ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. Σύνθεση πρωτεϊνών, Eπεξεργασία και Ρύθμιση της λειτουργίας τους. Ευάγγελος Κωλέττας

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Σύνθεση πρωτεϊνών, Eπεξεργασία και Ρύθμιση της λειτουργίας τους Ευάγγελος Κωλέττας Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Κυτταρικής Βιολογίας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων και Συμβεβλημένο Μέλος ΔΕΠ Τμήμα Βιοϊατρικών Ερευνών Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας (ΙΜΒΒ) Ίδρυμα Τεχνολογίας & Έρευνας (ΙΤΕ), Ιωάννινα Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση Ιωάννινα

2 Κεντρικό Δόγμα: Η πληροφορία μπορεί να διαιωνίζεται ή να μεταφέρεται από το ένα είδος νουκλεϊκού οξέος στο άλλο, αλλά η ροή της πληροφορίας προς την πρωτεΐνη είναι μονής κατεύθυνσης. ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ είναι η σύνθεση πρωτεϊνών που διεξάγεται στα ριβοσώματα και καθοδηγείται από το mrna. Είναι δε μια εξελικτικά μια καλά συντηρημένη διαδικασία. Οι πρωτεΐνες διεξάγουν σχεδόν όλες τις κυτταρικές διαδικασίες. Η πρωτεϊνοσύνθεση αποτελεί το τελικό στάδιο της διαδικασίας της γονιδιακής έκφρασης. Για να είναι λειτουργική μια πρωτεΐνη θα πρέπει: 1. να αναδιπλωθεί και να αποκτήσει την κατάλληλη στερεοδιαμόρφωση 2. συχνά, να υποστεί επεξεργασία πριν μετατραπεί στην ενεργή μορφή της 2

3 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΑΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, καθένα από τα στάδια στην πορεία της έκφρασης του γενετικού υλικού είναι δυνατόν να υφίσταται ρύθμιση. Το επίπεδο έκφρασης ενός γονιδίου καθορίζεται από τη συντονισμένη λειτουργία όλων αυτών των μηχανισμών ρύθμισης. Η γονιδιακή έκφραση δε ρυθμίζεται μόνο στο επίπεδο της μεταγραφής, αλλά και στο επίπεδο της μετάφρασης, τόσο στους προκαρυωτικούς, όσο και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Μετά την πρωτεϊνοσύνθεση, η ενεργότητα των πρωτεϊνών ρυθμίζεται από κυτταρικούς μηχανισμούς. Οι περισσότερες πρωτεΐνες ρυθμίζονται από: i. Ομοιοπολικές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ii. Aλληλεπιδράσεις με άλλα μόρια, ως απόκριση σε εξωκυτταρικά σήματα iii. Το ρυθμό αποικοδόμησης τους που καθορίζει τη συγκέντρωση τους Αυτές οι τροποποιήσεις, ιδιαίτερα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι στενά συνδεδεμένες με τις διαδικασίες διαλογής των πρωτεϊνών και μεταφοράς στα κατάλληλα κυτταρικά διαμερίσματα (ΕΔ, Συσκευή Golgi). Οι μηχανισμοί ελέγχου της ενεργότητας και της ποσότητας των πρωτεϊνών ευθύνονται επομένως και για τη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών. 3

4 Όλα τα mrna μεταφράζονται με κατεύθυνση 5 προς 3, και οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες συντίθενται στα ριβοσώματα από το αμινοτελικό προς το καρβοξυτελικό άκρο. Κάθε αμινοξύ καθορίζεται από μια τριάδα βάσεων του mrna, ένα κωδικόνιο, σύμφωνα με το γενετικό κώδικα. Ο βασικός μηχανισμός της μετάφρασης είναι κοινός σ όλα τα κύτταρα: 1. Η μετάφραση διεξάγεται στα ριβοσώματα 2. Στη πρωτεϊνοσύνθεση διεξάγονται αλληλεπιδράσεις μεταξύ: (α) 3 τύπων RNA: mrna, trna και rrna Τα μόρια trna λειτουργούν ως προσαρμοστές (adaptors) που παρεμβάλλονται ανάμεσα στη μήτρα mrna και τα αμινοξέα που ενσωματώνονται στην υπο σύνθεση πρωτεΐνη. (β) πρωτεϊνών, απαραίτητων στη διαδικασία της μετάφρασης (παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού) 4

5 ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Ο γενετικός κώδικας είναι: Τριαδικός (κωδικόνιο) Παγκόσμιος (καθολικός) Εκφυλισμένος (συνώνυμα) Μη επικαλυπτόμενος 64 κωδικόνια: 61 κωδικοποιούν ένα από τα 20 αμινοξέα (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ). Με εξαίρεση τη Met και Trp που κωδικοποιούνται από 1 κωδικόνιο, τα υπόλοιπα 18 αμινοξέα κωδικοποιούνται από 2-6 διαφορετικά κωδικόνια. Τα κωδικόνια που κωδικοποιούν το ίδιο αμινοξύ ονομάζονται συνώνυμα 3 είναι κωδικόνια τερματισμού αλυσίδας (UAA, UAG, UGA) και δεν καθορίζουν κάποιο αμινοξύ. Το AUG (κωδικοποιεί τη μεθειονίνη) είναι το κωδικόνιο έναρξης, δηλ. αυτό από το οποίο αρχίζει η πρωτεϊνοσύνθεση. 5

6 Ο γενετικός κώδικας είναι τριαδικός, μια τριάδα δηλαδή νουκλεοτιδίων (κωδικόνιο) κωδικοποιεί ένα αμινοξύ. Είναι παγκόσμιος (καθολικός), καθώς το ίδιο κωδικόνιο κωδικοποιεί το ίδιο αμινοξύ σε όλους τους οργανισμούς (εξαιρέσεις: archaea, fungi, μιτοχόνδρια). Η παγκοσμιότητα του γενετικού κώδικα είναι το ισχυρότερο επιχείρημα υπέρ της κοινής καταγωγής των οργανισμών. Τα διαφορετικά αμινοξέα που συγκροτούν τις πρωτεΐνες είναι 20. Ο αριθμός των διαφορετικών νουκλεοτιδίων που συγκροτούν το RNA είναι 4. Αν τα 4 νουκλεοτίδια συνδυαστούν ανά ένα: 41 = 4 δίνουν 4 διαφορετικούς συνδυασμούς νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν μόνο 4 από τα 20 αμινοξέα Αν τα 4 νουκλεοτίδια συνδυαστούν ανά δύο: 42 = 16 διαφορετικούς συνδυασμούς νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν μόνο 16 από τα 20 αμινοξέα Αν τα 4 νουκλεοτίδια συνδυαστούν ανά τρία: 43 = 64 διαφορετικούς συνδυασμούς νουκλεοτιδίων που είναι παραπάνω από αρκετοί Άρα, ο γενετικός κώδικας είναι εκφυλισμένος, με την έννοια ότι όλα τα αμινοξέα, εκτός από δύο, κωδικοποιούνται από περισσότερα του ενός κωδικόνια. Με εξαίρεση τη μεθειονίνη (Met) και την τρυπτοφάνη (Trp) που κωδικοποιούνται από ένα κωδικόνιο, τα υπόλοιπα 18 αμινοξέα κωδικοποιούνται από 2 μέχρι και 6 διαφορετικά κωδικόνια. Τα κωδικόνια που κωδικοποιούν το ίδιο αμινοξύ ονομάζονται συνώνυμα. Η ύπαρξη αυτών των συνώνυμων κωδικονίων, παρέχει τη δυνατότητα η γενετική πληροφορία να εκφράζεται αναλλοίωτα, παρά τις ενδεχόμενες αλλαγές (μεταλλάξεις) στο γενετικό υλικό. 64 κωδικόνια: 61 κωδικοποιούν ένα από τα 20 αμινοξέα, 3 είναι κωδικόνια τερματισμού αλυσίδας (UAA,UAG, UGA) και δεν καθορίζουν κάποιο αμινοξύ. Το AUG (κωδικοποιεί τη μεθειονίνη) είναι το κωδικόνιο έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Το GUG ή και το UUG, που κωδικοποιούν για βαλίνη (Val) και λευκίνη (leu) δρουν ως κωδικόνια έναρξης Ο γενετικός κώδικας είναι μη επικαλυπτόμενος. Αυτό σημαίνει ότι η μετάφραση αρχίζει από καθορισμένα σημεία του mrna προχωρώντας τρία νουκλεοτίδια κάθε φορά. Έτσι αποκλείεται ένα νουκλεοτίδιο να διαβαστεί δύο φορές ως μέλος διαφορετικών κωδικονίων. 6

7 Ρόλος του trna στην πρωτεϊνοσύνθεση Δομή τριφυλλιού Δομή του trnaphe CCA Βραχίονας-δέκτης Βρόγχος D Αναδιπλωμένη μορφή σε σχήμα L Μοντέλο στο χώρο (3D) Βρόγχος ΤψC Μεταβλητός βρόγχος Βραχίοναςαντικωδικωνίου ΕΙΚΟΝΑ 8.1: Δομή των trna - Δομή του trna της φαινυλαλανίνης στο σακχαρομύκητα (Α) Το trna απεικονίζεται στη μορφή του «τριφυλλιού» και υποδεικνύονται οι βάσεις που ζευγαρώνουν μεταξύ τους. Οι τροποποιημένες βάσεις συμβολίζονται με mg (μεθυλογουανοσίνη), mc (μεθυλοκυτιδίνη), DHU (διυδροουριδίνη), T (ριβοθυμιδίνη), Y (μια τροποποιημένη πουρίνη, συνήθως αδενοσίνη) και ψ (ψευδοουριδίνη). (Β) Το trna απεικονίζεται στην αναδιπλωμένη σε σχήμα L μορφή του. (Γ) Χωροπληρωτικό μοντέλο του trna. (Γ, Dan Richardson) Shi H & Moore PB (2000) RNA 6:

8 Δομή 2D (σχήμα τριφυλλιού): Οι 4 βραχίονες είναι διπλές έλικες που σταθεροποιούνται με δεσμοί υδρογόνου ( ), και οι 3 από τους 4 βραχίονες φέρουν 3 βρόγχους, στον μεσαίο από τους οποίους εντοπίζεται το αντικωδικώνιο. Η θέση πρόσδεσης του αμινοξέος εντοπίζεται στον βραχίονα χωρίς βρόγχο. Δομή 3D (σχήμα L): Η αναδίπλωση του trna σε μια συμπαγή τρισδιάστατη δομή σε σχήμα L, όπου ο βρόγχος του αντικωδικωνίου και ο βραχίονας-δέκτης αποτελούν τα 2 τμήματα του σχήματος L, απαραίτητη διαμόρφωση για την ορθή πρόσδεση του trna στο ριβόσωμα, αλλά και για την προαγωγή της αποκωδικοποίησης. 8

9 Ρόλος του trna στην πρωτεϊνοσύνθεση Κατά τη μετάφραση, καθένα από τα 20 αμινοξέα θα πρέπει να στοιχιστεί με ένα αντίστοιχο κωδικόνιο της μήτρας mrna. Αυτό επιτυγχάνεται από τα μόρια trna. Περίπου διαφορετικά trnas έχουν χαρακτηρισθεί στα βακτήρια, και trnas έχουν χαρακτηρισθεί σε ζωικούς και φυτικούς οργανισμούς. Επομένως, ο αριθμός των trnas στα περισσότερα κύτταρα είναι μεγαλύτερος από τον αριθμό των αμινοξέων που χρησιμοποιούνται στην πρωτεϊνοσύνθεση (20), αλλά και από τον αριθμό των κωδικονίων στο γενετικό κώδικα (61). Όλα τα μόρια trna έχουν παρόμοια δομή λόγω της κοινής λειτουργίας που επιτελούν κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Ωστόσο κάθε συγκεκριμένο trna φέρει μια χαρακτηριστική αλληλουχία ώστε να προσδένει μόνον το συγκεκριμένο αμινοξύ για τη μεταφορά του οποίου προορίζεται. Τα μόρια trna έχουν μήκος ~70-80 νουκλεοτίδια. Λόγω της διαμόρφωσης των διαφορετικών περιοχών τους που φέρουν συμπληρωματικές αλληλουχίες αποκτούν μια χαρακτηριστική δευτεροταγή διαμόρφωση σε σχήμα τριφυλλιού. Όλα τα trna αναδιπλώνονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίσουν μια συμπαγή τρισδιάστατη δομή σε σχήμα L, απαραίτητη για την ορθή πρόσδεση του trna στο ριβόσωμα. Τα μόρια trna δρουν ως προσαρμοστές που παρεμβάλλονται ανάμεσα στις τριπλέτες του mrna και τα αμινοξέα. Αυτή η λειτουργία των trna οφείλεται σε 2 διακριτές περιοχές του μορίου: (α) τη Περιοχή πρόσδεσης αμινοξέος στο 3' άκρο του μορίου το οποίο σ' όλα τα μόρια trna αποτελείται από τη συντηρημένη αλληλουχία CCA. Το αμινοξύ προσδένεται ομοιοπολικά στη ριβόζη της τελικές αδενοσίνης (Α) στο 3' άκρο του trna, και (β) τη περιοχή όπου εντοπίζεται ο βρόγχος του αντικωδικονίου (anticodon) που βρίσκεται στο άλλο άκρο του μορίου trna. Το αντικωδικώνιο αλληλεπιδρά με το αντίστοιχο κωδικώνιο του mrna λόγω της συμπληρωματικότητας των βάσεων. 9

10 Στάδια της Πρωτεϊνοσύνθεσης Η μετάφραση διεξάγεται στα ριβοσώματα [P: 70S (30S+50S); E: 80S (40S+60S)] 1. Η πρόσδεση των αμινοξέων στα trna καταλύεται από τις συνθετάσες των αμινοακυλο-trna 2. Στοίχιση του αμινοξέος με τη μήτρα mrna: Μετά την πρόσδεση του στο trna, το αμινοξύ στοιχίζεται στη μήτρα mrna, μέσω του ζευγαρώματος ανάμεσα στις συμπληρωματικές βάσεις του κωδικονίου του mrna και του αντι-κωδικονίου του trna. 3. Η οργάνωση των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών mrna και η έναρξη της μετάφρασης: Σήματα έναρξης της μετάφρασης 4. Η διαδικασία της μετάφρασης: Έναρξη - Επιμήκυνση - Τερματισμός εναρκτήριο μεθειονυλο-trna (trnafmet) Εξειδικευμένες μη-ριβοσωμικές πρωτεΐνες: Μεταφραστικοί Παράγοντες έναρξης (IF), επιμήκυνσης (EF), τερματισμού (RF) ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ: 8.1: ANIMATION ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ 10

11 Τα συστατικά που λαμβάνουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση 11

12 Πως εξασφαλίζεται η ορθή αλληλουχία / σειρά των αμινοξέων σε μια πρωτεΐνη; Θα πρέπει τα trna να μεταφέρουν το σωστό αμινοξύ στο σωστό κωδικόνιο του mrna. Αυτό επιτυγχάνεται με εξειδικευμένα ένζυμα: Η πρόσδεση των αμινοξέων στα ειδικά μόρια trna που προορίζονται για τη μεταφορά τους καταλύεται από μια ομάδα ενζύμων που ονομάζονται συνθετάσες των αμινοακυλο-trna (aminoacyl-trna synthetases) (Paul Zamecnik & Mahlon Hoagland, 1957). Καθένα από τα 20 ένζυμα αναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ και ένα ή περισσότερα συγκεκριμένα μόρια trna τα οποία είναι εξειδικευμένα για αυτό το αμινοξύ. Η αντίδραση διεξάγεται σε δύο στάδια. 12

13 ΕΙΚΟΝΑ 8.2: Η πρόσδεση των αμινοξέων στα trna. Αρχικά, το αμινοξύ ενεργοποιείται αντιδρώντας με ATP όπου το ATP υδρολύεται και συνδέεται στο αμινοξύ ένα AMP, ώστε να σχηματιστεί ένα ενδιάμεσο μόριο αμινοακυλο-amp. Στο επόμενο βήμα, το ενεργοποιημένο αμινοξύ (αμινοακυλοαμp) μεταφέρεται στο 3 άκρο CCA του αντίστοιχου trna με ταυτόχρονη απελευθέρωση του AMP. Συγκεκριμένα, προσδένεται μέσω της καρβοξυλομάδας στη ριβόζη του ριβονουκλεοτιδίου της αδενίνης (Α) της αλληλουχίας CCA. Και τα δύο βήματα της αντίδρασης καταλύονται από τη συνθετάση αμινοακυλο-trna. συνθετάσες των αμινοακυλο-trna Οι συνθετάσες των αμινοακυλο-trna είναι ένζυμα υψηλής εξειδίκευσης στην αναγνώριση του σωστού αμινοξέος που εξασφαλίζεται μέσω της αλληλεπίδρασης του ενζύμου με ειδικές αλληλουχίες χαρακτηριστικές για κάθε μόριο trna όπου συμπεριλαμβάνεται και το αντικωδικόνιο. Η υψηλή πιστότητα αναγνώρισης του σωστού αμινοξέος επιτυγχάνεται εν μέρει με ένα μηχανισμό διορθωτικού ελέγχου μέσω του οποίου το λανθασμένο ενεργοποιημένο αμινοξύ υδρολύεται και δεν προσδένεται στο trna κατά το 2ο βήμα της αντίδρασης. 13

14 2. Στοίχιση του αμινοξέος με τη μήτρα mrna: Μετά την πρόσδεση του στο trna, το αμινοξύ στοιχίζεται στη μήτρα mrna, μέσω του ζευγαρώματος ανάμεσα στις συμπληρωματικές βάσεις του κωδικονίου του mrna και του αντικωδικονίου του trna. Το ζευγάρωμα των βάσεων του κωδικονίου αντικωδικονίου είναι λιγότερο αυστηρό από το τυπικό ζευγάρωμα μεταξύ A-U & G-C. που αναγνωρίζει το κωδικόνιο UUC & UUU Εικόνα 8.3 (Α): Ζευγάρωμα του trnaphe με το κωδικόνιο του mrna. Το τυπικό ζευγάρωμα G-C είναι ισχυρό Το ζευγάρωμα G-U είναι λιγότερο ισχυρό: Μια γουανοσίνη ζευγαρώνει με Ουριδίνη Το ζευγάρωμα στην 3η θέση του κωδικονίου είναι λιγότερο αυστηρό Έτσι, είναι δυνατόν μια G να ζευγαρώσει κανονικά με μια C (G-C), αλλά και με μια U (G-U) - μη τυπικό ζευγάρωμα. 14

15 Αυτό σχετίζεται με τον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα, καθώς: - τα αμινοξέα καθορίζονται από περισσότερα του ενός κωδικόνια - το ότι ορισμένα αμινοξέα προσδένονται σε περισσότερα από ένα είδη trna - ορισμένα trna αναγνωρίζουν περισσότερα από ένα κωδικόνια του mrna μέσω της δημιουργίας μη τυπικών ζευγών βάσεων ανάμεσα στο αντι-κωδικόνιο του trna και την 3η βάση του κωδικονίου του mrna. Αυτό το φαινόμενο της δημιουργίας μη τυπικών ζευγών βάσεων ονομάζεται ταλάντευση (wobble). Στο πλαίσιο της ταλάντευσης, παρατηρούνται ζεύγη βάσεων του τύπου G-U. Ένα άλλο παράδειγμα ταλάντευσης κατά το αντικωδικονίου, εκτός του trnaphe, είναι το trnaleu. ζευγάρωμα κωδικονίου- Δυο διαφορετικά κωδικόνια λευκίνης (CUC, CUU) μπορούν να ζευγαρώσουν με το αντικωδικόνιο του ίδιου μορίου trna λευκίνης, κατά παράβαση των συνηθισμένων κανόνων ζευγαρώματος των βάσεων 15

16 Στο μεταφορικό RNA συναντώνται ριβονουκλεοτίδια που περιέχουν ασυνήθιστες αζωτούχες βάσεις NH2 (Αδενοσίνη) Δομή μερικών τροποποιημένων βάσεων του trna. Η ριβοθυμιδίνη (T), η διυδροουριδίνη (DHU) και η ψευδοουριδίνη (Ψ) σχηματίζονται μέσω της τροποποίησης ουριδινών του trna. Η μεθυλογουανοσίνη σχηματίζονται μέσω της τροποποίησης καταλοίπων γουανοσίνη (βλ. Εικ. 7.44) Η ινοσίνη προκύπτει από την τροποποίηση καταλοίπων αδενοσίνης (Α) με απαμίνωση κατά τη διαδικασία τροποποίησης (ωρίμανσης) των trna. Η αδενίνη μετατρέπεται σε αδενοσίνη ή μονοφωσφορική ινοσίνη (IMP) που και τα δύο μπορούν να μετατραπούν σε ινοσίνη. Στο πλαίσιο της ταλάντευσης, παρατηρούνται επίσης ζεύγη βάσεων του τύπου: Ι-U, I-C και I-A στα οποία συμμετέχει η Ινοσίνη (Ι) από την πλευρά του αντικωδικονίου. 16

17 ΕΙΚΟΝΑ 8.3 (Β): Το μη τυπικό ζευγάρωμα κωδικονίου και αντικωδικονίου Επίσης, μια ινοσίνη (I) του αντικωδικονίου είναι δυνατόν να ζευγαρώσει με μια ουριδίνη (U), μια κυτιδίνη ή μια αδενίνη του κωδικονίου. Στην Εικ 8.3A παρουσιάζονται δύο σχετικά παραδείγματα ασυνήθιστου ζευγαρώματος βάσεων, χάρη στο οποίο το trna της φαινυλαλανίνης μπορεί να αναγνωρίσει τόσο το κωδικόνιο UUC όσο και το κωδικόνιο UUU, ενώ το trna της αλανίνης (CGI) μπορεί να αναγνωρίσει τρία κωδικόνια: το GCU, το GCC και το GCA. Άρα η παρουσία της ινοσίνης (Ι) στο αντικωδικόνιο επιτρέπει σε ένα μόνο trna (trnaala) να αναγνωρίζει 3 διαφορετικά κωδικόνια της μήτρας mrna. 17

18 K14, Russell PJ, igenetics 18

19 Προκαρυωτικά και Ευκαρυωτικά Ριβοσώματα Είναι δομές/θέσεις όπου επιτελείται η πρωτεϊνοσύνθεση στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα Μετά από λύση κυττάρων διαχωρίζονται με υπερφυγοκέντρηση με βάση το συντελεστή καθίζησης S (συντελεστής καθίζησης Svedberg: ταχύτητα καθίζησης / χρόνο) Ο συντελεστής καθίζησης είναι 70S για τα βακτηριακά και 80S για τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα Aποτελούνται από 2 υπομονάδες (1 μικρή & 1 μεγάλη) και κάθε μία περιέχει χαρακτηριστικές πρωτεΐνες και rrna [P: 70S (30S+50S); E: 80S (40S+60S)] Οι υπομονάδες των ευκαρυωτικών είναι μεγαλύτερες και περιέχουν περισσότερες πρωτεΐνες από τις αντίστοιχες υπομονάδες των προκαρυωτικών Παίζουν κεντρικό ρόλο στη πρωτεϊνοσύνθεση και τα κύτταρα έχουν μεγάλο αριθμό ριβοσωμάτων: (Α) τα βακτηριακά κύτταρα, π.χ. E. Coli έχει ριβοσώματα ή 25% του ξηρού τους βάρους (Β) τα πολλαπλασιαζόμενα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν~10x106 ριβοσώματα 19

20 In vitro τα ριβοσώματα αυτοσυναρμολογούνται με ανάμιξη rrna και πρωτεϊνών (M. Nomura, 1968) In vivo, όμως η ανασύσταση λειτουργικών ριβοσωμάτων είναι περίπλοκη διαδικασία Professor Masayasu Nomura Professor of Biochemistry University of California, Irvine ( ) ΕΙΚΟΝΑ 8.4: Δομή του ριβοσώματος. (Α) Τα συστατικά των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων. Τα πλήρη προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά ριβοσώματα αναφέρονται ως 70S και 80S αντίστοιχα, με βάση τον συντελεστή καθίζησης τους κατά την υπερφυγοκέντρηση. Αποτελούνται από μία μεγάλη και μία μικρή υπομονάδα, οι οποίες συνίστανται από ριβοσωμικές πρωτεΐνες και ριβοσωμικά RNA (rrna). 20

21 Δομή του προκαρυωτικού ριβοσώματος Η μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος της E. Coli ονομάζεται 30S και αποτελείται από το 16S rrna και 21 πρωτεΐνες. Η μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος της E. Coli ονομάζεται 50S και αποτελείται από δύο μόρια rrna, τα 23S και 5S rrna, και από 34 πρωτεΐνες. Κάθε ριβόσωμα συνίσταται από ένα αντίγραφο των rrna του και ένα αντίγραφο καθεμιάς από τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, με εξαίρεση μια πρωτεΐνη της υπομονάδας 50S που υπάρχει σε 4 αντίγραφα. 30 S 50 S ΕΙΚΟΝΑ 8.4: Δομή του προκαρυωτικού ριβοσώματος. (Β-Γ) Κρυσταλλικές δομές υψηλής ανάλυσης με ακτίνες Χ της ριβοσωμικής υπομονάδας 30S (Β) και της ριβοσωμικής υπομονάδας 50S (Γ). [B, WimberlyBT et al., (2000) Nature 407:327. Γ, Ban N et al., (2000) Science 289:905] 21

22 III II Τα rrna, όπως τα trna, αποκτούν δευτεροταγή δομή με ζευγάρωμα συμπληρωματικών βάσεων Λόγω των αλληλεπιδράσεων τους με ριβοσωμικές πρωτεϊνες αναδιπλώνονται περαιτέρω προς τρισδιάστατες δομές 5 3 αλληλουχία αντιshine-dalgarno στο 3 άκρο IV I Το 16S rrna αλληλεπιδρά με το 23S της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας 50S και διευκολύνει τη συγκρότηση του λειτουργικού ριβοσώματος ΕΙΚΟΝΑ 8.5: Η δομή του 16S rrna της μικρής υπομονάδας 30S του προκαρυωτικού ριβοσώματος. Εξαιτίας του ζευγαρώματος των βάσεων διαφορετικών περιοχών του, το 16S rrna αποκτά μια χαρακτηριστική δευτεροταγή δομή. 16S rrna: δευτεροταγή δομή μετά από ζευγάρωμα βάσεων διαφορετικών [Yusupov MM et al., (2001) Science 292:883] περιοχών του I-IV 22

23 Ο ρόλος των rrna στη πρωτεϊνοσύνθεση Αρχικά, θεωρήθηκαν ότι τα rrna είχαν δομικό ρόλο ως σκελετός συναρμολόγησης ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Σήμερα, είναι γνωστό ότι έχουν καταλυτικό ρόλο στην πρωτεϊνοσύνθεση: 1. Η παρουσία των rrna in vitro είναι απαραίτητη για το σχηματισμό λειτουργικών ριβοσωμάτων 2. Πειράματα του Harry Noller, 1992: Η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 50S μπορεί να καταλύσει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού (αντίδραση πεπτιδυλο-τρανσφεράσης). (α) Η επεξεργασία με RNάση καταστέλλει πλήρως το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, ενώ (β) Η απουσία πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών (90%) μειώνει μόνο την ενεργότητα των ριβοσωμάτων (λίγη πρωτεϊνοσύνθεση), χωρίς να οδηγεί σε πλήρη απώλεια της λειτουργικότητας τους Άρα: Το rrna καταλύει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, χωρίς όμως να αποκλείεται η συμμετοχή ορισμένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών 23

24 Μελέτες δομής υψηλής ευκρίνειας της προκαρυωτικής ριβοσωμικής υπομονάδας 50S απέδειξαν τον καταλυτικό ρόλο του rrna στην πρωτεϊνοσύνθεση: (α) οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες απουσιάζουν από τη θέση αντίδρασης της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης (β) υπεύθυνο μόριο σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού είναι το 23S rrna Η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα λειτουργεί ως ριβοένζυμο και καταλύει τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης Επομένως, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν δομικό και όχι καταλυτικό ρόλο στην πρωτεϊνοσύνθεση 3 μόρια trna συνδεδεμένα στις θέσεις A, P και E του ριβοσώματος ΕΙΚΟΝΑ 8.6: Δομή της προκαρυωτικής ριβοσωμικής υπομονάδας 50S. Απεικονίζεται ένα μοντέλο υψηλής ανάλυσης της ριβοσωμικής υπομονάδας 50S με τρία μόρια trna συνδεδεμένα στις θέσεις A, P και E του ριβοσώματος (βλ. Εικ. 8.12). Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες απεικονίζονται με μοβ χρώμα ενώ το rrna με γαλάζιο. [Nissen P et al., (2000) Science 289:920] 24

25 Ρόλος των rrna στην εξέλιξη Η άμεση συμμετοχή του rrna στη διαδικασία κατάλυσης της αντίδρασης της πεπτυδυλο-τρανσφεράσης προς το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού έχει σημαντικές συνέπειες στην εξέλιξη. (α) Το RNA θεωρείται ότι είναι το πρώτο μόριο με ικανότητα αυτο-αντιγραφής (το ριβοένζυμο RΝάση P και αυτο-ματιζόμενα ιντρόνια καταλύουν αντιδράσεις με υποστρώματα RNA). (β) Το rrna καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού κατά τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης, και άρα επεκτείνεται η καταλυτική δράση του RNA πέραν της ικανότητας της αυτο-αντιγραφής (γ) το ριβοένζυμο rrna της Tetrahymena μπορεί επίσης να καταλύσει την πρόσδεση των αμινοξέων στα trna. Ίσως, οι πρώτες συνθετάσες των αμινοακυλο-trna να ήταν RNA και όχι πρωτεΐνες. Άρα, η διαπίστωση ότι τα μόρια RNA μπορούν να καταλύσουν τόσο τη διαδικασία της αυτο-αντιγραφής όσον και τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης έχει σημαντικές προεκτάσεις σε ότι αφορά την κατανόηση των πρώϊμων σταδίων της εξέλιξης των κυττάρων. 25

26 Η οργάνωση των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών mrna και η έναρξη της μετάφρασης Πολυσιστρονικό mrna με 3 γονίδια (π.χ., οπερόνιο lac της E. coli) Μονοσιστρονικό ευκαρυωτικό mrna: 1 γονίδιο με καλύπτρα m7g και ουρά Πολύ (A) ΕΙΚΟΝΑ 8.7: Η οργάνωση των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών mrna. Τόσο τα προκαρυωτικά όσο και τα ευκαρυωτικά mrna φέρουν μη μεταφραζόμενες περιοχές (UTR) στο 5 και στο 3 άκρο τους. Τα ευκαρυωτικά mrna φέρουν επίσης μία καλύπτρα 7μεθυλογουανοσίνης (m7g) στο 5 άκρο τους και μία ουρά πολυ(α) στο 3 άκρο τους. Τα προκαρυωτικά mrna είναι συχνά πολυσιστρονικά (polycistronic), κωδικοποιούν δηλαδή πολλαπλές πρωτεΐνες, καθεμία από τις οποίες μεταφράζεται από ένα ανεξάρτητο ανοικτό αναγνωστικό πλαίσιο. Με ελάχιστες εξαιρέσεις, τα ευκαρυωτικά mrna είναι μονοσιστρονικά (monocistronic), κωδικοποιούν δηλαδή ένα μόνο πολυπεπτίδιο. 26

27 Η οργάνωση των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών mrna και η έναρξη της μετάφρασης Οι μηχανισμοί της μετάφρασης των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών είναι παρόμοιοι αλλά έχουν διαφορές στα σήματα που καθορίζουν τη θέση έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης πάνω στη μήτρα mrna. Και στα 2 είδη κυττάρων: (α) η μετάφραση αρχίζει σε μια συγκεκριμένη θέση στο mrna και όχι στο 5 άκρο του (β) το 5 και 3 άκρο τους έχει 5 και 3 μη-μεταφραζόμενες (μη-κωδικές) περιοχές (5 και 3 UTR; UnTranslated Regions) Τα προκαρυωτικά mrna συχνά κωδικοποιούν πολλαπλά πολυπεπτίδια που συντίθενται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο, και η μετάφραση τους αρχίζει από διαφορετικά σημεία του mrna. Τα mrna αυτά ονομάζονται πολυσιστρονικά Τα ευκαρυωτικά mrna είναι μονοσιστρονικά: δηλ. κωδικοποιούν 1 πολυπεπτίδιο, φέρουν μία καλύπτρα 7-μεθυλογουανοσίνης (m7g) και μία ουρά πολύ-a Στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά, η πρωτεϊνοσύνθεση αρχίζει πάντοτε από το εναρκτήριο αμινοξύ μεθειονίνη (AUG). Ειδικότερα, στα προκαρυωτικά, αρχίζει με το τροποποιημένο κατάλοιπο μεθειονίνης (Met), τη Ν-φορμυλο-μεθειονίνη (fmet), ενώ στα ευκαρυωτικά, αρχίζει με μη-τροποποιημένα κατάλοιπα, πλην των μιτοχονδρίων (αφού η πρωτεϊνοσύνθεση είναι ίδια με τα βακτήρια). Σε σπάνιες περιπτώσεις, αν χρησιμοποιηθεί εναλλακτικό κωδικόνιο, π.χ. GUG (βαλίνη) στα προκαρυωτικά κύτταρα τότε το κωδικόνιο αυτό καθοδηγεί την τοποθέτηση μεθειονίνης στο 5 άκρο του πολυπεπτιδίου και ΟΧΙ της βαλίνης 27

28 Δεσμοί-Η αλληλουχία Shine-Dalgarno ή Θέση πρόσδεσης ριβοσώματος (RBS) (A/G)CCAUGG - αλληλουχία Kozak RBS: καλύπτρα 5'-m7G ή η εσωτερική θέση εισόδου του ριβοσώματος (IRES). Tο εναρκτήριο κωδικόνιο συνήθως εντοπίζεται στην αλληλουχία Kozak (A/G)CCAUGG ΕΙΚΟΝΑ 8.8: Τα σήματα έναρξης της μετάφρασης. 28

29 ΕΙΚΟΝΑ 8.8: Τα σήματα έναρξης της μετάφρασης. Οι θέσεις έναρξης της μετάφρασης στους προκαρυωτικούς οργανισμούς χαρακτηρίζονται από την παρουσία της αλληλουχίας Shine-Dalgarno, η οποία προηγείται του κωδικονίου έναρξης AUG. Μέσω δεσμών υδρογόνου που αναπτύσσονται ανάμεσα στις βάσεις της αλληλουχίας Shine-Dalgarno και τις συμπληρωματικές προς αυτές βάσεις μιας αλληλουχίας κοντά στο 3 άκρο του 16S rrna, επιτυγχάνεται η ορθή διευθέτηση του mrna σε σχέση με το ριβόσωμα, προκειμένου να αρχίσει η πρωτεϊνοσύνθεση, όχι μόνο στην 5 περιοχή ενός mrna, άλλα και σε εσωτερικές θέσεις, όπως στα πολυσιστρονικά mrna. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρόσδεση της ριβοσωμικής υπομονάδας 40S στο mrna επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με την καλύπτρα 7μεθυλογουανοσίνης (m7g) του 5 άκρου ή μιας άλλης αλληλουχίας γνωστή ως εσωτερική θέση εισόδου του ριβοσώματος (Internal Ribosome Entry Site; IRES) που εντοπίζεται στην 5 -UTR. Και οι δύο θέσεις λειτουργούν ως θέση πρόσδεσης του ριβοσώματος (Ribosome Binding Site: RBS). Ακολούθως, η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα σαρώνει το mrna μέχρι να συναντήσει το κωδικόνιο έναρξης AUG. Για να διασφαλιστεί η πιστότητα της έναρξης της μετάφρασης, το εναρκτήριο κωδικόνιο συνήθως εντοπίζεται σε μια αλληλουχία γνωστή ως αλληλουχία Kozak (A/G)CCAUGG. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το ριβόσωμα προσπερνάει το κωδικόνιο έναρξης AUG, και μπορεί να αρχίσει την πρωτεϊνοσύνθεση από κάποιο άλλο AUG που βρίσκεται καθοδικά. Τέτοιες εσωτερικές θέσεις έναρξης της μετάφρασης ενεργοποιούνται σε καταστάσεις στρες, ή λόγω διαφοροποιήσεων στην αλληλουχία Kozak. 29

30 Διαδικασίας της Μετάφρασης ΕΙΚΟΝΑ 8.9: Σχηματική αναπαράσταση των τριών σταδίων της διαδικασίας της μετάφρασης: Έναρξη, Επιμήκυνση και Τερματισμός Στους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς το πρώτο βήμα κατά την έναρξη είναι η πρόσδεση των: mrna και ενός ειδικού εναρκτήριου μεθειονυλο-trna, στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα. Μετά την προσδεση της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας, προκύπτει ένα λειτουργικό ριβόσωμα που μπορεί να ακολουθήσει την επιμήκυνση της πολυπετπιδικής αλυσίδας Για την ολοκλήρωση της μετάφρασης απαιτούνται και εξειδικευμένες μη-ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Μεταφραστικοί Παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης, τερματισμού), διαφορετικές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών και με διακριτό ρόλο σε κάθε στάδιο 30

31 ΠΙΝΑΚΑΣ 8.1: Μεταφραστικοί παράγοντες IF = Initiator Factor eif = eukaryotic Initiator Factor EF = Elongation Factor eef = eukaryotic Elongation Factor RF = Release Factor erf = eukaryotic Release Factor 31

32 ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΑ Η μορφή IF2-GTP μπορεί να δεσμεύσει το fmet εναρκτήριο trna, αλλά όχι η μορφή IF-2-GDP (προ) εναρκτήριο σύμπλοκο 70S ΕΙΚΟΝΑ 8.10: Η έναρξη της μετάφρασης στα βακτήρια. 1. Αρχικά, στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα 30S προσδένονται οι παράγοντες έναρξης IF1 και IF3. 2. Κατόπιν, στο σύμπλοκο αυτό προσδένονται το εναρκτήριο N φορμυλομεθειονυλο-trna (fmettrna) που αλληλεπιδρά με τον παράγοντα έναρξης IF2 που είναι συνδεδεμένος με GTP, και το mrna. 3. Μόλις το εναρκτήριο trnafmet προσδεθεί στο κωδικόνιο έναρξης AUG στο mrna, τότε απελευθερώνονται οι IF1 και IF3 4. Στο σύμπλοκο προσδένεται η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 50S η οποία προκαλεί την υδρόλυση του GTP του IF2-GTP και την απελευθέρωση του IF2 συνδεδεμένου με GDP (IF2-GDP). Ετσι σχηματίζεται το εναρκτήριο σύμπλοκο 70S με το mrna και το εναρκτήριο trna συνδεδεμένα στο ριβόσωμα, είναι έτοιμο για σχηματισμό πεπτιδικών δεσμών και επιμήκυνση του πολυπεπτιδίου 32

33 Οι προκαρυωτικοί και οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν 2 διαφορετικά trnas για Met: trnaimet αρχίζει την πρωτεϊνοσύνθεση, ενώ το trnamet ενσωματώνει τη Met μόνο στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Υπάρχουν 3 θέσεις πρόσδεσης των trna στο ριβόσωμα: η θέση P (πεπτιδυλο, peptidyl), η θέση A (αμινοακυλο, aminoacyl) και η θέση E (εξόδου, exit) Και τα 2 trnas για μεθειονίνη (met) φορτίζονται από την ίδια συνθετάση του αμινοακυλο-trnamet, με τη διαφορά ότι το trnaimet μπορεί να προσδέσει στη θέση P, ενώ το trnamet μπορεί να προσδεθεί μόνο στη θέση Α. Υπάρχουν 3 θέσεις πρόσδεσης των trna στο ριβόσωμα: η θέση P, η θέση A και η θέση E 33

34 ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ eif2-gtp προσδένεται στο εναρκτήριο trnaimet το σύμπλοκο fmet trna /eif2-gtp προσδένεται στην υπομονάδα 40S Το ριβόσωμα κινείται καθοδικά προς το 3 άκρο και σαρώνει το mrna μέχρι να συναντήσει το πρώτο κωδικόνιο έναρξης AUG. Η ενέργεια που απαιτείται για την κίνηση του ριβοσώματος εξασφαλίζεται από την υδρόλυση ATP. Όταν εντοπιστεί το εναρκτήριο AUG, ο eif5 διεγείρει την υδρόλυση του GTP που βρίσκεται ως eif2-gtp, προκαλώντας την απελευθέρωση του eif2 (eif2-gdp) και Πρόσδεση στην άλλων παραγόντων έναρξης. Με τη βοήθεια του eif5b υπομονάδα 40S οι προσδένεται στο υπάρχον σύμπλοκο και η ριβοσωμική παράγοντες έναρξης υπομονάδα 60S. eif1, eif1a, eif3, eif5 Προεναρκτήριο σύμπλοκο Η μεταφορά του mrna στο προεναρκτήριο σύμπλοκο πραγματοποιείται μέσω της οικογένειας eif4e. - eif4e προσδένεται στην 5 m7g καλύπτρα, eif4g προσδένεται στον eif4e & PABP που αλληλεπιδρά με την ουρά πολυ(α) & των eif4a & eif4b Σχηματισμός (προ)εναρκτηρίου συμπλόκου 80S των ευκαρυωτικών κυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 8.11: Η έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης στα ευκαρυωτικά κύτταρα 34

35 ΕΙΚΟΝΑ 8.11: Η έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Eίναι πολυπλοκότερη απαιτώντας τουλάχιστον 11 πρωτεΐνες, τους ευκαρυωτικούς παράγοντες έναρξης (eif, eukaryotic Inittiation Factors) που ο καθένας αποτελείται από πολλαπλές πολυπεπτιδικές αλυσίδες. 1. Αρχικά, προσδένονται στη ριβοσωμική υπομονάδα 40S οι παράγοντες έναρξης eif1, eif1a, eif3 και eif5. 2. Ο eif2 που βρίσκεται σε σύμπλοκο με GTP (eif2-gtp) προσδένεται στο εναρκτήριο μεθειονυλο-trna (trnafmet). 3. Ακολούθως, το σύμπλοκο trnafmet/eif2-gtp προσδένεται επίσης στην υπομονάδα 40S (Προεναρκτήριο σύμπλοκο). 4. Οικογένεια eif4: Η μεταφορά του mrna στο προεναρκτήριο σύμπλοκο πραγματοποιείται μέσω του eif4e που προσδένεται στην 5 m7g καλύπτρα, του eif4g που προσδένεται τόσο στον eif4e που βρίσκεται προσδεδεμένος στην 5 καλύπτρα, όσο και στην PABP (PolyA-Binding Protein), που αλληλεπιδρά με την ουρά πολυ(α) στο 3 άκρο, του eif4a & eif4b. Η πρόσδεση του συμπλόκου eif4-mrna στο προεναρκτήριο σύμπλοκο της υπομονάδας 40S επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται ανάμεσα στον eif4g και eif3. 5. Κατόπιν, το ριβόσωμα κινείται καθοδικά προς το 3 άκρο και σαρώνει το mrna μέχρι να συναντήσει το πρώτο κωδικόνιο έναρξης AUG. Η ενέργεια που απαιτείται για την κίνηση του ριβοσώματος εξασφαλίζεται από την υδρόλυση ATP. Όταν εντοπιστεί το εναρκτήριο AUG, ο eif5 διεγείρει την υδρόλυση του μορίου GTP που βρίσκεται ως eif2-gtp, προκαλώντας την απελευθέρωση του eif2 (eif2-gdp) και άλλων παραγόντων έναρξης. Τότε, με τη βοήθεια του eif5b προσδένεται στο υπάρχον σύμπλοκο και η ριβοσωμική υπομονάδα 60S. Έτσι σχηματίζεται το εναρκτήριο σύμπλοκο της μετάφρασης 80S των ευκαρυωτικών κυττάρων 35

36 ΕΙΚΟΝΑ 8.12: Το στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης Η επιμήκυνση μιας πολυπετιδικής αλυσίδας διεξάγεται με ένα ρυθμό 3-5 αμινοξέα / δευτερόλεπτο, άρα πρωτεΐνες αμινοξέων συνθέτονται σε 1 min Υπάρχουν 3 θέσεις πρόσδεσης των trna στο ριβόσωμα: η θέση A (αμινοακυλο, aminoacyl), η θέση P (πεπτιδυλο, peptidyl), και η θέση E (εξόδου, exit) Το εναρκτήριο μεθειονυλο - trna προσδένεται στη θέση P, αφήνοντας κενή τη θέση A Η πρόσδεση ενός νέου αμινοακυλο-trna στη θέση Α διεξάγεται από τον eef1α-gtp σχηματισμός πεπεπτιδυλο-trnamet-ala που καταλύεται από το 23S rrna της μεγάλης ριβισωμικής υπομονάδας Η είσοδος ενός νέου αμινοακυλοtrna προάγει την απελευθέρωση του αφόρτιστου trna από τη θέση Ε EF-Tu EF-G ριβοσώματος κατά 3 νουκλεοτίδια 36

37 ΕΙΚΟΝΑ 8.12: Το στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης. 1. Στο ριβόσωμα υπάρχουν 3 θέσεις πρόσδεσης των trna: η θέση A (αμινοακυλο, aminoacyl), η θέση P (πεπτιδυλο, peptidyl), και η θέση E (εξόδου, exit). Το εναρκτήριο μεθειονυλο-trna προσδένεται στη θέση P, αφήνοντας κενή τη θέση A 2. Το πρώτο στάδιο κατά την επιμήκυνση συνίσταται στην πρόσδεση του επόμενου αμινοακυλοtrna στη θέση Α: Το επόμενο αμινοακυλο-trna (π.χ., το trna της αλανίνης) μεταφέρεται στη θέση Α από τον eef1α (σε σύμπλοκο με GΤP) στα ευκαρυωτικά κύτταρα (και από τον EF-Tu στα προκαρυωτικά κύτταρα). Ακολουθεί η υδρόλυση του GTP και η απομάκρυνση του eef1α (σε σύμπλοκο με GDP) που προκαλείται από την πρόσδεση του αμινοακυλο-trna στη θέση Α. Τώρα στη θέση Α βρίσκεται το φορτισμένο trna της αλανίνης. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω δεσμών ανάμεσα στο αντικωδικόνιο του trnaala και στο κωδικόνιο του mrna. 3. Κατόπιν, συνδέονται με πεπτιδικό δεσμό η Met με Ala. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη μεταφορά της Met στο αμινοακυλο-trna της θέσης Α, προς σχηματισμό ενός πεπτιδυλο-trnamet-ala που καταλύεται από το 23S rrna της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας. Τώρα στη θέση P βρίσκεται ένα αφόρτιστο trna 4. Το ριβόσωμα μετακινείται τρία νουκλεοτίδια κατά μήκος του mrna, έτσι ώστε το πεπτιδυλο-(metala) trna μετατοπίζεται στη θέση P, το αφόρτιστο trna μεταφέρεται στη θέση Ε, και η θέση Α μένει κενή στο σημείο που βρίσκεται το επόμενο κωδικόνιο που πρόκειται να μεταφραστεί, προκειμένου να δεχτεί το επόμενο φορτισμένο trna. Η μετατόπιση του ριβοσώματος διεκπεραιώνεται από τον eef2 και συνοδεύεται από υδρόλυση GTP (eef2-gtp σε eef2-gdp) στα ευκαρυωτικά κύτταρα, και από τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-G στα προκαρυωτικά κύτταρα. 1. Κατόπιν, εισέρχεται στη θέση Α ένα νέο αμινοακυλο-trna. Η παρουσία του επάγει την απελευθέρωση του αφόρτιστου trna από τη θέση Ε. Τώρα το ριβόσωμα είναι έτοιμο να καταλύσει το σχηματισμό του επόμενου πεπτιδικού δεσμού στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η διαδικασία που αναπαρίσταται σχηματικά στην εικόνα αφορά τα ευκαρυωτικά κύτταρα, αλλά είναι παρόμοια με αυτή στα βακτήρια. (Οι προκαρυωτικοί παράγοντες επιμήκυνσης αναφέρονται στον Πίνακα 8.1). 37

38 Καθώς η επιμήκυνση συνεχίζεται, ο eef1α (EF-Tu) που απελευθερώθηκε από το ριβόσωμα συνδεδεμένος με GDP, πρέπει να μετατραπεί και πάλι σε eef1α/gtp Αναγέννηση του συμπλόκου eef1α/gtp από τον eef1βγ (EF-Ts) Το αναγεννημένο σύμπλοκο eef1α/gtp μπορεί να μεταφέρει ένα νέο αμινοακυλοtrna στη θέση Α του ριβοσώματος ώστε να eef1βγ (EF-Ts): αρχίσει ένας νέος διεγείρει την κύκλος επιμήκυνσης ανταλλαγή του GDP με GTP παράγοντας επιμήκυνσης EF-Ts Η ρύθμιση της δράσης του eef1α γίνεται μέσω της δέσμευσης και υδρόλυσης του GTP σε GDP ΕΙΚΟΝΑ 8.13: Η αναγέννηση του συμπλόκου eef1α/gtp. Ο eef1α σε σύμπλοκο με GTP μεταφέρει τα αμινοακυλο-trna στο ριβόσωμα. Όταν το trna εισέλθει στο ριβόσωμα, το GTP υδρολύεται και ο eef1α απελευθερώνεται στη μορφή ενός ανενεργού συμπλόκου με GDP που δεν είναι σε θέση να προσδεθεί σε ένα νέο trna. Προκειμένου να αναγεννηθεί το ενεργό σύμπλοκο eef1α/gtp και να προχωρήσει απρόσκοπτα η διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης, απαιτείται η δράση ενός άλλου παράγοντα επιμήκυνσης, του eefβγ (ή EF-Ts), που διεγείρει την ανταλλαγή του GDP με GTP. 38

39 Σχηματισμός ενός πεπτιδικού δεσμού. Η α-αμινομάδα του αμινοακυλο-trna στη θέση Α (κόκκινο) προσβάλλει το άτομο άνθρακα της καρβοξυλομάδας του πεπτιδυλο-trna στη θέση P (μπλε) για να σχηματισθεί ένα πεπτιδυλο-trna μεγαλύτερο κατά ένα αμινοξύ στη θέση Α και ένα αφόρτιστο trna στη θέση P. Η υπομονάδα 50S στην οποία εντοπίζεται το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PT) σκιαγραφείται με ανοιχτό γκρι και η υπομονάδα 30S με σκούρο γκρι. Απεικονίζονται οι θέσεις A, P, και E στο ριβόσωμα. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου PT εντοπίζεται στην περιοχή V του 23S rrna μαζί με αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες στην υπομονάδα 50S. Beringer M and Rodnina MV (2007) The Ribosomal Peptidyl Transferase. Molecular Cell 26:

40 Η υψηλότατη ακρίβεια της πρωτεϊνοσύνθεσης (% λάθους <10-3) δεν καθορίζεται μόνον από το ζευγάρωμα του κωδικονίου του mrna με το αντικωδικόνιο του (αμινοακυλο-)trna, αλλά εξασφαλίζεται από τη λειτουργία ενός «κέντρου αποκωδικοποίησης» (decoding centre) στη μικρή 40S ριβοσωμική υπομονάδα, που διακρίνει με μεγάλη ευαισθησία την περίπτωση λανθασμένου ζευγαρώματος των βάσεων του κωδικονίου και του αντικωδικονίου, και αυτή η υψηλή ευαισθησία βασίζεται στο rrna και όχι στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες. a, Contact regions of the E-site trna on the 40S subunit. b, Catalytic PTC region of the ribosome, highlighting the partial structural disorder of a region of protein ul16 (loop), and disorder of residue U4548 (28S rrna) in the absence of P-site trna, while all other residues are well-ordered. This suggests that the P-site pocket is largely pre-defined while U4548 and the loop participate in trna accommodation. Ogle JM, Carter AP and Ramakrishnan V (2003) Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structures. Trends in Biomedical Sciences 28: Demeshkina N, Jenner L, Westhof E, Yusupov M and Yusupova G (2012) A new understanding of the decoding principle on the ribosome. Nature 484: Khatter H, Myasnikov AG, Natchiar SK and Klaholz BP (2015) Structure of the human 80S ribosome. Nature 520:

41 ΕΙΚΟΝΑ 8.14: Ο τερματισμός της μετάφρασης. Όταν στη θέση Α εισέρχεται ένα κωδικόνιο τερματισμού (π.χ., UAA, UAG ή UGA), τότε αντί για κάποιο trna προσδένεται σε αυτό ένας παράγοντας απελευθέρωσης (RF, erf). Ο παράγοντας αυτός προκαλεί την απελευθέρωση της ολοκληρωμένης πολυπεπτιδικής αλυσίδας, που ακολουθείται από την απελευθέρωση των trna και mrna από το ριβόσωμα. Προκαρυωτικά κύτταρα: RF1 αναγνωρίζει τα UAA και UAG RF2 αναγνωρίζει τα UAA και UGA Ευκαρυωτικά κύτταρα: erf1 για τα 3 κωδικόνια τερματισμού UAA, UAG & UGA Οι RF1 & 2 και erf1 μοιάζουν με το trna, προσδένονται στη θέση Α όπου εντοπίζονται τα κωδικόνια τερματισμού. Τα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν επίσης τους RF3 & erf3/gtp, αντίστοιχα, που δεν αναγνωρίζουν κωδικόνια τερματισμού, συμμετέχουν όμως στη λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω αλληλεπιδράσεων με τους RF1, RF2 ή erf1, προάγοντας την απελευθέρωση του πεπτιδυλο-trna οι RFs προσδένονται στο κωδικόνιο τερματισμού στη θέση Α και διεγείρουν την υδρόλυση του δεσμού μεταξύ trna πολυπεπτιδίου στη θέση Ρ Έτσι επιτυγχάνεται η αποδέσμευση του trna και των ριβοσωμικών υπομονάδων από το mrna RF1 (UAA & UAG) RF2 (UAA & UGA) erf1 41

42 Ο τερματισμός της μετάφρασης Η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας συνεχίζεται μέχρι να εισέλθει στη θέση Α του ριβοσώματος ένα κωδικόνιο τερματισμού: UAA, UAG ή UGA του mrna. Στα κύτταρα δεν υπάρχουν trna με αντικωδικόνια συμπληρωματικά με τα κωδικόνια τερματισμού του mrna Τα κωδικόνια τερματισμού αναγνωρίζονται από τους παράγοντες απελευθέρωσης (RF, Release Factors) που σηματοδοτούν τον τερματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης Προκαρυωτικά κύτταρα φέρουν 2 παράγοντες απελευθέρωσης: αναγνωρίζει τα UAA και UAG και RF2 που αναγνωρίζει τα UAA και UGA RF1 που Ευκαρυωτικά κύτταρα διαθέτουν 1 παράγοντα απελευθέρωσης, τον erf1 και για τα 3 κωδικόνια τερματισμού UAA, UAG και UGA Τα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν επίσης τους RF3 και erf3, αντίστοιχα, που δεν αναγνωρίζουν κωδικόνια τερματισμού, συμμετέχουν όμως στη λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω αλληλεπιδράσεων με τους RF1, RF2 ή erf1. Συνολικά, οι RFs προσδένονται στο κωδικόνιο τερματισμού στη θέση Α και διεγείρουν την υδρόλυση του δεσμού μεταξύ trna - πολυπεπτιδικής αλυσίδας στη θέση Ρ. Έτσι επιτυγχάνεται η αποδέσμευση του trna και των ριβοσωμικών υπομονάδων από το mrna. 42

43 Πολυσώματα Ένα mrna μπορεί να μεταφράζεται από πολλά ριβοσώματα (ένα πολύσωμα) στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. Από τη στιγμή που ένα ριβόσωμα έχει απομακρυνθεί από τη θέση πρόσδεσης του κινούμενο προς το 3 άκρο του mrna, ένα νέο ριβόσωμα μπορεί να προσδεθεί και να αρχίσει τη σύνθεση μιας νέας πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Συνήθως τα mrna μεταφράζονται από μια σειρά ριβοσωμάτων που απέχουν μεταξύ τους νουκλεοτίδια. Το σύνολο των ριβοσωμάτων που βρίσκονται συνδεδεμένα πάνω σε ένα μόριο mrna αναφέρεται ως πολυριβόσωμα ή πολύσωμα. Κάθε ριβόσωμα ενός πολυσώματος λειτουργώντας ανεξάρτητα από τα υπόλοιπα συνθέτει μια πλήρη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Γιατί? Η μετάφραση ενός μορίου ευκαρυωτικού mrna προς σχηματισμό μιας πρωτεΐνης τυπικού μεγέθους διεξάγεται σε 1-2 λεπτά. Δύο φαινόμενα αυξάνουν σημαντικά το ρυθμό με τον οποίο τα κύτταρα συνθέτουν μια πρωτεΐνη: (1) Η ταυτόχρονη μετάφραση ενός μορίου ευκαρυωτικού mrna από πολλά ριβοσώματα (πολύσωμα), και (2) Η γρήγορη ανακύκλωση των ριβοσωμικών υπομονάδων μετά την αποδέσμευση τους από το 3 άκρο του mrna. ΕΙΚΟΝΑ 8.15: Πολυσώματα. Ένα mrna μεταφράζεται από μια σειρά διαδοχικών ριβισωμάτων (ένα πολύσωμα). (Α) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει ένα πολύσωμα. (Β) Σχηματική αναπαράσταση πολυσώματος. Προσέξτε πως, όσο πλησιάζει ένα ριβόσωμα στο 3 άκρο του mrna, τόσο μεγαλύτερη είναι η πολυπεπτιδική αλυσίδα που μεταφέρει. [Α, Boublik M, et al., (1990) The Ribosome, p American Society for Microbiology] 43

44 Ρύθμιση της Μετάφρασης Φερριτίνη εμπλέκεται στην αποθήκευση και την απελευθέρωση του σιδήρου στο εσωτερικό του κυττάρου, με βάση τις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις σιδήρου Μεταφραστικοί Καταστολείς IRE: 40 nts από 5 άκρο mrna Μεταγραφή του mrna φερριτίνης ρυθμίζεται από τη διαθεσιμότητα σιδήρου Η ρύθμιση της μετάφρασης συμβάλλει στον καθορισμό της έκφρασης γονιδίων και επιτυγχάνεται από μεταφραστικούς καταστολείς και από mirna. Στη ρύθμιση συμβάλλουν επίσης εξωτερικοί παράγοντες (στρες, διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών αυξητικοί παράγοντες, κλπ) ΕΙΚΟΝΑ 8.16: Μεταφραστική ρύθμιση από τη φερριτίνη. Ένα mrna που φέρει το στοιχείο απόκρισης στον σίδηρο (IRE) κοντά στο 5 άκρο του, όταν υπάρχει επαρκής ποσότητα σιδήρου, μεταφράζεται φυσιολογικά. Ωστόσο, όταν ο σίδηρος δεν επαρκεί, μια πρωτεΐνη που ονομάζεται ρυθμιστική πρωτεΐνη του σιδήρου (IRP, Iron Regulatory Protein) προσδένεται στο IRE και καταστέλλει τη μετάφραση παρεμποδίζοντας την αλληλεπίδραση του mrna με τη ριβοσωμική υπομονάδα 40S. 44

45 Η μετάφραση του mrna ρυθμίζεται επίσης από πρωτεΐνες που προσδένονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες της 3 μη μεταφραζόμενης περιοχής ορισμένων mrna. Σε ορισμένες περιπτώσεις αυτοί οι μεταφραστικοί καταστολείς προσδένονται στον παράγοντα έναρξης eif4e και παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση του με τον eif4g που αλληλεπιδρά με την PABP (PolyA-Binding Protein), που με τη σειρά της αλληλεπιδρά με την ουρά πολυ(α) στο 3 άκρο του mrna, καταστέλλοντας την έναρξη της μετάφρασης. ΕΙΚΟΝΑ 8.17: Πρόσδεση ενός μεταφραστικού καταστολέα στην 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή κάποιου mrna. Οι μεταφραστικοί καταστολείς συχνά συνδέονται σε ρυθμιστικές αλληλουχίες της 3 μη μεταφραζόμενης περιοχής και καταστέλλουν τη μετάφραση μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσουν με τον eif4e, ο οποίος βρίσκεται συνδεδεμένος στην καλύπτρα του 5 άκρου. Έτσι, καταστέλλεται η πρόσδεση του eif4ε στον eif4g, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατός ο φυσιολογικός σχηματισμός του εναρκτήριου συμπλόκου και κατά συνέπεια να μην πραγματοποιείται η 45 μετάφραση του mrna.

46 mirna RISC: RNA Inducing Silencing Complex τέλειο ζευγάρωμα ατελές ζευγάρωμα Η παρεμβολή RNA (RNAi) πραγματοποιείται από μικρά δίκλωνα μόρια RNA που κόβονται από το ένζυμο Dicer, σε βραχέα παρεμβαλλόμενα RNA (sirna). Τα sirna συνδέονται με το επαγόμενο από RNA σύμπλοκο αποσιώπησης (RISC) και απόπεριελίσσονται. Στη συνέχεια η αντισημαίνουσα αλυσίδα του sirna καθοδηγεί το RISC σε ένα ομόλογο mrna-στόχο που κόβεται από μια από τις πρωτεΐνες του RISC. Κατόπιν, το σύμπλοκο RISC-siRNA απελευθερώνεται και μπορεί να συμμετάσχει στην αποικοδόμηση άλλων ομόλογων μορίων mrna. Εκτός όμως από τα sirna, υπάρχουν και τα μικροrna (mirna), μήκους ~22 νουκλεοτιδίων, που μεταγράφονται από την RNA Pol III, σε ένα πρωτογενές μετάγραφο pri-mirna, ~70 νουκλεοτιδίων. ΕΙΚΟΝΑ 8.19: Ρύθμιση της μετάφρασης από mirna. Τα πρόδρομα μόρια των mirna (pri-mirna) κόβονται διαδοχικά από τις νουκλεάσες Drosha και Dicer, ώστε να παραχθούν μικρά δίκλωνα μόρια RNA μήκους ~22 νουκλεοτιδίων. Κατόπιν, τα mirna αλληλεπιδρούν με το RISC, που ξετυλίγει τους 2 κλώνους του. Συνδεδεμένος με το RISC μένει μόνο ο ένας κλώνος, που κατόπιν στοχεύει κάποιο ομόλογο προς αυτόν mrna και προκαλεί είτε την κοπή του (αν ζευγαρώνει τέλεια με αυτό) είτε την καταστολή της μετάφρασης του, την αποαδενυλίωση του και τελικά την αποικοδόμηση του (αν το ζευγάρωμα δεν είναι πλήρες).46

47 ΕΙΚΟΝΑ 8.20: Ρύθμιση της μετάφρασης από τη φωσφορυλίωση των eif2 και eif2b Οι eif2 και eif2b αποτελούν στόχους της ρυθμιστικής δράσης ορισμένων πρωτεϊνικών κινασών. Η φωσφορυλίωση τους καταστέλλει την ανταλλαγή του GTP με GDP, και άρα την έναρξη της μετάφρασης. (Α) Η ενεργή μορφή του eif2 (σε σύμπλοκο με GTP) μεταφέρει το εναρκτήριο μεθειονυλο-trna στο ριβόσωμα (Εικ. 8.11). Κατόπιν, ο eif2 απελευθερώνεται από το ριβόσωμα στη μορφή ανενεργού συμπλόκου με GDP. Για να συνεχιστεί η μετάφραση, ο eif2 πρέπει να επανενεργοποιηθεί από τον eif2b, που διεγείρει την ανταλλαγή του GDP και την αντικατάσταση του απο GTP. (Β) Η μετάφραση είναι δυνατόν να κατασταλεί (π.χ., αν τα κύτταρα υφίστανται στρες ή στερούνται αυξητικών παραγόντων) από πρωτεϊνικές κινάσες που φωσφορυλιώνουν τους eif2 & eif2b. Η φωσφορυλίωση καταστέλλει την ανταλλαγή του GDP με GTP και άρα δεν είναι δυνατή η αναγέννηση του ενεργού συμπλόκου Eif2/GTP. 47

48 Σε αντίθεση Απουσία ΑΠ, οι μη φωσφορυλιωμένες 4E-BP προσδένονται στον eif-4e και καταστέλλουν τη μετάφραση παρεμποδίζοντας την αλληλεπίδραση του με eif4g Ένας άλλος σημαντικός ελέγχου της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω του οποίου δρουν οι αυξητικοί παράγοντες (ΑΠ_ είναι η ρύθμιση της ενεργότητας του eif-4e που προσδένεται στην καλύπτρα στο 5 άκρο των mrna. ΑΠ που διεγείρουν την πρωτεϊνοσύνθεση ενεργοποιούν Ενεργοποίηση Πρωτεϊνικών πρωτεϊνικές κινάσες που Κινασών (π.χ. Ser/Thr, Tyr) φωσφορυλιώνουν τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες πρόσδεσης του eif-4e (4E-BP). Απουσία ΑΠ, οι μη φωσφορυλιωμένες 4EBP προσδένονται στον eif-4e και καταστέλλουν τη μετάφραση παρεμποδίζοντας την αλληλεπίδραση του με eif-4g. Παρουσία ΑΠ, οι 4E-BP φωσφορυλιώνονται και δεν αλληλεπιδρούν με eif-4e οπότε αυξάνεται ο ρυθμός πρωτεϊνοσύνθεσης. ΕΙΚΟΝΑ 8.21: Ρύθμιση του eif4g Απουσία αυξητικών παραγόντων, η μετάφραση καταστέλλεται από τις πρωτεΐνες πρόσδεσης στον eif4e (4EBP), οι οποίες προσδένονται στον eif4e και παρεμποδίζουν την αλληλεπίδρασή του με τον eif4g. Παρουσία αυξητικών παραγόντων, οι 4E-BP φωσφορυλιώνονται, γεγονός που προκαλεί την αποσύνδεσή τους από τον eif4e και καθιστά δυνατή τη μετάφραση. 48

49 ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Η πρωτεϊνοσύνθεση αποτελεί το τελευταίο στάδιο της ροής της γενετικής πληροφορίας. Όμως η σύνθεση μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας δεν συνεπάγεται και την παραγωγή μιας λειτουργικής πρωτεΐνης. Για να καταστούν λειτουργικά, τα πολυπεπτίδια αναδιπλώνονται για να αποκτήσουν μια συγκεκριμένη στερεοδιαμόρφωση. Επίσης, σε πολλές περιπτώσεις, το τελικό λειτουργικό προϊόν αποτελείται από πολλά πολυπεπτίδια που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο (ή σύμπλεγμα). Επίσης, πολλές πρωτεΐνες για να καταστούν ενεργές υφίστανται τροποποιήσεις, όπως αποκοπή τμήματος τους, ομοιοπολική πρόσδεση υδατάνθρακα ή λιπιδίου Η 3D διαμόρφωση των πρωτεϊνών προκύπτει μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων τους. Οι πρωτεΐνες που διευκολύνουν την αναδίπλωση άλλων πρωτεϊνών, και τη συναρμολόγηση συμπλόκων ονομάζονται μοριακοί συνοδοί (molecular chaperones), (νουκλεοπλασμίνη: ιστόνες-dna) ΕΙΚΟΝΑ 8.22: Η δράση των μοριακών συνοδών κατά τη μετάφραση. Οι μοριακοί συνοδοί προσδένονται στο αμινοτελικό τμήμα της υπό σύνθεσης πολυπεπτιδικής αλυσίδας και το σταθεροποιούν σε μια μη αναδιπλωμένη διαμόρφωση μέχρι να ολοκληρωθεί η πρωτεϊνοσύνθεση. Κατόπιν, το ολοκληρωμένο πολυπεπτίδιο ελευθερώνεται από το ριβόσωμα και αναδιπλώνεται προκειμένου να αποκτήσει τη σωστή στερεοδιαμόρφωση. 49

50 Οι μοριακοί συνοδοί σταθεροποιούν τα μη αναδιπλωμένα πολυπεπτίδια κατά τη μεταφορά της στα κυτταρικά οργανίδια, όπως από το κυτταρικό διάλυμα στα μιτοχόνδρια. ΕΙΚΟΝΑ 8.23: Η δράση των μοριακών συνοδών κατά τη μεταφορά των πρωτεϊνών. Ένα μερικώς αναδιπλωμένο πολυπεπτίδιο μεταφέρεται από το κυτταροδιάλυμα στο μιτοχόνδριο. Μοριακοί συνοδοί του κυτταροπλάσματος το σταθεροποιούν στη μη αναδιπλωμένη μορφή του. Άλλοι μοριακοί συνοδοί στο εσωτερικό του μιτοχονδρίου διευκολύνουν τη διαδικασία της μεταφοράς και υποβοηθούν την επακόλουθη αναδίπλωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο εσωτερικό του μιτοχονδρίου. 50

51 Σαπερονίνες: Πολλαπλές πρωτεϊνικές υπομονάδες που διευθετούνται σε 2 δακτυλίδια το ένα πάνω από το άλλο σχηματίζοντας μια δομή με 2 χώρους Πολλές πρωτεΐνες που λειτουργούν ως μοριακοί συνοδοί, αρχικά χαρακτηρίστηκαν ως πρωτεΐνες που συντίθενται όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε υψηλές θερμοκρασίες. Αυτές οι θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (Hsp; Heat Shock Proteins) σταθεροποιούν τις πρωτεΐνες και διευκολύνουν την επαναδίπλωση τους μετά τη μερική αποδιάταξη που υφίστανται από την έκθεση τους σε υψηλές θερμοκρασίες. Η οικογένεια των πρωτεϊνών Hsp και οι μοριακοί συνοδοί της οικογένειας της σαπερονίνης εμπλέκονται στο γενικό μονοπάτι της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών ΕΙΚΟΝΑ 8.24: Οι διαδοχικές δράσεις των μοριακών συνοδών. Μοριακοί συνοδοί της οικογένειας της Hsp70 προσδένονται στην υπό σύνθεση πολυπεπτιδική αλυσίδα και τη σταθεροποιούν κατά τη διάρκεια της μετάφρασης. Κατόπιν, το μη αναδιπλωμένο πολυπεπτίδιο μεταφέρεται σε μέλη της οικογένειας της σαπερονίνης που σχηματίζουν μια δομή, στο εσωτερικό της οποίας λαμβάνει χώρα η αναδίπλωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Τόσο για την απελευθέρωση της μη αναδιπλωμένης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από τα μέλη της οικογένειας της Hsp70 όσο και για την αναδίπλωσή της στο εσωτερικό των σαπερονινών απαιτείται η υδρόλυση ATP. 51

52 Ένζυμα που καταλύουν την αναδίπλωση πρωτεϊνών Εκτός από τους μοριακούς συνοδούς που προσδένονται στις πολυπετιδικές αλυσίδες και διευκολύνουν την αναδίπλωση τους σταθεροποιώντας τις μερικώς αναδιπλωμένες ενδιάμεσες μορφές πρωτεϊνών, τα κύτταρα διαθέτουν και 2 τουλάχιστον τύπους ενζύμων που λειτουργούν ως μοριακοί συνοδοί και καταλύουν την αναδίπλωση των πρωτεϊνών. 1. Ισομεράση πρωτεϊνικών δισουλφιδικών δεσμών: καταλύει το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ καταλοίπων κυστεΐνης που σταθεροποιούν τις αναδιπλωμένες πρωτεΐνες Η παρουσία δισουλφιδικών δεσμών περιορίζεται σε εκκρινόμενες και ορισμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες, γιατί το κυτταροδιάλυμα περιέχει αναγωγικούς παράγοντες που διατηρούν τα κατάλοιπα Cys στην ανηγμένη μορφή (-SH) εμποδίζοντας τη συμμετοχή τους στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών (S-S) ΕΙΚΟΝΑ 8.25: Η δράση της ισομεράσης πρωτεϊνικών δισουλφιδικών δεσμών. Η ισομεράση πρωτεϊνικών δισουλφιδικών δεσμών (PDI; Protein Disulfide Isomerase) αλληλεπιδρά με το υπόστρωμά της μέσω δύο καταλοίπων κυστεΐνης του ενεργού της κέντρου και καταλύει τον σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών. 52

53 2. Το δεύτερο ένζυμο που εμπλέκεται στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών είναι η ισομεράση της πεπτιδυλοπρολίνης που καταλύει τον ισομερισμό πεπτιδικών δεσμών στους οποίους ενέχονται κατάλοιπα προλίνης (Pro) ΕΙΚΟΝΑ 8.26: Η δράση της ισομεράσης της πεπτιδυλοπρολίνης. Η ισομεράση της πεπτιδυλοπρολίνης (Peptidyl Prolyl Isomerase) καταλύει τον ισομερισμό ανάμεσα στη cis και την trans διαμόρφωση των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται των καταλοίπων προλίνης. Το ένζυμο εντοπίζεται στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. 53

54 ΕΙΚΟΝΑ 8.39: Πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες. Οι πρωτεϊνικές κινάσες καταλύουν τη μεταφορά φωσφορικών ομάδων από το ATP στις πλευρικές αλυσίδες σερίνης και θρεονίνης (πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/θρεονίνης) ή τυροσίνης (πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης). Οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες καταλύουν την απομάκρυνση των φωσφορικών ομάδων από τα αμινοξέα αυτά μέσω υδρόλυσης. 54

55 Ουβικιτίνη: Πολυπεπτίδιο 76 αμινοξέων ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Τα επίπεδα πρωτεϊνών στο κύτταρο εξαρτώνται από το ρυθμό σύνθεσης και ρυθμό αποικοδόμησης, ώστε ο χρόνος ημιζωής ποικίλλει από λεπτά-ημέρες καθοριστικός παράγοντας ελέγχου των κυτταρικών λειτουργιών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν μικρό χρόνο ημιζωής και η ανακύκλωση τους παίζει σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή του κυττάρου. ΕΙΚΟΝΑ 8.43: Το μονοπάτι ουβικιτίνηςπρωτεασώματος. Οι πρωτεΐνες Animation 9.2: Ubiquitin-Proteasome pathway στοχοποιούνται για ταχεία αποικοδόμηση μέσω της ομοιοπολικής πρόσδεσης σε αυτές πολλών μορίων ουβικιτίνης στην αμινομάδα κατάλοπων lys (Gly-lys). Η ουβικιτίνη αρχικά ενεργοποιείται από το ένζυμο Ε1 (ένζυμο ενεργοποίησης ουβικιτίνης). Η ενεργοποιημένη ουβικιτίνη μεταφέρεται στη συνέχεια σε ένα από τα διάφορα ένζυμα σύζευξης της ουβικιτίνης (Ε2) που διαθέτει το κύτταρο. Κατόπιν, μια λιγάση της ουβικιτίνης (Ε3) αλληλεπιδρά με το Ε2 και διεκπεραιώνει τη μεταφορά της ουβικιτίνης σε μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη-στόχο. Ακολουθεί η εν σειρά προσθήκη πολλαπλών ουβικιτινών και τέλος η πολυουβικιτινιωμένη πρωτεΐνη αποικοδομείται από ένα σύμπλοκο με ενεργότητα πρωτεάσης (πρωτεάσωμα 26S). 55

56 ΕΙΚΟΝΑ 8.44: Η αποικοδόμηση της κυκλίνης Β κατά τον κυτταρικό κύκλο. Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων ελέγχεται εν μέρει από τη σύνθεση και την αποικοδόμηση της κυκλίνης Β, η οποία λειτουργεί ως ρυθμιστική υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης Cdk1. Η κυκλίνη Β συντίθεται κατά τη διάρκεια της μεσόφασης και προσδένεται στη Cdk1. Έτσι σχηματίζεται ένα σύμπλοκο κυκλίνης Β-Cdk1, το οποίο έχει ενεργότητα πρωτεϊνικής κινάσης και διεγείρει την έναρξη της μίτωσης. Η γρήγορη αποικοδόμηση της κυκλίνης Β προς το τέλος της μίτωσης έχει ως συνέπεια την απενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Cdk1, γεγονός που επιτρέπει στο κύτταρο να εξέλθει από τη μίτωση και να εισέλθει στη μεσόφαση του επόμενου κυτταρικού κύκλου. 56

57 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Ο καταλυτικός ρόλος του ριβοσωμικού RNA Η ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης προσδιορίζεται μέσω της μέτρησης της ποσότητας ενός ραδιενεργού συμπλόκου Nφορμυλομεθειονίνης-πουρομυκίνης (f-met-puro), το οποίο εντοπίζεται με ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία των προϊόντων της αντίδρασης. Κάτω από την εικόνα υποδεικνύεται η επεξεργασία που έχουν υποστεί τα ριβοσώματα του T. aquaticus πριν από την πραγματοποίηση της αντίδρασης. 57

58 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Η ανακάλυψη των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης Ταυτοποίηση της φωσφοτυροσίνης σε ανοσοσφαιρίνες φωσφορυλιωμένες από την Src. Ανοσοκατακρημνισμένη πρωτεΐνη Src του ιού RSV επωάστηκε με [32P]-ATP. Κατόπιν, η ανοσοσφαιρίνη απομονώθηκε και υδρολύθηκε. Τα αμινοξέα που προέκυψαν από την υδρόλυση διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση και χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε μια επιφάνεια κυτταρίνης. Οι θέσεις των σημασμένων με 32P αμινοξέων προσδιορίστηκαν μετά από έκθεση της επιφάνειας κυτταρίνης σε φιλμ ευαίσθητο στις ακτίνες Χ. Οι διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τις θέσεις μη σημασμένων φωσφοαμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Όπως φαίνεται στο αυτοραδιογράφημα, το αμινοξύ που σημάνθηκε με 32P είναι η φωσφοτυροσίνη. 58

59 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Οι δομές των 20 αμινοξέων που συναντώνται στη φύση, ταξινομημένες σύμφωνα με το χημικό τους τύπο. Ουδέτερα, πολικά Όξινα Βασικά 59

60 Ουδέτερα, μη πολικά 60

61 Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού Τα τέσσερα επίπεδα οργάνωσης των πρωτεϊνών 61