ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΥΛΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ TAXA ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ Crocus

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥTΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΛΥΜΠΕΡΟΠΟΥΛΟΥ ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΥΛΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ TAXA ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ Crocus ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΦΥΣΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ, 2016

2

3 ΛΥΜΠΕΡΟΠΟΥΛΟΥ ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΘΕΜΑ ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΥΛΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ TAXA ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ Crocus ΕΞΕΤΑΣΤΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Λάμαρη Φωτεινή Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστήμιο Πατρών Επιβλέπουσα της Μεταπτυχιακής Εργασίας Μαγκαφά Βασιλική Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστήμιο Πατρών Ιατρού Γρηγόριος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστήμιο Πατρών

4

5 Lowly, with a brok neck, the crocus lays her cheek to mire. George Meredith

6

7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στις «Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία» με κατεύθυνση στα «Φαρμακευτικά Φυσικά Προϊόντα», υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Κας Φωτεινής Λάμαρη κατά τα έτη Πρωτίστως, θα ήθελα να εκφράσω την εκ βαθέων ευγνωμοσύνη τον αείμνηστο Καθηγητή Παύλο Κορδοπάτη για την εμπιστοσύνη και την στήριξη που έδειξε προς το άτομο μου από τα προπτυχιακά κιόλας έτη φοίτησης μου στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Η φοίτηση δίπλα του μου έδωσε πολλά εφόδια σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο για τα οποία τον ευγνωμονώ. Ακολούθως, θα ήθελα να εκφράσω τις ολόθερμες ευχαριστίες μου στην επιβλέπουσα Καθηγήτρια μου Κα. Φωτεινή Λάμαρη, για την ευκαιρία που μου έδωσε για ένα ταξίδι έρευνας και επιστημονικών ανησυχιών με αποτέλεσμα την παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή. Την ευχαριστώ θερμά για την επιστημονική καθοδήγηση, της συμβουλές της, την ηθική και ψυχολογική στήριξή της καθ όλη την διάρκεια της συνεργασίας μας. Η εμπιστοσύνη της στις ικανότητες και στις γνώσεις μου με έκανε να αγαπήσω και να αφιερωθώ στο αντικείμενο της έρευνας μου καθώς και στην λήψη πρωτοβουλιών που πάντοτε την έβρισκαν σύμφωνη. Ακόμη, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τον χρόνο που μου αφιέρωνε παρά τον μεγάλο φόρτο εργασίας της. Στην συνέχεια θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια Κα. Βασιλική Μαγκαφά για την άψογη συνεργασία και την στήριξη που μου έδειχνε καθ όλη την διάρκεια της φοίτησης μου. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Γρηγόριο Ιατρού για την υλική και επιστημονική υποστήριξη που μου παρείχε σε θέματα που αφορούσαν την μορφολογία των φυτών. Ευχαριστώ εκ καρδίας τον Δρ. Νικόλαο Κουλακιώτη και τον Καθηγητή κ. Αντώνιο Τσαρμπόπουλο, που παρά το φορτωμένο τους πρόγραμμα με βοήθησαν στην διεξαγωγή των LC- MS αναλύσεων που χρειάστηκαν κατά την διάρκεια την έρευνας. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους και συναδέλφους από το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Φυσικών Προϊόντων με τους οποίους είχαμε μια άριστη συνεργασία, η οποία συνέβαλε στην ευχάριστη περαίωση αυτής της εργασίας. Ειδικότερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Δρ. Κωνσταντίνα Ζέλιου για την συνεχή και αμέριστη βοήθεια της σε ότι πρόβλημα ή ανησυχία αντιμετώπιζα.

8 Επιπροσθέτως, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές και τις καθηγήτριες του Τμήματος Φαρμακευτικής κοντά στους οποίους είχα την χαρά να φοιτήσω σε προπτυχιακό επίπεδο. Οι γνώσεις που μου μεταλαμπάδευσαν με βοήθησαν να εξελιχθώ και να μετατραπώ σε έναν συγκροτημένο και καταρτισμένο επιστήμονα, έτοιμο να προσφέρει τις γνώσεις του στο κοινωνικό σύνολο. Τέλος, με αίσθημα ευγνωμοσύνης και μεγάλης συγκίνησης θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου, τους γονείς μου Δημήτριο και Μάρθα και τον αδερφό μου Παναγιώτη, για την αγάπη και την στήριξη που δείχνουν στο πρόσωπο μου από την ημέρα της γέννησης μου. Ειδικότερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω των παππού μου Ιωάννη τον οποίο έχασα λίγες μέρες πριν την ολοκλήρωση των μεταπτυχιακών σπουδών μου και στον οποίο αφιερώνω την παρούσα εργασία. Πάτρα, Οκτώβριος 2016 Χριστίνα Λυμπεροπούλου

9 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Περιεχόμενα i Πίνακας Περιεχομένων......i Περιεχόμενα πινάκων iii Περιεχόμενα Εικόνων...v Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγικό Μέρος Α. Το γένος Crocus Μορφολογική ανάλυση...4 Ιστορική αναδρομή Συγκομιδή φυτού...11 Β. Crocus sativus Linnaeus: κρόκος ο ήμερος Μορφολογική ανάλυση..13 Φυτοχημική σύσταση στύλων Γ. Crocus nivalis Κεφάλαιο 2 ο Κεφάλαιο 3 ο Σκοπός της Εργασίας Πειραματικό Μέρος.. 37 Α. Φυτικό υλικό Β. Χημικά αντιδραστήρια Γ. Όργανα και σκεύη...41 Δ. Φυτοχημική ανάλυση στύλων C. sativus και C. nivalis Δ.1. Απομόνωση αιθέριων ελαίων C. sativus και C. nivalis Δ.1.1. Αέριος Χρωματογραφία Φασματομετρία Μάζας (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS) 43 Δ.1.2. Πειραματική πορεία απομόνωσης αιθέριων ελαίων 47 Δ.1.3. Πρωτόκολλο ανάλυσης αιθέριων ελαίων με την τεχνική GC-MS Δ.2. Εκχύλιση στύλων C. sativus και C. nivalis i

10 Δ.2.1. Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performace (ή Pressure) Liquid Chromatography, HPLC) Δ.2.2. Πρωτόκολλο εκχύλισης Δ.2.3. Πρωτόκολλο ανάλυσης εκχυλίσματος με την τεχνική HPLC Δ.2.4. Πρωτόκολλο ανάλυσης εκχυλίσματος με την τεχνική LC-ΜS.. 56 Δ.2.5. Αλκαλική υδρόλυση εκχυλίσματος C.nivalis Δ.3. In vitro τεχνικές ανάλυσης. 59 Δ.3.1. Ικανότητα αναγωγής του κατιόντος σιδήρου (Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP)..59 Δ.3.2. Ικανότητα σάρωσης της ρίζας του DPPH Δ.3.3. Προσδιορισμός ολικών φλαβονοειδών Κεφάλαιο 4 Ο Αποτελέσματα...65 Α. Μορφολογική εξέταση στύλων..67 Β. GC-MS ανάλυση αιθέριων ελαίων του C. sativus και C. nivalis. 67 Αιθέριο έλαιο C. sativus Αιθέριο έλαιο C. nivalis.70 Γ. HPLC ανάλυση μεθανολικού εκχυλίσματος C. sativus και C. nivalis.. 73 Δ. Ανάλυση των εκχυλισμάτων με την τεχνική LC-MS 86 Ε. Ανάλυση υδρολυθέντων εκχυλισμάτων του C. nivalis..98 ΣΤ. In vitro έλεγχος αντιοξειδωτικής δράσης και προσδιορισμός των ολικών φλαβονοειδών του C. sativus και C. nivalis Κεφάλαιο 5 Ο Κεφάλαιο 6 Ο Συζήτηση - Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Περίληψη - Abstract ii

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Ελληνικά ενδημικά είδη του γένους Crocus. (ΝΕ: βόρεια-ανατολική, NC: βόρειακεντρική, NPi: βόρεια Πίνδος, SPi: νότια Πίνδος, EC: ανατολική-κεντρική, Ste: Στερεά Ελλάδα, Pe: Πελοπόννησος, IoI: Ιόνια νησιά, WΑe: νησιά δυτικού Αιγαίου, NΑe: νησιά βόρειου Αιγαίου, EΑe: νησιά ανατολικού Αιγαίου, Kik: Κυκλάδες και KK: Κρήτη-Κάρπαθος.) Πίνακας 2: Συστατικά που ταυτοποιήθηκαν από τους Cadwallader et al. Πίνακας 3: Πρωτόκολλο ανάλυσης με την τεχνική HPLC των μεθανολικών εκχυλισμάτων C. sativus και C. nivalis. Πίνακας 4: Πρωτόκολλο ανάλυσης με την τεχνική HPLC του προϊόντος της αλκαλικής υδρόλυσης του υδατικού εκχυλίσματος των στύλων του C. nivalis. Πίνακας 5: Πίνακας παρουσίασης των μορφολογικών χαρακτηριστικών των στύλων των συλλεχθέντων πληθυσμών του C. nivalis. Πίνακας 6: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του είδους C. sativus: oνομασία, μοριακά βάρη (MW), χρόνοι έκλουσης (tr), θραύσματα, δείκτης κατακράτησης (RI). Το ΒΗΤ προστέθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Πίνακας 7: Συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος του είδους C. sativus και των τριών πληθυσμών του είδους C. nivalis: ονομασία, χρόνοι έκλουσης σε min, εμβαδά κορυφών απορρόφησης (Ε) σε mau*min, ένταση απορρόφησης κορυφών (Α) σε mau και συνολικό εμβαδό ταυτοποιημένων κροκινών σε mau*min. Η ολοκλήρωση της πικροκροκίνης και της HTCC έγινε στα 250nm, ενώ των κροκινών στα 440nm. Πίνακας 8: Χρόνοι έκλουσης και UV-Vis φάσματα των κοινών κορυφών των χρωματογραφημάτων στα 440nm των τριών πληθυσμών του C. nivalis. Πίνακας 9: Κοινά συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος των τριών πληθυσμών του είδους C. nivalis, τα οποία δεν περιέχονται στο αντίστοιχο του C. sativus: ονομασία, χρόνοι έκλουσης σε min, εμβαδά κορυφών απορρόφησης (Ε) σε mau*min και ένταση απορρόφησης κορυφών (Α) σε mau. iii

12 Πίνακας 10: Συγκεντρωτικός πίνακας του εμβαδού των ταυτοποιημένων και αγνώστων κροκινών που εντοπίζονται στους τρεις πληθυσμούς του C. nivalis και της επί τις εκατό περιεκτικότητα των συστατικών στα δείγματα του C. sativus και C. nivalis. Πίνακας 11: Ταυτοποιημένες κορυφές του χρωματογραφήματος του εκχυλίσματος του C. sativus με ανάλυση UPLC-MS (+ESI). (Με σκούρο χρώμα συμβολίζεται το κύριο θραύσμα του φάσματος μάζας). Πίνακας 12: Ταυτοποιημένες κοινές κορυφές των χρωματογραφημάτων των τριών πληθυσμών του C. nivalis με ανάλυση UPLC-MS (+ESI). (Με σκούρο χρώμα συμβολίζεται το κύριο θραύσμα του φάσματος μάζας). Πίνακας 13: Αποτελέσματα in vitro αναλύσεων αναγωγής κατιόντος σιδήρου (FRAP), σάρωσης της ρίζας DPPH και ολικών φλαβονοειδών του C. sativus και των τριών πληθυσμών του C. nivalis. Οι τιμές αποτελούν το μέσο όρο τριών πειραμάτων (Mean±SEM). iv

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Χάρτης περιοχών εξάπλωσης ειδών του γένους Crocus. Εικόνα 2: Μορφολογική απεικόνιση διαφόρων τύπων στύλων του γένους Crocus. Εικόνα 3: Σχηματική αναπαράσταση φυτού του γένους Crocus σε περιόδους ανθοφορίας και καρποφορίας [4]. Εικόνα 4: Τοιχογραφία από το μινωικό ανάκτορο της Κνωσού στην οποία απεικονίζεται ο «κροκοσυλλέκτης πίθηκος». Εικόνα 5: Τοιχογραφίες από το «Ξεστή 3» στο Ακρωτήριο της Σαντορίνης. Εικόνα 6: Συλλογή, απομόνωση, ξήρανση και παραλαβή των αποξηραμένων στύλων. Εικόνα 7: Το άνθος του C.sativus κατά την περίοδο συγκομιδής των στύλων του. Εικόνα 8: Δομές της κροκετίνης (1), της διμεθυλοκροκετίνης (2), της trans-κροκίνης-1 (3), της trans-κροκίνης-2 (4), της trans-κροκίνης-2 (5), της trans-κροκίνης-3 (6), της trans-κροκίνης-4 (7), της trans-κροκίνης-5 (8), και της trans-κροκίνης-5 (9). Εικόνα 9: Δομές της β-d-γλυκοζυλο-μονάδας (1), της β-d-γεντιοβιοζυλο-μονάδας (2), της β-dγεντιοτριοζυλο-μονάδας (3) και της β-d-νεαπολιτανοζυλο-μονάδας (4). Με κυματιστή γραμμή αναπαρίσταται η θέση όπου γίνεται ο δεσμός με το μόριο της κροκετίνης. Εικόνα 10: Μονοπάτια σχηματισμού της κροκετίνης. Άνω μέρος: Μονοπάτι σχηματισμού μέσω της οξειδωτικής αποικοδόμησης της ζεαξανθίνης. Κάτω μέρος: Μονοπάτι σχηματισμού μέσω του διμερισμού του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GGDP) με επακόλoυθη αφυδρογόνωση ή οξείδωση. Εικόνα 11: Μονοπάτι βιοσύνθεσης αποκαροτενοειδών στους στύλους του C. sativus. (GGDP: πυροφωσφορικό γερανύλιο, PSY: συνθάση φυτοενίου, PDS: ένζυμο αποκορεσμού του φυτοενίου, ZDS: ένζυμο αποκορεσμού του ζ-καροτενίου, CRTISO: καροτενική ισομεράση, LCYε: ε- κυκλάση λυκοπενίου, LCYβ: β-κυκλάση λυκοπενίου, βch: β-καροτενική υδροξυλάση, ZEP: εποξειδάση ζεαξανθίνης, VDE: απο- εποξειδάση βιολαξανθίνης, NXS: συνθάση νεοξανθίνης, CCD: διοξυγονάση αποικοδόμησης καροτενοειδούς, HTCC: 2,6,6- τριμεθυλ-4-υδροξυ-1- κυκλοεξεν- 1-καρβοξαλδεΰδη). v

14 Εικόνα 12: Σχηματισμός σαφρανάλης από πικροκροκίνη Εικόνα 13: Συστατικά του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus. [Καμπφερόλη(1), 3 β Dγλυκοζυλo-καμπφερόλη (2), 3,7-β D-γλυκοζυλo-καμπφερόλη (3), 3-σοφοροζυλo-7-β-Dγλυκοζυλo-καμπφερόλη (4), 7-σοφοροζυλo-καμπφερόλη (5), 3,7,4 -τριγλυκοζυλo-καμπφερόλη (6), 3-ρουτινοζυλo-7-β-D-γλυκοζυλo-καμπφερόλη (7), 3-ρουτινοζυλo-καμπφερόλη (8), 7-β-Dγλυκοζυλo-διυδροκαμπφερόλη (9), 3,4 -β D-γλυκοζυλo-ισοραμετίνη (10), 3-ρουτινοζυλoραμετίνη (11), 7-β D-γλυκοζυλo-ναριγενίνη (προυνίνη) (12), κερσετίνη (13), 3-β-Dγεντιοβιoζυλo-κερσετίνη (14), 3-σοφοροζυλo-κερσετίνη (15)]. Πηγή: φασματοσκοπική βάση δεδομένων του Δρ. Πέτρου Ταραντίλη. Εικόνα 14: Συστατικά του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus. [Γαλλικό οξύ (16), πυρογαλλόλη (17), πρωτοκατεχοικό οξύ (18), κροκοσατίνη-κ (19), κροκοσατίνη-l (20), α- καροτένιο (21), β-καροτένιο (22), γ-καροτένιο (23), λουκοπένιο (24)]. Εικόνα 15: Συστατικά του εκχυλίσματος των τεπάλων του C. sativus. [χλωριούχο άλας της 3,5- β-d-γλυκοζυλο-δελφινιδίνης (25), χλωριούχο άλας της 3,5-β-D-γλυκοζυλο-πετουνιδίνης (26), 3 β D γλυκοζυλο-δελφινιδίνη (27), χλωριούχο άλας της 3,5-β-D-γλυκοζυλο-μαλβιδίνης (28), χλωριούχο άλας της 3- β-d-γλυκοζυλο- πετουνιδίνης (29)]. Εικόνα 16: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Zarghami και Heinz. [ Σαφρανάλη (1), 3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (2), 4-υδροξυ-3,5,5- τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (3), 2,6,6-τριμεθυλο-κυκλοεξαν-1,4-διόνη (4), 2,6,6-τριμεθυλο-2- κυκλοεξεν-1,4-διόνη (5), 2-υδροξυ-3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (6), 4-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (HTCC) (7), 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1,4- κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξαλδεΰδη (8), 2-μεθυλεν-6,6-διμεθυλο-3-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (9), 3,5,5-τριμεθυλο-4-μεθυλεν-2-κυκλοεξεν-1-όνη (10), 3-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-4-οξο-2- κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (11), 2,3-εποξυ-4-(υδροξυμεθυλεν)-3,5,5-τριμεθυλοκυκλοεξανόνη (12), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1,4-κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξαλδεΰδη (13), 2-βουτενολακτόνη (14), ναφθαλένιο (15), 2-φαινυλαιθανόλη (16)]. Εικόνα 17: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Rodel και Petrzika [ 5,5-διμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (17), 3,5,5-τριμεθυλο-3-κυκλοεξεν-1-όνη (18), 2-υδροξυ-4,6,6-τριμεθυλο-2,5-κυκλοεξαδιεν-1-όνη (19), 2,4,6-τριμεθυλοβενζαλδεΰδη (20), vi

15 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (21), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1- κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (22), 2,2-διμεθυλο-4-οξοκυκλοεξαν-1-καρβοξαλδεΰδη (23), 2,4,6,6-τετραμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (24), 2,3-διυδροξυ-1,4-ναφθοκινόνη (25), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξ-4,6-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (26), 2,6,6-τριμεθυλο-1,3- κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξυλικό οξύ (27), 5-(βουτ-1,3-διενυλ)-4,6,6-τριμεθυλο-1,5-κυκλοεξαδιεν- 1-όλη (28), 1,3,3-τριμεθυλο-2-(3-οξοβουτ-1-ενυλ)-1-κυκλοεξένιο (29), 3,3-διμέθυλο-1- κυκλοεξένιο (30), 2-υδρόξυ-3,5,5-τριμεθυλο-4-μεθυλεν-2-κυκλοεξεν-1-όνη (31), 2-υδροξυ-3- μεθυλο-5,6,7,8-τετράϋδρο-1,4-ναφθοκινόνη (32), 3-(βουτ-1-ενυλο)-2,4,4-τριμεθυλο-2- κυκλοεξεν-1-όλη (33), 2,6-διμεθυλοβενζοϊκός μεθυλεστέρας (34), 2,2-διμεθυλοκυκλοεξαν-1- καρβοξαλδεΰδη (35), 1-(βουτ-1-ενυλο)-2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξα-1,3-διένιο (ισομερή) (36/37), 3-(βουτ-1-ενυλο)-2,4,4-τριμεθυλοκυκλοεξαν-1-όλη (38), 4-(3-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλοκυκλοεξανυλο)-3-βουτεν-2-όνη (ισομερή)(39/40)]. Εικόνα 18: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Semiond et al (41), Tarantilis και Polissiou (42-49) και Cadwallader et al (50-58). [2,6,6- τριμεθυλο-4-οξο-2-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (41), 2-υδροξυ-5-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (42), 2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξ-1,4-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (43), 3,7-διμεθυλο-1,6-οκταδιένιο (44), 3,3,4,5-τετραμεθυλο-1-κυκλοεξανόνη (45), 4,6,6-τριμεθυλοδικυκλο-[3.1.1]-επτ-3-εν-2όνη (46), 4-(2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξαν-1-υλ)-3-βουτεν-2-όνη (47), 2,4,4-τριμεθυλο-3-(3-οξο-1- βουτενυλ)-2-κυκλοεξεν-1-όλη (48), 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξαν-1- καρβοξαλδεΰδη (49), μεγαστίγμα-7,9,13-τριένιο (50), μεγαστίγμα-4,6,8-τριένιο (51), ), 4- υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (52), 2-υδροξυ-3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (53), ), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-4-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (54), 2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεπτα- 2,4-διεν-1-όνη (55), 5-tert-βουτυλοκυκλοπεντ-1,3-διένιο (56), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-1- κυκλοεξενυλ)-2-βουτενόνη (57), 6,10-διμεθυλενδεκα-5,9-διεν-2-όνη (58)]. Εικόνα 19: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Strausbinguer et al. (83-87) και Zareena et al. (88-89). [ 2,6,6-τριμεθυλο-2-κυκλοεξόνη (83), 4- υδροξυμεθυλο-3,5,5- τριμεθυλο-2-κυκλοεξόνη (84), 6-υδροξυ-3-υδροξυμεθυλο-2,4,4- τριμεθυλο-2,5-κυκλοεξαδιενόνη (85), 4-(4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο)-2-(κυκλοεξεν-1-υλ)-3- βουτεν-2-όνη (86), 2-μεθυλο-6-οξο-2,4-επταδιενοκαρβοξυλικό οξύ (87), 5-υδροξυ-2,6,6- vii

16 τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξ-1,4-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (88), 2,5-διμεθυλο-2- μεθυλοβινυλοκυκλοεξανόνη (89)]. Εικόνα 20: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους D Auria et al. [3-μεθυλοπροπανάλη (90), νονανάλη (91), 2,7,7-τριμεθυλ-2,4-κυκλοεπταδιεν-1- όνη (92), 1,3,3-τριμεθυλ-2-(Ε, Ζ-2-βοθτενυλοδιεν)-3-κυκλοεξένιο (93(Ζ)/ 94(Ε)), εξανάλη (95), επτανάλη (96), 2-ισοπροπυλιδεν-3-μεθυλ-3,5-εξαδιενάλη (97), 5,5-διμεθυλ-1,3-κυκλοεξαδιεν-1- καρβοξαλδεΰδη (98), 2-ακετυλ-6,6-διμεθυλοδικυκλο-[3.1.0]-2-εξένιο (99), δεκαεξάνιο (100), δεκαεπτάνιο (101)] Εικόνα 21: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Kanakis et al το [(2-φουρανυλο)-2-αιθανόνη (102), 4-(4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-1- κυκλοεξεν-1-υλο)-2-βουτεν-3-όλη (103), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-7-οξαδικυκλο-[4.1.0.]-επταν-1- υλο)-3-βουτεν-2-όνη (104), 4-(3,4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-υλο)-2-βουτεν-3-όλη (105), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-1-κυκλοεξ-1,3-διενυλο)-3-βουτεν-2-όνη (106), 3,8-υδροξυ-3,7- διμεθυλο-1,6-οκταδιένιο (107)] Εικόνα 22: Το άνθος του C.nivalis κατά την περίοδο συγκομιδής των στύλων του (αριστερά) και αποξηραμένο ολόκληρο άτομο (δεξιά). Εικόνα 23: Εμπορική συσκευασία του Crocus sativus που διατίθεται από τον Αναγκαστικό Συνεταιρισμό Κροκοπαραγωγών Κοζάνης. Εικόνα 24: Σχηματική απεικόνιση ενός μηχανήματος Αέριας Χρωματογραφίας [37]. Εικόνα 25: Σχηματική περιγραφή ενός HPLC μηχανήματος. [ Η εικόνα αποτελεί μετάφραση της αρχικής του Jacopo Werther]. Εικόνα 26: Σύσταση της κινητής φάσης σε κάθε χρονική στιγμή έκλουσης κατά την HPLC ανάλυση. Εικόνα 27: Σύσταση της κινητής φάσης σε κάθε χρονική στιγμή έκλουσης κατά την HPLC ανάλυση. Εικόνα 28: Fe(TPTZ) 3+. Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης οξειδοαναγωγής του συμπλόκου viii

17 Εικόνα 29: Συντακτικός τύπος της ρίζας DPPH πριν και μετά τη δέσμευση ενός ατόμου υδρογόνου. Εικόνα 30: Χρωματογράφημα του αιθέριου ελαίου του είδους C. sativus. Εικόνα 31: Χρωματογραφήματα του αιθέριου ελαίου του είδους C. nivalis. C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Α (Α), C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Β (Β) και C. nivalis Χελμού Περιοχή Ξηρόκαμπου (Γ). Πιο αναλυτικά, τα χρωματογραφήματα Α1, Β1 και Γ1 αντιστοιχούν στο αιθέριο έλαιο τελικού όγκου 5mL και τα Α2, Β2 και Γ2 στο αιθέριο έλαιο τελικού όγκου 2mL. Εικόνα 32: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. sativus στα 250nm, 308nm και 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Τα μετρούμενα μήκη κύματος είναι τα 250nm, 330nm και 440nm. [1: πικροκροκίνη, 2: trans-κροκίνη-4, 3: trans-κροκίνη-3, 4: trans-κροκίνη-2, 5: cis-κροκίνη-4, 6: cis-κροκίνη-3, 7: trans-κροκίνη-5, 8: cis-κροκίνη-5]. Εικόνα 33: Φάσματα απορρόφησης UV-Vis που ελήφθησαν κατά την χρωματογραφική ανάλυση του εκχυλίσματος του C.sativus με την τεχνική HPLC-DAD. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο το μήκος κύματος σε nm. Εικόνα 34: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α στα A) 250nm, B) 308nm και Γ) 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Εικόνα 35: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β στα A) 250nm, B) 308nm και Γ) 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Εικόνα 36: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα A) 250nm, B) 308nm και Γ) 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Εικόνα 37: Σύγκριση HPLC χρωματογραφημάτων των ειδών C. sativus και C. nivalis στα 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. ix

18 Εικόνα 38: Σύγκριση HPLC χρωματογραφημάτων των πληθυσμών C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α, Παναχαϊκού περιοχής Β και Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Εικόνα 39: Απεικόνιση της έντασης των ιόντων που λήφθηκε με την τεχνική θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τέσσερις πληθυσμούς του γένους Crocus με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι εντάσεις των ιόντων που οφείλονται στο εκάστοτε δείγμα και με κόκκινο χρώμα οι εντάσεις των ιόντων που οφείλονται στο τυφλό δείγμα (blank). Τα αποτελέσματα αφορούν τα μεθανολικά εκχυλίσματα των C. sativus (Α), C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α (Β), C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β (Γ) και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου (Δ). Εικόνα 40: Συγκεντρωτικό χρωματογράφημα της έντασης των ιόντων με εφαρμογή θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τέσσερις πληθυσμούς του γένους Crocus με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. Εικόνα 41: Συγκεντρωτικό χρωματογράφημα της έντασης των ιόντων με εφαρμογή θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τρεις πληθυσμούς του είδους Crocus nivalis με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. Εικόνα 42: Φάσματα μάζας των κορυφών του χρωματογραφήματος του C. sativus με χρόνους έκλουσης Α. 2,1min, B. 2,0min και Γ. 1,1min. Εικόνα 43: Φάσματα μάζας των κορυφών του χρωματογραφήματος του C. sativus με χρόνους έκλουσης Α. 2,8min, B. 3,1min, Γ. 3,5min, Δ. 3,7min, Ε. 4,3min, ΣΤ. 4,7min και Ζ. 4,8min. Εικόνα 44: Φάσματα μάζας των κορυφών των χρωματογραφημάτων των τριών πληθυσμών του C. nivalis με χρόνους έκλουσης Α. 2,7min, Β. 3,3min και Γ. 3,4min. x

19 Εικόνα 45: Α. Φάσμα μάζας την κοινής κορυφής των C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα 3,2min, Β. Δομή 3-ραμνοζυλο-ρουτυνοζυλοκαμπφερόλης. Εικόνα 46: Α.Φάσμα μάζας της κορυφής του χρωματογραφήματος του C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου με χρόνους έκλουσης 1,9min, Β. Δομή 3,7-διγλυκοζυλο-κερσετίνης. Εικόνα 47: Χρωματογράφημα του υδρολυθέντος εκχυλίσματος του C.nivalis (1mg/mL) στα 330nm και 440nm. Εικόνα 48: Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος κροκετίνης 1mg/mL στα 330nm και 440nm. Εικόνα 49: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς FeSO 4 *7H 2 O. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εύρους 0,1 1,2 mg/ml. Οι τιμές αποτελούν το μέσο όρο τριών πειραμάτων. Εικόνα 50: Καμπύλες του ποσοστού αναγωγής του DPPH προς τις διαφορετικές συγκεντρώσεις κάθε δείγματος. Κάθε δείγμα έχει μετρηθεί εις τριπλούν. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η επί τις εκατό (%) ικανότητα σάρωσης της ρίζας του DPPH και στον οριζόντιο ο λογάριθμος της συγκέντρωσης εκφραζόμενος σε μg/ml. Εικόνα 51: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς κερσετίνης. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εύρους 1-0,05 mg/ml. Οι τιμές αποτελούν το μέσο όρο τριών πειραμάτων. xi

20 xii

21 Κ ΕΦ ΑΛΑΙ Ο 1 Ο ΕΙ Σ ΑΓ ΩΓ Ι Κ Ο Μ ΕΡ Ο Σ 1

22 2

23 Α. Το γένος Crocus Το γένος Crocus ανήκει στην οικογένεια Iridaceae, στην κλάση των Monocotyledoneae και στην τάξη των Asparagales. Η οικογένεια των Ιριδοειδών περιλαμβάνει συνολικά 92 γένη και 1800 είδη, τα οποία εξαπλώνονται σε περιοχές την Νότιας και Κεντρικής Αμερικής, της Ανατολικής Μεσογείου και της Νότιας Αφρικής. Συνολικά το γένος Crocus συγκροτείται από 160 είδη τα οποία ευδοκιμούν στα ξηρά και θερμά καλοκαίρια και τους υγρούς χειμώνες που χαρακτηρίζουν τις περιοχές της Κεντρικής και Νότιας Ευρώπης, της Βόρειας Αφρικής και της Μέση Ανατολής, στα νησιά του Αιγαίου, καθώς και σε ολόκληρη την Κεντρική Ασία μέχρι την επαρχία Xinjiang της Δυτικής Κίνας. Εικόνα 1: Χάρτης περιοχών εξάπλωσης ειδών του γένους Crocus. Στην Ελλάδα φύονται 30 taxa από τα οποία 12 taxa είναι ενδημικά της χώρα μας. Πιο συγκεκριμένα, στην Κρήτη φύονται συνολικά 5 είδη (6 taxa) εκ των οποίων το 1 είδος (1 taxon) είναι ενδημικό του νησιού και στην Πελοπόννησο φύονται 9 είδη (12 taxa) εκ των οποίων τα 5 είδη (6 taxa) είναι ενδημικά της περιοχής. Από αυτά, οι C. pelistericus, C. oreocreticus και C. olivieri υποείδος balansae συναντώνται σπανίως, ενώ οι C. robertianus και C. goulimyi αναφέρονται ως απειλούμενα είδη. Όλα τα είδη του γένους Crocus που φύονται αποκλειστικά στην Ελλάδα παρουσιάζονται αναλυτικά στον Πίνακα 1. Το κυρίαρχο είδος του γένους Crocus είναι ο Crocus sativus L ή αλλιώς ο κρόκος ο ήμερος, επειδή καλλιεργείται σε μεγάλες εκτάσεις για την εμπορική αξία των στύλων του. Αποτελεί το είδος αναφοράς του γένους και έχει μελετηθεί ως προς τα συστατικά και την μορφολογία του, 3

24 περισσότερο από κάθε άλλο είδος. Άλλα γνωστά είδη είναι ο C. laevigatus ο οποίος έχει την μεγαλύτερη περίοδο ανθοφορίας που ξεκινάει στα τέλη του φθινοπώρου και ολοκληρώνεται τον Φεβρουάριο. Πίνακας 1: Ελληνικά ενδημικά είδη του γένους Crocus. (ΝΕ: βόρεια-ανατολική, NPi: βόρεια Πίνδος, SPi: νότια Πίνδος, EC: ανατολική-κεντρική, Ste: Στερεά Ελλάδα, Pe: Πελοπόννησος, IoI: Ιόνια νησιά, WΑe: νησιά δυτικού Αιγαίου, EΑe: νησιά ανατολικού Αιγαίου, Kik: Κυκλάδες και KK: Κρήτη-Κάρπαθος.)[1]. Ενδημικά είδη της Ελλάδας Περιοχές Μορφολογικά Χαρακτηριστικά Φυτού C. biflorus Miller ssp. melantherus Mathew Pe, StE Ωχρολευκά ή λευκά άνθη (1-4), επίπεδοςσφαιροειδής κορμός, 3-5 φύλλα C. biflorus Miller ssp. stridii Mathew Ne Άσπρα άνθη, 4-5 φύλλα C. tournefortii Gay Pe, Kik, KK, EAe Pe, Ste, C. cartwrightianus Herbert WAe, Kik, KK, EAc C. goulimyi Turril Pe C.laevigatus Bory & Chaub C.niveus Bowles Pe, Ste, WAe, Kik, KK, EAe Pe Λιλά άνθη, 5-10 φύλλα C.oreocreticus B.L.Burtt KK Απαλά μωβ άνθη C.robertianus C. D.Brickell C.nivalis Gay NPi, SPi, Pe, Ste KK Ανοιχτά ή σκούρα κυανοϊώδη άνθη (1-5), 7-12 φύλλα Ανοιχτά ιώδη-κυανοϊώδη άνθη (1-2), ωοειδής κόρμος, 4-7 φύλλα Λευκά ή λιλά άνθη (1-4), ωοειδής κόρμος, 3-6 φύλλα Άσπρα με λιλά άνθη, ωοειδής κόρμος, 4-8 φύλλα Άσπρα άνθη Άσπρα άνθη στο εξωτερικό και μωβ στο εσωτερικό Μορφολογική ανάλυση Μορφολογικά, τα είδη του γένους Crocus έχουν αρκετές ομοιότητες καθιστώντας δύσκολη την διάκριση τους. Προκειμένου να γίνει ο προσδιορισμός ενός είδους εξετάζεται κυρίως η μορφολογία των στύλων των φυτών καθώς, ανάλογα με το είδος οι στύλοι ποικίλουν σε ακέραιους, οδοντωτούς, δισχιδείς και πολισχιδείς (Εικόνα 2). Τα άνθη και η μορφολογία τους δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον προσδιορισμό ενός είδους καθώς, το χρώμα τους σε ένα 4

25 είδους είναι δυνατόν να ποικίλει, με σύνηθες το φαινόμενο της ύπαρξης λευκών ανθών (αλφικοί τύποι) αντί των χαρακτηριστικών βιολετί. Επίσης, υπάρχει περίπτωση δύο είδη να εμφανίζουν μεγάλη ομοιότητα ως προς τα άνθη τους αλλά να διαφέρουν ως προς το μέγεθος των στύλων, την ύπαρξη τριχών στον σωλήνα της στεφάνης, την εποχή εμφάνισης των φύλλων (συνανθία ή υστερανθία) και στην μορφή των νημάτων των χιτώνων του κόρμου. Εικόνα 2: Μορφολογική απεικόνιση διαφόρων τύπων στύλων του γένους Crocus. Τα μέλη του γένους αποτελούνται από ένα υπόγειο και ένα υπέργειο τμήμα (Εικόνα 3). Το υπόγειο τμήμα του φυτού περιλαμβάνει τον βολβό και το ρίζωμα. Ο βολβός είναι αυτός που αναπτύσσεται και σχηματίζει το υπέργειο τμήμα του φυτού. Είναι πλούσιος σε άμυλο ενώ περιβάλλεται από πολλές στρώσεις ξηρού ινώδους και μεμβρανώδους ιστού, οι οποίοι σχηματίζουν ένα χιτώνα που αποτελεί και την βάση των φύλλων. Ο κόρμος του φυτού αναπτύσσεται απευθείας από τον βολβό και έχει ετήσια διάρκεια. Ανάμεσα στις περιόδους ανθοφορίας και καρποφορίας του φυτού λαμβάνει χώρα η αντικατάσταση του βολβού από έναν νέο που αναπτύσσεται πάνω από τον παλαιό. Έχει παρατηρηθεί ότι οι κόρμοι του γένους Crocus έχουν ένα «ιδανικό βάθος λειτουργίας» στο οποίο λειτουργούν ως ώριμα φυτά. Όταν δεν βρίσκονται σε αυτό το βάθος αναπτύσσονται ανώριμα φυτά. Σε αυτήν την περίπτωση σχηματίζεται μια συσταλτή ρίζα που έχει μορφή κονδύλου και η οποία παράγεται από τον καινούργιο κόρμο, ο οποίος βρίσκεται πάνω από τον μητρικό. Στη συνέχεια, ο νέος κόρμος έλκεται ισχυρά προς τα κάτω καθώς ο παλιός μαραίνεται, ενώ παράλληλα η σαρκώδης ρίζα 5

26 συστέλλεται [2]. Οι ρίζες παράγονται στο σημείο γύρω από την επιφάνεια της ουλής της βάσης του κόρμου και είναι και αυτές περιορισμένης διάρκειας. Παραμένουν από την αρχή της αυξητικής περιόδου (συνήθως το φθινόπωρο) έως το στάδιο της καρποφορίας όπου ο μητρικός κόρμος μαραίνεται [3]. Τα φύλλα του φυτού περιβάλλουν τον νέο κόρμο και σχηματίζουν έναν παχύ άχρωμο σωλήνα που προστατεύει τον νέο βλαστό. Τα φύλλα του φυτού είναι γραμμικά με ευδιάκριτα όρια και ένα καλοσχηματισμένο υπόλευκο κεντρικό αυλάκι. Το χρώμα τους είναι βαθύ πράσινο και εμφανίζονται κατά την περίοδο της ανθοφορίας ή λίγο αργότερα. Η ωοθήκη βρίσκεται στο υπόγειο τμήμα του φυτού μέχρι το στάδιο της καρποφορίας. Ο καρπός φέρεται προς το ανώτερο τμήμα του φυτού λίγο πιο ψηλά από την επιφάνεια του εδάφους. Εκεί κατά την ωρίμανση του διαχωρίζεται σε τρία μέρη, ενώ οι παραγόμενοι σπόροι διασκορπίζονται γύρω από το μητρικό φυτό. Τα περισσότερα είδη Crocus είναι πρωτόγυνα, δηλαδή αναπτύσσουν αρχικά τα γυναικεία μέρη του φυτού και έπειτα τα ανδρικά. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι πολλά είδη του γένους, όπως ο C. sativus, λόγω στειρότητάς δεν μπορούν να αναπαραχθούν μέσω σπορίων αλλά μόνο με την αντικατάσταση του κορμού τους. Το περιάνθιο είναι συμμετρικό και αποτελείται από τρία εξωτερικά και τρία εσωτερικά τέπαλα που ενώνονται στην βάση του σχηματίζοντας έναν μακρύ αυλό. Εσωτερικά του άνθους βρίσκεται ένας στύλος, το μέγεθος του οποίου είναι συγκρίσιμο με τον αυλό της περιάνθου. Ο στύλος αποτελεί άμεση προέκταση της ωοθήκης και στο ανώτερο τμήμα του καταλήγει σε 3, 6 ή και περισσότερες διακλαδώσεις, τα ανώτερα τμήματα των οποίων αναφέρονται ως στίγματα (Εικόνα 2). Ο στύλος έχει χαρακτηριστικό κίτρινο, πορτοκαλί ή κόκκινο χρώμα. Το νέκταρ του φυτού παράγεται από τα τέπαλα. 6

27 Εικόνα 3: Σχηματική αναπαράσταση φυτού του γένους Crocus σε περιόδους ανθοφορίας και καρποφορίας [4]. Ιστορική αναδρομή Η ονομασία του γένους Crocus προέρχεται από την ελληνική λέξη «κρόκη», δηλαδή από το όνομα του νήματος που χρησιμοποιείται για ύφανση στον αργαλειό καθώς οι στύλοι του άνθους ομοιάζουν με μικρά νημάτια. Η χρήση και η καλλιέργεια του φυτού ξεκίνησε πριν από 3500 χρόνια. Το είδος Crocus sativus είναι αυτό που καλλιεργείται σε μεγάλες εκτάσεις. Ο άγριος πρόδρομος τύπος του είδους πιθανολογείται να είναι ο C. cartwrightianus, ο οποίος προέρχεται από την Κρήτη ή την Κεντρική Ασία. Επίσης, πιθανοί πρόγονοι του C. sativus θεωρούνται και οι C. thomasii και C. pallasii. Το φυτό αρχικά ήταν ενδημικό είδος της νοτιοδυτικής Ασίας, ωστόσο πρώτη φορά καλλιεργήθηκε στην Ελλάδα. Συγκεκριμένα, στο βορειοδυτικό τμήμα του ανακτόρου της Κνωσσού (Κρήτη, Ελλάδα) βρίσκεται και η αρχαιότερη οπτική αναπαράσταση του φυτού. Σε 7

28 αυτή παρουσιάζεται ένας νεαρός άντρας με μπλε σώμα που σκύβει και συλλέγει ένα Κρόκο (Εικόνα 4). Ωστόσο, περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι πρόκειται για έναν πίθηκο και έτσι η τοιχογραφία αναφέρεται και ως «ο κροκοσυλλέκτης πίθηκος». Μια ακόμη αναφορά στην παρουσία του κρόκου στον Ελλαδικό χώρο κατά τα ελληνιστικά χρόνια γίνεται και μέσω δύο τοιχογραφιών που βρίσκονται στο «Ξεστή 3» κτήριο στο Ακρωτήρι της Σαντορίνης και χρονολογούνται από τον αιώνα π.χ. (Εικόνα 5). Στην πρώτη φαίνεται μια Μινωική θεότητα να εποπτεύει την διαδικασία απομόνωσης των στιγμάτων από τα φυτά για την παρασκευή ενός θεραπευτικού φαρμάκου, ενώ στην δεύτερη απεικονίζεται μια γυναίκα που χρησιμοποιεί τους στύλους του φυτού για να θεραπεύσει μια πληγή στο πόδι της. Αυτές οι δύο τοιχογραφίες αποτελούν και την πρώτη βοτανικά ακριβή οπτική αναπαράσταση της χρήσης του φυτού στην θεραπευτική. Αναφορές της ίδιας περιόδου (2300 π.χ.) βρίσκουμε και στην Μεσοποταμία, όπου στην κωμόπολη Azupirano αναφέρεται ότι υπήρχαν μεγάλες εκτάσεις όπου καλλιεργούταν το συγκεκριμένο φυτό. Μάλιστα το όνομα της πόλης σημαίνει λιβάδι με κρόκο γεγονός που υποδεικνύει ότι η χρήση του C.sativus ήταν ήδη αρκετά διαδεδομένη. Εικόνα 4: Τοιχογραφία από το μινωικό ανάκτορο της Κνωσού στην οποία απεικονίζεται ο «κροκοσυλλέκτης πίθηκος». 8

29 Εικόνα 5: Τοιχογραφίες από το «Ξεστή 3» στο Ακρωτήριο της Σαντορίνης. Στην μυθολογία, ο Κρόκος αναφέρεται ως έναν νεαρός άνδρας που ήταν φίλος του θεού Ερμή. Μια μέρα και ενώ οι δύο φίλοι έπαιζαν στην εξοχή, ο Ερμής τραυμάτισε άθελά του στο κεφάλι τον Κρόκο. Καθώς ο κρόκος έπεφτε νεκρός, τρεις σταγόνες αίμα έπεσαν στο κέντρο ενός άνθους και δημιούργησαν τους τρεις στύλους του φυτού. Έκτοτε το συγκεκριμένο άνθος πήρε το όνομα του άτυχου νέου. Κατά το πέρασμα των αιώνων o C. sativus βρήκε ευρεία εφαρμογή σε τέσσερις κυρίως τομείς. Αρχικά, οι στύλοι του φυτού χρησιμοποιούνταν ως καρύκευμα στην μαγειρική, καθώς η πικρή γεύση και το χαρακτηριστικό κίτρινο χρώμα που προσδίδουν έκαναν τα αρτύματα γευστικότερα. Αναφορές για την χρήση του στην μαγειρική έχουμε από τους Πέρσες. Ακόμη, τα τέπαλα και οι στύλοι του φυτού έβρισκαν ευρεία χρήση στην υφαντουργία για την βαφή υφασμάτων. Αναφορές από τα ελληνορωμαϊκά χρόνια δείχνουν ότι στην Σινδόνη και στην Σαντορίνη υπήρχαν μεγάλα βαφεία, όπου χρησιμοποιούνταν εκτός των άλλων φυτών και ο κρόκος για την βαφή υφασμάτων. Μάλιστα, πολλά από αυτά τα υφάσματα προορίζονταν για μέλη των βασιλικών οικογενειών. Επιπλέον, την ίδια περίοδο, το φυτό χρησιμοποιούταν και ως αρωματικό των ναών και των δημόσιων κτηρίων. Η χαρακτηριστική πικρή και βαριά μυρωδιά του φυτού ήταν ικανή να καλύψει όλες τις δυσάρεστες οσμές των κοινών χώρων. Χαρακτηριστικός είναι και ένας λαϊκός μύθος κατά τον οποίον μετά το καύση της Ρώμης από 9

30 τον Νέρωνα, οι πολίτες διασκόρπισαν τον κρόκο στους δρόμους της πόλης για να καλυφθεί η μυρωδιά. Η πιο σημαντική και αξιοπρόσεκτη χρήση του φυτού ήταν στην λαϊκή θεραπευτική. Υπάρχουν χιλιάδες αναφορές σε ιστορικά κείμενα και σε λαϊκές παραδόσεις για την θεραπευτική ιδιότητα του φυτού, πολλές από τις οποίες χάνονται στα βάθη των αιώνων. O κρόκος πρωτοαναφέρθηκε σε Συριακό λεξικό κατά τη διάρκεια της βασιλείας του Ashurbanipal ( π.χ.), ως βοηθητικό της δύσπνοιας, των πόνων στην ούρηση, της γέννας, της δυσμηνόρροιας και των ασθενειών του κεφαλιού [5]. Στην αρχαία Αίγυπτο οι θεραπευτές χρησιμοποιούσαν μείγματα του φυτού σε κρέμες για την θεραπεία ποικίλων νοσημάτων του γαστρεντερικού και ουροποιητικού συστήματος. Οι Σουμέριοι, επίσης, χρησιμοποιούσαν τον κρόκο ως συστατικό των θεραπειών και των μαγικών φίλτρων τους, καθώς πίστευαν ότι το φυτό είχε θεϊκή υπόσταση. Στην αρχαία Ελλάδα ο κρόκος χρησιμοποιούταν για την καταπολέμηση της αϋπνίας και των δυσάρεστων συμπτωμάτων της μέθης από το κρασί. Τον 5ο-4ο αιώνα π.χ., ο κρόκος χορηγούνταν τοπικά σε λοιμώξεις πυώδους και υγρού οφθαλμού, σε έλκη του δέρματος και σε ανοιχτές πληγές ως αιμοστατική ουσία, ενώ το 300 π.χ. ο Ερασίστρατος τόνισε την πιθανή χρήση του σε φλεγμονή του λάρυγγα, ωταλγία και έλκος του στόματος και των γεννητικών οργάνων [6]. Στην Περσία, οι θεραπευτές ανεμείγνυαν στύλους του κρόκου στο τσάι για την αντιμετώπιση της μελαγχολίας. Ιδιαίτερα διαδεδομένη ήταν και η χρήση του στο μπάνιο. Πιο συγκεκριμένα, αναμειγνυόταν μαζί με άλλα φυτά, όπως το σανδαλόξυλο, και ζεστό νερό και στην συνέχεια χρησιμοποιούταν στο μπάνιο, καθώς, όπως αναφέρεται σε ιστορικές πηγές, βοηθούσε στην θεραπεία των πληγών ως αντισηπτικό, ενώ είχε και καλλυντικές ιδιότητες. Λάτρεις του μπάνιου με κρόκο αναφέρεται να είναι η Κλεοπάτρα και ο Μέγας Αλέξανδρος, ο οποίος μάλιστα είχε συστήσει και στους πολεμιστές του να το προτιμούν μετά τις μάχες. Στα νεότερα χρόνια, ο κρόκος διαδόθηκε μέσω του εμπορίου σε ολόκληρη την Ευρώπη και σε όλο τον κόσμο. Οι πρώτες αναφορές για εμπόριο του C. sativus χρονολογούνται από την εποχή των Φοινίκων. Οι Άραβες αφού συστηματοποίησαν την καλλιέργειά του, τον έφεραν στην Ισπανία το 960 μ.χ. και από εκεί διαδόθηκε έμμεσα ή άμεσα κατά τους νεότερους χρόνους στα 10

31 υπόλοιπα κράτη της Ευρώπης. Η σημερινή καλλιέργεια του φυτού στην Ελλάδα στην περιοχή της Κοζάνης εισήχθη από την Αυστρία κατά τον 17ο αιώνα, χάρη σε Έλληνες εμπόρους που διατηρούσαν στενές εμπορικές σχέσεις με τη Βιέννη. Συγκομιδή του φυτού Η συλλογή των ανθών του κρόκου αρχίζει κατά τα μέσα του Οκτώβρη όταν τα άνθη του φυτού έχουν ανοίξει πλήρως. Η συγκομιδή διαρκεί ημέρες από την ανατολή έως την δύση του ηλίου. Από μελέτες στο φυτικό υλικό έχει βρεθεί ότι η καλύτερη ώρα για την συγκομιδή είναι είτε νωρίς το πρωί είτε αργά το απόγευμα, καθώς αυτές τις ώρες τα φυτικά έλαια βρίσκονται στην υψηλότερη συγκέντρωση. Τα άνθη μαζεύονται σε καλάθια με ιδιαίτερη δεξιοτεχνία έτσι ώστε να μην τραυματιστεί το φυτό. Μετά την συγκομιδή αρχίζει το ξεχώρισμα των κόκκινων στύλων από τα άνθη. Η εργασία αυτή που γίνεται με το χέρι και διαρκεί αρκετή ώρα. Πρέπει να τονισθεί ότι κατά την διαδικασία παραλαβής των αποξηραμένων στύλων, το φυτικό υλικό πρέπει να διατηρείται σε σκοτεινό χώρο απουσία υγρασίας. Η ξήρανση των στύλων γίνεται με την τοποθέτηση σε λεπτά στρώματα των νωπών στιγμάτων, πάνω σε τελάρα με δικτυωτή συρμάτινη ή μεταξωτή βάση. Τα τελάρα μεταφέρονται σε σκοτεινά δωμάτια σε θερμοκρασία δωματίου (έως 40 C) για όσο διάστημα απαιτείται. Εάν ο κρόκος ξηραθεί σωστά, διατηρεί αναλλοίωτες τις χαρακτηριστικές του ιδιότητες (χρώμα και άρωμα), ενώ εφαρμόζεται ποιοτικός έλεγχος σύμφωνα με τις τεχνικές προδιαγραφές κατά ISO/TS 3632 (2003), προκειμένου να αποφευχθούν οι νοθείες. 11

32 Εικόνα 6: Συλλογή, απομόνωση, ξήρανση και παραλαβή των αποξηραμένων στύλων. Β. Crocus sativus Linnaeus: κρόκος ο ήμερος Ο Kρόκος ο ήμερος (Crocus sativus Linnaeus), ανήκει στο γένος Crocus και αποτελεί τον κύριο εκπρόσωπο του γένους και η καλλιέργειά του έχει εξαπλωθεί σε διάφορα μέρη του κόσμου. Οι χώρες με την κύρια παραγωγή C. sativus βρίσκονται στην περιοχή της Μεσογείου (Ελλάδα, Ισπανία, Ιταλία, Μαρόκο, Αζερμπαϊτζάν), καθώς και στην Ινδία και το Ιράν. Στην Ισπανία και το Ιράν παράγεται το 80% της παγκόσμιας παραγωγής C. sativus. Στην Ελλάδα καλλιεργείται εδώ και περίπου 300 χρόνια αποκλειστικά στο Νομό Κοζάνης. Το χωριό Κρόκος της Κοζάνης κατατάσσεται στην πρώτη θέση της παραγωγής κρόκου βιολογικής καλλιέργειας στον κόσμο ανάμεσα σε πολλά κράτη και ο κρόκος Κοζάνης αποτελεί προϊόν Προστατευόμενης Ονομασίας και Προέλευσης. 12

33 Μορφολογική Ανάλυση Όπως και τα υπόλοιπα μέλη του γένους, ο C. sativus L. είναι ένα βολβώδες πολυετές φυτό που αναπτύσσεται σε περιοχές με θερμά και ξηρά καλοκαίρια και υγρούς και κρύους χειμώνες. Το ύψος του φυτού κυμαίνεται από 8 έως 30cm. Ο κόρμος κάθε φυτού είναι σφαιρικού σχήματος με διάμετρο 2 έως 3cm και φέρει καστανόφαιους δικτυωτούς χιτώνες. Κάθε κόρμος παράγει 1 έως 3 άνθη και 6 έως 9 φύλλα. Τα φύλλα του που βγαίνουν απ' ευθείας από το βολβό αμέσως μετά τα λουλούδια, είναι καταπράσινα, σπαθωτά και γραμμωτά, αναπτύσσονται δε κατά τη διάρκεια του χειμώνα και φθάνουν την άνοιξη τα 40 έως 50cm, οπότε και θερίζονται λίγο πριν ξεραθούν. Η περίοδος ανθοφορίας του φυτού είναι το φθινόπωρο (Οκτώβριος). Κάθε άνθος που παράγεται έχει 3 τέπαλα βιολετί χρώματος μήκους 3,5 έως 5cm και πλάτους περίπου 1 cm και 3 τέπαλα παρόμοια μεταξύ τους. Ο ύπερος είναι κεντρικός με μία σωληνοειδή ωοθήκη μέσα από την οποία εξέρχεται ένας λεπτός στύλος. Ο λαιμός του στύλου, χρώματος απαλού κίτρινου, είναι αρκετά μακρύς ενώ στο πάνω μέρος χωρίζεται σε τρία στίγματα βαθύ κόκκινου χρώματος. Στο ανώτερο άκρο τους είναι οδοντωτά και γέρνουν από το βάρος τους προς τα κάτω, πολλές φορές έξω από το χωνάκι που σχηματίζουν τα τέπαλα. Στο εμπόριο οι στύλοι κυκλοφορούν σε αποξηραμένη μορφή με τις ονομασίες saffron, σαφράν ή ζαφορά. Εικόνα 7: Το άνθος του C.sativus κατά την περίοδο συγκομιδής των στύλων του. 13

34 Φυτοχημική σύσταση στύλων Οι στύλοι του C.sativus περιέχουν περισσότερες από 150 πτητικές και αρκετές μη-πτητικές ενώσεις [7]. Τα κυριότερα συστατικά των στύλων είναι οι κροκίνες, η πικροκροκίνη και η σαφρανάλη. Η κροκετίνη [ονομασία κατά IUPAC: (2Ε, 4Ε, 6Ε, 8Ε, 10Ε, 12Ε, 14Ε)-2,6,11,15-τετραμεθυλο- 2,4,6,8,10,12,14-εξαδεκαεπταενοδιικό οξύ] αποτελείται από 20 άτομα άνθρακα, 16 εκ των οποίων σχηματίζουν μια υδρογονανθρακική αλυσίδα ενώ τα υπόλοιπα ενώνονται στον γραμμικό σκελετό στις θέσεις C-2, C-6, C-11 και C-15 ως μεθυλομάδες. Ανάλογα με τη στερεοδιάταξη στη θέση C-6 απαντάται σε cis- ή trans-διαμόρφωση. Η δομή της κροκετίνης ανακαλύφθηκε από τον Richard Kuhn, ο οποίος και τιμήθηκε με το βραβείο Nobel για αυτή την ανακάλυψη το Επίσης, έχει ανακαλυφθεί και η ύπαρξη της διμεθυλοκροκετίνης, τον εστέρα της κροκετίνης με μεθυλικές ομάδες [8]. Οι κροκίνες αποτελούν την κυριότερη ομάδα ενώσεων που εμπεριέχονται στους στύλους του C. sativus. Είναι υδατοδιαλυτές, θερμο- και φωτο-ευαίσθητες χημικές ενώσεις, ενώ ευθύνονται και για το χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα των στύλων. Προέρχονται από την εστεροποίηση της κροκετίνης με μονάδες γλυκόζης. Έως σήμερα έχει ταυτοποιηθεί η ύπαρξη 7 κύριων κροκινών, οι οποίες διαφέρουν ως προς τον αριθμό των μορίων γλυκόζης που φέρουν και τον τρόπο σύνδεσης τους στον σκελετό της κροκετίνης. Ανάλογα με την στερεοδιάταξη του μορίου της κροκετίνης, οι κροκίνες απαντώνται σε cis- ή trans-διαμόρφωση. H πρώτη κροκίνη που ανακαλύφθηκε ήταν η trans-κροκίνη-4 το 1915 από τον Deker ο οποίος απέδειξε την γλυκοζιτική της φύση και κατοχύρωσε τον μοριακό της τύπο (C 44 H 24 O 24 ), ενώ αποτέλεσε και τον πρώτο φυσικό γλυκοζίτη που βρέθηκε. Το 1975 οι Pfander και Wittwer ανακάλυψαν τρεις νέες κροκίνες, την trans-κροκίνη-1, trans-κροκίνη-2 και trans-κροκίνη-3, χωρίς όμως να μπορέσουν να αποδείξουν ότι αποτελούν συστατικά των στύλων του C. sativus και όχι παραπροϊόντα των αντιδράσεων κατά την πορεία της απομόνωσης, κάτι που έκαναν οι Dinghra et al. την ίδια χρονιά (1975) [9, 10]. Η ύπαρξη των cis-διαμορφώσεων των κροκινών ήταν άγνωστες στους ερευνητές έως το 1984, όταν ο Speranza ανακάλυψε ότι η κροκίνη-4 απαντάται και στην cis-διαμόρφωση. Οι cis-διαμορφώσεις και των υπόλοιπων γνωστών έως τότε κροκινών ανακαλύφθηκαν από την ομάδα του Tarantilis το 1995, ενώ οι ίδιοι εντόπισαν και μια 14

35 νέα διαμόρφωση κροκίνης την trans-κροκίνη-5 [11]. Οι trans-διαμορφώσεις των κροκινών φαίνονται στην Εικόνα 8, Πιο αναλυτικά, οι γνωστές έως σήμερα κροκίνες είναι οι εξής: Κροκίνη-1: Είναι η απλούστερη κροκίνη που έχει ταυτοποιηθεί έως σήμερα. Το μόριο της αποτελείται από μια μονάδα β-d-γλυκόζης ενωμένη στο ένα από τα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Κροκίνη-2: Το μόριο της αποτελείται από δύο μονάδες β-d-γλυκόζης ενωμένες στα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Κροκίνη-2 : Το μόριο της αποτελείται από μια μονάδα β-d-γεντιοβιόζης ενωμένη στο ένα από τα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Η β-d-γεντιοβιόζη είναι ένας δισακχαρίτης που αποτελείται από δύο μόρια β-d-γλυκόζης ενωμένα μεταξύ τους με α β (1 6) γλυκοζιτικό δεσμό. Κροκίνη-3: Το μόριο της αποτελείται από μια μονάδα β-d-γεντιοβιόζης και μια μονάδα β-dγλυκόζης ενωμένες στα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Κροκίνη-4: Το μόριο της αποτελείται από δύο μονάδες β-d-γεντιοβιόζης ενωμένες στα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Βρίσκεται σε μεγαλύτερη αναλογία από τις υπόλοιπες κροκίνες στους στύλους του C.sativus. Στην βιβλιογραφία η κροκίνη-4 αναφέρεται και ως κροκίνη-α. 15

36 Εικόνα 8: Δομές της κροκετίνης (1), της διμεθυλοκροκετίνης (2), της trans-κροκίνης-1 (3), της trans-κροκίνης-2 (4), της trans-κροκίνης-2 (5), της trans-κροκίνης-3 (6), της trans-κροκίνης-4 (7), της trans-κροκίνης-5 (8), και της trans-κροκίνης-5 (9). 16

37 Κροκίνη-5: Το μόριο της αποτελείται από μια μονάδα β-d-γεντιοβιόζης και μια μονάδα β-dγεντιοτριόζης ενωμένες στα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Η γεντιοτριόζη είναι ένας τρισακχαρίτης που αποτελείται από τρεις μονάδες γλυκόζης ενωμένες μεταξύ τους με β β α (1 6) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Κροκίνη-5 : Το μόριο της αποτελείται από μια μονάδα β-d-γεντιοβιόζης και μια μονάδα β-dνεαπολιτανόζης ενωμένες στα δύο άκρα του σκελετού της κροκετίνης. Η νεαπολιτανόζη είναι ένας τρισακχαρίτης που αποτελείται από τρεις μονάδες γλυκόζης ενωμένες μεταξύ τους με έναν β β (1 6) και έναν β β (1 2) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Στην Εικόνα 9 φαίνονται οι δομές των σακχάρων που φέρουν οι κροκίνες. Εικόνα 9: Δομές της β-d-γλυκοζυλο-μονάδας (1), της β-d-γεντιοβιοζυλο-μονάδας (2), της β-dγεντιοτριόζυλο-μονάδας (3) και της β-d-νεαπολιτανοζυλο-μονάδας (4). Με κυματιστή γραμμή αναπαρίσταται η θέση όπου γίνεται ο δεσμός με το μόριο της κροκετίνης. Η πρώτη αναφορά στη βιοσύνθεση των καροτενοειδών του κρόκου έγινε από τους Pfander και Schurtenberger το 1982 [12], οι οποίοι πρότειναν δύο διαφορετικούς τρόπους βιοσύνθεσης του C20 άγλυκου τμήματος των κυρίως χρωστικών. Σύμφωνα με τον πρώτο, τα μόρια των καροτενοειδών προκύπτουν ύστερα από την οξειδωτική αποικοδόμηση ενός C40 καροτενοειδούς όπως η ζεαξανθίνη, ενώ σύμφωνα με τον δεύτερο από τον διμερισμό του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GGDP) με επακόλουθη αφυδρογόνωση ή οξείδωση (Εικόνα 10). Το μονοπάτι της αποικοδόμησης αναφέρεται ως το πιο πιθανό καθώς υποστηρίζεται και από την ταυτόχρονη δημιουργία της σαφρανάλης και της πικροκροκίνης, η στερεοχημική διάταξη (R) του υδροξυλικού άνθρακα της οποίας προκύπτει είναι ίδια με αυτή του μορίου της ζεαξανθίνης. 17

38 Εικόνα 10: Μονοπάτια σχηματισμού της κροκετίνης. Άνω μέρος: Μονοπάτι σχηματισμού μέσω της οξειδωτικής αποικοδόμησης της ζεαξανθίνης. Κάτω μέρος: Μονοπάτι σχηματισμού μέσω του διμερισμού του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GGDP) με επακόλουθη αφυδρογόνωση ή οξείδωση. Το 2010 από τους Ahrazem et al αναφέρθηκε ότι το πρώτο βήμα στο βιοσυνθετικό μονοπάτι της κροκετίνης από την αποικοδόμηση της ζεαξανθίνης λαμβάνει χώρα στα πλαστίδια και καταλύεται από τη συνθάση του φυτοενίου (Εικόνα 11). Το φυτοένιο υφίσταται τέσσερις αντιδράσεις αποκορεσμού, δηλαδή απόσπασης υδρογόνων και δημιουργίας διπλού δεσμού, και ισομεριώνεται με μεσολάβηση της καροτενικής ισομεράσης CRTISO σε all-trans λυκοπένιο. Αυτό μετατρέπεται μέσω μιας σειράς αντιδράσεων πρώτα σε β-καροτένιο και έπειτα σε ζεαξανθίνη. Η κροκετίνη προκύπτει τελικά από την οξειδωτική αποικοδόμηση της ζεαξανθίνης, προϊόν μεταβολισμού του β- καροτενίου [13]. 18

39 Εικόνα 11: Μονοπάτι βιοσύνθεσης αποκαροτενοειδών στους στύλους του C. sativus. (GGDP: πυροφωσφορικό γερανύλιο, PSY: συνθάση φυτοενίου, PDS: ένζυμο αποκορεσμού του φυτοενίου, ZDS: ένζυμο αποκορεσμού του ζ-καροτενίου, CRTISO: καροτενική ισομεράση, LCYε: ε- κυκλάση λυκοπενίου, LCYβ: β-κυκλάση λυκοπενίου, βch: β-καροτενική υδροξυλάση, ZEP: εποξειδάση ζεαξανθίνης, VDE: απο- εποξειδάση βιολαξανθίνης, NXS: συνθάση νεοξανθίνης, CCD: διοξυγονάση αποικοδόμησης καροτενοειδούς, HTCC: 2,6,6- τριμεθυλ-4-υδροξυ-1- κυκλοεξεν- 1-καρβοξυαλδεΰδη). Αναλύσεις σε στύλους διαφόρων ειδών του γένους Crocus έδειξαν ότι η αύξηση της έκφρασης των γονιδίων CsCCD και CsΖCD προκαλεί την συσσώρευση των αποκαροτενοειδών, ενώ λόγω της υψηλής σημασίας της ζεαξανθίνης ως πρόδρομο μόριο, η β-καροτενική υδροξυλάση (βch) που είναι υπεύθυνη για την μετατροπή του β-καροτενίου σε ζεαξανθινη θεωρήθηκε ένζυμοκλειδί στο μονοπάτι. Έτσι, η ποσοτική και ποιοτική αλλαγή στα περιεχόμενα καροτενοειδή σχετίζεται άμεσα με τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων CsβCH1 και CsβCH2 (τα οποία εμφανίζουν ομολογία σε μεγάλο ποσοστό), και κυρίως του CsβCH1, [14]. Διαφορές όμως σε μεταγραφικό επίπεδο οδηγούν σε τροποποίηση της καροτενοειδικής σύστασης. Το 2001 αποδείχθηκε ότι] η γλυκοζυλίωση της κροκετίνης σε κροκίνη αφορά δύο γλυκοζυλοτρανσφεράσες: την GΤάση 1, η οποία καταλύει την μεταφορά των μονάδων γλυκόζης στα δύο καρβοξυλικά άκρα και την GTάση 2, η οποία βοηθάει στον σχηματισμό εστέρων γεντιοβιόζης μέσω γλυκοζιτικών δεσμών [15]. Κατά τη διάρκεια της ανθοφορίας, η δράση της 19

40 GTάσης 1 φάνηκε να είναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια των τεσσάρων πρώτων ημερών και στη συνέχεια να μειώνεται [16]. Η πικροκροκίνη [ονομασία κατά IUPAC: 4-(β-D-γλυκοπυρανοζυλο)-2,6,6τριμεθυλοκυκλοεξ--1- εν-1- καρβοξαλδεΰδη] είναι το δεύτερο επικρατέστερο συστατικό των στύλων, καθώς αποτελεί το 1-13% του ξηρού βάρους. Θεωρείται υπεύθυνη για την πικρή γεύση του σαφράν, χωρίς ωστόσο να υπάρχουν τεκμηριωμένες αναφορές σε αυτό. Η δομή της πικροκροκίνης εδραιώθηκε το 1934 από τους Khun και Winterstein, ενώ η στερεοχημική της διάταξη (R) καθορίστηκε το 1973 από τους Buchecker και Eugster [17, 18]. Αποτελείται από μια μονάδα D-γλυκόζης και το άγλυκο μόριο HTCC (1-κυκλοεξεν-1- καρβοξαλδεΰδη). Βιοσυνθετικά, όπως προαναφέρθηκε, προέρχεται από την ενζυμική αποικοδόμηση της ζεαξανθίνης, ενώ αποτελεί πρόδρομη ένωση της σαφρανάλης. Κατά την αφυδρογόνωση, ο μετασχηματισμός της πικροκροκίνης σε σαφρανάλη λαμβάνει χώρα είτε λόγω αύξησης θερμότητας είτε λόγω της δράσης ενζύμων όπως οι γλυκοζιδάσες Η σαφρανάλη [ονομασία κατά IUPAC: 2,6,6 τριμεθυλοκυκλοεξα 1,3 διεν 1 καρβοξαλδεΰδη] είναι το κυριότερο συστατικό του αιθέριου ελαίου καθώς σε αυτό βρίσκεται σε ποσοστό 30-37%, ενώ αποτελεί μόλις το 0,001-0,006% της ξηρής μάζας του. Η σαφρανάλη θεωρείται υπεύθυνη για το άρωμα του σαφράν. Το 1922 οι Winterstein και Telezcky κατάφεραν να την απομονώσουν για πρώτη φορά μέσω αλκαλικής ή όξινης υδρόλυσης της πικροκροκίνης [19], ωστόσο η δομή και η ονομασία της καθορίστηκε το 1934 από τους Khun και Winterstein [17]. Το 1941 οι Khun και Low κατάφεραν να την απομονώσουν με ενζυμική υδρόλυση της πικροκροκίνης [20]. Η πορεία σχηματισμού της σαφρανάλης από την πικροκροκίνη παρουσιάζεται στην Εικόνα

41 Εικόνα 12: Σχηματισμός σαφρανάλης από πικροκροκίνη. Σύμφωνα με τον Moraga και τους συνεργάτες του, το ποσοστό της κροκετίνης μειώνεται κατά πολύ πριν καν αρχίσει η ανθοφορία ενώ η παραγωγή των πτητικών ουσιών (π.χ πικροκροκίνη, σαφρανάλη) αυξάνεται κατά την πορεία της ανάπτυξης του φυτού, φτάνοντας τα υψηλότερα επίπεδα όταν το λουλούδι ανθίζει [21]. Το γεγονός ότι το χαρακτηρικό άρωμα, του κρόκου εμφανίζεται κατά την ανθοφορία, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι τελικές βιοσυνθετικές αντιδράσεις ρυθμίζονται εξελικτικά και ότι λαμβάνουν χώρα μόνο εφόσον το λουλούδι αρχίζει να ανθίζει. Διάφορες άλλες ενώσεις έχουν, επίσης, απομονωθεί ύστερα από αναλύσεις στους στύλους και στα υπόλοιπα μέρη του φυτού. Οι στύλοι του C. sativus έχει βρεθεί ότι είναι πλούσιοι σε φλαβονοειδή, οι οποίοι στην πλειοψηφία τους είναι γλυκοζίτες της καμπεφερόλης και τα οποία φαίνεται να συμβάλλουν στην πικρή γεύση της δρόγης (Εικόνα 13) [7]. 21

42 Εικόνα 13: Συστατικά του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus. [27] [ Καμπφερόλη(1), 3 β D γλυκοζυλo-καμπφερόλη (2), 3,7-β D-γλυκοζυλo-καμπφερόλη (3), 3-σοφοροζυλo-7-β-Dγλυκοζυλo-καμπφερόλη (4), 7-σοφοροζυλo-καμπφερόλη (5), 3,7,4 -τριγλυκοζυλo-καμπφερόλη (6), 3-ρουτινοζυλo-7-β-D-γλυκοζυλo-καμπφερόλη (7), 3-ρουτινοζυλo-καμπφερόλη (8), 7-β-Dγλυκοζυλo-διυδροκαμπφερόλη (9), 3,4 -β D-γλυκοζυλo-ισοραμετίνη (10), 3-ρουτινοζυλoραμετίνη (11), 7-β D-γλυκοζυλo-ναριγενίνη (προυνίνη) (12), κερσετίνη (13), 3-β-Dγεντιοβιoζυλo-κερσετίνη (14), 3-σοφοροζυλo-κερσετίνη (15)]. Πηγή: φασματοσκοπική βάση δεδομένων του Δρ. Πέτρου Ταραντίλη. 22

43 Ακόμη, τερπενοειδή, όπως οι κροκοσατίνες Κ και L, ανακαλύφθηκαν στους στύλους και στα τέπαλα από τους Li και Wu [22, 23], ενώ γλυκοζιτικά παράγωγα που ανήκουν στα τερπενοειδή και θεωρούνται πρόδρομες ενώσεις των πτητικών ουσιών του κρόκου, εναλλακτικές της πικροκροκίνης ανακαλύφθηκαν από τους Straubinger et al. [24]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, στο μεθανολικό εκχύλισμα στύλων εντοπίστηκαν γαλλικό οξύ και πυρογαλλόλη [25]. Τέλος, έχει ταυτοποιηθεί και η παρουσία καροτενοειδών όπως των α-, β- και γ-καροτένιο, ζεαξανθίνης και λυκοπένιου στους στύλους σε μικρότερο από τις κροκίνες ποσοστό (Εικόνα 14). Εικόνα 14: Συστατικά του εκχυλίσματος των στύλων του C. sativus. [Γαλλικό οξύ (16), πυρογαλλόλη (17), πρωτοκατεχοικό οξύ (18), κροκοσατίνη-κ (19), κροκοσατίνη-l (20), α- καροτένιο (21), β-καροτένιο (22), γ-καροτένιο (23), λουκοπένιο (24)]. Πρόσφατες αναλύσεις στο εκχύλισμα των τεπάλων έδειξαν την ύπαρξη ανθοκυανινών, όπως γλυκοζiτικά παράγωγα της δελφινιδίνης, της πετουνιδίνης και της μαλβιδίνης [26] (Εικόνα 15). 23

44 Εικόνα 15: Συστατικά του εκχυλίσματος των τεπάλων του C. sativus. [26]. [χλωριούχο άλας της 3,5-β-D-γλυκοζυλο-δελφινιδίνης (25), χλωριούχο άλας της 3,5-β-D-γλυκοζυλο-πετουνιδίνης (26), 3 β D γλυκοζυλο-δελφινιδίνη (27), χλωριούχο άλας της 3,5-β-D-γλυκοζυλο-μαλβιδίνης (28), χλωριούχο άλας της 3- β-d-γλυκοζυλο- πετουνιδίνης (29)]. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, το κυριότερο συστατικό του αιθέριου ελαίου του C.sativus είναι η σαφρανάλη. Αναλύσεις στην σύσταση του ισπανικού και ελληνικού σαφράν έδειξαν ότι η σαφρανάλη αντιπροσωπεύει το 72% και 70% του αρώματος της δρόγης [28, 29]. Οι πρώτες έρευνες στην σύσταση του αιθέριου ελαίου έγιναν το 1971 από τους Zarghami και Heinz, οι οποίοι με την χρήση της Αέριας Χρωματογραφίας σε συνδυασμό με την Φασματομετρία Μάζας και τις Φασματοσκοπικές τεχνικές ταυτοποίησαν συνολικά 16 συστατικά, ανάμεσα στα οποία και την σαφρανάλη (Εικόνα 16, ενώσεις 1-16) [30]. Μερικά από αυτά θεωρήθηκαν παραπροϊόντα της αποικοδόμησης των καροτενοειδών, ενώ κύριες ενώσεις χαρακτηρίστηκαν από τους ερευνητές οι ενώσεις 2 έως 6, οι οποίες, όπως οι ίδιοι υποστηρίζουν, πιθανόν προέρχονται από ενζυμική δράση, καθώς σε κάθε άλλη περίπτωση δεν θα ευνοούταν η ύπαρξη τους. 24

45 Εικόνα 16: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Zarghami και Heinz. [ Σαφρανάλη (1), 3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (2), 4-υδροξυ-3,5,5- τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (3), 2,6,6-τριμεθυλο-κυκλοεξαν-1,4-διόνη (4), 2,6,6-τριμεθυλο-2- κυκλοεξεν-1,4-διόνη (5), 2-υδροξυ-3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (6), 4-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (HTCC) (7), 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1,4- κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξαλδεΰδη (8), 2-μεθυλεν-6,6-διμεθυλο-3-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (9), 3,5,5-τριμεθυλο-4-μεθυλεν-2-κυκλοεξεν-1-όνη (10), 3-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-4-οξο-2- κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (11), 2,3-εποξυ-4-(υδροξυμεθυλεν)-3,5,5-τριμεθυλοκυκλοεξανόνη (12), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1,4-κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξαλδεΰδη (13), 2-βουτενολακτόνη (14), ναφθαλένιο (15), 2-φαινυλαιθανόλη (16)]. Οι Rodel και Petrzika το 1991 ανίχνευσαν 24 νέα συστατικά, ενώ επιβεβαίωσαν και την παρουσία 12 από τα 16 συστατικά που είχαν ταυτοποιηθεί από τους Zarghami και Heinz [31]. Πιο συγκεκριμένα, δεν ανιχνεύθηκαν οι ενώσεις 11, 12, 14 και 15, με τις δύο πρώτες να θεωρούνται ασταθείς και τις υπόλοιπες παραπροϊόντα τις αναλυτικής διαδικασίας. Η ταυτοποίηση των νέων συστατικών έγινε μέσω σύγκρισης των φασμάτων μάζας τους με αντίστοιχα φασματικής βιβλιοθήκης (17-21) και μέσω επεξεργασίας των μοριακών θραυσμάτων των φασμάτων μάζας (22-40). Οι Rodel και Petrzika ήταν οι πρώτοι που χρησιμοποίησαν τον συνδυασμό της Αέριας χρωματογραφίας με την τεχνική της ολφακτομετρίας (γνωστή και ως οσφρητικής ανάλυσης, Gas Chromatography-Olfactometry, GC-O), καταλήγοντας έτσι στον προσδιορισμό των ενώσεων που είναι υπεύθυνες για το άρωμα του κρόκου. Από τις ενώσεις που 25

46 ταυτοποίησαν, οι 2,4,5,6,7,8,9, 17,19 και 22 κρίθηκαν ότι συνεισφέρουν μαζί με την σαφρανάλη στο χαρακτηριστικό άρωμα της δρόγης. Εικόνα 17: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Rodel και Petrzika [ 5,5-διμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (17), 3,5,5-τριμεθυλο-3-κυκλοεξεν-1-όνη (18), 2-υδροξυ-4,6,6-τριμεθυλο-2,5-κυκλοεξαδιεν-1-όνη (19), 2,4,6-τριμεθυλοβενζαλδεΰδη (20), 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (21), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-1- κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (22), 2,2-διμεθυλο-4-οξοκυκλοεξαν-1-καρβοξαλδεΰδη (23), 2,4,6,6-τετραμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (24), 2,3-διυδροξυ-1,4-ναφθοκινόνη (25), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξ-4,6-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (26), 2,6,6-τριμεθυλο-1,3- κυκλοεξαδιεν-1-καρβοξυλικό οξύ (27), 5-(βουτ-1,3-διενυλ)-4,6,6-τριμεθυλο-1,5-κυκλοεξαδιεν- 1-όλη (28), 1,3,3-τριμεθυλο-2-(3-οξοβουτ-1-ενυλ)-1-κυκλοεξένιο (29), 3,3-διμέθυλο-1- κυκλοεξένιο (30), 2-υδρόξυ-3,5,5-τριμεθυλο-4-μεθυλεν-2-κυκλοεξεν-1-όνη (31), 2-υδροξυ-3- μεθυλο-5,6,7,8-τετράϋδρο-1,4-ναφθοκινόνη (32), 3-(βουτ-1-ενυλο)-2,4,4-τριμεθυλο-2- κυκλοεξεν-1-όλη (33), 2,6-διμεθυλοβενζοϊκός μεθυλεστέρας (34), 2,2-διμεθυλοκυκλοεξαν-1- καρβοξαλδεΰδη (35), 1-(βουτ-1-ενυλο)-2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξα-1,3-διένιο (ισομερή) (36/37), 3-(βουτ-1-ενυλο)-2,4,4-τριμεθυλοκυκλοεξαν-1-όλη (38), 4-(3-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλοκυκλοεξανυλο)-3-βουτεν-2-όνη (ισομερή)(39/40)]. 26

47 Αναλύσεις των επόμενων χρόνων οδήγησαν στην ταυτοποίηση νέων συστατικών. Οι Semiond et al. ταυτοποίησαν την ένωση 41 [32], ενώ οι Tarantilis και Polissiou ταυτοποίησαν 8 νέα συστατικά (Εικόνα 18, ενώσεις 42-49) [29]. Επιπρόσθετα, αναλύσεις των Cadwallader et al. κατέδειξαν την ύπαρξη νέων συστατικών τα κυριότερα από τα οποία φαίνονται στην Εικόνα 18 (ενώσεις 50-58), ενώ οι υπόλοιπες στον Πίνακα 2 [33]. Επιπλέον, ανακαλύφθηκαν και 15 ήδη ταυτοποιημένες ενώσεις. Εικόνα 18: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Semiond et al (41), Tarantilis και Polissiou (42-49) και Cadwallader et al (50-58). [2,6,6- τριμεθυλο-4-οξο-2-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (41), 2-υδροξυ-5-κυκλοεξεν-1,4-διόνη (42), 2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξ-1,4-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (43), 3,7-διμεθυλο-1,6-οκταδιένιο (44), 3,3,4,5-τετραμεθυλο-1-κυκλοεξανόνη (45), 4,6,6-τριμεθυλοδικυκλο-[3.1.1]-επτ-3-εν-2όνη (46), 4-(2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεξαν-1-υλ)-3-βουτεν-2-όνη (47), 2,4,4-τριμεθυλο-3-(3-οξο-1- βουτενυλ)-2-κυκλοεξεν-1-όλη (48), 4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξαν-1- καρβοξαλδεΰδη (49), μεγαστίγμα-7,9,13-τριένιο (50), μεγαστίγμα-4,6,8-τριένιο (51), ), 4- υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (52), 2-υδροξυ-3,5,5-τριμεθυλο-2-κυκλοεξεν-1-όνη (53), ), 2,6,6-τριμεθυλο-3-οξο-4-κυκλοεξεν-1-καρβοξαλδεΰδη (54), 2,6,6-τριμεθυλοκυκλοεπτα- 2,4-διεν-1-όνη (55), 5-tert-βουτυλοκυκλοπεντ-1,3-διένιο (56), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-1- κυκλοεξενυλ)-2-βουτενόνη (57), 6,10-διμεθυλενδεκα-5,9-διεν-2-όνη (58)]. 27

48 Πίνακας 2: Συστατικά που ταυτοποιήθηκαν από τους Cadwallader et al. No Όνομα συστατικού No Όνομα συστατικού 59 2,3-βουτανοδιόνη 71 (E,Z)-2,6-νοναδιενάλη 60 3-υδροξυ-βουταν-2-όνη 72 Διυδρο-2-(3H)-φουρανόνη 61 1-οκτεν-3-όνη 73 3-μεθυλοβουτανοϊκό οξύ 62 2-ακετυλοπυρρολίνη 74 2-(5H)-φουρανόνη 63 Οξικό οξύ 75 (E,Z)-2,4-δεκαδιενάλη 64 3-μεθυλθειοπροπανάλη 76 2-φαινυλοξικό οξύ 65 2-φουρανοκαρβοξαλδεΰδη 77 Γερανιόλη 66 Λιναλοόλη 78 Εξανοϊκό οξύ 67 2-μεθυλοπροπανοικό οξύ 79 Βενζυλική αλκοόλη 68 5-μεθυλο-2-80 Διμεθυλοσουλφόνη φουρανοκαρβοξαλδεΰδη 69 βουταν-2,3-διόλη 81 2,4,6-τριμεθυλοβενζαλδεΰδη 70 Διμεθυλοσουλφόνη 82 4-υδροξυ-2,5-διμεθυλο-3(2H)- φουρανόνη Την επόμενη χρονιά, οι Strausbinguer et al., ταυτοποίησαν 5 νέα συστατικά (Εικόνα 19, ενώσεις 83-87) που προκύπτουν από την αποικοδόμηση των καροτενοειδών [24]. Τρία χρόνια αργότερα, οι Zareena et al. χρησιμοποιώντας γ-ακτινοβολία κατάφεραν να ταυτοποιήσουν 2 νέα συστατικά (Εικόνα 19, ενώσεις 88-89), ενώ εντόπισαν και τις ενώσεις 2, 4, 5, 6, 7, 55 και 74 [34]. Εικόνα 19: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Strausbinguer et al. (83-87) και Zareena et al. (88-89). [ 2,6,6-τριμεθυλο-2-κυκλοεξόνη (83), 4- υδροξυμεθυλο-3,5,5- τριμεθυλο-2-κυκλοεξόνη (84), 6-υδροξυ-3-υδροξυμεθυλο-2,4,4-28

49 τριμεθυλο-2,5-κυκλοεξαδιενόνη (85), 4-(4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο)-2-(κυκλοεξεν-1-υλ)-3- βουτεν-2-όνη (86), 2-μεθυλο-6-οξο-2,4-επταδιενοκαρβοξυλικό οξύ (87), 5-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλο-3-οξοκυκλοεξ-1,4-διεν-1-καρβοξαλδεΰδη (88), 2,5-διμεθυλο-2-μεθυλο-βινυλοκυκλοεξανόνη (89)]. Οι D Auria et al. αναφέρουν σε σχετική εργασία τους την ύπαρξη 18 νέων συστατικών. Ωστόσο, πολλά από αυτά τα συστατικά είχαν ήδη ταυτοποιηθεί από προηγούμενες μελέτες. Πιο συγκεκριμένα, μεταξύ των νέων ενώσεων περιλαμβάνονται οι ενώσεις 53, 57, 63 και 74 οι οποίες είχαν ήδη ταυτοποιηθεί από τους Cadwallader et al., ενώ τα συστατικά έχουν παρόμοια δομή με τα συστατικά 51,55,64 και 71. Ωστόσο λόγω της ελλιπούς γνώσης της βιβλιογραφίας από τους ερευνητές είναι δύσκολο να διαβεβαιωθεί η σωστή ταυτοποίηση των νέων συστατικών (Εικόνα 20, ενώσεις ) [35]. Εικόνα 20: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους D Auria et al. [3-μεθυλοπροπανάλη (90), νονανάλη (91), 2,7,7-τριμεθυλ-2,4-κυκλοεπταδιεν-1- όνη (92), 1,3,3-τριμεθυλ-2-(Ε, Ζ-2-βοθτενυλοδιεν)-3-κυκλοεξένιο (93(Ζ)/ 94(Ε)), εξανάλη (95), επτανάλη (96), 2-ισοπροπυλιδεν-3-μεθυλ-3,5-εξαδιενάλη (97), 5,5-διμεθυλ-1,3-κυκλοεξαδιεν-1- καρβοξαλδεΰδη (98), 2-ακετυλ-6,6-διμεθυλοδικυκλο-[3.1.0]-2-εξένιο (99), δεκαεξάνιο (100), δεκαεπτάνιο (101)]. 29

50 Το 2004 οι Kanakis et al. ανέλυσαν το αιθέριο έλαιο και την μεταβολή του κατά την διάρκεια της αποθήκευσης. Σε αυτήν την μελέτη ανιχνεύτηκαν 27 ήδη ταυτοποιημένα συστατικά και 7 νέα, πέντε από τα οποία ( ) αποτελούν C 13 -ισοπrενοειδείς ενώσεις [36]. Εικόνα 21: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του C. sativus που ταυτοποιήθηκαν από τους Kanakis et al το [(2-φουρανυλο)-2-αιθανόνη (102), 4-(4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-1- κυκλοεξεν-1-υλο)-2-βουτεν-3-όλη (103), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-7-οξαδικυκλο-[4.1.0.]-επταν-1- υλο)-3-βουτεν-2-όνη (104), 4-(3,4-υδροξυ-2,6,6-τριμεθυλο-1-κυκλοεξεν-1-υλο)-2-βουτεν-3-όλη (105), 4-(2,6,6-τριμεθυλο-1-κυκλοεξ-1,3-διενυλο)-3-βουτεν-2-όνη (106), 3,8-υδροξυ-3,7- διμεθυλο-1,6-οκταδιένιο (107)]. Οι ερευνητές που ασχολήθηκαν με την ανίχνευση και ταυτοποίηση των συστατικών του αιθέριου ελαίου πρότειναν και πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους αυτά τα συστατικά προκύπτουν. Ωστόσο, δεν έχει επιβεβαιωθεί έως σήμερα κάποιος από αυτούς. Περισσότερες μελέτες θεωρείτε σκόπιμο να γίνουν προκειμένου να διαλευκανθούν οι πραγματικοί μηχανισμοί. Γ. Crocus nivalis Ο Crocus nivalis αποτελεί μέλος του γένους Crocus και είναι φυτό της Βαλκανικής χερσονήσου. Φύεται σε πετρώδεις πλαγιές, ξέφωτα δασών και κορυφές βουνών, σε υψόμετρο 400 έως 2400 μέτρων. Ο C. nivalis σύμφωνα με το Mathew ανήκει στην ομάδα Nubiscapus του γένους Crocus και στην σειρά Reticulati. Παλαιότερα το είδος ήταν γνωστό με την ονομασία C. sieberi. Σε αυτό το είδος ανήκουν τα υποείδη C. nivalis subsp nivalis (Δυτική Πελοπόννησος), C. nivalis subsp atticus (Αττική, Άνδρος, Εύβοια) και C. nivalis ssp. sublimis (Βόρεια Πελοπόννησος έως Δυτική Βουλγαρία). 30

51 Εικόνα 22: Το άνθος του C.nivalis κατά την περίοδο συγκομιδής των στύλων του (αριστερά) και αποξηραμένο ολόκληρο άτομο (δεξιά). Το άνθος του μοιάζει με εκείνο του C. sativus καθώς τα τέπαλα του έχουν το χαρακτηριστικό μωβ χρώμα και περιλαμβάνει ένα στύλο που καταλήγει σε τρεις διακλαδώσεις και τρεις κίτρινου χρώματος ανθήρες. Ο λαιµός έχει χρώµα βαθύ κίτρινο. Τα τµήµατα του περιανθίου (τέπαλα) έχουν κορυφές αµβλείς προς στρογγυλεµένες, χωρίς εµφανείς ραβδώσεις, το πολύ µε µια µεσαία πορφυρή λωρίδα. Τα φύλλα έχουν πλάτος συνήθως 2 mm ή µεγαλύτερο. Η περίοδος ανάπτυξης του νέου κόρμου λαμβάνει χώρα κατά τον χειμώνα, ενώ η άνθιση του φυτού κατά τους πρώτους μήνες της άνοιξης. 31

52 32

53 Κ ΕΦ ΑΛΑΙ Ο 2 Ο Σ Κ Ο Π Ο Σ ΤΗ Σ ΕΡ Γ ΑΣ Ι ΑΣ 33

54 34

55 Το γένος Crocus αποτελείται από 160 είδη παγκοσμίως που ευδοκιμούν σε ασβεστολιθικά βράχια, πετρώδεις πλαγιές, αραιά δάση, θαμνώνες, λιβάδια, αλπικούς τυρφώνες και βοσκοτόπια. Μέλη του γένους συναντώνται στις περιοχές της Κεντρικής και Νότιας Ευρώπης, της Βόρειας Αφρικής, της Μέση Ανατολής και σε ολόκληρη την Κεντρική Ασία. Στην Ελλάδα έχει καταγραφεί η ύπαρξη 31 taxa από τα οποία τα 12 taxa είναι ενδημικά. Κύριος εκπρόσωπος του γένους είναι ο C. sativus, η χρήση του οποίου χρονολογείται από το 2300π.Χ. Οι αποξηραμένοι στύλοι του φυτού αποτελούν το σαφράν που χρησιμοποιείται ως καρύκευμα στην παρασκευή αρτυμάτων από την αρχαιότητα έως σήμερα. Ιστορικές αναφορές για την χρήση του σαφράν στην Ιατρική καθώς και αναφορές σε παρενέργειες που παρατηρήθηκαν από την υπερκατανάλωση του, οδήγησαν σύγχρονους ερευνητές στην λεπτομερή ανάλυση των συστατικών που περιέχονται στους στύλους του άνθους. Αρχικά, μελετήθηκε η σύσταση του αιθέριου ελαίου, που ευνοήθηκε από την παράλληλη πρόοδο που σημειώθηκε στην Αέριο Χρωματογραφία. Συνολικά έως σήμερα έχει ταυτοποιηθεί η ύπαρξη 150 πτητικών συστατικών, με κυριότερο την σαφρανάλη που ευθύνεται για το άρωμα του σαφράν. Εκτός, από το αιθέριο έλαιο του φυτού, οι ερευνητές εστίασαν τις μελέτες τους και στην ταυτοποίηση και ανάλυση των υδατοδιαλυτών συστατικών των στύλων. Οι κροκίνες ανακαλύφθηκε ότι αποτελούν την μεγαλύτερη ομάδα, ενώ βρέθηκε ότι ευθύνονται για το κόκκινο χρώμα των στύλων. Όπως προέκυψε από αναλύσεις της δομής τους με τις τεχνικές NMR και LC-MS, πρόκειται για γλυκοζυλιωμένα παράγωγα ενός αποκαροτενοειδούς, της κροκετίνης. Ακόμη, ανακαλύφθηκε η παρουσία της πικροκροκίνης, από την οποία προκύπτει η σαφρανάλη και η οποία ευθύνεται για την πικρή γεύση του σαφράν. Επιπλέον, οι στύλοι περιέχουν φλαβονοειδή, τερπενοειδή και άλλες υδατοδιαλυτές ενώσεις. Ύστερα από την ανάλυση των στύλων του C. sativus, οι ερευνητές έστρεψαν το ενδιαφέρον τους στην μελέτη των υπόλοιπων τμημάτων της δρόγης και κυρίως των τεπάλων του άνθους. Άλλες ομάδες εστίασαν στην επίδραση των συστατικών των στύλων σε παθήσεις, με κύριο γνώμονα τις αναφορές των ιστορικών πηγών. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση της κροκετίνης στον καταρράκτη, στον καρκίνο, σε παθήσεις του καρδιαγγειακού και σε άλλα συστήματα. Τις τελευταίες δεκαετίες το ενδιαφέρον των ερευνητών έχει στραφεί στην μελέτη των υπόλοιπων μελών του γένους, προκειμένου να διαπιστωθούν ομοιότητες και διαφορές στην σύσταση τους. 35

56 Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η φυτοχημική ανάλυση στύλων του C. nivalis, ενός ενδημικού είδους του γένους Crocus της Βαλκανικής Χερσονήσου και σύγκριση του προφίλ του με του C. sativus. Πιο αναλυτικά, οι στύλοι του C. nivalis προέρχονταν από τρεις διαφορετικούς πληθυσμούς, δύο του όρους Παναχαϊκού και μια του όρους Χελμού. Η ανάλυση κινήθηκε σε τρεις κύριους άξονες. Ανάλυση αιθέριου ελαίου Ακολουθήθηκε το ίδιο πρωτόκολλο παραλαβής και ανάλυσης του αιθέριου ελαίου των δύο ειδών. Η σύσταση του αιθέριου ελαίου μελετήθηκε με την βοήθεια της συζευγμένης τεχνικής της Αερίου Χρωματογραφίας- Φασματομετρία Μάζας (GC-MS). Ανάλυση μεθανολικού εκχυλίσματος των στύλων Ακολουθήθηκε το ίδιο πρωτόκολλο παραλαβής και ανάλυσης του μεθανολικού εκχυλίσματος των στύλων των δύο ειδών. Η σύσταση τους αναλύθηκε με την βοήθεια της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) και έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων τόσο ανάμεσα στα δύο είδη όσο και ανάμεσα στους τρείς πληθυσμούς του C. nivalis. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στα χρωματογραφικά προφίλ των μεθανολικών εκχυλισμάτων των δύο ειδών οδήγησαν στην περαιτέρω ανάλυση τους με την βοήθεια της συζευγμένης τεχνικής της Υγρής Χρωματογραφίας-Φασματομετρίας Μάζας (LC-MS). Επιπλέον, προκειμένου να διαπιστωθεί η παρουσία νέων αποκαροτενοειδών στο ενδημικό είδος, ακολούθησε υδρόλυση του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis και ανάλυση του με την LC-MS τεχνική. In vitro μελέτη αντιοξειδωτικής δράσης και περιεκτικότητας φλαβονοειδών Μελετήθηκαν οι C. nivalis και C. sativus ως προς την ικανότητα αναγωγής του κατιόντος σιδήρου (Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP), την Ικανότητα σάρωσης της ρίζας του DPPH, ενώ προσδιορίστηκαν και τα επίπεδα των ολικών φλαβονοειδών. 36

57 Κ ΕΦ ΑΛΑΙ Ο 3 Ο Π ΕΙ Ρ ΑΜ ΑΤΙ ΚΟ Μ ΕΡ Ο Σ 37

58 38

59 Α. Φυτικό υλικό Για τις πειραματικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε φυτικό υλικό δύο ειδών του γένους Crocus, του C. sativus και του C. nivalis. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν αποξηραμένοι στύλοι του είδους Crocus sativus, τους οποίους προμηθευτήκαμε από το εμπόριο. Η χρονολογία συγκομιδής τους ήταν το 2014 και της συσκευασίας τους το Η εταιρεία που τους διαθέτει είναι ο Αναγκαστικός Συνεταιρισμός Κροκοπαραγωγών Κοζάνης και η κάθε συσκευασία περιέχει 1 γραμμάριο ξηρών στύλων. Η συσκευασία φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου και σκοτεινό περιβάλλον. Εικόνα 23: Εμπορική συσκευασία του Crocus sativus που διατίθεται από τον Αναγκαστικό Συνεταιρισμό Κροκοπαραγωγών Κοζάνης. Όσον αφορά το είδος Crocus nivalis, χρησιμοποιήθηκαν και σε αυτή την περίπτωση ξηροί στύλοι, οι οποίοι συλλέχθηκαν από τρεις διαφορετικές περιοχές, δύο του όρους Παναχαϊκού (Περιοχή Καλαβρύτων, ΒΔ Πελοπόννησος) και μια του όρος Χελμού (Περιοχή Ξηροκάμπου, ΒΔ Πελοπόννησος). Η συλλογή και ταυτοποίηση των στύλων από τις δύο περιοχές του Παναχαϊκού έγινε τον Μάρτιο του 2015 από την Δρ. Κωνσταντίνα Ζέλιου και των στύλων της περιοχής Ξηροκάμπου τον Απρίλιο του 2015 από τον Καθηγητή Γρηγόριο Ιατρού, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών. Η διαδικασία της συλλογής και της αποξήρανσης των στύλων ακολούθησε το γενικό πρωτόκολλο, όπως αυτό περιγράφεται στο πεδίο «Συγκομιδή του φυτού». 39

60 Β. Χημικά αντιδραστήρια Υγροί διαλύτες Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν για τις HPLC αναλύσεις ήταν όλοι HPLC gradient. Αναλυτικότερα, η μεθανόλη (MeOH), το ακετονιτρίλιο (AcCN) και το τριφθοροξικό οξύ (TFA) ήταν 99,9% καθαρότητας της εταιρείας Sigma-Aldrich. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε υπερκαθαρό νερό (αγωγιμότητας <18ΜΩ) από συσκευή παραγωγής υπερκαθαρού νερού Millipore (Merck Millipore, Germany). Το οξικό οξύ (CH 3 COOH) [glacial, % a.r.] ήταν της εταιρείας Chem-LAB.Το πυκνό υδροχλωρικό οξύ (HCl) [fuming 37% for analysis] ήταν της εταιρείας Merck. Το θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) [95-97% καθαρότητα, LOT: SZBA0810] και η αιθανόλη (EtOH) [ 99,8% καθαρότητα, LOT: SZBE2190V] ήταν της εταιρείας Sigma-Aldrich. To διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) [ 99,9% καθαρότητα, LOT: SHBF7881V] ήταν της εταιρείας SIGMA. Ο πετρελαικός αιθέρας [ 90% καθαρότητα, LOT: STBG0824V] και ο διαιθυλαιθέρας [εμπεριέχει BHT, 99,8% καθαρότητα, LOT: STBF2866V] ήταν της εταιρείας Sigma-Aldrich. Στερεά αντιδραστήρια Η ισοφορόνη που χρησιμοποιήθηκε [97% καθαρότητα, LOT: ] ήταν της εταιρείας Alfa Aesar, η σαφρανάλη [>88% καθαρότητα, LOT: ΜΚΒC1684V] της Sigma-Aldrich, η κροκετίνη [Cat No: ] της εταιρείας MP Biomedicals και η κερσετίνη [ 99% καθαρότητα, LOT: ]. To xλωριούχο νάτριο (NaCl) [analytical reagent, LOT: ] ήταν της εταιρείας Fisher Scientific, το ανυδρο θειικό νάτριο (Na 2 SO 4 ) της εταιρείας ΡΕΝΤΑ, το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (BHT) [ 99% καθαρότητα, LOT: 59Η0368] της εταιρείας SIGMA, το οξικό νάτριο (CH 3 COONa) [analytical reagent, LOT: K ] της εταιρείας Merck, η 2,4,6- τριπυριδυλο-s-τριαζίνη (ΤΡΤΖ) [[ 99% καθαρότητα, LOT: ] της εταιρείας Fluka, ο εξαϋδρίτης χλωριούχου σιδήρου (FeCl 3 * 6H 2 O) [analytical reagent, LOT: 7Β010688] της εταιρείας AppliChem και ο εξαϋδρίτης χλωριούχου αργιλίου (AlCl 3 * 6H 2 O) τηε εταιρείας ALDRICH. 40

61 Γ. Όργανα και σκεύη Η ανάλυση των αιθέριων ελαίων πραγματοποιήθηκε με σύστημα Αέριας Χρωματογραφίας Φασματομετρίας Μάζας (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS) με τα εξής χαρακτηριστικά: i) Αέριος Χρωματογράφος 6890N GC: τριχοειδής στήλη HP-5MS capillary column (30m x 0.25mm, 0.25μm), φέρον αέριο: ήλιο (He) υψηλής καθαρότητας και ii) Φασματόμετρο Μάζας 5975Β inert MSD της εταιρίας Agilent Technologies (U.S.A.). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Agilent MSDChem. Οι GC-MS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο σύνολο τους στο Κέντρο Ενόργανης Ανάλυσης του Πανεπιστημίου Πατρών. Η επεξεργασία των φασμάτων του GC-MS έγινε με την βοήθεια του προγράμματος AMDIS και η ταυτοποίηση των συστατικών με την βοήθεια της φασματικής βιβλιοθήκης Nist MS Search v.2.0. Για την απομόνωση των αιθέριων ελαίων χρησιμοποιήθηκε το λουτρό υπερήχων Β-2200 της εταιρίας Branson (U.S.A.) με λειτουργικά χαρακτηριστικά: 47 khz± 6%, 120W, 220V. Η ανάλυση των μεθανολικών εκχυλισμάτων του Crocus sativus και Crocus nivalis πραγματοποιήθηκε με σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης συζευγμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιοδίων ( High Performace (ή Pressure) Liquid Chromatography - Diode Array Detector, HPLC-DAD) με τα εξής χαρακτηριστικά: i) αντλία παλινδρόμησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 3000Pump (Pump LPG-3400A), ii) θερμοστατούμενος χώρος, όπου τοποθετείται η αναλυτική χρωματογραφική στήλη (Column Compartment TCC-3100) και iii) ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιοδίων (Diode Array Detector, DAD), υπεριώδους-ορατού (Ultraviolet-Visual UV-Vis) Ultimate DAD-3000 diode Array Detector, της εταιρείας Dionex Corporation (U.S.A.). Επίσης, χρησιμοποιήθηκε βαλβίδα έγχυσης 8125 της εταιρείας Rheodyne (U.S.A.) με βρόχο χωρητικότητας 20 μl. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν ανάστροφης φάσης Luna C-18, 100 Å (250mm x 4,6mm, 5μm) της εταιρίας Phenomenex (U.S.A.) και η προ-στήλη ήταν η Security Guard Cartidges C-18 (4 x 3,0 mm) I.D. της εταιρίας Phenomenex (U.S.A.). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για την συλλογή και επεξεργασία των δεδομένων είναι το CHROMELEON v

62 Η ανάλυση των μεθανολικών δειγμάτων των φυτικού υλικού με τη συζευγμένη τεχνική Υγρής Χρωματογραφίας Φασματομετρίας Μάζας (LC-MS) πραγματοποιήθηκε με σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υπερυψηλής Απόδοσης, συνδεδεμένης με Φασματόμετρο Μάζας (Ultra Performance Liquid Chromatography, Mass Spectometry, UPLC-MS) της εταιρείας Waters Corporation (U.S.A.). Το φασματόμετρο μάζας διέθετε υβριδικό αναλυτή τετραπόλου - χρόνου πτήσης (Quadrupole Time of Flight, Q-TOF). Τα φάσματα MS ελήφθησαν με την τεχνική του ηλεκτροψεκασμού (Electron Spray Ionization, ESI). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντίστροφης φάσης BEH C18 (130 Å, 2.1 mm x 100 mm, 1,7 μm), της εταιρείας Waters Corporation (U.S.A.). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων ήταν το MassLynx V4.1 από την εταιρεία Waters Corporation ( U.S.A.). Οι αναλύσεις διεξήχθησαν στο Βιοαναλυτικό Εργαστήριο του Ερευνητικού Κέντρου ΓΑΙΑ, που βρίσκεται στο μουσείο Γουλανδρή Φυσικής Ιστορίας στην Κηφισιά από τον Δρ. Νικόλαο Κουλακιώτη, με την συνεργασία του Καθηγητή Αντωνίου Τσαρμπόπουλου. Η ανάλυση του υδρολυθέντος εκχυλίσματος του C. nivalis έγινε σε όργανο HPLC αναλυτικής κλίμακας Mod.10 AKTA, Amersham Biosciences, Piscataway (U.S.A.) με αντλία P-900, βαλβίδα έγχυσης INV 907 με βρόχο 1mL και ανιχνευτή PV 908. Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε είναι το Unicorn v Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε είναι η Luna 5u C18 (2) 100A (250x4,6mm) της εταιρείας Phenomenex (U.S.A.). Για τα in vitro πειράματα μελέτης της αντιοξειδωτικής δράσης και του προσδιορισμού του ολικού ποσού των φλαβονοειδών των φυτικών εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκαν πλαστικές μικροπλάκες 96-κελίων. Οι φωτομετρικές αναλύσεις έγιναν με την βοήθεια του φωτομετρου SunriseΤΜ της εταιρίας TECAN και την χρήση του υπολογιστικού προγράμματος XFLuoR4. Για τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν φίλτρα με μήκη κύματος 405, 540 και 595nm. Για την φόρτωση των μικροπλακών χρησιμοποιήθηκαν ηλεκτρονικές μικροπιπέτες Nichipet της εταιρίας Nichiryo με όγκους μL, μL και 20-2μL. Κατά τις πειραματικές πορείες χρησιμοποιήθηκαν ακόμη τα ακόλουθα όργανα: Συσκευή συμπύκνωσης υπό κενό: Rotavapor R-200 με θερμαντικό λουτρό B-490, BUCHI (USA) Συσκευή λυοφιλοποίησης (freeze-dry system): Freezone 6,Labconco (USA) Vacuum concentrator: centrivap concentrator και centrivap cold trap, Labconco (USA) 42

63 Φυγόκεντρος: J.P. Selecta (Spain) phμετρο: Consort C830, Consort (Belgium) Αναλυτικοί ζυγοί ακριβείας: Kern (Germany) Περιστροφικοί μαγνητικοί αναδευτήρες: CAT M 6,1, Finemesh (USA) και RCT, IKA Werke (Germany) Μικροσύριγγες ακριβείας: Hamilton (Switzerland) Ακόμη χρησιμοποιήθηκαν τα εξής αναλώσιμα: φίλτρα διήθησης διαλυτών διαμέτρου πόρων 0,45 mm, RC και CA type: Macherey-Nagel (Germany), eppendorf 1,5mL και 2mL, falcon 15 ml και 50 ml, σφαιρικές φιάλες, κωνικές φιάλες, ογκομετρικοί κύλινδροι, ποτήρια ζέσεως, υάλινα χωνιά, υάλινες ράβδοι και υάλινα φιαλίδια. Δ. Φυτοχημική ανάλυση στύλων C. sativus και C. nivalis Δ.1. Απομόνωση αιθέριων ελαίων C. sativus και C. nivalis Δ.1.1. Αέριος Χρωματογραφία Φασματομετρία Μάζας (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS) Η Αέριος Χρωματογραφία εμφανίσθηκε πρώτη φορά το 1941 από τους Martin και Synge, ωστόσο το 1950 αναδείχθηκε πειραματικά η πρακτική αξία της τεχνικής από τους James και Martin. Το πρώτο εμπορικά διαθέσιμο αεριοχρωματογραφικό σύστημα εμφανίσθηκε στην αγορά το 1955, ενώ μέχρις σήμερα και με την πρόοδο της επιστήμης τα μηχανήματα αυτά έχουν βελτιστοποιηθεί και αποτελούν πλήρως αυτοματοποιημένα όργανα. Στην Αέριο Χρωματογραφία η κινητή φάση είναι ένα αδρανές αέριο (όπως Ν 2, Η 2, Ηe, Ar) και η στατική φάση μπορεί να είναι στερεή (Gas-Solid Chromatography GSC) ή υγρή ακινητοποιημένη στη επιφάνεια ενός αδρανούς στερεού (Gas-Liquid Chromatography GLC). Συγκεκριμένα, το προς ανάλυση δείγμα διαλύεται σε ένα πτητικό διαλύτη (πχ εξάνιο, διαιθυλαιθέρα) και εγχύεται με την βοήθεια μιας μικροσύριγγας διαμέσου μιας ελαστικής πλακέτας ή ενός διαφράγματος (septum) στην ειδική οπή έγχυσης του δείγματος (αναφέρεται 43

64 και ως βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος), η οποία βρίσκεται πριν την στήλη. Το αδρανές αέριο από την φιάλη υψηλής πίεσης όπου είναι αποθηκευμένο μέσω του ρυθμιστή πίεσης και του ροομέτρου φέρεται στην στήλη συμπαρασύροντας μαζί του και το δείγμα. Στον καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος έχει παρατηρηθεί ότι σημαντικό ρόλο παίζει η θερμοκρασία. Έτσι, η στήλη είναι τοποθετημένη στο εσωτερικό ενός κλιβάνου, η θερμοκρασία του οποίου ρυθμίζεται ανάλογα με το επιθυμητό θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα μπορεί να είναι είτε ισοκρατικό, δηλαδή να διατηρείται σταθερή η θερμοκρασία καθ όλη την πορεία είτε διαβαθμιζόμενο, δηλαδή να μεταβάλλεται χρονικά. Μετά την στήλη τα διαχωριζόμενα συστατικά του δείγματος φέρονται στον ενισχυτή του σήματος και καταγράφονται με τη μορφή χρωματογραφήματος. Κάθε κορυφή που απεικονίζεται σε αυτό αντιστοιχεί σε ένα συστατικό και μπορεί ευκόλως να ταυτοποιηθεί και να ποσοτικοποιηθεί. Η ταυτοποίηση του γίνεται μέσω του χρόνου έκλουσης του (Retention time, t R ) που αντιστοιχεί στο χρονικό διάστημα από την στιγμή της έγχυσης του δείγματος και της εμφάνισης της κορυφής του ενώ η ποσοτικοποίηση γίνεται μέσω του εμβαδού της κορυφής. Εικόνα 24: Σχηματική απεικόνιση ενός μηχανήματος Αέριας Χρωματογραφίας [37]. Η στατική φάση βρίσκεται τοποθετημένη στο εσωτερικό μιας στήλης. Ανάλογα με τον τύπο της υπάρχουν δύο είδη στηλών οι πληρωμένες (packed) και οι ανοικτού σωλήνα (open tubular) ή τριχοειδείς (capillary). Κατασκευάζονται από ανοξείδωτο χάλυβα, ύαλο, τετηγμένο πυρίτιο ή 44

65 Teflon, ενώ το υλικό πλήρωσης τους μπορεί να είναι πολυ-(διμεθυλο)-σιλοξάνιο, πολυ- (φαινυλομεθυλο)-σιλοξάνιο και πολυ-(δικυανοαλλυλοδιμεθυλο)-σιλοξάνιο. Το μήκος τους κυμαίνεται από 1-2 m για τις πληρωμένες στήλες και αρκετών εκατοντάδων μέτρων για τις τριχοειδείς. Συνήθως διαθέτουν μορφή σπειράματος U για καλύτερη απόδοση και για να καταλαμβάνει λιγότερο χώρο εντός του κλιβάνου. Τα σπειράματα που σχηματίζουν έχουν μήκος m. Η διαχωριστική ικανότητα της στήλης μπορεί να βελτιωθεί με την αύξηση του μήκους της, οδηγώντας έτσι και στην αύξηση του χρόνου διαχωρισμού των συστατικών του δείγματος. Το αδρανές αέριο που χρησιμοποιείται ως κινητή φάση πρέπει να βρίσκεται σε υπερκάθαρη κατάσταση και να μπορεί να διαφοροποιηθεί στον ανιχνευτή, από τα διάφορα συστατικά του μίγματος. Ακόμη κρίνεται απαραίτητο να είναι απαλλαγμένο από υγρασία καθώς η υγρασία προκαλεί οξείδωση της στατικής φάσης και κατ επέκταση καταστροφή της στήλης. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο στην ανάλυση πτητικών ενώσεων ή παραγώγων. Συγκεκριμένα μέσω της τεχνικής της παραγωγοποίησης (derivatization) το προσδιοριζόμενο μόριο με την βοήθεια κατάλληλου αντιδραστηρίου μετασχηματίζεται σε περισσότερο πτητικό παράγωγο με βελτιωμένες χρωματογραφικές ιδιότητες. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται πριν της ανάλυση το δείγματος μέσω της αέριας χρωματογραφίας και οι κυριότεροι τύποι αντιδράσεων είναι η αλκυλίωση, ακυλίωση και σιλιλίωση ή σιλανοποίηση. (2) Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγεται η υψηλή διαχωριστική ικανότητα και η υψηλή ικανότητα ανίχνευσης των αναλυόμενων συστατικών που κυμαίνεται σε μερικά δισεκατομμυριοστά του γραμμαρίου (ng) και σε ορισμένες περιπτώσεις φτάνει τα μερικά τρισεκατομμυριοστά του γραμμαρίου (pg). Στους σύγχρονους αεριοχρωματογράφους υπάρχει η δυνατότητα σύνδεσής τους με ένα φασματόμετρο μάζας. Συγκεκριμένα με τη βοήθεια της κατάλληλης συνδεσμολογίας μετά την στήλη του αεριοχρωματογράφου τα διαχωρισμένα συστατικά του δείγματος περνούν στο φασματόμετρο μάζας. Εκεί το κάθε ένα συστατικό θραυσματοποιείται και τελικώς λαμβάνεται ένα χρωματογράφημα που δείχνει τον λόγο μάζας προς φορτίο (m/z) των θραυσμάτων που προκύπτουν του κάθε ενός συστατικού. Το φασματόμετρο μάζας αποτελείται συνήθως από τα εξής μέρη: 45

66 Το θάλαμο ιοντισμού, όπου μετατρέπεται η ένωση σε ιόντα με την βοήθεια της κατάλληλης πηγής ιοντισμού. Πιο αναλυτικά, υπάρχουν οι εξής κατηγορίες πηγών ιοντισμού: Πηγές Αέριας Φάσης: Το δείγμα αρχικώς εξαερώνεται και μετέπειτα ιονίζεται. Οι πηγές αυτές χρησιμοποιούνται κυρίως σε θερμικά σταθερές ενώσεις. Παραδείγματα πηγών αέριας φάσης είναι οι πηγές ιοντισμού πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (EI) και οι πηγές χημικού ιοντισμού (CI). Πηγές εκρόφησης: Το δείγμα είναι σε στερεή ή υγρή μορφή και μετατρέπεται απευθείας σε ιόντα σε αέρια κατάσταση. Οι πήγες αυτές χρησιμοποιούνται κυρίως σε μη πτητικές ή θερμικώς ασταθείς ενώσεις καθώς δεν απαιτούν εξάτμιση των μορίων του αναλύτη. Παραδείγματα πηγών εκρόφησης είναι οι πηγές ιοντισμού πεδίου (FI), οι πηγές ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI), οι πηγές ιοντισμού εκρόφησης με την βοήθεια υλικού μήτρας (MALDI), οι πηγές βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (FAB) και, τέλος, οι πηγές ιοντισμού με θερμοψεκασμό (TSI). Ως προς την παραγωγή θραυσμάτων οι πηγές διαχωρίζονται σε μαλακές και σκληρές. Στις μαλακές πηγές ιοντισμού προκαλείται περιορισμένη θραύση στα μόρια του δείγματος, ενώ στις σκληρές πηγές ιοντισμού μεταδίδεται στα μόρια του δείγματος αρκετή ενέργεια ώστε να παραμείνουν σε έντονα διεγερμένη κατάσταση. Τον αναλυτή μαζών, όπου γίνεται διαχωρισμός των ιόντων με βάση το λόγο m/z. Ο αναλυτής αποτελείται από ένα σωλήνα σε σχήμα τόξου, που βρίσκεται μέσα σε ομογενές μαγνητικό πεδίο μεγάλης έντασης ( gauss) και σε διεύθυνση κάθετη προς τις δυναμικές γραμμές του μαγνητικού πεδίου. Με δύο κυκλικές οπές διαφράγματα μεταβλητής ακτίνας στην αρχή και στο τέλος του σωλήνα ένα μέρος από τα ιόντα που δεν εστιάζονται στο κέντρο των διαφραγμάτων απορρίπτεται. Toν ανιχνευτή. 46

67 Ο ανιχνευτής αποτελεί το τελικό μέρος του φασματόμετρου μάζας. Είναι ένα ειδικό μηχάνημα το οποίο αναγνωρίζει και καταγράφει κάθε αλλαγή που προκαλείται από την διέλευση και την θραυσματοποίηση της ένωσης που αναλύεται. Πιο συγκεκριμένα, καταγράφει κάθε ελάττωση ή αύξηση του φορτίου που παράγεται ύστερα από την διέλευση ή πρόσκρουση ενός ιόντος σε μια επιφάνεια. Οι συνηθέστερες τεχνικές ανίχνευσης είναι το Κύπελλο Faraday (Faraday cup), ο Ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής (Electron Multiplier, EM), ο Ανιχνευτής Daly (Daly detector), και τέλος η Πλάκα Μικροδιόδων (Microchannel plate). Σημαντικό ρόλο στη σωστή ανάλυση διαδραματίζει το υψηλό κενό που επικρατεί στον θάλαμο ιοντισμού. Λόγω αυτού δημιουργούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες θέρμανσης ατμοί των ενώσεων του δείγματος χωρίς όμως να προκαλείται η διάσπασή τους. Οι ατμοί οδηγούνται στο θάλαμο ιοντισμού προκειμένου να λάβει χώρα ο ιοντισμός των ενώσεων και η θραυσματοποίηση τους. Το υψηλό κενό βοηθάει επίσης στην απομάκρυνση των μορίων της και των ουδέτερων προϊόντων της διάσπασης από το χώρο της ανάλυσης μετά από κάθε μέτρηση. Δ.1.2. Πειραματική πορεία απομόνωσης αιθέριων ελαίων Για την παραλαβή και ανάλυση του αιθέριου ελαίου από τους στύλους του C. sativus και του C. nivalis χρησιμοποιήθηκε η τεχνική που προτάθηκε από τους Kanakis et al. Συγκεκριμένα, σε αυτή την τεχνική το φυτικό υλικό εκχυλίζεται με οργανικό διαλύτη με την χρήση υπερήχων (Ultrasonic Extraction, USE) [36]. Στην εκχύλιση με υπερήχους, το δείγμα τοποθετείται με τον κατάλληλο οργανικό διαλύτη ή σύστημα διαλυτών σε λουτρό υπερήχων. Η διάδοση των υπερήχων χαρακτηρίζεται από ελάχιστη συχνότητα 16kHz και προκαλεί κίνηση του υγρού λόγω συμπίεσης και αραίωσης. Με την αύξηση της πίεσης επιτυγχάνονται φαινόμενα διείσδυσης και μεταφοράς, ενώ με την αύξηση της θερμοκρασίας επιταχύνονται φαινόμενα διάχυσης και διαλυτοποίησης. Με την χρήση των υπερήχων μειώνεται ο χρόνος εκχύλισης ενώ, χρησιμοποιούνται μικρότεροι όγκοι διαλυτών. Βασικό στοιχείο είναι η διατήρηση της θερμοκρασίας σε σταθερά επίπεδα, καθώς τα συστατικά των αιθέριων ελαίων είναι θερμοευαίσθητα και οποιαδήποτε ακραία αλλαγή της θερμοκρασίας μπορεί να οδηγήσει στην καταστροφή τους. (3) 47

68 Ως διαλύτης εκχύλισης χρησιμοποιήθηκε το διφασικό σύστημα διαλυτών διαιθυλαιθέρας : νερό σε αναλογία 1:1, καθώς σύμφωνα με τους Kanakis et al. φαίνεται ότι αποτελεί το κατάλληλο εκχυλιστικό μέσο για την παραλαβή των συστατικών του αιθέριου ελαίου αλλά και των υδατοδιάλυτων συστατικών των στύλων των μελών του γένους του κρόκου. Λεπτομερώς, ακολουθήθηκε η εξής πειραματική πορεία: Εντός σφαιρικής φιάλης των 100mL προστέθηκαν 200mg ολόκληρων στύλων και 10mL του συστήματος διαλυτών (διαιθυλαιθέρας:νερό, 1:1). Στην φιάλη εφαρμόσθηκε κάθετος ψυκτήρας και το σύστημα τοποθετήθηκε εντός του λουτρού των υπερήχων για 10min απουσία φωτός. Η παρουσία του κάθετου ψυκτήρα διασφαλίζει ότι οι παραγόμενοι κατά την διαδικασία της εκχύλισης ατμοί, οι οποίοι περιέχουν τα πτητικά συστατικά του δείγματος, υγροποιούνται και επιστρέφουν στην σφαιρική φιάλη. Έτσι, δεν έχουμε απώλειες στη συλλογή του ολικού εκχυλίσματος. Επιπλέον, η απουσία φωτός διασφαλίζει ότι τα φωτοευαίσθητα συστατικά του φυτικού υλικού θα παραμείνουν αναλλοίωτα. Μετά το πέρας τον 10min, το εκχύλισμα συλλέχθηκε και φυλάχθηκε εντός κωνικής φιάλης απουσία φωτός και σε θερμοκρασία δωματίου. Στην σφαιρική φιάλη με το φυτικό υλικό προστέθηκαν 10mL του συστήματος των διαλυτών και διαδικασία επαναλήφθηκε όπως προηγουμένως. Συνολικά η περιγραφόμενη διαδικασία της εκχύλισης έγινε 5 φορές και καθ όλη την διάρκεια της διατηρούνταν σταθερές οι συνθήκες περιβάλλοντος. Μετά την ολοκλήρωση της εκχύλισης, το συνολικό εκχύλισμα (50mL) τοποθετήθηκε σε διαχωριστική χοάνη μαζί με 20mL κεκορεσμένου διαλύματος NaCl. Ακολούθησε ήπια ανάδευση και συλλογή της υδατικής και της οργανικής φάσης σε δύο διαφορετικά δοχεία. Η προσθήκη του κεκορεσμένου διαλύματος NaCl έχει επιλεχθεί καθώς βοηθάει στον καλύτερο διαχωρισμό της υδατικής από την οργανική φάση. Συγκεκριμένα, ο διαιθυλαιθέρας έχει την τάση σε θερμοκρασία δωματίου να διαλύει 1.5% του νερού όταν αυτά συνυπάρχουν σε κοινό διάλυμα και αντιστοίχως να διαλύεται σε ποσοστό 7.5% στο νερό. Με την προσθήκη του κεκορεσμένου διαλύματος NaCl μειώνεται η τάση του διαιθυλαιθέρα τόσο να διαλύεται όσο και να διαλύει το νερό και έτσι επιτυγχάνεται ο καλύτερος διαχωρισμός των φάσεων. 48

69 Στη συνέχεια της πειραματικής πορείας έγινε δύο φορές εκχύλιση της υδατικής φάσης με 20mL διαιθυλαιθέρα εκάστη. Το συνολικό οργανικό εκχύλισμα (40mL) συλλέχθηκε και αναμείχθηκε με το αρχικό οργανικό εκχύλισμα (50mL). Έπειτα, ακολούθησε έκπλυση του συνολικού οργανικού εκχυλίσματος (90mL) με κεκορεσμένο διάλυμα NaCl με αναλογία υδατική φάση : οργανική φάση 3:1. Τέλος, το λαμβανόμενο οργανικό εκχύλισμα και ξηράνθηκε με προσθήκη άνυδρου Na 2 SO 4, διηθήθηκε μέσω πτυχωτού ηθμού και συμπηκνώθηκε με αέριο άζωτο μέχρι τελικού όγκου περίπου 5mL. Η συνολική υδατική και η οργανική φάση (5mL) αποθηκεύτηκε στην κατάψυξή σε γυάλινα δοχεία. Δ.1.3. Πρωτόκολλο ανάλυσης αιθέριων ελαίων με την τεχνική GC-MS Η ανάλυση των αιθέριων ελαίων πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο που αναπτύχθηκε από τους Kanakis et al. για την ανάλυση του αιθέριου ελαίου του C. sativus [36]. Συγκεκριμένα, με τη βοήθεια μιας μικροσύριγγας εγχύεται 1μL του δείγματος προς ανάλυση στην ειδική οπή που βρίσκεται στον χώρο ταχείας εξάτμισης του δείγματος. Εκεί η θερμοκρασία έχει ρυθμισθεί στους 200 ο C. Η αρχική θερμοκρασία του προγράμματος ανάλυσης ρυθμίζεται στους 50 ο C, όπου διατηρείται σταθερή για τα πρώτα 3min. Στην συνέχεια, η θερμοκρασία αυξάνεται με ρυθμό 3 ο C/min στους 180 ο C και έπειτα με ρυθμό 15 ο C/min έως ότου φτάσει στους 250 ο C, όπου παραμένει για 5min. Μετά το πέρας αυτού του χρονικού διαστήματος, η θερμοκρασία μειώνεται έως ότου φτάσει στους 60 ο C, όπου και ολοκληρώνεται το πρόγραμμα ανάλυσης έχοντας συνολικό χρόνο 57min. Καθ όλη την διάρκεια του προγράμματος ο ρυθμός ροής είναι 1mL/min, ενώ η μέθοδος χαρακτηρίζεται ως splitless, δηλαδή εισάγεται το δείγμα στη στήλη προς ανάλυση εξ ολοκλήρου από την αρχή. 49

70 Δ.2. Εκχύλιση στύλων C. sativus και C. nivalis Δ.2.1. Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performace (ή Pressure) Liquid Chromatography, HPLC) Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) είναι μια εξελιγμένη μορφή της Υγρής Χρωματογραφίας Στήλης στην οποία η κινητή φάση διαβιβάζεται με την εφαρμογή υψηλής πίεσης στην στατική φάση. Η τεχνική αναπτύχθηκε λόγω των διαφόρων προβλημάτων που παρουσιάζονταν στην ανάλυση με απλή Υγρή Χρωματογραφία, όπως η εξάρτηση του ρυθμού ροής των διαλυτών από την βαρύτητα και κατ επέκταση η μεγάλη χρονική διάρκεια που χρειαζόταν για την ολοκλήρωση των αναλύσεων. Οι πρώτες μελέτες για την δημιουργία αυτής της τεχνικής έγιναν το 1960, ενώ έως και σήμερα μελετώνται νέες προτάσεις για την βελτίωση της, όπως η μείωση της διαμέτρου των σωματιδίων πλήρωσης της στήλης, η χρήση νέων ειδών υλικών πλήρωσης και νέων αντλιών υψηλού κενού. Η τεχνική αυτή συγκεντρώνει το ενδιαφέρον των ερευνητών καθώς θεωρείται η πλέον κατάλληλη για τον ακριβή και επαναλήψιμο προσδιορισμό ενός μεγάλου εύρους οργανικών και ανόργανων ενώσεων. Στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης ο διαχωρισμός των συστατικών ενός δείγματος γίνεται μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. Η στατική φάση βρίσκεται στο εσωτερικό μιας στήλης και συνήθως χρησιμοποιούνται ως υλικά πλήρωσης πτητικά ή μη πτητικά υγρά, πολυμερή ή και είδη χημικών ουσιών που έχουν δεσμευτεί με χημικό τρόπο πάνω σε αδρανή υποστρώματα. Τα υλικά πλήρωσης των στηλών αποτελούνται από σωματίδια μεγέθους μέχρι 2 έως 10 μm, με σφαιρικό ή ακανόνιστο σχήμα. Οι στήλες που χρησιμοποιούνται είναι ευθύγραμμοι σωλήνες και κατασκευάζονται από ανοξείδωτο χάλυβα, έχουν συνολικό μήκος 10 έως 100cm και διάμετρο 2 έως 10mm [38]. Η κινητή φάση μπορεί να είναι ένας διαλύτης ή ένα σύστημα διαλυτών. Ανάλογα με την πολικότητα των διαλυτών που χρησιμοποιούνται ως κινητή φάση, διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας, την Χρωματογραφία Κανονικής Φάσης (Normal Phase, NP) και την Χρωματογραφία Ανάστροφης Φάσης (Reversed Phase, RP). Στην πρώτη, η στατική φάση είναι πολική (όπως silica gel SiO 2 ή AlO 3 ) και η κινητή φάση σχετικά μη πολική (όπως n-εξάνιο). Αυτός ο τύπος χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πολικών ενώσεων. Στην δεύτερη, η στατική 50

71 φάση είναι μη πολική (υδρόφοβη, SiO 2 συζευγμένο με αλκύλια) και η κινητή φάση πολική (όπως σύστημα διαλυτών μεθανόλης ή ακετονιτριλίου με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό). Ο τύπος αυτός χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μη πολικών ενώσεων. Κατά την ανάστροφη φάση, η ισχύς έκλουσης αυξάνει με την μείωση της πολικότητας του διαλύτη, διότι έτσι ελαττώνεται η συγκράτηση μιας ένωσης στη στατική φάση. Στην περίπτωση ενώσεων που μπορούν να υποστούν ιοντισμό, μια αλλαγή στο ph μπορεί να επηρεάσει τη συγκράτηση και την εκλεκτικότητά τους. Για την ανάλυση ενός δείγματος με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης χρησιμοποιείται κατάλληλο όργανο. Βασικά μέρη του μηχανήματος είναι: Η αντλία. Η αντλία αποτελεί το σύστημα παροχής της κινητής φάσης. Μέσω των κατάλληλων σωληνώσεων συνδέεται με τα ξεχωριστά δοχεία όπου βρίσκονται οι διαλύτες έκλουσης. Ανάλογα με το πρόγραμμα έκλουσης που χρησιμοποιείται κάθε φορά, η αντλία κανονίζει την σύσταση της κινητής φάσης και τον ρυθμό ροής της. Η αντλία που χρησιμοποιείται σε αυτού του τύπου τα μηχανήματα πρέπει να είναι ανθεκτική σε υψηλές συνθήκες πίεσης ( psi) και να εγγυάται σταθερότητά στην παροχή (ροή) της κινητής φάσης. Υπάρχουν τρεις τύποι αντλιών οι παλινδρομικές, οι αντλίες σύριγγας ή εκτόπισης και οι πνευματικές ή σταθερής πίεσης. Στα περισσότερα από τα σύγχρονα μηχανήματα ανάλυσης HPLC, η αντλία διαθέτει σύστημα απαέρωσης των διαλυτών, με το οποίο απομακρύνεται τυχόν ποσότητα εγκλωβισμένου αέρα από τους διαλύτες που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν. Επίσης, η αντλία είναι απαραίτητη για την εξισορρόπηση του μηχανήματος και της στήλης πριν αρχίσει η διαδικασία ανάλυσης του δείγματος. Για την σωστή λειτουργία της αντλίας απαραίτητη είναι η χρήση και ανανέωση του λιπαντικού των μεταλλικών μερών της όπως οι βαλβίδες. Η στήλη. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, η στήλη εμπεριέχει την στατική φάση. Ανάλογα με το υλικό πλήρωσης της κάθε στήλης μπορεί να χρησιμοποιηθεί η κατάλληλη για την ανάλυση του δείγματος που επιθυμούμε. Εκτός από το υλικό πλήρωσης της στήλης σημαντικό ρόλο στην ανάλυση έχει και το μέγεθος της. Στήλες με μεγαλύτερη διάμετρο και μήκος μπορούν να αναλύσουν μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος, ενώ στήλες με μικρότερη διάμετρο και μεγάλο μήκος μπορούν να διαχωρίσουν με μεγαλύτερη ακρίβεια τα συστατικά του δείγματος. Ο πιο συνηθισμένος τύπος στήλης έχει μήκος 25 cm, εσωτερική διάμετρο 4,6 mm και υλικό πλήρωσης 51

72 με σωματίδια μεγέθους 5 μm. Πολλές φορές πριν την αναλυτική στήλη, παρεμβάλλεται μια μικρότερου μήκους στήλη, η οποία ονομάζεται προστατευτική στήλη (guard column) ή προστήλη (pre-column). Ο λόγος χρήσης της είναι η προστασία της αναλυτικής στήλης από τυχόν μικροσωματίδια και βρωμιές που πιθανώς βρίσκονται στο δείγμα ή στους διαλύτες έκλουσης, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο ζωής της αναλυτικής στήλης. Κάθε φορά πρέπει να χρησιμοποιείται προ-στήλη με ίδιο υλικό πλήρωσης με την αναλυτική στήλη. Σύστημα εισαγωγής δείγματος. Το σύστημα εισαγωγής δείγματός μπορεί να είναι αυτόματο ή χειροκίνητο. Στο αυτόματο, το μηχάνημα λαμβάνει από την ειδική θέση που έχουμε τοποθετήσει το φιαλίδιο με το δείγμα, συγκεκριμένη ποσότητα χωρίς να χρειάζεται η ανάμειξη του ερευνητή. Αντίθετα, στο χειροκίνητο ο ερευνητής με την βοήθεια μιας μικροπιπέτας διαβιβάζει στην βαλβίδα εισαγωγής την κατάλληλη ποσότητα δείγματος. Και στις δύο περιπτώσεις, η βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος καθ όλη την διάρκεια της ανάλυσης παραμένει κλειστή και ανοίγει μόνο όταν γίνεται η έγχυση του δείγματος. Αμέσως μετά την βαλβίδα, βρίσκεται ο βρόγχος της εισαγωγής του δείγματος (loop). Σε αυτόν περνάει το δείγμα και από αυτόν μεταφέρεται με την βοήθεια του συστήματος έκλουσης στην στήλη για ανάλυση. Ανάλογα με την ποσότητα του δείγματος που εγχέεται χρησιμοποιείται ο κατάλληλος βρόγχος, ενώ πάντα φροντίζουμε να περάσει από αυτόν αρκετή ποσότητα του συστήματος έκλουσης έτσι ώστε να απομακρυνθεί από αυτόν όλη η ποσότητα του δείγματος και να ελαχιστοποιηθούν τυχόν απώλειες. Το σύστημα έκλουσης των διαλυτών περνάει από αυτόν μόνο κατά την διάρκεια της φόρτωσης του δείγματος στην στήλη. Ανάλογα με τον τύπο της στήλης που χρησιμοποιείται, κανονίζεται και η ποσότητα του δείγματος που θα αναλυθεί. Σε γενικά πλαίσια το μέγεθος του δείγματος που μπορεί να αναλυθεί είναι μL. Ο ανιχνευτής. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι οι ανιχνευτές: α) δείκτη διαθλάσεως, β) υπεριώδους ορατού, γ) φθορισμού, δ) υπερύθρου, ε) ηλεκτροχημικοί και στ) φασματομετρίας μάζας. Σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως ο συνδυασμός ανιχνευτών UV-Vis με ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector, DAD) για την ανίχνευση φαινολικών οξέων και φλαβονοειδών [39]. Γενικός κανόνας είναι οι χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές να χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία, χαμηλά όρια ανίχνευσης, ελάχιστα επίπεδα θορύβου και να παραμένουν αμετάβλητοι σε μεταβολές της θερμοκρασίας και του ρυθμού ροής της κινητής φάσης. Ο ανιχνευτής αναγνωρίζει κάθε αλλαγή της απορρόφησης του διαλύματος που 52

73 περνάει κάθε φορά από μπροστά του και παράγει ένα σήμα. Αυτό στην συνέχεια αναγνωρίζεται από το κατάλληλο λογισμικό που είναι εγκατεστημένο στον συνδεδεμένο με το μηχάνημα ηλεκτρονικό υπολογιστή και καταγράφεται ως χρωματογράφημα. Σε αυτό απεικονίζονται τα συστατικά του δείγματος ως ξεχωριστές κορυφές, κάθε μια από τις οποίες μπορεί να χαρακτηρισθεί από τον χρόνο έκλουσης της (Elution/Retention time, t R ). Ηλεκτρονικός Υπολογιστής Καταγραφέας. Το μηχάνημα HPLC είναι συνδεδεμένο με έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή στον οποίο είναι εγκατεστημένο το λογισμικό χειρισμού και λειτουργίας του μηχανήματος HPLC, το οποίο παρέχεται από την εταιρεία διάθεσης του οργάνου. Με αυτό το λογισμικό μπορεί να γίνει προετοιμασία του μηχανήματος και της στήλης πριν την εισαγωγή του δείγματος, να σχεδιαστεί το κατάλληλο πρωτόκολλο έκλουσης και να καθορισθούν όλες οι παράμετροι (ροή, θερμοκρασία στήλης, μήκη κύματος ανιχνευτή, μέγιστό και ελάχιστο όριο πίεσης στην στήλη, κα.), να ληφθεί το χρωματογράφημα κάθε ανάλυσης και, τέλος, να γίνει ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των λαμβανόμενων χρωματογραφημάτων. Εικόνα 25: Σχηματική περιγραφή ενός HPLC μηχανήματος. [ Η εικόνα αποτελεί μετάφραση της αρχικής του Jacopo Werther]. Κατά την ανάλυση με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης τόσο το δείγμα όσο και οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιούνται και συγκροτούν την κινητή φάση πρέπει να είναι υπερκάθαροι και απαλλαγμένοι από τυχόν σωματίδια ή και βρωμιές που μπορεί να προκαλέσουν βλάβη στην στήλη και στο μηχάνημα. Επίσης πρέπει να ελέγχεται η πίεση της 53

74 στήλης. Χαμηλή πίεση οφείλεται συνήθως στην μη ύπαρξη κατάλληλου κενού (κάποιο σημείο της διάταξης δεν είναι σωστά κλεισμένο), ενώ υψηλή πίεση μπορεί να οφείλεται είτε στην ύπαρξη κάποιου εγκλωβισμένου σωματιδίου στην στήλη ή σε κάποιο άλλο σημείο της διάταξης είτε στην εφαρμογή υψηλής ροής. Σε κάθε περίπτωση όλος ο εξοπλισμός πρέπει να διατηρείται σε υψηλές συνθήκες καθαρότητας και να ελέγχεται ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Όπως και στην περίπτωση της τεχνικής του GC-MS, μπορεί να υπάρξει συζευγμένη τεχνική Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης - Φασματομετρία Μάζας (HPLC-MS ή LC- MS). Σε αυτή την τεχνική, τα διαχωρισμένα συστατικά του δείγματος μετά την στήλη και τον ανιχνευτή περνάνε στο φασματόμετρο μάζας, όπου ιονίζονται και θραυσματοποιούνται. Τα θραύσματα που προκύπτουν οδεύουν στον ανιχνευτή και καταγράφονται με την βοήθεια του κατάλληλου λογισμικού τα φάσματα μάζας για κάθε ένα συστατικό του δείγματος. Έτσι, στο τέλος αυτής της συζευγμένης ανάλυσης λαμβάνεται ένα ολικό χρωματογράφημα όπου κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε ένα συστατικό του δείγματος (HPLC τεχνική) και ξεχωριστά φάσματα μάζας για κάθε ένα συστατικό (MS τεχνική). Δ.2.2. Πρωτόκολλο εκχύλισης Φυτικό υλικό από τους πληθυσμούς του C. sativus και του C. nivalis εκχυλίσθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει αναπτυχθεί και περιγραφεί στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων (Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) από τους Koulakiotis et al. [40]. Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Σε μια κωνική φιάλη τοποθετήθηκαν 50mg ολόκληρων στύλων μαζί με 10mL συστήματος διαλυτών MeOH-ddH 2 O σε αναλογία 1:1. Το σύστημα αφέθηκε υπό ήπια ανάδευση, απουσία φωτός και σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Στην συνέχεια συλλέχθηκε το ολικό εκχύλισμα, το οποίο επεξεργάστηκε κατάλληλα έτσι ώστε να απομακρυνθεί ο διαλύτης. Αρχικά, έγινε συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση της μεθανόλης με εφαρμογή ήπιας θέρμανσης (40-45 ο C) στο υδατόλουτρο του συμπυκνωτή. Έπειτα, ο εναπομείναντας διαλύτης 54

75 απομακρύνθηκε με την βοήθεια του vacuum. Το λαμβανόμενο ξηρό υπόλειμμα χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση με την τεχνική του HPLC και του LC-MS. Δ.2.3. Πρωτόκολλο ανάλυσης εκχυλίσματος με την τεχνική HPLC Πιο συγκεκριμένα, για την ανάλυση του ξηρού εκχυλίσματος του C. sativus και των τριών πληθυσμών του C. nivalis με την τεχνική του HPLC παρασκευάσθηκαν διαλύματα συγκέντρωσης 1mg/mL, με προσθήκη διαλύτη MeOH-ddH 2 O 1:1, v: v. Το πρωτόκολλο ανάλυσης HPLC που εφαρμόσθηκε παρουσιάζεται στον Πίνακα 3 και στην Εικόνα 26 και αναπτύχθηκε από τους Tarantilis et al. [11]. Οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιούνται είναι μεθανόλη και υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 1% v:v. Η ροή των διαλυτών έκλουσης ρυθμίζεται στα 0,7mL/min και η λήψη των χρωματογραφημάτων έγινε στα 250, 308 και 440nm. Πίνακας 3: Πρωτόκολλο ανάλυσης με την τεχνική HPLC των μεθανολικών εκχυλισμάτων C. sativus και C. nivalis. Χρόνος (min) Διάλυμα οξικού οξέος 1% (v/v ) 80% 80% 30% 0% 0% 80% 80% Μεθανόλη(v/v ) 20% 20% 70% 100% 100% 20% 20% 55

76 Εικόνα 26: Σύσταση της κινητής φάσης σε κάθε χρονική στιγμή έκλουσης κατά την HPLC ανάλυση. Δ.2.4. Πρωτόκολλο ανάλυσης εκχυλίσματος με την τεχνική LC-ΜS Τα συστατικά του εκχυλίσματος του C. sativus και του C. nivalis αναλύθηκαν με UPLC-ESI MS και MS/MS τεχνικές. Το φασματόμετρο μάζας διέθετε υβριδικό αναλυτή τετραπόλου - χρόνου πτήσης (Q-TOF). Τα φάσματα MS ελήφθησαν με την τεχνική του ηλεκτροψεκασμού (Electron Spray Ionization, ESI). Η χρωματογραφική ανάλυση έγινε με ένα Acquity UPLCTM σύστημα αποτελούμενο από έναν δυαδικό διαχειριστή των διαλυτών και έναν διαχειριστή των δειγμάτων, ικανό να διατηρεί την θερμοκρασία των δειγμάτων από -5 έως 40oC. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 40oC καθ όλη την διάρκεια των αναλύσεων, ενώ του δείγματος στους 10 oc και τέθηκε σε απουσία φωτός, έτσι ώστε να αποφευχθεί πιθανή απώλεια συστατικών. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν C18 BEH. Ως διαλύτες έκλουσης χρησιμοποιήθηκαν διάλυμα φορμικού οξέος 0,1% σε νερό και ακετονιτρίλιο, ενώ η ροή ρυθμίστηκε στα 0,4mL/min. Ο όγκος κάθε δείγματος ήταν 20μL. Το πρόγραμμα ανάλυσης διήρκησε συνολικά 25 min και είναι το ακόλουθο: 56

77 Ξεκινώντας από 5% ακετονιτρίλιο, η συγκέντρωση του φθάνει στο 50% σε 7 min. Ύστερα ανεβαίνει στο 80% σε 2min και στην συνέχεια στο 100% σε 7min, όπου μένει για 4 min. Έπειτα, επανέρχεται στο 5% σε 2 min, ισορροπώντας σε αυτή την συγκέντρωση για 3 min. Για την λήψη του χρωματογραφήματος πλήρους σάρωσης η ενέργεια σύγκρουσης ορίστηκε σε 5 ev, ενώ για την λήψη των διαδοχικών φασμάτων μάζας βελτιστοποιήθηκε μεταξύ ev. Ακόμη, οι αναλύσεις έγιναν με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης σε κλίμακα μάζας amu. Η ακρίβεια στην μέτρησης υψηλής μάζα εξασφαλίζεται με τη χρήση μιας ένωσης με γνωστή τιμή μάζας (500 pg/ L-1 σε διάλυμα Leu-εγκεφαλίνης, m/=z ), το οποίο εγχέεται συνεχώς με ροή 2 μl/min χρησιμοποιώντας την ενσωματωμένη σύριγγα στην αντλία του οργάνου. Για τον έλεγχο του οργάνου, την λήψη των δεδομένων και την επεξεργασία τους χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό MassLynx V 4.1 (SCN 703). Δ.2.5. Αλκαλική υδρόλυση εκχυλίσματος C.nivalis Η αλκαλική υδρόλυση είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική με την οποία διασπώνται χημικοί δεσμοί μιας ένωσης υπό την επίδραση νερού. Στην συγκεκριμένη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε αυτή η τεχνική προκειμένου να διασπασθούν οι χημικοί δεσμοί στα μόρια των κροκινών που ενώνουν το άγλυκο τμήμα τους (κροκετίνη) με τα σάκχαρα που φέρουν. Η διαδικασία αυτή έλαβε χωρά προκειμένου να διευκρινισθεί εάν οι στύλοι του C. nivalis περιέχουν εκτός της κροκετίνης και άλλα αποκαροτενοειδή. Συγκεκριμένα εκχυλίσθηκε 1g στύλων C. nivalis Χελμού αρχικά με 15mL πετρελαϊκού αιθέρα για 10min και έπειτα με 25mL διαιθυλαιθέρα για 20min υπό κάθετο ψυκτήρα σε λουτρό υπερήχων. Οι στύλοι κατόπιν εκχυλίσθηκαν δύο φορές διαδοχικά με 20mL ddh2o για 1 ώρα έκαστη φορά, υπό ανάδευση και σε θερμοκρασία δωματίου. Το υδατικό εκχύλισμα συλλέχθηκε και κατόπιν έλαβε χώρα η αλκαλική υδρόλυση του. Αρχικά προστέθηκε στάγδην διάλυμα 10% w/v NaOH υπό ανάδευση, απουσία φωτός και σε θερμοκρασία δωματίου. Το αρχικό ph του διαλύματος ήταν 5 και η προσθήκη διαλύματος 10% w/v NaOH μέχρι τελικού ph Το διάλυμα αφέθηκε υπό ανάδευση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και απουσία φωτός. Έπειτα προστέθηκε στάγδην διάλυμα H 2 SO 4 1Ν μέχρις τελικού ph 3. Η πτώση του ph σε όξινες 57

78 τιμές συνοδεύθηκε με την εμφάνιση θολώματος στο διάλυμα, το οποίο οφείλεται στα άγλυκα αποκαροτενοειδή. Το ίζημα της κροκετίνης συλλέχθηκε και ακλούθησαν δύο πλύσεις του με ddh 2 O και μια με MeOH. Τέλος, λάβαμε το ξηρό ίζημα κροκετίνης ύστερα από απομάκρυνση του διαλύτη με την βοήθεια του speed vacuum. Το ίζημα επαναδιαλύεται σε σύστημα διαλυτών DMSO/AcCN/ddH 2 O με αναλογία 1:5:3 v/v και ακολούθησε ανάλυση με HPLC ανάστροφης φάσης. Το πρόγραμμα που χρησιμοποιήθηκε παρουσιάζεται στον Πίνακα 4 και στην Eικόνα 27 και οι διαλύτες έκλουσης ήταν ακετονιτρίλιο με 0,05% τριφθοροξικό οξύ (TFA) και υδατικό διάλυμα TFA 0,05% v/v. Πίνακας 4: Πρωτόκολλο ανάλυσης με την τεχνική HPLC του προϊόντος της αλκαλικής υδρόλυσης του υδατικού εκχυλίσματος των στύλων του C. nivalis. Χρόνος (min) AcCN με 0,05% TFA (v/v ) Διάλυμα TFA 0,05% σε νερό (v/v ) 50% 50% 100% 100% 50% 50% 50% 50% 0% 0% 50% 50% 58

79 Εικόνα 27: Σύσταση της κινητής φάσης σε κάθε χρονική στιγμή έκλουσης κατά την HPLC ανάλυση. Δ.3. In vitro τεχνικές ανάλυσης Δ.3.1. Ικανότητα αναγωγής του κατιόντος σιδήρου Antioxidant Power, FRAP) (Ferric Reducing Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος βασίζεται στην αναγωγή του σιδηρικατιόντος του συμπλόκου Fe(TPTZ) 3+ από μια αντιοξειδωτική ουσία. Πιο συγκεκριμένα, ο τρισθενής σίδηρος σχηματίζει ένα σύμπλοκο με την 2,4,6-τριπυριδυλο-s-τριαζίνη (ΤΡΤΖ), το οποίο έχει την ιδιότητα σε χαμηλό ph και παρουσία ενός αντιοξειδωτικού παράγοντα να ανάγεται και να αλλάζει χρώμα το διάλυμα στο οποίο βρίσκονται. Η αναγωγή του συμπλόκου σε Fe(TPTZ) 2+ γίνεται μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων από την αντιοξειδωτική ένωση, η οποία και οξειδώνεται. Η αλλαγή του χρώματος του συμπλόκου και κατ επέκταση του διαλύματος, αποτελεί ένδειξη της αντιοξειδωτικής δράσης της υπό μελέτης ουσίας, η οποία μπορεί να προσδιοριστεί με την βοήθεια της υπεριώδους φωτομέτρησης του διαλύματος. Η μέτρηση της απορρόφησης γίνεται 59

80 συνήθως στα 593nm, ωστόσο μπορεί να γίνει και σε χαμηλότερες τιμές καθώς επηρεάζεται και από άλλους παράγοντες όπως το χρώμα της αντιοξειδωτικής ένωσης. Η μέτρηση πραγματοποιείται σε πολύ χαμηλό ph (3,6), καθώς έτσι διατηρείται η διαλυτότητα του σιδήρου. Ωστόσο το χαμηλό ph ελαττώνει την ενέργεια ιοντισμού και αυξάνει το δυναμικό οξειδοαναγωγής, επηρεάζοντας την αντίδραση. Η μέθοδος FRAP είναι απλή, γρήγορη, ακριβής και στηρίζεται σε μεγάλο βαθμό στο βαθμό υδροξυλίωσης και κορεσμού των πολυφαινολών [41]. Εικόνα 28: Fe(TPTZ) 3+. Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης οξειδοαναγωγής του συμπλόκου Πειραματική πορεία Η μέθοδος FRAP χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της in vitro αντιοξειδωτικής δράσης του C. sativus και των τριών πληθυσμών του C. nivalis. Για κάθε ένα από αυτά τα φυτικά δείγματα χρησιμοποιήθηκε ξηρή ποσότητα του μεθανολικού εκχυλίσματος, μέρος του οποίου χρησιμοποιήθηκε και για την ανάλυση με HPLC. Το ξηρό εκχύλισμα διαλύθηκε σε συγκεκριμένο όγκο διαλύτη (ddh 2 O) και παρασκευάσθηκε ένα πυκνό αρχικό διάλυμα. Περαιτέρω αραιώσεις του αρχικού διαλύματος οδήγησαν στην παρασκευή διαλυμάτων χαμηλότερων συγκεντρώσεων. Πιο συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις που παρασκευάσθηκαν για κάθε φυτικό πληθυσμό είναι οι ακόλουθες. C. sativus: 0,05mg/mL - 0,8mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Α: 0,3mg/mL - 2mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Β: 0,3mg/mL - 2mg/mL 60

81 C. nivalis Χελμού Περιοχή Ξηρόκαμπου: 2mg/mL- 0,3mg/mL Το αντιδραστήριο FRAP παρασκευάζεται ύστερα από ανάμιξη 75mL ρυθμιστικού διαλύματος οξικών 300mM ph 3,6, 15mL διαλύματος TPTZ (37,44mg TPTZ σε 20mL διαλύματος HCl 40mM) και 15mL διαλύματος FeCl 3 *6H 2 O 20mM. Ως πρότυπα διαλύματα χρησιμοποιήθηκαν υδατικά διαλύματα του FeSO 4 (FeSO 4 *7H 2 O 10mM) με συγκεντρώσεις 0,1mM - 1,2mM. Η αντίδραση έγινε σε μικροπλάκα 96-κελίων. Σε κάθε κελί προστίθενται 52μL ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος, 88μL διάλυμα αντιδραστηρίου FRAP και 60μL διάλυμα δείγματος. Εκτός από τις μετρήσεις της απορρόφησης στα διαλύματα των δειγμάτων και των προτύπων, έγιναν μετρήσεις και σε τυφλά διαλύματα, τόσο των δειγμάτων και των προτύπων όσο και των αντιδραστηρίων. Η φωτομέτρηση έγινε στα 595nm άμεσα και στην συνέχεια τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως μmol FeSO4/mg ξηρού εκχυλίσματος. Δ.3.2. Ικανότητα σάρωσης της ρίζας του DPPH Αρχή της μεθόδου Στόχος της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δράσης μιας ένωσης χρησιμοποιώντας την σταθερή ελεύθερη ρίζα του DPPH (1,1-διφαινυλο-2-πικρυλυδραζύλιο). Η DPPH ρίζα έχει στην δομή της ένα άτομο αζώτου το οποίο έχει ηλεκτρονιακό έλλειμμα. Όταν η ρίζα αυτή βρεθεί στο ίδιο διάλυμα με έναν αντιοξειδωτικό παράγοντα, μεταφέρεται ένα άτομο υδρογόνου από τον τελευταίο στη ρίζα ανάγοντας την (Εικόνα 29). Η αναγωγή που προκαλείται στην ρίζα είναι υπεύθυνη και για την αλλαγή του χρώματος στο διάλυμα. Αρχικά, η ελεύθερη μορφή της DPPH έχει ιώδες χρώμα το οποίο μετατρέπεται σε κίτρινο μετά την προσθήκη του αντιοξειδωτικού παράγοντα. Η αντίδραση αναγωγής διαρκεί περίπου 30min και η φωτομέτρηση στην συνέχεια γίνεται σε μήκος κύματος nm [42]. 61

82 Εικόνα 29: Συντακτικός τύπος της ρίζας DPPH πριν και μετά τη δέσμευση ενός ατόμου υδρογόνου. Πειραματική πορεία Για κάθε ένα από αυτά τα φυτικά δείγματα χρησιμοποιήθηκε ξηρή ποσότητα του μεθανολικού εκχυλίσματος, το οποίο διαλύθηκε σε συγκεκριμένο όγκο διαλύτη (μεθανόλη:νερό 1:1 v/v) προκειμένου να παρασκευασθεί το πυκνότερο διάλυμα. Περαιτέρω αραιώσεις αυτού με το ίδιο σύστημα διαλυτών οδήγησαν στην παρασκευή διαλυμάτων χαμηλότερων συγκεντρώσεων. Πιο συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις που παρασκευάσθηκαν για κάθε φυτικό πληθυσμό είναι οι ακόλουθες. C. sativus: 5mg/mL - 45mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Α: 2mg/mL - 40mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Β: 2mg/mL - 38mg/mL C. nivalis Χελμού Περιοχή Ξηρόκαμπου: 2mg/mL - 40mg/mL Το διάλυμα της DPPH παρασκευάζεται σε συγκέντρωση 0,1M με απλή διάλυση ποσότητας DPPH σε MeOH. Το διάλυμα έχει μωβ χρώμα και φυλάσσεται στο ψυγείο. Ως πρότυπα διαλύματα χρησιμοποιούμε διαλύματα συγκεντρώσεων εύρους 0,05mg/mL έως 5mg/mL BHT σε MeOH. Η αντίδραση έγινε σε μικροπλάκα 96-κελίων. Σε κάθε κελί προστίθενται 195μL διαλύματος DPPH και 5μL δείγματος. Και σε αυτή την περίπτωση παρασκευάσθηκαν και φωτομετρήθηκαν τυφλά διαλύματα των δειγμάτων αλλά και του DPPH. Η φωτομέτρηση γίνεται στα 540nm 62

83 ύστερα από επώαση 30min μετά την προσθήκη του διαλύματος DPPH σε θερμοκρασία δωματίου και απουσία φωτός. Η έκφραση των αποτελεσμάτων γίνεται ως το επί τοις εκατό ποσοστό αναστολής του DPPH και υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον τύπο: DPPH scavenging activity (%) = [(1 Α ο /Α δ ) x 100], όπου Α ο είναι η απορρόφηση του τυφλού διαλύματος του DPPH και Α δ είναι η απορρόφηση του DPPH στα κελία παρουσία δείγματος. Οι τιμές IC 50 των φυτικών εκχυλισμάτων αντιστοιχούν στη συγκέντρωση του δείγματος που προκαλεί 50% αναστολή της ελεύθερης ρίζας. Για τον υπολογισμό των τιμών IC 50 κατασκευάσθηκε καμπύλη του ποσοστού αναστολής του DPPH προς τον λογάριθμο των διαφορετικών τελικών συγκεντρώσεων κάθε δείγματος και τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν σε μg/ml, με την βοήθεια του λογισμικού GraphPad Prism 7. Δ.3.3. Προσδιορισμός ολικών φλαβονοειδών Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος βασίζεται στην δημιουργία σταθερών συμπλόκων μεταξύ του τριχλωριούχου αργιλίου (AlCl 3 ) και των υδροξυλομάδων ή κετονομάδων των φλαβονοειδών, σε όξινο διάλυμα. Πιο αναλυτικά, το όξινο ph που οφείλεται στην παρουσία του CH 3 COOH ευνοεί την συμπλοκοποίηση των ιόντων αργιλίου (Al 3+ ) με τα μόρια των φλαβονοειδών, προκαλώντας αλλαγή στο χρώμα του ολικού διαλύματος. Και σε αυτή την μέθοδο γίνεται φωτομέτρηση του ολικού διαλύματος για τον προσδιορισμό της ποσότητας των ολικών φλαβονοειδών στο δείγμα. Η φωτομέτρηση συνήθων γίνεται στα nm [43]. Πειραματική πορεία Για κάθε ένα από αυτά τα φυτικά δείγματα χρησιμοποιήθηκε ξηρή ποσότητα του μεθανολικού εκχυλίσματος, το οποίο διαλύθηκε σε συγκεκριμένο όγκο διαλύτη (MeOH) και παρασκευάσθηκε ένα πυκνό αρχικό διάλυμα, όπως ακολουθήθηκε και στην προηγούμενη τεχνική. Περαιτέρω αραιώσεις του αρχικού διαλύματος οδήγησαν στην παρασκευή διαλυμάτων 63

84 χαμηλότερων συγκεντρώσεων. Πιο συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις που παρασκευάσθηκαν για κάθε φυτικό πληθυσμό είναι οι ακόλουθες. C. sativus: 40mg/mL - 1mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Α: 40mg/mL - 2mg/mL C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Β: 40mg/mL - 2mg/mL C. nivalis Χελμού Περιοχή Ξηρόκαμπου: 40mg/mL - 2mg/mL Ως διαλύτες της αντίδρασης παρασκευάσθηκαν τρία διαλύματα. Αρχικά, ένα διάλυμα 95% αιθανόλης το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης της αντίδρασης. Έπειτα, παρασκευάσθηκαν τα διαλύματα των αντιδραστηρίων. Συγκεκριμένα παρασκευάσθηκε ένα διάλυμα 10% w/v AlCl 3 *6H 2 O και ένα διάλυμα 1Μ CH 3 COOH με απλή διάλυση των αντίστοιχων ουσιών σε ddh 2 O. Ως πρότυπα διαλύματα χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα καθαρής κερσετίνης. Συγκεκριμένα, παρασκευάσθηκαν διαλύματα συγκέντρωσης 0,05mg/mL - 1mg/mL, με απλή διάλυση της κατάλληλης ποσότητας κερσετίνης σε συγκεκριμένο όγκο MeOH. Η αντίδραση έγινε σε μικροπλάκα 96-κελίων. Σε κάθε κελί προστίθενται 40μL διαλύματος 95% EtOH, 5μL διαλύματος 1Μ CH 3 COOH, 5μL διαλύματος 10% w/v AlCl 3 *6H 2 O, 75μL ddh 2 Ο και, τέλος, 16μL από το κάθε δείγμα. Και σε αυτή την περίπτωση παρασκευάσθηκαν και φωτομετρήθηκαν τυφλά διαλύματα των δειγμάτων αλλά και των διαλυμάτων των αντιδραστηρίων και των προτύπων. Η φωτομέτρηση έγινε στα 405nm ύστερα από επώαση 45min μετά την προσθήκη των διαλυμάτων των αντιδραστηρίων σε θερμοκρασία δωματίου και απουσία φωτός. 64

85 Κ ΕΦ ΑΛΑΙ Ο 4 Ο ΑΠ Ο ΤΕΛΕΣ Μ ΑΤΑ 65

86 66

87 Α. Μορφολογική εξέταση στύλων Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των στύλων των πληθυσμών του C.nivalis παρατίθενται στον Πίνακα 5. Για τον C. sativus δεν ήταν δυνατή η καταγραφή των αντίστοιχων μορφολογικών χαρακτηριστικών, καθώς στη συσκαυασία του εμπορίου που προμηθευτήκαμε δεν υπήρχαν ολόκληροι στύλοι αλλά μόνο οι ξεχωριστές διακλαδώσεις τους. Πίνακας 5: Πίνακας παρουσίασης των μορφολογικών χαρακτηριστικών των στύλων των συλλεχθέντων πληθυσμών του C. nivalis. Β. GC-MS ανάλυση αιθέριων ελαίων του C. sativus και C. nivalis Αιθέριο έλαιο C. sativus Η ανάλυση του αιθέριου ελαίου του είδους C. sativus πραγματοποιήθηκε με την συζευγμένη τεχνική GC-MS. Το χρωματογράφημα (Εικόνα 30) αναλύθηκε ως προς τις κορυφές που απεικονίζει και οι οποίες αντιστοιχούν σε συστατικά του αιθέριου ελαίου. 67

88 Εικόνα 30: Χρωματογράφημα του αιθέριου ελαίου του είδους C. sativus. Η ταυτοποίηση των συστατικών του αιθέριου ελαίου έγινε με βάση τον δείκτη κατακράτησης (RI) και τα φάσματα μάζας. Ως προς τα τελευταία έγινε αναζήτηση στη βιβλιοθήκη NIST και σε βιβλιοθήκη του εργαστηρίου που έχει συγκροτηθεί με βάση τη γενικότερη βιβλιογραφία. Ο δείκτης κατακράτησης (Retention ή Kovats Index, RI ή ΚΙ) συσχετίζει τον χρόνο κατακράτησης του αναλυτή με τους χρόνους κατακράτησης μιας ομόλογης σειράς κανονικών αλκανίων. Σε ισόθερμη αέρια χρωματογραφία, ο δείκτης RI υπολογίζεται με βάση την ακόλουθη εξίσωση ύστερα από ανάλυση του μείγματος των κανονικών αλκανίων στην ίδια στήλη και με το ίδιο πρόγραμμα ανάλυσης που χρησιμοποιείται για τα άγνωστα δείγματα. Όπου ΚΙ: δείκτης κατακράτησης, Ν: ο αριθμός των ατόμων άνθρακα του μεγαλύτερου αλκανίου, n: ο αριθμός των ατόμων άνθρακα του μικρότερου αλκανίου, t r (x): ο σχετικός χρόνος κατακράτησης εξεταζόμενου συστατικού (αποτελεί τον νεκρό χρόνο που απαιτείται για να φθάσει μια μη κατακρατούμενη ένωση του δείγματος ή της κινητής φάσης στον ανιχνευτή), t r (n): ο σχετικός χρόνος κατακράτησης του μικρότερου συστατικού, t r (N): ο σχετικός χρόνος κατακράτησης του μεγαλύτερου αλκανίου [44]. Πιο αναλυτικά, ταυτοποιήθηκε η παρουσία 11 συστατικών. Η παρουσία της σαφρανάλης και της ισοφορόνης επιβεβαιώθηκε με συνένεση πρότυπων ενώσεων. Τα κύρια συστατικά του αιθέριου 68

89 ελαίου, τα μοριακά τους βάρη, τα θραύσματα τους και οι χρόνοι έκλουσης τους παρατίθενται στον Πίνακα 6. Στο τέλος του χρωματογραφήματος παρατηρούνται κάποιες κορυφές οι οποίες αποδίδονται σε ακαθαρσίες της στήλης του μηχανήματος ανάλυσης. Πίνακας 6: Συστατικά του αιθέριου ελαίου του είδους C. sativus: oνομασία, μοριακά βάρη (MW), χρόνοι έκλουσης (tr), θραύσματα, δείκτης κατακράτησης (RI). Το ΒΗΤ προστέθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. α/α κορυφ ής Όνομα ένωσης MW Μοριακός Τύπος t R (min) Θραύσματα RI 1 Ισοφορόνη 138 C 9 H 14 O 15,92 138, 95, 82, κέτο-ισοφορόνη 152 C 9 H 12 O 2 17,06 3 2,6,6-τριμεθυλο- 1,4-κυκλοεξαδιόνη 154 C 9 H 14 O 2 18,17 4 σαφρανάλη 150 C 10 H 14 O 19,61 4-υδροξυ-3,5,5-5 τριμεθυλο C 9 H 14 O 2 24,50 κυκλοεξεν-1-όνη 4-υδροξυ-2,6,6- τριμεθυλο-3-οξο- 6 κυκλοεξαν-1,4-180 C 10 H 12 O 3 27,99 διεν-1- καρβοξαλδεΰδη 7 HTCC 168 C 10 H 16 O 2 29,42 152, 137, 109, 96, , 139, 95, 83, 70, 69, , 135, 121, 107, 91, 79, , 112, 98, 70, 69, , 165, 152, 137, 123, 109, 83, 79, , 150, 135, 121, 107, 91, 79, υδροξυ-3,5,5- τριμεθυλοκυκλοεξ- 2-εν-1,4-διόνη 168 C 9 H 12 O 3 31,45 168, 138, 123, 111, 97, 79,

90 9 BHT 220 C 15 H 24 O 33,05 10 Εξαδεκανοϊκό οξύ 256 C 16 H 32 O 2 48,31 11 Λινολεϊκό οξύ 280 C 18 H 32 O 2 50,47 220, 205, 177, 145, 105, 81, , 213, 129, 115, 83, 73, , 150, 123, 109, 95, 81, Αιθέριο έλαιο C. nivalis Η ίδια διαδικασία απομόνωσης και ανάλυσης του αιθέριου ελαίου ακολουθήθηκε και για τους τρεις πληθυσμούς του είδους C. nivalis. Τα λαμβανόμενα χρωματογραφήματα παρουσιάζονται στην Εικόνα 31. Αξίζει να σημειωθεί ότι αρχικά η ανάλυση του αιθέριου ελαίου με την τεχνική GC-MS εφαρμόσθηκε σε δείγμα του εκχυλίσματος με όγκο 5mL. Ωστόσο, η απουσία των κύριων και χαρακτηριστικών συστατικών του ελαίου μας οδήγησε στην περαιτέρω συμπύκνωση του εκχυλίσματος σε τελικό όγκο 2mL. Α1 Α2 70

91 Β1 Β2 Γ1 Γ2 71

92 Εικόνα 31: Χρωματογραφήματα του αιθέριου ελαίου του είδους C. nivalis. C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Α (Α), C. nivalis Παναχαϊκού Περιοχή Β (Β) και C. nivalis Χελμού Περιοχή Ξηρόκαμπου (Γ). Πιο αναλυτικά, τα χρωματογραφήματα Α1, Β1 και Γ1 αντιστοιχούν στο αιθέριο έλαιο τελικού όγκου 5mL και τα Α2, Β2 και Γ2 στο αιθέριο έλαιο τελικού όγκου 2mL. Όπως γίνεται ευκόλως αντιληπτό από την παρατήρηση των ανωτέρω χρωματογραφημάτων, η περαιτέρω συμπύκνωση δεν οδήγησε στην εμφάνιση επιπλέον συστατικών. Χαρακτηριστική και αξιοσημείωτη είναι η απουσία της σαφρανάλης που αποτελεί και το κύριο συστατικό του αιθέριου ελαίου του γένους Crocus. Οι κορυφές που εμφανίζονται στο τελευταίο τμήμα των χρωματογραφημάτων αποδίδονται σε ακαθαρσίες της στήλης του μηχανήματος όπου έγινε η ανάλυση. Η απουσία των συστατικών του αιθέριου ελαίου του C. nivalis μπορεί να αποδωθεί στο οικοσύστημα στο οποίο φύονται οι συλλεχθέντες πληθυσμοί. Οι ορεινοί κρόκοι αρχίζουν την ανάπτυξη του βλαστού από τον διαχειμάζοντα υπόγειο βολβό νωρίς την άνοιξη, πριν ακόμη λιώσει ο πάγος που καλύπτει το έδαφος. Κατά την ανάπτυξη του βλαστού τους, διατρυπούν τον πάγο λιώνοντας τον. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω τροποποίησης της ενεργειακής απόδοσης της κυτταρικής τους αναπνοής και αύξησης της εκπεμπόμενης θερμότητας τους. Έτσι, ο αναδυόμενος βλαστός ζεσταίνει τον πάγο και τον λιώνει. Το σήμα για την μετατροπή της χημικής ενέργειας σε θερμότητα προέρχεται από το σαλικυλικό οξύ. Ωστόσο, αυτή η αύξηση της παραγόμενης θερμότητας έχει ως συνέπεια την απώλεια/έκκριση όλων των θερμοευαίσθητων και πτητικών συστατικών της δρόγης. 72

93 Γ. HPLC ανάλυση μεθανολικών εκχυλισμάτων του C. sativus και C. nivalis Μετά την εφαρμογή του speed vacuum ζυγίσθηκε το καθαρό βάρος των ξηρών μεθανολικών εκχυλισμάτων για τους τέσσερις πληθυσμούς. Η απόδοση της εκχύλισης ταξινομείται σε φθίνουσα σειρά ως εξής: C. sativus με απόδοση 52,4% C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου με απόδοση 42,2% C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α με απόδοση 37,6% C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β με απόδοση 35% Τα μεθανολικά εκχυλίσματα των C. sativus και C. nivalis αναλύθηκαν περαιτέρω με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης συζευγμένης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιοδίων (HPLC-DAD) προκειμένου να εξεταστεί το χρωματογραφικό τους προφίλ και να εντοπισθούν τυχόν διαφορές στην σύσταση τους. Η συγκέντρωση των μεθανολικών εκχυλισμάτων των τεσσάρων πληθυσμών είναι ίδια (1mg/mL), έτσι ώστε να είναι ευδιάκριτες οι διαφορές. Η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών πραγματοποιήθηκε στα μήκη κύματος που σύμφωνα με την βιβλιογραφία απορροφούν το μέγιστο, δηλαδή στα 250nm, 308nm και 440nm. Πιο συγκεκριμένα, τα φλαβονοειδή και η πικροκροκίνη έχουν μέγιστη απορρόφηση στα nm, οι cis-ισομορφές των αποκαροτενοειδών και οι μορφές με περισσότερους συζυγικούς δεσμούς στα nm και τέλος, οι trans-κροκίνες απορροφούν στα 440nm. Αρχικά, αναλύθηκε το χρωματογραφικό προφίλ του C. sativus. Τα λαμβανόμενα χρωματογραφήματα παρουσιάζονται στην Εικόνα

94 Εικόνα 32: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. sativus στα 250nm, 308nm και 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Τα μετρούμενα μήκη κύματος είναι τα 250nm και 440nm. [1: πικροκροκίνη, 2: HTCC, 3: trans-κροκίνη-5, 4: trans-κροκίνη-4, 5: trans-κροκίνη-3, 6: cis-κροκίνη-5, 7: transκροκίνη-2, 8: cis-κροκίνη-4, 9: cis-κροκίνη-3]. 74

95 Η ανάλυση των χρωματογραφημάτων του C. sativus βασίσθηκε στην σύγκριση των χρόνων έκλουσης και των UV φασμάτων των κορυφών με τα αντίστοιχα των Tarantilis et al. και Koulakiotis et al [45, 46]. Συνολικά, ταυτοποιήθηκε η παρουσία 9 κύριων συστατικών. Τα εφτά από αυτά έχουν μέγιστη απορρόφηση στα 440nm και ανήκουν στην οικογένεια των κροκινών, ενώ δύο μόνο απορροφούν στο μέγιστο στα 250nm και είναι η πικροκροκίνη (1) (t R = 24,4min) και η HTCC (2) (t R = 30,1min). Όσον αφορά τις κροκίνες, ταυτοποιήθηκε η παρουσία της transκροκίνης-4 (4) (t R = 41,2min), της trans-κροκίνης-3 (5) (t R = 45,2min), της trans-κροκίνης-2 (7) (t R = 56,8min), cis-κροκίνης-4 (8) (t R = 57,4min), της cis-κροκίνης-3 (9) (t R =60,4min), της transκροκίνης-5 (3) (tr= 36,5min) και της cis-κροκίνης-5 (6) (t R =49,3min). Το UV-Vis φάσμα απορρόφησης κάθε ενός από αυτά τα συστατικά παρατίθεται στην Εικόνα 33 και αποτελεί χαρακτηριστικό στοιχείο για την ταυτοποίηση των ενώσεων. 75

96 Εικόνα 33: Φάσματα απορρόφησης UV-Vis που ελήφθησαν κατά την χρωματογραφική ανάλυση του εκχυλίσματος του C.sativus με την τεχνική HPLC-DAD. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο το μήκος κύματος σε nm. Στην συνέχεια εφαρμόσθηκε το ίδιο πρωτόκολλο ανάλυσης στους πληθυσμούς του C. nivalis. Τα λαμβανόμενα χρωματογραφήματα παρατίθενται στις Εικόνες 34, 35 και

97 Εικόνα 34: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α στα 250nm και 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. 77

98 Εικόνα 35: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β στα 250nm και 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. 78

99 Εικόνα 36: HPLC χρωματογράφημα του μεθανολικού εκχυλίσματος του C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα 250nm και 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Συγκρίνοντας τα χρωματογραφήματα διαπιστώνεται ότι τα μέλη του είδους C. nivalis έχουν μεταξύ τους παρόμοιο χρωματογραφικό προφίλ, το οποίο διαφέρει σε αρκετά σημεία με αυτό του C. sativus. Πιο αναλυτικά, στα φάσματα των πληθυσμών του C. nivalis στα 250nm παρατηρείται η υψηλή απορρόφηση της HTCC (30,1min) που την καθιστά και κύρια κορυφή του φάσματος, ενώ η πικροκροκίνη δεν εντοπίζεται. Αντίθετα, στο αντίστοιχο φάσμα του C. sativus, η κύρια κορυφή αντιστοιχεί στην πικροκροκίνη (24,4min), ενώ η HTCC εντοπίζεται με σημαντικά μικρότερη απορρόφηση (30,1min). Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 7, αυτή η διαφορά αποτυπώνεται και στο εμβαδόν των συγκεκριμένων κορυφών. Το εμβαδόν της HTCC στον C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α είναι 10 φορές μεγαλύτερο από το αντίστοιχο στον C. sativus, στον C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β είναι 23 φορές και στον C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου είναι 12 φορές. 79

100 Πίνακας 7: Συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος του είδους C. sativus και των τριών πληθυσμών του είδους C. nivalis: ονομασία, χρόνοι έκλουσης σε min, εμβαδά κορυφών απορρόφησης (Ε) σε mau*min, ένταση απορρόφησης κορυφών (Α) σε mau και συνολικό εμβαδό ταυτοποιημένων κροκινών σε mau*min. Η ολοκλήρωση της πικροκροκίνης και της HTCC έγινε στα 250nm, ενώ των κροκινών στα 440nm. Συστατικό Χρόνος έκλουσης (min) C. sativus C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου Ε Ε Ε Ε Α Α Α Α (mau (mau (mau (mau (mau) (mau) (mau) (mau) *min) *min) *min) *min) Πικροκροκίνη 24,4 316,95 77, HTCC 30,1 12,25 3,16 191,40 43,82 312,56 70,97 164,28 37,51 Cis-κροκίνη-1 61,8 11,30 1,38 0,42 0,08 0,66 0,1 0,31 0,04 trans-κροκίνη-2 56,8 143,34 32,04 20,47 4,89 20,99 4,93 6,35 1,54 trans-κροκίνη-3 45,2 418,43 87,06 5,63 1,25 7,08 1,45 1,08 0,23 cis-κροκίνη-3 60,4 62,54 10,51 1,66 0,32 2,09 0,41 0,57 0,11 trans-κροκίνη-4 41,2 1052,32 223,08 5,14 2,00 7,51 2,05 2,43 0,38 cis-κροκίνη-4 57,4 110,16 27,53 0,80 0,23 1,27 0,33 0,60 0,14 trans-κροκίνη-5 36,5 17,63 3,69 12,65 2,75 24,58 5,29 11,06 2,36 cis-κροκίνη-5 49,3 24,93 6,1 1,24 0, Συνολικό εμβαδόν ταυτοποιημένων κροκινών (mau*min) ,39-12,13-14,56-4,8 Όσον αφορά τα 440nm, οι τρεις πληθυσμοί του C. nivalis παρουσιάζουν υψηλή συγκέντρωση σε συστατικά τα οποία δεν εμφανίζονται στο αντίστοιχο χρωματογράφημα του C. sativus (Εικόνα 37, Εικόνα 38). Ύστερα από ανάλυση των χρωματογραφημάτων επιβεβαιώθηκε μέσω σύγκρισης των UV φασμάτων και των χρόνων έκλουσης η ύπαρξη των συστατικών cis-κροκίνη- 80

101 1, trans-κροκίνη-2, trans-κροκίνη-3, cis-κροκίνη-3, trans-κροκίνη-4, cis-κροκίνη-4, transκροκίνη-5 και cis-κροκίνη-5. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ένταση της απορρόφησης των περισσοτέρων από αυτά τα συστατικά είναι σημαντικά χαμηλότερη από την αντίστοιχη που εμφανίζουν στο χρωματογράφημα του C. sativus, ενώ η συγκέντρωση πολλών από αυτά μπορεί να θεωρηθεί αμελητέα. Ο χρόνος έκλουσης, η ένταση της απορρόφησης και το εμβαδόν κάθε κορυφής και το συνολικό εμβαδόν των κροκινών σε κάθε δείγμα παρουσιάζονται στον Πίνακα 7. Εικόνα 37: Σύγκριση HPLC χρωματογραφημάτων των ειδών C. sativus και C. nivalis στα 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. 81

102 Εικόνα 38: Σύγκριση HPLC χρωματογραφημάτων των πληθυσμών C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α, Παναχαϊκού περιοχής Β και Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα 440nm. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η απορρόφηση σε mau και στον οριζόντιο ο χρόνος σε min. Στην συνέχεια, αναλύθηκαν τα χρωματογραφήματα των 440nm των τριών πληθυσμών του C. nivalis ως προς τις κοινές τους κορυφές, οι οποίες όμως δεν εμφανίζονται στο αντίστοιχο του C. sativus. Οι χρόνοι έκλουσης και τα UV φάσματα παρατίθενται στον Πίνακα 8. Για χάρη ευκολίας οι κορυφές ονομάστηκαν Α-ΣΤ κατά αύξουσα σειρά ανάλογα με τον χρόνο έκλουσης τους (Εικόνα 38). Πίνακας 8: Χρόνοι έκλουσης και UV-Vis φάσματα των κοινών κορυφών των χρωματογραφημάτων στα 440nm των τριών πληθυσμών του C. nivalis. Ονομασία Χρόνος έκλουσης (t R ) (min) UV φάσμα Α 32,5 82

103 Β 37,3 Γ 40,0 Δ 42,8 Ε 48,1 ΣΤ 50,7 83

104 Και στους πληθυσμούς η κύρια κορυφή των χρωματογραφημάτων των 440nm αντιστοιχεί στα 32,5min (Α), με ένταση απορρόφησης 72,91, 111,06 και 64,43 mau για τους C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α, C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου αντίστοιχα (Πίνακας 9). Όπως διαπιστώνεται από τα μήκη κύματος στα οποία απορροφούν, τα συστατικά Α-ΣΤ ανήκουν στην οικογένεια των κροκινών, χωρίς ωστόσο να μπορούμε να προσδιορίσουμε την δομή τους. Πίνακας 9: Κοινά συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος των τριών πληθυσμών του είδους C. nivalis, τα οποία δεν περιέχονται στο αντίστοιχο του C. sativus: ονομασία, χρόνοι έκλουσης σε min, εμβαδά κορυφών απορρόφησης (Ε) σε mau*min και ένταση απορρόφησης κορυφών (Α) σε mau. Χρόνος C. nivalis C. nivalis C. nivalis Χελμού Συστατικό έκλουσης Παναχαϊκού Παναχαϊκού περιοχής (min) περιοχής Α περιοχής Β Ξηροκάμπου Α Ε Α Ε Α Ε (mau) (mau*min) (mau) (mau*min) (mau) (mau*min) Α 32,5 72,91 16,71 111,06 24,66 64,43 14,70 Β 37,3 14,72 3,11 20,12 4,16 6,69 1,37 Γ 40 5,63 1,45 9,15 2,22 3,13 0,77 Δ 42,8 21,488 4,54 7,082 1,45 5,89 1,22 Ε 48,1 14,02 3,68 20,04 5,14 12,08 3,08 ΣΤ 50,7 18,04 4,32 18,41 4,46 18,79 4,27 Στην συνέχεια υπολογίσθηκε με την χρήση των εμβαδόν το επί της εκατό ποσοστό κάθε κροκίνης επί του συνόλου των κροκινών σε κάθε δείγμα C. nivalis. Τα αποτελέσματα αυτών των αναλύσεων παρουσιάζονται στον Πίνακα

105 Πίνακας 10: Συγκεντρωτικός πίνακας του εμβαδού των ταυτοποιημένων και αγνώστων κροκινών που εντοπίζονται στους τρεις πληθυσμούς του C. nivalis και της επί τις εκατό περιεκτικότητας κάθε κροκίνης επί του συνόλου των κροκινών στους C. sativus και C. nivalis. Συστατικό C. sativus C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου % % Ε % Ε % Ε ποσοστό ποσοστό (mau* ποσοστό (mau* ποσοστό (mau* κροκινώ κροκινών min) κροκινών min) κροκινών min) ν cis-κροκίνη-1 0,35 0,08 0,17 0,1 0,18 0,04 0,13 trans-κροκίνη-2 8,19 4,89 10,64 4,93 8,70 1,54 5,10 trans-κροκίνη-3 22,24 1,25 2,72 1,45 2,56 0,23 0,76 cis-κροκίνη-3 2,69 0,32 0,70 0,41 0,72 0,11 0,36 trans-κροκίνη-4 57,00 2,00 4,35 2,05 3,62 0,38 1,26 cis-κροκίνη-4 7,03 0,23 0,50 0,33 0,58 0,14 0,46 trans-κροκίνη-5 0,94 2,75 5,99 5,29 9,34 2,36 7,81 cis-κροκίνη-5 1,56 0,61 1, Α - 16,71 36,37 24,66 43,53 14,70 48,66 Β - 3,11 6,77 4,16 7,34 1,37 4,53 Γ - 1,45 3,16 2,22 3,92 0,77 2,55 Δ - 4,54 9,88 1,45 2,56 1,22 4,04 Ε - 3,68 8,01 5,14 9,07 3,08 10,20 ΣΤ - 4,32 9,40 4,46 7,87 4,27 14,13 Συνολικό Εμβαδόν κροκινών (mau*min) 391,39 45,94 56,65 30,21 Όπως φαίνεται στον Πίνακα 10, συγκρίνωντας τα συνολικά εμβαδά των κροκινών στους τέσσερις πληθυσμούς διαπιστώνεται ότι ο C. sativus έχει υψηλότερη περιεκτικότητα σε κροκίνες από τους τρεις πληθυσμούς του C. nivalis. Οι κύριες κροκίνες του C. sativus είναι η trans- 85

106 κροκίνη-4 (57%) και η trans-κροκίνη-3 (22,24%), ενώ οι υπόλοιπες εντοπίζονται σε αρκετά χαμηλότερα ποσοστά. Αντίθετα, και στους τρεις πληθυσμούς του C. nivalis παρατηρείται διαφορετικό προφίλ στις αναλογίες των κροκινών στους στύλους. Ως κύρια κροκίνη εντοπίζεται το μη ταυτοποιημένο συστατικό Α με 48,66%, 43,53% και 36,37% ποσοστό στον C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου, C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β και C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α αντίστοιχα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι και στους τρεις πληθυσμόυς του C. nivalis οι trans-κροκίνη-2 και trans-κροκίνη-5 περιέχονται σε αρκετά μεγαλύτερο ποσοστό από τις υπόλοιπες ταυτοποιημένες κροκίνες. Πιο αναλυτικά, στον C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α η trans-κροκίνη-2 εντοπίζεται σε ποσοστό 10,64% και η trans-κροκίνη-5 σε ποσοστό 5,99%, ενώ στους C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου η trans-κροκίνη-5 εντοπίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό (9,34% και 7,81% αντίστοιχα) και ακολουθεί η trans-κροκίνη-2 (8,70% και 5,10% αντίστοιχα). Προκειμένου να ταυτοποιηθούν οι δομές των άγνωστων κροκινών αλλά και των επιπλέον συστατικών ακολούθησαν αναλύσεις των εκχυλισμάτων με την τεχνική HPLC-MS. Δ. Ανάλυση των εκχυλισμάτων με την τεχνική LC-MS Η τεχνική HPLC-MS χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των μεθανολικών εκχυλισμάτων του C. sativus και των τριών πληθυσμών του C.nivalis. Στόχος των πειραμάτων ΗPLC-MS ήταν να ταυτοποιηθούν όσο το δυνατόν περισσότερα συστατικά των μεθανολικών εκχυλισμάτων των πληθυσμών του C. nivalis. Στα εξεταζόμενα δείγματα εφαρμόστηκε η τεχνική του θετικού ιοντισμού (+ESI) και η τεχνική της πλήρους σάρωσης (m/z 80 έως 1200). Ως πρόγραμμα ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε το MZmine (Version 2.19) και οι αναλύσεις έγιναν με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης (centroid mass detector). Σύμφωνα με αυτήν, κάθε σήμα πάνω από ένα συγκεκριμένο επίπεδο θορύβου μπαίνει στην λίστα μαζών ως ανιχνεύσιμο ιόν. Το επίπεδο θορύβου ορίζεται από τον αναλυτή έτσι ώστε μόνο μοριακά βάρη που αντιστοιχούν σε θραύσματα ενώσεων να εντοπίζονται ως ανιχνεύσιμα ιόντα. Για την ταυτοποίηση χρησιμοποιήθηκαν ως βοηθητικό εργαλείο οι ηλεκτρονικές βιβλιοθήκες PlantCyc Database ( PubChem Compound Database ( Mass Bank ( KEGG Compound 86

107 Database ( Η ταυτοποίηση των συστατικών πραγματοποιήθηκε με βάση τα μοριακά ιόντα που καταγράφηκαν στα φάσματα μάζας για κάθε δείγμα και σε συνδυασμό με τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τα συστατικά των εκχυλισμάτων του γένους Crocus. Τα χρωματογραφήματα που ελήφθησαν με αυτή την ανάλυση παρατίθενται στην Εικόνα 39, ενώ στην Εικόνα 40 παρατίθεται ένα συγκεντρωτικό χρωματογράφημα όλων των αναλυθέντων δειγμάτων. Α Β Γ Δ Εικόνα 39: Απεικόνιση της έντασης των ιόντων που λήφθηκε με την τεχνική θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τέσσερις πληθυσμούς του γένους Crocus με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι εντάσεις των ιόντων που οφείλονται στο εκάστοτε δείγμα και με κόκκινο χρώμα οι εντάσεις των ιόντων που οφείλονται στο τυφλό δείγμα (blank). Τα αποτελέσματα αφορούν τα μεθανολικά εκχυλίσματα των C. sativus (Α), C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α (Β), C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β (Γ) και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου (Δ). 87

108 Εικόνα 40: Συγκεντρωτικό χρωματογράφημα της έντασης των ιόντων με εφαρμογή θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τέσσερις πληθυσμούς του γένους Crocus με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. Εικόνα 41: Συγκεντρωτικό χρωματογράφημα της έντασης των ιόντων με εφαρμογή θετικού ιοντισμού (+ESI) πλήρους σάρωσης για τους τρεις πληθυσμούς του είδους Crocus nivalis με την χρήση οργάνου UPLC/MS- QTOF με την λειτουργία κεντραρισμένης ανίχνευσης. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται ο χρόνος έκλουσης σε min και στον κάθετο άξονα η ένταση του κύριου ιόντος (Base Peak Intensity) σε απόλυτες μονάδες. 88

109 Αρχικά, αναλύθηκε ως προς τις κορυφές που περιλαμβάνει το χρωματογράφημα του C. sativus. Το σύνολο των ταυτοποιημένων κορυφών, καθώς και τα θραύσματα των φασμάτων μάζας που τους αντιστοιχούν παρατίθενται στον Πίνακα 11. Πίνακας 11: Ταυτοποιημένες κορυφές του χρωματογραφήματος του εκχυλίσματος του C. sativus με ανάλυση UPLC-MS (+ESI). (Με σκούρο χρώμα συμβολίζεται το κύριο θραύσμα του φάσματος μάζας). A/A tr (min) Όνομα MW Θραύσματα 1 1,1 3-σοφοροζυλo-7-β-Dγλυκοζυλo-καμπφερόλη , 611, πικροκροκίνη , 158, 169, 186, 331, 661, 813, ,1 πικροκροκίνη σοφοροζυλo-καμπφερόλη , 169, 287, 331, ,8 trans-κροκίνη , 325, 329, 649, 815, ,1 cis-κροκίνη , 325, 329, 649, 815, ,5 trans-κροκίνη , 325, 329, 491, 652, ,7 trans-κροκίνη , 325, 329, 487, 649, 814, ,3 cis-κροκίνη , 325, 329, 487, 649, 814, 973, ,7 cis-κροκίνη , 311, 325, 329, 487, 649, 814, 973, ,8 κροκίνη , 329, 490 Η κύρια κορυφή του χρωματογραφήματος έχει χρόνο έκλουσης 2,1min (3) και αποτελεί συνέκλουση δύο συστατικών, της πικροκροκίνης με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=331 και της 7- σοφοροζυλo-καμπφερόλης με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=611. Η ύπαρξη και των δύο συστατικών στην ίδια κορυφή καταδεικνύεται από την ύπαρξη των θραυσμάτων τους στο αντίστοιχο φάσμα μάζας (Εικόνα 42, Α), καθώς και από το γεγονός ότι η ένταση της απορρόφησης έχει διπλάσια τιμή από τις υπόλοιπες κορυφές. Αναλυτικότερα, στην πικροκροκίνη ανήκουν τα θραύσματα με m/z=151 και m/z=169, τα οποία αντιστοιχούν στις δομές [M+H-Glu-H 2 O] και [M-C 6 H 11 O 5 ]. Στην 7-σοφοροζυλo-καμπφερόλη ανήκουν τα θραύσματα με m/z=287, m/z=449 και m/z= 325 που αντιστοιχούν στις δομές [M+H-Glu-Glu], [M+H-Glu] και [Glu+Glu-OH]. Η κορυφή με χρόνο έκλουσης 2,0min (2) αντιστοιχεί στην 89

110 πικροκροκίνη με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=331. Το κύριο θραύσμα έχει m/z=169 και αντιστοιχεί στην [M+H-Glu] δομή, δηλαδή στην HTCC (Εικόνα 42, Β). Η κορυφή με χρόνο έκλουσης 1,1min (1) αντιστοιχεί στην 3-σοφοροζυλo-7-β-D-γλυκοζυλo-καμπφερόλη με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=773. Το κύριο θραύσμα έχει m/z=449 και αντιστοιχεί στην [M+H-Glu] δομή (Εικόνα 42, Γ) [27]. Α Β Γ Εικόνα 42: Φάσματα μάζας των κορυφών του χρωματογραφήματος του C. sativus με χρόνους έκλουσης Α. 2,1min, B. 2,0min και Γ. 1,1min. 90

111 Όσον αφορά την ομάδα των κροκινών ταυτοποιήθηκε η παρουσία των εξής: Η trans-κροκίνη-4 εκλούεται στα 2,8min (4) με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=977 (Εικόνα 43, Α). Ως κύριο θραύσμα χαρακτηρίζεται αυτό με m/z=329, το οποίο αντιστοιχεί στην δομή [M C 12 H 20 O 10 -C 12 H 20 O 10 ], δηλαδή στο μοριακό ιόν [Μ+Η] + της κροκετίνης. Η cis-ισομορφή της εκλούεται στα 3,1min (5) με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=977 (Εικόνα 43, Β). Και εδώ το κύριο θραύσμα αντιστοιχεί στο μοριακό ιόν της κροκετίνης. Και στις δύο περιπτώσει το θραύσμα με m/z=325 αντιστοιχεί στην γεντοβιόζυλ-ομάδα (C 12 H 20 O 10 ) [27, 47]. Η trans-κροκίνη-3 εκλούεται στα 3,5min (6) με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=815 (Εικόνα 43, Γ). Ως κύριο θραύσμα χαρακτηρίζεται αυτό με m/z=311, το οποίο αντιστοιχεί στην δομή [M C 12 H 20 O 10 -ΟΗ], δηλαδή στην δομή της κροκετίνης χωρίς μια υδροξυλομάδα [48]. Οι κορυφές με χρόνους έκλουσης 3,7min (7), 4,3min (8) και 4,7min (9) αντιστοιχούν στις trans-κροκίνη-5, cis-κροκίνη-5 και cis-κροκίνη-5, με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=1139 για κάθε μια (Εικόνα 43, Δ, Ε και ΣΤ). Και στις τρεις ενώσεις κύριο θραύσμα είναι η ένωση με m/z=329, το οποίο αντιστοιχεί στην δομή [M C 12 H 20 O 10 -C 12 H 20 O 10 ], δηλαδή στο μοριακό ιόν [Μ+Η] + της κροκετίνης. Ακόμη, εντοπίζονται θραύσματα με m/z=325, m/z=487, m/z=652 και m/z=815 που αντιστοιχούν στις ομάδες γεντιοβιόζης, νεαπολιτανόζης/γεντιοτριόζης, στο μοριακό ιόν [Μ+Η] + της κροκίνης-2 και της κροκίνης-3. Η ταυτοποίηση των ενώσεων βασίστηκε στην σειρά έκλουσης τους όπως αυτή περιγράφεται από τους Koulakiotis et al. [46, 48]. Η κροκίνη-1 εκλούεται στα 4,8min (10) με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=490 (Εικόνα 43, Ζ). Ως κύριο θραύσμα είναι η ένωση με m/z=329, το οποίο αντιστοιχεί στην δομή [M C 12 H 20 O 10 -C 12 H 20 O 10 ], δηλαδή στο μοριακό ιόν [Μ+Η] + της κροκετίνης [49, 48]. 91

112 Α Β Γ Δ Ε ΣΤ 92

113 Ζ Εικόνα 43: Φάσματα μάζας των κορυφών του χρωματογραφήματος του C. sativus με χρόνους έκλουσης Α. 2,8min, B. 3,1min, Γ. 3,5min, Δ. 3,7min, Ε. 4,3min, ΣΤ. 4,7min και Ζ. 4,8min. Στην συνέχεια μελετήθηκαν τα χρωματογραφήματα των τριών πληθυσμών του C. nivalis. Με μια πρώτη ματιά γίνεται αντιληπτό ότι οι πληθυσμοί του είδους C. nivalis έχουν σε μεγάλο βαθμό παρόμοιο προφίλ (Εικόνα 41), το οποίο διαφέρει σε αρκετά σημεία με το αντίστοιχο του C. sativus, (Εικόνα 40) επιβεβαιώνοντας τα HPLC χρωματογραφήματα. Από την σύγκριση των χρωματογραφημάτων εντοπίσθηκε ότι οι κοινές κορυφές και των τεσσάρων χρωματογραφημάτων εμφανίζονται σε χρόνους έκλουσης 0,6, 0,8, 2,1, 5,8 και 7 min. Από αυτές μόνο η κορυφή με χρόνο έκλουσης 2,1min (3) μπορεί να ταυτοποιηθεί και αντιστοιχεί στην 7- σοφοροζυλo-καμπφερόλη με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=611. Τα λαμβανόμενα θραύσματα στο φάσμα μάζας έχουν m/z= 287, m/z=449 και m/z=611 και αντιστοιχούν στις δομές [M+H-Glu- Glu], [M+H-Glu] και στο μοριακό ιόν της ένωσης. Επιπρόσθετα, ο C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Β έχει μια κοινή κορυφή στα 1,1 min (1), που αντιστοιχεί στην 3-σοφοροζυλo-7-β-Dγλυκοζυλo-καμπφερόλη. Πρέπει να σημειωθεί ότι ανάμεσα στα διαφορετικά δείγματα διαπιστώνονται διαφορές στις τιμές των θραυσμάτων τις τάξεως των 1-3 μονάδων, ωστόσο τα κύρια θραύσματα έχουν την ίδια τιμή σε όλα τα δείγματα. Μεταξύ των τριών πληθυσμών του C. nivalis εμφανίζονται οι κοινές κορυφές, τα στοιχεία των οποίων παρατίθενται στον Πίνακα

114 Πίνακας 12: Ταυτοποιημένες κοινές κορυφές των χρωματογραφημάτων των τριών πληθυσμών του C. nivalis με ανάλυση UPLC-MS (+ESI). (Με σκούρο χρώμα συμβολίζεται το κύριο θραύσμα του φάσματος μάζας). A/A t R (min) Όνομα MW Θραύσματα 11 2,7 3-ρουτινοζυλο-καμπφερόλη , 309, 433, ,3 trans-κροκίνη , 325, 487, 649, 811, 973, ,4 Rha-Rha-Glc-[κροκετίνη]-Glc-Glc , 311, 325, 453, 619, 681, 781, 789, 1107 Α Β Γ 94

115 Εικόνα 44: Φάσματα μάζας των κορυφών των χρωματογραφημάτων των τριών πληθυσμών του C. nivalis με χρόνους έκλουσης Α. 2,7min, Β. 3,3min και Γ. 3,4min. Η κοινή κορυφή των τριών χρωματογραφημάτων που εντοπίζεται στα 2,7min (11) με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=595 και αντιστοιχεί στην 3-ρουτινοζυλο-καμπφερόλη (Εικόνα 44, Α). Ως κύριο θραύσμα είναι η ένωση με m/z=287, το οποίο αντιστοιχεί στο μοριακό ιόν [Μ+Η] + της καμπφερόλης, ενώ εντοπίζεται και το μοριακό ιόν της ρουτινόζυλο-ομάδας με m/z=309. Η κορυφή με χρόνο έκλουσης 3,3min (12) αντιστοιχεί στην trans-κροκίνη-5 με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=1139. Ως κύριο θραύσμα είναι η ένωση με m/z=973, το οποίο αντιστοιχεί στην δομή [Μ-C 6 H 11 O 5-3Η] (Εικόνα 44, Β) [50]. Τα χρωματογραφήματα του C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου έχουν μια κοινή κορυφή στα 3,2min (14) (Εικόνα 45, Α) η οποία ύστερα από υπολογισμούς βρέθηκε ότι αντιστοιχεί στην 3-ραμνοζυλο-ρουτυνοζυλο-καμπφερόλη (Εικόνα 45, Β)με μοριακό ιόν [Μ+Η] + με m/z=741, το οποίο αποτελεί και το κύριο θραύσμα. Άλλα θραύσματα του φάσματος είναι τα m/z=147, m/z=287, m/z=309 και m/z=453, τα οποία αντιστοιχούν στην ραμνόζυλ-ομάδα, στο μοριακό ιόν της καμπφερόλης, στο μοριακό ιόν της ρουτυνόζυλ-ομάδας και στην ραμνοζυλο-ρουτυνοζυλ-ομάδα. Α Β Εικόνα 45: Α. Φάσμα μάζας την κοινής κορυφής των C. nivalis Παναχαϊκού περιοχής Α και C. nivalis Χελμού περιοχής Ξηροκάμπου στα 3,2min, Β. Δομή 3-ραμνοζυλο-ρουτυνοζυλοκαμπφερόλης. 95