ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GST4 (S-ΜΕΤΑΦΟΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ) ΣΕ ΦΥΤΑ ΚΑΠΝΟΥ Μπενέκος Κωνσταντίνος Γεωπόνος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 Επιβλέπων : Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη, Λέκτορας Εξεταστική Επιτροπή: Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη, Λέκτορας Τσαυτάρης Αθανάσιος, Καθηγητής Κούτσικα-Σωτηρίου Μεταξία, Καθηγήτρια 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 4 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 5 ΑΓΓΛΙΚΟΙ ΟΡΟΙ... 7 ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ... 8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ A) Η ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΠΝΟΥ (Nicotiana tabacum L.) Β) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΣΤΗΝ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΚΑΠΝΟΥ Γ) ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ S-ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΩΝ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSTs) ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ Δ) Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ Ε) ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ S- ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΩΝ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α) ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27-gst4) ΣΕ E.coli Β) ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΟΥ Agrobacterium tumefaciens ΜΕ ΤΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (part27 και part27-gst4) Γ) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΜΠΑΣΜΑΣ, VIRGINIA ΚΑΙ BURLEY Δ) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ Ε) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GST4 ΣΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΚΑΠΝΟΥ AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α) ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27-gst4) ΣΕ E.coli Β) ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΟΥ Αgrobacterium tumefaciens ΜΕ ΤΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27 και pαρτ27-gst4) Γ) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΜΠΑΣΜΑΣ, VIRGINIA ΚΑΙ BURLEY Δ) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ Ε) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GST4 ΣΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΚΑΠΝΟΥ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη, Λέκτορα, για την ανάθεση του θέματος, τις υποδείξεις και την όλη υποστήριξη κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης τα μέλη της τριμελούς επιτροπής Καθηγητή κ. Τσαυτάρη Αθανάσιο για τις χρήσιμες υποδείξεις του καθ όλη την διάρκεια της μεταπτυχιακής μου διατριβής και για την ευκαιρία που μου έδωσε να πραγματοποιήσω το μεγαλύτερο μέρος της μεταπτυχιακής μου εργασίας στο Ινστιτούτο Αγροβιοτεχνολογίας, καθώς και την καθηγήτρια κ. Κούτσικα-Σωτηρίου Μεταξία για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών. Επιπλέον ευχαριστώ όλο το προσωπικό του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας για τις συμβουλές του πάνω σε τεχνικά θέματα και ιδιαιτέρως την κ. Καλαμάκη Μαρία για την πολύτιμη βοήθεια και συμπαράσταση που μου προσέφερε κατά την διάρκεια εκτέλεσης των μοριακών πειραμάτων. Θεωρώ επίσης υποχρεωσή μου να ευχαριστήσω και τον κ. Πασιέντση Κωνσταντίνο, τεχνικό επιστήμονα του Ινστιτούτου για το ενδιαφέρον του και τις πολύτιμες συμβουλές που μου έδινε κάθε φορά που παρουσιάζονταν οποιοδήποτε πρόβλημα μοριακής φύσης. 4

5 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ALS: acetolactate synthase (οξεικογαλακτική συνθετάση) BAP: benzyloaminopurine (βενζυλαμινοπουρίνη) BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ φωσφορικό άλας) bp: base pair (ζεύγος νουκλεοτιδίων) ΒSA: bovine serum albumin (βόεια οροαλβουμίνη) CAMV-35S: cauliflower mosaic virus (υποκινητής του γονιδίου 35S του ιού του μωσαϊκού του κουνουπιδιού) CTAB: hexadltrimethylammonium bromide (βρωμίδιο του εξατριμεθυλαμμωνίου) Dig: digoxygenin (διγοξυγενίνη) DNA: deoxyribonucleic acid (δεόξυριβονουκλεϊκό οξύ) GR: glutathione reductase (αναγωγάση της γλουταθειόνης) GSH: γ-glutamylcysteinylglycine (γλουταθειόνη ή ανηγμένη μορφή γλουταθειόνης) GSSG: glutathione disulfide (δισουλφίδιο της γλουταθειόνης ή οξειδωμένη μορφή γλουταθειόνης) GST: glutathione S-transferase (S-μεταφοράση της γλουταθειόνης) hgsh: homoglutathione (ομογλουταθειόνη) IPTG: isopropylthio-β-galacoside (ισοπροπυλθειο-β-γαλακτοσίδιο) Kb: kilobase (κιλοβάση) KDa: kilodalton (κιλοντάλτον) LB: Luria Bertani (υπόστρωμα ανάπτυξης βακτηρίων) MS: Murashige και Skoog (υπόστρωμα ανάπτυξης φυτών) MSR: Murashige και Skoog Regenaration (υπόστρωμα αναγέννησης ΜS) NAA: naphthalinoxyacetic acid (ναφθαλινοξικό οξύ) NBT: nitroblue tetrazolium chloride (μπλε νιτροτετραζολικό άλας) NPT II: neomycin phosphorotransferase II (φωσφομεταφοράση ΙΙ της νεομυκίνης) PAT: phosphinothricin acetyl transferase (τρανσφεράση της ακετυλ-φωσφινοθρυσίνης) PCR: polymerase chain reaction (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης) ROS: reactive oxygen species (ενεργές μορφές οξυγόνου) 5

6 T-DNA: transferred DNA (μεταφερόμενο DNA) ΤΝΤ: 2,4,6-Trinitrotoluene (τρινιτροτολουόλιο) U: Unit (μονάδα) X-gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-β-Dγαλακτοσίδιο) 6

7 ΑΓΓΛΙΚΟΙ ΟΡΟΙ Agrobacterium: Αγροβακτήριο Binary vector : δυαδικός φορέας γενετικής τροποποίησης Buffer : ρυθμιστικό διάλυμα Competent cells : δεκτικά κύτταρα Constitutive promoter : συστατικός υποκινητής Εscherichia coli (E. coli): Κολοβακτήριο Expression cassette : κασέτα έκφρασης Forward primer: ανοδικός εκκινητής Kit : τυποποιημένη συσκευασία Laminar flow : τράπεζα νηματικής ροής Magenta boxes : ειδικά δοχεία ιστοκαλλιέργειας Probe: ανιχνευτής Promoter : υποκινητής Reactive Oxygen Species (ROS) : ενεργές μορφές οξυγόνου Reverse primer: καθοδικός εκκινητής Stock solution : μητρικό διάλυμα Terminator sequence : αποληκτική αλληλουχία Thermocycler : θερμοκυκλωποιητής Tip : ακρορύγχιο Xenobiotic: ξενοβιοτική ουσία 7

8 ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ Αγροβακτήριο : Agrobacterium tumefaciens Ακρορύγχιο : tip Ανιχνευτής: probe Ανοδικός εκκινητής: forward primer Αποληκτική αλληλουχία : terminator sequence Βόεια οροαλβουμίνη : bovine serum albumin Δεκτικά κύτταρα : competent cells Δυαδικός γενετικής τροποποίησης : binary vector Ειδικά δοχεία ιστοκαλλιέργειας : Magenta boxes Ενεργές μορφές οξυγόνου : Reactive Oxygen Species Θερμοκυκλωποιητής : thermocycler Καθοδικός εκκινητής: reverse primer Κασέτα έκφρασης : expression cassette Κολοβακτήριο : Escherichia coli (Ε. coli) Μητρικό διάλυμα : stock solution Ρυθμιστικό διάλυμα : buffer Συστατικός υποκινητής : constitutive promoter Τράπεζα νηματικής ροής : laminar flow Τυποποιημένη συσκευασία : kit Υποκινητής: promoter Ξενοβιοτική ουσία: xenobiotic 8

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι S-τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs EC ) σχετίζονται με την αποτοξίνωση ξενοβιοτικών ουσιών στο φυτικό κύτταρο, καταλύοντας την ένωση του τριπεπτιδίου του γλουταθείου με την ξενοβιοτική ουσία. Στα καλλιεργούμενα φυτά και ζιζάνια οι GSTs παίζουν σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων, και είναι υπεύθυνες για την εκλεκτικότητα που παρουσιάζουν διάφορα φυτικά είδη απέναντι στα ζιζανιοκτόνα. Το γονίδιο gst4 απαντά σε φυτά σόγιας και ανήκει στην κλάση tau των GSTs. Έχει δραστηριότητα αποτοξίνωσης έναντι των ζιζανιοκτόνων, όπως είναι τα χλωροακεταμίδια και οι διφαινυλαιθέρες και επίσης φαίνεται να συμμετέχει στην προστασία των κυττάρων από τις οξειδωτικές και άλλες αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις. Το γονίδιο gst4 κλωνοποιήθηκε στον δυαδικό φορέα part27 και φυλλικοί δίσκοι από τις ποικιλίες καπνού Μπασμά, Virginia και Burley συγκαλλιεργήθηκαν με το Agrobacterium tumefaciens, το οποίο μετέφερε το διαγονίδιο στην T-DNA περιοχή κάτω υπό την επίδραση του συστατικού CaMV-35S υποκινητή. H ύπαρξη του γονιδίου gst4 στα γενετικά τροποποιημένα φυτά επιβεβαιώθηκε με PCR ανάλυση και υβριδισμό κατά Southern. Από την ποικιλία Μπασμάς αποκτήθηκαν τέσσερις ανεξάρτητες Το διαγονιδιακές γραμμές (φυτά Α, Β, C, D), από την ποικιλία Virginia τρεις (φυτά C, E, Η) και από την ποικιλία Burley δύο (φυτά B, D). Μικροπολλαπλασιασμένα γενετικά τροποποιημένα φυτά (Το γενιάς) της ποικιλίας Μπασμάς και από τις 4 διαγονιδιακές γραμμές εμβολιάστηκαν in vitro σε υπόστρωμα MS το οποίο είχε συμπληρωθεί με alachlor σε συγκέντρωση 0,03 g/lt και 0,06 g/lt. Επιπλέον σκληραγωγημένα διαγονιδιακά φυτά και των τριών ποικιλιών καλλιεργήθηκαν σε γλάστρες με έδαφος συμπληρωμένο με το ζιζανιοκτόνο alachlor σε δόσεις που αντιστοιχούν σε 144 gr δ.ο./στρέμμα και 288 gr δ.ο./στρέμμα. Όλα τα διαγονιδιακά φυτά και από τις τρεις ποικιλίες (Μπασμάς, Virginia και Burley), τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo συνθήκες έδειξαν μεγαλύτερη αύξηση ριζικού συστήματος και ανέπτυξαν μεγαλύτερο αριθμό φύλλων σε σύγκριση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά (μάρτυρες), των οποίων το κορυφαίο μερίστωμα είχε καταστραφεί με την επίδραση του alachlor.

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ένζυμα των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης (GSTs) είναι μία οικογένεια ενζύμων, πολυλειτουργικών, που βρίσκονται σε όλους τους οργανισμούς και αποτελούν σήμερα ένα εκτεταμένο πεδίο έρευνας στην Βιολογία, την Ιατρική και την Γεωπονία. Αποτελούν ένα μέρος του μηχανισμού άμυνας που διαθέτει το κύταρρο για αποτοξίνωση των κυττάρων από διάφορες ξενοβιοτικές ουσίες όπως είναι φάρμακα, ζιζανιοκτόνα, βαρέα μέταλλα και γενικότερα τοξικών παραγόντων που παράγονται κατά την διάρκεια του μεταβολισμού του κυττάρου, προστατεύοντας έτσι τον οργανισμό από πλήθος καταπονήσεων. Οι GSTs εκτός από το ρόλο τους στην αποτοξίνωση των ξενοβιοτικών φαίνεται να συμμετέχουν και στον μεταβολισμό ενδογενών ουσιών του φυτού μιας και εξελίχθησαν στα φυτά πολύ πριν αρχίσει η εφαρμογή ζιζανιοκτόνων και συνθετικών ρυπαντών από τον άνθρωπο. Στην γεωργία τα τελευταία χρόνια έχει αποκτήσει ενδιαφέρον η δημιουργία καλλιεργούμενων φυτών με ικανότητες φυτοεξυγίανσης του περιβάλλοντος (phytoremediation) από διάφορους ρύπους, ή ζιζανιοκτόνα που παρουσιάζουν υψηλή υπολειμματική διάρκεια στο έδαφος και τα οποία αποτελούν μια ενεργή απειλή για την βιόσφαιρα. Άλλωστε οι φυσικές και χημικές διεργασίες που χρησιμοποιούνται σήμερα για την αποκατάσταση του περιβάλλοντος από διάφορους ρύπους, δεν είναι ιδιαίτερα πρακτικές αν αναλογιστεί κανείς το κόστος των μεθόδων, στις περιπτώσεις όπου οι ποσότητες των ρυπογόνων ουσιών που πρέπει να αποικοδομηθούν είναι μικρές. Σήμερα η γενετική μηχανική έχει δημιουργήσει διαγονιδιακά φυτά με δυνατότητα αυξημένου μεταβολισμού ξενοβιοτικών ουσιών, όπως είναι τα ζιζανιοκτόνα, διαμέσου μεταφοράς γονιδίων από οργανισμούς συγγενείς ή μη (βακτήρια/μύκητες/ζώα/φυτά). Γονίδια που κωδικοποιούν για τα ένζυμα των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης έχουν σήμερα μεταφερθεί με βιοτεχνολογικές μεθόδους σε φυτά, όπως καπνός, σιτάρι, αραβίδοψη προσδίδοντας σε αυτά ικανότητες μεταβολισμού ζιζανιοκτόνων και αυξημένης αντοχής σε διάφορες αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες. Όπως αναφέρθηκε ανάμεσα στα υποψήφια φυτά είναι και ο καπνός (Νicotiana tabacum L.). Ο καπνός εξαιτίας της ευκολίας ιστοκαλλιέργειας και γενετικής τροποποίησης αποτελεί ένα σημαντικό πειραματικό εργαλείο της μοριακής βιολογίας και της γενετικής μηχανικής. Έτσι ο καπνός έχει τροποποιηθεί σχεδόν με όλα τα γονίδια που έχουν 10

11 χρησιμοποιηθεί από τους μοριακούς γενετιστές και σχεδόν αποκλειστικά με την μέθοδο του Αγροβακτηρίου. Στην Ελλάδα ο καπνός αποτελούσε μία δυναμική καλλιέργεια με τεράστια συμβολή στην εθνική οικονομία. Δυστυχώς σήμερα η εκτάσεις καπνοκαλλιέργειας συρρικνώθηκαν αρκετά αντιμετωπίζοντας διάφορα προβλήματα, όπως είναι το υψηλό κόστος παραγωγής, η αυξημένη χρήση φυτοφαρμάκων με ποιοτική υποβάθμιση του προϊόντος. Επιπλέον οι αρνητικές συνέπειες του προϊόντος στην υγεία και η διακοπή των επιδοτήσεων της καπνοκαλλιέργειας έχουν συμβάλει στην αλλαγή κατεύθυνσης προς άλλες πιο δυναμικές καλλιέργειες. Η βιοτεχνολογία σήμερα μπορεί να δώσει στην καπνοκαλλιέργεια καινούργιες προοπτικές για το μέλλον, στρέφοντας το ενδιαφέρον από την παραγωγή καπνιστικών προϊόντων σε περιβαλλοντικές εφαρμογές του καπνού, όπως είναι η φυτοεξυγιάνση των εδαφών από βαρέα μέταλλα και ζιζανιοκτόνα. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η δημιουργία ενός πλασμιδιακού φορέα γενετικής τροποποίησης που φέρνει το γονίδιο gst4 από την σόγια (Glycine max) και ο οποίος κλωνοποιήθηκε στο Agrobacterium tumefaciens. To γονίδιο αυτό κωδικοποιεί για μία S-μεταφοράση της γλουταθειόνης η οποία είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα της σόγιας σε διάφορα ζιζανιοκτόνα. Φυτά καπνού των ποικιλιών Μπασμά, Virginia και Βurley τροποποιήθηκαν γενετικά μέσω του Agrobacterium tumefaciens και δοκιμάστηκε η ανθεκτικότητα τόσο in vitro όσο και in planta στο ζιζανιοκτόνο alachlor. 11

12 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ A) Η ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΠΝΟΥ (Nicotiana tabacum L.) ΚΑΤΑΓΩΓΗ, ΕΞΕΛΙΞΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΕΣ ΠΟΙΚΙΛΙΕΣ Χώρα καταγωγής του καπνού είναι η Κεντρική Αμερική. Ο καλλιεργούμενος καπνός ανήκει στο γένος Nicotiana της οικογένειας Solanaceae, η οποία υπάγεται στην τάξη Tubiflorae. Ο αριθμός χρωμοσωμάτων του γένους Nicotiana κυμαίνεται από 9 24 ζεύγη με πλέον συνήθεις αριθμούς 12 και 24. Τα πιθανότερα προγονικά είδη είναι η Ν. sylvestris και πιθανώς η N. tomentosiformis (Goodspeed, 1954). Ο καπνός είναι αυτογονιμοποιούμενο φυτό με άνθη αρρενοθήλεα και οι καλλιεργούμενες ποικιλίες είναι κυρίως καθαρές σειρές. Εικόνα 1. Φυτό καπνού Nicotiana tabacum L. Στη χώρα μας σήμερα καλλιεργούνται κατά αποκλειστικότητα τα ανατολικού τύπου καπνά (Μπασμάς), ενώ η καλλιέργεια των καπνών αμερικάνικου τύπου (Burley και Virginia) έχει σχεδόν σταματήσει. Τα ανατολικά καπνά ανήκουν στην κατηγορία των ηλιοξηραινόμενων καπνών (sun-cured). Τα κύρια μορφολογικά χαρακτηριστικά των ανατολικών καπνών είναι το μικρό μέγεθος των φύλλων (μήκος 7-15 cm), με μήκος φύλλου διπλάσιο έως τριπλάσιο του πλάτους του. Οι πιο πολλοί τύποι ανατολικών καπνών είναι άμισχοι και μόνο μερικές ποικιλίες έχουν μίσχο που ποικίλει σε μέγεθος. Με την βοτανική ταξινόμηση κατατάσσονται σε τύπους άμισχους και έμμισχους, ενώ σύμφωνα με την 12

13 εμπορική ταξινόμηση κατατάσσονται στις κατηγορίες των αρωματικών καπνών (Ξάνθης), των ουδέτερων ή γεμίσματος (Κουλάκ, Μυρωδάτα Αγρινίου, Σμύρνης κ.α.) και των βασικών ή γεύσεως (Σαμψούς) Ο Μπασμάς Ξάνθης είναι μία από τις σπουδαιότερες υψηλόσωμες ποικιλίες ανατολικών καπνών. Είναι πρώιμη, αρωματική ποικιλία με φαρδιά (ευρεία βάση, στρογγυλή κορυφή) και λεπτά φύλλα, λεπτές νευρώσεις σε σχεδόν ορθή γωνία με το κεντρικό νεύρο. Επιπλέον είναι τύπος άμισχος, υψηλόσωμος, μικρόφυλλος. Τα σπουδαιότερα αμερικάνικου τύπου καπνά είναι τα Virginia και Burley. Τα Virginia είναι καπνά θερμοξηραινόμενα και θεωρούνται τα κυριότερα καπνά από τις βιομηχανίες τσιγάρων σε παγκόσμια κλίμακα αποτελώντας το βασικό συστατικό των μιγμάτων για παραγωγή τσιγάρων. Οι ποικιλίες καπνών Virginia χαρακτηρίζονται από φυτά μεγαλόσωμα (ύψος 1,5 2 μέτρα) που φέρνουν φύλλα μεγάλα, με μήκος 60 cm και πάνω και πλάτος cm. Η βάση τους είναι στενή χωρίς μίσχο και η κορυφή οξεία. Η ταξιανθία είναι ογκώδης, αραιά εξέχει από τα κορυφαία φύλλα και φέρει άνθη μεγάλα, επιμήκη και ροδόχροα. Τα Burley ανήκουν στα αεροξηραινόμενα ανοιχτόχρωμα καπνά (Light air cured). Είναι μεγαλόσωμα (ύψος 1,8 2 m), παχύκορμα και παχύσωμα με σχήμα κωνικό. Παράγουν χρήσιμα φύλλα με μήκος 50 cm περίπου και πλάτος cm, έχουν βάση άμισχη, περιφέρεια λεία ή πτυχωτή και κορυφή οξεία. Η γωνία των φύλλων με το στέλεχος είναι πιο οξεία σε σύγκριση με τα Βιρτζίνια. Το χρώμα των φύλλων είναι ανοιχτό πράσινο με στέλεχος και νευρώσεις λευκοκίτρινες. Η ταξιανθία είναι μέτριου μεγέθους, αραιά προεξέχει από τα κορυφαία φύλλα, φέρει άνθη επιμήκη με κάλυκα λευκοκίτρινο και στεφάνη ροζ χρώματος. Ο τύπος Burley βρέθηκε μέσα σε φυτεία καπνών Βιρτζίνια στο Ohio των ΗΠΑ. Προήλθε από μετάλλαξη των γονιδίων (yg ) που αντί για πράσινο, είναι υπεύθυνα για τον κιτρινοπράσινο χρωματισμό (Αναγνωστόπουλος, 1932, Αργυρούδης, 1960, Σφήκας, 1971, Παπακώστα-Τασοπούλου, 2002). 13

14 Β) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΣΤΗΝ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΚΑΠΝΟΥ Τα κυριότερα χαρακτηριστικά για βελτίωση του καπνού είναι: η στρεμματική απόδοση σε εμπορεύσιμο προϊόν, διάφορα γεωργικά χαρακτηριστικά, όπως η αντοχή στη ξηρασία, η αντίδραση στην λίπανση, η αντοχή στις υψηλές θερμοκρασίες, η αντοχή στις ασθένειες και έντομα κ.τ.λ., η αντοχή στις ασθένειες, το μέγεθος και σχήμα του φύλλου που σχετίζεται με τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Η κλασική βελτίωση χρησιμοποιεί διάφορες τεχνικές για την βελτίωση του καπνού, όπως οι διασταυρώσεις μεταξύ ντόπιων ποικιλιών, η πρόκληση τεχνητών μεταλλάξεων κ.τ.λ. Παρόλα αυτά το γενετικό απόθεμα που αξιοποιείται από την κλασική βελτίωση περιορίζεται από την φυλετική ασυμβατότητα που παρουσιάζεται μεταξύ διαφόρων ειδών. Με την γενετική τροποποίηση μπορούμε να ευρύνουμε το γενετικό απόθεμα με την μεταφορά επιλεγμένων γονιδίων από ένα οργανισμό σε ένα άλλον, ανεξάρτητα του είδους, πετυχαίνοντας μια κατευθυνόμενη βελτίωση φυτών. Ο καπνός εξαιτίας της ευκολίας γενετικής τροποποίησης και της καλής συμπεριφοράς σε συνθήκες ιστοκαλλιέργειας έχει χρησιμοποιηθεί σε πλήθος εφαρμογών της γενετικής μηχανικής. Η απόκτηση φυτών καπνού με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αποτελεί ένα πεδίο εφαρμογών της γενετικής μηχανικής, όταν σε μία περιοχή ο έλεγχος πλατύφυλλων ζιζανίων αποτελεί σημαντικό πρόβλημα και ο αριθμός των ζιζανιοκτόνων που χρησιμοποιούνται είναι περιορισμένος. Η ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα μπορεί να επιτευχθεί με την μεταφορά γονιδίων που είτε υπερεκφράζουν το ένζυμο στόχο του ζιζανιοκτόνου, είτε κωδικοποιούν για ανθεκτική στο ζιζανιοκτόνο μορφή του ενζύμου, ή κωδικοποιούν για ένζυμα μεταβολισμού/αποτοξίνωσης του ζιζανιοκτόνου (Tsaftaris, 1996). Για παράδειγμα η συνθετάση της γλουταμίνης είναι το ένζυμο στόχος για το ζιζανιοκτόνο phosphinothricin. Yπερέκφραση τoυ ενζύμου αυτού από το φυτό της μηδικής σε φυτά καπνού, είχε ως αποτέλεσμα τα φυτά μετά από ψεκασμό του ζιζανιοκτόνου σε συνθήκες αγρού να παθαίνουν μεν βλάβες, αλλά στο τέλος να αναπτύσσονται και να αναπαράγονται κανονικά (Εckes κ.α., 1989). Επιπλέον έχουν δημιουργηθεί ανθεκτικά φυτά καπνού στα ζιζανιοκτόνα glyphosate (Wang κ.α., 2003) και paraquat (Won κ.α., 2001) με εισαγωγή γονιδίων από βακτήρια που κωδικοποιούν για ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα ένζυμα.. Ένα μετάλλαγμα του γονιδίου crs1-1 που κωδικοποιεί για μια ανθεκτική μορφή του ενζύμου της 14

15 οξεικογαλακτικής συνθάσης (ALS), το οποίο είναι το ένζυμο στόχος των σουλφονυλουριών, απομονώθηκε από φυτά αραβίδοψη και εισήχθη σε φυτά καπνού προσδίδοντας ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα των σουλφονυλουριών (Haughn κ.α., 1988). Το γονίδιο bxn από ένα βακτήριο εδάφους κωδικοποεί για ένα ένζυμο που διασπά το ζιζανιοκτόνο bromoxynil σε μη τοξικούς μεταβολίτες (Stalker κ.α., 1988). Κατόπιν εισαγωγής του γονιδίου σε αεροξηραινόμενα φυτά καπνού στην Γαλλία τα φυτά έδειξαν εμπορικά αποδεκτά επίπεδα ανοχής του ζιζανιοκτόνου bromoxynil (Delon κ.α., 1994). Το γονίδιο bar κωδικοποιεί για το ένζυμο PAT που μεταβολίζει το ζιζανιοκτόνο phopsphinothricin. Διαγονιδιακά φυτά καπνού με ανθεκτικότητα σε δεκαπλάσιες δόσεις από αυτές που εφαρμόζονται στο αγρό του ζιζανιοκτόνου phosphinothrycin, δημιουργήθηκαν με μεταφορά του γονιδίου bar από τον μύκητα Streptomyces hydroscopicus (DeBlock κ.α., 1987). Τέλος με υπερέκφραση των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού, έχει επιτευχθεί επιπλέον ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα της ομάδας των χλωροακεταμιδίων, όπως το alachlor (Κaravangeli κ.α., 2005). Με μεθόδους γενετικής μηχανικής έχουν επίσης δημιουργηθεί καπνά με αντοχή στην αφίδα του ροδακίνου (Myzus persicae) (Barton κ.α., 1987, Warren κ.α., 1992), στον νηματώδη Meloidogyne incognita(rosso κ.α., 1996), στους μύκητες Rhizoctonia solani (Βrogue κ.α., 1991), Cercospora nicotianae (Ζhou κ.α., 1994), Oidium lycopersicon (Verberne κ.α., 2000), στα βακτήρια Pseudomonas syringae (Hantziloukas & Panopoulos, 1992), Phytophora parasitica (Belbahri κ.α., 2001), Erwinia carotovora (Mae κ.α., 2001, Dong κ.α., 2001), σε διαφόρους ιούς, όπως στον ιό ΤΜV (Powell-Albel κ.α., 1986), στον ιό Υ και στον ιό Χ της πατάτας (Kaniewski κ.α., 1990) και άλλους. Όσον αφορά τις αβιοτικές καταπονήσεις, έχει αναφερθεί δημιουργία ανθεκτικών φυτών καπνού στο όζον, στο κρύο και αλατότητα (Roxas κ.α., 1997), σε βαρέα μέταλλα όπως το κάδμιο (Βrandle κ.α., 1993, Υeargan κ.α., 1993, Elmayan & Tepfer, 1994), ενώ ήδη έχουν παραχθεί διαγονιδιακά φυτά καπνού για καταστροφή και μεταβολισμό επικίνδυνων εκρηκτικών ουσιών, όπως το ΤΝΤ (Ηannink κ.α., 2001). Τέλος η παραγωγή εμβολίων σε φυτά καπνού είναι ένας πρωτοποριακός τομέας έρευνας, μιας και αυτά τα εμβόλια θα είναι πιο φθηνά και πιο ασφαλή στη χρήση. Μέχρι στιγμής έχουν δημιουργηθεί φυτά καπνού που εκφράζουν πρωτεΐνες αντιγόνα από πολλά παθογόνα του ανθρώπου, όπως το Bacillus anthracis (Watson κ.α., 2004), Clostridium tetani (Tregoning κ.α., 2003), Eschericia coli 15

16 (Kang κ.α, 2003, Judge κ.α., 2004), Vibrio cholerae (Daniell κ.α., 2001), hepatitis C virus (Nianiou κ.α., 2008), προσφέροντας ανοσοποίηση στις ασθένειες. Γ) ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ S-ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΩΝ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSTs) ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ Δομή των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης Οι S-μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια διμερών πρωτεϊνών που καταλύουν την συμπύκνωση του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης (GSH) με μεγάλη ποικιλία υδρόφοβων υποστρωμάτων με δραστικό ηλεκτρονιόφιλο κέντρο, όπως φαίνεται στην παρακάτω αντίδραση: RX + GSH GSR + XH R: άλκυλο ή άρυλο ομάδα X: οργανικά ή ανόργανα ιόντα Τα ένζυμα αυτά απαντούν σε όλους τους οργανισμούς και αποτελούν το σημαντικότερο μηχανισμό αποτοξίνωσης του κυττάρου από μικροβιακές τοξίνες, ξενοβιοτικές και ενδογενείς ηλεκτρονιόφιλες τοξικές ουσίες, μέσω συμπύκνωσης τους με το γλουταθείο. Οι GSTs των θηλαστικών κατατάσσονται σε οχτώ κλάσεις: alpha, mu, pi, sigma, theta, kappa, zeta, omega, ενώ των φυτών σε τέσσερις phi, tau, theta, zeta (Frova, 2003) με τα εξής χαρακτηριστικά: Κλάση phi (F), περιλαμβάνει GSTs που επάγονται κατόπιν έκθεσης των φυτών σε πλήθος βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων (π.χ. ζιζανιοκτόνα), τα γονίδια που τις κωδικοποιούν περιέχουν τρία εξόνια και ένα-δύο ιντρόνια, απαντούν αποκλειστικά στα φυτά και εξελικτικά θεωρούνται τα πιο πρωτόγονα. 16

17 Kλάση zeta (Z), εξελικτικά είναι πιο κοντά στην ομάδα των zeta GST των θηλαστικών, τα γονίδια που τις κωδικοποιούν περιέχουν 10 εξόνια και 9 ιντρόνια. Eπάγονται από το αιθυλένιο ή από την γήρανση. Κλάση tau (U), τα γονίδια που τις κωδικοποιούν περιέχουν δύο εξόνια και δύο ιντρόνια, απαντούν αποκλειστικά στα φυτά. GSTs που ανήκουν σε αυτήν την κλάση επάγονται όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε έντονη κυτταροδιαίρεση ή κατόπιν έκθεσης σε φυτορυθμιστικές ουσίες, όπως αυξίνες, ενδογενείς και εξωγενείς καταπονήσεις, όπως επιθέσεις παθογόνων, πληγές, τοξικότητα από βαρέα μέταλλα, οξειδωτικό και θερμικό stress (Kilili et al 2004). Kλάση theta (Τ), περιλαμβάνει GSTs οι οποίες κωδικοποιούνται από διάφορα γονίδια στo φυτό Αραβίδοψη και οι οποίες είναι παρόμοιες με την κλάση theta των GSTs που απαντούν στα θηλαστικά. Στα φυτά έχουν έξι ιντρόνια Kλάσεις DHAR και lambda, περιλαμβάνουν GSTs που έχουν δραστηριότητα τρανσφερασών θειούχων ομάδων, και συγκεκριμένα οι DHAR καταλύουν την αναγωγή του αφυδρογωμένου ασκορβικού σε ασκορβικό οξύ. Αυτές οι δύο κλάσεις των GSTs φαίνεται να έχουν δραστηριότητα οξυδορεδουκτασών παρά δραστηριότητα τρανσφερασών γλουταθειόνης με ικανότητα συμπλοκοποίησης ξενοβιοτικών ουσιών (Basantani & Srivastava 2007). Έχουν εντοπιστεί σε διάφορα φυτά, όπως ρύζι, αραβίδοψη, μηδική, σόγια και οι DHAR εντοπίζονται τόσο στο κυτόπλασμα, όσο και στα πλαστίδια (Urano κ.α., 2000, Dixon κ.α., 2002a, Shimaoka κ.α., 2000). Μεταξύ των κλάσεων και μεταξύ των GST που απαντούν μέσα στην ίδια κλάση, παρατηρούνται διαφορές σε επίπεδο αλληλουχίας DNA, παρόλα αυτά οι δομές των ενζύμων GST είναι εξαιρετικά συντηρημένες μεταξύ των κλάσεων. Οι παραπάνω κλάσεις περιλαμβάνουν GSTs που εντοπίζονται στο κυτόπλασμα των φυτών (διαλυτές ή κυτοπλασματικές GSTs-cGSTs) (Scalla & Rpolet 2002). Τα φυτά περιέχουν επίσης γονίδια που κωδικοποιούν για μικροσωματικές GSTs (Jakobsson κ.α., 2000), οι οποίες σήμερα κατατάσσονται στην υπεροικογένεια των MAPEG (Membrane Associated Proteins involved in Eicosanoid and Glutathione metabolism). Υπάρχουν επίσης αναφορές για εντοπισμό ενζύμων GST στον πυρήνα η αποπλάστη (Takahashi κ.α., 1995, Flury κ.α., 1996, Dixon κ.α., 2002b), αλλά οι λειτουργίες αυτών των ενζύμων δεν έχουν διασαφηνιστεί πλήρως. Σε επίπεδο αλληλουχίας νουκλεοτιδίων οι μικροσωματικές GSTs 17

18 έχουν μόνο 10% ομολογία με τις κυτοπλασματικές. σε διαφέρουν από αυτές που εντοπίζονται στο κυτόπλασμα, με μόνο ομολογία. Oι GSTs είναι διμερείς πρωτεΐνες με δύο υπομονάδες με μοριακά βάρη kda, και περιέχουν μία καταλυτική περιοχή ανά υπομονάδα Σε κάθε υπομονάδα διακρίνονται δύο δομικές περιοχές. Η μια περιοχή βρίσκεται προς το Ν-τελικό άκρο της αλυσίδας και δεσμεύει το τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης, ενώ η δεύτερη περιοχή βρίσκεται προς το C-τελικό άκρο και δεσμεύει ένα δεύτερο υδρόφοβο υπόστρωμα ποικίλης δομής. Η θέση δέσμευσης της γλουταθειόνης, ονομάζεται G-θέση και η θέση δέσμευσης του ηλεκτρονιόφιλου υδρόφοβου υποστρώματος, ονομάζεται Η-θέση. Επιπλέον υπάρχει και μια περιοχή σύνδεσης σε κάθε υπομονάδα των δύο δομικών περιοχών, μεγέθους 5 10 αμινοξέων (Εικόνα 2). Η G-θέση είναι συντηρημένη με ένα κατάλοιπο σερίνης (Ser11) κοντά στο αμινοτελικό άκρο μεταξύ των διαφόρων GST των φυτών. Στα θηλαστικά μόνο στην κλάση theta συναντάται αυτή δομή, ενώ οι υπόλοιπες ομάδες χρησιμοποιούν την υδρόξυλομάδα ενός καταλοίπου τυροσίνης για την ενεργοποίηση της γλουταθειόνης (Wilce κ.α., 1995), (Board κ.α., 1995). Επιπλέον oι GSTs έχουν την ικανότητα σχηματισμού ετεροδιμερών που οδηγεί σε μεγάλο αριθμό ισοενζύμων με ικανότητα καταβολισμού ποικίλων ξενοβιοτικών oυσιών (Edwards κ.α, 2000). Εικόνα 2. Δομή του μορίου της S-τρανσφεράσης της γλουταθειόνης. α) Τα βέλη δείχνουν την θέση δέσμευσης της γλουταθειόνης (G-site) και την θέση δέσμευσης του υποστρώματος (Η-site). Το μονομερές αποτελείται από δύο δομικές περιοχές. Η μια περιοχή βρίσκεται 18

19 προς το N-τελικό άκρο και αποτελείται από ένα β-φύλλο τεσσάρων ελασμάτων (β1-β4) με δύο α-έλικες (α1-α2) στην εσωτερική του πλευρά. Η άλλη δομική περιοχή βρίσκεται προς το C-τελικό άκρο και αποτελείται από έξι α-έλικες (α3-α8), β) δομή του διμερούς του ίδιου του ενζύμου. Σε αντίθεση με τις κυτοπλασματικές, οι μικροσωμικές GSTs έχουν διαμεμβρανικές δομικές περιοχές, με το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης να προεκβάλει στην φωτεινή ζώνη της μεμβράνης, ενώ τα κέντρα για την δέσμευση της γλουταθειόνης και του υποστρώματος εντοπίζονται σε βρόγχους στραμμένους προς το κυτόλυμα (Lam κ.α., 1997, Busenlehner κ.α., 2004). Στα φυτά οι GSTs ξεπερνούν το 1% των συνολικών διαλυτών πρωτεϊνών (Marrs, 1996). Στο ρύζι οι tau και phi GSTs είναι οι πιο πολυπληθείς και κωδικοποιούνται από 28 και 13 γονίδια αντίστοιχα, ενώ υπάρχουν μόνο 3 theta και 2 zeta GSTs. Στο καλαμπόκι έχουν ανιχνευθεί 12 phi GSTs, 28 tau και 2 zeta, ενώ στην σόγια 20 tau, 1 zeta και 4 phi GSTs (McGonigle B κ.α., 2000), (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Κατανομή διαφόρων γονιδίων gst σε διάφορα φυτά. (Α) Κατανομή διαφόρων γονιδίων που κωδικοποιούν για τις κλάσεις των gst στα φυτά καλαμπόκι, ρύζι και σόγια, (Β) κατανομή της έκφρασης των διαφόρων κλάσεων gst στα φυτά καλαμπόκι, ρύζι και σόγια. Όπως παρατηρούμε τα ποσοστά έκφρασης των gst δεν σχετίζονται με τα ποσοστά κατανομής των γονιδίων στα διάφορα φυτά. Η κλάση που εκφράζεται πιο πολύ είναι η κλάση phi στο καλαμπόκι και η κλάση tau στο ρύζι και σόγια. Στο καλαμπόκι 54% των gst που εκφράζονται ανήκουν στην κλάση phi, 41% στην tau και 4% στη zeta, στο ρύζι 67% των gst που εκφράζονται ανήκουν στην κλάση tau, 26,6% στην phi και 5% στη zeta και 1,4% στην κλάση 19

20 theta, στην σόγια 92% των gst που εκφράζονται ανήκουν στην κλάση tau, 6% στην phi και 2% στη zeta. Ρόλος των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης Στα καλλιεργούμενα φυτά και ζιζάνια οι GSTs καταλύουν κυρίως την ένωση του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης με ηλεκτρονιόφιλα ζιζανιοκτόνα, ενώ στα ζώα οι GSTs καταλύουν την ένωση της γλουταθειόνης με καρκινογόνα (Hayes & Pulford, 1995), βαρέα μέταλλα ή τοξικούς μεταβολίτες που παράγονται κατά την διάρκεια οξειδωτικών καταπονήσεων (Daniel, 1993). Πολλές κατηγορίες ζιζανιοκτόνων, όπως σουλφονυλουρίες: chlorimuron ethyl, (Brown & Neighbors, 1987), trisulfuron methyl (Wittenbach κ.α., 1994) και flupyrsulfuronmethyl (Koeppe κ.α., 1998), τριαζίνες: atrazine, χλωροακεταμίδια: alachlor (Shimabukuro κ.α., 1971) και metolachlor (Cottingham & Hatzios, 1992), θειοκαρβαμιδικά σουλφοξίδια: S-ethyl dipropylthiocarbamate sulfoxide (Cottingham κ.α., 1993) και διαφαινυλαιθέρες (flurodifen) φαίνεται να αποτοξινώνονται από τα φυτά με την διαμεσολάβηση των GSTs. Έχει αναφερθεί ότι οι phi GSTs (GSTFs) είναι πολύ δραστικές έναντι των χλωροακεταμιδίων και θειοκαρβαμιδικών ζιζανιοκτόνων, ενώ οι tau GSTs (GSTUs) είναι δραστικές έναντι των διφαινυλαιθέρων και αρυλόξυ-φαινόξυ-προπιονικών ζιζανιοκτόνων (Jepson κ.α., 1994, Thom κ.α., 2002). Οι S-τρασνσφεράσες της γλουταθειόνης συμμετέχουν στην Φάση ΙΙ του μηχανισμού αποτοξίνωσης από ξενοβιοτικές ουσίες που διαθέτει το κύτταρο. Ο μηχανισμός μεταβολισμού και αποτοξίνωσης επιβλαβών ξενοβιοτικών ουσιών από τα φυτά, χωρίζεται σε τρεις διαδοχικές φάσεις (Φάη Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Στην Φάση Ι συμμετέχουν διάφορα ένζυμα, όπως η κυτοχρωμική μονοξυγενάση P450s (Sandermann, 1994, Hatzios 1997), εστεράσες, υπεροξειδάσες και νιτρορεδουκτάσες (Peterson κ.α., 1979, Stiborova & Anzenbacher, 1991). Με την βοήθεια αυτών των ενζύμων γίνεται μετατροπή και ενεργοποίηση (με αντιδράσεις οξείδωσης, αναγωγής, υδρόλυσης) των λιπόφιλων ξενοβιοτικών ουσιών σε πιο πολικά και υδατοδιαλυτά συστατικά (Komives & Gullner, 2005). Στην Φάση ΙΙ τα ενεργοποιημένα από τη Φάση Ι παράγωγα των ουσιών αντιδρούν με την γλουταθειόνη (GSH), με την UDP-γλυκόζη ή με θεϊκά ιόντα σχηματίζοντας ιονισμένα και υδατοδιαλυτά σύμπλοκα, λιγότερο τοξικά από τα προϊόντα της Φάσης Ι του μεταβολισμού (Edwards, 1998, Hatzios & Burgos, 2004). Στην Φάση ΙΙΙ τα 20

21 σύμπλοκα μεταφέρονται από το κυτόπλασμα στον αποπλάστη ή στα χυμοτόπια, με την βοήθεια των αντλιών GS-X (ΑΤP εξαρτώμενοι χυμοτοπιακοί μεταφορείς), (Martinois κ.α., 1993). Οι μεταφορείς αυτοί είναι υπεύθυνοι για την απομάκρυνση και διαμερισματοποίηση στα χυμοτόπια των τοξικών συμπλόκων που σχηματίζει η γλουταθειόνη με τις ξενοβιοτικές ουσίες, συμβάλλοντας σημαντικά στην προστασία του φυτού (Li κ.α., 1995, Martinoia κ.α., 1993, Coleman κ.α., 1997, 2002). Οι GSTs στα φυτά παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στον ενδογενή μεταβολισμό και αυτό φαίνεται από το γεγονός ότι οι GSTs ήταν ενεργοποιημένες στα φυτά πολύ πιο πριν αρχίζουν να εφαρμόζονται σε αυτά χημικά ζιζανιοκτόνα ή άλλες ξενοβιοτικές ουσίες. Έτσι συμμετέχουν σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης, με ορισμένους δευτερογενείς μεταβολίτες, φυσικά προϊόντα (Mueller κ.α., 2000). Για παράδειγμα στο σόργο ένα τοξικό αλκαλοειδές που ελευθερώνεται κατόπιν οξειδωτικής βλάβης του πλασμαλλήματος μεταβολίζεται από τις phi GSTs (Gronwald & Plaisance, 1998), ενώ και οι tau GSTs από το σιτάρι φαίνεται να έχουν παρόμοια δράση (Cummins, 1997). Επιπλέον οι τοξικοί μεταβολίτες που παράγονται στο σιτάρι και αραβόσιτο κατόπιν αλληλοπάθειας με ανταγωνιστικά είδη αποτελούν άριστα υποστρώματα για τις tau και phi GSTs (Dixon κ.α., 1998, Cummins κ.α., 1997). Σήμερα έχουν ανακαλυφθεί πολλές GSTs που δρουν και ως υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (Bartling κ.α., 1993, Cummins κ.α., 1999, Edwards κ.α., 2000) και φαίνεται να προστατεύουν το κύτταρο από τις βλάβες του οξειδωτικού stress. Τέτοιες GSTs έχουν βρεθεί σε φυτά αραβίδοψης (Eshdat, 1997), σιταριού (Cummins κ.α, 1998), αραβοσίτου (Dixon κ.α., 1997, 1998), σόγιας (Skipsey κ.α., 1997) κ.τ.λ. Κατά την διάρκεια των οξειδωτικών καταπονήσεων είναι γνωστό ότι παράγονται ενεργές μορφές οξυγόνου. Οι GSTs με δράση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. καταλύουν την πυρηνόφιλη προσβολή του GSH σε υπεροξείδια του υδρογόνου, προκαλώντας έτσι την αναγωγή οργανικών υπεροξειδίων στις λιγότερο τοξικές μονο-υδρόξυ αλκοόλες, αυξάνοντας την ανθεκτικότητα των φυτών. Για παράδειγμα φυτάρια καπνού στα οποία υπερεκφράζονταν μια tau GST με υψηλή δραστηριότητα υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης ήταν πιο ανθεκτικά στο ψύχος ή σε οσμωτικές καταπονήσεις από ότι τα φυτά μάρτυρες (Roxas κ.α., 1997). Στα φυτά οι GSTs συμμετέχουν και σε άλλες αντιδράσεις μέσα στο φυτικό κύτταρο, όπως αντιδράσεις ισομερίωσης (Jablonkai κ.α., 1997), ή μπορούν και να δρουν ως πρωτεΐνες δέσμευσης αυξινών και κυτοκινινών, παίζοντας ένα ρόλο στην μεταφορά των 21

22 φυτορυθμιστικών ουσιών μεταξύ των κυτταρικών διαμερισμάτων (Marrs 1996, Gonneau κ.α., 1998), (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Μια σύνοψη των ρόλων των GSTs στον ενδογενή μεταβολισμό και αποτοξίνωση ξενοβιοτικών. Οι περισσότερες GSTs των φυτών βρίσκονται στο κυτόπλασμα, αν και υπάρχουν ενδείξεις και για εντοπισμό ορισμένων GST σε ορισμένα φυτά στον πυρήνα και αποπλάστη. Οι GSTs καταλύουν την ένωση της γλουταθειόνης (GSH) με διάφορα ουσίες, και στην συνέχεια τα σύμπλοκα R-SG μεταφέρονται στο χυμοτόπιο (vacuole) για περαιτέρω επεξεργασία. Ορισμένες GSTs μπορεί να έχουν και δραστηριότητα υπεροξειδασών της γλουταθειόνης ή να συμμετέχουν σε αντιδράσεις ισομερίωσης, εστεροποίησης ή και να δρουν ως πρωτεΐνες δέσμευσης (binding proteins) οι οποίες παίζουν επιπρόσθετους ρόλους στον ενδογενή μεταβολισμό. 22

23 Δ) Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ Η γλουταθειόνη (GSH) είναι η πιο άφθονη μορφή μη πρωτεϊνικού θείου στα φυτά και απαντά σε συγκέντρωση μεγαλύτερη του 1 mm στο κυτόπλασμα των κυττάρων (Foyer & Halliwell, 1976, Noctor & Foyer 1998). Τα φυτά μπορούν και συνθέτουν και άλλες μορφές γλουταθειόνης, όπως είναι η ομογλουταθειόνη (hgsh) (γ-glu-cys-β-αla) που απαντά στα όσπρια και στη σόγια Υπό φυσιολογικές συνθήκες η γλουταθειόνη απαντά κυρίως στην ανηγμένη της μορφή (GSH) με μόνο ένα μικρό ποσοστό να απαντά στην πλήρως οξειδωμένη μορφή του δισουλφιδίου της γλουταθειόνης (GSSG). Έχει αναφερθεί ότι η ικανότητα των φυτικών κυττάρων να ανταπεξέρθουν σε μία οξειδωτική καταπόνηση εξαρτάται κατά πολύ και από την ικανότητα de novo σύνθεσης γλουταθείου (May & Leaver 1993). Η ομάδα SHπου απαντά στην γλουταθειόνη είναι ισχυρά πυρηνόφιλη και προσφέρει στο γλουταθείο μια μοναδική ιδιότητα να αντιδρά με μια μεγάλη ποικιλία ηλεκτρονιόφιλων ουσιών, όπως είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, τα βαρέα μέταλλα, οι κυτοτοξικές ξενοβιοτικές ουσίες, παίζοντας σημαντικό ρόλο στις διεργασίες αποτοξίνωσης του κυττάρου, ενώ μπορεί να δρα και στους μηχανισμούς μεταφοράς του σήματος για τις αλλαγές του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος (Sánchez-Femández κ.α., 1997). Έτσι η γλουταθειόνη παρέχει στο κύτταρο πολλαπλές άμυνες τόσο απέναντι στα ROS, όσο και απέναντι σε τοξικές ουσίες (Ηayes & ΜcLellan, 1999). H ενδοκυτταρική συγκέντρωση GSSG θεωρείται ένας δείκτης για το οξειδωτικό stress, ενώ η αναλογία GSSG/GSH αντανακλά την ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση. Μια υψηλή αναλογία GSH/GSSG είναι απαραίτητη, προκειμένου η γλουταθειόνη να συνεχίζει να λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό. Η λειτουργία επίσης πολλών πρωτεϊνών που περιέχουν θείο εξαρτάται από την οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου. Το γλουταθείο με το να ρυθμίζει οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου φαίνεται να συμμετέχει στην ρύθμιση της πρόσδεσης των παραγόντων μεταγραφής στο DNA και επομένως στην ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων (Κearns & Haull, 1998), (Εικόνα 5). 23

24 Η βιοσύνθεση του GSH γίνεται στο κυτόπλασμα μέσω δύο αντιδράσεων. Στην πρώτη αντίδραση με την συμμετοχή του ενζύμου συνθετάση της γ-γλουταμιλκυστεΐνης (γ-εcs, ΕC ) και την κατανάλωση ενός μορίου ATP σχηματίζεται το διπεπτίδιο της γ- γλουταμύλκυστεΐνης από τα αμινιξέα L-γλουταμινικό οξύ (L-Glu) και L-κυστεΐνη (L-Cys), (Αντίδραση 1). Στην δεύτερη αντίδραση με την συμμετοχή του ενζύμου συνθετάση του γλουταθείου (Gsh-S, E.C ) και με την την κατανάλωση ενός μορίου ATP, το αμινοξύ της γλυκίνης (L-Gly) αντιδρά με το καρβοξυτελικό άκρο του διπεπτιδίου της γ- γλουταμύλκυστεΐνης και σχηματίζεται η γλουταθειόνη, (Αντίδραση 2), (Ishikawa κ.α., 1997, Hell & Bergmann, 1990, Chengbin κ.α., 2001). L-Glu + L-Cys + ATP γ-γλουταμιλκυστείνη + ADP + Pi (Αντίδραση 1) γ-γλουταμιλκυστείνη + L-Gly + ATP GSH + ADP + Pi (Αντίδραση 2) H βιοσύνθεση της γλουταθειόνης στα κύτταρα είναι αυστηρά ελεγχόμενη (Noctor κ.α., 1997) και η συγκέντρωση της ελέγχεται από πολλά ένζυμα, όπως είναι η γ- γλουταμύλτρανσπεπτιδάση, μεταφορείς αμινοξέων, η συνθετάση της γλουταθειόνης και αναγωγάση της γλουταθειόνης, αλλά καθοριστικό ρόλο παίζει το ένζυμο της συνθετάσης της γ-γλουταμιλκυστείνης (γ-εcs), (Ishikawa κ.α., 1997, Wild & Mulcahy, 2000). Το ένζυμο γ-εcs είναι ένα αλλοστερικό ένζυμο, η δράση του οποίου ελέγχεται από την γλουταθειόνη (GSH) διαμέσου μη συναγωνιστικής αναστολής (Meister & Anderson, 1983). Στην Εικόνα 5 αναφέρονται οι παράγοντες που επιδρούν στην βιοσύνθεση της γλουταθειόνης μέσα στο κύτταρο. 24

25 Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση των παραγόντων που επιδρούν στην συγκέντρωση γλουταθειόνης (glutathione pool) στο κύτταρο. Κάτω από βέλτιστες συνθήκες (απουσία καταπονήσεων) διατηρείται μια υψηλή αναλογία GSH/GSSG στο κυτόπλασμα ή στο στρώμα του χλωροπλάστη με την δράση της ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης (GR) και επικρατεί αναγωγικό περιβάλλον στο κύτταρο. Αυτό αποτρέπει τον σχηματισμό εμδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών, εξασφαλίζοντας σωστή αναδίπλωση των πρωτεϊνών και διατήρηση της δράσης τους (Levitt 1962, Aslund & Beckwith, 1999). Σε καταστάσεις αβιοτικών και βιοτικών καταπονήσεων aυξάνεται η παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS), ενώ παράλληλα μεταβάλλεται η αναλογία GSH/GSSG, αλλάζοντας την οξειδοαναγωγική κατάσταση στο κυτόπλασμα και στο χλωροπλάστη (Foyer κ.α., 1997). Αυτή η αλλαγή στην οξειδοαναγωγική κατάσταση δρα ως σήμα (redox signaling) για την ενεργοποίηση παραγόντων μεταγραφής γονιδίων και αντιοξειδωτικών ενζύμων (Αslund & Beckwith, 1999, Polidoros & Scandalios 1999). Ο έλεγχος της οξειδοαναγωγικής κατάστασης του κυττάρου με την συμμετοχή της γλουταθειόνης (GSH) και της ρεδουκτάσης της γλουταθειόνης (GR) είναι πολύ σημαντική για την διατήρηση της ακεραιότητας των κυτταρικών δομών και για την σωστή λειτουργία των μεταβολικών οδών. Η βιοσύνθεση (biosynthesis) επίσης της γλουταθειόνης είναι αυστηρά ελεγχόμενη, Αυξημένη βιοσύνθεση μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση GSH, αλλά το πλεονάζων GSH αποικοδομείται ή εξάγεται από τα κύτταρα (degradation/export). 25

26 Ε) ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ S-ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΩΝ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ Σήμερα οι GSTs μπορούν να έχουν αξιοσημείωτες βιοτεχνολογικές εφαρμογές σε πάρα πολλούς τομείς. Στην Ιατρική μελετώνται προκειμένου να αναπτυχθούν ανθεκτικά χημειοθεραπευτικά φάρμακων απέναντι στα ένζυμα του μηχανισμού αποτοξίνωσης που διαθέτει ο οργανισμός (Τew, 1994, Armstrong, 1997) ενώ σημαντικές εφαρμογές μπορούν να έχουν στην αποικοδόμηση τοξικών ουσιών από το περιβάλλον την εξυγίανση του εδάφους από εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα (Zablotowicz κ.α., 1995, Nagata κ.α., 1999, Roberts κ.α., 2001) ή βαρέα μέταλλα (Cursino κ.α., 2000). Επιπλέον εξαιτίας της εξειδίκευσης που παρουσιάζουν οι GSTs για ποικίλα υποστρώματα είναι κατάλληλες για την ανάπτυξη διαφόρων ενζυματικών καταλυτών (Babbitt, 2000). Πολλά διαγονιδιακά φυτά έχουν δημιουργηθεί με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα, κατόπιν υπερέκφρασης των S- τρανσφερασών της γλουταθειόνης που συμμετέχουν στα μονοπάτια μεταβολισμού και αποτοξίνωσης των ζιζανιοκτόνων. Για παράδειγμα το ένζυμο GSTIV του καλαμποκιού ανήκει στην phi κλάση και είναι πολύ δραστικό έναντι των χλωροακεταμιδικού ζιζανιοκτόνου alachlor. Διαγονιδιακά φυτά καπνού στα οποία εκφράζονταν το ένζυμο GSTIV είχαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα έναντι των χλωροακεταμιδίων και των θεοκαρβαμιδικών ζιζανιοκτόνων (Jepson κ.α., 1997), ενώ αυξημένη ανθεκτικότητα έναντι των παραπάνω κατηγοριών ζιζανιοκτόνων παρατηρήθηκε και σε διαγονιδιακά φυτά σιταριού (Μilligan κ.α., 2001). Οι Gullner κ.α., (2001) κατάφεραν να αυξήσουν την ανθεκτικότητα δέντρων λεύκης στα χλωροακεταμιδικά ζιζανιοκτόνα με υπερέκφραση σε αυτά του ενζύμου συνθετάση της γ-γλουταμύλκυστεΐνης που ευθύνεται για αυξημένη παραγωγή GSH. Επίσης διαγονιδιακά φυτά καπνού με αυξημένη παραγωγή ομογλουταθειόνης (hgsh) η οποία απουσιάζει από τα φυτά αγρίου τύπου, προσέδωσε ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα acifluorfen και fomesafen (Sugiyama & Sekiya, 2005). Η Γενετική Μηχανική σήμερα μας προσφέρει δυνατότητες για δημιουργία καινούργιων μορφών των GST ενζύμων με αυξημένες ικανότητες αποτοξίνωσης ζιζανιοκτόνων. Με την μέθοδο του λογικού ενζυμικού ανασυνδυασμού γνωρίζοντας την στερεοδομή ενός GST ενζύμου, μπορούμε με εισαγωγή συγκεκριμένων σημειακών μεταλλαγών στο γονίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο, να δημιουργήσουμε σημειακές 26

27 μεταβολές σε αμινοξικά κατάλοιπα της ενεργού περιοχής του ενζύμου (Κλώνης, 2007). Χρησιμοποιώντας την μέθοδο αυτή, τεχνητές μεταλλαγές στο αμινοξικό κατάλοιπο Ιle118Phe του ενζύμου GSTF-1 του καλαμποκιού, οδήγησαν σε τετραπλάσια δραστικότητα έναντι του ζιζανιοκτόνου alachlor (Labrou κ.α., 2004, 2005). Με την τεχνική της κατευθυνόμενης εξέλιξης μπορούμε να δημιουργήσουμε in vitro τυχαίες μεταλλαγμένες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες DNA που να κωδικοποιούν για ανασυνδυασμένα ένζυμα και με συνεχείς κύκλους μεταλλαγών απομονώνουμε τα ένζυμα με τις επιθυμητές ιδιότητες (Κλώνης, 2007). Με την τεχνική αυτή από δύο GSTs του καλαμποκιού, που ανήκουν στην κλάση tau, τις ZmGSTU1 και ΖmGSTU2-2 δημιουργήθηκε ένα ανασυνδυασμένο ένζυμο. Φυτά Αrabidopsis thaliana που τροποποιήθηκαν με το ανασυνδυασμένο ένζυμο έδειξαν 29 φορές μεγαλύτερη δραστηριότητα έναντι του ζιζανιοκτόνου fluorodifen σε σχέση με τους μάρτυρες (Dixon κ.α., 2003). 27

28 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α) ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27- GST4) ΣΕ E.coli Κατά την διάρκεια δημιουργίας των πλασμιδιακών φορέων χρησιμοποιήθηκαν ορισμένες βασικές τεχνικές μοριακής βιολογίας οι οποίες φαίνονται παρακάτω Αντιδράσεις πέψης των πλασμιδίων Οι μονάδες του ενζύμου που χρησιμοποιούσαμε σε κάθε αντίδραση πέψης εξαρτώνται από την ποσότητα του DNA, έχοντας υπόψιν ότι 1 μονάδα (1 Unit) ενζύμου καταλύει την κοπή 1 μg DNA σε 1 ώρα στους 37 ο C. Σε κάθε αντίδραση προσθέταμε και την κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος, ώστε η συγκέντρωση του να είναι το 1/10 του τελικού όγκου αντίδρασης. Σε κάποιες αντιδράσεις με ένζυμα, ανάλογα με τις οδηγίες του κατασκευαστή προσθέταμε και BSA σε συγκέντρωση 1/10 ή 1/100 του τελικού όγκου της αντίδρασης ή και το απορυπαντικό Triton-X σε συγκέντρωση 1/10 του τελικού όγκου της αντίδρασης. Οι αντιδράσεις επωάζονταν στους 37 ο C για 1 ώρα τουλάχιστον ή και ολονυχτίως, ενώ στο τέλος της αντίδρασης η απενεργοποίηση του ενζύμου πραγματοποιούνταν συνήθως με θέρμανση στους 65 ο C για λεπτά. Πραγματοποιήθηκαν μονές ή διπλές πέψεις DNA. Απομόνωση και καθαρισμός πλασμιδιακών τμημάτων DNA από την πηκτή αγαρόζης Μετά τις αντιδράσεις πέψης, ακολουθούσε απομόνωση των τμημάτων DNA που προορίζονταν για αντιδράσεις ένωσης με πλασμίδια. Για την διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού τμημάτων DNA από την πηκτή αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε το kit Nucleospin Extract II της εταιρίας Macherey-Nagel. 28

29 Αποφωσφορυλίωση άκρων τμημάτων DNA Αντιδράσεις αποφωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκαν, όταν επρόκειτο να κλωνοποιήσουμε τμήματα DNA σε πλασμίδια, τα οποία είχαν κοπεί με το ίδιο ένζυμο περιορισμού. Η αποφωσφορυλίωση πραγματοποιείται με τη χρήση του ενζύμου αλκαλική φωσφατάση CIP (calf intestinal phosphatase). To ένζυμο όταν προστεθεί σε διάλυμα πλασμιδιακού DNA που έχει κοπεί με μια περιοριστική ενδονουκλεάση, αφαιρεί τις φωσφορικές ομάδες από τα 5 άκρα του πλασμιδιακού DNA, εμποδίζοντας την επανασύνδεση του πλασμιδίου με τον εαυτό του, μειώνοντας την πιθανότητα να πάρουμε μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης πραγματοποιήθηκε στο κομμένο με το ένζυμο NotI πλασμίδο part27. Η αντίδραση έγινε με επαναδιάλυση ποσότητας του κομμένου πλασμιδιακού DNA σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ, προσθήκη 0,5 μονάδες CIP/μg πλασμιδιακού DNA και συμπλήρωση με αποσταγμένο, αποστειρωμένο νερό μέχρι του επιθυμητού τελικού όγκου της αντίδρασης. Ένωση τμημάτων DNA με τα πλασμίδια Για την ένωση τμημάτων DNA χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο T4 DNA λιγάση. Το ένζυμο αυτό χρησιμοποιείται για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πλασμιδίων και καταλύει τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικών δεσμών με την παράλληλη κατανάλωση ATP μεταξύ του 3 υδρόξυ άκρου ενός δίκλωνου κομματιού DNA και του 5 φωσφορικού του ίδιου ή άλλου κομματιού. Σε αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα (eppedorf) και σε τελικό όγκο 10 μl προσθέσαμε ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης 5Χ και κατάλληλη αναλογία ενθέματος και πλασμιδίου με συμβατά άκρα. Η αναλογία που χρησιμοποιήσαμε ήταν 3:1 (ένθεμα:πλασμίδιο), κατόπιν μακροσκοπικής παρατήρησης σε πηκτή αγαρόζης του κομμένου πλασμιδίου και του ενθέματος. Στην συνέχεια προσθέσαμε 1 μονάδα λιγάσης και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 10 μl. Ακολουθούσε επώαση για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και χρησιμοποίηση όλου του μίγματος (10 μl) για την διαδικασία μεταμόρφωσης βακτηριακών κυττάρων E.coli. 29

30 Κλωνοποίηση των πλασμιδίων σε δεκτικά κύτταρα βακτηρίων E.coli (μεταμόρφωση βακτηρίων) Για την διαδικασία αυτή χρειαστήκαμε δεκτικά κύττταρα E.coli, πλασμιδιακό DNA και θρεπτικό υπόστρωμα SOC. Χρησιμοποιούσαμε 200 ml θρεπτικoύ υποστρώματος SOC τα οποία περιέχουν: 4 gr τρυπτόνη, 1 gr εκχύλισμα ζύμης, 0,1 gr ΝaCl και 2 ml KCl (250 mm). Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε ήταν το εξής: Σε δοκιμαστικό σωλήνα (eppedorf) που περιέχει 100 μl δεκτικών κυττάρων E.coli, του στελέχους DH5a προσθέταμε 5-10 ng πλασμιδιακό DNA και τα μεταφέραμε στον πάγο για 10 λεπτά. Ακολουθούσε θερμοκρασιακό σοκ στους 42 ο C για 30 δευτερόλεπτα και πολύ γρήγορα οι δοκιμαστικοί σωλήνες μεταφέρονταν στον πάγο. Ακολουθούσε προσθήκη 250 μl θρεπτικού υποστρώματος SOC. Στην συνέχεια οι δοκιμαστικοί σωλήνες με τα κύτταρα επωάζονταν οριζοντίως σε ανακινούμενο επωαστήρα για 1 ώρα στους 37 ο C. Το επόμενο βήμα ήταν η επίστρωση σε τρυβλία που περιέχουν στερεό αποστειρωμένο θρεπτικό υπόστρωμα LB (Luria Bertani) (Luria & Burrous,1957). Η διαδικασία αποστείρωσης των υποστρωμάτων γινόνταν σε αυτόκαυστο κλίβανο στους -121 ο C, στον οποίο τοποθετούνταν οι κωνικές φιάλες με τα υποστρώματα για 20 λεπτά περίπου. Στην συνέχεια και αφού τα υποστρώματα είχαν κρυώσει, αλλά πριν στερεοποιηθούν προσθέταμε στα υποστρώματα τα κατάλληλα αντιβιοτικά που είναι αποστειρωμένα, ανάλογα με το πλασμίδιο που θέλαμε να κλωνοποιήσουμε. Για το πλασμίδο part7 χρησιμοποιήθηκε το αντιβιοτικό αμπικιλίνη σε συγκέντρωση 50 μg/ml, ενώ για το πλασμίδιο part27 τα εξής αντιβιοτικά: σπεκτινομυκίνη σε συγκέντρωση 100 μg/ml, ή στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 25 μg/ml ή καναμυκίνη σε συγκέντρωση 20 μg/ml καθώς και οι ουσίες X-Gal και IPTG (επαγωγέας του γονιδίου lacz ). Οι ποσότητες κυττάρων που επιστρώνονταν υπό ασηπτικές συνθήκες στα τρυβλία ήταν 10, 20, 50 και 100 μl. Ακολουθούσε επώαση των τρυβλίων στους 37 ο C και σε περίπτωση που είχε πετύχει η κλωνοποίηση την επόμενη ημέρα παρατηρούσαμε αποικίες. Στην συνέχεια ακολουθούσε καλλιέργεια σε αποστειρωμένα υγρά υποστρώματα LB με την εξής διαδικασία: σε σωλήνες (falcon) των 15 ml που περιείχαν 3 ml υγρού αποστειρωμένου LB, ενοφθαλμίζουμε μια αποικία βακτηριακών κυττάρων E.coli. Στην συνέχεια οι σωλήνες με τις υγρές καλλιέργειες μεταφέρονταν σε ανακινούμενους επωαστήρες, με θερμοκρασία 30

31 37 ο C και ακολουθούσε επώαση στους 37 ο C για 16 ώρες, το πολύ 24 και την επόμενη ημέρα ακολουθούσε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA. Aπομόνωση πλασμιδιακού DNA από μεταμορφωμένα βακτήρια E.coli Ακολουθήθηκαν δύο μέθοδοι για την απομόνωση του πλασιδιακού DNA. H μία μέθοδος αφορούσε την απομόνωση πλασμιδιακού DNA με την εφαρμογή του πρωτοκόλλου κατά Birnboim (Birnboim, 1983) και η δεύτερη αφορούσε την εφαρμογή kit (Nucleospin Plasmid Kit της εταιρίας Macherey-Nagel). Η πρώτη μέθοδος εφαρμόστηκε όταν πραγματοποιούσαμε αντιδράσεις πέψης για διαγνωστικό έλεγχο σε πολλά πλασμίδια που απομονώναμε από τυχόν ανασυνδυασμένους βακτηριακούς κλώνους. Η δεύτερη μέθοδος σε αντίθεση με την πρώτη μας δίνει την δυνατότητα απομόνωσης υπερκάθαρου διαλύματος πλασμιδιακού DNA και εφαρμόστηκε στις περιπτώσεις που το πλασμιδιακό DNA προορίζονταν για αντιδράσεις ένωσης τμημάτων DNA. To πρωτόκολλο κατά Birnboim που ακολουθήσαμε είναι το εξής: Από φρέσκες καλλιέργειες βακτηρίων μεταφέραμε 1,5 ml καλλιέργειας σε δοκιμαστικό σωλήνα (eppedorf). Φυγοκεντρούσαμε για 1 λεπτό στα g και απορρίπταμε το υπερκείμενο. Στην συνέχεια ακολουθούσε προσθήκη 100 μl Διαλύματος Ι και επαναδιάλυση του ιζήματος ανακινώντας δυνατά, μετά προσθήκη 200 μl Διαλυμάτος ΙΙ και όχι δυνατή ανακίνηση, τέλος προσθήκη 150 μl από το Διάλυμα ΙΙΙ, όχι δυνατή ανακίνηση και επώαση του δωκιμαστικού σωλήνα σε πάγο για λεπτά. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα g, μεταφορά του υπερκείμενου σε καινούργιο δοκιμαστικό σωλήνα (eppedorf) και προσθήκη 500 μl διάλυμα 50% φαινόλη: 48% χλωροφόρμιο: 2% ισοαμυλική αλκοόλη (25:24:1), ανακίνηση και με το ακρορύγχιο της πιπέτας μεταφορά μόνο της υδάτινης φάσης σε καινούργιο eppedorf. Προσθέταμε στην συνέχεια 1 ml 95% αιθανόλη, ανακινούσαμε καλά και φυγοκεντρούσαμε για 15 λεπτά στα g. Τέλος το υπερκείμενο απορρίπτονταν, ακολουθούσε ξέπλυμα του ιζήματος με 500 μl 80% αιθανόλη και ο δοκιμαστικός σωλήνας με το ίζημα επωάζονταν σε θερμοκρασία δωματίου για μερικά λεπτά εωσότου στεγνώσει καλά. Το ίζημα επαναδιαλύονταν σε ρυθμιστικό διάλυμα TE που περιέχει 20 μg/ml RNάση. 31

32 Παρακάτω φαίνεται η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA Διάλυμα Ι Διάλυμα ΙΙ Διάλυμα ΙΙΙ Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ 5 mm σουκρόζη 0.2 Ν ΝaOH 3 Μ οξικό νάτριο 10 mm Tris-HCl 10 mm EDTA 1% (β/ο) SDS ph mm EDTA 25 mm Tris-HCl ph 8.0 ph 8.0 Αλυσιδωτή αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) Αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε πιθανά ανασυνδυασμένους πλασμιδιακούς φορείς για να διαπιστώσουμε εάν έχει πετύχει η ένθεση τμημάτων DNA σε αυτούς. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε θερμοκυκλοποιητή (PTC-200 DNA Engine Cycler της Bio-Rad) και χρησιμοποιήθηκε το kit DyNAzyme II (DNA Polymerase kit) της εταιρίας Finnzymes το οποίο περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν σε μια PCR. Oι αντιδράσεις PCR σε πλασμιδιακά DNA πραγματοποιούνταν σε 25 ή 50 μl όγκο, που περιείχε 0,2-0,4 μm από τους δύο εκκινητές, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR (σύσταση: 1,5 mm MgCl 2, 10 mm Tris-HCl (ph 8.0), 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100), 200 μμ από κάθε δεοξυριβονουκλεοτίδιο και 1 U DNA πολυμεράσης (DyNAzyme TM II) και η συγκέντρωση του DNA εκμαγείου ήταν 250 pg/όγκο αντίδρασης. Υβριδισμός κατά Southern O υβριδισμός κατά Southern πραγματοποιήθηκε σε προϊόντα πέψης τού πλασμιδιακού φορέα part27-gst4 για να διαπιστώσουμε εάν έχει πετύχει σε αυτούς η κλωνοποίηση του γονιδίου gst4, χρησιμοποιώντας έτοιμο ανιχνευτή CaΜV-35S επισημασμένο με το μόριο της διγοξυγενίνης. Για τον υβριδισμό κατά Southern χρησιμοποιήθηκε το σύστημα Dig της εταιρίας Roche Applied Science και ο υβριδισμός έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, μέσω αντίδρασης PCR ένας ανιχνευτής επισημαίνεται με μόρια της διγοξυγενίνης (DIG-11-dUTP) 32

33 και στην συνέχεια ο επισημασμένος ανιχνευτής υβριδίζει με συμπληρωματικές περιοχές κομμένου με περιοριστικά ένζυμα πλασμιδιακού ή γενωμικού DNA το οποίο έχει στυπωθεί σε θετικά φορτισμένες μεμβράνες. Ένα σύμπλοκο αλκαλικής φωσφατάσης και αντισώματος (anti-dig), δεσμεύεται με τον ανιχνευτή εφόσον αυτός έχει υβριδίσει με το πλασμιδιακό ή γενωμικό DNA και τα υβρίδια αντισώματος-ανιχνευτή οπτικοποιούνται κατόπιν αντίδρασης της αλκαλικής φωσφατάσης με διάφορα υποστρώματα. Συνοπτικά η διαδικασία υβριδισμού είχε ως εξής: κατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης των πλασμιδιακών DNA σε πηκτή αγαρόζης ακολουθούσε επώαση της πηκτής για 15 λεπτά σε 250 mm HCl, στην συνέχεια εμβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα μετουσίωσης (denaturation solution: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) για 15 λεπτά και ήπια ανάδευση (x 2 φορές) και τέλος εμβάπτιση της πηκτής σε διάλυμα ουδετεροποίησης (neutralization solution: 0,5 Μ Tris-HCl, ph 7.5, 1,5 M NaCl) για 2 x 15 λεπτά και ήπια ανάδευση. Η μεταφορά των κομματιών DNA από την πηκτή σε θετικά φορτισμένες μεμβράνες έγινε με την βοήθεια διαλύματος 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M sodium citrate, ph 7.0). Ο υβριδισμός έγινε στους 65 ο C για 12 ώρες με τον ανιχνευτή διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα: standard hybridization buffer (5x SSC, 0,02% SDS, 1% blocking solution από μητρικό διάλυμα 10% blocking solution). Τα ξεπλύματα της μεμβράνης έγιναν σε διάλυμα αποτελούμενο από 2% SSC και 0,1% SDS σε θερμοκρασία δωματίου καθώς και σε διάλυμα αποτελούμενο από 0.1% SSC και 0.1% SDS στους 65 ο C. Για την ανίχνευση του σήματος των υβριδίων αντισώματος-ανιχνευτή χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα, διάλυμα των δύο άχρωμων ουσιών NBT/BCIP το οποίο με προσθήκη του ενζύμου της αλκαλικής φωσφατάσης αποφωσφορυλιώνεται ένα βαθύ μπλε χρώμα παράγεται κατευθείαν πάνω στην μεμβράνη, στα τμήματα DNA που έχουν υβριδίσει. Προέλευση του γονιδίου gst4 To γονίδιο gst4 έχει απομονωθεί από φυτά σόγιας, ανήκει στην κλάση tau και έχει υψηλή δραστικότητα έναντι διαφαινυλαιθέρων και αρυλόξυ-φαινόξυ-προπιονικών ζιζανιοκτόνων (Jepson κ.α., 1994, Thom κ.α., 2002). Στάλθηκε κλωνοποιημένο στο πλασμίδιο pqe70 (Εικόνα 6) από το Εργαστήριο Ενζυμικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών). Το γονίδιο ήταν κλωνοποιημένο στην περιοχή του πολυσυνδέσμου (MCS-multiple cloning site), μεταξύ των 33

34 θέσεων SphI και ΗindIII. Σε απόσταση 19 νουκλεοτιδίων πίσω από την θέση SphI υπαρχει η θέση αναγνώρισης για το ένζυμο EcoRI. Αρχικά έγινε απομόνωση της κωδικής περιοχής του γονιδίου gst4 από τον πλασμιδιακό φορέα pqe70 και κλωνοποιήση της στον part7 (Gleave, 1992), προκειμένου να δημιουργηθεί η κασέτα έκφρασης του γονιδίου. Εικόνα 6. Δομή του πλασμιδίου pqe70 Δημιουργία του ενδιάμεσου πλασμιδιακού φορέα pαrτ7-gst4 Το πλασμίδιο part7 φέρει μια κασέτα έκφρασης που αποτελείται από τον ισχυρό συστατικό υποκινητή CaΜV-35S από τον ιό της μωσαϊκής του κουνουπιδιού, ακολουθεί η περιοχή του πολυσυνδέσμου για την εισαγωγή του επιθυμητού γονιδίου και στην συνέχεια η μη μεταφραζόμενη περιοχή του γονιδίου συνθάση των οκτοπινών (ocs 3 ) η οποία περιέχει σήματα πολυαδενυλίωσης για τον τερματισμό της μεταγραφής του επιθυμητού γονιδίου. Όλη η νουκλεοτιδική αλληλουχία της κασέτας έκφρασης περιβάλλεται τόσο από μπροστά όσο και από πίσω από την νουκλεοτιδική ακολουθία του ενζύμου NotI. Έτσι μπορεί να κοπεί και να εξαχθεί από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο όλη η κασέτα έκφρασης του γονιδίου. Το πλασμίδο part7 περιέχει και ένα γονίδιο επιλογής ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό αμπικιλίνη για την επιλογή των μεταμορφωμένων βακτηριακών κυττάρων του E.coli (Εικόνα 7). 34

35 Εικόνα 7. Δομή του πλασμιδίου part7, που χρησιμοποιήθηκε για την δημιουργία της κασέτας έκφρασης του γονιδίου gst4. Για την κλωνοποίηση του γονιδίου gst4 ακολούθησε πέψη του πλασμιδίου pqe70 με τα ένζυμα περιορισμού ΕcoRI και HindIII, ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης σε πηκτή αγαρόζης 1% και απομόνωση από την πηκτή του τμήματος DNA 691 bp που αντιστοιχεί στο γονίδιο gst4. Με τα ίδια ένζυμα EcoRI και HindIIIΙ κάναμε διπλή πέψη και το πλασμίδιο part7 για να το απομονώσουμε σε γραμμική μορφή. Ακολούθησε αντίδραση ένωσης του τμήματος DNA που αντιστοιχεί στο γονίδιο gst4 και του τμήματος DNA που αντιστοιχεί στο πλασμίδιο part7, προκειμένου να δημιουργηθεί ο πλασμιδιακός φορέας part7-gst4 και μεταμόρφωση δεκτικών κυττάρων του E. coli, με το μίγμα αντίδρασης. Ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Για να διαπιστώσουμε εάν πέτυχε η δημιουργία του ανασυνδυασμένου φορέα part7-gst4 έγιναν τρεις αντιδράσεις πέψης των πλασμιδίων. Μια μονή πέψη με το ένζυμο NotI από την οποία θα πάρουμε δύο τμήματα DNA: τo ένα τμήμα θα περιέχει την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 και θα έχει μέγεθος 2840 bp και το άλλο θα περιέχει το υπόλοιπο τμήμα του πλασμιδίου με μέγεθος bp. Μια διπλή πέψη με τα ένζυμα KpnI και NotI κατά την οποία η θέση αναγνώρισης του ενζύμου KpnI στο πλασμίδιο είναι μεταξύ των θέσεων EcoRI και HindIIIΙ ανάμεσα από τις οποίες 35

36 κλωνοποιείται η κωδική περιοχή του gst4 και επομένως στα ανασυνδυασμένα πλασμίδια το ένζυμο KpnI δεν έχει θέση αναγνώρισης. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια κατόπιν πέψης θα μας δώσουν δύο τμήματα, το ένα μεγέθους bp και το άλλο bp, ενώ σε περίπτωση που δεν έχει συνδεθεί η κασέτα έκφρασης στο πλασμίδιο θα πάρουμε τρία κομμάτια μεγέθους bp, bp και 813 bp. Τέλος πραγματοποιήθηκε και μια διπλή πέψη με τα ένζυμα XhoI και XbaI από την οποία θα πάρουμε δύο κομμάτια DNA το ένα με μέγεθος bp και το άλλο 709 bp στο οποίο θα περιέχεται την κωδική περιοχή του gst4 στα ανασυνδυασμένα μόνο πλασμίδια. Για επιβεβαίωση της ένθεσης του γονιδίου gst4 στο πλασμίδιο pαrτ7 πραγματοποιήθηκε μία αντίδραση PCR για την ανίχνευση περιοχής της κασέτας έκφρασης του gst4, η οποία θα περιλαμβάνει μέρος του υποκινητή CaMV-35S και όλη την κωδική περιοχή του γονιδίου gst4. Παρακάτω φαίνονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν: Εκκινητές 35S-pro5 ανοδικός GST4 καθοδικός Μέγεθος προϊόντος PCR: 947 bp Αλληλουχία 5 -GCTCCTACAAATGCCATCA-3 5 -CTACTCAATGCCTAACTTCT-3 Oι συνθήκες PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Αρχική αποδιατάξη 94 ο C 2 min denaturation step 94 ο C 30 sec annealing step 35 κύκλοι 50 ο C 1 min elongation step 72 ο C 1 min και 30 sec Tελικό στάδιο επιμύκηνσης 72 ο C 10 min Μετά το τέλος της PCR ακολουθούσε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1%. 36

37 Δημιουργία του φορέα γενετικής τροποποίησησης pαρτ27-gst4 Το επόμενο βήμα ήταν η κλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης του γονιδίου gst4 στο πλασμίδιο part27 (Εικόνα 8), (Gleave, 1992). Το πλασμίδιο part27 είναι μέρος του δυαδικού συστήματος φορέων και περιέχει μια τεχνητή περιοχή T-DNA με μια θέση αναγνώρισης για το ένζυμο NotI για κλωνοποίηση γονιδίων που θέλουμε να μεταφέρουμε σε φυτικά κύτταρα. Μέσα στην Τ-DNA περιοχή και ακριβώς στη περιοχή αναγνώρισης του ενζύμου NotI το πλασμίδιο part27 περιέχει το γονίδιο lacz το οποίο παρουσία του επαγωγέα IPTG παράγει την β-γαλακτοσιδάση σε μεταμορφωμένα βακτήρια. Ενζυμική αντίδραση της β-γαλακτοσιδάσης παρουσία του υποστρώματος X-Gal οδηγεί στον σχηματισμό χρωμογόνου προϊόντος γαλάζιου χρώματος. Συνεπώς στα βακτήρια στα οποία εκφράζεται το γονίδιο lacz οι αποικίες χρωματίζονται μπλέ, ενώ σε αυτά που δεν εκφράζεται λευκές. Επειδή το γονίδιο lacz βρίσκεται στην περιοχή αναγνώρισης του ενζύμου NotI εάν στην θέση αυτή κλωνοποιηθεί ένα γονίδιο, το γονίδιο lacz δεν θα εκφράζεται και επομένως μπορούμε να επιλέξουμε μεταξύ των βακτηρίων που έχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (άσπρες αποικίες) και αυτών που έχουν σκέτο το πλασμίδιο part27 (μπλε αποικίες). Τέλος το πλασμίδιο part27 περιέχει εκτός της Τ-DNA περιοχής και τα γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά της σπεκτυνομυκίνης/στρεπτομυκίνης για επιλογή μεταξύ μεταμορφωμένων και μη κυττάρων E.coli ή Αgrobacterium tumefaciens, ενώ μέσα στην T-DNA περιοχή το γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό καναμυκίνη για επιλογή μεταξύ μεταμορφωμένων και μη κυττάρων των παραπάνω βακτηρίων αλλά και φυτικών κυττάρων μετά την συγκαλλιέργεια του αγροβακτηρίου με φυλλικούς δίσκους. 37

38 Εικόνα 8. Δομή του πλασμιδίου part27, που χρησιμοποιήθηκε για την δημιουργία του φορέα γενετικής τροποποίησης part27-gst4. Για την δημιουργία του πλασμιδιακού φορέα part27-gst4 πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις διπλής πέψης του πλασμιδιακού φορέα part7-gst4 με τα ένζυμα NotI και PvuI. Το ένζυμο PvuI χρησιμοποιήθηκε γιατί αναγνωρίζει δύο θέσεις κοπής στο τμήμα του πλασμδίου που δεν περιέχει την κασέτα έκφρασης του γονιδίου με αποτέλεσμα να το κατακερματίζει, μιας και μονή πέψη με το ένζυμο NotI θα μας έδινε δύο τμήματα DNA περίπου ίσων μεγεθών που δεν θα μπορέσουν να διαχωριστούν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Τα τμήματα DNA που θα πάρουμε κατόπιν διπλής πέψης με τα ένζυμα NotI και PvuI έχουν μεγέθη: bp (το τμήμα αυτό είναι η κασέτα έκφρασης του γονιδίου), bp, bp και 140 bp και κατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης σε πηκτή αγαρόζης 0,7% απομονώσαμε μόνο το τμήμα DNA που αντιστοιχεί στην κασέτα έκφρασης του γονιδίου. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε αντίδραση πέψης του πλασμιδίου part27 με το ένζυμο NotI. Μετά την κοπή ακολούθησε απομόνωση και αποφωσφορυλίωση των άκρων του γραμμικού πλασμιδίου part27 με το ένζυμο της αλκαλικής φωσφατάσης CIP προκειμένου το πλασμίδιο part27 να μην μπορέσει να ενωθεί με τον εαυτό του κατά την αντίδραση ένωσης των δύο τμημάτων DNA (της κασέτας έκφρασης του gst4 και του γραμμικού πλασμιδίου part27). Mετά την αντίδραση της λιγάσης για την ένωση των δύο τμημάτων DNA ακολουθούσε μεταμόρφωση χημικά δεκτικών κυττάρων E.coli με το μίγμα 38

39 αντίδρασης, και επίστρωση των βακτηρίων σε τρυβλία που περιείχαν στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB, συμπληρωμένο με Xgal και IPTG και το αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 25 μg/ml. Λευκές αποικίες που εμφανίζονταν στα τρυβλία ενοφθαλμίζονταν σε υγρό LB που περιείχε τα αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 25 μg/ml και ακολουθούσε απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Οι λευκές αποικίες μπορεί να περιέχουν: α) ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιέχουν την κασέτα έκφρασης στη σωστή φορά, β) ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιέχουν την κασέτα έκφρασης σε αντίθετη φορά, γ) μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Για την επιλογή των σωστών βακτηριακών κλώνων πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις πέψης των πλασμιδίων διαφόρων κλώνων με τα ένζυμα NotI, BamHI και SalI. Συνολικά εξετάστηκαν περίπου 200 διαφορετικοί βακτηριακοί κλώνοι οι οποίοι μπορεί να περιείχαν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4. Το ένζυμο BamHI κόβει μία φορά εντός της κασέτας έκφρασης και μία εκτός, ώστε κατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης θα πάρουμε ευδιάκριτα τμήματα DNA διαφορετικών μεγεθών ανάλογα με την φορά ενσωμάτωσης της κασέτας: δύο τμήματα DNA μεγέθους bp και bp σε περίπτωση που η κασέτα έκφρασης είναι στη σωστή φορά και δύο τμήματα μεγέθους bp και bp στην αντίθετη περίπτωση. Το NotI κόβει στο σημείο ένωσης της κασέτας έκφρασης με το πλασμίδιο part27 και μας δίνει κατόπιν ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης δύο τμήματα μεγέθους bp και bp (περιέχει τη κασέτα έκφρασης του gst4) σε περίπτωση που έχουμε ανασυνδυασμένα πλασμίδια, ενώ στην αντίθετη περίπτωση παίρνουμε ένα τμήμα DNA μεγέθους bp. Το ένζυμο SalI κόβει στα άκρα του T-DNA και επομένως μπορούμε να απομονώσουμε όλο το T-DNA από το πλασμίδιο part27. Στη περίπτωση που έχουμε ανασυνδυασμένα πλασμίδια με τη κασέτα έκφρασης θα πάρουμε δύο τμήματα DNA μεγέθους bp και bp, ενώ στην αντίθετη περίπτωση δύο τμήματα DNA μεγέθους bp και το άλλο bp. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι η κασέτα έκφρασης του gst4 είχε ενσωματωθεί στο πλασμίδιο part27 πέρα από τις αντιδράσεις πέψης, ακολούθησε και υβριδισμός κατά Southern των προϊόντων πέψης με τα ένζυμα NotI και BamHI των πλασμιδιακών φορέων χρησιμοποιώντας έτοιμο ανιχνευτή CaΜV-35S επισημασμένο με το μόριο της διγοξυγενίνης. 39

40 B) ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΣΗ TOY Agrobacterium tumefaciens ME TOYΣ ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (part27 KAI part27-gst4) Ο τελικός πλασμιδιακός φορέας γενετικής τροποποίησης των φυτών καπνού part27-gst4 και το πλασμίδιο part27 (αρνητικός μάρτυρας ως προς το γονίδιο gst4) κλωνοποιήθηκαν σε δεκτικά κύτταρα του στελέχους LBA4404 του Agrobacterium tumefaciens. Σε αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα (eppedorf) που περιέχει 150 μl δεκτικών κυττάρων Agrobacterium tumefaciens προσθέσαμε 1,5 μg του πλασμιδιακού φορέα pαrt27-gst4 διαλυμένου σε 10 μl αποστειρωμένο, απεσταγμένο νερό. Μετά από ανακίνηση του δοκιμαστικού σωλήνα, ακολούθησε ταχεία ψύξη σε υγρό άζωτο για 5 λεπτά στην συνέχεια θέρμανση του περιεχομένου του δοκιμαστικού σωλήνα (eppedorf) στους 37 ο C, προσθήκη αποστειρωμένου θρεπτικού διαλύματος LB στα κύτταρα και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου σε ανακινούμενο επωαστήρα για 5 ώρες. Στην συνέχεια επιστρώσαμε το περιεχόμενο σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB που περιέχουν το αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 25 μg/ml (αντιβιοτικό επιλογής του πλασμιδίου) και την ριφαμπικίνη σε συγκέντρωση 50 μg/ml (λόγω χρωμοσωμικής ανθεκτικότητας του στελέχους LBA4404 στο εν λόγω αντιβιοτικό). Τα τρυβλία επωάστηκαν χωρίς να έχουν κλειστεί με ειδική ταινία (parafilm) σε θερμοκρασία δωματίου και σε συνθήκες σκότους και μετά από τις 4-5 ημέρες παρατηρήσαμε αποικίες. Απομόνωση των πλασμιδίων από μεταμορφωμένα κύτταρα Agrobacterium tumefaciens Προκειμένου να ταυτοποιήσουμε την μεταμόρφωση των κυττάρων Agrobacterium tumefaciens με τα πλασμίδια, ακολούθησε απομόνωση των πλασμιδιακών DNA που είχαμε κλωνοποιήσει σε αυτά. Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκε για τις απομονώσεις είναι η ίδια με αυτήν που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση πλασμιδίων από κύτταρα E.coli. Η διαδικασία απομόνωσης περιγράφεται παρακάτω: 40

41 Από 5 ml φρέσκιας καλλιέργειας αγροβακτηρίων μεταγγίζουμε 1 ml σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες (eppedorf) Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 45 sec στους g και απόρριψη του υπερκείμενου Προσθήκη ακόμα 1 ml καλλιέργειας στους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες (eppedorf) Φυγοκέντρηση και απόρριψη του υπερκείμενου Ισχυρή ανάδευση του ιζήματος των κυττάρων και προσθήκη 100 μl Διαλύματος Ι Ανάδευση και επώαση του eppedorf για 5 λεπτά σε θερμοκραία δωματίου Προσθήκη 20 μl διαλύματος 20 mg/ml λυσοζύμης, ανάδευση και επώαση για 15 λεπτά στους 37 ο C Προσθήκη 200 μl φρέσκου Διαλύματος ΙΙ ήπια ανακίνηση και επώαση για 5 λεπτά σε πάγο Προσθήκη 150 μl Διαλύματος ΙΙΙ, ισχυρή ανάδευση για 10 sec και επώαση για 5 λεπτά στον πάγο Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά και μεταφορά του υπερκείμενου σε καινούργιους δοικμαστικούς σωλήνες Προσθήκη 400 μl διαλύματος φαινόλης/χλωροφόρμιο/ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1), ισχυρή ανάδευση Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά και μεταφορά του υπερκείμενου σε καινούργια eppedorf Επανάληψη του παραπάνω σταδίου Ξανά επανάληψη του σταδίου με προσθήκη μόνο χλωροφορμίου Προσθήκη 300 μl ισοπροπανόλης και επώαση για 10 λεπτά στον πάγο Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά. Απόρριψη του υπερκείμενου και ξέπλυμα του ιζήματος με 80% αιθανόλη Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά Στέγνωμα του ιζήματος και επαναδιάλυση του ιζήματος από τους δύο δοκιμαστικούς σωλήνες σε 50 μl TE διάλυμα που περιέχει 20 μg/ml RNάση 41

42 Ταυτοποίηση της μεταμόρφωσης του Agrobacterium tumefaciens μέσω αντιδράσεων πέψεων των πλασμιδίων τους Τα πλασμίδια part27-gst4 και part27 που απομονώθηκαν από το Agrobacterium tumefaciens ξανακλωνοποιήθηκαν σε χημικά δεκτικά κύτταρα E. Coli (με την διαδικασία που έχει περιγραφεί), προκειμένου να απομονώσουμε μεγάλες ποσότητες πλασμιδιακού DNA. Ακολούθησε απομόνωση πλασμιδιακού DNA από το E.coli, αντιδράσεις πέψης με τα ένζυμα ΒamHI, SacI, SalI, NotI, NdeI, XbaΙ, HindIII, EcoRI και SpeI. Στα προϊόντα πέψης πραγματοποιήθηκε και υβριδισμός κατά Southern με ανιχνευτή CaΜV-35S επισημασμένο με το μόριο της διγοξυγενίνης προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν είχε πραγματοποιηθεί σωστά η μεταμόρφωση του αγροβακτηρίου με τα πλασμίδια part27-gst4 και part27. Γ) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΜΠΑΣΜΑΣ, VIRGINIA ΚΑΙ BURLEY Φυτικό υλικό Για τα πειράματα γενετικής τροποποίησης χρησιμοποιήθηκαν in vitro φυτά καπνού (Nicotiana tabacum L.) των τριών ποικιλιών Μπασμάς, Virginia και Burley. Το αρχικό υλικό ήταν σπόροι οι οποίοι προμηθεύτηκαν από το Καπνολογικό Ινστιτούτο Δράμας. Μικροπολλαπλασιασμός του φυτικού υλικού Οι σπόροι των ποικιλιών Μπασμάς, Virginia και Burley απολυμάνθηκαν με την εξής διαδικασία: οι σπόροι εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 10% και αναδεύονταν συνεχώς για 30 δευτερόλεπτα. Μετά ακολούθησε εμβάπτιση των σπόρων σε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 1,3% για 10 λεπτά και ανάδευση ανά διαστήματα. Ακολουθούσε ξέπλυμα των σπόρων τρεις φορές με απεσταγμένο αποστειρωμένο νερό και στη συνέχεια επιστρωσή τους σε στερεό αποστειρωμένο υπόστρωμα ΜS (Murashige & Skoog, 1962). Τα 42

43 τρυβλία κλείνονταν με ειδική ταινία (parafilm) που επιτρέπει την ανταλλαγή των αερίων, και τοποθετούνταν σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών σε συνθήκες σκότους και σε θερμοκρασία 25± 2 ο C. Μετά από 3-4 ημέρες παρατηρούνταν εκβλάστηση των φυταρίων τα οποία μεταφέρονταν σε αποστειρωμένα δοχεία Magenta που περιείχε υπόστρωμα MS και τοποθετούνταν σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών με ένταση φωτισμού περίπου 1500 Lux, 16 ώρες φως και 8 ώρες σκοτάδι και θερμοκρασία 25± 2 ο C. Μετά την πάροδο 20 ημερών εμφανίζονταν καλά ανεπτυγμένα φυτά με μεγάλο αριθμό μεσογονατίων διαστημάτων, στα οποία πραγματοποιούνταν μικροπολλαπλασιασμοί. Σαν έκφυτα χρησιμοποιούνταν γόνατα από τα μητρικά φυτά τα οποία κόβονταν υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα σε τράπεζα νηματικής ροής και τοποθετούνταν σε αποστειρωμένα δοχεία Magenta με στερεό υπόστρωμα ΜS. Τα δοχεία κλείνονταν με ειδική ταινία (parafilm) και τοποθετούνταν σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών με τις ίδιες συνθήκες που περιγράφηκαν παραπάνω. Η ανανέωση των υποστρωμάτων πραγματοποιούνταν κάθε μήνα. Γενετική τροποποίηση φυτών καπνού με το Agrobacterium tumefaciens Η γενετική τροποποίηση φυτών καπνού έγινε με τη χρήση του βακτηρίου Agrobacterium tumefaciens (στέλεχος LBA4404). To Aγροβακτήριο περιέχει δύο πλασμίδα. Το ένα είναι το μη ογκογενετικό (αφοπλισμένο) πλασμίδιο Ti που περιέχει τα γονίδια τοξικότητας vir που χρειάζονται για την μεταφορά του T-DNA και μία αρχή αντιγραφής ori και το άλλο είναι o φορέας τροποποίησης που εμείς κλωνοποιούμε σε αυτό. Χρησιμοποιήθηκαν δύο φορείς γενετικής τροποποίησης: ο part27-gst4 που περιέχει την περιοχή T-DNA με το γονίδιο gst4 και ο part27 (αρνητικός μάρτυρας ως προς το γονίδιο gst4). Ως έκφυτα χρησιμοποιήθηκαν φυλλικοί δίσκοι από τις τρεις ποικιλίες, Μπασμάς, Virginia και Βurley οι οποίοι συγκαλλιεργήθηκαν με το αγροβακτήριο που περιέχει τον part27-gst4, ενώ ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν φυλλικοί δίσκοι από την ποικιλία Virginia οι οποίοι συγκαλλιεργήθηκαν με το αγροβακτήριο που περιέχει τον part27 μόνο. Για την προετοιμασία του βακτηριακού διαλύματος ακολούθησε ενοφθαλμισμός 1 αποικίας μεταμορφομένων βακτηρίων Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) σε 5 ml υγρού υποστρώματος LB που περιείχε τα αντιβιοτικά: καναμυκίνη (20 μg/ml), 43

44 στρεπτομυκίνη (25 μg/ml), σπεκτυνομυκίνη (100 μg/ml) και ριφαμπικίνη (50 μg/ml) και ανάπτυξή τους στους 28 ο C σε ανακινούμενο επωαστήρα για 3 ημέρες. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των κυττάρων και αντικατάσταση του υπερκείμενου διαλύματος με υγρό MS ώστε να ακολουθήσει συγκαλλιέργεια με φυλλικούς δίσκους. Η συγκαλλιέργεια των εκφύτων έγινε ως εξής: για την κάθε ποικιλία χρησιμοποιήθηκαν 100 φυλλικοί δίσκοι οι οποίοι κόπηκαν σε τετράγωνο σχήμα μεγέθους 1 cm 2 και τοποθετήθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν 25 ml υγρό υπόστρωμα αναγέννησης MS (MSR) συμπληρωμένο με ΝΑΑ (0,1 mg/l) και ΒΑΡ (1 mg/l) καθώς και 1 ml από την καλλιέργεια του Agrobacterium tumefaciens. Σε κάθε τρυβλίο τοποθετήθηκαν 100 φυλλικοί δίσκοι με την κάτω επιφάνεια στραμμένη προς τα επάνω. Ακολούθησε ολονύχτια επώαση των τρυβλίων σε ημίφως στους 25 ο C και την επόμενη μέρα ξεπλύματα των φυλλικών δίσκων (5 φορές) σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και μεταφορά τους σε στερεό υπόστρωμα αναγέννησης ΜS (ΜSR) συμπληρωμένο με τα αντιβιοτικά σεφοταξίμη 250 μg/ml και καναμυκίνη συγκέντρωσης 100 μg/ml (παράγοντας επιλογής για τα μεταμορφωμένα φυτά). Ως αρνητικός μάρτυρας (ως προς την αναγέννηση) χρησιμοποιήθηκαν μη γενετικά τροποποιημένοι φυλλικοί δίσκοι από τις προαναφερόμενες ποικιλίες, οι οποίοι εμβολιάστηκαν σε υπόστρωμα ΜSR συμπληρωμένο με το αντιβιοτικό καναμυκίνη (100 μg/ml), ενώ ως θετικός μάρτυρας για την αναγέννηση μη γενετικά τροποποιημένοι φυλλικοί δίσκοι σε ΜSR χωρίς αντιβιοτικά. Μετά την πάροδο 3,5 εβδομάδων από την συγκαλλιέργεια με τα αγροβακτήριο, εμφανίζονταν κάλλοι στους φυλλικούς δίσκους. Ανά διαστήματα πραγματοποιούνταν συλλογή των πιθανά γενετικά τροποποιημένων βλαστών που εκπτύσσονταν και είχαν μέγεθος πάνω από 1 cm και οι οποίοι εμβολιάζονταν σε φρέσκο υπόστρωμα ΜS για περαιτέρω ανάπτυξη και ριζοβολία. Από το υπόστρωμα MS απουσίαζαν οι ρυθμιστές αύξησης (ΝΑΑ και ΒΑP), αλλά ήταν συμπληρωμένο με καναμυκίνη (100 μg/ml) και σεφοταξίμη (η συγκέντρωση της σεφοταξίμης μειώθηκε σταδιακά από τα 250 μg/ml στα 25 μg/ml). Οι ανανεώσεις των υποστρωμάτων πραγματοποιούνταν ανά μήνα. 44

45 Δ) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ Από κάθε ποικιλία συλλέχθηκαν πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά Το γενιάς που είχαν αναγεννηθεί σε υποστρώματα ΜSR κατόπιν συγκαλλιέργειας με το Agrobactrium tumefaciens κάτω από την πίεση επιλογής του αντιβιοτικού καναμυκίνη. Eπιλέξαμε 10 φυτά από κάθε ποικιλία (Μπασμάς, Virginia και Burley) που είχαν προέλθει από διαφορετικά έκφυτα και αντιστοιχούσαν σε διαφορετικά συμβάντα γενετικής τροποποίησης. Επιπλέον επιλέχθησαν 10 φυτά από την ποικιλία Virginia που είχαν τροποποιηθεί με το πλασμίδιο part27 μόνο (αρνητικός μάρτυρας ως προς το γονίδιο gt4) και 1 φυτό από κάθε ποικιλία μη γενετικά τροποποιημένο (αρνητικός μάρτυρας). Aπομόνωση γενωμικού DNA από τα Το γενετικά τροποποιημένα φυτά και τους αντίστοιχους μάρτυρες Για την απομόνωση γενωμικού DNA χρησιμοποιήθηκαν φύλλα από τα πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά των ποικιλιών Μπασμάς, Virginia και Burley. To γενωμικό DNΑ απομονώθηκε με τη χρήση του Nucleospin Plant II Kit της εταιρίας Macherey Nagel και ελέγχθηκε ως προς την ύπαρξη του γονιδίου gst4 με αντιδράσεις PCR. Από τα θετικά ως προς το γονίδιο gst4 φυτά, κόπηκαν φύλλα και απομονώθηκε DNA για να ελεγχθούν ως προς τον αριθμό ενθέσεων του γονιδίου gst4 με την μέθοδο υβριδισμού κατά Southern. Tο πρωτόκολλο απομόνωσης γενωμικού DNA για τον υβριδισμό κατά Southern που ακολουθήθηκε ήταν το εξής: 10 gr φυτικού ιστού (φύλλα καπνού) λειοτριβήθηκαν με γουδί παρουσία υγρού αζώτου. Από το ομογενοποιημένο δείγμα μεταφέρθηκαν 2 gr σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml, προστέθηκαν 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος CTAB, 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος Πρωτεινάσης K (20 mg/ml) και τοποθετήθηκαν για 1,5 ώρα στους 65 ο C με συνεχή ανακίνηση. Στην συνέχεια προσθέτουμε 10 μl RΝάση A και επωάζουμε στους 37 ο C για λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα g, μεταφορά 800 μl από το υπερκείμενο σε καινούργιο δοκιμαστικό σωλήνα 1,5 ml, προσθήκη 600 μl χλωροφορμίου και ανάδευση. Μετά φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στα g για διαχωρισμό φάσεων, μεταφορά 600 μl από την υδάτινη φάση σε καινούργιο δοκιμαστικό σωλήνα των 1,5 ml, προσθήκη 480 μl ισοπροπανόλης, καλή ανάδευση και επώαση για 30 45

46 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για κατακρύμνιση του DNA. Φυγοκεντρήσαμε για 15 λεπτά στα g, απομάκρυνση του υπερκείμενου, προσθήκη 500 μl 75% αιθανόλης στο ίζημα και δυνατή ανακίνηση για να καθαριστεί το ιζηματοποιημένο DNA. Στην συνέχεια φυγοκεντρήσαμε για 5 λεπτά στα g, ακολούθησε απομάκρυνση του υπερκείμενου, ξανά φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και προσεκτική απομάκρυνση με ακρορύγχιο πιπέτας όλου του υπερκείμενου. Τέλος έγινε επαναδιάλυση του ιζήματος σε 100 μl απεσταγμένου, αποστειρωμένου νερού. Ταυτοποίηση των γενετικά τροποποιημένων φυτών με την βοήθεια της Aλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR) Αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε πιθανώς γενετικά τροποποιημένα φυτά των τριών ποικιλιών Μπασμάς, Burley και Virginia για την ανίχνευση της κασέτας έκφρασης του γονιδίου gst4 και του χειμερικού γονιδίου nptii. Οι αντιδράσεις έγιναν σε θερμοκυκλοποιητή (PTC-200 DNA Engine Cycler της Bio-Rad) και χρησιμοποιήθηκε το kit DyNAzyme II (DNA Polymerase kit) της εταιρίας Finnzymes το οποίο περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν σε μια PCR. Oι αντιδράσεις πραγματοποιούνταν σε 25 ή 50 μl όγκο, που περιείχε 0,2-0,4 μm από τους δύο εκκινητές, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR (1,5 mm MgCl 2, 10 mm Tris-HCl (ph 8.0), 50 mm KCl, 0,1% Triton X-100), 200 μμ από κάθε δεοξυριβονουκλεοτίδιο και 1 μονάδα (U) DNA πολυμεράσης (DyNAzyme TM II). Στην περίπτωση γενωμικού DNA φυτών η συγκέντρωση του εκμαγείου ήταν ng/όγκο αντίδρασης, ενώ στα πλασμιδιακά η συγκέντρωση ήταν 250 pg/όγκο αντίδρασης. Παρακάτω φαίνονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, και το σχεδιάγραμμα δείχνει τις θέσεις δέσμευσης, πάνω στο T-DNA. Εκκινητές 35S-pro5 ανοδικός nos-ter3 καθοδικός Μέγεθος προϊόντος PCR: 3849 bp Αλληλουχία 5 -GCTCCTACAAATGCCATCA-3 5 -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 46

47 Θέσεις δέσμευσης των εκκινητών πάνω στο T-DNA: εκκινητής CamV35S forward εκκινητής nos3 reverse CAMV35S gst4 ocs3 pnos nptii nos bp Oι συνθήκες PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Αρχική αποδιατάξη 94 ο C 2 min denaturation step 94 ο C 45 sec annealing step 35 κύκλοι 56 ο C 45 sec elongation step 72 ο C 2,5 min Tελικό στάδιο επιμύκηνσης 72 ο C 10 min Aκολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR σε πηκτή 0,8-1% Ταυτοποίηση του αριθμού ενθέσεων του γονιδίου gst4 στα γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με υβριδισμό κατά Southern Ο υβριδισμός κατά Southern σε γενωμικά DNA φυτών πραγματοποιήθηκε με τον ανιχνευτή nptii-dig που ανιχνεύει το γονίδιο nptii σε γενετικά τροποποιημένα φυτά. Η επισήμανση του ανιχνευτή nptii με το μόριο της διγοξυγενίνης έγινε κατόπιν αντίδρασης pcr με το PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche, UK). Η αντίδραση έγινε σε όγκο 50 μl, με 47

48 προσθήκη 165 μμ dttp, 35 μμ DIG-dUTP, 200 μμ από τα τρία dntps (datp, dctp, dgtp), 0,2 μμ από τους δύο εκκινητές, 2,6 μονάδες (Units) ενζύμου DNA πολυμεράσης και 10 pg από το πλασμίδιο part27 το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο. Παρακάτω φαίνονται οι συνθήκες της αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν για την επισήμανση του nptii με το μόριο της διγοξυγενίνης: Εκκινητές NPT-1 ανοδικός nos-ter3 καθοδικός Μέγεθος προϊόντος PCR: 1587 bp Αλληλουχία 5 -GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3 5 -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 Oι συνθήκες PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Αρχική αποδιατάξη 94 ο C 2 min denaturation step 94 ο C 30 sec annealing step 35 κύκλοι 53 ο C 1 min elongation step 72 ο C 1 min και 30 sec Tελικό στάδιο επιμύκηνσης 72 ο C 10 min Aκολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε 0,8% πηκτή αγαρόζης και η συγκέντρωση επισημασμένου ανιχνευτή που χρησιμοποιήθηκε στους υβριδισμούς ήταν 25 ng/ml διαλύματος υβριδισμού. Για τον υβριδισμό κατά Southern τα γενωμικά DNA Το γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού και οι αντίστοιχοι μάρτυρες των ποικιλιών Μπασμάς, Virginia και Burley κόπηκαν με τα ένζυμα NcoI και EcoRI. To ένζυμο NcoI κόβει μία φορά εντός της περιοχής του nptii γονιδίου στα γενετικά τροποποιημένα φυτά και μία εντός του Τ-DNA, έτσι ώστε στον υβριδισμό κατά Southern, από το κάθε αντίγραφο γονιδίου θα υβριδίσουν δύο τμήματα DNA. To ένα τμήμα DΝΑ που θα υβριδίσει θα έχει μέγεθος 1016 bp σε όλα τα γενετικά τροποποιημένα φυτά και το άλλο θα είναι αγνώστου μεγέθους, μιας και το ένζυμο θα κόψει 48

49 σε άγνωστη θέση μέσα στο γενωμικό DNA (Εικόνα 9). Το EcoRI δεν έχει θέσεις αναγνώρισης μέσα στην περιοχή του T-DNA και επομένως κάθε αντίγραφο γονιδίου, θα αντιπροσωπεύεται από ένα μόνο υβριδισμένο τμήμα DNA bp RB T-DNA ανιχνευτής pnos nptii nos3 LB ΝcoI ΝcoI Εικόνα 9. Θέσεις κοπής του ενζύμου NcoI μέσα στο T-DNA Οι αντιδράσεις πέψης έγιναν σε όγκο 50 μl και χρησιμοποιήσαμε μg DNA, U ενζύμου NcoI ή EcoRI, 1x ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθησε ολονύχτια επώαση στους 37 ο C. Τα προϊόντα πέψης των γενωμικών DNA ηλεκτροφορήθηκαν για τουλάχιστον 3 ώρες στα 50 Volts σε πηκτή αγαρόζης 0,9% προκειμένου να διαχωριστούν τα διάφορα κομμάτια DNA. Ακολούθησε μεταφορά των κομμένων DNA από την πηκτή σε θετικά φορτισμένη μεμβράνη και μόνιμη στερέωση του DNA πάνω στην μεμβράνη με UV ακτινοβόλιση. O υβριδισμός και η ανίχνευση του σήματος έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του DIG DNA Labelling Kit της εταιρίας Roche Applied Science, UK. Ο υβριδισμός έγινε στους 45 ο C χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού DIG Easy Hyb της εταιρίας Roche μέσα στο οποίο ήταν διαλυμένος ο ανιχνευτής nptii. Για την οπτικοποίηση των υβριδίων χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα CPD-Star TM, όπου παρουσία του ενζύμου αλκαλικής φωσφατάσης αποφωσφορυλιώνεται παράγοντας φωτεινό σήμα το οποίο ανιχνεύεται ποιοτικά και ποσοτικά στην συσκευή GENEGNOME και μέσω του software GeneSnap (εταιρεία Syngene) λαμβάνονταν οι φωτογραφίες. με τον ανιχνευτή nptii. Από τα αποτελέσματα και των δύο υβριδισμών συμπεράναμε τον αριθμό ενθέσεων του γονιδίου gst4 στα γενετικά τροποποιημένα φυτά των ποικιλιών Μπασμά, Virginia και Burley 49

50 Μικροπολλαπλασιασμός και σκληραγώγηση των Το γενετικά τροποιημένων φυτών Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά των ποικιλιών Μπασμά, Virgia και Burley που ήταν θετικά στην PCR και Southern ως προς το γονίδιο gst4, μικροπολλαπλασιάστηκαν προκειμένου να αποκτήσουμε ένα ικανοποιητικό αριθμό κλώνων για τα πειράματα ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο alachlor. Στην συνέχεια οι Το κλώνοι νεαρών γενετικά τροποποιημένων φυτών των τριών ποικιλιών καπνού και οι αντίστοιχοι μάρτυρες (μη γενετικά τροποποιημένοι) που είχαν αναπτυχθεί σε ύψος 4-5 cm σε in vitro συνθήκες, μεταφέρθηκαν σε θερμοκήπιο για περαιτέρω σκληραγώγηση. Αφού απομακρύνθηκε με προσοχή το άγαρ, οι ρίζες πλύθηκαν με νερό και τα φυτάρια μεταφυτεύθηκαν σε γλάστρες οι οποίες τοποθετήθηκαν σε πάγκο του θερμοκηπίου σκεπασμένο με διαφανές νάϋλον προκειμένου να ελαττωθούν οι απώλειες των υδρατμών. Επίσης κάθε ημέρα η φυλλική επιφάνεια των φυτών και το εσωτερικό του νάϋλον ψεκάζονταν με νερό. Ακολούθησε σταδιακή αφαίρεση του νάϋλον για μια εβδομάδα. Κατά την διάρκεια αυτού του σταδίου σταμάτησε και ο ψεκασμός των φυτών με νερό στην φυλλική επιφάνεια, ενώ συνεχίστηκε μόνο το πότισμα. Στο τέλος της εβδομάδας αφαιρέθηκε ολικά το νάϋλον. Ε) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GST4 ΣΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΚΑΠΝΟΥ Το γονίδιο gst4 που ενσωματώσαμε στο γoνιδίωμα των φυτών καπνού προσδίδει σε αυτά μια αντοχή στο ζιζανιοκτόνο alachlor (McGonigle κ.α., 2000). Ο καπνός και κυρίως η ποικιλία Μπασμάς είναι ευαίσθητος στο alachlor. Ένας τρόπος για να δούμε εάν το γονίδιο εκφράζεται στα φυτά, περιλάμβανε την αξιολόγηση του φαινοτύπου των γενετικά τροποποιημένων φυτών που αναπτύσσονται υπό τη επίδραση του alachlor σε in vitro συνθήκες η συνθήκες θερμοκηπίου. 50

51 Ιn vitro δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο alachlor Για τα in vitro πειράματα χρησιμοποιήθηκαν 10 Το φυτά-κλώνοι της ποικιλίας Μπασμάς (προερχόμενοι από μικροπολλαπλασιασμό), γενετικά τροποποιημένοι με το γονίδιο gst4 από κάθε διαγονιδιακή γραμμή (φυτά Α, Β, C, D τα οποία προέρχονται από διαφορετικά συμβάντα γενετικής τροποποίησης) και οι αντίστοιχες μάρτυρες (μη γενετικά τροποποιημένα φυτά). Τα φυτά από τα οποία είχε αφαιρεθεί το ριζικό σύστημα και είχαν εκπτυγμένα 3-4 φύλλα τοποθετήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες σε δοχεία Magenta που περιείχαν θρεπτικό υπόστρωμα MS και ζιζανιοκτόνο alachlor σε συγκεντρώσεις 0,03 και 0,06 gr / lt. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 40 γενετικά τροποποιημένα φυτά από τα οποία τα 20 τοποθετήθηκαν στην δόση των 0,03 και τα άλλα 20 στην δόση των 0,06 gr / lt alachlor. Τα δοχεία Magenta με τα φυτά μεταφέρθηκαν στην συνέχεια σε θάλαμο ανάπτυξης με φωτοπερίοδο 16:8, θερμοκρασία 25 ο C και ένταση φωτισμού 1500 lux. Μετά την πάροδο 20 ημερών εκτιμήθηκαν τα συμπτώματα στο υπέργειο και ριζικό σύστημα. Μετά την πάροδο 30 ημερών in vitro καλλιέργειας των φυτών σε υποστρώματα MS που περιείχαν το ζιζανιοκτόνο alachlor, ακολούθησε μέτρηση του αριθμού των νεοεκπτυσσόμενων φύλλων τους. Μη γενετικά τροποποιημένα φυτά χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. In planta δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο alachlor Ποσότητα εδάφους που είχε τοποθετηθεί σε μεγάλες γλάστρες ψεκάστηκε με δύο δόσεις του ζιζανιοκτόνου alachlor (Alanex 48 EC) που αντιστοιχούν σε 300 cm 3 ψεκαστικού υγρού /στρέμμα (144 gr δ.ο./στρέμμα) και 600 cm 3 ψεκαστικού υγρού/ στρέμμα (288 gr δ.ο./στρέμμα). Mετά την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου οι γλάστρες ποτίστηκαν με πολύ λίγο νερό και μετά την πάροδο 3 ημερών μεταφυτεύτηκαν σε αυτές τα σκληραγωγημένα γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού των ποικιλιών Μπασμά, Virginia και Burley. Τα φυτά είχαν ριζικό σύστημα, λίγα φύλλα, ήταν τουλάχιστον 10 cm σε ύψος και δεν εμφάνιζαν συμπτώματα μαρασμού ή χλώρωσης. Για κάθε δόση που εφαρμόστηκε χρησιμοποιήθηκαν 12 γενετικά τροποποιημένα φυτά-κλώνοι από κάθε ανεξάρτητη διαγονιδιακή γραμμή των τριών ποικιλιών. Για την ποικιλία Μπασμά χρησιμοποιήθηκαν φυτά-κλώνοι από 4 51

52 διαγονιδιακές γραμμές (Α, B, C και D), για την Virginia από 3 (C, E, H) και για την Burley από 2 (B, D). Επίσης σε κάθε δόση χρησιμοποιήθηκαν και 5 μη γενετικά τροποποιημένα φυτά από κάθε ποικιλία (θετικοί μάρτυρες ως προς το alachlor). Tέλος χρησιμοποιήθηκαν και 5 μη γενετικά τροποποιημένα φυτά από κάθε ποικιλία στα οποία δεν έγινε καμία εφαρμογή του alachlor (αρνητικοί μάρτυρες ως προς το alachlor). Μετά την πάροδο 30 ημερών μετρήθηκε η διαφορά στην αύξηση του ύψους των φυτών καθώς και ο αριθμός των καινούργιων φύλλων που εκπτύσσονταν από τα γενετικά τροποποιημένα και τους μάρτυρες αντίστοιχα. 52

53 AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για την δημιουργία των γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού των ποικιλιών Μπασμά, Virginia και Burley ήταν αναγκαία η δημιουργία του ενδιάμεσου φορέα pαρτ7- GST4, ο οποίος φέρνει την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 και στην συνέχεια του τελικού φορέα γενετικής τροποποίησης pαρτ27-gst4 ο οποίος φέρνει όλη την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 μέσα στην T-DNA περιοχή. Α) ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΦΟΡΕΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27- GST4) ΣΕ E.coli Δημιουργία του ενδιάμεσου πλασμιδιακού φορέα part7-gst4 Στον πλασμιδιακό φορέα pqe70 πραγματοποιήθηκε αντίδραση πέψης με το ένζυμα EcoRI και HindIII, για την απομόνωση της κωδικής περιοχής του γονιδίου gst4. Τα προϊόντα της αντίδρασης πέψης αποτελούνται από ένα τμήμα μεγέθους 691 bp το οποίο περιέχει την κωδική περιοχή του γονιδίου και το υπόλοιπο τμήμα του πλασμιδίου μεγέθους 3362 bp (Εικόνα 10). Ακολούθησε απομόνωση από τη πηκτή αγαρόζης του τμήματος DNA μεγέθους 660bp που αντιστοιχεί στην κωδική περιοχή του γονιδίου. Μ bp Eικόνα 10. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης του πλασμιδίου pqe70 με το ένζυμα EcoRI και HindIII. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κομμένο με το ένζυμο Hind III και Φχ174 DNA κομμένο με το ένζυμο Hae III). 1-4: το προϊόν πέψης του πλασμιδίου pqe70 με τa ένζυμa ΕcoRI και HindIII. 53

54 Με τα ίδια ένζυμα EcoRI και HindIIIΙ πραγματοποιήθηκε διπλή πέψη και του πλασμιδίου part7 όπου πήραμε ένα γραμμικό τμήμα DNA μεγέθους bp το οποίο απομονώσαμε από τη πηκτή αγαρόζης (Εικόνα 11). Μ bp Εικόνα 11. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% των προϊόντων πέψης του πλασμιδίου part7 με τα ένζυμα EcoRI και HindIIIΙ. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κομμένο με το ένζυμο Hind III και Φχ174 DNA κομμένο με το ένζυμο Hae III), 1-6: το προϊόν πέψης του πλασμιδίου part7 με τα ένζυμα EcoRI και HindIIIΙ. Η κλωνοποίηση του γονιδίου gst4 στο πλασμίδιο part7 επιβεβαιώνεται από την εμφάνιση δύο τμημάτων DNA κατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης των πλασμιδίων με το ένζυμο NotI (Εικόνα 12). To ένα τμήμα περιέχει την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 και έχει μέγεθος bp και το άλλο είναι το υπόλοιπο τμήμα του πλασμιδίου με μέγεθος bp. Από την Εικόνα 13 φαίνεται ότι μόνο οι κώνων 3 και 15 έχουν τη κασέτα έκφρασης του gst4 διότι εμφανίζουν τις δύο ζώνες που αναμένουμε. M bp 2840 bp Εικόνα 12. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,7% των προϊόντων πέψης των πλασμιδίων 19 κλώνων με το ένζυμο NotI.. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κομμένο με το ένζυμο Hind III και Φχ174 DNA κομμένο με το ένζυμο Hae III), 1-19: οι αποικίες Όπως 54

55 φαίνεται στις αποικίες 3 και 15 φαίνεται να έχει πετύχει η κλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης του gst4 στο πλασμίδιο part7. Tα αποτελέσματα των αντιδράσεων διπλής πέψης των πλασμιδίων με τα ένζυμα KpnI- NotI και XhoI-ΧbaI, φαίνονται στην Εικόνα 13. Από την πρώτη διπλή πέψη, και μόνο από τα πλασμίδια των κλώνων 3 (θέση 1και 2) και 15 (θέση 3 και 4) στα οποία έχει πετύχει η κλωνοποίηση του γονίδιου gst4 προκύπτουν δύο κομμάτια DNA το ένα με μέγεθος bp και το άλλο bp, ενώ από τα μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια παίρνουμε κομμάτια μεγέθους bp, bp και 813 bp. Από την πέψη με XhoI-ΧbaI μόνο τα πλασμίδια των κλώνων 3 (θέση 11) και 15 (θέση 23) μας δίνουν τα αναμενόμενα κομμάτια DNA μεγέθους bp και 709 bp. Μ Μ bp 1365 bp 813 bp 709 bp Εικόνα 13. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% των προϊόντων πέψης των πλασμιδίων των προηγούμενων 20 κλώνων με τα ένζυμα KpnI- NotI και XhoI-ΧbaI. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κομμένο με το ένζυμο Hind III και Φχ174 DNA κομμένο με το ένζυμο Hae III), 1-8: προιόντα της διπλής πέψης πλασμιδίων με τα ένζυμα KpnI- NotI (θέση 1και 2 ο κλώνος 3, θέση 3-4 ο κλώνος 15), 9-26: προϊόντα της διπλής πέψης πλασμιδίων με τα ένζυμα XhoI-ΧbaI (θέση 11 ο κλώνος 3, θέση 23 ο κλώνος 15). 55

56 Δημιουργία του πλασμιδιακού φορέα part27-gst4 Πραγματοποιήθηκε απομόνωση πλασμιδιακού DNA από τον κλώνο 15 που βρήκαμε ότι έχει την κασέτα έκφρασης του gst4 κλωνοποιημένη στο πλασμίδιο part7. Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της διπλής πέψης του πλασμιδιακού φορέα part7-gst4 με τα ένζυμα NotI και PvuI επιβεβαιώνει την ύπαρξη τεσσάρων τμημάτων DNA με μεγέθη bp, bp, bp και 140 bp (δεν φαίνεται στην πηκτή). Το τμήμα των 2840 bp περιέχει την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 και ακολουθεί απομόνωση του από την πηκτή αγαρόζης (Εικόνα 14). Μ bp 1667 bp 1057 bp Εικόνα 14. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,7% των προϊόντων διπλής πέψης του πλασμιδίου part7-gst4 με τα ένζυμα NotI και PvuI. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κατόπιν πέψης με το ένζυμο HindIII), 1: το προϊόν πέψης του πλασμιδιακού φορέα part7-gst4. Στην Εικόνα 15 φαίνεται η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,7% των αποσφορυλιωμένων και κομμένων με το ένζυμο NotI πλασμιδίων part27 και της κασέτας έκφρασης του gst4 Μ bp bp Εικόνα 15. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,7% των αποσφορυλιωμένων και κομμένων με το ένζυμο NotI πλασμιδίων part27 και της κασέτας έκφρασης του gst4. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κατόπιν πέψης με το ένζυμο HindIII), 1: η κασέτα έκφρασης του gst4, 2 και 3: ο part27 κομμένος με το ένζυμο NotI. 56

57 Για να διαπιστώσουμε εάν πραγματικά έχουμε απομονώσει την κασέτα έκφρασης του gst4 πραγματοποιήθηκε μια PCR αντίδραση στο κομμάτι DNA μεγέθους bp που απομονώσαμε. Kατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της PCR της κασέτας έκφρασης του gst4 παίρνουμε την ζώνη μεγέθους 947 bp που αναμένουμε (Εικόνα 16). Μ bp Εικόνα 16. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna κατόπιν πέψης με το ένζυμο HindIII), 1: ενίσχυση της κασέτας έκφρασης του gst4, 2: ο αρνητικός μάρτυρας (πλασμίδιο part7 χωρίς τη κασέτα έκφρασης), 3: ο λευκός μάρτυρας. Έγιναν αρκετές προσπάθειες κλωνοποίησης του τμήματος της κασέτας έκφρασης του γονιδίου gst4 στον πλασμιδιακό φορέα part27. Ακολούθησαν αντιδράσεις πέψης πλασμιδίων που απομονώθηκαν με τα ένζυμα NotI, BamHI και SalI, τα οποία μόνο στα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μας δίνουν τα εξής μεγέθη τμημάτων DNA: με NotI παίρνουμε δύο τμήματα bp και bp (περιέχει την κασέτα έκφρασης του gst4), με SalI παίρνουμε δύο τμήματα bp και 6503 bp και το BamHI στα ανασυνδυασμένα πλασμίδια με τη σωστή φορά της κασέτας έκφρασης του gst4 μας δίνει δύο τμήματα bp (περιέχει την κασέτα έκφρασης του gst4) και 1275 bp, ενώ στα πλασμίδια με την αντίθετη φορά της κασέτας έκφρασης μας δίνει δύο τμήματα μεγέθους bp και bp (περιέχει την κασέτα έκφρασης του gst4), (Εικόνες 17 και 18). Aπό την Εικόνα 17 βλέπουμε ότι τα πλασμίδια των κλώνων 176 και 179 είναι ανασυνδυασμένα και έχουν την κασέτα έκφρασης στην σωστή φορά. Από τον υβριδισμό κατά Southern που πραγματοποιήθηκε σε προϊόντα πέψης πλασμιδίων, βλέπουμε ότι ο ανιχνευτής που αποτελεί μέρος του υποκινητή CaΜV-35S υβρίδισε μόνο με τα τμήματα των κομμένων πλασμιδίων στα οποία έχει 57

58 ενσωματωθεί η κασέτα έκφρασης του gst4, δηλαδή με τα τμήματα των bp στην πέψη με ΝοtI, bp και bp στην πέψη με BamHI. M M ,6kb 2,8 kb 13,2 kb 1,2 kb bp 2542 bp A B Εικόνα 17. Hλεκτροφόρηση και υβριδισμός κατά Southern προϊόντων πέψης πλασμιδίων βακτηριακών κλώνων A) Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης των πλασμιδίων με NotI και BamHI, B) Ανίχνευση της κασέτας έκφρασης του γονίδιου gst4 με υβριδισμό κατά Southern. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λ HindII DNA), 1-6: οι κλώνοι 164, 172, 173, 176, 179, 180 κομμένοι με NotI, 7-12: οι κλώνοι 164, 172, 173, 176, 179, 180 κομμένοι με BamHI, 13: προϊόν pcr 947 bp (αποτελείται από τον CaΜV-35S και το gst4). M M bp 6503 bp 8004 bp 6503 bp 3663 bp Εικόνα 18. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης πλασμιδίων από βακτηριακούς κλώνους με τα ένζυμα BamHI, NotI και SalI. Μ: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (1 Kb ladder). 1-3: οι κλώνοι κομμένοι με το ένζυμο BamHI, 4: ο part27 κομμένος με BamHI, 5-7: πλασμίδια βακτηρικών κλώνων κομμένα με ΝotI, 8: ο part27 κομμένος με ΝοtI, 9-19: οι κλώνοι 164, 165, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 179, 180, κομμένοι με SalI, 20: o part27 κομμένος με SalI. Για την μεταμόρφωση του Agrobacterium tumefaciens επιλέχθηκε ο κλώνος 176 (Εικόνα 17 και 18) που έχει την κασέτα έκφρασης στη σωστή φορά. 58

59 Β) ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΟΥ Αgrobacterium tumefaciens ΜΕ ΤΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ (pαρτ27 και pαρτ27-gst4) Η μεταμόρφωση δεκτικών κυττάρων Agrobacterium tumefaciens έγινε με τον ανασυνδυασμένο δυαδικό φορέα part27-gst4 και με τον φορέα part27 (αρνητικός μάρτυρας). Από τις αντιδράσεις πέψης που έγιναν στα πλασμίδια και τον υβριδισμό κατά Southern με ιχνηλάτη τον CaMV-35S επιβεβαιώσαμε την μεταμόρφωση του αγροβακτηρίου με τους δύο πλασμιδιακούς φορείς (Εικόνα 19). Ανάλογα με το ένζυμο και το πλασμίδιο τα τμήματα DNA που πήραμε ήταν τα εξής: ΒamHI : προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp και bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και ένα τμήμα των bp στον part27 μόνο (αρνητικός μάρτυρας ως προς το γονίδιο gst4). Στον υβριδισμό κατά Southern o ανιχνευτής υβριδίζει μόνο με το τμήμα των bp το οποίο περιέχει την κασέτα έκφρασης του gst4. SacI: προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp και bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και τμήμα των bp στον part27 μόνο. Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. SalI: προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp και bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και τμήματα των bp και bp στον part27 μόνο. Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. NotI : προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp και bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και τμήμα των στον part27 μόνο. Με το NotI απομονώνουμε τη κασέτα έκφρασης του gst4. Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. 59

60 NdeI και XbaI (διπλή πέψη): προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των 6097 bp, 5713 bp, 1358 bp, 1339 bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και τμήματα των 8970 bp, 1358 bp και 1339 στον part27 μόνο (το XbaI δεν κόβει τον part27 αλλά μόνο τη κασέτα έκφρασης του gst4). Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. HindIII και EcoRI (διπλή πέψη): προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp και 691 bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4, και τμήμα των bp στον part27 μόνο (το ΗindIII δεν κόβει τον part27 αλλά μόνο τη κασέτα έκφρασης του gst4). Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. ΗindIII και SpeI (διπλή πέψη): προϊόντα πέψης που αποτελούνται από τμήματα DNA των bp, 753 bp και 43 bp, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 και τμήμα των bp στον part27 μόνο (το ΗindIII δεν κόβει τον part27 αλλά μόνο τη κασέτα έκφρασης του gst4). Στον υβριδισμό κατά Southern μόνο το τμήμα των bp υβριδίζει με τον ανιχνευτή. 60

61 8004 bp 6503bp 3663 bp 1689 bp 1275 bp Μ Μ 2 Μ Μ bp bp 753 bp Α Β bp 6503 bp bp bp 5713 bp 2840 bp 1689 bp Γ Δ Eικόνα 19. Ηλεκτροφόρηση και υβριδισμός κατά Southern προϊόντων πέψης πλασμιδίων. Α-Β: Προϊόντα πέψης των δύο πλασμιδίων part27-gst4 και του part27 μόνου που είχαν απομονωθεί από το Agrobacterium tumefaciens, Γ-Δ: Υβριδισμός κατά Southern των προϊόντων πέψης της Εικόνας Α και Β αντίστοιχα. Μ 1 και Μ 2 : οι δείκτες μοριακών μεγεθών (λdna κομμένο με το ένζυμο Hind III) και 1 kb αντίστοιχα, 1-2: ο part27-gst4 κομμένος με BamHI, 3: ο part27 κομμένος με BamHI, 4-5: ο part27-gst4 κομμένος με SacI, 6: ο part27 κομμένος με SacI, 7-8: ο part27-gst4 κομμένος με SalI, 9: ο part27 κομμένος με SalI, 10-11: ο part27-gst4 κομμένος με NotI, 12: ο part27 κομμένος με NotI, 13-14: ο part27- GST4 κομμένος με NdeI και XbaI (διπλή πέψη), 15: ο part27 κομμένος με NdeI και XbaI, 16-17: ο part27-gst4 κομμένος με HindIII και EcoRI (διπλή πέψη), 18: ο part27 κομμένος με HindIII και EcoRI, 19-20: ο part27-gst4 κομμένος με ΗindIII και SpeI (διπλή πέψη), 21: ο part27 κομμένος με ΗindIII και SpeI, 22-23: τα πλασμίδια part27-gst4 τα οποία απομονώθηκαν από το Agrobacterium tumefaciens, 24: ο part27 σκέτος, o οποίος απομονώθηκε από το Agrobacterium tumefaciens. 61

62 Γ) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΜΠΑΣΜΑΣ, VIRGINIA ΚΑΙ BURLEY Φυλλικοί δίσκοι που είχαν συγκαλλιεργηθεί με τα μεταμορφωμένα αγροβακτήρια που περιέχουν τα πλασμίδια part27-gst4 και part27 (αρνητικός μάρτυρας ως προς το γονίδιο gst4) εμφάνισαν κάλλους με έκπτυξη μικρών βλαστιδίων μετά την πάροδο 3,5 εβδομάδων και κατόπιν εμβολιασμού τους σε στερεό υπόστρωμα αναγέννησης MSR με τα αντιβιοτικά καναμυκίνη και σεφοταξίμη. Κάλλοι εμφανίστηκαν και στους θετικούς μάρτυρες αναγέννησης, ενώ ο αρνητικός μάρτυρας παρουσίασε νεκρώσεις (Εικόνα 20 και 21). Α) Β) Γ) Δ) Eικόνα 20: Αναγέννηση πιθανών γενετικά τροποποιημένων εκφύτων καπνού που φέρουν το γονίδιο gst4. Α) και Β) γενετικά τροποποιημένα έκφυτα της ποικιλίας Μπασμά και Burley, μετά την πάροδο 5 εβδομάδων παραμονής σε υπόστρωμα αναγέννησης (MSR) συμπληρωμένο με τα αντιβιοτικά καναμυκίνη και σεφοταξίμη. Γ) μη γενετικά τροποποιημένο έκφυτο της ποικιλίας Μπασμά σε υπόστρωμα MSR (θετικός μάρτυρας) Δ) μη γενετικά τροποποιημένο έκφυτο της ποικιλίας Μπασμά σε υπόστρωμα MSR συμπληρωμένο με τα αντιβιοτικά καναμυκίνη και σεφοταξίμη (αρνητικός μάρτυρας). 62

63 Eικόνα 21: Αναγεννημένοι κάλλοι που παρουσιάζουν έκπτυξη βλαστών προερχόμενοι από γενετικά τροποποιημένα έκφυτα καπνού που έχουν εμβολιαστεί σε υπόστρωμα MSR παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζεται το ποσοστό αναγέννησης των εκφύτων παρουσία των αντιβιοτικών καναμυκίνη και σεφοταξίμη από τις τρεις ποικιλίες καπνού που τροποποιήθηκαν με τα πλασμίδια part27-gst4 και part27 μόνο. Πίνακας 1. Ποσοστό αναγέννησης εκφύτων από τις τρεις ποικιλίες καπνού Μπασμά, Virginia και Βurley, μετά την συγκαλλιέργεια τους με το Agrobacterium tumefaciens που φέρει τα πλασμίδια part27-gst4 και part27. Ποικιλία Συνολικός Αριθμός εκφύτων Ποσοστό αριθμός εκφύτων που αναγεννήθηκαν αναγέννησης Mπασμάς (part27gst4) % Βurley (part27gst4) % Virginia (part27gst4) % Virginia (part27) % Από τον Πίνακα 1 φαίνεται ότι οι ποικιλίες Μπασμάς και Burley παρουσίασαν το μεγαλύτερο ποσοστό αναγέννησης (60%). Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα ριζοβολίας εκφύτων βλαστού από τις τρεις ποικιλίες καπνού, τα οποία αναπτύσσονταν σε θρεπτικό υπόστρωμα MS παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη για τουλάχιστον 3,5 μήνες από την έναρξη της συγκαλλιέργειας με το αγροβακτήριο. Το κάθε πείραμα έγινε σε τρεις επαναλήψεις. 63

64 Πίνακας 2. Ποσοστό ριζοβολίας εκφύτων βλαστών από τις τρεις ποικιλίες καπνού Μπασμά, Virginia και Βurley, μετά την συγκαλλιέργεια τους με το Agrobacterium tumefaciens που φέρει τα πλασμίδια part27-gst4 και part27 και μετά την παραμονή σε υπόστρωμα ΜS παρουσία των αντιβιοτικών καναμυκίνη και σεφοταξίμη. Φυτά Βurley τροποποιημένα με το φορέα part27-gst4 Επανάληψη Αριθμός βλαστών Ριζοβόλησαν Ποσοστό ριζοβολίας ,66% ,9% % Σύνολο ,07% Φυτά Virginia τροποποιημένα με το φορέα part27-gst4 Επανάληψη Αριθμός βλαστών Ριζοβόλησαν Ποσοστό ριζοβολίας ,44% ,42% % Σύνολο ,03% Φυτά Mπασμά τροποποιημένα με το φορέα part27-gst4 Επανάληψη Αριθμός βλαστών Ριζοβόλησαν Ποσοστό ριζοβολίας ,98% ,98% ,34% Σύνολο ,1% Φυτά Virginia τροποποιημένα με το φορέα part27 Επανάληψη Αριθμός βλαστών Ριζοβόλησαν Ποσοστό ριζοβολίας ,86% ,85% ,23% Σύνολο ,3% 64

65 Σε σύνολο επαναλήψεων τα ποσοστά ριζοβολίας στα έκφυτα που τροποποιήθηκαν με το γονίδιο gst4 είναι τα εξής: στην ποικλία Burley είναι 46%, στην ποικιλία Virginia 44% και στην ποικιλία Μπασμά 39%, ενώ στα έκφυτα της ποικιλίας Virginia που τροποποιήθηκαν με το φορέα part27 (αρνητικός μάρτυρας) το ποσοστό ριζοβολίας είναι 43%. Παρατηρούμε ότι τα ποσοστά ριζοβολίας δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ποικιλιών Burley και Virginia. Η θερμοκρασία συγκαλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκε ήταν αυτή των 25 ο C, η οποία από την βιβλιογραφία εμφανίζεται να είναι η βέλτιστη θερμοκρασία για σταθερή μεταμόρφωση φυλλικών δίσκων καπνού (Salas κ.α., 2001). Στην Εικόνα 22 φαίνονται τα αναγεννημένα πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά των τριών ποικιλιών, τα οποία αναπτύχθηκαν σε υπόστρωμα MSR συμπληρωμένο με καναμυκίνη (100 μg/ml) και σεφοταξίμη (50 μg/ml). Α Β Γ Εικόνα 22. Πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού σε δοχεία Magenta, μετά την πάροδο 2-4 μηνών σε υπόστρωμα ΜS συμπληρωμένο με τα αντιβιοτικά καναμυκίνη και σεφοταξίμη. Α: Μπασμάς, Β: Virginia, Γ: Burley. 65

66 Δ) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΠΝΟΥ Ταυτοποίηση των γενετικά τροποποιημένων φυτών με την βοήθεια της Aλυσιδωτής αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) Τα πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτά καπνού των ποικιλιών Μπασμάς, Virginia και Burley που είχαν ριζοβολήσει σε υπόστρωμα MS παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη ταυτοποιήθηκαν με την μέθοδο της PCR. Χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές CaMV-35S forward και ο nos3 reverse, οι οποίοι ενισχύουν την κασέτα έκφρασης του γονιδίου gst4 και όλη την περιοχή του χειμερικού γονιδίου nptii, δίνοντας ένα προϊόν μεγέθους 3849 bp. Παρατηρήσαμε ότι ενώ στο αντιβιοτικό της καναμυκίνης το ποσοστό ριζοβολίας ήταν αρκετό υψηλό, στην PCR πολύ λίγα φυτά βγήκαν θετικά ως προς την ύπαρξη του γονιδίου gst4. Από 10 φυτά που χρησιμοποιήθηκαν από κάθε ποικιλία μόνο τέσσερα φυτά από την ποικιλία Μπασμά που προέρχονται από διαφορετικά συμβάντα γενετικής τροποποίησης (φυτά Α, B, C, D), τρία από την ποικιλία Virginia (φυτά C, E, H) και 2 από την ποικιλία Βurley (φυτά B και D) έδωσαν το αναμενόμενο τμήμα των 3849 bp (Εικόνα 23). Σε όλα τα πιθανά γενετικά τροποποιημένα με το γονίδιο gst4 φυτά είχαν πραγματοποιηθεί και άλλες αντιδράσεις PCR που ενίσχυαν μικρότερα τμήματα του διαγονιδίου και στις οποίες από το σύνολο των 30 φυτών που εξατάστηκαν 15 φυτά είχε βγεί θετικά ως προς την ύπαρξη του διαγονιδίου, από τα οποία όμως μόνο τα 9 είχαν το τμήμα DNA των 3849 bp. Yπάρχει πιθανότητα το φαινόμενο αυτό να οφείλεται σε απώλειες μέρους του διαγονιδίου ή αναδιατάξεις, οι οποίες έχουν παρατηρηθεί κατά την ενσωμάτωση του T-DNA μέσα στο φυτικό γένωμα (Deroles κ.α., 1988, Van der Leede-Plegt κ.α., 1995). 66

67 Μ Μ bp (A) 3849 bp (B) 3849 bp (Γ) Εικόνα 23. PCR aνάλυση DNA από πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού. Α: ανάλυση γενωμικών DNA από την ποικιλία Μπασμά, Β: ανάλυση γενωμικών DNA από την ποικιλία Virginia, Γ: ανάλυση γενωμικών DNA από την ποικιλία Burley. Μ 1 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λdna Hind III και Φχ174 DNA Hae III), Μ 2 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών 1 kb, 1-5: πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά με το φορέα part27-gst4, 6: μη γενετικά τροποποιημένο φυτό (αρνητικός μάρτυρας), 7: γενετικά τροποποιημένο φυτό με το φορέα part27 (αρνητικός μάρτυρας), 8: ο λευκός μάρτυρας (νερό), 9: ο θετικός μάρτυρας (πλασμίδιο part27-gst4). Ταυτοποίηση του αριθμού ενθέσεων του γονιδίου gst4 στα γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με υβριδισμό κατά Southern Ο υβριδισμός κατά Southern μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για τον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου gst4 που έχουν ενσωματωθεί στο φυτικό γονιδίωμα. Συνήθως στο τέλος επιλέγονται φυτά που έχουν μόνο ένα αντίγραφο, διότι θεωρητικά παρουσιάζουν μεγαλύτερη έκφραση του γονιδίου. Ως ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε η περιοχή του γονιδίου nptii η οποία 67

68 επισημάνθηκε με το μόριο της διγοξυγενίνης, διαμέσου αντίδρασης PCR χρησιμοποιώντας ως εκκινητές τον npt1 (forward) και nos ter3 (reverse), δίνοντας ένα προϊόν μεγέθους 1587 bp κατόπιν ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης 1% (Εικόνα 24) bp Εικόνα 24. Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της PCR αντίδρασης που χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση του ανιχνευτή nptii με το μόριο της διγοξυγενίνης. 1: ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λ DNA HindIII και ΦX174 DNA HaeIII), 2: ο επισημασμένος με το μόριο της διγοξυγενίνης ανιχνευτής nptii, 3: ενίσχυση της περιοχής nptii του πλασμιδίου part27- GST4. Ακολούθησε πέψη με το περιοριστικό ένζυμο NcoI των γενωμικών DNA από τα φυτά των τριών ποικιλιών καπνού Μπασμάς, Virginia και Βurley που είχαν ταυτοποιηθεί με την PCR ότι είναι γενετικά τροποποιημένα καθώς και από τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες, και πραγματοποιήθηκε υβριδισμός κατά Southern με τον επισημασμένο ανιχνευτή nptii. Τα φυτά που έχουν ένα αντίγραφο του γονιδίου δίνουν δύο υβριδισμένες ζώνες, εκ των οποίων η μία ζώνη των 1016 bp είναι κοινή σε όλα τα τροποποιημένα και στον θετικό μάρτυρα. Στο προϊόν πέψης του πλασμιδιακού φορέα part27 (θετικός μάρυρας) ο υβριδισμός μας δίνει δύο αναμενόμενες ζώνες, μία των 1016 bp και μία των 4818 bp, μιας και το ένζυμο NcoI κόβει μία φορά μέσα στην περιοχή του DNA στην οποία υβριδίζει ο ανιχνευτής (Eικόνα 25). Ένας δεύτερος υβριδισμός κατά Southern πραγματοποιήθηκε με τον ανιχνευτή nptii, αλλά σε προϊόντα πέψης γενωμικών DNA με το ένζυμο EcoRI. Τα φυτά που έχουν ένα αντίγραφο του γονιδίου δίνουν μία υβριδισμένη ζώνη (Eικόνα 26). 68

69 Μ Μ 2 Μ Μ bp 1016 bp Α Β Εικόνα 25. Ταυτοποίηση των διαγονιδιακών φυτών με την μέθοδο υβριδισμού κατά Southern. Α) Ηλεκτροφόρηση προϊόντων πέψης με το ένζυμο NcoI γενωμικών DNA, Β) Υβριδισμός κατά Southern των προϊόντων πέψης. Μ 1 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λ DNA HindIII, ΦX174 DNA Ηae III), Μ 2 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών 1 kb, 1-4: γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού ποικιλίας Μπασμάς (κλώνοι Α, B, C, D αντίστοιχα), 5: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Μπασμάς, 6-7: γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού ποικιλίας Virginia (κλώνοι Ε, Η αντίστοιχα), 8: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Virginia, 9-10: γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού ποικιλίας Burley (κλώνοι B, D αντίστοιχα), 11: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Burley, 12: o θετικός μάρτυρας (πλασμίδιο part27) κομμένο με το ένζυμο NcoI. Μ Μ 2 Μ Μ 2 14,5 kb Α Β Εικόνα 26. Ταυτοποίηση των διαγονιδιακών φυτών με την μέθοδο υβριδισμού κατά Southern. Α) Ηλεκτροφόρηση προϊόντων πέψης με το ένζυμο EcoRI γενωμικών DNA, Β) Υβριδισμός κατά Southern των προϊόντων πέψης. Μ 1 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών (λ DNA HindIII, ΦX174 DNA Ηae III), Μ 2 : ο δείκτης μοριακών μεγεθών 1 kb, 1-4: γενετικά τροποποιημένα 69

70 φυτά καπνού ποικιλίας Μπασμάς (κλώνοι Α, B, C, D αντίστοιχα), 5: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Μπασμάς, 6-8: γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού ποικιλίας Virginia (κλώνοι C, E, Η αντίστοιχα), 9-10: γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού ποικιλίας Burley (κλώνοι B, D αντίστοιχα), 11: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Virginia, 12: μη γενετικά τροποποιημένα φυτό καπνού ποικιλίας Burley, 13: o θετικός μάρτυρας (πλασμίδιο part27-gst4) κομμένο με το ένζυμο EcoRI. Από τις συγκρίσεις των αποτελεσμάτων των δύο υβριδισμών (Εικόνα 24 και 25) φαίνεται ότι 1 φυτό από την ποικιλία Μπασμάς (κλώνοι C) και 2 φυτά από την ποικιλία Virginia (κλώνοι C και Η) έχουν ενσωματώσει στο γενωμά τους 1 αντίγραφο του γονιδίου. Από την ποικιλία Burley κανένας κλώνος δεν βρέθηκε να έχει ένα αντίγραφο. Από την Εικόνα 15 βλέπουμε ότι η υβριδισμένη ζώνη του θετικού μάρτυρα, δεν συμπίπτει με τις υβριδισμένες ζώνες των κλώνων που έχουν ένα αντίγραφο, το οποίο μας διασφαλίζει ότι το σήμα δεν προέρχεται από τυχόν επιμολύνσεις επίφυτων αγροβακτηρίων ή τον πλασμιδιακό φορέα part27-gst4. Όλα οι ανεξάρτητες μεταξύ τους διαγονιδιακές γραμμές φυτών είχαν φυσιολογικό φαινότυπο, ανεξάρτητα από τον αριθμό ενθέσεων του γονιδίου. Ε) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GST4 ΣΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΚΑΠΝΟΥ Ιn vitro δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο alachlor Το alachlor ανήκει στην κατηγορία των χλωροακεταμιδίων. Αποροφάται κυρίως από τις ρίζες των νεαρών φυτών ενώ μπορεί να απορροφηθεί εξίσου καλά και από τους βλαστούς νεαρών φυτών. Όταν απορροφάται από τις ρίζες μετακινείται εύκολα στα ανώτερα τμήματα του φυτού δια μέσου του αποπλάστη (Worthing κ.α., 1982). To alachlor παρεμβαίνει στη διαίρεση και επιμήκυνση των κυττάρων, με αποτέλεσμα αναστολή της αύξησης των νεαρών φυτών και ειδικότερα της επιμήκυνσης της ρίζας (Ελευθεροχωρινός, 2002). Ως ζιζανιοκτόνο χρησιμοποιείται προφυτρωτικά σε καλλιέργειες αραβοσίτου και καλαμποκιού, για τον έλεγχο ετήσιων αγρωστωδών και πλατύφυλλων ζιζανίων (Sharp, 1998). O Μπασμάς ως 70

71 ποικιλία είναι ευαίσθητη, ενώ η Burley θεωρείται ανθεκτική. Στην Εικόνα 27 παρουσιάζονται in vitro μη γενετικά τροποποιημένα φυτά μετά την πάροδο 20 ημερών σε MS συμπληρωμένο με alachlor στις δόσεις 0,03 gr και 0,06 gr / lt. Και στις δύο δόσεις στα μη γενετικά τροποποιημένα παρατηρήθηκε η αναστολή της ανάπτυξης του ριζικού συστήματος και καθήλωση των φυτών χωρίς την ικανότητα έκπτυξης καινούργιων φύλλων, που είναι χαρακτηριστικό σύμπτωμα τοξικότητας σε φυτά καπνού που δεν έχουν την ικανότητα μεταβολισμού του ζιζανιοκτόνου. A) Δόση alachlor: 0,03 gr/lt 0,06 gr/lt 0,06 gr/lt B) Δόση alachlor: 0,03 gr/lt 0,06 gr/lt 0,06 gr/lt Εικόνα 27. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου alachlor στο υπέργειο (A) και ριζικό σύστημα (B) φυτών μαρτύρων της ποικιλίας Μπασμάς μετά την πάροδο 20 ημερών. Στην Εικόνα 28 φαίνεται ο φαινότυπος φυτών της ποικιλίας Μπασμάς μετά την πάροδο 30 ημερών παραμονής τους σε υπόστρωμα MS συμπληρωμένο με το ζιζανιοκτόνο alachlor στις δόσεις 0,03 και 0,06 gr/lt. Στα γενετικά τροποποιημένα φυτά το ακραίο μερίστωμα συνέχισε να αυξάνει και στα φυτά παρατηρήθηκε έκπτυξη σημαντικά μεγαλύτερου αριθμού καινούργιων φύλλων από ότι στα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά 71

72 που αναπτύσσονταν υπό την επίδραση του alachlor. Στους μάρτυρες η επιμήκυνση του ριζικού συστήματος ήταν ελάχιστη, ενώ στα τροποποιημένα φυτά με το gst4 γονίδιο παρατηρήθηκε μια σημαντική αύξηση του ριζικού συστήματος. αλλά μικρότερη από ότι στα φυτά που αναπτυσσόταν χωρίς alachlor (Εικόνα 28). 0,03gr/lt alachlor 0,06 gr/lt alachlor Εικόνα 28. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου alachlor στις δύο δόσεις των 0,03 gr/lt και 0,06 gr/lt στο υπέργειο και ριζικό σύστημα φυτών καπνού της ποικιλίας Μπασμάς. 1: μη γενετικά τροποποιημένα φυτά σε MS χωρίς alachlor, 2: γενετικά τροποποιημένα φυτά σε MS με alachlor, 3: μη γενετικά τροποποιημένα φυτά σε MS με alachlor. Οι Κaravangeli κ.α., πραγματοποίησαν παρόμοιες in vitro δοκιμές ως προς την ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο alachlor σε διαγονιδιακά φυτά καπνού που έφεραν το γονίδιο gst1 από τον αραβόσιτο, χρησιμοποιώντας δόσεις 0,01 και 0,015 g/lt (Κaravangeli κ.α., 2005). Τα διαγονιδιακά φυτά καπνού που έφερναν το gst4 γονίδιο από την σόγια 72

73 (Εικόνα 28) παρουσίασαν αυξημένη ανθεκτικότητα σε διπλάσιες και τριπλάσιες δόσεις του ζιζανιοκτόνου alachlor (0,03 και 0,06 gr/lt), σε σύγκριση με τα προαναφερόμενα αποτελέσματα. Άλλωστε το alachlor εφαρμόζεται τόσο σε καλλιέργειες αραβοσίτου, όσο και σόγιας και το ενζυμικό σύστημα των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ανθεκτικότητα των φυτών (Βreaux κ.α., 1987). Tα in vitro γενετικά τροποποιημένα φυτά στην δόση των 0,03 gr/lt εμφάνισαν μεγαλύτερο αριθμό επιπλέον φύλλων από ότι στην δόση των 0,06 gr/lt (Εικόνα 29). Διαφορές παρατηρήθηκαν και μεταξύ των κλώνων A, B, C, D οι οποίοι προέρχονται από ανεξάρτητα συμβάντα τροποποίησης. Οι κλώνοι B και D εμφάνισαν τον μεγαλύτερο αριθμό έκπτυξης φύλλων και στις δύο δόσεις του ζιζανιοκόνου. Φυτά από την διαγονιδιακή γραμμή Β έκπτυξαν 8,8±0,8 επιπλέον φύλλα, ενώ φυτά της γραμμής D έκπτυξαν 6,2±1,3 επιπλέον καινούργια φύλλα στην δόση των 0,03 gr/lt alachlor, με αποτέλεσμα να υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο κλώνων (Εικόνα 29). μέσος αριθμός καινούργιων φύλλων A B C D WT 0,03 g/l alachlor 0,06 g/l alachlor Εικόνα 29. Μέσος αριθμός καινούργιων φύλλων 4 ανεξάρτητων γενετικά τροποποιημένων φυτών κλώνων (Α, Β, C, D) και των φυτών μαρτύρων (WT) της ποικιλίας Μπασμάς μετά την πάροδο 1 μήνα παραμονής σε υπόστρωμα MS συμπληρωμένο με alachlor. Το T-DNA ενσωματώνεται τυχαία μέσα στο γονιδίωμα, αλλά σε υψηλό ποσοστό μέσα σε μεταγραφικά ενεργές περιοχές. Γενικότερα έχει βρεθεί ότι η έκφραση των διαγονιδίων μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες, όπως αλληλουχίες φυτικού DNA που βρίσκονται δίπλα του, από ύπαρξη πολλαπλών αντιγράφων του DNA (Dean κ.α., 1988, Jones κ.α., 1987, Odell κ.α., 1987, Shirsat κ.α., 1989), από απώλειες τμημάτων του 73

74 διαγονιδίου κατά την ενσωμάτωση του στο φυτικό γένωμα (Deroles κ.α., 1988, Jones κ.α., 1987), από φαινόμενα μεθυλίωσης του υποκινητή του διαγονιδίου (Meyer, 2000), ή από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς κατά τους οποίους το διαγονίδιο μεταγράφεται, αλλά το RNA δεν είναι σταθερό και αποικοδομείται (Μeins, 2000). Οι φαινοτυπικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των διαγονιδιακών φυτών Α, Β, C, D πιθανών να οφείλονται σε κάποιους από τους προαναφερόμενους μηχανισμούς. Ιn planta δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο alachlor Στην Εικόνα 30 παρουσιάζεται ο φαινότυπος των γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού των ποικιλιών Μπασμά, Virgia και Βurley τα οποία αναπτύσσονται υπό την επίδραση δύο δόσεων ζιζανιοκόνου: 144 gr δ.ο./στρέμμα και 288 gr δ.ο./στρέμμα alachlor. Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά μετά την πάροδο 1 μήνα είχαν αυξηθεί σημαντικά σε σύγκριση με τα μη τροποποιημένα. Στην Εικόνα 31 φαίνονται οι συγκρίσεις και οι διαφορές των τριών ποικιλιών μεταξύ γενετικά τροποποιημένων φυτών και μη, ως προς την επιμύκηνση του βλαστού και την έκπτυξη καινούργιων φύλλων. Μετά την πάροδο 1 μήνα υπό την επίδραση του alachlor, όλα τα γενετικά τροποποιημένα φυτά έδειξαν καλύτερη φαινοτυπική συμπεριφορά και στα δύο φαινοτυπικά χαρακτηριστικά από ότι τα μη γενετικά τροποποιημένα. Μεταξύ των δύο δόσεων του ζιζανιοκτόνου alachlor παρατηρήθηκε καλύτερη συμπεριφορά των διαγονιδιακών φυτών και των τριών ποικιλιών στην χαμηλότερη δόση των 144 gr δ.ο./στρέμμα alachlor. Eξαίρεση αποτέλεσε η ποικιλία Burley η οποία δεν παρουσίασε διαφορές στον αριθμό φύλλων μεταξύ των δύο δόσεων του ζιζανιοκτόνου alachlor. Παρατηρούμε ότι η φαινοτυπική συμπεριφορά των φυτών που αναπτύχθηκαν χωρίς την επίδραση του alachlor (μάρτυρες) παρουσίαζε περισσότερες ομοιότητες με τα διαγονιδιακά φυτά καπνού σε σύγκριση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά που ήταν εκτεθειμένα στο alachlor (Εικόνα 31). 74

75 Α Β C Eικόνα 30. Φαινότυπος των διαγονιδιακών φυτών καπνού που φέρνουν το γονίδιο gat4 και των αντίστοιχων μη διαγονιδιακών μαρτύρων, τα οποία αναπτύσσονται υπό την επίδραση του alachlor. A. Φυτά της ποικιλίας Μπασμάς, Β. Φυτά της ποικιλίας Virginia, C. Φυτά της ποικιλίας Burley. 1: μη διαγονιδιακά φυτά υπό την επίδραση alachlor συγκέντρωσης 288 gr δ.ο./στρέμμα, 2: γενετικά τροποποιημένα φυτά υπό την επίδραση alachlor συγκέντρωσης 144 gr δ.ο./στρέμμα, 3: γενετικά τροποποιημένα φυτά υπό την επίδραση alachlor συγκέντρωσης 288 gr δ.ο./στρέμμα, 4: μη διαγονιδιακά φυτά αναπτυσσόμενα χωρίς την επίδραση alachlor. 75