,0 mg/l, 1350,0 mg/l και 196

233 995,0 mg/l, αντίστοιχα (Σχήµα 4.3.6c). Αυτό οφείλεται στην τοξική δράση του αντιοξειδωτικού όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι η µέγιστη ποσότητα βκαροτένιου (1567,7 mg/l) παρήχθηκε µετά από 20 ηµέρες ζύµωσης του βασικού υποστρώµατος που περιείχε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Η µεγαλύτερη παραγωγή της χρωστικής στην παραπάνω περίπτωση, έναντι της αντίστοιχης µε την προσθήκη στο υπόστρωµα µίγµατος λινελαϊκού οξέος και αντιοξειδωτικού, πιθανόν οφείλεται στο διαφορετικό ρυθµό οξείδωσης και στα διαφορετικά προϊόντα οξείδωσης των λιπαρών οξέων στα φυτικά έλαια, λόγω της κατανοµής τους στα µόρια των ακυλογλυκερολών (το ποσοστό των ελεύθερων λιπαρών οξέων στα παραπάνω φυτικά ελαία κυµαίνεται µεταξύ 0,251,50%) και της παρουσίας άλλων συστατικών που συνοδεύουν τους εστέρες αυτούς στα φυτικά έλαια (Boskou 1989, Nawar 1996). Επιπλέον, η σηµαντική αύξηση της παραγωγής της χρωστικής παρουσία των παραπάνω φυτικών ελαίων µπορεί να αποδοθεί στην περιεκτικότητα τους και σε άλλα συστατικά, εκτός από τα ακόρεστα λιπαρά οξέα, που πιθανόν να ευνοούν τη σύνθεση της χρωστικής. Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα αυξανόταν µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια παρέµενε σε σταθερά επίπεδα µέχρι τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου. Κατόπιν, η βιοµάζα του µικροοργανισµού µειωνόταν ελαφρώς. Όταν το βασικό υπόστρωµα εµπλουτιζόταν µε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό και 15,0, 30,0 ή 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου, η συγκέντρωση της βιοµάζας ήταν 8,4 g/l, 9,04 g/l και 12,5 g/l, αντίστοιχα (Σχήµα 4.3.7b). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του µίγµατος των παραπάνω φυτικών ελαίων από 15,0 g/l έως 45,0 g/l ευνοεί την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα φυτικά έλαια είναι καλή πηγή άνθρακα και ενέργειας για την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου στο υπόστρωµα (45,0 g/l), το µεγαλύτερο ποσοστό των φυτικών ελαίων χρησιµοποιείται από το µικροοργανισµό για το σχηµατισµό βιοµάζας παρά για τη σύνθεση του βκαροτένιου. Σε µεγαλύτερη συγκέντρωση αντιοξειδωτικού (5,0 g/l) η βιοµάζα εµφανιζόταν µειωµένη, λόγω της κυτταροτοξικής δράσης του αντιοξειδωτικού όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο υπόστρωµα (Σχήµα 4.3.7c). Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε 197

234 εµπλουτιστεί µε 15,0, 30,0 και 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου, χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικού, παρατηρήθηκε µικρή µείωση της συγκέντρωσης της βιοµάζας κατά 6,31%, 11,5% και 12,8%, αντίστοιχα (Σχήµα 4.3.7a). Επιπλέον, σε όλες τις καλλιέργειες κατά τη διάρκεια της ζύµωσης παρατηρήθηκε σχηµατισµός υποκυτταρικών θέσεων µε κενοτόπια και σταδιακή εκφύλιση και καταστροφή των κυττάρων του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.3.2). Εντούτις, τα ποσοστά των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια και των κατεστραµµένων κυττάρων στις παραπάνω περιπτώσεις ήταν σηµαντικά µικρότερα από τα αντίστοιχα στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν σε υποστρώµατα που περιείχαν λινελαϊκό οξύ. Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις περιπτώσεις η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν κατά τη διάρκεια της ζύµωσης λόγω της αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου. Τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης η συγκέντρωση των σακχάρων στο υπόστρωµα µειωνόταν σηµαντικά, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων επιβραδύνονταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στη µεγάλη ανάπτυξη της βιοµάζας κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Σε όλες τις περιπτώσεις, στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης κατανάλωση των αρχικών σακχάρων του υποστρώµατος από το µικροοργανισµό (88,6%93,7%) (Σχήµα 4.3.7αc). Η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού (2235% του κορεσµένου), τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης (Σχήµα 4.3.8). Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι µετά τη φάση αυτή, όπου συνεχίζονταν οι µεταβολικές δραστηριότητες του µικροοργανισµού και επάγονταν η παραγωγή βκαροτένιου, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα. Η ελάχιστη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου αντιστοιχούσε στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση λόγω της προοδευτικής γήρανσης και θανάτωσης ενός µεγάλου ποσοστού κυττάρων της καλλιέργειας, µε αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού και της πρόσληψης οξυγόνου από τα κύτταρα (Πίνακας 4.3.2). Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις περιπτώσεις το ph του υγρού της ζύµωσης µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας λόγω της παραγωγής οργανικών οξέων. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα 198

235 της ζύµωσης και κυµαίνονταν µεταξύ 6,16,6. Η µεγαλύτερη πτώση του ph παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες που παρουσίαζαν τη µεγαλύτερη ανάπτυξη. Στη συνέχεια, το ph του υγρού της ζύµωσης εµφάνιζε αύξηση µέχρι το τέλος της ζύµωσης, πιθανόν λόγω της απαµίνωσης των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού από το µικροοργανισµό και της παραγωγής αµµωνίας. Από το Σχήµα 4.3.9a φαίνεται ότι η προσθήκη 5,0 g/l κηροζίνης την 3 η ηµέρα της ζύµωσης στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση της παραγωγής βκαροτένιου. Στην περίπτωση αυτή, η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (10,5 mg/l) και της βιοµάζας (9,04 g/l) παρατηρήθηκε τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια µειωνόταν συνεχώς µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Επίσης, από το Σχήµα 4.3.9a φαίνεται ότι η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης λόγω της αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων απο το µικροοργανισµό επιβραδύνονταν σηµαντικά µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων εµφανιζόταν ελαφρώς µειωµένο από το αντίστοιχο στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που δεν περιείχε κηροζίνη (83,6% έναντι 93,0%). Επιπλέον, όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.3.9b, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Μετά την προσθήκη της κηροζίνης στο υπόστρωµα η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου αυξανόταν µέχρι το τέλος τη ζυµωτικής διεργασίας λόγω της προοδευτικής εκφύλισης και καταστροφής των κυττάρων και τη µείωση των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.3.2). Επιπλέον, το ph του υγρού της ζύµωσης µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (Σχήµα 4.3.9a,b). Στη συνέχεια, το ph του υγρού της ζύµωσης αυξανόταν ελαφρώς µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Η κυτταροτοξική δράση της κηροζίνης και η αναστολή της παραγωγής β καροτένιου πιθανόν να οφείλεται, όπως προαναφέρθηκε, στην αύξηση του ρυθµού µεταφοράς της κηροζίνης από το υγρό στα κύτταρα, λόγω του έντονου αερισµού και ανάδευσης του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα ανάδευσης. Η συσσώρευση υψηλής 199

236 συγκέντρωσης κηροζίνης στο εσωτερικό τους επιφέρει καταστροφή της ακεραιότητας της κυτταρικής µεµβράνης και αδρανοποίηση των ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου (Wemedo και συν. 2002). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι ο εµπλουτισµός του υποστρώµατος µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό έχει ως αποτέλεσµα την παραγωγή υψηλής συγκέντρωσης β καροτένιου (1567,7 mg/l). Συγκρίνοντας τα αποτελέσµατα των ζυµώσεων στο ζυµωτήρα ανάδευσης και στις κωνικές φιάλες στην περίπτωση που το υπόστρωµα εµπλουτίστηκε µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου, παρατηρούµε ότι ενώ η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου στο σύστηµα του ζυµωτήρα είναι µεγαλύτερη από την αντίστοιχη στις κωνικές φιάλες (1567,7 έναντι 924,4 mg/l), η παραγωγικότητα της χρωστικής και η συγκέντρωση της βιοµάζας στο ζυµωτήρα (78,39 mg/l.d και 9,04 g/l, αντίστοιχα) είναι σηµαντικά µικρότερες, έναντι των τιµών των παραπάνω παραµέτρων στις κωνικές φιάλες (115,55 mg/l.d και 48,4 g/l, αντίστοιχα). Οι παραπάνω διαφορές στα δύο συστήµατα µπορεί να αποδοθούν στις συνθήκες αερισµού και ανάδευσης του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα ανάδευσης. Κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης, η ανάδευση και ο αερισµός του υγρού της ζύµωσης στο ζυµωτήρα αυξάνει το ρυθµό µεταφοράς οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών από το υγρό στα κύτταρα του µικροοργανισµού, εµποδίζει το σχηµατισµό συσσωµατωµάτων των κυττάρων του µικροοργανισµού, αυξάνει το ρυθµό µεταφοράς των µεταβολιτών του µικροοργανισµού από τα κύτταρα στο υγρό της ζύµωσης και διατηρεί οµοιόµορφη θερµοκρασία και σύσταση σε όλη τη µάζα του υγρού στο δοχείο του ζυµωτήρα (Ρουκάς 1995). Εντούτις, είναι πιθανόν οι εντονότερες συνθήκες αερισµoύ και ανάδευσης που επικρατούν στο ζυµωτήρα να ευνοούν την οξείδωση της χρωστικής και να οδηγούν σε υψηλούς ρυθµούς αναστολής της ανάπτυξης του µικροοργανισµού και µερική αυτόλυση των κυττάρων. Τα παραπάνω εξηγούνται και από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης των κυττάρων του µικροοργανισµού, όπου φαίνεται ότι το ποσοστό των κατεστραµµένων κυττάρων της καλλιέργειας που αναπτύσσεται σε ζυµωτήρα ανάδευσης είναι σηµαντικά µεγαλύτερο του αντίστοιχου ποσοστού στις κωνικές φιάλες (Πίνακες , 4.3.2). Σε προηγούµενες µελέτες για την παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου κυµαίνονταν µεταξύ 5,01000,0 mg/l ανάλογα µε τη σύσταση του υποστρώµατος και το µικροοργανισµό που 200

237 χρησιµοποιήθηκe (Ciegler και συν. 1963b, Ninet και Renaut 1979, Costa και συν. 1987, Shlomai και συν. 1991, Kim και συν. 1999, Bhosale και Gadre 2001a). 201

238 1600 a âêáñïôýíéï (m g/l) b c ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού και των φυτικών ελαίων στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, : ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα. 202

239 a ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) 0 25 b c ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) ñüíïò (çìýñåò) 0 Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης των φυτικών ελαίων και του αντιοξειδωτικού στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c: Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, και,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα. 203

240 100 a Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b c ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση του αντιοξειδωτικού και των φυτικών ελαίων στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c : Βασικό υπόστρωµα που περιέχει 0, 2,5 και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, αντίστοιχα.,, και,, : διαλυτό οξυγόνο και ph σε συγκεντρώσεις ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 0, 30,0 και 45,0 g/l, αντίστοιχα. 204

241 âêáñïôýíéï (m g/l) a ÂéïìÜæá îçñü âüñïò, ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της κηροζίνης στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. To βασικό υπόστρωµα που περιείχε 2,5 g/l αντιοξειδωτικό και 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου εµπλουτίστηκε µε 5,0 g/l κηροζίνη την 3 η ηµέρα της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα, διαλυτό οξυγόνο, ph. 205

242 4.3.4 Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora και της Παραγωγής βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης µε ιαφορετικά Υποστρώµατα Κατά τη διάρκεια του βιολογικού κύκλου του B. trispora ο θαλλός του µύκητα διαφοροποιείται σε βλαστικό και αναπαραγωγικό τµήµα. Το βλαστικό τµήµα βρίσκεται µε τη µορφή άθικτων µυκηλιακών υφών, µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων, ενώ επί του αναπαραγωγικού τµήµατος εµφανίζονται οι ζυγοφόροι που φέρουν τα όργανα αναπαραγωγής (γαµετάγγεια), από τα οποία µε συγχώνευση γενετικής ουσίας των πυρήνων τους προκύπτουν τα ζυγοσπόρια. Για τη µελέτη της επίδρασης της σύστασης του υποστρώµατος στη µορφολογία του B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση σε ζυµωτήρα ανάδευσης, έγινε µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού που αναπτυσσόταν σε υποστρώµατα µε διαφορετική χηµική σύσταση, κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Τα ποσοστά επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών παρουσιάζονται στον Πίνακα Επιπλέον, υπολογίστηκαν η µέγιστη συγκέντρωση και παραγωγικότητα του βκαροτένιου, η βιοµάζα και το ποσοστό των σακχάρων που καταναλώθηκαν στις ζυµώσεις των διαφορετικών υποστρωµάτων και συσχετίστηκαν µε τη µορφολογία του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.3.1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4.3.2, η καλλιέργεια που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης βρισκόταν κυρίως µε τη µορφή άθικτων µυκηλιακών υφών (96,30% ξηρού βάρους βιοµάζας), ενώ η περιεκτικότητα των ζυγοφόρων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας ήταν 3,55% και 0,15%, αντίστοιχα. Τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου (4 η ηµέρα ζύµωσης) το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών µειώθηκε σε 72,62%, ενώ το ποσοστό του µυκηλίου που εµφανιζόταν µε τη µορφή µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων ήταν 10,60%, 7,40% και 2,82%, αντίστοιχα. Την ίδια χρονική στιγµή η περιεκτικότητα των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου ήταν 5,91% και 0,65%, αντίστοιχα (Εικόνα 4.3.1a). Στο τέλος της ζύµωσης το µεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων ήταν µε τη µορφή κενών κυττάρων (89,67%). Επίσης, τα εκφυλισµένα κύτταρα εµφανιζόταν αυξηµένα κατά 26,56%, η περιεκτικότητα των ζυγοσπορίων δεν µεταβλήθηκε (5,91%), ενώ η περιεκτικότητα του βκαροτένιου 206

243 µειώθηκε ελαφρώς (0,58%). Επίσης, από τον Πίνακα φαίνεται ότι στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 5,0, 10,0 και 15,0 g/l λινελαϊκό οξύ, το ποσοστό των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης µειώθηκε κατά 79,15%, 85,35% και 91,55%, αντίστοιχα. Επιπλέον, στις παραπάνω περιπτώσεις τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου, τα ποσοστά των ζυγοσπορίων (1,22%, 1,05% και 0,83%, αντίστοιχα) και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου (0,17%, 0,14% και 0,10%, αντίστοιχα) στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας ήταν σηµαντικά µικρότερα από τα αντίστοιχα στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα χωρίς την προσθήκη λινελαϊκού οξέος (Εικόνα 4.3.1bd). Στο τέλος της ζύµωσης, σε όλες τις περιπτώσεις το µεγαλύτερο ποσοστό του µυκηλίου βρισκόταν µε τη µορφή κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων που κυµαίνονταν µεταξύ 80,9583,17% και 15,4618,12%, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.1, η µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου, η παραγωγικότητα, η βιοµάζα και το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων µειώθηκαν σηµαντικά όταν ο µικροοργανισµός αναπτυσσόταν σε υποστρώµατα που περιείχαν 5,0, 10,0 και 15,0 g/l λινελαϊκό οξύ, έναντι των αντίστοιχων τιµών των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης του βασικού υποστρώµατος που δεν περιείχε λινελαϊκό οξύ. Όταν το βασικό υπόστρωµα εµπλουτίστηκε µε 2,5 g/l και 5,0 g/l αντιοξειδωτικό, η περιεκτικότητα των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (0,12% και 0,05%, αντίστοιχα) και των ζυγοσπορίων την 4 η ηµέρα της ζύµωσης (0,25% και 0,09%, αντίστοιχα) ήταν πολύ χαµηλή (Πίνακας 4.3.2). Επίσης, στις παραπάνω περιπτώσεις παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζύµωσης, σε αντίθεση µε το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών που παρουσίαζε προοδευτική µείωση µέχρι το τέλος της ζύµωσης (Εικόνα 4.3.2). Το ελάχιστο ποσοστό των ζυγοσπορίων που παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα µε 5,0 g/l αντιοξειδωτικό αντιστοιχούσε στην ελάχιστη περιεκτικότητα του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου (0,01%) (Πίνακας 4.3.2). Σε αυτή την περίπτωση όλες οι κινητικές παράµετροι της ζύµωσης που υπολογίστηκαν ήταν σηµαντικά χαµηλές (Πίνακας 4.3.1). Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.2, ο εµπλουτισµός του υποστρώµατος µε 5,0, g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό αύξησε σηµαντικά το ποσοστό των ζυγοφόρων (7,32%) τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, και το ποσοστό των ζυγοσπορίων 207

244 (12,20%) και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου (4,53%) την 14 η ηµέρα της ζύµωσης (Εικόνα 4.3.3a). Σε αυτή την περίπτωση τα ποσοστά των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων εµφανιζόταν µειωµένα κατά 8,94% και 15,1%, αντίστοιχα, έναντι των αντίστοιχων ποσοστών στο µυκήλιο της καλλιέργειας που αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα. Η αύξηση του ποσοστού των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων που παρατηρήθηκε στην παραπάνω περίπτωση συνέπιπτε µε τη σηµαντική αύξηση της µέγιστης συγκέντρωσης και παραγωγικότητας του β καροτένιου (Πίνακας 4.3.1). Επίσης, από τον Πίνακα φαίνεται ότι η συγκέντρωση της βιοµάζας και το ποσοσό κατανάλωσης των σακχάρων εµφανιζόταν ελαφρώς αυξηµένα κατά 12,86% και 2,56%, αντίστοιχα. Σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις λινελαϊκού οξέος (10,0 και 15,0 g/l) και αντιοξειδωτικού (5,0 g/l) η περιεκτικότητα των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης µειωνόταν κατά 71,58% 88,52% (Πίνακας 4.3.2). Επίσης, στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου (4 η ή 6 η ηµέρα της ζύµωσης) το ποσοστό των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένα, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της περιεκτικότητας των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας (Εικόνα 4.3.3b). Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.1, η µέγιστη συγκέντρωση και παραγωγικότητα του βκαροτένιου µειωνόταν µε την αύξηση της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού στο υπόστρωµα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε µείωση της βιοµάζας και του ποσοστού των σακχάρων που καταναλώθηκαν µε την αύξηση της συγκέντρωσης των παραπάνω ουσιών. Τα αποτελέσµατα του Πίνακα δείχνουν ότι η προσθήκη 5,0 g/l και 10,0 g/l κηροζίνης την 3 η ηµέρα της ζύµωσης στο βασικό υπόστρωµα που περιείχε 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση της περιεκτικότητας των ζυγοσπορίων (κατά 92,21% και 93,93%, αντίστοιχα) και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου (κατά 93,16% και 94,26 %, αντίστοιχα). Επιπλέον, φαίνεται ότι η προσθήκη της κηροζίνης στο υπόστρωµα ευνοούσε το σχηµατισµό εκφυλισµένων κυττάρων (25,38%31,32% ξηρού βάρους βιοµάζας) (Εικόνα 4.3.4a). Όταν η κηροζίνη (5,0 g/l) προσθέτονταν την 6 η ηµέρα της ζύµωσης, στο τέλος της ζύµωσης το µεγαλύτερο ποσοστό του µυκηλίου αντιστοιχούσε σε κενά κύτταρα (50,67%), µυκηλιακές υφές µε κενοτόπια (25,43%) και εκφυλισµένα κύτταρα (20,76%), ενώ η περιεκτικότητα του µυκηλίου σε ζυγοσπόρια και β καροτένιο ήταν 2,55% και 0,59%, αντίστοιχα (Εικόνα 4.3.4b). Σε όλες τις 208

245 καλλιέργειες που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα που είχε προστεθεί κηροζίνη, οι κινητικές παράµετροι της ζύµωσης ήταν σηµαντικά µικρότερες από τις αντίστοιχες της ζύµωσης του υποστρώµατος που δεν περιείχε κηροζίνη (Πίνακας 4.3.1). Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.2, η αντικατάσταση του λινελαϊκού οξέος µε ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου στο υπόστρωµα οδήγησε σε σηµαντική αύξηση του ποσοστού των ζυγοφόρων, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου. Η µέγιστη περιεκτικότητα των παραπάνω παραµέτρων παρατηρήθηκε στην περίπτωση που ο µικροοργανισµός αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Στην περίπτωση αυτή, το ποσοστό των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης αντιστοιχούσε σε 30,88%, ενώ στη µέγιστη παραγωγή του βκαροτένιου το ποσοστό των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου ήταν 51,46% και 17,42%, αντίστοιχα (Πίνακας 4.3.2, Εικόνα 4.3.5a,b). Επίσης, στο τέλος της ζύµωσης το ποσοστό των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν χαµηλό (13,52% και 1,60%, αντίστοιχα). Από τον Πίνακα φαίνεται ότι οι µέγιστες τιµές των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης παρατηρήθηκαν στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα που είχε εµπλουτιστεί µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Στις περιπτώσεις των υποστρωµάτων µε συγκέντρωση ισοµοριακού µίγµατος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου 15,0 g/l και 45,0 g/l το ποσοστό των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης µειώθηκε κατά 50,45% και 64,22%, αντίστοιχα, το ποσοστό των ζυγοσπορίων τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής της χρωστικής (20 η ηµέρα ζύµωσης) µειώθηκε κατά 34,51% και 54,53%, αντίστοιχα και η µέγιστη περιεκτικότητα σε βκαροτένιο µειώθηκε κατά 23,48% και 62,92%, αντίστοιχα (Εικόνα 4.3.5c,d). Επιπλέον, στις παραπάνω περιπτώσεις παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων, έναντι των αντίστοιχων ποσοστών στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.2, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε 15,0 g/l, 30,0 g/l ή 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου χωρίς την προσθήκη αντιοξειδωτικού, το ποσοστό των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (10,55%, 17,30% και 8,95%, αντίστοιχα) και των 209

246 ζυγοσπορίων (20,50%, 35,50% και 15,55%, αντίστοιχα) και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου (7,81%, 9,50% και 3,76%, αντίστοιχα) την 20 η ηµέρα της ζύµωσης εµφανιζόταν µειωµένο. Στις παραπάνω περιπτώσεις, η περιεκτικότητα των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων κυµαίνονταν µεταξύ 19,33%25,64% και 1,97%4,32%, αντίστοιχα (Εικόνα 4.3.5e). Επίσης, όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.1, όλες οι κινητικές παράµετροι της ζύµωσης των υποστρωµάτων που περιείχαν µίγµα φυτικών ελαίων χωρίς την παρουσία αντιοξειδωτικού ήταν µικρότερες από τις αντίστοιχες της ζύµωσης των υποστρωµάτων που περιείχαν 15,0 g/l, 30,0 g/l ή 45,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικού (5,0 g/l) παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων και µείωση της περιεκτικότητας των ζυγοφόρων, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου σε αυτό (Εικόνα 4.3.5f). Η κυτταροτοξική δράση της κηροζίνης και η αναστολή της παραγωγής β καροτένιου από αυτή επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης της καλλιέργειας που αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό, στο οποίο προστέθηκαν 5,0 g/l κηροζίνης την 3 η ηµέρα της ζύµωσης. Από τον Πίνακα φαίνεται ότι η προσθήκη της κηροζίνης µείωσε κατά 89,97% την περιεκτικότητα των ζυγοσπορίων, ενώ ευνόησε σηµαντικά το σχηµατισµό κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων (71,03% και 23,66%, αντίστοιχα, την 20 η ηµέρα της ζύµωσης). Σε αυτή την περίπτωση οι τιµές της µέγιστης συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου, της βιοµάζας και του ποσοστού των σακχάρων που καταναλώθηκαν παρουσίαζαν σηµαντική µείωση, έναντι των αντίστοιχων τιµών στην περίπτωση που το υπόστρωµα δεν περιείχε κηροζίνη (Πίνακας 4.3.1). Το φαινόµενο της αυτόλυσης των κυττάρων έχει µελετηθεί παλιότερα από άλλους ερευνητές (Rober και συν. 1986, Klionsky και συν. 1990, Harvey και συν. 1998, White και συν. 2002). Οι παραπάνω ερευνητές αναφέρουν ότι οι σηµαντικότεροι παράγοντες που επιφέρουν καταστροφή των κυττάρων είναι η περιορισµένη συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών στο υπόστρωµα (starvation), η παρουσία τοξικών ουσιών ή προϊόντων µεταβολισµού, η δηµιουργία τοξικών ιόντων υδροξυλίων, υπεροξειδίων και υπεροξειδίου του υδρογόνου και η αύξηση της θερµοκρασίας κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Ανεξάρτητα από τα αίτια 210

247 που προκαλούν αυτόλυση των κυττάρων, αυτή λαµβάνει χώρα σε πολλά στάδια κατά τα οποία εµφανίζεται προοδευτική µείωση της µεταβολικής δραστηριότητας του µικροοργανισµού, δυσλειτουργία των βιολογικών µεµβρανών των κυττάρων, απουσία της διαµερισµατοποίησης στο εσωτερικό τους και δηµιουργία υποκυτταρικών θέσεων µε κενοτόπια, µε αποτέλεσµα τη σταδιακή εκφύλιση και καταστροφή των κυττάρων. Στην παρούσα εργασία, υψηλή περιεκτικότητα µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων στη συζευγµένη καλλιέργεια του B. trispora παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις που ο µικροοργανισµός αναπτυσσόταν στο βασικό υπόστρωµα ή στο υπόστρωµα που είχε εµπουτιστεί µε λινελαϊκό οξύ, αντιοξειδωτικό, µίγµα αυτών µε ή χωρίς την προσθήκη κηροζίνης και µε µίγµα φυτικών ελαίων, αντιοξειδωτικού και κηροζίνης (Εικόνα 4.3.6). Αυτό πιθανόν οφείλεται στην κυτταροτοξική δράση των παραπάνω ουσιών και των προϊόντων οξείδωσης τους που προκαλούν µοριακές ανακατατάξεις των δοµικών στοιχείων της κυτταρικής µεµβράνης και της µεγάλης συγκέντρωσης τοξικών ιόντων υδροξυλίων, υπεροξειδίων και υπεροξειδίου του υδρογόνου που παράγονται στο περιβάλλον µε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης στο ζυµωτήρα, τα οποία δρουν πάνω στα µεµβρανικά φωσφολιπίδια και τα καταστρέφουν. Επιπλέον, η έντονη αυτόλυση που παρατηρείται στις παραπάνω περιπτώσεις πιθανόν να οφείλεται στη δράση των αυτογενών λυτικών ενζύµων που υπάρχουν µέσα στο κύτταρο και προκαλούν τοπική λύση της κυτταρικής επιφάνειας που προχωρά βαθµιαία στο εσωτερικό των κυττάρων. Αντίθετα, στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υπόστρωµα µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό, το ποσοστό των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν χαµηλό. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στο διαφορετικό ρυθµό οξείδωσης και στα διαφορετικά προϊόντα οξείδωσης των λιπαρών οξέων των φυτικών ελαίων κατά τη διάρκεια της ζύµωσης. Σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε η µεγαλύτερη παραγωγή βκαροτένιου (1567,7 mg/l), η οποία συνέπιπτε µε το µεγαλύτερο ποσοστό ζυγοσπορίων (51,46%). 211

248 Πίνακας Μελέτη κινητικών παραµέτρων της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής. Κωδικός υποστρώµατος παραγωγής Σύσταση (%, w/v) Μέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου (mg/l) Παραγωγικότητα (mg/l.d) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) Κατανάλωση σακχάρων (%) 1 Βασικό υπόστρωµα (Β) a 45,80 ± 1,83 11,45 ± 0,46 7,0 ± 0,21 93,8 ± 1, Β + 0,5 % λινελαϊκό οξύ 9,50 ± 0,38 2,38 ± 0,09 5,7 ± 0,17 82,0 ± 1,64 Β + 1,0 % λινελαϊκό οξύ 6,50 ± 0,20 1,63 ± 0,07 4,5 ± 0,14 76,0 ± 1,52 Β + 1,5 % λινελαϊκό οξύ 3,50 ± 0,14 0,88 ± 0,04 3,5 ± 0,11 72,0 ± 1,44 Β + 0,25 % αντιοξειδωτικό 2,10 ± 0,08 0,53 ± 0,02 2,1 ± 0,06 14,0 ± 0,28 Β + 0,50 % αντιοξειδωτικό 0,20 ± 0,01 0,04 ± 0,001 2,1 ± 0,06 14,0 ± 0, B + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 0,5 % λινελαϊκό οξύ B + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 1,0 % λινελαϊκό οξύ B + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 1,5 % λινελαϊκό οξύ 340,00 ± 13,6 24,29 ± 0,97 7,9 ± 0,24 96,2 ± 1,93 96,40 ± 3,86 16,07 ± 0,64 9,2 ± 0,28 96,0 ± 1,92 55,80 ± 2,23 9,30 ± 0,37 9,9 ± 0,30 94,2 ± 1, b 14 b 15 c B + 0,5 % αντιοξειδωτικό + 0,5 % λινελαϊκό οξύ B + 0,5 % αντιοξειδωτικό + 1,0 % λινελαϊκό οξύ B + 0,5 % αντιοξειδωτικό + 1,5 % λινελαϊκό οξύ B + 0,5 % λινελαϊκό οξύ + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 0,5 % κηροζίνη B + 0,5 % λινελαϊκό οξύ + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 1,0 % κηροζίνη B + 0,5 % λινελαϊκό οξύ + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 0,5 % κηροζίνη 18,52 ± 0,74 4,63 ± 0,18 7,6 ± 0,23 95,2 ± 1,92 25,60 ± 1,02 6,40 ± 0,25 8,4 ± 0,25 93,2 ± 1,80 23,50 ± 0,94 5,88 ± 0,23 8,8 ± 0,26 90,0 ± 1,86 19,30 ± 0,77 4,83 ± 0,19 6,5 ± 0,20 94,8 ± 1,89 15,31 ± 0,61 3,83 ± 0,15 7,3 ± 0,22 94,2 ± 1,88 40,00 ± 1,60 6,67 ± 0,26 7,8 ± 0,23 95,4 ± 1, B + 0,5 % ελαιόλαδο + 0,5 % σογιέλαιο + 0,5 % βαµβακέλαιο B + 0,5% ελαιόλαδο + 0,5 % σογιέλαιο + 0,5 % βαµβακέλαιο + 0,25 % αντιοξειδωτικό B + 0,5% ελαιόλαδο + 0,5 %σογιέλαιο + 0,5 % βαµβακέλαιο + 0,50 % αντιοξειδωτικό 615,00 ± 24, ,00 ± 44,80 995,00 ± 39,80 30,75 ± 1,23 56,00 ± 2,24 49,75 ± 1,99 7,9 ± 0,23 8,4 ± 0,25 7,8 ± 0,23 88,7 ± 1,77 92,4 ± 1,85 92,0 ± 1, B + 1,0 % ελαιόλαδο + 1,0 % σογιέλαιο + 1,0 % βαµβακέλαιο B + 1,0% ελαιόλαδο + 1,0 % σογιέλαιο + 1,0 % βαµβακέλαιο + 0,25 % αντιοξειδωτικό B + 1,0% ελαιόλαδο + 1,0 %σογιέλαιο + 1,0 % βαµβακέλαιο + 0,50 % αντιοξειδωτικό 760,00 ± 30, ,70 ± 62, ,00 ± 54,00 38,00 ± 1,52 78,30 ± 3,13 67,50 ± 2,70 8,0 ± 0,24 9,0 ± 0,27 8,0 ± 0,24 89,0 ± 1,78 93,0 ± 1,86 92,4 ± 1, B + 1,5 % ελαιόλαδο + 1,5 % σογιέλαιο + 1,5 % βαµβακέλαιο B + 1,5% ελαιόλαδο + 1,5 % σογιέλαιο + 1,5 % βαµβακέλαιο + 0,25 % αντιοξειδωτικό B + 1,5% ελαιόλαδο + 1,5 % σογιέλαιο + 1,5 % βαµβακέλαιο + 0,50 % αντιοξειδωτικό 410,00 ± 16,40 807,64 ± 32,31 630,00 ± 25,20 20,50 ± 0,82 40,38 ± 1,61 31,50 ± 1,26 10,9 ± 0,33 12,5 ± 0,38 10,8 ± 0,32 91,0 ± 1,82 93,8 ± 1,88 93,2 ± 1,86 25 b B + 1,0 % ελαιόλαδο + 1,0 % σογιέλαιο + 1,0 % βαµβακέλαιο + 0,25 % αντιοξειδωτικό + 0,5 % κηροζίνη 30,37 ± 1,21 7,59 ± 0,30 9,5 ± 0,29 89,4 ± 1,79 a (g/l) : Γλυκόζη 50,0, εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0, υδρολυµένη καζεΐνη 2,0, εκχύλισµα ζύµης 1,0, Lασπαραγίνη 2,0, KH 2 PO 4 1,5, MgSO 4. 7H 2 0 0,5, Span 20 10,0, Tween 80 1,0, υδροχλωρική θειαµίνη 5,0 mg/l. b Η κηροζίνη προστέθηκε στο υπόστρωµα την 3η ηµέρα της ζύµωσης. c Η κηροζίνη προστέθηκε στο υπόστρωµα την 6η ηµέρα της ζύµωσης. 212

249 Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora κατά την παραγωγή β καροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα παραγωγής (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, µορφολογικών δοµών και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας). Υπόστρωµα Χρόνος παραγωγής ζύµωσης (ηµέρες) β καροτένιο 0,15 0,65 0,58 0,13 0,17 0,15 0,12 0,14 0,14 0,08 0,10 0,10 0,10 0,10 0,09 0,01 0,01 0,01 0,10 4,53 2,89 0,21 1,05 0,78 0,07 0,56 0,29 0,07 0,25 0,23 0,15 0,30 0,26 0,12 0,27 0,23 0,10 0,31 0,28 Άθικτες µυκηλιακές υφές 96,30 72,62 99,13 65,25 99,36 57,41 99,62 49,80 89,14 41,00 87,62 34,58 92,58 70,72 97,71 64,91 98,68 61,23 98,77 51,38 98,65 63,61 99,04 57,39 92,58 34,46 Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια 10,60 5,01 7,62 9,50 5,52 11,97 6,35 15,26 3,68 4,55 6,23 16,89 5,83 7,85 46,06 Κενά κύτταρα 7,40 89,67 17,45 83,17 21,33 81,94 25,45 80,95 3,84 30,26 76,14 4,22 32,83 74,43 6,73 81,65 15,68 81,83 18,36 83,17 12,11 76,50 17,11 82,46 20,32 80,23 1,94 73,39 Εκφυλισµένα κύτταρα 2,82 3,84 10,90 15,46 12,45 16,87 14,32 18,12 1,28 16,42 23,52 1,75 17,23 25,47 2,14 3,26 10,36 13,94 11,55 14,47 17,40 21,30 11,12 15,25 12,78 18,15 16,28 25,38 Ζυγοφόροι Ζυγοσπόρια 3,55 0,74 0,52 0,30 0,12 0,05 7,32 2,08 1,25 1,16 1,20 0,84 7,32 5,91 5,91 1,22 1,22 1,05 1,05 0,83 0,83 0,25 0,25 0,09 0,09 12,20 12,20 3,45 3,45 2,07 2,07 1,97 1,97 2,03 2,03 1,39 1,39 0,95 0,95 213

250 214 (συνέχεια Πίνακα 4.3.2). Υπόστρωµα παραγωγής Χρόνος ζύµωσης β καροτένιο Άθικτες µυκηλιακές υφές Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια Κενά κύτταρα Εκφυλισµένα κύτταρα Ζυγοφόροι Ζυγοσπόρια (ηµέρες) ,10 0,26 0,29 92,58 21,27 55,54 2,87 67,65 19,32 31,32 7,32 0,74 0, ,10 0,51 0,59 92,58 85,16 2,86 25,43 5,87 50,67 3,05 20,76 7,32 2,55 2, ,05 4,13 7,81 89,40 80,00 50,39 2,30 5,50 19,33 1,63 1,97 10,55 6,44 20, ,10 5,77 13,33 84,60 75,00 32,80 1,65 4,80 18,63 1,28 1,54 15,30 11,50 33, ,10 5,63 12,44 86,60 77,00 41,44 2,31 5,20 18,94 1,36 1,68 13,30 8,50 25, ,07 3,25 9,50 82,63 72,00 32,09 3,65 7,50 20,63 1,10 2,28 17,30 12,50 35, ,12 5,75 17,42 69,00 56,30 16,00 1,16 1,25 13,52 0,57 1,60 30,88 34,97 51, ,10 5,70 15,70 72,34 58,00 21,64 1,23 3,85 15,63 0,65 1,28 27,56 30,57 45, ,03 2,06 3,76 91,02 71,50 50,73 4,50 9,20 25,64 2,54 4,32 8,95 10,20 15, ,04 3,60 6,46 88,91 74,10 46,96 3,55 5,35 19,48 1,28 3,70 11,05 12,12 23, ,04 3,35 5,70 90,51 73,00 50,67 3,58 6,65 21,98 1,75 3,95 9,45 11,67 17, ,12 0,32 0,15 69,00 41,95 35,35 1,58 71,03 15,64 23,66 30,88 5,16 5,16

251 a b c d Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a, b, c, d: Υπόστρωµα παραγωγής 1, 2, 3 και 4, αντίστοιχα (όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1). 215

252 Εικόνα Απεικόνιση των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 6 µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης την 4 η ηµέρα της ζύµωσης. (Υπόστρωµα παραγωγής 6 όπως περιγράφεται στον Πίνακα 4.3.1, µονάδα µήκους 50 µm). 216

253 a b Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 7. b: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 8, 9, 10, 11 και 12. (Υποστρώµατα 7, 8, 9, 10, 11 και 12 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1). 217

254 α b Εικόνα Απεικόνιση εκφυλισµένων κυττάρων (α) και µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων (b) του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 14 (4 η ηµέρα ζύµωσης) και 15 (16 η ηµέρα ζύµωσης), αντίστοιχα, µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. (Υποστρώµατα 14 και 15 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1, µονάδα µήκους 50 µm).. 218

255 a b c d e f Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a, b: Ζυγοφόροι (2 η ηµέρα ζύµωσης) και ζυγοσπόρια (20 η ηµέρα ζύµωσης), αντίστοιχα, του B. trispora που αναπτύσσεται στο υπόστρωµα παραγωγής 20. c, d: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 17 και 23, αντίστοιχα, την 20 η ηµέρα της ζύµωσης. e, f: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα, εκφυλισµένα κύτταρα και ζυγοσπόρια του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα 22 και 24 αντίστοιχα, την 20 η ηµέρα της ζύµωσης. (Υποστρώµατα 17, 20, 22, 23 και 24 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1). 219

256 Εικόνα Απεικόνιση των ζυγοσπορίων, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων του B. trispora που αναπτύσσεται στα υποστρώµατα παραγωγής 2, 3, 7, 13 και 25 στο τέλος της ζύµωσης. (Υποστρώµατα 2, 3, 7, 13 και 25 όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.3.1). 220

257 4.3.5 Επίδραση του Ρυθµού Παροχής Αέρα και της Ταχύτητας Ανάδευσης στη Συγκέντρωση βκαροτένιου, Βιοµάζας, Σακχάρων, ιαλυτού Οξυγόνου, και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Για τη µελέτη της επίδρασης της παροχής αέρα στο υγρό της ζύµωσης και της ταχύτητας ανάδευσης στην παραγωγή βκαροτένιου και στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού πραγµατοποιήθηκαν ασυνεχείς ζυµώσεις σε ζυµωτήρα ανάδευσης ρυθµίζοντας τους παραπάνω παράγοντες σε διαφορετικές τιµές (ρυθµός παροχής αέρα: 0, 0,5, 1,0, 1,5 ή 2,0 vvm, ταχύτητα ανάδευσης: 0, 150, 325, 500 ή 700 rpm). Στα παραπάνω πειράµατα χρησιµοποιήθηκε το βασικό υπόστρωµα που περιγράφεται στην παράγραφο 3.4.2, το οποίο εµπλουτίστηκε µε 30,0 g/l ισοµοριακό µίγµα ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαµβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό. Η επίδραση του ρυθµού παροχής αέρα και της ταχύτητας ανάδευσης στην παραγωγή βκαροτένιου φαίνεται στο Σχήµα Όταν η ταχύτητα ανάδευσης έπαιρνε τιµές 150 και 325 rpm, η αύξηση της παροχής αέρα από 0,5 έως 1,5 vvm είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου κατά 99,17% και 73,33%, αντίστοιχα (Σχήµα b, c). Αυτό οφείλεται στην καλύτερη ανάµιξη του υγρού της ζύµωσης, µε συνέπεια τη διατήρηση οµοιόµορφης σύστασης του υποστρώµατος σε όλη τη µάζα του και την ύπαρξη διαβάθµισης συγκεντρώσεων των διαφόρων ουσιών και ιόντων µέσα και έξω από τα κύτταρα. Σε αυτές τις συνθήκες ευνοείται η καλύτερη διάχυση των θρεπτικών συστατικών και των ενεργοποιητών της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου στο εσωτερικό των κυττάρων, ενώ διευκολύνεται η αποµάκρυνση των τοξικών προϊόντων µεταβολισµού από τα κύτταρα στο υγρό της ζύµωσης. Στις παραπάνω περιπτώσεις, περαιτέρω αύξηση της παροχής αέρα σε 2,0 vvm µείωσε την παραγωγή βκαροτένιου κατά 23,39% και 21,35%, αντίστοιχα. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην οξείδωση του µορίου του β καροτένιου παρουσία υψηλής συγκέντρωσης οξυγόνου και στη συνοξείδωση του µε υδρουπεροξείδια των λιπαρών οξέων των φυτικών ελαίων (Πανέρας 1995). Όταν η ταχύτητα ανάδευσης έπερνε τιµές 500 και 700 rpm, η συγκέντρωση του β καροτένιου συνεχώς µειωνόταν µε την αύξηση της παροχής αέρα από 0,5 vvm σε 2,0 vvm (από 363,0 mg/l σε 260,0 mg/l και από 95,0 mg/l σε 50,0 mg/l, αντίστοιχα). Τα παραπάνω αποτελέσµατα µπορούν να αποδοθούν στην οξείδωση του βκαροτένιου σε υψηλές ταχύτητες ανάδευσης και υψηλούς ρυθµούς παροχής αέρα στο ζυµωτήρα. Επιπλέον, η µείωση της απόδοσης της χρωστικής πιθανόν να οφείλεται στη µειωµένη ικανότητα του µικροοργανισµού για εγγενή αναπαραγωγή σε υψηλές 221

258 ταχύτητες ανάδευσης του υποστρώµατος λόγω της αδυναµίας των γαµεταγγειακών κυττάρων να πλησιάσουν και να έρθουν σε επαφή. Η παραπάνω υπόθεση υποστηρίζεται από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης που περιγράφονται στην παράγραφο Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (1567,7 mg/l) παρατηρήθηκε µετά από 20 ηµέρες ζύµωσης στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε χαµηλή ταχύτητα ανάδευσης (150 rpm) και υψηλή παροχή αέρα (1,5 vvm). Στη συνέχεια, η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης λόγω της οξείδωσης του από το µικροοργανισµό σε εποξείδια και άλλες ισοµερείς ενώσεις (Ciegler και συν. 1961, Chichester και Mcfeeters 1971). Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν παρέχοντας αέρα στο υπόστρωµα χωρίς ανάδευση του υγρού της ζύµωσης ή το αντίστροφο, η συγκέντρωση του βκαροτένιου ήταν πολύ χαµηλή (Σχήµα ). Αυτό µπορεί να αποδοθεί στη συνεργιστική δράση του αερισµού και της ανάδευσης του υποστρώµατος στην επαγωγή της παραγωγής της χρωστικής. Ο κυριότερος παράγοντας που επηρεάζει την πρόσληψη οξυγόνου από τον αέρα στα κύτταρα του µικροοργανισµού είναι η ανάδευση του υγρού της ζύµωσης. Με την ανάδευση του υγρού αυξάνεται ο ρυθµός µεταφοράς οξυγόνου από τις φυσαλλίδες του αέρα στο υγρό της ζύµωσης, αυξάνεται ο ρυθµός µεταφοράς οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών από το υγρό στα κύτταρα του µικροοργανισµού, παρεµποδίζεται ο σχηµατισµός συσσωµατωµάτων των κυττάρων του µικροοργανισµού, προκαλείται διάσπαση των µεγάλων φυσαλλίδων του αέρα σε µικρές και διευκολύνεται η διάλυση του οξυγόνου, αυξάνεται ο ρυθµός µεταφοράς θερµότητας µεταξύ υγρού και θερµαινόµενης επιφάνειας του ζυµωτήρα, διατηρείται οµοιόµορφη η θερµοκρασία σε όλη τη µάζα του υγρού και αυξάνεται ο ρυθµός µεταφοράς των µεταβολιτών του µικροοργανισµού από τα κύτταρα στο υγρό της ζύµωσης (Ρουκάς 1995). Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι ανεξάρτητα από το ρυθµό παροχής αέρα στο ζυµωτήρα, ο χρόνος ζύµωσης µειωνόταν µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης. Αυτό σηµαίνει ότι η αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση του χρόνου που απαιτούνταν για την παραγωγή της µέγιστης συγκέντρωσης του βκαροτένιου και την αύξηση της παραγωγικότητας της χρωστικής. Η µεγαλύτερη παραγωγικότητα του βκαροτένιου σε υψηλότερες τιµές της ταχύτητας ανάδευσης πιθανόν να οφείλεται στην αύξηση του ρυθµού µεταφοράς των θρεπτικών συστατικών από το υγρό στα κύτταρα, όσο και των µεταβολιτών του µικροοργανισµού από τα κύτταρα στο υγρό της ζύµωσης, µε αποτέλεσµα την αύξηση του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριότητων του µικροοργανισµού. Η 222

259 µέγιστη παραγωγικότητα του βκαροτένιου (82,0 mg/l.d) παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε ταχύτητα ανάδευσης 500 rpm και παροχή αέρα 1,0 vvm µετά από 4 ηµέρες ζύµωσης. Τα αποτελέσµατα του Σχήµατος και του Πίνακα δείχνουν ότι σε χαµηλές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης και υψηλές τιµές της παροχής αέρα ευνοείται η παραγωγή υψηλής συγκέντρωσης βκαροτένιου, σε αντίθεση µε τη µεγάλη παραγωγικότητα της χρωστικής που ευνοείται όταν και οι δύο παράγοντες ρυθµίζονται σε υψηλές τιµές. Οι Ciegler και συν. (1963b) που µελέτησαν την παραγωγή βκαροτένιου από τo B. trispora NRRL 9216 και 9159 σε ζυµωτήρα ανάδευσης βρήκαν µέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου (1000,0 mg/l) σε ταχύτητα ανάδευση 300 rpm και παροχή αέρα 0,75 vvm. Οι Kim και συν. (1999) βρήκαν µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου 304 mg/l µε ταχύτητα ανάδευση 304 rpm και παροχή αέρα 1,5 vvm. Οι διαφορές των παραπάνω αποτελεσµάτων ως προς τις άριστες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης για την παραγωγή βκαροτένιου µπορούν να αποδοθούν σε διάφορους παράγοντες, όπως η διαφορετική σύσταση του υποστρώµατος, το διαφορετικό στέλεχος του µικροοργανισµού και ο διαφορετικός τύπος ζυµωτήρα που χρησιµοποιείται. Όπως φαίνεται από το Σχήµα b, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm η αύξηση της παροχής αέρα από 0,5 σε 1,0 και 1,5 vvm αύξησε τη συγκέντρωση της βιοµάζας κατά 13,77% και 17,40%, αντίστοιχα, ενώ σε µεγαλύτερες τιµές παροχής αέρα (2,0 vvm) η συγκέντρωση της βιοµάζας διατηρούνταν σε σταθερά επίπεδα. Αντίθετα, σε τιµές ταχύτητας ανάδευσης 325 και 500 rpm η συγκέντρωση της βιοµάζας αυξανόταν µε την αύξηση της παροχής αέρα από 0.5 σε 1,0 vvm κατά 15,53% και 16,30%, αντίστοιχα, ενώ σε µεγαλύτερους ρυθµούς παροχής αέρα εµφανιζόταν µειωµένη (Σχήµα c,d). Επιπλέον, περαιτέρω αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης σε 700 rpm µείωσε σηµαντικά τη συγκέντρωση της βιοµάζας (Σχήµα e). Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπυσσόταν µε µέτριες τιµές παροχής αέρα (1,0 vvm) και µε υψηλές τιµές ταχύτητας ανάδευσης (500 rpm). Γενικά, από τα αποτελέσµατα του Σχήµατος φαίνεται ότι η βιοµάζα αυξανόταν µε την αύξηση της παροχής αέρα και της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στο ότι ο B. trispora είναι αυστηρά αερόβιος µικροοργανισµός και το οξυγόνο που παρέχεται µε τον αέρα και την ανάµιξη του υγρού επηρεάζει την ανάπτυξη του µικροοργανισµού. Ο καλύτερος αερισµός του υποστρώµατος µε την αύξηση της παροχής αέρα και η καλύτερη επαφή 223

260 του µικροοργανισµού µε τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώµατος λόγω του τεµαχισµού του µυκηλίου σε µικρά κοµµάτια και της αύξησης της επιφάνειας του µυκηλίου µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης, σε συνδυασµό µε την καλύτερη µεταφορά του οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης σε ψηλότερη ταχύτητα ανάδευσης, είχαν ως αποτέλεσµα την αύξηση της βιοµάζας. Από το Σχήµα φαίνεται ότι σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα αυξανόταν µέχρι τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια παρέµενε σε σταθερά επίπεδα µέχρι τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου. Κατόπιν, η βιοµάζα του µικροοργανισµού µειωνόταν ελαφρώς. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του µικροοργανισµού (τις 2 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης) µε ταχύτητα ανάδευσης 150 και 325 rpm δεν παράγονταν β καροτένιο, ενώ στις περιπτώσεις που ο µικροοργανισµός αναπτυσσόταν µε ταχύτητα ανάδευσης 500 rpm παρατηρήθηκε µικρή παραγωγή βκαροτένιου κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Όπως ήταν αναµενόµενο, τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης η συγκέντρωση των σακχάρων στο υπόστρωµα µειωνόταν σηµαντικά, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων απο το µικροοργανισµό επιβραδύνονταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στη µεγάλη ανάπτυξη της βιοµάζας κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Σε όλες τις περιπτώσεις, στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση β καροτένιου παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης κατανάλωση των αρχικών σακχάρων του υποστρώµατος (80,0%94,0%) (Σχήµα ) (Πίνακας 4.3.3). Η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού, τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού (Σχήµα ). Μετά τη φάση αυτή, όπου συνεχίζονταν οι µεταβολικές δραστηριότητες του µικροοργανισµού και επάγονταν η παραγωγή β καροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα. Η ελάχιστη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου αντιστοιχούσε στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου. Όπως ήταν αναµενόµενο, η µεγαλύτερη µείωση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες που παρουσίαζαν τη µεγαλύτερη ανάπτυξη. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση, λόγω της µείωσης του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού και της πρόσληψης οξυγόνου από τα κύτταρα (Σχήµα ). 224

261 Όπως φαίνεται από το Σχήµα , σε όλες τις περιπτώσεις το ph του υγρού της ζύµωσης µειωνόταν τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας, λόγω της παραγωγής οργανικών οξέων από το µεταβολισµό της γλυκόζης στη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Η ελάχιστη τιµή του ph συνέπιπτε µε τη µεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιοµάζας του µικροοργανισµού τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και κυµαίνονταν µεταξύ 5,66,7. Η µεγαλύτερη πτώση του ph παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες που παρουσίαζαν τη µεγαλύτερη ανάπτυξη. Στη συνέχεια, το ph αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης, πιθανόν λόγω της απαµίνωσης των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού και την παραγωγή αµµωνίας. 225

262 a b âêáñïôýíéï (m g/l) c d e ñüíïò æýìù ó Þò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στην παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d, e : 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, : 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα. 226

263 ÂéïìÜæá îçñü âüñïò (g/l) 10 a ñüíïò (ç ì Ýñ åò) b c d e Õð ïëåéììáôéêü óüê áñá (g/l) Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d, e : 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, και,,,, : βιοµάζα ξηρό βάρος και υπολειµµατικά σάκχαρα σε συνθήκες αερισµού 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα. 227

264 100 a Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b c d ph e âêáñïôýíéï (m g/l) Σχήµα Επίδραση της ανάδευσης και του αερισµού στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d, e : 0, 150, 325, 500 και 700 rpm, αντίστοιχα.,,,, και,,,, : ph και συγκέντρωση διαλυτού οξυγόνου σε συνθήκες αερισµού 0, 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm, αντίστοιχα. 228

265 Πίνακας Μελέτη κινητικών παραµέτρων της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης. Αερισµός (vvm) Ταχύτητα ανάδευσης (rpm) Μέγιστη συγκέντρωση βκαροτένιου (mg/l) Παραγωγικότητα (mg/l.d) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) Κατανάλωση σακχάρων (%) ,0 ± 0,24 150,0 ± 6,00 220,4 ± 8,82 105,0 ± 4,20 1,00 ± 0,04 18,75 ± 0,75 36,73 ± 1,47 26,25 ± 1,05 5,0 ± 0,15 5,7 ± 0,17 6,2 ± 0,19 4,2 ± 0,13 81,0 ± 1,62 83,0 ± 1,66 84,0 ± 1,68 80,0 ± 1,60 0, ,5 ± 0,14 13,0 ± 0,52 245,7 ± 9,83 363,0 ± 14,52 95,0 ± 3,80 0,35 ± 0,02 2,17 ± 0,09 30,71 ± 1,23 57,95 ± 2,32 23,75 ± 0,95 6,8 ± 0,20 7,7 ± 0,23 10,7 ± 0,32 22,7 ± 0,68 6,5 ± 0,19 84,6 ± 1,69 89,0 ± 1,78 91,2 ± 1,82 92,0 ± 1,84 84,2 ± 1,68 1, ,0 ± 12,00 600,0 ± 24,00 394,3 ± 15,77 303,6 ± 12,14 82,0 ± 3,28 13,64 ± 0,55 41,38 ± 1,66 60,20 ± 2,41 82,00 ± 3,28 20,50 ± 0,82 7,9 ± 0,24 8,8 ± 0,26 12,3 ± 0,37 26,4 ± 0,79 7,7 ± 0,23 86,2 ± 1,72 91,4 ± 1,83 94,0 ± 1,88 94,0 ± 1,88 85,0 ± 1,70 1, ,0 ± 29, ,7 ± 62,71 921,4 ± 36,86 298,1 ± 11,92 70,0 ± 2,80 28,08 ± 1,12 79,50 ± 3,18 76,78 ± 3,07 74,53 ± 2,98 17,50 ± 0,70 8,3 ± 0,25 9,0 ± 0,27 11,5 ± 0,35 25,1 ± 0,75 7,5 ± 0,23 87,0 ± 1,74 93,0 ± 1,86 93,4 ± 1,87 93,8 ± 1,88 84,6 ± 1,69 2, ,0 ± 20, ,0 ± 59,20 850,0 ± 34,00 260,0 ± 10,40 50,0 ± 2,00 23,08 ± 0,92 74,00 ± 2,96 70,83 ± 2,83 65,00 ± 2,60 12,50 ± 0,50 8,1 ± 0,24 8,9 ± 0,27 11,0 ± 0,33 24,5 ± 0,74 7,3 ± 0,22 86,6 ± 1,73 92,8 ± 1,86 93,0 ± 1,86 93,4 ± 1,87 84,4 ± 1,69 229

266 4.3.6 Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την Παραγωγή βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης µε ιαφορετικές Συνθήκες Αερισµού και Ανάδευσης Για τη µελέτη της επίδρασης του ρυθµού παροχής αέρα και της ταχύτητας ανάδευσης στη µορφολογία του B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης έγινε µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου. Τα ποσοστά επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας που υπολογίστηκαν για κάθε περίπτωση παρουσιάζονται στον Πίνακα Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4.3.4, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε παροχή αέρα 0,5 και 1,0 vvm η αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από 150 έως 500 rpm είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση του ποσοστού των ζυγοσπορίων (Εικόνες 4.3.7a,b). Αντίθετα, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε παροχή αέρα 1,5 και 2,0 vvm το µεγαλύτερο ποσοστό των ζυγοσπορίων (51,46% και 49,50%, αντίστοιχα) εµφανιζόταν σε ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm, ενώ περαιτέρω αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης µέχρι 500 rpm είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση του αντίστοιχου ποσοστού (Εικόνες 4.3.7c,d). Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις που προαναφέρθηκαν παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση του µεγέθους των ζυγοσπορίων παράλληλα µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης µέχρι 500 rpm, ενώ όταν η ταχύτητα ανάδευσης ήταν 700 rpm το µέγεθος και το ποσοστό των ζυγοσπορίων εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένο (Εικόνες 4.3.7e,f). Όπως προαναφέρθηκε, αυτό πιθανόν να οφείλεται στην αδυναµία των γαµεταγγειακών κυττάρων να πλησιάσουν και να έρθουν σε επαφή σε υψηλές τιµές ανάδευσης του υποστρώµατος (700 rpm). Από τον Πίνακα φαίνεται ότι στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε παροχή αέρα 0,5 vvm η αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από 150 σε 325 rpm είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση του ποσοστού του βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας, ενώ στην καλλιέργεια µε ταχύτητα ανάδευσης 500 rpm παρατηρήθηκε µείωση του αντίστοιχου ποσοστού. Αυτό οφείλεται στο µεγαλύτερο ρυθµό αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού, έναντι του ρυθµού αύξησης της παραγωγής βκαροτένιου, µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από 325 σε 500 rpm (Πίνακας 4.3.3). Αντίθετα, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε παροχή 230

267 αέρα 1,0, 1,5 και 2,0 vvm παρατηρήθηκε συνεχής µείωση του ποσοστού του β καροτένιου µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από 150 σε 500 rpm. Τα παραπάνω αποτελέσµατα µπορούν να αποδοθούν στην οξείδωση του βκαροτένιου σε υψηλές ταχύτητες ανάδευσης και υψηλούς ρυθµούς παροχής αέρα. Επίσης, το ποσοστό του βκαροτένιου ήταν χαµηλό στις περιπτώσεις που οι καλλιέργειες αναπτυσσόταν µε παροχή αέρα 0,5, 1,0, 1,5 και 2,0 vvm και ταχύτητα ανάδευσης 700 rpm. Αυτό πιθανόν να οφείλεται τόσο στην οξείδωση της χρωστικής όσο και στο χαµηλό ποσοστό σύζευξης των αναπαραγωγικών οργάνων των δύο στελεχών σε υψηλές τιµές ανάδευσης του υποστρώµατος. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.3.4, το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε 0,5 και 1,0 vvm µειωνόταν µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από 150 σε 500 rpm (Εικόνες 4.3.7a,b) κυρίως λόγω της µεγάλης αύξησης του ποσοστού των ζυγοσπορίων που σχηµατίζονταν, ενώ όταν η ταχύτητα ανάδευσης ήταν 700 rpm το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών εµφανιζόταν αυξηµένο λόγω της µείωσης του ποσοστού των ζυγοσπορίων σε ψηλότερες ταχύτητες ανάδευσης (Εικόνα 4.3.7e). Αντίθετα, στις καλλιέργειες µε παροχή αέρα 1,5 και 2,0 vvm το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών αυξανόταν συνεχώς µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης απο 150 σε 700 rpm, λόγω της σηµαντικής µείωσης του ποσοστού των ζυγοσπορίων (Εικόνες 4.3.7c,d,f). Επιπλέον, τα αποτελέσµατα του Πίνακα δείχνουν ότι για την ίδια τιµή του ρυθµού παροχής αέρα το ποσοστό των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων αυξανόταν συνεχώς µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης από 150 σε 700 rpm (Εικόνες 4.3.7af). Αυτό µπορεί να αποδοθεί στην κυτταροτοξική δράση των τοξικών ιόντων υδροξυλίων, υπεροξειδίων και υπεροξειδίου του υδρογόνου που παράγονται σε µεγάλες ποσότητες στο περιβάλλον µε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης στο ζυµωτήρα, τα οποία δρουν πάνω στα φωσφολιπίδια της κυτταρικής µεµβράνης και τα καταστρέφουν. Επιπλέον, σε έντονες ταχύτητες ανάδευσης προκαλείται τραυµατισµός της κυτταρικής µεµβράνης και διαρροή κυτταρικών συστατικών, µε συνέπεια την καταστροφή των κυττάρων του µικροοργανισµού. Αντίθετα, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm παρατηρήθηκε µείωση του ποσοστού των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια µε την αύξηση της παροχής αέρα από 0,5 σε 1,5 vvm (Πίνακας 4.3.4, Εικόνες 4.3.5b, 4.3.7g) και του ποσοστού των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων µε την αύξηση της παροχής αέρα από 0,5 σε 1,0 vvm 231

268 (Πίνακας 4.3.4, Εικόνες 4.3.7a,g). Αυτό µπορεί να αποδοθεί στον καλύτερο αερισµό και στην καλύτερη ανάµιξη του υποστρώµατος, µε συνέπεια την καλύτερη διάχυση των θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου στο εσωτερικό των κυττάρων και την αύξηση του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού. Περαιτέρω αύξηση της παροχής αέρα σε 2,0 vvm είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση των ποσοστών των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων (Πίνακας 4.3.4, Εικόνα 4.3.7c). Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν παρέχοντας αέρα στο υπόστρωµα χωρίς ανάδευση ή το αντίστροφο, το µεγαλύτερο ποσοστό του µυκηλίου βρισκόταν κυρίως µε τη µορφή άθικτων µυκηλιακών υφών, ενώ το ποσοστό των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου ήταν σηµαντικά χαµηλά σε χαµηλές τιµές παροχής αέρα και ταχύτητας ανάδευσης και αυξανόταν µε την αύξηση των παραπάνω παραµέτρων (Πίνακας 4.3.4, Εικόνα 4.3.8a). Αντίθετα, η περιεκτικότητα των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια και των κενών κυττάρων µειωνόταν µε την αύξηση της παροχής αέρα µέχρι 1,5 vvm και αυξανόταν µε περαιτέρω αύξηση της παροχής αέρα σε 2,0 vvm, ενώ το ποσοστό των εκφυλισµένων κυττάρων αυξανόταν συνεχώς µε την αύξηση της παροχής αέρα µέχρι 2,0 vvm (Πίνακας 4.3.4, Εικόνα 4.3.8b). Αντίθετα, η συνεχής αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης µέχρι 700 rpm είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση του ποσοστού των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων (Πίνακας 4.3.4, Είκονα 4.3.8c). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι η µέγιστη περιεκτικότητα β καροτένιου (17,42%) συνέπιπτε µε το µέγιστο ποσοστό ζυγοσπορίων (51,46%) στην περίπτωση που η καλλιέργεια αναπτυσσόταν µε ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm και παροχή αέρα 1,5 vvm (Εικόνα 4.3.5b). Αυτό οφείλεται στην επαγωγή της εγγενούς αναπαραγωγής και του σχηµατισµού ζυγοσπορίων στις παραπάνω συνθήκες, µε συνέπεια την αύξηση της παραγωγής βκαροτένιου. Επίσης, φαίνεται ότι όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν σε υψηλή παροχή αέρα και χαµηλή ταχύτητα ανάδευσης ευνοούνταν ο σχηµατισµός µεγάλου αριθµού ζυγοσπορίων µε µέτριο µέγεθος (d zs = 14,16 µm) (Εικόνα 4.3.5b), ενώ σε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης του υποστρώµατος (2,0 vvm και 500 rpm) (Εικόνα 4.3.7d) ευνοούνταν ο σχηµατισµός µικρού αριθµού ζυγοσπορίων µε µεγάλο µέγεθος (d zs = 19,0 µm). Επιπλέον, η ανάπτυξη του µικροοργανισµού σε έντονες συνθήκες αερισµού και ανάδευσης 232

269 ευνοούσε το σχηµατισµό µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων (Εικόνα 4.3.7f). 233

270 Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας). Ταχύτητα β Άθικτες µυκηλιακές Μυκηλιακές υφές µε Κενά Εκφυλισµένα Ισοδύναµη διάµετρος Αερισµός ανάδευσης καροτένιο υφές κενοτόπια κύτταρα κύτταρα Ζυγοσπόρια ζυγοσπορίων (vvm) (rpm) (µm) 0 0,5 1,0 1,5 2, ,19 92,61 3,50 2,10 0,90 0,70 5, ,63 72,80 4,30 3,50 1,60 15,17 7, ,55 64,70 5,10 5,40 2,70 18,55 9, ,50 58,97 6,20 7,60 3,90 20,83 10,00 0 0,05 93,83 2,95 1,88 0,80 0,49 5, ,17 92,55 2,38 1,95 1,15 1,80 6, ,30 57,38 5,27 4,05 2,84 28,16 8, ,60 50,10 6,15 6,30 3,22 32,63 12, ,46 58,59 7,20 8,75 4,50 19,50 11,50 0 3,80 82,41 2,00 1,20 1,03 9,56 9, ,82 53,57 1,34 1,56 1,35 35,36 10, ,21 41,60 5,50 6,76 3,68 39,25 14, ,15 30,51 6,35 9,24 5,32 47,43 19, ,06 53,04 7,50 12,30 7,74 18,36 16,50 0 8,80 73,39 1,75 0,90 1,25 13,91 10, ,42 16,00 13,52 1,60 51,46 14, ,01 21,59 7,65 14,68 4,50 43,57 18, ,19 25,93 8,30 15,35 8,80 40,43 19, ,93 44,00 8,50 20,87 15,35 10,35 14,50 0 7,41 72,76 1,83 1,05 1,50 15,45 11, ,63 12,42 3,95 15,50 2,00 49,50 15, ,73 19,98 8,00 17,00 7,63 39,66 18, ,06 21,57 8,70 20,60 12,49 35,58 19, ,68 35,68 9,00 30,40 20,50 3,74 12,00 234

271 a b c d e f g Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου µε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικές συνθήκες αερισµού και ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: 1,0 vvm150 rpm, b: 1,0 vvm500 rpm, c: 2,0 vvm150 rpm, d: 2,0 vvm500 rpm, e: 1,0 vvm700 rpm, f: 2,0 rpm700 rpm και g: 0,5 vvm150 rpm. 235

272 a b c Εικόνα Απεικόνιση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των εκφυλισµένων κυττάρων και των ζυγοσπορίων του B. trispora στη µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a: 0,5 vvm 0 rpm ή 0 vvm150 rpm, b: 2,0 vvm0 rpm, c: 0 vvm700 rpm (µονάδα µήκους 50 µm). 236

273 4.3.7 Βελτιστοποίηση των Συνθηκών Αερισµού και Ανάδευσης για την Παραγωγή β Καροτένιου µε το B. trispora σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού σε Ζυµωτήρα Ανάδευσης Η βελτιστοποίηση των συνθηκών αερισµού και ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης, µε σκοπό την καλή ανάπτυξη του B. trispora και την υψηλή απόδοση του βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης, πραγµατοποιήθηκε µε την ανάπτυξη και την κατανόηση µοντέλων πρόβλεψης µε τη µεθοδολογία της επιφάνειας απόκρισης. Με βάση τις πληροφορίες που αναφέρονται στην παράγραφο , τα αποτελέσµατα των πειραµατικών δοκιµών που περιγράφονται στην ενότητα χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη τεσσάρων µαθηµατικών µοντέλων, τα οποία περιγράφουν, µέσω πολυωνυµικών εξισώσεων δευτέρου βαθµού, τη µεταβλητότητα της συγκέντρωσης (Y 1 ) και της παραγωγικότητας (Y 2 ) του βκαροτένιου, της συγκέντρωσης της βιοµάζας (Y 3 ) και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (Y 4 ) σε σχέση µε τις µεταβολές της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ). Το εύρος των τιµών της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα που εξετάστηκαν πειραµατικά περιγράφονται στον Πίνακα Η ανάλυση διακύµανσης (ANOVA) που έγινε για κάθε ένα µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης ξεχωριστά (Πίνακας 4.3.5AD), παρέχει πληροφορίες για την επάρκεια του µοντέλου, ως εξής: α) αν ο λόγος F για το µοντέλο είναι στατιστικώς σηµαντικός σε επίπεδο 5% και η τιµή της πιθανότητας (pvalue) του ελέγχου ολικής σηµαντικότητας του µοντέλου είναι χαµηλή (p<0,05), τότε το µοντέλο θεωρείται έγκυρο και ικανό να ερµηνεύσει την παραλλακτικότητα της απόκρισης, β) αν ο λόγος F για το σφάλµα προσαρµογής, το οποίο οφείλεται είτε σε παράλειψη µεταβλητών είτε σε χρήση µεταβλητών που δεν σχετίζονται µε την υπό εξέταση µεταβλητή, είναι στατιστικώς σηµαντικός, τότε θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί ένα πολυπλοκότερο µοντέλο, στο οποίο θα περιλαµβάνονται υψηλότερου βαθµού παραγοντικές επιδράσεις (Box και συν. 1978, Neter και συν. 1996). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του Πίνακα 4.3.5, η τιµή του συντελεστή προσδιορισµού R 2 για όλα τα µοντέλα είναι πολύ κοντά προς τη µονάδα (κυµαίνεται µεταξύ 0,982 και 0,995). Αυτό δείχνει ότι σχεδόν όλη η µεταβλητότητα των Y 1, Y 2, Y 3 και Y 4 οφείλεται στις σχέσεις που υπάρχουν µεταξύ των παραπάνω µεταβλητών 237

274 και των ανεξάρτητων µετβλητών Χ 1 και Χ 2. Επιπλέον, ο λόγος F για κάθε παλινδρόµηση είναι στατιστικώς σηµαντικός σε επίπεδο 5% (p<0,05), ενώ ο λόγος F για το σφάλµα προσαρµογής δεν είναι στατιστικώς σηµαντικός στο ίδιο επίπεδο (p>0,05). Άρα, τα µοντέλα κρίνονται ότι µπορούν να ερµηνεύσουν ικανοποιητικά τις επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα στη συγκέντρωση και την παραγωγικότητα του βκαροτένιου, στη συγκέντρωση της βιοµάζας και στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Για την περιγραφή των µοντέλων πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού χρησιµοποιήθηκαν οι παρακάτω µαθηµατικές σχέσεις: Για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου (Y 1 ): 2 Y 1 = 407,7 202,7 X ,9 X ,0 X 2 404,9 X 1 X 2 (10) Για την παραγωγικότητα του βκαροτένιου (Υ 2 ): 2 Y 2 = 60, ,33 X ,50 X 2 7,12 X 2 15,25 X 1 X 2 (11) Για τη συγκέντωση της βιοµάζας (Υ 3 ): Y 3 = 12, ,123 X 1 + 0,772 X 2 + 5,188 X 2 1 1,317 X 2 2 (12) Για τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας (Y 4 ): Y 4 = 0, ,09900 X 1 +0,06417 X 2 +0,05800 X ,01850 X ,041 X 1 X 2 (13) όπου Y i (i = 1, 2, 3, 4) είναι η εξαρτηµένη µεταβλητή και Χ 1, Χ 2 είναι οι κωδικοποιηµένες τιµές (από a έως +a) των ανεξάρτητων µεταβλητών (Πίνακας 3.4.2). Λαµβάνοντας υπ όψιν τα δεδοµένα του Πίνακα 4.3.6, όπου παρουσιάζονται οι εκτιµώµενοι συντελεστές των µοντέλων πολλαπλής παλινδρόµησης για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου, την παραγωγικότητα, τη συγκέντρωση της βιοµάζας και τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας, η εξίσωση (2) απλοποιήθηκε στη 2 µορφή των εξισώσεων (10), (11) και (12), µε την εξάλειψη του όρου Χ 1 για τις εξισώσεις (10) και (11) και του όρου Χ 1 Χ 2 για την εξίσωση (12), που δεν ήταν στατιστικώς σηµαντικοί. Αντίθετα, στην εξίσωση (13) συµπεριλαµβάνονται όλοι οι όροι της εξίσωσης (2) ως στατιστικώς σηµαντικοί. Στα Σχήµατα , , και (Pareto charts of the standardized effects) απεικονίζονται τα απόλυτα µεγέθη και η στατιστική σηµαντικότητα των κύριων γραµµικών επιδράσεων, των αλληλεπιδράσεων και των κύριων τετραγωνικών επιδράσεων των παραγόντων που µελετήθηκαν, στις µεταβλητές Y 1, Υ 2, Υ 3 και Υ 4, αντίστοιχα. Η κάθετη γραµµή στις στήλες του 238

275 διαγράµµατος Pareto αντιστοιχεί στο ελάχιστο σηµαντικό µέγεθος των επιδράσεων (επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας 5%) και κάθε µία επίδραση µε µέγεθος που εκτείνεται πέρα από αυτή τη γραµµή θεωρείται στατιστικώς σηµαντική. Όπως φαίνεται από τα Σχήµατα και 4.314, υπάρχει ισχυρή αρνητική γραµµική συσχέτιση µεταξύ της ταχύτητας ανάδευσης του υγρού της ζύµωσης και της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, σε αντίθεση µε τη σηµαντική θετική γραµµική επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου. Επιπλέον, ο ρυθµός παροχής αέρα εµφανίζει παρόµοιου µεγέθους στατιστικώς σηµαντική θετική επίδραση στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του β καροτένιου. Επίσης, φαίνεται ότι η τετραγωνική επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου δεν είναι σηµαντική και γι αυτό το λόγο δεν περιλαµβάνεται στις εξισώσεις (10) και (11). Αντίθετα, ο ρυθµός παροχής αέρα εµφανίζει στατιστικώς σηµαντική θετική ή αρνητική τετραγωνική επίδραση στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του β καροτένιου, αντίστοιχα (Σχήµα , ). Το γεγονός αυτό δείχνει ότι η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξάνεται σηµαντικά και η παραγωγικότητα του β καροτένιου µειώνεται σηµαντικά, όταν οι τιµές του ρυθµού παροχής αέρα προσεγγίζουν τις µέγιστες τιµές τους. Επιπλέον, εµφανίζεται αρνητική αλληλεπίδραση της ταχύτητας ανάδευσης µε το ρυθµό παροχής αέρα στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου, η οποία φανερώνει ότι η συγκέντρωση και η παραγωγικότητα µειώνονται όταν οι τιµές της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα προσεγγίζουν τις µέγιστες τιµές τους. Αυτό πιθανόν να οφείλεται τόσο στην οξείδωση της χρωστικής, όσο και στη µείωση της ικανότητας του µικροοργανισµού για εγγενή αναπαραγωγή σε υψηλές ταχύτητες ανάδευσης του υγρού ζύµωσης και υψηλούς ρυθµούς παροχής αέρα στο ζυµωτήρα. Όπως φαίνεται από τα Σχήµατα και , το µέγεθος της αλληλεπίδρασης µεταξύ της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα στη συγκέντρωση του βκαροτένιου είναι διπλάσια της αντίστοιχης αλληλεπίδρασης στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου. Από το Σχήµα φαίνεται ότι η συγκέντρωση της βιοµάζας επηρεάζεται σηµαντικά από την ταχύτητα ανάδευσης και τον ρυθµό παροχής αέρα. Συγκεκριµένα, εµφανίζεται ισχυρή θετική γραµµική και τετραγωνική επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στη βιοµάζα. Αυτό οφείλεται στην καλύτερη επαφή του µικροοργανισµού µε τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώµατος λόγω του τεµαχισµού του µυκηλίου σε µικρά κοµµάτια και της αύξησης της 239

276 επιφάνειας του µυκηλίου µε την αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης, σε συνδυασµό µε την καλύτερη µεταφορά του οξυγόνου στο υγρό της ζύµωσης σε ψηλότερες ταχύτητες ανάδευσης. Επιπλέον, υπάρχει ισχυρή θετική γραµµική επίδραση του ρυθµού παροχής αέρα στη συγκέντρωση της βιοµάζας, η οποία είναι σηµαντικά µικρότερη σε µέγεθος από την αντίστοιχη της ταχύτητας ανάδευσης. Αντίθετα, υπάρχει µικρή αρνητική τετραγωνική επίδραση του ρυθµού παροχής αέρα στη συγκέντρωση της βιοµάζας. Τα παραπάνω αποτελέσµατα µπορούν να αποδοθούν στο ότι το οξυγόνο που παρέχεται µε τον αέρα ευνοεί την ανάπτυξη του µικροοργανισµού που καλλιεργείται µε ζύµωση βυθού µέχρι ένα ορισµένο επίπεδο τιµών του, πάνω από το οποίο εµφανίζει τοξική δράση, µε αποτέλεσµα την αναστολή της ανάπτυξης του µικροοργανισµού και την καταστροφή των κυττάρων (Jeong και συν. 1999). Τέλος, η αλληλεπίδραση της ταχύτητας ανάδευσης µε τον ρυθµό παροχής αέρα δεν εµφανίζεται στατιστικώς σηµαντική και γι αυτό το λόγο δεν περιλαµβάνεται στην εξίσωση (12). Όσον αφορά τις επιδράσεις των παραπάνω παραγόντων στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας, φαίνεται ότι όλοι οι παράγοντες επηρεάζουν σηµαντικά την ανεξάρτητη µεταβλητή. Συγκεκριµένα, υπάρχει σηµαντική θετική γραµµική επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας, ενώ τα µεγέθη της θετικής τετραγωνικής επίδρασης της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα στη µεταβλητή Υ 4 εµφανίζονται σηµαντικά µικρότερα (Σχήµα ). Επιπλέον, η µικρή θετική αλληλεπίδραση της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα στη µεταβλητή Y 4 φανερώνει ότι η συνεργιστική δράση των παραπάνω παραγόντων δεν ευνοεί περισσότερο την αύξηση του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας απ ότι ο κάθε παράγοντας χωριστά. Στα Σχήµατα , , και παρουσιάζονται οι τρισδιάστατες απεικονίσεις των επιφανειών απόκρισης της συγκέντρωσης του β καροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας, αντίστοιχα, σε διαφορετικές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα. Στο Σχήµα φαίνεται ότι σε χαµηλές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξάνει σηµαντικά µε την αύξηση του ρυθµού παροχής αέρα και πλησιάζει τη µέγιστη τιµή της όταν ο ρυθµός παροχής αέρα λαµβάνει τιµές που βρίσκονται στο ανώτερο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών του. Αντίθετα, σε υψηλές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης η αύξηση του ρυθµού παροχής αέρα πάνω από τα µεσαία 240

277 επίπεδα των τιµών του επιφέρει σηµαντική µείωση στη συγκέντρωση του β καροτένιου. Επίσης, από το Σχήµα φαίνεται ότι για χαµηλές τιµές του ρυθµού παροχής αέρα, η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξάνεται ελαφρώς όταν η ταχύτητα ανάδευσης µεταβάλλεται από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα ανώτερα, ενώ σε υψηλές τιµές του ρυθµού παροχής αέρα η αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης επιφέρει σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου. Το Σχήµα δείχνει ότι σε χαµηλές και µεσαίες τιµές του ρυθµού παροχής αέρα η αύξηση της ταχύτητας ανάδευσης από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα ανώτερα αυξάνει σηµαντικά την παραγωγικότητα του βκαροτένιου. Σε υψηλές τιµές του ρυθµού παροχής αέρα η παραγωγικότητα του βκαροτένιου παραµένει σταθερή όταν η ταχύτητα ανάδευσης λαµβάνει τιµές που βρίσκονται πάνω από το µεσαίο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών της. Επιπρόσθετα, για χαµηλές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης η παραγωγικότητα του βκαροτένιου αυξάνει σηµαντικά µε την αύξηση του ρυθµού παροχής αέρα από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα ανώτερα, ενώ σε τιµές της ταχύτητας ανάδευσης πάνω από το µεσαίο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών της η αύξηση του ρυθµού παροχής αέρα επιφέρει µείωση της παραγωγικότητας της χρωστικής. Όπως φαίνεται από το Σχήµα , σε όλα τα επίπεδα των τιµών της ταχύτητας ανάδευσης η αύξηση του ρυθµού παροχής αέρα από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών της προς τα µεσαία αυξάνει σηµαντικά τη συγκέντρωση της βιοµάζας, ενώ µε περαιτέρω αύξηση του ρυθµού παροχής του αέρα προς τα ανώτερα επίπεδα των τιµών του η συγκέντρωση της βιοµάζας δεν µεταβάλλεται σηµαντικά (µικρή µείωση). Επίσης, για την ίδια τιµή της ταχύτητας ανάδευσης ή του ρυθµού παροχής αέρα η αύξηση των τιµών του ρυθµού παροχής αέρα ή της ταχύτητας ανάδευσης, αντίστοιχα, από τα χαµηλά επίπεδα των τιµών τους προς τα ανώτερα αυξάνουν σηµαντικά τη συγκέντρωση του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (Σχήµα ). Η αύξηση αυτή είναι µεγαλύτερη σε υψηλές τιµές της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα και πλησιάζει τη µέγιστη τιµή της όταν οι παραπάνω παράγοντες λαµβάνουν τιµές που βρίσκονται στο ανώτερο επίπεδο του υπό εξέταση εύρους των τιµών τους. Οι επιφάνειες απόκρισης που απεικονίζονται στα παραπάνω σχήµατα (Σχήµα , , και ) περιγράφονται από τη γενική µορφή της πολυωνυµικής εξίσωσης: 2 Y = β 0 + β 1 Χ 1 + β 2 Χ 2 + β 11 Χ 1 + β 22 Χ β 12 Χ 1 Χ 2 (14) 241

278 όπου Y είναι η εκτίµηση της πραγµατικής τιµής της συγκέντρωσης του β καροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας ή του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας, Χ 1 και Χ 2 είναι οι πραγµατικές τιµές του ρυθµού παροχής αέρα και της ταχύτητας ανάδευσης, αντίστοιχα και β ο, β 1, β 2, β 11, β 22, β 12 είναι οι µερικοί συντελεστές της πολυωνυµικής εξίσωσης που εκτιµήθηκαν για κάθε απόκριση εφαρµόζοντας την τεχνική της ανάλυσης παλινδρόµησης χρησιµοποιώντας τις πραγµατικές τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών. Μετά την εκτίµηση των συντελεστών της εξίσωσης (14), αυτή απλοποιήθηκε στη µορφή: Για τη συγκέντρωση του βκαροτένιου (Y 1 ): 2 Y 1 = 785,6 + 3,1 X ,1 X ,8 X 2 4,6 X 1 X 2 (15) Για την παραγωγικότητα του βκαροτένιου (Υ 2 ): 2 Y 2 = 98,62 + 0,25 X ,64 X 2 28,50 X 2 0,17 X 1 X 2 (16) Για τη συγκέντωση της βιοµάζας (Υ 3 ): Y 3 = 9,2410 0,0670 X ,1300 X 2 + 0,0002 X 2 1 5,2670 X 2 2 (17) Για τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας (Y 4 ): 2 Y 4 = 0, , Χ Χ Χ Χ ,0005 Χ 1 Χ 2 (18) Ο προσδιορισµός των συνδυασµών των τιµών των παραγόντων, οι οποίοι επιτυγχάνουν τις µέγιστες τιµές των αποκρίσεων, γίνεται όπως περιγράφεται στην παράγραφο Στη συνέχεια, µεταφέροντας τους άριστους προβλεπόµενους συνδυασµούς τιµών των παραγόντων Χ 1 και Χ 2 στις εξισώσεις (15), (16), (17) και (18) και λύνοντας ως προς Υ 1, Υ 2, Υ 3 και Υ 4, αντίστοιχα, προσδιορίζουµε την τιµή του µέγιστου της κάθε απόκρισης (Neter και συν. 1996). Μετά την εκτέλεση της παραπάνω µαθηµατικής επεξεργασίας προσδιορίστηκαν οι συνδυασµοί των τιµών της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα που επιτυγχάνουν τη µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (1536,1 mg/l), τη µέγιστη παραγωγικότητα (76,53 mg/l.d), τη µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (23,57 g/l) και το µέγιστο ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας (0,328 s 1 ) κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Στη συνέχεια τα µοντέλα αξιολογήθηκαν κάτω από πραγµατκές συνθήκες. Τα πειράµατα αξιολόγησης των µοντέλων έγιναν στον άριστο προβλεπόµενο συνδυασµό τιµών των παραγόντων Χ 1 και Χ 2 που δίνουν τη µέγιστη τιµή της 242

279 συγκέντρωσης του βκαροτένιου (Χ 1 =150 rpm, X 2 =1,50 vvm), της παραγωγικότητας (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,29 vvm), της συγκέντρωσης της βιοµάζας (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,43 vvm), ή του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (Χ 1 =500 rpm, X 2 =1,47 vvm) και οι παρατηρούµενες τιµές συγκρίθηκαν µε τις προβλεπόµενες µέγιστες τιµές των παραπάνω αποκρίσεων. Οι παραπάνω προβλέψεις για τις µέγιστες τιµές των Y 1, Y 2, Y 3 και Y 4 που υπολογίστηκαν µε τις εξισώσεις (15), (16), (17) και (18) βρέθηκαν να είναι πολύ κοντά στις αντίστοιχες τιµές που παρατηρήθηκαν στα ανεξάρτητα απο τα µοντέλα πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν στους άριστους συνδυασµούς των τιµών των παραγόντων X 1 και Χ 2 που αναφέρονται παραπάνω. Η διαφορά µεταξύ της παρατηρούµενης και της προβλεπόµενης τιµής για κάθε περίπτωση ήταν µικρότερη από 5% (Πίνακας 4.3.7). 243

280 Πίνακα Ανάλυση διακύµανσης για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (A), της παραγωγικότητας (B), της βιοµάζας ξηρό βάρος (C) και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας (D). Πηγή µεταβλητότητας β.ε. a Άθροισµα τετραγώνων Μέσο τετράγωνο F b P (A) Συγκέντρωση βκαροτένιου R 2 = 0,989 Παλινδρόµηση ,78 0,000 Γραµµική ,78 0,000 Τετραγωνική ,93 0,010 Αλληλεπίδραση ,47 0,000 Υπόλειµµα Έλλειψη προσαρµογής ,91 0,202 Πειραµατικό σφάλµα Σύνολο (B) Παραγωγικότητα R 2 = 0,982 Παλινδρόµηση , ,36 65,14 0,000 Γραµµική , ,08 132,61 0,000 Τετραγωνική 2 147,37 73,69 4,14 0,074 Αλληλεπίδραση 1 930,25 930,25 52,22 0,000 Υπόλειµµα 6 106,88 17,81 Έλλειψη προσαρµογής 3 81,88 27,29 3,27 0,178 Πειραµατικό σφάλµα 3 25,00 8,33 Σύνολο ,67 (C) Βιοµάζα ξηρό βάρος R 2 = 0,995 Παλινδρόµηση 5 475,516 95, ,65 0,000 Γραµµική 2 399, , ,26 0,000 Τετραγωνική 2 75,752 37, ,99 0,000 Αλληλεπίδραση 1 0,260 0,260 0,73 0,420 Υπόλειµµα 7 2,478 0,354 Έλλειψη προσαρµογής 3 1,839 0,613 3,83 0,114 Πειραµατικό σφάλµα 4 0,639 0,160 Σύνολο ,994 (D) K L a R 2 = 0,991 Παλινδρόµηση 5 0, , ,92 0,000 Γραµµική 2 0, , ,24 0,000 Τετραγωνική 2 0, , ,51 0,000 Αλληλεπίδραση 1 0, , ,13 0,001 Υπόλειµµα 6 0, , Έλλειψη προσαρµογής 3 0, , ,97 0,197 Πειραµατικό σφάλµα 3 0, , Σύνολο 11 0, a Βαθµοί ελευθερίας b Οι τιµές του F είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% 244

281 Πίνακας Εκτίµηση των µερικών συντελεστών του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού για τη συγκέντρωση του β καροτένιου (A), την παραγωγικότητα (B), τη βιοµάζα ξηρό βάρος (C) και τον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας (D). Όρος Συντελεστής T a P (A) Συγκέντρωση βκαροτένιου Σταθερά 407,7 15,502 0,000 Ανάδευση 202,7 8,615 0,000 Αερισµός 360,9 15,341 0,000 Ανάδευση x Ανάδευση 17,2 0,487 0,643 Αερισµός x Αερισµός 149,0 4,221 0,006 Ανάδευση x Αερισµός 404,9 14,053 0,000 (Β) Παραγωγικότητα Σταθερά 60,71 31,514 0,000 Ανάδευση 15,33 8,899 0,000 Αερισµός 23,50 13,639 0,000 Ανάδευση x Ανάδευση 0,38 0,145 0,889 Αερισµός x Αερισµός 7,12 2,757 0,033 Ανάδευση x Αερισµός 15,25 7,227 0,000 (C) Βιοµάζα ξηρό βάρος Σταθερά 12,296 49,771 0,000 Ανάδευση 8,123 33,443 0,000 Αερισµός 0,772 3,177 0,016 Ανάδευση x Ανάδευση 5,188 14,492 0,000 Αερισµός x Αερισµός 1,317 3,678 0,008 Ανάδευση x Αερισµός 0,255 0,857 0,420 (D) K L a Σταθερά 0, ,290 0,000 Ανάδευση 0, ,866 0,000 Αερισµός 0, ,876 0,000 Ανάδευση x Ανάδευση 0, ,759 0,000 Αερισµός x Αερισµός 0, ,475 0,048 Ανάδευση x Αερισµός 0, ,718 0,001 a Οι τιµές του T είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% 245

282 p=0,05 (2)X2(L) 15, Lby2L 14,0525 (1)X1(L) 8,6146 X2(Q) 4, X1(Q) 0, Εκτίµηση επίδρασης Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στη συγκέντρωση του βκαροτένιου. 246

283 p=0,05 (2)X2(L) 13,63895 (1)X1(L) 8, Lby2L 7,22666 X2(Q) 2,75681 X1(Q) 0, Εκτίµηση επίδρασης Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στην παραγωγικότητα του βκαροτένιου. 247

284 p=0,05 (1)X1(L) 33,44281 X1(Q) 14,49173 X2(Q) 3,67783 (2)X2(L) 3, Lby2L 0, Εκτίµηση επίδρασης Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στη συγκέντρωση της βιοµάζας. 248

285 p=0,05 (1)X1(L) 19,86633 (2)X2(L) 12,87633 X1(Q) 7, Lby2L 6, X2(Q) 2, Εκτίµηση επίδρασης Σχήµα Τυποποιηµένες επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης (Χ 1 ) και του ρυθµού παροχής αέρα (Χ 2 ) στον ογκοµετρικό συντελεστή µεταφοράς µάζας. 249

286 âêáñïôýíéï (mg/l) ,5 Áåñéóìüò (vvm ) 1,0 1, ÁíÜäåõóç (rpm ) 200 Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της συγκέντρωσης του βκαροτένιου σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού. 250

287 80 60 Ðáñáãù ãéêüôçôá 40 (mg/ld) ,5 Áåñéóìüò (vvm ) 1,0 1, ÁíÜäåõóç (rpm ) 200 Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της παραγωγικότητας του βκαροτένιου σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού. 251

288 25 ÂéïìÜæá 15 îçñü âüñïò (g/l) 5 0,5 Áåñéóìüò (vvm ) 1,0 1, ÁíÜäåõóç (rpm ) 200 Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της βιοµάζας ξηρό βάρος σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού. 252

289 0,3 K L a (s 1) 0,2 0,1 0,0 0,5 Áåñéóìüò (vvm ) 1,0 1, ÁíÜäåõóç (rpm ) 200 Σχήµα Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας σε διαφορετικές συνθήκες ανάδευσης και αερισµού. 253

290 Πίνακας Προβλεπόµενες (prd) και παρατηρούµενες (obs) µέγιστες τιµές της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora στους άριστους προβλεπόµενους συνδυασµούς της ταχύτητας ανάδευσης και του ρυθµού παροχής αέρα σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. Ανάδευση (rpm) Αερισµός (vvm) Προβλεπόµενη τιµή µεταβλητής prd a Παρατηρούµενη τιµή µεταβλητής obs b (Α) Συγκέντρωση βκαροτένιου (mg/l) 150 1, ,1 1567,7 (B) Παραγωγικότητα (mg/l.d) 500 1,29 76,53 78,83 (C) Βιοµάζα ξηρό βάρος (g/l) 500 1,43 23,57 24,70 (D) K L a (s 1 ) 500 1,47 0,328 0,330 a µέγιστες τιµές της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας προβλεπόµενες από τις εξισώσεις (15), (16), (17) και (18), αντίστοιχα. b µέγιστες τιµές της συγκέντρωσης του βκαροτένιου, της παραγωγικότητας, της συγκέντρωσης της βιοµάζας και του ογκοµετρικού συντελεστή µεταφοράς µάζας µετά από ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης. 254

291 4.4 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΚΑΡΟΤΕΝΙΟΥ ΑΠΟ ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΤΟ B. TRISPORA ΣΕ ΑΣΥΝΕΧΗ ΖΥΜΩΣΗ ΒΥΘΟΥ ΜΕ ΣΥΝΕΧΗ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΕ ΖΥΜΩΤΗΡΑ ΑΝΑ ΕΥΣΗΣ Στην ενότητα αυτή διερευνάται η δυνατότητα της παραγωγής βκαροτένιου µε τη µέθοδο της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος (Fedbatch culture). Βασικό χαρακτηριστικό των ζυµώσεων που πραγµατοποιούνται µε την παραπάνω µέθοδο είναι ότι η καλλιέργεια αναπτύσσεται αρχικά σε ασυνεχή ζύµωση βυθού, µέχρις ότου παρατηρηθεί η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας και στη συνέχεια προστίθεται συνεχώς στο ζυµωτήρα νέο υπόστρωµα, µέχρι να γεµίσει πλήρως. Αντικειµενικός σκοπός της διαδικασίας αυτής είναι η διατήρηση χαµηλών συγκεντρώσεων του υποστρώµατος κατά τη διάρκεια της ζύµωσης, έτσι ώστε να διατηρούνται καλύτερα οι συνθήκες αερισµού του υποστρώµατος και να αποφεύγεται η ανασταλτική επίδραση ενός ή περισσοτέρων συστατικών του υποστρώµατος που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή του προϊόντος, στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού και στην απόδοση του προϊόντος (Ρουκάς 1995, Gregersen και Jorgensen 1999). Κατά την πραγµατοποίηση ασυνεχών ζυµώσεων µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος, οι µικρές αλλαγές των συγκεντρώσεων και της ροής του υποστρώµατος επιδρούν σηµαντικά στους βιοχηµικούς µηχανισµούς των µικροβιακών κυττάρων και οδηγούν σε µεταβολές της ανάπτυξης τους και του ρυθµού παραγωγής του προϊόντος. Στην παρούσα εργασία µελετήθηκε η επίδραση του χρόνου έναρξης, της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας του ζυµωτήρα µε νέο υπόστρωµα καθώς και της σύστασης των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας στην παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης Επίδραση του Χρόνου Έναρξης Τροφοδοσίας στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Για τη µελέτη της επίδρασης του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας του ζυµωτήρα µε νέο υπόστρωµα (υπόστρωµα τροφοδοσίας) στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης πραγµατοποιήθηκαν δύο πειραµατικές δοκιµές, στις οποίες η έναρξη της προσθήκης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στο ζυµωτήρα γινόταν σε δύο διαφορετικά στάδια της ζυµωτικής διεργασίας. Στην πρώτη περίπτωση η παραγωγή 255

292 του βκαροτένιου πραγµατοποιήθηκε µε την αρχική ανάπτυξη της καλλιέργειας σε ασυνεχή ζύµωση βυθού (αρχικός όγκος υποστρώµατος 2 λίτρα) στο υπόστρωµα ανάπτυξης 1 (Πίνακας 4.4.1) για 2 ηµέρες, όπου παρατηρήθηκε η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας του µικροοργανισµού. Στη συνέχεια, το υπόστρωµα τροφοδοσίας 1 (Πίνακας 4.4.1) προστίθενταν µε σταθερό ρυθµό ροής (3,5 ml/h), έως ότου πληρωθεί ο ζυµωτήρας µε 3 λίτρα υποστρώµατος. Στη δεύτερη περίπτωση, µετά τον εµβολιασµό του υποστρώµατος ανάπτυξης 1 µε την καλλιέργεια, το υπόστρωµα τροφοδοσίας 1 προστίθενταν στο ζυµωτήρα µε ρυθµό ροής 3,5 ml/h από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας. Τα αποτελέσµατα της παραπάνω µελέτης δίνονται στα Σχήµατα και Η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου (15,29 mg/l) παρατηρήθηκε την 4 η ηµέρα της ζύµωσης, όταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας προστίθενταν από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας (Σχήµα 4.4.1b). Αντίθετα, όταν η τροφοδοσία του υποστρώµατος ξεκινούσε µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης η συγκέντρωση του β καροτένιου εµφανιζόταν µειωµένη κατά 22,83% (Σχήµα 4.4.1a). Από τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης των καλλιεργειών στις παραπάνω περιπτώσεις (Πίνακας 4.4.2) φαίνεται ότι στην πρώτη περίπτωση το ποσοστό των ζυγοσπορίων τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής της χρωστικής ήταν µεγαλύτερο από το αντίστοιχο ποσοστό στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας του µικροοργανισµού που αναπτυσσόταν σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (2,73% έναντι 1,62%). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι η εγγενής αναπαραγωγή του µικροοργανισµού, κατά την οποία επάγεται η σύνθεση του βκαροτένιου (Thomas και συν. 1967, Sutter και Rafelson 1968, van den Ende 1968, Desai και Modi 1977, Rao και Modi 1977, Govind και Modi 1981, Govind και συν. 1981, Feofilova και συν. 1994, Deacon 1997, Baets και συν. 2002, Mantzouridou και συν. 2002b,c), ευνοούνταν όταν η προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας στο ζυµωτήρα ξεκινούσε από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας. Επίσης, από το Σχήµα 4.4.1c φαίνεται ότι όταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας περιείχε µόνο 5,0 g/l λινελαϊκό οξύ και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό (υπόστρωµα τροφοδοσίας 2, Πίνακας 4.4.1) η συγκέντρωση του βκαροτένιου αυξήθηκε σε 30,5 mg/l. Η αύξηση της παραγωγής της χρωστικής που παρατηρήθηκε στην παραπάνω περίπτωση µπορεί να αποδοθεί στην απουσία της γλυκόζης και των άλλων αυξητικών παραγόντων από το υπόστρωµα τροφοδοσίας 2. Αντίθετα, η συνεχής προσθήκη του υποστρώµατος 256

293 τροφοδοσίας 1, το οποίο είναι πλούσιο σε γλυκόζη και πρωτεϊνική πηγή αζώτου, δεν ευνοεί τη σύζευξη πυρήνων των κυττάρων αντίθετου φύλου στα πλαίσια της εγγενούς αναπαραγωγής του µικροοργανισµού και τη σύνθεση τρισπορικού οξέος, το οποίο επάγει τη σύνθεση του βκαροτένιου (Deacon 1995). Επιπλέον, η αύξηση που παρατηρήθηκε στην απόδοση του βκαροτένιου στην περίπτωση που χρησιµοποιήθηκε το υπόστρωµα τροφοδοσίας 2 συνέπιπτε µε αύξηση του ποσοστού των ζυγοσπορίων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας, έναντι του αντίστοιχου ποσοστού µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 (5,10% έναντι 2,73%) (Πίνακας 4.4.2). Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.4.1, σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα του µικροοργανισµού αυξανόταν µέχρι την 6 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Αυτό αποδίδεται κυρίως στο µικρότερο ρυθµό ανάπτυξης του µικροοργανισµού µετά την 6 η ηµέρα της ζύµωσης, έναντι του ρυθµού αραίωσης καθώς και στη σταδιακή λύση ορισµένου ποσοστού κυττάρων των καλλιεργειών κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (8,0 g/l) παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µετά τη 2 η ηµέρα της ζυµωτικής διεργασίας, ενώ στις περιπτώσεις που η προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 και 2 ξεκινούσε από την αρχή της ζύµωσης η συγκέντρωση της βιοµάζας ήταν 5,9 και 4,9 g/l, αντίστοιχα. Επίσης, φαίνεται ότι σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν µέχρι την 6 η ηµέρα της ζύµωσης και στην συνέχεια αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζύµωσης. Τις δύο πρώτες ηµέρες της ζύµωσης τα σάκχαρα του υποστρώµατος µειωνόταν σηµαντικά, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός κατανάλωσης των σακχάρων από το µικροοργανισµό επιβραδύνονταν µέχρι την 6 η ηµέρα της ζύµωσης. Αυτό οφείλεται στη µεγάλη ανάπτυξη της βιοµάζας κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζυµωτικής διεργασίας. Η αύξηση της συγκέντρωσης των υπολειµµατικών σακχάρων µετά την 6 η ηµέρα της ζύµωσης ήταν αναµενόµενη λόγω των χαµηλών ρυθµών παραγωγής β καροτένιου και ανάπτυξης του µικροοργανισµού που παρατηρήθηκε στα συστήµατα αυτά. Στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας το ποσοστό κατανάλωσης των αρχικών σακχάρων κυµαίνονταν µεταξύ 93,8%95,0% (Σχήµα 4.4.1). Σε όλες τις καλλιέργειες το ph του υποστρώµατος µειωνόταν κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ηµερών της ζύµωσης λόγω της παραγωγής οργανικών 257

294 οξέων από το µεταβολισµό της γλυκόζης µέσω του κύκλου του Krebs στη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Στη συνέχεια, στην περίπτωση που το υπόστρωµα τροφοδοσίας περιείχε γλυκόζη (υπόστρωµα τροφοδοσίας 1), το ph µειωνόταν ελαφρώς µέχρι τη χρονική στιγµή της µέγιστης συγκέντρωσης της βιοµάζας και στη συνέχεια αυξανόταν ελαφρώς µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Αντίθετα, κατά την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 (χωρίς γλυκόζη), το ph του υποστρώµατος παρουσίαζε αύξηση µέχρι το τέλος της ζύµωσης πιθανόν λόγω της απαµίνωσης των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού και της παραγωγής αµµωνίας (Σχήµα 4.4.2). Όπως ήταν αναµενόµενο, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά τις δύο πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας (1235% του κορεσµένου) λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού και παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα µέχρι την 6 η ηµέρα της ζύµωσης, όπου συνεχίζονταν οι µεταβολικές δραστηριότητες του µικροοργανισµού. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση, η οποία αποδίδεται στους χαµηλούς ρυθµούς ανάπτυξης του µικροοργανισµού και παραγωγής βκαροτένιου. Επίσης, τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης των καλλιεργειών δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια της ζύµωσης το ποσοστό των γηρασµένων και κατεστραµµένων κύτταρα αυξανόταν σηµαντικά (Πίνακας 4.4.2). 258

295 a âêáñïôýíéï (mg/l) b c ÂéïìÜæá îçñü âüñïò,õðïëåéììáôéêü óüê áñá (g/l) ñüíïò æýìù óçò (çìýñåò) 0 Σχήµα Επίδραση του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας στις κινητικές παραµέτρους της ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h µετά την 2η ηµέρα της ζύµωσης και από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1, έναρξη τροφοδοσίας). 259

296 100 a Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b ph c ñüíïò æýìù óçò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση του χρόνου έναρξης της τροφοδοσίας στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h µετά την 2η ηµέρα της ζύµωσης και από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 1l υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1, έναρξη τροφοδοσίας). 260

297 4.4.2 Επίδραση του Ρυθµού Ροής του Υποστρώµατος Τροφοδοσίας στην Παραγωγή βκαροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του διαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Για να µελετηθεί η επίδραση του ρυθµού τροφοδοσίας του υποστρώµατος στην παραγωγή βκαροτένιου και στην ανάπτυξη του µικροοργανισµού σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης, το υποστρωµα τροφοδοσίας 3 (Πίνακας 4.4.1) προσθέτονταν στο ζυµωτήρα µε ρυθµό ροής 4,2 και 8,4 ml/h, έως ότου πληρωθεί ο ζυµωτήρας µε 4 λίτρα. Στις παραπάνω πειραµατικές δοκιµές ο αρχικός όγκος του υποστρώµατος (υπόστρωµα ανάπτυξης 2, Πίνακας 4.4.1) στο ζυµωτήρα ήταν 2 λίτρα. Τα αποτελέσµατα δίνονται στα Σχήµατα και Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.4.3a, η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειωνόταν µε την αύξηση του ρυθµού τροφοδοσίας από 4,2 σε 8,4 ml/h. Η µειωµένη αποτελεσµατικότητα των συστηµάτων της ζύµωσης, στα οποία προστίθεται το υπόστρωµα τροφοδοσίας µε υψηλούς ρυθµούς ροής στο ζυµωτήρα, ερµηνεύεται µε βάση το γεγονός ότι η εγγενής αναπαραγωγή του µικροοργανισµού που επάγει την παραγωγή βκαροτένιου δεν ευνοείται σε περιβάλλον µε αυξηµένη διαθεσιµότητα σε άνθρακα και άζωτο (Deacon 1995). Αυτό επιβεβαιώνεται µε βάση τα αποτελέσµατα της µορφοµετρικής ανάλυσης των κυττάρων των καλλιεργειών, από τα οποία φαίνεται ότι το ποσοστό των ζυγοσπορίων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας µειώνεται µε την αύξηση του ρυθµού τροφοδοσίας (Πίνακας 4.4.2). Η µέγιστη παραγωγή της χρωστικής (37,5 mg/l) και η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (19,5 g/l) παρατηρήθηκε µετά από 4 ηµέρες ζύµωσης στην περίπτωση που ο ρυθµός ροής του υποστρώµατος τροφοδοσίας στο ζυµωτήρα ήταν 4,2 ml/h. Επίσης, σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν σηµαντικά κατά τη διάρκεια των 4 πρώτων ηµερών της ζύµωσης, ενώ στη συνέχεια αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Αυτό οφείλεται στο µικρότερο ρυθµό ανάπτυξης του µικροοργανισµού µετά την 4 η ηµέρα της ζύµωσης, έναντι του ρυθµού αραίωσης καθώς και στη σταδιακή λύση ενός µεγάλου ποσοστού κυττάρων των καλλιεργειών κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας (Πίνακας 4.4.2). Σε όλες τις περιπτώσεις, στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση του βκαροτένιου και της βιοµάζας παρατηρήθηκε υψηλό ποσοστό κατανάλωσης των αρχικών σακχάρων του υποστρώµατος από το µικροοργανισµό (82,0%95,0%) (Σχήµα 4.4.3a,b). Επιπλέον, από το Σχήµα 4.4.4a,b φαίνεται ότι ανεξάρτητα από το ρυθµό τροφοδοσίας το ph 261

298 του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα µειωνόταν µέχρι την 4 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια αυξανόταν ελαφρώς µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας (Σχήµα 4.4.4a,b). Όπως ήταν αναµενόµενο, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά τις τέσσερις πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας (3,0 7,0% του κορεσµένου) λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση, η οποία αποδίδεται στη µείωση του ρυθµού ανάπτυξης του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου και στην προοδευτική αύξηση του ποσοστού των γηρασµένων και κατεστραµµένων κύτταρων (Πίνακας 4.4.2) Επίδραση της Μεθόδου Τροφοδοσίας του Ζυµωτήρα στην Παραγωγή β Καροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Η παραγωγή βκαροτένιου πραγµατοποιήθηκε µε δύο διαφορετικές µεθόδους τροφοδοσίας του ζυµωτήρα. Στην πρώτη περίπτωση γινόταν συνεχής προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 στο ζυµωτήρα µε ρυθµό ροής 4,2 ml/h, έως ότου πληρωθεί ο ζυµωτήρας µε 4 λίτρα υποστρώµατος σε 20 ηµέρες. Στη δεύτερη περίπτωση η προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 στο ζυµωτήρα γινόταν κατά παρτίδες, όπου 667 ml του υποστρώµατος προστίθονταν τη 2 η, 8 η και 14 η ηµέρα της ζύµωσης. Στις παραπάνω περιπτώσεις ο αρχικός όγκος του υποστρώµατος (υπόστρωµα ανάπτυξης 2) στο ζυµωτήρα ήταν 2 λίτρα. Η επίδραση της µεθόδου τροφοδοσίας του ζυµωτήρα στην παραγωγή βκαροτένιου, στη συγκέντρωση της βιοµάζας, των υπολειµµατικών σακχάρων, του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης δίνονται στα Σχήµατα 4.4.3a,c και 4.4.4a,c. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.4.3c, η συγκέντρωση του βκαροτένιου µειώθηκε σηµαντικά όταν ορισµένος όγκος του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 (667 ml) προστίθενταν σε τακτικά χρονικά διαστήµατα (2 η, 8 η και 14 η ηµέρα της ζύµωσης) στο ζυµωτήρα. Σε αυτή την περίπτωση η µέγιστη συγκέντρωση του β καροτένιου (10,0 mg/l) παρατηρήθηκε την 2 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Επιπλέον, η συγκέντρωση της βιοµάζας εµφανιζόταν χαµηλότερη από την αντίστοιχη στο σύστηµα της ζύµωσης όπου προστίθενταν συνεχώς στο ζυµωτήρα νέο υπόστρωµα τροφοδοσίας 3 µε ρυθµό 4,2 ml/h (12,5 g/l έναντι 19,5 g/l) (Σχήµα 4.4.3c). Εντούτις, και στα δύο συστήµατα ζύµωσης η συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων µειωνόταν σηµαντικά κατά 262

299 τη διάρκεια των 4 πρώτων ηµερών της ζύµωσης λόγω της αύξησης της βιοµάζας του µικροοργανισµού. Κατόπιν, παρουσίαζε µικρή αύξηση µέχρι το τέλος της ζύµωσης που οφείλεται στο µεγαλύτερο ρυθµό αραίωσης του υποστρώµατος, έναντι του ρυθµού ανάπτυξης του µικροοργανισµού µετά την 4 η ηµέρα της ζύµωσης. Η ελάχιστη συγκέντρωση των υπολειµµατικών σακχάρων (4,8 g/l) παρατηρήθηκε στην περίπτωση που το υπόστρωµα τροφοδοσίας προστίθενταν κατά παρτίδες στο ζυµωτήρα. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι µε την προσθήκη µεγάλου όγκου υποστρώµατος τροφοδοσίας (667 ml) σε τακτικά χρονικά διαστήµατα στο ζυµωτήρα πιθανόν να επέρχεται αλλαγή της φυσιολογίας του µικροοργανισµού όσον αφορά την παραγωγή δευτερογενών µεταβολιτών, παρεµποδίζοντας τη σύνθεση του βκαροτένιου. Επιπροσθέτως, σε όλες τις περιπτώσεις το ph του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα µειωνόταν µέχρι τη µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας και στη συνέχεια αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας λόγω της απαµίνωσης των αµινοξέων του εκχυλίσµατος καλαµποκιού και της παραγωγής αµµωνίας. Εντούτις, από το Σχήµα 4.4.4a,c φαίνεται ότι το ph του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα παρουσίαζε µεγαλύτερη µείωση στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας κατά παρτίδες από τη µείωση του ph στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας στο ζυµωτήρα. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στη µεγαλύτερη παραγωγή οργανικών οξέων από το µικροοργανισµό όταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας προστίθεται κατά παρτίδες, λόγω της αλλαγής των φυσιολογικών δραστηριοτήτων των κυττάρων. Επιπλέον, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά τις τέσσερις πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας (3,05,0% του κορεσµένου) λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Στη συνέχεια, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση, η οποία αποδίδεται στη µείωση του ρυθµού ανάπτυξης του µικροοργανισµού και στην προοδευτική αύξηση του ποσοστού των γηρασµένων και κατεστραµµένων κυττάρων. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.4.2, το µικρότερο ποσοστό ζυγοσπορίων (1,48%) και το µεγαλύτερο ποσοστό εκφυλισµένων κυττάρων (31,52%) στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη ορισµένου όγκου υποστρώµατος τροφοδοσίας σε τακτικά χρονικά διαστήµατα κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας. Το µικρό ποσοστό των ζυγοσπορίων πιθανόν να οφείλεται στην παρεµπόδιση της εγγενούς αναπαραγωγής του µικροοργανισµού που αναπτύσσεται σε υπόστρωµα µε 263

300 υψηλή περιεκτικότητα σε θρεπτικά συστατικά. Επίσης, το µεγάλο ποσοστό των εκφυλισµένων κυττάρων πιθανόν να οφείλεται στην παραγωγή µεγάλης ποσότητας τοξικών προϊόντων µεταβολισµού κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας και στη συνεχή έκθεση του µικροοργανισµού σε υψηλά επίπεδα οξειδωτικού στρες, µε αποτέλεσµα τη διαταραχή της φυσιολογικής λειτουργίας της κυτταρικής µεµβράνης και την καταστροφή των κυττάρων. 264

301 80 a âêáñïôýíéï (m g /l) b ÂéïìÜæá îçñ ü âüñïò, ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g /l) 80 c ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας (υπόστρωµα τροφοδοσίας 3) στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 και 8,4 ml/h από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2, προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας 3). 265

302 100 a Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) b c ph ñüíïò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της µεθόδου και του ρυθµού τροφοδοσίας (υπόστρωµα τροφοδοσίας 3) στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b: ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 και 8,4 ml/h από την αρχή της ζύµωσης, αντίστοιχα. c: προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2, προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας 3). 266

303 4.4.4 Επίδραση της Σύστασης του Υποστρώµατος Τροφοδοσίας στην Παραγωγή β Καροτένιου, στη Συγκέντρωση της Βιοµάζας, των Σακχάρων, του ιαλυτού Οξυγόνου και στο ph του Υγρού της Ζύµωσης Για να µελετηθεί η επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης, πραγµατοποιήθηκαν πειραµατικές δοκιµές µε τη χρήση υποστρωµάτων τροφοδοσίας µε διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης, πρωτεϊνικών πηγών αζώτου και ενεργοποιητών της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου (υποστρώµατα τροφοδοσίας 4, 5, 6 και 7, Πίνακας 4.4.1). Η σύνθεση του υποστρώµατος που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη της αρχικής καλλιέργειας του µικροοργανισµού (υπόστρωµα ανάπτυξης 2) και ο ρυθµός τροφοδοσίας του ζυµωτήρα (4,2 ml/h) ήταν εκείνα που χρησιµοποιήθηκαν στο αποτελεσµατικότερο σύστηµα ζύµωσης των προηγούµενων πειραµατικών δοκιµών. Τα αποτελέσµατα της παραπάνω µελέτης παρουσιάζονται στα Σχήµατα και Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.4.5a, όταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας περιείχε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (200,0 g/l) η απόδοση του βκαροτένιου ήταν πολύ χαµηλή (2,9 mg/l), σε αντίθεση µε τη µεγάλη συγκέντρωση της βιοµάζας που παρατηρήθηκε στην περίπτωση αυτή (13,6 g/l). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι δεν υπάρχει ανάλογη σχέση της βιοµάζας και του παραγόµενου β καροτένιου. Επιπλέον, η καταστολή της παραγωγής βκαροτένιου µε τη συνεχή προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας µε αυξηµένη συγκέντρωση γλυκόζης (200 g/l έναντι 50,0 g/l) αποδίδεται στην ανενεργοποίηση της µεβαλονικής κινάσης (MVA), η οποία καταλύει την αντίδραση φωσφορυλίωσης του µεβαλονικού οξέος σε 5 πυροφωσφοµεβαλονικό οξύ που σχηµατίζεται κατά τη βιοσυνθετική πορεία του β καροτένιου στα κύτταρα του µικροοργανισµού (Dandekar και συν. 1980). Από το Σχήµα 4.4.5b,c φαίνεται ότι η χρήση των υποστρωµάτων τροφοδοσίας χωρίς εκχύλισµα καλαµποκιού και µε µειωµένη συγκέντρωση γλυκόζης (υπόστρωµα τροφοδοσίας 5), ή χωρίς γλυκόζη, εκχύλισµα καλαµποκιού και µε µειωµένη συγκέντρωση των άλλων αυξητικών παραγόντων (υπόστρωµα τροφοδοσίας 6) είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της συγκέντρωσης του βκαροτένιου (67,5 mg/l και 82,5 mg/l, αντίστοιχα). Επιπροσθέτως, ο εµπλουτισµός του υποστρώµατος τροφοδοσίας 6 µε 1,0 g/l βιονόνη δεν αύξησε την παραγωγή βκαροτένιου (75,0 mg/l) (Σχήµα 4.4.5d). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι η προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας µε γλυκόζη, εκχύλισµα καλαµποκιού, λινελαϊκό οξύ ή βιονόνη δεν ευνόησε την παραγωγή βκαροτένιου. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η 267

304 µειωµένη απόδοση της χρωστικής στην καλλιέργεια που αναπτύσσεται σε περιβάλλον µε αυξηµένη διαθεσιµότητα σε πηγή άνθρακα και αζώτου αποδίδεται στο γεγονός ότι σε αυτές τις συνθήκες ο µικροοργανισµός δεν αναπαράγεται εγγενώς, οπότε δεν επάγεται η σύνθεση του βκαροτένιου (Deacon 1995). Επιπλέον, η µείωση της παραγωγής βκαροτένιου στο σύστηµα της ζύµωσης µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας µε λινελαϊκό οξύ µπορεί να αποδοθεί στην τοξική δράση των προϊόντων αυτοξείδωσης του λινελαϊκού οξέος κατά τη διάρκεια της ζυµωτικής διεργασίας (ενότητα 4.3.1). Το αποτελεσµατικότερο σύστηµα ζύµωσης είναι αυτό µε την προσθήκη υποστρώµατος, το οποίο περιέχει µίγµα φυτικών ελαίων και χαµηλές συγκεντρώσεις αυξητικών παραγόντων (πρωτεϊνική πηγή αζώτου, βιταµίνες και ιχνοστοιχεία). Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο διαφορετικό ρυθµό οξείδωσης και στα διαφορετικά προϊόντα οξείδωσης των λιπαρών οξέων στα φυτικά έλαια και στην περιεκτικότητα τους και σε άλλα συστατικά, εκτός από τα ακόρεστα λιπαρά οξέα, που πιθανόν να αυξάνουν τη συγκέντρωση της χρωστικής (Boskou 1989, Nawar 1996). Εντούτις, η παραγωγή β καροτένιου στο παραπάνω σύστηµα ζύµωσης είναι σηµαντικά χαµηλότερη από την παραγωγή της χρωστικής σε ασυνεχή ζύµωση βυθού σε ζυµωτήρα ανάδευσης χρησιµοποιώντας υπόστρωµα εµπλουτισµένο µε µίγµα φυτικών ελαίων (82,5 mg/l έναντι 1567,7 mg/l). Αυτό εξηγείται µε βάση το γεγονός ότι στο παραπάνω σύστηµα ζύµωσης διατηρούνται καλύτερα οι συνθήκες αερισµού του υποστρώµατος λόγω της καλύτερης αξιοποίησης των θρεπτικών συστατικών από το µικροοργανισµό και της αραίωσης του υποστρώµατος, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία και τη συσσώρευση µεγάλης ποσότητας υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και µεγάλου αριθµού ελευθέρων ανιονικών ριζών οξυγόνου (O 2 ) (Deacon 1995, Ρουκάς 1995). Η υψηλή συγκέντρωση του Η 2 O 2 και η επαγωγή της δράσης των ελευθέρων ριζών στις παραπάνω συνθήκες πιθανόν να προκαλεί αναστολή της δράσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου, καταστροφή της δοµής του κυτταρικού DNA και άλλες κυτταροτοξικές δράσεις. Όπως φαίνεται από το Σχήµα 4.4.5ad, σε όλες τις καλλιέργειες η βιοµάζα του µικροοργανισµού αυξανόταν µέχρι την 4 η ηµέρα της ζύµωσης και στη συνέχεια µειωνόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Αυτό αποδίδεται κυρίως στο µικρότερο ρυθµό ανάπτυξης του µικροοργανισµού µετά την 4 η ηµέρα της ζύµωσης, έναντι του ρυθµού αραίωσης καθώς και στη σταδιακή λύση ορισµένου ποσοστού κυττάρων των καλλιεργειών κατά τη διάρκεια της ζύµωσης (Πίνακας 4.4.2). Η 268

305 µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας (13,6 g/l) παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4. Εντούτις, η συγκέντρωση της βιοµάζας στην παραπάνω περίπτωση εµφανιζόταν µειωµένη από την αντίστοιχη όταν χρησιµοποιούνταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας 3 (19,5 g/l), το οποίο περιείχε µικρότερη συγκέντρωση γλυκόζης (50,0 g/l έναντι 200,0 g/l), πιθανόν λόγω οσµωτικών επιδράσεων. Στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη των υποστρωµάτων τροφοδοσίας 5, 6 ή 7 η συγκέντρωση της βιοµάζας ήταν 12,4, 11,6 και 10,5 g/l, αντίστοιχα. Επίσης, σε όλες τις καλλιέργειες η συγκέντρωση των σακχάρων µειωνόταν σηµαντικά τις 4 πρώτες ηµέρες της ζύµωσης λόγω της µεγάλης ανάπτυξης της βιοµάζας του µικροοργανισµού. Κατόπιν, παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης των υπολειµµατικών σακχάρων µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας λόγω του µικρότερου ρυθµού ανάπτυξης των καλλιεργειών, έναντι του ρυθµού αραίωσης, µετά την 4 η ηµέρα της ζύµωσης. Στο σηµείο που αντιστοιχούσε η µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων κυµαίνονταν µεταξύ 86,0%96,4% (Σχήµα 4.4.5ad). Tα αποτελέσµατα του Σχήµατος 4.4.6ad δείχνουν ότι σε όλες τις καλλιέργειες το ph του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα µειωνόταν µέχρι τη µέγιστη συγκέντρωση της βιοµάζας και στη συνέχεια αυξανόταν µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας. Η ελάχιστη τιµή του ph του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα αντιστοιχούσε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4 πιθανόν λόγω της παραγωγής µεγάλης ποσότητας οργανικών οξέων στη φάση ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Επιπλέον, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µειωνόταν σηµαντικά τις 4 πρώτες ηµέρες της ζυµωτικής διεργασίας (3,05,0% του κορεσµένου) λόγω της πρόσληψης µεγάλης ποσότητας οξυγόνου από τα κύτταρα του µικροοργανισµού. Κατόπιν, στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 5, 6 και 7 η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρέµενε σε χαµηλά επίπεδα µέχρι τη 10 η ηµέρα της ζύµωσης λόγω της συνέχισης των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού και της παραγωγής βκαροτένιου. Στις περιπτώσεις αυτές η ελάχιστη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου (6,87,2%) αντιστοιχούσε στη µέγιστη παραγωγή βκαροτένιου. Κατόπιν, η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου παρουσίαζε αύξηση λόγω της προοδευτικής γήρανσης και θανάτωσης ενός µεγάλου ποσοστού κυττάρων των καλλιεργειών, µε αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριοτήτων του µικροοργανισµού και της πρόσληψης 269

306 οξυγόνου από τα κύτταρα (Πίνακας 4.4.2). Αντίθετα, όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4 η συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου µετά την 4 η ηµέρα της ζύµωσης παρουσίαζε αύξηση µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας, η οποία αποδίδεται στη µείωση του ρυθµού των µεταβολικών δραστηριοτήτων µικροοργανισµού και στη σταδιακή αύξηση του ποσοστού των γηρασµένων και κατεστραµµένων κυττάρων (Πίνακας 4.4.2). 270

307 âêáñïôýíéï (m g/l) c d a b ñüíïò (çìýñåò) ÂéïìÜæá îçñü âüñïò, ÕðïëåéììáôéêÜ óüê áñá (g/l) Σχήµα Επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στις κινητικές παραµέτρους της ζύµωσης βυθού κατά την παραγωγή β καροτένιου µε το B. trispora σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d: υπόστρωµα τροφοδοσίας 4, 5, 6 και 7, αντίστοιχα. Ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. βκαροτένιο, βιοµάζα ξηρό βάρος, υπολειµµατικά σάκχαρα (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). 271

308 Äéáëõôü ïîõãüíï (% ôïõ êïñåóìýíïõ) a b c d ph ñüíïò æýìù óçò (çìýñåò) Σχήµα Επίδραση της σύστασης του υποστρώµατος τροφοδοσίας στη συγκέντρωση του διαλυτού οξυγόνου και στο ph του υγρού της ζύµωσης κατά την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης. a, b, c, d: υπόστρωµα τροφοδοσίας 4, 5, 6 και 7, αντίστοιχα. Ρυθµός τροφοδοσίας 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης. διαλυτό οξυγόνο, ph (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). 272

309 4.4.5 Μελέτη των Μορφολογικών Χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την Παραγωγή βκαροτένιου σε Ασυνεχή Ζύµωση Βυθού µε Συνεχή Προσθήκη Υποστρώµατος Για τη µελέτη της µορφολογίας του B. trispora κατά την παραγωγή β καροτένιου σε διαφορετικά συστήµατα ασυνεχούς ζύµωσης βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης, έγινε µορφοµετρική ανάλυση των άθικτων µυκηλιακών υφών, των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων, των ζυγοφόρων και των ζυγοσπορίων του µικροοργανισµού κατά τη διάρκεια των ζυµωτικών διεργασιών. Τα ποσοστά επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού β καροτένιου παρουσιάζονται στον Πίνακα Επιπλέον, υπολογίστηκαν η µέγιστη συγκέντρωση και παραγωγικότητα του βκαροτένιου, η βιοµάζα και το ποσοστό των σακχάρων που καταναλώθηκαν και συσχετίστηκαν µε τη µορφολογία του µικροοργανισµού (Πίνακας 4.4.3). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4.4.2, η καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό ροής 3,5 ml/h µετά τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης, τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου το ποσοστό των άθικτων µυκηλιακών υφών ήταν 36,22%, ενώ το ποσοστό του µυκηλίου που εµφανιζόταν µε τη µορφή µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων ήταν 32,5%, 21,3% και 8,2%, αντίστοιχα. Την ίδια χρονική στιγµή η περιεκτικότητα των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου ήταν 1,62% και 0,16%, αντίστοιχα. Στο τέλος της ζύµωσης το µεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων ήταν µε τη µορφή κενών κυττάρων (85,77%). Επίσης, τα εκφυλισµένα κύτταρα εµφανιζόταν αυξηµένα κατά 52,44%, η περιεκτικότητα των ζυγοσπορίων δεν µεταβλήθηκε (1,62%), ενώ η περιεκτικότητα του βκαροτένιου µειώθηκε ελαφρώς (0,11%). Στην περίπτωση που η τροφοδοσία του ζυµωτήρα µε το υπόστρωµα τροφοδοσίας 1 ξεκινούσε από την αρχή της ζυµωτικής διεργασίας, το ποσοστό των ζυγοσπορίων στη µέγιστη παραγωγή της χρωστικής αυξήθηκε σε 2,73%. Επιπλέον, η περιεκτικότητα του βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας του µικροοργανισµού εµφανιζόταν αυξηµένη κατά 75,0%, σε αντίθεση µε τα ποσοστά των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων, τα οποία τόσο τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου όσο και στο τέλος της ζύµωσης ήταν ελαφρώς µειωµένα (Πίνακας 4.4.2, Εικόνα 4.4.1a). Από τα αποτελέσµατα του Πίνακα

310 και φαίνεται ότι η αύξηση της συγκέντρωσης (30,5 mg/l) και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου (7,63 mg/ld) στο σύστηµα της ζύµωσης που προστίθενταν το υπόστρωµα τροφοδοσίας 2, το οποίο περιείχε µόνο λινελαϊκό οξύ και αντιοξειδωτικό, έναντι των αντίστοιχων τιµών των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1, συνέπιπτε µε την αύξηση του ποσοστού των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (3,35%) και των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου την 4 η ηµέρα της ζύµωσης (5,1% και 0,65%, αντίστοιχα) (Εικόνα 4.4.1b). Αυτό οφείλεται στην επαγωγή της εγγενούς αναπαραγωγής του µικροοργανισµού σε υπόστρωµα µε χαµηλή περιεκτικότητα σε θρεπτικά στοιχεία (Deacon 1995). Επιπλέον, µεγαλύτερη αύξηση του ποσοστού των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (3,43%) και των ζυγοσπορίων την 4 η ηµέρα της ζύµωσης (6,65%) παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 µε ρυθµό ροής 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Πίνακας 4.4.2, Εικόνα 4.4.1c). Σε αυτή την περίπτωση η µέγιστη συγκέντρωση και παραγωγικότητα του βκαροτένιου ήταν 37,5 mg/l και 9,38 mg/ld, αντίστοιχα και η συγκέντρωση της βιοµάζας 19,5 g/l (Πίνακας 4.4.2). Τα παραπάνω αποτελέσµατα µπορούν να εξηγηθούν µε βάση το γεγονός ότι τα φυτικά έλαια αποτελούν καλύτερο υπόστρωµα για την ανάπτυξη του µικροοργανισµού και την παραγωγή βκαροτένιου σε ζυµωτήρα ανάδευσης (ενότητα 4.3.3). Από τον Πίνακα φαίνεται ότι στο τέλος της ζυµωτικής διεργασίας τα ποσοστά των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας ήταν 82,67% και 10,49%, αντίστοιχα. Σε µεγαλύτερους ρυθµούς ροής του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 στο ζυµωτήρα (8,4 ml/h) παρατηρήθηκε µείωση του ποσοστού των ζυγοφόρων κατά 10,5% τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης και του ποσοστού των ζυγοσπορίων κατά 13,68% τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής βκαροτένιου, ενώ το ποσοστό των εκφυλισµένων κυττάρων στο τέλος της ζυµωτικής διεργασίας εµφανιζόταν αυξηµένο κατά 47,28% (Πίνακας 4.4.2). Επιπλέον, σε υψηλούς ρυθµούς ροής του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 όλες οι τιµές των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης εµφανιζόταν µειωµένες (Πίνακας 4.4.3). Τα χαµηλότερα ποσοστά των ζυγοφόρων τη 2 η ηµέρα της ζύµωσης (0,66%) και των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στη µέγιστη παραγωγή της χρωστικής (0,78% και 0,02%, αντίστοιχα) στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας παρατηρήθηκαν στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4, το οποίο περιείχε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης (

311 g/l) (Εικόνα 4.4.1d). Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.4.2, η συνεχής προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας µε αυξηµένη συγκέντρωση γλυκόζης είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση του ποσοστού των εκφυλισµένων κυττάρων στο τέλος της ζυµωτικής διεργασίας (29,26%). Σε αυτή την περίπτωση η µέγιστη συγκέντρωση και η παραγωγικότητα του βκαροτένιου ήταν πολύ χαµηλές (3,1 mg/l και 1,55 mg/ld, αντίστοιχα), σε αντίθεση µε τη συγκέντρωση της βιοµάζας και των υπολειµµατικών σακχάρων που ήταν 13,6 g/l και 88,4%, ανίστοιχα (Πίνακας 4.4.3). Η µειωµένη αποτελεσµατικότητα των συστηµάτων της ζύµωσης, στα οποία προστίθεται το υπόστρωµα τροφοδοσίας µε αυξηµένη συγκέντρωση γλυκόζης και µε υψηλούς ρυθµούς ροής, ερµηνεύεται µε βάση το γεγονός ότι η εγγενής αναπαραγωγή του µικροοργανισµού που επάγει τη σύνθεση του βκαροτένιου δεν ευνοείται σε περιβάλλον µε αυξηµένη διαθεσιµότητα σε άνθρακα και άζωτο (Deacon 1995). Επιπροσθέτως, από τον Πίνακα φαίνεται ότι η προσθήκη των υποστρωµάτων τροφοδοσίας χωρίς εκχύλισµα καλαµποκιού και µε µειωµένη συγκέντρωση γλυκόζης (υπόστρωµα τροφοδοσίας 5), ή χωρίς γλυκόζη, εκχύλισµα καλαµποκιού και µε µειωµένη συγκέντρωση των άλλων αυξητικών παραγόντων (υπόστρωµα τροφοδοσίας 6) είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της περιεκτικότητας των ζυγοφόρων, των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας, ενώ το ποσοστό των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων στο τέλος της ζυµωτικής διεργασίας εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένο (Εικόνα 4.4.1e). Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4.4.3, η αύξηση του ποσοστού των ζυγοσπορίων στις παραπάνω καλλιέργειες συνέπιπτε µε την αύξηση της συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας του βκαροτένιου, ενώ η συγκέντρωση της βιοµάζας µειωνόταν ελαφρώς. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις το ποσοστό κατανάλωσης των σακχάρων ήταν υψηλό (88,090,8%). Στην περίπτωση που το υπόστρωµα τροφοδοσίας 6 είχε εµπλουτιστεί µε βιονόνη (υπόστρωµα τροφοδοσίας 7) δεν παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής της χρωστικής, ενώ τα ποσοστά των µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων εµφανιζόταν ελαφρώς αυξηµένα από τα αντίστοιχα στην καλλιέργεια που αναπτυσσόταν µε την προσθήκη υποστρώµατος τροφοδοσίας 6, το οποίο δεν περιείχε βιονόνη (Πίνακας 4.4.2). Επίσης, από τα αποτελέσµατα του Πίνακα φαίνεται ότι όλες οι κινητικές παράµετροι της ζύµωσης µε τη συνεχή προσθήκη του 275

312 υποστρώµατος τροφοδοσίας 7 ήταν ελαφρώς µικρότερες από τις αντίστοιχες τιµές των κινητικών παραµέτρων της ζύµωσης µε τη χρήση του υποστρώµατος τροφοδοσίας 6. Τέλος, η προσθήκη του υποστρώµατος κατά παρτίδες στο ζυµωτήρα είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική µείωση του ποσοστού των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας τη χρονική στιγµή της µέγιστης παραγωγής της χρωστικής, ενώ παρατηρήθηκε προοδευτική αύξηση της περιεκτικότητας των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων µέχρι το τέλος της ζυµωτικής διεργασίας (Πίνακας 4.4.2, Εικόνα 4.4.1f). Σε αυτό το σύστηµα της ζύµωσης η µέγιστη συγκέντρωση και η παραγωγικότητα του β καροτένιου ήταν πολύ χαµηλές (10,5 mg/l και 5,25 mg/ld, αντίστοιχα) (Πίνακας 4.4.3). Τα παραπάνω αποτελέσµατα δείχνουν ότι κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης ευνοείται ο σχηµατισµός υψηλών ποσοστών µυκηλιακών υφών µε κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισµένων κυττάρων. Τα υψηλότερα ποσοστά των παραπάνω µορφοµετρικών παραµέτρων παρατηρήθηκαν στις καλλιέργειες που αναπτυσσόταν στα συστήµατα ζύµωσης, στα οποία γινόταν προσθήκη υποστρωµάτων τροφοδοσίας µε αυξηµένες συγκεντρώσεις γλυκόζης, λινελαϊκού οξέος, πρωτεϊνικών πηγών αζώτου και άλλων αυξητικών παραγόντων σε υψηλούς ρυθµούς τροφοδοσίας. Στις παραπάνω περιπτώσεις το ποσοστό των ζυγοσπορίων και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου ήταν σηµαντικά χαµηλό. Αυτό µπορεί να εξηγηθεί µε βάση το γεγονός ότι µε την προσθήκη υποστρωµάτων τροφοδοσίας µε αυξηµένη διαθεσιµότητα σε πηγή άνθρακα και αζώτου πιθανόν να επέρχεται αλλαγή της φυσιολογίας του µικροοργανισµού όσον αφορά την παραγωγή δευτερογενών µεταβολιτών, παρεµποδίζοντας τη σύνθεση του βκαροτένιου και ευνοώντας την παραγωγή άλλων µεταβολιτών και προϊόντων οξείδωσης των παραπάνω ουσιών που προκαλούν µοριακές ανακατατάξεις των δοµικών στοιχείων της κυτταρικής µεµβράνης, µε αποτέλεσµα τη σταδιακή καταστροφή των κυττάρων. Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, κατά την ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος διατηρούνται καλύτερα οι συνθήκες αερισµού του υποστρώµατος στο ζυµωτήρα, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία και τη συσσώρευση µεγάλης ποσότητας υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και µεγάλου αριθµού ελευθέρων ανιονικών ριζών οξυγόνου (O 2 ) (Deacon 1995, Ρουκάς 1995). Η υψηλή συγκέντρωση του Η 2 O 2 και η επαγωγή της δράσης των ελευθέρων ριζών στις παραπάνω συνθήκες 276

313 πιθανόν να προκαλεί αναστολή της δράσης ενός ή περισσοτέρων ενζύµων της βιοσύνθεσης του βκαροτένιου, καταστροφή της δοµής του κυτταρικού DNA και άλλες κυτταροτοξικές δράσεις. Επιπροσθέτως, η έντονη αυτόλυση που παρατηρείται στις παραπάνω περιπτώσεις µπορεί να αποδοθεί στη δράση των αυτογενών λυτικών ενζύµων που υπάρχουν µέσα στο κύτταρο και προκαλούν τοπική λύση της κυτταρικής επιφάνειας που προχωρά βαθµιαία στο εσωτερικό των κυττάρων. 277

314 Πίνακας Σύσταση των υποστρωµάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας για την παραγωγή βκαροτένιου µε το B. trispora σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα αναδεύσεως. Συστατικά (g/l) Υπόστρωµα ανάπτυξης 1 2 Γλυκόζη 50,0 50,0 Εκχύλισµα Καλαµποκιού 80,0 80,0 Υδρολυµένη καζεΐνη 2,0 2,0 Εκχύλισµα ζύµης 1,0 1,0 Ελαιόλαδο 10,0 Σογιέλαιο 10,0 Βαµβακέλαιο 10,0 Λινελαϊκό οξύ Lασπαραγίνη 2,0 2,0 KH 2 PO 4 1,5 1,5 MgSO 4. 7H 2 0 0,5 0,5 Span 20 5,0 5,0 Tween 80 1,0 1,0 Αντιοξειδωτικό 2,5 Υδροχλωρική θειαµίνη (mg/l) 5,0 5,0 Υπόστρωµα τροφοδοσίας Γλυκόζη 50,0 50,0 200,0 5,0 Εκχύλισµα καλαµποκιού 80,0 80,0 80,0 Υδρολυµένη καζεΐνη 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 Εκχύλισµα ζύµης 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 Ελαιόλαδο 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Σογιέλαιο 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Βαµβακέλαιο 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Λινελαϊκό οξύ 5,0 5,0 βιονόνη 1,0 Lασπαραγίνη 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 KH 2 PO 4 1,5 1,5 1,5 1,5 0,75 0,75 MgSO 4. 7H 2 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 Span 20 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tween 80 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Αντιοξειδωτικό 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Υδροχλωρική θειαµίνη (mg/l) 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 2,5 278

315 Πίνακας Μορφολογικά χαρακτηριστικά του B. trispora κατά την παραγωγή βκαροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης µε διαφορετικά υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας και διαφορετικές µεθόδους και ρυθµούς τροφοδοσίας (Ποσοστό επί τοις εκατό των διαφορετικών µορφών των µυκηλιακών υφών, µορφολογικών δοµών και του ενδοκυτταρικού βκαροτένιου στο συνολικό ξηρό βάρος της βιοµάζας). Υπόστρωµα ανάπτυξης Υπόστρωµα τροφοδοσίας Ρυθµός τροφοδοσίας (ml/h) Χρόνος ζύµωσης (ηµέρες) β καροτένιο Άθικτες µυκηλιακές υφές Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια Κενά κύτταρα Εκφυλισµένα κύτταρα Ζυγοφόροι Ζυγοσπόρια 1 1 3,5 a ,5 b ,5 b ,2 b ,4 b ,2 b ,2 b ,2 b ,2 b * 2 4 0,15 0,16 0,11 0,19 0,28 0,20 0,23 0,65 0,56 0,16 0,19 0,19 0,11 0,15 0,12 0,02 0,02 0,01 0,33 0,55 0,54 0,39 0,72 0,71 0,28 0,71 0,69 0,12 0,08 96,30 36,22 73,74 40,30 78,04 48,94 79,46 55,59 55,05 26,57 43,09 5,10 70,62 53,72 23,00 76,00 55,81 39,16 74,45 53,45 38,65 69,00 13,91 32,50 12,50 29,79 9,56 24,28 8,77 20,15 21,68 41,85 25,35 46,25 9,43 16,62 32,23 7,25 14,85 25,72 8,21 16,50 26,21 48,43 21,30 85,77 7,33 19,10 85,03 5,17 14,53 83,20 4,63 11,12 82,67 12,25 15,33 78,69 18,55 26,23 69,95 8,82 14,23 27,48 5,39 12,25 17,63 6,15 13,35 18,05 20, ,20 12,50 4,35 7,80 12,04 3,65 6,50 11,14 3,55 6,30 10,49 7,84 10,36 15,45 12,33 21,62 29,26 4,25 5,78 7,65 2,25 4,93 5,34 2,97 5,12 5,33 15,54 31, ,03 a έναρξη τροφοδοσίας την 2 η ηµέρα της ζύµωσης b έναρξη τροφοδοσίας στην αρχή της ζύµωσης * 667 ml του υποστρώµατος τροφοδοσίας προστέθηκαν την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης 3,55 1,89 3,35 3,43 3,07 0,66 6,55 8,72 7,94 30,88 1,62 1,62 2,73 2,73 5,10 5,10 6,65 6,65 5,74 5,74 0,78 0,78 9,10 9,10 11,44 11,44 10,87 10,87 1,48 1,48 279

316 a b c d e f Εικόνα Απεικόνιση των µορφολογικών χαρακτηριστικών του B. trispora κατά την παραγωγή β καροτένιου σε ασυνεχή ζύµωση βυθού µε συνεχή προσθήκη υποστρώµατος σε ζυµωτήρα ανάδευσης (µονάδα µήκους 50 µm). a: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (12 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 1 µε ρυθµό 3,5 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1). b, c: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora (4 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 2 µε ρυθµό 3,5 ml/h και του υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 µε ρυθµό 4,2 ml/h, αντίστοιχα, από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 1 και 2, αντίστοιχα). d: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (4 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 4 µε ρυθµό 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). e: Μυκηλιακές υφές και ζυγοσπόρια του B. trispora (10 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε συνεχή προσθήκη του υποστρώµατος τροφοδοσίας 5 ή 6 µε ρυθµό 4,2 ml/h από την αρχή της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). f: Μυκηλιακές υφές µε κενοτόπια, κενά κύτταρα και εκφυλισµένα κύτταρα του B. trispora (20 η ηµέρα ζύµωσης) που αναπτύσσεται µε την προσθήκη 667 ml υποστρώµατος τροφοδοσίας 3 την 2η, 8η και 14η ηµέρα της ζύµωσης (Υπόστρωµα ανάπτυξης 2). (Υποστρώµατα ανάπτυξης και τροφοδοσίας όπως περιγράφονται στον Πίνακα 4.4.1). 280