Έκφραση και χαρακτηρισμός μεταλλοπρωτεΐνών που συμμετέχουν στην ομοιόσταση του χαλκού στον άνθρωπο

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜ ΩΝ ΤΜ Η Μ Α Χ Η Μ Ε ΙΑ Σ Έκφραση και χαρακτηρισμός μεταλλοπρωτεΐνών που συμμετέχουν στην ομοιόσταση του χαλκού στον άνθρωπο ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ fr Λεοντάρη Η λιάνα Βιολόγος Μ.Sc λ * ΙΩΑΝΝΙΝΑ

2 ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΙΩΑΝΝΙΝΑΝ Θ Θ f -* Ο :? ' Ά $?Ρ ί * - * ή ; t / s'. J 1 \ 0 3 M. AS# ί ' * I

3 ΊίΡΙΜΈβΜΣ (Ε3ΐΙ(ΐΦ 0^ΐΗ - 1. Καθηγητής Ιω άννης Γεροθανάσης (Επιβλέπων - Τμήμα Χημείας, Πανε7ηστήμιο Ιωαννίνων) 2. Αναπλ. Καθηγήτρια Βασιλική Θ εοδώ ρου-κ ασσιούμη (Τμήμα Χημείας, Πανεταστήμιο Ιωαννίνων) 3. Επίκουρος Καθηγητής Α ναστάσιος Τρογκάνης (Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιώ ν, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) <Ε2ίΤβΜιΕ#!}ϋΣ ΖΫΜΘΟΥΛ'Ε'ΥΉΐΟίΉΠΊΤΦΟΊΐΗ 1. Καθηγητής Θ εόδω ρος Φ ώ τσης (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων) 2. Καθηγητής Ν ικόλαος Χ ατζηλιάδης (Τμήμα Χημείας, Πανεταστήμιο Ιωαννίνων) 3. Αναπλ. Καθηγήτρια Ελένη Μ παϊρακτάρη (Τμήμα Ιατρικής, Πανεταστήμιο Ιωαννίνων) 4. Αναπλ. Καθηγήτρια Θ εώ νη Τ ράγκα (Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιώ ν, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων)

4 Μ Ρ Ο Λ Ο Τ σ Σ Η π α ρ ο ύ σ α Διδακτορική Δ ια τριβή έγινε στα π λ α ίσ ια Μ ετα πτυχια κ ού Π ρ ο γρ ά μ μ α το ς του Τ μήματος Χ ημείας Π α νεπ ισ τη μ ίου Ιω α ν νίνω ν με επ ιστη μονικό υ π εύ θ υ νο το ν Κ αθηγητή του Τ μήματος Χ ημείας κ. Ιω ά ννη Γ εροθανάση τ ο ν ο π ο ίο ευχαριστώ θερ μ ά τόσο γ ια τη ν συμμετοχή μ ο υ στο Π ρ ό γρ α μ μ α όσο και για τη συνεχή κ α ι σχολαστικ ή π α ρ α κ ολούθηση της π ρ ο ό δ ο υ της Δ ιατριβής. Η ερ γα σ ία αυτή εκπονήθηκε στο σ ύ ν ο λ ο της στο Ινστιτούτο Π υ ρ η νικ ο ύ Μ αγνη τικ ού Σ υντονισ μ ού του Τ μήματος Χ ημείας του Π α νεπ ισ τη μ ίο υ Φ λω ρεντίας (M agnetic R esonance C enter CERM ) ό π ο υ έλα βε χώ ρ α εξ' ολοκ λή ρ ου το πειραματικ ό μ έρ ος αυτής, α π ό τ ο ν Ο κτώ βριο του 2004 έω ς το ν Ο κτώ βριο του 2006 υ π ό τ η ν επ ίβλεψ η του καθηγητή του Τ μήματος Χ ημείας του Π α νεπ ισ τη μ ίου Φ λω ρεντίας κ. Ivano Bertini τ ο ν ο π ο ίο ευχαριστώ θερμά γ ια τη ν καθοδήγηση σε ό λ α τα σ τά δια της ερ γ α σ ία ς κ α ι γ ια τη ν ευ κ α ιρ ία π ο υ μ ου έδω σε ν α επισκεφθώ κ α ι ν α εκτελέσω τα π ειρ ά μ α τα στο ερ γα σ τή ρ ιο του. Θ ερμές ευχαριστίες θα ήθελα ν α α π ευθύνω σ τη ν κ α θ η γή τρ ια του Τ μήματος Χ ημείας του Π α νεπ ισ τη μ ίου Φ λω ρεντίας Lucia B a n d γ ια την συμ παράσταση και ενθ ά ρ υνσ ή της σε ό λ α τα σ τά δια της ερ γα σ ία ς και γ ια τη ν επίλυση επ ιστη μ ονικ ώ ν π ρ οβλη μ ά τω ν π ο υ π ρ ο έκ υ ψ α ν. Η δομική μελέτη τω ν π ρ ω τεϊνώ ν μέσω Φ α σ μ ατοσκοπία ς Π υ ρ η νικ ο ύ Μ α γνη τικ ού Σ υ ντονισ μ ο ύ καθώ ς και η α νά λ υ σ η τω ν α π οτελεσ μ ά τω ν έγινε α π ό τους Dr S im one C iofi και D r S h en lin W ang. Ο ι εκτενείς συζητήσεις για τη ν π ο ρ εία της έρ ευ να ς καθώ ς και η μετάδοση τω ν γνώ σ εω ν τους σε θέματα φ α σ μ α τοσκοπ ία ς π υ ρ η νικ ο ύ μ α γνη τικ ο ύ σ υ ντονισ μ ο ύ επ έφ ερ α ν σημαντικές π λ η ρ ο φ ο ρ ίες κ α ι γνώ ση. Για τους π ρ ο α να φ ερ θ έντες λ ό γ ο υ ς εκφράζω τις θερμές μ ου ευχαριστίες. Κ αθοριστικός ή τα ν ο ρ ό λος του Dr M anuele M artinelli στην ολοκλήρω ση της Δ ιατριβής. Η πολύτιμ η π ρ ο σ φ ο ρ ά του σ τη ν εκμάθηση τεχνικ ώ ν Μ ορια κ ή ς Β ιολογία ς, οι επ ιστη μ ονικ ές σ υμ βουλές του και η σ υμ παράστα σ η του σε ό π ο ιες δυσκολίες α νέκ υ ψ α ν, α π ο τ ελ ο ύ ν μ ερ ικ ούς α π ό V

5 τους λ ό γους για τους οποίους θα ήθελα ν α εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου. Τα πειράματα και η ανάλυση των αποτελεσμάτων Φασματοσκοπίας Μάζας διεξήχθησαν καθ'ολοκληρίαν από τους Dr Peep Palumaa και Dr. Rannar Sillard, (Τμήμα Ιατρικής Βιοχημείας και Βιοφυσικής, Στοκχόλμη, Σουηδία) τους οποίους ευχαριστώ θερμά. Επίσης, θα ήθελά να ευχαριστήσω τα μέλη του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας του CERM για την κατανόηση τους και την συνεργασία μας και ιδιαίτερα τους: Miquela Vieru, Nunzia Della Malva, Eleonora Talluri και Χρήστο Χασάπη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου Χάρη και Βασιλική και την αδελφή μου Μαρία για την ηθική και ψυχολογική στήριξη που μου προσέφεραν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης και της συγγραφής της Διατριβής. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Πρόγραμμα υποτροφιών European Union Marie Curie Doctoral Research Fellcnvship. VI

6 w ΜΕΦΙΈΧΟΜΈΝΑ Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 1-ΕΙΣΑΓΩ ΓΗ...Ι Χ Ι 1.1 Ο ρ ό λ ο ς τω ν μ ε τα λ λ ο π ρ ω τεϊν ώ ν σ τα β ιο λ ο γ ικ ά σ υ σ τή μ α τα Μ ε τα λ λ ο π ρ ω τε ίν ε ς τ ο υ χ α λ κ ο ύ Ο μ ο ιό σ τα σ η τ ο υ χ α λ κ ο ύ... Σφάλμα! Δ εν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. 1.4 Η ο ξειδ ά σ η τ ο υ κ υ το χ ρ ώ μ α το ς c Π ρ ω τεΐν ε ς τ ο υ μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ...16 * 1.6 Η π ρ ω τ ε ΐν η S c o l Η π ρ ω τ ε ΐν η S c o Σ υ σ χ έ τ ισ η τ ο υ χ α λ κ ο ύ μ ε α ν θ ρ ώ π ιν ε ς α σ θ έ ν ε ιε ς Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ Μ ε λ έ τ η γ ο ν ιδ ιω μ ά τω ν Κ λ ω ν ο π ο ίη σ η κα ι έ κ φ ρ α σ η γ ο ν ιδ ίω ν Π ρ ω τεϊν ικ ή έ κ φ ρ α σ η σ το σ ύ σ τη μ α E.coli -Χ α ρ α κ τη ρ ισ τικ ά τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν σ ε δ ιά λ υ μ α...47 Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ Φ α σ μ α το σ κ ο π ία Π υ ρ η ν ικ ο ύ Μ α γ ν η τ ικ ο ύ Σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ Π ειρ ά μ α τα τ ιτλ ο δ ό τ η σ η ς μ ε N M R Δ ε ίκ τ η ς χ η μ ικ ή ς μ ε τ α τ ό π ισ η ς Σ τα θ ε ρ έ ς σ ύ ζ ε υ ξ η ς Το φ α ιν ό μ ε ν ο Ν Ο Ε Φ α σ μ α το σ κ ο π ία τ ρ ιώ ν δ ια σ τά σ εω ν κ α ι π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς π ρ ω τ ε ιν ικ ή ς δ ο μ ή ς...61 Σ Κ Ο Π Ο Σ ΤΗ Σ Δ ΙΑ Τ Ρ ΙΒ Η Σ Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 4 -Π Ε ΙΡ Α Μ Α Τ ΙΚ Ο Μ Ε Ρ Ο Σ Κ λ ω ν ο π ο ίη σ η τ ο υ γ ο ν ιδ ίο υ H Sco Σ χ ε δ ια σ μ ό ς ε κ κ ιν η τώ ν γ ια τη ν α ν τίδ ρ α σ η P C R...Σφάλμα! Δ εν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. 4.3 Τ ο π ο ε κ λ ε κ τικ ή α ν τίδ ρ α σ η κ λ ω ν ο π ο ίη σ η ς Μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο υ HSco2 γ ο ν ιδ ίο υ σ ε κ ύ τ τ α ρ α Έ χ ο Ιί Υ π ο κ λ ω ν ο π ο ίη σ η τ ο υ γ ο ν ιδ ίο υ H Sco2 μ ε τ η ν α ν τίδ ρ α σ η α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ο ύ L R τη ς G a te w a y Μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο υ γ ο ν ιδ ίο υ HSco2 σ ε κ ύ τ τ α ρ α έ κ φ ρ α σ η ς E.C o li Έ κ φ ρ α σ η τη ς δ ο μ ικ ή ς π ε ρ ιο χ ή ς H Sco Η λ ε κ τρ ο φ ό ρ η σ η S D S... Σφάλμα! Δ εν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. 4.9 Κ α θ α ρ ισ μ ό ς τ η ς δ ο μ ικ ή ς π ε ρ ιο χ ή ς Ε π ισ ή μ α ν σ η μ ε ισ ό το π α 13C και 15Ν Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τη ς δ ο μ ή ς τη ς H Sco2 μ ε φ α σ μ α το σ κ ο π ία N M R Τ ιτλ ο δ ό τη σ η μ ε Cu(I) τ ο υ δ ε ίγ μ α το ς H S c o Υ π ο λ ο γισ μ ο ί τ ο υ δ υ ν α μ ικ ο ύ ο ξ ειδ ο α ν α γ ω γ ή ς τη ς a p o H S c o VII

7 4.2 5 Έ κ φ ρ α σ η τ ο υ γ ο ν ιδ ίο υ P174L - H S c o l Έ κ φ ρ α σ η τη ς π ρ ω τ ε ΐν η ς P L H S c o l Χ α ρ α κ τη ρ ισ μ ό ς τω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν w t H S c o l και P L H S co l * 4.18 Β ΙΟ Φ Υ Σ ΙΚ Ε Σ Μ Ε Θ Ο Δ Ο Ι Χ Α Ρ Α Κ Τ Η Ρ ΙΣ Μ Ο Υ ΤΗ Σ H S c o l Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τ ο υ δ υ ν α μ ικ ο ύ ο ξ ειδ ο α ν α γω γή ς τω ν ε ν ε ρ γ ώ ν κ υ σ τ ε ϊν ώ ν τη ς S c o l Α λ λ η λ ε π ίδ ρ α σ η P L -H S col- C o x l Π ρ ο ετο ιμ α σ ία τω ν δ ε ιγ μ ά τ ω ν C o xl7, H S c o l κα ι P 174L-H S co l γ ια μ ε τ ρ ή σ ε ις φ α σ μ α το σ κ ο π ία ς μ ά ζα ς (M S ) Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τ η ς δ ο μ ή ς τη ς C ui(i)p 174L -H Scol μ ε φ α σ μ α το σ κ ο π ία N M R Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 5 -Α Π Ο Τ Ε Λ Ε Σ Μ Α Τ Α Ε κ φ ρ α σ η και δ ο μ ικ ό ς χ α ρ α κ τ η ρ ισ μ ό ς τη ς H S C Υ π ο λ ο γ ισ μ ο ί δ ο μ ή ς μ ε N M R Σ ύ γ κ ρ ισ η δ ο μ ικ ώ ν και δ υ ν α μ ικ ώ ν ι δ ι ο τ ή τ ω ν τω ν H S c o l- H S c o Σ η μ εια κ ές μ ε τα λ λ ά ξ ε ις σ τ η ν H S C Σ ύ γ κ ρ ισ η ο ξ ε ιδ ο α ν α γ ω γ ικ ώ ν ιδ ιο τ ή τ ω ν τω ν a p o H S c o l -H S c o Έ κ φ ρ α σ η και π α θ ο λ ο γ ικ έ ς σ υ ν έ π ε ιε ς τη ς μ ετά λ λ α ξ η ς P 1 7 4LH SC 01 σ το ν ά ν θ ρ ω π ο Χ α ρ α κ τη ρ ισ μ ό ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν W T -H S c o l και P l7 4 L -H S c o l Τ ρ ισ δ ιά σ τα τη δ ο μ ή τη ς C u i(i)p L -H S c o l Μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο υ χ α λ κ ο ύ α π ό τ η ν C o x l7 σ τ η ν H S c o l Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 6 -Σ Υ Ζ Η Τ Η Σ Η Β ιο λ ο γ ικ ή σ υ ν έ π ε ια κα ι σ υ μ π ε ρ ά σ μ α τ α Β ΙΒ Λ ΙΟ Γ Ρ Α Φ ΙΑ Π Α Ρ Α Ρ Τ Η Μ Α Π Α Ρ Α Ρ Τ Η Μ Α I I * VIII

8 Συντμήσεις Αμινοξέων Πίνακας Συντμήσεων Ala (Α) Αλανίνη Len (L) Λεύκινη Asn (Ν) Ασΰαραγί\τ Met (Μ) Μεθειονίνη Cys (C) Κυστεΐνη Pro (Ρ) Προλίνη Gin (Ε) Π.ουταμίΜκό οξύ Thr(T Θρεονίνη His (Η) Ισπδίνη Tyr (Ύ).Τυροσίνη Arg (R) Αργινίνη Lys (Κ) Λυσίνη Asp (D) Ασπαραγινικό οξύ Phe (F) Φαινυλαλοτίνη Gin (Q) Γλουταμίνη Ser (S) Σερίνη.. * Gly (G j Γλυκίνη Trp (W) Τρυπτοφάνη y lie (I) Ισολευκίνη Val (V) Βαλίνη Cco -. Οξειδάση του κυτοχρώματος c \ CD Κυκλικός διχρωισμός Cox ESI-MS Οξειδάση του κυτοχρώματος c Φασματομετρία μάζας ηλεκΐροψεκασμού EtBr Βρο^βιούχο αιθύλιο * GST IPTG Kb kda LB mrna N A D H O D rpm S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης Ισοπροπυλοθείο-βΌ-γαλακτοζίτης Χιλιάδα βάσεων Χιλιάδα Dalton Θρεπτικό μέσο Luria Bertani Αγγελιοφόρο RNA Νικοτινα μιδο-αδε\τνο-δινουκλεοτΐδιο Οπτική πυκνότητα I Ιεριστροφές ανά λεπτό RMSD: Συντελεστής Απόκλισης (Root Mean Square D eviation) SD S SO D TEV Tm Tris UV DTT Δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο Υπεροξειδική δισμουτάση Tobacco Etch Virus Θερμοκρασία τήξης Τρις (υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο Υπεριώδης ακτινοβολία Διθειοθρειτόλη

9 f ψ? OM ί/,λ.-ί..v..i > <,»- j \ ':. Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 1 <ε ι <ς α <γ ω <π η : ; ','ν '1 ;/ ι., >.Λ?Τ.Χϊί» y r * ν > 0 ο:;ϊ ν ι. : U UYk -yy / ; y * oifv ':. / Υ ; r { μ ' ^ 5 Γ. :f, ~ * * V 1:. r ; i. * -- : ^ e a j ;ν.-ν. ;.! Λ.. ' ', " _ - ' i I1.' '.' ' 4 ^. f.. -#.?*, Λ. '. '' *τ ψ :. V,v -,., ^..V.j/.V.'vJj! r ;. * y ι. ιί. : y.? ;yiiy/^yr;yy ' ; \s.< :, : ί;*.,. Mff Λ - ' ;-< : Λ\< r'-;'?r «Η.1 > ' - Ϋ;* 1" '* Λ ' > >, '. *' ' > *. ;. '... k. ' V, - -"vy^*? * '. ^ " ' ' ' '= ; ; y r ' y r i ϊ\; '*n.;.h. yyyy, -=-? *. r.x--u-rv-v: ^ r;» ' *;.- '/' -mv. ' *ί' ' *. *- :. '* λ<>::v -;-yy : */ - - *# ^ *e^ y 1 " ί ; ' ' v ' χ '. Γ * ^. ; *ι "?:>-y *Ctr ': :.= 'iv;lf?.,- W Ί Ϊ «' Μ ί ' > yyf>^y 7 "? ;f.vyu>. 0 «. φ -- ' *"' " 7 ;. ; :.1ν- ;: '>. ΐ.# ' " w # :ν/. ;: Λ ; y ι y ' - v- y- %. / f;

10 1.1 Ο ρ ό λ ο ς τ ω ν μ ε τ α λ λ ο π ρ ω τ ε ϊν ώ ν σ τα β ιο λ ο γ ικ ά σ υ σ τή μ α τα Τ α μ ετα λλικ ά ιό ντα δ ια δ ρ α μ α τ ίζο υ ν σ η μ α ντικ ό ρ ό λ ο ω ς ιχνο σ τοιχεία στις περισ σ ότερ ες βασικές βιοχη μ ικ ές δια δικ α σίες γ ια τη ζω ή1. Η χρήση τω ν μ ετά λ λ ω ν α π ό τους ζω ντα νο ύ ς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς κ ρ ίνετα ι α π α ρ α ίτη τη κυρίω ς λ ό γ ω τω ν ο ξειδ ο α να γ ω γ ικ ώ ν ιδιοτή τω ν τους κ αι της ικ α νότη τά ς τους ν α μ ετα φ έρ ο ντα ι σε δ ια φ ορετικ ά δ ια μ ερ ίσ μ α τα του κυττάρου. Π ρ ό σ φ α τες εκτιμήσεις δ ε ίχ ν ο υ ν π ω ς π ερ ίπ ο υ το έ ν α τρίτο τω ν δομ ικ ά χ α ρ α κ τ η ρ ισ μ ένω ν π ρ ω τεϊνώ ν π ε ρ ιέ χ ο υ ν μ ετα λλικ ά ιό ν τ α είτε ω ς δομ ικ ό σ υσ τα τικ ό είτε ω ς κ α τα λυτικ ό σ υ μ π α ρ ά γ ο ν τ α 2. Ο ι μ ετα λ λ ο π ρ ω τ εΐνες, π ρ ο κ ειμ ένο υ ν α εκ π λη ρ ώ σ ουν τις λ ειτουργίες τους χρ ειά ζετα ι ν α δ εσ μ εύσουν έ ν α ή π ερ ισ σ ότερ α μ ετα λλικ ά ιό ν τ α είτε επειδή το μ ετα λλικ ό ιό ν συμμετέχει στο κ α τα λυτικ ό μ η χ α ν ισ μ ό είτε γ ια τί σ τα θ εροπ οιεί / π ρ ο σ δ ιο ρ ίζει τη ν τρ ιτοτα γή ή τη ν τετα ρτοτα γή δομ ή τους. Τα μ ετα λλικ ά ιό ν τ α είνα ι επίσης π ο λ ύ σ η μ α ντικ ά γ ια τη δομ ή και τη λ ειτ ο υ ρ γ ία (στη ν περίπτω ση του R N A ) τω ν νο υ κ λ εϊκ ώ ν οξέω ν2. Α ρ χικ ά, επ ικ ρ α τούσ ε η υ π ό θ εσ η 3 ότι τα ^μεταλλικά ιό ν τ α α φ ού π ε ρ ά σ ο υ ν τ η ν κυτταρική μ εμ β ρ ά νη αμέσω ς δ εσ μ εύ ο ντα ι α π ό σ ο υ λ φ υ δ ρ υ λ ικ ο ύ ς υπ οκ α τα σ τά τες, μ ετα λ λ ο θ ειο νείνες κ α ι γλουτα θ ειό νες, οι ο π ο ίες β ρ ίσ κ ο ντα ι σε α φ θ ο ν ία σ το υ ς π ερ ισ σ ότερ ους τύ π ο υ ς κυττά ρω ν3. Α π ό σ ύ γ χ ρ ο ν ε ς β ιοχη μ ικ ές, α ν ό ρ γ α ν ε ς κ α ι δομ ικ ές μελέτες4 π ρ οέκ υ ψ ε μ ια κ α ιν ο ύ ρ ια ο ικ ο γ ένεια π ρ ω τεϊνώ ν ο ι ο π ο ίες φ α ίν ετα ι-ν α α λ λ η λ επ ιδ ρ ο ύ ν με τα μ ετα λλικ ά ιό ν τ α κ α ι ν α κ α θ ο ρ ίζο υ ν τ η ν δια κ ίνη σ η κ α ι τη ν ενσω μάτω ση τους σ τα ε ν ε ρ γ ά κ έντρ α ε ν ζ ύ μ ω ν /π ρ ω τ ε ϊν ώ ν -σ τόχω ν. Ο ι π ρω τεΐνες αυτές οι ο π ο ίες εντοπίσ θ η κ α ν π ρώ τα σ τους κα τώ τερους ευκ α ρυω τικ ούς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς (ζυμ ομ ύκητες) κ α ι έπ ειτα στα α ν θ ρ ώ π ιν α κ ύττα ρ α ο ν ο μ ά ζο ν τ α ι 'μ ετα λ λ ο σ υ νο δ ο ί'' (m eta llo ch a p ero n es)4. 2

11 9 1.2 Μ ετα λλοπρω τεγ νες του χ α λ κ ο ύ Έ να σ η μ α ντικ ό μ έταλλο, συστατικό π ρ ω τεϊνώ ν κ α ι ένζυ μ ω ν, είνα ι ο χ α λ κ ό ς. Για π ο λ λ ές δεκαετίες ή τα ν ευρέω ς α π ο δ εκ τό ότι ο χ α λ κ ό ς ε ίν α ι ένα α παραίτη το ιχνο σ το ιχείο γ ια τη ν επιβίω ση ό λ ω ν τω ν ο ρ γ α ν ισ μ ώ ν, α π ό τα βακτηριακά κύτταρα έως κ α ι τ ο ν ά νθ ρ ω π ο. Η χη μ εία τω ν ιό ντω ν χα λ κ ο ύ ε ίν α ι ιδιαίτερη λ ό γω της δ υ να τότη τά ς τους ν α β ρ ίσ κ οντα ι σε δύο ο ξειδ ο α να γω γικ ές κ αταστάσεις, σ τη ν οξειδω μ ένη C u (II) (π α ρ α μ α γνη τικ ό ς) ή σ τη ν α νη γ μ ένη C u(i) (δ ια μ α γνη τικ ός). Σ υνεπ ώ ς, τα ιό ν τα χα λ κ ο ύ χρ η σ ιμ εύ ο υ ν ως σ η μ α ντικ ο ί κ α τα λυτικ οί σ υ μ π α ρ ά γ ο ν τ ες στην ο ξειδ οα να γω γικ ή χη μ εία γ ια τις π ρ ω τεΐνες π ο υ εκ τελούν β ιο λογικ ές λειτουργίες α παραίτη τες γ ια τη ν αύξηση κ α ι τ η ν εξέλιξη του ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ 5'6'7 8. Η η λεκτρονιακή κατα νομ ή του σ τοιχεια κ ού χ α λ κ ο ύ είν α ι 3 d 10 4 s1. Ο ι δια φ ορετικ ές οξειδω τικές κα τα στά σεις τω ν ιό ν τω ν του χ α λ κ ο ύ ό χ ι μ ό ν ο ε υ ν ο ο ύ ν δια φ ορετικ ούς υ π οκατα σ τά τες α λ λ ά κ α ι δια φ ορ ετικ ές στερεοχημείες τω ν σ υμ π λοκώ ν τους. Η γεω μ ετρ ία δια μ όρφ ω σ η ς ενό ς σ υμ π λόκου εξα ρτά τα ι α π ό τη ν γεω μετρία του τρ ο χ ια κ ο ύ του κ εντρ ικ ού ιόντος. Α π ο υ σ ία στερικώ ν π α ρ εμ π ο δ ίσ εω ν, γ ια α ρ ιθ μ ό έντα ξη ς τέσσερα, ο C u + ευ νο εί τετραεδρική δια μ όρφ ω ση, ενώ ο C u2+ ευ ν ο εί επ ίπεδη τετραγω νική δια μ όρφ ω σ η 8. Ο ι πρω τεΐνες χ α λ κ ο ύ σ υ μ μ ετέχο υ ν σε π ο ικ ίλ ες β ιο λογικ ές δια δικ α σίες κ α ι έλλειψ η ή μ ετα β ολές στη δραστικότητα α υ τώ ν οδηγεί σε ασθένειες ή π α θ ο φ υ σ ιο λ ο γικ ές καταστάσεις. Η υπ εροξειδικ ή δισ μ ουτά σ η (προστατεύει τα κύτταρα α π ό τη δ η μ ιο υ ρ γ ία ελεύθερω ν ριζώ ν), η οξειδάοη τον κ υτο χρώ μ α το ς c (εντοπίζετα ι σ τη ν μ ιτο χονδ ρ ια κ ή α λυσίδ α μ ετα φ ο ρ ά ς η λεκ τρονίω ν), η λυσυλοξειδ ά σ η (διασύνδεση του κ ο λ λ α γ ό ν ο υ κ α ι ελα στίνη ς) κ α ι η γα λα κ τοξειδ ά σ η (οξείδω ση π ρω τοτα γώ ν α λ κ ο ο λ ώ ν σε αλδεύδες) είνα ι γνω σ τά ένζυ μ α στα ο π ο ία ο χ α λ κ ό ς α π οτελεί σ υ μ π α ρ ά γ ο ν τ α στις α ντιδ ρ ά σ εις κατά λυσης9'10. 3

12 Α φ ενό ς, λ ο ιπ ό ν, η ένδ εια χ α λ κ ο ύ σε α να π τ υ σ σ ό μ ενο υ ς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς μ π ο ρ εί ν α α π ο β εί θ α να τη φ ό ρ α, μ ε τα υ τ ό χρ ο νες επ ιδράσεις σε π ο λ λ α π λ ά. ό ρ γ α ν α λ ό γω της μ ειω μ ένη ς δραστικ ότητα ς τω ν ε ν λ ό γω ενζύ μ ω ν, α φ ετέρου ο χ α λ κ ό ς μ π ο ρ εί ν α μ ετα τρ α π εί σε κυτταροτοξικό π α ρ ά γ ο ν τ α εά ν συσσω ρευτεί σε υ ψ η λ ές σ υγκ εντρώ σ εις στο εσω τερικό του κυττάρου. Κ ύριο α ρ νη τικ ό α π ο τέλεσ μ α της υ ψ η λ ή ς συγκ έντρω σ η ς του χ α λ κ ο ύ α π οτελεί η π α ρ α γ ω γ ή ελευθέρ ω ν ρ ιζώ ν (ROS) σ υ μ π ερ ιλ α μ β α ν ο μ ένω ν τω ν π ο λ ύ ε π ικ ίν δ υ ν ω ν υ δ ρ ο ξυ λ ικ ώ ν ρ ιζώ ν (Ο Η +) μέσω της α ντίδ ρ α σ η ς F entonη \ Cu+ + Η Cu2++ O H +Ο Η Ο ι ελεύθερες ρ ίζες ε ίν α ι δραστικ ά α ντιδ ρ ώ ντα κ α ι δυνη τικ ά κ α τα στροφ ικ ές. Η επ ίδ ρ α σ η τω ν ρ ιζώ ν στα β ιο λ ο γ ικ ά συστήματα του κ υττά ρ ου σ υ νίσ τα τα ι, κυρίω ς, σ τη ν υπεροξείδω ση λ ιπ ώ ν κ α ι π ρ ω τεϊνώ ν με α π ο τέλεσ μ α τ η ν κ α τα σ τρ οφ ή της κυτταρικής μ εμ β ρ ά νη ς κ αι τη ν α π ενερ γ ο π ο ίη σ η τω ν π ρ ω τεΐνικ ώ ν ενζύ μ ω ν του κυττάρου. Τ ελικό α π οτέλεσ μ α της επ ίδ ρ α σ η ς α υτή ς ε ίν α ι ο θ ά ν α τ ο ς κ α ι η α π οσ ύ νθ εσ η του κυττάρου. Δ εδ ο μ ένο υ λ ο ιπ ό ν, του διττού ρ ό λ ο υ του χ α λ κ ο ύ (ουσια σ τικ ός α λ λ ά κ α ι τοξικός) ο ι ο ρ γ α ν ισ μ ο ί χ ρ ειά ζετ α ι ν α α ν α π τ ύ ξ ο υ ν κ α ι ν α εφ α ρ μ ό σ ο υ ν μ η χ α ν ισ μ ο ύ ς π ρ ό σ λ η ψ η ς α π ό τις θρεπτικές ουσίες, μ ετα φ ο ρ ά ς δ ια μ έσ ου τω ν β ιο λ ο γ ικ ώ ν μ εμ β ρ α ν ώ ν κ α ι π α ρ ά δ ο σ η ς το υ χα λ κ ο ύ στις π ρω τεΐνες. Ε π ιπ λέον, ρ υθμιστικ οί μ η χ α ν ισ μ ο ί π ρ έπ ει ν α α π ο τ ρ έπ ο υ ν τη. συσσώ ρευση τω ν ιό ντω ν χ α λ κ ο ύ σε τοξικ ά επ ίπ εδ α. Τ όσο ο ι ευκαρυω τικ οί ό σ ο κ α ι ο ι π ροκ α ρ υω τικ οί ο ρ γ α ν ισ μ ο ί έ χ ο υ ν α να π τ ύ ξει δ ιά φ ο ρ ο υ ς μ η χ α νισ μ ο ύ ς ο ι ο π ο ίο ι εξα σ φ α λ ίζο υ ν τ η ν ο μ ο ιο σ τα σ ία τω ν μ ετά λλω ν. Α ρ κ ετά γ ο ν ίδ ια κ α ι τα α ντίσ τ ο ιχ α π ρ ο ϊό ν τ α το υ ς ευ θ ύ ν ο ν τ α ι γ ια τη μ ετα φ ο ρ ά το υ χ α λ κ ο ύ δ ια μ έσου της μ εμ β ρ ά νη ς τω ν κ υττά ρω ν, τη ν ενσω μάτω σή του στις π ρ ω τεΐνες του χ α λ κ ο ύ, καθώ ς κ α ι γ ια τη ν διατή ρη ση της ομ οιόσ τα σ η ς του μ ετά λλου. 4

13 ψ Π ειραματικά αποτελέσματα ο δ η γ ο ύ ν στο σ υ μ π έρ α σ μ α ότι στο -κ υ ττα ρ όπλασμα τω ν ευκαρυω τχκώ ν κυττάρω ν ο χ α λ κ ό ς δ εν α π α ντά τ α ι σε ελεύθερη μορφ ή και η ολική συγκέντρω σή του είνα ι λ ιγ ό τερ ο α π ό 10-18Μ. Το γ ε γ ο ν ό ς α υτό υ π οδεικ νύει ότι η μ ετα φ ορά ελεύθερω ν ιό ν τω ν χ α λ κ ο ύ στο εσωτερικό το υ κυττάρου επ ιτυ γχά νετα ι μ ό ν ο μέσω της δέσμευσής το υ ς α π ό τα ενερ γ ά κ έντρα μ ετα λ λ ο σ υ νο δ ώ ν4. Δ εδομ ένη ς της σ η μασίας της οδού μ ετα φ ορ ά ς του χ α λ κ ο ύ, οι φυσικοχημικές κ αι βιολογικ ές του ιδιότητες α π ο τ ελ ο ύ ν α ντικ είμ ενο σ ύ γ χρ ο νη ς έρ ευ να ς π ο υ στοχεύει σ τη ν κ α τα νόη σ η τω ν μ ο ρ ια κ ώ ν μ η χα νισ μ ώ ν πρόσ λη ψ η ς, μ ετα φ οράς και απέκκρισης ιό ντω ν χ α λ κ ο ύ σε β ιο λ ο γικ ά συστήματα ανώ τερω ν θηλαστικώ ν, μ ε έμφαση σ το ν ά νθ ρ ω π ο Ο μ ο ιό σ τα σ η του χ α λ κ ο ύ Η διερεύνηση τω ν μ η χα νισ μ ώ ν, μέσω τω ν ο π ο ίω ν ο χ α λ κ ό ς μεταφέρεται κ α ι εισέρχεται σε δ ια φ ορ ετικ ά σ η μ εία τω ν π ρ ω τεϊνώ ν του χ α λ κ ο ύ, αποτελεί ένα α ν α δ υ ό μ ε ν ο π εδ ίο της έρ ευ να ς κ α τά τα τελευταία χ ρ ό ν ια. Η π α ρ ο ύ σ α ερ γα σ ία ενσω ματώ νετα ι μέσα σε α υτό το π λ α ίσ ιο κ α ι έχει ως σ τόχο ν α διαφω τίσει το ρ ό λ ο του χ α λ κ ο ύ, τις ιδιότητες ο ξειδ ο α να γ ω γ ή ς του κ α ι τις επ ιρ ρ οές π ο υ έχει σ τη ν α λλη λεπ ίδραση μεταξύ τω ν π ρω τεϊνώ ν. Μ ελέτες π ο υ έ γ ιν α ν σε β α κ τή ρια κ α ι σε ζυμ ομ ύκ η τες π α ρ έ χ ο υ ν σ η μ α ντικ ές π λη ρ ο φ ο ρ ίες σχετικά μ ε τ ο ν π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό τω ν γ ο ν ιδ ίω ν π ου εμ π λέκ ο ντα ι σ τη ν ομ οιόστα ση του χ α λ κ ο ύ, ενώ ο ι μ η χ α νισ μ ο ί π ο υ ευ θ ύ νο ντα ι γ ια τη μ ετα φ ορ ά το υ χ α λ κ ο ύ σ το ν ά νθ ρ ω π ο π α ρ α μ έ ν ο υ ν κ α τά ένα μ εγά λ ο μ έρ ο ς ακόμη α διευκ ρίνισ τοι. Η τα υτοποίη σ η τω ν π ρω τεϊνώ ν -σ υ ν ο δ ώ ν του * χ α λ κ ο ύ στα βακτήρια και στους ζυμ ομ ύκητες έχει οδη γή σ ει σ τ ο ν εντοπισ μ ό τω ν α ντίσ τοιχω ν ο μ ό λ ο γ ω ν π ρω τεϊνώ ν σ το ν ά νθ ρ ω π ο 12'15. 5

14 Σ τους ευκαρυω τικ ούς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς κ αι σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα σ το ν ζυ μ ο μ ύ κ η τα S.cerevisiae χα ρ α κ τη ρ ίσ τη κ α ν δ ύ ο π ρω τεΐνες με υψ η λή» σ υ γ γ έ ν ε ια γ ια το ιό ν το υ C u(i), η C trl κ α ι η Ctr3 ο ι ο π ο ίες φ α ίνετα ι ν α "προω θούν" το χ α λ κ ό στη π λα σ μ α τικ ή μ εμ β ρ ά νη Ο χ α λ κ ό ς α ρ χικ ά α ν ά γ ε τ α ι α π ό C u(ii) σε C u(i) με τη δράση τω ν π ρω τεϊνώ ν F r e l/f r e 2 και εν σ υ νεχεία δεσμεύεται α π ό τις C trl κ α ι Ctr3 οι οπ ο ίες το μ ετα φ έρ ο υ ν σε μ ία ά λλη σ ειρ ά ενζύ μ ω ν, σ τους σ υ ν ο δ ο ύ ς χ α λ κ ο ύ (π.χ A tx l), ο ι ο π ο ίο ι είνα ι υ π ε ύ θ υ ν ο ι γ ια τη ν κ υ κ λ ο φ ο ρ ία το υ ιό ν το ς μ έσ α στο κύτταρο (Σ χή μ α 1) 21, f Σ χ ή μ α 1: Ομοιόσταση χαλκού στους ζυμομύκητες S.cerevisia23 2* Σ τα θηλαστικά κ α ι σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα σ το ν ά νθ ρ ω π ο ο ι μ η χ α νισ μ ο ί π ρ ό σ λ η ψ η ς κ α ι μ ετα φ ο ρ ά ς του χ α λ κ ο ύ ε ίν α ι α κ όμ η υ π ό δ ιερ εύνη σ η Σ το ν α ν θ ρ ώ π ιν ό ο ρ γ α ν ισ μ ό η εισ α γω γή του χ α λ κ ο ύ στο κ ύττα ρο γ ίν ε τ α ι μ ε τη δρ ά ση του α ν θ ρ ώ π ιν ο υ ενζύ μ ο υ (h C trl) το ο π ο ίο ε ίν α ι ο μ ό λ ο γ ο του C trl τω ν ζυ μ ομ υ κ ή τω ν (Σ χή μ α 2)28'35 6

15 Γ ενικά στις πρω τεΐνες π ο υ είνα ι υ π εύθυνες γ ια τη ν εισαγω γή του Cu(I) -σ τον κυτταρικό χώ ρ ο το μ οτίβο έντα ξη ς α ποτελείτα ι α π ό τα α μ ινο ξέα κυστεϊνη, μ εθ ειονίνη και ιστιδίνη Σ το ν ά νθ ρ ω π ο η επίδοση του χ α λ κ ο ύ στην C u /Z n υπεροξειδική δισμουτάση (SO D ) γ ίνετα ι α π ό τη πρω τεΐνη - σ υ νο δ ό χ α λ κ ο ύ CCS πρω τεΐνη (ο μ ό λογη της L ys7 στο ζυμ ομ ύκητα ) με μ ο τίβ ο ένταξης του χ α λ κ ο ύ (I) M H C xxc (ό π ο υ Μ = μ εθ ειο νίνη, Η = ιστιδίνη, Χ= * ο π οιοδή π οτε α μ ινο ξύ, C = koot:εΐνη )41. Σε σειρές α νθ ρ ώ π ινω ν κ υττά ρ ω ν έχει βρεθεί ότι ο ι δύο π ρω τεΐνες C C S κ α ι SO D α λ λ η λ επ ιδ ρ ο ύ ν in v itro 42. Μ εταλλάξεις στις πρω τεΐνες αυτές ο δ η γ ο ύ ν στη μη σωστή σ υ νερ γ α σ ία τους με α ποτέλεσμα α τρ οφ ία τω ν μ υώ ν του α νθ ρ ώ π ινο υ ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ 43. Π α ρ ό μ ο ια με τους ζυμομύκητες, σ το ν α νθ ρ ώ π ινο ο ρ γ α ν ισ μ ό η ο μ ό λ ο γ η τη ς ευκαρυω τικής A tx l α νθ ρ ώ π ινη πρω τεΐνη ΑΤΟ ΧΙ (Η Α Η 1) δ ρ α ως σ υ νο δ ό ς χα λ κ ο ύ κ α ι τ ο ν α π ο δ ίδ ει στις α νθ ρ ώ π ινες πρω τεΐνες Μ ένκ ες κ α ι Γ ουίλσ ον (Σ χή μ α 2). Σ τη ν οξειδάση του κ υτοχρώ μ ατος c η π α ρ ά δ ο σ η του χ α λ κ ο ύ οφ είλετα ι κυρίω ς στις πρω τεΐνες S c o l, Sco2 κ αι C o x l7, Η ερευνητική μ α ς ομ ά δ α στα π λ α ίσ ια της π α ρ ο ύ σ α ς δια τρ ιβή ς α νέδειξε και μελέτησε το ρ όλο τω ν τριώ ν α υ τώ ν π ρω τεϊνώ ν. Έ ίοδοε Cu+ Σχήμα 2: Ομοιόσταση του χαλκού στον άνθρωπο. Επισημαΐνονται με κόκκινο χρώμα οι πρωτεΐνες Scol, Sco2 και Coxl7, οι οποίες αποτέλεσαν το αντικείμενο έρευνας της εργασίας αυτής.23'30'31 7

16 1.4 Η οξειδάση τοο κυτοχρώματος c Η οξειδά ση του κ υτοχρ ώ μ α τος c (CcO ή C O X), το τελικό ένζυ μ ο στην α να π νευ σ τικ ή α λυσίδ α του μ ιτ ο χ ο νδ ρ ίο υ, α π οτελεί ένα α π ό τα π ιο σ η μ α ντικ ά ένζυ μ α χ α λ κ ο ύ 44. Τ α μ ιτ ο χ ό ν δ ρ ια π ερ ισ τ ο ιχίζο ντα ι α π ό μ ια α π λή εξωτερική κ α ι μ ια π ερ ισ σ ότερ ο π ο λ ύ π λ ο κ η εσωτερική μ εμ β ρ ά νη. Η εσωτερική μ εμ β ρ ά νη α ν α δ ιπ λ ώ ν ετα ι σε μ ια σειρά εσω τερικώ ν πτυχώ σεω ν. Έτσι δ η μ ιο υ ρ γ ο ύ ντα ι δ ύ ο δ ια μ ερ ίσ μ α τα στα μ ιτοχόνδ ρ ια : ο δ ια μ εμ β ρ α νικ ό ς χώ ρ ο ς (IMS) μεταξύ της εσω τερικής κ α ι εξω τερικής μ εμ β ρ ά νη ς κ α ι η μ ή τρα (m atrix), η ο π ο ία π ερ ιβ ά λ λ ετ α ι α π ό τη ν εσωτερική μ εμ β ρ ά νη (Σ χή μ α 3)45. Εξωτερική μεμβράνη Μήτρα Μ ιτοχόνδριο \ Ί \ \7 \ / Εσωτερική μεμβράνη Διαμεμβρανικός χώρος (IM S) Σχήμα 3: Διάγραμμα ενός μιτοχονδρίου Η μ ετα φ ο ρ ά τω ν η λεκ τρ ονίω ν, σ τη ν εσωτερική μ εμ β ρ ά νη του μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ γ ίνετα ι μέσω μ ια ς α λ υ σ ίδ α ς τρ ιώ ν μ εγά λ ω ν π ρω τεϊνικώ ν σ υ μ π λ ο κ ώ ν τα ο π ο ία ο νο μ ά ζο ντα ι: N A D H -α να γ ω γ ά σ η του σ υ νενζύ μ ο υ Q, κυτοχρ ω μ ικ ή α να γ ω γ ά ο η κ α ι οξειδάση του κ υτο χρ ώ μ α το ς c. Η η λεκ τρονια κ ή ροή σε α υ τά τα σ ύ μ π λοκα, η ο π ο ία δ ια π ερ ν ά τ η ν ενδότερ η μ εμ β ρ ά νη του μ ιτ ο χ ο νδ ρ ίο υ, οδηγεί στη ν ά ντληση π ρ ω το νίω ν δ ια μ έσου της μ εμ βράνη ς. Ο ι ο μ ά δ ες π ο υ μ ετα φ έρ ο υ ν τα η λ εκ τρόνια σε α υ τά τα ένζυ μ α ε ίν α ι οι φ λα β ίνες, σ ύ μ π λ ο κ α σ ιδή ρ ου-θείου, αίμη κ αι ιό ν τ α χα λ κ ο ύ. 8

17 Τα η λεκ τρόνια μ ετα φ έρ οντα ι α π ό τη N A D H -α να γω γά σ η του -σ υ νενζύ μ ου Q σ τη ν κυτοχρω μική α να γ ω γόση α π ό τη ν α νη γ μ ένη μ ορφ ή της ο υ β ικ ινό νη ς, μ ια ς υ δ ρ ό φ ο β η ς κ ινόνη ς. Το κυτόχρω μ α c, μ ια μικρή πρω τεΐνη, μεταφέρει τα η λεκ τρόνια α π ό τη ν κυτοχρω μική α να γ ω γ ό σ η σ τη ν οξειδάση του κυτοχρώ ματος c, τ ο ν τελικό αποδέκτη στην α λυσίδα. Η οξειδάση του κυτοχρώ ματος c κ αταλύει τη μ ετα φ ορ ά τω ν η λεκ τρ ονίω ν α π ό το α ν η γ μ έ ν ο κ υ τόχρ ω μ α c π ρ ο ς το μ ορια κ ό ο ξυ γ ό νο, τ ο ν τελικό δέκτη45. 4 Κ υτόχρω μα c (+2) + 4Η+ + Ο2 >4 Κ υτόχρω μ α c (+3) +2Η2Ο Τέσσερα η λεκ τρόνια δ ιοχετεύ οντα ι στο Ο 2 γ ια ν α το α ν ά γ ο υ ν π λή ρω ς σε 2 Η 2Ο και σ υ γ χρ ό νω ς α ν τ λ ο ύ ν π ρ ω τό νια α π ό τη μ ή τρ α π ρ ο ς τη ν κυτταροπλασματική π λευ ρ ά της εσωτερικής μ ιτο χ ο νδ ρ ια κ ή ς μ εμ β ρ ά νη ς. Η οξειδάση του κυτοχρώ ματος c, περιέχει δύο ο μ ά δ ες α ίμ η ς Α κ α ι δ ύ ο ιό ντα χαλκ ού. Επίσης, η οξειδάση του κ υτοχρ ώ μ ατος c π ερ ιέχει έ ν α ιό ν μ α γ ν η σ ίο υ και ένα ιό ν ψ ευ δ α ρ γύρο. Η αίμη Α δια φ έρ ει α π ό τ η ν αίμ η του κ υτοχρ ώ μ ατος c, στο ότι μ ία φ ο ρ μ υ λ ο μ ά δ α αντικ α θιστά μία α π ό τις μ εθυλικ ές ομ ά δες, και μ ία υ δ ρ ο γονα νθ ρ α κ ικ ή α λυσίδα αντικ α θιστά μ ία α π ό τις β ινυ λ ο μ ά δ ες.45 Ο ι αίμες α ν και χη μ ικ ά είνα ι ισ οδύνα μ ες, έχ ο υ ν δια φ ορ ετικ ές ιδιότητες για τί β ρ ίσ κ οντα ι σε δια φ ορετικά μέρη της οξειδάσης του κυτο χρώ μ α το ς c. Η μ ία ο νο μ ά ζετα ι αίμη α και η ά λλη αίμη α3. Π α ρ ομοίω ς, τα δ ύ ο ιό ντα χα λ κ ο ύ κ α λ ο ύ ντα ι κ έντρα C ua κ α ι C ub κ α ι είνα ι δ ια κ ρ ιτά γ ια τί δεσ μ εύ οντα ι δια φ ορετικ ά α π ό τη πρω τεΐνη. Η αίμη α είνα ι κ ο ντά στο κ έντρ ο C ua/ ενώ η αίμ η α 3 κ ο ντά στο κ έντρ ο Ο ΐβ ^ Σ χ ή μ α 4). Τ ο σ ιδη ρ οκ υτόχω μ α c δ ίνει ένα η λεκ τρόνιο στο σ ύ μ π λ ο κ ο α ίμ η ς α - C ua. Έ να η λεκ τρόνιο μεταφέρεται τότε π ρ ο ς το σ ύ μ π λ εγμ α α ίμ η ς α3- C ub, ό π ο υ το ο ξ υ γ ό ν ο α νά γ ετα ι, σε μ ία σειρά βημάτω ν, σε δ ύ ο μ ό ρ ια νερ ο ύ. Η στρατηγική γ ια τ η ν α σ φ α λή α να γ ω γή του ο ξυ γ ό ν ο υ είνα ι σαφής: Ο καταλύτη ς δ εν πρέπ ει ν α α πελευ θερ ώ νει μερικώ ς οξειδ ούμενα π ρ οίοντα. 9

18 Η οξειδάση του κ υτοχρ ώ μ α τος c π λη ρ εί α υτό το κ ρ ίσ ιμ ο κριτήριο δ εσ μ εύ ο ντα ς το ο ξ υ γ ό ν ο α νά μ εσ α στα ιό ν τ α Fe2+ κ α ι C u + του κ έντρ ου α 3- C ub.» Κ άθε μ έτα λ λ ο τότε δ ίνει ένα η λεκ τρόνιο στο ο ξ υ γ ό ν ο γ ια ν α το μετατρέψ ει σε δ ια ν ιό ν (Σ χή μ α 4)45. Η εισροή ενό ς η λεκ τρ ονίου α π ό το κ έντρ ο α - Cu a, οδη γεί σ τ ο ν σ χη μ α τισ μ ό ενό ς σ ιδ η ρ υ λο - z v b ιά μ εσ ου, στο ο π ο ίο ο σ ίδη ρ ος έχει σθένος +4. Σ χη μ α τίζετα ι ένα μ ό ρ ιο ν ερ ο ύ κ α ι απελευθερώ νεται, μετά α π ό τ η ν εισροή το υ δεύτερου η λεκ τρ ο νίο υ, ενώ έ ν α Ο Η ' π α ρ α μ ένει δεσ μ ευ μ ένο με έ ν α Fe3+. Έ να τρίτο η λεκ τρ ό νιο χρ η σ ιμ εύει γ ια ν α α ν ά γ ε ι το ιό ν του χα λ κ ο ύ (+2) στη ν κατάσταση (+1). Σ τα τελευτα ία σ τά δια του κ ύκλου, ένα η λεκ τρ όνιο κ α ι 0 2 εισ έρ χο ντα ι γ ια ν α σ χη μ α τίσ ο υ ν Η 2Ο κ α ι ν α π α ρ ά γ ο υ ν έ ν α δ εσ μ ευμένο δ ια ν ιό ν ο ξ υ γ ό ν ο υ. Τ α π ρ ω τό ν ια εισ έρ χο ντα ι μ ε τα η λεκ τρ όνια στα τρ ία α π ό τα τέσσερα σ τά δια του κ ύ κ λ ου45. Σχήμα 4 : 0 μηχανισμός της οξειδάσης του κοτοχρώματος c45 Η οξειδά ση το υ κ υτοχρ ώ μ α τος c α π α ντά τ α ι σε μ ιτ ο χ ό ν δ ρ ια κ α ι αρκετά α ερ ό β ια βακτήρια. Ο α ρ ιθ μ ό ς τω ν υ π ο μ ο ν ά δ ω ν στις οξειδά σες του κ υ τοχρ ώ μ α τος c κ υ μ α ίνετα ι μ ετα ξύ 3 μ ε 5 στα β α κ τή ρ ια έως κ α ι 13 στα μ ιτ ο χ ό ν δ ρ ια τω ν θηλαστικώ ν47'48'49. 10

19 9 Σ τον ά νθρω π ο το ένζυ μ ο α υτό είνα ι ένα σ ύμ π λοκο δεκατριώ ν -οπ ομ ονά δ ω ν, α π ό τις οποίες οι τρεις μ εγαλύτερες, I, II και III (COXI, COXII, COXIII) κω δικ οπ οιούντα ι α π ό το μ ιτο χονδ ρ ια κ ό γ ο νιδ ίω μ α, ενώ οι υ π ό λ ο ιπ ες δέκα κ ω δικοποιούντα ι α π ό το π υ ρ η νικ ό γ ο νιδ ίω μ α (Σ χή μ α 5)48'49. Ο ι υ π ο μ ο νά δ ες I και II εμ φ α νίζο υ ν ομ οιότη τα σ τη ν α μ ινοζικ ή τους α λ λ η λ ο υ χία κ αι δια τη ρούν, ως σ ύμπλοκο, τη δραστικότητα του ενζύ μ ο υ (α να γω γή μ ο ρ ια κ ο ύ 0 2 και άντληση πρω τονίω ν). Ο ι υ π ό λ ο ιπ ες υ π ο μ ο ν ά δ ες σ υ νεισ φ έρ ουν στη δομική διαμόρφ ω ση, σταθερότητα κ α ι α π ο μ ό νω σ η του π υ ρ ή ν α τω ν I και II, σ τη ν π ρ οσ τα σ ία α π ό καταστροφ ικές ρ ίζες-ενδ ιά μ εσ α, στη ρύθμιση της δράσης της οξειδά σης μ ε α λλη λεπ ίδραση μ ε το Α ΤΡ κ α ι στη διαμόρφ ω ση κ α να λιώ ν μ ετα φ ορ ά ς Η +/ e -71. Μ Σχήμα 5: Η οξειδάση του κυτοχρώματος c του ανθρώπου. Διακρίνεται ο προσανατολισμός στο χώρο των υπομονάδων του ενζύμου, των δύο ομάδων αίμης και των ιόντων Cu, Zn, Mg46. Η υ π ο μ ο ν ά δ α II περιέχει συνήθω ς τη θέση δέσμευσης-α λλη λεπ ίδρασης με το κυτόχρ ω μ α c. Η υ π ο μ ο ν ά δ α II περιέχει, επίσης, το διμ ερές κ έντρ ο C ua % (Σ χή μ α 6 ), ό π ο υ τα δ ύ ο ά τομ α χα λ κ ο ύ είνα ι γεφ υ ρ ω μ ένο με δύο ά το μ α θείου α π ό κ υστεΐνες και σ χη μ α τίζο υ ν ένα επ ίπ εδ ο τετραγω νικό σ ύμ π λοκο46. 11

20 His o c \ / ^CH / h 7c HaC HjC / c h 2 / / Cys \. 2. \ / CH I c h 2 \ / " λ / /Cux cu SH HS X N I / c h 2 G lu hn- Hj^CH C \ -C \ Hj C / HN "L-c'h C \ 9 o a \ x M et C X H X NH II \ 0 ' C y s H is Σχήμα 6: Κέντρο C u A της οξειδάοης κυτοχρώματος c Σ τη ν υ π ο μ ο ν ά δ α I β ρ ίσ κ ο ντα ι δ ύ ο α ίμ ες, η α ΐμη α με δ ύ ο ισ τιδίνες ως α ξ ο ν ικ ο ύ ς υποκ α τα στά τες, κ α ι η α ίμ η as, η ο π ο ία μ α ζί μ ε το χ α λ κ ό Cub σ ο ν ισ τ ο ύ ν το δ ιπ υ ρ η νικ ό κ α τα λυτικ ό κ έντρ ο ό π ο υ λ α μ β ά ν ε ι χώ ρ α η α να γ ω γή του μ ο ρ ια κ ο ύ Ο 245 (Σ χή μ α 7). Ε κτός όμω ς τω ν υ π ο μ ο ν ά δ ω ν α υτώ ν, έ ν α μ ε γ ά λ ο δίκ τυο π ρ ω τεϊνώ ν ε ίν α ι α π α ρ α ίτη το γ ια τ η ν ομ α λή λ ειτ ο υ ρ γ ία της C co 47'48'49. Υπομονάδα II Υπομονάδα I Σχήμα 7: Τα κέντρα Cuakoi Cub του ένζυμου CcO. Στην υπομονάδα II βρίσκεται το κέντρο Cua ενώ στην υπομονάδα I το κέντρο Cub47. 12

21 ο Στο κέντρο C u b το ιό ν του χ α λ κ ο ύ βρίσκεται 13Α κάτω α π ό τη ν επ ιφ ά νεια της μ εμ βράνη ς, ενώ το κ έντρ ο C u a π εριέχει μ ία διπ υρηνικ ή θέση χα λκ ού τοποθετημένη μέσα στην εσωτερική μ εμ βράνη τω ν μ ιτο χ ο νδ ρ ίω ν στους ευκαρυω τικούς ο ρ γα νισ μ ο ύ ς, στο π ερ ίπ λ α σ μ α τω ν G ram -α ρ νη τικ ώ ν βακτηρίω ν και σ τη ν εξωτερική κυτταρική μ εμ β ρ ά νη τω ν G ram -θ ετικ ώ ν βακτηρίω ν. Καθώς ο ι υ π ο μ ο νά δ ες I κ αι II π α ρ ά γ ο ν τ α ι στο μ ιτο χ ό νδ ρ ιο, π ρ έπ ει μ ε κ ά π ο ιο τρ όπ ο τα τρία ιό ν τα χα λ κ ο ύ ν α εισ α χθ ο ύ ν α π ό το κ υ ττα ρ όπλα σ μ α ή α π ό τ η ν μ ιτοχονδρια κ ή μήτρα. Ε ίνα ι π λ έο ν γνω σ τό π ω ς στο κ υ ττα ρ ό π λα σ μ α δ εν υ π ά ρ χ ο υ ν ελεύθερα μ εταλλικά ιό ν τα α λ λ ά είνα ι π ά ν τ α δ εσ μ ευ μ ένα σε π ρω τεΐνες-μ ετα λλοσ υνοδούς (m etalloch aperon es) ο ι ο π ο ίες μ ετα φ έρ ο υ ν τα μ εταλλικά ιό ντα στις πρω τεΐνες σ τόχους. Σ τους ευκαρυω τικ ούς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς τέσσερις είνα ι οι πρω τεΐνες π ο υ εμ π λέκ οντα ι σ τη ν μ ετα φ ο ρ ά κ α ι σ τη ν εισαγω γή του χα λκ ού στο ένζυ μ ο CcO: C o x ll, C o x l7, CoxX9, κ α ι S c o l50 (Σ χή μ α 8 ). Β ιβλιογρ α φ ικ ά και πειραματικ ά δ εδ ο μ ένα υ π ο σ τ η ρ ίζο υ ν πω ς η C o x l7 π α ρ α δ ίδ ει το χα λ κ ό στην C o x ll γ ια δια δοχικ ή καταχώ ρησή του στο C u b σ τη ν υ π ο μ ο ν ά δ α I, και στη S c o l, α π ό ό π ο υ θα καταλήξει στο κ έντρ ο C u a της υ π ο μ ο ν ά δ α ς II (Σ χήμα 9). 13

22 Ίρωτεϊν ικό "μο νοπάτι" του χαλκού στο μιτοχόνδριο. Διακρίνονται οι πρωτεΐνες :23, C oxl7/ C oxl9, και S co l οι οποίες συμμετέχουν στη μεταφορά του χαλκού στο του μιτοχονδρίου και συγκεκριμένα στο ένζυμο οξειδάση του κυτοχρώματος c ίςοοχ). 14

23 Σ χ ή μ α 9: Μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο υ χ α λ κ ο ύ σ τ α κ έ ν τ ρ α Cua (Cox2 υ π ο μ ο ν ά δ α ) κ α ι Cub ( C o x l υ π ο μ ο ν ά δ α ) τ η ς C c O α π ό τ ις π ρ ω τ ε ΐν ε ς C o x l 7, S c o l κ α ι C o x l l Δ υ ν α μ ικ ό ο ξ ε ιδ ο α ν α γ ω γ ή ς στο μ ιτ ο χ ό ν δ ρ ιο Η μ ιτοχονδ ρ ια κ ή α ν α π ν ο ή είνα ι μ ία κ ύρια π η γή δραστικώ ν ο ξ υ γ ο νο ύ χ ω ν ενώ σεω ν. Τα α ν α π ν έ ο ν τ α μ ιτ ο χ ό νδ ρ ια μ ετα τρ έπ ο υ ν 1-2% του ο ξυ γ ό ν ο υ π ου κ α τα να λώ νετα ι σε α ν ιό ν τ α υπ εροξειδίου. Τ ο υπ ερ οξείδ ιο ίσως ν α π ρ οκ α λέσ ει το ίδιο βλάβη ή ν α α ντιδ ρ ά σ ει π εραιτέρω γ ια ν α δώ σει ά λλες δραστικές ενώ σεις, όπω ς υ π ερ οξείδιο του υ δ ρ ο γ ό ν ο υ ή τη ρ ίζα του υ δ ρ οξυ λίου. Η π α ρ ο υ σ ία τω ν ενώ σεω ν α υτώ ν μ π ο ρ εί ν α επιφ έρει καταστάσεις οξείδω σης, όπω ς τη ν τρ οποποίη σ η τω ν πρω τεϊνικώ ν θειολώ ν και στις δύο π λευρές της εσω τερικής μ εμ β ρ ά νη ς του μ ιτο χ ο νδ ρ ίο υ. Η π α ρ α γω γή α νιό ν τω ν σ ουπερ οξειδ ίου κατά την διάρκεια της α ν α π ν ο ή ς και η επακόλουθη π α ρ α γ ω γή υπ ερ οξειδίου του υ δ ρ ο γ ό ν ο υ στο δ ια μ εμ β ρ α νικ ό χώ ρ ο (IMS) αλλά κ αι σ τη ν μήτρα καθιστά α να γ κ α ίο τ ο ν έλεγχο της διαθεσιμότητας ιόντω ν μετάπτω σης (transient m etalls), ώστε ν α α π οφ ευχθ εί η π α ρ α γω γή ισ χυρότερ ω ν οξειδω τικώ ν ενώ σεω ν. Τ α ιό ντα χ α λ κ ο ύ δεσ μ ευμένα με 15

24 π ρ ω τεΐνες ελ α χ ισ τ ο π ο ιο ύ ν τις επ ιβ λ α β είς σ υνέπ ειες τω ν μη δεσ μ ευμένω ν ιό ν τ ω ν του Cu(I). Για ν α δια τη ρήσει τη ν οξειδ ο α να γω γικ ή ισ ο ρ ρ ο π ία, το μ ιτο χ ό νδ ρ ιο εξα ρ τά τα ι α π ό 2 συστήματα: της γ λ ο υ τ α θ ε ιό ν η ς/α ν α γ ω γ ά σ η της γ λ ο υ τ α θ ειό ν η ς (G lutared oxin) κ α ι της θειροδοξίνης. Το τρ ιπ επτίδιο γ λ ο υ τ α θ ειό ν η ς (G SH ) έχει χ α μ η λ ό δ υ ν α μ ικ ό ο ξειδ ο α να γ ω γ ή ς (ΕΟ = -240 m V ) κ α ι βρίσ κ ετα ι σε υ ψ η λ ή συγκέντρω ση (13m M ) στο κύτταρο, δ ύ ο χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ά π ο υ το κ α θ ισ το ύ ν σ η μ α ντικ ό ρυθμιστικό π α ρ ά γ ο ν τ α της κ υττα ρ ικ ή ς ο ξειδ ο α να γ ω γ ή ς. Η αντιοξειδω τική λ ειτουργ ία της γλουτα θ ειό νη ς μ ετα δ ίδ ετα ι δ ια μ έσ ου της ο ξειδ ο α να γω γικ ώ ς ενερ γή ς ο μ ά δ α ς θειόλη ς η ο π ο ία ο ξειδ ώ νετα ι ό τ α ν το G SH α ν α γ ά γ ε ι μ ό ρ ια -σ τόχο υ ς. Έτσι, δ ύ ο μ ό ρ ια α ν η γ μ έ ν η ς G SH ο ξειδ ώ νοντα ι σε δ ισ ο υ λ φ ίδ ιο γλουτα θ ειό νη ς (GSSG)51. Η α ν α γ ω γ ά σ η τη ς γ λ ο υ τ α θ ειό ν η ς κ α ι η θ ειρ οδοξίνη ε ίν α ι δ ομ ικ ά π α ρ ό μ ο ιες κ α ι έ χ ο υ ν δια τη ρη θ εί κ α θόλη τη ν δ ιά ρ κ εια της εξέλιξης52'53. Ε ίνα ι μικρές, σταθερές σ τη ν θερ μ ότη τα ο ξειδ ο α ν α γ ω γ ά σ ες (oxid ored u ctases) μ ε δ ύ ο δ ια τη ρ η μ ένα κ α τ ά λ ο ιπ α κυστεϊνη ς στις ενερ γές π ερ ιο χές τους. Ο ι δ ύ ο αυτές π ρω τεΐνες σ υ μ μ ετ έχο υ ν σε έ ν α ευρύ φ ά σ μ α κυτταρικώ ν λειτουργιώ ν οι ο π ο ίες σ υ μ π ε ρ ιλ α μ β ά ν ο υ ν τη ν α να δ ίπ λ ω σ η και τη ν ρύθμιση τω ν π ρ ω τεϊνώ ν, τ ο ν μ ετα β ο λ ισ μ ό του θείου, τη ν επιδιόρθω ση π ρ ω τεϊνώ ν οι οπ ο ίες έ χ ο υ ν υπ οστεί β λ ά β ες α π ό οξειδώ σεις. T o N A D P H κ α ι η ρεδουκτάση της θ ειρ ο δ ο ξίνη ς α ν α γ ά γ ο υ ν τ η ν οξειδω μ ένη μ ορφ ή το υ δ ισ ο υ λφ ιδ ίο υ της θ ειρ οδοξίνη ς, ενώ το G SH μ ε ή λ εκ τρόνια π ρ ο ε ρ χ ό μ ε ν α α π ό το N A D P H α ν ά γ ε ι τη ν α να γ ω γ ά σ η της γλουτα θ ειό νη ς Π ρ ω τ ε ΐν ε ς το υ μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ Α ρκετές α π ό τις π ρω τεΐνες π ο υ εντοπίζο ν τ α ι στο δ ια μ εμ β ρ α νικ ό χώ ρ ο του μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ είνα ι π λ ο ύ σ ιες σε κυστεϊνες σ η μ α ντικ ές α π ό λειτουργικ ή ς ά π ο ψ η ς, ο ι ο π ο ίες μ π ο ρ ο ύ ν ν α σ υ μ μ ετέχο υ ν ή ό χ ι σε σ χη μ α τισ μ ό δ ισ ο υ λ φ ιδ ικ ώ ν δεσμώ ν. 16

25 9 Η α φ θ ονία τω ν μ ο ρ ίω ν π ο υ π ερ ιέχουν δ ισ ουλφ ίδ ια στο εσω τερικό του IM S δ είχνει ότι ο οξειδ οα να γω γικ ός έλεγχος εντός α υ τού του τμ ή μ ατος διαφέρει α π ό εκ είνον του κυτταροπλάσματος, ό π ο υ ο σχη μ α τισ μ ός δισουλφ ιδικώ ν δεσμώ ν είνα ι σ π ά νιο ς εξαιτίας του α να γ ω γικ ο ύ π ερ ιβ ά λλοντος54. Η δισμουτάση του υ π εροξειδίου του χ α λ κ ο ύ /ψ ε υ δ α ρ γ ύ ρ ο υ (SO D 1) κ αι η σ υ νο δ ό ς χα λκ ο ύ, CCS, δ ια νέμ ο ντα ι μεταξύ τω ν μ εμ β ρ α νώ ν, στο κ υτταρόπλασμα, σ τον π υ ρ ή ν α κ αι στα λυσοσώ ματα. Ο εντοπισ μ ό ς της S o d l σ τον δ ια μ εμ β ρ α νικ ό χ ώ ρ ο προστατεύει α π ό τις ρίζες υ π ερ οξειδ ίου π ο υ π α ρ ά γ ο ντα ι α π ό τη ν α να π νευ σ τικ ή α λυσίδ α 55. Δ ο μ ικ ά, όλες ο ι ευκαρυω τικές πρω τεΐνες Sod π ερ ιέχ ο υ ν έ ν α ιό ν χ α λ κ ο ύ, ένα ιό ν ψ ευ δ α ρ γ ύ ρ ο υ, κ α ι ένα δεσμό δισ ουλφ ιδίου α ν ά μ ονομ ερ ές, α π α ρ α ίτη τα γ ια τη ομ α λή λ ειτ ο υ ρ γ ία της πρω τεΐνης. Η σ υ νο δ ό ς χ α λ κ ο ύ CCS μ εταφέρει το ιό ν του χ α λ κ ο ύ στη S o d l δημιουργώ ντα ς ένα ετεροδιμερές μέσω ενό ς σ χη μ α τισ μ ού δ ισ ουλφ ιδ ίου. Μ ία π ρόσφ ατη μελέτη δείχνει ότι η δεσμευμένη με χ α λ κ ό C C S δ ιευ κ ο λ ύ νει τη ν οξείδω ση τω ν κ α τα λοίπ ω ν της κυστεΐνης κ α ι τ η ν δ η μ ιο υ ρ γ ία του δισουλφ ιδικού δεσμού στη S o d l, με α ποτέλεσμα τη ν ω ρ ίμ α νσ η της τελευταίας. Ως εκ τούτου, ο δ ισ ουλφ ιδικ ός δεσμός στη S o d l είνα ι α π α ρ α ίτη τος γ ια τη ν ρύθμιση της ενζυμ α τικ ή ς δραστηριότητας, και γ ια τη ν εισ α γω γή της σ το ν χώ ρ ο μεταξύ τω ν μ εμ β ρ α νώ ν. Μ ια άλλη ο μ ά δ α πρω τεϊνώ ν, οι ο π ο ίες εντοπίζο ντα ι στο μ ιτο χόνδ ρ ιο, περιέχει μοτίβο CX9C στο ο π ο ίο δύο κ α τά λοιπ α κυστεΐνης δ ια χω ρ ίζο ντα ι α π ό εννέα α μ ινοξέα. Α υτή η ομ ά δ α σ υ μ π ερ ιλα μ β ά νει τις C o x l7, C o x l9, C ox23, C o x ll οι οπ οίες εμ π λέκ οντα ι στην συγκρότηση της οξειδά σης του κ υτοχρώ μ ατος c56. Δ ομ ικ ές μελέτες υπ ο σ τη ρ ίζο υ ν ότι η δέσμευση του χα λκ ο ύ εξα ρτά τα ι α π ό τη ν κατάσταση οξείδω σης τω ν κ α τα λοίπ ω ν της κυστεΐνης. Σ την π λή ρω ς α νη γ μ ένη κατάσταση, η C o x l7 δεσμεύει ιό ντα 4C u(i), α λ λ ά στην οξειδω μένη κατάσταση με δ ύ ο ή τρεις δισ ουλφ ιδικ ούς δεσμούς, η C o x l7 δεν δεσμεύει ιό ντα Cu(I). Δ ύ ο δισ ουλφ ιδικ οί δεσμοί (C ys36 - C ys47 και C ys26-17

26 C ys57) σ υ ν δ έ ο υ ν δ ύ ο α ντιπ α ρ ά λ λ η λ ες έλικες, δια τη ρώ ντα ς αυτές σε κ οντινή α π όσ τα σ η. Κ ατά τη ν α να γ ω γ ή, οι δ ύ ο έλικες α π λ ώ νο ν τ α ι γ ια ν α. δ ιε υ κ ο λ ύ ν ο υ ν τη ν είσ οδο τω ν ιό ντω ν Cu(I). Ο ι δισ ουλφ ιδ ικ οί δεσμοί δεν φ α ίνετα ι ότι είνα ι α π α ρ α ίτη τοι γ ια τη φ υσιολογικ ή λ ειτουργία, α λ λ ά έχ ο υ ν ρ ό λ ο στη σ τα θεροποίη ση της δομ ή ς. Η C o x l7 π ερ ιέχει δ ύ ο επ ιπ λ έο ν κ α τά λ ο ιπ α κυστεϊνης, το C ys23 κ α ι το C ys24 τα ο π ο ία δ εν σ χη μ α τίζο υ ν δ ισ ουλφ ιδ ικ ές σ υνδέσ εις, α λ λ ά α ν τ ί α υ το ύ είνα ι σ η μ α ντικ ά γ ια τ η ν δέσμευση του C u(i) κ α ι γ ια τη ν λ ειτ ο υ ρ γ ία τη ς πρω τεΐνης. Ο ι κυστείνες σ τη ν C o x l9 ε ίν α ι σ η μ α ντικ ές γ ια τη ν δέσμευση του Cu(I) κ αθώ ς επ ίσης κ α ι γ ια τη ν σ υμ μ έτοχη της C o x l9 σ τη ν σ υ να ρ μ ο λ ό γη σ η της C co. Η π ρω τεΐνη βρίσκεται ω ς επ ί το π λ είσ τον σ τη ν α ν η γ μ ένη κατάσταση, ενώ μελέτες έδ ειξα ν πω ς α φ α ίρ εσ η τω ν κ υ οτεινώ ν δ εν οδη γεί σε δ υ σ λ ειτουργία της πρω τεΐνης. Λ ίγ α ε ίν α ι γνω σ τά σχετικά μ ε τ η ν λ ειτουργ ία κ α ι τ η ν ο ξειδ ο α να γω γικ ή κατάσταση της C ox2355. Η μ ετα φ ο ρ ά Cu(I) α π ό τ η ν C o x ll στη ν C ox 1 υ π ο μ ο ν ά δ α της ο ξειδ ά σ η ς του κ υτοχρ ώ μ α τος c, σ χη μ α τίζο ντα ς το κέντρο C ub, φ α ίνετα ι ν α λ α μ β ά ν ε ι χ ώ ρ α στις νεο α να π τ υ σ σ ό μ ενες α λυσίδες C o x l κατά τη ν διά ρ κ εια της εισ α γω γή ς κ α ι της α να δ ίπ λ ω σ ή ς στην εσωτερική μ εμ β ρ ά νη του ο ρ γ α ν ιδ ίο υ (ΙΜ). Το κ έντρ ο CuB της υ π ο μ ο ν ά δ α ς C o x l α π οτελείτα ι α π ό ισ τιδ ινικ ο ύ ς υποκ α τα στά τες ενώ η θέση δέσμευσης του Cu(I) σ τη ν C o x ll α π οτελείτα ι α π ό κ α τά λ ο ιπ α κυστεϊνης. Η ο ξειδ ο α να γω γικ ή κατάσταση της C o x ll π ρ έπ ει ν α διατηρηθεί εντός του IM S ώστε ν α εξα σφ α λισθεί η επ ιτυχή ς μ ετα φ ο ρ ά του C u(i) Η μ ε τ α λ λ ο σ ο ν ο δ ό ς C ox 17 Η C o x l 7 είνα ι μ ια μικρή π ρω τεΐνη, 8 kd a, π ο υ α π α ν τ ά στους ζυ μ ομ ύ κ η τες κ α ι στα θηλαστικά. Π ειρ α μ α τικ ά δ εδ ο μ ένα δ ε ίχ ν ο υ ν πως σ υμ μ ετέχει στη μ ετα φ ο ρ ά του χ α λ κ ο ύ στο ένζυ μ ο C co 58'59'60. Ο ι μ η χα νισ μ ο ί δ ρ ά σ η ς καθώ ς κ α ι ο ι πρω τε'ΐνες-βοηθοί της C o x l 7 δ εν έ χ ο υ ν π ροσ διορισ τεί 18

27 Ρ πλήρω ς. Τρεις α π ό τις εφτά κυατεΐνες στην α λλη λ ο υ χία της π ρω τεΐνη ς β ρ ίσ κ ο ντα ι στο χαρακτηριστικό μ οτίβ ο CCXC το ο π ο ίο είνα ι σ η μ α ντικ ό γ ια τη ν δέσμευση του Cu(I). Π ειραματικ ά δ εδ ομ ένα δ ε ίχ ν ο υ ν πω ς μ εταλλάξεις τω ν κυστεϊνώ ν του μ οτίβου CCXC ο δ η γ ο ύ ν σε α να π νευστικ ή α νεπ ά ρ κ εια σε ευκαρυω τικά κύτταρα61. Π ροσ θέτοντα ς όμω ς εξω γενώ ς χα λ κ ό στο μέσο α νά π τυξη ς ο φ α ινότυ π ος α ντιστρέφ εται και επ α νέρ χετα ι η φ υσιολογικ ή κατάσταση. Το α ποτέλεσμα αυτό σ υμ φ ω νεί με τη ν ένδειξη γ ια συμ μετοχή της C o x l7 στη μ εταφ ορά του χα λ κ ο ύ στη CcO. Η C o x l7 εντοπίζετα ι στο κ υττα ρ όπλα σ μ α και στο δ ια μ εμ β ρ α νικ ό χώ ρ ο του μ ιτο χονδ ρ ίο υ, γ ε γ ο ν ό ς π ου ενισ χύει τη ν υπόθεση της λειτουργία ς της C o x l7 ως μ ετα φ ορέα του χα λ κ ο ύ α π ό τ δ κυττα ρ όπλα σ μ α στο μ ιτο χόνδ ρ ιο. Σ ύ μ φ ω να με π ειρ α μ α τικ ά δ εδ ο μ ένα κάθε μ ό ρ ιο της πρω τεΐνης δεσμεύει δ ύ ο ή τρία ιό ντα χ α λ κ ο ύ 62'63. Υ π ά ρ χ ο υ ν βιολογικ ές ενδείξεις ότι στο ζυμ ομ ύκ η τα η C o x l7 σ υ νερ γά ζετα ι μ ε τη ν μ ιτοχονδ ρ ια κ ή πρω τεΐνη S c o l και μ α ζί εξα σ φ α λ ίζο υ ν τη ν μ ετα φ ο ρ ά του χ α λ κ ο ύ στη θέση C u a της CcO. Μ ελέτες π ρ ο τ είνο υ ν επίσης ότι η C o x ll, μ ια άλλη μ ιτοχονδ ρ ια κ ή πρω τεΐνη, δέχετα ι το χ α λ κ ό α π ό τη ν C o x l7 κ α ι στη σ υ νέχεια το ν μεταφέρει στη θέση C u b της CcO. Α μ φ ότερ ες ο ι π ρω τεΐνες ( S c o l, C o x ll) π ερ ιέχουν στο Ν -τελικό ά κ ρ ο μ ια δ ια μ εμ β ρ α νικ ή έλικα η ο π ο ία τις σ υνδ έει σ τη ν εσωτερική μ ιτο χονδ ρ ια κ ή μ εμ β ρ ά νη κ α ι δια λυτές π ερ ιο χές οι οπ οίες π ρ ο β ά λ λ ο ντα ι στο δ ια μ εμ β ρ α νικ ό χώ ρο. Η δια δικ α σ ία εισ α γω γή ς του χ α λ κ ο ύ στις υ π ο μ ο νά δ ες I κ α ι II α π ό τη ν S c o l και τ η ν C o x ll, α ντίσ τοιχα, π α ρ ο υ σ ιά ζει ομοιότητες με μ ο ντέλα ά λ λ ω ν γνω σ τώ ν π ρω τεϊνώ ν στους ζυμομύκητες. Π α ρ α δ είγμ α τος χ ά ρ ιν, η λειτουργία της μ ετα λ λ ο σ υ νο δ ο ύ C csl σχετίζεται με τη ν μ ετα φ ορά του χ α λ κ ο ύ σ τη ν ^,Ζ π -υ π ε ρ ο ξ ε ιδ ικ ή δισμουτάση (S o d l) κ α ι η C cc2, ένα ς μ ετα φ ορέα ς του χα λκ ο ύ, δέχεται το μ έτα λλο α π ό την μ ετα λ λ ο σ υ νο δ ό A tx l64'65. Δ ε ν έχ ο υ ν διευκρινισ θεί πλή ρω ς οι λεπτομέρειες σχετικά με τη μ ετα φ ορ ά του μετάλλου. Στις δύο πρω τεΐνες, S o d l και Ccc2, λ α μ β ά ν ο υ ν χώ ρ α α ντιδράσεις α ντα λ λ α γ ή ς υποκατάστατη μεταξύ της π ρω τεΐνη ς-σ τόχου και της π ρ ω τεΐνη ς-μ ετα λλοσ υνοδού. 19

28 Σ υνεπ ώ ς, η υπ όθεση π ο υ γ ίνετ α ι είνα ι ότι η μ ετα φ ο ρ ά του χα λ κ ο ύ στα σ υστή μ ατα S c o l-υ π ο μ ο ν ά δ α II κ α ι C o x ll-υ π ο μ ο ν ά δ α I επ ιτυ γ χά νετα ι μέσω π ρ ω τεϊνικ ώ ν α λλη λεπ ιδ ρ ά σ εω ν. Π α ρ ομ οίω ς, η μ ετα φ ορά του χ α λ κ ο ύ α π ό τη ν C o x l7 στις S c o l κ α ι C o x l l α να μ ένετα ι ν α σ υ μ β α ίν ει μ ε τ ο ν ίδ ιο τρ όπ ο. Η S c o l κ α ι C o x ll δ εσ μ εύ ο υ ν τ ο ν χ α λ κ ό κ α ι μ ετα λλά ξεις ο ι ο π ο ίες α κ υ ρ ώ νο υ ν τη δέσμευση το υ C u(i) π ρ ο κ α λ ο ύ ν εξασθένηση στην in v iv o σ υ να ρ μ ο γ ή της CcO. Μ ελέτες στο ζυ μ ο μ ύ κ η τα π ο υ α π ο δ εικ ν ύ ο υ ν φ υσική μ ετα φ ο ρ ά του χ α λ κ ο ύ α π ό τ η ν C o x l7 στις S c o l κ α ι C o x l l δ ε ίχ ν ο υ ν πω ς ο χ α λ κ ό ς δεσμεύεται μ ό ν ο π α ρ ο δ ικ ά στις S c o l κ α ι C o x ll π ρ ιν μεταφερθεί σ τη ν C co 66. Β ιοχημικές μελέτες δ ε ίχ ν ο υ ν ότι στα κ ύττα ρ α η β ιολογικ ώ ς ενερ γή μ ορφ ή του σ υμ π λόκου χα λ κ ο ύ -Ο ο χ17 είνα ι η C u 4C o x l , γ ε γ ο ν ό ς π ο υ οδηγεί στο σ υ μ π έρ α σ μ α π ω ς η π ρω τεΐνη C o x l7 μ π ο ρ εί ν α μ ετα φ έρει μ έχρ ι κ α ι τέσσερα ιό ντα χα λ κ ο ύ στις π ρω τεΐνες σ τόχους. Α π ό π ειρ ά μ α τα γ ίνετ α ι φ α νερ ό ότι τα μ έτα λλα μ π ο ρ ο ύ ν ν α α π ο δ εσ μ ευ το ύ ν α π ό τη ν C iu C o x l 7 με δύο δια φ ορετικ ούς μ η χ α ν ισ μ ο ύ ς α π ο δ έσ μ ευ σ η ς μ ετά λλου. Σ ύ μ φ ω να με τ ο ν π ρώ το μ η χα νισ μ ό, τ ο ν μη-οξειδω τικό, η C u 4C o x l7 δ ίνει τα μ έτα λλα στις π ρ ω τεΐνες -σ τόχους π ο υ ε μ φ α ν ίζ ο υ ν υψ η λότερ η σ υ γ γ ένεια γ ια το μ έτα λλο κ α ι διευ κ ολύνετα ι α π ό τη ν Λ κινη τική α σ τά θεια τω ν ο μ ά δ ω ν σ υ ν α ρ μ ο γ ή ς μ ετά λλου-θ είου. Μ ε τ ο ν δεύτερο μ η χ α ν ισ μ ό, τ ο ν οξειδω τικό, τα μ έτα λ λ α ελευ θ ερ ώ νο ντα ι α π ό τις ο μ ά δ ες θείου της C o x l7 με οξείδω ση τω ν κ υστεϊνικ ώ ν α μ ινο ξέω ν αυτώ ν: Η C o x l7 θα π ρ έπ ει ν α α ν α χ θ ε ί π ρ ιν α π ό τ ο ν ε π ό μ ε ν ο κ ύκλο μ ετα φ ο ρ ά ς του μ ετά λλου. Η π ρω τεΐνη Sco, ό π ω ς θ α α ν α λ υ θ εί εκτενέστερα π α ρ α κ ά τω, εμ φ α νίζει α να δ ίπ λ ω σ η ό μ ο ια μ ε αυτή τω ν ο ξειδ ο α να δ ω γικ ώ ν π ρ ω τεϊνώ ν θ ειρ οδοξινώ ν (Trx). Ε πομ ένω ς, η S c o l μ π ο ρ εί ν α π α ίζει κ α τα λυτικ ό ρ ό λ ο σ τη ν σ υ να ρ μ ο γή της λειτουργικ ή ς C co, α ν ά γ ο ν τ α ς τη ν οξειδω μ ένη C o x l7 με σ κ οπό ν α επ α ν α φ έρ ει τη ν ικ α νότη τά της γ ια σωστή δέσμευση του μ ετά λλου, η ο π ο ία ε ίν α ι α π α ρ α ίτη τη γ ια τ η ν λ ειτ ο υ ρ γ ία της ως σ υ ν ο δ ό ς το υ χ α λ κ ο ύ. 20

29 9 Ε ναλλακτικά, η S c o l μ π ορεί ν α α νά γ ει τους δισ ουλφ ιδικ ούς δεσμούς στο κέντρο C ua της CcO, έτσι ώστε ν α γ ίνετα ι εφικτή η δέσμευση του μετάλλου α π ό τα κυστεΐνικά α μ ινοξέα το υ ένζυμ ου. 1.6 Η π ρ ω τεΐνη S c o l Η οικ ογένεια τω ν πρω τεϊνώ ν Sco είνα ι ευρέω ς δ ια δ ο μ ένη σε ό λ α τα βασίλεια * της ζωής. Στο γονιδ ίω μ α τω ν προκ α ρυω τικ ώ ν ο ρ γ α ν ισ μ ώ ν τα γ ο ν ίδ ια τω ν ένζυμ ω ν π ο υ π α ίρ ν ο υ ν μ έρος σε μ ια κ οινή μ ετα βολική ο δ ό β ρ ίσ κ οντα ι το ένα δ ίπ λα στο ά λλο, α π ο τελούν μ ια μ ο ν ά δ α και υ π ό κ ειντα ι σε κ ο ιν ό έλεγχο της έκφρασής τους. Η μ ο νά δ α αυτή ο νο μ ά ζετα ι ο π ερ ό νιο. Μ ελέτη εύρεσης γονιδ ιω μ ά τω ν κατέληξε πω ς ένα ς ή π ερισ σ ότερ οι α ντιπ ρ ό σ ω π ο ι της οικ ογένεια ς αυτής υ π ά ρ χ ο υ ν στα περισ σ ότερα βα κτη ρια κά κ α ι ευκαρυω τικά γονιδ ιώ μ α τα 69. Η μελέτη αυτή υπ οστη ρίζει ότι, σε κ ά π ο ια βακτήρια, δύο γ ο νίδ ια Sco β ρ ίσ κ οντα ι σε δ ιπ λ α νές θέσεις, ενώ στους ευκαρυω τικούς ο ρ γα νισ μ ο ύ ς υ π ά ρ χ ο υ ν δύο παρά λογες π ρω τεΐνες (π ρω τεΐνες π ο υ π ρ ο έρ χ ο ν τ α ι α π ό δ ιπ λα σ ια σ μ ό ενό ς κ ο ινού γ ο νιδ ίο υ ), οι S c o l κ α ι Sco2. Σ τα βακτη ριακά ο π ερ ό ν ια φ ά νη κ ε ότι ο ι S co π ρω τεΐνες σ υ νδ έο ν τ α ι σ υ χ ν ά μ ε ένζυ μ α του χα λκ ο ύ, γ ε γ ο ν ό ς π ο υ δηλώ νει πω ς εμ π λέκ ο ντα ι σ τη ν ω ρ ίμ α νσ η ή στην λειτουργία τω ν ενζύ μ ω ν αυτώ ν. Η π ο ικ ιλία σ το ν α ρ ιθ μ ό α λ λ ά και στη θέση εντοπισ μ ού τω ν γ ο νιδ ίω ν Sco υ π ο δ εικ νύ ει ότι τα γ ο ν ίδ ια α υ τά κ α τευ θ ύ νο υ ν και ά λλες λειτουργίες π έρ α α π ό τη ν μ ετα φ ορά του χ α λ κ ο ύ στο κ έντρ ο C ua. Α π ό τ η ν α νά λ υ σ η αυτή π ροέκυψ ε, επίσης, μ ια συσχέτιση μεταξύ της Sco και του κ υτοχρ ώ μ ατος c, το ο π ο ίο λειτουργεί ως δότη ς η λεκ τρονίω ν γ ια π ο λ λ ά ένζυ μ α χα λκ ού. Ό π ω ς θα α να λ υ θ εί παρακάτω, η Sco είνα ι π ιθ α ν ό να συμμετέχει σε α ντιδ ρ ά σ εις α να γ ω γή ς τω ν δισ ουλφ ιδικ ώ ν δεσμώ ν του κ έντρ ου C u a π ρ ιν τη ν εισαγω γή του χα λκ ο ύ σε α υτό. Ό π ω ς π ρ οα να φ έρ θ η κ ε, στα π ροκ α ρυω τικ ά γονιδ ιώ μ α τα δ εν α π α ντά τα ι ο μ ό λ ο γ η πρω τεΐνη της σ υ νο δ ο ύ C o x l7. Α π ό τη ν ίδια μελέτη βρέθηκε πω ς κ ά π οιες πρω τεΐνες Sco σ χετίζοντα ι με τη ν H y p l, μια πρω τεΐνη η 21

30 ο π ο ία έχει έ ν α μ ο τίβ ο π λ ο ύ σ ιο σε μ εθ ειο νίνες π ο υ ενδ εχομ ένω ς σ υ μ μ ετέχουν στη δέσμευση του χα λ κ ο ύ. Ε ίνα ι π ιθ α ν ό ν, λ ο ιπ ό ν, στα βα κ τή ρ ια το ρ ό λ ο της C o x l7 ν α τ ο ν έχει η H y p l69. Η α νθ ρ ώ π ινη S c o l (H S co l) α π οτελείτα ι α π ό α μ ινο ξέα π ο υ μέσω ε ν ό ς δ ια μ εμ β ρ α νικ ο ύ τμ ή μ α τος σ υνδέετα ι στη ν εσωτερική μ εμ β ρ ά νη του μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ 70 (Σ χή μ α 10). Το C -τελικό ά κ ρ ο π ρ οεξέχει στο ενδ ο μ εμ β ρ α νικ ό χώ ρ ο (IM S) κ α ι α π οτελεί τη λειτουργικ ή διαλυτή π ερ ιοχή της π ρω τεΐνη ς S c o l. * Σ χ ή μ α 10: Η π ρ ω τ ε ΐν η S c o l σ τ ο ν ά ν θ ρ ω π ο ( H S c o l ). Δ ι α κ ρ ί ν ε τ α ι τ ο δ ια λ υ τ ό - λ ε ιτ ο υ ρ γ ικ ό τ μ ή μ α τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς κ α ι τ ο Ν - τ ε λ ικ ό ά κ ρ ο τ ο ο π ο ίο β ρ ίσ κ ε τ α ι σ τ η ν ε σ ω τ ε ρ ικ ή μ ε μ β ρ ά ν η τ ο υ μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ίο υ. Μ ε α νά λ υ σ η τη ς π ρ ω τεϊνικ ή ς α κ ο λ ο υ θ ία ς π ρ οσ δ ιορίσ τη κ ε η π ερ ιοχή, C x x x C, η ο π ο ία δια τη ρείτα ι σε ό λ ες τις μ ιτο χ ο νδ ρ ια κ ές Sco π ρω τεΐνες καθώ ς κ α ι σε όλες τις βακτη ρια κ ές ο μ ό λ ο γ ές τους. Η π ερ ιο χή αυτή α ποτελεί χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ό μ ο τίβ ο δέσ μ ευσης μ ετά λλου. 22

31 Ρ Π ειράματα σ τον ζυμομύκητα δ ε ίχ ν ο υ ν πω ς οι δύο κυστεΐνες της α κ ολουθία ς C xxxc είν α ι α παραίτητες γ ια τη ν λ ειτουργία της πρω τεΐνη ς71. Τα αποτελέσματα αυτά σε σ υ νδ υ α σ μ ό με δ εδ ο μ ένα φ α σ μ α τοσκοπ ία ς ακτίνω ν-χ και N M R κ α τα λ ή γουν στο σ υμ π έρ α σμ α ότι ο ι υπ οκ α τα στά τες του Cu(I) είν α ι οι δ ύ ο κυστεΐνες του μ οτίβου C xxxc κ α ι μ ια ιστιδίνη οτο C- τελικό ά κ ρ ο 72. HSco1:l MTS(-40aa) TM(-IOaa) Soluble fragment LAfTFAHjGAlLA GMK.. EKA.MIG. CPXXCP...JOB Σ χ ή μ α 1 1: Δ ιά γ ρ α μ μ α τ η ς α κ ο λ ο υ θ ία ς τ η ς H S c o l. Η μ ι τ ο χ ο ν δ ρ ια κ ή α κ ο λ ο υ θ ία ( M T S ), η δ ια μ ε μ β ρ α ν υ α ] έ λ ικ α ( Τ Μ ) κ α ι τ ο δ ια λ υ τ ό τ μ ή μ α τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς, ό π ο υ ε ν τ ο π ίζ ε τ α ι η α κ ο λ ο υ θ ία C P X X C P. Για τη ν καλύτερη κ α τα νόη σ η του ρ ό λ ο υ τω ν μ ελώ ν της ο ικ ο γένεια ς τω ν Sco π ρω τεϊνώ ν π ροσδιορίστη κε στο π α ρ ελ θ ό ν η κρυσταλλική δομ ή της C -τελικής διαλυτής π ερ ιοχή ς της π ρω τεΐνη ς S c o l σ το ν ά νθ ρ ω π ο (H S co l) (Σ χή μ α 12)72. S c o L o o p Σ χ ή μ α 12: Κ ρ υ σ τ α λ λ ικ ή δ ο μ ή τ η ς δ ια λ υ τ ή ς π ε ρ ιο χ ή τ η ς H S c o l

32 Η συνολική αναδίπλωση της Scol παρουσιάζει πολλές ομοιότητες με αυτή της οικογένειας των θειορειδοξινών (Τγχ) και υπερ-οξειδασών (Pdx), παρά την, χαμηλή ομολογία (~20%)72σας αλληλουχίες των πρωτεϊνών αυτών (Σχήματα 13 και 14). SCO]: -GPFSLTTHT-. - MTDKD-Y LGQvJLLl V 164 PDX2: -PDFKATAWDGAFKEVKLSDYKGKYWLFF S. L K. «j l. 5C01: ΤΤΗΓ-^ν PEELEKMTQWDEIDSI7Tl?I: J55 PDX2: Vi'LDi 'IFVPTEIIAFSNRAEDFRKLG... t t i. v., a.: SC01: LTPLFfSlDPER'TKEAIAHYVXEFSPK PDX2: CE^VWJS^ELWItmXEGGLGFlK l>*. t f l. f,l SCOl! LVGLT0-TREEVDQVARAYRVYYSPGPKDEDE253 mix?: 1PLLADVT... HRLSEOYGVl.K'l D3... IliJ J* J1 SC01: SDYIVL T1IHYLIGPDGEFLDYF30HK PDX2:... GI AYGLF11 DGKGVliRQITVNDLFVG tc. SCC1:.RKGEIAAS1ATHMHPYRKKS 301 PDX2: SSVDEALRLWOYTDEHGEV Σ χ ή μ α 1 3: Υ π έ ρ θ ε σ η α κ ο λ ο υ θ ία ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν S C O l κ α ι P d x σ τ ο ν ά ν θ ρ ω π ο. 72 hscol Ρ γχ Τ γχ 4. Lxltet m >tc I Σ χ ή μ α 1 4 : Σ ύ γ κ ρ ισ η δ ο μ ώ ν τ ω ν S c o l, P r x κ α ι T r x π ρ ω τ ε ϊν ώ ν. Ο ι τ ρ ε ις δ ο μ έ ς ε μ φ α ν ίζ ο υ ν τ ο π υ ρ ή ν α τ η ς θ ε ιρ ε δ ο ξ ίν η ς α λ λ ά η S c o l κ α ι η Ρ γ χ π ε ρ ιέ χ ο υ ν κ ι ε π ιπ λ έ ο ν δ ε υ τ ε ρ ο τ α χ ή δ ο μ ικ ά ο τ ο ιχ ε ΐα κ α ι β ρ ό γ χ ο υ ς

33 Μ ετά α π ό υπέρθεση τω ν δραστικώ ν π ερ ιο χώ ν (core elem en ts) τω ν π ρω τεϊνώ ν διαπιστώ θηκε πω ς ο ι κυστεΐνες του μ οτίβου C xxxc της Sco βρίσ κ οντα ι σε α νά λ ο γες π εριοχές με αυτές τω ν κυστεΐνώ ν του ενερ γ ο ύ κ έντρ ου, C xxc, τω ν Τ γ χ κ α ι ά λλω ν οξειδ οα να γω γα σ ώ ν (Σ χή μ α 15)72. Σ χ ή μ α 1 5: Σ ύ γ κ ρ ισ η σ τ ε ρ ε ο δ ια γ ρ α μ μ σ τ ω ν τ ω ν ε ν ε ρ γ ώ ν κ έ ν τ ρ ω ν τ ω ν T r x, H S C O l, κ α ι P rx. Ο ι C y s τ ο υ μ ο τ ίβ ο υ C X X X C τ η ς S c o β ρ ίσ κ ο ν τ α ι σ τ ις ίδ ιε ς θ έ σ ε ις μ ε τ ι ς C y s τ ο υ μ ο τ ίβ ο υ C X X C τ η ς Τ γ χ κ α ι μ ε τ ις C y s κ α ι T h r τ ο υ ε ν ε ρ γ ο ύ κ έ ν τ ρ ο υ τ η ς P rx. Ο ι αξιοσημείω τες δομικές ομοιότητες μεταξύ τω ν π ρ ω τεϊνώ ν H S c o l και Τ γ χ, και κυρίω ς η θέση τω ν ενερ γ ώ ν κυστεΐνώ ν, υ π ο δ η λ ώ ν ο υ ν πω ς π ιθ α ν ό ν η H S col δ εν π α ίζει το ρ όλο της σ υ ν ο δ ο ύ του χ α λ κ ο ύ (chaperone), α λ λ ά συμμετέχει, ως ένζυ μ ο κ ατάλυσης της α ν α γ ω γ ή ς στο κύτταρο. Π α ρ ό λ α αυτά, τα δ εδ ο μ ένα φ α σ μ α τοσκοπ ικ ώ ν α να λ ύ σ εω ν επ ιβ εβ α ιώ νο υ ν ότι η S c o l δεσμεύει χα λκ ό. Λ όγω τω ν α π οτελεσμάτω ν α υτώ ν δ η μ ιο υ ρ γ ο ύ ντα ι κρίσιμα ερω τήματα γ ια τ ο ν ακριβή ρ ό λ ο της πρω τεΐνη ς S c o l. Η συμ μετοχή της S c o l στη μ ετα φ ορά του χ α λ κ ο ύ στο σ ύ μ π λ ο κ ο της C co π αρατη ρήθηκε γ ια πρώ τη φ ο ρ ά σε σειρές κυττάρω ν του Saccharom yces cerevisiae α π ο υ σ ία του γ ο νιδ ίο υ της μ ιτοχονδ ρ ια κ ή ς σ υ νο δ ο ύ του χα λ κ ο ύ C o x l7, το ο π ο ίο είχε α ρνητική επ ίδραση σ τη ν δραστικότητα της C co

34 Π α ρ ο υ σ ία υ ψ η λ ή ς συγκέντρω σης χα λ κ ο ύ, ή υπερέκ φ ρ αση της S c o l επ α νέφ ερ ε τη ν ομ α λή λ ειτουργ ία της CcO. Π ειρ ά μ α τα σε ευκαρυω τικ ά. κ ύττα ρ α με έλλειψ η του γ ο ν ιδ ίο υ S c o l φ α νερ ώ νο υ ν επίσης α δ ρ α νοποίη σ η του ενζύ μ ο υ C co. Σ τη ν περίπτω ση αυτή, περίσσεια χα λ κ ο ύ ή /κ α ι υπερέκ φ ραση τω ν C o x l7 δ εν α π ο κ α θ ισ τού ν τη ν φ υσιολογικ ή κατάσταση. Το α π οτέλεσ μ α α υτό δη λώ νει πω ς η ενερ γοποίη σ η του ενζύ μ ο υ C co εξα ρτά τα ι α π ό λ υ τα α π ό τ η ν S c o l η ο π ο ία δρά σε ένα επ ό μ ενο στά διο α π ό τη ν C o x l7. Μ άλιστα, μελέτες in vitro επ ιβ εβ α ιώ ν ο υ ν πω ς η S c o l π ρ ο σ λ α μ β ά νει χ α λ κ ό α π ό τη ν C o x l7. Η μ ετα φ ο ρ ά του χα λ κ ο ύ α π ό τη ν S c o l α ποκ λειστικ ά στο κ έντρ ο C u a της υ π ο μ ο ν ά δ α ς COXII βασίζετα ι σε π ειρ ά μ α τα σ η μ εια κ ώ ν μ ετα λλά ξεω ν στη ν π ρω τεΐνη S c o l του ζυ μ ομ ύ κ η τα (S co lp ). Τ α π ειρ ά μ α τα α υ τά α π ο δ ετκ νύ ο υ ν φ υσική α λλη λεπ ίδ ρ α σ η κ α ι ο μ ο λ ο γ ία στην α κ ο λ ο υ θ ία τω ν δραστικ ώ ν π ερ ιο χ ώ ν τω ν S c o lp και C ox2p72' Υ π ο λ ο γ ισ μ ο ί Δ ο μ ή ς μ ε Φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία Π υ ρ η ν ικ ο ύ Μ α γ ν η τικ ο ό Σ υ ν το ν ισ μ ο ύ τ η ς H S c o l το υ α ν θ ρ ώ π ο υ Μ ε τη χρήση της φ α σ μ α τοσκοπ ία ς Π υ ρ η νικ ο ύ Μ α γνη τικ ού Σ υ ντονισ μ ο ύ (N M R ) π ρ οσδιορίσ τη κ ε η τρισδιάστατη δομ ή της δ ια λυτή ς π ερ ιο χ ή ς της ελεύθερης μ ο ρ φ ή ς της π ρω τεΐνη ς του α νθ ρ ώ π ο υ (apo H S c o l) καθώ ς κ α ι της σ υ μ π λ ο κ ο π ο ιη μ ένη ς μ ο ρ φ ή ς μ ε χα λ κ ό (C u (I)H S col) (Σ χή μ α 16)74. Ο π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς της δ ομ ή ς της πρω τεΐνη ς σε σ ύ μ π λ ο κ ο μ ε το μ έτα λλο ε ίν α ι α π οφ α σ ισ τικ ή ς σ η μ α σ ία ς γ ια τη ν κ α τα νόη σ η του μ η χ α ν ισ μ ο ύ της εισ α γω γή ς του χα λ κ ο ύ στη C co με τη μ εσολά βηση της π ρω τεΐνη ς Sco. Η οξειδω μ ένη μ ορφ ή της π ρω τεΐνη ς π α ρ ο υ σ ιά ζει μικρή σ υ γ γ ένεια γ ια τ ο ν χ α λ κ ό, όπ ω ς α π ο δ εικ νύ ετα ι α π ό τα φ ά σ μ α τα H SQ C Ή - 15Ν της οξειδω μένης a p o H S co l κ α ι α π ό τα δ εδ ο μ ένα φ α σ μ α τοσκοπ ία ς μ ά ζα ς ESI-MS. Ε πομένω ς, τα π ειρ ά μ α τα π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ο ύ δ ο μ ή ς έ γ ιν α ν σε δ είγ μ α π ρω τεΐνη ς το ο π ο ίο π ρ ο η γ ο υ μ ένω ς είχε α να χθ εί με κ α τά λλη λο α ν α γ ω γ ικ ό α ντιδραστή ρ ιο. 26

35 Η τρισδιάστατη δομή δείχνει πω ς η ελεύθερη μ ορφ ή π α ρ ο υ σ ιά ζει μ ια α τα ξία γύρω α π ό τη ν π εριοχή δέσμευσης του μ ετά λλου. Η πρω τεΐνη υφ ίσταται α λλα γή σ τη ν διαμόρφ ω ση μ ετά τη δέσμευση το υ μ ετά λλου. Τα στοιχεία N M R επ ιβ εβ α ιώ νο υ ν ότι ο ι υποκαταστάτες του Cu(I) ε ίν α ι η C ys-169, η C ys-173 της π ερ ιοχή ς CPXXC στο β ρ ό γ χ ο 3 κ α ι η H is-260 στο β ρ ό γ χ ο 8. Σ την δομή N M R της ελεύθερης μ ο ρ φ ή ς της π ρω τεΐνη ς ο β ρ ό γ χ ο ς 8 ί:μ φ α νίζετα ι σε μ ια α νοιχτή και δια μ ορ φ ω τικ ά ευκίνητη κατάσταση, υ π ο δ εικ νύ ο ντα ς πω ς η δέσμευση του μ ετά λλου "παγώνει" τ ο ν β ρ ό γ χ ο α υ τό σε μ ια π ιο άκαμπτη διαμόρφω ση η ο π ο ία είνα ι σ ημαντική γ ια τη δ ια δ ικ α σ ία δέσμευσης του μετάλλου. Σ χ ή μ α 16: Τ ρ ισ δ ιά σ τ α τ ε ς δ ο μ έ ς τ η ς ε λ ε ύ θ ε ρ η ς μ ο ρ φ ή ς S c o l κ α ι τ η ς μ ο ρ φ ή ς C u ( I) - S c o l. Α π ε ι κ ο ν ί ζ ο ν τ α ι ε π ίσ η ς ο ι τ ρ ε ις υ π ο κ α τ α σ τ ά τ ε ς τ ο υ μ ε τ ά λ λ ο υ κ α ι η π ρ ο σ έ γ γ ισ η τ ω ν υ π ο κ α τ ά σ τ α τ ω ν σ τ η ν π ε ρ ίπ τ ω σ η ε ισ α γ ω γ ή ς τ ο υ C u ( I )

36 Ε ιδικότερα, η π α ρ ο υ σ ία της H is ως υποκαταστάτη στο β ρ ό γ χ ο 8 είνα ι σημαντικ ή για τί π ρ ο σ α ρ μ ό ζει τ η ν διαμορφ ω τική κατάσταση του β ρ ό γ χο υ 8ί α ν ά λ ο γ α με το α ν η πρω τεΐνη βρίσκεται σ τη ν σ υ μ π λοκοπ ο ιη μ ένη ή στην ελεύθερη μ ορφ ή. Λ α μ β ά ν ο ν τ α ς υ π ό ψ η ότι μη ο ρ γ α νω μ ένες π ερ ιο χές στις δ ομ ές σ υ χ ν ά π ρ ο κ α λ ο ύ ν α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εις μεταξύ τω ν π ρ ω τεϊνώ ν, ο β ρ ό γ χ ο ς 8 π ιθ α ν ό ν α ρ υθμίζει τέτοιου είδ ο υ ς α λλη λεπ ιδράσεις μεταξύ της H S c o l κ α ι της σ υ ν ο δ ο ύ του C u(i), C o x l7. Η δ η μ ιο υ ρ γία του σταθερού σ υ μ π λ ό κ ο υ C u (I)H S co l α π οτελεί ίσω ς τη ν σημαντικ ή κ α τευ θυντή ρ ια δ ύ να μ η γ ια τη ν μ ετα φ ο ρ ά του χα λ κ ο ύ α π ό τη ν C o x l7 στη ν H S co l. Τ α μ έχρ ι σ τιγμ ή ς δ εδ ο μ ένα α π ο κ α λ ύ π τ ο υ ν πω ς η μ ετα λλοπ ρω τεΐνη H S c o l δ η μ ιο υ ρ γ εί σ ύ μ π λ ο κ ο 1:1 με τα ιό ντα του C u(i), το ο π ο ίο επ ιβ εβ α ιώ νει ότι η H S c o l έχει ρ ό λ ο μ ετα φ ο ρ έα του μ ετά λλου. Ό λ α α υ τά τα στοιχεία επ ιβ εβ α ιώ ν ο υ ν ότι η H S c o l β οη θ ά σ τη ν εισ α γω γή του χα λ κ ο ύ στο κ έντρ ο C u a, α λ λ ά α φ ή ν ο υ ν α ν ο ιχ τ ό το ενδ εχόμ ενο μ ια ς π ολυλειτουργικ ότη τα ς της π ρω τεΐνη ς. Ε ξά λλου, όπ ω ς ήδη α να φ έρ θ η κ ε, έρ ευ να γ ο νιδ ιω μ ά τω ν έδω σε σ η μ α ντικ ές π λ η ρ ο φ ο ρ ίες γ ια ό λα τα δια θέσ ιμ α π ρ οκαρυω τικ ά συστήματα. Η μελέτη αυτή φ α νέρ ω σ ε τη ν π α ρ ο υ σ ία π ο λ λ ώ ν Sco π ρ ω τεϊνώ ν δ ίπ λ α σε π ρ ω τεΐνες του χα λ κ ο ύ κ α ι/ή ο ξειδ ο α να γ ω γ ικ ές ιίρω τεΐνες, υ π ο δ εικ ν ύ ο ντα ς ότι ο ι Sco ε ίν α ι δ υ ν α τ ό ν ν α σ υ μ μ ετέχουν σε δ ιά φ ο ρ ες φ υ σ ιο λογικ ές δια δ ικ α σ ίες εκτός της μ ετα φ ο ρ ά ς του χα λκ ού. 1.7 Η π ρ ω τ εΐν η Sco2 Σ το ν ά νθ ρ ω π ο α π α ντά τ α ι ένα δεύτερο γ ο ν ίδ ιο Sco το ο π ο ίο κ ω δικ οπ οιεί μ ια π ρω τεΐνη υ ψ η λ ή ς ο μ ο λ ο γ ία ς με τη ν S c o l, τη ν Sco2 (>50%). Η α νθ ρ ώ π ινη Sco2 (H Sco2) είνα ι κ α τά 35 α μ ινο ξέα μικρότερη της S c o l λόγω μ ικ ρ ότερ η ς π ερ ιο χή ς στη μ ή τρα του μ ιτ ο χ ο νδ ρ ίο υ (Σ χή μ α 17)75'76. Σ τη ν Sco2 δια τη ρείτα ι το μ ο τίβ ο C xxxc P, α λ λ ά ο ρ ό λ ο ς της π α ρ α μ ένει μ έχρ ι στιγμής α διευκ ρίνισ τος. 28

37 9 Δομική υπέρθεση τω ν S c o l και Sco2 του ζυμ ομ ύκητα κ α ι α νθ ρ ώ π ο υ έδειξε ότι έχ ο υ ν τη ν μεγαλύτερη ομ οιότη τα σ τη ν κεντρική π εριοχή (core) μεταξύ της G Iy-102 και G ly-242 της α νθ ρ ώ π ινη ς Sco2, ό π ο υ σ υ μ π ερ ιλ α μ β ά νοντα ι ο ι υποκατάστατες C ys-133, C ys-137 και H is-224. Σ τη ν π εριοχή αυτή η αμινοξικ ή ο μ ο λ ο γ ία μεταξύ τω ν δ ύ ο α νθ ρ ω π ίνω ν π ρω τεϊνώ ν (56%) είνα ι μικρότερη α π ό αυτή μεταξύ τω ν π ρω τεϊνώ ν στο ζυμ ομ ύκ η τα (73%). SC01 ftjts: sscol C xxxc C xxxc Sco2 MIS jjjj CxxscC ssco2 CxxxC Σ χ ή μ α 1 7 : Δ ιά γ ρ α μ μ α τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ικ ώ ν α κ ο λ ο υ θ ιώ ν τ ω ν S c o l κ α ι S c o 2 σ τ ο ν ά ν θ ρ ω π ο. M T S, ο ι μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ια κ έ ς α λ λ η λ ο υ χ ίε ς, Τ Μ, ο ι δ ια μ ε μ β ρ α ν ικ έ ς έ λ ικ ε ς, C X X X C, τ ο μ ο τ ίβ ο δ έ σ μ ε υ σ η ς. Ο ι δ ια λ υ τ έ ς π ε ρ ιο χ έ ς σ υ μ β ο λ ίζ ο ν τ α ι μ ε s S c o l κ α ι ss c o 2. Σε αντίθεση με τη ν περίπτω ση τη ς S c o l, μ ετα λλά ξεις τω ν γ ο ν ιδ ίω ν της Sco2 δ εν α κ υ ρ ώ νο υ ν τη ν λ ειτουργία του ενζύ μ ο υ C co. Σε μ ετα λ λ α γ μ ένα κύτταρα S c o lp (κύτταρα ζυμ ομ ύκητα ), ό τ α ν το C -τελικό ά κ ρ ο της πρω τεΐνη ς αντικατασταθεί α π ό το α ντίσ τοιχο τμ ή μ α της Sco2p, η π ρ ο κ ύ π τουσα πρω τεΐνη είνα ι λειτουργική κ αι επιτρέπει τ η ν σωστή α να π νευ σ τικ ή λ ειτουργία 76. Η έκφραση της Sco2 σε μ ετα λ λ α γμ ένα κύττα ρα C O X 17 επ α να φ έρ ει τη ν ομαλή λειτουργία του ενζύ μ ο υ της οξειδάσης του κ υτοχρ ώ μ α τος c, α λ λ ά ό χ ι σε μ ετα λ λ α γμ ένα κύτταρα S c o l26'77, υ π ο δ η λ ώ νο ντα ς ότι ο ι δ ύ ο αυτές ο μ ό λ ο γ ες π ρω τεΐνες έχ ο υ ν σ υνερ γικ ές α λ λ ά ό χ ι τις ίδιες ακριβώ ς λειτουργίες. Α ξίζει ν α σημειω θεί πω ς φ α σ ματοσκοπ ικ ές μελέτες τω ν πρω τεϊνώ ν α υτώ ν α π ό τον ά νθ ρ ω π ο, το ν ζυμ ομ ύκητα και το ν βακτη ριακό ο ρ γ α ν ισ μ ό Bacillus subtilis % υ π ο δ εικ ν ύ ο υ ν ότι και οι δύο πρω τεΐνες, S c o l/2, δ εσ μ εύ ουν Cu(I) και Cu(II) και η λειτουργία τους εξαρτάται α π ό τη δέσμευση τω ν ιό ντω ν αυτώ ν. Α ντικατάσταση σε κύτταρα α σ θ ενώ ν τω ν α μ ινο ξέω ν C ys και H is, π ου > δ εσ μ εύ ουν χ α λ κ ό, με α λ α ν ίν ες δ εν ο δ η γ ο ύ ν σε ομ α λή λειτουργία του ενζύ μ ο υ CcO. 29

38 Μ έχρ ι σ τιγμ ή ς δ εν είνα ι α π ό λ υ τα σαφ ές πώ ς "συνεργάζονται" ο ι δύο αυτές ο μ ό λ ο γ ες πρω τεΐνες στη ν π ο ρ εία του χα λ κ ο ύ π ρ ο ς το ένζυ μ ο της οξειδά σ η ς του κ υτοχρ ώ μ α τος c. Για π ο ιο λ ό γ ο σ υ ν υ π ά ρ χ ο υ ν ο ι δ ύ ο αυτές ο μ ό λ ο γ ες Sco πρω τεΐνες στα θηλαστικά; Σ υ μ μ ετέχο υ ν ά μ εσα στη μ ετα φ ορά του χ α λ κ ο ύ α π ό τη ν C o x l7 σ τη ν υ π ο μ ο ν ά δ α CoxII ή β ο η θ ο ύ ν στην δ ια δ ικ α σ ία αυτή μέοω α να γ ω γ ή ς τω ν κ υστεΐνω ν του μ ο τίβ ο υ C xxxc του κ έντρ ου C ua ; Σ υ μ π ερ α ίνο υ μ ε π ω ς η μ ετα φ ο ρ ά το υ χ α λ κ ο ύ α π α σ χο λ εί έ ν α σύνθετο μ ο ρ ια κ ό μ η χ α ν ισ μ ό ο ο π ο ίο ς α π α ιτεί περαιτέρω εξέταση. 1.8 Σ ο σ χ έ τ ι σ η τ ο υ χ α λ κ ο ύ μ ε α ν θ ρ ώ π ι ν ε ς α σ θ έ ν ε ι ε ς Ό π ω ς ήδη α να φ έρ θ η κ ε, ο χ α λ κ ό ς ε ίν α ι α π α ρ α ίτη το σ τοιχείο γ ια τη λ ειτ ο υ ρ γ ία κ ά π ο ιω ν ενζύ μ ω ν, όπω ς η λυσινικ ή οξειδά ση, η ο ξ ε ιδ ά σ η τ ο υ κ υ τ ο χ ρ ώ μ α τ ο ς c, η υπεροξειδικ ή δισ μ ουτά σ η, η ντοπαμινικ ή β-υδροξυ λάση κ.α. Ε ίνα ι α ν α μ ε ν ό μ ε ν ο ότι μ ετα βολές σ τη ν ομ οιόσ τα ση του χ α λ κ ο ύ ο δ η γ ο ύ ν σε σ φ ά λ μ α τ α του μ ετα β ολισ μ ού κ αι σ τη ν κ α τα στροφ ή τω ν κ υττά ρ ω ν με α π ο τέλεσ μ α π α θ ο λ ο γ ικ ές καταστάσεις. Τ όσο η ένδ εια, όσο κ α ι η π ερίσ σ εια.1 χ α λ κ ο ύ σε α να π τ υ σ σ ό μ ενο υ ς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς μ π ο ρ εί ν α α π ο β εί θ α να τη φ ό ρ α, λ ό γω τ α υ τ ό χ ρ ο ν ω ν επ ιδράσεω ν σε π ο λ λ α π λ ά ό ρ γ α ν α εξα ιτίας μ ειω μένη ς δ ρ α στικ ότη τα ς τω ν ενζύ μ ω ν-χα λ κ ο ύ. Δ ύ ο σ τενά σ χετιζόμενες δ ια τα ρ α χές του χ α λ κ ο ύ σ υ νδ εδ εμ ένες μ ε το χ ρ ω μ ό σ ω μ α X είνα ι γνω στές: η α σ θ ένεια M en k es και η α σ θ ένεια W ilso n 78,79. Κ αι στις δ ύ ο περιπτώ σεις μ ετα λ λ α γές σε δ ύ ο ο μ ό λ ο γ ες πρω τεΐνες π ο υ μ ετα φ έρ ο υ ν τ ο ν χ α λ κ ό (οι Α ΤΡ7Α κ α ι ΑΤΡ7Β) κ α ι εντοπ ίζο ν τα ι επιλεκτικά σε δ ια φ ο ρ ετικ ο ύ ς ιστούς, ο δ η γ ο ύ ν είτε σ τη ν μείω ση είτε σ τη ν υπερσυγκ έντρω ση του χ α λ κ ο ύ στα κύττα ρα. Η α σ θ ένεια του M en k es ε ίν α ι μ ια θ α να τη φ ό ρ ο ς δ ια τα ρ α χή οφ ειλόμ ενη σε έλλειψ η χα λ κ ο ύ, σ υ νδ εό μ ενη μ ε το γ ο ν ίδ ιο X, λόγω μ ετα λ λ α γώ ν π ο υ επ η ρ εά ζο υ ν το γ ο ν ίδ ιο του M en k es (Μ Ν Κ )80, ενώ τα ά τομ α π ο υ π ά σ χ ο υ ν α π ό 3 0

39 την ασθένεια W ilson εμ φ α νίζο υ ν συσσώ ρευση χα λ κ ο ύ στο συκώ τι και στον εγκέφ αλο. Ε πιπ λέον, κ ά π ο ια π ο λ ύ ενδ ια φ έρ ο ντα π ρ όσ φ α τα ευρήματα σ υ νδ έο υ ν τη δια ταραχή της ομ οιόστα σης του χ α λ κ ο ύ με κ ά π οιες νευροεκφ υλιστικ ές ασθένειες, όπω ς είνα ι η νό σ ο ς του Α λτσ χά ιμ ερ (A D ), η ν ό σ ο ς Κ ρόιτοφ ελντ Γ ιάκομπ, η ν ό σ ο ς του Π ά ρ κ ινσ ο ν (PD ) κ α ι η ν ό σ ο ς τη ς Π λευρικ ή ς Α μ υοτροφ ικ ής Σκλήρω σης (ALS)81. Α υτές ο ι δια τα ρ α χές μ π ο ρ ο ύ ν ν α τα ξινο μ η θ ο ύ ν ως «δομικές», υ π ό τ η ν έ ν ν ο ια ότι όλες ε μ φ α ν ίζ ο υ ν ως ξεχω ριστό χαρακτηριστικό δ ο μ ικ ά μ ετα λ λ α γμ ένες πρω τεΐνες, ο ι οπ οίες μ ετουσ ιώ νοντα ι και μ π ο ρ εί ν α ευ θ ύ νο ν τα ι γ ια τη ν κ α τα σ τροφ ή τω ν κύτταρώ ν. Ο ι μ ορια κ οί μ η χα νισ μ ο ί π ο υ ο δ η γ ο ύ ν σ τ ο ν εκ φ υ λισ μ ό τω ν νευρικ ώ ν ιστώ ν σε όλες αυτές τις ασθένειες π α ρ α μ έ ν ο υ ν α κ όμ η ά γνω στοι. Π αρ' ό λ α αυτά, το οξειδω τικό στρες π ο υ π ροκαλείτα ι α π ό τη δράση του μετάλλου, θα μ π ορούσε ν α π υροδοτή σ ει μ ία σειρά α π ό δ ια δ ο χ ικ ά γ εγονό τ α, σ υ μ π ερ ιλα μ β α νομ ένη ς και της μ ιτο χ ο νδ ρ ια κ ή ς δ υ σ λειτουργία ς, π ου ευ θ ύ νο ντα ι για το θ ά να το τω ν κυττάρω ν. Έ να ς μ εγά λ ο ς α ρ ιθ μ ό ς α π οδείξεω ν επ ιβεβαιώ νει το ρ όλο π ο υ δ ια δ ρ α μ α τίζει η συσσώ ρευση το υ μ ετά λλου στο γ η ρ α σ μ ένο εγκέφ αλο, ως τ ο ν π ρω τα ρ χικ ό ή το υ λ ά χ ισ το ν ως έ ν α ν συμ πλη ρω ματικό π α ρ ά γ ο ν τ α σ τη ν α ιτιο λ ο γ ία τω ν δ ια τα ρ α χώ ν του εκφ υλισ μού τω ν νευ ρ ικ ώ ν κυττάρω ν, ο ο π ο ίο ς εκ φ υ λισ μ ός ε ίν α ι τυ π ικ ός στην π ρ οχω ρ η μ ένη ηλικία, κυρίω ς στη ν ό σ ο του Α λτσ χά ιμ ερ κ α ι του Π ά ρ κ ινσ ο ν. Για π α ρ ά δ ειγ μ α, η π ρ ό δ ρ ο μ ο ς α μ υλοειδή ς πρω τεΐνη (ΑΡΡ) κ α ι η π ρ ω τογενή ς πρω τεΐνη Prion, ο ι οπ οίες μ ετα λλά σ σ οντα ι στις α σθένειες Α λτσ χά ιμ ερ κ α ι στις Σ π ο γγώ δ εις εγκεφ αλοπάθειες, είνα ι κ αι ο ι δύο π ρω τεΐνες της μ εμ β ρ ά νη ς του εγκ εφ ά λου, οι ο π ο ίες εμ φ α ν ίζο υ ν κ οινές π ερ ιοχές δέσμευσης του χ α λ κ ο ύ στην Ν -τελική π ερ ιο χή 82. Το γ ε γ ο ν ό ς αυτό, σε σ υ νδ υ α σ μ ό μ ε ά λ λ α πειραματικ ά σ τοιχεία, οδή γη σ ε στο σ υμ π έρ α σ μ α ότι μ πορεί αυτές ο ι δ ύ ο π ρω τεΐνες ν α εμ π λ έκ ο ντα ι σ τη ν μ ετα φ ορ ά κ α ι στη ρύθμιση του χα λκ ού στη μ εμ β ρ ά νη του ^ νευ ρ ώ να 83. Η Α ΡΡ δεσμεύει τ ο ν C u (II) μέσω δ ύ ο ιστιδινώ ν, π ο υ δια τη ρ ούντα ι σε μ ια π ερ ιο χή π λούσια σε κυστεϊνες, κ α ι εμ φ α νίζει υψ ηλή δομική ομοιότητα 31

40 μ ε π ρ ω τεΐνες-σ υ νο δ ο ύ ς του χ α λ κ ο ύ 83. Η Α ΡΡ φ α ίνετα ι ν α α π οτελεί το ν δια μ ορφ ω τή -κ λειδί στη ν ομ οιόσ τα σ η του χ α λ κ ο ύ τω ν νευ ρ ώ νω ν, διότι η έλλειψ η της π ρω τεΐνη ς έχει ως α π οτέλεσ μ α τη μείω ση τω ν επ ιπ έδ ω ν χα λκ ού, ενώ η υπερσυγκ έντρ ω σή της έχει ως α π οτέλεσ μ α τη ν αύξηση τω ν επ ιπ έδω ν χ α λ κ ο ύ σ το ν εγκ έφ α λ ο τω ν π οντικ ώ ν. Σ τη ν Π λευρική Α μ υοτρ οφ ικ ή Σ κλήρω ση (ALS) ο ι μ ετα λλά ξεις στο γ ο ν ίδ ιο του μ ετα λ λ ο -ενζύ μ ο υ SO D 1 έ χ ο υ ν σ υνδεθεί με τη ν εξέλιξη της α σ θ ένεια ς84. Η χρήση τω ν χ η λ ικ ώ ν α ντιδραστη ρ ίω ν του χ α λ κ ο ύ ως θεραπευτική α γω γή επ ιβ ρ α δ ύ νει τη ν εξέλιξη του εκ φ υλισ μ ού, γ ε γ ο ν ό ς π ο υ δ είχ ν ει ότι το μ έτα λλο εμ φ α νίζει μ ία επ ιβ λαβή σ υ μ π ερ ιφ ο ρ ά ό τ α ν δ εν δεσ μ εύετα ι κ α τα λλή λω ς σ τη ν π ρω τεΐνη 84. Ε π ιπ λ έο ν, ο ι μ ετα λ λ α γ μ ένες μη α να δ ιπ λ ω μ ένες π ρω τεΐνες SO D 1 δ η μ ιο υ ρ γ ο ύ ν π ο λ υ μ ερ ή μ ικ ρ ώ ν α λυσίδ ω ν π ο υ σ χ η μ α τ ίζο υ ν συσσω ματώ ματα ό λο και μ εγα λύτερ ου μ ο ρ ια κ ο ύ βάρους, γ ε γ ο ν ό ς π ο υ τελικά οδηγεί σ το ν εκ φ υ λισ μ ό τω ν νευ ρ ικ ώ ν κυττάρω ν. Κ λινικές δοκ ιμ ές α π έδ ειξα ν ότι η στέρηση χ α λ κ ο ύ μέσω δ ια τρ οφ ή ς ή μέσω τω ν χη λικ ώ ν α ντιδ ρ α σ τη ρ ίω ν του χ α λ κ ο ύ μ ειώ νο υ ν τ η ν ικ α νότη τα τω ν κ α κ οη θ ώ ν ό γκ ω ν ν α π ρ ο κ α λ ο ύ ν μ ία α γγειο -γενετικ ή α ντίδ ρ α σ η Μ ε τ α λ λ α γ έ ς τ ω ν γ ο ν ι δ ί ω ν H S c o l / 2 π ο ο ο δ η γ ο ύ ν σ ε α σ θ έ ν ε ι ε ς σ τ ο ν ά ν θ ρ ω π ο Σ το ν ά νθ ρ ω π ο μ ία α π ό τις π ιο δ ια δ εδ ο μ ένες αιτίες δ υ σ λ ειτουργία ς της α να π νευ σ τικ ή ς α λ υ σ ίδ α ς ε ίν α ι η α νεπ ά ρ κ εια του ε ν ζύ μ ο υ οξειδά σ η ς του κ υ τοχρ ώ μ α τος c (CcO) η ο π ο ία σ υ νδ έετα ι μ ε π ο ικ ιλ ία κ λ ινικ ώ ν εικ όνω ν. Η β ιο γένεσ η της C co α π α ιτεί τ η ν σ υ νερ γ α σ ία δ ύ ο γονιδ ιω μ ά τω ν. Το μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ια κ ό D N A (m td N A ) κ ω δικ οπ οιεί τις τρεις μ εγα λύτερ ες υ π ο μ ο ν ά δ ες ( I, II, κ α ι III) ο ι ο π ο ίες και σ το ιχειο θ ετο ύ ν τ ο ν κ α τα λυτικ ό π υ ρ ή ν α του ενζύ μ ο υ. Το π υ ρ η νικ ό D N A (n D N A ) κ ω δικ οπ οιεί τις 10 μικρότερες υ π ο μ ο ν ά δ ε ς ο ι ο π ο ίες έχ ο υ ν κ υρίω ς ρυθμιστικό κ α ι δ ο μ ικ ό ρ όλο. Ε πίσης υ π ά ρ χ ει κ α ι ένα σ ύ ν ο λ ο πρω τεϊνώ ν-"συνεργατώ ν", ο ι οπ ο ίες ελ έ γ χ ο υ ν τη ν α να δ ίπ λ ω σ η τω ν π ο λ υ π επ τιδ ικ ώ ν α λ υ σ ίδ ω ν κ α ι τ η ν μ ετα φ ο ρ ά τω ν 32

41 Ρ προσθετικώ ν ομ ά δ ω ν στο ολοένζυμ ο. Π ιστεύεται πω ς η α νεπ ά ρ κ εια στο ένζυμ ο C co προκ ύπτει α π ό μετα λλα γές στις δομικές υ π ο μ ο ν ά δ ες του ενζύ μ ο υ ή στις βοηθητικές πρω τεΐνες π ο υ α π α ιτούντα ι γ ια τη σωστή λ ειτουργία του ενζύμ ου Μ έχρι σήμερα π α θ ο γ ό νες μετα λλά ξεις π ο υ α φ ο ρ ο ύ ν το ένζυ μ ο C co έχ ο υ ν π ερ ιγρ ά φ ει γ ια τέσσερα χρω μ οσω μ ικ ά γονίδ ια : S c o l, Sco2, C O X 1 0, και SU R F 186. Ο ι μεταλλάξεις αυτές έ χ ο υ ν ω ς επ α κ ό λ ο υ θ ο μ ια π ο ικ ιλ ία κ λινικ ώ ν φ α ινοτύπ ω ν. Ε ν τούτοις, σε κ ά π ο ιο υ ς α σθενείς η μοριακή βάση τω ν μεταλλάξεω ν π α ρ α μ ένει άγνω στη. Μ ελέτες έκφ ρασης έδ ειξα ν ότι ο ι πρω τεΐνες SU R F 1, S c o l, και Sco2 εκ φ ρ ά ζοντα ι περισσότερο σε ιστούς π λ ο ύ σ ιο υ ς σε μ ιτο χόνδ ρ ια, όπω ς καρδιά, σκελετικούς μύες, συκώ τι κ α ι νεφ ρ ό. Σ το ν εγκέφ α λο σ υ να ντά μ ε χα μ η λό επ ίπ εδ ο έκφ ρασης τω ν π ρω τεϊνώ ν σε σύγκριση με τους π ρ ο α να φ ερ ό μ ενο υ ς α ερ ό β ιο υ ς ιστούς. Π ιθ α ν ό ν η διαφορετική κλινική π α ρ ουσία σ η ν α σχετίζεται μ ε έ ν α δ ια φ ορετικ ό τρ ό π ο (pattern) έκφρασης τω ν γ ο νιδ ίω ν στο εμ βρυϊκ ό στάδιο. Η α νθ ρ ώ π ινη SURF1 είνα ι μ ια δ ια μ εμ β ρ α νικ ή π ρω τεΐνη 30 kd a στην εσωτερική μ ιτοχονδρια κ ή μ εμ βράνη. Η α κριβής λειτουργία της π α ρ α μ ένει άγνω στη, α ν και φ α ίνετα ι πω ς σ υ μ βάλλει στην σύνδεση της υ π ο μ ο ν ά δ α ς COX2 με τις υ π ο μ ο ν ά δ ες COX1, COX4 κ α ι COX5. Μ εταλλάξεις στο γ ο ν ίδ ιο SU R F 1 έχ ο υ ν ως αποτέλεσμα το σ ύ νδ ρ ο μ ο του L eigh σ το ν ά νθ ρ ω π ο, μια νευ ρ ο λογικ ή ασθένεια η ο π ο ία χαρακτη ρ ίζετα ι κυρίω ς α π ό νέκρω ση στα γ ά γ γ λ ια και σ το ν εγκ έφ α λο87. Μ εταλλάξεις τω ν γ ο νιδ ίω ν H S c o l και H S co 2 π ρ ο κ α λ ο ύ ν σοβαρή α νεπ ά ρ κ εια του ενζύ μ ου CcO και ο δ η γ ο ύ ν σε δια φ ορετικ ούς κ λινικ ούς φ α ινο τύ π ο υ ς88. Α ξιοσημείω το είνα ι ότι η ένα ρ ξη της νό σ ο υ γίνετα ι π ο λύ νω ρ ίς στη ζωή κ α ι χα ν ε ο γ ν ά κ α τα λ ή γ ο υ ν στο θ ά να το. Σ την Sco2 έχ ο υ ν 1 παρατη ρ η θεί τέσσερις σημειακές μ ετα λλά ξεις89'90 ( Ε140Κ, S225F, W 166R, L151P) π ο υ σ υ νδ έο ντα ι με υπερτροφ ική κ α ρ διομ υοπάθεια,,, εγκ εφ α λομ υ ο π ά θ εια και υ π ο το νία κατά τις πρώ τες μέρες ζω ής του νεο γ ν ο ύ, ενώ μ ία σημειακή μετάλλαξη (P174L)91 στους α σθενείς H S c o l δημιουργεί 33

42 η π α τοεγκ εφ α λ ο μ υ ο π ά θ εια, μ ια προοδευτικ ή βρεφική α σθένεια π ο υ επ ηρεά ζει κ υρίω ς το συκώτι. Μ ελετώ ντας τη ν πρώ τη περίπτω ση ο ικ ογένεια ς π ο υ εμ φ ά νισ ε πρώ ιμη ηπατική α νεπ ά ρ κ εια κ α ι νευ ρ ο λ ο γ ικ ή εμπλοκή, χα ρ τογρ α φ ή θ η κ ε η θέση 17ρ13.1 του χρω μ οσ ώ μ α τος υ π εύ θ υ νο υ γ ια τη ν α σ θ ένεια κ α ι α π οδόθη κ ε σε μ ετα λλά ξεις της πρω τεΐνη ς S c o l Ο πρώ τος α σθενή ς ή τ α ν α γ ό ρ ι π ο υ μ ετά το τέλος της π ερ ιό δ ο υ της κ ύησης βρέθηκε ν α είνα ι υ π ο το νικ ό, λ η θ α ρ γικ ό κ αι χρειά σ τη κ ε άμεση βοή θ εια γ ια α να π νευ σ τικ ή κ α τα π όνη σ η. Ε ν σ υ νεχεία π ροκ λή θ η κ ε σ οβαρή μ εταβολική οξέω ση, α λ λ ά κ α ι μ εγέθυνσ η του ή πατος. Τ έλος, ο α σ θ ενή ς π α ρ ο υ σ ία σ ε β ρ α δ υ κ α ρ δ ία κ α ι π έθ α νε σ τη ν η λικ ία τω ν 2 μ η νώ ν. Έ να χ ρ ό ν ο μετά, έ ν α δεύτερ ο ν εο γ έν ν η τ ο π α ρ ο υ σ ία σ ε σ οβαρές ν ευ ρ ο λ ο γ ικ ές δ ια τα ρ α χές με μ ετα βολικ ή οξέωση κ α ι π έθ α νε 5 μ έρες μετά τη ν γ έννη σ ή του. Ο ι α σ θ ενείς π ο υ έ χ ο υ ν μελετηθεί μ έχρ ι σ τιγμ ή ς ε ίν α ι ετεροζυγώ τες κ α ι η μ ετά λλα ξη ο δ η γ εί σε υποκ α τά στα ση μ ια ς β ά σ η ς α π ό μ ια ά λλη. Το α π οτέλεσ μ α α ν τ α ν α κ λ ά τη ν αντικατάσταση ε ν ό ς α μ ινο ξέο ς σ τη ν π ρω τεΐνη π ο υ κ ω δικ οπ οιείτα ι α π ό το μ ετα λ λ α γμ ένο γ ο ν ίδ ιο. Έτσι, στη περίπτω ση της S c o l η π ρ ο λ ίνη 174, α κριβώ ς δ ίπ λ α στο μ οτίβ ο δέσμευσης του μ ετά λ λ ο υ C xxxc, α ντικ α θίστα τα ι α π ό τη λεύκινη. Ε πειδή οι π ρ ο λ ίνες είνα ι γνω σ τό ότι κ ά μ π τ ο υ ν τη ν π ο λυπεπ τιδ ικ ή α λυσίδα, η α ντικ α τά στα ση αυτή σε μ ια π ερ ιο χή άκρω ς σ η μ α ντικ ή μ π ο ρ εί ν α π α ρ εμ β α ίνει σ τη ν λ ειτουργία της S c o l, τ ρ ο π ο π ο ιώ ν τα ς τη ν τρισδιάστατη δομή της π ερ ιο χ ή ς δέσμευσης του χα λ κ ο ύ. Στη περίπτω ση της Sco2 η θέση της μ ετά λλα ξη ς Ε140Κ είνα ι δ ίπ λ α στο μ ο τίβ ο έντα ξη ς CXXXC (Σ χή μ α 18)94. To G lu 140 α ντισ τοιχεί στο α μ ινο ξύ 176 της H S c o l και βρίσκεται π ο λ ύ κ ο ντά στη ν μ ετα λλα γμ ένη π ρ ο λ ίνη (Pro 174). Ε πίσης η μετάλλαξη αυτή μ ετα τρέπει έ ν α α ρ νη τικ ά φ ο ρ τισ μ ένο γλουτα μ ινικ ό σε μ ια θετικά φ ορ τισμένη λ υ σ ίνη. Έ να θετικά φ ο ρ τισ μ ένο α μ ινο ξύ τείνει ν α α π ο σ τα θ ερ ο π ο ιεί το ιό ν του χ α λ κ ο ύ στη π ερ ιοχή δέσμευσης. Π α ρ ομοίω ς, η μ ετά λλα ξη S225F δ ίπ λ α α π ό τη ν H is-224 (τρίτος υ π οκ α τα σ τά τη ς του χα λ κ ο ύ σ τη ν S c o l) μ ετατρέπει έ ν α π ο λ ικ ό μη φ ο ρ τισ μ ένο α μ ινο ξύ (Ser) σε ένα 3 4

43 r υ δ ρ ό φ ο β ο (Phe), το ο π ο ίο μ π ορεί ν α επηρεάζει τη ν λειτουργία της Sco2. Ε πομένω ς, α ν η α νθ ρ ώ π ινη Sco2 χρ ειά ζετα ι γ ια τη ν εισαγω γή του χ α λ κ ο ύ στην ολοπρω τεΐνη CcO, ο ι υ π ο μ ο ν ά δ ες I και II θα επ η ρ εά ζο ντα ι ά μ εσ α α π ό τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Α π ό τους ασθενείς με μ εταλλάξεις Sco2, κ α νείς δεν είχε ιστορικό σ τη ν ο ικ ογένεια με νευ ρ ο λ ο γικ ές ασθένειες. Ιστολογικές α να λύσεις έδειξα ν σοβαρή μείωση της δραστικότητας της C co στους κ α ρ δια κ ούς κ α ι σκελετικούς μύες, ενώ π ιο ή π ια στο συκώ τι κ α ι στα κύττα ρα του συνεκτικού ιστού. 1 MLLLTRSPIAWHRLSQLKFRMPGTLGGQALHLRSWLLSRQGPAFrGGOGO 52 PQGPGLRlTlLLrrGU^GAGLGGAWLAiJlAF.KERlXJQQKRU.AlJlQAAVOQG 103 DFHUJJHRGRARCKADFRGQWVLMYFGFTH^roi^DBLEKi.VQVVRQi^A W IM KPOLPFVOPVRTMDFr.R[jDVEAMARYVQDFHrRLLGLTGSTlCQVAOASHSY F 206 RVYYNAGPKDfcDQDYIVI^?IAIYUJ<iPDGIJTDYYGRSRSAhQISI)SVRRH U A A FPC V I c Σ χ ή μ α 1 8 : Η π ο λ υ π ε π τ ιδ ικ ή α λ υ σ ίδ α S C 0 2 τ ο υ α ν θ ρ ώ π ο υ κ α ι ο ι π α θ ο γ ό ν ε ς μ ε τ α λ λ ά ξ ε ις. 35

44 ΊΖΕΦΜΆΙΟ 2 ΖΟΜΙΤΟίΦΙΟΛΟτίΑ

45 2.1 Μ ελέτη γ ο ν ο δ ιω μ ά τ ω ν στη Μ ο ρ ια κ ή Β ιο λ ο γ ία Μ ία α π ό τις π ροκ λή σ εις π ο υ αντιμετω πίζει η κ οινότη τα της Μ οριακ ής Β ιο λ ο γ ία ς σ ή μ ερ α ε ίν α ι ν α κ α τα νοή σ ει τ ο ν π λούτο τω ν δ εδ ο μ ένω ν π ο υ έ χ ο υ ν π ρ ο κ ό ψ ει α π ό έρ ευ νες π ο υ σ χετίζο ντα ι με τη ν α λ λ η λ ο υ χία του γονιδ ιώ μ α τος. Κ ατά τ η ν τελευτα ία δεκαετία η β ιοπ λη ρ οφ ορικ ή έχει γ ίν ε ι έ ν α α να π ό σ π α σ τ ο κ ο μ μ ά τι της έρ ευ να ς κ α ι της εξέλιξης στις βιο-ιατρικές επιστήμες. Η β ιο π λ η ρ ο φ ο ρ ικ ή δ ια δ ρ α μ α τίζει σήμερ α έ ν α ν σ η μ α ντικ ό ρ ό λ ο τόσ ο σ τη ν α π ο κ ρ υ π το γ ρ ά φ η σ η του γονιδ ιώ μ α τος, στη ν κ α τα γρ α φ ή κ α ι κ α τη γοριο π ο ίη σ η δ εδ ο μ ένω ν, τα ο π ο ία π α ρ ά γ ο ν τ α ι α π ό πειραματικ ές τ ε χ ν ο λ ο γ ίες υ ψ η λ ή ς π α ρ α γω γικ ότη τα ς, όσο κ α ι στη ν ο ρ γά νω σ η π λ η ρ ο φ ο ρ ιώ ν π ο υ σ υ γ κ εντρ ώ νο ν τα ι α π ό τη ν π α ρ α δ ο σ ια κ ή Β ιολογία. Ο α πώ τερος σ τόχος της β ιο π λ η ρ ο φ ο ρ ικ ή ς είνα ι ν α α π ο κ α λ ύ ψ ει τις β ιολογικ ές π λ η ρ ο φ ο ρ ίες π ο υ κ ρ ύ β ο ν τ α ι μ έσα στη ν ευ ρ εία σ υ λ λ ο γ ή δ εδ ο μ ένω ν κ α ι ν α βοηθήσει σ τη ν πλη ρέστερη κ α τα νό η σ η της β ιο λ ο γ ία ς τω ν ο ρ γ α ν ισ μ ώ ν. Έ χει δη μ ιουργη θ εί έ ν α ς μ εγά λ ο ς α ρ ιθ μ ό ς τρ α π εζώ ν δ εδ ο μ ένω ν κ αι π ρ ο γ ρ α μ μ ά τω ν, με σ κ ο π ό ν α π α ρ ά σ χ ο υ ν σ τη ν επ ιστη μ ονικ ή κ οινότη τα τα ερ γα λ εία εκ είνα π ο υ θα β ο η θ ή σ ο υ ν σ τη ν α να ζή τη σ η τρ α π εζώ ν γ ο ν ιδ ίω ν γ ια τη ν α νά λ υ σ η της α κ ο λ ο υ θ ία ς τω ν π ρ ω τεϊνώ ν κ αι γ ια τη ν π ρ ό β λεψ η της π ο ικ ιλ ία ς π ο υ διέπ ει τις ιδιότητες τω ν π ρ ω τεϊνώ ν95. Α ν επ ικ εντρω θ ούμ ε σ τη ν εξεύρεση νέω ν μ ετα λλο-π ρ ω τεϊνώ ν είνα ι π ιθ α ν ό ν α - χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή σ ο υ μ ε π ο λ λ ές δια φ ορετικ ές π ρ ο σ εγγίσ εις β ιοπ λη ρ οφ ορικ ή ς, α ν ά λ ο γ α με το τι σ τοχεύ ουμ ε ν α ερ ευνή σ ουμ ε. Μ ία π ιθ α νή στρατηγική είνα ι ν α δ ιεξά γουμ ε μ ια έρ ευ να τύ π ο υ BLAST (h ttp ://w w w.n c b i.n lm.n ih.g o v /B L A S T /), π ρ ο κ ειμ ένου ν α δ ιερ ευνή σ ουμ ε όλες τις διαθέσιμ ες βάσεις δ εδ ο μ ένω ν π ο υ σ χετίζοντα ι με α λλη λουχίες, ψ ά χ ν ο ν τ α ς ν α βρούμ ε μ ία ά γνω στη π ρω τεΐνη π ο υ ν α π εριέχει έ ν α γνω στό μ ο τίβ ο δέσμευσης μ ετά λλου. Για π α ρ ά δ ειγ μ α, ο ι H S c o l και H Sco2 ε μ φ α ν ίζ ο υ ν το ίδ ιο μ ο τίβ ο δέσμευσης χ α λ κ ο ύ CXXXC, το ο π ο ίο εντοπίζετα ι κ α ι στο κ έντρ ο C u A του C co. Η κ ο ινή α λ λ η λ ο υ χία του μ ο τίβ ο υ μ α ς δίνει μ ια 3 8

46 μ ονα δικ ή οπτική α να φ ο ρ ικ ά με τα δομ ικά γονιδ ιώ μ α τα τω ν μ ετα λλοπρω τεϊνώ ν, π ου βα σ ίζοντα ι στη φ υλλομέτρηση του γονιδ ιώ μ α τος, καθώ ς μέσω της δια δικασία ς αυτής αποκ α λύπτετα ι μ ια ενδ ια φ έρ ουσα και μ εγά λη π οικ ιλία λειτουργιώ ν και ιδιοτήτω ν μετάλλω ν-δέσμευσης τω ν π ρω τεϊνώ ν π ου μ ο ιρ ά ζο ντα ι τη ν ίδια ανα δίπ λω ση κ αι τη ν ίδια α λ λ η λ ο υ χία δέσμευσης. Στη σ υνέχεια με τη χρήση κατάλλη λω ν υπ ολογισ τικ ώ ν π ρ ο γ ρ α μ μ ά τω ν (C lustalw http: / / w w w.e b i.a c.u k / c lu s ta lw /και SeqSpace h ttp ://in d u s tr y.ebi.ac.uk) γίνετα ι υπέρθεση τω ν α λλη λ ο υ χιώ ν με βάση τη φ υλλομέτρηση του γονιδ ιώ μ α τος (gen om e b row sin g) κ α ι επ ιλέγετα ι μ ια μ α κ ρ ο -ο μ ά δ α γ ο ν ιδ ίω ν με κ ο ιν ά γνω ρίσ ματα. Σε κ ά π οιες περιπτώ σεις ε ίν α ι π ιθ α ν ό ν α π α ρ α τη ρ η θ εί η ύπαρξή- διαφ ορετικώ ν π ερ ιο χ ώ ν (dom ains) κ α ι επ α ν ά λ η ψ η μ οτίβ ω ν δέσμευσης μ ετά λλου μ έσα στο ίδιο γ ο νίδ ιο. Ο ι α λλη λ ο υ χίες π ο υ σ υ λ λ έχθη κ α ν μ π ο ρ ο ύ ν ν α δ ια χω ριστούν π ερισ σ ότερ ο σε υ π ο -ο ικ ο γ ένειες βάσει της ορ γά νω σ η ς τω ν π ερ ιο χώ ν τους. Η συγκριτική φ υλογενετικ ή α νά λ υ σ η κ α ι η α νά λυσ η του π ερ ιεχομ ένο υ τω ν γ ο ν ιδ ίω ν (STRING at h ttp ://s tr in g.e m b l.d e /), δ εδ ο μ ένο υ ότι τα γ ο ν ίδ ια έ χ ο υ ν π ροκ α ρ υω τικ ά ο μ ό λ ο γ α, θα μ π ορ ούσε ν α φ α νεί χρήσιμ η στο δια χω ρ ισ μ ό τω ν γ ο ν ιδ ίω ν α π ό μ α κ ρο-οικ ογένειες σε τάξεις. Ό τ α ν εντοπίζεται μ ία πρω τεΐνη σ υ γκ εκ ρ ιμ ένου ενδ ια φ έρ ο ντο ς, γίνετα ι α ντικ είμ ενο περαιτέρω ερ ευ νώ ν β ιοπ λη ρ οφ ορικ ή ς, π ρ οκειμ ένου ν α π ρ ο β λ εφ θ ο ύ ν γνω ρ ίσ μ α τα της πρω τεΐνη ς αυτής, όπ ω ς η σταθερότητα, η διαλυτότητα, η υδροφ οβικ ότη τα και οι δευτεροτα γείς και τριτοτα γείς δομές. Για κάθε τάξη π ρω τεϊνώ ν επ ιλ έγοντα ι δ ιά φ ο ρ ες π ερ ιοχές γ ια έκφραση. Ε πομένω ς, είνα ι α παραίτητες αρκετές προκαταρκτικές α να λύσεις, π ρ οκειμ ένου ν α επ ιλεγεί η / ο ι π ε ρ ιο χ ή /έ ς της πρω τεΐνη ς-σ τόχου με τη ν μ εγαλύτερη π ιθ α νότη τα ν α π ρ οκ ύ ψ ει μία ευδιάλυτη και σωστά α να δ ιπ λ ω μ ένη πρω τεΐνη. Ο προσδιορισμός των περιοχών αυτών διενεργείται λαμβάνοντας ογγ όψιν τους παρακάτω παράγοντες96-100: ^ 1) Τ η ν π α ρ ο υ σ ία δ ια μ εμ β ρ α νικ ώ ν π ερ ιοχώ ν. Ε ίνα ι π ο λ ύ σ η μ α ντικ ό ν α γνω ρ ίζο υ μ ε, ε ά ν π ρ όκ ειτα ι γ ια μ ία διαλυτή πρω τεΐνη ή για μία 39

47 δ ια μ εμ β ρ α νικ ή πρω τεΐνη ή γ ια μ ια πρω τεΐνη π ο υ έχει μ έσ α στο φ ω σ φ ολιπ ιδ ικ ό υ π όστρ ω μ α ένα μ ικ ρ ό π ο λυπεπ τιδ ικ ό τμ ή μ α, π ρ ά γ μ α π ο υ σ η μ α ίνει ότι είν α ι κατά το μ εγα λύτερ ο μ έρ ος διαλυτή. Ενώ σ τη ν πρώτη π ερίπ τω ση η π λ ή ρ ο υ ς μ ή κ ους π ο λυπεπ τιδ ικ ή α λ υ σ ίδ α α ντιπ ρ ο σ ω π εύ ει π ιθ α ν ό τ α τ α τ η ν βέλτιστη δια λυτότη τα, σ τη ν τελευτα ία περίπτω ση είνα ι π ρ ο τιμ ό τερ ο ν α κατασκευαστεί μ ία α να σ υ νδ υ α σ μ ένη π ρω τεΐνη, η ο π ο ία θα έχει α π α λ λ α χ θ εί α π ό το δ ια μ εμ β ρ α νικ ό τμήμα. Σε αυτή τη ν περίπτω ση, π ρ ο κ ειμ ένου ν α μ εγισ το π ο ιή σ ο υ μ ε το βαθμό της επ ιτυχία ς, σ χ εδ ιά ζο ν τ α ι δ ιά φ ο ρ ες π ιθ α ν ές κατασκευές(εοη8ίτυεί) του δ ια λυτού μ έρ ο υ ς / μερώ ν. 2) Το Ν -τελικ ό τμ ή μ α της π ρω τεΐνη ς ν α είνα ι σ χεδ ια σ μ ένο σ ύ μ φ ω να με το υ ς κ α ν ό ν ε ς τω ν Ν -ά κ ρ ω ν (N -en d rules). Α υ τό ς ο κ α ν ό ν α ς π ρ ο τ είνει ότι υ π ά ρ χ ε ι κ ά π ο ια σχέση α ν ά μ εσ α στη μ ετα βολικ ή σταθερότη τα μ ια ς π ρ ω τεΐνη ς κ α ι σ τη ν τα υτότη τα τω ν α μ ινο ξέω ν του Ν τελικού ά κ ρ ο υ ". 3) Τ η ν π α ρ ο υ σ ία ε γ γ ε ν ώ ν μη δ ο μ η μ ένω ν η δ ια τ α ρ α γ μ ένω ν π ερ ιο χ ώ ν σ τη ν α λ λ η λ ο υ χ ία (τα σ χετικ ά π ρ ο β λ έ π ο ν τ α ι α π ό το IU P red στη διεύθυνσ η h t tp ://iu p r e d.e n z im.h u /). 4) Τ η ν π α ρ ο υ σ ία, σ τη ν α λ λ η λ ο υ χ ία του D N A, κ ω δ ικ ονιώ ν, τα ο π ο ία ν α ε ίν α ι "σπάνια" σ το ν ξενιστή π ο υ επιλέχτήκε γ ια τ η ν έκφραση της α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν η ς π ρ ω τεΐνη ς (τα σχετικά γ ια το σύστη μ α έκ φ ρ α σ η ς στην E.coli π ρ ο β λ έ π ο ν τ α ι στη δ ιεύ θ υ νσ η h ttp ://n ih se r v e r.m b i.u c la.e d u /R A C C /). 2.2 Κ λ ω ν ο π ο ΐη σ η κ α ι έ κ φ ρ α σ η γ ο ν ιδ ίω ν Π ρω τεΐνες π ο υ π ρ ο έ ρ χ ο ν τ α ι α π ό ο π ο ιο δ ή π ο τε ο ρ γ α ν ισ μ ό είνα ι δ υ ν α τ ό ν ν α υ π ερ εκ φ ρ α σ το ύ ν σε β α κ τη ρ ια κ ά ή /κ α ι ευκαρυω τικ ά κύτταρα ή α κ ό μ α κ α ι σε κυτταρικές σειρές θηλαστικώ ν, ν α α π ο μ ο ν ω θ ο ύ ν και ν α χ ρ η σ ιμ ο π ο ιη θ ο ύ ν στη σ υ νέχ εια γ ια τη ν διεξα γω γή δ ια φ ό ρ ω ν π ειραμάτω ν. Π ρ ο κ ειμ ένο υ ν α επιτευχθεί η υ π ερέκ φ ρ α σ η μ ία ς π ρω τεΐνη ς σε βα κτη ρια κά κ ύττα ρ α Escherichia Coli π ρ έπ ει ν α α κ ολουθηθεί μ ία δ ια δ ικ α σ ία η ο π ο ία 40

48 9 αποτελείται α π ό π ο λ λ ά στάδια. Στη σ υ νέχεια α να φ έρ ο ντα ι εν σ υ ντομ ία τα κύρια στάδια: Το πρώ το βήμα είνα ι η εύρεση της α λ λη λουχία ς του D N A, π ου κω δικοποιεί τη ν π ρ ο ς έκφραση πρω τεΐνη. Η α λ λ η λ ο υ χία αυτή, σ τη ν περίπτω ση π ο υ πρόκειται γ ια βακτηριακή π ρω τεΐνη, μ π ο ρ εί ν α α π ομ ονω θ εί α π ό το γενο μ ικ ό D N A του κυττάρου. Σ τη ν περίπτω ση όμω ς, π ο υ η π ρ ο ς έκφραση πρω τεΐνη προέρ χετα ι α π ό ευκαρυω τικό ο ρ γ α ν ισ μ ό, η α π ομ όνω σ η ΐή ς α λλη λουχία ς του D N A π ο υ τη ν κω δικοποιεί, γίνετα ι α π ό το m R N A του ευκαρυω τικού κυττάρου. Ε φ όσον α π ο μ ο νω θ εί το τμ ή μ α του D N A π ο υ κω δικοποιεί τη ν π ρ ο ς έκφραση πρω τεΐνη, α κ ολουθεί η κλω νοπ οίη σ η α υ το ύ σε κ ατάλληλο φ ορέα έκφ ρασης (π λα σμίδιο). Το πρώ το σ τά διο τη ς κ λω νοπ οίη σ η ς είνα ι ο'"πολλαπλασιασμός της α λ λ η λ ο υ χία ς του D N A, π ο υ κω δικοποιεί τη ν π ρ ος έκφραση πρω τεΐνη, με τη χρή σ η της αλυσιδω τής α ντίδ ρ α σ η ς π ολυμ ερ ά σ η ς (P olym erase C hain R eaction (PCR)). Στο τέλος της δεκαετίας του '70, ένα σ ύ νο λ ο βιοχη μ ικ ώ ν μ εθόδω ν και τεχνικ ώ ν π ο υ ε ίχ α ν ως τότε α να π τυχθεί, βοή θησαν στην α νά π τυξη της τ ε χ ν ο λ ο γ ία ς π ο υ είν α ι σήμερα γνω στή ως τεχ νο λ ο γ ία του α να σ υ νδ υ α σ μ ένο υ D N A. Μ ε τη ν εφ α ρ μ ο γή τεχνικ ώ ν α να σ υ νδ υ α σ μ ένο υ D N A (μ ό ρ ιο D N A π ο υ π εριέχει μη σ υ γ γ ενικ ά γονίδ ια ) είνα ι δ υ να τό το " κ όψ ιμ ο" του D N A σε συγκ εκ ριμ ένες θέσεις κ α ι η σύνδεσή του (α να σ υ νδ υ α σ μ ό ς) μ ε D N A α π ό ά λλη π η γή. Ο ι ν έ ο ι α υτοί σ υ νδ υ α σ μ ο ί μ π ο ρ ο ύ ν ν α κ λ ω νο π ο ιη θ ο ύ ν, δη λα δή ν α π ο λ λ α π λ α σ ια σ τούν π ολλές φ ορές, με τη ν εισαγω γή τους σε κ α τά λλη λα κύτταρα (κύτταρα ξενιστές)100. Τα κ ύρια στάδια σ τη ν κ λω νοπ οιή σ η του D N A είνα ι (Σ χή μ α 19): -Κ α τα σ κ ευ ή ε ν ό ς α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο υ μ ο ρ ίο υ. Έ να τμ ή μ α D N A π ο υ π εριέχει το γ ο ν ίδ ιο π ο υ μ α ς ενδια φ έρ ει α π ο μ ο νώ νετ α ι κ α ι ενώ νετα ι ο μ ο ιο π ο λ ικ ά με ένα φ ο ρ έα D N A. Τ ο κ ύριο χαρακτη ρισ τικ ό του φ ορέα είνα ι ότι μ π ο ρ εί ν α α να π α ρ ά γ ετα ι α υ τό ν ο μ α σε έ ν α ν κ α τά λλη λο ξενιστή. Ο φ ορέα ς κ λω νοπ οίη σ η ς περιέχει μ ια α φ ετηρία α ντιγ ρ α φ ή ς κ αι μ π ορεί ν α διπλασιαστεί στο κ ύττα ρ ο ξενιστή.τ α π λα σ μ ίδ ια (φ υσικά εμ φ α νιζό μ ενα κυκλικά μ όρια D N A π ο υ λ ειτ ο υ ρ γ ο ύ ν ω ς βοηθητικά χρω μ οσώ μ α τα ) και ο φ ά γ ο ς λ (ένα ς ιός) είνα ι φ ο ρ είς επ ιλ ο γ ή ς για κ λω νοποίη ση στο βακτή ριο E.coli. 41

49 -Ε ισ α γ ω γ ή σ τα κ ύ τ τα ρ α ξενισ τ ές. Τ α υ β ρ ιδ ο π ο ιη μ ένα π λ α σ μ ίδ ια εισ ά γ ο ντα ι στη σ υ νέχεια σ τα κ ύττα ρ α ξενιστές μ ε τ η ν τεχνικ ή του μ ετα σ χη μ α τισ μ ού. Τ α π ιο γ νω σ τά κ ύ ττα ρ α ξενιστές είν α ι τα κ ύττα ρ α E.coli. Η δ ια δ ια κ α σ ία αυτή ε ίν α ι γνω σ τή ω ς δ ια δ ικ α σ ία μ ετα σ χη μ α τισ μ ού τω ν κυττάρω ν. -Ε π ιλ ο γ ή. Τ ο επ ό μ ενο β ή μ α είν α ι ν α π ρ ο σ δ ιο ρ ισ το ύ ν τα κ ύττα ρ α π ο υ π ε ρ ιέ χ ο υ ν το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο μ ό ρ ιο D N A το ο π ο ίο π ερ ιέχει το γ ο ν ίδ ιο π ο υ μ α ς ενδ ια φ έρ ει. Το ξένο DNA που θα ενσωματωθεί Πλασμιδιακός φορέας Έ ν ω σ η Ανασυνδυασμένο μόριο DNA / γ Ε ισ α γω γή σ τα κύττα ρ α ξ ε ν ισ τ έ ς με μ ετα σ χη μ α τισ μ ό ή μ όλυνσ η με ιο ύ ς 0 V Ε π ιλ ο γή κ υ ττά ρ ω ν π ο υ π ε ρ ιέ χ ο υ ν α ν α σ υ ν δυα σ μ ό ν α μόρια DNA γ Κ λω νοποίη σ η Σ χ ή μ α 19: Κ α τ α σ κ ε υ ή κ α ι κ λ ω ν ο π ο ίη σ η α ν α σ ο ν δ υ α σ μ έ ν ω ν μ ο ρ ίω ν D N A. 42

50 r Τα βακτηριακά κύτταρα π ο υ χρη σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι γ ια τη ν έκφραση των πρω τεϊνώ ν είνα ι στελέχη τα ο π ο ία έχ ο υ ν υποστεί σ υγκεκριμ ένες γενετικές τροποποιήσεις. Σ υγκεκριμ ένα, α π ό το γενο μ ικ ό D N A τω ν κ υττά ρω ν αυτώ ν έχ ο υ ν απαλειφ θεί ορ ισ μ ένα γ ο ν ίδ ια τα ο π ο ία κ ω δ ικ οπ οιούν πρω τεάσες, έτσι ώστε ν α ελαχιστοποιείται ο κ ίν δ υ ν ο ς α π οικ οδόμ η σ η ς της π ρ ο ς έκφραση πρω τεΐνης. Επίσης, έχει προστεθεί στο γ ενο μ ικ ό D N A α υτώ ν τω ν βακτηριακώ ν κυττάρω ν το γ ο ν ίδ ιο της Τ7 R N A π ολυμ ερ ά σ η ς το οπ οίο βρίσκεται υ π ό το ν έλεγχο του π ρ ο α γω γέα του ο π ερ ο ν ίο υ της λακτόζης. Π ρέπει ν α σημειωθεί ότι στο γ ενο μ ικ ό D N A τω ν βακτηριακώ ν κυττάρω ν υ π ά ρ χει το γο νίδ ιο π ου κω δικοποιεί το ν φ υσικό κατα στολέα του ο π ερ ο ν ίο υ της λ α κ ΐό ζη ς (la d repressor). Σε φ υ σ ιολογικ ά βακτη ριακά κύτταρα, ό τ α ν το θρεπτικό μέσο δ εν περιέχει λακτόζη α υτός καταστέλλει τη ν έκφ ραση τω ν γ ο ν ιδ ίω ν π ο υ α π α ιτούντα ι για τ ο ν κ α τα βολισ μ ό της. Ό τ α ν η λα κ τόζη είνα ι π α ρ ο ύ σ α, τότε η π α ρ α γ ό μ ενη α π ό αυτή γα λα κ τόζη δεσμεύει τ ο ν καταστολέα κ α ι έτσι εκ φ ρ ά ζοντα ι τα γ ο ν ίδ ια π ο υ κ ω δ ικ ο π ο ιο ύ ν τα α π α ιτ ο ύ μ ενα γ ια το ν κ α τα βολισ μ ό της ένζυ μ α. Κ ατά τ η ν α νά π τυ ξη τω ν χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ μ ενω ν για τη ν υπερέκφραση της επιθυμητής π ρω τεΐνη ς β α κ τη ρ ια κ ώ ν κυττάρω ν, επιτελείται η έκφραση ό λω ν τω ν α π α ρ α ίτη τω ν π ρ ο ς επιβίω ση τω ν π ρω τεϊνώ ν, σ υ μ π ερ ιλ α μ β α νομ ένου και του καταστολέα του ο π ερ ο ν ίο υ της λακτόζης. Ο καταστολέας α υτός δεσμεύεται σ το ν π ρ ο α γω γέα τη ς Τ7 π ολυμ ερ ά σ η ς, στο γ ενο μ ικ ό D N A τω ν κυττάρω ν, μ ε α π οτέλεσ μ α τη μη έκφ ρασή της. Η α λ λ η λ ο υ χία του φ ορ έα έκφ ρασης π ρ ιν α π ό τ η ν π ερ ιοχή π ο λ λ α π λ ή ς κ λω νοπ οίη σ η ς είν α ι ο π ρ ο α γ ω γ έα ς σ το ν ο π ο ίο δεσμεύεται η Τ7 R N A π ολυμ ερ ά σ η. Έτσι, η μη έκφραση της Τ7 R N A π ολυμ ερ ά σ η ς έχει ως σ υνέπ εια τη μη έκφραση της πρω τεΐνης π ο υ μ α ς ενδιαφ έρει. Τη χρονικ ή στιγμή π ου ε ίν α ι επιθυμητή η έκφραση της π ρω τεΐνης π ου μ α ς ενδιαφ έρει, γίνετα ι προσθήκη του μ ορίου IPTG (Iso p ro p y l^ -D -th io g a la cto p y ranosid e). To IPTG ε ίν α ι ένα μη μ ετα β ο λιζό μ ενο α ν ά λ ο γ ο της γα λα κ τόζη ς το ο π ο ίο δεσμεύει τον καταστολέα του ο π ερ ο ν ίο υ της λα κ τόζη ς (lacl) και επ ά γει τη ν έκφρασή του σε κύτταρα E.coli. Η δέσμευση του IPTG με το ν καταστολέα του ο π ερ ο ν ίο υ της 43

51 λα κ τό ζη ς έχει ως α π οτέλεσ μ α τη ν α λ λ α γή της δια μ όρ φ ω σής του. Στη σ υ νέχεια η α λ λ α γ ή αυτή α π οτελλεί τη ν κ ύρια κ α ι μ ονα δ ικ ή α ιτία της α π ώ λ εια ς τηςσ υ γ γ ένεια ς α υτού με τ ο ν π ρ ο α γ ω γ έα του ο π ερ ο νίο υ της λα κ τόζη ς. Έτσι, η Τ 7 R N A π ο λ υ μ ερ ά σ η μ π ο ρ εί π λ έ ο ν ν α εκφραστεί κ α ι στη σ υ νέχ εια ν α δεσμευτεί π ά ν ω σ τ ο ν π ρ ο α γ ω γ έα τη ς π ερ ιο χ ή ς π ο λ λ α π λ ή ς κ λ ω νο π ο ίη σ η ς του π λ α σ μ ιδ ίο υ κ α ι ν α α ρ χίσ ει η έκφ ραση της επιθυμητής πρω τεΐνη ς Τ α π λ α σ μ ί δ ι α ω ς φ ο ρ ε ί ς κ λ ω ν ο π ο ί η σ η ς Ε κ α τοντά δ ες δ ια φ ορετικ οί π λ α σ μ ιδ ια κ ο ί φ ορ είς κ λω νο π ο ίη σ η ς έ χ ο υ ν π ερ ιγ ρ ά φ ει κ α ι π ο λ λ ο ί α π ό α υ το ύ ς έχουν κατασκευαστεί γ ια ειδικ ούς σ κ ο π ο ύ ς. Π α ρ ό λ α α υτά, ό λ ο ι τους έ χ ο υ ν τα παρακάτω κ ο ιν ά χαρακτη ρισ τικ ά : 1) Ό λ ο ι ο ι φ ο ρ είς κ λ ω νο π ο ίη σ η ς έ χ ο υ ν ένα ή π ερ ισ σ ό τερ ο υ ς εύκολα ε π ιλ εγμ ένο υ ς γ ενετικ ο ύ ς δείκτες, όπ ω ς αντίστα ση σε α ντιβ ιο τικ ά. Η α π οτελεσ μ α τικ ότη τα της δ ια δ ικ α σ ία ς του μ ετα σ χη μ α τισ μ ού είν α ι π ο λ ύ χα μ η λ ή κ α ι τέτοιοι δείκτες είν α ι α π α ρ α ίτη τοι, ώστε τα κ ύ ττα ρ α π ο υ έ χ ο υ ν μ ετα σ χη μ α τισ τεί ν α μ π ο ρ ο ύ ν εύ κ ολα ν α επ ιλ εγούν. 2) Μ ία ιδιότη τα τω ν φ ο ρ έω ν είν α ι ότι π ερ ιέχουν μ ία α φ ετη ρ ία α ντιγ ρ α φ ή ς (o rig in ή ori) π ο υ δ ια σ φ α λ ίζει ότι π ο λ λ α π λ α σ ιά ζο ν τ α ι στο επ ιθυμητό κ ύ ττα ρ ο ξενιστή. 3) Δ ο μ ικ ά χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ά π ο υ επ ιτρ έπ ο υ ν τ η ν έκ φ ρ α σ η του κ λ ω νο π ο ιη μ ένο υ D N A (π.χ π ρ ο α γω γέα ς). Τις περισ σ ότερ ες φ ο ρ ές είνα ι επιθυμητή η π α ρ α γ ω γή μ εγά λ ω ν ποσοτή τω ν του π ρ ο ϊό ν τ ο ς τη ς έκφ ρασης ε ν ό ς γ ο ν ιδ ίο υ. Ό σ ο π ιο ισ χ υ ρ ό ς είνα ι ο π ρ ο α γ ω γ έα ς, τόσ ο π ερισ σ ότερ α μ ό ρ ια m R N A θα σ υ ντεθ ο ύ ν. Ο π ρ ο α γ ω γ έα ς ε ίν α ι τμ ή μ α τ ο υ D N A το ο π ο ίο α π οτελεί σ η μ είο ελ έγχου της ρύθμισης τη ς μ ετα γ ρ α φ ή ς του γ ο ν ιδ ίο υ Α π ο μ ό ν ω σ η τ ο ο γ ο ν ι δ ι α κ ο ύ σ τ ό χ ο υ μ ε τ η ν α λ υ σ ι δ ω τ ή α ν τ ί δ ρ α σ η π ο λ υ μ ε ρ ά σ η ς ( P C R r e a c t io n ). 44

52 m Η αλυσιδω τή αντίδραση της π ολυμ ερ ά σ η ς (P olym erase chain reaction) αποτελεί μ ια επαναστατική α να κ ά λ υ ψ η της Μ οριακής Β ιολογία ς η ο π ο ία σταδιακά α ποκ τά σ υνεχώ ς δ ιευ ρ ούμενες κ λινικ ές κ α ι δια γνω στικ ές εφ αρμογές. Η PCR είνα ι μ ια σχετικά α π λή μ έθ οδος π ο λ λ α π λ α σ ια μ ο ύ μ ια ς επ ιλεγμ ένη ς α λλη λουχία ς D N A με τη βοήθεια του ένζυ μ ο υ π ο λυμ ερ ά σ η ς κ α ι επ ιτυ γχά νετα ι με επ α ν α λ α μ β α ν ό μ ενο υ ς κ ύκ λους 3 δ ια δ ο χικ ώ ν α ντιδράσεω ν σι ο π οίες δ ια φ έρ ο υ ν στη θερ μ οκ ρ α σ ία κ α ι στο χ ρ ό ν ο 101. Κ άθε κ ύκλος αποτελείται α π ό τα εξής σ τάδια (Σ χή μ α 20): 1. Α ποδιά τα ξη του δίκ λω νου D N A (denaturation). 2. Υ βριδισμός τω ν εκκινητώ ν με τη ν α λλη λ ο υ χία -σ τό χο (annealing). 3. Σ ύνθεση σ υμπληρω ματικώ ν κ λώ νω ν του D N A μ ε επέκταση το υ 3' ά κ ρ ου τω ν εκκινητώ ν με τη βοήθεια της π ολυμ ερ ά σ η ς (extension). Η δ ια δικ α σ ία αυτή π ερ ιλ α μ β ά νει επώ αση τω ν δ ειγμ ά τω ν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες, κάτι π ο υ γ ίνετα ι α υ τόμ α τα α π ό ειδικά μ η χα νή μ α τα (therm al cyclers). Σε μ ια τυπική α ντίδ ρ α σ η το δίκ λω νο D N A αποδιατά σσετα ι με θέρμανση στους 95 C. Στη σ υ νέχεια ο ι εκκινητές π ο υ βρίσκοντα ι σε περίσσεια π ρ ο σ α ρ μ ό ζο ν τ α ι μ ε υ β ρ ιδ ισ μ ό στις συμπληρω ματικές α λλη λουχίες του εκ μ α γείου D N A με ψ ύ ξη του δείγμ α τος στους 40 C - 60 C. Ο ι εκκινητές είν α ι συνθετικά ολιγονο υ κ λ εο τίδ ια, μ ή κους βάσεω ν τα ο π ο ία α φ ο ρ ίζο υ ν τη ν α λ λ η λ ο υ χία το υ D N A π ο υ π ρόκειται ν α π ολλα π λα σ ια σ τεί. Ο ι εκκινητές α π ο τελ ο ύ ντα ι α π ό δια φ ορετικές, μη συμ πλη ρω ματικές α λλη λουχίες με α π οτέλεσμα ν α μ η ν υ β ρ ιδ ο π ο ιο ύ ντα ι μεταξύ τους α λ λ ά με τις συμπληρω ματικές α λλη λουχίες του D N A. Α κολουθεί επώ αση σ τους 72 C γ ια τη ν επ ιμήκυνσ η τω ν εκκινητώ ν α π ό μία θερμοσνθεκτική π ολυμ ερ ά σ η π α ρ ο υ σ ία τω ν τεσσάρω ν 5'-τριφ ω σφορικώ ν δ εοξυ ρ ιβ ονουκλεοτιδ ίω ν (dn T P s), da T P, dg TP, dttp, κ α ι dctp. Κ αθώς η δ ια δικ α σ ία επ α να λ α μ β ά νετα ι, οι νεοσ ύστα τοι κ λώ νοι με τη σειρά τους χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι ως εκ μ α γεία γ ια in vitro (χω ρίς κύτταρα) σύνθεση του 45

53 D N A. Μ ετά α π ό μ ερικ ούς κ ύκλους το π ρ ο ϊό ν π ο υ επ ικ ρ α τεί είν α ι ένα θ ρ α ύ σ μ α D N A το μ έγεθος του ο π ο ίο υ α ντιστοιχεί σ τη ν μ ετα ξύ τω ν δ ύ ο α ρ χικ ώ ν εκκινητώ ν α πόστα ση. Στη π ράξη 20 με 30 κ ύκλοι της α ντίδ ρ α σ η ς είν α ι α ρ κ ετοί γ ια τη ν α ποτελεσματική ενίσ χυση του θ ρ α ύ σ μ α το ς D N A. Σε κάθε κ ύκλο π ο υ δια ρ κ εί π ερ ίπ ο υ π έντε λεπ τά η π οσότη τα του D N A δ ιπ λα σ ιά ζετα ι. Η όλη δ ια δ ικ α σ ία κ λω νοπ οίη σ η ς ενό ς θ ρ α ύ σ μ α το ς D N A σε έ ν α σύστη μ α in v itro δ ια ρ κ εί μ ερικ ές ώρες, σε σχέση με τις μ ερικ ές μ έρ ες π ο υ α π α ιτ ο ύ ν τ α ι στις in v iv o δια δικ α σ ίες κ λω νοποίη σης. Σ χ ή μ α 2 0: Α λ υ σ ιδ ω τ ή α ν τ ίδ ρ α σ η π ο λ υ μ ε ρ ά σ η ς (P C R ) Σε μ ια τυπική α νά λ υ σ η PCR ο κ ύκλος α π οδιά τα ξη ς, υ β ρ ιδ ισ μ ο ύ κ α ι σ ύνθ εσ η ς του ν έο υ D N A μ π ο ρ εί ν α επ α να λ η φ θ εί π ο λ λ ές φ ορές, σ υνή θω ς 30 ή 40, κ α τ α λ ή γ ο ντα ς στο σ χη μ α τισ μ ό π ερισ σ οτέρ ω ν α π ό 1 δις. α κ ρ ιβ ώ ν α ν τ ιγ ρ ά φ ω ν το υ α ρ χικ ο ύ τμ ή μ α το ς D N A. Η α ξιο λόγη σ η του π ρ ο ϊό ν τ ο ς PCR γ ίν ε τ α ι σ υνή θ ω ς με η λεκ τροφ όρηση σε πηκτή α γ α ρ ό ζη ς. T o D N A γ ίνετα ι ο ρ α τό μ ε τη βοή θεια του β ρ ω μ ιο ύ χο υ α ιθ ιδίου. Το μ ή κ ος του π ρ ο ϊό ν τ ο ς 46

54 συγκρίνεται με το μήκος γνω σ τού μ ά ρτυρα (D N A Ladder) το ο π οίο ηλεκτροφ ορείται τα υτόχρ ονα. 2.3 Π ρ ω τ ε ϊ ν ι κ ή έ κ φ ρ α σ η σ τ ο σ ύ σ τ η μ α E.c o li Σ ύμ φ ω να με τη ν π ροσέγγισ η της λειτουργικ ή ς γονιδιω ματυ<ής (Functional genom ic), η ο π ο ία στην π α ρ ο ύ σ α ερ γα σ ία α ντιπ ρ οσ ω π εύ ει τη στρατηγική π ου ακολουθείται, η κ λω νοποίη ση μ ια ς π ρω τεΐνη ς σ χεδιάζετα ι * προσεκτικά, καθώς αυτή θα επ ηρεάσει τη σ υ μ π ερ ιφ ο ρ ά της, δη λαδή τη ν α πόδοση, τη διαλυτότητα, τη ν α να δίπ λω σ η κ.λ.π.102 Α ν κ α ι η έκφραση της πρω τεΐνης δεν θεωρείται π λ έο ν ως το σημαντικ ότερο π εριορισ τικ ό σ τά διο και οι τεχνικές καθαρισμού τω ν π ρω τεϊνώ ν έχουν βελτιωθεί σ η μ α ντικ ά κατά τη ν τελευταία δεκαετία, η π α ρ α γω γή δια λυτώ ν π ρω τεϊνώ ν σ υ νεχίζει ν α α ποτελεί ένα μ εγά λο π ρ ό β λη μ α στο π εδ ίο α υτό της επιστήμης. Δ υστυχώ ς π ολλές πρω τεΐνες, ιδιαίτερα οι α νθ ρ ώ π ινες, είνα ι εξαιρετικά δύσκολο ν α π α ρ α χ θ ο ύ ν ως διαλυτές σε ετερόλογα συστήματα έκφ ρασης, καθώ ς σ υ χ ν ά σ υσσω ρ εύονται ως α διάλυτες μάζες τα λ εγόμ ενα έγκλειστα (in clu sion b o d ies)102.ιδιαίτερα στη περίπτω ση π ο υ επιθυμούμε ν α μελετήσουμε μ ια πρω τεΐνη με Φ α σματοσκ οπία Π υρηνικ ού Μ αγνη τικ ού Σ υ ντονισ μ ο ύ, η ο π ο ία α π α ιτεί τη ν π α ρ α γω γή δειγμ ά τω ν υψ ηλής συγκέντρω σης, γ ίνετ α ι κ α τα νοη τό πω ς α π α ιτ ο ύ ντα ι οι βέλτιστες συνθήκες κ λω νοπ οίη σ η ς κ α ι έκφ ρασης του γ ο νιδ ίο υ -σ τό χου. Π α ρ ά γοντες, όπω ς η μειω μένη θερμοκ ρασία, δια φ ορετικ ές κυτταρικές σειρές E.coli, διαφορετικοί τρ ό π ο ι κ α ι φ ορ είς κλω νοπ οίη σ η ς, τα υ τόχρ ο νη έκφραση μ ορια κ ώ ν σ υνοδώ ν έχουν εξεταστεί κ α ι σε κ ά π οιες συγκ εκ ρ ιμ ένες περιπτώ σεις ο δ ή γη σ α ν σε βελτίωση της π α ρ α γ ω γή ς δια λυτώ ν π ρω τεϊνώ ν. Π ρ ιν αρκετά χ ρ ό ν ια ανα κ α λύφ θηκε ότι κ ά π οιες α μ ινοξικ ές α κ ολουθίες σ υ γ γ ένεια ς (affinity tag), όπ ω ς η m altose b in d in g protein (ΜΒΡ), η glutathione-s-transferase (GST), η th ioredoxin είνα ι δ υ ν α τ ό ν ν α α υξή σ ουν τη διαλυτότητα κ ά π οιω ν πρω τεϊνώ ν, ότα ν ενσ ω ματω θούν β ιο τεχνο λ ο γικ ά στη ν α λλη λουχία α υτώ ν103'106. Π ρ οκ ειμ ένου λ ο ιπ ό ν ν α αυξηθεί η σταθερότητα μ ια ς πρω τεΐνης και ν α α π λοπ οιη θ εί ο κ α θ α ρισ μ ός της σε τέτοιο βαθμό ώστε ν α λ α μ β ά ν ο ν τ α ι 47

55 εύ κ ολα κ α ι ο ικ ο νομ ικ ά π ρω τεΐνες υ ψ η λ ή ς καθαρότη τα ς, επ ιλέγετα ι ν α π α ρ α χ θ εί το β ιο μ ό ρ ιο υ π ό μελέτη ως π ρ ο ϊό ν σύντη ξη ς μ ε μ ία ά λλη δεύτερη π ρω τεΐνη. Ο ι π ρω τεΐνες σ ύντη ξη ς (fu sion protein s) π ρ ο κ ύ π τ ο υ ν α π ό τη ν α πλή ένω ση δ ύ ο π ρω τεϊνώ ν. Τ α γ ο ν ίδ ια τω ν π ρ ω τεϊνώ ν α ν α σ υ ν δ υ ά ζο ν τ α ι σε γ ειτονικ ές θέσεις σε έ ν α φ ο ρ έα έκφρασης, με α π οτέλεσ μ α ν α εκφ ράζεται τελικά το π ρ ο ϊό ν σύντηξης. Το μ εγά λ ο μ έγεθος τω ν π ρ ω τεϊνώ ν α υτώ ν συντελεί στη σ τα θεροπ οίη σ η κ αι α να δ ίπ λω σ η του μ ο ρ ίο υ π ο υ μ α ς ενδια φ έρει. Τ έλος η επίλυση της τρ ιτοτα γούς δ ομ ή ς β ιο μ ο ρ ίω ν με N M R, απαιτεί τω ν εμ π λ ο υ τισ μ ό τω ν β ιο μ ο ρ ίω ν με σ τα θ ερά ισ ό τ ο π α π ο υ β ρ ίσ κ ο ντα ι σε π ο λύ χ α μ η λ ά π ο σ ο σ τά στη φύση όπ ω ς α υτά του 15Ν κ αι του 13C Β α σ ικ ά χ α ρ α κ τ η ρ ισ τ ικ ά τ η ς δ ο μ ή ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν -Ο ρ ισ μ ο ί Κ άθε πρω τεΐνη στη φυσική της κατάσταση (native), χα ρ α κ τη ρ ίζετα ι α π ό τη ν τρισδιά στα τη δομ ή της στο χώ ρο. Η φυσική δομ ή τω ν π ρ ω τεϊνώ ν είνα ι εξα ιρετικ ά σ υ μ π α γ ή ς δ ια τα ρ ά σ σ ετα ι όμ ω ς εύ κ ολα α π ό αύξηση της θ ερ μ οκρασία ς, μείω ση ή αύξηση του p H, δια λύτες κ.α. Η π ρω τεΐνη τότε, χ ω ρ ίς διάσπαση (ή δη μ ιο υργία ) ομοιοπολικώ ν δεσμώ ν, μ ετα πίπτει σε μ ια κατάσταση χω ρ ίς κ α θ ορισ μ ένη π λ έ ο ν τρισδιάστατη δομ ή. Η δ ια δ ικ α σ ία της μετάπτω σης α υτή ς ο νο μ ά ζετα ι αποδιάταξη. Η α ντίσ τρ οφ η δ ια δ ικ α σ ία, δη λα δή η απόκτηση της φ υσ ικ ή ς δ ο μ ή ς ξεκ ινώ ντα ς α π ό μ ία τέτοια μη κ α θ ορισ μ ένη τρισδιάστατη δια μ όρφ ω σ η (μ ία α π ό π ο λ λ ές π ιθ α νές) ο νο μ ά ζετα ι δίπ λω μ α (folding). Σ α ν α π ο τέλεσ μ α της δ ια δ ικ α σ ία ς του διπ λώ μ ατος, κ ά π ο ια τμ ή μ α τα της α λ λ η λ ο υ χ ία ς έρ χο ν τα ι κ ο ντά στο χώ ρ ο, δ η μ ιο υ ρ γώ ντα ς π ο λ λ ές επ α φ ές μεταξύ τους, ενώ έ χ ο υ ν π ο λ ύ λιγότερ ες με τα υ π ό λ ο ιπ α τμ ή μ α τα της α λλη λουχία ς. Α υ τά σ υ γ κ ρ ο το ύ ν τις δομικές ενό τη τες (stru ctu ra l d o m a in s)107. Ο ι π ρω τεΐνες α π ο τ ελ ο ύ ντα ι μ ό ν ο α π ό 20 δ ια φ ορετικ ά α μ ινο ξέα τα ο π ο ία ε ν ώ ν ο ν τ α ι μεταξύ το υ ς με π επ τιδικ ό δεσμό. Η α λ λ η λ ο υ χία τω ν α μ ινο ξέω ν εμ περ ιέχει τ η ν π λ η ρ ο φ ο ρ ία γ ια τη σ τερεοδομ ή της π ολυπεπ τιδ ικ ή ς α λυσ ίδα ς. Π α ρ ό τι μ ια π ο λυπεπ τιδ ικ ή α λ υ σ ίδ α έχει τη δυνατότη τα ν'α π ο κ τή σ ει έ ν α ν α π ερ ιόρ ισ το α ρ ιθ μ ό στερ εοδομ ώ ν, εντούτοις η α λλη λουχία 4 8

56 9 τω ν α μ ινοξέω ν καθορίζει μ ό ν ο μ ια δομή. Έ να ς α π ό τους π ιο σ η μαντικούς π α ρ ά γ ο ντες π ο υ σ υμ μ ετέχουν στη δ μ ιο υ ρ γ ία της στερεοδομής είνα ι η κ α τα νομ ή τω ν πολικ ώ ν κ α ι μη π ολικ ώ ν π λευ ρ ικ ώ ν ο μ ά δ ω ν τω ν α μ ινοξέω ν της. Δ ιαφορετική κ α τα νομ ή τω ν ιδίω ν α μ ινο ξέω ν ευ νο εί ά λλη στερεοδομή. Ο ι υ δ ρ όφ οβες πλευρικές ομ ά δες τείν ο υ ν π ρ ο ς το εσω τερικό του μ ο ρ ίο υ κ α ι οι πολικ ές κ α τα νέμ οντα ι στην εξωτερική π λευ ρ ά. Ο ι κινή σεις αυτές ε υ ν ο ο ύ ν τη γέιτνίαση ορισ μ ένω ν α μ ινοξέω ν με επ α κ όλουθο τη ν α νά π τυξη μεταξύ τους μη ομ ο ιο π ο λ ικ ώ ν δεσμώ ν κ α ι σε ορισ μ ένες π εριπτώ σεις κ α ι ο μ ο ιο π ο λ ικ ώ ν (S-S δεσμοί). Στη στερεοδομή συμμετέχει κ α ι ο π επ τιδ ικ ός δεσ μ ός π ο υ δ η μ ιο υ ρ γεί δεσμό υ δ ρ ο γ ό ν ο υ με ά λ λ ο ν πεπτιδικό δεσ μ ό ή μ ε μ ια π ολικ ή πλευρική ο μ ά δ α. Μ ια πρω τεΐνη μ π ορ εί ν α α να δ ιπ λ ώ νετα ι σ χ εδ ό ν α ποκ λειστικ ά είτε ως α -έλικ α είτε ως β-δομή. Ο ι α να διπ λώ σ εις ο φ είλ ο ντα ι σε δεσ μ ούς υ δ ρ ο γ ό ν ο υ π ο υ α να π τύ σ σ ο ντα ι μεταξύ τω ν π επτιδικ ώ ν δεσ μ ώ ν κ α ι ό χ ι τω ν π λευρικ ώ ν ομ ά δω ν. Δ ια φ έρ ο υ ν όμω ς μεταξύ τους, γ ια τ ί σ τη ν α -έλικ α ο ι δεσ μ οί υ δ ρ ο γ ό ν ο υ π ο υ δ η μ ιο υ ρ γ ο ύ ντα ι είνα ι ενδ ο μ ο ρ ια κ ο ί, ενώ στη β-δομή ενώ ν ο υ ν π α ρ α κ είμ ενες π ολυπεπ τιδ ικ ές αλυσίδες. Σ τη ν α -έλικ α ο σκελετός της π ολυπεπ τιδ ικ ή ς α λυσίδα ς σχηματίζει μ ια σταθερή ελικοειδή δομ ή κ α ι η έλικα κ ά νει μ ια περιστροφ ή κάθε 3,6 α μ ινοξέα, φ έρ νο ν τ α ς σε γειτονία τους π επτιδικ ούς δεσμούς κάθε τέταρτου α μ ινοξέος. Η α πόστα ση αυτή είνα ι ακριβώ ς ότι χρειά ζετα ι γ ια τη δ η μ ιο υ ρ γία υ δ ρ ο γ ο ν ικ ο ύ δεσμού. Τ ελικό α ποτέλεσμα είνα ι, κάθε π επτιδικ ός δεσ μ ός της έλικ α ς ν α ενώ νετα ι με δεσμό υ δ ρ ο γ ό ν ο υ διαμέσου του Ο της CO ο μ ά δ α ς με τ ο ν αμέσω ς α π ό κάτω π επτιδικ ό δεσμό και δια μ έσου του Η της Ν Η ο μ ά δ α ς με το ν αμέσω ς α π ό π άνω π επ τιδικ ό δεσμό. Στη β- δομή, τμήματα της π ολυπεπ τιδ ικ ή ς α λυσίδα ς β ρ ίσ κ ο ντα ι το ένα δ ίπ λα στο ά λλο, είτε σε π α ρ ά λλη λη είτε σε α ντιπ α ρ ά λλη λη διάταξη. Ο ι δύο π α ρ α κ είμ ενες α λυσίδες ενώ ν ο ν τ α ι με υ δ ρ ο δ ο νικ ο ύ ς δεσμούς π ο υ α να π τ ύ σ σ ο ντα ι μεταξύ τω ν ομ ά δ ω ν Ν Η κ α ι CO τω ν π αρακείμ ενω ν π ολυπεπ τιδ ικ ώ ν αλυσίδω ν (Σ χήμα 21). 49

57 H -bond h y d ro g en XT' c a r b o n IP R c> P? e r Tfor \L> n itrogen % *> carb o n 'v i R V Cj R φ * «p e p t i d e ) ^ ^ C b o n d * «e P _ IR^, 4^ H ^ o x y g en ^ 1 «\» Τ' ό " Q*>" B R > R *> R 4.* o <+ C> R «> R R " c> "' V Σ χ ή μ α 21: Α ρ ισ τ ε ρ ά, σ χ η μ α τ ικ ό δ ι ά γ ρ α μ μ α μ ι α ς α -έ λ ικ α ς. Ο ι ά σ π ρ ε ς τ ε λ ΐτ σ ε ς δ ε ίχ ν ο υ ν δ ε σ μ ο ύ ς υ δ ρ ο γ ό ν ο υ μ ε τ α ξ ύ Ο κ α ι Ν. Δ ε ξ ιά σ χ η μ α τ ικ ή α ν α π α ρ ά σ τ α σ η τ ο υ π ρ ό τ υ π ο υ τ ω ν δ ε σ μ ώ ν υ δ ρ ο γ ό ν ο υ σ ε μ ί α α ν τ ιπ α ρ ά λ λ η λ η β - π τ υ χ ω τ η ε π ιφ ά ν ε ια. Α π ό π λ ευ ρ ά ς π ερ ιγ ρ α φ ή ς της φ υσικ ή ς δομ ή ς, η τοπ ικ ή δια μ όρφ ω ση κάθε α μ ινο ξικ ο ύ κ α τα λ ο ίπ ο υ εκ φ ράζετα ι α π ό τις γω νίες π ερ ισ τρ οφ ή ς γύρω α π ό δ ύ ο α π ό το υ ς α π λ ο ύ ς δεσ μ ούς π ο υ π εριέχει (Σ χή μ α 22): τ η ν (δίεδρη) γω νία φ, π ο υ εκ φ ρ ά ζει τη ν π ερισ τροφ ή γύρω α π ό το δεσμό N H -C a H, κ αι τη (δίεδρη) γω νία ψ, π ο υ εκ φ ρ ά ζει τη ν π ερισ τροφ ή γύρω α π ό το δεσμό H C a-c O. Ο ι γω νίες αυτές θεω ρ ούντα ι 0 ό τ α ν φ έ ρ ν ο υ ν σε θέση a s το αμέσω ς π ρ ο η γ ο ύ μ ε ν ο κ α ι το αμέσω ς επ ό μ ενο ά τομ ο κ α τά μ ή κ ος της κ ύ ρ ια ς α λυσίδα ς, κ α ι ό τ α ν τα φ έ ρ ν ο υ ν σε θέση trans. Α μ ινο ξικ ά κ α τά λ ο ιπ α σε α-έλικες έ χ ο υ ν γω νίες (φ,ψ ) «(-60,-40), ενώ στα β-πτυχω τά φ ύ λ λ α έχ ο υ ν γω νίες (φ,ψ ) «(-120,+140). Η γ ω ν ία π ερισ τροφ ή ς γύρω α π ό τ ο ν π επ τιδικ ό δεσμό ο νο μ ά ζετα ι γω νία ω, ενώ οι επ ί τ ω ν π λευ ρ ικ ώ ν α λ υ σ ίδ ω ν χ α ρ α κ τη ρ ίζο ντα ι σ α ν χ ΐ, χ 2 κοκ. 50

58 07(>οθο 3, o h M < 9 Σ χ ή μ α 22: Σ χ η μ α τ ικ ή α ν α π α ρ ά σ τ α σ η ε ν ό ς α μ ιν ο ξ ικ ο ύ κ α τ α λ ο ίπ ο υ, μ α ζ ί μ ε τ μ ή μ α τ α τ ω ν γ ε ιτ ο ν ικ ώ ν τ ο υ κ α τ ά μ ή κ ο ς τ η ς α λ λ η λ ο υ χ ία ς. Τ α ζευ γά ρ ια γ ω νιώ ν φ κ α ι ψ α ο νά α να π α ρ ισ τ ά ν ο ν τ α ι γρ α φ ικ ά, το έ ν α σε σχέση με το ά λλο, στο δ ιά γ ρ α μ μ α R am achandran. Σ το Σ χή μ α 23 π α ρ ο υ σ ιά ζο ντα ι τα α ποτελέσματα τέτοιω ν υ π ο λ ο γ ισ μ ώ ν κ α ι γ ίνετ α ι εμ φ α νές ότι οι π α ρ α τη ρ ούμ ενες τιμές σ υ να θ ρ ο ίζο ντα ι γύρω α π ό τις στερεοδιαταξικ ά επιτρεπτές περιοχές. Ο ι π ερ ιοχές στο δ ιά γ ρ α μ μ α R am achandran ο ν ο μ ά ζο ν τ α ι α ν ά λ ο γ α με τη δια μ όρφ ω ση π ο υ θα α ποκ τούσε έ ν α π ο λ υ π επ τίδ ιο, εά ν ο ι αντίστοιχες γω νίες φ κ α ι ψ ε π α ν α λ α μ β ά ν ο ν τ α ν σε ό λ α τα δ ια δ ο χικ ά α μ ινοξέα κατά μήκος της α λυσίδα ς. Ο ι κύριες επιτρεπτές π ερ ιο χές στο Σ χή μ α 23 είνα ι η ο μ ά δ α τω ν α-ελίκω ν στο κάτω αριστερά τετα ρτη μόριο, η ευρεία περιοχή τω ν β-πτυχω τώ ν φ ύλλω ν στο επ ά νω αριστερά τετα ρτη μόριο κ α ι η μικρή π εριοχή της α ριστερόστροφ η ς α-έλικας στο επ ά νω δεξιά τεταρτη μόριο (σχετικά σ π ά νιο). Κ α τά λοιπ α με γω νίες α ντίστοιχες τω ν αριστερ όστροφ ω ν α- ελίκω ν βρίσ κ οντα ι σ υ χ ν ά σε π ερ ιο χές β ρ ό χω ν ή σε μ ικρές α-έλικες

59 -psi Right handed alpha-helix..i*nf \ _ I phi 0 + phi 180 Σ χ ή μ α 23: Σ τ ο δ ι ά γ ρ α μ μ α R a m a n c h a n d r a n π α ρ ο υ σ ι ά ζ ο ν τ α ι ο ι ε π ιτ ρ ε π τ ο ί σ υ ν δ υ α σ μ ο ί τ ω ν γ ω ν ιώ ν φ κ α ι ψ. Ο ι έ γ ρ α ψ ε ς π ε ρ ιο χ έ ς α ν τ ι σ τ ο ι χ ο ύ ν σ ε γ ω ν ίε ς π ο υ σ υ ν α ν τ ώ ν τ α ι σ ε δ ε ξ ιό σ τ ρ ο φ ε ς α -έ λ ικ ε ς, β - π τ υ χ ω τ ά φ ύ λ λ α κ α ι α ρ ισ τ ε ρ ό σ τ ρ ο φ ε ς έ λ ικ ε ς α ν τ ί σ τ ο ι χ α., α 52

60 Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 3 ΦΑ'ΣΜΑΊ Ο'Σ'ΚΡΪΙΪΑ ΰΐη@ ϊβ {Ι1<$) Μ Α ΤΝ ϊρίΐ'κ ρν zwromvmor

61 3.1 Φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία Π υ ρ η ν ικ ο ύ Μ α γ ν η τ ικ ο ύ Σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ 108'114 * Η φ α σ μ α τοσκοπ ία π υ ρ η νικ ο ύ μ α γνη τικ ο ύ σ υ ντονισ μ ο ύ (N M R ) α π ο τελ εί τη μ ο να δ ικ ή μ έθ ο δ ο υ ψ η λ ή ς α νά λ υ σ η ς γ ια τη μελέτη τη ς τρ ισ δ ιά σ τα τη ς δ ο μ ή ς β ιο μ ο ρ ίω ν σε διά λυμ α. Η φ α σ μ α τοσκοπ ία N M R π α ρ έχ ει ε π ιπ λ έ ο ν π λ η ρ ο φ ο ρ ίες γ ια τις δ υ να μ ικ ές κ α ι κ ινητικές ιδιότητες τω ν μ ορίω ν, τ η ν ύ π α ρ ξη ισ ο ρ ρ ο π ιώ ν μ ετα ξύ δ ια φ ορετικ ώ ν μ ο ρ ια κ ώ ν δ ο μ ώ ν κ α ι α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εω ν π ρ ω τεϊνικ ώ ν μ ο ρ ίω ν με ά λ λ α μ α κ ρ ο μ ό ρ ια (πρω τεΐνες, D N A, R N A ) κ α ι με μ ικ ρ ό τερ ο υ μ ο ρ ια κ ο ύ β ά ρ ο υ ς συνδέτες. Υ στερεί ένα ν τ ι της κ ρ υ σ τ α λ λ ο γ ρ α φ ία ς α κ τίνω ν-χ ως π ρ ο ς το μ έγεθος τω ν β ιο μ ο ρ ίω ν τα ο π ο ία μ π ο ρ ο ύ ν ν α μ ελετη θ ούν, καθώ ς η π ο λ υ π λ ο κ ό τη τα τω ν φ α σ μ ά τω ν N M R α υ ξ ά ν ετ α ι δ ρ α μ α τικ ά λ ό γω της α λλη λ ο επ ικ ά λ η ψ η ς τω ν σ η μ ά τω ν γ ια α ρ ιθ μ ό α μ ιν ο ξ έω ν ά νω τω ν Α π εν α ν τία ς, η επίλυση της δ ο μ ή ς μ ε χρήση της N M R φ α σ μ α τοσκο π ία ς σε δ ιά λ υ μ α π εριέχει μ εγα λύτερ η π ρ οσομ οίω σ η της φ υ σ ικ ή ς κατά σ τα σ η ς μ ία ς π ρω τεΐνη ς σε σχέση μ ε τη στερεά κατάσταση στην κ ρ υ σ τα λ λ ο γ ρ α φ ία. Ε π ιπ λ έο ν, οι μελέτες με χρήση της N M R φ α σ μ α τοσκοπ ία ς υ π ερ τ ερ ο ύ ν ένα ν τ ι της κ ρ υ σ τα λ λ ο γ ρ α φ ία ς διότι επ ιτ ρ έπ ο υ ν τ η ν επ ιλογή π ειρ α μ α τικ ώ ν σ υ νθ η κ ώ ν α νά μ εσ α σε μ ία μ εγά λ η κ λ ίμ α κ α δ ια φ ορετικ ώ ν κ α ι ρ υ θ μ ιζό μ ενω ν π α ρ α μ έτρ ω ν όπ ω ς τω ν δ ια φ ορετικ ώ ν σ υ σ τη μ ά τω ν δια λυτώ ν, της θ ερ μ οκ ρ α σ ία ς, του p H, της ιο νικ ή ς ισ χ ύ ο ς κ,λ.π. Κ άθε π ρ ω τό νιο διαθέτει μ ία φυσική ιδιότη τα γνω σ τή ως μ α γνή τισ η, η ο π ο ία π ρ ο σ α να το λ ίζετ α ι π α ρ ά λ λ η λ α με το μ α γ ν η τ ικ ό π εδ ίο (ορ ίζετα ι ως z δ ιεύ θ υ νσ η ), ό τ α ν έ ν α δ είγ μ α χη μ ικ ή ς ένωσης,' π ο υ δια θέτει π ρ ω τό νια, εισ έρ χετα ι σε ένα μ α γ ν η τ ικ ό π εδ ίο Β0. Για τ η ν κ α τα γρ α φ ή ε ν ό ς μ ο ν ο δ ιά σ τ α τ ο υ φ ά σ μ α τος π υ ρ η ν ικ ο ύ μ α γ ν η τ ικ ο ύ σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ (N M R ), ρ α δ ιο σ υ χ ν ό τ η τ α Β1 εφ α ρ μ ό ζετα ι στο δ είγ μ α κ α ι π ρ ο κ α λ εί τη ν α πόκ λιση της μ α γ ν ή τ ισ η ς μ α κ ρ ιά α π ό τ η ν διεύ θυ νσ η z κ α ι π ρ ο ς το επ ίπ εδ ο x-y, ό π ο υ η μ α γ ν ή τισ η α π ο σ β ένετα ι. Η σ υνά ρ τη σ η α π ό σ β εσ η ς της μ α γνή τισ η ς του π υ ρ ή ν α μ ε τ ο ν χ ρ ό ν ο α π ό σ β εσ η ς κ α λείτα ι "ελεύθερη ε π α γ ό μ ε ν η απόσβεση" (Free in d u c tio n D ecay; FID) κ α ι έχει τη ν μ ο ρ φ ή μ ια ς φ θ ίν ο υ σ α ς ταλάντω σης. 54

62 w Ο μετασχηματισμός Fourier της FID α π οδίδει το κ λα σ ικ ό μ ονοδιά σ τα το N M R φάσμα Ο ι π υρήνες α τόμ ω ν Ή, 13C, 15Ν έχ ο υ ν μ ία μ α γνη τικ ή ροπή ή αλλιώ ς ιδιοστροφ ορμ ή (spin) με Ι#0 κ α ι χρη σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι στο β ιομ ορια κ ό N M R Μ ικρές πρω τεΐνες μ π ο ρ ο ύ ν ν α α ν α λ υ θ ο ύ ν με Ή N M R, α λ λ ά γ ια τη μελέτη μ εγαλύτερω ν πρω τεϊνώ ν κ α ι γ ια τη σ υλλογή επ α ρ κ ώ ν δ εδ ο μ ένω ν γ ια τ ο ν ιίροσδιορισμό τω ν διαμορφ ώ σεω ν τω ν π λευρικ ώ ν ο μ ά δ ω ν είν α ι απαραίτητη η εισαγω γή α τόμ ω ν 13C 15Ν σ τη ν πρω τεΐνη. Μ ελέτες (με N M R ) π ρω τεϊνώ ν π ο υ π ερ ιέχουν ισότοπα 13C ή 15Ν α να φ έρ ο ντα ι ως τρισδιά στα το (3D) N M R, ενώ ό τα ν είνα ι π α ρ ό ντα α μ φ ότερ α τα 13C 15Ν α ν α φ έρ ο ν τ α ι ω ς τετραδιάστατο (4D) NM R. ' 3.2 Π ειρ ά μ α τα τιτλοδότη σ η ς μ ε N M R Η N M R μελέτη της α λλη λεπίδρασης δ ύ ο β ιο μ ο ρ ίω ν σε δ ιά λ υ μ α βοη θά στην εξαγω γή π λη ρ οφ οριώ ν τόσο γ ια τη σ υ γ γ ένεια δέσμευσης τους κ α ι τη σταθερότητα τω ν εν δ υ νά μ ει σ υμ π λοκ ώ ν τους όσ ο κ α ι γ ια τα χαρακτη ρ ισ τικ ά της δομ ή ς τους, τη δυνα μ ικ ή τους και τις δ ια φ ο ρ ο π ο ιή σ εις π ο υ υφ ίσ τα ντα ι δομή κ α ι δυνα μ ικ ή, ό τα ν τα β ιομ όρια μ ε τ α β α ίν ο υ ν α π ό τη ν ελεύθερη κατάσταση σε κατάσταση σύμπλεξης. Η τιτλοδότηση χρ η σ ιμ ο π ο ιείτα ι ευρέω ς στη φ α σ ματοσκοπ ία N M R, διότι επ ιτρέπει σε σ υ νδ υ α σ μ ό με τη χα ρ τογρ ά φ η σ η της επ ιφ ά νεια ς α λλη λεπ ίδ ρ α σ η ς μεταξύ δ ύ ο π ρω τεϊνώ ν ικ α νοπ οιη τικ ό υ π ο λογισ μ ό της σ υ γ γ ένεια ς δέσμευσής τους κ α ι της στοιχειομετρίας της α λλη λεπ ίδρασης καθώ ς κ α ι τη μελέτη της κινητική της. Ο τρ όπ ος με τ ο ν ο π ο ίο μ ετα β ά λ λ ο ντα ι ο ι χη μικ ές μ ετα τοπ ίσ εις τω ν σημάτω ν σ υ ντονισ μ ο ύ τω ν α λλη λεπ ιδρώ ντω ν π ρω τεϊνώ ν σ χετίζεται άμεσα με τη ν κινητική της α λλη λεπίδρασης. Ό τ α ν ο ι δ ύ ο π ρω τεΐνες β ρ ίσ κ οντα ι σε τα χεία χημική α ντα λ λ α γή α νά μ εσ α στις δ ύ ο μ ο ρ φ ές τους, εμ φ α νίζετα ι μ ό ν ο ένα σήμα σ υ ντονισ μ ο ύ κατά τη δ ιά ρ κ εια της τιτλοδότησης και το καθεστώς της α λλη λεπ ίδ ρ α σ η ς χαρακτη ρ ίζετα ι ω ς ασθενές. Α ντίθετα, ό τα ν βρίσ κ οντα ι σε "αργή χη μ ικ ή α ντα λ λ α γ ή, εμ φ α νίζο ντα ι διακριτά σήματα σ υ ντονισ μ ο ύ κατά 55

63 τη διάρκεια της τιτλοδότησης και το καθεστώς της αλληλεπίδρασης χαρακτηρίζεται ως ισχυρό. 3.3 Δ Ε ΙΚ Τ Η Σ Χ Η Μ ΙΚ Η Σ Μ Ε Τ Α Τ Ο Π ΙΣ Η Σ Η τεχνικ ή του δείκτη χη μ ικ ή ς μ ετα τόπ ισ η ς (CSI) χρη σ ιμ ο π ο ιείτα ι ευρέω ς γ ια το π ο σ ο τικ ό π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό και εντοπισ μ ό της δ ευ τερ ο τα γούς δ ο μ ή ς τω ν π ρω τεϊνώ ν. Η χη μικ ή μετατόπιση έχει π ο λ ύ σ η μ α ντικ ό α λ λ ά έμ μ εσ ο ρ ό λ ο στο π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό της δομ ή ς με N M R. Η τεχνικ ή αυτή βασίζετα ι στο γ ε γ ο ν ό ς ότι οι χη μ ικ ές μ ετα τοπ ίσ εις δ ια φ ορετικ ώ ν π υ ρ ή ν ω ν της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς μ ια ς π ρ ω τεΐνη ς σ χετίζο ντα ι με το τπ Το του α μ ιν ο ξ έο ς α λ λ ά κ α ι μ ε τη φύση της δ ευ τερ ο τα γούς δομ ή ς σ τη ν ο π ο ία β ρ ίσ κ ο ντα ι. Η π α ρ ά μ ετρ ο ς αυτή επ η ρ εά ζετα ι α ρκετά α π ό το π ε ρ ιβ ά λ λ ο ν του σ υ γκ εκ ρ ιμ ένο υ π υ ρ ή ν α. Ε π ο μ ένω ς σε μ ια α να δ ιπ λ ω μ ένη πρω τεΐνη μ π ο ρ ο ύ μ ε ν α ξεχω ρ ίσ ουμ ε τα π ο λ λ α π λ ά α ν τ ίγ ρ α φ α του ίδ ιο υ α μ ινο ξέο ς με βάση τ η ν χη μ ικ ή μ ετα τόπ ισ η τους, η ο π ο ία εξα ρ τά τα ι α π ό τη δια μ όρφ ω ση. Υ π ά ρ χ ει έ ν α σ η μ α ντικ ό σ ύ ν ο λ ο δ εδ ο μ ένω ν π υ ρ ή ν ω ν Ή, 13C κ α ι 15Ν γνω σ τώ ν τρ ισ δ ιά σ τα τω ν δ ο μ ώ ν N M R π ρ ω τεϊνώ ν, το ο π ο ίο δ η μ ιο υ ρ γ εί τη βάση γ ια έ ν α μ ε γ ά λ ο α ρ ιθ μ ό εμ π ειρ ικ ώ ν σ υσχετίσ εω ν με δομ ικ ές π α ρ α μ έτρ ο υ ς. Για τη λ επ το μ ερ ή α νά λ υ σ η τω ν φ α σ μ ά τ ω ν N M R θ α π ρ έπ ει η π λη θώ ρ α τω ν α π ο ρ ρ ο φ ή σ εω ν σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ ν α π α ρ α τ η ρ η θ ο ύ ν ω ς ξεχω ριστές κ ορυφ ές. Για έ ν α π ρ ω τεϊνικ ό φ ά σ μ α α υ τό κ α θ ίσ τα τα ι δ υ ν α τ ό μ ό ν ο στο π ο λ υ δ ιά σ τα το φ ά σ μ α N M R μ ε τη χρή σ η ο ρ γ ά ν ω ν N M R σε υ ψ η λ ό μ α γ ν η τ ικ ό π εδ ίο της τάξεω ς τω ν 600 M H z ή κ α ι π α ρ α π ά ν ω στη π ερίπτω ση του π υ ρ ή ν α π ρ ω το νίο υ. Η δ ια δ ικ α σ ία αυτή χ ρ η σ ιμ ο π ο ιεί τ η ν π ρω τεϊνικ ή α κ ο λ ο υ θ ία γ ια ν α σ υ νδ έσ ει τα α μ ιν ο ξ έα τα ο π ο ία γ ε ιτ ν ιά ζ ο υ ν μ ετα ξύ το υ ς σ τη ν α κ ο λουθία. Για π ρ ω τεΐνες με μ ο ρ ια κ ό β ά ρ ο ς μ ικ ρ ό τερ ο α π ό 10 k D a δ εν κ ρ ίνετα ι α ν α γ κ α ία η επ ισ ή μ α νσ ή τους με 13C ή 15Ν κ α ι ο σ υ ν δ υ α σ μ ό ς φ α σ μ ά τω ν 2D TO CSY κ α ι 2D N O E SY συνή θω ς επ ιτρ έπ ει τη σωστή τα υτοποίη σ η τω ν π ρ ω το νίω ν. Σ υ γ κ ρ ίν ο ν τ α ς τη χη μ ικ ή 56

64 μετατόπιση ενό ς π υ ρ ή να ενό ς α μ ινο ξέο ς με μ ια τιμή α να φ ο ρ ά ς, είνα ι π ιθ α νό ν α προβλεφ θεΐ η δευτεροταγής δομή στην ο π ο ία α νή κ ει ο π υ ρ ή ν α ς αυτός. Η τιμή α να φ ο ρ ά ς α να φ έρ ετα ι στη χημικ ή μετατόπιση το υ ίδιου π υ ρ ή ν α σε διαμόρφ ω ση τυ χα ία ς διαμόρφω σης. Το π είρ α μ α 2D 1Η -1Η TOCSY α νιχ νεύ ει α λλη λεπ ιδράσεις μέσω δεσμού μεταξύ τω ν π ρω τονίω ν κ α ι μ ε αυτό το τρ ό π ο είν α ι δ υ ν α τ ό ν α συσ χετιστούν τα Τιρωτόνια ενό ς α μ ινοξέος, α λ λ ά δ εν επιτρέπει τη σ ύνδεσ η τω ν γειτονικ ώ ν α μ ινο ξέω ν στην πολυπεπ τιδικ ή α λυσίδα. Μ ε τη ν ολοκ λη ρ ω μ ένη α νά λ υ σ η του φ ά σ μ α τος TOCSY, κάθε α μ ινο ξύ α ντιπ ρ οσ ω π εύετα ι α π ό έ ν α σύστημα spin. Καθώς όμω ς ένα α μ ινο ξύ α π α ντά τα ι π α ρ α π ά ν ω α π ό μ ια φ ο ρ ά στην πολυπεπ τιδικ ή α λυσίδα, καθίσταται α δ ύ να τη η α πευθεία ς τα υτοποίη σ η σε μ ια συγκεκριμένη θέση σ τη ν ακολουθία. Για το σ κ ο π ό α υ τό χρ η σ ιμ ο π ο ιείτα ι το φ ά σ μ α 2D 1Η -1Η NOESY, με το ο π ο ίο τα sp in τοπ ο θ ετούντα ι στη σωστή σ ειρ ά στην α κ ολουθία και επ ομ ένω ς επ ιτυ γχά νετα ι η π λ ή ρ η ς τα υτοποίη σ η της α λλη λουχία ς. Σε μεγαλύτερες πρω τεΐνες η επ ικ ά λυψ η σ η μ ά τω ν εμ π ο δ ίζει τη πλήρη ταυτοποίηση όλω ν τω ν Ή στο π ρω τεϊνικ ό φ ά σ μ α. Στις περιπτώ σεις αυτές χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι οι τεχνικ ές N M R τρ ιώ ν δια σ τά σ εω ν καθώ ς κ α ι πρω τεΐνες επ ισημασμένες με 13C κ α ι 15Ν. Μ ε α υτό το τρ ό π ο μ π ο ρ ο ύ ν ν α μελετη θούν μ όρια με μ ορια κ ό βάρ ος ν α π ρ ο σ εγγίζει τα 35 kd a. 3.4 Σ Τ Α Θ Ε Ρ Ε Σ Σ Υ Ζ Ε Υ Ξ Η Σ Στις πρω τεΐνες, οι συζεύξεις J π έρ α α π ό τρεις χη μ ικ ο ύ ς δεσ μ ούς είνα ι συνήθω ς π ά ρ α π ολύ μικρές γ ια ν α π α ρ α τη ρ η θ ούν. Τα π ειρ ά μ α τα N M R π ο υ σ υσχετίζουν τους δια φ ορετικ ούς π υ ρ ή ν ες μέσω της σύζευξης J α να φ έρ ο ντα ι * ' σ υ χ ν ά ως π ειράματα COSY (COSY, correlated spectroscopy). Έ να σημαντικ ό χαρακτη ριστικό γνώ ρ ισ μ α τω ν π ειρ α μ ά τω ν α υτώ ν είνα ι, ότι μ π ο ρ ο ύ ν ν α μ ετα φ έρ ουν τη μ α γνή τισ η μεταξύ τω ν δια φ ορετικ ώ ν τύ π ω ν π υ ρ ή νω ν. Μ ε ^αυτό το τρ όπ ο η μ α γνή τισ η μ π ο ρ εί ν α μεταφερθεί α π ό ένα π υ ρ ή να σε έ ν α ν ά λ λ ο ή δ ιά φ ο ρ ο υ ς ά λ λ ο υ ς τύ π ους π υ ρ ή ν ω ν κατά τη διά ρκεια του π ειράματος. 57

65 Ο π υ ρ ή ν α ς π ρ ω το νίο υ είν α ι ο π ιο ευα ίσθητος τύ π ο ς π υ ρ ή νω ν. Κ ατά σ υ νέπ εια π ο λ λ ά π ειρ ά μ α τα N M R με τα β ιο λ ο γ ικ ά μ α κ ρ ο μ ό ρ ια α ρ χ ίζ ο υ ν μ ε τη μ α γνή τισ η π ρ ω το ν ίω ν κ α ι μ ετα φ έρ ο υ ν το σήμα μέσω τω ν ετερ ο π υ ρ ή νω ν (όπ ω ς του ά νθ ρ α κ α ή / κ α ι αζώ του) πίσω στα π ρ ω τό νια γ ια τ η ν κ α τα γρ α φ ή του FID μ ε τη μέγιστη ευαισθησία. Το μ έγεθ ο ς τω ν τιμ ώ ν τω ν σ τα θερώ ν σύζευξη ς μέσω τρ ιώ ν δεσμώ ν, 3J, εξα ρ τά τα ι α π ό τη δίεδρη γ ω ν ία θ π ο υ σ χ η μ α τ ίζο υ ν τα επ ίπ εδ α τω ν τρ ιώ ν π ρ ώ τω ν κ α ι τω ν τρ ιώ ν τελευ τα ίω ν α τόμ ω ν π ο υ σ υ μ μ ετέχο υ ν σε σ ειρ ά τεσ σ ά ρ ω ν σ τοιχείω ν (π.χ Η -Χ -Υ -Η ) κ α ι σ υ νεπ ώ ς μ π ο ρ εί ν α σ υ νεισ φ έρ ει στη μελέτη της δ ευ τερ ο τα γούς δ ια μ όρφ ω σ η ς β ιομ ορίω ν. Η εξάρτηση της σύζευξη ς α υ τή ς α π ό τη δίεδρη γω ν ία δ ίνετα ι α π ό τη ν εξίσωση K arplus J=A cos2(0)+ B cos(0)+c (1) Ό π ο υ A, Β κ α ι C α π ο τ ελ ο ύ ν π α ρ ά μ ετρ ο υ ς π ο υ εξα ρ τώ ντα ι α π ό το σ υ γ κ εκ ρ ιμ ένο μ ό ρ ιο. Για π α ρ ά δ ειγ μ α, η σταθερά σ ύζευξη ς μ ετα ξύ του α μ ιδ ικ ο ύ π ρ ω το νίο υ κ α ι του α -π ρ ω τ ο νίο υ, J h n c q εξα ρ τά τα ι α π ό τις τιμ ές της γ ω ν ία ς φ (θ=φ -60) όπ ω ς φ α ίν ετα ι ακολούθω ς: 3 jh N C a = 6.51cos2(cp-60)- 1.76cos(cp-60) (3) Η εξίσω ση K arplus έχει χ ρ η σ ιμ ο π ο ιη θ εί γ ια σε υ π ο λ ο γ ισ μ ο ύ ς γ ω νιώ ν δ εσ μ ώ ν κ α ι επ ο μ ένω ς δια μ ορφ ώ σ εω ν. Α π ό τ η ν εξίσωση K arplus ε ίν α ι π ρ ο φ α ν έ ς ότι δια φ ορετικ ές τιμ ές φ α ν τ ισ τ ο ιχ ο ύ ν σε μ ια σ υγκ εκ ρ ιμ ένη τιμή J. Ε πίσης, η ύ π α ρ ξη μ έσ ο υ ό ρ ο υ δ ια μ ο ρ φ ώ σ εω ν (conform ational a v era g in g ) θα μ π ο ρ ο ύ σ ε ν α ο δ η γή σ ει σε τιμές J π ο υ α ν τ ισ τ ο ιχ ο ύ ν σ τ ο ν μ έσ ο ό ρ ο (6-7 H z) ο ι ο π ο ίες ε ίν α ι δ ύ σ κ ο λ ο ν α α π ο δ ο θ ο ύ ν σε κ ά π ο ια σ υγκ εκ ρ ιμ ένη δευτερ οτα γή δ ια μ ό ρ φ ω σ η. Έ τσι ο ι π ιο α ξιόπ ισ τες τιμές ε ίν α ι jhnca~ 9-10 H z (εκτεταμένες δ ο μ ές β-π τυχω τού φ ύ λ λ ο υ ) κ α ι 3-4 Η ζ (δομ ή α-έλικας). Π α ρ ό μ ο ιες κ α μ π ύ λ ες 58

66 K arplus υ π ά ρ χ ο υ ν κ α ι γ ια τις σταθερές σύζευξης C H -C H α π ό τις οποίες ρ π ο ρ ο ύ ν ν α λ η φ θ ούν ο ι γω νίες χ. 3.5 Το φαινόμενο ΝΟΕ Ο ι μέσω χώ ρ ο υ συσχετισμοί π υ ρ η νικ ή ς επ ίδρασης O verh au ser (Ν Ο Ε), π α ρ έχουν τη βάση γ ια τις γεω μετρικές π λη ρ ο φ ο ρ ίες π ο υ α π α ιτούντα ι γ ια ν α κ α θ ορίσ ουν τη δομή ενό ς μ α κ ρομ ορίου. Το φ α ιν ό μ ενο Ν Ο Ε είνα ι σ υ νέπ εια της μεταβολής της σύζευξης δ ιπ ό λ ο υ -δ ιπ ό λ ο υ μ εταξύ διαφ ορετικώ ν π υρηνικ ώ ν spin λόγω της κ ίνη σης B row n τω ν μ ο ρ ίω ν στο δ ιά λυμ α, η δε ένταση αυτού σχετίζεται με τη ν απόσταση r, μεταξύ του α κ τινο β ο λ ο ύ μ ενο υ κ α ι του π α ρ α τη ρ η μ ένου sp in κ α ι με το χ ρ ό ν ο π ερισ τροφ ή ς του μ ο ρ ίο υ με τη γενικ ή εξίσωση της μ ορφ ή ς V= 1 / r6f(tc) Λ όγω της εξάρτησης α π ό τη ν αντίστροφ η έκτη δ ύ να μ η της α π όσ τα σ η ς μεταξύ τω ν π υ ρ ή νω ν η ένταση Ν Ο Ε μειώ νετα ι καθώ ς α υ ξά νετ α ι η α πόσταση. Η δια δικασία κ α τα γρ α φ ή ς δισδιά στα τω ν φ α σ μ ά τω ν N M R α φ ο ρ ά στην απόκτηση δεδομ ένω ν στις καλύτερες δυνα τές συνθήκες ευα ισθησία ς και α νά λυσης της μεθόδου. Για το λ ό γ ο α υτό, έχει μ εγά λη σ η μ α σ ία η επ ιλογή της κ ατάλλη λη ς π α λμ ικ ή ς α κ ολουθία ς κ α ι τω ν π α ρ α μ έτρ ω ν π ο υ επ ιλ έγοντα ι γ ια τη ν εκτέλεση τω ν π ειρ α μ ά τω ν. Ο ι π α ρ ά μ ετρ ο ι π ο υ επ ιλ έγοντα ι είνα ι σ υ νυ φ α σ μ ένες με το λ εγόμ ενο σχετικό χ ρ ό ν ο π ερ ισ τρ οφ ή ς του μ ο ρ ίο υ, xc 4 ("correlation tim e") τ0= 4 π π α 3/3 Κ Τ όπ ου, n = ιξώδες του διαλύτη y α = α κ τίνα του σ φ α ιρ ικ ού μ ο ρ ίο υ. Κ= σταθερά B oltzm an 59

67 Τ= θ ερ μ ο κ ρ α σ ία Τ α μ ικ ρ ά μ ό ρ ια (μικρή τιμή γ ια α) π ερ ισ τρ έφ ο ντα ι τα χύ τερ α κ α ι α υ τό σ η μ α ίν ει ότι έ χ ο υ ν μ ικ ρ ότερ ο το κ α ι μ εγα λ ύ τερ ο υ ς χ ρ ό ν ο υ ς α π ο δ ιέγερ σ η ς Τι. Τ ο α ν τ ίσ τ ρ ο φ ο σ υ μ β α ίν ει γ ια μ εγά λ α μ ό ρ ια (μ εγα λύτερ ες τιμές α, μ εγα λύ τερ ο το κ α ι μ ικ ρ ό τερ ο υ ς χ ρ ό ν ο υ ς Τι). Τ α πειράμοττα N M R π ο υ μ ετρ ο ύ ν το Ν Ο Ε α ν α φ έρ ο ν τ α ι σ υ χ ν ά ω ς π ειρ ά μ α τ α N O E SY, (N O ESY, N O E SpectroScopY ). Σε ένα φ ά σ μ α N O E 2D μ ια ς π ρ ω τεΐνη ς μ ο ρ ια κ ο ύ β ά ρ ο υ ς π ερ ίπ ο υ lo kd a π α ρ α τ η ρ ο ύ ντα ι τυ π ικ ά 1000 μ ε 2000 κ ο ρ υ φ ές δια σ τα ύρω σης. Θ α μ π ο ρ ο ύ σ ε ν α υποτεθεί ότι η σχέση μ ετα ξύ Ν Ο Ε κ α ι α π ό σ τα σ η ς (N O E ο r 6) κ α ι η π λη θώ ρ α του α ρ ιθ μ ο ύ Ν Ο Ε, μ π ο ρ εί ν α ο δ η γή σ ει σ το ν α κ ρ ιβή π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό α π ο σ τά σ εω ν κ α ι σ υ νεπ ώ ς τρ ισ δ ιά σ τα τω ν δ ο μ ώ ν. Π α ρ ό λ α α υτά, υ π ά ρ χ ο υ ν δ ύ ο σ ο β α ρ ο ί λ ό γ ο ι γ ια τους ο π ο ίο υ ς δ εν ε ίν α ι δ υ ν α τ ό ς ο επ α κ ρ ιβ ή ς π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς α ποσ τά σ εω ν. Ο π ρ ώ το ς ε ίν α ι η τοπική ευκ ινη σία. Ε πίσης, ε ά ν υ π ά ρ χ ει ισ ο ρ ρ ο π ία δ ια μ ο ρ φ ώ σ εω ν, η εξάρτηση r 6 δ ίνει π ερ ισ σ ότερ ο στατιστικό β ά ρ ο ς στις μ ικ ρ ές α π οσ τά σ εις. Έτσι, ο ι π ρ α γ μ α τ ικ ές α π ο σ τά σ εις μ π ο ρ εί ν α ε ίν α ι μ εγα λύτερ ες α υ τώ ν π ο υ π ρ ο κ ύ π τ ο υ ν λ α μ β ά ν ο ν τ α ς έ ν α ν μ έσ ο ό ρ ο α π οσ τά σ εω ν. Ο δεύτερος π α ρ ά γ ο ν τ α ς ε ίν α ι το φ α ιν ό μ ε ν ο δ ιά χυσης τω ν sp in (sp in d iffu sio n ). T o φ α ιν ό μ ε ν ο α υ τ ό οφ είλετα ι στη μ ετα φ ο ρ ά μ α γνή τισ η ς A...B...C κ α τά τη δ ιά ρ κ εια τ ο υ χ ρ ό ν ο υ α νά μ ειξη ς Tm, π α ρ ό τι τα Α κ α ι C δ ε ν ε ίν α ι σε γειτνία σ η κ α ι σ υ νεπ ώ ς δ ε ν θα έπ ρ επ ε ν α π α ρ α τη ρ η θ εί κ ορυφ ή δ ια σ τα ύρω σ η ς Ν Ο Ε μ ετα ξύ τω ν δ ύ ο. Μ ό ν ο ν γ ια π ο λ ύ μ ικ ρ ο ύ ς χ ρ ό ν ρ υ ς τς α υ τό τ ο ενδ ιά μ εσ ο μ ο ν ο π ά τ ι κατα στέλλεται. Γ ενικ ά σ τ ο ν π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό της δομ ή ς, ο ι π λ η ρ ο φ ο ρ ίες γ ια τ η ν γεω μετρική δ ια μ ό ρ φ ω σ η στη μ ορφ ή α π ο σ τά σ εω ν κ α ι/ή γ ω ν ιώ ν σ τρ έψ η ς π ρ ο έρ χ ο ν τ α ι α π ό δ εδ ο μ ένα N M R. Σ η μ α ντικ ές π λ η ρ ο φ ο ρ ίες π α ίρ ν ο υ μ ε α π ό τις μετρήσεις Ν Ο Ε ο ι ο π ο ίες π α ρ έ χ ο υ ν π λ η ρ ο φ ο ρ ίες α π ό σ τα σ η ς μ ετα ξύ ζευ γ ώ ν π ρ ω τονίω ν. Ε π ιπ λ έο ν π ερ ιο ρ ισ μ ο ί π ρ ο έ ρ χ ο ν τ α ι α π ό τις σ υσχετίσεις δ εσ μ ώ ν σε μ ορφ ή δ ίεδ ρ ω ν γ ω νιώ ν, α π ό τα δ εδ ο μ ένα CSI κ α ι α π ό το υ ς δ εσ μ ο ύ ς υ δ ρ ο γ ό ν ο υ. Μ ε έ ν α ικ α νο π ο ιη τ ικ ό α ρ ιθ μ ό δ ο μ ικ ώ ν π ερ ιορισ τικ ώ ν σ υ νθ η κ ώ ν, μ π ο ρ εί ν α 60

68 m προσδιοριστεί η τριτοταγής δομή μ ια ς πρω τεΐνης. Για έ ν α ν υψ η λής διακριτικής α νά λυσης π ρ οσ δ ιορισ μ ό δομ ή ς π ρ έπ ει ν α συλλεχθεί ο μέγιστος δ υ να τός α ρ ιθμός ΝΟΕ. Σ χ ή μ α 2 4 : Σ υ ν ά ρ τ η σ η τ ο υ 1Η - 1Η Ν Ο Ε α π ό τ ο τ 0 τ ο υ μ ο ρ ί ο υ (ω ε ί ν α ι η σ υ χ ν ό τ η τ α τ ο υ χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ μ ε ν ο υ φ α σ μ α τ ο γ ρ ά φ ο υ Π υ ρ η ν ικ ο ύ Μ α γ ν η τ ι κ ο ύ Σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ ). Π α ρ α τ η ρ ο ύ μ ε π ω ς ο ι τ ιμ έ ς Ν Ο Ε ε ί ν α ι θ ε τ ικ έ ς ό τ α ν τ ο μ ό ρ ι ο έ χ ε ι μ ι κ ρ ή τ ι μ ή ic ( γ ρ ή γ ο ρ η π ε ρ ισ τ ρ ο φ ή ) κ α ι α ρ ν η τ ικ έ ς ό τ α ν τ ο xc α π ο κ τ ά μ ε γ α λ ύ τ ε ρ ε ς τιμ ές. 3.7 Φασματοσκοπία τριών διαστάσεων και προσδιορισμός πρωτεινικής δομής Η δ ια φ ο ρ ά και το α δια μ φ ισβήτη το π λεονέκ τη μ α του N M R, σε σύγκριση με ά λλες τεχνικ ές φ α σ μ α τοσκοπ ία ς, έγκειται στο γ ε γ ο ν ό ς ότι κάθε π ρ ω τόνιο χα ρ α κ τη ρ ίζετα ι α π ό μ ία σ υγκεκριμ ένη σ υ χνότη τα σ υ ντονισ μ ο ύ στο φ ά σ μ α, η ο π ο ία μ π ο ρ εί ν α ταυτοποιηθεί εύκολα με τη χρήση τεχνικ ώ ν φ α σ μ α τοσκοπ ία ς 2, 3 ή κ α ι 4 διαστάσεω ν. Τ α π ειρ ά μ α τα τρ ιώ ν δια σ τά σ εω ν π α ρ έ χ ο υ ν τη ν δυνατότη τα της τα υτοποίησης α κ ολουθια κ ώ ν συζεύξεω ν μέσω ι] κ α ι 2Jcoupling/ua ο π ο ία χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι γ ια τη συσχέτιση τω ν α μ ινοξέω ν. Τα περισσότερα π ειρ ά μ α τα χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ν τους π υ ρ ή ν ες Ή, 15Ν, 13C και γ ια το λ ό γ ο α υτό α να φ έρ ο ντα ι ως π ειρ ά μ α τα τρ ιπ λ ο ύ σ υ ντονισ μ ο ύ. Τα π ειράματα 3D σ υ σ χετίζουν α ποκλειστικά τους σ υ ντονισ μ ο ύ ς της κύριας α λυσίδα ς (H N (i), N (i), C a(i), H a (i), C a (i-l), C O (i) κ α ι C O (i-l)). Τα πειράματα 3D π ο υ χρη σ ιμ ο π ο ιο ύ ντα ι σ τη ν α να γ νώ ρ ισ η τω ν σ υ ντονισ μ ώ ν της κύριας αλυσίδα ς είνα ι, συνήθω ς τα εξής: H N C A,H N C A C B, H N (C O )C A, H N (C O )C A C B, H N C O, H N (C A )C O κ α ι H N H A. Η στρατηγική που 61

69 α κ ο λ ο υ θ είτ α ι μ π ο ρ ε ί εύ κ ο λα ν α εξηγηθεί μέοω του π α ρ α κ ά τω H N C A π ειρ ά μ α τος: Έ να φ ά σ μ α H N C A έχει τρεις ά ξο νες Ή, 15Ν κ α ι 13C. Σ υσχετίζει το α μ ιδ ικ ό π ρ ω τ ό ν ιο μ ε το C a ά τ ο μ ο του ίδ ιο υ κ α ι του π ρ ο η γ ο ύ μ ενο υ, σ τη ν α κ ολουθία, α μ ινο ξέο ς. Μ ία Ή / 15Ν π ρ ο β ο λ ή του φ ά σ μ α τος μ ο ιά ζει μ ε ένα 1Η - 15Ν H S Q C φ ά σ μα: κάθε σ ή μ α α ντιπ ρ ο σ ω π εύ ει ένα α μ ινο ξύ. HNCA!cu, Η" - Ν; w, 11_ N 15k ι 13λ ι * Η",- N.- C'M ι H - C - H R I H -C -H Η διά κ ρ ισ η ενδ ο α μ ιν ο ξ ικ ώ ν κ α ι δ ια μ ινο ξικ ώ ν σ η μ ά τω ν γ ίν ε τ α ι μ ε τη βοή θ εια ε ν ό ς H N ( C O ) C A π ειρ ά μ α το ς, το ο π ο ίο επίσης σ υσχετίζει το α μ ιδ ικ ό π ρ ω τό νιο μ ε C a ά ν θ ρ α κ α του π ρ ο η γ ο ύ μ ε ν ο υ α μ ινο ξέο ς. Η μ α γνή τισ η μ ετα φ έρετα ι μέσω του C O α τό μ ο υ, ά ρ α β λ έπ ο υ μ ε μ ό ν ο μ ια δ ια μ ινο ξικ ή κ ορ υφ ή. HN(CO)CA * ΉΝ, - 15Ν - 13Cu,t Rest i -1 Rest i Σ υ χ ν ά, η α π οτίμ η σ η τω ν σ η μ ά τω ν σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ μ ε τη χρή σ η τω ν φ α σ μ ά τω ν α υ τώ ν ε ίν α ι α μ φ ίβ ο λ η, γ ια τί π α ρ α τη ρ είτα ι τ υ χ α ίο ς εκ φ υ λ ισ μ ό ς τω ν C a σ υ χνο τή τ ω ν γ ια τελείω ς δ ια φ ο ρ ετικ ά α μ ινο ξέα. Σ υσχετίσεις μέσω ά λλω ν π υ ρ ή ν ω ν χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ν τ α ι γ ια τη επ ίλυση α υ τώ ν τω ν α βεβαιοτή τω ν, όπω ς 62

70 9 γ ια π α ρ ά δ ειγμ α συσχετίσεις, ο ι οποίες π ρ ο κ ύ π τουν α π ό τα π ειρ ά μ α τα H N C O και H N (C A )C O. Α υτά τα δ ύ ο π ειράματα σ υ σ χετίζουν το α μ ιδικ ό π ρ ω τόνιο τω ν ενδ ό - και δ ια - α μ ινοξικ ώ ν C O -ατόμω ν. Α π ο τ ελ ο ύ ν δη λαδή μ ια ανεξάρτητη εναλλακτική μ έθοδο ελ έγχου τω ν α κ ολουθια κ ώ ν συζεύξεω ν. Έ να ά λλο ζευ γά ρ ι τρισδιάστατω ν π ειρ α μ ά τω ν π ο υ α π ο τ ελ ο ύ ν μ ια άλλη εναλλακτική ο δ ό τα υτοποίησης είνα ι τα H B H A ( C B C A C O )N H και * H B H A (C B C A )N H π ειράματα. HBHA(CBCACO)NH Ή ", - 1sNj - Ή ρμ / Ή μ HBHA(CBCA)NH R 1ΗΝ, - 15Ν, - Ήρ, / Ή 1ΗΝ, - 15Ν, - Ήρμι / Ή μι C II ο R esti-1 Resti 4 > τα ο π ο ία σ υ σ χετίζουν το α μ ιδ ικ ό π ρ ω τό νιο μέσω Η α κ α ι Η β σ υχνοτή τω ν και * τα παρεμ φ ερή C B C A ( C O )N H και C B C A N H, τα ο π ο ία σ υ σ χετίζο υ ν α μ ιδικά π ρω τόνια μέσω C a κ α ι C p σ υχνοτή τω ν. 63

71 CBCA(CO)NH CBCANH ΉΝ, - 1SN(- 1,CP, / 1JC ΉΝ, - 15Nj- 13cfiM/ 1JcrM Rest i -1 Resti Ο α κ ο λ ο υ θ ια κ ό ς π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς σ η μ ά τω ν σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ μέσω τρ ισ διά σ τα τω ν π ειρ α μ ά τω ν π α ρ έχ ει μ ό ν ο τη συσχέτιση μ ετα ξύ τω ν α νεξά ρ τη τω ν sp in sy ste m s, ό χ ι όμ ω ς το είδ ος του κάθε α μ ινο ξέο ς. Α υ τό π ρ ο σ δ ιο ρ ίζετ α ι μέσω T O C SY -H SQ C κ α ι H C C H -T O C SY π ειρ α μ ά τω ν. H - C - H I H - C - H I Ν C C I I II Η Η 0 HCCH-TOCSY Ή" - Ήρ; - Ή - Rest i -1 Rest i Σ υ μ π ερ α σ μ α τικ ά η στρατηγική π ο υ α κ ολουθείτα ι π ε ρ ιλ α μ β ά ν ε ι 3 βήματα: 1) κ α τα γρ α φ ή δ ύ ο ή τρ ιώ ν α νεξά ρ τη τω ν ζευ γ ώ ν τρ ισ δ ιά σ τα τω ν π ειρ α μ ά τω ν (σ υνή θ ω ς συσχέτιση μ ετα ξύ C a κ α ι C O ) 64

72 9 2) π ρ οσ διορ ισ μ ός της α μ ινοξικ ή ς ακολουθίας. Η επιβεβαίω ση γ ίνετα ι μέσω H N C A και H N (C O )C A και η προκαταρκτική ταυτοποίηση του είδους τω ν α μ ινοξέω ν μέσω C B C A C O N H και C B C A N H π ειραμάτω ν. 3) ταυτοποίηση τω ν π λευρικ ώ ν α λυσίδ ω ν με τη βοή θεια π ειρ α μ ά τω ν H B H A (C B C A C O )N H, T O C S Y - H S Q C κ α ι H C C H -T O C S Y. Τ ο τελικό αποτέλεσμα α π ό τη ν τα υτοποίηση τω ν σημάτω ν N M R είνα ι μια λίστα με π ερ ιο ρ ισ μ ο ύ ς σ τ η ν α π ό σ τα σ η (d istance constrains) μεταξύ σ υγκ εκ ρ ιμ ένω ν ζευ γώ ν α τόμ ω ν π ρ ω τονίου α π ό δ ύ ο δια φ ορ ετικ ά κ α τά λοιπ α. Α ρ χικ ά π ροσ διορ ίζετα ι μ ια τυ χα ία α να δ ιπ λ ω μ ένη δομ ή με βάση εμ πειρ ικ ά δ εδ ο μ ένα (μήκη κ α ι γω νίες δεσμώ ν) κ α ι τη γνω στή α μ ινοξικ ή α κ ολουθία. Το π ρ ό γ ρ α μ μ α τότε π ρ οσ π α θ εί ν α α να δ ιπ λώ σ ει τ η ν α ρ χικ ή δομή με τη ν μικρότερη δυνατή ενέρ γεια, λ α μ β ά ν ο ν τ α ς υ π ό ψ ιν τις ευρεθείσες δια π ρω τονια κ ές αποστάσεις. Ο ρ ό λ ο ς τω ν π εριορισ τικ ώ ν ό ρ ω ν π ο υ εισ ά γοντα ι στους δ ομ ικ ούς υ π ο λ ο γ ισ μ ο ύ ς εντοπίζετα ι στο συστηματικό α ποκ λεισμό ενό ς εξαιρετικά μ εγά λ ο υ α ρ ιθ μ ο ύ π ιθ α ν ώ ν δια μ ορ φ ώ σ εω ν του μ ορίου στο χώ ρο. Μ ετά τη ν ολοκλήρω ση τω ν υ π ο λ ο γ ισ μ ώ ν, σ υλλέγετα ι ένα ς σ υγκ εκ ρ ιμ ένος α ριθμός δομ ώ ν με τη χα μ η λότερη τιμή της σ υνά ρ τη σ η ς (target function), π ο υ α π ο τελ ο ύ ν τη ν ο ικ ο γ ένεια δομ ικ ώ ν μ οντέλω ν. Τα μ οντέλα α υτά π ρ έπ ει ν α τη ρ ο ύ ν κ ά π οια κ ριτήρια α κ ρ ίβεια ς κ α ι ν α σ υ γ κ λ ίν ο υ ν π ρ ος μ ια διαμόρφ ω ση. Η π οιότη τα τω ν υ π ο λ ο γισ θ έντω ν δ ο μ ώ ν χαρακτη ρ ίζεται α π ό τη μέση απόκλιση τω ν σ υ ντετα γμ ένω ν κάθε μ έλους της οικ ο γένεια ς α π ό τη μέση δομή (RMSD: root m ea n square d eviation ). Ό σ ο μικρότερη είνα ι η απόκλιση, τόσο υψ ηλότερη είνα ι η α κ ρ ίβεια τω ν υ π ολογισ θ έντω ν δομώ ν. Υ ψ ηλές τιμές RM SD είνα ι το α π οτέλεσμα έλλειψ η ς ικ α νοπ οιη τικ ού α ριθμού «πειραματικ ώ ν δομικώ ν δ εδ ο μ ένω ν κ α ι π α ρ α τη ρ είτα ι συνήθω ς σε τμήματα π ολυπεπ τιδ ικ ώ ν α λυσίδ ω ν με ευκινη σ ία ή χω ρίς δευτεροταγή δομή. 65

73 Σ χ ή μ α 25: Α π ε ι κ ό ν ι σ η μ ι α ς ο ικ ο γ έ ν ε ια ς δ ο μ ώ ν. Ο ι π ε ρ ιγ ρ α μ μ έ ν ε ς δ ο μ έ ς ε μ φ α ν ί ζ ο υ ν υ ψ η λ ή τ ι μ ή R M S D α\ 66

74 EflCOTrOE Ί.WLMMVKBWL

75 Τη βάση γ ια το σ χεδία σ μ ά κ α ι τη ν εκτέλεση α υτή ς τη ς δ ια τριβ ή ς α π οτέλεσ ε η μελέτη του μ η χ α νισ μ ο ύ π ο υ εξα σ φ α λίζει τη ν ομ οιόσ τα σ η του χ α λ κ ο ύ σ τους ευκαρυω τικ ούς κ α ι π ρ οκ α ρ υω τικ ούς ο ρ γ α ν ισ μ ο ύ ς. Η ομ ο ιό σ τα σ η του χ α λ κ ο ύ σ τ ο ν α ν θ ρ ώ π ιν ο ο ρ γ α ν ισ μ ό, ό π ω ς α να λ ύ θ η κ ε λ επ τομ ερ ώ ς π ρ ο η γ ο υ μ ένω ς, είνα ι α π ο τέλεσ μ α π ο λ ύ π λ ο κ ω ν λ ειτ ο υ ρ γ ιώ ν π ο υ γ ίν ο ν τ α ι σε έ ν α κ ύττα ρ ο, α λ λ ά μ έχρ ι σ τιγμ ή ς π ο λ λ ά ερω τήματα π α ρ α μ έ ν ο υ ν α ν α π ά ν τ η τ α σχετικ ά μ ε τη δ ια δ ικ α σ ία αυτή. Η π ρ ο σ ο χ ή μ α ς εστιάστηκε στις δ ύ ο ο μ ό λ ο γ ες π ρω τεΐνες σ τ ο ν ά νθ ρ ω π ο π ο υ σ υ μ μ ετ έχο υ ν στο μ ο ν ο π ά τ ι μ ετα φ ο ρ ά ς του χ α λ κ ο ύ στο κ ύττα ρ ο, τις H S c o l κ α ι H S co2 (H u m a n S c o l/2 ). Στη π α ρ ο ύ σ α ερ γ α σ ία έ γ ιν ε η κ λ ω νο π ο ίη σ η του μ ετα λ λ α γ μ έν ο υ τύ π ο υ H S c o l καθώ ς κ α ι του φ υ σ ικ ού τύ π ο υ H Sco2. Στη σ υ νέχεια εξετάστηκε ο μ η χ α ν ισ μ ό ς π ρ ό σ λ η ψ η ς του χ α λ κ ο ύ εκ μ έρ ους της H S c o lw T (w ild ty p e), φ υ σ ικ ο ύ τύ π ου) κ α ι της μ ετα λλα χθ είσ η ς P 174L -H S col α π ό τη σ υ νο δ ό -δ ό τη του C u(i), C o x l7 κ α ι έ γ ιν ε π ρ ο σ π ά θ εια ν α κ α τα νο ή σ ο υ μ ε το τ ρ ό π ο π ο υ γ ίνετ α ι η μ ετα φ ο ρ ά του μ ετά λ λ ο υ κ α ι π ο ια ε ίν α ι η επ ίδραση της μ ετά λ λ α ξη ς στη δ ια δ ικ α σ ία αυτή. Σε ένα δεύτερ ο σ τά διο π ρ ο σ δ ιο ρ ίσ τη κ ε η τρισδιά στα τη δομ ή της ελεύθερης (apo) κ α ι της σ υ μ π λ εγμ ένη ς με το μ έτα λ λ ο μ ο ρ φ ή ς της α νθ ρ ώ π ινη ς Sco2 (H Sco2) μ ε φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία N M R. Π ιο σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα, η στρατη γική π ο υ α κ ολουθήθηκε ή τ α ν η εξής: 1) Α π ο μ ό νω σ η του γ ο ν ίδ ιο υ (H Sco2) π ο υ κω δικ οπ οιεί τη ν λειτουργικ ή δια λυτή π ερ ιο χ ή έντα ξη ς μ ετα λλικ ού ιό ν τ ο ς της π ρω τεΐνη ς H Sco2 κ α ι η ο π ο ία π α ίζει π ρ ω τα γω νισ τικ ό ρ ό λ ο σ τη ν μ ετα φ ο ρ ά του χ α λ κ ο ύ (I) α π ό τη ν σ υ ν ο δ ό C o x l7 στο έ ν ζυ μ ο C co. 2) Έ κφ ραση του π ρ ω τεϊνικ ού σ τό χου H Sco2 χω ρ ίς C u(i) (apo) κ α ι μ ε δ εσ μ ευ μ ένο C u(i) {holo). 3) Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς της τρισ διά σ τα τη ς δ ο μ ή ς της ap o κ α ι τη ς h o lo H Sco2 με φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία N M R. 4) Κ λω νοπ οίη σ η κ α ι έκ φ ραση της μ ετα λ λ α γ μ ένη ς μ ο ρ φ ή ς P 174L -H S col μ ε τη μ έθ ο δ ο της σ η μ εια κ ή ς μ ετά λλα ξη ς. 68

76 » 5) Προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής της Cu(I)P174L-HScol με φασματοσκοπία NMR. 6) Διερεύνηση βιοχημικών ιδιοτήτων των HScol και P174L-HScol για την άντληση πληροφοριών σχετικά με τη δράση τους στην ομοιόσταση του χαλκού στον άνθρωπο. 69

77 Κ Ε Φ Α Λ Α ΙΟ 4 ΜΕΙφΙΜΑΊΪΚΡ ΜΕΦΟ<Σ -r ί* 1 i Ο {

78 Κύριες τεχνικές που \ρησιμοποιήθηκαν:αντιδρα(ττιΐρια κ αι πειραματική πορεία Ι.Α λ Ό σ ιδ ω τή Α ν τίδ ρ α σ η Π ο λ ο μ ερ ά σ η ς (PCR) Αντιδραστήρια Π ή κ τω μ α α γ α ρ ό ζη ς 1, 8 % = 1,8 g α γ α ρ ό ζη ς δ ια λ ύ ο ν τ α ι σε 100 m l IX ΤΑΕ ( G IBC O BRL). Β ρ ω μ ιο ύ χο Α ιθ ίδ ιο (eth id iu m brom id e, 1 0 m g / m l, Sigm a) E D T A (MB: 372,24, M erck) Tris B ase [(tri-h yd roxym eth yl-am in om eth an e H 2N C (C H 2 0 H )3)] Μ π λε της β ρ ω μ ο φ α ινόλη ς (BB) (FERAK) Σ υσκευή η λεκ τροφ όρησης (BIORAD) Τ ρ ο φ ο δ ο τικ ό (SIG M A -A L D R IC H PS2001-2) Φ ο ύ ρ νο ς μ ικ ρ οκυμ ά τω ν Φ ω τογραφ ική μ η χα νή ( σε α κ τινο β ο λ ία U V ) Π ε ιρ α μ α τ ικ ή π ο ρ ε ία Π α ρ α σ κ ευ ά ζετα ι κ α τά λλη λη πηκτή α γ α ρ ό ζη ς μ ε ή π ιο β ρ α σ μ ό π ο σ ό τη τα ς α γ α ρ ό ζ η ς σε δ ιά λ υ μ α η λεκ τροφ όρη σ η ς (ΤΑΕ). Η τη γμ ένη α γ α ρ ό ζη ψ ύ χετα ι σε θ ερ μ ο κ ρ α σ ία δω μ α τίου, π ο λ ύ π ρ οσ εχτικ ά π ρ ο σ τίθ εντα ι 5 μΐ β ρ ω μ ιο ύ χο υ α ιθ ιδ ίο υ, χ ύ ν ε τ α ι στο κ α λ ο ύ π ι της μ ο ν ά δ α ς η λεκ τρ οφ όρησης κ α ι εισ ά γετα ι η χ τ ένα. Η πηκτή α φ ή νετα ι ν α στερεοποιηθεί. Σ η μ είω σ η : Ό τ α ν χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ μ ε β ρ ω μ ιο ύ χο α ιθ ίδ ιο, π ρ έπ ει ν α φ ο ρ ο ύ μ ε π ά ν το τε γ ά ν τ ια γ ια τί είνα ι ισ χυρό μ ετα λ λ α ξιο γ ό νο. Α π ο μ α κ ρ ύ ν ετ α ι η χτένα. Η πηκτή βυθίζετα ι σε ΤΑ Ε έτσι ώ στε ν α κ α λύπ τετα ι ο ρ ια κ ά (2-3 m m ) α π ό το ρυθμιστικ ό δ ιά λ υ μ α. Σε φ ια λ ίδ ιο το π ο θ ετο ύ ν τ α ι 5 μΐ d d F h O, 5 μΐ χρω στικής κ α ι 5 μΐ κάθε δείγμ α τος. Η α νά δ ευ σ η γ ίν ετ α ι μ ε π ιπ έτα. Π ρ οσ τίθ εντα ι τα 15 μΐ του δ είγμ α το ς στα φ α τ ν ία της πηκτής. Η φόρτω ση γ ίν ε τ α ι με π ρ ο σ ο χ ή. Σε έ ν α τ ο υ λ ά χ ισ τ ο ν φ α τ ν ίο φ έρ ετα ι γ ια λ ό γ ο υ ς α ν α φ ο ρ ά ς κ α τά λ λ η λ ο ς ιχνη θ έτη ς D N A (m a rke r). 72

79 Ρ Σ υ νδ έο ντα ι τα κ α λώ δια στη συσκευή η λεκ τροφ όρησης κ α ι τη ν π η γή τροφ οδοσία ς. Η δ ιά ρ κ εια της ηλεκτροφ όρη σης είνα ι τουλά χ ισ το ν 45 m in υ π ό σταθερή τάση 120 Volt. Δ ια κ όπ τετα ι η τρ ο φ ο δ ο σ ία ρεύμ ατος. Τα καλώ δια α π ο σ υ νδ έο ντα ι α π ό τη μ ο ν ά δ α ηλεκτροφ όρησης, α π ο μ α κ ρ ύ νετα ι με π ρ ο σ ο χή η πηκτή. Α κ ολουθεί α π ο χρ ω μ α τισ μ ό ς σε α π εσ τα γμ ένο - νερ ό για λεπτά. Τ α σ υ ντεθ ειμ ένα τμ ή μ α τα D N A εμ φ α νίζο ντα ι με υπεριώ δη α κ τινοβολία. Η πηκτή μ ετα φ έρ ετα ι κάτω α π ό α κ τινο β ο λ ία U V κ α ι φ ω τογρ α φ ίζετα ι σε σ κ οτεινό θά λαμο. 2. Τ ο μ ο εκ λ εκ τικ ή α ν τίδ ρ α σ η κ λ ω ν ο π ο ίη σ η ς (Τ Ο Ρ Ο C lo n in g R eactio n ) Π ε ιρ α α α τικ ή π ο ρ ε ία Σε ειδικό φ ια λ ίδ ιο α ν α μ ε ιγ ν ύ ο ν τ α ι 1 μΐ ddh bo κ α ι 1 μΐ ρυθμιστικ ού δια λύμ α τος. Μ ετά α π ό ή π ια α νά δ ευ σ η μ ε π ιπ έτα, στο μ ίγ μ α α ντίδ ρ α σ η ς π ροσ τίθεντα ι 3 μΐ π ρ ο ϊό ν τ ο ς PCR (στη περίπτω ση μ α ς H Sco2) κ α ι τέλος Ιμ ΐ π λα σ μ ιδ ια κ ού φ ο ρ έα p E N T R /T E V /D T O P O. Τ ο μ ίγ μ α της α ντίδ ρ α σ η ς επω άζεται σε θερ μ οκ ρ α σ ία δω μ α τίου (22-23 C) επ ί π έντε λ επ τά κ α ι φ υλάσσετα ι σ τους -20 C. Μ ε τη ν α ντίδ ρ α σ η αυτή π α ίρ ν ο υ μ ε τελικά το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ένο μ ό ρ ιο pentr. 3. Μ ετα σ χ η μ α τισ μ ό ς ε π ιδ ε κ τ ικ ώ ν κ υ τ τ ά ρ ω ν (c o m p e te n t cells) E.coli μ ε π λ α σ μ ιδ ια κ ό D N A Α ντιδ ρ α σ τή ρ ια Π λή ρ ες θρεπτικό υλικ ό LB: 0,5 g εκ χύλισ μ α ζύμ η ς, 1 g τρ υ π τό νη, 1 g N ac l σε 100 m l d d H 20 Π λήρες στερεό Θ ρεπτικό υλικό: Π ροσθήκη στο LB 2% ά γα ρ. Ε πιδεικτικά κύτταρα της σ ειρ ά ς D H 5a (Life Technologies). Α ντιβ ιοτικ ό α μ π ικ ιλ λ ίνη (loorng/ m l) 73

80 Π ε ιρ α μ α τ ικ ή π ο ρ ε ία Τ α σ ω λ η νά κ ια π ο υ π ε ρ ιέ χ ο υ ν τα δεκτικά κύτταρα (ΙΟΟμΙ) μ ετα φ έρ ο ντα ι α π ό * τ ο υ ς -80 C, π ο υ φ υ λ ά σ σ ο ντα ι, σε π ά γ ο π ρ ο κ ειμ ένου ν α ξεπ α γώ σ ο υ ν. Α κ ο λ ο υ θ εί ή π ια α νά μ ιξη. Τ ο μ ίγ μ α επω άζεται σ τον π ά γ ο επ ί 20 m in. Έ πεται θ ερ μ ικ ό σοκ με μ ετα φ ο ρ ά σ τους 42 0 C επ ί 80 sec κ α ι α π ότομ η μ ετα φ ο ρ ά σε π ά γ ο γ ια 5 m in. Κ α τόπ ιν π ρ ο σ τίθ εντα ι σε ασηπτικές συνθήκες 800 μΐ θρεπτικ ό μ έσ ο LB χω ρ ίς α ντιβ ιο τικ ό κ α ι το μ ίγ μ α επω άζεται υ π ό α νά δ ευ σ η σε α ερ ό λ ο υ τ ρ ο σε 170 rp m σ τους 37 0 C επ ί 45 m in. Κ α τό π ιν τα κ ύττα ρ α φ υ γ ο κ ε ν τ ρ ο ύ ν τ α ι γ ια μ ισ ό λ επ τό σε στροφές, ε π α ν ν α δ ια λ ύ ο ν τ α ι σε 10 0 μΐ LB κ α ι επ ισ τ ρ ώ νο ντα ι σε στερεό θρεπτικό μέσο με τα κ α τά λ λ η λ α α ντιβ ιο τ ικ ά κ α ι υ π ο σ τρ ώ μ α τα επ ιλ ο γή ς, ολονύ κ τια (~ 8 ώρες). 4.Υ π ο κ λ ω ν ο π ο ίη σ η το υ γ ο ν ιδ ίο υ H S co2 μ ε τ η ν α ν τ ίδ ρ α σ η α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ο ύ L R τ η ς G a te w a y Α ν τ ιδ ρ α σ τ ή ρ ια LR 1. Ρ υ θ μ ι σ τ ι κ ό δ ι ά λ υ μ α α ν τ ί δ ρ α σ η ς L R 5 μ ΐ 2. ( Τ Ε b u ffe r ) 5 μ ΐ ( π α ρ έ χ ε τ α ι α π ό τ η ν ε τ α ιρ ε ία ) 3. Φ ο ρ έ α ς π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ ( d e s t in a t io n v e c t o r ) n g 4. Φ ο ρ έ α ς κ λ ώ ν ο υ ( p E N T R ) n g 5. Μ ε ί γ μ α έ ν ζ υ μ ω ν ( L R c lo n a s e e n z y m e m ix ) 4 μ ΐ Π ε ιρ α μ α τ ικ ή π ο ρ ε ία Η α ντίδ ρ α σ η υ π ο κ λ ω νο π ο ιή σ η ς του γ ο νιδ ια κ ο ύ σ τό χου α π ό τ ο ν φ ορέα pe N T R στο φ ο ρ έα π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ (d estin a tio n vector) δια ρ κ εί μ ία ώ ρα κ α ι η π ειρ α μ α τικ ή δ ια δ ικ α σ ία π ο υ χρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ ε είνα ι η παρακάτω : 1.Π ρ οσ θ έτουμ ε στο ειδ ικ ό φ ια λ ίδ ιο 1.5 m l σε θ ερ μ οκρασία δω μ α τίου και α ν α μ ειγ ν ύ ο υ μ ε: το φ ο ρ έα κ λ ω νο π ο ιή σ η ς pentr, το φ ο ρ έα π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ κ α ι το ρ υθμισ τικ ό δ ιά λ υ μ α α ντίδ ρ α σ η ς (ΤΕ buffer). 7 4

81 V 2. Α φ ή νουμε στο π ά γ ο το μ είγμ α ένζυ μ ω ν ( LR C lonase II e n z y m e m ix) επί π ερ ίπ ου 2 λεπτά. 3. Π ροσθέτουμε στο κάθε δ είγμ α 2 μΐ του μ είγμ α τος ένζυ μ ω ν LR C lonase en zym e m ix και α να δεύουμ ε. 4. Ε πιστρέφ ουμε το μ είγμ α LR C lonase II e n z y m e m ix στους -80 C. 5. Ε πω άζουμε τις α ντιδράσεις στους 25 C για 1 ώ ρα. ό.π ροσθέτουμε 1 μΐ α π ό το δ ιά λ υ μ α της P rotein ase Κ σε κάθε δ είγ μ α κ α ι η α ντίδραση τερματίζεται. 7. Τα δείγμ α τα επ ω ά ζοντα ι στους 37 C γ ια 10 λεπ τά. Τελικά τα δείγμ α τα φ υ λ ά σ σ ο ντα ι σ τους -20 C. δ.μ ετα φ ο ρ ά το υ α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έν ο υ γ ο ν ιδ ίο υ σε κ ύ ττα ρ α έκ φ ρ α σ η ς-τεα τ έ κ φ ρ α σ η ς * Α ντιδραστή ρ ια 1. Κ ύτταρα BL21-codon+ (για τη H Sco2), BL21(D E3)G O LD(Y ia τη ν H S c o l) 2. Π λήρες Θ ρεπτικό υλικ ό γ ια E.coli, Luria Bertani LB= l g τρ υ π τό νη, 0,5g εκχύλισμα ζύ μ η ς κ α ι l g N ac l δ ια λ ύ ο ν τα ι σε 100m l dde bo. 3. Ε λάχιστο Θ ρεπτικό υλικό για E.coli, Μ 9 = 780 m l d d H m l 5Χ Μ 9+2 m l δ ια λ ύ μ α το ς M gso i 1 M + 2 m l δια λύμ α τος Q + 10 m l δ ια λ ύ μ α το ς V itam in m ix + 20 m l δ ια λ ύ μ α το ς γλυκόζη ς (4 g r /lt) + N H 4 C I ( l,2 5 g r σε 6,2 m l dde ko ). 4. Δ ιά λ υ μ α 5X M 9= Δ ια λ ύ ο ντα ι 15 gr K H 2PO 4, 64 gr N a H 2PO 4.7H 2O, 2,5 gr N ac l ρε 1000 m l ddh ko Δ ιά λυμ α Q = HC1, Fe2C l24 H 2 0, C ac l22h 20, H 3BO 3, C 0 CI26H 2O, C 11CI22H 2O, Z nc l2, N a 2M 0 42 H 20, M nc l24h Δ ιά λυμ α V itam in m ix: θ εια μ ίνη ς, d -β ιοτίνη ς, χλω ρ ιο ύ χα χλω ρ ίνη ς, φ ολικ ό οξύ, π α ντο θ ενικ ό οξύ, π υ ρ ιδ ο ξίνη και ρ ιβ ο φ λ α β ίνη. " 7. Δ ιά λ υ μ α α μ π ικ ιλ λ ίνη ς 8. Δ ιά λ υ μ α χλω ρ α μ φ ενικ ό λ η ς 7 5

82 9. Π λ ή ρ ες στερεό θρεπτικό υλικ ό:π ροσθήκη στο LB 2% ά γ α ρ. 5Α ) Μ ε τ α σ χ η μ α τ ισ μ ό ς κ υ τ τ ά ρ ω ν έ κ φ ρ α σ η ς μ ε το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο π λ α σ μ ίδ ιο. Π ε ιρ α μ α τ ικ ή π ο ρ ε ία Α π ο ψ ύ χ ετα ι έ ν α φ ια λ ίδ ιο π ο υ π ερ ιέχ ο υ ν 100 μΐ κ ύττα ρα έκφ ρασης.. Μ ετά α π ό τ η ν α π ό ψ υ ξη τα κ ύττα ρ α δ ε ν μ π ο ρ ο ύ ν ν α ξα να χ ρ η σ ιμ ο π ο ιη θ ο ύ ν. Σ το π ρ ώ το e p p e n d o rf π ρ ο σ τίθ ο ν τα ι 10 μΐ π λ α σ μ ιδ ίο υ H S c o l/ ή H Sco2. Τ ο μ ίγ μ α α ν α δ εύ ετα ι ή π ια με π ιπ έτα κ α ι έπ ειτα μ ετα φ έρετα ι σε π ά γ ο κ α ι δια τη ρ είτα ι εκεί γ ια τρ ιά ντα λεπ τά. Έ πειτα μετα φ έρετα ι σε υ δ ρ ό λ ο υ τρ ο τω ν 42 C γ ια 45 δ ευτερ όλεπ τα κ α ι τέλος σε π ά γ ο γ ια δύο λεπ τά. Α φ ο ύ π ρ ο σ τεθ ο ύ ν στο δ είγ μ α 900 μΐ LB (χω ρίς α ντιβ ιο τικ ό ) τελικά επ ω ά ζετα ι σε α ερ ό λουτρ ο σε 170rp m σ τους 37 C γ ια μ ία ώ ρα. Μ ετά το π έρ α σ μ α της μ ία ς ώ ρας ε μ β ο λ ιά ζ ο ν τ α ι τρ υ β λ ία ά γ α ρ (με στερεό θρεπτικό υλικ ό μ ο λ υ σ μ ένο με α μ π ικ ιλ λ ίν η κ α ι ch loram p h en icol) με 200 μΐ α π ό το δείγμ α. Τα τρ υ β λία επ ω ά ζο υ ν σ τους 37 C γ ια δώ δεκα ώρες. 5Β) Ε ύ ρ εσ η τ ω ν κ α τ ά λ λ η λ ω ν σ υ ν θ η κ ώ ν α π ο μ ό ν ω σ η ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν Π ειρ α ιια τ ικ ή π ο ρ ε ία j - Για τ η ν α νά π τ υ ξη υ γ ρ ή ς π ρ ο κ α λ λ ιέρ γ εια ς π λή ρω ς θ ρ επ τικ ού υλικ ού LB (π ου π ερ ιέχει τα α ντιβ ιο τικ ά ) εμ βολιά σ τη κ ε α ρ χ ικ ά π οσότη τα 1 m l α υτού το υ υ λ ικ ο ύ με κ ύττα ρ α μ ο ν ή ς α π ο ικ ία ς α π ό στερεό θ ρεπτικ ό υ λ ικ ό.σ υ νο λ ικ ά π ρ ο ετ ο ιμ ά σ τη κ α ν 1 0 π ρ ο κ α λ λ ιέρ γ ειες ο ι ο π ο ίες επ ω ά σ τη κ α ν σε α ερ ό λ ο υ τρ ο σε 180 rpm, σ τους 37 C γ ια δώ δεκα ώ ρες. Για τ η ν α νά π τυξη τω ν υ γ ρ ώ ν κ α λ λ ιερ γ ειώ ν π λή ρ ω ς θ ρ επ τικ ού υ λικ ο ύ LB εμ β ο λ ιά σ τη κ α ν 1 m l π ρ ο κ α λ λ ιέρ γ εια ς σε κω νική φ ιά λη τω ν 0,5 It π ο υ π ερ ιέχει 100 m l LB γ ια κάθε μ ία κ α λ λ ιέρ γ εια ο ι ο π ο ίες α ν α π τ ύ χ θ η κ α ν σε δια φ ορ ετικ ές σ υνθ ή κ ες μ ε σ κ ο π ό ν α κ α τα λ ή ξο υ μ ε στις κ α τα λλη λότερ ες γ ια τ η ν υπ ερ έκ φ ρ α σ η της πρω τεΐνης. Π ροσ τέθηκε στα κ ύττα ρα 100 μΐ δ ια λ ύ μ α τ ο ς IPTG 1Μ κ α ι α ν ά δ ύ ο ώ ρες σ υ λ λ έ γ ο ν τ α ν δ είγ μ α τα σε φ ια λ ίδ ιο α π ό τ η ν κάθε κ α λ λιέρ γεια κ α ι φ υ γ ο κ ε ν τ ρ ο ύ τ α ν στις rp m γ ια 1 λεπ τό. Τ α κ υττα ρικ ά δ είγμ α τα π ρ ο ετ ο ιμ ά σ τη κ α ν γ ια η λεκ τροφ όρηση σε πηκτή π ο λ υ α κ ρ υ λ α μ ιδ ίο υ SDS. Α π ό 76

83 το gel ηλεκτροφ όρησης σημειώ θηκαν ο ι βέλτιστες σ υνθήκες ο ι ο π ο ίες ο δ η γ ο ύ ν στη ν εμ φ ά νισ η υπερεκ φ ρασμένη ς μ π ά ν τ α ς γ ια κάθε π ρω τεΐνη μετά τη ν προσθήκη του IPTG. 6. Κ α θ α ρ ισ μ ό ς μ ε χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία σ υ γ γ έ ν ε ια ς Α ντιδ ρ α σ τ ή ρ ια 1) Z n S 0 4 Ο,ΙΜ.Δ ιαλύονται 0,29 g Z ns0 4 σε 10 m l ddtfccx 2) Ρ υ θμ ισ τικ ό Δ ιά λ υ μ α Δ έ σ μ ε υ σ η ς (B IN D IN G ) = Δ ια λ ύ ο ν τ α ι 2,42 g Trisbase, 29.9 g N ac l και 0,34 g ιμ ιδ α ζο λ ίο υ σε 1000 m l ddl-fco. p H = 8, το δ ιά λ υ μ α διηθείται και διατηρείται σε θ ερ μ οκ ρ α σ ία π ερ ιβ ά λ λ ο ντο ς. 3) Ρ υ θ μ ισ τικ ό Δ ιά λ υ μ α Έ κ λ π υ σ η ς (W A S H )= Δ ια λ ύ ο ν τ α ι 2,42 g Tris-base, 29,9g N ac l και 4,088 g ιμ ιδ α ζο λ ίο υ σε 1000 m l d d tb O. p H = 8, το δ ιά λυμ α διηθείται και διατηρείται σε θερ μ οκ ρ α σ ία π ερ ιβ ά λ λ ο ντο ς. 4) Ρ υ θ μ ισ τικ ό Δ ιά λ υ μ α Έ κ λουσ η ς (ELUTE) = Δ ια λ ύ ο ντα ι 2,42 g Tris-base, 29.9 g N ac l κ α ι 68,08 g ιμ ιδ α ζο λ ίο υ σε 1000 m l d d H io, σε p H = 8. T o δ ιά λυμ α διηθείται κ α ι δια τη ρείτα ι σ ε θερ μ οκ ρ α σ ία π ερ ιβ ά λ λ ο ντο ς. 5) Ρ υ θ μ ισ τικ ό δ ιά λ υ μ α του TEV = Δ ια λ ύ ο ν τ α ι 2,42 g Tris B ase, l,3 g E D TA κ α ι 0,0077g DTT σε 400m l ddluo. p H = 8, το δ ιά λ υ μ α διηθείται και διατηρείται σε θερ μ οκ ρ α σ ία π ερ ιβ ά λ λ ο ντο ς. 6) N a C l, N a H 2P 0 4/ ιμ ιδ α ζό λιο, N P ijc l, E D TA (Sigm a). 7) Έ νζυ μ ο T E V (N ovagen ). Π ειρ α μ α τ ικ ή π ο ρ εία Η στήλη χ ρ ω μ α το γρ α φ ία ς εξισ ο ρ ρ ο π είτα ι με π οσότη τα ρυθμιστικού δ ια λ ύ μ α το ς B IN D IN G ίσης μ ε το 2 5 π λ ά σ ιο του ό γ κ ο υ της ρητίνης. 4 9 Δ ιο χετεύ ο ντα ι στο εσωτερικό τη ς στή λη ς 5 m l του δ ια λ ύ μ α το ς ZnSC>4 0,1 Μ για * τη ν αύξηση της συγκέντρω σης ιό ντω ν Ζ η +2 κ α ι π λένετα ι η στήλη με 25 m l δ ιά λ υ μ α δέσμευσης. Το υ π ερ κ είμ ενο τη ς φ υγοκ έντρ η σ η ς π ο υ περιέχει μ ίγμ α βα κ τη ρια κ ώ ν π ρω τεϊνώ ν κ α ι τ ο ν π ρ ω τεϊνικ ό σ τόχο H Sco2 φ έρεται στην εξισ ορροπ η μ ένη στήλη. Στη σ υ νέχεια, π ρ οσ τίθ εντα ι 20 ό γ κ ο ι ρυθμιστικού 77

84 δ ια λ ύ μ α τ ο ς έκ π λυσης γ ια τ η ν α π ο μ ά κ ρ υ νσ η βακτη ρ ια κ ώ ν π ρ ω τεϊνώ ν π ο υ δεν έ χ ο υ ν ισ τιδινικ ή ο υ ρ ά. Α κ ο λ ο υ θ εί η έκλουση της π ρω τεΐνη ς με ρυθμιστικό δ ιά λ υ μ α έκ λουσης κ α ι α υ ξ α ν ό μ ε ν η συγκέντρω ση ιμ ιδ α ζο λ ίο υ (1Μ ) μ ε σ υ νο λ ικ ή π ο σ ό τ η τα έκ λουσης ίσ η ς μ ε το 2 0 π λ ά σ ιο το υ ό γκ ο υ της ρ η τίνη ς της κ ο λ ό ν α ς. Σ υ λ λ έγετα ι τελικ ά ο π ρ ω τεϊνικ ός σ τόχος. Α κ ολουθεί α π ο μ ά κ ρ υ νσ η της ισ τιδ ινικ ή ς ο υ ρ ά ς του π ρ ω τεϊνικ ού σ τό χου α φ ο ύ επω αστεί το σ υ μ π υ κ ν ω μ ένο δ ιά λ υ μ α της π ρ ω τεΐνη ς μ ε τη π ρω τεϊνά ση TEV σε α ν α λ ο γ ία 10 μΐ ε ν ζ ύ μ ο υ γ ια 10 m g π ρ ω τεΐνη ς γ ια 16 ώρες. Στη σ υ νέχεια φ έρεται στο εσω τερικό της στήλης το δ ιά λ υ μ α π ο υ π ερ ιέχει τ ο ν π ρω τεϊνικ ό σ τόχο σ τον ο π ο ίο α π ο υ σ ιά ζει η ισ τιδινικ ή ο υ ρ ά και σ υ λλέγετα ι τελικά ο πρω τεϊνικ ός σ τόχος, π ο υ α υτή τη φ ο ρ ά δ ε ν δεσ μ εύετα ι α π ό τ η ν στήλη. 7.Ε π ισ ή μ α ν σ η τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς μ ε ισ ό τ ο π α *345678*13C κ α ι 15Ν Α ν τ ιδ ρ α σ τ ή ρ ια 1.Γ λυκόζη εμ π λ ο υ τισ μ ένη μ ε 13C (3 g /L ) 2 15N H 4)2S 0 4 ( l,5 g /L ) 3. N a C l (Sigm a)., 4. K H 2P 0 4, N a H 2P 0 4-7H20, N a C l (Sigm a). 5. HC1, F ec l2 4 H 20, C ac l2 2 H 20, H 3BO3, C oc126 H 20, C u C12 2H 20, Z nc l2/ N a 2M H 20, M nc l2 4 H Β ιταμίνες: θ εια μ ίνη, d -β ιο τ ίνη ς π υ ρ ιδ ο ξίνη ρ ιβ ο φ λ α β ίνη. 7. Α ντιβ ιο τ ικ ό α μ π ικ ιλ λ ίνη (lo O rng/m l). Φ υλάσσεται σ τους -20 C. 8. Α ντιβ ιο τικ ό χ λ ω ρ α μ φ ενικ ό λ η (3 4 m g /m l). Φ υλάσσεται σ τους -20 C. 9.IPTG (iso p rop y l-β -D -th io g a la cto p y ran o sid e) (Sigm a). 1 0.Α ερ ό λ ο υ τ ρ ο Shaker. Π ε ιρ α μ α τ ικ ή π ο ρ ε ία Η έκ φ ρ α σ η της α π λ ά (15Ν ) και δ ιπ λ ά (13C,15N ) επ ισ η μ α σ μ ένη ς π ρ ω τεΐνη ς έ γ ιν ε μ ε τ η ν α νά π τ υ ξη υ γ ρ ή ς κ α λ λ ιέρ γ εια ς ελά χισ του θρεπτικού 7 8

85 9 υλικού (15NH4)2S04 Μ 9 κ α ι (13C,15N )-M 9 α ντίσ τοιχα. Ο ι συνθήκες έκφ ρασης και η πειραματική δια δικ α σία είνα ι π α ρ ό μ ο ιες μ ε αυτές π ο υ εφ α ρ μ όστη κ α ν στην π α ρ α γω γή της μη επ ισημασμένη ς πρω τεΐνης. 8-Μ έθοδος σ η μ εια κ ή ς μ ετά λ λ α ξη ς ^ Α ντιδραστή ρια Ζ εύ γος εκκινητώ ν forw ard κ α ι reverse. Ο σ χεδ ια σ μ ός το υ ς έγινε στο π λ α ίσ ιο της π α ρ ο ύ σ α ς δια τριβή ς κ α ι η π ροέλευσή τους ή τ α ν α π ό τη ν P rim m (M ilano Italy)..Ν ο υ κ λεο τίδ ια da TP, dg TP, dttp, κ α ι dc T P (loomm το κ α θ ένα ) κ α ι π ροέλευσης STRATAG ENE. Pfu T urbo D N A π ολυμ ερ ά σ η π ροέλευ σ η ς STR A TAG EN E. Φ υλάσσεται στους -20 C και α π ο ψ ύ χετα ι λ ίγ ο π ρ ιν τη χρή σ η της. Ρυθμιστικό δ ιά λυμ α της αλυσιδω τής α ντίδ ρ α σ η ς της π ο λυμ ερ ά σ η ς (PCR buffer) και προέλευσης STRATAG EN E. Φ υλάσσεται στους -20 C. Δ ιά λ υ μ α μ ίγμ α τος νο υ κ λεο τιδ ίω ν (d N T P m ix) π ρ οέλευ σ η ς STRATAG ENE. Φ υλάσσεται σ τους -20 C. Θ ερ μ οκ υκ λοπ οιη τή ς ( BIO RAD M y C ycler T herm al C ycler). Π ε ιρ α α α τικ ή π ο ρ ε ία Π α ρ α σ κ ευά ζετα ι το μ ίγ μ α PCR σε φ ια λ ίδ ιο κ α ι μ ετα φ έρετα ι σε ειδικό φ ια λίδ ιο για PCR ό π ο υ π ροσ τίθεντα ι 2 μΐ α ρ α ιω μ ένο υ (10n g/ μΐ) π λ α σ μ ιδ ίο υ της w th S c o l. Α κ ολουθεί νέα α νά δ ευ σ η κ α ι το δ είγ μ α μετα φ έρετα ι στο θερμοκυκλοποιητή. Το π ρ ό γ ρ α μ μ α τη ς PCR γ ια τη σημειακή μετάλλαξη P 174L -H Scol ε ίν α ι 35sec σ τους 95 C lm in σ τους 55 C lo m in σ τους 68 C 79

86 Τ ο ν έ ο π λ α σ μ ίδ ιο μ ετα φ έρ ετα ι κ α τ ό π ιν στα κ α τά λ λ η λ α β α κ τη ρ ια κ ά κ ύ τ τα ρ α D H 5 a μ ε τ η ν ίδ ια π ειρ α μ α τικ ή π ο ρ εία π ο υ α να φ έρ θ η κ ε * π ρ ο η γ ο υ μ ένω ς. 1 \ Λ

87 Ά Μ<Ε<ΡΟ<Σ <Ε<ΡΓΆ<ΣΙΆ<Σ 4.1 Στάδια κλωνοποΐησης τοο γονιδίου HSco2 Ξ εκινώ ντας α π ό το συμ πλη ρω ματικ ό D N A (cd N A ) τη ς π ρω τεΐνη ς τα στάδια της κ λω νοπ οίη σ η ς τα ο π ο ία θα α ν α λ υ θ ο ύ ν εκτενέστερα π αρακάτω, ή τα ν τα ακόλουθα: 1 ΤΟΠΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣ1 ΕΝΩΣΗ TOY PCR ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΜΕ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΦΟΡΕΑ ΚΛΩΝΟΠΟΪΗΣΗΣ I 81

88 Σ τη ν π α ρ ο ύ σ α δια τριβή εκφράστηκε η δομ ικ ή π ερ ιοχή του γο ν ιδ ίο υ χω ρ ίς τα π ρ ώ τα 297 ζεύγη βάσεω ν. Η νο υ κ λεοτιδ ικ ή α λ λ η λ ο υ χ ία της π ερ ιο χ ή ς α υτή ς ^ είνα ι: GGCCAGGGCGACTTCCACCTGCTGGATCACAGAGGCCGGGCTCGCTGCAAGGCT GACTTCCGGGGCCAGTGGGTGCTGATGTACTTTGGCTTCACTCACTGCCCTGACA TCTGCCCAGACGAGCTGGAGAAGCTGGTGCAGGTGGTGCGGCAGCTGGAAGCA GAGCCTGGTTTGCCTCCAGTGCAGCCTGTCTTCATCACTGTGGACCCCGAGCGGG ACGACGTTGAAGCCATGGCCCGCTACGTCCAGGACTTCCACCCAAGACTGTTGGG TCTGACCGGCTCCACCAAACAGGTTGCCCAGGCTAGTCACAGTTACCGCGTGTAC TACAATGCCGGCCCCAAGGATGAGGACCAGGACTACATCGTGGACCACTCCATT GCCATCTACCTGCTCAACCCTGACGGCCTCTTCACGGATTACTACGGCCGGAGCA GATCGGCTGAGCAGATCTCAGACAGTGTGCGGCGGCACATGGCGGCTTTCCGCA GTGTCCTGTCTTGA Η π ερ ιο χ ή αυτή ό τ α ν εκφ ραστεί θα δώ σει τη λειτουργικ ή κ αι διαλυτή π ερ ιοχή (d o m a in ) της π ρ ω τεΐνη ς H Sco2, μ ο ρ ια κ ο ύ β ά ρ ο υ ς , κ α ι με τη ν εξής α μ ινο ξικ ή α κ ολουθία : GQGDFHLLDHRGRARCKADFRGQWVLMYFGFTHCPDICPDELEKLVQVVRQLEAEP GLPPVQPVFITVDPERDDVEAMARYVQDFHPRLLGLTGSTKQVAQASHSYRVYYNAG PKDEDQDYIVDHSIAIYLLNPDGLFTDYYGRSRSAEQISDSVRRHMAAFRSVLS Σ χ ε δ ια σ μ ό ς ε κ κ ιν η τ ώ ν γ ια τ η ν α ντίδ ρ α σ η PC R Ο σ χεδ ια σ μ ό ς τω ν εκ κ ινη τώ ν PCR γ ια τ η ν ενίσ χυσ η του γ ο ν ιδ ια κ ο ύ σ τό χ ο υ π ο υ μ α ς ενδ ια φ έρ ει ε ίν α ι κ α θοριστικ ή ς σ η μ α σ ία ς γ ια τη ν έκφ ρασή του. Στη π α ρ ο ύ σ α ερ γ α σ ία έ γ ιν ε χρήση μ ια ς μ εθ όδου κ λω νοπ οίη σ η ς, η ο π ο ία π ρ ο τείνετα ι α π ό τ η ν ετα ιρ εία In vitrogen κ α ι ο νο μ ά ζετα ι "The p E N T R D ir e c tio n a l Τ Ο Ρ Ο C lonin g". Το π ρ ω τόκ ολλο π ρ ο β λ έπ ει κ ά π ο ιο υ ς σ υ γκ εκ ρ ιμ ένο υ ς κ α ν ό ν ε ς γ ια το σω στό σ χεδία σ μ ά τω ν εκκινητώ ν. Η π ερ ιο χ ή π ο υ βρίσκεται στο 3' ά κ ρ ο του εκκινητή forw ard σ υμ π λη ρ ώ νετα ι με τις είκ οσ ι πρώ τες βά σεις της α λ λ η λ ο υ χ ία ς του γ ο ν ιδ ια κ ο ύ σ τόχου. Ε π ιπ λ έο ν σ το 5' ά κ ρ ο το υ εκκινητή fo rw a rd π ροσ τίθετα ι η α κ ο λουθία, C A C C, η ο π ο ία, ό π ω ς θ α α ν α λ υ θ εί στη σ υ νέχεια, εξα σ φ α λίζει υ ψ η λ ό π ο σ ο σ τό επ ιτυ χία ς στη 8 2

89 9 διαδικασία της κλω νοποίησης. Στο 5' ά κ ρ ο του εκκινητή reverse π ροστέθ η κ α ν δύο κ ω δικόνια ATC τα ο π ο ία δ ίν ο υ ν τη ν εντολή γ ια το τερματισμό της μ ετα γραφ ή ς (stop codon). Ο ι υ π ό λ ο ιπ ες βάσεις είνα ι ο ι συμ πλη ρω ματικές τω ν 25 βάσεω ν του C - ά κ ρ ου του γ ο νιδ ια κ ο ύ στόχου. Λ α μ β ά νο ντα ς υπ ό ψ η ό λα τα π α ρ α π ά ν ω δ εδ ο μ ένα ο ι εκκινητές π ο υ σ χεδιάστηκαν γ ια τ η ν α ντίδραση ενίσ χυ σ η ς του γ ο ν ιδ ια κ ο ύ σ τόχου H Sco2 ήταν: F o r w a r d : 5 -C A C C G G C C A G G G C G A C TTC C A C C TG -3' ' T m =66/8 C / Μ ή κ ος= 25, GC=40% R everse: 3,-C C G A A A G G C G T C A C A G G A C A G A A C T A T C A T C -5/ T m =71,57 C, Μ ήκος= 31, GC=42% To μ είγ μ α PCR με το α ρ α ιω μ ένο (5n g/ μΐ) γενετικ ό υ λ ικ ό H Sco2 μεταφέρεται στο θερμοκυκλοποιητή ό π ο υ α κ ο λ ο υ θ ο ύ ν 7 κ ύκ λοι ενίσ χυσης του D N A, π ο υ π ερ ιλ ά μ β α ν α ν α π οδιά τα ξη (95 C ), π ρόσ δεσ η τω ν εκ κ κ ινη τώ ν (45 C) κ α ι επ ιμύκηνσ η (72 C). Σ τους επ ό μ ενους 30 κ ύκλους έ γ ιν ε ξα νά, δια χω ρ ισ μ ός της διπ λή ς έλικας σ τους 95 C γ ια 35 sec, σ ύνδεσ η τω ν εκκινητώ ν γ ια 45 sec στους 60 C κ α ι μ ια τελική φ ά σ η π ο λ υ μ ερ ισ μ ο ύ γ ια 3 m in σ τους 72 C. Μ ετά τ η ν α ντίδ ρ α σ η PCR (τεχική 1)τεγίνετα ι εξακρίβω ση της π οιότη τα ς α λ λ ά κ α ι της π οσότη τα ς του γ ο ν ιδ ια κ ο ύ σ τόχου. Τ ο π ρ ο ϊό ν της 4 «τ PCR έγινε ορ α τό με η λεκτροφ όρηση 1% σε πήκτω μα α γα ρ ό ζη ς. Σε αυτή τη ν» τεχνική εφ α ρ μ όζετα ι ηλεκτρικό π εδ ίο κ α τά μ ή κ ος της πηκτής α γ α ρ ό ζη ς και τα νουκ λεϊκ ά οξέα λ όγω του α ρ νη τικ ού το υ ς φ ορτίου μ ετα κ ινο ύ ντα ι π ρ ο ς τ ο ν θετικό π ό λ ο. Μ ε α υ τό τ ο ν τρ ό π ο τα νο υ κ λ εϊκ ά οξέα δ ια χω ρ ίζο ντα ι με βάση το μ έγεθος τους. Σ τη ν πηκτή α γ α ρ ό ζη ς π ροσ τίθετα ι β ρ ω μ ιούχο α ιθ ίδιο, το ο π ο ίο 83

90 π α ρ εμ β ά λ λ ετα ι μ ετα ξύ τω ν βάσεω ν του D N A κ α ι φ θ ορίζει στο υπ εριώ δ ες φως. Μ ε τ ο ν τ ρ ό π ο α υ τό μ π ο ρ ο ύ ν ν α δ ια κ ρ ιθ ο ύ ν οι ζώ νες του D N A σε συσκευή * υ π ερ ιώ δ ο υ ς α κ τινο β ο λ ία ς. Ό τ α ν έχουμ ε το σωστό π ρ ο ϊό ν της PCR, τότε στο κ ά θε δ είγ μ α α ντισ τ ο ιχ εί μ ια έντονη τ α ιν ία (π ο λ υ μ ερ ισ μ ένο γενετικ ό υλικ ό) κ α ι μ ια μ ικ ρ ότερ η τα ιν ία (prim ers). Στη περίπτω ση π ο υ λ ά β ο υ μ ε π ο λλές τα ινίες, τότε δ ε ν έχουμ ε σω στό π ρ ο ϊό ν της PCR. Τέλος, το α ρ νη τικ ό δ είγμ α ελ έγχου (n eg a tiv e control) π ρ έπ ει ν α δώ σει μ ό ν ο μ ια τ α ιν ία π ο υ ν α α ντισ τ ο ιχ εί σ τους εκκινητές, για τί σε δ ια φ ορετικ ή περίπτω ση π ρόκ ειτα ι γ ια επ ιμ ό λ υ νσ ή του. Το π ρ ο ϊό ν PCR γ ια το H Sco2 μ α ζί με τους εκκινητές έχει μ ή κ ος ~ bp. Σ υ γ κ ρ ίνετ α ι σε σχέση με τ ο ν ιχνη θέτη D N A κ α ι π α ρ α τη ρ ο ύ μ ε π ω ς βρίσ κ ετα ι στο ύ ψ ο ς της τρίτης ζώ νη ς (band) η ο π ο ία α ντισ τοιχεί σε μ ο ρ ια κ ό β ά ρ ο ς ~600 b p (Σ χή μ α 26). «α \ M a r k e r HSco2 Σ χ ή μ α 2 6 : Η λ ε κ τ ρ ο φ ό ρ η σ η τ ο υ π ρ ο ϊό ν τ ο ς τ η ς P C R 4.3 Τοποεκλεκτική αντίδραση κλωνοποίησης (ΤΟΡΟ Cloning Reaction) Μ ετά τ η ν α π ο μ ό νω σ η του γ ο ν ιδ ια κ ο ύ σ τό χ ο υ H Sco2 μ ε τ η ν α ντίδ ρ α σ η PC R θα χρ εια σ τεί ν α τ ο ν ενσ ω μ α τώ σ ουμ ε σε έ ν α ν φ ορ έα D N A. Ο φ ορέα ς κ λ ω νο π ο ίη σ η ς π ο υ επ ιλέχθ η κ ε γ ια τη τεχνικ ή του α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ο ύ στη π ερίπ τω σ η της H S co2 ο ν ο μ ά ζετα ι φ ο ρ έα ς pentr /TEV/DTOPO α π ό τη ν 8 4

91 m G atew ay In vitrogen. Η τεχ νο λ ο γ ία G atew ay είνα ι μ ια επ ικ ρ α τούσα μ έθοδος κλω νοποίησης, η ο π ο ία α ξιοπ οιεί τις ιδιότητες α ν α σ υ νδ υ α σ μ ο ύ του βακτη ριοφ ά γου λ, γ ια γ ρ ή γ ο ρ ο και α π οδοτικ ό τρ ό π ο ενσω μάτω σης του γ ο νιδ ίο υ π ο υ μ α ς ενδια φ έρει στο φ ο ρ έα κλω νοπ οίη σ η ς(τεχνικ η 2). Η φ ιλοσοφ ία της μεθόδου Τ Ο ΡΟ C lo n in g στηρίζεται στη δράση του ενζύ μ ου τοποϊσομ εράση I. Ο ι τοπ οϊσ ομ εράσες α π ο τ ελ ο ύ ν μ ια ο μ ά δ α ενζύ μ ω ν π ο υ ρ υ θ μ ίζο υ ν το μ ετα βολισ μ ό του D N A κ α θ ο ρ ίζο ντα ς το β α θ μ ό της υπερελίκω σης του D N A, ο ο π ο ίο ς είνα ι σ η μ α ντικ ός γ ια το π α κ ετά ρ ισ μ α του D N A κ α ι γ ια τις α λλη λεπ ιδράσεις μ εταξύ ά λ λ ω ν μ ορίω ν. Σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα η τοπ οϊσ ομ εράση I του ιο ύ Vaccinia viru s δ ια σ π ά τη μ ία α π ό τις δ ύ ο αλυσίδες του D tfa σε σ υγκ εκ ριμ ένες θέσεις (CCCTT), δ η μ ιο υ ρ γώ ντα ς ο μ ο ιο π ο λ ικ ό δεσμό μεταξύ του 3' φ ω σ φ ορ ικ ού ά κ ρ ου τη ς δ ια κ εκ ομ μ ένη ς α λ υ σ ίδ α ς κ α ι μ ια ς τυ ροσ ίνη ς της ίδιας (Tyr-274). Στη σ υ νέχ εια ο δεσ μ ός μεταξύ το υ D N A κ α ι του ενζύ μ ο υ δια κόπτεται α π ό τη ν υδροξυλικ ή ο μ ά δ α του ά κ ρ ο υ 5'- του δια κ εκ ομ μ ένου ά κ ρ ου και η α ντίδραση α ντιστρέφ ετα ι, α π ελ ευ θ ερ ώ νο ντα ς τη ν τοπ οϊσ ομ εράση I κ α ι ενώ νο ντα ς ξ α ν ά τη δ ια σ π α σ μ ένη α λ υ σ ίδ α το υ D N A (Σ χήμα 27). CCCTT GGGAAGT»-»o Overhang CA.CCATGΝΝΝ GTGGTACΝΝΝ PCR product ΝΝΝ ΝΝΝ AAGGG TTC CC Η προεξοχή εισβάλλει στη δίκλωνη αλυσίδα του DNA τοποϊσομεράση CCCTTCACC ATG ΝΝΝ GGGAAGTGG.TAC ΝΝΝ ΝΝΝAAGGG ΝΝΝTTC CC Σ χ ή μ α 2 7 : Δ ρ ά σ η τ η ς τ ο π ο ϊσ ο μ ε ρ ά σ η ς I 8 5

92 Μ ε βάση τ ο ν τρ ό π ο δ ρ ά σ η ς της τοπ οϊσ ομ ερ ά σ η ς I, η In vitrogen π α ρ έχ ει φ ο ρ είς κ λ ω νο π ο ίη σ η ς ο ι ο π ο ίο ι έ χ ο υ ν τρ ο π ο π ο ιη θ εί β ιο τ εχνο λ ο γικ ά μ ε τ η ν» π ρ οσ θ ή κ η μ ια ς α λ λ η λ ο υ χ ία ς 4 βάσεω ν (GTGG) δ η μ ιο υ ρ γώ ντα ς μ ια 'π ρ ο εξο χή ' στο φ ορέα. Ό π ω ς ήδη π ερ ιγ ρ ά ψ α μ ε σ το ν εκκινητή forw ard έ χ ο υ ν π ρ οσ τεθ εί ο ι 4 βάσεις (C A C C ). Σ τη ν α ντίδ ρ α σ η κ λ ω νοπ οιή σ η ς η π ρ ο εξο χή του φ ο ρ έα κ λ ω νο π ο ιή σ η ς εισ β ά λ λ ει στο 5 ά κ ρ ο του σ τόχου, π ρ ο σ α ρ μ ό ζετα ι, λ όγω σ υ μ π λη ρ ω μ α τικ ότη τα ς στις π ρ ο σ τιθ έμ ενες βά σεις κ α ι σ τα θ ερ οπ οιεί το π ρ ο ϊό ν στη σωστή κ α τεύ θυνσ η π ρ ο σ δ ίδ ο ν τ α ς σ τη ν α ντίδ ρ α σ η κ λω νο π ο ίη σ η ς π οσοσ τό επ ιτυ χ ία ς >90%. Ο α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ό ς λ α μ β ά ν ε ι χώ ρ α μ εταξύ ειδικ ώ ν θέσεω ν του φ ο ρ έα, τις a ttl l κ α ι a t t L l (Σ χή μ α 28). PCR product \ Σ χ ή μ α 28: 1 ) Α π ο μ ό ν ω σ η τ ο υ γ ο ν ι δ ίο υ σ τ ό χ ο υ μ ε α ν τ ίδ ρ α σ η P C R. 2 ) Τ ο γ ε ν ε τ ικ ό υ λ ικ ό ε ν ώ ν ε τ α ι ο μ ο ιο π ο λ ικ ά, μ έ σ ω μ ι α ς τ ο π ο ε κ λ ε κ τ ικ ή ς α ν τ ίδ ρ α σ η ς, μ ε τ ο ν φ ο ρ έ α D N A ( p E N T R / T E V / D T O P O ) κ α ι σ χ η μ α τ ίζ ε τ α ι τ ο α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο μ ό ρ ι ο D N A ( e n t r y c lo n e ). Δ ι α κ ρ ί ν ο ν τ α ι ο ι θ έ σ ε ις a t t L l, a t t L 2 τ ο υ φ ο ρ έ α κ λ ω ν ο π ο ιή σ η ς. Ο φ ο ρ έα ς p E N T R /T E V /D T O P O έχει κ ά π ο ια χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ά τα ο π ο ία επ ιτ ρ έπ ο υ ν τη γ ρ ή γ ο ρ η κ α ι υψ η λή α π ό δ ο σ η έκ φ ρ α σ η ς του γ ο ν ιδ ίο υ. Σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα, ο φ ο ρ έα ς α υ τ ό ς ε ίν α ι τ ρ ο π ο π ο ιη μ ένο ς έτσι ώστε ν α σ υ νεκ φ ρ ά ζει τ η ν α κ ο λ ο υ θ ία α ν α γ ν ώ ρ ισ η ς ENLYFQG α π ό τη πρω τεάση TEV (T obac co E tch V iru s TEV). T o σ τοιχείο α υ τό π α ίζει π ο λ ύ σ η μ α ντικ ό ρ ό λ ο στο κ α θ α ρ ισ μ ό της α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν η ς π ρ ω τεΐνη ς (βλ.π α ρακάτω ). Ο ι φ ο ρ είς του γ ενετικ ο ύ υ λ ικ ο ύ π ρ έπ ει επ ίσ η ς ν α π ερ ιέχ ο υ ν ένα δείκτη επ ιλ ο γ ή ς π ο υ ν α δ ιευ κ ο λ ύ νει τη γ ρ ή γ ο ρ η κ α ι θετική επ ιλ ο γή τω ν κ υττά ρ ω ν π ο υ π ερ ιέχουν το φ ο ρ έα με το ν έο D N A. Ο φ ο ρ έα ς p E N T R /T E V /D T O P O π εριέχει ένα γ ο ν ίδ ιο α ντίσ τα σ η ς στο α ντιβ ιο τ ικ ό κ α να μ ικ ίν η έτσι ώστε ν α γ ίνετ α ι εφ ικ τός 86

93 9 ο δια χω ρισμός τω ν κυττάρω ν E.coli π ο υ π ερ ιέχουν το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ένο π λασμίδιο (Σ χή μ α 29). Σ χ ή μ α 2 9 : Χ ά ρ τ η ς τ ο υ φ ο ρ έ α p E N T R / T E V / D T O P O. Δ ι α κ ρ ί ν ε τ α ι η θ έ σ η α ν α γ ν ώ ρ ισ η ς τ η ς π ρ ω τ ε ά σ η ς T E V κ α θ ώ ς κ α ι τ ο τ μ ή μ α π ο υ φ έ ρ ε ι α ν τ ίσ τ α σ η σ τ ο α ν τ ι β ιο τ ι κ ό κ α ν α μ υ κ ΐ ν η. 4.4 Μ ετα φ ο ρ ά το υ H S co2 γ ο ν ιδ ίο υ σ ε επ ιδ ε ικ τ ικ ά κ ύ τ τα ρ α E.coli Το τρ ο π ο π ο ιη μ ένο π λασμίδ ιο α ν εισαχθεί σε βακτή ρ ια ή α λλιώ ς σε κύτταρα ξενιστές με τη ν τεχνική του μ ετα σ χη μ α τισ μ ού (transform ation), π ο λλα π λα σ ιά ζετα ι σε κάθε κυτταρική διαίρεση τω ν βακτη ρ ίω ν, τα ο π ο ία καθώ ς π ο λ λ α π λ α σ ιά ζο ντα ι γ ρ ή γ ο ρ α, π ο λ λ α π λ α σ ιά ζο υ ν τ α υ τ ό χ ρ ο ν α σε εκατοντάδες α ν τίγ ρ α φ α και το τ ρ ο π ο π ο ιη μ ένο π λα σ μ ίδ ιο. Ό π ω ς λέγετα ι το γ ο ν ίδ ιο κ λω νοπ οιείτα ι κ α ι φ ο ρ έα ς της κ λ ω νο π ο ίη σ η ς ε ίν α ι το π λα σ μ ίδ ιο. Η ικανότη τα εισ α γω γή ς είνα ι χα μ η λή (π ερ ίπ ο υ 1 στα ΙΟ6 μ ό ρ ια D N A ), α λ λ ά ένα ικ α νοπ οιη τικ ό π οσοσ τό κ υττά ρω ν μ π ο ρ εί ν α μ ετα σ χη μ α τισ θεί κάτω α π ό κατάλληλες π ειραματικ ές συνθήκες. Σ υ χ ν ά χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ν τ α ι ως ξενιστές μ ετα λ λ α γμ ένα βα κ τή ρ ια (com p eten t), π ο υ δ εν κ α τα σ τρ έφ ουν ξ ένο D N A γρ ή γο ρ α. Δεκτικά γ ια μ ετα σ χη μ α τισ μ ό χα ρ α κ τη ρ ίζο ντα ι τα βακτηριακά κύτταρα τα ο π ο ία έχ ο υ ν τρ ο π ο π ο ιη θ εί κ α τά λλη λα ώστε η κυτταρική τους > μ εμ β ρ ά νη ν α γ ίν ε ι π ερισ σ ότερ ο δια π ερ α τή σ τη ν εισχώ ρηση π λασμιδ ια κ ού D N A (τεχνική 3). 8 7

94 Ο ξενισ τή ς π ο υ επ ιλέχτη κ ε σ τη ν περίπτω σή μ α ς ή τα ν τα βακτη ρια κ ά κ ύ ττα ρ α D H 5 a της κ υττα ρ ικ ή ς σ ειρ ά ς E scherichia C oli κ α ι α να π τ ύ χ θ η κ α ν σ ε * τρ υ β λ ία μ ε τη βοή θ εια θ ρ επτικ ού μ έσου. Τ α β α κ τη ρ ίδια α ρ χ ίζ ο υ ν ν α α ν α π α ρ ά γ ο ν τ α ι σ χη μ α τίζο ντα ς α π ο ικ ίες κ υττά ρ ω ν σ τη ν επ ιφ ά νεια του θ ρ επ τικ ού μ έσου. Ο π ο ιο δ ή π ο τε κ ύττα ρ ο E.coli π ο υ ε ίν α ι επιτυχώ ς μ ο λ υ σ μ ένο α π ό το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο D N A θα σ υνθ έσ ει ο λ λ ά α ν τ ίγ ρ α φ α του α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο υ D N A, π ο υ ε μ φ α ν ίζο ν τ α ι στο θρεπτικ ό μ έσο ως ευ κ ρ ινή ς κ η λ ίδ α (α π ο ικ ία ) α π ό συσσω ματώ σεις κ υττά ρω ν. Κ άθε κ η λίδ α α ντιπ ρ ο σ ω π εύ ει έ ν α κ λ ώ νο α π ό το α ρ χικ ό α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο D N A μ ό ρ ιο. Για ν α επ ισ η μ α ν θ ο ύ ν τα β α κ τή ρ ια π ο υ έ χ ο υ ν ενσω ματώ σει το α π α ιτ ο ύ μ ενο τμ ή μ α του D N A θα π ρ έπ ει το θρεπτικό μ έσο ν α π ερ ιέχει μ ια ουσία, όπω ς ένα α ντιβ ιο τικ ό, το ο π ο ίο ν α επ ιτρ έπ ει τη ν α νά π τ υ ξη μ ό ν ο τω ν μ ο λ υ σ μ ένω ν βακτη ρ ιδίω ν. Κ αι σε α υ τό το σ τά διο ε ίν α ι α π α ρ α ίτη το ν α γ ίν ε ι α ρ νη τικ ό ς έλεγχος. Γι' α υ τό το λ ό γ ο γ ίν ε τ α ι μ ετα φ ο ρ ά στα κ ύ ττα ρ α D H 5a 10 μΐ του α ρ νη τικ ο ύ δ είγ μ α το ς ελ έγχου της ενσ ω μ ά τω σ η ς α κ ο λ ο υ θ ώ ντα ς τ η ν ίδ ια π ειραματικ ή π ο ρ εία. Τ ο α ρ νη τ ικ ό δ είγ μ α ενσω μάτω σης π ερ ιέχει τ ο ν π λ α σ μ ιδ ια κ ό φ ο ρ έα χω ρ ίς το γ ο ν ιδ ια κ ό σ τό χο. Α ν η σ υ γ χώ νευ σ η έ γ ιν ε μ ε επ ιτυ χία στο π ρ ο η γ ο ύ μ ε ν ο σ τά δ ιο, δ ε ν θ α π ρ έπ ει ν α υ π ά ρ χ ο υ ν α π ο ικ ίες στο τρ υ β λ ίο του α ρ νη τικ ο ύ δ είγ μ α τ ο ς ελ έγχου, ενώ θα υ π ά ρ χ ο υ ν π ο λ λ ές α π ο ικ ίες στα τρ υ β λ ία τω ν κ υ ττά ρ ω ν D H 5a π ο υ π ε ρ ιέ χ ο υ ν το π λ α σ μ ίδ ιο H S co2 (Σ χή μ α 30). Σ χ ή μ α 30: Α π ο ι κ ί ε ς β α κ τ η ρ ιδ ίω ν σ ε τ ρ υ β λ ίο μ ε θ ρ ε π τ ικ ό υ λ ικ ό. 88

95 9 Μ ε τη χρήση κ α τά λλη λου π ρω τοκ όλλου το ο π ο ίο βα σίζετα ι στη χρήση ρητινώ ν α νιοντικ ή ς α ντα λ λ α γή (Q IA G E N P lasm id M id i and, M axi Kits) εξάγεται το α να σ υ νδ υ α σ μ ένο μ όριο α π ό τα κύτταρα D H 5a κ α ι στη σ υνέχεια επ ιβεβαιώ νεται η νουκ λεοτιδική α λ λ η λ ο υ χ ία με τη τεχνικ ή της δ ια δ ο χ ή ς του D N A (D N A sequencing). ί. 6 Υ π ο κ λ ω νο π ο ίη σ η του γ ο ν ιδ ίο υ H S co 2 μ ε τ η ν α ντίδ ρ α σ η α να σ υ ν δ υ α σ μ ο ΰ LR τ η ς G a tew a y Η G atew ay έχει εισ ά γει μ ια π α γκ οσμίω ς γνω στή τεχνικ ή κ λω νοπ οίη σ η ς η ο π ο ία εφ α ρμόζετα ι τα τελευταία χ ρ ό ν ια. Η τεχνική α υτή, η ο π ο ία ο νο μ ά ζετα ι α ντίδραση LR, επ ιτρ έπει τη μ ετα φ ορά τμ η μ ά τω ν D N A μεταξύ διαφ ορετικώ ν φ ορέω ν κ λω νοπ οίη σ η ς κ α ι έχει α ντικαταστήσει αποτελεσματικά τη ν χρήση τω ν π εριορισ τικ ώ ν ενζύ μ ω ν (en zim atic restriction) π ο υ χρ η σ ιμ ο π ο ιεί η κλασσική μ έθ ο δ ο ς κ λω νοπ οίη σ η ς. Η τεχνικ ή αυτή α ποτελεί το καλύτερο τρ ό π ο μ ετά βασης α π ό το σ τά διο της κ λω νοπ οίη σ η ς στο στάδιο της πρω τεϊνικής έκφρασης (G a tew a y c lo n in g m ech a n ism ) (τεχνικ ή 4). Σ υγκ εκ ρ ιμ ένα η α ντίδραση LR ε ίν α ι μ ια α ντίδ ρ α σ η α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ο ύ μεταξύ ειδικώ ν θέσεω ν, attl κ α ι attr, τω ν φ ο ρ έω ν κ λ ω νο π ο ίη σ η ς pe N T R κ α ι ε ν ό ς φ ο ρ έα π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ (d estin ation vector). Π ρ ο ϊό ν τη ς α ντίδ ρ α σ η ς είνα ι η δ η μ ιο υ ρ γία ενό ς φ ορέα έκφ ρασης (ex p ressio n vector) (Σ χή μ α 31). * 89

96 P C R product Σ χ ή μ α 31: Η α ν τ ίδ ρ α σ η L R κ α ι μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο υ γ ο ν ι δ ίο υ H S c o 2 σ τ ο φ ο ρ έ α έ κ φ ρ α σ η ς. Ο φ ο ρ έα ς εισ ό δ ο υ (entry clone) ο οποίο ς δ η μ ιουργή θ η κ ε στο π ρ ο η γ ο ύ μ ενο σ τά δ ιο π ερ ιέχ ει τις θέσεις attl ενώ ο φ ο ρ έα ς π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ (D estin ation vector) έχει σ χεδ ια σ τεί έτσι ώ στε ν α π ερ ιέχει τις θέσεις attr. Η εκτέλεση της α ν τ ίδ ρ α σ η ς LR έχει ω ς α π ο τέλ εσ μ α τη μ ετα φ ο ρ ά τη ς χ ο ν ιδ ια κ ή ς α κ ο λ ο υ θ ία ς π ο υ μ α ς ενδ ια φ έρ ει σε έ ν α ή κ α ι σε π ερ ισ σ ό τερ ο υ ς φ ο ρ είς π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ τ α υ τ ό χ ρ ο ν α, α ν α δ ε ικ ν ύ ο ν τ α ς τη χρ η σ ιμ ό τη τα της τεχνικ ή ς αυτής. Ο φ ο ρ έα ς π ρ ο ο ρ ισ μ ο ύ π ο υ επ ιλέχθ η κ ε σ τη ν π ερίπ τω σ η της H S co2 γ ια τ η ν α ντίδ ρ α σ η τ ο υ α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ο ύ LR ε ίν α ι ο p E T G -30A (E u ropean M olecu lar B iology L aboratory P rotein E xpression a n d P u rification F acility). 4.7 Μ ε τ α φ ο ρ ά το υ γ ο ν ιδ ίο υ H S co2 σε κ ύ τ τ α ρ α έ κ φ ρ α σ η ς E.C oli Μ ετά τ η ν κ λω νο π ο ίη σ η του γ ο ν ιδ ίο υ σ τ ο ν pe T G -30A α κ ολούθησε ο μ ετα σ χη μ α τισ μ ό ς κ α τά λ λ η λ ω ν, γ ια υ π ερ π α ρ α γ ω γ ή π ρ ω τεϊνώ ν, κ υττάρω ν B L 21-cod on +(Stratagene) κ α ι π α ρ ή χ θ η σ α ν μ ικ ρ ές κ α λλιέρ γειες γ ια τη ν εύρεση κ α τά λ λ η λ ω ν σ υ νθ η κ ώ ν γ ια τ η ν υ π ερ π α ρ α γ ω γ ή τη ς π ρω τεΐνη ς. Σε 90

97 πρώτο στά διο χρη σιμ οποιείτα ι πλή ρες θρεπτικό υλικ ό Luria Bertani LB γ ια Exoli. Η εύρεση τω ν κατά λλη λω ν σ υνθ η κ ώ ν α π ο μ ό νω σ η ς του πρω τεΐνικ ού μ ορίου ώστε ν α καταστεί δ υ να τός ο δομ ικ ός τους χα ρ α κ τη ρ ισ μ ός κ ρ ίνετα ι απαραίτητη. Π ολύ σ υ χνά παρατη ρ είτα ι π ερ ιορ ισ μ ένη έκφραση, α π οδιά τα ξη ή π εριορισ μ ένη διαλυτότητα τα ο π ο ία μ π ορεί ν α ο φ είλ ο ντα ι είτε στα χαρακτηριστικά του βιομ ορίου, είτε σε δ ιά φ ο ρ ο υ ς π α ρ ά γ ο ντες κ α τά τη ν έκφραση ή τη ν α πομ όνω σ η. Μ εταξύ ά λ λ ω ν π α ρ α μ έτρ ω ν π ο υ α φ ο ρ ο ύ ν στις διαδικασίες της έκφ ρασης ή της α π ομ όνω σ η ς,σ η μ α ντικ ό ρ ό λ ο π α ίζει ο φ ορέα ς έκφρασης. Η επ ιλογή του π λ α σ μ ιδ ίο υ π ο υ χρη σ ιμ οποιή θ η κ ε στη περίπτω ση μας έγ ινε βάσει σ υγκ εκ ρ ιμ ένω ν χαρακτη ρ ισ τικ ώ ν του π ο υ το κ α θ ισ τούν κ α τά λλη λο κυρίω ς γ ια τη ν αύξηση της δια λυτότη τας κ α ι το υ ψ η λ ό επ ίπ εδ ο έκφρασης της πρω τεΐνη ς (τεχνική 5). Ο φ ο ρ έα ς κλω νοπ οίη σ η ς petg -30A είνα ι τ ρ ο π ο π ο ιη μ ένο ς έτσι ώστε ν α σ υ νεκ φ ράζετα ι α μ ινοτελικ ά μ ε μ ια ο υ ρ ά έξι κ α τα λ ο ίπ ω ν ισ τιδ ίνη ς κ α ι μ ε τη πρω τεΐνη τρ α νσ φ ερ ά σ η ς της γ λ ο υ τα θ ειό νη ς (GST) (Σ χή μ α 32). Μ ε α υ τό τ ο ν τρ όπ ο η π ρω τεΐνη π ο υ θα π ρ ο κ ό ψ ει θα α ποτελεί π ρ ο ϊό ν σ ύ ντη ξη ς μ ε τ η ν GST (πρω τεΐνη 40 α μ ινοξέω ν) κ α ι τ ο ν ισ τιδινικ ό επ ίτο π ο μ ε σ υ νο λ ικ ό μ ο ρ ια κ ό β ά ρ ος His-Tag I GST TEV site r Μ.Β= H_sco2 λ μ!β=^ Σ χ ή μ α 3 2 : Η H S c o 2 μ ε τ ά τ η ν α ν τ ίδ ρ α σ η κ λ ω ν ο π ο ίη σ η ς Τ Ο Ρ Ο θ α φ έ ρ ε ι σ τ ο Ν - τ ε λ ικ ό ά κ ρ ο έ ν α ε ξ α ΐ σ π δ ιν ι κ ό ε π ίτ ο π ο κ α ι τ η ν π ρ ω τ ε ΐν η G S T. 91

98 Η δ υ να τ ό τη τα α π ο κ ο π ή ς του α μ ινο τελικ ο ύ, σ υ νεκ φ ρ α ζό μ ενο υ μ ε τη ν H S co2, τμ ή μ α το ς δ ίνετα ι μ ε τη χρ ή σ η της εξειδικευμ ένη ς π ρω τεάσης (TEV) η ' ο π ο ία α ν α γ ν ω ρ ίζει το ο λ ιγ ο π επ τ ίδ ιο ENLYFQ G κ α ι δ ια σ π ά τ ο ν π επτιδικ ό δεσ μ ό γ λ ο υ τ α μ ίν η ς κ α ι γ λ υ κ ίν η 115. Dralll Xhd (15S) Origl EcoRV (3S55) Σ χ ή μ α 33: Χ ά ρ τ η ς τ ο υ φ ο ρ έ α p E T G A. Σ ε κ ύ κ λ ο δ ια κ ρ ίν ο ν τ α ι, ο ι π ε ρ ιο χ έ ς, Τ 7 p r o m o t e r, H is - t a g, G S T. T o σ η μ ε ίο έ ν α ρ ξ η ς τ η ς μ ε τ α γ ρ α φ ή ς β ρ ίσ κ ε τ α ι λ ίγ ο μ ε τ ά τ ο ν Τ 7 ε π α γ ω γ έ α. Π α ρ α τ η ρ ο ύ μ ε π ω ς α μ έ σ ω ς μ ε τ ά τ ο ν Τ 7 ε π α γ ω γ έ α β ρ ί σ κ ο ν τ α ι ο ι γ ο ν ιδ ια κ έ ς π ε ρ ιο χ έ ς H i s - T a q κ α ι G S T. Η έκ φ ρ α σ η τη ς επ ιθ υμητή ς π ρ ω τεΐνη ς στα βακτη ρ ια κ ά κ ύττα ρ α δ ε ν γ ίνετ α ι α νεξέλεκ τα, α λ λ ά υ π ό κ ειτα ι σε α υ σ τη ρ ό έλ εγχο. Α υτό επ ιτ υ γ χ ά νετα ι μ ε τη χρ ή σ η του π ρ ο α γ ω γ έα του ο π ερ ο ν ίο υ της λα κ τόζη ς. Έτσι, π ρ ο κ ειμ έν ο υ ν α ξεκ ινή σ ει η έκ φ ραση του π επ τιδ ίο υ α π α ιτείτα ι η π α ρ ο υ σ ία λα κ τό ζη ς σ τ ο π ε ρ ιβ ά λ λ ο ν π ο υ α να π τ ύ σ σ ο ν τ α ι τα βακτη ρ ια κ ά κύτταρα. Ε πειδή, η λα κ τόζη ε ίν α ι έ ν α μ ό ρ ιο το ο π ο ίο κ α τα β ο λ ίζετα ι α π ό τα β α κ τη ρ ια κ ά κ ύττα ρα μ ετα β ά λ λ ο ν τ α ς έτσι τη σ υγκ έντρω σ ή της στο θρεπτικ ό μ έσο, α ντί α υτή ς χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ν τ α ι ο υ σ ίες π ο υ έ χ ο υ ν α ν ά λ ο γ η δράση ο ι ο π ο ίες δ εν κ α τ α β ο λ ίζο ντα ι. Η ο υ σ ία π ο υ χ ρ η σ ιμ ο π ο ιείτα ι ε ίν α ι ο ισ ο π ρ ο π υ λ ο -β -D - θ ειο γ α λ α κ τ ο π υ ρ α ν ο ζίτ η ς (iso p r o p y l^ -D -th io g a lo c to p y r a n o z id e (IPTG)). Α π ό τη σ τιγμ ή π ο υ π ρ οσ τίθ ετα ι στο θρεπτικ ό μ έσ ο κ α ι γ ια ό σ ο χ ρ ό ν ο σ υνεχισ τεί η 92

99 κ αλλιέργεια τω ν βακτηριακώ ν κυττάρω ν γ ίνετ α ι επ α γω γή της έκ φ ρ α σ η ς του επιθυμητού πεπτιδίου ή πρω τεΐνης. Α ρ χικ ά, η επαγω γή της έκφρασης κ α ι η παρατή ρηση της δια λυτότη τας διενεργήθηκε σε κ α λλιέργειες μικρής κ λίμ α κ α ς (l-1 0 m l π λ ή ρ ε ς θρεπτικού υλικ ού LB) κ α ι σε δ ιά φ ορες συνθήκες θερμοκ ρασία ς, σ υγκ έντρω σης του επ α γω γέα (IPTG ).K ai χ ρ ό ν ο υ επώ ασης. Σ τη ν περίπτω σή μ α ς ο βέλτιστος σ υ νδ υ α σ μ ός ή τα ν ο εξής: χρόνο ς επώ α σης 16 ώ ρες, θερμοκρασία 3 0 C κ α ι τελική συγκέντρω ση IP T G 0.7 m M. Στις συνθήκες αυτές βρέθηκε η κ ύ ρ ια π οσότη τα της πρω τεΐνης και σε διαλυτή μ ορφ ή. Το α π οτέλεσμα της π ρώ της δοκ ιμής α να λύθηκε με ηλεκτροφ όρηση σε πηκτή π ο λ υ α κ ρ υ λ α μ ιδ ίο υ SD S-PA G E 17% και στη βάση τω ν δ εδ ο μ ένω ν α υτώ ν α π ο φ α σ ίσ α μ ε ν α π ρ ο χω ρ ή σ ο υ μ ε σε μεγαλύτερη κ λίμ ακα κ α ι ν α εξετάσουμε τη ν α π όδοση της π ρω τεΐνη ς σε θρεπτικό υλικό με ελά χιστα μ έσα (βλ. παρακάτω ). Τ α υ τόχρ ονα, α κ ολουθώ ντα ς τη ν ίδια μ εθ ο δ ο λ ο γία, έγινε και ο π ρ οσ δ ιορισ μ ός τω ν σ υνθ η κ ώ ν έκφρασης της π ρω τεΐνη ς σε υ γ ρ ή κ α λλιέρ γεια ελάχιστου θρεπτικού υλικ ού Μ Η λ εκ τροφ ό ρ η σ η S D S Ο ι πρω τεΐνες είνα ι γνω σ τό ότι μ π ο ρ ο ύ ν ν α δ ια χ ω ρ ισ τ ο ύ ν κ α ι ν α εμ φ α νισ το ύ ν με η λεκτροφ όρηση σε πηκτή. Σε μ ια η λεκτροφ όρηση π ολυα κ ρ υ λα μ ιδ ίου, κάτω α π ό σ υνθ ή κ ες α π ο δ ιά τα ξη ς ο ι π ρω τεΐνες μ π ο ρ ο ύ ν ν α δια χω ρ ισ τούν κυρίω ς με βάση τη μ ά ζα τους. Τ ο μ είγ μ α τω ν πρω τεϊνώ ν πρώ τα δια λύετα ι σε δ ιά λ υ μ α δω δεκ υλοθΐΐκ ού να τ ρ ίο υ (SDS), ε ν ό ς σ ν ιο ν ικ ο ύ <α π ο ρ ρ υ π α ντικ ο ύ π ο υ καταστρέφ ει σ χ ε δ ό ν ό λες τις μη ο μ ο ιοπολικ ές α λλη λεπιδράσεις μ ία ς φ υσικ ή ς πρω τεΐνης. Π ροστίθετα ι επίσης μ ερ κ α π τοα ιθ α νόλη, π ο υ α ν ά γ ε ι δ ισ ο υ λφ ιδ ικ ο ύ ς δεσμούς. Τα α ν ιό ν τ α του SD S δεσ μ εύοντα ι στις κ ύριες α λυσ ίδες σε α ν α λ ο γ ία ε ν ό ς μ ο ρ ίο υ SD S α ν ά δ ύ ο ''α μ ινοξέα, π ο υ δ ίνει στο σ ύ μ π λ ο κ ο του SD S με α π ο δ ια τ α γ μ ένη πρω τεΐνη ένα μ εγά λ ο φ ορτίο π ερ ίπ ο υ α ν ά λ ο γ ο μ ε τη μ ά ζα τη ς π ρω τεΐνη ς. Τ α σ ύμ π λοκ α 93

100 SD S-α π ο δ ια τ α γ μ ένη ς π ρ ω τεΐνη ς η λ εκ τρ ο φ ο ρ ο ύ ντα ι σε π ο λ υ α κ ρ υ λ α μ ίδ ιο κ α ι η κ α τεύ θυνσ η ε ίν α ι α π ό π ά ν ω π ρ ο ς τ α κάτω. Σ το τέλος ο ι π ρω τεΐνες σ τη ν «πηκτή ε μ φ α ν ίζ ο ν τ α ι μ ε χρώ σ η κ υ α ν ο ύ το υ C o o m a ssie, π ο υ α π ο κ α λ ύ π τει μ ια σ ειρ ά α π ό ζώ νες. Η μ ετα κ ίνη σ η τω ν π ερ ισ σ οτέρ ω ν π ο λ υ π επ τιδ ικ ώ ν α λυσίδ ω ν κάτω α π ό αυτές τις σ υ νθ ή κ ες ε ίν α ι α π ολύτω ς α ν ά λ ο γ η μ ε τ ο ν λ ο γ ά ρ ιθ μ ο της μ ά ζα ς τ ο υ ς (Σ χή μ α 34). ν > ' ) Α ΰ ί\ >.. * r τ m * Σ χ ή μ α 34: Δ ια χ ω ρ ισ μ ό ς τω ν π ρ ω τειν ικ ώ ν μ ο ρ ίω ν μ ε β ά σ η το μ έγεθ ό ς τους. * Μ ετά τ η ν εύρεση τω ν βέλτιστω ν σ υ νθ η κ ώ ν έκφ ρασης της π ρω τεΐνη ς π ρ ο χ ω ρ ή σ α μ ε σε κ α λλιέρ γειες μ ε γ ά λ ο υ ό γκ ο υ. Για τ η ν α νά π τ υ ξη υ γ ρ ή ς π ρ ο κ α λ λ ιέρ γ εια ς π λή ρ ω ς θ ρ επ τικ ού υλικ ο ύ LB (π ου π ερ ιέχ ει τα α ντιβ ιο τικ ά ) εμ β ολιά σ τη κ ε π οσότη τα 10 m l α υ τού το υ υ λικ ο ύ μ ε κ ύ ττα ρ α μ ο ν ή ς α π ο ικ ία ς α π ό στερεό θρεπτικό υλικ ό. Η π ρ ο κ α λ λ ιέρ γεια επω άστη κε σε α ερ ό λ ο υ τρ ο σε 180 rpm, σ τους 3 7 C επ ί δώ δεκα ώρες. Γ ια τ η ν α νά π τ υ ξη υ γ ρ ή ς κ α λ λ ιέρ γεια ς π λή ρ ω ς θρεπτικ ού υλικ ού LB εμ β ο λ ιά σ τ η κ α ν 10 m l π ρ ο κ α λ λ ιέρ γ εια ς σε κω νική φ ιά λη τω ν 2 It π ο υ π εριέχει 94

101 m l LB. Τα κύτταρα επω άστη καν σ τους 30 C κ α ι στους 180 rp m μ έχρ ι το τέλος της εκθετικής φ άσης α νά π τυ ξη ς (0 0 = 0,7 ). Τότε π ρ οσ τέθ η κ α ν στη ν υγρή κ α λλιέργεια 0.7 m l δια λύμ α τος IPTG 1Μ κ α ι τα κύτταρα επ ω ά σ τη κ α ν στις ίδιες συνθήκες (180 rpm, 30 C) γ ια π ερ ίπ ο υ 16 ώ ρες (o v e r n ig h t). Μ ετά α π ό 16 ώρες επαγω γή ς, τα κύτταρα κ α τα β υ θ ίζο ντα ι με φ υγοκ έντρ η σ η στις 8000 rpm επί 20 λεπτά. Στη σ υνέχεια εκ π λύθηκαν με το ρυθμιστικό δ ιά λ υ μ α κ α ι έγινε Χύση τω ν κυττάρω ν με υ π έρ η χους σε π ά γ ο. Α μέσω ς μετά, τα κύτταρα υ π ερφ υγοκ εντρή θ η κ α ν για 40 λεπ τά στις rpm (4 C) γ ια ν α ξεχω ρίσει το δια λυτό α π ό το α διά λυτο κ λά σ μ α τω ν π ρω τεϊνώ ν. Δ είγμ α τα α π ό το υπ ερκ είμ ενο δ ιά λυμ α α λλά κ α ι α π ό το ίζη μ α η λεκ τρ οφ ορήθηκαν σε πηκτή π ο λυα κ ρ υ λα μ ιδ ίου SDS. Τ ελικά στο g el εμ φ α νίσ τη κ ε υπ ερ εκ φ ρ α σ μ ένη τα ινία της πρω τεϊνικής π ερ ιοχή ς H Sco2 στο δ είγ μ α του υ π ερ κ είμ ενο υ δ ια λύμ α το ς γ εγ ο ν ό ς π ο υ δείχνει πω ς η πρω τεΐνη βρίσκεται σε διαλυτή μ ορφ ή. Για τη ν α νά π τυξη υ γρ ή ς κ α λλιέρ γεια ς ελά χισ του θρεπτικού υλικ ού Μ 9 (π ου π εριέχει τα α παραίτη τα α ντιβ ιοτικ ά ) εμ β ο λιά σ τη κ α ν 10 m l π ρ οκαλλιέρ γεια ς σε κωνική φ ιάλη τω ν 2 It π ο υ π ερ ιέχει 1000 m l Μ 9. Τα κύτταρα επω άστηκαν στις ίδιες συνθήκες (180 rpm, 30 C) μ έχρ ι το τέλος της εκθετικής φ άσης α νά π τυξη ς (O D = 0,7). Τότε π ρ οσ τέθ η κ α ν σ τη ν υγρ ή κ α λλιέρ γεια 0.7 m l δ ια λύμ α το ς IPTG 1Μ κ α ι τα κ ύττα ρ α επ ω ά σ τη κ α ν στις ίδιες συνθήκες (180 rpm, 30 C) επ ί 16 ώ ρες. Τα κύτταρα σ υ λλέχθη κ α ν και φ υ γ ο κ εντρ ή θ η κ α ν γ ια 20 λ επ τά στις 8000 rpm (4 C). Στη σ υ νέχεια εκ π λύθηκαν μ ε κ α τά λλη λο ρυθμιστικό δ ιά λ υ μ α και έγινε λύση τω ν κυττάρω ν μ ε υ π έρ η χ ο υ ς σε π ά γ ο. Α μέσω ς μετά τα κύτταρα υ π ερ φ υ γοκεντρ ή θ η κ α ν επί 40 λεπ τά στις rpm (4 C). Δ είγμ α τα α π ό το, υπερ κ είμ ενο δ ιά λυμ α, α λλά κ α ι α π ό το ίζη μ α, η λεκ τροφ ορή θ η κ α ν σε πηκτή π ολυα κ ρ υ λ α μ ιδ ίο υ SDS. Τ ελικά στο g el εμ φ α νίσ τη κ ε υ π ερ εκ φ ρ α σ μ ένη τα ινία της πρω τεϊνικής π ερ ιοχή ς H Sco2 στο δ είγ μ α του υ π ερ κ είμ ενο υ δια λύμ α τος. 95

102 4.10 Κ α θ α ρ ισ μ ό ς τ η ς δ ο μ ικ ή ς π ε ρ ιο χ ή ς Ο ι π ρ ω τεΐνες μ π ο ρ ο ύ ν ν α κ α θ α ρ ισ τ ο ύ ν σε ενερ γή μ ο ρ φ ή βάσει τω ν * χ α ρ α κ τη ρ ισ τικ ώ ν τους, όπ ω ς μ έγεθος, δια λυτότη τα, φ ο ρ τίο και ειδική δέσμευση. Η α π ο μ ό νω σ η κ α ι ο κ α θ α ρ ισ μ ό ς της α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ένη ς π ρω τεΐνη ς H S co2 α π ό το μ ίγ μ α π ρ ω τεϊνώ ν έγινε μ ε χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία σ υ γ γ ένεια ς χ ρ η σ ιμ ο π ο ιώ ν τ α ς το π ρ ο ϊό ν H it rap C h e la tin g H P τ η ς Q ia g en. Η χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία σ υ γ γ έ ν ε ια ς β α σ ίζετα ι σ τη ν εξειδικευμ ένη κ α ι αντιστρεπτή δέσμευση της π ρ ω τεΐνη ς, π ά ν ω σε μ ό ρ ια (ligan d s) π ο υ β ρ ίσ κ οντα ι κ α θ η λ ω μ ένα π ά ν ω σε α δ ρ α ν έ ς υ λ ικ ό χ ρ ω μ α το γ ρ α φ ία ς. Γ ενικ ά η χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία σ υ γ γ έ ν ε ια ς μ π ο ρ εί ν α χρη σ ιμ ο π ο ιη θ εί α π οτελεσ μ α τικ ά στη ν α π ο μ ό ν ω σ η π ρ ω τεϊνώ ν π ο υ α ν α γ ν ω ρ ίζ ο υ ν μ ια ο μ ά δ α X ως εξής: 1) ο μ ο ιο π ο λ ικ ή δέσμευση του X σε στήλη 2) π ρ οσ θ ή κ η του μ είγ μ α τ ο ς της π ρ ω τεΐνη ς στη στήλη, π ο υ στη σ υ νέχεια ξεπ λ ένετα ι μ ε ρ υθμισ τικ ό δ ιά λ υ μ α γ ια ν α α π ο μ α κ ρ υ ν θ ο ύ ν ο ι π ρω τεΐνες π ο υ δ ε ν δ εσ μ εύ τη κ α ν, και 3) έκ λουση της π ρ ω τεΐνη ς σε κ α θ α ρ ή μ ο ρ φ ή Η δομ ικ ή π ερ ιο χ ή H S co2 είνα ι μ ια π ρ ω τεΐνη η ο π ο ία φ έρει στο Ν - τελικ ό ά κ ρ ο της α κ ο λ ο υ θ ία μ ε έξι ισ τιδίνες (H is-t aq) κ α ι τη ν π ρ ω τεΐνη ϋ 5 Τ (Σ χή μ α 35). Το π λ εο νέκ τη μ α της π ροσ θ ή κ η ς της α κ ο λ ο υ θ ία ς τω ν ισ τιδ ινώ ν στο μ ό ρ ιο της H S co2 έγκ ειτα ι σ το ν εύκολο, γ ρ ή γ ο ρ ο κ α ι α ποτελεσματικ ό κ α θ α ρ ισ μ ό της π ρ ω τεΐνη ς μ ε τη χρήση χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία ς σ υ γ γ ένεια ς H itrap. Στη χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία H it rap η στήλη φ ορ τίζετα ι μ ε ιόντα- Ζ π2+ κ α ι η μ έθ οδος σ τη ρ ίζετα ι σ τη ν ισ χυρή π ρ όσ δ εσ η τω ν εκ τεθειμένω ν ισ τιδ ινώ ν στα ιό ν τ α Ζ η2+. Μ ε α υ τό τ ο ν τ ρ ό π ο μ π ο ρ εί ν α γ ίν ε ι γ ρ ή γ ο ρ α δ ια χω ρ ισ μ ό ς του π ρω τεϊνικ ού σ τό χ ο υ α π ό μ ίγ μ α β α κ τη ρ ια κ ώ ν π ρω τεϊνώ ν. 96

103 9 Ρητίνη Zn Hb-Tag GST TEVsite C J k. H sco2 Σ χ ή μ α 3 5: Δ έ σ μ ε υ σ η τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς σ τ η ρ η τ ίν η τ η ς σ τ ή λ η ς κ α θ α ρ ισ μ ο ύ. Καθώς π ερ νά ει το πρω τεϊνικό εκ χύλισ μ α α π ό τη ν στήλη, θα κατακρατηθεί μ ό ν ο η πρω τεΐνη π ο υ φ έρει τ ο ν επ ίτο π ο τω ν ισ τιδινώ ν, ενώ οι τυ χό ν μη ειδικές α λλη λεπιδράσεις με άλλες π ρω τεΐνες εξα λείφ ο ντα ι με εκπλύσεις της στήλης με ρυθμιστικό δ ιά λυμ α, π ο υ π ερ ιέχει κατάλληλη ποσότητα ιμ ιδα ζολίου. Α κολουθεί δεύτερος κ α θ α ρ ισ μ ός ό π ο υ α ποκόπ τετα ι η ιστιδινική ο υ ρ ά α π ό τη ν επιθυμητή πρω τεΐνη με τ η ν δράση της πρω τεάσης TEV ενώ τ α υ τ ό χρ ο να α ποδεσ μ εύετα ι α π ό τη ν π ρω τεΐνη GST. Η πρω τεάση TEV α να γ νω ρ ίσ ει κ α ι 'κόβει' μ ια α κ ο λ ο υ θ ία (TEV site) η οπ οία, όπω ς ήδη α να φ έρθηκε, εντοπίζετα ι ακριβώ ς π ρ ιν α π ό το Ν -ά κ ρ ο της π ολυπεπτιδικής α λυσίδ α ς της π ρω τεΐνη ς στόχου. Α υτή τη φ ο ρ ά δ εσ μ εύοντα ι α π ό τη ν ρητίνη της στήλης ο ι μη επιθυμητές βακτη ριακές π ρω τεΐνες, ενώ η πρω τεΐνη στόχος συλλέγεται καθαρή. Η ηλεκτροφ ορητική α νά λυση με SD S-PA G E του καθαρισ μ ο ύ της 6H is- T ag-g ST -H Sco2 π α ρ ουσιά ζετα ι στο Σ χή μ α 36. Ό π ω ς φ α ίνετα ι, μ ετά τη ν α π ομ ά κ ρ υνσ η της ιστιδινικ ής ο υ ρ ά ς κ α ι επ ομ ένω ς κ α ι τη ς GST, η H Sco2 π α ρ ά χετα ι σε μ εγά λες ποσότητες (0,7-0,8m M ) κ α ι με μ εγά λ η κ αθαρότη τα (τεχνική 6). 1ος κ α θαρισμός. Τ ο Μ.Β τη ς π ρ ω τεΐνη ς είνα ι ~ Υ π ά ρ χει ακόμ η η H i-tag και η G ST. T E V π ρω τεά ση 2 ι κ α θ α ρ ισ μ ό ς. Τ ο Μ.Β τη ς π ρ ω τ ε ΐν η ς ε ί ν α ι Έ χ ει π ρ ο η γ η θ ε ί α π ο μ ά κ ρ υ ν σ η τ ω ν 6 H is κ ο τ η ς G S T. Η H S c o 2 ε ίν α ι κ α θ α ρ ή. Σ χ ή μ α 36: Η λ ε κ τ ρ ο φ ο ρ ε τ ικ ό ς κ α θ α ρ ισ μ ό ς τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς H S c o 2. 97

104 4.11 Ε π ισ ή μ α ν σ η μ ε ισ ό το π α 13C κ α ι 15Ν Π ρ ο κ ειμ ένο υ ν α επ ισ η μ α νθ εί κ α ι ν α υπερεκ φ ραστεί η H Sco2 μ ε τα, ισ ό το π α 15Ν, 13C χρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ ε στο μ έσο κ α λλιέρ γεια ς π η γή αζώ του ή ά ν θ ρ α κ α εμ π λ ο υ τισ μ ένη στο επ ιθ υμητό ισ ό το π ο (τεχνική 7) Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τ η ς δ ο μ ή ς τ η ς H S co 2 μ ε φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία N M R Η τα υ τοποίη σ η τω ν φ α σ μ ά τω ν N M R καθώ ς κ α ι ο π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς της δ ο μ ή ς τη ς C u (I)H S co2 επ ιτεύχθηκε μ ε έ ν α σ ύ ν ο λ ο π ειρ α μ ά τω ν (Π ίν α κ α ς 1 Π α ρ ά ρ τ η μ α I). Ό λ α τα φ ά σ μ α τα N M R π ρ α γ μ α τ ο π ο ιή θ η κ α ν σε θ ερ μ οκρασία 308 Κ. Σ υ ν ο λ ικ ά, γ ια τ η ν C u (I)H S co2 τα υ τοποιή θ η κ α ν ο ι σ υ ντονισ μ ο ί του 96% τω ν α τ ό μ ω ν ά νθ ρ α κ α, 98% τω ν α τό μ ω ν αζώ του κ α ι 95% τω ν π ρ ω το νίω ν (Π ίν α κ α ς 2 Π α ρ ά ρ τ η μ α I). Για τ η ν ελεύθερη μ ο ρ φ ή (apo), η τα υτοποίη σ η της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς π ρ α γ μ α τ ο π ο ιή θ η κ ε σ υ ν δ υ ά ζο ν τ α ς π ειρ ά μ α τα τρ ιπ λ ο ύ σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ (H N C A, H N (C O )C A κ α ι H N C O ) (Π ίν α κ α ς 3 Π α ρ ά ρ τ η μ α I) ενώ η τα υ τοποίη σ η τω ν π ρ ω το ν ίω ν του ισ τιδ ινικ ού δα κ τυλίου έ γ ιν ε μ ε τη ν α ν ά λ υ σ η του φ ά σ μ α τ ο ς 13C -N O E SY -H SQ C κ α ι με j o π είρ α μ α 1Η -15Ν H SQ C με το ο π ο ίο α ν ιχ ν ε ύ ο ν τ α ι οι σ υζεύξεις 2] Ή - 15Ν. Ο ι π εριορισ τικ ές συνθήκες α π ό σ τα σ η ς Ή - 1 Η (d istance constrain s) εξά χθ η κ α ν α π ό τη ν α νά λ υ σ η τω ν φ α σ μ ά τ ω ν 2D -N O E SY, 15N -N O E SY -H S Q C, 13C -N O E SY -H SQ C κ α ι 13C- N O E SY -H SQ C. Σ υ νο λ ικ ά, γ ια το π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό της δομ ή ς της C u(i)h Sco2 χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή σ α μ ε 2296 α π ο σ τά σ εις π ρ ω το νίο υ -π ρ ω το νίο υ μ α ζί μ ε 87 φ κ α ι 89 ψ π ερ ιο ρ ισ μ ο ύ ς γ ω νιώ ν στρέψ εω ς. Η δομ ή υ π ολογίσ τη κ ε με το π ρ ό γ ρ α μ μ α D Y A N A. Τ ο ιό ν του χ α λ κ ο ύ σ υμ π ερ ιλή φ θ η κ ε στους υ π ο λ ο γ ισ μ ο ύ ς π ρ ο σ θ έτο ντα ς έ ν α κ α ιν ο ύ ρ ιο α μ ιν ο ξ ύ σ τη ν α μ ινο ξικ ή α κ ο λουθία, όπ ω ς έγινε κ α ι γ ια ά λ λ α π α ρ ό μ ο ια σ υστή μ ατα. Τα ά τομ α θείου τω ν κ υστεινικ ώ ν υ π ο κ α τα σ τ α τώ ν (C ys 133 κ α ι C ys 137) κ α ι το Ν Η 2 της H is 224 σ υ νδ έθ η κ α ν με ο το μ ετα λ λ ικ ό ιό ν με μ έγισ το ό ρ ιο α π ό σ τα σ η ς 2.3 και 2.1 Α, α ντίσ τοιχα. 98

105 9 Ο ι καλύτερες 30 δομές α π ό τ η ν ο ικ ο γένεια D Y A N A υ π ο β λ ή θ η κ α ν σε π εριορ ισ μ ό ελα χιστοποίη σης της ενέρ γ εια ς (REM) με το π ρ ό γ ρ α μ μ α AM BER 8.0. Η στατιστική α νά λυση της ο ικ ο γένεια ς REM της C u(i)h Sco2 δομ ή ς π α ρ ουσιά ζετα ι στο Π α ρ ά ρ τη μ α I (Π ίν α κ α ς 4). Στη σ υ νέχεια έγ ινε χρή σ η τω ν π ρ ο γρ α μ μ ά τω ν PROCHECK, PR O C H ECK-N M R και W H A TIF π ρ οκ ειμ ένου ν α α ξιολογη θεί η ποιότητα τω ν δ ομ ώ ν (Π α ρ ά ρ τη μ α 4) Τ ιτλοδότη σ η μ ε Cu(I) του δείγ μ α τ ο ς H S co2 Η α νη γ μ ένη μορφ ή της H Sco2 δεσμεύει ένα ισ ο δ ύ ν α μ ο χαλκ ού(ι) ή χαλκού(ιι), όπω ς και η ο μ ό λ ο γή της H S c o l. Π ρ ο κ ειμ ένου ν α τιτλοδοτή σουμ ε το δείγμ α της H Sco2 με χ α λ κ ό γ ίνετ α ι α λλα γή του π ρω τεϊνικ ού δ ια λ ύ μ α το ς σε ρυθμιστικό φ ω σφορικό δ ιά λυμ α 50 m M, ρ Η = 7.2 με τη χρή σ η στήλης αφαλάτω σης (PD -10 d esa ltin g colum n ). Α ρ α ιώ νετα ι η π ρω τεΐνη μ έχρ ι τελικής συγκέντρω σης 60μΜ. Π ροστίθεται στο δ ιά λ υ μ α α να γ ω γ ικ ό DTT( διθειοθρειτόλη) κ α ι η τελική του συγκέντρω ση στο δ ιά λ υ μ α ε ίν α ι 10 m M, π ροκειμ ένου ν α α να χθ εί ο δ ισ ουλφ ιδ ικ ός δεσ μ ός του μ ο τίβ ο υ C PXXCP π ρ ιν τη προσθήκη του χα λ κ ο ύ. Έ πειτα, σ τη ν περίπτω ση της μ ετα λλοπ ο ίη σ η ς με Cu(II), α π ο μ α κ ρ ύ νετα ι το DTT με τη χρή σ η της P D -10, ενώ στη περίπτω ση της μ ετα λλοπ οίη σης μ ε C u(i), στο δ είγμ α π α ρ α μ ένει Im M DTT. Ο ι μ ετα λλοπ οιη μ ένες μ ορφ ές Cu(I) κ α ι Cu(II) α π οκ τή θ η κ α ν με προσθήκη στοιχειομ ετρικ ώ ν π οσοτή τω ν τω ν μ ετα λλικ ώ ν ιό ντω ν, όπω ς [Cu(I)(CH3CN)4]PFe ή C us0 4, στο δ ιά λ υ μ α της π ρω τεΐνη ς. Το δ ιά λ υ μ α σ υμ π υκνώ νετα ι σε τελικό ό γ κ ο 500μ1 κ α ι π ροσ τίθετα ι 1 0 % (ν /ν ) D 2O. Η τελική συγκέντρω ση της π ρω τεΐνη ς είνα ι ~ 1 m M κ α ι η α ν α λ ο γ ία δεσ μ ευμένου,χα λ κ ο ύ (Ι) /π ρ ω τ ε ΐν η ς 1,0:1,0. Ό λη η πειραματικ ή δ ια δ ικ α σ ία τιτλοδότησης χ α λ κ ο ύ έγ ινε σε α να ερ ό β ιες συνθήκες μ έσα σε θ ά λα μ ο glove box κ α ι το σο^ληνάριο N M R α σ φ α λίζετα ι αεροστεγώ ς π ρ ιν βγει α π ό τ ο ν θάλα μ ο. 99

106 4.14 Υπολογισμοί τοο δυναμικού οξειδοαναγωγής της apohsco2 Σ ε έ ν α ε π ό μ ε ν ο σ τά δ ιο υ π ο λ ο γ ίσ τη κ ε τ ο δ υ να μ ικ ό ο ξειδ ο α να γ ω γ ή ς της ap o H S co 2. Η ο ξειδ ο α ν α γ ω γ ικ ή ισ ο ρ ρ ο π ία μ ετα ξύ της ap o H S co 2 κ α ι της γ λ ο υ τ α θ ε ιό ν η ς μελετήθηκε μ ε φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία φ θ ορισ μ ού. Η οξείδω ση της ο μ ά δ α ς θειόλη ς τη ς G SH ο δ η γ εί σ τ ο ν σ χη μ α τισ μ ό οξειδω μ ένη ς γλουτα θ ειό νη ς (G SSG ) στο ο π ο ίο δ ύ ο μ ό ρ ια τη ς G S H ε ν ώ ν ο ν τ α ι μ ε δ ισ ο υ λφ ιδ ικ ό δεσ μ ό Η σ υγκ έντρ ω σ η του π ρ ω τεϊνικ ο ύ δ είγ μ α το ς ή τ α ν 5μΜ. Τ ο δ είγ μ α επω άστηκε γ ια τ ο υ λ ά χ ισ τ ο ν 6 h σε α ν α ε ρ ό β ιε ς σ υνθ ή κ ες, μ ε δ ια φ ορετικ ούς λ ό γ ο υ ς G S H /G S S G (0.1 πιμ GSSG κ α ι διαφ ορετικές συγκεντρώ σεις G SH, m M ) σε ρ υθμισ τικ ό δ ιά λ υ μ α φ ω σ φ ο ρ ικ ο ύ 50 m M, ρ Η =

107 » <BM B.ν σ Σ <Ε<ΡΤΆ<ΣΙΆ<Σ 4.15 ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ P174L -H Scol Ό π ω ς α να φ έρθηκε στο Κ εφ ά λα ιο 1, στα α νθ ρ ώ π ινα γ ο ν ίδ ια τω ν H S c o l και H Sco2 έ χ ο ο ν παρατη ρηθεί π α θ ο γ ενείς μεταλλάξεις, ο ι ο π ο ίες π ρ ο κ α λ ο ύ ν σ οβαρή α νεπ ά ρ κ εια του ένζυ μ ο υ C co κ α ι ο δ η γ ο ύ ν σε δια φ ορετικ ούς κ λινικ ούς φ α ινοτύπους. Σ τη ν Sco2 έ χ ο υ ν π α ρ α τη ρ η θ εί τέσσερις σημειακές μεταλλάξεις (Ε140Κ, S225F, W 166R, L151P) π ο υ σ υ νδ έο ν τ α ι με υπερτροφ ική κ α ρ διομ υοπάθεια, εγκ εφ α λομ υ οπ ά θ εια κ α ι υ π ο τ ο ν ία κ α τά τις πρώ τες μ έρες ζω ής του ν ε ο γ ν ο ύ, ενώ μ ία σημειακή μ ετά λλα ξη (P174L) σ τους α σ θ ενείς H S c o l δ η μ ιουργεί η π α τοεγκ εφ α λομ υοπάθεια, μ ια π ρ οοδευ τικ ή βρεφ ική α σ θ ένεια π ο υ επηρεά ζει κυρίω ς το συκώτι. Για ν α διαφω τιστεί α κ όμ η π ερισ σ ότερ ο ο ρ ό λος τω ν δ ύ ο α υτώ ν π ρω τεϊνώ ν, στο δεύτερο μ έρ ο ς τη ς ερ γα σ ία ς, σχεδιάστηκε η π α θ ο γ ό ν ο ς μ ετάλλαξη P 174L -H Scol κ α ι α κ ολούθησε συγκριτική μελέτη τω ν δομ ικ ώ ν κ α ι β ιοχη μ ικ ώ ν ιδιοτή τω ν τω ν H S co lw T (φ υσικού τύπου) και P 174L -H S col π ρ ο κ ειμ ένο υ ν α δ ιευ κ ρινισ τεί ο ρ ό λ ο ς της π ρω τεΐνη ς H S c o l στη βιοχημική ο δ ό, δ η λα δ ή το μ η χ α ν ισ μ ό μ ετα φ ο ρ ά ς του χα λ κ ο ύ σ το ν ά νθρω π ο Μ έθ ο δ ο ς σ η μ εια κ ή ς μ ετά λ λ α ξη ς σ το γ ο ν ίδ ιο H S c o l Για ν α αποκτήσει το γ ο ν ίδ ιο H S c o l τη ν α λ λ η λ ο υ χ ία του μ ετα λλα γμ ένο υ τύ π ου θα π ρ έπ ει ν α α ντικ α τα στα θεί η π ρ ο λ ίν η 174 α π ό τη λεύκινη. Σ την νουκ λεοτιδικ ή α λ λ η λ ο υ χ ία η αντικ α τά στα ση αυτή α φ ο ρ ά τη θέση C520T. Για τη δ η μ ιο υ ρ γία σημειακής μ ετα λλά γη ς σ τη ν α λ λ η λ ο υ χ ία της *». H S c o l, χρησιμ οποιή θη κ ε το σύστημα α ντιδ ρ ά σ εω ν Q u ik C h a n g e I I S ite - i D ir e c te d M u ta g e n e s is K i t της ετα ιρ εία ς Stratagene. Π ρ όκ ειται γ ια ένα σύστημα κ α τευ θυνόμ ενη ς μ ετα λλα ξιογένεσ η ς, το ο π ο ίο επιτρέπει την απευθείας μετάλλαξη του γ ο νιδ ίο υ -σ τ ό χ ο υ, χω ρ ίς τη ν α νά γ κ η ιιεραιτέρω κ λω νοπ οίη σ η ς του γ ο νιδ ίο υ. Π ερ ιλ α μ β ά ν ει τέσσερα σ τά δια με α π όδοση σε 101

108 σωστή μ ετα λ λ α γ ή ά νω το υ 80%. Α ρ χικ ά μ ια π ο λυμ ερ ά σ η υ ψ η λ ή ς α κ ρ ίβεια ς ( P ju T u rb o D N A p o ly m era se) δ η μ ιο υ ρ γ εί ν έ α α ν τ ίγ ρ α φ α του πλ α σ μ ιδ ίο υ, π ο υ * φ έ ρ ο υ ν τη μ ετά λλα ξη, μ ε π ερ ιο ρ ισ μ ένο α ρ ιθ μ ό κ ύ κ λ ω ν α π οδιά τα ξη ς, υ β ρ ιδ ο π ο ίη σ η ς κ α ι επέκτασης. Τ ο δεύτερ ο σ τά δ ιο π ερ ιλ α μ β ά ν ει τ η ν π έψ η του D N A -μ ή τρ α ς, π ο υ ε ίν α ι μ εθ υ λ ιω μ ένο, με το ένζυ μ ο D p n I. Τ ο τελικό στά διο α φ ο ρ ά το μ ετα σ χη μ α τισ μ ό κ α τά λ λ η λ ω ν επιδεκτικώ ν κ υττά ρω ν μ ε τα μ ε τ α λ λ α γ μ έ ν α α ν τ ίγ ρ α φ α το υ π λ α σ μ ιδ ίο υ. Η επ ιλ ο γή τω ν μ ετα λλα γμ ά τω ν γ ίν ε τ α ι με τη χρήση α ντιβ ιο τικ ο ύ, στο ο π ο ίο ο π λ α σ μ ιδ ια κ ό ς φ ορέα ς π ρ ο σ δ ίδ ει α νθ εκ τικ ότη τα (Σ χή μ α 37). Στη π α ρ ο ύ σ α ερ γ α σ ία ω ς D N A -μ ή τρα χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ ε το π λ α σ μ ίδ ιο pe T G -30A (G atew ay) το ο π ο ίο π εριέχει τη ν α κ ο λ ο υ θ ία π ο υ εκ φ ρ ά ζει τ η ν π ρ ω τεΐνη H S c o l φ υ σ ικ ού τ ύ π ο υ (w t H S c o l). Π ρ έπ ει ν α τονισ τεί π ω ς η κ λ ω νο π ο ίη σ η κ α ι η έκφ ραση τη ς w th S c o l έγ ινε στο ίδ ιο ερ γα σ τή ρ ιο α π ό τ ο ν ερ ευνη τή M an u elle M artinelli σε π ρ ο η γ ο ύ μ ενο σ τά δ ιο της π α ρ ο ύ σ α ς ερ γ α σ ία ς. Η H S c o l φ έρει στο ά μ ινο -τ ελ ικ ό της ά κ ρ ο έ ν α ν εξα ϊσ τιδ ινικ ό επ ίτο π ο (6xH is-t ag) καθώ ς κ α ι τη ν π ρω τεΐνη GST. Ε π ο μ ένω ς κ α ι η μ ετα λ λ α γ μ έν η π ρ ω τεΐνη π ο υ θ α π α ρ α χ θ εί θ α π ερ ιέχει τη ν α κ ο λ ο υ θ ία 6H is-g ST σ το Ν -τ ελ ικ ό ά κ ρ ο της (τεχνική 8). Αρχικό πλασμίδιο Εκκινητής που περιέχει την επιθυμητή μετάλλαξη Μ εταλλαγμένο πλασμίδιο Σ χή μ α 37: Τα σ τά δ ια της σ η μ εια κ ή ς μ ετά λλα ξη ς του γ ο ν ίδ ιο υ H S c o l119 Για τη μ ετά λλα ξη α υτή σ χεδ ιά σ τ η κ α ν ο ι π α ρ α κ ά τω εκκινητές, ό π ο υ φ α ίνετα ι εμ φ α νίζετ α ι η επιθυμητή μετάλλαξη : 102

109 C C A i For: 5'-C A T T G C C C T G A T G T C T G T C T A G A A G A A C T A G A A A A G A T G -3' Rev: 5'-C A T C T T T T C T A G T T C T T C T A G A C A G A C A T C A G G G C A A T G -3' Τελικά, το νέο π λα σ μ ίδιο (m u ta n t type), μ εταφέρεται στα βακτη ρια κ ά κύτταρα D H 5a με τη ν ίδια πειραματική π ο ρ εία π ο υ α να φ έρ θ η κ ε γ ια τη Sco2. Μ ε βάση το π ρω τόκ ολλο Q IA G E N P lasm id M id i an d M axi K its έγινε εξα γω γή του π λ α σ μ ι$ίου από τα κύτταρα D H 5a σε υψ η λή α π όδοση. Ο ι υ π ο ψ ή φ ιο ι κ λώ νοι στά λθηκαν σε ειδικ ό ερ γα σ τή ρ ιο στο Μ ιλ ά ν ο γ ια α νά λυση της νουκ λεοτιδικ ή ς α λ λ η λ ο υ χ ία ς κ α ι γ ια επιβεβαίω ση της αντικατάστασης της π ρ ο λ ίνη ς α π ό τη ν λεύ κ ινη στη θέση Έ κ φ ρ α σ η τη ς π ρ ω τ εΐν η ς P L H S co l Μ ετά τη ν κλω νοποίηση του μ ετα λ λ α γ μ ένου γ ο ν ιδ ίο υ α κ ολούθησε ο μ ετα σχη μ α τισμός κ α τά λλη λω ν, γ ια υ π ερ π α ρ α γ ω γ ή π ρ ω τεϊνώ ν, κυττάρω ν [BL21(DE3)GOLD] κ α ι π α ρ ή χθη σ α ν μικ ρές κ α λλιέρ γειες σε υ γρ ή κ α λλιέρ γεια ελά χιστου κ α ι π λ ή ρ ο υ ς θρεπτικού υ λικ ού γ ια τη ν εύρεση κ α τά λλη λω ν συνθηκώ ν γ ια τη ν υ π ερ π α ρ α γω γή της π ρ ω τεΐνη ς (π α ρ ό μ ο ια με τη Sco2). Τα α ρ χικ ά π ειρ ά μ α τα έδειξα ν ότι η π ρω τεΐνη είνα ι διαλυτή κ α ι π α ρ ά γ ετα ι σε μ εγά λες ποσότητες. Σ την περίπτω ση της P 174L H S col ο ι βέλτιστες συνθήκες έκφρασης ή τα ν οι εξής: χ ρ ό ν ο ς επώ ασης 16 ω ρώ ν (overn ight Ο /Ν ),, θερμοκρασία 30 C και τελική συγκέντρω ση IPTG 0.7 m M. Έτσι, α κ ολούθησε η π α ρ α γω γή πρω τεΐνη ς σε μ εγά λη κ λίμ α κ α κ α ι ο κ α θ α ρ ισ μ ός της σ ύ μ φ ω να με το α ρ χικ ό σ χή μ α κ α θ α ρισ μ ού, π ο υ π ερ ιγρ ά φ η κ ε π ρ οη γουμ ένω ς. Η η λεκτροφ ορη τικη α νά λ υ σ η μ ε SD S-PA G E τω ν βημάτω ν καθαρισμού 'τη ς 6H is-t ag-g ST - P 174L H S col έδειξε π ω ς η P 174L H S col π α ρ ά γ ετα ι σε μ εγά λες π οσότη τες κ α ι με μ εγά λη κ αθαρότη τα. 103

110 Μ ετά τ ο ν επ ιτυχή κ α θ α ρ ισ μ ό της π ρω τεΐνη ς, α κ ολούθησε ο χ α ρ α κ τη ρ ισ μ ό ς του μ ο ρ ίο υ με τεχνικ ές π ο υ θ α α ν α λ υ θ ο ύ ν παρακάτω. Η? επ ισ ή μ α νσ η της π ρ ω τεΐνη ς έγινε με τ ο ν ίδιο τ ρ ό π ο π ο υ π ερ ιγρ ά φ η κ ε γ ια τη Sco2. Η τ α υ τ ό χ ρ ο ν η π α ρ α γ ω γ ή του α γ ρ ίο υ τύ π ο υ w t H S c o l (α π ό τ ο ν ερ ευνη τή M a n u elle M artinelli) κρίθηκε α ν α γ κ α ία, γ ια τη σ υγκ ρ ισ ιμ ότη τα κ α ι σωστή ερ μ η ν εία τω ν π ειρ α μ α τικ ώ ν α π οτελεσμ ά τω ν. Η π α ρ α γ ω γή του α γ ρ ίο υ τύ π ο υ κ α ι ο κ α θ α ρ ισ μ ό ς της έ γ ιν ε μ ε τ ο ν ίδ ιο τρ ό π ο π ο υ π α ρ ή χθη κ α ι κ α θ α ρίσ τη κ ε η μ ετα λ λ α γ μ ένη π ρω τεΐνη. Ο ι π ρ ω τεΐνες π α ρ ά γ ο ν τ α ι σε σ υ γκ ρ ίσ ιμ ες ποσότη τες Χ α ρ α κ τη ρ ισ μ ό ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν w t H S c o l κ α ι P 174L H S col Π ρ ο ε τ ο ιμ α σ ία δ ε ιγ μ ά τ ω ν Ο ι μ ετα λ λ ο π ρ ω τεΐνες του χ α λ κ ο ύ κ α ι το υ ψ ευ δ α ρ γ ύ ρ ο υ, π ο υ τις π ερ ισ σ ό τερ ες φ ο ρ ές δ εσ μ εύ ο υ ν μ ετα λλικ ά ά τομ α μέσω τω ν α μ ινο ξέω ν της κ υ σ τεΐνη ς ε ίν α ι δ ύ σ κ ο λ ο ν α μ ελετη θ ούν. Η π α ρ ο υ σ ία τω ν δ ισ ουλφ ιδ ικ ώ ν δ εσ μ ώ ν ε ίν α ι π ο λ ύ σ η μ α ντικ ή κ α ι επ η ρ εά ζει τ η ν σ υ μ π λ ο κ ο π ο ίη σ η του μ ετά λ λ ο υ κ α ι τη στα θερότη τα του δ είγμ α τος. Η α ν α γ ω γ ή τω ν δισ ουλφ ιδικ ώ ν a δεσ μ ώ ν, σ υ νεπ ώ ς, π ο λ λ ές φ ο ρ ές επ ιβ ά λ λ ετα ι π ρ ιν το σ τά διο της μ ετα λ λ ο π ο ίη σ η ς. Δ υσ τυχώ ς τα π ιο γνω σ τά α ν α γ ω γ ικ ά α ντιδ ρ α σ τή ρ ια, όπω ς το DTT, χ α ρ α κ τ η ρ ίζο ν τ α ι α π ό μ ικ ρ ό χ ρ ό ν ο ζω ή ς κ α ι α π ό υ ψ η λ ή σ υ γ γ ένεια γ ια τα μ έτα λ λ α. Σ υ νεπ ώ ς, μ ετά τ η ν α ν α γ ω γ ή τω ν δ ισ ο υ λ φ ιδ ίω ν κ α ι π ρ ιν τη π ροσ θ ή κ η του μ ετά λ λ ο υ, το α ν α γ ω γ ικ ό π ρ έπ ει _να α π ο μ α κ ρ υ νθ εί α π ό το δ είγ μ α. Μ ια π ιθ α ν ή οξείδω ση τω ν α μ ινο ξέω ν της κ υστεΐνη ς θα π ρ ο κ α λούσε μη εκλεκτική ενδ ο μ ο ρ ια κ ή δ η μ ιο υ ρ γ ία δ ισ ο υ λ φ ιδ ικ ο ύ δεσ μ ού κ α ι επ ομ ένω ς συσσω μάτω ση κ α ι κ α θίζη ση τη ς π ρω τεΐνη ς. Στη π ερίπτω ση της H S c o l η α ν α γ ω γ ή κ α ι η π ροσ θήκη του μ ετά λ λ ο υ π ρ α γ μ α τ ο π ο ιή θ η κ α ν σε α ν α ε ρ ό β ιο θ ά λ α μ ο, έτσι ώστε ν α α π ο φ ευ χθ εί η οξείδω ση τω ν α μ ινο ξέω ν κυστεΐνης. Το DTT π ροσ τέθ η κ ε στο δ είγ μ α σε σ υγκ έντρω σ η lo m M γ ια ν α α ν ά γ ε ι τις cys του μ ο τίβ ο υ CXXXC π ρ ιν τ η ν π ροσθήκη το υ χ α λ κ ο ύ. Μ ε τη χρ ή σ η ειδικής στήλης α φ α λά τω σ η ς (P D -lo d esaltin g colu m n ) έγινε η α λ λ α γ ή του ρυθμιστικού 104

111 δια λύμ α τος σε φ ω σφ ορικό 50 m M, p H =7.2 γ ια α π ο μ ά κ ρ υ νσ η π ερίσσειας του DTT. Στη σ υ νέχεια π ρ α γμ α τοποιή θη κ ε τιτλοδότηση σε σ τά δια, ο έλ εγχος της οπ οία ς γ ιν ό τ α ν σε κάθε βήμα με τη βοή θεια π ειρ α μ ά τω ν H SQ C -15N χρησιμ οποιώ ντα ς το μ έτα λλα στη μ ορφ ή C u(i)(c H 3C N )4]PF6. Η συγκέντρω ση της πρω τεΐνης δ εν ξεπ ερνούσε στο σ τά διο α υτό τα 0.2 m M. Η π ερίσσεια του χα λκ ού α π ομ α κ ρ ύνθ η κ ε με στήλη PD -10. Α φ ο ύ ετοιμάστηκε το δείγμ α π ρ α γμ α τοποιή θ η κ α ν αρκετές μελέτες π ρ οκ ειμ ένου ν α χα ρ α κ τη ρ ισ το ύ ν ο ι πρω τεΐνες Π ειρ ά μ α τα Ν Μ Κ -Ή Π ρ ιν τη ν επ ισήμανσ η της P 174L H S col ελέγχθηκε η α να δ ίπ λω σ ή της με φ α σματοσκοπ ία N M R - Ή και κυκλικού διχρ ω ισμού (κεφ. αποτελέσματα - συζήτηση). Η πρω τεΐνη α ποδείχθηκε π λή ρω ς α να δ ιπ λ ω μ ένη κ α ι επ ομένω ς συνεχίσ αμε με π ειρ ά μ α τα δύο κ α ι τριώ ν διαστάσεω ν ΒΙΟ Φ Υ ΣΙΚ ΕΣ Μ Ε Θ Ο Δ Ο Ι Χ Α Ρ Α Κ Τ Η Ρ ΙΣ Μ Ο Υ Τ Η Σ H S c o l 1) Φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία φ θ ο ρ ισ μ ο ό U V : Τα ευκαρυω τικά κ α ι τα π ροκ α ρ υω τικ ά κ ύττα ρα π ερ ιέχ ο υ ν συστατικά τα ο π ο ία φ θ ο ρ ίζο υ ν μετά α π ό διέγερση με υπεριώ δη α κ τινο β ο λ ία. Το φ α ιν ό μ ενο του φ θ ορισ μ ού βασίζεται σ τη ν εκ π ομ π ή α κ τ ινο β ο λ ία ς κ α τά τη ν επιτρεπτή μετάπτω ση η λεκ τρ ονίω ν α π ό α π λ ή (sin glet) δ ιεγερ μ ένη στη βασική κατάσταση, κ α τό π ιν διέγερ σ η ς α π ό α π ο ρ ρ ό φ η σ η ενέρ γ εια ς με τη μ ορφ ή α κ τινοβολία ς. Τ α τρ ία α μ ινο ξέα (χρ ω μ οφ όρα) π ο υ ευ θ ύ νο ν τ α ι κυρίω ς γ ια τη ν ιδιότη ΐα φ θ ορισ μ ού τω ν π ρω τεϊνώ ν ε ίν α ι τα αρω ματικά: η τρ υ π το φ ά νη, η 4 τυροσ ίνη και η φ α ιν υ λ α λ α ν ίν η κ α ι σ υ γκ εκ ρ ιμ ένα ο ι α ρ ω μ α τικ οί δακτύλιοι i αυτώ ν. Σ την π α ρ ο ύ σ α ερ γα σ ία, το δ υ ν α μ ικ ό ο ξειδ ο α ν α γ ω γ ή ς της W T -H Scol και της P 174L -H Scol εξετάστηκε μ ε φ α σ μ α τοσκοπ ία φ θ ο ρ ισ μ ο ύ π ροκειμ ένου ν α διαπιστω θεί ε ά ν η μ ετά λλα ξη επ η ρ εά ζει τις ο ξειδ ο α να γω γικ ές ιδιότητες της H S c o l. Η επ ισ ή μ α νσ η μ ια ς π ρω τεΐνη ς με φ θ ορισ μ οφ όρες ουσίες 105

112 (flu o ro p h o res) α π οτελεί έ ν α α π α ρ α ίτη το ερ γ α λ είο γ ια το χα ρ α κ τη ρ ισ μ ό της. Στη δ ια τριβ ή αυτή χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή σ α μ ε τρ ία δια φ ορετικ ά α ντιδ ρ α σ τή ρ ια ^ (flu oroprobe) κ α ι κ ά να μ ε τις π α ρ α κ ά τω α να λύσεις: 2) T h e r m a l-s h ift a ssa y (T h erm oflu or): Η τεχνικ ή αυτή στηρίζεται στο γ ε γ ο ν ό ς ότι ο ι α να δ ιπ λ ω μ ένες κ α ι ο ι μ η α να δ ιπ λ ω μ ένες π ρω τεΐνες μ π ο ρ ο ύ ν ν α δ ια χ ω ρ ισ τ ο ύ ν μέσω της έκθεσής τους σε έ ν α υ δ ρ ο φ ο β ικ ό α ντιδ ρ α σ τή ρ ιο, το S y p ro O range117. Τ ο α ντιδ ρ α σ τή ρ ιο α υ τό έχει χ α μ η λ ή κ βαντικ ή α π όδοση (q u a n tu m y ie ld ) σε υ δ α τικ ό δ ιά λ υ μ α α λ λ ά φ θ ο ρ ίζει έντον α σε μη π ολικ ό π ε ρ ιβ ά λ λ ο ν μ ε χα μ η λ ή διηλεκτρική σ τα θ ερά όπ ω ς ε ίν α ι τα υ δ ρ ο φ ο β ικ ά τμ ή μ α τα τω ν πρω τεϊνώ ν. Ό τ α ν η π ρ ω τεΐνη α ρ χίζει ν α χ ά ν ε ι τη ν α να δίπ λω σ ή της ή ν α τήκεται, η χρω στική δεσ μ εύετα ι στις εκτεθειμένες υ δ ρ ο φ ο β ικ ές π λ ευ ρ ές τη ς π ρω τεΐνη ς, μ ε α π ο τέλ εσ μ α τη ν αύξηση της έντα σ η ς του φ θ ο ρ ισ μ ο ύ (Σ χή μ α 38). Η έντα σ η φ τά νει έ ν α μ έγισ το κ α ι μετά α ρ χίζει ν α μ ειώ νετα ι, λ ό γ ω π ιθ α ν ή ς κ α θ ίζη σης του σ υ μ π λ έγμ α το ς του α ντιδ ρ α σ τη ρ ίου κ α ι τη ς μ ετουσιω μ ένη ς π ρω τεΐνη ς. Η θ ερ μ ικ ά επ α γ ό μ ενη α να δ ίπ λ ω σ η είν α ι μ ια μη α ντισ τρ έψ ιμ η δ ια δ ικ α σ ία μ ε μ ια μετάπτω ση μ ετα ξύ δ ιπ λω μ ένη ς κ α ι μη α ν α δ ιπ λ ω μ έ ν η ς κ α τά σ τα σ η ς, ό π ο υ η T m ο ρ ίζετα ι ω ς το μ έσο σημείο της θ ερ μ ο κ ρ α σ ία ς κ α τά τη δ ιά ρ κ εια τη ς μ ετουσίω σης της π ρω τεΐνη ς. Wydropnobi rliicro-probe Folded Ipro*eif Unfolded protein Probe (Sypro Orange) Hgly f luoreicert ;r lew dielectric pcdia Σχήμα 38: Ανάλυση Thermal-Shift

113 Ρ Σ την ερ γα σ ία αυτή η χρήση του T herm ofluor περιορίστηκε στη μέτρηση της Tm της W T -H Scol και P174L μ ετα λλα γμ ένη ς π ρω τεΐνη ς με σ κ οπό ν α σ υγκ ρ ίνουμ ε τη θερμική σταθερότητά τους (κεφ. α ποτελέσματα και συζήτηση). Η ένταση του φ θορ ισ μ ού κ α λύφ θηκε ένα εύρος θερμοκ ρασιώ ν α π ό 20 C -70 C ενώ τα μήκη κύματος δ ιέγερ σ η ς/εκ π ο μ π ή ς ή τα ν στα /5 7 5 nm, α ντίστοιχα. Η τιμή της θερμοκ ρασία ς κ α τα γρ ά φ η κ ε με τη χρή σ η κ α τά λλη λου θερμομέτρου και χρησιμ οποιή θη κ ε το φ θ ορ ισ μ όμ ετρο A v eik in SP ) Π ο σ ο τικ ο π ο ΐη σ η τ ω ν ελεύ θ ερ ω ν σ ο υ λ φ ο δ ρ ο λ ικ ώ ν ο μ ά δ ω ν Το σ υγκ εκ ρ ιμ ένο π είρ α μ α έγ ινε με τη χρή σ η του α ντιδ ρ α σ τη ρ ίο υ 4- acetam iclo 4' m a leim id ylstilb en e-2,2'-d isu lfom c acid (A M S), το ο π ο ίο διαλύεται στο νερ ό και δεσμεύεται στις σ ο υ λφ υ δ ρ υ λικ ές ο μ ά δ ες της εκάστοτε πρω τεΐνης υ π ό μελέτη. Η κατάσταση τω ν δισ ουλφ ιδ ικ ώ ν δεσ μ ώ ν ελέγχετα ι α π ό τη ν ειδική α ντίδραση τω ν ελευθέρω ν ο μ ά δ ω ν θείου μ ε το A M S, το ο π ο ίο προσθέτει στο μ ορια κ ό β ά ρ ος π ερ ίπ ο υ 500 D a γ ια κάθε ενερ γή σουλφ υδρυλικ ή ο μ ά δ α και επ ομ ένω ς μ ετα τοπ ίζει τη ν κινη τικότη τα της π ρω τεΐνη ς στο SD S p age gel. Το π είρ α μ α π ρ α γμ α τοποιή θ η κ ε με προσθήκη του α ντιδραστη ρ ίου A M S στα π ρω τεϊνικ ά δ είγμ α τα σ τη ν ελεύθερη μ ο ρ φ ή τους και επώ αση α υτώ ν στους 37 C. Μ ε το π είρ α μ α α υτό ουσια σ τικ ά ελέγχετα ι η οξειδω τική κατάσταση τω ν κυστεϊνώ ν τω ν W T- κ α ι P 174L H S col πρω τεϊνώ ν α φ ού ξεκ ινώ ντα ς α π ό ένα πλή ρω ς σ ν η γ μ έ ν ο δ είγ μ α (η ετοιμ α σ ία του οπ οίου έγ ινε σε θ ά λα μ ο g lo o v e box), εξετά ζουμ ε α ν ά μ ια ώ ρ α το β α θ μ ό οξείδω σης του μ ορίου. * *4.19 Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς το υ δ υ ν α μ ικ ο ύ ο ξ ε ιδ ο α ν α γ ω γ ή ς τ ω ν ε ν ερ γ ώ ν κ υ σ τεϊν ώ ν τ η ς S co l Ο ι φ θ ορίζουσες ιδιότητες της H S c o l κ α ι η α να γ ω γή τω ν ενερ γώ ν δισ ουλφ ιδ ικ ώ ν δεσ μ ώ ν α π ό τη ν γλουτα θ ειό νη (GSH) χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ α ν για 'τ η ν μέτρηση της στα θεράς ισ ο ρ ρ ο π ία ς μεταξύ της H S c o l και της 107

114 γ λ ο υ τ α θ ειό ν η ς. Τ α φ ά σ μ α τ α φ θ ο ρ ισ μ ο ύ της ap ow T -H S col κ α ι τη ς apop174l - H S c o l έ γ ιν α ν σ τους 298Κ σε φ α σ μ α τόμετρ ο C ary 50 E clipse ενισ χ υ μ ένο μ ε θερμοσ τα τικ ή συσκευή σ υ γκ ρ ά τη σ η ς S in gle cell Peltier. Η α να γ ω γ ή της π ρ ω τεΐνη ς επ ιτεύχθηκε με επώ αση του δ είγμ α το ς γ ια 6 h π α ρ ο υ σ ία 200 m M G SH (α ν η γ μ έ ν η μ ο ρ φ ή γλουτα θ ειό νη ς), ενώ γ ια ν α οξειδω θεί π λή ρω ς η π ρ ω τεΐνη χρειά σ τη κ ε ν α επω αστεί το δ είγμ α γ ια 6h με 0.1 m M GSSG (οξειδ ω μ ένη μ ο ρ φ ή γλουτα θ ειό νη ς). Μ ετά α π ό διέγερ σ η σ τα 280 n m, η ένταση φ θ ο ρ ισ μ ο ύ σ τα 327 n m (το μ ή κ ο ς κ ύ μ α τος στο ο π ο ίο π α ρ α τη ρ είτα ι η μ έγιστη δ ια φ ο ρ ά μ εταξύ της εκ π ο μ π ή ς τη ς οξειδ ω μ ένη ς κ α ι τη ς α ν η γ μ έ ν η ς π ρω τεΐνη ς) κ α τα γρ ά φ η κ ε γ ια 60 sec κ α ι υ π ο λ ο γ ίσ τη κ ε ο μ έσ ο ς ό ρ ο ς. Η α ντίδ ρ α σ η ισ ο ρ ρ ο π ία ς της S c o l με τη ν γ λ ο υ τ α θ ειό ν η δ ίν ο ν τ α ι α π ό τις εξισώ σεις 1 και 2. H S c o1 sh + G SSG «- - -» H S co lss + 2G SH (Εξ. 1) [H S co lss][g SH ]2 K *q= [H S co1sh][gssg] (Εξ. 2) Η οξειδ ω μ ένη H S c o l (5 u M ) επω άστηκε σε α ν α ε ρ ό β ιε ς συνθήκες, σε δ ιά λ υ μ α a φ ω σ φ ο ρ ικ ο ύ ν α τ ρ ίο υ 50 m M, p H 7.0 κ α ι Τ =298Κ μ ε δια φ ορ ετικ ές σ υ γκ εντρώ σ εις G SH (0.1 m M to 200 m M ). 10 u M G SSG π ρ ο σ τέθ η κ α ν σε ό λ α τα μ είγ μ α τ α α ντίδ ρ α σ η ς. Τ ο σ χετικ ό π ό σ ο τη ς α ν η γ μ έ ν η ς H S c o l (R) σ τη ν ισ ο ρ ρ ο π ία μ ετρήθηκε μ ε τ ο ν εγγενή φ θ ο ρ ισ μ ό της H S c o l (F). T o R υ π ο λ ο γ ίσ τ η κ ε σ ύ μ φ ω να μ ε τ η ν εξίσω ση 3, ό π ο υ το F α να φ έρ ετα ι σ τη ν μ ετρ ή σιμ η ένταση φ θ ο ρ ισ μ ο ύ (στα 327 nm ), κ α ι Fred κ α ι Fox ε ίν α ι οι εντά σ εις της α ν η γ μ έ ν η ς κ α ι της ο ξειδ ω μ ένη ς S c o l, α ντίσ τοιχα. R= F -F o x Fox ~ Fred (Εξ. 3) 108

115 m Π ρ ο σ α ρ μ ό ζο ντα ς τα δ εδ ο μ ένα του π ειρ ά μ α τος οε μ ια μαθηματική μη γραμμική εξίσωση, προσδιορίστη κε μ ια στα θερά ισ ο ρ ρ ο π ία ς γ ια τη ν αντίδραση της εξίσω σης 1 με τη βοή θεια της εξίσω σης F - Fox _ [GSH]2/[G SSG ] F * Fred Keq + [G SH ]2/[G SSG ] (Εξ. 4) To δ υ να μ ικ ό ο ξειδ ο α να γω γή ς τω ν ενερ γ ώ ν κ υστεΐνώ ν τω ν W T -H Scol και P 174L -H Scol υπολογίσ τη κ ε α π ό τ η ν εξίσωση του N ern st (Εξ. 5) κ α ι γνω ρ ίζο ντα ς το δ υ να μ ικ ό της γλουτα θ ειόνη ς, στους 298Κ κ α ι p H 7.0. E o(hscoi) = E,o(gsh/gssg) log K eq (Εξ.5) 4.20 Α λ λ η λ επ ίδ ρ α σ η P 174L -H S col- C o x l7 Μ ετά το χα ρ α κ τη ρ ισ μ ό τω ν δ ομ ικ ώ ν κ α ι ο ξειδ ο α ν α γ ω γ ικ ώ ν ιδιοτήτω ν της P 174L -H S col, το ενδ ια φ έρ ο ν μ α ς στρ ά φ η κ ε σ τη ν α νά λ υ σ η του μ η χα νισ μ ο ύ της απόκτησης του χ α λ κ ο ύ α π ό τη σ υ ν ο δ ό π ρω τεΐνη C o x l7, ο οπ οίος, επίσης, θα μ π ο ρ ο ύ σ ε ν α επηρεαστεί α π ό τη μ ετά λλα ξη. Για το λ ό γ ο αυτό χρ η σ ιμ ο π ο ιή σ α μ ε C o x l7 βοοειδούς η ο π ο ία δια φ έρει α π ό τη ν α νθρώ πινη C o x l7 μ ό νο στα τέσσερα πρώ τα α μ ινοξέα 119. Η C o x l7 υ π ά ρ χ ει σε τρεις διαφορετικές καταστάσεις οξείδω σης, ο ι ο π ο ίες π α ρ ο υ σ ιά ζ ο υ ν διαφορετικές ιδιότητες δέσμευσης του μ ετά λλου. Π ειρ ά μ α τα φ α σ μ α τομετρ ία ς μ ά ζα ς κατέληξαν πω ς η C o x l7 μεταφέρει ένα ιό ν χ α λ κ ο ύ στη ν apow T -H S col μ ό νο <. όταν βρίσκεται στην ανηγμένη μορφή, Cui(I)Cox172s-s, και επομένως, όλα τα * πειράματα N M R και μάζας έγιναν με τη μορφή αυτή της πρωτεΐνης. 109

116 4.21 Π ρ ο ε τ ο ιμ α σ ία τ ω ν δ ε ιγ μ ά τ ω ν C o x l7, H S c o l κ α ι P 174L -H S col γ ια μ ε τ ρ ή σ ε ις φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία ς μ ά ζ α ς (M S) Για τα π ειρ ά μ α τα M S οι π ρω τεΐνες W T- and P 174L -H Scol μ ετά τ ο ν κ α θα ρισμό το υ ς κ α ι π ερ ιέχοντα ς ένα δ ισ ουλφ ιδικ ό δεσμό μ εταφέρθηκαν σε ά λα ς α μ μ ω νίου 50 m M (ph 7.5) με τη χρήση της στήλης H ip rep 2 6 /1 0 desaltin g (A m ersham B iosciences, U ppsala, S w ed en ). Η α ν η γ μ ένη μ ορφ ή της C o x l7 προετοιμάστηκε με επώ αση της οξειδω μένης C oxl73s-s μ ε 1 m M DTT στους 45 C γ ια 100 λεπτά Π ε ιρ ά μ α τ α M A L D I-T O F κ α ι E S I-M S Σ τα π ειρ ά μ α τα M A L D I-T O F, η π α ρ α κ ο λούθηση της α να γ ω γ ή ς της οξειδ ω μ ένη ς a p o W T -H S co l κ α ι a p o P L -H S col (σε συγκέντρω ση 2 μμ ) α π ό 1 m M D TT έγινε σε ρ υθμισ τικ ό δ ιά λ υ μ α ά λ α το ς α μ μ ω νίο υ 50 m M, p H 7.5 κ α ι τερματίστη κε α π ό 5 m M ιω δ οα κ ετα μ ίδ ιο. Ο ι μετρήσεις έ γ ιν α ν σε ό ρ γ α ν ο V o y a g er STR (A p p lied B io sy stem s, U SA ). Σ τα π ειρ ά μ α τα ESI-M S, χρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ α ν μμ δείγμ α τος π ρω τεΐνη ς σε φ α σ μ α τ ο γ ρ ά φ ο μ ά ζα ς Ettan API ESI-TOF (A m ersh am B iosciences, U ppsala, S w ed en ). O i H S c o l κ α ι P 174L -H S col α νά χθ η κ α ν μ ε 1.0 m M D TT στους 298K. Δ ια φ ορετικ ά ισ ο δ ύ ν α μ α του σ υμ π λόκ ου C u(i)d TT J π ρ ο σ τέθ η κ α ν σ τη ν H S c o l ή σ τη ν C o x l7, επ ω ά σ τη κ α ν σε ρυθμιστικ ό δ ιά λ υ μ α μ ε 1.0 m M DTT γ ια 1 m in σ τους 25 C κ α ι έγινε η κ α τα γρ α φ ή του φ ά σ μ α τος ESI-M S. Σ τα π ειρ ά μ α τ α τιτλοδότη σ η ς C o x l7 /H S c o l, η Cui(I)Cox172s-s π ρ οετοιμ ά σ τη κ ε με π ρ οσ θ ή κ η Cu(I) σ τη ν Cox172ss, κ α ι στη σ υ νέχεια α να μ είχθ η κ ε με έ ν α δ είγ μ α π ρ ω τεΐνη ς H S c o l. Σε ό λ α τα ρυθμιστικά δ ια λ ύ μ α τ α υ π ή ρ χε 1 m M DTT. Η σ τα θ ερά σ χη μ α τισ μ ο ύ του σ υ μ π λ ό κ ο υ Cui(I)Cox172s-s υ π ο λ ο γίσ τη κ ε όπ ω ς σε π ρ ο η γ ο ύ μ ενες ερ γα σ ίες Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τ η ς δ ο μ ή ς τ η ς C u i(i)p L -H S co l μ ε φ α σ μ α το σ κ ο π ία N M R Τ α π ειρ ά μ α τ α α π ο κ α τά σ τα σ η ς,5ν R i, R2, καθώ ς κ α ι τα ετερ οπ υ ρ η νικ ά (stea d y -sta te) 1Η - 15Ν N O E s π ειρ ά μ α τ α γ ια τη π ρω τεΐνη H Sco2 έ γ ιν α ν στα 600 M H z με π ρ ό τυ π ες π α λ μ ικ ές α κ ολουθίες. Ο ι β α θ μ ο ί α π οκατά σ τα σ η ς Ri and R2 110

117 Ρ π ροσ διορίσ τη κ α ν με το π ρ ό γ ρ α μ μ α Sparky. Α ξιόπιστες τιμές 75Ν R i, R i, κ α ι 7Η -75Ν Ν Ο Ε υ π ολογίσ τη κ α ν γ ια τους 107 α π ό τους 160 σ υ ντονισ μ ο ύ ς Ν Η της κ ύριας α λυσίδας. Ο ι υ π ό λ ο ιπ ο ι ή τα ν π ο λ ύ α σθενείς ή λόγω επ ικ ά λυψ η ς δ εν έγ ινε εφικτή η σωστή ολοκλήρω σή τους. Ο ι μέσες τιμές Ri, R2, κ α ι 1Η -15Ν Ν Ο Ε είνα ι 1.70 ± 0.26 s*1, ± 5.81 S' 1 κ α ι 0.72 ± 0.14, α ντίσ τοιχα. Τ α δ εδ ο μ ένα της αποκατάστασης χρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ α ν γ ια τη ν εκτίμηση τω ν τιμ ώ ν της σ υνά ρτη σης π υκ νότη τα ς του φ ά σ μ α τος (spectral d en sity fu n ctio n v a lu es), J(cdh), J(con), J(0), α κ ολουθώ ντα ς μ ια διαθέσιμη α π ό τη β ιβ λ ιο γ ρ α φ ία διαδικασία. Η ταυτοποίηση τω ν φ α σ μ ά τω ν N M R κ α ι ο π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς της δ ο μ ή ς της C u l(i)p l7 4 L -H S co l π ρ α γ μ α τ ο π ο ιή θ η κ α ν με τα π ειρ ά μ α τα του Π ίν α κ α 2 (Π α ράρτη μα II). Ο ι τα υτοποιή σ εις τω ν σ υ ντονισ μ ώ ν Ή, 13C κ α ι 15Ν της C ul(i)p 174L -H Scol π α ρ ο υ σ ιά ζο ντα ι στο Π ίν α κ α 1 του Π α ρ ά ρ τη μ α τος II. Η ταυτοποίηση τω ν κ ορ υφ ώ ν της C u l(i)w T -H S co l είνα ι διαθέσιμη α π ό τη β ιβ λιογρ α φ ία. Μ ετά τη μετατροπή τω ν δ εδ ο μ ένω ν N M R σε δ ο μ ικ ο ύ ς π εριορισ μ ούς, υπ ολογίσ τη κ ε η δομ ή με τ ο π ρ ό γ ρ α μ μ α D Y A N A. Ο ι κ αλύτερες 30 δια μ ορφ ώ σεις υ π ο β λή θ η κ α ν σε ελα χισ τοποίη σ η ενέρ γεια ς (REM ) με το π ρ ό γ ρ α μ μ α AM BER 8. Η στατιστική α νά λ υ σ η της ο ικ ο γ ένεια ς REM τω ν δ ομ ώ ν C u l(i)p 174L -H S col π α ρ ο υ σ ιά ζετα ι σ το ν Π ίνα κ α 2 (Π α ρ ά ρ τη μ α II). Τα π ρ ο γ ρ ά μ μ α τα PROCHECK, PR O C H E C K -N M κ α ι W H A TIF χρ η σ ιμ οποιή θ η κ α ν για τη ν α ξιολόγη σ η της π οιότη τα ς τω ν δομώ ν. Π ερισσότερα α π ό 90% τω ν α μ ινο ξέω ν β ρ ίσ κ ο ντα ι στις επιτρεπτές π ερ ιο χές του R am achandran. Τ ιτλοδοτήσεις της επ ισ η μ α σ μ ένη ς 15Ν a p o H S c o l κ α ι 15Ν apop 174L -H S col με, τη μη επ ισημασμένη C u l(i)c o x l7 2 S -S ή με [C u(i)(c H 3C N )4]PF6 μ ελετήθηκαν * με φ α σ μ α τοσκοπ ία N M R. Μ ε τη λή ψ η του φ ά σ μ α τος H SQ C είνα ι δ υ ν α τ ό να π α ρ α κ ο λ ο υ θ ο ύ μ ε τις α λ λ α γ ές 1Η -15Ν στο φ ά σ μ α μετά α π ό προσθήκη α υ ξα νό μ ενω ν π ο σ ώ ν του χ α λ κ ο ύ (I) ή της σ υ νο δ ο ύ π ρω τεΐνη ς, π α ρ ο υ σ ία Ί π ι Μ DTT. Η τιτλοδότηση έγ ινε σε θ ά λ α μ ο C o y A liq u ots σε α τμ όσ φ α ιρ α αζώ του κ α ι θερ μ οκ ρ α σ ία 298Κ. Η μ ετα λλοπ οίη σ η της W T -H S col και της 111

118 P 174L -H S col κ α τά τ η ν τιτλοδότη ση N M R π α ρ α κ ολουθήθηκε μέσω ο ρ ισ μ ένω ν α μ ιν ο ξ έω ν τα ο π ο ία β ρ ίσ κ ο ντα ι δ ίπ λ α στο μ ο τίβ ο δέσμευσης, CXXXC, κ α ι επ ο μ ένω ς υ π ό κ ειντα ι σε σ η μ α ντικ ές χ η μ ικ ές μετατοπίσεις. Ε πιπρόσθετα, τα Ν Η τω ν α μ ιν ο ξ έω ν α υ τώ ν σ τους χ ά ρ τες H SQ C -1H -15N δεν α λ λ η λ ο επ ικ α λ ύ π τ ο ν τ α ι κ α ι επ ο μ ένω ς γ ίν ε τ α ι εύκολη η ολοκλήρω σή τους. Μ ε το τ ρ ό π ο α υ τό στα δ ιά φ ο ρ α β ή μ α τα της τιτλοδότη σ η ς γ ίνετ α ι εκτίμηση του σ χετικ ού π λ η θ υ σ μ ο ύ τω ν μ ο ρ φ ώ ν a p o κ α ι C ui(i) κ α ι υ π ο λ ο γ ίζετα ι η σ υ γ γ έ ν ε ια γ ια το μ έτα λ λ ο (κ εφ.αποτελέσ μ α τα -σ υζή τη σ η ). Ο ι β α θ μ ο ί α π ο κ α τά σ τα σ η ς Ri κ α ι R2 15Ν στο μ είγ μ α C u i(i)c o x l7 /W T - H S c o l σε α ν α λ ο γ ία 1:1, υ π ο λ ο γ ίσ τ η κ α ν σ τους 298 Κ σε φ α σ μ α τόμ ετρο της B ruker A v a n c e 500 κ α ι α ν α λ ύ θ η κ α ν μ ε γνω σ τή δ ια δ ικ α σ ία 121. Ο σ υ νο λ ικ ό ς χ ρ ό ν ο ς μ ο ρ ια κ ή ς π ερ ισ τροφ ή ς υ π ο λ ο γ ίσ τη κ ε α π ό το λ ό γ ο R2/ R 1.

119 Κ β Φ Ά Λ Ά Ι Ο 5 A r t & t t A W M M A

120 ΆΜΕ<ΡΟ<Σ 5.1 Έ κ φ ρ α σ η κ α ι δ ο μ ικ ό ς χ α ρ α κ τ η ρ ισ μ ό ς τ η ς H S C 0 2 Ό π ω ς α να φ έρ θ η κ ε στο Κ εφ ά λα ιο 1 η α νθ ρ ώ π ινη Sco2 (H Sco2) είνα ι μ ια μ εμ β ρ α νικ ή μ ιτο χ ο νδ ρ ια κ ή π ρω τεΐνη η ο π ο ία π ρ ομ η θ εύει το χ α λ κ ό στο έ ν ζυ μ ο οξειδά σ η του κ υ τοχρ ώ μ α τος c (CcO). Η H Sco2 π α ρ ο υ σ ιά ζει μ εγά λη ο μ ο ιό τη τα με τη π ρω τεΐνη H S c o l. Ο ι δ ύ ο αυτές πρω τεΐνες δ εσ μ εύ ο υ ν ιό ντα χ α λ κ ο ύ in v itro κ α ι in vivo. Έ χει π ρ ο τα θ εϊ επ ίσης, ότι η Sco2, σε σ υ νερ γ α σ ία μ ε τη ν S c o l, ελέγχει το επ ίπ εδ ο το υ ενδ ο κ υ ττά ρ ιο υ χ α λ κ ο ύ, ε π ά γ ο ν τ α ς σ υγκ εκ ρ ιμ ένες κυτταρικές λ ειτουργ ίες, δ ια μ έσ ο υ της ενερ γ ο π ο ίη σ η ς επ ιλ εγμ ένω ν μ ο ρ ια κ ώ ν μ η χ α ν ισ μ ώ ν 122. Μ έχρ ι σ τιγμ ή ς η α κ ρ ιβ ή ς δράση τω ν δ ύ ο π ρ ω τεϊνώ ν δ εν έχει δ ιευ κ ρ ινισ τεί π λ ή ρ ω ς κ α ι γ ίνετ α ι εμ φ α ν ές ότι χ ρ ειά ζο ν τ α ι επ ιπ λ έο ν π ειρ ά μ α τ α γ ια τ η ν ά ντλ η σ η π ερ ισ σ ο τέρ ω ν π λ η ρ ο φ ο ρ ιώ ν. Για το λ ό γ ο α υ τό, στο π ρώ το μ έρ ο ς τη ς δια τριβή ς, π ρ α γμ α τοποιή θ η κ ε δ ο μ ικ ό ς χ α ρ α κ τ η ρ ισ μ ό ς κ α ι μελέτη δ υ ν α μ ικ ή ς μ ε Φ α σ μ α τοσκοπία N M R της ελεύθερης (apo) κ α ι της δεσ μ ευ μ ένη ς μ ο ρ φ ή ς (h olo) τω ν δ ια λυτώ ν τμ η μ ά τω ν Λ της π ρ ω τεΐνη ς S co2 κ α ι σ η μ ειώ θηκαν ο ι ομ οιότη τες και οι δ ια φ ο ρ ές α νά μ εσ α στη Sco2 κ α ι σ τη ν S c o l. Η τρισδιά στα τη δομ ή δ είχ νει πω ς η H Sco2, όπ ω ς και η H S c o l, εμ φ α νίζει α να δ ίπ λ ω σ η ό μ ο ια με αυτή τω ν ο ξειδ ο α να δ ω γικ ώ ν π ρ ω τεϊνώ ν, θ ειρ ο δ ο ξιν ώ ν (Trx). Ο ι τρεις υπ οκατα σ τά τες του χ α λ κ ο ύ, κ α ι στις δ ύ ο π ρ ω τεΐνες, ε ίν α ι ο ι δ ύ ο C y s του μ ο τίβ ο υ ένταξη ς, CXXXC, κ α ι μ ια H is Π ρ ο ε τ ο ιμ α σ ία κ α ι χ α ρ α κ τ η ρ ισ μ ό ς το ο δ ε ίγ μ α τ ο ς H S co2 Δ ύ ο π ερ ιο χ ές (d o m a in s) τη ς H S co2 (χω ρίς τα πρώ τα 234 κ α ι 297 ζεύγη βάσεω ν, α ντίσ τ ο ιχ α, π ο υ α ν τ ισ τ ο ιχ ο ύ ν στα α μ ινο ξέα κ α ι ) α π ο μ ο ν ώ θ η κ α ν μ ε τ η ν τεχνικ ή PCR. Ο ι δ ύ ο π ερ ιο χές π ο υ α π ο τ ελ ο ύ ν το δ ια λ υ τό μ έρ ο ς της π ρω τεΐνη ς, δ ια φ έρ ο υ ν κ α τά 21 α μ ινο ξέα στο Ν -τελικ ό τους ά κ ρ ο, το ο π ο ίο π ρ ο β λ έπ ετα ι ότι ε ίν α ι μη δ ομ η μ ένη π ερ ιοχή. Για τη ν δ ιερ εύ νη σ η τω ν δ ο μ ικ ώ ν χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ώ ν κ α ι γ ια τις ιδιότητες δέσμευσης 114

121 του μετάλλου, χρη σ ιμ οποιή θη κ ε η π ιο μικρή α π ό τις δ ύ ο π ερ ιο χές (short construct), η ο π ο ία α ποτελείται α π ό 166 α μ ινο ξέα κ α ι π α ρ ο υ σ ιά ζει, στα στάδια του καθαρισμού, μεγαλύτερη σταθερότητα στο δ ιά λ υ μ α (Σ χή μ α 39). H S C 0 2 lo n g H S C 0 2 sh o r t GSFT RAEKERLQQQKRTEALRQAAVC...CPXXCP...VLS GSFTC... C p x x C p...vls Σ χ ή μ α 39: Α π ε ικ ό ν ισ η τ ω ν κ λ ω ν ο π ο ιη μ έ ν ω ν τ μ η μ ά τ ω ν τ η ς H S C 0 2. Τ α τ μ ή μ α τ α τ η ς δ ια λ υ τ ή ς π ε ρ ιο χ ή ς π ο υ χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ α ν σ τ η ν ε ρ γ α σ ία ο ν ο μ ά ζ ο ν τ α ι μ ι κ ρ ό κ α ι μ ε γ ά λ ο π ρ ο ϊό ν ( lo n g κ α ι s h o r t c o n stru c ts). Ο ι δ ύ ο π ε ρ ιο χ έ ς σ τ ε ρ ο ύ ν τ α ι τ η μ ιτ ο χ ο ν δ ρ ια κ ή κ α ι τ η ν δ ια μ ε μ β ρ α ν ικ ή α κ ο λ ο υ θ ώ. Ε π ίσ η ς ε π ισ η μ α ίν ο ν τ α ι τ ο μ ο τ ί β ο C P X X P C κ α ι η θ έ σ η α ν α γ ν ώ ρ ισ η ς τ η ς π ρ ω τ ε ά σ η ς T E V (G S F T ). Ε ν σ υ νεχεία το δια λυτό τμ ή μ α της π ρω τεΐνη ς, κ λω νοπ οιή θ η κ ε στο π λα σ μ ιδια κ ό φ ορέα G atew ay Entry pe N T R -tobac co etch virus-d -T O P O και υποκ λω νοπ οιή θηκε στο φ ορέα pe T G -30A (E uropean M olecu lar B iology Laboratory Protein) με τη ν τεχνική της α ντίδ ρ α σ η ς LR. Μ ε α υ τό τ ο ν τρ ό π ο ο πρω τεϊνικ ός σ τόχος π εριείχε επ ιπ λ έο ν στο Ν -ά κ ρ ο τ η ν α λ λ η λ ο υ χ ία H is-g ST. Στο τέλος α π ομ α κ ρ ύνθ η κ ε α π ό τ ο ν π ρ ω τεϊνικ ό σ τό χο η ισ τιδινικ ή ο υ ρ ά καθώ ς και η βοηθητική πρω τεΐνη GST (Σ χή μα 40). r ΜΒ49^8 H*Tag TEVsite λ ί \ h GST Μ Β^δίω Hsoo2 y Σ χ ή μ α 40: Τ ο α ν α σ υ ν δ υ α σ μ έ ν ο μ ό ρ ι ο τ η ς H S c o 2 Το α ν α σ υ ν δ υ α σ μ ένο π λ α σ μ ίδ ιο μεταφέρθηκβ στα βακτη ρια κ ά κύτταρα ^BL21-codon + cells (Stratagene) της σ ειρ ά ς Escherichia colt γ ια έκφ ραση του πρω τεϊνικού σ τόχου. Η κ α λλιέρ γεια τω ν κυττάρω ν έγ ινε σε π λή ρ ες (Luria- 115

122 1 Bertani) κ α ι σε ελά χισ το θρεπτικ ό υ λ ικ ό [(15N H 4)2S04 κ α ι/ή [13C ]-giucose] γ ια τ η ν π α ρ α γ ω γ ή επ ισ η μ α σ μ ένω ν δ ειγμ ά τω ν. Σ τα π ειρ ά μ α τα έκ φ ρ α σ η ς της * δ ο μ ικ ή ς π ερ ιο χ ή ς εμ φ α νίζετ α ι στο g e l π ο λ υ α κ ρ υ λ α μ ιδ ίο υ υ π ερ εκ φ ρ α σ μ ένη τ α ιν ία 1 6 h μ ετά τ η ν π ροσ θ ή κ η του IPTG (0.7 m M ) σ τους 30 C σ τη ν κ α λ λ ιέρ γ εια κ υττά ρ ω ν (Σ χή μ α 41) D a Marker Oh 4h 8h 16h Σ χ ή μ α 4 1 : Τ ε σ τ έ κ φ ρ α σ η ς τ η ς δ ο μ ικ ή ς π ε ρ ιο χ ή ς H S c o 2 μ ε τ ά α π ό 0, 8 κ α ι 1 6 h ε π ώ α σ η ς. Ο κ α θ α ρ ισ μ ό ς τ ο υ δ είγ μ α τ ο ς έ γ ιν ε μ ε τη χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία H it rap (A m ersh a m P h arm acia B ioscien ces). Η α λ λ η λ ο υ χ ία H is-g ST α π ο κ ό π η κ ε μ ε τη χ ρ ή σ η της π ρ ω τεά σ η ς A ctev (Invitrogen), κ ά ι α κ ολούθησε δεύτερος κ α θ α ρ ισ μ ό ς γ ια τη ν α π ο μ ά κ ρ υ ν σ ή της. Μ ετά τ ο ν κ α θ α ρ ισ μ ό, π ά ρ θηκε το δ ε ίγ μ α σε κ α θ α ρ ή κ α ι υ π ερ εκ φ ρ α σ μ ένη μ ορφ ή (Σ χή μ α 42). y G S T H S c o z D a Σ χ ή μ α 4 2 : Α π ο τ έ λ ε σ μ α κ α θ α ρ ισ μ ο ύ τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς μ ε τ ά τ η ν α π ο μ ά κ ρ υ ν σ η τ η ς α κ ο λ ο υ θ ία ς H i s - G S T. 116

123 Μ ε υγρ ή χρ ω μ α τογρ α φ ία (FPLC) με οτήλη Superd ex75 H R -1 0 /3 0 AKTA-FPLC (A m ersham Pharm acia B iosciences) σε σ υ νδ υ α σ μ ό μ ε τη τεχνική light-scattering (D A W N -E O S, W yatt T ech n ologies, Santa Barbara, C A ) παρατη ρήσαμε πω ς κ α ι τα δ ύ ο τμ ή μ α τα (lon g κ α ι short) της H S co2 εξή χθη σ α ν σε κ λάσματα π ο υ α ντισ τοιχούν σε μ ο νο μ ερ ή κατάσταση γ ια τ η ν π ρω τεΐνη (Σ χήμα 43). Σ χ ή μ α 43: Α π ο τ ε λ έ σ μ α τ α υ γ ρ ή ς χ ρ ω μ α τ ο γ ρ α φ ία ς. Ο ι δ ύ ο π ε ρ ιο χ έ ς τ η ς a p o H S c o 2, μ ε γ ά λ η (L, μ π λ ε ) κ α ι μ ικ ρ ή (S, κ ό κ κ ιν ο ) β ρ ίσ κ ο ν τ α ι σ ε μ ο ν ο μ ε ρ ή μ ο ρ φ ή. Τ ο θ ε ω ρ η τ ικ ό Μ. Β τ η ς μ ο ν ο μ ε ρ ο ύ ς H S c o 2 L κ α ι H S c o 2 S ε ί ν α ι D a κ α ι D a, α ν τ ίσ τ ο ιχ α. Σ η μ ε ιώ ν ε τ α ι ε π ίσ η ς τ ο φ ά σ μ α π ρ ό τ υ π ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν π ο υ έ χ ο υ ν μ ε λ ε τ η θ ε ί σ τ ο π α ρ ε λ θ ό ν (a: A l b u m i n, (6 6,0 0 0 D a ), b: H u m a n C u, Z n S O D 1 (3 2,5 0 0 D a ), c: α - C h y m o t r y p s i n o g e n A (2 6,6 5 6 D a ), d: C y t o c h r o m e c β ο ε ιδ ο ύ ς ( D a ). a 117

124 1 5.2 Υπολογισμοί δομής με NMR Σ το Σ χ ή μ α 44 π α ρ ο υ σ ιά ζετα ι το φ ά σ μ α N M R - Ή της π ρω τεΐνη ς H Sco2 * σε ελεύθερη μ ο ρ φ ή κ α ι σε σ υγκ έντρω σ η ~ 0.8 χημ. i I I I I Γ i i I I 9 ε 7 If p p m Σ χ ή μ α 4 4 : Φ ά σ μ α N M R - Ή σ τ α M H z ( σ τ ο υ ς Κ κ α ι ρ Η = 7 ) τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς a p o H S c o 2. Η κ α τα γ ρ α φ ή του μ ο νο δ ιά σ τ α τ ο υ φ ά σ μ α τ ο ς 1D επ ιβ εβ α ιώ νει τ η ν α να δ ίπ λ ω σ η της π ρω τεΐνη ς, α φ ο ύ π α ρ α τη ρ είτα ι δ ια σ π ο ρ ά τω ν κ ο ρ υ φ ώ ν Ή σε ό λ ο το φ ά σ μ α τιμ ώ ν δ (ppm ). Ο β α θ μ ό ς της α να δ ίπ λ ω σ η ς τη ς π ρ ω τεΐνη ς εξετάσθηκε μ ε τη λή ψ η φ α σ μ ά τ ω ν Ή - 15Ν H SQ C κ α ι ih -13C H SQ C. Τ α φ ά σ μ α τ α Ή - 15Ν και Ή -MC H S Q C της ελεύθερης κ α ι της μ ο ρ φ ή ς C u(i)h S co2 δ ε ίχ ν ο υ ν πω ς η πρω τεΐνη ε ίν α ι π λ ή ρ ω ς α να δ ιπ λ ω μ ένη α φ ο ύ δ ια κ ρ ίν ο ν τ α ι σ υ χνό τη τες σ υ ντονισ μ ο ύ δ ια σ κ ο ρ π ισ μ ένες σε ο λόκλη ρ η τη π ερ ιο χ ή του φ ά σ μ α τ ο ς κ α ι μ ικ ρ ό μ ό ν ο π ο σ ο σ τό π ε ρ ιο χ ώ ν μ ε α λ λ η λ επ ικ α λ υ π τ ό μ ενες κ ο ρ υ φ ές (Σ χή μ α 45). 118

125 9.Ρ Ν ppr 130 Η ppm Σ χ ή μ α 45: Φ ά σ μ α H S Q C Ι Η - 15Ν τ η ς a p o H S c o 2. Π α ρ α τ η ρ ο ύ μ ε σ υ χ ν ό τ η τ ε ς σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ύ σε * ο λ ό κ λ η ρ η τ η π ε ρ ιο χ ή τ ο υ φ ά σ μ α τ ο ς, έ ν δ ε ιξ η ό τ ι η π ρ ω τ ε ΐν η ε ί ν α ι α ν α δ ιπ λ ω μ έ ν η. 119

126 Σ το φ ά σ μ α Ή - 15Ν H SQ C της a p o H S co 2 π ρ ο σ δ ιο ρ ίσ τη κ α ν μ ό ν ο 84 α π ό τα α ν α μ ε ν ό μ ε ν α 160 σ ή μ α τα π ο υ ο φ είλ ο ντα ι στο σ υ ντονισ μ ό τω ν α μ ιδικ ώ ν * α ζώ τω ν 15Ν της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς, ενώ μ ό ν ο 3 σήματα Ν Η λ ε ίπ ο υ ν α π ό το φ ά σ μ α τη ς C u(i)s co2 (Σ χή μ α τα 46 κ α ι 4 7 κ α ι Π ίνα κ ες 2 κ α ι 3 Π α ρ ά ρ τ η μ α 1). Σ χή μ α 46: Τ α υτοπ οίη σ η τω ν σ η μ ά τω ν N M R της ap H S co 2 120

127 r Σ χ ή μ α 47: Τ α υ τ ο π ο ίη σ η τ ω ν σ η μ ά τ ω ν N M R τ η ς C u ( I ) H S c o 2. Σ η μ ε ιώ ν ο ν τ α ι ο ι κ ο ρ υ φ έ ς τ ω ν C y s κ α ι ο ι ο π ο ίε ς α π ο υ σ ιά ζ ο υ ν α π ό τ ο φ ά σ μ α τ η ς ε λ ε ύ θ ε ρ η ς μ ο ρ φ ή ς τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς κ α ι α π ο τ ε λ ο ύ ν τ ις θ έ σ ε ις δ έ σ μ ε υ σ η ς τ ο υ χ α λ κ ο ύ. r s 121

128 5.2.1 Π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό ς τη ς δ ο μ ή ς τ η ς C u (I)H S co2 Η σ υ νολικ ή α να δ ίπ λ ω σ η της C u(i)h Sco2 π ερ ιέχει τέσσερις α-έλικες κ α ι. 9 β-π τυχω τά φ ύ λ λ α τα ο π ο ία σ χ η μ α τ ίζο υ ν έ ν α κ εντρικ ό β-πτυχω τό φ ύ λ λ ο κ α ι δ ύ ο μ ε δ ομ ή β -φ ο υ ρ κ έτα ς (Σ χή μ α 4 8 ). Τ α χα ρ α κ τη ρ ισ τικ ά α υ τά είν α ι ό μ ο ια μ ε α υ τά της δ ο μ ή ς της π ρ ω τεΐνη ς θ ειορ εδοξίνη ς (Trx). Π α ρ ό μ ο ια α π ο τελ έσ μ α τα εξά χθ η κ α ν κ α ι α π ό τη δη μ οσ ιευθείσ α δομ ή της C u (I)H S co l. Ο χα λκ ός(ι) δεσ μ εύετα ι α π ό τις δ ύ ο C ys του μ ο τίβ ο υ CXXXC, του β ρ ό γ χ ο υ 3 κ α ι τη ς έλικ α ς α ΐ, κ α ι α π ό τ η ν H is224, η ο π ο ία βρίσκεται σε δομ ή β- φ ουρκέτα ς. Τ α π ρ ω τ ό ν ια τω ν ιμ ιδ α ζο λ ικ ώ ν δα κ τυλίω ν τω ν ισ τιδ ινώ ν τα υ τ ο π ο ιή θ η κ α ν μ ε τη λ ή ψ η φ α σ μ ά τ ω ν H SQ C 1Η -15Ν π ο υ β α σ ίζο ν τ α ι σε σ υ ζεύ ξεις 2J Ν Η κ α ι μ ε τ η ν α ν ά λ υ σ η τω ν φ α σ μ ά τω ν 13C -N O E SY -H SQ C. Α π ό το π ρ ώ το π είρ α μ α (2J Ν Η -H S Q C ) φ α ίνετα ι ότι η H is 224 α π ο κ τά μ ια δ ια μ ό ρ φ ω σ η ό π ο υ το Ν δ ΐ ε ίν α ι π ρ ω το ν ιω μ ένο ενώ το Ν ε2 εντά σ σ ετα ι α π ό το μ ετα λ λ ικ ό ιό ν (Σ χή μ α 49). Ο σ υ ντελεσ τή ς α π όκλισ η ς R M SD (R oot M ean S q u are D evia tio n ) γ ια τ η ν κ ύ ρ ια α λ υ σ ίδ α ε ίν α ι / Α. Σ υνεπ ώ ς, η δ ο μ ή της C u(i)h Sco2 π ρ ο σ δ ιο ρ ίσ τη κ ε με υ ψ η λ ή ακρίβεια. Σ τη ν ap o H S co 2 ο ι σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ί τω ν α μ ιδ ΐκ ώ ν π ρ ω το νίω ν του Ν - τελικ ού ά κ ρ ο υ της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς π ο υ δ εν π ρ ο σ δ ιο ρ ίσ τη κ α ν α ντισ τ ο ιχ ο ύ ν στα α μ ιν ο ξ έα 100, 101, 102,103, στο φ ύ λ λ ο β ΐ ( α μ ιν ο ξ έα 105, 107), σ τη ν 3ιοέλ ικ α (α μ ινο ξύ 116), στο φ ύ λ λ ο β3, στο β ρ ό γ χ ο 3, σ τη ν έλικ α α ΐ (α μ ινο ξέα ), στο β ρ ό γ χ ο 5 (α μ ιν ο ξ έα ), στο β ρ ό γ χ ο 7, σ τη ν έλικ α α 3, στο β ρ ό γ χ ο 8, σ το φ ύ λ λ ο β6 (α μ ιν ο ξ έα , ), στο φ ύ λ λ ο β7 κ α ι στο β ρ ό γ χ ο 10 (α μ ινο ξέα ), σ ύ μ φ ω να με τα δευτεροτα γή δ ο μ ικ ά σ τοιχεία π ο υ π ρ ο κ ύ π τ ο υ ν α π ό τη δομ ή της C u(i)h S co2 (βλ.π α ρακάτω ). Π α ρ α τη ρ ούμε επ ίσ η ς, π ω ς α ρ κ ετά α μ ιν ο ξ έα (17, 23, 29, 33, 34, 53, 54, 72, 73, 80, 99 κ α ι 100) σ τη ν δ ομ ή της ελεύθερ η ς μ ο ρ φ ή ς της π ρ ω τεΐνη ς ε μ φ α ν ίζ ο υ ν δ ιπ λή ή π ο λ λ α π λ ή δ ια μ όρ φ ω σ η στο φ ά σ μ α N M R, ενώ δ ε ν σ υ μ β α ίνει το ίδ ιο στο α ντίσ τ ο ιχ ο φ ά σ μ α της C u(i)h S co2 (Σ χή μ α 50). 122

129 9 Σ χ ή μ α 48: Η τ ρ ισ δ ιά σ τ α τ η δ ο μ ή τ η ς C u ( I ) H S c o 2. Α ρ ισ τ ε ρ ά, η δ ο μ ή μ ε τ η χ α μ η λ ό τ ε ρ η ε ν έ ρ γ ε ια ^ ό π ο υ φ α ίν ο ν τ α ι τ α δ ε υ τ ε ρ ο τ α γ ή δ ο μ ικ ά σ τ ο ιχ ε ία. Ο ι υ π ο κ α τ α σ τ ά τ ε ς τ ο υ μ ε τ ά λ λ ο υ 'C y s 133, C y s κ α ι H i s 224. Τ ο ιό ν τ ο υ χ α λ κ ο ύ (I) ω ς σ φ α ίρ α. Δ ε ξ ιά, η υ π έ ρ θ ε σ η τ ω ν 3 0 π ιο χ α μ η λ ώ ν ε ν ε ρ γ ε ια κ ά δ ο μ ώ ν τ η ς C u ( I ) H S c o 2 π α ρ ισ τ ά ν ε τ α ι ω ς σ ω λ ή ν α ς τ ο υ ο π ο ίο υ η α κ τ ίν α. ε ί ν α ι α ν ά λ ο γ η τ ο υ R M S D τ η ς κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς. 123

130 H {(ppm) 11 lfl 0 8 Σ χ ή μ α 4 9 : Φ ά σ μ α H S Q C Ή - 15Ν π ρ ο σ α ρ μ ο σ μ έ ν ο γ ια τ η ν α ν ίχ ν ε υ σ η τ ω ν 2J Ν Η τ ω ν ι σ τ ι δ ι ν ι κ ώ ν δ α κ τ υ λ ίω ν τ η ς C u ( I ) H S c o 2 σ ε φ α σ μ α τ ο γ ρ ά φ ο ε ξ ο π λ ισ μ έ ν ο μ ε c r y o - p r o b e σ τ ο υ ς Μ Η ζ, Τ = Κ, p H 7.2. Σ τ ο δ ι ά γ ρ α μ μ α α π ε ικ ο ν ί ζ ο ν τ α ι ο ι τ ρ ε ις π ρ ω τ ο ν ια κ έ ς κ α τ α σ τ ά σ ε ις τ ω ν ι σ τ ι δ ι ν ι κ ώ ν δ α κ τ υ λ ίω ν κ α θ ώ ς κ α ι η ο ν ο μ α σ ί α π ο υ χ ρ η σ ι μ ο π ο ι ε ί τ α ι γ ια ν α π ε ρ ιγ ρ α φ ο ύ ν τ α ά τ ο μ α τ ο υ ιμ ιδ α ζ ο λ ίο υ. Α π ό τ α σ χ έ δ ια 2J (p a tte rn s ), φ α ί ν ε τ α ι ό τ ι η H i s β ρ ίσ κ ε τ α ι σ ε τ α υ τ ο μ έ ρ ε ια a - τ ό π ο υ, ο ι H i s 1 0 5, H i s 1 0 9, H i s κ α ι H i s σ ε b - τ ύ π ο υ κ α ι ο ι H i s κ α ι H i s σ ε τ α υ τ ο μ έ ρ ε ια c-τ ύ π ο υ. 124

131 ^ Σ χ ή μ α 50: Δ ο μ ή τ η ς C u ( I) H S c o 2. Μ ε κ ό κ κ ιν ο υ π ο δ ε ικ ν ύ ο ν τ α ι ο ι π ε ρ ιο χ έ ς π ο υ λ ε ίπ ο υ ν σ τ η δ ο μ ή τ η ς a p o H S c o 2. Τ α α μ ιν ο ξ έ α π ο υ ε μ φ α ν ίζ ο υ ν δ ιπ λ έ ς ή π ο λ λ α π λ έ ς δ ια μ ο ρ φ ώ σ ε ις σ τ ο φ ά σ μ α N M R τ η ς a p o H S c o 2, β ρ ίσ κ ο ν τ α ι σ τ ο β ρ ό γ χ ο 1 (1 09 ), σ τ ο φ ύ λ λ ο β 2 (1 15 ), σ τ ο β ρ ό γ χ ο 2 (121), σ τ ο φ ύ λ λ ο β 3 ( 1 2 5,1 2 6 ), σ τ η ν έ λ ικ α α ΐ (1 4 5, ), σ τ ο φ ύ λ λ ο β 4 (1 6 4,1 6 5 ), σ τ ο β ρ ό γ χ ο 5 (172), σ τ ο φ ύ λ λ ο β 5 (1 91 κ α ι 192), κ α ι σ η μ ε ιώ ν ο ν τ α ι μ ε μ π λ ε χ ρ ώ μ α. Τ ο ιό ν τ ο υ χ α λ κ ο ύ, ο ι υ π ο κ α τ ά σ τ α τ ε ς κ α ι η π ρ ο λ ϊν η, φ α ί ν ο ν τ α ι μ ε μ ω β, κ ίτ ρ ι ν ο κ α ι μ α ύ ρ ο χ ρ ώ μ α, α ν τ ίσ τ ο ιχ α. 125

132 Π α ρ α τ η ρ ο ύ μ ε λ ο ιπ ό ν, π ω ς ο ι σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ί π ο υ λ ε ίπ ο υ ν στο φ ά σ μ α της a p o S co 2 π ε ρ ιλ α μ β ά ν ο υ ν τ η ν π ερ ιο χ ή έντα ξη ς του μ ετα λλικ ού ιόντος, CXXXC, το β ρ ό γ χ ο 8, ό π ο υ βρίσκετα ι ο τρίτος υποκ α τα στά τη ς (H is), κ α ι τις γειτονικ ές π ερ ιο χές. Τ α α μ ιν ο ξ έα π ο υ τα υ τ ο π ο ιή θ η κ α ν στα φ ά σ μ α τα Ή - 15Ν H SQ C της C u (I)H S co2 α λ λ ά κ α ι της a p o H S co 2 π α ρ ο υ σ ιά ζο υ ν ό μ ο ιες χη μ ικ ές μ ετα τοπ ίσ εις, γ ε γ ο ν ό ς π ο υ υ π ο δ η λ ώ νετα ι α π ό το ότι οι μ ετρήσιμες δ ια φ ορές ΔδΝΗ ε ίν α ι μ ικ ρ ότερ ες α π ό O.lOppm (Σ χή μ α 51) , Ε α Α ριθμός αμινοξέος Σ χ ή μ α 51: Δ ια φ ο ρ έ ς σ τ ις χ η μ ικ έ ς μ ε τ α τ ο π ίσ ε ις Ν Η μ ε τ α ξ ύ τ η ς a p o κ α ι τ η ς δ ε σ μ ε υ μ έ ν η ς μ ο ρ φ ή ς τ η ς H S c o 2. Η μ έ σ η τ ι μ ή τ η ς μ ε τ α β ο λ ή ς A av g( H N ) ( ά ξ ο ν α ς y ) γ ια κ ά θ ε α μ ι ν ο ξ ύ ( ά ξ ο ν α ς χ ) υ π ο λ ο γ ίσ τ η κ ε μ ε τ ο π α ρ α κ ά τ ω μ α θ η μ α τ ι κ ό τ ύ π ο ( { [ ( Δ Η ) 2 + ( Δ Ν / 5 ) 2 ] / 2 ) 1 / 2, ό π ο υ Δ Η κ α ι Δ Ν ε ί ν α ι ο ι μ ε τ α β ο λ έ ς τ ω ν χ η μ ικ ώ ν μ ε τ α τ ο π ίσ ε ω ν τ ο υ Ή κ α ι τ ο υ 15Ν, α ν τ ίσ τ ο ιχ α. 126

133 m Η α δ υ να μ ία εύρεσης π ο λ λ ώ ν δ ια σ τα υ ρ ο ύ μ ενω ν σ η μ ά τω ν (cross peaks) Ν Η κύριας α λυσίδα ς καθώ ς και η π α ρ ο υ σ ία διπ λώ ν Ν Η σ υ ντονισ μ ώ ν γ ια το ίδιο α μ ινοξύ κ ύριας α λυσίδας στο δείγμ α της apoh S co2 (Π ίνα κ α ς 3 Π α ρ ά ρ τη μ α I) οδη γεί στο σ υμ π έρ α σ μ α ότι η πρω τεΐνη σ τη ν ελεύθερη μορφ ή της επιδεικνύει π ο λλα π λές διαμορφω τικές καταστάσεις ο ι οποίες ενα λλά σ σ οντα ι σε_ ενδιά μ εσ ο ή σε α ρ γ ό χ ρ ό ν ο στη κ λίμ α κ α του N M R (tim escale). Ο ι τοπικές αυτές ενα λ λ α γές στη διαμόρφ ω ση α φ ο ρ ο ύ ν τη π ερ ιοχή ένταξης του μ ετάλλου α λλά και τις π ερ ιο χές π ο υ τη ν π ερ ιβ ά λ λ ο υ ν (σε αντίθεση με ότι σ υμ βαίνει στην H S co l), οι οπ οίες α π ο τ ελ ο ύ ν κ α ι το π υ ρ ή ν α της H Sco2 (Σ χήμα 52). Σ χ ή μ α 52: Δ ο μ έ ς τ ρ ιώ ν δ ια σ τ ά σ ε ω ν 3 D C u ( I ) - H S c o l ( α ρ ισ τ ε ρ ά ) κ α ι C u ( I ) - H S c o 2 (δ ε ξ ιά ), ό π ω ς α υ τ έ ς υ π ο λ ο γ ίσ τ η κ α ν α π ό τ ο μ έ σ ο ό ρ ο δ ια μ ο ρ φ ώ σ ε ω ν κ α ι σ ύ γ κ ρ ισ η α υ τ ώ ν. Ο ι σ υ ν τ ο ν ισ μ ο ί, Ν Η τ η ς κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς π ο υ δ ε ν α ν ι χ ν ε ϋ θ η κ α ν σ τ ις δ ο μ έ ς a p o H S c o l ή a p o H S c o 2 σ η μ ε ιώ ν ο ν τ α ι μ ε κ ό κ κ ιν ο. Η δέσμευση του χ α λ κ ο ύ (I) επ ιφ έρ ει το "πάγω μ α" οτις π α ρ α π ά νω π εριοχές τω ν π ο λ λ α π λ ώ ν δια μ ορ φ ώ σ εω ν, επ ιτρ έπ ο ντα ς τ ο ν π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό της τρισδιάστατης δομ ή ς. Τα π ειρ ά μ α τα N M R έ γ ιν α ν σε θ ερ μ οκ ρ α σ ία 3U8K, * καθώ ς η π λειο νό τη τα τω ν κ ο ρ υ φ ώ ν τω ν σημάτω ν Ν Η γ ιν ό τ α ν ευρείες σε 127

134 χα μ η λότερες θ ερ μ οκ ρ α σ ίες, γ ε γ ο ν ό ς π ο υ εμ π ό δ ιζε το π ρ ο σ δ ιο ρ ισ μ ό της δομ ή ς με υ ψ η λ ή διακριτική α νά λ υ σ η. Ε π ιπ λ έο ν, ο α ρ ιθ μ ός τω ν π α ρ α τη ρ ο ύ μ ενω ν Ν Ο Ε ή τ α ν π ο λ ύ μ εγα λ ύ τερ ο ς α π ό ό,τι σ τους 298Κ. Σε έ ν α δεύτερο σ τά δ ιο μ ελετή θηκαν ο ι δ υ να μ ικ ές ιδιότητες της (h olo) μ ο ρ φ ή ς της π ρ ω τεΐνη ς μ ε π ειρ ά μ α τ α α π οκατά σ τα σ η ς και με ετερ ο π υ ρ η νικ ά Ν Ο Ε 1Η -15Ν. Ο ι τιμές τω ν Ri κ α ι R2 είνα ι ίδιες γ ια δ ύ ο δια φ ορετικ ές σ υ γκ εντρ ώ σ εις δ είγ μ α το ς π ρω τεΐνη ς. Ε π ομ ένω ς σ υ μ π ερ α ίνο υ μ ε πω ς ο β α θ μ ός σ υσσώ ρ ευσης (a g g reg a tio n state) της π ρω τεΐνη ς κ α ι επ ο μ ένω ς ο χ ρ ό ν ο ς π ερ ισ τ ρ ο φ ή ς του μ ο ρ ίο υ τ0 ε ίν α ι α νεξά ρ τη το ς α π ό τη μετα βολή της σ υ γκ έντρ ω σ η ς του δ είγ μ α το ς (Σ χή μ α 53). Για τα α μ ινο ξέα π ο υ δ ίν ο υ ν α λ λ η λ ο επ ικ ά λ υ ψ η στις κ ορυφ ές, ο υ π ο λ ο γ ισ μ ό ς τω ν Ν Ο Ε α π ο φ εύ γετα ι π ρ ο κ ειμ ένου η α νά λ υ σ η ν α ε ίν α ι υ ψ η λ ό τερ η ς ακρίβεια ς. Residue number Residue number 128

135 0 Β Residue number Residue number Σ χ ή μ α 53: Π α ρ ά μ ε τ ρ ο ι α π ο κ α τ ά σ τ α σ η ς 15N Κ ι, R 2, κ α ι ε τ ε ρ ο π υ ρ η ν ικ ά N O E. ( A ) Σ ύ γ κ ρ ισ η μ ε τ α ξ ύ δ ε δ ο μ έ ν ω ν π ο υ σ υ λ λ έ χ θ η κ α ν σ ε σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η 0.6 m M γ ια τ η ν C u ( I ) H S c o 2 σ τ ο υ ς M H z ( Κ ) (δ ε ξ ιά ) κ α ι σε σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η 0. 2 m M σ τ ο υ ς M H z ( Κ ) (α ρ ισ τ ε ρ ά ). (Β ) Σ ύ γ κ ρ ισ η μ ε τ α ξ ύ δ ε δ ο μ έ ν ω ν π ο υ σ υ λ λ έ χ θ η κ α ν σ ε σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η 0.2 m M C u ( I ) H S e o 2 σ τ ο υ ς M H z ( Κ ) (δ ε ξ ιά ) κ α ι σ ε σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η 0. 2 m M σ τ ο υ ς M H z ( Κ ) (α ρ ισ τ ε ρ ά ). Κ ατά τη μ εταβολή της σ υγκ έντρω σης του δείγμ α τος, δ εν μ ετα βάλλετα ι τα υ τόχρ ο να κ α ι η τιμή της χη μ ικ ή ς μ ετα τόπ ισ η ς 15Ν ( 0.05ppm ) για οπ οιοδή π οτε α μ ινο ξύ της πρω τεΐνης. Ο ι τιμές Ri π ο υ μ ετρήθηκαν στους 500 Μ Η ζ (0.2 m M συγκέντρω ση δείγμ α τος) κ α ι στους 600 Μ Η ζ (0.6 mm συγκέντρω ση δείγμ ατος) δ ε ίχ ν ο υ ν πω ς η π ρω τεΐνη σε δ ιά λ υ μ α βρίσκεται σε μ ονομ ερ ή κατάσταση. Π ρ ά γμ α τι, α κ ολούθησε σύγκριση τω ν τιμώ ν α υτώ ν σε θερμοκρασία 298Κ (1.3 2 ± s7) με πρω τεΐνες με ιια ρ ό μ ο ιο μ έγεθος (α νθρώ πινη S c o l, 1.38±0.1s_1, B acillus su b tillis Sco, 1.40±0.06 s 1, SO D 'm onom eric, 1.41±0.29 S'1) και επαληθεύτηκε η π ρ ο η γούμ ενη διαπίστω ση. Π α ρ όλα α υτά, η μέση τιμή του R2(25.9±4.5 s'1 στους 500 Μ Η ζ και 298Κ) της 129

136 C u(i)h S co2 ε ίν α ι π ο λ ύ υψ η λ ότερ η α π ό τη ν α ν α μ ε ν ό μ ε ν η (17.3±0.7 S'1 στους 500 Μ Η ζ μ ε βάση τις μετρήσεις μ ε το π ρ ό γ ρ α μ μ α H Y D R O N M R γ ια τη μ ο ν ο μ ερ ή μ ο ρ φ ή της C u(i)h Sco2. Τ ο γ ε γ ο ν ό ς α υ τό μ π ο ρ εί ν α α π ο δ ο θ εί σε κ ά π ο ιο υ β α θ μ ο ύ δ ια μ ορφ ω τικ ές δ ια κ υ μ ά νσ εις της κ ύ ρ ια ς α λυσίδ α ς της π ρ ω τεΐνη ς, οι ο π ο ίες π α ρ α τ η ρ ο ύ ντα ι κ α τά μ ή κ ος όλη ς της α μ ινοξικ ή ς α κ ο λ ο υ θ ία ς στη χ ρ ο ν ικ ή κ λ ίμ α κ α του N M R (~10"3s). Ε πομένω ς, η H Sco2 σ υ μ π ερ ιφ έρ ετα ι κ α ι στις δ ύ ο μ ορφ ές ω ς μ ια π ρω τεΐνη με μ ια τεράστια ευελιξία κ α ι ευ κ ινη σ ία τη ς κ ύ ρ ια ς α λυσίδ α ς, σε δ ια φ ο ρ ετικ ό β α θ μ ό στις δ υ ο μ ορφ ές, κ α ι η ο π ο ία δ ε ν π α ρ α τη ρ είτ α ι σ τη ν H S c o l. Η ιδ ιότη τα αυτή, ίσω ς κ α θ ορίζει κ α ι το ξεχω ρισ τό ρ ό λ ο τω ν δ ύ ο α υτώ ν ο μ ό λ ο γ ω ν π ρ ω τεϊνώ ν σ τ ο ν ά νθ ρ ω π ο. 5.3 Σύγκριση δομικών και δυναμικών ιδιοτήτων των HScol και HSco2 Σ το ε π ό μ ε ν ο σ τά διο, α ν α λ ύ θ η κ α ν ο ι α μ ινο ξικ ές α κ ολουθίες τω ν δ ια λ υ τ ώ ν τμ η μ ά τω ν τω ν H S c o l κ α ι H S co2 μ ε σ κ ο π ό ν α π ρ ο σ δ ιο ρ ισ τ ο ύ ν ο ι π α ρ ά γ ο ν τ ε ς π ο υ κ α θ ο ρ ίζο υ ν τη δ ια φ ορετικ ή σ υ μ π ερ ιφ ο ρ ά τω ν δ ύ ο π ρ ω τεϊνώ ν στο δ ιά λ υ μ α. Η υπέρθεση α λ λ η λ ο υ χ ία ς δ είχ νει π ω ς ο ι δ ύ ο π ρ ω τεΐνες δ ια φ έ ρ ο υ ν μ ό ν ο σε 51 α μ ιν ο ξ έα (ομ οιότη τα α κ ο λ ο υ θ ία ς 51%), (Σ χή μ α 54). 130

137 9 V pi L1 l : PL L3 al ^99*&*ΙΪΛ..Ι HSfo: 0 P F H L L D H R G R AF C K A P F E G Q W VL Μ YF G F T H C P Π I C P P E L E mv oi p f s i. τ τ π τ n f r e τ n κ n y l ο ο τύ i- 1- i V f rj r τ n r p n v r p f f i. f p ' L4 β4 L5 mini mvoi K L VV V VR y I. If A H > ιί l V V Vy V V V I Ί VI» ] V R I» U V V A MA ft V Vy b K M t Q V V D F I f t f i l T T L P D L T P L F l s T f t P F ft ft T K IT A I A ft Y V K F t ; ; * t t ; : : ; * * ;»:*#;; T*t*t m o : TTfirol L6 05 L7 a3 LS β-hflirpiu - h«i J LS β-hairpin rhprllgltcistkqvaqashsyrwywagfkpfp Q D YI V DH F S P Kr L V 0 L T «T R E F VI) y VAR AY R VY Y ft P fi P K ft F ft E ft Y ΤV ft FT V * * n t * * ; ' ' * * V * R * «r i R M I M t M T L8 B6 L9 67 L10 a4 f: i»>wry<r»t1 jra> j ESco2 FI A I YLLftPDGLFTDYYGRFRFAEQISPSYRRHMAAFRftVLS HS. ο! T 1 I Μ Y L I GPI) OF F L I) Y F G Q NK R K GF I A A S I AT Η M RP YRK K S ' w * p p * p P P * p» * p * * p * p * P P 9 m. *... ' 1 i Σ χ ή μ α 54: Υ π έ ρ θ ε σ η α κ ο λ ο υ θ ία ς τ ω ν H S c o l κ α ι H S c o 2. T a α μ ιν ο ξ έ α π ο υ δ ια τ η ρ ο ύ ν τ α ι σ υ μ β ο λ ίζ ο ν τ α ι μ ε α σ τ ε ρ ίσ κ ο (*), ε ν ώ α υ τ ό π ο υ δ ια φ έ ρ ο υ ν ε λ ά χ ισ τ α ή π ο λ ύ σ υ μ β ο λ ίζ ο ν τ α ι μ ε : κ α ι, α ν τ ίσ τ ο ιχ α. Α π ε ικ ο ν ίζ ο ν τ α ι ε π ίσ η ς τ α δ ε υ τ ε ρ ο τ α γ ή δ ο μ ικ ά σ τ ο ιχ ε ία σ ύ μ φ ω ν α μ ε τ η δ ο μ ή τ η ς C u ( I) H S c o 2. Α ν υπερθέσ ουμ ε τα α μ ινο ξέα α υ τά στις τρισδιά στα τες δ ο μ ές (3D ) τω ν C u(i)h S col κ α ι C u(i)h Sco2, π ρ ο κ ύ π τει πω ς 29 α μ ινο ξέα β ρ ίσ κ οντα ι σε. π ερ ιοχές δευτερ οτα γούς δομ ή ς, ενώ 22 σε π ερ ιο χές β ρ ό γχω ν. Τα α μ ινοξέα αυτά βρίσ κ οντα ι κυρίω ς σ τη ν επ ιφ ά νεια της π ρω τεΐνη ς μ ε εξαίρεση τα τρία α μ ινο ξέα π ο υ β ρ ίσ κ οντα ι βαθιά στο εσω τερικό τω ν δ ύ ο πρω τεϊνώ ν. Στην H Sco2 τα α μ ινο ξέα α υτά ε ίν α ι η A la201, AIa227, η Thr238 κ α ι α ντικ α θισ τούν 131

138 α μ ιν ο ξ έ α μ ε μ εγα λύ τερ ες υ δ ρ ο φ ο β ικ ές π λευρικ ές α λυσίδες στην H S co l(v a l2 3 7, Ile263, L eu274, α ντίσ τοιχα ). Γ ίνεται κ α τα νο η τό πω ς μ ικρότερες * π λ ευ ρ ικ ές α λ υ σ ίδ ες στις π ερ ιο χ ές α υτές ο δ η γ ο ύ ν σε μ ικρότερες υ δ ρ οφ οβικ ές επ α φ ές κ α ι επ ο μ ένω ς π ιο α σ θ ενή υ δ ρ ο φ ο β ικ ό π υ ρ ή ν α στη apoh S co2 σε σχέση με τ η ν a p o H S c o l. Ε π ομ ένω ς η ap o H S co 2 π α ρ ο υ σ ιά ζει π ο λ λ α π λ ές τοπικές δ ια μ ο ρ φ ώ σ εις. Π ρ ό σ φ α τα π α ρ α τη ρ ή θ η κ ε μ ια π α ρ ό μ ο ια περίπτω ση σ τη ν π ρ ω τεΐνη φ ερ ο δ ο ξίν η, ό π ο υ μ ε τη μ έθ ο δ ο της σημειακής μ ετά λλα ξη ς α ντικ α τα σ τά θ η κ ε έ ν α λ ιγ ό τ ερ ο ογκ ώ δες α μ ινο ξύ (Ser ή A la) μ ε ένα μ εγα λ ύ τ ερ ο υ δ ρ ο φ ο β ικ ό α μ ιν ο ξ ύ (V al) σ τ ο ν υ δ ρ ο φ ο β ικ ό π υ ρ ή ν α κ α ι μ ε α υτό το τ ρ ό π ο σ τα θ ερ οπ οιή θ η κ ε η τρισ διά σ τα τη δομ ή της π ρ ω τεΐνη ς σε μ ια μ ο ν α δ ια ία δια μ όρφ ω σ η. Σ ύ μ φ ω να λ ο ιπ ό ν με τη ν υπόθεση αυτή, η θέση 201 (α ρ ίθ μ η σ η H Sco2) ε ίν α ι π ο λ ύ σ η μ α ντικ ή δ ο μ ικ ά γ ια τ ο ν π ρ ο σ α ν α τ ο λ ισ μ ό της έλικ α ς α 3 σε σχέση μ ε το β-π τυχω τό φ ύ λ λ ο, δ ια μ έσ ου υ δ ρ ο φ ο β ικ ώ ν α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εω ν μ ετα ξύ α μ ιν ο ξ έ ω ν π ο υ δ ια τ η ρ ο ύ ντα ι σ τη ν H S c o l κ α ι στη ν H S co2 ( P h e 104, L e u l0 6, P h e l2 8, κ α ι He 165 Η 5εο2):η V al 237 στη H S c o l σ τα θ ερ ο π ο ιεί π ερ ισ σ ότερ ο το π ρ ω τεϊνικ ό π υ ρ ή ν α α π ό ότι η A la 210 στη H Sco2. Ε π ο μ ένω ς η α ντικ α τά σ τα σ η ε ν ό ς κ α ι μ ό ν ο α μ ινο ξέο ς μ π ο ρ εί ν α α ντιπ ρ ο σ ω π εύ ει τη ν δομ ικ ή βάση γ ια τ η ν δια μ ορφ ω τικ ή α τα ξία π ο υ π α ρ α τη ρ είτ α ι σ τη ν έλικα α3 κ α ι α ν τ α ν α κ λ ά τη ν α δ υ ν α μ ία α ν ίχ ν ευ σ η ς τω ν Ν Η τη ς κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς σ τη ν apoh S co 2. Π α ρ ό μ ο ια, ο ι θέσεις 227 κ α ι (α ρ ίθ μ η σ η H Sco2) σ υ μ μ ετ έχο υ ν σε υ δ ρ ο φ ο β ικ ές α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εις μ ετα ξύ τω ν φ ύ λ λ ω ν β6, β7 κ α ι β3 μ ε α μ ιν ο ξ έα π ο υ δ ια τη ρ ο ύ ντα ι στις δ ύ ο ο μ ό λ ο γ ες π ρ ω τεΐνες (T rp l2 3, P h e l2 8, T yr229, L eu230 κ α ι T yr240 στη ν H Sco2). Ο ι μ ικ ρ ότερ ες π λευ ρ ικ ές α λυσίδ ες τω ν A la 227 κ α ι Thr 238 της H S co2 σε αντίθεση μ ε τις μ εγα λ ύ τερ ες τω ν lie 263 κ α ι L eu274 της H S c o l, σ υ μ β ά λ λ ο υ ν σ τη ν α π ο σ τα θ ερ ο π ο ίη σ η της δ ια μ ό ρ φ ω σ η ς τω ν φ ύ λ λ ω ν β6 κ α ι β7. Α π οτέλεσ μ α του α σ θ ενο ύ ς υ δ ρ ο φ ο β ικ ο ύ "πακεταρίσματος" ε ίν α ι ότι τα Ν Η της κ ύρια ς α λ υ σ ίδ α ς δ ε ν τα υ τ ο π ο ιή θ η κ α ν στο φ ά σ μ α της apoh S co2. Σ το φ ά σ μ α H SQ C αη -15Ν δ εν α ν ιχ ν ε ύ ο ν τ α ι τα Ν Η της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς σ τη ν π ερ ιοχή του β ρ ό γ χ ο υ 8, σ τ ο ν ο π ο ίο βρίσ κ ετα ι η H is 224 (τρίτος υ π οκατα σ τά τη ς του 132

139 χα λκ ού). Ο β ρ ό γ χο ς 8 αποτελεί τη σύνδεση μεταξύ της έλικας α3 κ α ι του φ ύλλου β6, κ α ι η μη α νίχνευ σ η τω ν σημάτω ν σ υμ φ ω νεί με τη ν τοπική δομική "αταξία" της συγκ εκ ριμ ένη ς π ερ ιοχή ς στη ν apoh Sco2. Τέλος, μ ια α πλή α λλα γή ενό ς α μ ινο ξέο ς σε στρατηγικές θέσεις σ τη ν α κ ο λ ο υ θ ία μ π ο ρ εί ν α επηρεάσει τη δυνα μ ικ ή σ υ μ π ερ ιφ ο ρ ά της apoh S co2 σε σχέση με τη ν a p o H S co l. Ε νδ ια φ έρ ο ν π α ρ ο υ σ ιά ζει το γ ε γ ο ν ό ς ότι μετά τη δέσμευση του χα λκ ο ύ (I) α π ό τη ν πρω τεΐνη, α ν ιχ νεύ ο ν τ α ι ό λ α τα σήματα Ν Η της κ ύρια ς α λυσίδας (εκτός α π ό τα α μ ινο ξέα 196 κ α ι 237) τα ο π ο ία επ ίση ς α π ο υ σ ιά ζο υ ν α π ό το φ ά σ μ α της apoh Sco2. Φ αίνεται λ ο ιπ ό ν ότι με τη ν ένταξη του μ ετά λλου η πρω τεΐνη επ ιλέγει εκείνη τη δια μ όρφ ω ση η ο π ο ία π ρ ο σ δ ίδ ει σταθερότητα στο μ ό ρ ιο κ α ι π ρ ο σ α να το λ ίζει τους υποκαταστάτες, έτσι ώστε ν α δεσ μ εύ σ ουν το χ α λ κ ό (I). Η τιμή RM SD της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς της C u(i)h Sco2 είνα ι μεγαλύτερη α π ό αυτή της C u (I)H S col στις έλικες α3, α 4 κ α ι κ υρίω ς στις π εριοχές τω ν β ρ ό γ χω ν (Σ χή μ α 55). Residue number Σ χ ή μ α 55: Σ ύ γ κ ρ ισ η τ ω ν τ ιμ ώ ν R M S D μ ε τ α ξ ύ τ η ς C u ( I ) H S c o l ( κ ό κ κ ιν ο ) κ α ι C u ( I ) H S c o 2 ( μ α ύ ρ ο ). Π α ρ α τ η ρ ο ύ μ ε μ ε γ α λ ύ τ ε ρ η τ ι μ ή R M S D γ ι α τ η C u ( I ) H S c o 2 σ τ ις π ε ρ ιο χ έ ς τ ω ν β ρ ό γ χ ω ν 5 κ α ι 3 α λ λ ά κ α ι σ τ ις έ λ ικ ε ς α 3 κ α ι α

140 Ιδια ίτερ α ο ι β ρ ό γ χ ο ι 5 κ α ι 8 π α ρ ο υ σ ιά ζο υ ν τις σημαντικ ότερες δ ια φ ο ρ ές σε α υτή τη δια μ ορφ ω τικ ή κατάσταση. Στη δομ ή της C u(i)h Sco2, ο β ρ ό γ χ ο ς 8 π α ρ ο υ σ ιά ζει σε μ εγα λ ύ τερ ο β α θ μ ό α τα ξία σ τη ν π εριοχή π ο υ εκτίθεται στο δια λύτη, α π ό το α μ ινο ξύ 211 έως το 222, α φ ο ύ σε αυτή τη ν π ερ ιο χ ή δ ε ν σ υ λ λ έχ θ η κ α ν Ν Ο Ε μ εσ α ία ς κ α ι μ α κ ρ ά ς α πόσ τα σ η ς. Α ντίθετα, στη δ ο μ ή της C u (I)H S co l συλλέχθη κ ε ικ α νο π ο ιη τ ικ ό ς α ρ ιθ μ ό ς Ν Ο Ε μ α κ ρ ά ς α π ό σ τα σ η ς μ ετα ξύ του β ρ ό γ χ ο υ 8 κ α ι β ρ ό γ χ ο υ 5, ό π ο υ π ε ρ ιλ α μ β ά ν ο ν τ α ι τα α μ ιν ο ξ έ α T yr256 (β ρ ό γ χ ο 8) κ α ι G lu 206 (β ρ ό γ χ ο 5), τα ο π ο ία σ χη μ α τίζο υ ν δ εσ μ ο ύ ς υ δ ρ ο γ ό ν ο υ. Ο ι α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εις αυτές δ εν υφ ίσ τα τα ι στη ν π ερίπ τω σ η της C u(i)h Sco2, π α ρ ό τ ι τα α μ ιν ο ξ έα αυτά δ ια τη ρ ο ύ ντα ι κ α ι στις δ ύ ο π λευρές. Ε π ίσ η ς ο α ρ ιθ μ ό ς τω ν μ α κ ρ ά ς α π όσ τα σ η ς Ν Ο Ε σ τη ν έλικα α3 ε ίν α ι μ ικ ρ ό τερ ο ς α π ό ότι σ τη ν C u (I)H S co l (5 ένα ν τ ι 8 Ν Ο Ε μ α κ ρ ά ς α π ό σ τα σ η ς α ν ά α μ ινο ξύ ) κ α ι επ ο μ ένω ς σ η μειώ νετα ι μ ια ελ α φ ρ ά αύξηση σ τη ν τιμή του R M SD της κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς σ τη ν C u(i)h Sco2. Σ τη ν H Sco2 τα α μ ιν ο ξ έα 195 κ α ι 199 π ο υ β ρ ίσ κ ο ντα ι σε π ερ ιο χή έλικ α ς δ εν σ υ μ μ ετέχο υ ν σε δ εσ μ ο ύ ς-γέφ υ ρ ες κ α ι σε α λ λ η λ επ ιδ ρ ά σ εις δεσ μ ώ ν υ δ ρ ο γ ό ν ο υ, όπ ω ς σ υ μ β α ίνει στη H S c o l (Σ χή μ α 56). R231 / Ε206 ΤΙ 95 ν Ε170 Σ χ ή μ α 5 6 : Δ ίκ τ υ ο δ ε σ μ ώ ν υ δ ρ ο γ ό ν ο υ κ α ι δ η μ ι ο υ ρ γ ία ιο ν τ ικ ώ ν δ ε σ μ ώ ν σ τ η ν π ε ρ ίπ τ ω σ η τ η ς H S c o l κ α ι τ η ς H S c o 2. Ο ιο ν τ ι κ ό ς δ ε σ μ ό ς μ ε τ α ξ ύ G l u ( β ρ ό γ χ ο ς 5 ) κ α ι A r g ( έ λ ικ α α 3 ) ε μ φ α ν ί ζ ε τ α ι σ τ η H S c o l ( α ρ ισ τ ε ρ ά ) α λ λ ά λ ε ίπ ε ι σ τ η H S c o 2 (δ ε ξ ιά ), ό π ο υ η A r g

141 ψ α ν τ ικ α τ α σ ιά θ η κ ε α π ό τ η ν T h r l 9 5. Π α ρ ό μ ο ια, ο δ ε σ μ ό ς υ δ ρ ο γ ό ν ο υ μ ε τ α ξ ύ τ ο υ Ο δ τ ο υ A s p (έ λ ικ α α 3 ) κ α ι τ ο υ Ο Η τ η ς T y r (β ρ ό γ χ ο δ ) δ η μ ιο υ ρ γ ε ίτ α ι σ τ η H S c o l α λ λ ά ό χ ι σ τ η H S c o 2, ό π ο υ τ ο A s p α ν τ ικ α τ α σ τ ά θ η κ ε α π ό τ η ν A l a 199. Μάλιστα, τα αμινοξέα στις θέσεις αυτές αλλάζουν από Arg σε Thr και από Asp σε Ala, αντίστοιχα, εμποδίζοντας τη δημιουργία ιοντικής γέφυρας μεταξύ Arg 231 (έλικα α3) και Glu 206(βρόγχο 5) και δεσμού υδρογόνου μεταξύ Asp235( έλικα α3) και ΤγΓ245(βρόγχο 8) στην HScol. Επομένως η έλλειψη δεσμών υδρογόνου και φορτισμένων αλληλεπιδράσεων μεταξύ της έλικας α3, του βρόγχου 5 και 8 στην HSco2 εξηγεί την μεγαλύτερη διαμορφωτική ευκινησία της δομής της HSco2 συγκριτικά με την HScol. 5.4 Σημειακές μεταλλάξεις στην HSC02 Μέχρι στιγμής είναι πέντε οι παθογενείς μεταλλάξεις που έχουν προσδιοριστεί στο γονίδιο της HSco2 και προκαλούν μιτοχονδριακή δυσλειτουργία: Cysl33Ser, Glul40Lys, Leul51Pro, Argl71Trp, Ser225Phe. H αντικατάσταση της Cysl33, του μοτίβου ένταξης του χαλκού CXXXC, από τη Ser εμποδίζει τη δέσμευση του μετάλλου και επομένως οδηγεί σε πιθανή μη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης. Στη δομή της Cu(I)HSco2, το Glul40, στην έλικα α ΐ και μη εκτεθειμένο στο διαλύτη, συμμετέχει σε ιοντικό δεσμό γέφυρας με τη Lysl43, ο οποίος δεν παραμένει μετά την αντικατάστασή του από τη Lys. Επιπρόσθετα, η εισαγωγή μεγαλύτερης πλευρικής αλυσίδας σε μια πιο "κρυμμένη" περιοχή είναι δυνατό να αποσταθεροποιεί το πακετάρισμα (packing) των πλευρικών αλυσίδων μεταξύ της έλικας αΐ και,του β-πτυχωτού, φύλλου που αυτή έρχεται σε επαφή. Αφού το Glul40 βρίσκεται κοντά στον υποκαταστάτη Cysl37, μια πιθανή δομική αποδιοργάνωση λόγω μετάλλαξης, θα μπορούσε να επηρεάσει τη σταθερότητα και τις ιδιότητες δέσμευσης της πρωτεΐνης. Οι δύο αυτοί ^παράγοντες επηρεάζουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης και εξηγούν τη δυσλειτουργία σε μοριακό επίπεδο του μεταλλαγμένου τύπου Glul40Lys- 135

142 HSco2. Παρόμοια, η μετάλλαξη Ser225Phe αποσταθεροποιεί την ένταξη του χαλκού(ι) από τον υποκαταστάτη His224. Καθώς η δέσμευση του χαλκού (I) * προκαλεί μια μετάβαση από μια ανοιχτή κατάσταση apohsco2 σε μια πιο συμπαγή δομή της Cu(I)HSco2 όπου η His αποτελεί τον υποκαταστάτη του μετάλλου, η μετάλλαξη πιθανόν μεταβάλλει τη μετάβαση αυτή και οδηγεί σε ασθενέστερη συγγένεια για το μέταλλο. Το ίδιο συμπέρασμα εξάγεται και για τη μετάλλαξη Prol74L στην πρωτεΐνη HScol, όπου και εκεί η Prol74 βρίσκεται δίπλα στον υποκαταστάτη του χαλκού. Η μετάλλαξη Argl71Trp ευθύνεται για την απώλεια των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της Argl71 και των φορτισμένων αμινοξέων Aspl68 και Glul70 στο βρόγχο 5, ενώ η Leul51Pro πιθανόν εμπλέκεται στην εξασθένηση υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων, αφού η Leul51 βρίσκεται στην έλικα αΐ και αλληλεπιδρά με την Leul57 (βρόγχο 4), νά1147(έλικα αΐ), VaL160( φύλλο β4), Val 254 (έλικα α4). Συνεπάγεται πως και οι δύο αυτές μεταλλάξεις αποσταθεροποιούν την αναδίπλωση της πρωτεΐνης, καθιστώντας τη πρωτεΐνη πιο επιρρεπή σε συσσώρευση κ α ι/ή αποδόμηση. 5.5 Σ ύ γ κ ρ ισ η ο ξ ε ιδ ο α ν α γ ω γ ικ ώ ν ιδ ιο τ ή τ ω ν τ ω ν a p o H S c o l κ α ι ap o H S co 2 Η οξειδωμένη και η ανηγμένη μορφή της apohsco2 χαρακτηρίζονται από διαφορετικά φάσματα φθορισμού (όπως συμβαίνει και με την apohscol). Το δυναμικό αναγωγής των δύο κυστεϊνών της apohsco2 σε ph 7.0 είναι μικρότερο από -0.3 V, το οποίο πλησιάζει αρκετά τη τιμή του δυναμικού της apohscol, V. Το 90% των δισουλφιδικών δεσμών στην apohsco2 ανάγεται με υψηλότερες συγκεντρώσεις GSH(50mM) από ότι στην apohscol (30 mm), πράγμα που δηλώνει πως το δυναμικό οξειδοαναγωγής είναι λίγο χαμηλότερο στην HSco2 από την HScol. Σε κάθε περίπτωση όμως, οι αρνητικές τιμές του δυναμικού δείχνουν πως και οι δύο πρωτεΐνες χρειάζονται ένα αναγωγικό μέσο που θα ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσμούς, έτσι ώστε να δεσμευτεί το ιόν του χαλκού. Πράγματι, η 136

143 μιτοχονδριακή εσωτερική μεμβράνη παρουσιάζει ένα περιβάλλον περισσότερο οξειδωτικό από ότι το κυτοσόλιο του οποίου το δυναμικό οξειδοαναγωγής κυμαίνεται στα -0.29V.123 ΦΜΉΡΟΕ 5.6. Έ κ φ ρ α σ η κ α ι π α θ ο λ ο γ ικ ές σ υ ν έπ ειε ς τ η ς μ ετά λ λ α ξ η ς P 1 74L H S C 01 σ το ν ά νθ ρ ω π ο Η παθογόνος μετάλλαξη (P174L) της πρωτεΐνης Scol στον άνθρωπο προκαλεί αναπνευστική ανεπάρκεια σε συνδυασμό με δυσλειτουργία του ενζύμου οξειδάση του κυτοχρώματος c (CcO). Στη παρούσα εργασία το ενδιαφέρον στράφηκε στην επίδραση, σε μοριακό επίπεδο, της μετάλλαξης x αυτής στη λειτουργία της Sco. Για τη διερεύνηση του παραπάνω θέματος κλωνοποιήθηκε, εκφράστηκε και προσδιορίστηκε για πρώτη φόρα η τρισδιάστατη δομή της P174L-HScol με φασματοσκοπία NMR. Επίσης χαρακτηρίστηκαν οι οξειδοαναγωγικές ιδιότητες και μελετήθηκε ο μηχανισμός ένταξης του χαλκού από τη πρωτεΐνη. Στο επόμενο στάδιο κρίθηκε απαραίτητη η συγκριτική μελέτη των δομικών και βιοφυσικών ιδιοτήτων του μεταλλαγμένου τύπου P174L-HScol με αυτές του φυσικού τύπου της πρωτεΐνης (wild-type HScol). Επιπλέον, ερευνήθηκε και ο ρόλος της μεταλλοσυνοδού πρωτεΐνης Coxl7 στη μεταφορά του μετάλλου και στους δύο τύπους της πρωτεΐνης Κ λ ω ν ο π ο ίη σ η κ α ι έκ φ ρ α σ η τη ς π ρ ω τ ε ΐν η ς P 174L -H S col Αρχικά, επιτεύχθηκε στο εργαστήριο με τη μέθοδο της σημειακής μετάλλαξης (QuikChange mutagenesis kit) η παθογόνος μετάλλαξη P174L- ^HScol χρησιμοποιώντας ως μήτρα DNA το πλασμίδιο που περιείχε την γενετική ακολουθία της πρωτεΐνης HScol φυσικού τύπου. Η αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί τη διαλυτή περιοχή της πρωτεΐνης (αμινοξέα 137- τέλος) κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε (Σχήμα 57).. 137

144 *1 I ι t ι ι I ι ι ι ι I ι ι ι ι I t j ι ι I ι ι ι ι I ι ι ι ι d SCO Σ χ ή μ α 57: Η π ε ρ ιο χ ή π ο υ α ν τ ι σ τ ο ι χ ε ί σ τ ο δ ια λ υ τ ό μ έ ρ ο ς τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς H S c o l. Στη συνέχεια μελετήθηκε και βελτιστοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο για την έκφραση και το καθαρισμό επισημασμένων (σε 15Ν και 13C /15N) και μη δειγμάτων της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη παρασκευάστηκε με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχει στο Ν-τελικό άκρο την αλληλουχία 6His-GST για υψηλή απόδοση έκφρασης και καθαρισμού (όμοια με την HScolwt). Η P174L-HScol παράχθηκε σε κύτταρα της σειράς Ε. coli BL21-Gold(DE3) (Stratagene). Όπως φαίνεται και παρακάτω, μετά από τα απαραίτητα τεστ έκφρασης και καθαρισμού εμφανίζεται στο gel πολυακρυλαμιδίου υπερεκφρασμένη ταινία δεκαέξι ώρες (ΟΝ) μετά την προσθήκη του IPTG στην καλλιέργεια κυττάρων στους 30 C. Όπως αναμένονταν η υπερεκφρασμένη ταινία που αντιστοιχεί στη δομική περιοχή P174L-HScol (Μ.Β Da) βρίσκεται στο ύψος της πέμπτης ταινίας (50.000) του Marker. Ο καθαρισμός του πρωτεϊνικού στόχου έγινε με χρωματογραφία HiTrap, η οποία αποτελείται από δύο στάδια καθαρισμού με στήλη HiTrap 138

145 m Chelating HP. Στον πρώτο καθαρισμό ο πρωτεϊνικός στόχος, που έχει ιστιδινική ουρά, δεσμεύεται από την στήλη και έτσι διαχωρίζεται από τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες πού δεν έχουν ιστιδινική ουρά. Η αποκοπή της ακολουθίας 6His-GST έγινε με επώαση του πρωτεϊνικού διαλύματος με το ένζυμο TEV για 16h (Σχήμα 58). * Σ χ ή μ α 58: Τ α δ ύ ο σ τ ά δ ια κ α θ α ρ ισ μ ο ύ τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς. Α ) Π ρ ώ τ ο ς κ α θ α ρ ισ μ ό ς. Η π ρ ω τ ε ΐν η, π ε ρ ιέ χ ε ι α κ ό μ η τ η ν ^ ισ τ ιδ ιν ικ ή ο υ ρ ά κ α ι τ η ν π ρ ω τ ε ΐν η - β ο η θ ό G S T. Β ) Δ ε ύ τ ε ρ ο ς κ α θ α ρ ισ μ ό ς κ α ι α π ο μ ά κ ρ υ ν σ η τ η ς ισ τ ι δ ι ν ι κ ή ς ο υ ρ ά ς κ α ι τ η ς G S T. Τ ο Μ. Β τ η ς π ρ ω τ ε ΐν η ς ε ί ν α ι D a. 139

146 5.7 Χ α ρ α κ τη ρ ισ μ ό ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν W T -H S c o l κ α ι P 174L -H S col Δ ο μ ικ ά χ α ρ α κ τ η ρ ισ τ ικ ά τ η ς P 1 74L -H S col Η apop174l-hscol σε συγκέντρωση mm είναι μια επαρκώς αναδιπλωμένη πρωτεΐνη, όπως φαίνεται από το φάσμα HSQC Ή -15Ν το οποίο είναι παρόμοιο με αυτό της apowt-hscol. Η υπέρθεση των φασμάτων HSQC Ή -15Ν για τις δύο πρωτεΐνες δίνει την ίδια εικόνα, με μικρές διαφορές στις χημικές μετατοπίσεις των αμινοξέων και παρόμοια διασπορά των κορυφών σε όλο το εύρος του φάσματος HSQC Ή -15Ν (Σχήμα 59). p p m Σ χ ή μ α 5 9 : Υ π έ ρ θ ε σ η φ α σ μ ά τ ω ν H S Q C Ή - 15Ν τ η ς a p o W T - H S c o l ( μ α ύ ρ ο ) κ α ι τ η ς a p o P L - H S c o I ( k o k k iv o ) σ ε φ ω σ φ ο ρ ικ ό δ ι ά λ υ μ α 5 0 m M, p H 7.2, Τ = Κ Φ α σ μ α τ ο σ κ ο π ία κ υ κ λ ικ ο ύ δ ιχ ρ ω ϊσ μ ο ύ Η τεχνική του κυκλικού διχρωϊσμού εφαρμόζεται στην μελέτη της δομής και της διαμόρφωσης των πρωτεϊνών προκειμένου να εξαχθούν πληροφορίες αναφορικά με τα δομικά μοτίβα (α-έλικα, β-φύλλο, β-στροφή, τυχαίο σπείραμα) που υπάρχουν σε μία πρωτεΐνη. Ο τρόπος υπολογισμού των δομικών μοτίβων π.χ. ποσοστό του δομικού μοτίβου α-έλικας σε μία 140

147 εξεταζόμενη πρωτεΐνη, είναι κατά κύριο λόγο εμπειρικός και στηρίζεται στην μορφή που έχουν τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού για κάθε μία από τις διαμορφώσεις σε κάθε πρωτεΐνη γνωστής δομής. Οι αρωματικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων φαινυλαλανίνη, τυροσίνη, και τρυπτοφάνη παρουσιάζουν μεταπτώσεις στην εγγύς UV περιοχή ( nm). Στην άπω υπεριώδη περιοχή. (<250nm ) απορροφά κυρίως ο πεπτιδικός κορμός μίας πρωτεΐνης αλλά και ορισμένες πλευρικές αλυσίδες. Σ χ ή μ α 60: Χ α ρ α κ τ η ρ ισ τ ικ έ ς δ ο μ έ ς φ ά σ μ α τ ο ς κ υ κ λ ικ ο ύ δ ιχ ρ ω ϊσ μ ο ύ π ρ ω τ ε ϊν ώ ν π ο υ π ε ρ ιέ χ ο υ ν τ α δ ο μ ικ ά χ α ρ α κ τ η ρ ισ τ ικ ά, α - έ λ ιχ α, β -φ ύ λ λ ο, τ υ χ α ίο σ π ε ίρ α μ α, κ α ι β -σ τ ρ ο φ ή. Ο ι κ α μ π ύ λ ε ς α υ τ έ ς χ ρ η σ ιμ ο π ο ιο ύ ν τ α ι ω ς π ρ ό τ υ π α σ τ α δ ιά φ ο ρ α λ ο γ ισ μ ικ ά υ π ο λ ο γ ισ μ ο ύ δ ο μ ή ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν 128. Το φάσμα κυκλικού διχρωϊσμού της α-έλικας χαρακτηρίζεται από την παρουσία μίας ευρείας και μεγάλης σε ένταση αρνητικής περιοχής με δύο ελάχιστες τιμές ίδιας έντασης, σε μήκος κύματος 222nm και 208nm. Τα γενικά χαρακτηριστικά του φάσματος του κυκλικού διχρωϊσμού μπορεί να είναι η εμφάνιση μίας αρνητικής τιμής σε μήκος κύματος περίπου 216nm, μικρής έντασης, και μίας θετικής τιμής ίδιας έντασης σε μήκος κύματος περίπου *195nm. Το φάσμα των τυχαίων σπειραμάτων μίας πρωτεΐνης παρουσιάζει μία ισχυρή αρνητική απορρόφηση σε μήκος κύματος λίγο χαμηλότερο από τα 200nm και μία θετική απορρόφηση σε μήκος κύματος περίπου στα 218nm. Σε πολλές περιπτώσεις εμφανίζεται μία αδύναμη αρνητική απορρόφηση σε 'μήκος κύματος 235nxn. 141

148 \ \ I Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη διατηρεί την ίδια αναδίπλωση με την WT- I 1 HScol, με όμοιο περιεχόμενο β -φύλλων (21%) και α-έλικας (26%) όπως * 1 προκύπτει από το φάσμα κυκλικού διχρωϊσμού (Σχήμα 61). 1 nm H S c o 1 ( k o k k iv o ). Σ χ ή μ α 6 1 : Φ ά σ μ α τ α κ υ κ λ ικ ο ύ δ ιχ ρ ω ϊσ μ ο ύ τ η ς W T - H S c o l ( μ π λ ε ) κ α ι P L - 142

149 w Έλεγχος της θερμικής σταθερότητας Η χρήση της τεχνικής Thermofluor περιορίστηκε στη μέτρηση της Tm (μέσο σημείο της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της μετουσίωσης της πρωτεΐνης) της WT-HScol και μεταλλαγμένης πρωτεΐνης P174L με σκοπό τη σύγκριση των θερμικών σταθεροτήτων τους (Σχήμα 62). Το πείραμα αυτό έδειξε πως οι δύο πρωτεΐνες παρουσιάζουν την ίδια θερμική σταθερότητα, με θερμοκρασία τήξης, Tm=:540C. Σ χ ή μ α 62: Τ ε χ ν ικ ή φ θ ο ρ ισ μ ο ΰ μ ε τ ο υ σ ίω σ η ς τ η ς W T - H S c o l κ α ι P L - H S c o l σ ε φ ω σ φ ο ρ ικ ό δ ιά λ υ μ α 2 0 m M, p H 7.2 μ ε τ η χ ρ ή σ η τ ο υ α ν τ ιδ ρ α σ τ η ρ ίο υ S Y P R O o r a n g e d y e. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι η φύση της μετάλλαξης δεν προέρχεται -από διαφορές στην αναδίπλωση και/ή στη σταθερότητα της apop174l-hscol,σε σχέση με την πρωτεΐνη WT Τ ιτλ ο δ ό τη σ η τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν μ ε χ α λ κ ό (I) Όπως ήδη αναφέρθηκε, η apop174l-hscol δεσμεύει, όπως και η 9 apowt-hscol, ιόντα Cu(I), όταν αυτά παρέχονται ως σόμπλοκο Cu(I)- 143

150 ακετονιτριλίου. Η τιτλοδότηση των δύο πρωτεϊνών με Cu(I) μελετήθηκε στα διάφορα στάδια με τη λήψη φασμάτων HSQC 1Η-15Ν. Παρουσία 1 mm DTT, η παρουσία του μετάλλου στο διάλυμα προκαλεί διαφορετικές επιδράσεις στις δύο πρωτεΐνες (Σχήμα 63). WT-HSco1 P174L-HSco1 15Ν Σ χ ή μ α 6 3 : Φ ά σ μ α τ α H S Q C 'Η - Ι5Ν κ α τ ά τ η ν τ ιτ λ ο δ ό τ η σ η τω ν W T - H S C O l κ α ι P I 7 4 L - H S C 0 1 μ ε C u ( I) [ C u ( I ) ( C H 3C N ) 4P F 6] Παρατηρείται, ότι ενώ αρκεί ένα ισοδύναμο του χαλκού Cu(I) για τη πλήρη μεταλλοποίηση της WT-HScol, η μεταλλοποίηση της P174L-HScol δεν επιτυγχάνεται ούτε με τη προσθήκη 3 ισοδύναμων του Cu(I), αφού 20% της

151 P174L-HScol βρίσκεται ακόμη στη ελεύθερη μορφή. Στο πείραμα αυτό, ο Cu(I) συναγωνίζεται ανάμεσα στη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη και στο χηλικό αντιδραστήριο DTT επιτρέποντας τον προσδιορισμό της σταθερός διάσπασης (Κυ) του συμπλόκου Cu(I)P174L-HScol. Τα φάσματα HSQC αη-15ν κατά τη διάρκεια της τιτλοδότησης (η αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης και του συμπλόκου Cu(I)DTT είναι αργή στη χρονική κλίμακα της χημικής μετατόπισης του NMR ) επιτρέπουν τη καταγραφή των σχετικών λόγων των apo και holo μορφών, και επομένως το προσδιορισμό της Κυ του συμπλόκου Cu(I)P174L-HScol, η τιμή της οποίας υπολογίζεται ότι είναι 3.2 ± 0.6 x ΙΟ-13 Μ. Η τιμή αυτή είναι κατά πολύ μεγαλύτερη από τη Κυ ~1017 της πρωτεΐνης WT (βλ.παρακάτω). Η δέσμευση του χαλκού από τη WT-HScol προκαλεί σημαντικές διαμορφωτικές αλλαγές στη πρωτεΐνη, η οποία μεταβαίνει από μια ανοιχτή κατάσταση σε μια συμπαγή μετά την ένταξη του μετάλλου. Το παραπάνω γίνεται εμφανές από τις δομές των δύο μορφών της WT-HScol καθώς επίσης και από την ανάλυση των φασμάτων μάζας ESI-MS. Η ανάλυση της διαμόρφωσης με βάση τη φασματοσκοπία ESI-MS βασίζεται στη παρατήρηση ότι, κατά το ιονισμό με ηλεκτροψεκασμό, οι πρωτεΐνες με σταθερή, συμπαγή δομή αποκτούν ένα μικρό εύρος χαμηλών τιμών φορτίου, σε αντίθεση με τις ανοιχτές διαμορφώσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ετερογενή και υψηλά φορτισμένο πληθυσμό. Η κατανομή του φορτίου της Cui(I)P174L-HScol (Int+9/Int+io = 1.6, Σχήμα 64) είναι παρεμφερής με αυτή της apop174l~hscol (Int+9/Int+io = 1.7) και της apowt- HScol (Int+9/Int+io = 1.4), υποδεικνύοντας ότι τα συγκεκριμένα συστήματα.έχουν μια πιο ανοιχτή διαμόρφωση από την Cui(I)WT-HScol. 145

152 «10 ions «9 tons «βίοι* COX1?(3S-S) 6Cu** apo WT-HSco1 A 0 L 0 m / z u* B J J i_ ^ apop174l-hsco1 C 0 L. sj. P174L-HSC01 + 1Cu D 0 } 1 mu DTT h ; Σ χ ή μ α 6 4 : Φ ά σ μ α τ α E S I - M S τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ώ ν P L - H S c o l κ α ι H S c o l w t σ ε a p o κ α ι h o lo μ ο ρ φ ή. Γίνεται φανερό πως σε αυτές τις συνθήκες η δέσμευση του Cu(I) από την P174L-HScol δεν οδηγεί σε σταθερή διαμόρφωση όπως συμβαίνει στην πρωτεΐνη WT. Στο φάσμα HSQC Ή -15Ν της Cui(I)P174L-HScol, 32 αμινοξέα εμφανίζουν δύο ή, σε μερικές περιπτώσεις, τρεις κορυφές ΝΗ, αποτέλεσμα Λ δομικής αστάθειας, η οποία απουσιάζει από τη δομή της Cui(I)WT-HScol (Πίνακας 2). Οι δύο κύριες μορφές βρίσκονται σε βαθμό 60:40. Η σχετική ένταση των συντονισμών των δύο μορφών εξαρτάται από τη θερμοκρασία, υποδεικνύοντας ότι στο σύστημα υπάρχει ισορροπία. t 5.8 Τρισδιάστατη δομή της Cui(I)P174L-HScol Η δομή της Cui(I)P174L-HScol εμφανίζει αναδίπλωση θειρεδοξίνης, όμοια με την WT (Σχήματα 65, 66) με μέση τιμή RMSD της κύριας αλυσίδας 1.30 Α. 146

153 Σ χ ή μ α 6 5 : Τ ρ ι σ δ ι ά ο τ α τ η δ ο μ ή τ η ς C u ( I ) - P L H S c o l Στην έλικα α2 απαντώνται πολλές διπλές διαμορφώσεις στην περιοχή ένταξη*: του μετάλλου, CXXXC, που προκύπτουν μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων που αφορούν τα αμινοξέα Leu ή Pro 174 και Leu 177 (έλικα 11), και Tyr 216 και Phe 220 (έλικα α2). Ενώ στην Cui(I)WT-HScol η Pro 174 σχηματίζει εκτενείς υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις με την Tyr 216 και Phe 220, δημιουργώντας ένα συμπαγές υδροφοβικό τμήμα, στην Cui(I)P174L-HScol η πλευρική αλυσίδα της Leu εμποδίζει την καταλληλότερη, από δομική άποψη, επαφή με τις δύο αρωματικές πλευρικές αλυσίδες και ευνοεί τη δημιουργία διπλών διαμορφώσεων των αρωματικών παράπλευρων αλυσίδων. 147

154 Α μ ι ν ο ξ ύ Τ ι μ έ ς τ α υ τ ο π ο ί η σ η ς Ν ( Η Ν ) F S Τ * Τ Η G * L ' F * G Η L T Q V V D D F ' Τ Α * Ν Υ V T Κ * Ε (7.8 4 )/ (7.78) (8.3 9 )/ (8.54) (9.0 6 )/ (9.27) (9.1 9 )/ (9.36) (8.8 5 )/ (8.89) (8.2 1 )/ (8.13) (8.0 9 )/ (7.98) (9.29)/(9.32) (6.67)/)6.80) (7.3 1 )/ (7.62) (7.27)/(7.49) (8.19)/(8.34) (7.93)/ H 7. 3 (7.99) (7.8 0 )/ (7.80) ( ) / (8.03) ( ) / (7.90) ( ) / (8.79) ( ) / (9.30) (8.7 6 )/ (8.90) (7.1 6 ) / (7.17) ( ) / (8.60) ( ) / (8.80) (7.40) / ( 7.60) (7.43) (7.54) ( ) / (8.48) ( ) / (6.73) ( ) / (6.85) F S L ' V G L * Τ G * Κ * Η * G ( ) / (7.18 ) ( ) / (7.15) ( ) / (6.56) ( ) / (7.91) ( ) / (9.73) ( ) / (9.33) ( ) / (8.81 ), ( ) / (8.07) (8.2 4 ) / (8.29) (7.9 0 )/ (7.92 ) ( ) / (8.82) Π ί ν α κ α ς 2: Α π ο τ ε λ έ σ μ α τ α τ α υ τ ο π ο ίη σ η ς τ ω ν κ ο ρ υ φ ώ ν Ν Η τ η ς C u i ( I ) P L H - S c o l π ο υ ε μ φ α ν ί ζ ο υ ν δ ιπ λ έ ς κ ο ρ υ φ έ ς σ τ ο φ ά σ μ α H S Q C 1Η - 15Ν. Τ = Κ, φ ω σ φ ο ρ ικ ό δ ι ά λ υ μ α 5 0 m M, ρ Η =

155 P174L WT Σ χ ή μ α 66; Τ ρ ισ δ ιά σ τ α τ ε ς δ ο μ έ ς τ ω ν C u i( I) P L - H S c o l κ α ι C u i ( I) W T - H S c o l. Α ) Τ α ά τ ο μ α τ η ς 'κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς π α ρ ισ τ ά ν ο ν τ α ι μ ε τ η μ ο ρ φ ή σ ω λ ή ν α μ ε μ ε τ α β λ η τ ή α κ τίν α / α ν ά λ ο γ η μ ε τ η τ ιμ ή τ ο υ R M S D τ η ς κ ύ ρ ια ς α λ υ σ ίδ α ς γ ια κ ά θ ε α μ ιν ο ξ ύ τ ω ν δ ύ ο π ρ ω τε ϊν ώ ν. Ο ι π λ ε υ ρ ικ έ ς α λ υ σ ίδ ε ς. τ ω ν α μ ιν ο ξ έ ω ν C y s 169/ C y s 173/ H i s κ α ι τ ο ιό ν τ ο υ χ α λ κ ο ύ ( Ι) α π ε ικ ο ν ίζ ο ν τ α ι μ ε κ ίτ ρ ιν ο,. π ρ ά σ ιν ο κ α ι π ο ρ το κ α λ ί/ α ν τ ίσ τ ο ιχ α. Τ α δ ε υ τ ε ρ ο τ α γ ή δ ο μ ικ ά σ τ ο ιχ ε ία ; β -φ ύ λ λ α μ ε κ υ α ν ό κ α ι α- έ λ ικ ε ς μ ε κ ό κ κ ιν ο. (Β ) Σ τ ις δ ο μ έ ς τ ω ν W T κ α ι P L α π ε ικ ο ν ίζ ε τ α ι τ ο π α κ ε τ ά ρ ισ μ α τω ν π λ ε υ ρ ικ ώ ν α λ υ σ ίδ ω ν π ο υ π ε ρ ιλ α μ β ά ν ε ι τ η ν P r o ή τ η L e u (μ ε κ ίτ ρ ιν ο ), T y r κ α ι P h e (μ ε π ρ ά σ ιν ο ). 149

156 H Leu 174 αλληλεπιδρά έντονα μόνο με την Phe 220, και εκτίθεται περισσότερο στο διαλύτη (25%) από την Pro 174 (12%). Η έλλειψη ενός καλά * οργανωμένου υδροφοβικού πυρήνα σε αυτή την περιοχή ένταξης του μετάλλου δημιουργεί διπλές διαμορφώσεις της His 260, στο βρόγχο 8. Για αυτό το λόγο, στο φάσμα 2/ ν η Ή -15Ν HSQC παρατηρούνται δύο διαφορετικοί τύποι (patterns) για τις αρωματικές πλευρικές αλυσίδες της His 260 (Σχήμα 67). Ένα από τα δύο pattern, συμφωνεί με τις μετατοπίσεις που δίνει η His 260 στην Cui(I)WT-HScol, ενώ το άλλο έχει διαφορετικές μετατοπίσεις, αλλά ενδεικτικές της ένταξης του χαλκού διαμέσου του αμιδικού πρωτονίου Νε2 όπως συμβαίνει και στην πρωτεΐνη WT. Σ χ ή μ α 67: Φ ά σ μ α H S Q C Ή - 15Ν π ο υ χ ρ η σ ιμ ο π ο ιή θ η κ ε γ ια τ η ν α ν ίχ ν ε υ σ η τ ω ν 2 J - N H τ ω ν ι σ τ ι δ ι ν ι κ ώ ν δ α κ τ υ λ ίω ν, τ η ς C u ( I ) P L - H S c o l ( κ ό κ κ ιν ο ) κ α ι C u ( I ) W T - H S c o l ( μ α ύ ρ ο ). Η κ α τ α γ ρ α φ ή τ ω ν φ α σ μ ά τ ω ν έ γ ιν ε σ τ ο υ ς Κ κ α ι p H 7.2 σ ε φ α σ μ α τ ο γ ρ ά φ ο ε ξ ο π λ ισ μ έ ν ο μ ε κ ρ ο ο γ ε ν η τ ικ ό υ π ο δ ο χ έ α ( c r y o - p r o b e ) σ τ ο υ ς Μ Η ζ. Τ α α μ ιν ο ξ έ α H i s κ α ι H i s π α ρ ο υ σ ι ά ζ ο υ ν δ ύ ο κ α ι τ ρ ί α p a t t e r n s, α ν τ ίσ τ ο ιχ α, έ ν α ε κ τ ω ν ο π ο ίω ν τ α ιρ ι ά ζ ε ι μ ε α υ τ ό τ η ς W T ( μ α ύ ρ η ε υ θ ε ία γ ρ α μ μ ή ). Στη WT εμφανίζονται αλληλεπιδράσεις ΝΟΕ μεταξύ της His 260 και του μοτίβου CXXXC, γεγονός που δεν παρατηρείται στην P174LHSC01. Μείωση του αριθμού ΝΟΕ παρατηρείται επίσης μεταξύ του βρόγχου 3 (βρόγχος 150

157 ένταξης του μετάλλου) και βρόγχων 5, 7 και 8. Από τη δομική εξέταση, μπορούμε να συμπεράνουμε πως η μετάλλαξη: α) διαταράσσει τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, β) προκαλεΐ διαμορφωτική αταξία γύρω από τη θέση ένταξης του χαλκού. Οι δύο αυτές επιδράσεις έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωση της συγγένειας της πρωτεΐνης για τον χαλκό. * 5.9 Οξειδοαναγωγικές ιδιότητες της P174L-HScol Όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο 2, έχει προταθεί πως ο ρόλος των δύο Cys του μοτίβου CXXXC της οικογένειας των Sco πρωτεϊνών είναι η εμπλοκή τους σε οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις, πιθανόν στην αναγωγή των οξειδωμένων κυστεϊνών στο κέντρο Cua του CcO. Η παραπάνω πρόταση βασίζεται στη διαπίστωση ότι η δομή της HScolwt εμφανίζει αναδίπλωση όμοια με αυτή των θειροδοξινών. Η οξειδωμένη και η ανηγμένη μορφή της apohscol χαρακτηρίζονται από διαφορετικά φάσματα φθορισμού (Σχήμα 68). Οι δύο Tyr (Tyr 163 και 216) κοντά στο μοτίβο ένταξης CXXXC συμβάλλουν κατά πολύ στην μεταβολή του φθορισμού η οποία οφείλεται σε μεταβολή της κατάστασης οξείδωσης της πρωτεΐνης. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας φθορισμού υπολογίστηκε το δυναμικό αναγωγής των δύο κυστεϊνών της WT- και της P174L-HScol όταν αυτές βρίσκονται στην ελεύθερη μορφή τους. Η τιμή του δυναμικού αναγωγής σε ph 7.2 είναι V ± και V ± για την WT-HScol και την P174L-HScol, αντίστοιχα. Η ανθρώπινη θειροδοξίνη χαρακτηρίζεται από παρόμοια τιμή ( V) και ενισχύει την υπόθεση της λειτουργίας της HScol ως θειροδοξίνη130. Οι κοινές τιμές δυναμικού των WT-HScol και P174L-HScol * «V δηλώνουν επίσης ότι η παθογόνος μετάλλαξη δεν επηρεάζει σημαντικά τη.* θερμοδυναμική ισορροπία μεταξύ της οξειδωμένης και ονηγμένης HScol. 151

158 f 1 l ,6 * c 0.4 H e Z tai 0.0 WT- HScol i cs.2 Z P174L-HSco1 1 I i i i -0.2 IE -4 IE [GSH]2/[GSSG] [M] IE-4 IE I T [GSH]2/[GSSG] [M] 1000 Σ χ ή μ α 68: Ο ξ ε ι δ ο α ν α γ ω γ ικ έ ς ιδ ιό τ η τ ε ς τ ω ν W T - H S c o l κ α ι P L - H S c o l. ( A ) Κ α τ α γ ρ α φ ή τ η ς ε κ π ο μ π ή ς φ θ ο ρ ισ μ ο ύ τ η ς W T - H S c o l ( μ α ύ ρ ο ) κ α ι P L - H S c o l (μ π λ ε ) σ ε κ α ν ο ν ικ έ ς σ υ ν θ ή κ ε ς τ η ς ο ξ ε ιδ ω μ έ ν η ς (5 0 m M φ ω σ φ ο ρ ικ ό ρ υ θ μ ισ τ ικ ό δ ιά λ υ μ α, p H 7.0, 0.01 m M G S S G ; δ ι α κ ε κ ο μ μ έ ν η γ ρ α μ μ ή ) κ α ι τ η ς α ν η γ μ έ ν η ς (5 0 m M φ ω σ φ ο ρ ικ ό ρ υ θ μ ισ τ ικ ό δ ιά λ υ μ α, p H 7.0, m M G S H ; σ τ α θ ε ρ ή γ ρ α μ μ ή ) π ρ ω τ ε ΐν η ς μ ε τ ά α π ό δ ιέ γ ε ρ σ η σ τ α n m ; (Β ) Ο ξ ε ι δ ο α ν α γ ω γ ικ ή ισ ο ρ ρ ο π ία τ η ς W T - H S c o l κ α ι P L - H S c o l μ ε δ ια φ ο ρ ε τ ικ ο ύ ς λ ό γ ο υ ς G S H / G S S G. Βέβαια, ο κινητικός ρυθμός της δημιουργίας του δισουλφιδικού δεσμού και η αναγωγή αυτού διαφοροποιείται σημαντικά στις δύο πρωτεΐνες. Η οξείδωση των cys στην apowt-hscol έχει χρόνο ημι-ζωής (half-life time) περίπου 4 ώρες. Η οξείδωση της apop174l-hscol είναι πολύ πιο αργή διαδικασία, αφού μετά από 4 ώρες το 70% της πρωτεΐνης εξακολουθεί να βρίσκεται στην ανηγμένη μορφή (Σχήμα 69). 152

159 Reduced form Oxidized form WT-HScol Time=0 P!74L-HSeol Time=0 Σ χ ή μ α 69: T o π ο σ ο σ τ ό τ η ς ο ξ ε ιδ ω μ έ ν η ς μ ο ρ φ ή ς τ ο υ δ ισ ο υ λ φ ιδ ικ ο ύ δ ε σ μ ο ύ τ η ς a p o W T - H S c o l κ α ι a p o P L - H S c o l ό π ω ς δ ια κ ρ ίν ε τ α ι μ ε η λ ε κ τ ρ ο φ ό ρ η σ η S D S μ ε τ ά α π ό 1 έω ς 5 ώ ρες. Η κατάσταση των δισουλφιδίων προσδιορίστηκε με την ειδική αντίδραση των ελεύθερων ομάδων -SH με το αντιδραστήριο AMS (4- acetairudo^-maleiirddylstilbene-2,2-disulfonic acid). Το συγκεκριμένο αντιδραστήριο καθιστά δυνατό το διαχωρισμό, με ηλεκτροφόρηση σε πήκτη πολυακρυλαμιδίου SDS, σε ταινίες διαφορετικού μοριακού βάρους, της πρωτεΐνης με ελεύθερες ομάδες θειόλης και της πρωτεΐνης της οποίας έχουν οξειδωθεί οι δισουλφιδικοί δεσμοί (To AMS θα δεσμευτεί από τις ελεύθερες ομάδες-sh ). Γίνεται εμφανές, από τη μελέτη του gel, ότι ο βαθμός οξείδωσης της WTHScol είναι πιο γρήγορος συγκριτικά με την P174L-HScol. Μετά από 2 ώρες περίπου, η ταινία που αντιστοιχεί στην ανηγμένη μορφή της P174L- HScol είναι πιο έντονη σε σχέση με αυτή που αντιστοιχεί στην οξειδωμένη μορφή της, πράγμα που δεν παρατηρείται για την WTHScol. Από το αποτέλεσμα αυτό, προκύπτει ότι μετά από τέσσερις ώρες περίπου, οι κυστεΐνες της WTHScol έχουν οξειδωθεί κατά το ήμισυ σε αντίθεση με τις κυστεΐνες της P174L-HScol που συνεχίζουν να βρίσκονται σε ανηγμένη μορφή σε μεγάλο, ποσοστό (>70%), Το φάσμα μάζας MALDI-TOF έδειξε ότι η αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού στην οξειδωμένη apohscol, από 1 mm DTT, πραγματοποιείται, επίσης, σε διαφορετικούς βαθμούς στις δύο πρωτεΐνες (Σχήμα 70). Στην WT- "HScol γίνεται πολύ πιο γρήγορα από ότι στη μεταλλαγμένη HScol. Στην πρώτη, η αναγωγή ολοκληρώνεται μετά από 1 λεπτό, ενώ, για την ίδια 153

160 χρονική περίοδο, μόνο το 20% της οξειδωμένης apop174l-hscol έχει αναχθεί και μετά από 5 λεπτά το επίπεδο αναγωγής βρίσκεται στο 55%. Συνοψίζοντας, * η P174L-HScol έχει το ίδιο δυναμικό οξειδοαναγωγής με την πρωτεΐνη WT, αλλά πιο αργούς ρυθμούς οξείδωσης και αναγωγής. Σ χ ή μ α 7 0 : Α ν α γ ω γ ή τ η ς W T - H S c o l κ α ι P L - H S c o l μ ε D T T. Φ ά σ μ α μ ά ζ α ς M A L D I - T O F τ η ς W T - H S c o l (2.0 μ Μ ) κ α ι P L - H S c o l (2.0 μ Μ ) π ο υ έ χ ο υ ν α ν α χ θ ε ί μ ε 1 m M D T T σ τ ο υ ς 25 C σ ε ρ υ θ μ ισ τ ικ ό δ ι ά λ υ μ α ά λ α τ ο ς α μ μ ω ν ί ο υ 5 0 m M, p H 7.5. Η α ν α γ ω γ ή τ ε ρ μ α τ ίσ τ η κ ε μ ε π ρ ο σ θ ή κ η 5 m M ιω δ ο α κ ε τ α μ ιδ ίο υ. ( A ) W T - H S c o l ; (Β ) W T - H S c o l m M D T T, ε π ώ α σ η 1 m in ; ( C ) P L - H S c o l ; ( D ) P L - H S c o l m M, ε π ώ α σ η 1 m in ; ( E ) P L - H S c o l m M D T T, ε π ώ α σ η 5 m in ; Ο ι α ρ ι θ μ ο ί σ τ ις κ ο ρ υ φ έ ς α ν τ ισ τ ο ιχ ο ύ ν σ τ ις ο μ ά δ ε ς κ α ρ β ο ξ υ α μ ι δ ο μ ε θ υ λ ί ο υ π ο υ σ χ η μ α τ ίζ ε ι η α ν η γ μ έ ν η π ρ ω τ ε ΐν η μ ε τ ο ιω δ ο α κ ε τ α μ ίδ ιο Μεταφορά του χαλκού από την Coxl7 στην HScol Φασματοσκοπία μάζας Μετά το χαρακτηρισμό των δομικών και οξειδοαναγωγικών ιδιοτήτων της P174L-HScol, ερευνήθηκε και αναλύθηκε ο μηχανισμός πρόσληψης του 154

161 χαλκού από τη μεταλλοσυνοδό Coxl7, ο οποίος πιθανόν να επηρεάζεται από τη μετάλλαξη. Για τα πειράματα αλληλεπίδρασης χρησιμοποιήθηκε Coxl7 βοοειδούς η οποία διαφέρει από την ανθρώπινη Coxl7 μόνο στα τέσσερα πρώτα αμινοξέα. Η Coxl7 υπάρχει σε τρεις διαφορετικές καταστάσεις οξείδωσης, οι οποίες παρουσιάζουν διαφορετικές ιδιότητες δέσμευσης του μετάλλου. Σύμφωνα με πειράματα φασματοσκοπίας μάζας η Coxl7 μεταφέρει ένα ιόν χαλκού στην apowt-hscol μόνο όταν βρίσκεται στην ανηγμένη μορφή, Cui(I)Coxl72s-s. Σε οξειδωτικό περιβάλλον, η πλήρως οξειδωμένη μορφή της Coxl7 με τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς (Coxl73s-s) δεν δεσμεύει χαλκό, ενώ παρουσία 1 mm DTT, όπου η Coxl7 είναι μερικώς οξειδωμένη με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς (Coxl72s-s) και δύο ανηγμένες Cys, δεσμεύει ένα ιόν Cu(I) (Cui(I)Coxl72S-s. Σε ακόμη περισσότερο αναγωγικές συνθήκες, η Coxl7 ανάγεται πλήρως, και δεσμεύει 4 ιόντα Cu(I) (Cu4(I)Coxl7 ). Στην πραγματικότητα, οι δύο τελευταίες μορφές της Coxl7 θα μπορούσαν να έχουν το ρόλο της μεταλλοσυνοδού για την HScol. Για να ελεγχθεί η μορφή της Coxl7 όταν μεταφέρει Cu(I) στην WT- HScol, παράχθηκε ένα πρωτεϊνικό μείγμα της Cu4(I)Coxl7 και της C u i ( I ) C o x s -s τ ο οποίο αναμείχθηκε με την ανηγμένη μορφή της apowt- HScol. Τα δεδομένα ESI-MS δηλώνουν ότι η apowt-hscol δεσμεύει ένα ιόν Cu(I) με ταυτόχρονη μείωση της κορυφής που αντιστοιχεί στην C u i ( I ) C o x s s / ενώ η κορυφή της Ciu(I)Coxl7 παραμένει αναλλοίωτη. Στο φάσμα μάζας ESI-TOF το ιόν του φορτίου για την Coxl7 είναι +6 ενώ για την WT-HScol είναι +9 και +10 (Σχήμα 71). 155

162 f C ο x 1 7 WT-HScol m / z Σ χ ή μ α 71: Α λ λ η λ ε π ίδ ρ α σ η τ η ς W T - S c o l μ ε δ ια φ ο ρ ε τ ικ έ ς μ ε τ α λ λ ο μ ο ρ φ έ ς τ η ς C o x l 7. ( Α ) Φ ά σ μ α μ ά ζ α ς E S I - T O F τ ο υ μ ε ί γ μ α τ ο ς C o x l 7 3 S - S, C u l C o x l 7 2 S - S, C u 4 C o x l 7 κ α ι C u 5 C o x l 7 ( σ υ ν ο λ ικ ή σ υ γ κ έ ν τ ρ ω σ η τ η ς C o x l μ Μ ), p H 7.5, 0.5 m M D T T. (Β ) ε π ίδ ρ α σ η τ η ς W T - H S c o l (1.6 μ Μ ) σ τ ο μ ε ί γ μ α C o x l 7 3 S - S, C u l C o x l 7 2 S - S, C u 4 C o x l 7 κ α ι C u 5 C o x l 7. Ο ι α ρ ι θ μ ο ί σ τ ις κ ο ρ υ φ έ ς δ η λ ώ ν ο υ ν τ η σ τ ο ιχ ε ιο μ ε τ ρ ία τ ο υ μ ε τ ά λ λ ο υ τ ο υ σ υ μ π λ ό κ ο υ. Σε ένα επόμενο στάδιο έγιναν με τη τεχνική ESI-MS πειράματα συναγωνισμού ανάμεσα στο Cu(I), στη Coxl72s-s και στο χηλικό DTT όπως έχουν ήδη περιγράφει στη βιβλιογραφία. Τα αποτελέσματα έδειξαν, πως η C ox172s-s δεσμεύει ισχυρά ένα ιόν Cu(I) με τιμή σταθεράς διάσπασης Κυ ίση με 6.4 ± 0.6 χ ΙΟ-15 Μ Φ ασματοσκοπία Π υρηνικού Μ αγνητικοό Συντονισμού Για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της WT-HScol με την Coxl72ss, τιτλοδοτήθηκε η επισημασμένη με 15Ν πρωτεΐνη apowt-hscol με την μη επισημασμένη C u i(i)c o x172s-s- Η τιτλοδότηση συνεχίστηκε μέχρι την αναλογία 1:1. Κατά τη διάρκεια της τιτλοδότησης τα σήματα 15Ν της apowt- HScol εξασθενούν με την σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης της C u i(i)c o x172s-s. Ανάλογα, τα σήματα που αντιστοιχούν στην Cui(I)WT-HScol εμφανίζονται και γίνονται ολοένα και πιο έντονα κατά την διάρκεια της τιτλοδότησης (Σχήμα 72). 156

163 Μ m Σ χ ή μ α 72: Α λ λ η λ ε π ίδ ρ α σ η C u l ( I ) C o x l 7 2 S - S /W T - H S c o l. Υ π έ ρ θ ε σ η τ ω ν φ α σ μ ά τ ω ν 1Η - 15Ν * H S Q C τ η ς ε π ισ η μ α σ μ έ ν η ς σ ε 15Ν a p o W T - H S c o l n p t v τ η π ρ ο σ θ ή κ η τ ο υ χ α λ κ ο ύ ( μ α ύ ρ ο ) κ α ι π α ρ ο υ σ ία ε ν ό ς ισ ο δ ύ ν α μ ο υ C u l ( I ) C o x l 7 2 S - S ( κ ό κ κ ιν ο ) σ ε 5 0 m M φ ω σ φ ο ρ ικ ό δ ιά λ υ μ α, p H 7.2, 1 m M D T T, σ τ ο υ ς Κ. Ο ι υ π ο κ α τ α σ τ ά τ ε ς C y s κ α ι τ α γ ε ιτ ο ν ικ ά α μ ιν ο ξ έ α * α π ε ικ ο ν ίζ ο ν τ α ι. 157

164 ί Στα στάδια της τιτλοδότησης δεν εμφανίστηκαν καινούργιες χημικές * μετατοπίσεις γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν σχηματίζεται κάποιο ενδιάμεσο προϊόν μέχρι να αποκατασταθεί η ισορροπία. Η apowt-hscol φτάνει το 90% της μεταλλοποίησης μετά από προσθήκη ενός γραμμοισοδύναμου της C u i(i)c o x172s-s- Γνωρίζοντας τη τιμή της Κυ για την C u i(i)c o x172s-s, υπολογίζεται ότι η τιμή της Kd για την Cui(I)WT-HScol είναι ~10'17 ή και χαμηλότερη. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι η συγγένεια για τον Cu(I) είναι μεγαλύτερη για την WT συγκριτικά με την μεταλλαγμένη HScol (Κυ = 3.2 ± 0.6 χ ΙΟ13 Μ). Ο χρόνος περιστροφής (correlation time) (13.2 ± 0.9 ns) της WT- HScol σε αναλογία 1:1 με την Cui(I)Cox172s-s δεν είναι μεγαλύτερος από ότι στην apo μορφή ή στην Cui(I)WT-HScol μορφή ( και 14.5 ± 1.1 ns, αντίστοιχα), ενδεικτικό ότι δεν σχηματίζεται κάποιο σύμπλοκο σε ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις. Η μεταφορά του χαλκού μεταξύ της Coxl7 και της HScol είναι αργή στην χρονική κλίμακα των χημικών μετατοπίσεων, θέτοντας ένα ελάχιστο όριο για το λόγο ισορροπίας ( 102 s 1) (υπολογίζεται από τη μικρότερη διαφορά χημικής μετατόπισης μεταξύ της apowt-hscol και Cui(I)WT-HScol που μπορεί να ανιχνευθεί, π.χ * 0.1 ppm στα 800 MHz). Από τη σύγκριση των φασμάτων HSQC 1Η-15Ν της Cui(I)WT-HScol μετά από τη τιτλοδότησή της με Cui(I)Coxl72s-s και της Cui(I)WT-HScol που έχει τιτλοδοτηθεί με σύμπλοκο (Ζυ(Ι)-ακετονιτριλίου (Σχήμα 73) παρατηρούνται αξιοσημείωτες διαφορές. 158

165 ppm Ν ' V ^. / ο * 260 ο φ «Λ ^«* * 243 β / 164» #=- 258 / PPm m Σ χ ή μ α 73: Ε π ίδ ρ α σ η τ η ς C u lc o x l 7 2 s - s σ τ ο φ ά σ μ α τ η ς W T - H S c o l. Υ π έ ρ θ ε σ η τ ο υ φ ά σ μ α τ ο ς H S Q C τ η ς C u ( I ) W T - H S c o l ό τ α ν τ ιτ λ ο δ ο τ ε ίτ α ι μ ε ^ ( Ι ) - α κ ε τ ο ν ο τ ρ ΐ λ ι ο ( μ α ύ ρ ο ) κ α ι μ ε C u l C o x l 7 2 S - S ( κ ό κ κ ιν ο ) σε 5 0 m M φ ω σ φ ο ρ ικ ό ρ υ θ μ ισ τ ικ ό δ ιά λ υ μ α, p H 7.2, 1 m M D T T σ τ ο υ ς Κ. Από τη σύγκριση των δύο φασμάτων προκύπτει ότι αρκετά αμινοξέα (164, 243, 245, 258, και ) κοντά στη θέση ένταξης του χαλκού παρουσιάζουν αλλαγές στις κορυφές ΝΗ. Ορισμένες από αυτές τις κορυφές εξαφανίζονται ενώ άλλες γίνονται ευρείες και κάποιες εμφανίζονται με διπλές διαμορφώσεις κατά την τιτλοδότηση με Cm(I)Coxl72S-s. Είναι προφανές ότι η Coxl7 αλληλεπιδρά παροδικά με την περιοχή αυτή της WT-HScol επιφέροντας διαδικασίες διαμορφωτικών ανταλλαγών των συγκεκριμένων. ΝΗ συντονισμών. Όταν προστέθηκε δείγμα C u i ( I ) C o x s -s στην apop174l-hscol, σε αντίθεση με τη προηγούμενη περίπτωση, δεν παρατηρήθηκε μεταφορά του χαλκού, σε αναλογία 1:1 για το μείγμα Cui(I)Coxl72s-s/P174L-HScol, όπως ' * προκύπτει από το φάσμα HSQC 1Η-15Ν. Αυξάνοντας το λόγο C u i ( I ) C o x s - ^s/p174l-hscol μέχρι και 2:1, η μεταφορά του χαλκού γίνεται αργά στη χρονική κλίμακα χημικής μετατόπισης, αλλά μόνο το 20% της P174L-HScol 159

166 » έχει δεσμεύσει χαλκό. Όπως αναφέρθηκε, η τιμή της σταθερός σχηματισμού του συμπλόκου C u i ( I ) C o x s -s είναι πολύ μεγαλύτερη ( K d = 6.4 ± 0.6 χ ΙΟ-15 ' Μ) από τη τιμή της σταθερός σχηματισμού ( K d = 3.2 ± 0.6 χ ΙΟ'13 Μ) του Cui(I)P174L-HScol. Γίνεται φανερό πως σε αυτή τη περίπτωση, η Coxl72S-s έχει μεγαλύτερη συγγένεια για το ιόν του χαλκού από ότι η πρωτεΐνη P174L- HScol, καθιστώντας δύσκολη την πλήρη μεταλλοποίηση της δεύτερης. Τα αποτελέσματα NMR υποστηρίζονται και από τα πειράματα ESI- MS, τα οποία έδειξαν πως με προσθήκη περίσσιας apocoxl72s-s, ο λόγος apowt-hscol/cui(i)wt-hscol δεν μεταβάλλεται (Σχήμα 74 a,b,c), υποδηλώνοντας ότι το ιόν του Cu(I) δεσμεύεται με μεγαλύτερη συγγένεια στην HScol από ότι στην Cui(I)Coxl72s-s COX17 W T-HSco1 +7 ions +6 ions +5 ions +fo ions +9 ions Σ χ ή μ α 74: Η ε π ί δ ρ α σ η τ η ς C o x l 7 σ τ η ν τ ι τ λ ο δ ό τ η σ η τ η ς S c o l μ ε ι ό ν τ α C u ( I). Φ ά σ μ α μ ά ζ α ς E S I - T O F τ η ς W T - H S c o l μ ε σ ύ μ π λ ο κ ο C u ( I ) D T T ή C u l ( I ) C o x l 7 2 S - S, p H 7.5. ( A ) W T - H S c o l (0.8 μ Μ ) + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο τ ο υ C u ( I ) π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D I T ; (Β ) W T - H S c o l (0.8 μ Μ ) + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C u ( I ) + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C o x l 7 2 S - S π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T ; ( C ) W T - H S c o l (0.8 μ Μ ) + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C u ( I ) + 3 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C o x l 7 2 S - S π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T ; ι ο ν τ ι κ ό φ ο ρ τ ίο + 9 κ α ι γ ι α τ η ν W T - H S c o l κ α ι + 5, + 6, + 7 γ ια τ η ν C o x l 7 2 S - S. Ο ι α ρ ι θ μ ο ί σ τ ις κ ο ρ υ φ έ ς δ η λ ώ ν ο υ ν τ η σ τ ο ιχ ε ιο μ ε τ ρ ία τ ο υ μ ε τ ά λ λ ο υ σ τ ο σ ύ μ π λ ο κ ο. 160

167 Περαιτέρω πειράματα ESI-MS υποστηρίζουν ότι ακόμη και με προσθήκη 10 mm DTT δεν αποσπάται ο Cu(I) από την Cui(I) WT-HScol, ενώ αρκούν μόνο 5 mm DTT για να δεσμεύσουν το 40% του χαλκού από την C u i(i)c ox172s-s. Επομένως, η Coxl72s-s δεν συναγωνίζεται με τη ν WT-HScol για τα ιόντα Cu(I) αλλά αντίθετα συνεισφέρει στην μεταλλοποίηση της WT- HScol, όπως προκύπτει από το φάσμα ESI-Ms όπου φαίνεται ότι η Coxl72s-s * μετατοπίζει την ισορροπία προς το μέρος της μορφής Cui(I)HScol. Τα φάσματα ESI-MS έδειξαν επίσης, πως απουσία του μετάλλου οι πρωτεΐνες WT-HScol και Coxl7 δεν δημιουργούν σόμπλοκο. Παρόλα αυτά, εμφανίζονται δύο μικρές κορυφές στο φάσμα, παρουσία ενός χ γραμμοισοδυνάμου του Cu(I), (Σχήμα 75) που αντιστοιχούν σε μοριακές μάζες των και Da δηλαδή στις θεωρητικές τιμές των μοριακών βαρών των συμπλοκών WT-HScol/Cui(I)/Coxl72s-s και WT- HScol/Cu2(I)/Coxl72s-s ( και Da, αντίστοιχα). (ft c Φ 5 0 Complexes +11 ions Cu1WT-HScq1 WT-HScol + C o x Cu(l) D I i! ns 1 mm DTT 288 Complexes +10 ions ' Wt,.L m / z 2700 Σ χ ή μ α 7 5 : Π ρ ο ο δ ιο ρ ισ μ ό ς τ ω ν π ρ ω τ ε ϊν ικ ώ ν σ υ μ π λ ο κ ώ ν σ τ ο μ ε ί γ μ α C o x l 7 2 S - S (2.4 μ Μ ) + C u ( I ) (2.4 μ Μ ) + W T - H S c o l (2.4 μ Μ ) π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T., Η ένταση των κορυφών αυτών είναι πολύ μικρή και επομένως η δημιουργία των συμπλοκών αυτών είναι παροδική. Η παραπάνω υπόθεση συμφωνεί με τα αποτελέσματα NMR τα οποία έγιναν σε συγκεντρώσεις mm. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα ESI-MS δείχνουν πως η WT- 'HScol/Cui(I)/Coxl72S-s αποτελεί το ενδιάμεσο προϊόν στη μεταφορά του χαλκού από την Cui(I)Coxl72S-s στην WT-HScol. 161

168 Όπως φαίνεται στο παρακάτω φάσμα ESI-MS η προσθήκη μέχρι και 3 γραμ/μω ν της Coxl72s-s δεν βελτιώνει την μεταλλοποίηση της P174L-HScol * (Σχήμα 76), σε αντίθεση με ότι συμβαίνει στην πρωτεΐνη WT. «10 ions «9 Ions *8 ions έ 0 L 0 K 0 w L. 0. L 0 apo WT-HScol A WT-HScol + 1Cu* 1 1 rn M DT T apop174l-hsco1 «i - J P174L*HSC01 1 Cu* D 0 f mm D T T B C - j L P174L-HSC01 1 C u * 3COX17 E mm D T T L m..... : / Z Σ χ ή μ α 76: Δ έ σ μ ε υ σ η τ ω ν ιό ν τ ω ν χ α λ κ ο ύ σ τ η ν S c o l κ α ι σ τ η ν P L S c o l. Φ ά σ μ α E S I - T O F τ η ς W T - H S c o l (0.8 μ Μ ) κ α ι P L - H S c o l (1.2 μ Μ ) μ ε σ υ μ π λ ο κ ο C u ( I ) D T T ( A ) a p o W T - H S c o l ; ( B ) W T - H S c o l + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ό ν α μ ο C u ( I ) π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T ; ( C ) a p o P L - H S c o l ; ( D ) P L - H S c o l + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C u ( I ) π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T ( E ) P L - H S c o l + 1 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ ο C u ( I ) + 3 γ ρ α μ μ ο ΐ σ ο δ ύ ν α μ α C o x l7 2 s - s π α ρ ο υ σ ία 1.0 m M D T T 1.0 m M D T T. 162

169 ΊΰΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΖΫΜΠ <ΡΑ<Σ!ΜΜΑ *1 % ' ' **<. ν, >>? f

170 6.1 Βιολογική συνέπεια και συμπεράσματα Η ενσωμάτωση του χαλκού στο CcO είναι βιολογικά κρίσιμης σημασίας. Αποτελεί, όμως, μία πολύπλοκη διαδικασία, η οποία ρυθμίζεται εξαιρετικά αυστηρά και απαιτεί την ύπαρξη ενός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών, καθεμία από τις οποίες διαδραματίζει, στις περισσότερες των περιπτώσεων, έναν αναντικατάστατο ρόλο. Η επιστημονική γνώση, σχετικά με αυτές τις διαδικασίες, είναι ακόμη σε εμβρυακό στάδιο. Επομένως, για να έχουμε μία συνολική περιγραφή των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παράδοση του χαλκού στο CcO, έχει διενεργηθεί μία ευρεία γονιδιακή έρευνα στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, η οποία αναζητά ακολουθίες που να εμφανίζουν κάποια ομοιότητα με τα ανθρώπινα γονίδια Coxl7, Scol/2 και C oxll, και επεκτάθηκε η ανάλυση αυτή στα γονίδια που βρίσκονται κοντά στις εν λόγω πρωτεΐνες. Διαπιστώθηκε ότι, ενώ το C oxll είναι ιδιαίτερα δικτυωμένο μέσα στα πλαίσια της συναρμολογητικής υποομάδας του CcO και πιθανότατα εκπληρώνει μια μονοσήμαντη λειτουργία στη διάθεση του χαλκού στο κέντρο Λ CuB, η ποικιλία στον αριθμό και στον εντοπισμό των γονιδίων Sco υποδηλώνει ότι, οι σχετιζόμενες πρωτεΐνες, θα μπορούσαν να έχουν πολυ- λειτουργικές ιδιότητες και θα μπορούσαν να εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες. Κατά την ανάλυση αυτή παρατηρήθηκε ότι υπάρχει ένας ισχυρός συσχετισμός ανάμεσα στα γονίδια Sco και στην οξειδοαναγωγική ομοιόσταση, αλλά και στην ομοιόσταση του χαλκού. Η δομή της Sco παρουσιάζει πράγματι μια θειοοξειδοαναγωγική πτυχή και μια θειολο-δισουλφιδική οξειδοαναγωγική λειτουργία, η οποία προορίζεται για την πρωτεΐνη αυτή. Επομένως, η Sco, πέρα από τον τεκμηριωμένο ρόλο που διαδραματίζει στη μεταφορά του χαλκού στο κέντρο του CuA, ίσως να σχετίζεται και με τη αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών της πρωτεΐνης- εταίρου Cox2 που προηγείται της δέσμευσης του χαλκού. Η ύπαρξη δύο παραλόγων Sco στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Scol και Sco2), μπορεί να 164

171 * αιτιολογηθεί λογικά υπό το πρίσμα της ανάλυσης γονιδιωματικού περιεχομένου των προκαρυωτικών παραλόγων: ένα γονίδιο Sco μπορεί κατά προτίμηση να αλληλεπιδρά με την υποομάδα Cox2 του CcO, και συνεπώς να βοηθά στη συναρμολόγηση του CcO, ενώ το δεύτερο γονίδιο μπορεί να βοηθά τη μεταλλοσυνοδό Coxl7, η οποία είναι υπεύθυνη για τη συλλογή του χαλκού στο διαμεμβρσνικό πεδίο των μιτοχονδρίων. Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή, είναι πιθανόν τα δύο ευκαρυωτικά παράλογα ( ομόλογα γονίδια που προέρχονται από κοινό πρόγονο αλλά τείνουν να έχουν διαφορετικές λειτουργίες) Sco να αλληλεπιδρούν, προκειμένου να προωθήσουν την εισαγωγή του χαλκού στο κέντρο CuA. Σε παρόμοια συμπεράσματα καταλή^αμε και για τα ανθρώπινα γονίδια Sco, μέσω πειραματικών προσεγγίσεων. Βιβλιογραφικά δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η εισαγωγή του χαλκού στο κέντρο CuA της υποομάδας Cox2, δεν είναι μια παθητική μεταφορά του χαλκού από τη Coxl7 στις πρωτεΐνες των γονιδίων Scol/2 και τελικά στη μεταφορά του χαλκού στο Cox2, αλλά αρκετές οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις συνδέονται εσωτερικά με τη διαδικασία της μεταφοράς του χαλκού. Η δομή των μεταλλοσυνοδών του μετάλλου και η ανάλυση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών είναι κρίσιμης σημασίας για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού εισχώρησης του χαλκού στο CcO, μέσω του γονιδίου Sco. Τα αποτελέσματα του πρώτου μέρους της διατριβής αυτής δείχνουν ότι η HSco2: 1) έχει αναδίπλωση θειρεδοξίνης, όπως και η ομόλογή της HScol και 2) έχει όμοιες οξειδοαναγωγικές ιδιότητες και χαρακτηριστικά δέσμευσης,. με την HScol. Η HSco2 εμφανίζει παρόλα αυτά μια μεγαλύτερη ευελιξία στη δομή και εσωτερική δυναμική αταξία από ότι η HScol. Το παραπάνω γίνεται περισσότερο εμφανές στην apo μορφή της, η οποία παρουσιάζει πολλαπλές -διαμορφώσεις. Οι δομές των δύο πρωτεϊνών εμφανίζουν μια ομοιότητα στη συνολική δομή τους αλλά υπάρχουν κάποιες καίριες διαφορές σε θέσεις 165

172 κλειδιά του βιομορϊου. Για παράδειγμα υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και δεσμοί υδρογόνου ή ιοντικές γέφυρες εμφανίζουν σημαντικές διαφορές στις δύο πρωτεΐνες. Οι διαφορετικές ιδιότητες δυναμικής στη HSco2 ίσως παίζουν σημαντικό ρόλο στη μοριακή αναγνώριση από άλλους πρωτεϊνικούς "συντρόφους". Ο λειτουργικός ρόλος του παραλόγου της πρωτεΐνης HSco2 και η οξειδοαναγωγική λειτουργία της οικογένειας των πρωτεϊνών Sco, δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Επομένως, είναι απαραίτητο να γίνουν και άλλες μελέτες, προκειμένου να διαφωτιστεί ο μηχανισμός συναρμολόγησης του CcO. Το επόμενο βήμα θα είναι η διερεύνηση των δομικών και βιοχημικών ιδιοτήτων της HSco2. Επιπλέον, προς το παρόν δε γνωρίζουμε τίποτα σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο οι δύο κυστεϊνες του μοτίβου CXXXC του HScol/2 ανάγονται, πριν από τη μεταφορά του χαλκού από το Coxl7. Συνεπώς μελλοντικά θα διενεργηθούν κάποιες μελέτες σχετικά με την αλληλεπίδραση μεταξύ των HScol/HSco2 και HCoxl7, τόσο σε αναγωγικό, όσο και σε οξειδοτικό περιβάλλον. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας, δείξαμε πως η μετάλλαξη P174L στην ακολουθία HScol επηρεάζει σημαντικά τις οξειδοαναγωγικές ιδιότητες και την ικανότητα δέσμευσης του μετάλλου από την πρωτεΐνη. Μελέτες ESI-MS και NMR, σχετικά με την αλληλεπίδραση των HScol και Coxl 7, έδειξαν ότι η Cul(I)-HCoxl72S-S είναι σε θέση να μεταφέρει αποτελεσματικά Cu(I) στην apowt-hscol, αλλά όχι στην apop174l-hscol. Επιπλέον, η οξείδωση και οι ρυθμοί αναγωγής του δισουλφιδικού δεσμού τηςηιεταλλαγμένης πρωτεΐνης είναι πιο αργοί από εκείνους της πρωτεΐνης ελεύθερου τύπου. Ο θειοοξειδοαναγωγικός ρόλος της HScol, (που προορίζεται για να διατηρεί το κέντρο CuA, που λαμβάνει το χαλκό, σε ανηγμένη κατάσταση), διαταράσσεται σημαντικά, καθώς η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη δε μπορεί να ανάγει τις κυστεϊνες που δεσμεύουν το χαλκό στο πεδίο CuA του CcO με τον ίδιο ρυθμό με τη wt. Γενικά, αυτές οι μεταβολές στη δέσμευση του χαλκού και στις οξειδοαναγωγικές ιδιότητες της HScol, που προκαλούνται από τη μετάλλαξη, 166

173 μ π ο ρ ο ύ ν ν α μειώ σουν σε μ εγά λ ο βαθμό τη ν α ποτελεσματικότητα της μεταφοράς του χα λκ ο ύ α π ό τη ν C u l(i)h S c o l στο π εδ ίο C u A του CcO. Ό λ α αυτά τα δ εδ ο μ ένα επ ιβ εβ α ιώ νουν τ ο ν π ο λ υ -λειτουργικ ό ρ ό λ ο της H S c o l, η ο π ο ία μ π ορεί ν α λειτουργήσει, τα υ τ ό χρ ο να, ως σ υ ν ο δ ό ς του χ α λ κ ο ύ κ α ι ως θειοοξειδ οανα γω γικ ός π α ρ ά γ ο ντα ς, κ α τά τη ν εισχώ ρηση του χ α λ κ ο ύ στο πεδίο C ua. Τ α α ποτελέσματά της π α ρ ο ύ σ α ς δια τριβή ς π α ρ έ χ ο υ ν επίσης μ ια λεπτομερή α νά λυση της α λλη λεπ ίδρασης της H S c o l με τη ν C o x l7 και δ είχ νο υ ν π ώ ς επηρεάζεται αυτή α π ό τη ν μετάλλαξη στη θέση 174. Τα δεδομ ένα ESI-MS α π ο δ εικ νύ ο υ ν ότι η C u i ( I ) C o x S - s, α λ λ ά ό χ ι η C u 4 ( I ) C o x 1 7, μεταφέρει το ιό ν του χ α λ κ ο ύ (I) σ τη ν apow T -H S col. Στη δια δικ α σία αυτή εμ φ α νίζετα ι έν α π ο λ ύ μ ικ ρ ό π ο σ ο σ τό σ υ μ π λόκ ου W T- H S c o l/c u i(i)/c o x l7 2 s-s, το ο π ο ίο α π οτελεί έ ν α π ιθ α ν ό ενδ ιά μ εσ ο βήμα στη μετα φ ορά του χα λ κ ο ύ α π ό τη ν C u i ( I ) C o x s -s σ τη ν ap ow T -H S col. Η παροδική αυτή ενδιάμεση κατάσταση επ ιτρ έπ ει στη W T -H S col ν α π εράσει α π ό μ ια α νοιχτή σε μ ια κλειστή δια μ όρ φ ω ση, σ τη ν ο π ο ία μ π ο ρ εί ν α δεσμεύσει με μεγάλη σ υ γ γ ένεια το μ έτα λλο (Σ χή μ α 77). «167

174 Apo-HSco1 Cu(l)-Cox17 WT Cu(l)-HSco1 KD~ KD~ Σ χ ή μ α 77: Ε π ίδ ρ α σ η τ η ς μ ε τ ά λ λ α ξ η ς P L - S c o l σ τ η μ ε τ α φ ο ρ ά τ ο ο χ α λ κ ο ύ α π ό τ η ν C o x l 7. Η π α θ ο γ ό ν ο ς μ ε τ ά λ λ α ξ η P L, δ ί π λ α σ τ η π ε ρ ιο χ ή έ ν τ α ξ η ς τ ο ο μ ε τ ά λ λ ο υ, κ α θ ο ρ ίζ ε ι τ η μ ε ίω σ η τ η ς α π ο τ ε λ ε σ μ α τ ικ ό τ η τ α ς τ η ς μ ε τ α φ ο ρ ά ς τ ο ο χ α λ κ ο ύ α π ό τ η ν μ ε τ α λ λ ο σ υ ν ο δ ό C o x l 7 σ τ η S c o l. Η μ ετα λ λ α γ μ ένη π ρ ω τεΐνη συμπερκρέρεται δια φ ορ ετικ ά. Η δια μ ο ρ φ ω τικ ή α τα ξία π ο υ εμ φ α νίζετα ι στη δομ ή της C ui(i)p 174L -H Scol ο δ η γ εί σε ασθενέστερη δέσμευση το υ μ ετά λ λ ο υ κ α ι η C oxl72s-s α δ υ να τ εί ν α βοη θήσει στη δ η μ ιο υ ρ γ ία μ ια ς σ τα θερή ς σ υ μ π α γ ο ύ ς δ ια μ όρφ ω σ η ς της P174L- H S c o l. Σ υ μ π ερ α ίνο υ μ ε, π ω ς η μ ετά λλα ξη P174L εξα σ θενεί τ η ν ικ α νό τη τα δέσ μ ευσης του χ α λ κ ο ύ α λ λ ά κ α ι δ ια φ ο ρ ο π ο ιεί τις ο ξειδ ο α να γω γικ ές ιδιότητες τη ς H S c o l, ο ι ο π ο ίες εμ π λ έκ ο ν τα ι ά μ εσ α στη μ ετα φ ο ρ ά του χ α λ κ ο ύ κ α ι τω ν ή λ εκ τ ρ ο ν ίω ν α π ό τ η ν C o x l7 σ το κ έντρ ο C ua της COXII. 168