ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ. Ιατρός-Οδοντίατρος Στοματικός & Γναθοπροσωπικός Χειρουργός

Transcript

1 ΛΟΝΙΚΗΣ - ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ - ΑΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΤΟ ΑΚΑΝΘΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ ΚΑΙ Η ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΣΧΕΣΗΣ ΤΟΥΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΤΑΣΤΑΤΙΚΗ ΤΡΑΧΗΛΙΚΗ ΝΟΣΟ ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Ιατρός-Οδοντίατρος Στοματικός & Γναθοπροσωπικός Χειρουργός ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΤΟΜΑΤΙΚΗΣ & ΓΝΑΘΟΠΡΟΣΩΠΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΛΑΖΑΡΙΔΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΛΑΖΑΡΙΔΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΝΤΩΝΙΑΔΗΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΕΠΙΒΑΤΙΑΝΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΚΟΛΟΚΟΤΡΩΝΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΜΑΡΚΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής διατριβής από την Οδοντιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα» (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 παρ.2 και νόμος 1268/82, αρθρο 50 παρ.8) 3

4

5 Στους γονείς μου Στη σύζυγό μου Γιούλη και στο γιο μου Παναγιώτη Στους δασκάλους μου

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ. 17 α. Αγγείωση της γλώσσας 17 β. Νεύρωση της γλώσσας ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΒΛΕΝΝΟΓΟΝΟΥ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ Ι. Το επιθήλιο.. 21 ΙΙ. Άλλα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου της γλώσσας 24 ΙΙΙ. Διεπιθηλιακές κυτταρικές συνδέσεις 26 IV. Βασική μεμβράνη V. Μεσοκυττάρια ουσία του επιθηλίου της γλώσσας 29 VI. Χόριο VII. Αγγείωση-νεύρωση του συνδετικού ιστού της γλώσσας ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΗΣ ΣΤΟΜΑΤΙΚΗΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑΣ.. 35 I. Επιδημιολογία II. Σταδιοποίηση του καρκίνου του στόματος 36 III. Κλινική παθολογία-ιστοπαθολογία. 38 IV. Προκαρκινικές βλάβες καρκινογένεση 39 V. Ιστολογικοί τύποι ακανθοκυτταρικού καρκινώματος 42 VI. Δεύτεροι πρωτοπαθείς όγκοι ΛΕΜΦΑΔΕΝΙΚΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΑΝΘΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ. 51 I. Ανατομία της λεμφαδενικής μετάστασης Παράγοντες κινδύνου II. Βιολογία της μεταστατικής νόσου III. Ανοσολογία του ακανθοκυτταρικού καρκινου της γλώσσας και της μεταστατικής νόσου ΤΟ ΑΝΟΣΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ-ΕΙΔΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 61 A. Φυσική-μη ειδική ανοσία. 61 I. Πρωτεΐνες οξείας φάσης 62 II. Το συμπλήρωμα. 63 III. Τα φαγοκύτταρα.. 63 VI.Φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (Natural killer cells NK cells).. 64 Β. Ειδική ανοσιακή απάντηση. 66 Ι. Κύτταρα της ΕΑΑ α. Λεμφοκύτταρα λεμφικό σύστημα.. 66 β. Τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ cells) γ. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα 73 ΙΙ. Φάσεις της ΕΑΑ

8 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 7. ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΕΣ 83 I. Εισαγωγή. 83 II. Χημική δομή και κατηγορίες χημειοκινών 84 III. Λειτουργίες και ιδιότητες των χημειοκινών. 86 VI. Υποδοχείς των χημειοκινών-γενικά στοιχεία. 88 V. Χημική δομή των υποδοχέων 88 VI. Ενεργοποίηση των υποδοχέων των χημειοκινών-έναρξη χημειοταξίας VII. Η χημειοκίνη SLC 90 VIII.Ο υποδοχέας CCR7 93 IX. Ο ρόλος του συμπλέγματος SLC-CCR7 στον καρκίνο και τη μετάσταση ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ I. Γενικά. 97 II. Η επαγωγική διαδικασία της αγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης. 98 III. Ο ρόλος της λεμφαγγειογένεσης σε νοσολογικές οντότητες 102 α. Λεμφαγγειογένεση σχετιζόμενη με τη φλεγμονώδη αντίδραση 102 β. Λεμφαγγειογένεση και καρκίνος. Ο ρόλος της στη μεταστατική νόσο 103 γ. Οι παράγοντες λεμφαγγειογένεσης και οι χημειοκίνες. 105 δ. Λεμφαγγειογένεση επαγόμενη από τα μακροφάγα του όγκου. 105 ε. Ο ρόλος της λεμφαγγειογένεσης στον καρκίνο του στόματος ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς 115 Ανοσοϊστοχημεία. 116 Στατιστική Μεθοδολογία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 121 Α. Συσχέτιση μεταβλητών στις πρωτοπαθείς βλάβες των δύο ομάδων ασθνών. 121 Β. Συσχέτιση μεταβλητών στα τραχηλικά παρασκευάσματα των δύο ομάδων ασθενών 151 Γ. Συσχετίσεις μεταξύ των μεταβλητών ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY 191 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 199 8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η μελέτη της βιολογίας της μεταστατικής νόσου των συμπαγών όγκων αποτελεί σήμερα αντικείμενο εντατικής έρευνας. Για πολλά χρόνια οι γνώσεις μας για τη βιολογία της μεταστατικής νόσου θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν απλοϊκές. Από το 1889 με βάση την μελέτη των Paget και συν., η ερμηνεία της λεμφαδενικής μετάστασης βασίστηκε στη γνωστή πλέον θεωρία του σπόρου και του εδάφους. Σήμερα, με την εξέλιξη που έχει σημειωθεί στη μοριακή βιολογία και στην ανοσολογία των όγκων, η θεώρηση αυτή εγκαταλείπεται και αναδεικνύεται η σημασία της αγγειογένεσης, των χημειοτακτικών παραγόντων της ανοσιακής απάντησης, των μακροφάγων και άλλων αυξητικών παραγόντων και υποδοχέων. Η λεμφαδενική μετάσταση στον τράχηλο αποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό πρόβλημα στους ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνο της γλώσσας, που αυξάνει τη νοσηρότητα και μειώνει δραματικά το ποσοστό ολικής επιβίωσης των ασθενών. Εκτιμάται ότι η γλώσσα αποτελεί την συχνότερη εντόπιση μεταστατικού καρκίνου στο βλεννογόνο του στόματος με ποσοστό που ξεπερνά το 30% κατά την αρχική εξέταση. Στην παρούσα διατριβή επιχειρήθηκε να αναλυθεί ο μηχανισμός της λεμφαδενικής μετάστασης του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της γλώσσας. Διερευνήθηκε η συμμετοχή της χημειοκίνης SLC και του υποδοχέα της CCR7, καθώς και ο ρόλος της λεμφαγγειογένεσης στη βιολογία της μεταστατικής νόσου με την ανάλυση της έκφρασης των λεμφαγγειογενετικών παραγόντων VEGF-C, VEGFR-3, D2-40, και της συγκέντρωσης των μακροφάγων στο στρώμα του όγκου. Η υποθετική θεώρηση της βιολογίας της μεταστατικής νόσου που παρουσιάστηκε ως αποτέλεσμα της παρούσας μελέτης, περιλαμβάνει μία αλληλουχία γεγονότων που περιγράφουν την αλληλεπίδραση μεταξύ του μικροπεριβάλλοντος του όγκου και των καρκινικών κυττάρων με τελικό αποτέλεσμα τη λεμφαδενική μετάσταση. Έγινε φανερό ότι η λειτουργία των μακροφάγων, των δενδριτικών κυττάρων αλλά και όλων των υπόλοιπων ανοσιακών κυττάρων στο καρκινικό περιβάλλον της γλώσσας, καθιστά δεδομένη την άμεση σχέση της ανοσιακής απάντησης 9

10 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ αλλά και του γενικότερου ανοσολογικού προφίλ του οργανισμού με τη λεμφαδενική μετάσταση. Επομένως, ο έλεγχος των μηχανισμών και των παραγόντων που μεταβάλλουν τη λειτουργία των ανοσιακών κυττάρων στο περιβάλλον του όγκου μπορεί να θεωρηθεί ιδιαίτερα κρίσιμος για το σχεδιασμό περισσότερο στοχευμένων κυτταρικών και μοριακών θεραπευτικών πρωτοκόλλων. Ευχαριστώ θερμά τον Καθηγητή Στοματικής & Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής κ. Ιωάννη Δημητρακόπουλο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση αυτής της διατριβής, την πολύτιμη υποστήριξή του στο σχεδιασμό και στην υλοποίηση της έρευνας και την παρακολούθησή της σε όλα τα σταδια της διεξαγωγής της. Τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Λαζαρίδη ευχαριστώ για τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις του και τις πολύτιμες γνώσεις που μου παρείχε σε όλη τη διάρκεια της εκπαίδευσής μου. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Λαμπρόπουλο μέλος της τριμελούς επιτροπής για τις συμβουλές του κατά τη διάρκεια της διατριβής και τις ιδιαίτερα χρήσιμες επισημάνσεις του. Πολύτιμη συνεισφορά στην ολοκλήρωση της διατριβής είχε και ο Καθηγητής κ. Κωνσταντίνος Αντωνιάδης, Διευθυντής της Στοματικής & Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής Κλινικής και μέλος της επταμελούς επιτροπής. Ευχαριστώ επίσης τους Καθηγητές του Εργαστηρίου της Στοματολογίας κκ. Αναστάσιο Μαρκόπουλο, Απόστολο Επιβατιανό και Αλέξανδρο Κολοκοτρώνη για τις καίριες παρατηρήσεις τους ως μέλη της επταμελούς επιτροπής. Θεωρώ ιδιαίτερη υποχρέωση να ευχαριστήσω τον Επίατρο κ. Στέφανο Μηλιά Ιστοπαθολόγο-Επιμελητή του Εργαστηρίου Ιστοπαθολογίας του 424 Γενικού Στρατιωτικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης και όλο το προσωπικό του εργαστηρίου για την ακριβή, επιμελημένη και επιστημονικά τεκμηριωμένη ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των παρασκευασμάτων. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον Στατιστικολόγο κ. Βασίλη Καραγιάννη για την ε- πιμέλεια της πολύπλοκης και αναλυτικής στατιστικής επεξεργασίας. 10

11 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Ευχαριστώ επίσης και τον Ιστοπαθολόγο του Γενικού Νοσοκομείου Γ. Παπανικολάου κ. Φώτη Ιορδανίδη για τη συνεισφορά του στη συλλογή των παρασκευασμάτων. Επιπλέον, ευχαριστώ θερμά την γραφίστρια κ.βιβή Οικονόμου για την επιμελημένη διόρθωση και τεχνική υποστήριξη του κειμένου. Τέλος δε θα μπορούσα βέβαια να παραλείψω την πολύτιμη συνεισφορά της οικογενείας μου στην ολοκλήρωση της διατριβής με την συμπαράσταση και την υπομονή τους σε όλη τη διάρκεια της διεξαγωγής της. 11

12

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

14

15 1. ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ Η γλώσσα εμβρυολογικά προέρχεται από το πρώτο, δεύτερο και τρίτο βραγχιακό τόξο και διαπλάθεται κατά την διάρκεια της 4 ης έως την 15 η εμβρυϊκή εβδομάδα. Η κορυφή και το σώμα της γλώσσας που αποτελούν και τα δύο πρόσθια τριτημόρια, προέρχονται από το πρώτο βραγχιακό τόξο, σχηματίζονται στο κοιλιακό τοίχωμα της αρχέγονης στοματοφαρυγγικής κοιλότητας από τη συνένωση των δύο πλάγιων γλωσσικών επαρμάτων με το άζυγο φύμα στο κέντρο και καλύπτονται από επιθήλιο εξωδερμικής προέλευσης. Πίσω από το άζυγο φύμα βρίσκεται το βραχιακό έπαρμα προερχόμενο από το δεύτερο και τρίτο βραγχιακό τόξο, ενώ μεταξύ τους βρίσκεται το τυφλό τρήμα. Ταυτόχρονα σχηματίζεται το οπίσθιο τριτημόριο (βάση) της γλώσσας, που αποτελεί και το ακίνητο τμήμα της, από την αύξηση του συνδετικού επάρματος προερχόμενο από το δεύτερο και τρίτο βραγχιακό τόξο. Το όριο μεταξύ σώματος και βάσης της γλώσσας αποτελεί η τελική αύλακα αμέσως μπροστά από το τυφλό τρήμα και αντιστοιχεί στο όριο μεταξύ πρώτου και δεύτερου βραγχιακού τόξου. Στη θέση του τυφλού τρήματος σχηματίζεται ο θυρεογλωσσικός πόρος προερχόμενος από κατάδυση του έσω βλαστικού δέρματος, κατάλοιπα του οποίου ενδέχεται να παραμείνουν και μετά την γέννηση. Γύρω στην 7 η εμβρυϊκή εβδομάδα αρχίζουν να σχηματίζονται οι γευστικές κάλυκες στη ραχιαία επιφάνεια της γλώσσας, η διάπλαση των οποίων ολοκληρώνεται μεταξύ της 13 ης και 15 ης εμβρυϊκής εβδομάδας με την διάπλαση των μυκητοειδών, τριχοειδών, φυλλοειδών και περιχαρακωμένων θηλών της γλώσσας. Οι αυτόχθονες μύες της γλώσσας που αποτελούν και την κύρια μάζα της προέρχονται από τα ινιακά μυοτόμια, ενώ μέσα στο χόριο και μεταξύ των μυϊκών δεσμίδων εμπεριέχονται οι σιελογόνοι αδένες της γλώσσας οι οποίοι είναι ορώδεις (γευστικοί), βλεννώδεις ή μικτοί. Η αισθητική νεύρωση των δύο προσθίων τριτημορίων της γλώσσας δίδεται από το γλωσσικό νεύρο, κλάδο του τριδύμου ως κεντρικό στέλεχος του πρώ- 15

16 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ του βραγχιακού τόξου. Το προσωπικό νεύρο δίνει αισθητηριακές νευρικές ίνες μέσω της χορδής του τυμπάνου για την αίσθηση της γεύσης, προερχόμενο από το δεύτερο βραγχιακό τόξο, ενώ το γλωσσοφαρυγγικό, προερχόμενο από το τρίτο βραγχιακό τόξο, δίνει τόσο αισθητικές όσο και αισθητηριακές ίνες που κατανέμονται στη βάση της γλώσσας. 1 16

17 2. ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ Τα πρόσθια δύο τρίτα της γλώσσας που αποτελούν και το κινητό τμήμα της εκτείνονται από τη τελική γραμμή των περιχαρακωμένων θηλών έως την ένωση της κάτω επιφάνειας της γλώσσας με το έδαφος του στόματος. Μπορεί να διαχωριστεί σε επιμέρους ανατομικά στοιχεία όπως η κορυφή, τα πλάγια χείλη, η ραχιαία και η κοιλιακή επιφάνεια, ενώ από την επιφάνεια έως το βάθος αποτελείται από το βλεννογόνο και τη μάζα των μυών οι οποίοι διαχωρίζονται μεταξύ τους κατά τη μέση γραμμή από το λεπτό ινώδες διάφραγμα. Μεταξύ των μυϊκών δεσμίδων της μυϊκής μάζας της γλώσσας βρίσκονται μικροί έκτοποι σιελογόνοι αδένες. 2 α. Αγγείωση της γλώσσας 1. Αρτηρίες Ο συνδετικός ιστός της γλώσσας δέχεται πλούσια αιμάτωση από κλάδους της γλωσσικής αρτηρίας, η οποία εκφύεται από το πρόσθιο έσω τοίχωμα της έξω καρωτίδας. Αρχικά πορεύεται επί τα εντός του υογλωσσικού μυός γειτνιάζοντας προς τα έξω με το υπογλώσσιο νεύρο, τη συνοδό του φλέβα και τη γλωσσική φλέβα. Στη συνέχεια χορηγεί ραχιαίους γλωσσικούς κλάδους που αιματώνουν τη ράχη της γλώσσας. Οι τελευταίοι πορεύονται προς τα άνω και εμπρός κατά μήκος του πλαγίου της ρίζας της γλώσσας, όπου χορηγούν κλωνία στο βλεννογόνο της φαρυγγικής μοίρας της γλώσσας και της επιγλωττίδας. Κατόπιν, η γλωσσική αρτηρία πορεύεται προς το μέσο του πρόσθιου χείλους του υογλωσσικού μυός πάνω στο γενειογλωσσικό και κάτω από τον γναθουοειδή μυ, οπότε χορηγεί την ελικοειδή υπογλώσσια αρτηρία. Αυτή καθώς πορεύεται προς τα άνω και εμπρός παράλληλα προς τον πόρο του υπογναθίου αδένα, διανέμεται στον υπογλώσσιο αδένα, στα γλωσσικά ούλα και στο χαλινό της γλώσσας. 17

18 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Στη συνέχεια η γλωσσική αρτηρία πορεύεται λοξά προς τα άνω και ε- μπρός, κατά μήκος της κάτω μοίρας του πλαγίου χείλους της γλώσσας, οπότε ονομάζεται εν τω βάθει γλωσσική αρτηρία. Αυτή δίνει άφθονα κλωνία για τους μυς και το βλεννογόνο της στοματικής μοίρας της γλώσσας και τελικά καταλήγει στη κορυφή της γλώσσας, όπου αναστομώνεται με κλωνία της ετερόπλευρης αρτηρίας. Αρτηριακές αναστομώσεις κατά μήκος της μέσης γραμμής του σώματος της γλώσσας δεν υφίστανται, αλλά υπεράριθμες αναστομώσεις υπάρχουν μεταξύ των δύο ημιμορίων της γλώσσας αντίστοιχα προς την κορυφή και την βάση της γλώσσας Φλέβες Το κύριο φλεβικό στέλεχος που αποχετεύει το φλεβικό αίμα από τη γλώσσα είναι η γλωσσική φλέβα. Πρόκειται για φλεβικό στέλεχος που εκβάλλει απευθείας στην έσω σφαγίτιδα, είναι ασταθές και πορεύεται επί τα εκτός του υογλωσσικού μυός σε αντίθεση με τη γλωσσική αρτηρία που πορεύεται επί τα ε- ντός του μυός. Η ραχιαία γλωσσική φλέβα συλλέγει το φλεβικό αίμα από τη ραχιαία επιφάνεια της γλώσσας καθώς πορεύεται μεταξύ του υογλωσσικού και του γενειογλωσσικού μυός. Η εν τω βάθει γλωσσική φλέβα αθροίζει το αίμα από τη κορυφή της γλώσσας, πορεύεται στη κάτω επιφάνειά της κάτω από το βλεννογόνο και σε αυτήν εκβάλλουν η υπογλώσσια φλέβα και η συνοδός φλέβα του υπογλωσσίου νεύρου Λεμφαγγεία Τα λεμφαγγεία της γλώσσας ταξινομούνται σε κορυφαία ή πρόσθια, επιχείλια ή πλάγια και βασικά ή οπίσθια. Τα κορυφαία λεμφαγγεία φέρονται στα πλάγια του χαλινού και εκβάλλουν στους υπογενείδιους λεμφαδένες. Τα επιχείλια λεμφαγγεία αφενός μεν φέρονται στα πλάγια του υπογλώσσιου αδένα και εκβάλλουν στους υπογνάθιους λεμφαδένες, αφετέρου δε αφού συνοδεύσουν τη 18

19 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ γλωσσική αρτηρία εκβάλλουν στους εν τω βάθει τραχηλικούς λεμφαδένες. Τα βασικά λεμφαγγεία προς τα πίσω, αφού διέλθουν διαμέσου του φάρυγγα εκβάλλουν στους εν τω βάθει τραχηλικούς λεμφαδένες. 5 β. Νεύρωση της γλώσσας Η γλώσσα δέχεται αισθητικές ίνες από το γλωσσικό νεύρο, το οποίο αποτελεί κλάδο του κάτω γναθικού νεύρου της Vης εγκεφαλικής συζυγίας (τρίδυμο νεύρο). Επίσης η γλώσσα δέχεται αισθητηριακές ίνες για την αίσθηση της γεύσης από την χορδή του τυμπάνου του προσωπικού νεύρου για τις μυκητοειδείς γευστικές κάλυκες και από γλωσσικούς κλάδους του γλωσσοφαρυγγικού και του πνευμονογαστρικού νεύρου για τις υπόλοιπες γευστικές κάλυκες. Η κινητικότητα της γλώσσας εξασφαλίζεται από τους τελικούς γλωσσικούς κλάδους του υπογλωσσίου νεύρου (ΧΙΙ εγκεφαλική συζυγία). 2 19

20

21 3. ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΒΛΕΝΝΟΓΟΝΟΥ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ Ο βλεννογόνος του στόματος γενικά αποτελείται από το επιθήλιο, το χόριο και σε ορισμένες ανατομικές περιοχές από τον υποβλεννογόνιο, με τη βοήθεια του οποίου διαχωρίζεται αλλά και στηρίζεται στις υποκείμενες ανατομικές δομές όπως οι μύες, και τα οστά. Ειδικότερα στη γλώσσα λείπει ο υποβλεννογόνιος χιτώνας και το χόριο να συνδέεται απευθείας με τους υποκείμενους μύες. I. Το επιθήλιο Ο βλεννογόνος της ραχιαίας επιφάνειας της γλώσσας καλύπτεται από κερατινοποιημένο επιθήλιο, ενώ ονομάζεται και εξειδικευμένος βλεννογόνος, λόγω της γευστικής λειτουργίας που επιτελεί με τις γευστικές κάλυκες των θηλών. Το κερατινοποιημένο επιθήλιο της ραχιαίας επιφάνειας της γλώσσας διακρίνεται σε ορθοκερατινοποιημένο όπου η επιφανειακή στιβάδα είναι κερατίνη και παρακερατινοποιημένο όπου η επιφανειακή στιβάδα είναι παρακερατίνη. Το πάχος του κυμαίνεται από 0,2-0,3 χιλ. και χαρακτηρίζεται από βαθιές επιθηλιακές καταδύσεις προς τον υποκείμενο συνδετικό ιστό. Η σύνδεση των επιθηλιακών κυττάρων με τον υποκείμενο συνδετικό ιστό επιτελείται από την πλευρά του επιθηλίου με ημιδεσμοσωματιακούς δεσμούς με την παρεμβολή του βασικού υ- μένα και από την πλευρά του συνδετικού ιστού με προσκολλητικά ινίδια αγκύρωσης. Το κερατινοποιημένο επιθήλιο αποτελείται από τέσσερις στιβάδες οι ο- ποίες από την επιφάνεια προς το βάθος είναι: η κερατίνη ή παρακερατίνη, η κοκκώδης, η ακανθωτή και η βασική στιβάδα, ενώ χωρίζεται από το χόριο με την βασική μεμβράνη. Η βασική ή βλαστική στιβάδα αποτελείται από μικρά κυβοειδή ή κυλινδρικά κύτταρα με διαυγή χρώση αιματοξυλίνης ηωσίνης. Μεταξύ των κυττάρων της βασικής στιβάδας ανευρίσκονται συχνά κοκκία μελανίνης. Το κυτταρόπλασμά τους περιέχει πολλά ελέυθερα ριβοσωμάτια, λίγα μιτοχόνδρια, μικρό συ- 21

22 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ στημα Golgi, και μικρές ποσότητες ενδοπλασματικού δικτύου. Μεγάλο τμήμα του κυτταροπλασματικού χώρου καταλαμβάνουν δέσμες ινιδίων και τονοϊνιδίων, οι οποίες προσκολλούνται στις κυτταροπλασματικές πλάκες πρόσφυσης κατά μήκος των κυτταρικών μεμβρανών, διαμορφώνοντας έτσι τον βασικό σκελετό διατήρησης του σχήματος των κυττάρων. Ταυτόχρονα, το δίκτυο αυτό είναι υπεύθυνο για την συγκράτηση των κυττάρων τόσο μεταξύ τους, όσο και με τον υποκείμενο συνδετικό ιστό. Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας είναι τα μόνα που μπορούν να πολλαπλασιάζονται μέσω μιτωτικής διαίρεσης και να αναπαράγουν έτσι τα κύτταρα που αποπίπτουν από την επιφάνεια. Κάθε φορά που γίνεται μιτωτική διαίρεση των κυττάρων της βασικής στιβάδας, τα παρακείμενα ώριμα κύτταρα εξωθούνται προς την ακανθωτή στιβάδα αρχίζοντας την διαφοροποίησή τους, με τελικό προορισμό την κερατίνη στιβάδα. Ολόκληρη η διαδικασία της προώθησης και διαφοροποίησής του από την βασική στιβάδα μέχρι την απόπτωσή του από την εξωτερική στιβάδα διαρκεί περίπου τριάντα ημέρες. Η ακανθωτή στιβάδα αποτελείται από αρκετές σειρές χαρακτηριστικών πολυεδρικών κυττάρων, με πολυάριθμα τονοϊνίδια στο κυτταρόπλασμά τους Παρουσιάζουν αυξημένο όγκο κυτταροπλάσματος, εντός του οποίου αναγνωρίζονται ελεύθερα ριβοσωμάτια σε μεγάλες ποσότητες, γεγονός που υποδηλώνει και την μεγάλη πρωτεϊνοσυνθετική ικανότητα των κυττάρων της ακανθωτής στιβάδας. Οι κυριότερες από τις πρωτεΐνες αυτές είναι οι κερατίνες που χρησιμεύουν στην παραγωγή των τονοϊνιδίων. Αυτά καταλαμβάνουν συνήθως το 40% του κυτταροπλάσματος και σε συνεργασία με τα δεσμοσωμάτια τα οποία παρουσιάζονται αυξημένα σε αριθμό-είναι υπεύθυνα για την διατήρηση του κυτταρικού σκελετού και της δομής της ακανθωτής στιβάδας.η ακανθωτή στιβάδα είναι συνήθως η πλέον διακριτή στιβάδα του επιθηλίου, ενώ στις ανώτερες κυτταρικές σειρές παρουσιάζονται χαρακτηριστικά ωοειδή κοκκία, τα σωμάτια Odland τα οποία θεωρούνται ως τροποποιημένα λυοσωμάτια που πριέχουν μεγάλες ποσότητες αλκαλικής φωσφατάσης και είναι υπεύθυνα για την μετάπτωση των κυττάρων από την ακανθωτή στην κοκκώδη στιβάδα. Η κοκκκώδης στιβάδα αποτελείται από αποπλατυσμένα κύτταρα μεγαλύτερα σε μέγεθος από αυτά της ακανθωτής στιβάδας. Το κυτταρόπλασμά τους αποτελείται από ένα σχετικά μεγάλο δίκτυο τονοϊνιδίων, ενώ πολλά οργανίδια 22

23 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ εκλείπουν τελείως. Περιέχουν πολυάριθμα μικρά κοκκία που ονομάζονται κοκκία κερατοϋαλίνης με χαρακτηριστικό κυανό χρώμα σε χρώση αιματοξυλίνης- ηωσίνης. Τα κοκκία αυτά είναι υπεύθυνα για την έκκριση ειδικών πρωτεϊνών, των φιλαγκρινών στο μεσοκυττάριο χώρο. Οι φιλαγκρίνες που είναι εμφανέστερες στην κερατίνη στιβάδα, σχηματίζουν ένα σχετικά αδιαπέρατο φραγμό, ο οποίος συμμετέχει στις διαδικασίες της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης ως φυσικός φραγμός των ανώτερων στιβάδων του επιθηλίου. Στο παρακερατινοποιημένο επιθήλιο, ενδέχεται η στιβάδα αυτή να λείπει τελείως. Η κερατίνη στιβάδα αποτελείται από αποπλατυσμένα απύρηνα (ορθοκερατίνη) ή εμπύρηνα κερατινοκύτταρα (παρακερατίνη), το πάχος της οποίας ποικίλει ανάλογα με την ανατομική περιοχή και είναι ιδιαίτερα αυξημένο σε περιοχές που δέχονται μεγάλες μασητικές πιέσεις. Η κερατίνη στιβάδα περιέχει κερατινοκύττρα στο τελικό στάδιο ωρίμανσης, τα οποία αποτελούνται από πυκνές δέσμες τονοϊνιδίων και περιβάλοναι από ένα στρώμα πρωτεϊνών όπως η φιλαγκρίνη, η κερατολινίνη και η ινβολουγκρίνη. Τα δεσμοσωμάτια μεταξύ των κυττάρων της κερατίνης στιβάδας παρουσιάζουν χαλαρές συνδέσεις, ώστε τα κερατινοκύτταρα στο τελικό στάδιο ωρίμανσής τους να αποπίπτουν ευκολότερα, διατηρώντας σταθερό τον αριθμό τους σε ολόκληρο το επιθήλιο. Η κερατίνη στιβάδα αποτελεί τον πρώτο φυσικό φραγμό του επιθηλίου, προσφέροντας μηχανική και χημική αντοχή στο επιθήλιο. Ποικίλει σε πάχος και είναι περισσότερο πεπαχυμένη στις περιοχές που δέχονται μεγαλύτερη μηχανική πίεση. Το μη κερατινοποιημένο επιθήλιο διαφέρει από το κερατινοποιημένο στο γεγονός ότι λείπουν οι δύο πρώτες στιβάδες δηλαδή η κερατίνη και η κοκκώδης και αντί για αυτές υπάρχουν η επιφανειακή και η ενδιάμεση οι οποίες α- ποτελούνται από εμπύρηνα κύτταρα με διαυγές κυτταρόπλασμα. Οι δύο κατώτερες στιβάδες, η ακανθωτή και η βασική υπάρχουν και στο μη κερατινοποιημένο επιθήλιο με μικρές διαφορές. Τα κύτταρα της επιφανειακής στιβάδας είναι αποπλατυσμένα, χωρίς τονονημάτια, ενώ στην ενδιάμεση στιβάδα βρίσκουμε κύτταρα μεγαλύτερου μεγέθους από την ακανθωτή στιβάδα, με λίγα κοκκία κερατοϋαλίνης και αθροίσεις γλουκαγόνου. Μη κερατινοποιημένο επιθήλιο εκτός από την κοιλιακή επιφάνεια της γλώσσας βρίσκουμε σε περιοχές με μικρές μασητικές πιέσεις όπως η πα- 23

24 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ρειά, το έδαφος του στόματος, η μαλθακή υπερώα, ο βλεννογόνος του άνω και κάτω χείλους, ενώ κερατινοποιημένο εκτός από την ραχιαία επιφάνεια της γλώσσας, βρίσκουμε στα ούλα, το οπισθογόμφιο τρίγωνο και στη σκληρά υπερώα. Ειδικότερα, στην ραχιαία επιφάνεια της γλώσσας βρίσκεται το εξειδικευμένο επιθήλιο, όπου υπάρχουν τέσσερα είδη θηλών οι τριχοειδείς, οι μυκητοειδείς, οι περικεχαρακομένες και οι φυλοειδείς οι οποίες σχετίζονται με τη γευστική λειτουργία. 6 II. Άλλα κύτταρα του στοματικού επιθηλίου της γλώσσας Εκτός όμως από τα επιθηλιακά κύτταρα-κερατινοκύτταρα τα οποία προέρχονται από τη βασική στιβάδα και διαφοροποιούνται κατά την ανάδυσή τους στις ανώτερες στιβάδες, στο επιθήλιο υπάρχουν και μη κερατινοκύτταρα που δεν σχετίζονται με την διαδικασία της κερατινοποίησης, αλλά επιτελούν άλλες λειτουργίες ενώ αποτελούν περίπου το 10% του συνόλου των κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά είναι τα μελανινοκύτταρα, τα κύτταρα Langerhans, τα κύτταρα Merkel και λίγα φλεγμονώδη κύτταρα, όπως λεμφοκύτταρα, πολυμορφοπύρηνα και μακροφάγα. Μελανινοκύτταρα Τα μελανινοκύτταρα είναι πολυγωνικά ή ατρακτοειδή κύτταρα μεγάλου μεγέθους με χαρακτηριστικές αποφυάδες, και θεωρούνται ως δενδριτικά κύτταρα. Βρίσκονται μεταξύ των κυττάρων της βασικής στιβάδας και προέρχονται από κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας. Είναι υπεύθυνα για την παραγωγή μελανίνης από ειδικά κυτταροπλασματικά κοκκία που ονομάζονται μελανινοσωμάτια. Τα μελανινοσωμάτια φαγοκυτταρώνονται από κοντινά επιθηλιακά κύτταρα και από μακροφάγα κύτταρα του χορίου που ονομάζονται μελανινοφόρα κύτταρα. Τα μελανινοκύτταρα, ανάλογα με τον αριθμό τους και την ποσότητα μελανίνης που παράγουν, προσδίδουν στον βλεννογόνο του στόματος και το ανάλογο χρώμα. 24

25 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Κύτταρα Langerhans Τα κύτταρα Langerhans βρίσκονται στα ανώτερα τμήματα της ακανθωτής στιβάδας του επιθηλίου με διαυγές κυτταρόπλασμα στη χρώση αιματοξυλίνης ηωσίνης. Αποτελούν κατηγορία των άωρων δενδριτικών κυττάρων, όπου ο ρόλος τους περιορίζεται στα αρχικά στάδια της ειδικής ανοσιακής απάντησης κατά την οποία γίνεται η σύνδεση του δενδριτικού κυττάρου με το ειδικό αντιγόνο και επιτελείται η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης. Ταυτόχρονα τα κύτταρα αυτά είναι υπεύθυνα για την επαγωγή των επόμενων σταδίων της ανοσιακής απάντησης που αφορούν κυρίως την αντιγονοπαρουσίαση και την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Επίσης, δεν διαθέτουν δεσμοσωμάτια και τονοϊνίδια, ενώ έχουν χαρακτηριστικά οργανίδια τα κοκκία Birbeck. Κύτταρα Merkel Τα κύτταρα του Merkel βρίσκονται στη βασική στιβάδα του στοματικού ε- πιθηλίου μεταξύ των κερατνοκυττάρων. Σε αντίθεση με τα μελανινοκύτταρα και τα κύτταρα Langerhans δεν είναι δενδριτικά κύτταρα και περιέχουν μερικά δεσμοσωμάτια και τονοϊνίδια και γι αυτό το λόγο δεν φαίνονται ως διαυγή κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά φέρουν νευρικές απολήξεις και υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι μπορεί να είναι αισθητήρια κύτταρα που έχουν σχέση με την αίσθηση της αφής. Η προέλευσή τους παραμένει αμφισβητούμενη, καθώς φαίνεται να προέρχονται από τη νευρική ακρολοφία ή από επιθηλιακά κύτταρα. Φλεγμονώδη κύτταρα Μερικά φλεγμονώδη κύτταρα μπορεί παροδικά να μεταναστεύσουν από το χόριο στο επιθήλιο χωρίς ουσιαστικά να ανήκουν σε αυτό. Σε αντίθεση με τα άλλα κερατινοκύτταρα, τα φλεγμονώδη κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται μέσα στο επιθήλιο. Τα πιο συχνά φλεγμονώδη κύτταρα του επιθηλίου είναι τα λεμφοκύτταρα και σε μικρότερα ποσοστά τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και τα μονοκύτταρα. 7 25

26 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ III. Διεπιθηλιακές κυτταρικές συνδέσεις Στο στοματικό επιθήλιο έχουν παρατηρηθεί τρία κύρια είδη κυτταρκών συνδέσεων: 1. Συνδέσεις απόφραξης 2. Συνδέσεις αγκύρωσης 3. Συνδέσεις επικοινωνίας Συνδέσεις απόφραξης Κύριος αντιπρόσωπος της ομάδας αυτής κυτταρικών συνδέσεων είναι οι ερμητικές συνδέσεις. Στο στοματικό επιθήλιο οι ερμητικές συνδέσεις είναι σπάνιες και παρατηρούνται κυρίως μεταξύ των κυττάρων της κοκκώδους στοιβάδας. Οι ερμητικές συνδέσεις αποτελούν περιοχές στενότερης επαφής μεταξύ των παρακείμενων κυττάρων με τελικό αποτέλεσμα την πλήρη εξάλειψη του μεσοκυττάριου χώρου και τη διακοπή επικοινωνίας λιπιδίων και πρωτεϊνών ανάμεσα στα κύτταρα. Συνήθως συνυπάρχουν με δεσμοσωματιακές συνδέσεις και δρουν ως φραγμός επικοινωνίας υγρών στοιχείων μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών παρακείμενων κυττάρων. Συνδέσεις αγκύρωσης Πρόκειται για συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων του επιθηλίου ή μεταξύ αυτών και της εξωκυττάριας ουσίας. Στο επιθήλιο του στόματος οι συνδέσεις αυτές εξασφαλίζουν την ομοιόμορφη κατανομή των δυνάμεων μέσω των επιθηλιακών κυττάρων στον υποκείμενο συνδετικό ιστό. Διακρίνονται δύο βασικοί τύποι συνδέσεων αγκύρωσης: α) συνδέσεις προσκόλλησης και β) δεσμοσωμάτια και ημιδεσμοσωμάτια. Οι συνδέσεις προσκόλλησης αποτελούνται από πρωτεΐνες προσκόλλησης που βρίσκονται είτε ενδοκυττάρια ως ινίδια ακτίνης συνθέτοντας τον κυτταρικό σκελετό, είτε διαμεμβρανικά ως γλυκοπρωτεΐνες σύνδεσης. Το ενδοκυττάριο τμήμα των γλυκοπρωτεϊνών αυτών συνδέεται με ενδοκυττάριες πρωτεΐνες προσκόλλησης, ενώ το εξωκυττάριο τμήμα αλληλεπιδρά με την μεσοκυττάρια ουσία 26

27 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ και ανήκει στην οικογένεια των ιντεγρινών ή συνδέεται με το εξωκυττάριο τμήμα μιας γλυκοπρωτεϊνης ενός άλλου κυττάρου οπότε ανήκει στην οικογένεια των κατχερινών. Οι συνδέσεις αυτές αποτελούν συνδέσεις Ca ++ και δημιουργούν ζώνες προσκόλλησης μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων. Τα δεσμοσωμάτια σχηματίζονται από τον συνδυασμό ενδοκυττάριων πρωτεϊνών προσκόλλησης που συνθέτουν μία πυκνή κυτταροπλασματική πλάκα και διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών σύνδεσης οι οποίες συνδέουν τις κυτταροπλασματικές πλάκες δύο γειτονικών κυττάρων. Τα δεσμοσωμάτια αποτελούν και αυτά συνδέσεις Ca ++ και είναι οι συχνότερες διεπιθηλιακές συνδέσεις του στοματικού επιθηλίου. Βρίσκονται σε όλες τις στιβάδες του επιθηλίου με συχνότερη εντόπιση στην κοκκώδη και κερατίνη στιβάδα. Τα ημιδεσμοσωμάτια συνδέουν τα κύτταρα της βλαστικής στιβάδας του επιθηλίου με την βασική μεμβράνη. Διαφέρουν από τα δεσμοσωμάτια στο σύμπλεγμα ενδοκυττάριων πρωτεϊνών όπου αντί για την δεσμοπλακίνη και την πλακοσφαιρίνη, οι ενδοκυττάριες πλάκες αποτελούνται από ιντεγκρίνη μέσω της οποίας γίνεται η σύνδεση του κυττάρου της βλαστικής στιβάδας με την λαμινίνη της βασικής μεμβράνης. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται ισχυρή σύνδεση του κυτταροσκελετού της βλαστικής στιβάδας με την βασική μεμβράνη, η οποία εξασφαλίζει τελικά και την σταθερότητα ολόκληρου του επιθηλίου. Συνδέσεις επικοινωνίας Οι συνδέσεις επικοινωνίας ή ρωγμώδεις συνδέσεις αποτελούνται από διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που ονομάζονται κονεξόνια. Σχηματίζουν ειδικούς διαύλους επιτρέποντας μικρομόρια να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και να μεταφέρονται από κύτταρο σε κύτταρο εξασφαλίζοντας με αυτόν τον τρόπο τη μεταβολική σύνδεση μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων. Κάθε είδος κυττάρου εκφράζει συγκεκριμένο τύπο κονεξονίου, επιτρέποντας την σύνδεση μόνο όμοιων κυττάρων. Τα κονεξόνια λειτουργούν ουσιαστικά ως μία δυναμική πύλη εισόδου του κυττάρου, μεταφέροντας ουσίες διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης ως αποτέλεσμα ανταπόκρισης σε συγκεκριμένα ερεθίσματα, όπως οι αλλαγές του ph, της συγκέντρωσης ιόντων Ca++ στο κυτταρόπλασμα και ορμονικών μετα- 27

28 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ βολών. Οι διεπιθηλιακές συνδέσεις αυτού του τύπου βρίσκονται σε όλες τις στιβάδες του κερατινοποιημένου στοματικού επιθηλίου εκτός από την επιφανειακή κερατίνη στιβάδα, όπου παρατηρούνται κυρίως συνδέσεις απόφραξης δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα φυσικό φραγμό του επιθηλίου έναντι των εξωτερικών ερεθισμάτων. Γίνεται φανερό ότι οι διεπιθηλιακές συνδέσεις εξασφαλίζουν τόσο την ακεραιότητα του στοματικού επιθηλίου, όσο και την σταθερότητα του κυτταροσκελετού μεταξύ των στοιβάδων του, μεταφέροντας έτσι δυνάμεις και τάσεις της ελεύθερης επιφάνειας, στον υποκείμενο συνδετικό ιστό. Ταυτόχρονα οι διεπιθηλιακές συνδέσεις συμβάλλουν στην ομοιόσταση των επιθηλιακών κυττάρων επιτρέποντας την επιλεκτική μετακίνηση ουσιών δημιουργώντας έτσι ένα δυναμικό συνδετικό σύμπλεγμα. 8 IV. Βασική μεμβράνη Η βασική μεμβράνη καταλαμβάνει το χώρο ανάμεσα στα κύτταρα της βλαστικής στιβάδας του επιθηλίου και του υποκείμενου συνδετικού ιστού. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο η βασική μεμβράνη είναι μια ακύτταρη ζώνη που παράγεται τόσο από τα επιθηλιακά κύτταρα όσο και από τα κύτταρα του συνδετικού ιστού και έχει πάχος 1-2 μm. Εμφανίζει ιδιαίτερα μεγάλο μήκος εξαιτίας των χαρακτηριστικών καταδύσεων του επιθηλίου και των αντίστοιχων προσεκβολών του χορίου. Αποτελεί σημαντικό φραγμό μεταφοράς ουσιών από το επιθήλιο προς τον υποκείμενο συνδετικό ιστό, ενώ ταυτόχρονα προσδίδει σταθερότητα μέσω των ημιδεσμοσωματίων στη σύνδεση του επιθηλίου με το χόριο. Χαρακτηρίζεται από τέσσερις διαφορετικές στιβάδες ή ζώνες. Η πρώτη ζώνη σχηματίζεται από τις διεπιθηλιακές συνδέσεις των ημιδεσμοσωματίων και η δεύτερη ή διαυγής ζώνη πάχους nm περιλαμβάνει την λαμινίνη, η οποία συνδέεται με τις ενδοκυττάριες πλάκες ιντεγκρίνης του κυττάρου της βλαστικής στιβάδας μέσω των ημιδεσμοσωματίων. Οι δύο επόμενες ζώνες, η σκοτεινή και η δικυωτή αποτελούν ουσιαστικά την μετάβαση της βασικής μεμβράνης στο υποκείμενο χόριο. Στη σκοτεινή ζώνη που ονομάζεται και βασικός υμένας βρίσκεται το κολλαγόνο τύπου IV το οποίο 28

29 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ αποτελεί βασικό συστατικό της βασικής μεμβράνης. Από τη ζώνη αυτή ξεκινούν τα ινίδια αγκύρωσης της δικτυωτής στιβάδας τα οποία αποτελούνται από κολλαγόνο τύπου VII και τα οποία παράγονται από τα κύτταρα της βλαστικής στιβάδας. Σχηματίζεται με αυτόν τον τρόπο η δικτυωτή στιβάδα από την διαπλοκή των ινιδίων αγκύρωσης με τις ίνες κολλαγόνου τύπου IV δημιουργώντας τις πλάκες αγκύρωσης και συμβάλλοντας με αυτό τον τρόπο στη σταθερή σύνδεση της βασικής μεμβράνης με το υποκείμενο χόριο. 9 V. Μεσοκυττάρια ουσία του επιθηλίου της γλώσσας Η πυκνή διάταξη των κυττάρων του επιθηλίου και οι ισχυρές διεπιθηλιακές συνδέσεις, περιορίζουν την ποσότητα της μεσοκυττάριας ουσίας που μπορεί να αναπτυχθεί στο επιθήλιο της γλώσσας. Ο ρόλος της είναι στηρικτικός και μεσολαβητικός για την θρέψη και ομοιόσταση των επιθηλιακών κυττάρων. Αποτελείται από λίγες ίνες κολλαγόνου, από γλυκοπρωτεϊνες, πρωτεογλυκάνες, λιπίδια και νερό. Από τις γλυκοπρωτεϊνες σημαντικότερη είναι η λαμινίνη, η οποία βρίσκεται στη βασική μεμβράνη και συνδέεται με το κολλαγόνο τύπου IV, εμποδίζοντας τον πολλαπλασιασμό και την πρόσφυση των ινοβλαστών αποτρέποντας με αυτό τον τρόπο την ανεξέλεγκτη παραγωγή ινών κολλαγόνου. Έτσι δημιουργείται μία σαφής διαχωριστική ζώνη στη βασική μεμβράνη μεταξύ του επιθηλίου και του υποκείμενου συνδετικού ιστού. Άλλες σημαντικές γλυκοπρωτεϊνες της μεσοκυττάριας ουσίας αποτελούν οι φιμρονεκτίνες οι οποίες εντοπίζονται κυρίως κατά την εμβρυϊκή φάση της α- νάπτυξης, καθώς και οι ιντεγκρίνες και το μόριο προσκόλλησης ICAM-1, τα ο- ποία ως επιφανειακοί κυτταρικοί υποδοχείς χρησιμεύουν στη σύνδεση των επιθηλιακών κυττάρων της βλαστικής στιβάδας με την βασική μεμβράνη αλλά και στην ενδοκυττάρια μεταφορά μεταβολικών σημάτων. Από τις πρωτεογλυκάνες της μεσοκυττάριας ουσίας, σημαντικότερες είναι οι συνδεκάνες και η δεκορίνη. 9 29

30 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ VI. Χόριο Ο συνδετικός ιστός που βρίσκεται αμέσως κάτω από την βασική μεμβράνη ονομάζεται χόριο. ΟΙ θηλώδεις προσεκβολές του χορίου αντίστοιχες με τις ε- πιθηλιακές καταδύσεις του επιθηλίου αποτελούν τη θηλώδη στιβάδα του χορίου, ενώ κάτω από αυτήν βρίσκεται η δικτυωτή στιβάδα. Το χόριο αποτελείται από κύτταρα και εξωκυττάρια ή θεμέλια ουσία και περιέχει αγγεία (αιμοφόρα και λεμφοφόρα) και νεύρα. Τα κύτταρα του χορίου αποτελούν κυρίως οι ινοβλάστες και τα ινοκύτταρα που είναι ουσιαστικά ώριμοι ινοβλάστες. Σε μικρότερη αναλογία εντοπίζονται και άλλα κύτταρα υπεύθυνα κυρίως για την αμυντική λειτουργία του χορίου, ό- πως είναι τα μαστοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, τα λεμφοκύτταρα και τα πλασματοκύτταρα. Οι ινοβλάστες είναι τα κυρίαρχα κύτταρα του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού του χορίου. Έχουν ατρακτοειδές σχήμα με κυτταροπλασματικές προσεκβολές και διαθέτουν μεγάλο σε μέγεθος ενδοπλασματικό δίκτυο και συσκευή Golgi που δικαιολογούν και την μεγάλη βιοσυνθετική τους ικανότητα, καθώς και πολυάριθμα μιτοχόνδρια και τονοϊνίδια. Είναι υπεύθυνα για την παραγωγή και διατήρηση τόσο των ινών όσο και της μεσοκυττάριας ουσίας του χορίου. Η ομοιοστατική ιδιότητα των ινοβλαστών επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της φαγοκυτταρικής τους ικανότητας και της έκκρισης πρωτεολυτικών ενζύμων που αποδομούν την εξωκυττάρια ουσία. Μέσω δηλαδή της φαγοκυττάρωσης των κολλαγόνων, των δικτυωτών, των ελαστικών και των ινών οξυταλάνης της εξωκυττάριας ουσίας, αλλά και μέσω της παραγωγής μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), συμβάλλουν στην αναδιαμόρφωση και στην ομοιόσταση του χορίου ανάλογα με τα ενδοκυττάρια ή εξωκυττάρια ερεθίσματα που δέχονται. Άλλες λειτουργίες των ινοβλαστών είναι η έκκριση μορίων κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων τα οποία δρουν αυτοκρινώς ή παρακρινώς στην λειτουργία άλλων κυττάρων, ενώ βοηθούν ταυτόχρονα την χημειοταξία των ινοβλαστών ανάλογα με τις συνθήκες που επικρατούν. 30

31 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Τα μαστοκύτταρα εντοπίζονται γύρω από τα αγγεία του συνδετικού ιστού και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή και την έκκριση αγγειοδραστικών ουσιών όπως είναι η ισταμίνη και η ηπαρίνη, καθώς και πρωτεολυτικών ενζύμων, με την αποκοκκίωση πολυάριθμων μεταχρωματικών κοκκίων που βρίσκονται διατεταγμένα γύρω από τον πυρήνα. Κατά τις διαδικασίες της ανοσιακής απάντησης του οργανισμού, η αποκοκκίωση των μαστοκυττάρων οδηγεί σε απελευθέρωση των μορίων αυτών με σκοπό την αγγειοδιαστολή και την διευκόλυνση της μετανάστευσης των αμυντικών κυττάρων στο σημείο της εισβολής. Τα μακροφάγα του χορίου προέρχονται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος και ανευρίσκονται σε μικρό αριθμό σε σχέση με τα υπόλοιπα κύτταρα. Η διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα και η μετανάστευσή τους στους ιστούς επάγεται από μια σειρά διαδικασιών κυρίως κατά την φάση της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης, όπου μαζί με τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα δρουν ως φαγοκύτταρα. Τα μακροφάγα περιέχουν ανεπτυγμένη συσκευή Golgi και ορισμένα ριβοσωμάτια, ενώ τα λυσοσωμάτια συμμετέχουν στη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης. Συνθέτουν και εκκρίνουν αρκετές κυτοκίνες, όπως ιντερλευκίνες προσταγλανδίνες, παράγοντα νέκρωσης του όγκου, μετατρεπτικό αυξητικό παράγοντα, καθώς και ιντερφερόνη και μεταλλοπρωτεϊνάσες. Μικρότερος είναι ο ρόλος των μακροφάγων στις διαδικασίες της ειδικής φλεγμονώδους απάντησης, όπου συμμετέχουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, παρουσιάζοντας τα αντιγόνα «εισβολείς» στα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. Ταυτόχρονα διεγείρουν και ενεργοποιούν και άλλα αμυντικά κύτταρα όπως τα δενδριτικά κύτταρα, μέρος των οποίων προέρχεται από διαφοροποιημένα μακροφάγα. Σημαντικός επίσης είναι ο ρόλος τους στο καρκινικό περιβάλλον, όπου αποκτούν τελείως διαφορετικές ιδιότητες από αυτές της φλεγμονής, προάγοντας την αύξηση και την εξέλιξη της καρκινικής νόσου. Νεότερα ερευνητικά δεδομένα συνδέουν τα μακροφάγα με αυξημένο στάδιο της νόσου και με την μετάσταση. Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα αποτελούν μαζί με τα μακροφάγα την πρώτη γραμμή άμυνας στη περιοχή της φλεγμονώδους αντίδρασης. Είναι 31

32 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ τα κύρια φαγοκύτταρα που εμφανίζονται στο συνδετικό ιστό, τα οποία μεταναστεύουν συνεχώς από τα αγγεία στην περιοχή της φλεγμονής κατά τις πρώτες φάσεις της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης. Τα λεμφοκύτταρα που εντοπίζονται στο συνδετικό ιστό είναι κυρίως Τ- λεμφοκύτταρα και ο πληθυσμός τους αυξάνεται κατά τις φάσεις της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης. Διαθέτουν ωοειδή πυρήνα με μικρή ποσότητα κυτταροπλάσματος που περιέχει ριβοσωμάτια, αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, μιτοχόνδρια και λυσοσωμάτια. Τα Τ-λεμφοκύτταρα είναι κυτταροτοξικά και είναι υπεύθυνα για την καταστροφή του αντιγόνου που παρουσιάζεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τα πλασματοκύτταρα βρίσκονται σε πολύ μικρό αριθμό στο συνδετικό ιστό και αποτελούν παράγωγα των ενεργοποιημένων Β-λεμφοκυττάρων. Διαθέτουν σφαιρικό πυρήνα, ριβοσωμάτια, μιτοχόνδρια και σύστημα Golgi. Συμμετέχουν στις φάσεις της χρόνιας φλεγμονής κυρίως ως κύτταρα μνήμης. Η εξωκυττάρια ή θεμέλια ουσία του χορίου αποτελείται από ίνες συνδετικού ιστού και οργανικό υπόστρωμα. Οι ίνες συνδετικού ιστού είναι κυρίως ίνες κολλαγόνου και σε μικρότερο βαθμό δικτυωτές ίνες, ελαστικές και ίνες οξυταλάνης. Οι κολλαγόνες ίνες συνθέτουν περίπου το 65% του συνολικού όγκου του χορίου με τη μορφή ενός καλά οργανωμένου και προσανατολισμένου δικτύου. Οι κύριες λειτουργίες τους είναι η διατήρηση της αρχιτεκτονικής του χορίου, η στθερότητα, η αντίσταση στα μηχανικά ερεθίσματα, καθώς και η συνοχή και η πρόσφυση στους υποκείμενους ιστούς. Οι κολλαγόνες ίνες παράγονται από τους ινοβλάστες του χορίου και διακρίνονται ανάλογα με την διάταξή τους και την λειτουργία τους σε διαφορετικούς τύπους. Το κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί και το 90% του συνολικού όγκου του κολλαγόνου και συνθέτει κυρίως τις πυκνές δεσμίδες, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αποτελεί περίπου το 8% του συνολικού όγκου του και είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση των χαλαρών ινών. Το υπόλοιπο αποτελείται από κολλαγόνο τύπου V που επενδύει το σύμπλεγμα των ινών Ι και ΙΙΙ, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙV βρίσκεται γύρω από τα αγγεία και τα νεύρα καθώς και ως συστατικό της βασικής μεμβράνης του επιθηλίου. 32

33 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Οι ελαστικές ίνες αποτελούν και αυτές μεγάλο μέρος του όγκου του συνδετικού ιστού προσδίδοντας στο βλεννογόνο του στόματος και ιδιαίτερα στη γλώσσα ελαστικές ιδιότητες. Αποτελούνται από μία ελαστική πρωτεΐνη την ελαστίνη κα από δίκτυο μικρών ινών διαμέτρου nm. Οι δικτυωτές ίνες έχουν διάμετρο περίπου 0,5-2 μm και ονομάζονται και αργυρόφιλες ίνες εξαιτίας της ειδικής χρώσης τους με άλατα αργύρου. Αποτελούνται κυρίως από ίνες κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ σχηματίζοντας ένα χαλαρό πλέγμα μαζί με γλυκοπρωτεϊνες και πρωτεογλυκάνες αμέσως κάτω από την βασική μεμβράνη του επιθηλίου. Κατά παρόμοιο τρόπο σχηματίζουν χαλαρόσυνδετικό ιστό και γύρω από τα αγγεία του χορίου. Οι ίνες οξυταλάνης τέλος συναντώνται σε μικρό αριθμό κα μέγεθος στο χόριο του βλεννογόνου της γλώσσας. Αποτελούνται και αυτές από οργανικό υ- πόστρωμα κα δίκτυο ινών, και φαίνεται να συνθέτουν ένα πλέγμα άωρων ελαστικών ινών. Η εξωκυττάρια ή θεμέλια ουσία του συνδετικού ιστού της γλώσσας αποτελεί το οργανικό υπόστρωμα και αποτελείται από κολλαγόνο και ένα δίκτυο μη κολλαγονούχων πρωτεϊνικών μορίων. Η θεμέλια ουσία παράγεται από τους ινοβλάστες και εξασφαλίζει την οργάνωση, την στήριξη τη διάπλαση, τη χημειοταξία των κυττάρων και την ομοιόσταση του χορίου. Το κολλαγόνο είναι βασικό δομικό συστατικό του χορίου συμβάλλοντας στην απορρόφηση των μηχανικών πιέσεων. Η βιοσύνθεσή του ρυθμίζεται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες, ενώ η αποσύνθεσή του κυρίως κατά τις διαδικασίες της επούλωσης και της φλεγμονής προάγεται από τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs). Το δίκτυο των μη κολλαγονούχων πρωτεϊνικών μορίων αποτελείται από ελαστινη, γλυκοπρωτεΐνες προσκόλλησης και πρωτεογλυκάνες. Είναι υπεύθυνο για την ενίσχυση της ελαστικότητας του χορίου, την αλληλεπίδραση των κυττάρων του και την διήθηση των θρεπτικών ουσιών μέσα από αυτό. 10 Τα πρωτεϊνικά αυτά μόρια φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: 33

34 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πίνακας 1. Οι μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας του χορίου ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ Ελαστίνη Γλυκοπρωτεΐνες προσκόλλησης πρωτεογλυκάνες ΟΝΟΜΑ Ελαστίνη Φιμπρονεκτίνη Λαμινίνη Βιτρνεκτίνη Εντακτίνη Τενασίνη Περλεκάνη Βερσικάνη Δεκορίνη Διγλυκάνη Συνδεκάνες (1-4) Υαλουρονικό οξύ VII. Αγγείωση-νεύρωση του συνδετικού ιστού της γλώσσας Τα αγγεία που γειτνιάζουν στο βλεννογόνο της γλώσσας σχηματίζουν τριχοειδείς αγκύλες η κάθε μία από τις οποίες αποτελείται από ένα ανερχόμενο αρτηριακό τριχοειδές και από ένα κατερχόμενο φλεβικό τριχοειδές. Οι αγκύλες αυτές εισχωρούν στις επιμήκεις θηλές του συνδετικού ιστού. Παράλληλη πορεία ακολουθούν και τα τριχοειδή λεμφαγγεία σχηματίζοντας με αυτόν τον τρόπο ένα αγγειακό πλέγμα στο συνδετικό ιστό του βλεννογόνου της γλώσσας. Τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων και λεμφοφόρων τριχοειδών εκφράζουν μία σειρά κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων, συμβάλλοντας στη χημειοταξία των κυττάρων του συνδετικού ιστού και στην μεταφορά τους μέσα στα αγγεία. Στο συνδετικό ιστό υπάρχει επίσης πληθώρα νευρικών στοιχείων που προέρχονται από τις εγκεφαλικές συζυγίες V, VII, IX, και X. Πρόκειται για εμμύελες νευρικές ίνες που βρίσκονται σε στενή σχέση με τα αγγεία. Εκτός από τον ρόλο τους στην αίσθηση, την κίνηση και την γεύση, εκκρίνουν ένα σύνολο πεπτιδίων όπως τα πεπτίδια Ρ και Υ τα οποία συμμε τεχουν στη ρύθμιση της φλεγμονώδους διαδικασίας. Ορισμένες από τις νευρικές ίνες είναι δυνατόν να εισχωρήσουν στο επιθήλιο, αφού όμως μετατραπούν σε αμύελες ίνες, εξυπηρετώντας την επικοινωνία του συνδετικού ιστού με το επιθήλιο. 2 34

35 4. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΗΣ ΣΤΟΜΑΤΙΚΗΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑΣ I. Επιδημιολογία Ο καρκίνος της στοματικής κοιλότητας αποτελεί την έκτη συχνότερη μορφή καρκίνου, με το ακανθοκυτταρικού τύπου να αποτελεί την πιο συχνή μορφή κακοήθειας, σε ποσοστό που ξεπερνά το 95% των κακοήθων όγκων της περιοχής. Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα αναπτύσσεται στο πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο του βλεννογόνου του στόματος και στο ερυθρό κράσπεδο των χειλέων. Είναι όμως δυνατόν, ακαθοκυτταρικά καρκινώματα να αναπτυχθούν και στο επιθήλιο των εκφορητικών πόρων των σιαλογόνων αδένων και σε σπάνιες περιπτώσεις ενδοστικά στις γνάθους από επιθλιακά υπολείμματα. Παρά την δυνατότητα για πρώιμη διάγνωση και τη βελτίωση των τεχνικών για τοπικό και περιοχικό έλεγχο της νόσου τα ποσοστά της πενταετούς επιβίωσης έχουν ελάχιστα βελτιωθεί τα τελευταία 30 χρόνια παραμένοντας στα χαμηλότερα επίπεδα στις διάφορες θέσεις ενέδρασης. Υπολογίζεται ότι οι μισοί από τους ασθενείς πεθαίνουν στα πέντε πρώτα χρόνια από τη διάγνωση ενώ οι επιζώντες δοκιμάζονται από τις σοβαρές μετεγχειρητικές λειτουργικές και αισθητικές διαταραχές. Καρκίνος της γλώσσας Από όλες τις ανατομικές θέσεις εμφάνισης καρκίνου στη στοματική κοιλότητα η γλώσσα αποτελεί τη συχνότερη εντόπιση ακολουθούμενη από το έδαφος του στόματος. 11 Η ενδοστοματική εντόπιση του καρκίνου της γλώσσας αφορά το κινητό τμήμα αυτής δηλαδή τα δύο τρίτα του συνολικού μεγέθους της γλώσσας. Περίπου το 75% των ακανθοκυτταρικών καρκινωμάτων της γλώσσας εμφανίζεται στο κινητό τμήμα της δηλαδή ενδοστοματικά. Τα υπόλοιπο 25% εντοπίζεται στη βάση της γλώσσας με τα ίδια ιστολογικά χαρακτηριστικά αλλά με χειρότερη πρόγνωση κυρίως λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης. 35

36 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ο καρκίνος της γλώσσας κατανέμεται ηλικιακά μεταξύ 50 και 80 ετών με συχνότερη εντόπιση στους άνδρες σε ποσοστό 2 έως 3 προς 1 στις γυναίκες. Τελευταία καταγράφεται μία διαρκώς αυξανόμενη κατανομή σε νεότερες ηλικίες αλλά και σε γυναίκες χωρίς μάλιστα την συμμετοχή του καπνίσματος και του αλκοόλ ως προδιαθεσικών παραγόντων. Ειδικότερα η ομάδα των νέων ασθενών κάτω των 40 ετών τείνει να αποτελέσει μία εντελώς ξεχωριστή κλινική οντότητα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Αρκετοί ερευνητές μάλιστα διαχωρίζουν την ομάδα αυτή ασθενών σε δύο επιμέρους υποκατηγορίες όπου η πρώτη εμφανίζει τα ίδια χαρακτηριστικά και την ίδια πρόγνωση με το γενικό πληθυσμό και η δεύτερη εμφανίζει ιδιαίτερα βαριά πρόγνωση με μικρότερη ολική επιβίωση και μεγαλύτερη συχνότητα υποτροπών αλλά και πρώιμων περιοχικών και απομακρυσμένων μεταστάσεων. Η συχνότητα γενικότερα του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της στοματικής κοιλότητας σε νέους ασθενείς κυμαίνεται από 0,4 έως 5 % με μία μικρή προτίμηση στις γυναίκες, ενώ λιγότερα του 4% των καρκινωμάτων της γλώσσας εμφανίζονται σε νέους ασθενείς. Παρόλα αυτά η πρόγνωση στους νέους ασθενείς είναι εμφανώς χειρότερη από αυτήν των γηραιότερων παρά το γεγονός ότι το σύνολο των νέων ασθενών με νόσο σταδίου Ι και ΙΙ αποτελεί περίπου το 65% αυτών. 11 II. Σταδιοποίηση του καρκίνου του στόματος Η σταδιοποίηση του καρκίνου του στόματος είναι ιδιαίτερα σημαντική για την πρόγνωση και τον καθορισμό του σχεδίου θεραπείας. Ακολουθεί το σύστημα ταξινόμησης ΤΝΜ (American Joint Committee on Cancer) από τους όρους tumor που εκφράζει το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου, node που εκφράζει την ύ- παρξη ή όχι μεταστατικής νόσου στους τραχηλικούς λεμφαδένες και metastasis που καθορίζει την ύπαρξη ή όχι απομακρυσμένης μετάστασης. 36

37 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Πίνακας 2. Σταδιοποίηση του καρκίνου του στόματος σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης ΤΝΜ από την AJCC (American Joint Committee on Cancer), Chicago, Illinois. Σταδιοποίηση T-status N-status M-status Στάδιο 0 Tis N0 M0 Στάδιο Ι T1 N0 M0 Στάδιο ΙΙ T2 N0 M0 Στάδιο ΙΙΙ T3 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0 Στάδιο IVA T4a N0 M0 T4a N1 M0 T1 N1 M0 T2 N2 M0 T3 N2 M0 T4a N2 M0 Στάδιο IVB Οποιοδήποτε Τ N3 M0 T4b Οποιοδήποτε N M0 Στάδιο IVC Οποιοδήποτε Τ Οποιοδήποτε N M1 Το μέγεθος της πρωτοπαθούς βλάβης σταδιοποιείται ως εξής: Tis: κακίνωμα in situ. T1: διάμετρος όγκου <2 εκ. Τ2: διάμετρος όγκου >2 εκ και <4εκ. Τ3: διάμετρος όγκου >4εκ και <6εκ. Τ4: διάμετρος όγκου >6εκ ή διήθηση παρακείμενων ανατομικών δομών. Οι επιχώριοι λεμφαδένες σταδιοποιούνται περεταίρω με βάση το μέγεθος και την εντόπισή τους ως εξής: Ν0: μη διηθημένος λεμφαδένας. Ν1: μονήρης <3εκ στη μέγιστη διάμετρο σύστοιχα της βλάβης. Ν2a: μονήρης >3εκ και <6εκ στη μέγιστη διάμετρο σύστοιχα της βλάβης. Ν2b: πολλαπλοί <6εκ στη μέγιστη διάμετρο σύστοιχα της βλάβης. Ν2c: ετερόπλευρος ή αμφοτερόπλευροι <6εκ. Ν3: οποιοσδήποτε >6εκ. Η σταδιοποίηση αυτή περιγράφει με σαφήνεια την ανατομική επέκταση του όγκου, αλλά δεν λαμβάνει υπόψη άλλους σημαντικούς προγνωστικούς παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση του ασθενούς όπως είναι η γενική φυσική κατάσταση του οργανισμού, η θρέψη, το αμυντικό σύστημα, καθώς και άλλους ιστοπαθολογικούς παράγοντες όπως είναι το βάθος διήθησης της πρωτοπαθούς βλάβης και η εξωκαψική επέκταση του μεταστατικού λεμφαδένα. Παρό- 37

38 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ λα αυτά αποτελεί ένα γενικά αποδεκτό σύστημα σταδιοποίησης που καθορίζει το σχέδιο θεραπείας του καρκίνου του στόματος. III. Κλινική παθολογία-ιστοπαθολογία Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της γλώσσας στην τυπική κλινική του εικόνα εμφανίζεται ως ανώδυνο σκληρό έλκος συνηθέστερα στο πλάγιο χείλος. Επίσης το καρκίνωμα της γλώσσας μπορεί να εμφανιστεί ως λευκή ή ερυθρή πλάκα, ως βλατίδα, διάβρωση ή ραγάδα, εστιακή σκλήρυνση ή συνδυασμός των παραπάνω. Σε ένα ποσοστό 12-15% εμφανίζεται στην κοιλιακή επιφάνεια, 5-7% στη ραχιαία επιφάνεια και 2-3% στην κορυφή. Συχνότερα εμφανίζει καλή ως μέτρια διαφοροποίηση, ενώ η συνήθης σταδιοποίηση κυμαίνεται μεταξύ σταδίου Ι έως ΙΙΙ. 12,13 Περίπου το ένα τέταρτο των καρκινωμάτων της γλώσσας παρουσιάζουν επέκταση σε παρακείμενες δομές όπως στο έδαφος του στόματος, στα ούλα, στην κάτω γνάθο και στη βάση της γλώσσας καθώς δεν υφίστανται διακριτά ανατομικά όρια μεταξύ των δομών αυτών. Τα ποσοστά ολικής επιβίωσης κυμαίνονται από 55% στα δύο πρώτα χρόνια μέχρι 34% στην πενταετία, ενώ οι υποτροπές εμφανίζονται συνήθως τους πρώτους 24 μήνες από την αρχική διάγνωση με την πλειονότητα αυτών τον πρώτο χρόνο. Η μεταστατική νόσος του καρκίνου της γλώσσας αφορά κυρίως στους επιχώριους λεμφαδένες με τα ποσοστά να κυμαίνονται από 27 έως 40%, ενώ τα ποσοστά ολικής επιβίωσης για τους ασθενείς με μεταστατική νόσο μειώνονται δραματικά. 14,15,16 Ιστοπαθολογικά παρατηρούνται αθροίσματα νεοπλασματικών επιθηλιακών κυττάρων με μορφή χορδών ή νησιδίων τα οποία διηθούν αρχικά τις δομές του χορίου και στη συνέχεια τους υποκείμενους μυικούς ιστούς της γλώσσας. Τα νεοπλασματικά κύτταρα παρουσιάζουν πολυγωνικό σχήμα και πυρήνες ακανόνιστους βαθυχρωματικούς ή φυσαλιδώδεις με ανώμαλη κατανομή της χρωματίνης. Παρατηρείται επίσης απώλεια προσανατολισμού των κυττάρων, καθώς και διάσπαση των διεπιθηλιακών συνδέσεων όπως είναι οι συνδέσεις απόφραξης, αγκύρωσης και επικοινωνίας. Συχνές είναι οι αθροίσεις κερατινοποιημένων ή παρακερατινοποιημένων κυττάρων καθορίζοντας και τα καρκινώματα καλής δι- 38

39 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ αφοροποίησης. Τα νεοπλασματικά κύτταρα αναλόγως του βαθμού διαφοροποίησης εμφανίζουν αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα και ανώμαλες μιτώσεις. IV. Προκαρκινικές βλάβες - καρκινογένεση Στις προκαρκινικές βλάβες περιλαμβάνονται αλλοιώσεις με διαφορετική κλινική και ιστολογική εικόνα που σε ποσοστό μεγαλύτερο του φυσιολογικού ε- ξελίσσονται σε ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Προκαρκινικές βλάβες θεωρούνται η λευκοπλακία, η ερυθροπλακία και υπό προϋποθέσεις άλλα γενικά νοσήματα όπως είναι το σύνδρομο Plummer-Vinson, η σύφιλη, η υποβλεννογόνια ίνωση και η διαβρωτική μορφή του ομαλού λειχήνα. Η λευκοπλακία ως ξεχωριστή βλάβη καθορίστηκε από την WHO το 1978 ως μία λευκή αλλοίωση ή πλάκα η οποία με κλινικά και ιστολογικά κριτήρια δεν μπορεί να χαρακτηριστεί ως άλλη νόσος και δεν συνδέεται αιτιολογικά με οποιοδήποτε άλλο φυσικό ή χημικό παράγοντα εκτός από το κάπνισμα. Η κλινική εικόνα της λευκοπλακίας περιλαμβάνει δύο κύριες μορφές την ομοιογενή και την ανομοιογενή. Η ομοιογενής μορφή μπορεί να είναι επίπεδη, αυλακωτή, λεία ή πτυχωτή. Η ανομοιογενής μορφή μπορεί να είναι ακροχορδονώδης (proliferative verrucus leukoplakia), οζώδης (nodular), διαβρωτική, να εμφανίζεται ως ερυθρολευκοπλακία ή να έχει τη μορφή της τριχωτής λευκοπλακίας που συνδέεται αιτιολογικά με ιούς όπως HIV, HPV, EBV. Σύμφωνα με άλλη μελέτη των Sugar και Banoczy βρέθηκε σημαντική συσχέτιση του κλινικού τύπου της λευκοπλακίας με κακοήθη εξαλλαγή της βλάβης. Ο κλινικός τύπος Leukoplakia simplex (ομοιογενής λευκοπλακία) που ορίζεται ως λευκή ομοιογενής κερατινοποιημένη βλάβη, ελαφρώς επηρμένη εμφανίζει τα μικρότερα ποσοστά κακοήθους εξαλλαγής. Ο δεύτερος και τρίτος τύπος Leukoplakia verrucosa με χαρακτηριστική ακροχορδονώδη υφή και Leukoplakia erosiva με ερηθηματώδη και διαβρωτικά στοιχεία, εμφανίζουν τα υψηλότερα ποσοστά κακοήθους εξαλλαγής τα οποία αναφέρεται ότι μπορεί να φτάσουν και το 17,5% Γενικότερα, οι λευκοπλασιακές αλλοιώσεις άσχετα με την κλινική και ιστοπαθολογική τους εικόνα, μεταπίπτουν σε διηθητικό καρκίνο σε ποσοστό που 39

40 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ κυμαίνεται μεταξύ 2 και 6%, με ένα μέσο όρο που αναφέρεται να είναι 4,5 έως 6%. Ιστοπαθολογικά η λευκοπλακία οφείλεται τόσο στην αύξηση του πάχους του επιθηλίου όσο και στη βιολογική μετατροπή των κερατινοκυττάρων τα οποία αποκτούν υδρόφιλες ιδιότητες. Έτσι προσροφούν νερό από το σάλιο, διογκώνονται, και διαθλούν τις ακτίνες του φωτός προκαλώντας το λευκό χρώμα της βλάβης. Η αύξηση του πάχους του επιθηλίου μπορεί να προκαλείται είτε από την ομοιόμορφη αύξηση όλων των στιβάδων, είτε συνηθέστερα από την πάχυνση μεμονωμένων στιβάδων. Έτσι, όταν διαπιστώνεται μικροσκοπικά αύξηση αντίστοιχα της ακανθωτής στιβάδας ονομάζεται υπερακάνωση, της κερατίνης στιβάδας υπερκεράτωση και της κοκκώδους στιβάδας υπερκόκκωση. Η ερυθροπλακία εμφανίζεται με τη μορφή εξέρυθρης ομοιογενούς ελαστικής επιφάνειας του βλεννογόνου. Συνήθως είναι περιγεγραμμένη με λεία ή κοκκώδη επιφάνεια, που σε αντίθεση με τη λευκοπλακία δεν σχηματίζει πλάκα. Συχνότατα στην ερυθροπλακία και σε ένα ποσοστό 15-20% στη λευκοπλακία είναι δυνατόν να αναπτυχθεί και μεταβολή στην μορφολογία των κυττάρων του επιθηλίου οι οποίες καλούνται ατυπίες. Δημιουργείται έτσι η επιθηλιακή δυσπλασία που αποτελεί το επόμενο στάδιο στη διαδικασία της καρκινογένεσης κατά την οποία τα άτυπα κύτταρα απαντώνται αρχικά στην βασική στιβάδα και στη συνέχεια επεκτείνονται στις ανώτερες στιβάδες του επιθηλίου. Κατά αυτόν τον τρόπο η επιθηλιακή δυσπλασία διακρίνεται ιστοπαθολογικά σε ήπια όταν οι κυτταρικές ατυπίες περιορίζονται στη βασική στιβάδα με φυσιολογική μιτωτική δραστηριότητα, μέτρια όταν οι ατυπίες επεκτείνονται στην α- κανθωτή στιβάδα με φυσιολογική μιτωτική δραστηριότητα και ανώμαλη ωρίμανση των κερατινοκυττάρων και έντονη όταν τα άτυπα κύτταρα καλύπτουν τα δύο τρίτα του πάχους του επιθηλίου με αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα και ανώμαλη ωρίμανση των κερατινοκυττάρων. Η ήπια δυσπλασία ονομάζεται διεθνώς και Grade I, συνήθως οφείλεται σε τραυματισμό και είναι αναστρέψιμη. Η μέτρια δυσπλασία ονομάζεται Grade II, έχει μεγάλα ποσοστά υποτροπής και θεωρείται σε έναν βαθμό αναστρέψιμη και η έντονη δυσπλασία ή Grade III εμφανίζει υψηλά ποσοστά υποτροπής και εξαλλαγής σε διηθητικό καρκίνωμα. 40

41 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Βασικό ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό της επιθηλιακής δυσπλασίας είναι το σχήμα σταγόνας της βλάβης (drop shaped) όπου τα κατώτερα επίπεδα της βλάβης έχουν μεγαλύτερη διάμετρο από τα επιφανειακά. Όταν κυτταρικές ατυπίες βρίσκονται σε ολόκληρο το πάχος του επιθηλίου τότε πρόκειται για καρκίνωμα in situ. Όπως γίνεται κατανοητό τα όρια μεταξύ έντονης δυσπλασίας και καρκινώματος in situ είναι δυσδιάκριτα και οι δύο όμως αυτές βλάβες έχουν παρόμοια βιολογική συμπεριφορά και εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά καρκινικής εξαλλαγής. Ιστοπαθολογικά στο καρκίνωμα in situ τα επιθηλιακά κύτταρα παρουσιάζουν μικρή έως καθόλου ωρίμανση και το σύνολο των στιβάδων του επιθηλίου εμφανίζεται ιδιαίτερα λεπτό. Είναι σχετικά σπάνιο στο βλεννογόνο της γλώσσας αντιπροσωπεύοντας περίπου το 2% όλων των καρκινωμάτων κεφαλής και τραχήλου και συχνά συνυπάρχει με ερυθροπλακία. Σε όλες τις παραπάνω βλάβες το κύριο ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό είναι ότι η βασική μεμβράνη του επιθηλίου δεν διασπάται. Κατά την εξελικτική πορεία της καρκινογένεσης στο μικροδιηθητικό καρκίνωμα οι κυτταρικές ατυπίες μετατρέπονται πλέον σε καρκινικά κύτταρα τα οποία διασπούν σημειακά την βασική μεμβράνη. Αυτό γίνεται πιθανότατα μέσω της παραγωγής πρωτεολυτικών ενζύμων από τα καρκινικά κύτταρα που διασπούν τις διεπιθηλιακές συνδέσεις των ημιδεσμοσωματίων και αποδομούν το κολλαγόνο IV και τη λαμινίνη της βασικής μεμβράνης. Το βάθος διήθησης του μικροδιηθητικού καρκινώματος ορίζεται περίπου στα 1,5-2mm από το πέρας της βασικής μεμβράνης και εάν δεν συνοδεύεται από διηθητικό καρκίνωμα δεν φαίνεται να διαθέτει μεταστατική ικανότητα. Η βιολογική συμπεριφορά του μικριδιηθητικού καρκινώματος δικαιολογεί την κατάταξή του μαζί με την δυσπλασία Grade III και το καρκίνωμα in situ. Βλάβες σπάνιες μεν στο βλεννογόνο της γλώσσας αλλά με παρόμοια βιολογική συμπεριφορά μπορούν να χαρακτηριστούν και το μικροκαρκίνωμα καθώς και το επιφανειακά επεκτεινόμενο καρκίνωμα. Ιστοπαθολογικά και οι δύο αυτές μορφές καρκινώματος διαθέτουν περαιτέρω διηθητική συμπεριφορά διασπώντας τη βασική μεμβράνη σε μεγαλύτερο εύρος ενώ ταυτόχρονα γίνονται εμφανείς κλινικά αφού αποκτούν όγκο τουλάχιστον 500 mm 3. Τα καρκινικά κύτταρα διαθέτουν υπερχρωματικό πυρήνα και μικρή μιτωτική δραστηριότητα. Α- 41

42 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ παντούνται συχνότερα στο βλεννογόνο του οισοφάγου του υποφάρυγγα και του λάρυγγα και λιγότερο στο βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας και ειδικότερα της γλώσσας. Όλες οι παραπάνω βλάβες συχνά ακολουθούν την συγκεκριμένη πορεία εξέλιξης που αναφέρθηκε χωρίς όμως να αποτελεί τον κανόνα. Σε αρκετές περιπτώσεις η εξελικτική πορεία της καρκινογένεσης παρακάμπτεται με αποτέλεσμα να εμφανίζεται διηθητικός καρκίνος σε περιοχές χωρίς λευκοπλακία, δυσπλασία ή ακόμη και μικροδιηθητικού καρκινώματος 17. V. Ιστολογικοί τύποι ακανθοκυτταρικού καρκινώματος Παρά το γεγονός ότι το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα αποτελεί την συντριπτική πλειοψηφία των καρκινωμάτων της γλώσσας και γενικότερα του στοματικού βλεννογόνου, εμφανίζει αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία ως προς τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί. Τύποι ακανθοκυτταρικού καρκινώματος του βλεννογόνου της στοματικής κοιλότητας 1. Συμβατικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα με διάφορα επίπεδα διαφοροποίησης 2. Ακροχορδονώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (verrucus carcinoma) 3. Βασικοκυτταροειδές-ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Basaloid squamous cell carcinoma) 4. Σαρκωματώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Sarcomatoid squamous cell carcinoma) 5. Αδενοειδές ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Adenoid squamous cell carcinoma) 6. Αδενοακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Adeno-squamous cell carcinoma) 7. Θηλώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα 8. Λεμφοεπιθηλιακό ή Ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα (Nasopharyngeal carcinoma) Ακροχορδονώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Το ακροχορδονώδες ή μυρμηκιώδες καρκίνωμα κλινικά και ιστοπαθολογικά αποτελεί μία ξεχωριστή οντότητα ακανθοκυτταρικού καρκινώματος. Η βιολογική του συμπεριφορά το κατατάσσει μεταξύ του συμβατικού ακανθοκυτταρικού καρκινώματος και της υπερπλασίας της ακανθωτής στιβάδας του επιθηλίου. Ως νοσολογική οντότητα συναντάται εκτός από τους βλεννογόνους του ανώτερου αεροπεπτικού συστήματος και στο δέρμα της γεννητικής περιοχής (giant condyloma acuminatum) και των άκρων (carcinoma cuniculatum). 42

43 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Από τους βλεννογόνους της αεροπεπτικής οδού συχνότερα εμφανίζεται στο βλεννογόνο του στόματος και του λάρυγγα. Αποτελεί περίπου το 2 έως 10% όλων των τύπων ακανθοκυτταρικού καρκινώματος του στόματος με συχνότερη εντόπιση τον βλεννογόνο της παρειάς. Αντίθετα με το συμβατικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, το ακροχορδονώδες καρκίνωμα της γλώσσας αποτελεί κατά σειρά μόλις την τρίτη συχνότερη εντόπιση μετά από την παρειά και τη φατνιακή απόφυση. Κλινικά, εμφανίζεται ως όγκος ποικίλων διαστάσεων συνήθως με ευρεία βάση και ανώμαλη θηλωματώδη επιφάνεια. Συχνά εμφανίζεται σε έδαφος λευκοπλακίας και στα αρχικά στάδια έχει σχήμα περιγεγραμμένο με πεπαχυμένη και μαλακή υφή, ενώ στη συνέχεια εμφανίζεται ακανόνιστο και λεπτότερο. Ιστοπαθολογικά αποτελείται από καλά διφοροποιημένα ακανθωτά κύτταρα με σπάνιες μιτώσεις. Συχνά οι βλάβες εμφανίζουν υπερκεράτωση με θηλώδεις προσεκβολές και επιθηλιακές καταδύσεις ευρείες σε πάχος και σταγονοειδές σχήμα. Σε αρκετές περιπτώσεις τα νεοπλασματικά κύτταρα εμφανίζουν μικροσκοπικά την εικόνα βασικής μεμβράνης με αποτέλεσμα να δημιουργείται σύγχυση ως προς τη διηθητικότητα ή μη του καρκινώματος. Σε κάθε περίπτωση βέβαια, πρόκειται για ένα διηθητικό καρκίνωμα με ηπιότερα χαρακτηριστικά από αυτό του συμβατικού ακανθοκυτταρικού καρκινώματος που σπάνια μεθίσταται, αλλά συχνά υποτροπιάζει λόγω κυρίως το μεγάλου μεγέθους και της ευρείας βάσης του. Επίσης, ο συνδετικός ιστός στα όρια της βλάβης εμφανίζεται πυκνότερος με πυκνές διηθήσεις φλεγμονωδών κυττάρων κυρίως λεμφοκυττάρων. Συχνή είναι και η συνύπαρξη του ακροχορδονώδους καρκινώματος με το συμβατικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Πρόκειται για το υβριδικό ακροχορδονώδες καρκίνωμα στα όρια του οποίου αναπτύσσεται σύγχρονο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Βασικοκυτταροειδές-ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Πρόκειται για μία ξεχωριστή μορφή ακανθοκυτταρικού καρκινώματος με ιδιαίτερα επιθετικό χαρακτήρα και δυσμενή πρόγνωση, το οποίο εμφανίζεται συ- 43

44 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ χνότερα στην ανώτερη αεροπεπτική οδό από άλλες ανατομικές περιοχές του σώματος και παρουσιάζει ιδιαίτερη προτίμηση στους άνδρες. Η μέση ηλικία εμφάνισης είναι τα 63 έτη, ενώ η συχνότερη περιοχή εμφάνισης είναι η βάση της γλώσσας, ο απιοειδής βόθρος και η υπεργλωτιδική περιοχή του λάρυγγα. Στο πρόσθιο τριτημόριο της γλώσσας εμφανίζεται ιδιαίτερα σπάνια σε ποσοστό περίπου 10% όλων των καρκινωμάτων της αεροπεπτικής οδού αυτού του τύπου. Εμφανίζει πολύ υψηλά ποσοστά υποτροπής αλλά και μετάστασης τόσο στους περιοχικούς λεμφαδένες όσο και απομακρυσμένες κατά σειρά συχνότητας στους πνεύμονες, στο ήπαρ, στα οστά στον εγκέφαλο και στο δέρμα. Συχνά, κατά την πρώτη εξέταση διαγιγνώσκεται ευρεία διήθηση των παρακείμενων και υποκείμενων δομών καθώς και η μεταστατική νόσος. Η επιθετικότητα του βασικοκυτταροειδούς-ακανθοκυτταρικού καρκινώματος έγκειται κυρίως στο βαθμό επικράτησης των κυττάρων της βλαστικής στιβάδας του επιθηλίου, ενώ τα ακανθοκυτταρικά νεοπλασματικά κύτταρα είναι συνήθως καλής έως μέτριας διαφοροποίησης. Όταν το ακανθοκυτταρικό τμήμα του νεοπλάσματος είναι αδιαφοροποίητο, το καρκίνωμα παρουσιάζει ιδιαίτερη διαγνωστική δυσκολία, με τη διαφορική διάγνωση να περιλαμβάνει το αδενοκυστικό καρκίνωμα υψηλής κακοήθειας και το μικροκυτταρικό αδιαφοροποίητο καρκίνωμα νευροενδοκρινικής προέλευσης. Σε κάθε περίπτωση, πρόκειται για ένα σπάνιο, αλλά ιδιαίτερα επιθετικό καρκίνωμα, με την πρόγνωση να επιβαρύνεται όταν το ποσοστό των βλαστικών κυττάρων υπερβαίνει το 50% του συνόλου των καρκινικών κυττάρων. Σαρκωματώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Το σαρκωματώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα προσδιορίζεται ιστοπαθολογικά από τις δύο κατηγορίες νεοπλασματικών κυττάρων από τα οποία προέρχεται, δηλαδή από τα σακωματώδη και τα ακανθοκυτταρικά κύτταρα. Παλαιότερα χρησιμοποιήθηκαν οι όροι πλειόμορφο καρκίνωμα, πολυποειδές καρκίνωμα και μεταπλαστικό καρκίνωμα για να περιγράψουν την προέλευση του καρκινώματος. Φαίνεται όμως πως ο όρος σακωματώδες καρκίνωμα ανταποκρίνεται περισσότερο στην πραγματικότητα, καθώς νεότερα ερευνητικά δεδομέ- 44

45 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ να ενισχύουν την άποψη για μονοκλωνική προέλευση των δύο σειρών νεοπλασματικών κυττάρων. Πρόκειται για μια ιδιαίτερη μορφή ακανθοκυτταρικού καρκινώματος το οποίο αναπτύσσεται σπάνια στο βλεννογόνο της γλώσσας. Η κλινική του εικόνα είναι είτε πολυποειδής εξωφυτική μάζα, είτε ενδοφυτική ελκωτική σκληρία του βλεννογόνου, ενώ συνήθως αποκτά μεγάλες διαστάσεις και γίνεται απειλητικό για απόφραξη της αεροφόρου οδού. Παρουσιάζει παρόμοια βιολογική συμπεριφορά με το συμβατικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, έχει την ίδια περίπου κατανομή σε ηλικία και φύλο και εμφανίζει παρόμοια μεταστατική συμπεριφορά με αυτό. Αδενοειδές ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Εμφανίζεται κυρίως σε περιοχές του δέρματος εκτεθειμένες στην ηλιακή ακτινοβολία όπως είναι το δέρμα της κεφαλής και του τραχήλου και σπανιότερα στον βλεννογόνο του στόματος με το κάτω χείλος να είναι η συχνότερη εντόπιση και τη γλώσσα να ακολουθεί σε συχνότητα. Κλινικά εμφανίζεται συνήθως ως ογκόμορφος σχηματισμός με αδενοειδείς χαρακτήρες αφήνοντας ακέραιο τον υπερκείμενο βλεννογόνο. Ιστοπαθολογικά επικρατούν τα αδενοειδή νεοπλασματικά κύτταρα, ενώ τα ακανθοκυτταριά κύτταρα είναι συνήθως καλής διαφοροποίησης. Το αδενοειδές ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του βλεννογόνου του στόματος φαίνεται να έχει χειρότερη πρόγνωση από το συμβατικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, με μεγαλύτερη διηθητική και μεταστατική ικανότητα. Αδενοακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Το αδενοακανθοκυτταρικό καρκίνωμα χαρακτηρίζεται ως κακοήθης όγκος με ιστολογικά χαρακτηριστικά αδενοκαρκινώματος και ακνθοκυτταρικού καρκονώματος. Συναντάται συχνότερα στο γαστρεντερικό, στο ανώτερο και κατώτερο αναπνευστικό και στο ουρογεννητικό σύστημα, ενώ σπανιότερα αναπτύσσεται στο δέρμα. Στη ανώτερη αεροπεπτική οδό συχνότερα εντοπίζεται στη στοματική 45

46 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ κοιλότητα, στους παραρίνιους κόλπους και στο λάρυγγα. Από το βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας, η γλώσσα αποτελεί την συχνότερη εντόπιση σε πολύ υψηλό ποσοστό που φτάνει το 85%. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερα κακόηθες νεόπλασμα με υψηλή μεταστατική ικανότητα και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης που το 25% στην πενταετία. Ιστοπαθολογικά αποτελείται από βασικοκυτταρικά, ακανθοκυτταρικά και αδιαφοροποίητα στοιχεία. Η διαφορική διάγνωση του αδενοακανθοκυτταρικού καρκινώματος περιλαμβάνει κυρίως το υψηλής κακοήθειας βλενοεπιδερμοειδές καρκίνωμα στις περιπτώσεις όπου το ακανθοκυτταρικό στοιχείο τείνει να επικρατήσει. Η διαφορετική βιολογική συμπεριφορά των δύο καρκινωμάτων σε κάθε περίπτωση βοηθά στη διάγνωση, με το αδενοακανθοκυτταρικό να διαθέτει εμφανώς υψηλότερη διηθητική και μεταστατική ικανότητα. Θηλώδες ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα Κλινικά χαρακτηρίζεται ως εξωφυτική μάζα με εμφανή θηλώδη χαρακτηριστικά, αλλά με κακοήθη χαρακτήρα. Εμφανίζεται συχνότερα στο βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας, στο στοματοφάρυγγα, στον υποφάρυγγα και στο λάρυγγα. Δεν φαίνεται να έχει αιτιολογική σχέση με τη λευκοπλακία, αλλά περισσότερο με υπερπλαστικές βλάβες και συνυπάρχουσα δυσπλασία. Ιστοπαθολογικά πρόκειται για συμπαγές νεόπλασμα με ινοαγγειακά στοιχεία και απουσία κερατινοποιημένου επιθηλίου. Σύγχρονες μελέτες έχουν καταδείξει τη σαφή αιτιολογική του σχέση με τον ιό HPV, ενώ η βιολογική του συμπεριφορά εμφανίζει σχετικά ήπιο χαρακτήρα. Λεμφοεπιθηλιακό ή Ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα Πρόκειται ουσιαστικά για λεμφοεπιθηλιακό καρκίνωμα με εντόπιση στην ανώτερη αεροπεπτική οδό, στο οποίο μαζί με τα νεοπλασματικά κύτταρα αδενικής προέλευσης συνυπάρχουν αδιαφοροποίητα κύτταρα και νεοπλασματικά κύτταρα ακανθοκυτταρικού τύπου. 46

47 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Παρουσιάζει αιτιολογική σχέση με τον ιό EBV, και εντοπίζεται συχνότερα στις φαρυγγικές αμυγδαλές, στη μαλθακή υπερώα και στη γλώσσα, ενώ πιο σπάνια εντοπίζεται στο φάρυγγα, στο λάρυγγα και στην τραχεία. Η βιολογική του συμπεριφορά είναι κακή και φαίνεται να επηρεάζεται από το είδος των κυττάρων που επικρατούν. Στις περιπτώσεις όπου το αδιαφοροποίητο στοιχείο επικρατεί, το καρκίνωμα αποκτά αυξημένη διηθητική και μεταστατική ικανότητα. Άλλες νεοπλασματικές και μη-νεοπλασματικές βλάβες της γλώσσας Στη διαφορική διάγνωση του καρκίνου της γλώσσας περιλαμβάνονται και άλλες νεοπλασματικές ή μη νεοπλασματικές βλάβες. Από τις νεοπλασματικές βλάβες συχνότερα συναντώνται οι βλάβες του αδενικού επιθηλίου όπου στη γλώσσα αποτελούν περίπου το 2% των καλοήθων και το 11% των κακοήθων όγκων των μικρών σιελογόνων αδένων του στόματος. Σπανιότερα είναι το νευροενδοκρινικό νεόπλασμα, το καρκίνωμα των κυττάρων Merkel, το κερατοακάνθωμα και το μικροκυστικό καρκίνωμα με ελάχιστες αναφορές εντόπισης στη γλώσσα. Μη νεοπλασματικές βλάβες που συμμετέχουν στη διαφορική διάγνωση του καρκίνου της γλώσσας είναι ο κοκκκιωματώδης όγκος της γλώσσας που εμφανίζεται κυρίως στη ραχιαία επιφάνεια, η νεκρωτική σιαλομεταπλασία και ο φλεγμονώδης ψευδοόγκος ο οποίος εκτός από τη στοματική κοιλότητα μπορεί να εντοπιστεί ενδοκοιλιακά, στους πνεύμονες και στο ουρογεννητικό σύστημα 17. VI. Δεύτεροι πρωτοπαθείς όγκοι Μία ιδιαίτερη κλινική οντότητα του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της ανωτέρας πεπτικής και αεροφόρου οδού είναι η ανάπτυξη δεύτερων πρωτοπαθών ό- γκων (ΔΠΟ). Παρά την δυνατότητα για πρώιμη διάγνωση και τη βελτίωση των τεχνικών για τοπικό και περιοχικό έλεγχο της νόσου τα ποσοστά της πενταετούς επιβίωσης έχουν ελάχιστα βελτιωθεί τα τελευταία 30 χρόνια παραμένοντας στα 47

48 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ χαμηλότερα επίπεδα από τις διάφορες θέσεις ενέδρασης. Τα ποσοστά επιβίωσης και η κατάσταση των αρρώστων μπορούν να επιβαρυνθούν περαιτέρω α- φού ένα σημαντικό ποσοστό από αυτούς που έχουν θεραπευτεί αρχικά επιτυχώς για καρκινώματα του στοματοφάρυγγα θα αναπτύξουν ΔΠΟ. Το ποσοστό αυτών των επιζώντων κυμαίνεται σε διάφορες αναφορές μεταξύ του 17% και 30% και σε αυτό περιλαμβάνονται τόσο οι όγκοι που αναπτύσσονται σε διάστημα μικρότερο των 6 μηνών από την αφαίρεση του αρχικού καρκινώματος και ορίζονται ως σύγχρονοι, όσο και οι όγκοι που εμφανίζονται μετά το πρώτο εξάμηνο και τα επόμενα χρόνια από τη θεραπεία και ορίζονται ως μετάχρονοι. Η βιβλιογραφία που επικεντρώνεται ειδικότερα στα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα της στοματικής κοιλότητας καθώς και τα καρκινώματα της κεφαλής και του τραχήλου αναφέρει μια ετήσια αύξηση μόνο των μετάχρονων δεύτερων πρωτοπαθών όγκων μεταξύ του 3% και 10%, από τους οποίους οι μισοί περίπου εντοπίζονται στη στοματική κοιλότητα και το φάρυγγα και οι άλλοι μισοί στο λάρυγγα, πνεύμονα και οισοφάγο. Βεβαίως και το αντίστροφο αναφέρεται, ότι δηλαδή 3% περίπου των αρρώστων με καρκίνο του πνεύμονα θα αναπτύξουν δεύτερο πρωτοπαθή όγκο του στοματοφάρυγγα, ενώ τονίζεται ότι υπάρχει μια αύξουσα συχνότητα εμφάνισης δεύτερων πρωτοπαθών όγκων στη περιοχή κεφαλής και του τραχήλου. Έτσι σύμφωνα με τα τρέχοντα δεδομένα οι δεύτεροι πρωτοπαθείς όγκοι ανεξάρτητα εάν είναι σύγχρονοι ή μετάχρονοι, γενικά είναι ακανθοκυτταρικού τύπου κακοήθειες που αναπτύσσονται με ένα σταθερό ρυθμό (4-7% των θεραπευομένων ασθενών κατά έτος), δεν εξαρτώνται από τη θεραπευτική αγωγή και εντοπίζονται στη αεροφόρο και ανώτερη πεπτική οδό που θεωρούνται ως οι πλέον υποκείμενες σε μεταλλακτικό κίνδυνο περιοχές δηλαδή την κεφαλή και το τράχηλο, καθώς και τα άνω δύο τρίτα του οισοφάγου και τους πνεύμονες. Η υψηλή αυτή προδιάθεση ανάπτυξης δεύτερων πρωτοπαθών όγκων στη περιοχή του στόματος και της ανωτέρας πεπτικής και αεροφόρου γενικότερα περιοχής έχει επιχειρηθεί να ερμηνευτεί με την υπόθεση της καρκινογένεσης πεδίου σύμφωνα με την οποία η έκθεση μιας περιοχής σε καρκινογόνους παράγοντες που ενοχοποιείται για την εμφάνιση μιας πρωτοπαθούς κακοήθειας 48

49 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ οδηγεί ταυτόχρονα πολλαπλές ομάδες κυττάρων να υποστούν κακοήθη μεταμόρφωση σε διάφορες χρονικές περιόδους μιας αρχικά κλινικά υγιούς περιοχής. Πρώτος ο Slaughter και συν. το 1953 καθόρισε τον όρο δεύτεροι πρωτοπαθείς όγκοι (second primary tumors - SPTs) εισάγοντας την έννοια της καρκινογένεσης πεδίου (field cancerization) βασιζόμενος στην παρατήρηση ότι μία ευρεία περιοχή επιθηλίου γύρω από τον αρχικό όγκο εμφάνιζε ιστολογικές μεταβολές με πιθανότητα εμφάνισης δεύτερων ανεξάρτητων εστιών ακανθοκυτταρικού καρκίνου σε ολόκληρη την ανώτερη αεροπεπτική οδό. 18 Οι ΔΠΟ σε ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνο κεφαλής και τραχήλου καθορίζονται από τους περισσότερους ερευνητές με βάση τα κριτήρια των Warren and Gates: 1. Κάθε ένας από τους όγκους να είναι κακοήθης, 2. Όλοι οι ό- γκοι να είναι ξεχωριστοί μεταξύ τους, 3. Κανένας όγκος να μην είναι μεταστατικός. Στις κακοήθεις βλάβες του στοματικού βλεννογόνου, η απόσταση μεταξύ τους πρέπει να είναι τουλάχιστον 2 εκ. ενώ ορισμένοι ερευνητές προσθέτουν ως κριτήριο το ελάχιστο χρονικό διάστημα που παρεμβάλλεται κατά την εμφάνιση της πρώτης από την δεύτερη βλάβη να είναι 3 έτη. 19,20,21 Σήμερα γίνεται προσπάθεια με μοριακές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους ανάλυσης συγκεκριμένων δεικτών που ρυθμίζουν την λειτουργία του καρκινικού κυττάρου σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, να διερευνηθεί όλη η διαδικασία της καρκινογένεσης πεδίου η οποία χαρακτηρίζεται από την συσσώρευση χρωμοσωμικών μεταλλάξεων και γενετικών ανωμαλιών. 22,23,24 Η διάγνωση και η θεραπεία μιας δεύτερης πρωτοπαθούς κακοήθους βλάβης είτε αναπτύσσεται στο στοματοφάρυγγα είτε στο πνεύμονα είναι καλύτερης πρόγνωσης και αυξάνει την επιβίωση συγκρινόμενη με μια νέα βλάβη που μπορεί να είναι αποτέλεσμα υποτροπής ή μετάστασης

50

51 5. ΛΕΜΦΑΔΕΝΙΚΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΑΝΘΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΗΣ ΓΛΩΣΣΑΣ Η λεμφαδενική μετάσταση στον τράχηλο αποτελεί ένα ιδιαίτερα σημαντικό πρόβλημα στους ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνο της γλώσσας. Εκτιμάται ότι η γλώσσα αποτελεί την συχνότερη εντόπιση μεταστατικού καρκίνου στο βλεννογόνο του στόματος με ποσοστό που ξεπερνά το 30% κατά την αρχική ε- ξέταση. 26 Ο καρκίνος της γλώσσας αναπτύσσεται διηθητικά και μεθίσταται μέσω του πλούσιου λεμφικού δικτύου που διαθέτει, στους επιχώριους τραχηλικούς λεμφαδένες, οι οποίοι κατά την κλινική εξέταση εμφανίζονται συνήθως διογκωμένοι, σληροελαστικοί και κάποιες φορές καθηλωμένοι ιδιαίτερα σε περιπτώσεις εξωκαψικής διήθησης. I. Ανατομία της λεμφαδενικής μετάστασης Ο καρκίνος της γλώσσας μεθίσταται συχνότερα στα επίπεδα Ι, ΙΙ και ΙΙΙ του τραχήλου, που αφορούν στους υπογνάθιους-υπογενείδιους και στους άνω και μέσους σφαγιτιδικούς λεμφαδένες αντίστοιχα. (εικ.1) Oπίσθιοι ωτιαίοι Ινιακοί Επιπολής τραχηλικοί Εν τω βάθει τραχηλικοί (επίπεδα ΙΙ,ΙΙΙ,IV) Εν τω βάθει τραχηλικοί (επίπεδo V) Πρόσθιοι ωτιαίοι Παρωτιδικοί Αμυγδαλικοί Υπογενείδιοι (επίπεδo IA) Υπογνάθιοι (επίπεδo IB) Υπερκλείδιοι Εικόνα 1. Λεμφαδενικές ομάδες κεφαλής και τραχήλου. Συμπληρωματικά αναφέρονται οι μέσοι τραχηλικοί λεμφαδένες (επίπεδο VI) και οι οπισθοστερνικοί (επίπεδο VIΙ). 51

52 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ειδικότερα, η κορυφή της γλώσσας μεθίσταται συχνότερα στα επίπεδα Ι και ΙΙ, ενώ το πλάγιο χείλος στα επίπεδα Ι, ΙΙ και ΙΙΙ. Λόγω του ιδιαίτερα πυκνού λεμφικού δικτύου και ιδιαίτερα όταν η καρκινική βλάβη επεκτείνεται κοντά στο διάφραγμα της γλώσσας ή και πέρα από αυτό, παρατηρείται μετάσταση και στο αντίθετο πλάγιο του τραχήλου. Παρόλα αυτά, είναι ιδιαίτερα σπάνια και εξαρτάται εκτός από το μέγεθος της πρωτοπαθούς βλάβης, από την παρουσία μεταστατικής νόσου στο σύστοιχο πλάγιο του τραχήλου. 26 Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι οι τραχηλικές μεταστάσεις στο αντίθετο πλάγιο με εγκατεστημένη μεταστατική νόσο σύστοιχα της πρωτοπαθούς εστίας φτάνουν σε ποσοστά 7% σε βλάβες μεγέθους Τ1, 25% σε βλάβες Τ2 και 39% σε βλάβες Τ3/Τ4. Τα ποσοστά αυτά είναι πολύ μικρότερα σε Ν0 τράχηλο. 27 Η μετακίνηση του καρκινικού κυττάρου φαίνεται να επηρεάζεται τόσο από κυτταρικές-χημειοτακτικές διαδικασίες, όσο και από μηχανικούς παράγοντες όπως είναι η υδροστατική πίεση του εξωκυττάριου υγρού του όγκου. Τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν διαμέσου της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας σε περιοχή μικρότερης ιστικής υδροστατικής πίεσης από την ενδοογκική πίεση, με τελικό προορισμό τα περιογκικά λεμφοφόρα τριχοειδή. Η κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, εκτός από την διαφορά της υδροστατικής πίεσης, ελέγχεται επίσης από ένα σύμπλεγμα πρωτεολυτικών ενζύμων, χημειοκινών, κυτταροκινών και άλλων μορίων προσκόλλησης απαραίτητων για την μετακίνησή τους στα λεμφοφόρα τριχοειδή. 28 Καθώς το νεόπλασμα αυξάνεται σε μέγεθος, αυξάνεται ο όγκος ιστικού υγρού και η ενδοογκική υδροστατική πίεση, οδηγώντας την λεμφική ροή προς τα περιογκικά λεμφοφόρα τριχοειδή τα οποία με τη σειρά τους με την επίδραση κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων αυξάνονται σε αριθμό, όπως θα αναλυθεί παρακάτω. 29 Ταυτόχρονα ινίδια αγκύρωσης χαρακτηριστικά των λεμφοφόρων σε σχέση με τα αιμοφόρα τριχοειδή επάγουν τόσο την αύξηση της διαμέτρου των τριχοειδών, όσο και το άνοιγμα των διακυτταρικών κενών μεταξύ των λεμφικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα μετακινούμενα με τη λέμφο, εισέρχονται στη λεμφική κυκλοφορία. Σε αυτό βοηθάει και η α- πουσία στα λεμφικά τριχοειδή τόσο βασικής μεμβράνης, όσο και της χαρακτηριστικής στιβάδας περικυττάρων που βρίσκουμε στα αιμοφόρα τριχοειδή. Καθώς 52

53 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ στη συνέχεια ο όγκος υγρού και η υδροστατική πίεση μειώνεται σταδιακά στο εξωτερικό περιβάλλον των τριχοειδών, τα διακυτταρικά κενά αρχίζουν να κλείνουν, εμποδίζοντας την αντίστροφη ροή της λέμφου προς το στρώμα. 30,31 Τα καρκινικά κύτταρα αφού εισέλθουν στα λεμφοφόρα τριχοειδή μετακινούνται προς τα μεγαλύτερα λεμφικά αγγεία, όπου οι λείες μυϊκές ίνες του τοιχώματός τους συσπώνται ρυθμικά μετακινώντας την λέμφο προς μία κατεύθυνση, ενώ ειδικές βαλβίδες εμποδίζουν την επιστροφή της στα τριχοειδή. 32 Στην αιματογενή μετάσταση, ο τραυματισμός των καρκινικών κυττάρων κατά τη κυκλοφορία τους, οδηγεί πολλά από αυτά σε κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα, στη λεμφογενή μετάσταση δεν φαίνεται να ακολουθείται το ίδιο μοντέλο, ενώ κάποια από τα καρκινικά κύτταρα που δεν καταφέρουν να φτάσουν στους επιχώριους λεμφαδένες, προσκολλώνται στο λεμφικό ενδοθήλιο, μεταναστεύοντας τελικά πίσω στο στρώμα των γύρω ιστών. Τα υπόλοιπα καρκινικά κύτταρα ε- γκαθίστανται στον υποκάψιο λεμφόκολπο των επιχώριων λεμφαδένων μέσω των προσαγωγών λεμφαγγείων και στα ενδοθηλιακά φλεβίδια της παραφλοιώδους ζώνης. Εκεί, είτε διηθούν τον φλοιό του λεμφαδένα δημιουργώντας τελικά την μεταστατική νόσο, είτε τον παρακάμπτουν και εισέρχονται στην αιματική κυκλοφορία μέσω λεμφοφλεβικών αναστομώσεων. Λίγα από τα καρκινικά κύτταρα ακολουθούν διαφορετικό δρόμο, παρακάμπτουν τους επιχώριους λεμφαδένες μέσω των απαγωγών λεμφαγγείων και καταλήγουν σε επόμενο λεμφαδενικό ε- πίπεδο δημιουργώντας την λεγόμενη μετάσταση παράκαμψης. 33,34 Το ερώτημα βέβαια που παραμένει, είναι γιατί άλλα καρκινικά κύτταρα υ- φίστανται μετάσταση και κάποια άλλα όχι, ή γιατί τελικά άλλα καρκινικά κύτταρα περνούν στη συστηματική κυκλοφορία και εγκαθίστανται σε απομακρυσμένα όργανα δημιουργώντας μεταστατικές εστίες στα όργανα αυτά και κάποια άλλα παραμένουν στους επιχώριους λεμφαδένες και δημιουργούν τη λεμφαδενική μετάσταση; Η απάντηση στο πρώτο ερώτημα φαίνεται να εξαρτάται από την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα κύτταρα του στρώματος μέσω ενός μεγάλου αριθμού αυξητικών παραγόντων, κυτταροκινών και άλλων ιστικών παραγόντων περιογκικά και ενδοογκικά, μέρος των οποίων αποτελεί αντικείμενο της παρούσας μελέτης. Νεότερα ερευνητικά δεδομένα αναδεικνύουν τα μεσεγχυμα- 53

54 νόσο. 35 Η απάντηση στο δεύτερο ερώτημα εστιάζεται κυρίως στην χαρακτηριστική ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ τικά κύτταρα ως κυρίαρχα στη διαδικασία της μετάστασης. Φαίνεται πως η μετατροπή των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων σε μεσεγχυματικά (epithelial to mesechymal transition-emt) σηματοδοτεί την εγκατάσταση της μεταστατικής νόσου. Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή, αφού τα καρκινικά κύτταρα εισέλθουν στη λεμφική κυκλοφορία, αυτά το οποία αποκτούν χαρακτήρα μεσεγχυματικού κυττάρου, μεταναστεύουν τελικά και εγκαθίστανται σε «φωλιές» άλλων μεσεγχυματικών κυττάρων στους επιχώριους λεμφαδένες, δημιουργώντας τη μεταστατική ιστολογική εικόνα του χορίου του βλεννογόνου της γλώσσας, το οποίο είναι πλούσιο σε λεμφοφόρα τριχοειδή, καθώς και στην ανατομική εγγύτητα της γλώσσας με το λεμφικό δίκτυο του τραχήλου. Επίσης οι χαρακτηριστικές διαφορές στην ιστολογική εικόνα των λεμφικών τριχοειδών σε σχέση με τα αιμοφόρα τριχοειδή, η παθολογική φυσιολογία των ενδοθηλιακών κυττάρων των λεμφοφόρων τριχοειδών και οι διαφορετικές κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που εκφράζουν σε σχέση με τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων τριχοειδών συντείνουν προς αυτήν την κατεύθυνση, όπως θα αναλυθεί εκτενώς στην παρούσα μελέτη. 36,37 Παράγοντες κινδύνου Η εμφάνιση μεταστατικής νόσου στους τραχηλικούς λεμφαδένες επιβαρύνει την πρόγνωση μειώνοντας σημαντικά το προσδόκιμο επιβίωσης σε σχέση με τα μη μεταστατικά καρκινώματα. Η εμφάνισή της έχει συνδεθεί κυρίως με κλινικές και ιστοπαθολογικές παραμέτρους και παράγοντες κινδύνου όπως η εντόπιση, η σταδιοποίηση, το βάθος και πάχος διήθησης, καθώς και η διήθηση συγκεκριμένων ανατομικών δομών (αγγείων, νεύρων, λεμφαγγείων). α. Κλινικοί παράγοντες κινδύνου Πιο συγκεκριμένα, η εντόπιση της πρωτοπαθούς καρκινικής βλάβης στη γλώσσα και στο έδαφος του στόματος έχει συνδεθεί με υψηλότερα ποσοστά λεμφαδενικής μετάστασης σε σχέση με βλάβες ίδιου σταδίου στη σκληρά υπε- 54

55 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ ρώα και στα ούλα της άνω γνάθου. Επίσης, πρωτοπαθείς βλάβες που εδράζονται σε περισσότερο πρόσθιες ανατομικά περιοχές εμφανίζουν μικρότερα ποσοστά μεταστατικής νόσου από βλάβες του οπισθίου τμήματος της στοματικής κοιλότητας. Έτσι, οι πρωτοπαθείς βλάβες του κινητού τμήματος της γλώσσας παρουσιάζουν μικρότερα ποσοστά μεταστατικής νόσου από βλάβες της βάσης της γλώσσας. 38 Σημαντικός παράγοντας κινδύνου εμφάνισης λεμφαδενικής μετάστασης είναι και το μέγεθος της πρωτοπαθούς βλάβης. Μελέτες έχουν δείξει τη σαφή συσχέτιση του αυξημένου Τ δείκτη του συστήματος σταδιοποίησης ΤΝΜ με τη μεταστατική νόσο. β. Ιστοπαθολογικοί παράγοντες κινδύνου Σύμφωνα με το σύστημα βαθμονόμησης της κακοήθειας των Anneroth και συν. (Anneroth point scoring criteria) που χρησιμοποιήθηκε ευρέως κατά το παρελθόν ως βασικό ιστοπαθολογικό προγνωστικό εργαλείο, η έλλειψη κερατινοποιημένου επιθηλίου και η ανεύρεση στα όρια της βλάβης καρκινικών νησίδων ή διάσπαρτων καρκινικών κυττάρων λιγότερων των 15, αποτέλεσαν κακό προγνωστικό δείκτη. 39 Σύμφωνα με το ίδιο σύστημα βαθμονόμησης της κακοήθειας, καθώς και την τροποποίηση κατά Woolgar and Scott άλλοι ιστοπαθολογικοί παράγοντες κινδύνου θεωρήθηκαν ο πυρηνικός πολυμορφισμός, η αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων, το βάθος διήθησης του όγκου, καθώς και η μειωμένη λεμφοκυτταρική και πλασματοκυτταρική διήθηση του στρώματος. 40 Νεότερες μελέτες έχουν εξειδικεύσει περισσότερο έχουν διαφοροποιήσει ή και έχουν εγκαταλείψει τους προγνωστικούς αυτούς δείκτες, σε σημείο ώστε η συγκεκριμένη βαθμονόμηση να αποτελεί πλέον αναχρονισμό. Ιδιαίτερα, η διήθηση του στρώματος του όγκου από ανοσιακά κύτταρα τείνει σήμερα να αποτελεί κακό προγνωστικό δείκτη, όπως θα αναλυθεί εκτενώς στην παρούσα μελέτη. Το πάχος διήθησης (ορίζεται ως η απόσταση μεταξύ της κορυφής του εξωφυτικού τμήματος και του βαθύτερου σημείου της βλάβης) και κυρίως το βάθος διήθησης (ορίζεται ως η απόσταση μεταξύ της κορυφής του παρακείμενου 55

56 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ φυσιολογικού βλεννογόνου και του βαθύτερου σημείου της βλάβης) θεωρείται ακόμη και σήμερα σημαντικός προγνωστικός δείκτης εμφάνισης μετάστασης στους επιχώριους λεμφαδένες. Σύγχρονες μελέτες έχουν αναδείξει το βάθος διήθησης των 4 mm ως ένα ιστολογικό όριο πέρα από το οποίο η εμφάνιση μετάστασης του καρκίνου της γλώσσας θεωρείται περισσότερο πιθανή. 38 Παρόλα αυτά, εμφανίζεται σημαντική διχογνωμία ως προς το ακριβές βάθος διήθησης που μπορεί να θεωρηθεί ασφαλής παράγοντας κινδύνου. Άλλες μελέτες το τοποθετούν στα 5 χιλ. ενώ κάποιες άλλες θεωρούν ακόμη και το βάθος διήθησης των 2 χιλ. ως αρνητικό προγνωστικό στοιχείο του καρκίνου της γλώσσας. Η περινευρική διήθηση του όγκου αποτελεί έναν σημαντικό όσο και αμφιλεγόμενο προγνωστικό δείκτη μεταστατικής νόσου του καρκίνου της γλώσσας. Πληθώρα ερευνητικών δεδομένων θεωρούν την περινευρική διήθηση επίσημων νευρικών στελεχών ως κακό προγνωστικό δείκτη. Γίνεται βέβαια εύκολα κατανοητό πως η διήθηση του γλωσσικού νεύρου και της χορδής του τυμπάνου συνδέεται άμεσα με τη μεταστατική νόσο και μόνο από το βάθος διήθησης του όγκου, λόγω της ανατομικής θέσης των δομών αυτών. Ο νευροτρόπος χαρακτήρας όμως του όγκου, δηλαδή η επέκτασή του κατά μήκους του περινευρίου των νευρικών στελεχών αποτελεί αντικείμενο έντονης αμφισβήτησης. Κατά τον ίδιο τρόπο αμφισβητείται και η προγνωστική αξία της διήθησης μικρών ανώνυμων νευρικών κλάδων. 38 II. Βιολογία της μεταστατικής νόσου Για πολλά χρόνια οι γνώσεις μας για τη βιολογία της μεταστατικής νόσου θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν απλοϊκές. Από το 1889 με βάση την μελέτη των Paget και συν., η ερμηνεία της λεμφαδενικής μετάστασης βασίστηκε στη γνωστή πλέον θεωρία του σπόρου και του εδάφους. 41 Σήμερα, με την εξέλιξη που έχει σημειωθεί στη μοριακή βιολογία και στην ανοσολογία των όγκων, η θεώρηση αυτή εγκαταλείπεται και αναδεικνύεται η σημασία της αγγειογένεσης, των χημειοτακτικών παραγόντων της ανοσιακής απάντησης, των μακροφάγων και άλλων αυξητικών παραγόντων και υποδοχέων. Οι βιολογικοί παράγοντες που ευνοούν ή αναστέλλουν την μετάσταση φαίνονται επιγραμματικά στον παρακάτω πίνακα: 56

57 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Πίνακας 3. Παράγοντες σχετιζόμενοι με τη μετάσταση. Από τον όγκο Από τον οργανισμό Παράγοντες που ευνοούν τη μετάσταση Αυξητικοί παράγοντες και υποδοχείς Νεοαγγείωση Αγγειογενετικοί παράγοντες Αυξητικοί παράγοντες- Αιμοπετάλια και παράγωγα Κινητικότητα και διηθητικότητα Υποδοχείς και μόρια προσκόλλησης Μονοκύτταρα-μακροφάγα Παράγοντες που αναστέλλουν την μετάσταση Αντιγονοκότητα Αναστολείς πρωτεασών Αναστολείς αγγειογέννεσης Αμυντικό σύστημα Καδχερίνες Ανοσιακή απάντηση Αναστολείς πρωτεασών Ο ρόλος των χημειοκινών στην ανάπτυξη της μεταστατικής νόσου ως χημειοτακτικών παραγόντων της ανοσιακής απάντησης που επηρεάζουν την κινητικότητα και διηθητικότητα των καρκινικών κυττάρων, άρχισε να αποσαφηνίζεται τα τελευταία 20 χρόνια. Νεότερα ερευνητικά δεδομένα αναδεικνύουν την έκφρασή τους τόσο στα καρκινικά κύτταρα όσο και στα κύτταρα του στρώματος τόσο της πρωτοπαθούς όσο και της μεταστατικής βλάβης. 42 Ταυτόχρονα, η αλληλεπίδραση των κυττάρων και των δομών του στρώματος με τα κύτταρα του όγκου, ανέδειξαν την αγγειογένεση και ιδιαίτερα την λεμφαγγειογένεση ως βασικό παράγοντα στην ανάπτυξη της λεμφαδενικής μετάστασης. Νεότερα ερευνητικά δεδομένα επεκτείνουν τη μελέτη της συμπεριφοράς του καρκινικού κυττάρου πέρα από το σημείο εισόδου του στο λεμφαγγειακό δίκτυο. Αναπτύχθηκε έτσι η θεωρία του μεσεγχυματικού καρκινικού κυττάρου με την οποία επιχειρείται να ολοκληρωθεί το νέο μοντέλο της βιολογίας της μεταστατικής νόσου. Μεσεγχυματική μετάβαση του καρκινικού επιθηλιακού κυττάρου (epithelial to mesenchymal transition-emt) Η ενσωμάτωση της θεωρίας των προγονικών-μεσεγχυματικών κυττάρων στη μεταστατική διαδικασία άρχισε στη δεκαετία του 90, όταν φάνηκε ότι σε μερικές κακοήθειες, αν και απελευθερώνονται εκατομμύρια καρκινικά κύτταρα στην 57

58 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ κυκλοφορία, μόνο ελάχιστα από αυτά είναι ικανά να προκαλέσουν τη μεταστατική νόσο. Με βάση πρόσφατα ερευνητικά δεδομένα, θεωρείται ότι μόνο 1-2% από τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιαζόμενα, έχουν την ικανότητα να αναπαράγουν όλο τον όγκο. Αν και πιθανώς πολλά από τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να ξεφύγουν από την πρωτοπαθή εστία, δεν μπορούν όλα να α- ναπτύξουν μεταστατική νόσο. 43 Ο φαινότυπος ενός τέτοιου προγονικού κυττάρου το κάνει να διαφέρει από την πλειονότητα των υπόλοιπων καρκινικών κυττάρων επιθηλιακού χαρακτήρα, προσδίδοντάς του ιδιότητες μεσεγχυματικών κυττάρων κάνοντάς το ικανό να μετακινείται, να ανοσοδιαφεύγει και να πολλαπλασιάζεται όπως ένα φυσιολογικό προγονικό κύτταρο. Η διαδικασία αυτή της μετάβασης του καρκινικού επιθηλιακού κυττάρου σε κύτταρο με μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά (epithelial to mesenchymal transition-emt), στοιχειοθετεί τη νέα ιεραρχική δόμηση της καρκινογένεσης που έχει αυτομάτως σοβαρές επιπτώσεις στο μοντέλο της μεταστατικής διαδικασίας. Σύμφωνα με τη θεώρηση αυτή επαναδιατυπώνεται η παλιά άποψη για τη μεταστατική νόσο του σπόρου και του εδάφους όπου τελικά η προτίμηση των καρκινικών κυττάρων για τους λεμφαδένες θα μπορούσε να εξηγηθεί με τη ύ- παρξη σε αυτούς φωλεών ανάπτυξης μεσεγχυματικών κυττάρων που προσφέρουν ιδανικά σημεία προσέλκυσης νέων κυττάρων με προγονικούς χαρακτήρες. 44 III. Ανοσολογία του ακανθοκυτταρικού καρκινου της γλώσσας και της μεταστατικής νόσου Η εξέλιξη της σύγχρονης ανοσολογίας οδήγησε πρόσφατα στην καλύτερη κατανόηση της ανοσιακής απάντησης του οργανισμού έναντι των αντιγόνων των όγκων. Διχογνωμία βέβαια παραμένει σχετικά με το είδος των αντιγόνων που αναγνωρίζονται από το ανοσιακό σύστημα, δηλαδή αν πρόκειται για νέες πρωτεΐνες που παράγονται από καρκινικά κύτταρα ως προϊόν γενετικής μετάλλαξης ή επιγενετικού μετασχηματισμού, ή αν πρόκειται για πρωτεΐνες του οργανισμού με διαφορετική έκφραση. 58

59 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Σε κάθε περίπτωση όμως, ο τρόπος αντίδρασης του ανοσιακού συστήματος και τα κύτταρα τα οποία συμμετέχουν σε αυτόν φαίνεται ότι καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό την πρόγνωση του όγκου. Από την άλλη μεριά, τα ίδια τα κύτταρα του όγκου αναπτύσσουν διάφορους μηχανισμούς διαφυγής από το ανοσιακό σύστημα, ώστε τελικά, η βιολογική συμπεριφορά του όγκου να είναι αποτέλεσμα της δυναμικής συνύπαρξης των ανοσιακών κυττάρων και των κυττάρων του ό- γκου. Ο κύριος μηχανισμός διαφυγής των όγκων από το ανοσιακό σύστημα α- φορά στο συνδυασμό της ελλιπούς διέγερσης των Τ λεμφοκυττάρων και της παραγωγής ανοσοκατασταλτικών ουσιών από τα κύτταρα του όγκου. Έτσι, από τη μία πλευρά η λειτουργία των «ειδικών» αμυντικών κυττάρων δεν επαρκεί να α- ντιμετωπίσει τον αντιγονικό ερεθισμό των καρκινικών κυττάρων, και από την άλλη πλευρά διεγείρουν συγκεκριμένες ομάδες ανοσοκατασταλτικών κυττάρων και παράγουν κυτταροκίνες με ανοσοκατασταλτική δράση. Είναι σαφές ότι η λεπτομερής μελέτη της ανοσιακής απάντησης, των κυττάρων τα οποία συμμετέχουν σε αυτήν καθώς και των προϊόντων της μπορεί να οδηγήσει στην καλύτερη κατανόηση της συμπεριφοράς του καρκινικού κυττάρου σε όλες τις φάσεις εξέλιξης της νόσου και ειδικότερα στην μετάσταση. 59

60

61 6. ΤΟ ΑΝΟΣΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ-ΕΙΔΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Το φυσιολογικό ανοσιακό σύστημα του ανθρώπου προστατεύει τον οργανισμό από τις λοιμώξεις, τις νεοπλασίες, τα αυτοάνοσα νοσήματα και κάθε «ξένο» προς αυτόν αντιγονικό ερεθισμό. Οι αμυντικοί μηχανισμοί διακρίνονται σε δύο συστήματα: α) στους μη ειδικούς ή φυσικούς και στους ειδικούς ή επίκτητους. A. ΦΥΣΙΚΗ-ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Η φυσική ανοσία χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι αναγνωρίζει και απαντάει σε μικρόβια και όχι σε μη μικροβιακές ουσίες. Δεν αποκτάται με προηγούμενη επαφή με τον λοιμογόνο παράγοντα και δεν αφορά μόνο ορισμένο ειδικό παράγοντα γι αυτό ονομάζεται και μη ειδική. Οι φυσικοί μηχανισμοί που απαρτίζουν την μη ειδική ανοσία είναι το δέρμα και οι βλεννογόνοι, καθώς και τα βιοχημικά συστατικά των ιστών όπως είναι η βλέννη, το όξινο pη του στομάχου, η λακτοϋπεροξειδάση στο γάλα, η λυσοζύμη στα δάκρυα, τις ρινικές εκκρίσεις και το σάλιο. Το δέρμα δεν διαπερνάται παρά από ελάχιστα είδη μικροοργανισμών, ενώ σε περιπτώσεις κατά τις οποίες γίνεται λύση της συνέχειάς του όπως σε τραύματα ή εγκαύματα είναι δυνατόν να προκληθεί λοίμωξη. Άλλοι παράγοντες που συμμετέχουν στους μηχανισμούς της μη ειδικής ανοσίας είναι οι πρωτεΐνες οξείας φάσης που παράγονται από το ήπαρ με τη δράση συγκεκριμένων κυτοκινών, η ενεργοποίηση του συμπληρώματος, η δράση των ΝΚ κυττάρων και η φαγοκυττάρωση από τα φαγοκύτταρα του οργανισμού

62 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ I. Πρωτεΐνες οξείας φάσης Πρόκειται για πρωτεϊνικά μόρια του πλάσματος όπως είναι η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), η οποία έχει την ιδιότητα να συνδέεται παρουσία Ca με υποδοχείς φωσφορυλχολίνης του κυτταρικού τοιχώματος των μικροβίων ενεργοποιώντας παράγοντες της κλασικής οδού του συμπληρώματος και την φαγοκυττάρωση. Άλλες πρωτεΐνες οξείας φάσης είναι η πρωτεΐνη του αμυλοειδούς Α, η α1 αντιθρυψίνη, η α2 μακροσφαιρίνη, το ινωδογόνο και η σελουλοπλασμίνη. Η έκκριση όλων αυτών των πρωτεϊνικών μορίων από το ήπαρ επάγεται από συγκεκριμένες κυτοκίνες όπως είναι η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF). Μετά την είσοδο του «ξένου» αντιγόνου στον οργανισμό, τα μακροφάγα αντιδρούν παράγοντας τις κυτοκίνες TNF και IL-1. Αυτές με τη σειρά τους διεγείρουν την έκφραση των μορίων προσκόλλησης Ε και Ρ- σελεκτίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα των μικρών αγγείων. Τα μακροφάγα των ιστών ως φαγοκύτταρα πλέον, συνδέονται και αποσυνδέονται διαδοχικά στα μόρια προσκόλλησης κινούμενα κατά μήκος του ενδοθηλίου των αγγείων, ενώ ταυτόχρονα επάγουν την έκφραση και άλλων κυτοκινών, των χημειοκινών, οι οποίες επιταχύνουν την μετακίνησή τους. Επάγοντας τελικά την παραγωγή ιντεγκρινών, τα μακροφάγα μεταναστεύουν από τα αγγεία στον τόπο της φλεγμονής όπου εκτελούν την φαγοκυττάρωση. II. Το συμπλήρωμα Το συμπλήρωμα αποτελείται από ένα σύνολο 30 περίπου πρωτεϊνών του πλάσματος τα οποία αντιδρούν με ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς ή άμεσα με τα κυτταρικά τοιχώματα των μικροβίων, επάγοντας την λύση και καταστροφή τους. Τα συμπλήρωμα ενεργοποιείται με τρεις διαφορετικές οδούς: α) εναλλακτική οδός όπου γίνεται ενεργοποίηση του συμπλέγματος των πρωτεϊνών του συμπληρώματος επάνω στο κυτταρικό τοίχωμα του μικροβίου. β) κλασσική οδός όπου ενεργοποιείται μέσω της σύνδεσης αντισωμάτων κατά τις φάσεις της ειδικής ανοσιακής απάντησης. 62

63 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ γ) οδός λεκτίνης όπου ενεργοποιείται όταν η λεκτίνη του συμπληρώματος συνδέεται με την πρωτεΐνη μαννόγη επάνω στο μικροβιακό κυτταρικό τοίχωμα. Η σύνδεση της πρωτεΐνης C3β στο κυτταρικό τοίχωμα των μικροβίων επιταχύνει και ισχυροποιεί την σύνδεσή τους με τα φαγοκύτταρα επάγοντας τελικά την φαγοκυττάρωση και την καταστροφή τους. Επίσης, η ενεργοποίηση του συμπληρώματος μέσω της δημιουργίας διαμεμβρανικών καναλιών των προσβεβλημένων κυττάρων επιταχύνει τον κυτταρικό τους θάνατο, ενώ ταυτόχρονα ορισμένες πρωτεΐνες του συμπληρώματος α- σκούν χημειοτακτική δράση στα φαγοκύτταρα προς την περιοχή της φλεγμονής. III. Τα φαγοκύτταρα Τα κύτταρα που συμμετέχουν στις διαδικασίες της φαγοκυττάρωσης είναι τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και τα μακροφάγα. Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα είναι κύτταρα με μικρό χρόνο ζωής και είναι αυτά που προσελκύονται πρώτα στον τόπο της φλεγμονής. Διαθέτουν πολύλοβο πυρήνα, δεν πολλαπλασιάζονται και περιέχουν τριών ειδών κοκκία. Αυτά είναι τα πρωτογενή που περιέχουν μυελοϋπεροξειδάση, λυσοσώματα και κατιονικές πρωτεΐνες, τα δευτερογενή που περιέχουν λακτοφερρίνη, λυσοζύμη και μια πρωτεϊνη που συνδέεται με την Β12 και τα τριτογενή που περιέχουν υδρολάσες. Τα μακροφάγα προέρχονται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος, τα οποία μετά την είσοδό τους στο αίμα και την μετανάστευσή τους ιστούς διαφοροποιούνται σε μακροφάγα. Τα μακροφάγα του συνδετικού ιστού ονομάζονται ιστιοκύτταρα, των οστών οστεοκλάστες, των νεφρών μεσεγχυματικά κύτταρα, του εγκεφάλου μικρογλοία, του σπλήνα, του θύμου αδένα και των λεμφαδένων ονομάζονται μακροφάγα των φλεβωδών κόλπων. Στο ήπαρ φαγοκυτταρικές ι- διότητες έχουν τα κύτταρα Kupffer, στους πνεύμονες τα μακροφάγα των κυψελίδων και στην κοιλία τα μακροφάγα του περιτοναίου. Κατά την είσοδο του μικροοργανισμού τα φαγοκύτταρα κινούνται χημειοτακτικά στον τόπο της φλεγμονής με την βοήθεια αρχικά μορίων προσκόλλησης όπως οι σελεκτίνες και στη συνέχεια των χημειοκινών, στοιχείων του συμπληρώματος και της ιντρλευκίνης 8. Σημαντικό ρόλο στη μετακίνηση των φαγοκυτ- 63

64 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ τάρων διαδραματίζουν και οι λευκοτριένες, τα σιτευτικά κύτταρα, η ισταμίνη, καθώς και προϊόντα των μικροβίων. Στη συνέχεια γίνεται η προσκόλληση των μικροβίων στην επιφάνεια του φαγοκυττάρου με τη βοήθεια ειδικών υποδοχέων όπως οι ελικοειδείς διαμεμβρανικοί υποδοχείς, οι υποδοχείς μαννόζης, οι υποδοχείς Toll και CD 14, οι υποδοχείς για το Fc τμήμα της IgG,καθώς και μιας ειδικής πρωτεΐνης που συνδέει την LPS των μικροβίων. Το προσκολλημένο σωματίδιο περιβάλλεται από προεκβολές του φαγοκυττάρου και τελικά εγκλείεται στο πρωτόπλασμα σε κενοτόπιο σχηματίζοντας το φαγοσωμάτιο. Κατόπιν με τη βοήθεια του λυσοσωματίου σχηματίζεται το φαγολυσοσωμάτιο, μέσα στο οποίο με ειδικά μικροβιοκτόνα μόρια γίνεται η καταστροφή των μικροβίων. Στα μακροφάγα εκτός των μικροβιοκτόνων μορίων υπάρχουν και άλλοι ενζυματικοί μηχανισμοί οι οποίοι συμμετέχουν στη καταστροφή των μικροβίων. Τέτοιοι είναι η λυσοζύμη και η ελαστάση που δρουν στην πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των μικροβίων, καθώς και ειδικές πρωτεΐνες όπως οι ντεφεσίνες και η λακτοφερρίνη με αντιμικροβιακές ιδιότητες. IV. Φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (Natural killer cells NK cells) Τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα είναι μεγάλα λεμφοκύτταρα τα οποία μορφολογικά μοιάζουν με τα Τ-λεμφοκύτταρα. Περιέχουν πολλά κοκκία και δεν έχουν υποδοχείς ούτε των Τ ούτε των Β λεμφοκυττάρων. Συνδέονται με την ε- πιφάνεια μολυσμένων με ιό κυττάρων με συγκεκριμένους υποδοχείς γλυκοπρωτεϊνών των κυττάρων αυτών, μέσω των οποίων έχουν την ικανότητα να διακρίνουν τα μολυσμένα από τα φυσιολογικά κύτταρα. Κατά τη σύνδεση αυτή, τα φυσικά κυτταροκτόνα απελευθερώνουν από τα κοκκία τους το ένζυμο περφορίνη μέσω του οποίου προκαλούν οπές στην κυτταρική μεμβράνη των μολυσμένων κυττάρων. Μέσα από αυτές τις οπές εισέρχονται στο εσωτερικό του κυττάρου στόχου νερό, ιόντα ασβεστίου, κοκκοένζυμα και κοκκολυσίνη με αποτέλεσμα την καταστροφή ενδοκυττάριων βακτηριδίων ή την αποδόμηση του κυτταρικού DNA και τον θάνατο του κυττάρου. Ο ακριβής τρόπος διάκρισης των φυσιολογικών από τα μη φυσιολογικά κύτταρα δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός, αλλά φαίνεται να εξαρτάται από 64

65 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ δύο τύπους επιφανειακών υποδοχέων των φυσικών κυτταροκτόνων: α. τους ε- νεργοποιητικούς ή επαγωγικούς ανοσοσφαιρινικούς υποδοχείς οι οποίοι αναγνωρίζουν τις γλυκοπρωτείνες των μη φυσιολογικών κυττάρων και ενεργοποιούν το σήμα καταστροφής τους και β. τους ανασταλτικούς ανοσοσφαιρινικούς υποδοχείς οι οποίοι αναγνωρίζουν μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι εμποδίζοντας την καταστροφή των κυττάρων αυτών. Η αναγνώριση των μορίων αυτών αποτελεί έτσι τον κύριο ρυθμιστή της έκλυσης ανασταλτικών ή ενεργοποιητικών μηνυμάτων προς το ΝΚ κύτταρο, με αποτέλεσμα την τελική εμφάνιση ή όχι της κυτταρολυτικής τους δράσης. Κύτταρα δηλαδή που φέρουν χαμηλή ή διαταραγμένη έκφραση του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι (MHC I) αναγνωρίζονται και λύονται με την κυτταροτοξική δράση των φυσικών κυτταροκτόνων. Τα φυσικά κυτταροκτόνα δεν διαθέτουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες, και αρχικά αναγνωρίστηκαν για την ικανότητά τους να καταστρέφουν καρκινικά κύτταρα. Βασικό τους χαρακτηριστικό είναι ότι διεγείρονται πολύ γρήγορα - εντός ωρών- από την εμφάνιση της λοίμωξης συμμετέχοντας στις διαδικασίες της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης. Ενεργοποιούνται από κυττοκίνες που παράγονται από τα φαγοκύτταρα όπως είναι οι ινερλευκίνες 8 και 12, ενώ στη συνέχεια απελευθερώνουν ιντερφερόνη γ επανενεργοποιώντας τα φαγοκύτταρα. Τα φυσικά κυτταροκτόνα έχουν περιορισμένη συμμετοχή στους μηχανισμούς της ειδικής ανοσιακής απάντησης, μέσω ειδικών ανοσοσφαιρινικών υποδοχέων φόνευσης (KIRs: killer immunoglobulin-like receptors), και άλλων επαγωγικών υποδοχέων που διαθέτουν ειδικό Fc τμήμα για ορισμένα IgG αντισώματα. 65

66 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ B. ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Το κύριο χαρακτηριστικό της ειδικής ανοσιακής απάντησης (ΕΑΑ) είναι η ειδικότητα. Ενώ η φυσική ανοσία ως πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού α- ντιδρά άμεσα στον εισβάλλοντα ερεθισμό, η ειδική ανοσία αντιδρά και επάγεται μόνο μετά την πρώτη επαφή με συγκεκριμένο αντιγόνο. Διαθέτει μνήμη, μετά την πρωτογενή απάντηση από την πρώτη έκθεση στο αντιγόνο, ενώ ταυτόχρονα είναι ειδικότερη, αποτελεσματικότερη αλλά και βραδύτερη από την φυσική ανοσία. Η ειδική ανοσιακή απάντηση διακρίνεται στην χυμική που επιτελείται κυρίως από τα Β λεμφοκύτταρα και την κυτταρική που επιτελείται κυρίως από τα Τ λεμφοκύτταρα. Άλλα κύτταρα, κυττοκίνες και μεσολαβητές διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις φάσεις εξέλιξης της ΕΑΑ. 46 I. Κύτταρα της ΕΑΑ Τα σημαντικότερα κύτταρα που συμμετέχουν στις διαδικασίες της ΕΑΑ θεωρούνται τα Β και Τ λεμφοκύτταρατα,τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ) και τα α- ντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑΠΚ). α. Λεμφοκύτταρα λεμφικό σύστημα Τα ώριμα λεμφοκύτταρα περιλαμβάνουν δύο χαρακτηριστικούς πληθυσμούς, τα Τ και Β λεμφοκύτταρα. Είναι οργανωμένα σε ιστούς και όργανα του σώματος με σκοπό την προσφορότερη ενεργοποίηση από τους αντιγονικούς ερεθισμούς αλλά και την καταλληλότερη μεταξύ τους αλληλεξάρτηση και αλληλοβοήθεια η οποία είναι απαραίτητη. Όλο αυτό το σύστημα ονομάζεται λεμφικό σύστημα, το οποίο εκτός από τα λεμφοκύτταρα περιλαμβάνει τα πρωτογενή λεμφικά όργανα που είναι ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών, και τα δευτερογενή λεμφικά όργανα που είναι οι λεμφαδένες και ο σπλήνας. 66

67 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Τα Β λεμφοκύτταρα είναι υπεύθυνα για την χυμική ανοσία μέσω της ω- ρίμανσής τους σε πλασματοκύτταρα και της παραγωγής αντισωμάτων, ενώ τα Τ λεμφοκύτταρα είναι υπεύθυνα για την κυτταρική ανοσία. Τα Β λεμφοκύτταρα με την επίδραση αντιγόνων και με την συνεργασία των Τ λεμφοκυττάρων διαφοροποιούνται στον μυελό των οστών και στη συνέχεια στους λεμφαδένες και στο σπλήνα. Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα τα οποία χαρακτηρίζονται ως IGM+, IGD+, εισέρχονται στην κυκλοφορία και μεταναστεύουν στα δευτερογενή λεμφικά όργανα όπου αρχίζει η δεύτερη περίοδος διαφοροποίησής τους σε πλασματοκύτταρα, τα οποία όμως εφόσον δεν δεχτούν για ορισμένο χρονικό διάστημα αντιγονική διέγερση υφίστανται κυτταρικό θάνατο. Ορισμένα μόνο από τα Β λεμφοκύτταρα εξελίσσονται σε κύτταρα μνήμης τα οποία επιζούν για μεγάλο χρονικό διάστημα και σε ενδεχόμενη νέα διέγερση από το ίδιο αντιγόνο διαφοροποιούνται γρήγορα σε πλασματοκύτταρα παράγοντας αντισώματα. Το Β λεμφοκύτταρο εκφράζει στην επιφάνειά του ορισμένους υποδοχείς: 1. Ο κύριος υποδοχέας είναι η ανοσοσφαιρίνη Ig στην επιφάνειά του, η οποία μαζί με άλλα δύο διαμεμβρανικά μόρια, τα Igα και Igβ αποτελούν τον αντιγονικό υποδοχέα του Β λεμφοκυττάρου. Ταυτόχρονα άλλα επιβοηθητικά μόρια μετάδοσης σήματος (CD19, CD20, CD21) σχετίζονται με τον υποδοχέα αντιγόνου. 2. Ο υποδοχέας CD32 για το τμήμα Fc της ανοσοσφαιρίνης IgG. 3. Ο υποδοχέας CD40 για την μετατροπή της ανοσοσφαιρινικής τάξης που παράγεται από το Β λεμφοκύτταρο. 4. Τα μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι και ΙΙ (MHC I, MHC II) για τη σύνδεση του αντιγόνου με τον αντίστοιχο υποδοχέα του Τ λεμφοκυττάρου κατά τη φάση της αντιγονοπαρουσίασης. 5. Τα συνδιεγερτικά μόρια Β7.1 (CD80) και Β7.2 (CD86) τα οποία αντιδρούν με τους υποδοχείς CD 28 και CTLA-4 στο Τ λεμφοκύτταρο κατά τη φάση της ε- νεργοποίησης του Τ λεμφοκυττάρου στην αντιγονοπαρουσίαση. Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγονικά πεπτίδια μόνον εφόσον αυτά παρουσιάζονται στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων μέσω του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας Ι και ΙΙ (MHC I, MHCII). Οι κυριότεροι υποπληθυσμοί των Τ λεμφοκυττάρων είναι τα Τ βοηθητικά (T-helper,Th), τα 67

68 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Τ κυτταροτοξικά (T-cytotoxic, Tc) και τα Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα (T- regulatory cells, Tregs). Όλες οι λειτουργίες των Τ λεμφοκυττάρων επιτελούνται μέσω των ειδικών μορίων-υποδοχέων που φέρουν στην επιφάνειά τους οι οποίοι είναι οι εξής: 1. Ο υποδοχέας TCR με τον οποίο γίνεται η αναγνώριση του αντιγόνου κατά την παρουσίασή του από το αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο μαζί με τα μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι και ΙΙ. 2. Οι υποδοχείς CD28 και CTLA-4 οι οποίοι συνδέονται με τα μόρια συνδιέγερσης Β7.1 και Β7.2 στη επιφάνεια του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου. 3. Οι υποδοχείς LFA-1, LFA-2 και L-σελεκτίνη που συνδέονται με αντίστοιχα μόρια προσκόλλησης. 4. Οι υποδοχείς CD4, CD8 και CD25, με βάση την έκφραση των οποίων οι πληθυσμοί των Τ λεμφοκυττάρων διακρίνονται σε βοηθητικά κυτταροτοξικά και ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα. Τα Τ βοηθητικά κύτταρα ονομάζονται CD4+ CD8- λεμφοκύτταρα και βοηθούν τα Β λεμφοκύτταρα στην αναγνώριση του αντιγόνου και υποβοηθούν άλλους υποπληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων στην αναγνώριση και αντιδραση με το αντιγόνο. Τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, ανάλογα με τις κυτταροκίνες που παράγουν διαχωρίζονται σε βοηθητικά τύπου 1 και 2 (Th1, Th2). Τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα ονομάζονται CD8+ CD4- και είναι υπεύθυνα για την κυτταρόλυση των κυττάρων στόχων, ενώ παράλληλα είναι υπεύθυνα και για την καταστροφή και απομάκρυνση κυττάρων μολυσμένων από ιούς. Ομοίως με τα Τ βοηθητικά κύτταρα, και ανάλογα με τις κυτταροκίνες που συνθέτουν διαχωρίζονται σε κυτταροτοξικά τύπου 1 και 2 (Tc1, Tc2). Επίσης, στα CD8+ περιλαμβάνονται κύτταρα τα οποία καταστέλλουν την παραγωγή αντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα, καθώς και κυτταρικές ανοσοαπαντήσεις των Τ λεμφοκυττάρων. Κατά άλλους ερευνητές αυτά αποτελούν ξεχωριστή κατηγορία λεμφοκυττάρων τα οποία ονομάζουν Τ κατασταλτικά λεμφοκύτταρα (T-suppressor, Ts). Η λειτουργία τους επάγεται από την παρουσία ιντερλευκίνης 2 η οποία παράγεται από ενεργοποιηθέντα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα ονομάζονται CD25-CD4+ λεμφοκύτταρα και α- ποτελούν ένα μικρό ποσοστό του συνολικού αριθμού των λεμφοκυττάρων. Είναι 68

69 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ υπεύθυνα για την λειτουργία του μηχανισμού ανοσοανοχής έναντι δικών μας α- ντιγόνων και η διαφοροποίησή τους σε ρυθμιστικά λεμφοκτταρα γίνεται στο θύμο αδένα. Εκεί, με την επίδραση του αυξητικού παράγοντα TGF-β οι δείκτες ε- πιφανείας μετατρέπονται από CD25-CD4+ σε CD25+Foxp3+ και τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα αποκτούν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες. Διαθέτουν παρόμοιους υποδοχείς με τα άλλα Τ λεμφοκύτταρα, ενώ μετά τη διέγερσή τους από την παρουσία ιντερλευκίνης 10 εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες ιντερλευκίνης 10 (IL- 10) και TGF-β, προσδίδοντας στα λεμφοκύτταρα αυτά ισχυρή ανοσοκατασταλτική δράση στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 1 και 2, καθώς και στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Ουσιαστικά πρόκειται για CD4+ κύτταρα, τα οποία μετατρέπονται σε ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα με την επαγωγή της IL-10. Άλλοι υποπληθυσμοί Τ λεμφοκυττάρων είναι τα Τ λεμφοκύτταρα επιβραδυνόμενης υπερευαισθησιας και τα Τ βοηθητικά συνεργαζόμενα με τα Β λεμφοκύτταρα. 47 Πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα Η αρχική διαφοροποίηση των αρχέγονων λεμφοειδών κυττάρων σε ώριμα λεμφοκύτταρα γίνεται στα πρωτογενή λεμφικά όργανα που είναι ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών και για τα έμβρυα το ήπαρ. Τα Τ λεμφοκύτταρα α- ναπτύσσονται στο θύμο αδένα και τα Β λεμφοκύτταρα στο μυελό των οστών και στο εμβρυικό ήπαρ. Εκεί αποκτούν το ειδικό ανοσολογικό τους προφίλ, που επιτρέπει στα ώριμα πλέον λεμφοκύτταρα να αντιδρούν έναντι των διαφόρων αντιγονικών ερεθισμών. Ο θύμος αδένας είναι ένα λεμφοεπιθηλιακό όργανο που βρίσκεται στο πρόσθιο μεσοθωράκιο και αποτελείται από δύο λοβούς κάθε ένας από τους ο- ποίους εμφανίζει μία εξωτερική φλοιώδη και μία εσωτερική μυελώδη μοίρα. Τα αρχέγονα λεμφοειδή κύτταρα από τον μυελό των οστών μεταναστεύουν στη φλοιώδη μοίρα, όπου μεταμορφώνονται σε θυμοκύτταρα. Στη συνέχεια μετακινούνται προς το εσωτερικό του αδένα όπου με την επίδραση των ορμονών θυμουλίνης, θυμοσίνης, θυμοποιητίνης και του θυμικού χυμικού παράγοντα γ2, διαφοροποιούνται σε ώριμα Τ λεμφοκύτταρα. Σχηματίζεται έτσι ο επιφανειακός 69

70 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ αντιγονικός υποδοχέας του Τ λεμφοκυττάρου, καθώς και οι άλλοι δείκτες που προσδιορίζουν τους υποπληθυσμούς των Τ λεμφοκυττάρων όπως οι CD4 και CD8. Στη συνέχεια τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα εγκαταλείπουν τον θύμο αδένα και μεταφέρονται με την κυκλοφορία στα δευτερογενή λεμφικά όργανα στις λεγόμενες θυμοεξαρτώμενες περιοχές. Η ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα επιτελείται κατά την εμβρυική ζωή και λίγο μετά την γέννηση. Από τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στον θύμο αδένα μόνο ένα ποσοστό 10-15% τον εγκαταλείπουν για την κυκλοφορία και παραμένουν λειτουργικά. Ο μυελός των οστών αποτελεί το βασικό αιμοποιητικό όργανο, αλλά και τον τόπο διαφοροποίησης των αρχέγονων λεμφοειδών κυττάρων σε Β λεμφοκύτταρα. Τα ώριμα Β λεμφοκύτταρα αφού έχουν σχηματίσει τους ειδικούς αντιγονικούς υποδοχείς επιφανείας,εγκαταλείπουν τον μυελό των οστών και μεταναστεύουν στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, έτοιμα να κινητοποιήσουν τους μηχανισμούς της χυμικής ανοσίας σε ενδεχόμενο αντιγονικό ερεθισμό. Τα δευτερογενή λεμφικά όργανα είναι ο σπλήνας, οι λεμφαδένες και τα λεμφοειδή αθροίσματα όπως είναι ο λεμφικός ιστός σχετιζόμενος με το βλεννογόνο (MALT-mucosa associated lymphoid tissue). Ο σπλήνας περιβάλλεται από ινώδη κάψα στο εσωτερικό της οποίας σχηματίζονται ινώδη έλυτρα που περιβάλλουν την σπληνική αρτηρία και φλέβα, καθώς και τους κλάδους τους. Δημιουργείται έτσι το εριστικό υπόστρωμα του σπλήνα, στα διάκενα του οποίου σχηματίζεται ο ερυθρός και λευκός πολφός. Στον ερυθρό πολφό καταστρέφονται τα γερασμένα ερυθρά αιμοσφαίρια ενώ ταυτόχρονα συνυπάρχουν μακροφάγα, ερυθρά αιμοσφαίρια και λεμφοκύτταρα. Στο λευκό πολφό γύρω από τους κλάδους της σπληνικής αρτηρίας βρίσκονται αθροίσματα Τ λεμφοκυττάρων, ενώ εξωτερικά της περιοχής αυτής σχηματίζονται πρωτογενή και δευτερογενή λεμφοζίδια που περιέχουν Β λεμφοκύτταρα και βλαστικά κέντρα. Οι λεμφαδένες έχουν σχήμα ατρακτοειδές ή υποστρόγγυλο και αποτελούν τα σημεία διήθησης της λέμφου προερχόμενη από τα λεμφαγγεία. Η λέμφος εισέρχεται στον λεμφαδένα με τα προσαγωγά λεμφαγγεία στην κυρτή επι- 70

71 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ φάνεια του λεμφαδένα και εξέρχεται με τα απαγωγά λεμφαγγεία που βρίσκονται στην πύλη αυτού. Οι λεμφαδένες αποτελούνται από λεμφαδενοειδή ιστό και περιβάλλονται από ινώδη κάψα η οποία επεκτείνεται στο εσωτερικό του παρεγχύματος σχηματίζοντας ινώδεις δοκίδες που αναστομώνονται μεταξύ τους. Κάθε λεμφαδένας αποτελείται στην περιφέρεια από την φλοιώδη και στο κέντρο του από την μυελώδη μοίρα. Μεταξύ των δύο βρίσκεται η παραφλοιώδης ή Τ κυτταροτοξική ζώνη η οποία αποτελείται από πυκνό λεμφαδενοειδή ιστό. Στη ζώνη αυτή ανεβρίσκονται κυρίως Τ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα, μέσω των οποίων επιτελείται η τελική φάση της ειδικής ανοσιακής απάντησης με στόχο την καταστροφή του αντιγόνου «εισβολέα». Στη ζώνη αυτή ε- πίσης, καταλήγουν τα τριχοειδή αρτηρίδια και φλεβίδια, προερχόμενα από τα αγγεία της πύλης του λεμφαδένα. Τα φλεβίδια αυτά ονομάζονται ενδοθηλιακά φλεβίδια υψηλής συγκέντρωσης (high endothelial venules-hevs), καθώς επενδύονται εσωτερικά από πολυάριθμα κυβοειδή και μεγάλα σε μέγεθος ενδοθηλιακά κύτταρα. 48 Η περιοχή αυτή ονομάζεται και θυμοεξαρτώμενη γιατί περιέχει λεμφοκύτταρα προερχόμενα από τον θύμο αδένα. Η φλοιώδης μοίρα του λεμφαδένα αποτελείται από τους λεμφικούς κόμβους ή λεμφοζίδια. Πρόκειται για σφαιρικά μορφώματα που περιέχουν άφθονα ελεύθερα κυρίως Β λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα σε διάφορα στάδια κυτταρικής διαφοροποίησης, καθώς και δενδριτικά κύτταρα και αντιγονοπαρουσιαστικά μακροφάγα. Ανάλογα με το λειτουργικό στάδιο που βρίσκεται ο λεμφαδένας, τα λεμφοζίδια διαθέτουν ή όχι βλαστικό κέντρο όπου γίνεται η παραγωγή νέων λεμφοκυττάρων. Ακριβώς κάτω από την ινώδη κάψα του λεμφαγγείου, μεταξύ αυτής και της φλοιώδους μοίρας βρίσκεται ο επιχείλιος λεμφόκολπος ο οποίος επεκτείνεται στο εσωτερικό του λεμφαδένα σχηματίζοντας τους διάμεσους λεμφόκολπους. Το δίκτυο αυτό των σχισμοειδών χώρων των λεμφόκολπων αποτελείται από πλήθος δικτυωτών ινών και δικτυωτών κυττάρων και επενδύεται εσωτερικά από ενδοθηλιακά κύτταρα. Μέσα από τους λεμφόκολπους μετακινείται η λέμφος που διέρχεται από τα προσαγωγά προς τα απαγωγά λεμφαγγεία. 71

72 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Η μυελώδης ουσία εκτός από τις δοκίδες της ινώδους κάψας περιέχει μυελώδεις δοκίδες που αναστομώνονται μεταξύ τους δημιουργώντας τους μυελώδεις λεμφόκολπους. Οι μυελώδεις δοκίδες αποτελούνται από λεμφαδενοειδή ι- στό που περιέχει κυρίως Β λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα προερχόμενα από την φλοιώδη μοίρα, ενώ μακροφάγα ιστών βρίσκονται διασπαρμένα σε ο- λόκληρο το παρέγχυμα του λεμφαδένα παίζοντας τον ρόλο είτε του φαγοκυττάρου είτε του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου. Μέσα στις δοκίδες αυτές γίνεται η παραγωγή των αντισωμάτων τα οποία απελευθερώνονται στη λεμφική κυκλοφορία των μυελωδών λεμφόκολπων και από εκεί στο δίκτυο των διάμεσων λεμφόκολπων με τελικό προοροσμό τα απαγωγά λεμφαγγεία. Ο ιστός του λεμφαδένα αποτελείται από πλέγμα δικτυοκυττάρων μεταξύ των οποίων υπάρχουν πολλά Β και Τ λεμφοκύτταρα. Β λεμφοκύτταρα βρίσκονται κυρίως στο φλοιό όπου συναθροίζονται σε πρωτογενή και δευτερογενή λεμφοζίδια όπως και στον σπλήνα. Εκεί κατά την εξέλιξη της ΕΑΑ τα Β λεμφοκύτταρα μετακινούνται από τα πρωτογενή στα δευτερογενή λεμφοζίδια, μέσα στα οποία σχηματίζονται βλαστικά κέντρα από ταχέως πολλαπλασιαζόμενα λεμφοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα και αντιγονοπαρουσιαστικά μακροφάγα. Εικόνα 2. Η ανατομική δομή του λεμφαδένα 72

73 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Παρόμοια δομή και λειτουργία παρουσιάζει και ο λεμφικός ιστός σχετιζόμενος με βλεννογόνο (MALT). Βρίσκεται υποβλεννογόνια τόσο στο γαστρεντερικό ως αμυγδαλές, πλάκες Payer ή σκωληκοειδής απόφυση, όσο και στο αναπνευστικό ως λεμφικός ιστός των βρόγχων. Όπως και στα άλλα δευτερογενή λεμφικά όργανα σχηματίζονται λεμφοζίδια με βλαστικά κέντρα, μέσα στα ο- ποία τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνη Α (IgA) η ο- ποία εμποδίζει τον αποικισμό του βλεννογόνου από μικροοργανισμούς. β. Τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ cells) Η συμμετοχή των φυσικών κυτταροκτόνων στους μηχανισμούς της ΕΑΑ εξαρτάται από την λειτουργία των ειδικών ανασοσφαιρινικών υποδοχέων KIRs. Οι πολυμορφισμοί των υποδοχέων αυτών διαδραματίζουν αξιόλογο ρόλο στον έλεγχο ιδιαίτερα της 3 ης (εκτελεστικής) φάσης της ΕΑΑ συμβάλλοντας ουσιαστικά στην προστασία των υγιών κυττάρων από ενδεχόμενη επίθεση των ΝΚ αναβαθμίζοντας τη λειτουργική σημασία των HLA μορίων και προσδίδοντας σημαντικά χαρακτηριστικά στο ανοσογενετικό προφίλ κάθε ατόμου. Επίσης, άλλοι ειδικοί επαγωγικοί αντισωματοεξαρτώμενοι υποδοχείς, μέσω της σύνδεσης με το Fc τμήμα IgG αντισωμάτων, ρυθμίζουν την κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κυττάρων με τους μηχανισμούς της χυμικής ανοσίας. γ. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα Πρόκειται για κύτταρα των οποίων ο ρόλος είναι η παρουσίαση των αντιγόνων στα Τ λεμφοκύτταρα, με κυριότερους εκπρόσωπους τα δενδριτικά κύτταρα και τα μακροφάγα. Λιγότερο εξειδικευμένα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα θεωρούνται τα Β λεμφοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά, τα επιθηλιακά και τα κύτταρα Kupfer. Τα μακροφάγα αν και δεν διαθέτουν αντιγονοειδικούς υποδοχείς όπως συμβαίνει με τα λεμφοκύτταρα, έχουν την ικανότητα να προσλαμβάνουν αντιγόνα, να τα επεξεργάζονται μετατρέποντας τα σε ανοσογόνο μορφή και να τα παρουσιάζουν μέσω ειδικών υποδοχέων στα Τ λεμφοκύτταρα. Η επεξεργασία αυτή η οποία 73

74 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ συμβαίνει στα αρχικά στάδια της ΕΑΑ έχει ως αποτέλεσμα την αποκάλυψη αντιγονικών επίτοπων οι οποίοι κάτω από άλλες συνθήκες δεν θα ήταν προσιτοί στα Τ λεμφοκύτταρα. Τα μακροφάγα διαδραματίζουν αξιόλογο ρόλο σε όλες τις φάσεις της ΕΑΑ καθότι δρουν ως ΑΠΚ τόσο για τα CD4+ όσο και για τα CD8+ λεμφοκύτταρα. Εκκρίνοντας κυτταροκίνες αλλά και αυξητικούς παράγοντες επάγουν την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων ενώ παράλληλα και τα ίδια αποτελούν δραστικά κύτταρα της κυτταρικού τύπου ανοσοαπάντησης. Τα δενδριτικά κύτταρα. Τα δενδριτικά κύτταρα εκπροσωπούν μια ετερογενή οικογένεια κυττάρων που δρουν ως «φρουροί» του ανοσοποιητικού συστήματος. Εκφράζουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς με τους οποίους αναγνωρίζουν και δεσμεύουν το αντιγόνο με φαγοκύττωση, πινοκύττωση ή ενδοκυττάρωση. Με την είσοδο κάποιου αντιγόνου στο δενδριτικό κύτταρο, υφίσταται ενζυματική αποδόμηση προς πεπτίδια στα λυσοσωμάτια και ενδοσωμάτια του ΑΠΚ. Ταυτόχρονα, μόρια του MHC τάξης Ι και ΙΙ παράγονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και συνδέονται με το αντιγονικό πεπτίδιο στη σχισμή (cleft) του ΑΠΚ. To όλο σύμπλεγμα μεταφέρεται στην επιφάνεια του ΑΠΚ, όπου αναγνωρίζεται από τον ειδικό υποδοχέα TCR του Τ βοηθητικού ή κυτταροτοξικού λεμφοκυττάρου. Η τελική ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου γίνεται με τη συνδιέγερση και άλλων βοηθητικών μορίων στην επιφάνεια των ΑΠΚ. Ο κύκλος ζωής του δενδριτικού κυττάρου Τα άωρα δενδριτικά κύτταρα μεταναστεύουν από τον μυελό των οστών μέσω της κυκλοφορίας του αίματος προς όλους σχεδόν τους ιστούς του οργανισμού. Τα κύτταρα Langerhans (LC) της επιδερμίδας είναι το περισσότερο μελετημένο παράδειγμα άωρων δενδριτικών κυττάρων, τα οποία εμφανίζουν ισχυρή αντιγονοδεσμευτική και ασθενή αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα. Μετά την «εισβολή» ενός ξένου αντιγόνου το άωρο δενδριτικό κύτταρο δεσμεύει το συγκεκριμένο αντιγόνο και γρήγορα εγκαταλείπει την επιδερμίδα. Στη συνέχεια μετακινείται μέσω του δέρματος, διαπερνά το ενδοθήλιο των λεμ- 74

75 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ φικών τριχοειδών και καταληγει στους επιχώριους λεμφαδένες. Κατά την διάρκεια αυτή της μετακίνησης, το άωρο δενδριτικό κύτταρο υφίσταται φαινοτυπική και λειτουργική ωρίμανση. Αφού φτάσει στη πύλη του λεμφαδένα μέσω του προσαγωγού λεμφαγγείου, μετακινείται προς την παραφλοιώδη, θυμοεξαρτώμενη μοίρα, εκεί όπου συναντά και την μεγαλύτερη συγκέντρωση Τ λεμφοκυττάρων τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί και μετακινηθεί από την κυκλοφορία του αίματος. Τα ώριμα πλέον δενδριτικά κύτταρα συμπεριφέρονται ως αντιγονοπαρουσιαστικά, παρουσιάζοντας το αντιγόνο στους πληθυσμους των Τ λεμφοκυττάρων. Αυτή θεωρείται και η τελική αποστολή των δενδριτικών κυττάρων, μετά από την οποία, παραμένουν στην περιοχή των Τ λεμφοκυττάρων και υφίστανται κυτταρικό θάνατο και απόπτωση. Αυτή η πολύπλοκη διαδικασία μετανάστευσης των δενδριτικών κυττάρων επάγει την παρουσίαση των αντιγόνων που δεσμεύονται στη περιφέρεια στις Τ λεμφοκυτταρικές περιοχές των λεμφαδένων καθώς και την ενεργοποίηση και την κλωνική διαίρεση των Τ λεμφοκυττάρων. Τα στάδια ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων Όπως φαίνεται και από τον κύκλο ζωής τους, τα δενδριτικά κύτταρα αποκτούν τις διαφορετικές λειτουργίες τους κατά τη διάρκεια της σταδιακής τους ω- ρίμανσης, η οποία μπορεί να διαχωριστεί αδρά σε τέσσερις φάσεις. Η πρώτη φάση περιλαμβάνει ένα σύνολο άωρων μορφών δενδριτικών κυττάρων που ανευρίσκονται είτε στο μυελό των οστών είτε στην κυκλοφορία του αίματος που έχουν την ικανότητα να εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες προφλεγμονοδών και αντιϊκών κυτοκινών. Η δεύτερη φάση αντιπροσωπεύει το στάδιο άωρων δενδριτικών κυττάρων που βρίσκονται στην περιφέρεια και διαθέτουν έντονες φαγοκυτταρικές ι- διότητες όπως είναι τα κύτταρα Langerhans (LC) τα οποία εμφανίζουν ισχυρή αντιγονοδεσμευτική ικανότητα. Άλλες κατηγορίες άωρων δενδριτικών κυττάρων αποτελούν τα ιστικά δενδριτικά κύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα προερχόμενα από μονοκύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα προερχόμενα από τα πλασματοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα των βλαστικών κέντρων. 75

76 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Η τρίτη φάση αντιπροσωπεύει το στάδιο όπου τα δενδριτικά κύτταρα καθώς ωριμάζουν χάνουν την φαγοκυτταρική και ενδοκυττωσική τους ιδιότητα και κατά συνέπεια την αντιγονοδεσμευτική τους ικανότητα. Αντιδρώντας σε μεσολαβητές φλεγμονής όπως είναι η IL-1 και ο TNF-α χάνουν την έκφρασή τους στους υποδοχείς μαννόζης και λαγκερίνης που είναι υπεύθυνοι για την ανάπτυξη της αντιγονοδεσμευτικής τους ικανότητας. Αντίθετα, τα ώριμα δενδριτικά κύτταρα αποκτούν ιδιότητες αντιγονοπαρουσίασης στα CD4+ T λεμφοκύτταρα, με ταυτόχρονη αύξηση της έκφρασης συνδιεγερτικών μορίων όπως τα CD80, CD86 και μείωση της έκφρασης άλλων μορίων όπως το CD68 που εκφράζει κυρίως την συγκέντρωση των μακροφάγων των ιστών. Τέλος, κατά την φάση αυτή μόρια του συστήματος ιστοσυμβατότητας MHC II μετακινούνται από τα λυσοσωμάτια προς την κυτταρική μεμβράνη. Κατά την τέταρτη φάση ωρίμανσης, τα δενδριτικά κύτταρα αποκτούν τελικά αντιγονοπαρουσιαστικές ιδιότητες στα CD8+ κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα. Διαφορετικοί πληθυσμοί άωρων δενδριτικών κυττάρων έλκονται από διαφορετικές χημειοκίνες Η μεταναστευτική ικανότητα των δενδριτικών κυττάρων σε όλες τις φάσεις ωρίμανσης ελέγχεται από χημειοτακτικούς παράγοντες που ονομάζονται χημειοκίνες. Η χημειοταξία των δενδριτικών κυττάρων, όπως και των υπολοίπων λευκοκυττάρων, από το ενδοθήλιο των αγγείων έως τους ιστούς αποτελεί μία διαδικασία διαδοχικών σταδίων που περιλαμβάνει αρχικά την μετακίνησή τους με τη βοήθεια των σελεκτινών, την έλξη τους στη συνέχεια από τις χημειοκίνες και την προσκόλλησή τους στο τελικό σημείο-στόχο με τη βοήθεια των ιντεγκρινών. Ταυτόχρονα, τα δενδριτικά κύτταρα υποβοηθούμενα από το δίκτυο ινοβλαστών του στρώματος, παράγουν συγκεκριμένες μεταλλοπρωτεϊνάσες, κυρίως MMP-2 και MMP-9 διασπούν τη βασική μεμβράνη, επάγοντας με αυτό τον τρόπο την χημειοταξία τους. Όλη αυτή η διαδικασία συγκέντρωσης των δενδριτικών κυττάρων αντιπροσωπεύει κατά κύριο λόγο τη χημειοταξία των άωρων κυκλοφορούντων κυτ- 76

77 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ τάρων μέσω των χημειοκινών μετά την εισβολή ενός αντιγόνου και την έναρξη της ειδικής ανοσιακής απάντησης (ΕΑΑ). In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι τα άωρα δενδριτικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών χημειοκινών όπως είναι οι MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, RANTES, MDC, TECK, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 και SDF-1. Η δράση των χημειοκινών αυτών ενισχύεται μέσω της επαγωγικής υπερέκφρασης των υποδοχέων τους όπως είναι οι CCR1, CCR2, CCR5, CCR6, CX3C και CXCR4. Φαίνεται λοιπόν πως ένα πλήθος χημειοκινών και των υποδοχέων τους ρυθμίζει τη μετανάστευση των άωρων δενδριτικών κυττάρων. Παρόλα αυτά, η ταυτοποίηση του σταδίου ωρίμανσης και της προέλευσης των δενδριτικών κυττάρων, καθώς και των σημάτων ελέγχου της έκκρισής τους in vivo, αποτελούν ακόμη πεδία μελέτης. Ένας καλά μελετημένος υποπληθυσμός άωρων δενδριτικών κυττάρων αποτελούν τα κύτταρα Langerhans (LC) τα οποία κατανέμονται στις επιθηλιακές επιφάνειες. Κατά τη διάρκεια εισβολής λοιμογόνων αντιγόνων, φλεγμονώδεις ενεργοποιητές δρουν στα LC τα οποία πριν την μετανάστευσή τους εκκρίνουν κυτοκίνες όπως IL-1 που ενεργοποιεί τα επιθηλιακά κύτταρα. Στη συνέχεια τα αντιγόνα αυτά παρουσιάζονται τοπικά από τα LC στα Τ λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν κυτοκίνες όπως IFN-γ, IL-17 και CD40L. Όλοι αυτοί οι παράγοντες συνεργαζόμενοι ενεργοποιούν τα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία με τη σειρά τους εκκρίνουν χημειοκίνες, ιδιαίτερα την MIP-3α. Κατά αυτόν τον τρόπο, κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, κυτταρικά σήματα επάγουν τη χημειοταξία των LC μέσω της MIP-3α χημειοκίνης και τελικά την επαναπληθυσμοποίηση του επιθηλίου από άωρα LC και CCR6+ ικανά Τ λεμφοκύτταρα με επιθηλιακό τροπισμό. Κατά παρόμοιο τρόπο μέσω της χημειοκίνης MIP-3α έλκονται χημειοτακτικά άωρες μορφές δενδριτικών κυττάρων στο επιθήλιο των πλακών Payer του εντέρου καθώς και στις κρύπτες των αμυγδαλών που αποτελούν συνήθεις πύλες εισόδου παθογόνων αντιγόνων στον οργανισμό

78 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χημειοταξία των ώριμων δενδριτικών κυττάρων προς τους επιχώριους λεμφαδένες στα πλαίσια της ΕΑΑ Κατά την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων και με την επίδραση φεγμονωδών παραγόντων όπως IL-1, TNF, LPS, CpG, DNA,IFN-γ, CD40L, αυτά χάνουν την αντιγονοδεσμευτική τους ικανότητα και αποκτούν αντιγονοπαρουσιαστικές ιδιότητες. Ταυτόχρονα, χάνεται η αντιδραστικότητά τους έναντι των χημειοκινών MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, RANTES, MDC, TECK, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 και SDF-1, κυρίως μέσω της μείωσης της έκφρασης των υποδοχέων τους στην επιφάνειά τους. Τα ώριμα πλέον δενδριτικά κύτταρα εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα CCR7 ο οποίος δεν εκφράζεται στα άωρα κύτταρα. Οι χημειοκίνες που συνδέονται με τον υποδοχέα αυτόν είναι η SLC/6Ckine ή CCL-21 και η ELC/MIP-3β ή CCL-19 που σε αντίθεση με άλλες CC- φλεγμονώδεις χημειοκίνες δεν ασκούν καμία χημειοτακτική δράση στα άωρα δενδριτικά κύτταρα. Κατά αυτόν τον τρόπο, μετά την έναρξη της φλεγμονώδους διέγερσης και της ΕΑΑ, τα δενδριτικά κύτταρα που ωριμάζουν, εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα CCR7. Ταυτόχρονα, η χημειοκίνες ELC και SLC που υπερεκφράζονται κατά την ΕΑΑ τόσο στα ώριμα δενδριτικά κύτταρα όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών λεμφαγγείων ενεργοποιούν την χημειοταξία των ώριμων δενδριτικών κυττάρων αλλά και των Τ λεμφοκυττάρων προς την λεμφική κυκλοφορία. Φαίνεται δηλαδή, ότι οι χημειοκίνες ELC και SLC δρουν τόσο με αυτοκρινείς, όσο και με παρακρινείς μηχανισμούς προκειμένου να κινητοποιήσουν τα κύτταρα της ΕΑΑ. Τα ώριμα πλέον δενδριτικά κύτταρα καθώς εισέρχονται στους επιχώριους λεμφαδένες οδηγούνται προς τη παραφλοιώδη περιοχή αντιδρώντας στην έκκριση των χημειοκινών ELC και SLC κυρίως από ενεργοποιημένα δενδριτικά κύτταρα της Τ κυτταροτοξικής ζώνης. Ταυτόχρονα τα νέα δενδριτικά κύτταρα που φτάνουν στην περιοχή ενισχύουν την χημειοτακτική δράση των χημειοκινών με τελικό αποτέλεσμα την ολοκλήρωση της αντιγονοπαρουσίασης και της λύσης του αντιγονικού εισβολέα με την βοήθεια των CD8+ λεμφοκυττάρων. Μετά την αντίδραση των ώριμων δενδριτικών κυττάρων με τα Τ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα και τη επιτέλεση της διαδικασίας της αντιγονοπαρουσίασης, τα δενδριτικά κύτταρα παράγουν ένα σύνολο άλλων χημειοκινών όπως εί- 78

79 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ ναι οι DC-CK-1, MDC, TARK, RANTES που διευκολύνουν την αντίδραση μεταξύ των CD4+, CD8+ και Β λεμφοκυττάρων. Ένα υποσύνολο Τ μνημονικών λεμφοκυττάρων συνεχίζει να εκφράζει CCR7 και L-σελεκτίνη παραμένοντας σε ετοιμότητα να ενεργοποιήσει έναν ακόμη κύκλο δευτερογενούς φλεγμονώδους αντίδρασης. 50 αγγείο μυελός οστού προγονικά κύτταρα ιστός 1. ΕΙΣΟΔΟΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ 3. ΠΡΟΣΕΛΚΥΣΗ DC ΚΑΙ ΔΕΣΜΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ άωρα DC 2. ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ MIP-3α 4. ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ DC ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΩΝ (ρόλος για την SLC;) επιχώριος λεμφαδένας 5. ΠΑΡΑΓΩΓΗ MIP-3β ΚΑΙ SLC (6Ckine) ΣΤΗΝ Τ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΗ ΖΩΝΗ ΟΠΟΥ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΝΟΝΤΑΙ ΩΡΙΜΑ DC ώριμα DC Εικόνα 3. Η χημειοταξία των δενδριτικών κυττάρων προς τους επιχώριους λεμφαδένες. Η διαδοχική δράση των χημειοκινών. Διαφοροποιημένη αναπαραγωγή από Caux C et al. Springer Semin Immunopathol. 2000;22(4):

80 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΙ. Φάσεις της ΕΑΑ Ο κύκλος ζωής ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων αντιπροσωπεύει σε μεγάλο βαθμό και τις φάσεις εξέλιξης της ΕΑΑ. Κατά την αρχική - επαγωγική φάση γίνεται η παραλαβή, επεξεργασία και παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑΠΚ) στα Τ λεμφοκύτταρα με τη βοήθεια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας. Η επεξεργασία του αντιγόνου γίνεται είτε με τη βοήθεια των μορίων MHC Ιης τάξης, οπότε η παρουσίαση εκτελείται απευθείας στα CD8+ λεμφοκύτταρα, είτε με τη βοήθεια των μορίων MHC IIης τάξης, οπότε η παρουσίαση εκτελείται πρώτα στα CD4+ λεμφοκύτταρα και στη συνέχεια στα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα. Κατά την κεντρική φάση ή φάση πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης γίνεται πολλαπλασιασμός όλων των κυττάρων της ΕΑΑ και διαφοροποίησή τους από παρθένα (naïve cells) που βρίσκονται σε φάση κυτταρικής η- ρεμίας G0, σε εκτελεστικά κύτταρα (effector cells). Η έναρξη της φάσης αυτής επάγεται από την έκκριση IL-I από τα ΑΠΚ η οποία διαφοροποιεί κυρίως τα CD4+ λεμφοκύτταρα τα οποία στη συνέχεια ενεργοποιούνται αυτοκρινώς με τη βοήθεια της IL-2 της IFN-γ και του TNF προς Τ βοηθητικά τύπου Ι (ThI). Η διέγερση των Th2 είναι περιορισμένη, εκτελείται στα αρχικά στάδια της ΕΑΑ και επάγεται με τη βοήθεια της IL-4, IL-5 και της IL-10 που παράγονται κυρίως από τα σιτευτικά κύτταρα. Η ενεργοποίηση των ThI κυττάρων δραστηριοποιεί επαγωγικά στη συνέχεια κυρίως τα CD8+ λεμφοκύτταρα, αλλά και τα φυσικά κυτταροκτόνα και τα μακροφάγα, ενώ η περιορισμένη ενεργοποίηση των Th2 διεγείρει τα Β- λεμφοκύτταρα στρέφοντας την παραγωγή αντισωμάτων προς την αυξημένη σύνθεση κυρίως IgE, IgM και IgG4. Κατά την δραστική ή εκτελεστική φάση γίνεται η καταστροφή του εισβολέα ή του ξένου κυττάρου με κυρίως με την δράση των ενεργοποιημένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CD8+) και λιγότερο με την βοήθεια των φυσικών κυτταροκτόνων, των μακροφάγων και των ειδικών αντισωμάτων που παράγονται από τα Β-λεμφοκύτταρα. 80

81 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Τα CD8+ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν το αντιγονικό πεπτίδιο σε συνδυασμό με τα μόρια MHC Ιης τάξης στην επιφάνεια του κυττάρου στόχου. Βασικός μηχανισμός κυτταρόλυσης από τα CD8+ λεμφοκύτταρα είναι η έκκριση του περιεχομένου των κυτταροπλασματικών κοκκίων στο σημείο επαφής με το κύτταρο στόχο αλλά και η ενεργοποίηση ενζύμων τα οποία προκαλούν κατάτμηση του DNA του πυρήνα του κυττάρου στόχου (απόπτωση)

82

83 7. ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΕΣ I. Εισαγωγή Από τα τέλη του 19 ου αιώνα, η μετακίνηση λευκοκυττάρων έχει αναγνωριστεί ως κυρίαρχο πρώιμο γεγονός στους μηχανισμούς ανοσιακής απάντησης του οργανισμού. Αρκετές ομάδες διαφορετικών μορίων και πεπτιδίων έχουν α- ναγνωριστεί ως παράγοντες προσέλκυσης λευκοκυττάρων. Ως τέτοια, θεωρούνται τα λευκοτριένια και κυτοκίνες όπως ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF), και ο παράγοντας ενεργοποίησης των μονοκυττάρων (MCSF). Η σημαντικότερη ομάδα χημειοτακτικών κυτοκινών που έχει αναγνωριστεί ως σήμερα είναι οι χημειοκίνες. Στις αρχές της δεκαετίας του 70 οι χημειοκίνες αναγνωρίστηκαν ως χημειοτακτικές πρωτεΐνες των μονοκυττάρων (monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1). Θεωρήθηκε ότι ενεργοποιημένα μονοκύτταρα του αίματος εκφράζουν στην επιφάνειά τους χημειοκίνες υπεύθυνες για την χημειοταξία των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων. Η πρώτη χημειοτακτική κυτοκίνη που θεωρήθηκε πρόδρομος των χημειοκινών, ταυτοποιήθηκε το 1977 (Walz και οι συνεργάτες από pdf) και ονομάστηκε παράγοντας 4 των αιμοπεταλίων (Platelet Factor 4, PF4). Πρόκειται για ένα μόριο που εκφράζεται στα αιμοπετάλια προσδίδοντας αντιπηκτικές και αγγειοστατικές ιδιότητες. Η αναγνώριση αργότερα της ιντερλευκίνης-8 (IL 8), συνέβαλε καθοριστικά στην κατανόηση της δράσης των χημειοτακτικών κυτοκινών, καθώς βρέθηκε να προκαλεί εκλεκτική χημειοταξία σε εξειδικευμένο τύπο λευκοκυττάρων, τα ουδετερόφιλα. Το ενδιαφέρον για το συγκεκριμένο πεδίο αυξήθηκε μετά την ανακάλυψη των παραγόντων CCL2, CCL5 και CCL11, οι οποίοι εμφάνιζαν χημειοτακτική δράση επί των μονοκυττάρων, των Τ-κυττάρων και των ηωσινοφίλων αντίστοιχα. Την αρχική διχογνωμία ως προς την ονοματολογία των κυτοκινών αυτών αποκατέστησαν τα αποτελέσματα του 3 ου Παγκόσμιου Συμπόσιου των Χημειο- 83

84 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ τακτικών Κυτταροκινών στο Baden το 1992, όπου προτάθηκε ένας νέος σύντομος όρος για την περιγραφή των μορίων αυτών που ήταν χημειοκίνες. Τελικά, το 2000 η Παγκόσμια Ένωση Φαρμακολογίας (NC-IUPHAR) καθόρισε ένα ολοκληρωμένο σύστημα ονοματολογίας των χημειοκινών και των υποδοχέων τους, ανάλογα με την παρουσία μιας συντηρημένης αλληλουχίας στο Ν τελικό άκρο του μορίου. 52 Έως σήμερα αναγνωρίστηκαν περί τις 50 χημειοκίνες (από φυλλάδιο χημειοκινών) με λειτουργίες όπως είναι η χημειοταξία των μακροφάγων, η αγγειογένεση και η συμμετοχή τους στις νεοπλασματικές νόσους στις διαδικασίες της καρκινογένεσης, της επέκτασης του όγκου και της μετάσταση. Άλλες λιγότερο γνωστές λειτουργίες των χημειοκινών είναι η επαγωγική δράση παραγωγής κολλαγόνου και η ενεργοποίηση και ο πολλαπλασιασμός των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. II. Χημική δομή και κατηγορίες χημειοκινών Οι χημειοκίνες απαρτίζουν μία ομάδα μικρών βασικών πρωτεϊνών που αποτελούνται από αμινοξέα. Πρόκειται για μόρια μικρού συνήθως ΜΒ (8-14kDa), των οποίων η χημική δομή συνίσταται από ένα κεντρικό μόριο με τρία β-πτυχωτά φύλλα το οποίο συνδέεται μέσω κυστεϊνικού δεσμού με ένα Ν- τελικό βρόγχο και μία C-τελική α-έλικα. Το σχήμα της χημικής δομής του μορίου της χημειοκίνης εμφανίζεται με τη μορφή κλειδιού. Το βασικό χαρακτηριστικό της δομής του μορίου των χημειοκινών είναι οι κυστεϊνικοί δεσμοί του. Ανάλογα με το είδος των δεσμών αυτών, οι χημειοκίνες χωρίζονται σε 4 διαφορετικές κατηγορίες-οικογένειες, τις CXC, τις CC, τις C και τις CX3C. 53 Από αυτές η οικογένεια των CXC χημειοκινών διαθέτει δύο κυστεϊνες προς το Ν-τελικό άκρο τους οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους από ένα τυχαίο αμινοξύ. Οι χημειοκίνες της οικογένειας CC διαθέτουν δύο κυστεϊνες προς το Ν- τελικό άκρο τους οι οποίες γειτνιάζουν μεταξύ τους. Στην οικογένεια των C χημειοκινών που ονομάζονται και λεμφοτακτίνες, περιλαμβάνονται αυτές που διαθέτουν μία κυστεϊνη στο Ν-τελικό τους άκρο, ενώ η οικογένεια των CX3C χημει- 84

85 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ κινών περιλαμβάνει διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που ονομάζονται φρακταλάνες και έχουν δομή παρόμοια με τις προηγούμενες, με τη διαφορά ότι στο Ν-τελικό άκρο φέρουν τρία διαφορετικά αμινοξέα μεταξύ των δύο πρώτων κυστεϊνικών. Εικόνα 4. Οικογένειες χημειοκινών - χημική δομή και χρωμοσωμική θέση. Διαφοροποιημένη αναπαραγωγή από Rollins, J.Blood.1997; 90: Εικόνα 5. Τριτοταγής δομή των χημειοκινών. Διαφοροποιημένη αναπαραγωγή από Rollins, J.Blood.1997; 90:

86 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πίνακας 4. Οι CC χημειοκίνες, οι εναλλακτικές ονομασίες τους και οι υποδοχείς τους. Διαφοροποιημένη αναπαραγωγή από Rosenkilde & Schwartz, J.APMIS.2004; 112: CC χημειοκίνες Εναλλακτική ονομασία Υποδοχέας CCL1 I-309 /SCYA1 (TCA-3) CCR8 CCL2 MCP-1/ SCYA2/MCAF/HC11 (JE) CCR2, CCR5, CCR10 CCL3 MIP-1α/SCYA 3/LD78α/SIS- α CCR1, CCR5 CCL4 MIP-1β/SCYA4/ACT-2/G-26/HC21/LAG-1/SIS-γ CCR5, CCR10 CCL5 RANTES/SCYA5/SIS-δ CCR1, CCR3, CCR5, CCR10 CCL7 MCP-3/SCYA7 CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCL8 MCP-2/SCYA8/HC14 (MARC) CCR2, CCR3, CCR5 CCR1 CCL11 Eotaxin/SCYA11 CCR3 CCL13 MCP-4/SCYA13/Ck β10/ncc-1 CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 CCL14 HCC-1/SCYA14/Ck β1/mcif/ncc-2/cc-1 CCR1 CCL15 MIP-1 δ/scya15/lkn-1/hcc-2/mip-5/ncc- CCR1, CCR3 3/CC-2 CCL16 HCC-4/SCYA16/Ck β12/lec/lcc-1/ncc- CCR1 4/ILINCK/LMC/Mtn-1 CCL17 TARC/ SCYA17 (ABCD-2) CCR4 CCL18 PARC/SCYA18/Ckβ7/DC-CK1/AMAC-1/MIP- unknown 4/DCtactin CCL19 MIP-3β/ SCYA19/ Ckβ11/ELC/Exodus-3 CCR7 CCL20 MIP-3α/ SCYA20/LARC/Exodus-1 CCR6 CCL21 6Ckine/SCYA21/ Ckβ9/SLC/Exodus-2 CCR7 CCL22 MDC/SCYA22 (ABCD-1) CCR4 CCL23 MPIF/SCYA23/ Ckβ8/ Ckβ8 1/MIP-3/MPIP-1 CCR1 CCL24 Eotaxin-2/SCYA24/ Ckβ6/MPIF-2 CCR3 CCL25 TECK/SCYA25/ Ckβ15 CCR9 CCL26 Eotaxin-3/SCYA26/MIP-4α/TSC-1/IMA CCR3 CCL27 CTACK/SCYA27/ESkine/Skinkine CCR3, CCR2, CCR10 CCL28 CCL28/SCYA28/MEC CCR10, CCR3 III. Λειτουργίες και ιδιότητες των χημειοκινών Όπως οι περισσότερες κυτοκίνες, έτσι και οι χημειοκίνες διαθέτουν μία πληθώρα λειτουργιών. Εκτός από την κύρια λειτουργία τους που είναι η ενεργοποίηση και χημειοταξία των φλεγμονωδών κυττάρων στην περιοχή της φλεγμονής, ρυθμίζουν την κυτταρική συγκολλητική ικανότητα, την αγγειογένεση, την εμβρυική ανάπτυξη, την αιμοποίηση, την ανοσολογική αντίδραση, καθώς και την ενεργοποίηση και είσοδο των λεμφοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων στη λεμφική κυκλοφορία και στους επιχώριους λεμφαδένες. Επιπλέον, οι χημειοκίνες εμπλέκονται και σε μία σειρά από παθοφυσιολογικές διεργασίες όπως είναι η αλλεργική αντίδραση, τα αυτοάνοσα νοσήματα, 86

87 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ η καρκινογένεση και η μετάσταση. Σημαντική είναι επίσης η συμμετοχή των χημειοκινών σε κάποιες ειδικές λοιμώξεις όπως είναι η λοίμωξη από τον ιό HIV-1 και από το Plasmodium vivax για τα οποία έχει βρεθεί τελευταία ότι χρησιμοποιούν τους υποδοχείς των χημειοκινών ως σημεία-στόχους κυτταρικής εισόδου στον οργανισμό. Ταυτόχρονα, αρκετά γονιδιακά προϊόντα των ιών φαίνεται πως προσομοιάζουν με τις χημειοκίνες και τους υποδοχείς τους, χρησιμοποιώντας τους στην εξέλιξη της ιογενούς λοίμωξης. (από βιβλίο χημειοκινών) Η εξειδίκευση της δραστικότητας των χημειοκινών σε κύτταρα-στόχους είναι αρκετά ετερογενής. Οι CXC χημειοκίνες (ή α-χημειοκίνες) είναι δραστικές έναντι των ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων, των λεμφοκυττάρων και λιγότερο των κυττάρων φυσικών φονέων (ΝΚ κυττάρων). Η οικογένεια των CXC χημειοκινών απαρτίζεται μέχρι στιγμής από 15 μέλη, εκ των οποίων τα δύο τελευταία (CXCL14 και CXCL16) ταυτοποιήθηκαν σχετικά πρόσφατα και είναι άγνωστης μέχρι στιγμής λειτουργίας. 54 Οι CXC χημειοκίνες μπορούν να διαχωριστούν σε δύο υποομάδες, με βάση την παρουσία ή μη μιας συντηρημένης αλληλουχίας τριών αμινοξέων στο N τελικό άκρο του μορίου τους, πριν τη θέση της πρώτης κυστεΐνης. Η αλληλουχία αυτή ονομάζεται ELR και αποτελείται κατά σειρά από τα αμινοξέα: Γλουταμινικό Οξύ (E), Λευκίνη (L) και Αργινίνη (R). Οι ELR(+) χημειοκίνες επάγουν την αγγειογένεση, ενώ οι ELR(-) χημειοκίνες έχουν αγγειοστατικές ιδιότητες. Η διατήρηση της ισορροπίας στην έκφραση των ELR(+) και ELR(-) χημειοκινών είναι σημαντική για την ορθή πορεία της αγγειογενετικής διαδικασίας. 55,56 Παράλληλα, όσον αφορά στη χημειοτακτική δραστηριότητα, παρατηρήθηκε ότι οι χημειοκίνες που φέρουν την τριπεπτιδική αλληλουχία ELR (κυριότερος εκπρόσωπος της ομάδας είναι η ιντερλευκίνη 8) δρουν αποκλειστικά επί ουδετεροφίλων, ενώ οι χημειοκίνες που στερούνται της συγκεκριμένης αλληλουχίας (με κυριότερο εκπρόσωπο την IP-10) είναι εκλεκτικοί χημειοτακτικοί παράγοντες των Β και Τ λεμφοκυττάρων. 57 Οι CC χημειοκίνες (ή β-χημειοκίνες) αποτελούν την μεγαλύτερη οικογένεια χημειοκινών. Περιλαμβάνει 24 διαφορετικά μέλη τα οποία είναι τα CCL1-5, CCL7-8, CCL11 και CCL Αρκετές από αυτές τις χημειοκίνες παρουσιάζουν μία αρκετά διευρυμένη εκλεκτικότητα σε κύτταρα-στόχους. Γενικότερα, είναι 87

88 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ δραστικές σε πολλούς υποπληθυσμούς λευκοκυττάρων, όπως τα μονοκύτταρα, τα εοσινόφιλα, τα βασεόφιλα, τα ΝΚ κύτταρα, τα Τ λεμφοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα, ενώ θεωρούνται ανενεργείς έναντι των πολυμορφοπύρηνων ουδετερόφιλων. 59,60 Οι C (ή γ-χημειοκίνες) και CX3C χημειοκίνες (ή δ-χημειοκίνες) διαθέτουν σχετικά περιορισμένη δραστικότητα, καθώς είναι ενεργές κυρίως έναντι των Τ λεμφοκυττάρων και των ΝΚ κυττάρων, ενώ οι φρακταλάνες είναι δράστικές και στα μονοκύτταρα. 61,62,63 IV. Υποδοχείς των χημειοκινών - Γενικά στοιχεία Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα στην κατανόηση της φυσιολογίας και της παθοφυσιολογίαςτου δικτύου των χημειοκινών προκύπτει από την πολυπλοκότητα που χαρακτηρίζει τη σύνδεσή τους με συγκεκριμένους υποδοχείς. Παρατηρείται ένας μεγάλος αριθμός αλληλεπιδράσεων και συνδέσεων, καθώς πολλές χημειοκίνες μπορούν να ανταγωνίζονται ή να συναγωνίζονται μεταξύ τους προκειμένου να συνδεθούν επί του ιδίου υποδοχέα, ενώ την ίδια στιγμή μία και μόνο χημειοκίνη μπορεί να συνδέεται και να ενεργοποιεί πολλούς διαφορετικούς υποδοχείς. Έως σήμερα, έχουν αναγνωριστεί 6 υποδοχείς των CXC χημειοκινών 10 υποδοχείς των CC χημειοκινών και 1 υποδοχέας των C και CX3C χημειοκινών. Προσδιορίζονται με το όνομα CXCR για τις CXC χημειοκίνες, CCR για τις CC χημειοκίνες, ενώ ο CXR1 είναι ο υποδοχέας των C χημειοκινών και ο CX3CR1 είναι ο υποδοχέας των CX3C χημειοκινών. Διακρίνονται σε εκλεκτικούς, οι οποίοι συνδέονται με μία συγκεκριμένη χημειοκίνη και ενεργοποιούνται μόνο από αυτήν, και σε μη εκλεκτικούς, οι οποίοι μπορούν να ενεργοποιούνται από περισσότερες της μιας χημειοκίνες. V. Χημική δομή των υποδοχέων Η χημική δομή των υποδοχέων όλων των χημειοκινών εμφανίζεται σε ένα μεγάλο ποσοστό ταυτόσημη. Αποτελούν μέλη της οικογένειας των GPC υποδο- 88

89 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ χέων (G-Protein-Coupled Receptors). Το ακριβές όριο διαφοράς στη δομή των συγκεκριμένων υποδοχέων με τις υπόλοιπες GPC πρωτεΐνες είναι δυσδιάκριτο. Παρόλα αυτά, αρκετά δομικά στοιχεία των υποδοχέων των CC χημειοκινών παρουσιάζουν διαφορές όπως είναι το μήκος της αλυσίδας των αμινοξέων, το ιδιαίτερα όξινο N τελικό άκρο και η συγκεκριμένη ακολουθία DRY του 2 ου ενδοκυττάριου βρόγχου. 64 Πιο αναλυτικά, ο κάθε υποδοχέας απαρτίζεται από 7 διαμεμβρανικές α- έλικες, τρεις ενδοκυττάριους και τρεις εξωκυττάριους βρόγχους, ένα εξωκυττάριο N τελικό άκρο, που είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση της χημειοκίνης, και ένα κυτταροπλασματικό C τελικό άκρο, το οποίο συνδέεται με ετεροτριμερείς G πρωτεΐνες και ευθύνεται για τη μεταγωγή του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου. Χαρακτηριστικό σημείο των CC υποδοχέων αποτελεί η κυτταροπλασματική τριπεπτιδική αλληλουχία DRY που εντοπίζεται επί του 2 ου ενδοκυττάριου βρόγχου και απαρτίζεται από ασπαραγινικό (D), αργινίνη (R) και τυροσίνη (Y). Επειδή οποιαδήποτε μεταβολή στην αλληλουχία DRY προκαλεί την απενεργοποίηση του υποδοχέα, η αλληλουχία θεωρείται βασική για τη διαδικασία της χημειοταξίας. 65 VI. Ενεργοποίηση των υποδοχέων των χημειοκινών - έναρξη χημειοταξίας Παρόλη την σημαντική πρόοδο που έχει επιτευχθεί στην κατανόηση του μηχανισμού της χημειοταξίας, η αναγνώριση του ακριβούς ενδοκυττάριου μεταβολικού δρόμου που ακολουθείται παραμένει άγνωστος. Φαίνεται πάντως πως η διαδικασία ξεκινάει με την μετατροπή ενός GDP σε GTP μιας υποομάδας της G-πρωτεΐνης του υποδοχέα της χημειοκίνης και συνεχίζεται με την επαγωγή δεύτερων μηνυμάτων, όπως αυτό της φωσφορυλίωσης του ERK1 και 2 (Extracellular signal-regulated kinases ή p44/42) και της κινητικότητας των Ca +2. Τον κύριο ρόλο όμως στη μεταγωγή του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου τον παίζει η C-τελική περιοχή των CC υποδοχέων, η οποία είναι πλούσια σε μόρια σερίνης και θρεονίνης και ευθύνεται για την ενεργοποίηση G πρωτεϊνών και την έναρξη αλυσιδωτών αντιδράσεων φωσφορυλίωσης. Σύγχρονα ερευνητικά 89

90 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ δεδομένα τονίζουν τη σημασία ειδικών σημάτων της G-πρωτεΐνης μέσω των μεταβολικών δρόμων Rho και Rac τα οποία καταλήγουν στον πολυμερισμό της ακτίνης και στην ανασύνθεση μορίων προσκόλλησης και άλλων κυτταρικών παραγόντων που οδηγούν στην κυτταρική μετανάστευση. 66 VII. Η χημειοκίνη SLC Γενικά στοιχεία Πρόκειται για μία από τις ομοιοστατικές χημειοκίνες, η οποία εκφράζεται κυρίως στο λεμφικό ιστό και στα δευτερογενή λεμφικά όργανα και έλκει κυρίως τα λεμφοκύτταρα και όχι τα μονοκύτταρα. Ονομάζεται SLC (secondary lymphoid tissue chemokine), με εναλλακτικές ονομασίες CCL21, 6Ckine και Exodus-2. Λιγότερο συχνά χρησιμοποιήθηκαν οι ονομασίες TCA-4 και CKβ-9.Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία προσέλκυσης των Τ λεμφοκυττάρων και των α- ντιγονοπαρουσιαστικών δενδριτικών κυττάρων στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, επάγοντας με αυτόν τον τρόπο την έναρξη της ειδικής ανοσιακής απάντησης. Η λειτουργία της χημειοκίνης SLC και ρυθμίζεται από τη σύνδεσή της με τον υποδοχέα CCR7. Παρόλο που ο συγκεκριμένος υποδοχέας συνδέεται και με τη χημειοκίνη CCL19 ή ELC/MIP-3β, οι δύο χημειοκίνες εμφανίζονται ταυτόσημες μόνο στο 32% των αμινοξέων τους. 67 Χημική δομή Συγκρινόμενη με άλλες χημειοκίνες, η SLC διαθέτει μία C-τελική α-έλικα επεκτεινόμενη κατά 30 αμινοξέα, πλούσια σε βασικά αμινοξέα και η οποία είναι πολύ πιθανό να λειτουργεί ως ενεργοποιητής της αλληλεπίδρασης της χημειοκίνης με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η C-τελική α-έλικα, διαθέτει δύο επιπλέον κυστεϊνικά μόρια τα οποία ενώνονται με δισουλφιδικό δεσμό

91 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Κύτταρα και ιστοί που εκφράζουν την χημειοκίνη SLC Το mrna της SLC έχει ανιχνευτεί σε υψηλά επίπεδα στους λεμφαδένες και στη σκωληκοειδή απόφυση, σε μέτρια επίπεδα στο σπλήνα, στο λεπτό έντερο, στο θυρεοειδή αδένα και στην τραχεία και σε χαμηλά επίπεδα στην καρδιά, στο πάγκρεας, στο θύμο αδένα και στο παχύ έντερο. Μελέτες που χρησιμοποίησαν in situ υβριδισμό αναγνώρισαν την SLC στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφόκολπων και των HEVs των λεμφαδένων, στις πλάκες του Peyer του εντέρου, στη σκωληκοειδή απόφυση, στην Τ κυτταροτοξική περιοχή των λεμφαδένων, στο σπλήνα και στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων πολλών οργάνων. Χαρακτηριστικό είναι ότι οι Willimann και συν. αναγνώρισαν την έκφραση της SLC στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων δενδριτικών κυττάρων στην Τ κυτταροτοξική περιοχή της παραφλοιώδους μοίρας των λεμφαδένων. 69 Κύριες λειτουργίες Η SLC εκφράζεται κυρίως σε περιοχές πλούσιες σε λεμφικό ιστό, αλλά και στις ενδοθηλιακές περιοχές του δικτύου των λεμφόκολπων καθώς και στα ειδικά φλεβίδια υψηλής συγκέντρωσης ενδοθηλιακών κυττάρων (high endothelial venules-hevs) των δευτερογενών λεμφικών οργάνων. Υπερεκφράζεται κυρίως κατά την κεντρική φάση ή φάση πολλαπλασιασμού της ειδικής ανοσιακής απάντησης (ΕΑΑ). Βασική της λειτουργία είναι η ρύθμιση της μετανάστευσης κυρίως των Τ αλλά και των Β λεμφοκυττάρων μέσω του λεμφαγγειακού συστήματος, από τις θέσεις αντιγονικού ερεθισμού στα δευτερογενή λεμφικά όργανα δηλαδή στο σπλήνα, στους λεμφαδένες και στο λεμφικό ιστό σχετιζόμενο με το βλεννογόνο (MALT-mucosa associated lymphoid tissue). Ταυτόχρονα, η SLC έλκει τα ώριμα πλέον δενδριτικά κύτταρα, τα οποία αφού περάσουν από όλα τα στάδια ωρίμανσης κατά τη μετανάστευσή τους από την κυκλοφορία στην περιοχή του αντιγονικού ερεθισμού, λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα εκφράζοντας στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα 91

92 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ CCR7 και την SLC. Στο σημείο αυτό και λίγο προ της εισόδου τους στα λεμφικά τριχοειδή παρουσιάζουν το αντιγόνο στον TCR υποδοχέα των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων μέσω του συστήματος ιστοσυμβατότητας MHCI ή II. Η σύνδεση αυτή με τη βοήθεια των συδιεγερτικών μορίων Β7.1 και Β7.2 αυξάνει την έκκριση του υποδοχέα CCR7 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία τελικά μαζί με τα ώριμα δενδριτικά κύτταρα έλκονται από την SLC στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφικών τριχοειδών. Τα ώριμα δενδριτικά κύτταρα και τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα εισέρχονται στους λεμφόκολπους των επιχώριων λεμφαδένων καθώς προσελκύονται από τις SLC και ELC των ενδοθηλιακών κυττάρων. Κατόπιν οδηγούνται προς τη παραφλοιώδη ζώνη αντιδρώντας στην έκκριση των SLC και ELC αυτή τη φορά από ενεργοποιημένα αλληλεπιδρώντα δενδριτικά κύτταρα της Τ κυτταροτοξικής ζώνης των λεμφαδένων. Ταυτόχρονα τα νέα δενδριτικά κύτταρα που φτάνουν στην περιοχή ενισχύουν την χημειοτακτική δράση των χημειοκινών με τελικό αποτέλεσμα την ολοκλήρωση της αντιγονοπαρουσίασης και της λύσης του αντιγονικού εισβολέα με την βοήθεια των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων. Άλλες in vitro μελέτες καταδεικνύουν ότι η χημειοκίνη SLC διεγείρει και την άμεση προσκόλλησή των δενδριτικών κυττάρων και Τ λεμφοκυττάρων στα μόρια ICAM-1 και MAdCAM-1 μέσω των ιντεγκρινών α L β 2 (LFA-1) και α 4 β 7 αντίστοιχα προκειμένου να διευκολύνει το «ρολάρισμά» τους στη λεμφική κυκλοφορία. Φαίνεται τελικά πως η χημειοτακτική δράση της SLC δεν περιορίζεται στο σημείο εισόδου του αντιγόνου στη λεμφική κυκλοφορία, αλλά συνεχίζεται σε ο- λόκληρη τη διαδρομή του προς τα δευτερογενή λεμφικά όργανα. Λιγότερο γνωστές λειτουργίες της SLC αποτελούν η ανασταλτική δράση της στον πολλαπλασιασμό των άωρων αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και η χημειοταξία των θυμοκυττάρων από το φλοιό στο μυελό του θύμου αδένα και από εκεί στην κυκλοφορία του αίματος

93 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ VIII. Ο υποδοχέας CCR7 Γενικά στοιχεία Ο CCR7 αρχικά αναγνωρίστηκε ως αυτόνομος G-πρωτεϊνικός υποδοχέας, ενώ αρκετά αργότερα ταυτοποιήθηκε ως υποδοχέας των χημειοκινών ELC και SLC (CCL-19 και CCL-21 αντίστοιχα). Ο CCR7 κυρίως εκφράζεται στα λεμφοκύτταρα και στα δενδριτικά κύτταρα και θεωρείται υπεύθυνος για την μετανάστευση των κυττάρων αυτών στα δευτερογενή λεμφικά όργανα. Πιθανολογείται ότι συμμετέχει και στην παθογένεση των ιογενών λοιμώξεων, καθώς βρέθηκε αυξημένη έκφρασή του σε κυτταρική λοίμωξη από τον ιό Epstein-Barr (EBV) και τον ανθρώπινο ερπητοϊό τύπου 6 και 7 (human herpesvirus-hhv). Εναλλακτικές ονομασίες του υποδοχέα CCR7 είναι EBI1 (Epstei-Barr virus-induced gene 1) και BLR2 (Burkitt s lymphoma receptor 2). Άλλες ονομασίες που αναφέρονται είναι CMKBR7 (chemokike β family receptor 7), CKR7 και CC- CKR7. 71 Χημική δομή Ο υποδοχέας CCR7 εμφανίζει την τυπική χημική δομή των CC υποδοχέων, δηλαδή αποτελείται από 7 διαμεμβρανικές α-έλικες, τρεις ενδοκυττάριους και τρεις εξωκυττάριους βρόγχους, ένα εξωκυττάριο N τελικό άκρο, που είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση της χημειοκίνης SLC, και ένα κυτταροπλασματικό C τελικό άκρο, το οποίο συνδέεται με ετεροτριμερείς G πρωτεΐνες και ευθύνεται για τη μεταγωγή του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου. Χαρακτηριστική είναι επίσης και η κυτταροπλασματική τριπεπτιδική αλληλουχία DRY που εντοπίζεται επί του 2 ου ενδοκυττάριου βρόγχου και αναγνωρίζεται και στους υπόλοιπους CC υποδοχείς

94 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Κύτταρα και ιστοί που εκφράζουν τον υποδοχέα CCR7 To mrna του CCR7 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, στο σπλήνα, στο θύμο αδένα, στις φαρυγγικές αμυγδαλές, και στους λεμφαδένες. Σε χαμηλά επίπεδα εκφράζεται στο λεπτό και το παχύ έντερο, στο μυελό των οστών και στον εμβρυικό ηπατικό ιστό. Ο CCR7 αντιδρά με τις χημειοκίνες ELC και SLC, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα στους ιστούς αυτούς είναι τα Τ λεμφοκύτταρα, τα θυμοκκύτταρα, τα Β λεμφοκύτταρα, τα δενδριτικά κύτταρα, τα κύτταρα φυσικοί φονείς και τα μακροφάγα. Όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούμενη ενότητα, ο υποδοχέας CCR7 εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στα ώριμα δενδριτικά κύτταρα κατά τις φάσεις εξέλιξης της ειδικής ανοσιακής απάντησης. In vitro έρευνες, έχουν αναγνωρίσει τον υποδοχέα σε θυμοκύτταρα που μεταναστεύουν από τον φλοιό στο μυελό του θύμου αδένα, σε νευρικά κύτταρα και σε άωρα δενδριτικά κύτταρα ποντικών. 73,74 Κύριες λειτουργίες Κύρια λειτουργία του υποδοχέα CCR7 είναι η χημειοταξία των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και των ώριμων δενδριτικών κυττάρων μέσω του λεμφαγγειακού συστήματος από τις θέσεις αντιγονικού ερεθισμού στα δευτερογενή λεμφικά όργανα δηλαδή στο σπλήνα, στους λεμφαδένες και στο λεμφικό ιστό σχετιζόμενο με το βλεννογόνο (MALT-mucosa associated lymphoid tissue). Η σύνδεση των χημειοκινών ELC και SLC με τον υποδοχέα CCR7, όπως προαναφέρθηκε, αποτελεί την βασική βιοχημική διαδικασία με την οποία ενεργοποιείται αρχικά η χημειοταξία των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων και των ώριμων δενδριτικών κυττάρων προς την περιοχή του αντιγονικού ερεθισμού και στη συνέχεια η αντιγονοπαρουσίαση και η μετανάστευση των κυττάρων αυτών στα δευτερογενή λεμφικά όργανα. Η έκφραση του υποδοχέα στην επιφάνεια των κυττάρων αυτών γίνεται κυρίως στη μέση φάση της ειδικής ανοσιακής απάντησης και συνήθως διαρκεί 94

95 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 24 ώρες. Στη συνέχεια, ένα υποσύνολο Τ μνημονικών λεμφοκυττάρων συνεχίζει να εκφράζει CCR7 και L-σελεκτίνη παραμένοντας σε ετοιμότητα να ενεργοποιήσει έναν ακόμη κύκλο δευτερογενούς φλεγμονώδους αντίδρασης. 75 IX. Ο ρόλος του συμπλέγματος SLC-CCR7 στον καρκίνο και τη μετάσταση Ο υποδοχέας CCR7 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε διάφορους τύπους καρκίνου. Κατά παρόμοιο τρόπο με τους μηχανισμούς της ειδικής ανοσιακής απάντησης, η αυξημένη έκφραση του υποδοχέα από τα καρκινικά κύτταρα, επάγει την χημειοταξία των καρκινικών κυττάρων προς την αυξημένη έκφρασης της χημειοκίνης SLC αρχικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφοφόρων τριχοειδών και στη συνέχεια στα ενδοθηλιακά κύτταρα των επιχώριων λεμφαδένων. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα από καρκίνο του μαστού, του στομάχου, του οισοφάγου και του παχέως εντέρου, καθώς και από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και από ακανθοκυτταρικό καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου εκφράζουν αυξημένο τον υποδοχέα CCR7. Τα καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν τον CCR7 μεταναστεύουν προς υψηλές συγκεντρώσεις της χημειοκίνης SLC αρχικά στα προϋπάρχοντα ή νέα λεμφαγγεία πέριξ του όγκου, και στη συνέχεια στους επιχώριους λεμφαδένες. 76,77,78,79,80 Έχει αναφερθεί ότι αυξημένη έκφραση του CCR7 σε κυτταρικές σειρές μελανώματος οδήγησε αυξημένη πιθανότητα λεμφαδενικής μετάστασης in vitro. Η ενεργοποίηση επίσης του CCR7 και η σύνδεσή του με τη χημειοκίνη SLC α- ναφέρεται ότι ευνοεί τη διηθητική ικανότητα του όγκου, τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τελικά τη μετάσταση στους επιχώριους λεμφαδένες. 81,82 Ο υποδοχέας CCR7 έχει θεωρηθεί πιθανός προγνωστικός δείκτης της μεταστατικής νόσου του καρκίνου του μαστού, ενώ έχει συνδεθεί με την εξέλιξη της νόσου και την κακή πρόγνωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου. 83,84,85,86 95

96 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επίσης, η έκφραση του CCR7 από τα καρκινικά κύτταρα έχει συνδεθεί με τη μετάσταση στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του οισοφάγου, 87 ενώ η έκφραση του CCR7 σε συνδυασμό με τον CCR6 έχει συσχετιστεί με τη λεμφαδενική μετάσταση στον ακανθοκυτταρικό καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. 88 Παρόμοια συσχέτιση αναδείχθηκε και σε πρόσφατες μελέτες ακανθοκυτταρικόυ καρκινώματος κεφαλής και τραχήλου, όπου ο υποδοχέας CCR7 θεωρήθηκε υπεύθυνος για αυξημένη κινητικότητα και χημειοταξία των καρκινικών κυττάρων. 89,90,91,92 Λίγα είναι τα ερευνητικά δεδομένα σήμερα για το ρόλο του συμπλέγματος SLC-CCR7 στον ακανθοκυτταρικό καρκίνο του στόματος. Οι Shang και συν. μελετώντας 85 περιστατικά ακανθοκυτταρικού καρκίνου του στόματος, ανέδειξαν την αιτιολογική σχέση του συμπλέγματος SLC-CCR7 με τη λεμφαδενική μετάσταση. 93 Οι Tsusuki και συν. συνέδεσαν την έκφραση του υποδοχέα CCR7 με τη μεταστατική νόσο και την τοπική υποτροπή σε 90 παεριστατικά ακανθοκυτταρικού καρκίνου του στόματος. 94 Αντίθετα, η έκφραση του συμπλέγματος SLC-CCR7 δεν έχει επαρκώς μελετηθεί έως σήμερα στον ακανθοκυτταρικό καρκίνο της γλώσσας. 96

97 8. ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ I. Γενικά Τα τελευταία χρόνια, η έρευνα γύρω από το ρόλο και τις ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων έχει αποκαλύψει μία αμφίδρομη σχέση του ενδοθηλίου και του στρώματος που το περιβάλλει. Είναι πλέον γνωστό ότι η αλληλεπίδραση αυτή αποτελεί σημαντικό παράγοντα όχι μόνο κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως είναι η ρύθμιση της ανοσιακής απάντησης του οργανισμού και των μηχανισμών αύξησης και μετάστασης των όγκων. Η δημιουργία και η ανάπτυξη δικτύου νέων αιμοφόρων και λεμφοφόρων αγγείων μπορεί να γίνει με δύο βασικούς τρόπους. Είτε δηλαδή με τη βοήθεια των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (endotheial progenitor cells-epc) που αναφέρεται ως vasculogenesis, είτε με τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ώριμων ενδοθηλιακών κυττάρων από προϋπάρχοντα αγγεία και τη σταθεροποίηση του νέου αυτού δικτύου με περικύτταρα και λείες μυϊκές ίνες που αναφέρεται ως angiogenesis ή arteriogenesis. 95 Η ολοκλήρωση της δημιουργίας ώριμων αγγείων αποτελεί μία ιδιαίτερα σύνθετη διαδικασία όπου χαρακτηριστική είναι η δυναμική ισορροπία μεταξύ διεγερτικών και ανασταλτικών σημάτων, όπως είναι οι ιντεγκρίνες, οι αγγειοποιητίνες, μόρια σύνδεσης και προσκόλλησης, αισθητήρες οξυγόνωσης, οι χημειοκίνες και άλλοι ενδογενείς αναστολείς. 97

98 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ II. Η επαγωγική διαδικασία της αγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης α. Αγγειογένεση Η έναρξη της σύνθετης διαδικασίας της αγγειογένεσης θεωρείται το αποτέλεσμα της απώλειας της δυναμικής ισορροπίας μεταξύ των διεγερτικών και ανασταλτικών μορίων ως ένας «αγγειογενετικός διακόπτης». Κύριο ρόλο κατέχει ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας-α (vascular endothelial growth factor-a, VEGF-A) μέσω της στρατολόγησης ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, των αγγειοβλαστών ή μέσω προϋπαρχόντων αιμοφόρων τριχοειδών. 96 Ο VEGF-A θεωρείται ο κύριος αγγειογενετικός παράγοντας, ο οποίος ο- φείλει τη δράση του στη σύνδεσή του με δύο υποδοχείς τυροσινικής κινάσης, τους VEGFR-1 (Flt) και VEGFR-2(KDR, Flk-1). Ιδιαίτερα, ο VEGFR-2 θεωρείται ως ο κύριος ρυθμιστής της μιτογενετικής και αγγειογενετικής δράσης του VEGF- A, ενώ ο VEGFR-1 ως επαγωγικός παράγοντας της αιμοποίησης και της προσέλκυσης άλλων αρχέγονων κυττάρων του μυελού των οστών στο αγγειακό δίκτυο του όγκου που προάγουν περεταίρω την αγγειογένεση. Επιπλέον, ο VEGFR-1 μέσω της σύνδεσής του με τον VEGF-A, είναι υπεύθυνος για την αύξηση της έκφρασης μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs), καθώς και για την επαγωγή της παρακρινικής απελευθέρωσης άλλων αυξητικών παραγόντων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. 97 Άλλοι αγγειογενετικοί παράγοντες-κυτοκίνες που έχουν αναγνωριστεί είναι ο ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας-2 (FGF-2), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο αυξητικός παράγοντας προερχόμενος από τα αιμοπετάλια (PDGF), η ιντερλευκίνη 8 (IL-8) και η κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2). Οι κυτοκίνες αυτές ενεργοποιώντας τους μηχανισμούς της αγγειογένεσης ρυθμίζουν έμμεσα άλλες βιολογικές διαδικασίες όπως η κυτταρική χημειοταξία, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η πρωτεόλυση, η έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών και τελικά η δημιουργία νέων αιμοφόρων τριχοειδών. 98

99 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Αντίθετα, οι αναστολείς της αγγειογένεσης όπως είναι οι στατίνες ή οι α- ναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών εμποδίζουν τη δημιουργία νεόπλαστων τριχοειδών κυρίως όμως στο καρκινικό περιβάλλον. Η ωρίμανση των νεόπλαστων τριχοειδών ή η αρτηριογένεση, περιλαμβάνει τη δημιουργία νέας βασικής μεμβράνης και τον εμπλουτισμό τους με περικύτταρα και λείες μυϊκές ίνες. Ο PDGF στρατολογεί κύτταρα λείων μυϊκών ινών, ενώ ταυτόχρονα, μεταβολικά σήματα μέσω του μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα β (TGF-β) και της αγγειποιητίνης-1 σταθεροποιούν την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων των λείων μυϊκών ινών και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αυτόν τον τρόπο, τα ώριμα αγγεία μετατρέπονται σε αρτηρίες και φλέβες αποκτώντας διαφοροποιημένα μορφολογικά χαρακτηριστικά. 98 Βέβαια, η φυσιολογία και η λειτουργικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων εξαρτάται από το όργανο στο οποίο συμμετέχουν. Για παράδειγμα, στο κεντρικό νευρικό σύστημα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα σχηματίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό εμποδίζοντας μεταφορά κυττάρων και μορίων διαμέσου των ενδοθηλικών κυττάρων, ενώ αντίθετα στους ενδοκρινείς αδένες, στο έντερο και στο νεφρό εμφανίζουν αυξημένη διαπερατότητα με τη δημιουργία ειδικών πόρων με τη βοήθεια του VEGF. Φαίνεται δηλαδή, πως το ενδοθήλιο των αιμοφόρων τριχοειδών εκτός από τη βασική του λειτουργία που είναι η μεταφορά οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών στους ιστούς, λειτουργεί και ως ξεχωριστός ενδοκρινής αδένας, ρυθμίζοντας πολλαπλές λειτουργίες οι οποίες εξαρτώνται από το περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται. Κατά τον ίδιο τρόπο και στο καρκινικό περιβάλλον, φαίνεται πως τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν τελείως διαφορετική λειτουργικότητα από το φυσιολογικό ενδοθήλιο μέσα στο ίδιο όργανο που εξαρτάται από τα μεταβολικά σήματα που δέχονται από τα καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα του στρώματος του όγκου. β. Λεμφαγγειογένεση Το λεμφικό δίκτυο του ανθρώπου προέρχεται σύμφωνα με την επικρατούσα θεωρεία από το εμβρυικό φλεβικό δίκτυο και η μορφογένεσή του μέσω ενός συνόλου κυτοκινών τα οποία αλληλεπιδρούν με τα λεμφικά ενδοθηλιακά 99

100 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ κύτταρα (lymphatic endothelial cells-lecs). Άλλες ερευνητικές μελέτες αναδεικνύουν την προέλευση του λεμφικού δικτύου από λεμφικά ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα, τους λεμφαγγειοβλάστες κατά ανάλογο τρόπο με τους αγγειβλάστες των αιμοφόρων τριχοειδών. 99 Κατά τη μετεμβρυική περίοδο η δημιουργία νεόπλαστων λεμφικών τριχοειδών επιτελείται με τις διαδικασίες της λεμφαγγειογένεσης. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναδείξει ένα σύστημα σηματοδότησης το οποίο θεωρείται υπεύθυνο για τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των λεμφικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Το σύστημα αυτό αποτελείται από τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα C και D (VEGF-C, VEGF-D), και τον υποδοχέα τους VEGFR-3. Οι παράγοντες αυτοί φαίνεται πως παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της λεμφαγγειογένεσης σε φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. 100 Χημική δομή και λειτουργίες του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR-3 Ο παράγοντας VEGF-C αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας VEGF/ PDGF (platelet derived growth factor). Χαρακτηριστικό της χημικής δομής των παραγόντων αυτών αποτελεί το σύνολο των 8 κυστεϊνικών τμημάτων στο μόριό τους, τα δύο από τα οποία δημιουργούν ένα διαμοριακό δισουλφιδικό δεσμό, ενώ τα υπόλοιπα 6 δημιουργούν τρεις διαφορετικούς ενδομοριακούς βρόγχους. Ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα είναι ο VEGFR-3, ο οποίος είναι εξειδικευμένος τόσο για τον VEGF-C, όσο και για τον VEGF-D. Αποτελεί έναν υποδοχέα τυροσινικής κινάσης, με κύριο χαρακτηριστικό της χημικής του δομής την ύπαρξη 7 Ig ανοσοσφαιρινικών περιοχών στο εξωκυττάριο τμήμα του. Η κύρια λειτουργία των παραγόντων της οικογένειας VEGF στη εμβρυική περίοδο είναι η δημιουργία του καρδιοαγγειακού συστήματος. Κατά τη μετεμβρυική ζωή, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο αρχικά στην ανάπτυξη και σταθεροποίηση του αγγειακού δικτύου του οργανισμού και στη συνέχεια σε άλλες επιμέρους διαδικασίες όπως είναι η αύξηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, η αγγειακή διαπερατότητα, η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και των μακροφάγων, η νεοαγγειογένεση σε φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ιστούς και η 100

101 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ λεμφαγγειογένεση. Οι παράγοντες VEGF-C και VEGF-D θεωρούνται κυρίως λεμφαγγειογενετικοί παράγοντες, ενώ ο υποδοχέας VEGFR-3 παρόλο που εκφράζεται κυρίως στα κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων κατά την εμβρυϊκή περίοδο, στη συνέχεια εκφράζεται αποκλειστικά από τα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα. 101 Η λειτουργία του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR-3, όπως και των υπόλοιπων αγγειακών ενδοθηλιακών παραγόντων ελέγχεται από ένα πλήθος ερεθισμάτων όπως είναι η υποξία, οι αυξητικοί παράγοντες, γονιδιακές μεταλλάξεις όπως του γονιδίου p53, η παραγωγή ορμονών όπως τα οιστρογόνα και ο TSH και το μονοξείδιο του αζώτου (NO). Τα τελευταία χρόνια η δράση του VEGF-C αποτελεί αντικείμενο εντατικής μελέτης στη λεμφαγγειογένεση του καρκίνου. Kατά τη διάρκεια της τελικής τους διαφοροποίησης, τα μη ώριμα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν και άλλους ειδικούς δείκτες όπως είναι ο Prox- 1 που ρυθμίζει την κινητικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αναστολή των δεικτών της αγγειογένεσης, καθώς και ο LYVE-1 που ρυθμίζει την ωρίμανση του λεμφικού δικτύου. 102 Άλλοι λεμφαγγειογενετικοί παράγοντες με έμμεση κυρίως δράση θεωρούνται η αγγειοποιητίνη-2, ο ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας-2 και -3 (FGF-2, FGF-3), ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας-1 και 2 (IGF-1, IGF-2) και ο αυξητικός παράγοντας προερχόμενος από τα αιμοπετάλια ΒΒ. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τον ηπατοκυτταρικό αυξητικό παράγοντα ως σημαντικό λεμφαγγειογενετικό παράγοντα (HGF). O HGF επάγει των πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των LECs, καθώς και το σχηματισμό του αυλού του λεμφαγγείου μέσω της σύνδεσής του με τον υποδοχέα HGF-R. Επίσης, παρόλο που τόσο ο VEGF-A όσο και ο COX-2 θεωρήθηκαν για αρκετά χρόνια αποκλειστικά αγγειογενετικοί παράγοντες, νέα ερευνητικά δεδομένα τους κατατάσσουν στους πιθανούς επαγωγικούς παράγοντες της λεμφαγγειογένεσης. 103,

102 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ III. Ο ρόλος της λεμφαγγειογένεσης σε νοσολογικές οντότητες Η ανακάλυψη τα τελευταία χρόνια των λεμφαγγειογενετικών παραγόντων οδήγησε σε νέα ερευνητικά δεδομένα για τον ρόλο της λεμφαγγειογένεσης σε νοσολογικές οντότητες όπως είναι η φλεγμονώδης αντίδραση και ο καρκίνος. α. Λεμφαγγειογένεση σχετιζόμενη με τη φλεγμονώδη αντίδραση Είναι γνωστή η άμεση αιτιολογική σχέση της φλεγμονώδους αντίδρασης του οργανισμού με σημαντικές αλλαγές στη δομή και λειτουργία του αγγειακού δικτύου, προκαλώντας την τριάδα των συμπτωμάτων του πόνου της ερυθρότητας και του οιδήματος. Παράλληλα με την αγγειογένεση, νέα ερευνητικά δεδομένα έχουν συνδέσει τη λοίμωξη του αναπνευστικού, την ψωρίαση και τη ρευματοειδή αρθρίτιδα με τη λεμφαγγειογένεση. Σε φλεγμονώδεις ιστούς έχει αποδειχθεί η αυξημένη απελευθέρωση λεμφαγγειογενετικών παραγόντων όπως ο VEGF-C και ο VEGF-A τόσο από ανοσοϊκανά κύτταρα όπως τα μακροφάγα, όσο και από κύτταρα του στρώματος όπως οι ινοβλάστες. ( από lymphatic endothelioum in health and disease). 105 Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα, τα λεμφαγγεία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των δενδριτικών κυττάρων στην ειδική ανοσιακή απάντηση. Βασικό ρόλο στη χημειτακτική μετακίνηση έχει ο υποδοχέας CCR7 στην επιφάνεια των δενδριτικών κυττάρων και η χημειοκίνη SLC των ενδοθηλιακών κυττάρων η οποία βρέθηκε αυξημένη σε περιβάλλον αυξημένης έκφρασης των λεμφαγγειογενετικών παραγόντων VEGF-C και VEGFR Πειραματικά δεδομένα σε μεταμόσχευση κερατοειδούς χιτώνα σε ποντικούς, έδειξαν ότι η αναστολή της έκφρασης του VEGFR3 στα αρχικά στάδια της ανοσιακής απάντησης αποτρέπει τη μετανάστευση των δενδριτικών κυττάρων στους επιχώριους λεμφαδένες, με αποτέλεσμα τη αναστολή της εκδήλωσης επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας και της απόρριψης του μοσχεύματος. 107 Από την άλλη πλευρά, η λεμφαγγειογένεση ενδεχομένως να έχει ευεργετική δράση στη θεραπεία χρόνιας λοίμωξης, εφόσον η ακεραιότητα των λεμφαγγείων προάγει την ομαλή αποχέτευση του υγρού των ιστών, των ανοσιακών 102

103 κυττάρων και των φλεγμονωδών κυτοκινών από τα σημεία της χρόνιας φλεγμονής. 108 Έτσι, η αναστολή της σηματοδότησης του VEGFR3, έχει βρεθεί ότι αλλοιώνει τη δομή του λεμφαγγειακού δικτύου, ευνοώντας τον σχηματισμό λεμφοιδήματος σε μοντέλα ποντικών που έπασχαν από χρόνια λοίμωξη αναπνευστικού. 109 Φαίνεται λοιπόν η σαφής και πολύπλευρη σχέση της λεμφαγγειογένεσης ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ με τους μηχανισμούς φλεγμονώδους αντίδρασης του οργανισμού. Με δεδομένη τη σχέση της ανοσιακής απάντησης με την εξέλιξη του καρκίνου και τη μεταστατική νόσο, όπως αναπτύχθηκε στην προηγούμενη ενότητα, διαφαίνεται η αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων αυτών με τελικό αποτέλεσμα την δυσμενή πρόγνωση του καρκίνου. β. Λεμφαγγειογένεση και καρκίνος. Ο ρόλος της στη μεταστατική νόσο. Η είσοδος των καρκινικών κυττάρων στο δίκτυο των λεμφαγγείων αποτελεί αναμφίβολα ένα από τα πρώτα βήματα της λεμφαδενικής μετάστασης των καρκινωμάτων. Η λεμφαγγειογένεση τόσο περιογκικά, όσο και ενδοογκικά, πιθανότατα ενισχύει τη δυναμική των καρκινικών κυττάρων για μετάσταση αυξάνοντας τον πληθυσμό των λειτουργικών λεμφαγγείων-στόχων. Σύγχρονα ερευνητικά δεδομένα αναφέρουν ότι η ύπαρξη λειτουργικών λεμφαγγείων στην περιφέρεια του όγκου είναι αρκετή για την έναρξη της μεταστατικής νόσου, καθώς φαίνεται πως τα καρκινικά κύτταρα συχνότερα διηθούν τον περιβάλλοντα στρωματικό ιστό και εισέρχονται στη λεμφική κυκλοφορία μέσω των περιογκικών λεμφαγγείων. 110 Τα τελευταία χρόνια, αρκετά πειραματικά ερευνητικά μοντέλα έχουν αναδείξει το ρόλο των λεμφαγγειογενετικών παραγόντων VEGF-C, VEGF-D και του υποδοχέα τους VEGFR3 στη βιολογία του καρκίνου. Σε ένα από αυτά, η μεταφορά και έκφραση ανασυνδυασμένου VEGFR3 μέσω μεταφορέα αδενοϊού στην κοίτη του όγκου, ανέστειλε τη λεμφαγγειογένεση και την VEGF-C επαγόμενη ανάπτυξη του όγκου, καθώς το πλεονάζον VEGFR3 «παγίδευσε» την έκφραση του VEGF-C και VEGF-D

104 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Άλλες μελέτες έδειξαν ότι το μπλοκάρισμα του VEGFR3 αναστέλλει την περιογκική λεμφαγγειογένεση και τη λεμφαδενική μετάσταση αλλά όχι την αιματογενή μετάσταση στον πνεύμονα δηλώνοντας ότι πιθανότατα άλλοι μηχανισμοί εμπλέκονται σε αυτήν. 112,113 Επειδή η έκφραση του υποδοχέα VEGFR3 είναι ευρέως αποδεκτό ότι περιορίζεται στα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα (LECs), θεωρείται ότι ο αυξητικοί παράγοντες VEGF-C και VEGF-D είναι υπεύθυνοι για τη λεμφαδενική μετασταση στα περισσότερα είδη καρκίνου. 114,115 Η έκφραση του VEGFR3 συνδέθηκε με μειωμένη επιβίωση στον καρκίνο του στομάχου και το σύμπλεγμα VEGF-C/VEGFR3 συσχετίστηκε με λεμφαδενική μετάσταση. Η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση αξιολόγησε τον VEGFR3 ως ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη μετάστασης. 116 Στον καρκίνο του μαστού ο VEGFR3 συσχετίστηκε με το βαθμό κακοήθειας του όγκου και βρέθηκε να επηρεάζει σημαντικά την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων. 117 Το σύμπλεγμα VEGF-C/VEGFR3 συνδέθηκε με φτωχότερη πρόγνωση στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και στον καρκίνο του προστάτη. 118,119,120 Ταυτόχρονα συσχετίστηκε με τη λεμφαγγειογένεση και τη λεμφαδενική μετάσταση στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, στον καρκίνο του προστάτη, του ενδομητρίου, του παχέως εντέρου, του στομάχου και του θυρεοειδούς. 121,122,123,124,125 Επίσης, η έκφραση του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR3 βρέθηκε να ε- πηρεάζει την λεμφαγγειογένεση και τη λεμφαδενική μετάσταση στον καρκίνο του οισοφάγου, 126 καθώς και τη μετάσταση και την επέκταση του όγκου στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της κεφαλής και του τραχήλου. 127 Παρόλα αυτά, άλλες έγκυρες μελέτες αναδεικνύουν ότι ενώ ο VEGF-C σχετίζεται άμεσα με τη μεταστατική νόσο και τη διηθητική ικανότητα, η λεμφαγγειογένεση δεν εμφανίζει σαφή αιτιολογική σχέση με αυτόν, υποδηλώνοντας και εναλλακτικούς λειτουργικούς ρόλους του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR3. Πράγματι, έγινε φανερό τελευταία ότι τόσο ο VEGFR3 όσο και ο VEGF-C εκφράζονται στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα, προτείνοντας αυτοκρινείς επαγωγικούς μηχανισμούς πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και διηθητικής τους ικανότητας, με την αύξηση άμεσα ή έμμεσα της ροής στα υπερπλα- 104

105 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ στικά περιογκικά λεμφαγγεία. Με αυτόν τον τρόπο, τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν την πολλαπλή δράση του VEGF-C στο καρκινικό περιβάλλον. 110 γ. Οι παράγοντες λεμφαγγειογένεσης και οι χημειοκίνες Σε αυτούς τους πολύπλοκους και δαιδαλώδεις μηχανισμούς φαίνεται ότι έχουν ενεργό ρόλο και οι χημειοκίνες. Μετά την αρχική έκφραση από τα καρκινικά κύτταρα παραγόντων αγγειογένεσης και λεμφαγγειογένεσης όπως VEGF-A, αγγειποιητίνης, IL-8, VEGF-C, οι χημειοκίνες των καρκινικών κυττάρων διεγείρουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων και λεμφικών τριχοειδών τα οποία πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν για να δημιουργήσουν το μεταλλαγμένο ενδοθήλιο του όγκου. Ταυτόχρονα, άλλες χημειοκίνες (SDF-1) που εκφράζονται τόσο από τα καρκινικά κύτταρα όσο και από αυτά του στρώματος προσελκύουν προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα (EPCs), περικύτταρα, και κύτταρα λείων μυϊκών ινών ενισχύοντας την αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση στο περιβάλλον του όγκου. 128 Με αυτόν τον τρόπο, από τη μία πλευρά ο VEGF-C αυξάνοντας τα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την αυξημένη παραγωγή χημειοκινών από αυτά όπως είναι η SLC και από την άλλη, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα, το καρκινικό κύτταρο εισέρχεται διαδοχικά σε ένα προ-μεταστατικό στάδιο όπου εκφράζει στη επιφάνειά του τον υποδοχέα CCR7. Έτσι, καθώς προσελκύεται από την SLC, το CCR7+ καρκινικό κύτταρο εισέρχεται στη λεμφική κυκλοφορία. 129 δ. Λεμφαγγειογένεση επαγόμενη από τα μακροφάγα του όγκου Το λεμφαδενικό αγγειακό σύστημα οργανώνει και ρυθμίζει την κυκλοφορία των ανοσιακών κυττάρων και τη μετανάστευσή τους στους επιχώριους λεμφαδένες στη φλεγμονή και στη μετάσταση. Στο στρωματικό περιβάλλον του ό- γκου, το σύνολο των ανοσιακών κυττάρων αποτελείται κυρίως από μακροφάγα και πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα προερχόμενα από το μυελό των οστών 105

106 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ και λιγότερο από Τ και Β λεμφοκύτταρα, φυσικά κυτταροκτόνα, και δενδριτικά κύτταρα σε διάφορες φάσεις διαφοροποίησης ανάλογα με το είδος και τη μορφή του καρκινικού περιβάλλοντος. Όπως αναλύθηκε στην ενότητα της περιγραφικής ιστολογίας του χορίου του καλυπτικού επιθηλίου, τα μακροφάγα απελευθερώνονται από το μυελό των οστών ως άωρα μονοκύτταρα και παραμένουν στην κυκλοφορία μέχρι την χημειοτακτική μετανάστευσή τους διαμέσου του ενδοθηλιακού φραγμού στον ιστό στόχο, όπου διαφοροποιούνται σε μακροφάγα των ιστών. Τα μακροφάγα αποτελούν ένα κυτταρικό πληθυσμό που διαθέτει μεγάλη φαινοτυπική πλαστικότητα με διαφορετικές κάθε φορά λειτουργίες ανάλογα με το κυτταρικό μικροπεριβάλλον στο οποίο συμμετέχει. Έτσι τα μακροφάγα ανευρίσκονται σε κάθε ιστό του οργανισμού, ενώ αντιδρώντας σε φλεγμονώδες ερέθισμα ή στο περιβάλλον του στρώματος του όγκου αποκτούν εξειδικευμένες ιδιότητες όπως η φαγοκυττάρωση, η αντιγονοπαρουσίαση και η έκκριση ενός συνόλου αυξητικών παραγόντων και κυττοκινών. 130,131,132 Με βάση αυτά τα κριτήρια, τα μακροφάγα των ιστών διαχωρίζονται σε δύο κύριες υποκατηγορίες, τα ενεργοποιημένα με την κλασική και με την εναλλακτική οδό. Τα πρώτα αναφέρονται ως Μ1 μακροφάγα, συμμετέχουν στους μηχανισμούς της ειδικής ανοσιακής απάντησης και ενεργοποιούνται από την ι- ντερφερόνη-γ, τα λιποπολυσακχαρίδια (LPS) και από κυττοκίνες όπως η IL-12 και 23, ενώ τα δεύτερα αναφέρονται ως Μ2 μακροφάγα και ενεργοποιούνται από κυττοκίνες των Th2 λεμφοκυττάρων όπως είναι οι IL-4,IL-10 και IL-13. Φαίνεται πως την απαρχή για την εμφάνιση των TAMs κάνει η ενεργοποίηση από τα καρκινικά κύτταρα των ρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων τα οποία με τη σειρά τους αναστέλλουν όλους τους μηχανισμούς της ειδικής ανοσιακής απάντησης (ΕΑΑ) και ευνοούν την μετάλλαξη των μακροφάγων σε Μ2 μακροφάγα. 133,134 Νεότερα ερευνητικά δεδομένα αναδεικνύουν τα Μ2 μακροφάγα ως τον κύριο πληθυσμό μακροφάγων στο φλεγμονώδες στρώμα των συμπαγών όγκων και αναφέρονται ως μακροφάγα σχετιζόμενα με τον όγκο (tumor associated macrophages TAMs). Τα Μ2 μακροφάγα συγκεντρώνονται κυρίως περιογκικά βρισκόμενα σε επαφή με τα ενδοθηλιακά κύτταρα των νεόπλαστων τριχοειδών, με κύριες λειτουργίες την έκκριση αυξητικών παραγόντων, χημειοκινών, μεταλ- 106

107 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ λοπρωτεασών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και παραγόντων αγγειογένεσης και λεμφαγγειογένεσης. Τα Μ2 μακροφάγα, δεχόμενα σήματα από διαφορετικά κύτταρα στο στρώμα του όγκου, έχουν συνδεθεί με κακή πρόγνωση της νόσου και με τη λεμφαδενική μετάσταση. 135,136,137 Τελευταία, το ερευνητικό ενδιαφέρον έχει μετατοπιστεί προς την αγγειογενετική και ιδιαίτερα τη λεμφαγγειογενετική ικανότητα των Μ2 μακροφάγων του όγκου. Τα μακροφάγα αυτά θεωρείται ότι εκφράζουν συνεχώς τον υποδοχέα VEGFR-1/-3 και λιγότερο τον υποδοχέα VEGFR-2. Ιδιαίτερα ο VEGFR-3 και η σύνδεσή του με τον VEGF-C θεωρήθηκε σημαντικός ρυθμιστής της λεμφαγγειογένεσης επαγόμενης από τα μακροφάγα in vitro και in vivo. 138,139 Οι Fujii και συν. συσχέτισαν την αυξημένη συγκέντρωση Μ2 μακροφάγων με τη συγκέντρωση ινοβλαστών σχετιζόμενους με τον όγκο (cancer associated fibroblasts- CAFs), καθώς και με κακή πρόγνωση σε 108 ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνο του στόματος. 140 Σε άλλη πρόσφατη μελέτη οι Bremmes και συν. θεωρούν ότι σε κάποιο σημείο της εξέλιξης της καρκινογένεσης, αυξάνεται η έκκριση του TGF-β από τα καρκινικά κύτταρα με αποτέλεσμα οι CAFs που ε- νεργοποιούνται να έλκουν χημειοτακτικά και να ενεργοποιούν με τη σειρά τους τα Μ2 μακροφάγα στο στρώμα του όγκου. Η χημειοτακτική αυτή μετακίνηση γίνεται πιθανότατα με τη βοήθεια του υποδοχέα CXCR4 στην επιφάνεια των μακροφάγων ο οποίος συνδέεται με τη χημειοκίνη SDF-1 στην επιφάνεια των CAFs. 141 Ο El-Rouby συσχέτισε τα TAMs με την αγγειογένεση αναλύοντας ανοσοϊστοχημικά παρασκευάσματα ακανθοκυτταρικού καρκίνου του στόματος. 142 Επίσης, οι Liu και συν. κατέδειξαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των μακροφάγων του όγκου και του μεγαλύτερου μεγέθους του, της λεμφαδενικής μετάστασης και της φτωχής πρόγνωσης στον καρκίνο του στόματος, 143 ενώ οι Marcus και συν. διαπίστωσαν σημαντική συσχέτιση της συγκέντρωσης μακροφάγων του όγκου με τη λεμφαδενική μετάσταση, την εξωκαψική διήθηση και τη σταδιοποίηση του όγκου σε μία σειρά στοματικών και στοματοφαρυγγικών καρκινωμάτων

108 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ε. Ο ρόλος της λεμφαγγειογένεσης στον καρκίνο του στόματος Λίγα είναι τα ερευνητικά δεδομένα που αφορούν στο ρόλο του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR3 και της λεμφαγγεογένεσης στον καρκίνο του στόματος. Οι Halder και συν. αναδεικνύουν την αιτιολογική σχέση του VEGF-C και της πυκνότητας των λεμφαγγείων με τη μεταστατική νόσο στον καρκίνο του στόματος, ενώ τονίζουν και τη διαφορετική έκφραση των δεικτών αυτών στον καρκίνο του δέρματος. 145 Οι Ishii και συν. θεωρούν ότι το σύμπλεγμα VEGF-C/VEGFR3 παίζει σημαντικό ρόλο στη λεμφαγγειογένεση του καρκίνου του στόματος και στην αναγνώριση του φρουρού λεμφαδένα. Στη μελέτη όμως αυτή χρησιμοποιήθηκε μικρό δείγμα ασθενών (μόλις 10), ενώ και η θεωρεία του φρουρού λεμφαδένα στον καρκίνο του στόματος αμφισβητείται. 146 Επιπλέον οι Sasahira και συν. συνδέουν την λεμφαγγειογένεση και τον VEGF-C με τη μετάσταση στον καρκίνο του στόματος θεωρώντας ως αιτιολογικό παράγοντα τον αναστολέα του μελανώματος (melanoma inhibitory activity-mia). Το δείγμα όμως αφορούσε μικρό αριθμό παρασκευασμάτων ταχείας βιοψίας από τα οποία τα λιγότερα ήταν μεταστατικά. 147 Επίσης και οι Tsuyoshi και συν. τονίζουν την αιτιολογική σχέση του συμπλέγματος VEGF-C/VEGFR3 με τη μεταστατική νόσο του στοματικού καρκίνου, ενώ άλλες σύγχρονες μελέτες συνδέουν μόνο την λεμφαγγειακή πυκνότητα με τη λεμφαδενική μετάσταση. Παρόλα αυτά ελάχιστα είναι τα ερευνητικά δεδομένα που αφορούν στη σχέση της λεμφαγγειογένεσης και των παραγόντων της με το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της γλώσσας. Οι Tanigaki και συν. σε μελέτη από το 2004 συνδέουν τον VEGF-C με τη μετάσταση σε σύνολο 73 ασθενών με καρκίνο της γλώσσας. Άλλες τρεις πιο σύγχρονες ερευνητικές μελέτες, συνδέουν την λεμφαγγειογένεση και τη μετάσταση του καρκίνου της γλώσσας κυρίως με την πυκνότητα των λεμφαγγείων στο στρώμα του όγκου και λιγότερο με άλλους λεμφαγγειογενετικούς παράγοντες

109 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Αντίθετα με τα παραπάνω ευρήματα, φαίνεται πως μέχρι σήμερα δεν υ- πάρχουν σαφή ερευνητικά δεδομένα για το ρόλο των μακροφάγων σχετιζόμενων με τον όγκο ( TAMs) στη λεμφαγγειογένεση και τη μετάσταση στον καρκίνο της γλώσσας. Η επίδραση των στρωματικών κυττάρων στην εξέλιξη και την πρόγνωση διαφόρων μορφών καρκίνου άρχισε να ερευνάται μόλις τα τελευταία χρόνια, με τα μακροφάγα του όγκου κατέχουν σημαντικό μερίδιο της ερευνητικής διαδικασίας. Γίνεται λοιπόν φανερό, ότι η μελέτη του ρόλου των κυττάρων αυτών στη λεμφαγγειογένεση και στη πρόγνωση του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της γλώσσας, θα βοηθήσει σημαντικά στην κατανόηση της βιολογίας της λεμφαδενικής μετάστασης. 109

110

111 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

112

113 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η μελέτη της βιολογίας της μεταστατικής νόσου των συμπαγών όγκων αποτελεί σήμερα αντικείμενο εντατικής έρευνας. Παρόλα αυτά, οι μηχανισμοί που διέπουν τη λεμφαδενική μετάσταση του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της γλώσσας έχουν ελάχιστα μελετηθεί. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί ο ρόλος της χημειοκίνης SLC και του υποδοχέα της CCR7 στους μηχανισμούς της μεταστατικής νόσου του καρκίνου της γλώσσας και να συνδεθεί η λειτουργία τους με αυτή των διαδικασιών της ειδικής ανοσιακής απάντησης. Όπως αναλύθηκε σε προηγούμενη ενότητα, το σύμπλεγμα SLC/CCR7 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά την κεντρική φάση της ειδικής ανοσιακής απάντησης καθώς θεωρείται υπεύθυνο αρχικά για την ενεργοποίηση και τη χημειοταξία των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων και των ώριμων δενδριτικών κυττάρων προς την περιοχή της αντιγονικής εισβολής και στη συνέχεια για την αντιγονοπαρουσίαση και τη μετανάστευση των κυττάρων αυτών στα δευτερογενή λεμφικά όργανα. Το σύμπλεγμα SLC/CCR7 διευκολύνει ουσιαστικά την είσοδο του αντιγόνου εισβολέα αρχικά στο λεμφικό τριχοειδές και στη συνέχεια στους επιχώριους λεμφαδένες. Στην παρούσα μελέτη θα ερευνηθεί κατά πόσο το καρκινικό κύτταρο μιμούμενο τη δράση των δενδριτικών κυττάρων, κινείται χημειοτακτικά στο στρωματικό περιβάλλον του όγκου και εισέρχεται τελικά στο τριχοειδές λεμφαγγείο χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο σύμπλεγμα χημειοκίνης. Ταυτόχρονα θα μελετηθεί και η δράση της λεμφαγγειογένεσης στη μεταστατική νόσο του καρκίνου της γλώσσας, καθώς και η σύνδεση των μηχανισμών της με τη δράση του συμπλέγματος SLC/CCR7 κατά την είσοδο του καρκινικού κυττάρου στο λεμφικό δίκτυο. Τελευταία, αντικείμενο μελέτης αποτελεί η αλληλεπίδραση των ανοσιακών κυττάρων του στρώματος του όγκου και ειδικότερα των μακροφάγων, με τα καρ- 113

114 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ κινικά κύτταρα στα πλαίσια της μεταστατικής νόσου των συμπαγών όγκων. Σύγχρονα ερευνητικά δεδομένα καταδεικνύουν την άμεση σχέση της συγκέντρωσης αυτών των μακροφάγων με την αγγειογένεση και κυρίως με τη λεμφαγγειογένεση που οδηγεί στη μετάσταση. Σύμφωνα με τη νέα αυτή ερευνητική τάση, θα επιχειρηθεί να μελετηθεί η ακριβής κυτταρική προέλευση της λεμφαγγειογένεσης τόσο στα μεταστατικά, όσο και στα μη μεταστατικά καρκινώματα της γλώσσας, ώστε να διατυπωθεί τελικά μία συνολική υποθετική θεώρηση της βιολογίας της λεμφαδενικής μετάστασης του ακανθοκυτταρικού καρκίνου της γλώσσας. 114

115 2. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για τον παραπάνω σκοπό έγινε αναδρομική κλινική μελέτη ασθενών που χειρουργήθηκαν για αφαίρεση μεταστατικού και μη μεταστατικού ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της γλώσσας. Ταυτόχρονα διενεργήθηκε ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των παρασκευασμάτων τόσο της πρωτοπαθούς βλάβης όσο και του τραχήλου των ασθενών αυτών και στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της μελέτης. Ασθενείς Μελετήθηκαν συνολικά 60 ασθενείς οι οποίοι κατά το χρονικό διάστημα 2002 έως το 2010 είχαν χειρουργηθεί για αφαίρεση ακανθοκυτταρικού καρκινώματος της γλώσσας. Από αυτούς οι 30 περιπτώσεις αφορούσαν καρκινώματα σε ασθενείς χωρίς μετάσταση στους επιχώριους λεμφαδένες, ενώ οι υπόλοιπες 30 περιπτώσεις καρκινώματα σε ασθενείς με μετάσταση στους επιχώριους λεμφαδένες. Για το σύνολο των ασθενών και των δύο ομάδων η χειρουργική αποκατάσταση περιελάμβανε εκτομή της πρωτοπαθούς βλάβης σε υγιή όρια και ε- κλεκτική ή ριζική τραχηλική λεμφαδενεκτομή. Κανένας από τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη δεν υποβλήθηκε σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, ενώ η χειρουργική αποκατάσταση αποτέλεσε την πρώτη θεραπευτική εκλογή για το σύνολο των ασθενών. Η αναλογία φύλου ήταν για την ομάδα των ασθενών με μετάσταση στον τράχηλο: άνδρες/γυναίκες 2,75/1, ενώ για την ομάδα των ασθενών χωρίς μετάσταση στον τράχηλο: άνδρες/γυναίκες 1,5/1. Η ηλικιακή κατανομή των ασθενών και των δύο ομάδων φαίνεται στο παρακάτω γράφημα: Η ιστοπαθολογική διάγνωση για όλους τους ασθενείς ήταν ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τόσο στην πρωτοπαθή βλάβη, όσο και στη τραχηλική μετάστα- 115

116 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ση, ενώ σε κανέναν από τους ασθενείς που εμφάνισαν τραχηλική μετάσταση δεν διαγνώστηκε απομακρυσμένη μεταστατική νόσος. Η σταδιοποίηση για το σύνολο των ασθενών φαίνεται στους πίνακες 56 και 58 του παραρτήματος και η διαφοροποίηση διαχωρίστηκε στις κατηγορίες καλή, μέτρια και χαμηλή με ισοπαθολογικά κριτήρια. Εικόνα 6. Η ηλικιακή κατανομή των των δύο ομάδων ασθενών. Ανοσοϊστοχημεία Από κάθε κύβο παραφίνης αντιπροσωπευτικό κάθε περίπτωσης λήφθηκαν 10 τομές πάχους 3,5 μ με τη βοήθεια μικροτόμου, οι οποίες επιστρώθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες φορτισμένες θετικά για ανοσοϊστοχημικές χρώσεις και άλλη μία τομή, η οποία επιστρώθηκε σε απλές αντικειμενοφόρες πλάκες για χρώση ρουτίνας αιματοξυλίνης και εωσίνης. Τα φορτισμένα πλακίδια αποπαραφινώθηκαν σε επωαστικό κλίβανο σε θερμοκρασία 64,5 o C για 45. Οι ανοσοϊ- 116

117 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ στοχημικές χρώσεις διενεργήθηκαν με τη χρησιμοποίηση μηχανήματος αυτόματης ανοσοϊστοχημικής χρώσης (Bond, Leica Microsystems). Το συγκεκριμένο μηχάνημα χρησιμοποιεί κιτ ανίχνευσης πρωτογενών αντισωμάτων (Bond Polymer Refine Detection, Leica Biosystems Ltd, Newcastle, United Kingdom) που περιλαμβάνει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3.0%, διάλυμα ενίσχυσης του πρωτογενούς (Post Primary), πολυμερές-hrp/αντίσωμα έναντι IgG ποντικού/κουνελιού, χρωμογόνων DAB και αιματοξυλίνης. Για την ανοσοϊστοχημική μελέτη χρησιμοποιήθηκαν έξι αντισώματα: SLC (CCL21), CCR7 (CKR7), VEGFC, VEGFR3, CD68, και D2-40. Για τη μελέτη της λεμφαγγειογένεσης χρησιμοποιήθηκαν οι παράγοντες του συμπλέγματος VEGF-C/ VEGFR-3, καθώς όπως προαναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα ο υποδοχέας VEGFR-3 εκφράζεται αποκλειστικά στο λεμφικό αγγειακό δίκτυο και το σύμπλεγμα VEGF-C/VEGFR-3 έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη της λεμφαγγειoγένεσης σε συμπαγείς όγκους. Χρησιμοποιήθηκαν τα αντισώματα VEGFC (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, αραίωση 1:50, επώαση σε ph8 για 30, Epitomics Inc, Burlingame California, USA) και το VEGFR3(πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, αραίωση 1:40, επώαση σε ph8 για 20, Epitomics Inc, Burlingame California, USA), Ως δείκτης της λεμφαγγειογενετικής δραστηριότητας χρησιμοποιήθηκε η λεμφαγγειακή πυκνότητα (lymphatic vessel density-lvd) η ανάλυση της οποίας διενεργήθηκε με τη βοήθεια του α- ντισώματος D2-40 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, αραίωση 1:150, επώαση σε ph6 για 20, Dako, Glostrup, Denmark). Για τον καθορισμό της συγκέντρωσης των μακροφάγων του όγκου, χρησιμοποιούνται ευρέως τα μονοκλωνικά αντισώματα CD163 και CD68. Σύγχρονες ερευνητικές μελέτες θεωρούν το CD163 ειδικότερο στη μελέτη των Μ2 μακροφάγων. Παρόλα αυτά οι περισσότεροι ερευνητές αναδεικνύουν και το CD68 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, έτοιμο προς χρήση, επώαση σε ph6 για 20, Leica Biosystems Ltd, Newcastle, UK) με την ίδια ειδικότητα και ευαισθησία για την ανάλυση της συγκέντρωσης των Μ2 μακροφάγων. Τα υπόλοιπα δύο αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το SLC (CCL21) (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, αραίωση 1:300, επώαση σε ph6 για 20, Abcam 117

118 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ plc, Cambridge UK) και το CCR7 (CKR7) (μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, αραίωση 1:250, επώαση σε ph8 για 20, Abcam plc, Cambridge UK). Όλες οι ανοσοϊστοχημικές χρώσεις εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας κοινό οπτικό μικροσκόπιο. Ως θετικοί μάρτυρες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα για το VEGF-C και VEGFR-3, αμυγδαλικός ιστός για το CD68 και λεμφαδένας για το CCR7 και το SLC. Ως θετικό αποτέλεσμα θεωρήθηκε η κυτταροπλασμική ή /και μεμβρανική καφέ χρώματος απεικόνιση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν. Η κάθε χρώση θεωρήθηκε αρνητική (βαθμός 0) επί απουσίας χρωσμένων κυττάρων (ή λεμφαγγείων αντίστοιχα) ενώ η θετικότητα εκφράστηκε ως ποσοστό επί τοις ε- κατό των κυττάρων (εύρος 1-100%) και με τρεις διαβαθμίσεις έντασης της χρωστικής αντίδρασης (1: ήπια, 2: μέτρια, 3: έντονη). Οι δείκτες λεμφαγγειογένεσης εκφράστηκαν ως απόλυτος αριθμός λεμφαγγείων ανά τετραγωνικό χιλιοστό. Ο αριθμός των μακροφάγων εκφράστηκε ως ο μέσος όρος του απόλυτου αριθμού τους σε δέκα οπτικά πεδία ισχυρής μεγέθυνσης. Στατιστική Μεθοδολογία Η περιγραφή των αριθμητικών μεταβλητών έγινε με τα στατιστικά ελάχιστη τιμή, διάμεσος, μέγιστη τιμή, μέση τιμή, τυπική απόκλιση και αντίστοιχες γραφικές παραστάσεις (θηκόγραμμα-boxplot). Η περιγραφή ονομαστικών ή διατακτικών-ordinal μεταβλητών έγινε με χρήση συχνοτήτων και ποσοστών σε πίνακες διπλής εισόδου (crosstabulation) καθώς και με τα αντίστοιχα ραβδογράμματα (barplot). Η συσχέτιση μεταξύ ομάδας ασθενών και ποιοτικών μεταβλητών με δυο κατηγορίες έγινε με το έλεγχο Fisher s Exact Test. Δεν βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις οπότε δε χρησιμοποιήθηκε κάποιο μέτρο για την εκτίμηση της έντασης της συσχέτισης στις περιπτώσεις αυτές. Η συσχέτιση μεταξύ ομάδας ασθενών και διατακτικών μεταβλητών έγινε με τον έλεγχο Mann-Whitney U test κατάλληλο για 2xc πίνακες (singly ordered rxc tables)149, ενώ για τον υπολογισμό της έντασης μιας στατιστικά σημαντικής 118

119 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ συσχέτισης χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης effect size (μέγεθος της επίδρασης), υπολογισμένος με τον τύπο ES=z/ N, όπου z είναι η κατάλληλη τιμή της τυπικής κανονικής κατανομής που προέκυψε από τον έλεγχο Mann-Whitney και Ν το σύνολο των ασθενών, στην κλίμακα ES 0.10: μικρή, 0.10< ES 0.30: μέτρια, 0.30< ES 0.50: καλή, 0.50< ES < 0.70 μεγάλη και ES 0.70 ισχυρή. Στις περιπτώσεις που βρέθηκε μεγάλη ή ισχυρή συσχέτιση έγινε ανάλυση ROC για την εκτίμηση της τιμής της μεταβλητής που επιτρέπει το διαχωρισμό των δυο ομάδων ενώ υπολογίστηκε για την τιμή αυτή η ευαισθησία και η ειδικότητα της τιμής της μεταβλητής για την περαιτέρω χρήση της ως διαγνωστικού ελέγχου (σε ασθενείς που προέρχονται από πληθυσμό όπου ο επιπολασμός της μετάστασης είναι ίσος με αυτόν του δείγματος). 150 Ο έλεγχος Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη σύγκριση μεταξύ των δυο ομάδων ασθενών σε αριθμητικές μεταβλητές με μη κανονική κατανομή (ratio, στις περιπτώσεις αυτές δόθηκε και το 95% διάστημα εμπιστοσύνης των μέσων διαφορών για τις δυο ομάδες) ενώ για μεταβλητές που ακολουθούσαν την κανονική κατανομή χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος Independent Samples t- test. Ως δείκτης συσχέτισης μεταξύ ομάδας ασθενών και μεταβλητής χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό odds ratio (OR, με 95% διάστημα εμπιστοσύνης) που προέκυψε από την εφαρμογή του μοντέλου της λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) 150 στα δεδομένα και το οποίο ερμηνεύεται ως ο κίνδυνος να υπάρξει μετάσταση. Το μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές (multivariate linear logistic regression) με τη μέθοδο stepwise χρησιμοποιήθηκε επιπλέον για την εκτίμηση των κύριων μεταβλητών που μπορούν να προβλέψουν τον κίνδυνο εμφάνισης μετάστασης. Τέλος η συσχέτιση μεταξύ αριθμητικών μεταβλητών έγινε με τον συντελεστή Spearman s rho καθώς και με το διάγραμμα διασποράς μεταξύ των 2 μεταβλητών. 151 Το σύνολο της ανάλυσης πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό IBM Statistics SPSS 19.0 ενώ η στατιστική σημαντικότητα τέθηκε για p<

120

121 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α. Συσχέτιση μεταβλητών στις πρωτοπαθείς βλάβες των δύο ομάδων ασθενών 1. Συσχέτιση ηλικίας και μετάστασης Ηλικία και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 5. Περιγραφική στατιστική της ηλικίας ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης ηλικίας ομάδας (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact) N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 7. Κατανομή ηλικίας ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). 121

122 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πίνακας 6. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση ηλικίας ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Συντελεστής Τυπικό σφάλμα Στατιστικό β.ε. p- Odds Ratio 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald (df) value (Exp(B)) Lower Upper ΗΛΙΚΙΑ Constant Συμπεράσματα: Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τη μέση ηλικία, p=0.673, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 5, Εικόνα 7. Επίσης δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση της ηλικίας με την εμφάνιση μετάστασης p=0.803, OR=1.005, 95%ΔΕ: , Πίνακας Συσχέτιση φύλου και μετάστασης Φύλο και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 7. Κατανομή Φύλου ανά ομάδα ασθενών (N=30). ΦΥΛΟ Θ Α Total Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Ν % 40.0% 60.0% 100.0% Μεταστατικό καρκίνωμα Ν % 26.7% 73.3% 100.0% Total Ν % 33.3% 66.7% 100.0% *Fisher s Exact Test. p-value* Πίνακας 8. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση φύλου ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Στατιστικό β.ε. p- Συντελεστής B Wald (df) value Lower Upper ΦΥΛΟ (A) Constant

123 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Καρκίνος γλώσ χωρίς μετάστ Καρκίνος γλώσ με μετάστ στον τραχηλο 0,1 0,0 Θ Α Εικόνα 8. Κατανομή φύλου ανά ομάδα ασθενών (N=30) Συμπεράσματα: Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς το φύλο, p=0.412 (Fisher s Exact Test), Πίνακας 8, Εικόνα 8. Επίσης δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του φύλου με την εμφάνιση μετάστασης p=0.276, OR=1.756, 95%ΔΕ: , Πίνακας Συσχέτιση Τ status και μετάστασης T-status και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 9. Κατανομή T-status ανά ομάδα ασθενών (N=30). T- status Total Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα N % 23.3% 70.0% 6.7% 100,0% Μεταστατικό καρκίνωμα N % 20.0% 76.7% 3.3% 100,0% Total N % 21.7% 73.3% 5.0% 100.0% * Mann-Whitney U test (Exact). p-value*

124 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, Καρκίνος γλώσ χωρίς μετάστ Καρκίνος γλώσ με μετάστ στον τραχηλο Εικόνα 9. Κατανομή T- status ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Συμπεράσματα: Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ T- status και μετάστασης, p=1.00, Πίνακας 9, Εικόνα Συσχέτιση σταδιοποίησης νόσου και μετάστασης STAGE και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 10. Κατανομή STAGE ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Παρατηρείται ισχυρός διαχωρισμός. STAGE Ι ΙΙ ΙΙΙ IVA Total Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα N % 23.3% 70.0% 6.7% 0% 100,0% Μεταστατικό καρκίνωμα N % 0%.0% 30.0% 70.0% 100,0% Total N % 11.7% 35.0% 18.3% 35.0% 100.0% * Mann-Whitney U test (Exact), effect size (ES) = 0.88 (ισχυρή συσχέτιση). p-value* <

125 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Καρκίνος γλώσ χωρίς μετάστ Καρκίνος γλώσ με μετάστ στον τραχηλο 0,1 0,0 Ι ΙΙ ΙΙΙ IVA Εικόνα 10. Κατανομή STAGE ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Παρατηρείται ισχυρός διαχωρισμός. Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική ισχυρή συσχέτιση μεταξύ STAGE και μετάστασης, p<0.001, ES=0.88, Πίνακας 10, Εικόνα 10. Εικόνα 11. Ανάλυση με καμπύλες ROC, (AUC = 0.99, 95%CI: , p<0.001). Θεωρώντας ως κατώφλι την τιμή STAGE = III, για τιμές μεγαλύτερες ή ίσες του ΙΙΙ, ο ασθενής έχει σχεδόν 1.00 πιθανότητα σωστής διάγνωσης της μετάσταση (Sensitivity), ενώ για τιμές μικρότερες του ΙΙΙ, έχει πιθανότητα 0.93 σωστής διάγνωσης (Specificity) ότι δεν έχει μετάσταση (Ν=30). 125

126 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Συμπεράσματα: Από την ανάλυση με καμπύλη ROC παρατηρούμε ότι AUC = 0.99, 95%CI: , p<0.001, δηλαδή ο δείκτης είναι σημαντικός ως πρόγνωση (σε πληθυσμό με ίδιο επιπολασμό στις μεταστάσεις). Μάλιστα η ειδικότητα (TP) είναι ίση με σχεδόν 1.00 και η ευαισθησία (TN) ίση με 0.93 αν επιλεχτεί ως κατώφλι για ύπαρξη μετάστασης η STAGE=ΙΙΙ, Εικόνα Συσχέτιση διαφοροποίησης και μετάστασης Διαφοροποίηση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 11. Κατανομή διαφοροποίησης ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). ΔIΑΦΟΡΟΠΟIΗΣΗ ΧΑΜΗΛΗ ΜΕΤΡΙΑ ΚΑΛΗ Total Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα N % 10.0% 23.3% 66.7% 100,0% Μεταστατικό καρκίνωμα N % 10.0% 36.7% 53.3% 100,0% Total N % 10.0% 30.0% 60.0% 100.0% * Mann-Whitney U test (Exact). p-value* ,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Καρκίνος γλώσ χωρίς μετάστ Καρκίνος γλώσ με μετάστ στον τραχηλο 0,1 0,0 ΧΑΜΗΛΗ ΜΕΤΡΙΑ ΚΑΛΗ Εικόνα 12. Κατανομή διαφοροποίησης ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Συμπεράσματα: Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ διαφοροποίησης και μετάστασης, p=0.393, Πίνακας 11, Εικόνα

127 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 6. Συσχέτιση βάθους διήθησης και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 12. Περιγραφική στατιστική του βάθους διήθησης ανά ομάδα ασθενών και σύγκριση του βάθους μεταξύ των δυο ομάδων ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value* <0.001 *Independent Samples t-test (for normally distributed data). Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 13. Κατανομή του βάθους διήθησης ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 13. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση βάθους διήθησης ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper Βάθος < Constant <

128 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Συμπεράσματα: υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς το βάθος διήθησης, p<0.001, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση), Πίνακας 11, Εικόνα 5. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση του βάθους διήθησης με την εμφάνιση μετάστασης p<0.001, OR=1.79 (για κάθε μονάδα αύξησης του βάθους αυξάνει κατά 79% ο κίνδυνος μετάστασης), 95%ΔΕ: , Πίνακας Συσχέτιση έκφρασης της χημειοκίνης SLC και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 14. Περιγραφική στατιστική της SLC ανά ομάδα ομάδα ασθενών και σύγκριση μεταξύ των δυο ομάδων (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact) N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 14. Κατανομή της SLC ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). 128

129 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Πίνακας 15. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση SLC ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper SLC Constant Συμπεράσματα: υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς την SLC, p=0.001, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση), Πίνακας 14, Εικόνα 14. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση της SLC με την εμφάνιση μετάστασης p=0.006, OR=1.06 (για κάθε μονάδα αύξησης της SLC αυξάνει κατά 6% ο κίνδυνος μετάστασης), 95%ΔΕ: , Πίνακας Συσχέτιση έκφρασης της χημειοκίνης SLC ένταση και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 16. Περιγραφική στατιστική της SLC x ένταση ανά ομάδα ασθενών και σύγκριση μεταξύ των δυο ομάδων (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact) N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value*

130 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 15. Κατανομή SLC x ένταση ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 17. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση SLC x ένταση ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής Στατιστικό β.ε. B Wald (df) p-value Lower Upper SLC ένταση Constant Συμπεράσματα: υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς την SLC ένταση, p=0.002, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση), Πίνακας 16, Εικόνα 15. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση της SLC ένταση με την εμφάνιση μετάστασης p=0.022, OR=1.03 (για κάθε μονάδα αύξησης της SLC ένταση αυξάνει κατά 3% ο κίνδυνος μετάστασης), 95%ΔΕ: , Πίνακας

131 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Εικόνα 16. Κυτταροπλασματική χρώση της χημειοκίνης SLC στα καρκινικά κύτταρα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων της πρωτοπαθούς βλάβης. Εικόνα 17. Ήπια κυτταροπλασματική χρώση της χημειοκίνης SLC στα καρκινικά κύτταρα και έντονη χρώση στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων του μεταστατικού λεμφαδένα. Αρνητικός μάρτυρας το φλεβίδιο (κάτω δεξιά της βλάβης). Μεγάλη μεγέθυνση. 131

132 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 9. Συσχέτιση έκφρασης του υποδοχέα CCR7 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 18. Περιγραφική στατιστική του CCR7 ανά ομάδα ασθενών και σύγκριση του CCR7 μεταξύ των δυο ομάδων (Ν=30). Group N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact). CCR7 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 18. Κατανομή του CCR7 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 19. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση CCR7 ομάδας α- σθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper CCR Constant

133 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Συμπεράσματα: υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον CCR7, p=0.007, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση), Πίνακας 18, Εικόνα 18. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση του CCR7 με την εμφάνιση μετάστασης p=0.005, OR=1.12 (για κάθε μονάδα αύξησης του CCR7 αυξάνει κατά 12% ο κίνδυνος μετάστασης), 95%ΔΕ: , Πίνακας Συσχέτιση έκφρασης του υποδοχέα CCR7 ένταση και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 20. Περιγραφική στατιστική του CCR7 ένταση ανά ομάδα ασθενών και και σύγκριση του CCR7 ένταση μεταξύ των δυο ομάδων (Ν=30). μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) Group N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) 95% ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact). CCR7 x ένταση Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 19. Κατανομή του CCR7 ένταση ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). 133

134 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πίνακας 21. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση CCR7 ένταση ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Συντελεστής B Τυπικό σφάλμα S.E. Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Lower Upper CCR7 ένταση Constant Συμπεράσματα: υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον CCR7 ένταση, p=0.006, 95% ΔΕ: 2 6 (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση), Πίνακας 20, Εικόνα 19. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση του CCR7 ένταση με την εμφάνιση μετάστασης p=0.006, OR=1.12 (για κάθε μονάδα αύξησης του CKR7 ένταση αυξάνει κατά 12% ο κίνδυνος μετάστασης), 95%ΔΕ: , Πίνακας 21. Εικόνα 20. Έντονη ανοσοϊστοχημική μεμβρανική και κυτταροπλασματική χρώση του υποδοχέα CCR7 στα καρκινικά κύτταρα της πρωτοπαθούς βλάβης. Μεγάλη μεγέθυνση. 134

135 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Εικόνα 21. Ήπια έως μέτρια κυτταροπλασματική (κυρίως) και μεμβρανική (λιγότερο) ανοσοϊστοχημική χρώση του υποδοχέα CCR7 στα καρκινικά κύτταρα του μεταστατικού λεμφαδένα. Μεσαία μεγέθυνση. 11. Πολυμεταβλητή ανάλυση: SLC + SLC Ένταση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 22. Πολυμεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης. 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a SLC SLC Ένταση Constant Step 2 a SLC Constant a. Variable(s) entered on step 1: SLC. SLC Ένταση. Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise (Πίνακας 9), στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές, παρατηρούμε ότι η SLC φαίνεται να σχετίζεται περισσότερο με την εμφάνιση μετάστασης (παίρνουμε τα συμπεράσματα από την αντίστοιχη παράγραφο). 135

136 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 12. Πολυμεταβλητή ανάλυση : CCR7+ CCR7 Ένταση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας % C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a CCR CCR7 Ένταση Constant Step 2 a CCR7 Ένταση Constant a. Variable(s) entered on step 1: CCR7. CCR7 Ένταση Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise (Πίνακας 10), στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές, παρατηρούμε ότι ο CCR7 ένταση φαίνεται να σχετίζεται περισσότερο με την εμφάνιση μετάστασης (παίρνουμε τα συμπεράσματα από την αντίστοιχη παράγραφο). 13. Συσχέτιση έκφρασης του D2-40 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 24. Περιγραφική στατιστική του D2-40 ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης D2-40 ομάδας ασθενών (Ν=30). Ελάχιστη τιμή (Min) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) Διάμεσος 95% ΔΕ Group N (Median) (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα <0.001 *Mann-Whitney U test (Exact). 136

137 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ D2-40 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 22. Κατανομή του D2-40 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 25. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση D2-40 ομάδας ασθενών (N=30). Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper Step 1 D Constant Συμπεράσματα: Yπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον D2-40, p<0.001, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 23, Εικόνα 18. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση τον D2-40 με την εμφάνιση μετάστασης p=0.001, OR=1.219, 95%ΔΕ: , Πίνακας

138 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εικόνα 23. Ήπια κυτταροπλασματική χρώση του D2-40 στο ενδοθήλιο μη μεταστατικού λεμφαδένα. Μεσαία μεγέθυνση. 14. Συσχέτιση έκφρασης του VEGF-C και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 26. Περιγραφική στατιστική του VEGF-C ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης VEGF-C ομάδας ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact), N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value*

139 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ VEGF-C Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 24. Κατανομή του VEGF-C ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 27. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση του VEGF-C ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper VEGF-C % Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον VEGF-C, p=0.007, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 26, Εικόνα 24. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του VEGF-C με την εμφάνιση μετάστασης p=0.012, OR=1.046, 95%ΔΕ: , Πίνακας

140 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 15. Συσχέτιση έκφρασης του VEGF-Cx ένταση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 28. Περιγραφική στατιστική του VEGF-C x ένταση ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης VEGF-C ένταση ομάδας ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact). N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 25. Κατανομή του VEGF-C x ένταση ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). 140

141 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Πίνακας 29. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση του VEGF-C x ένταση ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Συντελεστής B Τυπικό σφάλμα S.E. Στατιστικό Wald β.ε. (df) Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) p-value Lower Upper VEGF-C % x ένταση Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον VEGF-C % ένταση, p=0.011, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 28, Εικόνα 25. Επίσης υπάρχει (οριακά) στατιστικά σημαντική συσχέτιση του VEGF-C % ένταση με την εμφάνιση μετάστασης p=0.043, OR=1.022, 95%ΔΕ: , Πίνακας Πολυμεταβλητή ανάλυση: VEGF-C + VEGF-C Ένταση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 30. Πολυμεταβλητή ανάλυση 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a VEGF-C_,066,041 2,660 1,103 1,069,987 1,158 VEGF-C_ by VEGF- -,014,023,371 1,543,986,943 1,031 C_ένταση Constant -,705,370 3,630 1,057,494 Step 2 a VEGF-C_,045,018 6,268 1,012 1,046 1,010 1,084 Constant -,688,365 3,553 1,059,503 a. Variable(s) entered on step 1: VEGF-C_, VEGF-C_ * VEGF-C_ένταση. Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise, στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές, σημαντικότερη μεταβλητή για την πρόβλεψη της μετάστασης είναι ο VEGF-C. 141

142 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εικόνα 26. Μέτρια ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση του VEGF-C στα καρκινικά (βέλος), και στα στρωματικά κύτταρα της πρωτοπαθούς βλάβης. Μεσαία μεγέθυνση. 17. Συσχέτιση έκφασης του υποδοχέα VEGFR-3 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 31. Περιγραφική στατιστική του VEGFR-3 ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης VEGFR-3 ομάδας ασθενών (Ν=30). Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p-value* Group N Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact). 142

143 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ VEGFR-3 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 27. Κατανομή του VEGFR-3 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 32. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση του VEGFR-3 ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper VEGFR3 % Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον VEGFR-3, p=0.003, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 31, Εικόνα 27. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του VEGFR-3 με την εμφάνιση μετάστασης p=0.011, OR=1.102, 95%ΔΕ: , Πίνακας

144 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 18. Συσχέτιση έκφρασης του VEGFR-3 x ένταση και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 33. Περιγραφική στατιστική του VEGFR-3 x ένταση ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης VEGFR- 3 x ένταση ομάδας ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact) N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) % ΔΕ (95% CI) p-value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 28. Κατανομή του VEGFR-3 x ένταση ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 34. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση VEGFR-3 x ένταση ομάδας ασθενών (N=30). Step 1 Συντελεστής B Τυπικό σφάλμα S.E. Στατιστικό Wald β.ε. (df) Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) p-value Lower Upper VEGFR3 ένταση Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον VEGFR-3 x ένταση, p=0.010, 95% ΔΕ: (χωρίς 144

145 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 33, Εικόνα 28. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του VEGFR-3 x ένταση με την εμφάνιση μετάστασης p=0.020, OR=1.087, 95%ΔΕ: , Πίνακας Πολυμεταβλητή ανάλυση: VEGFR-3 + VEGFR-3 x Ένταση και ομάδα ασθενών (Ν=30) Πίνακας 35. Πολυμεταβλητή ανάλυση 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a VEGFR-3_ -, ,719, ,000,502,000. VEGFR-3_ by, ,719, ,000 2,186,000. VEGFR3_ένταση Constant -,665,359 3,420 1,064,515 Step 2 a VEGFR3_ by,094,038 6,168 1,013 1,098 1,020 1,183 VEGFR3_ένταση Constant -,670,358 3,509 1,061,512 a. Variable(s) entered on step 1: VEGFR-3_, VEGFR-3_ * VEGFR-3_ένταση. Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise, στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές, σημαντικότερη μεταβλητή για την πρόβλεψη της μετάστασης είναι ο VEGFR-3 ένταση, Πίνακας 35. Εικόνα 29. Μέτρια ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση του υποδοχέα VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα (κόκκινο βέλος), στα στρωματικά και στα ενδοθηλιακά κύτταρα (μαύρο βέλος) μεταστατικού λεμφαδένα. Μεσαία μεγέθυνση. 145

146 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 20. Συσχέτιση του CD68 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 36. Περιγραφική στατιστική του CD68 ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης CD68 - ομάδας ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Mann-Whitney U test (Exact) N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p- value* Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 30. Κατανομή του CD68 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 37. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση CD68 ομάδας α- σθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper CD Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον CD68, p=0.002, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 36, Εικόνα 30. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του CD68 με την εμφάνιση μετάστασης p=0.003, OR=1.012, 95%ΔΕ: , Πίνακας

147 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Εικόνα 31. Μέτρια έως έντονη ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση των μακροφάγων του όγκου (CD68) στην πρωτοπαθή βλάβη. Κάτω δεξιά διακρίνονται επιθηλιακά κύτταρα (μαύρο βέλος), και διάσπαρτα διακρίνονται πλασματοκύτταρα (κόκκινο βέλος) και ινοβλάστες (μπλε βέλος). Μεσαία μεγέθυνση. Εικόνα 32. Έντονη ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση των μακροφάγων στην περιφέρεια μη μεταστατικού λεμφαδένα. Μικρή μεγέθυνση. 147

148 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 21. Πολυμεταβλητή ανάλυση: όλων των σημαντικών λεμφαγγειογενετικών παραγόντων (N=30). Πίνακας 38. Πολυμεταβλητή ανάλυση. 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper Step 1 a D2-40,150,072 4,293 1,038 1,161 1,008 1,338 VEGF-C_,038,045,698 1,404 1,039,950 1,135 VEGFR-3_ -, ,718, ,000,420,000. VEGFR-3_ by, ,718, ,000 2,297,000. VEGFR3_ένταση CD68,006,005 1,912 1,167 1,006,997 1,015 Constant -2,588,818 10,015 1,002,075 Step 2 a D2-40,138,069 4,038 1,044 1,148 1,003 1,313 VEGF-C_,016,033,250 1,617 1,016,953 1,084 VEGFR-3_ by,015,058,066 1,798 1,015,907 1,136 VEGFR3_ένταση CD68,006,005 1,950 1,163 1,006,997 1,015 Constant -2,514,798 9,925 1,002,081 Step 3 a D2-40,137,069 3,972 1,046 1,147 1,002 1,312 VEGF-C_,023,020 1,301 1,254 1,023,984 1,065 CD68,007,004 2,802 1,094 1,007,999 1,015 Constant -2,570,774 11,034 1,001,077 Step 4 a D2-40,161,065 6,131 1,013 1,175 1,034 1,335 CD68,007,004 2,998 1,083 1,007,999 1,015 Constant -2,482,757 10,756 1,001,084 a. Variable(s) entered on step 1: D2-40, VEGF-C_, VEGFR-3_, VEGFR-3_ * VEGFR-3_ένταση, CD68. Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise, στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με περισσότερες από μια ανεξάρτητες μεταβλητές, σημαντικότερες μεταβλητές για την πρόβλεψη της μετάστασης είναι η D2-40 και η CD Πολυμεταβλητή ανάλυση: όλων των σημαντικών παραγόντων της μελέτης (N=30). Πίνακας 39. Αποτελέσματα multivariate stepwise logistic regression. Step 1 a 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper D VEGF-C_ VEGFR-3_ by VEGFR3_ένταση CD SLC Βάθος CCR7.CCR7ent Constant

149 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ Step 2 a Step 3 a Step 4 a Step 5 a Step 6 a 95% C.I.for EXP(B) B S.E. Wald df Sig. Exp(B) Lower Upper D VEGF-C_ CD SLC Βάθος CCR7.CCR7ent Constant D VEGF-C_ CD SLC Βάθος Constant D CD SLC Βάθος Constant D SLC Βάθος Constant SLC Βάθος < Constant < Συμπεράσματα: Με εφαρμογή της μεθόδου stepwise, στο μοντέλο της λογιστικής παλινδρόμησης με τις σημαντικότερες από τις μεταβλητές (λόγω περιορισμένου πλήθους παρατηρήσεων σε σχέση με το πλήθος των μεταβλητών συμπεριλήφθηκαν όσες στις προηγούμενες λογιστικές παλινδρομήσεις ήταν οι σημαντικές) παρατηρείται ότι σημαντικότερες είναι: το βάθος, p<0.001 OR=1.8 (δηλαδή κρατώντας τη SLC σταθερή κάθε mm αύξησης του βάθους αυξάνει τον κίνδυνο μετάστασης κατά 1.8 φορές) με 95% διάστημα εμπιστοσύνης , και η SLC, p=0.025, OR=1.052 (δηλαδή κρατώντας το βάθος σταθερό κάθε μονάδα αύξησης της SLC αυξάνει τον κίνδυνο μετάστασης κατά 5.2%) με 95% διάστημα εμπιστοσύνης (δηλαδή αύξηση από 0.5% ως 10% - αρκετά μεγάλο εύρος). 149

150 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Β. Συσχέτιση μεταβλητών στα τραχηλικά παρασκευάσματα των δύο ομάδων ασθενών Πίνακας 40. Περιγραφική στατιστική των μεταβλητών στα τραχηλικά παρασκευάσματα (Ν=30). Group SLC Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα SLC ένταση Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα D2-40 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα CCR7 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα CCR7 Μη μεταστατικό ένταση καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα VEGF-C Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα VEGF-C Μη μεταστατικό ένταση καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα VEGFR-3 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα VEGFR-3 Μη μεταστατικό ένταση καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα CD68 Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD)

151 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ 1. Συσχέτιση έκφρασης του D2-40 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας. 41 Περιγραφική στατιστική του D2-40 ανά ομάδα ασθενών και έλεγχος συσχέτισης D2-40 και ομάδας ασθενών (Ν=30). Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p-value* Group N Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα <0.001 *Mann-Whitney U test (Exact). D2-40 τραχήλου Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 33. Κατανομή του D2-40 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Πίνακας 42. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση D2-40 ομάδας α- σθενών (N=30). Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper Step 1 D Constant Συμπεράσματα: Yπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον D2-40, p<0.001, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και 151

152 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ (με μετάσταση) Πίνακας 41, Εικόνα 33. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του D2-40 με την ύπαρξη μετάστασης p=0.001, OR=2.307, 95%ΔΕ: , Πίνακας 42. Εικόνα 34. Μέτρια ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση του D2-40 στα λεμφαγγεία του μεταστατικού λεμφαδένα. 2. Συσχέτιση έκφρασης του CD68 και ομάδας ασθενών (Ν=30) Πίνακας 43. Περιγραφική στατιστική του CD68 ανά ομάδα και έλεγχος συσχέτισης CD68 και ομάδας ασθενών (Ν=30). Group Μη μεταστατικό καρκίνωμα Μεταστατικό καρκίνωμα *Independent Samples t- test, N Ελάχιστη τιμή (Min) Διάμεσος (Median) μέγιστη τιμή (Max) Μέση τιμή (Mean) Τυπική απόκλιση (SD) 95% ΔΕ (95% CI) p- value*

153 ΧΡΗΣΤΟΣ Π. ΜΑΓΟΠΟΥΛΟΣ CD68 τραχήλου Μη μεταστατικό καρκίνωμα Εικόνα 35. Κατανομή του CD68 ανά ομάδα ασθενών (Ν=30). Μεταστατικό καρκίνωμα Πίνακας 44. Αποτελέσματα λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) για τη συσχέτιση CD68 ομάδας α- σθενών (N=30). Step 1 Τυπικό σφάλμα S.E. Odds Ratio (Exp(B)) 95% C.I.for EXP(B) Συντελεστής B Στατιστικό Wald β.ε. (df) p-value Lower Upper CD Constant Συμπεράσματα: Υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ως προς τον CD68, p=0.038, 95% ΔΕ: (χωρίς μετάσταση) και (με μετάσταση) Πίνακας 43, Εικόνα 35. Επίσης υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση του CD68 με την ύπαρξη μετάστασης p=0.016, OR=1.009, 95%ΔΕ: , Πίνακας

154 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εικόνα 36. Έντονη ανοσοϊστοχημική κυτταροπλασματική χρώση των μακροφάγων του όγκου (CD68) στον μεταστατικό λεμφαδένα. Διακρίνονται αθροίσεις λεμφοκυττάρων (μαύρο βέλος) και επιθηλιακά κύτταρα (κόκκινο βέλος). Μικρή μεγέθυνση. 154