ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΘΗΝΩΝ. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΙ ΕΦAΡΜΟΣΜΕΝΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ. Διευθυντής & Επιστημονικός Υπεύθυνος:

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΘΗΝΩΝ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΙ ΕΦAΡΜΟΣΜΕΝΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Διευθυντής & Επιστημονικός Υπεύθυνος: Καθηγητής Ιατρικής ΕΚΠΑ ΜΙΧΑΛΗΣ ΚΟΥΤΣΙΛΙΕΡΗΣ Διπλωματική Εργασία «ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΤΟΥΣ ΣΗΜΑΣΙΑ» ΟΝΟΜΑ: Παπακωνσταντίνου Μαρία, Ιατρός-Αιματολόγος, (Αρ. Μητρώου ) ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: Μάγκουρα Δήμητρα, Καθηγήτρια Ερευνήτρια Α στο ΙΙΒΕΑΑ Αθήνα 2017 [1]

2 Διπλωματική Εργασία «ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΤΟΥΣ ΣΗΜΑΣΙΑ» ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΚΟΥΤΣΙΛΙΕΡΗΣ ΜΙΧΑΛΗΣ Καθηγητής Ιατρικής ΕΚΠΑ 2. ΜAΓΚΟΥΡΑ ΔΗΜΗΤΡΑ Καθηγήτρια-Ερευνήτρια Α ΙΙΒΕΑΑ 3. ΒΑΪΟΠΟΥΛΟΣ ΓΙΩΡΓΟΣ Ομότιμος Καθηγητής Ιατρικής ΕΚΠΑ ΟΝΟΜΑ: Παπακωνσταντίνου Μαρία, Ιατρός-Αιματολόγος,

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για την ολοκλήρωση της διπλωματικής μου εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω εκείνους οι οποίοι συνέβαλαν στην διεκπεραίωσή της. Εκφράζω τις βαθιές μου ευχαριστίες στην επιβλέπουσα Καθηγήτρια- Ερευνήτρια Α στο ΙΙΒΕΑΑ, κ Μάγκουρα Δήμητρα για την εμπιστοσύνη της και την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω την διπλωματική μου στο συγκεκριμένο επιστημονικό αντικείμενο. Την ευχαριστώ επίσης για τις γνώσεις και τις συμβουλές που μου παρείχε. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Κουτσιλιέρη Μιχάλη, Καθηγητή Ιατρικής ΕΚΠΑ και τον κ. Βαϊόπουλο Γιώργο, Ομότιμο καθηγητή Ιατρικής ΕΚΠΑ για την ευκαιρία που μου έδωσαν να συμμετάσχω στο μεταπτυχιακό Μοριακή και Εφαρμοσμένη Φυσιολογία. Ευχαριστίες επίσης απευθύνω για την συμπαράσταση και τις συμβουλές τους στην κα Σερένα Βαλσάμη Αιματολόγο Επίκουρη Καθηγήτρια στην Αιμοδοσία Αρεταίειου Νοσοκομείου, την κα Συρίου Βασιλική Ενδοκρινολόγο Διευθύντρια στο Νοσοκομείο ΕΛΠΙΣ και την κ. Βλαχοπάνου Δήμητρα Βιοπαθολόγο Επικουρική γιατρό στην Αιμοδοσία του ΓΝΠΠ Άγιος Παντελεήμων. [1]

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μετα-μεταφραστική τροποποίηση (post-translational modification) των ανοσοσφαιρινών, περιλαμβάνει κατά κύριο λόγο την Ν-γλυκοζυλίωση των ανοσοσφαιρινών και ιδίως της κύριας ανοσοσφαιρίνης που είναι η IgG. Οι IgG ανοσοσφαιρίνες αποτελούν τα αντισώματα που είναι μεσολαβητές της χυμικής ανοσίας, με στόχο την προστασία του οργανισμού από εξωκυττάρια βακτήρια και τοξίνες. Η Ν-γλυκοζυλίωση επιτελείται στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο και την συσκευή Golgi. Πρόκειται για την προσθήκη ενός ολιγοσακχαρίτη στο αμιδικό άτομο Ν της ασπαραγίνης 297 (Asn-297) που είναι ένα αμινοξικό κατάλοιπο, που βρίσκεται στην θέση 297 στο σταθερό Fc τμήμα της IgG ανοσοσφαιρίνης. Ο ολιγοσακχαρίτης είναι ο GlcNAc GlcNAc - μανόζη - (μανόζη) 2 - (GlcNAc) 2 διακλαδισμένος σε δύο συνήθως βραχίονες που εκτείνονται από τον σταθερό συντηρημένο πυρήνα μανόζη-(glcnac) 2 με την προσθήκη μιας μανόζης και ενός GlcNAc σε κάθε βραχίονα της διακλάδωσης. Επίσης μπορεί να προστεθεί στη συνέχεια σε κάθε βραχίονα από μία γαλακτόζη (Gal) ή και ένα σιαλικό οξύ. Η Ν-γλυκοζυλίωση επιδρά στην διαμόρφωση της δομής της ανοσοσφαιρίνης IgG και τελικά στην αλληλεπίδραση των αντισωμάτων IgG με τους Fcγ υποδοχείς (FcγRs) των κυττάρων της ανοσίας, με πιθανό αποτέλεσμα την ανάπτυξη διαφόρων παθήσεων όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα και οι κακοήθειες. Η γνώση της επίδρασης της Ν-γλυκοζυλίωσης των IgG σε παθολογικές καταστάσεις, βρίσκει εφαρμογή στην ανάπτυξη φαρμακευτικών σκευασμάτων με κύριους εκπροσώπους τα μονοκλωνικά αντισώματα. [2]

5 SUMMARY The post-translational modification of immunoglobulins, includes mainly the N-glycosylation of the immunoglobulins, and in particular of the main immunoglobulin which is IgG. The IgG immunoglobulins constitute the antibodies which are mediators of humoral immunity, aiming to protect the human body from extracellular bacteria and toxins. The N-glycosylation is performed in the rough endoplasmic reticulum and in the Golgi apparatus. It is the addition of an oligosaccharide to the amide N-atom of asparagine 297 (Asn-297), which is an amino acid residue located in position 297 in the Fc portion of the constant IgG immunoglobulin fragment. The oligosaccharide is a GlcNAc-GlcNAc-mannose- (mannose) 2 - (GlcNAc) 2, branched usually into two arms and extending from the fixed core conserved mannose- (GLcNAc) 2, by the addition of a mannose and a GlcNAc residue on each arm of the oligosaccharide. Afterwards, a galactose (Gal) or a sialic acid residue, can be added to each arm. The N-glycosylation affects the IgG immunoglobulin structure and eventually the interaction of IgG to Fc-gamma receptors (FcγRs) of the immune cells, possibly resulting in the development of various diseases, such as autoimmune diseases and malignancies. The knowledge of the effect of N-glycosylation of IgG on pathological conditions has application in the development of pharmaceutical formulations, with monoclonal antibodies being the main representatives. [3]

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ MEΤΑΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΤΟΥΣ ΣΗΜΑΣΙΑ... 7 Α. ΑΝΟΣΙΑ... 7 Α.1 ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ... 8 Α.1.1 ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ... 8 Α.1.2 ΑΝΤΙΓΟΝΟΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ... 9 Α.1.3 ΔΡΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ... 9 Α.2 ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Α.3 ΕΠΙΚΤΗΤΗ ΑΝΟΣΙΑ Α.3.1 ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Α.3.2 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Α.3.3 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Α.3.4 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΤΩΝ Ag ΣΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ Α.3.5 MHC ΜΟΡΙΑ: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Α.3.6 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ Ag ΑΠΟ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ.. 16 Α.3.7 ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.3.8 ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.3.9 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Α.4 ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Α.4.1 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΒΟΗΘΗΤΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗ ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Α.4.2 ΟΙ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ -ΔΟΜΗ Α.4.3 ΤΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΥΠΟΤΑΞΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Α.4.4 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Α.5 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ FcγRs Α.5.1 Fcγ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Α.6 ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ( εικόνα 11) Α.7 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ ΚΑΙ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ Α.7.1 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ Α.7.2 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΗ ΜΕ ΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ [4]

7 Α.7.3 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΟΔΗΓΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΚΔΗΛΩΣΗ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑΣ Α.8 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Α.8.1 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Α.8.2 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ Α.8.3 ΤΑ Ag ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ Α.8.4 Η ΑΝΟΣΙΑ ΣΤΗΝ ΑΜΥΝΑ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Β. ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Β.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Β.2 ΣΤΑΔΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ Β.3 ΤΑ ΒΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Β.4 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΓΛΥΚΑΝΩΝ ΣΤΟ RER ΚΑΙ Σ. GOLGY (εικόνα 18) Γ. ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ IgG Γ.1 ΓΕΝΙΚΑ Γ.2 ΤΥΠΟΙ ΓΛΥΚΟΜΟΡΦΩΝ IgG Γ.3 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΤΩΝ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Γ.4 ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ FcγR ΜΕ ΤΟ Fc ΤΜΗΜΑ ΤΩΝ IGG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Γ.5 ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ FcyR ΜΕ IgG ΙΣΟΤΥΠΟΥΣ Γ.6 Η ΦΥΣΙΟΛΟΓΙKΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΟΣΑΚΧΑΡΙΤΩΝ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ IgG Γ.6.1 ΣΙΑΛΥΛΟΠΟΙΗΣΗ Γ.6.2 ΓΑΛΑΚΤΟΖΥΛΙΩΣΗ Γ.6.3 ΦΟΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ Γ.6.4 GLCNAC Δ. FAB ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ E. ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ IgG E.1 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ IgG - FcRs ΣΤΗΝ ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ. 62 E.2 Ο ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΣ FcγRIIB ΣΑΝ ΡΥΘΜΙΣΤΗΣ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ (ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ) E.3 ΡΥΘΜΙΣΗ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥΣ FcγRIIB ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΗΣ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ (ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ) E.4 ΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ [5]

8 E.5 Η ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ ΕΑΥΤΟΥ/ ΞΕΝΟΥ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ IgG E.6 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΛΕΚΤΙΝΗΣ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΕΙ ΜΑΝΝΟΖΗ ΣΤΗΝ ΑΝΟΣΙΑ ΣΤ. Η ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ IgG ΚΑΙ Ο ΚΑΡΚΙΝΟΣ Ζ. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΤΗΣ IgG Ζ.1 ΕΝΔΟΦΛΕΒΙΑ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΗ IV IG Ζ.2 ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ Ζ.2.1 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Ζ.2.2 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Ζ.2.3 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΣΤΑ ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [6]

9 MEΤΑΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ Η ΚΛΙΝΙΚΗ ΤΟΥΣ ΣΗΜΑΣΙΑ Α. ΑΝΟΣΙΑ Ανοσία ορίζεται ως η αντίσταση σε νόσους και ειδικότερα σε λοιμώδεις νόσους. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα σύνολο κυττάρων, ιστών και μορίων. Ανοσολογική απάντηση είναι η εναρμονισμένη αντίδραση αυτών των κυττάρων και των μορίων σε λοιμογόνα μικρόβια. Η λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος είναι να αναχαιτίζει και να εκριζώνει τις ήδη εγκατεστημένες λοιμώξεις. Οι μηχανισμοί που διασφαλίζουν την άμυνα εναντίον των λοιμογόνων παραγόντων διακρίνονται στην φυσική ανοσία (innate immunity) και στην επίκτητη ανοσία (acquired immunity, adaptive immunity). Η φυσική ανοσία εξασφαλίζει την αρχική προστασία εναντίον των λοιμώξεων, ενώ η επίκτητη ή αλλιώς ειδική ανοσία αναπτύσσεται πιο αργά και αφορά την όψιμη και πιο αποτελεσματική άμυνα εναντίον των μικροβίων από τον ξενιστή 1. [7]

10 Α.1 ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Διακρίνονται στα λεμφοκύτταρα, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και τα δραστικά ή τελεστικά κύτταρα (effector cells)(εικόνα 1). Εικόνα 1 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Α.1.1 ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ Διαθέτουν ειδικούς υποδοχείς και παίζουν σημαντικό ρόλο στην επίκτητη ανοσία. Διακρίνονται με βάση επιφανειακές πρωτεΐνες που έχουν την ονοματοδοσία CD (cluster of differentiation, ομάδα διαφοροποίησης) με έναν αριθμό που τις συνοδεύει π.χ. CD4. Οι επιφανειακές αυτές πρωτεΐνες αναγνωρίζονται από μονοκλωνικά αντισώματα και αφορούν στάδια διαφοροποίησης των λεμφοκυττάρων. Διακρίνονται στα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα. Τα Β λεμφοκύτταρα παράγουν τα αντισώματα και είναι υπεύθυνα για την χυμική ανοσία. Διαθέτουν αντιγονικούς υποδοχείς που είναι μεμβρανικοί τύποι αντισωμάτων και οι ποιοι προσδένουν τα αντιγόνα (Ags) που είναι είτε στην επιφάνεια μικροοργανισμών ή κυττάρων είτε είναι διαλυτά Ag 2. [8]

11 Τα Τ λεμφοκύτταρα φέρουν αντιγονικούς υποδοχείς που αναγνωρίζουν πρωτεϊνικά Ag, τα οποία είναι προσδεμένα σε ειδικά μόρια που τα παρουσιάζουν. Τα ειδικά αυτά μόρια, είναι τα μόρια του Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex, MHC) και βρίσκονται στην επιφάνεια των λεγόμενων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (Antigen Presenting Cells, APCs). Τα Τ λεμφοκύτταρα επίσης διακρίνονται σε δυο κύριες ομάδες: 1) Τα CD4 + λεμφοκύτταρα ή βοηθητικά (helper T-cells) που βοηθούν τα Β-λεμφοκύτταρα να παράγουν αντισώματα και τα φαγοκύτταρα να φαγοκυτταρώνουν τους μικροοργανισμούς. 2) Τα CD8 + T λεμφοκύτταρα ή κυτταροτοξικά (cytotoxic T-cells) που φονεύουν κύτταρα που περιέχουν ενδοκυττάρια παθογόνα. 3) Άλλη ομάδα λεμφοκυττάρων είναι τα φυσικά κυτταροκτόνα ή ΝΚ-cells που είναι συστατικά της φυσικής ανοσίας και επίσης καταστρέφουν κύτταρα που φέρουν ενδοκυττάρια παθογόνα 2. Α.1.2 ΑΝΤΙΓΟΝΟΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Είναι κατά κύριο λόγο τα δενδριτικά κύτταρα. Μεταφέρουν μετά την είσοδο τους από τα επιθήλια, πρωτεϊνικά Ag των παθογόνων μικροοργανισμών στους επιχώριους λεμφαδένες, όπου και τα παρουσιάζουν στα Τ λεμφοκύτταρα για αναγνώριση. Γι αυτό τον λόγο ονομάζονται αντιγονοπαρουσιαστικά (Antigen Presenting Cells, APCs). Παρέχουν επίσης ένα δεύτερο σήμα για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Αυτό γίνεται μέσω μορίων στην επιφάνειά τους που ονομάζονται συνδιεγέρτες (co-stimulators), οι οποίοι συνδέονται με υποδοχείς στα Τ λεμφοκύτταρα. Άλλοι τύποι APCs είναι τα μακροφάγα, τα μονοκύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα. Α.1.3 ΔΡΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Πρόκειται για κύτταρα που εξαλείφουν τα εισβάλλοντα παθογόνα. Ονομάζονται επίσης τελεστικά κύτταρα (effector cells) και εκτός από τα λεμφοκύτταρα είναι και άλλα λευκοκύτταρα, όπως τα κοκκιοκύτταρα (ουδετερόφιλα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα), τα μονοκύτταρα/μακροφάγα κ.α. [9]

12 Α.2 ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Η φυσική ανοσία περιλαμβάνει γραμμές άμυνας εναντίον λοιμογόνων παραγόντων με α) πρώτη γραμμή άμυνας τα επιθήλια, που εμποδίζουν την είσοδο των μικροβίων και φυσικά αντιβιοτικά που παράγουν τα επιθήλια και β) δεύτερη γραμμή άμυνας, να περιλαμβάνει τα φαγοκύτταρα και τα ειδικά λεμφοκύτταρα που ονομάζονται φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (Natural killer, NK), καθώς και το σύστημα του συμπληρώματος, που περιλαμβάνει σύστημα πρωτεϊνών του πλάσματος. Μετά την αναγνώριση των παθογόνων από τα φαγοκύτταρα ακολουθεί η φαγοκυττάρωσή τους. Φαγοκυττάρωση είναι η διαδικασία εγκόλπωσης του μικροοργανισμού μέσα στο φαγοκύτταρο όπου δημιουργείται το φαγόσωμα. Γίνεται κατόπιν η συνένωση του φαγοσώματος με τα λυσοσώματα και η αποδόμηση των μικροοργανισμών από ένζυμα και δραστικές ουσίες των λυσοσωμάτων 1. Εκτός από τα φαγοκύτταρα, άλλα κύτταρα της φυσικής ανοσίας είναι τα φυσικά κυτταροκτόνα NK που είναι τύπος λεμφοκυττάρων 1 [10] που φονεύουν μολυσμένα κύτταρα και ενδοκυττάρια παθογόνα. Αυτή η διαδικασία γίνεται μέσω έκκρισης κυτοκινών όπως η ιντερφερόνη-γ (IFN-γ). Η ιντερλευκίνη-12 (IL-12) μία άλλη κυτταροκίνη ενεργοποιεί τα NK κύτταρα. Εκφράζουν υποδοχείς για επιφανειακά μόρια κυττάρων του ξενιστή, τα οποία είναι μολυσμένα με ιούς ή ενδοκυττάρια βακτήρια. Επίσης εκφράζουν άλλους υποδοχείς, οι οποίοι συνδέονται με το Fc τμήμα των αντισωμάτων, τους λεγόμενους Fcγ υποδοχείς. Οι κυτταροκίνες που παράγονται κατά την φυσική ανοσία, όπως ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (Tumor Necrosis Factor, TNF) και η ιντερλευκίνη-1 (Interleukin-1, IL-1), ενεργοποιούν την διαδικασία της φλεγμονής. Το σύστημα του συμπληρώματος περιλαμβάνει σύστημα πρωτεϊνών μέσω διαδοχικής ενεργοποίησης αυτών των πρωτεϊνών (πρωτεολυτικά ένζυμα κυρίως) γίνεται η ενεργοποίησή του σαν ένα είδος ενζυμικού καταρράκτη. Περιλαμβάνει τρείς οδούς: 1) την εναλλακτική οδό, που είναι στοιχείο της φυσικής ανοσίας και ενεργοποιείται με την σύνδεση των πρωτεϊνών του συμπληρώματος με επιφάνειες μικροοργανισμών, 2) την κλασσική οδό, που είναι μέρος της επίκτητης ανοσίας και ενεργοποιείται με την σύνδεση των αντισωμάτων με μικροοργανισμούς ή αντιγόνα, και 3) την οδό της λεκτίνης, που ενεργοποιείται και

13 όταν μία πρωτεΐνη πλάσματος, η λεκτίνη, συνδεθεί με την τελική μανόζη των γλυκοπρωτεϊνών, που βρίσκονται στην επιφάνεια των μικροοργανισμών. Θεωρείται η οδός της λεκτίνης συστατικό της φυσικής ανοσίας. Η ενεργοποίηση αρχίζει από το κλάσμα του συμπληρώματος c3, c3b. Μετά την σύνδεση με τα παθογόνα ενεργοποιούνται οι επόμενες πρωτεΐνες του καταρράκτη του συμπληρώματος και οδηγεί τελικά στην δημιουργία οπών στην μεμβράνη του παθογόνου και καταστροφή του. Α.3 ΕΠΙΚΤΗΤΗ ΑΝΟΣΙΑ Εκδηλώνεται μετά από έκθεση του οργανισμού σε ένα ξένο αντιγόνο. Η ανοσία που επάγεται με αυτόν τον τρόπο, ονομάζεται ενεργητική ανοσία με παράδειγμα τον εμβολιασμό. Αντίθετα, η ανοσία που επάγεται με την χορήγηση κυττάρων ή όρου από ανοσοποιημένο άτομο στον οργανισμό που δεν έχει εκτεθεί άλλοτε στο συγκεκριμένο Ag, λέγεται παθητική ανοσία. Η ειδική ανοσία διακρίνεται στην χυμική και την κυτταρική ανοσία 3. Α.3.1 ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Μεσολαβείται από γλυκοπρωτεϊνικά μόρια που καλούνται αντισώματα (Ab), τα οποία αναγνωρίζουν με ειδικότητα τα Ag, τα οποία εξουδετερώνουν. Τα Ab παράγονται από τα Β κύτταρα που μετά την αναγνώριση του Ag πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται στα πλασματοκύτταρα, που είναι τα ειδικά κύτταρα που παράγουν Ab. Η χυμική ανοσία προστατεύει από εξωκυττάρια βακτήρια και τοξίνες. Α.3.2 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Α) ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ: Η ικανότητα των διαφορετικών λεμφοκυττάρων να αναγνωρίζουν με μεγάλη ακρίβεια δομικά συστατικά στοιχεία των πρωτεϊνικών ή πολυσακχαριδικών αντιγόνων. Αυτά τα δομικά στοιχεία αναγνώρισης στα Ag ονομάζονται Αντιγονικοί καθοριστές (Antigen determinants) ή επίτοποι. [11]

14 Β) ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ: Αφορά την ύπαρξη τεράστιου ρεπερτορίου λεμφοκυττάρων με διαφορετική αντιγονική ειδικότητα, ώστε να αναγνωρίζουν περίπου 10 9 διαφορετικούς αντιγονικούς επιτόπους 11. Γ) ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΜΝΗΜΗ: Η επανειλημμένη έκθεση στο ίδιο Ag αυξάνει την ικανότητα ανοσολογικής απάντησης σε νέα επαφή. Δ) ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΕΑΥΤΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΞΕΝΟ : Η ικανότητα να αναγνωρίζει και να αντιδρά στα ξένα Ag και να μην αντιδρά στα Ag που συναντώνται στον οργανισμό. Αυτό γίνεται μέσω καταστροφής ή αδρανοποίησης των λεμφοκυττάρων εκείνων που κατά την εμβρυική ζωή είναι ικανά να αναγνωρίζουν τα εαυτού Ag. Η απουσία αντίδρασης σε Ag ονομάζεται ανοσολογική ανοχή (immune tolerance). Η αδυναμία εκδήλωσης ανοσολογικής ανοχής έναντι των Ag εαυτού, αυτοάνοσων παθήσεων. οδηγεί στην ανάπτυξη Α.3.3 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Τα αντισώματα προσδένονται σε μεγάλη ποικιλία αντιγόνων, τα οποία μπορεί να είναι μακρομοριακές ή μικρές χημικές ενώσεις. Η επιφάνεια αλληλεπίδρασης είναι σχετικά επίπεδη, με προσεκβολές και εσοχές που διαθέτουν συμπληρωματικότητα για τις δύο επιφάνειες αλληλεπίδρασης Ag/Ab 8. Oι χημικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις δύο επιφάνειες είναι αναστρέψιμες με μη ομοιοπολικούς δεσμούς, όπως δεσμοί υδρογόνου αλλά και ιοντικές αλληλεπιδράσεις. Η αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα γίνεται σε δομικά στοιχεία του Ag που ονομάζονται επίτοποι. Ορισμένοι μάλιστα μπορεί να είναι κρυμμένοι μέσα στο αντιγονικό μόριο και αποκαλύπτονται μετά από φυσικοχημικές αλλαγές (νεοκαθοριστές). Η ισχύς που συνδέεται το Ab σε έναν επίτοπο του Ag ονομάζεται συγγένεια (affinity) της αλληλεπίδρασης. Εκφράζεται με την σταθερά διάστασης Kb που ορίζεται σαν η μοριακή συγκέντρωση του Ag που απαιτείται, ώστε να καταληφθούν τα μισά από τα διαθέσιμα μόρια του αντισώματος σε ένα διάλυμα. Επομένως, όσο πιο χαμηλή είναι η Kb τόσο μεγαλύτερη είναι η συγγένεια (δηλαδή απαιτείται μικρή συγκέντρωση Ag για τα μισά διαθέσιμα μόρια Ab) 5. [12]

15 Η ολική ισχύς πρόσδεσης που αφορά την σύνδεση ενός πολυσθενούς Ag με τo Ab είναι πολύ μεγαλύτερη από την συγγένεια ενός μόνο δεσμού μεταξύ Ag με το Ab. Η συνολική ισχύς σύνδεσης ονομάζεται συνάφεια (avidity). Είναι συνάρτηση του αριθμού των δεσμών που σχηματίζονται μεταξύ των πολλαπλών επιτόπων του Ag και των πολλαπλών θέσεων σύνδεσης που διαθέτει το Ab ανάλογα με την τάξη του αντισώματος ( Οι IgG, IgD, IgE διαθέτουν δύο θέσεις πρόσδεσης, η IgA διαθέτει 4 θέσεις και η IgM διαθέτει 10 θέσεις). Α.3.4 ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΤΩΝ Ag ΣΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ Τα πρωτεϊνικά Ag των μικροοργανισμών που εισέρχονται στον οργανισμό προσλαμβάνονται από τα λεγόμενα Αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs), με τελικό στόχο την παρουσίασή τους στα Τ λεμφοκύτταρα, προκειμένου να ξεκινήσει η ανοσολογική απάντηση. Μετά την είσοδο των παθογόνων στον οργανισμό, παράγονται κυτοκίνες από μακροφάγα/επιθηλιακά κύτταρα που βρίσκονται στα σημεία εισόδου και έτσι αρχίζει η ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων (dendritic cells, DCs ) που έχουν προσλάβει τα Ag των παθογόνων. Χάνουν την προσκολλητικότητά τους στο ενδοθήλιο και έτσι μεταναστεύουν με την επίδραση χημειοκινών στους επιχώριους λεμφαδένες. Εδώ ωριμάζουν από κύτταρα που προσλαμβάνουν Ag σε κύτταρα που ο ρόλος τους είναι να παρουσιάζουν τα Ag στα Τ λεμφοκύτταρα και να τα διεγείρουν. Τα APCs παρουσιάζουν τα Ag σε σύμπλοκο με τα μόρια MHC που βρίσκονται στην επιφάνειά τους, στα Τ λεμφοκύτταρα 12. Τα ενδογενή πρωτεϊνικά Ag που προέρχονται από ιούς ή βακτήρια που πολλαπλασιάζονται στην κυτοσόλη, μέσα στο APC σχηματίζουν σύμπλοκο με το MHC τάξης Ι μόριο. Αυτό το σύμπλοκο σχηματίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο του APC και κατόπιν απελευθερώνεται και μεταφέρεται δια της σ. Golgi στην μεμβράνη του κυττάρου. Τα εξωγενή πρωτεϊνικά Ag που προέρχονται από βακτήρια ή παράσιτα που εισέρχονται στο APC μέσω φαγοκύτωσης, σχηματίζουν σύμπλοκο με το MHC τάξης II μόριο που συντίθεται στα ριβοσώματα. Η σύνδεση γίνεται κατά την μεταφορά δια [13]

16 της σ. Golgi σε κάποιο σημείο της πορείας τους και σύντηξης με τα ενδοσώματα που περιέχουν τα αντιγονικά πεπτίδια. Μεταφέρονται κατόπιν στην μεμβρανική επιφάνεια του κυττάρου 5. Τα πεπτιδικά Ag που συνδέονται με τα τάξης II MHC αναγνωρίζονται από τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα, τα βοηθητικά λεμφοκύτταρα (helper cells). Αυτά τα λεμφοκύτταρα βοηθούν τα Β λεμφοκύτταρα να παράγουν αντισώματα. Τα ενδογενή Ag που παρουσιάζονται από MHC τάξης I αναγνωρίζονται από τα CD8 + T λεμφοκύτταρα που διαφοροποιούνται σε κυτταροτοξικά και σκοτώνουν τα μολυσμένα κύτταρα 2. Α.3.5 MHC ΜΟΡΙΑ: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Εικόνα 2 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC, Major Histocompatibility Complex 69 (εικόνα 2) είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες των APCs, που [14]

17 παρουσιάζουν τα αντιγονικά πεπτίδια στα Τ λεμφοκύτταρα. Ονομάζονται έτσι, επειδή σχετίζονται με την αποδοχή ή την απόρριψη μοσχεύματος από ένα άτομο σε άλλο. Οι πρωτεΐνες MHC ονομάζονται και ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (Human Leukocyte Antigens, HLA) επειδή πρωτοανακαλύφθηκαν σαν αντιγόνα των λευκοκυττάρων. Τα γονίδια που τα κωδικοποιούν αποτελούν τον γενετικό τόπο HLA και είναι εξαιρετικά πολυμορφικά, πράγμα που σημαίνει ότι υπάρχουν πολλά διαφορετικά αλλήλια σε διαφορετικά άτομα ενός πληθυσμού. Διακρίνουμε δύο τύπους μορίων MHC. 1) Τα μόρια MHC τάξης I, που αποτελούνται κυρίως από τα HLA-A, HLA-B και HLA-C και 2) Τα μόρια MHC τάξης II, που αποτελούνται κυρίως από τα HLA-DR, HLA-DP και HLA-DQ. Τα μόρια MHC τάξης I και II είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες που έκαστη περιέχει στο αμινοτελικό τμήμα της μία αύλακα σύνδεσης του αντιγονικού πεπτιδίου. Η δομή και στις δύο τάξεις μοιάζει πολύ. Τα μόρια τάξης Ι αποτελούνται από μία α αλυσίδα που συνδέεται μη ομοιοπολικά με μία πρωτεΐνη, την β2 μικροσφαιρίνη. Ο TCR υποδοχέας του Τ λεμφοκυττάρου αναγνωρίζει το συνδεδεμένο με το MHC αντιγονικό πεπτίδιο ταυτόχρονα με τον συνυποδοχέα CD8 στο CD8+ λεμφοκύτταρο που συνδέεται με περιοχή της α αλυσίδας. Τα μόρια τάξης ΙΙ αποτελούνται από δύο αλυσίδες, α και β. Τα αμινοτελικά τμήματα και των δύο αλυσίδων σχηματίζουν την αύλακα που συνδέεται το αντιγονικό πεπτίδιο. Η αλυσίδα β περιέχει επίσης τη θέση σύνδεσης με τον συνυποδοχέα CD4 των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων 2. Οι πολυμορφισμοί των γονιδίων εξασφαλίζουν ότι διαφορετικά άτομα αντιδρούν σε πληθώρα διαφορετικών αντιγονικών πεπτιδίων. Τα MHC II, εκφράζεται στα APCs, μακροφάγα και Β λεμφοκύτταρα, ενώ τα MHC I εκφράζεται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα. Αυτό εξηγεί γιατί τα CD4 + βοηθητικά λεμφοκύτταρα αλληλεπιδρούν με τα δενδριτικά, τα μακροφάγα και Β κύτταρα, ενώ τα κυτταρολυτικά CD8+ (CTLs) φονεύουν οποιοδήποτε κύτταρο έχει μολυνθεί από ιό. [15]

18 Α.3.6 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ Ag ΑΠΟ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΕΠΙΚΤΗΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Τα Ag αναγνωρίζονται από δύο δομικά παρόμοιες γλυκοπρωτεΐνες της μεμβράνης των λεμφοκυττάρων, που είναι οι αντιγονικοί υποδοχείς των Β και των Τ λεμφοκυττάρων. Οι υποδοχείς αυτοί αναγνωρίζουν μεγάλο αριθμό και ποικιλία αντιγόνων και επομένως είναι ικανοί να διακρίνουν πολλές συχνά παρόμοιες χημικές δομές. Κάθε κλώνος Β ή Τ λεμφοκυττάρου αναγνωρίζει με μεγάλη ειδικότητα συγκεκριμένο Ag. Κλώνος είναι ο πληθυσμός κυττάρων που προέρχεται από κοινό προγονικό κύτταρο. Μετά την αναγνώριση του Ag μεταβιβάζονται βιοχημικά σήματα εντός του κυττάρου που είναι όμοια σε όλα τα λεμφοκύτταρα. Την αναγνώριση την επιτυγχάνουν με περιοχές του υποδοχέα που έχουν μεγάλη ποικιλία όσον αφορά την διαδοχή αμινοξέων σε περιοχές που ονομάζονται μεταβλητές. Διαθέτουν και άλλες περιοχές οι υποδοχείς που είναι συντηρημένες όσον αφορά την αμινοξική αλληλουχία, οι οποίες εξυπηρετούν την δομική ακεραιότητα και την μεταβίβαση του σήματος εντός του κυττάρου. Α.3.7 ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Πρόκειται για τύπους αντισωμάτων (ανοσοσφαιρίνες) που είναι γλυκοπρωτεΐνες που είτε είναι διαλυτές και εκκρίνονται στην κυκλοφορία, είτε είναι αγκυροβολημένες στην μεμβράνη των Β κυττάρων 1. Εικόνα 3 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) [16]

19 Οι εκκρινόμενες ανοσοσφαιρίνες εξυπηρετούν την λειτουργία της χυμικής ανοσίας, δηλαδή εξαλείφουν Ag μέσω της σύνδεσης μαζί τους ή εξυπηρετούν τις λεγόμενες δραστικές λειτουργίες των αντισωμάτων, μέσω της σύνδεσης με υποδοχείς στα φαγοκύτταρα καθώς και σε πρωτεΐνες του συστήματος του συμπληρώματος. Οι αγκυροβολημένοι υποδοχείς στην μεμβράνη του Β κυττάρου έχουν την ίδια δομή με τα αντισώματα αλλά συνδέονται μη ομοιοπολικά με δύο πρωτεΐνες, την Igα και την Igβ ( οι πρωτεΐνες σηματοδότησης ) που μαζί αποτελούν το σύμπλεγμα υποδοχέα του Β κυττάρου (B Cell Receptor complex, BCR) (εικόνα 3). Όταν γειτονικοί αντιγονικοί υποδοχείς ενός λεμφοκυττάρου προσδένονται σε 2 ή περισσότερα μόρια Ag, οι υποδοχείς σχηματίζουν συσσωμάτωμα επειδή έλκονται. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται γεφύρωση ή διασύνδεση (cross-linking). Με αυτόν τον τρόπο έρχονται κοντά οι πρωτεΐνες σηματοδότησης του συμπλέγματος του υποδοχέα και αρχίζει καταρράκτης φωσσφορυλίωσης πρωτεϊνών καθοδικά, μετά από ενεργοποίηση ενζύμων που συνδέονται με τα κυτταροπλασματικά τμήματα των πρωτεϊνών σηματοδότησης. Τελικό αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση του Β κυττάρου. Α.3.8 ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων είναι ετεροδιμερή που αποτελούνται από μία α και μία β πεπτιδική αλυσίδα. Κάθε αλυσίδα περιέχει μία μεταβλητή (variable, V) και μια σταθερή (constant, C) περιοχή με ομολογία με τις αντίστοιχες περιοχές των ανοσοσφαιρινών. Οι υποδοχείς αυτοί, αντίθετα με αυτούς των Β κυττάρων δεν παράγονται σε διαλυτή μορφή (εικόνα 3). Ο υποδοχέας των Τ κυττάρων αναγνωρίζει πεπτιδικά Ag, αλλά η μεταβίβαση του σήματος στο εσωτερικό του κυττάρου γίνεται με ένα σύμπλεγμα πρωτεϊνών, τα μόρια CD3 και την αλυσίδα ζ, με τα οποία είναι συνδεδεμένος και αποτελούν όλα μαζί το σύμπλεγμα του Τ κυτταρικού υποδοχέα (T Cell Receptor complex, TCR). Εκτός από την αναγνώριση του πεπτιδικού αντιγόνου, απαιτείται για την ενεργοποίηση του Τ κυττάρου και η δέσμευση των συνυποδοχέων CD8 ή CD4, που [17]

20 συμμετέχουν στην αναγνώριση του MHC. Το μόριο MHC παρουσιάζει, όπως προαναφέραμε, το πεπτιδικό Ag στα Τ κύτταρα μέσα στην αύλακα που φέρει 1. Α.3.9 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Μεσολαβείται από τα Τ κύτταρα που μετά από συνεργασία συνήθως με τα μακροφάγα φονεύουν τα μικρόβια. Αντιμετωπίζει τα ενδοκυττάρια παθογόνα, όπως ιούς και κάποια βακτήρια που πολλαπλασιάζονται ενδοκυττάρια. Η κυτταρική ανοσία προάγει την καταστροφή αυτών των παθογόνων ή την λύση των μολυσμένων κυττάρων. Α.4 ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Α.4.1 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΒΟΗΘΗΤΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗ ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Στη διαδικασία παραγωγής αντισωμάτων σημαντική είναι η αλληλεπίδραση των βοηθητικών CD4+ T-cells με τα B-cells που πραγματοποιείται στο θύμο, λεμφικό ιστό και σπλήνα. Τα Β κύτταρα που είναι ειδικά για ένα πρωτεϊνικό αντιγόνο για να πολλαπλασιαστούν και να διαφοροποιηθούν προς πλασματοκύτταρα που παράγουν αντισώματα, πρέπει να συναντήσουν ένα βοηθητικό Τ κύτταρο στα λεμφικά όργανα, το οποίο θα είναι ειδικό για ένα από τα πεπτίδια του συγκεκριμένου Ag 13. Τα Β κύτταρα μετά την πρόσδεση στους αντιγονικούς τους υποδοχείς πρωτεϊνικών αντιγόνων, τα ενδοκυτταρώνουν, τα επεξεργάζονται και τα παρουσιάζουν στα CD4+ βοηθητικά Τ-cells, αφού τα συνδέσουν με τα MHC τάξης II μόρια. Αυτό επιτυγχάνεται και μέσω της αλληλεπίδρασης του CD40 υποδοχέα που εκφράζεται στα Β κύτταρα με τον προσδέτη CD40 (CD40 ligand) (εικόνα 4) που εκφράζεται στα Τ κύτταρα και έκκρισης κυτταροκινών που ενεργοποιούν τα Β κύτταρα ώστε αυτά να πολλαπλασιαστούν και να διαφοροποιηθούν προς πλασματοκύτταρα που παράγουν τα Ab. Επίσης διεγείρεται και η μεταστροφή τάξης των βαρειών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, ώστε να παραχθούν οι διάφοροι ισότυποι των αντισωμάτων. [18]

21 Εικόνα 4 (Αbul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Α.4.2 ΟΙ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ -ΔΟΜΗ Οι IgG ανοσοσφαιρίνες είναι οι προεξέχουσες ανοσοσφαιρίνες στον άνθρωπο. Έχουν το μακρύτερο χρόνο ημιζωής από τις άλλες οικογένειες ανοσοσφαιρινών και έχουν διερευνηθεί στον μεγαλύτερο βαθμό. Η IgG ανοσοσφαιρίνη (150 KDa) αποτελείται από 2 μεταξύ τους ταυτόσημες ελαφρές (κ και λ) και 2 βαρειές αλυσίδες που ζευγαρώνουν μεταξύ τους (κάθε ελαφρά με μια βαρειά αλυσίδα και κάθε βαρειά με την άλλη βαρειά αλυσίδα). Οι αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δισουλφιδικούς δεσμούς, καθώς και με μη ομοιοπολικούς δεσμούς. Υπάρχει πανομοιότητα μεταξύ των δυο ελαφρών αλυσίδων (23KDa), καθώς και μεταξύ των δυο βαρειών αλυσίδων (50KDA) 4. Με τη χρήση ενός πρωτεολυτικού ενζύμου, της παπαΐνης (Porter) που υδρολύει τους πεπτιδικούς δεσμούς της IgG, επιτυγχάνεται μερική πέψη του μορίου της IgG σε τρία τμήματα, δυο Fab (fragments of antigen binding) και ένα Fc (fragment crystallizable) (εικόνα 5). Κάθε Fab τμήμα αποτελείται από ολόκληρη την ελαφρά αλυσίδα και μέρος της βαρειάς αλυσίδας. Ο προσανατολισμός των 2 τμημάτων Fab είναι τέτοιος, ώστε το μόριο IgG να μοιάζει με ένα <<Τ>> 5. [19]

22 Εικόνα 5 (Εισαγωγή στη δομή των πρωτεϊνών) Οι ελαφρές (light chains, L) αλυσίδες του μορίου IgG αποτελούνται από δυο τμήματα το μεταβλητό τμήμα (Variable domain, VL) και το σταθερό τμήμα (Constant domain, CL), ενώ οι βαρειές (heavy chains, H) από τέσσερα τμήματα το VH και τα CH1, CH2, CH3 με τη σειρά (εικόνα 6), όπως είναι τοποθετημένα αρχίζοντας από τα αμινοτελικά άκρα των αλυσίδων 6. Walsh G. Post-translation Modification of Protein Biopharmaceuticals. Part One, Glycosylation Εικόνα 6 [20]

23 Κάθε ελαφρά αλυσίδα αποτελείται από μια μεγάλη περιοχή που είναι σταθερή για διάφορους τύπους αντισωμάτων (ακόμα και σε διαφορετικά είδη). Η μεγάλη περιοχή, η constant region (σταθερή επικράτεια) έχει σχεδόν ταυτόσημη ακολουθία αμινοξέων προς το καρβοξυτελικό άκρο (κατάλοιπα ) ενώ στο άλλο άκρο το αμινοτελικό (κατάλοιπα 1-108) επιδεικνύει μεγάλη ποικιλότητα, όσον αφορά την ακολουθία των αμινοξέων στις διάφορες αλυσίδες και ονομάζεται Variable region (μεταβλητή επικράτεια) 4. Η ποικιλότητα αυτή ευθύνεται για την ικανότητα των Ab να συνδέουν διαφορετικά Ag λόγω της μεγάλης ποικιλότητας στην τριτοταγή δομή κάθε V (Variable region VL και VH) επακόλουθο της μοναδικής αλληλουχίας των αμινοξέων. Η μεγαλύτερη ποικιλότητα στις ελαφρές αλυσίδες εκτείνεται γύρω από τα κατάλοιπα 30, 55 και 95, περιοχές που ονομάζονται υπερμεταβλητές περιοχές (Hypervariable regions) ή περιοχές καθορισμού της συμπληρωματικότητας (Complementarity determining regions, CDR). Κάθε CDR αποτελείται από 10 αμινοξικά κατάλοιπα περίπου και με τη σειρά, όπως τοποθετούνται αρχόμενα από το αμινοτελικό άκρο κάθε αλυσίδας αριθμούνται CDR1, CDR2, CDR3 7. Τα τμήματα VL, VH, CL, CH παρουσιάζουν ομολογία όσον αφορά την αμινοξική αλληλουχία (συντηρημένες περιοχές) δηλαδή το VL με το VH domain, όπως επίσης τα CH1, CH2, CH3 μεταξύ τους, όπως και με το CL της ελαφράς αλυσίδας, πράγμα που δείχνει την ύπαρξη εξελικτικών σχέσεων μεταξύ τους και ενισχύει την υπόθεση ότι οι σταθερές περιοχές προέκυψαν από γονιδιακό αναδιπλασιασμό των προγονικών γονιδίων. Τα Ab έχουν υψηλή ευκαμψία (segment flexibility), δηλαδή τα δυο Fab τμήματα μετακινούνται το ένα σε σχέση με το άλλο, καθώς και σε σχέση με το στέλεχος Fc κατά την σύνδεση με το Ag. Η περιοχή που προσδίδει αυτή την ευκαμψία ονομάζεται περιοχή άρθρωσης (hinge region) που είναι σημαντική για την λειτουργία των IgG και βρίσκεται ανάμεσα στα CH1 και CH2 domains. Παρουσιάζει αμινοξική αλληλουχία με κατάλοιπα κυστεΐνης που σχηματίζουν δισουλφιδικές γέφυρες μεταξύ των βαρειών αλυσίδων στη θέση ανάμεσα σε CH1 και CH2. Περιέχει επίσης μεγάλο ποσοστό καταλοίπων προλίνης 3. [21]

24 Μοριακά μοντέλα της IgG1βάσει της κρυσταλλικής δομής (4,137). ( The impact of Glycosylation on the Biological Function and Structure of Human Immunoglobulins, J.N. Arnold et al) Εικόνα 7 Με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ (εικόνα 7) έχουμε πληροφορίες για τη δομή των IgG. Οι σταθερές επικράτειες (CL, CH1, CH2, CH3) δομικά αποτελούνται από 7 β- κλώνους, που σχηματίζουν οι μεν 4 μια β-πτυχωτή επιφάνεια και λοιποί 3 μια δεύτερη β-πτυχωτή επιφάνεια που είναι τοποθετημένες αντιπαράλληλα πακετάρονται στενά μεταξύ τους με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και συνδέονται μεταξύ τους με μια δισουλφιδική γέφυρα (intrachain bond, διαλυσιδικοί δεσμοί) και σχηματίζεται δομή βαρελιού. Ανάμεσα στους β- κλώνους σχηματίζονται οι βρόχοι που πιθανότατα εμπλέκονται στις φυσιολογικές λειτουργίες των IgG(εικόνα 8) 8. [22]

25 Εισαγωγή στη δομή των πρωτεϊνών Εικόνα 8 Μετά δηλαδή τη σύνδεση του Ag αποστέλλονται σήματα μέσω της περιοχής Fc που επιτελεί τις τελεστικές λειτουργίες του Ab. H μεταβλητή επικράτεια (VL, VH) έχει παρόμοια δομή με τη σταθερή αλλά απoτελείται από 9 β-κλώνους. Οι VL και VH επικράτειες βρίσκονται στους βρόχους μεταξύ των β-κλώνων που είναι συγκεντρωμένοι στο ένα άκρο των β-πτυχωτών επιφανειών, με τις 6 υπερμεταβλητές περιοχές (3 για τις ελαφρές και 3 για τις βαρείες αλυσίδες) να βρίσκονται κοντά. Σχηματίζονται ή ειδική επίπεδη επιφάνεια για την πρόσδεση πρωτεϊνικών Ag ή ειδικές βαθειές κοιλότητες για πρόσδεση με απτένια 8. Η μεγάλη ποικιλότητα στην αμινοξική αλληλουχία στους υπερμεταβλητούς βρόχους CDR προσδίδει τη μεγάλη ειδικότητα για τη σύνδεση Ag και τη δυνατότητα να προσδένεται μεγάλο εύρος Ag. Οι περιοχές των Ag που αναγνωρίζονται και συνδέονται με τα Ab είναι οι επίτοποι. Η σύνδεση γίνεται με πολλαπλούς μη ομοιοπολικούς δεσμούς δηλαδή δεσμούς υδρογόνου, υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, δυνάμεις Vander Waals, ηλεκτροστατικές δυνάμεις με υψηλή ενέργεια σύνδεσης. [23]

26 Α.4.3 ΤΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΥΠΟΤΑΞΕΙΣ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Διαγραμματική παρουσίαση των IgM, IgA1, IgA2m(2), IgG1, IgD, και IgE που δείχνουν τα LCs (μωβ), HCs (μπλε), την αλυσίδα IgMJ (ροζ) και τις διαλυσιδικές δισουλφιδικές γέφυρες (μαύρο). Οι τοποθεσίες της Ν-γλυκοζυλίωσης φαίνονται με σύνθετες (κόκκινο) και ολογομανοζικές (πράσινο) γλυκάνες σύμφωνα με την γλυκανική ανάλυση. Οι ομάδες των Ο-γλυκανών είναι κίτρινες. ( The impact of Glycosylation on the Biological Function and Structure of Human Immunoglobulins, J.N. Arnold et al) Εικόνα 9 Διακρίνουμε 5 τάξεις των ανοσοσφαιρινών IgG, IgM, IgA, IgD και IgΕ με μοναδικά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά και κατανομή στο σώμα του ανθρώπου (εικόνα 9). Οι διαφορετικές τάξεις των Ig προσδιορίζονται από τους 5 διαφορετικούς ισότυπους των βαρειών αλυσίδων (γ), (μ), (α), (δ), (ε) που συνδυάζονται με μια από τις 2 τάξεις των ελαφρών αλυσίδων κ ή λ. Το μόριο της IgM είναι πενταμερές όπου οι βαρειές αλυσίδες διαθέτουν 4 σταθερές επικράτειες, ενώ η IgG διαθέτει 3 σταθερές επικράτειες. Το μόριο της IgA είναι διμερές ενώ οι υπόλοιπες IgG, IgD και IgE είναι μονομερείς 68. Υπάρχουν κοινά προσδιοριστικά χαρακτηριστικά (determinants) που είναι ειδικά για τις σταθερές περιοχές και με βάση αυτά, τις διαιρούμε σε τάξεις. Άλλα προσδιοριστικά χαρακτηριστικά ορίζουν διαφορές μέσα στην ίδια τάξη που τις διακρίνουν σε υποτάξεις (λειτουργικές και [24]

27 δομικές διαφορές στις σταθερές επικράτειες της βαρειάς αλυσίδας και ειδικά στις CH1 και CH3). Η IgG έχει 4 υποτάξεις (subclasses) και είναι οι IgG1, IgG2, Gg3, IgG4 (11) και η IgA έχει 2 υποτάξεις τις IgA1 και IgA2 2. Οι IgG υποτάξεις έχουν διαφορετικές λειτουργίες, όπως επί παραδείγματι στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος που είναι σημαντική για την απομάκρυνση οψωνινοποιημένων παθογόνων. Η IgG4 είναι η μόνη υποτάξη που δεν συνδέει το συμπλήρωμα. Η κατά σειρά ελάττωσης της συγγένειας για το C1q το πρώτο συστατικό του καταρράκτη του συμπληρώματος (σύνδεση στοch2 τμήμα) είναι IgG3>IgG1>IgG2. Υπάρχουν επίσης διαφορές στη συγγένεια για τους 3 υποδοχείς FcγR. Η IgG1 και IgG3 συνδέεται και με τις 3 τάξεις των υποδοχέων (FcγRI, FcγRII και FcγRIII), η IgG4 με τον FcγΙΙ και FcγIII ενώ η IgG4 μόνο με τον FcγII. Διαφορές επίσης υπάρχουν όσον αφορά την ανοσολογική απάντηση δηλ. οι IgG1 και IgG3 αντιδρούν σε πρωτεϊνικά Ag ενώ οι IgG2 και IgG4 σε πολυσακχαρίτες 18. Τα Ab περιέχουν υδατανθρακικά μόρια που διαφέρουν στο ποσοστό και την τοποθέτησή τους ανάλογα με την τάξη της ανοσοσφαιρίνης. Όλα τα μόρια της IgG είναι γλυκοπρωτεΐνες γιατί περιέχουν μια συντηρημένη θέση γλυκοζυλίωσης Ν- συνδεδεμένη (N-linked glycosylation site) στο αμινοξύ ασπαραγίνη Asn-297 σε κάθε Cγ2 επικράτεια. Η γλυκάνη εξυπηρετεί τη διατήρηση της τεταρτοταγούς δομής του μορίου IgG και τη σταθερότητα του Fc στελέχους. Ένας πληθυσμός από 32 ειδών δομές ολιγοσακχαριτών μπορεί να συνδέονται με τα μόρια IgG, με αποτέλεσμα την ύπαρξη ποικιλίας γλυκομορφών ανάλογα με το σάκχαρο που συνδέεται στη θέση γλυκοζυλίωσης. Α.4.4 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Στις λειτουργίες της IgG συμπεριλαμβάνονται: Εξουδετέρωση μικροβίων και τοξινών Οψωνινοποίηση αντιγόνων για φαγοκυττάρωση από μακροφάγα, ουδετερόφιλα ADCC μεσολαβούμενη από NKcells Νεογνική ανοσία Αναστολή της ενεργοποίησης των Β κυττάρων [25]

28 Διακρίνονται δύο τύποι αναγνώρισης των παθογόνων μέσω των ειδικών τμημάτων του Ab. (Τα παθογόνα περιλαμβάνουν τοξίνες, βακτήρια, ιούς, tumor cells κλπ.) Α) Ειδική αναγνώριση του αντιγονικού στόχου που μεσολαβείται από τα αμινοτελικά μεταβλητά V τμήματα των 2 Fab περιοχών. Β) Αλληλεπιδράσεις των σταθερών C επικρατειών της Fc περιοχής με διάφορα εκτελεστικά μόρια συμπεριλαμβανομένου του συμπληρώματος και το πιο σημαντικό του Fcγ υποδοχέα που βρίσκεται στα φαγοκύτταρα και άλλα ανοσοκύτταρα που ενεργοποιείται από τη σύνδεση Ag-Ab. Α.5 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ FcγRs Η οικογένεια των FcγR αποτελείται από τρεις εκπροσώπους που είναι οι εξής: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) και FcγRIII(CD16) που εκφράζονται σε όλα αιμοποιητικά κύτταρα. Tα εξωκυττάρια τμήματα των υποδοχέων επιδεικνύουν υψηλό βαθμό ομολογίας στις αμινοξικές αλληλουχίες και μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να διακρίνουν ανάμεσα τους. Τα CD64 μονοκλωνικά αντιδρούν με τον FcγRI, τα CD32 με τον FcγRII και τα CD16 με τον FcγRIII. Είναι όλες διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες που ανήκουν στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Όλοι έχουν υψηλή ομολογία στο εξωκυττάριο τμήμα τους, ενώ διαφέρουν στα κυτταροπλασματικά τμήματα διαθέτοντας tyrosine based (ITAM) ενεργοποιητικά και tyrosine based (ITIM) ανασταλτικά μοτίβα 9. Φλεγμονώδεις κυτοκίνες ρυθμίζουν την έκφραση τους. τα Α.5.1 Fcγ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Οι ανθρώπινοι IgG υποδοχείς αποτελούνται από ενεργοποιητικούς υποδοχείς (FcγRI, FcγRIIC, FcγRIIA και FcγRIIIA), έναν ανασταλτικό υποδοχέα(fcγriib), έναν υποδοχέα με ασαφή λειτουργία (FcγRIIIB) και έναν (FcγRn) που ενέχεται στην κάθαρση και την μεταφορά της IgG,ανάμεσα σε άλλες λειτουργίες. Οι υποδοχείς FcγR είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και αποτελούνται από ένα εξωκυττάριο τμήμα με δύο ή τρεις επικράτειες, που προσομοιάζουν σε IgG (immunoglobulin-like [26]

29 domain),ένα διαμεμβρανικό και ένα κυτταροπλασματικό ή ενδοκυττάριο τμήμα (εικόνα 10). Η οικογένεια των Fc υποδοχέων από τον ποντικό και άνθρωπο της IgG. Υπάρχει συγγένειας υποδοχέας FcγRI. Όλοι οι άλλοι υποδοχείς έχουν χαμηλή με μέση συγγένεια για το Fc τμήμα των αντισωμάτων. Ανασταλτικός υποδοχέας FcγRIIb με μια αλυσίδα που περιέχει ένα Immunoreceptor Tyrosine based Inhibitory Motif (ITIM) στο κυτταροπλασματικό τμήμα. Οι ενεργοποιητικοί υποδοχείς αποτελούνται από μια α-αλυσίδα που συνδέει τον συνδέτη και μια γ- αλυσίδα σε μορφή διμερούς που μεταφέρει το μήνυμα και περιέχει Immunoreceptor Tyrosine based Activatory Motif (ITAM). ( Fcγ receptors as regulators of immune responses Falk Nimmerjahn et al.) Εικόνα 10 Μετά από σύνδεση με πολυμερείς αγωνιστές, οι ενεργοποιητικοί FcγR συσσωρεύονται στην κυτταρική μεμβράνη και μεταφέρουν ενδοκυτταρικά τη σηματοδότηση, μέσω ενός μοτίβου ITAM (immunoreceptor tyrosine-based motif). Το μοτίβο ITAM 73 αποτελείται από δύο σειρές αμινοξέων ΥΧΧL (τυροσίνηοτιδήποτεε Χ2-λευκίνη) που βρίσκονται πολύ κοντά. Ειδικά για τον FcγRIIIΑ, το μοτίβο ανευρίσκεται στη συνοδευτική γ αλυσίδα. Το ITAM επιτρέπει την στρατολόγηση κινασών της τυροσίνης της οικογένειας SRC και SYC και το σηματοδοτικό αυτό μονοπάτι τελικά ενεργοποιεί το κύτταρο, προκαλεί την παραγωγή κυτοκινών και χημειοκινών και οδώνει την μετανάστευση του κυττάρου 43. [27]

30 To μοτίβο ΙΤΙΜ (immunoreceptor tyrosine -based inhibition motif) βρίσκεται στο κυτταροπλασματικό άκρο, ενδοκυττάρια του ανασταλτικού υποδοχέα FcγRIIB. Μετά την σύνδεση με τον συνδέτη του, στρατολογεί κινάσες τυροσίνης της οικογένειας SRC και τελικά στρατολογούνται φωσφατάσες φωσφοτυροσίνης που ελαττώνουν την ενεργοποίηση από μόρια που ενέχονται στην κυτταρική σηματοδότηση. Με τη χρήση μονοκλωνικών Ab βρέθηκαν τα εξής όσον αφορά την κυτταρική κατανομή των υποδοχέων της ανοσοσφαιρίνης FcγRs που παρουσιάζονται στον κάτωθι πίνακα 1. Πίνακας 1 Τύπος Κυτταρική κατανομή Δράσεις FcγRI(CD64) FcγIIA(CD32A) FcγIIB(CD32B) FcγIIIA(CD16A) μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα Όλα τα μυελικά εκτός λεμφοκυττάρων Σε όλα τα κύτταρα ανοσοποιητικού, κυρίως στα Β- cells, βασεόφιλα και όχι στα NK Μονοκύτταρα/μακροφάγα, NK Φαγοκυττάρωση Κυτταρική Ενεργοποίηση Φαγοκυττάρωση Αναστολή δραστηριότητας των κυττάρων Επάγει την ADCC και την απελευθέρωση κυτοκινών FcγIIIB(CD16B) Ουδετερόφιλα Καταστροφή μικροβίων Από την κυτταρική κατανομή των FcγRs όπως φαίνεται στον πίνακα 1 βγαίνει το συμπέρασμα ότι οι ενεργοποιητικοί υποδοχείς μπορεί να ρυθμιστούν αρνητικά από τον ανασταλτικό FcγRIIB, μόνο στα Β λεμφοκύτταρα και βασεόφιλα και όχι στα κύτταρα που δεν εκφράζουν τον ανασταλτικό υποδοχέα 9. Μετά την αναγνώριση σύνδεσης του Ag από την IgG γίνεται αλλαγή διαμόρφωσης, μετατόπιση του IgG και μετακίνηση του Fc, επιτρέποντας την αλληλεπίδραση με τον FcR. Πιο συγκεκριμένα γίνεται ασύμμετρο άνοιγμα περίπου 7 A 0 ανάμεσα στα [28]

31 αμινοτελικά άκρα των CH2 τμημάτων. Η αλληλεπίδραση Fc τμήματος της IgG και FcR γίνεται με το αμινοτελικού άκρου του CH2 τμήματος εντός της χαμηλής hinge region περιοχής μέσω συνδυασμού υδρογονοδεσμών, ιοντικών δεσμών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Κατόπιν, οι FcR επανατοποθετούνται σε διαμερίσματα της κυτταρικής μεμβράνης των εκτελεστικών κυττάρων πλούσιων σε σφιγγολιπίδια χοληστερόλη όπου υπάρχουν μηνυματοφόρα μόρια και έτσι επιτρέπεται η μεταγωγή σήματος 65. Οι FcR οι οποίες έχουν συνδεθεί με τo Fc τμήμα της IgG πυροδοτούν φωσφορυλίωση των ΙΤΑΜ από τυροσινικές κινάσες, μέλη της οικογενείας των src κινασών, ώστε να επιτευχτεί η μεταγωγή σήματος. Το αποτέλεσμα είναι η φαγοκυττάρωση, η εξαρτώμενη από το Ab κυτταροτοξικότητα (ADCC) των επικαλυμμένων με Ab κυττάρων στόχων, καθώς και η απελευθέρωση (μέσω αποκοκκίωσης ή άμεσα) πρωτεολυτικών ενζύμων, δραστικών ριζών οξυγόνου και φλεγμονωδών μεσολαβητών. Παραδείγματα υποδοχέων ανοσοσφαιρινών και ο ρόλος τους in vivo FcγΙΙb: αναστέλλει τη φλεγμονή. FcγΙΙΙa: προωθεί την ADCC. C1qR: έναρξη της κλασσικής οδού στον καταρράκτη του συμπληρώματος. FcRn: προστατεύει το Ab από την αποδόμηση από τα λυσοσώματα, ώστε να παρατείνεται ο χρόνος ημισείας ζωής 10. Στα εκτελεστικά κύτταρα εκφράζονται 2 είδη FcγRs, οι ενεργοποιητικοί και οι ανασταλτικοί. Η σχέση της έκφρασης αυτών των αντίθετων συστημάτων προσδιορίζει την απάντηση του ανοσοκυττάρου. Τα ανοσοσυμπλέγματα ενεργοποιούν επίσης το συμπλήρωμα μέσω σύνδεσης με το C1q κλάσμα του συμπληρώματος. Η γλυκομορφή των υποδοχέων μπορεί να ενεργοποιήσει το συμπλήρωμα μέσω της οδού της λεκτίνης. Ανάλογα με τον τύπο τους οι γλυκομορφές μπορούν να συνδεθούν με υποδοχείς μανόζης που εκφράζονται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Οι FcnRs (neonatal FcR, νεογνικοί Fc υποδοχείς) υπηρετούν μια άλλη σημαντική βιολογική δραστηριότητα των IgG, που είναι η μεταφορά των μητρικών Ab μέσω του πλακούντα στο έμβρυο και από το μητρικό γάλα μέσω ΓΕΣ [29]

32 στο νεογνό (τα επιθηλιακά τους κύτταρα εκφράζουν FcRn υποδοχείς). Τα ανθρώπινα έμβρυα και νεογνά μέχρι μιας ηλικίας δεν έχουν αναπτυγμένο δικό τους ανοσολογικό σύστημα και την προστασία τους αναλαμβάνουν τα μητρικά Ab (παθητική ανοσία). Εξ άλλου οι υποδοχείς αυτοί έχουν και τη λειτουργία να μεταφέρουν με ασφάλεια το IgG αντίσωμα από την επακόλουθη λυσοσωματική αποικοδόμηση και να το διατηρεί στην κυκλοφορία 66. Α.6 ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ( εικόνα 11) Εικόνα 11 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Α. ΟΨΩΝΙΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ Τα αντισώματα μόλις συναντήσουν τα παθογόνα προσδένονται επί αυτών και τα επικαλύπτουν με μία διαδικασία που ονομάζεται οψωνινοποίηση. Η σύνδεση με το Ag γίνεται με το τμήμα Fab, ενώ τα τμήματα Fc προβάλλουν προς τα έξω. Εφ όσον ο ισότυπος του αντισώματος είναι IgG1 και IgG3, τα Fc τμήματα προσδένονται με τον [30]

33 υψηλής συγγένειας υποδοχέα FcγRI (CD64) που εκφράζεται στα μακροφάγα και ουδετερόφιλα. Ενεργοποιούνται έτσι τα φαγοκύτταρα με σήματα που αποστέλλονται λόγω της πρόσδεσης του Fc με τον FcγRI. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την εγκόλπωση από το φαγοκύτταρο του οψωνινοποιημένου μικροοργανισμού. Δημιουργείται το φαγόσωμα που συντήκεται με το λυσόσωμα που παράγει μεγάλες ποσότητες δραστικών μεταβολιτών του Οξυγόνου, μονοξείδιο του Αζώτου, πρωτεολυτικά ένζυμα και επέρχεται καταστροφή του φαγοκυτταρομένου μικροοργανισμού (εικόνα 12). Εικόνα 12 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Β. ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ Στην αντισωματοεξαρτώμενη κυτταρική κυτταροτοξικότητα (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC), επιλαμβάνουν δράση τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (NK) που συνδέονται με κύτταρα που καλύπτονται με αντισώματα. Αυτό γίνεται μέσω του χαμηλής συγγένειας υποδοχέα που εκφράζουν τα NK cells του FcγRIII (CD16) που προσδένεται στο Fc τμήμα των IgG αντισωμάτων που είναι προσκολλημένα στο κύτταρο στόχο. Τα σήματα που παράγονται από την σύνδεση Fc/FcγRIII ενεργοποιούν τα NK cells που απελευθερώνουν το περιεχόμενο των κοκκίων τους και καταστρέφουν τα επενδεδυμένα με IgG κύτταρα στόχους (εικόνα 13) 14. [31]

34 Εικόνα 13 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Γ. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Προαναφέρθηκαν οι τρεις οδοί ενεργοποίησης του συμπληρώματος, δηλαδή η εναλλακτική οδός, η κλασική οδός και η οδός της λεκτίνης. Η μεν εναλλακτική οδός και η οδός της λεκτίνης ανήκουν στη φυσική ανοσία, η δε κλασική οδός ανήκει στην επίκτητη ανοσία. Στην Εναλλακτική οδό, το προϊόν υδρόλυσης του C3 κλάσματος του συμπληρώματος, το C3b, εναποτίθεται στην μεμβράνη του μικροβίου και ξεκινάει ο καταρράκτης της ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Στην Κλασσική οδό, η ανοσοσφαιρίνη IgM ή οι υποτάξεις IgG1 και IgG3 προσδένονται στα Ag στην επιφάνεια του μικροβίου. Οι περιοχές Fc των αντισωμάτων συμπλησιάζουν και δύο γειτονικές Fc συνδέονται με το συστατικό C1 του συμπληρώματος. Ξεκινάει έτσι ο καταρράκτης της ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Στην οδό της Λεκτίνης, μία λεκτίνη του ορού, η συνδέουσα την μανόζη λεκτίνη, (Mannose Binding Lectin, MBL) συνδέεται με την μαννόζη που βρίσκεται στα μικρόβια. Στη συνέχεια ενεργοποιείται ο καταρράκτης του συμπληρώματος. Οι τρεις αυτοί οδοί ξεκινούν από διαφορετική αφετηρία αλλά και στις τρεις αναπτύσσεται στα τελικά στάδια του καταρράκτη το σύμπλεγμα προσβολής της μεμβράνης (Membrane Attack Complex, MAC) που σχηματίζει πόρο στην μεμβράνη του κυττάρου στόχου και τελικά με την είσοδο νερού και ηλεκτρολυτών γίνεται ωσμωτική λύση του κυττάρου 15. [32]

35 Α.7 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ ΚΑΙ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ Α.7.1 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ Το ανοσιακό σύστημα έχει την ικανότητα να διακρίνει τις ξένες πρωτεΐνες, όπως αυτές που προέρχονται από τα εισβάλλοντα παθογόνα, από αυτές που προέρχονται από τα κύτταρα του ίδιου του οργανισμού. Είναι δηλαδή χαρακτηριστικό του οργανισμού να αντιδρά στα ξένα αντιγόνα, ενώ δεν αντιδρά στα προερχόμενα από τον ίδιο, δηλαδή στα εαυτού Αντιγόνα. Η μη αντίδραση στα εαυτού Ag ονομάζεται Ανοσοανοχή (immune tolerance) 2. Εικόνα 14 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) Τα λεμφοκύτταρα του οργανισμού έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν εκτός από τα ξένα και τα εαυτού Ag με τους κατάλληλους υποδοχείς που διαθέτουν. Η ανοσοανοχή διακρίνεται σε κεντρική (εικόνα 14) και περιφερική ανοσοανοχή. Η κεντρική ανοσοανοχή προκαλείται όταν τα ωριμάζοντα λεμφοκύτταρα συναντήσουν τα αντίστοιχα Ag στα κεντρικά λεμφικά όργανα (θύμος και μυελός των οστών) ενώ η περιφερική ανοσοανοχή όταν η συνάντηση αυτή γίνει από τα ώριμα πια λεμφοκύτταρα στα περιφερικά λεμφικά όργανα. [33]

36 Αυτοανοσία είναι η ανοσοαπάντηση εναντίον των εαυτού αντιγόνων. Προκαλείται από την απώλεια της ιδιότητας της ανοσοανοχής, είτε λόγω ανωμαλιών στα αυτοδραστικά λεμφοκύτταρα, είτε ανωμαλιών στην φύση του Ag και στην παρουσίαση των εαυτού Ag, Α.7.2 ΑΝΟΣΟΑΝΟΧΗ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΗ ΜΕ ΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ Στην κεντρική Τ ανοσοανοχή τα ωριμάζοντα Τ λεμφοκύτταρα στον θύμο όταν αναγνωρίσουν με μεγάλη ισχύ (avidity) τα εαυτού Ag δέχονται σήματα που πυροδοτούν την απόπτωση και το λεμφοκύτταρο πεθαίνει. (Αρνητική Επιλογή) 1. Η αναγνώριση με υψηλή ισχύ γίνεται όταν τα Ag βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση όπως πράγματι συμβαίνει με τα εαυτού Ag είτε όταν τα λεμφοκύτταρα διαθέτουν υποδοχείς που αναγνωρίζουν τα Ag με υψηλή ισχύ (υποδοχείς υψηλής συγγένειας). Τα υψηλής συγγένειας αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα που εξαλείφονται μπορεί να είναι CD4+ ή CD8+ T κύτταρα. Στην περιφερική Τ ανοσοανοχή τα ώριμα αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν το εαυτού Ag στην περιφέρεια μπορεί να υποστούν 1) απενεργοποίηση (ανεργία) (εικόνα 15) 2) κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) και 3) καταστολή της δράσης τους. Εικόνα 15 (Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman) [34]

37 1) Η λειτουργική απενεργοποίηση (ανεργία) είναι κατάσταση λειτουργικής αδράνειας των λεμφοκυττάρων που παρατηρείται εφ όσον δεν υπάρξει κατά την αναγνώριση του Ag από τα Τ κύτταρα, η έκφραση των συνδιεγερτών που απαιτείται για την πλήρη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Τα APCs εκφράζουν συνδιεγέρτες όπως το μόριο B7 (CD28) και δίνουν το 2 ο σήμα στα Τ λεμφοκύτταρα που διαθέτουν τους υποδοχείς για το εαυτού Ag. Το πρώτο σήμα είναι το ίδιο το Ag. Εάν δεν υπάρξει το 2 ο σήμα, τα Τ κύτταρα μεταπίπτουν σε κατάσταση ανεργίας. Αυτό επιτελείται και μέσω του μορίου CTLA-4 που συνδέεται με το Β7 στα APCs και έτσι αναστέλλεται η λειτουργία του Τ cell. 2) Ο κυτταρικός θάνατος (απόπτωση) 71 είναι ένας μηχανισμός απάλειψης των αυτοδραστικών Τ-cells. Mέσω της επανειλημμένης ενεργοποίησης των Τ-cells από τα εαυτού Ag, εκφράζεται ο υποδοχέας του κυτταρικού θανάτου Fas μαζί με τον προσδέτη του FasL, οπότε ενεργοποιούνται οι κασπάσες και επέρχεται ο θάνατος των αυτοδραστικών Τ κυττάρων. 3) Η καταστολή της δράσης των αυτοδραστικών Τ κυττάρων γίνεται μέσω μετατροπής τους σε κατασταλτικά (Ts) ή σε ρυθμιστικά (Treg) που αναστέλλουν την ενεργοποίηση και άλλων δυνητικά βλαπτικών αυτοδραστικών Τ κυττάρων. Αυτό γίνεται μέσω παραγωγής κυτοκινών, όπως η TGF-2 (Tumor Growth Factor-2) και η IL-1 (Interleukin-10, ιντερλευκινη-10), που αναστέλλουν την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Όσον αφορά τα Β κύτταρα, μέσω επαγωγής ανοχής στα Β cells προλαμβάνεται η παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Και εδώ έχουμε την κεντρική και την περιφερική ανοσοανοχή. Στην κεντρική ανοσοανοχή η αλληλεπίδραση με τα εαυτού Ag γίνεται στον μυελό των οστών, οπότε τα Β cells είτε πεθαίνουν (αρνητική επιλογή) είτε αλλάζουν την ειδικότητα του υποδοχέα τους (επεξεργασία υποδοχέα, receptor editing) και έτσι παύει να είναι ειδικός για τα εαυτού Ag. Στην περιφερική ανοσοανοχή καταστέλλεται η λειτουργία των Β-cells που συναντούν σε μεγάλες συγκεντρώσεις τα εαυτού Ag στους περιφερικούς [35]

38 λεμφικούς ιστούς. Αυτό γίνεται πιθανά λόγω μη ύπαρξης βοήθειας από τα βοηθητικά Τ- cells (T helper). Α.7.3 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΟΔΗΓΟΥΝ ΣΤΗΝ ΕΚΔΗΛΩΣΗ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑΣ 1) Τροποποίηση των «εαυτού» αντιγόνων μέσω σύνδεσης με απτίνες, ώστε να αναγνωρίζονται από τα Τ βοηθητικά κύτταρα σαν ξένα Ag και να διεγείρεται η παραγωγή αντισωμάτων από τα Β κύτταρα. 2) Ανεξάρτητος από την αναγνώριση του εαυτού Ag πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση αυτοδραστικών κλώνων λεμφοκυττάρων, που προκαλείται από διάφορους παράγοντες όπως LPS, ιοί κ.λ.π. 3) Ιστική βλάβη μπορεί να επιφέρει αποδόμηση ιδίων μορίων του οργανισμού και να αποκαλυφθούν επίτοποι που αλλιώς δεν θα παρουσιάζονταν στο ανοσολογικό σύστημα. 4) Αναστολή της δράσης των Τ κατασταλτικών κυττάρων με αποτέλεσμα να έχουμε αύξηση της δράσης των αυτοδραστικών λεμφοκυττάρων. 5) Διασταυρούμενη αντίδραση του ανοσοποιητικού σε "εαυτού" Ag που μοιάζουν με ξένα Ag (μοριακή μίμηση). 6) Φαινόμενο μοριακής μίμησης έχουμε και σε καταστάσεις κυτταρικού stress που παράγονται πρωτεΐνες θερμικού shock (heat shock proteins, Hsp) που έχουν ομολογία με μικροβιακές πρωτεΐνες. 7) Ανεπαρκής έλεγχος παραγωγής αντι-ιδιοτυπικών Ab, με αποτέλεσμα ανάπτυξη αυτοανοσίας λόγω ανεξέλεγκτης παραγωγής Αυτο Ab. Τα ιδιοτυπικά Ab μπορεί να δράσουν σαν Ag και να παραχθούν αντισώματα που ονομάζονται αντι-ιδιοτυπικά Ab σύμφωνα με την θεωρία του Niels Jerne. 8) Η διέγερση της έκφρασης των MHC μορίων I και II τάξης οδηγεί σε ευαισθητοποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων έναντι των "εαυτού" Ag, με συνέπεια την ενεργοποίηση των Β κυττάρων που παράγουν αυτο-abs 5. [36]

39 Α.8 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Α.8.1 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Υπάρχει σχέση μεταξύ ανοσοκαταστολής και ανάπτυξης καρκινικών όγκων. Η επίπτωση του καρκίνου είναι αυξημένη σε ανοσοκατασταλμένους και σε άτομα με πρωτοπαθή ανοσοανεπάρκεια. Η συχνότητα ανάπτυξης Ca στους μεταμοσχευμένους είναι 13 : 2000 σε σύγκριση με 8,2 : 2000 στον γενικό πληθυσμό. Α.8.2 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ Από την δεκαετία του 1950 εθεωρείτο πως μία λειτουργία του ανοσολογικού συστήματος ήταν η προστασία του οργανισμού από την ανάπτυξη κακοήθειας είτε με την αποτροπή της ανάπτυξής της είτε με την καταστροφή των εξαλλαγέντων κυττάρων πριν να αναπτυχθούν σε επιβλαβείς όγκους. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ανοσοεπιτήρηση (immune surveillance). Ωστόσο, η προστασία αφορά τα πολύ αρχικά στάδια της ανάπτυξης του όγκου γιατί η ανοσία είναι ασθενής και υπερκαλύπτεται από την ταχεία ανάπτυξη του όγκου 2. Α.8.3 ΤΑ Ag ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ Το ανοσοποιητικό σύστημα στρέφεται κατά Ag των όγκων που αναγνωρίζονται σαν ξένα. Διακρίνονται στα ειδικά αντιγόνα TSAs (Tumor Specific Ags) και στα σχετικά με τον όγκο αντιγόνα TAAs (Tumor Associated Ags). Τα TSAs είναι ειδικά για έναν όγκο ή τύπο όγκου και δεν εκφράζονται φυσιολογικά στους ιστούς του οργανισμού. Είναι δομικά καινοφανή και δεν προκαλούν ανοσολογική ανοχή κατά τη ανάπτυξη του ανοσολογικού συστήματος. Παράδειγμα αποτελούν τα Ras, p53, bcr-abl. Υπάρχουν μόνο στα εξαλλαγμένα κύτταρα του συγκεκριμένου όγκου και όχι στα φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού. Πρόκειται για μεταλλαγμένες ενδοκυττάριες πρωτεΐνες που προέρχονται είτε από σημειακές μεταλλάξεις ή μεταθέσεις και είναι προϊόντα ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή ογκογόνων ιών. Πιο συχνά εμφανίζονται σε πειραματικούς όγκους από χημικά καρκινογόνα ή ακτινοβολία. Παράγονται στο κυττοσόλιο και ως επεξεργασμένα πεπτίδια παρουσιάζονται στην [37]

40 επιφάνεια του κυττάρου συνδεδεμένα με τα MHC μόρια τάξης I και ενεργοποιούν τα κυτταρολυτικά λεμφοκύτταρα CTLs 16. Τα TAAs είναι φυσιολογικές πρωτεΐνες του οργανισμού που προκαλούν ανοσοαπαντήσεις λόγω ανώμαλης έκφρασής τους ή υπερέκφρασής τους. Τέτοια είναι ογκοεμβρυικά Ag, όπως η α- εμβρυική πρωτεΐνη ( AFP, a-fetoprotein) και το καρκινοεμβρυικό αντιγόνο (cea, carcinoembryonic Ag). Άλλα TAAs είναι Ag διαφοροποίησης που εκφράζονται κατά την φυσιολογική διαφοροποίηση των ιστών, όπως είναι το CD10 ή GALLA (Common Acute lymphoblastoid Leukemia Ag) που συνοδεύει τύπους λευχαιμίας. Πολλοί όγκοι εκφράζουν στις μεμβράνες των κυττάρων, παθολογικές γλυκοπρωτεΐνες ή γλυκολιπίδια που διαφέρουν από τα φυσιολογικά στις πλευρικές ολιγοσακχαριτιδικές αλυσίδες. Οι διαφορές αφορούν το σιαλικό οξύ που είναι ο τελικός υδατάνθρακας της αλυσίδας. Αυτό πιθανόν οφείλεται σε παθολογική δράση των ενζύμων γλυκοζυλτρανσφερασών (καταλύουν την γλυκοζυλίωση που γίνεται στην σ. Golgi). Διαταράσσεται έτσι η λειτουργία της μεμβράνης των Ca κυττάρων. Παράδειγμα είναι η επιθηλιακή μουκίνη MUC-1, η οποία καλύπτει την επιφάνεια των επιθηλίων. Η παθολογική της γλυκοζυλίωση δεν σχηματίζει το προστατευτικό κάλυμμα και το κύτταρο αναγνωρίζεται από το ανοσολογικό σύστημα 5. Α.8.4 Η ΑΝΟΣΙΑ ΣΤΗΝ ΑΜΥΝΑ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Τα αντιγόνα των όγκων επάγουν χυμική και κυτταροεξαρτώμενη ανοσοαπάντηση που οδηγεί σε καταστροφή των εξαλλαγμένων κυττάρων που εκφράζουν αυτές τις πρωτεΐνες. Τα κυτταρολυτικά λεμφοκύτταρα (CTLs) αναγνωρίζουν τα Ag των όγκων (tumor-antigens) που τους παρουσιάζονται από τα MHC τάξης I μόρια. Ισχυρή δραστικότητα των CTLs εναντίον του όγκου συσχετίζεται με ύφεση του όγκου. Τα CTLs που φέρουν τον FasL ( Fas ligand, Fas-συνδέτη) στην επιφάνειά τους, ενεργοποιούν τον Fas υποδοχέα που επιδεικνύεται από άλλους κυτταρικούς τύπους και οδηγεί σε ενεργοποίηση της απόπτωσης αυτών των κυττάρων. Τα αντι Ca αντισώματα επικαλύπτουν τα καρκινικά κύτταρα. Οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος συνδέονται με τα Ab που είναι συνδεδεμένα στην επιφάνεια [38]

41 του Ca κυττάρου και ενεργοποιείται ο καταρράκτης του συμπληρώματος με τελικό αποτέλεσμα να δημιουργούνται οπές στην κυτταρική μεμβράνη του Ca κυττάρου και τον θάνατο του. (CDC, Complement Dependent Cytotoxicity, από το συμπλήρωμα εξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα) 16. Τα Β κύτταρα ανταποκρίνονται στα Ag του όγκου, παράγοντας Ab (antitumor- Abs) που αναγνωρίζουν και καταστρέφουν τα κακοήθη κύτταρα. Χρησιμοποιώντας τους FcRs (Fc υποδοχείς) τα NK κύτταρα και τα μακροφάγα παίρνουν μέρος στην καταστροφή μέσω της από το Ab εξαρτώμενης κυτταροτοξικότητας (ADCC). Ο τύπος των λεμφοκυττάρων που διηθούν τον όγκο είναι πολύ σημαντικός και σε μερικές περιπτώσεις έχει μεγαλύτερη προγνωστική αξία από το στάδιο της νόσου. Γενικά, μεγάλος αριθμός των CD8+ T λεμφοκυττάρων και η υψηλή σχέση των CTLs σε σχέση με τα Tregs συνοδεύεται με αυξημένη επιβίωση. [39]

42 Β. ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Β.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Εκτός από τα νουκλεϊνικά οξέα, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια, τα σάκχαρα επίσης είναι θεμελιώδη συστατικά των ζωικών συστημάτων. Σε σύγκριση με την πρόοδο στην γονιδιωματική και στην πρωτεομική, η μελέτη των γλυκανικών μορίων (glucoscience) είναι υπό διερεύνηση. Είναι γνωστό ότι η ροή της πληροφορίας ξεκινάει από το DNA και καταλήγει στις πρωτεΐνες. Μετά την σύνθεσή τους οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες σχηματίζοντας δίκτυα αλληλεπίδρασης. Ωστόσο μία πρωτεΐνη για να είναι λειτουργική απαιτείται η μεταμεταφραστική τροποποίησή της (PTM, Post-Translational Modification) που συνήθως αφορά την προσθήκη σακχάρων στις νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες. Αυτό συμβαίνει στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στη συσκευή Golgi 17. Επομένως, η προσθήκη σακχάρου στις πρωτεΐνες θεωρείται το τελευταίο βήμα στη ροή της πληροφορίας. Το κύτταρο συνθέτει χιλιάδες πολυσακχαρίτες που αποτελούνται από περιορισμένο αριθμών μονοσακχαριτών. Η δομή των πολυσακχαριτών καθώς και η θέση σύνδεσής τους στις πρωτεΐνες φέρει κάποιες πληροφορίες σχετικά με τον φαινότυπο του κυττάρου. Η πιο σημαντική όπως αναφέρθηκε παραπάνω μετα-μεταφραστική τροποποίηση είναι η γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών που διακρίνεται στην Ν- γλυκοζυλίωση και στην Ο-γλυκοζυλίωση. Σε αυτήν την διπλωματική εργασία αναπτύσσεται η Ν-γλυκοζυλίωση των ανοσοσφαιρινών και ειδικότερα της πιο συχνής ανοσοσφαιρίνης στον άνθρωπο της IgG 72. Β.2 ΣΤΑΔΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ Η Ν-γλυκοζυλίωση (N-linked glycosylation), που είναι η προσθήκη ενός ολιγοσακχαρίτη σε αμιδικό άτομο N, στο αμινοξικό κατάλοιπο των πρωτεϊνών Ασπαραγίνη (Asn), είναι σημαντική για τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Συμβαίνει στους ευκαριώτες, ευρέως στα αρχαία, σπάνια σε eubacteria. Η φύση της [40]

43 γλυκοζυλίωσης εξαρτάται από την πρωτεΐνη, το κύτταρο που αυτή εκφράζεται και το είδος του οργανισμού. Η Ν-linked και O-linked glycosylation έχουν μελετηθεί όσον αφορά τις θέσεις που συμβαίνουν, τις συνθετικές διαδικασίες και τα ένζυμα που καταλύουν αυτές τις αντιδράσεις. Στο παρόν θα αναφερθούμε στην N- γλυκοζυλίωση. Στην διαδικασία γλυκοζυλίωσης συμμετέχουν πρόδρομοι ολιγοσακχαρίτες συνδεδεμένοι με λιπίδια, κατάλοιπα μονοσακχαριτών, νουκλεοτίδια μεταφοράς μονοσακχαριτών, πεπτίδια δέκτες, ενδιάμεσα προϊόντα και τα τελικά προϊόντα που είναι οι γλυκοπρωτεΐνες. Συμμετέχουν ένζυμα όπως γλυκοζυλτρανσφεράσες (glycosyltransferases, Gtfs) και γλυκοσιδάσες (glycosyldases).. Οι μονοσακχαρίτες που αποτελούν τις γλυκάνες των ανθρώπινων γλυκοπρωτεϊνών είναι οι εξής: Glc:D-γλυκόζη, Man:D- μανόζη, GlcNAc:Ν-ακετυλο- D γλυκοζαμίνη, Gal:D-γαλακτόζη, Fuc:L-φουκόζη, GalNAc: Ν-ακετυλο-Dγαλακτοζαμίνη Xyl:D-ξυλόζη, NeuNAc:Ν-ακετυλο-νευραμινικό οξύ ή σιαλικό οξύ και Dol:δολιχόλη) 6 ( εικόνα 16). Οι κύριες συνθετικές διαδικασίες και διαδικασίες προσθήκης και αποκοπής επισυμβαίνουν στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο (RER) και στη συσκευή Golgi. Η προσθήκη ολιγοσακχαριτών γίνεται στο αμινοξικό κατάλοιπο των πρωτεϊνών ασπαραγίνη Asn. Τα αρχικά συνθετικά στάδια στο RER περιλαμβάνουν τον πρόδρομο ολιγοσακχαρίτη Glc3Man9GlcNAc2, που συνδέεται με πυροφωσφoρικό δεσμό στον λιπιδικό φορέα Δολιχόλη (Dolichol, Dol) με κατά βήματα προσθήκη μονοσακχαριτών 30. Αρχικά προστίθενται στο Dol-P, μονοσακχαρίτες με τη βοήθεια νουκλεοτιδικών υποστρωμάτων εξοζών, σε 7 αρχικά βήματα, με δότες μονοσακχαριτών τα νουκλεοτιδικά σάκχαρα UDP-GlcNAc και GDP-Man και 7 τελικά βήματα, όπου δότες μονοσακχαριτών είναι οι ενώσεις Man-P-Dol και Glc-P-Dol. Προκύπτει τελικά, το ολιγοσαχαριτικό λιπίδιο Glc3Man9GlcNAc2 -PP-Dol, από το οποίο προστίθεται στο πεπτίδιο στη θέση Asn το Glc3Man9GlcNAc2 με αποβολή του Dol-PP. Τα νουκλεοτιδικά υποστρώματα εξοζών είναι τα αντίστοιχα νουκλεοτιδικά σάκχαρα: UDP- Glc, (όπου UDP: 5 διφωσφορική ουριδίνη), GDP-Man (όπου GDP: 5 διφωσφορική γουανοσίνη) και UDP-GlcNAc. [41]

44 Οι 7 μονοσακχαρίτες που αποτελούν τις γλυκάνες των ανθρώπινων γλυκοπρωτεϊνών. Εικονίζονται εδώ στον δακτυλιόσχημο σχηματισμό τους, όπως στον τύπο προβολής του Haworth. όλοι εμφανίζονται εδώ ως α-ισομερή, το υδροξύλιο (-ΟΗ) ομάδα προσκολλημένη στο πρώτο δακτύλιο άνθρακα στο C1 βρίσκεται κάτω από το δακτύλιο, όπως φαίνεται στο μόριο της γλυκόζης. (Walsh G. Post-translational Modification of protein Biopharmaceuticals. Part One, Clycosylation ) Εικόνα 16 Β.3 ΤΑ ΒΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Τα βήματα της γλυκοζυλίωσης είναι τα εξής (εικόνα 17) : 1. Σύνθεση GlcNAc2-PP-Dol. Προστίθενται 2 GlcNAc κατάλοιπα με πυροφωσφορικό δεσμό στη Dol, είτε στην κυτταροπλασματική πλευρά του RER, είτε στον αυλό του RER και μετά μεταφέρεται στη κυτταροπλασματική πλευρά. 2. Σύνθεση Man5GlcNAc2-PP-Dol. Προσθήκη 5 Man κατάλοιπα από GDP-Man στο GlcNAc2-PP-Dol στην κυτταροπλασματική πλευρά του RER και κατόπιν [42]

45 γίνεται εισδοχή του λιπιδικού ολιγοσακχαρίτη Man5GlcNAc2-PP-Dol με χτύπημα ( flip) στον αυλό του RER. 3. Σύνθεση Man-P-Dol στην κυτταροπλασματική πλευρά και κατόπιν γίνεται εισδοχή του στον αυλό του RER, που έχει το ρόλο δότη μανόζης στην επέκταση του ολιγοσακχαρίτη. 4. Σύνθεση Man9GlcNAc2-PP-Dol. Η προσθήκη των τελευταίων 4 Man εξοζών από Man-P-Dol γίνεται στον αυλό του RER. 5. Σύνθεση είτε Glc-P-Dol στην κυτταροπλασματική πλευρά του RER, είτε UDP- Glc που μεταφέρεται στον αυλό RER που χρησιμεύουν σαν δότες Glc. 6. Μεταφορά των Glc εξοζών στον ολιγοσακχαρίτη Man9GlcNAc2-PP-Dol και σύνθεση Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol. 7. Προσθήκη του λιπιδικού ολιγοσακχαρίτη Glc3Man9GlcNAc2 στο πεπτίδιο στον αυλό του RER 17. Μονοπάτι της συνθέσεως του ολιγοσακχαρίτη συνδεδεμένου με Asn στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο ( Topography of Glykosylation in the rough endoplasmic reticulum and Goilgi apparatus, Carlos B. Hirschberg, Martin D. Snider) Εικόνα 17 Φαίνεται ότι υπάρχουν 2 διαφορετικοί δότες μανόζης που είναι GDP-Man και Man-P-Dol. Τα πρώτα 5 Man προστίθενται στην κυτταροπλασματική πλευρά από το GDP-Man και τα λοιπά 4 από Man-P-Dol στον αυλό του RER. [43]

46 Δέκτης του 14-σακχαριτη δότη Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol είναι το καρβοξυαμιδικό Ν (Άζωτο) του αμινοξικού καταλοίπου Asn, που επιτελείται με πυρηνόφιλη προσβολή στον δότη. Πρόκειται για συμμεταφραστική διαδικασία που επισυμβαίνει κατά τη σύνθεση πρωτεϊνών (μετάφραση) στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο. Η σακχαριτική αλυσίδα που μεταφέρεται στο αμινοξικό κατάλοιπο Asn της συντηρημένης τριπεπτιδικής αλληλουχίας Asn-X-Ser/Thr (όπου X κάθε αμινοξύ εκτός της Προλίνης) είναι ένας διακλαδισμένος 14-σακχαρίτης (tetradeccasaccharide). Το β-οη των καταλοίπων Ser/Thr βοηθά με τους υδρογονοδεσμούς του στη διαμόρφωση του πεπτιδίου, έτσι ώστε το αδρανές N στη CONH2 ομάδα του Asn να αποκτά αυξημένη πυρηνοφιλικότητα 30. Προσδίδονται με τη σύνδεση ολιγοσακχαριτών φυσικές ιδιότητες στις πρωτεΐνες, ώστε να υποβοηθείται η αναδίπλωση τους,επίσης αποκτούν ιδιότητες όπως να είναι αναγνωριστικοί συνδέτες (ligands) και να προστατεύονται από την αποδομητική δράση των πρωτεασών. Υπάρχει μεγάλη ποικιλία στις υδατανθρακικές αλυσίδες όσον άφορα τη σύσταση τους και τη διακλάδωση τους. Σχηματίζονται με 23 περίπου ενζυμικά βήματα, που αφορούν την συναρμολόγηση των σακχάρων, την αποκοπή και προσθήκη εξοζών και την ωρίμανση των γλυκοπρωτεϊνών εν γένει. Τα κύρια ένζυμα που ενέχονται στη διαδικασία αυτή, είναι οι γλυκοσυλτρανσφεράσες (Gtfs ) και οι γλυκοσιδάσες. Τα ένζυμα και οι πρωτεΐνες είναι παράγωγα έκφρασης γονίδιων σε αντίθεση με τους ολιγοσακχαρίτες που δεν είναι. Στις περισσότερες από τις αντιδράσεις χρειάζεται η παρουσία δισθενών κατιόντων, όπως ταmg+2 και Mn+2. Η γλυκοζυλίωση επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως τα επίπεδα έκφρασης των Gtfs, η προσφορά του κατάλληλου δότη και δέκτη σακχάρου και ο συναγωνισμός των Gtfs μεταξύ τους για τα διάφορα υποστρώματα. [44]

47 Β.4 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΓΛΥΚΑΝΩΝ ΣΤΟ RER ΚΑΙ Σ. GOLGY (εικόνα 18) Μοντέλο της γλυκοζυλίωσης της ασπαραγίνης στο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο. ( Topography of Glykosylation in the rough endoplasmic reticulum and Goilgi apparatus, Carlos B. Hirschberg, Martin D. Snider) Εικόνα 18 Η αποκοπή των εξοζών γίνεται στον αυλό του RER 17 με κατάλυση από τα ένζυμα γλυκοσιδάσες. Αρχικά 3 κατάλοιπα Glc απομακρύνονται από τις Glycosidases I και ΙΙ.(301) Για να απομακρυνθεί το τελευταίο Glc κατάλοιπο γίνεται σύνδεσή του με μοριακούς συνοδούς (chaperone), την καλρετικουλίνη (calreticulin, CRT) και την καλνεξίνη (calnexin,cnx). Αφού αφαιρεθεί η τελική Glc απελευθερώνεται ο ολιγοσακχαρίτης, λόγω της χαμηλής συγγένειας που έχουν οι μοριακοί συνοδοί για την τελική μανόζη και προκύπτει το Man9GlcNAc2-Asn πρωτεΐνη. Εδώ υπεισέρχεται η UDP-glycose glycoproteinglycosyltransferase (UGGT) που επαναγλυκοζυλιώνει τον ολιγοσακχαρίτη. Ξαναρχίζει έτσι ένας νέος κύκλος επαναγλυκοζυλίωσης απογλυκοζυλίωσης από τους μοριακούς συνοδούς ώστε να διευκολυνθεί και να δοθεί χρόνος, οι μερικά αναδιπλωμένες πρωτεΐνες να αναδιπλωθούν στην αρτιγενή (native) μορφή. Πρόκειται για μια διαδικασία ποιοτικού έλεγχου πρωτεϊνών στο RER (quality control) 19 που γίνεται με τη προσφορά ενέργειας από τη διάσπαση του υψηλού ενεργειακού δυναμικού UDP- Glc δεσμού. Το protein quality control είναι ουσιώδης διαδικασία για τη διατήρηση της λειτουργιάς του κυττάρου. Η συσσώρευση ελαττωματικά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών προκαλεί διάφορες νόσους. Γίνονται επαναλαμβανόμενες προσπάθειες [45]

48 για αναδίπλωση πρωτεϊνών. Οι μη σωστά αναδιπλωμένες πρωτεΐνες μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα για αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. Μόνο οι καλά αναδιπλωμένες πρωτεΐνες 20 μεταφέρονται στη σ.golgi για περαιτέρω επεξεργασία (μετα-μεταφραστική τροποποίηση, post translational modification). Στo cis στοιχείο της σ. Golgi γίνεται περαιτέρω αποκοπή μανοζών από τα ένζυμα μαννοσιδάσες, ώστε να προκύψει ο ολιγοσακχαριτικός πυρήνας Man3GlcNAc2, συνδεδεμένος με την πρωτεΐνη. Στα μεσαία και trans στοιχεία της σ. Golgi ολοκληρώνεται η αποκοπή και έτσι υπάρχει η δυνατότητα να δράσουν οι γλυκοζυλτρανσφεράσες (Gtfs) και να προσθέσουν εξόζες, ώστε να δομηθούν οι εξωτερικές διακλαδώσεις των γλυκανών. Προστίθενται στις εξωτερικές μανόζες GlcNAc και Gal με δότες τα υποστρώματα νουκλεοτιδικών σακχάρων UDP εξόζες και δημιουργούνται 2 ή 3 διακλαδώσεις. [46]

49 Γ. ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ IgG Γ.1 ΓΕΝΙΚΑ Συνολικά, το μόριο IgG στερείται συμμετρίας. Στους χάρτες ηλεκτρονικής πυκνότητας φαίνονται όλα τα τμήματα του Ab και η hinge region και οι προσκολλημένοι υδατάνθρακες σε κάθε επικράτεια CH2 στην περιοχή της μεσεπιφάνειας, που ευθύνονται για την ασθενή γέφυρα ανάμεσα τους (εικόνα 19). (Walsh G. Post-translational Modification of protein Biopharmaceuticals. Part One, Clycosylation ) Εικόνα 19 Οι IgG παρουσιάζουν διακριτό αριθμό γλυκομορφών που αντανακλά τη μεγάλη ποικιλία στον τύπο των ολιγοσακχαριτών τους. Οι συντηρημένοι ολιγοσακχαρίτες αυτοί έχουν δομικούς και λειτουργικούς ρόλους που έχουν διερευνηθεί. Γλυκοζυλίωση υφίστανται τα Fc τμήματα πιο σταθερά, αλλά και τα Fab τμήματα σε συντηρημένες θέσεις. Στην IgG ανοσοσφαιρίνη ο ολιγοσακχαρίτης αποτελεί το 2-3% του ΜΒ 150 KDa, ενώ στις πιο έντονα γλυκοζυλιωμένες IgM, IgD, IgE το 12-14%. Οι ολιγοσακχαρίτες είναι μεγάλου μεγέθους (περίπου 2KDa) και όσο δεν περιορίζονται από τη θέση τους παρουσιάζουν ευκαμψία. Έχουν κρίσιμο δομικό και λειτουργικό ρόλο, όπως η σύνδεση σε λεκτίνες (MBL) λόγω της παρουσίας επιτόπων γλυκάνης. Παίζουν ρόλο στη διατήρηση της διαλυτότητας, της διαμόρφωσης του μορίου, διευκολύνουν την υποκυττάρια μετακίνηση και την κάθαρση του μορίου. Υπάρχει ελαττωματική γλυκοζυλίωση (με ρόλο στην [47]

50 παθογένεια της νόσου) σε παθήσεις όπως η ρευματοειδής αρθρίτις και έχει εφαρμογή στην ανάπτυξη διαγνωστικών βιοδεικτών. ψn= ClcNAc M= Μανόζη G= Γαλακτόζη S= Σιαλικό οξύ Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη πολύπλοκου τύπου («Antibody Glycosylation and Inflammation Kai-Ting C. Shade, et al.) Εικόνα 20 Η επεξεργασία των ολιγοσακχαριτών είναι ειδική για κάθε κύτταρο και κάθε ξεχωριστή πρωτεΐνη ενώ η τρισδιάστατη δομή του μορίου της πρωτεΐνης γύρω από τη θέση γλυκοζυλίωσης ελέγχει την επεξεργασία της γλυκάνης σε κάθε θέση πρόσδεσης. Φαίνεται ότι μεγάλη επιφάνεια κάθε πρωτεΐνης καλύπτεται από τα σάκχαρα λόγω του μεγάλου μεγέθους τους και της ευκαμψίας τους. Έτσι τα σάκχαρα μπορούν και να αποκλείσουν την αλληλεπίδραση Ab με τους υποδοχείς τους. Η N-linked θέση γλυκοζυλίωσης βρίσκεται στο Asn (εικόνα 20) κατάλοιπο στην συντηρημένη αλληλουχία Asn-X-Ser/Thr (όπου Χ κάθε αμινοξύ εκτός προλίνης) προς την αμινοτελική περιοχή του CH2 τμήματος της IgG. Τα δυο CH2 τμήματα γεφυρώνονται από τις γλυκάνες από μια για κάθε τμήμα, που καταλαμβάνουν το εσωτερικό κοίλωμα που σχηματίζεται μεταξύ των CH2 τμημάτων. Προσδίδεται έτσι μια πιο ανοικτή διαμόρφωση στο IgG Fc τμήμα, ώστε να επιτρέπεται η σύνδεση με τους FcγRs. Αναπτύσσονται μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ Fc τμήματος της IgG και των γλυκανών, ώστε να [48]

51 σχηματίζεται μια σταθερή διαμόρφωση που επηρεάζει την τεταρτοταγή δομή του Fc τμήματος. Μελέτες με κρυσταλλογραφία ακτινών Χ και μοριακές δυναμικές απομιμήσεις έχουν δείξει ότι η απομάκρυνση καταλοίπων γλυκάνης προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση στο CH2 τμήμα λόγω απώλειας αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκάνης γλυκάνης και γλυκάνης πρωτεϊνικού σκελετού. Γενικά αλλαγές στη γλυκοζυλίωση επηρεάζουν την ευαισθησία στις πρωτεάσες, τη διαλυτότητα, την ευκαμψία, τη σταθερότητα και την συσσώρευση των Ab. Υπάρχει μια υδρόφοβη περιοχή σε κάθε CH2 τμήμα που αλληλεπιδρά με το Asn-297 και παρόμοια με περιοχή στο Fab τμήμα που αλληλεπιδρά με σακχαριτικά Ag. Κάθε Asn-297 παίρνει μέρος σε περίπου 70 μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις 25 με την επιφάνεια της πρωτεΐνης που περιορίζει την κίνηση της γλυκάνης. Από την κρυσταλλική δομή του Fc συμπεραίνεται ότι αναπτύσσονται 38 συνολικά μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις του σακχαρίτη GlcNAc2Man3GlcNac, που είναι 13 για το πρόσθετο εξωτερικό GlcNac, 27 για τη Gal στον 1-6 βραχίονα (εικόνα 21) και 7 για την core-fuc, με το CH2 τμήμα του Fc. Ο Man 1-3 βραχίονας του σακχάρου δεν έρχεται σε επαφή με την επιφάνεια της πρωτεΐνης και εξέχει στο κενό εντός του Fc τμήματος 25. Υδατανθρακική ακολουθία που συνδέεται στην Asn297 της ανθρώπινης IgG1-Fc. Τα κατάλοιπα Man5 και Man8 συνδέονται στην Man4 και σχηματίζουν τους α(1-6) και α(1-3) βραχίονες, αντίστοιχα ( Structural Analysis of Human IgG-Fc Glycoforms Reveals a Correlation Between Glycosylation and Structural Integrity, S.Krapp, Y. Mimura). Εικόνα 21 [49]

52 Γ.2 ΤΥΠΟΙ ΓΛΥΚΟΜΟΡΦΩΝ IgG Οι IgG γλυκοπρωτεΐνες αποτελούνται κατά 82-96% από πρωτεΐνη και κατά 4-18% από υδατάνθρακες 6,21,22. Η γλυκοζυλίωση των Ab μια PTM διαδικασία περιλαμβάνει ποικιλότητα στην θέση γλυκοζυλίωσης, στον τύπο, μήκος και διακλάδωση των βραχιόνων του ολιγοσακχαρίτη. Οι ολιγοσακχαρίτες έχουν ετερογένεια. Έχουν πολύπλοκη δομή και συνήθως διαθέτουν δυο βραχίονες (biantennary). Κάθε Asn -297 περιέχει μια από την οικογένεια των συνολικά 32 τύπων γλυκανών και διακρίνονται σε γενικές γραμμές 3 υπότυποι IgG-GO, IgG-G1, IgG-G2. Προκύπτουν συνολικά 512 IgG-Fc γλυκομορφές (32 επί 32 =1024, που διαιρείται δια του 2) (εικόνα 22). Δομή του πλήρως ωριμασμένου σύνθετου διπλού βραχίονα τύπου ολιγοσακχαρίτη (επάνω) και 16 πιθανές δομές φυσικού ολιγοσακχαρίτη που περιέχεται στην IgG-Fc (A-P) F, φουκόζη G, γαλακτόζη GN, Ν- ακετυλγλυκοζαμίνη, Μ μανόζη ( Topography of Glykosylation in the rough endoplasmic reticulum and Goilgi apparatus, Carlos B. Hirschberg, Martin D. Snider) Εικόνα 22 Οι πιθανές μορφές γλυκομορφών, σύμφωνα με το τρέχον σύστημα ονοματολογίας που χρησιμοποιείται είναι G0 (ο επτασακχαρίτης χωρίς γαλακτόζη), [50]

53 G1 (προσθήκη μιας γαλακτόζης στον ένα ή στον άλλο βραχίονα), G2 (προσθήκη δυο γαλακτοζών από μια σε κάθε βραχίονα), G0F (προσθήκη φουκόζης στην αρχική GlcNAc) G1F, G2F (προσθήκη φουκόζης και γαλακτόζης κατά τα ανωτέρω), G0B (προσθήκη ενός ακόμα βραχίονα bisecting GlcNAc στον αρχικό επτασακχαρίτη) G1B, G2B, G0BF, G1BF και G2BF. Σημειωτέον ότι μπορεί να υπάρχουν δυο μορφές G1 σε κάθε περίπτωση, ανάλογα σε ποιο βραχίονα προστίθεται η γαλακτόζη, προσθήκη στον α(1-3) ή στον α(1-6) βραχίονα 23,24. Οι IgG-G2 γλυκομορφές με 2 τελικές Gal και στους 2 βραχίονες αποτελούν περίπου το 16% από τη συνολική δεξαμενή των γλυκανών του ορού. Οι IgG-G1 όπου η Gal λείπει από τον ένα η τον άλλο βραχίονα, έτσι ώστε να εκτίθεται μια GlcNAc αποτελούν το 35% περίπου. Οι IgG-GO που δεν περιέχουν Gal και οι 2 βραχίονες καταλήγουν σε GlcNAc αποτελούν το 35%. Το υπόλοιπο περιέχει τις γλυκάνες G1 και G2 που φέρουν σιαλικό οξύ. Επίσης, το 30% της συνολικής δεξαμενής γλυκανών περιέχει τον τρίτο βραχίονα GlcNAc (bisecting GlcNAc) και το υπόλοιπο 30% περιέχει την core-fuc. Ο τύπος της IgG γλυκομορφής που εκφράζεται εξαρτάται από το είδος, την ηλικία, παθολογικές καταστάσεις, τις καλλιεργητικές συνθήκες για κύτταρα που παράγουν IgG, την κύηση 26. Το ζευγάρωμα των τύπων γλυκάνης στο Fc τμήμα επηρεάζει την ενδοκυττάρια διαδρομή έκαστου μορίου IgG στο μονοπάτι της βιοσύνθεσής της. Γ.3 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗΣ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΤΩΝ IgG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Η μελέτη της δομής της IgG αναδεικνύει μεγάλη ασυμμετρία και ευκαμψία στο Ab. Η προεξέχουσα core δομή στον άνθρωπο είναι ο οκτασακχαρίτης FucGLcNAc2Man3GLcNAc2 με τη Fuc στο αρχικό GLcNAc το συνδεδεμένο στο Asn Η δομή επεκτείνεται με την προσθήκη Gal (γαλακτόζης) και σιαλικού οξέος. Ο α(1-6) βραχίονας που διακλαδίζεται από την Man4 κατευθύνεται προς το CH2-CH3 επιφάνεια και σχηματίζει πολλαπλές αλληλεπιδράσεις με την επιφάνεια του CH2, ενώ ο βραχίονας α(1-3) εκτείνεται στο κενό διάστημα μεταξύ των CH2 τμημάτων και έρχεται σε επαφή με τον (1-3) βραχίονα του αντιθέτου συνδεόμενου με CH2 ολιγοσακχαρίτη. Τα CH2 τμήματα γέρνουν σε γωνία γύρω από την σύνδεση CH2- [51]

54 CH3. Η κάμψη αυτή προσδιορίζει το άνοιγμα του πεταλοειδούς IgG τμήματος. Η απόσταση μεταξύ των CH2 τμημάτων ρυθμίζεται από τους ολιγοσακχαρίτες που είναι συνδεδεμένοι με αυτά, ώστε να προσεγγίζουν ή να απομακρύνονται μεταξύ τους. Πολλαπλές μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις υπάρχουν μεταξύ σακχάρου πρωτεΐνης. Τα σάκχαρα του α(1-6) βραχίονα μαζί με τον Ν-γλυκοσιδικό δεσμό είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση του ολιγοσακχαρίτη με την πρωτεΐνη. Η αντίστροφη σχέση μεταξύ του μήκους του ολιγοσακχαρίτη και της απόστασης μεταξύ των δύο CH2 περιοχών του Fc τμήματος (όσο ποιό μικρό το μήκος τόσο μεγαλύτερη η απόσταση) οφείλεται στην απώλεια των ασθενών αλληλεπιδράσεων που σταθεροποιούν την επαφή μεταξύ ολιγοσακχαρίτη πρωτεΐνης και καθιστούν άκαμπτο το CH2 τμήμα 27. Γ.4 ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ FcγR ΜΕ ΤΟ Fc ΤΜΗΜΑ ΤΩΝ IGG ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Τα IgG μόρια επιδεικνύουν δυο τύπους λειτουργίας: Α. Σχηματίζουν ειδικά ανοσοσυμπλέγματα (IC) με Ag που συνδέονται στη περιοχή Fab. Β. Λειτουργίες που συνδέονται με το Fc τμήμα που διακρίνονται στις δραστικές λειτουργίες, που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση του καταρράκτη του συμπληρώματος, καθώς και την ενεργοποίηση κυττάρων μέσω σύνδεσης με FcRs. Η σταυρωτή σύνδεση των IgG που συνδέονται στον FcγRI με πολυδύναμα (multivalent) Ag ή η αλληλεπίδραση των IC (Immune complexes, ανοσοσυμπλέγματα) με τους FcγRII και FcγRIII προκαλεί συσσώρευση των υποδοχέων με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση κυττάρων και την έναρξη τελεστικών διεργασιών όπως ADCC, φαγοκυττάρωση των IC ή απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών 27. [52]

55 Μοντέλο σύνδεσης αντισώματος FcγRIII και συσσώρευσης που προκαλείται από υποδοχέα σύνδεσης. (Α) ένα άθικτο μοντέλο σύνδεσης αντισώματος FcγRIII. Η δομή του αντισώματος φαίνεται με πράσινο χρώμα Fab και κυανό Fc. Οι συντεταγμένες του αντισώματος στην καταχώρηση της Τράπεζας δεδομένων Πρωτεϊνών είναι 1IGT. (Β) Ένα απλό μοντέλο βαθμού συγγένειας της σύνδεσης του αντιγόνου- αντισώματος FcγRIII που επάγεται. (Γ) Ένα μοντέλο επιθυμητής (?) συσσωμάτωσης του υποδοχέa (Review Recognition of immunoglobulins by Fcy receptors, Sergei Radaev, Peter Sun). Εικόνα 23 Ο FcγRIII συνδέεται με το Fc τμήμα στο κέντρο του πεταλοειδούς ανοίγματος των IgG ανοσοσφαιρινών κάνοντας επαφές με την κατώτερη hinge region 28 και των δυο Α και Β αλυσίδων του Fc. Αυτή η σύνδεση σπάει τη συμμετρία στο Fc και δημιουργείται μια ασύμμετρη μεσεπιφάνεια, διότι τα ολόιδια αμινοξικά κατάλοιπα της hinge A και hinge B αλληλεπιδρούν με διαφορετικές επιφάνειες του υποδοχέα. Αποκλείεται έτσι η σύνδεση και με δεύτερο υποδοχέα από το ίδιο Fc τμήμα με αποτέλεσμα στοιχειομετρία 1:1 για τη σύνδεση Fc:FcγR 28. Αυτό εξασφαλίζει ότι είναι αναγκαίο το Ag για να γίνει η συσσώρευση του υποδοχέα (που έχει αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των τελεστικών λειτουργιών) (εικόνα 24), πράγμα που θα απέκλειε η στοιχειομετρική σχέση 1:2. [53]

56 ( The Structure of a Human Type III Fcγ Receptor in Complex with Fc Sergei Radaev et al.) Εικόνα 24 Συνδυασμός γεφυρών άλατος, υδρογονοδεσμών, υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, συνεισφέρουν στην αναγνώριση του υποδοχέα. Στη σύνδεση με το FcA επικρατούν οι υδρογονοδεσμοί, ενώ με το FcB οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Η σημασία του δικτύου των υδρογονοδεσμών για τη σταθερότητα του συμπλόκου αποδεικνύεται από το γεγονός ότι οι μεταλλαγές Ala στον FcγRIII που καταλήγουν στην απώλεια των 2 υδρογονοδεσμών φαίνεται ότι μειώνουν την σύνδεση με τον υποδοχέα 21,28. Σε όλους τους υποδοχείς στον άνθρωπο, 4 αμινοξικά κατάλοιπα είναι σταθερά: η Trp9, η Trp113, η Lys131 και η Gly159. Γ.5 ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ FcyR ΜΕ IgG ΙΣΟΤΥΠΟΥΣ Ο FcγRIII συνδέεται πιο στενά με τους IgG1 και IgG3 σε σχέση με τους IgG2 και IgG4. Τα περισσότερα αμινοξικά κατάλοιπα του Fc στην επαφή με τον υποδοχέα είναι συντηρημένα στην αλληλουχία της IgG, πράγμα που συνηγορεί για συντηρημένη θέση σύνδεσης για όλες τις ανθρώπινες IgG. Οι διαφορές στην αμινοξική αλληλουχία ανάμεσα στους IgG ισότυπους βρίσκονται κυρίως στην lower hinge region. H IgG2 έχει μια Val και μια Ala στις θέσεις 234 και 235 αντίστοιχα, σε [54]