Kυτταρική Bιολογία ΣΥΝΘΕΣΗ, ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ, ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ & ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔIAΛEΞΕΙΣ 8, 9 & 10 (15, 17 & 20/3/2017)

Transcript

1 Kυτταρική Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 8, 9 & 10 (15, 17 & 20/3/2017) ΣΥΝΘΕΣΗ, ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ, ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ & ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

2 Τα κύρια σημεία της σημερινής διάλεξης είναι τα παρακάτω: Aποκωδικοποίηση του mrna, γενετικός κώδικας, Κωδικόνια-αντικωδικόνια & το μεταφορικό RNA Ριβοσωμάτιο-ο χώρος αποκωδικοποίησης. Ριβοσωμικά RNA & βιοσύνθεση ριβοσωματίων. Η Διαδικασία και η Ρύθμιση της Μετάφρασης Συνοδοί Πρωτεΐνες και Αναδίπλωση Πρωτεϊνών Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις & αποδόμηση Πρωτεϊνών

3 Το βασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας Γονιδιακή έκφραση Mεταγραφή Aγγελιαφόρο RNA (mrna) Kωδικόνιο Mετάφραση Πρωτεΐνη (πολυπεπτιδική αλυσίδα)

4 Πως επιτυγχάνεται η μεταφορά της γενετικής πληροφορίας από τα νουκλεϊνικά οξέα στις πρωτεΐνες; 1. Τα αμινοξέα έχουν τελείως διαφορετική σύσταση από το mrna. Πως λοιπόν θα μπορέσουν να συνταχθούν με το mrna κατά τη μετάφραση για να γίνει η αποκωδικοποίηση; 2. Πως είναι δυνατόν μια αλληλουχία τεσσάρων βάσεων να κωδικοποιεί 20 αμινοξέα; Ποιος είναι ο κώδικας; 3. Πως έσπασε ο κώδικας;

5 Ο γενετικός κώδικας

6 Πως έσπασε ο γενετικός κώδικας;

7 Αποκωδικοποίηση πολυριβονουκλεοτιδίων με γνωστές επαναλαμβανόμενες ακολουθίες

8 Πλαίσια ανάγνωσης στην πρωτεϊνοσύνθεση

9 Για τη μετατροπή της γενετικής πληροφορίας (αλληλουχία νουκλεοτιδικών βάσεων) σε πρωτεΐνες (αλληλουχία αμινοξέων) απαιτείται ένα ενδιάμεσο μόριο ΤΟ ΜΕΤΑΦΟΡΙΚΟ RNA (trna)

10 Η δομή του μεταφορικού RNA (trna)

11 To μεταφορικό RNA δρα ως προσαρμογέας His trna His Συνθετάση του ιστιδυλο-trna His Φορτισμένο trna His His Συμπληρωματικές βάσεις mrna

12 Η λειτουργία των μορίων προσαρμογέων

13 Δεσμοί υδρογόνου καθορίζουν το επιλεκτικό «ζευγάρωμα» κωδικονίου-αντικωδικονίου

14 Η πρόσδεση του αμινοξέως στο trna

15 Η εκλεκτικότητα της μετάφρασης απαιτεί τη μεσολάβηση δύο μορίων προσαρμογής αμινοξύ (τρυπτοφάνη) δεσμός υψηλής ενέργειας συνθετάση (τρυπτοφάνυλο trna συνθετάση) Σύνδεση του αμινοξέως στο RNA το trna συνδέεται στο κωδικόνιο του στο mrna ζευγάρωμα βάσεων ΚΑΘΑΡΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ: Η ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΟΥ ΑΜΙΝΟΞΕΩΣ ΚΑΘΟΡΙΖΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΚΩΔΙΚΟΝΙΟ ΤΟΥ

16 Ριβοσωμάτια: Οι χώροι αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας

17 Το βακτηριακό ριβοσωμάτιο

18 Το ευκαρυωτικό ριβοσωμάτιο

19 Το ενδοπλασματικό δίκτυο στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

20 Απομόνωση μικροσωματίων

21 Θέσεις σύνδεσης trna στο ριβοσωμάτιο Θέση Ε Θέση P Θέση Α Θέση πρόσδεσης mrna Μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα Μικρή ριβοσωμική υπομονάδα

22 Τα στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης

23 Η διαφορετική οργάνωση προκαρυωτικών & ευκαρυωτικών mrnas υπαγορεύει διαφορετικές στρατηγικές πρωτεϊνοσύνθεσης

24 Ειδικές αλληλουχίες βάσεων στα προκαρυωτικά mrnas καθορίζουν τα σημεία έναρξης της μετάφρασης Θέσεις πρόσδεσης ριβοσωματίου Πρωτεΐνη Α Πρωτεΐνη Β Πρωτεΐνη Γ

25 Προκαρυωτικά & ευκαρυωτικά σήματα έναρξης της μετάφρασης

26 Η έναρξη της μετάφρασης στα βακτήρια

27 Η έναρξη της μετάφρασης στους ευκαρυώτες RNA καλύπτρα εναρκτήριο trna μικρή υπομονάδα μαζί με παράγοντες έναρξης (δεν δείχνονται στο σχήμα) σύνδεση mrna mrna το σύμπλοκο μικρής υπομονάδας/εναρκτή ριου trna ψάχνει το πρώτο AUG του mrna Απομάκρυνση των παραγόντων έναρξης Σύνδεση της μεγάλης ροβοσωμικής υπομονάδας Σύνδεση αμινοακυλο-trna (Βήμα 1) Σχηματισμός πρώτου πεπτιδικού δεσμού (Βήμα 2)

28 συντιθέμενη ολυπεπτιδική αλυσίδα Η διαδικασία της επιμήκυνσης

29 Το τέλος της μετάφρασης Πρόσδεση παράγοντα απελευθέρωση ς ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ

30 Το πολυριβοσωμάτιο: ένα mrna που μεταφράζεται ταυτόχρονα από πολλά ριβοσωμάτια Κωδικόνιο τερματισμού Εναρκτήριο κωδικόνιο Αγγελιοφόρο RNA (mrna) Πολυπεπτιδική αλυσίδα

31 Μεταφραστική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης: Το παράδειγμα της φερριτίνης

32 Ρύθμιση της μετάφρασης από το σωματίδιο αναγνώρισης σήματος (ΣΑΣ ή SRP)

33 H πληροφορία αναδίπλωσης μιας πρωτεΐνης εμπεριέχεται στην πρωτοταγή της δομή H δομή της Pιβονουκλεάσης I (RNαση I, 124 αμινοξέα), σταθεροποιείται από τέσσερις ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς (Oι μπλέ κύκλοι= μόρια του αμινοξέος κυστεΐνη που συμμετέχουν στους δισουλφιδικούς δεσμούς).

34 Οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες χρειάζονται συνοδούς-πρωτεΐνες για να αναδιπλωθούν σωστά αναδιπλωμένη πρωτεΐνη Συνοδός πρωτεΐνη (σαπερόνη) Απελευθέρωση ολοκληρωμένου πολυπεπτιδίου

35 ΓΙΑΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΟΣΟ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΕΣ ΟΙ ΣΥΝΟΔΟΙ-ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ;

36 Το πρόβλημα του συνωστισμού των μακρομορίων <0.1 mg/ml in vitro κυτταρόπλασμα E. coli ~340 mg/ml Ellis and Hartl (1996) FASEB J. 10:20-26 ριβόσωμα πρωτεΐνες συνοδός-πρωτεΐνη νουκλεϊνικά οξέα Άλλα μακρομόρια

37 Αναδίπλωση ή συσσωμάτωση; Σωστές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων της πρωτεΐνης Λάθος αλληλεπιδράσεις μεταξύ πλευρικών αλυσίδων διαφορετικών πρωτεϊνών

38 ΕΠΟΜΕΝΩΣ Ο ρόλος των συνοδών-πρωτεϊνών ή πρωτεϊνών της θερμικής καταπόνησης (Heat-shock proteins, HSPs) ΕΙΝΑΙ:

39 Οι συνοδοί-πρωτεΐνες εμπλέκονται στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών Eμποδίζουν τα υδρόφοβα τμήματα των πρωτεϊνών να έρθουν σε επαφή με άλλα υδρόφοβα μόρια ΚΑΝΟΝΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ ΑΝΕΠΑΝΩΡΘΩΤΑ (ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΙΚΑ) ΛΑΘΗ Βοηθούν στη σωστή αναδίπλωση λιωμένο σφαιρίδιο Eπάγονται από έκθεση των κυττάρων σε υψηλές θερμοκρασίες Oι δύοκύριες οικογένειες των συνοδών-πρωτεϊνών αυτών είναι οι Hsp70 και οι Hsp60 Ορθά αναδιπλωμένη πρωτεΐνη συνοδοί πρωτεΐνες συνοδοί πρωτεΐνες πρωτεάσες/απ οικοδόμηση

40 Οι συνοδοί-πρωτεΐνες δρουν διαδοχικά Hsp70 (DnaK) Μεταφορά στη σαπερονίνη (Hsp60, GroEL) Μη αναδιπλωμένη πρωτεΐνη Aναδιπλωμένη πρωτεΐνη

41 Οι πρωτεΐνες μοριακοί-συνοδοί βοηθούν στη πρωτεϊνική αναδίπλωση Αποσυσσωμάτωση J K TF 3' 5' ClpB GrpE ATP ADP J K ATP Μερικώς αναδιπλωμένη πρωτεΐνη GrpE Αναδίπλωση ADP Αναδιπλωμένη πρωτεΐνη ADP IbpA/B ATP Αναδίπλωση Κατακράτηση Hsp31 GroEL GroES Hsp33

42 Συνοδοί πρωτεΐνες εμπλέκονται στη μεταφορά σε μεμβρανικά οργανίδια Το παράδειγμα του μιτοχονδρίου Πολυπεπτιδική αλυσίδα Κυτταροπλασματική συνοδός πρωτεΐνη Μιτοχονδριακή συνοδός πρωτεΐνη Αναδιπλωμένη πρωτεΐνη Μιτοχόνδριο

43 Η είσοδος των πρωτεϊνών στο ΕΔ γίνεται ταυτόχρονα με τη μετάφραση σηματοδοτική αλληλουχία Σωματίδιο αναγνώρισης σήματος (ΣΑΣ) κυτταρόπλασμα αυλός του ΕΔ Υποδοχέας του ΣΑΣ σύμπλοκο μεταφοράς Sec61 (=κανάλι μετατόπισης) σηματοδοτική πεπτιδάση 2000 by Geoffrey M. Cooper

44 Συνοδοί-πρωτεΐνες αναδιπλώνουν αλλά και συγκρατούν τις πρωτεΐνες στον αυλό του ΕΔ Αυλός του ΕΔ 2000 by Geoffrey M. Cooper

45 Συνοδοί πρωτεΐνες εμπλέκονται και στον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών του ΕΔ EΔ Λάθος αναδιπλωμένη πρωτείνη Σωστά αναδιπλωμένη πρωτείνη Συνοδός πρωτείνη Eκβλαστάνον κυστίδιο μεταφοράς

46 Ρύθμιση της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης στο ΕΔ μεταφορά έξω από το ΕΔ Ουβικιτινωση πρωτεασωμική αποικοδόμηση Προϊόντα αποικοδόμησης Golgi ριβοσωμάτιο λάθος αναδίπλωση κυστίδιο Είσοδος στο ΕΔ Μετατροπή & αναδίπλωση Ορθή αναδίπλωση ΕΔ CM Dobson, Protein folding and misfolding, Nature, 426, (2003) Πολλές νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες μεταφέρονται στο ΕΔ όπου και αποκτούν τις ανώτερες δομές τους με τη βοήθεια συνοδώνπρωτεϊνών ή άλλων παραγόντων που προάγουν την πρωτεϊνική αναδίπλωση. Οι σωστά αναδιπλωμένες πρωτεΐνες μεταφέρονται κατόπιν στη συσκευή Golgi και στη συνέχεια κατευθύνονται (με κυστιδιακή μεταφορά) στο σωστό μεμβρανικό οργανίδιο ή στον εξωκυττάριο χώρο. Πρωτεΐνες που δεν έχουν αναδιπλωθεί σωστά ανιχνεύονται από τους μηχανισμούς ποιοτικού ελέγχου της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης και ανακατευθύνονται με διαφορετικό μηχανισμό (unfolded protein response, απόκριση σε μη αναδιπλωμένες πρωτεΐνες). Ο μηχανισμός αυτός οδηγεί στην ουβικιτίνωση των λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών και στην αποικοδόμηση τους από τα πρωτεασωμάτια.

47 Μετά τη σύνθεση τους πολλές πρωτεΐνες συνδέονται μη ομοιοπολικά με μικρά μόρια Ρετινάλη Αίμη

48 Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών είναι μία από τις σημαντικότερες ομοιοπολικές τροποποιήσεις ØΗ φωσφορυλίωσητων πρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την μεταβολή των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων και κατα συνέπεια της δομής τους. ØΟι παραπάνω δομικές αλλαγές μπορεί να επηρεάσουν την ενεργότητα της πρωτεΐνης ή/και τις αλληλεπιδράσεις της με άλλα βιομόρια. ΑΝΕΝΕΡΓΟ Πλευρική αλυσίδα σερίνης Κινάση πρωτεϊνών Κινάση Φωσφατάση πρωτεϊνών φωσφατάση ΕΝΕΡΓΟ ΕΝΕΡΓΟ Κινάση φωσφατάση ΑΝΕΝΕΡΓΟ

49 Η φωσφορυλίωση των πυρηνικών λαμινών οδηγεί σε αποσυναρμολόγηση του πυρηνικού υμένα Σύντηξη των κυστιδίων του πυρηνικού φακέλου Πυρηνικός πόρος λαμίνες εσωτερική πυρηνική μεμβράνη εξωτερική πυρηνική μεμβράνη Πυρηνικός φάκελλος Φωσφορυλίωση των λαμινών ΜΕΣΟΦΑΣΙΚΟΣ ΠΥΡΗΝΑΣ χρωματίδη χρωμόσωμ α κυστίδιο πυρηνικού φακέλου ΤΕΛΟΦΑΣΗ Αποφωσφορυλίωση των λαμινών φωσφορυλιωμένες λαμίνες ΠΡΟΦΑΣΗ

50 Σύνδεση υδατανθρακικών αλυσίδων στις γλυκοπρωτεΐνες Ν-Δεσμός Ασπαραγίνη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη συνδεδεμένη με ασπαραγίνη Ο-Δεσμός Σερίνη Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη συνδεδεμένη με σερίνη

51 Σύνδεση πρωτεϊνών με μεμβρανικά γλυκολιπίδια κυτταρόπλασμα Αλυσίδες λιπαρών οξέων αιθανολαμίνη ολιγοσακχαρίτης Αυλός ενδοπλασματικού δικτύου

52 Τοπολογίας μιάς μεμβρανικής πρωτεΐνης συνδεδεμένης με γλυκολιπιδική «άγκυρα»

53 Προσθήκη λιπαρών οξέων σε πρωτεΐνες

54 Ωρίμανση πρωτεϊνών με μερική πρωτεόλυση και με σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών Πρε-προϊνσουλίνη Οσχηματισμός των δισουλφιδικών δεσμών απαιτεί οξειδωτικό περιβάλλον και επιταχύνεται από εξειδικευμένα ένζυμα (π.χ. την ισομεράση των δισουλφιδικών δεσμών, PDI) Σηματοδοτική αλληλουχία Αποκοπή σηματοδοτικής αλληλουχίας Σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών Ενδιάμεσο (συνδετικό) πολυπεπτίδιο Αποκοπή συνδετικού πολυπεπτιδίου προϊνσουλίνη ϊνσουλίνη

55 Επιτάχυνση του σχηματισμού δισουλφιδικών δεσμών από εξειδικευμένα ένζυμα

56 Πολλά οργανίδια και πρωτεΐνες αποδομούνται στα λυσοσωμάτια βακτήριο φαγόσωμα φαγοκυττάρωση Kυτταρική Mεμβράνη Πρώιμο ενδόσωμα ενδοκυττάρωση Όψιμο ενδοσωμάτιο Λυσοσωμάτιο Eνδοπλασματικό δίκτυο Mιτοχόνδριο αυτοφαγοσωμάτιο αυτοφαγία

57 Η αποδόμηση των πρωτεϊνών των ευκαρυωτών επιτελείται κυρίως στα πρωτεοσωμάτια Μηχανισμός εισόδου εξαρτώμενος από την ουβικιτίνη Πρωτεΐνη που προορίζεται για αποικοδόμηση πεπτίδια Πρωτεολυτική μηχανή

58 Αποδόμηση ευκαρυωτικών πρωτεϊνών στα πρωτεοσωμάτια

59 Οι λιγάσες της ουβικιτίνης «μαρκάρουν» τις πρωτεΐνες για αποικοδόμηση ουβικιτίνη Πρωτεΐνη στόχος Πολυουβικιτίνωση Πρωτεάσωμα πεπτίδιο

60 Ο μηχανισμός της ουβικιτίνωσης Ε1 ενεργοποιητής της ουβικιτίνης Ε2 μεταφορέας της ουβικιτίνης Ε3 λιγάση της ουβικιτίνης Πρωτεϊνικά υποστρώματα ουβικιτίνη Ενεργοποίηση Εξειδικευμένη ουβικιτίνωση Αναγνώριση υποστρώματος

61 Σας Ευχαριστώ για την Προσοχή σας