Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων βενζαμιδίων με βιολογικό ενδιαφέρον

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Κατεύθυνση: Φαρμακοχημεία-Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Ενώσεων Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων βενζαμιδίων με βιολογικό Μαυρίδης Ευάγγελος Στρατιωτικός Φαρμακοποιός (Α.Π.Θ) Υπό την επίβλεψη της κ. Δ. Χατζηπαύλου-Λίτινα Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Θεσσαλονίκη, 2014

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία με τίτλο Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων Βενζαμιδίων με βιολογικό ενδαφέρον εκπονήθηκε στο εργαστήριο του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας, της Φαρμακευτικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κατά το χρονικό διάστημα Αρχικά χρειάστηκε μία περίοδος προσαρμογής κατά την επιστροφή μου, μετά από περίπου 3 χρόνια απουσίας, στην ακαδημαϊκή ζωή (κάτι το οποίο ήταν περιττό για την προσαρμογή μου στη μεταπτυχιακή φοιτητική ζωή!). Ωστόσο το εξαιρετικό κλίμα το οποίο επικρατούσε στο εργαστήριο της επιβλέπουσας καθηγήτριάς μου κ. Δήμητρα Χατζηπαύλου Λίτινα αποτέλεσε εχέγγυο για μία γρήγορη και ομαλή επανένταξη. Συνεπώς θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλα τα μέλη αυτής της ομάδας, ξεκινώντας από τη συμφοιτήτριά μου στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών Μαρκέλλα Κωνσταντινίδου, τους υποψήφιους διδάκτορες Θάλεια Λιαργκόβα, Κατερίνα Πεπερίδου και Αργύρη Σίσκο, και την διδάκτορα Άννα Μαρία Κατσώρη. Ιδιαίτερες ευχαριστίες αξίζουν στους μεταδιδάκτορες κ. Ελένη Ποντίκη και κ. Χρήστο Κοντογιώργη, οι οποίοι πλέον αποτελούν για μένα πρότυπα ολοκληρωμένων επιστημόνων και ανθρώπων. Φυσικά το μεγαλύτερο μέρος της ευγνωμοσύνης μου απολαμβάνει η επικεφαλής αυτής της ομάδας, η καθηγήτρια κ. Δήμητρα Χατζηπαύλου Λίτινα. Η καθημερινή τριβή μαζί της με έκανε να αντιληφθώ χαρακτηριστικά της προσωπικότητάς της, πέρα από την ήδη καταξιωμένη επιστημονική της προσφορά. Είναι λοιπόν ένας άνθρωπος αισιόδοξος, υποστηρικτικός, κατανοητικός και με τεράστια αποθέματα υπομονής. Για όλα αυτά, αλλά και για ακόμα παραπάνω τα οποία δεν μπορούν να αποδοθούν μέσα σε λίγες γραμμές, την ευχαριστώ και την θαυμάζω. Βαθιές ευχαριστίες οφείλω στον καθηγητή κ. Βασίλη Δημόπουλο και στον επίκουρο καθηγητή κ. Ιωάννη Νικολάου, μέλη της τριμελούς μου επιτροπής για τις ιδιαίτερα χρήσιμες υποδείξεις τους στην εκπόνηση της εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ θερμά όλα τα μέλη ΔΕΠ του τομέα Φαρμακευτικής Χημείας, τον καθηγητή Οργανικής Χημείας κ. Κωνσταντίνο Λίτινα για την πολύτιμη βοήθεια του, το μεταπτυχιακό φοιτητή του τομέα της Οργανικής Χημείας Θωμά Μπαλαλά για τη βοήθειά του στη λήψη φασμάτων δύο διαστάσεων, αλλά και την κ. Ελένη Ευγενίδου η οποία με τις γνώσεις της με βοήθησε στη λήψη και ερμηνεία των φασμάτων μαζών. Επιπλέον, θέλω να ευχαριστήσω το κατάλληλα εκπαιδευμένο και επιστημονικά καταρτισμένο προσωπικό του μικροβιολογικού εργαστηρίου του 424 ΓΣΝΕ, και ιδιαίτερα το μικροβιολόγο κ. Δημήτρη Σπανογιάννη, καθώς και τον καθηγητή Α.Leo και την εταιρία Biobyte για την διευκόλυνση στην ελεύθερη διαχείριση του υπολογιστικού προγράμματος C QSAR. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την ηθική υποστήριξη της καθ όλη τη διάρκεια της προσπάθειας μου, καθώς είναι πάντα δίπλα και στηρίζει τις επιλογές μου. Ευχή μου είναι αυτή η εργασία να εκτιμηθεί από την επιστημονική κοινότητα και να αποτελέσει έρεισμα για περαιτέρω έρευνα και εξέλιξη στον Τομέα της Φαρμακευτικής Χημείας. 2

3 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...8 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βιολογική δράση 5(4H)-οξαζολονικών παραγώγων Βιολογική δράση βενζαμιδίων τα οποία προκύπτουν από τις 5(4H)-οξαζολόνες Φλεγμονή Κυκλοξυγονάση Λιποξυγονάση Άλλες παθολογικές καταστάσεις στις οποίες εμπλέκεται η φλεγμονή Πόνος- Αλγαισθησία Πηγές πρόκλησης Μηχανισμός μεταφοράς Αντίληψη του πόνου Τυροσινάση Φυσιολογικός ρόλος ενζύμου Παθολογικές καταστάσεις με εμπλοκή της τυροσινάσης Αναστολείς τυροσινάσης Πρωτεόλυση Πρωτεόλυση και ασθένειες Συνθετικές πορείες 5(4H)-Οξαζολονικών παραγώγων Μέθοδοι παρασκευής οξαζολονικών παραγώγων με τεχνολογία υπερήχων Συνθετικές πορείες βενζαμιδίων μέσω οξαζολονικών παραγώγων Άλλα βενζαμίδια μέσω οξαζολινικών παραγώγων Μικροκύματα Θεωρία πραγματοποίησης αντιδράσεων στα μικροκύματα Παραδείγματα αντιδράσεων Συμπεράσματα (πλεονεκτήματα-μειονεκτήματα) ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ-ΣΚΟΠΟΣ ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

4 4.1 Ποσοτικές σχέσεις δομής δράσης (2D-QSAR) Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) 5-4(Η)-Οξαζολονικών παραγώγων με ανοσοτροποποιητική ικανότητα Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) διβενζαμιδικών παραγώγων με αντιφλεγμονώδη δράση Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) αρυλο-βινυλο-βενζαμιδικών παραγώγων με βάση την γαστροπροστατευτική αντιφλεγμονώδη δράση τους Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) 5-4(Η)-Οξαζολονικών παραγώγων με ικανότητα αναστολής της τυροσινάσης Μελέτη προσομοίωσης πρόσδεσης στη 5-LOX για το σχεδιασμό νέων πιπεραζινικών βενζαμιδίων (3D-QSAR) Σύνθεση οξαζολονικών παραγώγων Γενική μέθοδος Παρασκευή της (Z)-4-βενζυλιδενο-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ1α] Παρασκευή της (Ε)-4-βενζυλιδενο-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ1b] Παρασκευή της (Z)-4-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)βενζυλιδενο)-2-φαινυλοξαζολ- 5(4Η)-όνης [ΕΜΚ16α] Παρασκευή του (Z)-2-βενζαμιδο-3-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)ακρυλικού αιθυλεστέρα [ΕΜΚ16e] Παρασκευή της (Z)-2-φαινυλο-4-(θειεν-2-υλομεθυλενο)οξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ17α] Παρασκευή του (Z)-2-βενζαμιδο-3-(θειοφαιν-2-υλο)ακρυλικού αιθυλεστέρα [ΕΜΚ17e] Παρασκευή της (Z)-4-(ναφθαλιν-1-υλμεθυλενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ18α] Παρασκευή της (Z)-4-(φουρυλ-2-μεθυλενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ19α] Σύνθεση βενζαμιδίων η Μέθοδος η Μέθοδος Παρασκευή του (Z)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-φαινυλοπροπ-1-εν-2- υλ)βενζαμιδίου [ΕΜΚ1-(Ζ)] Παρασκευή του (Ε)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν-2- υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ1-(Ε)] Παρασκευή του (E)-Ν-(1-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-μορφολινυλ-3- οξοπροπ-1-εν-2-υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ16-(Ε)]

5 4.4.6 Παρασκευή του (Ζ/E)-Ν-(1-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-μορφολινυλ-3- οξοπροπ-1-εν-2-υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ16-(Ζ/Ε)] Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(θειενυλ-2-υλο)προπ-1-εν-2- υλο)βενζαμιδίου [(ΕΜΚ17-(Ζ)] Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(ναφθαλιν-1-υλ) προπ-1-εν-2-υλ) βενζαμίδιο [ΕΜΚ18-(Ζ)] Παρασκευή του (Ζ/Ε)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(ναφθαλιν-1-υλ) προπ-1-εν-2-υλ) βενζαμίδιο [ΕΜΚ18-(Ζ/Ε)] Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-οξο-3-(πιπεριδιν-1-υλο)-1-(θειεν-2-υλο)προπ-1-εν-2 υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ17π-(Ζ)] Παρασκευή του (Ζ/Ε)-Ν-(3-οξο-3-(πιπεριδιν-1-υλο)-1-(θειεν-2-υλο)προπ-1-εν-2 υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ17π-(Ζ/E)] Παρασκευή του N,N -((1Z, 1Z )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν- 3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ1p-(Z)] Παρασκευή του N,N -((1E, 1E )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν- 3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ1p-(E)] Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(1-(4-((4- βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-οξοπροπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ16p- (Ζ)] Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(3-οξο-1-(θειοφαιν-2- υλο)προπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ17p-(Ζ)] Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(1-(ναφθαλεν-1-υλο)-3- οξοπροπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ18p-(Ζ)] Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλδις(1-(φουραν-2-υλο)-3- οξοπροπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ19p-(Ζ)] Μελέτη των φυσικοχημικών ιδιοτήτων Βιολογικές δοκιμασίες in vitro Μελέτη δραστικότητας Εκτίμηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος η οποία επάγεται από το διϋδροχλωρικό άλας του 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμιδίου (AAPH) Εκτίμηση της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων επί της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης in vitro Εκτίμηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της τυροσινάσης από μανιτάρι in vitro Εκτίμηση της αντιμικροβιακής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί του εντεροβακτηριδίου Escherichia coli

6 4.6.5 Εκτίμηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης in vitro Εκτίμηση της δράσης της θρυψίνης επί των εξεταζόμενων βενζαμιδίων in vitro Βιολογικές δοκιμασίες in vivo Μελέτη δραστικότητας Εκτίμηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την επαγωγή οιδήματος άκρου ποδός επίμυα η οποία προκαλείται μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης Εκτίμηση της αναλγητικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Χημεία των 5(4Η)-οξαζολονών και των αντίστοιχων βενζαμιδικών παραγώγων Σύνθεση των 5(4H)-οξαζολονών Σύνθεση των βενζαμιδικών παραγώγων Γεωμετρική ισομέρεια οξαζολονικών παραγώγων και των αντίστοιχων βενζαμιδίων Διευκρίνιση δομής ΕΜΚ19p-(Ζ) με τη βοήθεια φασματοσκοπίας δύο διαστάσεων (2D NMR) Βιολογικές δοκιμασίες in vitro Αξιολόγηση δραστικότητας Αξιολόγηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος η οποία επάγεται από το διϋδροχλωρικό άλας του 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμιδίου (AAPH) Αξιολόγηση της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων επί της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης in vitro Αξιολόγηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της τυροσινάσης από μανιτάρι in vitro Αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί του εντεροβακτηριδίου Escherichia coli Αξιολόγηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης in vitro Αξιολόγηση της in vitro δράσης της θρυψίνης επί των εξεταζόμενων ενώσεων Βιολογικές δοκιμασίες in vivo Αξιολόγηση δραστικότητας Αξιολόγηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την επαγωγή οιδήματος άκρου ποδός επίμυα η οποία προκαλείται μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης

7 5.3.2 Αξιολόγηση της αναλγητικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΠΑΡΑΤΗΜΑ-ΦΑΣΜΑΤΑ Παραδείγματα φασμάτων υπερύθρου (IR) Παραδείγματα φασμάτων 1 H NMR, 13 C NMR Φάσματα NMR δύο διαστάσεων για την ένωση ΕΜΚ19p-(Z) (2D NMR) Παραδείγματα φασμάτων LC MS ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν ενώσεις οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των 5(4Η)- οξαζολονών και των βενζαμιδικών παραγώγων τους. Από βιολογικής άποψης, οι 5(4Η)-οξαζολόνες φαίνεται να εμφανίζουν πλήθος βιολογικών εφαρμογών όπως αναλγητική, αντιμικροβιακή και αντιδιαβητική, ενώ παρουσιάζουν και δυνατότητα αναστολής της πρωτεόλυσης, της τυροσινάσης και του οιδήματος της φλεγμονής. Από χημικής άποψης, οι 5(4Η)-οξαζολόνες είναι ετεροκυκλικές ενώσεις οι οποίες αποτελούν ευέλικτους δομικούς λίθους στην οργανική σύνθεση, καθώς διαθέτουν έναν αριθμό στοιχείων τα οποία επιτρέπουν μια σειρά από πιθανές μετατροπές. Συνεπώς, δίνεται η δυνατότητα πυρηνόφιλης προσβολής στον άνθρακα της θέσης 5 των οξαζολονικών δακτυλίων με σκοπό την κατευθυνόμενη σύνθεση π.χ. ενολο-οξικών και βενζοξαζινικών παραγώγων, φαινυλο-πυρουβικών οξέων, ιμιδαζολονών, αμινοξέων, τριαζινονών κ.α. Στην έρευνα μας εστιάσαμε στο σχηματισμό βενζαμιδίων. Γενικά, τα βενζαμίδια αποτελούν μία ενδιαφέρουσα βιολογικά κατηγορία ενώσεων με αντιβακτηριακή, αντιιική, αντισχιστοσωμική και αντιφλεγμονώδη δράση. Στα πλαίσια του ορθολογικού σχεδιασμού των ενώσεών μας πραγματοποιήσαμε προκαταρκτικές μελέτες QSAR (Biobyte Corp. 4.31) και εικονικές μελέτες πρόσδεσης. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών μας καθοδήγησαν στο σχεδιασμό των επιθυμητών 4- υποκατεστημένων-2-φαινυλοξαζολ-5(4η)-ονικών και βενζαμιδικών παραγώγων, μέσω της χρήσης κατάλληλων πρώτων υλών και λειτουργικών ομάδων (πιπεριδίνης, μορφολίνης, πιπεραζίνης). Για τον προσδιορισμό φυσικοχημικών ιδιοτήτων και απεικονίσεων εφαρμόσθηκε το πρόγραμμα Silicon Graphics (Spartan v ). Η σύνθεση των 4-υποκατεστημένων-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-ονών στηρίχθηκε στην αντίδραση Erlenmeyer-Plochl μεταξύ της Ν-βενζoϋλογλυκίνης και της κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης. Τα βενζαμίδια προήλθαν μετά από τις πυρηνόφιλες προσβολές αλκοολών (αιθανόλης) και δευτεροταγών αμινών στον οξαζολονικό δακτύλιο. Επίσης, μετατρέψαμε το οξαζολονικό παράγωγο ΕΜΚ1α (Ζ-ισομερές) σε ΕΜΚ1b (Εισομερές), ενώ επιτύχαμε τη στερεοεκλεκτική σύνθεση των ενώσεων ΕΜΚ1-(Ζ), ΕΜΚ1-(Ε), ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E). Γενικά, για τη σύνθεση των ενώσεων, εφαρμόστηκαν γνωστές αλλά και τροποποιημένες αντιδράσεις και τεχνικές απλές στην εφαρμογή αλλά και αποτελεσματικές στην απόδοση. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας, που αποτελεί μία οικονομική και φιλική προς το περιβάλλον μέθοδο. Για την ταυτοποίηση των δομών, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι ενόργανης ανάλυσης, φασματοσκοπία IR, 1 H NMR, 13 C NMR, φασματοσκοπία δύο διαστάσεων (2D NMR), MS(ΕSI), στοιχειακή ανάλυση και χρωματογραφικές μέθοδοι. Οι ενώσεις μελετήθηκαν με τη βοήθεια in vitro και in vivo φαρμακοχημικών δοκιμασιών ως προς την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αναλγητική και αντιμικροβιακή τους δράση, αλλά και ως πιθανοί αναστολείς της τυροσινάσης και της θρυψίνης (αντιπρωτεολυτική δράση). Πιο συγκεκριμένα: Φαρμακοχημικές δοκιμασίες in vitro: 1. Αναστολή της υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος 8

9 2. Αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης (από σόγια) 3. Αναστολή της τυροσινάσης από μανιτάρι 4. Αντιμικροβιακή δράση επί του εντεροβακτηριδίου Escherichia coli 5. Αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης 6. Μελέτη της in vitro σταθερότητας των βενζαμιδίων EMK1p-(Z), EMK1p-(E), EMK17p-(Z) Βιολογικά πειράματα in vivo: 1. Αναστολή της εμφάνισης του οιδήματος του άκρου ποδός επίμυα που προκαλείται από την ενδοδερμική χορήγηση της καρραγενίνης 2. Μελέτη αναλγητικής δράσης μέσω πρόκλησης πόνου με χημικό ερέθισμα (Writhing Test) Από τις παραπάνω πειραματικές βιολογικές δοκιμασίες διαπιστώσαμε την υψηλή ικανότητα, στις περισσότερες περιπτώσεις των Ζ-ισομερών και ιδιαίτερα των πιπεραζινικών βενζαμιδίων, να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος, με δραστικότερη την ένωση ΕΜΚ16p-(Z). Όσον αφορά στην αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης, την καλύτερη δράση έδειξαν οι ενώσεις ΕΜΚ1-(Ε) και ΕΜΚ17p-(Z) με τιμές ΙC 50 =40,5 και 41 μm, αντίστοιχα. Στην αναστολή της τυροσινάσης η ένωση ΕΜΚ17p-(Z) παρουσίασε διπλάσια δραστικότητα (42%) από την ένωση αναφοράς (κογικό οξύ-20%). Δυστυχώς, τα αποτελέσματα για την αντιμικροβιακή δράση, υπό τις δοθείσες πειραματικές συνθήκες, δεν ήταν εξίσου ενθαρρυντικά. Στην αξιολόγηση της ανασταλτικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης, το εστερικό παράγωγο ΕΜΚ17e εμφάνισε την καλύτερη τιμή ΙC 50 =1 μm. Επίσης, η in vitro επίδραση της θρυψίνης επί των ενώσεων EMK1p-(Z), EMK1p-(E), EMK17p-(Z), υπέδειξε τη μερική υδρόλυσή τους. Από τα in vivo βιολογικά πειράματα παρατηρήσαμε ότι η αναστολή του οιδήματος άκρου ποδός επίμυα από την ένωση ΕΜΚ17p-(Z) (56%) είναι ισοδύναμη με την αναστολή η οποία επάγεται από την ινδομεθακίνη (58%). Επίσης, διαπιστώσαμε ότι η ίδια ένωση είναι η αποτελεσματικότερη και στην προστασία του πειραματόζωου από το χημικά προκαλούμενο πόνο (58%). Συνεπώς, η ένωση EMK17p-(Z), με το in vitro και in vivo βιολογικό προφίλ, μπορεί να αποτελέσει οδηγό ένωση για το σχεδιασμό μορίων για πολλαπλούς στόχους. Τέλος, έγινε προσπάθεια να συσχετισθούν ποσοτικά τα in vitro αποτελέσματα με τις σημαντικότερες φυσικοχημικές ιδιότητες των δομικών στοιχείων των μορίων, με τη βοήθεια της υπολογιστικής φαρμακοχημείας και την εφαρμογή του υπολογιστικού προγράμματος C QSAR, με σκοπό την καλύτερη στόχευση στη σύνθεση νέων ενώσεων με βελτιωμένη βιολογική δράση. 9

10 ABSTRACT In the presented work 5-(4H)-oxazolones and their benzamides were studied. From the biological perspective of view, 5-(4H)-oxazolones show a variety of pharmacological applications such as analgesic, antimicrobial and antidiabetic, as well as inhibition of proteolysis, tyrosinase and inflammation edema. Chemically 5-(4H)-oxazolones are heterocyclic compounds which could be used as versatile building blocks in organic synthesis, as they contain numerous reactive sites allowing for a diverse set of possible modifications. Their reactivity (nucleophilic attack to the carbon atom at position 5 of the oxazolone ring) makes them excellent substrates for their use in diverse oriented synthesis e.g. of enol acetate and benzoxazinone derivatives, phenyl pyruvic acid, imidazolinones, amino acids, triazinones e.t.c. In our study we focused on the synthesis of benzamides. Benzamides are also biologically active agents demonstrating antibacterial, antiviral, antischistosomal and anti-inflammatory activities. Preliminary QSAR (Biobyte Corp. 4.31) studies were conducted in order to rational design our new compounds. The results of the above studies led us to desirable 4-substituted-2- phenyloxalon-5(4h)-ones and their benzamides, using appropriate materials and functional groups (piperidine, morpholine, piperazine). Especially, for amides ΕΜΚ17p-(Ζ) and EMK18p-(Z), because of their promising structures, docking simulations binding studies (virtual screening in 5-lipoxygenase) were performed. The molecular features that govern our compounds bioactivity were explored through Silicon Graphics (Spartan v ). The general synthetic procedure for the preparation of 4-substituted-2-phenyloxalon-5(4H)- ones includes the condensation of the appropriate aldehyde and hippuric acid with a stoichiometric amount of fused sodium acetate, in the presence of acetic anhydride as the dehydrating agent (Erlenmeyer-Plochl reaction). Subsequently, benzamides were produced via a nucleophilic attack of alcohols (ethanol) or of the appropriate secondary amine on the oxazolone ring. For the synthesis of the compounds, known and/or modified reactions and simple techniques were applied, which led to good yields. We focused on microwave irradiation because it is an environmentally friendly method. The structures of the compounds were confirmed by IR, 1 H NMR, 13 C NMR, 2D NMR, MS (ΕSI), elemental analysis and chromatographic methods. The compounds were studied with in vitro and in vivo protocols for their activity as antioxidant, anti-inflammatory, analgesic and antimicrobial agents, as well as inhibitors of tyrosinase and trypsin. In particular, the compounds were tested in the following experiments: Pharmacochemical tests in vitro: 1. Inhibition of lipid peroxidation 2. Soybean lipoxygenase inhibition assay 3. Mushroom tyrosinase inhibition assay 4. Antimicrobial activity against Escherichia coli 5. Inhibition of proteolytic action of trypsin 6. Stability study of EMK1p-(Z), EMK1p-(E), EMK17p-(Z) against trypsin 10

11 Biological experiments in vivo: 1. Inhibition of the carrageenin induced paw edema (CPE) 2. Study of analgesic activity using the Writhing Test In the above series of experiments, we found that most of the compounds in their Z isomeric form, especially piperazine benzamides, highly inhibited lipid peroxidation of linoleic acid and the most potent was ΕΜΚ16p-(Z). As far as lipoxygenase inhibition is concerned, compounds ΕΜΚ1-(Ε) and ΕΜΚ17p-(Z) were the most active inhibitors with ΙC 50 =40.5 and 41 μm, respectively. In addition, results from tyrosinase inhibition assay showed that ΕΜΚ17p- (Z) inhibited the enzyme (42%) better than the reference compound (kojic acid-20%). Unfortunately, under the given experimental conditions, compounds showed no antimicrobial activity. The evaluation of our compounds capability to inhibit proteolysis indicated that the most potent inhibitor was the only ester derivative, EMK17e (ΙC 50 =1μM). Through in vitro stability studies, we have defined experimentally that EMK1p-(Z), EMK1p- (E) and EMK17p-(Z) underwent partial hydrolysis. In vivo biological experiments revealed that the compound EMK17p-(Z) induced inhibition (56%) against rat paw edema equipotent to the commonly used standard drug, indomethacin (58%). Furthermore, the same compound presented potent analgesic activity (58%). Therefore, it is obvious that EMK17p-(Z), presenting an interesting in vitro and in vivo multiple biological profile, could be used as a lead molecule for the design of new multitarget compounds. Finally, an effort was undertaken to analyze and correlate quantitatively the in vitro results with the most important physicochemical properties and develop QSAR models using the C QSAR, in order to direct design and synthesis of molecules with improved biological activity. 11

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ 5(4H)-ΟΞΑΖΟΛΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Τα οξαζολονικά παράγωγα όχι μόνο φέρονται να παρουσιάζουν πλήθος βιολογικών εφαρμογών, γεγονός το οποίο τα έφερε στο επίκεντρο βιολογικών δοκιμασιών από πολλές επιστημονικές ομάδες, αλλά αποτελούν και πολύτιμο ενδιάμεσο για τη σύνθεση κι άλλων βιολογικά δραστικών μορίων. Μερικές από τις βιολογικές τους δράσεις περιγράφονται παρακάτω. Αντιπρωτεολυτική δράση Εφόσον τα οξαζολονικά παράγωγα λογίζονται σαν ημι-ανυδρίτες οξέων, ορθότερα ισοηλεκτρικά ανάλογα οξικού ανυδρίτη, συμμετέχουν και σε αντιδράσεις ανυδριτών οξέων αλλά με χαμηλότερες ταχύτητες. Αυτή η δυνατότητα κατέστησε τα 4-(αλκοξυμεθυλενο)-2-φαινυλ-5-οξαζολονικά παράγωγα (σχήμα 1) χρήσιμα ως αναστολείς πρωτεασών σερίνης όπως χυμοθρυψίνης, ανθρώπινης λευκοκυτταρικής ελαστάσης, παγκρεατικής ελαστάστης χοίρου και καθεψίνης G [1]. Η παραπάνω διαπιστωθείσα δυνατότητα των οξαζολονών βρίσκει συγκεκριμένη εφαρμογή στην αναστολή των πρωτεασών των ερπητοϊών, οι οποίες, αν και δεν εμφανίζουν ομολογία στην αλληλουχία με τις υπάρχουσες πρωτεάσες σερίνης, ανήκουν στην ίδια οικογένεια με αυτές [2]. Στην οικογένεια των ερπητοϊών ανήκουν οι ιοί απλός έρπητας τύπου Ι και ΙΙ (HSV), ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (HCMV), ο έρπητας ζωστήρα (VZV) και ο ιός Epstein- Bar (EBV), οι οποίοι ευθύνονται για πλήθος νοσηρών καταστάσεων συνοδευόμενες από υποκλινικές εκδηλώσεις έως και το θάνατο σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Οι αναστολείς πρωτεασών σερίνης των HSV-2 και HCMV ανήκουν στην κατηγορία των σπιροκυκλοπροπυλοξαζολονών (σχήμα 2) και έχουν την δυνατότητα να ακυλιώνουν, και συνεπώς να ανενεργοποιούν, τη σερίνη στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Αντιδιαβητική δράση [3] Ο σακχαρώδης διαβήτης είναι μία βασική μεταβολική νόσος, η οποία μάλιστα συγκαταλέγεται στις πρώτες εφτά πιο θανατηφόρες νόσους παγκοσμίως, ενώ εάν ληφθούν υπόψιν και οι επιπλοκές της νόσου τότε καταλαμβάνει την τρίτη θέση! Καθώς η χρήση των θειαζολινιδιονών ως υπογλυκαιμικών φαρμάκων σε ασθενείς με αντίσταση στην ινσουλίνη παρουσιάζει καρδιαγγειακά προβλήματα, κρίθηκε αναγκαία η εύρεση νέων δραστικών per os ουσιών ως εκλεκτικών αναστολέων των PPRA-γ υποδοχέων. Μία τέτοια προσπάθεια οδήγησε στην ανάπτυξη οξαζολονικών παραγώγων, με καλά αποτελέσματα (εικόνα 1). 12

13 Εικόνα 1 Σχεδιασμός οξαζολονικών παραγώγων με αντιδιαβητική δράση Αντινεοπλασματική δράση [4] Με στόχο την αξιολόγηση της επίδρασης των διαφόρων υποκαταστατών στη θέση 3 των 1- υποκατεστημένων-β-καρβολινών όσον αφορά στην αντινεοπλασματική τους δράση, ενσωματώθηκαν και μόρια βενζυλιδενο-4η-οξαζολ-5-ονών. Σχήμα 3 1,3-δισυποκατεστημένες-β-καρβολίνες Οι συντεθείσες ενώσεις αξιολογήθηκαν in vitro σε έξι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως γλοιώματος (U251), μελανώματος (UACC-62), μαστού (MCF-7), προστάτη (PC- 3), ωοθηκών (OVCAR-03) και του κόλου (HT-29). Η ένωση 2-[1-(4-μεθοξυφαινυλο)-9Η-βκαρβολιν-3-υλ]-4Η-οξαζολ-5-όνη (4) είναι η πιο δραστική, εμφανίζοντας δράση κατά του γλοιώματος, του καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών με IC 50 =0.48, 1.50 and 1.07 μm, αντίστοιχα. DAPK ανασταλτική δράση α/α R 1 R 2 1 H m-no 2 2 p-ococh 3 m-no 2 3 p-och 3 m-no 2 4 p-och 3 H Η DAP-κινάση (DAPK), η οποία είναι μία σερίνη/θρεονίνη κινάση ενεργοποιούμενη από το σύμπλοκο Ca +2 / καλμοδουλίνης, ανήκει στην οικογένεια των κινασών οι οποίες εμπλέκονται στην κυτταρική απόπτωση. Έτσι η DAP-κινάση είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης ως απόκριση σε διάφορους παράγοντες όπως υποδοχείς ενεργοποίησης απόπτωσης, κυτοκίνες, κεραμίδιο και άλλους. Μάλιστα εμπλέκεται στους αποπτώσεις τύπου Ι και ΙΙ με τη συμμετοχή, ή μη, των κασπασών. Η επιστημονική ομάδα του Shamloo [5] πρότεινε ότι η DAP-κινάση μπορεί να αποτελέσει στόχο για τη θεραπευτική 13

14 αντιμετώπιση των επιπτώσεων ενός ισχαιμικού επεισοδίου, αποτρέποντας τον κυτταρικό θάνατο και την περαιτέρω καταστροφή των ισχαιμικών περιοχών. Όλα τα παραπάνω αποτέλεσαν έναυσμα για τη σύνθεση των 4-(3- πυριδινυλμεθυλενο)-5(4η)-οξαζολονών (σχήμα 4) με εξαιρετική εκλεκτικότητα για τις DAP-κινάσες. Εντομοκτόνος δράση [6] Η απώλεια της γεωργικής παραγωγής λόγω των παθογόνων βακτηρίων αποτελεί παγκόσμιο πρόβλημα, καθώς τα υπάρχοντα εντομοκτόνα παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα όπως πολύπλοκη σύνθεση, υψηλό κόστος, υψηλή τοξικότητα, μειωμένη δραστικότητα λόγω ανάπτυξης ανθεκτικότητας και είναι περιβαλλοντικά βλαβερά. Γι αυτόν τον λόγο συντέθηκαν οξαζολονικά παράγωγα με αντιβακτηριακή δράση κατά των παθογόνων Xanthomonas oryzae, Ralstonia solanacearum και των νιτροποιητικών βακτηρίων της οικογένειας Nitrosomonas. Η κύρια δραστικότητα εντοπίζεται κατά των νιτροποιητικών βακτηρίων με βασικότερο εκπρόσωπο την 2-φουρυλο-4-(3- μεθοξυ-4-υδροξυβενζυλιδενο)-5(4η)-οξαζολόνη (σχήμα 5). Επίσης οι ενώσεις αυτές αναφέρουν αντιφλεγμονώδη [3], αναλγητική[3], αντιτυροσινασική [7], κατά της παχυσαρκίας [3] και αντιμικροβιακή [3] δράση. 1.2 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΒΕΝΖΑΜΙΔΙΩΝ ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΑΠΟ ΤΙΣ 5(4H)- ΟΞΑΖΟΛΟΝΕΣ Οι οξαζολόνες αποτελούν μία ομάδα σημαντικών ετεροκυκλικών παραγώγων τα οποία είναι χρήσιμα πρόδρομα μόρια και για τη σύνθεση, εκτός των άλλων, αμινοξέων και πεπτιδίων. Η πεπτιδομιμητική έρευνα για το σχεδιασμό νέων φαρμάκων αποτελεί πολύ δυναμική προσέγγιση για την εύρεση αναστολέων βασιζόμενων στο υπόστρωμα. Έτσι εισήχθησαν στα νεοπαραχθέντα βενζαμιδικά παράγωγα γνωστές λειτουργικές ομάδες (πιπεριδίνη, μορφολίνη, πιπεραζίνη), με σκοπό να προσδώσουν στα πεπτιδομιμητικά κατάλληλες ιδιότητες ώστε να οδηγηθούμε σε νέες θεραπευτικές μεθόδους αλλά και να κατανοήσουμε καλύτερα τις αλληλεπιδράσεις των υποκαταστατών με τα ένζυμα στόχους και τους υποδοχείς. Αντιική δράση Οι ιοί του δυτικού Νείλου, του Δάγγειου πυρετού, της κροτωγενούς εγκεφαλίτιδας, του κίτρινου πυρετού, οι οποίοι ανήκουν στους Flavi ιούς, αλλά και ο ιός της ηπατίτιδας C, ο οποίος έχει χαρακτηριστικά Flavi ιού, διαθέτουν ένα πολύ σημαντικό ένζυμο, μία σέρινο πρωτεάση. Όπως είδαμε και παραπάνω, οι σερινοπρωτεάσες, αποτελούν ένζυμα στόχους για την εύρεση νέων αντιπρωτεολυτικών φαρμάκων. Καθώς η παρούσα θεραπευτική αντιμετώπιση, η οποία περιλαμβάνει α-ιντερφερόνες και το νουκλεοσιδικό ανάλογο ριμπαβαρίνη, είναι 14

15 μόνο εν μέρει αποτελεσματική και εμφανίζει παρενέργειες, παρασκευάσθηκαν μερικά ψευδο-πεπτίδια σε καλές αποδόσεις από την αντίδραση μεταξύ ισομαννίδης και κατάλληλων οξαζολονών. Η ένωση 28 (σχήμα 6) είναι ο πιο αποτελεσματικός αναστολέας της συγκεκριμένης σερινοπρωτεάσης με IC 50 =20μΜ [8]. Επίσης, τα φαινυλοπροπεναμίδια (σχήμα 7) αναφέρονται ως μηνουκλεοσιδικοί αναστολείς του ιού της ηπατίτιδας B [9]. Γαστροπροστατευτική αντιφλεγμονώδης δράση [10] Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί πολλά βενζαμιδικά παράγωγα με αντιφλεγμονώδη δράση όπως το παρσαλαμίδιο (parsalmide) και η ροφλουμιλάστη (roflumilast), με την τελευταία ένωση μάλιστα να αποτελεί εκλεκτικό αναστολέα της 4-φωσφοδιεστεράσης (PDE 4). Ωστόσο, το μεγαλύτερο μειονέκτημα των ενώσεων αυτών είναι η πρόκληση έλκους, με αποτέλεσμα πολλές από αυτές να έχουν αποσυρθεί ή ακόμη και να έχουν προκαλέσει θάνατο σε Σχήμα 8 Βενζαμίδια με αντιφλεγμονώδη δράση ασθενείς με ρευματισμούς, αρθρίτιδες και άλλες παρόμοιες διαταραχές, λόγω της γαστροτοξικότητάς τους. Από την άλλη πλευρά, κάποιες ουσίες οι οποίες εισήχθησαν στα θεραπευτικά πρωτόκολλα ως εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς της φλεγμονής, παρουσίασαν αυξημένη πιθανότητα πρόκλησης καρδιαγγειακών και εγκεφαλικών επεισοδίων, γι αυτό και αποσύρθηκαν. Για να μειωθούν/εξαφανισθούν αυτές οι ανεπιθύμητες ενέργειες συντέθηκαν βενζαμιδικά παράγωγα από κατάλληλες οξαζολόνες με συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά, όπως αλεικυκλικές αμίνες (πιπεριδίνη, μορφολίνη, πιπεραζίνη), οι οποίες βελτιώνουν τις φαρμακολογικές ιδιότητες των εν λόγω ουσιών σε σχέση με τη συμμετοχή υποκατεστημένων ή μη αρυλοαμινών, και ελαττώνουν τη γαστρεντερική κινητικότητα, και κατ επέκταση τη δημιουργία έλκους [11]. Αντισχιστοσωμική δράση [12] Η σχιστοσωμίαση είναι μία παρασιτική ασθένεια, η οποία σχετίζεται με τη μόλυνση του νερού στις καλλιέργειες και επηρεάζει εκατομμύρια ανθρώπους στις τροπικές και υποτροπικές περιοχές σε Αφρική, Ασία, κεντρική και νότια Αμερική. Βασική θεραπεία για την αντιμετώπιση της είναι η ουσία πραζικουατέλη (PZQ), η οποία επιτυγχάνει 100% θνησιμότητα του έλμινθα Schistosoma mansoni από την πρώτη κιόλας μέρα. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι και ορισμένα βενζαμίδια παρουσιάζουν μέτρια δράση, με το αποτελεσματικότερο [Ν-((1-διμεθυλοκαρβαμοϋλο)-2-(3,4,5-τριμεθοξυ)βινυλ)βενζαμίδιο] να επιτυγχάνει, με IC 50 =10μM/ml, 100% καταπολέμηση της σχιστοσωμίασης εντός 4 ημερών. Αντιχολινεστερασική δράση εστερικών βενζαμιδίων [13] Παρασκευάσθηκε μία σειρά βενζαμιδικών παραγώγων που προέκυψαν από την εστεροποίηση με το τριτοταγές ή τεταρτοταγές παράγωγο της χολίνης (σχήμα 9), και 15

16 μελετήθηκε για τις αλληλεπιδράσεις της με την ανθρώπινη ερυθροκυτταρική ακετυλοχολινεστεράση (AChE) και την ανθρώπινη βουτυρυλοχολινεστεράση του πλάσματος (BChE). Σχήμα 9 Σύνθεση βενζαμιδικών παραγώγων εστεροποιημένων με την τριτοταγή ή τεταρτοταγή μορφή της χολίνης Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι χαμηλότερες τιμές IC 50 παρατηρήθηκαν για την BChE ενώ για την AChE οι αντίστοιχες τιμές ήταν κατά πολύ υψηλότερες. Γενικά οι αμινοεστέρες παρουσιάζουν από 19 ως 700 φορές μεγαλύτερη εκλεκτικότητα για την BChE. Από την άλλη πλευρά, τόσο το τριτοταγές όσο και το τεταρτοταγές προϊόν βρέθηκαν να επηρεάζουν ελάχιστα τις τιμές IC 50 και για τα δύο ένζυμα. Αντιβακτηριακή δράση Στη βιβλιογραφία [14] αναφέρεται η αντιμικροβιακή μελέτη ορισμένων βενζαμιδίων κατά διαφόρων βακτηρίων (S. aureus, B. subtilis, S. mutans and Gram αρνητικά όπως E. coli, P. Aeruginosa). 1.3 ΦΛΕΓΜΟΝΗ Ορισμός Ως φλεγμονή ορίζεται η προστατευτική ή καταστρεπτική απόκριση των ιστών του σώματος σε ένα ερέθισμα ή σε ένα τραυματισμό, και διακρίνεται σε οξεία ή χρόνια. Η φλεγμονώδης απόκριση μπορεί να προκληθεί από φυσικά, χημικά και βιολογικά αίτια, τα οποία περιλαμβάνουν μηχανικό τραυματισμό, έκθεση σε υπέρμετρη ηλιακή ακτινοβολία, ακτίνες Χ και ραδιενεργά υλικά, διαβρωτικές ουσίες, ακραίες θερμοκρασίες ή ακόμη και σε λοιμογόνους παράγοντες όπως βακτήρια, ιούς και άλλους παθογόνους μικροοργανισμούς. Τα κυριότερα συμπτώματά της είναι η αύξηση της θερμοκρασίας, η ερυθρότητα, το οίδημα, ο πόνος και συχνά η απώλεια λειτουργικότητας του φλεγμαίνοντος ιστού [15]. 16

17 Η διαδικασία της φλεγμονής ξεκινά με παροδική αγγειοσυστολή (αιμοδυναμική μεταβολή), και ακολουθείται από σύντομη αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Το δεύτερο στάδιο διαρκεί περισσότερο και μπορεί να περιλαμβάνει [16]: παρατεταμένη αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας, διάχυση των υγρών από τα αγγεία (χημικών διαμεσολαβητών), συγκέντρωση των λευκοκυττάρων στα αγγειακά τοιχώματα, φαγοκυττάρωση μικροοργανισμών, εναπόθεση ινώδους στα αγγεία, έκθεση των κατεστραμμένων μικροοργανισμών στην επιφάνεια των μακροφάγων, Τελικά, παρατηρείται μετανάστευση των ινοβλαστών στη φλεγμαίνουσα περιοχή, ώστε να αναπτυχθούν νέα και υγιή κύτταρα. Η ένταση, ο χρόνος και τα χαρακτηριστικά της φλεγμονώδους απόκρισης εξαρτώνται από την αιτία, την περιοχή και τις συνθήκες οι οποίες επικρατούν τη δεδομένη στιγμή. Ως χημικοί διαμεσολαβητές μίας φλεγμονώδους διαδικασίας θεωρούνται οι ουσίες οι οποίες παράγονται στο πλάσμα, στα υγιή κύτταρα, αλλά και στους τραυματισμένους ιστούς. Οι κύριοι διαμεσολαβητές είναι (1) οι αγγειοδραστικές αμίνες όπως ισταμίνη, σεροτονίνη, (2) οι ενδοπεπτιδάσες του πλάσματος οι οποίες περιλαμβάνουν αλληλένδετα συστήματα όπως αυτό των κινινών (π.χ βραδυκινίνη), το συμπλήρωμα και ο μηχανισμός πήξης ο οποίος αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα και τη χημειοτακτική δραστηριότητα των λευκοκυττάρων, (3) οι προσταγλανδίνες (PGs), (4) τα προϊόντα των ουδετερόφιλων, (5) οι λεμφοκυτταρικοί παράγοντες (λεμφοκίνες) και (6) άλλοι όπως προστακυκλίνη (PGI 2 ), θρομβοξάνια (ΤΧs) και λευκοτριένια (LTs). Οι τρεις τελευταίοι διαμεσολαβητές, μαζί με τις προαναφερθείσες προσταγλανδίνες (PGs), συντίθενται από το αραχιδονικό οξύ (πολυακόρεστο λιπαρό οξύ που βρίσκεται σε αφθονία στην διπλοστιβάδα των κυτταρικών τοιχωμάτων), μέσω δύο κύριων ενζυμικών οδών, της κυκλοξυγονάσης και της λιποξυγονάσης [17]. Στο σημείο της φλεγμονής, το αραχιδονικό οξύ απελευθερώνεται από τη φωσφολιπιδική μεμβράνη των κυττάρων είτε μόνο με τη βοήθεια μιας υδρολάσης, της φωσφολιπάσης Α 2 (PLA 2 ), είτε μαζί με τη φωσφολιπάση D, ή από τη συνδυασμένη δράση της φωσφολιπάσης C και της κινάσης της διακυλογλυκερόλης (εικόνα 2). Εικόνα 2 Βιοσύνθεση εικοσανοειδών 17

18 1.3.1 Κυκλοξυγονάση Εντοπισμός και έκφραση [18] Η COX, γνωστή και ως συνθάση της προσταγλανδίνης Η 2 ή του ενδοϋπεροξειδίου της προσταγλανδίνης (PGHS), ταυτοποιήθηκε ως το βασικό ένζυμο της οξειδωτικής μετατροπής του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) σε υδροϋπεροξυ ενδοϋπεροξείδιο (PGG 2 ) και κατόπιν σε υδροξυ ενδοϋπεροξείδιο (PGH 2 ). Μόλις την περασμένη δεκαετία έγινε ο διαχωρισμός ανάμεσα στις δύο ισομορφές του συγκεκριμένου ενζύμου (COX 1 και COX 2), ενώ το 2002 δημοσιεύθηκε η απομόνωση της COX 3 (εικόνα 3). Εικόνα 3 Κρυσταλλογραφικές δομές ομοδιμερών COX-1 (αριστερά) προβάτου και COX-2 (δεξιά) ποντικού Η COX 1 εντοπίζεται κυρίως στο ενδοπλασμικό δίκτυο, ενώ η COX 2 τόσο στο ενδοπλασμικό δίκτυο όσο και στον αυλό του πυρηνικού φακέλου. Όσον αφορά στην έκφρασή τους, η COX 1 εκφράζεται ουσιαστικά σε όλους τους ιστούς (κυρίως σε αιμοπετάλια, ενδοθηλιακά κύτταρα, γαστρεντερικό σωλήνα, νεφρικό αγγειώδες σπείραμα και αθροιστικά ουροφόρα σωληνάρια), ενώ η COX 2 εκφράζεται μόνο σε συγκεκριμένα σημεία των νεφρών, του εγκεφάλου, των οστών, των γυναικείων αναπαραγωγικών οργάνων (ωοθήκες και μήτρα) και του γαστρεντερικού σωλήνα. Ωστόσο το σημαντικότερο είναι ότι εκφράζεται σε πληθώρα νεοπλασιών (της ουροδόχου κύστης, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου, του ενδομητρίου, του οισοφάγου, του στομάχου), στο γλοίωμα, σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, στο καρκίνο του πνεύμονα, των ωοθηκών, του παγκρέατος, του προστάτη και του δέρματος. Τελικά, η πιο σημαντική διαφορά δεν έγκειται στον τόπο έκφρασής τους αλλά στον τρόπο! Η COX 1 εκφράζεται συνεχώς και μάλιστα, ενώ η έκφρασή της μπορεί να αυξηθεί 2-4 φορές υπό την επίδραση διεγερτικών παραγόντων, δεν επηρεάζεται από τα γλυκοκορτικοειδή. Αντίθετα, η έκφραση της COX 2, η οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν ανιχνεύεται στους ιστούς, αυξάνεται κατά φορές υπό την επίδραση διεγερτικών παραγόντων όπως κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων ή ενδοτοξινών. Τέλος, η έκφραση της COX 2 εν αντιθέσει με αυτήν της COX 1 μπορεί να ανασταλεί στο επίπεδο της μεταγραφής, καθώς και να επηρεαστεί από τα γλυκοκορτικοειδή. Δομή [19] Παρόλο που οι δύο ισομορφές της COX (1 και 2) εμφανίζουν κάποιες δομικές διαφορές, για παράδειγμα η COX-2 διαθέτει περισσότερο χώρο στο ενεργό της κέντρο, οι δομές τους ταυτίζονται σε μεγάλο βαθμό. Περιέχουν σίδηρο τύπου αίμης και αποτελούν ομοδιμερή, 18

19 εκ των οποίων το κάθε μονομερές περιλαμβάνει τρεις περιοχές: (1) την Ν-τελική [ή αλλιώς EGF-περιοχή καθώς προσομοιάζει στον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF)], η οποία συγκρατεί τα δύο μονομερή μέσω δεσμών υδρογόνου, υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και ιοντικών ζευγών (γέφυρες άλατος) προς σχηματισμό του ομοδιμερούς,(2) την περιοχή πρόσδεσης στη μεμβράνη και (3) την C-τελική καταλυτική περιοχή η οποία αποτελείται από περίπου 480 αμινοξέα (80% της πρωτεΐνης) και διαθέτει τις δύο διακριτές καταλυτικές ομάδες-την COX ομάδα και την ομάδα της υπεροξειδάσης. Η περιοχή πρόσδεσης στη μεμβράνη αποτελείται από τέσσερις α-έλικες οι οποίες, σχηματίζοντας μία υδρόφοβη επιφάνεια, εισέρχονται στη λιπιδική διπλοστιβάδα του ενδοπλασμικού δικτύου και του πυρηνικού φακέλου. Τέλος, όσον αφορά στην C-τελική καταλυτική περιοχή, η ομάδα της υπεροξειδάσης γειτνιάζει με τον δακτύλιο της αίμης κοντά στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Οι έλικες της περιοχής πρόσδεσης στη μεμβράνη δημιουργούν ένα υδρόφοβο κανάλι που παρέχει πρόσβαση στο αραχιδονικό οξύ το οποίο απελευθερώνεται από τον υδρόφοβο πυρήνα της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Αυτό το στενό και αδιέξοδο κανάλι οδηγεί στην καταλυτική ομάδα της COX. Καταλυτική δράση [19] Όπως προαναφέρθηκε η COX αποτελεί μία διλειτουργική πρωτεΐνη διαθέτοντας δύο δράσεις: (1) δράση ενδοϋπεροξειδάσης κατά την οποία το αραχιδονικό οξύ οξυγονώνεται και κυκλοποιείται ώστε να σχηματισθεί το κυκλικό υπεροξείδιο της προσταγλανδίνης G 2, και (2) δράση υπεροξειδάσης η οποία μετατρέπει την προσταγλανδίνη G 2 σε προσταγλανδίνη Η 2. Η τελευταία, μέσω ειδικών ενζυμικών μονοπατιών τα οποία περιλαμβάνουν τη συνθάση της προστακυκλίνης, τη συνθάση του θρομβοξανίου και την ισομεράση, μετατρέπεται στα κυκλικά προστανοειδή: προστακυκλίνη (προσταγλανδίνη Ι 2 ), θρομβοξάνιο (Α 2 ) και προσταγλανδίνες (π.χ προσταγλανδίνη Ε 2 ), αντίστοιχα. Οι PGI 2 και ΤxΑ 2 είναι βιολογικά δραστικές αλλά ασταθείς ενώσεις, γι αυτό και διασπώνται μηενζυμικά ώστε να σχηματισθούν η λιγότερο δραστική 6-κετο-PGF 1α και η αδρανής TXB 2, αντίστοιχα (εικόνα 4). Εντός του ενεργού κέντρου, και πιο συγκεκριμένα στην κορυφή του καναλιού, υπάρχουν δύο αμινοξέα, η Tyr385 και η Ser530, τα οποία παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα του ενζύμου. Η αντίδραση ενός ενδογενούς οξειδωτικού (π.χ υδροϋπεροξείδιο) με την αίμη έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της οξειδωτικής βαθμίδας της αίμης, η οποία με τη σειρά της οξειδώνει τη Tyr385 σε τυρόσυλο ρίζα. Το ένζυμο είναι ανενεργό έως ότου παραχθεί η τυρόσυλο ρίζα, γεγονός καθοριστικό για το ρυθμό του καταλυτικού κύκλου. Κατά την διάρκεια της οξυγόνωσης του αραχιδονικού οξέος, η τυρόσυλο ρίζα αρχικά ανάγεται σε τυροσίνη, αλλά στη συνέχεια αναγεννάται στο τελευταίο στάδιο του καταλυτικού κύκλου από την υπέροξυ ρίζα του πρόδρομου μορίου του PGG 2. 19

20 Εικόνα 4 Η διαδικασία μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος από την COX [20] Λιποξυγονάση [21] Οι λιποξυγονάσες (LOXs) αποτελούν μία μεγάλη οικογένεια μονομερών πρωτεϊνών με συμπαράγοντα το σίδηρο, ο οποίος δεν είναι τύπου αίμης. Ανήκουν στις διοξυγονάσες και καταλύουν την οξείδωση πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA) τα οποία διαθέτουν τουλάχιστον μία ομάδα 1Ζ, 4Ζ-πενταδιενίου (όπως λινολεϊκό, λινολενικό και αραχιδονικό οξύ), μεταβολίζοντάς τα σε υδροϋπεροξυεικοσιτετρανοϊκά οξέα (ΗΡΕΤΕs). Δομή Όλες οι LOX αναδιπλώνονται δομικά δημιουργώντας δύο περιοχές οι οποίες αποτελούνται από μία μικρή περιοχή β-βαρελιού (Ν-τελική) και από μία μεγαλύτερη καταλυτική περιοχή α-έλικας (C-τελική). Ο σίδηρος βρίσκεται βαθιά μέσα σε μία μεγάλη κοιλότητα όπου προσδένεται το υπόστρωμα. Η τόπο- και στέρεο-εκλεκτικότητα των διάφορων ισοενζύμων της LOX καθορίζεται από το σχήμα και το βάθος αυτής της κοιλότητας, καθώς και από τον προσανατολισμό πρόσδεσης του υποστρώματος. Έτσι διακρίνονται 6 λειτουργικά ισοένζυμα της LOX στον άνθρωπο: 5-LOX, 12/15-LOX (15-LOX-1), αιμοπεταλιακή 12-LOX, 12R-LOX, επιδερμική 15-LOX (15-LOX-2), και επιδερμική-alox 3. Καθεμία από τις παραπάνω ισομορφές διαθέτει την προαναφερθείσα καταλυτική δραστηριότητα, πλην της επιδερμικής-alox 3 η οποία διαθέτει δράση υδροϋπεροξειδάσης. Συνεπώς, οι απαντώμενες ισομορφές στον άνθρωπο είναι οι 5-LOX, 15-LOX-1, 15-LOX-2, αιμοπεταλιακή 12-LOX και 12R-LOX. Τα προϊόντα του μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος είναι τα υδροϋπεροξυεικοσιτετρανοϊκά οξέα (ΗΡΕΤΕs), τα οποία στη συνέχεια μεταβολίζονται σε εικοσανοειδή. Στα εικοσανοειδή περιλαμβάνονται βιορυθμιστικά μόρια όπως λευκοτριένια, εποξιλίνες και υδροξυ-εικοσιτετρανοϊκά οξέα (HETEs), τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο 20

21 στην διατήρηση της ομοιόστασης των κυττάρων, αλλά έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται και σε πλήθος ασθενειών όπως φλεγμονή, πυρετό, αρθρίτιδα και καρκίνο. Τέλος, οι LOX μπορούν να οξειδώσουν περίπλοκα λιπίδια, οδηγώντας σε δομική τροποποίηση των κυτταρικών μεμβρανών επηρεάζοντας την ωρίμανση πολλών κυτταρικών τύπων όπως ερυθροκυττάρων, επιθηλιακών κυττάρων των φακών και κερατινοκυττάρων (εικόνα 5)[8]. Καταλυτική δράση [22] Εικόνα 5 Μεταβολισμός αραχιδονικού οξέος μέσω των ισομορφών της LOX Το αρχικό βήμα της ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης από τη LOX αποτελεί η απομάκρυνση του υδρογόνου από τη μεθυλενική ομάδα μεταξύ των διπλών δεσμών του υποστρώματος. Η προκύπτουσα ελεύθερη ρίζα σταθεροποιείται με απεντοπισμό των ηλεκτρονίων μέσω των διπλών δεσμών (Α). Στη συνέχεια, μοριακό οξυγόνο προστίθεται στο άτομο άνθρακα που βρίσκεται σε θέση +2 ή -2 από την αρχική ελεύθερη ρίζα (Β) και υδρογονώνεται ώστε να σχηματισθεί υδροϋπεροξείδιο (C). Η αρχική απομάκρυνση του υδρογόνου και η επακόλουθη προσθήκη του οξυγόνου λαμβάνουν χώρα σε αντίθετες πλευρές (antarafacial) σε σχέση με το επίπεδο που ορίζεται από την ομάδα του 1Ζ, 4Ζπενταδιενίου (εικόνα 6). Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι προκύπτουσες υδροϋπέροξυ ομάδες είναι S-διαμόρφωσης, ενώ μόνο μία LOX παράγει R- υδροϋπεροξείδια (12R-LOX). 21

22 Εικόνα 6 Καταλυτικός κύκλος της LOX. Η LOX βρίσκεται συνήθως με την ανενεργή οξειδωτική κατάσταση του σιδήρου (Fe +2 ), αλλά για την κατάλυση απαιτείται η οξειδωμένη μορφή (Fe +3 ) Άλλες παθολογικές καταστάσεις στις οποίες εμπλέκεται η φλεγμονή Παραπάνω αναφέρθηκε τόσο ο ρόλος της COX σε διάφορους τύπους νεοπλασιών, όσο και η εμπλοκή της LOX σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις (πχ αρθρίτιδες, καρκίνος κλπ). Παρακάτω αναφέρονται ενδεικτικά κάποια παραδείγματα. Φλεγμονή και καρκίνος [20] Όλη η λογική της συσχέτισης της φλεγμονής με το καρκίνο αποδίδεται στο εξής σχόλιο: If genetic damage is the match that lights the fire, inflammation may provide the fuel that feeds the flames, δηλαδή Εάν η γενετική βλάβη είναι το σπίρτο που ανάβει τη φωτιά, η φλεγμονή παρέχει το καύσιμο το οποίο θρέφει τις φλόγες. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι αυξητικοί παράγοντες, προαγωγείς όγκων και ογκογονίδια επάγουν τη σύνθεση των προστανοειδών, γι αυτό και θεωρούνται πλέον ότι συμμετέχουν στην παθογένεση του καρκίνου. Έτσι αναγνωρίστηκε η συμβολή της επαγωγής της COX-2, σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, στην παραγωγή αυτών των προστανοειδών (Dubois, 1998). Επίσης έχει αποδειχθεί ότι ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ) μέσω της COX αυξάνεται σε διάφορους όγκους, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη καρκινικά κύτταρα (Levine, 1981). Προς επιβεβαίωση τούτου, έχει βρεθεί ότι οι μαστικοί όγκοι εκκρίνουν υψηλότερα επίπεδα PGE 2 συγκρινόμενα με αυτά των παρακείμενων φυσιολογικών μαστικών ιστών (Karmali, 1983). Παρόλο που δεν έχει γίνει απευθείας συσχέτιση των προστανοειδών, τα οποία προέρχονται από του όγκους, με το λειτουργικό τους ρόλο, εικάζεται ότι συμμετέχουν στην επαγωγή την αγγειογένεσης και της αύξησης των καρκινικών κυττάρων, στην ανοσοκαταστολή και στην παρεμπόδιση του κυτταρικού θανάτου (Taketo, 1998). Λόγω όλων των παραπάνω δεδομένων, 22

23 πραγματοποιήθηκαν επιδημιολογικές μελέτες για το ρόλο της ασπιρίνης και των άλλων μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΗΣΑΦ) στον έλεγχο του καρκίνου. Από αυτές τις μελέτες διαπιστώθηκε ότι ασθενείς οι οποίοι λάμβαναν ΜΗΣΑΦ χρόνια, παρουσίασαν 40 έως 50 % μικρότερη πιθανότητα εμφάνισης διάφορων καρκίνων όπως του παχέος και του λεπτού εντέρου, του στομάχου, του μαστού και της ουροδόχου κύστης [Thun (2002)]. Επίσης επιβεβαιώθηκε η εμπλοκή του μονοπατιού της COX στη χημειοπροληπτική δράση των ΜΗΣΑΦ ενάντια στον καρκίνο του γαστρεντερικού σωλήνα (Baron, 2003). Όσον αφορά συγκεκριμένα στη δράση της COX-2, πολλές μελέτες [Eberhart (1994), Kargman (1995), και Sano (1995)] απέδειξαν ότι το ένζυμο υπερεκφράζεται στο 80% των καρκινικών ιστών του παχέος εντέρου από τα επιθηλιακά, στρωματικά και φλεγμονώδη κύτταρα. Φλεγμονή και νόσος τους Alzheimer (AD) [20] Η ασθένεια αυτή διαθέτει ένα ισχυρά φλεγμονώδες υπόβαθρο το οποίο οφείλεται στα ινώδη β-φύλλα των β-αμυλοειδών πλακών. Κι αυτό γιατί γύρω από αυτές τις πλάκες, οι οποίες υπάρχουν στον εγκέφαλο των ασθενών με AD, συγκεντρώνονται προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, πρωτεΐνες οξείας φάσεως, προσταγλανδίνες και άλλοι μεσολαβητές της φλεγμονής. Παρόλο που η COX-2 βρέθηκε ότι αυξάνεται στον εγκεφαλικό φλοιό ασθενών με AD (Kitamura, 1999), είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το ένζυμο φυσιολογικά εκφράζεται σε νευρώνες του νεοφλοιού και στον ιππόκαμπο, ενώ εκλεκτικά εκφράζεται και στους γλουταμινεργικούς πυραμιδικούς νευρώνες. Ο Pasinetti και οι συνεργάτες του (2001) συσχέτισαν τα αυξημένα επίπεδα της COX-2 στους νευρώνες αυτούς με αυξημένη υπάρχουσα άνοια μέτριου έως και προχωρημένου σταδίου. Οι περισσότερες μελέτες έχουν αποδείξει την προστατευτική δράση που ασκεί η ασπιρίνη στο AD, αλλά μερικές άλλες μελέτες υποστηρίζουν ότι τα συναγωνιστικά ΜΗΣΑΦ μειώνουν περισσότερο την πιθανότητα ανάπτυξης AD (Stewart, 1997). Συνεπώς, με δεδομένη την προστατευτική δράση την οποία ασκούν τα ΜΗΣΑΦ, μένει να αποσαφηνιστεί εάν αυτή οφείλεται στην αναστολή των φλεγμονωδών παραγόντων ή στην επίδραση τους στο αγγειακό σύστημα, στα αιμοπετάλια και στα ενδοθηλιακά κύτταρα! Φλεγμονή και αρθρίτιδες Η φλεγμονώδης αρθρίτιδα αποτελεί αυτοάνοσο νόσημα, που διαμορφώνεται από μία ομάδα συνθηκών οι οποίες συνυπάρχουν, επηρεάζουν το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή και ενεργοποιούν το αμυντικό σύστημα ενάντια στους δικούς του ιστούς, με αποτέλεσμα την πρόκληση πόνου, ακαμψίας και καταστροφής του συνδέσμου. Οι πιο κοινές μορφές φλεγμονώδους αρθρίτιδας είναι: η ρευματοειδής αρθρίτιδα η αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα η ψωριασική αρθρίτιδα η ουρική αρθρίτιδα και ο ερυθηματώδης λύκος Οι παραπάνω ασθένειες ορίζονται ως συστηματικές καθώς μπορούν να επηρεάσουν ολόκληρο τον οργανισμό. 23

24 Φλεγμονή και αθηροσκλήρωση [23] Πολλοί συγχέουν την αρτηριοσκλήρυνση με την αθηροσκλήρωση. Η αρτηριοσκλήρυνση δεν είναι τίποτα άλλο από απώλεια της ελαστικότητας των αρτηριών. Οι αρτηρίες γίνονται πιο ανελαστικές, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η αρτηριακή πίεση. Όμως, η αθηροσκλήρωση αφορά ανάπτυξη βλαβών στο τοίχωμα των αρτηριών, τα επονομαζόμενα αθηρώματα, και εάν αφεθεί στην τύχη της κάποια στιγμή θα προκαλέσει έμφραγμα του μυοκαρδίου ή εγκεφαλικό επεισόδιο ή ρήξη ανευρύσματος των αρτηριών ή και θρόμβωση των αρτηριών. Ενώ στην αρχή πιστεύαμε ότι η αθηροσκλήρωση αποτελεί μία ήπια εναπόθεση λίπους στα τοιχώματα των αρτηριών, στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι η φλεγμονή παίζει κυρίαρχο ρόλο τόσο στην έναρξη και εξέλιξη, όσο και στις θρομβωτικές επιπλοκές της νόσου. Τα παραπάνω ευρήματα οδήγησαν στη συσχέτιση των παραγόντων κινδύνου με το μηχανισμό της αθηρογένεσης. Αρχικά, στο ενδοθήλιο των αρτηριών εμφανίζονται αθηρωματικές πλάκες των οποίων ο πυρήνας αποτελείται κυρίως από οξειδωμένη LDL με εναπόθεση ασβεστίου. Ταυτόχρονα, στα φλεγμαίνοντα αυτά ενδοθήλια εκφράζονται ειδικά μόρια-προσκόλλησης τα οποία δεσμεύουν λευκοκύτταρα. Στη συνέχεια, σελεκτίνες, ιντεργκρίνες και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, προϊόντα του αθηρώματος, παρέχουν χημειοτακτική διέγερση στα προσκολλημένα λευκοκύτταρα και τα οδηγούν στο εσωτερικό του ενδοθηλίου. Με τη σειρά τους τα λευκοκύτταρα εκκρίνουν κυτοκίνες και αναπτυξιακούς παράγοντες οι οποίοι προάγουν τη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των αρτηριακών λείων μυικών κυττάρων (SMCs). Τα λεία μυικά κύτταρα της μέσης στιβάδας των αρτηριών παράγουν εξειδικευμένα ένζυμα τα οποία αποδομούν την ελαστίνη και το κολλαγόνο ως απόκριση στην φλεγμονώδη διέγερση. Συνεπώς, η αποδόμηση της εξωκυττάριας αρτηριακής στιβάδας επιτρέπει την διείσδυση των λείων μυικών κυττάρων διαμέσου της στιβάδας ελαστίνης και κολλαγόνου των αναπτυσσόμενων αθηρωματικών πλακών. Επιπροσθέτως, οι διαμεσολαβητές της φλεγμονής όχι μόνο αναστέλλουν τη σύνθεση κολλαγόνου, αλλά και επάγουν τη παραγωγή κολλαγονασών, με συνέπεια τη λέπτυνση της ινώδους κάψας της πλάκας. Έτσι την καθιστούν αδύναμη, με αποτέλεσμα τη διάρρηξή του αθηρώματος και την απελευθέρωση του θρόμβου, ο οποίος αποτελεί βασική επιπλοκή της αθηροσκλήρωσης (εικόνα 7). Η διαδικασία της φλεγμονής σηματοδοτείται από την παραγωγή ειδικών μορίων. Έτσι ανιχνεύοντας τις ουσίες αυτές μπορούμε να πιθανολογήσουμε τον επερχόμενο κίνδυνο ενός καρδιακού ή εγκεφαλικού επεισοδίου, και να τις αξιοποιήσουμε ως προγνωστικά και προληπτικά εργαλεία. Η αποσαφήνιση του ρόλου της φλεγμονής στην αθηρωμάτωση μπορεί να μας οδηγήσει σε επαναστατικές στρατηγικές αντιμετώπισης της νόσου! 24

25 Εικόνα 7 Συμμετοχή φλεγμονής σε όλα τα στάδια της αθηροσκλήρωσης. Α) Χημειοταξία λευκοκυττάρων στο αθήρωμα εν τη γενέσει του, Β) τα Τ-λεμφοκύτταρα συναντούν τα μακροφάγα στο αγγειακό ενδοθήλιο κατά την εξέλιξη της νόσου και C) διάρρηξη της αθηρωματικής πλάκας 1.4 ΠΟΝΟΣ - ΑΛΓΑΙΣΘΗΣΙΑ Ορισμός και κατηγοριοποίηση Ο διεθνής οργανισμός για τη μελέτη του πόνου [International Association for the Study of Pain (IASP)] ορίζει τον πόνο «ως μια δυσάρεστη αισθητική και συναισθηματική εμπειρία, η οποία συνοδεύεται από πραγματική ή δυνητική βλάβη των ιστών ή περιγράφεται ως τέτοια» (2012). Η κατηγοριοποίηση του πόνου, διεργασία χρήσιμη για την αξιολόγηση και κατόπιν θεραπεία του, γίνεται με βάση [24]: την παθοφυσιολογία (αισθητικός, νευροπαθητικός, φλεγμονώδης, ψυχογενής) την ένταση (ήπιος, μέτριος, έντονος βαθμολόγηση σε κλίμακα 0-10) τα χρονικά χαρακτηριστικά (οξύς, χρόνιος) τον τύπο του εμπλεκόμενου ιστού (δέρμα, μύες, σπλάχνα, σύνδεσμοι, τένοντες, οστά) τα υπάρχοντα σύνδρομα (καρκίνος, μυαλγία, ημικρανία κλπ) τα εξατομικευμένα χαρακτηριστικά του πάσχοντα (ψυχολογική κατάσταση, ηλικία, φύλο, μόρφωση) Πηγές πρόκλησης [24] Μέσω της κατηγοριοποίησης του πόνου με βάση την παθοφυσιολογία του, μπορούμε να διακρίνουμε αδρά τις πηγές πρόκλησής του. Αισθητικός πόνος: αντιπροσωπεύει τη φυσιολογική απόκριση σε μία επιβλαβή προσβολή ή τραυματισμό ιστών όπως το δέρμα, οι μύες, τα σπλάχνα, οι σύνδεσμοι, οι τένοντες ή τα οστά. Παραδείγματα τέτοιων πόνων αποτελούν οι σωματικοί μυοσκελετικοί και οι σπλαχνικοί πόνοι. Νευροπαθητικός πόνος: προκαλείται από μία αρχική οργανική βλάβη ή ασθένεια στο σωματοαισθητικό νευρικό σύστημα (είναι ένα περίπλοκο αισθητικό σύστημα το οποίο αποτελείται από θερμοϋποδοχείς, φωτοϋποδοχείς, μηχανοϋποδοχείς και χημειοϋποδοχείς). Οι προκαλούμενες αισθητικές ανωμαλίες οδηγούν σε αντιφατικά συμπτώματα με αποτέλεσμα να εμφανίζονται από αιμωδίες μέχρι υπερευαισθησία (υπεραλγησία ή αλλοδυνία) και παραισθησία (μυρμηκιάσεις). Ως νευροπαθητικοί πόνοι 25

26 ορίζονται η διαβητική νευροπάθεια, η μετα-ερπητική νευραλγία, ο πόνος τραυματισμού της σπονδυλικής στήλης, οι πόνοι μετά τον ακρωτηριασμό και το εγκεφαλικό επεισόδιο. Φλεγμονώδης πόνος: είναι αποτέλεσμα της ενεργοποίησης και ευαισθητοποίησης του μονοπατιού του πόνου με τη βοήθεια ποικιλίας μεσολαβητών (IL-1-alpha, IL-1-beta, IL-6, TNF-alpha, χημειοκίνες, δραστικές μορφές οξυγόνου, αγγειοδραστικές αμίνες, λιπίδια, ATP, οξέα), οι οποίοι απελευθερώνονται στο σημείο της φλεγμονής από τα διηθούμενα λευκοκύτταρα, αγγειο-ενδοθηλιακά κύτταρα ή από τα μαστοκύτταρα των ιστών. Ως παραδείγματα αναφέρονται οι σκωληκοειδίτιδα, ρευματοειδής αρθρίτιδα, φλεγμονώδης νόσος του εντέρου και ο έρπητας ζωστήρας. Ψυχογενής πόνος: είναι ο πόνος για τον οποίο έχουμε μικρή ή καμία ένδειξη οργανικής ασθένειας ή ταυτοποιημένου τραυματισμού των ιστών του σώματος. Παραδείγματα αποτελούν ο ψυχοδυναμικός πόνος (συναισθηματικό τραύμα, πόνος απώλειας) και ο συμπεριφορικός πόνος (π.χ πόνος ανταμοιβής). Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι στις παθολογικές καταστάσεις συνυπάρχουν πολλοί αιτιολογικοί μηχανισμοί, και αυτό έχει ως επακόλουθο να εμφανίζονται σε έναν ασθενή περισσότεροι από ένας τύποι πόνου. Για παράδειγμα είναι γνωστό ότι στους μηχανισμούς της φλεγμονής συμμετέχει και ο νευροπαθητικός πόνος. Το μονοπάτι του πόνου περιλαμβάνει τέσσερα διαδοχικά στάδια (εικόνα 8): Μετατροπή (transduction) Μεταβίβαση (transmission) Αντίληψη (perception) Τροποποίηση (modulation) Ενώ τα πρώτα τρία στάδια γίνονται εύκολα αντιληπτά, ιδιαίτερη αναφορά γίνεται για το τέταρτο (τροποποίηση). Μόλις ο εγκέφαλος αντιληφθεί τον πόνο, ο οργανισμός απελευθερώνει νευροτροποποιητές όπως ενδογενή οπιοειδή, σεροτονίνη, νορεπινεφρίνη και γ-άμινοβουτυρικό οξύ. Αυτές οι χημικές ουσίες εμποδίζουν την αγωγή του πόνου και έτσι συμβάλλουν στην αναλγησία. Αυτή η αναστολή των ώσεων του πόνου ονομάζεται τροποποίηση. Τα κατιόντα μονοπάτια των φυγόκεντρων ινών εκτείνονται από τον φλοιό του εγκεφάλου προς τη σπονδυλική στήλη και μπορούν να επηρεάσουν τις ώσεις του πόνου στο επίπεδο της σπονδυλικής στήλης (descending modulation). 26

27 Εικόνα 8 Τα τέσσερα διαδοχικά στάδια στο μονοπάτι του πόνου Μηχανισμός μεταφοράς [25] Όπως προτάθηκε το 1964 από τους Melzac και Wall, ο πόνος είναι ένα αισθητικό ερέθισμα και ως εκ τούτου διαβιβάζεται από την περιφέρεια στο κέντρο μέσω 3 διαδοχικών νευρώνων (εικόνα 9). 1 ος αισθητικός νευρώνας: Από την περιφέρεια παραλαμβάνεται το ερέθισμα με κεντρομόλες νευρικές ίνες (afferent nerve fiber) και φθάνει στο Γασέριο γάγγλιο (Dorsal ganglion) και από εκεί με τις οπίσθιες αισθητικές νευρικές ίνες εισέρχεται στους πυρήνες των οπισθίων κεράτων του νωτιαίου μυελού. 2 ος αισθητικός νευρώνας: Από τους πυρήνες των οπισθίων κεράτων ακολουθεί το νωτιοθαλαμικό δεμάτιο (spinothalamic tract) και φθάνει στο θάλαμο (στον κοιλιοπλάγιο πυρήνα) μέσω του δικτυωτού σχηματισμού (reticular formation) του εγκεφαλικού στελέχους (brainstem). 3 ος αισθητικός νευρώνας: Από τον θάλαμο με θαλαμοφλοιώδεις ίνες φθάνει στο σωματοαισθητικό επίπεδο του φλοιού (οπίσθια κεντρική έλιξ του βρεγματικού λοβούsomatosensory cortex) όπου εδράζεται το υψηλότερο επίπεδο αντίληψης του πόνου. Εδώ το ερέθισμα «πόνος» γίνεται αντιληπτό με ανάλογες αντιδράσεις. Οι νευρικές ίνες οι οποίες είναι υπεύθυνες για την μεταβίβαση του αισθήματος του πόνου είναι οι Αδ (εμμύελες) και c (λεπτότερες, βραδύτερες και αμύελες). Συγκεκριμένα οι Αδ ίνες είναι υπεύθυνες για τον οξύ εντοπισμένο πόνο ενώ οι c άγουν τον διάχυτο αμβλύ πόνο. 27

28 1.4.3 Αντίληψη του πόνου [25] Εικόνα 9 Μονοπάτι του πόνου Ο πόνος οφείλεται στην έκκριση της ουσίας Ρ στις συνάψεις από την διέγερση των Αδ - c ινών του πόνου. Όταν όμως διεγείρονται οι Αβ νευρικές ίνες (παχιές εμμύελες και ταχείες, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την μεταβίβαση του αισθήματος αφής και πίεσης) εκκρίνουν ενδορφίνες στις συνάψεις οι οποίες εξουδετερώνουν τη δράση της ουσίας Ρ. Η διέγερση περιφερικών μηχανο- ή θερμο-ψυχροϋποδοχέων διεγείρει ανώτερα κέντρα του Κ.Ν.Σ. τα οποία επηρεάζουν την πύλη ελέγχου του πόνου. Όπως διατυπώθηκε από τους Simons & Pomeranzy, σε όλο το νευρικό σύστημα υπάρχουν κατάλληλοι υποδοχείς για την πρόσδεση εξωγενών παυσίπονων ουσιών. Έρευνες έχουν αποδείξει ότι ο οργανισμός απελευθερώνει ενδογενείς αναλγητικές ουσίες οι οποίες αλληλεπιδρούν με τους παραπάνω υποδοχείς. Οι ουσίες αυτές είναι πολυπεπτίδια, οι ενδορφίνες α, β, γ, οι εγκεφαλίνες : μεθειονίνη, λευκεγκεφαλίνη και οι δυνορφίνες. Επίσης προκαλεί και ποσοτική μεταβολή στους νευροδιαβιβαστές ντοπαμίνη, σερετονίνη, ACTH κ. ά. Τα ενδογενή αυτά αναλγητικά ονομάζονται «ενδογενή οπιούχα» διότι έχουν την ίδια φαρμακολογική δράση με τα εξωγενή οπιούχα, π.χ. τη μορφίνη. Προκαλούν δηλαδή αναλγησία, ευεξία, ευφορία, αύξηση του libido κλπ., όπως ακριβώς και η μορφίνη, με τη μόνη διαφορά ότι δεν προκαλούν εθισμό, διότι ο οργανισμός εκκρίνει τόση ποσότητα όση ακριβώς χρειάζεται. Αξιοσημείωτο είναι ότι η αναλγητική δράση των ενδογενών οπιούχων 28

29 είναι πολλαπλασίως ισχυρότερη από της μορφίνης και μάλιστα 200 φορές όσον αφορά στις ενδορφίνες και 400 και πλέον φορές ισχυρότερη όσον αφορά στις δυνορφίνες. 1.5 ΤΥΡΟΣΙΝΑΣΗ Γενικά Στη μοριακή βιολογία, η τυροσινάση αναφέρεται ως μία οξειδάση η οποία είναι το καθοριστικό ένζυμο για την παραγωγή της μελανίνης. Συμμετέχει βασικά σε δύο διαφορετικά στάδια: αρχικά υδροξυλιώνει μία μονοφαινόλη και στην συνέχεια μετατρέπει την παραγόμενη ο-διφαινόλη στην αντίστοιχη ο-κινόνη. Στη συνέχεια, η ο-κινόνη καταλήγει στον σχηματισμό της μελανίνης. Η τυροσινάση είναι ένα ένζυμο το οποίο περιέχει χαλκό (Cu) και είναι παρούσα σε πολλούς φυτικούς και ζωικούς (ανθρώπινους) ιστούς, καθώς καταλύει την οξείδωση της τυροσίνης προς τον σχηματισμό της μελανίνης και άλλων χρωστικών. Εντοπισμός Η ανθρώπινη τυροσινάση είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία εντοπίζεται στα μελανοσώματα. Πιο συγκεκριμένα, η ενεργή της περιοχή η οποία πραγματοποιεί την κατάλυση βρίσκεται εντός του μελανοσώματος, ενώ μόνο ένα μικρό μη λειτουργικό μέρος της εκτείνεται εντός του κυτταροπλάσματος του μελανοκυττάρου. Το μελανόσωμα είναι το οργανύλιο εντός του μελανοκυττάρου όπου γίνεται και η σύνθεση της μελανίνης. Τα μελανοκύτταρα εντοπίζονται στην κατώτερη στοιβάδα της επιδερμίδας, στην μεσαία στοιβάδα του ματιού, στο εσωτερικό του αυτιού, στις μήνιγγες, στα οστά, στην καρδία κ.α. Εικόνα 10 Εμβρυϊκή ανάπτυξη μελανοβλαστών από την νευρική ακρολοφία και μετανάστευσή τους τόσο στο δέρμα και στα μαλλιά (μελανοκύτταρα) όσο και στις λεπτομήννιγες (χοριοειδής και αραχνοειδής µήνιγγα), στο εσωτερικό του αυτιού και στα μάτια. Στην επιδερμίδα υπάρχει συμβιωτική σχέση μεταξύ των μελανοκυττάρων και των γειτονικών τους κερατινοκυττάρων (επιδερμική μονάδα μελανίνης). 29

30 Δομή [26] Όπως προαναφέρθηκε, τυροσινάσες έχουν απομονωθεί από ποικιλία φυτών, ζώων και μυκήτων. Ωστόσο από είδος σε είδος διαφέρουν οι δομικές τους ιδιότητες (πρωτοταγής δομή, μέγεθος, γλυκοσυλίωση, χαρακτηριστικά ενεργοποίησης), η κατανομή τους στους ιστούς ακόμη και η ενδοκυττάρια θέση τους. Έχει προταθεί ότι δεν υπάρχει καμία δομικά κοινή τυροσινάση που να εντοπίζεται σε όλα τα είδη. Παρόλα αυτά, όλες οι τυροσινάσες στον ενεργό τους κέντρο διαθέτουν ένα διπυρηνικό τύπου III κέντρο χαλκού, και κάθε άτομο του χαλκού ενώνεται με τρία υπόλοιπα ιστιδίνης. Εικόνα 11 Κρυσταλλογραφική δομή τυροσινάσης προερχόμενη από Στρεπτομύκητα. Σε όλα τα μοντέλα τά άτομα χαλκού είναι πράσινα και η επιφάνεια του μορίου είναι κόκκινη. Στα μοντέλα D και E οι ιστιδίνες είναι μπλε. Από το μοντέλο E φαίνεται καθαρά ότι κάθε άτομο χαλκού μέσα στο ενεργό κέντρο όντως συνδέεται με τρία υπόλοιπα ιστιδίνης, σχηματίζοντας το τύπου III κέντρο του χαλκού. Επίσης φαίνεται από τα μοντέλα C και D ότι το ενεργό κέντρο αυτού του ενζύμου βρίσκεται εντός ενός σχηματισμού τσέπης στην επιφάνεια του μορίου. Εικόνα 12 Οι τρεις μορφές της τυροσινάσης Η τυροσινάση έχει τρεις μορφές: met (Em), deoxy (Ed) και oxy (Eo) (εικόνα 12). Η μορφή του ανενεργού ενζύμου είναι η met, ενώ του ενεργού η oxy. Ενώ οι μορφές Εm και Ed μπορούν να καταλύσουν διφαινολικά υποστρώματα, η Eo μορφή μπορεί να καταλύσει και μονοφαινολικά. Η Εο μορφή προκύπτει από την ανενεργή μορφή Εm είτε απευθείας παρουσία υπεροξειδίων ή με αναγωγή κατά δύο ηλεκτρόνια πρώτα στην Ed μορφή και στη συνέχεια με αναστρέψιμη σύνδεση με Ο 2. Στο διπλανό σχήμα φαίνονται σχηματικά οι παραπάνω μορφές του ενεργού κέντρου του ενζύμου Φυσιολογικός ρόλος ενζύμου Η τυροσινάση είναι το καθοριστικό ένζυμο στην μελανογένεση, η οποία είναι η φυσιολογική διαδικασία για την παραγωγή της μελανίνης. Η σύνθεση της μελανίνης 30

31 ξεκινάει στο ήπαρ όπου η φαινυλαλανίνη μετατρέπεται σε τυροσίνη με την δράση της υδροξυλάσης της φαινυλαλανίνης. Όπως έχει αναφερθεί, η οξείδωση της L-τυροσίνης σε L- DOPA καταλύεται από την τυροσινάση εντός των μελανοσωμάτων των μελανοκυττάρων, και σε επόμενο στάδιο η L-DOPA οξειδώνεται και πάλι από την τυροσινάση σε L- DOPAκινόνη. Από την DOPAκινόνη, τα συνθετικά μονοπάτια της μελανίνης διαχωρίζονται ώστε να παράξουν την ευμελανίνη και την φαιομελανίνη. Παρακάτω δίνεται ο καταλυτικός κύκλος όπου συμμετέχει η τυροσινάση με τις τρεις προαναφερθείσες, διαφορετικές μορφές του ενεργού της κέντρου (εικόνα 13) και στην εικόνα 14 φαίνεται σχηματικά η σύνθεση της μελανίνης με την συμμετοχή της τυροσινάσης. Εικόνα 13 Καταλυτικός κύκλος της μονοοξυγόνωσης των μονοφαινολών και της οξείδωσης των ο- διφαινολών σε ο-κινόνες από την τυροσινάση. Εικόνα 14 Βιοσυνθετικά μονοπάτια μελανίνης 31

32 Μετά την έκθεση των ιστών σε υπεριώδη ακτινοβολία, η καταστροφή του DNA από τις παραχθείσες ελεύθερες ρίζες, πυροδοτεί την έκλυση κυτοκινών, αναπτυξιακών και άλλων φλεγμονωδών παραγόντων οι οποίοι με την σειρά τους διεγείρουν την παραγωγή της μελανίνης. Πιο αναλυτικά, η μελανίνη σχηματιζόμενη στα μελανοκύτταρα, τα οποία είναι άφθονα κυρίως στην κατώτερη στοιβάδα της επιδερμίδας και στην εφαπτόμενη σε αυτήν στοιβάδα της δερμίδας, είναι υπεύθυνη για την χρώση του δέρματος. Τα μελανοκύτταρα, αυξάνοντας την παραγωγή του ενδοκυττάριου μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), πυροδοτούν σηματοδοτικά μονοπάτια ώστε να αρχίσει η μελανογένεση δηλαδή η παραγωγή της μελανίνης. Τα κοκκία που περιέχουν μελανίνη μετά την σύνθεσή τους μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα των μελανοκυττάρων στο κυτταρόπλασμα των κερατινοκυττάρων. Στην ανθρώπινη επιδερμίδα, τα μελανοκύτταρα συνεργάζονται με αγαστή σύμπνοια με τα γειτονικά κύτταρα όπως τα κερατινοκύτταρα. Έτσι σχηματίζεται ένα προστατευτικό κάλυμμα στις εσωτερικές στοιβάδες της επιδερμίδας, το οποίο απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία και εμποδίζει την διείσδυσή της. Στην συνέχεια θα αναφερθούν λίγα λόγια για τις δύο βασικές μορφές της μελανίνης (ευμελανίνη και φαιομελανίνη), καθώς και για την βιολογική διαδικασία της χρώσης του δέρματος. Η ευμελανίνη για πολύ καιρό θεωρούνταν ένα πολυμερές από ενωμένα 5,6- δι-ύδροξυ-ινδόλια (DHI) και 5,6-δι-υδροξυ-ίνδολο-οξέα (DHICA). Ωστόσο, στην πορεία αποδείχθηκε οτι αποτελείται από κάποια βασικά ολιγομερή τα οποία είναι ενωμένα μεταξύ τους με διαφορετικό μηχανισμό. Η ευμελανίνη εντοπίζεται στα μαλλιά, στην θηλαία άλω και στο δέρμα και χωρίζεται σε δύο τύπους: στην καφε και στην μαύρη οι οποίες εμφανίζονται στους σκουρόχρωμους ανθρώπους. Μικρή ποσότητα μαύρης ευμελανίνης σε απουσία άλλων Σχήμα 10 Δομικό μέρος ευμελανίνης χρωστικών προκαλεί το γκριζάρισμα των μαλλίων, ενώ μικρή ποσότητα καφέ ευμελανίνης απουσία άλλων χρωστικών ευθύνεται για τα ξανθά μαλλιά. Η φαιομελανίνη υπάρχει στα μαλλιά και στο δέρμα ανοιχτόχρωμων ανθρώπων (π.χ βρίσκεται σε μεγάλη ποσότητα στους κοκκινομάλληδες καθώς προσδίδει έντονα ροζ έως κόκκινες αποχρώσεις). Συγκεντρώνεται κυρίως στα χείλη, στις θηλές, στην βάλανο του πέους και στον κόλπο. Η φαιομελανίνη έχει καρκινογενετικό δυναμικό όταν εκτίθεται στη υπεριώδη ακτινοβολία. Από χημικής απόψεως, διαφέρει από την ευμελανίνη στο ότι τα ολιγομερή της αποτελούνται από βενζοθειαζίνες και βενζοθειαζόλια τα οποία παράγονται αντι των Σχήμα 11 Δομικό μέρος φαιομελανίνης DHI και DHICA, όταν είναι παρόν το αμινοξύ L- κυστεϊνη. Όσον αφορά στη βιολογική διαδικασία χρώσης του δέρματος έχουμε δύο βασικές κατευθύνσεις: την γενετικά προγραμματισμένη παραγωγή της μελανίνης απουσία UV ακτινοβολίας (εξ ιδιοσυστασίας χρώση) και την άμεση ή καθυστερημένη αντίδραση μαυρίσματος η οποία επάγεται μετά από έκθεση σε UV ακτινοβολία (εξ επαγωγής χρώση). 32

33 Η τελευταία κατεύθυνση καθορίζεται από τον συνδυασμό ακτινοβολίας, ορμονών και άλλων παραγόντων όπου εμπλέκεται και η γονιδιακή ιδιοσυγκρασία του καθενός πέρα από την συμμετοχής της, όπως είπαμε, στην χρώση εξ ιδιοσυστασίας. Αυτό γίνεται περισσότερο κατανοητό αν παρατηρήσει κανείς την μεγαλύτερη ικανότητα για μαύρισμα που έχουν οι ανοιχτόχρωμοι άνθρωποι! Συνεπώς οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για υπέρχρωση (π.χ solarium) επηρεάζουν την χρώση εξ επαγωγής. Τέλος, αξίζει να αναφερθεί και η ύπαρξη της νευρομελανίνης η οποία είναι μία σκούρα χρωστική και εντοπίζεται σε τέσσερις βασικούς πυρήνες του εγκεφάλου: μέλανα ουσία, υπομέλανα τόπο, ανώτερο κεντρικό πυρήνα (MRN) και στον νωτιαίο κινητικό πυρήνα του πνευμονογαστρικού νεύρου. Αν και είναι ακόμη υπό εξέταση τόσο ο ρόλος της (αφού πιστεύεται οτι εμποδίζει τον εκφυλισμό των νευρώνων του εγκεφάλου) όσο και η βιοσύνθεσή της, θεωρείται οτι στην παραγωγή της δεν συμμετέχει η τυροσινάση Παθολογικές καταστάσεις με εμπλοκή της τυροσινάσης Η τυροσινάση είναι ευρέως διαδεδομένο ένζυμο στην φύση και βρίσκεται σε διάφορα φυλογενετικά δέντρα όπως στο ανθρώπινο, όπου έλλειψή της προκαλεί παθολογικές καταστάσεις όπως οφθαλμοδερματικό αλφισμό (τύπου 1), αλλά και σε φρούτα, λαχανικά και μανιτάρια, όπου η παρουσία της ευθύνεται για το μεγάλης οικονομικής σημασίας μαύρισμα μετά από την κοπή τους. Αλφισμός τύπου 1 Οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου της τυροσινάσης που οδηγεί σε παραγωγή πλήρως ή μερικώς ανενεργής μορφής του ενζύμου (Τύπος 1Α και 1Β αντίστοιχα). Είναι μία αυτοσωμικά κληρονομούμενη ανωμαλία στην οποία απουσιάζει ή υπολειτουργεί η βιοσύνθεση του ενζύμου σε δέρμα, μάτια και μαλλιά. Οι περισσότεροι ασθενείς έχουν γαλακτώδες λευκό δέρμα, άσπρα μαλλιά και μπλε μάτια κατά τη γέννηση και παρουσιάζουν αυξημένη ευαισθησία στην UV ακτινοβολία με προδιάθεση για καρκίνο του δέρματος. Επίσης εμφανίζουν μειωμένη οπτική οξύτητα, νυσταγμό, στραβισμό και φωτοφοβία. Τέλος κάποιοι ασθενείς έχουν άσπρα μαλλιά σε πιο ζεστές περιοχές και προοδευτικά πιο σκούρα μαλλιά σε ψυχρότερες περιοχές του σώματός τους, γεγονός το οποίο οφείλεται στην απώλεια της δραστικότητας της τυροσινάσης σε θερμοκρασίες άνω των ο C Παρκινσονισμός [27] Οι επιστήμονες οδηγήθηκαν στο συμπέρασμα για την ύπαρξη της τυροσινάσοεξαρτώμενης παραγωγής DA ή L-DOPA μετά από τις παρακάτω παρατηρήσεις. Αρχικά βρέθηκε ότι οι οπτικές ανωμαλίες στον αλφισμό τύπου 1 ανατάσσονται με την τοπική χορήγηση L-DOPA. Επίσης παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη αντίσταση των φυσιολογικών ποντικιών έναντι των αλφικών στις ντοπαμινεργικές νευροτοξίνες που μειώνουν την παραγωγή DA στο ΚΝΣ. Τέλος επισημάνθηκαν τα αξιοπρόσεκτα μικρότερα ποσοστά παρκινσονισμού στις έγχρωμες φυλές. Ιδιαίτερα όσο αφορά στον παρκινσονισμό, έχει βρεθεί οτι η παρατεταμένη θεραπεία με L-DOPA όχι μόνο δεν βελτιώνει την κατάσταση του ασθενούς αλλά εμπλέκεται και στην παθογένεια της ασθένειας λόγω της νευροτοξικότητας των DA και L-DOPA. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου και αζώτου που παράγονται κατά την ενζυματική οξείδωση ή αυτοοξείδωση της επιπλέον ποσότητας της DA επάγουν την 33

34 νευρωνική καταστροφή και/ή τον αποπτωτικό ή μη κυτταρικό θάνατο. Επίσης η DA και οι DΟΡΑ-κινόνες που παράγονται μπορούν να αλλάξουν τη λειτουργία μίας πρωτεϊνης με την ενσωμάτωση μίας 5-κυστεονυλο-κατέχολο ομάδας. Οι πρωτεϊνες αυτές μπορεί να οδηγήσουν σε μη αναστρέψιμη αύξηση της κυτταροτοξικότητας των πρωτοϊνιδίων (παροδικά ινίδια που σχηματίζονται στα αρχικά στάδια νευροεκφυλιστικών ασθενειών) και τροποποίηση της υδροξυλάσης της τυροσίνης. Κάπου εδώ όμως μπαίνει η τυροσινάση η οποία οξειδώνει πολύ γρήγορα τις επιπλέον κυτοσολικές ποσότητες των DA και L-DOPA με αποτέλεσμα να αναστέλλει την προοδευτική καταστροφή των κυττάρων από την αυτοοξείδωση της DA. Επίσης, εφόσον η τυροσινάση όπως είδαμε έχει και δράση συνθετάσης της DA, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε περίπτωση απουσίας της υδροξυλάσης της τυροσίνης σε εκφυλισμένους ιστούς. Τέλος η τυροσινάση με τις παραπάνω δύο ιδιότητες μπορεί να χρησιμοποιηθεί ώστε να εξομαλυνθεί η ανώμαλη ανακύκληση της DA σε ασθενείς του πάρκινσον που υποβάλλονται σε μακροχρόνια θεραπεία. Λεύκη (Vitiligo) Η λεύκη είναι μία δερματική διαταραχή η οποία χαρακτηρίζεται από τοπικές ή διάχυτες αποχρωματισμένες περιοχές του δέρματος και θεωρείται αυτοάνοση νόσος καθώς στον ορό των ασθενών εντοπίζονται αυτοαντισώματα κατά των μελανοκυττάρων (vitiligo αυτοαντισώματα) και πιο συγκεκριμένα αυτοαντισώματα και κατά της τυροσινάσης. Ωστόσο, τελικά αποδείχθηκε ότι τα αυτοαντισώματα της τυροσινάσης δεν είναι vitiligo αυτοαντισώματα καθώς δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογέννεια της νόσου. Έτσι η αύξηση τους χαρακτηρίζεται ως επιφαινόμενο παρόμοιο και με την μικρή αύξηση κι άλλων αυτοαντισωμάτων που παρατηρείται σε ασθενείς με vitiligo. Υπέρχρωση [28] Στις περιπτώσεις της υπέρχρωσης η ποσότητα της μελανίνης του δέρματος παίζει πρωταρχικό ρόλο. Η αύξησή της οφείλεται, είτε στην αύξηση των μελανοκυττάρων (μελανοκυττάρωση), ή στην αύξηση της παραγωγής της χωρίς να έχει προηγηθεί αύξηση του αριθμού των μελανοκυττάρων (μελάνοση). Τα μελανοσώματα των μελανοκυττάρων όπου παράγεται η μελανίνη μεταναστεύουν όπως είδαμε στα γειτονικά κερατινοκύτταρα ώστε να ισχυεί η αναλογία μελανοκύτταρα:κερατινοκύτταρα 1:36. Εκεί τα μελανοσώματα συντήκονται με τα λυσοσώματα των κερατινοκυττάρων και σε περιπτώσεις φλεγμονής του δέρματος και κυτταρικής καταστροφής μεταφέρονται στην δερμίδα όπου εγκολπώνονται από τα μακροφάγα (μελανοφάγα). Η διέγερση αυτή μπορεί να προκληθεί είτε άμεσα με την επίδραση UV ακτινοβολίας ή εμμέσως μέσω κυτοκινών και αναπτυξιακών παραγόντων (π.χ επιδερμικών, ινοβλαστικών, νευρικών, αιμοπεταλιακών και ενδοθηλίνες) που παράγονται από τα κερατινοκύτταρα ή από άλλα κύτταρα όπως τους ινοβλάστες. Τέλος η υπέρχρωση επηρεάζεται από ορμόνες όπως η ινσουλίνη, η διεγερτική ορμόνη των μελανοκυττάρων (MSH), και η υδροκορτιζόνη. Μελάνωμα Το μελάνωμα είναι κακοήθης όγκος των μελανοκυττάρων, ο οποίος οφείλεται σε γονιδιακές μεταλλάξεις. Η τυροσινάση δεν εμπλέκεται στην παθολογία της νόσου αλλά η 34

35 δραστηριότητά της αύξανεται κατά την διάρκεια της νόσου. Το γεγονός αυτό, ωστόσο, το εκμεταλλευόμαστε για ακόμη μία, μετά από αυτην στο πάρκινσον, προς όφελός μας χρήση του ενζύμου. Πιο συγκεκριμένα μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε ως προφάρμακα υποστρώματα του ενζύμου (π.χ ορισμένες υποκατεστημένες φαινόλες) τα οποία θα αποφεύγουν τον ηπατικό και κάποιο άλλο ενδοκυττάριο μεταβολισμό ώστε να συγκεντρωθούν και να μεταβολιστούν μόνο από τα μελανοσώματα όπου παρουσιάζεται αυξημένη δραστηριότητα της τυροσινάσης. Έτσι θα δημιουργηθούν κινόνες οι οποίες, ως γνωστό, είναι πολύ δραστικά ενδιάμεσα και μπορούν να οδηγήσουν σε απόπτωση τα κακοήθη κύτταρα (εκλεκτική τοξικότητα). Ενζυματική υπερωρίμανση τροφίμων Όπως προαναφέρθηκε, ο έλεγχος της τυροσινάσης παίζει σπουδαίο ρόλο και στην βιομηχανία τροφίμων καθώς, μέσω της μετατροπής των φαινολικών συστατικών των φρούτων και λαχανικών σε κινόνες, οδηγεί στο μαύρισμά τους με επακόλουθες συνέπειες στην ποιότητα (ανεπιθύμητο χρώμα και οσμή) του εκάστοτε προϊόντος. Αξίζει όμως να περιγραφεί η παραπάνω διαδικασία από χημικής απόψεως: οι ορθο-κινόνες οι οποίες Σχήμα 12 Χλωρογενικό οξύ δημιουργούνται, ως ισχυρά ηλεκτρονιόφιλα μπορούν να υποστούν πυρηνόφιλες προσβολές από νερό, άλλες πολυφαινόλες, αμινοξέα, πεπτίδια και πρωτεϊνες και να δώσουν προϊόντα προσθήκης τύπου Michael τα οποία στην ουσία αποτελούν το ενζυματικό μαύρισμα. Επίσης τα φυτικά τρόφιμα διαθέτουν ως κύριο φαινολικό συστατικό χλωρογενικό οξύ (εστέρας του ύδροξυ-κινναμωνικού οξέος με κυκλιτόλη), το οποίο κι αυτό οξειδώνεται από την τυροσινάση σε πολύ δραστικά κίνονοενδιάμεσα προϊόντα τα οποία με την σειρά τους αντιδρούν με πυρηνόφιλη προσθήκη με την ΝΗ 2 της λυσίνης, την SCH 3 της μεθειονίνης και το ινδόλιο της τρυπτοφάνης, δίνοντας τις επονομαζόμενες browning και greening αντιδράσεις. Αυτές οι μετατροπές εκτός του οτι καταστρέφουν βασικά αμινοξέα, εμποδίζουν την πέψη και μειώνουν την θρεπτική αξία αυτών των τροφών, μπορεί να οδηγήσουν και στον σχηματισμό τοξικών προϊόντων! Αναστολείς τυροσινάσης [29] Όλα τα παραπάνω παρατέθηκαν για να κατανοηθούν τόσο η λειτουργία όσο και ο τρόπος δράσης του ενζύμου, καθώς και οι ανωμαλίες όπου εμπλέκεται, ώστε να τονισθεί η σημασία ελέγχου του για ιατρικούς (π.χ θεραπεία υπέρχρωσης) και όχι μόνο λόγους. Δράση πραγματικού αναστολέα τυροσινάσης (και όχι αναστολείς μελανογένεσης) έχουν ενώσεις οι οποίες την ανενεργοποιούν βασιζόμενη στον μηχανισμό δράσης της (αναστολείς αυτοκτονίας) και οι ειδικοί αντιστρεπτοί αναστολείς. Σε αυτές τις ομάδες αναστολέων ανήκουν ενώσεις από διάφορες κατηγορίες όπως: λιπίδια μακράς αλύσου και στερεοειδή, βενζαλδεϋδικά και βενζοϊκά παράγωγα, στιλβένια, κουμαρίνες και φλαβονοειδή. Ενδεικτικά αναφέρονται το κογικό οξύ (kojic acid), η τροπολόνη και η L- μιμοσίνη (ανάλογο υποστρώματος). 35

36 Σχήμα 13 Αναστολέις τυροσινάσης Το κογικό οξύ είναι μεταβολίτης του μύκητα Aspergillus oryzae και χρησιμοποιείται στην κοσμητολογία ως δερματικό λευκαντικό και στα τρόφιμα για την αναστολή την ενζυματικής υπερωρίμανσης. Συναρμόζεται με τον Cu του ενεργού κέντρου του ενζύμου όταν αυτό είναι έτοιμο για κατάλυση παρουσία κατάλληλου υποστρώματος. Με τον ίδιο τρόπο δρούν και οι άλλοι δύο πρότυποι αναστολείς και όλοι μαζί χρησιμοποιούνται ως μέτρο σύγκρισης της ανασταλτικής ικανότητας άλλων αναστολέων. Αξίζει να σημειωθεί ότι και στους τρεις υπάρχει η ομάδα της υδροξυκετόνης. Εκτός όμως από τους παραπάνω φυσικούς αναστολείς, παρήχθησαν και συνθετικοί αναστολείς. Είναι προφανές ότι αλλαγές στην δομή ενός ήδη γνωστού αναστολέα μπορεί να επιφέρουν επιθυμητά αποτελέσματα. Έτσι, για παράδειγμα, αν στην φαινυλοθειουρία (PTU), η οποία αναστέλλει την τυροσινάση με σύνδεση του ατόμου S με τα δύο άτομα Cu, αντικατασταθεί η αμινοομάδα με υδροξυλαμίνη και το S με O τότε έχουμε αύξηση της δράσης. Επίσης τα Ν-φαινυλοαλκυλ-κινναμίδια παρουσιάζουν ισχυρότερη αναστολή από το κογικό οξύ και από τις ενώσεις από τις οποίες συνετέθησαν (κινναμωμικό οξύ και φαινυλοαλκυλαμίνες). Επιπλέον, σύζευξη κογικού και καφεϊκού οξέος (παράγωγο υδροξυκινναμωμικού οξέος) οδηγεί σε ένωση που βελτιώνει τον αποχρωματισμό σε μελάνωμα. Ακόμη βρέθηκε ότι Ν-υποκατάσταση της καμπφερόνης (Ν-νιτροδωυδροξυλαμίνη), δημιουργεί ακόμη πιο ισχυρούς συναρμοτές του Cu και κατ επέκταση αναστολείς του ενζύμου. Αντίθετα, με απώλεια της νιτρωδο- ή υδροξυ- ομάδας έχουμε και απώλεια της δραστικότητας. Τέλος, στην κατηγορία αυτή ανήκουν και οι οξαζολόνες οι οποίες μπορούν να παρουσιάσουν μέχρι και 14 φορές ισχυρότερη δράση από το κογικό οξύ! 1.6 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Ως πρωτεόλυση ορίζεται η αποδόμηση των πρωτεϊνών σε μικρότερα πολυπεπτίδια ή αμινοξέα, η οποία, στην ουσία, οφείλεται στην υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών [30]. Η υδρόλυση αυτή επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενζύμων πρωτεασεών, με την ενδομοριακή πέψη, αλλά και με μη-ενζυμικό τρόπο όπως με τη επίδραση ανόργανων οξέων και θέρμανσης. Η πρωτεόλυση εξυπηρετεί πολλαπλούς σκοπούς όπως: Απομάκρυνση της Ν-τελικής μεθειονίνης μετά τη μετάφραση Απομάκρυνση της αλληλουχίας σήματος των πεπτιδίων μετά τη μεταφορά τους διαμέσω μιας μεμβράνης Διαχωρισμό των ιικών πρωτεϊνών οι οποίες μεταφράζονται από πολυσιστρονικό (πολυγονιδιακό) mrna Αποδόμηση των πρωτεϊνών των τροφών ως πηγή αμινοξέων 36

37 Μετατροπή των πρόδρομων μορφών των πρωτεϊνών (προένζυμα, ζυμογόνα, προορμόνες) στις τελικές λειτουργικές τους δομές Αποδόμηση των κυκλινών, οι οποίες, όπως δηλώνει το όνομά τους, παρουσιάζουν διακύμανση των επιπέδων τους κατά τη διάρκεια του κύκλου Ως πρωτεάση (πεπτιδάση ή πρωτεϊνάση) ορίζεται οποιοδήποτε ένζυμο το οποίο καταλύει τον καταβολισμό των πρωτεϊνών με την υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών οι οποίοι συνδέουν τα αμινοξέα (πρωτεόλυση). Με βάση το καταλυτικό τους κέντρο, οι πρωτεάσες κατηγοριοποιούνται σε έξι ευρείες ομάδες: Σερινο-πρωτεάσες Θρεονινο-πρωτεάσες Κυστεϊνο-πρωτεάσες Πρωτεάσες ασπαρτικού οξέος Πρωτεάσες γλουταμινικού οξέος Μεταλλο-πρωτεάσες Ο μηχανισμός της θραύσης του πεπτιδικού δεσμού περιλαμβάνει τη μετατροπή ενός αμινοξέος (σερίνης, θρεονίνης και κυστεΐνης) ή ενός μορίου νερού (πρωτεάσες ασπαρτικού οξέος και γλουταμινικού οξέος, μεταλλο-πρωτεάσες) σε πυρηνόφιλο κέντρο ώστε να προσβληθεί η καρβοξυλική ομάδα του πεπτιδίου (εικόνα 15). Εικόνα 15 Σύγκριση των δύο μηχανισμών πρωτεόλυσης (το ένζυμο παρουσιάζεται με μαύρο χρώμα, το υπόστρωμα-πρωτεΐνη με κόκκινο και το νερό με μπλε). Στο πάνω σχήμα φαίνεται η υδρόλυση σε ένα βήμα όπου το ένζυμο χρησιμοποιεί το οξύ του ώστε να πολώσει το νερό το οποίο με τη σειρά του υδρολύει το υπόστρωμα. Στο κάτω σχήμα φαίνεται η υδρόλυση σε δύο βήματα όπου το αμινοξύ στο ενεργό κέντρο του ενζύμου ενεργοποιείται ώστε να δράσει ως πυρηνόφιλο και να προσβάλλει το υπόστρωμα. Έτσι σχηματίζεται ένα ενδιάμεσο όπου το ένζυμο είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με το Ν-τελικό άκρο του υποστρώματος. Στο δεύτερο βήμα ενεργοποιείται το νερό ώστε να υδρολυθεί το ενδιάμεσο και να ολοκληρωθεί η κατάλυση. Άλλα ένζυμα λειτουργούν ως δότες και δέκτες υδρογόνων τα οποία εξισορροπούν τα ηλεκτροστατικά φορτία κατά την διάρκεια των αντιδράσεων. 37

38 Εικόνα 16 Η ιστιδίνη και το ασπαρτικό οξύ συμβάλουν στην απομάκρυνση του ατόμου υδρογόνου από τη σερίνη (άσπρο χρώμα), γεγονός το οποίο την καθιστά περισσότερο δραστική ώστε να προσβάλλει την πρωτεΐνη στόχο Πρωτεόλυση και ασθένειες Η ανώμαλη πρωτεολυτική δραστηριότητα συνδέεται με πολλές ασθένειες [31]. Στην παγκρεατίτιδα, η διαρροή των πρωτεασών και η πρώιμη ενεργοποίησή τους στο πάγκρεας έχουν ως αποτέλεσμα την αυτοπέψη του. Στους διαβητικούς ανθρώπους αυξάνεται η λυσοσωμική δραστηριότητα και η αποδόμηση κάποιων πρωτεϊνών σε σημαντικό βαθμό. Στις χρόνιες φλεγμονώδεις παθήσεις, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, εμπλέκεται η απελευθέρωση λυσοσωμικών ενζύμων στον εξωκυττάριο χώρο με αποτέλεσμα τη λύση των περιβαλλόντων ιστών. Τέλος η ανώμαλη πρωτεόλυση, η παραγωγή πεπτιδίων τα οποία συγκεντρώνονται ενδοκυττάρια και η αναποτελεσματική τους απομάκρυνση έχουν ως συνέπεια πολλές νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως το Alzheimer [32]. Άλλες ασθένειες οι οποίες συνδέονται με την παρεκκλίνουσα πρωτεόλυση περιλαμβάνουν τη μυική δυστροφία, τις εκφυλιστικές δερματικές ανωμαλίες, αναπνευστικές και γαστροοισοφαγικές ασθένειες και κακοήθειες. 1.7 ΣΥΝΘΕΤΙΚΕΣ ΠΟΡΕΙΕΣ 5(4H)-ΟΞΑΖΟΛΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Τα πρώτα παράγωγα των 5-(4Η)-οξαζολονών παρασκευάστηκαν περίπου πριν από 100 χρόνια όταν οι Traube και Ascher περιέγραψαν τη σύνθεση των 2-αμινο-5-(4Η)-οξαζολονών (ψευδοϋδαντοϊνες) μέσω συμπύκνωσης γουανιδίνης με υδροξυ-εστέρες (σχήμα 14) [33]. Λίγα χρόνια αργότερα οι Sheehan και Izzo παρασκεύασαν το πρώτο απλό 2-αρυλοανάλογο από την αντίδραση βενζοϋλοισοκυανικού εστέρα με διαζωμεθάνιο ώστε να παραχθεί η 2-φαινυλο-4(5Η)-οξαζολόνη (σχήμα 15). Τελικά η σύνθεση των 5-(4Η)-οξαζολονών έγινε κατανοητή με την αποσαφήνιση του μηχανισμού της αντίδρασης από τον Γερμανό χημικό Friedrich Gustav Carl Emil Erlenmeyer ( ) για τη σύνθεση αμινοξέων, πεπτιδίων και αζαλακτονών (σχήμα 16) [1]. 38

39 Σχήμα 14 Σύνθεση των 2-αμινο-5-(4Η)-οξαζολονών (ψευδοϋδαντοϊνες) Σχήμα 15 Σύνθεση 2-φαινυλο-4(5Η)-οξαζολόνης Σχήμα 16 Σύνθεση Erlenmeyer Άλλες μέθοδοι παρασκευής οξαζολονικών παραγώγων Στην πρόσφατη βιβλιογραφία αναφέρονται και άλλοι τρόποι σύνθεσης υποκατεστημένων οξαζολονών οι οποίες δίνουν έμφαση στην πράσινη χημεία. Ο όρος αυτός υποδηλώνει τη χρήση μικροκυμάτων, τα οποία αντικαθιστούν τη συμβατική θέρμανση για την παροχή της απαιτούμενης για την πραγματοποίηση της αντίδρασης ενέργειας, καθώς και ετερογενών και ανακυκλώσιμων καταλυτών ή/και διαλυτών οι οποίοι μάλιστα αντικαθιστούν σε αρκετές περιπτώσεις τους συμβατικούς διαλύτες που πολλές φορές είναι ακριβοί και ρυπογόνοι. Αυτές οι πράσινες μέθοδοι πλεονεκτούν προσφέροντας καθαρότερα προϊόντα, υψηλότερη εκλεκτικότητα, απλούστερη εργασία και μικρότερους χρόνους αντιδράσεων. Στις παραλλαγές της αντίδρασης Erlenmeyer-Plochl, που δίνονται στη συνέχεια, ως καταλύτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν: 1) το οξικό ασβέστιο (σχήμα 17) [34], Σχήμα 17 Καταλυτική αύξηση ηλεκτρονιόφιλου κέντρου αρωματικών αλδεϋδών παρουσία Ca 2+ 2) το δωδεκαβόλφραμοφωσφορικό οξύ (H 3 PW 12 O 40 ), 3) το σαμάριο, 4) το ρουθήνιο [35], 5) το ιώδιο [36], 6) το [(C 14 H 24 N 4 ) 2 W 10 O 32 ]-[bmim]no 3 * (σχήμα 18) [37], 39

40 Σχήμα 18 Σύνθεση 4-αρυλιδενο-2-φαινυλ-5(4Η)-οξαζολονών ξεκινώντας από βενζυλική αλκοόλη με τη βοήθεια [(C 14 H 24 N 4 ) 2 W 10 O 32 ]-[bmim]no 3 καθώς και 7) αμφολυτικά ιμιδαζολινικά άλατα τα οποία σχηματίζουν εσωτερικά άλατα (zwitterionic salts) (σχήμα 19) [38]. Όλες οι παραπάνω αντιδράσεις πραγματοποιούνται με τη βοήθεια μικροκυμάτων και απουσία διαλύτη. Σχήμα 19 Προτεινόμενος μηχανισμός αντίδρασης με ιμιδαζολονικά εσωτερικά άλατα ως καταλύτες Υπάρχουν και παραλλαγές της Erlenmeyer-Plochl όπου η αντίδραση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου παρουσία οξειδίου ψευδαργύρου (ZnO) [39] ή [bmim]oh *[40] ως καταλύτες. Επίσης, ως καταλύτες σε ανάλογες αντιδράσεις, αλλά με θέρμανση στους 80 ο C, 80 ο C και 40 ο C, χρησιμοποιούνται οι ενώσεις [bmim] 3 PW 12 O 40, [bmim] 4 W 10 O 32 *[41] και Yb(OTf) 3 (τριφθορομεθανοσουλφονικό υττέρβιο)[42] αντίστοιχα. Παρόλ αυτά υπάρχουν και άλλες μέθοδοι παρασκευής οι οποίες δεν μπορούν να χαρακτηρισθούν ως μέθοδοι πράσινης χημείας. Τέτοια μέθοδος είναι εκείνη στην οποία το οξικό νάτριο της κλασικής Erlenmeyer-Plochl σύνθεσης αντικαθίσταται με το φθηνότερο φωσφορικό κάλιο [43]. *Το bmim (1-βούτυλο-3-μεθυλοϊμαδοζολινικό κατιόν) με ανιόντα σχηματίζει βασικές ιοντικές ενώσεις οι οποίες αποτελούν φιλικούς προς το περιβάλλον διαλύτες και καταλύτες, με υψηλή εκλεκτικότητα και δυνατότητα ανακύκλωσης. Έτσι χρησιμοποιούνται ώστε να αντικαταστήσουν στις αντιδράσεις τις παραδοσιακές βάσεις όπως KOH, NaOH, K 2 CO 3, NaHCO 3, NaOAc κτλ [44] Μέθοδοι παρασκευής οξαζολονικών παραγώγων με τεχνολογία υπερήχων Αρχικά θα ήταν σκόπιμο να αναφερθούν κάποια γενικά στοιχεία για τον τρόπο δράσης της τεχνολογίας των υπερήχων και το λόγο χρήσης της, στη σύνθεση νέων ενώσεων [45]. Η 40

41 αρχή λειτουργίας των υπερήχων στις χημικές αντιδράσεις σε διαλύματα βασίζεται σε ένα φυσικό φαινόμενο: στη δημιουργία ακουστικών κοιλοτήτων (acoustic cavitations). Το φαινόμενο αυτό αποτελεί μια διαδικασία κατά την οποία η έντονη μηχανική δραστηριότητα καταστρέφει τις ελκτικές δυνάμεις των μορίων σε υγρή φάση, με αποτέλεσμα αρχικά να έχουμε συμπίεση του υγρού ακολουθούμενη από εκτόνωση, κατά την διάρκεια της οποίας μία ξαφνική πτώση της πίεσης οδηγεί στο σχηματισμό μικρών, ταλαντευόμενων φυσαλίδων αέριας μάζας. Αυτές οι φυσαλίδες διαστέλλονται σε κάθε ώση της εφαρμοζόμενης υπερηχητικής ενέργειας μέχρις ότου το μέγεθός τους φτάσει σε ένα κρίσιμο ασταθές σημείο, από το οποίο και ύστερα μπορούν να συγκρουσθούν και/ή να καταρρεύσουν. Έχει υπολογισθεί ότι η πίεση σε μία φυσαλίδα μέσα στο νερό μπορεί να αυξηθεί πάνω από χίλιες ατμόσφαιρες, και η θερμοκρασία μπορεί να φτάσει σε μερικές χιλιάδες βαθμούς, καθώς δεν μπορεί να γίνει μεταβίβαση της θερμότητας με αποτέλεσμα την αδιαβατική θέρμανση (μεταβολή της θερμοκρασίας της αέριας μάζας, χωρίς ανταλλαγή θερμότητας με το περιβάλλον, η οποία συνοδεύεται από συμπίεση των υδρατμών). Συνεπώς, καθώς αυτές οι μικρές φυσαλίδες καταρρέουν βίαια, μπορούν να θεωρηθούν ως μικροαντιδραστήρες οι οποίοι παρέχουν την δυνατότητα επιτάχυνσης συγκεκριμένων αντιδράσεων καθώς και την δυνατότητα ανάπτυξης νέων μηχανισμών αντιδράσεων με απόλυτα ασφαλή τρόπο. Ο κύριος λόγος χρήσης αυτής της τεχνολογίας, αποδίδεται στην προσπάθεια εφαρμογής φιλικών προς το περιβάλλον τεχνολογιών οι οποίες θα ελαχιστοποιούν τη σπατάλη πρώτων υλών, τη χρήση ακριβών και ρυπογόνων αντιδραστηρίων και θα μειώνουν αισθητά την κατανάλωση ενέργειας. Οι υπέρηχοι αποτελούν μία τέτοια μέθοδο αφού επιταχύνουν και βελτιστοποιούν τις αντιδράσεις, ιδιαίτερα όσες συμπεριλαμβάνουν ενδιάμεσα ελευθέρων ριζών, αλλά επιτρέπουν και τη χρήση μη-ενεργοποιημένων, ακατέργαστων αντιδραστηρίων καθώς και υδατικών διαλυμάτων. Εφαρμογή της τεχνολογίας των υπερήχων έχουμε και στη σύνθεση των οξαζολονών με καταλύτη νανομόρια οξειδίου του σιδήρου (σχήμα 20). Η επίδραση των νανομορίων αυτών εντοπίζεται στην αύξηση του ηλεκτρονιόφιλου χαρακτήρα της αλδεΰδης κατά την πυρηνόφιλη προσβολή της. Σχήμα 20 Προτεινόμενος μηχανισμός σύνθεσης με καταλύτη νανομόρια οξειδίου του σιδήρου 1.8 ΣΥΝΘΕΤΙΚΕΣ ΠΟΡΕΙΕΣ ΒΕΝΖΑΜΙΔΙΩΝ ΜΕΣΩ ΟΞΑΖΟΛΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Οι 5(4Η)-οξαζολόνες είναι ετεροκυκλικές ενώσεις οι οποίες αποτελούν ευέλικτους δομικούς λίθους στην οργανική σύνθεση, καθώς διαθέτουν έναν αριθμό δομικών στοιχείων τα οποία επιτρέπουν μια σειρά από πιθανές μετατροπές. Το πρώτο ευπρόσβλητο σημείο είναι ο διπλός δεσμός C=O στον οξαζολονικό δακτύλιο, το δεύτερο ο διπλός δεσμός C=N εντός του δακτυλίου, και το τρίτο ο αρυλομεθυλενικός διπλός δεσμός C=C [46](εικόνα 17). Στις περισσότερες περιπτώσεις, όμως, τα πυρηνόφιλα αντιδραστήρια προσβάλουν τον C 5, δηλ. το καρβονυλικό C, ο οποίος παρουσιάζει έλλειψη ηλεκτρονίων, γεγονός το οποίο 41

42 οδηγεί σε ηλεκτρονιακή ανακατανομή με αποτέλεσμα την διάνοιξη του οξαζολονικού δακτυλίου και παραγωγή ακόρεστου προϊόντος με τουλάχιστον μία αμιδική αλυσίδα. Σε αυτές τις αντιδράσεις, ο χρόνος που απαιτείται για την διάνοιξη του δακτυλίου από το πυρηνόφιλο άτομο (π.χ άζωτο, οξυγόνο), εξαρτάται από την ισχύ του ατόμου ως πυρηνόφιλο και από την στερεοχημική παρεμπόδιση η οποία προκύπτει από τους υποκαταστάτες του άνθρακα που πρόσκεινται στην πυρηνόφιλη ομάδα. Από την άλλη πλευρά, όσον αφορά στην ηλεκτρονιακή πυκνότητα του C 5 Εικόνα 17 Σημεία προσβολής οξαζολονικού δακτυλίου των 4-(4-υποκατεστημένων-βενζυλιδενο)-2- φαινυλο-5-οξαζολονών, βρέθηκε ότι επηρεάζει την πορεία αυτών των αντιδράσεων, καθώς ομάδες δότες ηλεκτρονίων όπως για παράδειγμα η διμεθυλάμινο ομάδα στον φαινυλικό δακτύλιο της θέσης 4 της οξαζολόνης αυξάνει σημαντικά την ηλεκτρονιακή πυκνότητα του C 5 και συνεπώς το χρόνο αντίδρασης [47]! Η δυνατότητα πυρηνόφιλης προσβολής καθιστά τα οξαζολονικά παράγωγα εξαιρετικά υποστρώματα για κατευθυνόμενη σύνθεση όπως για παράδειγμα ενολο-οξικών παραγώγων [48], φαινυλο-πυρουβικών οξέων [49], βενζοξαζινικών παραγώγων [1], ιμιδαζολονών [50], αμινοξέων [51], τριαζινονών [52]. Το παρακάτω σχήμα (σχήμα 21) παρουσιάζει τις πυρηνόφιλες προσβολές αλκοολών και δευτεροταγών αμινών στον οξαζολονικό δακτύλιο προς σχηματισμό βενζαμιδίων, και οι οποίες θα μας απασχολήσουν εκτενέστερα στη συνέχεια. Σχήμα 21 Σύνθεση βενζαμιδίων μέσω οξαζολονών Άλλα βενζαμίδια μέσω οξαζολινικών παραγώγων Ωστόσο, όπως είναι φυσικό, οι οξαζολόνες αντιδρούν και με άλλα πυρηνόφιλα αντιδραστήρια δίνοντας βενζαμίδια. Παρακάτω θα γίνει μία αναφορά στα κυριότερα βενζαμιδικά μόνο παράγωγα τα οποία προκύπτουν από την πυρηνόφιλη προσβολή του οξαζολονικού δακτυλίου [1]. Συνεπώς, σύμφωνα με τους Carter και Stevens [53] κατεργασία οξαζολονών με καρβοξυλικά οξέα, ακόμη και απουσία νερού, οδηγεί στην δημιουργία βενζαμιδίου (σχήμα 22). 42

43 Σχήμα 22 Προσβολή με καρβοξυλικά οξέα Ακόμη μεγαλύτερο παρουσιάζει η επίδραση των πρωτοταγών αμινών στα οξαζολονικά παράγωγα με διάνοιξη αρχικά του δακτυλίου και παρασκευή βενζαμιδοαροϋλοακρυλικών οξέων, τα οποία στη συνέχεια επανακυκλοποιούνται σε ιμιδαζολόνες (σχήμα 23) [1]. Σχήμα 23 Προσβολή με πρωτοταγείς αρωματικές αμίνες Οι ακόρεστες οξαζολόνες μετατρέπονται στα αντίστοιχα διπεπτίδια με αλληλουχία δύο αντιδράσεων. Η πρώτη περιλαμβάνει την αντίδραση με εστέρα αμινοξέος προς παραγωγή βενζαμιδίου το οποίο στη συνέχεια υδρολύεται προς το τελικό διπεπτίδιο (σχήμα 24) [1]. Σχήμα 24 Προσβολή με εστέρα αμινοξέος Οι 4-αρυλομεθυλενο-2-φαινυλο-οξαζολ-5(4Η)-όνες αντιδρούν με υδραζίνες σε αλκοόλη και δίνουν υδραζίδια, τα οποία στη συνέχεια κυκλοποιούνται με θέρμανση σε συνθήκες επαναρροής διαλύματος με NaOH ώστε να δώσουν τριαζινονικά παράγωγα (σχήμα 25) [54]. Σχήμα 25 Κυκλοποίηση υδραζιδίου μετά από προσβολή με υδραζίνη Μία άλλη ενδιαφέρουσα περίπτωση προσβολής οξαζολονικού παραγώγου είναι με την ο- φαινυλενοδιαμίνη σε αιθανόλη από όπου προκύπτει βενζαμιδικό παράγωγο, το οποίο στη συνέχεια με θέρμανση παρουσία οξικού οξέος και οξικού νατρίου δίνει παράγωγο βενζιμιδαζολίου (σχήμα 26) [55]. 43

44 Σχήμα 26 Κυκλοποίηση προς παράγωγο βενζιμιδαζολίου Τέλος με την επίδραση διαζωμεθανίου σε μεθανόλη, έχουμε μετατροπή της 4- αρυλομεθυλενο-2-φαινυλο-οξαζολ-5(4η)-όνης σε βενζαμιδικό-ακρυλικό-μεθυλεστέρα (σχήμα 27) [56]. 1.9 ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΑ Ιστορικά στοιχεία Σχήμα 27 Προσβολή με διαζωμεθάνιο σε μεθανόλη Πραγματοποιώντας μια σύντομη ιστορική αναδρομή παρατηρούμαι ότι μόλις το 1855, την ίδια εποχή που ο Robert Bunsen εφηύρε τον ομώνυμο λύχνο, έγινε δυνατή η εστιασμένη παροχή θερμότητας στις αντιδράσεις. Στη συνέχεια ο λύχνος αντικαταστάθηκε από θερμαντικό μανδύα, ελαιόλουτρο και θερμαντική πλάκα. Πλέον η χρήση της τεχνολογίας των μικροκυμάτων ως πηγή θέρμανσης στην διεξαγωγή των αντιδράσεων κερδίζει όλο και περισσότερο έδαφος ανάμεσα στην επιστημονική κοινότητα. Η επιφυλακτική χρήση της τεχνολογίας στα τέλη της δεκαετίας του 80 και στις αρχές του 90, αποδόθηκε στην έλλειψη δυνατότητας ελέγχου της και επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων της, αλλά κυρίως στην αδυναμία κατανόησης της βασικής αρχής η οποία διέπει τη θέρμανση με μικροκύματα- της διηλεκτρικής θέρμανσης. Επίσης κίνδυνοι που αφορούσαν την αναφλεξιμότητα των οργανικών διαλυτών μαζί με την απουσία κατάλληλων συστημάτων για τον επαρκή έλεγχο της θερμοκρασίας και της πίεσης, αποτέλεσαν τροχοπέδη στην ανάπτυξη της μεθόδου αυτής [57]. Τι είναι τα μικροκύματα Τα μικροκύματα ανήκουν στο φάσμα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και κυμαίνονται σε εύρος συχνοτήτων από 300MHz έως 30GHz (μήκη κύματος m). Όλοι οι οικιακοί αλλά και οι εργαστηριακοί, για τη χημική σύνθεση, φούρνοι μικροκυμάτων λειτουργούν σε συχνότητα 2.45GHz (η οποία αντιστοιχεί σε μήκη κύματος 12.24cm) ώστε να αποφεύγεται η παρεμβολή στις συχνότητες τηλεπικοινωνιών και κινητών τηλεφώνων. Η ενέργεια του μικροκυματικού Εικόνα 18 Ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία φωτονίου σε αυτή την περιοχή συχνοτήτων (0.0016eV) είναι μικρότερη από την ενέργεια ενός χημικού δεσμού (ούτως ώστε να μην μπορεί να τον διασπάσει) αλλά και μικρότερη από την ενέργεια της κίνησης Brown (τυχαία 44

45 κίνηση στερεών σωματιδίων μέσα σε ένα υγρό ή αέριο). Συνεπώς γίνεται σαφές ότι τα μικροκύματα δεν μπορούν να επάγουν άμεσα χημικές αντιδράσεις. Εργαστηριακός φούρνος μικροκυμάτων Η καρδιά του εργαστηριακού φούρνου μικροκυμάτων είναι το μάγνητρο, δηλαδή ένας ταλαντωτής ο οποίος μετατρέπει έναν παλμό υψηλής τάσης σε μικροκύμα. Στη συνέχεια το παραχθέν μικροκύμα εισέρχεται σε ειδικό αγωγό, του οποίου τα ανακλαστικά τοιχώματα επιτρέπουν τη διέλευσή του μικροκύματος από το μάγνητρο στην κοιλότητα. Η κοιλότητα αποτελεί το μέρος του φούρνου όπου επιτυγχάνεται η αλληλεπίδραση της ακτινοβολίας με το χημικό σύστημα. Κάθε φούρνος είναι κατασκευασμένος ώστε να λειτουργεί σε προκαθορισμένη Εικόνα 19 Εργαστηριακός φούρνος μικροκυμάτων συχνότητα (όπως είδαμε στα 2.45 GHz), ενώ η παρεχόμενη ενέργεια (συνήθως 6-700Watts) καθορίζεται από μία μονάδα ελέγχου η οποία την εισάγει στην κοιλότητα ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Με αυτό τον τρόπο περίπου 43000cal εισάγονται στην κοιλότητα για κάθε 5 λεπτά ακτινοβόλησης. Ωστόσο, κατά την ακτινοβόληση με μικροκύματα προκύπτουν δύο προβλήματα: η ομοιομορφία της απορρόφησης και η ανακλαστικότητα των κυμάτων. Τα μικροκύματα, ταξιδεύοντας σε δέσμη, εξέρχονται του αγωγού και με τη βοήθεια ενός κυκλοφορητή εκτρέπονται στην κοιλότητα, της οποίας τα τοιχώματα με τη σειρά τους ανακλούν την δέσμη, έως ότου αυτή χτυπήσει στο δείγμα και απορροφηθεί. Παράλληλα με στόχο την αύξηση της αλληλεπίδρασης του κύματος με το δείγμα, δηλαδή την αύξηση της απορρόφησης, το τελευταίο τίθεται υπό ανάδευση. Τέλος, σε πολλές περιπτώσεις για την προστασία του μάγνητρου και του χειριστή του οργάνου από την ανακλόμενη ακτινοβολία, τοποθετείται εντός της κοιλότητας ένα δοχείο με νερό το οποίο δρα ως ψεύτικο δείγμα. Υπάρχουν τρεις κατηγορίες υλικών των οποίων ο διαχωρισμός οφείλεται στην διαφορετική συμπεριφορά κατά την έκθεση τους σε μικροκύματα. Συνεπώς, υπάρχουν υλικά τα οποία ανακλούν την ακτινοβολία (π.χ μέταλλα), υλικά τα οποία διαπερνά η ακτινοβολία χωρίς να απορροφηθεί (π.χ χαλαζίας) και, τέλος, υλικά τα οποία την απορροφούν σε διαφορετικό βαθμό το καθένα και γι αυτό είναι ικανά να προσφέρουν θερμότητα και να εκκινήσουν μία χημική αντίδραση (π.χ διηλεκτρικά) Θεωρία πραγματοποίησης αντιδράσεων στα μικροκύματα Ορισμός διηλεκτρικού υλικού Ως διηλεκτρικό ορίζεται εκείνο το υλικό το οποίο κατά την εφαρμογή εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου πολώνεται. Δηλαδή όταν ένα διηλεκτρικό τοποθετηθεί εντός ηλεκτρικού πεδίου έχουμε ελαφρά μετατόπιση των ηλεκτρικών φορτίων του από τις θέσεις ισορροπίας 45

46 τους, προκαλώντας το φαινόμενο της διηλεκτρικής πολωσιμότητας, εν αντιθέσει με τους αγωγούς διαμέσου των οποίων, στις ίδιες συνθήκες, παρατηρείται ελεύθερη ροή ηλεκτρικών φορτίων. Εξαιτίας του παραπάνω φαινομένου, τα θετικά ηλεκτρικά φορτία μετατοπίζονται σύμφωνα με την κατεύθυνση του πεδίου ενώ τα αρνητικά προς την αντίθετη, γεγονός το οποίο δημιουργεί ένα εσωτερικό ηλεκτρικό πεδίο που μειώνει την ένταση του εφαρμοζόμενου εξωτερικού πεδίου εντός του διηλεκτρικού. Στις περιπτώσεις κατά τις οποίες τα μόρια του διηλεκτρικού όχι μόνο πολώνονται, αλλά μπορούν να επαναπροσανατολίσουν τον άξονα συμμετρίας τους σύμφωνα με το πεδίο, θεωρούμε ότι το υλικό αυτό παρουσιάζει υψηλή πολωσιμότητα. Γενικότερα, η τελευταία ιδιότητα εκφράζεται μαθηματικά και ορίζεται ως σχετική αγωγιμότητα (ή καλύτερα ως διηλεκτρική σταθερά). Η μαθηματική της έκφραση είναι περίπλοκη και σύνθετη αφού συμμετέχουν και μιγαδικοί αριθμοί! Στην ουσία η διηλεκτρική σταθερά υποδηλώνει την ποσότητα της ηλεκτρικής ενέργειας την οποία μπορεί να αποθηκεύσει (με τη μορφή πολωσιμότητας) το κάθε διηλεκτρικό υλικό. Διηλεκτρική θέρμανση Όλο το οικοδόμημα της χρήσης των μικροκυμάτων για την παροχή θερμότητας στις χημικές αντιδράσεις στηρίζεται στη διαδικασία της μικροκυματικής διηλεκτρικής θέρμανσης των υλικών. Η διαδικασία αυτή βασίζεται στην ικανότητα ορισμένων υλικών (κυρίως αυτών που εμφανίζουν διπολική ροπή αλλά όχι μόνο) να απορροφούν την ενέργεια η οποία προσφέρεται από τα μικροκύματα και να την μετατρέπουν σε θερμότητα. Ας δούμε όμως πως πραγματοποιείται κάτι τέτοιο! Η ηλεκτρική συνιστώσα ενός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου προκαλεί θέρμανση μέσω δύο μηχανισμών: κυρίως με την διπολική πολωσιμότητα αλλά, δευτερευόντως, και με την ιοντική αγωγιμότητα. Όταν ένα δείγμα υποστεί ακτινοβόληση με μικροκύματα, τα δίπολα του θα ευθυγραμμιστούν με το ηλεκτρικό πεδίο (εικόνα 20). Καθώς, όμως, το εφαρμοζόμενο πεδίο ταλαντώνεται τα δίπολα προσπαθούν να επανευθυγραμμιστούν με το εναλλασσόμενο ηλεκτρικό πεδίο. Το γεγονός αυτό αποκαλείται διπολική περιστροφή ή διπολική πολωσιμότητα. Εικόνα 20 Τα δίπολα προσπαθούν να ευθυγραμμιστούν με το ταλαντευόμενο ηλεκτρικό πεδίο Τα περιστρεφόμενα μόρια απωθούν, έλκουν και συγκρούονται με άλλα μόρια (πάντα μέσω ηλεκτρικών δυνάμεων) διαχέοντας την ενέργεια σε παρακείμενα μόρια και άτομα του υλικού. Σε αυτήν την διαδικασία χάνεται ενέργεια με μορφή θερμότητας μέσω της μοριακής τριβής και της διηλεκτρικής απώλειας. Με αυτό τον τρόπο το ποσό της παραγόμενης θερμότητας είναι ευθέως ανάλογο με την ικανότητα των διπόλων του δείγματος να ευθυγραμμίζονται σε εφαρμοζόμενο πεδίο συγκεκριμένης συχνότητας. Αυτό σημαίνει ότι εάν τα δίπολα δεν διαθέτουν αρκετό χρόνο ώστε να ευθυγραμμιστούν, τότε το πεδίο παρουσιάζει υψηλή συχνότητα ταλάντωσης, ή, από την άλλη πλευρά, αν επαναπροσανατολίζονται πολύ γρήγορα με την αλλαγή φάσης του κύματος, τότε το πεδίο παρουσιάζει μικρή συχνότητα ταλάντωσης, και δεν παρατηρείται το φαινόμενο της διηλεκτρικής θέρμανσης. Γι αυτό το λόγω και η συχνότητα σε όλους τους φούρνους 46

47 μικροκυμάτων έχει οριστεί στα 2.45GHz, δηλαδή μεταξύ των δύο ακραίων καταστάσεων, ούτως ώστε τα δίπολα να έχουν μεν αρκετό χρόνο να περιστραφούν, αλλά να μην προλαβαίνουν δε να ακολουθήσουν επακριβώς την ταλάντωση του εφαρμοζόμενου πεδίου. Τέλος, όσον αφορά στην ιοντική αγωγιμότητα, τα ιόντα κινούνται ελεύθερα μέσα στο διάλυμα υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου, με αποτέλεσμα την σπατάλη ενέργειας λόγω αυξημένων συγκρούσεων, μετατρέποντας έτσι την κινητική ενέργεια σε θερμότητα. Ο ρόλος του διαλύτη Ο ρόλος ενός κατάλληλου διαλύτη σε μία αντίδραση με μικροκύματα είναι πιο ενεργός από το γεγονός ότι απλά διαλύει τα αντιδρώντα και τα προϊόντα, αφού η επιτάχυνση της αντίδρασης εξαρτάται από τις διηλεκτρικές ιδιότητες του εκάστοτε διαλύτη. Η ικανότητα μίας ειδικής ουσίας να μετατρέπει την ηλεκτρομαγνητική παρεχόμενη ενέργεια σε θερμότητα εκφράζεται με την εφαπτομένη της γωνίας απωλειών (δ) (συμβολίζεται ως tan δ), ονομάζεται παράγοντας απωλειών, και εξαρτάται από τη συχνότητα της ακτινοβολίας και τη θερμοκρασία περιβάλλοντος. Αυτό δεν αποτελεί ικανότητα του εκάστοτε υλικού, αλλά, αντίθετα, αδυναμία στο να αποθηκεύσει το σύνολο της παρεχόμενης ηλεκτρομαγνητικής ενέργειας με αυτή ακριβώς τη μορφή, με αποτέλεσμα να υπάρχει διαφυγή-απώλεια της με τη μορφή θερμότητας. Αυτό απλά σημαίνει ότι σε ιδανικές συνθήκες (π.χ σε ένα κύκλωμα πηνίου-πυκνωτή κατασκευασμένο από ιδανικά διηλεκτρικά υλικά) η εγκλωβιζόμενη ηλεκτρομαγνητική ενέργεια θα αλληλομετατρέπονταν αέναος από ηλεκτρική σε μαγνητική, και το αντίθετο, χωρίς θερμικές απώλειες! Συνεπώς στη θέρμανση με μικροκύματα εκμεταλλευόμαστε αυτή την αστοχία των διηλεκτρικών υλικών και την εκφράζουμε με την εξίσωση tan δ=e /e όπου το e συμβολίζει τον παράγοντα διηλεκτρικής απώλειας, ο οποίος είναι ενδεικτικός της αποτελεσματικότητας με την οποία η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία μετατρέπεται σε θερμότητα, και το e συμβολίζει τη διηλεκτρική σταθερά, η οποία, όπως είδαμε και παραπάνω, περιγράφει την ικανότητα των μορίων του διηλεκτρικού να πολώνονται εντός ηλεκτρικού πεδίου. Πίνακας 1 Παράγοντες απωλειών (tan δ) διαφόρων διαλυτών Διαλύτης tanδ Διαλύτης tanδ Αιθύλενο γλυκόλη Χλωροφόρμιο Αιθανόλη Ακετονιτρίλιο DMSO Οξικός αιθυλεστέρας Μεθανόλη Ακετόνη Οξικό οξύ Δίχλωρομεθάνιο Νερό τολουόλιο Γενικά, με βάση τον παράγοντα απωλειών τους, οι διαλύτες διακρίνονται σε υψηλής (tan δ>0.5), μέσης (tan δ ), και χαμηλής (tan δ<0.1) απορροφητικότητας στα μικροκύματα. Συνεπώς διαλύτες ικανοί να απορροφήσουν μικροκύματα (υψηλό tan δ) αυξάνουν τον ρυθμό αντίδρασης των διαλυμένων αντιδρώντων, ενώ άλλοι κοινοί διαλύτες οι οποίοι δεν παρουσιάζουν μόνιμη διπολική ροπή (πολύ μικρό tan δ ως μηδενικό) όπως τετραχλωράνθρακας, βενζόλιο, διοξάνιο κ.λ.π είναι ουσιαστικά διαπερατοί από τα μικροκύματα. Ωστόσο το σημαντικό είναι ότι ακόμα και διαλύτες με μικρό tan δ δεν αποκλείονται από τη χρήση τους στα μικροκύματα, καθώς σε περιπτώσεις όπου τα 47

48 αντιδρώντα/καταλύτες είναι πολικά μόρια τότε το μίγμα της αντίδρασης αποκτά τις κατάλληλες διηλεκτρικές ιδιότητες ώστε να αλληλεπιδράσει, και κατά συνέπεια να θερμανθεί ικανοποιητικά, με τα μικροκύματα. Επίσης, σε ανάλογες περιπτώσεις, μπορούμε να εκμεταλλευτούμε και το μηχανισμό ιοντικής αγωγιμότητας για τη θέρμανση με μικροκύματα, προσθέτοντας, στο κατά τα άλλα μικρής απορροφητικότητας μίγμα της αντίδρασης, ιοντικά υγρά! Τέλος ένα φαινόμενο το οποίο παρατηρείται στα μικροκύματα είναι η υπερθέρμανση του διαλύτη. Παρουσία των μικροκυμάτων βρέθηκε ότι κοινοί διαλύτες παρουσιάζουν μεγαλύτερα σημεία βρασμού από τα γνωστά. Έτσι για το νερό η διαφορά είναι περίπου 5 ο C, για τη μεθανόλη 19 ο C, ενώ για το τετραϋδροφουράνιο και το ακετονιτρίλιο η διαφορά φτάνει τους 36 ο C. Οι διαφορές αυτές αποδίδονται στον διαφορετικό τρόπο παροχής της ενέργειας. Στη συμβατική μέθοδο θέρμανσης η μεταφορά της θερμότητας από το ελαιόλουτρο στο περιεχόμενο του δοχείου επηρεάζεται από τις ατέλειες της παρεμβαλλόμενης γυάλινης επιφάνειας, η οποία και ενεργοποιεί το βρασμό με αποτέλεσμα ο διαλύτης να βράζει σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Με αυτή τη μέθοδο τα σημεία βρασμού των διαλυτών υποεκτιμούνται. Ωστόσο, στη μικροκυματική μέθοδο θέρμανσης δεν υπάρχει ενεργοποίηση του βρασμού, αφού ο διαλύτης ακτινοβολείται στο σύνολό του και έτσι στη μεταφορά ενέργειας δεν παρεμβάλλεται η επιφάνεια του δοχείου. Γι αυτό το λόγο πολλοί επιστήμονες θεωρούν ότι τα σημεία βρασμού των διαλυτών θα έπρεπε να καθορίζονται με αυτή τη μέθοδο, ώστε να λαμβάνονται υπόψιν μόνο οι πραγματικές διαμοριακές αλληλεπιδράσεις στην υγρή φάση Παραδείγματα αντιδράσεων Η αξία της χρήσης των μικροκυμάτων στην πραγματοποίηση χημικών αντιδράσεων εκτιμάται σε σύγκριση με το χρόνο που απαιτείται στη συμβατική μέθοδο για τη σύνθεση του ίδιου τελικού προϊόντος δεδομένης απόδοσης. Οι αντιδράσεις οι οποίες ευνοήθηκαν περισσότερο από την παρουσία των μικροκυμάτων είναι προφανώς αυτές οι οποίες πραγματοποιούνταν με χαμηλούς ρυθμούς υπό φυσιολογικές συνθήκες. Συμπεριλαμβάνονται ουσιαστικά πολλές κατηγορίες χημικών αντιδράσεων όπως αλκυλιώσεις, ηλεκτρονιόφιλες και πυρηνόφιλες αρωματικές υποκαταστάσεις, συμπυκνώσεις, κυκλοπροσθήκες, εστεροποιήσεις, μεταθέσεις, αναγωγές, ετεροκυκλική σύνθεση κλπ [58]. Παρακάτω δίνονται μερικά παραδείγματα όπου συγκρίνονται η συμβατική μέθοδος με αυτή των μικροκυμάτων [59]: Αντίδραση Diels-Alder Συμβατική Μικροκύματα Διαλύτης DMF DMF Θερμοκρασία αντίδρασης reflux (153 o C) o C (30psi) Απόδοση 67% 58% Χρόνος αντίδρασης 6 ώρες 20 λεπτά 48

49 Εστεροποίηση Fischer Συμβατική Μικροκύματα Διαλύτης MeOH MeOH Θερμοκρασία αντίδρασης reflux (65 o C) o C (70 psi) Απόδοση 80% 72% Χρόνος αντίδρασης 80 ώρες 4 ώρες Μετάθεση p-claisen Συμβατική Μικροκύματα Διαλύτης DMF DMF Θερμοκρασία αντίδρασης reflux (153 o C) o C (17 psi) Απόδοση 83% 91% Χρόνος αντίδρασης 4 μέρες 20 λεπτά Σύνθεση παραγώγων ινδολίου κατά Fischer (ετεροκυκλική σύνθεση) Συμβατική Μικροκύματα Διαλύτης CH 3 COOH CH 3 COOH Θερμοκρασία αντίδρασης reflux(118 o C) 118 o C (46 psi) Απόδοση 100% 100% Χρόνος αντίδρασης 15 λεπτά 2 λεπτά Αντίδραση Erlenmeyer-Ploch Συμβατική Μικροκύματα Διαλύτης Ac 2 O Ac 2 O Θερμοκρασία αντίδρασης reflux(90-95 o C) - Απόδοση 88% 98% Χρόνος αντίδρασης 15 λεπτά 3 λεπτά 49

50 1.9.3 Συμπεράσματα (πλεονεκτήματα-μειονεκτήματα) Το πιο σημαντικό συμπέρασμα το οποίο μπορεί να εξαχθεί μετά από τη μελέτη πολλών αντιδράσεων είναι ότι τα μικροκύματα ασκούν περισσότερο κινητικό παρά θερμοδυναμικό έλεγχο επί των πραγματοποιούμενων αντιδράσεων, κι αυτό γιατί είναι ακόμα αμφίβολο αν μπορούν στα μικροκύματα να πραγματοποιηθούν αντιδράσεις οι οποίες δεν λαμβάνουν χώρα υπό συμβατικές συνθήκες. Ωστόσο τα γνωστά πλεονεκτήματά της χρήσης των μικροκυμάτων ως πηγής θέρμανσης των αντιδράσεων πέραν από κάθε αμφιβολία είναι: 1) καθολική θέρμανση του μίγματος της αντίδρασης, χωρίς επαφή, (εικόνα 21) 2) υψηλός ρυθμός θέρμανσης, 3) καλή αλληλεπίδραση με πολλά διηλεκτρικά υλικά και φτωχή με μη σιδηρούχα μέταλλα και αέρια, 4) πράσινη πηγή θέρμανσης λόγω μειωμένης κατανάλωσης ενέργειας και 5) μειωμένες ανεπιθύμητες αντιδράσεις (παραπροϊόντα), με επακόλουθο αυξημένες αποδόσεις και αυξημένη επαναληψιμότητα. Η παρουσία των Εικόνα 21 Ανεστραμμένη βαθμίδωση θερμοκρασίας στα μικροκύματα σε σχέση με τη θέρμανση σε ελαιόλουτρο μετά από παροχή ενέργειας για 1 λεπτό. Στα μικροκύματα (αριστερά) η θερμοκρασία ανεβαίνει σε όλο τον όγκο του δ/τος ταυτόχρονα (καθολική θέρμανση, ενώ στο ελαιόλουτρο (δεξιά) θερμαίνεται πρώτα το τμήμα του δ/τος το οποίο είναι σε επαφή με το φιαλίδιο. μικροκυμάτων μειώνει τόσο πολύ τον χρόνο των αντιδράσεων, ώστε να υπολογίζεται ότι σε κάθε αύξηση της θερμοκρασίας κατά 10 ο C, ο ρυθμός πραγματοποίησης της αντίδρασης διπλασιάζεται υπακούοντας στην εξίσωση του Arrhenius Κ=Ae - Ea/RT. Επίσης μπορούν να πραγματοποιηθούν αντιδράσεις μεταξύ στερεών υλικών, δηλαδή απουσία διαλύτη, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως στεγνή χημεία (dry-chemistry). Από την άλλη πλευρά το μεγαλύτερο ερώτημα στη χρήση των μικροκυμάτων αποτελεί η ύπαρξη ή μη των μη-θερμικών επιδράσεων (nonthermal effects). Ιστορικά, ως μη θερμικές καλούνται οι επιδράσεις εκείνες κάτω από τις οποίες παράγονται διαφορετικά προϊόντα όταν μία αντίδραση πραγματοποιείται στα μικροκύματα, σε σχέση με αυτά τα οποία παράγονται όταν η ίδια αντίδραση πραγματοποιείται με συμβατική θέρμανση στην ίδια θερμοκρασία. Οι μη θερμικές επιδράσεις είναι αποτέλεσμα της απευθείας αλληλεπίδρασης του ηλεκτρικού πεδίου με ειδικά μόρια του μίγματος της αντίδρασης, ούτως ώστε να προκαλούνται είτε από την πτώση της ελεύθερης ενέργειας Gibbs (επίδραση στον προεκθετικό παράγοντα Α της εξίσωσης Arrhenius), μέσω της αποθήκευσης της μικροκυματικής ενέργειας ως ενέργεια δόνησης των μορίων ή των λειτουργικών τους ομάδων (ενθαλπία), ή από την πτώση της ενέργειας ενεργοποίησης των αντιδράσεων (επίδραση στον εκθετικό παράγοντα της εξίσωσης Arrhenius-εντροπία). Το παραπάνω ερώτημα μπορεί να μην είναι υπαρκτό, ωστόσο η πλήρης διαλεύκανση του μυστηρίου της ύπαρξης ή μη των μη-θερμικών επιδράσεων μπορεί να βοηθήσει ώστε να παραχθούν ακόμη καλύτερα αποτελέσματα στο μέλλον με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροκυμάτων! 50

51 2. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ-ΣΚΟΠΟΣ Οι οξαζολόνες αποτελούν μία σημαντική τάξη πενταμελών ετεροκυκλικών ενώσεων και παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών εφαρμογών. Επίσης, ως εσωτερικοί ανυδρίτες ακυλ-άμινο οξέων, είναι χρήσιμα ενδιάμεσα για τη σύνθεση διάφορων άλλων οργανικών μορίων, όπως αμινοξέων και βενζαμιδίων, τα οποία με τη σειρά τους παρουσιάζουν βιολογικές δράσεις [1]. Λαμβάνοντας υπόψη τη βιβλιογραφία και τις προκαταρκτικές μελέτες QSAR τις οποίες πραγματοποιήσαμε (τα αποτελέσματα των οποίων δίνονται στο επόμενο κεφάλαιο), προσανατολίσαμε το σχεδιασμό μας προς τη σύνθεση κατάλληλων 4-υποκατεστημένων-2- φαινυλοξαζολ-5(4η)-ονικών παραγώγων με στόχο την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντιμικροβιακή και αντιτυροσινασική δράση. Έτσι ως υποκαταστάτες επιλέχθηκαν οι φαινυλο, 1-ναφθυλο και 4-((4- βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο ομάδες, οι οποίες καλύπτουν επιθυμητό εύρος τιμών μοριακής διαθλασιμότητας (MR-πίνακας 10), αφού η MR φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά βιολογικές δράσεις οι οποίες μας ενδιαφέρουν (π.χ αναστολή της τυροσινάσης ή LOX). Επίσης από τους ετεροκυκλικούς αρωματικούς δακτυλίους επιλέξαμε τις 2-θειενυλο και 2-φουρυλο ομάδες οι οποίες διαθέτουν μικρή τιμή MR. Ειδικά για τη θειένυλο ομάδα η επιλογή έγινε ως ισοστερής της φαίνυλο, ώστε να προβούμε σε σύγκριση των βιολογικών τους αποτελεσμάτων. Γενικότερο στόχο αποτέλεσε η σύνθεση οξαζολονικών παραγώγων με μέτριες τιμές λιποφιλικότητας, παράμετρος σημαντική για την φαρμακοκινητική συμπεριφορά. Στη συνέχεια, όσον αφορά στη σύνθεση βενζαμιδικών παραγώγων για αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή, αντιφλεγμονώδη/αναλγητική και αντιπρωτεολυτική δράση, επιλέξαμε την προσβολή των αρχικών οξαζολονών με μορφολίνη, πιπεριδίνη και πιπεραζίνη. Ο αμιδικός δεσμός αποτελεί συνδετικό στοιχείο σε πολλά φαρμακομόρια και το σημείο δράσης πολλών ενζυμικών συστημάτων, κι έτσι τα αμιδικά παράγωγα μπορούν να αποτελέσουν αναστολείς διαφόρων ενζύμων και να εκδηλώσουν διάφορες βιολογικές δράσεις. Η επιλογή των παραπάνω τριών ομάδων έγινε, επειδή στη βιβλιογραφία αναφέρονται βενζαμίδια με πιπεριδίνη, μορφολίνη και πιπεραζίνη με γαστροπροστατευτική αντιφλεγμονώδη δράση [2] και βελτιωμένες φαρμακοκινητικές ιδιότητες [3]. Ειδικότερα η πιπεριδίνη απαντάται σε πολλά βασικά φάρμακα (εικόνα 22). 51

52 Εικόνα 22 Φάρμακα με πιπεριδίνη [4] Τα παράγωγα της μορφολίνης παρουσιάζουν δράση όπως αντικαταθλιπτική, ανορεξιογόνο, αντικαρκινική, αντιοξειδωτική, αντιβιοτική κ.α. Πιο συγκεκριμένα η μορφολίνη αποτελεί δομικό λίθο του αντιβιοτικού λινεζολίδη, του αντικαρκινικού γεφιτινίμπη και του αναλγητικού δεξτρομοραμίδιο. Τέλος, επιλογή της πιπεραζίνης, η οποία εμπεριέχεται σε αντικαταθλιπτικά, αντιισταμινικά κλπ, έγινε για να παραχθούν συμμετρικά βενζαμίδια τα οποία θα προσομοιάζουν στα διπλά βενζαμίδια της μελέτης QSAR που πραγματοποιήσαμε, με στόχο την αντιφλεγμονώδη δράση. Για τη σύνθεση των νέων ενώσεων, εφαρμόστηκαν γνωστές αλλά και τροποποιημένες αντιδράσεις και τεχνικές και καταβλήθηκε προσπάθεια να βρεθούν μέθοδοι απλές στην εφαρμογή αλλά και αποτελεσματικές στην απόδοση. Για την ταυτοποίηση των δομών, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι ενόργανης ανάλυσης, φασματοσκοπία IR, 1 H NMR, 13 C NMR, MS(ΕSI), στοιχειακή ανάλυση και χρωματογραφικές μέθοδοι. Η διερεύνηση της βιολογικής δράσης των νέων παραγώγων περιλαμβάνει in vitro και in vivo πειράματα. Τα πειράματα αυτά έχουν σαν σκοπό να αποδείξουν την ύπαρξη της βιολογικής δράσης για την οποία σχεδιάσθηκαν και συντέθηκαν. Επίσης θα βοηθήσουν στην εύρεση και διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης τους. Η πιθανή βιολογική δράση που μελετάται είναι η αντιφλεγμονώδης/αναλγητική, η αντιμικροβιακή, η αντιπρωτεολυτική, η αναστολή της λιποξυγονάσης, της τυροσινάσης και η αντιοξειδωτική με διάφορα πειραματικά πρωτόκολλα. Δύο πιπεραζινικά βενζαμίδια ελέγχονται in vivo για αντιφλεγμονώδη δράση, χρησιμοποιώντας σαν πρότυπο φλογιστικό την καρραγενίνη σε πειραματόζωα, και για αναλγητική δράση με το πρότυπο του οξικού οξέος. Tέλος, συσχετίζονται οι βιολογικές δράσεις που προσδιορίσαμε με επιλεγμένες φυσικοχημικές ιδιότητες με σκοπό τη συγκριτική τους μελέτη. Οι τιμές των φυσικοχημικών ιδιοτήτων υπολογίσθηκαν με τα προγράμματα C QSAR και Spartan v Μελετώνται οι δομικές σχέσεις που διέπουν τις βιολογικές δράσεις των νέων ενώσεων και γίνεται προσπάθεια διερεύνησης του μηχανισμού δράσης τους, ώστε να εξαχθούν χρήσιμα συμπεράσματα για τις αναγκαίες δομικές τροποποιήσεις για τη σύνθεση νέων μορίων. 52

53 Πίνακας 2 Δομές οξαζολονών και μορφολινικών/πιπεριδινικών/πιπεραζινικών βενζαμιδίων Ένωση Δομές Ένωση Δομές ΕΜΚ1α ΕΜΚ1 ΕΜΚ16α ΕΜΚ16 ΕΜΚ17α ΕΜΚ17 ΕΜΚ18α ΕΜΚ18 ΕΜΚ19α EMK17π ΕΜΚ1p 53

54 ΕΜΚ16p ΕΜΚ17p EMK18p EMK19p 54

55 3. ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Όργανα Για τον προσδιορισμό του σημείου τήξεως χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Mell Temp II (Laboratory Devices, Holliston, MA, USA) Τα φάσματα υπερύθρου (IR) καταγράφηκαν σε φασματοφωτόμετρο μονής δέσμης Perkin Elmer, FT-IR System SpectrumvBX Τα φάσματα υπεριώδους (UV) ελήφθησαν με φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης Perkin Elmer UV Vis Lambda 20 και Hitachi U 2001, χρησιμοποιώντας κυψελίδα πάχους 1 cm Τα φάσματα 1 H NMR και 13 C NMR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker AM 300 στα 300 και 75 MHz, αντίστοιχα, ενώ τα φάσματα NOESY σε φασματόμετρο Agilent 500/54 (Varian) στα 500MHz. Οι τιμές της χημικής μετατόπισης καταγράφηκαν σε μέρη ανά εκατομμύριο (δ), χρησιμοποιώντας τετραμεθυλοσιλάνιο (TMS) σαν εσωτερικό πρότυπο (δtms=0) και διαλύτη το δευτεριωμένο χλωροφόρμιο (CDCl 3 ) ή το DMSO, όποτε ήταν απαραίτητο. Τα φάσματα μάζας καταγράφηκαν με τη βοήθεια φασματοφωτόμετρου LC MS 2010 EV Shimadzu Οι στοιχειακές αναλύσεις των προϊόντων πραγματοποιήθηκαν με αυτόματο στοιχειακό αναλυτή Perkin Elmer 2400 Για την χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, κανονικής φάσης, χρησιμοποιήθηκαν πλάκες 5554 F254 Silica gel/ TLC cards, Merck και Fluka. Για την εμφάνιση των ουσιών χρησιμοποιήθηκε λάμπα UV ή θάλαμος ατμών I 2. Κατά την εκτέλεση προπαρασκευαστικής χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (PLC) χρησιμοποιήθηκαν πλάκες Silica gel 60 F254, 2 mm, Merck KGaA ΗΧ Για τις φαρμακοχημικές δοκιμασίες in vitro χρησιμοποιήθηκε θάλαμος επώασης BIOLine scientific Για την εκτέλεση των αντιδράσεων στα μικροκύματα χρησιμοποιήθηκε εργαστηριακός φούρνος μικροκυμάτων CEM, Discover system, Model No , Maq.Freq: 2455 MHz Διηθητικά χαρτιά 593 Rundfilter 50mm, Schleicher&Schuell (τύπου Whatman filter paper 3) Φελλοτρυπητήρι DIN 7200, 6mm, 7/32 Αποστειρωτήρας CERTOclav, Gruber&Kaja, A-4050 Traun,Austria, TypCVII/1600 Χημικά αντιδραστήρια Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν, προέρχονται από εμπορικές πηγές και ήταν μεγίστης καθαρότητας (Merck, Fluka, Alfa and Sigma Aldrich). Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας, ή της υψηλότερης ποιότητας που ήταν δυνατόν να βρεθεί στο εμπόριο ή προήλθαν από ανακύκλωση μέσω κλασματικής απόσταξης. Αντιδραστήρια για βιολογικές δοκιμασίες Λιποξυγονάση φυτικής προέλευσης (Σόγια) Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA) Άλας λινελαϊκού οξέος με νάτριο Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA) 55

56 1,1 διφαινυλ 2 πικρυλυδραζυλική ρίζα (DPPH), νορ διυδρογουαϊρετικό οξύ (NDGA), 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμίδιο 2,2 Azinobis 2 methyl propanimidamide (AAPH), τρολόξη από Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, (USA) Θρυψίνη (Παγκρεατοπρωτεάση) 200 Fip U/ g Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, (USA) Τυροσινάση από μανιτάρια Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA) Για τον προσδιορισμό της αντιφλεγμονώδους δράσης (in vivo) χρησιμοποιήθηκαν: ως φλογιστικό μέσο η καρραγενίνη τύπου Κ 100 (του εμπορίου) και ως πρότυπο σύγκρισης για την αντιφλεγμονώδη δράση χρησιμοποιήθηκε η ινδομεθακίνη (Sigma Chemical Co. St Louis, MΟ, USA) Ως χημικό ερέθισμα πρόκλησης πόνου χρησιμοποιείται υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 0,6% στα πειράματα in vivo για την μελέτη της αναλγητικής δράσης Στα αντιμικροβιακά πειράματα χρησιμοποιήθηκε μικρόβιο Ε. Coli από εξωτερικό ασθενή (μικρόβιο κοινότητας) το οποίο ταυτοποιήθηκε με EnteroPluri Test της Liofilchem Τα επιστρωμένα με θρεπτικό υλικό τρυβλία τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ήταν Mueller Hinton Agar, E & O Laboratories Limited και οι πρότυποι αντιμικροβιακοί δίσκοι ήταν Ceftriaxone, CRO 30μg, Liofilchem srl, Roseto, Italy Πειραματόζωα Κατά την in vivo μελέτη της αναλγητικής δράσης (χημικό ερέθισμα πρόκλησης πόνου: διάλυμα οξικού οξέος 0,6%) χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί επίμυες της αιμομικτικής σειράς Fischer 344 βάρους g. Κατά την in vivo μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης χρησιμοποιήθηκαν επίμυες της αιμομικτικής σειράς Fischer 344, τους οποίους διατηρούμε σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας (20 ± 2 οc), με τεχνητή φωτοπεριοδικότητα 12 ωρών. Οι επίμυες ζουν μέσα σε κλωβούς από plexiglass σε ομάδες των 5 7 ζώων. Έχουν ελεύθερη πρόσβαση σε τυποποιημένη ειδική τροφή για επίμυες (ζωοτροφή Rat Feed Extra και ΕΛΒΙΖ 40Κ) και σε νερό του δικτύου ύδρευσης. Ο χειρισμός των ζώων και η διεξαγωγή των πειραμάτων γίνεται σύμφωνα με το νόμο προστασίας πειραματόζωων (Ελληνική Δημοκρατία) και είναι δηλωμένα στην Κτηνιατρική Αρχή της Δημοκρατίας της Ελλάδος. Υπολογιστικά Προγράμματα Χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Clog P της Biobyte Corp USA για τον υπολογισμό της λιποφιλικότητας και το πρόγραμμα C QSAR Biobyte Corp. USA για την εξαγωγή ποσοτικών σχέσεων δομής δράσης Χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Spartan v στον υπολογισμό διαφόρων φυσικοχημικών παραμέτρων και στη διαμόρφωση της τρισδιάστατης μορφής των ενώσεων που εισήχθησαν στις μελέτες πρόσδεσης Autodock Vina v The Scripps Research Institute PyRx program, USA PyRx program UCSF Chimera software v Regents of the University of California, USA AnteChamber Python Parser interface (ACPYPE) tool J Image graphic design London (πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας εξαγωγή τιμών SFI) 56

57 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1 ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΔΟΜΗΣ-ΔΡΑΣΗΣ (2D-QSAR) Το QSAR στηρίζεται στην αρχή ότι οι διαφορές στις δομικές και φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων, οι οποίες μπορούν να υπολογιστούν πειραματικά, βρίσκονται σε αντιστοιχία με τις διαφορές τους σε βιολογικό επίπεδο και άρα υπάρχει μία σχέση που τις συνδέει. Στην πράξη λοιπόν, η μέθοδος αναγνωρίζει και περιγράφει σημαντικά δομικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των χημικών ενώσεων, τα οποία μπορούν να αξιολογηθούν και να χρησιμοποιηθούν για την ερμηνεία της βιολογικής δραστικότητας των ενώσεων αυτών. Η βιολογική δραστικότητα (ΒΔ) είναι όρος ο οποίος εξαρτάται από ποικίλες παραμέτρους, όπως η λιποφιλικότητα, οι ηλεκτρονιακές και οι στερεοχημικές αλληλεπιδράσεις. ΒΔ = [Σ (στερεοχημικές) + Σ (ηλεκτρονιακές) + Σ (υδρόφοβες)] παράμετροι όπου ως στερεοχημικές παράμετροι ορίζονται ο μοριακός όγκος, οι διατομικές επιδράσεις, η ακτίνα van der Waals κλπ, ως ηλεκτρονιακές η σταθερά ιονισμού και οι επιδράσεις λόγω συντονισμού, ενώ ως υδρόφοβες, ο συντελεστής κατανομής και η διαλυτότητα. Όσον αφορά στα στατιστικά στοιχεία που πρέπει να συνοδεύουν την ποσοτική σχέση, αυτά είναι [1]: N: ο αριθμός των δεδομένων ενώσεων R: ο συντελεστής συσχέτισης, πρέπει να τείνει στην μονάδα και λαμβάνει τιμές από -1 έως 1 R 2 : το ποσοστό των περιπτώσεων που ερμηνεύει η εξίσωση x100 S: η τυπική απόκλιση, πρέπει να τείνει στο μηδέν Q 2 : διασταυρωμένος συντελεστής, μέτρο της ικανότητας πρόβλεψης του προτύπου F-test: ορίζουν το επίπεδο εμπιστοσύνης σε σχέση παραμέτρων-ποσοτικής συσχέτισηςβαθμών ελευθερίας (συνήθως χρησιμοποιείται επίπεδο εμπιστοσύνης 95%) ( ), confidence limits/standard errors: συνοδεύουν τον συντελεστή κάθε παραμέτρου, οπωσδήποτε μικρότερα από το μισό της τιμής του συντελεστή. Για τις εξισώσεις που περιγράφονται παρακάτω, τηρήθηκαν όλες οι απαιτούμενες προϋποθέσεις για μία αξιόπιστη μελέτη QSAR, όπως αυτές αναφέρονται στη βιβλιογραφία [2]: Επαναλήψιμες και καλά κατανεμημένες τιμές μιας συγκεκριμένης βιολογικής δράσης Επιλογή των παραμέτρων (πειραματικών ή και θεωρητικών) για την ακριβή περιγραφή της δομής όλων των ενώσεων Στατιστική μέθοδος που επιτρέπει την αξιολόγηση μιας Ποσοτικής Σχέσης, ενός προτύπου QSAR Μέθοδος που επιτρέπει τον έλεγχο αξιοπιστίας του μοντέλου QSAR που προέκυψε Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) 5-4(Η)-Οξαζολονικών παραγώγων με ανοσοτροποποιητική ικανότητα [3] Ο έλεγχος του οξειδωτικού stress το οποίο προκαλείται από τη δράση των ουδετερόφιλων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν μέτρο έκφρασης της ανοσοτροποποιητικής ικανότητας των 5-4(Η)-οξαζολονικών παραγώγων. Οι ενώσεις μελετήθηκαν σε δόση 50μg/ml για την ικανότητα τους να 57

58 αναστέλλουν τη δημιουργία δραστικών μορφών οξυγόνου από τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα, μετά από διέγερσή με το φλογιστικό πολυσακχαρίτη ζυμοζάνη. Για το πείραμα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της χήμειο-φωταύγειας με τη χρήση λουμινόλης. Πίνακας 3 Οι δομές των ενώσεων που μελετήθηκαν από την άποψη του QSAR Ένωση R R 1 Ένωση R R Isobutyl 11 6 Πειραματικό μέρος Ένωση Log %(πειραματικό) Log %(υπολογιστικό) Δ(log πειραμ. - log υπολογ.) MR-R m MR-R m, p * * *

59 *τιμές που εξαιρέθηκαν από την εξαγωγή της εξίσωσης Η σχέση που προέκυψε από τα παραπάνω δεδομένα είναι η εξής: Log %=-2,081(±1,035) MR-R m + 1,074(±0,759) MR-R m, p + 1,277(±0,535) Ν=8 R=0,919 Q 2 =0,595 R 2 =0,845 S=0,271 F 2,5 =13,6 α=0,01 Παρακάτω δίνεται ο υπολογισμός του συντελεστή F (Fisher s statistic) ο οποίος υποδηλώνει τo επίπεδο εμπιστοσύνης μεταξύ της προκύπτουσας εξίσωσης, των παραμέτρων (Χ) και των βαθμών ελευθερίας (DF): F 2,5 =(DF/X) x [(SS 1 -SS 2 )/SS 2 ]=5/2 x (2,37-0,368)/0,368 = 13,6 Συγκρίνοντας το αποτέλεσμα αυτό με δεδομένα από κατάλληλους πίνακες φτάνουμε στο συμπέρασμα ότι το επίπεδο εμπιστοσύνης είναι 99% αφού α=0,01. Η απουσία της λιποφιλικότητας (R=0,436) στη σχέση υποδηλώνει ότι η συγκεκριμένη ιδιότητα δεν διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση της βιολογικής δράσης. Αντίθετα, ιδιαίτερα σημαντικές είναι οι στερεοχημικές ιδιότητες των υποκαταστατών στη m και p θέση του φαίνυλο-υποκαταστάτη R, εκφρασμένες με τη μορφή της μοριακής διαθλασιμότητας MR. Γενικά η μοριακή διαθλασιμότητα εκφράζει την πολωσιμότητα και σχετίζεται με τις δυνάμεις διασποράς. Η ανάλυση αποδεικνύει ότι η παράμετρος MR-R m αποτελεί τη σημαντικότερη φυσικοχημική ιδιότητα. Μειονέκτημα της συσχέτισης αποτελεί ο μικρός αριθμός των δεδομένων σε σχέση με τον αριθμό των παραμέτρων. Οι παράμετροι δεν φαίνεται να συσχετίζονται μεταξύ τους, αλλά ούτε με τη λιποφιλικότητα. MR-R m MR-R m, p CLOGP MR-R m MR-R m, p CLOGP Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) διβενζαμιδικών παραγώγων με αντιφλεγμονώδη δράση [4] Για τη μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο της επαγωγής οιδήματος άκρου ποδός επίμυα μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης. Η δόση για κάθε ένωση καθορίστηκε στα 100mg/Kg και οι μετρήσεις για την αναστολή του οιδήματος καταγράφηκαν 4 ώρες μετά τη χορήγηση του φλογιστικού. 59

60 Πίνακας 4 Οι δομές των ενώσεων που μελετήθηκαν από την άποψη του QSAR Ενώσεις Πειραματικό μέρος Ένωση Log %(πειραματικό) Log %(υπολογιστικό) Δ(log πειραμ. - log υπολογ.) CLogP

61 7* *τιμές που εξαιρέθηκαν από την εξαγωγή της εξίσωσης Συσχετίζοντας τα πειραματικά δεδομένα προέκυψε η παρακάτω σχέση: Log %=-0,064(±0,045) CLogP + 2,218(±0,334) Ν=6 R=0,891 Q 2 =0,578 R 2 =0,793 S=0,050 F 1,4 =14,8 α=0,05 από την οποία υποστηρίζεται ότι για την αντιφλεγμονώδη δράση των ενώσεων προαπαιτούμενη είναι η χαμηλή λιποφιλικότητα (αρνητική τιμή). Μόνο η υδροφιλικότητα φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο. Τα μόρια ασκούν λιπόφιλες αλληλεπιδράσεις από όλα τα σημεία υποκατάστασης Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) αρυλο-βινυλο-βενζαμιδικών παραγώγων με βάση την γαστροπροστατευτική αντιφλεγμονώδη δράση τους [5] Για τη μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο της επαγωγής οιδήματος άκρου ποδός επίμυα μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης, με δόση για κάθε ένωση 10mg/Kg. Πίνακας 5 Οι δομές των ενώσεων που μελετήθηκαν από την άποψη του QSAR Ένωση Ar R Ένωση Ar R

62 8 Πειραματικό μέρος Ένωση Log %(πειραματικό) Log %(υπολογιστικό) Δ(log πειραμ. - log υπολογ.) MgVol E s R * * * *τιμές που εξαιρέθηκαν από την εξαγωγή της εξίσωσης Η ανάλυση αποδεικνύει ότι η παράμετρος MgVol είναι η σημαντικότερη φυσικοχημική ιδιότητα και ότι οι στερεοχημικές επιδράσεις με τη μορφή του μοριακού όγκου των μορίων και της σταθεράς του Taft, Es για τον υποκαταστάτη R 1, φαίνονται να περιγράφουν καλύτερα το βιολογικό αποτέλεσμα. Η εξίσωση που προέκυψε από την ποσοτική μελέτη των παραπάνω δεδομένων είναι η εξής: Log %=-0,006(±0,002) MgVol - 0,261(±0,120) E s R 1 + 3,468(±0,665) Ν=12 R=0,924 Q 2 =0,683 R 2 =0,853 S=0,058 F 2,9 =25,84 α=0,01 Οι παράμετροι δεν αλληλοεπικαλύπτονται μεταξύ τους. Είναι σημαντική όμως η παρατήρηση ότι ενώ η λιποφιλικότητα ως CLogP δεν φαίνεται να είναι η πιο σημαντική παράμετρος για τη δράση (R=0,807), η συσχέτιση MgVol vs CLOGP=0,871 υποδηλώνει τον έμμεσο ρόλο της στη δράση. MgVol E s R 1 CLOGP MgVol - 0,335 0,871 E s R ,110 CLOGP

63 Επεξήγηση παραμέτρων Η σταθερά του Taft εκφράζει τις στερικές τοπικές ενδομοριακές επιδράσεις του μ- υποκαταστάτη του αρυλίου (Ar). Οι τιμές E s R 1 φέρουν αρνητικό πρόσημο και σχετίζονται πολύ καλά με την ακτίνα van der Waals των υποκαταστατών. Έτσι το αρνητικό πρόσημο του E s R 1 στην παραπάνω σχέση υποδηλώνει ότι μικρότερες τιμές E s υποκαταστάτη οδηγούν σε ισχυρότερη δράση Ποσοτική συσχέτιση (QSAR) 5-4(Η)-Οξαζολονικών παραγώγων με ικανότητα αναστολής της τυροσινάσης [6] Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε παλαιότερα στο εργαστήριό μας [7] και δίνονται τα αποτελέσματα και συμπεράσματα τα οποία εξήχθησαν. LOG1/IC 50 =0,304(±0,184) ClogP + 0,602(±0,359) MR-R 2 + 2,240(±1,629) Ν=12 R=0,821 Q 2 =0,399 R 2 =0,674 S=0,219 F 2,9 =4,359 α=0,05 Συμπεράσματα Από την προκύπτουσα σχέση είναι εμφανής ο θετικός ρόλος της λιποφιλικότητας στην αύξηση της αναστολής. Η παρουσία της μοριακής διαθλασιμότητας με το θετικό πρόσημο του συντελεστή του MR-R 2, σηματοδοτεί την ύπαρξη στερεοχημικών επιδράσεων. 4.2 ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΗ 5-LOX ΓΙΑ ΤΟ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟ ΝΕΩΝ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΙΚΩΝ ΒΕΝΖΑΜΙΔΙΩΝ (3D-QSAR) Επιλέχθηκε η λιποξυγονάση 5-LOX λόγω της εύκολης διαθεσιμότητας της και των ιδιαίτερων δομικών χαρακτηριστικών της. Για τις μελέτες πρόσδεσης της λιποξυγονάσης χρησιμοποήθηκε το μοντέλο 1RRH (λιποξυγονάση σόγιας) με τον προσδέτη 13S που διατίθεται από την Protein Data Bank (PDB) και φέρει μεταλλικό κατιονικό κέντρο με φορτίο q=+3. Οι παράμετροι Lennarde Jones για το πεδίο δυνάμεων του Fe(III) είναι σ vdw = e 01 nm και ε vdw = 2.092e 1 kj/mol. Για τις μελέτες σύνδεσης χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα PyRx και για την ανάλυση των αποτελεσμάτων το λογισμικο UCSF Chimera. Τα μόρια σχεδιάστηκαν και μετατράπηκαν στην τρισδιάστατη δομή τους, με ταυτόχρονη ελαχιστοποίηση της ενέργειάς τους, με τη βοήθεια του προγράμματος Spartan v Το εργαλείο AnteChamber Python Parser interface (ACPYPE) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των τυπολογιών των προσδετών και την παραμετροποίηση τους [8]. Οι προσομοιώσεις πρόσδεσης έγιναν με το λογισμικό Autodock Vina [9] και το πρόγραμμα AutoDockTools χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του αρχείου της μελέτης πρόσδεσης [10]. Οι πρωτεΐνες θεωρούνται άκαμπτες. Για όλους τους προσδέτες, οι απλοί δεσμοί θεωρούνται ως ενεργοί στροφικοί δεσμοί (torsional bonds). Το τελικό αποτέλεσμα της διαδικασίας είναι ένα σύνολο λύσεων, που κατατάσσονται σύμφωνα με τις τιμές λειτουργικής βαθμολόγησης (scoring function values), οι οποίες προσδιορίζονται από τις 3D συντεταγμένες των ατόμων τους και εκφράζονται ως pdb αρχείο. 63

64 Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης αναστολέων για τις ενώσεις με τα καλύτερα αποτελέσματα ενέργειας πρόσδεσης [ΕΜΚ18p-(Z) και ΕΜΚ17p-(Z)], χρησιμοποιήθηκαν για την περαιτέρω εικονική ανάλυση (virtual screening). Από τα δεδομένα επιλέγονται οι κρύσταλλοι 1RRH. Τα πιπεραζινικά παράγωγα, αφού συντέθηκαν, αξιολογήθηκαν ως προς τις βιολογικές τους δράσεις. Πίνακας 6 Ενέργειες πρόσδεσης στη 5-LOX Α/Α Ένωση Ενέργεια πρόσδεσης (KJ/mol) 1 ΕΜΚ18p-(Z) ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ16p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) ΕΜΚ19p-(Z) ΕΜΚ17-(Z) ΕΜΚ1-(Z) ΕΜΚ1-(E) ΕΜΚ17π-(Z) ΣΥΝΘΕΣΗ ΟΞΑΖΟΛΟΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Γενική μέθοδος Για την παρασκευή των οξαζολονών, αντιδρά εμπορικά διαθέσιμη γλυκίνη με βενζοϋλοχλωρίδιο για την παρασκευή της Ν- βενζοϋλογλυκίνης (ιππουρικό οξύ). 20mmol γλυκίνης προστίθενται και αναμιγνύονται με διάλυμα NaOH (40mmol NaOH σε 20ml Η 2 Ο). To μίγμα αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι πλήρους διάλυσης (20 λεπτά). Ακολουθεί στάγδην προσθήκη του βενζοϋλοχλωριδίου (20mmol) και θέρμανση στους 80 Ο C. Μετά το τέλος της προσθήκης η θέρμανση και η ανάδευση συνεχίζουν για 30 min. Το μίγμα ρίχνεται σε πάγο, προστίθεται HCl μέχρι ph=1 και το λευκό στερεό που προκύπτει εκπλύνεται με νερό, μέχρι τα απόνερα της έκπλυσης να μη δίνουν θετική αντίδραση για χλωριούχα. Στη συνέχεια 1mmol της Ν-βενζοϋλογλυκίνης και 1mmol πρόσφατα παραχθέντος άνυδρου οξικού νατρίου προστίθενται σε σφαιρική φιάλη όπου περιέχει 3mmol οξικού ανυδρίτη και 1mmol της κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης (σχήμα 28). Η φιάλη αρχικά τοποθετείται σε απ ευθείας επαφή με τη θερμαντική πλάκα ώστε να επιτευχθεί άμεση και αποτελεσματική τήξη των στερεών αντιδρώντων (σ.τ Ν- βενζοϋλογλυκίνης 187 ο C και οξικού νατρίου 324 ο C). Μετά από πέντε λεπτά και αφού το μίγμα υγροποιηθεί και ομογενοποιηθεί, η σφαιρική τοποθετείται σε ελαιόλουτρο με μέτρια συνεχή ανάδευση και θέρμανση. Δύο ώρες περίπου μετά από την έναρξη της θέρμανσης με επαναρροή, η Ν-βενζοϋλογλυκίνη φαίνεται να εξαντλείται (χρωματογραφικός έλεγχος με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 3:1) και η αντίδραση διακόπτεται. Αφού διαπιστωθεί το πέρας της αντίδρασης, η θέρμανση διακόπτεται, προστίθενται 5ml απόλυτης αιθανόλης και το μίγμα αφήνεται να ψυχθεί για ένα ολόκληρο βράδυ. Την επόμενη μέρα το προϊόν διηθείται και γίνονται δύο πλύσεις με 64

65 2x5ml παγωμένης απόλυτης αιθανόλης και 2x5ml ζεστού νερού. Η διαδικασία αυτή ακολουθείται για να απομακρυνθούν, με την μεν απόλυτη αιθανόλη το παραχθέν από την αντίδραση του οξικού ανυδρίτη με το νερό, οξικό οξύ (χαρακτηριστική οσμή στο πέρας της αντίδρασης) και με το δε νερό τα τυχόν υπόλοιπα οξικού νατρίου και ιππουρικού οξέος. Ωστόσο, κατά τις πλύσεις μικρή ποσότητα του προϊόντος μπορεί να διαφύγει στο διήθημα, γι αυτό η διήθηση επαναλαμβάνεται για να επιτύχουμε όσο το δυνατόν καλύτερη απόδοση. Η καθαρότητα του προϊόντος εξασφαλίζεται μέσω ανακρυστάλλωσης με μίγμα 95 ο αιθανόλης και νερού ή μόνο 95 ο αιθανόλης. Τελικά το ίζημα ξηραίνεται, προσδιορίζεται το σημείο τήξης του και επιβεβαιώνεται η δομή του φασματοσκοπικά (πίνακας 7) [11]. Σχήμα 28 Γενική σύνθεση οξαζολονικών παραγώγων Πίνακας 7 Οξαζολονικά παράγωγα που παρασκευάσθηκαν Α/Α Ένωση Δομές R f Σ.τ Α % 1 ΕΜΚ1α (βιβλιογρ. Σ.τ ) 67 2 ΕΜΚ1b (βιβλιογρ. Σ.τ ) 53 3 ΕΜΚ16α

66 4 ΕΜΚ17α (βιβλιογρ. Σ.τ 175) 66 5 ΕΜΚ18α (βιβλιογρ. Σ.τ ) 53 6 ΕΜΚ19α (βιβλιογρ. Σ.τ 175) 36 πετρελαϊκός αιθέρας/οξικό αιθυλεστέρας 6: Παρασκευή της (Z)-4-βενζυλιδενο-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ1α] Ακολουθήθηκε η γενική μέθοδος και από την διαδικασία παρήχθησαν 448mg καθαρής ουσίας (απόδοση 67%) ως κίτρινες βελόνες. Τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα ταυτίζονται με τα αναφερόμενα στη βιβλιογραφία [12]. Επιπλέον, με στόχο τη μείωση του χρόνου αντίδρασης ή/και την αύξηση της απόδοσης, μελετήσαμε την πορεία και την επιτυχία της αντίδρασης με την εφαρμογή των μικροκυμάτων (σχήμα 29). Έτσι στο κατάλληλο φιαλίδιο τοποθετήθηκαν 1,12mmol ιππουρικού οξέος, ισομοριακή ποσότητα βενζαλδεϋδης, 94mg πρόσφατα παραχθέντος άνυδρου οξικού νατρίου και 0,32ml οξικού ανυδρίτη. Οι συνθήκες ακτινοβόλησης ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=100 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά και μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης. Με το πέρας της αντίδρασης, το οποίο διαπιστώθηκε χρωματογραφικά, έγινε έγχυση 3ml απόλυτης αιθανόλης και το φιαλίδιο τοποθετήθηκε στο ψυγείο όλο το βράδυ. Την επόμενη μέρα, το διάλυμα διηθήθηκε, το ίζημα ξεπλύθηκε με 2x3ml παγωμένης απόλυτης αιθανόλης και 2x3ml βραστού νερού και τοποθετήθηκε στην αντλία κενού για ξήρανση. Από την παραπάνω διαδικασία παρήχθησαν 309mg καθαρής ουσίας (απόδοση 56%) ως κίτρινες βελόνες με σημείο τήξεως o C. Τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα ταυτίζονται με τα αναφερόμενα στη βιβλιογραφία [12]. Σχήμα 29 Σύνθεση ΕΜΚ1α με MW 66

67 IR (KBr) (cm -1 ): (αρωμ. C-Η), 1793, (C=Ο), (C=N), (C=C), , (αρωμ. C-C), , (C-O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): 7.26 (s, 1H, βινυλικό), (m, 3H, αρωμ.), 7.53 (t, 2H, αρωμ.), 7.62 (t, 1H, αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.) LC-MS %: (C 16 H 11 NO 2 ) [Μ+H] + = Παρασκευή της (Ε)-4-βενζυλιδενο-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ1b] Έγινε προσπάθεια ισομερίωσης ώστε από το Z-ισομερές να παραληφθεί το Ε-ανάλογο (σχήμα 30). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [13] υπάρχουν δύο τρόποι, όπου στον μεν πρώτο έχουμε συμπύκνωση της αρωματικής αλδεΰδης με το ιππουρικό οξύ με θέρμανση στους ο C παρουσία του PPA (πολυφωσφορικού οξέος), ενώ στον δε δεύτερο, ο οποίος και ακολουθήθηκε, χρησιμοποιείται η απ ευθείας θέρμανση του Ζ-ισομερούς με PPA υπό τις ίδιες συνθήκες. Έτσι στη συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε αναλογία 1:17 ΕΜΚ1α:PPA (0,1gr και 1.727gr αντίστοιχα), και το μίγμα θερμάνθηκε για 2 ώρες σε ελαιόλουτρο στους 95 ο C. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε με 35ml νερό υπό ανάδευση για μία ώρα (κίτρινο διάλυμα), διηθήθηκε και το ίζημα ξεπλύθηκε με 2x5ml παγωμένης απόλυτης αιθανόλης, θερμό νερό, απόλυτη αιθανόλη ξανά και τέλος 5ml εξάνιο. Παρελήφθησαν 53mg ΕΜΚ1b (Ε-ισομερές), με σημείο τήξης ο C. Τα φασματοσκοπικά δεδομένα αυτής της ένωσης δίνονται παρακάτω. Σχήμα 30 Ισομερίωση ΕΜΚ1α (Ζ-ισομερές) σε ΕΜΚ1b (Ε-ισομερές) IR (KBr) (cm -1 ): 3055 (αρωμ. C-Η), , (C=Ο), (C=N), (C=C), , (αρωμ. C-C), , (C-O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 4H, αρωμ.), 7.53 (s, 1H, βινυλικό), (m, 1H, αρωμ.), (m, 1H, αρωμ), (m, 4H, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: , , , , , , , , , , , , , , , Παρασκευή της (Z)-4-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)βενζυλιδενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)- όνης [ΕΜΚ16α] Σύμφωνα με τη γενική μέθοδο, παρήχθησαν 495mg καθαρής ουσίας (απόδοση 83%) ως έντονα κίτρινο ίζημα με τα παρακάτω φασματοσκοπικά δεδομένα: IR (KBr) (cm -1 ): (αρωμ. C-Η), (βινυλικό C-H), 1780, (C=Ο), (C=N), (C=C), (αρωμ. C-C), , (C-O) 67

68 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 2H, αλειφατικά), (m, 2H, αρωμ.), 7.21 (s, 1H, βινυλικό), 7.31 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.), 7.59 (t, 1H, αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 69.50, , , , , , , , , , LC-MS %: (C 23 H 16 BrNO 3 ) [M] + = 433, [M+H] + =434 (436), [M+Na] + = Παρασκευή του (Z)-2-βενζαμιδο-3-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)ακρυλικού αιθυλεστέρα [ΕΜΚ16e] Στην προσπάθεια ανακρυστάλλωσης του ΕΜΚ16α με σύστημα 95 ο αιθανόλης/νερού με αναλογία 2:1 και θέρμανση, προέκυψε ένα νέο προϊόν του οποίου η φασματοσκοπική εξέταση επιβεβαίωσε την διάνοιξη του οξαζολονικού δακτυλίου από την αιθανόλη (σχήμα 31) οδηγώντας στην ένωση ΕΜΚ16e με απόδοση 4%. Σχήμα 31 Σύνθεση ΕΜΚ16e IR (KBr) (cm -1 ): (Ν-Η), (C=O εστερικό), (ΝΗ-C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): 1.34 (t, 3H, εστερ.), 4.31 (q, 2H, J=6Hz, εστερικά), (m, 2H, αλειφατικά), 6.89 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 6H, αρωμ.+1η βινυλικό), (m, 1H, αρωμ.), 7.70 (s, 1H, Ν-Η), 7.87 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 45.72, 69.39, , , , , , , , , LC-MS %: (C 25 H 22 BrNO 4 ) [M-H] + =478 (480), [M+H] + =480 (482), [M+Na] + =502 (504), [M+K] + =518 (520) Παρασκευή της (Z)-2-φαινυλο-4-(θειεν-2-υλομεθυλενο)οξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ17α] Ακολουθώντας τη γενική μέθοδο, παρήχθησαν 213mg καθαρής ουσίας (απόδοση 37%) ως μουσταρδί ίζημα, με σημείο τήξης ο C [12]. Και για τη σύνθεση αυτής της γνωστής ένωσης δοκιμάσθηκε η χρήση μικροκυμάτων. Ακολουθώντας δύο τροποποιημένες πορείες, στην πρώτη περίπτωση προστέθηκαν στο φιαλίδιο 1,12mmol ιππουρικού οξέος, ισομοριακή ποσότητα θειενυλ-2-καρβαλδεΰδης, 0,448ml οξικού ανυδρίτη, αλλά αντί για το συνηθισμένο οξικό νάτριο προστέθηκαν 15mg μοριακού ιωδίου ως καταλύτη (5mol% I 2 ) [14]. Οι συνθήκες ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=90 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=20 λεπτά και μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης (σχήμα 32). Στη συνέχεια, μετά το πέρας της αντίδρασης, το οποίο προσδιορίστηκε με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό 68

69 αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 3:1, ακολουθήθηκε η ίδια κατεργασία με αυτή της γενικής μεθόδου. Παρήχθη προϊόν με σημείο τήξης ο C και με απόδοση 19%. Σχήμα 32 Σύνθεση ΕΜΚ17α με MW (μέθοδος 1) Στη δεύτερη περίπτωση, σε φιαλίδιο προστέθηκαν 1,12mmol ιππουρικού οξέος, ισομοριακή ποσότητα θειενυλ-2-καρβαλδεΰδης, 0,317ml οξικού ανυδρίτη και 92mg πρόσφατα παραχθέντος άνυδρου οξικού νατρίου. Οι συνθήκες ακτινοβόλησης ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=100 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά και μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης (σχήμα 33). Στη συνέχεια, μετά το πέρας της αντίδρασης, το οποίο προσδιορίστηκε με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 3:1, ακολουθήθηκε η ίδια κατεργασία με αυτή της γενικής μεθόδου. Παρήχθη προϊόν με σημείο τήξης ο C (βιβλιογραφικό 180 ο C) [15] και με απόδοση 66%. Σχήμα 33 Σύνθεση ΕΜΚ17α με MW (μέθοδος 2) IR (KBr) (cm -1 ): (αρωμ. C-Η), (βινυλικό C-H), , (C=Ο), (C=N), (C=C), , (αρωμ. C-C), , (C-O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 1H, θειένυλο), 7.49 (s, 1H, βινυλικό), (m, 2H, αρωμ.), (m, 1H, αρωμ.), (m, 1H, θειένυλο), 7.72 (d, 1H, J=6Hz, θειένυλο), 8.17 (d, 2H, J=6Hz, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: , , , , , , , , , , , , , , LC-MS %: (C 14 H 9 NO 2 S) [M+H] + =256, [M+H+HCOOH] + = Παρασκευή του (Z)-2-βενζαμιδο-3-(θειοφαιν-2-υλο)ακρυλικού αιθυλεστέρα [ΕΜΚ17e] Στην προσπάθεια ανακρυστάλλωσης του ΕΜΚ17α με 95 ο αιθανόλη και θέρμανση, προέκυψε ένα νέο προϊόν με R f =0,45 (σύστημα διαλυτών πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 3:1) και σημείο τήξης ο C, του οποίου η φασματοσκοπική εξέταση επιβεβαίωσε την διάνοιξη του οξαζολονικού δακτυλίου από την αιθανόλη (σχήμα 34) οδηγώντας στην ένωση ΕΜΚ17e με απόδοση 19%. 69

70 Σχήμα 34 Σύνθεση ΕΜΚ17e IR (KBr) (cm -1 ): (Ν-Η), (C=O εστερικό), (ΝΗ-C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): 1.33 (t, 3H, εστερικά), 4.30 (q, 2H, J=6Hz, εστερικά), 7.07 (dd, 1H, J 1 =3Hz, J 2 =3Hz, θειένυλο), 7.34 (d, 1H, J 1 =3Hz, θειένυλο), 7.39 (s, 1H, βινυλικό), 7.44 (d, 1H, J 2 =3Hz, θειένυλο), (m, 2H, αρωμ.), (m, 1H, αρωμ.), 7.86 (s, 1H, Ν-Η), 7.96 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.) Υπολογισθέντα % : (C 16 H 15 NO 3 S) C: 63.77, H: 5.02, N: 4.65 Ευρεθέντα % : C: 63.45, H: 5.15, N: 4.51 LC-MS %: (C 16 H 15 NO 3 S) [M-H] + =300, [M+H] + =302, [M+Νa] + =324, [M+K] + =340, [M+CH 3 OH+Na] + =356, [2M+Na] + = Παρασκευή της (Z)-4-(ναφθυλο-1-μεθυλενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ18α] Σύμφωνα με τη γενική μέθοδο παρήχθησαν 441mg καθαρής ουσίας (απόδοση 53%) ως πορτοκαλί ίζημα [16]. Για τη σύνθεση ακολουθήθηκε εναλλακτικά και η εφαρμογή μικροκυμάτων με ποσότητες 1.4mmol ιππουρικού οξέος, ισομοριακή ποσότητα 1-ναφθαλδεϋδης, 115mg πρόσφατα παραχθέντος άνυδρου οξικού νατρίου και 0,4ml οξικού ανυδρίτη. Οι συνθήκες ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=100 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά, μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης και η κατεργασία ήταν ίδια με αυτή της γενικής μεθόδου. Παρήχθη το επιθυμητό προϊόν όπως επιβεβαιώθηκε και φασματοσκοπικά. IR (KBr) (cm -1 ): (αρωμ. C-Η), , 1779 (C=Ο), (C=N), (C=C), , (C-O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 3H), (m, 3H), 7.93 (d, 1H, J=6Hz), 7.99 (d, 1H, J=6Hz), 8.16 (s, 1H, βινυλικό), (m, 2H), 8.34 (d, 1H, J=6Hz), 9.04 (d, 1H, J=6Hz) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: , , , , , , , , LC-MS %: (C 20 H 13 NO 2 ) [M+H] + =300, [M+Νa] + = 322, [M+K] + = 338, [M+CH 3 OH+Na] + = Παρασκευή της (Z)-4-(φουρυλ-2-μεθυλενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης [ΕΜΚ19α] Ακολουθήθηκε η γενική μέθοδος από την οποία παρήχθησαν 242mg καθαρής ουσίας (απόδοση 36%) ως καστανοκίτρινο ίζημα [17]. IR (KBr) (cm -1 ): (αρωμ. C-Η), (C=Ο), (C=N), (C=C), , (αρωμ. C-C), , (C-O) 70

71 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 1H, φούρυλο), 7.20 (s, 1H, βινυλικό), (m, 1Η, φούρυλο), (m, 2H, αρωμ.), (m, 1H, αρωμ.), (m, 1H, φούρυλο), (m, 2H, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: , , , , , , , LC-MS %: (C 14 H 9 NO 3 ) [M+H] + =240, [M+2CH 3 OH+Η] + = ΣΥΝΘΕΣΗ ΒΕΝΖΑΜΙΔΙΩΝ η Μέθοδος Ισομοριακές ποσότητες της αρόϋλο-υποκατεστημένης οξαζολόνης και της μορφολίνης/πιπεριδίνης προστίθενται σε σφαιρική με 5ml ξηρού τολουολίου (σχήμα 35) [18]. Ακολουθεί θέρμανση σε ελαιόλουτρο στους 120 ο C, με επαναρροή και συνεχή ανάδευση για περίπου δύο ώρες. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίζεται χρωματογραφικά με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3 και το μίγμα αφήνεται για ένα βράδυ υπό ψύξη ώστε να διευκολυνθεί ο σχηματισμός του ιζήματος. Στη συνέχεια διηθείται και γίνονται πλύσεις με HCL 0,5N και νερό. Η ανακρυστάλλωση γίνεται από αιθανόλη/dmf ώστε να παραχθούν καθαρότερα προϊόντα. Μετά από ξήρανση προσδιορίζεται το σημείο τήξης των νέων ενώσεων και η δομή τους επιβεβαιώνεται φασματοσκοπικά και με τη βοήθεια στοιχειακών αναλύσεων η Μέθοδος Η δεύτερη μέθοδος αποτελεί μία παραλλαγή της παραπάνω μεθόδου. Προστίθενται ισομοριακές ποσότητες της αροϋλο-υποκατεστημένης οξαζολόνης και της μορφολίνης/πιπεριδίνης σε 5ml ξηρού τολουολίου (σχήμα 35). Η σφαιρική θερμαίνεται απ ευθείας σε προθερμασμένη θερμαντική πλάκα ώστε τα αντιδρώντα να διαλυθούν και να ομογενοποιηθούν άμεσα. Ακολουθεί θέρμανση (120 ο C) με επαναρροή σε ελαιόλουτρο με ανάδευση για περίπου 1 ώρα και 30 λεπτά. Μετά το πέρας της αντίδρασης, το οποίο προσδιορίζεται χρωματογραφικά με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3, το προϊόν συμπυκνώνεται υπό κενό στα 2/3 του όγκου του και παραμένει υπό ψύξη για ένα ολόκληρο βράδυ. Στη συνέχεια διηθείται και γίνονται πλύσεις με πετρελαϊκό αιθέρα [19]. Τα τελικά προϊόντα ξηραίνονται, προσδιορίζονται τα σημεία τήξης τους και οι δομές τους επιβεβαιώνονται φασματοσκοπικά και με τη βοήθεια στοιχειακών αναλύσεων. Σχήμα 35 Γενική μέθοδος σύνθεσης βενζαμιδίων Πίνακας 8 Βενζαμίδια μορφολίνης/πιπεριδίνης Α/Α Ένωση Δομές R f Σ.τ Α % Μορφολινικά 71

72 1 ΕΜΚ1-(Z) ΕΜΚ1-(Ε) ΕΜΚ1-(Ζ/Ε) - 0.5, ΕΜΚ16-(Ε) ΕΜΚ16-(Ζ/Ε) - 0.4, ΕΜΚ17-(Ζ) ΕΜΚ18-(Ζ) ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) - 0.5, Πιπεριδινικά 9 EMK17π-(Z) EMK17π-(Z/Ε) - 0.7, πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3 72

73 Μορφολινικά βενζαμιδικά παράγωγα Παρασκευή του (Z)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-φαινυλοπροπ-1-εν-2-υλ)βενζαμιδίου [ΕΜΚ1-(Ζ)] Για την παρασκευή της παραπάνω ένωσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος 2 εξαιτίας αποτυχίας της μεθόδου 1. Το πέρας της αντίδρασης προσδιορίστηκε με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3 και η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας επιβεβαίωσε την ύπαρξη δύο ισομερών με R f =0,6 και R f =0,5. Ακολουθώντας την επεξεργασία της μεθόδου 2, μετά τη ξήρανση ζυγίστηκαν 94mg (απόδοση 65%) με σημείο τήξης ο C. Για τον διαχωρισμό των ισομερών πραγματοποιήθηκε προπαρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (PLC) με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3. Από την διαδικασία παρελήφθη το ημιστερεό ΕΜΚ1-(Ζ) με R f =0,5 σε πολύ μικρή ποσότητα, του οποίου η δομή επιβεβαιώθηκε φασματοσκοπικά. Για τη σύνθεση του ΕΜΚ1-(Ζ) με τη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας (συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=50w, θερμοκρασία=80 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης), ισομοριακές ποσότητες της EMK1α και της μορφολίνης διαλύθηκαν σε 2ml οξικού αιθυλεστέρα. Μετά το τέλος της αντίδρασης (χρωματογραφικός έλεγχος με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3), το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού και ακολούθησε ανακρυστάλλωση από 95 ο αιθανόλη/νερό. Έγιναν διήθηση, πλύσεις με πετρελαϊκού αιθέρα / HCl 0,5N και παρελήφθη το επιθυμητό προϊόν σε μορφή λευκού ιζήματος. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, μορφολίνυλο), 6.16 (s, 1H, βινυλικό), (m, 1H, αρωμ.), (m, 6H, αρωμ.), (m, 1H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), 8.05 (s, 1H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 65.67, 66.46, , , , , , , , , LC-MS %: (C 20 H 20 N 2 O 3 ) [M-H] + =335, [M+Νa] + =359, [M+CH 3 OH+Na] + = 391, [2M+Na] + = Παρασκευή του (Ε)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν-2-υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ1-(Ε)] Έγινε προσπάθεια σύνθεσης του ΕΜΚ1-(Ε) με τροποποίηση της μεθόδου 1. Σφαιρική φιάλη των 10ml, όπου προστέθηκαν 0,28mmol της ΕΜΚ1α, 24μl μορφολίνης και 4ml ξηρού τολουολίου, τoποθετήθηκε σε προθερμασμένη πλάκα και η θερμοκρασία ορίστηκε στους 123 ο C. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε μετά από 2 ώρες με χρωματογραφία λεπτής στιβάδος και σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3 με R f =0,6. Το περιεχόμενο της φιάλης συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού, στη συνέχεια προστέθηκε δίχλωρομεθάνιο/πετρελαϊκός αιθέρας και καταβυθίστηκε λευκό ίζημα, σε απόδοση 29%, το οποίο μελετήθηκε φασματοσκοπικά. Για τη σύνθεση του ΕΜΚ1-(Ε) χρησιμοποιήθηκαν μικροκύματα. Στο κατάλληλο φιαλίδιο προστέθηκαν 0,6mmol ΕΜΚ1α, 52μl μορφολίνης, 3ml ξηρού τολουολίου, 3 σταγόνες Et 3 N 73

74 και οι συνθήκες ακτινοβόλησης ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=100 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3. Το φιαλίδιο αφέθηκε να ψυχθεί με αποτέλεσμα την κατακρήμνιση λευκού ιζήματος. Ακολούθησε διήθηση και πλύσεις με 4x3ml πετρελαϊκού αιθέρα. Παρήχθη καθαρό προϊόν το οποίο ταυτοποιήθηκε φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): 3210(Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, μορφολίνυλο), 6.98 (s, 1H, βινυλικό), (m, 5H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), 7.55 (t, 1H,αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), 8.06 (s, 1H, N-H) LC-MS %: (C 20 H 20 N 2 O 3 ) [M-H] + =335, [M+Νa] + =359, [M+K] + =375, [M+CH 3 OH+Na] + = 391, [2M+Na] + = Παρασκευή του (E)-Ν-(1-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-μορφολινυλ-3- οξοπροπ-1-εν-2-υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ16-(Ε)] Χρησιμοποιήθηκε μία τροποποίηση της μεθόδου 1 με πρώτη ύλη την (Ε)-4-(4-((4- βρωμοβενζυλ)οξυ)βενζυλιδενο)-2-φαινυλοξαζολ-5(4η)-όνη (ΕΜΚ16b), η οποία είχε παλαιότερα παρασκευαστεί στο εργαστήριό μας. Μετά από 4 ώρες θέρμανσης διαπιστώθηκε χρωματογραφικά το τέλος της αντίδρασης (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3 και R f =0,5). Το περιεχόμενο της φιάλης συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού, και στη συνέχεια έγιναν πλύσεις με 3x10ml HCl 0,5N. Το παραχθέν προϊόν ανακρυσταλλώθηκε από 95 ο αιθανόλη και προέκυψε σε μικρή ποσότητα το ΕΜΚ16-(Ε), του οποίου η δομή εξακριβώθηκε και φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, μορφολίνυλο), (m, 2H, αλειφατικά), 6.88 (s, 1H, βινυλικό), (m, 2H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 3H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 65.75, 66.55, 69.30, , , , , , , Υπολογισθέντα % : (C 27 H 25 BrN 2 O 4 ) C: 62.20, H: 4.83, N: 5.37 Ευρεθέντα % : C: 62.04, H: 5.10, N: 5.25 LC-MS %: (C 27 H 25 BrN 2 O 4 ) [M-H] + =519 (521), [M+H] + =521 (523), [M+Na] + =543 (545), [M+K] + =559 (561) Παρασκευή του (Ζ/E)-Ν-(1-(4-((4-βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-μορφολινυλ-3- οξοπροπ-1-εν-2-υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ16-(Ζ/Ε)] Με τη χρήση της 2 ης μεθόδου παραλάβαμε μίγμα ισομερών (Ε/Ζ). Μετά από 4 ώρες θέρμανσης διαπιστώσαμε το τέλος της αντίδρασης χρωματογραφικά (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3 και R f =0,5, R f =0,4). Το περιεχόμενο της φιάλης 74

75 συμπυκνώθηκε κατά 2/3 και αφέθηκε να ψυχθεί για σχηματισμό ιζήματος. Ακολούθησε διήθηση και έγιναν πλύσεις με πετρελαϊκό αιθέρα. Η παρουσία μίγματος ισομερών επιβεβαιώθηκε φασματοσκοπικά. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια διαχωρισμού τους με προπαρασκευαστική χρωματογραφία (PLC) χρησιμοποιώντας σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3, αλλά χωρίς επιτυχία. 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 16H, μορφολίνυλο), (m, 4H, αλειφατικά), 6.03 (s, 2/3 H, βινυλικό-ζ ισομερούς), 6.72 (s, 1H, βινυλικό-ε ισομερούς), 6.78 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.), 6.90 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.), 7.10 (d, 2H, J=9Hz, αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.), (m, 5H, αρωμ.), (m, 7H, αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.), 8.22 (s, 1H, N- H), 8.33 (s, 1H, N-H) Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(θειενυλ-2-υλο)προπ-1-εν-2- υλο)βενζαμιδίου [(ΕΜΚ17-(Ζ)] Χρησιμοποιήθηκε μία τροποποίηση της μεθόδου 1 και έπειτα από 2 ώρες θέρμανσης, οπότε και προσδιορίστηκε το πέρας της αντίδρασης με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3, το περιεχόμενο συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού και έγιναν πλύσεις με 30ml HCl 0,5N και 2x10ml νερό. Το παραχθέν προϊόν ανακρυσταλλώθηκε από 95 ο αιθανόλη και ταυτοποιήθηκε φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, μορφολίνυλο), 6.43 (s, 1H, βινυλικό), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 3H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), 8.12 (s, 1H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 66.59, , , , , , , , , , , , , Υπολογισθέντα % : (C 18 H 18 N 2 O 3 S) C: 63.14, H: 5.30, N: 8.18 Ευρεθέντα % : C: 63.10, H: 5.57, N: 8.47 LC-MS %: (C 18 H 18 N 2 O 3 S) [M-H] + =341, [M+Na] + =365, [M+K] + =381, [2M+Na] + = Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(ναφθαλιν-1-υλ) προπ-1-εν-2-υλ) βενζαμίδιο [ΕΜΚ18-(Ζ)] Για τη σύνθεση του ΕΜΚ18-(Ζ) με τη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας (συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=50w, θερμοκρασία=80 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης), ισομοριακές ποσότητες της EMK18α και της μορφολίνης διαλύθηκαν σε 2ml οξικού αιθυλεστέρα. Μετά το τέλος της αντίδρασης (χρωματογραφικός έλεγχος με σύστημα διαλυτών πετρελαϊκό αιθέρα/οξικό αιθυλεστέρα 1:3), το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού και ακολούθησε ανακρυστάλλωση από 95 ο αιθανόλη/νερό. Έγιναν διήθηση και πλύσεις με πετρελαϊκό αιθέρα, ώστε να παρεληφθή το επιθυμητό προϊόν σε μορφή υπόλευκου ιζήματος. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 75

76 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, μορφολίνυλο), (m, 1H, βινυλικό), 7.33 (t, 2H), 7.45 (t, 1H), 7.50 (t, 1H), (m, 2H), (m, 3H), (m, 2H), (m, 1H), 8.09 (m, 1H, N-H) LC-MS %: (C 24 H 22 N 2 O 3 ) [M-H] + =385, [M+Na] + =409, [M+CH 3 OH+Na] + = 441, [2M+Na] + = Παρασκευή του (Ζ/Ε)-Ν-(3-μορφολινυλ-3-οξο-1-(ναφθαλιν-1-υλ) προπ-1-εν-2-υλ) βενζαμίδιο [ΕΜΚ18-(Ζ/Ε)] Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των μικροκυμάτων όπως και στη σύνθεση του ΕΜΚ1-(Ε), με συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=120 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=10 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3) και το φιαλίδιο αφέθηκε να ψυχθεί. Ακολούθησε διήθηση και πλύσεις με 4x3ml πετρελαϊκού αιθέρα, ανακρυστάλλωση από 95 ο αιθανόλη και ξήρανση. Το καθαρό προϊόν μελετήθηκε φασματοσκοπικά. 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 16H, μορφολίνυλο), 6.62 (s, 1/3 H, βινυλικό-ζ ισομερούς), (m, 3H), (m, 10H), 7.59 (s, 1H, βινυλικό-ε ισομερούς), 7.62 (d, 3H, J=5Hz), 7.78 (d, J = 10 Hz, 1H), (m, 3H), (m, 3H), (m, 1H, N-H), 8.04 (d, J = 10 Hz, 1H), 8.74 (s, 1H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 41.94, 47.02, 65.37, 65.70, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , Πιπεριδινικά βενζαμιδικά παράγωγα Παρασκευή του (Ζ)-Ν-(3-οξο-3-(πιπεριδιν-1-υλο)-1-(θειεν-2-υλο)προπ-1-εν-2 υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ17π-(Ζ)] Για τη σύνθεση αυτής της ένωσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος μικροκυμάτων. Στο φιαλίδιο προστέθηκαν 0,78mmol ΕΜΚ17α, 77,3μl μορφολίνης, 3,5ml ξηρού τολουολίου και οι συνθήκες ακτινοβόλησης ορίστηκαν ως εξής: ισχύς=300w, θερμοκρασία=100 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 8:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3) και το φιαλίδιο αφέθηκε υπό ψύξη. Ακολούθησε συμπύκνωση μέχρι ξηρού και ανακρυστάλλωση από 95 ο αιθανόλη. Παρήχθη λευκό κρυσταλλικό προϊόν που μελετήθηκε φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 6H, πιπεριδίνυλο), (m, 4H, πιπεριδίνυλο), 6.43 (s, 1H, βινυλικό), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), 7.37 (d, 1Η, J=6Hz, θειένυλο), (m, 2Η, αρωμ.), 7.54 (t, 1H, αρωμ.), 7.94 (d, 2H, J=6Hz, αρωμ.), 8.09 (s, 1H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 24.69, 25.59, , , , , , , , , , , LC-MS %: (C 19 H 20 N 2 O 2 S) [M+H] + =341, [M+Na] + =363, [M+K] + =379, [M+Na+MeOH] + =395, [2M+Na] + =703 76

77 Παρασκευή του (Ζ/Ε)-Ν-(3-οξο-3-(πιπεριδιν-1-υλο)-1-(θειεν-2-υλο)προπ-1-εν-2 υλο)βενζαμιδίου [ΕΜΚ17π-(Ζ/E)] Στο διήθημα της παραπάνω κατεργασίας προστέθηκε νερό που οδήγησε σε σχηματισμό ιζήματος. Το παρεληφθέν υποκίτρινο προϊόν ταυτοποιήθηκε φασματοσκοπικά ως μίγμα των (Ζ/Ε) ισομερών. 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 12H, πιπεριδίνυλο), (m, 2H, πιπεριδίνυλο), (m, 6H, πιπεριδίνυλο), 6.43 (s, 2/5 H, βινυλικό-z ισομερούς), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), (m, 1Η, θειένυλο), 7.19 (s, 1H, βινυλικό-ε ισομερούς), 7.23 (d, 1Η, J=3Hz, θειένυλο), (m, 4Η, αρωμ.+ θειένυλο), (m, 3H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 2H, αρωμ.), (m, 2H, N-H) Για τη σύνθεση των βενζαμιδίων πιπεραζίνης εφαρμόσθηκαν οι παραπάνω γενικοί μέθοδοι 1 και 2, με μόνη διαφορά ότι η στοιχειομετρική αναλογία της αροϋλο-υποκατεστημένης οξαζολόνης και της πιπεραζίνης διαμορφώθηκε σε 1 προς 2. Έτσι, συντέθηκαν διπλά βενζαμίδια (σχήμα 36) γεγονός το οποίο επιβεβαιώνεται από τα φασματοσκοπικά δεδομένα των ενώσεων αυτών. Σχήμα 36 Σύνθεση διπλών βενζαμιδίων πιπεραζίνης Πίνακας 9 Βενζαμίδια πιπεραζίνης Α/Α Ένωση Δομές Rf Σ.τ Πιπεραζινικά Α % 1 ΕΜΚ1p-(Ζ) ΕΜΚ1p-(E)

78 3 ΕΜΚ16p-(Ζ) ΕΜΚ17p-(Ζ) ΕΜΚ18p-(Ζ) ΕΜΚ19p-(Ζ) πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:2 & θάλαμος ιωδίου Παρασκευή του N,N -((1Z, 1Z )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν- 3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ1p-(Z)] Εφαρμόζοντας τη γενική μέθοδο 2, έπειτα από 1 ώρα και 15 λεπτά, προσδιορίστηκε το πέρας της αντίδρασης χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 9:1). Ακολούθησε συμπύκνωση κατά 2/3 του όγκου, ψύξη, διήθηση και πλύσεις με πετρελαϊκό αιθέρα. Μετά από διαδοχικές πλύσεις με αιθανόλη παραλήφθηκε καθαρό προϊόν σε απόδοση 12%, του οποίου η δομή επιβεβαιώθηκε φασματοσκοπικά. Κατά την τροποποίηση της αντίδρασης [20], μετά από αντικατάσταση του τολουολίου με ίση ποσότητα αιθανόλης και 74 ώρες ανάδευση, προσδιορίστηκε το τέλος της αντίδρασης χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 9:1)(σχήμα 37). Ακολούθησε συμπύκνωση για την απομάκρυνση της αιθανόλης, προστέθηκε αιθέρας και έγινε διήθηση για να παραληφθεί το ίζημα. Η φασματοσκοπική εξέταση έδειξε παρουσία του επιθυμητού προϊόντος σε μικρή ποσότητα (19mg). 78

79 Σχήμα 37 Σύνθεση ΕΜΚ1p-(Z) με ανάδευση Εφαρμογή μικροκυμάτων (σχήμα 38) με συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=130 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=10 λεπτά και μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης, οδήγησαν στο επιθυμητό λευκό προϊόν, το οποίο παρελήφθη με διήθηση και πλύσεις με 4x3ml πετρελαϊκού αιθέρα και 2x4ml HCl 0,5N. Σχήμα 38 Σύνθεση ΕΜΚ1p-(Ζ) με μικροκύματα IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, πιπεραζίνυλο), 6.20 (s, 2H, βινυλικά), (m, 2H), (m, 12H), (m, 2H), (m, 4H), 8.19 (s, 2H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 43.79, , , , , , , , , , , , Υπολογισθέντα % : (C 36 H 32 N 4 O 4 ) C: 73.95, H: 5.52, N: 9.58 Ευρεθέντα % : C: 73.74, H: 5.24, N: 9.31 LC-MS %: (C 36 H 32 N 4 O 4 ) [M-H] + =583, [M+H] + =585, [M+Na] + =607, [M+K] + = Παρασκευή του N,N -((1E, 1E )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(3-οξο-1-φαινυλπροπ-1-εν- 3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ1p-(E)] Εφαρμόσθηκε η μέθοδος 1. Μετά από 3 ώρες, διαπιστώθηκε η εξάντληση του ΕΜΚ1b χρωματογραφικά (δίχλωρομεθάνιο/αιθανόλη 9:1) και ο σχηματισμός λευκού ιζήματος. Το μίγμα αφέθηκε να ψυχθεί, διηθήθηκε και έγιναν πλύσεις με 3x10ml HCl 0,5N και 2x10ml νερό. Παρακάτω δίνονται τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα της ένωσης. Η αντίδραση επαναλήφθηκε στα μικροκύματα με συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=110 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=10 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης. Το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 9,5:0,5 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3) και το φιαλίδιο αφέθηκε να ψυχθεί. Ακολούθησε διήθηση, πλύσεις με 4x3ml πετρελαϊκού αιθέρα και 3x3ml HCl 0,5N, και τελικά ανακρυστάλλωση από DMF:95 ο αιθανόλη 1:1 (απόδοση 10%). 79

80 Σχήμα 39 Σύνθεση ΕΜΚ1p-(Ε) με μικροκύματα 1 H-NMR (DMSO), δ (ppm): 3.14 (m, 8H, πιπεραζίνυλ), (m, 2H, βινυλικά), (m, 10H), (m, 6H), (m, 4H), (m, 2H, N-H) Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(1-(4-((4- βρωμοβενζυλ)οξυ)φαινυλο)-3-οξοπροπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ16p-(Ζ)] Εφαρμόζοντας τη γενική μέθοδο 2, η αντίδραση ολοκληρώθηκε μετά από 4 ώρες (δίχλωρομεθάνιο/μεθανόλη 9:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3). Το περιεχόμενο συμπυκνώθηκε κατά 2/3 του όγκου και ψύχθηκε. Ακολούθησε διήθηση, πλύσεις με 3x5ml απόλυτης αιθανόλης και παραλαβή καθαρού προϊόντος, όπως επιβεβαιώνεται φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (DMSO), δ (ppm): (m, 8H, πιπεραζίνυλο), (m, 4H), (m, 2H, βινυλικά), (m, 4H), (m, 4H), (m, 4H), (m, 4H), (m, 6H), (m, 4H), 8.12 (s, 1H, N-H), (m, 1H, N-H) Υπολογισθέντα % : (C 50 H 42 Br 2 N 4 O 6 ) C: 62.90, H: 4.43, N: 5.87 Ευρεθέντα % : C: 62.87, H: 4.56, N: 5.73 LC-MS %: (C 50 H 42 Br 2 N 4 O 6 ) [M-H] + =953, [M+Na] + =977, [M+Κ] + = Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(3-οξο-1-(θειεν-2-υλο)προπ-1- εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ17p-(Ζ)] Εφαρμόσθηκε η γενική μέθοδος 1. Μετά από 2 ώρες και 15 λεπτά, οπότε και διαπιστώθηκε η εξάντληση του ΕΜΚ17α χρωματογραφικά (αιθανόλη/dmf 9:1 και οξικός αιθυλεστέρας/τολουόλιο 1:1), διακόπηκε η θέρμανση και η φιάλη αφέθηκε υπό ψύξη. Ακολούθησε διήθηση, πλύσεις με 2x10ml HCl 0,5N και 2x10ml νερό, ανακρυστάλλωση από DMF/95 ο αιθανόλη 1:3 (απόδοση 14%). Μετά την εφαρμογή μικροκυμάτων [21], με ποσότητες 0,47mmol ΕΜΚ17α, 40mg πιπεραζίνης και 1ml αιθύλενο γλυκόλης, και συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=120 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=5 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης, το τέλος της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 9:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 7:3). Το περιεχόμενο εγχύθηκε σε 10ml παγωμένου νερού, διηθήθηκε και ανακρυσταλλώθηκε από DMF/95 ο αιθανόλη. 80

81 Σχήμα 40 Σύνθεση ΕΜΚ17p στα μικροκύματα με αιθύλενο γλυκόλη Επανάληψη της αντίδρασης στα μικροκύματα με συνθήκες: ισχύς=300w, θερμοκρασία=110 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=15 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης, με διήθηση και πλύσεις με 3x5ml παγωμένης απόλυτης αιθανόλης, έδωσε το επιθυμητό προϊόν το οποίο ανακρυσταλλώθηκε από DMF/95 ο αιθανόλη 1:2,5. Σχήμα 41 Σύνθεση ΕΜΚ17p με μικροκύματα IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, πιπεραζίνυλο), 6.49 (s, 2H, βινυλικά), (m, 2Η, θειένυλο), (m, 2Η, θειένυλο), (m, 2Η, θειένυλο), (m, 4H, αρωμ.), (m, 2H,αρωμ.), (m, 4H, αρωμ.), 8.22 (s, 2H, N-H) Υπολογισθέντα % : (C 32 H 28 N 4 O 4 S 2 ) C: 64.41, H: 4.73, N: 9.39 Ευρεθέντα % : C: 64.90, H: 4.71, N: 9.02 LC-MS %: (C 32 H 28 N 4 O 4 S 2 ) [M-H] + =595, [M+H] + =597, [M+Na] + =619, [M+Κ] + = Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(1-(ναφθ-1-υλο)-3-οξοπροπ- 1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ18p-(Ζ)] Εφαρμόσθηκε η γενική μέθοδος 2. Μετά από 2 ώρες, οπότε και διαπιστώθηκε η εξάντληση του ΕΜΚ18α χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 8:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3), το περιεχόμενο συμπυκνώθηκε κατά 2/3 του όγκου και η φιάλη αφέθηκε να ψυχθεί. Ακολούθησε διήθηση και πλύσεις με 3x5ml παγωμένης απόλυτης αιθανόλης. Τελικά το προϊόν ανακρυσταλλώθηκε από 95 ο αιθανόλη (απόδοση 10%). Έγινε προσπάθεια σύνθεσης της ένωσης με τη βοήθεια μικροκυμάτων σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [21] (0,67mmol ΕΜΚ18α, 57mg πιπεραζίνης και 1ml αιθύλενο γλυκόλης) συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=120 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=5 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης (σχήμα 42). Μετά το πέρας της 81

82 αντίδρασης, το οποίο προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 7:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 7:3), το περιεχόμενο εγχύθηκε σε παγωμένο νερό με εμφάνιση λευκών σφαιριδίων. Ακολούθησε διήθηση και ξήρανση. Το ίζημα παραμένοντας μετατράπηκε σε πορτοκαλί κολλώδη μάζα. Επαναλήφθηκε η κατεργασία με ψυχρό νερό και έγινε ανακρυστάλλωση από 95 ο αιθανόλη. Σχήμα 42 Σύνθεση ΕΜΚ18p στα μικροκύματα με αιθύλενο γλυκόλη Επαναλαμβάνεται η αντίδραση με χρήση μικροκυμάτων (0,6mmol ΕΜΚ18α, 25,8mg πιπεραζίνης, 3 σταγόνες τριαιθυλαμίνης (Et 3 Ν) και 4ml ξηρού τολουολίου) και συνθήκες ακτινοβόλησης: ισχύς=300w, θερμοκρασία=110 ο C, πίεση=100psi, χρόνος αντίδρασης=20 λεπτά με μέγιστη ταχύτητα ανάδευσης (σχήμα 43). Το πέρας της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρωματογραφικά (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 8:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 1:3). Το φιαλίδιο αφέθηκε να ψυχθεί, και ακολούθησαν διήθηση και πλύσεις με 2x4ml HCl 0,5N και πετρελαϊκό αιθέρα. Τελικά απομονώθηκε απ ευθείας καθαρό προϊόν υποκίτρινου χρώματος. Σχήμα 43 Σύνθεση ΕΜΚ18p με μικροκύματα IR (Nujol) (cm -1 ): 3210 (Ν-Η), (ευρεία, C=O), C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, πιπεραζίνυλο), 6.68 (s, 2H, βινυλικά), (m, 4H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 4H), (m, 6H), (m, 6H), (m, 2H, N-H) LC-MS %: (C 44 H 36 N 4 O 4 ) [M-H] + =683, [M+Na] + =707, [M+Κ] + = Παρασκευή του N,N -((1Ζ, 1Ζ )-πιπεραζιν-1,4-διυλ-δις(1-(φουραν-2-υλο)-3- οξοπροπ-1-εν-3,2-διυλο))διβενζαμιδίου [ΕΜΚ19p-(Ζ)] Εφαρμόσθηκε η γενική μέθοδος 2. Έπειτα από 2 ώρες, οπότε και προσδιορίστηκε το πέρας της αντίδρασης (χλωροφόρμιο/μεθανόλη 9:1 και πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας 82

83 1:3), το περιεχόμενο συμπυκνώθηκε κατά 2/3 του όγκου, αφέθηκε να ψυχθεί, διηθήθηκε και έγιναν πλύσεις με 3x5ml απόλυτης αιθανόλης και με πετρελαϊκό αιθέρα με αποτέλεσμα την παραγωγή γκρι χρώματος καθαρού προϊόντος, όπως επιβεβαιώνεται φασματοσκοπικά. IR (Nujol) (cm -1 ): (Ν-Η), (ΝΗ-C=O), (C=O), (C=C), (κάμψης, Η-Ν-C=O) 1 H-NMR (CDCl 3 ), δ (ppm): (m, 8H, πιπεραζίνυλο), 5.83 (s, 2H, βινυλικά), (m, 2H, φούρυλο), (m, 2H, φούρυλο), (m, 8Η, αρωμ. και φούρυλο), (m, 4H, αρωμ.), (m, 2H, N-H) 13 C-NMR (CDCl 3 ), δ: 41.39, 47.00, 103.1, , , , , , , , , , , , Υπολογισθέντα % : (C 32 H 28 N 4 O 6 ) C: 68.07, H: 5.00, N: 9.92 Ευρεθέντα % : C: 68.26, H: 5.07, N: LC-MS %: (C 32 H 28 N 4 O 6 ) [M-H] + =563, [M+Na] + =587, [M+K] + = ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ Με το πρόγραμμα C QSAR της Biobyte υπολογίστηκαν θεωρητικά οι τιμές της λιποφιλικότητας ClogP, η ολική μοριακή διαθλασιμότητα των μορίων CMR, καθώς και η μοριακή διαθλασιμότητα του αρυλίου (Ar) MR Ar [22]. Σχήμα 44 Απεικόνιση των δομών του αρυλίου (Ar) Σύμφωνα με τον ορισμό κατά IUPAC η λιποφιλικότητα εκφράζει την συγγένεια ενός μορίου ή τμήματος μορίου ως προς ένα λιπόφιλο περιβάλλον. Ο όρος ClogP αποτελεί το θεωρητικά υπολογισμένο συντελεστή κατανομής σε n οκτανόλη/νερό και αποτελεί μέτρο της υδροφοβικότητας-λιποφιλικότητας. Οι στερεοχημικές παράμετροι σχετίζονται με το μέγεθος, τον όγκο, την επιφάνεια και το σχήμα των μορίων. Μία τέτοια στερεοχημική παράμετρος είναι η μοριακή διαθλασιμότητα MR (Molecular Refractivity), η οποία εκφράζει 83

84 την συνεισφορά του όγκου (bulk) και της πολωσιμότητας (polarizability) της ένωσης ή ενός υποκαταστάτη. Η MR υπολογίζεται από τη σχέση: ΜR=(n 2 1/n 2 +2)MW/d) και περιλαμβάνει το μοριακό βάρος (MW), το συντελεστή διάθλασης (n), την πυκνότητα της ένωσης (d) και συσχετίζεται με δυνάμεις London και διασποράς. Οι τιμές ΜR αφορούν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ολόκληρο το μόριο ή για κάποιο υποκαταστάτη. Οι τιμές ClogP αναφέρονται στην ουδέτερη κατάσταση και εμφανίζονται ως μη διορθωμένες. Πίνακας 10 Θεωρητικά υπολογισμένες τιμές λιποφιλικότητας (ClogP) και μοριακής διαθλασιμότητας (ολική μοριακή διαθλασιμότητα CMR, MR Ar αρυλίου) Ενωση CLOGP CMR MR-Ar EMK1α EMK16α EMK17α EMK18α EMK19α EMK17e EMK17π-(Z) ΕΜΚ1-(Ζ) EMK17-(Ζ) EMK18-(Ζ) EMK1p-(Z) EMK16p-(Z) EMK17p-(Z) EMK18p-(Z) EMK19p-(Z) Για τον υπολογισμό των τιμών των υπολοίπων φυσικοχημικών ιδιοτήτων, έγινε αρχικά προσδιορισμός διαμόρφωσης ελάχιστης ενέργειας των ενώσεων με το πρόγραμμα Spartan v (Wavefunction Inc.). Συνοπτικά, για κάθε ένωση έγινε α) βελτιστοποίηση της δομής με χρήση της κβαντομηχανικής ημιεμπειρικής μεθόδου AM1 και β) τυχαία αναπαραγωγή διαμορφώσεων με τη μέθοδο Monte Carlo με επιλογή όλων των δυνατών δεσμών που μπορούν να περιστραφούν και εφαρμογή του δυναμικού πεδίου μοριακής μηχανικής Merck (MMFF94). Στη συνέχεια, στο διαμορφομερές με την ελάχιστη ενέργεια έγιναν εκ νέου υπολογισμοί με μεθόδους κβαντομηχανικής. Ωστόσο, στο διαμορφομερές ελάχιστης ενέργειας της ένωσης ΕΜΚ16p-(Z) δεν κατέστησαν δυνατοί οι παραπάνω υπολογισμοί λόγω του μεγάλου μοριακού του βάρους. Πίνακας 6 Φυσικοχημικές ιδιότητες που σχετίζονται με ενεργειακά φαινόμενα των ενώσεων Ενωση E (HOMO) E (LUMO) Δ [E(HOMO)- E(LUMO)] Ενέργεια ενυδατώσεως (kcal/mol) EMK1α EMK16α EMK17α

85 EMK18α EMK19α EMK17e EMK17π-(Z) ΕΜΚ1-(Ζ) EMK17-(Ζ) EMK18-(Ζ) EMK1p-(Z) EMK16p-(Z) EMK17p-(Z) EMK18p-(Z) EMK19p-(Z) Πίνακας 7 Φυσικοχημικές ιδιότητες που αναφέρονται στη μορφή στερεοδιάταξη και στην κατανομή φορτίου των μορίων Ενωση Επιφάνεια ηλεκτρoνιακής πυκνότητας (Å 2 ) Όγκος ηλεκτρονιακής πυκνότητας (Å 3 ) Διπολική ροπή (Debye) Elpot min Elpot max EMK1α EMK16α EMK17α EMK18α EMK19α EMK17e EMK17π-(Z) ΕΜΚ1-(Ζ) EMK17-(Ζ) EMK18-(Ζ) EMK1p-(Z) EMK16p-(Z) EMK17p-(Z) EMK18p-(Z) EMK19p-(Z) ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Εκτίμηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος η οποία επάγεται από το διϋδροχλωρικό άλας του 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμιδίου (AAPH) [23] Στο συγκεκριμένο πείραμα γίνεται προσπάθεια να μελετηθεί η ικανότητα των ενώσεων να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος. Σε κυψελίδα χαλαζία περιεκτικότητας 1ml, που περιέχει 930μl ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (συγκέντρωσης 0,05Μ) ph 7,4 προστίθενται 10μl διαλύματος άλατος του λινελαϊκού οξέος 85

86 με νάτριο (16mM) σε ph 9 με ρυθμιστικό διάλυμα Tris HCl και 10μl διαλύματος των υπό εξέταση ενώσεων (10mM). Η οξειδωτική διαδικασία επάγεται με την προσθήκη 50μl AAPH (40mM σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών με ph 7,4) σε θερμοκρασία 37 C παρουσία αέρα. Καταγράφεται η μεταβολή της τιμής της απορρόφησης στα 234nm (μετατροπή του λινελαϊκού οξέος σε 13 υπεροξυ λινελαϊκό οξύ). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 8 Τιμές της % ικανότητας των εξεταζομένων ενώσεων να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το διϋδροχλωρικό άλας του AAPH Α/Α Ενωση Αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης % σε C=100μΜ 1 EMK1α 95 2 ΕΜΚ1b 56 3 EMK16α 79 4 EMK17α 91 5 EMK18α 81 6 EMK19α 60 7 EMK17e 59 8 EMK17π-(Z) 72 9 EMK1-(Z/E) ΕΜΚ1-(Ζ) EMK1-(E) ΕΜΚ16-(Z/E) ΕΜΚ17-(Z) ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) ΕΜΚ18-(Ζ) ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) EMK16p-(Z) ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ18p-(Z) ΕΜΚ19p-(Z) Τρολόξη 63 Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο τριών μετρήσεων και η SD <10% Εκτίμηση της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων επί της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης in vitro [24] Στο πείραμα γίνεται προσπάθεια να μελετηθεί η ικανότητα των νέων ενώσεων να αναστέλλουν την λιποξυγονάση, ένζυμο το οποίο εμπλέκεται στον κύκλο του αραχιδονικού οξέος. Η αναστολή της φυτικής προέλευσης λιποξυγονάσης (soyabean lipoxygonase) (1:9x10 4 w/v σε φυσιολογικό ορό) γίνεται σε συγκεντρώση 0,1-0,01 mm για τον υπολογισμό της % αναστολής των εξεταζόμενων ουσιών και ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται το άλας του λινελαϊκού οξέος με νάτριο σε ph 9 με ρυθμιστικό διάλυμα 86

87 Tris HCl, σε θερμοκρασία δωματίου. Καταγράφεται στα 234 nm η μεταβολή της απορρόφησης (μετατροπή του λινελαϊκού σε 13 υπεροξυλινελαϊκό οξύ). Τα αποτελέσματα δίνονται στον παρακάτω πίνακα ως % ή IC 50 τιμές αναστολής. Πίνακας 9 Τιμές IC 50 και της % ικανότητας των εξεταζομένων ενώσεων να αναστέλλουν το ενζύμο λιποξυγονάση από σόγια (SLOΧ) Α/Α Ενωση % αναστολή σε C=100μΜ/(IC 50 ) 1 EMK1α no 2 ΕΜΚ1b 40 3 EMK16α no 4 EMK17α no 5 EMK18α 49 6 EMK19α 15 7 EMK17e 36 8 EMK17π-(Z) 41 9 EMK1-(Z/E) 77/(92μΜ) 10 ΕΜΚ1-(Ζ) 50/(100μΜ) 11 EMK1-(E) 93/(40.5μΜ) 12 ΕΜΚ16-(Z/E) no 13 ΕΜΚ17-(Z) ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) 93/(50.5μΜ) 15 ΕΜΚ18-(Ζ) ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) no 18 EMK16p-(Z) 53/(85μΜ) 19 ΕΜΚ17p-(Z) 89/(41μΜ) 20 ΕΜΚ18p-(Z) 68/(65μΜ) 21 ΕΜΚ19p-(Z) 67/(87.5μΜ) 22 NDGA 84/(50μΜ) Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο τριών μετρήσεων και η SD <10% Εκτίμηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της τυροσινάσης από μανιτάρι in vitro [6] Η αναστολή της τυροσινάσης (5370 U/mg σε 2,6 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών 0,1M ph 6,5) προσδιορίζεται σε συγκέντρωση 100μM των εξεταζόμενων ουσιών, με υπόστρωμα 0,2ml L-Dopa (συγκέντρωση 1,5mM σε ph 6,5 με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 M). Μετά από επώαση 20 λεπτών σε θερμοκρασία 37 o C καταγράφεται στα 490nm η μεταβολή της απορρόφησης, η οποία οφείλεται στην μετατροπή του υποστρώματος σε DOPA-κινόνη. Τα αποτελέσματα δίνονται στον παρακάτω πίνακα σε συγκριση με το κογικό οξύ το οποίο χρησιμοποιείται ως ένωση αναφοράς. 87

88 Πίνακας 10 Τιμές της % ικανότητας των εξεταζομένων ενώσεων να αναστέλλουν την τυροσινάση του μανιταριού Α/Α Ενωση % αναστολή σε C=100 μμ 1 EMK1α no 2 ΕΜΚ1b 21 3 EMK16α no 4 EMK17α 16 5 EMK18α 5 6 EMK19α 3 7 EMK17e 5 8 EMK17π-(Z) 13 9 EMK1-(E) ΕΜΚ16-(Z/E) 6 11 ΕΜΚ17-(Z) 7 12 ΕΜΚ18-(Z/E) 5 13 ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) EMK16p-(Z) ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ18p-(Z) ΕΜΚ19p-(Z) Κογικό οξύ 20 Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο τριών μετρήσεων και η SD <10% Εκτίμηση της αντιμικροβιακής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί του εντεροβακτηριδίου Escherichia coli Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι για την μελέτη της αντιμικροβιακής ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος με τους αντιμικροβιακούς δίσκους (disc diffusion method) και στη συνέχεια η μέθοδος με τα πηγαδάκια (cup plate method). Μέθοδος εμβολιασμού με αντιμικροβιακούς δίσκους [25] Η μέθοδος η οποία ακολουθήθηκε είναι μία παραλλαγή της μεθόδου η οποία αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Αρχικά με τον διακορευτή κατασκευάζονται οι αντιβιοτικοί δίσκοι διαμέτρου 5mm από διηθητικό χαρτί Whatman No 3, και προσημειώνονται με το χαρακτηριστικό κωδικό της κάθε ένωσης. Στη συνέχεια οι αντιβιοτικοί δίσκοι αποστειρώνονται για 15 λεπτά σε πίεση 2 bar. Παρασκευάζονται τα διαλύματα των υπο μελέτη ενώσεων με περιεκτικότητα 1.5 mg/ml σε DMSO. Η ποσότητα αυτή καθορίστηκε με βάση τους πίνακες του CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) με ποσότητες αντιμικροβιακών ουσιών [26]. Επιπρόσθετα 88

89 κατάλληλοι ενοφθαλμισμοί (1 2 x10 7 c.f.u./ml 0.5 McFarland standards) διαλύματος μικροβίου εγχύονται στην επιφάνεια του στείρου θρεπτικού υλικού των τρυβλίων και διαχέονται με τη βοήθεια βαμβακοφόρου στηλεού. Στη συνέχεια οι αποστειρωμένοι δίσκοι εμποτίζονται με 20μl από την κάθε ουσία (30μg σε κάθε δίσκο) και τοποθετούνται επί του θρεπτικού υλικού σε απόσταση περίπου 6cm μεταξύ τους. Ως ουσία αναφοράς χρησιμοποιείται κεφτριαξόνη, CRO 30μg, και ως τυφλό δείγμα δίσκος εμποτισμένος με 20μl DMSO. Τα τρυβλία με τους αντιβιοτικούς δίσκους αφήνονται για επώαση στους 37 o C για 22 ώρες. Στο πείραμα διερευνήθηκαν οι ουσίες ΕΜΚ1α, ΕΜΚ1b, ΕΜΚ16α, ΕΜΚ17α, ΕΜΚ18α, ΕΜΚ19α, ΕΜΚ1-(Ε), ΕΜΚ16-(Ζ/Ε), ΕΜΚ17, ΕΜΚ17e, ΕΜΚ1p-(Z), ΕΜΚ1p-(E), ΕΜΚ16p, ΕΜΚ17p, ΕΜΚ18p και ΕΜΚ19p, χωρίς, ωστόσο, να παρουσιάσουν κάποια ζώνη αναστολής παρά μόνο ενδείξεις. Όμως για να επιβεβαιωθεί το παραπάνω αποτέλεσμα ακολουθήθηκε και μία δεύτερη πειραματική μέθοδος. Μέθοδος έγχυσης σε πηγαδάκια [27] Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό ανοίγονται πηγαδάκια με τη βοήθεια ειδικού αποστειρωμένου εργαλείου. Το εργαλείο αυτό δημιουργεί κυκλικές τομές-φέτες διαμέτρου 6mm και πάχους ίσο με αυτό του θρεπτικού υλικού, δηλ. περίπου 4mm, οι οποίες στη συνέχεια αφαιρούνται και έτσι κατασκευάζονται τα πηγαδάκια. Στη συνέχεια σ αυτά τοποθετούνται 20μl από τα διαλύματα των υπο εξέταση ουσιών περιεκτικότητας 1,5mg/ml σε DMSO, δηλ. ποσότητα ίδια με αυτή που εμποτίστηκαν οι αντιβιοτικοί δίσκοι στο προηγούμενο πείραμα. Στην δοκιμασία αυτή μελετήθηκαν οι ενώσεις ΕΜΚ1α, ΕΜΚ1b, ΕΜΚ16α, ΕΜΚ17α, ΕΜΚ18α, ΕΜΚ19α, ΕΜΚ1-(Ε), ΕΜΚ1p-(E) για τις οποίες στο προηγούμενο πείραμα υπήρχε ένδειξη ζώνης αναστολής. Ωστόσο, και σε αυτή τη μέθοδο, με ποσότητα ουσιών 30μg σε κάθε πηγαδάκι, δεν παρατηρήθηκαν ζώνες αναστολής. Για το λόγο αυτό αυξήθηκε η εγχυόμενη ποσότητα των υπο εξέταση ουσιών σε 45μg, δυστυχώς, χωρίς ενθαρρυντικά αποτελέσματα Εκτίμηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης in vitro [28] Οι ενώσεις διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων με ph=7,6, (σε συγκεντρώσεις μm) και δοκιμάζεται η ανασταλτική τους ικανότητα. Οι ενώσεις τοποθετούνται σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες και προστίθεται 0,2ml θρυψίνης από διάλυμα συγκέντρωσης 0,075mg/ml. Το μίγμα επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 37 C για 30min και στο τέλος, στα μεν δύο σωληνάκια προστίθεται 1ml διαλύματος βόειας αλβουμίνης συγκέντρωσης 6g/100ml, στο δε τρίτο 1ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών αλάτων με ph=7,6. Στη συνέχεια το μίγμα επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 37 C για 30min. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης προστίθεται ορισμένος όγκος τριχλωροξικού οξέος (5%w/w), οπότε η αντίδραση τερματίζεται με κρoκίδωση της αλβουμίνης. Ακολουθεί φυγοκέντριση, διαχωρισμός των φάσεων και μέτρηση της απορρόφησης του υπερκείμενου υγρού σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους στα 280nm σε 89

90 θερμοκρασία περιβάλλοντος, ενώ όπου είναι εφικτό προσδιορίζονται οι τιμές IC 50. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 11 Τιμές της % ικανότητας των εξεταζομένων ενώσεων να αναστέλλουν την πρωτεολυτική δράση της θρυψίνης Α/Α Ενωση % αναστολή σε C=10 μμ ή IC 50 1 EMK1α 33 2 ΕΜΚ1b 7.1μΜ 3 EMK16α 8.25μΜ 4 EMK17α 10μΜ 5 EMK18α 7μΜ 6 EMK19α 60μΜ 7 EMK17e 1μΜ 8 EMK17π-(Z) 6.7μΜ 9 EMK1-(Z/E) no 10 EMK1-(Ζ) no 11 EMK1-(E) no 12 ΕΜΚ16-(Z/E) 100μΜ 13 ΕΜΚ17-(Z) 6.75μΜ 14 ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) 6.9μΜ 15 ΕΜΚ1p-(Z) 8μΜ 16 ΕΜΚ1p-(E) 100μΜ 17 EMK16p-(Z) 9μΜ 18 ΕΜΚ17p-(Z) 9.1μΜ 19 ΕΜΚ18p-(Z) 8.5μΜ 20 ΕΜΚ19p-(Z) 8.75μΜ 21 Σαλικυλικό οξύ 100μΜ Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο τριών μετρήσεων και η SD <10% Εκτίμηση της δράσης της θρυψίνης επί των εξεταζόμενων βενζαμιδίων in vitro Μελετάμε την ενζυμική δράση αμιδάσης επί των αμιδικών δεσμών των νέων ενώσεων ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E) και EMK17p-(Z). Γι αυτό το σκοπό παρασκευάζουμε διάλυμα του ενζύμου (θρυψίνης) περιεκτικότητας 0,075mg/ml, καθώς και διάλυμα των εξεταζόμενων ενώσεων σε DMSO συγκέντρωσης 10 mm. Η αντίδραση πραγματοποιείται με την προσθήκη του διαλύματος του ενζύμου (0,2ml) σε 0,2ml των υπό εξέταση ενώσεων και 0,6ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών αλάτων με ph=7,6. Το μίγμα, τελικού όγκου 1 ml, αφήνεται προς επώαση σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 C. Μετά από 24 ώρες λαμβάνει χώρα εκχύλιση του επωασθέντος διαλύματος με χλωροφόρμιο (1 ml) και παραλαμβάνεται η στιβάδα του χλωροφορμίου. Ακολούθει χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (ΤLC) με σύστημα διαλυτών χλωροφορμίου/μεθανόλης (7:1). Τα φασματοσκοπικά δεδομένα και η χρωματογραφική ανάλυση επιβεβαιώνουν τις τιμές R f των τριών εξεταζόμενων μορίων ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E) και EMK17p-(Z) μετά από 24 ώρες επώασης (πίνακας 17). 90

91 * Πίνακας 12 Τιμές R f των εξεταζόμενων ενώσεων πριν και μετά την επώαση (* χλωροφόρμιο/μεθανόλη 7:1 & θάλαμος ιωδίου) Α/Α Ένωση R f πριν την επώαση R f μετά την επώαση 1 ΕΜΚ1p-(Z) EMK1p-(E) EMK17p-(Z) ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ IN VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Εκτίμηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την επαγωγή οιδήματος άκρου ποδός επίμυα η οποία προκαλείται μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης [29] Χρησιμοποιούμε τρεις ομάδες πειραματόζωων (επίμυες Fisher 344) σωματικού βάρους g. Περίπου μια ώρα πριν από την έναρξη του πειράματος αφαιρείται η τροφή και το νερό από τα πειραματόζωα. Οι ενώσεις χορηγούνται αρχικά ενδοπεριτοναϊκά, ώστε να εξασφαλισθεί ταχύτατη βιοδιαθεσιμότητα της ένωσης και κυκλοφορία της σε όλο το σώμα του πειραματόζωου και ταυτόχρονα προκαλείται φλεγμονή στο πέλμα του δεξιού άκρου ποδός με την ενδοδερμική χορήγηση διαλύματος καραγεννίνης. Στην πρώτη ομάδα πειραματόζωων χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά εφάπαξ δόση της εξεταζόμενης ένωσης (0,0057mmol/kg σωματικού βάρους), με τη μορφή εναιωρήματος σε Η 2 Ο και τη βοήθεια του Tween 80. Σε μια δεύτερη ομάδα πειραματόζωων χορηγείται μόνο ο υγρός φορέας σε ίσο όγκο. Στην τρίτη ομάδα, χορηγείται κατά τον ίδιο τρόπο ένα κλασσικό μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο, η ινδομεθακίνη (0,0057mmol/kg σωματικού βάρους), η οποία χρησιμοποιείται ως ένωση αναφοράς. Στη συνέχεια προκαλείται πειραματικά οξεία φλεγμονή, χρησιμοποιώντας ως φλογιστικό μέσο την καρραγενίνη, η οποία διαλύεται σε φυσιολογικό ορό (σε περιεκτικότητα 2%, 0,1ml διαλύματος καρραγενίνης). Η καραγεννίνη ενίεται ενδοδερμικά στο πέλμα του πίσω δεξιού άκρου ποδιού των επιμύων και στις τρεις ομάδες των πειραματόζωων, ενώ το αριστερό άκρο χρησιμοποιείται ως μάρτυρας. Μετά το πέρας 3,5 ωρών από τη χορήγηση του φλογιστικού μέσου, οι επίμυες θανατώνονται με αυχενική εξάρθρωση και λαμβάνονται τα πίσω άκρα, τα οποία ζυγίζονται. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως % αύξηση του βάρους του άκρου ποδιού στο οποίο ενέθηκε το φλογιστικό, συγκρινόμενο με το αντίστοιχο άκρο πόδι στο οποίο δεν ενέθηκε το φλογιστικό. Με βάση τον υπολογισμό αυτό, προσδιορίζεται στη συνέχεια η % μέση αναστολή του οιδήματος που προκαλεί η εξεταζόμενη ένωση σε σχέση με τους μάρτυρες [30]. Τα αποτελέσματα δίνονται στον παρακάτω πίνακα

92 Πίνακας 13 Τιμές της % in vivo αναστολής η οποία προκαλείται από τις εξεταζόμενες ενώσεις στο οίδημα του άκρου ποδός από καρραγενίνη Α/Α Ενωση CPE % 1 EMK1p-(Z) 44 2 ΕΜΚ17p-(Z) 56 3 ινδομεθακίνη 58 Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο μετρήσεων 5 πειραματόζωων και η SD <10% Εκτίμηση της αναλγητικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων [31] Για την μελέτη της αναλγητικής δράσης προκαλείται πόνος με χημικό ερέθισμα. Ως τέτοιο χημικό ερέθισμα, χρησιμοποιείται υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 0,6%, που χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά σε αρσενικά πειραματόζωα Fisher 344 βάρους g. Μετά την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση (σε δόση 1ml/0,1 kg βάρους σώματος) αυτού του διαλύματος παρατηρούνται περιοδικές συστολές του υπογαστρίου, περιστροφές του κορμού, εκτάσεις και εκτινάξεις των οπισθίων άκρων του πειραματόζωου (writhing test). Έτσι χαρακτηριστική μείωση του αριθμού των συστολών και συσπάσεων αποτελεί μέτρο για την εκτίμηση της αναλγητικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων. Τα ζώα παραμένουν στο χώρο πειραματισμού 24 ώρες πριν αρχίσει το πείραμα. Σε μια ομάδα από 5 επίμυες χορηγείται, όπως αναφέρθηκε, υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 0,6 % και καταγράφεται ο αριθμός των συστολών του υπογαστρίου και οι εκτάσεις των οπισθίων άκρων κάθε ζώου ξεχωριστά ανά 5 λεπτά και για διάστημα 30 λεπτών. Αυτή η ομάδα αντιπροσωπεύει τους μάρτυρες. Οι ενώσεις που μελετήθηκαν γίνονται εναιώρημα σε Η 2 Ο παρουσία Tween 80. Έπειτα λαμβάνει χώρα ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση αυτού του αιωρήματος (0,0057mmol/kg σωματικού βάρους) σε αρσενικά ζώα και ακολουθεί παραμονή των πειραματόζωων στο χώρο πειραματισμού για 30 λεπτά. Μετά την πάροδο των 30 λεπτών ενίεται το διάλυμα οξικού οξέος. Για κάθε ένωση που μελετείται, χρησιμοποιείται ομάδα 5 πειραματόζωων και μετρείται η απόκριση του φαρμάκου στον προκαλούμενο από χημικό ερέθισμα περιφερικό πόνο. Το επί τοις εκατό ποσοστό προστασίας για κάθε ένωση που δοκιμάζεται, υπολογίζεται από τον τύπο: Ο μέσος όρος των σπασμών υπολογίζεται από το σύνολο των σπασμών όλων των ζώων. Παρακάτω δίνονται τα αποτελέσματα των εξεταζόμενων ενώσεων (πίνακας 19), χρησιμοποιώντας ως πρότυπη αναλγητική ένωση το ακετυλοσαλικυκικό οξύ (ασπιρίνη). 92

93 Πίνακας 14 Τιμές της % προστασία η οποία παρέχεται από τις εξεταζόμενες ενώσεις σε πειραματικό πρότυπο πρόκλησης πόνου μετά από χορήγηση 0,6 % διαλύματος οξικού οξέος. M.O σπασμών EMK1p-(Z) Επιμέρους προστασία ΕΜΚ17p-(Z) Επιμέρους προστασία Ασπιρίνη-Επιμέρους προστασία ανά 5 λεπτά 0% 100% 0% ανά 10 λεπτά 32% 78% 76% ανά 15 λεπτά 42% 75% 86% ανά 20 λεπτά 33% 62% 81% ανά 25 λεπτά 35% 49% 77% ανά 30 λεπτά 23% 28% 72% Ολική προστασία 32 % 58 % 77 % Οι τιμές αποτελούν τον μέσο όρο μετρήσεων 5 πειραματόζωων και η SD <10% λεπτά 10 λεπτά 15 λεπτά 20 λεπτά 25 λεπτά 30 λεπτά Ασπιρίνη ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ1p-(Z) Μάρτυρες Γράφημα 1 Αριθμός writhes σε συνάρτηση με το χρόνο (σε λεπτά), μετά τη χορήγηση δ/τος οξικού οξέος 93

94 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5.1 ΧΗΜΕΙΑ ΤΩΝ 5(4Η)-ΟΞΑΖΟΛΟΝΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΩΝ ΒΕΝΖΑΜΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Σύνθεση των 5(4H)-οξαζολονών Παρακάτω παρατίθενται δύο διαφορετικοί μηχανισμοί για τη σύνθεση των 5-(4Η)- οξαζολονών των οποίων η κύρια διαφορά εντοπίζεται στο ότι στην πρώτη περίπτωση (Erlenmeyer-σύνθεση, σχήμα 45) έχουμε κυκλοποίηση του ενδιάμεσου προϊόντος στα τελικά στάδια, ενώ στην δεύτερη (αντίδραση Erlenmeyer-Plochl, σχήμα 46), η οποία είναι και η επικρατέστερη, έχουμε άμεση κυκλοποίηση του ενδιάμεσου προϊόντος προς το σχηματισμό του τελικού. Επεξήγηση Μηχανισμού Αντίδρασης Σχήμα 45 Σύνθεση Erlenmeyer Αρχικά πραγματοποιείται εστεροποίηση της αροϋλο-υποκατεστημένης γλυκίνης (1) με τη βοήθεια του οξικού ανυδρίτη. Στη συνέχεια ο προκύπτων εστέρας (2), μέσω της ταυτομερούς κετο-ενολικής του μορφής (3) αντιδρά με την κατάλληλα υποκατεστημένη αλδεΰδη δίνοντας το ενδιάμεσο προϊόν (4), το οποίο με τη σειρά του μετά από αφυδάτωση σχηματίζει το ενδιάμεσο προϊόν (5). Η ενδιάμεση ένωση (5) ταυτομερίζεται σχηματίζοντας το ενδιάμεσο προϊόν (6) το οποίο υφίσταται ενδομοριακή κυκλοποίηση μέσω της πυρηνόφιλης προσβολής του αρνητικά φορτισμένου οξυγόνου στον καρβονυλικό δεσμό, ο οποίος απέχει κατά τέσσερα άτομα, προς σχηματισμό του ενεργειακά σταθερότερου πενταμελή δακτυλίου. Τέλος, με την απόσπαση οξικού οξέος σχηματίζεται η επιθυμητή υποκατεστημένη 5-(4Η)-οξαζολόνη. 94

95 Μία παραλλαγή της σύνθεσης Erlenmeyer [1] αποτελεί η σύνθεση Erlenmeyer-Plochl [2] όπου ξεκινώντας και πάλι από αροϋλο-υποκατεστημένη γλυκίνη, σχηματίζεται μία αζαλακτόνη η οποία μέσω της αντίδρασης τύπου Perkin συμπυκνώνεται με τις κατάλληλες αλδεΰδες δίνοντας τις επιθυμητές 5-(4Η)-οξαζολόνες (σχήμα 46). Επεξήγηση Μηχανισμού Αντίδρασης Σχήμα 46 Σύνθεση Erlenmeyer-Plochl Κι εδώ αρχικά πραγματοποιείται εστεροποίηση της αροϋλο-υποκατεστημένης γλυκίνης (1) με τη βοήθεια του οξικού ανυδρίτη και ο εστέρας (2) ο οποίος προκύπτει κυκλοποιείται ενδομοριακά, μέσω της ταυτομερούς μορφής του, σε αζαλακτόνη (3). Στη συνέχεια, κι εφόσον οι αζαλακτόνες φέρονται σαν ισοηλεκτρικά ανάλογα του οξικού ανυδρίτη, πραγματοποιείται συμπύκνωση τύπου Perkin (σχήμα 47) μεταξύ του ενδιάμεσου (4) και της κατάλληλης αλδεΰδης. Τέλος, μετά την αφυδάτωση της ασταθούς ένωσης (5) προκύπτει η επιθυμητή υποκατεστημένη 5-(4Η)-οξαζολόνη (6). 95

96 Σχήμα 47 Αντίδραση Perkin Η αντίδραση Perkin [3] περιγράφει τη σύνθεση κινναμωμικών οξέων (α,β-ακόρεστα αρωματικά οξέα), μέσω της αλδολικής συμπύκνωσης μεταξύ αρωματικής αλδεΰδης και οξικού ανυδρίτη, παρουσία αλκαλικού άλατος του οξέος (π.χ οξικό νάτριο). Η πορεία της αντίδρασης όταν χρησιμοποιείται αρωματική αλδεΰδη, καθοδηγείται από την σταθεροποίηση λόγω συντονισμού των προϊόντων μέσω συζυγίας μεταξύ του αρωματικού δακτυλίου, του νέου διπλού δεσμού που σχηματίζεται και του καρβονυλικού δεσμού. Έτσι, θεωρητικά, το θετικό φορτίο το οποίο εμφανίζεται δίπλα από τον αρωματικό δακτύλιο σταθεροποιείται λόγω του +R συζυγιακού φαινομένου του δακτυλίου. Ωστόσο, πειραματικά έχει αποδειχθεί ότι όταν στην αντίδραση χρησιμοποιούνται αρωματικές αλδεΰδες οι οποίες φέρουν υποκαταστάτες ομάδες δέκτες ηλεκτρονίων (electron withdrawing groups-ewgs) δίνουν καλύτερες αποδόσεις συγκριτικά με τις περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται αρωματικές αλδεΰδες οι οποίες φέρουν υποκαταστάτες ομάδες δότες ηλεκτρονίων (electron donating groups-edgs)[4]. Το γεγονός αυτό μπορεί να ερμηνευθεί, καθώς ομάδες με R συζυγιακό φαινόμενο αυξάνουν τον ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα του άνθρακα της γειτονικής αλδεϋδικής ομάδας, ούτως ώστε να διευκολυνθεί η πυρηνόφιλη προσβολή του κυκλοποιημένου ενδιάμεσου στην αρωματική αλδεΰδη (σχήμα 46). Συνεπώς, αρωματικές αλδεΰδες με +R συζυγιακό φαινόμενο οδηγούν σε θερμοδυναμικά σταθερότερα προϊόντα, ενώ αρωματικές αλδεΰδες με -R συζυγιακό φαινόμενο έχουν θετικότερη επίδραση στην κινητική των αντιδράσεων. Όσον αφορά στις ετεροκυκλικές αρωματικές αλδεΰδες, οι αποδόσεις οι οποίες επιτυγχάνονται είναι μέτριες. Τέλος οι αλειφατικές αλδεΰδες όντως αντιδρούν υπό τις ίδιες συνθήκες, αλλά με μικρότερες αποδόσεις σε σύγκριση με τις αρωματικές αλδεΰδες, καθώς συχνά προκύπτουν παραπροϊόντα αλδολικής συμπύκνωσης [5]. Τα προϊόντα λαμβάνονται σε μέτριες αποδόσεις (κυμαίνονται από 36 έως 67 %), με εξαίρεση το EMK16α το οποίο λαμβάνεται σε απόδοση 83%. Διαφοροποιήσεις στις 96

97 αποδόσεις παρατηρούνται, επίσης, όταν γίνεται χρήση μικροκυματικής ακτινοβόλησης, σε αντικατάσταση της κλασικής θέρμανσης για την παροχή ενέργειας κατά τη σύνθεση των οξαζολονών. Στην περίπτωση της ΕΜΚ17α παρατηρείται θεαματική αύξηση 30 ποσοστιαίων μονάδων με τη χρήση μικροκυμάτων (66% έναντι 36% της κλασικής θέρμανσης). Στις άλλες περιπτώσεις όπου εφαρμόσθηκε η χρήση μικροκυμάτων, είχαμε πτώση των αποδόσεων μέχρι και 15 ποσοστιαίες μονάδες (για ΕΜΚ1α από 67% σε 56% και για ΕΜΚ18α από 53% σε 38%). Συνεπώς, η μικροκυματική μέθοδος της σύνθεσης των οξαζολονών ευνοεί μόνο την EMK17α (οξαζολόνη με ετεροκυκλικό αρωματικό δακτύλιο) της οποίας η απόδοση πλησιάζει τις αποδόσεις των οξαζολονών με αρωματικό δακτύλιο (όταν αυτές παρασκευάζονται με την κλασική μέθοδο). Πιθανό ρόλο φαίνεται να διαδραματίζει η διπολική ροπή των πρώτων υλών (αλδεϋδών) και των προϊόντων. Με δεδομένο ότι οι υπόλοιπες παράμετροι διατηρούνται σταθερές, θεωρούμε ότι η διαφοροποίηση αυτή επηρεάζει τη διαδικασία της μικροκυματικής διηλεκτρικής θέρμανσης του μίγματος (εισαγωγή-μικροκύματα) και, κατ επέκταση, την απόδοση της αντίδρασης. Έτσι, ενώ οι τιμές της διπολικής ροπής των αλδεϋδών είναι παραπλήσιες [βενζαλδεΰδη=3,63d (ΕΜΚ1α), 2-θειενυλο-καρβοξυαλδεΰδη=3,82D (ΕΜΚ17α) και 1-ναφθαλδεΰδη=4,00D (ΕΜΚ18α) δεδομένα από το πρόγραμμα Spartan v ], οι τιμές της διπολικής ροπής των προϊόντων διαφέρουν (πίνακας 12). Η κλιμάκωση των αποδόσεων των τριών οξαζολονών είναι ανάλογη με την κλιμάκωση των τιμών της διπολικής τους ροπής. Όμως, σε μία προσπάθεια σύνθεσης του ΕΜΚ17α με τη χρήση μικροκυμάτων και ιωδίου ως καταλύτη, το αποτέλεσμα ήταν απογοητευτικό με απόδοση μόλις 19%. Εξετάζοντας το ρόλο των στερεοχημικών επιδράσεων στην πορεία/απόδοση των αντιδράσεων σύνθεσης των οξαζολονών παρατηρούμε ότι οι ενώσεις ΕΜΚ17α και ΕΜΚ19α, οι οποίες έχουν το μικρότερο MR-Ar (και με δεδομένο ότι R=φαινύλιο σε όλες τις οξαζολόνες-πίνακας 10), παρουσιάζουν τις μικρότερες αποδόσεις (36% αμφότερες) υπό συνθήκες κλασικής θέρμανσης, γεγονός το οποίο καταδεικνύει ότι οι στερεοχημικές επιδράσεις δεν είναι σημαντικές. Τα δεδομένα από την φασματοσκοπική εξέταση υπερύθρου IR των 5(4H)-οξαζολονών (μορφή δισκίου σε στερεό KBr) έδειξαν οξεία απορρόφηση στα cm 1 όπου απορροφά ο καρβονυλικός δεσμός των οξαζολονικών δακτυλίων, ισχυρή απορρόφηση στα cm 1 περιοχή στην οποία απορροφά ο δεσμός C=N και στα cm 1 περιοχή στην οποία απορροφά ο αρυλομεθυλενικός δεσμός ( C=C). Τα δύο ισομερή ΕΜΚ1α και ΕΜΚ1b εμφανίζουν παρόμοια φάσματα. Τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα συμφωνούν με τα αντίστοιχα βιβλιογραφικά. Εδώ κρίνεται σκόπιμο να αναφερθεί το φαινόμενο συντονισμού Fermi. Όταν δύο κινήσεις δόνησης ενός μορίου έχουν συχνότητες πολύ κοντά η μία στην άλλη χαρακτηρίζονται τυχαία εκφυλισμένες. Το φαινόμενο συντονισμού των παραπάνω απορροφήσεων είναι γνωστό ως συντονισμός Fermi (Fermi resonance) και εμφανίζεται πολλές φορές στις ακόρεστες λακτόνες, με συνέπεια την εμφάνιση δύο ταινιών απορρόφησης για το καρβονύλιο των 5(4Η)- οξαζολονών [7]. Κατά την εξέταση των ενώσεων με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1 H NMR και 13 C-NMR (CDCl 3, TMS), οι παρατηρηθείσες χημικές μετατοπίσεις και ο αριθμός πρωτονίων επιβεβαιώνουν τις προτεινόμενες δομές. Όπως θα αναπτυχθεί παρακάτω, ο αρυλομεθυλενικός δεσμός μπορεί να οδηγήσει σε Ε και Ζ ισομερή, με το Ζ ισομερές, όμως, 97

98 να είναι θερμοδυναμικά σταθερότερο και έτσι όλα τα οξαζολονικά παράγωγα απομονώνονται κυρίως με αυτή τη δομή. Χαρακτηριστικότερη κορυφή των Ζ-ισομερών στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1 H NMR είναι αυτή του βινυλικού υδρογόνου, η οποία εμφανίζεται ως απλή σε τιμές δ από 7.20 έως 8.16 ppm, και τα διαφοροποιεί από τα αντίστοιχα Ε-ισομερή στα οποία η ίδια κορυφή εμφανίζεται σε υψηλότερες τιμές δ. Για παράδειγμα, όπως φαίνεται και στα φασματοσκοπικά δεδομένα, το βινυλικό υδρογόνο του ΕΜΚ1α (Z-ισομερές) εμφανίζεται σε τιμή δ=7.26ppm, ενώ του ΕΜΚ1b (Ε-ισομερές) σε τιμή δ=7.53ppm (μικρότερες τιμές μαγνητικού πεδίου). Πιθανός λόγος που δικαιολογεί την παραπάνω παρατήρηση είναι ότι στα Ε-ισομερή το βινυλικό υδρογόνο δέχεται μόνο την επίδραση του R συζυγιακού φαινομένου της γειτονικής καρβονυλικής ομάδας λόγω στερεοχημικών δεδομένων (κάμψης φαινυλίου), με αποτέλεσμα την αποπροστασία του. Για τον ίδιο λόγο ισχύει ακριβώς το αντίστροφο στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 13 C-NMR, όπου ο καρβονυλικός άνθρακας του ΕΜΚ1α (Z-ισομερές) εμφανίζεται σε δ=167.6ppm, ενώ του ΕΜΚ1b (Εισομερές) σε τιμές δ=164.6ppm Σύνθεση των βενζαμιδικών παραγώγων Στην παρούσα εργασία μας απασχολεί η σύνθεση βενζαμιδίων με ταυτόχρονη διάνοιξη του οξαζολονικού δακτυλίου μετά από πυρηνόφιλη προσβολή με δευτεροταγή αμίνη ή ακόμη και με επίδραση αιθανόλης. Σχήμα 48 Μηχανισμός πυρηνόφιλης προσβολής με πιπεριδίνη/μορφολίνη Σχήμα 49 Μηχανισμός πυρηνόφιλης προσβολής με αιθανόλη 98

99 Επεξήγηση Μηχανισμού Αντίδρασης Αρχικά έχουμε τη δημιουργία του ασταθούς ενδιάμεσου οξαζολονικού δακτυλίου, μετά από την πυρηνόφιλη προσθήκη στον καρβονυλικό δεσμό του ελεύθερου ζεύγους ηλεκτρονίων του αζώτου της πιπεριδίνης/μορφολίνης ή της υδροξυομάδας της αιθανόλης. Στη συνέχεια έχουμε αναδιάταξη των δεσμών του οξαζολονικού δακτυλίου με αποτέλεσμα την διάνοιξη του προς το σχηματισμό του σταθερότερου τελικού προϊόντος (πιπεριδινικό/μορφολινικό και εστερικό βενζαμίδιο αντίστοιχα)(σχήματα 48 και 49). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [8], για τη σύνθεση των ακρυλικών αιθυλεστέρων απαιτείται παρουσία EtONa (σχήμα 49). Ωστόσο, στις δύο παραπάνω περιπτώσεις (ΕΜΚ16e και EMK17e) απουσιάζει το EtONa (αιθοξείδιο του νατρίου). Το κοινό τους σημείο είναι ότι γίνεται προσπάθεια καθαρισμού τους καθώς διαθέτουν προσμίξεις από πρώτες ύλες. Mπορούμε να υποθέσουμε ότι η προστιθέμενη EtOH, με τη βοήθεια της θέρμανσης, πραγματοποίησε πυρηνόφιλη προσβολή στον οξαζολονικό δακτύλιο. Στην περίπτωση κατά την οποία ένα πυρηνόφιλο αντιδραστήριο, όπως η πιπεραζίνη, διαθέτει δύο ισοδύναμα πυρηνόφιλα κέντρα, τότε έχουμε ως αποτέλεσμα την διπλή πυρηνόφιλη προσθήκη στα καρβονύλια δύο διακριτών οξαζολονικών δακτυλίων. Σχήμα 50 Μηχανισμός πυρηνόφιλης προσβολής με πιπεραζίνη Επεξήγηση Μηχανισμού Αντίδρασης Συνεπώς, με μηχανισμό ανάλογο των παραπάνω αντιδράσεων, αρχικά δημιουργείται το μονοϋποκατεστημένο βενζαμιδικό παράγωγο, το οποίο στη συνέχεια προσβάλει με τη σειρά του ένα νέο καρβονυλικό δεσμό οξαζολονικού δακτυλίου δίνοντας τελικά το διπλό συμμετρικό βενζαμίδιο (σχήμα 50). Σε αυτή την κατηγορία των προϊόντων μας παρατηρείται μεγάλη διακύμανση των αποδόσεων τόσο λόγω των πιθανών στερεοχημικών παρεμποδίσεων κατά την διάνοιξη των δακτυλίων, αλλά κυρίως λόγω της παρασκευής μιγμάτων ισομερών, με αποτέλεσμα η προσπάθεια απομόνωσης του κάθε ισομερούς, όποτε αυτό έγινε εφικτό, να είναι 99

100 χρονοβόρα και να οδηγεί σε ακόμη χαμηλότερες αποδόσεις. Συνεπώς, το εύρος των αποδόσεων στα μορφολινικά/πιπεριδινικά και εστερικά βενζαμίδια κυμαίνεται από 4 έως 79%. Οι χαμηλότερες αποδόσεις παρατηρήθηκαν στα 4-βρωμοβενζυλόξυ παράγωγα ΕΜΚ16-(Ε) και ΕΜΚ16e με 8 και 4% αντίστοιχα. Οι υψηλότερες αποδόσεις αντιστοιχούν στα μίγατα ΕΜΚ1-(Ζ/Ε), ΕΜΚ16-(Ζ/Ε) και ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) με 65, 74 και 79%, και στο ισομερές ΕΜΚ1-(Ζ) με 68%. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις περιπτώσεις όπου εφαρμόσθηκε η χρήση των μικροκυμάτων [ΕΜΚ1-(Ζ), ΕΜΚ1-(Ε), ΕΜΚ17π-(Ζ), ΕΜΚ18-(Ζ) και ΕΜΚ18-(Ζ/Ε)], οι αποδόσεις ήταν πολύ καλύτερες [68, 35, 45, 60 και 79% αντίστοιχα]. Το κυριότερο πλεονέκτημα είναι ότι απομονώθηκαν απ ευθείας καθαρά προϊόντα, κυρίως σε μία μορφή ισομερούς [πλην ΕΜΚ18-(Ζ/Ε)]. Αντίθετα, με την εφαρμογή της μεθόδου 2 παρήχθησαν μόνο μίγματα ισομερών [ΕΜΚ1-(Ζ/Ε), ΕΜΚ16-(Ζ/Ε)]. Όσον αφορά στη σύνθεση των ενώσεων ΕΜΚ1-(Ε) και ΕΜΚ16-(Ε) με τη μέθοδο 1, απομονώθηκαν μετά από ανακρυστάλλωση σε μία μορφή ισομερούς και αύξηση της τιμής του όγκου του Ar (πίνακας 10) οδήγησε σε μείωση της απόδοσης τους (29 και 8% αντίστοιχα). Τα πιπεραζινικά διπλά βενζαμίδια λαμβάνονται σε αποδόσεις από 16 ως 94%. Οι υψηλότερες παρατηρούνται στα ΕΜΚ1p-(Ζ) (94%) και EMK18p-(Z) (92%), με το χαρακτηριστικότερο κοινό τους σημείο η χρήση μικροκυμάτων. Ωστόσο, για τα ΕΜΚ1p-(E) και EMK17p-(Z) η χρήση της μικροκυματικής μεθόδου δεν είχε ανάλογα αποτελέσματα (10 και 19% αντίστοιχα). Πάντως, ανεξάρτητα από την ακολουθούμενη μέθοδο, παραλαμβάνεται πάντα μία μορφή ισομερούς. Σημαντικότερο ρόλο στον καθορισμό της τελικής διαμόρφωσης των βενζαμιδίων στο χώρο, παίζει η αρχική διαμόρφωση της οξαζολόνης από την οποία προέρχονται. Αυτό ισχύει για το μεγαλύτερο μέρος των συνθέσεων [π.χ EMK1b EMK1p-(E), EMK16b EMK16-(E), ΕΜΚ17α ΕΜΚ17-(Ζ) κλπ], με εξαίρεση τη σύνθεση του ΕΜΚ1-(E) από την ΕΜΚ1α. Η παρασκευή του ΕΜΚ1-(Ζ) από την ΕΜΚ1α κατέστη δυνατή μόνο μετά τη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας με διαλύτη οξικό αιθυλεστέρα αντί για τολουόλιο, και μείωση της ισχύος και της θερμοκρασία στα 50W και 80 o C αντίστοιχα, αντί για τις συνθήκες των 300W και 100 o C, οι οποίες οδήγησαν στην παρασκευή του ΕΜΚ1-(Ε). Η παραπάνω παρατήρηση αποτελεί μία επιβεβαίωση του κινητικού ελέγχου τον οποίο ασκεί η μικροκυματική μέθοδος στην εξέλιξη μίας αντίδρασης. Όλα τα μίγματα ισομερών προήλθαν από οξαζολόνες Z διαμόρφωσης. Τέλος για την παρασκευή του ΕΜΚ17p-(Z) με τη μέθοδο της αιθύλενο γλυκόλης αξίζει να σημειωθεί ότι, ενώ η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας με σύστημα διαλυτών χλωροφόρμιο/μεθανόλη 7:1 έδινε την εικόνα καθαρού προϊόντος, η παραχθείσα μικρή ποσότητα περιόρισε την περαιτέρω κατεργασία. Τα δεδομένα από την φασματοσκοπική εξέταση υπερύθρου IR των μορφολινικών/πιπεριδινικών, εστερικών και πιπεραζινικών βενζαμιδίων (μορφή αιωρήματος σε nujol πλην ΕΜΚ16e και ΕΜΚ17e τα οποία πάρθηκαν σε μορφή δισκίου σε στερεό KBr) έδειξαν ευρεία απορρόφηση στα cm 1 όπου απορροφά ο αμινικός δεσμός Ν-Η, ισχυρές απορροφήσεις στα cm 1, περιοχή στην οποία απορροφούν τα δύο αμιδικά καρβονύλια και στα cm 1, περιοχή στην οποία απορροφά ο διπλός δεσμός (C=C). Στα εστερικά βενζαμίδια έχουμε μόνη διαφορά στην περιοχή στην οποία απορροφούν οι δύο καρβονυλικοί δεσμοί καθώς το εστερικό καρβονύλιο (ισχυρότερο) απορροφά στα 1705 cm 1, ενώ το αμιδικό-όπως ήταν αναμενόμενο-απορροφά στα 1648 cm 1. Τέλος σε όλα τα αμιδικά παράγωγα στην περιοχή cm 1 100

101 εμφανίζεται η δεύτερη ζώνη απορρόφησης του αμιδικού δεσμού, η οποία οφείλεται στη δόνηση κάμψης του δευτεροταγούς αμιδικού υδρογόνου. Κατά την εξέταση των ενώσεων με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1 H NMR και 13 C-NMR (DMSO/CDCl 3, TMS), οι παρατηρηθείσες χημικές μετατοπίσεις και ο αριθμός πρωτονίων επιβεβαιώνουν τις προτεινόμενες δομές. Όπως θα αναφερθεί παρακάτω, ο αρυλομεθυλενικός δεσμός μπορεί να οδηγήσει σε Ε και Ζ ισομερή, ωστόσο τα βενζαμίδια στις περισσότερες περιπτώσεις διατηρούν την διαμόρφωση της αρχικής οξαζολόνης. Και σε αυτές τις ενώσεις το χαρακτηριστικότερο πρωτόνιο των Ζ-ισομερών στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1 H NMR είναι το βινυλικό υδρογόνο, το οποίο εμφανίζεται σε τιμές δ από 5.83 έως 6.68 ppm, και το διαφοροποιεί από τα αντίστοιχα Ε-ισομερή στα οποία το ίδιο πρωτόνιο εμφανίζεται σε υψηλότερες τιμές δ. Για παράδειγμα, όπως φαίνεται και στα φασματοσκοπικά δεδομένα, το βινυλικό υδρογόνο του ΕΜΚ1 (Z-ισομερές) εμφανίζεται σε τιμή δ=6.16ppm, ενώ του ΕΜΚ1 (Ε-ισομερές) σε τιμή δ=6.98ppm (μικρότερες τιμές μαγνητικού πεδίου-downfield). Ανάλογα δεδομένα ισχύουν και για τις ενώσεις ΕΜΚ16-(Ζ) (δ=6.03ppm) και ΕΜΚ1p-(Z) (δ=6.35ppm), σε σχέση με τα ισομερή τους ΕΜΚ16-(Ε) (δ=6.88ppm) και ΕΜΚ1p-(Ε) (δ= ppm). Στα εστερικά βενζαμίδια EMK16e και EMK17e η χημική μετατόπιση του βινυλικού δακτυλίου εμφανίζεται αρκετά υψηλότερα από τα μορφολινικά ανάλογά τους, σε τιμές δ= και 7.39 ppm αντίστοιχα. Τέλος σημαντικότατο ρόλο στην διευκρίνιση/ταυτοποίηση όλων των δομών των παραγόμενων προϊόντων είχε η φασματοσκοπία μάζας LC MS (ΕSΙ). Παρατηρήθηκε η εμφάνιση μοριακών ιόντων [Μ+Η] +, κορυφών [Μ+Η+Νa] +, [Μ+Η+Κ] +, [M+H+HCOOH] +, [M+CH 3 OH+Na] +, [M+2CH 3 OH+Η] +, καθώς και του μοριακού ιόντος [Μ Η] + στην αρνητική κλίμακα του φάσματος MS. Ιδιαίτερα στα μορφολινικά/πιπεριδινικά/εστερικά παράγωγα, πλην ΕΜΚ16e και EMK16 λόγω μεγάλου μοριακού βάρους, εμφανίζεται η χαρακτηριστική κορυφή [2Μ+Νa] + [9]. Ειδική περίπτωση ήταν η σάρωση των παραγώγων τα οποία περιέχουν ένα άτομο βρωμίου (ΕΜΚ16α, ΕΜΚ16e, EMK16), καθώς εμφανίζονται οι ισοϋψείς κορυφές των θραυσμάτων με διαφορά δύο μονάδων λόγω της ισόποσης παρουσίας των δύο ισομερών του βρωμίου ( 79 Br και 81 Br) στη φύση. Ωστόσο, η καθοριστικότερη συμβολή της φασματοσκοπίας μαζών ήταν στην επιβεβαίωση της παρασκευής των πιπεραζινικών παραγώγων ως διπλών βενζαμιδίων και όχι ως μονοϋποκατεστημένων αναλόγων Γεωμετρική ισομέρεια οξαζολονικών παραγώγων και των αντίστοιχων βενζαμιδίων Αρχικά θα ήταν σκόπιμο να αναφερθούμε στην στερεοχημεία των οξαζολονικών παραγώγων και των αντίστοιχων βενζαμιδίων τους. Όλα τα προϊόντα των αντιδράσεων που πραγματοποιήθηκαν εμφανίζουν γεωμετρική ισομέρεια Z (Zusammen)-E (Entgegen) λόγω ύπαρξης του αρυλομεθυλενικού δεσμού τόσο στα οξαζολονικά παράγωγα, όσο και στα αντίστοιχα βενζαμίδια. Εξάλλου η γεωμετρική διάταξη των προϊόντων της διάνοιξης του οξαζολονικού δακτυλίου (βενζαμιδίων) καθορίζεται: 101

102 Ζ-διαμορφώσεις Ε-διαμορφώσεις Σχήμα 51 Διαμορφώσεις (Z/E) προϊόντων α) από τη γεωμετρική ισομέρεια ως προς τον διπλό δεσμό της αρχικής οξαζολόνης και β) από τις πειραματικές συνθήκες [10]. Ενώ αρχικά είχε υποστηριχθεί ότι παράγονται τα E- ισομερή, εκ των υστέρων αποδείχθηκε σύμφωνα με τη βιβλιογραφία [11], ότι με τη γενική μέθοδο παρασκευής των οξαξολονικών παραγώγων την οποία ακολουθήσαμε παράγονται κυρίως τα Z-ισομερή, γεγονός το οποίο μπορεί να επιβεβαιωθεί: με τη βοήθεια της διάθλασης των ακτίνων X στα κρυσταλλικά προϊόντα (X-ray diffraction) [12], με φασματοσκοπικά δεδομένα 1 H-NMR όπου η χημική μετατόπιση του βινυλικού υδρογόνου του Z-ισομερούς εμφανίζεται σε υψηλότερες τιμές μαγνητικού πεδίου (χαμηλότερες τιμές δ) από ότι του Ε-ισομερούς [13], αλλά και με δεδομένα από 13 C-NMR [14]. Εξάλλου, εξαιτίας των στερεοχημικών παρεμποδίσεων η Z διαμόρφωση μοιάζει περισσότερο εφικτή [8]. Τέλος, η Ζ διαμόρφωση μπορεί να ισομεριωθεί σε Ε, αλλά η τελευταία λόγω αστάθειας μετασχηματίζεται και πάλι στη Ζ διαμόρφωση με φωτοενεργοποίηση [15]. Όσον αφορά στα βενζαμίδια το πιο πιθανό είναι να διατηρούν, όπως προαναφέρθηκε, τη γεωμετρική ισομέρεια του αρχικού οξαζολονικού παραγώγου, και συνεπώς να αποκτούν κι αυτά Z διαμόρφωση [16], πλην ορισμένων περιπτώσεων όπου, προκύπτουν Ε-ισομερή λόγω των εκάστοτε ακολουθούμενων πειραματικών συνθηκών. Για παράδειγμα, όπως προαναφέρθηκε, τα μικροκύματα ασκούν περισσότερο κινητικό παρά θερμοδυναμικό έλεγχο επί των πραγματοποιούμενων αντιδράσεων, με αποτέλεσμα σε ορισμένες περιπτώσεις να παραλαμβάνονται τα κινητικά σταθερότερα Ε ισομερή σε βάρος των αναμενόμενων, θερμοδυναμικά σταθερότερων, Ζ ισομερών, ή και το αντίστροφο. Η σύνθεση της ένωσης ΕΜΚ17π πραγματοποιήθηκε από την κατάλληλη οξαζολόνη Ζ διαμόρφωσης. Κατά την παραμονή της (διαλυμένη σε CHCl 3 ), το διάλυμα άλλαξε χρώμα και από διαυγές μετατράπηκε σε κίτρινο, του οποίου η ανάλυση με φασματοσκοπία 1 H- NMR απέδειξε ότι είναι μίγμα ισομερών Z/E. Μία ακόμη παρατήρηση η οποία αποτελεί ένδειξη Ζ διαμόρφωσης των βενζαμιδίων είναι το γεγονός ότι όλα τα προϊόντα με χαμηλή τιμή δ βινυλικού Η, παρουσιάζουν ενιαία κορυφή των πρωτονίων μορφολίνης/πιπεριδίνης που βρίσκονται δίπλα στον αμιδικό δεσμό. Απεναντίας τα ισομερή τους εμφανίζουν τιμή δ βινυλικού Η υψηλότερη και ταυτόχρονα διαχωρισμό των πρωτονίων μορφολίνης/πιπεριδίνης με παρουσία τους σε υψηλότερη τιμή μαγνητικού πεδίου (χαμηλότερη τιμή δ). Ο διαχωρισμός τους και η χημική τους μετατόπιση προφανώς οφείλεται στο ότι τώρα, με την αλλαγή της διαμόρφωσης από Ζ σε Ε ή το αντίστροφο, αλλάζει και το χημικό περιβάλλον αυτών των πρωτονίων. Επειδή όμως η μόνη προφανής αλλαγή η οποία λαμβάνει χώρα κατά την αλλαγή της διαμόρφωσης Ζ/Ε είναι η αλλαγή προσανατολισμού του αρυλικού δακτυλίου των βενζαμιδίων (σχήμα 51), συμπεραίνουμε ότι τα εν λόγω πρωτόνια εισέρχονται πλέον στη σφαίρα επιρροής (ή 102

103 στον δακτύλιο προστασίας) του δακτυλίου αυτού, γεγονός το οποίο μπορεί να συμβεί στη Ε-διαμόρφωση. Συνεπώς, προϊόντα με τιμή δ βινυλικού Η χαμηλή έχουν Ζ διαμόρφωση, ενώ τα ισομερή τους με τιμή δ βινυλικού Η υψηλότερη έχουν Ε διαμόρφωση Διευκρίνιση δομής ΕΜΚ19p-(Ζ) με τη βοήθεια φασματοσκοπίας δύο διαστάσεων (2D NMR) Η ένωση ΕΜΚ19p-(Ζ) μελετήθηκε με τη βοήθεια φασματοσκοπίας δύο διαστάσεων. Χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι COSY, HSQC, HMBC και NOESY, με σκοπό αφενός την απόδοση των κορυφών του 1 Η-NMR στα αντίστοιχα υδρογόνα, και αφετέρου την αποσαφήνιση της στερεοχημείας (Ζ ή Ε) της ένωσης. Όσον αφορά στις παραπάνω τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν η μέθοδος COSY (correlation spectroscopy) αποτελεί ομοπυρηνική μέθοδο με την οποία εντοπίζονται γειτονικά Η τα οποία βρίσκονται σε spin-spin σύζευξη (Homonuclear through-bond correlation method), ενώ οι μέθοδοι HSQC και HMBC αποτελούν ετεροπυρηνικές μεθόδους (Heteronuclear through-bond correlation method) οι οποίες φανερώνουν τη συσχέτιση δύο διαφορετικών πυρήνων που ενώνονται μεταξύ τους με δεσμούς. Τέλος με τη μέθοδο NOESY (Nuclear Overhauser effect spectroscopy) υποδεικνύονται Η τα οποία βρίσκονται κοντά στο χώρο σε αποστάσεις 4-6 Å, γι αυτό και αποτελεί μέθοδο συσχέτισης πυρήνων στο χώρο (through-space correlation method). Η διαφορά μεταξύ των δύο 1 Η ομοπυρηνικών τεχνικών COSY και NOESY οφείλεται στο ότι στη COSY τεχνική κυρίαρχο ρόλο παίζει η βαθμιαία-j-σύζευξη (Scalar (J) coupling) η οποία προκαλεί spin-spin συσχέτιση μεταξύ γειτονικών πυρήνων, ενώ στη τεχνική NOESY οι διασταυρούμενες αποδιεγέρσεις (cross-relaxations), οι οποίες είναι χαρακτηριστικές πυρήνων που βρίσκονται κοντά στο χώρο, οφείλονται κατ αποκλειστικότητα στις άμεσες διπολικές συζεύξεις (direct dipoledipole coupling). Από την άλλη πλευρά, η κυριότερη διαφορά μεταξύ των ετεροπυρηνικών τεχνικών HSQC και HMBC έγκειται στο ότι στη μέθοδο HSQC (Heteronuclear singlequantum correlation spectroscopy) εντοπίζονται ετεροπυρήνες οι οποίοι απέχουν κατά ένα δεσμό, ενώ με τη μέθοδο HMBC (Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy) εντοπίζονται ετεροπυρήνες οι οποίοι απέχουν από 2 ως 4 δεσμούς. Συνεπώς, ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων από τις παραπάνω μεθόδους οδηγεί στην εξαγωγή συμπερασμάτων ως προς την πιθανή διαμόρφωση του μορίου στο χώρο. 103

104 Σχήμα 52 Τυχαία δομή ΕΜΚ19p Δεδομένα και συμπεράσματα από φάσματα HSQC, HMBC και COSY Κατά την αρχική αποτίμηση του φάσματος 1 H-NMR της παραπάνω ένωσης οι κορυφές οι οποίες αποδόθηκαν εξ αρχής είχαν ως εξής: δ=9.40 σε Η 8, 7.93 σε Η 1, 7.58 Η 3 και 3.88 σε Η 9. Αδιευκρίνιστες παρέμειναν οι κορυφές δ=7.54, 7.52, 6.49, 6.39, 5.83 οι οποίες έπρεπε να αποδοθούν στα εναπομείναντα Η 2, 4, 5, 6 και 7. Σε αυτή την περίπτωση τη λύση έδωσαν τα φάσματα HSQC, HMBC και COSY. Αρχικά από το φάσμα COSY (εικόνα 23) παρατηρούμε ότι υπάρχουν δύο σημαντικές διασταυρούμενες, και συμμετρικές ως προς την διαγώνιο, κορυφές (cross peaks) σε τιμές δ (7.93, 7.52) και (7.54, 6.49). Σύμφωνα με όσα προαναφέρθηκαν για την τεχνική αυτή συμπεραίνουμε ότι κάθε διασταυρούμενη κορυφή ανήκει σε δύο γειτονικά Η. Συνεπώς, αφού η τιμή δ=7.93 ανήκει στο Η 1 και διασταυρώνεται με την τιμή δ=7.52, τότε και αυτή η κορυφή θα ανήκει σε υδρογόνο του φαινυλίου. Άρα δ=7.52 σε Η 2 και δ=7.54 σε Η 6. Από το γεγονός αυτό απορρέει λογικά και το επόμενο συμπέρασμα: εφόσον η τιμή δ=7.54 ανήκει στο Η 6 και διασταυρώνεται με την τιμή δ=6.49, τότε και αυτή η κορυφή θα ανήκει σε υδρογόνο της φούρυλο ομάδας. Άρα δ=6.49 σε Η 5. (Όλες οι παραπάνω λογικές συνεπαγωγές απορρέουν αρχικά από τα όσα ήδη είναι γνωστά για τη φασματοσκοπία 1 Η-NMR στους υποκατεστημένους ετεροκυκλικούς και μη αρωματικούς δακτυλίους και τελικά απομένουν να επαληθευθούν από τη συνδυαστική φασματοσκοπική μελέτη η οποία ακολουθήθηκε για την εν λόγω ένωση). Λόγω του γεγονότος ότι οι κορυφές 6.39 και 6.49 είναι πολύ κοντά στο φάσμα COSY, δεν μπορεί να γίνει σαφές εάν υπάρχει μεταξύ τους συσχέτιση (διασταυρούμενη κορυφή) ώστε να αποδοθεί και η κορυφή 6.39 σε υδρογόνο της φούρυλο ομάδας. Βέβαια η απουσία διασταυρούμενης κορυφής της τιμής 5.83 με κάποιο άλλο υδρογόνο, αποτελεί μία ένδειξη ότι αντιστοιχεί στο βινυλικό υδρογόνο (Η 7 ), αλλά όχι και απόδειξη. Σε αυτό το σημείο επιστρατεύτηκε το φάσμα HMBC (πίνακας 20), από όπου φαίνεται διασταυρούμενη κορυφή του υδρογόνου 5.83 με τον άνθρακα , ο οποίος αδιαμφισβήτητα αποτελεί άνθρακα καρβονυλίου. Λαμβάνοντας και πάλι υπόψη ότι η φασματοσκοπική αυτή μέθοδος εντοπίζει ετεροπυρήνες οι οποίοι απέχουν από 2 ως 4 δεσμούς, αλλά όχι παραπάνω, συμπεραίνουμε ότι το μόνο υδρογόνο (πλην αμιδικού) το οποίο πληρεί αυτή την προϋπόθεση είναι το βινυλικό. Άρα δ=6.39 σε Η 4 και δ=5.83 σε Η 7. Τέλος μπορεί να ειπωθεί ότι ο λόγος για τον οποίο το Η 4 εμφανίζεται περισσότερο προστατευμένο (upfield-shielded) 104

105 από το Η 5, είναι ότι βρίσκεται στον κώνο προστασίας του διπλού δεσμού, συμπέρασμα το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί και στην προσπάθεια διευκρίνισης της δομής του μορίου στο χώρο. Πίνακας 15 Συγκεντρωτικά στοιχεία φάσματος HMBC Τιμές (δ) υδρογόνων Η Τιμές (δ) ανθράκων C b ` c 164 d a a c g i f i e Επίσης για να αποκλειστεί το ενδεχόμενο ότι η κορυφή στα δ=5.83 αντιστοιχεί στο αμιδικό υδρογόνο, παρατηρούμε στο φάσμα HSQC (πίνακας 21), ότι το υδρογόνο αυτό παρουσιάζει διασταυρούμενη κορυφή με άνθρακα! Πίνακας 16 Συγκεντρωτικά στοιχεία φάσματος HSQC Τιμές (δ) υδρογόνων Η Τιμές (δ) ανθράκων C k k j f g h b c a Προς επιβεβαίωση των παραπάνω συμπερασμάτων παρατίθενται μόνο τα τμήματα των φασμάτων COSY, HSQC και HMBC (εικόνες 24, 25, 26 αντίστοιχα) με τα σημεία τος. Ολόκληρα τα φάσματα παρατίθενται στο παράρτημα-φάσματα. 105

106 Εικόνα 24 Φάσμα COSY με εστίαση στην αρωματική περιοχή με τις χαρακτηριστικές διασταυρούμενες κορυφές Εικόνα 25 Φάσμα HSQC με εστίαση στην περιοχή με τις χαρακτηριστικές διασταυρούμενες κορυφές. Με τη τεχνική διόρθωσης φάσης η οποία ακολουθήθηκε, οι μπλε κορυφές αντιπροσωπεύουν τα μεθυλενικά υδρογόνα (πιπεραζίνυλο), ενώ οι κόκκινες τα μεθινικά. 106

107 Εικόνα 26 Φάσμα HΜΒC με εστίαση στην αρωματική περιοχή με τις χαρακτηριστικές διασταυρούμενες κορυφές Δεδομένα και συμπεράσματα από φάσμα NOESY Στο φάσμα NOESY εμφανίζονται περισσότερες διασταυρούμενες κορυφές με αποτέλεσμα η μελέτη του να απαιτεί περισσότερη προσοχή και οργάνωση. Έτσι ο παρακάτω πίνακας (πίνακας 22) σκοπό έχει την ομαδοποίηση και απλοποίηση των αποτελεσμάτων τα οποία παρουσιάζονται ευκρινέστερα κατά την εστίαση στην περιοχή τος του φάσματος (εικόνα 27). Ολόκληρο το φάσμα παρατίθεται στο παράρτημα-φάσματα. Πίνακας 17 Συγκεντρωτικά και ομαδοποιημένα χρωματικά ανά χαρακτηριστικές ομάδες τα στοιχεία φάσματος NOESY Διασταυρούμενες Εμπλεκόμενα Η κορυφές (δ) (9.40, 7.52) Η 8 (αμιδικό) Η 2 (φαινύλιο) (9.40, 3.87) Η 8 (αμιδικό) Η 9 (πιπεραζίνυλο) (7.92, 7.55) Η 1 (φαινύλιο) Η 6 (φούρυλο) (7.92, 6.49) Η 1 (φαινύλιο) Η 5 (φούρυλο) (7.93, 6.39) Η 1 (φαινύλιο) Η 4 (φούρυλο) (7.92, 5.82) Η 1 (φαινύλιο) Η 7 (βινυλικό) (7.92, 3.88) Η 1 (φαινύλιο) Η 9 (πιπεραζίνυλο) (7.51, 6.49) Η 2 (φαινύλιο) Η 5 (φούρυλο) (7.51, 6.40) Η 2 (φαινύλιο) Η 4 (φούρυλο) (7.51, 5.82) Η 2 (φαινύλιο) Η 7 (βινυλικό) (7.51, 3.88) Η 2 (φαινύλιο) Η 9 (πιπεραζίνυλο) (6.49, 5.82) Η 5 (φούρυλο) Η 7 (βινυλικό) 107

108 Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων Βενζαμιδίων με βιολογικό (6.49, 3.88) (6.39, 3.88) Η5 (φούρυλο) Η4 (φούρυλο) Η9 (πιπεραζίνυλο) Η9 (πιπεραζίνυλο) Εικόνα 27 Εστίαση στην περιοχή τος με τις διασταυρούμενες κορυφές Από τα παραπάνω δεδομένα προκύπτει εγγύτητα μεταξύ χαρακτηριστικών ομάδων του μορίου. Συνεπώς το φαινύλιο είναι κοντά σε όλες τις χαρακτηριστικές ομάδες (πιπεραζίνυλο, φούρυλο, βινυλικό και αμιδικό Η), ενώ το βινυλικό Η είναι κοντά σε φαινύλιο και φούρυλο ομάδα. Τα υδρογόνα της φούρυλο ομάδας παρουσιάζουν εγγύτητα με τα υδρογόνα του φαινυλίου και της πιπεραζίνυλο ομάδας αλλά μόνο το Η5 βρίσκεται σε απόσταση μικρότερη των 6Å από το βινυλικό. Τέλος το αμιδικό υδρογόνο βρίσκεται στο χώρο κοντά σε φαίνυλο και πιπεραζίνυλο ομάδα. Τελικά, λαμβάνοντας υπόψη όλα τα δεδομένα δεν είμαστε σε θέση να προτείνουμε με ασφάλεια την Ζ ή Ε μορφή της ένωσης. Σε αυτό συντελεί η συμμετρική δομή του μορίου αλλά και η δυνατότητα του δακτυλίου της πιπεραζίνης να αλλάζει συνεχώς τη δομή της στο χώρο (κυρίως δομή ανάκλιντρου). 5.2 ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ IN VITRO ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Η μελέτη της δραστικότητας των υπό εξέταση ενώσεων για τη δράση τους ως αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη-αναλγητικά, αναστολείς της τυροσινάσης και της πρωτεόλυσης, αλλά και ως αντιμικροβιακά πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια πειραμάτων in vitro και in vivo. Η αξιολόγηση των συγκεκριμένων ενώσεων έγινε με τη χρήση γνωστών ή τροποποιημένων τεχνικών από τη βιβλιογραφία και τα αποτελέσματά τους συγκρίθηκαν ως προς αυτά που παρουσίασαν οι πρότυπες ουσίες αναφοράς, στις ίδιες πειραματικές συνθήκες. 108

109 5.2.1 Αξιολόγηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την υπεροξείδωση του λινελαϊκού οξέος η οποία επάγεται από το διϋδροχλωρικό άλας του 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμιδίου (AAPH) Ως λιπιδική υπεροξείδωση ορίζεται η οξειδωτική αλλοίωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων που αποτελούν βασικά συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών και των υποκυτταρικών σωματιδίων. Είναι γνωστή από πολλά χρόνια και πρόκειται για τη χημική διαδικασία που προκαλεί την τάγγιση των λιπών και των ελαίων. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα περιέχουν μη διακλαδιζόμενες αλυσίδες με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα (συνήθως 14 24), με διπλούς δεσμούς cis διαμόρφωσης και, λόγω της ιδιομορφίας της δομής τους και του χαμηλού σημείου τήξεως τους, συμβάλλουν στη ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Κατά συνέπεια, κάθε αλλοίωση αυτών συνεπάγεται τη μείωση της ρευστότητας και τελικώς την απώλεια της λειτουργικότητας της μεμβράνης. Η διαδικασία της λιπιδικής υπεροξείδωσης ξεκινά με την προσβολή του πολυακόρεστου λιπαρού οξέος από οποιοδήποτε χημικό είδος ικανό να προκαλέσει την απόσπαση ατόμου υδρογόνου από μεθυλενική ομάδα (έναρξη), π.χ. ρίζα υδροξυλίου, ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου κ.ά. Μετά την απόσπαση του υδρογόνου, η επικεντρωμένη στο άτομο του άνθρακα λιπιδική ρίζα βρίσκεται σε ισορροπία με τη διενική της μορφή. Έπειτα, το μοριακό οξυγόνο, αφού είναι αρκετά λιπόφιλο, εισέρχεται στη μεμβράνη και προκύπτει η υπεροξυ ρίζα. Από το σημείο αυτό αρχίζει η διάδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης, της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η υπεροξυ-ρίζα μπορεί: α) να οδηγήσει στο σχηματισμό κυκλικών υπεροξειδίων, β) να αποσπάσει άτομο υδρογόνου από άλλο πολυακόρεστο λιπαρό οξύ, ώστε να πυροδοτηθεί νέος κύκλος λιπιδικής υπεροξείδωσης και γ) να δώσει υπεροξείδιο λιπιδίου (σχήμα 53). Επίσης όταν η συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών είναι υψηλή (ή η συγκέντρωση του οξυγόνου χαμηλή) δύναται να συνενωθούν δύο μόρια ριζών δίνοντας ένα «συζευγμένο διένιο», γεγονός το οποίο οδηγεί στο πέρας της αλυσιδωτής αντίδρασης ελευθέρων ριζών. Η απόσπαση του υδρογόνου μπορεί να συμβεί σε διαφορετικά σημεία της ανθρακικής αλυσίδας, π.χ. το αραχιδονικό οξύ μπορεί να δώσει τουλάχιστον τρία υδροϋπεροξείδια με απόσπαση υδρογόνου από τους άνθρακες C 7, C 10 και C 13. Κύρια τελικά προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης είναι δραστικές αλδεΰδες, όπως η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) και η 4-υδροξυ-εννεάλη (HNE), ενώ προκύπτουν και άλλα προϊόντα πολυμερισμού. Από όλα τα παραπάνω γίνεται σαφές ότι η μελέτη της ικανότητας των ενώσεων να αναστέλλουν την λιπιδική υπεροξείδωση είναι επιτακτική. 109

110 Σχήμα 53 Διαδικασία λιπιδικής υπεροξείδωσης Ως εκκινητής των αντιδράσεων ελευθέρων ριζών, στο πείραμα για τον έλεγχο της αντιοξειδωτικής ικανότητας των νέων ενώσεων, χρησιμοποιείται μία υδατοδιαλυτή αζωένωση, το διϋδροχλωρικό άλας του 2,2 διαζω 2 μεθυλο προπανιμιδαμιδίου (AAPH). Η ικανότητα της να παράγει ελεύθερες ρίζες κατά τη θερμική της αποδόμηση, ακόμη και στους 37 o C, την καθιστά κατάλληλη για την έναρξη και τη μελέτη της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Εφόσον το λιπίδιο που χρησιμοποιείται είναι το λινελαϊκό οξύ, τα προϊόντα τα οποία προκύπτουν κατά την υπεροξείδωση του είναι τα συζευγμένα διένια των υπεροξυ-ριζών και υδροϋπεροξειδίων του, τα οποία απορροφούν στα 234nm (σχήμα 54) [17]. Σχήμα 54 Οξειδωτική διαδικασία παρουσία AAPH 110

111 EMK1α ΕΜΚ1b EMK16α EMK17α EMK18α EMK19α EMK17e EMK17π-(Z) EMK1-(Z/E) EMK1-(Z) EMK1-(E) ΕΜΚ16-(Z/E) ΕΜΚ17-(Z) ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) ΕΜΚ18-(Ζ) ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) EMK16p-(Z) ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ18p-(Z) ΕΜΚ19p-(Z) Τρολόξη Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων Βενζαμιδίων με βιολογικό Στο πείραμα η αντιοξειδωτική ικανότητα μπορεί να αποδοθεί στη σταθεροποίηση, μέσω δομών συντονισμού, της ενδιάμεσης ρίζας η οποία προκύπτει κατά την προσβολή του μορίου από την ελεύθερη ρίζα, με συνέπεια τη διακοπή της αλυσιδωτής αντίδρασης λιπιδικής υπεροξείδωσης % Αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης 0 Γράφημα 2 % Αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης 100μM (οξαζολόνες, εστερικά-πιπεριδινικάμορφολινικά βενζαμίδια, πιπεραζινικά βενζαμίδια) Εκτιμώντας την αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης παρατηρούμε τα εξής: α) Οι οξαζολόνες παρουσιάζουν σημαντική αναστολή. Ιδιαίτερα οι ΕΜΚ1α και ΕΜΚ17α εκδηλώνουν πολύ ισχυρή και σχεδόν ισοδύναμη δράση. Η αλλαγή της υποκατάστασης Ar από φαινύλιο σε θειενύλιο, πολύ λίγο φαίνεται να επηρεάζει το αποτέλεσμα. Ακολουθούν οι ΕΜΚ16α και ΕΜΚ18α για τις οποίες ισχύει η ίδια παρατήρηση. Ο μέσος όρος αναστολής που προκύπτει για τα 4 μόρια κυμαίνεται στο 86,5%. Από αυτό γίνεται φανερό ότι η αλλαγή της Ar υποκατάστασης (μικρός ή ογκώδης υποκαταστάτης) δεν προκαλεί στατιστικά σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα και έτσι η δράση φαίνεται να συσχετίζεται περισσότερο με την παρουσία του οξαζολονικού δακτυλίου. Ενδιαφέρουσα όμως είναι η μείωση του ποσοστού αναστολής της ΕΜΚ19α που συνοδεύεται με την παρουσία της φούρυλο ομάδας ως ετεροκυκλικού δακτυλίου. Συγκρίνοντας με το θειένυλο παράγωγο (91%) φαίνεται ότι η φύση του ετεροατόμου στον 5μελή ετεροκυκλικό δακτύλιο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο. Αξιολογώντας την επίδραση της ισομέρειας στο αποτέλεσμα της δράσης για την περίπτωση της 4-βενζυλιδενο-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνης, για την οποία έχουμε απομονώσει τα δύο ισομερή, φαίνεται ότι το cis-ισομερές (ΕΜΚ1α) για στερεοχημικούς λόγους είναι ισχυρότερος αναστολέας συγκρινόμενο με το trans-ισομερές (ΕΜΚ1b). Ενδιαφέρουσα αναστολή παρουσιάζει και το εστερικό προϊόν ΕΜΚ17e το οποίο σχετίζεται με τα επιμέρους δομικά στοιχεία του. β) Μελετώντας την αναστολή η οποία προκαλείται από τα βενζαμίδια, τα αποτελέσματα που προέρχονται τόσο από τα Ζ όσο και από τα Ε ισομερή είναι πολύ ενθαρρυντικά. Όλα τα 111

112 πιπεραζινικά παράγωγα αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση με ποσοστά αναστολής >80%. Στα μορφολινικά παράγωγα τα μίγματα ισομερών ΕΜΚ16-(Ζ/Ε), ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) και οι ενώσεις ΕΜΚ17-(Ζ), ΕΜΚ18-(Ζ) διατηρούν υψηλή αναστολή με ποσοστά > 90%. Εξαιρούνται τα βενζαμίδια της ομάδας ΕΜΚ1 [-(Ζ/Ε), -(Ζ) και -(Ε)]. Επισημαίνεται λοιπόν ότι ανεξάρτητα από την αμίνη που χρησιμοποιήθηκε για την αμιδοποίηση (πιπεραζίνη/μορφολίνη), στις περισσότερες περιπτώσεις επετεύχθη ισχυρή αναστολή της υπεροξείδωσης. Επίσης, παρατηρούμε ότι στην ένωση ΕΜΚ17-(Ζ) αντικατάσταση της μορφολίνης από την πιπεριδίνη [ΕΜΚ17π-(Ζ)] οδηγεί σε μείωση της δράση κατά 21% (από 93% σε 72%). γ) Γενικά διαπιστώνουμε αύξηση της δράσης κατά τη μετατροπή των οξαζολονών στα μορφολινικά και πιπεραζινικά παράγωγά τους, με μοναδική εξαίρεση την ομάδα ενώσεων 1-(Ζ). Η ένωση ΕΜΚ16p-(Ζ) παρουσιάζει υψηλή δραστικότητα (99%), πιθανόν λόγω και της εκτεταμένης συζυγίας του διπλού αυτού βενζαμιδίου, με αποτέλεσμα τη δημιουργία της σταθερότερης ενδιάμεσης ρίζας. Η ομάδα των ενώσεων ΕΜΚ17α-ΕΜΚ17-(Ζ)-ΕΜΚ17p-(Ζ) με τη σταθερά υψηλή ανασταλτική ικανότητα (>90%, γράφημα 3) υποδεικνύει την ευεργετική παρουσία του θειένυλο δακτυλίου στις ενώσεις αυτές, πάντα όμως σε συνδυασμό και με τα άλλα δομικά χαρακτηριστικά των ενώσεων. Εξάλλου, η σημασία της φύσης του ετεροατόμου (S/O) επιβεβαιώνεται και από την παρατήρηση ότι αν ο θειένυλο δακτύλιος αντικατασταθεί με φούρυλο δακτύλιο [ΕΜΚ19α και ΕΜΚ19p-(Ζ)] έχουμε πτώση της δραστικότητας (59.7 και 82.6 % αντίστοιχα) (Z) 1-(E) οξαζολόνες μορφολινικά βενζαμίδια πιπεραζινικά βενζαμίδια Γράφημα 3 Ομαδοποιημένα αποτελέσματα της % αναστολής λιπιδικής υπεροξείδωσης Τέλος, στις περιπτώσεις που ήταν δυνατή η μελέτη και των δύο ισομερών (Ε/Ζ) φάνηκε ότι τα Ε ισομερή [ΕΜΚ1-(E) και ΕΜΚ1p-(E)] προκαλούν ελαφρώς ισχυρότερη αναστολή από τα αντίστοιχα Ζ [ΕΜΚ1-(Ζ) και ΕΜΚ1p-(Ζ)]. Στις περιπτώσεις που δεν έγινε η απομόνωση και των δύο ισομερών (Ε/Ζ) ώστε να μελετηθούν χωριστά, η μελέτη των μιγμάτων έδωσε υψηλά ποσοστά αναστολής. Προσπαθώντας να συσχετίσουμε τα βιολογικά μας δεδομένα με τις φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων ώστε να διερευνήσουμε τις ιδιότητες που εμπλέκονται στην εκδήλωση και το μηχανισμό της αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης, καταλήξαμε στην παρακάτω εξίσωση: 112

113 Log(LP)%=0,009 CMR 2,189 LUMO + 1,945 Ν=12 R=0,706 R 2 =0,499 S=0,049 F 2,9 =4,5 α=0,05 σύμφωνα με την οποία η ολική μοριακή διαθλασιμότητα (CMR) και τα ηλεκτρονιακά φαινόμενα, μέσω της ενέργειας του χαµηλότερου µη κατειληµµένου µοριακού τροχιακού (LUMO), επηρεάζουν την ικανότητα των ενώσεων να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση. Η παράμετρος LUMO είναι η σημαντικότερη και αύξηση της τιμής της σηματοδοτεί ελάττωση της δραστικότητας των μορίων. Εξάλλου, όπως προαναφέρθηκε, η αντιοξειδωτική ικανότητα εξαρτάται από τη(ν) (από)σταθεροποίηση την οποία προκαλούν τα ηλεκτρονιακά φαινόμενα των εκάστοτε υποκαταστατών στο κάθε μόριο. Η λιποφιλικότητα φαίνεται να συμμετέχει πολύ λίγο στην έκφραση της αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης (R=0,354). Αυτό πιθανά να οφείλεται στη συσχέτισή της με τη μοριακή διαθλασιμότητα (0,640). CLOGP CMR LUMO CLOGP - 0,640 0,001 CMR 12-0,254 LUMO Αξιολόγηση της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων επί της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης in vitro Υπάρχουν όλο και περισσότερα πειραματικά δεδομένα και κλινικές παρατηρήσεις οι οποίες υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της λιποξυγονάσης, και συνεπώς τα προϊόντα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος (λευκοτριένια), εκτός από την εμπλοκή τους σε αρκετές παθοφυσιολογικές καταστάσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το άσθμα, η ψωρίαση και οι φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και στη μετάσταση του καρκίνου. Έτσι πολλές ουσίες αξιολογούνται ως προς την ικανότητα τους να αναστέλλουν τη λιποξυγονάση, ούτως ώστε να διερευνηθεί η αντιφλεγμονώδης και, κατ επέκταση, η δυνητικά αντικαρκινική τους δράση [18]. Στο πείραμα γίνεται προσπάθεια να μελετηθεί η ικανότητα των νέων ενώσεων να αναστέλλουν τη λιποξυγονάση, ένζυμο που εμπλέκεται στον κύκλο του αραχιδονικού οξέος. Οι φυτικές λιποξυγονάσες είναι διοξυγονάσες που καταλύουν την οξυγόνωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων και περιέχουν ένα «μη τύπου» αίμης άτομο σιδήρου στο ενεργό τους κέντρο. Κύριο υπόστρωμα για τις φυτικές λιποξυγονάσες αποτελεί το λινελαϊκό οξύ με 18 άτομα άνθρακα και δύο διπλούς δεσμούς, ενώ το αραχιδονικό οξύ, το οποίο αποτελεί το υπόστρωμα για τις λιποξυγονάσες των θηλαστικών, έχει 20 άτομα άνθρακα και 4 διπλούς δεσμούς [19]. 113

114 Σχήμα 55 Δύο πιθανά μονοπάτια (Α και Β) μεταβολισμού του λινελαϊκού οξέος από τη λιποξυγονάση. Επομένως, η λιποξυγονάση καταλύει την είσοδο δύο ατόμων οξυγόνου με τη μορφή της υπερόξυ ρίζας στο άκρο ενός cis 1,4 διενίου. Το αλλυλικό 13 υδρο υπεροξείδιο (13-HPOD) το οποίο προκύπτει απορροφά στα 234nm. Έχει βρεθεί ότι υπάρχει ποιοτική αναλογία μεταξύ της αναστολής που προκαλείται από NSAIDs στη φυτικής προέλευσης (σόγια) LOX και της αναστολής της ζωικής LOX [20]. Έτσι, η φυτική LOX μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μια απλή κατά προσέγγιση δοκιμασία αναστολής. Τα αποτελέσματα παρατίθενται παρακάτω με τη μορφή γραφικών παραστάσεων % Αναστολή της S-LOX Γράφημα 4 % Αναστολή επί της S-LOX των υπό εξέταση ενώσεων 100μM (οξαζολόνες, εστερικάπιπεριδινικά-μορφολινικά βενζαμίδια, πιπεραζινικά βενζαμίδια) Για τις περιπτώσεις όπου η αναστολή της LOX ήταν μεγαλύτερη από 50%, προσδιορίστηκαν οι τιμές IC 50 υπό τις δοθείσες πειραματικές συνθήκες, όπως φαίνεται στο παρακάτω γράφημα

115 Τιμές IC 50 (μμ) ενώσεων επί της S-LOX Γράφημα 5 IC 50 των υπό εξέταση ενώσεων επί της S-LOX (μορφολινικά βενζαμίδια, πιπεραζινικά βενζαμίδια) Γενικά οι οξαζολόνες και το εστερικό παράγωγο που μελετήθηκαν δεν έδωσαν ιδιαίτερα τα αποτελέσματα στις δοθείσες πειραματικές συνθήκες. Από το γράφημα 4 παρατηρούμε ότι η ένωση EMK-1(E), η οποία φέρει ως υποκαταστάτη (Ar) το φαινύλιο, είναι η πιο δραστική με τιμή IC 50 =40.5μM, ενώ το Ζ-ισομερές [ΕΜΚ1-(Ζ)] παρουσιάζει τη μεγαλύτερη IC 50 με τιμή 100μM. Η παρουσία της μορφολινικής ομάδας, γενικά, φαίνεται να σχετίζεται με την εμφάνιση ικανοποιητικής βιολογικής δράσης, καθώς τα μίγματα μορφολινικών βενζαμιδίων ΕΜΚ1-(Ζ/Ε) και ΕΜΚ18-(Ζ/Ε) παρουσιάζουν τιμές IC 50 =92 και 50.5 μm, αντίστοιχα. Εξετάζοντας τα υπόλοιπα αμίδια συμπεραίνεται ότι ενώ το πιπεριδινικό παράγωγο ΕΜΚ17π-(Ζ) και τα μορφολινικά ανάλογα ΕΜΚ17-(Ζ) και ΕΜΚ18-(Ζ) δεν παρουσιάζουν ικανοποιητική δράση, τα πιπεραζινικά παράγωγα ΕΜΚ16p-(Ζ), ΕΜΚ17p- (Ζ), ΕΜΚ18p-(Ζ) και ΕΜΚ19p-(Ζ) εμφανίζουν τιμές IC 50 85, 41, 65 και 87.5 μm αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα δεδομένα από τη μελέτη προσομοίωσης πρόσδεσης των ενώσεων στην 5-LOX (πίνακας 6). Ειδικά για τα βενζαμίδια ΕΜΚ18p-(Z) και ΕΜΚ17p-(Z), από την εικονική μελέτη προσομοίωσης πρόσδεσης στη 5-LOX (virtual screening) φάνηκε ότι και οι δύο ενώσεις προσδένονται στο ίδιο αλλοστερικό κέντρο της πρωτεΐνης, ενώ και ο τρόπος πρόσδεσής τους δεν διαφέρει πολύ. Πιο συγκεκριμένα αναπτύσσονται ισχυρές, λιπόφιλες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στους λιπόφιλους δακτύλιους των μορίων και στα αμινοξέα της πρωτεΐνης, αλλά και δεσμοί υδρογόνου με τη συμμετοχή των αμιδικών τους ομάδων. 115

116 Εικόνα 28 Θέση πρόσδεσης του πιπεραζινικού βενζαμιδίου ΕΜΚ17p-(Z) (σκούρο πράσινο). Το ιόν του σιδήρου αποδίδεται ως πορτοκαλί σφαίρα Εικόνα 29 Θέση πρόσδεσης του πιπεραζινικού βενζαμιδίου ΕΜΚ18p-(Z) (μωβ). Το ιόν του σιδήρου αποδίδεται ως πορτοκαλί σφαίρα Επισημαίνεται ότι, με βάση τη δραστικότητά τους, για τα μορφολινικά βενζαμίδια ισχύει EMK1-(E)>> ΕΜΚ1-(Ζ). Για τα πιπεραζινικά ανάλογά τους ισχύει EMK1p-(E)<< ΕΜΚ1p-(Ζ). Ενώ λοιπόν είναι εμφανής η θετική επίδραση της πιπεραζινικής ομάδας, η λιποφιλικότητα των ενώσεων δεν φαίνεται να επηρεάζει άμεσα τη δράση, αν και οι βιβλιογραφικές ποσοτικές συσχετίσεις έδειξαν ότι για τους αναστολείς της LOX η λιποφιλικότητα είναι η σπουδαιότερη φυσικοχημική ιδιότητα [21]. Αντίθετα, η στερεοχημεία των επιμέρους υποκαταστατών και των μορίων συνολικά, φαίνεται να επηρεάζει το παρόν βιολογικό αποτέλεσμα. Προκαταρκτική QSAR ανάλυση έδειξε ότι η μοριακή διαθλασιμότητα (CMR) των εκάστοτε μορίων, αλλά και η επιμέρους μοριακή διαθλασιμότητα του αρυλικού υποκαταστάτη (MR-Ar), επηρεάζει τη δράση. Ωστόσο, η διαπίστωση αυτή δεν μπορεί να αποτυπωθεί με σαφήνεια, λόγω του μικρού αριθμού των ενώσεων! 116

117 Σε μία προσπάθεια συσχέτισης της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων επί της SLOX με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, καταλήξαμε στην παρακάτω εξίσωση η οποία μας δίνει μία πρώτη προσέγγιση του ρόλου του μοριακού όγκου και της στερεοχημείας στην ενζυμική αναστολή: Log(LOX)%=0,001 MgVol + 1,254 Ν=11 R=0,687 R 2 =0,472 S=0,155 F 1,9 =8,08 α=0,05 Οι στερεοχημικές επιδράσεις με τη μορφή του μοριακού όγκου των μορίων (MgVol) φαίνεται να ασκούν την κυριότερη επίδραση στην εμφάνιση βιολογική δράσης. Ο ρόλος της λιποφιλικότητας δεν είναι διακριτός (R=0,520), λόγω της συσχέτισής της με το μοριακό όγκο (MgVol vs CLOGP=0,634). Παρόλα αυτά, οι συντελεστές R/R 2 είναι μικρής σπουδαιότητας και υπάρχει ανάγκη για τη μελέτη επιπλέον μορίων Αξιολόγηση της ανασταλτική δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της τυροσινάσης από μανιτάρι in vitro Καταλυτική δράση ενζύμου [22] Η τυροσινάση καταλύει τόσο την όρθο-υδροξυλίωση των μονοφαινολών (δράση κρεσολάσης, αντίδραση 1), όσο και την κατά δύο ηλεκτρόνια οξείδωση των όρθοδιφαινολών σε όρθο-κινόνες (δράση κατεχολάσης, αντίδραση 2)(σχήμα 56). Σχήμα 56 Καταλυτική δράση τυροσινάσης (Tyr) Έχει βρεθεί ότι το οξυγόνο το οποίο ενσωματώνεται στο φαινολικό υπόστρωμα προέρχεται από το Ο 2, ενώ τα δύο ηλεκτρόνια που απαιτούνται για την αναγωγή του δεύτερου οξυγόνου σε Η 2 Ο προέρχονται από το ίδιο το υπόστρωμα. Συνεπώς, η τυροσινάση δρα ως εσωτερική μονοοξυγονάση. Επίσης, επισημαίνεται ότι η οξυγόνωση του υποστρώματος σε DOPA είναι το χρονικά καθοριστικό στάδιο της κατάλυσης, η οποία συνεχίζεται με την πολύ γρήγορη οξείδωση της τελευταίας σε DOPA-κινόνη. Τα αποτελέσματα παρατίθενται παρακάτω με τη μορφή γραφικής παράστασης. 117

118 EMK1α ΕΜΚ1b EMK16α EMK17α EMK18α EMK19α EMK17e EMK17π-(Z) EMK1-(E) ΕΜΚ16-(Z/E) ΕΜΚ17-(Z) ΕΜΚ18-(Z/E) ΕΜΚ1p-(Z) ΕΜΚ1p-(E) EMK16p-(Z) ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ18p-(Z) ΕΜΚ19p-(Z) Κογικό οξύ Σχεδιασμός, Σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων Βενζαμιδίων με βιολογικό % Αναστολή της τυροσινάσης μανιταριού Γράφημα 6 % Αναστολή επί της τυροσινάσης των υπό εξέταση ενώσεων 100μM (οξαζολόνες, εστερικά-πιπεριδινικά-μορφολινικά βενζαμίδια, πιπεραζινικά βενζαμίδια) Από το γράφημα 6 παρατηρούμε ότι τα εστερικά, πιπεριδινικά και μορφολινικά βενζαμίδια [ΕΜΚ17e, EMK17π-(Z), EMK1-(E), EMK6-(Z/E), EMK17-(Z), EMK18-(Z/E)] δεν παρουσιάζουν δραστικότητα, ενώ όσον αφορά στις οξαζολόνες, μικρή δράση παρουσιάζουν οι ΕΜΚ1b και ΕΜΚ17α. Τα πιπεραζινικά βενζαμίδια [ΕΜΚ1p-(Z),ΕΜΚ1p-(E), ΕΜΚ16p-(Z), ΕΜΚ17p-(Z), ΕΜΚ18p-(Z), ΕΜΚ19p-(Z)] παρουσιάζουν μικρή ως μέτρια αναστολή του ενζύμου. Φαίνεται ότι η παρουσία της πιπεραζινικής ομάδας συμβάλλει θετικά στην ανασταλτική ικανότητα των υπό εξέταση ενώσεων. Από τα πιπεραζινικά βενζαμίδια μεγαλύτερη δραστικότητα εμφανίζει η ένωση ΕΜΚ17p-(Z) (41.7%), σε συνδυασμό με την ύπαρξη της θειενυλοομάδας. Η αντικατάσταση της θειενυλο-ομάδας από άλλο ετεροκυκλικό δακτύλιο, όπως αυτό του φούρυλο [ΕΜΚ19α, ΕΜΚ19p-(Z)], συντελεί στην απώλεια της δραστικότητας (3 και 17 % αντίστοιχα). Χαμηλή δράση παρουσιάζουν επίσης τόσο το μορφολινικό [ΕΜΚ17- (Ζ)], όσο και το πιπεριδινικό παράγωγο [ΕΜΚ17π-(Ζ)] με θειένυλο ομάδα. Η στερεοχημεία των μορίων (Ε/Ζ) δεν φαίνεται να επηρεάζει την αναστολή της τυροσινάσης από τα πιπεραζινικά βενζαμίδια, γεγονός το οποίο δεν παρατηρήθηκε στις οξαζολόνες στις οποίες η Ε-διαμόρφωση σχετίζεται με την παρουσία της δράσης (ΕΜΚ1b>EMK1α). Προκαταρκτική QSAR ανάλυση των αποτελεσμάτων σηματοδοτεί το ρόλο των στερεοχημικών επιδράσεων με τη μορφή της μοριακής διαθλασιμότητας. Αναλύοντας τα αποτελέσματα με τη βοήθεια του προγράμματος C QSAR καταλήξαμε σε ποσοτική συσχέτιση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των υποκαταστατών με την % αναστολή της τυροσινάσης. Πιο σημαντική ιδιότητα αποδεικνύεται η στερεοχημεία εκφρασμένη ως ολική μοριακή διαθλασιμότητα (CMR), και αύξησή της οδηγεί σε αυξημένη βιολογική δράση. Ακολουθεί η στερεοχημεία του υποκαταστάτη Ar (MR-Ar), αύξηση του οποίου οδηγεί σε μείωση της αναστολής. Log(TYR)%=0,071 CMR - 0,177 MR-Ar + 0,624 Ν=10 R=0,877 R 2 =0,762 S=0,210 F 2,7 =11,61 α=0,01 118

119 Η λιποφιλικότητα (R=0,459) δε φαίνεται να διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην εκδήλωση βιολογικής δράσης, παρά μόνο μέσω της συσχέτισής της με την ολική μοριακή διαθλασιμότητα (CMR) και της μοριακής διαθλασιμότητας του υποκαταστάτη Ar (MR-Ar). Τα παραπάνω αποτελέσματα της ποσοτικής συσχέτισης συμφωνούν με τα αρχικά τα οποία είχαν εξαχθεί από τη μελέτη μόνο οξαζολονκών παραγώγων με ικανότητα αναστολής της τυροσινάσης (πειραματικό μέρος-qsar). Αυτή η ταύτιση δικαιολογεί πιθανόν το κοινό μηχανισμό δράσης των μορίων. CLOGP CMR MR-Ar CLOGP - 0,793 0,595 CMR 13-0,222 MR-Ar Αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί του εντεροβακτηριδίου Escherichia coli Οι δύο διαφορετικές μέθοδοι οι οποίες ακολουθήθηκαν για την διερεύνηση της αντιμικροβιακής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων, χαρακτηρίζονται ως αντιβιοτικές δοκιμασίες Kirby-Bauer (ή KB), καθώς χρησιμοποιούνται είτε αντιβιοτικοί δίσκοι ή πηγαδάκια όπου περιέχονται αντιβιοτικά διαλύματα με σκοπό να διαπιστωθεί εάν συγκεκριμένα βακτήρια είναι ευαίσθητα στην εκάστοτε εξεταζόμενη αντιβιοτική ουσία. Συνοπτικά η διαδικασία έχει ως εξής: μία γνωστή ποσότητα βακτηριακού φορτίου [Escherichia Coli, Gram-αρνητικό, προαιρετικά αναερόβιο, ραβδοειδούς σχήματος εντεροβακτηρίδιο (Enterobacteriaceae)] επωάζεται για ένα ολόκληρο βράδυ παρουσία συγκεκριμένης ποσότητας αντιβιοτικής ουσίας, η οποία είτε βρίσκεται προσροφημένη στον αντιβιοτικό δίσκο ή μέσα στο πηγαδάκι με τη μορφή διαλύματος. Εάν το βακτήριο είναι ευαίσθητο στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό, τότε παρουσιάζεται μία ζώνη γύρω από τη θέση του αντιβιοτικού όπου δεν είναι δυνατή η ανάπτυξη του βακτηρίου, η επονομαζόμενη άλως (ζώνη) αναστολής. Καθώς όμως η ποσότητα του αντιβιοτικού διαχέεται διαμέσω του θρεπτικού υλικού, η συγκέντρωσή του μεταβάλλεται αντιστρόφως ανάλογα με την αύξηση της απόστασης από την πηγή του (δίσκος ή πηγαδάκι), με αποτέλεσμα όσο μεγαλύτερη είναι η άλως αναστολής τόσο πιο ευαίσθητο να αποδεικνύεται το βακτήριο έναντι της υπό εξέταση αντιβιοτικής ουσίας. Επειδή οι δοκιμασίες KB διενεργούνται πάντα υπό τις ίδιες συνθήκες, έχουν μελετηθεί και χαρακτηρισθεί οι ζώνες αναστολής των γνωστών αντιβιοτικών έναντι πολλών μικροβίων. Συνεπώς τα μικρόβια κρίνονται ως ευαίσθητα, ενδιάμεσα ή ανθεκτικά ανάλογα με την παρατηρούμενη ζώνη αναστολής τους. Για παράδειγμα εάν η άλως αναστολής ενός μικροβίου είναι μεγαλύτερη ή ίδια με την προδιαπιστωμένη άλω αναστολής του για το συγκεκριμένο αντιβιοτικό, τότε το μικρόβιο αυτό θεωρείται ευαίσθητο. Αντιθέτως, εάν η άλως αναστολής είναι μικρότερη από την προδιαπιστωμένη, τότε το μικρόβιο θεωρείται ανθεκτικό. Από όλα τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι η άλως αναστολής σε μία δοκιμασία KB, είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (ελάχιστη ποσότητα αντιβιοτικού η οποία απαιτείται για την παρεμπόδιση ανάπτυξης του μικροβίου σε θρεπτικό υλικό για ένα βράδυ- MIC) του εκάστοτε αντιβιοτικού. Η MIC (σε μg/ml) υπολογίζεται από γνωστές γραφικές παραστάσεις, οι οποίες προέκυψαν από προηγούμενες μετρηθείσες ζώνες αναστολής. 119

120 Υπό τις δοθείσες πειραματικές συνθήκες δεν παρατηρήθηκε κάποιο μετρήσιμο αποτέλεσμα (εικόνα 30). Εικόνα 30 Ενώ φαίνεται καθαρά η άλως την οποία δημιουργεί η ουσία αναφοράς (κεφτριαξόνη), οι υπό εξέταση ουσίες δεν παρουσιάζουν καμία ζώνη αναστολής Αξιολόγηση της ανασταλτικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης in vitro Από τη βιβλιογραφία [23] είναι γνωστό ότι η θρυψίνη, η οποία ανήκει στις σερινοπρωτεάσες και παράγεται στο πάγκρεας με την ανενεργή της μορφή ως θρυψινογόνο, επάγει την υδρόλυση της λευκωματίνης-αλβουμίνης η οποία απομονώθηκε από τον ορό βοοειδών. Η θρυψίνη υδρολύει τους πεπτιδικούς δεσμούς της αλβουμίνης οι οποίοι αναπτύσσονται μεταξύ των αμινοξέων λυσίνης και αργινίνης. Τα αποτελέσματα παρατίθενται παρακάτω με τη μορφή γραφικής παράστασης (γράφημα 7) Τιμές IC 50 (μμ) ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης Γράφημα 7 IC 50 των υπό εξέταση ενώσεων επί της πρωτεολυτικής δράσης (οξαζολόνες, εστερικάπιπεριδινικά-μορφολινικά βενζαμίδια, πιπεραζινικά βενζαμίδια) Από τον πίνακα 16 παρατηρούμε ότι οι περισσότερες ενώσεις παρουσιάζουν τιμές IC 50 <10μΜ. Η δραστικότητα των πιπεριδινικών, μορφολινικών και πιπεραζινικών βενζαμιδίων οφείλεται στην κοινή φαρμακοφόρο δομή τους, με την ύπαρξη αμιδικών δεσμών, οι οποίοι αποτελούν το βιολογικό στόχο της θρυψίνης. Οι τιμές IC 50 των 120

121 πιπεραζινικών παραγώγων [ΕΜΚ1p-(Z), ΕΜΚ16p-(Z), ΕΜΚ17p-(Z), ΕΜΚ18p-(Z), ΕΜΚ19p-(Z)] εμφανίζουν μικρή διακύμανση (από 8-9.1μΜ), γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι τα επιμέρους χαρακτηριστικά των ενώσεων δεν παίζουν το σημαντικότερο ρόλο στην εκδήλωση της δραστικότητας. Το πιπεριδινικό και μορφολινικό παράγωγο [ΕΜΚ17π-(Ζ), ΕΜΚ17-(Ζ)] παρουσιάζουν την ίδια δράση, ενώ το εστερικό παράγωγο ΕΜΚ17e, το οποίο αποδείχθηκε ισχυρότερο όλων με IC 50 =1μΜ, διαφοροποιείται δομικά μόνο λόγω της ύπαρξης του εστερικού δεσμού. Όσον αφορά στα οξαζολονικά παράγωγα [ΕΜΚ1b, EMK16a, EMK17a, EMK18a], η υψηλή δραστικότητά τους μπορεί να αποδοθεί στην διάνοιξη του οξαζολονικού δακτυλίου, μετά από την πυρηνόφιλη προσβολή του αμινοξέος του ενεργού κέντρου του ενζύμου στον C της θέσης 5 (εικόνα 15). Στη συνέχεια έγινε περαιτέρω προσπάθεια συσχέτισης δομής-δράσης των ενώσεων με τη βοήθεια του προγράμματος C-QSAR. Η εξαγωγή συμπερασμάτων δεν κατέστη δυνατή λόγω μικρής διακύμανσης των τιμών IC 50. Ωστόσο, διαφάνηκε η συμμετοχή ηλεκτρονιακών φαινομένων στην εκδήλωση της δράσης μέσω των φυσικοχημικών ιδιοτήτων E (HOMO), E (LUMO) και Δ [E(HOMO)-E(LUMO)] (πίνακας 11) Αξιολόγηση της in vitro δράσης της θρυψίνης επί των εξεταζόμενων ενώσεων Το πείραμα πραγματοποιήθηκε ώστε να διαπιστωθεί η in vitro σταθερότητα των νέων ενώσεων ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E) και EMK17p-(Z) παρουσία της θρυψίνης. Όπως προαναφέρθηκε, η θρυψίνη έχει την δυνατότητα να υδρολύει αμιδικούς δεσμούς, με αποτέλεσμα τη μερική διάσπαση των εξεταζόμενων ενώσεων μας, καθεμία εκ των οποίων διαθέτει 4 πιθανά σημεία δράσης του ενζύμου. Σχήμα 57 Πιθανά σημεία δράσης της θρυψίνης Η μερική διάσπαση υποδεικνύεται αρχικά από το χρωματογραφικό έλεγχο των δειγμάτων μετά την έκθεσή τους στη θρυψίνη (πίνακας 17). Η ανάλυση με φασματοσκοπία 1 Η-NMR επιβεβαιώνει τη συνύπαρξη μέρους της αρχικής ένωσης και άλλων προϊόντων, αλλά δεν δίνει σαφή εικόνα για τη δομή των παραγόμενων προϊόντων λόγω των πολλών δυνατών συνδυασμών διάσπασης των μορίων (σχήμα 57). Ωστόσο, στα φάσματα των τριών ενώσεων εμφανίζονται κοινές κορυφές, γεγονός το οποίο υποδηλώνει την δημιουργία ίδιων προϊόντων μετά την επώαση. Η ελεύθερη πιπεραζίνη αποτελεί ένα από τα κοινά προϊόντα και η παρατήρηση αυτή είναι σημαντική, καθώς μπορούμε να εικάσουμε ότι η διάσπαση πραγματοποιείται στα σημεία 2 και 3 με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ανάλογου οξέος, το οποίο ίσως ευθύνεται για τις διαφορετικές τιμές R f 0.6, 0.5 και 0.5 των ενώσεων ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E) και EMK17p-(Z), αντίστοιχα. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι, υπό τις δοθείσες πειραματικές συνθήκες, ο βαθμός διάσπασης της κάθε ένωσης διαφέρει. Φαίνεται ότι το Ζ-ισομερές της ένωσης ΕΜΚ1p [ΕΜΚ1p-(Z)] είναι σταθερότερο από το Ε-ισομερές [EMK1p-(E)]. 121

122 5.3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ IN VIVO ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Αξιολόγηση της ικανότητας των εξεταζόμενων ενώσεων να αναστέλλουν την επαγωγή οιδήματος άκρου ποδός επίμυα η οποία προκαλείται μετά από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης Ο όρος καρραγενίνη, ο οποίος προέρχεται από την ιρλανδική λέξη carraigin και σημαίνει ιρλανδική βρύα, αναφέρεται τόσο στο είδος αυτό καθαυτό του κόκκινου φύκους Chondrus Crispus το οποίο απαντάται στις βραχώδεις περιοχές κατά μήκος των ατλαντικών ακτών, όσο και στο βλεννοπολυσακχαριδικό εκχύλισμά του, το οποίο ανακαλύφθηκε από το Βρετανό φαρμακοποιό Stanford το Ειδικότερα, η καρραγενίνη αποτελεί ένα γνωστό φλογιστικό μέσο που μπορεί να προκαλέσει εμφάνιση φλεγμονής, ενώ απαντάται κυρίως σε 3 μορφές (κ, λ, ι) οι οποίες διαφέρουν ως προς το βαθμό σουλφούρωσης και την αναλογία της γαλακτόζης [24]. Η πρόκληση φλεγμονής από καρραγενίνη χαρακτηρίζεται ως διφασική. Κατά την πρώτη φάση, η οποία διαρκεί 0,5 με 1,5 ώρα, τα κύρια σημεία της φλεγμονής - οίδημα, υπεραλγησία και ερύθημα - εμφανίζονται ταχύτατα μετά τη χορήγηση της καραγεννίνης ως αποτέλεσματα της δράσης προ-φλεγμονωδών παραγόντων βραδυκινίνη, ισταμίνη, ταχυκινίνες, συμπλήρωμα και δραστικές μορφές οξυγόνου και αζώτου. Η δεύτερη φάση, η οποία διαρκεί 3 με 6 ώρες, χαρακτηρίζεται από τη συμμετοχή των προσταγλανδινών. Η αντιφλεγμονώδης δράση των όξινων μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (NSAIDs) είναι συχνά ασθενής στην πρώτη φάση του οιδήματος καρραγενίνης, σε αντίθεση με την επόμενη φάση, όπου συμμετέχουν οι προσταγλανδίνες και εκδηλώνεται ισχυρή αντιφλεγμονώδης δράση. Στο εν λόγω πείραμα η φλεγμονώδης απόκριση ποσοτικοποιείται με την αύξηση του οιδήματος του άκρου ποδός, η οποία φτάνει στο μέγιστο 5 ώρες μετά την ένεση καρραγενίνης και ελέγχεται από αναστολείς των ειδικών μορίων (δραστικών μορφών οξυγόνου και αζώτου, προσταγλανδινών κλπ) τα οποία εμφανίζονται κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους διαδικασίας. Τα αποτελέσματα παρατίθενται παρακάτω με τη μορφή γραφικής παράστασης. Για τον έλεγχο της in vivo αντιφλεγμονώδους δράσης επιλέχθηκαν οι ενώσεις EMK1p-(Z) και EMK17p-(Z) οι οποίες παρουσίασαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα στις in vitro δοκιμασίες. % Aναστoλή της επαγωγής οιδήματος άκρου ποδός επίμυα ΕΜΚ17p-(Z) EMK1p-(Z) Iνδομεθακίνη Γράφημα 8 % Αναστολή της επαγωγής οιδήματος άκρου ποδός επίμυα 122

123 Και τα δύο πιπεραζινικά παράγωγα ΕΜΚ1p-(Z) και EMK17p-(Z) τα οποία διερευνήσαμε παρουσιάζουν ικανοποιητική αντιφλεγμονώδη δράση συγκρινόμενα με την ινδομεθακίνηένωση αναφοράς (58%, γράφημα 8). Μάλιστα στην ΕΜΚ17p-(Z) η παρουσία του ετεροκυκλικού θειένυλο δακτυλίου προσδίδει αναστολή του οιδήματος ισοδύναμη με αυτή της ινδομεθακίνης (56%), ενώ η παρουσία του φαινυλίου [ΕΜΚ1p-(Ζ)] έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της δραστικότητας της ένωσης (44%) Αξιολόγηση της αναλγητικής δράσης των εξεταζόμενων ενώσεων Από τις διάφορες δοκιμασίες οι οποίες χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της αναλγητικής δράσης (π.χ hot plate method) των υπό εξέταση ουσιών, επιλέχθηκε η writhing test καθώς είναι απλή, επαναλήψιμη, γρήγορη, χωρίς να προκαλείται μόνιμη βλάβη των ιστών. Παρά τη φαινομενική έλλειψη μεγάλης εξειδίκευσης της μεθόδου, αφού ελάττωση των συσπάσεων (writhes) λόγω του πόνου μπορεί να παρατηρηθεί και από άλλες ουσίες οι οποίες δεν ανήκουν στα αναλγητικά (π.χ παρασυμπαθητικομιμητικά, αντιισταμινικά, αγχολυτικά κ.α), το writhing test στηρίζεται στο ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε περιπτώσεις έλλειψης άλλων αξιόπιστων δοκιμασιών για τον έλεγχο ασθενούς αναλγητικής δράσης [25]. Η κεντρική ιδέα της δοκιμασίας έγκειται στο ότι το ενιέμενο οξικό οξύ επάγει αντανακλαστικές συσπάσεις ώστε να μελετηθούν οι περιφερικοί αλγοαισθητικοί υποδοχείς. Το οξικό οξύ προκαλεί πόνο αυξάνοντας την τριχοειδική διαπερατότητα [Raj, 1996] και προκαλώντας απελευθέρωση ενδογενών ουσιών, κυρίως PGE 2, στο περιτοναϊκό υγρό των ποντικιών. Οι προσταγλανδίνες, με τη σειρά τους, επάγουν τις κοιλιακές συσπάσεις ευαισθητοποιώντας και ενεργοποιώντας τους περιφερικούς χήμειοαλγοαισθητικούς υποδοχείς οι οποίοι κυρίως ευθύνονται για τον πόνο. Τα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (NSAIDs) αναστέλλουν την κυκλοξυγονάση (COX) στους περιφερικούς ιστούς και έτσι παρεμβάλλονται στο μηχανισμό ώσης του πόνου από τους πρωτεύοντες προσαγωγούς αλγοϋποδοχείς. Από την άλλη πλευρά, ο μηχανισμός δράσης των αναλγητικών σε περιφερικό επίπεδο πιθανόν οφείλεται στον αποκλεισμό της επίδρασης (διαφορά από NSAIDs) ή/και απελευθέρωσης (ομοιότητα με NSAIDs) των ενδογενών ουσιών οι οποίες διεγείρουν τις νευρικές απολήξεις [26]. Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη (NSAIDs) δρουν περιφερικά ως αναλγητικά, με αποτέλεσμα να προκαλούν ανακούφιση από πόνο μικρής έντασης συνδεδεμένο με φλεγμονή. Στα παρακάτω γραφήματα φαίνεται η ικανότητα των υπό εξέταση ενώσεων να ελαττώνουν τον πειραματικό πόνο, σύμφωνα με το writhing test, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. 123

124 % Προστασία από τον πειραματικά προκαλούμενο πόνο ΕΜΚ17p-(Z) ΕΜΚ1p-(Z) Ασπιρίνη Γράφημα 9 % Προστασία από τον πειραματικά προκαλούμενο πόνο-μελέτη αναλγητικής δράσης Για τη μελέτη της αναλγητικής δράσης αξιολογήθηκαν εκ νέου οι ενώσεις ΕΜΚ1p-(Z) και EMK17p-(Z), οι οποίες μελετήθηκαν για την αντιφλεγμονώδη δράση, ενώ ως πρότυπο αναλγητικό χρησιμοποιήθηκε η ασπιρίνη (76.7%, γράφημα 9). Και εδώ τα αποτελέσματα ήταν ανάλογα με το προηγούμενο πείραμα, με την ένωση EMK17p-(Z) να παρέχει μεγαλύτερη προστασία από τον πειραματικά προκαλούμενο πόνο σε σχέση με την ένωση ΕΜΚ1p-(Z) (58.1% έναντι 32.4%). Ίσως το αποτέλεσμα αυτό να σχετίζεται με την αντιφλεγμονώδη δράση των ουσιών αυτών. Από την διακύμανση του αριθμού των συσπάσεων ανά 5 λεπτά (γράφημα 1), παρατηρούμε ότι ενώ με την ένωση αναφοράς παρουσιάζεται μία σχετικά σταθερή εικόνα, με τις υπό εξέταση ενώσεις έχουμε μία κλιμάκωση των συσπάσεων από το 10 ο λεπτό και μετά, με κορύφωση στο τελευταίο πεντάλεπτο. Συγκρίνοντας λοιπόν αυτές τις καμπύλες με την καμπύλη των μαρτύρων (control), συμπεραίνουμε ότι η μέγιστη δυνατή προστασία του ΕΜΚ1p-(Z), όπως και της ασπιρίνης, παρέχεται στα 15 λεπτά με το επιμέρους ποσοστό προστασίας να είναι 42%, ενώ του EMK17p-(Z) εκδηλώνεται άμεσα, με το αντίστοιχο ποσοστό να είναι 100%! λεπτά 10 λεπτά 15 λεπτά 20 λεπτά 25 λεπτά 30 λεπτά Ασπιρίνη ΕΜΚ17p ΕΜΚ1p-(Z) Γράφημα 10 % Προστασία από τον πειραματικά προκαλούμενο πόνο ανά πεντάλεπτο (επιμέρους προστασία) 124

125 Τέλος, από το γράφημα 10 παρουσιάζει το γεγονός ότι η προστατευτική δράση την οποία ασκεί το EMK17p-(Z) στο πειραματόζωο μειώνεται συνεχώς μετά το πρώτο πεντάλεπτο, κάτι το οποίο δεν συμβαίνει στις άλλες δύο ουσίες, και πιθανώς να οφείλεται στην διαφορετική φαρμακοκινητική συμπεριφορά της κάθε ουσίας. 125

126 6. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ολοκληρώνοντας τη μελέτη του σχεδιασμού, της σύνθεσης και της βιολογικής αξιολόγησης των 5-(4Η)-οξαζολονικών και βενζαμιδικών παραγώγων, προκύπτουν τα παρακάτω συμπεράσματα: 1. Σχεδιάσαμε και συνθέσαμε 15 τελικά προϊόντα [5 οξαζολονικά, 4 μορφολινικά βενζαμίδια, 1 πιπεριδινικό βενζαμίδιο και 5 πιπεραζινικά βενζαμίδια] αξιοποιώντας τις προκαταρκτικές μελέτες QSAR και την επιλογή ομάδων οι οποίες πληρούν τα κριτήρια μιας φαρμακοφόρου-λειτουργικής ομάδος. Επιπλέον των ομάδων αυτών, ως πρώτες ύλες χρησιμοποιήσαμε βενζοϋλο-γλυκίνη και κατάλληλα υποκατεστημένες αρωματικές αλδεΰδες. 2. Οι 4-υποκατεστημένες-2-φαινυλοξαζολ-5(4Η)-όνες παρασκευάζονται με την αντίδραση Erlenmeyer-Plochl, και τα βενζαμιδικά παράγωγα τους προκύπτουν κατόπιν πυρηνόφιλης προσβολής του οξαζολονικού δακτυλίου από δευτεροταγείς κυκλικές αμίνες (μορφολίνη, πιπεριδίνη και πιπεραζίνη). 3. Κατά τη συνθετική διαδικασία προέκυψαν δύο εστερικά βενζαμίδια [ΕΜΚ16e και ΕΜΚ17e], κατόπιν πυρηνόφιλης προσβολής από αιθανόλη. 4. Οι δομές των ενώσεων επιβεβαιώθηκαν με στοιχειακές αναλύσεις και φασματοσκοπική εξέταση IR, 1 H NMR, 13 C NMR και MS. 5. Παρατέθηκαν και συζητήθηκαν οι μηχανισμοί όλων των παραπάνω αντιδράσεων. 6. Μετατρέψαμε το οξαζολονικό παράγωγο ΕΜΚ1α (Ζ-ισομερές) σε ΕΜΚ1b (Ε-ισομερές), ενώ επιτύχαμε τη στερεοεκλεκτική σύνθεση των ενώσεων ΕΜΚ1-(Ζ), ΕΜΚ1-(Ε), ΕΜΚ1p- (Z), EMK1p-(E). 7. Μελετήσαμε και διευκρινίσαμε τη γεωμετρική ισομέρεια των οξαζολονικών παραγώγων και των αντίστοιχων βενζαμιδίων τους, ενώ πραγματοποιήσαμε μελέτη φασματοσκοπίας δύο διαστάσεων για την ένωση ΕΜΚ19p-(Z). 8. Γενικά οι νέες ενώσεις οι οποίες συντέθηκαν με κλασική θέρμανση ελήφθησαν σε μέτριες αποδόσεις, ενώ με τη βοήθεια της μικροκυματικής ακτινοβολίας επιτύχαμε καλύτερες αποδόσεις, καθαρότερα προϊόντα και υψηλότερη στερεοεκλεκτικότητα. 9. Επιχειρήσαμε την τυποποίηση των βέλτιστων συνθηκών στις συνθέσεις με μικροκυματική ακτινοβολία με σκοπό τον κινητικό έλεγχο των αντιδράσεων, λαμβάνοντας υπόψη τις φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων και τις αρχές της μικροκυματικής διηλεκτρικής θέρμανσης. 10. Μελετήθηκε η δράση των ενώσεων με διάφορα πειραματικά πρωτόκολλα φαρμακοχημικών δοκιμασιών in vitro και in vivo. 11. Οι περισσότερες ενώσεις παρουσίασαν υψηλή ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το AAPH, με δραστικότερη την ένωση ΕΜΚ16p-(Z). 12. Στην αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης την καλύτερη δράση έδειξαν οι ενώσεις ΕΜΚ1-(Ε) και ΕΜΚ17p-(Z) με τιμές ΙC 50 =40,5 και 41 μm, αντίστοιχα. 13. Η ένωση ΕΜΚ17p-(Z) παρουσίασε την αποτελεσματικότερη αναστολή της τυροσινάσης, εμφανίζοντας διπλάσια δραστικότητα από το κογικό οξύ. 14. Στην αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δράσης, υπό τις δοθείσες πειραματικές συνθήκες, καμία εκ των ενώσεων δεν παρουσίασε ικανοποιητική άλω αναστολής. 126

127 15. Η πλειονότητα των νέων ενώσεων παρουσίασε πολύ υψηλή αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης, με την υψηλότερη να ανήκει στο μοναδικό εστερικό παράγωγο ΕΜΚ17e (ΙC 50 =1μM). 16. Για τις ενώσεις ΕΜΚ1p-(Z), EMK1p-(E) και EMK17p-(Z) μελετήθηκε in vitro η σταθερότητα τους με την επίδραση της θρυψίνης. 17. Οι ενώσεις ΕΜΚ1p-(Z) και EMK17p-(Z) μελετήθηκαν in vivo (0,0057mmol/kg σωματικού βάρους) ως προς την αναλγητική τους δράση και βρέθηκαν να αναστέλλουν τον πόνο που προκλήθηκε από χημικό ερεθισμό. Την μεγαλύτερη προστασία από τον πόνο παρουσίασε η ένωση EMK17p-(Z) με ποσοστό 58%. 18. In vivo μελέτη για την αντιφλεγμονώδη δράση των ίδιων ενώσεων οδήγησε στο συμπέρασμα ότι αποτελεσματικότερη είναι η ένωση EMK17p-(Z) (56%). 19. Για τα βενζαμιδικά παράγωγα τα οποία απομονώθηκαν σε μία μορφή ισομερούς (Z ή E), πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσδεσης στη 5-LOX. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι τα αποτελέσματα των in vitro φαρμακοχημικών πειραματικών διαδικασιών συμφωνούν με τα θεωρητικά αποτελέσματα των μελετών πρόσδεσης. 20. Για τις ενώσεις που συνθέσαμε έγινε προσπάθεια συσχέτισης των in vitro βιολογικών δράσεων που προσδιορίστηκαν, με επιλεγμένες φυσικοχημικές ιδιότητες καθώς και προσπάθεια συσχέτισης των σχέσεων που προέκυψαν με προηγούμενες που αναφέρθηκαν, με σκοπό τη συγκριτική τους μελέτη. Οι τιμές των φυσικοχημικών ιδιοτήτων που χρησιμοποιήθηκαν υπολογίστηκαν με τη βοήθεια των προγραμμάτων C QSAR και Spartan v (Wavefunction Inc.). Σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν η λιποφιλικότητα, οι ηλεκτρονιακές ιδιότητες και οι στερεοχημικές επιδράσεις με τη μορφή της μοριακής διαθλασιμότητας, τόσο ολόκληρου του μορίου όσο και του εκάστοτε υποκαταστάτη. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Τα δεδομένα από τα υπολογιστικά προγράμματα (C QSAR, Spartan v ) και τις μελέτες πρόσδεσης θα αξιοποιηθούν για την καλύτερη στόχευση στη σύνθεση νέων ενώσεων με βελτιωμένη βιολογική δράση. Τα πειραματικά αποτελέσματα υποστηρίζουν τη δυνατότητα χρήσης μικροκυματικής ακτινοβολίας στη σύνθεση των 5-(4Η)-οξαζολονικών και βενζαμιδικών παραγώγων, με οικονομικά (απόδοση, καθαρότητα) και περιβαλλοντικά πλεονεκτήματα. Προσπάθεια στερεοεκλεκτικής σύνθεσης και των υπόλοιπων βενζαμιδικών παραγώγων (τα οποία είτε παρήχθησαν σε μία μορφή ισομερούς ή ως μίγματα), με στόχο τόσο τη διερεύνηση της βιολογικής δράσης του κάθε στερεοϊσομερούς, όσο και την εξαγωγή συμπερασμάτων για τη διαφορετικότητα στη δράση. Πραγματοποίηση μελέτης φασματοσκοπίας δύο διαστάσεων και/ή κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ και σε άλλες ενώσεις, ώστε να αποτυπωθεί πλήρως η στερεοχημεία των βενζαμιδικών παραγώγων. Αξιοποίηση των in vitro αποτελεσμάτων αναστολής της LOX σε περαιτέρω μελέτες προσομείωσης και πρόσδεσης, για τη βελτιστοποίηση του μοντέλου. Η υψηλή δραστικότητα των περισσότερων παραγώγων επί της αναστολής της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης, μπορεί να καταστήσει τα μόρια ως εργαλεία για την επιτυχημένη χρήση τους και σε άλλες σερινοπρωτεάσες όπως θρομβίνη. 127

128 Τα μόρια EMK1p-(Z), EMK1p-(Ε) και EMK17p-(Z) θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως υποστρώματα ή biomarkers για τον έλεγχο της θρυψίνης. Λαμβάνοντας υπόψιν τις ανησυχίες της διεθνούς επιστημονικής κοινότητας για την αναπτυσσόμενη ανθεκτικότητα των βακτηρίων έναντι των ήδη γνωστών αντιβιοτικών, αλλά και την έλλειψη εύρεσης νέων, προτείνεται η διεύρυνση της διερεύνησης της αντιμικροβιακής δράσης, κυρίως των οξαζολονικών παραγώγων, παρά τα μέχρι στιγμής αρνητικά αποτελέσματα. Κι αυτό γιατί παρατηρήθηκε ότι αντιμικροβιακές ενώσεις οι οποίες βρίσκονται σε προχωρημένες φάσεις κλινικών μελετών, ανήκουν στην κατηγορία των οξαζολιδινών [Radezolid-Melinta Therapeutics (Φάση ΙΙ), AZD5847- AstraZeneca (Φάση ΙΙ), Cadazolid-Actelion (Φάση ΙΙΙ), Tedizolid-Cubist Pharmaceuticals (υπό έγκριση από FDA)] [1]. Η ένωση EMK17p-(Z), με το in vitro και in vivo πολλαπλό βιολογικό προφίλ, μπορεί να αποτελέσει αρχική ένωση για το σχεδιασμό οδηγών μορίων με πολλαπλούς στόχους (διαδικασία hit to lead ). Από τα αποτελέσματα είναι πιθανό τα πιπεραζινικά βενζαμιδία, εξαιτίας της υδρόλυσής τους (όπως προκύπτει και από το ανάλογο in vitro πείραμα), να συμπεριφέρονται ως προφάρμακα απελευθερώνοντας δύο μόρια οξέων τα οποία προσομοιάζουν με τα κλασικά όξινα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Αυτό όμως απαιτεί περαιτέρω πειραματικό φαρμακοκινητικό έλεγχο. 128