Οταν επώασαν σε Ιn vitro σύστηµα πρωτεϊνοσυνθέσεως

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Οταν επώασαν σε Ιn vitro σύστηµα πρωτεϊνοσυνθέσεως"

ŌἈβαδδών Βασιλόπουλος
7 χρόνια πριν
Προβολές:

Οι Ενδείξεις οι οποίες υποστηρίζουν οτι η αναστολή της πρωτεϊνοσυνθέσεως από τους αναστολείς HCR και DAI εξασφαλίζεται µέσω της αντεπίδρασης µε τον eif-2 είναι πολλές η σηµαντικότερη οµως είναι µία

1 Οι Ενδείξεις οι οποίες υποστηρίζουν οτι η αναστολή της πρωτεϊνοσυνθέσεως από τους αναστολείς HCR και DAI εξασφαλίζεται µέσω της αντεπίδρασης µε τον eif-2 είναι πολλές η σηµαντικότερη οµως είναι µία Οταν επώασαν σε Ιn vitro σύστηµα πρωτεϊνοσυνθέσεως τον eif-2 µε τον HCR παρουσία σηµασµένου ΑΤΡ και στην συνέχεια ανέλυσαν τις σηµασµένες πρωτεΐνες µε ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία διαπίστωσαν Οτι µόνο η daltons υποµονάδα του παράγοντα έναρξης eif-2 ήταν ραδιενεργός ένδειξη που υπεδείκνυε ότι στην διαδικασία αναστολής εµπλέκεται η φωσφορυλίωση του συγκεκριµένου παράγοντα

2 Για την διερεύνηση των αποτελεσµάτων αυτών οι διάφορες ερευνητικές οµάδες χρησιµοποίησαν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις Στην πρώτη προσέγγιση Επώασαν τον HCR σε In vitro σύστηµα πρωτεϊνοσυνθέσεως στο οποίο υπήρχε πλήρως καθαρισµένος παράγοντας έναρξης eif-2. 2.Τα αποτελέσµατα από ένα τέτοιο πείραµα δείχνουν ότι ο HCR δεν έχει την ικανότητα να επηρεάσει τον σχηµατισµό τετραµερούς συµπλέγµατος Στην δεύτερη προσέγγιση.επώασαν HCR µέσα σε ένα σύστηµα πρωτεϊνοσυνθέσεως το οποίο περιείχε µερικά µόνο παράγοντα έναρξης eif-2.τα αποτελέσµατα από τέτοια πειράµατα δείχνουν ότι στην περίπτωση αυτή ο παράγοντας αναστολής παρεµποδίζει τον σχηµατισµό τετραµερούς συµπλέγµατος

3 Οι απαντήσεις πού πήραν οι διάφορες ερευνητικές οµάδες από τα πειράµατα που έγιναν µε την χρησιµοποίηση του eif-2 ηταν συχνά αντικρουόµενες Κοινό χαρακτηριστικό όλων των πειραµατικών προσεγγίσεων η αναστολή της πρωτεινοσύνθεσης όταν χρησιµοποιείται φωσφορυλιωµένος παράγοντας έναρξης αλλά µόνο όταν οι αντιδράσεις γινόταν παρουσία διαφορων παραγόντων πού αποµονωνόταν από τα ριβοσώµατα Πράγµα πού µε άλλα λόγια σηµαίνει ότι µόνο στις περιπτώσεις πού για τις διάφορες αντιδράσεις της πρωτεϊνοσυνθέσεως χρησιµοποιούντο µη καθαρά ριβοσώµατα µπορεί κανείς να παρατηρήσει ξεκάθαρα την ανασταλτική ικανότητα του φωσφορυλιωµένου παράγοντα έναρξης

4 Για να δειχθεί ότι µόνο η φωσφορυλίωση του παράγοντα έναρξης 2 (eif-2) ήταν υπεύθυνη για την αναστολή έπρεπε να γίνουν δύο πειράµατα ελέγχου Να δειχθεί ότι ο φωσφορυλιωµένος παράγοντας έναρξης 2 (eif-2) είναι ανενεργός σε In vitro συστήµατα ως πρός µια από τις λειτουργίες του Η αποµάκρυνση µε µια φωσφατάση της φωσφορικής οµάδας από τον παράγοντα έναρξης 2 (eif-2) να έχει σαν συνέπεια την επαναφορά της πρωτεινοσύνθεσης στα κανονικά επίπεδα

5 Ρυθµιση της Φωσφορυλίωσης του eif-2 Μέχρι σήµερα πιστευόταν οτι µία ή περισσότερες πρωτεινικές κινάσες υπάρχουν σε αδρανή µορφή στα ζωικά κύτταρα και ενεργοποιούνται υπο ωρισµένας συνθήκας για να φωσφορυλιώσουν τον eif-2 και να αδρανοποιήσουν την πρωτεινοσύνθεση Εχει δειχθεί οτι στα δικτυοκύτταρα υπάρχουν κινάσες που ενεργοποιούνται µε τον HCR και τον DAI Σήµερα εχει βρεθεί µια 67Kda πρωτείνη η οποία προστρατευει τον eif-2 απο την φωσφορυλίωση Σήµερα πιστευεται οτι η κινάση του eif-2 είναι πάντα ενεργός εξαρταται οµως αν λειτουργεί ή οχι από την παρουσία της p67 στο σύστηµα Υπό ωρισµένας συνθήκας οπως κατά την διάρκεια ελλειψης αίµης στα δικτυοκύτταρα η p67 αποικοδοµείται αφήνοντας ευπρόσβλητο τον eif-2 στην φωσφορυλίωση

6 Έγινε έλεγχος της Ενεργότητος του φωσφορυλιωµένου και µη φωσφορυλιωµένου eif-2 στις παρακάτω αντιδράσεις ΚαταΚατα τον σχηµατισµό τού διµερούς συµπλέγµατος µε GTP ή GDP Κατά Κατά τον σχηµατισµό του τετραµερούς συµπλεγµατος eif-2 2 Met-t-RNAf GTP

7 Κατά την φωσφορυλίωση του eif-2 σύµφωνα µε το µοντέλο υποστηρίζεται οτι επισυµβαίνουν οι εξής µεταβολές Παρεµποδίζεται η αποµάκρυνση του GDP από το σύµπλεγµα eif-2 2 GDP Η Η παρουσία GDP στο σύµπλεγµα πιθανά να επηρεάζει την τριτοταγή διαµόρφωση µε συνέπεια του υπεύθυνου για την ανταλλαγή παράγοντος eif-2b να γίνεται προβληµατική

9 Το 1958 για πρώτη φορά δηµοσιεύεται οτι όταν κάποιος ιός µολύνει µια σειρά κυττάρων είτε αυτά ανήκουν σε ζώα ή σε κυτταρικές καλλιέργειες η πρώτη µόλυνση επηρεάζει την ικανότητα άλλων ασχέτων ιών να επιµολύνουν τα ίδια τα κύτταρα Με άλλα λόγια µπορεί κανείς να υποστηρίξει ότι µετά την επίδραση του πρώτου ιού τα κύτταρα αποκτούν ενα ανοσοποιητικό σύστηµα µε το οποίο µπορούν να ανθίστανται στις µετέπειτα µολύνσεις Τα κύτταρα το κατορθώνουν αυτό µε την έκκριση από τα µολυσµένα κύτταρα µιας ουσίας πού ονοµάζεται Ιντερφερόνη Η Ιντερφερόνη απλά παρεµβαίνει στα αλλα κύτταρα και µέσα από την επαγωγή της σύνθεσης κάποιων πρωτεινών παρεµβαίνει στην µετάφραση των µηνυµάτων των ιών

10 Λειτουργίες των Ιντερφερονών ΟιΟι Ιντερφερόνες ανήκουν στην µεγάλη υπεροµάδα των κυτοκινών οι οποίες έχουν ως λειτουργία να µεταφέρουν το µήνυµα από το ένα κύτταρο στο άλλο Οι Οι ιντερφερόνες φαίνεται να τροποποιούν τις ενεργότητες των διαφόρων στοιχείων του ανοσοποιητικού συστήµατος και κατ αυτό τον τρόπο να αυξάνουν την ικανότητα του συστήµατος να αµύνεται στις προσβολές τις οποίες υφίσταται από τους περισσότερους παράγοντες που προκαλούν τις διάφορες ασθένειες Οι Οι Ιντερφερόνες φαίνεται να προωθούν ή να καταστέλλουν την διαφοροποίηση µπορούν να αναστέλλουν την κυτταρική διαίρεση που µπορεί εν µέρει τουλάχιστον να ερµηνεύσει την παρέµβαση στο διπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων

11 Κύριο Ερώτηµα όσον Αφορά την δράση των Ιντερφερονών Πώς µε την δέσµευση των διαφόρων τύπων Ιντερφερονών στους αντιστοίχους υποδοχείς τα κύτταρα καθίστανται ικανά να ανθίστανται στούς ιούς να προωθούν την κυτταροδιαφοροποίση ή να αναστέλλουν την κυτταρική διαίρεση Είναι εδώ και αρκετά καιρό γνωστό ότι οι Ιντερφερόνες σε συνεργασία µε άλλες πρωτείνες οι οποίες παίρνουν οδηγίες επίσης από τα κύτταρα εστιάζουν την ενεργότητα τους στην ενεργοποίηση των δρόµων µεταγωγής

12 Σύµφωνα µε τις απόψεις του Darnell ακολουθείται η παρακάτω πορεία Η δέσµευση του τυπου Ι της Ιντερφερόνης στους υποδοχείς καταλήγει στην ενεργοποίηση ενός ενζύµου πού ονοµάζεται κινάση της τυροσίνης 2 (Tyr( K2).H κινάση της τυροσίνης είναι προσκολληµένη στο ενδοκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα Σύγχρονα µε την κινάση της τυροσίνης φαίνεται να ενεργοποιείται η Janus kinase Οι κινάσες αυτές µαζί η χωριστά φωσφορυλιώνουν τρεις πρωτεϊνες που ονοµάζονται stat (Signal Transducers) 113,91 και 84 Με την φωσφορυλίωση οι παράγοντες επάγονται και ενώνονται ο ένας µε τον άλλο και µε µια πρωτεΐνη 48 Kda και σχηµατίζουν ένα πλέγµα Τα γονίδια στα οποία δεσµεύεται το πλέγµα και τα οποία είναι εκείνα τα οποία στην συνέχεια ενεργοποιούνται περιέχουν ειδικές ακολουθίες βάσεων στην περιοχή του προµότορα

13 Τρόπος δράσης της Ιντερφερόνης Υπάρχουν δύο τρόποι µε τους οποίους η Ιντερφερόνη ρυθµίζει την µετάφραση των διαφόρων µηνυµάτων Με επαγωγή της πρωτεϊνικής κινάσης η οποία φωσφορυλιώνει την µικρή υποµονάδα του eif-2 Με επαγωγή του ενζύµου Ολιγοισοαδενυλικής συνθετάσης αυτή παρουσία ΑΤΡ µετατρέπει ΑΤΡ σε ολιγοαδενυλικό νουκλεοτίδιο το οποίο µε την σειρά του ενεργοποιεί µια ριβονουκλεάση F Η Η προσθήκη της Ριβονουκλεάσης µαζί µε το ολιγονουκλεοτίδιο ενεργοποιητή σε εκχύλισµα L κυττάρων πού δεν έχουν κατεργασθεί µε Ιντερφερόνη προκαλεί µια ελάττωση στο σχηµατισµό των πολυριβοσωµάτων και στην συνέχεια µια συσσώρευση στο σύµπλεγµα έναρξης

14 Θεωρίες µε τις οποίες γίνεται προσπάθεια να απαντηθεί το ερώτηµα Πως µη ειδικοί αναστολείς µπορούν να επηρεάζουν ειδικά την µετάφραση των µηνυµάτων των ιών ΜεΜε την δράση της νουκλεάσης το 2,5 ολιγοαδενυλικό το οποίο απαιτείται για την ενεργοποίηση αποικοδοµείται πάρα πολύ γρήγορα στην θέση που συντίθεται υπό την επίδραση του δίκλωνου RNA. Έτσι η δράση της νουκλεάσης περιορίζεται στ ο δίκλωνο RNA του ιού και δεν επεκτείνεται σε άλλα RNA του κυττάρου Το Το κύτταρο µπορεί να είναι ικανό να ανταποκρίνεται στην δράση της νουκλεάσης αυξάνοντας την σύνθεση του RNA που αποικοδοµείται και έτσι µπορεί να επαναλαµβάνει την πρωτεινοσύνθεση µετά την καταστροφή των ιών

16 Συστήµατα µεταφραστικού ελέγχου έχουν εντοπισθεί και σε κύτταρα τα οποία µολύνονται από διάφορους ιούς Μόλυνση του Κυττάρου από Πολυιό Το Το mrna τού ιού δεν φέρει καπέλο στο 5 άκρο και κατά συνέπεια δεν χρειάζεται να σχηµατίσει λειτουργικό σύµπλεγµα µε τον eif-4f για να µεταφρασθεί Στην Στην συνέχεια ο ιός ανενεργοποιεί το σύµπλεγµα µε τον eif-4f που σχηµατίζουν τα µηνύµατα τού κυττάρου ξενιστού αποικοδοµώντας την daltons του eif-4f

17 Ιός Εγκεφαλοµυοκαρδίτιδος ΤοΤο mrna του ιού δεν φέρει κάλυµµα στο 5 άκρο όπως και το µήνυµα του πολυιού Το Το mrna του ιού έχει µεγαλύτερη συγγένεια να δεσµεύει τον παράγοντα eif-4b από ότι έχουν τα κυτταρικά mrna έτσι κατορθώνει και παρεµποδίζει την µετάφραση των µηνυµάτων του κυττάρου ξενιστού Το Το mrna του ιού της εγκεφαλοµυοκαρδίτιδος µπορεί να µεταφράζεται σε κύτταρα πού έχουν µολυνθεί από πολυιό. Αυτό είναι µια επιπλέον ένδειξη ότι το µήνυµα του ιού δεν εχει κάλυµµα και κατά συνέπεια δεν εχει ανάγκη τον παράγοντα έναρξης eif-4f

Στο σύστηµα Ανάπτυξης του Αχινού Εγιναν οι παρακάτω διαπιστωσεις που σχετίζονται µε τον Μεταφραστικό Ελεγχο Τα µη γονιµοποιηµένα αυγά έδειχναν πάρα πολύ χαµηλή πρωτεινοσυνθετική ικανότητα σε σύγκριση

18 Στο σύστηµα Ανάπτυξης του Αχινού Εγιναν οι παρακάτω διαπιστωσεις που σχετίζονται µε τον Μεταφραστικό Ελεγχο Τα µη γονιµοποιηµένα αυγά έδειχναν πάρα πολύ χαµηλή πρωτεινοσυνθετική ικανότητα σε σύγκριση µε εκείνη την οποία δείχνουν όταν γονιµοποιηθούν Στα µη γονιµοποιηµένα αυγά υπάρχει µεγάλη ποσότητα καλυµµένου RNA το οποίο αποκαλύπτεται µετά την γονιµοποίηση Η Η πρωτεινοσύνθεση σε οµογενοποίηµα µη γονιµοποιηµένων αυγών διεγείρεται οταν προστεθεί ο eif-2 ή ο GEF o οποίος καταλύει την ανακύκλωση του eif-2 µεταξύ δύο διαδοχικών κύκλων έναρξης Πρέπει να σηµειωθεί ότι και οι δύο αυτοί παράγοντες καµµία σχέση δεν εχουν µε αποκάλυψη του µηνύµατος

19 Ο παράγοντας eif-4f και eif-4e επάγουν την µετάφραση σ αυτό το σύστηµα και η δράση τους είναι προσθετική µε εκείνη του GEF Μετά την γονιµοποίηση των αυγών παρατηρειται φωσφορυλίωση της Daltons υποµονάδας του eif-4f και αποφωσφορυλίωση της Daltons υποµονάδας του eif-2

Σχετικά έγγραφα

πρωτεινοσύνθεσης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη έκταση είναι

πρωτεινοσύνθεσης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη έκταση είναι Για τον εντοπισμό των μεταβολών πού επισυμβαίνουν στις διάφορες παραμέτρους της πρωτεινοσύνθεσης υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων χρησιμοποιούνται τα In vitro συστήματα Με τον ορο In vitro συστήματα