ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ COX-2 ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΣΤΟ ΚΑΡ ΙΑΓΓΕΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΠΙΜΥΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΑΤΡΟ ΙΚΑΣΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΨΑΡΟΥΛΗΣ ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ ΑΡIΘ ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ COX-2 ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΣΤΟ ΚΑΡ ΙΑΓΓΕΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΕΛΒΙΖΗ Χ. ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΝΗ ΤΣΟΥΚΑΛΗ-ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ (Επιβλέπουσα) ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΨΑΡΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΝΗ ΤΣΟΥΚΑΛΗ-ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ (Επιβλέπουσα) ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΨΑΡΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΑΧΠΑΡΑΚΗ-ΑΛΒΑΝΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΧΡΙΣΤΟ ΟΥΛΟΣ ΠΛΙΑΚΟΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΡΑΪΚΟΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΟ ΩΡΙ ΗΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως». (Νόµος 5343/32, άρθρο 202 παρ.2 και ν.1268/82, άρθρο 50 παρ.8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4 4

5 Στους γονείς µου, Χρήστο και Μαρία, που µου έµαθαν ν αναζητώ τη γνώση. Στο σύζυγό µου Μιχάλη για την συµπαράσταση και την υποµονή του 5

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΑΝΑΛΓΗΤΙΚΑ 1.1 Εισαγωγή-Ιστορία Μηχανισµοί δράσης των αναλγητικών ιαφορές στις αναλγητικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες των αναλγητικών Χρήση των αναλγητικών στην κλινική πράξη ΜΗ ΣΤΕΡΟΕΙ Η ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩ Η ΦΑΡΜΑΚΑ 2.1 Ταξινόµηση Μηχανισµοί δράσης των ΜΣΑΦ ράσεις των ΜΣΑΦ Αναστολή της COX-1 και ανεπιθύµητες δράσεις των ΜΣΑΦ Ανεπιθύµητες δράσεις των ΜΣΑΦ από το γαστρεντερικό σύστηµα ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝ ΙΝΕΣ 3.1 Σχηµατισµός προσταγλανδινών οµή και σύνθεση Ταξινόµηση προσταγλανδινών και δράσεις Παράγωγα λιποξυγενασών Προσταγλανδίνη PGΕ Προσταγλανδίνη PGI 2 (Προστακυκλίνη) Θροµβοξάνιο ΤxA Ο ρόλος της προστακυκλίνης και του θροµβοξανίου Α 2 στη ρύθµιση του αγγειακού τόνου, στην ενεργοποίηση και τη συσσώρευση αιµοπεταλίων ΥΟ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΕΣ 4.1 Χαρακτηριστικά των ισοµορφών COX-1 και COX οµή της COX-1 και COX Λειτουργίες της COX-1 και COX COX-2 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ 5.1 Η ανακάλυψη των COX-2 αναστολέων Η εξέλιξη των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων Η COX-2 ως θεραπευτικός στόχος 53 7

8 5.4 Eκλεκτικοί COX-2 αναστολείς και ο σχετικός κίνδυνος των καρδιαγγειακών επεισοδίων Κρίσιµα ερωτήµατα σε σχέση µε τους COX-2 αναστολείς ΡΟΦΕΚΟΞΙΜΠΗ (COX-2 ANAΣΤΟΛΕΑΣ) 6.1 Φαρµακοκινητική ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) 7.1 Γενικά Τυπική διάταξη της HPLC Αρχές της HPLC Τεχνικές της HPLC Χρωµατογραφία της αντίστροφης φάσης Χαρακτηριστικά της στατικής φάσης Χαρακτηριστικά της κινητής φάσης Βελτιστοποίηση της ανίχνευσης στην HPLC Πλεονεκτήµατα-µειονεκτήµατα της HPLC- κλινικές εφαρµογές ΑΘΗΡΟΣΚΛΗΡΩΣΗ 8.1 Εισαγωγή Αθηρωµάτωση Θροµβογενετική θεωρία Η αγγειακή βιολογία της αθηροσκλήρωσης Συµβάµατα (επιπλοκές) της αθηροσκλήρωσης Θρόµβωση και επιπλοκή του αθηρώµατος Χοληστερόλη και εστέρες αυτής Τριγλυκερίδια ή τριακυλογλυκερόλες Λιπoπρωτεΐνες-ταξινόµηση Χοληστερόλη πλάσµατος-αθηροσκλήρωση Τριγλυκερίδια πλάσµατος- αθηροσκλήρωση είκτες µυοκαρδιακής νέκρωσης Τρανσαµινάσες (Αµινοτρανσφεράσες) Κινάση της κρεατίνης (CK) Καρδιοεκλεκτικές τροπονίνες C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) 90 EΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9.1 Σκοπός Υλικά και µέθοδοι 95 8

9 9.3 Χορήγηση ροφεκοξίµπης ο Πείραµα ο Πείραµα ο Πείραµα ο Πείραµα Συλλογή δειγµάτων ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 10.1 Επιλογή της µεθόδου ανάλυσης Όργανα Υλικά οκιµές πριν την επιλογή της κατάλληλης µεθόδου οκιµές για τη κατάλληλη κινητή φάση οκιµές ανακρυστάλλωσης οκιµές ανίχνευσης οκιµές µε εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης µε HPLC Χρωµατογραφικές συνθήκες Προετοιµασία του δείγµατος Χρωµατογραφήµατα-Πρότυπες καµπύλες Μετρήσεις- Αποτελέσµατα Βιοστατιστική ανάλυση Υπολογισµοί-επεξεργασία αποτελεσµάτων ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 11.1 Γενικά Yλικά και µέθοδοι Αρχές της µεθόδου Μέθοδος µέτρησης της χοληστερόλης Μέθοδος µέτρησης των τριγλυκεριδίων Μέθοδος µέτρησης της ασπαρτικής αµινοτρανσφεράσης (SGOT) Μέθοδος µέτρησης της αλανινο-αµινοτρανσφεράσης (SGPT) Μέθοδος µέτρησης της κινάσης της κρεατίνης (CPK) Μέθοδος µέτρησης της C-αντιδρώσας πρωτείνης (CRP) Μέθοδος µέτρησης της τροπονίνης Μετρήσεις-αποτελέσµατα ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 12.1 Eπεξεργασία των ιστών µε το οπτικό µικροσκόπιο 146 -Παράρτηµα φωτογραφιών 147 9

10 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 153 ΠΕΡΙΛΗΨΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 161 SUMMARY ΑND CONCLUSIONS 166 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εκπόνηση µιας διδακτορικής διατριβής αποτελεί µια δύσκολη και επίπονη προσπάθεια που απαιτεί πολύ κόπο και χρόνο. Το αποτέλεσµα αυτής της δουλειάς δεν είναι µόνο η ικανοποίηση της επίτευξης του στόχου µιας µελέτης και των προσωπικών φιλοδοξιών των επιστηµόνων, αλλά και η πεποίθηση ότι µέρος της επιτυχηµένης µελέτης θα µπορέσει στο µέλλον να βοηθήσει τους αυριανούς ερευνητές. Ο στόχος κάθε µελέτης είναι να προσθέτει ένα µικρό λιθαράκι στις ήδη υπάρχουσες γνώσεις και να ανοίξει τους ορίζοντες στους επιστήµονες, αποτελώντας κινητήριο δύναµη για περαιτέρω και βαθύτερη έρευνα. Η φαρµακολογική αναστολή της σύνθεσης των προστανοϊδών (προσταγλανδινών, PG S ) ήταν το επίκεντρο της εξέλιξης των φαρµάκων πάνω από 100 χρόνια. Από την ασπιρίνη και τα άλλα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα (ΜΣΑΦ) που αναστέλλουν το ένζυµο κυκλοοξυγενάση COX, το πεδίο εξελίχθηκε γρήγορα και ανευρέθη ένας µεγάλος αριθµός παραγώγων µε ποικίλες αντιφλεγµονώδεις και αναλγητικές ιδιότητες και διαφορετική φαρµακοδυναµική. Η άµεση ανάγκη ύπαρξης αντιφλεγµονωδών τα οποία να µην επηρεάζουν το γαστρεντερικό σύστηµα ή τουλάχιστον να έχουν λιγότερες παρενέργειες, οδήγησε στην ανακάλυψη µιας νέας κατηγορίας φαρµάκων, των COX-2 αναστολέων. Οι νέοι αυτοί εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς επιτυγχάνουν ταχεία αναλγησία από µετεγχειρητικό οδοντικό άλγος, πρωτοπαθή δυσµηνόρροια και µετεγχειρητικό ορθοπαιδικό άλγος, καθώς επίσης και σε χρόνιο άλγος από οστεοαρθρίτιδα και ρευµατοειδή αρθρίτιδα. Εκτός όµως από τα αντιαθηρογενετικά αποτελέσµατα που διαθέτουν αναστέλλοντας τη φλεγµονή, οι COX-2 αναστολείς µπορεί να οδηγήσουν σε αυξηµένη προθροµβωτική δραστηριότητα. Υπάρχουν έντονες ανησυχίες ότι οι COX-2 αναστολείς µπορεί να αυξάνουν τον καρδιαγγειακό κίνδυνο. Οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς, µε κύριο εκπρόσωπο τους τη ροφεκοξίµπη, δεν έχουν καµία επίδραση στην παραγωγή θροµβοξανίου Α 2. Μειώνοντας όµως την παραγωγή της προστακυκλίνης PGI 2 που προκαλεί αγγειοχάλαση, διαταράσσουν την φυσική ισορροπία µεταξύ του προθροµβωτικού θροµβοξανίου Α 2 και της αντιθροµβωτικής PGI 2 και µπορούν να οδηγήσουν έτσι στην αύξηση των θροµβωτικών καρδιαγγειακών επεισοδίων (Egil Fosslien, 2005). Σε πολλές κλινικές και εργαστηριακές µελέτες, οι εκλεκτικοί COX- 2 αναστολείς ενοχοποιούνται για αυξηµένο κίνδυνο θροµβοεµβολικών επεισοδίων, µεταξύ αυτών έµφραγµα µυοκαρδίου, αγγειακά εγκεφαλικά έµφρακτα και πνευµονική εµβολή. Τα διαθέσιµα αυτά στοιχεία απ όλες τις σχετικές µελέτες καθώς και οι αντικρουόµενες απόψεις που προκύπτουν από αυτές έδωσαν την ιδέα για να γίνει αυτή η διατριβή. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η µελέτη της επίδρασης των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων στο καρδιαγγειακό σύστηµα επίµυων σε 11

12 περιπτώσεις υπερδοσολογίας. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, σκεφθήκαµε να µελετήσουµε πειραµατικά την επίδραση της ροφεκοξίµπης, ως κυριότερου εκπροσώπου των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων, σε επίµυες. Πραγµατοποιήθηκαν τέσσερις σειρές πειραµάτων, στα οποία χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη υποδόρια, σε τοξική δόση 25mg/kg Β.Σ µία φορά την ηµέρα για 10, 20, 30 και 45 ηµέρες αντίστοιχα σε τέσσερις διαφορετικές οµάδες ζώων. Στο τέλος κάθε πειραµατισµού γινόταν συλλογή δειγµάτων αίµατος. Ακολουθούσε η θανάτωση των ζώων µε έκθεσή τους σε διαιθυλαιθέρα, η αφαίρεση του µυοκαρδίου και άλλων οργάνων, η κατεργασία τους και στη συνέχεια η ανάλυσή τους. Η διατριβή αυτή βασίστηκε σε 3 επιµέρους µελέτες. Τα δείγµατα αίµατος και οι ιστοί-όργανα των επίµυων-πειραµατοζώων µελετήθηκαν τοξικολογικά, βιοχηµικά και ιστολογικά, ενώ πραγµατοποιήθηκε η φαρµακοκινητική επεξεργασία των αποτελεσµάτων αυτών µε τη βοήθεια στατιστικού προγράµµατος. Στο τοξικολογικό µέρος, ανιχνεύθηκαν και µετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της ροφεκοξίµπης στον ορό αίµατος των επίµυων µετά την υποδόρια χορήγηση της ουσίας στο καθορισµένο χρονικό διάστηµα. Στο βιοχηµικό µέρος, προσδιορίσθηκαν οι συγκεντρώσεις των κυριότερων βιοχηµικών παραµέτρων, που η αύξηση των τιµών τους οδηγεί µε εξαιρετική ειδικότητα και ευαισθησία στον εντοπισµό αυξηµένου καρδιαγγειακού κινδύνου. Μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, της ασπαρτικής αµινοτρανσφεράσης SGOT, της αλανινο-αµινοτρανσφεράσης SGPT, της κινάσης της κρεατίνης CPK, της C-αντιδρώσας πρωτεϊνης CRP και της τροπονίνης. Η έρευνα πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας σε συνεργασία µε το Εργαστήριο Φαρµακολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Συµµετείχαν ακόµη το Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ και το Εργαστήριο Ιστολογίας-Εµβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. Τα πειράµατα στους επίµυες που έγιναν κατά τη διάρκεια αυτής της διατριβής, είχαν την έγκριση (αριθµ. Πρωτ. 13/8711/2004) της ιεύθυνσης Κτηνιατρικής Υπηρεσίας Θεσσαλονίκης και πραγµατοποιήθηκαν σύµφωνα µε τις διατάξεις του Ν.1197/81 περί «Προστασίας των Ζώων» άρθρο 4, του Ν.2015/92 περί «Κυρώσεως της Ευρωπαϊκής Σύµβασης για την προστασία σπονδυλωτών ζώων που χρησιµοποιούνται για πειραµατικούς ή άλλους επιστηµονικούς σκοπούς» και τις διατάξεις του Π. 160/91 περί «Προστασίας των Ζώων που χρησιµοποιούνται για πειραµατικούς ή άλλους επιστηµονικούς σκοπούς, σε συµµόρφωση µε την οδηγία 86/609/ΕΟΚ του Συµβουλίου».Στο σηµείο αυτό θεωρώ υποχρέωση αλλά και τιµή να ευχαριστήσω θερµά όλους όσους βοήθησαν στη διεξαγωγή αλλά και στην ολοκλήρωση της διδακτορικής αυτής διατριβής συντελώντας µε κάθε δυνατό τρόπο στην τεκµηρίωση των αποτελεσµάτων της. 12

13 Ευχαριστώ από βάθους καρδιάς και αισθάνοµαι ευγνωµοσύνη για τη σεβαστή µου δασκάλα, επιβλέπουσα, Καθηγήτρια της Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κ. Ελένη Τσούκαλη-Παπαδοπούλου, που µου εµπιστεύθηκε την εκπόνηση αυτής της πειραµατικής µελέτης και στη συνέχεια όχι µόνο µε καθοδήγησε αλλά µου συµπαραστάθηκε συνεχώς σ όλα τα στάδια της εκπόνησής της και µε βοήθησε ιδιαιτέρως µε τα εύστοχα σχόλια και τις πολύτιµες συµβουλές της. Θερµές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω και στον Αναπληρωτή Καθηγητή της Φαρµακολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, κ. ηµήτριο Κούβελα, για την πολύτιµη βοήθεια του στο σχεδιασµό της πειραµατικής αυτής µελέτης, την παραχώρηση των πειραµατοζώων και τον ιδιαίτερα σηµαντικό συµβουλευτικό του ρόλο. Ευχαριστώ θερµά επίσης τη συνάδελφο ιατρό, συνεργάτη του κ. Κούβελα και διδάκτορα της Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ, κ. Χρύσα Πουρζιτάκη για τη µετάδοση της γνώσης και της εµπειρίας της στην εκτροφή, συντήρηση και θυσία των πειραµατοζώων και την πολύτιµη βοήθεια της στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Ιδιαίτερα επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή Αναλυτικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ κ. Γεώργιο Θεοδωρίδη καθώς και το φοιτητή Κοσµά Χαρισµανίδη για την πολύτιµη βοήθειά τους στην ανάλυση των δειγµάτων µε την τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης HPLC. Ευχαριστώ θερµά επίσης την Καθηγήτρια Ιστολογίας- Εµβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ κ. Αθανασία Αχπαράκη- Αλβανού για την πολύτιµη βοήθειά της µε τη γνώση και την εµπειρία της στην ιστολογική µελέτη µε το οπτικό µικροσκόπιο. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω για τη συµπαράσταση και συµβολή τους στην τεχνική επεξεργασία των δειγµάτων για την παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο, τη λέκτορα Ιστολογίας-Εµβρυολογίας κ. Θεοδώρα Παπαµήτσου, την παρασκευάστρια κ. Όλγα Παπουτσάκη-Μπάτζιου και τον κ. Στέλιο Τουπαδάκη για την επεξεργασία των φωτογραφιών του οπτικού µικροσκοπίου. Σ αυτό το σηµείο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Πέτρο Σκεπαστιανό, ιατρό µικροβιολόγο και καθηγητή στο Αλεξάνδρειο Τ.Ε.Ι Θεσσαλονίκης, για την πολύτιµη βοήθεια και συνεργασία του στη βιοχηµική ανάλυση και στις µετρήσεις των δειγµάτων. Από τη θέση αυτή, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ιευθυντή του Εργαστηρίου Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας και µέλος της Τριµελούς Επιτροπής, Καθηγητή κ. ηµήτριο Ψαρούλη, όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου, τους παρασκευαστές και ιδιαίτερα τον Επίκουρο Καθηγητή Τοξικολογίας κ. Νικόλαο Ράϊκο και την λέκτορα Τοξικολογίας κ. Λήδα Κοβάτση για την αµέριστη συµπαράστασή τους, την υποµονή και αγάπη µε την οποία µε αντιµετώπιζαν καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής αυτής. 13

14 Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς µου για ότι έχουν κάνει για µένα µέχρι σήµερα και ιδιαίτερα τη µητέρα µου κ. Μαρία Τιµούδα- ελβίζη, παρασκευάστρια του Εργαστηρίου Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας, για την αγάπη και την αµέριστη συµπαράστασή της µε κάθε δυνατό τρόπο, ιδιαίτερα στις δύσκολες στιγµές σ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της διδακτορικής διατριβής. Tον αδερφό µου Γιάννη, ιδιαίτερα ευχαριστώ, που µε τη γνώση του πάνω στην πληροφορική αποτέλεσε σηµαντική βοήθεια κατά τη συγγραφή της παρούσας διατριβής. Τον σύζυγο µου Μιχάλη Τζώγκα, ιδιαίτερα ευχαριστώ για τη στήριξη, την υποµονή και την αγάπη του. Οφείλω ξεχωριστές ευχαριστίες και στην Επιτροπή Ερευνών του Α.Π.Θ για την ιδιαίτερη τιµή που µου έκαναν να µου απονείµουν χρηµατική υποτροφία ως βραβείο αριστείας για την απόδοση µου στην Ιατρική Σχολή του Α.Π.Θ και τη βοήθεια στη συνέχιση της εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ελπίζω ειλικρινά να ανταπεξήλθα στις απαιτήσεις της διατριβής και τις προσδοκίες των καθηγητών µου και να µην απογοήτευσα αυτούς που µε εµπιστεύθηκαν. 14

15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15

16 16

17 1. ΑΝΑΛΓΗΤΙΚΑ 1.1 Εισαγωγή-Ιστορία Η αποτελεσµατική αντιµετώπιση του άλγους και της φλεγµονής αποτελεί µια σηµαντική πρόκληση για τους ιατρούς και τους ασθενείς. Το άλγος αποτελεί φυσιολογική εκδήλωση της καθηµερινής ζωής και λειτουργεί ως ένας ζωτικής σηµασίας αµυντικός µηχανισµός. Ωστόσο, όταν το άλγος υπερβαίνει ορισµένα όρια και καταστεί ανεξέλεγκτο, είναι δυνατό να επηρεάζει δραµατικά την ποιότητα ζωής. Η φλεγµονή και οι φλεγµονώδεις νόσοι έχουν αναγνωρισθεί από πολλούς αιώνες. Ως εκ τούτου, εκχυλίσµατα σαλικυλικών από φυτά έχουν χρησιµοποιηθεί επί µακρόν στις νόσους αυτές. Η πρώτη αναφορά σχετικά µε τη χρήση αυτών των εκχυλισµάτων ανευρέθη στον Αιγυπτιακό πάπυρο Ebers (1500 π.χ). Αυτό το πρώιµο ιατρικό κείµενο συνιστούσε την εφαρµογή αποξηραµένων φύλλων µυρτιάς στην κοιλιακή ψώρα και στη ράχη για την ανακούφιση των ρευµατικών πόνων των προερχόµενων από τη µήτρα. Ο Ιπποκράτης ( ) γνώριζε επίσης την αξία των εκχυλισµάτων από φυτά, τα οποία περιέχουν σαλικυλικά. Συνιστούσαν τη χρήση χυµών λεύκας για τη θεραπεία παθήσεων των µατιών και τη χρήση φλούδας ιτιάς για την ανακούφιση του πυρετού και των πόνων του τοκετού. Ο Ρωµαίος Κέλσιος (30 µ.χ) περιέγραψε την κλασσική εικόνα της φλεγµονής (ερυθρότης, θερµότης, άλγος, διόγκωση) και τη χρήση εκχυλίσµατος φύλλων ιτιάς (που περιείχαν σαλικυλικό), ως αναλγητικό. Βότανα πoυ περιείχαν σαλικυλικό ήταν γνωστά στην Κίνα και σε άλλα µέρη της Ασίας, καθώς επίσης στη Νότια Αφρική. Oι Stricker, Ries και Maclagan βρήκαν ότι τα σαλικυλικά αντιµετώπιζαν επιτυχώς όχι µόνο τον πυρετό και το άλγος αλλά και την ερυθρότητα και το οίδηµα. Αυτή η αντιφλεγµονώδης ιδιότητα χρησιµοποιήθηκε ευρέως από τον Παρισινό Germain See, ο οποίος το 1877 εισήγαγε τα σαλικυλικά ως αποτελεσµατικές θεραπείες της ουρικής αρθρίτιδας και της χρόνιας πολυαρθρίτιδας [1]. Το 1898, ο Felix Hofmann, ένας χηµικός χρωστικών ανιλίνης στο παράρτηµα Friedrich-Bayer-Eberfeld της Ι.G.Farben, ανακάλυψε την ύπαρξη των ακετυλιωµένων παραγώγων του σαλικυλικού νατρίου. Το φάρµακο αποδείχθηκε περισσότερο εύγευστο και λιγότερο ερεθιστικό στο στοµάχι και του δόθηκε η ονοµασία ασπιρίνη. Στην ονοµασία αυτή το α προέρχεται από το ακετύλιο και το σπιρίνη από το γερµανικό Spirsaure [2]. Από την εµφάνισή της στην αγορά, το έτος 1899, η ασπιρίνη αποτελεί το πιο ευρέως χρησιµοποιούµενο φάρµακο, µε σηµερινή κατανάλωση η οποία ανέρχεται στους τόνους κάθε χρόνο. Το 1930 ανακαλύφθηκαν οι δυνητικοί µεσολαβητές των λιπιδίων, οι προσταγλανδίνες (PGs) ενώ η ανάµιξή τους στη διαδικασία της 17

18 φλεγµονής τεκµηριώθηκε στα 1960 και Στο µεταξύ, διάφορα αντιφλεγµονώδη φάρµακα εµφανίστηκαν στην αγορά, αν και ο µηχανισµός δράσης τους δεν είχε γίνει σαφής. Η ανακάλυψη ότι, φάρµακα παρόµοια της ασπιρίνης εµποδίζουν τη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών και η πρόταση ότι αυτός ήταν ο µηχανισµός δράσης τους, οδήγησε στο σχεδιασµό ουσιών, οι οποίες θα εµπόδιζαν τη δράση του ενζύµου κυκλοοξυγενάση (COX). Ωστόσο, η τοξική δράση στο στοµάχι, όπως η αιµορραγία και το έλκος αναγνωρίστηκε πολύ σύντοµα, ως η σοβαρότερη ανεπιθύµητη ενέργεια της θεραπείας µ αυτά τα φάρµακα. Αποµάκρυναν τις προστατευτικές προσταγλανδίνες από το βλεννογόνο του στοµάχου µαζί µε τις επιβλαβείς προσταγλανδίνες, οι οποίες προκαλούσαν τη φλεγµονώδη συµπτωµατολογία στις αρθρώσεις και σε άλλες περιοχές φλεγµονής.τη λύση στο πρόβληµα αυτό έφερε η ανακάλυψη ότι υπάρχουν δύο ισοένζυµα COX, ένα το οποίο παράγει ουσιαστικές προσταγλανδίνες (COX-1) και ένα άλλο το οποίο γεννάται και δρα κατά τη διάρκεια της φλεγµονής (COX-2). Ο σχεδιασµός αντιφλεγµονωδών, τα οποία να δρουν εκλεκτικά αναστέλλοντας την COX-2, έγινε στόχος πολλών φαρµακευτικών εταιριών. Η αναγνώριση ωστόσο, ότι υπήρχαν δύο µορφές COX οδήγησε στην ανάπτυξη ουσιαστικά λιγότερο τοξικών φαρµάκων, τα οποία µπορούσαν να επηρεάσουν την επαγώµενη COX-2, η οποία βρίσκεται ως επί το πλείστον σε περιοχές φλεγµονής, αφήνοντας ανεπηρέαστη τη δοµική COX-1, η οποία είναι κυρίως υπεύθυνη για τη γαστρεντερική προστασία. 1.2 Mηχανισµοί δράσης των αναλγητικών Οι δράσεις των αναλγητικών µπορούν να γίνουν κατανοητές, τουλάχιστον κατά ένα µέρος. Τα σηµεία δράσης τους φαίνονται στον πίνακα 1. Τα αναλγητικά χωρίζονται σε δύο µεγάλες κατηγορίες: τα οπιούχα και τα µη οπιούχα (πίνακας 2). Στα µη οπιούχα αναλγητικά ανήκουν φάρµακα, όπως η ασπιρίνη και τα άλλα σαλικυλικά και η παρακεταµόλη. Τα οπιούχα αναλγητικά χωρίζονται επίσης σε δύο κατηγορίες, τις µη συνθετικές ή ηµισυνθετικές ενώσεις, που έχουν σχέση µε τη µορφίνη, και τα συνθετικά οπιούχα, που δεν έχουν σχέση µε τη µορφίνη. Στο παρελθόν, τα οπιούχα αναλγητικά ονοµάζονταν ναρκωτικά αναλγητικά.πιστεύεται ότι τα µη οπιούχα αναλγητικά δρουν περιφερικά, αλλά µπορεί να υπάρχουν στοιχεία της δράσης τους που αφορούν το ΚΝΣ. Η ασπιρίνη είναι ισχυρός αναστολέας της κυκλοοξυγενάσης (συνθετάσης των προσταγλανδινών) κι έτσι αναστέλλει το σχηµατισµό των προσταγλανδινών. Με αυτό το µηχανισµό, επιτυγχάνεται τουλάχιστον η αντιφλεγµονώδης δράση της. Από την άλλη µεριά, ακόµη κι όταν τα περιφερικά ερεθίσµατα άλγους δεν οφείλονται σε φλεγµονή, η αναστολή σύνθεσης προσταγλανδινών αίρει την ευαισθητοποίηση που, ως γνωστόν, προκαλούν οι προσταγλανδίνες στις αισθητικές απολήξεις 18

19 του πόνου. ηλαδή, η απουσία προσταγλανδινών µειώνει την ευαισθησία των νευρικών απολήξεων στα επώδυνα ερεθίσµατα [3]. Η αναλγητική δράση της παρακεταµόλης δεν είναι τόσο εύκολο να εξηγηθεί. εν είναι ισχυρός αναστολέας της σύνθεσης προσταγλανδινών στην περιφέρεια, αλλά µάλλον αναστέλλει τη δραστικότητα της κυκλοοξυγενάσης στον εγκέφαλο και µε κάποιον τρόπο προκαλεί κεντρική αναλγησία. Ωστόσο, το θέµα αυτό δεν έχει διευκρινιστεί. 1.3 ιαφορές στις αναλγητικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες των αναλγητικών Είναι σηµαντικό να σηµειωθεί ότι τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα και τα φάρµακα που χρησιµοποιούνται ως αναλγητικά διαφέρουν στις αναλγητικές και τις αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες τους, όπως φαίνεται στον πίνακα 1. Τα φάρµακα που έχουν και αναλγητικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες είναι ιδιαίτερα χρήσιµα στη θεραπεία των ρευµατικών και άλλων αρθροπαθειών, καθώς και στην αντιµετώπιση των επώδυνων οστικών µεταστάσεων [3]. ΠΙΝΑΚΑΣ 1: Αναλγητικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες ορισµένων συνηθισµένων µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων. Αναλγητική δράση Αντιφλεγµονώδης δράση Ασπιρίνη + + Παρακεταµόλη + - Ιβουπροφένη + + Ινδοµεθακίνη + ++ Φαινυλοβουταζόνη + ++ Μεφεναµικό οξύ + + Φλουφεναµικό οξύ

20 1.4 Χρήση των αναλγητικών στην κλινική πράξη Στην κλινική πράξη χρησιµοποιούνται τα αναλγητικά που καταγράφονται στον πίνακα 2. ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Φάρµακα που χρησιµοποιούνται στη συµπτωµατική αντιµετώπιση του πόνου. 1. Μη οπιούχα αναλγητικά (για ήπιο έως µέτριο πόνο) Ασπιρίνη Παρακεταµόλη Μερικά µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα 2. Οπιούχα και άλλα ναρκωτικά αναλγητικά Για ήπιο εως µέτριο πόνο Κωδεΐνη εξτροπροποξυφαίνη ιϋδροκωδεΐνη Βουπρενορφίνη Για έντονο πόνο Μορφίνη ιαµορφίνη Βουπρενορφίνη Πεθιδίνη εξτροµοραµίδη ιπιπανόνη Μεθαδόνη 20

21 2. ΜΗ ΣΤΕΡΟΕΙ Η ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩ Η ΦΑΡΜΑΚΑ 2.1 Ταξινόµηση Τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα (ΜΣΑΦ) ανήκουν σε πέντε µεγάλες χηµικές κατηγορίες: τα αρυλαλκανοϊκά οξέα (παράγωγα του οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος), τα ανθρανιλικά οξέα (παράγωγα του φαινυλανθρανιλικού οξέος), τις οξικάµες (πιροξικάµη και τενοξικάµη), τις πυραζολόνες (αζαπροπαζόνη, φαινυλοβουταζόνη και οξυφαινοβουταζόνη) και τα σαλικυλικά [4]. Στον πίνακα 3 δίνονται τα περισσότερα και τα κυριότερα από τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα που κυκλοφορούν. ΠΙΝΑΚΑΣ 3: Μη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα. 1. Σαλικυλικά Ασπιρίνη Βενορυλάτη Τρισαλικυκικό χολινοµαγνήσιο ιφλουνιζάλη Αλοξιπρίνη Σαλσαλάτη 2. Αρυλαλκανοϊκά οξέα (α) Παράγωγα του οξικού οξέος ικλοφενάκη Ετοδολάκη Ινδοµεθακίνη Σουλινδάκη Ακεµετακίνη Θειαπροφενικό οξύ Τολµετίνη (β) Παράγωγα του προπιονικού οξέος Φαινοπροφένη Φλουρβιπροφένη Ιβουπροφένη Κετοπροφένη Ναπροξένη 21

22 (γ) Παράγωγα του βουτυρικού οξέος Φενβουβένη Ναβουµετόνη 3. Ανθρανιλικά οξέα Μεφεναµικό οξύ 4. Πυραζολόνες Αζαπροπαζόνη Φαινυλοβουταζόνη (µόνο στην αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα) 5. Οξικάµες Πιροξικάµη Τενοξικάµη 2.2 Μηχανισµοί δράσης των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων Υπάρχουν δύο πλευρές στη δράση των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων (ΜΣΑΦ): η αναλγησία και η αντιφλεγµονώδης ενέργεια. Τα αναλγητικά αποτελέσµατα αυτών των φαρµάκων εµφανίζονται γρήγορα και εξαφανίζονται µέσα σε λίγες ώρες. Αντίθετα, τα αντιφλεγµονώδη αποτελέσµατα τους εµφανίζονται ύστερα από µερικές ηµέρες και χρειάζονται τακτική και επαναλαµβανόµενη χορήγηση. Τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα παρεµποδίζουν τη µετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε κυκλικά ενδοϋπεροξείδια αναστέλλοντας το ένζυµο κυκλοοξυγενάση και αυτό έχει αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη παραγωγή προσταγλανδινών, όπως η PGE 2. Πολλές από τις ενέργειες των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων, τόσο θεραπευτικές όσο και ανεπιθύµητες, είναι πιθανό να οφείλονται σ αυτό το µηχανισµό δράσης [5, 6]. Τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα οφείλουν τουλάχιστον ένα µέρος της αντιφλεγµονώδους δράσης τους στην αναστολή της σύνθεσης των προσταγλανδινών. Φυσιολογικά, οι προσταγλανδίνες απελευθερώνονται στους φλεγµαίνοντες ιστούς. Συµµετέχουν στην εµφάνιση υπεραλγησίας, ερυθήµατος και εξίδρωσης και τα αποτελέσµατά τους συνεργούν µε τα αποτελέσµατα των άλλων 22

23 φλεγµονωδών παραγόντων. Καθώς ελέγχεται η φλεγµονώδης αντίδραση, αυτό το φαρµακολογικό αποτέλεσµα µειώνει τον πόνο, την ευαισθησία, το οίδηµα, τον πυρετό και τη δυσκαµψία, ενώ αυξάνει την κινητικότητα και την ισχύ των προβληµατικών αρθρώσεων [7]. Η αναστολή της σύνθεσης των προσταγλανδινών ευθύνεται επίσης για τη βλάβη του γαστρεντερικού βλεννογόνου, τις µικροδιαβρώσεις και τις εξελκώσεις, καθώς και για τη γαστρεντερική αιµορραγία που σχετίζεται µε τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα. Η µισοπροστόλη, ένα ανάλογο των προσταγλανδινών, µπορεί να προλάβει αυτά τα αποτελέσµατα όταν χορηγηθεί µαζί µε τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα, αν και δεν πρέπει να θεωρείται δεδοµένη η χρήση της σε όλους τους ασθενείς που παίρνουν τέτοια φάρµακα [4, 20]. Η τάση για αιµορραγία που προκαλούν τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα οφείλεται επίσης στην αναστολή της κυκλοοξυγενάσης των αιµοπεταλίων. Η µειωµένη παραγωγή θροµβοξανίων παρεµβαίνει στη συγκόλληση των αιµοπεταλίων και υπάρχει αιµορραγική διάθεση, η οποία επιβαρύνει τους κινδύνους από τις διαβρώσεις του πεπτικού βλεννογόνου. Η πιο σηµαντική πρόσφατη συµβολή στην ιστορία των φαρµάκων τύπου ασπιρίνης, υπήρξε εκείνη του John Vane και των συνεργατών του [7,8], οι οποίοι βρήκαν ότι τα φάρµακα του τύπου της ασπιρίνης, οδηγούσαν in vitro σε αναστολή της βιοσύνθεσης των προσταγλανδινών PGE 2 και PGF 2 a από ραδιοσηµασµένο αραχιδονικό οξύ. Επιπλέον ανακάλυψαν ότι τα αιµοπετάλια τα οποία λαµβάνονταν από εθελοντές, στους οποίους είχε χορηγηθεί ασπιρίνη και ινδοµεθακίνη, µία ώρα πριν τη φλεβοκέντηση, δεν ήταν σε θέση να παράγουν προσταγλανδίνες ως ανταπόκριση στη θροµβίνη, και ότι η προκαλούµενη από τις κατεχολαµίνες απελευθέρωση των προσταγλανδινών από σπλήνες σκύλων, µπορούσε να ανασταλεί από την ινδοµεθακίνη, αν και λιγότερο σταθερά σε σύγκριση µε την ασπιρίνη [1]. Τα παρόµοια µε την ασπιρίνη φάρµακα αναστέλλουν το ένζυµο που µετατρέπει το αραχιδονικό οξύ προς τις σταθερές PGE 1 και PGE 2. Tο ενδογενές ένζυµο, η κυκλοοξυγενάση 1, είναι ένα οµοδιµερές, 70kd που εντοπίζεται στις µικροσωµατικές µεµβράνες. Αρχικά ονοµάστηκε «προσταγλανδινική συνθετάση», στη συνέχεια «κυκλοοξυγενάση», ενώ σήµερα είναι επίσης γνωστή σαν «προσταγλανδινική συνθετάση», ή COX-1. H PGH συνθετάση καταλύει δύο αντιδράσεις: την bisδεοξυγόνωση του αραχιδονικού οξέος για τον σχηµατισµό της PGH 2 (δραστηριότητα κυκλοοξυγενάσης) και την αναγωγή των υδροϋπεροξειδίων προς τις αντίστοιχες αλκοόλες (δραστηριότητα υπεροξειδάσης). Το ένζυµο αυτό, καθώς επίσης και η COX-2, παράγει σταθερές προσταγλανδίνες των σειρών Ε και F, µέσω των ενδιάµεσων ασταθών ενδοϋπεροξειδίων PGG 2 και PGH 2. Τα ενδοϋπεροξείδια που είναι κρίσιµα για τη λειτουργία των αιµοπεταλίων, µετατρέπονται από τα 23

24 αιµοπετάλια σε µία ουσία που προκαλεί αγγειοσύσπαση και συσσώρευση των αιµοπεταλίων, το θροµβοξάνιο Α 2 (ΤxA 2 ). O Vane αποµόνωσε έναν ισχυρό αγγειοδιασταλτικό παράγοντα, την προστακυκλίνη PGI 2, η οποία παράγεται επίσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα από το αραχιδονικό οξύ µε τη δράση της κυκλοοξυγενάσης. εδοµένου ότι τα αιµοπετάλια παράγουν ΤxA 2, το οποίο προκαλεί σύσπαση των λείων µυϊκών ινών των αγγείων και επειδή τα αγγειακά τοιχώµατα παράγουν PGΙ 2, η οποία προκαλεί δυναµική χάλαση των αιµοφόρων αγγείων και αναστέλλει την συσσώρευση των αιµοπεταλίων, η όλη αναζήτηση στράφηκε προς την αναστολή της σύνθεσης θροµβοξανίων, όχι όµως και της προστακυκλίνης. Ο Vane και οι συνεργάτες του κατά τη δεκαετία του 1970, συγκέντρωσαν πειστικές ενδείξεις, ότι η αρχική υπόθεση για τη δράση της ασπιρίνης στις προσταγλανδίνες, ήταν σωστή [9]. Σχεδόν όλα τα φάρµακα του τύπου της ασπιρίνης (τα οποία από τότε έλαβαν γενικά την ονοµασία «µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα» ή ΜΣΑΦ) προκαλούν αναστολή της συνθετάσης της προσταγλανδίνης και η ισχύς των φαρµάκων αυτών (ID50) ως προς τη δράση αυτή βαίνει παράλληλα µε την κλινική τους αποτελεσµατικότητα στα πειραµατόζωα (π.χ. η ασπιρίνη είχε το ένα τεσσαρακοστό έως το ένα διακοσιοστό της δράσεως της ινδοµεθακίνης και το ένα πέµπτο έως το ένα πεντηκοστό της δράσεως της ιβουπροφαίνης). Τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν την PG συνθετάση, δράση που στερούνται τα κεντρικά αναλγητικά, όπως είναι η µορφίνη, ή η κωδεΐνη, τα αντιϊσταµινικά, τα αντισεροτονικά φάρµακα καθώς και η κορτιζόνη και τα ανάλογά της. Ο Vane και οι συνεργάτες υποστήριξαν ότι οι σταθερές προσταγλανδίνες δεν παράγονται µόνο στη θέση της φλεγµονής και ότι από µόνες τους ή σε συνδυασµό µε άλλους µεσολαβητές θα µπορούσαν να προκαλέσουν όλα τα κυρίαρχα σηµεία της φλεγµονής. Πράγµατι, οι PGE1 και PGE2 προκαλούν αγγειοχάλαση. Προάγουν το οίδηµα όταν τα διασταλµένα αιµοφόρα αγγεία παρουσιάζουν ήδη απώλεια, λόγω ισταµίνης. Προκαλούν πυρετό, όταν ενίενται είτε στις κοιλίες του εγκεφάλου, είτε άµεσα στον πρόσθιο υποθάλαµο και ευαισθητοποιούν τους δερµατικούς υποδοχείς του πόνου, σε άλλες ουσίες που προκαλούν πόνο, όπως η βραδυκινίνη και η ισταµίνη. Η ακεταµινοφαίνη από την άλλη πλευρά δεν αναστέλλει αποτελεσµατικά τη σύνθεση προσταγλανδίνων από παρασκευάσµατα ενζύµων, από µία ποικιλία ιστών, υπήρξε όµως αποτελεσµατική έναντι της συνθετάσης στον εγκέφαλο. Και παρά το γεγονός, ότι τα µονοακετυλιωµένα σαλικυλικά έχουν σχεδόν το ένα δέκατο της ισχύος της ασπιρίνης in vitro, µελέτες των µεταβολιτών των προσταγλανδινών των ούρων, έδειξαν ότι το σαλικυλικό νάτριο µείωσε αποτελεσµατικά την απέκκριση των µεταβολιτών αυτών στους ανθρώπους. Το σαλικυλικό νάτριο µείωσε επίσης αποτελεσµατικά την απελευθέρωση προσταγλανδίνης σε πειραµατικά πρότυπα φλεγµονής σε ζώα. 24

25 Η σύνθεση των διαφόρων τύπων προσταγλανδινών δεν παρουσιάζει την ίδια ευαισθησία στην ασπιρίνη. Οι µικρές δόσεις ασπιρίνης αναστέλλουν µόνο την παραγωγή του θροµβοξανίου των αιµοπεταλίων, ενώ οι µεγαλύτερες δόσεις αναστέλλουν την παραγωγή τόσο τoυ θροµβοξανίου των αιµοπεταλίων όσο και της προστακυκλίνης των ενδοθηλιακών κυττάρων του τοιχώµατος των αγγείων. Γι αυτό η ασπιρίνη σε µικρές δόσεις είναι χρήσιµη στην πρόληψη του εµφράγµατος του µυοκαρδίου και των θροµβωτικών εγκεφαλικών επεισοδίων. 2.3 ράσεις των ΜΣΑΦ Το συνηθέστερα χρησιµοποιούµενο σαλικυλικό είναι το ακετυλοσαλικυλικό οξύ ή ασπιρίνη. Σε χαµηλές δοσολογίες (80 έως 325 mg ηµερησίως) το ακετυλοσαλικυλικό οξύ [10, 11] χρησιµοποιείται για την πρόληψη της στεφανιαίας και εγκεφαλικής θρόµβωσης, µε βάση την αντιαιµοπεταλιακή της δράση. Ενδιάµεσες, µη συνταγογραφούµενες δόσεις (650 mg έως 3 g ηµερησίως) χρησιµοποιούνται ως αναλγητικές και αντιπυρετικές. Τέλος, εδώ και 100 χρόνια έχουν χρησιµοποιηθεί πολύ υψηλές δόσεις (>3 g ηµερησίως) για τη µείωση της ερυθρότητας και του οιδήµατος των αρθρώσεων, στο ρευµατικό πυρετό, την ουρική αρθρίτιδα και τη ρευµατοειδή αρθρίτιδα (πίνακας 4). Η ασπιρίνη και τα άλλα σαλικυλικά έχουν επίσης µία ποικιλία άλλων βιολογικών δράσεων, από τις οποίες µερικές µόνο σχετίζονται µε τη σύγχρονη χρήση τους στην κλινική ιατρική. Τα σαλικυλικά έχουν κερατολυτική (µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως θεραπεία υπερκεράτωσης), ουρικοζουρική (προάγουν την αποβολή του ουρικού οξέος από τους νεφρούς) και αντισηπτική δράση (θανατώνουν βακτήρια in vitro). Η ασπιρίνη αναστέλλει το σχηµατισµό των προσταγλανδινών και ως εκ τούτου παρεµποδίζει την πήξη του αίµατος, προκαλεί πεπτικά έλκη και προάγει την κατακράτηση υγρών από τους νεφρούς. Οι κυτταροβιολόγοι χρησιµοποιούν την ασπιρίνη και τα σαλικυλικά για να αναστείλουν τη µεταφορά ανιόντων διαµέσου των κυτταρικών µεµβρανών, για να παρεµποδίσουν τη διέγερση των λευκοκυττάρων και για να αναστείλουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση στα αποµονωθέντα µιτοχόνδρια. Τέλος, οι µοριακοί βιολόγοι χρησιµοποιούν σαλικυλικά για να ενεργοποιήσουν γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες του θερµικού σοκ στα χρωµατοσώµατα της Drosophila, για να επηρεάσουν τις ενεργοποιούµενες από µιτογόνα πρωτεϊνικές κινάσες [12] και να προκαλέσουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. 25

26 ΠΙΝΑΚΑΣ 4: Oι κυριότερες δράσεις των ΜΣΑΦ. 26

27 Η πρώτη δράση των φαρµάκων του τύπου ασπιρίνης στον κυτταρικό µεταβολισµό, βρέθηκε ότι είναι η αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης [13] σε αποµονωθέντα µιτοχόνδρια. Πιο πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η ασπιρίνη (αλλά όχι η ακεταµινοφαίνη) τροποποιεί την πρόσληψη της πρόδροµου ουσίας αραχιδονικού και την είσοδο της στις µεµβράνες, σε καλλιέργειες ανθρώπινων µονοκυττάρων και µακροφάγων. Τα σαλικυλικά επίσης αναστέλλουν τη µεταφορά ανιόντων διαµέσου µίας ποικιλίας κυτταρικών µεµβρανών. Την ικανότητα όµως αυτή των σαλικυλικών να αναστέλλουν τη διακίνηση των ανιόντων δεν τη διαθέτει και πάλι η ακεταµινοφαίνη. Τελικά τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν τη σύνθεση πρωτεογλυκάνης του χόνδρου, και το µεταβολισµό των οστών, τόσο in vitro, όσο και in vivo, µε µηχανισµούς που δεν εξαρτώνται από την αναστολή της COX-1 ή της COX-2. Είναι κλινικά ενδιαφέρον το γεγονός ότι µερικές κατηγορίες ΜΣΑΦ (π.χ τα σαλικυλικά), αλλά όχι όλες (π.χ η πιροξικάµη), αναστέλλουν την σύνθεση πρωτεογλυκάνης, προάγοντας ως εκ τούτου την απώλεια της θεµέλιας ουσίας του χόνδρου. Πρόσφατες εργασίες, έδειξαν ότι τα φάρµακα µε τη δράση της ασπιρίνης, επηρεάζουν την προκαλούµενη από διάφορα ερεθίσµατα, σύζευξη κυττάρων, που υπερέχουν αριθµητικά στην οξεία φλεγµονή των ουδετεροφίλων [9]. Τα ουδετερόφιλα προκαλούν βλάβη των ιστών, µέσω της απελευθέρωσης πρωτεασών, φλεγµονωδών πεπτιδίων, δραστικών µορφών οξυγόνου όπως του Ο 2 και του Η 2 Ο 2, καθώς και του παράγοντα ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων και της LTB 4. Η ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων σαν απάντηση σε ένα χηµειοτακτικό ερέθισµα ή σε ανοσοσυµπλέγµατα, ακολουθεί τις γενικές οδούς ανταπόκρισης των εκκριτικών κυττάρων και αναστέλλεται από όλα τα µέχρι σήµερα γνωστά ΜΣΑΦ. Τα ΜΣΑΦ, ινδοµεθακίνη, πιροξικάµη, δικλοφενάκη και ιβουπροφαίνη (σε συγκεντρώσεις micromol) και τα σαλικυλικά (σε συγκεντρώσεις millimol), αναστέλλουν τη συσσώρευση των ανθρώπινων ουδετεροφίλων, που προκαλείται από χηµειοτακτικά ερεθίσµατα, και διαµεσολαβείται από το προσκολλητικό µόριο της κυτταρικής επιφάνειας CD11b/CD18. Αν και όλα τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν τη συσσώρευση, µόνο µερικά από αυτά αναστέλλουν την απελευθέρωση ενζύµων και/ή τη δηµιουργία ελεύθερων ριζών Ο 2. Ωστόσο, στις εν λόγω συγκεντρώσεις τα σαλικυλικά [1] δεν παρεµβαίνουν στην ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων ή στη σύνθεση ΤxΑ 2. Αντιθέτως, η ασπιρίνη αναστέλλει τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων και αποκλείει πλήρως τη βιοσύνθεση των θροµβοξανίων µέσω της δράσης της στην ΡGH συνθετάση. Φαίνεται λοιπόν ότι, οι κοινές αντιφλεγµονώδεις δράσεις της ασπιρίνης και του σαλικυλικού νατρίου σχετίζονται κυρίως µε την κοινή αναστολή της ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων παρά µε τις αρνητικές δράσεις τους στη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών. Αντίθετα µε την ασπιρίνη και το σαλικυλικό νάτριο, η ακεταµινοφαίνη δεν επηρεάζει τη συσσώρευση των ουδετεροφίλων. 27

28 Οι ανασταλτικές ενέργειες των ΜΣΑΦ στην ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων in vitro µπορούν να αποδειχθούν και στην κλινική πράξη. Πράγµατι τα ουδετερόφιλα που προέρχονται από το αρθρικό υγρό ασθενών µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα, παρήγαγαν λιγότερο υπεροξειδικό ανιόν µετά από 10 ηµέρες θεραπείας µε πιροξικάµη, ενώ κύτταρα από φυσιολογικούς εθελοντές στους οποίους χορηγήθηκε ιβουπροφαίνη ή πιροξικάµη για 3 ηµέρες, απέτυχαν να συσσωρευτούν κανονικά προς χηµειοτακτικά ερεθίσµατα. Το σαλικυλικό νάτριο, ένας αποτελεσµατικός αναστολέας της PGH συνθετάσης in vitro, είναι τόσο αποτελεσµατικός όσο και η ασπιρίνη στην αναστολή της ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων. Πρόσφατες εργασίες που αφορούσαν στον µηχανισµό δράσης της µεγάλης δόσης ασπιρίνης και σαλικυλικού in vitro έδειξαν ότι τα σαλικυλικά: 1)προκαλούν απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου παχέος εντέρου [14] (που υπερεκφράζουν την COX-2), 2)αναστέλλουν τη µετακίνηση και την είσοδο στον πυρήνα κυτταροπλασµατικών µεταγραφικών παραγόντων, όπως ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών και οι συνακόλουθες αυτού πρωτεΐνες θερµικού σοκ, 3) παρεµβαίνουν στην µετατόπιση του NFkB σε ανταπόκριση προς τον TNFa, τις άλλες κυτταροκίνες ή τον ιστικό παράγοντα και 4) παρεµβαίνουν στην ενεργοποίηση της θέσης του προαγωγού AP-1, η οποία παίζει κρίσιµο ρόλο στην σύνθεση των µεταλλοπρωτεασών. Τα σαλικυλικά διαταράσσουν επίσης διάφορες οδούς ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης, συµπεριλαµβανοµένων των οδών του p38 και του ras-raf-1- ΜΕΚ-p44erk, και p42erk [15]. Τέλος η µεγάλη δόση ασπιρίνης ασκεί µεταγραφικές και µεταφραστικές επιδράσεις στις συνθετάσες του µονοξείδιου του αζώτου (π.χ. inos, Cinos). Η ακεταµινοφαίνη δεν προκαλεί καµία από αυτές τις in vitro δράσεις των σαλικυλικών. Κατά συνέπεια, οι µοριακοί αυτοί στόχοι καθώς επίσης και η COX έχουν εµπλακεί στις νεώτερες τεκµηριωµένες επιδράσεις της παρατεταµένης χρήσης των ΜΣΑΦ και της ενδιάµεσης δράσης της ασπιρίνης για την (1) πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου στα ζώα και τους ανθρώπους, (2) για την καθυστέρηση της εξέλιξης της νόσου του Alzheimer [16] στους ενήλικες και (3) για την εξάλειψη του συνδρόµου Reye στα παιδιά. Οι εν λόγω ενέργειες στην νόσο του Alzheimer και τον καρκίνο του παχέος εντέρου, δεν περιορίζονται µόνο µε τις ενδιάµεσες δόσεις της ασπιρίνης. Αντίθετα και άλλα ΜΣΑΦ, όπως είναι η σουλινδάκη ή η πιροξικάµη, µπορεί να είναι ακόµα και δραστικότερα. Παρόλα αυτά, η ακεταµινοφαίνη στερείται αυτών των ιδιοτήτων. 28

29 2.4 Αναστολή της COX-1 και ανεπιθύµητες δράσεις των ΜΣΑΦ Η πλέον δόκιµη ίσως άποψη της υπόθεσης της προσταγλανδίνης, όπως αυτή τροποποιήθηκε µετά την ανακάλυψη της COX-2, ήταν η εξήγηση των ανεπιθύµητων δράσεων των ΜΣΑΦ [1,5,17]. Ένα σηµαντικό πρόβληµα µε τα ΜΣΑΦ στις αντιφλεγµονώδεις δόσεις τους είναι ότι ερεθίζουν τον στόµαχο και προκαλούν πεπτικό έλκος [18,19]. Ο ερεθισµός οφείλεται στην ανάγκη του γαστρικού βλεννογόνου για ενδογενείς προσταγλανδίνες, προκειµένου να επιτευχθεί η ρύθµιση της παραγωγής οξέος και για τη σύνθεση του βλεννώδους φραγµού που προλαµβάνει την αυτοπεψία. Η αναστολή σχηµατισµού στον στόµαχο, των PGE 2 και PGI 2 προσταγλανδινών, που ασκούν αγγειοδιασταλτική και προστατευτική δράση αποτελεί έναν σηµαντικό παράγοντα στην ανάπτυξη της δεδοµένης ανεπιθύµητης ενέργειας. Έχει καταστεί σαφές, ότι η ενδογενής συνθετάση, είναι το ένζυµο που προσβάλλεται από τα ΜΣΑΦ και ότι η προσθήκη ενός εξωγενούς αναλόγου της PGE1, [20] της µισοπροστόλης, µπορεί να έχει σηµαντική κυτταροπροστατευτική δράση. Επιπλέον, τα περισσότερα ΜΣΑΦ προάγουν την κατακράτηση άλατος και νερού, κυρίως όταν υπάρχει µείωση της νεφρικής αιµατικής ροής και µπορούν να προκαλέσουν νεφρική ανεπάρκεια [21,22]. Η ελαττωµένη νεφρική λειτουργία και οι συνθήκες που σχετίζονται µε την ελάττωση του δραστικού ενδοαγγειακού όγκου, όπως η θεραπεία µε διουρητικά φάρµακα, η κίρρωση ή η συµφορητική καρδιακή ανεπάρκεια µπορούν να αυξήσουν τον κίνδυνο της νεφροτοξικότητας των ΜΣΑΦ. Ακόµη, µπορεί να παρατηρηθεί νεφρική θηλώδης νέκρωση, διάµεση νεφρίτιδα και νεφρωσικό σύνδροµο [23]. Τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν το σχηµατισµό της αγγειοδιασταλτικής PGI 2 από τα νεφρικά κύτταρα και η νεφρική αιµατική παροχή µειώνεται ακόµα περισσότερο [24]. Αυτός είναι και ο λόγος που όργανα πλούσια σε COX-1, όπως ο νεφρός και ο στόµαχος και οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς εµφανίζουν µικρότερη τοξικότητα σ αυτά. Μια άλλη ανεπιθύµητη δράση των ΜΣΑΦ είναι το σύνδροµο ευαισθησίας στην ασπιρίνη στα άτοµα µε γενετική προδιάθεση, η οποία οδηγεί σε συριγµό, πταρµούς και σχηµατισµό ρινικών πολυπόδων [4,17]. Οι συνέπειες αυτές οφείλονται στην εκτροπή του µεταβολισµού του αραχιδονικού, λόγω του αποκλεισµού των COX, προς την οδό της 5-λιποξυγενάσης, η οποία δεν αναστέλλεται από τα ΜΣΑΦ. Έτσι µέσω της οδού της λιποξυγενάσης σχηµατίζονται τα λευκοτριένια (LT) C, D και Ε, [25] τα οποία ενέχονται στην υπερευαισθησία της ασπιρίνης. Οι εµβοές [26], µια συνηθισµένη ανεπιθύµητη δράση που είναι κοινή για την ασπιρίνη και το σαλικυλικό νάτριο, έχει αποδοθεί από µερικούς, στην εξαρτώµενη από την COX-1 σύνθεση των PGE, στα κύτταρα του µέσου ωτός. 29

30 Τέλος, η συνηθέστερη ανεπιθύµητη δράση των ΜΣΑΦ και ιδιαίτερα της ασπιρίνης είναι η εµπλοκή τους στην αιµοπεταλιακή λειτουργία. Οι ασθενείς, που λαµβάνουν τα φάρµακα αυτά, εµφανίζουν µερικές φορές αιµορραγία µετά από ελάσσονα χειρουργική επέµβαση ή τραυµατισµό. Όλα τα ΜΣΑΦ µπορούν να παρατείνουν τον χρόνο πήξης του αίµατος. Με εξαίρεση την ασπιρίνη, αυτή η ενέργεια γρήγορα αναστρέφεται µε τη διακοπή του φαρµάκου, αλλά ο συνδυασµός του γαστρεντερικού ερεθισµού και της παράτασης του χρόνου πήξης του αίµατος µπορεί να προκαλέσει σοβαρή γαστρεντερική αιµορραγία, ιδιαίτερα σε άτοµα προχωρηµένης ηλικίας. Το 1967, οι Weiss και Αledort έδειξαν ότι η ασπιρίνη αναστέλλει τη φυσιολογική συσσώρευση των αιµοπεταλίων [5,27], τόσο in vitro, όσο και in vivo. Mε εξαίρεση το σαλικυλικό νάτριο, όλα τα ΜΣΑΦ που αναστέλλουν την COX-1, τη µόνη COX που εκφράζεται στα θροµβοκύτταρα, αναστέλλουν την αιµοπεταλιακή λειτουργία µέσω του αποκλεισµού της δηµιουργίας ενδοϋπεροξειδίων και ΤxA 2, που αποτελούν ενδιάµεσα προϊόντα, για τη σύζευξη των διεγερµένων αιµοπεταλίων. Αφού ακετυλιωθεί από την ασπιρίνη, η COX-1 των αιµοπεταλίων, παραµένει αδρανοποιηµένη [28] για όλη τη διάρκεια ζωής του κυττάρου και δεν µπορούν να δηµιουργηθούν θροµβοξάνια. Ωστόσο, η σύνθεση προστακυκλίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία µπορούν να συνθέσουν νέα COX-1 ή COX-2, αναστέλλεται για λίγες µόνο ηµέρες. Η χαµηλή δόση ασπιρίνης (<325 mg ηµερησίως) µπορεί να αποκλείσει µη αναστρέψιµα τη δραστικότητα της COX-1, µιας δεξαµενής αιµοπεταλίων στην πυλαία κυκλοφορία, ακόµα και πριν την εµφάνιση του σαλικυλικού στην γενική κυκλοφορία. Οι εν λόγω παρατηρήσεις εξηγούν το γιατί είναι δυνατή, ακόµα και µε χαµηλή δόση ασπιρίνης, η αναστολή του σχηµατισµού [29] των ενδοϋπεροξειδίων (PGG 2, PGH 2 ) και του ΤxA 2 (όλα τους προάγουν τη θρόµβωση και την αγγειοσύσπαση) χωρίς τον παράλληλο αποκλεισµό της σύνθεσης προστακυκλίνης (PGI 2 ), η οποία αναστέλλει την αιµοπεταλιακή λειτουργία και προκαλεί χάλαση στα αιµοφόρα αγγεία. Τα ΜΣΑΦ προκαλούν ήπια ηπατική δυσλειτουργία και σπανίως σοβαρή ηπατίτιδα. Έχει παρατηρηθεί ακόµη και παγκρεατίτιδα. Ασθµατικοί ασθενείς ευαίσθητοι στην ασπιρίνη µπορούν να αναπτύξουν βρογχόσπασµο και αναπνευστική ανεπάρκεια [26]. 2.5 Ανεπιθύµητες δράσεις των ΜΣΑΦ από το γαστρεντερικό σύστηµα Τα θεραπευτικά πλεονεκτήµατα των ΜΣΑΦ περιλαµβάνουν αναστολή του οιδήµατος ή του πόνου στην περιοχή της φλεγµονής. Επιπλέον η ασπιρίνη προσφέρει προστασία από το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, τη θρόµβωση και τη νόσο του Alzheimer [16]. Υπάρχουν όµως ανεπιθύµητες δράσεις [30] που περιορίζουν τη χρήση τους από 30

31 κάποιους ασθενείς. Οι πιο κοινές από αυτές είναι η διάβρωση και η καταστροφή του γαστρεντερικού βλεννογόνου. Τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη ΜΣΑΦ αυξάνουν τη θνητότητα και θνησιµότητα από διάβρωση του γαστρεντερικού βλεννογόνου, έλκη και αιµορραγία PUBS (perforations, ulcerations, bleeding). Στις Η.Π.Α ο αριθµός των θανάτων από τα ΜΣΑΦ ήταν περίπου το χρόνο µε νοσηλείες την ίδια περίοδο [31]. Στη Μεγάλη Βρετανία εκτιµάται ότι επιπλοκές του έλκους και θάνατοι κάθε χρόνο συνδέονται άµεσα µε κατάχρηση ΜΣΑΦ [19]. Πάντως, µερικά ΜΣΑΦ προκαλούν λιγότερες παρενέργειες από το γαστρεντερικό σύστηµα από κάποια άλλα [32]. Μελέτες έδειξαν ότι η ικανότητα των ΜΣΑΦ να αναστέλλουν την COX-1 συνδέεται µε το βαθµό των παρενεργειών που αυτό προκαλεί. Από τα κλασικά ΜΣΑΦ που χρησιµοποιούνται ευρέως η κετορολάκη, κετοπροφένη, ινδοµεθακίνη, τολµετίνη και πιροξικάµη αποτελούν την πρώτη και πιο επικίνδυνη οµάδα φαρµάκων (πίνακας 5). ΠΙΝΑΚΑΣ 5: είκτης γαστρεντερικής τοξικότητας των κυριότερων ΜΣΑΦ. Η φενοπροφαίνη, ασπιρίνη, ναπροξένη και η σουλινδάκη αντιπροσωπεύουν µεσαίου µεγέθους κίνδυνο γαστρεντερικών παρενεργειών, ενώ αντίθετα, η ιβουπροφαίνη και δικλοφενάκη φαίνεται να έχουν τις πιο λίγες ποιοτικώς και ποσοτικώς επιπλοκές από το γαστρεντερικό σύστηµα [33, 34]. Φαίνεται ότι η αναστολή της κυκλοοξυγενάσης-1 και όχι η αναστολή της κυκλοοξυγενάσης-2 είναι αυτή που κυρίως ευθύνεται για τις ανεπιθύµητες ενέργειες των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων από το γαστρεντερικό [35]. Μέχρι την ανακάλυψη της COX-2, δεν µπορούσε να γίνει κατανοητό, γιατί τα ΜΣΑΦ είχαν διαφορετικές δράσεις στο γαστρικό 31

32 βλεννογόνο, αφού εξασκούσαν τις θεραπευτικές τους δράσεις αλλά και τις επιπλοκές τους, δρώντας στο ίδιο ένζυµο. Η ανακάλυψη της COX-2 απάντησε σ αυτό το ερώτηµα, διότι τα δυο ένζυµα αντιδρούν διαφορετικά στα διάφορα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη. Η ασπιρίνη, η ινδοµεθακίνη και η πιροξικάµη είναι αυτά τα οποία προκαλούν τη µεγαλύτερη βλάβη στο στοµάχι. Το φάσµα δραστηριοτήτων, µερικών από αυτά έναντι των δυο ενζύµων, κυµαίνεται από υψηλή εκλεκτικότητα έναντι της COX-1 (166 φορές για την ασπιρίνη) µέχρι την ισοδύναµη δραστηριότητα έναντι και των δυο ενζύµων. Το φάσµα δραστηριότητας των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων έναντι της COX-2 ερµηνεύει την ποικιλία των επιπλοκών των ΜΣΑΦ στις αντιφλεγµονώδεις δόσεις αυτών. Φάρµακα, τα οποία έχουν µεγάλη ισχύ έναντι της COX-2 και χαµηλή ισχύ έναντι της COX-1, έχουν ισχυρή αντιφλεγµονώδη δράση και εµφανίζουν λίγες ανεπιθύµητες ενέργειες από το στόµαχο και τους νεφρούς. Πολλοί ερευνητές, όπως οι Langman και συν. [18] και οι Garcia-Rodriguez και Jick [36] έχουν δηµοσιεύσει συγκριτικά επιδηµιολογικά στοιχεία σχετικά µε τις ανεπιθύµητες ενέργειες των ΜΣΑΦ (πίνακας 6). Η πιροξικάµη και η ινδοµεθακίνη, σε αντιφλεγµονώδεις δόσεις, έδειξαν µεγάλη γαστρική τοξικότητα. Αυτά τα φάρµακα είναι εκλεκτικότερα για την COX-1 παρά για την COX-2. ΠΙΝΑΚΑΣ 6: Συγκριτικά επιδηµιολογικά στοιχεία σε σχέση µε την γαστρική τοξικότητα και τις COX-2/COX-1 αναλογίες (Garcia Rodriguez & Jick Langman και συν.). Είναι προφανής η άµεση ανάγκη ύπαρξης αντιφλεγµονωδών τα οποία δεν επηρεάζουν το γαστρεντερικό σύστηµα ή τουλάχιστον εµφανίζουν λιγότερες επιπλοκές από αυτό. Η ανάγκη αυτή οδήγησε στην ανακάλυψη των αναστολέων της κυκλοοξυγενάσης-2 (εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς) που εµφανίζουν σαφώς λιγότερες ανεπιθύµητες ενέργειες από το γαστρεντερικό [37,38] σε σχέση µε τα κλασσικά µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα. 32

33 3. ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝ ΙΝΕΣ 3.1 Σχηµατισµός προσταγλανδινών Τα τελευταία πενήντα χρόνια έχει σηµειωθεί αξιοσηµείωτη πρόοδος στη γνώση µας, σχετικά µε τις προσταγλανδίνες (PG s ) και συναφείς ουσίες, που όλες συντίθενται από το αραχιδονικό (C20:4w6) και το εικοσαπεντανοϊκό οξέα (C20:5w3). Με τις ιδιότητες των τοπικών ορµονών, οι προσταγλανδίνες εµφανίζουν ποικιλία δράσης σε φυσιολογικά και παθολογικά επίπεδα. Ανιχνεύονται σχεδόν σε κάθε ιστό και υγρό του ανθρώπινου σώµατος [1]. Ποικιλία ερεθισµάτων επάγει την αύξηση της παραγωγής τους. Προκαλούν, σε ελάχιστες ποσότητες, δράσεις οι οποίες πρακτικά περιλαµβάνουν κάθε βιολογική λειτουργία. Η αναστολή της βιοσύνθεσής τους, από φάρµακα ανάλογα της ασπιρίνης, προκαλεί σηµαντικές µεταβολές στις φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές λειτουργίες του οργανισµού. Η σηµαντικότητά τους αναγνωρίσθηκε το 1982 µε την απονοµή του βραβείου Νόµπελ της Φυσιολογίας και της Ιατρικής στους Sune Bergstrom, Bengt Sammuelsson [25] και John Vane [7, 9] για τις ανακαλύψεις τους σχετικά µε τις προσταγλανδίνες και οµόλογες βιολογικές ουσίες. Οι PGE 1 και PGF 2a αποµονώθηκαν σε κρυσταλλική µορφή και η δοµή τους προσδιορίσθηκε το έτος Όταν έγινε γνωστή η γενική δοµή των προσταγλανδινών, αναγνωρίσθηκε η συγγένεια αυτών µε τα λιπαρά οξέα και το 1960 βρέθηκε ότι οι προσταγλανδίνες προέρχονται από το αραχιδονικό οξύ (εικόνα 1). Η PGE1, PGE2 και PGF2a εµφάνισαν ένα ευρύ φάσµα δραστικότητας. Για παράδειγµα, η PGE1 προκάλεσε σύσπαση της µήτρας, των λείων µυϊκών ινών του γαστρεντερικού, χάλαση των αεραγωγών, αγγειοχάλαση, αναστολή της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων και διάρροια. Η θεραπευτική δυνατότητα ήταν προφανής. Αρκούσε µόνο η ανακάλυψη ουσιών µε µια από αυτές τις δράσεις ή µεγαλύτερη εκλεκτικότητα. Πράγµατι, παρασκευάστηκαν χιλιάδες µόρια, ανάλογα των προσταγλανδινών, µε την ελπίδα να προκύψουν ενώσεις µε θεραπευτική αξία και περισσότερο εκλεκτική δράση. Ενώ ακολούθησαν διάφορες ανακαλύψεις, όπως το γεγονός ότι, η ασπιρίνη και παρόµοιες µ αυτήν ουσίες αναστέλλουν τη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών. Στη συνέχεια αποµονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δύο ασταθή κυκλικά ενδοϋπεροξείδια, η PGG 2 και PGH 2. Αυτό οδήγησε στη διευκρίνιση το 1974, της δοµής του θροµβοξανίου Α 2 (ΤxΑ 2 ), ενός ασταθούς αλλά σηµαντικού παράγοντα αγγειοσύσπασης και συσσώρευσης αιµοπεταλίων, καθώς επίσης του ανενεργού προϊόντος αποδόµησής του, του θροµβοξανίου Β 2 (ΤxΒ 2 ). Το 1976 έλαβε χώρα η ανακάλυψη της 33

34 προστακυκλίνης (PGI 2 ). Αυτά τα ευρήµατα, µαζί µε την ανακάλυψη των οδών της λιποξυγενάσης, οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι οι προσταγλανδίνες αποτελούν ένα µέρος των φυσιολογικώς ενεργών προϊόντων του µεταβολισµού του αραχιδονικού οξέος [25]. Το 1979, χαρακτηρίσθηκε η οδός της λιποξυγενάσης (εικόνα 2). Μεσολαβητές, που προέρχονται από αυτήν την οδό, είναι το λευκοτριένιο LTB 4 και 5-υδροξυπαράγωγα τα οποία συζεύγνυνται µε τη γλουταθειόνη (LTC 4 και LTD 4 ). Αυτές οι ουσίες αποτελούν σηµαντικούς µεσολαβητές στην πρόκληση βρογχόσπασµου στο άσθµα. Ανταγωνιστές της παραγωγής ενζύµων ή ανταγωνιστές της δράσης τους επί των υποδοχέων τους υπάρχουν τώρα στη φαρµακευτική αγορά για τη θεραπεία του άσθµατος. Πρόσφατα, έχουν ανακαλυφθεί διάφορα άλλα παράγωγα του αραχιδονικού οξέος µε το όνοµα λιποξίνες, εποξιλίνες και τριοξιλίνες. Υπάρχουν επίσης οι ισοπροστάνες, οι οποίες σχηµατίζονται µε µη ενζυµικό τρόπο. Η πλέον πρόσφατη εκδοχή της αλυσίδας του αραχιδονικού οξέος περιλαµβάνει περισσότερες από 100 ουσίες στην παθολογία. ΕΙΚΟΝΑ 1: O καταρράκτης της φλεγµονής. 34

35 3.2 οµή και σύνθεση Η οικογένεια των προσταγλανδινών, τα λευκοτριένια και οι σχετικές ενώσεις καλούνται εικοσανοειδή, γιατί προέρχονται από λιπαρά οξέα µε 20 άτοµα άνθρακα στο µόριο τους. Αυτά τα οξέα περιέχουν τρεις, τέσσερις ή πέντε διπλούς δεσµούς: εικοσατριενοϊκό οξύ (γλινολενικό οξύ), εικοσατετρανοϊκό οξύ (αραχιδονικό οξύ) και εικοσαπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ). Τα ιχθυέλαια [39] περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις ΕΡΑ και γι αυτό συνιστώνται στη θεραπεία των θροµβωτικών νόσων. Στον άνθρωπο, το αραχιδονικό οξύ αποτελεί την πλέον άφθονη πρόδροµη ουσία. Προέρχεται είτε από το λινολεϊκό οξύ των λαχανικών είτε αποτελεί συστατικό του κρέατος. ΕΙΚΟΝΑ 2: Μεταβολισµός του αραχιδονικού οξέος- Σύνθεση προσταγλανδινών. 35

36 Η βιοσύνθεση των εικοσανοειδών, η οποία αποτελεί απάντηση σε φυσικά, χηµικά ή ορµονικά ερεθίσµατα εµπλέκει δραστηριότητα ενζύµων, όπως οι ακυλ-υδρολάσες ή οι φωσφολιπάσες, τα οποία απελευθερώνουν το αραχιδονικό οξύ από την κυτταρική µεµβράνη. Στη συνέχεια, το αραχιδονικό οξύ µεταβολίζεται ταχέως σε PG S, θροµβοξάνια ή PGI 2 ή µέσω της οδού της λιποξυγενάσης σε λευκοτριένια [40]. 3.3 Ταξινόµηση προσταγλανδινών και δράσεις Οι προσταγλανδίνες ταξινοµούνται σε διάφορες κύριες οµάδες, οι οποίες δηλώνονται µε γράµµατα και διακρίνονται από τις υποκαταστάσεις στον δακτύλιο του κυκλοπεντανίου. Οι κύριες οµάδες υποδιαιρούνται µε βάση τον αριθµό των διπλών δεσµών στις πλάγιες αλυσίδες. Αυτό δηλώνεται µε το δείκτη 1, 2, ή 3. Οι προσταγλανδίνες της σειράς D, E και Fa µερικές φορές αναφέρονται ως πρωταρχικές προσταγλανδίνες. Η σύνθεση αυτών των πρωταρχικών PG S επιτυγχάνεται σε διαδοχικά στάδια µε τη συλλογή µικροσωµιακών ενζύµων, εκ των οποίων το πρώτο είναι η λιπο-οξυ-κυκλο-οξυγενάση. Τα µη εστεροποιηµένα οξέα οξυγονώνονται και κυκλοποιούνται για να σχηµατίσουν τα κυκλικά ενδοϋπεροξείδια, PGG και PGH. Αυτά τα ενδοϋπεροξείδια, τα οποία είναι χηµικώς ασταθή, στη συνέχεια ισοµερίζονται ενζυµατικώς ή µη ενζυµατικώς και δίνουν διάφορα παράγωγα, όπως PGD, PGE, PGI και PGF [41]. Το ενδοϋπεροξείδιο PGH 2 µεταβολίζεται επίσης σε δύο άλλα ασταθή και βιολογικώς ενεργά συστατικά. Το ένα εξ αυτών είναι το θροµβοξάνιο ΤxΑ2, το οποίο σχηµατίζεται από το PGH 2 µε τη δράση του ενζύµου συνθετάση της θροµβοξάνης, το οποίο βρίσκεται ως επί το πλείστον στα αιµοπετάλια. Το ΤxΑ 2 έχει πολύ µικρό χρόνο ηµίσειας ζωής, περίπου 30 δευτερόλεπτα. ιασπάται χωρίς τη δράση κάποιου ενζύµου στο σταθερό και σχετικά ανενεργό ΤxΒ 2. Ο άλλος ασταθής µεταβολίτης της PGH 2 είναι η προστακυκλίνη PGI2, µε χρόνο ηµίσειας ζωής περίπου 3 λεπτά. Προέρχεται από τη PGH2, µε τη δράση του ενζύµου συνθετάση της προστακυκλίνης, έχει δοµή διπλού δακτυλίου και υδρολύεται σ ένα λιγότερο ενεργό, σταθερό συστατικό, την 6-κετο-PGF 1a. H παρουσία των διαφόρων ισοµερών ποικίλλει από ιστό σε ιστό. Για παράδειγµα, ο πνεύµονας και ο σπλήνας συνθέτουν όλα τα παράγωγα. Η πνευµονική κυκλοφορία περιέχει περίπου το ήµισυ των ενδοθηλιακών κυττάρων του σώµατος, τα οποία αποτελούν την κύρια πηγή της PGI 2. Τα αιµοπετάλια συνθέτουν κυρίως ΤxΑ 2, ενώ η PGE 2 είναι σηµαντική για τους νεφρούς. Η PGD 2 παράγεται στα µαστοκύτταρα και στον εγκέφαλο. 36

37 Από το εικοσαπεντανοϊκό οξύ, η COX παράγει PGG 3 και PGH 3. Αυτές καταβολίζονται περαιτέρω σε εικοσανοειδή των τριών σειρών. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η PGI3 έχει την ίδια ισχυρή δράση στην αναστολή της συγκέντρωσης των αιµοπεταλίων µε την PGI 2, ενώ το ΤxΑ 3 εµφανίζει ασθενέστερη δράση από το ΤxΑ 2 στη συγκέντρωση των αιµοπεταλίων. Οι κυριότερες δράσεις των εικοσανοειδών δίνονται στον πίνακα 7. Αυτή η διαφοροποίηση της δράσης µεταξύ των εικοσανοειδών, τα οποία συντίθενται από το ενδοθηλιακό κύτταρο και εκείνων τα οποία συντίθενται από τα αιµοπετάλια, συνιστά τη βάση της αντιθροµβωτικής επίδρασης της ΕΡΑ και των ιχθυελαίων. ΠΙΝΑΚΑΣ 7: Oι κυριότερες δράσεις των εικοσανοειδών. 37

38 3.4 Παράγωγα λιποξυγενασών Ένας αριθµός ενζύµων έχουν τη δυνατότητα να προκαλούν υπεροξείδωση του αραχιδονικού οξέος σε διάφορες θέσεις, όπως φαίνεται και στην εικόνα 2. Εξ αυτών, το πλέον σηµαντικό είναι µια 5- λιποξυγενάση, η οποία οδηγεί στο σχηµατισµό των λευκοτριενίων [25]. Η 5-λιποξυγενάση [42] χρήζει ενεργοποίησης µέσω της αύξησης των συγκεντρώσεων του ενδοκυττάριου ασβεστίου. Το πρώτο βήµα στην οδό της λιποξυγενάσης είναι ο σχηµατισµός του 5-υδροϋπεροξυεικοσατετρανοϊκού οξέος (5-HPETE). Στη συνέχεια αυτό µετατρέπεται ή στο µονο-υδροξυ-εικοσιτετρανοϊκό οξύ (5-HETE) ή στο λευκοτριένιο Α 4 (LTA 4 ). To LTA 4 µπορεί να µετατραπεί ή στο 5,12-διϋδροξυεικοσατετρανοϊκό οξύ (λευκοτριένιο Β 4, LTB 4 ) ή στο λευκοτριένιο C 4 (LTC 4 ), το οποίο είναι ένα παράγωγο της γλουταθειόνης. Το λευκοτριένιο D 4 (LTD 4 ) παράγεται από την αφαίρεση του γλουταµινικού οξέος από το LTC 4 και το LTE 4 προκύπτει από την αποκοπή της γλυκίνης. Το τελικό βήµα αυτών των µετατροπών παράγει LTF 4 µε την επανενσωµάτωση του γ-γλουταµινικού οξέος στο µόριο µε σκοπό τον σχηµατισµό ενός γ-γλουταµυλ-κυστεϊνικού παραγώγου. Είναι πλέον γενικά παραδεκτό ότι ένα µίγµα από LTC 4 και LTD 4 ευθύνεται για την αναφυλαξία βραδείας αντίδρασης (SRS-A). 3.5 Προσταγλανδίνη Ε 2 Η PGE 2 συµµετέχει σ ένα µεγάλο αριθµό λειτουργιών. Ανευρίσκεται στο αρθρικό υγρό των ασθενών µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα, σε συγκέντρωση της τάξης των 20 ng/ml. Είναι η σηµαντικότερη PG, η οποία εµπλέκεται στη φλεγµονή και γι αυτό τα αντισώµατα έναντι της PGE 2 αναστέλλουν τη φλεγµονή και τον πόνο. Αµφότερες οι PGE 2 και PGI 2 απελευθερώνονται σε µικρότερες ποσότητες. Η PGE 2 προκαλεί έντονο πόνο. Η αλγογόνος δράση της επιτυγχάνεται µέσω της βραδυκυνίνης. H PGE 2 ευαισθητοποιεί τους υποδοχείς του πόνου στα επώδυνα ερεθίσµατα και η αναστολή της σύνθεσής της ευθύνεται για την περιφερική αναλγητική δράση των φαρµάκων των ανάλογων της ασπιρίνης. [43] Ο πυρετός προκαλείται από την απελευθέρωση της PGE 2 στον υποθάλαµο από φλεγµονώδεις µεσολαβητές. Λιποπολυσακχαρίτης, προερχόµενος από µολυσµατικούς οργανισµούς, διεγείρει το σχηµατισµό της ιντερλευκίνης-1 (IL-1), η οποία στη συνέχεια διεγείρει τη σύνθεση της PGE 2. H PGE 2 παράγεται από µακροφάγα, µονοκύτταρα και πολυµορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, τα οποία διεγείρονται από τους 38

39 φλεγµονώδεις µεσολαβητές, ενώ τα λεµφοκύτταρα εµπλέκονται λίγο στην παραγωγή της. Η απελευθέρωση της PGE 2 από τα µακροφάγα πιθανόν λειτουργεί ως αρνητικός µηχανισµός ανατροφοδότησης, εµποδίζοντας την περαιτέρω ενεργοποίηση των µακροφάγων. Η PGE 2 εµποδίζει επίσης την απελευθέρωση της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) και της ιντερφερόνης-γ από τα λεµφοκύτταρα και της IL-1 και του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (ΤΝF-a) από άλλα µακροφάγα [44]. Η ανοσοκαταστολή από τα καρκινικά κύτταρα προκαλείται από την απελευθέρωση µεγάλων ποσοτήτων PGE 2 από τους όγκους, όπως αυτούς του εντέρου, των πνευµόνων, του µαστού ή του προστάτη. Όλα τα τµήµατα του γαστρεντερικού σωλήνα µπορούν να παράγουν PGE 2 στα υποεπιθηλιακά στρώµατα. Ωστόσο, η κυτταροπροστατευτική δράση είναι ιδιαίτερα σηµαντική για τον στόµαχο. Η κυτταροπροστατευτική δράση είναι πολύπλοκη και εξαρτάται από συνδυασµό πολλών µηχανισµών: Η PGE 2 µειώνει την έκκριση του υδροχλωρικού οξέος, περιλαµβανοµένης και της έκκρισης η οποία διεγείρεται από την ισταµίνη, από τα τοιχωµατικά κύτταρα του στοµάχου. Αυτή η δράση επιτυγχάνεται δια της µεσολαβήσεως του υποδοχέα της ΕΡ 3. Η PGE 2 αυξάνει την αιµατική ροή του γαστρικού βλεννογόνου προκαλώντας αγγειοχάλαση στα αιµοφόρα αγγεία αυτού. Αυτή και άλλες δράσεις τύπου αγγειοχάλασης επιτυγχάνονται δια της µεσολαβήσεως του υποδοχέα της ΕΡ 2. Η PGE 2, παραγόµενη από τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα των λείων µυών στο στόµαχο, διεγείρει το σχηµατισµό παχύρρευστης βλέννας, η οποία σχηµατίζει προστατευτικό στρώµα στον στόµαχο. Όταν τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν τη σύνθεση των γαστρικών PGs, ο γαστρικός βλεννογόνος υφίσταται βλάβη. Αυτή η βλάβη µπορεί να προληφθεί όταν χορηγείται ταυτόχρονα ένα ανάλογο της PGE 1, η µισοπροστόλη [20]. Η ισχυρή δράση τύπου αγγειοχάλασης, της PGE 2, είναι σε µεγάλο βαθµό υπεύθυνη για την ερυθρότητα της τοπικής φλεγµονής. Η χάλαση του λείου µυός του αγγείου επιτυγχάνεται µε τη µεσολάβηση του υποδοχέα της ΕΡ 2, ο οποίος δρα ως ζεύγος µε µια διεγερτική πρωτεΐνη G (Gs) και οδηγεί στη διέγερση της αδενυλ-κυκλάσης αυξάνοντας τη συγκέντρωση της ενδοκυττάριας µονοφωσφορικής κυκλικής αδενοσίνης c-amp. H PGE 2 διευκολύνει επίσης το σχηµατισµό οιδήµατος. Η PGE 2 συντίθεται στο νεφρικό φλοιό, καθώς επίσης και στο νεφρικό µυελό. Ο µυελός παράγει 20 φορές την ποσότητα που παράγει ο φλοιός. Η PGE 2 προκαλεί χάλαση στα νεφρικά αγγεία µε σκοπό ν αυξηθεί η νεφρική ροή, αλλά αυτή η δράση είναι σηµαντική µόνο σε παθήσεις, όπως η κίρρωση του ήπατος, η καρδιακή ανεπάρκεια ή η νεφρική ανεπάρκεια και όχι σε φυσιολογικά άτοµα. Το ανθρώπινο σπερµατικό υγρό περιέχει µεγάλες συγκεντρώσεις PGE 2, καθώς επίσης PGE 1. Αυτή µπορεί επίσης να διευκολύνει τη σύλληψη προκαλώντας συσπάσεις του τραχήλου, των φαλλοπιανών 39

40 πόρων και της µήτρας. Η PGE 2 εµπλέκεται στην ωρίµανση του τράχηλου πριν τον τοκετό και δύναται να προκαλέσει τοκετό σε οποιαδήποτε φάση της εγκυµοσύνης. Παράγεται µαζί µε την PGE 2a στην εγκυµονούσα µήτρα, τις εµβρυϊκές µεµβράνες και τον οµφάλιο λώρο. Ο εγκέφαλος συνθέτει PGE 2 και PGD 2 οι οποίες έχουν ανταγωνιστική δράση όσον αφορά στη ρύθµιση του ύπνου και της θερµοκρασίας. 3.6 Προσταγλανδίνη Ι 2 (Προστακυκλίνη) Η προστακυκλίνη PGI 2 (Vane και συν, 1976) είναι ένα δικυκλικό εικοσανοειδές µε βραχεία ηµίσεια ζωή, διάρκειας τριών περίπου λεπτών. ιασπάται αµέσως σε 6-κετο-PGF 1a, η µέτρηση του οποίου αντανακλά τον σχηµατισµό της PGI2. Η παραγωγή της PGI 2 σε ολόκληρο τον οργανισµό συνήθως εκτιµάται από το µεταβολίτη της στα ούρα, 2,3- δινορ-6-κετο-pgf 1a. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων συνθέτουν κυρίως PGI 2, της οποίας η απελευθέρωση επάγεται από µεσολαβητές, όπως η βραδυκινίνη ή η ακετυλοχολίνη. Η PGI 2 δραστικά αναστέλλει τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων και προκαλεί αγγειοχάλαση [45,46]. Αµφότερες οι δράσεις επιτυγχάνονται µε την ενεργοποίηση του υποδοχέα της IP που οδηγεί στη διέγερση της ενδοκυττάριας αδενυλκυκλάσης και στον σχηµατισµό ΑΜP στα αιµοπετάλια και στα κύτταρα των λείων µυών. Στην αθηρωµάτωση και στο διαβήτη, τα ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν µικρότερες ποσότητες PGI 2 απ ότι συνήθως. Ως εκ τούτου, επαρκής παραγωγή PGI 2 πιθανόν να είναι σηµαντική στην πρόληψη της θρόµβωσης και της αθηρωµάτωσης [47]. Επίµυες, στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο που εκφράζει τον υποδοχέα της IP, εµφανίζουν αυξηµένη τάση θρόµβωσης και µειωµένη απάντηση στην φλεγµονή και τον πόνο. Η αντισυσσωρευτική, αγγειοδιασταλτική δράση της PGI 2 έρχεται σε αντίθεση µε την ισχυρή προσυσσωρευτική αγγειοσυσπαστική δράση του ΤxΑ 2 (θροµβοξάνιο Α 2 ), το οποίο συντίθεται από τα αιµοπετάλια [48]. Η PGI 2, συντιθέµενη από την COX-2 [49] στα σπειραµατικά και µεσαγγειακά κύτταρα των νεφρών του ανθρώπου, πιθανόν να αποτελεί το ερέθισµα για την απελευθέρωση της ρενίνης από τα γειτονικά του σπειράµατος κύτταρα. Η PGI 2 απελευθερώνεται στα φλεγµονώδη εξιδρώµατα µαζί µε την PGE 2, αλλά η ποσότητα της απελευθερούµενης PGI 2 είναι µεγαλύτερη εκείνης της PGE 2. Η PGI 2 είναι ασταθής και υφίσταται αυτόµατη υδρόλυση σε 6-κετο-PGF 1a. Οι κυριότεροι µεταβολίτες, οι οποίοι απελευθερώνονται στα ούρα, είναι οι 2,3-δινορ-6- κετο-pgf 1a και 6,15-δικετο-2,3-δινορ-PGF 1a. 40

41 3.7 Θροµβοξάνιο Α 2 ( ΤxΑ 2 ) Το 1975, ο Samuelsson [50] ανακάλυψε ότι τα αιµοπετάλια παρήγαγαν το θροµβοξάνιο ΤxΑ 2, ένα δραστικό προσυσσωρευτικό και αγγειοσυσπαστικό εικοσανοειδές από το αραχιδονικό οξύ. Η συνθετάση της θροµβοξάνης µετατρέπει στα αιµοπετάλια την PGH 2 σε ΤxΑ 2, το οποίο έχει χρόνο ηµισείας ζωής µόνο 30 δευτερόλεπτα και διασπάται αυτόµατα σε ανενεργό ΤxΒ 2. Τα µονοκύτταρα του αίµατος, συνθέτουν επίσης ΤxΑ 2 και µετά τα αιµοπετάλια, έχουν τα υψηλότερα επίπεδα συνθετάσης της θροµβοξάνης στον οργανισµό. Ο µεταβολισµός του ΤxΑ 2 στον άνθρωπο προκύπτει από τους µεταβολίτες του ΤxΒ 2. Αν και έχουν ταυτοποιηθεί γύρω στους 20 µεταβολίτες, στα ούρα µέχρι τώρα ο πλέον άφθονος είναι ο 2,3-δινορ-ΤxΒ 2. Με τις αντίθετες δράσεις τους, η PGI 2 και το ΤxΑ 2 ρυθµίζουν τη δραστηριότητα των αιµοπεταλίων στην κυκλοφορία. Ο υποδοχέας της ΤΡ παίζει µεσολαβητικό ρόλο στη σύσπαση όλων των λείων µυών των αγγείων και των αεραγωγών, µέσω του ΤxΑ 2, καθώς επίσης η διέγερση του υποδοχέα της ΤΡ στα αιµοπετάλια οδηγεί στη συσσώρευση αυτών. Οι υποδοχείς της ΤΡ [51] βρίσκονται σε σύζευξη, µέσω ρυθµιστικών G- πρωτεϊνών, µε σκοπό τη διέγερση της υδρόλυσης της ενδοκυττάριας φωσφοϊνοσιτόλης. Ανταγωνιστές του υποδοχέα της ΤΡ στα αιµοπετάλια αναπτύχθηκαν ως αντιθροµβωτικοί παράγοντες, αλλά δεν µπόρεσαν να συναγωνιστούν τη χαµηλή τιµή της ασπιρίνης. 3.8 Ο ρόλος της προστακυκλίνης και του θροµβοξανίου Α 2 στη ρύθµιση του αγγειακού τόνου, στην ενεργοποίηση και συσσώρευση αιµοπεταλίων Το αγγειακό ενδοθήλιο αποτελεί έναν ιδανικό ρυθµιστή της αιµόστασης [52]. ιαθέτει ένα αξιόλογο φάσµα δραστηριοτήτων, οι οποίες του επιτρέπουν, όποτε παραστεί ανάγκη, να µετατρέπεται ταχύτατα από µια ισχυρή αντιθροµβωτική σε µια προθροµβωτική επιφάνεια. Πρόκειται για µια µονή στιβάδα από ενδοθηλιακά κύτταρα που επικαλύπτει την εσωτερική επιφάνεια ολόκληρου του κυκλοφορικού δικτύου. Έτσι, τα ενδοθηλιακά κύτταρα αποτελούν το µόνο τύπο κυττάρων µε τον οποίο έρχεται σε επαφή το αίµα υπό κανονικές συνθήκες. Η επιφάνεια του ενδοθηλίου στους ενήλικες είναι τεράστια. Το ενδοθήλιο ζυγίζει 1kg και καλύπτει µια επιφάνεια περίπου ίση µε αυτήν που καταλαµβάνουν έξι γήπεδα τέννις [53]. 41

42 Το φυσιολογικό ενδοθήλιο αποτελεί µια σταθερή, ισχυρή αντιθροµβωτική (θροµβοανθεκτική) επιφάνεια ροής του αίµατος. Εκδηλώνει αντιπηκτικές, προϊνωδολυτικές και αντι-αιµοπεταλιακές ιδιότητες. Ωστόσο, όποτε το ενδοθήλιο ενεργοποιείται ή διαταράσσεται, µετατρέπεται τάχιστα σε µία προθροµβωτική επιφάνεια, η οποία, στην πράξη, προωθεί την πήξη, αναστέλλει την ινωδόλυση και ενεργοποιεί τα αιµοπετάλια. Η αιµοστατική µετατροπή του τοιχώµατος του αγγείου προκαλείται από µηχανική βλάβη ή από διαταραχή και ενεργοποίηση των αγγειακών κυττάρων από παράγοντες όπως οι κυτοκίνες, η βακτηριδιακή ενδοτοξίνη, η υποξία και διάφορες αιµοδυναµικές δυνάµεις. Όµοια, µία λεπτή ισορροπία υπάρχει στην ικανότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων να ρυθµίζουν τον αγγειακό τόνο (εικόνα 3). Ένας σηµαντικός φυσιολογικός αγγειοδιαστολέας απελευθερώνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, το µονοξείδιο του αζώτου (NO), ένα αέριο το οποίο συντίθεται από τα αµινοτελικά άτοµα γουανιδίνης της L-αργινίνης µε τη δράση µιας οµάδας ενζύµων γνωστά ως συνθετάσες µονοξειδίου του αζώτου (NOS S ). Η σηµαντικότερη ισοµορφή NOS S στα ενδοθηλιακά κύτταρα, η ενδοθηλιακή συνθετάση µονοξειδίου του αζώτου (enos), είναι σταθερά δραστική αλλά ενεργοποιείται περαιτέρω µέσω ερεθισµάτων τα οποία αυξάνουν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου, συµπεριλαµβανοµένων πολλών ανταγωνιστών που εξαρτώνται από υποδοχείς (π.χ θροµβίνη) και αιµοδυναµικές δυνάµεις (π.χ διατµητική τάση και κυκλική τάση) [54]. Το µονοξείδιο του αζώτου (NO) δρα ως ένας ισχυρός αγγειοδιαστολέας αλλά και ως αναστολέας της προσκόλλησης και συσσώρευσης αιµοπεταλίων, µε τη διέγερση της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης, που έχει ως αποτέλεσµα να αυξάνονται τα επίπεδα της κυκλικής µονοφωσφορικής γουανοσίνης (cgmp) στα αγγειακά λεία µυϊκά κύτταρα και τα αιµοπετάλια. ΕΙΚΟΝΑ 3: Ρύθµιση του αγγειακού τόνου µέσω της ισορροπίας παραγόντων αγγειοδιαστολής και αγγειοσυστολής, προερχόµενων από το ενδοθήλιο. (όπου: EDHF= υπερπολωτικός ενδοθηλιακός παράγοντας, PAF= παράγοντας ενεργοποίησης αιµοπεταλίων, PGI 2 = προστακυκλίνη, ΤΧΑ 2 = θροµβοξάνιο Α 2 ) 42

43 Η προσταγλανδίνη I 2 (PGI 2, προστακυκλίνη) είναι ένα σηµαντικό ενδοθηλιακό προϊόν οξυγόνωσης, το οποίο συντίθεται µέσω της κυκλοοξυγενάσης (COX) και της συνθετάσης της προστακυκλίνης από το αραχιδονικό οξύ [55,56]. Η προστακυκλίνη, όπως και το µονοξείδιο του αζώτου (NO), είναι παράλληλα αγγειοδιαστολέας και αναστολέας της συσσώρευσης αιµοπεταλίων (όχι όµως της προσκόλλησης αιµοπεταλίων). Οι δράσεις αυτές επιτελούνται µέσω ενεργοποίησης της αδενυλικής κυκλάσης αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα της κυκλικής µονοφωσφορικής αδενοσίνης (camp) στα κύτταρα-στόχους που είναι τα αγγειακά λεία µυϊκά κύτταρα και τα αιµοπετάλια. Ο υπερπολωτικός ενδοθηλιακός παράγοντας (EDHF) [57] και το µονοξείδιο του άνθρακα, ένα υποπροϊόν µεταβολισµού της αίµης σε χολοπρασίνη από οξυγενάσες της αίµης [58], αποτελούν, επίσης, άµεσους αγγειοδιαστολείς, οι οποίοι χρησιµοποιούνται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ενδοθηλιακή εκτο-διφωσφορική αδενοσίνη (ADPase) ή CD39 [59], είναι ένας µεµβρανικός αναστολέας αιµοπεταλίων, ενώ παράλληλα µπορεί έµµεσα να προωθεί την αγγειοδιαστολή, παράγοντας αδενοσίνη. Αυτές οι αγγειοδιασταλτικές ιδιότητες του ενδοθηλίου αντισταθµίζονται από ενδοθηλιακούς παράγοντες αγγειοσύσπασης, συµπεριλαµβανοµένων του παράγοντα ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων, της ενδοθηλίνης-1 και του θροµβοξανίου Α 2 (ΤΧΑ 2 ) [60,61]. Σε πολλές περιπτώσεις, οι ενδοθηλιακοί παράγοντες αγγειοδιαστολής µπορούν να αναστείλουν τη δράση των αιµοπεταλίων και αντίστροφα οι ενδοθηλιακοί παράγοντες αγγειοσύσπασης µπορούν, επίσης, να ενεργοποιήσουν τα αιµοπετάλια. Η καθαρή επίδραση αγγειοδιαστολής και αναστολής της λειτουργίας των αιµοπεταλίων είναι η ενίσχυση της ρευστότητας του αίµατος, ενώ η καθαρή επίδραση της αγγειοσύσπασης και της ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων είναι η ενίσχυση της αιµόστασης. Έτσι, η ρευστότητα του αίµατος και η αιµόσταση µπορούν να ρυθµιστούν εξαιρετικά από τις αντιθροµβωτικές/προθροµβωτικές και τις αγγειοδιασταλτικές /αγγειοσυσταλτικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων, οι οποίες µε τη σειρά τους ρυθµίζονται από τη σχετική κατάσταση καταστολής και ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων [52]. Υπό κανονικές συνθήκες, µια µονή στιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων καλύπτει την εσωτερική επιφάνεια του κυκλοφορικού δένδρου και απελευθερώνει µεσολαβητές που αναστέλλουν τα αιµοπετάλια, όπως η PGI2 (προστακυκλίνη) και το οξείδιο του αζώτου (εικόνα 4Α). Στα σηµεία αγγειακής βλάβης (11 η εως 1 η ώρα στην εικόνα 4Β), το ενδοθήλιο χάνεται και τα αιµοπετάλια υφίστανται «προσκόλληση» (αλληλεπίδραση αιµοπεταλίων-αγγειακού τοιχώµατος) στις υπενδοθηλιακές δοµές που έχουν αποκαλυφθεί (π.χ κολλαγόνο). Τα προσκολλούµενα αιµοπετάλια ενεργοποιούνται και απελευθερώνουν κοκκιώδη συστατικά [62,63] (π.χ ADP, ινωδογόνο, παράγοντα von Willebrand) και θροµβοξάνιο Α 2 (ΤΧΑ 2 ) (εικόνα 4Γ). Οι ουσίες που απελευθερώνονται από τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια προσελκύουν 43

44 και άλλα αιµοπετάλια [64] από την κυκλοφορία στο σηµείο της βλάβης και επιτελούν τη διαδικασία «συσσώρευσης» των αιµοπεταλίων (αλληλεπιδράσεις µεταξύ αιµοπεταλίων) που οδηγεί στο σχηµατισµό ενός αποφρακτικού θρόµβου από αιµοπετάλια (εικόνα 4 ). ΕΙΚΟΝΑ 4: Η σειρά των σταδίων ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων. 44

45 4. ΥΟ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΕΣ 4.1 Χαρακτηριστικά των ισοµορφών COX-1 και COX-2 Τα ΜΣΑΦ αποτελούν µια χηµικώς ανοµοιογενή οµάδα φαρµάκων, που αναστέλλουν τη βιοσύνθεση υπεραλγογόνων και προφλεγµονωδών PGs. Από φαρµακολογική άποψη, εκδηλώνουν αντιφλεγµονώδη, αντιπυρετική και ήπια αναλγητική δράση. Η ιστική βλάβη και η συνοδός παραµόρφωση της κυτταρικής µεµβράνης ενεργοποιούν την φωσφολιπάση Α 2, η οποία προκαλεί απελευθέρωση ελεύθερου αραχιδονικού οξέος από τα φωσφολιπίδια της µεµβράνης και το καθιστά επιδεκτικό σε προσβολή από την κυκλοοξυγενάση (COX ή συνθετάση της PGH). Όλα τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν τη δραστικότητα της COX, γεγονός που αποτελεί το υπόβαθρο της αναλγητικής δράσης τους. Στη δεκαετία του 1990 ταυτοποιήθηκαν δυο διαφορετικές ισοµορφές COX [65]. Η COX-1 αποτελεί ένα ένζυµο που απαντά σ ένα ευρύ φάσµα κυττάρων ολόκληρου του οργανισµού. Συντηρεί το σχηµατισµό των PGs που εµπλέκονται στην επιτέλεση βασικών λειτουργιών (π.χ έλεγχος της αιµατικής ροής διαµέσου µεµονωµένων οργάνων). ΠΙΝΑΚΑΣ 8: Kυριότερα χαρακτηριστικά των ισοµορφών COX-1 και COX-2. 45

46 Η COX-2 συντίθεται εξ αρχής (de novo) στα αντιφλεγµονώδη κύτταρα [66,67], όπως είναι τα ουδετερόφιλα και τα ιστιοκύτταρα, µετά την έκθεση τους σε βακτηριακές ενδοτοξίνες και /ή κυτοκίνες (π.χ Tumor Necrosis Factor TNF και ιντερλευκίνη 1β). Είναι υπεύθυνη για την παραγωγή PGs στη θέση της φλεγµονής και /ή της ιστικής βλάβης (πίνακας 8). Μέχρι το 1989, µια ισοµορφή COX είχε αναγνωρισθεί αν και υπήρχαν ενδείξεις στη βιβλιογραφία ότι µάλλον υπήρχε και δεύτερη. Η COX-2 ανακαλύφθηκε από τον Simmons [68] και τους συνεργάτες του το 1989 και διάφορες άλλες οµάδες επιβεβαίωσαν στη συνέχεια την παρουσία της. Η COX-2 κωδικοποιείται σε διαφορετικό γονίδιο από εκείνο της COX-1. Το γονίδιο της COX-2 είναι µικρό, της τάξης 8,3 Kb, ενώ αυτό της COX-1 είναι το µεγαλύτερο (22Kb). Τα ένζυµα COX-1 και COX-2 είναι οµοδιµερή και έχουν παρόµοιο µοριακό βάρος (71ΚDa). Η αλληλουχία των αµινοξέων της COX-2 πρωτεΐνης εµφανίζει οµοιότητα κατά 60% µε την αλληλουχία του µη επαγώµενου ενζύµου, µε το µέγεθος του αγγελιοφόρου RNA (m-rna) για το επαγώµενο ένζυµο να είναι περίπου 4,5Kb και αυτό του δοµικού ενζύµου 2,8Kb [69]. Η αναστολή της έκφρασης της COX-2 από τα γλυκοκορτικοειδή αποτελεί µια επιπλέον µορφή αντιφλεγµονώδους δράσης των κορτικοστεροειδών. Η δράση της COX-2, φυσιολογικά χαµηλή στα κύτταρα, ελέγχεται αυστηρά από µια σειρά παράγοντες, όπως οι κυτταροκίνες και ενδοκυττάριους αγγελιοφόρους, καθώς επίσης από τη διαθεσιµότητα του υποστρώµατος. H COX-1 απαντά στα περισσότερα µαστοκύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες [70], όπως επίσης και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, αιµοπετάλια και νεφρικά κύτταρα σε µεγάλες ποσότητες. Η COX-1 αρχικά ταυτοποιήθηκε στη δεκαετία του 1970 χρησιµοποιώντας κλασικές βιοχηµικές µεθόδους από πρόβατο [71] και βρέθηκε να είναι ένα οµοδιµερές των 70KDa. Η πρωτεΐνη περιείχε συγχρόνως τις δραστηριότητες της κυκλοοξυγενάσης και της υπεροξειδάσης, που απαιτούνται για να σχηµατισθούν αντίστοιχα η PGG 2 και η PGH 2. Η τοξική δοµή της κυκλοοξυγενάσης-1 (COX-1) καθορίστηκε από την δοµή του DNA των 2,7 kilobases [72]. H COX-2 απελευθερώνεται σε µεγάλες ποσότητες τοπικά στην περιοχή της φλεγµονής ή συστηµατικά µετά από µόλυνση. Αρχικά θεωρούνταν ότι αυτό συνέβαινε σαν αποτέλεσµα αύξησης του αραχιδονικού οξέος. Το 1990 όµως, αποδείχθηκε ότι η αύξηση αυτή στο σχηµατισµό των προσταγλανδινών οφείλονταν σε αύξηση της έκφρασης του ενζύµου της κυκλοoξυγενάσης [73]. Τώρα γνωρίζουµε ότι η αυξηµένη κυκλοοξυγενάση δεν είναι η κυκλοοξυγενάση-1 αλλά µια ισοµορφή της κυκλοοξυγενάσης-2. Η ταυτοποίηση της COX-2 ήταν, απ όλες τις απόψεις, ένας θρίαµβος στην µοριακή βιολογία. Παλαιότερες έρευνες έδειξαν ότι καλλιεργηµένα επιθηλιακά κύτταρα περιείχαν 2 είδη από σεσηµασµένα m-rna, που αναγνωρίσθηκαν κάτω από αυστηρές συνθήκες από c- 46

47 DNA, έρευνες που αντιστοιχούσαν στην µέχρι τότε γνωστή κυκλοοξυγενάση (κυκλοοξυγενάση-1) [74]. Αυτές οι έρευνες κατέληξαν στο προβλεπόµενο m-rna των 2,8 kilobase αλλά και σε ένα καινούριο προϊόν των 4 kilobase. Είναι αξιοσηµείωτο επίσης ότι οι ερευνητές απέδειξαν ότι το προϊόν αυτό αντιστοιχούσε σε αύξηση της ενζυµικής δραστηριότητας, πράγµα που ενίσχυε το συµπέρασµα ότι αυτό το m- RNA αντιστοιχούσε σε ενεργή πρωτεΐνη. Τελευταίες έρευνες από την ίδια οµάδα συνεργατών επιβεβαίωσαν ότι αυτά τα επιθηλιακά κύτταρα πράγµατι εξέφραζαν δυο διακριτές µορφές της κυκλοοξυγενάσης [75]. 4.2 οµή της COX-1 και COX-2 H κρυσταλλική δοµή της COX-2 [76] µοιάζει πολύ µε αυτή της COX-1 (εικόνα 5), αλλά οι θέσεις δέσµευσης του αραχιδονικού οξέος σ αυτά τα ένζυµα είναι ελαφρά διαφορετικές (εικόνα 6). Η τρισδιάστατη δοµή της COX-1 και COX-2 [77] συνιστάται από τρεις ανεξάρτητες µονάδες: Μια περιοχή τύπου επιδερµικού αυξητικού παράγοντα, µια περιοχή σύνδεσης µεµβράνης και µια ενζυµική περιοχή. Οι περιοχές δράσης της υπεροξειδάσης και της δράσης της COX είναι γειτονικές, αλλά διαφορετικές στο χώρο. Και τα δύο ένζυµα ενσωµατώνονται σε µια µόνο επιφάνεια του διπλού στρώµατος λιπιδίων της κυτταρικής µεµβράνης, έτσι ώστε η θέση του καναλιού της COX να επιτρέπει στο αραχιδονικό οξύ να αποκτά πρόσβαση στην ενεργό πλευρά από το εσωτερικό µέρος του διπλού στρώµατος. ΕΙΚΟΝΑ 5: Ακτινολογική κρυσταλλική δοµή ανθρώπινης COX-2. 47

48 Πολλά ΜΣΑΦ συναγωνίζονται το αραχιδονικό οξύ στη σύνδεση µε την εν λόγω ενεργό περιοχή. Με µοναδικό τρόπο, η ασπιρίνη αναστέλλει την COX-1, µη αναστρέψιµα, µε την ακετυλίωση της σερίνης 530, αποκλείοντας έτσι στο υπόστρωµα την πρόσβαση. Η ασπιρίνη αναστέλλει επίσης την COX-2 µε την ακετυλίωση της σερίνης 530. Το αραχιδονικό οξύ µπορεί, ωστόσο, ακόµη να προσπεράσει πιέζοντας την ακετυλιωµένη σερίνη στη θέση COX-2 και να µετατραπεί σε 15- HPETE. Η εικόνα 5 [76] δείχνει µε λεπτοµέρειες τις µοριακές διαφορές µεταξύ των ενεργών περιοχών (COX-κανάλια) της COX-1 και COX-2. Οι αναστολείς της COX εισέρχονται στο κανάλι από το στρώµα των λιπιδίων και χρειάζεται να περάσουν τη στένωση, η οποία δηµιουργείται εν µέρει από την αργινίνη 120. Η τυροσίνη 385 βρίσκεται στην κορυφή του καναλιού και λειτουργεί ως το ενεργό κέντρο. Η σερίνη 530 αποτελεί την περιοχή ακετυλίωσης για την ασπιρίνη. Ο συνολικός όγκος του COX-2 καναλιού είναι µεγαλύτερος του COX-1. Επιπλέον, το COX-2 κανάλι επεκτείνεται µε την αντικατάσταση δύο ισολευκινών της COX-1 µε βαλίνες στην COX-2. Η βαλίνη 523 επιτρέπει καλύτερη πρόσβαση στην περιοχή τσέπης και η βαλίνη 434 επιτρέπει στη φαινυλανίνη 518 να µεταβάλλει τη µορφή της, παράγοντας επιπλέον χώρο στην κορυφή του καναλιού. Η αργινίνη 513 στην COX-2, η οποία αντικαθιστά την ισταµίνη 513 στην COX-1, επιτρέπει επιπλέον αλληλεπιδράσεις στην περιοχή τσέπης (εικόνα 6). ΕΙΚΟΝΑ 6: Η ενεργός πλευρά της COX-2 είναι µεγαλύτερη της COX-1 και έχει επίσης περιοχή τσέπης. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2, όπως η µελοξικάµη, η σελεκοξίµπη και ροφεκοξίµπη, είναι µεγαλύτερα µόρια από τους συνήθεις µη εκλεκτικούς αναστολείς. Ως εκ τούτου, προσαρµόζονται ευκολότερα στη µεγαλύτερη ενεργό περιοχή της COΧ-2, σε σύγκριση µε 48

49 την COX-1. Επιπλέον, οι δοµές της σελεκοξίµπης και ροφεκοξίµπης προσαρµόζονται στην περιοχή τσέπης της ενεργούς πλευράς της COX-2, ενώ η µελοξικάµη συνδέεται στο άνω τµήµα του καναλιού. Οι γραµµοσκιασµένες περιοχές στην COX-1 είναι περιοχές περισσότερο προσβάσιµες στην COX-2 λόγω των αντικαταστάσεων των αµινοξέων, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία περισσότερου χώρου (extra space) και την πρόσβαση στην περιοχή τσέπης (εικόνα 7). ΕΙΚΟΝΑ 7: Αντικαταστάσεις αµινοξέων µεταξύ COX-1 και COX Λειτουργίες της COX-1 και COX-2 Η COX-1 είναι σταθερά παρούσα στα περισσότερα κύτταρα και παρουσιάζει σαφείς φυσιολογικές λειτουργίες. Για παράδειγµα, η ενεργοποίησή της οδηγεί στην παραγωγή PGI 2, η οποία απελευθερούµενη από το ενδοθήλιο είναι αντιθροµβογενετική και όταν απελευθερώνεται από το γαστρικό βλεννογόνο είναι κυτταροπροστατευτική. Οι Mc Adam και συνεργάτες [49], ωστόσο, βρήκαν ότι ένας εκλεκτικός αναστολέας της COX-2 µείωσε την παραγωγή της αγγειακής PGI 2 σε εθελοντές, πράγµα το οποίο υποδηλώνει ότι η ενδοθηλιακή PGI 2 παράγεται από την COX-2 και όχι από την COX-1. Οι ανεπιθύµητες ενέργειες, οι οποίες προκαλούνται από τα ΜΣΑΦ οφείλονται στο ότι αυτά αποκλείουν την COX-1. Για παράδειγµα, η αποµάκρυνση της PGI2, η οποία συντίθεται από την COX-1, από το γαστρικό βλεννογόνο προκαλεί αιµορραγία και έλκη. Παρ όλα αυτά, 49

50 υπάρχει µια ευεργετική επίδραση στα αιµοπετάλια, όπου τα ΜΣΑΦ µειώνουν τη σύνθεση του ΤxΑ 2, και ως εκ τούτου εµποδίζουν τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων µε αποτέλεσµα να προλαµβάνεται η θρόµβωση. Η COX-2 επάγεται σε µεταναστευτικά και άλλα κύτταρα από φλεγµονώδη ερεθίσµατα. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι οι αντιφλεγµονώδεις δράσεις των ΜΣΑΦ οφείλονται στην αναστολή του ενζύµου COX-2. Εκτός από τη φλεγµονώδη δράση της, η COX-2 έχει επίσης φυσιολογικές λειτουργίες. Για παράδειγµα, η έκφραση της COX-2 επιφέρει ωορρηξία και τοκετό. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η COX-2 ανευρίσκεται τώρα σε µερικά όργανα ως δοµικό ένζυµο [30]. Η ισοµορφή COX-1 παράγεται σε συνεχή ποσότητα στον οργανισµό, στους διάφορους ανθρώπινους ιστούς και ευθύνεται για την παραγωγή της προσταγλανδίνης Ε 2 (PGE 2 ), η οποία και εµπλέκεται σ ένα µεγάλο αριθµό προστατευτικών για τον οργανισµό λειτουργιών (π.χ διατήρηση/ προστασία του γαστρικού βλεννογόνου, ρύθµιση της αιµοδυναµικής των νεφρών, συγκόλληση των αιµοπεταλίων). Η ισοµορφή COX-2 φυσιολογικά δεν ανιχνεύεται στους περισσότερους ιστούς στο σώµα, αλλά η παραγωγή της επάγεται τοπικά σε σηµεία βλάβης των ιστών µετά από διέγερση από φλεγµονώδεις παράγοντες και κυτοκίνες (εικόνα 8). Οι προσταγλανδίνες, που παράγονται από την COX-2, σχετίζονται µε τα σηµεία και συµπτώµατα της φλεγµονής, όπως ερύθηµα, οίδηµα, άλγος και καταστροφή του χόνδρου. Ένα εκλεκτικό αντιφλεγµονώδες φάρµακο θα µπορούσε να αναστέλλει την COX-2, αναστέλλοντας την παραγωγή προφλεγµονωδών προσταγλανδινών χωρίς να προκαλεί κλινικά σηµαντική αναστολή της COX-1, ένζυµο που µεσολαβεί στην παραγωγή προσταγλανδινών που διατηρούν την οµοιόσταση σε σηµαντικά οργανικά συστήµατα. ΕΙΚΟΝΑ 8: Σχέση µεταξύ των οδών γένεσης των προσταγλανδινών από τις COX-1 και COX-2. 50

51 5. COΧ-2 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ 5.1 Η ανακάλυψη των COΧ-2 αναστολέων Η φαρµακολογική αναστολή της σύνθεσης των προστανοειδών (προσταγλανδινών, PG S ) ήταν το επίκεντρο της εξέλιξης των φαρµάκων πάνω από 100 χρόνια. Από την ασπιρίνη και τα άλλα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα (ΜΣΑΦ) που αναστέλλουν τη COX, το πεδίο εξελίχθηκε γρήγορα στη δεκαετία του Ανευρέθη ένας µεγάλος αριθµός παραγώγων µε ποικίλες αντιφλεγµονώδεις και αναλγητικές δυνατότητες και διαφορετική φαρµακοδυναµική [78]. Αυτά τα ΜΣΑΦ περιλαµβάνουν µια οµάδα παραγώγων µε ετερογενείς δοµές. Θεραπευτικώς, διαθέτουν αντιπυρετικές, αναλγητικές και αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες, αλλά ο σχετικός βαθµός αυτών των αποτελεσµάτων ποικίλλει ανάλογα µε τα συστατικά τους (π.χ η ακεταµινοφαίνη έχει αντιπυρετικές και αναλγητικές ιδιότητες αλλά µικρή αντιφλεγµονώδη δράση). Επιπλέον τα ΜΣΑΦ µοιράζονται τις ίδιες ανεπιθύµητες ενέργειες, όπως πεπτικό έλκος-διάβρωση, νεφρική δυσλειτουργία, αναστολή της κινητικότητας της µήτρας και υπέρταση. Η σχετική συχνότητα των ανεπιθύµητων αυτών δράσεων ποικίλλει πάντως αξιοσηµείωτα µεταξύ των µελών αυτής της οµάδας. Με την αναγνώριση ότι η ασπιρίνη αναστέλλει τη λειτουργία των αιµοπεταλίων, το αντιθροµβωτικό αποτέλεσµα αυτών των παραγώγων κέρδισε µοναδική θεραπευτική αξία και φυσικά έχει αποδειχθεί ότι είναι µια µοναδική θεραπευτική στρατηγική στη διαδικασία της αθηρωµάτωσης. Επειδή η ενδοθηλιακή προστακυκλίνη (PGI 2 ) έχει αντιθροµβωτική δράση, ενώ το θροµβοξάνιο Α 2 (ΤxA 2 ) στα αιµοπετάλια έχει προθροµβωτική δράση, οι ερευνητές κατάλαβαν στη δεκαετία του 1970 ότι οι έρευνες για την µη εκλεκτική αναστολή της κυκλοοξυγενάσης (COX) στους δυο αυτούς τύπους κυττάρων θα κατέληγε θεωρητικά στο αντιθροµβωτικό αποτέλεσµα της αναστολής της COX στα αιµοπετάλια. Σαν αποτέλεσµα της µη αναστρέψιµης αναστολής (µέσω οξείδωσης) της COX από την ασπιρίνη και τη διαφορά στην ηµιπερίοδο ζωής των αιµοπεταλίων και της ενδοθηλιακής COX, η χαµηλή δόση ασπιρίνης φάνηκε να δίνει επαρκή αντιθροµβωτική εκλεκτικότητα για πρωτογενή και δευτερογενή προστασία από αθηροθροµβωτικά επεισόδια. Στις αρχές της δεκαετίας του 1990, µια νέα ακτίδα φωτός φάνηκε στην περίπλοκη ως τότε µοριακή σύνθεση των αγγειακών προστανοειδών µε την ταυτοποίηση δυο µελών της COX-οικογένειας [65]. H COX-1 εκφράζεται σε πολλά κύτταρα και είναι το µόνο ισοένζυµο στα αιµοπετάλια, ενώ η COX-2 επάγεται από αντιφλεγµονώδεις κυτοκίνες σε πολλά είδη κυττάρων. Η αναγνώριση ότι υπάρχουν δυο διαφορετικές ισοµορφές COX οδήγησε στην άποψη ότι η COX-2 είναι υπεύθυνη για τις ανεπιθύµητες προφλεγµονώδεις δράσεις των 51

52 προστανοειδών και ότι οι µη εκλεκτικοί COX-αναστολείς προκαλούν αιµορραγία µε την αναστολή της COX-1 στα αιµοπετάλια. Η σκέψη αυτή οδήγησε τη φαρµακευτική βιοµηχανία στο να παράγει τους εκλεκτικούς COX-2 αναστολείς, τις κοξίµπες [79,80], µε το επιχείρηµα ότι αυτά τα παράγωγα θα έδιναν επαρκή αναλγησία και αντιφλεγµονώδη δράση, χωρίς τον κίνδυνο αιµορραγίας. Η γαστροτοξικότητα που συνοδεύει τη χρήση των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων φαίνεται να είναι µεγάλης σηµασίας, ώστε να δικαιολογήσει την παραγωγή και εξέλιξη των COX-2-εκλεκτικών αναστολέων. Σύµφωνα µε µια µετα-ανάλυση, περίπου ένα τρίτο των ασθενών που έπαιρναν µη στεροειδές αντιφλεγµονώδες NSAID, είχαν έλκος στοµάχου ή βολβού δωδεκαδακτύλου ενδοσκοπικώς και ασθενείς νοσηλεύονται κάθε χρόνο λόγω γαστρεντερικών ανεπιθύµητων ενεργειών από τη χρήση αυτών. Ο κίνδυνος αυτός φέρεται να µειώθηκε σε µεγάλο βαθµό µετά τη χρήση των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων [81]. 5.2 Η εξέλιξη των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων Η άµεση ανάγκη ύπαρξης αντιφλεγµονωδών τα οποία να µην επηρεάζουν το γαστρεντερικό ή τουλάχιστον να έχουν λιγότερες ανεπιθύµητες δράσεις οδήγησε στην εξέλιξη των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων L-745,337 [82], DFU (5,5-διµεθυλ-3- (3-φλουροφενυλ)-4, (4-µεθυλσουλφονυλ) φενυλ-2(5h)-φουρανόνη [83] και DFP (3-(2- προπυλοξυ)-4-(4-µεθυλσουλφονυλφενυλ)-5,5-διµεθυλφουρανόνη [84] και SC [85]. Η ετοδολάκη, η µελοξικάµη και η νιµεσουλίδη ταυτοποιήθηκαν το 1980 ως ισχυρά αντιφλεγµονώδη φάρµακα µε χαµηλή ελκογόνο δράση στο στόµαχο του επίµυος. Σε µερικές περιπτώσεις, οι ιδιότητες αυτές εµφανίζονταν παράλληλα µε ήπια δράση έναντι της σύνθεσης προσταγλανδινών στον στόµαχο του επίµυος. Μετά τον χαρακτηρισµό του COX-2 γονιδίου σ αυτά τα τρία φάρµακα, βρέθηκε ότι είναι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2, µε µια διακύµανση στις αναλογίες COX-2/COX-1 µεταξύ 0,1 και 0,01, ανάλογα µε το σύστηµα ελέγχου. Επιπλέον αυτή η προσέγγιση οδήγησε στην ανακάλυψη 2 νέων εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 µε την έγκριση του FDA που χρησιµοποιούνται συχνότερα, τη ροφεκοξίµπη [86] και τη σελεκοξίµπη [87], καθώς επίσης και ετορικοξίµπη, βαλντεκοξίµπη και παρεκοξίµπη (εικόνα 9). 52

53 ΕΙΚΟΝΑ 9: Χηµική δοµή των κυριότερων COX-2 αναστολέων. 5.3 Η COX-2 ως θεραπευτικός στόχος Ένας αριθµός µελετών στηρίζουν δυνατά το ρόλο της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) στον πόνο έναντι της φλεγµονής. Οι υψηλά εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 αναστέλλουν την υπεραλγησία στους αρουραίους [83]. Επιπλέον, η διαδικασία του αισθήµατος του άλγους µπορεί πράγµατι να οδηγήσει στην επαγωγή του ενζύµου COX-2 στην σπονδυλική στήλη, όπως έχει επιβεβαιωθεί σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε αντιφλεγµονώδες κίνητρο στο πέλµα [88,89]. Οι νέοι COX-2 ειδικοί αναστολείς επιτυγχάνουν ταχεία αναλγησία από µετεγχειρητικό οδοντικό άλγος [90], πρωτοπαθή δυσµηνόρροια και µετεγχειρητικό ορθοπαιδικό άλγος καθώς επίσης και σε χρόνιο άλγος από οστεοαρθρίτιδα και ρευµατοειδή αρθρίτιδα [30]. Καθυστέρηση πρόωρου τοκετού: Οι προσταγλανδίνες προκαλούν συσπάσεις της µήτρας κατά τον τοκετό. Τα ΜΣΑΦ, όπως η 53

54 ινδοµεθακίνη καθυστερούν τον πρόωρο τοκετό αναστέλλοντας την παραγωγή προσταγλανδινών, αλλά προκαλούν επίσης πρώιµη σύγκλειση του αρτηριακού πόρου και µειώνουν την παραγωγή ούρων από τους νεφρούς του εµβρύου. Η καθυστέρηση της διαδικασίας του τοκετού επιτυγχάνεται µάλλον µέσω της αναστολής της COX-2, αφού η παραγωγή m- RNA για την COX-2 αυξάνεται σηµαντικά στο αµνιακό υγρό και στον πλακούντα αµέσως πριν και µετά την έναρξη του τοκετού, ενώ οι ανεπιθύµητες ενέργειες στο έµβρυο οφείλονται στην αναστολή της COX-1. Eίναι η προς τα άνω ρύθµιση της COX-2 παρά της COX-1 [91], η οποία παίζει µεσολαβητικό ρόλο στην αύξηση της σύνθεσης των προσταγλανδινών εντός των εµβρυικών µεµβρανών στο τέλος της κύησης. Αυτή η αύξηση της έκφρασης της COX-2 προηγείται της έναρξης του τοκετού, υποδηλώνοντας ότι αποτελεί αιτία και όχι συνέπεια του τοκετού. Η νιµεσουλίδη µειώνει τη σύνθεση προσταγλανδινών σε µεµονωµένες εµβρϋικές µεµβράνες και έχει χρησιµοποιηθεί επιτυχώς για µεγάλο διάστηµα στην καθυστέρηση πρόωρου τοκετού χωρίς την εκδήλωση των ανεπιθύµητων ενεργειών της ινδοµεθακίνης στο έµβρυο. Προφύλαξη από τον καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλες µορφές καρκίνου: Επιδηµιολογικές µελέτες έχουν δείξει ότι η συστηµατική χρήση της ασπιρίνης µειώνει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου. Η σουλινδάκη επέφερε επίσης µείωση της σύνθεσης προσταγλανδινών και υποχώρηση των αδενωµατωδών πολυπόδων σε 11 από τους 15 ασθενείς µε οικογενή αδενωµατώδη πολυποδίαση (FAP), νόσο η οποία επιπλέκεται µε κακοήθη εξαλλαγή πολλών πολυπόδων του κόλου και του ορθού. Η ένδειξη ότι η COX δραστηριότητα εµπλέκεται στη διαδικασία η οποία οδηγεί σε καρκίνο του κόλου υποστηρίζεται από τη διαπίστωση ότι η COX-2 και όχι η COX-1 εµφανίζουν υψηλή έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του κόλου σε ανθρώπους και πειραµατόζωα, καθώς επίσης αδενοκαρκινωµάτων του κόλου και του ορθού στον άνθρωπο. Περαιτέρω υποστήριξη της στενής σχέσης µεταξύ COX και καρκίνου του κόλου έρχεται από µελέτες σε Apc επίµυες [92], τα οποία αποτελούν µοντέλο της οικογενούς αδενωµατώδους πολυποδίασης του ανθρώπου. Η αυτόµατη ανάπτυξη πολυπόδων του εντέρου στους παραπάνω επίµυες µειώθηκε σηµαντικά ή µε την απάλειψη του COX-2 γονιδίου ή µε τη θεραπεία µε υψηλής εκλεκτικότητας COX-2 αναστολέα. Η νιµεσουλίδη µείωσε επίσης τον αριθµό και το µέγεθος των εντερικών πολυπόδων στους επίµυες. Εποµένως, φαίνεται αρκετά πιθανόν ότι οι COX-2 αναστολείς µπορούν να χρησιµοποιηθούν προφυλακτικά στην πρόληψη του καρκίνου του κόλου σε άτοµα µε γενετική προδιάθεση [93], χωρίς την πρόκληση γαστρεντερικής βλάβης. Είναι επίσης πιθανόν, οι COX-2 αναστολείς να χρησιµοποιηθούν στη θεραπεία του καρκίνου του κόλου. Πρόσφατα, έχει διαπιστωθεί έκφραση της COX-2 στον καρκίνο του µαστού, του οισοφάγου [94], του παγκρέατος [95], του ήπατος και του στοµάχου [96]. Στο µέλλον, οι COX-2 αναστολείς πρόκειται να δοκιµασθούν σε αυτές τις καταστάσεις. 54

55 Επιβράδυνση της εξέλιξης της νόσου Alzheimer: Η σχέση µεταξύ της COX και της νόσου Alzheimer έχει βασισθεί ως επί το πλείστον σε επιδηµιολογικές µελέτες λόγω απουσίας πειραµατικού µοντέλου της νόσου. Μία σειρά µελετών, έχει δείξει σηµαντικά µειωµένη επίπτωση νόσου Alzheimer σε άτοµα τα οποία λαµβάνουν ΜΣΑΦ, ως αντιφλεγµονώδη θεραπεία. Η µελέτη µακράς διάρκειας ηλικίας της Βαλτιµόρης, µε 1686 συµµετέχοντες, ανέφερε το 1997 [16] ότι ο κίνδυνος ανάπτυξης της νόσου Alzheimer είναι µειωµένος µεταξύ εκείνων οι οποίοι χρησιµοποιούν ΜΣΑΦ, ειδικά εκείνοι οι οποίοι τα λαµβάνουν για περισσότερο από δύο χρόνια. Ο κίνδυνος δεν ήταν µειωµένος σε εκείνους οι οποίοι ελάµβαναν ασπιρίνη ή παρακεταµόλη, αν και η δόση της ασπιρίνης ήταν πολύ χαµηλή για να έχει αντιφλεγµονώδη δράση. Η προστατευτική δράση των ΜΣΑΦ ευρίσκεται σε συµφωνία µε την ένδειξη φλεγµονώδους δραστηριότητας στην παθοφυσιολογία της νόσου Alzheimer. Σε µία ελεγχόµενη µε µάρτυρες µελέτη ατόµων τα οποία απεβίωσαν, το mrna για την COX-2 στον εγκεφαλικό φλοιό [97] ήταν υψηλότερο στη νόσο Alzheimer σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Χρόνια θεραπεία µε εκλεκτικούς COX-2 αναστολείς µπορεί εποµένως να επιβραδύνει την εξέλιξη της νόσου Alzheimer [98], χωρίς επιβλαβείς επιδράσεις στο γαστρικό βλεννογόνο. 5.4 Εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς και ο σχετικός κίνδυνος των καρδιαγγειακών επεισοδίων Η αθηροσκλήρωση είναι µία διαδικασία µε φλεγµονώδη χαρακτηριστικά και οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 µπορεί δυνητικά να διαθέτουν αντιαθηρογενετικά αποτελέσµατα αναστέλλοντας τη φλεγµονή. Πάντως, µειώνοντας την παραγωγή της αγγειοδιασταλτικής προστακυκλίνης, οι COX-2 αναστολείς µπορεί να οδηγήσουν σε αυξηµένη προθροµβωτική δραστηριότητα [99]. Από τα µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη φάρµακα, µόνο η ασπιρίνη [100,101] είναι αποδεδειγµένο ότι σηµαντικά µειώνει τον καρδιαγγειακό κίνδυνο, κυρίως µέσω της αναστολής της COX-1, που συσσωρεύεται στα αιµοπετάλια. Από τους άλλους µη εκλεκτικούς αναστολείς, κυρίως η ναπροξένη µπορεί να προσφέρει καρδιοπροστασία σε µικρότερο βαθµό, αλλά η απόδειξη γι αυτό εκλείπει. Αντιθέτως, υπάρχουν ανησυχίες ότι οι COX-2 αναστολείς µπορεί να αυξάνουν τον καρδιαγγειακό κίνδυνο. Πάντως, οι µηχανισµοί που είναι σχετικοί µε τον καρδιαγγειακό κίνδυνο είναι περίπλοκοι και όχι πλήρως ξεκαθαρισµένoι. Έρευνες έχουν δείξει τον προστατευτικό ρόλο της COX-2 στη λειτουργία του µυοκαρδίου που αρνητικοποιούνται µε την αναστολή της COX-2, ενώ άλλες έχουν δείξει βελτιωµένη ενδοθηλιακή λειτουργία µε τους COX-2 αναστολείς. Επιπρόσθετα, το αποτέλεσµα της συνδυασµένης θεραπείας 55

56 µε ασπιρίνη και άλλους COΧ-2 αναστολείς δεν είναι ακόµη ξεκαθαρισµένο [102]. ιάφοροι µηχανισµοί συνδέονται µε την παθογένεση αυτών των παρενεργειών [103, 112]: α) Η εκλεκτική αναστολή της COX-1 µειώνει τη σύνθεση του θροµβοξανίου (ΤxΑ 2 ) στα αιµοπετάλια, ένα αθηρογενετικό εικοσανοειδές, ενεργοποιητή και συσσωρευτή αιµοπεταλίων. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 δεν έχουν καµιά επίδραση στην παραγωγή θροµβοξανίου Α 2 αλλά δρουν µειώνοντας την παραγωγή της προστακυκλίνης (PGI 2 ) στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η προστακυκλίνη, είναι ένα παράγωγο του αραχιδονικού οξέος που έχει αντίθετες δράσεις από το θροµβοξάνιο, προκαλεί αγγειοχάλαση και είναι αναστολέας της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων. Η µείωση του θροµβοξανίου περιορίζει την αθηρογένεση ενώ η µείωση της προστακυκλίνης επιταχύνει την αθηρογένεση. Η εκλεκτική αναστολή της COX-2 µπορεί εποµένως να διαταράξει τη φυσιολογική ισορροπία µεταξύ του προθροµβωτικού θροµβοξανίου Α 2 και της αντιθροµβωτικής προστακυκλίνης PGI 2 και µ αυτόν τον τρόπο να επιταχύνει την αθηροσκλήρωση, θροµβογένεση και να οδηγήσει έτσι στην αύξηση των θροµβωτικών καρδιαγγειακών επεισοδίων. β) Η αναστολή του ενζύµου COX µπορεί ν αυξήσει τα επίπεδα του αραχιδονικού οξέος και να αναστείλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS). Πολλά ΜΣΑΦ, συµπεριλαµβανοµένου των COX-2 αναστολέων και της µελοξικάµης, άµεσα αναστέλλουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση [13]. Επάγεται ακόµη η αυξηµένη έκφραση της θροµβοµοντουλίνης (αναστολέας θροµβίνης) στα ανθρώπινα λεία µυικά κύτταρα που παρέχει µια µοριακή βάση για έναν άγνωστο αιµοπεταλιακά-εξαρτώµενο µηχανισµό, υπογραµµίζοντας τα προθροµβωτικά αποτελέσµατα των ΜΣΑΦ και των COX-2 αναστολέων [225]. Από τις διαθέσιµες κλινικές µελέτες µε τους COX-2 αναστολείς, υπάρχουν δυο µεγάλες πολυκεντρικές και δυο ακόµη µικρότερες έρευνες [ ]. Σύµφωνα µε τις µελέτες αυτές και τα διαθέσιµα απ αυτές στοιχεία, οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς ενοχοποιούνται για σοβαρές επιπλοκές από το καρδιαγγειακό σύστηµα, µεταξύ αυτών είναι το έµφραγµα µυοκαρδίου, ο αιφνίδιος θάνατος, το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο και η πνευµονική εµβολή. Οι αναστολείς της COX-2 φαίνεται επίσης να αυξάνουν την αρτηριακή πίεση [113,114,115,116] και πολλοί ασθενείς ανέπτυξαν για πρώτη φορά αρτηριακή υπέρταση µε τη ροφεκοξίµπη παρά µε τη ναπροξένη. Για τη ροφεκοξίµπη η ελάχιστη αύξηση στη συστολική πίεση ήταν 4,6 mmhg και 1,7 mmhg στη διαστολική πίεση. Αυτές οι αυξήσεις ήταν µεγαλύτερες απ τη ναπροξένη (1 mmhg συστολική και 0,1 mmhg διαστολική αύξηση). Είναι αποδεδειγµένο ότι η ελάττωση των 2 mmhg στην διαστολική αρτηριακή πίεση έχει ως αποτέλεσµα 40% µείωση στα αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια και 25% µείωση στο έµφραγµα 56

57 µυοκαρδίου. Σύµφωνα µε στοιχεία από την µελέτη Framingham (Framinghham Heart Study) ο βαθµός από τα οφέλη της ελάττωσης στην αρτηριακή πίεση έχει υποεκτιµηθεί. Εποµένως, η αύξηση της αρτηριακής πίεσης που καταγράφεται µε τη χρήση των COX-2 αναστολέων µπορεί να παίζει σπουδαίο ρόλο στα ανεπιθύµητα αποτελέσµατα από το καρδιαγγειακό. 5.5 Κρίσιµα ερωτήµατα σε σχέση µε τους COX-2 αναστολείς Είναι κλινικά χρήσιµο να θεωρήσουµε ότι οι εκλεκτικοί και µη εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς κατέχουν ένα µεγάλο φάσµα βιολογικών δράσεων, επιθυµητών και µη. Από τη µία µεριά, οι COX-2 αναστολείς εµφανίζουν µικρότερη γαστρεντερική τοξικότητα αλλά µεγαλύτερο προθροµβωτικό δυναµικό, από την άλλη πλευρά η ασπιρίνη και η ναπροξένη εµφανίζουν µεγαλύτερη τοξικότητα από το γαστρεντερικό αλλά εµφανίζουν καρδιοπροστατευτική δράση. Όλα τα κλινικά και πειραµατικά στοιχεία από επιστηµονικές µελέτες θέτουν κρίσιµα ερωτήµατα που είναι δύσκολο να απαντηθούν µε σιγουριά. Είναι η δράση των COX-2 αναστολέων προθροµβωτική; Mπορεί η χαµηλή δόση ασπιρίνης να ενισχύσει τον κίνδυνο θρόµβωσης; Μειώνει η χαµηλή δόση ασπιρίνης τη γαστρεντερική ασφάλεια των COX-2 αναστολέων; Θα πρέπει οι COX-2 αναστολείς να αποφεύγονται από ασθενείς µε στεφανιαία νόσο; Θα πρέπει αυτοί να αποφεύγονται από ασθενείς µε παράγοντες υψηλού κινδύνου για στεφανιαία νόσο; Έχουν αυτά τα παράγωγα επιθυµητή δράση στην αθηροσκλήρωση εξαιτίας των αντιφλεγµονωδών ενεργειών τους; Είναι δυνατόν να παραχθεί ένα παράγωγο που θα αναστέλλει την COX-2 στις περιοχές φλεγµονής, χωρίς να επηρεάζει την αγγειακή COX-2 και την παραγωγή προστακυκλίνης PGI 2 ; Τα µέχρι τώρα διαθέσιµα στοιχεία έχουν προκαλέσει ανησυχία σχετικά µε τον ρυθµό αύξησης των καρδιαγγειακών επεισοδίων µε τους COX-2 αναστολείς. Γι αυτό και οι κλινικοί ιατροί συνταγογραφούν τη νέα αυτή δηµοφιλή οµάδα φαρµάκων µε προσοχή σε ασθενείς µε στεφανιαία νόσο ή µε άλλους παράγοντες κινδύνου για αθηροσκλήρωση. Γι αυτόν τον λόγο, τα στοιχεία αυτά καθώς και οι αντικρουόµενες απόψεις έδωσαν αφορµή για περαιτέρω ενασχόληση και αποτέλεσαν ισχυρό κίνητρο ώστε να δοθεί η ιδέα για το αντικείµενο έρευνας αυτής της διατριβής και να πραγµατοποιηθεί αυτή η πειραµατική µελέτη. 57

58 6. ΡΟΦΕΚΟΞΙΜΠΗ (COX-2 ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ) Η ροφεκοξίµπη (εικόνα 9) είναι ένας εκλεκτικός COX-2 αναστολέας µε αποτελεσµατικότητα εφάµιλλη των υψηλών δόσεων ΜΣΑΦ, χωρίς όµως τις ανεπιθύµητες ενέργειες από το γαστρεντερικό ή την επίδραση στη συγκόλληση των αιµοπεταλίων που παρουσιάζουν τα ΜΣΑΦ. Περιγράφεται χηµικά ως 4-[4-(µεθυλσουλφονυλ)φενυλ]-3-φενυλ- 2(5)-φουρανόνη (Chan, 1999) [86]. Η ροφεκοξίµπη είναι µια λευκή εως ελαφρά κίτρινη σκόνη. Είναι ισχυρά διαλυτή στην ακετόνη, ελαφρά διαλυτή στη µεθανόλη και το ισοπροπυλικό οξύ, πολύ ελαφρά διαλυτή στην αιθανόλη και πρακτικά αδιάλυτη στην οκτανόλη και αδιάλυτη στο νερό. Ο εµπειρικός της τύπος είναι C 17 H 14 O 4 S και το µοριακό της βάρος είναι 314,36. Τον Σεπτέµβριο του 2004, η ροφεκοξίµπη αποσύρθηκε από την αγορά από την ίδια την εταιρία. Η κίνηση αυτή της απόσυρσης βασίστηκε στη µελέτη APPROVe που δηµοσιεύθηκε το Πρόκειται για µια διπλή- τυφλή, τυχαιοποιηµένη, πολυκεντρική µελέτη, η οποία περιελάµβανε 2586 ασθενείς, από τους οποίους 1287 πήραν ροφεκοξίµπη 25mg (τη µέση συνιστώµενη δόση) και 1299 πήραν placebo. Η µελέτη αυτή ήθελε να αποδείξει ότι µετά από 3 χρόνια συνεχούς χορήγησης ροφεκοξίµπης σε ασθενείς µε γνωστό ιστορικό αδενωµατωδών πολυπόδων, η ροφεκοξίµπη θα δρούσε προφυλακτικά ώστε να µην µετατραπούν σε νεοπλασµατικούς (όπως είπαµε και στις δράσεις του φαρµάκου). Η µελέτη σταµάτησε στους 36 µήνες πριν καν ολοκληρωθεί γιατί διαπιστώθηκε ότι µετά από 18 µήνες εµφανίσθηκαν επιβεβαιωµένα καρδιαγγειακά θροµβοεµβολικά επεισόδια, ΑΕΕ στους 46 απ αυτούς που πήραν ροφεκοξίµπη, έναντι 26 της placebo οµάδας. Ο σχετικός κίνδυνος ήταν 1,92 (διπλάσιος) έναντι της placebo [226]. 6.1 Φαρµακοκινητική Απορρόφηση: Η ροφεκοξίµπη χορηγείται από το στόµα µε τη µορφή δισκίου ή πόσιµου εναιωρήµατος. Απορροφάται καλά στις θεραπευτικά συνιστώµενες δόσεις των 12,5, 25 και 50mg άπαξ ηµερησίως. Η µέση βιοδιαθεσιµότητά της είναι περίπου 93% [117]. Μετά από επαναλαµβανόµενη, άπαξ καθηµερινή χορήγηση της ροφεκοξίµπης των 25 mg εως την επίτευξη σταθερών συγκεντρώσεων, η µέση µέγιστη συγκέντρωση στο πλάσµα (Cmax) των 0,305 µg/ml επιτεύχθηκε περίπου 2 ώρες (Τmax) µετά τη χορήγησή του σε νηστικούς ενήλικες. Η µέση τιµή για την περιοχή κάτω από την καµπύλη χρόνουσυγκέντρωσης κατά τη διάρκεια των 24 ωρών (ΑUCo-24hr) ήταν 3,87µg 58

59 hr/ml µετά την επίτευξη των σταθερών επιπέδων. Τα δισκία και το πόσιµο εναιώρηµα είναι βιοϊσοδύναµα. Η χορήγηση ενός συνήθους γεύµατος δεν επηρεάζει κλινικά σηµαντικά την έκταση ή το ρυθµό απορρόφησης. Η φαρµακοκινητική της ροφεκοξίµπης είναι παρόµοια όταν χορηγείται µόνη της ή µε υδροξείδια του µαγνησίου/αργιλίου, αντιόξινα ανθρακικού ασβεστίου (περίπου 50mEq ικανότητα εξουδετέρωσης οξέος). Κατανοµή: Η ροφεκοξίµπη δεσµεύεται κατά 85% περίπου µε τις πρωτεΐνες του πλάσµατος στο εύρος των συγκεντρώσεων του από 0,05-25µg/ml. Ο όγκος κατανοµής µετά την επίτευξη σταθερών επιπέδων (Vds) είναι περίπου 100ml στους ανθρώπους. Η ροφεκοξίµπη διαπερνά τον πλακούντα σε ποντίκια και αρουραίους και το φραγµό αίµατοςεγκεφάλου στα ποντίκια [118]. Μεταβολισµός: Η ροφεκοξίµπη µεταβολίζεται κυρίως µέσω της ηπατικής οδού. Η κύρια µεταβολική οδός είναι η αναστολή της παραγωγής Cis και Trans-rofecoxib (ως υδροξυοξέα). Τα ένζυµα του κυτοχρώµατος P450 (CYP) δεν αποτελούν τις κύριες µεταβολικές οδούς. Συγχορήγηση της ροφεκοξίµπης µε ριφαµπικίνη, ενός ισχυρού αναστολέα των CYP ενζύµων, προκάλεσε περίπου 50% µείωση της συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης στο πλάσµα. Τα ένζυµα του κυτοχρώµατος P450 (CYP) δεν αποτελούν τις κύριες µεταβολικές οδούς για την ροφεκοξίµπη. Έξι µεταβολίτες έχουν αναγνωρισθεί στους ανθρώπους. Οι κύριοι µεταβολίτες είναι cis- και trans- (ως υδροξυοξέα) και ένας 5-υδροξυγλυκουρονικός µεταβολίτης. Οι µεταβολίτες αυτοί δεν επιδεικνύουν µετρήσιµη δραστικότητα ως αναστολείς της κυκλοοξυγενάσης [118]. Αποµάκρυνση: Μετά από χορήγηση 125mg ραδιοσεσηµασµένου από του στόµατος χορηγηµένης ροφεκοξίµπης σε υγιή άτοµα, 72% αυτού ανιχνεύθηκε στα ούρα και 14% στα κόπρανα. Η αποµάκρυνση της ροφεκοξίµπης συµβαίνει σχεδόν αποκλειστικά µέσω της νεφρικής απέκκρισης. Σταθερά επίπεδα του φαρµάκου επιτυγχάνονται εντός 4 ηµερών συνεχούς χορήγησης ενός δισκίου 25mg ηµερησίως, µε ρυθµό συσσώρευσης περίπου 1,7, το οποίο αντιστοιχεί σε µια συσσωρευµένη ηµιπερίοδο ζωής 17 ωρών, γεγονός που βρίσκεται σε άµεση συµφωνία µε την πραγµατικά µια φορά την ηµέρα χορήγησή του. Η κάθαρση από το πλάσµα υπολογίζεται περίπου 120 ml/min για τη δόση των 25mg [118]. Aλληλεπιδράσεις µε άλλα φάρµακα: To κυτόχρωµα P450 (CYP) δεν αποτελεί την κύρια µεταβολική οδό για τη ροφεκοξίµπη. εν έχουν παρατηρηθεί αλληλεπιδράσεις µε κορτικοστεροειδή, από του στόµατος αντισυλληπτικά, διγοξίνη, σιµετιδίνη, αντιόξινα, ασπιρίνη και κετοκοναζόλη. Συγχορήγηση ροφεκοξίµπης µε ριφαµπικίνη, έναν ισχυρό 59

60 επαγωγέα των CYP ενζύµων είχε ως αποτέλεσµα 50% περίπου µείωση των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης στο πλάσµα. Για τον λόγο αυτό, πρέπει να λαµβάνεται υπ όψιν όταν η ροφεκοξίµπη συγχορηγείται µε ισχυρούς επαγωγείς του ηπατικού µεταβολισµού. Σε άτοµα σε χρόνια θεραπεία µε βαρφαρίνη, η χορήγηση 25mg ροφεκοξίµπης ηµερησίως συνδέεται µε 8% περίπου αύξηση στο χρόνο προθροµβίνης. Για τον λόγο αυτό, σε ασθενείς που λαµβάνουν θεραπεία µε βαρφαρίνη πρέπει να παρακολουθείται συχνά ο χρόνος προθροµβίνης, όταν αυτή συνδυάζεται µε ροφεκοξίµπη. Στοιχεία από µελέτη αλληλεπίδρασης ροφεκοξίµπης µε τη βαρφαρίνη υποδεικνύουν ότι η ροφεκοξίµπη είναι δυνατό να προκαλέσει µέτρια αναστολή του CYP 1 A 2. Yψηλές δόσεις ροφεκοξίµπης (τρεις εως έξι φορές πάνω από τις δόσεις που συνιστώνται για οστεοαρθρίτιδα για 10 µέρες χορήγηση) είχαν ως αποτέλεσµα αύξηση της συγκέντρωσης της µεθοτρεξάτης στο πλάσµα κατά 23%, σε ασθενείς µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα που ελάµβαναν µεθοτρεξάτη 7,5-15% mg/εβδοµάδα. Σε ασθενείς µε ήπια εως µέτρια υπέρταση, χορήγηση ροφεκοξίµπης 25mg ηµερησίως µαζί µ έναν αναστολέα µετατρεπτικού ενζύµου (α-μεα) για τέσσερις εβδοµάδες, συνδέθηκε µε µικρή εξασθένηση του αντιϋπερτασικού αποτελέσµατος, (αύξηση της µέσης αρτηριακής πίεσης κατά 2,8mmHg) σε σύγκριση µε τον α-μεα µόνο του. Σε κλινικές µελέτες διάρκειας 12 εβδοµάδων, η ροφεκοξίµπη επέδειξε συχνότητα εµφάνισης ενδοσκοπικά επιβεβαιωµένων ελκών παρόµοια µε τον placebo και συνολική συχνότητα εµφάνισης διατρήσεων, ελκών και αιµορραγιών του ανωτέρου γαστρεντερικού στατιστικά σηµαντικά µικρότερη σε σχέση µε τα παραδοσιακά ΜΣΑΦ. Ασθενείς, µε ιστορικό διάτρησης, έλκους ή αιµορραγίας και ασθενείς >65 ετών βρίσκονται σε υψηλότερο κίνδυνο. Οι συνήθεις διαταραχές από το πεπτικό σύστηµα είναι ο οπισθοστερνικός καύσος, η δυσφορία από το επιγάστριο, η διάρροια, η ναυτία και η δυσπεψία. Λιγότερο συνήθεις η δυσκοιλιότητα, ο έµετος και η παλινδρόµηση γαστρικού υγρού. Σε µεµονωµένες περιπτώσεις έχει αναφερθεί ηπατοτοξικότητα, συµπεριλαµβανοµένης της ηπατίτιδας και του ικτέρου. Ιδιαίτερη προσοχή επιβάλλεται σε ασθενείς µε επιβαρυµένο καρδιαγγειακό ιστορικό διότι έχει παρατηρηθεί οίδηµα, κατακράτηση υγρών και υπέρταση. Αυτές οι επιδράσεις φαίνεται να είναι δοσοεξαρτώµενες και παρατηρούνται σε αυξηµένη συχνότητα κατά τη χρόνια χρήση της ροφεκοξίµπης και σε υψηλότερες θεραπευτικές δόσεις. Σε ασθενείς µε προηγούµενο ιστορικό καρδιακής ανεπάρκειας, δυσλειτουργία της αριστεράς κοιλίας, υπέρτασης ή µε προϋπάρχον οίδηµα χορηγείται αρχικά η χαµηλότερη δόση ροφεκοξίµπης. Η ροφεκοξίµπη δεν µπορεί να υποκαταστήσει την ασπιρίνη για καρδιαγγειακή προφύλαξη λόγω έλλειψης δράσής της στα αιµοπετάλια, 60

61 γι αυτό και δεν θα πρέπει να διακόπτονται οι αντιαιµοπεταλιακές θεραπείες και να χορηγείται µε την κατάλληλη ιατρική παρακολούθηση. Αντιδράσεις υπερευαισθησίας συµπεριλαµβανοµένου του αγγειοοιδήµατος, κνίδωση και αναφυλακτικές αντιδράσεις δεν είναι συνήθεις. Αναφέρεται ακόµη κεφαλαλγία και πολύ σπάνια διαταραχές από το αναπνευστικό σύστηµα. Από το πεπτικό σύστηµα µπορεί να προκληθούν δυσκοιλιότητα, στοµατικές εξελκώσεις, έµετος, αέρια από το πεπτικό, παλινδρόµηση οξέος. Γενικά υπάρχει περίπτωση να προκαλέσει εµβοές, αδυναµία και εύκολη κόπωση. Το νευρικό σύστηµα µπορεί να επηρεαστεί από αϋπνία, υπνηλία, ίλιγγο καθώς και ψυχιατρικές διαταραχές όπως κατάθλιψη και µείωση πνευµατικής οξύτητας. 61

62 7. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) 7.1 Εισαγωγή Το τοξικολογικό µέρος της διατριβής περιλαµβάνει την ανίχνευση και τη µέτρηση των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης στον ορό αίµατος των επίµυων, στους οποίους έγινε η υποδόρια χορήγηση της ουσίας για καθορισµένο χρονικό διάστηµα. Η τεχνική που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή για την ανίχνευση των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων, µε κύριο εκπρόσωπο τους τη ροφεκοξίµπη, στον ορό αίµατος επίµυων, αναλύεται παρακάτω. Για πρώτη φορά αναπτύχθηκε µέθοδος προσδιορισµού της ροφεκοξίµπης µε την τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης (High Pressure Liquid Chromatography ή High Performance Liquid Chromatography-HPLC) και προσδιορίστηκαν µε ακρίβεια οι συνθήκες ανάλυσης των βιολογικών δειγµάτων. Μετά από πολλές δοκιµές, προσδιορίστηκαν οι κατάλληλες συνθήκες ανίχνευσης του φαρµάκου και αναπτύχθηκε µια απλή, προσιτή, οικονοµική όσον αφορά το κόστος των υλικών και εύκολα επαναλήψιµη τεχνική. Η προτεινόµενη τεχνική της HPLC βρίσκεται πιο κοντά στο βιολογικό πείραµα και παρουσιάζει µεγαλύτερη ευαισθησία σε σύγκριση µε τις άλλες διαθέσιµες χρωµατογραφικές τεχνικές, οι οποίες δοκιµάστηκαν και τελικά απορρίφθηκαν. Η ροφεκοξίµπη ανιχνεύθηκε τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά στα διαθέσιµα βιολογικά δείγµατα. 7.2 Τυπική διάταξη της HPLC Η υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης ή υψηλής απόδοσης είναι µία τεχνική που αναπτύχθηκε στη δεκαετία του 1960, βελτιώθηκε στη δεκαετία του 1970, τελειοποιήθηκε και χρησιµοποιήθηκε ευρέως στις 2 τελευταίες δεκαετίες και είναι σήµερα ίσως η καλύτερη τεχνική για το διαχωρισµό µίγµατος ενώσεων. Η τεχνική HPLC χρησιµοποιήθηκε και στην παρούσα διατριβή για την ανίχνευση της ροφεκοξίµπης στον ορό επίµυων. Πρόκειται για την εξέλιξη της χρωµατογραφίας στήλης, στην οποία εφαρµόζονται υψηλές πιέσεις. Η εξέλιξη της τεχνικής ήταν άµεσα συνδεδεµένη µε την εξέλιξη της τεχνολογίας (οργανολογίας και ηλεκτρονικών υπολογιστών). Η εφαρµογή της HPLC στη χηµική ανάλυση ξεκίνησε από τους Horvath, Kirkland, Huber, Hulsman κ.α. το Όπως όλες οι χρωµατογραφικές τεχνικές λειτουργεί διαχωρίζοντας τις διάφορες 62

63 χηµικές ουσίες που βρίσκονται υπό µορφή µίγµατος. Αυτό που ξεχωρίζει την HPLC από τις άλλες µεθόδους είναι ότι επιτυγχάνει το αποτέλεσµα αυτό µε µεγάλη ταχύτητα, ευαισθησία και ακρίβεια [119]. Η τυπική διάταξη της HPLC αποτελείται από τα επιµέρους τµήµατα (εικόνα 10): Α) Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών έκλουσης Β) Αντλία υψηλής πίεσης Γ) Σύστηµα εισαγωγής δείγµατος ) Χρωµατογραφική στήλη-προστήλη Ε) Σύστηµα ανίχνευσης των διαχωριζόµενων ουσιών Στ) Καταγραφέα του σήµατος του ανιχνευτή ΕΙΚΟΝΑ 10: ιάγραµµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης, ισοκρατικής έκλουσης. Α=διαλύτης, Β=αντλία, C=βαλβίδα εισαγωγής δείγµατος, D=προστήλη, Ε=αναλυτική στήλη, F=ανιχνευτής, G=καταγραφέας. 7.3 Αρχές της HPLC Η βασική αρχή στην οποία στηρίζεται η αναλυτική διαδικασία είναι ότι, όπως οι διάφορες ουσίες µπορούν να διαλύονται στα διάφορα υγρά έτσι µπορούν να απορροφούνται ή να αντιδρούν µε την επιφάνεια των στερεών. Για την εφαρµογή αυτής της αρχής το όλο σύστηµα αποτελείται από δύο µέρη: 1) την κινητή φάση, που είναι το υγρό διάλυµα (liquid chromatography) κατ αντίθεση µε την αέριο χρωµατογραφία (gas chromatography) και 2) τη στατική φάση, που αποτελείται από τα διάφορα συστατικά της στήλης (column chromatography). Αυτές οι δυο φάσεις είναι τα απαραίτητα στοιχεία της αναλυτικής διαδικασίας υποστηριζόµενη από µία σειρά οργάνων. Το διάλυµα της κινητής φάσης ποικίλλει ανάλογα µε το είδος των ουσιών που θέλουµε να προσδιορίσουµε. Τα περισσότερα 63

64 χρησιµοποιούµενα διαλύµατα αποτελούνται από νερό και ακετονιτρίλιο ή νερό και µεθανόλη σε διάφορες αναλογίες. Το διάλυµα βρίσκεται σε µία συνεχή ροή µε τη βοήθεια µιας αντλίας, η οποία εξασφαλίζει τη συνεχή ροή αλλά και τη σταθερή πίεση µέσα στο σύστηµα. Οι πιέσεις που αναπτύσσονται στο σύστηµα είναι πολύ υψηλές ανερχόµενες µέχρι 6000psi. Μ αυτές τις πιέσεις επιτυγχάνεται η δίοδος του διαλύµατος µέσα από τη στερεά φάση στη στήλη που αποτελεί και τη βάση του συστήµατος. Η στήλη µήκους 10-30cm και διαµέτρου 5-7mm αποτελείται από ένα µεταλλικό περίβληµα και στο εσωτερικό της περιέχει υπό συµπίεση στερεά σωµατίδια διαφόρου φύσεως, στα οποία αλληλεπιδρούν οι διάφορες υπό εξέταση ουσίες. Τα σωµατίδια καταλαµβάνουν το 60% του χώρου και από το υπόλοιπο διέρχεται η υγρά φάση [120]. Ανάλογα µε τις ανάγκες της ανάλυσης µπορούν να χρησιµοποιηθούν διάφορες αναλυτικές στήλες, ανιχνευτές, συστήµατα διαλυτών έκλουσης, συνθήκες λειτουργίας των συσκευών δίνοντας έτσι στην τεχνική πολύ µεγάλη δυνατότητα εφαρµογής και ευελιξία στη χηµική ανάλυση. Οι κυριότερες εφαρµογές είναι η ανάλυση περιβαλλοντικών δειγµάτων, ουσιών µε βιολογική αξία, φαρµακευτικών σκευασµάτων, τροφίµων, πολυµερών. Στην χρωµατογραφία κανονικής ή αντίστροφης φάσης εξετάζονται ουσίες τόσο υδατοδιαλυτές όσο και λιποδιαλυτές και ο διαχωρισµός τους στηρίζεται στην υδρόφιλη ή υδρόφοβη ιδιότητά τους. Υπάρχουν διάφορα είδη χρωµατογραφίας, ανεξάρτητα όµως από το είδος της το τελικό αποτέλεσµα είναι ότι µετά τη διέλευση του µίγµατος από τη στήλη, επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός του που επιτρέπει την αναγνώριση και τον ποσοτικό προσδιορισµό των ουσιών. Για τον σκοπό αυτό, οι διαχωρισθείσες πλέον ουσίες διέρχονται µέσω της κινητής φάσης στον ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας, όπου και γίνεται η αναγνώρισή τους σ ένα ορισµένο µήκος κύµατος. Η κάθε ουσία καταγράφεται στα χρωµατογραφήµατα υπό µορφή αιχµής (peaks) από τα χαρακτηριστικά της οποίας, όπως ο χρόνος συγκράτησης (retention time), το ύψος της (peak height), το εµβαδόν της επιφάνειάς της και η σχέση της µε αιχµές γνωστής συγκέντρωσης ουσιών, προσδιορίζεται η ποσότητά της στα εξεταζόµενα βιολογικά υγρά. 7.4 Τεχνικές της HPLC Η υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης µπορεί να διακριθεί σε δυο είδη: Α)Χρωµατογραφία κανονικής φάσης (normal phase chromatography), όπου η στατική φάση είναι πολικότερη της κινητής. Η στατική φάση αποτελείται συνήθως από διοξείδιο του πυριτίου ή οξείδιο 64

65 του αργιλίου, ενώ η κινητή φάση από µη πολικούς οργανικούς διαλύτες (εξάνιο, χλωροφόρµιο κ.α). Ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται µε βάση τη διαφορά στην πολικότητα των µορίων των αναλυόµενων ενώσεων, εφόσον ο κυρίαρχος µηχανισµός είναι αυτός της χρωµατογραφίας προσρόφησης. Β)Χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης (reversed phase chromatography), όπου η στατική φάση είναι λιγότερο πολική της κινητής φάσης. Η στατική φάση αποτελείται συνήθως από silica, τα υδροξύλια της οποίας είναι δεσµευµένα µε διάφορες οµάδες όπως αλκύλια (δεκαοκτύλιο, οκτύλιο, φαινύλιο κ.α), ενώ η κινητή φάση αποτελείται από µίγµατα πολικών οργανικών διαλυτών (µεθανόλη, ακετονιτρίλιο κ.α) µε υδατικά διαλύµατα ή νερό. Στην περίπτωση ανάλυσης της ροφεκοξίµπης σε βιολογικά δείγµατα, επιλέχθηκε η χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης. Στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης, σηµαντικό ρόλο παίζουν και οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µορίων του διαλύτη και των αναλυόµενων ενώσεων, αλληλεπιδράσεις οι οποίες στη χρωµατογραφία κανονικής φάσης παίζουν δευτερεύοντα ρόλο. Το γεγονός αυτό δίνει στην τεχνική αυτή µεγαλύτερη δυνατότητα προσέγγισης και µεγαλύτερη ευελιξία, εφόσον οι παράγοντες που επηρεάζουν το διαχωρισµό είναι περισσότεροι. 7.5 Χρωµατογραφία της αντίστροφης φάσης Η χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης είναι η τεχνική της HPLC µε τις περισσότερες εφαρµογές και τη µεγαλύτερη δυνατότητα ανάπτυξης νέων µεθόδων και τεχνικών. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι είναι περισσότεροι οι παράγοντες που επηρεάζουν το διαχωρισµό. Η διαχωριστική ικανότητα εξαρτάται από τρεις παράγοντες, όπως φαίνεται και από την παρακάτω εξίσωση: συγκράτηση (Κ`) εκλεκτικότητα (α) και ικανότητα της στήλης (Ν). Οι τρεις αυτοί παράγοντες συνδέονται µε την ακόλουθη σχέση: Rs = ( ½ ) (α-1) / (α+1). N0,5 ( Kx' / Κx` ) Οι τρεις αυτοί θεµελιώδεις παράγοντες καθορίζονται από τους επιµέρους παράγοντες: α) Συγκράτηση (Κ ) - ελουοτροπική ισχύς, δηλαδή το ποσοστό (φ) του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση β) Εκλεκτικότητα (α) - φύση του οργανικού διαλύτη, - τιµή ph της κινητής φάσης, 65

66 - ελουοτροπική ισχύς, - συγκέντρωση προσθέτων στην κινητή φάση, - εκλεκτικότητα της στατικής φάσης, - θερµοκρασία γ) Ικανότητα της στήλης (Ν) - µήκος και διάµετρος της στήλης, - διαστάσεις των σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης - ταχύτητα ροής, - θερµοκρασία, - σύσταση της κινητής φάσης. Το ζητούµενο σ ένα χρωµατογραφικό διαχωρισµό είναι η αύξηση της Rs (διαχωριστικής ικανότητας) χωρίς όµως µεγάλη αύξηση του χρόνου ανάλυσης. Γενικά πρέπει η τιµή της Rs µεταξύ δυο διαδοχικών κορυφών να είναι µεγαλύτερη της µονάδας. Η βελτιστοποίηση του διαχωρισµού στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης HPLC ξεκινά από τη ρύθµιση του πρώτου από τους παράγοντες που επηρεάζουν την Rs, της συγκράτησης µεταξύ των ορίων 1< Κ <10 και επιτυγχάνεται µε µεταβολές στο (φ), στο ποσοστό δηλαδή του οργανικού διαλύτη. Το δεύτερο βήµα είναι η ρύθµιση της εκλεκτικότητας (α) που συνήθως γίνεται µε αλλαγές µεταξύ των κυρίων οργανικών διαλυτών MeOH, CAN, THF ή µε αλλαγές της θερµοκρασίας και της συγκέντρωσης των τυχόν προσθέτων της κινητής φάσης. Τέλος, η ικανότητα της στήλης ρυθµίζεται µε αλλαγές της ταχύτητας ροής ή της θερµοκρασίας και σπανιότερα µε αλλαγές της ίδιας της στήλης [121]. 7.6 Χαρακτηριστικά της στατικής φάσης Η επιλογή της αναλυτικής στήλης είναι ίσως από τους σηµαντικότερους παράγοντες για την ανάπτυξη µιας αναλυτικής µεθόδου. Τα χαρακτηριστικά της στήλης παίζουν πρωτεύοντα ρόλο στο διαχωρισµό αφού αυτά καθορίζουν και τις αλληλεπιδράσεις που θα εµφανισθούν. Οι παράµετροι που επηρεάζουν την επιλογή της στατικής φάσης είναι οι εξής: α) Το µέγεθος των µορίων του υλικού πλήρωσης και οι γεωµετρικές διαστάσεις της στήλης (µήκος, εσωτερική διάµετρος). β) Η φύση της οµάδας που είναι δεσµευµένη στο διοξείδιο του πυριτίου. Οι ιδιότητες της οµάδας αυτής (λιπόφιλο, δυνατότητα π-π δεσµών µε µόρια των αναλυόµενων ενώσεων, µήκος της 66

67 ανθρακικής αλυσίδας κ.α), καθορίζουν την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης. γ) Η διάµετρος των πόρων του υλικού πλήρωσης. δ) Ο τύπος του υποστρώµατος (οξείδιο του αργιλίου, διοξείδιο του πυριτίου, πολυµερές) και η µέθοδος παρασκευής του επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις των µορίων των αναλυόµενων ενώσεων µε το υπόστρωµα. ε) Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Αυτή µπορεί να αλλάξει δραµατικά τη συµπεριφορά της στήλης. Όσο µεγαλύτερο είναι το ποσοστό των σιλανολικών υδροξυλίων τόσο πιο πολική (όξινη) είναι η στήλη και τόσο µικρότερη είναι η συγκράτηση των µη πολικών ενώσεων [122]. στ) Η µέθοδος παρασκευής του υποστρώµατος. 7.7 Χαρακτηριστικά της κινητής φάσης Η σύσταση της κινητής φάσης είναι ένας πολύ σηµαντικός παράγοντας για τον επιτυχή διαχωρισµό και επιπλέον είναι ο παράγοντας που µεταβάλλεται ευκολότερα δίνοντας έτσι στην τεχνική µεγάλη ευελιξία. Στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης, η κινητή φάση είναι συνήθως µίγµατα υδατικών διαλυµάτων µε πολικούς οργανικούς διαλύτες. Η βελτιστοποίηση της σύστασης της κινητής φάσης είναι από τους πιο αποφασιστικούς παράγοντες της ανάλυσης και συνήθως είναι µια χρονοβόρος και επίπονη διαδικασία. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί προγράµµατα βελτιστοποίησης των συνθηκών, τα οποία µέσω του ηλεκτρονικού υπολογιστή µπορούν να προτείνουν το βέλτιστο σύστηµα ανάλυσης, έχοντας ως δεδοµένα τα αποτελέσµατα λίγων µόνο αναλύσεων. Η εύρεση της καλύτερης κινητής φάσης βασίζεται σε ορισµένες ιδιότητες των διαλυτών που την απαρτίζουν και οι οποίες είναι: α) Πολικότητα. Όσο µεγαλύτερη είναι η πολικότητα ενός διαλύτη τόσο πιο γρήγορα θα εκλούονται οι πολικές ενώσεις και πιο αργά οι µη πολικές ενώσεις. β) Βασικότητα, δυνατότητα διπολικών αλληλοεπιδράσεων που υπεισέρχονται στην εκλεκτικότητα του κάθε διαλύτη. γ) Ιξώδες. Η πίεση που πρέπει να εφαρµοσθεί για τη διαβίβαση ενός διαλύτη διαµέσου µιας στήλης είναι ανάλογη του ιξώδους αυτού. δ) Ελουοτροπική ισχύς του κάθε διαλύτη. ε) Τοξικότητα και άλλοι κίνδυνοι, όπου βέβαια η γενική αρχή είναι να αποφεύγονται κατά το δυνατόν οι διαλύτες που έχουν τέτοιες ιδιότητες. 67

68 στ) Τιµή, παράγοντας αναπόφευκτος που κάποτε γίνεται και καθοριστικός (σε αναλύσεις ρουτίνας). ζ) Συµβατότητα µε τον ανιχνευτή, παράγοντας που συχνά παραβλέπεται και δηµιουργεί µεγάλα προβλήµατα, για παράδειγµα µε ανίχνευση στο υπεριώδες υπάρχουν τα κατώτερα όρια για τη χρήση οργανικών [123,124]. Η εκλεκτικότητα της κινητής φάσης και η ελουοτροπική ισχύς της είναι τα δύο σπουδαιότερα χαρακτηριστικά της. Η µεταβολή της εκλεκτικότητας συνήθως επιτυγχάνεται µε αλλαγή του οργανικού διαλύτη, µε αλλαγή της συγκέντρωσης των αλάτων της κινητής φάσης ή τέλος µε αλλαγή του ποσοστού συµµετοχής του στην κινητή φάση. Σηµαντικό βοήθηµα για τη µελέτη της εκλεκτικότητας των διαλυτών είναι το τρίγωνο της εκλεκτικότητας (selectivity triangle) που δόθηκε από τον Snyder. Σύµφωνα µε τον ηµιεµπειρικό αυτό τρόπο ταξινόµησης, κάθε διαλύτης κατατάσσεται σε 8 οµάδες ανάλογα µε τις ιδιότητες, ως δότης ή δέκτης ηλεκτρονίων, την πολικότητα του και τη δυνατότητα ανάπτυξης διπολικών δυνάµεων. Με τον τρόπο αυτό, είναι εύκολα κατανοητό ότι οι αλλαγές από διαλύτη για µεταβολή της εκλεκτικότητας πρέπει να γίνονται µε αλλαγή από οµάδα σε οµάδα διαλυτών και όχι µε αλλαγή διαλυτών της ίδιας οµάδας. Για παράδειγµα αν η MeOH (που ανήκει στην οµάδα ΙΙ) δεν δίνει ικανοποιητικό διαχωρισµό η αλλαγή προς βουτανόλη (οµάδα ΙΙ επίσης) δε θα µεταβάλει την εκλεκτικότητα τόσο όσο η αλλαγή προς CAN (οµάδα Vlb) ή η αλλαγή THF (οµάδα ΙΙΙ) [124,125,126]. 7.8 Βελτιστοποίηση της Ανίχνευσης στην HPLC Οι ανιχνευτές χρησιµοποιούνται για το συνεχή έλεγχο του υγρού που βγαίνει από τη στήλη. Ένα από τα προβλήµατα της HPLC είναι η έλλειψη ενός ανιχνευτή, ο οποίος να έχει όλα τα χαρακτηριστικά που καθορίστηκαν ως τα χαρακτηριστικά του ιδανικού ανιχνευτή και τα οποία είναι : α) Η υψηλή ευαισθησία και η µεγάλη γραµµική περιοχή ανταπόκρισης. β) Η δυνατότητα ανίχνευσης όλων των ενώσεων ή η γνωστή εκλεκτικότητα. γ) Η ανεξαρτησία σε µεταβολές της θερµοκρασίας και της ροής. δ) Η ανεξαρτησία σε µεταβολές της σύστασης της κινητής φάσης. ε) Η σωστή σχεδίαση ώστε να µη συνεισφέρει στη διεύρυνση των κορυφών. στ) Η αξιοπιστία και η ευκολία στη χρήση. ζ) Η παροχή στοιχείων για την ταυτοποίηση των αναλυόµενων ενώσεων. 68

69 η) Η µη καταστροφή του αναλυόµενου δείγµατος. θ) Χαµηλό επίπεδο θορύβου. Τα χαρακτηριστικά και οι δυνατότητες των ανιχνευτών της HPLC συνοψίζονται στον πίνακα 9 [126]. ΠΙΝΑΚΑΣ 9: Χαρακτηριστικά των κύριων ανιχνευτών της HPLC. Οι πιο συνηθισµένοι ανιχνευτές στην υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης είναι οι ακόλουθοι: Aνιχνευτές υπεριώδους-ορατού Ανιχνευτές παράταξης φωτοδιόδων Φθορισµοµετρικοί ανιχνευτές Ηλεκτροχηµικοί ανιχνευτές Αγωγιµοµετρικοί ανιχνευτές Φασµατογράφοι µάζας Ο ανιχνευτής µε τη µεγαλύτερη χρήση είναι σαφώς το φασµατοφωτόµετρο ορατού-υπεριώδους. Η απορρόφηση ακτινοβολίας από µία χηµική ένωση εξαρτάται από το µήκος κύµατος της ακτινοβολίας και τις οµάδες της χηµικής ένωσης. Το ηλεκτροµαγνητικό πεδίο ανάλογα µε την ενέργεια του αλληλεπιδρά µε ηλεκτρόνια και προκαλεί τη διέγερση και µεταφορά τους σε υψηλότερα ενεργειακά επίπεδα ή ακόµη προκαλεί δόνηση ή περιστροφή µοριακών δεσµών ορισµένων οµάδων της ένωσης. Τα προβλήµατα της ανίχνευσης στο υπεριώδες είναι: α) Το γεγονός ότι τα φάσµατα στο υπεριώδες δεν έχουν κορυφές και εποµένως δίνουν περιορισµένες πληροφορίες. β) Το γεγονός ότι τα φάσµατα στο υπεριώδες µεταβάλλονται µε τις αλλαγές της κινητής φάσης. γ) Το γεγονός ότι το φάσµα της αναλυόµενης ένωσης συχνά υπερκαλύπτεται ή αλληλοκαλύπτεται µε το φάσµα των παρεµποδίζουσων ουσιών. Η ανίχνευση πραγµατοποιείται συνήθως στο µέγιστο της απορρόφησης µιας ενώσεως, ώστε να επιτευχθεί η µέγιστη ευαισθησία και ο µέγιστος λόγος του σήµατος της ένωσης προς το σήµα θορύβου. Για την ανάλυση οργανικών ενώσεων η µέγιστη ευαισθησία 69

70 παρατηρείται στις χαµηλές περιοχές του υπεριώδους ( nm). Σ αυτές τις περιοχές παρατηρείται και το µέγιστο της απορρόφησης των οργανικών διαλυτών αλλά και γενικά της πλειοψηφίας των οργανικών ενώσεων µε αποτέλεσµα τη δραστική µείωση της εκλεκτικότητας και την αύξηση του σήµατος θορύβου. 7.9 Πλεονεκτήµατα-µειονεκτήµατα της HPLC. Κλινικές εφαρµογές Η HPLC (υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης), όταν χρησιµοποιείται σαν µέθοδος ρουτίνας στην καθηµερινή πράξη, παρουσιάζει πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα. Στα πλεονεκτήµατα περιλαµβάνεται η ευαισθησία, η ακρίβεια και η µεγάλη ικανότητα διάκρισης µορίων που βρίσκονται σε µίγµατα όπως συνδυασµός αµινοξέων, στεροειδών ή προϊόντων µεταβολισµού. Στα µειονεκτήµατα περιλαµβάνεται ο µακρός χρόνος προετοιµασίας, οι παρεµβολές από ακάθαρτες προσµίξεις και το σχετικά υψηλό κόστος της µεθόδου. Η χρησιµότητά της στην κλινική πράξη αφορά την ικανότητά της να ανιχνεύει στα διάφορα βιολογικά υγρά ποιοτικά και ποσοτικά, ουσίες που σχετίζονται µε τη διάγνωση και µελέτη µεταβολικών νόσων όπως π.χ ο προσδιορισµός της βιταµίνης D και των µεταβολιτών της. Επίσης, η ικανότητά της να διαχωρίζει αµινοξέα και ορµόνες βοηθά στην ακριβή διάγνωση νόσων, όπως οι αιµοσφαιρινοπάθειες, ο σακχαρώδης διαβήτης, η αρτηριακή υπέρταση και το φαιοχρωµοκύτωµα [120]. Μια άλλη σπουδαία εφαρµογή είναι ο έλεγχος της φαρµακευτικής αγωγής (Therapeutic Monitoring) που επιτυγχάνεται µε τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του φαρµάκου στο αίµα, τα υγρά και τους ιστούς του σώµατος. Αυτό είναι κλινικά επιβεβληµένο κατά τη χορήγηση φαρµάκων που είναι τοξικά σε µεγάλες δόσεις ή η δοσολογία τους µπορεί να είναι υποθεραπευτική (αντιεπιληπτικά, αντιαρρυθµικά, χηµειοθεραπευτικά) ή κατά τη χορήγηση φαρµάκων σε ασθενείς µε νεφρική ή ηπατική ανεπάρκεια. Τέλος, η ικανότητά της να ελέγχει διάφορα φάρµακα και τους µεταβολίτες τους ταυτόχρονα, την καθιστά µέθοδο εκλογής για τον έλεγχο της θεραπευτικής αγωγής µε αντιβιοτικά όπως επίσης και για τη φαρµακοκινητική αξιολόγηση νέων φαρµάκων, η οποία βασίζεται στη συγκέντρωση τους στο αίµα, τα ούρα ή άλλα βιολογικά υγρά. Τα πλεονεκτήµατα της τεχνικής απέναντι στις άλλες χρωµατογραφικές τεχνικές πηγάζουν κυρίως από τη συµβατότητα και την ευελιξία της και είναι: α) Ο διαχωρισµός µιγµάτων σε µικρό χρόνο. 70

71 β) Η δυνατότητα ανάλυσης πολικών ή ασταθών σε υψηλές θερµοκρασίες ενώσεων, χωρίς την ανάγκη παρασκευής παραγώγων που υπάρχει στην αέριο χρωµατογραφία. γ) Η δυνατότητα εφαρµογής της σε ανάλυση ιχνοστοιχείων. δ) Η δυνατότητα ανάλυσης µεγάλης ποικιλίας ενώσεων (οργανικές ή ανόργανες), µε µεγάλο εύρος µοριακού βάρους. ε) Οι πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν την ανάλυση και οι οποίοι δίνουν στον αναλυτή πολλές δυνατότητες προσέγγισης του βέλτιστου στο διαχωρισµό και τον προσδιορισµό περίπλοκων µιγµάτων. Όλοι αυτοί οι λόγοι έχουν τοποθετήσει την ΗPLC (υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης) στην πρώτη θέση τόσο για τις αναλύσεις ρουτίνας όσο και για την έρευνα [127,128]. 71

72 8. ΑΘΗΡΟΣΚΛΗΡΩΣΗ 8.1 Εισαγωγή Στην ενότητα αυτή περιγράφεται η επίδραση των βιοχηµικών παραµέτρων που πιστοποιούν τις ανεπιθύµητες δράσεις στο καρδιαγγειακό σύστηµα των επίµυων και ο σηµαντικός ρόλος που διαδραµατίζουν αυτοί στην αθηροσκλήρωση και στον στεφανιαίο κίνδυνο. Οι κλασικοί αυτοί βιοχηµικοί δείκτες της καρδιαγγειακής και µεταβολικής λειτουργίας παρέχουν ένα ικανοποιητικό «παράθυρο διάγνωσης», εξαιρετική ειδικότητα και ευαισθησία για τον εντοπισµό αυξηµένου καρδιαγγειακού κινδύνου, στις περιπτώσεις που οι τιµές αυτών των βιοχηµικών δεικτών είναι παθολογικές. Για να αποδειχθεί αυτή η σχέση της αύξησης των συγκεντρώσεων των βιοχηµικών δεικτών και της αθηροσκλήρωσης µετρήθηκαν και προσδιορίστηκαν οι τιµές της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, των τρανσαµινασών SGOT/SGPT, της CPK, της CRP και της τροπονίνης. 8.2 Αθηρωµάτωση Με τον όρο αρτηριοσκλήρυνση ή αρτηριοσκλήρωση εννοούµε την αλλοίωση του τοιχώµατος των αρτηριών κατά την οποία έχουµε µεταβολή της φυσιολογικής υφής αυτών, µε αποτέλεσµα την απώλεια της ελαστικότητας του τοιχώµατος και τη στένωση ή απόφραξη του αυλού στις αρτηρίες µυϊκού τύπου ή τη διάταση του αυλού στις αρτηρίες ελαστικού τύπου [129,130] (Robinson). ιακρίνουµε 3 µορφές αρτηριοσκλήρυνσης: 1)αθηρωµάτωση 2)ασβέστωση και 3)αρτηριδιοσκλήρυνση (υαλοειδής και υπερπλαστική). Η αθηροσκλήρυνση είναι η µορφή της αρτηριοσκλήρυνσης που αφορά τον έσω χιτώνα. Τα χαρακτηριστικά της αθηρωµατώσεως είναι η πάχυνση του έσω χιτώνα των αρτηριών, λόγω συσσωρεύσεως λιπιδίων και κυρίως κατά εστίες ή µεγάλες περιοχές. Οι βλάβες του έσω χιτώνα ποικίλλουν από µικρές και ελαφρώς υπεγειρόµενες επιµήκεις ραβδώσεις (λιπώδεις ραβδώσεις) ως τον σχηµατισµό εστιών υπό µορφή οζιδίων ή πλακών ή και ακόµη ως τον σχηµατισµό προχωρηµένων βλαβών µε εξελκώσεις, θροµβώσεις, αιµορραγίες και εναποθέσεις αλάτων ασβεστίου Ca (επιπεπλεγµένες αλλοιώσεις) [131]. 72

73 Η αθηρωµάτωση αφορά κυρίως τις αρτηρίες µεγάλου και µέσου εύρους όπως την αορτή, την ανιούσα αορτή, το αορτικό τόξο, την κατιούσα, την κοιλιακή και τις δύο λαγόνιους. Επίσης τις σπλαγχνικές (στεφανιαίες, εγκεφάλου, νεφρικές κ.λ.π.) σπανίως τις µικρές αρτηρίες και καθόλου τα αρτηρίδια. Έτσι επεκτείνεται όχι πολύ πέραν του πρώτου κλάδου των εγκεφαλικών αρτηριών και των στεφανιαίων αρτηριών και όχι σε µεγάλη έκταση στις αρτηρίες των νεφρών. Τα στάδια εξελίξεως της είναι: 1)Λιπαρά γράµµωση ή ράβδωση, 2)Στάδιο αθηρώµατος, 3) Πλήρης αθηροσκλήρυνση. 8.3 Θροµβογενετική θεωρία Η αντίληψη του Von Rokitansky, έναν αιώνα πριν, ήταν ότι η αρχική αλλοίωση της αθηρωµατώσεως οφείλεται σε σχηµατισµό µικροσκοπικών θρόµβων στο τοίχωµα των αρτηριών επί του ενδοθηλίου. Κατά τον Virchow, το αθήρωµα οφείλεται σε φλεγµονώδεις και εκφυλιστικές αλλοιώσεις του έσω χιτώνα κατ αρχήν µε συσσώρευση λίπους επ αυτών. Η υπόθεση είχε ξεχαστεί ως το 1946, οπότε ο Duguid µελέτησε σειρά περιπτώσεων θροµβώσεων στεφανιαίων αρτηριών και βρήκε µετατροπές θρόµβων σε αθηρώµατα. [132]. Η θεωρία του συνοψίζεται στο ότι «πολλές κλασσικές περιπτώσεις αθηρωµατώσεως είναι αρτηριακοί θρόµβοι, οι οποίοι µε ορισµένες συνθήκες µετατρέπονται σε ινώδη πάχυνση» και πρόσθεσε ότι πολλά από τα «αθηρωµατικά» λιπαρά τµήµατα είναι επακόλουθο (αποτέλεσµα) µαλακυντικών εξεργασιών στον θρόµβο. Η θεωρία του Duguid J.B. επιβεβαιώθηκε αργότερα από πολλούς ερευνητές, καθώς και ο τρόπος µε τον οποίο µία ινώδης σκλήρυνση αρχίζει να εµφανίζεται ως πάχυνση του έσω χιτώνα. [133,134]. ιπλός µηχανισµός εµπλέκεται στην ανάπτυξη των αρχικών αλλοιώσεων (deposits). Oι επιπολής στιβάδες του έσω χιτώνα, που βρίσκονται πλησιέστερα στον αυλό, διελαύνονται από ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία συντηρούνται από οξυγόνο και θρεπτικό υλικό, από διάχυση του εντός του αυλού αίµατος και είναι υπεύθυνα για την οργάνωση σε ίνες του στρώµατος των κολλαγόνων ινών. Τα εν τω βάθει τµήµατα διελαύνονται από τριχοειδή και ινοβλάστες που επεκτείνονται στον έσω χιτώνα από τα vasa vasorum και η οργάνωση τους ακολουθεί κοινή πορεία. Οι δύο αυτές ζώνες (επιπολής και εν τω βάθει) µπορεί να αποτύχουν να συνενωθούν, αφήνοντας ένα τµήµα µη οργανωµένου ιστού πλούσιου σε λίπη, κειµένου στο βάθος του πυκνού έσω χιτώνα δίνοντας έτσι µία εντελώς δυσδιάκριτη εικόνα αθηροσκληρύνσης. Στις µελέτες αυτές οι ερευνητές βρέθηκαν στη δυσάρεστη θέση να αναφέρουν ότι παρόλο που υπάρχει ινώδης ανάπτυξη (υαλοείδωση) 73

74 στον έσω χιτώνα ποτέ δεν µπόρεσαν να την παρατηρήσουν σε πρώιµες καταστάσεις. Τώρα θεωρείται βέβαιο ότι η συσσώρευση των ινωδών στοιχείων είναι ένα σηµαντικό στοιχείο στη δηµιουργία της πλήρως ανεπτυγµένης αθηρωµατώδους βλάβης, αν και τα πρώιµα στάδια δεν µπορούν να ερµηνευτούν µε τον ίδιο τρόπο [135]. Χρησιµοποιώντας ένα σύµπλοκο fluoresein-antihuman [136] διευκολύνεται η αναγνώριση του ινωδογόνου απ τις λιπώδεις ραβδώσεις. Φαίνεται δε ότι ακόµα και στις πρώιµες βλάβες τα λιπίδια διερχόµενα µε το πλάσµα στον έσω χιτώνα συνοδεύονται από ινωδογόνο το οποίο παραµένει στο τοίχωµα του αγγείου. Η προέλευση του λίπους στις πλάκες του έσω χιτώνα αµφισβητείται. Η ορθόδοξη άποψη είναι ότι τα λιπαρά µόρια διαχέονται εντός του έσω χιτώνα απ το πλάσµα [137]. Πολλές άλλες απόψεις έχουν διατυπωθεί, αλλά το ενιαίο µέρος της θροµβογενούς θεωρίας είναι η λιπώδης εκφύλιση ή λιποειδοφανέρωση σε συνδυασµό µε την ύπαρξη θρόµβου [138]. 8.4 Η αγγειακή βιολογία της αθηροσκλήρωσης Κατά την έναρξη µιας αθηρογενετικής δίαιτας, πλούσιας δηλαδή σε χοληστερόλη και κορεσµένα λιπαρά, µικρά λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια συσσωρεύονται στον έσω χιτώνα [139]. Αυτά τα λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια φαίνεται να συνδέονται µε τις πρωτεογλυκάνες του αρτηριακού έσω χιτώνα και τείνουν να δηµιουργούν συσσωµατώµατα [140]. Τα λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια που είναι προσδεδεµένα στις πρωτεογλυκάνες έχουν αυξηµένη ευαισθησία στις οξειδωτικές ή άλλες χηµικές τροποποιήσεις (οξείδωση και µη ενζυµατική γλυκοζυλίωση), οι οποίες θεωρούνται από πολλούς ερευνητές ως ένα σηµαντικό συστατικό της παθογένεσης των αρχικών σταδίων της αθηροσκλήρωσης [141,142,143]. Το οξειδωτικό στρες, περιλαµβάνοντας προϊόντα που βρίσκονται στις τροποποιηµένες λιποπρωτεΐνες, µπορεί να προκαλέσει την τοπική παραγωγή κυτοκινών. Οι κυτοκίνες, στη συνέχεια, επάγουν την αυξηµένη έκφραση µορίων προσκόλλησης για τα λευκοκύτταρα προκαλώντας την πρόσδεση των λευκοκυττάρων καθώς και την έκφραση χηµειοτακτικών µορίων που κατευθύνουν τη µετανάστευσή τους στον έσω χιτώνα (εικόνα 11). 74

75 EIKONA 11: Σχηµατική αναπαράσταση της εξέλιξης της αθηρωµατικής πλάκας. Ωστόσο, αρκετά νωρίς µετά την έναρξη της υπερχοληστερολαιµίας, τα λευκοκύτταρα προσκολλώνται στο ενδοθήλιο και διαπηδούν ανάµεσα από τα πλευρικά τοιχώµατα σύνδεσης των ενδοθηλιακών κυττάρων, για να εισέλθουν στον έσω χιτώνα, όπου αρχίζουν να συγκεντρώνουν λιπίδια και να µετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Αυτοί που είναι υπεύθυνοι για την πρόσληψη των τροποποιηµένων λιποπρωτεϊνικών σωµατιδίων και προωθούν την ανάπτυξη των αφρωδών κυττάρων είναι οι υποδοχείς-καθαριστές. Τα µακροφάγα αφρώδη κύτταρα αποτελούν πηγή παραγόντων µεσολάβησης, όπως περαιτέρω κυτοκίνες και µόρια εκτελεστές όπως το υποχλωριώδες οξύ, το ανιόν του υπεροξειδίου και οι µεταλλοπρωτεάσες της θεµέλιας ουσίας. Τα λεία µυϊκά κύτταρα στον έσω χιτώνα προκαλούν τη διαίρεση άλλων λείων µυϊκών κυττάρων, που µεταναστεύουν στον έσω χιτώνα από το µέσο χιτώνα. Τα κύτταρα αυτά µπορούν στη συνέχεια να διαιρεθούν και να παράγουν εξωκυττάρια ουσία, προωθώντας την εξωκυτταρική συσσώρευση θεµέλιας ουσίας στην αναπτυσσόµενη αθηροσκληρωτική πλάκα. Μ αυτόν τον τρόπο, η λιποειδής γράµµωση µπορεί να εξελιχθεί σε ινολιπαρή αλλοίωση. Στα µεταγενέστερα στάδια, µπορεί να εµφανιστεί ασβεστοποίηση, ενώ η ίνωση συνεχίζεται συνοδευόµενη µερικές φορές από το θάνατο των λείων µυϊκών κυττάρων (προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση). Παράγεται έτσι µια σχετικά ακυτταρική ινώδη κάψα που περιβάλλει έναν πλούσιο σε λιπίδια πυρήνα, που µπορεί επίσης να περιέχει ετοιµοθάνατα ή νεκρά κύτταρα και τα υπολείµµατά τους. 75

76 8.5 Συµβάµατα (επιπλοκές) της αθηροσκλήρωσης H πιο συνήθης παθολογική δράση της αθηρωµάτωσης είναι: 1) H στένωση της αρτηρίας, στις αρτηρίες µυϊκού τύπου, µε αποτέλεσµα την εµφάνιση ισχαιµικών αλλοιώσεων της περιοχής αιµατώσεως αυτής. Η δράση αυτή είναι πιο συχνή στις στεφανιαίες αρτηρίες, στις εγκεφαλικές, στις νεφρικές και στους κλάδους τους. 2) Απόπτωση υπάρχοντος τοιχωµατικού θρόµβου ή τµήµατος αυτού στον αυλό της αρτηρίας. Η πιο δραµατική εκδήλωση είναι πλήρης απόφραξη της αρτηρίας µε ισχαιµικές εκδηλώσεις, που στην περίπτωση των στεφανιαίων και των εγκεφαλικών αρτηριών, µπορεί να έχει σαν αποτέλεσµα αιφνίδιο θάνατο. 3) Ρήξη της αρτηρίας (κυρίως στους µικρούς κλάδους των εγκεφαλικών αρτηριών) ή ο σχηµατισµός ανευρύσµατος (συχνότερα στην αορτή). 4) Εµβολή, λόγω αποσπάσεως συντρήµατος από ελκώδη πλάκα ή απόσπαση τοιχωµατικού θρόµβου. Ήταν αναγκαία η αφιέρωση αρκετού χώρου για την ανάλυση της αιτιολογίας και της παθογένειας της αθηροσκλήρυνσης, διότι αν και το πρόβληµα είναι σε τέτοιο στάδιο και έχει απασχολήσει πολλούς ερευνητές, εν τούτοις κανείς δεν µπορεί να είναι απόλυτος για το ποιος από τους παράγοντες έχει µεγαλύτερη σηµασία. Είναι κοινή αποδοχή πια ότι οι «λιπώδεις βλάβες» των αρτηριών έχουν σχέση µε τη διαταραχή του µεταβολισµού του λίπους, κυρίως του ζωϊκού. Επίσης, ο σχηµατισµός του τοιχωµατικού θρόµβου παίζει σηµαντικό ρόλο στη µετατροπή ενός σχετικά καλοήθους αθηρώµατος σε ολοκληρωµένη ανάπτυξη της νόσου, όπου έχουµε στένωση ή και απόφραξη της αρτηρίας, ενώ η υπερβολικά λιπαρή διατροφή αυξάνει και την πυκνότητα του αίµατος, η οποία θεωρείται σαν µία από τις αιτίες της ινώδους κρυσταλλώσεως του έσω χιτώνα (θροµβογενής θεωρία). Αυτή µπορεί να οφείλεται στην αύξηση της πηκτικότητας του αίµατος από τη µία και στη µείωση της ινωδολυτικής ικανότητας από την άλλη. Η άποψη αυτή συνδέεται και πάλι µε το λίπος στη διατροφή, διότι τα λιπαρά γεύµατα προκαλούν σηµαντική ελάττωση του χρόνου πήξεως. Η δράση αυτή φέρεται συνδεδεµένη µε το Εthanolamine-Phosphatide, που βρίσκεται τόσο στα ζωϊκά όσο και στα φυτικά λίπη. Για τη µελέτη της ινωδολυτικής δραστηριότητας του αίµατος (ή την ικανότητα διαλύσεως του ινωδογόνου), υπάρχουν πολλές τεχνικές δυσκολίες, τα αποτελέσµατα όµως είναι ενδιαφέροντα. Η δράση αυτή είναι αυξηµένη µε την φυσική άσκηση και µειωµένη µε τη λήψη λιπαρών γευµάτων. Χαµηλή ινωδολυτική δράση παρατηρείται σε άτοµα µε διαλείπουσα χωλότητα πιθανότατα συνδεδεµένη µε αθηροσκληρωτική απόφραξη των αγγείων των κάτω άκρων. 76

77 8.6 Θρόµβωση και επιπλοκή του αθηρώµατος Αυτή η εξέλιξη στη γνώση µας για την παθογένεια των οξέων στεφανιαίων συνδρόµων δίνει νέα έµφαση στη θρόµβωση, ως τον κρίσιµο µηχανισµό της µετάβασης από τη χρόνια στην οξεία αθηροσκλήρωση. Η κατανόηση των µηχανισµών της στεφανιαίας θρόµβωσης έχει προοδεύσει σηµαντικά. Εκτιµάται πλέον, ότι µια φυσική ρήξη της αθηροσκληρωτικής πλάκας προκαλεί συνήθως οξεία θρόµβωση. Αρκετοί κύριοι µηχανισµοί ρήξης της πλάκας προκαλούν τους περισσότερους στεφανιαίους θρόµβους. Ο πρώτος µηχανισµός, που είναι υπεύθυνος για τα δυο τρίτα περίπου των οξέων εµφραγµάτων του µυοκαρδίου, περιλαµβάνει ρήξη της ινώδους κάψας της πλάκας. Ένας άλλος µηχανισµός περιλαµβάνει µια επιφανειακή διάβρωση του έσω χιτώνα, που είναι υπεύθυνη για το ένα τέταρτο των οξέων εµφραγµάτων του µυοκαρδίου σε ιδιαίτερα επιλεγµένες περιπτώσεις παραποµπής από ιατρούς, σε άτοµα που υπέστησαν αιφνίδιο καρδιακό θάνατο. Η επιφανειακή διάβρωση εµφανίζεται συχνότερα στις γυναίκες από ό,τι στους άντρες, ως µηχανισµός του αιφνίδιου στεφανιαίου θανάτου [144]. Στις καρδιαγγειακές παθήσεις είναι γνωστός εδώ και χρόνια ο ρόλος ορισµένων «επικίνδυνων» παραγόντων κινδύνου. Οι κυριότεροι απ αυτούς είναι οι εξής: -Υπερχοληστεριναιµία -Κάπνισµα -Υπέρταση -Παχυσαρκία -Έλλειψη µυϊκής ασκήσεως (καθιστική ζωή) -Σακχαρώδης διαβήτης -Ουρική αρθρίτης - υπερουριχαιµία -Πολυερυθραιµία Οι τρεις πρώτοι είναι κατά την γνώµη του Schettler C. οι πιο βασικοί «επικίνδυνοι» παράγοντες και θεωρείται σίγουρο ότι επιταχύνουν την ανάπτυξη αρτηριοσκληρυντικών αλλοιώσεων στα αγγεία. Με τον όρο υπερχοληστεριναιµία ή υπερλιπιδαιµία εννοούµε την αύξηση των λιπιδίων στο αίµα. Τέλος, το 95% των λιπιδίων του αίµατος βρίσκονται συνδεδεµένα µε πρωτεΐνες, ως λιποπρωτεΐνες, οι οποίες ανιχνεύονται µε ηλεκτροφόρηση, υπερφυγοκέντρηση και χηµικές µεθόδους [145]. Ο προσδιορισµός των διαφόρων λιπιδίων και ο διαχωρισµός τους γίνεται µετά τη διάσπαση των συµπλεγµάτων των λιποπρωτεϊνών. 77

78 8.7 Χοληστερόλη και εστέρες αυτής Είναι η κυριότερη στερόλη των ζωϊκών οργανισµών. Η χηµική φυσιολογία και παθολογία της χοληστερόλης έχει περιγραφεί από τους Cook [146] και Kritckersky [147]. Η χοληστερόλη είναι ένα ουσιώδες συστατικό των κυτταρικών µεµβρανών των θηλαστικών και αποτελεί το υπόστρωµα για τις στεροειδείς ορµόνες και τα χολικά οξέα. Πολλές κυτταρικές λειτουργίες εξαρτώνται αυστηρά από τη µεµβρανική χοληστερόλη, ενώ τα κύτταρα ρυθµίζουν αυστηρά το περιεχόµενο τους σε χοληστερόλη. Το µεγαλύτερο ποσό χοληστερόλης που κυκλοφορεί στο πλάσµα είναι στη µορφή των εστέρων της χοληστερόλης, που εντοπίζονται συγκεκριµένα στον πυρήνα των λιποπρωτεϊνικών σωµατιδίων. Το ένζυµο λεκιθίνη: χοληστερόλη ακυλοτρανσφεράση (lecithin: cholesterol acyltransferase, LCAT) δηµιουργεί εστέρες της χοληστερόλης µεταφέροντας µια ακυλοµάδα από τη φωσφατιδυλχολίνη στη χοληστερόλη [148]. Οι περισσότερες αντιδράσεις της χοληστερόλης συµβαίνουν στην ΟΗ-οµάδα (αλκοολική) στον διπλό δεσµό και στον C7 (Βehring R.) στην ΟΗ-οµάδα γίνεται ο σχηµατισµός των εστέρων της χοληστερόλης. Υδρογόνωση στο διπλό δεσµό οδηγεί στα στερεοϊσοµερή κοπροστανόλη και χολεστανόλη. Η κοπροστανόλη σχηµατίζεται στο έντερο και δεν ανευρίσκεται στον ορό. Η χολεστανόλη ενίοτε ανευρίσκεται στον ορό σε συγκέντρωση περίπου στο 1-3% της ολικής χοληστερόλης. Μικρό ποσό από άλλα παράγωγα µπορεί ενίοτε να υπάρχει. Το υπόλοιπο της ολικής χοληστερόλης του πλάσµατος, περίπου 85% υπάρχει ως ελεύθερη χοληστερόλη ή εστέρες αυτής. Περίπου 35% της ολικής χοληστερόλης βρίσκεται ως ελεύθερη χοληστερόλη και 65% ως εστέρες [149]. Η ολική χοληστερόλη των ερυθρών είναι περίπου 10-30% λιγότερη απ ότι στον ορό. Τα ερυθρά όµως έχουν σηµαντικά λιγότερους εστέρες χοληστερόλης απ ότι ο ορός. Η σχέση ελευθέρας-εστεροποιηµένης χοληστερόλης είναι 4:1 στα ερυθρά και περίπου 1:3 στον ορό [150]. Τον πρώτο καιρό υπήρχε πρόθεση στους κλινικούς να υπολογισθεί η ολική χοληστερόλη ολικού αίµατος. Αλλά το επίπεδο της χοληστερόλης στον ορό ήταν µεταβλητό από κάποιον παράγοντα, ο οποίος δεν επηρεάζει αυτή των ερυθρών [151]. Έτσι σαν υλικό επιλογής για τον υπολογισµό της ολικής χοληστερόλης και των εστέρων της είναι ο ορός ή το πλάσµα. 8.8 Τριγλυκερίδια ή τριακυλογλυκερόλες Τα τριγλυκερίδια αποτελούνται από τον τριανθρακικό σκελετό της γλυκερόλης που είναι οµοιοπολικά συνδεδεµένος µε τρία λιπαρά οξέα. Η 78

79 σύσταση των λιπαρών οξέων ποικίλλει όσον αφορά στο µήκος της αλυσίδας και στην παρουσία διπλών δεσµών (βαθµός κορεσµού). Τα µόρια των τριγλυκεριδίων είναι µη πολικά και υδρόφοβα. Η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από λιπάσες δηµιουργεί ελεύθερα λιπαρά οξέα, που χρησιµοποιούνται ως εφεδρικές ουσίες ή για την παραγωγή ενέργειας [152]. Τα τριγλυκερίδια είναι αφ ενός µεν φορείς ενέργειας και αφ ετέρου εναποθηκεύµενες ουσίες π.χ. η περίσσεια του λίπους των τροφών εναποθηκεύεται µόνο µε την µορφή των τριγλυκεριδίων στον λιπώδη ιστό, πράγµα που θεωρείται πρακτικώς ως δυνατότητα απεριόριστη του λιπώδους ιστού για εναποθήκευση τριγλυκεριδίων. Η εναποθήκευση γίνεται στο κυτταρόπλασµα των λιποκυττάρων, τα οποία είναι εξειδικευµένα κύτταρα για σύνθεση και αποθήκευση τριγλυκεριδίων [153]. Τα απλά τριγλυκερίδια φέρουν το όνοµά τους από το περιεχόµενο λιπαρό οξύ µε την πρόθεση tri και η κατάληξη (in) αντικαθιστά την κατάληξη (ic) του οξέος π.χ. εκ του Oleic Acid-Triolein, περιέχουν γλυκερόλη και 3 λιπαρά οξέα (R1, R2, R3). Yπολογίζεται ότι τα εναποθηκευµένα τριγλυκερίδια ενός ατόµου βάρους 75 kg αντιπροσωπεύουν kcal καύσιµη ύλη. Τα λιπαρά οξέα των τριγλυκεριδίων, µε τη δράση διαφόρων λιπασών, ελευθερώνονται απ τον λιπώδη ιστό στο αίµα, όπου συνδέονται µε λευκωµατίνη και µ αυτήν την µορφή (µορφή µεταφοράς) µεταφέρονται στα κύτταρα των διαφόρων ιστών εκεί, (µε τη δράση ακυλο-co A-συνθετασών) µετατρέπονται σε θειολεστέρες του συνενζύµου Α και µεταφέρονται στα µιτοχόνδρια, όπου οξειδώνονται, µε αποτέλεσµα την παραγωγή ΑΤΡ. Μ αυτόν τον τρόπο (οξείδωση λιπαρών οξέων) καλύπτονται οι ενεργειακές ανάγκες των διαφόρων οργάνων (κυρίως της καρδιάς και των σκελετικών µυών), εκτός του εγκεφάλου και των ερυθρών. Τα τριγλυκερίδια των τροφών υδρολύονται (µε την λιπάση του παγκρεατικού υγρού). Επειδή όµως πρόκειται για ενώσεις αδιάλυτες σε υδατικά µέσα, γι αυτό σ αυτή τη φάση της πέψεως (α φάση) έχουµε τον καταµερισµό των ενώσεων αυτών σε µικρά σταγονίδια (γαλακτωµατοποίηση του λίπους). Ο καταµερισµός αυτός γίνεται αφ ενός µεν µε µηχανικά µέσα (κινήσεις στοµάχου) και αφ ετέρου µε τη δράση χολικών αλάτων (έλλειψη χολικών αλάτων προκαλεί ανωµαλία στην πέψη και την απορρόφηση των λιπών της τροφής και αύξηση λιπών και λιπαρών οξέων στα κόπρανα). Τα λιποκύτταρα στα οποία εναποθηκεύονται τα τριγλυκερίδια, είναι εξειδικευµένα κυρίως για εστεροποίηση των λιπαρών οξέων σε τριγλυκερίδια καθώς και για την ελευθέρωση των λιπαρών οξέων απ αυτά. Στο εντερικό κύτταρο τα µονογλυκερίδια και τα λιπαρά οξέα επανασυντίθενται σε τριγλυκερίδια. Η χοληστερόλη επανεστεροποιείται. 79

80 Τα τριγλυκερίδια, οι εστέρες της χοληστερόλης και τα φωσφολιπίδια µαζί µε τις λιποδιαλυτές βιταµίνες επικαλύπτονται µε ένα στρώµα λιποπρωτεΐνης και σχηµατίζουν τα χυλοµικρά. Τα χολικά άλατα συντίθενται στο ήπαρ από χοληστερόλη, εισέρχονται στο έντερο µε την χολή και ξανααπορροφώνται στον ειλεό. Αυτά επιστρέφουν στο ήπαρ και ξαναεκκρίνονται στην χολή (εντεροηπατική κυκλοφορία). 8.9 Λιποπρωτεΐνες-ταξινόµηση Το 95% των λιπιδίων του αίµατος βρίσκονται συνδεδεµένα µε πρωτεΐνες, ως λιποπρωτεΐνες, οι οποίες ανιχνεύονται µε ηλεκτροφόρηση, υπερφυγοκέντρηση και χηµικές µεθόδους. Το περίβληµα απολιποπρωτεΐνης περιβάλλει τον πυρήνα των σφαιρικών λιποπρωτεϊνικών σωµατιδίων, όπου βρίσκονται οι υδρόφοβοι εστέρες της χοληστερόλης και τα τριγλυκερίδια, επιτρέποντας τη µεταφορά τους στο αίµα. Οι λιποπρωτεΐνες ποικίλλουν σε µέγεθος, πυκνότητα στο υδάτινο περιβάλλον του πλάσµατος και σε περιεχόµενο λιπιδίων και απολιποπρωτεϊνών. Η ταξινόµηση των λιποπρωτεϊνών αντανακλά την ποιότητά τους στο πλάσµα (1,006 gm/ml) όπως υπολογίζεται από την επίπλευσή τους µετά από υπερφυγοκέντρηση. Οι πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες αποτελούµενες από χυλοµικρά και πολύ-χαµηλής-πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) έχουν πυκνότητα µικρότερη από 1,006 gm/ml. Το υπόλοιπο υπερφυγοκεντρηµένο πλάσµα αποτελείται από χαµηλής-πυκνότητας λιπoπρωτεΐνες (LDL), HDL και λιποπρωτεΐνη(α) [153]. Το σύστηµα µεταφοράς των λιποπρωτεϊνών έχει δυο βασικούς ρόλους: την αποτελεσµατική µεταφορά των τριγλυκεριδίων από το έντερο και το ήπαρ στα σηµεία χρήσης (λιπώδης ιστός ή µύες) και τη µεταφορά της χοληστερόλης στους περιφερειακούς ιστούς για τη σύνθεση µεµβρανών και την παραγωγή στεροειδών ορµονών ή στο ήπαρ για τη σύνθεση χολικών οξέων. Η ταξινόµηση των λιποπρωτεϊνών γίνεται µε 3 τρόπους που παρουσιάζονται στον πίνακα 10. ΠΙΝΑΚΑΣ 10: Tαξινόµηση λιποπρωτεϊνών. Με υπερφυγοκέντρηση Με ηλεκτροφόρηση 80 Λιπίδια που µεταφέρουν Χυλοµικρά Χυλοµικρά Τριγλυκερίδια VLDL Προ Β-λιποπρωτεΐνες >> LDL Β-λιποπρωτεΐνες Εστέρες χοληστερόλης Φωσφολιπίδια και HDL A-λιποπρωτεΐνες χοληστερόλη

81 1)Χυλοµικρά Είναι µεγαλοµοριακά συµπλέγµατα µε περιεκτικότητα 98% σε λιπίδια, περιέχουν κυρίως τριγλυκερίδια και πολύ µικρό ποσό φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης. Όταν βρίσκονται στον ορό σε µεγάλα ποσά προσδίδουν σ αυτόν όψη θολερή. Σχηµατίζονται στον βλεννογόνο του εντέρου και µε τη λέµφο µέσω του θωρακικού πόρου διοχετεύονται στο αίµα. Κύρια αποστολή τους είναι η µεταφορά τριγλυκεριδίων από το έντερο στους διάφορους ιστούς. 2)VLDL λιποπρωτεΐνες (very low density lipoproteins) Οι λιποπρωτεΐνες πολύ χαµηλής πυκνότητας καλούνται και προ β-λιποπρωτεΐνες. Είναι επίσης µεγαλοµοριακά συµπλέγµατα και περιέχουν 90% λιπίδια και κυρίως τριγλυκερίδια. Συντίθενται στο ήπαρ και σκοπό έχουν την µεταφορά τριγλυκεριδίων από το ήπαρ σε άλλους ιστούς και κυρίως στο λιπώδη ιστό (σύνθεση VLDL γίνεται και στο βλεννογόνο του εντέρου). 3)LDL (low density lipoproteins) Καλούνται και β-λιποπρωτεΐνες. Περιέχουν κυρίως εστεροποιηµένη χοληστερόλη (κυρίως του λινολεϊκού) µε Μ.Β Προέρχονται από τον µεταβολισµό των VLDL µετά την αποµάκρυνση των τριγλυκεριδίων. Ο ρόλος τους είναι η µεταφορά της χοληστερόλης στα κύτταρα των ιστών. Έχουν σχέση παραγωγής 1:1 µε τις VLDL και συνδέονται µε ειδικούς υποδοχείς στο τοίχωµα των κυττάρων, εισέρχονται στο εσωτερικό των κυττάρων και µεταφέρονται στα λυσοσώµατα που είναι ενδοκυτταρικά στοιχεία πλούσια σε ένζυµα (Αugustin J.G., Middelhoff W., V. Brown, 1976). Tα λυσοσώµατα µε τα ένζυµα που περιέχουν δρουν ως «πεπτικά όργανα» του κυττάρου όταν αυτό πεθάνει, αποικοδοµώντας όλες τις µεγαλοµοριακές ουσίες µικρού Μ.Β κατά τον θάνατο του κυττάρου [154]. Στα ζώντα κύτταρα, η µεµβράνη των λυσοσωµάτων προστατεύει το κύτταρο από την επαφή µε τα ένζυµα των λυσοσωµάτων και άρα την αποικοδόµηση των µεγαλοµοριακών ουσιών αυτού. Από την προστασία αυτή, εξαιρούνται οι LDL λιποπρωτεΐνες, οι οποίες αποικοδοµούνται σε χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιηµένη), γλυκερίνη, ελεύθερα λιπαρά οξέα, φωσφολιπίδια και αµινοξέα. Σ αυτό το σηµείο έχουµε αδιέξοδο στη µεταφορά της χοληστερόλης. Ο µηχανισµός γίνεται ανεπαρκής επί υψηλών συγκεντρώσεων LDL λιποπρωτεϊνών µε αποτέλεσµα να έχουµε άθροιση χοληστερόλης στο κυτταρόπλασµα [155]. 81

82 4)HDL (High density lipoproteins) Καλούνται και α-λιποπρωτεΐνες. Συνθέτονται στο ήπαρ υπό µορφή επίπεδων µορίων. Αποτελούνται κατά 50% από πρωτεΐνες και τα κυρίως λιπίδια τους είναι φωσφολιπίδια και εστέρες χοληστερόλης. Ρόλος τους είναι η µεταφορά της χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ (το σχήµα τους τότε γίνεται σφαιρικό [155] εκεί αποικοδοµούνται και απεκκρίνονται στην χολή µε την µορφή χολικών οξέων και ουδέτερων στεροειδών). Αυτή είναι και η µόνη οδός αποµακρύνσεως µεγάλης ποσότητας χοληστερίνης από τον ανθρώπινο οργανισµό. Η σύσταση των λιποπρωτεϊνών ορού ή πλάσµατος παρουσιάζεται στον πίνακα 11. ΠΙΝΑΚΑΣ 11: Σύσταση λιποπρωτεϊνών ορού ή πλάσµατος. Xυλοµικρά VLDL LDL HDL Πρωτεΐνες Τριγλυκερίδια Χοληστερόλη Εστέρες χοληστερόλης Φωσφολιπίδια Υδατάνθρακες ίχνη Χοληστερόλη πλάσµατος- αθηροσκλήρωση Oι καρδιαγγειακές παθήσεις είναι η µοναδική πιο κοινή αιτία θανάτου στον αναπτυγµένο κόσµο, υπεύθυνη για σχεδόν 1 εκατοµµύριο θανάτους ανά έτος µόνο στις Ηνωµένες Πολιτείες. Από αυτούς τους καρδιαγγειακούς θανάτους, σχεδόν οι µισοί είναι το άµεσο αποτέλεσµα της στεφανιαίας νόσου, ενώ ένα άλλο 20% οφείλεται σε εγκεφαλικά επεισόδια [156]. Η αθηροσκλήρωση είναι µια προοδευτική πολυπαραγοντική διαδικασία που αρχίζει κατά την παιδική και εφηβική ηλικία, εξελίσσεται πολύ αργά για να εκδηλωθεί µετά την 3 η δεκαετία της ζωής συνήθως µε ισχαιµική νόσο, αποτελώντας τη σπουδαιότερη αιτία θανάτου και αναπηρίας στις υτικές χώρες. Πρόκειται, όπως έχει ήδη αναφερθεί, για ένα συνδυασµό αλλαγών στον έσω χιτώνα των αρτηριών, που συνίσταται σε εστιακή συσσώρευση λιπιδίων, άλλων συστατικών του αίµατος και ινώδους ιστού, συνοδευόµενος από αλλαγές στο µέσο χιτώνα του τοιχώµατος του αγγείου. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι το αποτέλεσµα της 82

83 αλληλεπίδρασης ανάµεσα στις δοµικές και µεταβολικές ιδιότητες του αρτηριακού τοιχώµατος, που εξαρτώνται από το αίµα και την αιµοδυναµική κατάσταση. Η ρήξη ινώδους πλάκας οδηγεί σε σοβαρά κλινικά συµβάµατα όπως το έµφραγµα του µυοκαρδίου και ο αιφνίδιος θάνατος. Τη ρήξη της ινώδους πλάκας ακολουθεί ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού, ο οποίος οδηγεί σε σχηµατισµό θρόµβου. Έτσι επιτείνεται η απόφραξη του αγγείου. Με βάση τη σύγχρονη γνώση για την αθηροθρόµβωση, η αιτιοπαθογένεια της είναι σύνθετη και πολύπλευρη και βασίζεται σε πολλαπλούς παράγοντες κινδύνου. Από επιδηµιολογική άποψη, ένας «παράγοντας κινδύνου» είναι ένα χαρακτηριστικό ή ένα γνώρισµα ενός ατόµου ή ενός πληθυσµού που συνδέεται µε αυξηµένο κίνδυνο για την µελλοντική ανάπτυξη της νόσου [156]. Τα κλάσµατα των λιπιδίων του αίµατος έχει αποδειχθεί ότι είναι µεταξύ των πιο ισχυρών και καλύτερα τεκµηριωµένων παραγόντων κινδύνου για την αθηροσκλήρωση και τη στεφανιαία νόσο ειδικότερα. Συγκεκριµένα, οι κοινές δυσλιποπρωτεϊναιµίες σπάνια προκαλούν συµπτώµατα ή παράγουν κλινικά σηµεία που να είναι εµφανή κατά την κλινική εξέταση. Αντίθετα, αποτελούν κοινό εργαστηριακό εύρηµα και απαιτούνται οι κατάλληλες εργαστηριακές εξετάσεις για την ανίχνευσή τους. Τα πειράµατα που διεξάγονται στις αρχές του 20 ου αιώνα, χρησιµοποιούσαν διαιτητικές ρυθµίσεις για την παραγωγή λιπιδικών αλλοιώσεων στις αρτηρίες κουνελιών, ενώ τελικά εντοπίστηκε ως υπαίτιος η χοληστερόλη. Η σχέση µεταξύ χοληστερόλης και αρτηριοσκλήρωσης περιλαµβάνει ευρείας αποδοχής [157]. Μία από τις πρώτες µελέτες που συσχέτισαν την αυξηµένη χοληστερόλη µε τη στεφανιαία νόσο διεξήχθη µετά τον Β Παγκόσµιο Πόλεµο σε µια µικρή πόλη κοντά στην Βοστώνη, στις Η.Π.Α. Η πόλη λεγόταν Framingham και όλοι οι κάτοικοί της εξετάζονταν κάθε λίγα χρόνια, για να διαπιστωθεί αν είχαν αναπτύξει στεφανιαία νόσο ή όχι. Η ισχυρή σχέση µεταξύ αυξηµένης χοληστερόλης και στεφανιαίας νόσου έγινε αντιληπτή στις αρχές της µελέτης όσο υψηλότερη ήταν η χοληστερόλη, τόσο µεγαλύτερος ο κίνδυνος ανάπτυξης εµφράγµατος (Framingham Heart study). H αιτιολόγηση της σχέσης µεταξύ της ολικής χοληστερόλης και του κινδύνου για στεφανιαία νόσο προέκυψε από τη δοκιµή Multiple Risk Factor Interrention (MRFIT) Trial, από µελέτες στο Ηνωµένο Βασίλειο και την Ευρώπη όπως οι Northwick Park Munster (PROCAM) Cohort, και πιο πρόσφατα από τη µελέτη Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) [157]. Τα αυξηµένα επίπεδα χοληστερόλης βρέθηκε ότι σχετίζονται µε δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, ενώ της LDL µε αυξηµένο σχηµατισµό οξειδωµένης LDL και αυξηµένη παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου, που οδηγούν µε τη σειρά τους σε δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και µειωµένη παραγωγή ΝΟ, µε όλες τις δυσµενείς συνέπειες [158]. 83

84 Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, το πλάσµα φυσιολογικού ατόµου περιέχει κυρίως τις LDL και HDL λιποπρωτεΐνες, ελάχιστο ποσό και καθόλου χυλοµικρά. Οι LDL λιποπρωτεΐνες περιέχουν το 60-70% της ολικής χοληστερόλης. Όσον αφορά το φύλο οι άνδρες έχουν περισσότερες LDL λιποπρωτεΐνες από τις γυναίκες (πριν από την κλιµακτήριο), οι οποίες έχουν περισσότερες HDL άρα µεγαλύτερη προστασία Τριγλυκερίδια πλάσµατος- αθηροσκλήρωση Σε αντίθεση µε τα αναµφισβήτητα αποτελέσµατα, που υποστηρίζουν έναν αιτιολογικό ρόλο για τις LDL στην αθηρογένεση, ο ρόλος των τριγλυκεριδίων προκαλεί ακόµη αντιπαραθέσεις. ιάφορα ζητήµατα υποθάλπουν αυτήν την σύγχυση [159]. Κατ αρχάς, καθώς τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων τείνουν να ποικίλλουν αντιστρόφως ανάλογα µε τα επίπεδα των HDL, δεν έχει αποδειχθεί πλήρως µια σαφής επίδραση των τριγλυκεριδίων στα καρδιαγγειακά επεισόδια και στη θνησιµότητα. Εξάλλου, τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων στο αίµα εξαρτώνται ιδιαίτερα από τη διατροφή. Η πραγµατική έκθεση του τοιχώµατος των αρτηριών στα πλούσια σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια, όπως οι πολύ χαµηλής πυκνότητας (VLDL) λιποπρωτεΐνες µπορεί στην πραγµατικότητα να αποτελεί έναν παράγοντα που προωθεί την αρτηριοσκλήρωση και δεν θα εντοπιζόταν από το λιπιδαιµικό προφίλ νηστείας. Ωστόσο, λαµβάνοντας υπόψη τη στενή σχέση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων µε γνωστούς παράγοντες κινδύνου για αρτηριοσκλήρωση (χαµηλό επίπεδο HDL χοληστερόλης, µη ελεγχόµενος διαβήτης, υποθυρεοειδισµός), τα αυξηµένα επίπεδα τριγλυκεριδίων θα πρέπει να εκτιµώνται στη συνολική αξιολόγηση του κινδύνου ενός ατόµου [159]. Σε άτοµα µε µεταβολικό σύνδροµο και σε διαβητικούς ασθενείς, η αύξηση των συγκεντρώσεων των τριγλυκεριδίων συµβαίνει πιο συχνά παρουσία σπλαχνικής (κοιλιακής) παχυσαρκίας και µιας δίαιτας πλούσιας σε θερµίδες, υδατάνθρακες και κορεσµένα λίπη. Οι σοβαρές αυξήσεις στα τριγλυκερίδια µπορούν να προέλθουν από γενετικές διαταραχές των ενζύµων επεξεργασίας ή των απολιποπρωτεϊνών και από διαβήτη που δεν ελέγχεται σωστά. Τα αυξηµένα τριγλυκερίδια του πλάσµατος ανεξάρτητα, αλλά µάλλον ασθενώς προβλέπουν τον κίνδυνο για στεφανιαία νόσο. Η κύρια καρδιαγγειακή σηµαντικότητά τους είναι ως συστατικό και δείκτης της αθηρογενετικής δυσλιπιδαιµίας, η οποία εντοπίζεται συχνά σε ασθενείς µε παχυσαρκία, µεταβολικό σύνδροµο και σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 [160]. Η τριάδα των λιπιδικών ανωµαλιών σε αυτές τις παθήσεις περιλαµβάνει αυξηµένα τριγλυκερίδια στο πλάσµα, µειωµένη HDL χοληστερόλη και ένα σχετικό πλεόνασµα µικρών, πυκνών LDL 84

85 σωµατιδίων µε τα επίπεδα της ολικής LDL-χοληστερόλης να βρίσκονται σε γενικά συνήθη επίπεδα [161]. Η παχυσαρκία από µόνη της αποτελεί τη βασική επίδραση που σχετίζεται µε τη διατροφή στην αθηρογενετική δυσλιπιδαιµία. Μεταξύ των θρεπτικών ουσιών, ο κύριος παράγοντας καθορισµού αυτής της δυσλιπιδαιµικής τριάδας είναι οι υδατάνθρακες [162]. Γενικά, τα απλά σάκχαρα και το ταχύτατα υδρολυώµενο άµυλο προκαλούν µεγαλύτερη αύξηση τριγλυκεριδίων από ότι οι περισσότεροι σύνθετοι υδατάνθρακες και αυτοί που καταναλώνονται σε συνδυασµό µε µεγαλύτερη πρόσληψη ινών. Οι γλυκεριδαιµικές επιδράσεις των υδατανθράκων τείνουν να συσχετίζονται µε τις γλυκαιµικές τους επιδράσεις [163]. Οι διαιτητικές αυξήσεις στα τριγλυκερίδια του πλάσµατος, που προκαλούνται από υδατάνθρακες, συχνά συνοδεύονται από µειώσεις στην HDL χοληστερόλη και αυξήσεις στα επίπεδα των µικρών, πυκνών LDL σωµατιδίων [164]. Αν και δεν υπάρχει άµεση απόδειξη, ότι αυτές οι µεταβολές που προκαλούνται από τη δίαιτα συµβάλλουν στην αύξηση του κινδύνου για στεφανιαία νόσο, έχει αναφερθεί ότι το διαιτητικό γλυκαιµικό φορτίο που σχετίζεται µε υψηλά τριγλυκερίδια στο πλάσµα και χαµηλή HDL χοληστερόλη, ισχυρά και ανεξάρτητα προβλέπει τον κίνδυνο για στεφανιαία καρδιακή νόσο. Κατά συνέπεια, ο περιορισµός των σακχάρων και των έντονα γλυκαιµικών υδατανθράκων προτείνεται για τους ασθενείς µ αυτή τη µορφή δυσλιπιδαιµίας είκτες µυοκαρδιακής νέκρωσης Για ασθενείς µε µια µέτρια ή υψηλή πιθανότητα οξέος στεφανιαίου συνδρόµου, οι κλινικοί ιατροί συνήθως εκτελούν αναλύσεις στον ορό αίµατος για δείκτες µυοκαρδιακής νέκρωσης, όπως οι καρδιακές τροπονίνες Τ ή Ι (ctnt ή ctni) ή το ισοένζυµο ΜΒ της κρεατινικής κινάσης (CK-MB), που θα αναλυθούν µε περισσότερη λεπτοµέρεια παρακάτω. Κατά την νέκρωση των µυϊκών κυττάρων, η ακεραιότητα της µεµβράνης του σαρκολείµµατος χάνεται και τα ενδοκυττάρια µακροµόρια (καρδιακοί δείκτες) αρχίζουν να διαχέονται στον καρδιακό διάµεσο ιστό και τελικά στη µικροκυκλοφορία και στα λεµφαγγεία της εµφραγµατικής περιοχής. Ο ρυθµός εµφάνισης αυτών των µακροµορίων στην κυκλοφορία εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως η ενδοκυττάρια εντόπισή τους, το µοριακό τους βάρος, η τοπική αιµατική και λεµφική άρδευση και ο ρυθµός αποµάκρυνσης από το αίµα [165,166]. Πολλά νοσοκοµειακά εργαστήρια εκτελούν αυτές τις εξετάσεις άµεσα, ενώ οι αναλύσεις αυτών των δεικτών στο σηµείο περίθαλψης είναι πλέον ευρύτερα διαθέσιµες κι έτσι τα αποτελέσµατα είναι συχνά διαθέσιµα ως πληροφορία για τις αρχικές αποφάσεις αντιµετώπισης. Μελέτες της διαγνωστικής απόδοσης των ctnt, ctni και CK-MB 85

86 υποδεικνύουν ότι όταν οποιοδήποτε από τα ευρήµατα αυτών των εξετάσεων είναι παθολογικό, η πιθανότητα ο ασθενής να έχει ένα οξύ στεφανιαίο σύνδροµο είναι µεγάλη. Τα πιο προκλητικά ζητήµατα στην ερµηνεία των ευρηµάτων αυτών των αποτελεσµάτων στη διάρκεια της αρχικής αξιολόγησης του οξέος θωρακικού πόνου είναι: (1) η συχνότητα και οι αιτίες των ψευδώς-θετικών αποτελεσµάτων, (2) οι προγνωστικές επιπλοκές των παθολογικών αποτελεσµάτων των εξετάσεων και (3) η ερµηνεία των µεµονωµένων τιµών αυτών των εξετάσεων, όπως είναι διαθέσιµες στη διάρκεια της αρχικής αξιολόγησης του οξέος θωρακικού πόνου. Μελέτες των βασικών αναλύσεων που χρησιµοποιούνται στην αξιολόγηση των ασθενών µε οξύ θωρακικό πόνο (CK-MB, ctni και ctnt) υποδεικνύουν ότι µε διαδοχική δειγµατοληψία, όλοι αυτοί οι παράγοντες έχουν εξαιρετική ευαισθησία για τον εντοπισµό του οξέος εµφράγµατος µυοκαρδίου [ ]. Για την καλύτερη ειδικότητα, ο καρδιακός δείκτης πρέπει να εµφανίζεται σε µεγάλη πυκνότητα στο µυοκάρδιο και να µην εµφανίζεται σε άλλους ιστούς ή στον ορό. Για την καλύτερη ευαισθησία πρέπει να εκκρίνεται άµεσα στο αίµα µετά την εκδήλωση του εµφράγµατος µυοκαρδίου και πρέπει να εµφανίζει µια καλή συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων του στο πλάσµα και του µεγέθους του εµφράκτου. Για την διευκόλυνση του κλινικού έργου, ο δείκτης πρέπει να παραµένει στο αίµα για αρκετό χρονικό διάστηµα, για να παρέχει ένα ικανοποιητικό «παράθυρο διάγνωσης». Τέλος, η όλη εξέταση πρέπει να µην είναι ακριβή και να είναι όσο το δυνατό πιο εύχρηστη [173] Τρανσαµινάσες (Αµινοτρανσφεράσες) Οι τρανσαµινάσες είναι ένζυµα µεταφοράς αµινοξέων. Πρόκειται για ένζυµα, που καταλύουν τις αντιδράσεις τρανσαµίνωσης, δηλαδή την µεταφορά της α-αµινοµάδας από ένα αµινοξύ στον α-άνθρακα ενός κετοξέος. Η τρανσαµίνωση έχει αναµφισβήτητα σπουδαία συµµετοχή στο διάµεσο µεταβολισµό, γιατί παρέχει το µέσο για την σύνθεση και διάσπαση των αµινοξέων µέσα στα ζώντα κύτταρα και τα αµινοξέα γλουταµινικό οξύ, ασπαραγινικό οξύ και αλανίνη µπορούν µε τον τρόπο αυτό να µετατραπούν στα αντίστοιχα α-κετοξέα τα οποία αποτελούν συστατικό του κύκλου του κιτρικού οξέος [174]. Είναι γνωστός µεγάλος αριθµός των ενζύµων αυτών, που χρησιµοποιούν ως συνένζυµο την φωσφορική πυριδοξάλη. υο όµως από αυτά παρουσιάζουν κυρίως κλινική σηµασία. Η ασπαρτικήγλουταµική τρανσαµινάση ή γλουταµική οξαλοξική τρανσαµινάση (SGOT) και η αµινοτρανσφεράση της αλανίνης ή γλουταµική-πυρουβική τρανσαµινάση (SGPT). Τα ένζυµα αυτά υπάρχουν σ όλους τους ιστούς, 86

87 σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις όµως υπάρχουν στο ήπαρ και στον καρδιακό µυ. Αύξηση των τρανσαµινασών στον ορό πάνω από τα φυσιολογικά επίπεδα είναι ενδεικτική βλάβης κάποιου ιστού ή οργάνου, διότι η νέκρωση των κυττάρων επιτρέπει στα ένζυµα αυτά να εισέλθουν στο αίµα σε µεγάλα ποσά [174]. Η γλουταµική-οξαλοξική τρανσαµινάση (SGOT) καταλύει την αντιστρεπτή µεταφορά µιας αµινοοµάδας από το γλουταµικό οξύ στο οξαλοξικό. Υπάρχει σε υψηλότερες συγκεντρώσεις στο µυοκάρδιο και σε χαµηλότερες στο ήπαρ και στους σκελετικούς µυς. Η SGOT είναι ένζυµο του κυτταροπλάσµατος και των µιτοχονδρίων και βρίσκεται κατά φθίνουσα σειρά συγκεντρώσεως στα ηπατοκύτταρα, στις καρδιακές και σκελετικές µυικές ίνες, στους νεφρούς, στον εγκέφαλο, στο πάγκρεας, στους πνεύµονες, στα λευκά και ερυθρά αιµοσφαίρια. Η τιµή της στον ορό αυξάνει στο έµφραγµα του µυοκαρδίου, 3-9 ώρες µετά την εισβολή και φθάνει στη µέγιστη τιµή µετά από περίπου 24 ώρες. Επίσης αυξάνει σε παθήσεις των σκελετικών µυών, π.χ. µυϊκή δυστροφία, πολυµυοσίτιδα. Η χρονική διάρκεια κατά την οποία παραµένει αυξηµένη είναι ώρες [175]. Η γλουταµική-πυρουβική τρανσαµινάση (SGPT) καταλύει την αντιστρεπτή µεταφορά µιας αµινοοµάδας από το γλουταµικό οξύ στο πυρουβικό. Βρίσκεται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις στο ήπαρ και µαζί µε την SGOT, αποτελούν ευαίσθητους δείκτες ηπατοκυτταρικής βλάβης. Η SGPT είναι ένζυµο µόνο του κυτταροπλάσµατος και βρίσκεται σχεδόν αποκλειστικά στα ηπατοκύτταρα. Μεγάλη αύξηση στον ορό παρατηρείται σε οξεία ηπατίτιδα, ενώ µέτρια σε χρόνιες ηπατικές παθήσεις, αποφρακτικό ίκτερο, λοιµώδη µονοπυρήνωση και όγκους του ήπατος. Για τον µεταβολισµό των τρανσαµινασών είναι πολύ λίγα γνωστά. Ισχύει όµως και για τις τρανσαµινάσες, ο γενικός κανόνας που αφορά το µεταβολισµό των ενζύµων σύµφωνα µε τον οποίο απεκκρίνονται µε τη χολή και τα ούρα και µεταβολίζονται στην περιφέρεια. Το συνολικό ποσό των τρανσαµινασών που απεκκρίνεται στο 24ωρο δια της χολής και των ούρων δεν υπερβαίνει το 10% περίπου του ποσού των τρανσαµινασών που κυκλοφορούν στο αίµα. Ενώ το 90% µεταβολίζεται στον οργανισµό χωρίς να είναι γνωστό σε ποιους ιστούς µεταβολίζεται και µε ποιο µηχανισµό [176] Κινάση της κρεατίνης (CK) Καταλύει τη φωσφορυλίωση της κρεατίνης. Βρίσκεται άφθονη στους σκελετικούς µυς. Στο µυοκάρδιο επικρατεί το ισοένζυµο (CK-MB). Στο έµφραγµα του µυοκαρδίου η CK αυξάνει στον ορό σε 4-6 ώρες πριν από τα άλλα ένζυµα και φθάνει στη µέγιστη τιµή σε 24 ώρες [175]. Μεγάλη διαγνωστική αξία έχει η αύξηση του ισοενζύµου CK-MB. Η CK αυξάνει επίσης στον ορό σε µυϊκές δυστροφίες και σε κακώσεις των 87

88 µυών. Αύξηση µπορεί να προκαλέσει και η ενδοµυϊκή ένεση ορισµένων φαρµάκων. Η διαγνωστική της αξία είναι µεγάλη γιατί το ισοένζυµο είναι αποκλειστικά µυοκαρδιακό. Η χρονική διάρκεια που η κρεατινική κινάση (CPK) παραµένει αυξηµένη είναι ώρες [177]. Αν και η άνοδος της CK είναι ένας ευαίσθητος ενζυµικός δείκτης του εµφράγµατος µυοκαρδίου, που είναι µέρος της εργαστηριακής ρουτίνας κάθε νοσοκοµείου [178], εµφανίζει σηµαντικά µειονεκτήµατα, όπως τα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα, σε ασθενείς µε µυϊκές νόσους, δηλητηρίαση µε αλκοόλ, σακχαρώδη διαβήτη, τραύµα των σκελετικών µυών, σπασµούς, µετά από ενδοµυϊκές ενέσεις και σε πνευµονική εµβολή [179]. Ισοένζυµα της κρεατινικής κινάσης: Έχουν αναγνωρισθεί 3 διαφορετικά ισοένζυµα της CK (τα ΜΜ, ΒΒ και ΜΒ) µε ηλεκτροφόρηση. Το ισοένζυµο ΒΒ βρίσκεται κυρίως στον εγκέφαλο και στους νεφρούς, ενώ οι σκελετικοί µύες περιέχουν κυρίως το ΜΜ και µικρές ποσότητες του ΜΒ (1-3%). Ο καρδιακός µυς περιέχει κυρίως τα ΜΜ και ΜΒ ισοένζυµα. Το ΜΒ ισοένζυµο µπορεί να βρίσκεται σε µικρές ποσότητες στο λεπτό έντερο, στη γλώσσα, στο διάφραγµα, στη µήτρα και στον προστάτη. Η εργώδης γυµναστική, ιδιαίτερα σε γυµνασµένους αθλητές µεγάλων αποστάσεων, προκαλεί αύξηση τόσο της ολικής CK όσο και της CK-MB [180]. Επειδή η CK-MB µπορεί να ανιχνευθεί στο αίµα υγιών ατόµων, καθορίζεται πάντα το όριο για τις ανώτερες τιµές αναφοράς του κάθε εργαστηρίου. Παρά το γεγονός ότι µικρές ποσότητες της CK-MB ανευρίσκονται και σε άλλους ιστούς, εκτός του καρδιακού, οι αυξηµένες τιµές της θεωρούνται πρακτικά ότι οφείλονται σε έµφραγµα µυοκαρδίου (εκτός από τις περιπτώσεις τραύµατος ή εγχείρησης στα προαναφερθέντα όργανα). Η CK-MB αναλύεται στα περισσότερα εργαστήρια µε ευαίσθητες και ειδικές ανοσοενζυµικές µεθόδους, που χρησιµοποιούν µονοκλωνικά αντισώµατα ενάντια στην CK-MB80. Τα αποτελέσµατα έχουν µεγαλύτερη ακρίβεια όταν εκφράζονται σε ng/ml αντί για IU/ml, ιδιαίτερα σε ασθενείς που εµφανίζονται µέσα σε 4 ώρες από την εκδήλωση του εµφράγµατος µυοκαρδίου. Η σκελετικής αιτιολογίας έκκριση της CK-MB διαρκεί γενικά περισσότερο από την µυοκαρδιακής αιτιολογίας έκκριση και στο διάγραµµα φαίνεται ως plateau διάρκειας αρκετών ηµερών, σε αντίθεση µε τη µικρότερης διάρκειας αύξηση που παρατηρείται στην CK-MB καρδιακής αιτιολογίας. Μια αναδροµική ανάλυση των δηµοσιευµένων δεδοµένων υποδεικνύουν ότι η τιµή του CK-MB έχει µια κλινική ευαισθησία για το οξύ έµφραγµα του µυοκαρδίου 97% και ειδικότητα 90% [178]. 88

89 8.15 Καρδιοεκλεκτικές τροπονίνες Τελευταία, είναι δυνατή η ανίχνευση στον ορό του αίµατος ορισµένων πρωτεϊνών, οι οποίες απελευθερώνονται από τα νεκρωµένα µυοκαρδιακά κύτταρα, όπως η τροπονίνη Ι, η τροπονίνη Τ και η µυοσφαιρίνη. Η αύξηση των πρωτεϊνών αυτών και ιδιαίτερα του καρδιακού κλάσµατος της τροπονίνης Ι (ctni) και της τροπονίνης Τ (ctnt) επιβεβαιώνουν µε ασφάλεια τη διάγνωση του εµφράγµατος του µυοκαρδίου. Πολύ µικρές αυξήσεις στον ορό του αίµατος των δύο παραπάνω πρωτεϊνών είναι διαγνωστικές του εµφράγµατος του µυοκαρδίου, ακόµη και στις περιπτώσεις εκείνες, στις οποίες η νέκρωση των µυοκαρδιακών κυττάρων είναι πολύ περιορισµένη και δεν ανευρίσκονται αυξηµένες τιµές του ενζύµου CK-MB. Ανιχνεύονται στον ορό του αίµατος των εµφραγµατιών αρρώστων περίπου 3 ώρες από την εµφάνιση του πόνου και η µεν τροπονίνη Ι παραµένει αυξηµένη για 7-10 ηµέρες, ενώ η τροπονίνη Τ για ηµέρες. Αντίθετα, η αύξηση στον ορό του αίµατος της µυοσφαιρίνης δεν είναι απολύτως διαγνωστική εµφράγµατος του µυοκαρδίου. Εντός 24 ωρών, οι αυξηµένες τιµές της µυοσφαιρίνης επανέρχονται στο φυσιολογικό [175]. Το σύµπλεγµα της τροπονίνης αποτελείται από 3 υποοµάδες, που ρυθµίζουν τη σύσπαση των γραµµωτών µυών που είναι εξαρτώµενη από το ασβέστιο. Οι υποοµάδες αυτές περιλαµβάνουν την τροπονίνη C, η οποία ενώνεται µε το ασβέστιο, την τροπονίνη Ι (ctni) που ενώνεται µε την ακτίνη και εµποδίζει τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ ακτίνης-µυοσίνης και την τροπονίνη Τ (TnT), που ενώνεται µε την τροποµυοσίνη, συνδέοντας έτσι το σύµπλεγµα της τροπονίνης µε το λεπτό νηµάτιο. Αν και το µεγαλύτερο µέρος της TnT περικλείεται στο σύµπλεγµα της τροπονίνης, περίπου 6% βρίσκεται διαλυµένο στο κυτταρόπλασµα, ενώ ένα 3% βρίσκεται στην κυτταροπλασµατική αποθήκη. Μετά τη ρήξη της µεµβράνης του σαρκειλήµµατος, η κυτταροπλασµατική τροπονίνη ελευθερώνεται ακολουθούµενη από µια παρατεταµένη απελευθέρωση από τα µυϊκά ινίδια, που µπορεί να διαρκέσει πολλές ηµέρες. Τα επίπεδα καρδιακής τροπονίνης αυξάνονται 20 µε 50 φορές πάνω από τα ανώτερα φυσιολογικά σε ασθενείς µε κλασσικό έµφραγµα µυοκαρδίου και σοβαρή εκτεταµένη µυοκαρδιακή νέκρωση, που οδηγεί σε αύξηση της CK-MB. Μπορούν ακόµη να διαγνωσθούν και µικροεµφράγµατα µέσω της αύξησης της τροπονίνης, ακόµα και αν τα επίπεδα της CK-MB είναι µέσα στα φυσιολογικά πλαίσια. Παρότι τόσο η TnT όσο και η TnI βρίσκονται τόσο στους καρδιακούς όσο και στους σκελετικούς µύες, κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και η αλληλουχία των αµινοξέων τους είναι διαφορετική. Αυτό επιτρέπει την παραγωγή αντισωµάτων ειδικών 89

90 ενάντια στις καρδιακές µορφές (ctnt και ctni) και οδήγησε στην ανακάλυψη ποσοτικών µεθόδων για τον υπολογισµό των επιπέδων τους [166]. Αρκετές µελέτες έχουν επιβεβαιώσει την αξιοπιστία των µεθόδων αυτών στη διάγνωση του εµφράγµατος µυοκαρδίου, ενώ πλέον η µέτρηση των ctnt και ctni βρίσκεται στο επίκεντρο των διαγνωστικών κριτηρίων του εµφράγµατος [181]. Επειδή οι ctni και ctnt δεν ανιχνεύονται στην κυκλοφορία σε φυσιολογικές καταστάσεις, οι ανώτερες τιµές τίθενται ελαφρώς παραπάνω από το εύρος των φυσιολογικών τιµών. Επιπλέον, ενώ η CK-MB µπορεί να αυξηθεί µόνο φορές πάνω από τα φυσιολογικά επίπεδα, τα ctni και ctnt µπορούν να αυξηθούν πολύ περισσότερο από 20 φορές των τιµών αναφοράς. Αυτή η αυξηµένη ειδικότητα της τροπονίνης την καθιστά ιδανικό δείκτη για τη διάγνωση ακόµα και µικρού µεγέθους µυοκαρδιακής νέκρωσης [172]. Αφού οι ειδικές καρδιακές τροπονίνες Ι και Τ (ctni, ctnt) µπορούν να ξεχωρίσουν την καρδιακή από την σκελετική προέλευση, οι τροπονίνες θεωρούνται πλέον οι πιο ειδικοί βιολογικοί δείκτες για την διάγνωση του εµφράγµατος µυοκαρδίου. Όταν συγκρίνουµε τη διαγνωστική ικανότητα της τροπονίνης σε σχέση µε την CK-MB, πρέπει να έχουµε υπόψη µας ότι οι τροπονίνες µπορούν να διακρίνουν ακόµα και µικρής έκτασης έµφραγµα, κι έτσι να δώσουν «ψευδώς θετικά» αποτελέσµατα αν χρησιµοποιήσουµε την CK-MB ως µέθοδο εκλογής της διάγνωσης του εµφράγµατος µυοκαρδίου. Η προγνωστική αξία της τροπονίνης είναι ανεξάρτητη από άλλους παράγοντες κινδύνου, όπως η ηλικία και οι ηλεκτροκαρδιογραφικές αλλοιώσεις ή τον κλασσικό δείκτη CK-MB [165] C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) Σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως λοιµώξεις, καταστροφή ιστών, µη ειδικές φλεγµονές, παρατηρείται αύξηση ή µείωση των συγκεντρώσεων ορισµένων πρωτεϊνών του αίµατος. Οι µεταβολές αυτές προηγούνται των κλινικών συµπτωµάτων και οι πρωτεΐνες επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα κατά το στάδιο της επούλωσης ή της ανάρρωσης. Επειδή οι µεταβολές συµπίπτουν µε την οξεία φάση της εισβολής της νόσου, ονοµάσθηκαν πρωτεΐνες οξείας φάσης [182]. Είναι γλυκοπρωτεΐνες µε διαφορετικές λειτουργίες και ποικίλες φυσικοχηµικές ιδιότητες. Όλες σχεδόν παρουσιάζουν µεγάλη περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες. Η σύνθεση των περισσότερων γίνεται στα ηπατοκύτταρα, στα λευκά αιµοσφαίρια, καθώς και στα κύτταρα του µονοπυρηνικού φαγοκυτταρικού συστήµατος. Η παραγωγή των πρωτεϊνών οξείας φάσης, µετά από ένα ερέθισµα, δεν αρχίζει ταυτόχρονα. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών οξείας φάσης αποτελούν χρήσιµους εργαστηριακούς δείκτες διάγνωσης, πρόγνωσης και 90

91 παρακολούθησης της θεραπευτικής αντιµετώπισης πολλών νοσηµάτων και καταστάσεων. Η σηµαντικότερη από τις πρωτεΐνες οξείας φάσης είναι η C- αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP). Πρωτοπεριγράφηκε το 1930, από τους Tillet και Francis, οι οποίοι παρατήρησαν ότι οροί ασθενών µε πνευµονία αντιδρούσαν µε τον C πολυσακχαρίτη του πνευµονιόκοκκου. Το 1941, οι Avery και συνεργάτες, παρατήρησαν ότι η CRP χρειάζεται ιόντα ασβεστίου για να αντιδράσει µε τον C-πολυσακχαρίτη. Η CRP κατά την ηλεκτροφόρηση εστιάζεται στην περιοχή των γ-σφαιρινών, έχει Μ.Β Daltons, δεν περνάει τον πλακουντιακό φραγµό, δεν ανιχνεύεται στο µητρικό γάλα, ενώ ανιχνεύεται στον ορό όλων των ατόµων, ανεξάρτητα φύλου και ηλικίας. Η φλεγµονή χαρακτηρίζει όλες τις φάσεις αθηροθρόµβωσης και παρέχει µια κρίσιµη παθοφυσιολογική σύνδεση µεταξύ του σχηµατισµού της πλάκας και της οξείας ρήξης, που οδηγεί σε απόφραξη και έµφραγµα [183]. Ο σχηµατισµός των λιπωδών ραβδώσεων που απoτελεί την πρώτη φάση της αθηρογένεσης, περιλαµβάνει τη µετανάστευση λευκοκυττάρων, εξαιτίας της έκφρασης µορίων προσκόλλησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία µε τη σειρά τους ενεργοποιούνται από φλεγµονώδεις κυτοκίνες, όπως η ιντερλευκίνη-1 και ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων α (TNF-α). Η επακόλουθη µετανάστευση των φλεγµονωδών κυττάρων στον υποενδοθηλιακό χώρο απαιτεί χηµειοτακτισµό. Τα µονοπύρηνα κύτταρα σ αυτήν την αρχική διείσδυση καθώς και τα εγγενή αγγειακά κύτταρα, απελευθερώνουν στη συνέχεια αυξητικούς παράγοντες που διεγείρουν τον πολλαπλασιασµό των λείων µυϊκών κυττάρων και οδηγούν στην εξέλιξη της πλάκας. Οι θροµβωτικές επιπλοκές των πλακών συχνά περιλαµβάνουν τη φυσική ρήξη, που συνδέεται συνήθως µε σηµεία τοπικής και συστηµατικής φλεγµονής [184]. Επιπλέον, οι αρχικές προφλεγµονώδεις κυτοκίνες έχουν ως αποτέλεσµα την έκφραση κυτοκινών αγγελιοφόρων, όπως η ιντερλευκίνη-6, που µπορούν να µετακινηθούν από τις τοπικές περιοχές της φλεγµονής στο ήπαρ, όπου προκαλούν µια µεταβολή στο πρόγραµµα πρωτεΐνικής σύνθεσης, χαρακτηριστική της απόκρισης οξείας φάσης. Ο δραστικός παράγοντας της οξείας φάσης CRP, ένας απλός γενικός δείκτης της φλεγµονής, έχει αναδειχθεί πλέον ως ένας σηµαντικός καρδιαγγειακός παράγοντας κινδύνου [185]. Αποτελούµενος από πέντε υποµονάδες των 23 KD, η CRP που µετακινείται µέσω της κυκλοφορίας, διαδραµατίζει έναν σηµαντικό ρόλο στην ανθρώπινη εγγενή ανοσολογική απόκριση. Αν και συντίθεται κυρίως στο ήπαρ, πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν ότι τα κύτταρα στις ανθρώπινες στεφανιαίες αρτηρίες, ιδιαίτερα στον αρτηριοσκληρωτικό έσω χιτώνα, µπορούν να παράγουν CRP [186,187]. Στην πρωτογενή πρόληψη, µια µεγάλη σειρά προοπτικών επιδηµιολογικών µελετών έχει δείξει µε σαφήνεια ότι η CRP, όταν µετράται µε τις νέες αναλύσεις υψηλής ευαισθησίας προβλέπει ισχυρά και ανεξάρτητα τον κίνδυνο για έµφραγµα του µυοκαρδίου, εγκεφαλικό 91

92 επεισόδιο, περιφεριακή αρτηριακή νόσο και αιφνίδιο καρδιακό θάνατο [188, ]. Επιπλέον, αρκετές µελέτες έχουν δείξει ότι η CRP προσθέτει σηµαντική προγνωστική αξία σ όλα τα επίπεδα κινδύνου όπως καθορίζονται από τη βαθµολογία Framingham Risk Score [188,194]. Επιπρόσθετα δεδοµένα που επιβεβαιώνουν την ικανότητα της CRP να προβλέπει τον αγγειακό κίνδυνο µετά από στάθµιση των παραδοσιακών παραγόντων κινδύνου, έχουν παρασχεθεί από αρκετές µεγάλες µελέτες τόσο στις Ηνωµένες Πολιτείες όσο και στην Ευρώπη [195,196]. Ο κίνδυνος αυτός ενισχύεται όχι µόνο µετά από στάθµιση των συµµεταβλητών της Framingham αλλά και µετά από τον πρόσθετο έλεγχο για διαβήτη, τριγλυκερίδια, δείκτη σωµατικής µάζας και δείκτες της πνευµονικής λειτουργίας [197]. Κυρίως µε βάση τα δεδοµένα αυτά, η Αµερικανική Καρδιολογική Εταιρία και τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης των Ασθενειών, εξέδωσαν πρόσφατα τις πρώτες οδηγίες για τη χρήση της CRP στην κλινική πρακτική [198]. Επίπεδα της CRP µικρότερα από 1, από 1 έως 3 και µεγαλύτερα από 3mg/L θα πρέπει να ερµηνεύονται ως χαµηλός, µέτριος και υψηλός αγγειακός κίνδυνος αντίστοιχα. Ωστόσο, οι µόνιµα υψηλές τιµές αντιπροσωπεύουν πολύ υψηλό κίνδυνο για µελλοντική καρδιαγγειακή νόσο, επειδή ο κίνδυνος εµφανίζει γραµµική συσχέτιση σ όλο το εύρος τιµών της CRP. Επιπλέον, η CRP έχει προγνωστική αξία σε περιπτώσεις ισχαιµίας ακόµη και χωρίς αύξηση της τροπονίνης, δεδοµένα που υποστηρίζουν ότι µια ενισχυµένη φλεγµονώδης απόκριση µπορεί να καθορίσει την επακόλουθη ρήξη πλακών. Από τους διαθέσιµους νέους παράγοντες κινδύνου, η CRP έχει το µεγαλύτερο µέγεθος προγνωστικής αξίας. Σε αντίθεση µε άλλες πρωτεΐνες οξείας φάσης, η CRP προσθέτει σηµαντική προγνωστική αξία στη συνολική εκτίµηση του κινδύνου. Ωστόσο, είναι σηµαντικό να αναγνωρισθεί ότι καµία ένδειξη µέχρι σήµερα δεν έχει δείξει ότι η µείωση της CRP, αυτή καθαυτή, θα µειώσει τον αγγειακό κίνδυνο. Εντούτοις, η διακοπή του καπνίσµατος, η απώλεια βάρους, η διατροφή και η άσκηση µειώνουν τα επίπεδα της CRP, ενώ µειώνουν επίσης και τον καρδιακό κίνδυνο. Τα επίπεδα CRP σχετίζονται µόνο µέτρια µε την υποκείµενη αρτηριοσκληρωτική νόσο, όπως µετράται από το πάχος του έσω-µέσου χιτώνα της καρωτίδας ή από την παρουσία ασβεστίου στα στεφανιαία. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζει ότι η CRP δεν αντανακλά απλά την παρουσία υποκλινικής νόσου, αλλά µάλλον δείχνει µια αυξηµένη ροπή για ρήξη της πλάκας και /ή θρόµβωση. Λαµβάνοντας υπόψη την ισχύ των εργαστηριακών και επιδηµιολογικών ενδείξεων και το χαµηλό κόστος της εξέτασης, η CRP θεωρείται βασικό τµήµα της πρόγνωσης του στεφανιαίου κινδύνου. Η αξιολόγηση της CRP µπορεί, σε συνδυασµό µε τα επίπεδα της LDLχοληστερόλης, να προσδιορίσει τους πληθυσµούς υψηλού κινδύνου και να δώσει πρόσθετο κίνητρο στο γιατρό για την εφαρµογή επιθετικής πρωτογενούς πρόληψης. 92

93 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 93

94 94

95 9. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9.1 Σκοπός Το µέγιστο κλινικό ενδιαφέρον των COX-2 αναστολέων είναι ότι ανακουφίζουν συµπτώµατα οστεοαρθρίτιδας, ρευµατοειδούς αρθρίτιδας, οξέος πόνου και φλεγµονής όπως και τα ΜΣΑΦ, ενώ συγχρόνως έχουν συνδεθεί µε πολύ λιγότερα περιστατικά γαστρεντερικής αιµορραγίας, κυρίως σε ηλικιωµένα άτοµα. Οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς, όπως η ροφεκοξίµπη, µε το βελτιωµένο προφίλ τους ως προς τη γαστρεντερική τοξικότητα, έχουν καθιερωθεί από το 1999 ως η ασφαλέστερη εναλλακτική επιλογή σε σχέση µε τα κλασσικά µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη (ΜΣΑΦ). Από τα τέλη του 2000 όµως, εµφανίστηκαν σοβαρές υποψίες ως προς την καρδιοτοξικότητα αυτών των φαρµάκων. Ενοχοποιήθηκαν σοβαρά για αυξηµένο κίνδυνο θροµβοεµβολικών επεισοδίων, χάρη στην αγγειοσυσπαστική και προθροµβωτική τους δράση. Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να µελετηθεί η επίδραση της ουσίας ροφεκοξίµπης, ως σηµαντικός εκπρόσωπος των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων, στο µυοκάρδιο καθώς και οι ανεπιθύµητες ενέργειες της ουσίας αυτής στο καρδιαγγειακό σύστηµα των επίµυων. Η επίδραση της ροφεκοξίµπης στα πειραµατόζωα µελετήθηκε τοξικολογικά, βιοχηµικά και ιστολογικά. Συγκεκριµένα, στο τοξικολογικό µέρος ανιχνεύθηκαν οι συγκεντρώσεις της ροφεκοξίµπης στον ορό αίµατος µετά την υποδόρια χορήγησή της σε 4 οµάδες επίµυων για το χρονικό διάστηµα των 10, 20, 30 και 45 ηµερών αντίστοιχα. Στο βιοχηµικό µέρος µελετήθηκε η επίδραση της ροφεκοξίµπης στους κλασσικούς βιοχηµικούς δείκτες της καρδιαγγειακής και µεταβολικής δυσλειτουργίας ενώ, τέλος στο ιστολογικό µέρος αναζητήθηκαν τυχόν ιστολογικές αλλοιώσεις στο µυοκαρδιακό ιστό των πειραµατοζώων µε τη βοήθεια του οπτικού µικροσκοπίου. 9.2 Υλικά και µέθοδοι Η έρευνα πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρµακολογίας καθώς και στο Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, όπου έγιναν η πειραµατική χορήγηση της ροφεκοξίµπης και οι τοξικολογικές αναλύσεις στα δείγµατα του αίµατος των επίµυων αντίστοιχα. Τα πειράµατα στους επίµυες που έγιναν κατά τη διάρκεια αυτής της διατριβής είχαν την έγκριση (αριθµ. Πρωτ.13/8711) της ιεύθυνσης Κτηνιατρικής Υπηρεσίας Θεσσαλονίκης και πραγµατοποιήθηκαν σύµφωνα µε τις διατάξεις του Ν.1197/81 περί «Προστασίας των Ζώων» 95

96 άρθρο 4, του Ν.2015/92 περί «Κυρώσεως της Ευρωπαϊκής Σύµβασης για την Προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιµοποιούνται για πειραµατικούς ή άλλους επιστηµονικούς σκοπούς» και τις διατάξεις του Π. 160/91 περί «Προστασίας των ζώων που χρησιµοποιούνται για πειραµατικούς ή άλλους επιστηµονικούς σκοπούς, σε συµµόρφωση µε την οδηγία 86/609/ΕΟΚ του Συµβουλίου». Τα πειραµατόζωα που χρησιµοποιήθηκαν στους πειραµατισµούς ήταν επίµυες της φυλής Wistar και η προς µελέτη ουσία χορηγήθηκε σε 4 σειρές αρσενικών επίµυων. Όλοι οι επίµυες ήταν ενήλικοι 12 εβδοµάδων, βάρους 300g, υγιείς και προέρχονταν από εκτροφή του Εργαστηρίου Φαρµακολογίας του Α.Π.Θ. Τα ζώα διαβιούσαν σε κλουβιά από πολυπροπυλένιο που είχαν στρωµνή από ροκανίδι, το οποίο δεν είχε υποστεί καµία χηµική κατεργασία, σε ειδικά διαµορφωµένο χώρο στο εργαστήριο Φαρµακολογίας του Α.Π.Θ. Η φύλαξη-στέγαση των ζώων γινόταν σε χώρο αποµονωµένο και καλά αεριζόµενο, µε θερµοκρασία ο C και συνθήκες φωτισµού-σκότους 12 ώρες φως/24ωρο. Κατά τη διάρκεια των πειραµατισµών, τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό, ενώ η τροφή τους είχε τη µορφή συµπήκτων (pellets) ενδεδειγµένων για τρωκτικά µε γνωστή σταθερή και συγκεκριµένη σύσταση (ΕΛ.ΒΙ.Ζ., συγκέντρωση µετάλλων/kg τροφή: 7,5mg Cu, 50mg Zn, 50mg Mg, 10g Ca). Κατά τη διάρκεια όλων των πειραµάτων, οι επίµυες ζυγίζονταν κάθε 3 ηµέρες για τυχόν µεταβολή του βάρους τους και έτσι τροποποιούνταν κάθε φορά η δόση χορήγησης ανάλογα µε το βάρος τους. Στην εκκίνηση των πειραµάτων, όλα τα ζώα είχαν το ίδιο βάρος. Στο τέλος κάθε σειράς πειραµάτων γινόταν συλλογή δειγµάτων αίµατος. Ακολουθούσε η θανάτωση των ζώων µε έκθεσή τους σε διαιθυλαιθέρα, η παρασκευή των προς µελέτη ιστών και οργάνων, η κατεργασία τους και στη συνέχεια η ανάλυσή τους. Στην τοξικολογική ανάλυση και για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης στον ορό αίµατος των πειραµατόζωων χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Το βιοχηµικό µέρος της διατριβής βασίστηκε στην ανάλυση συγκεκριµένων βιοχηµικών παραµέτρων, που η αύξηση των συγκεντρώσεων τους στο αίµα πιστοποιεί τις ανεπιθύµητες δράσεις της ροφεκοξίµπης στο καρδιαγγειακό σύστηµα και θα αναλυθούν παρακάτω. Για τη µέτρηση αυτών των παραµέτρων χρησιµοποιήθηκαν οι κλασσικές φασµατοφωτοµετρικές και ανοσοχηµικές µέθοδοι. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων των βιοχηµικών παραµέτρων που µελετήθηκαν στο αίµα των πειραµατόζωων αξιολογήθηκαν µετά από σύγκριση µε τα αντίστοιχα αποτελέσµατα που προέρχονταν από µάρτυρες, µε τη βοήθεια της στατιστικής αναλυτικής µεθόδου της ανάλυσης της διακύµανσης (ANOVA-Analysis of Variance). Τέλος, στο µυοκαρδιακό ιστό των πειραµατοζώων αναζητήθηκαν ιστολογικές αλλοιώσεις µε το οπτικό µικροσκόπιο, αφού πρώτα 96

97 προηγήθηκε η επεξεργασία των ιστών µε τη χρώση αιµατοξυλίνηςεωσίνης. 9.3 Χορήγηση ροφεκοξίµπης ο Πείραµα Για την πραγµατοποίηση του πειράµατος χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 23 πειραµατόζωα. Όλοι οι επίµυες ήταν ηλικίας 3 περίπου µηνών και είχαν σωµατικό βάρος 300g. Η ροφεκοξίµπη χορηγήθηκε υποδόρια στους επίµυες σε τοξική δόση 25mg/kg B.Σ. Πραγµατοποιήθηκαν 4 σειρές πειραµάτων. Στο πρώτο πείραµα χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 10 επίµυες (7 πειραµατόζωα και 3 µάρτυρες) και χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη εφάπαξ καθηµερινά για 10 ηµέρες. Η επιλογή της δόσης και της οδού χορήγησης έγινε µε βάση τα θεραπευτικά και τα τοξικά όρια της πρότυπης ουσίας. Στη βιβλιογραφία, ως θεραπευτική δόση στον επίµυ αναφέρεται αυτή των 10mg/kg Β.Σ, ενώ ως τοξική δόση επιλέχθηκε τουλάχιστον διπλάσια δόση απ αυτή και χορηγήθηκαν 25mg/kg Β.Σ. Η πρόσβαση στο νερό και στην τροφή ήταν πάντα ελεύθερη. Τα κλουβιά στα οποία φυλάσσονταν παρέµεναν στον ίδιο χώρο µε σταθερή θερµοκρασία-υγρασία και σταθερές συνθήκες φωτισµού-σκότους, ενώ η στρωµνή από ροκανίδι αλλάζονταν καθηµερινά ώστε ο προσωπικός τους χώρος µέσα στα µεταβολικά κλουβιά να είναι καθαρός. Επειδή η πρότυπη ουσία διατίθεται στο εµπόριο σε στερεά µορφή (δισκία), το δισκίο της ροφεκοξίµπης που περιέχει 25mg από τη δραστική ουσία µετά από κονιοποίηση σε ιγδίο, αναµιγνυόταν µε 4,5ml NaCl 0,9% και µετά από κατάλληλη ανάµιξη και κατεργασία για 5-10 λεπτά της ώρας εως ότου γίνει ένα οµοιογενές µίγµα, ενιόταν 1,5ml από το διάλυµα που προέκυπτε υποδόρια σε κάθε ένα από τα 7 πειραµατόζωα. Στους 3 µάρτυρες χορηγήθηκε 1,5ml NaCl 0,9% υποδόρια (subcutaneously: s.c) για όλο το χρονικό διάστηµα των 10 ηµερών. Η υποδόρια οδός χορήγησης επιλέχθηκε ως πιο εύκολη στο χειρισµό, προσιτή και ενδεδειγµένη. Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία κατεργασίας πριν τη χορήγηση του διαλύµατος. Τα ζώα που είχαν περίπου το ίδιο βάρος, όπως και στην αρχή του πειράµατος, θυσιάστηκαν µετά από 10 ηµέρες και 17 ώρες µετά την τελευταία δόση χορήγησης της ροφεκοξίµπης µε βάση την ηµιπερίοδο ζωής της πρότυπης ουσίας ο Πείραµα Στην δεύτερη σειρά πειραµάτων χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 8 επίµυες (6 πειραµατόζωα και 2 µάρτυρες). Όλοι οι επίµυες ήταν 97

98 αρσενικοί, υγιείς, 3 περίπου µηνών και είχαν σωµατικό βάρος 300g, ενώ µε το τέλος του πειράµατος ζύγιζαν g. Στα 6 πειραµατόζωα χορηγούνταν υποδόρια (s.c) η ροφεκοξίµπη για συνολικό διάστηµα 20 ηµερών καθηµερινά µία φορά την ηµέρα σε δόση 25mg/kg Β.Σ. Στους άλλους 2 µάρτυρες ενέθηκε µόνο NaCl 0,9%-1,5ml σε καθένα απ αυτά για 20 συνεχόµενες ηµέρες. Κατά τη διάρκεια των 20 αυτών ηµερών, τα πειραµατόζωα έπρεπε να παραµένουν καθαρά και καλώς συντηρηµένα. Οι συνθήκες διαβίωσης των πειραµατοζώων διατηρήθηκαν ίδιες όπως στο 1 ο πείραµα. Τα ζώα θυσιάστηκαν 17 ώρες µετά την τελευταία χορήγηση της ροφεκοξίµπης την 21 η ηµέρα ο Πείραµα Για το πείραµα αυτό χρησιµοποιήθηκαν άλλοι 8 επίµυες (6 πειραµατόζωα και 2 µάρτυρες). Όλοι οι επίµυες ήταν αρσενικοί, υγιείς, 3 περίπου µηνών και είχαν σωµατικό βάρος στο τέλος του πειράµατος που κυµαίνονταν µεταξύ 350 και 370g. Η ροφεκοξίµπη χορηγήθηκε υποδόρια (s.c) στα 6 πειραµατόζωα για 30 ηµέρες εφάπαξ στην ίδια δόση όπως και στα άλλα 2 πειράµατα. Για την κατεργασία του χορηγούµενου διαλύµατος, ακολουθήθηκε η ίδια ακριβώς διαδικασία. Για 30 ηµέρες συνεχόµενα, χορηγήθηκε 1,5ml διαλύµατος ροφεκοξίµπης αραιωµένο σε NaCl 0,9% εφάπαξ στα 6 πειραµατόζωα, ενώ στους 2 µάρτυρες χορηγήθηκε placebo 1,5ml για το ίδιο χρονικό διάστηµα. Η υποδόρια χορήγηση της ροφεκοξίµπης γινόταν πάντα την ίδια περίπου χρονική στιγµή κάθε µέρα στο διάστηµα των 30 αυτών ηµερών. Τα ζώα θυσιάστηκαν 17 ώρες µετά την τελευταία χορήγηση της ροφεκοξίµπης στο τέλος των 30 ηµερών ο Πείραµα Στο πείραµα αυτό το οποίο διήρκεσε 45 ηµέρες ακολουθήθηκε η ίδια ακριβώς διαδικασία. Χρησιµοποιήθηκαν 8 επίµυες (6 πειραµατόζωα και 2 µάρτυρες). Κατά τη διάρκεια όµως του πειράµατος αυτού και από άγνωστη αιτία ένας από τους επίµυες-πειραµατόζωα στα οποία χορηγούνταν το φάρµακο βρέθηκε νεκρό µέσα στο κλουβί. Έτσι οι µετρήσεις έγιναν σε 5 πειραµατόζωα και 2 µάρτυρες. Το σωµατικό βάρος των επίµυων κατά τη θανάτωση κυµαίνονταν µεταξύ 370 και 385g. Μετά από 45 ηµέρες και 17 ώρες µετά την τελευταία χορήγηση της ροφεκοξίµπη, τα ζώα θανατώθηκαν µετά από έκθεσή τους σε διαιθυλαιθέρα. 98

99 9.4 Συλλογή δειγµάτων Κατά τη διάρκεια των πειραµατισµών δεν παρατηρήθηκε µεταβολή στη συµπεριφορά των πειραµατόζωων, ούτε παρατηρήθηκε κάποιος τραυµατισµός. Αξίζει όµως να σηµειωθεί, ότι την 25 η ηµέρα και κατά τη διάρκεια του τέταρτου πειράµατος σηµειώθηκε ένας αιφνίδιος θάνατος. Στο τέλος των πειραµατισµών, τα ζώα θυσιάζονταν µε έκθεσή τους σε διαιθυλαιθέρα. Λίγο πριν από το θανάτωσή τους γινόταν συλλογή δείγµατος ολικού αίµατος από την καρδία µε παρακέντηση µε βελόνη και σύριγγα. Τα δείγµατα του αίµατος, µετά από καταγραφή του όγκου τους, ο οποίος κυµαίνονταν στα 5-6ml φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 στροφές (rpm) για 5 λεπτά της ώρας και αποµονώθηκε ορός. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα δείγµατα ορού αίµατος φυλάσσονταν µέσα σε σφραγισµένους γυάλινους δοκιµαστικούς σωλήνες σε καταψύκτη (-18 ο C) µέχρι την ανάλυσή τους. Μετά το θάνατο των ζώων αφαιρούνταν: η καρδία, το ήπαρ, οι πνεύµονες, ο στοµάχος και οι νεφροί. Τα όργανα αυτά επιλέχθηκαν έτσι ώστε να αντιπροσωπεύουν τα βασικότερα συστήµατα του οργανισµού. Τα δείγµατα από τους ιστούς και τα όργανα τοποθετούνταν σε φιαλίδια από πολυαιθυλένιο µέσα σε ουδέτερη φορµόλη 10% και µετά από 1 βδοµάδα µονιµοποίηση µέσα στη φορµόλη, τα δείγµατα ήταν έτοιµα για κατεργασία και παρατήρηση µε το οπτικό µικροσκόπιο. Όλα τα εργαλεία που χρησιµοποιούνταν (λαβίδες, νυστέρια, ψαλίδια) ήταν κατασκευασµένα από ανοξείδωτο χάλυβα. 99

100 10. ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 10.1 Επιλογή της µεθόδου ανάλυσης Το πρώτο µέρος της διατριβής περιλαµβάνει την τοξικολογική ανάλυση, στην οποία πραγµατοποιείται η ανίχνευση της συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης στον ορό των επίµυων µετά τη χορήγησή της στο χρονικό διάστηµα των 10, 20, 30 και 45 ηµερών. Προσδιορίζεται επίσης το όριο ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικής εκτίµησης (LOQ) για την ανιχνευόµενη ουσία καθώς και η επαναληψιµότητα (RSD) της µεθόδου που χρησιµοποιήθηκε. Στην ενότητα αυτή, πραγµατοποιείται η ανάπτυξη της µεθόδου, η ανάλυση των φαρµάκων αλλά και των δειγµάτων µε την µέθοδο της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης ή HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Η παραπάνω τεχνική, όπως αναφέρθηκε και στο θεωρητικό µέρος, είναι ευρέως διαδεδοµένη καθώς στις µέρες µας αποτελεί το κυριότερο κοµµάτι µιας αναλυτικής διαδικασίας, από αναλύσεις ρουτίνας εως εξαιρετικά εξειδικευµένες αναλύσεις, οι οποίες απαιτούν µεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία στους υπολογισµούς. H τεχνική HPLC προτιµήθηκε σε σχέση µε την αέριο χρωµατογραφία (Gas Chromatography), γιατί παρουσιάζει καλύτερη χρωµατογραφική συµπεριφορά, κυρίως για µη πτητικές ενώσεις ή ουσίες µε µεγάλο Μ.Β. Η ακρίβεια, η ευαισθησία, το µικρό κόστος απόκτησης αλλά και συντήρησης καθώς και ο µικρός χρόνος που απαιτείται για τη λήψη αποτελεσµάτων, την έχουν κατατάξει στις πλέον διαδεδοµένες τεχνικές ενόργανης χηµικής ανάλυσης. Στα πλεονεκτήµατα της συγκεκριµένης τεχνικής ανήκουν ακόµη η ταχύτητα της ανάλυσης, το ευρύτατο πεδίο της εφαρµογής της (το µεγαλύτερο από οποιαδήποτε άλλη τεχνική), η επαναληψιµότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων της. Συγχρόνως, η µέθοδος HPLC βρίσκεται πιο κοντά στο βιολογικό πείραµα. Κατά τη διάρκεια της µελέτης και στην προσπάθεια ανάπτυξης µιας µεθόδου, η οποία θα συγκέντρωνε όσο το δυνατόν περισσότερα από τα πλεονεκτήµατα, τα οποία χαρακτηρίζουν τις ενόργανες αναλυτικές µεθόδους, δοκιµάστηκαν διάφορες µέθοδοι προκατεργασίας των δειγµάτων. Μία από αυτές ήταν η εκχύλιση στερεάς φάσης (solid phase extraction, SPE) και αναφέρεται, σε αντίθεση µε τις άλλες, καθώς αποτελεί µια πολύ γνωστή τεχνική η οποία όµως δεν απέδωσε για τη συγκεκριµένη ανάλυση. Στη συνέχεια, αναπτύσσονται οι δοκιµές, οι οποίες πραγµατοποιήθηκαν πριν την τελική επιλογή της µεθόδου, καθώς επίσης τα όργανα και οι διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν στα διάφορα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας. Προσδιορίζονται µε λεπτοµέρεια οι συνθήκες στις οποίες πραγµατοποιήθηκε η ανάλυση 100

101 καθώς και τα αποτελέσµατα της µεθόδου µε διαγράµµατα, χρωµατογραφήµατα και τους απαιτούµενους υπολογισµούς. Η µέθοδος που τελικά επιλέχθηκε για την ανάλυση είναι µία απλή ισοκρατική µέθοδος χωρίς δαπανηρά αλλά ευκόλως προµηθευόµενα αντιδραστήρια, χωρίς να απαιτούνται ιδιαίτερα πολύπλοκες διατάξεις ή όργανα και αναλώσιµα, τα οποία δύσκολα βρίσκει κάποιος σε ένα εργαστήριο. Πρόκειται δηλαδή για µια απλή, οικονοµική µέθοδο, η οποία µπορεί πολύ εύκολα να εφαρµοστεί στην πράξη Όργανα Τα όργανα που χρησιµοποιήθηκαν στα διάφορα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας είτε στις δοκιµές είτε στην τελική µέθοδο HPLC αναφέρονται παρακάτω: Αντλίες: Aντλία Spectroflan 400 JASCO. Ανιχνευτές: 1) Aνιχνευτής JASCO UVIDEC-100-IV UV SPECTROPHOTOMETER 2) D2 Lamp φθορισµοµετρικός ανιχνευτής FASMA 502 (Rigas Labs), για τις δοκιµές που πραγµατοποιήθηκαν, στην προσπάθεια εξέτασης του φθορισµού των ενώσεων. ιαχωριστικές στήλες: Xρωµατογραφική στήλη Kromasil C18, διαστάσεων 5µm, 250x4mm. Kαταγραφικό: DAQ Software for chemists Microsoft Visual Basic. Άλλα όργανα: 1) Συσκευή εξάτµισης µε ρεύµα αζώτου Reacti-Vap 2) Φυγόκεντρος Hermle Z230 3) Συσκευή VORTEX GLAS-COL, TERRE HAUTE, IN ) Λουτρό υπερήχων ultrasonic 460/H της εταιρίας ELMA Υλικά Οι κυριότεροι διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν σ όλα τα στάδια της πειραµατικής αναλυτικής διαδικασίας καθώς και στις δοκιµές είναι οι εξής: Mεθανόλη (αναλυτικώς καθαρή, οίκος Merck): Η µεθανόλη χρησιµοποιήθηκε ευρέως στην παρούσα εργασία, είτε ως διαλύτης, είτε ως κινητή φάση. Χρησιµοποιήθηκε ακόµη και για τις διάφορες πλύσεις αλλά βρήκε εφαρµογή και για την ενεργοποίηση του υλικού κατά τις δοκιµασίες µε SPE. 101

102 Ακετονιτρίλιο (αναλυτικώς καθαρό, οίκος Merck): Επικράτησε ως η οργανική φάση και µαζί µε το οξικό αµµώνιο αποτελούν το υγρό έκλουσης που χρησιµοποιήθηκε για την εκπόνηση αυτής της διατριβής. Χρησιµοποιήθηκε ως διαλύτης των προτύπων ενώσεων, για διάφορες πλύσεις και τέλος δοκιµάστηκε ως οργανική φάση στο υγρό έκλουσης. Ακόµη χρησιµοποιήθηκε και κατά τις δοκιµές µε SPE (εκχύλιση στερεάς φάσης ). Οξικό αµµώνιο (πρότυπη ουσία, κρυσταλλική µορφή): Αποτέλεσε την υδατική φάση του υγρού έκλουσης. Πρόκειται για υδατικό διάλυµα από διάλυση κρυσταλλικής πρότυπης ένωσης. Οξικό οξύ (πρότυπο υδατικό διάλυµα): Χρησιµοποιήθηκε σε ποσοστό 1% επί της κινητής φάσης για την οξίνισή της. Υδροχλωρικό οξύ: Χρησιµοποιήθηκε για την υδρόλυση των πρωτεϊνών και κατ επέκταση για την παραλαβή της ποσότητας της ένωσης, η οποία δεσµεύθηκε από αυτές, ώστε να µετρηθεί και να βρεθεί το ποσοστό δέσµευσης του φαρµάκου, καθώς µε τη µέθοδο της SPE δεν υπήρχαν ικανοποιητικά αποτελέσµατα. Καθαρό νερό: Eπειδή σε µια αναλυτική µέθοδο είναι απαραίτητη η χρήση πολύ καθαρών αντιδραστηρίων, το νερό της βρύσης αφού πέρασε από ιονανταλλακτικές ρητίνες, στη συνέχεια διηθήθηκε µε τη βοήθεια φίλτρου 20µm Schleicher & Schuel και υδραντλίας κενού. Έτσι προέκυψε νερό υψηλής καθαρότητας, κατάλληλο στην HPLC. Πρότυπη ουσία ροφεκοξίµπης (σε µορφή κόνης): Η πρότυπη ουσία, απαραίτητη για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης αναφοράς και τον ποσοτικό προσδιορισµό, παρελήφθη µε τη µορφή λευκής κόνης οκιµές πριν την επιλογή της κατάλληλης µεθόδου Ακολούθως, περιγράφονται οι δοκιµές που πραγµατοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραµάτων. Οι δοκιµές αυτές αποτελούν σηµαντικό µέρος της πειραµατικής διαδικασίας καθώς οδήγησαν τελικά στην επιλογή και ανάπτυξη των κατάλληλων συνθηκών ανάλυσης. Παρατίθενται ακόµη στοιχεία τεκµηρίωσης του λόγου για τον οποίο απορρίφθηκαν οκιµές για την κατάλληλη κινητή φάση Πραγµατοποιήθηκαν κυρίως για την εύρεση ενός συστήµατος, το οποίο θα επέτρεπε την ανίχνευση των ενώσεων σε συγκεκριµένο χρόνο και θα έδινε ικανοποιητικά σε µορφή χρωµατογραφήµατα, δηλαδή χρωµατογραφήµατα που να ικανοποιούν δυο κριτήρια: α) οι κορυφές 102

103 τους να παρουσιάζονται σε εύλογο χρονικό διάστηµα, µε σύντοµο χρόνο συγκράτησης (Retention time, Rt) και β) να είναι οξείες οι κορυφές των ουσιών που καταγράφονται, χωρίς υπολειπόµενο ίχνος. O χρόνος συγκράτησης (Rt), µιας ουσίας, είναι ο χρόνος που µεσολαβεί από την εισαγωγή της ουσίας στη χρωµατογραφική στήλη (ή άλλου είδους στατική φάση) µέχρι την έκλουσή της, δηλαδή µέχρι την κορυφή της καµπύλης, της καµπύλης του Gauss, δηλαδή ο χρόνος που απαιτείται για να εξέλθει ένα συστατικό από τη στήλη και να φθάσει στον ανιχνευτή. Πρόκειται για τον χρόνο έκλουσης του µεγίστου της κορυφής. Στη συνέχεια, τα χρωµατογραφήµατα ελέγχονταν ως προς την ανταπόκριση στον ανιχνευτή από τη µορφή της καταγραφής, ως ύψος τριγώνου ή κορυφής (peak height=κορυφή). Το ύψος κορυφής (h, peak height) είναι η απόσταση του µεγίστου της καµπύλης Gauss από τη βάση της, κάθετα στον άξονα του χρόνου. Αρχικά δοκιµάστηκε ένα σύστηµα CH 3 OH-CH 3 COONH 4 0,05M σε διάφορες αναλογίες οργανικής-υδατικής φάσης. Οι κορυφές ήταν στον επιθυµητό χρόνο, η µορφή τους όµως δεν ήταν ικανοποιητική καθώς εµφανιζόταν υπολειπόµενο ίχνος, διεύρυνση δηλαδή της κορυφής τόσο ώστε να µην είναι δυνατή η εµβαδοµέτρηση και κατά συνέπεια ο ποσοτικός προσδιορισµός της ένωσης. οκιµάστηκε στη συνέχεια οξίνιση της κινητής φάσης, χρησιµοποιώντας όξινο φωσφορικό νάτριο (NaHPO 4 ) και ρύθµιση του ph σε όξινη περιοχή. Παρ όλα αυτά τα αποτελέσµατα δεν ήταν τα επιθυµητά. Κατ αυτόν τον τρόπο, η οξίνιση και η ρύθµιση του ph εγκαταλείφθηκε καθώς εισήγαγε ένα ακόµη στάδιο κατά την προετοιµασία της κινητής φάσης, όχι ιδιαίτερα δύσκολο και χρονοβόρο αλλά περισσότερο από την προετοιµασία µιας απλής κινητής φάσης, όπως τελικά επιλέχθηκε. Επειδή, τα χρωµατογραφήµατα µε τη µεθανόλη εξακολουθούσαν να παρουσιάζουν διευρυµένες κορυφές τριγώνου, δοκιµάστηκε η χρήση ακετονιτριλίου (ACN), ενός διαλύτη περισσότερο πολικού από τη µεθανόλη. Οι κορυφές σ αυτή την περίπτωση είχαν πολύ καλύτερη µορφή, δεν εµφανιζόταν υπολειπόµενο ίχνος (tailing) και τα χρωµατογραφήµατα ήταν τα επιθυµητά. Τελικά, µε οξίνιση µε 1% επί του συνολικού όγκου της κινητής φάσης µε CH 3 COOΗ, η αναλογία 48/52% ήταν η καλύτερη επιλογή για τον προσδιορισµό της ροφεκοξίµπης οκιµές ανακρυστάλλωσης Στην τεχνική της χρωµατογραφίας, είναι απαραίτητη η δραστική ουσία ροφεκοξίµπη σε καθαρή µορφή για το σχηµατισµό προτύπων. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε αρχικά ήταν η λήψη ιδιοσκευάσµατος του εµπορίου και η ανακρυστάλλωση της ροφεκοξίµπης [ ]. 103

104 Το πρόβληµα που προέκυψε όµως ήταν το εξής: Στην HPLC, οι κορυφές της πρότυπης ουσίας εµφάνιζαν υπολειπόµενο ίχνος και είχαν πολύ µικρό εµβαδό συγκρινόµενο µε τις αναµενόµενες συγκεντρώσεις των διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν. Ήταν λοιπόν σαφές, πως τίποτα δεν διασφάλιζε ότι οι συγκεντρώσεις των διαλυµάτων ήταν πράγµατι αυτές που υπολογίστηκαν, βάσει της ποσότητας των ενώσεων τις οποίες ισχυριζόταν ο παρασκευαστής του φαρµάκου πως ήταν. Συγκεκριµένα, τίποτα δεν διασφάλιζε πως το χάπι της ροφεκοξίµπης περιείχε 25mg της ένωσης, όπως αναφερόταν στη συσκευασία του σκευάσµατος. Τελικά αποφασίσθηκε η προµήθεια της πρότυπης ουσίας για την παρασκευή των προτύπων διαλυµάτων και όχι η χρήση ανακρυστάλλωσης οκιµές ανίχνευσης ύο ήταν οι διατάξεις ανίχνευσης, οι οποίες δοκιµάστηκαν και οι οποίες προτεινόταν από διάφορους ερευνητές. Συγκεκριµένα, δοκιµάστηκε ανίχνευση µε υπεριώδη ακτινοβολία (UV), η οποία και προτιµήθηκε τελικά και µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή (fluorescence detector). Με τη χρήση UV-ανιχνευτή, το µέγιστο απορρόφησης εµφανιζόταν στα 272nm. Η ανίχνευση µε φθορισµόµετρο προτεινόταν από σαφώς λιγότερους ερευνητές, γι αυτό και δεν επιλέχθηκε από την αρχή οκιµές µε εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) Για να αποµονωθεί η ροφεκοξίµπη από τα βιολογικά δείγµατα και να προσδιορισθεί µε τη µέθοδο HPLC, δοκιµάστηκε η εκχύλιση στερεάς φάσης SPE (Solid Phase Extraction, SPE). Η SPE εφαρµόστηκε στα πρότυπα διαλύµατα ροφεκοξίµπης αλλά και στα βιολογικά δείγµατα ορού αίµατος, τη χρονική στιγµή κατά την οποία ήταν απαραίτητη η κατασκευή πρότυπης καµπύλης για τη µέτρηση της ένωσης ροφεκοξίµπης στα διαθέσιµα δείγµατα. Η SPE αποτελεί µια πολύ καλή µέθοδο για την προκατεργασία του υποστρώµατος και την παραλαβή της ένωσης που µας ενδιαφέρει. Η εκχύλιση στερεάς φάσης υγρού (SPE) είναι µια εφαρµογή της χρωµατογραφίας στήλης, σε µικρή κλίµακα, στην προκατεργασία των δειγµάτων πριν τη χρωµατογραφική ανάλυση. Εφαρµόζεται για την αποµάκρυνση των παρεµποδίσεων και τον καθαρισµό του δείγµατος αλλά και για την προσυγκέντρωση του συστατικού που πρόκειται να 104

105 προσδιοριστεί. Για την ανάλυση βιολογικών δειγµάτων, η συνήθης διαδικασία περιλαµβάνει τα στάδια: α) Αποπρωτεΐνωση του δείγµατος αίµατος, που γίνεται µε προσθήκη οργανικού διαλύτη ή αλλαγή της τιµής του ph και φυγοκέντρηση για την καταβύθιση των πρωτεϊνών. β) ιήθηση, του υγρού που προκύπτει από το προηγούµενο στάδιο. γ) Εκχύλιση, για την παραλαβή των ενώσεων που πρόκειται να αναλυθούν από το δείγµα. Το τελευταίο στάδιο είναι το πιο σηµαντικό, επειδή η παραλαβή των ενώσεων πρέπει να είναι ποσοτική και η αποµάκρυνση των παρεµποδίσεων όσο το δυνατόν µεγαλύτερη. Η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού έχει σηµαντικά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε την κλασική εκχύλιση υγρού-υγρού και γι αυτό το λόγο την έχει υποσκελίσει τα τελευταία χρόνια στην εφαρµογή σε δύσκολους διαχωρισµούς. Παρά το γεγονός ότι δοκιµάστηκαν αρκετά πρωτόκολλα ενεργοποίησης, πλύσης και παραλαβής, καθώς και διάφορα υλικά πλήρωσης των στηλών, τα αποτελέσµατα δεν ήταν ικανοποιητικά. Η ένωση παρέµενε δεσµευµένη από το πλάσµα του αίµατος και δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισµός του πραγµατικού ποσοστού της ένωσης το οποίο δεσµευόταν ή δεν δεσµευόταν από την πρωτεΐνη. Μετά από τις συγκεκριµένες δυσκολίες, εγκαταλείφθηκε η προκατεργασία µε τη συγκεκριµένη µέθοδο. Κατ αυτόν τον τρόπο, µετά από δοκιµές, επιτυχείς αυτή τη φορά, προτιµήθηκε η υδρόλυση των πρωτεϊνών µε 0,1Μ ΗCl ώστε να αποδεσµευθεί η ουσία από αυτές και να µετρηθεί. Συγκεκριµένα, το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είχε ως εξής: Προσθήκη 250 µl ροφεκοξίµπης, 250 µl πλάσµα αίµατος και τέλος 100 µl ΗCl 0,1Μ. Για την περάτωση της υδρόλυσης, τα δείγµατα παρέµειναν σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 24 ώρες. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκαν στις rpm ώστε το στερεό υπόλειµµα, οι πρωτεΐνες δηλαδή, να καταβυθιστούν και να αποµακρυνθούν από το δείγµα. Ακολουθήθηκε απ ευθείας εισαγωγή του υπερκειµένου στη διάταξη της HPLC και ανάλυση του δείγµατος. Οι κορυφές που προέκυψαν ήταν εξαιρετικές χωρίς εµφάνιση διεύρυνσης ή κάποιου άλλου προβλήµατος Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης µε HPLC- Χρωµατογραφικές συνθήκες Ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης στον ορό αίµατος των επίµυων έγινε µε τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Η µέθοδος αυτή επιλέχθηκε ως πιο εύκολη στο χειρισµό, προσιτή και πιο ενδεδειγµένη σε σύγκριση µε τις άλλες µεθόδους στη βιβλιογραφία. Η υγρή χρωµατογραφία εµφανίζει καλύτερη 105

106 χρωµατογραφική συµπεριφορά σε σχέση µε την αέριο για µη πτητικές ενώσεις ή ουσίες µε µεγάλο Μ.Β. Το σύστηµα HPLC που χρησιµοποιήθηκε αποτελούνταν από έναν ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού (UV) µε µήκος κύµατος λ=272nm, µια αναλυτική στήλη χρωµατογραφίας τύπου Chromasil C18 µε διαστάσεις 5µm, 250x4mm ID και ένα καταγραφικό των χρωµατογραφηµάτων, τύπου DAQ Software for Chemists Microsoft Visual Basic. Όλοι οι χρωµατογραφικοί διαχωρισµοί εκτελέστηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου. Η λειτουργία της αντλίας διατηρούσε µια σταθερή ταχύτητα ροής 0,8ml/min του διαλύµατος της κινητής φάσης, µε πίεση 25 MPA διαµέσου της στήλης της χρωµατογραφίας. Η ανίχνευση του σήµατος (peak) της ροφεκοξίµπης επιτυγχάνονταν µε τον ανιχνευτή της υπεριώδους ακτινοβολίας σε µήκος κύµατος λ=272nm. Η ισοκρατική κινητή φάση προετοιµάστηκε ως εξής: Σε 0,05Μ CH 3 COONH 4 προστέθηκε 1% CH 3 COOΗ: ACN µε αναλογία 48/52 (ν/ν) (πίνακας 12). ΠΙΝΑΚΑΣ 12: Χρωµατογραφικές συνθήκες HPLC. Χρωµατογραφική στήλη ΣΥΝΘΗΚΕΣ HPLC-UV Chromasil C18 ιαστάσεις στήλης 250mm x 4mm; 5µm Κινητή φάση Ροή CH 3 COONH 4 /ACN (48/52;(v/v) 0,8 ml/min Ανίχνευση (UV) 272 nm Lοοp 20µl Εισαγόµενο δείγµα (όγκος) 40µl Η προπαρασκευή της καµπύλης του πλάσµατος έγινε µε τη χρήση διαλυµάτων εργασίας µετά από διαδοχικές αραιώσεις πυκνού διαλύµατος ροφεκοξίµπης συγκέντρωσης 110 µg/ml µε µεθανόλη και προέκυψαν µετά από διαδοχικές αραιώσεις τα εξής διαλύµατα εργασίας µε συγκεντρώσεις αντίστοιχα : 50, 44, 25,3, 7,04, 2,816, 1,126, 0,451, 0,180 µg/ml Προετοιµασία του δείγµατος Το κατεψυγµένο πλάσµα αποψύχθηκε και αφέθηκε να φτάσει σε θερµοκρασία δωµατίου. Τριακόσια 300µl αυτού του πλάσµατος 106

107 τοποθετήθηκαν σε δοκιµαστικό σωλήνα µε 100µl HCl (0,1Μ) και 200µl ACN. Το συγκεκριµένο διάλυµα µετά από πολύ καλή ανάµιξη αφέθηκε για 20 ώρες. Έπειτα οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις στροφές (rpm). Το υπερκείµενο προϊόν µεταφέρθηκε σ ένα καθαρό δοκιµαστικό σωλήνα και εξατµίστηκε µέχρι ξηρού κάτω από ρεύµα αζώτου. Το υπόλειµµα ανασυστάθηκε σε 300µl µεθανόλης, αναµίχθηκε και 50µl από το τελικό καθαρό διάλυµα ενέθηκε στη στήλη της υγρής χρωµατογραφίας HPLC. Τα διαλύµατα τιτλοποίησης της ροφεκοξίµπης ετοιµάστηκαν επιµολύνοντας 50µl από πρότυπα διαλύµατα ροφεκοξίµπης, 100µl HCl (0,1M), 200µl ΑCN σε 250µl πλάσµα Χρωµατογραφήµατα-Πρότυπες καµπύλες Στην ενότητα που ακολουθεί, παρατίθενται και παράλληλα σχολιάζονται τα χρωµατογραφήµατα και οι πρότυπες καµπύλες που προέκυψαν από µετρήσεις της πρότυπης ουσίας ροφεκοξίµπης σε διάφορες συγκεντρώσεις, µε τη µέθοδο HPLC, στις συνθήκες που καταλήξαµε. Πρότυπα µεθανολικά δείγµατα ροφεκοξίµπης, σε διάφορες συγκεντρώσεις, αναλύονται µε HPLC. Στα σχήµατα 1 και 2 που ακολουθούν, απεικονίζονται χαρακτηριστικά χρωµατογραφήµατα µεθανολικών δειγµάτων ροφεκοξίµπης σε συγκεντρώσεις 5 και 10µg/ml αντίστοιχα. Με τη βοήθεια αυτών των χρωµατογραφηµάτων, κατασκευάστηκε η πρότυπη καµπύλη αναφοράς για την εν λόγω ουσία. 0,3 0,2 a AU 0,1 0-0, min ΣΧΗΜΑ 1: Χρωµατογράφηµα των 5µg/ml πρότυπης ουσίας ροφεκοξίµπης 107

108 b 0,3 0,2 AU 0,1 0-0, min ΣΧΗΜΑ 2: Χρωµατογράφηµα των 10µg/ml πρότυπης ουσίας ροφεκοξίµπης. Η καµπύλης αναφοράς αποτελεί τη γραφική παράσταση των συγκεντρώσεων των πρότυπων µεθανολικών δειγµάτων ροφεκοξίµπης και κατασκευάστηκε µετά από εµβαδοµέτρηση των τριγώνων ανταπόκρισης (σχήµα 3). Εµβαδόν ανταπόκρισης y = 2,1454x - 0,3282 R 2 = 0, Συγκέντρωση µg/ml ΣΧΗΜΑ 3: Πρότυπη καµπύλη αναφοράς ροφεκοξίµπης. Η εξίσωση (1) που δίνεται παρακάτω προέκυψε µε βάση την εξίσωση των ελαχίστων τετραγώνων της καµπύλης αναφοράς του 108

109 εµβαδού ανταπόκρισης ή κορυφής του ανιχνευτή προς τη συγκέντρωσή της σε πρότυπα µεθανολικά διαλύµατα, η οποία ήταν: (1) y=2,1454x-0,3282, µε συντελεστή συσχέτισης R=0, ) Στην εξίσωση, το y είναι η συντεταγµένη µε το εµβαδό ανταπόκρισης και το x µε τις συγκεντρώσεις (σε µg/ml). 2) O συντελεστής γραµµικής συσχέτισης, R (correlation coefficient) εκφράζει την απόκλιση των τιµών από την καµπύλη αναφοράς. Όταν ο R=1, τότε έχουµε µηδενική απόκλιση τιµών από την ευθεία των ελαχίστων τετραγώνων, δηλαδή όλα τα σηµεία βρίσκονται πάνω σ αυτήν την ευθεία. 3) Ως όριο ανίχνευσης (Limit of detection, LOD) της ροφεκοξίµπης υπολογίστηκε η συγκέντρωση (σε µg/ml) που έδωσε στον ανιχνευτή σήµα τριπλάσιο από το σήµα θορύβου, ενώ ως όριο γραµµικής περιοχής και ποσοτικής εκτίµησης (Limit of Quantification, LOQ) θεωρήθηκε η συγκέντρωση που έδωσε στον ανιχνευτή σήµα 5-10 φορές µεγαλύτερο από το όριο ανίχνευσης. Στα σχήµατα 4 και 5 απεικονίζονται τα χρωµατογραφήµατα από το πρότυπο διάλυµα ροφεκοξίµπης και το λευκό δείγµα υποστρώµατος (πλάσµα). Rofecoxib-standard solution 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-0,05-0,1-0, time(min) ΣΧΗΜΑ 4 : ιάλυµα προτύπου ροφεκοξίµπης (µε Rt=6min). 109

110 1,2 Blank plasma 1 0,8 0,6 0,4 0, time(sec) ΣΧΗΜΑ 5 : Λευκό δείγµα υποστρώµατος (πλάσµα). Στο λευκό δείγµα υποστρώµατος (σχήµα 5) δεν παρουσιάζεται κορυφή στα 6min, γεγονός που σηµαίνει ότι δεν υπάρχει ενδογενής ουσία που να παρεµποδίζει την ανάλυση. Αντίθετα, στο χρωµατογράφηµα του διαλύµατος προτύπου ροφεκοξίµπης διακρίνεται καθαρά η κορυφή στα 6min (σχήµα 4).. Spiked solution 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, time(min) ΣΧΗΜΑ 6 : Επιβαρυµένο διάλυµα µε ροφεκοξίµπη (µε Rt=5,8min). 110

111 Στο σχήµα 6 παρατίθεται το χρωµατογράφηµα πλάσµατος επιβαρυµένο µε ροφεκοξίµπη (spiked solution) και στο σχήµα 7 το χρωµατογράφηµα µε πραγµατικό δείγµα πλάσµατος επίµυων στους οποίους χορηγήθηκε ροφεκοξίµπη. Real sample 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, time(min) ΣΧΗΜΑ 7 : Πραγµατικό δείγµα πλάσµατος επίµυων (µε Rt=5,8min). Συγκρίνοντας και το χρωµατογράφηµα από το πραγµατικό δείγµα πλάσµατος επίµυων (σχήµα 7) φαίνεται η κορυφή (peak) περίπου στα 5,8min και πάλι. Αυτό σηµαίνει ότι η µέγιστηχαρακτηριστική συγκέντρωση της πρότυπης ουσίας ανιχνεύεται περίπου στα 5,8min. Η µικρή ένταση των κορυφών οφείλεται όχι µόνο στην συγκέντρωση του φαρµάκου αλλά και στο σχετικά σύντοµο χρονικό διάστηµα για το οποίο χορηγήθηκε. Στη συνέχεια δείγµατα πλάσµατος (ελεύθερα οποιασδήποτε ουσίας) επιµολύνθηκαν µε ροφεκοξίµπη σε διάφορες συγκεντρώσεις (50, 11, 2,816, 1,126, 0,451, 0,180µg/ml) και προέκυψαν συγκεντρώσεις ροφεκοξίµπης στο πλάσµα. Τα δείγµατα αυτά αναλύθηκαν µε HPLC µε τις χαρακτηριστικές συνθήκες και έτσι προέκυψε η πρότυπη καµπύλη αναφοράς (σχήµα 8) επιµολυσµένου (spiked plasma) πλάσµατος µε πρότυπη ουσία ροφεκοξίµπη. Η εξίσωση της καµπύλης ήταν: (2) y=0,9349-0,1862, µε συντελεστή συσχέτισης R=0,

112 ΣΧΗΜΑ 8 : Καµπύλη αναφοράς επιµολυσµένου (spiked plasma) πλάσµατος µε πρότυπη ένωση ροφεκοξίµπης Μετρήσεις-Αποτελέσµατα Τα αποτελέσµατα των συγκεντρώσεων του COX-2-αναστολέα, ροφεκοξίµπη, µετά από υποδόρια χορήγηση για διάστηµα 10, 20, 30 και 45 ηµερών στους επίµυες, σε δόση 25mg/kg Β.Σ, µε την τεχνική της ΗPLC φαίνονται στον πίνακα 13. ΠΙΝΑΚΑΣ 13 : Συγκεντρώσεις ροφεκοξίµπης σε µg/ml στον ορό επίµυων µετά από πειραµατική χορήγηση σε διάστηµα 10, 20, 30 και 45 ηµερών. ΑΡΙΘ. ΕΙΓΜ. 10 ηµέρες 20 ηµέρες 30 ηµέρες 45 ηµέρες V1 N/D 3,61±0,13 2,97±0,07 3,97±0,03 V2 N/D 2,88±0,08 3,27±0,07 3,44±0,12 V3 N/D 3,76±0,11 2,9+0,1 3,87±0,17 V4 N/D 3,05±0,13 2,97±0,1 4,85±0,16 V5 N/D 3,20±0,13 2,93±0,29 3,95±0,09 V6 N/D 3,08±0,15 3,50±0,21 NS 112

113 N/D : Μη ανιχνεύσιµη (not detectable) NS : Χωρίς δείγµα (no sample) Όπως φαίνεται από τον παραπάνω πίνακα, η συγκέντρωση της ροφεκοξίµπης στα δείγµατα ορού των επίµυων-πειραµατοζώων στις 10 ηµέρες χορήγησης δεν ήταν ανιχνεύσιµη παρά τη χορήγηση υψηλήςτοξικής δόσης. Η συγκέντρωση της ροφεκοξίµπης στις 10 ηµέρες ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης, ενώ στις 45 ηµέρες υπολείπεται ένα δείγµα (no sample) λόγω του αιφνιδίου θανάτου ενός επίµυος. Πιο συγκεντρωτικά, τα αποτελέσµατα που προσδιορίζουν τη συγκέντρωση του COX-2 αναστολέα στα πειραµατόζωα (analysis of variance, p=0,0027) φαίνονται στον πίνακα 14. Τα αποτελέσµατα στον συγκεκριµένο πίνακα παρατίθενται κατά µέσο όρο. Από τον παρακάτω πίνακα, διαπιστώνεται µια σταδιακή αύξηση στη συγκέντρωση της ροφεκοξίµπης αναλογικά µε την αύξηση του χρονικού διαστήµατος χορήγησής της στους επίµυες. Η µικρή µείωση της συγκέντρωσης µεταξύ 20 και 30 ηµερών που παρατηρείται είναι µέσα στα όρια της τυπικής απόκλισης. Στις 45 ηµέρες παρατηρείται, όπως είναι αναµενόµενο, η µέγιστη συγκέντρωση της χορηγούµενης ουσίας. ΠΙΝΑΚΑΣ 14 : Μέσες τιµές συγκεντρώσεων ροφεκοξίµπης. 10 ηµέρες 20 ηµέρες 30 ηµέρες 45 ηµέρες Μη ανιχνεύσιµη 3,26±0,14 µg/ml 3,09±0,09 µg/ml 4,03±0,23 µg/ml 10.9 Βιοστατιστική Ανάλυση Τα δεδοµένα εισήχθησαν σε βάση δεδοµένων (data base) καταγραφής και διαχείρισης πληροφοριών (Microsoft Access Office for Windows XP) ώστε να γίνεται ευχερής ανάκληση των δεδοµένων, για έλεγχο της εγκυρότητας των καταγραφών. Στη συνέχεια τα στοιχεία που χρησιµοποιήθηκαν για την παρούσα µελέτη, µεταφέρθηκαν σε πακέτο φύλλων εργασίας (spreadsheet). Για την είσοδο των τιµών, έγινε χρήση του πακέτου Microsoft Excel Office 10 for Windows ΜΕ Ακολούθως, έγινε έλεγχος της κανονικότητας των κατανοµών (normal distribution), όλων των ποσοτικών µεταβλητών (quantitative variables), µε τη χρήση της µη παραµετρικής δοκιµασίας Kolmogorov- Smirnov. Για τη βιοστατιστική ανάλυση των στοιχείων χρησιµοποιήθηκαν τα προγράµµατα στατιστικής ανάλυσης και επεξεργασίας δεδοµένων 113

114 (statistical package) SPSS 14.0 edition (SPSS Inc.) και Primer Biostatistics 4.0 for Windows (McGraw-Hill Inc.). Για την περιγραφή του υλικού χρησιµοποιήθηκαν ο µέσος όρος (mean) για το δείγµα (sample) και η αντίστοιχη δειγµατική έκφραση για την τυπική απόκλιση (standard deviation). Από την τυπική απόκλιση υπολογίστηκε το τυπικό σφάλµα (standard error) το οποίο και απεικονίζεται στις γραφικές παραστάσεις κατά υποοµάδα περιστατικών. Ο µέσος όρος (mean) για δείγµα (sample) υπολογίσθηκε σύµφωνα µε τη γνωστή µαθηµατική διατύπωση : Όπου Σ=άθροισµα, xi=τιµές της µεταβλητής, n=σύνολο των _ x = περιστατικών κατά µεταβλητή, ενώ η αντίστοιχη δειγµατική έκφραση για την τυπική απόκλιση (standard deviation) ορίζεται ως εξής : Ο τύπος για το τυπικό σφάλµα Sx είναι ο παρακάτω: n x ni ( xi x) s= n 1 s _ x = i s 2 n Για τον έλεγχο βιοστατιστικών υποθέσεων (hypothesis tests) εφαρµόσθηκε, ανάλογα µε τη φύση των συγκρίσεων, η παραµετρική µέθοδος student t-test για ανεξάρτητα δείγµατα (t-test for independent samples ), µε υπολογισµό της τιµής του t (t value), σύµφωνα µε τον τύπo: t = _ x s µ = _ x µ s 2 x + n = x _ s n 1 1 x _ 2 s n 2 2 όπου t= τιµή του στατιστικού student t-test και η δοκιµασία χ 2 [204]. 114

115 Επιπλέον, υπολογίσθηκαν οι συντελεστές µεταβλητότητας (correlation coefficie nts) σύµφωνα µε τον τύπο : r = [ ( x x)( y y) _ ( x x) 2 _ ] [ 2 ( y y) ] = [ ( x)( y) xy n 2 ( x) ( 2 2 x ] [ y n n y) 2 ] όπου χ,ψ µεταβλητές. Ακόµη, ελέγχθηκε η στατιστική σηµαντικότητα των συντελεστών t = r n r r, κατά περίπτωση, µε βάση την αντίστοιχη διατύπωση : Επιπρόσθετα, υπολογίσθηκαν οι συντελεστές µεταβλητότητας (correlation coefficients) και ελέγχθηκε η στατιστική σηµαντικότητα των συντελεστών r κατά περίπτωση, τόσο για τους µάρτυρες, όσο και για τα περιστατικά. Για τον έλεγχο βιοστατιστικών υποθέσεων που αφορούσαν σε δείγµατα άνω των δύο οµάδων χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της ανάλυσης διακύµανσης (ANOVA Analysis of Variance). Για τη βιοστατιστική ανάλυση εφαρµόσθηκαν οι κατάλληλες δοκιµασίες, µε τη χρήση των στατιστικών πακέτων που προαναφέρθηκαν ενώ για τις γραφικές απεικονίσεις χρησιµοποιήθηκαν επίσης τα δύο στατιστικά πακέτα Υπολογ ισ µοί-επεξεργασία αποτελεσµάτων Στην ενότητα που ακολουθεί δίνονται οι απαραίτητες παράµετροι, ώστε µια HPLC-µέθοδος να θεωρηθεί πλήρης. Αυτές είναι το όριο ανίχνευσης (LOD), το όριο ποσοτικού προσδιορισµού (LOQ) καθώς και η επαναληψιµότητα της µεθόδου (RSD). ίνεται ακόµ η η στατιστική ανάλυση και η σύγκριση των αποτελεσµάτων και υπολογίζονται όλες οι παράµετροι της βιοστατιστικής ανάλυσης. Όριο ανίχνευσης (Limit of detection, LOD): Ορίζεται ως η ελάχιστη συγκέντρωση του προσδιοριζόµενου συστατικού σε διάλυµα, η οποία µπορεί να ανιχνευτεί µε βεβαιότητα 99,6%. Πρακτικά το όριο ανίχνευσης δίνεται από την εξίσωση : c L = 3s/S όπου s είναι η τυπική απόκλιση και S η ευαισθησία της µεθόδου [205,206]. 115

116 Η τυπική απόκλισ η (Standard deviation) εξίσωση: δίνεται από την s = N i = 1 ( x i x N 1 ) 2 όπου Ν ο αριθµός των µετρήσεων x i το σήµα της µέτρησης x η µέση τιµή των σηµάτων. Η ευαισθησία ορίζεται ως η κλήση της ευθείας των ελαχίστων τετραγώνων της καµπύλης αναφοράς και εκφράζει τη µεταβολή του µετρούµενου µεγέθους (π.χ. σήµατος) ανά µονάδα µεταβολής της συγκέντρωσης του προσδιοριζόµενου στοιχείου. Πιο απλά το όριο ανίχνευσης (LOD) θεωρείται το σήµα που δίνει η ουσία και είναι τριπλάσιο από το θόρυβο. Επαναληψιµότητα µεθόδου: Εκφράζεται από την σχετική τυπική απόκλιση, δηλαδή το λόγο της τυπική ς απόκλισης s µιας σειράς Ν µετρήσεων, προς τη µέση τιµ ή των µετρήσεων αυτών. Sr. = (s / x) 100 Η σειρά των Ν µετρήσεων αποτελείται από µετρήσεις του ίδιου δείγµατος αλλά µε ίδιες εργαστηριακές συνθήκες (π.χ. την ίδια µέρα). Μια µέθοδος είναι πιο επαναλήψιµη, όσο πιο µικρή είναι η σχετική τυπική απόκλιση. Αναπαραγωγικότητα (εντός της ηµέρας): Εκφράζεται επίσης µε τη σχετική τυπική απόκλιση. Η διαφορά µε την επαναληψιµότητα είναι ότι αναφέρεται σε σειρά Ν µετρήσεων που λαµβάνονται επί του ιδίου δείγµατος αλλά µε διαφορετικές εργαστηριακές συνθήκες (π.χ. σε διαφορετικές ηµέρες). Σύµφωνα πάντα και µε τα παραπάνω, υπολογίστηκαν τα όρια ανίχνευσης (Limit of Detection, LOD) αλλά και ποσοτικής αποτίµησης (Limit of Quantitation, LOQ) για τη ροφεκοξίµπη. Βρέθηκε πως τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίµησης ήταν 0,180 και 0,54 αντίστοιχα. 116

117 ΠΙΝΑΚΑΣ 15: Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού. LOD = 0,180 µg/ml LOQ = 0,54 µg/ml Η επαναληψιµότητα υπολογίστηκε µε βάση τον τύπο που αναφέρεται παραπάνω και δίνεται για µια σειρά 7 µετρήσεων για την ίδια µ έρα (inter day). Χρησιµοποιήθηκαν διαλύµατα των δύο ουσιών µε συγκεντρώσεις 5 και 10 pp m για τη ροφεκοξίµπη. ιαλύµατα των ίδιων συγκεντρώσεων χρησιµοποιήθηκαν και για τον υπολογισµό της επαναληψιµότητας σε διάρκεια 10 ηµερών (intra day). Η inter day επαναληψιµότητα για την ένωση της ροφεκοξίµπης υπολογ ίστηκε στο 5,9%, επαναληψιµότητα αρκετά καλή για τη µέθοδο που αναπτύχθηκε. Το ίδιο φαίνεται και από την τιµή της intra day επαναληψιµότητας 10 ηµερών, η οποία υπολογίστηκε στην τιµή 4,5%. ΠΙΝΑΚΑΣ 16: Επαναληψιµότητα κατά τη διάρκεια µιας µέρας (inter day). Inter day µg/ml Average(ng) Stdev RSD % , ,51 5, , ,26 5,83 ΠΙΝΑΚΑΣ 17: Επαναληψιµότητα σε διάστηµα 10 ηµερών (intra day). INTRA DAY µg/ml average (ng) Stdev RSD % , ,14 4, , ,47 4,45 Όπου: Stdev=τυπική απόκλιση, RSD= επαναληψιµότητα αverage=µέσος όρος, Στο παρακάτω σχήµα (σχή µα 9 ) δίνεται η σύγκριση των µετρήσεων των συγκεντρώσεων της ουσίας ροφεκοξίµπης µ εταξύ των ηµερών χορήγησης. Λαµβάνεται υπόψη η µέση τιµή των 117

118 συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης (πίνακας 14). Για το χρονικό διάστηµα των 10 ηµερών δε σηµειώνεται η συγκέντρωση της, καθώς όπως προαναφέρθηκε, αυτή δεν ήταν ανιχνεύσιµη µε τη µέθοδο HPLC. Στο ίδιο σχήµα σηµειώνονται και τα όρια του στατιστικού λάθους (standard error). ιακρίνεται η σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης στον ορό των επίµυων από τις 30 εως τις 45 ηµέρες χορήγησης. Mεταξύ 20 και 30 ηµερών όµως παρατηρείται, όπως φαίνεται και στο σχήµα 9, µικρή ελάττωση της ανιχνευόµενης συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης παρά το γεγονός ότι αυξήθηκε το χρονικό διάστηµα χορήγησής της. Η µικρή αυτή ελάττωση είναι µέσα στα όρια της τυπικής απόκλισης. ROFECOXIB CONCENTRATION IN RAT BLOOD SERUM WITH HPLC DETERMINATION (µg/ml) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, DAYS 30 DAYS 45 DAYS ΣΧΗΜΑ 9 : Σύγκριση των µετρήσεων των συγκεντρώσεων µε HPLC στον ορό αίµατος των επίµυων. Aναλυτικά στον πίνακα 18 δίνονται οι µετρήσεις των τιµών της τυπικής απόκλισης (standard deviation) και του τυπικού σφάλµατος (standard error) για όλα τα δείγµατα ορού επίµυων για 20, 30 και 45 ηµέρες. Απεικονίζονται επίσης η µέση τιµή των συγκεντρώσεων καθώς και ο αριθµός των δειγµάτων ορού αίµατος των επίµυων στα οποία χορηγήθηκε ο COX-2 αναστολέας. Η τυπική απόκλιση όπως και το τυπικό σφάλµα εµφανίζουν µικρές τιµές. Τα όρια του στατιστικού λάθους είναι µικρά. Παρατηρείται ακόµη σταδιακή αύξηση αυτών των δυο τιµών αναλογικά σε σχέση µε την αύξηση του χρονικού διαστήµατος στο οποίο χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη. Το ίδιο παρατηρείται και στην τιµή της διακύµανσης. 118

119 ΠΙΝΑΚΑΣ 18: Βασικές στατιστικές παράµετροι για τα δείγµατα ορού επίµυων για το χρονικό διάστηµα των 20, 30 και 45 ηµερών. Μέση συγκέντρωση Οµάδα (ηµέρες χορήγησης) ΣΧΗΜΑ 10: Γραφική απεικόνιση των συγκεντρώσεων της ροφεκοξίµπης σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησής της. Στην παραπάνω γραφική απεικόνιση φαίνεται πολύ καθαρά η µεγάλη αύξηση της συγκέντρωσης της ροφεκοξίµπης από τις 30 εως τις 45 ηµ έρες, η οποία ανιχνεύθηκε µε τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). 119

120 ΠΙΝΑΚΑΣ 19 : Ανάλυση διακύµανσης µεταξύ των οµάδων και µέσα στην ίδια την οµάδα για το χρονικό διάστηµα των 20, 30 και 45 ηµερών συνεχούς χορήγησης ροφεκοξίµπης. Για τον έλεγχο βιοστατιστικών υποθέσεων για δείγµατα άνω των δυο, χρησιµοποιήθηκε και η µέθοδος της ανάλυσης διακύµανσης (ANOVA Analysis of Variance). Mε τη µέθοδο αυτή υπολογίζεται το άθροισµα τετραγώνων µεταξύ των οµάδων καθώς και µέσα στην ίδια την οµάδα για το συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα. Οι συγκεντρώσεις της ροφεκοξίµπης παρέµειναν σταθερές για τις 20 και τις 30 ηµέρες και µόνο µ ετά από 45 ηµέρες η συγκέντρωση της ροφεκοξίµπης στο πλάσµ α αυξήθηκε σηµαντικά. Προκύπτει, όπως διακρίνεται και από τον πίνακα 19, ότι στις 45 ηµέρες η ανιχνεύσιµη συγκέντρωση της ροφεκοξίµπης στο πλάσµα ήταν εξαιρετικά στατιστικώς σηµαντική (p=0,0027). Συµπερασµατικά, οι τιµές των συγκεντρώσεων του COX-2 αναστολέα που ανιχνεύθηκαν µε τη µέθοδο HPLC αυξάνονται αναλογικά σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησής του. 120

121 11. ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 11.1 Γενικά Στην ενότητα αυτή περιγράφεται η µελέτη της επίδρασης της ροφεκοξίµπης στους κλασσικούς βιοχηµικούς δείκτες της καρδιαγγειακής και µεταβολικής λειτουργίας. Όπως περιγράφηκε και στο θεωρητικό µέρος, οι παράµετροι αυτές παρέχουν ένα ικανοποιητικό «παράθυρο διάγνωσης», εξαιρετική ειδικότητα και ευαισθησία για τον εντοπισµ ό αυξηµένου καρδιαγγειακού κινδύνου, στις περιπτώσεις που οι τιµές αυτών των βιοχηµικών δεικτών είναι παθολογικές [207]. Μετρήθηκαν τα επίπεδα χοληστερόλης, τριγλυκεριδίων και των µυοκαρδιακών ενζύµων SGOT, SGPT, CPK, CRP και τροπονίνης στα δείγµατα του ορού αίµατος των 24 πειραµατόζωων και στις 4 σειρές πειραµάτων που πραγµατοποιήθηκαν. Μετά από υποδόρια χορήγηση του φαρµάκου σε δόση 25mg/kg Β.Σ για 10, 20, 30 και 45 ηµέρες στους επίµυες, προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των βιοχηµικών αυτών δεικτών και στα πειραµατόζωα και στους µάρτυρες (control). Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων των βιοχηµικών παραµέτρων που µελετήθηκαν στο αίµα των πειραµατόζωων αξιολογήθηκαν µετά από σύγκριση µε τα αντίστοιχα αποτελέσµατα που προέρχονταν από µάρτυρες, µε τη βοήθεια της στατιστικής αναλυτικής µεθόδου (t-test) ή (student-test) Υλικά και µέθοδοι Για την εκτίµηση της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, των τρανσαµ ινασών SGOT/SGPT και της CPK χρησιµοποιήθηκαν οι κλασσικές χρωµατοµετρικές-ενζυµικές µέθοδοι. Οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν µε τη βοήθεια του αναλυτή τύπου ILAB 350/ BQA (FURUNO ELECTRIC CO, LTD, JAPAN) και τη χρήση των παρακάτω αντιδραστηρίων: 1) Χοληστερόλη FS (DIAGNOSTΙC SYSTEMS GmbH, Germany) 2) Τριγλυκερίδια FS (DIAGNOSTΙC SYSTEMS GmbH, Germany) 3) SGOT IFCC (ALFA WASSERMANN, NL) 4) SGPT IFCC (ALFA WASSERMANN, NL) 5) CPK IFCC (ALFA WASSERMANN, NL) 121

122 Για τον προσδιορισµό των τιµών της τροπονίνης χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της ενισχυµένης φωταύγειας µε τη βοήθεια αναλυτ ή του τύπου «IMMULITE AUTOMATED IMMUNOASSAY ANALYZER D.P.C Cirrus Inc.USA. Το αντιδραστήριο που χρησιµ οποιήθηκε για τη συγκεκριµένη µέτρηση είναι της DPC (Diagnostic Products Corporation-Los Angeles, CA USA) Αρχές της µεθόδου Στην ενότητα αυτή περιγράφονται οι αρχές στις οποίες στηρίζονται οι χρωµατοµετρικές-ενζυµικές µέθοδοι. Οι µέθοδοι αυτές χρησιµοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισµό της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, των τρανσαµινασών (SGOT/SGPT), της CPK και της CRP στον ορό αίµατος. Για το ν ποσοτικό προσδιορισµό της τροπονίνης χρησιµοποιείται η µέθοδος της ενισχυµένης φωταύγειας, η οποία αναλύεται παρακάτω Mέθοδος µέτρησης της χοληστερόλης Τα δύο τρίτα της χοληστερόλης του ορού εστεροποιούνται, αλλά η αναλογία της ελεύθερης προς την εστεροποιηµένη χοληστερόλη δεν θεωρείται πλέον κλινικά σηµαντική. Η χηµική µέθοδος που χρησιµ οποιήθηκε για τη µέτρηση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στον ορό αίµατος των επίµυων στηρίζεται στο γεγονός ότι τα στεροειδή παράγουν ένα σκούρο χρώµα όταν αναµειγνύονται µε οξειδωτικά οξέα. Tο συγκεκριµένο χρώµα που παράγεται εξαρτάται από τις συνθήκες που επικρατούν κατά την αντίδραση. Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται σ αυτές τις µεθόδους είναι εύφλεκτα. Αυτή η χρωµατοµετρική-ενζυµική µέθοδος πραγµατοποιείται σε ουδέτερο ph και είναι ειδική. Η χρήση των ενζύµων στην αντίδραση αυτή έχουν περιγραφεί από τους Allain και συνεργάτες και από τους Roeschlan και συνεργάτες. Οι εστέρες της χοληστερόλης στον ορό υδρολύονται πλήρως σε ελεύθερη χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα από την παγκρεατική εστεράση της χοληστερόλης [208]. εστέρας χοληστερόλης εστεράση +H2 0 χοληστερόλη + λιπαρά οξέα H χοληστερόλη που ελευθερώνεται από την εστεράση καθώς και κάθε ελεύθερη χοληστερόλη που βρίσκεται στον ορό οξειδώνεται από την οξειδάση της χοληστερόλης. 122

123 Οξειδάση της χοληστερόλη + Ο 2 χολεστ-4-ενο-3-ονη + Η 2 Ο 2 χοληστερόλης Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται αντιδρά µε τη φαινόλη και µε την 4-αµινοαντιπυρίνη και καταλύεται από το ένζυµο υπεροξειδάση σχηµατίζοντας την κουϊνονιµίνη, η οποία απορροφάται στα 500nm. περοξειδάση 2Η 2 Ο αµινοαντιπυρίνη+ φαινόλη κουϊνονιµίνη+4h 2 O H αλλαγή αυτή στην απορροφητικότητα µετράται και στα 505nm και στα 692nm και είναι ευθέως ανάλογη µε το ποσό της χοληστερόλης που περιέχεται στο δείγµα. Σύσταση αντιδραστηρίου Το αντιδραστήριο ACE χοληστερόλη που χρησιµοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισµό της χοληστερόλης στον ορό βασίζεται στο κλινικό χηµικό σύστηµα που φέρει την ονοµασία ACE (Alfa Wassermann Clinical Chemistry Systems) και έχει την ακόλουθη σύσταση: Eνεργά συστατικά Συγκεντρώσεις ιάλυµα φωσφορικού οξέος 30mmol/L, ph 6,5 4-αµινοαντιπυρίνη 0,25mmol/l Φαινόλη 25mmol/l Υπεροξειδάση 5ΚU/L Οξειδάση της χοληστερόλης 0,1KU/L Eστεράση της χοληστερόλης 0,15 KU/L Ο ορός ή το πλάσµα για τον προσδιορισµό της χοληστερόλης φυλάσσεται στο ψυγείο (4 ο C) για 4 ηµέρες πριν από την ανάλυση, στην κατάψυξη (-20 ο C) για 3 µήνες, ενώ στους -70 ο C για πολλά χρόνια. Τα κατεψυγµένα δείγµατα πρέπει να αναµιχθούν καλά αφού λιώσουν, πριν από την ανάλυση Μέθοδος µέτρησης των τριγλυκεριδίων Τα τριγλυκερίδια είναι τριεστέρες της γλυκερόλης µε λιπαρά οξέα. Οι µέθοδοι για τον καθορισµό των τριγλυκεριδίων βασίζονται στον ποσοτικό προσδιορισµό της γλυκερόλης που απελευθερώνεται από την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων. 123

124 Η µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε είναι µία πλήρως ενζυµική διαδικασία στην οποία τα τριγλυκερίδια του ορού υδρολύονται από τη µικροβιακή λιπάση και σχηµατίζουν τη γλυκερόλη. Η κινάση της γλυκερόλης αποτελεί την αρχή για µια σειρά αντιδράσεων που περιγράφονται παρακάτω [208]: Τριγλυκερίδια λιπάση γλυκερόλη + λιπαρά οξέα Γλυκερόλη + ATP GK G-3-P + ADP GPO G-3-P + O 2 διϋδροξυακετονο-φωσφορικό οξύ + POD H 2 O 2 2H 2 O 2 +4-αµινοαντιπυρίνη+4-χλωροφαινόλη κουϊνονιµίνη + HCl + 4H 2 O όπου: ATP αδενοσινο-5-τριφωσφορικό οξύ GK κινάση της γλυκερόλης G-3-P γλυκερόλη-3-φωσφορικό οξύ ADP αδενοσινο-5-διφωσφορικό οξύ NAD+ νικοτιναµινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο GPO γλυκερόλη-3-φωσφορική οξειδάση Η απορροφητικότητα τη ς κουϊνονιµίνης µετράται στα 505nm και στα 692nm και είναι ευθέω ς ανάλογη µε τη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων. Το αντιδραστήριο ACE τ ριγλυκερίδια που χρησιµοποιήθηκε για τη µέτρηση της συγκέντρωσης των τριγλυκεριδίων στον ορό βασίζεται στο κλινικ ό χηµικό σύστηµα που φέρει την ονοµασία ACE (Alfa Wassermann Clinical Chemistry Systems) και έχει την ακόλουθη σύσταση: Σύσταση αντιδραστηρίου Ενεργά συστατικά Συγκεντρώσεις Pipes ρυθµιστικό διάλυµα 40mmol/L, ph 7,5 4-χλωροφαινόλη 5,0mmol/L Ιόντα µαγνησίου 5,0mmol/L ATP 1,0mmol/L Λιπάσες 150U/ml Υπεροξειδάση 0,5U/ml 124

125 Κινάση της γλυκερόλης 0,4U/ml Καυστικό νάτριο 0,05% 4-αµινοαντιπυρίνη 0,4mmol/L Γλυκερόλη-3-φωσφορική 1,5U/ml oξειδάση καυστικό νάτριο 0,05% Προετοιµασία του διαλύµατος εργασίας: Μια ταινία-φορέας του αντιδραστηρίου εµβαπτίζεται σ ένα φιαλίδιο µε ρυθµ ιστικό διάλυµα. Αναδεύεται το φιαλίδιο και η ταινία µ ένει µ έσα στο ρυθµιστικό διάλυµα 5min και µετά απορρίπτεται. Το φιαλίδιο ανακινείται και πάλι. Το αντιδραστήριο είναι έτοιµο και µπορεί να διατηρηθεί σταθερό για 2 εβδοµάδες στο ψυγείο Μέθοδος µέτρησης της ασπαρτικής αµινοτρανσφεράσης (AST ή SGOT) H ενζυµική-χρωµ ατοµετρική µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της ασπαρτικής αµινοτρανσφεράσης στον ορό είναι µία παραλλαγή της κλασσικής χηµικής µεθόδου σύµφωνα µε τις συστάσεις της IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) [ ]. H AST καταλύει την αντίδραση µεταφοράς της αµινοµάδας του L- ασπαρτικού στο 2-κετογλουταρικό οξύ. Η πρώτη κινητική ενζυµική µέθοδος για τον προσδιορισµ ό της δραστικότητας της AST βασίζεται στην οξείδωση του NADH που περιγράφεται. Η µέθοδος βελτιστοποιήθηκε οπότε αυξήθηκε η ακρίβεια και η απόδοση της δοκιµασίας και ελαττώθηκε η επίδραση διαφόρων ανεπιθύµητων παραγόντων. Η ΑST καταλύει την αντίδραση απαµίνωσης του ασπαρτικού οξέος κατά την εξής αντίδραση [208]: 2-κετογλουταρικό οξύ + L-ασπαρτικό οξύ ΑST L-γλουταµινικό οξύ+ οξαλοξεικό οξύ Το σχηµατιζόµενο από την απαµίνωση του ασπαρτικού οξαλοξεικό µετατρέπεται σε L-µηλικό από τη µηλική αφυδρογονάση, ενώ το NAD H οξειδώνεται σε NAD+. MDH ο ξαλοξεικό οξύ+ NADH + H + L-µ ηλικό οξύ + NAD + O ρυθµός της οξείδ ωσης του NADH είναι ανάλογος µε τη δραστικότητα του ενζύµου. Η ταχύτητα της αντίδρασης µετράται στα 340nm. 125

126 Το αντιδραστήριο ACE Ασπαρτική Αµινοτρανσφεράση (AST) που χρησιµοποιήθηκε για τη µέτρηση της συγκέντρωσης της Ασπαρτικής Αµινοτρανσφεράσης στον ορό βασίζεται στο κλινικό χηµικό σύστηµα που φέρει την ονοµασία ACE (Alfa Wassermann Clinical Chemistry Systems) και έχει την ακόλουθη σύσταση: Σύσταση αντιδραστηρίου Ενεργά συστατικά Συγκεντρώσεις 2-κετογλουταρικό NADH 3,12 mmol/l 0,18 mmol/l MDH (µαλική δεϋδρογονάση) 420 U/l LDH 600 U/l Ρυθµιστικό διάλυµα Tris ph 7,5, 80 mmol/l L-ασπαρτικό 240 mmol/l Μέθοδος µέτρησης της αλανινο-αµινοτρανσφεράσης (ALT ή SGPT) Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της ALT ή SGPT χρησιµ οποιήθηκε η ενζυµική-χρωµατοµετρική µέθοδος που βασίζεται στην παρακάτω σειρά αντιδράσεων σύµφωνα µε τις συστάσεις της IFCC (Interna tional Federation of Clinical Chemistry) [209, 210, ). Η ALT καταλύει την αντίδραση απαµίνωσης της αλανίνης κατά την εξής αντίδραση [208]: ALT 2-κετογλουταρικό οξύ + L-αλανίνη L-γλουταµινικό οξύ + πυροσταφυλικό Το σχηµατιζόµενο από την απαµίνωση της αλανίνης πυροσταφυλικό µετατρέπεται σε γαλακτικό από τη γαλακτική αφυδρογονάση και το NADH οξειδώνεται σε NAD. LDH πυροσταφυλ ικό + NADH + H + L- γαλακτικό οξ ύ + NA D+ O ρυθµός της οξείδωσης του NADH είναι ανάλογος της δραστικότητας της ALT. Η ταχύτητα της αντίδρασης µετράται στα 340nm. H σύσταση του αντιδραστηρίου ALT-ACE (Alanine Aminotransferase-Alfa Wassermann Clinical Chemistry Systems) που χρησιµοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισµό της αλανινοαµινοτρανσφεράσης στον ορό δίνεται παρακάτω: 126

127 Σύσταση αντιδραστηρίου Ενεργά συστατικά 2-κετογλουταρικ ό οξύ NADH LDH (γαλακτική δεϋδρογονάση) ιάλυµα Τris, pη 7,5 L-αλανίνη Συγκεντρώσεις 15 mmol/l 0,18 mmol/l 1,24 U/ml 100 mmol/l 0,5 mmol/l Μέθοδος µέτρησης της κινάσης της κρεατίνης ( CK, CPK) Για τον ποσοτικό προσ διορισ µό της κινάσης της κρεατίνης στον ορό χρησιµοποιήθηκε το κλινικό χηµικό σύστηµα, που φέρει την ονοµασία, ACE (Alfa Wassermann Clinical Chemistry Systems). Υψηλές συγκεν τρώσεις κινάσης της κρεατίνης βρίσκονται στους σκελετικούς και τους καρδιακούς µύες. Το ένζυµο αυτό είναι υπεύθυνο για τον αναερόβιο µεταβο λισµό της φωσφοκρεατίνης και την αναγέννηση του ΑΤΡ. Η δραστηριότητα της CK καθορίζεται απ ό µία κινητική µέθοδο, η οποία µετρά την αλλαγή στην απορροφητικότητα στα 340nm σε ένα καθορισµένο χρονικό όριο. Η σειρά των αντιδράσεων που πυροδοτείται από την κινάση της κρεατίνης του ορού καταλήγει στον σχηµατισµό του NADPH [208]. Η φωσφοκρεατίνη αντιδρά µε το ADP παρουσία CK δίνοντας κρεατίνη και ATP. Η γλυκόζη µε το ATP και τη δράση της εξοκινάσης δίνει γλυκοζο-6-φωσφορικό και ADP. Το γλυκοζο-6-φωσφορικό µε NAD + και τη δράση της G-6PDH µετατρέπεται σε 6-φωσφογλυκονικό και NADH και H +. εδοµένου ότι η CK είναι το µόνο στοιχείο της αντίδρασης που δεν είναι σε περίσσεια, ο ρυθµός παραγωγής του NADH θα είναι ευθέως ανάλογος µε τη δραστικότητα της CK στο εξεταστέο δείγµα. φωσφοκρεατίνη + ADP CK κρεατίνη + ΑΤΡ ΑΤΡ + γλυκόζη HK G-6-P + ADP G-6-P + NADP + G-6-PDH NADPH + 6-P-γλυκονικό οξύ + H + όπου : ADP = αδενοσινο-5 -διφωσφονικό οξύ ΑΤΡ = αδενοσινο-5 -τριφωσφονικό οξύ 127

128 HK = εξοκινάση G-6-P = γλυκοζο-6-φωσφορικό οξύ G-6-PDH = γλυκοζο-6-φωσφορική δεϋδρογονάση Πιθανή παρεµβολή από τη δραστικότητα της αδενυλικής κινάσης αντιµετωπίζεται µε συνδυασµό δυο αναστολέων της, του AMP και του δι(αδενοσινο 5 ) πενταφωσφορικού oξέος. Το NADPH απορροφάται ισχυρά στα 340nm, ενώ το NADP δεν απορροφάται. Το αντιδραστήριο CK-ACE έχει την ακόλουθη σύσταση: Σύσταση αντιδραστηρίου Ενεργά συστατικά ιάλυµα ιµιδαζόλης, ph 6,7 Γλυκόζη Οξικό µαγνήσιο EDTA AMP ADP Φωσφοκρεατίνη NADP Εξοκινάση G-6-PDH ι(αδενοσινο5 )πενταφωσφορικό οξύ n-ακετυλοκυστεϊνη Συγκεντρώσεις 0,11 mol/l 21 mmol/l 11 mmol/l 2,1 mmol/l 5,2 mmol/l 2,1 mmol/l 31 mmol/l 2,1 mmol/l 2,6 U/ml 1,6 U/ml 10,5 Tmol/l 21 mmol/l Μέθοδος µέτρησης της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) O Kraus το 1897, παρατήρησε ότι αναµειγνύοντας διαλυτό αντιγόν ο και ειδικά αντισώµατα είχε ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό αδιάλυτων (αντιγόνου-αντισωµάτων) συµπλόκων ή ιζηµάτων. Αυτή η ανακάλυψη οδήγησε τη δεκαετία του 1920 και 1930, τους Heidelberger και Kendall στην εξέλιξη µιας δοκιµασίας καθιζήσεως που προσδιόριζε αντιγόνο και αντισώµατα. Το 1947, ο Boyden και οι συνεργάτες έδειξαν ότι τα ιζήµατα διασκόρπιζαν το φως σε ευθεία αναλογία µε τις συγκεντρώσεις τους και ότι τα αντιγόνα µπορούσαν να προσδιορισθούν ποσοτικά µε τη θολεροµετρία. Η θολεροµετρία είναι η µέτρηση της ελάττωσης στην πυκνότητα του µεταδιδόµενου φωτός που είναι αποτέλεσµα είτε απορρόφησης είτε διάχυσης. Η θολεροµετρική µέθοδος αναφέρεται στον ποσοτικό προσδιορισµό του αντιγόνου µε την προσθήκη αντισώµατος υπό διάλυση και το σχηµατισµό συµπλόκων. Τα σύµπλοκα αντιγόνου- αντισώµατος διασκορπίζουν το φως και ελαττώνουν το µετρήσιµο 128

129 µεταδιδόµενο φως σε αναλογία µε τις συγκεντρώσεις τους. Το 1973, ο Hellsing παρατήρησε ότι η προσθήκη πολυµερών, όπως η πολυαιθυλενογλυκόλη, ενίσχυσε την ανοσοδιάχυση και βελτίωσε σηµαντικά την ευαισθησία και την ταχύτητα της ανοσοθολεροµετρίας. Αυτ ό οδήγησε στα µέσα του 1970 στην εξέλιξη γρήγορων, ευαίσθητων και ηµιαυτόµατων ανοσοθολεροµετρικών µεθόδων (ITA) για πρωτεΐνες χρησιµοποιώντας φυγόκεντρους αναλυτές. Ο ποσοτικός προσδιορισµός των πρωτεϊνών του ορού χρησιµοποιώντας ανοσοθολεροµετρικές µεθόδους δείχνει εξαιρετική συσχέτιση µε παραδοσιακές µεθόδου ς όπως τη ραδιενεργό ανοσοδιάχυση (radial immunodiffusion). Με τ η βοήθεια της θολεροµετρίας προσδιορίστηκε ποσοτικά και η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP). Πρόκειται για πρωτεΐνη οξείας φάσης (Μ.Β ), που αναστέλλει τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων, δηλαδή είναι µία µη ειδική οψωνίνη. Η ουσία αυτή ενεργοποιεί το συµπλήρωµα, ενώνεται µε φωσφορυλοχολίνη, λιπίδια, πολυκατιόντα, γαλακτάνες και µετέχει στο σχ ηµατισµ ό των πρωτεϊνών της αίµης και ιδιαίτερα της καταλάσης. Tο αντιδραστήριο ACE της CRP που χρησιµοποιήθηκε περιέχει ανθρώπινη CRP, αναµιγνύεται µε ρυθµιστικό διάλυµα και µετά από επώαση αντιδρά µε ειδικό άντρο ώστε να σχηµατίσει ίζηµα το οποίο µετράται θολεροµετρικά στα 340 nm/692 nm. Το αντιδραστήριο ACE- CRP έχει την ακόλουθη σύσταση: Σύσταση αντιδραστηρίου Ενεργά συστατικά Συγκεντρώσεις Ρυθµιστικό διάλυµα Assay Πολυαιθυλενογλυκόλη 4% µέγιστη ποσότητα Ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCL 20mmol/l, ph 7,4 HCL 150mmol/l Αντίσωµα-αντιδραστήριο Ανθρώπινη αντι-crp Μέθοδος µέτρησης της τροπονίνης Το οξύ έµφραγµα του µυοκαρδίου διαγιγνώσκεται συνήθως µε βάση τον στηθαγχικό πόνο, τις ηλεκτροκαρδιογραφικές αλλοιώσεις και την άνοδο των δεικτών της µυοκαρδιακής νέκρωσης. Το ισοένζυµο ΜΒ της κρ εατινικής κινάσης (CK-MB) ήταν για δυο δεκαετίες [216] ο βιοχηµικός δείκτης προτίµησης. Ο Wu και συν, µέσα από τη µελέτη τους βρήκαν εξαιρετική κλινική ευαισθησία του δείκτη CK-MB µεταξύ 6 και

130 ωρών του εµφράγµατος, ενώ η ευαισθησία του δείκτη αυτού µειώνεται στο διάστηµα µεταξύ 24 και 48 ωρών [217]. Ο Cummins και συνεργάτες του [218,219], ανέφεραν πρώτοι την απελευθέρωση της καρδιακής τροπονίνης I (ctni) στο έµφραγµα. Οι περισσότερες µελέτες έχουν αναδείξει την πρωτεΐνη ctni ως δείκτη µε εξαιρετική ευαισθησία και εξειδίκευση στο έµφραγµα µυοκαρδίου και άλλες καρδιακές παθήσεις. Η τροπονίνη είναι ένα µόριο που ρυθµίζει τη σύσπαση των γραµµωτών µυών που είναι εξαρτώµενη από το ασβέστιο. Η τροπονίνη αποτελείται από 3 υποοµάδες: την Τ (ctnτ) που ενώνεται µε την τροποµυοσίνη, συνδέοντας έτσι το σύµπλεγµα της τροπονίνης µε το λεπτό νηµάτιο, την τροπονίνη I (ctni) που ενώνεται µε την ακτίνη και εµποδίζει τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ ακτίνης-µυοσίνης, τη σύσπαση δηλαδή των γραµµωτών µυών απουσία ασβεστίου και τη C που συνδέει το ασβέστιο [220]. Η καρδιακή τροπονίνη I (MB 22,5 kdα) και οι δυο σκελετικές ισοµορφές της τροπονίνης Ι έχουν σηµαντική οµόλογη σειρά αµινοξέων αλλά η ctni περιέχει µία επιπλέον Ν-τελική σειρά [221] και είναι εξαιρετικά ειδική για το µυοκάρδιο [222]. Η µέθοδος µε την οποία προσδιορίστηκε ποσοτικά η τροπονίνη I είναι η µέθοδος της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας. Πρόκειται για µία στερεής φάσης ανοσοµετρική µέθοδο. Με τις ανοσοµετρικές µεθόδους προσδιορίζονται κυρίως ουσίες µε µικρό µοριακό βάρος, όπως είναι οι ορµόνες και τα φάρµακα. Ανιχνεύονται και προσδιορίζονται χηµικές ουσίες σε βιολογικά υγρά χρησιµοποιώντας την αντίδραση αντιγόνου (Ag)-αντισώµατος (Αb). Χαρακτηριστικές ιδιότητες των ανοσοχηµικών-ανοσοµετρικών µεθόδων είναι η µεγάλη ευαισθησία και η ειδικότητα. Έτσι ένα αντιγόνο διεγείρει µόνο εκείνα τα κύτταρα, που από την καταβολή τους είναι προικισµένα µε ειδικούς υποδοχείς γι αυτό. Έτσι η αντίδραση αντιγόνου-αντισώµατος είναι τελείως ειδική. Η ειδικότητα και η ευαισθησία κάνουν ικανό ένα αντίσωµα να αναγνωρίσει το αντιγόνο του µέσα σ ένα σύνθετο, πολύπλοκο µίγµα. Η σύνδεση αντιγόνου-αντισώµατος είναι πολύ ισχυρή, αλλά αναστρέψιµη. Στις ανοσοµετρικές µεθόδους (immunometric methods) το σηµασµένο αντιδραστήριο είναι ένα αντίσωµα ειδικό προς την αναλυόµενη ουσία-αντιγόνο. Στην αντίδραση µ ετέχει και άλλο ένα όµοιο αντίσωµα, µη σηµασµένο, που είναι καθηλωµένο σε µια στερεή επιφάνεια και που έχει σαν προορισµό να αποσπάσει µε προσρόφηση το αντιγόνο από τον ορό. Επειδή στις αντιδράσεις αυτές το µετρούµενο αντιγόνο βρίσκεται ανάµεσα σε δύο αντισώµατα, τις αναφέρουν συχνά και σαν αντιδράσεις sandwich. Το αποτέλεσµα της αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογο µε τη συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας µέσα στο δείγµα [208]. 130

131 Η επιµέρους ονοµατολογία των µεθόδων καθορίζεται από τη σηµαίνουσα ουσία, την ουσία που κάνει ορατή την αντίδραση, τον ιχνηθέτη. Σαν ιχνηθέτες στις µεθόδους αυτές χρησιµοποιούνται ουσίες που εκπέµπουν βιοφωταύγεια, όπως η λουµινόλη και η λουσιφερόλη, καθώς και ουσίες χηµειοφωταυγείς, που εκπέµπουν φως όταν οξειδωθούν. Βασικά πλεονεκτήµατα των µεθόδων αυτών είναι η µεγάλη ευαισθησία, τα σταθερά αντιδραστήρια και το χαµηλό κόστος ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ-ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στους παρακάτω πίνακες παρατίθενται οι τιµές των µετρήσεων των βιοχηµικών δεικτών που προσδιορίστηκαν µε τις παραπάνω προαναφερθείσες µεθόδους και τα κατάλληλα αντιδραστήρια. Στον πίνακα 20 παρουσιάζονται οι τιµές όλων των προσδιοριζόµενων παραµέτρων στο αίµα των πειραµατόζωων και των µαρτύρων µετά από υποδόρια χορήγηση του φαρµάκου για 10 ηµέρες καθώς και οι µονάδες µέτρησης αυτών. ΠΙΝΑΚ ΑΣ 20 : Aποτελέσµατα µέτρησης των βιοχηµ ικών παραµέτρων που προσδιορίζουν τον καρδιαγγειακό κίνδυνο µετά από χορήγηση ροφεκοξίµπης για 10 ηµέρες σε πειραµατόζωα και µάρτυρες. 131

132 Σύµφωνα µε τον πίνακα 20 και στα πλαίσια του γενικότερου σχολιασµού των µετρήσεων στις 10 ηµέρες, δεν προκύπτει στο συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα χορήγησης του φαρµάκου στατιστικώς σηµαντική διαφορά ανάµεσα στις τιµές των πειραµατόζωων και των µαρτύρων για τη χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια, τις τρανσαµινάσες, τη CPK και την CRP. Μεµονωµένες µόνο τιµές είναι αυξηµένες στα πειραµατόζωα σε σχέση µε τους µάρτυρες. Αυτό όµως δε µπορεί να οδηγήσει σε ασφαλή συµπεράσµατα για τις καρδιαγγειακές επιπτώσεις του φαρµάκου. Είναι αξιοσηµείωτο όµως, ότι όλες οι τιµές της τροπονίνης 0,01 ng/ml είναι ίδιες και για τα πειραµατόζωα και για τους µάρτυρες, γεγονός που σηµαίνει ότι δεν υπάρχει καµία επίδραση της ροφεκοξίµπης στις τιµές της τροπονίνης και άρα και στον καρδιαγγειακό κίνδυνο. Όπως προαναφέρθηκε, η τροπονίνη αποτελεί σηµαντικό κλινικό και βιοχηµικό δείκτη µε εξαιρετική ευαισθησία και εξειδίκευση στο έµφραγµα και άλλες καρδιαγγειακές παθήσεις. Ακολουθεί ο πίνακας, στον οποίο αναγράφονται ανάλογες µετρήσεις των βιοχηµικών παραµέτρων για 20 ηµέρες χορήγησης ροφεκοξίµπης σε πειραµατόζωα και µάρτυρες (πίνακας 21). ΠΙΝΑΚΑΣ 21: Αποτελέσµατα-µετρήσεις των ίδιων βιοχηµικών παραµέτρων µ ετά από χρονικό διάστηµα χορήγησης του COX-2 αναστολέα για 20 ηµέρες σε πειραµατόζωα και µάρτυρες. Στον πίνακα 21 παρουσιάζονται οι µετρήσεις των ίδιων µεγεθών, όπως και στον πίνακα 20, µετά από συνεχή χορήγηση του φαρµάκου για 20 ηµέρες. Με εξαίρεση τη χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια, όπου οι 132

133 τιµές κυµαίνονται στα ίδια περίπου επίπεδα µεταξύ πειραµατόζωων και µαρτύρων, οι τιµές των SGOT, SGPT, CPK, και CRP στα πειραµατόζωα είναι µεγαλύτερες από αυτές των µαρτύρων. Ιδιαίτερα οι τιµές της τροπονίνης στις 20 ηµέρες είναι µεγαλύτερες σε σύγκριση και µε το χρονικό διάστηµα των 10 ηµερών αλλά και µεταξύ τους. Ακολουθεί ο πίνακας µε ανάλογες µετρήσεις των βιοχηµικών παραµέτρων για 30 ηµέρες χορήγησης ροφεκοξίµπης σε πειραµατόζωα και µάρτυρες (πίνακας 22). ΠΙΝΑΚΑΣ 22: Aποτελέσµατα-µετρήσεις των βιοχηµικών δεικτών µετά από χρονικό διάστηµα χορήγησης ροφεκοξίµπης 30 ηµερών σε πειραµατόζωα και µάρτυρες. Στον πίνακα 22, όπου προσδιορίζονται οι τιµές των ίδιων µεγεθών µετά από χορήγηση του φαρµάκου για 30 ηµέρες, υπάρχει µία σταθερά αυξητική τάση των τιµών όλων των βιοχηµικών πα ραµέτρων σε σύγκριση µ αυτές των 10 και 20 ηµερών, µ ε εξαίρεση τη χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια. Στις 30 ηµέρες συνεχούς χορήγησης της ροφεκοξίµπης, οι τιµές της τροπονίνης είναι σταθερά αυξηµένες σε σχέση µε αυτές των µαρτύρων, αλλά και σε σχέση µε αυτές των προηγούµενων ηµερών. Στον πίνακα 23 που ακολουθεί, παρουσιάζονται οι τιµές των ίδιων βιοχηµικών µεγεθών µετά από χρονικό διάστηµα χορήγησης της ροφεκοξίµπης 45 ηµερών. 133

134 ΠΙΝΑΚΑΣ 23: Αποτελέσµατα-µετρήσεις των βιοχηµικών δεικτών σε πειραµατόζωα και µάρτυρες µετά από χρονικό διάστηµα χορήγησης ροφεκοξίµπης 45 ηµερών. Στον πίνακα 23 παρουσιάζονται οι µετρήσεις των τιµών των ίδιω ν παραµέτρων µετά από 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου. Οι τιµές της τροπονίνης στα πειραµατόζωα είναι πολύ µεγαλύτερες από αυτές των µαρτύρων. Το ίδιο συµβαίνει και για τα υπόλοιπα ένζυµα, εκτός από τη χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια. Συγκρίνοντας τις µετρήσεις µ εκείνες των 10, 20 και 30 ηµερών παρατηρείται σηµαντική αύξηση των τιµών. Αυτό οδηγεί στο συµπέρασµα ότι η αύξηση του χρονικού διαστήµατος χορήγησης του φαρµάκου έχει ως αποτέλεσµα την αναλογική αύξηση των τιµών των µετρούµενων βιοχηµικών µεγεθών. Τα αποτελέσµατα συγκεντρωτικά παρουσιάζονται κατά προσέγγιση 2 δεκαδικών ψηφίων στον πίνακα

135 ΠΙΝΑΚΑΣ 24: Συγκεντρωτικά αποτελέσµατα για όλους τους βιοχηµικούς δείκτες στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα. Υπολογισµός της µέσης τιµής, του τυπικού σφάλµατος και των ορίων εµπιστοσύνης για όλα τα δείγµατα σύµφωνα µε την δοκιµασία t (Student s test). Για όλα τα µεγέθη υπολογίστηκε ο µέσος όρος, το τυπικό σφάλµα καθώς και τα όρια (ανώτερα και κατώτερα) των µέσων τιµών µε εύρος εµπιστοσύνης 95% (confidence interval) για τα πειραµατόζωα και τους µάρτυρες για όλες τις ηµέρες. Συγκρίνοντας τις τιµές των βιοχηµικών δεικτών µεταξύ των επίµυων-πειραµατόζωων στα οποία χορηγήθηκε ο COX-2 αναστολέας ροφεκοξίµπη και των επίµυων-µαρτύρων (control groups) διαπιστώνεται άνοδος αυτών των τιµών στα πειραµατόζωα που έλαβαν το φάρµακο, µε εξαίρεση αυτές των τριγλυκεριδίων. Στα τριγλυκερίδια, παρατηρείται άλλωστε και το µεγαλύτερο τυπικό σφάλµα 11,73 για τους µάρτυρες και 10,68 περίπου για τα πειραµατόζωα. Ειδικότερα, οι τιµές της CRP και της τροπονίνης στους επίµυες που έλαβαν τη ροφεκοξίµπη, είναι σχεδόν διπλάσιες σε σχέση µε αυτές των µαρτύρων και τα όρια του τυπικού σφάλµατος είναι πολύ µικρά (<1). Αυτό οδηγεί σε πιο ασφαλή συµπεράσµατα για την ακρίβεια των συγκεκριµένων µετρήσεων. Τα διαγράµµατα που ακολουθούν αποδεικνύουν τη διακύµανση των τι µών των βιοχηµικών παραµέτρων σε σχέση µε το χρόνο χορήγησης του φαρµάκου. 135

136 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΗΜΕΡΕΣ ΣΧΗΜΑ 11: Σύγκριση των τιµών της χοληστερόλης στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησης της ροφεκοξίµπης. Η χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια στο πλάσµα δεν έδειξαν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ των µαρτύρων και των πειραµ ατοζώων. Οι τιµές τους κυµαίνονται στα ίδια περίπου επίπεδα, αν τις συγκρίνουµε µεταξύ των ηµερών χορήγησης. Η στατιστική αναλυτική µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε είναι η δοκιµασία t του student (student s t-test). Πρόκειται για δοκιµασία σηµαντικότητας (test of significance) στην οποία εξακριβώνεται: 1) εάν το δείγµα αντανακλά τις ιδιότητες του πληθυσµού και 2) εάν δυο ή περισσότερα δείγµατα προέρχονται από τον ίδιο ή από παρόµοιους πληθυσµούς. Το t-κριτήριο χρησιµοποιείται σε µικρά δείγµατα (n<30) και χρησιµοποιώντας την κοινή διακύµανση (s 2 ) (pooled variance) βοηθά στη σύγκριση µεταξύ µέσων όρων µικρών δειγµάτων. Ακολουθεί ο πίνακας 25, που περιλαµβάνει τα βασικότερα µεγέθη µιας φαρµακοκινητικής ανάλυσης για τη χοληστερόλη µε βάση τη δοκιµασία-t για το µέσο όρο. 136

137 ΠΙΝΑΚΑΣ 25: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο χοληστερόλης στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης της ροφεκοξίµπης στα πειραµατόζωα. Στον πίνακα 25 υπολογίζονται οι τιµές της χοληστερόλης για τα πειραµατόζωα στα οποία χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη για τις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης. Υ πολογίζεται το κριτήριο t, η µέση διαφορά, το τυπικό σφάλµα και το εύρος εµ πιστοσύνης για πιθανότητα πλάνης p=0,05 ή 5%. Στις 30 και τις 45 ηµέρες, οι τιµές της χοληστερόλης είναι στατιστικώς σηµαντικές σε σχέση µ αυτές των µαρτύρων, όπως διακρίνεται και στο σχήµα 11. Η σηµαντικότητα σηµειώνεται στο σχήµα 11 µε αστεράκια. Στη συνέχεια, παρουσιάζεται το σχήµα (σχήµα 12) που απεικονίζει τις τιµές των τριγλυκεριδίων σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησης της ροφεκοξίµπης και γίνεται η σύγκριση µεταξύ µαρτύρων και πειραµατοζώων. 137

138 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΗΜΕΡΕΣ Σχήµα 12: Σύγκριση των τιµών των τριγλυκεριδίων στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησης του. Χρησιµοποιώντας το ίδιο κριτήριο t διαπιστώνεται ότι η διαφορά των τριγλυκεριδίων είναι στατιστικώς σηµαντική (p= 0,021) σε σύγκριση µε αυτή της οµάδας των µαρτύρων µετά την 30 η ηµέρα χορήγησης. Στο σχήµα η σηµαντικότητα διακρίνεται µε το αστεράκι. εν είναι όµως στατιστικά σηµαντική µετά από 45 ηµ έ ρες χορήγησης του φαρµάκου (πίνακας 26). Στον πίνακα 26 υπολογίζονται οι τιµές των τριγλυκεριδίων για τα πειραµατόζωα στα οποία χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη για τις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης. Υπολογίζεται το κριτήριο t, η µέση διαφορά, το τυπι κό σφάλµα και το εύρος εµπιστοσύνης για πιθανότητα πλάνης p= 0,05 ή 5%. 138

139 ΠΙΝΑΚΑΣ 26: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο των τριγλυκεριδίων στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης της ροφεκοξίµπης στα πειραµατόζωα. Ακολουθεί το σχήµα 13, όπου απεικονίζεται η διακύµανση των τιµών της SGOT τόσο στα πειραµατόζωα όσο και στους µάρτυρες στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες. Οι τιµές της SGOT παρουσιάζουν σταθερή και σηµαντική άνοδο από τις 10 έως και τις 30 ηµέρες χορήγησης. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΗΜΕΡΕΣ ΣΧΗΜΑ 13: ιακύµανση των τιµών της SGOT στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησης του φαρµάκου. 139

140 Ακολουθεί ο πίνακας 27, που περιλαµβάνει τα βασικότερα µεγέθη µιας φ αρµακοκινητικής ανάλυσης για τη SGOT µε βάση τη δοκιµασία-t για το µέσο όρο. ΠΙΝΑΚΑΣ 27: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο της SGOT στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου στα πειραµατόζωα. Από τον πίνακα 27 διαπιστώνεται ότι, η τιµή της SGOT στα πειραµατόζωα που έλαβαν τη ροφεκοξίµπη είναι στατιστικώς σηµαντική στις 30 ηµέρες χορήγησής της (p= 0,005) σε σχέση µε τους µάρτυρες. Από το σχήµα 14 διακρίνεται η σταθερά ανοδική και αυξητική τάση που παρουσιάζει η SGPT σε σχέση µε το χρόνο. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΗΜΕΡΕΣ ΣΧΗΜΑ 14: ιακύµανση των τιµών της SGΡT στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησης του φαρµάκου. 140

141 Ακολουθεί ο πίνακας 28, που περιλαµβάνει τα βασικότερα µεγέθη µιας φαρµακοκινητικής ανάλυσης για τη SGΡT µε βάση τη δοκιµασία-t για το µέσο όρο. Οι τιµές της όπως φαίνεται και από τον πίνακα 28 είναι στατιστικώς σηµαντικές στις 20 και στις 30 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου (p= 0,006 και p= 0,056) αντίστοιχα. ΠΙΝΑΚΑΣ 28: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο της SGΡT στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου στα πειραµατόζωα. Στο παρακάτω σχήµα διακρίνεται η αυξητική τάση της τιµής της CPK στα πειραµατόζωα στα οποία χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη σε σύγκριση µ αυτή των µαρτύρων (σχήµα 15). ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΗΜΕΡΕΣ ΣΧΗΜΑ 15: ιακύµανση των τιµών της CPK στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα από τις 10 ως τις 45 ηµέρες χορήγησης της ρ οφεκοξίµπης. 141

142 ΠΙΝΑΚΑΣ 29: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο της CPK στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου στα πειραµατόζωα. Η διαφορά της CPK στους επίµυες που έλαβαν ροφεκοξίµπη είναι εξαιρετικά στατιστικώς σηµαντική για τις 20, 30 και 45 ηµέρες (< 0,001), όπως φαίνεται και στον πίνακα 29. Ακολουθεί η διακύµανση των τιµών της CRP σε σχέση µε το χρονικό διάστηµα χορήγησής της και γίνεται η σύγκριση των τιµών της στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα (σχήµα 16). ΣΧΗΜΑ 16: ιακύµανση των τιµών της CRP στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα από τις 10 ως τις 45 ηµέρες χορήγησης της ροφεκοξίµπης. 142

143 Οι τιµές της CRP, όπως διακρίνεται στο σχήµα 16, παρουσιάζουν σταθερή άνοδο στα πειραµατόζωα σε σύγκριση µε τους µάρτυρες και σε σχέση µε το χρόνο χορήγησης του φαρµάκου. ΠΙΝΑΚΑΣ 30: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο της CRP στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου στα πειραµατόζωα. Από τον πίνακα 30 διαπιστώνεται ακόµη ότι η διαφορά της CRP στους επίµυες που έλαβαν τη δραστική ουσία είναι εξαιρετικά στατιστικώς (<0,001) σηµαντική στις 10, 20 και 45 ηµέρες σε σχέση µ αυτή των µαρτύρων. Στις 30 ηµέρες είναι (<0,05) επίσης στατιστικώς σηµαντική. Στο σχήµα 17, δίνεται η διακύµανση των τιµών µιας άλλης βιοχηµικής παραµέτρου, µε σηµαντική ευαισθησία και εξειδίκευση στις καρδιαγγειακές παθήσεις, σε σχέση µε το χρόνο χορήγησής της. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΣΧΗΜΑ 17: ιακύµανση των τιµών της τροπονίνης στους µάρτυρες και τα πειραµατόζωα από τις 10 ως τις 45 ηµέρες χορήγησης της ροφεκοξίµπης. 143 ΗΜΕΡΕΣ

144 Ιδιαίτερα σ η µαντική άνοδο παρουσιάζουν οι τιµ ές τη ς τροπονίνης από τις 10 έως και τις 45 ηµέρες χορήγησης (σχήµα 17). Είναι αξιοσηµείωτο ότι όλες οι τιµές της στους µάρτυρες είναι οι ίδιες 0,01, ενώ µ ε τη χορήγηση του φαρµάκου παρουσιάζουν µια σταθερά αυξητική πορεία. Αυτό έχει ιδιαίτερη σηµασία, κρίνοντας από το γεγονός ότι η τροπονίνη είναι ένα καθαρά µυοκαρδιακό ένζυµο που αυξάνεται ακόµ η και σε µικροέµ φρακτα και νεκρώσεις µυοκαρδίου µικρού βαθµού. ΠΙΝΑΚΑΣ 31: Αναλυτικός πίνακας των κυριότερων κριτηρίων της t- δοκιµασίας για το µέσο όρο της τροπονίνης στις 10, 20, 30 και 45 ηµέρες χορήγησης του φαρµάκου στα πειραµατόζωα. Στον πίνακα 31, η διαφορά της τροπονίνης είναι εξαιρετικά στατιστικώς σηµαντική, ενώ τα όρια του τυπικού σφάλµατος είναι πάρα πολύ µ ικρά, σχεδόν µηδαµινά. Συµπερασµατικά, η διαφορά των CPK, CRP και τροπονίνης είναι στατιστικά σηµαντική στα πειραµατόζωα που έλαβαν ροφεκοξίµπη σε σχέση µε των µαρτύρων και δείχνει µια σταθερή άνοδο σε σχέση µε το χρόνο (σχήµατα 15, 16 και 17). Στον πίνακα 32, παρουσιάζεται ξεχωριστά η ανάλυση διακύµανσης µεταξύ των οµάδων στις οποίες χορηγήθηκε ο COX-2 αναστολέας και υπολογίζεται η στατιστική σηµαντικότητα για κάθε βιοχηµικό µέγεθος ξεχωριστά. 144

145 ΠΙΝΑΚΑΣ 32: Ανάλυση της διακύµανσης µεταξύ των δειγµάτων ορού αίµατος των πειραµατόζωων στα οποία χορηγήθηκε ροφεκοξίµπη σε δόση 25mg/kg Β.Σ. Με εξαίρεση τη χοληστερόλη που δεν είναι στατιστικώς σηµαντική, όλες οι άλλες βιοχηµικές παράµετροι είναι εξαιρετικά στατιστικώς σηµαντικές. 145

146 12. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ 12.1 Επεξεργασία των ιστών για παρατήρηση µε το οπτικό µικροσκόπιο Μετά την ανίχνευση της συγκεντρώσεως του φαρµάκου ροφεκοξίµπης στον ορό των επίµυων-πειραµατοζώων µε τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) και τον προσδιορισµό των βιοχηµικών δεικτών στον ορό, αναζητήθηκαν ιστολογικές αλλοιώσεις στο µυοκάρδιο των πειραµατοζώων. Σκοπός ήταν να συγκριθούν οι ιστολογικές αλλοιώσεις στα πειραµατόζωα στα οποία είχε χορηγηθεί ο COX-2 αναστολέας ροφεκοξίµπη για το χρονικό διάστηµα των 10, 20, 30 και 45 ηµερών µε το φυσιολογικό µυοκαρδιακό ιστό των µαρτύρων. Μετά τη θανάτωση των πειραµατοζώων και τη λήψη αίµατος, λήφθηκε µυοκαρδιακός ιστός από πειραµατόζωα και επίµυες για εξέταση µε το οπτικό µικροσκόπιο. Για το σκοπό αυτό, τα ιστοτεµάχια µυοκαρδιακού ιστού µονιµοποιήθηκαν για 7 ηµέρες σε διάλυµα ουδέτερης φορµόλης πυκνότητας 10%. Ακολούθησε η διαδικασία της σκήνωσης µε έγκλεισή τους σε παραφίνη, η λήψη λεπτών ιστολογικών τοµών, πάχους 0,5mm και η χρώση τους µε αιµατοξυλίνη-εωσίνη. Η χρώση εωσίνης-αιµατοξυλίνης (Ηαrris) είναι µία µη ειδική, ιστολογική χρώση κατάλληλη για εµφάνιση στο οπτικό µ ικροσκόπιο των λείων µυϊκών ινών του µ υοκαρδίου. Βάφει τους πυρήνες µε κυανό χρώµα (προέρχεται από την αιµατοξυλίνη), ενώ προσδίδει στο κυτταρόπλασµα και στο κολλαγόνο των ιστών ροζ µέχρι κόκκινο χρώµα (προέρχεται από την εωσίνη). Η επιλογή του οπτικού µικροσκοπίου ως µέσο διάγνωσης στην παρούσα µελέτη βασίστηκε στο γεγονός ότι το οπτικό µικροσκόπιο είναι εργαλείο προσιτό, µε µικρό σχετικά κόστος και δεν απαιτεί ιδιαίτερη εξειδίκευση στη χρήσή του σε σχέση µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο παρ όλο που προσφέρει τα µέγιστα σε πολλούς τοµείς της Ιατρικής, αποκλείστηκε ως διαγνωστικό εργαλείο για όλους τους παραπάνω λόγους αλλά και γιατί η παρούσα µελέτη απαιτούσε ταχύτητα στη διάγνωση. Η πολυτέλεια άλλωστε ενός ηλεκτρονικού µικροσκοπίου δεν υπάρχει πάντα. Στη συνέχεια του πειραµατικού µέρους, παρουσιάζεται ένα παράρτηµα φωτογραφιών από το µυοκάρδιο των πειραµατοζώων στα οποία χορηγήθηκε η ροφεκοξίµπη για χρονικό διάστηµα 20, 30 και 45 ηµερών. Το µυοκάρδιο αυτό συγκρίνεται µ αυτό του µάρτυρος και ακολουθούν σχολιασµός και συµπεράσµατα. 146

147 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ 147

148 148

149 ΕΙΚΟΝΑ 12: Μυοκάρδιο µάρτυρος. Φυσιολογικό µυοκάρδιο. Κατά τόπους είναι εµφανής η εγκάρσια γράµµωση του σαρκοπλάσµατος. Επίσης φαίνονται και αρκετοί ωοειδείς πυρήνες των µυοκαρδιακών κυττάρων καθώς και δυο µικρά τριχοειδή αγγεία και λίγα κύτταρα του συνδετικού ιστού µεταξύ των ινών του µυοκαρδίου. 149

150 ΕΙΚΟΝΑ 13: Μυοκάρδιο πειραµατοζώων στα οποία χορηγήθηκε ροφεκοξίµπη για διάστηµα 20 ηµερών. Οι ίνες του µυοκαρδίου φαίνονται ίδιες µε του µάρτυρα. Είναι εµφανής η εγκάρσια γράµµωση του σαρκοπλάσµατος καθώς και λίγοι πυρήνες των ινών του µυοκαρδίου. Επίσης φαίνονται λίγα λεµφοκύτταρα στο συνδετικό ιστό µεταξύ των µυοκαρδιακών ινών. 150

151 ΕΙΚΟΝΑ 14: Μυοκάρδιο πειραµατοζώων στα οποία χορηγήθηκε ροφεκοξίµπη για διάστηµα 30 ηµερών. Οι µυοκαρδιακές ίνες είναι φυσιολογικές. Είναι ορατοί ορισµένοι πυρήνες καθώς και η εγκάρσια γράµµωση του σαρκοπλάσµατος. 151

152 ΕΙΚΟΝΑ 15: Μυοκάρδιο πειραµατοζώων στα οποία χορηγήθηκε ροφεκοξίµπη για χρονικό διάστηµα 45 ηµερών. Παρατηρούνται ίνες του µ υοκαρδίου σε εγκάρσια και επιµήκη διατοµή, οι οποίες είναι όµοιες µε τις ίνες του µυοκαρδίου των µαρτύρων. Σ υµπέρασµα Όσον αφορά την ιστολογική µελέτη του µυοκαρδίου δεν παρατηρήθηκαν µορφολογικές αλλοιώσεις στο οπτικό µικροσκόπιο. Το µ υοκάρδιο των πειραµατοζώων ήταν όµοιο µε των µαρτύρων. 152