ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΚΟΚΚΙΝΟΥ ΡΥΖΙΟΥ (Oryza sativa L.) ΓΙΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΙΜΑΖΑΜΟΧ ΗΛΙΑΝΑ Δ. ΣΙΕΚΡΗ Πτυχιούχος γεωπόνος Α.Π.Θ. Επιβλέπων καθηγητής: Ηλίας Γ. Ελευθεροχωρινός ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θεσσαλονίκη

2 ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΚΟΚΚΙΝΟΥ ΡΥΖΙΟΥ (Oryza sativa L.) ΓΙΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΙΜΑΖΑΜΟΧ ΗΛΙΑΝΑ Δ. ΣΙΕΚΡΗ Πτυχιούχος γεωπόνος Α.Π.Θ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Γεωπονίας Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Τριμελής Eξεταστική Επιτροπή Ηλίας Ελευθεροχωρινός, επιβλέπων καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Γρηγόριος Διαμαντίδης, καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Χρήστος Δόρδας, αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. 2

3 Ηλιάνα Σιέκρη ΑΠΘ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΚΟΚΚΙΝΟΥ ΡΥΖΙΟΥ (Oryza sativa L.) ΓΙΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΙΜΑΖΑΜΟΧ «Η έγκριση της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής από τη Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν.5343/1932 άρθρο 202, παρ. 2) 3

4 Ευχαριστίες Επιθυμώ να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στο Δάσκαλό μου, καθηγητή του Τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ) κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό, για την αμέριστη συμπαράσταση που έδειξε στην προσπάθειά μου να εκπονήσω την μεταπτυχιακή μου διατριβή. Ειδικότερα, τον ευχαριστώ για την ανάθεση, το σχεδιασμό και την εποπτεία των πειραμάτων, την βοήθειά του κατά την ερμηνεία των δεδομένων, καθώς επίσης και για τις πολύτιμες οδηγίες και υποδείξεις κατά τη διάρκεια της συγγραφής αυτής της εργασίας, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την πληρότητά της ως προς το περιεχόμενο, τη δομή και την παρουσίασή της. Ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή του ΑΠΘ κ. Γρηγόριο Διαμαντίδη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Χρήστο Δόρδα, μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις πολύτιμες υποδείξεις και τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων, αλλά και για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Επίσης, εκφράζονται ευχαριστίες στον ερευνητή του Ινστιτούτου Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών του ΕΚΕΤΑ κ. Παναγιώτη Μαδέση για τις πολύτιμες υποδείξεις του κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων και για την φιλοξενία στο Εργαστήριο, καθώς επίσης και στον επίκουρο καθηγητή κ. Γεώργιο Μενεξέ για την καθοδήγηση κατά την στατιστική ανάλυση των δεδομένων. Θα ήθελα ιδιαιτέρως να ευχαριστήσω τους γονείς μου, Δημήτρη και Αργυρώ Σιέκρη, για την αμέριστη συμπαράσταση και για τη συνεχή τους ενθάρρυνση καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής αλλά και για την οικονομική στήριξη που μου παρείχαν. Εκφράζονται επίσης θερμές ευχαριστίες στους υποψήφιους διδάκτορες Συμέλα Ντοανίδου και Γρηγόριο Μοράκη για την καθοδήγηση στα πειράματα εργαστηρίου και την αμέριστη βοήθεια κατά την εκτέλεση των πειραμάτων στο αγρόκτημα του ΑΠΘ, αντίστοιχα. Ευχαριστώ θερμά τις συναδέλφους και φίλες Νικολέττα Καλίτσου και Βασιλική Ταγκούλη για την ειλικρινή συναδελφική αλληλεγγύη, την ευγενική συνεργασία και την συμπαράστασή τους κατά την εκπλήρωση του κοινού μας στόχου καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής. 4

5 Τέλος ευχαριστώ τον συνάδελφο Γεώργιο Ελευθεροχωρινό και την προπτυχιακή φοιτήτρια Χρύσα Θεοφυλίδου για την πολύτιμη βοήθεια κατά την εγκατάσταση των πειραμάτων, καθώς επίσης και το Ινστιτούτο Τεχνολογίας και Έρευνας (ΙΤΕ) για την μερική χρηματοδότηση των πειραματικών εργασιών (Πρόγραμμα ΘΑΛΗΣ). 5

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σε πειράματα φυτοδοχείων αξιολογήθηκαν οκτώ πληθυσμοί κόκκινου ρυζιού (Oryza sativa L.), μία ευαίσθητη (cv. Ολυμπιάδα) και μία ανθεκτική στο imazamox ποικιλία ρυζιού τύπου Clearfield (cv. Sirio), ως προς την ανθεκτικότητα στο imazamox. Επίσης, για τη μοριακή βάση της ανθεκτικότητας του κόκκινου ρυζιού χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της αλληλούχησης τμήματος του als γονιδίου, καθώς και η in vitro δράση του ενζύμου ALS παρουσία ή απουσία του imazamox. Οι οκτώ πληθυσμοί του κόκκινου ρυζιού προέρχονταν από ορυζώνες του Νομού Θεσσαλονίκης, όπου η εφαρμογή του imazamox είχε μειωμένη αποτελεσματικότητα. Τα δεδομένα των φυτοδοχείων έδειξαν ότι η εφαρμογή 4 g δ.ο. imazamox/στρ προκάλεσε μεγαλύτερη από 50% μείωση του νωπού βάρους τριών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού, ενώ για την κατά 50% μείωση του νωπού βάρους (τιμές GR 50 ) πέντε πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ποικιλίας Clearfield χρειάστηκαν 6-64 g δ.ο. imazamox/στρ. Η αλληλούχηση του als γονιδίου έδειξε ότι η ανθεκτικότητα των πέντε πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ποικιλίας Clearfield οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη του als γονιδίου, η οποία είχε ως συνέπεια την έκφραση ενζύμου ALS με αντικατάσταση του αμινοξέος σερίνη στη θέση 653 από ασπαραγίνη (Ser653-Asn) και του αμινοξέος βαλίνη στη θέση 679 από μεθειονίνη (Val679-Met) στην πολυπεπτιδική αλυσίδα του ενζύμου ALS. Οι ίδιες αντικαταστάσεις ανιχνεύτηκαν και στην ποικιλία Clearfield, γεγονός που ισχυροποιεί την πιθανότητα ότι η ανθεκτικότητα του κόκκινου ρυζιού οφείλεται σε ροή του μεταλλαγμένου als γονιδίου από την ποικιλία Clearfield. Η in vitro δράση του ενζύμου ALS έδειξε ότι οι τιμές Ι 50 (δόση imazamox για αναστολή της δράσης του ενζύμου κατά 50%) για τους ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού ήταν και μm imazamox, αντίστοιχα. Η υπολογισθείσα ένταση ανθεκτικότητας (R/S = Ι 50 ανθεκτικού/ι 50 ευαίσθητου) κυμάνθηκε από 45 έως 400. Τα αποτελέσματα των τριών μεθόδων δείχνουν ότι η ανθεκτικότητα των τεσσάρων πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού στο imazamox, η οποία οφείλεται σε ροή του μεταλλαγμένου als γονιδίου από την ποικιλία Clearfield (Sirio). 6

7 SUMMARY Eight red rice (Oryza sativa L.) populations, one susceptible (cv. Olympiada) and one resistant to imazamox rice variety ( Clearfield, cv. Sirio) were evaluated in pot experiments for possible development of resistance to imazamox. Additionally, the sequencing of an als gene fragment and the in vitro ALS enzyme activity assay were used to evaluate the molecular basis of red rice resistance. The red rice populations were originated from rice fields in Thessaloniki, where the application of imazamox failed to control effectively red rice. The pot experiments showed that 40 g ai imazamox/ha caused a greater than 50% fresh weight reduction on three red rice populations and the susceptible rice variety, while g ai imazamox/ha were needed for a 50% fresh weight reduction (GR 50 values) of five red rice populations and Clearfield variety. The als gene sequencing revealed that the observed resistance of the five red rice populations and the Clearfield variety is attributed to a point mutations of the ALS enzyme and particularly on codon 653 leading to substitution of serine (TCT)) by asparagine (AAG) and of valine (GTG) at position 679 by methionine (ATG). The same substitutions were detected in Clearfield variety, which suggests that the red rice resistance was due to mutant ALS gene flow from the Clearfield variety. The in vitro ALS enzyme activity showed that the I 50 values (imazamox dose for 50% inhibition of the enzyme activity) for the susceptible and the resistant red rice populations were μm imazamox and μm imazamox, respectively. The calculated resistance factor (R/S= I 50 resistant/i 50 susceptible) ranged from 45 to 400. These findings indicate that the insufficient control of the putative resistant red rice populations with imazamox was due to targetsite resistance and particularly due to a point mutation at the Ser653 codon, which is positively identified as having been derived from the Clearfield (Sirio) rice cultivar. 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες... 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 SUMMARY Εισαγωγή Γενική εισαγωγή Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Σκοπός εργασίας Πειράματα φυτοδοχείων για διερεύνηση ανθεκτικότητας κόκκινου ρυζιού στο imazamox Εισαγωγή Βιολογία ρυζιού και κόκκινου ρυζιού Αντιμετώπιση κόκκινου ρυζιού Ανθεκτικότητα ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα Ορισμοί-Ορολογία Διεθνή δεδομένα ανθεκτικότητας ζιζανίων Ανθεκτικότητα ζιζανίων στην Ελλάδα Μηχανισμοί ανθεκτικότητας ζιζανίων Παράγοντες εξέλιξης της ανθεκτικότητας ζιζανίων Πειραματικές εργασίες Σκοπός της εργασίας Υλικά και μέθοδοι Συλλογή φυτικού υλικού Πειράματα φυτοδοχείων Αποτελέσματα και συζήτηση Συμπεράσματα Γονιδιακή και βιοχημική βάση της ανθεκτικότητας οκτώ πληθυσμών κόκκινου ρυζιού στο imazamox Εισαγωγή Δομή του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) Δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) Βιοχημική βάση της πρόσδεσης ζιζανιοκτόνων στο ένζυμο ALS Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστoλείς της δράσης του ενζύμου ALS

9 Τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS Ενίσχυση αλληλομόρφων γονιδίων με τεχνικές αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης Πειραματικές εργασίες Αξιολόγηση της γενετικής βάσης της ανθεκτικότητας σε οκτώ πληθυσμούς κόκκινου ρυζιού Σκοπός της εργασίας Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Απομόνωση, ενίσχυση και αλληλούχηση τμήματος του als γονιδίου Αποτελέσματα και συζήτηση Συμπεράσματα Αξιολόγηση της in vitro δράσης του ενζύμου ALS στην παρουσία του imazamox Σκοπός εργασίας Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Εκχύλιση ενζύμου In vitro δράση του ενζύμου ALS Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα και συζήτηση Συμπεράσματα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (Α. APPENDIX) ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (Β. APPENDIX)

10 1. Εισαγωγή 1.1. Γενική εισαγωγή Το κόκκινο ρύζι (Oryza sativa f. spontanea), το οποίο ανήκει στο ίδιο είδος με το καλλιεργούμενο ρύζι (Oryza sativa L.), συγκαταλέγεται μεταξύ των δέκα σημαντικότερων ζιζανίων παγκοσμίως (Avila κ.ά., 2004). Αυτό αποτελεί σοβαρό πρόβλημα στις καλλιέργειες του ρυζιού διότι προκαλεί σημαντική μείωση της απόδοσης και υποβάθμιση της ποιότητας του παραγόμενου προϊόντος. Σύμφωνα με έρευνες στις ΗΠΑ, το κόκκινο ρύζι είναι πολύ ανταγωνιστικό ζιζάνιο και αρκούν 4 φυτά/m 2 για να προκαλέσουν μείωση στην απόδοση του ρυζιού κατά 5-40% (Busconi κ.ά., 2012). Στην χώρα μας και ειδικότερα στη Βόρεια Ελλάδα, το κόκκινο ρύζι θεωρείται ένα από τα σημαντικότερα ζιζάνια της καλλιέργειας του ρυζιού μετά τη μουχρίτσα (Echinochloa spp.) και τη μοσχοκύπερη (Cyperus difformis). Η αποτελεσματική αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού κρίνεται αναγκαία διότι η συνεχιζόμενη εξάπλωσή του μπορεί να επιφέρει σημαντικά προβλήματα στην καλλιέργεια του ρυζιού. Η αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού ήταν και εξακολουθεί να είναι ένα δύσκολο εγχείρημα έως και σήμερα, αφού, όπως προαναφέρθηκε, παρουσιάζει γενετικές και φυσιολογικές ομοιότητες με το καλλιεργούμενο είδος (Andres κ.ά., 2014). Η αποτελεσματική αντιμετώπιση αυτού του ζιζανίου κατέστη δυνατή με τη χρήση ζιζανιοκτόνων της οικογένειας των ιμιδαζολινονών, τα οποία αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS, αλλά μόνον σε ποικιλίες καλλιεργούμενου ρυζιού τύπου Clearfield που δημιουργήθηκαν με τεχνικές της κλασικής βελτίωσης και χαρακτηρίζονται για την ανθεκτικότητα τους στα προαναφερθέντα ζιζανιοκτόνα. Η ανακάλυψη των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS συνέβαλε στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες παγκοσμίως (Tranel κ.ά., 2002). Ειδικότερα οι ιμιδαζολινόνες, συνέβαλαν στην εκλεκτική αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού και άλλων ζιζανίων της καλλιέργειας του ρυζιού. Βέβαια, ο εφησυχασμός των παραγωγών παγκοσμίως από την ικανοποιητική αντιμετώπιση των ζιζανίων του ρυζιού με τη χρήση των ιμιδαζολινονών και η ως εκ τούτου συνεχής χρήση τους, χωρίς να λαμβάνεται μέριμνα για εναλλαγή ζιζανιοκτόνων διαφορετικού μηχανισμού δράσης, οδήγησε στην εμφάνιση ανθεκτικών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και άλλων ζιζανίων εντός της καλλιέργειας του ρυζιού. Το ίδιο συνέβη και στη χώρα μας, δηλαδή εμφάνιση 10

11 ανθεκτικών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού, μουχρίτσας και μοσχοκύπερης (Kaloumenos κ.ά., 2012; 2013; Ντοανίδου, 2014), γεγονός που οδήγησε στην εκπόνηση της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Το σημαντικότερο πρόβλημα της επιστήμης της ζιζανιολογίας θεωρείται η ανάπτυξη ανθεκτικών πληθυσμών ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα, αφού η ύπαρξη τέτοιων πληθυσμών περιορίζει την επιλογή ζιζανιοκτόνων για την αντιμετώπισή τους. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, η μειωμένη αποτελεσματικότητα ενός ζιζανιοκτόνου λόγω εμφάνισης ανθεκτικών πληθυσμών ζιζανίων, σε συνδυασμό με την αναγκαστική επιλογή κάποιου άλλου, μπορεί να συνεπάγεται αρνητικές οικονομικές και περιβαλλοντικές επιπτώσεις (Ελευθεροχωρινός, 2014). Η διαδικασία διάγνωσης και ταυτοποίησης ανθεκτικών βιοτύπων απαιτεί ειδικές γνώσεις, είναι αρκετά χρονοβόρα, επίπονη και δαπανηρή διαδικασία. Η διαπίστωση της εμφάνισης ανθεκτικότητας προϋποθέτει συλλογή στοιχείων από τους αγρούς και στην συνέχεια διεξαγωγή πειραμάτων στο θερμοκήπιο, στο εργαστήριο και στον αγρό. Η αναγκαιότητα εκπόνησης αυτής της διατριβής προέκυψε μετά από συνεχή παράπονα ορισμένων παραγωγών ρυζιού για μη επιτυχή αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού, μετά από εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου imazamox της οικογένειας των ιμιδαζολινονών, σε ορυζώνες της Χαλάστρας του Νομού Θεσσαλονίκης κατά τα έτη Έτσι, αποφασίστηκε να πραγματοποιηθεί, στο πλαίσιο της εκπόνησης μεταπτυχιακής διατριβής, η μελέτη αυτή όπου διερευνήθηκε η πιθανότητα εμφάνισης ανθεκτικότητας στο κόκκινο ρύζι. Το πρόβλημα μελετήθηκε με πραγματοποίηση πειραμάτων σε φυτοδοχεία και στο εργαστήριο. Το φυτικό υλικό (σπόροι) συλλέχτηκε από ορυζώνες της Χαλάστρας του Ν. Θεσσαλονίκης, όπου η επέμβαση με το ζιζανιοκτόνο imazamox δεν ήταν αποτελεσματική Σκοπός εργασίας Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η διερεύνηση οκτώ πληθυσμών του ζιζανίου κόκκινου ρυζιού για πιθανή εμφάνιση ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο imazamox (αναστολέα της δράσης του ενζύμου ALS). Για τον σκοπό αυτό διεξήχθησαν πειράματα φυτοδοχείων (υπαίθρου) και εργαστηρίου όπου διερευνήθηκαν : 11

12 1) Η επιστημονική υπόθεση ότι η μη ικανοποιητική αντιμετώπιση των πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού οφείλεται σε ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο imazamox (πειράματα φυτοδοχείων). 2) Η πιθανότητα της ανθεκτικότητας του κόκκινου ρυζιού να οφείλεται σε μεταλλαγμένο γονίδιο ALS (αλληλούχηση τμήματος του γονιδίου ALS, το οποίο είναι υπεύθυνο για την έκφραση του ενζύμου ALS σε ανθεκτικά και ευαίσθητα φυτά του ζιζανίου κόκκινου ρυζιού). 3) Η πιθανότητα της ανθεκτικότητας του κόκκινου να οφείλεται σε τροποποιημένο ένζυμο ALS (in vitro δράση του ενζύμου ALS από ανθεκτικά και ευαίσθητα φυτά κόκκινου ρυζιού στην παρουσία του ζιζανιοκτόνου imazamox). 12

13 2. Πειράματα φυτοδοχείων για διερεύνηση ανθεκτικότητας κόκκινου ρυζιού στο imazamox 2.1. Εισαγωγή Βιολογία ρυζιού και κόκκινου ρυζιού Το ρύζι είναι το δεύτερο σε σπουδαιότητα σιτηρό στον κόσμο, μετά από το σιτάρι, αφού αποτελεί το κυριότερο φυτό παραγωγής τροφής για τον άνθρωπο. Καλλιεργείται κυρίως στην Ασία, όπου καταλαμβάνει πάνω από το 90% των εκτάσεων που καλλιεργούνται με ρύζι παγκοσμίως, ενώ μικρότερες εκτάσεις καλλιεργούνται στη Λατινική Αμερική και στην Αφρική. Γενικότερα, το ρύζι καλλιεργείται σε περιοχές από 53 ο ΒΠ έως 35 ο ΝΠ και σε περιοχές κάτω από την επιφάνεια της θάλασσας και σε υψόμετρο μεγαλύτερο από 2500 μέτρα-ιμαλάϊα. Οι δύο Ευρωπαϊκές χώρες με την μεγαλύτερη παραγωγή ρυζιού είναι η Ιταλία και η Ισπανία, ενώ ακολουθούν η Ουκρανία, η Ελλάδα, η Πορτογαλία και η Γαλλία. Το 80% περίπου των διεθνών συναλλαγών ρυζιού αφορά σε ρύζι τύπου indica ενώ το υπόλοιπο 20% τύπου japonica. Τα 75% της παγκόσμιας παραγωγής ρυζιού προέρχεται από υπό κατάκλυση ορυζώνες (paddy ρύζι). Αφορά εντατικοποιημένη μορφή καλλιέργειας με προηγμένες τεχνολογίες παραγωγής, ενώ το υπόλοιπο ρύζι καλλιεργείται σε μη αρδευόμενες εκτάσεις και πτωχά εδάφη. Το ρύζι στη χώρα μας καλλιεργείται υπό κατάκλυση κυρίως σε αλατούχα παθογενή εδάφη, ακατάλληλα για άλλες καλλιέργειες. Η εξοικονόμηση νερού λόγω της καλύτερης ισοπέδωσης των αγρών, με χρήση των ακτίνων Laser, σε συνδυασμό με την εκτέλεση έργων αποταμίευσης νερού και με την χρησιμοποίηση νερού που προέρχεται από την επεξεργασία λυμάτων βιολογικού καθαρισμού διατηρεί την καλλιέργεια σε έκταση στρ., της οποίας η παραγωγή καλύπτει τις ανάγκες της χώρας για ρύζι και για εξαγωγή. Το ρύζι ανήκει στο γένος Oryza, το οποίο περιλαμβάνει είκοσι πλήρως αναγνωρισμένα είδη με χρωμοσωμικό αριθμό 2n = 24 ή 48, ενώ τα δύο καλλιεργούμενα είδη Oryza sativa L. και Oryza glaberrima Sted. έχουν χρωμοσωμικό αριθμό 24. Το γένος Oryza έχει ομαδοποιηθεί σε πέντε είδη (Ο. sativa, Ο. officinalis, Ο. meyeriana, Ο. ridleyi και ένα μη ταξινομημένο) (Rathore κ.ά., 2013). Το O. sativa είναι το κύριο είδος ρυζιού, το οποίο κατάγεται από την ανατολική Ασία και ειδικότερα από την Ινδία και την Ινδοκίνα. Αυτό καλλιεργείται σε όλες τις περιοχές του κόσμου (Παπακώστα, 2008) 13

14 Πίνακας 1. Βοτανική κατάταξη ρυζιού ΒΑΣΙΛΕΙΟ Plantae ΥΠΟΒΑΣΙΛΕΙΟ Tracheobionta ΥΠΟΔΙΑΙΡΕΣΗ Spermatophyta ΔΙΑΙΡΕΣΗ Magnoliophyta ΣΥΝΟΜΟΤΑΞΙΑ Magnoliophyta ΚΛΑΣΗ Liliopsida ΥΠΟΚΛΑΣΗ Commelinidae ΤΑΞΗ Cyperales ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Poaceae ΓΕΝΟΣ Oryza ΕΙΔΗ Oryza glaberrima L. Oryza sativa L. Το κόκκινο ρύζι (Oryza sativa L.) συμπεριλαμβάνεται στα πιο επιβλαβή ζιζάνια της καλλιέργειας του ρυζιού παγκοσμίως. Ανήκει στο ίδιο είδος με το καλλιεργούμενο ρύζι (Oryza sativa L.) και γι αυτό η διαχείρισή του αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τους παραγωγούς ρυζιού, αφού τα φυσιολογικά, τα μορφολογικά και τα βιολογικά χαρακτηριστικά του είναι όμοια με αυτά των καλλιεργούμενων ποικιλιών του ρυζιού. Το ρύζι, αν και θεωρείται αυτογονιμοποιούμενο είδος, μπορεί να ανταλλάξει γονίδια (ροή γονιδίων μέσω της γύρης-σταυρεπικονίαση) με το κόκκινο ρύζι όταν συμπίπτει η ανθοφορία τους. Το ποσοστό σταυρεπικονίασης του καλλιεργούμενου ρυζιού είναι περίπου 5%, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για το κόκκινο ρύζι είναι πολύ μεγαλύτερο. Η συχνότητα με την οποία γίνεται η σταυρεπικονίαση μεταξύ ρυζιού και κόκκινου ρυζιού επηρεάζεται από τις ποικιλίες του καλλιεργούμενου ρυζιού, το περιβάλλον και την πυκνότητα σποράς του ρυζιού (Rathore κ.ά., 2013; Zhang κ.ά., 2006). Η παρουσία του κόκκινου ρυζιού στις καλλιέργειες του ρυζιού προκαλεί σημαντική μείωση στην απόδοση και υποβάθμιση της ποιότητας του παραγόμενου προϊόντος. Αυτό οφείλεται στο ότι το κόκκινο ρύζι ανταγωνίζεται την καλλιέργεια του ρυζιού για θρεπτικά στοιχεία και φως και μάλιστα έχει την ικανότητα να προσλαμβάνει γρηγορότερα το άζωτο για παραγωγή βιομάζας από το έδαφος σε σχέση με το καλλιεργούμενο ρύζι (Busconi κ.ά., 2012; Rathore κ.ά., 2013). Το κόκκινο ρύζι οφείλει το όνομά του στο κόκκινο περικάρπιο των αποφλοιωμένων 14

15 κόκκων του, λόγω της παρουσίας ανθοκυανινών. Η παρουσία του κόκκινου περικαρπίου μειώνει την αξία του εμπορευόμενου προϊόντος (Zhang κ.ά., 2006). Το κόκκινο ρύζι είναι ετήσιο, θερινό, μονοκοτυλήδονο είδος. Έχει κατακόρυφη έκφυση με ύψος που κυμαίνεται από 80 έως 150 cm. Γενικώς, το κόκκινο ρύζι, επειδή αδελφώνει γρηγορότερα και είναι υψηλότερο από το καλλιεργούμενο ρύζι, εμφανίζει μεγαλύτερη ανταγωνιστική ικανότητα. Ο κολεός των φύλλων δεν περιβάλλει πλήρως όλο το μήκος του αντίστοιχου τμήματος του στελέχους, είναι πράσινος, επιμήκης με λεπτά τριχωτά ωτίδια. Το γλωσσίδιο είναι πολύ μεγάλο, μεμβρανώδες και μυτερό. Χαρακτηριστικό του ελάσματος των φύλλων αποτελεί το πράσινο χρώμα και το ευδιάκριτο κεντρικό νεύρο. Το έλασμα των φύλλων είναι επίπεδο, μακρύ και στενό με τραχιά επιφάνεια. Τα φύλλα διατάσσονται σε δύο κατευθύνσεις. Η ταξιανθία είναι φόβη, χρώματος καστανού έως ερυθρού και μήκους cm. Ο χιτώνας καταλήγει σε μικρό ή μεγάλο άγανο, ενώ υπάρχουν και πληθυσμοί κόκκινου ρυζιού χωρίς άγανο. Ανθίζει από Αύγουστο έως Οκτώβριο. Η ύπαρξη ανθοκυανινών στο περικάρπιο προσδίδει στους σπόρους την κόκκινη απόχρωση. Το κόκκινο ρύζι φυτρώνει σε χαμηλότερες θερμοκρασίες από ό,τι το καλλιεργούμενο ρύζι αποτελόντας ένα από τα σημαντικότερα ζιζάνια στην καλλιέργεια του ρυζιού (Studianto κ.ά., 2013; Rathore κ.ά., 2013; Βασιλάκογλου, 2004; Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009). Το κόκκινο ρύζι θεωρείται μέγιστη απειλή για τα οικοσυστήματα της καλλιέργειας του ρυζιού παγκοσμίως. Παραμένει ασαφές, εάν το κόκκινο ρύζι αποτελούσε σημαντικό πρόβλημα στις καλλιέργειες του ρυζιού κατά το παρελθόν. Έρευνες δείχνουν ότι το κόκκινο ρύζι είχε κάνει την εμφάνιση του στην Ευρώπη και στην Αμερική στις αρχές του 19 ου αιώνα (Andres κ.ά., 2014). Συγκεκριμένα, η πρώτη τεκμηριωμένη καταγραφή του κόκκινου ρυζιού έγινε το 1846 στις ΗΠΑ και από τότε εξακολουθεί να έχει αρνητική επίδραση στις περισσότερες περιοχές παραγωγής ρυζιού ανά τον κόσμο. Ο λόγος που η αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού είναι δύσκολη σχετίζεται με την γενετική και την ως εκ τούτου μορφολογική ομοιότητα με το καλλιεργούμενο ρύζι, γεγονός που καθιστά σχεδόν αδύνατη την εκλεκτική και αποτελεσματική διαχείρισή του εντός της καλλιέργειας του ρυζιού (Andres κ.ά., 2014). 15

16 Αντιμετώπιση κόκκινου ρυζιού Η εκλεκτική αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού εντός της καλλιέργειας του ρυζιού πριν από το 2004 ήταν αδύνατη εξαιτίας της μη ύπαρξης εκλεκτικών ζιζανιοκτόνων. Αυτό είχε ως συνέπεια η αντιμετώπιση του να βασίζεται στη χρήση καλλιεργητικών μέτρων [αμειψισπορά (όπου είναι δυνατή), επιλογή ανταγωνιστικών ποικιλιών ρυζιού, ρύθμιση εποχής σποράς, αύξηση πυκνότητας σποράς] ή σε βοτάνισμα των φυτών κατά το στάδιο της έναρξης της ανθοφορίας (μικρές πυκνότητες του ζιζανίου) ή στη χρήση μη εκλεκτικών ζιζανιοκτόνων (χρήση σχοινοδιαβρεκτών με glyphosate κατά την εποχή ανάπτυξης των φυτών κόκκινου ρυζιού πάνω από την καλλιέργεια του ρυζιού) ή στην εφαρμογή της μεθόδου ψευδοσπορά/ψεύτικη σπορά (false seeding) (Ελευθεροχωρινός, 2014). Η μέθοδος αυτή (ψευδοσπορά) συνίσταται στην κατεργασία του εδάφους (προετοιμασία σποροκλίνης) για μη πραγματική σπορά ( ψεύτικη σπορά ) του ρυζιού, η οποία επάγει το φύτρωμα κόκκινου ρυζιού/μουχρίτσας και, ακολούθως, με εφαρμογή των εγκεκριμένων ζιζανιοκτόνων glyphosate ή propaquizafop (χωρίς κατεργασία) ή με ελαφρά κατεργασία, καταστρέφονται τα ζιζάνια πριν από την πραγματική σπορά του ρυζιού. Το κόκκινο ρύζι, κατά την τελευταία δεκαετία, αντιμετωπίζεται με την καλλιέργεια ανθεκτικών ποικιλιών ρυζιού τύπου Clearfield, όπου παρέχεται η δυνατότητα της μεταφυτρωτικής εφαρμογής ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στην οικογένεια των ιμιδαζολινονών και αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS. Η αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού στη χώρα μας βασίζεται κυρίως στη μεταφυτρωτική εφαρμογή του imazamox 1 (Σχήμα 2), εμπορικό σκεύασμα Pulsar 1 4 SL, ενώ σε άλλες χώρες χρησιμοποιείται και το imazethapyr (Kaloumenos κ.ά., 2013β). Το imazamox, αν και μπορεί να εφαρμοστεί δύο φορές [(87,5 κ. εκ. Pulsar 4 SL Dash HC)/(87,5 κ. εκ. Pulsar 4 SL Dash HC)] στο στάδιο των σποροφύτων, εφαρμόζεται συνήθως μία φορά στις ημέρες από τη σπορά και μάλιστα στη δόση των 200 κ. εκ. Pulsar 4 SL Dash HC. Αυτό γίνεται επειδή η επέμβαση αυτή μειώνει το κόστος εφαρμογής, αλλά και αντιμετωπίζει αποτελεσματικότερα τα ζιζάνια που φυτρώνουν αργότερα. 16

17 Σχήμα 1. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου imazamox (ammonium2-[(rs)-4isopropyl- 4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl]-5-methoxymethylnicotinate) Οι ιμιδαζολινόνες είναι μια από τις πέντε οικογένειες ζιζανιοκτόνων [σουλφονυλουρίες, ιμιδαζολινόνες, τριαζολοπυριμιδίνες, πυριμιδινυλ(θειο)βενζοϊκά και σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολίνες] που ανήκουν στην ομάδα των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης του ενζύμου ALS. Ειδικότερα, ο μηχανισμός δράσης αυτών των ζιζανιοκτόνων σχετίζεται με την αναστολή της δράσης του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση ή συνθάση του οξικογαλακτικού οξέος ή συνθάση του ακετογαλακτικού οξέος (ALS), γνωστό και ως συνθάση του ακετο-υδροξυβουτυρικού οξέος (AHAS). Το ALS ή AHAS είναι το ένζυμο κλειδί που καταλύει το πρώτο βήμα κατά την βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνης, λευκίνης και ισολευκίνης, τα οποία χαρακτηρίζονται από διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα (Andres κ.ά., 2014; Ελευθεροχώρινός, 2014; Tan κ.ά., 2002). Η οικογένεια των ιμιδαζολινονών αναπτύχθηκε μετά το Το πρώτο ζιζανιοκτόνο της οικογένειας αυτής κυκλοφόρησε το 1971 με πρώτη δραστική ουσία το imazamethabenz-methyl. Στην συνέχεια ακολούθησαν οι δραστικές ουσίες imazapyr το 1979, imazaquin το 1981, imazathapyr το 1982 και αργότερα το imazamox και το imazapic. Ο βασικός χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων αυτής την οικογένειας αποτελείται από ένα αρωματικό δακτύλιο με την καρβοξυλική ομάδα και από τον ιμιδαζολινικό δακτύλιο (Σχήμα 1). Η χρήση των ζιζανιοκτόνων αυτής της οικογένειας γίνεται στο έδαφος ή στο φύλλωμα των ζιζανίων. Η απορρόφησή τους λαμβάνει χώρα από τις ρίζες και τα φύλλα, ενώ η περεταίρω μετακίνηση στους μεριστωματικούς ιστούς πραγματοποιείται δια μέσου του ξυλώματος και του φλοιώματος, αντιστοίχως. Τα ανθεκτικά καλλιεργούμενα είδη δεν εμφανίζουν συμπτώματα τοξικότητας αφού έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν ταχύτατα τα ζιζανιοκτόνα ή να 17

18 απορροφούν μικρότερες ποσότητές τους ή να διαθέτουν μια ισομορφή του ενζύμου ALS με μειωμένη ευαισθησία. Ειδικότερα, τα ζιζανιοκτόνα imazamethabenz και imazethapyr μεταβολίζονται εντός των ανθεκτικών φυτών μέσω υδροξυλίωσης και ακολούθως σχηματισμού συμπλόκου με γλυκόζη, ενώ το imazaquin μέσω δημιουργίας δακτυλίου μεταξύ της καρβοξυλικής ομάδας της κινολίνης και του ιμιδαζολινονικού δακτυλίου και ακολούθως υδρόλυσης ή αναγωγής. Η διεύρυνση της εκλεκτικότητας των ιμιδαζολινονών σε ευαίσθητα καλλιεργούμενα είδη επιτεύχθηκε μέσω της κλασικής βελτίωσης. Ειδικότερα, η επιλογή μεταλλαγμένης γύρης ή μεταλλαγμένων μικροσπορίων ή μεταλλαγμένων σπόρων μετά από επίδραση μεταλλαξιογόνων ουσιών συνέβαλε στην επιλογή και δημιουργία ποικιλιών αραβοσίτου, ελαιοκράμβης, ηλιάνθου, σιταριού και ρυζιού με ανθεκτικότητα σε ιμιδαζολινόνες (Tan κ.ά., 2002; Zhang κ.ά., 2006). Η ανθεκτικότητα όλων των προαναφερθέντων καλλιεργούμενων φυτών οφειλόταν σε μεταλλαγμένο als γονίδιο που κωδικοποιεί ανθεκτικό ένζυμο ALS σε ζιζανιοκτόνα της οικογένειας των ιμιδαζολινονών. Ειδικότερα, τα ανθεκτικά στις ιμιδαζολινόνες φυτά αραβοσίτου, σιταριού, ρυζιού και ελαιοκράμβης, έχουν τη σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο als που είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση του αμινοξέος σερίνη (Ser) από ασπαραγίνη (Asn) στη θέση 653 (Ser653-Asn), ενώ τα ανθεκτικά φυτά αραβοσίτου και ελαιοκράμβης έχουν και δεύτερη μετάλλαξη στο ίδιο γονίδιο που είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση του αμινοξέος τρυπτοφάνη (Trp) από λευκίνη (Leu) στη θέση 574 (Trp574-Leu). Επίσης, το ρύζι μπορεί να έχει δύο μεταλλάξεις στο ίδιο γονίδιο, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την αντικατάσταση των αμινοξέων γλυκίνη (Gly) από γλουταμικό οξύ (Glu) στη θέση 654 (Gly654-Glu) και αλανίνη (Ala) από θρεονίνη (Thr) στη θέση 122 (Ala122-Thr). Τέλος, ο ηλίανθος έχει τη σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο als που είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση του αμινοξέος αλανίνη (Ala) από βαλίνη (Val) στη θέση 205 (Ala205-Val). Το γονίδιο als των προαναφερθέντων μη ΓΤ φυτών είναι ημικυρίαρχο, γεγονός που σημαίνει ότι η ύπαρξή του σε ομόζυγη κατάσταση εντός των φυτών είναι αναγκαία επειδή αυξάνει την παραγωγή του ανθεκτικού ενζύμου ALS και την ως εκ τούτου ανθεκτικότητα αυτών των φυτών στις ιμιδαζολινόνες (Kadaru κ.ά., 2008). Αρκετές από τις ποικιλίες των προαναφερθέντων μη ΓΤ τροποποιημένων φυτών καλλιεργούνται διεθνώς και είναι γνωστές ως Clearfield ποικιλίες (Ελευθεροχωρινός, 2014). Η οικογένεια των σουλφονυλουριών αναπτύχθηκε το 1977 με πρώτη δραστική ουσία το chlorsulfuron. Το 1982 το ζιζανιοκτόνο αυτό πήρε έγκριση στις ΗΠΑ και 18

19 στην Μ. Βρετανία, ενώ στην χώρα μας εγκρίθηκε το Δέκα χρόνια μετά την ανακάλυψη του chlorsulfuron, η οικογένεια των σουλφονυλουριών περιλάμβανε 230 δραστικές ουσίες. Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής είναι δραστικά σε δόσεις φορές μικρότερες από εκείνες των ήδη χρησιμοποιούμενων ζιζανιοκτόνων. Οι σουλφονυλουρίες είναι διασυστηματικά ζιζανιοκτόνα και εφαρμόζονται στο έδαφος είτε στο φύλλωμα με σκοπό την αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες. Η απορρόφηση τους γίνεται από το ριζικό σύστημα και από τα φύλλα και η μετακίνηση στους μεριστωματικούς ιστούς πραγματοποιείται δια μέσου του ξυλώματος και του φλοιώματος. Τα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron και halosulfuron, τα οποία ανήκουν στην οικογένεια των σουλφονυλουριών, χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια του ρυζιού για την αντιμετώπιση κυπεροειδών και πλατύφυλλων ζιζανίων. Η εκλεκτικότητα των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής οφείλεται στην ικανότητα των καλλιεργούμενων φυτών να τα μεταβολίζουν ταχύτατα σε μη τοξικές για το φυτό ουσίες. Ο μηχανισμός μεταβολισμού γίνεται μέσω υδροξυλίωσης που καταλύεται από το ένζυμο μονοξυγονάση και στην συνέχεια μέσω σχηματισμού συμπλόκων με γλυκόζη. Η διεύρυνση της εκλεκτικότητας των σουλφονυλουριών σε ευαίσθητα καλλιεργούμενα είδη κατέστη δυνατή μέσω της χρήσης μεθόδων της κλασικής βελτίωσης ή της γενετικής μηχανικής. Πιο συγκεκριμένα, έχουν δημιουργηθεί γενετικώς τροποποιημένες ποικιλίες π.χ. βαμβακιού και καπνού με ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες. Η ανθεκτικότητα προέκυψε λόγω μεταφοράς ενός als γονιδίου από το φυτό Arabidopsis thaliana το οποίο κωδικοποιεί εντός των ΓΤ φυτών ανθεκτικό ένζυμο ALS προσδίδοντας έτσι ανθεκτικότητα στις σουλφονυλουρίες. Ο βασικός χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας των πυριμιδινυλ(θειο)βενζοϊκών αποτελείται από έναν πυριμιδινικό δακτύλιο ενωμένο με βενζοϊκό οξύ δια μέσου ατόμων S ή O. Το bispyribac εφαρμόζεται κυρίως στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση του αγρωστώδους ζιζανίου μουχρίτσα στην καλλιέργεια του ρυζιού (Kaloumenos κ.ά., 2013), ενώ το pyrithiobac εφαρμόζεται στο φύλλωμα και στο έδαφος για την αντιμετώπιση ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων στην καλλιέργεια του βαμβακιού (Kaloumenos κ.ά., 2005). Ο βασικός χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας τριαζολοπυριμιδίνες αυτής (π.χ. chloransulam, penoxsulam) αποτελείται από τον τριαζολοπυριμιδινικό δακτύλιο, τη σουλφαμιδική γέφυρα και ένα φαινυλικό 19

20 δακτύλιο. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των ζιζανίων και μετακινούνται στους μεριστωματικούς ιστούς δια μέσου του ξυλώματος και του φλοιώματος. Οι τριαζολοπυριμιδίνες είναι αποτελεσματικά ζιζανιοκτόνα εναντίον ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων και ορισμένων αγρωστωδών ζιζανίων (penoxsulam) ή/και ορισμένων ζιζανίων που ανήκουν στα κυπεροειδή (penoxulam, diclosulam). To penoxsulam χρησιμοποιείται στην καλλιέργεια του ρυζιού για την αντιμετώπιση της μουχρίτσας (Echinochloa) και της μοσχοκύπερης (Cyperus difformis). Τα ζιζανιοκτόνα αυτά δρουν σε πολύ μικρότερες δόσεις από ό,τι τα ήδη χρησιμοποιούμενα ζιζανιοκτόνα. Τα καλλιεργούμενα φυτά καθιστούν εκλεκτικά τα ζιζανιοκτόνα αυτής της οικογένειας, διότι έχουν τη δυνατότητα να τα μεταβολίζουν σε μη τοξικές ουσίες. Η οικογένεια των σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινονών περιλαμβάνει τα ζιζανιοκτόνα φυλλώματος flucarbazone, propoxycarbazone και thiencarbazone. Τα δύο πρώτα ζιζανιοκτόνα χρησιμοποιούνται για την αποτελεσματικότητά τους κυρίως εναντίον ετήσιων αγρωστωδών ζιζανίων. Από το φάσμα δράσης τους δεν αποκλείονται και ορισμένα ετήσια πλατύφυλλα ζιζάνια (Ελευθεροχωρινός, 2014). Το thiencarbazone είναι εκλεκτικό μεταφυτρωτικό ζιζανιοκτόνο για την αντιμετώπιση αγρωστωδών και πλατύφυλλων ζιζανίων στην καλλιέργεια αραβοσίτου και σιταριού. Η απορρόφηση των ζιζανιοκτόνων αυτών γίνεται τόσο από την ρίζα όσο και από τα φύλλα και η μετακίνηση τους εντός των φυτών πραγματοποιείται δια μέσου του ξυλώματος και του φλοιώματος Ανθεκτικότητα ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα Ορισμοί-Ορολογία Πριν εξεταστούν οι μηχανισμοί που εξηγούν την ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα και οι παράγοντες που την επηρεάζουν, θα οριστούν οι έννοιες ανθεκτικότητα, αντοχή, ανθεκτικός βιότυπος, ανθεκτικός πληθυσμός, διασταυρωτή ανθεκτικότητα και πολλαπλή ανθεκτικότητα. Αυτό κρίνεται αναγκαίο αφού οι όροι αυτοί χρησιμοποιούνται συχνά κατά αδόκιμο τρόπο, αλλά και διότι η γνώση τους συμβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση της ανθεκτικότητας και των παραγόντων που επηρεάζουν την εξέλιξή της (Ελευθεροχωρινός, 2014). Ο όρος ανθεκτικότητα (resistance) ενός ζιζανίου σε ζιζανιοκτόνο ορίζεται ως «η κληρονομούμενη ικανότητα μερικών φυτών ενός είδους ζιζανίου να επιβιώνουν και να αναπαράγονται μετά από εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης ενός ζιζανιοκτόνου, 20

21 στο οποίο τα περισσότερα φυτά του αρχικού πληθυσμού ήταν ευαίσθητα»). Σύμφωνα με τον ορισμό, τα ανθεκτικά φυτά δεν δημιουργούνται από επαγόμενη μετάλλαξη του ζιζανιοκτόνου αλλά προϋπάρχουν στον αρχικό πληθυσμό του ζιζανίου και επιλέγονται, ως συνέπεια της συνεχούς πίεσης επιλογής, που ασκείται από την επαναλαμβανόμενη χρήση του ίδιου ζιζανιοκτόνου. Ο όρος αντοχή (tolerance) ζιζανίου σε ζιζανιοκτόνο διαφέρει από την ανθεκτικότητα και ορίζεται ως «η κληρονομούμενη ικανότητα όλων των φυτών του αρχικού πληθυσμού ενός είδους ζιζανίου να επιβιώνουν και να αναπαράγονται στην εξαρχής εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης του ζιζανιοκτόνου». Σύμφωνα με τον ορισμό αυτό, όλα τα φυτά του αρχικού πληθυσμού του ζιζανίου με αντοχή ήταν μη ευαίσθητα πριν από την έναρξη χρήσης του ζιζανιοκτόνου. Ο όρος ανθεκτικός βιότυπος (resistant biotype), με βάση τον ορισμό της ανθεκτικότητας και τον γενικό ορισμό του βιοτύπου (plant biotype) ορίζεται ως «το σύνολο των γενετικώς όμοιων φυτών ενός είδους ζιζανίου που διαφέρουν, ως προς το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας τους σε κάποιο ζιζανιοκτόνο, από τα υπόλοιπα φυτά του είδους, που επιβιώνουν και αναπαράγονται στο ίδιο περιβάλλον». Ο όρος ανθεκτικός πληθυσμός (resistant population), σύμφωνα με τον ορισμό της ανθεκτικότητας και τον αντίστοιχο του πληθυσμού (plant population), ορίζεται ως «το σύνολο γενετικώς ανόμοιων φυτών ενός είδους που διαφέρουν, ως προς το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας τους σε κάποιο ζιζανιοκτόνο, από τα υπόλοιπα φυτά του είδους, που επιβιώνουν και αναπαράγονται στο ίδιο περιβάλλον». Ο όρος διασταυρωτή ανθεκτικότητα ή σταυρανθεκτικότητα (cross resistance) ορίζεται ως «η ανθεκτικότητα ενός πληθυσμού ζιζανίου σε δύο ή περισσότερα ζιζανιοκτόνα, τα οποία έχουν ίδιο μηχανισμό δράσης και ανήκουν στην ίδια ή σε διαφορετικές χημικές οικογένειες». Ο όρος πολλαπλή ανθεκτικότητα (multiple resistance) ορίζεται ως «η ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε δύο ή περισσότερα ζιζανιοκτόνα, τα οποία έχουν διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης και ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες» (Ελευθεροχωρινός, 2014) Διεθνή δεδομένα ανθεκτικότητας ζιζανίων Η πρώτη διαπίστωση ανθεκτικού ζιζανίου σε ζιζανιοκτόνο έγινε το 1957 στον Καναδά, όπου βρέθηκε πληθυσμός του ζιζανίου (Daurus carota) με ανθεκτικότητα στο μέχρι τότε αποτελεσματικό ζιζανιοκτόνο 2,4-D. Το 1964 έγινε αναφορά για 21

22 πληθυσμό του ζιζανίου περικοκλάδα (Convolvulus arvensis) με μειωμένη ευαισθησία στο ίδιο ζιζανιοκτόνο. Τέσσερα χρόνια αργότερα στις ΗΠΑ, έγινε η πρώτη επαρκώς τεκμηριωμένη καταγραφή πληθυσμού του ζιζανίου μαρτιάκος (Senecio vulgaris) με ανθεκτικότητα στο αποτελεσματικό μέχρι τότε ζιζανιοκτόνο simazine (Ελευθεροχωρινός, 2014; Καλούμενος, 2009). Η πρόσφατη επισκόπηση των ζιζανίων έδειξε ότι 237 είδη (99 μονοκοτυλήδονα, 138 δικοτυλήδονα) παγκοσμίως έχουν ήδη εμφανίσει ανθεκτικούς πληθυσμούς σε ένα ζιζανιοκτόνο ή διασταυρωτή ή πολλαπλή ανθεκτικότητα σε διάφορα ζιζανιοκτόνα. Διάφορα είδη ζιζανίων εμφάνισαν ανθεκτικότητα σε 22 από τις 25 ομάδες ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό μηχανισμό δράσης και πιο συγκεκριμένα σε 155 από 300 διαφορετικά ζιζανιοκτόνα (Heap, 2015). Τα 145 είδη ζιζανίων εμφανίζουν ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν την δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS) κατά το έτος Τα ζιζανιοκτόνα αυτού του μηχανισμού δράσης έχουν υποστεί την μεγαλύτερη ζημιά λόγο εμφάνισης των περισσότερων ανθεκτικών πληθυσμών ζιζανίων. Η επαναλαμβανόμενη χρήση κυρίως σουλφονυλουριών στην καλλιέργεια του ρυζιού είχε ως συνέπεια την εμφάνιση ανθεκτικότητας σε πολλά ζιζάνια, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιούνται μίγματα σουλφονυλουριών με άλλα ζιζανιοκτόνα για την αντιμετώπιση αυτών των ζιζανίων σε ορυζώνες (Kuk κ.ά., 2003). Η διαγραμματική απεικόνιση για την εξέλιξη της πορείας ανθεκτικών ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων για το 2015 (Σχήμα 2) δείχνει ότι, το 2000, τα είδη ζιζανίων με ανθεκτικότητα στην ομάδα των ALS αναστολέων ανέρχονταν σε 75, ενώ ο αντίστοιχος αριθμός το 2014 σχεδόν διπλασιάστηκε σε 145 ανθεκτικά είδη. Επίσης, τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν την ροή ηλεκτρόνιων στο φωτοσύστημα II (τριαζίνες) περιλαμβάνουν 75 ανθεκτικά είδη, ενώ τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν την βιοσύνθεση λιπαρών οξέων (αναστολείς της δράσης του ενζύμου ACCase) έχουν 46 περιπτώσεις ανθεκτικών ειδών. 22

23 Σχήμα 2. Διαγραμματική απεικόνιση ανθεκτικών ειδών ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων από το 1950 έως σήμερα (Heap, 2015) Τα ανθεκτικά είδη ζιζανίων οφείλουν κυρίως την ανθεκτικότητα τους ή σε τροποποίηση του στόχου δράσης των ζιζανιοκτόνων, είτε στον μεταβολισμό τους εντός των ανθεκτικών φυτών (Ελευθεροχωρινός, 2014). Η εμφάνιση ανθεκτικών πληθυσμών ζιζανίων διευκολύνεται από την επαναλαμβανόμενη χρήση ζιζανιοκτόνων με ίδιο μηχανισμό δράσης, την μεγάλη δράση των ζιζανιοκτόνων, την μεγάλη υπολειμματική δράση και τέλος από την μεγάλη ευαισθησία των πληθυσμών ενός ζιζανίου στη συνιστώμενη δόση των ζιζανιοκτόνων (Corbett και Tardif, 2006) Ανθεκτικότητα ζιζανίων στην Ελλάδα Στην Ελλάδα, σύμφωνα με τα διεθνή και εθνικά δεδομένα, έχουν εξακριβωθεί και καταγραφεί 14 ανθεκτικά είδη ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν 1) τη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα ΙΙ, 2) τη δράση του ενζύμου ALS, 3) τη δράση του ενζύμου ACCase και 4) τη δράση του ενζύμου EPSPS (Ελευθεροχωρινός, 2014). 23

24 Πίνακας 2. Είδη ζιζανίων της χώρας μας που εμφάνισαν ανθεκτικούς πληθυσμούς σε ζιζανιοκτόνα (Ελευθεροχωρινός, 2014). α/α Ζιζάνιο Στόχος δράσης (Ζιζανιοκτόνα) 1 Μουχρίτσα (Echinochloa crusgalli) PS II (propanil) 2 Βλήτο (Amaranthus retroflexus) PS II (metribuzin) 3 Λουβουδιά (Chenopodium PS II (metribuzin) album) 4 Λεπτή ήρα (Lolium rigidum) ALS (chlorsulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron) ACCase (clodinafop, diclofop, tralkoxydim) 5 Αγριοτομάτα (Solanum nigrum) PS II (prometryn) 6 Παπαρούνα (Papaver rhoeas) ALS (chlorsulfuron, tribenuron, triasulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, florasulam, pyrithiobac, imazamox) 7 Βέλιουρας (Sorghum halepense) ACCase (quizalofop, propaquizafop) 8 Αγριοβρώμη (Avena sterilis) ACCase (diclofop, clodinafop, fenoxaprop, tralkoxydim, pinoxaden) 9 Μουχρίτσα (Echinochloa ALS (penoxsulam, bispyribac, imazamox, oryzicola) foramsulfuron, nicosulfuron, rimsulfuron) 10 Κόκκινο ρύζι (Oryza sativa) ALS (imazamox, imazethapyr) 11 Κόνυζα (Conyza spp.) EPSPS (glyphosate) 12 Φάλαρη (Phalaris minor ) ACCase (diclofop, clodinafop, fenoxaprop) 13. Άγριο σινάπι (Sinapis arvensis) ALS (tribenuron) 14. Μοσχοκύπερη (Cyperus ALS (azimsulfuron, halosulfuron, difformis) imazosulfuron) Τα περισσότερα είδη ανθεκτικών πληθυσμών ζιζανίων στη χώρα είναι αυτά με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS. Ειδικότερα, οι πληθυσμοί της λεπτής ήρας (Lolium rigidum) έχουν εμφανίσει πολλαπλή ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του του ενζύμου ALS (chlorsulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron) και σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς του ενζύμου ACCase (clodinafop, diclofop και tralkoxydim) (Kotoula-Syka κ.ά., 24

25 2000; Kaloumenos κ.ά., 2012). Επίσης, πληθυσμοί της κοινής παπαρούνας (Papaver rhoeas) και της μουχρίτσας (Echinochloa oryzicola) εμφάνισαν διασταυρωτή ανθεκτικότητα σε διαφορετικές οικογένειες της ομάδας των ALS αναστολέων. Αναλυτικότερα, άτομα της παπαρούνας είναι ανθεκτικά στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, tribenuron, triasulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, florasulam, pyrithiobac και imazamox (Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2008; Kaloumenos κ.ά., 2009; Kaloumenos κ.ά., 2011), ενώ της μουχρίτσας στα ζιζανιοκτόνα penoxsulam, bispyribac, imazamox, foramsulfuron, nicosulfuron και rimsulfuron (Kaloumenos κ.ά., 2013a). Τέλος, άτομα του κόκκινου ρυζιού (Oryza sativa) εμφάνισαν διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα imazamox και imazethapyr (Kaloumenos κ.ά., 2013b), άτομα του άγριου σιναπιού (Sinapis arvensis) με ανθεκτικότητα στο tribenuron και άτομα της μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) εμφάνισαν διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, halosulfuron και imazosulfuron (Ελευθεροχωρινός, 2014). Τα είδη της χώρας μας που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ACCase είναι ο βέλιουρας (Sorghum halepense) με διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα quizalofop και propaquizafop (Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2009), η αγριοβρώμη (Avena sterilis) με διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα diclofop, clodinafop, fenoxaprop, tralkoxydim και pinoxaden (Papapanagiotou κ.ά., 2012; Travlos κ.ά., 2011) και η φάλαρη με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα diclofop, clodinafop, fenoxaprop (Travlos, 2012). Το μοναδικό είδος ζιζανίου που έχει εμφανίσει ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου EPSPS είναι η κόνυζα (Conyza spp.) με ανθεκτικούς πληθυσμούς στο ζιζανιοκτόνο glyphosate (Mylonas κ.ά., 2014; Nol κ.ά., 2012; Travlos και Chachalis, 2010) Μηχανισμοί ανθεκτικότητας ζιζανίων Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα οφείλεται είτε σε φυσιολογικούς είτε σε βιοχημικούς μηχανισμούς των φυτών. Οι κυριότεροι φυσιολογικοί μηχανισμοί που συμβάλλουν στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα είναι οι μηχανισμοί μη στόχου δράσης, οι οποίοι οφείλονται σε 1)μειωμένη διέλευση του ζιζανιοκτόνου διά μέσου της κυτταρικής μεμβράνης, 2) μεταφορά-εναπόθεση του ζιζανιοκτόνου σε χώρους μη δράσης (χυμοτόπιο), 3) μειωμένη μεταφορά του ζιζανιοκτόνου σε χώρους δράσης (χλωροπλάστη) ή απέκκριση από τον χλωροπλάστη 25

26 στο κυτταροδιάλυμα, 4) απέκκριση του ζιζανιοκτόνου από τον χλωροπλάστη στο κυτταρικό τοίχωμα. Οι σπουδαιότεροι βιοχημικοί μηχανισμοί που συμβάλλουν στην ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα σχετίζονται με την 1) ικανότητα των ζιζανίων να μεταβολίζουν τα ζιζανιοκτόνα με ένζυμα μη στόχου δράσης μέσω αντίδρασης τροποποίησης της δομής του ζιζανιοκτόνου (μονοοξυγονάσες) ή/και αντίδρασης σχηματισμού συμπλόκου μεταξύ ζιζανιοκτόνου και συστατικών του κυττάρου (γλουταθειόνη-s-τρανσφεράση, γλυκοζυλοτρανσφερασών), 2) υπερέκφραση γονιδίου ανθεκτικότητας που προκαλεί υπερπαραγωγή του ενζύμου μεταβολισμού ενός ζιζανιοκτόνου ή του ευαίσθητου ενζύμου-στόχου δράσης, 3) τροποποίηση του στόχου δράσης και αδυναμία πρόσδεσης του ζιζανιοκτόνου (Ελευθεροχωρινός, 2014) Παράγοντες εξέλιξης της ανθεκτικότητας ζιζανίων Οι παράγοντες που επηρεάζουν τον ρυθμό εμφάνισης της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα κατατάσσονται σε παράγοντες που σχετίζονται με το ζιζάνιο, το ζιζανιοκτόνο και τις γεωργικές πρακτικές. Οι παράγοντες που έχουν σχέση με το ζιζάνιο είναι 1) η συχνότητα εμφάνισης του γονιδίου ανθεκτικότητας στον αρχικό πληθυσμό, 2) ο αριθμός των γονιδίων που ελέγχουν την ανθεκτικότητα, 3) η προέλευση του γονιδίου ανθεκτικότητας (DNA πυρήνα, χλωροπλαστών, μιτοχονδρίων) σε συνδυασμό με τον τρόπο δράσης (κυρίαρχο-επικρατές, ημικυρίαρχο), 4) η δυνατότητα μεταφοράς-ροής του γονιδίου ανθεκτικότητας (προέλευση DNA και τρόπος επικονίασης του ζιζανίου) ο τρόπος κληρονόμησης των γονιδίων ανθεκτικότητας, 5) η διάρκεια βιωσιμότητας και ο λήθαργος των σπόρων του αρχικού πληθυσμού των ζιζανίων, 6) η ένταση ευαισθησίας του αρχικού πληθυσμού του ζιζανίου στο ζιζανιοκτόνο, 7) η προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών έναντι των ευαίσθητων, 8) η πλειοτροπική επίδραση του γονιδίου ανθεκτικότητας στην αναπαραγωγή, στην φυτρωτική ικανότητα, στην αντοχή σε εχθρούς και ασθένειες, στην ανταγωνιστική ικανότητα. Οι παράγοντες που σχετίζονται με τις ιδιότητες του ζιζανιοκτόνου είναι 1) η ένταση δράσης του ζιζανιοκτόνου, 2) η υπολειμματική διάρκεια του ζιζανιοκτόνου, 3) ο μηχανισμός δράσης του ζιζανιοκτόνου. Οι παράγοντες που σχετίζονται με τις μεθόδους της γεωργικής πρακτικής είναι 1) οι υψηλές δόσεις και η συχνότητα εφαρμογής του ζιζανιοκτόνου, 2) η μη χρήση μιγμάτων ζιζανιοκτόνων, 3) η μη εναλλαγή ζιζανιοκτόνων στον ίδιο αγρό, 4) η μη 26

27 συνδυασμένη χρήση εναλλακτικών μεθόδων αντιμετώπισης ζιζανίων, 5) το εφαρμοζόμενο σύστημα αμειψισποράς των καλλιεργειών, 6) ο τρόπος κατεργασίας του εδάφους. Ο βαθμός κυριαρχίας των γονιδίων της ανθεκτικότητας ευνοεί τον ρυθμό ανάπτυξης της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα. Γενικώς, η εμφάνιση ανθεκτικού πληθυσμού προϋποθέτει πίεση επιλογής σε έναν πληθυσμό και κυρίως γενετική παραλλακτικότητα. Όταν πρόκειται για ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνααναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS ή AHAS, τα ανθεκτικά αλληλόμορφα ALS είναι κυρίαρχα γονίδια του πυρήνα που ακολουθούν Μενδελική κληρονομικότητα. Αυτό σημαίνει ότι τα ανθεκτικά ALS γονίδια μπορούν να διαδοθούν μέσω της γύρης και του σπόρου (Ελευθεροχωρινός, 2014; Καλούμενος, 2009; Tranel και Wright, 2002). Ο τρόπος επικονίασης του ζιζανίου επηρεάζει το είδος και κυρίως τον ρυθμό ανάπτυξης της ανθεκτικότητας στα ζιζανιοκτόνα. Ειδικότερα, τα αυτογονιμοποιούμενα είδη έχουν μικρότερη πιθανότητα και βραδύτερο ρυθμό εμφάνισης διασταυρωτής ή πολλαπλής ανθεκτικότητας από τα σταυρογονιμοποιούμενα είδη. Αυτό συμβαίνει διότι τα αυτογονιμοποιούμενα είδη αδυνατούν να μεταφέρουν μέσω της γύρης γονίδια ανθεκτικότητας, ενώ τα σταυρογονιμοποιούμενα είδη μπορούν μέσω της σταυροεπικονίασης να συσσωρεύσουν γονίδια ανθεκτικότητας με αποτέλεσμα την επίσπευση του χρόνου εμφάνισης πληθυσμών με διασταυρωτή ή πολλαπλή ανθεκτικότητα. Η προέλευση και ο αριθμός των γονιδίων που ελέγχουν τον μηχανισμό δράσης επιδρά σημαντικά στην πιθανότητα εμφάνισης ανθεκτικών πληθυσμών. Όταν ο μηχανισμός δράσης ελέγχεται από ένα γονίδιο, η πιθανότητα εμφάνισης ανθεκτικών πληθυσμών αυξάνεται, διότι μία μετάλλαξη στο γονίδιο είναι αρκετή για να προσδώσει ανθεκτικότητα στο ένζυμο-στόχο δράσης ή στην πρωτεΐνη-θέση δράσης του ζιζανιοκτόνου. Τα γονίδια μπορεί να προέρχονται από DNA του πυρήνα, των χλωροπλαστών και των μιτοχονδρίων. Η κληρονομούμενη ανθεκτικότητα μέσω του DNA του πυρήνα αναπτύσσεται με ταχύτερο ρυθμό γιατί υπάρχει η δυνατότητα να μεταφερθεί η ανθεκτικότητα μέσω της γύρης σε ευαίσθητους πληθυσμούς. Αυτό προϋποθέτει ότι η ανθεκτικότητα κληρονομείται με κυρίαρχο αλληλόμορφο γονίδιο και το είδος του ζιζανίου είναι σταυρογονιμοποιούμενο. Αντίθετα, η κυτοπλασματική κληρονόμηση ανθεκτικότητας μέσω του DNA των χλωροπλαστών ή των μιτοχονδρίων αναπτύσσεται με βραδύτερο βαθμό, διότι οι μόνο τα ανθεκτικά φυτά με 27

28 κυτοπλασματική κληρονόμηση (μητρική κληρονόμηση) παράγουν σπόρους που δίνουν ανθεκτικά άτομα (Ελευθεροχωρινός, 2014) Πειραματικές εργασίες Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός διεξαγωγής των πειραμάτων που θα περιγραφούν παρακάτω ήταν η διερεύνηση της πιθανότητας ύπαρξης ανθεκτικότητας σε οκτώ πληθυσμούς κόκκινου ρυζιού στο ζιζανιοκτόνο imazamox, το οποίο, όπως προαναφέρθηκε, ανήκει στην οικογένεια των ιμιδαζολινονών και αναστέλλει τη δράση του ενζύμου ALS Υλικά και μέθοδοι Συλλογή φυτικού υλικού Οι σπόροι του κόκκινου ρυζιού συλλέχθηκαν από ορυζώνες της Χαλάστρας του Νομού Θεσσαλονίκης κατά τους θερινούς μήνες του Ειδικότερα, οι σπόροι συλλέχθηκαν από ορυζώνες παραγωγών, οι οποίοι εξέφρασαν παράπονα για μη αποτελεσματική αντιμετώπιση του κόκκινου ρυζιού, μετά από εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου imazamox. Οι σπόροι, μετά τη συλλογή, μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο του Αγροκτήματος ΑΠΘ, όπου, αφού έγινε αεροξήρανση και απομάκρυνση ξένων υλών, αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασία ψυγείου 3-5 βαθμούς Κελσίου έως την διεξαγωγή των πειραμάτων. Η σύγκριση των πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού έγινε με σπόρους της ευαίσθητης ποικιλίας καλλιεργούμενου ρυζιού 'Ολυμπιάδα' και της ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού ('Sirio') τύπου 'Clearfield', οι οποίοι (σπόροι) αποθηκεύθηκαν στο ίδιο ψυγείο Πειράματα φυτοδοχείων Η διεξαγωγή των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε στο Αγρόκτημα του ΑΠΘ κατά την χρονική περίοδο Μαϊου - Σεπτεμβρίου του Χρησιμοποιήθηκαν πλαστικά φυτοδοχεία διαστάσεων 9 x 9 x 10 cm που περιείχαν μίγμα εδάφους και άμμου σε αναλογία 3:1 (v:v). Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 14 σπόροι και στην συνέχεια καλύφθηκαν με λεπτό στρώμα 1 cm του ίδιου μίγματος. Το σύνολο των φυτοδοχείων τοποθετήθηκε σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήματος που ήταν προστατευμένος με δίχτυ. Στο στάδιο των των 2-3 φύλλων έγινε αραίωμα και 28

29 αφέθηκαν 4-7 φυτά ανά φυτοδοχείο (ανάλογα με τη φυτρωτική ικανότητα των σπόρων). Όλα τα φυτοδοχεία διατηρήθηκαν καθαρά από άλλα ζιζάνια καθ όλη την διάρκεια του πειράματος. Επίσης, για την κάλυψη των αναγκών των φυτών σε θρεπτικά στοιχεία γινόταν λίπανση με νιτρική αμμωνία, ενώ για την κάλυψη των αναγκών των φυτών σε νερό εγκαταστάθηκε σύστημα αυτόματης άρδευσης με μικροψεκαστήρες τύπου υδρονέφωσης. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν καθημερινά και ήταν τοποθετημένα σε τελάρα γεμάτα με νερό με σκοπό την προσομοίωση των ορυζώνων υπό κατάκλυση. Η εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων imazamox, glyphosate 2 και cycloxydim 3 έγινε μεταφυτρωτικά όταν τα φυτά βρίσκονταν στο στάδιο 3-5 φύλλα. Για τους ψεκασμούς χρησιμοποιήθηκε επιστήθιος ψεκαστήρας ΑΖΟ 4 (ΑΖΡ- SPRAYERS, P.O.Box BJEDE Ολλανδία), ο οποίος φέρει ιστό έξι ακροφυσίων τύπου ριπιδίου (TeeJet Spray Systems Co., P.O. Box 7900, Wheaton, IL 60188, Ηνωμένες Πολιτείες) και πλάτους 2,4m. Η εφαρμογή έγινε με όγκο ψεκαστικού υγρού 30L/στρ και πίεση 280 kpa. Το ζιζανιοκτόνο imazamox εφαρμόστηκε σε πέντε δόσεις [0x, μισή (1/2x), συνιστώμενη (1x), διπλάσια (2x), τετραπλάσια (4x) και οκταπλάσια της συνιστώμενης (8x)]. Συγκεκριμένα, οι δόσεις του imazamox (Pulsar 4 SL, BASF Hellas, Σίνδος, Θεσσαλονίκη) ήταν 0, 4, 8, 16, 32 και 64 g δ.ο./στρ, οι οποίες εφαρμόστηκαν με την προσθήκη της επιφανειοδραστικής ουσίας Dash 6 (0,33% v/v) (Dash HC, Basf Hellas, Λεωφόρος Μεσογείων, , Αττική). Τα ζιζανιοκτόνα glyphosate και cycloxydim εφαρμόστηκαν στη συνιστώμενη δόση τους. Τέσσερις εβδομάδες μετά την εφαρμογή των επεμβάσεων αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα του ζιζανιοκτόνου imazamox εναντίον των πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού. Αρχικά έγινε μέτρηση του αριθμού των φυτών ανά φυτοδοχείο που επέζησαν μετά την επέμβαση, ενώ στη συνέχεια προσδιορίστηκε και το υπέργειο νωπό βάρος ανά φυτοδοχείο. Το νωπό βάρος των φυτών εκφράστηκε ως % μείωσης της ανάπτυξής τους σε σχέση με τα φυτά του αψέκαστου μάρτυρα κάθε πληθυσμού. Τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA). Το πειραματικό σχέδιο ήταν πλήρως τυχαιοποιημένο (Complete Random Design, CRD) και για κάθε επέμβαση υπήρχαν τέσσερεις επαναλήψεις. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές ακολουθώντας ακριβώς την ίδια διαδικασία. Η ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) έγινε με βάση την παραγοντική προσέγγιση 10 (8 πληθυσμοί κόκκινου ρυζιού, 1 ανθεκτική ποικιλία ρυζιού, 1 ευαίσθητη ποικιλία 29

30 ρυζιού) x 5 (δόσεις ζιζανιοκτόνου) x 4 (επαναλήψεις). Οι επεμβάσεις των μη εκλεκτικών ζιζανιοκτόνων glyphosate και cycloxydim δεν συμπεριλήφθηκαν στην ANOVA, διότι είχαν άριστη δράση εναντίον όλων των πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και των δύο ποικιλιών ρυζιού. Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS. Τα δεδομένα των δύο πειραμάτων, μετά τη σύγκριση των μέσων όρων με το κριτήριο της Ελάχιστης Σημαντικής Διαφοράς (ΕΣΔ) και σε επίπεδο σημαντικότητας 5%, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της δόσης του ζιζανιοκτόνου imazamox που απαιτείται για την μείωση της ανάπτυξης των φυτών των πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού κατά 50% (GR 50 ). Ειδικότερα, τα δεδομένα του νωπού βάρους (εκφρασμένα ως % αναστολή της ανάπτυξης των φυτών σε σχέση με τα φυτά του αψέκαστου μάρτυρα του κάθε πληθυσμού) χρησιμοποιήθηκαν για τους ανθεκτικούς πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού R2, R3, R4, R5 και R6 και της ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού Clearfield (Sirio) με σκοπό την εξεύρεση της εξίσωσης συμμεταβολής, που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ της δόσης του imazamox και του νωπού βάρους των φυτών. Μεταξύ των εξισώσεων συμμεταβολής αξιολογήθηκε και η λογιστική-λογαριθμική εξίσωση του Seefeldt κ.ά. (1995). y = C + D - C 1 + exp [b (log(x) - log(gr 50 ))] Όπου C = το πάνω όριο, D = το κάτω όριο, b = η κλίση της καμπύλης στην συγκέντρωση και GR 50 = η δόση του ζιζανιοκτόνου που απαιτείται για 50% μείωση στην ανάπτυξη των φυτών. Στην εξίσωση αυτή η δόση του ζιζανιοκτόνου είναι η ανεξάρτητη μεταβλητή (x), ενώ το νωπό βάρος η εξαρτημένη μεταβλητή (y). Η εξίσωση συμμεταβολής που περιέγραψε καλύτερα την σχέση μεταξύ της δόσης του ζιζανιοκτόνου και του νωπού βάρους χρησιμοποιήθηκε με σκοπό τον υπολογισμό της δόσης του ζιζανιοκτόνου imazamox που προκαλεί μείωση στην ανάπτυξη του νωπού βάρους κατά 50% (GR 50 ). Στην συνέχεια υπολογίστηκαν με βάση την λογιστικήλογαριθμηκή εξίσωση του Seefeldt κ.ά. (1995) οι τιμές GR 50 για τους πέντε πιθανώς ανθεκτικούς πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού (Πινακας 3). 30

31 2.3. Αποτελέσματα και συζήτηση Η ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι το νωπό βάρος των φυτών επηρεάστηκε από τον χρόνο εκτέλεσης του πειράματος, τους πληθυσμούς-ποικιλίες, τις δόσεις του imazamox και από τις αλληλεπιδράσεις χρόνος πειράματος x πληθυσμοί-ποικιλίες, πληθυσμοί-ποικιλίες x δόσεις imazamox, χρόνος πειράματος x δόσεις imazamox και τέλος από την αλληλεπίδραση χρόνος πειράματος x πληθυσμοί-ποικιλίες x δόσεις imazamox (Παράρτημα Β). Έτσι, αποφασίστηκε να παρουσιαστούν και να συγκριθούν οι μέσοι όροι της τριπλής αλληλεπίδρασης των παραγόντων. Ειδικότερα, η εφαρμογή της διπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση (2x) στο πρώτο πείραμα προκάλεσε μικρή μείωση της ανάπτυξης των φυτών πέντε πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού (R2, R3, R4, R5 και R6, οι οποίο χαρακτηρίστηκαν ως πιθανώς ανθεκτικοί) και της ανθεκτικής ποικιλίας Clearfield (Sirio) κατά 20, 18, 0, 48, 53 και 23%, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Τα δεδομένα του δεύτερου πειράματος έδειξαν παρόμοια εικόνα με τα δεδομένα του πρώτου πειράματος, αφού η εφαρμογή της διπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση του imazamox μείωσε την ανάπτυξη των φυτών των R2, R3, R4, R5 και R6 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ποικιλίας Clearfield (Sirio) κατά 50, 44, 13, 8, 53 και 62%, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Τα δεδομένα των δύο πειραμάτων δείχνουν ότι η εφαρμογή της διπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση (8x) προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης των φυτών των πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού R2, R3, R4, R5 και R6 και της ποικιλίας Clearfield (Sirio), η οποία κυμάνθηκε από 6% έως και 53%, ενώ η φθίνουσα σειρά ευαισθησίας στο imazamox, βάσει του νωπού των επιβιωσάντων φυτών, είναι R4 > R3 > R2 > Clearfield Sirio R5 > R6. 31

32 Μείωση νωπού βάρους (% του μάρτυρα) Μείωση νωπού βάρους (% του μάρτυρα) 100 Πείραμα R4 R3 Sirio R2 R5 R Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) 100 R2 Πείραμα 2 80 R4 60 Sirio 40 R5 20 R3 R Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) Σχήμα 3. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου imazamox στο νωπό βάρος των φυτών πέντε πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ανθεκτικής ποικιλίας Clearfield (Sirio) στα δύο πειράματα. Η ανάλυση των δεδομένων-αριθμός φυτών ανά φυτοδοχείο έδειξε ότι, στο πρώτο πείραμα, η εφαρμογή της διπλάσιας από τη συνιστώμενη δόση (2x) προκάλεσε μείωση στον αριθμό των επιβιωσάντων φυτών του κάθε πληθυσμού (σε σύγκριση με τα φυτά του αψέκαστου μάρτυρα του ιδίου πληθυσμού) του κόκκινου ρυζιού, η οποία μείωση για τους προαναφερθέντες πιθανώς ανθεκτικούς R2, R3, R4, R5 και R6 πληθυσμούς και την ανθεκτική ποικιλία Clearfield (Sirio) ήταν 0, 0, 0, 32

33 Αριθμός φυτών/φυτοδοχείο Αριθμός φυτών/φυτοδοχείο 20, 70 και 0%, αντίστοιχα (Σχήμα 4), ενώ η αντίστοιχη μείωση στο δεύτερο πείραμα ήταν 0, 0, 0, 0, 0 και 0% (Σχήμα 4). 10 Πείραμα 1 R1 R3 R2 5 R4 R5 0 R Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) 10 Πείραμα R2 Sirio R3 R4 R6 R Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) Σχήμα 4. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου imazamox στον αριθμό φυτών/φυτοδοχείο για τους ανθεκτικούς πληθυσμούς στο 1ο και 2ο πείραμα. Η συνδυασμένη ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι το νωπό βάρος των φυτών τριών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού (S1, S3, S4) και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού Ολυμπιάδα μειώθηκε κατά 100, 96, 98 και 100%, αντίστοιχα, από την εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης του imazamox και στα δύο πειράμα (Σχήματα 5). Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η φθίνουσα σειρά ευαισθησίας στο imazamox, βάσει του νωπού των επιβιωσάντων φυτών στη συνιστώμενη δόση, είναι S1 = Ολυμπιάδα > S4 33

34 Μείωση νωπού βάρους (% του μάρτυρα) Μείωση νωπού βάρους (% του μάρτυρα) > S3. Η αντίστοιχη συνδυασμένη ανάλυση των δεδομένων-αριθμός φυτών έδειξε ότι το χαρακτηριστικό αυτό των τριών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού Ολυμπιάδα μειώθηκε κατά % από την εφαρμογή της μισής από τη συνιστώμενη δόση του imazamox και στα δύο πειράμα (Σχήματα 6). Οι τρεις πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ευαίσθητοι (S1, S3, S4). 100 Πείραμα Ολυμπιάδα S3 S4 S Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) Πείραμα 2 Ολυμπιάδα S3 S4 S Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) Σχήμα 5. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου imazamox στο νωπό βάρος (εκφραζόμενο % μάρτυρα) των τριών ευαίσθητων πληθυσμών και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού στα δύο πειράματα. 34

35 Αριθμός φυτών/φυτοδοχείο Αριθμός φυτών/φυτοδοχείο 10 5 Πείραμα 1 Ολυμπιάδα S3 S4 S Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) 10 5 Πείραμα 2 Ολυμπιάδα S3 S4 S Δόση imazamox (g δ.ο./στρ) Σχήμα 6. Επίδραση του ζιζανιοκτόνου imazamox στον αριθμό φυτών των τριών ευαίσθητων πληθυσμών και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού στα δύο πειράματα. Οι υπολογισθείσες τιμές GR 50 από τη λογιστική-λογαριθμική εξίσωση του Seefeldt κ.ά. (1995) έδειξαν ότι 6->64 g δ.ο. imazamox/στρ χρειάστηκαν για να μειωθεί το νωπό βάρος των πιθανώς ανθεκτικών R2, R3, R4, R5 και R6 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ανθεκτικής ποικιλίας Clearfield (Sirio) (Πίνακας 3). Ειδικότερα, η δόση των 64 g δ.ο. imazamox/στρ δεν κατάφερε, στο πρώτο πείραμα, να μειώσει κατά 50% το νωπό βάρος των πληθυσμών R3 και R4. Αντίστοιχες τιμές GR 50 δεν υπολογίστηκαν για τους ευαίσθητους πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού διότι η μίση της συνιστώμενης δόσης του ζιζανιοκτόνου imazamox προκαλεί μείωση στην ανάπτυξη των ευαίσθητων φυτών μεγαλύτερη του 50%. 35

36 Πίνακας 3. Τιμές GR 50 πέντε ανθεκτικών πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ποικιλίας Clearfield (R1) Πληθυσμοί GR 50 (g δ.ο imazamox/στρ) Πείραμα Ι Πείραμα ΙΙ Clearfield R R3 >64 16 R4 >64 31 R R6 6 6 Η μείωση του νωπού βάρους και του αριθμού φυτών των S1, S3 και S4 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού κατά % από τη συνιστώμενη δόση δείχνει ότι οι πληθυσμοί αυτοί δεν εμφάνισαν ανθεκτικότητα στο imazamox. Αντίθετα, η μείωση του νωπού βάρους και του αριθμού φυτών των R2, R3, R4, R5 και R6 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού κατά 0-60% από τη διπλάσια της συνιστώμενης δόσης του imazamox δείχνει ότι οι πληθυσμοί αυτοί πιθανώς εμφάνισαν ανθεκτικότητα. Αυτό άλλωστε επιβεβαιώθηκε και από τον υπολογισμό των GR 50 τιμών, οι οποίες έδειξαν ότι απαιτούνται 6->64 g δ.ο./στρ για τη μείωση κατά 50% του νωπού βάρους των φυτών τους. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρονται από τους Kaloumenos κ.ά. (2013), οι οποίοι βρήκαν ότι το νωπό βάρος των ευαίσθητων πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού μειώθηκε κατά 96% και 95%, αντίστοιχα, μετά από εφαρμογή της συνιστώμενης δόσης του imazamox. Επιπροσθέτως, το ποσοστό επιβίωσης των ευαίσθητων πληθυσμών του κόκκινου ρυζού και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού για το imazamox ήταν μικρότερο από 2%. Αντίθετα, οι ίδιες δόσεις του imazamox είχαν ως αποτέλεσμα τη μη ικανοποιητική αντιμετώπιση των πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού. Πιο συγκεκριμένα, η συνιστώμενη δόση του imazamox προκάλεσε μείωση στο νωπό βάρος τους κατά 6,4 με 15,8% αντίστοιχα, ενώ η επέμβαση της οκταπλάσιας δόσης του μείωσε το νωπό βάρος των πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών ρυζιού κατά 26%. Η εξίσωση συμμεταβολής που περιέγραψε καλύτερα την σχέση μεταξύ της δόσης του ζιζανιοκτόνου και του νωπού βάρους χρησιμοποιήθηκε με σκοπό τον 36

37 υπολογισμό της δόσης του ζιζανιοκτόνου imazamox που προκαλεί μείωση στο νωπό βάρος κατά 50% (GR 50 ). Πιο συγκεκριμένα, οι υπολογισθείσες τιμές GR 50 για τους ευαίσθητους πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού και την ευαίσθητη ποικιλία ρυζιού ήταν 2,8 και 2 g/στρ για το imazamox, αντίστοιχα. Αντίθετα, για τον πιθανώς ανθεκτικό πληθυσμό του κόκκινου ρυζιού και την ανθεκτική ποικιλία ρυζιού Clearfield οι δόσεις GR 50 δεν μπόρεσαν να υπολογισθούν διότι ήταν μεγαλύτερες της οκταπλάσιας δόσης του imazamox (64 g δ.ο./στρ). Οι υπολογισθείσες τιμές της έντασης ανθεκτικότητας για τoν πιθανώς ανθεκτικό πληθυσμό του κόκκινου ρυζιου και της ποικιλίας ρυζιού Clearfield ήταν μεγαλύτερες από 23 και 33 για το ζιζανιοκτόνο imazamox. Παρόμοια πειράματα φυτοδοχείων έδειξαν ότι το 56% των πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού, που δεν αντιμετωπίστηκαν ικανοποιητικά με imazamox, προήλθαν από ορυζώνες που καλλιεργούνταν με Clearfield ποικιλίες ρυζιού (Rio Grande do Sul). Επιπροσθέτως, πειράματα αγρού που έγιναν στο Αρκάνσας των ΗΠΑ έδειξαν ότι τρείς από τους 130 πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού ήταν περιπού 9 με 21,4 φορές ανθεκτικοί από ό,τι ο ευαίσθητος πληθυσμός στο imazamox Συμπεράσματα 1) Η μείωση του νωπού βάρους και του αριθμού φυτών των R2, R3, R4, R5 και R6 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ανθεκτικής ποικιλίας Clearfield (Sirio) επηρεάστηκε κατά 0-60% από τη διπλάσια της συνιστώμενης δόσης. 2) Η φθίνουσα σειρά ανθεκτικότητας, με βάση το νωπό βάρος, των πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών και της ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού ήταν R4 > R3 > R2 > Clearfield (Sirio) > R5 > R6, ενώ η αντίστοιχη φθίνουσα σειρά, με βάση την τιμή GR 50, ήταν R4 > R3 > Clearfield (Sirio) > R2 > R5 > R6. 3) Η μείωση του νωπού βάρους και του αριθμού φυτών των S1, S3 και S4 πληθυσμών κόκκινου ρυζιού και της ευαίσθητης ποικιλίας Ολυμπιάδα επηρεάστηκε κατά % από τη συνιστώμενη δόση. 4) Η φθίνουσα σειρά ευαισθησίας, βάσει του νωπού βάρους, των ευαίσθητων πληθυσμών και της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού ήταν S1 = Ολυμπιάδα > S4 > S3. 37

38 5) Οι πέντε από τους οκτώ πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού ήταν ανθεκτικοί στο imazamox, ενώ οι υπόλοιποι τρεις ήταν ευαίσθητοι. 6) Το νωπό βάρος των πέντε πιθανώς ανθεκτικών πληθυσμών R2, R3, R4, R5 και R6 ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού Clearfield (Sirio) μειώθηκε με την αύξηση της δόσης του imazamox αλλά όχι ανάλογα. 38

39 3. Γονιδιακή και βιοχημική βάση της ανθεκτικότητας οκτώ πληθυσμών κόκκινου ρυζιού στο imazamox 3.1. Εισαγωγή Η ανθεκτικότητα των περισσοτέρων ειδών ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνααναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS ελέγχεται-κωδικοποιείται από ένα κυρίαρχο ή ημικυρίαρχο als γονίδιο του πυρήνα. Υπάρχουν όμως είδη φυτών που έχουν περισσότερα als γονίδια, ενώ άλλα είδη εμφανίζουν als γονίδιο με πλειοτροπική έκφραση. Γενικώς, τα als γονίδια των διαφόρων φυτών κωδικοποιούν πολυπεπτίδια με 80% ταυτόσημη αλληλουχία αμινοξέων (Chipman κ.ά., 1998), ενώ ο αριθμός των als γονιδιακών θέσεων στο γένωμα των φυτών ποικίλει ανάλογα με το βαθμό πλοειδίας τους (Scarabel κ.ά., 2004; Stidham, 1991). Για παράδειγμα, ο πολυπλοειδής αραβόσιτος (Zea mays L.) έχει als γονίδια σε δύο ασύνδετους γενετικούς τόπους, ενώ το διπλοειδές είδος Arabidopsis thaliana L. έχει ένα als γονίδιο (Mazur κ.ά, 1987; Fang κ.ά., 1992) Δομή του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) Τα φυτά και οι μικροοργανισμοί φέρουν το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS) με αποτέλεσμα να είναι ικανά να βιοσυνθέτουν τα αμινοξέα με διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile). Αντίθετα, οι ζωικοί οργανισμοί στερούνται της παρουσίας αυτού του ενζύμου (Coruzzi και Last, 2000). Το ένζυμο ALS ή AHAS κωδικοποιείται-βιοσυντίθεται στα ριβοσώματα από το als γονίδιο του πυρήνα και στη συνέχεια μεταφέρεται, με τη βοήθεια ενός διαμετακομιστικού πεπτιδίου-μεταφορέα CTP (chloroplast transit peptide), στα πλαστίδια-χλωροπλάστες, όπου εκδηλώνει την καταλυτική του δράση (Scarabel κ.ά., 2004; McCourt και Duggleby, 2006). Το ALS ή AHAS είναι ένζυμο κλειδί κατά τη βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile) (Chipman και Duggleby, 2005). Το ένζυμο ALS αποτελείται από την καταλυτική και τη ρυθμιστική υπομονάδα. Η καταλυτική υπομονάδα, η οποία καταλύει παράλληλες αντιδράσεις κατά τη βιοσύνθεση των τριών αμινοξέων εντός των χλωροπλαστών, περιλαμβάνει το ενεργό κέντρο του ενζύμου και τρεις συμπαράγοντες-προσθετικές ομάδες, ενώ η ρυθμιστική υπομονάδα αναστέλλει τη δράση του ενζύμου ALS όταν τα αμινοξέα 39

40 βαλίνη, λευκίνη και ισολευκίνη παράγονται στην αναγκαία για το φυτό ποσότητα. Η αρνητική αυτή ρύθμιση της δράσης του ενζύμου ALS είναι γνωστή ως ανάδρομη παρεμπόδιση (feedback inhibition) ή ανάδραση ή αναστολή από ανάδρομη τροφοδότηση (Duggleby κ.ά., 2008; Ελευθεροχωρινός, 2014).). Η δομή της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου ALS, σύμφωνα με την κρυσταλλογραφική ανάλυση του ενζύμου ALS από το φυτικό είδος A. thaliana, περιλαμβάνει από τρείς περιοχές (domains) α, β, γ και από ένα πολυπεπτίδιο, το οποίο περιλαμβάνει μέχρι και 85 αμινοξέα και αποτελεί το πεπτίδιο μεταφορέα του ενζύμου ALS από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες. Η α-, β- και γ-περιοχή αποτελείται από , και αμινοξέα, αντίστοιχα (Σχήμα 7). Σχήμα 7. Σχηματική απεικόνιση της δομής των α-, β-, γ-, περιοχών της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου ALS από το φυτικό είδος A.thaliana. Η α-περιοχή, β- περιοχή και γ-περιοχή αντιστοιχεί στο λαχανί, πράσινο και γκρι χρώμα (Duggleby κ.ά., 2008) Δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) Το ένζυμο οξικογαλακτική συνθάση (ALS ή AHAS), όπως προαναφέρθηκε, είναι το ένζυμο κλειδί κατά τη βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνη (Val), λευκίνη (Leu) και ισολευκίνη (Ile). Ειδικότερα, το ένζυμο αυτό είναι υπεύθυνο για τις παράλληλες αντιδράσεις συμπύκνωσης δύο μορίων πυροσταφυλικού οξέος για τη βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος ή της συμπύκνωσης του πυροσταφυλικού οξέος με το 2-κετοβουτυρικό οξύ για τη βιοσύνθεση του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού οξέος. Η βιοσύνθεση οξικογαλακτικού οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης των αμινοξέων Val και Leu, ενώ η βιοσύνθεση του 2-οξικο-2-υδροξυβουτυρικού 40

41 οξέος είναι το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης του αμινοξέος Ile (Chipman κ.ά., 1998; Corbett και Tardif, 2006; Duggleby κ.ά., 2008). Το πρώτο στάδιο των δύο αντιδράσεων συμπύκνωσης είναι η διάσπαση ενός δεσμού C C που βρίσκεται κοντά σε μία καρβονυλομάδα. Τα ένζυμα που καταλύουν τέτοιου είδους αντιδράσεις διάσπασης, όπως το ένζυμο ALS, απαιτούν την παρουσία τριών συμπαραγόντων-προσθετικών ομάδων, δηλαδή τη διφωσφορική θειαμίνη (ThDP), ένα δισθενές μεταλλικό κατιόν (Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Cd 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+, Ba 2+ ή Ni 2+ ) και το φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (FAD)] (Duggleby κ.ά., 2008 ). Η ThDP αντιδρά με το πυροσταφυλικό οξύ και σχηματίζει το συνδεδεμένο στο ένζυμο σύμπλοκο υδροξυαιθυλο-thdp ως ενδιάμεσο προϊόν, αφού απομακρυνθεί ένα άτομο άνθρακα με τη μορφή CO 2. Στη συνέχεια, το ενδιάμεσο προϊόν αντιδρά με το 2-κετοβουτυρικό οξύ ή το πυροσταφυλικό οξύ για το σχηματισμό του 2-οξικό-2- υδροξυ-βουτυρικού οξέος ή οξικογαλακτικού οξέος, αντίστοιχα. Σχήμα 8. Αντιδράσεις που καταλύονται από το ένζυμο ALS για την βιοσύνθεση βαλίνης (Val), λευκίνης (Leu), ισολευκίνης (Ile), αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα (Corbett και Tardif, 2006). Το ένζυμο ALS, για την καταλυτική του δραστηριότητα, εκτός από την ThDP, απαιτεί, όπως προαναφέρθηκε, ένα μεταλλικό ιόν, το οποίο συμβάλλει στην πρόσδεση της ThDP με το πολυπεπτίδιο και την αύξηση της δράσης του. Για παράδειγμα, το ένζυμο AHASII του μικροογρανισμού Salmonella typhimurium ενεργοποιείται με την παρουσία ενός εκ των μεταλλικών ιόντων Mg 2+, Ca 2+, Cd 2+, 41

42 Co 2+, Mn 2+, Zn 2+, Cu 2+, Al 3+, Ba 2+, Ni 2+. Ειδικότερα, η καταλυτική δράση του AHASII αυξάνεται κατά 50% και κατά 133% με την παρουσία του Ni 2+ και του Mn 2+, αντίστοιχα, συγκριτικά με την παρουσία του Mg 2+ (Duggleby, 2008). Τέλος, το ένζυμο ALS για να δράσει απαιτεί το φλαβινοαδενινο-δινουκλεοτίδιο (FAD), το οποίο αποτελεί εξελικτικό κατάλοιπο της υποομάδας των ThDP-εξαρτώμενων ενζύμων. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση έδειξε ότι το FAD είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο στην επιφάνειά του και συγκεκριμένα στην β-περιοχή (Duggleby κ.ά., 2008) Βιοχημική βάση της πρόσδεσης ζιζανιοκτόνων στο ένζυμο ALS Τα ζιζανιοκτόνα ALS-αναστολείς δεν δρουν ως απλοί υποκαταστάτες ή ως ανταγωνιστικές ουσίες των υποστρωμάτων ή των συμπαραγόντων του ενζύμου, αλλά ο μηχανισμός αναστολής της δράσης του ενζύμου ALS είναι πολύπλοκος (Duggleby και Pang, 2000). Συγκεκριμένα, τα ζιζανιοκτόνα των σουλφονυλουρίων και των ιμιδαζολινόνων προσδένονται σε θέσεις στο εσωτερικό του ενζύμου, με αποτέλεσμα να εμποδίζουν την πρόσβαση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο του. Έτσι, οι δύο οικογένειες των ζιζανιοκτόνων αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS εμποδίζοντας την είσοδο-πρόσβαση του υποστρώματος στην ενεργή περιοχή (Duggleby κ.ά.,2008). Η σουλφονυλομάδα των σουλφονυλουριών και ο αρωματικός δακτύλιος λαμβάνουν θέση στην είσοδο της διόδου προς το ενεργό κέντρο, ενώ το υπόλοιπο μόριο λαμβάνει θέση εντός της διόδου. Το μόριο των ιμιδαζολινονών είναι τοποθετημένο εντός της διόδου του υποστρώματος με τέτοιο τρόπο ώστε ο διυδροϊμιδαζολινονικός δακτύλιος να προσανατολίζεται προς τη διφωσφορική θειαμίνη (ThDP), ενώ ο κινολινικός δακτύλιος να βρίσκεται προς την επιφάνεια του ενζύμου. Είναι γεγονός ότι οι σουλφονυλουρίες είναι ισχυρότεροι αναστολείς του ενζύμου ALS συγκριτικά με τις ιμιδαζολινόνες, και αυτό εξηγείται από την καλύτερη συνάφειά τους με το ένζυμο ALS. Γενικώς, οι σουλφονυλουρίες εμφανίζουν μεγαλύτερο αριθμό τόσο υδρόφοβων δεσμών και όσο δεσμών υδρογόνου με την πολυπεπτιδική αλυσίδα του ALS, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους δεσμούς των ιμιδαζολινονών. Επίσης, οι σουλφονυλουρίες προσδένονται πιο κοντά στο ενεργό κέντρο του ενζύμου και πιο κοντά στη ThDP από ό,τι οι ιμιδαζολινόνες (McCourt κ.ά., 2006). Οι σουλφονυλουρίες και οι ιμιδαζολινόνες έχουν αλληλεπικαλυπτόμενο σημείο σύνδεσης στο ένζυμο ALS των φυτών (10 από τα 24 αμινοξέα που συμμετέχουν στις 42

43 αλληλεπιδράσεις με το ένζυμο είναι κοινά για τις δύο οικογένειες). Οι σουλφονυλουρίες σχηματίζουν δεσμό υδρογόνου με την προλίνη στη θέση 197 (Pro197) του ενζύμου ALS και υδρόφοβο δεσμό με την τρυπτοφάνη στη θέση 574 (Trp574), ενώ οι ιμιδαζολινόνες σχηματίζουν υδρόφοβο δεσμό με την Trp574 ή με την αλανίνη στη θέση 122 (Ala122) και δεσμό υδρογόνου με τη σερίνη στη θέση 653 (Ser653). Βεβαίως, εκτός από αυτά τα αμινοξέα, η αλανίνη στη θέση 205 (Ala205), το ασπαρτικό οξύ στη θέση 376 (Asp376), η αργινίνη στη θέση 377 (Arg377) και η γλυκίνη στη θέση 654 (Gly654) συμμετέχουν στην πρόσδεση μεταξύ ενζύμου ALS και ζιζανιοκτόνων της ομάδας αυτής. Τέλος, και άλλα αμινοξέα, τα οποία δεν έχουν ταυτοποιηθεί ακόμη, μπορεί να συμμετέχουν στην πρόσδεση μεταξύ ALS και ζιζανιοκτόνων (Ελευθεροχωρινός, 2014; Duggleby κ.α., 2008; McCourt κ.ά., 2006; Scarabel κ.ά., 2009). Σχήμα 9. Διαγραμματική απεικόνιση της διάταξης-σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων (Α) chlorimuron (σουλφονυλουρία) και (Β) imazaquin (ιμιδαζολινόνη) στη δίοδο πρόσβασης του υποστρώματος προς το ενεργό κέντρο του ενζύμου ALS. Τα ζιζανιοκτόνα απεικονίζονται με τη μορφή ράβδων, ενώ τα αμινοξέα με γκρι επιφάνεια (McCourt κ.ά., 2006) Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστoλείς της δράσης του ενζύμου ALS Η ανθεκτικότητα των περισσότερων πληθυσμών ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της βιοσύνθεσης των αμινοξέων βαλίνης, λευκίνης και ισολευκίνης 43

44 (σουλφονυλουρίες, ιμιδαζολινόνες, πυριδινυλθειοβενζοϊκά, τριαζολοπυριμιδίνες, σουλφονυλαμινοκαρβονυλτριαζολινόνες) οφείλεται είτε στην τροποποίηση του ενζύμου ALS ή AHAS-στόχου δράσης είτε σε μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων εντός των ανθεκτικών φυτών. Το ένζυμο ALS, όπως προαναφέρθηκε, κωδικοποιείται από το als γονίδιο του πυρήνα, αλλά δρα στους χλωροπλάστες όπου και καταλύει τις αντιδράσεις βιοσύνθεσης των αμινοξέων με διακλαδισμένη αλυσίδα ατόμων άνθρακα (Ελευθεροχωρινός, 2014). Μια σημειακή μετάλλαξη στο als γονίδιο είναι υπεύθυνη για την αντικατάσταση ενός από τα αμινοξέα του ενζύμου ALS (Corbett και Tardif, 2006; Delye κ.ά., 2009; Tranel και Wright, 2002), με αποτέλεσμα την αδυναμία σύνδεσης των ζιζανιοκτόνων της ομάδας αυτής με το ένζυμο ALS και την ως εκ τούτου μη αναστολή της δράσης του ενζύμου (Boutsalis κ.ά., 1999; Duggleby κ.ά., 2008; Tranel και Wright, 2002). Τα διεθνή δεδομένα δείχνουν ότι έχει γίνει καταγραφή 22 διαφορετικών μεταλλάξεων του ALS γονιδίου, οι οποίες οδηγούν σε αντικαταστάσεις αμινοξέων που είναι υπεύθυνες για ανθεκτικότητα σε ζύμες, βακτήρια, πράσινα φύκη, φυτά (Duggleby κ.ά., 2008; Duggleby και Pang, 2000; Heap, 2014; Tranel και Wright, 2002). Ειδικότερα, σύμφωνα με την προτεινόμενη πρόσδεση του ενζύμου ALS με τις σουλφονυλουρίες, αυτές σχηματίζουν δεσμoύς υδρογόνου με την προλίνη στη θέση 197 (Pro 197) και υδρόφοβο δεσμό με την τρυπτοφάνη στη θέση 574 (Trp 574). Αντιστοίχως, οι ιμιδαζολινόνες σχηματίζουν δεσμό υδρογόνου με τη σερίνη στη θέση 653 (Ser 653) και υδρόφοβο δεσμό με την τρυπτοφάνη στην θέση 574 (Trp 574) ή την αλανίνηστη θέση 122 (Ala 122) (Duggleby κ.ά., 2008; Scarabel κ.ά., 2009). Επίσης, η πρόσδεση του ενζύμου ALS με τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής μπορεί να γίνει στα αμινοξέα αλανίνη στη θέση 205 (Ala 205), ασπαρτικό οξύ στη θέση 376 (Asp 376), αργινίνη στη θέση 377 (Arg 377) και γλυκίνη στη 654 (Gly 654) (Ελευθεροχωρινός, 2014). Η αντικατάσταση ενός εκ των προαναφερθέντων αμινοξέων παρέχει ανθεκτικότητα στο ένζυμο ALS και αυτό συμβαίνει διότι το νέο αμινοξύ εμποδίζει την πρόσδεση, δηλαδή την δημιουργία δεσμού υδρογόνου ή υδρόφοβου δεσμού μεταξύ ενζύμου και ζιζανιοκτόνου, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η δράση του. Οκτώ σημειακές μεταλλάξεις που έχουν καταγραφεί σε πληθυσμούς ζιζανίων (επιλογή μετά από εφαρμογές ζιζανιοκτόνου που αναστέλλει τη δράση του ALS ενζύμου) είναι οι σπουδαιότερες για την εμφάνιση ανθεκτικότητας. Ειδικότερα, οι μεταλλάξεις αυτές αφορούν την αντικατάσταση ενός από τα αμινοξέα Ala122, 44

45 Pro197 και Ala205 κοντά στο -ΝΗ+3 άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, του αμινοξέος Asp376 και Arg377 περίπου στο μέσο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και των αμινοξέων Trp574 Ser653 και Gly654 στο COO- άκρο (Σχήμα 10) (Delye κ.ά., 2009; Heap, 2014; Laplante κ.ά. 2009; Massa κ.ά., 2011; Tranel και Wright, 2002; Tranel κ.ά., 2012; Whaley κ.ά., 2007). Σχήμα 10. Σχηματική απεικόνιση του ενζύμου ALS με τα οκτώ αμινοξέα των οποίων η αντικατάσταση είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση ανθεκτικότητας των ζιζανίων. Το τμήμα στην αρχή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (CTP, Chloroplast Transit Peptide) είναι το πεπτίδιο μεταφοράς του ενζύμου από τον πυρήνα στους χλωροπλάστες (Tranel και Wright, 2002; Whaley κ.ά., 2007). Η αντικατάσταση της προλίνης στη θέση 197 (Pro 197) από θρεονίνη (Thr), σερίνη (Ser), αλανίνη (Ala) και άλλα αμινοξέα επάγει διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα των σουλφονυλουριών και των τριαζολοπυριμιδινών, σουλφονυλαμικαρβοξυλοτριαζολινονών, πυριμιδινυλοθειοβενζοϊκών και μέτρια ανθεκτικότητα σε ιμιδαζολινόνες. Η αντικατάσταση του αμινοξέος Ser653 από τη Thr ή την Asn οδήγησε σε ανάπτυξη πληθυσμών ζιζανίων με ανθεκτικότητα στις ιμιδαζολινόνες και όχι στις σουλφονυλουρίες. Επιπλέον, η αντικατάσταση του αμινοξέος αλανίνη στη θέση 205 (Ala205) επάγει ανθεκτικότητα στις ιμιδαζολινόνες και ευαισθησία στις σουλφονυλουρίες. Τέλος, η αντικατάσταση του αμινοξέος τρυπτοφάνη στη θέση 574 (Trp 574) από λευκίνη (Leu) οδηγεί σε διασταυρωτή ανθεκτικότητα σε όλα τα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS (Ελευθεροχωρινός, 2014). Ο μεγάλος αριθμός ζιζανίων με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS μπορεί να αποδοθεί στη συνεχή χρήση τους, την υψηλή δράση, την υπολειμματική τους διάρκεια, αλλά και σε γενετικούς, φυσιολογικούς και βιοχημικούς παράγοντες των φυτών (Beckie κ.ά., 2007). 45

46 Τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS Η ανθεκτικότητα ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS έχει εξελιχθεί με ραγδαίο ρυθμό σε σύγκριση με άλλες ομάδες των ζιζανιοκτόνων. Η πλειοψηφία των περιπτώσεων ανθεκτικότητας οφείλονται σε αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου στο als γονίδιο, η οποία προσδίδει ανθεκτικότητα στο ένζυμο-στόχο δράσης. Αυτό είχε ως συνέπεια την ανάπτυξη αξιόπιστων τεχνικών μοριακής διάγνωσης, οι οποίες βασίζονται στην αλληλούχηση τμήματος ή και ολόκληρου του als γονιδίου. Οι μοριακές τεχνικές παρέχουν ακριβή αποτελέσματα σε μικρό χρόνο, είναι υψηλού κόστους, απαιτούν εργαστηριακές εγκαταστάσεις και εξειδικευμένο προσωπικό, αλλά αδυνατούν να εξακριβώσουν ανθεκτικότητα που οφείλεται σε μη στόχο δράσης (non-target site resistance). Οι κυριότερες τεχνικές μοριακής διάγνωσης είναι 1) η ενίσχυση αλληλομόρφων γονιδίων με τεχνικές αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και στη συνέχεια αλληλούχηση του γονιδίου, 2) η ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους των θραυσμάτων DNA με ένζυμα περιορισμού, 3) η μετουσιωτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Οι τεχνικές αυτές παρέχουν σημαντικές και αξιόπιστες πληροφορίες που σχετίζονται με τον μηχανισμό ανθεκτικότητας και ειδικότερα με την μετάλλαξη του als γονιδίου, η οποία συμβάλλει στην κωδικοποίηση τροποποιημένου-ανθεκτικού ενζύμου ALS σε ζιζανιοκτόνα (Corbett και Tardif, 2006). Επιπλέον, για τη διάγνωση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων γίνονται πειράματα σε φυτοδοχεία, βιοδοκιμές προβλαστημένων σπόρων σε τρυβλία και in vitro μελέτη της κινητικής του ενζύμου ALS παρουσία ζιζανιοκτόνων. Τα πειράματα σε φυτοδοχεία και οι βιοδοκιμές, αν και παρέχουν αξιόπιστες πληροφορίες για την ανθεκτικότητα από πρακτικής πλευράς, αδυνατούν να παράσχουν πληροφορίες για τον μηχανισμό ανθεκτικότητας Ενίσχυση αλληλομόρφων γονιδίων με τεχνικές αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης Η μοριακή αυτή τεχνική βασίζεται στη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) με σκοπό τον εκθετικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος του γονιδίου όπου εικάζεται ότι περιέχονται μεταλλάξεις, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση ανθεκτικότητας. Στη συνέχεια, γίνεται αλληλούχηση των ενισχυμένων τμημάτων του γονιδίου, η οποία ακολουθείται από ανίχνευση των μεταλλάξεων μέσω 46

47 στοίχισης και σύγκρισης των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων από τα πιθανώς ανθεκτικά άτομα του ζιζανίου με τις αντίστοιχες αλληλουχίες ευαίσθητων ατόμων. Η αντίδραση που λαμβάνει χώρα στην τεχνική της PCR περιλαμβάνει τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο το γενωμικό (genomic) DNA θερμαίνεται με σκοπό την μετουσίωση του δίκλωνου (dsdna) DNA σε μονόκλωνο (ssdna), ενώ στο δεύτερο στάδιο η αντίδραση ψύχεται για να διευκολυνθεί η πρόσδεση των εκκινητών στην μονόκλωνη αλυσίδα του DNA. Τέλος, στο τρίτο στάδιο, με την βοήθεια της DNA πολυμεράσης, γίνεται η επέκταση του ολιγονουκλεοτιδίου με την χρήση περίσσειας τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dntps) ώστε να ενισχυθεί η περιοχή ενδιαφέροντος. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται αρκετές φορές (κύκλοι) (Corbett και Tardif, 2006α). Σχήμα 11. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) (Corbett και Tardif, 2006). Η αλληλούχηση του als γονιδίου, ως μέθοδος διάγνωσης της ανθεκτικότητας, είναι πολύ ακριβής και αξιόπιστη. Η μέθοδος αυτή όμως χαρακτηρίζεται από 1) περιορισμένο αριθμό διαδοχικών νουκλεοτιδίων που μπορούν να αλληλουχηθούν με την έως σήμερα διαθέσιμη τεχνολογία, 2) μεγάλο όγκο δεδομένων που παρέχει και δυσκολία ως εκ τούτου διαχείρισης και ελέγχου τους, 3) μεγάλες απαιτήσεις σε χρόνο εκτέλεσης και σε γνώσεις σε σύγκριση με άλλες μοριακές τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας (Corbett και Tardif, 2006). 47

48 3.2. Πειραματικές εργασίες Αξιολόγηση της γενετικής βάσης της ανθεκτικότητας σε οκτώ πληθυσμούς κόκκινου ρυζιού Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός αυτών των πειραμάτων ήταν η αλληλούχηση τμήματος του als γονιδίου από οκτώ πληθυσμούς κόκκινου ρυζιού (πέντε ανθεκτικοί και τρείς ευαίσθητοι) και από δύο ποικιλίες ρυζιού (ανθεκτική ποικιλία Clearfield (Sirio) και ευαίσθητη ποικιλία 'Ολυμπιάδα') ώστε να διερευνηθεί η γενετική βάση της ανθεκτικότητας και ειδικότερα να εντοπιστούν πιθανές μεταλλάξεις υπεύθυνες για την ανθεκτικότητα του κόκκινου ρυζιού στο ζιζανιοκτόνο imazamox Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Οι σπόροι από τους πέντε ανθεκτικούς και τρεις ευαίσθητους πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού καθώς επίσης και οι σπόροι από την ανθεκτική και ευαίσθητη ποικιλία ρυζιού στο imazamox σπάρθηκαν σε πλαστικά φυτοδοχεία διαστάσεων 10 x 10 x 9 cm, τα οποία περιείχαν μίγμα εδάφους και άμμου σε αναλογία 3:1 (v/v). Σε κάθε φυτοδοχείο σπάρθηκαν 14 σπόροι και στην συνέχεια καλύφθηκαν με λεπτό στρώμα 1 cm του ίδιου μίγματος. Το σύνολο των φυτοδοχείων τοποθετήθηκε σε υπαίθριο χώρο του Αγροκτήματος που ήταν προστατευμένος με δίχτυ. Στο στάδιο των 2-3 φύλλων έγινε αραίωμα και αφέθηκαν 7 φυτά ανά φυτοδοχείο. Όλα τα φυτοδοχεία διατηρήθηκαν καθαρά από άλλα ζιζάνια καθ όλη την διάρκεια του πειράματος, ενώ για την κάλυψη των αναγκών σε θρεπτικά στοιχεία εφαρμοζόνταν νιτρική αμμωνία δύο φορές την εβδομάδα. Για την κάλυψη των αναγκών των φυτών σε νερό εγκαταστάθηκε σύστημα αυτόματης άρδευσης με μικροψεκαστήρες τύπου υδρονέφωσης. Τα φυτοδοχεία αρδεύονταν καθημερινά δύο φορές και ήταν τοποθετημένα σε πλαστικά τελάρα γεμάτα με νερό με σκοπό την προσομοίωση των ορυζώνων υπό κατάκλυση. Η εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου έγινε μεταφυτρωτικά στην τετραπλάσια δόση (32 g/στρ) και όταν τα φυτά βρίσκονταν στα 3-5 φύλλα, ενώ για τον ψεκασμό χρησιμοποιήθηκε επιστήθιος ψεκαστάρας ΑΖΟ (ΑΖΡ-SPRAYERS, P.O. Box BJ EDE Ολλανδία), ο οποίος φέρει ιστό έξι ακροφυσίων τύπου ριπιδίου 8002 (TeeJet Spray Systems Co., P. O. Box 7900, Wheaton, IL 60188, Ηνωμένες Πολιτείες) και έχει πλάτος 2,4 m. Η εφαρμογή έγινε με όγκο ψεκαστικού υγρού 30 L/στρ και πίεση ψεκασμού 280 kpa. Τέσσερις εβδομάδες μετά την 48

49 εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων, συλλέχθηκαν δύο φυτά από κάθε ανθεκτικό πληθυσμό (από δύο φυτοδοχεία) και στη συνέχεια πάρθηκαν 100 mg φυτικού ιστού (έλασμα φύλλων) και, αφού τοποθετήθηκαν σε μικροσωλήνες φυγοκέντρου 1,5 ml, αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη Απομόνωση, ενίσχυση και αλληλούχηση τμήματος του als γονιδίου Τα δείγματα φυτικού ιστού (τοποθετημένα σε μικροσωλήνες φυγοκέντρησης όγκου 1,5 ml) αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη για να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων έως την εκχύλιση του γενωμικού DNA. Η απομόνωση του γενωμικού DNA από φυτά κάθε πληθυσμού κόκκινου ρυζιού (ανθεκτικού ή ευαίσθητου) έγινε με εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια και υλικά, αλλά με προδιαγεγραμμένο τρόπο και χρονική σειρά χρήσης τους ακολουθώντας τη CTAB μεθοδολογία 7, όπως αυτή περιγράφεται στις οδηγίες του παρασκευαστή. Από τη διαδικασία εκχύλισης παραλήφθηκαν 50 μl διαλύματος γενωμικού DNA, το οποίο διατηρήθηκε στους -80 o C έως την χρήση του. Το γενωμικό DNA των ανθεκτικών και των ευαίσθητων πληθυσμών κόκκινου ρυζιού χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την ενίσχυση τμήματος του als γονιδίου (210bp) με χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Αναλυτικότερα, η ενίσχυση του συγκεκριμένου τμήματος πραγματοποιήθηκε με χρήση του πάνω εκκινητή 5 -CCTGCAGTCCGTGTAACAAA-3 (Up-02) και του κάτω εκκινητή 5 GTGCTTTGCCAACATACAGATT-3 (Down-02). Το μείγμα της κάθε αντίδρασης για την PCR, για συνολικό όγκο 20 μl, περιείχε 10 μμ από κάθε εκκινητή, 10 μμ dntps mix, 1,5 mm MgCl 2, 2 μl από το 10x Taq Buffer και 0,2 μl Taq DNA polymerase. Το πρόγραμμα του θερμοκυκλοποιητή 8 περιλάμβανε ένα αρχικό στάδιο τήξης του DNA εκμαγείου στους 95 C για 3 min και στη συνέχεια 35 κύκλους με τα εξής στάδια: τήξη του DNΑ εκμαγείου στους 95 C για 30 sec, υβριδοποίηση των εκκινητών στους 53 C για 20 sec και επέκταση των εκκινητών στους 72 C για 15 sec. Μετά το πέρας του 35ου κύκλου, συμπεριλήφθηκε ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 C για 1 min. Τα προϊόντα των αντιδράσεων για κάθε πληθυσμό αποθηκεύτηκαν στους -20 C. Το προϊόν κάθε αλυσιδωτής αντίδρασης διαχωρίστηκε σε πηκτή αγαρόζης (1,5%) από όπου η ζώνη που αντιστοιχούσε στο τμήμα του als γονιδίου (210 bp) εντοπίστηκε και αποκόπηκε. Η παραλαβή του τμήματος του als γονιδίου από την 49

50 πηκτή αγαρόζης πραγματοποιήθηκε με χρήση εμπορικά διαθέσιμου συνόλου αντιδραστηρίων και υλικών, αλλά με προδιαγεγραμμένο τρόπο και χρονική σειρά χρήσης σύμφωνα με τη μεθοδολογία 9 που περιγράφεται στις οδηγίες χρήσης του παρασκευαστή (NucleoSpin ExtractII kit. Macherey Nagel GmbH &Co.KG. Postfach D Düren, Γερμανία). Το καθαρό προϊόν αποστάλθηκε αμέσως για αλληλούχηση σε εξειδικευμένο εργαστήριο της Λάρισας 10 (CeMIA. Λάρισα, , Λάρισα). Κάθε προϊόν αλληλουχήθηκε δύο φορές με τον εκκινητή Up-02. Η οπτικοποίηση και επεξεργασία των χρωματογραφημάτων αλληλούχησης έγινε με χρήση του λογισμικού BioEdit Sequence Alignment Editor. Το ίδιο λογισμικό χρησιμοποιήθηκε και για τη μετάφραση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων σε αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και αμινοξέων συγκρίθηκαν με χρήση του λογισμικού ClustalW Αποτελέσματα και συζήτηση Η σύγκριση-στοίχιση των χρωματογραφημάτων της αλληλούχησης τμήματος DNA (210 bp ζευγών βάσεων) του als γονιδίου από όλους τους πληθυσμούς του κόκκινου ρυζιού ακριβώς κάτω από την αλληλουχία του als ανθεκτικού γονιδίου του είδους A. thaliana (αλληλουχίες από την δικτυακή βάση δεδομένων GenBank Χ51514) καθώς και του als αλληλομόρφου μοριακού δείκτη της ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού 'Clearfield (Sirio)' έδειξε ότι όλα τα φυτά της ευαίσθητης ποικιλίας ρυζιού 'Ολυμπιάδα' και όλων των ευαίσθητων πληθυσμών του κόκκινου ρυζιού (S 1, S 3, S 4 ) περιείχαν στην θέση 653 της πολυπεπτιδικής αλυσίδας το κωδικόνιο που κωδικοποιεί το αμινοξύ σερίνη (Ser, AGT) και στην θέση 679 της πολυπεπτιδικής αλυσίδας το κωδικόνιο που κωδικοποιεί το αμινοξύ βαλίνη (Val, GTG) (Πίνακας 4). Η σύγκριση-στοίχιση των χρωματογραφημάτων της αλληλούχησης από τους ανθεκτικούς πληθυσμούς R2, R3, R4, R5 επιβεβαίωσε την ύπαρξη μετάλλαξης που οδηγεί στην αντικατάσταση στη θέση 653 του αμινοξέος σερίνη (Ser, AGT) από ασπαραγίνη (Asn, AAT) (Σχήμα 12) καθώς και την μετάλλαξη που οδηγεί την αντικατάσταση στη θέση 679 του αμινοξέος βαλίνη (Val, GTG) από μεθειονίνη (Met, ATG) (Σχήμα 13). Οι ίδιες μεταλλάξεις υπήρχαν και στο als γονίδιο της ανθεκτικής ποικιλίας ρυζιού Clearfield (Sirio), ενώ την μετάλλαξη Ser653-Asn είχε και το als γονίδιο από την A. thaliana (X51514) (Πίνακας 4). Αναλυτικότερα, στους ανθεκτικούς πληθυσμούς R 2, R 3, R 4, R 5 και ανθεκτική ποικιλία ρυζιού Clearfield 50

51 (Sirio) ανιχνεύτηκε μετάλλαξη στη δεύτερη βάση του κωδικονίου 653 και συγκεκριμένα αλλαγή της δεύτερης βάσης γουανίνη (G) από αδενίνη (A), η οποία οδήγησε σε αντικατάσταση της σερίνης (Ser, AGT) από ασπαραγίνη (Asn, AAT) στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Επιπροσθέτως, στους ανθεκτικούς πληθυσμούς διαπιστώθηκε δεύτερη μετάλλαξη στην πρώτη βάση του κωδικονίου 679 και συγκεκριμένα αλλαγή της πρώτης βάσης γουανίνη (G) από αδενίνη (A), η οποία οδήγησε σε αντικατάσταση της βαλίνης (Val, GTG) από μεθειονίνη (Met, ATG) στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Οι προαναφερθείσες αντικαταστάσεις ήταν σε ομοζυγωτία για όλα τα αξιολογηθέντα φυτά των ανθεκτικών πληθυσμών, εκτός των φυτών του ανθεκτικού πληθυσμού R6. 51

52 Σχήμα 12. Απεικόνιση χρωματογραφήματος αλληλούχησης του κωδικονίου της σερίνης (Ser, AGT) στη θέση 653 του als γονιδίου και του χρωματογραφήματος με αντικατάσταση του ενός νουκλεοτιδίου (G από Α) που οδηγεί σε αντικατάσταση της σερίνης (Ser, AGT) από ασπαραγίνη (Asn, AAT) στους ανθεκτικούς πληθυσμούς RR και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (μονές κορυφές). Πράσινη κορυφή αδενίνη (Α), με κόκκινη κορυφή θυμίνη (T) και με μαύρη κορυφή γουανίνη (G). Σχήμα 13. Απεικόνιση χρωματογραφήματος αλληλούχησης του κωδικονίου της βαλίνης (Val, GTG) στην θέση 679 του als γονιδίου και του χρωματογραφήματος με αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου (G από Α) που οδηγεί σε αντικατάσταση της βαλίνη (Val, GTG) από μεθειονίνη (Met, ATG) στους ανθεκτικούς πληθυσμούς RR και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (μονές κορυφές). Πράσινη κορυφή αδενίνη (Α), με κόκκινη κορυφή θυμίνη (T) και με μαύρη κορυφή γουανίνη (G). 52