ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΙΤΛΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΛΟΠΟΥΡΙΝΟΛΗΣ ΣΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΤΟ ΜΥΟΚΑΡΔΙΟ ΕΠΙΜΥΩΝ Κερασιώτη Ευθαλία Λάρισα 2008

2 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΠΗΡΕΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΕΙΑΙΚΗ ΣΥΛΛΟΓΗ «ΓΚΡΙΖΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ» Αριθ. Εισ.: Ημερ. Εισ.: Δωρεά: Ταξιθετικός Κωδικός: 6596/ Π.Θ. ΠΤ-ΒΒ 2008 ΚΕΡ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

3 1 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Κουρέτας Δημήτριος: Καθηγητής Φυσιολογίας Ζώων Κυπάρος Αντώνης: Διδάσκων ΠΔ 407/80 Κοντού Μαρία: Λέκτορας Κλινικής Χημείας Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή μου κ. Κουρέτα Δημήτριο, για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα, την πολύτιμη βοήθειά του και την καθοδήγησή του καθ' όλη τη διάρκεια της εργασίας. Ακόμη ευχαριστώ τον κ. Βεσκούκη Άρη για τις συμβουλές του σχετικά με την συγγραφή της συγκεκριμένης εργασίας μου και την συνεργασία του. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Κυπάρο Αντώνιο για την ευχάριστη συνεργασία και βοήθειά του στο εργαστήριο καθώς και τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη 8 1. Εισαγωγή Ελεύθερες Ρίζες (Free Radicals, FR) και Δραστικά Είδη 9 Οξυγόνου (ROS) Ανιόν του σουπεροξειδίου (02") Ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ ) Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) Μονήρες οξυγόνο (1θ2) Υποχλωριώδες οξύ (HOC1) Πηγές Παραγωγής Δρατικών Μορφων Οξυγόνου Ενδογενείς πηγές α Οξειδωτική φωσφορυλίωση 13 «έκρηξη» β Ουδετερόφιλα και αναπνευστική γ Μετατροπή της ξανθίνης σε ουρικό οξύ δ Κυτόχρωμα Ρ ε Αυτοοξείδωση μορίων Εξωγενείς πηγές 16

5 3 1.3 Βιολογική Δράση Των Δραστικών Ειδών Οξυγόνου Θετικές επιδράσεις Αρνητικές επιδράσεις Αντιοξειδωτικοί Μηχανισμοί Ενζυμικοί μηχανισμοί α Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) ρ Καταλάση (CAT) γ Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) δ Αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR) Μη Ενζυμικοί Μηχανισμοί α Βιταμίνη Ε β Βιταμίνη C γ Β-καροτίνη δ Γλουταθειόνη ε Συνένζυμο Q στ Σελήνιο Οξειδωτικό Στρες Επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες Άσκηση και οξειδωτικό στρες Αλοπουρινόλη Μηχανισμός δράσης 29

6 Χρήσεις Μεταβολισμός Αντιοξειδωτική δράση της αλοπουρινόλης Σκοπός Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Πειραματόζωα Χορήγηση Αλοπουρινόλης Εξοικείωση των Πειραματόζωων Πρωτόκολο Κολύμβησης Συλλογή Των Καρδιακών Μυών Μέθοδοι Οξειδάση της ξανθίνης Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) Πρωτεϊνικά καρβονύλια Γλουταθειόνη Καταλάση Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (Total 40 Antioxidant Capacity, TAC) 3.8 Στατιστική Ανάλυση Αποτελέσματα 41

7 4.1 Οξειδάση Της Ξανθίνης TBARS Πρωτεϊνικά Καρβονύλια Ανηγμένη Γλουταθειόνη Οξειδωμένη Γλουταθειόνη Λόγος Ανηγμένης προς Οξειδωμένη Γλουταθειόνη Καταλάση Αντιοξειδωτική Ικανότητα (TAC) Συζήτηση Παράρτημα Πρωτόκολλα Δεικτών Οξειδωτικού Στρες Οξειδάση ξανθίνης Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ(τβακ8) Πρωτεϊνικά καρβονύλια Γλουταθειόνη Καταλάση Ολική αντιοξειδωτική ικανότηταβγοίθι 55 Antioxidant Capacity, TAC) 7. Βιβλιογραφία 56

8 6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών 16 Εικόνα 2: Μηχανισμός πρωτεϊνικής οξείδωσης και 19 νιτροποίηση Εικόνα 3: Μηχανισμός δράσης της SOD 21 Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση του οξειδωτικού στρες 24 Εικόνα 5: Μονοπάτι δράσης της αλοπουρινόλης 29 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1: Συντακτικός τύπος της γλουταθειόνης 23 Σχήμα 2: Αντίδραση του ΤΒΑ με την MDA 36 Σχήμα 3: Αρχή προσδιορισμού της γλουταθειόνης 38 Σχήμα 4: Μονοπάτι αναγωγής του Η2Ο2 σε Η2Ο 39

9 7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Διάγραμμα 1: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 41 στη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης στην καρδιά Διάγραμμα 2: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 42 στη συγκέντρωση των ΤΒARS στην καρδιά Διάγραμμα 3: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 42 στη συγκέντρωση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων στην καρδιά Διάγραμμα 4: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 43 στη συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης στην καρδιά Διάγραμμα 5: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 43 στη συγκέντρωση της οξειδωμένης γλουταθειόνης στην καρδιά Διάγραμμα 6: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 44 στο λόγο ανηγμένης προς οξειδωμένη γλουταθειόνης στην καρδιά Διάγραμμα 7: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 45 στη δραστικότητα της καταλάσης στην καρδιά Διάγραμμα 8: Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης 45 στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα της καρδιάς

10 8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η άσκηση προκαλεί παραγωγή ελευθέρων ριζών και ως εκ τούτου είναι σημαντική πηγή οξειδωτικού στρες. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της άσκησης και της αλοπουρινόλης σε δείκτες οξειδωτικού στρες στο μυοκάρδιο επιμύων. Οι επίμυες μελετήθηκαν κάτω από τρεις καταστάσεις, κάτω από χορήγηση αλλοπουρινόλης, άσκησης και τον συνδυασμό τους. Τα δείγματα λήφθηκαν πριν, αμέσως μετά και 5 ώρες μετά το τέλος της άσκησης καθώς και τις αντίστοιχες χρονικές στιγμές μετά τη χορήγηση αλοπουρινόλης. Οι δείκτες οξειδωτικού στρες που μελετήθηκαν είναι η καταλάση (CAT), ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό (TBARS), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα(τac), τα πρωτεϊνικά καρβονύλια, η ανηγμένη (GSH) και η οξειδωμένη (GSSG) γλουταθειόνη και η οξειδάση της ξανθίνης. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων έδειξαν ότι μόνο η δραστικότητα της καταλάσης (CAT) αυξήθηκε από την επίδραση της άσκησης ενώ οι υπόλοιποι δείκτες παρέμειναν ανεπηρέαστοι. Η αλοπουρινόλη οδήγησε σε μείωση της δραστικότητας της οξειδάσης της ξανθίνης και σε μείωση της δραστικότητας της καταλάσης. Από την άλλη αύξησε την πρωτεϊνική οξείδωση και την συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στους υπόλοιπους δείκτες. Τέλος ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης μείωσαν τη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης ενώ αύξησαν τη συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης και το λόγο ανηγμένης προς οξειδωμένης γλουταθειόνης. Οι υπόλοιποι δείκτες δεν επηρεάστηκαν.

11 9 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ελεύθερες Ρίζες και Δραστικά Είδη Οξυγόνου Ελεύθερη ρίζα (Free Radical) είναι ένα χημικό μόριο που έχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική στοιβάδα σθένους. Προκύπτει από την προσθήκη ή την απώλεια ενός ηλεκτρονίου στην εξωτερική στοιβάδα (Mylonas and Kouretas, 1999). Εξαιτίας αυτών των ελεύθερων ηλεκτρονίων προκαλούν βλάβες στο DNA, στα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών και στις πρωτεΐνες. Λιποειδή Πρωτεΐνες Ένζυμα Νουκλεϊκά οξέα Υπεροξείδωση Μετουσίωση Απενερ γοποίη ση Μεταλλάξεις Βλάβες Α λ Ασθένειες Γήρανση Αρκετές ελεύθερες ρίζες είναι ή προέρχονται από τις δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) και από τις δραστικές μορφές αζώτου (reactive nitrogen species, RNS). Δραστικές μορφές οξυγόνου (π.χ. ΟΗ, RO, ROO, ROOH ) ονομάζονται τα δραστικά μόρια που προκύπτουν από το μοριακό οξυγόνο ή εκείνα που εύκολα μετατρέπονται σε δραστικές μορφές και συμμετέχουν σε τοξικές αντιδράσεις για τα κύτταρα. Μερικές από αυτές είναι ελεύθερες ρίζες. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου είναι τύποι οξυγόνου υψηλής δραστικότητας και εμφανίζονται φυσιολογικά στον οργανισμό ως αποτέλεσμα βιοχημικών διεργασιών. Συναντιόνται επίσης στο περιβάλλον και πιο συγκεκριμένα στους

12 10 ρυπαντές της ατμόσφαιρας, στον καπνό του τσιγάρου, στο αλκοόλ, στα συντηρητικά και τα λιπάσματα, στις υπεριώδεις ακτίνες και στο όζον. Οι ελεύθερες ρίζες έχει διαπιστωθεί ότι καταστρέφουν την μεμβράνη των κυττάρων, βλάπτουν και μεταλλάσσουν το DNA αυξάνοντας τον κίνδυνο δημιουργίας καρκινικών κυττάρων, μετατρέπουν ορισμένες χημικές ουσίες σε ενεργούς καρκινογόνους παράγοντες ενώ απενεργοποιούν και διασπούν πρωτεΐνες. Οι ενώσεις στις οποίες συμμετέχει το άζωτο λέγονται δραστικές μορφές αζώτου (NO, ΝΟ2, ΟΝΟΟ ) ενώ αυτές στις οποίες συμμετέχει το χλώριο λέγονται δραστικές μορφές χλωρίου. ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Radicals Ανιόν Σουπεροξειδίου (02") Ρίζα Υδροξυλίου (ΟΗ ) Ρίζα Υπεροξειδίου (ΙΑΑτ) Ρίζα Αλκοξειδίου (RO ) Ρίζα Υδροϋπεροξειδίου (Ηθ2') Non-radicals Υπεροξείδιο Υδρογόνου (Η2Ο2) Υποχλωριώδες Οξύ (HOC1) Υποβρωμιώδες Οξύ HOBr) Όζον (Ο3) Μονήρες Οξυγόνο (αθ2) ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΑΖΩΤΟΥ Radicals Ρίζα Μονοξειδίου Αζώτου (ΝΟή Ρίζα Διοξειδίου Αζώτου (Νθ2') Non-radicals Νιτρώδες Οξύ (ΗΝΟ2) Κατιόν Νιτροσυλίου (ΝΟ+) Ανιόν Νιτροσυλίου (ΝΟή Ανιόν του σουπεροζειδίου (Οι") Σχηματίζεται από την αναγωγή του οξυγόνου από ένα e_ σύμφωνα με την ακόλουθη αντίδραση: Ο2 + e---- Ο2 -

13 11 Η ρίζα του σουπεροξειδίου μπορεί να σχηματιστεί από την απευθείας μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο2 από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων του μιτοχονδρίου. Η ρίζα του σουπεροξειδίου μπορεί επίσης να σχηματιστεί από φαγοκύτταρα κατά τη διάρκεια της δράσης τους. Μικρότερες ποσότητες Or- παράγονται σαν ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μόρια από πολλούς τύπους κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών κυττάρων, των λεμφοκυττάρων και των ινοβλαστών. Η ρίζα του σουπεροξειδίου παράγεται επίσης από τη δράση της οξειδάσης της ξανθίνης κατά τη μετατροπή της υποξανθίνης σε ξανθίνη και εκείνης σε ουρικό οξύ Ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ ) Η δραστικότητα της ρίζας υδροξυλίου είναι εξαιρετικά υψηλή (Bielski and Cabelli, 1995; Halliwell and Gutteridge, 1999; von Sonntag, 1987). Η ρίζα υδροξυλίου προκύπτει σύμφωνα με την αντίδραση Fenton-Haber-Weiss μεταξύ του ανιόντος του σουπεροξειδίου (Οζ~) και του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) παρουσία ενός μετάλλου μετάπτωσης, το οποίο επιταχύνει την αντίδραση. Στα βιολογικά συστήματα το μέταλλο αυτό είναι συνήθως ο σίδηρος (Mylonas and Kouretas, 1999). Ο2- + Η+ 02 Ή 02 Η Η+ Η Fe3+ + Ο 2'' Fe2+ + Ο2 Fe2+ + Η2Ο2 Fe3+ + OH- + OFF O χαλκός και άλλα μεταλλικά ιόντα μπρούν επίσης να καταλύσουν την αντίδραση. Η ρίζα υδροξυλίου είναι ένας ισχυρός οξειδωτικός παράγοντας που αντιδρά με πολλά οργανικά και ανόργανα μόρια στο κύτταρο (DNA, πρωτεΐνες, λιπίδια, αμινοξέα και μέταλλα). Οι τρεις κύριες

14 12 αντιδράσεις τη ρίζας υδροξυλίου είναι η απόσπαση υδρογόνου, η προσθήκη και η μεταφορά ηλεκτρονίου (Halliwell and Gutteridge, 1999) Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) Το υπεροξείδιο του υδρογόνου σχηματίζεται από οξειδάσες, οι οποίες καταλύουν τη μεταφορά δύο ηλεκτρονίων στο μοριακό οξυγόνο, όπως οι οξειδάσες των αμινοξέων, η οξειδάση της γλυκόζης και η οξειδάση του γλυκολικού. Σχηματίζεται επίσης με αυτο-οξειδοαναγωγή της ρίζας υπεροξειδίου SOD 2Ο2'' + 2Η Η2Ο2 + Ο2 Το υπεροξείδιο του υδρογόνου δεν είναι ελεύθερη ρίζα αλλά προκαλεί βλάβες στο κύτταρο σε μικρές συγκεντρώσεις (ΙΟμΜ). Αποτελεί πηγή από την οποία προέρχεται το ΟΗ\ Λόγω της οξειδωτικής του ικανότητας προκαλεί απελεύθερωση σιδήρου, απενεργοποίηση ενζύμων, οξείδωση DNA, λιπιδίων, -SH ομάδων και κετοξέων Μονήρες οξυγόνο ΟΟ2) Το 1θ2 (singlet oxygen) σχηματίζεται μέσω μιας αλλαγής στην κατάσταση του spin, από παράλληλη σε αντιπαράλληλη. Αυτό αυξάνει πάρα πολύ τη δραστικότητά του επειδή αναιρείται ο περιορισμός του spin. Μπορεί να αντιδράσει εύκολα με αμινοξέα (όπως η κυστεϊνη, η μεθειονίνη, η τρυπτοφάνη και η ιστιδίνη) και αποτελεί το μεγαλύτερο καταλύτη για την έναρξη της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, η οποία οδηγεί σε καταστροφή των μεμβρανών. Το αθ2 σχηματίζεται κατά την άμεση μεταφορά ενέργειας από φωτοευαίσθητα μόρια Υπογλωριώδες οξύ (HOCI)

15 13 Προκύπτει από την αντίδραση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) με το χλώριο (C1), σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση και είναι φορές πιο τοξικό από το Η2Ο2 και το Οχ- Η C1- OC1- + Η Πηγές Παραγωγής Δραστικών Μορφών Οξυγόνου Υπάρχουν ενδογενείς και άλλες εξωγενείς πηγές παραγωγής ROS Ενδογενείς πηγές: α. Οζειδωτική φωσφορυλίωση Είναι μία διαδικασία, η οποία λαμβάνει χώρα στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και θεωρείται ίσως η σημαντικότερη ενδογενής πηγή ROS. Η πλειοψηφία των ROS παράγεται στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια αφού 90% της κατανάλωσης οξυγόνου από τον οργανισμό ανάγεται σε νερό. Η αναγωγάση της NADH-ουβικινόνης και η αναγωγάση της ουβικινόνης-κυτόχρωμα c είναι γνωστές θέσεις παραγωγής Ο2" και Η2Ο2 (Chance et al., 1979). To H2O2 δημιουργείται με τη μεταφορά από το NADH και FADH2 στην ουβικινόνη. Η ροή ηλεκτρονίων στο μοριακό οξυγόνο παράγει Ο2" ( Chance et al., 1979). To O2" ανάγεται σε H2O2 από τη μιτοχονδριακή υπεροξειδική δισμουτάση (Mn-SOD). Μέσω της αντίδρασης Haber-Weiss ανάμεσα στο Or- και στο Η2Ο2 δημιουργείται ΟΗ\ Fe Fe Fe2+ + Η2Ο2 Fe3+ + OH" + ΟΗ Αντίδραση Haber-Weiss Net Ο- + H2O2 OH- + OH + O2 Στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου παράγεται επίσης μονοξείδιο του αζώτου (NO) από την ενζυμική δράση της συνθάσης του NO.

16 14 Το μονοξείδιο του αζώτου αντιδρά με το ανιόν σουπεροξειδίου (Or') και παράγει υπεροξυνιτρικό ανιόν (ΟΝΟΟ), το οποίο σε φυσιολογικό ph παράγει υπεροξυνιτρώδες οξύ (ONOOH) (Koppenol, 1998). Από αυτό τελικά σχηματίζονται οι ρίζες ΟΗ και NCV. Η αντίδραση του μονοξειδίου του αζώτου (NO) με την ουβικινόλη (UQTh) οδηγεί στο σχηματισμό ημικινόνης (UQH), η οποία λειτουργεί σαν σημείο παραγωγής σουπεροξειδίου (02") (Boveris and Cadenas, 1997) β. Ουδετερόφιλα και αναπνευστική «έκρηξη» Τα πολυμορφοουδετερόφιλα (ΡΜΝ) είναι κύτταρα του αίματος που παίζουν σημαντικό ρόλο στην προστασία των ιστών από την προσβολή τους από ιούς και βακτήρια (Pyne, 1994). Η ενεργοποίηση των ΡΜΝ τυπικά αρχίζει με την καταστροφή του ιστού που προκαλείται από ROS ή άλλους μηχανισμούς (Meydani and Evans, 1979). Στην οξεία φάση αντίδρασης, τα ΡΜΝ μεταναστεύουν στην περιοχή τραυματισμού καθώς προσελκύοντσι από χημειοτακτικούς παράγοντες που προέρχονται από τα κατεστραμμένα κύτταρα και απελευθερώνουν τα λυτικά ένζυμα και το Ο2" κατά τη διάρκεια της φαγοκύτωσης. Τα λυτικά ένζυμα διευκολύνουν την καταστροφή των πρωτεϊνών που έχουν υποστεί βλάβες ενώ το 02" παράγεται από τη μυελοπεροξειδάση και την NADPH οξειδάση (Petrone et al., 1992). Η κυτταροπλασματική υπεροξειδική δισμουτάση μετατρέπει το Οι" σε Η2Ο2, το οποίο στη συνέχεια μετατρέπεται σε ΟΡΕ από ιόντα μετάλλων ή σε HOC1. μυελοπεροξειδάση Η202 + CP HOC1 +ΟΗ Αν και αυτή η φλεγμονώδης αντίδραση θεωρείται σημαντική για την απομάκρυνση κατεστραμμένων πρωτεϊνών και την παρεμπόδιση βακτηριακής και ιϊκής μόλυνσης, ROS και άλλα οξειδωτικά που απελευθερώνονται από τα ουδετερόφιλα μπορούν να προκαλέσουν

17 15 δευτερογενή βλάβη όπως υπεροξείδωση των λιπιδίων (Meydani and Evans, 1979; Meydani et al., 1992). 1.2.Ι.γ. Μετατροπή της ξανθίνης σε ουρικό οξύ Οι αντιδράσεις που καταλύονται από την οξειδάση της ξανθίνης αποτελούν σημαντική πηγή παραγωγής ελευθέρων ριζών (Downey, 1990; Kuppasamy and Zweier, 1989). Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας το ΑΤΡ απαμινώνεται σε ADP και ΑΜΡ εξαιτίσς της ενέργειας που απαιτείται λόγω της σύσπασης του μυοκαρδίου. Αν τα αποθέματα οξυγόνου είναι ανεπαρκή το ΑΜΡ μετατρέπεται σε υποξανθίνη, ξανθίνη και τελικά σε ουρικό οξύ. Η αντίδραση αυτή καταλύεται από την οξειδάση της ξανθίνης και συνοδεύεται από σχηματισμό του Ο2". Η οξειδάση της ξανθίνης πρέπει να μετατραπεί από την ανηγμένη στην οξειδωμένη της μορφή από μία ενδοκυτταρική πρωτεάση που ενεργοποιείται από το Ca2+ ενώ το μοριακό οξυγόνου είναι δέκτης ηλεκτρονίων δ. Κυτόγρωμα Ρ450 Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες τα μικροσώματα του ήπατος παράγουν ελεύθερες μορφές οξυγόνου μέσου του κυτοχρώματος Ρ450 (Yu, 1994). To NADPH οξειδώνεται δίνοντας γέννηση στο Οι" το οποίο μπορεί να μετατραπεί σε Η2Ο2 (Chance et al., 1979). Ο ρυθμός παραγωγής του Η2Ο2 είναι ανάλογος με την κατανάλωση οξυγόνου στο μικρόσωμα (Halliwell and Gutteridge, 1989). Παρουσία ADP και Fe3+ η NADPH οξειδάση καταλύει τη μεταφορά ενός ηλεκτρονίου από το NADPH στο CE παράγοντας CE". Η NADPH οξειδάση βρίσκεται, εκτός από την μεμβράνη του πλάσματος και σε άλλα κυτταρικά συστατικά όπως τα μιτοχόνδρια.

18 ε. Αυτοοζείδωση μορίων Ορισμένα μόρια όπως φλαβίνες, κατεχολαμίνες, θειόλες και η αιμογλοβίνη μπορούν να αυτοοξειδωθούν σχηματίζοντας ανιόν σουπεροξειδίου (Or') Εξωγενείς πηγές: Η ηλιακή και ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία καθώς και το όζον, η ατμοσφαιρική ρύπανση, ο καπνός του τσιγάρου και τα βιομηχανικά απόβλητα (Koren, 1995; Victoria, 1994) είναι σημαντικοί οξειδωτικοί παράγοντες. Επίσης, ελεύθερες ρίζες παράγονται από τη δράση φαρμάκων (Naito et al., 1998; Rav et al., 2001) και άλλων ξενοβιοτικών όπως τοξίνες και εντομοκτόνα αλλά και από το αλκοόλ (Elsayed et al., 1992; Jones et al., 2000; Obata et al., 2001; Wormser et al., 2000). Σημαντική πηγή οξειδωτικών είναι επίσης η διατροφή (Ames, 1986; Kanner and Labidot, 2001; Lijinsky, 1999). Εικόνα 1: Πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών

19 Βιολογική Δράση Των Δραστικών Ειδών Οξυγόνου Θετικές επιδράσεις Οι ελεύθερες ρίζες χρησιμεύουν ως κυτταρικοί αγγελιοφόροι, έχουν δηλαδή την ικανότητα να μεταφέρουν σήματα από τα σηματοδοτικά μονοπάτια μεταξύ των κυττάρων (Sen et al., 1996; Rimbach et al., 1999; Reid, 2001; Sen, 2001; Linnane et al., 2002). Συνεισφέρουν και στο ανοσοποιητικό σύστημα, δρώντας ενάντια στα αντιγόνα κατά τη διάρκεια της φαγοκύττωσης (Finaud et al., 2006). Ο ρόλος τους αυτός ενισχύεται κατά τη διάρκεια της φλεγμονής. Επιπλέον οι ROS ρυθμίζουν μηχανισμούς που συνδέονται με την ανοσία, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, το μεταβολισμό, την απόπτωση και τη μυϊκή συστολή (Reid, 2001; Linnane et al., 2002). Αναστολή της παραγωγής ROS οδηγεί σε απώλεια της μυϊκής συστολής ενώ αυξημένη παραγωγής ROS έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μυϊκής κόπωσης Αρνητικές επιδράσεκ Προκαλούν οξείδωση λιπιδίων, πρωτεϊνών και καταστροφή του DNA. Επίσης, συνδέονται με νευροεκφυλιστικές νόσους (Parkinson's, Alzheimer's, κατάθλιψη), φλεγμονές, λοιμώδεις νόσους, νόσους των νεφρών, ηπατικές νόσους, πνευμονικές νόσους καθώς και με τη γήρανση. Επίσης, οι ελεύθερες ρίζες προσβάλλουν βιολογικά μακρομόρια (τα λιπίδια, τις πρωτεΐνες και το DNA). Λιπίδια: Όλες οι κυτταρικές μεμβράνες είναι ευάλωτες σε οξείδωση εξαιτίας των υψηλών συγκεντρώσεων σε ακόρεστα λιπαρά οξέα. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων συμβαίνει σε τρία στάδια. Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει την επίθεση του μεταβολίτη δραστικού οξυγόνου ικανού να αποσπά ένα άτομο

20 18 υδρογόνου από μια ομάδα μεθυλενίου στα λιπίδια. Η παρουσία ενός διπλού δεσμού γειτονικά της ομάδας μεθυλενίου εξασθενεί τον δεσμό μεταξύ των ατόμων υδρογόνου και άνθρακα έτσι ώστε να μπορεί να αποσπαστεί εύκολα από το μόριο. Μετά την απόσπαση του υδρογόνου το λιπαρό οξύ διατηρεί ένα ηλεκτρόνιο και σταθεροποιείται με επαναδιευθέτηση της μοριακής δομής για να σχηματίσει ένα συζυγές διένιο. Όταν το οξυγόνο είναι σε επαρκή ποσότητα στο περιβάλλον, το λιπαρό οξύ θα αντιδράσει με αυτό για να σχηματίσει ROO' κατά τη διάρκεια της φάσης πολλαπλασιασμού. Αυτές οι ελεύθερες ρίζες είναι ικανές να αποσπάσουν κι άλλο άτομο υδρογόνου από ένα γειτονικό λιπαρό οξύ, το οποίο οδηγεί ξανά σε παραγωγή ριζών λιπαρών οξέων που υποβάλλονται στις ίδιες διαδικασίες- επαναδιευθέτηση και αλληλεπίδραση με οξυγόνο (Halliwell and Gutteridge, 1999). Πρωτεΐνες: Ανάμεσα στις διάφορες ROS, το ΟΗ, το RO- και οι ενεργές ρίζες αζώτου προκαλούν πρωτεϊνική καταστροφή. Οι πρωτεΐνες υποβάλλονται σε άμεση και έμμεση καταστροφή μετά την αλληλεπίδραση με ROS όπως είναι οι αλλαγές στην τριτοταγή τους δομή, ο εκφυλισμός και ο θρυμματισμός τους. Οι επιπτώσεις της πρωτεϊνικής καταστροφής είναι απώλεια της ενζυμικής λειτουργίας, αλλαγμένες κυτταρικές λειτουργίες όπως παραγωγή ενέργειας και αλλαγές στον τύπο και στο επίπεδο των κυτταρικών πρωτεϊνών (Davis, 1987; Grune et al., 1997; Halliwell and Gutteridge, 1999; Levine et al., 2000; Stadtman, 1986).

21 19 Protein oxidation and nitrosation (Inflammatory disorders, degenerative disorders, diabetes, lipid peroxidation, ageing) h202, ROOH CIO' I CO I HC (CH2)2S-CH3 NH Methionine f MetSO reductase Chlorylnitrite Cl- N, + O' Peroxynitrite 0= N 0-0' i c=o HC (CH2)2S CH3 NH O 1 Methionine sulphoxide Highly prevalent protein oxidation product HO llih 1 >=/ 6=0 h6 CHj-χ V-OH ISIH Dityrosine (Haemoglobin is particularly susceptible) 1 c=o HC CH2 -X Λ-ΟΗ NH '-----( 1 no2 3-Nitrotyrosine May be increased selectively in vascular dysfunction Εικόνα 2: Μηχανισμός πρωτεϊνικής οξείδωσης και νιτροποίηση DNA: Αν και το DNA είναι ένα σταθερό και καλά προστατευμένο μόριο οι ROS μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αυτό και να προκαλέσουν καταστροφές όπως η τροποποίηση των βάσεων, θραύσεις του DNA, απώλεια πουρινών, ζημιά στο σάκχαρο δεοξυριβόζης και βλάβη στο σύστημα επιδιόθωσης του DNA. Η ρίζα υδροξυλίου(οη-) επιτίθεται στην γουανίνη στην θέση C-8 και σχηματίζει ένα οξειδωτικό προϊόν την 8- υδροξυδιογουανοσίνη (8-OHdG). Οι ρίζες υδροξυλίου μπορούν επίσης να επιτεθούν και σε άλλες βάσεις όπως η αδενίνη για να σχηματίσουν την 8- υδροξυαδενίνη. Αλληλεπίδραση ανάμεσα στις πυριμιδίνες και στις ρίζες υδροξυλίου οδηγεί στο σχηματισμό υπεροξειδίου της θυμίνης, 5-ουρακίλης, γλυκολών της θυμίνης και άλλων τέτοιων προϊόντων (Ames, 1986; Beckman and Koppenol, 1996; Dizdaroglu and Jaruga et al., 2002q Halliwell, 2001; Halliwell and Gutteridge, 1999; Helbock et al., 1999).

22 Αντιοξειδωτικοί Μηχανισμοί Είναι ενζυμικοί και μη ενζυμικοί μηχανισμοί που εξουδετερώνουν ή ελέγχουν τη δράση των ελευθέρων ριζών. Αυτό το κατορθώνουν με τρεις τρόπους. > Εμποδίζουν το σχηματισμό ριζών > Μετατρέπουν τις ελεύθερες ρίζες σε λιγότερο δραστικά μόρια > Βοηθούν στην επιδιόρθωση των βλαβών που προκαλούνται από τις ελεύθερες ρίζες Ενζυμικοί μηχανισμοί: Περιλαμβάνουν ένζυμα όπως η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), καταλάση (CAT), υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) και αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR). 1 Λ.1.η. Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Είναι ίσως το πιο σημαντικό ένζυμο του αντιοξειδωτικού μηχανισμού. Καταλύει την αντίδραση μετατροπής του 02" σε Η2Ο2 : SOD 2 Ο2- +2Η Η Υπάρχουν διάφορες μορφές SOD στα βιολογικά συστήματα όπως η Cu-SOD στο κυτταρόπλασμα, η Mn-SOD στα μιτοχόνδρια, η Cu,Zn-SOD στο εξωκυττάριο υγρό και η Fe-SOD στα βακτήρια και τα φυτά.

23 21 Εικόνα 3: Μηχανισμός δράσης της SOD ΙΑ.Ι.β. Καταλάση (CAT) Εντοπίζεται στα υπεροξειδιοσώματα. Αποτελείται από τέσσερις πρωτεϊνικές υπομονάδες καθεμία από τις οποίες περιέχει μία ομάδα αίμης στην ενεργό περιοχή τους. Κάθε υπομονάδα φέρει ένα μόριο NADPH, το οποίο συμβάλλει στη σταθερότητα του ένζυμου. Καταλύει την μετατροπή του Η2Ο2 σε νερό και οξυγόνο σύμφωνα με την αντίδραση: 2 Η2Ο Η2Ο+Ο2 ΊΑ.Ι.γ. Υπεροξειδάση της γλουταθειόνηζ (GPX) Εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, το κυτταρόπλασμα καθώς και στο εξωτερικό του κυττάρου και είναι άφθονη στην καρδιά, τους πνεύμονες και τον εγκέφαλο. Η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης ανάγει τα υδροϋπεροξείδια

24 22 (ROOH) σε αλκοόλες (ROH) και επίσης ανάγει το υπεροξείδιο χου υδρογόνου σε νερό ενώ προκαλεί την οξείδωση της ανηγμένης γλουταθειόνης. 2GSH +2 Η2Ο2 GSSG +2 Η20 Ή 2GSH+ROOH GSSG+R0H + H δ. Αναγωγάση τγς γλουταθειόνης (GR) Η αναγωγάση της γλουταθειόνης είναι υπεύθυνη για την αναγωγή της GSSG σε GSH και συνεπώς για τη διατήρηση της φυσιολογικής αναλογίας GSSG:GSH στο εσωτερικό του κυττάρου. Αποτελείται από δύο υπομονάδες καθεμία από τις οποίες περιέχει στην ενεργό περιοχή της ένα φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (FAD). Το NADPH ανάγει το FAD, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρει τα ηλεκτρόνιά του στη δισουλφιδική γέφυρα. Οι δύο σουλφυδρυλομάδες που σχηματίζονται αλληλεπιδρούν με την GSSG και την ανάγουν σε 2 μόρια GSH Μη Ενζυμικοί Μηχανισμοί Περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τη βιταμίνη Ε, τη βιταμίνη C, τη β- καροτίνη, τη γλουταθειόνη, το συνένζυμο Q-10 και το σελήνιο α. Βιταμίνη Ε Είναι μια λιποδιαλυτή βιταμίνη και υπάρχει σε μεγάλες συγκεντρώσεις στις μεμβράνες των κυττάρων και των μιτοχονδρίων. Έχει ισχυρή αντιοξειδωτική δράση καθώς προστατεύει τη βιταμίνη Α από την οξείδωση και αναστέλλει την αλυσιδωτή αντίδραση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. ROO + ΑΗ ROOH + Α ROO- + Α ROOA

25 β. Βιταμίνη C Η βιταμίνη C παίρνει μέρος στην απομάκρυνση της αμμωνίας και έχει ισχυρή αντιοξειδωτική δράση γ. Β-καροτίνη Εντοπίζεται στις κυτταρικές μεμβράνες και μετατρέπεται σε βιταμίνη Α όταν απαιτείται από τις ανάγκες του οργανισμού. Η β-καροτίνη πιστεύεται ότι αδρανοποιεί τις ελεύθερες ρίζες και περιορίζει την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Η β-καροτίνη αλληλεπιδρά με τις βιταμίνες C και Ε και το σελήνιο. Παίζει ρόλο στην ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω της αντιοξειδωτικής της δράσης δ. Γλουταθειόνη Η γλουταθειόνη (GSH) είναι ένα τριπεπτίδιο (γ-glu-cys-gly) και περιέχει μία σουλφυδρυλομάδα. Αποτελεί σημαντικό διαλυτό αντιοξειδωτικό καθώς συμβάλλει στην προστασία των ερυθροκυττάρων από οξειδωτική βλάβη. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της συνεχούς και κυκλικής μετάπτωσής της από μία ανηγμένη (GSH) σε μία οξειδωμένη μορφή (GSSG) και το αντίθετο. Σχήμα 1: Συντακτικός τύπος της γλουταθειόνης ε. Συνένζυμο 0 10 Το συνένζυμο Q 10 (ουβικινόνη) παίρνει μέρος στις λειτουργίες της αναπνευστικής αλυσίδας, όπου παράγεται ΑΤΡ. Ακόμη έχει ισχυρή

26 24 αντιοξειδωτική δράση ενώ παράλληλα είναι υπεύθυνο για την αναγέννηση ενός άλλου πολύ ισχυρού λιπόφιλου αντιοξειδωτικού, της α-τοκοφερόλης στ. Σελήνιο Το σελήνιο είναι ένα απαραίτητο ιχνοστοιχείο, που συμμετέχει στη διατήρηση της υγείας και την πρόληψη ασθενειών στον άνθρωπο. Ως συμπαράγοντας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης εμφανίζει αντιοξειδωτικές ιδιότητες. 1.5 Οξειδωτικό Στρες Είναι η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και της αντιοξειδωτικής άμυνας των ιστών σε βάρος του δεύτερου σκέλους της ισορροπίας αυτής. Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση του οξειδωτικού στρες Το οξειδωτικό στρες μπορεί να προκληθεί από εξωγενείς και ενδογενείς παράγοντες: 1) Εξωγενείς πηγές: > Περιβαλλοντική ρύπανση (μόλυνση νερού, αέρα, τροφής)

27 25 > Ακτινοβολία (ηλιακή, ηλεκτρομαγνητική) > Βαριά σωματική άσκηση > Κάπνισμα, αλκοόλ, κακή διατροφή > Φάρμακα > Τοξικές ουσίες 2) Ενδογενείς πηγές: > Μιτοχόνδρια > Ενδοπλασματικό δίκτυο > Κυτταρόπλασμα > Βιολογικές μεμβράνες > Λευκοκύτταρα Επιπτώσεις του οζειδωτικού στρες Το οζειδωτικό στρες μπορεί να προκαλέσει βλάβες σε όλα τα μακρομόρια (DNA, πρωτεΐνες και λιπίδια) καθώς και κυτταρικό θάνατο. Οι πρωτεΐνες μπορεί να υποστούν αλλαγές στην τριτοταγή τους δομή, εκφυλισμό και γενικότερα άμεση και έμμεση καταστροφή. Οι επιπτώσεις της πρωτεϊνικής καταστροφής σχετίζονται συνήθως με την απώλεια της φυσιολογικής λειτουργίας των πρωτεϊνών. Όσον αφορά το DNA, οι τροποποιήσεις των βάσεων, οι θραύσεις των αλυσίδων του, οι καταστροφές στο σάκχαρο της δεοξυριβόζης και οι βλάβες στο σύστημα επιδιόθωσής του είναι μερικές επιπτώσεις του οζειδωτικού στρες που μπορεί να οδηγήσουν στον εκφυλισμό του. Στον κυτταρικό θάνατο το κύτταρο φτάνει είτε μέσω της νέκρωσης είτε μέσω της απόπτωσης. Κατά τη νέκρωση το κύτταρο διογκώνεται και διαρρηγνύεται απελευθερώνοντας το περιεχόμενό του στο περιβάλλον

28 26 επηρεάζοντας τα γειτονικά κύτταρα. Το περιεχόμενό του μπορεί να περιλαμβάνει αντιοξειδωτικά μόρια όπως η καταλάση και η GSH και προοξειδωτικά όπως ιόντα χαλκού και σιδήρου. Στην απόπτωση τα κύτταρα δεν απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους και δεν προκαλούν βλάβες στα γειτονικά κύτταρα. Τα αποπτωτικά κύτταρα ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένες ασθένειες όπως μερικές από τις νευροεκφυλιστικές ασθένειες Άσκηση και οζειδωτικό στρες Η άσκηση συμβάλλει V Στη βελτίωση της ποιότητας ζωής V Στη μείωση του κινδύνου εμφάνισης ασθενειών V Στη βελτίωση της λειτουργίας των σκελετικών μυών και στη διατήρηση της μυϊκής μάζας Ωστόσο, τα αποτελέσματα από έρευνες που πραγματοποιήθηκαν τόσο σε ανθρώπους όσο και σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η άσκηση συνδέεται με την αύξηση της παραγωγής των ελευθέρων ριζών και άρα επάγει την εμφάνιση του οξειδωτικού στρες. Ο Davies et al. (1982) ήταν ο πρώτος που έδειξε ότι η άσκηση αυξάνει την παραγωγή των ελεύθερων ριζών. Από τότε, πολλές μελέτες αποκάλυψαν τις επιδράσεις της άσκησης στο οξειδωτικό στρες. Οι περισσότερες από αυτές περιελάμβαναν αερόβια άσκηση (τρέξιμο, ποδηλασία και κολύμβηση) (Alessio, 1993; Vasankari et al., 1997; Liu et al., 1999; Mastaloudis et al., 2001; Palmer et al., 2003; Ashton et al., 1998; Child et al., 1998; Lovlin et al., 1987; Aguilo et al., 2005). Η αερόβια άσκηση συνοδεύεται από αυξημένο VO2, γεγονός το οποίο ίσως αυξάνει την δραστηριότητα των ελευθέρων ριζών. Επομένως, πολλές μελέτες έδειξαν ότι τέτοια φυσική δραστηριότητα προκαλεί παραγωγή ελευθέρων ριζών και στα ζώα και στους ανθρώπους. ( Alessio, 1993; Vasankari et al., 1997; Liu Ml et al., 1999; Mastaloudis et al., 2001;

29 27 Palmer et al., 2003; Child et al., 1998; Lovlin et al., 1987; Aguilo et al., 2005; Vider et al., 2001). Όμως αυτό το φαινόμενο δεν μπορεί να συμβεί σε άσκηση χαμηλής έντασης (< 50% μεγίστη κατανάλωση οξυγόνου [V02max]). Σε μια τέτοια περίπτωση η αντιοξειδωτική ικανότητα του οργανισμού επαρκεί και δεν εμφανίζεται κάποια βλάβη προκαλούμενη από τις ελεύθερες ρίζες (Lovlin et al., 1987). Όσο πιο έντονη είναι η άσκηση τόσο μεγαλύτερη είναι η παραγωγή ελευθέρων ριζών και επομένως και το οξειδωτικό στρες.( Palmer et al., 2003; Lovlin et al., 1987) Εκτός από την αερόβια άσκηση υπάρχει και η αναερόβια που περιλαμβάνει μια ποικιλία δραστηριοτήτων(άλμα, ασκήσεις αντοχής, sprints). Οι μελέτες για την παραγωγή των ελευθέρων ριζών σαν αποτέλεσμα της αναερόβιας άσκησης μειονεκτούν συγκρινόμενες με αυτές της αερόβιας άσκησης (Groussard et al., 2003). Αυτές οι μελέτες γενικά δείχνουν μια αύξηση στο οξειδωτικό στρες. Ρί αυξημένη παραγωγή των ελευθέρων ριζών στην αναερόβια άσκηση προέρχεται από ποικίλα μονοπάτια επιπρόσθετα της διαρροής των ηλεκτρονίων (McBride et al., 1998; Groussard et al., 2003; Sahlin et al., 1992). Η παραγωγή της οξειδάσης της ξανθίνης, η ισχαιμία επαναιμάτωση, η φαγοκυτταρική αναπνευστική «έκρηξη», η φλεγμονή, ο κυτταρικός τραυματισμός εμπλέκονται στην παραγωγή ελευθέρων ριζών κατά τη διάρκεια της αναερόβιας άσκησης (Kayatekin et al., 2002; Sahlin et al., 1992). Σε αθλητές του τριάθλου μετά από αγώνα παρατηρείται αύξηση των ουσιών που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) (Palazzeti et al., 2003). Έχει επίσης βρεθεί ότι τα επίπεδα της καταλάσης είναι αυξημένα στο αίμα κολυμβητών των 800 μέτρων (Inal et al.2001). Επίσης μελέτες έχουν δείξει ότι η άσκηση αυξάνει τα επίπεδα της GSSG στο αίμα σε ποδηλάτες (Aguilo et al., 2005), όπως επίσης και της GSH (Accominotti et al., 1991). Επιπλέον, τα επίπεδα των πρωτεϊνικών καρβονυλίων είναι αυξημένα στα ερυθροκύτταρα σε ποδηλάτες που έφθασαν

30 28 το 100% V02max σε σύγκριση με αυτά των σε ποδηλάτες με 40% VC>2max (Lovlin et al., 1987). Υπάρχουν, επίσης, αποτελέσματα για την επίδραση της αναερόβιας άσκησης στο οξειδωτικό στρες. Σε μια πρόσφατη μελέτη (Kayatekin et al., 2002) επίμυες εκτέλεσαν 15 sprints στα 35m/min για 30sec και μελετήθηκε το οξειδωτικό στρες και στον σκελετικό μυ και στο ήπαρ. Ενώ τα TBARS αυξήθηκαν στον μυ, στο ήπαρ δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή. Ο Alessio et al., (1988) εξέτασε την υπεροξείδωση των λιπιδίων στον σκελετικό μυ επιμύων κάνοντας 1 λεπτού sprint στα 45m/ min. Οι τιμές των TBARS ήταν αυξημένες συγκρινόμενες με αυτές των επιμύων σε κατάσταση ηρεμίας. Μια ακόμη μελέτη που έγινε σε ανθρώπους οι οποίοι εκτέλεσαν μια ισοτονική άσκηση αντοχής έδειξε αύξηση στην MDA του αίματος (Me Bride et al., 1998). Σήμερα είναι πλέον τεκμηριωμένο ότι η εξαντλητική άσκηση αυξάνει το οξειδωτικό στρες. Ωστόσο υπάρχουν μελέτες που δεν συμφωνούν με την παραπάνω διαδοχή και δείχνουν ότι το οξειδωτικό στρες δεν αυξάνεται μετά από έντονη αερόβια άσκηση(vasankari et al., 1997; Vider et al., 2001; Chevion et al., 2003). Αυτά τα αντιφατικά αποτελέσματα μπορούν να εξηγηθούν από το επίπεδο των αντιοξειδωτικών( το οποίο δεν ελέγχεται πάντα στις μελέτες), την ένταση της άσκησης ή το επίπεδο εκπαίδευσης. Επιπλέον κάποιες διαφορές μπορούν να εξηγηθούν από τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για την μέτρηση του οξειδωτικού στρες. 1.6 Αλοπουρινόλη Η αλοπουρινόλη είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της χρόνιας ουρικής αρθρίτιδας, ασθένειας προκαλούμενης από την υπερβολική συσσώρευση ουρικού οξέος στους ιστούς.

31 Μηχανισμός δράσης Η αλοπουρινόλη είναι ένα δομικό ισομερές της υποξανθίνης και αναστέλλει τη δράση της οξειδάσης της ξανθίνης. Η οξειδάση της ξανθίνης είναι υπεύθυνη για την οξείδωση της υποξανθίνης σε ξανθίνη οδηγώντας στην παραγωγή ουρικού οξέος, προϊόντος του μεταβολισμού των πουρινών. Η Ν' ο X V..r> \ xanthine amopurinol - blocks the actions of xanthine oxidase by substrate LuriipeliUoi di d is also metaboiiseci by it to "orm allaxanthine 0 1 x> HN kh' N H oypoxenthire - a breakdown product of adenine - catalysed by adenaoe (EC } oxidase xdiilli iiu oxidase xanthine oxidase / / / A / r~''n H xaith nc HN o X r V. An^N t H xanthine N oxidase HN V > -Λ"N H alloxarthine - a nor-corrpatitiva xarthine oxidase inhbitor which blocks uric acid production o<vl H uric acid - relatively insoluble compound which can build up in joints leading to its crystallization and painful end inflamed joints (juul) Εικόνα 5: Μονοπάτι δράσης της αλοπουρινόλης Χρήσεις Εκτός από τη χρήση της ενάντια στην ουρική αρθρίτιδα, η αλοπουρινόλη χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση των δυσμενών συνεπειών της χημειοθεραπείας (πολύ υψηλές συγκεντρώσεις ουρικού οξέος εξαιτίας του εξαπλώμενου κυτταρικού θανάτου). Επίσης, η αλοπουρινόλη χρησιμοποιείται απέναντι στον ιστικό τραυματισμό που προκαλεί η ισχαιμία επαναιμάτωση καθώς και στην ουρολιθίαση και σε πρωτοζωικές μολύνσεις Μεταβολισμός Η αλοπουρινόλη μεταβολίζεται από την οξειδάση της ξανθίνης στον ενεργό μεταβολίτη οξυπουρινόλη, η οποία είναι επίσης ένας αναστολέας της οξειδάσης της ξανθίνης. Ο χρόνος ημιζωής της οξυπουρινόλης είναι πολύ μεγαλύτερος σε σχέση με της αλοπουρινόλης και γι' αυτό το λόγο η

32 30 οξυπουρινόλη θεωρείται σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για τις επιπτώσεις της δράσης της αλοπουρινόλης Αντίοξειδωτική δράση της αλοπουρινόλης Η αλοπουρινόλη αναστέλλει τη δράση της οξειδάσης της ξανθίνης, η οποία είναι το ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή της υποξανθίνης σε ξανθίνης και της ξανθίνης σε ουρικό οξύ. Η οξειδάση της ξανθίνης χρησιμοποιεί μοριακό οξυγόνο ως δέκτη ηλεκτρονίων κατά τη διαδικασία της διάσπασης των πουρινών. Η δράση της οδηγεί στην παραγωγή ανιόντος σουπεροξειδίου (Hoey et al., 1988) και υπεροξειδίου του υδρογόνου (McCord and Fridovich, 1968). Η αλοπουρινόλη μπορεί να έχει αντιοξειδωτικό ρόλο λόγω της αναστολής παραγωγής του CV' και του Η2Ο2 αλλά ταυτόχρονα είναι πιθανό να έχει και προοξειδωτική δράση εξαιτίας της αναστολής της παραγωγής του ουρικού οξέος, ενός πολύ ισχυρού αντιοξειδωτικού μορίου. Σε προηγούμενες εργασίες, έχει μελετηθεί ο προστατευτικός ρόλος της αλοπουρινόλης απέναντι στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από διαφορετικές αιτίες όπως είναι η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (Heunks et al., 1999), η δυσλειτουργία του μυοκαρδίου (Belboul et al. 2001) και η άσκηση (Gomez-Cabrera et al., 2005; Koyama et al., 1999). Σε περιβάλλον άσκησης, βρέθηκε ότι η αλοπουρινόλη απέτρεψε την οξείδωση της γλουταθειόνης και των λιπιδίων στο αίμα καθώς και τη λιπιδική υπεροξείδωση στο ήπαρ σε άλογα (Mills et al., 1997). Επίσης, έχει βρεθεί ότι η αλοπουρινόλη μειώνει το παραγόμενο από την άσκηση οξειδωτικό στρες σε επίμυες (Gomez-Cabrera et al., 2005) και στον άνθρωπο (Gomez-Cabrera et al., 2006). Όλες οι παραπάνω εργασίες έχουν μελετήσει τη δράση της αλοπουρινόλης στο αίμα και στο σκελετικό μυ ενώ δεν υπάρχουν εργασίες που να έχουν ασχοληθεί με τη μελέτη του προκαλούμενου από την άσκηση οξειδωτικού στρες στον καρδιακό μυ επιμύων. Η αλοπουρινόλη έχει επίσης χρησιμοποιηθεί σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (COPD). Κατά τη διάρκεια της άσκησης προκλήθηκε οξείδωση της γλουταθειόνης και λιπιδική υπεροξείδωση του

33 31 αίματος ενώ η αλοπουρινόλη ανέστειλε τις ζημιογόνες επιδράσεις της άσκησης (Heunks et al., 1999). Επιπλέον, σε μελέτες σε ασθενείς με χρόνια καρδιακή ανεπάρκεια, η αναστολή της οξειδάσης της ξανοίνης λόγω της χορήγησης αλοπουρινόλης αύξησε την συσταλτική ικανότητα της καρδιάς (Perticone et al., 2001) εξαιτίας ενός μηχανισμού ευαισθητοποίησης του ασβεστίου (Al Suwaidi et al., 2000) και βελτίωσε την κατάσταση των ασθενών. Η έντονη σωματική άσκηση συνδέεται με δραματική αύξηση στην κατανάλωση Ο2 από ολόκληρο το σώμα και από τον σκελετικό μυ. Το περισσότερο από το Ο2 που καταναλώνεται χρησιμοποιείται από τα μιτοχόνδρια σαν υπόστρωμα μεταβολισμού και για τη παραγωγή ΑΤΡ και ανάγεται σε Η2Ο2. Όμως, ένα μικρό ποσοστό του Ο2 (~2-5%), μετατρέπεται σε διάφορα μεταβολικά ενδιάμεσα( π.χ Ο2 ', Η2Ο2, ΌΗ) τα οποία διαρρέουν από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (Chance et al., 1979). Ωστόσο, νεώτερες μελέτες έδειξαν ότι το ποσοστό αυτό διαρροής ηλεκτρονίων είναι κατά πολύ μικρότερο (St-Pierre et al., 2002; Hansford et al., 1997). Αυτά τα μεταβολικά ενδιάμεσα ονομάζονται δραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Η παραγωγή των ROS οδηγεί σε μια σειρά βιοχημικών αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της άσκησης και είναι δείκτες οξειδωτικού στρες (Jenkins, 1988). 2. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εξετάσει την επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης σε δείκτες οξειδωτικού στρες στο μυοκάρδιο επιμύων.

34 32 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Υλικά Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν αποκτήθηκαν από τις ακόλουθες εταιρείες. SIGMA-ALDRICH CO St Louis MO, USA. TBA, DTNB, DPPH, NADPH, ρεδουκτάση της γλουταθειόνης, οξειδωμένη μορφή της γλουταθειόνης. MERCK. NaFLPOi, NaHP04 και Tris (hydroxymethyl) aminomethane PANREAC. TCA FLUCA. Na2S04 Για τους φωτομετρικούς προσδιορισμούς χρησιμοποιήθηκε τα φωτόμετρο HITACHI U Πειραματόζωα 80 ένηβοι αρσενικοί επίμυες (ηλικίας 8 εβδομάδων, βάρους 220±10g, mean ± SEM) φιλοξενήθηκαν κάτω από ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες (12-ωρος κύκλος φως/σκοτάδι και θερμοκρασία 20 C) σε κλουβιά των τριών. Η τροφή και το νερό ήταν διαθέσιμα ελεύθερα. Οι επίμυες μελετήθηκαν σε 8 ομάδες των 10 ατόμων κάτω από τις ακόλουθες τρεις καταστάσεις: άσκηση, χορήγηση αλοπουρινόλης και το συνδυασμό τους. Το διμέθυλ-σουλφοξείδιο (DMSO) ή η αλοπουρινόλη χορηγήθηκαν 1.5Ιτ πριν την έναρξη του πειράματος. Τα δείγματα λήφθηκαν πριν, αμέσως μετά και 5 ώρες μετά το τέλος της άσκησης καθώς και τις αντίστοιχες χρονικές στιγμές μετά τη χορήγηση αλοπουρινόλης. Η ομάδα

35 33 στην οποία χορηγήθηκε DMSO και θανατώθηκε πριν την άσκηση θεωρήθηκε ως ομάδα ελέγχου (control). Πειραματικές ομάδες 1. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε DMSO, ασκήθηκαν και θανατώθηκαν αμέσως μετά την άσκηση. 2. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε DMSO, ασκήθηκαν και θανατώθηκαν 5 ώρες μετά την άσκηση. 3. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε αλοπουρινόλη, ασκήθηκαν και θανατώθηκαν αμέσως μετά την άσκηση. 4. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε αλοπουρινόλη, ασκήθηκαν και θανατώθηκαν 5 ώρες μετά την άσκηση. 5. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε αλοπουρινόλη και θανατώθηκαν 1.5 ώρες μετά τη χορήγηση. 6. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε αλοπουρινόλη και θανατώθηκαν 2.5 ώρες μετά τη χορήγηση. 7. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε αλοπουρινόλη και θανατώθηκαν 7.5 ώρες μετά τη χορήγηση. 8. Δέκα επίμυες, στους οποίους χορηγήθηκε DMSO και θανατώθηκαν 1.5 ώρες μετά τη χορήγηση (ομάδα control). Βασιζόμενοι σε προηγούμενες μελέτες που έδειξαν ότι οι δείκτες οξειδωτικού στρες αυξήθηκαν σημαντικά πολλές ώρες μετά την άσκηση σε ανθρώπους (Michailidis et al., 2007) και επίμυες (Koyama et al., 1999), αποφασίστηκε η συλλογή δειγμάτων τόσο αμέσως μετά όσο και 5 ώρες μετά την άσκηση.

36 Χορήγηση Αλοπουρινόλης Η αλοπουρινόλη χορηγήθηκε σε μία δόση των 50mg/kg βάρους σώματος κάθε επίμυος ενδοπεριτοναϊκά 1.5 ώρα πριν την εκτέλεση του πρωτοκόλου κολύμβησης καθώς τα επίπεδα της αλοπουρινόλης στον ιστό φτάνουν τη μεγίστη τιμή τους 1.5 με 2 ώρες μετά τη χορήγηση. Η αλοπουρινόλη διαλύθηκε σε DMSO καθώς δεν ήταν δυνατό να διαλυθεί σε φυσιολογικό ορό ή σε μείγμα DMSO και φυσιολογικού ορού. To DMSO είναι ένας καλός διαλύτης της αλοπουρινόλης και έχει χρησιμοποιηθεί και σε ανθρώπινα πειράματα (Lee and Wang, 1999). 3.4 Εξοικείωση Των Πειραματόζωων Πριν ξεκινήσει το πειραματικό πρωτόκολο, οι επίμυες έμειναν στο περιβάλλον του πειράματος 7 μέρες ώστε να εγκλιματιστούν. Στη συνέχεια εξοικειώθηκαν με το νερό για μια περίοδο 5 ημερών πριν το πρωτόκολο κολύμβησης. Την πρώτη μέρα της εξοικείωσης οι επίμυες παρέμειναν στο νερό για 10 λεπτά χωρίς βάρος στη βάση της ουράς τους. Τις επόμενες δύο μέρες το βάρος αυξήθηκε στο 1% του σωματικού τους βάρους και τις τελευταίες 2 μέρες στο 2%. Πριν την εκτέλεση του πρωτοκόλου κολύμβησης οι επίμυες ξεκουράστηκαν για 3 μέρες. 3.5 Πρωτόκολο Κολύμβησης Οι επίμυες ασκήθηκαν μέχρι εξάντλησης σε ειδική δεξαμενή (διάμετρος: 1.0 m, βάθος: 0.7m) με τη θερμοκρασία του νερού ρυθμισμένη στους C. Ένα βαρίδι ίσο με το 4% του σωματικού βάρους κάθε επίμυος προσδέθηκε στη βάση της ουράς του με σκοπό να επιτευχθεί συνεχής άσκηση. Η άσκηση επιλέχθηκε να γίνει μέχρι εξάντλησης καθώς έχει αναφερθεί ότι το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την άσκηση είναι άμεσα εξαρτώμενο από την ένταση της άσκησης (Palmer et al.2003). Το κολύμπι επιλέχθηκε επειδή είναι μια μορφή άσκησης που προκαλεί περιορισμένο μυϊκό τραυματισμό (Komulainen et al., 1995). Έτσι, οι

37 35 επιδράσεις του πρωτοκόλου στο οξειδωτικό στρες δεν αποδίδονται στο μυϊκό τραυματισμό αλλά αποκλειστικά στην άσκηση. 3.6 Συλλογή του μυοκαρδίου Ο καρδιακοί μύες αφαιρέθηκαν χειρουργικά, ψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους -80 C μέχρι τη βιοχημική τους ανάλυση. Κατά την προετοιμασία για τη βιοχημική ανάλυση του ιστού τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με γουδί και γουδοχέρι χρησιμοποιώντας υγρό άζωτο. Ο ιστός ομογενοποιήθηκε σε αναλογία 1:2 σε PBS ph 7.4 (138mM NaCl, 2.7 mm KCL και lmm EDTA) και ένα προστέθηκε ένα μίγμα αναστολέων πρωτεασών (ΙμΜ σπροτινίνη, lpg/ml λιουπεπτίνη και lmm PMSF). Ακολούθως, το ομογενοποίημα υπέστη επεξεργασία με υπερήχους για την απελευθέρωση της μεγαλύτερης δυνατής ποσότητας πρωτεΐνης και φυγοκεντρήθηκε. 3.7 Μέθοδοι Τα πρωτόκολα των δεικτών οξειδωτικού στρες που μελετήθηκαν στην διπλωματική εργασία παρουσιάζονται αναλυτκά στο παράρτημα. Οι δείκτες οξειδωτικού στρες μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά και η αρχή προσδιορισμού του καθενός αναφέρεται αναλυτικά παρακάτω Οζειδάση της ξανθί'νης Αρχή της μεθόδου Η οξειδάση της ξανθίνης είναι ένα ένζυμο που περιέχει δύο άτομα Μο, τέσσερις διπυρηνικές φερρεδοξίνες και ένα δινουκλεοτίδιο φλαβίνης αδενίνης (FAD). Η δράση του σχετίζεται με τη μετατροπή της υποξανθίνης και της ξανθίνης σε ουρικό οξύ. Ο προσδιορισμός τη οξειδάσης της ξανθίνης βασίστηκε στην μέθοδο των Pradja and Weber, (1975).

38 Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβπουρικό οξύ (TBARS) Αρχή της μεθόδου Το οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ασταθών υπεροξειδίων των λιπιδίων από τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Προϊόν της διάσπασης αυτών των ασταθών μορίων είναι η μηλονική διαλδεΰδη (MDA). Η μηλονική διαλδεΰδη μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της αντίδρασής της με το θειοβαρβπουρικό οξύ (ΤΒΑ). Έτσι, τα TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) εκφράζονται σαν ισοδύναμα της μηλονικής διαλδεΰδης., η οποία σχηματίζει μία ένωση με το θειοβαρβπουρικό οξύ με αναλογία 1/2 αντίστοιχα. 2 HS. :\AVoh Ν,. ΟΗ ΤΒΑ CHO I CHO * + 2Η20. product Σχήμα 2: Αντίδραση του ΤΒΑ με την MDA Η μέτρηση της μηλονικής διαλδεΰδης είναι μία φωτομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό του βαθμού υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Για τον προσδιορισμό των TBARS χρησιμοποιήθηκε μια ελαφρά τροποποιημένη μέθοδος του Keles et al., (2001) Πρωτεϊνικά καρβονύλια Αρχή της μεθόδου Οι πρωτεΐνες και τα αμινοξέα είναι ευαίσθητα σε βλάβες προκαλούμενες από τις ελεύθερες ρίζες. Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια είναι ένας

39 37 δείκτης της οξείδωσης ων πρωτεϊνών και χρησιμοποιείται ευρέως. Οι καρβονυλικές ομάδες (αλδεΰδες και κετόνες) παράγονται κυρίως στις προσθετικές ομάδες της προλίνης (pro), της αργινίνης (arg), της λυσίνης (lys) και της θρεονίνης (thr). Είναι ένα αξιόπιστος δείκτης οξείδωσης των πρωτεϊνών καθώς τα καρβονύλια είναι σταθερά μόρια. Οι πρωτεΐνες που καρβονυλιώνοται υφίστανται μη αναστρέψιμες βλάβες καθώς εκτρέπονται από τη φυσιολογική τους λειτουργία. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες σε μέτριο βαθμό, διασπώνται από το πρωτεόσωμα αλλά αν υποστούν πολύ δριμείες βλάβες τότε δεν μπορούν να διασπαστούν και συγκεντρώνονται σε συσσωματώματα υψηλού μοριακού βάρους. Η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών όχι μόνο επηρεάζει τη δική τους λειτουργία αλλά και τον τρόπο με τον οποίο λειτουργούν και άλλα βιομόρια. Για παράδειγμα, αν υποστούν καρβονυλίωση ένζυμα όπως εκείνα που επισκευάζουν το DNA ή οι DNA πολυμεράσες, το DNA δε θα επιδιορθώνεται ούτε θα αντιγράφεται με την απαραίτητη πιστότητα. Ο σχηματισμός των καρβονυλίων συνήθως ανιχνεύεται με την αντίδρασή τους με το DNPH (2,4- δίνιτριφαινυλυδραζίνη) προς σχηματισμό του 2,4-δίνιτροφαινυλυδραζονίου. Ο προσδιορισμός των καρβονυλίων βασίστηκε στη μέθοδο Patsoukis et. αΐ Γλουταθειόνη Η γλουταθειόνη (γ-γλουταμυλο-κυστέινο-γλυκίνη) είναι η πιο άφθονη θειόλη (SH) στους ιστούς των ζώων και του ανθρώπου. Είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη και κυστείνη. Οι αναγωγικές (αντιοξειδωτικές) της ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια. Η γλουταθειόνη απαντάται κυρίως στην ανηγμένη (GSH) και λιγότερο στην οξειδωμένη της μορφή (δισουλφίδιο της γλουταθειόνης GSSG). Ο λόγος της ανηγμένης προς την οξειδωμένη γλουταθειόνη στα κύττρα χρησιμοποιείται συχνά σαν δείκτης οξειδωτικού στρες. Η GSH λειτουργεί ως

40 38 συνένζυμο σε πολλά ένζυμα. Ενδεικτικά αναφέρονται η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, η S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης και η θειολτρανσφεράση. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των φαρμάκων και του ασβεστίου καθώς και στη λειτουργία των αιμοπεταλίων και των κυτταρικών μεμβρανών. Είναι επίσης ζωτική η συμμετοχή της στην απομάκρυνση των ξενοβιοτικών ουσιών από τον οργανισμό, στην απομάκρυνση των υπεροξειδίων και των ελεύθερων ριζών αλλά και στη μεταφορά των αμινοξέων διαμέσου των μεμβρανών. Ανηγμένη Γλουταθειόνη Αρχή της μεθόδου Το πειραματικό πρωτόκολλο βασίζεται στην οξείδωση της GSH από το διθειοδυονιτροβενζοϊκό οξύ (DTNB). Η GSH αντιδρά με το DTNB παράγοντας GSSG και 2-νιτρο-5-θειοβενζοϊκό οξύ σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση, το οποίο είναι έγχρωμο προϊόν που απορροφάει στα 412nm. 2 GSH + DTNB >GSSG +2-nitro-5-thiobenzoic acid H GSH παράγεται από την GSSG μέσω της δράσης της αναγωγάσης της γλουταθειόνης.?g>sh Glutathione rediieias GSSG 2-NI*ro-S-tttkrtwnz<:>ic acid Area* 412 nm Σχήμα 3: Αρχή προσδιορισμού της γλουταθειόνης

41 39 Ο προσδιορισμός των GSH και GSSG έγινε με τις μεθόδους των Reddy et al., (2004) και Tietze, (1969) αντίστοιχα Καταλάση Αρχή της μεθόδου Η καταλάση είναι ένα ένζυμο που καταλύει τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) σε νερό και οξυγόνο. Ένα μόριο καταλάσης μπορεί να μετατρέψει μόρια Η2Ο2 δευτερόλεπτο σε νερό και οξυγόνο. Είναι ένα τετραμερές με 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες μεγέθους τουλάχιστον 500 αμινοξέων. Στο τετραμερές αυτό υπάρχουν 4 πορφυρινικές ομάδες αίμης, οι οποίες επιτρέπουν στην καταλάση να αντιδρά με το Η2Ο2. Το ιδανικό ph δράσης της είναι ουδέτερο. Η αντίδραση διάσπασης του Η2Ο2 από την καταλάση είναι η ακόλουθη: 2 Η202 > 2Η Η αντίδραση πραγματοποιείται σε δύο στάδια: Η202 +Fe (ΙΙΙ)-Ε -+ Η2Ο +0=Fe (IV)-E Η2Ο2 + 0= Fe (IV)-E -» H2O + Fe (III)-E +O2 LOO Σχήμα 4: Μονοπάτι αναγωγής του Η202 σε Τί20 Ο προσδιορισμός της καταλάσης έγινε με τη μέθοδο του Aebi (1984).

42 Ολική αντιοζειδωτική ικανότητα (Total Antioxidant Capacity, TAC) Αρχή της μεθόδου Ο όρος ολική αντιοζειδωτική ικανότητα (TAC) αναφέρεται στην ικανότητα των συστατικών του ιστού να εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες. Κάθε συστατικό του ιστού που έχει αντιοζειδωτική δράση συνεισφέρει με διαφορετικό τρόπο στην ολική αντιοζειδωτική ικανότητα, η οποία είναι γενικά ένα μέτρο της αντιοξειδωτικής κατάστασης. Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τρόποι προσέγγισης της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Ο πρώτος και πιο επίπονος τρόπος είναι ο υπολογισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας κάθε συστατικού του ιστού ξεχωριστά. Ο δεύτερος τρόπος είναι η μέτρηση της TAC ως συνόλου. Το ουρικό οξύ φαίνεται να είναι το μόριο που έχει τον πιο ισχυρό ρόλο στον καθορισμό της τιμής της TAC προκαλώντας μεγάλη αύξησή της όταν η συγκέντρωσή του αυξάνεται. Η βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ), οι βιταμίνες Ε και Α και η αλβουμίνη είναι μερικά από τα μόρια που συμβάλλουν επίσης στην ολική αντιοζειδωτική ικανότητα του ιστού. Ο προσδιορισμός της TAC βασίστηκε στη μέθοδο των Janaszweska και Bartosz, (2002). 3.8 Στατιστική Ανάλυση Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν μέσω της ανάλυσης διακύμανσης δύο παραγόντων (παρέμβαση χ χρόνος) (ANOVA). Οι ζευγαρωτές συγκρίσεις έγιναν μέσω ανάλυσης απλής κύριας επίδρασης. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο Ρ < Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS, version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, 111.). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως mean ± SEM.

43 41 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Οξειδάση Της Ξανθίνης Βρέθηκε κύρια επίδραση της παρέμβασης και του συνδυασμού παρέμβασης και χρύνου. Η αλοπουρινόλη και ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης μείωσαν κατά 4 περίπου φορές τη δραστικότητά της. Διάγραμμα 1. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης στην καρδιά. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την τιμή pre στην ίδια πειραματική ομάδα (Ρ < 0.05). # Στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στην άσκηση και την αλοπουρινόλη κατά την ίδια χρονική στιγμή (Ρ < 0.05).

44 TBARS Δε βρέθηκε καμία επίδραση Διάγραμμα 2. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη συγκέντρωση των TBARS στην καρδιά. 4.3 Πρωτεϊνικά Καρβονύλια Βρέθηκε κύρια επίδραση της παρέμβασης. Η αλοπουρινόλη αυξάνει την πρωτεϊνική οξείδωση σε σχέση με την άσκηση 5 ώρες μετά το τέλος της άσκησης. Διάγραμμα 3. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη συγκέντρωση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων στην καρδιά. # Στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στην άσκηση και την αλοπουρινόλη κατά την ίδια χρονική στιγμή (Ρ < 0.05)

45 Ανηγμένη Γλουταθειόνη Βρέθηκε κύρια επίδραση της παρέμβασης και του χρόνου. Ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης αυξάνει τη συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης και η αλοπουρινόλη την αυξάνει 5 ώρες μετά την άσκηση. Διάγραμμα 4. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης στην καρδιά. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την τιμή pre στην ίδια πειραματική ομάδα (Ρ < 0.05). # Στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στην άσκηση και την αλοπουρινόλη κατά την ίδια χρονική στιγμή (Ρ < 0.05). 4.5 Οξειδωμένη Γλουταθειόνη Δε βρέθηκε κύρια επίδραση της παρέμβασης, του χρόνου ή του συνδυασμού τους. Διάγραμμα 5. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη συγκέντρωση της οξειδωμένης γλουταθειόνης στην καρδιά.

46 Λόγος Ανηγμένης Προς Οξειδωμένη Γλουταθειόνη Βρέθηκε κύρια επίδραση της παρέμβασης, του χρόνου και του συνδυασμού τους. Ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης αυξάνουν το λόγο της ανηγμένης προς την οξειδωμένη γλουταθειόνη. Διάγραμμα 6. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στο λόγο ανηγμένης προς οξειδωμένη γλουταθειόνης στην καρδιά. # Στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στην άσκηση και την αλοπουρινόλη κατά την ίδια χρονική στιγμή (Ρ < 0.05).

47 Καταλάση Βρέθηκε κύρια επίδραση του συνδυασμού παρέμβασης και χρόνου. Η άσκηση αυξάνει τη δραστικότητα της καταλάσης και η αλοπουρινόλη τη μειώνει. Διάγραμμα 7. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στη δραστικότητα της καταλάσης στην καρδιά. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την τιμή pre στην ίδια πειραματική ομάδα (Ρ < 0.05). 4.8 Ολική Αντιοξειδωτική Ικανότητα(ΤAC) Δε βρέθηκε καμία επίδραση. Διάγραμμα 8. Η επίδραση της άσκησης και της αλοπουρινόλης στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στην καρδιά.

48 46 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε την απόκριση ενηλίκων επίμυων στο οξειδωτικό στρες μετά από έντονη φυσική δραστηριότητα. Οι επίμυες μελετήθηκαν κάτω από τρεις καταστάσεις: άσκηση, χορήγηση αλλοπουρινόλης και ο συνδυασμό τους. Τα δείγματα λήφθηκαν πριν, αμέσως μετά και 5h μετά την άσκηση και τις αντίστοιχες χρονικές στιγμές μετά τη χορήγηση αλλοπουρινόλης. Σε μέχρι τώρα μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί και αφορούν τον τρόπο που η άσκηση επιδρά στο οξειδωτικό στρες, έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα είδη άσκησης. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήσαμε το κολύμβηση επειδή είναι μια μορφή άσκησης που προκαλεί περιορισμένο μυϊκό τραυματισμό (Komulainen et al., 1995). Έτσι, οι επιδράσεις του πρωτοκόλου στο οξειδωτικό στρες δεν αποδίδονται στο μυϊκό τραυματισμό αλλά αποκλειστικά στην άσκηση. Στην παρούσα εργασία η άσκηση αύξησε μόνο την καταλάση αφήνοντας ανεπηρέαστους τους υπόλοιπους δείκτες οξειδωτικού στρες (οξειδάση ξανθίνης, πρωτεϊνικά καρβονύλια, ανηγμένη γλουταθειόνη, οξειδωμένη γλουταθειόνη, λόγος GSH/GSSG, TAC, TBARS). Σε προηγούμενη μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε αρσενικούς και θηλυκούς επίμυες, οι οποίοι ήταν χωρισμένοι σε δύο ομάδες διαφορετικού φύλου και εκτέλεσαν κολύμβηση για μία ώρα, η άσκηση αύξησε την δραστικότητα της καταλάσης στον καρδιακό μυ και στις δύο ομάδες (Terblanche, 2000). Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας. Σε μια άλλη έρευνα παρατηρήθηκε αύξηση της οξειδάσης της ξανθίνης, της GSSG και του λόγου GSH/GSSG στον καρδιακό μυ επιμύων οι οποίοι έτρεξαν σε διάδρομο με ταχύτητα 30m/min, με κατανάλωση VCbmax 70-75% (Lin et al., 2006). Αντίθετα σε άλλη εργασία βρέθηκε ότι η άσκηση μείωσε την συγκέντρωση πρωτεϊνικών καρβονυλίων στον καρδιακό μυ επιμύων μετά από τρέξιμο σε δαπεδοεργόμετρο (Liu et al., 2000).

49 47 Σε μια μελέτη που έγινε στον γαστροκνήμιο μυ επίμυων η άσκηση αύξησε τη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης και των πρωτεϊνικών καρβονυλίων (Gomez-Cabrera et al 2005). Σε μια άλλη μελέτη σε κολυμβητές η δραστικότητα της καταλάσης του πλάσματος βρέθηκε αυξημένη (Inal et al. 2001). Ο Vider et al σε μια μελέτη που πραγματοποίησε ένα V02max τεστ σε δαπεδοεργόμετρο (treadmill) έδειξε ότι η άσκηση αύξησε τη δραστικότητα των TBARS, της TAC, της GSH και της CAT του πλάσματος. Στην παρούσα εργασία η αλοπουρινόλη και ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης μείωσαν σημαντικά (4 φορές) τη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης. Η επίδραση αυτή της αλοπουρινόλης ήταν αναμενόμενη αφού είναι ένας αναστολέας της οξειδάσης της ξανθίνης. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν σύμφωνο με αυτό μιας άλλης σχετικής μελέτης που έδειξε ότι η αλοπουρινόλη μειώνει τη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης του γαστροκνήμιου μυός επιμύων κατά την άσκηση (Gomez- Cabrera et al 2005). Ο δείκτης υπεροξείδωσης λιπιδίων TBARS δεν παρουσίασε καμία μεταβολή. Ακόμη μια μελέτη που έχει γίνει επίσης σε επίμυες έδειξε ακριβώς το ίδιο αποτέλεσμα, καμία δηλαδή μεταβολή στον δείκτη υπεροξείδωσης λιπιδίων (Koyama et al., 1999). Επίσης παρατηρήθηκε ότι η αλοπουρινόλη αύξησε την οξείδωση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων (Gomez-Cabrera et al., 2005). Αντίθετα, σε άλλες μελέτες που έγιναν στον γαστροκνήμιο μυ επίμυων η αλοπουρινόλη οδήγησε σε μείωση της οξείδωσης των πρωτεϊνικών καρβονυλίων κατά την άσκηση (Gomez-Cabrera et al., 2005). Σε μελέτες που έγιναν σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια η αλοπουρινόλη δεν επηρέασε την οξείδωση των καρβονυλίων (Vina et al., 2000 & Heunks et al 1999). Όσον αφορά την GSH η αλοπουρινόλη και ο συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης αυξάνουν την χλουταθειόνη. Τα αποτελέσματα τριών άλλων μελετών έδειξαν ότι η αλοπουρινόλη δεν επηρέασε καθόλου την

50 48 GSH. Η μία από αυτές τις μελέτες έγινε στο γαστροκνήμιο μυ επιμύων μετά από εξαντλητική άσκηση σε δαπεδοεργόμετρο (Gomez-Cabrera et al 2005), η δεύτερη έγινε σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (COPD) μετά από εξαντλητική άσκηση σε κυκλοεργόμετρο (Heunks et al., 1999) και η τρίτη στα ερυθροκύτταρα αλόγων μετά από τρέξιμο σε δαπεδοεργόμετρο ( Mills et al 1997). Δεν βρέθηκε καμία μεταβολή στην GSSG. Σε μια μελέτη που έγινε στα ερυθροκύτταρα σε αλόγα μετά από τρέξιμο σε δαπεδοεργόμετρο η αλοπουρινόλη οδήγησε σε μείωση της GSSG μετά από άσκηση ( Mills et al 1997). Όσον αφορά το λόγο ανηγμένης προς οξειδωμένη γλουταθειόνη, αυτός εμφάνισε αύξηση στα δείγματα που έγινε συνδυασμός αλοπουρινόλης και άσκησης. Συμπερασματικά, η άσκηση που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία αύξησε μόνο τη δραστικότητα της καταλάσης και δεν φάνηκε να επηραάζει τους υπόλποιπους δείκτες οξειδωτικού στρες που μετρήθηκαν. Από την άλλη μεριά, η χορήγηση αλοπουρινόλης αύξησε τα πρωτεϊνικά καρβονύλια, την GSH και το λόγο GSH/GSSG, ενώ μείωσε τη δραστικότητα της καταλάσης και την οξειδάση της ξανθίνης.

51 49 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 6.1 Πρωτόκολλα Δεικτών Οξειδωτικού Στρες Οξειδάση ξανθίνης Ο προσδιορισμός τη οξειδάσης της ξανθίνης βασίστηκε στην μέθοδο των Pradja and Weber (1975). Είκοσι μι, ομογενοποιημένου ισρού (αραιωμένου 1:2) προστέθηκαν σε 430pL 33mM sodium potassium phosphate (ph 7.5) και 50pL ξανθίνης 1.7mM και η αντίδραση σταμάτησε αμέσως με την προσθήκη 50pL 100% TCA. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 10000g για 15 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 293nm. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε και η αντίδραση σταμάτησε όπως προηγουμένως αφού όμως τα δείγματα επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 37 C. Ακολούθησε η ίδια φυγοκέντρηση και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 293nm. Υπολογισμοί Δραστικότητα Ο.Ξ. (U/mg total prot.) = (AbsSampie 20 min per min - Abssampie 0 min per min/ 20/12.2) * 27,5 x3 x 2) /Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml). Όπου 12.2 (mmol/l) είναι o mill συντελεστής μοριακής απόσβεσης του ουρικού οξέος στα 293nm, 27,5 είναι ο συντελεστής αραίωσης, που προκύπτει από τη διαίρεση του τελικού όγκου (550pL) με τον όγκο του δείγματος (20μίή (550/20 = 27,5). Πολλαπλσιάζουμε με 3 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης, με 2 επειδή η αραίωση του δείγματος είναι 1/2 και διαιρούμε με 20 για να υπολογιστεί η δραστικότητα του ενζύμου σε lmin.

52 Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό o66(tbars) Για τον προσδιορισμό των TBARS χρησιμοποιήθηκε μια ελαφρά τροποποιημένη μέθοδος του Keles et al. (2001). Πενήντα μι ομογενοποιημένου ιστού (αραιωμένου 1:2) προστέθηκαν σε 500pL TCA 35% και 500μΣ Tris-HCL (200mM, ph 7.4) και ακολούθησε επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστέθηκε lml NaoSCL (2Μ)-ΤΒΑ (55mM) και τα δείγματα επωάστηκαν στους 95 C για 45 λεπτά. Ακολούθησε μεταφορά των δειγμάτων στον πάγο για 5 λεπτά και έπειτα αφού προστέθηκε 1 ml TCA 70% τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 15000g για 3 λεπτά και η απορρόφηση του υπερκείμενου μετρήθηκε στα 530nm. Υπολογισμοί TBARS (nmol/mg total prot.) = (ΑύβδείΥματος - Αύβτυφλού)/0.156 χ 62 χ 3 X 2/Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml) Όπου, 62 είναι ο συντελεστής αραίωσης, που προκύπτει από το λόγο του τελικού όγκου (3100pL) προς τον όγκο του δείγματος (50μ1) (3100/50=62). Το προέρχεται από το συντελεστή μοριακής απόσβεσης της MDA που είναι (mol/l) διαιρούμενου με ΙΟ'6 με σκοπό να μετατραπούν τα mol/l σε μ mol/l, 3 είναι η αραίωση του δείγματος (1/3) κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης and 2 είναι η αραίωση του δείγματος κατά τη μέτρηση.

53 Πρωτεϊνικά καρβονύλια Ο προσδιορισμός των καρβονυλίων βασίστηκε στη μέθοδο Patsoukis et. αΐ. Πενήντα μσ 20%TCA προστέθηκαν σε 50μΣ ομογενοποιημένου ιστού (αραιωμένου 1:2), τα δείγματα επωάστηκαν στον πάγο για 15 λεπτά και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 15000g για 5 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και προστέθηκαν 500μΣ DNPH (διαλυμένο σε 2.5Ν HCL) για τα δείγματα ή δοομσ 2.5Ν HCL για τα τυφλά. Ακολούθησε επώαση των δειγμάτων για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου με ενδιάμεση ανάδευση κάθε 15 λεπτά και στο τέλος φυγοκέντρηση στα 15000g για 5 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και προστέθηκε 1ml 10% TCA. Ακολούθησε ανάδευση και φυγοκέντρηση στα 15000g για 5 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και προστέθηκε 1ml μίγματος αιθανόλης- οξικού αιθυλεστέρα (1:1 ν/ν) ενώ έγινε φυγοκέντρηση στα 15000g για 5 λεπτά στους 4 C. Το συγκεκριμένο βήμα επαναλήφηκε δύο ακόμη φορές. Στο τέλος προστέθηκς lml 5Μ ουρίας (ph 2.3), και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 C για 15 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 15000g για 3 λεπτά στους 4 C και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 375nm. Υπολογισμοί Συγκέντρωση πρωτεϊνικών καρβονυλίων (nmol/mg total prot.)= Αδείγματος- Αχυφλού/0.022x1000/50 χ 3 χ 2/Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml). Όπου, 100/50 είναι ο συντελεστής αραίωσης, 3 είναι η αραίωση του δείγματος (1/3) κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης και 2 είναι η αραίωση του δείγματος κατά τη μέτρηση. Ο συντελεστής μοριακή απόσβεσης του DNPH είναι 22mM cm'1.

54 Γλουταθειόνη Ο προσδιορισμός των GSH και GSSG έγινε με τις μεθόδους των Reddy et al. (2004) και Tietze (1969) αντίστοιχα. Για την GSH, 20pL ομογενοποιημένου ιστού (αραιωμένου 1:2) προστέθηκαν σε 660pL 67mM sodium potassium phosphate (ph 8.0) και 330pL ImM DTNB σε eppendorfs. Τα δείγματα επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 412nm. Για τον προσδιορισμό της GSSG, αρχικά σε 50μΓ αιμολύματος προστέθηκαν σταδιακά σε ποσότητες l-2pl κάθε φορά 1Μ NaOH μέχρι το ph να φτάσει την τιμή Κατόπιν προστέθηκε lpl 2-vinyl pyridine και τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Πέντε pl του ομογενοποιημένου ιστού (αριαωμένου 1:2) προστέθηκαν σε 600pL 143mM sodium phosphate (6.3mM EDTA, ph 7.5), 100pL 3mM NADPH, 100pL lomm DTNB και 194pL απετσαγμένου νερού. Τα δείγματα επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά και την προσθήκη lpl αναγωγάσης της γλουταθειόνης μετρήθηκε η αλλαγή στην απορρόφηση στα 412nm για 70 δευτερόλεπτα. Υπολογισμοί Δραστικότητα GSH (pmol/mg total prot.)=(abs6eiwaro? AabsIOq),\oi)/13.6) χ 3 χ 2 χ 2χ50.5/ Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml) Όπου το 50.5 είναι ο συντελεστής αραίωσης που προκύπτει διαιρώντας τον τελικό όγκο (1010pL) με τον όγκο του αιμολύματος (20μΠ) (1010/20=50.5), πολλαπλασιάζουμε με 2 για να συνυπολογίσομε και την πρώτη αραίωση που έγινε από το TCA 5% (1:1), πολλαπλασιάζουμε με 3 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση που έγινε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης και με 2 για να λάβουμε υπόψην την αραίωση του δείγματος (1/2). Το 13.6 είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του DTNB.

55 53 GSSG συγκέντρωση(pmol/mg total prot.)=pmol/ml/mg/ml ολ.πρωτ. Σό γκ. GSSG (mmol / L) [ [ ( AtlSoiiypu τος-aabs1 ικρλού) X 0/ 75/ A Απρότυπου" ΔΑτυφλού]χ3χ2χ2χ200χ0.9]/2/1000/Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml) Όπου το 200 είναι ο συντελεστής αραίωσης που προκύπτει διαιρώντας τον τελικό όγκο (ΙΟΟΟμΣ) προς τον όγκο του δείγματος (5μΣ) (1000:5=200). Πολλαπλσιάζουμε με 3 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση κατά τη διάτκεια της ομογενοποίησης (1:3), πολλαπλασιάζουμε με 2 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση του δείγματος (1:2), με 2 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση με το TCA 5% (1:1), με 0.9 για να λάβουμε υπόψη την αραίωση που έγινε από τα ~5μΣ NaOH για την διόρθωση του ph, διαιρούμε με 2 για να λάβουμε υπόψη την στοιχειομετρία της αντίδρασης (2GSH >1GSSG) και διαιρούμε με 1000 για να μετατρέψουμε τα μσ σε mmol. Το 0.75 είναι η σύγκεντρωση του πρότυπου.

56 Καταλάση Ο προσδιορισμός της καταλάσης έγινε με τη μέθοδο του Aebi (1984). Σαράντα μσ ομογενοποιημένου ιστού (αραιωμένου 1:2) προστέθηκαν σε 2955μΣ 67mM sodium potassium phosphate (ph 7.4) και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 C για 10 λεπτά. Πέντε μσ Η2Ο2 30% προστέθηκαν στα δείγματα και η αλλαγή στην απορρόφηση καταγράφηκε στα 240nm για 130 δευτερόλεπτα. Υπολογισμοί Δραστικότητα καταλάσης (U/mg total prot.) = (Z\Abs6 iwaro?per min / 40) x (75 x 1000 x 3 x 2) / Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml) Όπου, 40 (mol/l) είναι ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης του Η2Ο20 οποίος πολλαπλασιάζεται με το 1000 για να μετατραπούν τα mol/l σε pmol/ml, το 75 είναι ο συντελεστής αραίωσης, ο οποίος προκύπτει διαιρώντας τον τελικό όγκο (3000) με τον όγκο του δείγματος (40μΣ) (3000/40 = 75), 3 είναι η αραίωση του δείγματος (1/3) κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης and 2 είναι η αραίωση του δείγματος κατά τη μέτρηση. Ζ\ Abs (min) = η αλλαγή στην απορρόφηση σε ένα λεπτό. Ό συντελεστής μοριακής απόσβεσης μιας ουσίας ισούται με την απορρόφηση της ουσίας αυτής σε συγκέντρωση lmol/l.

57 Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα(τοίαι Antioxidant Capacity, TAC) Ο προσδιορισμός της TAC βασίστηκε στη μέθοδο των Janaszweska και Bartosz (2002). Σαράντα pl ομογενοποιημένου ιστού (αραιωμένου 1:5) προστέθηκαν σε 460μΣ lomm sodium potassium phosphate (ph 7.4) και 500pL O.lmM ρίζας 2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl (DPPH) και τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα 20,000g και μέτρηση της απορρόφησης στα 520nm. Υπολογισμοί Τα αποτελέσματα μπορούν να εκφραστούν ως: % μείωση της απορόφησης (Abs) σε σχέση με το τυφλό, %Abs μείωση=(abs τυφλού-abs δείγματος)/abs τυφλούχιοο ή ως μυτοί DPPH που απομακρύνθηκαν/(mmol/mg total prot.) = [(%Abs μείωση/100) χ50x 50]/1000/Συγκ. πρωτεΐνης (mg/ml) Διαιρούμε με το 100 με σκοπό να μετατραπεί η ποσοστιαία μείωση της απορρόφησης σε απλή μείωσή της, πολλαπλασιάζουμε με το 50 διότι η συγκέντρωση του DPPH στην κυψελίδα είναι 50μπτο1/Τ, πολλαπλασιάζουμε με το 50 διότι η αραίωση του δείγματος στην κυψελίδα είναι 1:5 (ΙΟΟΟμΣ στην κυψελίδα/20μσ δείγματος=50) και τέλος διαιρούμε με το 1000 για τη μετατροπή των Σσε ml.

58 56 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Accominotti Μ, Duey Ρ, Labet C (1991). Evlution des taux de selenium et de glutathione peroxydase sanguine de sportifs haut niveau. Sri Sports 6: Aguilo A, Tauler P, Fuentespina E (2005). Antioxidant response to oxidative stress induced by exhaustive exercise. Physiol Behan 84(1): A1 Suwaidi J, Hamsaki S, Higano ST et al (2000). long term follow up to patients with mild coronary disease and endothelial dysfunction. Circulation 2000;101: Alessio HM (1993). Exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 25: Alessio HM, Goldfarb AH, Cutler RG (1988). MDA content increases in fast-and slow twitch skeletal muscle with intensity of exercise in a rat. Am ] Physiol 255: C874-C Ames BN (1986). Food constituents as a source of mutagens, carcinogens and anticarcinogens. Prog Clin Biol Res 206: Ames BN (1999). Micronutrient deficiencies. A major cause of DNA damage. Ann NY Acad Sci 889: Ashton T, Rowlands CC, Jones E, et al (1998). Electron spin resonance spectroscopic detection of oxygen-centred radicals in human serum following exhaustive exercise. Eur ] Appl Physiol 77(6): Beckman KB and Ames BN (1997). Oxidative decay of DNA. J Biol Chem 272: Belboul A, Roberts D, Borjesson R, Johnsson J (2001). Oxygen free radical generation in healthy blood donors and cardiac patients: the protective effect of allopurinol. Perfusion 16: Bielski BHJ and Cabelli DE (1995). Superoxide and hydroxyl radical chemistry in aqueous solution. In: Active Oxygen in Chemistry. Foole CS, Valentine JS, Greenber A, Liebman JF(eds). Chapman and Hall, London, pp

59 Chance B, Sies H, Boveris A (1979). Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev 59: Chevion S, Moran DS, Heled Y, et al (2003). Plasma antioxidant status and cell injury after severe physical exercise. Proc Natl Acad Sci USA 100(9): Child RB, Wilkinson DM, Fallowfield JL et al (1998). Elevated serum antioxidant capacity and plasma malondialdehyde concentration in response to a simulated half-marathon run. Med Sci Sports Exerc 30(11): Davies KJ, Quintanilha AT, Brooks GA et al (1982). Free radicals and tissue damage produced by exercise. Biochem Biophys Res Commun 107: Davis KJ (1987). Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. general aspects. / Biol Chem 262: Dizdaroglu M, Jaruga P, Birincioglu M, Rodriguez H (2002). Free radical-induced damage to DNA: Mechanisms and measurement. Free Radic Biol Med 32: Downey JM (1990). Free radicals and their involvement during longterm myocardial ischemia-reperfusion. Annu Rev Physiol 52: Elsayed NM, Omaye ST, Klain GJ, Korte DW Jr (1992). Free radicalmediated iung response to the monofunctional sulfur mustard butyl 2- chloroethyl sulfide after subcutaneous injection. Toxicology 72: Gokce N, Keaney JF, Hunter LM et al (2002). Risk stratification for postoperative cardiovascular events via non-invasive assessment of endothelial function: a prospective study. Circulation 2002;105: Gokce N, Keaney JF, Hunter LM et al (2003). Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. ] Am Coll GmftbZ;410: Gomez-Cabrera MC, Borras C, Pallardo FV, Sastre J, Ji LL, Vina J (2005). Decreasing xanthine oxidase-mediated oxidative stress prevents useful cellular adaptations to exercise in rats. ] Physiol 567:

60 Gomez-Cabrera MC, Martinez A, Santangelo G, Pallardo FV, Sastre J, Vina J (2006). Oxidative stress in marathon runners: interest of antioxidant supplementation. Br ] Nutr 96 Suppl l:s Groussard C, Rannou-Bekono F, Machefer G et al (2003). Changes in blood lipid peroxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise. Eur ] Appl Physiol 89: Grune T, Reinheckei T, Davies KJA (1997). Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. FASEBJ 11: Halliwell B (2000). Why and how should we measure oxidative DNA damage in nutritional studies? Flow far have we come?am ] Clin Nutr 72: Halliwell B and Gutteridge JM (1999). Free Radicals in Biology and Medicine, third edition. Oxford Univesrity Press, Midsomer Norton, Avon, England. 28. Halliwell B and Gutteridge JMC (1989). Free radicals in biology and medicine (2nd ed.) Oxford: Clarendon Press, pp Hansford RG, Hogue BA and Mildaziene V (1997). Dependence of H2O2 formation by rat heart mitochondria on substrate availability and donor age. Bioenerg Biomembr 29: Heitzer T, Schlinzig T, Krohn K et al (2001). Endothelial dysfunction, oxidative stress and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease. Circulation 2001;104: Helbock HJ, Beckman KB, Ames BN (1999). 8-Hydroxydeoxyguanosine and 8-hydroxy guanine as biomarkers of oxidative DNA damage. Methods Enzymol 300: Heunks LM, Vina J, van Herwaarden CL, Folgering HT, Gimeno A, Dekhuijzen PN (1999). Xanthine oxidase is involved in exercise-induced oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol 277:R Hille R and Stewart RC (1984), ]. Biol Chem. 259, Hoey BM, Butler J, Halliwell B (1988). On the specificity of allopurinol and oxypurinol as inhibitors of xanthine oxidase. A pulse radiolysis

61 59 determination of rate constants for reaction of allopurinol and oxypurinol with hydroxyl radicals. Free Rndic Res Commun 4: Inal M, Akyiiz F, Turgut A (2001). Effect of aerobic and anaerobic metabolism on free radical generation swimmers. Med Sci Sports Exerc 33(4): Jenkins R (1988). Free radical chemistry: Relationship to exercise. Sport Med 5: Jones DP, Carlson JL, Mody VC, Cai J, Lynn MJ, Sternberg P (2000). Redox state of glutathione in human plasma. Free Radic Biol Med 28: Kanner J and Lapidot T (2001). The stomach as a bioreactor: Dietary lipid peroxidation in the gastric fluid and the effects of plant-dervied antioxidants. Free Radic Biol Med 31: Kayatekin BM, Gonenc S, Acikgoz O, Uysal N, Dayi A (2002). Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. Eur ] Appl Physiol 87: Koren HS (1995). Association between criteria air pollutants and asthma. Environ Health Perspect 103: Koyama K, Kaya M, Ishigaki T, Tsujita J, Hori S, Seino T, Kasugai A (1999). Role of xanthine oxidase in delayed lipid peroxidation in rat liver induced by acute exhausting exercise. Eur ] Appl Physiol Occup Physiol 80: Kuppasamy P and Zweier JL (1989). Characterization of free radical generation by xanthine oxidase. Evidence for hydroxyl radical generation. / Biol Chem 264: Levine RL and Stadtman ER (2001). Oxidative modification of proteins during aging. Exp. Gerontol 36: Lijinsky W (1999). N-Nitroso compounds in the diet. Mutat Res 443: Lin WT, Yang SC, Tsai SC, Huang CC, Lee NY (2006). L-Arginine attenuates xanthine oxidase and myeloperoxidase activities in heart of rats during exhaustive exercise. Br ] Nutr 95(1):

62 Liu J, Overvik-Douki E, Hagen T, Doniger S), Chyu DW, Brooks GA, Ames BN (2000). Chronically and acutely exercised rats: biomarkers of oxidative stress and endogenous antioxidants. ] Appl Physiol 89(1): Liu ML, Bergholm R, Makimattila S, et al (1999). A marathon run increases the susceptibility of LDL to oxidation in vitro and modifies plasma antioxidants. Am ] Physiol 276 (6): E Lovlin R, Cottle W, Pyke I (1987). Are indices of radical damage related to exercise intensity? Eur J Apl Physiol 56: Mastaloudis A, Leonard SW, Traber MG (2001). Oxidative stress in athletes during extreme endurance exercise. Free Radio Biol Med 31(7): McBride JM, Kraemer WJ, Triplett-McBride T, Sebastianelli W (1998). Effect of resistance exercise on free radical production. Med Sci Sports Exerc 30: McCord JM and Fridovich I (1968). The reduction of cytochrome c by milk xanthine oxidase. J Biol Chem 243: Meral A, Tuncel P, Surmen-Gur E, Ozbek R, Ozturk E, Gunay U (2000). Lipid peroxidation and antioxidant status in beta-thalassemia. Pediatr Hematol Oncol 17: Meydani M and Evans WJ (1993). Free radicals, exercise and aging. In: Yu BP, Ed Free Radicals in Aging Boca raton, FL: CRC Press, pp Meydani M, Evans W, Handelman G, Fielding RA, Meydani SN, Fiatarone MA, Blumberg JB, Cannon JG (1992). Antioxidant response to exercise-induced oxidative stress and protection by vitamin E. Ann N Y Acd Sci 669: Mills PC, Smith NC, Harris R. C, Harris P (1997). Effect of allopurinol on the formation of reactive oxygen species during intense exercise in the horse. Res Vet Sci 62: Mylonas C, Kouretas D (1999). Lipid peroxidation and tissue damage. In Vivo 13: Naito Y, Yoshikawa T, Yoshiba N, Kondo M (1998). Role of oxygen radical and lipid peroxidation in idomethanic-induced gastric mucosal injury. Dig Dis Sci 43:30S-34S.

63 Obata T, Yamanaka Y, Kinemuchi H, Oreland L (2001). Release of dopamine by perfusion with l-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP(+)) into the striatum is associated with hydroxyl free radical generation. Brain Res 906: Palazzetti S, Richard MJ, Favir A (2003). Overload training increase exercise-induced oxidative stress and damage. Can } Appl Physiol 28(4) Palmer FM, Nieman DC, Henson Da, et al (2003). Influence of vitamin C supplementation on oxidative and salivary Ig A changes following an ultramarathon. Eur J Appl Physiol 89: Pericone F, Ceravolo R, Pujia A et al (2001). Prognostic significance of endothelial dysfunction in hypertensive patients. Circulation 2002;104: Petrone WF, English DK, Wong K, McCord JM (1980). Free radicals and inflammation: Superoxide-dependent activation of a neutrophil chemotactic factor in plasma. Proc Natl Acad Sci USA 77: Pick FM and Bray RC (1969), Biochem J. 114, Pyne DB (1994). Regulation of neutrophil function during exercise. Sports Med 17: Rav RS, Mehrotra S, Shanker U, Babu GS, Joshi PC, Hanss RK (2001). Evaluation of UV-induced superoxide radical generation potentional of some common antibiotics. Drug Chem Toxicol 24: Sahlin K, Cizinsky S, Warholm M et al (1992). Repetitive static muscle contractions in humans: a trigger of metabolic and oxidative stress? Eur J Appl Physiol 64: Schachinger V, Britten MB, Zeiher AM (2000). Prognostic impact of coronary vasodilator dysfunction in adverse long-term outcome of coronary heart disease. Circulation 2000;101: Spector T, Hall WW, Krenitsky TA (1986), Biochem Pharmac 35, Stadtman ER (1986). Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems, implication in protein turnover, aging and neutrophil function. Trends Biochem Sci 11:11-12.

64 St-Pierre J, Buckingham JA, Roebuck SJ and Brand MD (2002). Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. ] Biol Chem 277: Ter blanche SE (2000). The effects of exhaustive exercise on the activity levels of catalase in various tissues of male and female rats. Cell Biol Int 23(11): Vasankari TJ, Kujala UM, Vasankari TM, et al (1997). Effects of acute prolonged exercise on serum and LDL oxidation and antioxidants defences. Free Radic Biol Med 22(3): Victoria K (1994). Review oh the genotoxicity of nitrogen oxides. Mutat Res 317: Vider J, Lehtmaa J, Kullisaar T et al (2001). Acute immune response in respect to exercise-induced oxidative stress. Pathophysiology 7: Vina J, Servera E, Asensi M, Sastre J, Pallardo FV, Ferrero JA Garcia de la Asuncion J, Anton V, Martini J (1996). Exercise causes blood glutathione oxidation in chronic obstructive pulmonary disease: prevention by O2 therapy. ]. Appl Physiol 81: Von Sonntag C (1987). The Chemical Basis of radiation Biology. Taylor & Francis, London. 77. Wormser U, Sintov A, Brodsky B, Nyska A (2000). Topical iodine preparation as therapy against sulfur mustard-induced skin lesions. Toxicol Appl Pharmacol 169: Yu BP (1994). Cellular defences against damage from reactive oxygen species. Physiol Rev 74:

65