Μικροβιακή Οικολογία. Εισαγωγικές έννοιες Συμβατικές και βιοχημικές τεχνικές

Transcript

1 Μικροβιακή Οικολογία Εισαγωγικές έννοιες Συμβατικές και βιοχημικές τεχνικές

2 Μικροβιακή Οικολογία Αναφέρεται στον οικοφυσιολογικό ρόλο των μικροοργανισμών σε χερσαία, υδάτινα αλλά και αέρια οικοσυστήματα 1 γραμμάριο εδάφους μπορεί να περιέχει ως και 10 δις μικροοργανισμούς!!

3 Μικροβιακή Οικολογία Οι περισσότερες οικολογικές θεωρίες δεν είναι απόλυτα εφαρμόσιμες στην μικροβιακή οικολογία διότι δημιουργήθηκαν με βάση οικοσυστήματα βασιζόμενα σε ζώα και φυτά

4 «Σε οικοσυστήματα με αυξημένη εισροή ενέργειας και βιοποικιλότητα η απώλεια ενός είδους δεν θα έχει σημαντική επίδραση στην σταθερότητα του οικοσυστήματος» ΜcArthur 1955 «Η απώλεια ενός ή περισσοτέρων ειδών είναι σε απόλυτο βαθμό και επηρεάζει εξίσου την σταθερότητα των οικοσυστημάτων ανεξάρτητα από την βιοποικιλότητα τους» May 1973

5 Θεωρίες στην Μικροβιακή Οικολογία Θεωρία της παραλλακτικότητας των εισροών: Αύξηση της ποικιλότητας των εισροών σε ένα οικοσύστημα αυξάνει οδηγεί σε αύξηση της μικροβιακής ποικιλότητας και της παραγωγικότητας του οικοσυστήματος μέχρι ενός σημείου που αρχίζει αντίθετη πορεία λόγω ανταγωνισμού μεταξύ των ειδών (Tilman 1982) Θεωρία της ασφάλειας: Αυξημένη μικροβιακή ποικιλότητα συνεπάγεται αυξημένη παραγωγικότητα και μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε εξωγενής καταπονήσεις (Yachi and Loreau 1999)

6 Τα οικοσυστήματα χαρακτηρίζονται τόσο με βάση της σύσταση τους σε είδη όσο και με βάση της λειτουργία τους Ποιές είναι οι λειτουργίες της μικροβιακής κοινότητας σε ένα εδαφικό οικοσύστημα? Γεωχημικοί κύκλοι C, N, P, S, Fe

7 Microbial Structure vs Microbial Function Μεταβολές στην σύσταση της μικροβιακής κοινότητας φαίνεται ότι δεν συνεπάγονται πάντα ή απαραίτητα μεταβολές και στην λειτουργία Functional redundancy Μια συγκεκριμένη λειτουργία (νιτροποίηση) μπορεί να συνεχίζει να εκτελείται από ένα μικρό αριθμό μελών της μικροβιακής κοινότητας παρά την μείωση της ποικιλότητας

8 Τι σημαίνει το functional redundancy για την μικροβιακή οικολογία; Εκτός της μελέτης μεταβολών στην σύσταση της μικροβιακής κοινότητας θα πρέπει να μελετήσουμε παράλληλα και την αντίστοιχη λειτουργία στην οποία συμμετέχουν οι μικροοργανισμοί Νιτροποίηση Νιτροποιητικά βακτήρια και αρχαία Απονιτροποίηση Απονιτροποιητικά βακτήρια Αποσύνθεση οργανικής ουσίας Βασιδιομύκητες και Ακτινοβακτήρια

9 Πως μετράμε την λειτουργία της μικροβιακής κοινότητας; Δραστηριότητα ενζύμων μικροβιακής προέλευσης που ελέγχουν βήματα σε κύκλου στοιχείων όπως C (κυτταρινάση, β-γλυκοσιδάση), Ν (μονοξειδάση αμμωνίου, νιτρογενάση) - In vitro Χρήση ραδιοισοτόπων ( 14 C, 15 N) In situ

10 Πως μετράμε την μικροβιακή ποικιλότητα; Συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι που προϋποθέτουν καλλιέργεια σε θρεπτικά υποστρώματα «1-10% των μικροοργανισμών αναπτύσσονται στα μέχρι σήμερα γνωστά θρεπτικά μέσα» Βιοχημικές και Μοριακές βιολογικές μέθοδοι που δεν προϋποθέτουν καλλιέργεια των μικροοργανισμών

11 Συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι Καταμέτρηση σε εκλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα για διαφορετικές (φυλογεννετικά) ομάδες μικροοργανισμών - Potato Dextrose Agar (PDA) για μύκητες - Bacillus broth για βακτήρια του γένους Bacillus - Glycerol-casein Agar για ακτινοβακτήρια - Soil Extract Agar για ετερότροφα βακτήρια

12 Συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι Τεχνική διαδοχικών αραιώσεων

13 Καταμέτρηση μικροοργανισμών με συγκεκριμένο φαινότυπο (functional groups) Νιτροποιητικά βακτήρια Διαλυτοποιητικά βακτήρια Αζωτοδεσμευτικά βακτήρια Θειο-αναγωγικά βακτήρια

14 Μέθοδος Most Probable Number

15 No. of Tubes Positive in first set middle set last set MPN in the inoculum of the middle set of tubes Πίνακας καταγραφής MPN 0.26 x 10 3

16 Βιοχημικές Τεχνικές στην μικροβιακή οικολογία PLFAs (Phospholipid Fatty Acid Analysis) Ανάλυση Λιποκινονών BIOLOG

17 PLFAs Τα λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων που βρίσκονται στις κυτταρικές μεμβράνες των βακτηρίων, μυκήτων, πρωτοζώων εκχυλίζονται από περιβαλλοντικά δείγματα και χρησιμοποιούνται ως βιοδείκτες μεταβολών στην σύσταση της μικροβιακής κοινότητας

18 Τα φωσφολιπίδια είναι αμφιπαθητικά μόρια που αποτελούνται από ένα υδρόφοβο τμήμα (λιπαρό οξύ) και ένα πολικό, υδρόφιλο τμήμα γλυκερόλη φωσφορικό

19 Γιατί τα PLFAs είναι αξιόπιστοι βιοδείκτες; Βρίσκονται στις κυτταρικές μεμβράνες όλων των ζωντανών οργανισμών και δεν συσσωρεύονται σε όργανα αποθήκευσης των μικροοργανισμών Διασπώνται άμεσα σε ουδέτερα λιπίδια μετά τον θάνατο του μικροοργανισμού Μπορούν να εκχυλιστούν και να αξιολογηθούν ποσοτικά και ποιοτικά με σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους δίνοντας έτσι και ποσοτικά στοιχεία για την μικροβιακή κοινότητα του εδάφους

20 Τα φωσφολιπίδια διασπώνται αμέσως μετά τον θάνατο του μικροοργανισμού από ενδογενής φωσφολιπάσες με απομάκρυνση του πολικού φωσφορικού τμήματος προς διγλυκερίδια

21 Εστερικός δεσμός των φωσφολιπιδίων σε προκάρυα, ευκάρυα ισοπρένιο (n) Αιθερικός δεσμός των φωσφολιπιδίων σε Αρχαία

22 Χρωματογράφημα από αέριο χρωματογράφο με ανίχνευση Ιονισμού Φλόγας (FID) όπου σε 40 min ανιχνεύονται τα σημαντικότερα λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους

23 Ομάδες PLFAs με βάση τα παρακάτω χαρακτηριστικά τους: 1. Συνολικό αριθμό ατόμων C 2. Αριθμό και θέση διπλών δεσμών 3. Πλευρικές αλυσίδες

24 Παράδειγμα 16:0 = 16 C, χωρίς διπλό δεσμό 18:2ω5 = 18 C, με δύο διπλούς δεσμούς με τον πρώτο στο 5ο άτομοc απότοαλειφατικόάκρο a15:0 = 15 C, χωρίς διπλό δεσμό με anteisoπλευρική αλυσίδα

25 Μερικά PLFAs είναι βιοδείκτες ομάδων μικροοργανισμών Βακτήρια θετικά κατά Gram: i14:0, i15:0, i- 17:0 Βακτήρια αρνητικά κατά Gram: cy19:0, cy17:0, 16:1ω7, 18:1ω9cis/trans Μύκητες: 18:2ω6, 16:1ω5 (Δενδρόμορφοι μυκορριζικοί μύκητες) Ακτινοβακτήρια: 10Me17:0, 10Me18:0 Θείο-αναγωγικά βακτήρια: i-17:1 Μεθανιότροφα βακτήρια: 16:1ω8c, 18:1ω8c

26 Αποτύπωμα μικροβιακής κοινότητας Εφαρμογή στατιστικών αναλύσεων πολύμεταβλητότητας όπως: CO 2 x AM: amb, -AM amb, +AM ele, -AM ele, +AM -Principle Components Analysis (PCA) - Cluster analysis

27 Χρήση των φωσφολιπιδίων ως δείκτες φυσιολογικής κατάστασης της μικροβιακής κοινότητας Υψηλές ποσότητες συγκεκριμένων φωσφολιπιδίων έχει αποδειχτεί ότι αποτελούν δείκτες ότι η μικροβιακή κοινότητα, βρίσκεται υπό συνθήκες στρες Οι μικροοργανισμοί μεταβάλουν την σύσταση των φωσφολιπιδίων στις κυτταρικές τους μεμβράνες ώστε να προσαρμόσουν την λειτουργικότητα και ανθεκτικότητα των μεμβρανών στις νέες περιβαλλοντικές συνθήκες

28 Ποίοι είναι αυτοί οι δείκτες; Αύξηση του λόγου trans/cis ισομερών δύο μονοακόρεστων PLFAs Αύξηση της συγκέντρωσης των cy17:0, cy19:0 PLFAs σε σχέση με τα μητρικά τους μόρια 16:1ω7cis, 18:1ω7cis

29 Πλεονεκτήματα PLFAs Παρέχουν εικόνα της ζωντανής μικροβιακής κοινότητας Η συνολική ποσότητα των PLFAs αποτελούν δείκτη του μεγέθους της βιομάζας Στατιστική ανάλυση μπορεί να δώσει πληροφορίες για την επίδραση διαφόρων παραγόντων στην σύσταση της μικροβιακής κοινότητας Η αναλογία μεταξύ διαφόρων λιπαρών οξέων παρέχει γενικές πληροφορίες για την φυσιολογική κατάσταση της μικροβιακής κοινότητας (στρες ή φυσιολογική)

30 Μειονεκτήματα PLFAs Ορισμένα PLFAs που θεωρούνται δείκτες για συγκεκριμένες ομάδες μικροοργανισμών περιέχονται σε σημαντικές ποσότητες και σε μικροοργανισμούς άλλων ομάδων Δύσκολος ο ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός των PLFAs που ανιχνεύτηκαν σε περιβαλλοντικά δείγματα (π.χ. Υποθέτουμε ότι ο ανιχνευτής του GC παρουσιάζει όμοια ευαισθησία για όλα τα PLFAs!!!) Παρέχει πληροφορίες για την μικροβιακή κοινότητα σε επίπεδο ομάδας μικροοργανισμών και όχι σε επίπεδο είδους ήγένους(όπως DNA, RNA-PCR methods)

31 Βιοχημικές Τεχνικές για προσδιορισμό της μικροβιακής ποικιλότητας PLFAs (Phospholipid Fatty Acid Analysis) Ανάλυση Αναπνευστικών Λιποκινονών BIOLOG plates

32 Τι είναι οι λιποκινόνες; Αποτελούν απαραίτητους φορείς ηλεκτρονίων στους μηχανισμούς αναπνοής όλων των μικροοργανισμών κινολινικός δακτύλιος Ισοπρενοειδή πλευρική αλυσίδα

33 Λιποκινόνες Γιατί Βιοδείκτες; Όλοι οι αερόβιοι και μερικοί αναερόβιοι μικροοργανισμοί έχουν αναπνευστικές λιποκινόνες Συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί παράγουν σε υψηλές ποσότητες μια συνήθως μορφή λιποκινόνης δείκτη Η συνολική ποσότητα λιποκινονών έχει βρεθεί ότι είναι ανάλογη της συνολικής βιομάζας του εδάφους Μπορούν να προσδιοριστούν ποιοτικά και ποσοτικά με Υγρή Χρωματογραφία (HPLC)

34 Κατηγορίες αναπνευστικών λιποκινονών Ναφθοκινόνες (πχ. Menaquinones) Βενζοκινόνες (πχ. Ubiquinones) Βενζοθειοφαινοκινόνες O O CH 3 O CH 3 CH 3 CH 3 O O n H O n H Ubiquinones Menaquinones (Q-n) (Mk n)

35 Μενακινόνες Αποτελούν τις πιο συχνά απαντούμενες λιποκινόνες στα βακτήρια

36 Μενακινόνες MK6 - Bacterioidetes (Cytophaga, Flavobacterium sp.) MK7 - Staphylococcus, Bacillus MK7(H2) Brevibacterium MK8 Lactobacillus MK8(H2) (H4) - Rhodococcus, Nocardia MK9 Arthrobacter MK9(H2) Corynebacterium MK9 (H4) Cellulomonas MK9(H6) ή (Η8) Streptomyces MK10 Rathaybacter MK10(H2 H8) - Glycomyces, Nocardiopsis, Thermomonospora MK11 and 12 Microbacterium, Agrococcus, Aureobacterium

37 Ουμπικινόνες - Ροδοκινόνες Απαντώνται κυρίως στα α-, β- και γ-πρωτεοβακτήρια α-proteobacteria Q9 Agrobacterium, Rhizobium β-proteobacteria Q8 Escerichia coli, Nitrosomonas, Stenotrophomonas γ-proteobacteria ;Q10 Pseudomonas

38 Βενζοθειοφαινοκινόνες Κυρίως παρατηρούνται σε θερμόφιλα και οξεόφιλα Αρχαία

39 Πως διαφοροποιούνται οι λιποκινόνες μεταξύ βακτηρίων; Διαφοροποιήσεις υπάρχουν και στο αρωματικό τμήμα του μορίου τους αλλά κυρίως παρουσιάζονται στην ισοπρενοειδή αλυσία Προσθήκη CH 3 στον δακτύλιο Διαφοροποίηση στο μήκος της ισοπρενοειδούς αλυσίδας (4-15 μονάδες ισοπρενίου) Βαθμός κορεσμού της ισοπρενοειδούς αλυσίδας και θέση διπλών δεσμών

40 Βιοχημικές Τεχνικές για προσδιορισμό της μικροβιακής ποικιλότητας PLFAs Ανάλυση Λιποκινονών BIOLOG - CLPP

41 BIOLOG Microtitre plates (96 κελία) που περιέχουν 95 υποστρώματα όπως υδατάνθρακες, αμινοξέα, καρβοξυλικά οξέα, αμίνες, αμίδια και πολυμερή + 1 κελί-μάρτυρα Ολατακελίαπεριέχουνtetrazolium dye Προσθήκη υδατικού εκχυλίσματος εδάφος στα κελιά, επώαση για επιλεγμένο χρονικό διάστημα και παρακολούθηση της ανάπτυξης χρώματος που οφείλεται στην οξείδωση του υποστρώματος με παράλληλη αναγωγή του tetrazolium προς ιώδες formazan

42 BIOLOG plates

43 Υποστρώματα στα BIOLOG GN

44 Υποστρώματα που βρίσκονται στο BIOLOG GN και έχουν αναφερθεί να παράγονται στην ριζόσφαιρα

45 BIOLOG ή CLPP Community Level Physiological Profiling Αρχικά (λανθασμένα) θεωρήθηκε ότι παρέχουν πληροφορίες για την καταβολική ή λειτουργική ποικιλότητα της μικροβιακής κοινότητας Αποδείχθηκε ότι παρέχουν μόνο συγκριτικές πληροφορίες για την μικροβιακή ποικιλότητα μεταξύ δύο οικοσυστημάτων

46 BIOLOG BIOLOG GN BIOLOG GP BIOLOG GN2 (εξέλιξη των GN) ECOPLATES (31 υποστρώματα αντιπροσωπευτικά της ριζόσφαιρας) BIOLOG FF (για μύκητες) BIOLOG MT

47 Πλεονεκτήματα Απλή και γρήγορη μέθοδος συγκριτικής αξιολόγησης της σύστασης της μικροβιακής κοινότητας μεταξύ παρόμοιων οικοσυστημάτων (έδαφος ριζόσφαιρα ρυπασμένο έδαφος) Σχετικά χαμηλό κόστος

48 Μειονεκτήματα Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται δεν είναι αντιπροσωπευτικά από το περιβάλλον (Λύση: ECOPLATE) Η επώαση ευνοεί την ανάπτυξη πλεοτροφικών βακτηρίων (γπρωτεοβακτήρια) στα κελία που καταναλώνουν τα υποστρώματα αλλά δεν αποτελούν σημαντικά μέλη της βακτηριακής κοινότητας στο έδαφος εμβόλιο Οι μύκητες δεν λαμβάνονται υπόψη καθώς δεν ανάγουν το tetrazolium dye (Λύση: BIOLOG FF) Τα αποτελέσματα εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από το επίπεδο του αρχικού εμβολίου (Λύση: Κανονικοποίηση δεδομένων)