«Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού της α- τοκοφερόλης με HPLC σε υπόστρωμα αίματος επίμυων και εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ «Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού της α- τοκοφερόλης με HPLC σε υπόστρωμα αίματος επίμυων και εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ Αντωνακάκη Μαρίας ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ κ. Τζήμου- Τσιτουρίδου Ρωξάνη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2017

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία γίνεται προσπάθεια να αναπτυχθεί μια αξιόπιστη, απλή, γρήγορη μέθοδο ανάλυσης, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της α- τοκοφερόλης σε υπόστρωμα αίματος. Η ανάπτυξη της αναλυτικής μεθόδου γίνεται με την χρήση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC). Η μέθοδος αξιοποιείται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της α-τοκοφερόλης σε πραγματικά δείγματα επιμύων. Επιλέχθηκε, για την μέθοδο ανάλυσης ανιχνευτής Υπεριώδους-Ορατού (UV-Vis), με στήλη αντίστροφης φάσης(reversed phase- RP), σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και με τις εξής συνθήκες χρωματογραφίας : Σύσταση Κινητής φάσης (v/v) 5% Η2Ο- 95% MeOH Μήκος κύματος απορρόφησης(nm) 292 Στήλη Απορρόφησης Zorbax XDB-C x50mm με διάμετρο σωματιδίων 3,5μm Όγκος εγχεόμενου δείγματος (μl) 20 Ροή κινητής φάσης (ml/min) 0,6 Μέσος χρόνος έκλουσης, t res (min) 2,66 Η καμπύλη βαθμονόμησης, που προέκυψε από την ανάλυση πρότυπων δειγμάτων τοκοφερόλης, διάφορων συγκεντρώσεων είναι η εξής: y = 5102x και με συντελεστή συσχέτισης R² = 0,9912. Το μέσο ποσοστό επαναληψιμότητας είναι %RSD= 3,157. Το όριο ανίχνευσης βρέθηκε να είναι στα 0,1 μg/ml για κάθε 20 μl εγχεόμενου δείγματος. Από την ανάλυση εμβολιασμένων δειγμάτων ορού αίματος επιμύων, με διάλυμα α- τοκοφερόλη, προέκυψε καμπύλη βαθμονόμησης της συγκέντρωσης των εμβολισμένων δειγμάτων με την εξής εξίσωση : y = 32171x και συντελεστή συσχέτησης R² = 0,9929. Επιτεύχθηκε ικανοποιητικός βαθμός ανάκτησης στα εμβολιασμένα δείγματα ( το ποσοστό ανάκτησης κυμαίνεται από 90 ως και 98%). Το μέσο ποσοστό επαναληψιμότητας ήταν αρκετά ικανοποιητικό (%RSD= 2,458). Η μέθοδος εφαρμόζεται σε τρεις ομάδες δειγμάτων ορού αίματος, που ανήκουν σε τρεις διαφορετικές ομάδες επιμύων, για την μελέτη της διαφοροποίησης της συγκέντρωσης της α-τοκοφερόλης στις ομάδες αυτές. Προκύπτει, ότι από την πρώτη ομάδα, που είναι η ομάδα ελέγχου( group CC) ο μέσος όρος συγκέντρωσης α-τοκοφερόλης είναι 0.81 μg/ml, για την δεύτερη ομάδα, Ομάδα C2( group C2) είναι 0,77 μg/ml και για την τρίτη ομάδα, Ομάδα Ε ( group E) είναι 0,92 μg/ml. i

3 ABSTRACT In the present study, a simple, reliable and rapid HPLC procedure has been developed for the determination of a- tocopherol in blood substrate. The method is applied in real rat blood samples. Detection and quantification was performed using a UV-Visible detector. The reversed-phased analytical column, Zorbax XDB-C 18, was operating at ambient temperature. The chromatographic conditions are presented in the following table: Mobile phase consistence(v/v) Wavelength absorption (nm) 292 Analytical column Zorbax 3,5μm Volume of injected sample (μl) 20 Flow rate (ml/min) 0,6 Average retention time, t res 2,66 (min) 5% Η2Ο- 95% MeOH XDB-C x50mm The calibration curve of standard samples of a- tocopherol, is the following: y = 5102x , and correlation coefficients R² = 0,9912. The average % of repeatability was found at % RSD = 3,157. Detection limits were found in the range of 0,1 μg/ml per 20μl injected sample A second calibration curve was constructed for the spiked samples, with the following equation: y = 32171x and correlation coefficients R² = 0,9929. High extraction recoveries from blood serum were achieved (average recovery ranging between 90 and 98%). The average percentage of repeatability was found at %RSD= 2,458. The method was applied to three groups of serum samples belonging to three different groups of rats. The aim was to study the modulation of concentrations in these groups. It was shown that in the first group, the control group, group CC, the average a-tocopherol concentration was found to be 0.81 μg/ml, for the second group, Group C2 was 0.77 μg/ml and for the third group, group E was found to be 0.92 μg/ml ii

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..1 ΙΙ. ΘΕΩΡΙΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.. 2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΓΕΝΙΚΑ Ορισμός Χρωματογραφίας Αρχή λειτουργίας ΕΙΔΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και σύγκριση με την κλασική χρωματογραφία Πλεονεκτήματα της μεθόδου Οργανολογία HPLC Επιλογή παραμέτρων χρωματογραφίας Εφαρμογές HPLC ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ HPLC Βασικές παράμετροι χρωματογραφίας Παράμετροι προσέγγισης της αναλυτικής μεθόδου ΜΕΤΡΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Απόλυτο και Σχετικό Σφάλμα, Ε και Ε r Εκατοστιαίο ποσοστό ανάκτησης(% Recovery), %R Εὐρος, R Τυπική Απόκλιση, s Σχετική τυπική απόκλιση Συντελεστής μεταβλητότητας, RSD% ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΣΤΑΣΕΩΝ- ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Γενικά Μέθοδος πολλαπλών εξωτερικών προτύπων-καμπύλη αναφοράς Μέθοδος παρεμβολής Μέθοδος ενός εξωτερικού προτύπου iii

5 1.7.5 Μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας Μέθοδος πολλαπλών γνωστών προσθηκών Μέθοδος εσωτερικού πρότυπου Μέθοδος κανονικοποιήσης ΚΕΦΆΛΑΙΟ 2: Η ΟΥΣΊΑ ΤΟΚΟΦΕΡΌΛΗ ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΕΣ Η σημασία της Βιταμίνης Ε ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΩΝ Συστηματική ονομασία των τοκοφερολών Φυσικοχημικές ιδιότητες τοκοφερολών ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε ΙΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΣΤΑΔΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ, ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΌΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΚΕΥΗ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ iv

6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΑΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ-ΟΡΑΤΟΥ (UV-VIS) ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΜΕ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΟ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Ο ορός αίματος ως μήτρα δείγματος Στάδια κατά την προκατεργασία των δειγμάτων Μέθοδοι προκατεργασίας δειγμάτων που αναπτύχθηκαν ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ Έλεγχος γραμμικότητας και εύρους ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΕΠΙΜΥΩΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΕΠΙΜΥΩΝ Τα δείγματα-προέλευση-συντήρηση Διαδικασία προκατεργασίας των δειγμάτων, μέτρησης και ποσοτικοποίησης αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ v

7 I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σημασία της βιταμίνης Ε σε βιολογικές, μεταβολικές και διατροφικές μελέτες, καθιστά την ανάπτυξη ικανοποιητικών, αποτελεσματικών και γρήγορων αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού των τοκοφερολών, πεδίο υψηλού ενδιαφέροντος. Τα τελευταία χρόνια, η κλινική μελέτη βιταμινών και κύρια της βιταμίνης Ε, έχει αποκτήσει μεγάλο ενδιαφέρον, κυρίως για την αντιοξειδωτική δράση της. Η βιταμίνη Ε, μαζί με άλλες βιταμίνες όπως η βιταμίνη Α(ρετινόλη), αποκτά ιδιαίτερη κλινική σημασία σε πρόωρα βρέφη, ασθενείς που λαμβάνουν μακροχρόνια παρεντερική διατροφή, και οι ασθενείς με καρκίνο ή δυσαπορρόφηση, ή ασθενείς που έχουν υποστεί εντερική χειρουργική επέμβαση[1]. Σε αυτές τις μελέτες, είναι απαραίτητο, για να μειώνεται ο χρόνος των πειραμάτων, άλλα και να αυξάνεται η εγκυρότητα τους, η χρήση μεθόδων ανάλυσης και προσδιορισμού γρήγορων, απλών άλλα και αξιόπιστων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) για τον ποσοτικό προσδιορισμό α-τοκοφερόλης σε υπόστρωμα αίματος επιμύων. Η μέθοδος ανάλυσης εφαρμόστηκε στην σύγκριση της συγκέντρωσης α-τοκοφερόλης σε δείγματα ορού αίματος από τρεις πειραματικές ομάδες επιμύων, με στόχο να προσδιοριστεί εάν παρουσιάζεται κάποια διαφοροποίηση στον τρόπο απορρόφησης της α- τοκοφερόλης. Η πρώτη ομάδα είναι ομάδα ελέγχου, η δεύτερη ομάδα τρέφονταν με κανονική τροφή ενώ στην τρίτη χορηγούνταν συμπλήρωμα βιταμίνης Ε. Στην παρούσα εργασία, εξετάζονται, αναλυτικά, οι πιο αποτελεσματικές συνθήκες ανάλυσης των δειγμάτων, όσων αφορά τον προσδιορισμό της κατάλληλης στήλης απορρόφησης, το κατάλληλο μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης της α- τοκοφερόλης. Εξετάζεται, επίσης. συγκριτικά η χρήση ανιχνευτή Υπεριώδους Ορατού (UV- Vis), σε σχέση με την χρήση ανιχνευτή Φθορισμού (FLD). Εξετάζονται, ακόμα, κριτικά, διάφοροι τρόποι προκατεργασίας δειγμάτων σε υπόστρωμα ορού αίματος, και η ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού της α- τοκοφερόλης στα δείγματα αυτά. 1

8 II. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ 1.1 ΓΕΝΙΚΑ Ορισμός Χρωματογραφίας Η χρωματογραφική ανάλυση, γνωστή συνήθως ως χρωματογραφία, περιλαμβάνει σειρά τεχνικών φυσικού διαχωρισμού και προσδιορισμού των συστατικών μίγματος ανόργανων ή οργανικών ουσιών[2] Αρχή λειτουργίας Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με κατανομή των συστατικών μεταξύ δύο μη μιγνυόμενων φάσεων, μιας στατικής και μιας κινητής. Ο διαχωρισμός βασίζεται στις διαφορές, που υπάρχουν σε ορισμένες ιδιότητες των συστατικών ενός μίγματος, όπως είναι το σημείο ζέσεως, η πολικότητα, τα ηλεκτρικά φορτία (για ιονικές ενώσεις), το μέγεθος των μορίων κ.α.. Οι διαφορές αυτές διαφοροποιούν τη σχετική φυσικοχημική συγγένεια κάθε συστατικού προς τις δύο φάσεις[2]. Βασική αρχή και ορολογία χρωματογραφίας εκλούσεως Ορισμένη ποσότητα δείγματος δύο συστατικών, Α και Β, προστίθεται στην κινητή φάση στην κορυφή ή αρχή της στήλης. Καθώς το δείγμα μετακινείται στη στήλη, τα συστατικά του κατανέμονται, με κάποιο μηχανισμό, μεταξύ της στατικής και κινητής φάσεως. Τα κλάσμα κάθε συστατικού που βρίσκεται στην κινητή φάση, μετακινείται στη στήλη, ερχόμενο σε επαφή με το νέο τμήμα της στατικής φάσεως, οπότε συμβαίνει νέα κατανομή. Κατά τον ίδιο χρόνο, το κλάσμα του συστατικού, που βρισκόταν στη στατική φάση, έρχεται σε επαφή με νέο τμήμα της κινητής φάσεως, οπότε υφίσταται περαιτέρω κατανομή. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές, καθώς διαβιβάζεται συνεχώς, και συνήθως με σταθερή παροχή, νέα κινητή φάση στη στήλη. Τα συστατικά μετακινούνται μέσα από τη στήλη, μόνο όταν βρίσκονται στην κινητή φάση και η ταχύτητα μετακινήσεώς τους εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους σε αυτή, το οποίο είναι συνάρτηση του συντελεστή κατανομής τους στις δύο φάσεις. Έτσι, συστατικά με διαφορετικούς συντελεστές κατανομής θα μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες μέσα από τη 2

9 στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες. Στο τέλος τα διαχωρισμένα συστατικά εξέρχονται από τη στήλη, όπου μπορούν να ανιχνευθούν ή και να συλλέγουν. Η κινητή φάση (υγρό ή αέριο) ονομάζεται υγρό (ή αέριο) εκλούσεως, ενώ το διάλυμα, που εξέρχεται από τη στήλη, έκλουσμα. Η διαδικασία αυτή, δηλαδή η διαβίβαση υγρού (ή αέριου) εκλούσεως μέσα από τη χρωματογραφική στήλη, ονομάζεται έκλουση και εάν αυτό γίνεται με σταθερή παροχή, τότε μιλούμε για γραμμική έκλουση. Στο τέλος της στήλης τοποθετείται συνήθως ένας ανιχνευτής, που παρακολουθεί μία αναλυτική ιδιότητα του εκλούσματος και παράγει ένα σήμα, κάθε φορά που εκλούεται ένα συστατικό (χρωματογραφική κορυφή). Το διάγραμμα αυτού του σήματος ως συνάρτηση του όγκου του υγρού (ή αερίου) εκλούσεως ονομάζεται χρωματογράφημα. Στην περίπτωση γραμμικής εκλούσεως, αντί του όγκου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο χρόνος..τα χρωματογραφήματα εκλούσεως παρέχουν πληροφορίες, χρήσιμες για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση, επειδή ο χρόνος, που χρειάζεται ένα συστατικό για να εκλουσθεί, είναι χαρακτηριστικός για το συστατικό αυτό, ενώ το ύψος ή η ολοκληρωμένη επιφάνεια της κορυφής του σήματος μπορεί να σχετισθεί με τη συγκέντρωση του συστατικού. Σχήμα 1. 1: Αρχή διαχωρισμού συστατικού μειγμάτων με την τεχνική της χρωματογραφίας Η βάση της χρωματογραφίας εκλούσεως είναι η κατανομή των συστατικών ενός δείγματος μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσεως (Σχήμα1.1), η οποία είναι μία διαδικασία ισορροπίας, που περιγράφεται με το λόγο ή συντελεστή κατανομής Κ, που ορίζεται με τη σχέση: K=Cs/C Μ (1) Όπου Cs και C Μ είναι οι συγκεντρώσεις του συστατικού στη στατική (S) και κινητή φάση (Μ) αντίστοιχα. 1.2 ΕΙΔΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ Η διαφοροποίηση των χρωματογραφικών τεχνικών καθιστά δύσκολη την 3

10 ταξινόμησή τους με ένα μόνο κριτήριο. Οι τεχνικές αυτές διαφέρουν ως προς τη φύση της κινητής φάσεως, ως προς το μηχανισμό, στον οποίο οφείλεται ο διαχωρισμός και ως προς τον τρόπο εισαγωγής του δείγματος στη στατική φάση και κινήσεώς του μέσα απ αυτή. Έτσι η ταξινόμηση μπορεί να γίνει: 1) Με βάση τη φύση της κινητής και στατικής φάσεως: Ταξινομούνται σε υγρή χρωματογραφία (LC) και αέρια χρωματογραφία (GC), αναλόγως του εάν η κινητή φάση είναι υγρή ή αέρια. Οι δύο αυτές τάξεις υποδιαιρούνται παραπέρα ανάλογα με τη φύση της στατικής φάσεως, που μπορεί να είναι στερεή ή υγρή επάνω σε στερεό αδρανή φορέα. Έτσι, διακρίνονται σε υγρήστερεή χρωματογραφία (LSC), υγρή-υγρή χρωματογραφία (LLC), αέρια-στερεή χρωματογραφία (GSC), και αέρια-υγρή χρωματογραφία (GLC). 2) Με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού: Ταξινομούνται στις ακόλουθες πέντε τάξεις, ανάλογα με το μηχανισμό, με τον οποίο τα συστατικά του μίγματος κατακρατούνται από τη στατική φάση και γίνεται έτσι δυνατός ο διαχωρισμός: i) Χρωματογραφία Προσρόφησης ii) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής iii) Χρωματογραφία κατανομής iv) Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού v) Χρωματογραφία Συγγένειας 3) Με βάση τη φυσική μορφή της στατικής φάσεως: α) χρωματογραφία στήλης: i) χρωματογραφία πληρωμένων στηλών ii) χρωματογραφία ανοικτών τριχοειδών στηλών β) επίπεδη χρωματογραφία: i) χρωματογραφία χάρτου ii) χρωματογραφία λεπτής στιβάδας 4) Με βάση τον τρόπο εισαγωγής και κινήσεως του δείγματος α) μετωπική χρωματογραφία ( το διάλυμα του δείγματος εισάγεται στη στήλη 4

11 συνεχώς και ο διαλύτης δρα και ως κινητή φάση. Τα συστατικά του δείγματος εξέρχονται από τη στήλη με τη μορφή μετώπων) β) χρωματογραφία εκτοπίσεως (χρησιμοποιείται κινητή φάση που συγκρατείται ισχυρώς από τη στατική φάση, εκτοπίζοντας έτσι σε διάφορο βαθμό τα συστατικά του δείγματος μέσα από τη στήλη) γ) χρωματογραφία εκλούσεως (τα συστατικά του δείγματος μεταφέρονται από την κινητή φάση με διαφορετική ταχύτητα κατά μήκος της στατικής φάσης, οπότε εξέρχονται από τη στήλη σε διαφορετικούς χρόνους)[2] 1.3 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και σύγκριση με την κλασική χρωματογραφία Η τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αποτελεί επέκταση της κλασικής υγρής χρωματογραφίας στήλης και η ανάπτυξη της οφείλεται στην βελτίωση της τεχνολογίας (χρήση ηλεκτρονικού υπολογιστή, χρήση νέων ανιχνευτών). Στην κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης, η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα στην στατική πετυχαίνεται με την δύναμη της βαρύτητας ή με την χρησιμοποίηση αντλιών χαμηλής πιέσεως και η στατική φάση αποτελείται από μεγάλης διαμέτρου σωματίδια, που παρουσιάζουν μικρή αντίσταση. Στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης( High Performance Liquid Chromatography ή HPLC), ωστόσο, χρησιμοποιούνται αντλίες υψηλής πίεσης, γιατί η στατική φάση αποτελείται από σωματίδια πολύ μικρής διαμέτρου, και επομένως, μεγάλης αντίστασης[2]. Συγκεκριμένα για την πλήρωση της στήλης, χρησιμοποιούνται μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου του πυριτίου(silica gel), διαμέτρου 2-10μm[3]. Με την HPLC επιτυγχάνονται ταχύτεροι και καλύτερης απόδοσης διαχωρισμοί μιγμάτων Πλεονεκτήματα της μεθόδου Βασικά κριτήρια για την επιλογή της Υγρής Χρωματογραφίας και ιδιαίτερα της HPLC είναι: Η αναγκαιότητα υψηλής ικανότητας διαχωρισμού και εκλεκτικότητας, στον 5

12 παράλληλο προσδιορισμό περισσότερων δραστικών ουσιών ή στον προσδιορισμό προϊόντων διάσπασης, παράλληλα με τον προσδιορισμό της δραστικής ουσίας (π.χ. έλεγχος καθαρότητας, έλεγχος σταθερότητας). Η διαχωριστική ικανότητα των στηλών της HPLC είναι πολύ μεγαλύτερη από τις κοινές ανοιχτές στήλες. Η απλή προετοιμασία του δείγματος στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης.. Όπως και σε όλες τις άλλες χρωματογραφικές μεθόδους, έτσι και στη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από μία ανάλυση, είναι τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά και επομένως μπορεί να προσδιοριστεί, αφενός μεν το είδος, αφετέρου δε και η ποσότητα της δραστικής ουσίας.[4] Οι στήλες της HPLC χρησιμοποιούνται πολλές φορές χωρίς την ανάγκη αναγέννησης. Ο χρόνος ανάλυσης στην HPLC είναι μικρότερος Η οργανολογία της HPLC αυτοματοποιείται εύκολα και επομένως είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί μεγάλος αριθμός ποσοτικών αναλύσεων. Επειδή η όλη διαδικασία της ανάλυσης εξαρτάται από την οργανολογία και λιγότερο από την ικανότητα του χειριστή-αναλυτή, η επαναληψιμότητα είναι καλύτερη. Πλεονεκτήματα της HPLC σε σχέση με άλλες τεχνικές ανάλυσης είναι το γεγονός ότι η ταχύτητα αναλύσεων είναι παρόμοια με αυτή της GLC, η διαχωριστική της ικανότητα 3 ως 10 φορές καλύτερα από την χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας[2] Μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι το κόστος μιας συσκευής HPLC, είναι αρκετά υψηλό Οργανολογία HPLC από: Ένα τυπικό σύστημα οργάνου HPLC για ισοκρατική έκλουση αποτελείται i) Σύστημα Παροχής κινητής φάσης που περιλαμβάνει τα δοχεία των διαλυτών και αντλία υψηλής πίεσης ii) Απαερωτή κενού: Ο απαερωτής εξασφαλίζει την απαέρωση της κινητής φάσης, ώστε να είναι εφικτός ο έλεγχος της πίεσης στη χρωματογραφική στήλη[5] iii) Σύστημα εισαγωγής του δείγματος(injection system/ injector valve). 6

13 Συνήθως είναι μια βαλβίδα υψηλής πίεσης iv) Μια χρωματογραφική στήλη(column). Είναι ευθύγραμμη και συνήθως από χάλυβα. v) Έναν ανιχνευτή. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα είδη ανιχνευτών. Αυτός που χρησιμοποιείται ευρύτερα είναι ανιχνευτής υπεριώδους- ορατού( UV-Vis Detector) vi) Ένα σύστημα συλλογής δεδομένων: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή που παράγει το χρωματογράφημα της ανάλυσης vii) Η στήλη συνδέεται με τον εγχυτήρα και τον ανιχνευτή με σωληνώσεις στενής εσωτερικής διαμέτρου, περίπου 0,2 mm, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο «νεκρός όγκος», δηλ. ο κενός χώρος στο σύστημα στον οποίο δεν γίνεται χρωματογραφία και μπορεί να προκαλέσει διεύρυνση των ζωνών λόγω της διαμήκους διάχυσης. viii) Δεξαμενή αποβλήτων: Είναι δοχείο όπου συλλέγεται η κινητή φάση μαζί με τα περιεχόμενα συστατικά του προς ανάλυση δείγματος Σχήμα 1. 3: Τυπικό σύστημα HPLC[6] Επιλογή παραμέτρων χρωματογραφίας Τα περισσότερα δείγματα ουσιών μπορούν να διαχωριστούν με την χρήση της HPLC, αρκεί να επιλεγεί το κατάλληλο σύστημα διεξαγωγής της χρωματογραφικής ανάλυσης. Βασικό στοιχείο είναι η επιλογή της κατάλληλης κινητής και στατικής 7

14 φάσης. Αυτό που επιδιώκεται από τον αναλυτή είναι ο προσδιορισμός των συνθηκών εκείνων, στις οποίες τα συστατικά ενός μείγματος συγκρατούνται σε κάποιο βαθμό στην στατική φάση, αλλά όχι ισχυρά[2]. Α. Επιλογή κινητής φάσης Η εύρεση της καταλληλότερης κινητής φάσης αποτελεί τη σημαντικότερη παράμετρο στην ανάπτυξη των αναλυτικών μεθόδων. Η επιλογή γίνεται με κριτήριο τον επιτυχή διαχωρισμό των συστατικών του μίγματος σε εύλογο χρονικό διάστημα. Η βελτιστοποίηση της σύστασης της κινητής φάσης αποτελεί επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία. Οι παράμετροι που εξετάζονται είναι η πολικότητα, η ελουοτροπική ισχύς, η τοξικότητα των διαλυτών. Επίσης η συμβατότητα με τον χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή και το κόστος. Πολικότητα : η πολικότητα ενός διαλύτη σε συνδυασμό με την πολικότητα των υπό ανάλυση ουσιών καθορίζει το χρόνο συγκράτησής τους στην επιφάνεια της στήλης. Όσο πιο πολικός είναι ένας διαλύτης τόσο πιο γρήγορα εκλούονται οι πολικές ενώσεις και τόσο πιο αργά οι μη πολικές. Ελουοτροπική ισχύς Ε : είναι μία παράμετρος που σχετίζεται με την πολικότητα των διαφόρων διαλυτών και καθορίζεται από τη στατική φάση που χρησιμοποιείται. Τη μικρότερη ελουοτροπική ισχύ στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης την έχει το νερό (Η2Ο) που είναι διαλύτης με την μεγαλύτερη πολικότητα ενώ έχει τη μεγαλύτερη ελουοτροπική ισχύ στη χρωματογραφία κανονικής φάσης. Το αντίστροφο συμβαίνει με το εξάνιο, που είναι διαλύτης με την μικρότερη πολικότητα. Τοξικότητα : αποφεύγονται διαλύτες με τοξικές και ερεθιστικές ιδιότητες. Συμβατότητα με τον χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή : όταν χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής UV-Vis θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη τα κατώτερα όρια απορρόφησης (cut off) των διαφόρων διαλυτών στο υπεριώδες. Επίσης ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης θα πρέπει να είναι χημικά αδρανής, απόλυτης καθαρότητας και να μη δημιουργεί καταβυθίσεις των συστατικών του δείγματος στην αναλυτική στήλη. Κόστος: το κόστος των χρησιμοποιούμενων διαλυτών αποτελεί απαγορευτική παράμετρο ειδικά σε αναλύσεις μεγάλου αριθμού δειγμάτων, όπου η κατανάλωση διαλυτών είναι μεγάλη. 8

15 Β. Επιλογή στατικής φάσης Η επιλογή της στατικής φάσης και της αναλυτικής στήλης είναι σημαντικά για την ανάπτυξη της αναλυτικής μεθόδου και καθορίζεται από τις επιμέρους παραμέτρους : Το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης Η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης Η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως Ο τύπος του υποστρώματος το οποίο πρέπει να είναι χημικά αδρανές. Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους, τόσο πιο πολική (όξινη) είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων. Γ. HPLC κανονικής και αντίστροφης φάσης Στην HPLC κανονικής φάσης, η στατική φάση αποτελείται από κάποιο πολικό υλικό, όπως οξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) ή οξείδιο του αργιλίου (Al 2 O 3 ). Η κινητή φάση που χρησιμοποιείται στην HPLC είναι μη πολική. Χρησιμοποιούνται διαλύτες όπως εξάνιο ή χλωροφόρμιο[5]. Οι πολικές ενώσεις στο διαχωριζόμενο μίγμα αλληλεπιδρούν ισχυρότερα με την πολική στατική φάση, σε σύγκριση με τις μη πολικές ενώσεις. Συνεπώς, οι λιγότερο πολικές ενώσεις διασχίζουν τη στήλη ταχύτερα και εκλούονται από αυτήν νωρίτερα. Αντίθετα, τα μόρια των πολικών μορίων προσροφώνται στην στατική φάση. Η έκλουση των πολικών μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με την αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την πορεία της ανάλυσης. Η HPLC κανονικής φάσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό χημικών ενώσεων που δεν διαλύονται στο νερό ή που υδρολύονται. Για μη πολικά μόρια χρησιμοποιούνται στήλες αντίστροφης φάσης (reversed phase- RP). Στην RP- HPLC ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση των υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας[5]. Η στατική φάση αποτελείται από υδρόφοβα, μη πολικά υλικά. Τέτοια μπορεί να είναι το οξείδιο του πυριτίου, συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκάλια. Οι ομάδες αυτές προσδίδουν στο υλικό πλήρωσης της στήλης 9

16 μη πολικό χαρακτήρα. Αντίθετα, η κινητή φάση αποτελείται από πολικά διαλύματα, όπως διάφορους οργανικούς διαλύτες(μεθανόλη, ακετονιτρίλιο) με νερό. Στην ΗPLC αντίστροφης φάσης ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας. Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφώνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC και γενικότερα η περισσότερο κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού ουσιών για αναλυτικούς σκοπούς Εφαρμογές HPLC H HPLC, όπως και κάθε άλλη χρωματογραφική τεχνική, μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για τον ποιοτικό όσο και για τον ποσοτικό προσδιορισμό ουσιών. Η HPLC βρίσκει εφαρμογή στην ανάλυση μιγμάτων ουσιών, πολικών και μη, ποικίλης προέλευσης. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό και την ανάλυση μειγμάτων ουσιών με μεγάλο μοριακό βάρος. Σήμερα, η τεχνική αυτή βρίσκει εφαρμογή σε αρκετά φαρμακευτικά σκευάσματα, καθώς και για την ανάλυση διάφορων βιολογικών δειγμάτων. 1.4 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ HPLC Βασικές παράμετροι χρωματογραφίας M Σχήμα 1. 4 Παράδειγμα τυπικού χρωματογραφήματος 10

17 Χρόνος κατακράτησης ή συγκράτησης(retention time, t R ) Είναι ο χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της εισαγωγής του δείγματος στη στήλη και την εμφάνιση του μέγιστου της κορυφής της χρωματογραφίας[4] Νεκρός χρόνος συγκράτησης( dead retention time), t M Είναι ο χρόνος συγκράτησης μιας ουσίας που δεν συμμετέχει στην χρωματογραφία[4]. Παράγοντας χωρητικότητας ή ανάσχεσης( capacity factor), k Ορίζεται ως: k =(t R -t M )/t M (2) Ο συντελεστής κατακράτησης k είναι πιο χρήσιμο μέτρο της κατακράτησης από το χρόνο κατακράτησης t R, επειδή ο χρόνος κατακράτησης μεταβάλλεται όταν το μήκος της στήλης ή η ταχύτητα ροής αλλάζουν. Αντίθετα το k δεν μεταβάλλεται. Αυξημένη τιμή του k δείχνει ισχυρή κατακράτηση της ουσίας και μεγαλύτερο χρόνο παραμονής στη στατική φάση. Κατά τη βελτιστοποίηση χρωματογραφικών μεθόδων επιδιώκεται οι τιμές που λαμβάνει ο k να κυμαίνονται στην περιοχή Για τιμές k < 1 η έκλουση είναι αρκετά ταχεία για ακριβή προσδιορισμό του t R. Για τιμές k > 10 η ουσία κατακρατείται ισχυρά από την στατική φάση με αποτέλεσμα μη ικανοποιητικό διαχωρισμό[6]. Ο συντελεστής κατακράτησης μπορεί να μεταβληθεί με μεταβολή της ταχύτητας της κινητής φάσης, της θερμοκρασίας κ.α.[7] Παράγοντας διαχωρισμού ή εκλεκτικότητας(selectivity factor),α Εκφράζει το μέτρο της ευκολίας ή της δυσκολίας διαχωρισμού δύο ουσιών, 1 και 2, κάτω από τις εξεταζόμενες συνθήκες. Ορίζεται ως: α=k 1 /k 2 (3) όπου k 1, k 2 οι συντελεστές συγκράτησης των δύο ουσιών. Όσο η τιμή α αποκλίνει από την μονάδα, τόσο ο διαχωρισμός των δύο ουσιών είναι ευκολότερος. 11

18 Εύρος κορυφής( peak width), w Κατά το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος μέσω μίας στήλης συμβαίνει αραίωση του δείγματος. Ως αποτέλεσμα, η ζώνη που περιέχει το καθένα από τα διαχωρισμένα συστατικά διευρύνεται διαρκώς, κατά την εξέλιξη του διαχωρισμού. Έτσι, η κάθε κορυφή που καταγράφεται από τον ανιχνευτή έχει ένα συγκεκριμένο εύρος, που καλείται εύρος κορυφής (peak width), W b (Σχήμα 1.4). Το εύρος της κορυφής υπολογίζεται γραφικά, όταν οι κορυφές αποδοθούν κατά προσέγγιση ως τρίγωνα. Διαχωριστική ικανότητα στήλης (Resolution), Rs Είναι το μέτρο διαχωρισμού ή αλληλεπικάλυψης δύο κορυφών. Η διαχωριστική ικανότητα της στήλης, R s, ορίζεται ως: (4) όπου t R2 είναι ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας και t R1 ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας που εκλούεται αμέσως πριν στο χρωματογράφημα, w 2 και w 1 είναι το εύρος της αντίστοιχης κορυφής (προπορευόμενης και επακόλουθης) στη βάση της κορυφής Ο διαχωρισμός είναι πλήρης όταν R s 1.5[4], όπως φαίνεται και στο Σχήμα Σχήμα 1. 5: Μεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών. Στο σχήμα σημειώνεται η μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης[5] 12

19 Αριθμός θεωρητικών πλατών Σχήμα 1. 6: Σχηματική παράσταση θεωρητικών πλακών σε χρωματογραφική στήλη[5] Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών (plate number), N, είναι καθαρά θεωρητικό μέγεθος. Χρησιμοποιείται προκειμένου να συγκριθεί η αποδοτικότητα χρωματογραφικών στηλών. Το μοντέλο των θεωρητικών πλακών θεωρεί ότι μία χρωματογραφική στήλη αποτελείται από έναν μεγάλο αριθμό ξεχωριστών πλακών (μικρών τμημάτων στήλης). Ν είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών που υπάρχουν σε μία στήλη(σχήμα 1.6). Κάθε μόριο μιας ουσίας, κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης, μετακινείται όντας σε ισορροπία μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης της κάθε θεωρητικής πλάκας με την οποία αλληλεπιδρά. Η διεύρυνση αυτή οφείλεται στη διάχυση των μορίων του αναλυτή και εξαρτάται από το συντελεστή διάχυσης της ουσίας καθώς και από τον χρόνο παραμονής στη στήλη. Το κλάσμα των μορίων το οποίο διαχέεται είναι ανάλογο της βαθμίδας συγκέντρωσης καθώς και του συντελεστή διάχυσης. Μέτρο της διασποράς των μορίων ή των ιόντων των ουσιών κατά τη διέλευσή τους από τη στήλη αποτελεί ο αριθμός των θεωρητικών πλακών Ν, ή παράμετρος Ν. Υπολογίζεται με δεδομένα που λαμβάνονται σε ισοκρατικές συνθήκες, από τον τύπο: (5) 13

20 (6) όπου t R : απόσταση σε χιλιοστόμετρα κατά μήκος της βασικής γραμμής, μεταξύ του σημείου έγχυσης του δείγματος στη στήλη και της κατακόρυφης που άγεται από το μέγιστο της εξεταζόμενης κορυφής και w 1/2 : εύρος της κορυφής, σε χιλιοστόμετρα, στο μισό του ύψους της. Ο αριθμός θεωρητικών πλακών, Ν, είναι καθαρός αριθμός. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός Ν, τόσο πιο στενές είναι οι κορυφές και τόσο αποτελεσματικότερη είναι η στήλη κατά των διαχωρισμό μειγμάτων ουσιών. Είναι σημαντικό να έχει κανείς κατά νου ότι οι θεωρητικές πλάκες δεν υπάρχουν στην πραγματικότητα μέσα σε μία στήλη, απλώς βοηθούν στην κατανόηση των διεργασιών σε αυτή. Συνήθως, οι χρωματογραφικές στήλες συμπεριφέρονται ως να έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για τα διάφορα συστατικά ενός μείγματος[2]. Παράγοντας ασυμμετρίας (asymmetry factor), A s Ο παράγοντας ασυμμετρίας As είναι το ποσοτικό μέτρο του σχηματισμού «ουράς» των χρωματογραφικών κορυφών. Σχήμα 1. 7: Ασύμμετρη χρωματογραφική κορυφή Για τον υπολογισμό του Αs χαράσσεται μία κάθετος μεταξύ του μεγίστου της κορυφής ως τη βασική γραμμή (Σχήμα 1.7). Στο 10% του ύψους της κορυφής, το εύρος από αυτή τη γραμμή ως το εμπρόσθιο και ως το πίσω μέρος της κορυφής μετρούνται. Διαιρώντας τα μήκη a και b μεταξύ τους, καθορίζεται το As της κορυφής. Γενικά, οι τιμές του As μεταξύ των τιμών 0,9 και 1,2 είναι οι βέλτιστες για 14

21 την καλύτερη απόδοση της στήλης[8]. Επίδραση της κατακράτησης, του παράγοντα εκλεκτικότητας και του αριθμού θεωρητικών πλακών στη διαχωριστική ικανότητα Αν υποθέσουμε ότι για τους αναλύτες 1 και 2, με παραπλήσιους χρόνους κατακράτησης, ισχύει w 1 =w 2 =w, τότε η διαχωριστική ικανότητα θα δίνεται από την σχέση: Λαμβάνοντας υπόψη την εξίσωση (6) προκύπτει ότι: ή με αντικατάσταση του k =(t R -t M )/t M, προκύπτει: Αν, στην παραπάνω σχέση, χρησιμοποιηθεί ο παράγοντας εκλεκτικότητας α=k 1 /k 2, τότε προκύπτει η σχέση μεταξύ της διαχωριστικής ικανότητας και των παραγόντων εκλεκτικότητας και κατακράτησης: (7) ή η σχέση μεταξύ του αριθμού των θεωρητικών πλακών, της διαχωριστικής ικανότητας και των παραγόντων εκλεκτικότητας και κατακράτησης : (8) Η εξίσωση του van Deemter Η αποτελεσματικότητα της στήλης χαρακτηρίζεται από τη λεπτότητα μιας θεωρητικής πλάκας ή το ύψος ισοδύναμο με μια θεωρητική πλάκα (ΥΙΘΠ), δηλαδή το μήκος της στήλης που αντιστοιχεί σε μια θεωρητική πλάκα και ισούται με : ΥΙΘΠ= h= L/N (9) 15

22 όπου N: ο αριθμός θεωρητικών πλακών της στήλης και L : το μήκος της στήλης. Η επίδραση της ταχύτητας της κινητής φάσης, υ, στις τιμές των παραμέτρων h και N, περιγράφεται με την εξίσωση van Deemter, η οποία προτάθηκε για την αέρια χρωματογραφία με πληρωμένες στήλες, έχει όμως εφαρμογή και στις άλλες χρωματογραφικές τεχνικές με τροποποιημένη μορφή. Η σύντομη μορφή της εξίσωσης είναι: h=α + Β/υ +C. υ (10) όπου Α, Β και C είναι σταθερές, χαρακτηριστικές για μια ορισμένη στήλη, που εξαρτώνται από τη φύση της στατικής και κινητής φάσεως και από το υλικό και τον τρόπο πληρώσεως της χρωματογραφικής στήλης. Ο πρώτος όρος της εξίσωσης, Α, αντιπροσωπεύει τη «στροβιλώδη διάχυση», είναι πρακτικώς ανεξάρτητος από την ταχύτητα υ και αποτελεί μέτρο της διευρύνσεως μιας χρωματογραφικής κορυφής. Ο δεύτερος όρος, Β/υ, σχετίζεται με τη «διαμήκη διάχυση» της ουσίας x στην κινητή φάση. Η διάχυση αυτή είναι μεγαλύτερη στα αέρια από ό,τι στα υγρά και η ταχύτητα διάχυσης εξαρτάται από το συντελεστή διαχύσεως, ο οποίος επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως το ιξώδες του διαλύτη και η θερμοκρασία. Ο τρίτος όρος, C. υ, σχετίζεται αφ ενός μεν με την «αντίσταση μεταφοράς μάζας» στη στήλη, η οποία εμποδίζει την ακαριαία αποκατάσταση ισορροπίας μεταξύ των δύο φάσεων και αφ ετέρου με την εγκάρσια διάχυση μέσα στην στατική φάση, από τον ένα δίαυλο στον άλλο. Η διεύρυνση της κορυφής λόγω αυτής της αιτίας μειώνεται, άρα η αποτελεσματικότητα της στήλης αυξάνεται με οτιδήποτε αυξάνει την ταχύτητα αποκαταστάσεως ισορροπίας στις δύο φάσεις[9] Παράμετροι προσέγγισης της αναλυτικής μεθόδου Κατά την επιλογή μιας ενόργανης μεθόδου αναλύσεως (και γενικότερα κάθε αναλυτικής μεθόδου), πρέπει να λαμβάνονται υπόψη ορισμένα χαρακτηριστικά ποιότητας της μεθόδου, τα οποία συνήθως μελετώνται και αναφέρονται είτε από ερευνητές, που προτείνουν τη μέθοδο (μέθοδος είναι η εφαρμογή μιας τεχνικής για τον προσδιορισμό συγκεκριμένου συστατικού), είτε από ειδικές επιτροπές επιστημονικών ενώσεων, που πρόκειται να υιοθετήσουν τη μέθοδο ως επίσημη ή αποδεκτή. Τα κυριότερα από τα χαρακτηριστικά ποιότητας είναι : 16

23 Ισχύς Η ισχύς της μεθόδου, δηλαδή η δυνατότητα εφαρμογής της για τον προσδιορισμό ενός συστατικού σε ένα συγκεκριμένο δείγμα Αξιοπιστία (reliability) Μέτρο της αξιοπιστίας μιας αναλυτικής μεθόδου αποτελεί η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα. Το πρώτο από τα παραπάνω μεγέθη, καθορίζει το σφάλμα ενός προσδιορισμού και αποτελεί μέτρο κυρίως των συστηματικών σφαλμάτων, ενώ το δεύτερο κυρίως των τυχαίων[9]. Η επαναληψιμότητα μιας σειράς μετρήσεων χαρακτηρίζει τη συμφωνία των αποτελεσμάτων μεταξύ τους, δηλαδή δείχνει πόσο κοντά μεταξύ τους βρίσκονται τα αποτελέσματα. Η επαναληψιμότητα είναι τόσο μεγαλύτερη, όσο μικρότερη είναι η διασπορά των αποτελεσμάτων. Ως μέτρα επαναληψιμότητας μιας σειράς μετρήσεων χρησιμοποιούνται κυρίως το εύρος, η μέση απόκλιση, η τυπική απόκλιση, η σχετική τυπική απόκλιση και ο συντελεστής μεταβλητότητας[2] Καλή επαναληψιμότητα δεν συνεπάγεται αναγκαστικά και καλή ακρίβεια, γιατί είναι δυνατόν να υπεισέρχεται στις μετρήσεις ένα καθορισμένο σφάλμα, που να επηρεάζει εξίσου όλες τις μετρήσεις, χωρίς να βλάπτει με αυτόν τον τρόπο την επαναληψιμότητα τους[9]. Κακή επαναληψιμότητα συνήθως συνεπάγεται κακή ακρίβεια, που μπορεί να βελτιωθεί με εκτέλεση μεγάλου αριθμού μετρήσεων, με την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχει καθορισμένο σφάλμα. Καλή ακρίβεια προϋποθέτει συνήθως και καλή επαναληψιμότητα[9]. Ευαισθησία (sensitivity) Η ευαισθησία της μεθόδου (sensitivity), συνήθως ορίζεται ως ο λόγος της μεταβολής της μετρούμενης αναλυτικής παραμέτρου δια της μεταβολής της συγκεντρώσεως, και συνήθως δίνεται ως η κλίση της καμπύλης αναφοράς[2] Όριο ανίχνευσης (detection limit), LOD Το όριο ανίχνευσης χαρακτηρίζει τη μικρότερη συγκέντρωση ή ποσότητα του μετρούμενου συστατικού που μπορεί να προσδιορισθεί αξιόπιστα[2]. 17

24 Αξιόπιστη ανίχνευση σημαίνει ότι η μέθοδος μπορεί να διακρίνει, με δεδομένη στάθμη εμπιστοσύνης (ή πιθανότητα σφάλματος), το σήμα του αναλύτη από το σήμα του λευκού δείγματος (blank) ή υποβάθρου (background) ή θορύβου (noise)[9].ως όριο ανίχνευσης θεωρείται εκείνη η συγκέντρωση ή ποσότητα, για την οποία η απόκριση της μεθόδου μπορεί να διακριθεί από το τυφλό ή το θόρυβο. Έτσι μπορούμε να ορίσουμε, ότι το όριο ανίχνευσης ενός συστατικού με μία μέθοδο, είναι εκείνη η συγκέντρωση ή ποσότητα του συστατικού, για την οποία η απόκριση της μεθόδου διαφέρει από την απόκριση του τυφλού κατά το τριπλάσιο της τυπικής απόκλισης του μέσου όρου του τυφλού[11]. Το ελάχιστο όριο ανιχνεύσεως υπολογίζεται σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο: LOD (όριο ανιχνεύσεως) =3.3*SD[12] (11) (για στάθμη εμπιστοσύνης 99.87%), όπου SD= τυπική απόκλιση. Όριο ποσοτικοποίησης, LOQ[11] Είναι η ελάχιστη συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου, που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί (να προσδιοριστεί ποσοτικά) με αποδεκτή ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Το όριο ποσοτικοποίησης υπολογίζεται σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο: LOQ (όριο ποσοτικοποίησης) =10x SD (12) Χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων Είναι η περιοχή συγκεντρώσεων του συστατικού στην οποία η καμπύλη αναφοράς είναι ευθεία. Έτσι υποβοηθείται ο αναλυτής για την ανάγκη πιθανής αραίωσης του δείγματος πριν τη μέτρηση Εκλεκτικότητα (selectivity) Χαρακτηρίζει τη δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου για την ανάλυση ενός συστατικού παρουσία άλλων. Συνήθως εκφράζεται με τη μέγιστη επιτρεπτή συγκέντρωση πιθανών παρεμποδιστών ή το λόγο συγκεντρώσεων παρεμποδιστήπροσδιοριζομένου, για την πρόκληση ορισμένου σφάλματος (συνήθως 5%). Για τα ηλεκτρόδια ιόντων έχει ορισθεί και ειδικός συντελεστής εκλεκτικότητας[2] 18

25 1.5 ΜΕΤΡΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Απόλυτο και Σχετικό Σφάλμα, Ε και Ε r Η «αληθινή ή πραγματική» τιμή (μ) του μετρούμενου μεγέθους σπάνια είναι γνωστή και αντ αυτής χρησιμοποιείται μία «παραδεκτή» τιμή, προς την οποία μπορούν να συγκριθούν όλες οι πειραματικές τιμές. Μετά την εκτέλεση (Ν) επαναλαμβανόμενων μετρήσεων του μεγέθους και τη λήψη των αριθμητικών τιμών, xi ως αντιπροσωπευτικότερη τιμή της (μ) προτείνεται ο αριθμητικός μέσος όρος ή μέση τιμή ( x μέσο ) των πειραματικών μετρήσεων. Η ακρίβεια ενός αναλυτικού αποτελέσματος χαρακτηρίζει την εγγύτητα της πειραματικής τιμής προς την «αληθινή ή παραδεκτή τιμή» (μ) και συνήθως εκφράζεται με το απόλυτο σφάλμα (Ε), δηλαδή τη διαφορά μεταξύ της αντιπροσωπευτικής πειραματικής τιμής x (μεμονωμένης μετρήσεως xi, μέσης τιμής x μεσο ή διάμεσης τιμής Μ) και της μ: E= x-μ (13) Όσο μικρότερο είναι το σφάλμα, τόσο μεγαλύτερη είναι η ακρίβεια. Σε μια ποσοτική ανάλυση η «αληθινή» τιμή της μετρούμενης ποσότητας παραμένει στην πραγματικότητα άγνωστη και δεν υπάρχει τρόπος να προσδιορίσουμε την ακρίβεια του αποτελέσματος της αναλύσεως. Είναι όμως δυνατός ο έλεγχος της ακρίβειας της μεθόδου με την ανάλυση «γνωστού» πρότυπου δείγματος, παρόμοιας κατά το δυνατόν συστάσεως με το άγνωστο δείγμα. Ο έλεγχος της ακρίβειας της μεθόδου επιβάλλεται τόσο κατά το στάδιο της αναπτύξεώς της, όσο και περιοδικά κατά την εφαρμογή της[2]. Το σχετικό σφάλμα, Ε r, είναι ο λόγος της απόλυτης τιμής του σφάλματος προς την πραγματική τιμή, μ Εr= (14) Εκατοστιαίο ποσοστό ανάκτησης(% Recovery), %R Το μέτρο ακρίβειας που χρησιμοποιείται στην πράξη στις αναλυτικές μεθόδους και το οποίο υπολογίζεται από τον επί τοις εκατό λόγο (%) της μέσης συγκέντρωσης που ανευρίσκεται πειραματικά προς την πραγματική συγκέντρωση 19

26 του εξεταζόμενου δείγματος Εὐρος, R Εύρος του δείγματος είναι η διαφορά της μικρότερης από τη μεγαλύτερη παρατήρηση του δείγματος [10] R=x min -x max (15) Τυπική Απόκλιση, s Η απόκλιση μιας τιμής (di) ορίζεται ως η διαφορά της μέσης τιμής από την τιμή αυτή : di=xi- x μέσο (16) Η μέση απόκλιση (d μεσο ) ορίζεται από την σχέση: d μεσο = (17) Η τυπική (σταθερή) απόκλιση για μικρό αριθμό μετρήσεων (s), ορίζεται από τη σχέση: (18) Η ποσότητα Ν-1 καλείται και βαθμοί ελευθερίας. Η ποσότητα s 2 καλείται διασπορά (ή μεταβλητότητα ή διακύμανση) Σχετική τυπική απόκλιση Αντί για την απόλυτη τιμή της αποκλίσεως, που δίνεται στις ίδιες μονάδες με το μετρούμενο μέγεθος, πολλές φορές είναι χρησιμότερη η σχετική τιμή της, ως προς το μετρούμενο μέγεθος. Είναι ο λόγος της απόλυτης τιμής της τυπικής απόκλισης προς τη μέση τιμή των πειραματικών μετρήσεων και δίνεται από τη σχέση : 20

27 S r =S/ x μέσο (19) Συντελεστής μεταβλητότητας, RSD% Η % σχετική τυπική απόκλιση, που συμβολίζεται συνήθως ως RSD%, είναι γνωστή και ως συντελεστής μεταβλητότητας (coefficient of variation). RSD%= sr * 100 (20) Σε γενικές γραμμές, η τιμή RSD (Relative Standard Deviation) που εκφράζει την inter-day precision είναι μεγαλύτερη από αυτήν της intra-day precision. Το γεγονός αυτό δικαιολογείται από το μεγαλύτερο αριθμό βημάτων που απαιτούνται για την επανάληψη των μετρήσεων σε περισσότερες από μια ημέρες σε σχέση με αυτά που απαιτούνται για την πραγματοποίηση τους εντός της ίδιας ημέρας (πχ. καθημερινή ετοιμασία προτύπων διαλυμάτων, αντιδραστηρίων κτλ) 1.6 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΣΤΑΣΕΩΝ- ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ Για τις περισσότερες αναλυτικές τεχνικές η καμπύλη αναφοράς περιγράφεται από μια ευθεία γραμμή και έτσι χρησιμοποιείται η γραμμική μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων (linear least square regression). Η σχέση μεταξύ κάθε ζεύγους παρατηρήσεων (xi, yi) παριστάνεται ως: yi = a +bxi + ei, όπου a είναι η τομή (intercept) της ευθείας γραμμής με τον άξονα y και b είναι η κλίση (slope) της γραμμής. Δηλαδή το σήμα yi συνίσταται από ένα καθορισμένο μέγεθος (a + bxi) που προβλέπεται από το γραμμικό μοντέλο και ένα τυχαίο συστατικό (σφάλμα) ei. Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να βρεθούν οι εκτιμήτριες (estimates) των αληθινών τιμών a και b. Αυτό πετυχαίνεται με τον υπολογισμό τιμών a και b για τις οποίες το άθροισμα των τετραγώνων των αποκλίσεων (δηλαδή των ei) να γίνεται ελάχιστο (εξ ου και το όνομα της μεθόδου): 21

28 Το τυχαίο συστατικό αντιπροσωπεύει τη διαφορά: e i = y i - y s,όπου ei = υπόλοιπο (residual) ή απόκλιση yi = παρατηρούμενη τιμή σήματος y s = τιμή σήματος υπολογιζόμενη από το μοντέλο = a + bxi Επομένως: ei = yi - a bxi [12] Σχήμα 1. 8: Έννοια των υπολοίπων (residuals) στη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων Η καλύτερη προσαρμογή μίας ευθείας γραμμής σε αυτές τις τιμές μπορεί να προσδιοριστεί υπολογίζοντας τα a και b από τις ακόλουθες εξισώσεις[12]: Με βάση τις υπολογισθείσες τιμές των συντελεστών α και b χαράζουμε καμπύλη, γνωστή ως ευθεία παλινδρομήσεως, που παρέχει την άριστη γραμμική προσαρμογή των σημείων. Το μέτρο της καλής προσαρμογής μεταξύ των δύο μεταβλητών, x και y, δίνεται από το συντελεστή συσχετίσεως (correlation coefficient) 22

29 R, που παρέχεται από τη σχέση: Η προσαρμογή είναι τόσο καλύτερη όσο πλησιέστερα προς τη μονάδα βρίσκεται η τιμή του R. Μια καμπύλη αναφοράς θεωρείται ικανοποιητική για τιμές 0,95< <0,99, ενώ για τιμές > 0,99 υποδηλώνεται πολύ καλή γραμμικότητα[1]. Στην Ενόργανη Ανάλυση συχνότερα χρησιμοποιείται ο συντελεστής προσδιορισμού (coefficient of determination) R 2, ο οποίος ισούται με το τετράγωνο του συντελεστή συσχετίσεως R. 1.7 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Γενικά[13] Οι τεχνικές ποσοτικοποίησης γενικά είναι οι εξής: Μέθοδος πολλαπλών εξωτερικών προτύπων / Καμπύλης αναφοράς (multiple external standards / calibration curve). Μέθοδος παρεμβολής (bracketing). Μέθοδος ενός εξωτερικού προτύπου (single external standard). Μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας (standard addition method) Μέθοδος πολλαπλών προσθηκών γνωστών ποσοτήτων (multiple standard addition). Μέθοδος μειώσεως κατά γνωστή ποσότητα (standard subtraction). Μέθοδος εσωτερικού προτύπου (internal standard). Μέθοδος κανονικοποίησης (normalization) Μέθοδος πολλαπλών εξωτερικών προτύπων-καμπύλη αναφοράς Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη βαθμονόμηση της μετρητικής διατάξεως και γενικότερα της μεθόδου με χρήση προτύπων εργασίας (working standards) του 23

30 αναλύτη. Τα πρότυπα εργασίας μπορεί να είναι καθαρά διαλύματα αναλύτη στο χρησιμοποιούμενο διαλύτη. Στην περίπτωση, που το μητρικό υλικό των δειγμάτων (matrix) επηρεάζει την απόκριση της μεθόδου, τα πρότυπα πρέπει να παρασκευασθούν στο ίδιο μητρικό υλικό. Η μελέτη επίδρασης του μητρικού υλικού επιτυγχάνεται με τη σύγκριση των εξισώσεων παλινδρόμησης από πρότυπα σε μητρικό υλικό και καθαρό διαλύτη. Τα πρότυπα πρέπει να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στη γραμμική περιοχή και οπωσδήποτε να περικλείουν τις αναμενόμενες συγκεντρώσεις αγνώστων. Τα πρότυπα αναλύονται πριν και μετά τα άγνωστα ή μεταξύ των αγνώστων. Από τα ζεύγη τιμών (xi, yi) χαράσσεται γραφικά η καμπύλη βαθμονόμησης (αναφοράς) σε χιλιοστομετρικό χάρτη (γραφική χάραξη), προτιμάται όμως να υπολογίζεται η εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησης (regression equation) με τη μέθοδο ελαχίστων τετραγώνων: y = a(±sa) + b(±sb) C, r Ο υπολογισμός του αγνώστου γίνεται υπολογιστικά: (21) Η συχνότητα κατασκευής της καμπύλης αναφοράς εξαρτάται από την ανθεκτικότητα της μεθόδου. Η καθημερινή κατασκευή της εξασφαλίζει αξιοπιστία, αλλά συνεπάγεται κόστος και χρόνο. Σε μεθόδους αυξημένης ανθεκτικότητας μπορεί να ελέγχεται με την ανάλυση ενός προτύπου. Ο αριθμός των προτύπων, σε περίπτωση γραμμικής σχέσεως βαθμονόμησης θα πρέπει να είναι 3-6, σε περιπτώσεις ρουτίνας. Αποτελεί την πλέον αξιόπιστη μέθοδο ποσοτικοποίησης[13] Μέθοδος παρεμβολής Χρησιμοποιείται όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι γραμμική, π.χ. στη φλογοφωτομετρία, όπου λόγω αυτοαπορρόφησης υπάρχει καμπύλωση προ τα κάτω. Απαιτείται μεγάλος σχετικά αριθμός προτύπων και χαράσσεται η μη γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης. O υπολογισμός του αγνώστου γίνεται γραφικά, χρησιμοποιώντας το τμήμα της καμπύλης μεταξύ δυο σημείων / προτύπων που περικλείουν (bracketing) το σήμα του αγνώστου και το οποίο τμήμα, χωρίς μεγάλο σφάλμα, θεωρείται γραμμικό. 24

31 1.7.4 Μέθοδος ενός εξωτερικού προτύπου Χρησιμοποιείται στις περιπτώσεις όπου η μέθοδος αποδεδειγμένα παρουσιάζει γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης και διέρχεται από την αρχή των αξόνων, δηλαδή τομή, α = μηδέν. Ο έλεγχος για στατιστικά μηδενική τομή γίνεται με τη δοκιμασία t (t-test) χρησιμοποιώντας για το t θεωριτικό Μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας Εφαρμόζεται στις περιπτώσεις όπου το μητρικό υλικό του δείγματος ασκεί μεγάλη επίδραση στην συνάρτηση βαθμονόμησης (στατιστικά διαφορετική κλίση b) και δεν είναι δυνατή η παρασκευή προτύπων όμοιας σύστασης με τα άγνωστα. Απαιτείται γραμμική σχέση της καμπύλης βαθμονόμησης και υποχρεωτική διέλευση από αρχή αξόνων (a = 0). Εκτελείται μέτρηση του σήματος του αγνώστου διαλύματος. Έστω η τιμή της μέτρησης ότι είναι P 0. Στην συνέχεια γίνεται προσθήκη στο άγνωστο μικρού όγκου (ώστε να μην αλλάξει ο όγκος του αγνώστου) και μεγάλης σχετικά συγκέντρωσης προτύπου του αναλύτη έτσι, ώστε να προκύψει γνωστή αύξηση της συγκέντρωσης ΔC και ακολούθως επαναμέτρηση του σήματος. Έστω ότι η νέα τιμή του σήματος είναι P 1. Η συγκέντρωση του αγνώστου C x δίνεται από την επόμενη σχέση: (22) Σε αυτή τη μέθοδο δεν απαιτείται η γνώση της κλίσεως b της καμπύλης βαθμονόμησης. Η επιλογή της συγκεντρώσεως του προστιθέμενου προτύπου πρέπει να είναι τέτοια έτσι, ώστε ΔC/Cx = 0,5-2. Η μέθοδος ενδείκνυται όταν μέρος του αναλύτη βρίσκεται συνδεδεμένο με το μητρικό υλικό (π.χ. πρωτεΐνες), οπότε επιτυγχάνεται προσδιορισμός ολικής συγκέντρωσης του αναλύτη Μέθοδος πολλαπλών γνωστών προσθηκών Είναι βελτιωμένη επέκταση της μεθόδου προσθήκης απλής γνωστής ποσότητας. Σε αυτή τη μέθοδο μετράται το άγνωστο δείγμα και δίνει σήμα P 0. Στη συνέχεια σε Ν ίσα υποδείγματα προστίθενται διαφορετικές γνωστές ποσότητες προτύπου του αναλύτη, χωρίς σημαντική μεταβολή του όγκου, ώστε να προκύψουν 25

32 γνωστές αυξήσεις ΔC i, και μετρείται το σήμα P i. Για το διάγραμμα P i ως προς ΔC i υπολογίζεται η εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησης: P i = a + bδc i, οπότε (θα είναι P 0 = a). Η συγκέντρωση του αγνώστου θα δίνεται από την σχέση: (23) Σχήμα 1. 9: Πρότυπο γραφικής παράστασης στη μέθοδο προσθήκης πολλαπλών σημείων Μέθοδος εσωτερικού πρότυπου Εφαρμόζεται στην περίπτωση που αναμένονται μεταβολές στην ευαισθησία της μετρητικής διατάξεως, από μέτρηση σε μέτρηση, και σε μη απόλυτα επαναλαμβανόμενη επίδραση του μητρικού υλικού του δείγματος σε διαδικασίες της μεθόδου, όπως την εκχύλιση του αναλύτη και άλλες κατεργασίες του δείγματος. Η φιλοσοφία είναι ότι οι σχετικές αυξομειώσεις της ευαισθησίας της μεθόδου σε συστατικό Α του δείγματος θα είναι ίδιες για το συστατικό Β. Εφαρμόζεται κυρίως στις χρωματογραφικές τεχνικές (GLC, HPLC), στις οποίες είναι δυνατή η σύγχρονη μέτρηση σημάτων περισσότερων του ενός συστατικού. Συνδυάζεται κυρίως με τη μέθοδο πολλαπλών ή ενός εξωτερικών προτύπων. Στα πρότυπα και στα άγνωστα προστίθεται αυστηρά η ίδια συγκέντρωση μιας ουσίας (εσωτερικό πρότυπο, internal standard, IS), που δεν υπάρχει στο δείγμα, με την ίδια αναλυτική συμπεριφορά με τον αναλύτη. Η συγκέντρωσή του επιλέγεται έτσι, ώστε το σήμα του να είναι παρόμοιου μεγέθους με τα αναμενόμενα άγνωστα. Το ιδανικό εσωτερικό πρότυπο πρέπει να παρουσιάζει παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες με τον αναλύτη και η μέθοδος να αποκρίνεται κατά τον ίδιο τρόπο με τον αναλύτη, αλλά να μπορεί να μετράται 26

33 εκλεκτικά. Στην περίπτωση υπάρξεως σταδίου κατεργασίας του δείγματος (π.χ. εκχύλισης) το εσωτερικό πρότυπο πρέπει να δείχνει συμπεριφορά παρόμοια με τον αναλύτη. Μετρούνται τα σήματα P x και P ID και ο λόγος P x / P ID χρησιμοποιείται ως το «διορθωμένο σήμα» του αγνώστου για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς ή/και τον υπολογισμό του αγνώστου Μέθοδος κανονικοποιήσης Χρησιμοποιείται στις χρωματογραφικές τεχνικές (GLC, HPLC) για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας των συστατικών μείγματος ουσιών. Χρησιμοποιούνται τα εμβαδά των κορυφών των συστατικών του δείγματος (κλάσμα εκάστου εμβαδού ως προς το συνολικό άθροισμα των εμβαδών). Η συγκέντρωση του άγνωστου συστατικού i, υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο: (24), όπου Α ι είναι το εμβαδόν της κορυφής του συστατικού i. 27

34 ΚΕΦΆΛΑΙΟ 2: Η ΟΥΣΙΑ ΤΟΚΟΦΕΡΌΛΗ 2.1 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΕΣ Οι τοκοφερόλες (tocopherols) είναι μια ομάδα λιποδιαλυτών χημικών ενώσεων παρόμοιας χημικής δομής (ομόλογες ενώσεις) με έντονες αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Παρουσιάζουν πολλαπλές φυσιολογικές δράσεις και η πρόσληψη από τον ανθρώπινο οργανισμό σε μικρές ποσότητες μέσω της τροφής είναι απαραίτητη. Συλλογικά οι τοκοφερόλες είναι γνωστές ως βιταμίνη Ε και συναντώνται σε φυτικά έλαια και γενικά σε φυτικής προέλευσης τροφές. Στο σύμπλεγμα των βιταμινών Ε ανήκουν οι α, β, γ και δ τοκοφερόλη. Η βιταμίνη Ε παρασκευάστηκε, για πρώτη φορά, από σπορέλαιο στα 1936, αν και η ύπαρξή της ήταν γνωστή από τα Στα 1922 ανακαλύφθηκε η ικανότητα της βιταμίνης Ε να βοηθάει στην αναπαραγωγή. Αμερικανοί επιστήμονες διαπίστωσαν ότι η ικανότητα αναπαραγωγής των ποντικών μειωνόταν, όταν έλειπε αυτή η βιταμίνη από την τροφή τους. Το 1931, διαπιστώθηκε ότι τα πειραματόζωα, μετά από στέρηση αυτής της ουσίας, ανέπτυσσαν κάποια μυϊκή δυστροφία. Το 1938, εξάλλου, παιδιά που υπέφεραν από την ίδια αυτή αρρώστια θεραπεύτηκαν, ύστερα από παροχή βιταμίνης Ε [15]. Η ονομασία τους προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις "τόκος" (γέννα, δημιουργία) και "φέρω", επειδή η απουσία τους από νωρίς είχε συσχετισθεί με προβλήματα στην αναπαραγωγική λειτουργία, όπως αποβολές εμβρύων. Η βιταμίνη Ε, βρίσκεται σε μεγάλη αναλογία στο γάλα, στα φυτικά έλαια, τους ξηρούς καρπούς. Σχήμα 2. 1: Βιταμίνη Ε σε εμπορική μορφή 28

35 2.1.1 Η σημασία της Βιταμίνης Ε Η Βιταμίνη Ε είναι η βιταμίνη που συμμετέχει σε όλες τις μεταβολικές λειτουργίες των κυττάρων και γι αυτό αποκτά αρκετά μεγάλη σημαντικότητα για την υγιή λειτουργία του οργανισμού. Παράλληλα, η Βιταμίνη Ε έχει προταθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη γενική υγεία, με συγκεκριμένες επιπτώσεις σχετικά με την προστασία από τις συνθήκες, που επιφέρουν αύξηση της συγκέντρωσης ελεύθερων ριζών οξυγόνου στον ανθρώπινο οργανισμός. Διάφορες επιβλαβείς ασθένειες, που σχετίζονται με οξειδωτικές βλάβες, θεωρούνται μεταξύ άλλον ο καρκίνος, καταρράκτης και ο διαβήτης. Αναλυτικότερα, η βιταμίνη Ε έχει θεμελιώδη ρόλο στο φυσιολογικό μεταβολισμό όλων των κυττάρων, του ανθρώπινου οργανισμού. Ως εκ τούτου, η έλλειψη της μπορεί να επηρεάσει πολλά διαφορετικά συστήματα οργάνων. Η λειτουργία της σχετίζεται με εκείνες αρκετών άλλων θρεπτικών συστατικών και ενδογενείς παράγοντες που, συλλογικά, περιλαμβάνουν ένα σύστημα πολλαπλών συστατικών που παρέχει προστασία κατά τις δυνητικά βλαβερές συνέπειες των διάφορων δραστικών ειδών ριζών οξυγόνου σχηματίζονται κατά το μεταβολισμό ή απαντώνται στο περιβάλλον. Ως εκ τούτου, τόσο η ανάγκη για βιταμίνη Ε, όσο και η έκφραση της ελλιπής πρόσληψής της, μπορεί να επηρεαστεί από τέτοιες θρεπτικές ουσίες, όπως το σελήνιο και η Βιταμίνη C, και από την έκθεση σε τέτοιους οξειδωτικούς παράγοντες, όπως πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (polyunsaturated fatty acids, PUFA), ρύπανση του αέρα, και υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) Σε αντίθεση με άλλες βιταμίνες, η Βιταμίνη Ε, όχι μόνο δεν είναι τοξική, άλλα φαίνεται, επίσης, να είναι επωφελής ακόμα και σε αρκετά μεγαλύτερες δόσεις, από αυτές που απαιτούνται για την πρόληψη των κλινικών συμπτωμάτων ανεπάρκειας[15]. 2.2 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΩΝ Η αντιοξειδωτική δράση των τοκοφερολών είναι αντίστροφη προς την βιταμινηκή τους δράση, δηλαδή η δ-τοκοφερόλη είναι ισχυρότερο αντιοξειδωτικό από την α-τοκοφερόλη [16] 29

36 Σχήμα 2. 2: Βασικές χημικές ομάδες της δομής των τοκοφερολών Κοινό χημικό χαρακτηριστικό των τοκοφερολών (α-, β-, γ- και δ-τοκοφερόλη) είναι η ύπαρξη μια ομάδας χρωμανίου (chromane)( Σχήμα 2.2), η οποία στη θέση 6 περιέχει ένα (φαινολικό) υδροξύλιο, σχηματίζοντας την 6-χρωμανόλη (6-chromanol), όπως και μια πλευρική αλειφατική αλυσίδα, η οποία αναφέρεται στη βιβλιογραφία ως ουρά φυτολίου (phytyl tail), στη θέση 2. Ο αντιοξειδωτικός χαρακτήρας των τοκοφερολών οφείλεται στο φαινολικό υδροξύλιο του χρωμανίου, ενώ ο έντονα λιπόφιλος χαρακτήρας τους και η ουσιαστική μηδενική διαλυτότητά τους στο νερό οφείλεται στην ουρά φυτυλίου. Η ομάδα αυτή προέρχεται από την άκυκλη διτερπενική αλκοόλη φυτόλη (phytol), η οποία εστεροποιημένη αποτελεί το "λιπόφιλο" τμήμα του μορίου της χλωροφύλλης. [17]. Σχήμα 2. 3: Οι χημικές δομές της α, β, γ, και δ-τοκοφερόλης Οι διάφορες τοκοφερόλες διαφέρουν ως προς τον αριθμό και τις θέσεις των μεθυλίων στον αρωματικό δακτύλιο της χρωμανόλης. Περιέχουν 3 ασύμμετρα άτομα άνθρακα. Επομένως, για κάθε τοκοφερόλη υπάρχουν 2 3 = 8 οπτικώς ισομερή (RRR, RRS, RSR, RSS, SRR, SRS, SSR, SSS). Η δομή των τεσσάρων τοκοφερολών παρουσιάζεται στο Σχήμα 2.3. Στις φυσικές τοκοφερόλες και οι τρεις άνθρακες έχουν στερεοχημική διαμόρφωση R, ενώ στις συνθετικές βιταμίνες και τα οκτώ δυνατά στερεοϊσομερή βρίσκονται στην ίδια αναλογία. Από τα 3 ασύμμετρα άτομα άνθρακα, 30

37 αυτό του οποίου η στερεοχημική διαμόρφωση έχει ιδιαίτερη σημασία ως προς την ενεργότητα των τοκοφερολών είναι εκείνο της θέσης 2 της ομάδας της χρωμανόλης. Μόνο οι τοκοφερόλες με στερεοχημική διαμόρφωση R στον άνθρακα αυτόν είναι βιολογικώς ενεργές. Από τις τέσσερις τοκοφερόλες, η α-τοκοφερόλη βρίσκεται συνήθως σε μεγαλύτερη αναλογία (ακολουθούμενη από τη γ-τοκοφερόλη) και είναι η πλέον ενεργή από βιολογική άποψη, ενώ η δ-τοκοφερόλη εμφανίζεται να διαθέτει την εντονότερη αντιοξειδωτική ενεργότητα (ακολουθούμενη και αυτή από τη γ- τοκοφερόλη). Η γ-τοκοφερόλη έχει ελεύθερη τη θέση 5 της χρωμανόλης, η οποία μπορεί εύκολα να δεχθεί τη νιτροομάδα (-ΝΟ2) και έχει αποδειχθεί με πειράματα in vitro, ότι δρα ως "παγίδα" οξειδίων του αζώτου, αζωτούχων ριζών και άλλων ηλεκτρονιόφιλων μεταλλαξιγόνων σωματιδίων και θεωρείται ως η κατ' εξοχήν "αντιγηραντική" από τις τοκοφερόλες Σχήμα 2. 4: Μόριο α-τοκοφερόλης Συστηματική ονομασία των τοκοφερολών. Το συστηματικό όνομα της φυσικής α-τοκοφερόλης είναι: [2R- 2R*(4R*,8R*)-3,4-διυδρο-2,5,7,8-τετραμεθυλο-2-(4,8,12-τριμεθυλο-δεκατριυλο)- 2Η-1-βενζοπυρανόλη-6 ή [2R-2R*(4R*,8R*)-3,4-διυδρο-2,5,7,8-τετραμεθυλο-2- (4,8,12-τριμεθυλο-δεκατριυλο-)-χρωμανόλη-6. 'Ενας απλουστευμένος τρόπος ονομασίας των τοκοφερολών βασίζεται στη "μητρική ένωση" των τοκοφερολών, την τοκόλη (tocol), η οποία δεν φέρει μεθύλια στον αρωματικό δακτύλιο, οπότε π.χ. η α-τοκοφερόλη μπορεί να ονομασθεί: 5,7,8-τριμεθυλο-τοκόλη Φυσικοχημικές ιδιότητες τοκοφερολών Οι τοκοφερόλες είναι πρακτικά αδιάλυτες στο νερό, αναμίξιμες σε κάθε αναλογία με έλαια, ακετόνη, αλκοόλη, χλωροφόρμιο, αιθέρα και άλλους διαλύτες 31

38 λιπαρών υλών Όσον αφορά την σταθερότητα, οξειδώνονται σταδιακά από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο αποκτώντας πιο σκούρο χρώμα. Είναι σταθερές έναντι των οξέων και βάσεων απουσία οξυγόνου. Η οξείδωση τους έκθεση στο φως. επιταχύνεται κατά την Πίνακας 2. 1 Οι ιδιότητες της α-τοκοφερόλης[17] Εμφάνιση Ελαφρά ιξώδες, ανοικτά κίτρινο έλαιο με πολύ ελαφριά χαρακτηριστική οσμή Μοριακός τύπος C29H50Ο2 Σχετική μοριακή μάζα 430,71 Σημείο τήξης Σημείο ζέσεως Πυκνότητα (d 4 25 ): 0,95 2,5-3,5ºC Δείκτης διάθλασης (n D 25 ) 1, ºC (σε πίεση 0,1 mm Hg) 2.3 ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ Οι βιταμίνες του συμπλέγματος Ε δεν βιοσυντίθεται από τον άνθρωπο και τα άλλα θηλαστικά και προσλαμβάνονται αποκλειστικά μέσω της διατροφής. Η ημερήσια πρόσληψη α-τοκοφερόλης διαφέρει σημαντικά από χώρα σε χώρα. Μπορεί να κυμαίνεται από 8-10 mg (π.χ. Ισλανδία, Φινλανδία, Νέα Ζηλανδία) έως mg (π.χ. Γαλλία, Ελλάδα, Ισπανία)[19]. Οι διαφορές αυτές οφείλονται κυρίως στον τύπο των ελαίων, που χρησιμοποιούνται, από τους κατοίκους των διαφόρων χωρών, στα οποία τόσο οι ποσότητες, όσο και οι αναλογίες των διαφόρων τοκοφερολών διαφέρουν σημαντικά. Για παράδειγμα το ηλιέλαιο περιέχει περίπου 70 mg α-τοκοφερόλης /100 g σε αντίθεση με το σογιέλαιο, το οποίο περιέχει μόνο 10 mg /100 g. Το σογιέλαιο, που χρησιμοποιείται κυρίως στη Βόρεια Ευρώπη είναι πλουσιότερο σε γ-τοκοφερόλη, που όμως, υστερεί σε βιολογική ενεργότητα σε σχέση με την α-τοκοφερόλη. Σε κάθε περίπτωση, μια εξισορροπημένη διατροφή δεν μπορεί να προσφέρει ημερησίως (ούτε και χρειάζεται) περισσότερα από περίπου 30 mg α-τοκοφερόλης[19]. Σημαντικά ποσοστά των περιεχόμενων τοκοφερολών χάνονται (οξειδώνονται) κατά την επεξεργασία (ραφινάρισμα) των λαδιών. Πλούσιοι σε τοκοφερόλες είναι διάφοροι καρποί και σπόροι, πολλοί από τους οποίους καταναλώνονται ως "ξηροί καρποί". 32

39 2.4 ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε Οι συγκεντρώσεις των τοκοφερολών στο πλάσμα του αίματος ρυθμίζονται από το ήπαρ, το οποίο τις παραλαμβάνει μετά την απορρόφησή τους από το λεπτό έντερο. Στο αίμα μεταφέρονται με τις λιποπρωτεΐνες και τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Οι διαφορές στη βιολογική ενεργότητα των διαφόρων τοκοφερολών οφείλονται κατά κύριο λόγο στη διαφορετική δυνατότητα δέσμευσής τους από πρωτεΐνες. 'Έτσι, η α- τοκοφερόλη δεσμεύεται επιλεκτικά από μια ηπατική πρωτεΐνη (hepatic α-tocopherol transfer protein, α-ttp), η οποία την απομακρύνει εύκολα από το ήπαρ και τη μεταφέρει, μέσω της κυκλοφορίας του αίματος, στα σημεία όπου θα πρέπει να δράσει αντιοξειδωτικά. Με αυτόν τον τρόπο, το ήπαρ επανεκκρίνει επιλεκτικά την α-τοκοφερόλη μέσω της α-ttp, ενώ μεταβολίζει και αποβάλλει τις άλλες μορφές της βιταμίνης Ε, με αποτέλεσμα οι συγκεντρώσεις των άλλων τοκοφερολών να είναι πολύ μικρότερες από εκείνες της α-τοκοφερόλης. Ενδεικτικά η συγκέντρωση στο πλάσμα του αίματος της γ-τοκοφερόλης είναι σχεδόν το 1/10 της συγκέντρωσης της α-τοκοφερόλης και αντίστοιχα οι συγκεντρώσεις των μεταβολιτών της γ-τοκοφερόλης στα ούρα είναι μεγαλύτερες από τις συγκεντρώσεις των μεταβολιτών της α-τοκοφερόλης[17]. Αναλυτικά ο μεταβολισμός της α-τοκοφερόλης είναι ο εξής[19]: Οι βιταμίνη Ε είναι φυσικός αντιοξειδωτικός παράγοντας. Ως λιποδιαλυτή παίζει πρωταρχικό ρόλο στον κύκλο των οξειδώσεων, συμμετέχοντας έτσι στο σύστημα άμυνας του οργανισμού εμποδίζοντας το σχηματισμό υπεροξειδίων των λιπαρών οξέων Η περιεκτικότητα της βιταμίνης Ε στη δομή της κυτταρικής μεμβράνης, καθορίζει το βαθμό οξείδωσης της LDL χοληστερόλης και το βαθμό δέσμευσης των ελεύθερων ριζών. Πιθανά υπεύθυνη, ως αντιοξειδωτική βιταμίνη, για την πρόληψη διαφόρων μορφών καρκίνου και της αθηροσκλήρωσης. Παρεμποδίζει το σχηματισμό νιτροζαµινών. Ουσιώδης παράγοντας που σχετίζεται µε την ακεραιότητα των ερυθρών αιμοσφαιρίων, παίζει ρόλο στη σύνθεση της αίμης και επιδρά θετικά στους παράγοντες πήξεως (II, VII, IX, X). Η βιταμίνη Ε είναι απαραίτητη για την κυτταρική αναπνοή. 33

40 Ρυθμίζει τη βιοσύνθεση του DNA και την ενσωμάτωση των πυριµιδινών μέσα στη δομή του πυρηνικού οξέος. Πρόσφατες μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι η τοκοφερόλη θεωρείται προστατευτικός παράγων του πνευμονικού ιστού από την µμόλυνση της ατμόσφαιρας (καπνό, ΝΟ2, όζον). 2.5 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε Οι δραστικές οξυγονούχες ενώσεις (reactive oxygen species, ROS) αποτελούν οξειδωτικούς παράγοντες που προκαλούν φθορά και γήρανση στους ζώντες οργανισμούς. Σε αυτές περιλαμβάνονται ρίζες και μόρια όπως τα:. Ο - 2 (ανιοντική ρίζα σουπεροξειδίου), Η 2 Ο 2 (υπεροξείδιο υδρογόνου), η ρίζα του υπεροξυλίου. ΟΟΗ και το. ΟΗ (ρίζα υδροξυλίου). Σχήμα 2. 5: Μηχανισμός αντιοξειδωτικής δράσης α-τοκοφερόλης Τα λιποειδή αποτελούν ζωτικής σημασίας συστατικά των κυττάρων και ειδικότερα της κυτταρικής μεμβράνης, η οποία πρέπει να διατηρείται ακέραιη και να παρουσιάζει μια ευκαμψία και ρευστότητα. 'Όταν οι ανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων υποστούν βλάβη από ελεύθερες ρίζες αρχίζουν να αντιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας σταυροδεσμούς (crosslinking) καθιστώντας την κυτταρική μεμβράνη δύσκαμπτη. Ανάλογη οξειδωτική δράση προκαλούν και στη χοληστερόλη, που υπό την επίδραση ελεύθερων ριζών παρέχει κολλώδη προϊόντα οξείδωσης, τα οποία συμβάλλουν στον σχηματισμό αθηρωματικών πλακών (αρτηριοσκλήρυνση)[17]. 34