ΕΘΝΙΚΟ KAI ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΕΘΝΙΚΟ KAI ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ"

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ KAI ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ «ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΚΩΝ ΣΥΝΔΡΟΜΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ (NGS)» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΡΟΥΣΣΟΥ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ Α.Μ: ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΑΛΕΠΟΡΟΥ-ΜΑΡΙΝΟΥ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΑΘΗΝΑ 2017

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Αρχικά, θέλω να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα της διπλωματικής εργασίας μου, κυρία Αλεπόρου-Μαρίνου Βασιλική, καθηγήτρια βιοχημείας και μοριακής γενετικής, για τη δυνατότητα που μου προσέφερε να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία σε ένα αντικείμενο που με ενδιαφέρει και την κυρία Κόλλια Παναγούλα, αναπληρώτρια καθηγήτρια μοριακής γενετικής ανθρώπου για την πολύτιμη βοήθεια και καθοδήγηση μου κατά τη διάρκεια της εργασίας. Οφείλω ευχαριστίες και στον κύριο Παπαδάκη Μανούσο, που δέχτηκε να πραγματοποιήσω την πρακτική μου και αργότερα τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριο του Πρότυπου Κέντρου Μοριακής Βιολογίας και Κυτταρογενετικής «EUROGENETICA Α.Ε.» και με βοήθησε να αναπτύξω τόσο τις γνώσεις μου στο επίπεδο της επιστήμης όσο και τον τρόπο σκέψης μου. Επιβάλλονται θερμές ευχαριστίες στον κύριο Παπανικολάου Βασίλη και την κυρία Dubos Stephanie για την καθοδήγησή τους καθ όλη τη διάρκεια της εργασίας. Στάθηκαν πραγματικοί δάσκαλοι για μένα, οι οποίοι με θέρμη, καλοσύνη και υπομονή εμπλούτισαν τις γνώσεις μου σαν Βιολόγο και την προσωπικότητά μου ως άνθρωπο. Ευχαριστώ ξεχωριστά το διδάκτορα Μαρούλη Βασίλη και το μεταπτυχιακό φοιτητή Στύλιο Ιωάννη για την πολύτιμη βοήθειά τους στην πραγματοποίηση και συγγραφή της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Σας ευχαριστώ όλους από καρδιάς που συμβάλατε στη διαμόρφωση ενός ευχάριστου και φιλικού κλίματος εργασίας, γεγονός που μετέτρεψε την εμπειρία εκπόνησης της διπλωματικής σε μία εμπειρία ζωής. 1

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Φυσιολογική δομή και λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Τύποι αιμοσφαιρινών Οι αιμοσφαιρίνες κατά την οντογένεση Προέλευση και οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Διαταραχές στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης : οι θαλασσαιμίες Η α-θαλασσαιμία α Κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά της α-θαλασσαιμίας β Η μοριακή βάση της α-θαλασσαιμίας Η β-θαλασσαιμία α Κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά της β-θαλασσαιμίας β Η μοριακή βάση της β-θαλασσαιμίας Παγκόσμια κατανομή των θαλασσαιμιών Η περίπτωση της Ελλάδας Τρόποι διάγνωσης Αιματολογική και βιοχημική διάγνωση Μοριακή διάγνωση Ένα πολυδύναμο διαγνωστικό εργαλείο: η αλληλούχιση νέας γενιάς Προγεννητικός έλεγχος Επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος Σκοπός ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Δείγματα Χειρισμός δειγμάτων και απομόνωση γενετικού υλικού Το πάνελ για την ανίχνευση θαλασσαιμικών μεταλλαγών Η Αλληλούχιση Νέας Γενιάς Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης Η PCR γαλακτώματος (emulsion PCR) Αλληλούχιση Συλλογή δεδομένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Αλληλούχιση μαρτύρων για α- και β- θαλασσαιμίες Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος Μη επεμβατική διερεύνηση κληρονόμησης πολυμορφισμών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ 68 2

4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Φυσιολογική δομή και λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Η ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη είναι ένα ετεροτετραμερές σφαιρικό μόριο που κύριο σκοπό έχει τη μεταφορά οξυγόνου από τους πνεύμονες στους ιστούς και διοξειδίου του άνθρακα από τους ιστούς στους πνεύμονες. Η αιμοσφαιρίνη ήταν μία από τις πρώτες πρωτεΐνες που αλληλουχήθηκαν (Konigsberg, Guidotti, & Hill, 1961; Rabbitts, 1976; Schroeder et al., 1961) και τα σχετιζόμενα γονίδια ήταν από τα πρώτα που κλωνοποιήθηκαν (Rabbitts, 1976). Μετέπειτα μελέτες προσδιόρισαν τη δομή του συμπλόκου με υψηλή ευκρίνεια (Park, Yokoyama, Shibayama, Shiro, & Tame, 2006). Αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες οι οποίες σχηματίζουν δύο ζεύγη. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες που δομούν την αιμοσφαιρίνη ονομάζονται σφαιρίνες. Ο γενικός τύπος του μορίου είναι x 2 y 2 ώστε να υποδηλώνεται ότι κάθε ένα από τα δύο ζεύγη σχηματίζεται από δύο ίδιες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Το μέγεθος των πολυπεπτιδικών αλυσίδων των σφαιρινών μπορεί να ποικίλει και είναι συνήθως ίσο και μεγαλύτερο από 140 αμινοξέα. Κάθε αλυσίδα σφαιρίνης συγκρατεί και από ένα μόριο αίμης, η οποία αποτελείται από ένα πεπτίδιο πρωτοπορφυρίνης ΙΧα συνδεδεμένο με ένα μόριο δισθενούς σιδήρου. Ένα τυπικό μόριο σφαιρίνης αποτελείται από 8 ελικοειδή και 6 μη ελικοειδή τμήματα. Η ομάδα της αίμης σε κάθε μόριο σφαιρίνης αλληλεπιδρά κυρίως με τα κατάλοιπα ιστιδίνης, βαλίνης και τυροσίνης στις θέσεις Ε7, Ε11 και HC2 αντίστοιχα, οι οποίες ονομάζονται από το αμινοτελικό άκρο, με τα μονά κεφαλαία γράμματα να αντιστοιχούν σε περιοχές α-έλικας και αυτά με τα δύο κεφαλαία γράμματα σε περιοχές εκτός αυτής (Collins & Weissman, 1984). Οι τέσσερις σφαιρίνες με τις αντίστοιχες ομάδες αίμης αποτελούν το ενεργό κέντρο του μορίου, στο οποίο επιτελείται τη λειτουργία της μεταφοράς του οξυγόνου. Εικόνα 1.1: Α. Η συντηρημένη τριτοταγής δομή δύο αλυσίδων σφαιρινών. Β. Η δομή της αιμοσφαιρίνης, με κίτρινο φαίνεται ο δακτύλιος της πρωτοπορφυρίνης ΙΧ, με πορτοκαλί το άτομο σιδήρου και με κόκκινο το συνδεδεμένο οξυγόνο. Προσαρμογή από (Schroeder et al., 1961; Thom, Dickson, Gell, & Weiss, 2013) 3

5 1.1.1 Τύποι αιμοσφαιρινών Γενικά, οι αλυσίδες των σφαιρινών χωρίζονται σε δύο κατηγορίες, αυτές του τύπου α, οι οποίες είναι οι α και ζ, και αυτές τύπου β, που είναι οι β, γ, δ, και ε. Αυτές συνδυάζονται σε διαφορετικά ζευγάρια, δύο ίδιες αλυσίδες τύπου α με δύο ίδιες αλυσίδες τύπου β και δημιουργούν διαφορετικούς τύπους αιμοσφαιρινών. Οι αλυσίδες κάθε τύπου παρουσιάζουν ομολογία μεταξύ τους στην πρωτοταγή διάταξη. Η κύρια αιμοσφαιρίνη του ανθρώπου είναι η HbA, η οποία συναντάται σε παιδιά και ενήλικες. Αποτελεί ένα ετεροτετραμερές με δύο αλυσίδες α και δύο αλυσίδες β και ο τύπος της είναι α 2 β 2. Η α αλυσίδα αποτελείται από 141 αμινοξέα ενώ η β από 146. Επίσης στους ενήλικες εντοπίζεται σε μικρό ποσοστό 2-3% η αιμοσφαιρίνη HbA 2 η οποία αποτελείται από δύο α αλυσίδες και δύο δ αλυσίδες και έχει τύπο α 2 δ 2. Στα έμβρυα, ανάλογα με την πορεία της κύησης εντοπίζονται διαφορετικές αιμοσφαιρίνες. Στο πρώτο τρίμηνο της κύησης υπάρχουν τρεις αιμοσφαιρίνες: η αιμοσφαιρίνη Hb Gower I, η οποία αποτελείται από δύο αλυσίδες ζ και δύο ε και έχει τύπο ζ 2 ε 2, η αιμοσφαιρίνη Hb Gower II η οποία αποτελείται από δύο α αλυσίδες και δύο ε και έχει τύπο α 2 ε 2 και η αιμοσφαιρίνη Portland η οποία αποτελείται από δύο ζ αλυσίδες και δύο γ και έχει τύπο ζ 2 γ 2. Μετά τον τρίτο μήνα εγκυμοσύνης οι παραπάνω σφαιρίνες εξαφανίζονται και εμφανίζεται η κύρια εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη, η HbF. Αυτή, αποτελεί τετραμερές δύο α αλυσίδων και δύο γ, με τύπο α 2 γ 2. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι γ αλυσίδων, αυτός που έχει αλανίνη στη θέση 136 του μορίου και αυτός που έχει γλυκίνη στην αντίστοιχη θέση. Ο πρώτος αναφέρεται σαν Αγ και ο δεύτερος σαν Gγ τύπος σφαιρινικής αλυσίδας (Enver et al., 1990). Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται οι διαφορετικοί τύποι αιμοσφαιρίνης, το όνομα και το χρονικό στάδιο στο οποίο αυτοί εντοπίζονται στον άνθρωπο: Όνομα αιμοσφαιρίνης Τύπος αιμοσφαιρίνης Χρονικό στάδιο Hb Gower I ζ 2 ε 2 έως το πρώτο τρίμηνο κύησης Hb Gower II α 2 ε 2 έως το πρώτο τρίμηνο κύησης Hb Portland ζ 2 γ 2 έως το πρώτο τρίμηνο κύησης HbF α 2 γ 2 εμβρυϊκό και ενήλικο (<0,5%) HbA α 2 β 2. ενήλικο HbA 2 α 2 δ 2 ενήλικο Πίνακας 1.1:Οι διαφορετικές αιμοσφαιρίνες του ανθρώπου. 4

6 1.1.2 Οι αιμοσφαιρίνες κατά την οντογένεση Σε όλους τους οργανισμούς που χρησιμοποιούν αιμοσφαιρίνη για τη μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς αυτή διαφοροποιείται ανάμεσα στα πρώτα και στα τελευταία στάδια της ανάπτυξης. Κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του ανθρώπου συμβαίνουν δύο, κυρίως, αλλαγές στην αιμοσφαιρίνη: η μία πραγματοποιείται κατά το πέρας του πρώτου τριμήνου της κύησης και η δεύτερη την περίοδο που ακολουθεί τη γέννηση. Η πρώτη συμπίπτει χρονικά με την περίοδο που η ερυθροποίηση παύει να συμβαίνει στο λεκιθικό σάκο και η λειτουργία μεταφέρεται στο ήπαρ του εμβρύου. Η δεύτερη επικαλύπτεται χρονικά με την περίοδο που τον κύριο λόγο στην ερυθροποίηση αναλαμβάνει ο μυελός των οστών. Η αλλαγή από την έκφραση της ε αλυσίδας σφαιρίνης στη γ και από την γ στη β ελέγχεται αποκλειστικά στο επίπεδο της μεταγραφής. Αντίθετα, η αντικατάσταση της έκφρασης των ζ αλυσίδων σφαιρίνης από τις α ελέγχεται εν μέρει στο επίπεδο της αντιγραφής αλλά παίζουν ρόλο και μετά-μεταφραστικοί παράγοντες. Στον άνθρωπο, η ζ είναι η πρώτη αλυσίδα τύπου α που εκφράζεται, σύντομα όμως αντικαθίσταται από την α. Οι ε και γ είναι οι πρώτες αλυσίδες τύπου β που εκφράζονται και αντικαθίστανται αργότερα από τις δ και β. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η χρησιμότητα της παραπάνω ιδιότητας: οι πρώιμες και οι όψιμες εμβρυικές αιμοσφαιρίνες εμφανίζουν μεγαλύτερη χημική συγγένεια με το οξυγόνο δίνοντας τη δυνατότητα στο έμβρυο να προσλαμβάνει αρκετό οξυγόνο από το μητρικό αίμα (Hardison, 1998). Τα περισσότερα είδη έχουν μόνο ένα χρονικό σημείο μετάβασης όσον αφορά στις αιμοσφαιρίνες τους που συνάδει με το πρώτο στάδιο των ανθρώπων. Αυτό δείχνει πως η έκφραση των γ αλυσίδων σφαιρίνης την εμβρυϊκή περίοδο είναι ένα σχετικά πρόσφατο συμβάν στην εξέλιξη που τοποθετείται στα 35 με 55 εκατομμύρια χρόνια πριν (Stamatoyannopoulos, 2005). Πιο συγκεκριμένα, στα αρχικά στάδια της εμβρυϊκής ζωής πρώτες εκφράζονται οι ζ και ε αλυσίδες σφαιρίνης. Η έκφρασή τους τερματίζεται κατά την 8 η -10 η εβδομάδα. Στις αρχές της κύησης, πριν το πέρας του πρώτου μήνα αρχίζει η έκφραση των αλυσίδων α και γ. Η παραγωγή α αλυσίδων είναι αμετάβλητη και συνεχόμενη και μετά τη γέννηση και ενηλικίωση του ατόμου, ενώ αυτή της γ υφίσταται κυρίως σε όλη τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και ελαττώνεται δραματικά την περίοδο μετά τη γέννηση. Η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη εξακολουθεί να εκφράζεται σε μικρό ποσοστό και μετά τη γέννηση και αποτελεί έως και το 0,5% των αιμοσφαιρινών του μέσου ενήλικου ατόμου (Enver et al., 1990) Από την τρίτη έως την όγδοη εβδομάδα κύησης, όπως προαναφέρθηκε, η ερυθροποίηση πραγματοποιείται στο λεκιθικό σάκο. Μετά την όγδοη εβδομάδα αυτή πραγματοποιείται κυρίως στο ήπαρ του εμβρύου και σε μικρότερο βαθμό στον σπλήνα. Την περίοδο κοντά στη γέννηση τον ερυθροποιητικό ρόλο αναλαμβάνει ο μυελός των οστών. Μετά τη γέννηση τα ποσοστά της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης μειώνονται ώστε να πάρουν την τιμή του ποσοστού που αυτά εντοπίζονται στο ενήλικο άτομο. 5

7 Εικόνα 1.2: Έκφραση σφαιρινικών αλυσίδων κατά την ανάπτυξη του οργανισμού. Προσαρμογή από Προέλευση και οργάνωση των γονιδίων των σφαιρινών Τα γονίδια των σφαιρινών ομαδοποιούνται σε δυο μεγάλες γονιδιακές συστοιχίες. Η διάκριση των αλυσίδων σε τύπου α και τύπου β αντικατοπτρίζεται στις δύο αυτές μεγάλες γονιδιακές συστοιχίες στις οποίες οργανώνονται. Οι γονιδιακές συστοιχίες των γονιδίων των σφαιρινών είναι από τις καλύτερα χαρακτηρισμένες. Όλα τα γονίδια των σφαιρινών προέρχονται από γεγονότα διπλασιασμού και απόκλισης ενός, μόνο, προγονικού γονιδίου. Αυτό συμπεριλαμβάνει επίσης και τα γονίδια της μυοσφαιρίνης και λεγκαιμοσφαιρίνης. Τα γονίδια των σφαιρινών α και β διαχωρίστηκαν κατά την περίοδο της πρώιμης εξέλιξης των σπονδυλωτών και οι συστοιχίες των γονιδίων τύπου α και τύπου β δημιουργήθηκαν αργότερα (Hardison, 1998). Η συστοιχία των σφαιρινών τύπου β βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 11, εκτείνεται σε μήκος μεγαλύτερο από 50 kb και περιέχει πέντε λειτουργικά γονίδια: τα ε, δύο γ, το δ και το β και ένα μη λειτουργικό γονίδιο: το ψβ. Όπως έχει προαναφερθεί, οι αλυσίδες που κωδικοποιούνται από τα δύο γονίδια γ διαφέρουν στην αλληλουχία τους σε ένα μόνο αμινοξύ, με αποτέλεσμα η αλυσίδα Αγ να έχει στη θέση 136 αλανίνη ενώ η αλυσίδα Gγ να έχει στην αντίστοιχη θέση το αμινοξύ γλυκίνη. Η συστοιχία των σφαιρινών τύπου α βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 16, είναι πιο συμπαγής από αυτή τύπου β και εκτείνεται σε μήκος 28 kb. Περιλαμβάνει ένα ενεργό γονίδιο ζ, ένα μη λειτουργικό γονίδιο ζ, δύο γονίδια α, δύο μη λειτουργικά γονίδια α και το γονίδιο θ, το οποίο έχει άγνωστη λειτουργία. Τα δύο γονίδια α 6

8 κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη. Μη λειτουργικά γονίδια ή αλλιώς ψευδογονίδια χαρακτηρίζονται αυτά που δεν οδηγούν στη σύνθεση σφαιρινών. Αυτή η αδυναμία έκφρασης μπορεί να εντοπίζεται είτε στο επίπεδο της μεταγραφής είτε στο επίπεδο της μετάφρασης ή και στα δύο. Εικόνα 1.3: Οι γονιδιακές συστοιχίες των γονιδίων σφαιρινών τύπου α και τύπου β. Προσαρμογή από Όλα τα γονίδια έχουν δομικές και λειτουργικές ομοιότητες. Το καθένα έχει τρία εξώνια τα οποία κωδικοποιούν τη αμινοξική αλληλουχία κάθε σφαιρινικής αλυσίδας. Μεταξύ αυτών παρεμβάλλονται δύο εσώνια που ονομάζονται IVSI και IVSII. Τα εσώνια μεταγράφονται παράλληλα με τα εξώνια και τα αρχικά μετάγραφα των γονιδίων περιέχουν τόσο τις κωδικές όσο και τις μη κωδικές αλληλουχίες του κάθε γονιδίου. Τα εσώνια στη συνέχεια απομακρύνονται με τη διαδικασία της ωρίμανσης του προδρόμου mrna. Τα εσώνια των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β είναι πανομοιότυπα αλλά διαφορετικά και μικρότερα από εκείνα του των γονιδίων τύπου α. Εικόνα 1.4: Τα γονίδια α και β σφαιρίνης. Με μαύρο σκιαγραφούνται τα εξώνια των γονιδίων και με άσπρο τα εσώνια IVS1 και IVS2. Προσαρμογή από 7

9 1.3 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών. Όσον αφορά τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β, πρώτα θα αναφερθούν τα cis ρυθμιστικά στοιχεία. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται ο υποκινητής, ο οποίος περιέχει τις αλληλουχίες προς την 5 πλευρά του γονιδίου μέχρι τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Οι εγγύς αλληλουχίες του υποκινητή περιλαμβάνουν το κουτί ΤΑΤΑ που απέχει 30 bp από το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Μία άλλη αλληλουχία CAAT απέχει περίπου 80 bp από το σημείο έναρξης και είναι ένα σημείο αναγνώρισης της RNA πολυμεράσης. Επιπλέον, ρυθμιστικό ρόλο παίζει και μια τρίτη αλληλουχία που βρίσκεται σε απόσταση bp και έχει τη χαρακτηριστική σύσταση CACCC. Εκτός από αυτές, καταρροϊκά του δομικού γονιδίου υπάρχουν δύο ενισχυτές (Antoniou, deboer, Habets, & Grosveld, 1988). Επίσης, πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση ολόκληρης της γονιδιακής συστοιχίας των γονιδίων τύπου β σφαιρινών παίζει η ρυθμιστική περιοχή του γονιδιακού τόπου LCR. Η περιοχή εκτείνεται σε απόσταση 6kb 20kb από το ε γονίδιο και περιέχει σημεία μεγάλης ευαισθησίας στη DNάση Ι τα οποία εντοπίστηκαν όταν το ένζυμο αυτό χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης αλλαγών στη δομή της χρωματίνης. Με πειράματα ευαισθησίας σε αυτό το ένζυμο εντοπίστηκαν τέσσερις υποπεριοχές αποκλειστικά στη χρωματίνη των ερυθροειδών κυττάρων και μία επιπλέον περιοχή στη χρωματίνη και άλλων τύπων κυττάρων. Οι περιοχές αυτές αναφέρονται ως hypersensitive sites HS. Είναι σημαντικό να αναφερθεί πως η κύρια, αυτή, ρυθμιστική περιοχή βρίσκεται σε μεγάλη, σχετικά, απόσταση από τα δομικά γονίδια που ρυθμίζει. Στη λειτουργία της εντάσσεται μια έντονη ενεργότητα ενισχυτή και η δημιουργία μιας ενεργής δομής της χρωματίνης που περιλαμβάνει ολόκληρο το γενετικό τόπο. Έλλειψη της LCR προκαλεί απώλεια έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών και επιδρά στη δομή της χρωματίνης και στο χρόνο αντιγραφής του DNA σε όλο το γενετικό τόπο. Ανάλυση των μεμονωμένων υπερευαίσθητων θέσεων της β-lcr έδειξε ότι η μεγαλύτερη ενεργότητά της συνδέεται με τις θέσεις 5 HS-2, HS-3 και HS-4 ενώ η έλλειψη λη καταστολή της HS-1 δεν φαίνεται να επηρεάζει εμφανώς την έκφραση των δομικών γονιδίων. Η HS3 λειτουργεί ως ενεργοποιητής της έκφρασης των γονιδίων ε και γ. Εικόνα 1.5: Η οργάνωση της γονιδιακής συστοιχίας των σφαιρινών β τύπου. Με βέλη εμφανίζονται οι περιοχές υπερευαισθησίας (HS), με ανοιχτόχρωμα κουτιά εμφανίζονται τα δομικά γονίδια και με μαύρες γραμμές οι ελλείψεις της ρυθμιστικής περιοχής και τα θαλασσαιμικά σύνδρομα που προκαλούν (Cao & Moi, 2002). 8

10 Όσον αφορά στη γενετική συστοιχία των γονιδίων τύπου α έχει εντοπιστεί μια παρόμοια ρυθμιστική περιοχή. Αυτή αναφέρεται ως hypersensitive site -40 (HS-40) και βρίσκεται 40kb καταρροϊκά του ζ γονιδίου και περιλαμβάνει μία υπερευαίσθητη θέση. Η περιοχή αυτή λειτουργεί σαν ισχυρός ενισχυτής και είναι απαραίτητη για τα υψηλά επίπεδα έκφρασης των δομικών γονιδίων αλλά δεν έχει τις ιδιότητες της LCR των β τύπου γονιδίων. Ελλείψεις και στις δύο αυτές ρυθμιστικές περιοχές μπορούν να οδηγήσουν σε θαλασσαιμικά σύνδρομα, όπως εικονίζεται στην εικόνα 5. Η δράση των ρυθμιστικών περιοχών όπως αυτές που μόλις αναφέρθηκαν πρέπει να περιορίζεται ώστε αυτές να μη δρουν και σε άλλα γονίδια σε κοντινές ή όχι θέσεις του γονιδιώματος. Για αυτό το σκοπό σημαντικό ρόλο παίζουν οι μονωτές. Στην περίπτωση των β γονιδίων στον άνθρωπο ο γενετικός τόπος των β γονιδίων περικλείεται από δύο υπερευαίσθητες θέσεις που παίζουν το ρόλο του μονωτή. Οι θέσεις αυτές είναι η 5 HS5 και μια HS θέση στο 3 άκρο του συμπλόκου. Αναφορικά με τον τρόπο λειτουργίας της LCR έχουν προταθεί πολλά μοντέλα, όπως αυτό της δημιουργίας θηλιάς, το οποίο είναι και αυτό που υποστηρίζουν τα πειραματικά δεδομένα. Αξίζει να αναφέρουμε πως τα άλλα μοντέλα είναι αυτά της ανίχνευσης, της κατευθυνόμενης ανίχνευσης και της σύνδεσης. Σύμφωνα με το μοντέλο της θηλιάς οι υπερευαίσθητες περιοχές της LCR σχηματίζουν ένα ολοσύμπλοκο στο οποίο προσδένονται μεταγραφικοί παράγοντες. Έτσι, σχηματίζεται μια θηλιά που φέρνει πιο κοντά την LCR στο εκάστοτε γονίδιο. Η στενή επαφή με τις αλληλουχίες κοντά στο γονίδιο επιτρέπει τη μεταφορά μεταγραφικών παραγόντων προσδεμένων στην LCR και άλλων ενεργοποιητών που μπορούν, έτσι, να αλληλεπιδράσουν με το βασικό μηχανισμό της μεταγραφής. Σύμφωνα με το ανταγωνιστικό μοντέλο, τα γονίδια της συστοιχίας ανταγωνίζονται για την ενεργοποιητική δράση της LCR η οποία μπορεί να αλληλεπιδρά με ένα μόνο γονίδιο κάθε φορά. Επομένως, τα μεμονωμένα γονίδια των σφαιρινών που βρίσκονται στη σειρά ανάλογα με το χρόνο έκφρασής τους, ανταγωνίζονται διαδοχικά το ένα το άλλο για την επίδραση της LCR. Εκτός από τον ανταγωνισμό, άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν την ισχύ και τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ της LCR και των γονιδίων των σφαιρινών και κατ επέκταση την συνολική έκφραση είναι η σειρά των γονιδίων, η απόσταση από την LCR και οι διαφορετικοί μεταγραφικοί παράγοντες που ποικίλουν ανάλογα με το επίπεδο ανάπτυξης του οργανισμού (Cao & Moi, 2002). Εικόνα 1.6: Το μοντέλο της ανταγωνιστικής ρύθμισης της συστοιχίας γονιδίων σφαιρινών τύπου β. Με το γράμμα S σημειώνονται θέσεις αποσιωποιητών. Προσαρμογή από (Steinberg, 2009). 9

11 Ένας από αυτούς τους παράγοντες είναι ο EKLF (Erythroid Kruppel-like factor). Ο παράγοντας EKLF αλληλεπιδρά ειδικά με την αλληλουχία CACCC στην περιοχή του υποκινητή του β γονιδίου, ενώ δεν αλληλεπιδρά με την ίδια αλληλουχία των ε και γ γονιδίων, κάτι που ενισχύει την άποψη ότι μπορεί να είναι βασικός παράγοντας στη μετατροπή έκφρασης από το γ γονίδιο στο β. Επιπλέον τα δεδομένα αρκετών πειραμάτων δείχνουν ότι η πρωτεΐνη EKLF δεν απαιτείται κατά την πρώτη εμβρυϊκή περίοδο. Η EKLF προσδένεται επίσης στις HS θέσεις της LCR και μπορεί έτσι να αυξάνει την πιθανότητα αλληλεπίδρασης της LCR με τον υποκινητή του β γονιδίου. Όταν ο παράγοντας είναι απών η περιοχή DNάση Ι HS δεν επιδρά στον υποκινητή του β γονιδίου και επηρεάζεται ο «διακόπτης» άρσης της έκφρασης των γ αλυσίδων και ενίσχυσης των β και παρατηρείται μεγαλύτερη παραμονή γ σφαιρινών και μειωμένα ποσοστά β σφαιρινών. Αξίζει να σημειωθεί πως η αλληλεπίδραση της κύριας ρυθμιστικής περιοχής με τα γονίδια είναι αντιστρεπτή. Αυτό υποστηρίζεται από το γεγονός ότι πρώιμα μετάγραφα γ σφαιρινικών αλυσίδων μπορούν να εντοπιστούν σε κύτταρα στα οποία έχει ήδη προαχθεί η εναλλαγή από γ σε β σφαιρίνες. Αυτά τα πειραματικά δεδομένα αποδεικνύουν πως η LCR δύναται να μετακινείται εμπρός και πίσω στα γονίδια του συμπλέγματος. Ο χρόνος τον οποίο αυτή παρέμεινε συνδεδεμένη στο κάθε γονίδιο καθορίζει την σφαιρίνη που θα υπερισχύει στο κυτόπλασμα. Άλλος μεταγραφικός παράγοντας που παίζει ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων των σφαιρινών είναι ο GATA-1, ο οποίος είναι ειδικός για τα ερυθροειδή κύτταρα μεταγραφικός παράγοντας με δομή δαχτύλων ψευδαργύρου. Η αλληλουχία που αναγνωρίζει (T/A)GATA(A/G) συναντάται στους υποκινητές όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε ερυθροειδή κύτταρα όπως και στις κεντρικές περιοχές της LCR και στην HS-40. Φαίνεται να παίζει ρόλο στη διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων και πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της χρωματίνης σε μια «ανοιχτή» δομή, δεδομένου ότι προσδένεται στις ρυθμιστικές περιοχές όλων των ερυθροειδών γονιδίων, βρίσκεται σε αφθονία στους πυρήνες των ερυθροειδών κυττάρων και απαιτείται μόνο κατά την τελευταία φάση της διαφοροποίησής τους. Ο παράγοντας NF-E2 (Nuclear factor-erythroid 2 είναι επίσης ειδικός για τα ερυθροειδή κύτταρα και αναγνωρίζει την αλληλουχία [(T/C)TGCGA(C/G)TCA(T/C)]. Αποτελεί ένα ετεροδιμερές από δύο πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια του φερμουάρ της λευκίνης. Η μεγάλη υπομονάδα p45 εκφράζεται σε αιμοποιητικά κύτταρα, ενώ η μικρότερη υπομονάδα p18 σε πολλούς τύπους κυττάρων. Θέσεις πρόσδεσης για την NF-E2 υπάρχουν τόσο στη β-lcr όσο και στην HS-40 (Noordermeer & de Laat, 2008). Αξίζει να σημειωθεί ότι η αρνητική ρύθμιση των γονιδίων των σφαιρινών πραγματοποιείται με την πρόσδεση γνωστών ήδη πρωτεϊνών που ο συνδυασμός τους καθορίζει κάθε φορά αν η ρύθμιση θα είναι ενισχυτική ή κατασταλτική. Παράδειγμα αποτελεί το εύρημα ότι η πρόσδεση της πρωτεΐνης GATA-1 στον υποκινητή του ε γονιδίου δρα κατασταλτικά στην έκφρασή του στα ερυθροειδή κύτταρα της ενήλικης μορφής. Στα πλαίσια αυτής της εργασίας αναφέρθηκαν ενδεικτικά τρεις σημαντικές πρωτεΐνες-παράγοντες που παίζουν κάποιο ρόλο στην ιστοειδική και εξαρτώμενη από το στάδιο ανάπτυξης έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών. Όπως φαίνεται και στην 10

12 ακόλουθη εικόνα, μελέτες έχουν δείξει πως το πλήθος αυτών των παραγόντων είναι πολύ μεγαλύτερο και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις πολύπλοκες. Εικόνα 1.7: Απεικόνιση ορισμένων παραγόντων που σχετίζονται με τη ρύθμιση της συστοιχίας των γονιδίων των σφαιρινών β τύπου. Προσαρμογή από (Noordermeer & de Laat, 2008). 1.4 Διαταραχές στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης: οι θαλασσαιμίες Θαλασσαιμίες είναι οι ασθένειες στις οποίες υπάρχει γενετικά καθοριζόμενη έλλειψη ή απουσία σύνθεσης μιας από τις αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης. Οι ίδιες ασθένειες αναφέρονται και ως μεσογειακή αναιμία. Οι θαλασσαιμίες αποτελούν μία από τις πιο διαδεδομένες γενετικές ασθένειες παγκοσμίως με τουλάχιστον γεννήσεις πασχόντων ατόμων κάθε χρόνο. Μεγαλύτερη πιθανότητα να πάσχουν ή να είναι φορείς έχουν άτομα με προέλευση από τις τροπικές ή υποτροπικές περιοχές. Ο όρος θαλασσαιμικό σύνδρομο προέρχεται από τη λέξη θάλασσα για να περιγραφεί η μεσογειακή προέλευση πολλών φορέων. Οι θαλασσαιμίες και η δρεπανοκυτταρική αναιμία ήταν από τις πρώτες ασθένειες που ταυτοποιήθηκαν και έχουν ερευνηθεί και χαρακτηριστεί λεπτομερώς στη διάρκεια των τελευταίων 50 χρόνων. Οι θαλασσαιμίες οφείλονται σε ανωμαλίες στη σύνθεση ή στη δομή των σφαιρινικών αλυσίδων τύπου α και β που σχηματίζουν το τετραμερές της αιμοσφαιρίνης. Όταν υπάρχει μειωμένη ή και μηδενική παραγωγή στις σφαιρινικές αλυσίδες τύπου α προκαλείται α-θαλασσαιμία ενώ όταν υπάρχει μειωμένη ή και μηδενική παραγωγή στις 11

13 σφαιρινικές αλυσίδες τύπου β έχουμε β-θαλασσαιμία. Από το 1970, κιόλας, οι ασθένειες αυτές, οι οποίες επηρεάζουν πρωταρχικώς τα ερυθρά αιμοσφαίρια, ήταν ανάμεσα σε αυτές που αναλύθηκαν πρώτες με τη χρήση της μοριακής βιολογίας. Ο λεπτομερής χαρακτηρισμός τους έχει εγκαθιδρύσει πολλές από τις γενετικές αρχές που συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση της γενετικής του ανθρώπου. Επιπλέον, η έρευνα στα γονίδια των σφαιρινών έχει συμβάλει σε πολύ μεγάλο βαθμό στην κατανόηση του ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στη διάρκεια της διαφοροποίησης των κυττάρων και της ανάπτυξης του οργανισμού (Higgs, Engel, & Stamatoyannopoulos, 2012) Η α- θαλασσαιμία Η α-θαλασσαιμία είναι μία από τις πιο συχνές γενετικές διαταραχές παγκοσμίως. Κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Χαρακτηρίζεται από μειωμένη σύνθεση ή απουσία σύνθεσης των σφαιρινικών αλυσίδων τύπου α που συνθέτουν το τετραμερές της αιμοσφαιρίνης. Προκαλείται, κυρίως, από ελλείψεις που αφορούν το ένα ή και τα δύο γονίδια των α σφαιρινικών αλυσίδων και σπανιότερα από μη ελλειπτικά συμβάντα α Κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά της α- θαλασσαιμίας Η α-θαλασσαιμία χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια σε κλινικό και μοριακό επίπεδο. Αναγνωρίζονται τέσσερες κλινικές καταστάσεις στις οποίες η βαρύτητα των συμπτωμάτων μεταβάλλεται. Αυτές είναι η κατάσταση του σιωπηλού φορέα, του στίγματος της α-θαλασσαιμίας, της ενδιάμεση μορφή της αιμοσφαιρίνης Η και του συνδρόμου Hb Bart s του εμβρυϊκού ύδρωπα. Oι πρώτες δύο κατηγορίες είναι σαφώς πιο ελαφριές στην εκδήλωση συμπτωμάτων από τις δεύτερες. Πρέπει να αναφερθεί πως ο κάθε άνθρωπος φέρει στο γονιδίωμα του τέσσερα α γονίδια, δύο από το μητρικό αλληλόμορφο και δύο από το πατρικό. Σιωπηλός φορέας ονομάζεται το άτομο που φέρει στο γονιδίωμα του έλλειψη ενός, μόνο, γονιδίου α σφαιρίνης, με γονότυπο (-α/αα), και χαρακτηρίζεται ως έμβρυο από μία πολύ ήπια αύξηση της τάξεως του 1% με 2% της αιμοσφαιρίνης Hb Bart, η οποία είναι ένα τετραμερές από γ σφαιρίνες και σχηματίζεται όταν υπάρχει περίσσεια γ αλυσίδων σε σχέση με τις α σφαιρινικές αλυσίδες. Στους ενήλικες η έλλειψη του ενός α γονιδίου μπορεί να μην έχει απολύτως κανένα σύμπτωμα ή να σχετίζεται με μία μέτρια μικροκυττάρωση και υποχρωμία, με φυσιολογικά επίπεδα HbA 2 και HbF. Τα άτομα που φέρουν το λεγόμενο στίγμα της α-θαλασσαιμίας έχουν έλλειψη δύο α γονιδίων από τα τέσσερα που φέρουν φυσιολογικά, και ο γονότυπος τους είναι είτε in cis (--/αα) είτε in trans (-α/-α). Χαρακτηρίζονται από μέτρια αύξηση 5% - 6% της Hb Bart κατά τη γέννηση, φαινότυπο α- θαλασσαιμικών ερυθροκυττάρων, φυσιολογικές τιμές HbA 2 και HbF και ελαττωμένο λόγο α προς β σφαιρινικών αλυσίδων που κυμαίνεται στα 0,7-0,8. Οι φορείς μη ελλειπτικών μεταλλαγών έχουν ποικίλο φαινότυπο ανάμεσα στα στάδια που προαναφέρθηκαν. Η γενετική ασθένεια HbH προκαλείται από την ύπαρξη μόνο ενός λειτουργικού α γονιδίου εκ των τεσσάρων και ο γονότυπος μπορεί να είναι (--/-α) ή (--/α ND α). Ως αποτέλεσμα, υπάρχει σχετική περίσσεια β αλυσίδων οι οποίες σχηματίζουν τετραμερή, την 12

14 αιμοσφαιρίνη HbH. Η αιμοσφαιρίνη HbH είναι ασταθής και καθιζάνει σαν ίζημα στα γερασμένα ερυθροκύτταρα, τα οποία καταστρέφονται πρόωρα στον σπλήνα, με αποτέλεσμα μέτριας έως και έντονης αιμόλυσης. Τα πιο βασικά χαρακτηριστικά της ασθένειας είναι μικροκυττάρωση και υποχρωματική υπατική αναιμία, ηπατοσπληνομεγαλία, και ίκτερος. Η έλλειψη και των τεσσάρων α γονιδίων με γονότυπο (-- /--) δημιουργεί μια κατάσταση που είναι θνησιγόνος κατά τη γέννηση. Τα άτομα που τη φέρουν ονομάζονται ύδρωπες, λόγω του εκτεταμένου οιδήματος που εμφανίζουν. Σε αυτή την περίπτωση σχηματίζεται η Hb Bart s, η οποία περιγράφηκε παραπάνω. Η επιβίωση των ατόμων αυτών μέχρι τη γέννηση οφείλεται στην παρουσία της εμβρυονικής αιμοσφαιρίνης Hb Portland. Στον παρακάτω πίνακα εμφανίζονται συγκεντρωτικά τα κλινικά χαρακτηριστικά των προαναφερθέντων τεσσάρων περιπτώσεων. Κατάσταση Σιωπηλός φορέας Στίγμα α-θαλασσαιμίας Σύνδρομο HbH Εμβρυϊκός ύδρωπας Κλινικά χαρακτηριστικά κλινικά και αιματολογικά φυσιολογικά μικροκυττάρωση, υποχρωμία και ήπια αναιμία Μέτρια έως σοβαρή μικροκυττάρωση, υποχρωμία, αιμολυτική αναιμία, ήπιος ίκτερος, μέτρια ηπατοσπληνομεγαλία σοβαρή αναιμία, γενικευμένο οίδημα, σημαντική ηπατοσπληνομεγαλία, σκελετικές και καρδιομυικές δυσπλασίες, συνήθως θάνατος πριν ή κατά τη γέννηση Πίνακας 1.2: Κλινικά χαρακτηριστικά διαβαθμισμένων φαινοτύπων α-θαλασσαιμικών συνδρόμων β Η μοριακή βάση της α- θαλασσαιμίας Η α-θαλασσαιμία όπως προαναφέρθηκε προκαλείται συχνότερα από ελλείψεις που αφορούν το ένα ή και τα δύο γονίδια α σφαιρίνης του κάθε αλληλομόρφου. Οι πιο συχνές ελλείψεις αφαιρούν ένα γονίδιο α σφαιρίνης οδηγώντας σε έναν πολύ ήπιο α + - θαλασσαιμικό φαινότυπο. Ο αμοιβαίος ανασυνδιασμός μετά από λανθασμένη αντιπαράθεση υψηλά ομόλογων περιοχών που ονομάζονται κουτιά Ζ, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός χρωμοσώματος με μία έλλειψη έκτασης 3,7 kb η οποία περιέχει ένα γονίδιο α σφαιρίνης. Ο γονότυπος ενός ατόμου ετερόζυγου για την παραπάνω έλλειψη αναφέρεται ως (αα -3.7 /αα). Με παρόμοιο τρόπο, λόγω λανθασμένης αντιπαράθεσης και ανασυνδιασμού δύο άλλων υψηλά ομόλογων περιοχών, των κουτιών Χ οδηγεί σε μία έλλειψη 4,2 kb. Ο γονότυπος ενός ατόμου ετερόζυγου για την παραπάνω έλλειψη αναφέρεται ως (αα -4,2 /αα). Αυτά τα γεγονότα ανασυνδιασμού επίσης οδηγούν στο σχηματισμού ενός αλληλομόρφου που περιέχει τρία γονίδια της α σφαιρίνης. Οι ελλείψεις α -3,7 και α -4,2 ευθύνονται για το μεγαλύτερο ποσοστό του α + φαινοτύπου θαλασσαιμίας. Άλλες σπανιότερες ελλείψεις αφαιρούν μερικώς ή ολικώς ένα ή περισσότερα α γονίδια. 13

15 Εικόνα 1.8: Σχηματική απεικόνιση των μηχανισμών δημιουργίας των συχνότερων ελλείψεων που οδηγούν σε α- θαλασσαιμία. (Α) Τμήμα της γονιδιακής συστοιχίας στην οποία φαίνονται οι περιοχές ομολογίας x και z. (Β) Επιχιασμός μεταξύ των x ομόλογων περιοχών οδηγεί στην έλλειψη 4,2 kb και αναφέρεται ως αριστερόστροφος καθώς τα ομόλογα κουτιά βρίσκονται στη αριστερή πλευρά του γονιδίου. Επιχιασμός μεταξύ των z ομόλογων περιοχών οδηγεί στην έλλειψη 3.7 kb και αναφέρεται ως δεξιόστροφος καθώς τα ομόλογα κουτιά βρίσκονται στη δεξιά πλευρά του γονιδίου. Kαι στις δύο περιπτώσεις μόνο ένα γονίδιο α σφαιρίνης είναι λειτουργικό. (Borg et al., 2009) Εκτεταμένες ελλείψεις, που ποικίλουν από 100 έως περισσότερες από 250 kb, αφαιρούν όλο το κομμάτι ή τμήμα της γονιδιακής συστοιχίας συμπεριλαμβανομένων και των δύο γονιδίων των α σφαιρινών και καμιά φορά και το εμβρυονικό γονίδιο ζ σφαιρίνης, οδηγούν σε παντελή έλλειψη παραγωγής της α σφαιρίνης από το συγκεκριμένο αλληλόμορφο. Τέτοιες ελλείψεις προκαλούν α 0 -θαλασσαιμικό φαινότυπο. Αυτές οι εκτεταμένες ελλείψεις είναι αποτελέσματα μοριακών μηχανισμών όπως ο άνισος ανασυνδιασμός, η αμοιβαία μετάθεση και η αναστροφή του χρωμοσώματος 16. Περισσότερες από 40 διαφορετικές ελλείψεις που προκαλούν α 0 -θαλασσαιμικό φαινότυπο έχουν ταυτοποιηθεί, με τις πιο συνηθισμένες να είναι οι νοτιοανατολικού ασιατικού (SEA) και μεσογειακού τύπου (MED). Δύο ακόμα ελλείψεις, οι α 5,2 και α 20,5 αφαιρούν το α2 σφαιρινικό γονίδιο και τμήμα του α1 σφαιρινικού γονιδίου και οδηγούν επίσης σε α 0 - θαλασσαιμία. Εκτός από αυτές, έχουν ταυτοποιηθεί πολλές ακόμα ελλείψεις που αφορούν άλλα γονίδια της γονιδιακής συστοιχίας όπως τα Rho GDI γ, PDI-R ή άλλες περιοχές της συστοιχίας που δεν ανήκουν στο δομικό μέρος των γονιδίων. Τέλος, ποικίλες ελλείψεις που αφορούν την ρυθμιστική περιοχή MCS-R ενώ αφήνουν άθικτα και τα δύο α γονίδια έχουν χαρακτηρισθεί πως προκαλούν α 0 -θαλασσαιμία. 14

16 Εικόνα 1.9: Οι κύριες μεταλλάξεις ελλειπτικού τύπου που προκαλούν α-θαλασσαιμία. (Chui, 2005) Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η α-θαλασσαιμία προκαλείται και από μεταλλάξεις μη ελλειπτικού τύπου. Μία από αυτές είναι η μετάλλαξη που χαρακτηρίζεται από έλλειψη των κωδικονίων έναρξης AUG. Δεδομένου ότι το νέο κωδικόνιο έναρξης βρίσκεται στη θέση 32 η αλυσίδα που παράγεται είναι ελαττωματική. Έχει βρεθεί ακόμα μία μετάλλαξη καταρροϊκά του γονιδίου που παράγει μικρότερο σε μέγεθος λειτουργικό mrna. Έχει διαπιστωθεί μόνο μία μετάλλαξη που σχετίζεται με την ωρίμανση του πρώιμου mrna και αποτελείται από έλλειψη 5 ζευγών βάσεων και η οποία αδρανοποιεί μία θέση δότη στο εσώνιο 1. Τέσσερις διαφορετικές σημειακές μεταλλάξεις έχουν τροποποιήσει το κωδικόνιο λήξης UAA της α αλυσίδας με αποτέλεσμα να διαβάζεται η αλληλουχία έως ότου βρεθεί νέο κωδικόνιο λήξης, 31 τριπλέτες μετά. Τα μετάγραφα που δημιουργούνται είναι ασταθή. Η Hb Contant Sping είναι η πιο συχνή από αυτές τις επιμηκυμένες σφαιρίνες και ακολουθούν οι Hb Ikaria, Hb Seal Rock και Ηb Koya Dora. Στην Hb Quong Sze η μεταλλαγή 109 Leu Pro σχετίζεται με την ένωση του διμερούς α1β1 και έχει ως αποτέλεσμα την πρόκληση μεγάλης αστάθειας στο μόριο. Άλλα τέτοια παράγωγα είναι η Hb Heraklion με τη μεταλλαγή 137 pro 0, και η Hb Agrinio με τη μεταλλαγή 29 Leu Pro, οι οποίες δεν δύνανται να σχηματίσουν σταθερά τετραμερή και αποδομούνται ταχέως προκαλώντας σε κάποιες περιπτώσεις α-θαλασσαιμικό φαινότυπο Η β- θαλασσαιμία Η β-θαλασσαιμία είναι μία από τις πιο συχνές γενετικές διαταραχές παγκοσμίως. Κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Η β-θαλασσαιμία προκαλείται από μειωμένη σύνθεση ή απούσα σύνθεση των σφαιρινικών αλυσίδων τύπου β που συνθέτουν το τετραμερές της αιμοσφαιρίνης. Αν η παραγωγή αυτή είναι μειωμένη τότε η θαλασσαιμία χαρακτηρίζεται ως β + ενώ αν είναι απούσα χαρακτηρίζεται ως β - ή β 0. Αναγνωρίζονται τρεις κλινικές και αιματολογικές περιπτώσεις, ανάλογα με τα επίπεδα σοβαρότητας του συνδρόμου, αυτά είναι: η 15

17 περίπτωση του φορέα της β-θαλασσαιμίας, της ενδιάμεσης θαλασσαιμίας και της μείζονος θαλασσαιμίας. Η κλινική σοβαρότητα της β-θαλασσαιμίας σχετίζεται με την έκταση της ανισορροπίας μεταξύ των σφαιρινικών αλυσίδων τύπου α και αυτές τύπου β. Όταν απουσιάζουν ή υποεκφράζονται οι β-τύπου αλυσίδες, οι α-τύπου σφαιρινικές αλυσίδες που δεν χρησιμεύουν στο σχηματισμό του ετεροτετραμερούς της αιμοσφαιρίνης σχηματίζουν έγκλειστα και προκαλούν οξειδωτική βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων επιφέροντας την απόπτωσή τους. Τα συσσωματώματα που δημιουργούνται από την περίσσεια των α αλυσίδων ονομάζονται σωμάτια Heinz α Κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά της β- θαλασσαιμίας Η κατάσταση του φορέα της β-θαλασσαιμίας, η οποία είναι αποτέλεσμα ετεροζυγωτίας για τη διαταραχή, δεν εμφανίζει κλινικά συμπτώματα και χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες αιματολογικές ενδείξεις. Τα αιματολογικά αυτά χαρακτηριστικά είναι η μικροκυττάρωση, δηλαδή ο μειωμένος όγκος των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η υποχρωμία, δηλαδή η μειωμένη μέση περιεκτικότητα των ερυθρών αιμοσφαιρίων σε αιμοσφαιρίνη, η αυξημένη αναλογία των επιπέδων HbA 2 και ο ελαφρώς ανισόρροπος λόγος σύνθεσης των ά σφαιρινών προς τις β (1,5-2,4). Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης σε άτομο φορέα χαρακτηρίζεται από 92% - 95% HbA, περισσότερη της 3.8% HbA 2, και ποικίλο ποσοστό της HbF που κυμαίνεται από 0,5% έως και 4%. Η μείζον β-θαλασσαιμία είναι μια σοβαρή κατάσταση αναιμίας που χρήζει μεταγγίσεων. Ασθενείς με τέτοιο τύπο θαλασσαιμίας έχουν μία σοβαρή μικροκυτταρική και υποχρωματική αναιμία που σχετίζεται με αυξημένο αριθμό ερυθρών αιμοσφαιρίων, χαμηλό μέσο όγκο αιμοσφαιρίων (MCV) και χαμηλή μέση κατά βάρος περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη (MCH). H μικροσκοπική παρατήρηση παρασκευάσματος από το περιφερειακό αίμα δείχνει επίσης ανισοκυττάρωση, ποικιλοκύτταρωση και πυρηνοειδή ερυθρά αιμοσφαίρια, όπως ερυθροβλάστες. Ο αριθμός των ερυθροβλαστών σχετίζεται με τον βαθμό της αναιμίας και είναι εμφανώς αυξημένο μετά από σπληνεκτομή. Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης σε ένα πάσχων άτομο ποικίλει. Σε ασθενείς με β 0 τύπο θαλασσαιμίας η HbA απουσιάζει εντελώς, η HbF κυμαίνεται στα ποσοστά 95% έως 98% και η HbA 2 στα 2-5%. Σε ασθενείς με β + τύπο θαλασσαιμίας σε ομόζυγη κατάσταση ή ετερόζυγους με β 0 / β + αλληλόμορφα η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης δείχνει την HbA μεταξύ 10% και 30%, την HbF μεταξύ 70-90%, και HbA2 στο 2-5%. Αιματολογικός Δείκτης Αιμοσφαιρίνη Hb Μονάδα μέτρησης g/dl Αιματοκρίτης % Αριθμός ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) /L Φυσιολογικές Τιμές A: Γ: A: Γ: A: Γ: Ετερόζυγος β- θαλασσαιμίας χαμηλότερη χαμηλότερος Ελαφρά μεγαλύτερος αριθμός 16

18 Μέσος όγκος ερυθροκυττάρων (MCV) fl Μέση κατά βάρος περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη (MCH ) Μέση εκατοστιαία περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη (MCHC ) pg g/dl χαμηλότερη Hb A 2 % έως HbF % έως 0.5 Πίνακας 1.3: Οι αιματολογικές παράμετροι ενός ατόμου ετερόζυγου για β-θαλασσαιμία. ΚΦ ή ελαφρά αυξημένη Η ενδιάμεση β-θαλασσαιμία περικλείει μία κλινικά και γενετικά ιδιαιτέρως ετερογενή ομάδα διαταραχών που μοιάζουν με τη θαλασσαιμία, οι οποίες ποικίλουν στη σοβαρότητα, από αυτή του ασυμπτωματικού φορέα έως αυτή που χρήζει μεταγγίσεως αίματος. Τα αιματολογικά χαρακτηριστικά αυτών των ατόμων παρουσιάζουν ετερογένεια και ποικίλουν σε σοβαρότητα από την κατάσταση του φορέα μέχρι αυτή του πάσχοντος ατόμου από μέιζουσα β-θαλασσαιμία (Cao & Galanello, 2010) β Η μοριακή βάση της β- θαλασσαιμίας H β-θαλασσαιμία παρουσιάζει υψηλή ετερογένεια σε μοριακό επίπεδο. Μέχρι τώρα έχουν χαρακτηριστεί περισσότερες από 200 μεταλλαγές που προκαλούν ασθένεια. Η πλειοψηφία των μεταλλαγών είναι μεμονωμένες νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις, αλλά υπάρχουν και ελλείψεις ή προσθήκες ολιγονουκλεοτιδίων που οδηγούν σε μετατόπιση του πλαισίου ανάγνωσης. Σπάνια η β-θαλασσαιμία ευθύνεται σε έλλειψη σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδίου. Ακόμα και σήμερα, μέρα με τη μέρα, η γνώση των μεταλλαγών που προκαλούν την ασθένεια μεγαλώνει και οι βάσεις δεδομένων εμπλουτίζονται, καθώς εντοπίζονται καινούριες μεταλλάξεις. Είναι εσφαλμένο να υποθέσουμε πως επειδή η β- θαλασσαιμία είναι μια διαταραχή που έχει ερευνηθεί διεξοδικά, γνωρίζουμε σήμερα όλα τα πιθανά αίτια. Γενικά, οι μεταλλαγές που αφορούν ένα συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο και επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β ανήκουν σε τρεις διαφορετικές κατηγορίες: σε μεταλλαγές που οδηγούν σε λανθασμένη μεταγραφή του β γονιδίου οι οποίες είναι μεταλλαγές στον υποκινητή και στην περιοχή 5 UTR, μεταλλαγές που αφορούν την ωρίμανση του μεταγραφικού RNA, οι οποίες μπορεί να βρίσκονται στις περιοχές ματίσματος, πολυαδενυλίωσης, και στην περιοχή 3 UTR, και μεταλλαγές που οδηγούν σε μη φυσιολογική μετάφραση όπως αυτές που δημιουργούν πρώιμο κωδικόνιο λήξης, προκαλούν μετακίνηση του πλαισίου ανάγνωσης ή τροποποιούν το κωδικόνιο έναρξης. Ο φαινότυπος της β 0 -θαλασσαιμίας χαρακτηρίζεται από παντελή έλλειψη της β σφαιρινικής αλυσίδας ως αποτέλεσμα: 17

19 έλλειψης, μεταλλαγής στο κωδικόνιο έναρξης της μεταγραφής, μεταλλαγής που δημιουργεί πρώιμο κωδικόνιο λήξης, μεταλλαγής που προκαλεί μετακίνηση του πλαισίου ανάγνωσης και μεταλλαγές στις περιοχές ματίσματος. Στον αντίποδα, Ο φαινότυπος της β + -θαλασσαιμίας χαρακτηρίζεται από μειωμένη παραγωγή της β σφαιρινικής αλυσίδας και μπορεί να ευθύνεται σε: μεταλλαγή στην περιοχή του υποκινητή, είτε στην αλληλουχία CACCC είτε στο κουτί TATA μεταλλαγή στην αλληλουχία-σήμα πολυαδενυλίωσης στις περιοχές 5 και 3 UTR μεταλλαγή που προκαλεί λανθασμένη ωρίμανση Ανάλογα με την έκταση της μείωσης στην παραγωγή της β σφαιρινικής αλυσίδας οι μεταλλάξεις που προκαλούν β + -θαλασσαιμία μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε σοβαρές, ήπιες και αθόρυβες. Οι "σιωπηλές " μεταλλάξεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ομαλά αιματολογικά στοιχεία προκαλούνται από μεταλλάξεις στην αλληλουχία του υποκινητή CACCC, στην περιοχή 5 UTR, την αλληλουχία-σήμα πολυαδενυλίωσης και σε κάποιες περιοχές που επηρεάζουν το μάτισμα. Οι ήπιες μεταλλάξεις χαρακτηρίζονται από ήπια αναιμικά αιματολογικά στοιχεία και ανισόρροπη σύνθεση σφαιρινικών αλυσίδων και αποτελούνται από μεταλλάξεις στην αλληλουχία του υποκινητή CACCC, στο κουτί TATA, στις περιοχές 5 και 3 UTR, στο εξώνιο 1, μεταλλάξεις που προκαλούν εναλλακτική συρραφή (Hb Malay, HbE, και μετάλλαξη codon 24 T A) και στη θέση πολυαδενυλίωσης. Μεταλλάξεις που ενεργοποιούν μια κρυφή αλληλουχία που αποτελεί σημείο ματίσματος στο εξώνιο 1, στο κωδικόνιο 19, 26 και 27 σχετίζονται με ήπιο ή αθόρυβο φαινότυπο εξαιτίας της προτιμώμενης χρήσης του κανονικού σημείου ματίσματος και οδηγούν στην παραγωγή της αιμοσφαιρίνης Hb Malay, HbE και Hb Knossos αντίστοιχα. Μερικές μεταλλάξεις β 0 -θαλασσαιμίας εμφανίζουν έναν ήπιο φαινότυπο (παραδείγματα αποτελούν οι cd6-a και η cd 8-AA) εξαιτίας της συσχέτισής τους με μία μεταλλαγή στον υποκινητή του Gγ γονιδίου ( 158 ) η οποία σχετίζεται με υψηλή παραγωγή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης. 18

20 Εικόνα 1.10: Σιωπηλές και ήπιες μεταλλαγές που προκαλούν β-θαλασσαιμία. Προσαρμογή από (Cao & Galanello, 2010). Παρά την ετερογένεια και το πλήθος των διαφορετικών τύπων των μεταλλάξεων που αναφέρθηκαν παραπάνω οι μεταλλάξεις που προκαλούν μείζον τύπο θαλασσαιμίας και ξεχωρίζουν για τη σοβαρότητά τους είναι πληθυσμιακά περιορισμένες και 4-10 μεταλλάξεις ευθύνονται για τα περισσότερα παθολογικά αλληλόμορφα παγκοσμίως. Στο χάρτη που ακολουθεί φαίνονται οι πιο συχνές παθολογικές μεταλλάξεις καθώς και η πληθυσμιακή τους τοποθέτηση στους πληθυσμούς της μεσογείου. 19

21 Εικόνα 1.11: Κατανομή των πιο συχνών παθολογικών μεταλλάξεων που προκαλούν β-θαλασσαιμία στη Μεσόγειο. Προσαρμογή από (Cao & Galanello, 2010). Οι ελλείψεις στο β γονίδιο είναι σπάνιες, εκτός από μία έλλειψη 619-bp στο 3 άκρο του β γονιδίου. Μια άλλη ομάδα ελλείψεων που δημιουργούν τις σύνθετες β-θαλασσαιμίες αφορούν εκτός από το γονίδιο της β σφαιρίνης και αυτό της δέλτα σφαιρίνης και προκαλούν τη δβ-θαλασσαιμία. Αν η έλλειψη περικλείει και τα γονίδιο Gγ και Αγ έχουμε τη Gγ/Αγδβ-θαλασσαιμία. Τέλος, μερική η ολική έλλειψη της LCR η οποία αφήνει ανέπαφο το β γονίδιο οδηγεί παρόλα αυτά στην αποσιώπηση του (Cao & Galanello, 2010). Οι ελλείψεις προκαλούνται λόγω κακής αντιπαράθεσης των ομόλογων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μείωσης. Η κακή αντιπαράθεση οφείλεται στη μεγάλη ομολογία την οποία έχουν οι περιοχές γύρω από την έλλειψη. Ανασυνδυασμοί που ακολουθούν την κακή αντιπαράθεση οδηγούν σε ελλείψεις διαφόρων μεγεθών. Η αντιγραφή των γονιδίων συνήθως ακολουθείται από επιπλέον γεγονότα ανασυνδιασμού. Ο άνισος επιχιασμός μπορεί να αυξήσει ή να μειώσει τον αριθμό γονιδίων μιας συστοιχίας. Η ομολογία των γονιδίων των σφαιρινών ευθύνεται για τη λανθασμένη αντιπαράθεση μεταξύ των ομολόγων αλλά κα πανομοιότυπων γονιδίων η οποία οδηγεί σε διπλασιασμούς, ελλείψεις, αλλά και δημιουργία υβριδικών γονιδίων με την ένωση του αμινοτελικού άκρου μιας σφαιρινικής αλυσίδας και του καρβοξυτελικού άκρου μιας άλλης. Η Hb Lepore είναι προϊόν ενός τέτοιου μη ομόλογου ανασυνδιασμού και είναι μια σφαιρίνη αποτέλεσμα υβριδισμού των γονιδίων της β και της δ σφαιρίνης. Αυτή μπορεί να έχει διαφορετικά μεγέθη δ και β γονιδίων που εξαρτώνται από το σημείο που έχει γίνει ο επιχιασμός. Μαζί με το αλληλόμορφο που παράγει την Hb Lepore δημιουργείται και το αντίστροφο, το οποίο εκφράζεται στην πρωτεΐνη anti Lepore. Ένα άλλο παράδειγμα υβριδικής σφαιρίνης αποτελεί η Hb Kenya στην οποία συμβαίνει κακή αντιπαράθεση μεταξύ των Αγ και β γονιδίων (Borg et al., 2009). 20

22 . Εικόνα 1.12: Σχηματισμός μέσω άνισου επιχιασμού των υβριδικών γονιδίων της (A) Ηb Lepore μετά από λανθασμένη αντιπαράθεση των β και δ γονιδίων και (Β) της Hb Kenya μετά από λανθασμένη αντιπαράθεση των β και Gγ γονιδίων Προσαρμογή από (Borg, Georgitsi, Aleporou-Marinou, Kollia, & Patrinos, 2009). 1.5 Κατανομή των θαλασσαιμιών παγκοσμίως Τόσο η α-θαλασσαιμία όσο και η β-θαλασσαιμία είναι ιδιαίτερα διαδεδομένες σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές. Συγκεκριμένα για την η α-θαλασσαιμία, οι πιο σοβαρές μορφές είναι ευρέως περιορισμένες στην Νοτιοανατολική Ασία και στην Κίνα (SEA) και πιστεύεται ότι αποτελούν μικρότερο πρόβλημα από τη β-θαλασσαιμία. Παρόλα αυτά, η αύξηση των τάσεων μετανάστευσης από αυτές τις περιοχές έχει σαν αποτέλεσμα την τάση προς ανάδειξη της α-θαλασσαιμίας σε ένα παγκόσμιο πρόβλημα. Το ποσοστό των φορέων για την κοινή έλλειψη του γονιδίου της α σφαιρίνης με γονότυπο (--/SEA) έχει καταγραφεί από 3% έως 14% σε διάφορες περιοχές της Ασίας συμπεριλαμβανομένου 4.6% στην Βόρεια Ταϊλάνδη, 4,1% στο Χονγκ Κονγκ και 4,1% στην Γκουάγκντονγκ περιφέρεια της Κίνας. Η συχνότητα του μη ελλειπτικού αλληλομόρφου Constant Spring βρέθηκε να κυμαίνεται μεταξύ 1% και 6% σε διάφορες περιοχές της Νοτιοανατολικής Ασίας. Στην βόρεια Αμερική και την Ευρώπη οι μεταναστευτικές τάσεις οδήγησαν σε εκδήλωση κλινικών φαινοτύπων πολλοί εκ των οποίων προκαλούνται από μεταλλάξεις προηγουμένως λιγότερο αναγνωρισμένες (Singer, 2009). 21

23 Εικόνα 1.13: Κατανομή της α-θαλασσαιμίας σε Ευρώπη, Αφρική, Ασία και Ωκεανία. Με κόκκινο σκιαγραφούνται οι περιοχές στις οποίες εμφανίζεται. (Singer, 2009). Όσον αφορά στη β-θαλασσαιμία ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας εκτιμά πως το 1%-5% του παγκόσμιου πληθυσμού ενδέχεται να είναι φορείς της β-θαλασσαιμίας και πως περίπου σοβαρά νοσούντα παιδιά γεννιούνται κάθε χρόνο (Modell & Darlison, 2008). Αυτά τα άτομα προέρχονται κυρίως από την περιοχή της Μεσογείου, της Κεντρικής Ασίας, Ινδίας και νότιας Κίνας γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή ύπαρξη κάποιου προσαρμοστικού πλεονεκτήματος στους φορείς του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου. Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει και για την κατανομή της α-θαλασσαιμίας, η οποία είναι ευρύτερα διαδεδομένη και πιο συχνή από τη β-θαλασσαιμία. Ευρήματα από εκτενείς μελέτες υποδηλώνουν έντονα πως άτομα με το στίγμα είτε της α-θαλασσαιμίας είτε της β- θαλασσαιμίας είναι με κάποιον τρόπο προστατευμένοι στις περιοχές που η ελονοσία που προκαλείται από το Plasmodium falciparum είναι ή ήταν σε επιδημία. Τα ερυθροκύτταρα των φορέων είναι περισσότερο ανθεκτικά στην προσβολή από το πρωτόζωο προσδίνοντας τους προσαρμοστικό πλεονέκτημα στις πληγείσες περιοχές. Έτσι, με τη δράση της φυσικής επιλογής η συχνότητα των φορέων αυξήθηκε στις περιοχές που υπήρχε επιδημία ελονοσίας (Weatherall, Williams, Allen, & O'Donnell, 2010). 1.6 Η περίπτωση της Ελλάδας Η Ελλάδα είναι μία χώρα υψηλού κινδύνου για τα θαλασσαιμικά σύνδρομα καθώς αυτά αποτελούν την πιο συχνή κληρονομική διαταραχή για τη χώρα. Συγκεκριμένα, στην Ελλάδα υφίσταται μία μέση επικράτηση των ετερόζυγων ατόμων για τη β-θαλασσαιμία περίπου στο 8%. Η θαλασσαιμίες, όπως έχει αναφερθεί, χαρακτηρίζονται από μεγάλη ετερογένεια. Η ετερογένεια αυτή αντικατοπτρίζεται και στον ελληνικό πληθυσμό. Κάποιες θαλασσαιμικές μεταλλάξεις έχουν εισαχθεί σχετικά πρόσφατα στη χώρα εξαιτίας της μετανάστευσης πληθυσμών από Βόρεια, κυρίως από την Αλβανία, ανατολικά κυρίως από Τουρκία, Ιράκ, Ιράν, Πακιστάν, Φιλιππίνες και νότια από την Αίγυπτο. Η μεγάλη συχνότητα των θαλασσαιμιών στην Ελλάδα έχει τεράστιο αντίκτυπο στη δημόσια υγεία. Το Εθνικό 22

24 Πρόγραμμα για την Πρόληψη της Θαλασσαιμίας (ΕΠΠΑ) δημιουργήθηκε το 1973 ώστε να επιτευχθεί η πρόληψη νέων περιπτώσεων μέσω γενετικής συμβουλευτικής και προγεννητικού ελέγχου. Δεδομένα από 3796 ετερόζυγους για τη β-θαλασσαιμία που απευθύνθηκαν στο προαναφερθέν κέντρο πρόληψης για προγεννητικό έλεγχο έδωσαν μια εικόνα στους ερευνητές για τη συχνότητα των μεταλλάξεων της β-θαλασσαιμίας στον ελληνικό πληθυσμό και οδήγησαν στην ταυτοποίηση κάποιων σπανίων μεταλλάξεων (Boussiou et al., 2008). Μετά από τον έλεγχο 4489 χρωμοσωμάτων σχηματίστηκε ο πίνακας που ακολουθεί: Εικόνα 1.14: Η συχνότητα των μεταλλάξεων σε ετερόζυγα άτομα για β-θαλασσαιμία. Προσαρμογή από (Boussiou et al., 2008) Πολύ σημαντική περίπτωση που χρήζει ιδιαίτερης προσοχής είναι η γέννηση παιδιών που πάσχουν από κάποιο θαλασσαιμικό σύνδρομο επειδή οι γονείς ήταν ετερόζυγοι για κάποια μεταλλαγή. Σε αυτές τις περιπτώσεις το σημαντικότερο ρόλο παίζει η πρόληψη, η οποία παίρνει τη μορφή του προγεννητικού ελέγχου. Τα τελευταία χρόνια με τις καινούριες τεχνικές και την βελτίωση των υφιστάμενων μεθόδων προγεννητικού ελέγχου η μείωση στις γεννήσεις πασχόντων βρεφών είναι ραγδαία. Παρόλα αυτά, η συντονισμένη προσπάθεια γενετικής συμβουλευτικής πρέπει να συνεχιστεί ώστε να το ποσοστό πασχόντων βρεφών να πλησιάσει το μηδενικό (Voskaridou et al., 2012). 23

25 Εικόνα 1.15: Πίνακας με τον αριθμό των γεννήσεων ατόμων με αιμοσφαιρινοπάθειες για τα έτη στην Ελλάδα. Προσαρμογή από (Voskaridou et al., 2012). 1.7 Τρόποι διάγνωσης Η διάγνωση των θαλασσαιμιών μπορεί να γίνει με βάση τα αιματολογικά χαρακτηριστικά, βιοχημικές μεθόδους και μοριακές τεχνικές Αιματολογική και βιοχημική διάγνωση Όπως αναφέρθηκε, τα αιματολογικά χαρακτηριστικά των πασχόντων και φορέων θαλασσαιμίας διαφέρουν από το μέσο όρο του υπόλοιπου πληθυσμού. Οι βασικές παράμετροι που διαφοροποιούνται όπως απεικονίζονται και στον πίνακα είναι ο μέσος όγκος ερυθροκυττάρων, ο αριθμός ερυθροκυττάρων, η μέση περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη, ο αιματοκρίτης. Τα χαρακτηριστικά αυτά εξετάζονται από αυτοματοποιημένο αναλυτή ερυθρών αιμοσφαιρίων από δείγμα περιφερικού αίματος. Μικροσκοπική αιματολογική παρατήρηση προϊδεάζει επίσης για την ύπαρξη θαλασσαιμικού συνδρόμου (Cao & Galanello, 2010). Επίσης, σε πάσχοντες ή φορείς διαφοροποιούνται και τα ποσοστά ορισμένων αιμοσφαιρινών όπως η HbA2 και η HbF, ανάλογα με τη μετάλλαξη. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής ευκρίνειας (HPLC) ή της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης ποσοτικοποιούντα τα ποσοστά των προαναφερθέντων αιμοσφαιρινών και ανιχνεύεται η ύπαρξη άλλων τύπων αιμοσφαιρίνης, όπως είναι η HbS, HbS, HbC, και HbE αν αναφερόμαστε στη β-θαλασσαιμία ή η HbH και Hb Barts αν αναφερόμαστε σε α- θαλασσαιμικά σύνδρομα. Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης με ισοηλεκτρική εστίαση (ΙΕF) ή ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με κλίση συγκέντρωσης (DGGE) αποτελούν μία παραδοσιακή μέθοδο ανίχνευσης συγκεκριμένων τύπων θαλασσαιμιών όπως είναι η διαταραχή HbH, Hb 24

26 Barts, Hb Contant Spring, HbE και Ηb Lepore. Oι δύο παραπάνω μέθοδοι συνήθως συνδυάζονται. Ευρύτατα χρησιμοποιημένη μέθοδος εκτίμησης θαλασσαιμικών συνδρόμων είναι ο υπολογισμός του λόγου των α σφαιρινικών αλυσίδων προς τις β σφαιρινικές αλυσίδες όπως περιγράφηκε από τους Weatherall και Clegg το 1965 (Harteveld & Higgs, 2010).. Εικόνα 1.16: Εικόνα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Ανάλυσης και Ηλεκτροφόρισης ενός ατόμου με α- θαλασσαιμία HbH (Harteveld & Higgs, 2010) Μοριακή διάγνωση Για τη μοριακή διάγνωση της α-θαλασσαιμίας, δεδομένου ότι τα συχνότερα αίτια της είναι μεταλλάξεις ελλειπτικού τύπου, χρησιμοποιείται ευρύτατα η μέθοδος της Μultiplex gap PCR με εκκινητές σχεδιασμένους για να περιστοιχίζουν την χαρακτηρισμένη εκάστοτε έλλειψη. Η αντίδραση θα δώσει προϊόν συγκεκριμένου μεγέθους μόνο αν η συγκεκριμένη έλλειψη υπάρχει. Το προϊόν ανιχνεύεται στη συνέχεια με κλασική ή τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Για υποπτευόμενες ή εντελώς άγνωστες μεταλλάξεις χρησιμοποιείται κυρίως η μέθοδος πολλαπλής ενίσχυσης ανιχνευτών εξαρτώμενης από την αντίδραση λιγάσης (ΜLPA). Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην υβριδοποίηση δυο ειδικών ανιχνευτών ανά περιοχή-στόχο, οι οποίοι συνδέονται μεταξύ τους με την αντίδραση της λιγάσης μόνον εφόσον οι ανιχνευτές είναι ειδικά υβριδοποιημένοι. Αντίθετα, οι πιο συνηθισμένες μεταλλάξεις που προκαλούν β-θαλασσαιμία είναι σημειακές ή μικρές ελλείψεις και προσθήκες. Η πιο συνηθισμένη μέθοδος γι αυτή την περίπτωση είναι η πολλαπλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιώντας εκκινητές συγκεκριμένους για το κάθε αλληλόμορφο που εξετάζεται, όπως για παράδειγμα το σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση (ARMS) το οποία βασίζεται 25

27 στο γεγονός ότι μια ασυμφωνία ζευγαρώματος ανάμεσα στο 3 νουκλεοτίδιο ενός εκκινητή PCR και της μήτρας μειώνει ή εμποδίζει την επιμήκυνση του εκκινητή από την Taq πολυμεράση. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση (DGGE) αποτελεί μία μοριακή μέθοδο, η οποία βασίζεται στη διαφορά στη θερμοκρασία τήξης (Tm) ανάμεσα σε δίκλωνα προϊόντα PCR, που προκαλείται εξαιτίας διαφορών στην αλληλουχία. Ακόμα και μία μονονουκλεοτιδική αντικατάσταση τροποποιεί το Tm του δείγματος και το διαφοροποιεί από το φυσιολογικό μάρτυρα στο πήκτωμα. Εξαιτίας του μικρού, συγκριτικά, μεγέθους των γονιδίου των σφαιρινών οι σημειακές μεταλλαγές που ευθύνονται τόσο για την α όσο και τη β-θαλασσαιμία μπορούν να ανιχνευθούν οικονομικά αποδοτικά με αλληλούχιση. Η πιο διαδεδομένη μέθοδος αλληλούχισης μέχρι τώρα είναι η μέθοδος sanger, η οποία βασίζεται στην επιλεκτική ενσωμάτωση διδεσοξυριβονουκλεοτιδίων που σταματούν το διπλασιασμό του DNA από την DNA πολυμεράση κατά τη διάρκεια του διπλασιασμού in vitro. Η μέθοδος αυτή έχει προοδεύσει αρκετά από την εφεύρεσή της το 1977 και παραμένει 30 χρόνια μετά ευρύτατα χρησιμοποιημένη. Τροποποιώντας σε μικρό βαθμό τη μέθοδο αλλά στηριζόμενοι στην ίδια αρχή έχουν κατασκευαστεί αυτοματοποιημένοι αναλυτές που είναι ευρέως διαδεδομένοι, ταχείς και χρησιμοποιούνται για την αλληλούχιση μονογονιδιακών διαταραχών στον μεγαλύτερο αριθμό των διαγνωστικών εργαστηρίων (Ip & So, 2013) Ένα πολυδύναμο διαγνωστικό εργαλείο: η αλληλούχιση νέας γενιάς Αν και η αλληλούχιση κατά Sanger παρέμεινε στο προσκήνιο για 30 χρόνια μετά την εφεύρεσή της το 1977, σήμερα επισκιάζεται από την τεχνολογία αλληλούχισης δεύτερης γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS). Η αλληλούχιση δεύτερης γενιάς επιτρέπει ακόμα και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του συνολικού DNA ενός ατόμου με την πραγματοποίηση ταυτόχρονα εκατομμυρίων αντιδράσεων αλληλούχισης μικρών τμημάτων γενωμικού υλικού. Υπάρχουν διαφορετικές τεχνολογίες αλληλούχισης νέας γενιάς. Μερικές από αυτές είναι κατά σειρά εμφάνισης: η GS 20 τεχνολογία του 454 Life Science αναλυτή νέας γενιάς, η τεχνολογία Solexa που χρησιμοποιείται από την πλατφόρμα του γενετικού αναλυτή Illumina (San Diego), η πλατφόρμα SOLiD που χρησιμοποιείται στον αναλυτή της Applied Biosystems (FosterCity, CA, USA) η τεχνολογία HeliScope Single Molecule Sequencer technology που χρησιμοποιείται από την Helicos (Cambridge, MA, USA) και η τεχνολογία PGM (Personal Genome machine) που χρησιμοποιείται από την Ion Torrent Life Technologies. Όλες οι πλατφόρμες βασίζονται στην ακόλουθη βασική αρχή: το γονιδίωμα κατακερματίζεται και τα θραύσματα γενετικού υλικού ενώνονται με ουδέτερους προσαρμογείς (adaptors) και στη συνέχεια υπεισέρχονται σε επεξεργασία ανάλογα με το πρωτόκολλο κάθε πλατφόρμας, ώστε να σχηματιστεί μια συστοιχία από εκατομμύρια ακινητοποιημένες στο χώρο ομάδες προϊόντων PCR. Η κάθε ομάδα αποτελείται από πολλαπλά αντίγραφα ενός τμήματος της θραυσματοποιημένης αρχικής βιβλιοθήκης. Όπως οι προαναφερθείσες ομάδες είναι ακινητοποιημένες σε μια επίπεδη παράταξη, μία μικροποσότητα αντιδραστηρίου είναι ικανή να επιδράσει σε όλες, ώστε να γίνει παράλληλος χειρισμός. Με τον ίδιο τρόπο μπορεί να επιτευχθεί και η ανίχνευση βασισμένη σε φθορισμό ή μεταβολή του ph, για όλες τις μονάδες παράλληλα. Διαδοχικές επαναλήψεις του ενζυμικού χειρισμού και της ανίχνευσης χρησιμοποιούνται ώστε να δημιουργηθεί η συνεχής αλληλουχία κάθε συστοιχίας (Shendure & Ji, 2008). Η κάθε πλατφόρμα παρουσιάζει μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα ανάλογα με το αντικείμενο της χρήσης της. Οι ευρύτερα χρησιμοποιημένες σήμερα είναι οι τεχνολογίες 26

28 των γενετικών αναλυτών της Ion Torrent (PGM, Proton) και των γενετικών αναλυτών της Illumina (ΗiSeq, Genome analyzer lix και MySeq). Οι διαφορετικές πλατφόρμες, αν και διαφέρουν στη βιοχημεία της διαδικασίας και στον τρόπο κατασκευής των συστοιχιών, στο σύνολό τους στηρίζονται σ' έναν αξιοθαύμαστο συνδυασμό διατάξεων νανοτεχνολογίας και οπτικής, στην ανάπτυξη υπολογιστικών μεθοδολογιών για την επεξεργασία μεγάλου όγκου δεδομένων και την εντατικοποίηση τεχνικών μοριακής βιολογίας. Για το σκοπό της παρούσας διπλωματικής εργασίας θα αναλυθεί περαιτέρω η μέθοδος που χρησιμοποιείται στον αναλυτή PGM της Ion Torrent. Η συγκεκριμένη μέθοδος βασίζεται στην αρχή του ημιαγωγού. Σύμφωνα με αυτή, χαμηλού κόστους ημιαγωγικές τεχνικές χρησιμοποιούνται ώστε να δημιουργηθεί ένα διαβαθμισμένο κύκλωμα ικανό να πραγματοποιήσει αλληλούχιση γενετικού υλικού η οποία δεν είναι αποτέλεσμα οπτικών ερεθισμάτων. Τα δεδομένα της αλληλούχισης συγκεντρώνονται από την άμεση ανίχνευση ιόντων που παράγονται από τη δράση της πολυμεράσης στην πλατφόρμα με τη χρήση μη επεξεργασμένων νουκλεοτιδίων. Η μαζική και παράλληλη αλληλούχιση πραγματοποιείται από ημιαγώγιμη συσκευή ή ιοντική πλατφόρμα (Ion chip). Η ιοντική πλατφόρμα περιέχει ευαίσθητους σε ιόντα ανιχνευτές που καταγράφουν τέλεια τις μεταβολές των 1-2 εκατομμυρίων εσοχών, γεγονός που επιτρέπει την ανεξάρτητη παράλληλη και ταυτόχρονη ανίχνευση ξεχωριστών αντιδράσεων αλληλούχισης (Rothberg et al., 2011). Η διαδικασία μπορεί να χωρισθεί σε 4 βήματα: i) την προετοιμασία των βιβλιοθηκών, ii) την PCR γαλακτώματος, (Emulsion PCR), iii) την αλληλούχιση και iv) τη συλλογή και επεξεργασία δεδομένων. Κατά την προετοιμασία των βιβλιοθηκών απομονώνονται οι περιοχές ενδιαφέροντος από ολόκληρο το γονιδίωμα μέσω μιας αρχικής PCR και στα άκρα των μονόκλωνων sstdnas που προκύπτουν προσδένονται προσαρμογείς. Στην PCR γαλακτώματος, τα προϊόντα της βιβλιοθήκης sstdna ανακατεύονται με τα ειδικά σφαιρίδια ISPs (Ion Sphere Particles) και μέσω μιας διαδικασίας μίξης συνδέονται και ενισχύονται, ώστε σε κάθε σφαιρίδιο να υπάρχουν συνδεδεμένα πολλά sstdna. Στο στάδιο της αλληλούχισης το διάλυμα που προέκυψε φορτώνεται σε ειδικό chip που περιέχει εσοχές, η κάθε μία εκ των οποίων επικοινωνεί με έναν ανιχνευτή. Ο ανιχνευτής ανιχνεύει τη μεταβολή του ph που συμβαίνει όταν παράγεται ένα ιόν υδρογόνου (H + ) από την ένωση δύο νουκλεοτιδίων, κατά τον κανόνα της συμπληρωματικότητας. Καθώς τα μονονουκλεοτίδια πλημμυρίζουν το chip διαδοχικά, ο αναλυτής μπορεί να υπολογίσει πότε υπήρξε συμπληρωματικότητα και να προβεί στην αλληλούχιση του κάθε κλώνου. Τα δεδομένα οπτικοποιούνται μετά από πολλαπλές διαδικασίες ελέγχου και αντιστοιχίζονται σε επιλεγμένα γονιδιώματα αναφοράς. Αναλυτικότερη αναφορά στα στάδια της μεθόδου θα πραγματοποιηθεί στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Εικόνα 1.17 Σχηματική απεικόνηση των βημάτων ίδιας τεχνολογίας με τον γενετικό αναλυτή δεύτερης γενιάς PGM. Προσαρμογή από (Mardis, 2008). 27

29 1.8 Προγεννητικός έλεγχος Λόγω της αυξημένης συχνότητας των ατόμων που φέρουν κάποια θαλασσαιμική μεταλλαγή και εξαιτίας της ολοένα και μεγαλύτερης γεωγραφικής εξάπλωσης των συνδρόμων κρίνεται αναγκαία η πρόληψη της ομόζυγης κατάστασης μέσω του προγεννητικού ελέγχου και της γενετικής συμβουλευτικής. Ο προγεννητικός έλεγχος κρίνεται απαραίτητος σε περίπτωση που και οι δύο γονείς είναι φορείς κάποιας μετάλλαξης που έχει χαρακτηρισθεί ότι προκαλεί θαλασσαιμικό σύνδρομο, ανεξάρτητα από το αν και οι δύο φέρουν την ίδια ή διαφορετική μεταλλαγή. Γενετική συμβουλευτική θα πρέπει να παρέχεται πριν αλλά και μετά τον έλεγχο ώστε να ερμηνευθεί το αποτέλεσμα για κάθε κύηση του προαναφερθέντος ζεύγους. Ο προγεννητικός έλεγχος γίνεται με δύο τρόπους: τον επεμβατικό και τον μη επεμβατικό Επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος Επεμβατικά, η προγεννητική διάγνωση των θαλασσαιμιών γίνεται είτε με λήψη χοριακών λαχνών του πλακούντα, ή αλλιώς τροφοβλαστών (CVS), κατά την 10 η 14 η εβδομάδα της κύησης είτε με αμνιοπαρακέντηση και λήψη αμνιακού υγρού μετά την 15 η εβδομάδα κύησης είτε, σπανιότερα, με τη λήψη εμβρυϊκού αίματος μέσω ομφαλοπαρακέντησης μετά τη 18 η εβδομάδα κύησης. Η επαρκής ποσότητα ιστού για μοριακό χειρισμό από τη λήψη τροφοβλαστών είναι 2 mm ενώ από τη λήψη αμνιακού υγρού 10ml. Μετά τη λήψη του δείγματος γίνεται απομόνωση του εμβρυϊκού DNA και αυτό στη συνέχεια υφίσταται επεξεργασία ανάλογα με την προτιμούμενη διαγνωστική μέθοδο κάθε εργαστηρίου. Συνηθέστερες μέθοδοι είναι η Gap-PCR, η τεχνική MLPA και η ΑRMS-PCR (βλέπε υποενότητα 1.7.2). Εμβρυϊκό αίμα που αποκτάται με την ομφαλοπαρακέντηση μπορεί, εκτός από τις μοριακές τεχνικές, να εξετασθεί και βιοχημικά και να μετρηθεί η ποσότητα της HbA. Αυτή η περίπτωση είναι πολύ χρήσιμη για τη διάγνωση της εμβρυϊκής διαταραχής του ύδρωπα της α-θαλασσαιμίας. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται, κυρίως, μετά από υπερηχογραφικά ευρήματα που σχετίζονται με τη διαταραχή. Για να πραγματοποιηθεί, όμως, σωστά η διάγνωση είναι απαραίτητο να έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί μοριακά οι μεταλλάξεις των γονέων από δείγματα περιφερικού αίματος. Τα κύρια μειονεκτήματα του επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου είναι ότι η διαδικασία ελλοχεύει κίνδυνο σε ποσοστό 1% αυτόματης αποβολής του εμβρύου και ψυχολογικής καταπόνησης της εγκύου. Επίσης, για τη λήψη αμνιακού υγρού και εμβρυϊκού αίματος κύριο μειονέκτημα αποτελεί η απαιτούμενη διάρκεια κύησης ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ομφαλοπαρακέντηση έχει συσχετισθεί με μεγαλύτερο ποσοστό αυτόματων αποβολών από ότι οι άλλες μέθοδοι. Επίσης, η πρόωρη λήψη χοριακών λαχνών αυξάνει περαιτέρω τον κίνδυνο αυτόματων αποβολών, και δυσπλασίας μελών, ενώ η πρόωρη λήψη αμνιακού υγρού έχει συσχετισθεί με πνευμονική υποπλασία (Li & Yang, 2016). 28

30 1.8.2 Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος Εξαιτίας των κινδύνων που προαναφέρθηκαν η σύγχρονη έρευνα έχει οδηγηθεί σε μία προσπάθεια εύρεσης τρόπων μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου. Οι περισσότερες έρευνες επικεντρώθηκαν σε στρατηγικές ανίχνευσης και ανάλυσης του γενετικού υλικού του εμβρύου το οποίο υπάρχει στην κυκλοφορία της εγκύου. Η απόδειξη ότι το εμβρυϊκό DNA υπάρχει θραυσματοποιημένο και ελεύθερο στον ορό της εγκύου στη διάρκεια της εγκυμοσύνης αποδείχθηκε από τον Dennis Lo και τους συνεργάτες του το 1997 με την ανίχνευση αλληλουχιών ειδικών για το Y χρωμόσωμα από εγκυμοσύνες αρρένων εμβρύων. Η ανακάλυψη αυτή άνοιξε το δρόμο για την κατασκευή μιας μεθοδολογίας διάγνωσης γενετικών ασθενειών των εμβρύων από το περιφερικό αίμα των εγκύων, χωρίς τον κίνδυνο της αυτόματης αποβολής και του στρες αλλά με την πραγματοποίηση μίας, μόνο, αιμοληψίας. Προγεννητικός μη επεμβατικός έλεγχος μπορεί να αφορά ολόκληρο το γονιδίωμα, όπως η περίπτωση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών, αλλά και μονογονιδιακές ασθένειες. Το ελεύθερο DNA (cfdna) στον ορό της εγκύου αποτελεί μια μίξη ελεύθερου μητρικού και ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffdna). Το ελεύθερο εμβρυϊκό DNA αποτελεί ένα μικρό κλάσμα στον ορό της εγκύου το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί με τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου από την 18 η,κιόλας, ημέρα της κύησης. Προέρχεται από κύτταρα τροφοβλαστών τα οποία αποδομούνται με αποτέλεσμα το γενετικό υλικό του εμβρύου να εισέρχεται στην κυκλοφορία της μητέρας. Αντιθέτως, το ελεύθερο γενωμικό DNA της εγκύου είναι κυρίως αιμοποιητικής προέλευσης. Τόσο το μητρικό όσο και το εμβρυϊκό ελεύθερο DNA είναι αλληλουχίες λίγων βάσεων, λιγότερο από 200 ζ.β., με το εμβρυϊκό να είναι ακόμα μικρότερο από το μητρικό με μέσω όρο μεγέθους τις 145 βάσεις. Ποσοτική ανάλυση του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA με την τεχνολογία της PCR πραγματικού χρόνου το ανάγει σε ποσοστό 3-6% στον ορό της εγκύου. Παρόλα αυτά, πιο πρόσφατες εφαρμογές μεθόδων με μεγαλύτερη ευαισθησία, όπως είναι η μαζική παράλληλη αλληλούχιση (MPS) έχουν αποδείξει ότι το ποσοστό αυτό αγγίζει ακόμα και το 10% κατά μέσο όρο στην αρχή της εγκυμοσύνης. Με την ίδια μέθοδο έχει αποδειχθεί πως στο cfdna αντιπροσωπεύεται ολόκληρο το γονιδίωμα της εγκύου και του εμβρύου με σταθερή αναλογία μεταξύ τους. Η συγκέντρωση του εμβρυϊκού DNA αυξάνεται στο μητρικό περιφερικό αίμα όσο εξελίσσεται η κύηση. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας του μη επεμβατικού ελέγχου επιτρέπει την ανίχνευση της πατρικά κληρονομήσιμης μεταλλαγής, η οποία δεν υπάρχει στο γονιδίωμα της μητέρας. Η αρχή της μεθόδου είναι η ποσοτική ανάλυση που ανιχνεύει την παρουσία ή απουσία του πατρικού αλληλομόρφου στο πλάσμα της εγκύου. Εφαρμογές του μη επεμβατικού ελέγχου μπορούν να συμπεριλαμβάνουν την ανίχνευση μονογονιδιακών ασθενειών, το χαρακτηρισμό του φύλου του εμβρύου, το χαρακτηρισμό του rhesus D (RhD) του εμβρύου ακόμα και για έλεγχο πατρότητας (Liao, Gronowski, & Zhao, 2014). 29

31 1.9 Σκοπός Οι θαλασσαιμίες είναι από τις ευρύτερα διαδεδομένες γενετικές παθήσεις στον ανθρώπινο πληθυσμό και προκαλούν μειωμένη σύνθεση ή ακόμα και έλλειψη κάποιας σφαιρινικής αλυσίδας. Η α-θαλασσαιμία προκαλείται κυρίως εξαιτίας μεταλλαγών ελλειπτικού τύπου σε ένα ή περισσότερα από τα τέσσερα α γονίδια ενώ η β-θαλασσαιμία προκαλείται συνήθως από σημειακές μεταλλαγές στο γονίδιο της β σφαιρίνης. Η συχνότητα των φορέων κάποιας μεταλλαγής α ή β θαλασσαιμίας είναι μεγαλύτερη σε πληθυσμούς περιμετρικά της Μεσογείου, στην Αφρική, στη Μέση Ανατολή και την Κίνα. Οι φορείς κάποιας θαλασσαιμικής μεταλλαγής δεν παρουσιάζουν κατά κανόνα παθολογικό φαινότυπο αλλά αναγνωρίζονται από τα αιματολογικά τους χαρακτηριστικά, με βιοχημικές ή μοριακές μεθόδους. Μία νέα μοριακή μέθοδος είναι η αλληλούχιση νέας γενιάς με την οποία καθίσταται δυνατή η ταυτόχρονη αλληλούχιση εκατομμυρίων θέσεων με βάθος αλληλούχισης χιλιάδες φορές για την κάθε θέση, μειώνοντας το κόστος και αυξάνοντας την ακρίβεια της διάγνωσης. Η τεχνολογία αυτή έχει ήδη βρει εφαρμογή και στην επεμβατική προγεννητική διάγνωση η οποία παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην αποφυγή γέννησης πασχόντων από θαλασσαιμία, δεδομένης της υψηλής συχνότητας φορέων παγκοσμίως αλλά και στη χώρα μας. Όμως, η τυπική προγεννητική διάγνωση με επεμβατικές μεθόδους είναι μια επίπονη διαδικασία η οποία ελλοχεύει κινδύνους για την κύηση. Προκύπτει, λοιπόν, το ερώτημα αν η ακρίβεια μιας μεθόδου όπως η αλληλούχιση νέας γενιάς δύναται να βρει εφαρμογή στην πρακτική του ασφαλούς για την κύηση μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, ο οποίος από τη στιγμή της ανακάλυψης του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στον ορό της εγκύου μέχρι σήμερα, κερδίζει διαρκώς έδαφος. Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μοριακή διερεύνηση ελλειπτικών και μη θαλασσαιμικών συνδρόμων με τη μέθοδο της αλληλούχισης νέας γενιάς, όπως, επίσης, και η διερεύνηση της ικανότητας της μεθόδου στην ανίχνευση παθολογικών πατρικών μεταλλάξεων στο κλάσμα του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA, ώστε να χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα στα πλαίσια του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου. 30

32 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Δείγματα Τα δείγματα που αλληλουχήθηκαν με την τεχνολογία αλληλούχισης νέας γενιάς στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας μπορούν να χωρισθούν σε δύο κατηγορίες: 1. Δείγματα μάρτυρες για χαρακτηρισμένες μεταλλαγές που προκαλούν θαλασσαιμία: δείγματα γενετικού υλικού απομονωμένου από το περιφερικό αίμα ασθενών και φορέων θαλασσαιμικών μεταλλάξεων από το εργαστήριο του Πρότυπου Κέντρου Μοριακής Βιολογίας και Κυτταρογενετικής «EUROGENETICA Α.Ε.» στα πλαίσια της διαγνωστικής εξέτασης, και δείγματα μάρτυρες που παραχωρήθηκαν από το Κέντρο Μεσογειακής Αναιμίας του Λαϊκού Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών. Οι μεταλλαγές που φέρουν τα συγκεκριμένα δείγματα είχαν νεώτερα ταυτοποιηθεί με μοριακές μεθόδους. Η κατηγορία αυτή αριθμούσε 28 δείγματα. 2. Δείγματα μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου: i. Ένα δείγμα μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου που παραχωρήθηκε από το Κέντρο Μεσογειακής Αναιμίας του Λαϊκού Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών, στο οποίο το έμβρυο έφερε αναγνωρισμένη πατρική μετάλλαξη β-θαλασσαιμίας. ii. Ένα δείγμα μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου εμβρύου χωρίς ύπαρξη πατρικού παθολογικού αλληλομόρφου, στις 12 και μετέπειτα στις 14 εβδομάδες κύησης, με σκοπό τη διερεύνηση πιθανής κληρονόμησης πολυμορφισμών υφιστάμενων στα γονίδια των σφαιρινών. 2.2 Χειρισμός δειγμάτων και απομόνωση γενετικού υλικού Σχετικά με τα δείγματα της πρώτης κατηγορίας, πραγματοποιήθηκε απομόνωση του γενωμικού υλικού από ολικό περιφερικό αίμα που συλλέχθηκε σε φιαλίδια EDTA. Η απομόνωση του DNA έγινε με το QIAamp DNA Mini Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μεθόδου. Παρελήφθη έτοιμο απομονωμένο γενετικό υλικό από ασθενείς και φορείς χαρακτηρισμένων θαλασσαιμικών μεταλλάξεων όπως αυτό επιλέχθηκε από το αρχείο του Πρότυπου Κέντρου Μοριακής Βιολογίας και Κυτταρογενετικής «EUROGENETICA Α.Ε.». Απομονωμένο γενετικό υλικό από περιφερικό αίμα φορέων και ασθενών θαλασσαιμικών συνδρόμων παρελήφθη και από το Κέντρο Μεσογειακής Αναιμίας του Λαϊκού Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών. Το δείγμα του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, που παραχωρήθηκε από το Κέντρο Μεσογειακής Αναιμίας του Λαϊκού Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών, παρελήφθη στη 31

33 μορφή προϊόντος PCR. Η συλλογή του δείγματος των 10 ml του περιφερικού αίματος της εγκύου έγινε σε δοχεία EDTA. Μετά τον διαχωρισμό του πλάσματος από το ολικό αίμα, η απομόνωση του ελεύθερου γενετικού υλικού του εμβρύου και της εγκύου από το πλάσμα πραγματοποιήθηκε με το QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, σύμφωνα με της οδηγίες του πρωτοκόλλου της εταιρίας. Αξίζει να αναφερθεί πως το QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit έχει αποδειχθεί πως είναι εξαιρετικά κατάλληλο για απομόνωση του ελεύθερου εμβρυϊκού cffdna από τον ορό περιφερικού αίματος εγκύου (Repiska, Sedlackova, Szemes, Celec, & Minarik, 2013). Όσον αφορά στο δείγμα της μη επεμβατικής προγεννητικής διερεύνησης ενδεχόμενης κληρονόμησης πολυμορφισμών ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: συλλέχθηκαν 4ml σε περιφερικού αίματος σε φιαλίδια EDTA από κυοφορούσα γυναίκα που διένυε τη 12 η εβδομάδα κύησης. Αμέσως μετά, το ολικό αίμα διαχωρίστηκε στα συστατικά του με φυγοκέντρηση διάρκειας 10 λεπτών και επιτάχυνσης x g. Συλλέχθηκε 1 ml πλάσμα και τοποθετήθηκε σε ισόποσες ποσότητες σε δύο δοχείο eppendorf του 1.5 ml. Διατηρήθηκε σε θερμοκρασία -20 C προσωρινά. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε μετά το πέρας δύο εβδομάδων, ώστε να συλλεχθεί υλικό και για τη 14 η εβδομάδα κύησης. Προκειμένου να απομονωθεί το ελεύθερο γενετικό υλικό μητρικής και εμβρυϊκής προέλευσης το δείγμα αποψύχθηκε και φυγοκεντρήθηκε για 3 λεπτά σε επιτάχυνση x g, ώστε να απομακρυνθούν τυχών υπολείμματα έμμορφων συστατικών του αίματος. Για την απομόνωση του cfdna χρησιμοποιήθηκε το NucleoSpin Plasma XS kit, της εταιρίας Macherey-Nagel. Στη μέθοδο αυτή γίνεται χρήση στηλών με μεμβράνες σιλικόνης ως διαχωριστικό μέσο, στις οποίες προσδένεται το γενετικό υλικό υπό συνθήκες υψηλής αλατότητας. Το προτεινόμενο πρωτόκολλο υψηλής ευαισθησίας διαφοροποιήθηκε ελαφρώς. Το διαφοροποιημένο πρωτόκολλο παρατίθεται παρακάτω: Πρωτόκολλο απομόνωσης cfdna με το NucleoSpin Plasma XS kit: μl πλάσματος αφαιρούνται προσεκτικά από το υπερκείμενο του δοχείου φύλαξης και τοποθετούνται σε δοχείο eppendorf των 1.5 ml, το οποίο εμπεριέχεται στο κιτ. To δοχείο αριθμείται νούμερο 1 2. Προστίθενται 20 μl πρωτεάσης Κ, η οποία εμπεριέχεται στο κιτ 3. Το μίγμα ανακινείται ελαφρώς και αφήνεται να επωάσει σε υδατόλουτρο που έχει προηγουμένως ρυθμιστεί στους 37 C για 10 λεπτά 4. Προστίθενται 360 μl διαλύματος με την ένδειξη Binding Buffer (ΒΒ) και πραγματοποιείται πολύ καλή ανάδευση με την πιπέττα 5. Το μίγμα ανακινείται για 3 δευτερόλεπτα σε συσκευή vortex σε μεγάλη ισχύ ώστε όλο τα τυχόν σταγονίδια των τοιχωμάτων να ενωθούν με τον κυρίως όγκο του υγρού 6. Το προϊόν του eppendorf τοποθετείται σε ειδική στήλη διαχωρισμού με μεμβράνη σιλικόνης NucleoSpin Plasma XS Column όγκου 1,5 ml, η οποία εμπεριέχεται στο κιτ 7. Η στήλη τοποθετείτε σε ειδικό δοχείο συλλογής αποβλήτων όγκου 2 ml 8. Πραγματοποιείται πρώτη φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα σε επιτάχυνση x g 9. Πραγματοποιείται δεύτερη φυγοκέντρηση για 5 δευτερόλεπτα σε επιτάχυνση x g 32

34 10. Το δοχείο συλλογής αποβλήτων απορρίπτεται με προσοχή και επανατοποθετείται ένα νέο 11. Επαναλαμβάνονται τα βήματα 1-5 για διαφορετική αρχική ποσότητα 300 μl πλάσματος. Το νέο δοχείο eppendorf αριθμείται νούμερο Το περιεχόμενο του eppendorf νούμερο 2 τοποθετούνται στην ίδια στήλη διαχωρισμού από την οποία είχε φιλτραριστεί προηγουμένως το δείγμα νούμερο Προστίθενται 500 μl Wash Buffer (WB) 14. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα σε επιτάχυνση x g 15. Το δοχείο συλλογής αποβλήτων απορρίπτεται με προσοχή και επανατοποθετείται ένα νέο 16. Προστίθενται 250 μl Wash Buffer (WB) 17. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 3 λεπτά σε επιτάχυνση x g 18. Το δοχείο συλλογής αποβλήτων απορρίπτεται με προσοχή και επανατοποθετείται ένα νέο δοχείο eppendorf των 1.5 ml με πώμα 19. Προστίθενται 20 μl Elution Buffer 20. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα σε επιτάχυνση x g 21. Η στήλη απορρίπτεται και το υγρό έκλουσης είναι συγκεντρωμένο στο δοχείο eppendorf Η διαφοροποίηση του παραπάνω πρωτοκόλλου, σε σχέση με το προτεινόμενο από την εταιρία, έγκειται στο γεγονός ότι από την ίδια στήλη διαχωρισμού περνά διπλάσια ποσότητα πλάσματος σε δύο γεγονότα. Έτσι, η ποσότητα του cfdna που θα έχει κατακρατηθεί στη μεμβράνη σιλικόνης της στήλης θα αυξηθεί, με αποτέλεσμα να έχουμε μεγαλύτερη ποσότητα cfdna στην έκλουση. Η παραπάνω τροποποίηση έγινε μετά από επιβεβαίωση εκπροσώπου της κατασκευαστικής εταιρίας, πως από την ίδια στήλη διαχωρισμού μπορούν να φιλτραριστούν έως και 600 μl πλάσματος χωρίς να υπάρχει κανένας κίνδυνος απόφραξης της μεμβράνης, γεγονός, μάλιστα, που αυξάνει την απόδοση της μεθόδου. 2.3 Το πάνελ για την ανίχνευση θαλασσαιμιών Για το σχεδιασμό του πάνελ, με το οποίο πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση των μεταλλάξεων στα γονίδια των σφαιρινών τύπου α και β, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο Ion Ampliseq ΤΜ Designer της Ion torrent by Thermo Fisher Scientific. Το πρόγραμμα αυτό, αποτελεί ένα εργαλείο που επιτρέπει το σχεδιασμό προσαρμοσμένων εκκινητών για την υψηλής ακρίβειας πολυπλεκτική PCR, η οποία αποτελεί βήμα της μεθόδου της αλληλούχισης μέσω ημιαγωγού, που χρησιμοποιεί ο γενετικός αναλυτής PGM της Ion torrent. Το πάνελ σχεδιάστηκε με την έκδοση 5.2 του εργαλείου Ion Ampliseq ΤΜ Designer, ως γονιδίωμα αναφοράς ορίστηκε το human genome 19 (hg19) και σαν είδος εργασίας (workflow) επιλέχθηκε το DNA. O συνολικός αριθμός αμπλικονίων ορίστηκε στα 61 και αυτά σχεδιάστηκαν σε δύο ανεξάρτητες δεξαμενές, τις 1 και 2. Η πρώτη δεξαμενή περιέχει 33

35 31 αμπλικόνια και η δεύτερη 30. Τα αμπλικόνια κατανέμονται σε τέσσερα χρωμοσώματα: τα χρωμοσώματα 2,11,16 και 19. Τα αμπλικόνια έχουν σχεδιαστεί για να καλύπτουν περιοχές των γονιδίων, τόσο εσωνικές όσο και εξωνικές και κάποιες περιοχές υποκινητών. Συγκεκριμένα σχεδιάστηκαν 3 αμπλικόνια σε περιοχές του γονιδίου BCL11A στο χρωμόσωμα 2, 29 αμπλικόνια σε περιοχές της γονιδιακής συστοιχίας των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β στο χρωμόσωμα 11 εκ των οποίων: 9 βρίσκονται εντός του γονιδίου ΗΒΒ, 7 βρίσκονται εντός του γονιδίου HBD, 1 στην 5 περιοχή του HBD, 2 στις περιοχές των υποκινητών των G1 και G2 γονιδίων αντίστοιχα και τα υπόλοιπα διανέμονται σε ενδιάμεσες περιοχές. 21 αμπλικόνια σε περιοχές της γονιδιακής συστοιχίας των γονιδίων των σφαιρινών τύπου α στο χρωμόσωμα 16 εκ των οποίων: τα 5 βρίσκονται εντός του γονιδίου HBA1, 5 εντός του γονιδίου HBA2, 7 στην ευρύτερη 5 περιοχή της γονιδιακής συστοιχίας, 1 εντός του γονιδίου ΗΒQ1 και τα υπόλοιπα διανέμονται σε ενδιάμεσες περιοχές. Ο όρος εντός του γονιδίου αναφέρεται τόσο σε κωδικές όσο και σε μη κωδικές περιοχές αυτού. 8 αμπλικόνια σε περιοχές του γονιδίου KLF στο χρωμόσωμα 19. Το μέσο μέγεθος κάθε αμπλικονίου του σχεδιασμού είναι περίπου στις 200 βάσεις και η συνολική έκταση του γονιδιώματος που αλληλουχείται με αυτό ανέρχεται στις νουκλεοτιδικές θέσεις. Ο συγκεκριμένος σχεδιασμός επιτρέπει την αλληλούχιση ολόκληρων των γονίδιων ΗΒΒ, ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2 (με την εξαίρεση 26 βάσεων). Εικόνα 2.1 : Η κάλυψη ολόκληρου του γονιδίου της β σφαιρίνης ΗΒΒ από τα σχεδιασμένα αμπλικόνια, όπως φαίνεται στο πρόγραμμα οπτικοποίησης IGV. Τα αμπλικόνια φαίνονται με πράσινο χρώμα, τα εξώνια του γονιδίου με μπλε πλαίσια και τα εσώνια του γονιδίου με μπλε λεπτή γραμμή. Ακολουθεί αναλυτικός πίνακας στον οποίον καταγράφονται ο κωδικός, το χρωμόσωμα στο οποίο βρίσκεται, η χρωμοσωμική θέση στην οποία ξεκινά, η χρωμοσωμική θέση στην οποία τελειώνει και το συνολικό μήκος του κάθε αμπλικονίου: 34

36 Κωδικός αμπλικονίου Χρωμόσωμα Θέση έναρξης Θέση λήξης Μήκος (bp) AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr ES7.HBB_4 chr ES7.HBB_5 chr ES7.HBB_6 chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr ES7.HBA2_1 chr ES7.HBA2_2 chr ES7.HBA2_3 chr ES7.HBA2_4 chr ES7.HBA2_5 chr AMPL chr

37 ES7.HBA1_1 chr ES7.HBA1_2 chr ES7.HBA1_3 chr ES7.HBA1_4 chr ES7.HBA1_5 chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr ES7.KLF1_1 chr ES7.KLF1_2 chr ES7.KLF1_3 chr ES7.KLF1_4 chr ES7.KLF1_5 chr ES7.KLF1_6 chr ES7.KLF1_7 chr ES7.KLF1_8 chr AMPL chr AMPL chr AMPL chr Πίνακας 2.1: Τα αμπλικόνια του πάνελ ανίχνευσης θαλασσαιμικών μεταλλαγών με αλληλούχιση νέας γενιάς. 2.4 Η Αλληλούχιση Νέας Γενιάς Όπως αναφέρθηκε στην υποενότητα 1.7.3, η μέθοδος αλληλούχισης νέας γενιάς με τον αναλυτή PGM (Personal Genome machine) της Ion Torrent βασίζεται στην τεχνολογία ημιαγωγού, η οποία ανιχνεύει τα πρωτόνια που απελευθερώνονται εξαιτίας της σύνδεσης νουκλεοτιδίων, μόνο σε περίπτωση που βρεθεί συμπληρωματικότητα, κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης ακινητοποιημένων αλυσίδων DNA πάνω σε ειδικά σφαιρίδια. Η διαδικασία γίνεται σε τέσσερα στάδια: την προετοιμασία των βιβλιοθηκών, την PCR γαλακτώματος (Emulsion PCR), την αλληλούχιση και την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Ακολουθεί λεπτομερής περιγραφή των σταδίων: H προετοιμασία της βιβλιοθήκης Σε αυτό το στάδιο προετοιμάζονται μονόκλωνα προϊόντα PCR τα οποία αποτελούνται από τις περιοχές ενδιαφέροντος και μπορούν να συμπεριλαμβάνουν τόσο εξώνια όσο και εσώνια. Αυτά προετοιμάζονται από το ολικό γενετικό υλικό με χρήση κάποιου από τα διαθέσιμα panel της εταιρίας ή κάποιου προσωπικά σχεδιασμένου, όπως αυτό που σχεδιάστηκε για την ανίχνευση των θαλασσαιμικών μεταλλαγών, μέσω του Ion AmpliSeq Designer. Στα μονόκλωνα, αυτά, τμήματα sstdnas που δημιουργούνται προσδένονται στα 5 και 3 άκρα ειδικοί προσαρμογείς για την περαιτέρω επεξεργασία αλλά και για την ταυτοποίηση των δειγμάτων. Οι βιβλιοθήκες στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται, ώστε οι διαφορετικές βιβλιοθήκες να είναι ισόποσες και να έχουν τον 36

38 ίδιο μέσο όρο διαβασμάτων αλλά και για να αποφευχθούν εσφαλμένα πολυκλονικά διαβάσματα ή μη συντηγμένα σφαιρίδια ISPs (βλέπε βήμα 2). Πρώτο βήμα, αποτελεί η φωτομέτρηση του δείγματος DNA που απομονώθηκε, με το σύστημα Qubit 2.0 Fluorometer της εταιρείας Invitrogen, το οποίο χρησιμοποιεί φθοριοχρώματα, που προσδένονται ειδικά σε δίκλωνο γενετικό υλικό (dsdna) καθιστώντας δυνατή την ποσοτικοποίηση του. Εικόνα 2.2: Το φθοριόμετρο Qubit 2.0 Η διαδικασία είναι η ακόλουθη: Για κάθε δείγμα αναμιγνύονται 199 μl Qubit Buffer με 1 μl Qubit Reagent και σχηματίζεται το working solution. Μοιράζεται σε assay tubes 199 μl από το working solution και προστίθεται 1 μl από το δείγμα. Πραγματοποιείται καλή ανάδευση με τη χρήση Vortex. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 2 min. Φωτομέτρηση. Μετά τη φωτομέτρηση όλα τα δείγμα αραιώνονται σε όγκο 12.5, 25, 50 ή και 100μL ώστε η τελική τους συγκέντρωση να είναι 5 ng/μl. Δεύτερο βήμα αποτελεί η αρχική αντίδραση PCR ώστε να απομονωθεί από το ολικό DNA η περιοχή ή περιοχές που μας ενδιαφέρουν. Στο πάνελ που έχει σχεδιαστεί οι εκκινητές έχουν χωρισθεί σε δύο δεξαμενές (pools). Κατά κανόνα, επιλέγεται δύο εκκινητές για διαδοχικά αμπλικόνια να βρίσκονται σε διαφορετικές δεξαμενές. Αυτή η τακτική συστήνεται από την εταιρία, ώστε να επιτυγχάνεται η μέγιστη απόδοση και κανονικότητα στην πρώτη Multiplex PCR. Tα χαρακτηριστικά της αρχικής Multiplex PCR όπως και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων παρατίθενται στους πίνακες που ακολουθούν: 5xION Ampliseq HiFi mix 2μL x αριθμό δειγμάτων 2xCustom made Primer Pool 5μL x αριθμό δειγμάτων Nuclease-free water 2μL x αριθμό δειγμάτων Total volume: 9 μl DNA (5ng/μL): 1μl 37

39 Πίνακας 2.1: Ποσότητες αντιδραστηρίων για την αρχική Multiplex PCR. Πρόγραμμα PCR (THALASSEMIA) 99 C 2 min 99 C 15 sec 60 C 4 min 10 C Έως και 1h 19 κύκλοι Πίνακας 2.3: Χαρακτηριστικά της αρχικής Multiplex PCR. Μετά την πραγματοποίηση της αρχικής PCR ακολουθεί η επώαση με το χαρακτηρισμένο από την κατασκευαστική εταιρία ως ένζυμο FUPA και η πραγματοποίηση της 2 ης PCR: Ενώνονται τα προϊόντα της PCR του κάθε δείγματος μεταξύ τους. Προσθήκη 2 μl FUPA σε κάθε δείγμα για μερική πέψη των αλληλουχιών των εκκινητών (primers) και πραγματοποίηση πολύ καλής ανάδευσης. Πρόγραμμα PCR (FUPA) 50 C 10 min 55 C 10 min 60 C 20 min 10 C Έως και 1h Πίνακας 2.4: Χαρακτηριστικά της PCR (FUPA). Το τρίτο βήμα είναι η προετοιμασία των προσαρμογέων σε ένα μίγμα adapter-barcode mix. Με αυτό τον τρόπο στο ένα άκρο των μονόκλωνων τμημάτων συνδέεται ο κοινός (universal) προσαργμογέας Ρ1, ο οποίος τοποθετείται σε όλα τα δείγματα, είναι υπεύθυνος για την σύνδεση των ssτdna με τα σφαιρίδια ΙSP (βλέπε βήμα 2) και σηματοδοτεί την έναρξη της αλληλούχισης. Στο άλλο άκρο συνδέεται ένας προσαργμογέας που φέρει κωδικό ώστε να γίνεται διαχωρισμός των δειγμάτων κατά την ανάλυση. Ο κωδικός-αλληλουχία που προστίθεται είναι μοναδικός για κάθε δείγμα στο ίδιο run και αποτελείται από 10 νουκλεοτίδια. Ion P1 Adapter Ion Xpress Barcode X Nuclease free water 0.7 μl 0.7 μl 1.4 μl Πίνακας 2. 5: ποσότητες των προσαρμογέων Στο τέλος της πέψης, σε κάθε δείγμα προστίθεται: Swich Solution Adapter-barcode mix Ligase 4 μl 2 μl 2 μl 38

40 Πραγματοποιείται PCR για την προσθήκη των adapter-barcodes. Πρόγραμμα PCR (LIGASE) 22 C 30 min 72 C 10 min 10 C Έως και 1h Πίνακας 2.6: PCR για την προσθήκη των προσαρμογέων Με το πέρας της διαδικασίας της PCR επιλέγεται η συνέχιση του πρωτοκόλλου την ίδια ημέρα ή η αποθήκευση των δειγμάτων στους -20 C για συνέχιση των εργασιών την επομένη. Έναρξη σταδίου καθαρισμών: Αφαίρεση των beads καθαρισμού (Agencourt AMPure XP Reagent) από τη συντήρηση ώστε να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου. Παρασκευή διαλύματος 70% αιθανόλης. Πολύ καλή ανάδευση με χρήση Vortex των beads και προσθήκη 200μL Agencourt AMPure XP Reagent σε κάθε δείγμα, πραγματοποιώντας πολύ καλή ανάδευση. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. Τοποθέτηση του plate (ή tube strip) στο μαγνήτη για τουλάχιστον 2 min ή έως το διάλυμα να φαίνεται διαυγές. Προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου, χωρίς να διαταραχθούν τα beads. Προσθήκη 150 μl 70% αιθανόλης σε κάθε δείγμα. Μετακίνηση του plate στο μαγνήτη αριστερά-δεξιά, τουλάχιστον 5 φορές. Προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου. Προσθήκη σε κάθε δείγμα 150 μl 70% αιθανόλης. Μετακίνηση του plate στο μαγνήτη αριστερά-δεξιά, τουλάχιστον 5 φορές. Αφαίρεση του υπερκείμενου. Το plate αφήνεται για 5 min στον μαγνήτη να στεγνώσει. Απομάκρυνση του plate από το μαγνήτη και προσθήκη Platinum PCR Supermix HiFi 50 μl Library amplification primer mix 2 μl Πολύ καλή ανάδευση και τοποθέτηση του plate στον μαγνήτη για τουλάχιστον 2 min. Προσεκτική μεταφορά του υπερκείμενου σε διπλανά πηγαδάκια (wells) ή σε νέο plate. Πραγματοποιείται PCR για την ενίσχυση των βιβλιοθηκών. Πρόγραμμα PCR (LIBAMP) 98 C 2 min 98 C 15 sec 64 C 1 min 10 C Έως και 1h 5 κύκλοι Πίνακας 2.7: Χαρακτηριστικά προγράμματος PCR LIBAMP. 39

41 Με το πέρας της διαδικασίας της PCR επιλέγεται η συνέχιση του πρωτοκόλλου την ίδια ημέρα ή η αποθήκευση των δειγμάτων στους -20 C για συνέχιση των εργασιών την επομένη. 1 ος κύκλος καθαρισμών: - Προσθήκη 25 μl Agencourt AMPure XP Reagent σε κάθε δείγμα, καλή ανάδευση. - Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. - Τοποθέτηση του plate στο μαγνήτη για τουλάχιστον 5 min ή έως το διάλυμα να φαίνεται διαυγές. - Προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου ~75 μl σε διπλανά πηγαδάκια. 2 ος κύκλος καθαρισμών: - Απομάκρυνση του plate από το μαγνήτη. - Προσθήκη 60 μl Agencourt AMPure XP Reagent σε κάθε δείγμα, πραγματοποιώντας πολύ καλή ανάδευση. - Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. - Τοποθέτηση του plate στο μαγνήτη για 3 min ή έως το διάλυμα να φαίνεται διαυγές. - Προσεκτική απομάκρυνση του υπερκείμενου, χωρίς να διαταραχθούν τα beads - Προσθήκη 150 μl 70% αιθανόλης σε κάθε δείγμα. - Μετακίνηση του plate στο μαγνήτη αριστερά-δεξιά, τουλάχιστον 5 φορές. - Προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου. - Προσθήκη 150 μl 70% αιθανόλης σε κάθε δείγμα. - Μετακίνηση του plate στο μαγνήτη αριστερά-δεξιά, τουλάχιστον 5 φορές. - Αφαίρεση πλήρως του υπερκείμενου. - Το plate αφήνεται να στεγνώσει στον μαγνήτη για 5 min. - Απομάκρυνση του plate από τον μαγνήτη και προσθήκη 50 μl Low TE στο ίζημα, πολύ καλή ανάδευση. - Τοποθέτηση του plate στον μαγνήτη για τουλάχιστον 2 min και μεταφορά του κάθε υπερκείμενου σε Eppendorf. - Επόμενο βήμα αποτελεί η δεύτερη φωτομέτρηση στο Qubit Fluorometer: Για κάθε δείγμα αναμιγνύονται 199 μl Qubit Buffer με 1 μl Qubit Reagent και σχηματίζεται το working solution. Μοιράζεται σε assay tubes 199 μl από το working solution και προστίθεται 1 μl από το δείγμα. Πραγματοποιείται καλή ανάδευση με τη χρήση Vortex. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 2 min. Φωτομέτρηση. Στο τέλος, θα πρέπει η συγκέντρωση του κάθε δείγματος να είναι 22 ng/ml. Η κανονικοποίηση αυτή γίνεται ώστε να αποφευχθεί η διακύμανση στην αλληλούχιση των διαφορετικών τμημάτων γενετικού υλικού PCR γαλακτώματος (emulsion PCR) 40

42 2.4.2 PCR γαλακτώματος (emulsion) Σημειώνεται πως η διαδικασία αναφέρεται στο πρωτόκολο και ως προετοιμασία προτύπου (template preparation). Ως πρότυπο (template) ορίζεται ένα σφαιρίδιο στο οποίο είναι συνδεδεμένα πολλά πανομοιότυπα αντίγραφα ενός μονόκλωνου τμήματος sstdna. Σε αυτό το βήμα. τα προϊόντα της βιβλιοθήκης sstdna ανακατεύονται με τα ειδικά σφαιρίδια ISPs (Ion Sphere Particles). Πραγματοποιείται γαλακτωματοποίηση του μίγματος ώστε να συνδεθούν τα τμήματα DNA με τα σφαιρίδια και να βρεθούν έγκλειστα σε υδρόφοβα μικροσταγονίδια. Η αντιδράσεις πραγματοποιούνται με τη βοήθεια του συστήματος Ion OneTouch System, το οποίο αποτελείται από δύο συσκευές, το Ion OneTouch 2 Instrument και Ion OneTouch ES. Μετά το τέλος της διαδικασίας, το ιδανικό σενάριο είναι ένα σφαιρίδιο με ένα μόριο βιβλιοθήκης έγκλειστο σε ένα υδρόφοβο μικροσταγονίδιο. Στη συνέχεια αυτό το μόριο βιβλιοθήκης ενισχύεται ώστε να βρίσκονται πολλά στο ίδιο σφαιρίδιο, όπως φαίνεται στην εικόνα. Έτσι, προετοιμάζονται τα πρότυπα (templates). Η ενίσχυση της βιβλιοθήκης, ώστε να δημιουργηθούν πολλά αντίγραφα του μονόκλωνου αρχικού τμήματος sstdna έχει ως σκοπό την ενίσχυση του χημικού σήματος της αντίδρασης επιμήκυνσης του κλώνου, την αύξηση, δηλαδή, της ποσότητας των παραγόμενων κατιόντων υδρογώνου (Merriman et al., 2012). Εικόνα 2.3: Το στάδιο της PCR γαλακτώματος. Προσαρμογή από (Mardis, 2008) Εικόνα 2.4: το Ion One Touch System, στο οποίο γίνεται η ενίσχυση του προτύπου και ο εμπλουτισμός της βιβλιοθήκης ( Πρώτα, πρέπει να προετοιμάστεί το amplification solution: ΙΟΝ PGM Template OT2 Reagent mix: τοποθετείται σε θερμοκρασία δωματίου, Vortex 30 sec, φυγοκέντρηση 2 sec. 41

43 ΙΟΝ PGM Template OT2 Reagent B: Vortex 1 min, φυγοκέντρηση 2 sec. ΙΟΝ PGM Template OT2 Enzyme mix: φυγοκέντρηση 2 sec και τοποθέτηση στο κρυοστατώ. ΙΟΝ PGM Template OT2 Ion Sphere particles: τοποθετείται σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, ενώνονται 10 μl από την κάθε βιβλιοθήκη σε ξεχωριστό tube. Πραγματοποιείται Vortex για 5 sec και φυγοκέντρηση για 5 sec. Προστίθενται 2 μl από το mix σε ξεχωριστό tube και προστίθενται 23 μl Nuclease Free Water. Πραγματοποιείται Vortex για 5 sec, φυγοκέντρηση για 2 sec και τοποθέτηση στο κρυοστατώ. Σε Eppendorf 1.5 ml προστίθενται τα εξής: Nuclease free water ΙΟΝ PGM Template OT2 Reagent mix ΙΟΝ PGM Template OT2 Reagent B ΙΟΝ PGM Template OT2 Enzyme mix Αραιωμένη Βιβλιοθήκη 25 μl 500 μl 300 μl 50 μl 25 μl Πραγματοποιείται Vortex για 5 sec και φυγοκέντρηση για 2 sec. Ετοιμάζονται τα ISPs (Ion Sphere Particles): Vortex για 1 min, φυγοκέντρηση για 2 sec και ανάδευση με την πιπέτα. Προσθήκη 100 μl ISPs στα 900 μl του προηγούμενου mix. Πραγματοποιείται Vortex για 5 sec και φυγοκέντρηση για 2 sec. Το ανωτέρω Amplification Solution τοποθετείται στο ειδικό sample port του Reaction Filter Assembly, το οποίο τοποθετείται σε tube 15 ml για ασφαλείς χειρισμούς. Προστίθεται 1.5 ml Reaction Oil στο ίδιο sample port. Γίνεται εμφανής ο σχηματισμός δύο φάσεων. Το Reaction Filter Assembly μετά την πλήρωση του αναποδογυρίζεται με αργό αλλά σταθερό ρυθμό από αριστερά προς τα δεξιά και τοποθετείται ανάποδα στη συσκευή. Ακολουθούνται οι οδηγίες που παρέχονται στην οθόνη αφής της συσκευής και επιλέγεται η ένδειξη RUN. (Ο χρόνος περάτωσης του τρεξίματος είναι ~5.5 ώρες, αλλά μπορεί να μείνει στη συσκευή έως και 16 ώρες. Αν το run πραγματοποιηθεί στις 5.5 ώρες εντός του ωραρίου λειτουργίας του εργαστηρίου, ακολουθείται η συνέχεια του πρωτοκόλλου. Διαφορετικά, την επομένη ημέρα επιλέγεται η ένδειξη 42

44 NEXT στην οθόνη της συσκευής ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία του FINAL SPIN διάρκειας 10 min.) Ανοίγεται το καπάκι της συσκευής πατώντας OPEN LID. Αφαιρούνται προσεκτικά τα Recovery Tubes από τη φυγόκεντρο και τοποθετούνται σε στατώ. Από τα 2 Recovery Tubes αφαιρείται προσεκτικά το υπερκείμενο, χωρίς να διαταραχθεί το σχηματισμένο ίζημα μαύρου χρώματος, αφήνοντας μόνο 50 μl. Γίνεται χρήση ενός παρόμοιου Recovery Tube ως οδηγού που έχει μαρκαριστεί ο όγκος των 50 μl. Πραγματοποιείται πολύ καλή ανάδευση για να ξεκολλήσουν τα σφαιρίδια και ενώνονται τα περιεχόμενα των 2 tubes (~100 μl) σε νέο Eppendorf 0.2 ml. Επιλέγεται ένα καινούριο 8well strip σχεδιασμένο για χρήση στη συσκευή Ion OneTouch ES, στο οποίο μεταφέρονται τα 100 μl στο well No1 (με την τετράγωνη προεξοχή να βρίσκεται στα αριστερά). Μια ποσότητα της τάξεως ~2 μl χρησιμοποιείται ως aliquot για ενδεχόμενο troubleshooting. Προετοιμασία Melt Off Solution: Tween Solution 280 μl NaOH 1 M 40 μl Μεταφέρονται 300 μl από το Melt Off Solution στο well No7 του 8well strip. Πραγματοποιείται ξέπλυμα και επαναδιάλυση των Dynabeads MyOne Streptavidin beads. - Πραγματοποιείται Vortex για 30 sec και φυγοκέντρηση για 2 sec. - Ανάδευση με την πιπέτα και μεταφορά 13 μl σε νέο Low Bind 1.5 ml Eppendorf. - Τοποθέτηση του Eppendorf στον μεγάλο μαγνήτη για 2 min. - Προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου, χωρίς να διαταραχθούν τα beads. - Προσθήκη 130 μl MyOne beads Wash Solution. - Αφαίρεση από τον μαγνήτη και πραγματοποιήση Vortex για 30 sec και φυγοκέντρηση για 2 sec. - Τοποθέτηση των Dynabeads (130 μl) στο well No2 του 8well strip. Στα wells No3, No4, No5προστίθενται από 300 μl Ion OneTouch Wash Solution. Τοποθετείται το 8well strip στη συσκευή Ion OneTouch ES με την τετράγωνη προεξοχή να βρίσκεται στα αριστερά. Τοποθετείται νέο tip στο tip loader. Σε ένα Eppendorf 0.2 ml προστίθενται 10 μl Neutralization Solution και έπειτα τοποθετείται ανοικτό στην ειδική υποδοχή πίσω από το tip loader. Ενεργοποίηση της συσκευής Ion OneTouch ES. Ανάδευση του περιεχομένου του well No2, αποφεύγοντας τη δημιουργία φυσαλίδων. Πραγματοποιείται εκκίνηση της διαδικασίας πατώντας την ένδειξη START/STOP. 43

45 Με το πέρας του run, διάρκειας ~35 min, το Eppendorf το οποίο περιέχει πλέον τα Enriched ISPs αναδεύεται χειροκίνητα 5 φορές. Ακολουθεί έπειτα η διαδικασία του Sequencing. Απορρίπτεται το tip καθώς και το 8well strip από τη συσκευή. Πραγματοποιείται επίβλεψη της συσκευής για τυχόν υγρά σε επιφάνειες της και απενεργοποίηση της. Στη διάρκεια του run, καθαρίζεται το Ion OneTouch 2 Instrument: - Έλεγχος του επιπέδου του αριστερού Reagent Tube (Oil) το οποίο πρέπει να είναι >20mL. - Απορρίπτεται το Ion PGM One Touch Plus Reaction Filter Assembly. - To Ion PGM One Touch 2 Plate αφήνεται στην θέση του. - Σε ένα στατώ δεξιά από τη συσκευή τοποθετείται ένα άδειο falcon 50 ml. - Τοποθετείται ένα νέο cleaning adapter. - Αφαιρείται το disposable injector από το injector hub και το disposable tubing από τη βαλβίδα. - Τοποθετείται η βελόνα στο falcon και επιλέγεται η ένδειξη CLEAN. - Ακολουθούνται οι οδηγίες που εμφανίζονται στην οθόνη αφής της συσκευής. Η διαδικασία καθαρισμού διαρκεί ~ 20 min. - Η συσκευή δεν απενεργοποιείται έως και την επιτυχή ολοκλήρωση της διαδικασίας του Sequencing. Στη διάρκεια του run, πραγματοποιείται ο καθαρισμός με νερό του Sequencer Αλληλούχιση Η αλληλούχιση λαμβάνει χώρα στη συσκευή Ion PGM Sequencer, η οποία σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή πρέπει να χρησιμοποιείται σε εσωτερικούς χώρους σε θερμοκρασία C και υγρασία μεταξύ 40-60%. Εικόνα 2.5: Ο Ion torrent Personal Genome Machine (PGM) αναλυτής Κατά το στάδιο αυτό, το διάλυμα που περιέχει τα ενισχυμένα, πλέον, σφαιρίδια φορτώνεται σε ειδικό chip που περιέχει εκατομμύρια εσοχές-ανιχνευτές. Σε κάθε εσοχή 44

46 ιδανικά εναποτίθεται ένα, μόνο, σφαιρίδιο με μονόκλωνο ενισχυμένο sstdna. Στο chip στη συνέχεια εισέρχονται διαδοχικά κύματα μονονουκλεοτιδίων. Η εισαγωγή μιας βάσης αποτελεί ένα flow, ενώ με την ολοκλήρωση εισαγωγής τεσσάρων βάσεων ολοκληρώνεται ένα cycle. Στις νεότερες πλατφόρμες PGM ένα cycle έχει τροποποιηθεί ώστε να έχει μια περίοδο 32 βάσεων. Σε περίπτωση που το μονονουκλεοτίδιο που εισήχθη είναι το συμπληρωματικό, τότε επιτυγχάνεται σύνδεση και παράγεται ως παραπροϊόν ένα πρωτόνιο (ιόν υδρογόνου). Η απελευθέρωση του πρωτονίου θα αλλάξει το ph του διαλύματος στο μικροπεριβάλλον της εσοχής και αυτή η αλλαγή θα αναγνωρισθεί από τον ανιχνευτή ως σήμα συμπληρωματικότητας. Αν δεν υπάρχει συμπληρωματικότητα για το συγκεκριμένο μονονουκλεοτίδιο τότε αυτό θα απομακρυνθεί και θα αντικατασταθεί από το επόμενο χωρίς ο ανιχνευτής να αναγνωρίσει κάποια μεταβολή στο ph. Η όλη διαδικασία συνεχίζεται διαδοχικά σε κύκλους και η χημική πληροφορία μετατρέπεται σε ψηφιακή. Εικόνα 2.6: Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων που συμβαίνουν κατά την επιμήκυνση. Ο ανιχνευτής ανιχνεύει το πρωτόνιο που απομακρύνεται από το υδροξύλιο του 3 άκρου του νουκλεοτιδίου της συντιθέμενης αλυσίδας, εφόσον το μονονουκλεοτίδιο που εκείνη τη στιγμή πλημυρίζει το σύστημα είναι το συμπληρωματικό ( Εικόνα 2.7: Α. Όταν το συμπληρωματικό μονονουκλεοτίδιο εισέρχεται στο chip η πολυμεράση δραστηριοποιείται και παράγονται πρωτόνια ταυτόχρονα από όλους τους ακινητοποιημένους σε ένα σφαιρίδιο πανομοιότυπος κλώνους. Η τοπική αύξηση της συγκέντρωσης σε κατιόντα υδρογόνου δημιουργεί θετική τάση κοντά στην αισθητήρια πλακέτα και προκαλεί μεταβολή στο ηλεκτρικό ρεύμα που διέρχεται από το τρανζίστορ. Β. Η μεταβολή του διερχόμενου ηλεκτρικού ρεύματος καταγράφεται ως σήμα συμπληρωματικότητας (Merriman et al., 2012). 45

47 Πριν την έναρξη της αλληλούχισης προηγείται: Ξεπάγωμα των dntps στο κρυοστατώ. Έλεγχος της πίεσης Ν 2 (Σύνθεσης: grade 4.5, %) η οποία πρέπει να εντοπίζεται μεταξύ του εύρους τιμών psi. Ξεπλυμα των τριών δοχείων 3 φορές με 100 ml 18 ΜΩ νερό. Πλήρωση του μεγαλύτερου δοχείοτ μέχρι τη γραμμή με 2 L 18 ΜΩ νερό. Στο ίδιο μπουκάλι προστίθεται όλο του μπουκάλι του Ion PGM Sequencing 200 v2 W2 Solution και 70 μl φρέσκου 100 mm NaOH. Τοποθετείται το καπάκι του μπουκαλιού και ακολουθεί ανάδευση 5 φορές. Στο μπουκάλι Wash1 προστίθενται 350 μl φρέσκου διαλύματος 100 μm NaOH το οποίο κλείνεται. Στο μπουκάλι Wash3 προστίθεται το Ion PGM Sequencing 200 v2 1X W3 Solution μέχρι τα 50 μl το οποίο κλείνεται. Έναρξη του run: Βεβαιώνεται η ύπαρξη cleaning chip στον Sequencer. Επιλογή της ένδειξης INITIALIZE στην οθόνη αφής του Sequnecer. Στην επόμενη οθόνη πρέπει να είναι επιλεγμένο το Ion PGM Sequencing 200 kit v2,. Επιλέγεται η ένδειξη NEXT και βεβαιώνεται η παρουσία cleaning chip, reagent bottle, sipper tubes και collection trays στη συσκευή και επιλέγεται η ένδειξη NEXT. Με χρήση νέων γαντιών τοποθετούνται νέα sipper tubes στις άλλες 2 θέσεις και τα αντίστοιχα μπουκάλια και επιλέγεται η ένδειξη NEXT. Η διαδικασία προσαρμογής του ph, μπορεί να διαρκέσει έως και 30 min και κάποιες φορές ίσως και περισσότερο. Ως βέλτιστη τιμή ph θεωρείται το Προετοιμασία διαλυμάτων dntps: Πραγματοποιείται Vortex και Spin σε κάθε tube dntp. Σε falcon 50 ml του kit, τοποθετούνται οι αντίστοιχες ετικέτες dntps και προστίθενται σε κάθε ένα το αντίστοιχο dntp όγκου 20 μl με τη σειρά G, C, A, T. Αφαιρούνται τα παλιά reagent sipper tubes και τοποθετούνται με νέα γάντια τα καινούρια. Τοποθετούνται τα falcon που περιέχουν τα dntps στις σωστές θέσεις και σφίγγονται καλά. Ακολουθούνται οι οδηγίες της οθόνης για την ολοκλήρωση του Initialization. Η διαδικασία διαρκεί ~20 min. Στο τέλος της διαδικασίας πρέπει να εμφανιστεί μια πράσινη οθόνη με την ένδειξη PASSED. Οργάνωση του run στο server του συστήματος: δεν θα δοθούν αναλυτικές οδηγίες καθώς τα χαρακτηριστικά του κάθε run μεταβάλονται ανάλογα με τον αριθό δειγμάτων, το μέγεθος του chip, το σχειασμό του πάνελ κ.α. 46

48 Αλληλούχιση : Επιλέγεται το πρωτόκολλο Sequencing ανάλογα με το είδος του Chip που θα φορτωθεί. Συνήθως, για λίγα δείγματα το Chip που χρησιμοποιείται είναι το 314. Μεταφέρεται ο μισός όγκος από τα Enriched ISPs σε νέο Eppendorf. Πραγματοποιείται Vortex και Spin των Control Ion Sphere Particles. Προσθήκη 5 μl Control Ion Sphere Particles στον μισό όγκο από τα Enriched ISPs και πολύ καλή ανάδευση. Φυγοκέντρηση για 2 min σε 15,500 x g. Αφαίρεση υπερκειμένου, αφήνοντας ~3 μl. Προσθήκη 3 μl Sequencing Primer και πραγματοποιείται πολύ καλή ανάδευση Πραγματοποιείται PCR για την πρόσδεση των εκκινητών (primers): Chip Check: Πρόγραμμα PCR (Ionseq) 95 C 2 min 37 C 2 min Πίνακας 2.7: Πρόγραμμα PCR Ionseq. Αφαιρείται το Chip που θα χρησιμοποιηθεί από τη συσκευασία, η οποία φυλάγεται καθώς αναγράφεται σε αυτή το barcode του Chip, και σημειώνεται σε επιφάνεια του Chip η ημερομηνία του run. Επιλογή της ένδειξης RUN στην οθόνη του Sequencer. Με το cleaning Chip στην ειδική θέση, επιλέγεται το NEXT για να πραγματοποιηθεί η ενέργεια: cleaning fluidic lines, διάρκειας ~20 sec. Ακολουθούνται οι οδηγίες της οθόνης. Χωρίς γάντια πραγματοποιείται γείωση με την επαφή των δαχτύλων σε ειδική επιφάνεια του Sequencer με σκοπό να αποφευχθούν ηλεκτροστατικές εκφορτίσεις που μπορούν να επηρεάσουν την λειτουργικότητα του. Το νέο Chip τοποθετείται στην ειδική υποδοχή αφαιρώντας το cleaning Chip. Εικόνα 2.8: Το PGM s chip 3.14 ( και ηλεκτρονική παρατήριση των εσοχών (wells) του (Merriman, Ion Torrent, Team, & Rothberg, 2012). 47

49 To φόρτωμα του Chip: Χωρίς γάντια, το Chip τοποθετείται σε γωνία 45 και αδειάζεται το εναπομείναν υγρό από το loading port. Για να αδειάσει εντελώς, τοποθετείται το Chip στην ειδική φυγόκεντρο γυρισμένο ανάποδα και με την στρογγυλή προεξοχή προς το κέντρο της φυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 5 sec. Αφαιρείται το Chip από τη φυγόκεντρο και σκουπίζεται ότι υγρό υπάρχει. Τοποθετείται το Chip στο bucket και στον πάγκο. Ολόκληρη η ποσότητα του δείγματος (~7 μl) συγκεντρώνεται σε πιπέτα και φορτώνεται σιγά σιγά στο loading port του Chip, αποφεύγοντας τη δημιουργία φυσαλίδων. Τοποθετείται στη φυγόκεντρο με την στρογγυλή προεξοχή προς το κέντρο της φυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 30 sec. Ρυθμίζεται η πιπέτα στα 5 μl και αναδεύεται το περιεχόμενο του Chip 3 φορές κρατώντας το σε γωνία 45, αποφεύγοντας τη δημιουργία φυσαλίδων. Τοποθετείται στη φυγόκεντρο με την στρογγυλή προεξοχή προς τα έξω και φυγοκεντρείται για 30 sec. Ρυθμίζεται η πιπέτα στα 5 μl και αναδεύεται το περιεχόμενο του Chip 3 φορές κρατώντας το σε γωνία 45, αποφεύγοντας τη δημιουργία φυσαλίδων. Τοποθετείται στη φυγόκεντρο με την στρογγυλή προεξοχή προς το κέντρο της φυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 30 sec. Υπό γωνία 45, αδειάζεται όλο το υγρό σιγά σιγά από το loading port. Αν παραμείνει ποσότητα υγρού, μπορεί να ξαναπραγματοποιηθεί φυγοκέντρηση για 5 sec με την στρογγυλή προεξοχή προς τα έξω, αφαιρώντας έπειτα τυχόν εναπομείναν υγρό. Επιλογή Planned Run : επιλέγεται από τη λίστα το όνομα του run που οργανώθηκε σε προηγούμενο βήμα Συλογή δεδομένων Τα δεδομένα συλλέγονται, από το πρόγραμμα Ion Torrent Suite και ο Torrent Server που είναι συνδεδεμένος με τον αναλυτή χρησιμοποιείται για να αντιστοιχίσει την αλληλουχία που έχει συλλεχθεί από την κάθε μία από τις εκατομμύρια αντιδράσης στην αλληλουχία αναφοράς με τη χρήση του Torrent Mapping Alignment Program. Τα δεδομένα οπτικοποιούνται μετά από πολλαπλές διαδικασίες ελέγχου και αντιστοιχίζονται σε επιλεγμένα γονιδιώματα αναφοράς. Μετά από επεξεργασία τα αρχεία δεδομένων είναι διαθέσημα σε μορφή αρχείων τύπου bam. Τα αρχεία αυτού του τύπου μπορούν στη συνέχεια να οπτικοποιηθούν σε κάποιο πρόγραμμα όπως το Integrative Genome Viewer (IGV) κατασκευασμένο από το Broad Institute Εναλλακτική μέθοδος δημιουργίας και ενίσχυσης βιβλιοθήκης. Στην περίπτωση του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου στον οποίο εξετάζεται η ανίχνευση της κληρονόμησης από το έμβρυο του χαρακτηρισμένου πατρικού αλληλομόρφου χρησιμοποιείται η στοχευμένη προσέγγιση (targeted approach). Σύμφωνα με αυτή, κατασκευάζονται εκκινητές για ενίσχυση μόνο ενός μικρού τμήματος της 48

50 αλληλουχίας που περιέχει τη χρωμοσωμική θέση της μεταλλαγής που μας ενδιαφέρει (Lam et al., 2012). Τα βασικά χαρακτηριστικά των εκκινητών για το δείγμα μη επεμβατικού ελέγχου με χαρακτηρισμένη πατρική μεταλλαγή που παραχωρήθηκε από το Κέντρο Μεσογειακής Αναιμίας του Λαϊκού Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών είναι τα ακόλουθα: Χαρακτηριστικά εκκινητών στοχευμένης προσέγγισης Γονίδιο ΗΒΒ Περιοχή εντοπισμού Εσώνιο Ι (IVS I )και εξώνιο 2 Αλληλουχία εκκινητή Forward Αλληλουχία εκκινητή Reverse Μέγεθος αμπλικονίου 5'-TCACTAGCAACCTCAAACAGACA-3' 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-3' 100 bp Πίνακας 2.8: Χαρακτηριστικά εκκινητών για στοχευμένη ενίσχυση τμήματος που φέρει τη θέση της χαρακτηρισμένης μεταλλαγής του πατρικού αλληλομόρφου. Σε αυτή την προσέγγιση, όμως, απαιτείται διαφορετικός χειρισμός του δείγματος κατά το στάδιο της κατασκευής της βιβλιοθήκης, αφού η αλληλουχία ενδιαφέροντος δεν απομονώθηκε με εμπορικό πάνελ της εταιρίας Ion torrent ή τροποποιημένο πάνελ κατασκευασμένου μέσω του Ion AmpliSeq Designer. Σε αυτή την περίπτωση, η κατασκευή βιβλιοθηκών γίνεται με χρήση της πλατφόρμας KAPA Library Preparation Kit Ion Torrent Platform, της εταιρίας KAPA BIOSYSTEMS (Boston, Massachusetts, US). Πριν το πρώτο βήμα του πρωτοκόλλου πραγματοποιείται φωτομέτρηση του δείγματος με χρήση του συστήματος Qubit 2.0 Fluorometer, όπως περιγράφηκε στην υποενότητα Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για κατασκευή βιβλιοθήκης με το KAPA Library Preparation Kit Ion Torrent Platform αποτελείται από 6 βήματα και περιγράφεται αναλυτικά: Βήμα 1 ο : Σχεδιασμός αντίδρασης επιδιόρθωσης των άκρων (end repair) 1.1 Η προετοιμασία για κάθε αντίδραση είναι η εξής: Fragmented, double-stranded DNA 25 µl (5 µl DNA και 20µl water) End Repair Master Mix 10 µl Συνολικός όγκος 75 µl 1.2 Μίξη και επώαση στους 20 C για 30 min. Βήμα 2 ο : Καθαρισμός αντίδρασης επιδιόρθωσης των άκρων (end repair cleanup) 2.1 Σε κάθε αντίδραση 35 µl end, προστίθεται: Agencourt AMPure XP reagent 60 µl 49

51 Συνολικός όγκος 95 µl 1. Πολύ καλή ανάδευση πολλαπλές φορές με την πιπέττα και/ή με το Vortex. 2. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 5 min. 3. Τοποθετώ το Plate (ή tube strip) στο μαγνήτη μέχρι το διάλυμα να φαίνεται καθαρό. 4. Αφαιρώ προσεκτικά το υπερκείμενο, χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 5. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 100 µl από 80% αιθανόλη. 6. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 7. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. 8. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 100 µl από 80% αιθανόλη. 9. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 10. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. Προσπαθώ να αφαιρέσω όλα τα κατάλοιπα αιθανόλης χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 11. Αφήνω τα beads να στεγνώσουν επαρκώς και όλη η αιθανόλη να εξατμιστεί. (3-5 min σε θερμοκρασία δωματίου). Προσοχή: υπερβολική ξήρανση των beads μπορεί να οδηγήσει σε δραματική μείωση της απόδοσης. 12. Απομακρύνω το plate/tube από τον μαγνήτη και σε κάθε well/tube προσθέτω 20 µl από 10 mm Tris-HCl (ph 8.0). 13. Επαναραιώνω τα beads με vortexing ή πολύ καλή ανάδευση πολλαπλές φορές με την πιπέττα. 14. Τοποθετώ το plate/tube στον μαγνήτη μέχρι το διάλυμα να φαίνεται καθαρό και έπειτα μεταφέρω 17,5μl από το υπερκείμενο σε νεό plate/tube. Σημείο ασφαλούς διακοπής Αν δεν προχωρήσω άμεσα στην σύνδεση με προσαρμογείς (adaptors) και στην επιδιόρθωση των ασυνεχειών (Nick Repair), το πρωτόκολλο μπορεί να σταματήσει εδώ. Αποθηκεύω στους: 4 C για μικρό χρονικό διάστημα ή -20 C για τη διάρκεια της νύχτας. Βήμα 3 ο : Σχεδιασμός της αντίδρασης της σύνδεση με προσαρμογείς (adaptors) και επιδιόρθωσης ασυνεχειών (Nick Repair). 3.1 Για κάθε well/tube το οποίο περιέχει 15 µl, προσθέτω: Ligation and Nick Repair Master Mix 10 µl P1 Adapter 0.7 µl A Adapter 0.7 µl Συνολικός όγκος 26.4 µl 3.2 Μίξη και επώαση του plate/tube στους 20 C for 15 min, ακολουθούμενο από 65 C for 5 min. 50

52 Βήμα 4 ο : Σύνδεση με προσαρμογείς και επιδιόρθωση ασυνεχειών. Αναλόγως από τις απαιτήσεις μας και την επιλεγμένη ροή εργασίας (workflow) μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε ένας είτε δύο καθαρισμοί (cleanups). Στην περίπτωσή μας πραγματοποιήθηκε ένας. 4.1 Σε κάθε αντίδραση 26.4 µl: Agencourt AMPure XP reagent 26.4 µl Συνολικός όγκος 54 µl 1. Πολύ καλή ανάδευση πολλαπλές φορές με την πιπέττα και/ή με το vortex. 2. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 5 min. 3. Τοποθετώ το Plate (ή tube strip) στο μαγνήτη μέχρι το διάλυμα να φαίνεται καθαρό. 4. Αφαιρώ προσεκτικά το SN, χωρίς χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 5. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 200 µl από 80% αιθανόλη. 6. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 7. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. 8. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 200 µl από 80% αιθανόλη. 9. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 10. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. Προσπαθώ να αφαιρέσω όλα τα κατάλοιπα αιθανόλης χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 11. Αφήνω τα beads να στεγνώσουν επαρκώς και όλη η αιθανόλη να εξατμιστεί. (3-5 min σε θερμοκρασία δωματίου). Προσοχή: υπερβολική ξήρανση των beads μπορεί να οδηγήσει σε δραματική μείωση της απόδοσης. 12. Επαναραιώνω διεξοδικά τα beads σε όγκο 12.5 µl 10 mm Tris-HCl (ph 8.0). Βήμα 5 ο : Αντίδραση ενίχυσης της βιβλιοθήκης 5.1 Παρασκευάζω την κάθε αντίδραση library amplification ως εξής: Water (if required) 0 µl Library DNA 10 µl 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 µl 10X Primer premix (5 µm each primer) l 2.5 µl Συνολικός όγκος 25µl 5.2 Πραγματοποιώ PCR με τις ακόλουθες παραμέτρους του θερμοκυκλοποιητή: PCR ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΗΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ Θερμοκρασία Διάρκεια (sec) Κύκλοι 98 C C C

53 72 C C C Hold Hold Πίνακας 2.9 Τα χαρακτηριστικά της PCR για ενίσχυσης της βιβλιοθήκης Βήμα 6 ο : Καθαρισμοί της αντίδρασης ενίσχυσης της βιβλιοθήκης Σε κάθε well/tube που περιέχει αντίδραση 25 µl library amplification, προσθέτω: Agencourt AMPure XP reagent 35 µl Συνολικός όγκος 60 µl 1. Πολύ καλή ανάδευση πολλαπλές φορές με την πιπέττα και/ή με το vortex. 2. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 5 min. 3. Τοποθετώ το Plate (ή tube strip) στο μαγνήτη μέχρι το διάλυμα να φαίνεται καθαρό. 4. Αφαιρώ προσεκτικά το υπερκείμενο, χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 5. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 100 µl από 80% αιθανόλη. 6. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 7. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. 8. Κρατώντας το plate/tube στον μαγνήτη, προσθέτω 100 µl από 80% αιθανόλη. 9. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα 30 sec. 10. Αφαιρώ προσεκτικά και απορρίπτω την αιθανόλη. Προσπαθώ να αφαιρέσω όλα τα κατάλοιπα αιθανόλης χωρίς να διαταραχθούν τα beads. 11. Αφήνω τα beads να στεγνώσουν επαρκώς και όλη η αιθανόλη να εξατμιστεί. (3-5 min σε θερμοκρασία δωματίου). Προσοχή: υπερβολική ξήρανση των beads μπορεί να οδηγήσει σε δραματική μείωση της απόδοσης. 12. Επαναραιώνω τα beads σε όγκο 50 µl συγκέντρωσης 10 mm Tris-HCl (ph 8.0) για να εκλούσω το DNA. 13. Τοποθετώ το plate/tube στον μαγνήτη για να ακινητοποιηθούν τα beads. Επωάζω έως ότου το υγρό είναι καθαρό. 14. Μεταφέρω το καθαρό υπερκείμενο σε ένα νέο plate/tube και προχωρώ με το βήμα PCR γαλακτώματος (emulsion PCR). Στο πέρας της διαδικασίας έχει δημιουργηθεί ενισχυμένη βιβλιοθήκη του προϊόντος PCR που αποτέλεσε το αρχικό δείγμα μας. Έχει γίνει τέτοιος χειρισμός ώστε πλέον η ενισχυμένη βιβλιοθήκη να πληροί τις προδιαγραφές και να φέρει τα χαρακτηριστικά που είναι απαραίτητα για να γίνει η αλληλούχιση του αρχικού δείγματος από το Ion PGM αναλυτή. Το πρωτόκολλο αυτό, δηλαδή, χρησιμοποιείται στη θέση του βήματος «προετοιμασία της βιβλιοθήκης» που περιγράφηκε στο υποκεφάλαιο του πρωτοκόλλου της αλληλούχισης με τον αναλυτή Ion PGM. Το τελικό προϊόν της πορείας που περιγράφηκε παραπάνω, εισέρχεται στη διαδικασία του πρωτοκόλλου αλληλούχισης στο βήμα PCR γαλακτώματος (emulsion PCR) και από εκεί και πέρα ακολουθείται ο ίδιος χειρισμός που περιγράφεται στα βήματα 2.4.2, και του προτινόμενου από την ατασκευαστική ετερία πρωτοκόλλου αλληλούχισης που περιγράφηκε στα υποκεφάλαια αυτά. 52

54 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Αλληλούχιση μαρτύρων για μεταλλαγές α- και β- θαλασσαιμίας. Οι μάρτυρες που αλληλουχήθηκαν με το Ion torrent PGM, είχαν χαρακτηριστεί τόσο για σημειακές αντικαταστάσεις όσο και για μεταλλαγές ελλειπτικού τύπου, οι οποίες είναι υπεύθυνες για φαινότυπο α-θαλασσαιμίας ή β-θαλασσαιμίας. Όσον αφορά στη β- θαλασσαιμία, προσδιορίστηκαν τέσσερις μάρτυρες που φέρουν τη μεταλλαγή IVS-I-110, η οποία βρίσκεται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου HBB, τρεις μάρτυρες που φέρουν τη μεταλλαγή IVS-I-1, η οποία βρίσκεται και αυτή στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου, δύο μάρτυρες που φέρουν τη μεταλλαγή HbS, η οποία βρίσκεται στο πρώτο εξώνιο του γονιδίου, δύο μάρτυρες που φέρουν τη μεταλλαγή codon (CD) 39, η οποία βρίσκεται στο δεύτερο εξώνιο του γονιδίου, και ένας μάρτυρας για τη μεταλλαγή IVS-I-6, η οποία εδράζεται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου. Για το γονίδιο HBD ερευνήθηκε ένας μάρτυρας που έφερε τη μεταλλαγή HbA2-Yialousa c.82 G>C. Επίσης, αλληλουχήθηκε ένας μάρτυρας που φέρει τη μεταλλαγή CD 5, η οποία δεν αποτελεί μεταλλαγή αντικατάστασης, αλλά έλλειψης δύο βάσεων, και βρίσκεται στο πρώτο εξώνιο του γονιδίου HΒB, όπως και ένας μάρτυρας για τη μεταλλαγή FS6, η οποία εξαιτίας έλλειψης μίας βάσης τροποποιεί το πλαίσιο ανάγνωσης. Στους πίνακες 3.1 και 3.2 που ακολουθούν αναγράφονται οι χαρακτηρισμένες μεταλλαγές των μαρτύρων β-θαλασσαιμίας, η χρωμοσωμική θέση στην οποία εντοπίστηκαν, ο κωδικός του δείγματος, το βάθος διαβάσματος στη θέση της μεταλλαγής, ο αριθμός και τα ποσοστά ανίχνευσης φυσιολογικού και παθολογικού αλληλομόρφου και αντίστοιχα παραδείγματα φαίνονται στις εικόνες 3,1 και 3,2. Πίνακας 3.2: Αποτελέσματα ανίχνευσης δειγμάτων μαρτύρων για χαρακτηριμένες σημειακές αντικαταστάσεις, υπεύθυνες για β-θαλασσαιμία, με τη μέθοδο της αλληλούχισης νέας γενιάς. 53

55 Όνομα μεταλλαγής Χρωμοσωμική θέση Κωδικός δείγματος Διαβάσματα θέσης Ελλείψεις Αναλογία CD 5 chr11: , , , : 1 FSC 6 chr11: : 1 Πίνακας 3.3: Αποτελέσματα αλληλούχισης δειγμάτων μαρτύρων για χαρακτηρισμένες σημειακές ελλείψεις, υπεύθυνες για β-θαλασσαιμία, με τη μέθοδο της αλληλούχισης νέας γενιάς. Εικόνα 3.1: Απεικόνιση της μεταλλαγής IVS-I-110 όπως αυτή εμφανίζεται στο πρόγραμμα οπτικοποίησης Integrative Genomics Viewer (IGV). Απεικονίζονται οι τρεις ετερόζυγοι για τη μεταλλαγή μάρτυρες. Το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο (C) φαίνεται με μπλε χρώμα ενώ το μεταλλαγμένο νουκλεοτίδιο (T) φαίνεται με κόκκινο χρώμα, στην ίδια χρωμοσωμική θέση. Το γκρι χρώμα των γειτονικών νουκλεοτιδικών θέσεων σημαίνει πως εντοπίζεται σε αυτές μόνο το νουκλεοτίδιο αναφοράς. Παρατηρείται αντικατάσταση A>G στη θέση chr11: του τρίτου δείγματος, η οποία σύμφωνα με τη βάση δεδομένων ClinVar, χαρακτηρίζεται ως πολυμορφισμός. 54

56 Αξίζει να αναφερθεί πως το πρόγραμμα οπτικοποίησης Integrative Genomics Viewer (IGV) επεξεργάζεται αρχεία τύπου BAM και SAM (βλ υποκεφάλαιο 2.4.4). Σε αυτά τα αρχεία η αλληλούχιση εμφανίζεται πάντα αναφορικά με τον εμπρόσθιο (forward) κλώνο του χρωμοσώματος, ανεξάρτητα από το που εδράζεται το γονίδιο που εξετάζεται. Αν το γονίδιο χαρτογραφείται στο συμπληρωματικό κλώνο, τότε μια αντικατάσταση G>A θα οπτικοποιείται μέσω του προγράμματος σαν αντικατάσταση C>T. Αυτό συμβαίνει στην περίπτωση του γονιδίου ΗΒΒ, και έτσι εξηγείται πως η αντικατάσταση IVS-I-110 G>A οπτικοποιείται στον συμπληρωματικό κλώνο, σαν αντικατάσταση C>T, όπως φαίνεται στην εικόνα 3.1. Εικόνα 3.2: Απεικόνιση της μεταλλαγής Codon 5 (CD5) όπως αυτή εμφανίζεται στο πρόγραμμα οπτικοποίησης Integrative Genomics Viewer (IGV). Στο παράθυρο διαλόγου του προγράμματος εμφανίζεται ο αριθμός των διαβασμάτων στη συγκεκριμένη θέση και ο αριθμός των ελλείψεων, όπως αυτός υπολογίστηκε από το πρόγραμμα, σε σύγκριση με το βάθος διαβάσματος των γειτνιαζόντων νουκλεοτιδίων. 55

57 Από τον πίνακα 3.1 παρατηρούμε πως το βάθος διαβάσματος για την κάθε θέση στην οποία υπάρχει κάποια από τις εικονιζόμενες σημειακές μεταλλαγές κυμαίνεται μεταξύ 111x και 4.705x, με μέσο βάθος διαβάσματος 381x. Η ανίχνευση ετεροζυγωτιών κυμαίνεται σε ποσοστά μεταξύ 38% και 62% με μέσο όρο στα 49.3% και τυπική απόκλιση 5%. Σε ένα ομόζυγο δείγμα για τη μεταλλαγή IVS-I-110 (Νο 69322) το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ανιχνεύτηκε σε ποσοστό >99% των διαβασμάτων, ενώ το φυσιολογικό σε εξαιρετικά μικρό ποσοστό, το οποίο αποτελεί λανθασμένα διαβάσματα (θόρυβο) της μεθόδου. Στον πίνακα 3.2 παρατηρούμε πως οι σημειακές ελλείψεις ανιχνεύθηκαν σε βάθος κάλυψης κατά μέσο όρο 410x που αντιστοιχεί σε ποσοστό 55,3%. Επιπλέον, εκτός από την ανίχνευση των παθολογικών μεταλλαγών, στα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ανιχνεύτηκαν και επιπλέον αντικαταστάσεις, οι οποίες μετά από διερεύνηση στη βάση δεδομένων ClinVar ( και Human Genome Variation Society ( έχουν ήδη χαρακτηριστεί ως πολυμορφισμοί. Ο μικρός αριθμός δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, σε συνδυασμό με το γεγονός πως τα δείγματα της μελέτης δεν αποτελούν αντιπροσωπευτικό δείγμα του γενικού πληθυσμού αλλά μάρτυρες ήδη χαρακτηρισμένων μεταλλαγών, αποτρέπει την οποιαδήποτε συσχέτιση των πολυμορφικών θέσεων με τις παθολογικές μεταλλαγές, τον υπολογισμό συχνοτήτων εμφάνισης και τη διερεύνυση πιθανών απλοτύπων. Οι πιο συχνές από τις προαναφερθείσες μονονουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις που εντοπίστηκαν στο γονίδιο HBB στα δείγματα της μελέτης παρουσιάζονται στον πίνακα 3.3 που ακολουθεί. Reference SNP ID number Περιοχή Χρωμοσωμική θέση Αμπλικόνιο Αντικατάσταση Χαρακτηρισμός rs exon1 chr11: hbb_6 A>G πολυμορφισμός rs IVS-II chr11: hbb_4 C>G πολυμορφισμός rs IVS-II chr11: AMPL G>A πολυμορφισμός rs IVS-II chr11: hbb_4 A>C πολυμορφισμός Πίνακας 3.4: Εντοπισμένες νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις του γονιδίου HBB, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως πολυμορφισμοί σύμφωνα με τη βάση δεδομένων ClinVar. Όσον αφορά στις μεταλλάξεις ελλειπτικού τύπου μεγάλης έκτασης, οι οποίες χαρακτηρίζουν τα θαλασσαιμικά σύνδρομα, η προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε είναι η κατασκευή αλγόριθμου, με τον οποίο να επιτρέπεται ο εντοπισμός των ελλείψεων σε ετερόζυγη κατάσταση, με βάση τη σχέση του μέσου βάθους διαβάσματος των αμπλικονίων που βρίσκονται εντός και εκτός των περιοχών της έλλειψης. Με βάση τη βιβλιογραφία, για να γίνει η ανίχνευση παρεκκλίσεων στον αριθμό των αντιγράφων (Copy number variations CNV) o κανονικοποιημένος αριθμός κάλυψης κάθε ενός εξωνίου των μαρτύρων συγκρίνεται με τη μέση κάλυψη των αντίστοιχων εξωνίων σε δείγματα μάρτυρες, οι οποίοι δεν φέρουν καμία μεταλλαγή ελλειπτικού τύπου (Feng, Chen, Wang, Zhang, & Wong, 2015). 56

58 Όμως, στην περίπτωση του σχεδιασμένου πάνελ για την ανίχνευση θαλασσαιμικών μεταλλαγών που χρησιμοποιήθηκε, λόγω της μεγάλης διακύμανσης στο βάθος διαβασμάτων μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων, ακόμα και εκείνων που μελετήθηκαν στο ίδιο τρέξιμο, κρίθηκε προτιμότερο να κατασκευαστεί ένας αλγόριθμος στο πρόγραμμα excel, με τον οποίο να συγκρίνεται το μέσο βάθος διαβάσματος κάθε αμπλικονίου εντός έλλειψης με αυτό κάθε αμπλικονίου εκτός έλλειψης για το κάθε δείγμα. Συγκρίθηκαν μόνο τα αμπλικόνια που βρίσκονταν στην ίδια δεξαμενή εκκινητών (primer pool) για να αποφευχθούν λάθος αποτελέσματα που θα οφείλονταν σε διαφορετική αρχική ποσότητα εκκινητών και διακύμανση στην αρχική multiplex PCR (βλ υποκεφάλαιο ). Για τον κάθε μάρτυρα μετάλλαξης ελλειπτικού τύπου, μελετήθηκε το μέσο βάθος διαβασμάτων εντός και εκτός της περιοχής της έλλειψης και ο λόγος που προέκυψε συγκρίθηκε με τον αντίστοιχο λόγο σε δείγματα φυσιολογικών μαρτύρων, ώστε να διαπιστωθεί αν από τη μεταξύ τους αναλογία δύναται να ανιχνευτούν αυτού του είδους οι μεταλλαγές. Αρχικά, υπολογίστηκε το μέσο βάθος διαβάσματος για το κάθε αμπλικόνιο τόσο για τους παθολογικούς όσο και για τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Στη συνέχεια, για κάθε δείγμα, διαιρέθηκε το μέσο βάθος διαβάσματος κάθε αμπλικονίου εντός έλλειψης με κάθε αμπλικονίου εκτός έλλειψης. Σχηματίστηκε ένας πίνακας, στον οποίο φαίνονται οι αναμενόμενες αναλογίες για τα φυσιολογικά δείγματα, καθώς και οι αντίστοιχες αναλογίες για τα δείγματα με ελλείψεις. Ως πρώτο σημάδι ελέγχου για ελλειπτικού τύπου μεταλλαγή στη γονιδιακή συστοιχία των σφαιρινών β τύπου χρησιμοποιήθηκε η περιοχή των γονιδίων HBB και HBD, στην οποία αλληλεπικαλύπτονται τρεις συχνές ελλειπτικές μεταλλαγές, αυτή που προκαλεί την υβριδικού τύπου σφαιρίνη Ηb Lepore, και αυτές που προκαλούν δβθαλασσαιμία Σικελικού και Τουρκικού τύπου. Τα αμπλικόνια του πάνελ ονομάστηκαν για ευκολία 1-11 στις περιοχές εκτός γονιδίων, B1-B9 στην περιοχή του γονιδίου HBB, και D1- D7 στην περιοχή του γονιδίου HBD. Η διάταξη των αμπλικονίων του πάνελ, η σχέση τους με τις ελλείψεις, καθώς και η προαναφερθείσα ονομασία παρουσιάζεται στην εικόνα 3.3. Εικόνα 3.3: Απεικόνιση της θέσης των αμπλικονίων σε σχέση με τα γονίδια HBB, HBD και τις ελλείψεις υπεύθυνες για την Hb Lepore και τη δβ-θαλασσαιμία στο πρόγραμμα οπτικοποίησης Integrative Genomics Viewer (IGV) Σικελικού και Τουρκικού τύπου. Με το ίδιο πράσινο χρώμα εμφανίζονται τα αμπλικόνια των οποίων οι εκκινητές προέρχονται από την ίδια δεξαμενή (pool) και με μπλε πλαίσιο σημειώνεται η θέση των ελλείψεων. 57

59 Μετά την πραγματοποίηση του υπολογισμού των προαναφερθέντων αναλογικών τιμών για δύο δείγματα μαρτύρων, βρέθηκε ο μέσος όρος και απεικονίζεται στον πίνακα που ακολουθεί, ο οποίος αποτελεί τον «πρότυπο πίνακα». Στην οριζόντια στήλη εμφανίζονται τα αμπλικόνια εντός της εκάστοτε έλλειψης και στην κατακόρυφη στήλη αυτά εκτός αυτής. Τα αμπλικόνια δεν φέρουν την πλήρη ονομασία τους, αλλά αριθμούς όπως αναφέρθηκαν προηγουμένως, για χάριν ευκολίας. Στα κελιά του πίνακα αναγράφεται ο λόγος του μέσου βάθους διαβάσματος των αμπλικονίων εντός έλλειψης προς το μέσο διάβασμα των αμπλικονίων εκτός αυτής. Οποιαδήποτε στατιστικά σημαντική παρέκκλιση από τα αποτελέσματα του παρακάτω πίνακα που έχει σχηματιστεί από το μέσο όρο δύο φυσιολογικών μαρτύρων ενδέχεται να αποτελεί αποτέλεσμα έλλειψης. Πίνακας 3.4: Ο πρότυπος πίνακας με τους λόγους των μέσου βάθους διαβάσματος αμπλικονίων εντός και εκτός περιοχών ελλείψεων, όπως κατασκευάστηκε στο πρόγραμμα excel. Επεξηγηματικά, στον πίνακα 3.4 φαίνονται οι τιμές των φυσιολογικών μαρτύρων που δε φέρουν καμία μεταλλαγή ελλειπτικού τύπου. Έτσι, ο λόγος των μέσων διαβασμάτων ενός αμπλικονίου της οριζόντιας στήλης (εντός περιοχής έλλειψης) προς τα μέσα διαβάσματα ενός αμπλικονίου της κάθετης στήλης (εκτός περιοχής έλλειψης) θεωρητικά 58

60 πρέπει να πλησιάζει τη μονάδα. Κάτι τέτοιο όμως δεν παρατηρείται πάντα καθώς υπάρχει μεγάλη διακύμανση στο βάθος διαβασμάτων μεταξύ ορισμένων αμπλικονίων του πάνελ. Οι τιμές που απεικονίζονται με κόκκινο καθώς αποκλίνουν αρκετά από τη θεωρητικά αναμενόμενη αναλογία, έχουν απορριφτεί προς χρήση για τον εντοπισμό ελλείψεων. Στο μισό πάνω μέρος του πίνακα ελέγχεται η πιθανή ύπαρξη έλλειψης που προκαλεί την έκφραση της Hb Lepore και έλλειψης που προκαλεί δβ θαλασσαιμία Σικελικού και Τουρκικού τύπου. Αν οι τιμές ενός δείγματος διαφέρουν μόνο από αυτές του πάνω μέρους του πρότυπου πίνακα, τότε ενδέχεται στο δείγμα να υπάρχει η έλλειψη Hb Lepore σε ετερόζυγη κατάσταση. Αν παρατηρούνται διαφορές και στις τιμές του υπόλοιπου πίνακα, τότε πραγματοποιείται σύγκριση με τους υποπίνακες «δβ-turkish» και «δβ-sicilian» ώστε να προσδιοριστεί ο πιθανότερος τύπος της έλλειψης από τις δύο. Πίνακας 3.5: Πίνακας με τους λόγους των μέσου βάθους διαβάσματος αμπλικονίων εντός και εκτός περιοχών ελλείψεων, για δείγμα μάρτυρα της έλλειψης που οδηγεί στη σύνθεση της Hb Lepore, όπως αυτός κατασκευάστηκε στο πρόγραμμα excel. Στον πίνακα 3.5 αναγράφεται ο λόγος του μέσου βάθους διαβάσματος αμπλικονίων εντός της έλλειψης που οδηγεί στη σύνθεση της Hb Lepore προς το μέσο βάθος διαβασμάτων των αμπλικονίων εκτός έλλειψης. Παρατηρείται πως στο πάνω μέρος του πίνακα, στο οποίο διερευνείται η συγκεκριμένη έλλειψη, οι τιμές διαφέρουν από αυτές 59

61 του πρότυπου πίνακα (πίνακας 3.4). Συγκεκριμένα, στο δείγμα μάρτυρα της έλλειψης οι τιμές του κυμαίνονται στα με μέσο όρο το 0.52 ενώ οι τιμές του πάνω μέρους του προτυπου πίνακα διαμορφώνονται στα με μέσο όρο το Η σχέση των δύο παραπάνω μέσων όρων, 0.52 στο δείγμα της έλλειψης Hb Lepore και 0.95 στον πρότυπο πίνακα, είναι κατά προσέγγιση 1:2 και έτσι υπάρχει ένδειξη εντοπισμού της μεταλλαγής ελλειπτικού τύπου. 3.2 Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος. Το πρώτο δείγμα του προγεννητικού ελέγχου υπήρξε ενισχυμένο δείγμα ελεύθερου cfdna απομονωμένου από ορό εγκύου, η οποία έφερε σε ετερόζυγη κατάσταση τη μεταλλαγή Codon 39 C>T, μία μεταλλαγή που προκαλεί πρώιμο κωδικόνιο λήξης και σταματά παντελώς την παραγωγή β-σφαιρίνης από το αλληλόμορφο στο οποίο βρίσκεται. Ο πατέρας έφερε σε ετερόζυγη κατάσταση την μεταλλαγή IVS G>A, μία μεταλλαγή που όπως έχει προαναφερθεί βρίσκεται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου HBB και ενεργοποιεί ένα κρυφό σημείο ματίσματος (cryptic splice site) οδηγώντας σε β 0 φαινότυπο θαλασσαιμίας. Ο προγεννητικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε για να εξετασθεί η πιθανή ανίχνευση της μεταλλαγής του πατρικού αλληλομόρφου στο ελεύθερο εμβρυϊκό DNA (cffdna) στον ορό εγκύου. Το προϊόν της PCR που παρελήφθη είχε αρχική συγκέντρωση 36.4 ng/μl και μετά από τη διαδικασία ενίσχυσης ώστε να αλληλουχηθεί είχε συγκέντρωση 220 ng/μl. Το μέσο βάθος κάλυψης ήταν διαβάσματα ανά νουκλεοτιδική θέση. Στο γενετικό τόπο chr11: της μεταλλαγής Codon 39 C>T, ανιχνεύθηκε η μεταλλαγή Codon 39 C>T σε διαβάσματα από τα οποία τα (53%) έφεραν το φυσιολογικό αλληλόμορφο και (47%) την παθολογική αντικατάσταση και αντιστοιχούν στη μετάλλαξη της μητέρας. Στο γενετικό τόπο chr11: της μεταλλαγής IVS ανιχνεύθηκε σε συνολικά διαβάσματα (98%) φορές το φυσιολογικό νουκλεοτίδιο (C) αλλά ανιχνεύθηκε 863 φορές, σε ποσοστό 2% το νουκλεοτίδιο Τ. Στη θέση, δηλαδή, της μεταλλαγής IVS ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 2% η νουκλεοτιδική μετάλλαξη του πατρικού αλληλομόρφου. Αυτό σημαίνει πως το έμβρυο έχει κληρονομήσει την πατρική μεταλλαγή σε ετερόζυγη κατάσταση και πρέπει να ελεγχθεί επεμβατικά για την πιθανή κληρονόμηση της μητρικής μεταλλαγής. Γνωρίζοντας πως στην 12 η εβδομάδα το εμβρυϊκής προέλευσης ελεύθερο DNA στον ορό της εγκύου κυμαίνεται σε τιμές πλησίον του 8%-10%, παρατηρείται πως το ποσοστό στο οποίο εντοπίστηκε το πατρικό αλληλόμορφο είναι πολύ χαμηλό. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται επίσης πως το ποσοστό του εμβρυϊκού cffdna στο μητρικό πλάσμα σχετίζεται εκτός από την εβδομάδα κύησης και με ποικίλους επιπλέον παράγοντες, όπως η ηλικία της μητέρας, το βάρος της, η καταγωγή, 60

62 συνήθειες όπως η διατροφή, το μήκος του κεφαλουραίου οστού του εμβρύου, και η πιθανότητα εμβρυϊκής χρωμοσωμικής ανωμαλίας του εμβρύου (Ashoor, Syngelaki, Poon, Rezende, & Nicolaides, 2013). Παρόλα αυτά, το ποσοστό του 2% που εντοπίστηκε η μεταλλαγή IVS διαφέρει από τα ποσοστά του θορύβου της μεθόδου, τα οποία για το συγκεκριμένο δείγμα κυμαίνονταν σε τιμές μικρότερες του 1%, με μέσο όρο το 0,59% και τυπική απόκλιση 0,2%. Η κληρονόμηση του πατρικού αλληλομόρφου που έφερε τη μεταλλαγή πιστοποιήθηκε αργότερα με απομόνωση αμιγώς εμβρυϊκού γενωμικού υλικού από χοριακές λάχνες (CVS), με επεμβατική διαδικασία. Εικόνα 3.4: Απεικόνιση στο πρόγραμμα οπτικοποίησης Integrative Genomics Viewer (IGV)του προγεννητικού ελέγχου κληρονόμησης της μεταλλαγής IVS-I-110 η οποία ευθύνεται για β-θαλασσαιμία. Η διακεκομένες μαύρες κάθετες γραμμές σημειώνουν την νουκλεοτιδική θέση στην οποία εντοπίστηκε η μεταλλαγή. Με κόκκινο Τ φαίνεται η νουκλεοτιδική αντικατάσταση σε ορισμένα διαβάσματα αυτής της θέσης. Στην εικόνα συμπεριλαμβάνεται επίσης και η ετερόζυγη μεταλλαγή CD39 της μητέρας, στη θέση chr11: του εξωνίου 2. 61

Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές

Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές 1 Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές διαταραχές της αιμοσφαιρίνης 2 Αποτελείται από δύο α

Διαβάστε περισσότερα

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής Κεφάλαιο 6: ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ -ΘΕΩΡΙΑ- Μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές που συμβαίνουν στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού, τόσο σε γονιδιακό επίπεδο (γονιδιακές μεταλλάξεις) όσο και σε χρωμοσωμικό επίπεδο (χρωμοσωμικές

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ)

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) «Οι σύγχρονες τεχνικές βιο-ανάλυσης στην υγεία, τη γεωργία, το περιβάλλον και τη διατροφή» Η κυκλοφορία του αίματος και

Διαβάστε περισσότερα

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων A. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ Αιμοσφαιρίνες Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 S HbS s α 2 β 2 Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ Αλλαγή σε αζωτούχες

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις

Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις ΕΛΕΓΧΟΣ ΓΝΩΣΕΩΝ 1. Τι ονομάζονται μεταλλάξεις και ποια τα κυριότερα είδη τους; 2. Ποιες οι διαφορές μεταξύ γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων; 3. Οι μεταλλάξεις στα σωματικά

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΣΦΑΙΡΙΝΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017 ομή της αιμοσφαιρίνης Α του ανθρώπου γονιδιακοί τόποι ευθύνονται για

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΣΦΑΙΡΙΝΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016 ομή της αιμοσφαιρίνης Α του ανθρώπου γονιδιακοί τόποι ευθύνονται

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ-ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΡΑ

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ-ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΡΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ Η μεσογειακή αναιμία ή θαλασσαιμία είναι κληρονομική αυτοσωμική υπολειπόμενη νόσος η οποία εντοπίζεται κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου Θάλασσας. Στη Μεσογειακή αναιμία η γονιδιακή

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ. 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1 o

ΒΙΟΛΟΓΙΑ. 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1 o ΘΕΜΑ 1 o Γ ΛΥΚΕΙΟΥ-ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ Α. Γιατί τα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν «εργοστάσια παραγωγής ανθρώπινων πρωτεϊνών»; Β. Σε ένα βακτήριο εισάγεται με τη μέθοδο του ανασυνδυασμένου

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΔΩΡΙΖΑ ΖΑΜΠΕΤΑ Επιμελήτρια Β Αιματολογικού Εργαστηρίου Γ.Ν.Α. «Ο ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ» Οι αιμοσφαιρινοπάθειες αποτελούν τις πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες παγκοσμίως.

Διαβάστε περισσότερα

ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ

ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ΛΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ 1. Ο γενετικός κώδικας είναι ένας κώδικας αντιστοίχισης των κωδικονίων του mrna με αμινοξέα στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Σύμφωνα με αυτόν η 3 μετάφραση όλων των mrna αρχίζει

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΩΝ 2017 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Ι Α, ΙΙ Ε, ΙΙΙ ΣΤ, ΙV Β, V Ζ, VII Γ, VII Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦ. 6 ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ

ΚΕΦ. 6 ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ ΚΕΦ. 6 ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ 1. Μπορούν τα γονίδια που ελέγχουν τη σύνθεση της α-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης να χαρακτηριστούν ως πολλαπλά αλληλόμορφα; Τα γονίδια που ελέγχουν την α-αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης

Διαβάστε περισσότερα

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στην κόλλα σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία συμπληρώνει σωστά την ημιτελή πρόταση.

Διαβάστε περισσότερα

Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία. β-θαλασσαιμία

Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία. β-θαλασσαιμία Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία β-θαλασσαιμία Θάλασσα + αίμα = θαλασσαιμία Εισαγωγή Η πιο κοινή γενετική νόσος που κληρονομείται Mενδελικά ~ 1 : 100.000 παγκοσμίως ~ 1 : 10.000

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ B

Βιολογία ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ B Βιολογία προσανατολισμού Α. 1. β 2. γ 3. δ 4. γ 5. δ ΘΕΜΑ Α B1. 4,1,2,6,8,3,5,7 ΘΕΜΑ B B2. Σχολικό βιβλίο σελ. 103 Η γενετική καθοδήγηση είναι.υγιών απογόνων. Σχολικό βιβλίο σελ. 103 Παρ ότι γενετική καθοδήγηση

Διαβάστε περισσότερα

«β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας»

«β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας» Εργαστήριο Κυτταρογενετικής ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» «β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας» Ζαχάκη Σοφία - Ουρανία Βιολόγος, MSc, PhD β μεσογειακή αναιμία Η θαλασσαιμία ή νόσος

Διαβάστε περισσότερα

1) Τα γονίδια της β-θαλασσαιμίας κληρονομούνται ως:

1) Τα γονίδια της β-θαλασσαιμίας κληρονομούνται ως: ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ-ΚΕΦ. 5-6 Θέμα 1 ο Στις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις, να επιλέξετε το γράμμα που συμπληρώνει σωστά την πρόταση: 1) Τα γονίδια της β-θαλασσαιμίας κληρονομούνται

Διαβάστε περισσότερα

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι.

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. σύγχρονο Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. µαθητικό φροντιστήριο Γραβιάς 85 ΚΗΠΟΥΠΟΛΗ 50.51.557 50.56.296 25ης Μαρτίου 74 ΠΛ.ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗΣ 50.50.658 50.60.845 25ης Μαρτίου 111 ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗ 50.27.990

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 1 ΙΟΥΛΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. γ 3. α 4. γ 5. δ ΘΕΜΑ 2ο 1. Σχολικό

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων που συμβαίνουν στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού τόσο σε γονιδιακό επίπεδο (γονιδιακές μεταλλάξεις)

Διαβάστε περισσότερα

Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι.

Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. σύγχρονο Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. μαθητικό φροντιστήριο 1. 25ης Μαρτίου 111 ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗ 50.27.990 50.20.990 2. 25ης Μαρτίου 74 Π. ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗΣ 50.50.658 50.60.845 3. Γραβιάς 85 ΚΗΠΟΥΠΟΛΗ

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο...2 I. Μεταλλάξεις...2 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ...7

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο...2 I. Μεταλλάξεις...2 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ...7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο...2 I. Μεταλλάξεις...2 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ...7 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο I. Μεταλλάξεις Εκπαιδευτικοί στόχοι: Μετά την ολοκλήρωση της µελέτης αυτού του κεφαλαίου ο µαθητής θα πρέπει

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ ΚΩΛΕΤΤΗ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ ΚΩΛΕΤΤΗ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ε Ν Δ Ε Ι Κ Τ Ι Κ Ε Σ Α Π Α Ν Τ Η Σ Ε Ι Σ Θ Ε Μ Α Τ Ω Ν ΘΕΜΑ Α Α1-δ Α2-δ Α3-β

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25)

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25) ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 ΕΠΩΝΥΜΟ:... ΟΝΟΜΑ:... ΤΜΗΜΑ:... ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ:... ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 11 Ιουνίου 2015 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Απαντήσεις Θεμάτων Επαναληπτικών Πανελληνίων Εξετάσεων Ημερησίων & Εσπερινών Γενικών Λυκείων ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. α Α4. γ Α5. δ ΘΕΜΑ B Β1. 1. Β 2. Γ 3. Α

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. δ Α3. α Α4. α Α5. γ

ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. δ Α3. α Α4. α Α5. γ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. δ Α3. α Α4. α Α5. γ ΘΕΜΑ B B1. Η συχνότητα των ετερόζυγων ατόμων με δρεπανοκυτταρική αναιμία ή β- θαλασσαιμία είναι αυξημένη σε περιοχές όπως οι χώρες της Μεσογείου, της Δυτικής και Ανατολικής

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014 ΘΕΜΑ 1 Ο Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Αλλαγές στην ποσότητα

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΠ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 22/01/2017 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ: ΝΟΤΑ ΛΑΖΑΡΑΚΗ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Από

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. β, Α2. δ, Α3. γ, Α4. δ, Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Σχολικό βιβλίο σελ. 90-91: «Το παράδειγμα της δρεπανοκυτταρικής

Διαβάστε περισσότερα

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους;

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους; Βιολογία Γ Ενιαίου Λυκείου / Θετική Κατεύθυνση κεφαλαιο 2ο: αντιγραφη, εκφραση και ρυθμιση τησ ΓενετικηΣ ΠληροφοριαΣ 1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; Ευκαρυωτικά κύτταρα: στον πυρήνα,

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΑ ΘΕΜΑΤΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α. Α1. Για τις παρακάτω προτάσεις να επιλέξετε τη σωστή απάντηση.

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΑ ΘΕΜΑΤΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α. Α1. Για τις παρακάτω προτάσεις να επιλέξετε τη σωστή απάντηση. ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΑ ΘΕΜΑΤΑ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α Α1. Για τις παρακάτω προτάσεις να επιλέξετε τη σωστή απάντηση. 1. Έχοντας στη διάθεσή μας στο εργαστήριο αμιγή στελέχη για ένα συγκεκριμένο χαρακτηριστικό

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/2016

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/2016 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/2016 ΘΕΜΑ 1 ο 1. α 2. β 3. γ 4. γ 5. δ ΘΕΜΑ 2ο Β1. Σημειώστε κάθε πρόταση με Σωστό ή Λάθος παραθέτοντας μια σύντομη δικαιολόγηση

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 1. Με ποιο μηχανισμό αντιγράφεται το DNA σύμφωνα με τους Watson και Crick; 2. Ένα κύτταρο που περιέχει ένα μόνο χρωμόσωμα τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει ραδιενεργό

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά;

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΘΡΩΠΟΛΟΓΙΑ 12 26/10/2016 Κεφάλαιο 3 Α μέρος Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; Ποια είναι η δομή

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΚΑΙ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 6 ΙΟΥΝΙΟΥ 207 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5.

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ

ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ 1. Το γενεαλογικό δένδρο είναι η διαγραμματική απεικόνιση των μελών μιας οικογένειας για πολλές γενιές, στην οποία αναπαριστώνται οι γάμοι, η σειρά των γεννήσεων, το φύλο

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16-06-2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α. φωσφορική ομάδα (Ι) E. υδροξύλιο (II) Β. mrna

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ)

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ) ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ) Αλεξάνδρα Κουράκλη-Συμεωνίδου Απαρτιωμένη διδασκαλία Φεβρουάριος-Μάρτιος 2015 ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (Θαλασσαιμία) Πρόκειται για μία ετερογενή ομάδα κληρονομικών αναιμιών (αυτοσωματικών-υπολοιπόμενων)

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες

Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες Αιμοσφαιρίνη Η ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη μπορεί να μελετηθεί ευκολότερα από οποιαδήποτε άλλη πρωτεΐνη του ανθρώπου. Παράδειγμα για: ομή και λειτουργία πρωτεϊνών, ομή και

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Απαντήσεις στα θέματα των Εισαγωγικών Εξετάσεων τέκνων Ελλήνων του Εξωτερικού και τέκνων Ελλήνων Υπαλλήλων στο εξωτερικό 2013 ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. δ Α4. α Α5. δ ΘΕΜΑ Β Β1.

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ 2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ËÁÌÉÁ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ 2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ËÁÌÉÁ ΘΕΜΑ Α Α1: δ Α2: δ Α3: β Α4: γ Α5: α ΘΕΜΑ Β ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ 2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Β1. Ι Α, ΙΙ Ε, ΙΙΙ ΣΤ, ΙV Β, V Ζ, VII Γ, VII - Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Αυτό

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Ως φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται:

ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Ως φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιούνται: ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΧΕΙΜΕΡΙΝΑ ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 04/03/12 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Ως φορείς κλωνοποίησης

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 27 Μαΐου 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλαδικών Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων (Νέο & Παλιό Σύστημα) ΘΕΜΑ Γ Γ.1 Ο χαρακτήρας της ομάδας αίματος στον άνθρωπο

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α. 1. δ 2. δ 3. β 4. γ 5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI Δ VII Ε II ΣΤ III Ζ V Η -

ΘΕΜΑ Α. 1. δ 2. δ 3. β 4. γ 5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI Δ VII Ε II ΣΤ III Ζ V Η - ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ 2017 ΛΥΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Π. ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΔΗΣ 1. δ 2. δ 3. β 4. γ 5. α ΘΕΜΑ Α Β1. Α I Β IV Γ VI Δ VII Ε II ΣΤ III Ζ V Η - ΘΕΜΑ Β Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθ. Ν. Βαμβακόπουλος «ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΕΜΒΡΥΪΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού

Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού Θέμα Α Α1) γ Α2) γ Α3) δ Α4) β Α5) β Θέμα Β Β1. Α = υδροξύλιο, Β = πρωταρχικό τμήμα, Γ = θέση έναρξης αντιγραφής, Δ = φωσφορική ομάδα, Ε = τμήμα

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2.

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2. ΘΕΜΑ Α Α1. γ (το πριμόσωμα) Α2. γ (οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες κάθε γονιδίου) Α3. α (μεταφέρει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ στο ριβόσωμα) Α4. β (αποδιάταξη των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων)

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις βιολογίας κατεύθυνσης 2014

Ενδεικτικές απαντήσεις βιολογίας κατεύθυνσης 2014 Θέμα Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β Θέμα Β ΑΓ.ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ 11 -- ΠΕΙΡΑΙΑΣ -- 18532 -- ΤΗΛ. 210-4224752, 4223687 Ενδεικτικές απαντήσεις βιολογίας κατεύθυνσης 2014 Β1. 4 2 1 6 3 5 Β2. α. DNA πολυμεράση

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 5 ο -6 ο Κεφ. ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 5 ο -6 ο Κεφ. ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 5 ο -6 ο Κεφ. ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Θέμα Α : Α1.β, Α2.γ, Α3.β, Α4.γ, Α5β. Θέμα Β: Β1. Αυτόματες : Οι μεταλλάξεις που εμφανίζονται αιφνίδια μέσα στον πληθυσμό ονομάζονται αυτόματες

Διαβάστε περισσότερα

Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17

Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17 Πανελλήνιες 2017 Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ ΘΕΜΑ Β Β1. Ι-Α ΙΙ-Ε ΙΙΙ-ΣΤ ΙV-Β V-Ζ VI-Γ VII-Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε Προκαρυωτικό κύτταρο.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ)

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ) ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ (ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ) Αλεξάνδρα Κουράκλη-Συμεωνίδου Διευθύντρια ΕΣΥ Υπεύθυνη Μον. Μεσογ. Αναιμίας ΠΓΝ Πατρών Απαρτιωμένη διδασκαλία Αιματολογίας Μάρτιος 2017 Εκπαιδευτικοί στόχοι Κλινική ταξινόμηση

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΙΚΟΝΑ 2.4 ΣΤΑΔΙΑ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ σ ε λ ί δ α 1 ΕΙΚΟΝΑ 4.2β ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Να συμπληρώσετε τα κενά πλαίσια της εικόνας με την κατάλληλη λέξη ή φράση 2. Να γράψετε τον προσανατολισμό της μετακίνησης του ριβοσώματος

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ)

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) «Οι σύγχρονες τεχνικές βιο-ανάλυσης στην υγεία, τη γεωργία, το περιβάλλον και τη διατροφή» ΜΕΝΔΕΛΙΚΑ ΚΛΗΡΟΝΟΜΟΥΜΕΝΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α. 1. β 2. β 3. γ 4. β Β. Ζύμωση: Διαδικασία ανάπτυξης μικροοργανισμών σε υγρό θρεπτικό υλικό κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες Υβριδοποίηση:

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1 δ Α2 γ Α3 β Α4 γ Α5 β ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Β Β1. 4 2 1 6 3 5 Β2. α. DNA πολυμεράση β. πριμόσωμα γ. DNA δεσμάση δ. DNA ελκάση ε. RNA πολυμεράση Β3. Σχολικό βιβλίο, Σελ.: 98: «Η διάγνωση των

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ 16/06/2017 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: ΑΝΔΡΙΑΝΗ ΠΑΡΑΧΗ ΘΕΜΑ Α A1. Δ Α2. Δ Α3. Β Α4. Γ Α5.Α ΘΕΜΑ Β Β1) I A II E III Σ IV Β V Ζ VI Γ VII Δ Β2) ε προκαρυωτικό γιατί

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 2019

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 2019 ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 2019 Θέμα Α Α1-α, Α2-β, Α3-γ, Α4-γ, Α5-β Θέμα Β Β1. 1-ζ, 2-στ, 3-α, 4-ε, 5-β, 6-δ Περισσεύει το γ-β θαλασσαιμία Β2. Τα κύρια ένζυμα που συμμετέχουν

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Β Β1. Η σειρά των βημάτων που οδηγούν στην κατασκευή καρυότυπου είναι: 4, 2, 1, 6, 3, 5 Β2. α.

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις

Ενδεικτικές απαντήσεις ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 8 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ενδεικτικές απαντήσεις

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Επαναληπτικό διαγώνισμα ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 1-9 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ 1/3/2015 ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Σημείωση: η διπλή αρίθμηση στις σελίδες αφορά την παλιά και τη νέα έκδοση του σχολικού βιβλίου

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α Α1. Β, Α2. Β, Α3. Δ, Α4. Γ, Α5. γ ΘΕΜΑ Β Β1. 1 Α, 2 Γ, 3 Α,4 Β, 5 Α, 6 Α, 7 Γ Β2. Βλ. σχολικό βιβλίο, σελ.24(έκδοση 2014-15)

Διαβάστε περισσότερα

Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις

Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις Απαντήσεις διαγωνίσματος Κεφ. 6 ο : Μεταλλάξεις ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. β Α4. δ Α5. γ ΘΕΜΑ B B1. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια του ανθρώπου περιέχουν κυρίως μια πρωτεΐνη, την αιμοσφαιρίνη. Κάθε μόριο αιμοσφαιρίνης

Διαβάστε περισσότερα

Β. Σιωπηλές μεταλλάξεις: όταν προκύπτει συνώνυμο κωδικόνιο, οπότε το αμινοξύ που προκύπτει από τη μετάφραση είναι ίδιο με το φυσιολογικό

Β. Σιωπηλές μεταλλάξεις: όταν προκύπτει συνώνυμο κωδικόνιο, οπότε το αμινοξύ που προκύπτει από τη μετάφραση είναι ίδιο με το φυσιολογικό Θέμα 1 ο 1. α 2. γ 3. γ 4.β 5. δ Θέμα 2 ο Α. Οι νόμοι του Mendel δεν ισχύουν σε πολυγονιδιακούς χαρακτήρες και σε συνδεδεμένα γονίδια (μη ανεξάρτητα), ενώ οι αναλογίες δεν είναι οι αναμενόμενες σε φυλοσύνδετα

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Κατεύθυνσης Κεφάλαιο 6 ο : Μεταλλάξεις

Βιολογία Κατεύθυνσης Κεφάλαιο 6 ο : Μεταλλάξεις Βιολογία Κατεύθυνσης Κεφάλαιο 6 ο : Μεταλλάξεις ΘΕΜΑ Α Να γράψετε τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις A1 έως A5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία συμπληρώνει

Διαβάστε περισσότερα

3. Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) επιτρέπει την επιλεκτική αντιγραφή μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωικών κυττάρων.

3. Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) επιτρέπει την επιλεκτική αντιγραφή μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωικών κυττάρων. ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΑΣ ΘΕΜΑ 1ο ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Σ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 3 ΙΟΥΝΙΟΥ 2003 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ: ΤΕΣΣΕΡΙΣ (4) Α. Να γράψετε τον αριθμό της

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου. Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου. Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου 04 01-2018 Νότα Λαζαράκη Αλέξανδρος Παπαγιαννακόπουλος ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Ένζυμο που διασπά

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ:

Διαβάστε περισσότερα

ΕΚΤΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ

ΕΚΤΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΕΚΤΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Γίνονται μόνο στο γενετικό υλικό των κυττάρων, δηλαδή στο DNA και έχουν μόνιμο χαρακτήρα. Δεν θεωρούνται μεταλλάξεις, μεταβολές των προϊόντων της έκφρασης του γενετικού

Διαβάστε περισσότερα

Η Επιτροπή Παιδείας της ΠΕΒ. Αθήνα, 4/6/2014 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ

Η Επιτροπή Παιδείας της ΠΕΒ. Αθήνα, 4/6/2014 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Αθήνα, 4/6/2014 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Ημερησίων Γενικών Λυκείων και ΕΠΑΛ (Ομάδα Β ).

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία προσανατολισμού

Βιολογία προσανατολισμού Βιολογία προσανατολισμού Α. 1. β. 2. γ. 3. γ. 4. α. 5. δ. ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β Β1. Σχολικό βιβλίο σελ. 131 «Το βακτήριο... στο σώμα των φυτών.» Β2.1 Ε, 2 Δ, 3 Α, 4 Β Β3. Σχολικό βιβλίο σελ. 108 «Η θερμοκρασία..

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/ ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/2015 29 12 2016 ΘΕΜΑ 1 ο Επιλέξτε τη σωστή απάντηση που συμπληρώνει τις παρακάτω προτάσεις: 1. Η περιοριστική

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΤΜΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1-2-4-5-6 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να γράψετε τον αριθμό της καθεμιάς από τις παρακάτω προτάσεις 1-5 και δίπλα του τη λέξη Σωστό αν η πρόταση είναι σωστή,

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου ΘΕΜΑ Α Α1. Η αναλογία Α+G/T+C στο γενετικό υλικό ενός ιού είναι ίση με 2/3. Ο ιός μπορεί να είναι: α. ο φάγος λ. β. ο ιός της πολιομυελίτιδας. γ. φορέας κλωνοποίησης

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. δ Α4. β Α5. α 2 β 5 γ 6 δ 1 ε 3 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Διαβάστε περισσότερα

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ 1 Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΜΑ 1 ο 1 γ 2 δ 3 β 4 α 5 γ ΘΕΜΑ 2 ο ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Μονάδες 25 (5Χ5) Α. ιαγονιδιακά ζώα ονοµάζονται εκείνα στα οποία το γενετικό τους υλικό έχει τροποποιηθεί µε την

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΡΙΤΗ 21 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: BΙΟΛΟΓΙΑ (ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ)

Διαβάστε περισσότερα

3. Σχ. Βιβλίο σελ «το βακτήριο Αgrobacterium.ξένο γονίδιο» Και σελ 133 «το βακτήριο Bacillus.Βt».

3. Σχ. Βιβλίο σελ «το βακτήριο Αgrobacterium.ξένο γονίδιο» Και σελ 133 «το βακτήριο Bacillus.Βt». 2 ο Διαγώνισμα Βιολογίας Γ Λυκείου Θέμα Α 1. Α 2. Β 3. Β 4. Α 5. C Θέμα Β 1. Σελ 40 «τα ριβοσώματα μπορούν..πρωτεινών» Και σελ 39 «ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν καθολικός πρωτείνη». 2. Σελ 98 «η φαινυλκετονουρία.φαινυλαλανίνης»

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: 16 / 06 / 2017 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ Θέμα Α Α1: δ Α2:

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ ΣΥΣΤΗΜΑ) ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ ΤΡΟΠΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΥΝΕΠΕΙΕΣ ΕΙΔΟΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ Οικογενή υπερχοληστερολαιμία Αυτοσωμική επικρατής κληρονομικότητα Σχετίζεται με αυξημένο

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. α Α4. δ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Σελ. 123 124 σχολ. βιβλίου: «Η διαδικασία που ακολουθείται παράγουν το ένζυμο ADA». Β2. Σελ. 133 σχολ.

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Κατεύθυνσης Γ Λυκείου ΚΥΡΙΑΚΗ 9 ΜΑΡΤΙΟΥ 2014 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Βιολογία Κατεύθυνσης Γ Λυκείου ΚΥΡΙΑΚΗ 9 ΜΑΡΤΙΟΥ 2014 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Βιολογία Κατεύθυνσης Γ Λυκείου ΚΥΡΙΑΚΗ 9 ΜΑΡΤΙΟΥ 2014 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Επιμέλεια: Δημήτρης Κοτρόπουλος ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. γ Α4. δ Α5. δ ΘΕΜΑ B B1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1. στ 2. ζ 3. ε 4. α 5. δ 6. β 7. γ Β2.

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014 ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ : - ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2014 ΘΕΜΑ A Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ B Β1. 4 2 1 6 3 5 Β2. α. DNA πολυμεράση β. Πριμόσωμα γ. DNA δεσμάση δ. DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε την ορθή πρόταση: ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1. Το κωδικόνιο του mrna που κωδικοποιεί το αµινοξύ µεθειονίνη είναι α. 5 GUA

Διαβάστε περισσότερα

«Μεταλλάξεις και ο ρόλος τους στην γενετική ποικιλότητα» Εργασία στο μάθημα της Βιολογίας ΓΥΜΝΑΣΙΟ ΚΕΡΑΤΕΑΣ

«Μεταλλάξεις και ο ρόλος τους στην γενετική ποικιλότητα» Εργασία στο μάθημα της Βιολογίας ΓΥΜΝΑΣΙΟ ΚΕΡΑΤΕΑΣ «Μεταλλάξεις και ο ρόλος τους στην γενετική ποικιλότητα» Εργασία στο μάθημα της Βιολογίας ΓΥΜΝΑΣΙΟ ΚΕΡΑΤΕΑΣ Μια εργασία των: Μακρυδάκη Ελευθερία Μπούρλα Ελένη Τμήμα: Γ 3 Ημερομηνία: 27/1/2015 Γενικά με

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ Τρίτη 18 Ιουνίου 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ. (Ενδεικτικές Απαντήσεις)

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ Τρίτη 18 Ιουνίου 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ. (Ενδεικτικές Απαντήσεις) ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ Τρίτη 18 Ιουνίου 2019 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Ενδεικτικές Απαντήσεις) ΘΕΜΑ Α Α1. α Α2. β Α3. γ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Β Β1. 1-ζ 2-στ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ Α κ Θέµα 1 ο Από τις παρακάτω πολλαπλές απαντήσεις να επιλέξετε τη σωστή. 1. Αν ένα γονίδιο βακτηριακού DNA έχει µήκος 1500 ζεύγη βάσεων,

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1 δ Α2 γ Α3 β Α4 γ Α5 β ΘΕΜΑ Β Β1 Κατά σειρά τα βήματα που οδηγούν στην κατασκευή του καρυότυπου είναι τα ακόλουθα: 4 2 1 6 3 5 Β2 α DNA πολυμεράσες

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α1. β. Α2. γ. Α3. δ. Α4. γ. Α5. β Β1. 5, 4, 2, 1, 3. Β2. Τα δομικά μέρη του οπερονίου της λακτόζης είναι κατά σειρά τα εξής:

ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α1. β. Α2. γ. Α3. δ. Α4. γ. Α5. β Β1. 5, 4, 2, 1, 3. Β2. Τα δομικά μέρη του οπερονίου της λακτόζης είναι κατά σειρά τα εξής: ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣ:ΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ Λυκείου 23 Φεβρουάριοου 2014

ΔΙΑΓΩΝΙΣ:ΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ Λυκείου 23 Φεβρουάριοου 2014 ΔΙΑΓΩΝΙΣ:ΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ Λυκείου 23 Φεβρουάριοου 2014 Ονοματεπώνυμο εξεταζόμενου:. ΘΕΜΑ 1 Ο Να απαντήσετε στις ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής: 1. Η ανευπλοειδία είναι είδος μετάλλαξης που οφείλεται:

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014. Ενδεικτικές απαντήσεις Θέµα Β

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014. Ενδεικτικές απαντήσεις Θέµα Β ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΕΤΑΡΤΗ 4 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 Θέµα Α Α1. δ Α2. γ Α3. β A4. γ A5. β Ενδεικτικές απαντήσεις Θέµα Β Β1. Η σειρά των βημάτων που οδηγούν στην κατασκευή καρυοτύπου

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. α Α4. γ Α5. δ ΘΕΜΑ Β Β1.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αποτελώντας βασική πηγή της γενετικής ποικιλότητας, οι μεταλλάξεις τροφοδοτούν την εξελικτική αλλαγή

ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ. Αποτελώντας βασική πηγή της γενετικής ποικιλότητας, οι μεταλλάξεις τροφοδοτούν την εξελικτική αλλαγή ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Αποτελώντας βασική πηγή της γενετικής ποικιλότητας, οι μεταλλάξεις τροφοδοτούν την εξελικτική αλλαγή Τι είναι οι μεταλλάξεις; o Οι μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, οι οποίες

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. Β Α2. Γ Α3. Α Α4. Α5. Γ ΘΕΜΑ Β ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ B1. Α (Σωµατικά κύτταρα στην αρχή της µεσόφασης): 1, 4, 5, 6 Β (Γαµέτες): 2, 3, 7, 8 Β2. (Κάθε

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ: ΠΕΝΤΕ (5) ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα