ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΤΩΣΕΩΝ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΣΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΣΙ ΗΡΟΥ, ΤΟΥ ΧΑΛΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΨΕΥ ΑΡΓΥΡΟΥ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΣΤΟ ΗΠΑΡ ΝΕΚΤΑΡΙΟΣ Χ. ΣΟΥΜΠΑΣΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

2 Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή: Τ. Ράλλης, Καθηγητής: Επιβλέπων Ι. Βλέµµας, Καθηγητής: Μέλος Ν. Ρουµπιές, Αναπληρωτής Καθηγητής: Μέλος 2

3 Στους γονείς µου, για την απεριόριστη υποµονή τους 3

4 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ σελ. Συντοµογραφίες 5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ Ι. Ο ρόλος του ήπατος στον µεταβολισµό του σιδήρου, του χαλκού και του ψευδαργύρου. 9 ΙΙ.Τετραχλωριούχος άνθρακας και χρόνια ηπατική νόσος 15 ΙΙΙ. Χρόνια ηπατική νόσος και σίδηρος 17 ΙV. Χρόνια ηπατική νόσος και χαλκός 20 V. Χρόνια ηπατική νόσος και ψευδάργυρος 22 ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 24 I. Πειραµατόζωα - ιατροφή 24 ΙΙ. Πρόκληση χρόνιας ηπατικής νόσου 25 ΙΙΙ. ειγµατοληψία βιολογικών υλικών 27 IV. Μέθοδοι προσδιορισµού των παραµέτρων 28 V. Ιστοπαθολογική εξέταση. 31 VΙ. Ιστοχηµική εξέταση 33 VII. Aνοσοϊστοχηµική εξέταση 35 VIΙΙ. Μεθοδολογία στατιστικής ανάλυσης 36 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 39 Ι. Κλινική Εικόνα 39 ΙΙ. Εργαστηριακά Ευρήµατα 40 1.Σίδηρος ορού (SI) 40 2.Ολική ικανότητα της τρανσφερρίνης να δεσµεύει σίδηρο (TIBC) % κορεσµός της τρανσφερρίνης (SAT) Χαλκός ορού του αίµατος (Cu) Ψευδάργυρος ορού του αίµατος (Zn) Συγκέντρωση του Fe, του Cu και του Zn στο ήπαρ (µg/gr Ξ.Ο) Αιµατολογικές και λοιπές βιοχηµικές παράµετροι που µελετήθηκαν Συνολική Iστοχηµική Βαθµολόγηση των εναποθέσεων Fe στο ήπαρ(total Iron 46 Scoring - TIS). 9. Συσχετισµός ALT / SI Συσχετισµός SI / Fe Ήπατος και SI / TIS Συσχετισµός SI/Fe Ηπατικών Κυττάρων (HIS) και SI/ Fe Κυττάρων Κολπωδών 47 Τριχοειδών (SIS). 12. Συσχετισµός SI/Ίνωσης Συσχετισµός Fe Ήπατος / Ίνωσης και TIS/ Ίνωσης Συσχετισµός HIS/ Ίνωσης και SIS/ Ίνωσης Συσχετισµός Cu Ορού / Ολικής Χολερυθρίνης Ορού του Αίµατος Συσχετισµός Cu Ορού / ALP Ορού του Αίµατος. 48 ΙΙΙ. Παθολογοανατοµικά Ευρήµατα Μακροσκοπικές Αλλοιώσεις Ιστοπαθολογικά ευρήµατα Ιστοχηµικά Ευρήµατα Ανοσοϊστοχηµικά Ευρήµατα 51 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 57 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 71 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 72 SUMMARY 76 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΕΣ 78 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ 93 4

5 Συντοµογραφίες DMT-1(Divalent Metal Transporter-1)= Πρωτεΐνη µεταφοράς δισθενών ιόντων µετάλλων IREG-1(ferroportin)= Φερροπρωτεΐνη-1 SI (Serum Iron) = Σίδηρος ορού του αίµατος TIBC (Total iron binding capacity) = Ολική ικανότητα της τρανσφερρίνης του ορού να δεσµεύει σίδηρο SAT (% Transferin saturation) = % κορεσµός της τρανσφερρίνης ΑΤP= Tριφωσφορική αδενοσίνη Ξ.Ο= Ξηρά ουσία BUN (Blood urea nitrogen) = Άζωτο ουρίας ορού αίµατος ΟΧ = Ολική χολερυθρίνη ορού αίµατος ΑΧ = Άµεση χολερυθρίνη ορού αίµατος ΧΟ = Χολικά οξέα ορού αίµατος ALP (Alkaline phosphatase) = Αλκαλική φωσφατάση ορού αίµατος ALT (Alanine aminotransferase) = Αλανινοαµινοτρανσφεράση ορού αίµατος ABC= Σύµπλεγµα Αβιδίνης Βιοτίνης PBS= Phosphate Buffered Saline TIS (Total iron scoring) = Συνολικός βαθµός εναπόθεσης σιδήρου στο ήπαρ HIS (Hepatocyte iron scoring) = Βαθµός εναπόθεσης σιδήρου στα ηπατικά κύτταρα των τριών ζωνών SIS (Sinusoidal iron scoring) = Βαθµός εναπόθεσης σιδήρου στα κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών AST (Aspartate aminotransferase) = Ασπαρτική αµινοτρανσφεράση ορού αίµατος NTBI (Non-transferin bound iron) = Σίδηρος όχι δεσµευµένος µε τρανσφερρίνη 5

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ιχνοστοιχεία σίδηρος, χαλκός και ψευδάργυρος κατέχουν, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, κεντρικό ρόλο σε πολλούς βιολογικούς µηχανισµούς συµπεριλαµβανοµένων των οξειδωτικών και άλλων µεταβολικών διεργασιών, στους οποίους το ήπαρ έχει κυρίαρχη θέση. Από την άλλη πλευρά, η αύξηση ή µείωση της συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων αυτών στον οργανισµό, είτε βρίσκονται σε «ελεύθερη µορφή», είτε συνδεδεµένα µε πρωτεΐνες, είτε συµµετέχουν σε διάφορα ενζυµικά συστήµατα, µπορεί να προκαλέσει ποικίλες ηπατικές βλάβες. Πρόσφατες κλινικοεργαστηριακές µελέτες στον άνθρωπο έχουν καταδείξει ότι σε περιστατικά χρόνιας ηπατίτιδας Β ή C µε ή χωρίς ευρήµατα ηπατικής ανεπάρκειας, η συγκέντρωση των διαφόρων παραµέτρων του ορού του αίµατος που συνδέονται µε το σίδηρο, καθώς και αυτή του σιδήρου του ήπατος ήταν αυξηµένη µε αποτέλεσµα την επιδείνωση της ήδη υπάρχουσας από την πρωτογενή νόσο ηπατικής βλάβης και την διέγερση των µηχανισµών της ηπατικής ίνωσης (Barton και συν.1995, Kaji και συν. 1995, Lefkowitch και συν. 1998, Casaril και συν. 2000, Pirisi και συν. 2000). Σε ανάλογες µελέτες βρέθηκε µειωµένη συγκέντρωση ψευδαργύρου σε ασθενείς που έπασχαν από αλκοολική κίρρωση (Boyett και Sullivan 1980, Kuntz και Kuntz 2002) ή από χρόνια φλεγµονώδη νοσήµατα του ήπατος (Keeling και συν. 1980). Σ ότι αφορά στη συγκέντρωση του χαλκού στον ορό και στο ήπαρ, είναι γνωστό ότι αυτή αυξάνεται σε ανθρώπους αλλά και σκύλους που πάσχουν από χολοστατικά νοσήµατα ή νεοπλάσµατα του ήπατος (Center 1996, Kuntz και Kuntz 2002). Ακόµα είναι γνωστή η αύξηση της συγκέντρωσης του ιχνοστοιχείου αυτού στο ήπαρ σκύλων ορισµένων φυλών µε ηπατίτιδα από χαλκό (Twedt και συν. 1979, 6

7 Johnson και συν. 1982, Crawford και συν. 1985, Thornburg και συν. 1986, Rolfe και συν. 1995, Center 1996, Thornburg και συν. 1996, Webb και συν. 2002) καθώς και στη νόσο Wilson στον άνθρωπο (Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002, Gitlin 2003). Στο σκύλο δεν υπάρχουν δηµοσιευµένα στοιχεία από κλινικοεργαστηριακές ή πειραµατικές µελέτες που να διερευνούν τις µεταβολές της συγκέντρωσης του σιδήρου και του ψευδαργύρου, τόσο στον ορό του αίµατος όσο και στο ήπαρ, κατά τη χρόνια ηπατική νόσο, ούτε και τον πιθανό συσχετισµό της βαρύτητας της ηπατικής βλάβης µε τις µεταβολές αυτές. Η διερεύνηση της συγκέντρωσης του χαλκού στον ορό και στο ήπαρ ενώ δεν έγινε για πρώτη φορά, αποφασίστηκε να συµπεριληφθεί στη παρούσα µελέτη λόγω αφενός της στενής αλληλεξάρτησης του µεταβολισµού του µε αυτόν του σιδήρου και αφετέρου λόγω της πιθανής εµπλοκής του στην υπό µελέτη ηπατική βλάβη. Με τους παραπάνω προβληµατισµούς αποφασίστηκε η πειραµατική πρόκληση χρόνιας ηπατικής νόσου µε χορήγηση από το στόµα τετραχλωριούχου άνθρακα (CCl 4 ) σε σκύλους-πειραµατόζωα, µε σκοπό τη µελέτη των πιθανών αλλαγών στις συγκεντρώσεις των υπό διερεύνηση ιχνοστοιχείων στον ορό του αίµατος και στο ήπαρ, καθώς και των προκαλούµενων ιστοπαθολογικών και ιστοχηµικών αλλοιώσεων στο ηπατικό παρέγχυµα. Η χρήση του τετραχλωριούχου άνθρακα, για την πρόκληση της χρόνιας ηπατικής νόσου, αποφασίστηκε διότι αποτελεί αποδεκτό και πλήρως διερευνηµένο, σ ό,τι αφορά τον µηχανισµό πρόκλησης αλλά και τη δηµιουργία ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων, ηπατοτοξικό παράγοντα (Rees και συν.1961, Van Vleet και Alberts 1968, Litchfield και Gartland 1974, Aguilera-Tejero και συν.1988). 7

8 Η έρευνα αυτή πραγµατοποιήθηκε στην κλινική παθολογίας των ζώων συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του ΑΠΘ. Η εργασία αποτελείται από δύο µέρη: Στο πρώτο, γίνεται µια σύντοµη ανασκόπηση σχετική µε το µεταβολισµό των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων καθώς και τον ρόλο τους στην χρόνια ηπατική νόσο, τόσο στον άνθρωπο και στο σκύλο, όσο και σε άλλα είδη πειραµατόζωων. Στο δεύτερο µέρος παρουσιάζεται ο σχεδιασµός, η εκτέλεση, τα αποτελέσµατα και η συζήτηση της δικής µας πειραµατικής µελέτης. 8

9 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ Ι. Ο ρόλος του ήπατος στον µεταβολισµό του σιδήρου, του χαλκού και του ψευδαργύρου. Το ήπαρ ενώ αποτελεί το κυριότερο όργανο αποθήκευσης του σιδήρου στον οργανισµό, δεν συνιστά όργανο ρύθµισης του µεταβολισµού του (Kuntz και Kuntz 2002, Van Ho και Kaplan 2003) και ως εκ τούτου σ αυτό εκδηλώνονται µεταξύ των άλλων και τα αποτελέσµατα της τοξικότητας του υπό µελέτη ιχνοστοιχείου (Van Ho και Kaplan 2003). Ο µεταβολισµός του σιδήρου, αν και δεν είναι πλήρως κατανοητός, τελευταία έχει διευκρινιστεί αρκετά τουλάχιστον σ ό,τι αφορά στον άνθρωπο και στα ανώτερα θηλαστικά. Μάλιστα στον πρώτο, έχουν εντοπισθεί γονίδια που συµβάλουν στον έλεγχο τόσο της απορρόφησης όσο και της αποθήκευσής του (Van Ho και Kaplan 2003). Η απορρόφηση του σιδήρου από τα απορροφητικά επιθηλιακά κύτταρα του δωδεκαδάκτυλου και της αρχής της νήστιδας, είναι ενεργός διαδικασία που εξαρτάται αφενός από τις ανάγκες του οργανισµού σε σίδηρο και αφετέρου από τα αποθέµατά του. (Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002, Van Ho και Kaplan 2003). Στον εντερικό αυλό ο τρισθενής σίδηρος, µε τη συµµετοχή της βιταµίνης C και µιας σιδηροαναγωγάσης, µετατρέπεται σε δισθενή για να συνδεθεί µε ειδική πρωτεΐνη µεταφοράς δισθενών ιόντων µετάλλων της κυτταρικής µεµβράνης, την DMT-1 (Divalent Metal Transporter- 1) και να µεταφερθεί στη συνέχεια στο εσωτερικό των απορροφητικών κυττάρων του επιθηλίου του εντέρου. Η DMT-1 δεν είναι ειδική για να µεταφέρει µόνο το δισθενή σίδηρο αλλά µπορεί να µεταφέρει και άλλα δισθενή ιόντα µετάλλων, όπως του µαγγανίου, του κοβαλτίου, του χαλκού, του ψευδαργύρου, 9

10 του καδµίου και του µολύβδου ( Sherlock και Dooley 2002, Kuntz και Kuntz 2002, Van Ho και Kaplan 2003). H σύνδεση και µεταφορά του δισθενή σιδήρου µε την DMT-1 εξαρτάται άµεσα από την ενδοκυτταρική συγκέντρωση του, η οποία και τελικά ρυθµίζει τον εκάστοτε ρυθµό απορρόφησης του σιδήρου από τον εντερικό αυλό. Ο σίδηρος που φτάνει στο κυτταρόπλασµα των απορροφητικών επιθηλιακών κυττάρων του εντερικού βλεννογόνου αποθηκεύεται είτε µε τη µορφή φερριτίνης (υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη που περιέχει 20% σίδηρο), είτε εµπλουτίζει τη κυτταρική δεξαµενή του σιδήρου (σίδηρος όχι δεσµευµένος µε πρωτεΐνη). Η µεταφορά του ενδοκυτταρικά ευρισκόµενου σιδήρου προς την τριχοειδική µικροκυκλοφορία του εντερικού τοιχώµατος, επιτυγχάνεται µε την φερροπρωτεΐνη ή IREG-1, πρωτεΐνη του βασικού πετάλου των απορροφητικών κυττάρων του εντερικού επιθηλίου. Εκεί ο δισθενής σίδηρος µετατρέπεται εκ νέου σε τρισθενή και ενώνεται µε την τρανσφερρίνη που είναι η κυριότερη πρωτεΐνη εξωκυτταρικής µεταφοράς του. Αυτή παράγεται στο ήπαρ, είναι µη υδατοδιαλυτή και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες το 1/3 της ολικής ποσότητάς της δεσµεύει σίδηρο (Andrews 1999, Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002, Van Ho και Kaplan 2003). H µετατροπή του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή γίνεται µέσω οξειδασών που προέρχονται από την κυτταρική µεµβράνη των επιθηλιακών κυττάρων του λεπτού εντέρου όσο και από τα ηπατικά κύτταρα (Σχήµα 1) (Andrews 1999, Sherlock και Dooley 2002, Van Ho και Kaplan 2003). Tο ήπαρ, ως όργανο αποθήκευσης, δέχεται την περισσότερη ποσότητα του απορροφούµενου από το έντερο σιδήρου. Έτσι αυξηµένη απορρόφησή του, που ξεπερνά τις ανάγκες αιµοποίησης, έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της συγκέντρωσής του στον ήπαρ. Ο σίδηρος κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, βρίσκεται τόσο στα ηπατικά κύτταρα όσο και στα κύτταρα του Kuppfer, τα οποία εµφανίζουν 10

11 διαφορετικά συστήµατα µεταφοράς και αποµάκρυνσής του µέσω του πλάσµατος (Kuntz και Kuntz 2002, Van Ho και Kaplan 2003). Σχήµα 1. Υποθετικό πρότυπο ρύθµισης της απορρόφησης του σιδήρου από τον εντερικό αυλό. Ανάλογα µε την ποσότητα του σιδήρου στον οργανισµό µέσω των κυττάρων της εντερικής κρύπτης αυξάνεται ή µειώνεται η απελευθέρωση της DMT-1 (Divalent Metal Transporter 1) η οποία µε τη σειρά της µειώνει ή αυξάνει την απορρόφηση του σιδήρου µέσω των απορροφητικών κυττάρων της εντερικής λάχνης. Τα ηπατικά κύτταρα προσλαµβάνουν το σίδηρο που µεταφέρεται προς αυτά µέσω υποδοχέων. Έχουν εντοπιστεί σ αυτά υποδοχείς της τρανσφερρίνης, της αιµοπηξίνης (πρωτεΐνη µεταφοράς της αίµης), της απτοσφαιρίνης (πρωτεΐνη µεταφοράς της αιµοσφαιρίνης), καθώς και υποδοχείς για τον µη συνδεδεµένο µε τρανσφερρίνη σίδηρο (Kino και συν.1980, Smith και Morgan 1981, Wright και συν. 1986, Kuntz και Kuntz 2002, Van Ho και Kaplan 2003). Τα κύτταρα του Kuppfer κινητοποιούν το σίδηρο που προέρχεται από τα φαγοκυτταρωµένα ερυθρά αιµοσφαίρια. Τα τελευταία διασπώνται στα λυσσοσωµάτια 11

12 και η απελευθερούµενη αίµη µεταφέρεται στο κυτταρόπλασµα όπου µέσω µιας οξυγενάσης αποσπάται από αυτήν ο σίδηρος. Αυτός είτε αποθηκεύεται µε τη µορφή φερριτίνης, είτε µεταφέρεται εκτός κυττάρου µέσω της φερροπρωτεΐνης-1. Η ικανότητα της τελευταίας να αποµακρύνει µικρή ή µεγάλη ποσότητα σιδήρου εξαρτάται από τα συνολικά αποθέµατα του ιχνοστοιχείου αυτού στον οργανισµό. Ο ελευθερούµενος από τα κύτταρα του Kuppfer δισθενής σίδηρος, αφού µετατραπεί σε τρισθενή, δεσµεύεται από την τρανσφερρίνη για την κινητοποίησή του. Σε περιπτώσεις που η δέσµευση αυτή δεν είναι εφικτή, είτε γιατί δεν υπάρχει επαρκής τρανσφερρίνη, είτε διότι ο µηχανισµός µετατροπής του από δισθενή σε τρισθενή δεν είναι εφικτός, o σίδηρος συσσωρεύεται στο ηπατικό παρέγχυµα (Van Ho και Kaplan 2003). Κάτω από συνθήκες ηπατικής φόρτισης σε σίδηρο, τα κύτταρα του Kupffer ενεργοποιούνται και απελευθερώνουν κυτταροκίνες οι οποίες µετατρέπουν τα αστεροειδή κύτταρα (Ito cells-λιποκύτταρα) του ήπατος σε µυοινοβλάστες (Stal και συν. 1995). Όταν η συγκέντρωση του σιδήρου αυξάνεται στο κυτταρόπλασµα του ηπατικού κυττάρου, ανεξάρτητα από την πηγή προέλευσής του, αρχικά προάγεται ο σχηµατισµός της φερριτίνης και κατόπιν της αιµοσιδηρίνης, η οποία αποτελεί και την κυρίαρχη µορφή αποθήκευσης του σιδήρου σε συνθήκες αυξηµένης συγκέντρωσής του στο ήπαρ. Η πρόκληση ή η επιδείνωση της ήδη υπάρχουσας ηπατικής βλάβης οφείλεται στην αυξηµένη συγκέντρωση του εξωγενώς (πρόσληψη µεγάλων ποσοτήτων σιδήρου) ή ενδογενώς (βλάβη ηπατικών κυττάρων) προερχόµενου σιδήρου. Η βλάβη αυτή προκαλείται είτε µέσω της παραγωγής ελευθέρων ριζών οξυγόνου που προέρχονται από την αυξηµένη συγκέντρωση της φερριτίνης, είτε µέσω οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων που εκδηλώνονται κατά την µετατροπή της σε 12

13 περίσσεια ευρισκόµενης φερριτίνης σε αιµοσιδηρίνη (O Connell και συν. 1985, O Connell και συν. 1986, Van Ho και Kaplan 2003). Στο κυτταρόπλασµα του ηπατικού κυττάρου, εκτός από το σίδηρο που βρίσκεται αποθηκευµένος µε τη µορφή φερριτίνης και αιµοσιδηρίνης, αναφέρεται και η παρουσία των δύο ιοντικών µορφών (Fe +2 και Fe +3 ) του συγκεκριµένου ιχνοστοιχείου, ενωµένων µέσω ασθενών δεσµών µε µόρια µικρού µοριακού βάρους (κιτρικά, αµινοξέα, νουκλεοτίδια), πολυπεπτίδια και επιφανειακά µόρια µεµβρανών (φωσφολιπίδια). Ο σίδηρος αυτός χαρακτηρίζεται ως «ασταθής δεξαµενή σιδήρου», και θεωρείται ιδιαίτερα ενεργός, έτσι ώστε οποιαδήποτε µεταβολή της συγκέντρωσής του, ακόµα και παροδική, να συµµετέχει στην παραγωγή ελευθέρων ριζών µε όλες τις βλαπτικές, σε κυτταρικό επίπεδο, επιπτώσεις που απορρέουν από αυτή (Stäubli και Boelsterli 1998, Zanninelli και συν. 2002, Κakhlon και Cabantchik 2002) O χαλκός απορροφάται από τον αυλό του λεπτού εντέρου µέσω των απορροφητικών κυττάρων του εντερικού επιθηλίου. Μια ειδική πρωτεΐνη, η µεταλλοθειονίνη, ρυθµίζει την απορρόφηση του. Υψηλές συγκεντρώσεις της καθηλώνουν τον χαλκό εντός των απορροφητικών κυττάρων του εντερικού επιθηλίου εµποδίζοντας κατ αυτόν τον τρόπο την ελευθέρωσή του στη συστηµατική κυκλοφορία (Center 1996). Ο χαλκός στη συνέχεια µεταφέρεται από το έντερο στο ήπαρ, µέσω της πυλαίας κυκλοφορίας, ενωµένος µε ιστιδίνη και λευκωµατίνη (Harris και Gitlin 1996). Σ ό,τι αφορά τον ρόλο της σερουλοπλασµίνης στην µεταφορά και την κατανοµή του χαλκού στον οργανισµό φαίνεται οι διάφορες απόψεις να διίστανται. Νεότερες µελέτες στον άνθρωπο δείχνουν ότι η πρωτεΐνη αυτή δεν κατέχει κυρίαρχο ρόλο στη µεταφορά του χαλκού (Meyer και συν. 2001). Αντίθετα οι Kuntz και Kuntz (2002) θεωρούν τη σερουλοπλασµίνη καθοριστική για την µεταφορά του συγκεκριµένου ιχνοστοιχείου. Τα ηπατικά κύτταρα αποτελούν τα 13

14 κυρίως κύτταρα πρόσληψης και αποθήκευσής του. Σε περιπτώσεις περίσσειας του συγκεκριµένου ιχνοστοιχείου στα ηπατικά κύτταρα, η µεταλλοθειονίνη περιορίζει, µέχρι ένα βαθµό, τα τοξικά αποτελέσµατά του, µη επιτρέποντας την ελευθέρωσή του στο κυτταρόπλασµα (Sternlieb 1980, Kelly και Palmiter 1996). Η απέκκριση του χαλκού από το ήπαρ, γίνεται µέσω της χολής και ρυθµίζεται είτε από µια ATP-άση, η οποία εντοπίζεται στη συσκευή Golgi του ηπατικού κυττάρου (Scaefer και συν. 1995, Schaefer και συν. 1999), είτε µέσω συµπλόκου του παραπάνω ιχνοστοιχείου µε το γλουταθείο του ηπατικού κυττάρου ( Ferenci και συν. 2002). Ο ψευδάργυρος κυρίως απορροφάται από το λεπτό, αλλά µικρές ποσότητές του µπορεί να απορροφώνται και από το παχύ έντερο (McClain και συν. 1991, Center 1996). Η ρύθµιση της απορρόφησης του γίνεται µέσω µεταλλοθειονίνης που εντοπίζεται στα απορροφητικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου, αλλά και στα ηπατικά κύτταρα (Center 1996). Στο πλάσµα του αίµατος το 70% του ψευδαργύρου είναι συνδεδεµένο µε λευκωµατίνη, µε α 2 -µακροσφαιρίνη, µε αµινοξέα και σε µικρό ποσοστό µε τρανσφερρίνη (McClain και συν. 1991, Kuntz και Kuntz 2002). O ψευδάργυρος που µεταφέρεται στο ήπαρ συµµετέχει στον κύκλο της ουρίας ( Burch και συν. 1975, Rabbani και Prasad 1978, Reding και συν. 1984). Η απέκκριση του ιχνοστοιχείου αυτού γίνεται µέσω των κοπράνων, ενώ κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η απέκκρισή του µέσω του ούρου είναι ασήµαντη (ΜcClain και συν. 1991). 14

15 ΙΙ.Τετραχλωριούχος άνθρακας και χρόνια ηπατική νόσος Ο τετραχλωριούχος άνθρακας (CCl 4 ), αποτελεί γνωστή και καλά µελετηµένη ηπατοτοξική ουσία που προκαλεί ηπατικές αλλοιώσεις µέσω ιδιοσυγκρασιακών και άµεσα τοξικών µηχανισµών στον άνθρωπο (Sherlock και Dooley 2002), στο σκύλο (Center 1996) και σε άλλα είδη ζώων (Nath και συν. 1972, Everret και συν. 1977, Minami και συν. 1986). Επειδή οι ηπατικές αλλοιώσεις που προκαλεί έχουν σταθερή και χαρακτηριστική ιστοπαθολογική εικόνα, η ουσία αυτή έχει χρησιµοποιηθεί ευρέως για την πειραµατική πρόκληση ηπατικής νόσου σε διάφορα πειραµατόζωα, όπως στο σκύλο (Van Vleet και Alberts 1968, Litchfield και Gartland 1974), στη γάτα (Everret και συν. 1977), στα ποντίκια (Rees και συν. 1961), και στους πιθήκους (Nath και συν. 1972). Βέβαια η χρονιότητα της νόσου και η σοβαρότητα των αλλοιώσεων του ήπατος ποικίλουν εξαρτώµενες από τη χορηγούµενη δόση, την οδό και τη διάρκεια χορήγησής της, καθώς και από το είδος του πειραµατόζωου. Στο σκύλο έχουν χρησιµοποιηθεί δόσεις που το εύρος τους κυµαίνονταν από 0,05 ml/kg ΣΒ/24ωρο έως και 1,5 ml/kg ΣΒ/24ωρο από το στόµα καθηµερινά ή µε διαλείπουσα συχνότητα και για διάφορα χρονικά διαστήµατα (Van Vleet και Alberts 1968, Litchfield και Gartland 1974, Aguilera-Tejero και συν. 1988). Σε κάθε περίπτωση η νόσος που προκαλούνταν χαρακτηρίζονταν ως χρόνια ηπατική νόσος µε χαρακτηριστικές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στο ήπαρ. Ειδικότερα, αυτές αφορούσαν λιπώδη εκφύλιση και νέκρωση των ηπατικών κυττάρων, αρχικά στη ζώνη 3 και συνέχεια στις ζώνες 2 και 1, µικρού βαθµού διήθηση των πυλαίων διαστηµάτων από φλεγµονικά κύτταρα, και αυξηµένη παρουσία αστεροειδών κυττάρων στη θέση των νεκρωµένων ηπατικών κυττάρων (Van Vleet και Alberts 1968, Litchfield και Gartland 1974). Τα κολπώδη τριχοειδή εµφανίζουν συµφόρηση ενώ σε ορισµένα 15

16 περιστατικά που ελάµβαναν µεγαλύτερη δόση CCl 4, αναπτύχθηκε και κίρρωση (Litchfield και Gartland 1974). Η τοξική δράση του CCl 4 είναι αποτέλεσµα του συνδυασµού άµεσα τοξικών και ιδιοσυγκρασιακών µηχανισµών (Sherlock και Dooley 2002). Οι πρώτοι εκδηλώνονται µε τη καταστροφή της ηπατοκυτταρικής και των ενδοκυτταρικών µεµβρανών µέσω µιας σειράς αντιδράσεων που καταλήγουν είτε στην παραγωγή ελευθέρων ριζών, είτε στην αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων του ενδοκυτταρικού ασβεστίου και στη µείωση των ιόντων του ενδοκυτταρικού καλίου. H ενδοκυτταρική µετατροπή του CCl 4, µέσω του κυτοχρώµατος P-450, οδηγεί στην παραγωγή τοξικών µεταβολιτών οι οποίοι δρουν ως ελεύθερες ρίζες ( CCl 3, CCl 3 OO ) και έχουν αρνητική επίδραση στη λιποπρωτεΐνική δοµή της κυτταρικής µεµβράνης (Center 1996, Watson και συν. 2003). Ακόµα, οι προκαλούµενες ενδοκυτταρικές µεταβολές στη συγκέντρωση των διαφόρων ιόντων επιδρούν αρνητικά στη λειτουργία ενζύµων και συνενζύµων µε αποτέλεσµα την καταστροφή των κυτταρικών οργανιδίων και ιδιαίτερα των λυσσοσωµατίων και των µιτοχονδρίων (Center 1996, Watson και συν. 2003). Ο CCl 4 περιορίζει την ικανότητα των κυττάρων του Κuppfer να αποµακρύνουν ενδοτοξίνες που φτάνουν µέσω της πυλαίας κυκλοφορίας σε αυτό (Lough και συν. 1987). Τελικά η συνέργεια όλων των παραπάνω προκαλεί λειτουργικές διαταραχές που εκδηλώνονται µε λιπώδη εκφύλιση και νέκρωση του ηπατικού κυττάρου. Επίσης λόγω της ύπαρξης του CCl 4 διεγείρεται και ο ιδιοσυγκρασιακός µηχανισµός που προκαλεί ανοσολογικού τύπου αντίδραση η οποία τελικά είναι υπεύθυνη για την διήθηση των πυλαίων διαστηµάτων µε φλεγµονικά κύτταρα (Sherlock και Dooley 2002). Στην πρόκληση της ηπατικής βλάβης φαίνεται ότι η συµβολή του άµεσα τοξικού µηχανισµού υπερισχύει έναντι του ιδιοσυγκρασιακού (Kuntz και Kuntz 2002). 16

17 ΙΙΙ. Χρόνια ηπατική νόσος και σίδηρος Αύξηση της συγκέντρωσης των διαφόρων παραµέτρων των σχετικών µε το σίδηρο του ορού (σίδηρος ορού-si, ολική σιδηροδεσµευτική ικανότητα της τρανσφερρίνης ή ολική ικανότητα της τρανσφερρίνης να δεσµεύει σίδηρο-tibc, % κορεσµός της τρανσφερρίνης-sat, φερριτίνη) και του σιδήρου του ήπατος είναι γνωστή σε ανθρώπους που πάσχουν από διάφορες µορφές αιµοχρωµάτωσης (Rowe και συν. 1977, Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002), από τοξίκωση µε σίδηρο -σιδήρωση της αφρικανικής φυλής Bandou- (Gangaidzo και συν. 1999), καθώς και σε εκείνους στους οποίους γίνονται επανειληµµένες µεταγγίσεις αίµατος (Gabutti και Borgna-Pignatti 1994). Στην κτηνιατρική έχουν αναφερθεί παρόµοιας φύσης αυξήσεις σε σκύλους µετά από τυχαία λήψη από το στόµα µεγάλης ποσότητας σκευασµάτων µε σίδηρο (Papich 1990), σε άλογα του ιπποδρόµου µετά από παρεντερική χορήγηση σκευασµάτων που περιέχουν οργανικές ενώσεις σιδήρου (Casteel 2001) και σε πρόβατα µετά από λήψη τροφής πλούσιας σε σίδηρο (Rallis και συν. 1989). Κατά την τελευταία δεκαετία οι ηπατολόγοι ολοένα και περισσότερο εστιάζουν την προσοχή τους στην αύξηση της συγκέντρωσης του σιδήρου στον ορό του αίµατος και στο ήπαρ ανθρώπων που πάσχουν ιδιαίτερα από χρόνια φλεγµονώδη (ηπατίτιδα B,C) (Di Bisceglie και συν. 1992, Olynyk και συν. 1995, Bonkovsky και συν. 1997, Shedlofsky 1998) αλλά και µη (κίρρωση) νοσήµατα του ήπατος (Milman και συν. 1994, Ludwig και συν. 1997, Casaril και συν. 2000). Η αύξηση της συγκέντρωσης του σιδήρου δεν συνδέεται µε αυξηµένη πρόσληψη του ιχνοστοιχείου από το στόµα ή παρεντερικά, ούτε έχει σχέση µε κληρονοµική προδιάθεση, όπως 17

18 συµβαίνει µε την αιµοχρωµάτωση. Το µεγάλο ενδιαφέρον έγκειται στο γεγονός ότι η αυξηµένη συγκέντρωση του ηπατικού ιδιαίτερα σιδήρου, συνδέεται άµεσα µε την επιδείνωση της ηπατικής βλάβης (Andant και συν. 1996) ή την επιτάχυνση πρόκλησης κίρρωσης (Shedlofsky 1998, Casaril και συν. 2000). Αντίθετα, σε ασθενείς στους οποίους εκτελούνταν αφαιµάξεις (Sartori και συν. 1999), ή σε εκείνους στους οποίους χορηγούνταν δεσµευτικές του σιδήρου ουσίες, όπως η δεφεροξαµίνη, η κλινική εικόνα της νόσου βελτιώνονταν, κυρίως όµως οι ηπατικές αλλοιώσεις αναστρέφονταν όσο η συγκέντρωση του ήπατος σε σίδηρο µειώνονταν (Fontana και συν. 2000). Aκόµα σε ασθενείς µε ηπατίτιδα C βρέθηκε θετική συσχέτιση µεταξύ της µείωσης της δραστηριότητας των τρανσαµινασών και της µείωσης της φερριτίνης του ορού (Iwasa και συν. 2002). Τέλος σε ασθενείς µε ηπατίτιδα B ή C και αυξηµένη συγκέντρωση σιδήρου του ορού του αίµατος και του ήπατος η ανταπόκριση στη θεραπεία µε ιντερφερόνη δεν υπήρξε καλή (Kaji και συν. 1995, Olynyk και συν. 1995, Bonkovsky και συν. 1997). Αντίθετα, σε ασθενείς µε τις ίδιες παθήσεις και ανάλογη βαρύτητα κλινικής και εργαστηριακής εικόνας που λάµβαναν δεφεροξαµίνη ή είχαν υποστεί αφαίµαξη, µε σκοπό τη µείωση της συγκέντρωσης του σιδήρου στο ήπαρ, η ανταπόκριση στη θεραπεία µε ιντερφερόνη υπήρξε πολύ καλή (Bayraktar και συν. 1998, Fargion και συν. 1999), µε ανάλογη ιστοπαθολογική βελτίωση των αλλοιώσεων στο ηπατικό παρέγχυµα (Bayraktar και συν.1998, Di Bisceglie και συν. 2000, Fontana και συν. 2000). Με βάση πολλές κλινικοεργαστηριακές µελέτες αναπτύχθηκαν διάφοροι συσχετισµοί µεταξύ των διαφόρων παραµέτρων του σιδήρου του ορού του αίµατος και της εναπόθεσης του ιχνοστοιχείου αυτού στο ήπαρ (Di Bisceglie και συν. 1992, Milman και συν. 1994, Fabris και συν. 2001). Αναφέρουµε ενδεικτικά ότι ο SAT σχετίζεται θετικά µε την εναπόθεση σιδήρου στο ήπαρ, αποτελώντας κατ αυτόν τον τρόπο τον 18

19 καταλληλότερο δείκτη εναπόθεσης σιδήρου στο ήπαρ ανθρώπων µε ηπατική νόσο (Fabris και συν. 2001). Στο σκύλο, αλλά και σε άλλα είδη ζώων δεν υπάρχουν παρόµοιες παρατηρήσεις. Υπάρχει µόνο µια πρόσφατη ανακοίνωση σε συνέδριο η οποία αφορά στη συγκέντρωση του σιδήρου στο ήπαρ 64 σκύλων που έπασχαν από χρόνια ηπατίτιδα ή κίρρωση (Center και Warner 2001). Στη µελέτη αυτή βρέθηκε µέση συγκέντρωση σιδήρου 1710 (εύρος τιµών: ) µg/g Ξ.Ο ήπατoς, µε υψηλότερες συγκεντρώσεις στα ζώα εκείνα που εµφάνιζαν ηπατική νόσο µε ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά νέκρωσης και φλεγµονής (διάφορες µορφές ηπατίτιδας). Σε αυτά µε κίρρωση, αναστοµώσεις της πυλαίας φλέβας και δυσπλασία της πυλαίας φλέβας, η συγκέντρωση του σιδήρου ήταν µικρότερη. Στην ανακοίνωση δεν γίνεται περαιτέρω οποιοσδήποτε σχολιασµός. Σε ασθενείς µε αιµοχρωµάτωση η εναπόθεση του σιδήρου αφορά αρχικά τα περιπυλαία διαστήµατα (ζώνη 1) και στη συνέχεια τις ζώνες 2 και 3.( Rowe και συν. 1977, Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002, Tavill και Bacon 2003). Ανάλογη ιστοχηµική εικόνα παρατηρείται και σε ασθενείς µε ηπατίτιδα C. Στο ζωικό είδος που µελετούµε, δεν υπάρχουν στην προσιτή σε µας βιβλιογραφία, λεπτοµερή στοιχεία που να δείχνουν την πιθανή σχέση SI, TIBC, SAT και της συγκέντρωσης σιδήρου του ήπατος, µε τη χρόνια ηπατική νόσο, ούτε βέβαια πιθανοί συσχετισµοί µεταξύ των παραπάνω παραµέτρων και της ιστοπαθολογικής ή ιστοχηµικής εικόνας του ήπατος. Το ηπατοτοξικό αποτέλεσµα του αυξηµένου σιδήρου σε κυτταρικό επίπεδο εκδηλώνεται µέσω: υψηλού ρυθµού σχηµατισµού ελευθέρων ριζών οξυγόνου, άµεσης διέγερσης των µηχανισµών παραγωγής κολλαγόνου και τέλος αλλαγών στην σύνθεση του DNA του πυρήνα (Britton 1996, Kuntz και Kuntz 2002). 19

20 ΙV. Χρόνια ηπατική νόσος και χαλκός Η νόσος Wilson στον άνθρωπο, οφείλεται σε αυτοσωµικό υπολειπόµενο γονίδιο που ελέγχει την σύνθεση µιας ΑΤΡ-άσης η οποία µεταφέρει χαλκό, χαρακτηρίζεται από αυξηµένη συσσώρευση χαλκού στο ήπαρ, µειωµένη σύνθεση σερουλοπλασµίνης και σηµαντική µείωση της απέκκρισης του χαλκού µέσω της χολής (Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002, Gitlin 2003). Στην Ινδία έχει περιγραφεί αντίστοιχη παθολογική κατάσταση, που έχει ως κύριο ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό τη µικροοζώδη κίρρωση σε παιδιά ηλικίας µεταξύ 1-3 ετών. Η συγκέντρωση του χαλκού του ήπατος είναι αυξηµένη ενώ αυτή της σερουλοπλασµίνης του ορού του αίµατος κυµαίνεται σε φυσιολογικά όρια (Kuntz και Kuntz 2002, Sherlock και Dooley 2002). Τα Bedlington terrier και τα West Highland white terrier αποτελούν τις φυλές σκύλων στις οποίες έχει µελετηθεί πιο συστηµατικά η ηπατική νόσος που συνδέεται µε υψηλές συγκεντρώσεις χαλκού στα ηπατικά κύτταρα (Twedt και συν. 1979, Thornburg και συν. 1986, Rolfe και Twedt 1995, Thornburg και συν. 1996). Σχετικά µε την παθογένεια της νόσου, παρατηρείται παρεµπόδιση της απέκκρισης του χαλκού που συσσωρεύεται στα λυσσοσωµάτια των ηπατικών κυττάρων. Στα Bedlington terrier ευθύνεται για τη διαταραχή αυτή, µια µεταλλαγµένη ηπατική µεταλλοθειονίνη. Ως αποτέλεσµα του εγκλωβισµού του συγκεκριµένου ιχνοστοιχείου στα ηπατικά κύτταρα εµφανίζεται νέκρωσή τους και ταυτόχρονα ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων, µε τελικό αποτέλεσµα την ίνωση-κίρρωση του ήπατος (Rolfe και Twedt 1995). Σε σκύλους φυλής Doberman διαγνώστηκε ηπατική νόσος που χαρακτηρίζονταν από αυξηµένη συσσώρευση χαλκού, κυρίως στη ζώνη 1. Η 20

21 εντόπιση των κοκκίων του χαλκού µοιάζει µε αυτή που παρατηρείται σε χολοστατικά νοσήµατα του ανθρώπου (Johnson και συν. 1982, Crawford και συν. 1985). Πρόσφατα ανακοινώθηκε µελέτη που περιγράφει ηπατική νόσο από χαλκό σε σκύλους της φυλής αλµατίας που πιθανότατα οφείλεται σε διαταραχή του µεταβολισµού του εν λόγω ιχνοστοιχείου χωρίς ωστόσο να έχει αποσαφηνιστεί ικανοποιητικά ο µηχανισµός πρόκλησης και η ενδεχόµενη γενετική βάση της παθολογικής αυτής κατάστασης (Webb και συν. 2002). Σε 64 σκύλους µε χρόνια ηπατίτιδα-κίρρωση µετρήθηκε ο χαλκός του ήπατος και βρέθηκε µέση τιµή 510 (εύρος τιµών: ) µg/g Ξ.Ο ήπατος ενώ κατά την οµαδοποίηση των ηπατικών νοσηµάτων, σε εκείνα µε ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά νέκρωσης και φλεγµονής και σε µη, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις του παραπάνω ιχνοστοιχείου διαπιστώθηκαν στην πρώτη κατηγορία. (Center και Warner 2001). To 80% του απορροφούµενου από το λεπτό έντερο χαλκού φυσιολογικά απεκκρίνεται µέσω της χολής. Σε περιστατικά χρόνιας χολόστασης σε ανθρώπους, ο χαλκός συσσωρεύεται στο ήπαρ σε συγκεντρώσεις που κυµαίνονται στα ίδια ή υψηλότερα επίπεδα από αυτά που παρατηρούνται στη νόσο Wilson. Στα περιστατικά αυτά, ο χαλκός που συσσωρεύεται πιθανότατα δεν είναι ηπατοτοξικός (Sherlock και Dooley 2002). Xολόσταση µεγάλης χρονικής διάρκειας οδηγεί συχνά σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις χαλκού στο ήπαρ (Smallwood και συν. 1968). Στην ίδια εργασία διαπιστώθηκε θετικός συσχετισµός µεταξύ της συγκέντρωσης χαλκού στο ήπαρ και της διάρκειας των συµπτωµάτων. Σε ασθενείς µε οξεία ιογενή ηπατίτιδα, αρχικά παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης του χαλκού του ορού του αίµατος, για να επανέλθει αυτή στη συνέχεια στα φυσιολογικά όρια (Versieck και συν. 1974). Ενώ σε περιστατικά χρόνιας εµµένουσας ηπατίτιδας δεν εµφανίστηκαν µεταβολές στη συγκέντρωση του χαλκού του ορού του αίµατος (Versieck και συν. 1974). 21

22 Το ηπατοτοξικό αποτέλεσµα της αυξηµένης συγκέντρωσης χαλκού σε κυτταρικό επίπεδο εκδηλώνεται µέσω, πρώτον, του σχηµατισµού ελευθέρων ριζών οξυγόνου και υπεροξείδωσης των λιπιδίων των κυτταρικών ή ενδοκυτταρικών µεµβρανών και δεύτερον, της δηµιουργίας δεσµών S-Cu-S, οι οποίοι πολυµερίζουν σηµαντικά κυτταροπλασµατικά µόρια, πλούσια σε σουλφυδριλικές οµάδες (-SH). Το άµεσο αποτέλεσµα του παραπάνω πολυµερισµού είναι η αδρανοποίηση των µορίων αυτών, µε αρνητικές επιπτώσεις σε κυτταρικό και υποκυτταρικό επίπεδο (Sternlieb 1980, Kuntz και Kuntz 2002). V. Χρόνια ηπατική νόσος και ψευδάργυρος Στην παθολογία του ήπατος του ανθρώπου τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερο ερευνάται ο ρόλος του ψευδαργύρου στα νοσήµατα του ήπατος. Στην κίρρωση παρατηρείται σηµαντική µείωση της συγκέντρωσης του ψευδαργύρου στον ορό του αίµατος και στο ήπαρ και συνιστάται η χορήγησή του σε ασθενείς που εκδηλώνουν συµπτωµατολογία ηπατικής εγκεφαλοπάθειας (Kuntz και Kuntz 2002). Άνθρωποι που πάσχουν από ηπατική νόσο παρουσιάζουν απέκκριση αυξηµένης ποσότητας ψευδαργύρου µε το ούρο και ταυτόχρονα θετικό συσχετισµό µεταξύ της ποσότητας του αποβαλλόµενου ψευδαργύρου και της βαρύτητας της ηπατικής νόσου (McClain και συν. 1991). Η αυξηµένη δραστηριότητα των κυτταροκινών (IL-1, IL-6, TNF) προκαλεί διέγερση της σύνθεσης της εντερικής µεταλλοθειονίνης, η οποία εµποδίζει την απορρόφηση του ψευδαργύρου σε εντερικό επίπεδο. Ο µηχανισµός που προαναφέρθηκε εξηγεί, τουλάχιστον εν µέρει, τη διαταραχή του µεταβολισµού του ψευδαργύρου που παρατηρείται σε ασθενείς µε χρόνια ηπατική νόσο (McClain και συν. 1991). Σε ανθρώπους µε οξεία ιογενή 22

23 ηπατίτιδα, δεν παρατηρήθηκαν µεταβολές στη συγκέντρωση του ψευδαργύρου του ορού του αίµατος. Η φυσιολογική συγκέντρωση του ψευδαργύρου του ορού που παρατηρείται σε αυτά τα περιστατικά πιθανότατα οφείλεται στην εξισορρόπηση που προκύπτει µεταξύ του ιχνοστοιχείου που ελευθερώνεται από τη νέκρωση των ηπατικών κυττάρων και την αυξηµένη απέκκριση του τελευταίου µέσω του ούρου. Στην παραπάνω µελέτη χαµηλές συγκεντρώσεις ψευδαργύρου στον ορό του αίµατος παρατηρήθηκαν σε ένα µόνο περιστατικό χρόνιας ηπατίτιδας και σε τρία περιστατικά προχωρηµένης κίρρωσης (Versieck και συν. 1974). Η συγκέντρωση του ψευδαργύρου στο ήπαρ ασθενών µε κίρρωση ήταν χαµηλότερη συγκριτικά µε την αντίστοιχη ασθενών µε χρόνια ενεργό ηπατίτιδα, εύρηµα που υποδηλώνει ότι όσο επιδεινώνεται η ηπατική νόσος, µειώνεται η συγκέντρωση του ηπατικού ψευδαργύρου (Gur και συν. 1995). Τέλος σε ασθενείς µε κίρρωση έχει βρεθεί οτι η λευκωµατίνη που λαµβάνονταν από το πλάσµα του αίµατος, παρουσίαζε ασθενέστερη ικανότητα δέσµευσης του ψευδαργύρου από την αντίστοιχη φυσιολογικών ατόµων. Λαµβάνοντας υπ' όψιν το γεγονός ότι το 70% του ψευδαργύρου του ορού είναι συνδεδεµένο µε λευκωµατίνη, µπορούµε να εξηγήσουµε τις µεταβολές στη βιοδιαθεσιµότητα του ψευδαργύρου και την κατανοµή του στους διάφορους ιστούς (Giroux και συν. 1977). H ανεπάρκεια ψευδαργύρου φαίνεται ότι επιτρέπει τη συσσώρευση άλλων ηπατοτοξικών µετάλλων όπως του σιδήρου και του χαλκού στο ήπαρ (Center 1996). Σε 64 σκύλους µε χρόνια ηπατίτιδα-κίρρωση µετρήθηκε ο ψευδάργυρος του ήπατος και βρέθηκε µέση τιµή 148 (εύρος τιµών: ) µg/g Ξ.Ο ήπατος. Η χαµηλότερη τιµή ψευδαργύρου, 127µg/g Ξ.Ο ήπατος, παρατηρήθηκε σε σκύλους µε συγγενείς αναστοµώσεις της πυλαίας φλέβας (Center και Warner 2001). 23

24 ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ ΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΡΓΑΣΙΑΣ I. Πειραµατόζωα - ιατροφή Στη µελέτη µας χρησιµοποιήθηκαν 14 σκύλοι, 7 ανήκαν στη φυλή Beagle και 7 ήταν ακαθόριστης φυλής, ηλικίας 1 έτους, οι οποίοι προήλθαν από 2 τοκετοοµάδες. Τα πειραµατόζωα χωρίστηκαν σε δύο οµάδες, των 7 σκύλων η κάθε µία. Στην µια οµάδα, που χαρακτηρίστηκε ως Π, ανήκαν τα ζώα στα οποία προκλήθηκε χρόνια ηπατική νόσος, ενώ στην άλλη, που χαρακτηρίστηκε ως Μ, οι µάρτυρες. Στην οµάδα Π υπήρχαν 4 αρσενικά και 3 θηλυκά ζώα και στη Μ η ίδια αναλογία σ ό,τι αφορά το φύλο των ζώων. Τα ζώα παρέµειναν για 8 µήνες στις εγκαταστάσεις της Κλινικής Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ., µε σκοπό την προσαρµογή τους και τον έλεγχο της γενικής τους κατάστασης. Η διατροφή τους στηρίζονταν σε βιοµηχανοποιηµένη ξηρή τροφή για σκύλους. Τα ζώα εµβολιάστηκαν (σύµφωνα µε το επικρατούν εµβολιακό πρόγραµµα) κατά της νόσου του Carré, της λοιµώδους ηπατίτιδας, της λεπτοσπείρωσης, της εντερίτιδας από παρβοιό και της λύσσας. Επίσης υποβάλλονταν σε αντιπαρασιτική αγωγή κατά των έξω και ενδοπαρασίτων ανά τακτά χρονικά διαστήµατα. Για την πρόληψη της διροφιλαρίασης χορηγούνταν στα ζώα µιλµπεµυκίνη (Interceptor Novartis), 0,5 mg/kg Σ.Β, από το στόµα, ανά µηνιαία διαστήµατα. Τέλος, αυτά ελέγχθηκαν µε ορολογικές και κυτταρολογικές εξετάσεις για το ενδεχόµενο νόσησης από λεισµανίωση και ερλιχίωση. 24

25 Κατά την έναρξη του πειραµατισµού η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση ( Χ ± SD) του σωµατικού βάρους των πειραµατόζωων ήταν 13,75 ± 3,98 για την οµάδα Π και 14,71 ± 3,49 για την οµάδα Μ. Τρεις εβδοµάδες πριν από την έναρξη του πειραµατισµού άρχισε στα ζώα και των δύο οµάδων η χορήγηση της τροφής την οποία θα κατανάλωναν καθ όλη τη διάρκεια της µελέτης. Tο σιτηρέσιο τους αποτελούσε βιοµηχανοποιηµένη ξηρή τροφή για σκύλους, της Εταιρείας Waltham- ΤΡΟΦΕΚΛΕΚΤ (Pedigree Pal - κοτόπουλο). Η ηµερήσια ποσότητα της χορηγούµενης τροφής καθορίζονταν σύµφωνα µε το σωµατικό βάρος και τη δραστηριότητα των ζώων ( Lewis και συν ). Η τροφή, που περιλάµβανε υποπροϊόντα πουλερικών, δηµητριακά, υποπροϊόντα φυτικής προέλευσης, ζωικά λίπη, ανόργανα άλατα, βιταµίνες, µέταλλα, χρωστικές, συντηρητικά και αντιοξειδωτικά, περιείχε: 20% πρωτεΐνες, 10% λίπη, 6% ολική τέφρα, 3% φυτικές ίνες και 9% υγρασία. Η περιεκτικότητά της σε βιταµίνες ήταν: βιταµίνη Α IU/kg, βιταµίνη D 1000 IU/kg και βιταµίνη Ε 150 mg/kg. Σε ό,τι αφορά τα υπό µελέτη ιχνοστοιχεία η χορηγούµενη ξηρή τροφή περιλάµβανε Fe 103,51 ± 8,32 µg/g ΞΟ, Cu 14,75±3,6 µg/g ΞΟ και Zn 89,32 ±10,23 µg/g ΞΟ. (Ανάλυση σε 100 δείγµατα). ΙΙ. Πρόκληση χρόνιας ηπατικής νόσου. Πριν από την έναρξη πρόκλησης της χρόνιας ηπατικής νόσου στα ζώα και των δύο οµάδων, Π και Μ, πραγµατοποιήθηκε λαπαροτοµή µε σκοπό τη λήψη ιστοτεµαχίου ήπατος για ιστοπαθολογική, ιστοχηµική και ανοσοϊστοχηµική εξέταση καθώς και για τον προσδιορισµό σ αυτό των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων σιδήρου, χαλκού και ψευδαργύρου. Η λαπαροτοµή πραγµατοποιήθηκε µετά από γενική Οι συγκεντρώσεις των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων σε δείγµατα τροφών καθώς και σε δείγµατα του ήπατος εκφράζονται πάντα σε Ξηρά Ουσία (ΞΟ), εκτός και αν υπάρχει άλλος χαρακτηρισµός 25

26 αναισθησία. Η εισαγωγή στην αναισθησία έγινε µε συνδυασµό φαιντανύλης (Fentanyl, ΒΙΟΣΕΡ ΑΕ), 10µg/kg ΣΒ, ενδοφλέβια και διαζεπάµης (Stedon, ADELCO), 0,5mg/kg ΣΒ, ενδοφλέβια, ενώ η διατήρησή της, µε την χορήγηση µίγµατος αλοθανίου-οξυγόνου µέσω συστήµατος To and Fro. Τριάντα λεπτά πριν την έναρξη της λαπαροτοµής χορηγήθηκε στα ζώα κεφαµανδόλη (Mandokef, Lilly), στη δόση των 30 mg/kg ΣΒ, εφ άπαξ, ενδοφλέβια. Στα ζώα της οµάδας Π, µετά το πέρας δύο εβδοµάδων από τη λαπαροτοµή και βιοψία του ήπατος, άρχισε η χορήγηση τετραχλωριούχου άνθρακα (CCl 4 1,59mg/ml ΜERCK) σε δόση 0,25ml/kg ΣΒ, από το στόµα, το 24ωρο, για χρονικό διάστηµα 10 εβδοµάδων. Η ποσότητα του CCl 4 τοποθετούνταν σε κάψουλες οι οποίες χορηγούνταν στα ζώα. Τα ζώα της οµάδας Μ λάµβαναν εικονικό φάρµακο (κενή κάψουλα), για χρονικό διάστηµα επίσης 10 εβδοµάδων. Μετά το πέρας των 10 εβδοµάδων στα ζώα και των δύο οµάδων έγινε εκ νέου λαπαροτοµή, βιοψία ήπατος και λήψη ιστοτεµαχίου για ιστοπαθολογική, ανοσοϊστοχηµική και ιστοχηµική εξέταση και προσδιορισµό των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων. Ο τρόπος αναισθησίας, λαπαροτοµής και βιοψίας ήπατος ήταν ο ίδιος µε αυτόν που έγινε αρχικά στα ζώα. Η εκτίµηση του σωµατικού βάρους των ζώων και των δύο οµάδων γίνονταν ανά εβδοµαδιαία διαστήµατα καθ όλη τη διάρκεια του πειραµατισµού. Το παρόν πειραµατικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή έγκρισης και παρακολούθησης πειραµατισµών της ιεύθυνσης Κτηνιατρικής Ν. Θεσσαλονίκης (Αρ. Πρωτ. 13/ /4/2000). Σε κάθε χειρισµό που αφορούσε στα πειραµατόζωα λαµβάνονταν ειδική πρόνοια ώστε αυτός να είναι ανώδυνος και να µην προκαλεί αγωνία σ αυτά. 26

27 ΙΙΙ. ειγµατοληψία βιολογικών υλικών. Στα ζώα και των δύο οµάδων πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος πραγµατοποιήθηκαν τρεις αιµοληψίες, ανά τριήµερα µεταξύ τους διαστήµατα. Οι αιµοληψίες γίνονταν µε σύριγγες και βελόνες µιας χρήσης. Το αίµα που προορίζονταν για γενική εξέταση αίµατος συλλέγονταν σε σωληνάρια που περιείχαν ως αντιπηκτικό άλας καλίου-νατρίου του αιθυλενοδιαµινοτετραοξικού οξέως (EDTA), ενώ αυτό που προορίζονταν για τη µέτρηση των βιοχηµικών παραµέτρων, σε σωλήνες τύπου Monovette. Στις βιοχηµικές παραµέτρους που µελετήθηκαν στον ορό του αίµατος περιλαµβάνονταν: οι συγκεντρώσεις του αζώτου της ουρίας (BUN), της κρεατινίνης, της γλυκόζης, των λευκωµατινών, της ολικής (ΟΧ) και άµεσης χολερυθρίνης (ΑΧ) και των χολικών οξέων (ΧΟ) καθώς και οι δραστηριότητες της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), και της αλανιναµινοτρανσφεράσης (ALT). Για τη µέτρηση των Χ.Ο του ορού του αίµατος γίνονταν δύο αιµοληψίες, η πρώτη µετά από 12ωρη νηστεία των ζώων, από την οποία υπολογίζονταν και οι υπόλοιπες παράµετροι, και η δεύτερη 2 ώρες µετά τη κατανάλωση συγκεκριµένης ποσότητας και σύστασης τροφής (κονσέρβα p/d Hill s) (Bostwick και Meyer 1995). Για την µέτρηση της συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων, σιδήρου, χαλκού και ψευδαργύρου στον ορό του αίµατος, πραγµατοποιήθηκαν επίσης τρεις αιµοληψίες ανά τριήµερα διαστήµατα. Σε κάθε αιµοληψία συλλέγονταν περίπου 12 ml αίµατος, µε βελόνες από ανοξείδωτο χάλυβα, σε γυάλινους σωλήνες πλυµένους αρχικά µε νιτρικό οξύ και στη συνέχεια µε δισαπεσταγµένο νερό για την αποφυγή µόλυνσης του δείγµατος από ιχνοστοιχεία. Εάν ο ορός του αίµατος εµφάνιζε αιµόλυση, επαναλαµβάνονταν η αιµοληψία. Μετά πάροδο 2 εβδοµάδων από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία στα ζώα και των δύο οµάδων άρχισαν οι αιµοληψίες οι οποίες πραγµατοποιούνταν κάθε 2 27

28 ηµέρες, προκειµένου να εκτιµηθούν οι παράµετροι της ALP και της ALT και κάθε 7 ηµέρες προκειµένου για τις υπόλοιπες καθώς και για τις συγκεντρώσεις των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων. Όλες οι αιµοληψίες πραγµατοποιούνταν στις προκαθορισµένες ηµέρες και πάντοτε την ίδια ώρα του 24ώρου. IV. Μέθοδοι προσδιορισµού των παραµέτρων Ο σίδηρος του ορού (Serum Iron, SI) που εκφράζεται σε µg/100ml ορού ή πλάσµατος, είναι συνήθως δεσµευµένος από το 1/3 περίπου της ολικής τρανσφερρίνης που κυκλοφορεί στο αίµα. Τα υπόλοιπα 2/3 της τρανσφερρίνης είναι ελεύθερα και µπορούν κάθε στιγµή να δεσµεύουν τις νέες ποσότητες σιδήρου που εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος. Η δυνατότητα που θεωρητικά έχει η ολική ποσότητα της τρανσφερρίνης του ορού να δεσµεύει σίδηρο χαρακτηρίζεται ως «ολική ικανότητα της τρανσφερρίνης του ορού να δεσµεύει σίδηρο ή σιδηροδεσµευτική ικανότητα της τρανσφερίνης» (Total Iron Binding Capacity, TIBC) και εκφράζεται σε µg/100ml ορού ή πλάσµατος (Underwood 1977, Smith 1989). Στην κλινική πράξη για τον έλεγχο της κατάστασης των ζωικών οργανισµών σε ό,τι αφορά το σίδηρο χρησιµοποιείται η εκατοστιαία σχέση του SI προς την TIBC [(SI/TIBC)x100] ή αλλιώς ο % κορεσµός της τρανσφερρίνης (% saturated, SAT). Οι προσδιορισµοί του SI και της TIBC, έγιναν µε φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης τη εταιρείας PERKIN ELMER, τύπου Α Analyst 100. Οι µέθοδοι προσδιορισµού είναι εκείνες που υποδεικνύονται από την κατασκευάστρια εταιρεία (Perkin-Elmer Co 1996) και τους Olsen και Hamlin (1969). Προσδιορισµός SI. Σε ένα ml ορού, τοποθετηµένο σε γυάλινο σωληνάριο, γίνονταν προσθήκη 1 ml 20% (w/v) τριχλωροξικού οξέος. Το µίγµα µετά από ανάδευση, 28

29 θερµαίνονταν σε 90 ºC για 15 πρώτα λεπτά. Ακολουθούσε ψύξη και φυγοκέντρηση. Στο υπερκείµενο υγρό γίνονταν προσδιορισµός της συγκέντρωσης του σιδήρου µε το φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης. Προσδιορισµός TIBC. Σε 2 ml ορού, τοποθετηµένα σε γυάλινο σωληνάριο, γίνονταν προσθήκη 2 ml τριχλωριούχου Fe (FeCl 3.6H 2 O) που περιείχε 5 µg Fe/ml. Στο µίγµα, µετά από ανάδευση και παραµονή σε ηρεµία για 5 λεπτά, γίνονταν προσθήκη 200 mg στερεού βασικού ανθρακικού µαγνησίου (4 MgCO 3. Mg(OH) 2. nh 2 O). Ακολουθούσε φυγοκέντρηση µετά από 30 πρώτα λεπτά, αφού στο διάστηµα αυτό γίνονταν κάθε 7-8 πρώτα λεπτά καλή ανάδευση. Από το υπερκείµενο υγρό 2 ml µεταφέρονταν σε άλλο γυάλινο σωλήνα. Σε αυτά γίνονταν προσθήκη 2 ml διαλύµατος τριχλωροξικού οξέος 20% (w/v). Tο µίγµα µετά από ανάδευση θερµαίνονταν σε 90ºC για 15 πρώτα λεπτά. Ακολουθούσε ψύξη και φυγοκέντρηση. Στο υπερκείµενο υγρό γίνονταν ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του σιδήρου. Προσδιορισµός Ζn και Cu στον ορό του αίµατος. Σε γυάλινο σωληνάριο γίνονταν προσθήκη 1 ml ορού και 3 ml δισαπεσταγµένου νερού, ανάδευση και στη συνέχεια προσδιορίζονταν η συγκέντρωση του χαλκού και του ψευδαργύρου µε φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης τη εταιρείας PERKIN ELMER, τύπου Α Αnalyst 100. Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων Fe, Cu και Zn στο ήπαρ. Τα δείγµατα του ήπατος που είχαν βάρος gr τεµαχίζονταν και ξηραίνονταν σε κλίβανο θερµοκρασίας 105 ºC µέχρι σταθερού βάρους. Από τα δείγµατα του ήπατος λαµβάνονταν 250 mg ιστού που γίνονταν σκόνη σε κατάλληλο «κονιοποιητή- 29

30 αναµίκτη» ( mixer ) και τοποθετούνταν σε φιάλη kjeldahl για να υποβληθεί σε υγρή πέψη µε µίγµα οξέων νιτρικού, θειικού και υπερχλωρικού στην αναλογία κατ όγκο 2:1:2. Η πέψη αυτή που αποσκοπούσε στην καταστροφή της οργανικής ύλης,διαρκούσε έως ότου το υγρό περιεχόµενο της φιάλης µειωθεί σε 1 ml περίπου. Έτσι στη φιάλη παρέµεναν τα µεταλλικά συστατικά του δείγµατος µε τη µορφή ανόργανων αλάτων. Στο υγρό που απέµενε γίνονταν κατάλληλη αραίωση µε δισαπεσταγµένο νερό και στο τελικό διάλυµα γίνονταν ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων στο φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης της εταιρείας PERKIN ELMER, τύπου Α Analyst 100. Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων Fe, Cu και Zn στα δείγµατα τροφής. Από κάθε δείγµα της τροφής λαµβάνονταν 700 mg και ακολουθούσε πέψη όµοια µε εκείνη που αναφέρθηκε στον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων των Fe, Cu και Zn στο ήπαρ. Στη συνέχεια γίνονταν προσθήκη 5 ml δισαπεσταγµένου νερού και στο διάλυµα αυτό γίνονταν ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων στο ίδιο µε το παραπάνω αναφερόµενο φασµατοφωτόµετρο ατοµικής απορρόφησης. Τονίζεται ότι η διαδικασία τεµαχισµού και κονιοποίησης δεν επιβάρυνε τα δείγµατα µε τα υπό µελέτη ιχνοστοιχεία, όπως άλλωστε φάνηκε από επανειληµµένες δοκιµές, που έγιναν πριν από την ανάλυση των προς έλεγχο δειγµάτων. Προσδιορισµός των βιοχηµικών παραµέτρων στον ορό του αίµατος. Ενζυµατικές φασµατοφωτοµετρικές µέθοδοι χρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό της δραστηριότητας της ALT (Thefeld W. και συν. 1974), και της ALP (Schlebusch H. και συν. 1974), κινητική χρωµατοµετρική µέθοδος για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της κρεατινίνης (Bartles Hand Böhmer M. 1971) και χρωµατοµετρικές 30

31 φασµατοφωτοµετρικές µέθοδοι για τον προσδιορισµό των συγκεντρώσεων του BUN (Fawcett J.K. και Scott J.E 1960), της ολικής και άµεσης χολερυθρίνης (Jendrassik L. και Grof P 1938), της γλυκόζης (Barham D. και Trinder P. 1972), των λευκωµατινών (Doumas B.T. και συν. 1971) και των χολικών οξέων (Mashige F. και συν. 1981) στον ορό του αίµατος, σε φασµατοφωτόµετρο τύπου Hitachi U V. Ιστοπαθολογική εξέταση. Τα ιστοτεµάχια του ήπατος µονιµοποιήθηκαν σε διάλυµα φορµόλης 10% µε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα. Μετά τη συνήθη επεξεργασία τους έγιναν τοµές παραφίνης πάχους 6-8µ. και χρωµατίστηκαν µε Αιµατοξυλίνη-Εωσίνη (Η-Ε) και Van Geison s. Ο βαθµός της ηπατικής ίνωσης εκτιµήθηκε, µετά από χρώση των τοµών µε Van Geison s, σύµφωνα µε τους Knodell και συν.(1981), πίνακας Α. 31

32 ΠΙΝΑΚΑΣ Α Βαθµός Ίνωσης Αλλοιώσεις + Απουσία ίνωσης ++ Ίνωση Πυλαίων ιαστηµάτων +++ Γεφυροποιός Ίνωση (Ινώδης συνδετικός ιστός µεταξύ πυλαίων διαστηµάτων και µεταξύ πυλαίων διαστηµάτων και κεντρολόβιας φλέβας) ++++ Κίρρωση 32

33 VΙ. Ιστοχηµική εξέταση Τα ιστοτεµάχια του ήπατος µονιµοποιήθηκαν σε διάλυµα φορµόλης 10% µε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα. Μετά τη συνήθη επεξεργασία τους έγιναν τοµές παραφίνης πάχους 6-8µ. και χρωµατίστηκαν µε κυανό της Πρωσίας (Perl s Prussian blue) προκειµένου να ανιχνευτούν εναποθέσεις σιδήρου, µε τη µορφή κοκκίων αιµοσιδηρίνης και µε ρουβεανικό οξύ (Rubeanic acid) προκειµένου να ανιχνευτούν εναποθέσεις χαλκού. Για τον προσδιορισµό της εναπόθεσης του σιδήρου στο ήπαρ ακολουθήθηκε η µέθοδος Barton και συν. (1995), η οποία καθορίζει µε ηµιποσοτικό τρόπο τον ιστοχηµικά ανιχνεύσιµο σίδηρο. Για το σκοπό αυτό µελετήθηκε η παρουσία κοκκίων αιµοσιδηρίνης σε κάθε µια από τις παρακάτω ανατοµικές περιοχές του ήπατος: α) στα ηπατικά κύτταρα των ζωνών 1,2 και 3, β) στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών και στα κύτταρα του Kupffer, των ζωνών 1,2 και 3 [Ζώνη 1: Περιπυλαία Περιοχή, Ζώνη 3: Περιοχή γύρω από την κεντρολόβια φλέβα και Ζώνη 2: Περιοχή µεταξύ των ζωνών 1 και 3 (Rappaport και συν. 1954)] και γ) στον συνδετικό ιστό καθώς και στα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιµοφόρων αγγείων των πυλαίων διαστηµάτων. Η µελέτη αφορούσε όλες τις ζώνες και τα πυλαία διαστήµατα που ανευρίσκονταν σε µια τοµή. Η συχνότητα του ανιχνεύσιµου σιδήρου µελετήθηκε σε κάθε µια από τις παραπάνω περιοχές και βαθµολογήθηκε κατάλληλα (Scoring) σύµφωνα µε τον Πίνακα Β. Ως συνολικός βαθµός εναπόθεσης σιδήρου λαµβάνεται το άθροισµα των επιµέρους βαθµών εναπόθεσης του συγκεκριµένου ιχνοστοιχείου στις ανατοµικές περιοχές που µελετήθηκαν. Το µέγιστο πιθανό αποτέλεσµα της βαθµολογίας ήταν το 36. Ο βαθµός εναπόθεσης σιδήρου στα ηπατικά κύτταρα αντιπροσώπευε το άθροισµα του 33

34 ανιχνεύσιµου σιδήρου σ αυτά. Για τον προσδιορισµό του βαθµού εναπόθεσης του σιδήρου στα κολπώδη τριχοειδή, εκτιµήθηκε ως ενιαία η παρουσία του στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών και στα κύτταρα του Kupffer. Έτσι, στον πίνακα Β, όταν αναγράφονται «κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών», νοούνται τα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών και τα κύτταρα του Kupffer. Ο συνολικός βαθµός για τα πυλαία διαστήµατα προέκυψε από το άθροισµα των επιµέρους βαθµών εναπόθεσης του σιδήρου στα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων, στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιµοφόρων αγγείων και στο συνδετικό ιστό. ΠΙΝΑΚΑΣ Β Συχνότητα Εντόπιση Ανιχνεύσιµου Σιδήρου Ζώνη 1 Ζώνη 2 Ζώνη 3 Ηπατικά Κύτταρα Όχι σίδηρος <1/3 ζώνης /3-2/3 ζώνης >2/3 ζώνης Ολόκληρη ζώνη Ζώνη 1 Ζώνη 2 Ζώνη 3 Κύτταρα κολπωδών τριχοειδών Όχι σίδηρος <1/3 ζώνης /3-2/3 ζώνης >2/3 ζώνης Ολόκληρη ζώνη Συνδετικός Ιστός Επιθηλιακά Κύτταρα Χοληφόρων Πόρων Ενδοθηλιακά Κύτταρα Αιµοφόρων Αγγείων Πυλαία ιαστήµατα Όχι σίδηρος <1/3 ζώνης /3-2/3 ζώνης >2/3 ζώνης Ολόκληρη ζώνη

35 VII. Aνοσοϊστοχηµική εξέταση Για την ανίχνευση της δεσµίνης στα αστεροειδή κύτταρα του ήπατος (Ito cells) χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος του συµπλέγµατος της Αβιδίνης Βιοτίνης (ABC) η οποία περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Αποπαραφίνωση και ενυδάτωση των τοµών σε σειρά λουτρών ξυλόλης και διαλυµάτων αλκοόλης. 2. Θερµική επεξεργασία των τοµών σε κλίβανο µικροκυµάτων µε διάλυµα κιτρικού νατρίου (ph = 6) για 10 λεπτά. 3. Αναστολή της δράσης της ενδογενούς υπεροξειδάσης µε τη βοήθεια δείγµατος 48,5 ml µεθανόλης και 1,5 ml υπεροξειδίου του υδρογόνου περιεκτικότητας 35% σε H 2 O 2 για χρονικό διάστηµα 30 λεπτών. 4. Επώαση των τοµών µε αδρανοποιηµένο ορό ίππου για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου σε αραίωση 1:10 µε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών αλάτων (PBS: Phosphate Buffered Saline) (ph = 7,2). 5. Κάλυψη των τοµών µε µονοκλωνικό αντίσωµα IgG ποντικού κατά της δεσµίνης του ανθρώπου (code: Μ0760 DAKO A/S Denmark) 6. Οι τοµές φέρονται σε επαφή µε το σύµπλεγµα αβιδίνης βιοτίνης σε θερµοκρασία δωµατίου (PK 4000 Vector Lab. Inc Burling Ame.). 7. Εκτέλεση της ενζυµο-ιστοχηµικής αντίδρασης µε επώαση των τοµών σε διάλυµα 0,05% 3,3-διαµινοβενζιδίνης σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl (ph = 7,6) στο οποίο έχουν προστεθεί 2 ml Η 2 Ο 2 περιεκτικότητας 3%. Χρόνος επώασης: 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 8. Χρώση των τοµών µε αιµατοξυλίνη Meyer s, έκπλυσή τους σε νερό βρύσης, αφυδάτωσή τους σε σειρά διαλυµάτων αλκοολών και λουτρών ξυλόλης και τέλος κάλυψή τους µε βάλσαµο του Καναδά. 35

36 Η µετάβαση από το ένα στο άλλο στάδιο δεν ήταν άµεση, αφού κάθε φορά παρεµβάλλονταν τρεις διαδοχικές εκπλύσεις των τοµών µε ρυθµιστικό διάλυµα Tris- HCl (ph = 7,6), διάρκειας 5 λεπτών καθεµιά. Εξαίρεση αποτελούσε η µετάβαση από το στάδιο 4 στο 5 (καµία έκπλυση). Όταν η παραπάνω αντίδραση είναι θετική, η οξειδωµένη διαµινοβενζιδίνη έχει χρώµα καστανό και η εντόπισή της αποδεικνύει την παρουσία δεσµίνης στα αστεροειδή κύτταρα του ήπατος. VIΙΙ. Μεθοδολογία στατιστικής ανάλυσης Το πειραµατικό σχέδιο θεωρήθηκε ως µικτός σχεδιασµός ή σχεδιασµός χωριστού σχεδίου (Mixed/Split Plot Design), σύµφωνα µε τους Brown και Melamed 1990 και Girden Τα αποτελέσµατα από τον πειραµατισµό υποβλήθηκαν σε ανάλυση διακύµανσης, ANOVA, (Iversen και συν. 1987, Kirkwood 1998), µε τη βοήθεια γενικών γραµµικών προτύπων (Μendenhall και Sincich, 1996). Σε περιπτώσεις που απαιτούνταν πολλαπλές συγκρίσεις µέσων όρων εφαρµόστηκε ο έλεγχος Bonferroni (Toothaket και Larry 1993, Klockars και Sax 1986). To γραµµικό πρότυπο ανάλυσης περιλαµβάνει δύο κύριες επιδράσεις και µια αλληλεπίδραση. Ειδικότερα, περιλαµβάνει την κύρια επίδραση του παράγοντα «οµάδα» µε δύο επίπεδα (οµάδα Π και οµάδα Μ), την κύρια επίδραση του παράγοντα «χρόνος» µε δύο επίπεδα -χρόνος 0(χρόνος πριν από τη πρώτη λαπαροτοµή) και χρόνος 10 εβδοµάδων-και την αλληλεπίδραση «οµάδα Χ χρόνος». Στην περίπτωση αυτή τα δύο επίπεδα του παράγοντα «οµάδα» θεωρήθηκαν ως ολόκληρα σχέδια (whole plots), ενώ τα δύο επίπεδα του παράγοντα «χρόνος» ως χωριστά σχέδια (split plots). Συνοπτικά το 36

37 πειραµατικό σχέδιο εκφράζεται ως εξής: Σχέδιο = «οµάδα» + σφάλµα 1 + «χρόνος» + «οµάδα» Χ «χρόνος» + σφάλµα 2. Ισοδύναµη διατύπωση του πειραµατικού σχεδιασµού στηρίζεται στην έννοια των επαναλαµβανόµενων µετρήσεων (repeated measures) σύµφωνα µε τους Gomez K.-Gomez A και Girden 1992, όπου στη συγκεκριµένη περίπτωση ο παράγοντας µε τις επαναλαµβανόµενες µετρήσεις είναι ο «χρόνος». Στην περίπτωση αυτή, το πειραµατικό σχέδιο εκφράζεται συνοπτικά ως εξής: Σχέδιο µεταξύ των υποκειµένων (Between subjects design) = «Οµάδα» + σφάλµα 1 Σχέδιο ανάµεσα στα υποκείµενα (Within subjects design) = «Χρόνος» + («Οµάδα» Χ «Χρόνος») + σφάλµα 2. Για να διερευνηθεί η διαχρονική τάση των SI, TIBC, SAT, Cu, Zn του ορού προσαρµόστηκαν τα δεδοµένα σε γραµµικά πρότυπα της µορφής: y = bo+b 1 xt+σφάλµα, όπου, y: SI, TIBC, SAT, Cu, Zn, bo: σταθερός όρος, b 1 : σταθερά του χρόνου, t: χρόνος σε εβδοµάδες. Η µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε ήταν η απλή γραµµική παλινδρόµηση ( Μπόρα-Σέντα, Μωυσιάδης 1990). Για τον υπολογισµό του µέσου % µεταβολής των διαφόρων τιµών των εργαστηριακών παραµέτρων εφαρµόστηκε η παρακάτω µεθοδολογία: Έστω ότι έχουµε n παρατηρήσεις µιας εργαστηριακής παραµέτρου σε n ισαπέχοντα χρονικά διαστήµατα. Αν συµβολιστούν µε Κ i, i = 1,,n οι παρατηρήσεις αυτές, τότε από τον τύπο του ανατοκισµού (Αποστολόπουλος 1991) και µε την προϋπόθεση ότι οι παρατηρήσεις αποτελούν γεωµετρική πρόοδο, προκύπτει: K n = K 1 (1+i) n-1 όπου K 1 : ο πρώτος όρος της χρονικής σειράς (πρώτη παρατήρηση) K n : ο τελευταίος όρος της χρονικής σειράς (τελευταία παρατήρηση) n: πλήθος των όρων της χρονικής σειράς δηλ. πλήθος των παρατηρήσεων. 37

38 i: µέσο % µεταβολής ( δηλ. ο µέσος γεωµετρικός) Έχουµε: K n = K 1 (1+i) n-1 Kn 1+ i = n 1 K 1 Kn i = n 1-1 K 1 Οι συσχετίσεις µεταξύ των διαφόρων παραµέτρων έγιναν µε το συντελεστή συσχέτισης Spearman (Daniel 1995, Pagano και Gauvreau 2000). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν σε προσωπικό υπολογιστή µε χρήση του προγράµµατος SPSS, έκδοση Η στάθµη σηµαντικότητας των ελέγχων ορίστηκε εξαρχής στο α=0,05, αλλά σε ορισµένες περιπτώσεις, λόγω του µικρού µεγέθους του δείγµατος, θεωρήθηκε και το α=0,1. 38

39 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ι. Κλινική Εικόνα Όπως προαναφέρθηκε, πριν από την έναρξη του πειραµατισµού τα ζώα και των δύο οµάδων δεν παρουσίαζαν τίποτα το παθολογικό. Στα ζώα της οµάδας Π τα πρώτα συµπτώµατα εµφανίστηκαν την δεύτερη εβδοµάδα µετά την έναρξη της χορήγησης του τετραχλωριούχου άνθρακα και συνεχίστηκαν µε υφέσεις και εξάρσεις έως και τη λήξη του πειραµατισµού. Περιλάµβαναν µερική ανορεξία και απώλεια σωµατικού βάρους, κατάπτωση, σποραδικούς εµέτους, διαρροϊκές κενώσεις καθώς και την εµφάνιση ικτερικής χροιάς στους ορατούς βλεννογόνους. Σε τρία από τα ζώα της οµάδας Π (α.α 1,3,13) εµφανίστηκε ασκίτης την έκτη εβδοµάδα µετά την έναρξη της χορήγησης του τετραχλωράνθρακα. Τα πειραµατόζωα της οµάδας Μ καθ όλη τη διάρκεια του πειραµατισµού δεν παρουσίασαν τίποτα το παθολογικό. 39

40 ΙΙ. Εργαστηριακά Ευρήµατα 1.Σίδηρος ορού (SI) Οι µέσοι όροι των συγκεντρώσεων της µεταβλητής SI των ζώων και των δύο οµάδων κατά τη διάρκεια του πειραµατισµού και η σηµαντικότητα της διαφοράς µεταξύ αρχικών και τελικών επιπέδων παρουσιάζονται στους πίνακες (1 και 1α)* και απεικονίζονται στο διάγραµµα (1). Στην οµάδα Π παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική διαχρονική τάση αύξησης του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του SI ( Πίνακας 7). Ο ρυθµός αύξησης της παραµέτρου αυτής ήταν της τάξης 9,12% ανά εβδοµάδα. Αντίθετα στην οµάδα Μ δεν παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική µεταβολή στις συγκεντρώσεις του SI (Πίνακας 7) µg/100ml M Π εβδοµάδες ιάγραµµα 1: ιακυµάνσεις του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του SI και των δύο οµάδων. 0: πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος (µέσος όρος από 3 µετρήσεις) Μ:µάρτυρες 1: πρώτη εβδοµάδα µετά την έναρξη χορήγηση CCl 4 Π: πειραµατόζωα *: Όλοι οι πίνακες µε αριθµητική σήµανση βρίσκονται σε παράρτηµα στο τέλος της εργασίας 40

41 2. Ολική ικανότητα της τρανσφερρίνης να δεσµεύει σίδηρο (TIBC) Τα αντίστοιχα αποτελέσµατα των αναλύσεων για την µεταβλητή TIBC παρουσιάζονται στους πίνακες (2 και 1α) και απεικονίζονται στο διάγραµµα (2). Στην οµάδα Π παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική διαχρονική τάση αύξησης του µέσου όρου των συγκεντρώσεων της ΤIBC ( Πίνακας 8). Ο ρυθµός αύξησης της ΤΙΒC ήταν της τάξης του 4,82% ανά εβδοµάδα. Αντίθετα στην οµάδα Μ δεν παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική µεταβολή στις συγκεντρώσεις της ΤIBC (Πίνακας 8) mg/100ml Μ Π εβδοµάδες ιάγραµµα 2: ιακυµάνσεις του µέσου όρου των συγκεντρώσεων της TIBC και των δύο οµάδων. 0: πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος (µέσος όρος από 3 µετρήσεις) Μ:µάρτυρες 1: πρώτη εβδοµάδα µετά την έναρξη χορήγηση CCl 4 Π: πειραµατόζωα 41

42 3. % κορεσµός της τρανσφερρίνης (SAT) Τα αντίστοιχα αποτελέσµατα των αναλύσεων για τον SAT παρουσιάζονται στους πίνακες (3 και 1α) και απεικονίζονται στο διάγραµµα (3). Tόσο στην οµάδα Π όσο και στην οµάδα Μ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική µεταβολή των µέσων όρων της παραµέτρου σε σχέση µε το χρόνο (Πίνακας 9) % Μ Π εβδοµάδες ιάγραµµα 3: ιακυµάνσεις του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του SAT και των δύο οµάδων. 0: πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος (µέσος όρος από 3 µετρήσεις) Μ:µάρτυρες 1: πρώτη εβδοµάδα µετά την έναρξη χορήγηση CCl 4 Π: πειραµατόζωα 42

43 4. Χαλκός ορού του αίµατος (Cu) Τα αντίστοιχα αποτελέσµατα των αναλύσεων για τη µεταβλητή Cu παρουσιάζονται στους πίνακες(4 και 4α) και απεικονίζονται στο διάγραµµα (4). Στην οµάδα Π παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική διαχρονική τάση αύξησης του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του Cu ( Πίνακας 10). Ο ρυθµός αύξησης της παραµέτρου ήταν της τάξης του 1,99% ανά εβδοµάδα. Αντίθετα στην οµάδα Μ δεν παρουσιάστηκε στατιστικά σηµαντική µεταβολή στις συγκεντρώσεις του Cu (Πίνακας 10) µg/100ml Μ Π εβδοµάδες ιάγραµµα 4: ιακυµάνσεις του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του Cu στον ορό αίµατος και των δύο οµάδων. 0: πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος (µέσος όρος από 3 µετρήσεις) Μ:µάρτυρες 1: πρώτη εβδοµάδα µετά την έναρξη χορήγηση CCl 4 Π: πειραµατόζωα 43

44 5. Ψευδάργυρος ορού του αίµατος (Zn) Τα αντίστοιχα αποτελέσµατα των αναλύσεων για τη µεταβλητή Zn παρουσιάζονται στους πίνακες(5 και 4α) και απεικονίζονται στο διάγραµµα (5). Tόσο στην οµάδα Π όσο και στην οµάδα Μ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική µεταβολή του µέσου όρου της παραµέτρου σε σχέση µε το χρόνο (Πίνακας 11) µg/100ml Μ Π εβδοµάδες ιάγραµµα 5: ιακυµάνσεις του µέσου όρου των συγκεντρώσεων του Zn στον ορό αίµατος και των δύο οµάδων. 0: πριν από την πρώτη λαπαροτοµή και βιοψία ήπατος (µέσος όρος από 3 µετρήσεις) Μ:µάρτυρες 1: πρώτη εβδοµάδα µετά την έναρξη χορήγηση CCl 4 Π: πειραµατόζωα 44

45 6. Συγκέντρωση του Fe, του Cu και του Zn στο ήπαρ (µg/gr Ξ.Ο) Στον πίνακα Γ σηµειώνονται οι µέσοι όροι των συγκεντρώσεων των υπό µελέτη ιχνοστοιχείων στο ήπαρ καθώς και η στατιστική σηµαντικότητα µεταξύ τους στις δύο οµάδες, στην αρχή και στο τέλος του πειράµατος. Πίνακας Γ. ΣΙ ΗΡΟΣ M n Π n Α 240,11±54,09 7 NS 231,6±43,9 7 ΝS P 0,001 T 273,68±68,58 7 P 0, ,15±42,04 7 ΧΑΛΚΟΣ M n Π n Α 432,43±164,03 7 NS 340,4±81,5 7 NS NS Τ 358,57±96,14 7 NS 350,4±132,8 7 ΨΕΥ ΑΡΓΥΡΟΣ Μ n Π n A 158,69±29,54 7 NS 117,9±28,1 7 NS NS T 159,72±14,44 7 P 0, ,55±30,13 7 A: αρχική τιµή (πριν τη χορήγηση CCl 4 ) Τ: τελική τιµή (στο τέλος της 10 ης εβδοµάδας) Π: πειραµατόζωα Μ: µάρτυρες NS: Στατιστικά µη σηµαντική διαφορά n: αριθµός πειραµατόζωων p: παρατηρούµενη στάθµη σηµαντικότητας 45

46 7. Αιµατολογικές και λοιπές βιοχηµικές παράµετροι που µελετήθηκαν. Στα ζώα της οµάδας Μ τόσο οι αιµατολογικές όσο και οι λοιπές βιοχηµικές παράµετροι που µελετήθηκαν κυµαίνονταν µέσα στα φυσιολογικά, για το ζωικό είδος που µελετήθηκε, όρια. Στα ζώα της οµάδας Π οι δραστηριότητες της ALT, ALP και οι συγκεντρώσεις της ΟΧ, ΑΧ, και των ΧΟ ήταν αυξηµένες, σε σχέση µε εκείνες της οµάδας Μ, σε όλη τη διάρκεια της χορήγησης CCl 4 (10 εβδοµάδες). Οι υπόλοιπες βιοχηµικές παράµετροι που προσδιορίστηκαν κυµαίνονταν µέσα στα φυσιολογικά όρια σε όλη τη διάρκεια του πειραµατισµού. 8. Συνολική Iστοχηµική Βαθµολόγηση των εναποθέσεων Fe στο ήπαρ(total Iron Scoring - TIS). Στο πίνακα σηµειώνονται οι µέσοι όροι του αθροίσµατος των εναποθέσεων του σιδήρου στο ήπαρ καθώς και η στατιστική σηµαντικότητα µεταξύ τους, στις δύο οµάδες πειραµατισµού, στην αρχή και στο τέλος του πειράµατος. Πίνακας. Μ n Π n A 5,14±2,97 7 NS 3±0,82 7 NS P 0,001 T 5,29±3,45 7 P 0,001 21,25±2,63 7 A: αρχική τιµή (πριν τη χορήγηση CCl 4 ) Τ: τελική τιµή (στο τέλος της 10 ης εβδοµάδας) Π: πειραµατόζωα Μ: µάρτυρες NS: Στατιστικά µη σηµαντική διαφορά n: αριθµός πειραµατόζωων p: παρατηρούµενη στάθµη σηµαντικότητας 46

47 9. Συσχετισµός ALT / SI. Θετική συσχέτιση παρουσιάζεται µεταξύ της δραστηριότητας της αλανιναµινοτρανσφεράσης και της συγκέντρωσης του σιδήρου του ορού του αίµατος στην οµάδα Π την 1 η (rho:0,59/p 0,1) και την 3 η εβδοµάδα ( rho:0,64/p 0,1) του πειραµατισµού. 10. Συσχετισµός SI / Fe Ήπατος και SI / TIS. Θετικές συσχετίσεις παρουσιάζονται µεταξύ του σιδήρου του ορού του αίµατος και του ήπατος (rho:0,82/p 0,05) καθώς και µεταξύ του πρώτου και του ιστοχηµικά προσδιοριζόµενου συνολικού ηπατικού σιδήρου (TIS) ( rho:0,75/p 0,05) στην οµάδα Π τη 10 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 11. Συσχετισµός SI/Fe Ηπατικών Κυττάρων (HIS) και SI/ Fe Κυττάρων Κολπωδών Τριχοειδών (SIS). Θετικές συσχετίσεις παρουσιάζονται µεταξύ του σιδήρου του ορού του αίµατος και του ιστοχηµικά προσδιοριζόµενου σιδήρου των ηπατικών κυττάρων των τριών ζωνών-his-(rho:0,69/p 0,1) καθώς και µεταξύ του πρώτου και του ιστοχηµικά προσδιοριζόµενου σιδήρου των κυττάρων των κολπωδών τριχοειδών των τριών ζωνών-sis- (rho:0,75/p 0,05) στην οµάδα Π τη 10 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 12. Συσχετισµός SI/ίνωσης. Θετική συσχέτιση παρουσιάζεται µεταξύ του σιδήρου του ορού του αίµατος και του βαθµού ίνωσης (rho:0,86/p 0,05) στην οµάδα Π τη 10 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 47

48 13. Συσχετισµός Fe ήπατος / ίνωσης και TIS/ ίνωσης. Θετικές συσχετίσεις παρουσιάζονται µεταξύ του βαθµού ίνωσης και, τόσο του χηµικά ( rho:0,87/p 0,05) όσο και του ιστοχηµικά ( rho:0,72/p 0,05) προσδιοριζόµενου σιδήρου στο ήπαρ στην οµάδα Π τη 10 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 14. Συσχετισµός HIS/ ίνωσης και SIS/ ίνωσης. Θετικές συσχετίσεις παρουσιάζονται µεταξύ του ιστοχηµικά προσδιοριζόµενου σιδήρου των ηπατικών κυττάρων των τριών ζωνών και του βαθµού ίνωσης (rho:0,61/p 0,1) καθώς και µεταξύ της τελευταίας και του ιστοχηµικά προσδιοριζόµενου σιδήρου των κυττάρων των κολπωδών τριχοειδών των τριών ζωνών (rho:0,60/p 0,1) στην οµάδα Π, τη 10 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 15. Συσχετισµός Cu ορού / ολικής χολερυθρίνης ορού του αίµατος. Στον πίνακα (6) παρουσιάζεται θετικός συσχετισµός µεταξύ χαλκού και ολικής χολερυθρίνης του ορού του αίµατος στην οµάδα Π, την 3 η, 5 η,6 η, 7 η εβδοµάδα του πειραµατισµού. 16. Συσχετισµός Cu ορού / ALP ορού του αίµατος. Θετική συσχέτιση παρουσιάζεται µεταξύ της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης και της συγκέντρωσης του χαλκού του ορού του αίµατος στην οµάδα Π την 1 η (rho:0,85/p 0,05) και την 2 η εβδοµάδα ( rho:0,79/p 0,05) του πειραµατισµού. 48

49 ΙΙΙ. Παθολογοανατοµικά Ευρήµατα 1. Μακροσκοπικές Αλλοιώσεις 1α. Πειραµατόζωα της οµάδας Μ Στα πειραµατόζωα της οµάδας αυτής δεν παρατηρήθηκαν µακροσκοπικές αλλοιώσεις. 1β. Πειραµατόζωα της οµάδας Π Κατά τη λαπαροτοµή, µε σκοπό τη λήψη ιστοτεµαχίων ήπατος για ιστοπαθολογικές και ιστοχηµικές εξετάσεις ( τέλος 10 ης εβδοµάδας), στα ζώα της οµάδας Π διαπιστώθηκε ικτερική χροιά στους βλεννογόνους και στο υποδόριο λίπος και ήπαρ ελαφρώς αποχρωµατισµένο αλλά χωρίς σοβαρές µεταβολές στο µέγεθός του. Στα πειραµατόζωα µε α/α 1,3 και 13 υπήρχε ασκιτικό υγρό στην περιτοναϊκή κοιλότητα µε φυσικά και χηµικά χαρακτηριστικά διιδρώµατος. 2. Ιστοπαθολογικά ευρήµατα 2α.Πειραµατόζωα της οµάδας Μ Η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος όλων των πειραµατόζωων της οµάδας Μ δεν έδειξε την παρουσία αλλοιώσεων. 2β. Πειραµατόζωα της οµάδας Π Η ιστοπαθολογική εικόνα των τεµαχίων του ήπατος που λήφθηκαν πριν από την έναρξη χορήγησης του CCl 4 ήταν φυσιολογική. Από την παρατήρηση των 49

50 ιστολογικών τοµών του ήπατος όλων των πειραµατόζωων µετά την συµπλήρωση των 10 εβδοµάδων χορήγησης CCl 4 διαπιστώθηκαν οι ακόλουθες ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις: ιήθηση από φλεγµονικά κύτταρα, πολυµορφοπύρηνα ουδετερόφιλα και µονοπύρηνα κύτταρα (κυρίως µακροφάγα και ολιγάριθµα λεµφοκύτταρα), στην περιοχή των πυλαίων διαστηµάτων και του µεσολόβιου συνδετικού ιστού (Εικ. 1). Επιπρόσθετα, πολυµορφοπύρηνα ουδετερόφιλα κύτταρα διαπιστώθηκαν και στον αυλό των κολπωδών τριχοειδών του ήπατος. Παράλληλα, παρατηρήθηκε λιπώδης εκφύλιση των ηπατικών κυττάρων στις ζώνες 1 και 2 του ηπατικού λοβίου. Αξιοσηµείωτη ήταν επίσης η παρουσία νέκρωσης στα ηπατικά κύτταρα, ιδιαίτερα της ζώνης 3, η οποία χαρακτηρίζονταν, κυρίως, από πυρηνολυσία και πύκνωση. Συχνό εύρηµα αποτελούσε ακόµα η παρουσία «σφαιροειδών» σχηµατισµών στο εσωτερικό του πυρήνα των ηπατικών κυττάρων οι οποίοι περιβάλλονταν από µεµβράνη, που έρχονταν σε επαφή µε το πυρηνικό περίβληµα, δίνοντας την εικόνα εγκλείστου (Εικ. 2). Σε όλες τις περιπτώσεις στη ζώνη 1, γειτονικά µε τις φλεγµονικές διηθήσεις παρατηρήθηκαν «ωοειδή» κύτταρα (oval cells) και αναγέννηση των ηπατικών κυττάρων. Σε 4 από τα ζώα της οµάδας Π διαπιστώθηκε διάσπαση του αφοριστικού πετάλου (Πίνακας Ε). Επίσης, διαπιστώθηκε υπερπλασία των χοληφόρων πόρων και παρουσία χολοχρωστικών εξωκυτταρικά, στο κυτταρόπλασµα των ηπατικών κυττάρων και των κυττάρων του Kupffer. Τέλος στην περιοχή των πυλαίων διαστηµάτων και του µεσολόβιου συνδετικού ιστού, παρατηρήθηκε αύξηση της ανάπτυξης συνδετικού ιστού, που χαρακτηρίζονταν από την παρουσία ινοβλαστών και κολλαγόνων ινών (Εικ. 3). Σε ορισµένα από τα πειραµατόζωα λεπτοφυής συνδετικός ιστός διαπιστώθηκε στο εσωτερικό των λοβίων (γεφυροποιός ίνωση) (Πίνακες Ε και ΣΤ). 50

51 3. Ιστοχηµικά Ευρήµατα 3α. Πειραµατόζωα της οµάδας Μ Η ιστοχηµική εξέταση του ήπατος µε κυανό της Πρωσίας για την παρουσία αιµοσιδηρίνης ήταν αρνητική σε όλα τα πειραµατόζωα της οµάδας Μ (Εικ. 4). Αρνητικά ήταν επίσης και τα αποτελέσµατα για την παρουσία χαλκού µε τη χρήση της µεθόδου του ρουβεανικού οξέος 3β. Πειραµατόζωα της οµάδας Π Η ιστοχηµική εξέταση του ήπατος µε κυανό της Πρωσίας έδειξε την παρουσία αιµοσιδηρίνης στο συνδετικό ιστό των πυλαίων διαστηµάτων, στα ενδοθηλιακά κύτταρα των ενδοηπατικών κλάδων της πυλαίας φλέβας, στα ηπατικά κύτταρα, στα κύτταρα του Kupffer και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών µε µειούµενη συχνότητα από τη ζώνη 1 προς την 3 (Εικ. 5). Η ειδική χρώση των τοµών µε ρουβεανικό οξύ ήταν αρνητική. 4. Ανοσοϊστοχηµικά Ευρήµατα 4α. Πειραµατόζωα της οµάδας Μ Η εφαρµογή της ανοσοϊστοχηµικής µεθόδου του συµπλέγµατος Αβιδίνης- Βιοτίνης για την ανίχνευση δεσµίνης στα αστεροειδή κύτταρα του ήπατος των ζώων της οµάδας Μ ήταν αρνητική. 4β. Πειραµατόζωα της οµάδας Π Από την εφαρµογή της ανοσοϊστοχηµικής µεθόδου του συµπλέγµατος Αβιδίνης-Βιοτίνης για την ανίχνευση δεσµίνης παρατηρήθηκε θετική αντίδραση στις λεπτοφυείς αποφυάδες των αστεροειδών κυττάρων του ήπατος των ζώων της οµάδας Π (Εικ. 6). 51

52 Πίνακας Ε. Ιστολογικά ευρήµατα στο ήπαρ των ζώων της οµάδας Π α/α πειραµατόζωων Κυτταρική διήθηση πυλαίων διαστηµάτων /µεσολόβιου συνδετικού ιστού ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ Νέκρωση ηπατικών κυττάρων ιάσπαση αφοριστικού πετάλου Ίνωση Υπερπλασία χοληφόρων πόρων Αναγεννητικά οζίδια / ωοειδή κύτταρα Λιπώδης εκφύλιση

53 Πίνακας ΣΤ Βαθµός ίνωσης στο ήπαρ των ζώων της οµάδας Π. α/α πειραµατόζωων Βαθµός ίνωσης : 2 ου βαθµού (Grade II) (Κατά Knodell και συν. 1981) +++: 3 ου βαθµού (Grade III) 53

54 Εικόνα 1. ιήθηση από φλεγµονικά κύτταρα, πολυµορφοπύρηνα ουδετερόφιλα και µονοπύρηνα κύτταρα στα πυλαία διαστήµατα και στο µεσολόβιο συνδετικό ιστό του ήπατος, Πειραµατόζωο οµάδας Π, Η-Ε x 50. Εικόνα 2. Πυρήνας ηπατικού κυττάρου στο εσωτερικό του οποίου παρατηρείται «σφαιροειδής» σχηµατισµός, που περιβάλλεται από µεµβράνη και έρχεται σε επαφή µε το πυρηνικό περίβληµα (κεφαλή βέλους), Πειραµατόζωο οµάδας Π, Η-Ε x

55 Εικόνα 3. Αύξηση της παρουσίας συνδετικού ιστού (ίνωση) στα πυλαία διαστήµατα του ήπατος. (ερυθρή χρώση), Πειραµατόζωο οµάδας Π, Van Gieson s x 50. Εικόνα 4. Ήπαρ πειραµατόζωου της οµάδας Μ, στο οποίο δεν ανιχνεύεται η παρουσία σιδήρου µε τη µορφή κοκκίων αιµοσιδηρίνης, κυανό της Πρωσίας x

56 Εικόνα 5. Έντονη παρουσία σιδήρου µε τη µορφή κοκκίων αιµοσιδηρίνης (κυανή χρώση) σε ήπαρ πειραµατόζωου της οµάδας Π, κυανό της Πρωσίας x 100. Εικόνα 6. Ήπαρ πειραµατόζωου της οµάδας Π στο οποίο παρατηρείται θετική αντίδραση σε λεπτοφυείς αποφυάδες των αστεροειδών κυττάρων (Ito cells) για την παρουσία δεσµίνης (κεφαλές βελών), ανοσοϊστοχηµική χρώση, ABC, Χρωµογόνο DAB, x