ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ: Διατριβή για το Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών.

Transcript

1 ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΙΟΛΩΝ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΑΠΟΤΕΛΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΩΣΦΑΤΙΔΥΛΟΧΟΛΙΝΗ, ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΙΔΙΟ C 16 ΚΑΙ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ, ΧΩΡΙΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΚΑΛΥΨΗ ΜΕ ΠΟΛΥΑΙΘΥΛΕΝΟΓΛΥΚΟΛΗ Διατριβή για το Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών Χάικου Μαρία Πάτρα 2006

2 ii

3 ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΙΟΛΩΝ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΑΠΟΤΕΛΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΦΩΣΦΑΤΙΔΥΛΟΧΟΛΙΝΗ, ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΙΔΙΟ C 16 ΚΑΙ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ, ΧΩΡΙΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙΚΑΛΥΨΗ ΜΕ ΠΟΛΥΑΙΘΥΛΕΝΟΓΛΥΚΟΛΗ ΧΑΪΚΟΥ ΜΑΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αντιμησιάρη Σοφία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Υπεύθυνη Ανάθεσης Θέματος Τμήμα φαρμακευτικής Αυγουστάκης Κωνσταντίνος Επίκουρος Καθηγητής Μέλος τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Τμήμα Φαρμακευτικής Κλεπετσάνης Παύλος Επίκουρος Καθηγητής Μέλος τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Τμήμα Φαρμακευτικής iii

4 iv

5 v Αφιερωμένο στην Οικογένεια μου

6 vi

7 Περιεχόμενα Σελίδα Συντομογραφίες Πρόλογος 1 Περίληψη 3 1. Εισαγωγή Λιποσώματα Χαρακτηριστικά-χημική σύσταση λιποσωμάτων Δομικά στοιχεία Θερμοκρασία μετάβασης φάσης Διαχωρισμός φάσης Επίδραση χοληστερόλης Επίδραση φορτίου λιπιδίων Διαπερατότητα των λιπιδικών μεμβρανών Τύποι λιποσωμάτων Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Μηχανική διασπορά Ακίδα υπερήχων Εξώθηση μέσω φίλτρων MLV και SUV λιποσωμάτων Χρήση μικρογαλακτοματοποιητή Εξώθηση σε θάλαμο εφαρμογής μεγάλης πίεσης Ένεση λιπιδίων Δημιουργία μικτών μικκυλίων με απορρυπαντικό Άλλες ειδικές μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Αφυδατωμένα αναγεννημένα κυστίδια Ψύξη-απόψυξη-υπερήχηση Τεχνική ενός βήματος Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Διαπίδυση Φυγοκέντηση Χρωματογραφία γέλης Τεχνικές χαρακτηρισμού λιποσωμάτων 28 vii

8 viii

9 Ηλεκτρονική μικροσκοπία Ηλεκτρικές ιδιότητες των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση τη χημική σύσταση Πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Ενδοφλέβια χορήγηση Μηχανισμός προστασίας των λιποσωμάτων από την πολυαιθυλενογλυκόλη Εναλλακτικές οδοί χορήγησης Εφαρμογές λιποσωμάτων Αρσονολιποσώματα Χημική σύσταση Παρασκευή αρσονολιποσωμάτων Ιδιότητες αρσονολιποσώμάτων Μορφολογία Μέγεθος ζ-δυναμικό Ικανότητα εγκλωβισμού και σταθερότητα αρσονολιποσωμάτων Αλληλεπιδράσεις αρσονολιποσωμάτων με κύτταρα Μελέτη in vivo κατανομής αρσονολιποσωμάτων Σκοπός Πειραματικό μέρος Υλικά Οργανα-χρήση Μεθοδολογία παρασκευής πολυστοιβαδικών λιποσωμάτων Μέθοδος λεπτού υμενίου Μέθοδος ενός βήματος Παρασκευή μικρών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων Λιπιδική σύσταση λιποσωμάτων Μελέτη της in vitro σταθερότητας λιποσωνάτων Καθαρισμός λιποσωμάτων από τη μη εγκλωβισμένη καλσεΐνη Επώαση λιποσωμάτων Μέτρηση συγκράτησης καλσεΐνης 67 ix

10 x

11 2. 7 Μελέτη επίδρασης αρσονολιποσωμάτων στη βιωσιμότητα 68 καρκινικών κυττάρων Καλλιέργεια και ανακαλλιέργεια κυττάρων PC Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Πειραματική διαδικασία για τον υπολογισμό της %βιωσιμότητας των PC3 κυττάρων ύστερα από επώαση με αρσονολιποσώματα Υπολογισμός συγκέντρωσης αρσενικού των αρσονολιποσωμάτων Αποτελέσματα Σταθερότητα μικτών αρσονολιποσωμάτων με φωσφατιδυλοχολίνη Λιπιδική σύσταση Σταθερότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα Συμπεράσματα για τη σταθερότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα Σταθερότητα σε διάλυμα γλουταθειόνης Συμπεράσματα για τη σταθερότητα σε διάλυμα γλουταθειόνης Σταθερότητα μικτών αρσονολιποσωμάτων με δισταροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη Λιπιδική σύσταση Σταθερότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα Σταθερότητα σε διάλυμα γλουταθειόνης Συμπεράσματα για τη σταθερότητα σε διάλυμα γλουταθειόνης Επίδραση βαθμού ακορεστότητας στη σταθερότητα λιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης Συμπεράσματα για την επίδραση του βαθμού ακορεστότητας στη σταθερότητα λιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης Επικάλυψη των λιποσωμάτων με πολυαιθυλενογλυκόλη Γενικά Λιπιδική σύσταση 89 xi

12 xii

13 Σταθερότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα Σταθερότητα σε διάλυμα γλουταθειόνης Συμπεράσματα της επίδρασης της πολυαιθυλενογλυκόλης στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης Μελέτη επίδρασης της λιπιδικής σύστασης και της προσθήκης λιπιδίων συζευγμένων με πολυαιθυλενογλυκόλη στη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων Λιπλιδική σύσταση Επίδραση λιποσωμάτων στη βιωσιμότητα των PC3 κυττάρων Συμπεράσματα από την επίδραση αρσονολιποσωμάτων στη βιωσιμότητα των PC3 κυττάρων Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 105 xiii

14 xiv

15 xv Συντομογραφίες

16 xvi

17 PC Φωσφατιδυλοχολίνη (phosphatidylcholine) PA Φωσφατιδικό οξύ (phosphatidic acid) DPPC Διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (dipalmitoylphosphatidylcholine) DSPC Διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (distearoylphosphatidylcholine) DPPE Διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (dipalmitoylphosphatidylethonolamine) DSPE Διστεαροϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (distearoylphosphatidylethonolamine) Chol Χοληστερόλη (cholesterol) Ars Αρσονολιπίδιο (arsonolipid) PEG Πολυαιθυλενογλυκόλη (polyethylene glycol) MLV Πολυστοιβαδιακά κυστίδια (multilamellar vesicles) SUV Μικρά μονοστοιβαδιακά κυστίδια (small unilamellar vesicles) LUV Μεγάλα μονοστοιβαδιακά κυστίδια (large unilamellar vesicles) DRV Συμπυκνωμένα-αναγενημενα κυστίδια (dried reconstituted vesicles) CL Συμβατικά λιποσώματα (conventional liposomes) SSL Στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα (sterically stabilized liposomes, Stealth liposomes) T C Θερμοκρασία μετάπτωσης (transition temperature) xvii

18 xviii

19 FI Ένταση φθορισμού (fluorescence intensity) GSH Γλουταθειόνη (glutathione) GFAAS Φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης με φούρνο γραφίτη (graphite furnace atomic absorbance spectroscopy) MTT 3-(4,5-διμεθυλοθειαζολυλο-2)-2,5-διμεθυλοτετραζολιο βρωμίδιο (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)- 2, 5-diphenyltetrazolium bromide) FBS Βόειος ορός (fetal bovine serum) xix

20 xx

21 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της αναπληρώτριας καθηγήτριας κ. Σ. Αντιμησιάρη προς την οποία εκφράζω τις θερμότατες ευχριστίες μου για τη συνεχή βοήθεια και συμπαράστασή της. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους επίκουρους καθηγητές κ. Κλεπετσάνη Παύλο και κ. Αυγουστάκη Κωνσταντίνο για τη βοήθεια και τις πολύτιμες συμβουλές που μου προσέφεραν κατά την εκπόνηση της εργασίας αυτής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους μου Π. Χατζή, Χ. Λόη Β. Ντυμένου, Π. Ζαγανά, Σ. Ντουράι, και Σ. Μουρτά για τη συνεργασία τους. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου για την υλική και ηθική στήριξη που μου προσέφεραν

22 - 2 -

23 - 3 - Περίληψη

24 Abstract In cell culture studies, sonicated liposomes composed of phospholipidarsonolipid mixtures (arsonoliposomes) demonstrate a specific toxicity against cancer cells. It has been previously proposed that this may be linked with the ability of arsonolipid As(V) to be reduced to As(III) by membrane-bound or cytoplasmic thiols. The fact that HL-60 cells which are very sensitive towards arsonoliposomes were found to have high basal glutathione concentrations, is in correlation with this theory. Here we studied in vitro, the effect of a thiol-containing compound, glutathione, on the integrity of arsonoliposomes, in order to gain some information about the interaction between thiols and arsonoliposomes. If GSH interacts with the As(V) of arsonoliposomes, this may alter their membrane stability. Furthermore, the cytotoxicity of these arsonoliposome types towards a cancer cell line (PC3) was measured in order to see if the results from the in vitro test with GSH can predict arsonoliposome toxicity towards cancer cells. The results of this study show that the effect of glutathione on arsonoliposome integrity is higher when their arsonolipid content increases, indicating that arsonolipid molecules interact with glutathione. In some cases, depending on the rigidity of their membranes, this interaction leads to a destabilization of arsonoliposomes. The destabilizing effect of GSH was higher for PC-based arsonoliposomes compared to DSPC-based ones). Perhaps the enhanced stability of the DSPC arsonoliposomes in presence of glutathione compared to the PC-based-ones is related with the fact that they are also significantly more stable during incubation in serum, as previously proven. For pegylated-arsonoliposomes membrane destabilization was minimal and this may be related to the high stability demonstrated previously for these specific arsonoliposomes, or, it may indicate that pegylation results in prevention (total or partial) of arsonolipid interaction with thiols (perhaps because of steric repulsion). In order to see if PEG-arsonoliposomes are cytotoxic towards cancer cells, we measured by MTT assay, the proliferation of PC3 cells after incubation in presence and absence (control) of different types and amounts of arsonoliposomes. Results show that DSPC-based arsonoliposomes are slightly, but significantly less cytotoxic compared to the equivalent PC-based ones, in agreement with the higher effect of GSH on PCbased arsonoliposomes. However although the pegylated arsonoliposomes studied were basically not affected by GSH, their PC3 cytotoxicity is equal with that - 4 -

25 measured for the PC-based arsonoliposomes, (PEG-related cytotoxicity was excluded by control experiments). To conclude the results of this study show that interaction between thiol groups and As-containing headgroups of arsonoliposomes take place. For the nonpegylated-arsonoliposomes the results of the GSH- study agree with the relative cytotoxicity of the corresponding arsonoliposomes towards PC3 cells. However, this is not the case for pegylated arsonoliposomes. Perhaps this implies that another mechanism is responsible for the pegylated liposome cytotoxicity

26 - 6 -

27 Περίληψη Μελέτες αλληλεπίδρασης μικρών μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων τα οποία αποτελούνται από μίγματα αρσονολιπιδίων και φωσφολιπιδίων, έδειξαν ότι αυτά είναι ιδιαίτερα τοξικά απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Έχει προταθεί ότι το γεγονός αυτό μπορεί να συνδέεται με την ιδιότητα των αρσονολιπιδίων As(V) να ανάγονται σε As(III) από μεμβρανικές ή κυτταροπλασματικές θειόλες. Το γεγονός ότι τα HL-60 κύτταρα τα οποία είναι πολύ ευαίσθητα στα αρσονολιποσώματα βρέθηκαν να περιέχουν υψηλά επίπεδα γλουταθειόνης, έρχεται σε πλήρη συμφωνία με τη θεωρία αυτή. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε in vitrο, η επίδραση μιας θειόλης, της γλουταθειόνης, η οποία αποτελεί την κύρια θειόλη των κυττάρων, στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων, με σκοπό να διαλευκανθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ θειολών και αρσονολιποσωμάτων. Αν η γλουταθειόνη αλληλεπιδρά με το As(V) των αρσονολιπιδίων, τότε είναι πιθανόν να μεταβάλλεται η μεμβρανική τους σταθερότητα. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα αυτών των αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε σε μια καρκινική σειρά (PC3) μελετήθηκε με σκοπό να εξακριβωθεί εάν ένα in vitro τεστ με γλουταθειόνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της τοξικότητας αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη όταν το περιεχόμενο των λιποσωμάτων σε αρσονολιπίδιο αυξάνει, σαν συνέπεια αλληλεπίδρασης του αρσονολιπιδίου με τη γλουταθειόνη. Μάλιστα σε κάποιες περιπτώσεις που εξαρτώνται από τη σκληρότητα της λιπιδικής μεμβράνης, η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί σε αποσταθεροποίηση του αρσονολιποσώματος. Η αρνητική επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των λιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη στα PC-αρσονολιποσώματα απ ότι στα DSPC. Πιθανόν η αυξημένη σταθερότητα των DSPC-αρσονολιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης σε σχέση με τα PC να σχετίζεται με το γεγονός ότι τα πρώτα είναι πιο σταθερά ακόμα και στην περίπτωση που αυτά επωάζονται σε διάλυμα ορού. Για τα σταθεροποιημένα με PEG αρσονολιποσώματα η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα της μεμβράνης είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με τα μη σταθεροποιημένα γεγονός που μπορεί να σχετίζεται είτε με την υψηλή σταθερότητα που έχουν εμφανίσει σε προηγούμενες - 7 -

28 μελέτες, είτε με την ιδιότητα της πολυαιθυλενογλυκόλης να περεμποδίζει στερεοχημικά την προσέγγιση και άρα την αλληλεπίδραση των αρσονολιποσωμάτων με τη γλουταθειόνη. Με σκοπό να εξακριβώσουμε αν τα PEG-αρσονολιποσώματα παρουσιάζουν κυταροτοξικότητα, μετρήσαμε τη % βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων ύστερα από επώαση αυτών παρουσία και απουσία (control) αρσονολιποσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PC-αρσονολιποσώματα εμφανίζουν αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με τα DSPC, γεγονός που συμφωνεί απόλυτα με τη μειωμένη σταθερότητά τους παρουσία γλουταθειόνης. Παρoλ αυτά τα PEGαρσονολιποσώματα τα οποία είναι σταθερά παρουσία γλουταθειόνης, εμφανίζουν παρόμοια κυτταροτοξικότητα με τα μη σταθεροποιημένα PC-αρσονολιποσώματα. (Πειράματα που έγιναν με συμβατικά PEG-λιποσώματα δείχνουν ότι η παρουσία πολυαιθυλενογλυκόλης δεν προκαλεί κυτταροτοξικότητα). Συμπερασματικά τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας δείχνουν ότι όντος πραγματοποιείται αλληλεπίδραση μεταξύ του As της πολικής κεφαλής του αρσονολιπιδίου και της θειολομάδας της γλουταθειόνης. Για τα μη σταθεροποιημένα αρσονολιποσώμτα τα αποτελέσματα από τη μελέτη της γλουταθειόνης συμφωνούν με την κυτταροτοξικότητα που εμφανίζουν στα PC3 κύτταρα, γεγονός που δεν ισχύει για τα σταθεροποιημένα. Αυτό μπορεί να οφείλετα σε διαφορετικό μηχανισμό υπεύθυνο για την κυτταροτοξικότητα των PEG-αρσονολιποσωμάτων

29 Εισαγωγή

30 - 10 -

31 1. ΕΣΑΓΩΓΗ 1. 1 ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ Τα λιποσώματα είναι κολλοειδή σωματίδια σφαιρικού σχήματος στα οποία απαντούν μία ή περισσότερες διπλοστοιβάδες λιπιδίων που εναλλάσσονται με υδατικά τμήματα. Αυτά σχηματίζονται αυθόρμητα όταν τα λιπίδια διασπείρονται σε υδάτινο μέσο δημιουργώντας ένα πληθυσμό κυστιδίων το μέγεθος των οποίων κυμαίνεται από τάξεις των δεκάδων νανομέτρων έως δεκάδων μικρομέτρων σε διάμετρο. Τα λιπίδια όντας αμφιπαθή μόρια όταν βρεθούν σε ένα υδάτινο περιβάλλον, για θερμοδυναμικούς λόγους, απομονώνουν τις υδρόφοβες περιοχές σε σφαιρικές διπλοστοιβάδες (Σχήμα 1). Αυτές οι στοιβάδες αναφέρονται ως lamellae. Σχήμα 1. Λιπιδική διπλοστοιβάδα και λιπόσωμα. Τα λιποσώματα φτιάχνονται έτσι ώστε να παγιδεύουν ποσότητες υλικών τόσο στο εσωτερικό υδατικό διαμέρισμα όσο και εντός της λιπιδικής διπλοστοιβάδας (Σχήμα 2). Η αξία των λιποσωμάτων ως μοντέλα μεμβρανικών συστημάτων προέρχεται από το γεγονός ότι τα λιποσώματα μπορεί να λιποδιαλυτή ουσία στη διπλοστοιβάδα παρασκευαστούν από συστατικά φυσικής μικροκρυσταλλική ουσία στο υδατικό εσωτερικό λιπιδική διπλοστοιβάδα προέλευσης. Η λιποσωμική μεμβράνη σχηματίζει μια δομή διπλοστοιβάδας η οποία σε βασικές Σχήμα 2. Εγκλωβισμένη ουσία στο εσωτερικό και γραμμές είναι πανομοιότυπη με το λιπιδικό τμήμα μεμβράνη λιποσώματος. των φυσικών κυτταρικών μεμβρανών (μοντέλο ρευστού μωσαϊκού κατά Singer και Nicholson). Η ομοιότητα μεταξύ των λιποσωμάτων και μεμβρανών φυσικής προέλευσης αυξάνεται μέσω της δυνατότητας που υπάρχει για εκτενή χημική τροποποίηση της λιποσωμικής μεμβράνης και μπορεί

32 να αξιοποιηθεί σε τομείς που αφορούν τη στόχευση φαρμάκων ή την ανοσοτροποποιήση, in vivo και in vitro. Η δυνατότητα των λιποσωμάτων να μιμούνται τη συμπεριφορά των μεμβρανών φυσικής προελεύσεως και να αποικοδομούνται από τις ίδιες οδούς, τα κάνουν ένα πολύ ασφαλές και αποτελεσματικό σύστημα για ιατρικές εφαρμογές. Εναλλακτικά τα λιποσώματα μπορεί να απαρτίζονται εξ ολοκλήρου από συνθετικά συστατικά, που επιλέγονται επειδή φέρουν βελτιωμένες χημικές ιδιότητες. Επομένως εκτός των φωσφολιπιδίων, σταθερά οχήματα μεμβρανικής διπλοστοιβάδας μπορούν να σχηματιστούν από ένα ευρύ φάσμα άλλων αμφίφιλων μορίων, όπως για παράδειγμα λιπαρά οξέα, δευτεροταγείς αμίνες διπλής αλυσίδας ή παράγωγα χοληστερόλης. Ένα χαρακτηριστικό των λιπιδικών διπλοστοιβάδων είναι ότι είναι συνεργειακές δομές. Τέτοιες δομές διατηρούνται εξαιτίας πολλών αλληλοενισχυόμενων, μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων. Τα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια ως αμφιπαθή μόρια σε υδατικό περιβάλλον συναθροίζονται το ένα δίπλα στο άλλο για να ελαχιστοποιήσουν τον αριθμό των εκτεθειμένων υδρογονανθρακικών αλυσίδων (Σχήμα 1). Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις είναι η κύρια κινητήρια δύναμη στον σχηματισμό λιπιδικών μεμβρανών. Αυτή η συνάθροιση υδρογονανθρακικών αλυσίδων ευνοείται επίσης και από τις μεταξύ τους ελκτικές δυνάμεις τύπου Van der Waals, καθώς επίσης και από τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις και τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των πολικών κεφαλών και των μορίων νερού από το περιβάλλον. Η συμπεριφορά των λιπιδίων σε υδατικό περιβάλλον υπαγορεύεται από εγγενείς παράγοντες όπως πολικότητα λιπιδίου, το μήκος της αλειφατικής αλυσίδας λιπαρού οξέος, από τη θέση και το βαθμό ακορεστότητας της αλειφατικής αλυσίδας, από τη διακλάδωση αλειφατικού οξέος, από το μέγεθος τη πολικότητα και το φορτίο της περιοχής της κεφαλής καθώς επίσης και από εξωγενείς παράγοντες όπως η συγκέντρωση (lyotropism) και η θερμοκρασία (thermotropism). Τα φωσφολιπίδια διαφέρουν σημαντικά από τα αλλά αμφιπαθή μόρια (απορρυπαντικά, λυσολεκιθίνη) στο ότι η ευνοούμενη δομή για τα περισσότερα από αυτά σε υδατικό περιβάλλον είναι το διμοριακό λεπτό φύλλο, παρά το μικκύλιο. Ο λόγος είναι ότι οι δυο αλυσίδες λιπαρών οξέων δίνουν στα μόρια των φωσφολιπιδίων ένα σχήμα κυλινδρικό καταλαμβάνοντας υπέρμετρα μεγάλο όγκο και επομένως δε χωρούν στο εσωτερικό του μικκυλίου αλλά είναι κατάλληλα να συσσωματώνονται σε λιπιδικές διπλοστοιβάδες (Σχήμα 3)

33 Λιπίδια Σχήμα Οργάνωση Φάση Σάπωνες λυσοφωσφολιπίδια Ανάστροφος κώνος Μικκύλια Φωσφατιδυλοχολίνη -σερίνη -ινοσιτόλη Σφυγκομυελίνη DODAC Κύλινδρος Διπλοστοιβάδα Φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη Φωσφατιδικό οξύ Χοληστερόλη Καρδιολιπίνη Λιπίδιο Α Κώνος Ανεστραμένα μικκύλια Μίγματα λυσοφωσφατιδυλοχολίνης και φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης Lamellar Σχήμα 3. Μερικά παραδείγματα λιπιδίων και οι αντίστοιχες φάσεις που σχηματίζουν σε υδατικό μέσο ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ - ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Δομικά στοιχεία Τα κύρια δομικά στοιχεία των βιολογικών μεμβρανών είναι τα φωσφολιπίδια (Σχήμα 4). Υπάρχουν δύο είδη φωσφολιπιδίων, τα φωσφογλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια με τα αντίστοιχα προϊόντα υδρόλυσής τους. Η δομή των φωσφογλυκεριδίων αποτελείται από ένα μόριο γλυκερόλης στο οποίο λιπαρά οξέα αλκυλιώνονται στις θέσεις C 1 και C 2, και από μία φωσφορική ομάδα εστεροποιημένη στη θέση C 3. Το μόριο αυτό αναφέρεται ως φωσφατιδικό οξύ (PA)

34 Πολική ομάδα Υδρόφιλη κεφαλή Πολική γλυκερόλη Αλυσίδες λιπαρών οξέων Υδρόφιλο τμήμα Λιπόφιλο τμήμα Σχήμα φωσφολιπιδίου Υδρόφοβη ουρά Μη πολική Σχήμα 4. Απεικόνιση τυπικού φωσφολιπιδίου. Ένα φωσφολιπίδιο αποτελείται από την πολική κεφαλή (polar head group) και το υδρόφοβο τμήμα (non polar tails) που αποτελείται από ένα ζευγάρι αλυσίδων υδρογονανθράκων. Διαφορετικές κλάσεις φωσφολιπιδίων χαρακτηρίζονται από τους εστεροποιημένους στη φωσφορική ομάδα του φωσφατιδικού οξέος υποκαταστάτες. Αντιπροσωπευτικές δομές αυτών φαίνονται στο Σχήμα 5. Φωσφατιδυλοχολίνη Φωσφατίδυλοαιθανολαμίνη Φωσφατιδυλοσερίνη Φωσφατιδυλογλυκερόλη Φωσφατιδυλοινισιτόλη Σχήμα 5. Κατηγορίες φωσφολιπιδίων. Η δομή της πολικής κεφαλής για κάθε φωσφολιπίδιο (χολίνη, αιθανολαμίνη, σερίνη, γλυκερόλη, ινοσιτόλη). Ένα λιπίδιο που χρησιμοποιείται ευρέως για το σχηματισμό λιποσωμάτων είναι η φωσφατιδυλοχολίνη (λεκιθίνη, PC), η οποία διαθέτει δύο υδρόφοβες υδρογονανθρακικές αλυσίδες ενωμένες, μέσω μιας γέφυρας γλυκερόλης, με μία υδρόφιλη ομάδα φωσφοχολίνης που αποτελεί και την πολική κεφαλή του λιπιδίου

35 Τα μόρια της φωσφατιδυλοχολίνης είναι αδιάλυτα στο νερό και όταν βρεθούν σε υδατικό μέσο, διατάσσονται ευθύγραμμα σε διπλοστοιβάδες με μορφή επίπεδων φύλλων ώστε να μειωθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της λιπαρής αλυσίδας των υδρογονανθράκων και του υδατικού περιβάλλοντος (Σχήμα 1) Θερμοκρασία μετάβασης φάσης (Phase transition -T c ) Σε διαφορετικές θερμοκρασίες, οι μεμβράνες από φωσφατιδυλοχολίνες υφίστανται σε διαφορετικές φάσεις. Η μετάβαση από τη μία φάση στην άλλη μπορεί να διαπιστωθεί με φυσικές μεθόδους κατά την αύξηση της θερμοκρασίας. Η πλέον διαδεδομένη τεχνική για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας μετάβασης είναι η θερμιδομετρία (Huang C. et al., 1999). Οι πιο συχνά παρατηρούμενες αλλαγές φάσης συμβαίνουν στην υψηλότερη θερμοκρασία στη οποία η μεμβράνη αποδιατάσσεται από την οργανωμένη μορφή του πηκτώματος (gel) ή του στερεού (solid) και μεταβαίνει σε υγρή - κρυσταλλική δομή κατά την οποία οι βαθμοί ελευθερίας των μορίων είναι περισσότεροι. Γενικά αύξηση του μήκους της λιπαρής αλυσίδας ή αύξηση του κορεσμού της αλυσίδας αυξάνει την Tc Διαχωρισμός φάσης Κατά την αύξηση της θερμοκρασίας, οι λιπαρές αλυσίδες των κεκορεσμένων οξέων τείνουν να τοποθετηθούν με διαφορετική από την all - trans ευθύγραμμη διευθέτηση, π.χ. τη διευθέτηση gauche. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να επεκτείνεται η περιοχή που καταλαμβάνουν οι υδρογονανθρακικές αλυσίδες ενώ συγχρόνως μειώνεται το συνολικό μήκος αυτών, οπότε μειώνεται και το πάχος της διπλοστοιβάδας και ευνοείται η μετάβαση από τη στερεή στην υγρή - κρυσταλλική φάση. Η μετάβαση αυτή για τη φωσφατιδυλοχολίνη δεν ολοκληρώνεται σε ένα στάδιο, αλλά περιλαμβάνει δύο μεταπτώσεις: την κύρια μετάπτωση που περιγράφηκε παραπάνω και την προ - μετάπτωση, περίπου πέντε βαθμούς κάτω από τη θερμοκρασία της κύριας μετάπτωσης, κατά την οποία συμβαίνει και αλλαγή στον προσανατολισμό της πολικής κεφαλής του λιπιδίου. Σε θερμοκρασίες μεταξύ των δύο

36 αυτών μεταπτώσεων, η μεμβράνη υιοθετεί μία πτυχωτή εμφάνιση όπου μετασχηματίζεται από ευθύγραμμη σε κυματιστή επιφάνεια με ορισμένη περιοδικότητα (Kohlwein S.D. et al., 1992) Επίδραση Χοληστερόλης Από τα συνήθη δομικά συστατικά των λιποσωμάτων είναι και η χοληστερόλη, η οποία μόνη της δε σχηματίζει διπλοστοιβάδες, ενσωματώνεται όμως σε φωσφολιπιδικές μεμβράνες επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές τους π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους (Σχήμα 6). Αυτό οφείλεται στη μεταβολή της κάμψης της αλυσίδας του φωσφολιπιδίου με αποτέλεσμα πιο συμπαγείς μεμβράνες σε σύγκριση με λιποσώματα των οποίων οι μεμβράνες δεν περιέχουν χοληστερόλη. Η παρουσία της χοληστερόλης μεταβάλλει επιπλέον τη θερμοκρασία μετάβασης φάσης των λιποσωμικών μεμβρανών, ανάλογα με την κατάσταση του λιπιδίου. Όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από την θερμοκρασία μετάβασης φάσης, η χοληστερόλη συμβάλλει στη μείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συμπύκνωση τελικά της μεμβράνης και μείωση της ρευστότητάς της. Σε ορισμένες περιπτώσεις όμως όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερμοκρασίες χαμηλότερες από την θερμοκρασία μετάβασης φάσης η απόσταση μεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της μεμβράνης αυξάνει. Φωσφολιπιδική Πολική κεφαλή Πολική υδροξυλομάδα Χοληστερόλη Σχήμα 6. Αναπαράσταση της ενσωμάτωσης μορίων χοληστερόλης σε μεμβράνες φωσφολιπιδίων. Ακυλικές αλυσίδες λιπαρών οξέων

37 Επίδραση φορτίου λιπιδίων Η παρουσία φορτισμένων λιπιδίων μεταβάλλει το ποσοστό εγκλωβισμού βιοδραστικών μορίων στα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα. Ουδέτερα λιπίδια δημιουργούν μικρό χώρο μεταξύ των στοιβάδων τους και έχουν μικρό ποσοστό εγκλωβισμού στην υδατική φάση. Τα φορτισμένα λιπίδια αντιθέτως παρουσιάζουν αυξημένα ποσοστά εγκλωβισμού λόγω παραχώρησης μεγαλύτερων υδατικών τμημάτων μεταξύ των διπλοστοιβάδων εξαιτίας της απώθησης ομώνυμα φορτισμένων ομάδων (Tyrrel et al., 1976). Οι επιδράσεις αυτές ποικίλλουν βέβαια ανάλογα και με το φορτίο του προς εγκλωβισμό μορίου Διαπερατότητα των λιπιδικών μεμβρανών Η λιπιδικές διπλοστοιβάδες είναι δισδιάστατα ρευστά. Ένα χαρακτηριστικό τους είναι ότι είναι ημιδιαπερατές μεμβράνες που σημαίνει ότι παρουσιάζουν εκλεκτικότητα σε ότι αφορά τις ουσίες που θα περάσουν μέσα από την μεμβράνη. Ο μηχανισμός με το οποίο οι ουσίες περνάνε μέσα από τη λιποσωμική μεμβράνη είναι η απλή διάχυση. Επομένως η ταχύτητα διάχυσης των μορίων και των ιόντων διαμέσου της μεμβράνης διαφέρει σημαντικά. Τα αέρια O 2, CO 2, διαχέονται πολύ γρήγορα μέσω της μεμβράνης. Για λιπόφιλα μόρια με μεγάλη διαλυτότητα σε οργανικό διαλύτη μια μεμβράνη φωσφολιπιδίων αποτελεί ένα ισχνό φραγμό. Από τη άλλη πολικά μόρια όπως γλυκόζη και συστατικά μεγαλύτερου μοριακού βάρους διαπερνούν διαμέσου της μεμβράνης μόνο πολύ αργά. Μικρότερα μόρια με ουδέτερο φορτίο όπως νερό και ουρία μπορούν να διαχυθούν πολύ γρήγορα ενώ τα φορτισμένα ιόντα διαφέρουν σημαντικά στη συμπεριφορά τους. Τα μόρια του νερού βρίσκονται βαθιά στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας έως τη χαμηλότερη καρβονυλομάδα. Τα πρωτόνια και τα ιόντα υδροξυλίου διαπερνούν τη μεμβράνη πολύ γρήγορα. Τα ιόντα νατρίου και καλίου διασχίζουν τη μεμβράνη πολύ αργά σε σχέση με τα πρωτόνια καθώς επίσης και με τα ανιόντα όπως τα χλωριούχα και τα νιτρικά. Φαίνεται ότι ο μηχανισμός διάχυσης των μεταλλικών ιόντων δια της μεμβράνης είναι πολύ διαφορετικός από εκείνο των άλλων κατηγοριών μορίων όπως υποδεικνύεται και από το γεγονός ότι η διαπερατότητα των ιόντων νατρίου μειώνεται καθώς

38 αυξάνεται ο βαθμός ακορεστότητας των αλυσίδων λιπαρών οξέων ενώ η διαπερατότητα της γλυκόζης αυξάνεται ελαφρώς καθώς αυξάνεται ο βαθμός ακορεστότητας των αλυσίδων λιπαρών οξέων. Μια εξήγηση μπορεί να είναι ότι τα μεταλλοϊόντα κινούνται διάμεσου προσωρινών συστροφών των αλυσίδων των λιπαρών οξέων που δημιουργούνται ως αποτέλεσμα περιστροφών των απλών δεσμών. Αντίθετα το μόριο της γλυκόζης είναι πολύ μεγάλο για να χρησιμοποιήσει αυτές τις αλλαγές διαμόρφωσης στα ξεχωριστά μόρια. Συντελεστές διαπερατότητας μεμβράνης Εξανοϊκό οξύ οξικό οξύ νερό αιθανόλη ινδόλιο Συντελεστές διαπερατότητας Γλυκερόλη, ουρία Τρυπυοφάνη Γλυκόζη Σχήμα 7. Συντελεστές διαπερατότητας της μεμβράνης για διάφορα μόρια και ιόντα. Παρόλα αυτά αύξηση στο μήκος της αλυσίδας δηλαδή στο πάχος της διπλοστοιβάδας έχει την ίδια επίδραση σε όλες τις ουσίες φορτισμένες και μη. Αυτό σημαίνει ότι σε όλες τις περιπτώσεις μειώνει το ρυθμό διάχυσης. Η διαπερατότητα

39 των λιποσωμικών μεμβρανών στο ασβέστιο και άλλα πολυσθενή ιόντα είναι μικρότερη από ότι για τα μονοσθενή ιόντα όπως το νάτριο και αυτό μπορεί να οφείλεται στο μεγαλύτερο φορτίο και τη μεγαλύτερη διάμετρο της στοιβάδας νερού που περιβάλλει τα ιόντα. Το γεγονός ότι υπάρχουν μερικοί διαφορετικοί μηχανικοί για τη διαπερατότητα των μορίων διαμέσου της λιπιδικής διπλοστοιβάδας ενισχύεται από τη διαφορετική συμπεριφορά μεταξύ των πρωτονίων και μεταλλοϊόντων στη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσεως. Η διαπερατότητα των πρωτονίων αυξάνεται στη κρίσιμη θερμοκρασία (Τ C ) και παραμένει υψηλή καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται αντίθετα με τα ιόντα νατρίου και πολλές άλλες διαλυμένες ουσίες για τις οποίες η διαπερατότητα πάνω και κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσεως είναι χαμηλότερη από τη διαπερατότητα της μεμβράνης σ αυτήν τη θερμοκρασία. Επομένως τα πρωτόνια και τα μόρια νερού των οποίων η μεταφορά είναι σημαντικά πιο γρήγορη από τα ιόντα νατρίου έχουν επιπλέον οδούς διάμεσου της μεμβράνης οι οποίοι είναι ποιοτικά διαφορετικοί, πιθανώς υπό τη μορφή των διαύλων νερού. Η πιο πάνω συζήτηση αναφέρεται σε λιποσώματα στα οποία τα εσωτερικά και εξωτερικά υδατικά διαμερίσματα είναι σε ισορροπία μεταξύ τους. Αν και οι φωσφολιπιδικές διπλοστοιβάδες είναι ημιδιαπερατές, παρόλο αυτό μια διαφορά συγκέντρωσης της διαλυμένης ουσίας μεταξύ των δυο πλευρών της μεμβράνης μπορεί να γεννάει μια οσμωτική πίεση που θα οδηγήσει στη συσσώρευση των μορίων του νερού στη μια πλευρά. Στην περίπτωση που η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας εγκλωβισμένης εντός των λιποσωμάτων είναι υψηλή ενώ η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο εναιωρούνται τα λιποσώματα είναι χαμηλή, τα λιποσώματα θα υπερδιογκωθούν καθώς ο όγκος του νερού στο εσωτερικό διαμέρισμα θα αυξάνεται σε τέτοιο βαθμό που η επιφάνεια της μεμβράνης αυξάνεται σημαντικά καθώς αυξάνεται αντίστοιχα ο χώρος των γειτονικών μορίων των φωσφολιπιδίων. Κάτω από αυτές τις συνθήκες μια αναπτυσσόμενη διαρροή διαμέσου της μεμβράνης μπορεί να συμβαίνει για διαλυμένες ουσίες με μέγεθος μορίων ίσον ή μικρότερο από αυτό των μορίων της γλυκόζης. Η διαρροή σουκρόζης δεν επηρεάζεται. Σε μερικές περιπτώσεις, παρολ αυτά, η πίεση που δημιουργείται μπορεί να είναι ικανή να προκαλέσει εντελώς τη ρήξη της μεμβράνης, δίνοντας αφορμή για να χαθεί το όλο περιεχόμενο των λιποσωμάτων στο κύριο όγκο της υδατικής φάσης, πριν σχηματιστούν ξανά τα λιποσώματα. Μερικοί παράγοντες που επηρεάζουν τη διαπερατότητα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας σε διάφορα μόρια και ιόντα αναφέρονται παρακάτω:

40 Παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα της μεμβράνης όπως: λιπιδική σύσταση, παρουσία χοληστερόλης και θερμοκρασία. Χαμηλή διαπερατότητα μεμβράνης Υψηλή διαπερατότητα μεμβράνης Χαμηλή διαπερατότητα μεμβράνης Σχήμα.8. Σχέση μεταξύ θερμοκρασίας και διαπερατότητας της λιπιδικής διπλοστοιβάδας. Χημική φύση των μορίων (εάν το μόριο είναι ένα λιπίδιο τότε διαλύεται εύκολα στα λιπιδικά συστατικά της μεμβράνης και τη διαπερνά αμέσως) Το μοριακό ή ατομικό βάρος (τα μικρότερα σε μέγεθος μόρια διέρχονται γρήγορα διαμέσω της μεμβράνη) Το σθένος των ιόντων και το βαθμό ενυδάτωσης (το μόριο γίνεται πιο πολικό και επομένως δύσκολα διαπερνά τη λιπιδική διπλοστοιβάδα). Από τη κλίση της διαβάθμισης συγκέντρωσης. Από το pka της διαχεόμενης ουσίας και το ph του περιβάλλοντος ΤΥΠΟΙ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Το μέγεθος των λιποσωμάτων είναι σημαντική παράμετρος καθορισμού του χρόνου ημιζωής των λιποσωμάτων. Το μέγεθος και ο αριθμός των διπλοστοιβάδων επηρεάζουν το ποσοστό του φαρμάκου που εγκλωβίζεται στα λιποσώματα. Το μέγεθος των λιποσωμάτων ποικίλλει από 0,025 μm έως 10 μm και ο αριθμός των διπλοστοιβάδων από μία μέχρι και δεκάδες. Ο καθοριστικός παράγοντας που προσδιορίζει το μέγεθος και τον αριθμό διπλοστοιβάδων είναι η μέθοδος παρασκευής των λιποσωμάτων. Έτσι με βάση αυτές τις παραμέτρους τα λιποσώματα κατατάσσονται σε (Papahadjopoulos D., 1978):

41 Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar vesicles, MLV) Αποτελούνται από πέντε έως δεκάδες ομόκεντρες πολλαπλές διπλοστοιβάδες, με μέγεθος που κυμαίνεται από nm. Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάμεων άπωσης. Η κυριότερη μέθοδος παρασκευής MLV λιποσωμάτων είναι η μέθοδος του Bangham (solvent evaporation method ή thin film hydration method) (Bangham A.D. et al., 1965). Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (large unilamellar vesicles, LUV) Τα λιποσώματα αυτά έχουν διάμετρο της τάξης των 1000 nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Ανάλογα με το επιθυμητό μέγεθος, τα LUV μπορούν να παρασκευασθούν με διαφορετικές μεθόδους όπως η απομάκρυνση απορρυπαντικού, η έγχυση αιθανολικού ή αιθερικού διαλύματος φωσφολιπιδίων και η εξάτμιση διαλύτη. Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (small unilamellar vesicles, SUV) Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Οι μέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωμάτων είναι (i) η κατεργασία με υπέρηχους και (ii) η μέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - θέρμανσης (freeze - thaw) ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουμένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημικά αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης

42 των διαλυτών, πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, υλοποιείται με τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση μέσω φίλτρων ή μεμβρανών (extrusion), μικρoγαλακτωματοποίηση (microemulcification) κ.ά. (Σχήμα 7). Στο τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται η διαδικασία της ομαλοποίησης (annealing), κατά την οποία τα λιποσώματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερμοκρασία υψηλότερη αυτής της μετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραμένουν για μία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να ομαλοποιηθεί η μορφοποίηση της δομής τους. Η διάμετρος των λιποσωμάτων που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή κυμαίνεται από 5 έως 6 μm Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Τα λιποσώματα (SUV) που λαμβάνονται με τη χρήση ακίδας υπερήχων έχουν διάμετρο της τάξης μερικών δεκάδων nm. Το σημείο εκκίνησης είναι συνήθως μία διασπορά πολυστοιβαδιακών MLV λιποσωμάτων. Δεδομένου ότι αυτά τα σωματίδια θα σπάσουν ολοκληρωτικά στην πορεία, δεν είναι απαραίτητο να ληφθεί προσοχή σχετικά με το αρχικό μέγεθος των MLV λιποσωμάτων, το ποσοστό εγκλωβισμού και το πάχος του λιπιδικού υμενίου. Η ακίδα υπερήχων προτιμάται για διασπορές που απαιτούν υψηλή ενέργεια σε μικρό όγκο (π.χ. υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου, ή παχύρρευστη υδατική φάση), ενώ το λουτρό υπερήχων είναι περισσότερο κατάλληλο για μεγάλους όγκους διαλυμένου λιπιδίου και για περιπτώσεις που δεν είναι απαραίτητη η απόδοση οριακού μεγέθους σωματιδίων. Την υπερήχηση με ακίδα ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές για πέντε λεπτά προκειμένου να απομακρυνθούν αδιάσπαρτο λιπίδιο και MLV

43 λιποσώματα καθώς και ρινίσματα τιτανίου που σχηματίζονται από τη μεγάλη δύναμη τριβής μεταξύ της διασποράς και της ακίδας.. MLV λιποσώματα SUV λιποσώματα Σχήμα 9. Σχηματική παράσταση παρασκευής λιποσωμάτων Εξώθηση μέσω φίλτρων MLV και SUV λιποσωμάτων Στα λιποσώματα αυτού του τύπου η μείωση μεγέθους επιτυγχάνεται με τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριμένη διάμετρο. Η μέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι παρέχει επαναλήψιμα αποτελέσματα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σημαντική μεταβολή. Επιπλέον μπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισμού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση μέσω φίλτρων διαμέτρου 0,2 μm οδηγεί σε εξαιρετικά ομοιογενείς πληθυσμούς λιποσωμάτων διαμέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979)

44 Χρήση Μικρογαλακτωματοποιητή Για την παρασκευή λιποσωμάτων μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν γαλακτωματοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι μικρογαλακτωματοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειμένη περίπτωση τα λιποσώματα, με πολύ υψηλές πιέσεις μέχρι και (10000 p.s.i., bar) μέσα από φίλτρα διαμέτρου 5μm. Στη συνέχεια διαπερνούν το μίγμα χωρισμένο σε δύο τμήματα με πολύ μεγάλη ταχύτητα, από μικρά κανάλια που αναμιγνύουν τα δύο ρεύματα υπό ορθή γωνία παρέχοντας με τον τρόπο αυτό πολύ μεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο μικρογαλακτωματοποιητή με τη μορφή εναιωρήματος μεγάλων λιποσωμάτων MLV ή με τη μορφή μη ενυδατωμένου λιπιδίου εντός υδατικού μέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται μικρά MLV λιποσώματα με καλή κατανομή μεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οι γαλακτωματοποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στη βιομηχανική παραγωγή για την παρασκευή μεγάλων ποσοτήτων λιποσωμάτων (Vemuri S. et al., 1989) Εξώθηση σε θάλαμο εφαρμογής μεγάλης πίεσης Η τεχνική περιλαμβάνει την εισαγωγή προσχηματισμένων μεγάλων λιποσωμάτων σε θάλαμο (French Press) υπό μεγάλη πίεση ( p.s.i.), και αποδίδει ομογενείς μονο- ή ολιγο- στοιβαδιακές λιποσωμικές διασπορές ενδιάμεσων μεγεθών (30 80 nm σε διάμετρο ανάλογα με την εφαρμοζόμενη πίεση) (Barenholtz Y. et al., 1979). Τα λιποσώματα που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά ευαίσθητων μακρομορίων και είναι πιο σταθερά από τα κατεργασμένα με υπέρηχους λιποσώματα Ένεση λιπιδίων Περιλαμβάνει μεθόδους κατάλληλες για την παρασκευή SUV και LUV λιποσωμάτων. Διάλυμα λιπιδίου σε οργανικό διαλύτη ενίεται ταχέως σε περίσσεια υδατικού μέσου που περιέχει την ουσία που πρόκειται να εγκλωβισθεί στα λιποσώματα. Στη διεπιφάνεια μεταξύ νερού και οργανικού διαλύτη, τα φωσφολιπίδια αυτοδιατάσσονται σε λιποσώματα μικρής διαμέτρου. Τα μεγάλα συγκριτικά

45 πλεονεκτήματα των μεθόδων είναι η εύκολη εφαρμογή της και ο περιορισμένος κίνδυνος αποικοδόμησης των λιπιδίων. Μειονέκτημα των μεθόδων είναι το χαμηλό ποσοστό εγκλωβισμού για υδατοδιαλυτές ουσίες. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενες μεθοδολογίες παρασκευής τέτοιων λιποσωμικών διασπορών περιγράφονται παρακάτω και αφορούν σε περιπτώσεις κατά τις οποίες: ο οργανικός διαλύτης είναι αναμίξιμος με την υδατική φάση, ο οργανικός διαλύτης είναι μη αναμίξιμος με την υδατική φάση, ο οργανικός διαλύτης είναι σε περίσσεια και μη αναμίξιμος με την υδατική φάση Δημιουργία μικτών μικκυλίων με απορρυπαντικά Κατά την ανάμιξη λιπιδίων με απορρυπαντικά ιονικά αμφοτερικά ή μη ιονικά σε ρυθμιστικό διάλυμα, σχηματίζονται αυθόρμητα μεικτά μικκύλια (micelles). Το είδος και η κατανομή των πολικών και λιπόφιλων ομάδων του απορρυπαντικού μέσα στο μικκύλιο καθορίζουν το μέγεθος και το σχήμα του. Η συγκέντρωση απορρυπαντικού στο νερό κατά την οποία αρχίζουν να σχηματίζονται μικκύλια είναι γνωστή ως κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλίων (critial micelle concentration, CMC). Σε συγκεντρώσεις μικρότερες της κρίσιμης τα μόρια του απορρυπαντικού απαντούν ελεύθερα στο διάλυμα, ενώ σε μεγαλύτερες σχηματίζουν ολοένα μεγαλύτερες ποσότητες μικκυλίων. Τα απορρυπαντικά διακρίνονται σύμφωνα με την κατανομή της πολικής και υδρόφοβης περιοχής που διαθέτουν σε πεπλατυσμένα (αλκυλογλυκοσίδια που δίνουν σφαιρικά μικκύλια) και επιμήκη (χολικά άλατα που σχηματίζουν δισκοειδή μικκύλια). Η απομάκρυνση του απορρυπαντικού από τα μικκύλια γίνεται με διαπίδυση ή χρωματογραφία στήλης και έτσι σχηματίζονται λιποσώματα που εγκλωβίζουν ότι υπάρχει στην υδατική φάση. Στο στάδιο αυτό είναι εύκολο να απομακρυνθούν και μικρά μόρια, γι`αυτό τα ποσοστά εγκλωβισμού με αυτή την τεχνική δεν είναι αξιόλογα. Είναι όμως αποτελεσματική μέθοδος για το σχηματισμό λιποσωμάτων που φέρουν λιπόφιλα μόρια, αφού αυτά μπορούν να εισαχθούν στα μικκύλια παρουσία ήπιων απορρυπαντικών με ποσοστό εγκλωβισμού ακόμη και 100%

46 Άλλες ειδικές μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Αφυδατωμένα-Αναγεννημένα Σφαιρίδια (DRV) Η μέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, Κατά την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze - drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωμάτων παρουσία διαλύματος της προς εγκλωβισμό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση με την κλασσική παρασκευή μέσω εξάτμισης του διαλύτη όπου τα μόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανομή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωμένο στη δομή της μεμβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού μέσου σχηματίζονται λιποσώματα με υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού και διάμετρο από 400 nm μέχρι μερικά μm Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (Freeze thaw sonication method, FTS) Η προηγούμενη DRV μέθοδος είναι παραλλαγή μίας άλλης παρόμοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισμό υλικό εισάγεται στα λιποσώματα επίσης μετά το σχηματισμό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται μία πορεία επαναλαμβανόμενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωμάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυμένη ουσία εξισορροπείται μεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώματα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσημείωτα σε μέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισμού μέχρι και 30%. Τα λιποσώματα που παράγονται με τη μέθοδο αυτή παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα DRV λιποσώματα. Το κυριότερο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηματισμό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόμοιους λόγους η σουκρόζη, δισθενή μεταλλικά ιόντα (που μπορούν να εξουδετερώνουν το επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύματα αλάτων δεν μπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσματικά. Ωστόσο η μέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια, χρήσιμα για τη μελέτη φαινόμενων μεταφοράς μέσω μεμβρανών

47 Τεχνική ενός βήματος (one step method) Κατά την τεχνική αυτή το λιπίδιο ή μίγμα λιπιδίων τοποθετούνται σε φιαλίδιο με πώμα. Προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα νερού ή ρυθμιστικού διαλύματος, το οποίο έχει προθερμανθεί σε θερμοκρασία υψηλότερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. Ακολουθεί θέρμανση υπό ανάδευση σε θερμοκρασία επίσης μεγαλύτερη της θερμοκρασίας μετάπτωσης για 4 έως 7 ώρες (Shmeider et al., 1995). Ο μηχανισμός σχηματισμού λιποσωμάτων απουσία οργανικών διαλυτών και επιφανειοδραστικών ουσιών, δεν είναι πλήρως γνωστός. Κάτω από ήπιες συνθήκες, η ενυδάτωση των λιπιδίων είναι μία αργή διαδικασία (Lasic D.P. et al., 1988). Η ύπαρξη φορτισμένων λιπιδίων, η παρουσία και η συγκέντρωση της χοληστερόλης και η ιονική ισχύς του υδατικού μέσου, επηρεάζουν το σχηματισμό λιποσωμάτων. Μία εναλλακτική περίπτωση είναι η μέθοδος γνωστή ως μέθοδος φυσαλίδας ("bubble method") που χρησιμοποιεί άζωτο στη διεπιφάνεια νερού λιπιδίου, για τη μείωση του μεγέθους των παρασκευασθέντων λιποσωμάτων (Talsma H. et al., 1994). Στην πράξη, οι περισσότερες μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων οδηγούν σε αρκετά ετερογενείς πληθυσμούς σωματιδίων με ευρεία κατανομή μεγέθους. Δεδομένου ότι ο διαθέσιμος προς εγκλωβισμό, όγκος λιποσωμάτων ποικίλλει με την κατανομή μεγέθους, είναι πολύ σημαντικό οι λιποσωμικές παρασκευές να χαρακτηρίζονται σχετικά με το μέγεθος, ώστε να ερμηνεύονται σωστά οι ιδιότητές τους in vivo και in vitro. Ακόμη και λιποσώματα με το ίδιο μέγεθος και τον ίδιο αριθμό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στην εσωτερική κατανομή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συμμετέχει στη δομή των σωματιδίων. Η επιλογή του τύπου λιποσωμάτων που θα χρησιμοποιηθεί για συγκεκριμένη εφαρμογή εξαρτάται εν μέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί αλλά και από την επιθυμητή συμπεριφορά του λιποσώματος μετά την παρασκευή του ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Συνήθως είναι απαραίτητος ο διαχωρισμός της ελεύθερης ουσίας από αυτήν που έχει εγκλωβιστεί στα λιποσώματα. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται ως επι τω πλείστον με τις μεθόδους που περιγράφονται παρακάτω

48 Διαπίδυση (dialysis) Κατά τη διαδικασία της διαπίδυσης η λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σε ένα δοχείο, ο πυθμένας η τα τοιχώματα του δοχείου αποτελούνται από μεμβράνες διαπίδυσης. Το δοχείο τοποθετείται με τη σειρά του σε ένα μεγαλύτερο δοχείο που περιέχει καθαρό διαλύτη. Κατά τη διαπίδυση, τα ιόντα του ηλεκτρολύτη και άλλες διαλυτές ουσίες μικρού μοριακού βάρους εξέρχονται από τους πόρους της μεμβράνης, ενώ τα λιποσώματα λόγω μεγέθους, δεν μπορούν να εξέλθουν Φυγοκέντρηση (centrifugation) Η πυκνότητα των διπλοστοιβάδων από φωσφατιδυλοχολίνη έχει αναφερθεί ότι είναι ίση με 1,0135 g ml -1 (Johnson et al., 1973). Η τιμή αυτή αυξάνει ελαφρά (1,0142 g ml -1 ) με την προσθήκη χοληστερόλης σε ποσοστό 50% και αναμένεται μεγαλύτερη για κορεσμένα λιπίδια, κυρίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης. Επίσης η παρουσία πρωτεϊνών στις μεμβράνες οδηγεί σε αισθητή αύξηση της πυκνότητας. Έτσι λιποσωμικές μεμβράνες διεσπαρμένες σε νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα καθιζάνουν υπό την επίδραση της βαρύτητας. Έχει υπολογιστεί ότι μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUV) από φωσφατιδυλοχολίνη (PC) έχουν συντελεστή καταβύθισης S (sedimentation coefficient) 2,6 S στο νερό, ενώ το μέγεθος αυτό αυξάνει σε 5,2 S με την προσθήκη μεγάλων ποσών χοληστερόλης (Newman et al., 1975). Έτσι ανάλογα με τη σύσταση της διπλοστοιβάδας, μικρά μονοστοιβαδικά λιποσώματα μπορούν αν καταβυθιστούν στα g μετά από ώρες σε μια υπερφυγόκεντρο. Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα καταβυθίζονται ευκολότερα (στα g ή λιγότερο ανάλογα με το μέγεθος, για 1 ώρα περίπου). Στην περίπτωση που εγκλωβίζεται μέσα στα λιποσώματα ουσία με υψηλή συγκέντρωση ή με υψηλό μοριακό βάρος σε συγκέντρωση ισοτονική με ρυθμιστικό διάλυμα, η πυκνότητα του μέσου πλησιάζει ή υπερβαίνει αυτή των λιπιδίων, με αποτέλεσμα η καταβύθιση να είναι αδύνατη. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να ξεπεραστεί με αραίωση των λιποσωμάτων σε ένα μέσο με χαμηλότερη πυκνότητα έτσι ώστε τα λιποσώματα να είναι βαρύτερα από αυτό

49 Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Στην υγρή χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού τα μόρια των συστατικών ενός μίγματος, μετακινούνται με τη βοήθεια μιας υγρής κινητής φάσης μέσα στο πορώδες δίκτυο στατικής φάσης και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους. Το δικτυωτό πλέγμα της στατικής φάσης λειτουργεί σα μοριακό κόσκινο, επιτρέποντας την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο σε μόρια και ιόντα που είναι μικρότερα από το μέγεθος των πόρων του. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και εκλούονται πρώτες παρασυρόμενες από την κινητή φάση. Οι υπόλοιπες ουσίες, ανάλογα με το μέγεθος τους κατανέμονται λιγότερο ή περισσότερο στη στατική φάση και εκλούονται κατά σειρά μεγέθους. Ως στατικές φάσεις χρησιμοποιούνται κυρίως υδρόφιλες πηκτές από διακλαδισμένα πολυμερή δεξτράνης (Sephadex G), αγαρόζης (Sepharose B) ή πολυακρυλαμιδίου (Bio-Gel-P). Ειδικά πολυμερή δεξτράνης σχηματίζουν μετά από αλκυλίωση των υδροξυλομάδων τους υδρόφοβες γέλες με οργανικούς διαλύτες (Sephadex LH). Όσον αφορά στα λιποσώματα, οι πλέον διαδεδομένες γέλες για το διαχωρισμό της ελεύθερης από την εγκλωβισμένη ουσία είναι οι Sephadex G (κυρίως G-50 και G-25) ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Οι παράγοντες που χαρακτηρίζουν τα λιποσώματα και επηρεάζουν τη συμπεριφορά τους, είναι κυρίως το φυσικό τους μέγεθος και οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειάς τους. Για τον προσδιορισμό των ανωτέρω χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές που παρουσιάζονται στη συνέχεια.. Τύποι λιποσωμάτων Συντομογραφία διαμέτρου στοιβάδων Μέγεθος Αριθμός λιπιδικών Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα SUV nm. 1 διπλοστοιβάδα Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα LUV >100nm. 1 διπλοστοιβάδα Πολυστοιβαδιακά MLV >0.5μm 5-20 διπλοστοιβάδες

50 λιποσώματα Ολιγοστοιβαδιακά λιποσώματα OLV 0.1-1μm Περίπου 5 διπλοστοιβάδες Πολυδιαμερισματικά λιποσώματα MVV >1μm Πολυδιαμερισματική δομή Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Από τις πλέον διαδεδομένες τεχνικές παρατήρησης λιποσωμάτων είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης, (Transmission Electron Microscopy, TEM). Στην περίπτωση αυτή το δείγμα μεταφέρεται σε ένα διαφανές πλαστικό υπόστρωμα ή φιλμ άνθρακα (πάχους nm) το οποίο είναι τοποθετημένο σε δίκτυο χαλκού. Το δείγμα σκεδάζει ηλεκτρόνια εκτός πεδίου παρατήρησης και η τελική εικόνα γίνεται ορατή σε φθορίζουσα οθόνη. Το ποσό σκέδασης ηλεκτρονίων εξαρτάται από το πάχος και τον ατομικό αριθμό των ατόμων του μείγματος. Με την τεχνική αυτή τα σωματίδια φαίνονται διάχυτα φωτισμένα και έτσι μπορεί να μετρηθεί το μέγεθος και η συσσωμάτωσή τους, αλλά υπάρχει περιορισμένη ένδειξη του βάθους.. Με την ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM), μία λεπτή δέσμη ηλεκτρονίων μέσης ενέργειας από ένα λεπτό σύρμα βολφραμίου εστιάζεται με σύστημα μαγνητικών φακών σε μια επιφάνεια διαμέτρου 5-15 nm σε ένα κενό θάλαμο. Η δέσμη ηλεκτρονίων σαρώνει το προς παρατήρηση δείγμα σε μια σειρά μέχρι και 1000 διαδοχικών παράλληλων σαρώσεων. Οι ηλεκτρονικές αυτές σαρώσεις αλληλεπιδρούν με το δείγμα και παράγουν διάφορα σήματα, όπως δευτεροταγή εκπομπή ηλεκτρονίων (Secondary Electron Emission, SEE), οπίσθια σκέδαση ηλεκτρονίων (Back Scattered Electrons, BSE), ακτίνες Χ. Τα σήματα ενισχύονται και εμφανίζονται σε οθόνη σωλήνα καθοδικών ακτινών όπου και φωτογραφίζονται. Με την τεχνική αυτή τα σωματίδια φαίνονται να φωτίζονται από μία σημειακή πηγή και η προκύπτουσα σκιά δίνει αρκετά καλή αίσθηση του βάθους. Άλλες τεχνικές παρατήρησης λιποσωμάτων με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας είναι η τεχνική παγωμένης κατάτμησης (Freeze fracture technique), όπου είναι δυνατή η παρατήρηση των στοιβάδων και των εσωτερικών μορφολογικών

51 χαρακτηριστικών τους (Fluck D.J et al., 1969) και η cryo TEM τεχνική με υψηλή ποιότητα αποτελεσμάτων (Dubochet J. et al., 1996) Ηλεκτρικές Ιδιότητες λιποσωμάτων Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειας των λιποσωμάτων μπορούν να μελετηθούν με ηλεκτροφόρηση κατά την οποία προκαλείται κίνηση των λιποσωμάτων μέσα σε στάσιμο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρμοζόμενης διαφοράς δυναμικού. Η κίνηση αυτή μετριέται με Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) και βασίζεται στη μετατόπιση Doppler που προκαλείται από την πρόσπτωση μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser He Ne, 5 mw, 633 nm) στα κινούμενα σωματίδια. Γενικά δύο παράμετροι που χαρακτηρίζουν την επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορούν να υπολογισθούν από τις μετρούμενες κινητικότητες το δυναμικό επιφάνειας, ζ δυναμικό (ζ-potential) και η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου σ (surface charge density). Η εξίσωση Helmholtz Smoluchowski (Jones M.N., 1995) που ακολουθεί δίνει την τιμή του ζ δυναμικού, u n ζ = ε E όπου u (cm/sec) η ταχύτητα μετακίνησης του λιποσώματος στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm 2 ) το ιξώδες του μέσου, ε η διηλεκτρική σταθερά του μέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρμοζόμενου δυναμικού. Το ζ - δυναμικό σχετίζεται με το δυναμικό επιφάνειας των σωματιδίων και επηρεάζει μεγάλο φάσμα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστημάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους με ηλεκτρολύτες και φάρμακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρημάτων. Η τιμή του ζ-δυναμικού αποτελεί ένδειξη για την καλή εκτίμηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι λιποσωμικές διασπορές με μεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ δυναμικό εμφανίζουν απωστικές δυνάμεις που εμποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωμάτωση και κατακρήμνιση των σωματιδίων τους

52 Η φύση και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου είναι επίσης πολύ σημαντικοί παράμετροι που επηρεάζουν τη συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Και οι δύο παράμετροι μπορούν να μεταβληθούν με την αλλαγή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων. Η έλλειψη φορτίου επιφάνειας μπορεί να μειώσει τη φυσική σταθερότητα των SUV, αυξάνοντας τη συσσωμάτωσή τους. Επιπλέον τα ουδέτερα λιποσώματα δεν αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα, ενώ μεγάλο επιφανειακό φορτίο προάγει σημαντικά αλληλεπιδράσεις τέτοιου είδους ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ Τα λιποσώματα με βάση τη χημική σύσταση και το φορτίο τους μπορούν να χωριστούν σε πέντε τύπους (Σχήμα 10): 1. Συμβατικά λιποσώματα ( Conventional Liposomes) 2. Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας (Long Circulation Liposomes) 3. Λιποσώματα ευαίσθητα στο ph (ph sensitive Liposomes) 4. Κατιονικά λιποσώματα ( Cationic Liposomes) 5. Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes) ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΣΤΑΘΕΡΟ- ΠΟΙΗΜΕΝΑ ΜΟΡΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΚΑΤΙΟΝΙΚA ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΑ Σχήμα 10. Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωμάτων

53 Συμβατικά λιποσώματα: Τα συμβατικά λιποσώματα αποτελούνται από φωσφατιδυλοχολίνη και χοληστερόλη και σπανιότερα από ανιονικά φωσφολιπίδια. Τα συμβατικά λιποσώματα παρουσιάζουν το μειονέκτημα της γρήγορης αναγνώρισης τους από τα μακροφάγα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η λιπιδική τους σύσταση, καθώς και το μέγεθος τους αποτελούν δυο σημαντικούς παραμέτρους για την κατανομή και τη φαρμακοκινητική της εγκλωβισμένης βιοδραστικής ένωσης. Ο χρόνος παραμονής των λιποσωμάτων στο αίμα χαρακτηρίζεται ως ημιπερίοδος ζωής τους και μπορεί να κυμαίνεται από λίγα λεπτά έως λίγες ώρες. Οι μηχανισμοί οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη γρήγορη καταστροφή των λιποσωμάτων στο αίμα είναι δύο: a. Σήμανση τους κυρίως από τις πρωτεΐνες του πλάσματος (οψωνίνες) και στη συνεχεία καταστροφή τους από τα μακροφάγα του μονοπυρηνικού φαγοκυτταρικού συστήματος (MPS), γνωστό και ως δικτυοενδοθυλιακό σύστημα (RES). Εφαρμογές της στόχευσης σε μακροφάγα έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές σε λιποσωμικά εμβόλια, καθώς και στη μεταφορά ανοσορυθμιστών για την καταστροφή νεοπλασματικών κυττάρων. b. Αλληλεπίδραση με τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος που έχει ως αποτέλεσμα την αποσύνθεση των λιποσωμάτων στα λιπίδια εκ των οποίων αποτελούνται. Στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα (Stealth liposomes) ή δεύτερης γενιάς λιποσώματα: Τα λιποσώματα χρησιμοποιούνται επί πολλά χρόνια ως φορείς φαρμάκων και στόχευσης ιστών. Ωστόσο τα συμβατικά λιποσώματα έχουν ένα σημαντικό πρόβλημα: πολύ γρήγορα εγκαταλείπουν το κυκλοφοριακό σύστημα και συσσωρεύονται στα μακροφάγα της σπλήνας και στα κύτταρα Kufper του ήπατος. Διαφορετικές προσεγγίσεις και μέθοδοι έχουν δοκιμαστεί και διερευνηθεί για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα. Η πραγματική επιτυχία ήρθε με την ανακάλυψη των τροποποιημένων με πολυμερή λιποσωμάτων μεγάλου χρόνου κυκλοφορίας (Σχήμα 11). Είναι γνωστό ότι κάποια παθογόνα βακτήρια με υδρόφιλη επιφάνεια διαφεύγουν από το ανοσοποιητικό σύστημα. Έτσι, διάφοροι ερευνητές, σε μια προσπάθεια τους να μιμηθούν τη φύση, συμπεριέλαβαν σε λιποσωμικές παρασκευές διάφορες ενώσεις που καθιστούν την επιφάνεια αρκετά υδρόφιλη, ώστε να αυξάνεται ο χρόνος κυκλοφορίας τους στο αίμα. Μεταξύ των πολυμερών που είχαν σχεδιαστεί για λιποσώματα μεγάλου χρόνου

54 κυκλοφορίας οι ευθύγραμμες πολυαιθυλενογλυκόλες ( poly(ethylene glycol) ή PEG όντας υδατοδιαλυτά, βιοσυμβατά και ευλύγιστα πολυμερή είναι τα πιο δημοφιλή. Οι αιτίες για την παρατεταμένη κυκλοφορία των PEGλιποσωμάτων είναι οι εξής: Σχήμα 11. Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου λιποσώματος. Η μοριακή δομή του PEG-λιπιδίου, DSPE-PEG, όπου το n συνήθως ποικίλλει μεταξύ Το επιφανειακό φορτίο των PEG-λιποσωμάτων. 2. Οι απωστικές δυνάμεις που επικρατούν (repulsive interaction) ανάμεσα στα PEG-λιποσωμάτων και άλλων σωματιδίων. 3. Η υδροφιλικότητα των PEG-λιποσωμάτων. 4. Μείωση στο ρυθμό προσρόφησης των πρωτεϊνών του πλάσματος στην επιφάνεια των PEG-λιποσωμάτων. Ενσωμάτωση των PEGs στη λιποσωμική μεμβράνη Παρά τις αρκετές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη σύζευξη της πολυαιθυλενογλυκόλης σε λιπίδια (Zalipsky S., 1995), οι περισσότερες από αυτές περιλαμβάνουν σύνδεση της πολυαιθυλένογλυκόλης στη δραστική αμινομάδα της φωσφατίδυλοαιθανολαμίνης (PE). Στο εμπόριο είναι διαθέσιμα πολλά προϊόντα από διάφορες πηγές, όπως για παράδειγμα η διστεαροϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη (DSPE-PEG) μέσο ενός πεπτιδικού δεσμού. Οι φυσικές ιδιότητες των PEG-lipids είναι παρόμοιες με αυτές των επιφανειοδραστικών ενώσεων. Μελέτες με PE-PEG δείχνουν ότι μπορεί να σχηματίσει μικκύλια δίνοντας διαυγή διαλύματα στο νερό και ότι μπορεί να

55 αποσταθεροποιήσει το σχηματισμό των διπλοστοιβάδων, όταν προστίθεται σε υψηλο ποσοστό σε σχέση με τα άλλα λιπίδια (Lasic D.D. et al., 1991). Τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα με πολυαιθυλενογλυκόλη παρασκευάζονται είτε με προσθήκη του PEG-lipid στο μείγμα πριν το σχηματισμό λιποσωμάτων, είτε με σύζευξη της PEG σε ήδη σχηματισμένα λιποσώματα (Woodle et al, 1992). Προσάρτηση των PEG στην επιφάνεια των προπαρασκευασμένων λιποσωμάτων Ένα παράγωγo PEG με ενεργό άκρο μπορεί να συζευχθεί με ορισμένες ενεργές ομάδες στη λιποσωμική επιφάνεια όμως η maleimide ομάδα. Αυτή η τεχνική συνήθως ονομάζεται post-coating PEGylation τεχνική και είναι κατάλληλη για την προσκόλληση PEG στη επιφάνεια προπαρασκευασμένων ανοσολιποσωμάτων. Σ αυτή την περίπτωση οι αλυσίδες του πολυμερούς βρίσκονται μόνο στην εξωτερική πλευρά των λιποσωμάτων. Διαμόρφωση στερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων Ανάλογα με τη συγκέντρωση επικάλυψης και το μοριακό βάρος τη πολυαιθυλενογλυκόλη, τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα μπορούν να έχουν διαφορετικές διαμορφώσεις, όπως φαίνεται στο Σχήμα 12 (Hristova K. Et al., 1995). Καθοριστικός παράγοντας για τη διαμόρφωσή τους είναι η απόσταση ανάμεσα στις αλυσίδες του πολυμερούς επάνω στη λιποσωμική διπλοστοιβάδα. Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph: Αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE), διολεϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DOPE). Σε χαμηλό ph ενώνονται με τη κυτταρική μεμβράνη του ενδοσώματος και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 12). Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφορά ασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων

56 Σχήμα 12. Σχηματική απεικόνιση της πυροδοτούμενης από το ph απελευθέρωσης ουσιών. Κατιονικά λιποσώματα: Αποτελούνται από κατιονικά λιπίδια όπως η διολεϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DOPE). Τα κατιονικά λιποσώματα παρουσιάζουν μεγάλη συγγένεια σύνδεσης με τις κυτταρικές μεμβράνες και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να μεταφέρουν εξωγενές γενετικό υλικό μέσα στα κύτταρα μετά από σύντηξή τους με την κυτταρική μεμβράνη. Τα συστατικά των κατιονικών λιπιδίων αντιδρούν με το DNA (αντίδραση εξουδετέρωσης) με αποτέλεσμα τη συμπύκνωση του σε μια σταθερότερη δομή. Αυτά τα είδη λιποσωμάτων χρησιμοποιούνται σε μελέτες γονιδιακής θεραπείας για μεταφορά γενετικού υλικού στον πυρήνα (Σχήμα 13). Υπόστρωμα Συμπλοκο DNA-λιποσώματος Σύνδεση στον υποδοχέα Υποδοχείς μεμβράνης Πρόληψη από το ενδόσωμα Διαφυγή από το ενδόσωμα Μεταναστευση στον πυρήνα Σχήμα 13. Λιποσωμική χορήγηση γενετικού υλικού

57 Ανοσολιποσώματα: Τα ανοσολιποσώματα είναι συμβατικά αλλά στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα που φέρουν στην επιφάνεια τους μόρια που λειτουργούν ως κέντρα αναγνώρισης, όπως τα αντισώματα. Η σύνδεση αυτή γίνεται με διάφορες μεθόδους. Διάφορα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν συνδεθεί με τα λιποσώματα. Η χρήση ανοσολιποσωμάτων στον καρκίνο των ωοθηκών είχε ως αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη βελτίωση της δράσης του φαρμάκου, όχι μόνο σε σύγκριση με το ελεύθερο φάρμακο αλλά και με τα συμβατικά λιποσώματα. Τα ανοσολιποσώματα αυτά έχουν συνδεθεί με μονοκλωνικά αντισώματα αναγνωρίσιμα από αντιγόνα επιφάνειας καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών ΠΟΡΕΙΑ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΟΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟ Ενδοφλέβια χορήγηση Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση τα λιποσώματα αλληλεπιδρούν με τις υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες του πλάσματος (HDL), οι οποίες ανταλλάσσονται με τα φωσφολιπίδια των λιποσωμικών μεμβρανών, αποσταθεροποιώντας έτσι τη μεμβρανική συνέχεια. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη διαφυγή της περιεχόμενης ουσίας στην κυκλοφορία (Lasic D.D. et al., 1991). Ταυτόχρονα οι πρωτεΐνες οψωνίνες του ανοσοποιητικού συστήματος προσκολλώνται στην επιφάνεια των λιποσωμάτων και λειτουργούν ως ενδεικτικά για να αναγνωρισθούν αυτά ως «ξένα σώματα» και να καταστραφούν από τα μακροφάγα κύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (ΔΕΣ), του σπλήνα, του ήπατος και των λεμφαδένων. Τα μακροφάγα κύτταρα έχουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες, οπότε εγκολπώνουν τα λιποσώματα μέσω ενδοκύττωσης και τα περικλείουν σε ένα πεπτικό κενοτόπιο (ενδόσωμα). Το πεπτικό κενοτόπιο εν συνεχεία συντήκεται με ένα ή περισσότερα λυσοσώματα που περιέχουν υδρολυτικά ένζυμα. Επακολουθεί καταστροφή της λιποσωμικής μεμβράνης και οι δραστικές ουσίες που απελευθερώνονται είτε αντιδρούν μέσα στο λυσόσωμα, είτε μεταναστεύουν σ άλλες κυτταρικές περιοχές (π.χ. στον πυρήνα κατά τη διάρκεια χημειοθεραπείας καρκίνου) διαχεόμενα μέσω της λυσοσωμικής μεμβράνης. (Gregoriadis G. 1976) (Σχήμα 14)

58 Σχήμα 14. Αναγνώριση μονοστοιβαδιακού σωματιδίου από ένα κύτταρο στόχο. Πιο πρόσφατα έχουν σχεδιαστεί λιποσώματα που αποφεύγουν την εντόπιση από τα λυσοσώματα και την αδρανοποίηση του περιεχομένου τους. Για παράδειγμα, όταν ευαίσθητα στο ph λιποσώματα βρεθούν στο όξινο περιβάλλον των ενδοσωμάτων, πιστεύεται ότι συντήκονται με τη μεμβράνη των κενοτοπίων και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (Connor J. et al., 1985). Ωστόσο τα αποτελέσματα που έχουν παρατηρηθεί in vitro είναι υπό διερεύνηση σε in vivo μελέτες, όπου οι πρωτεΐνες του πλάσματος που προσροφώνται στην λιποσωμική επιφάνεια ίσως παρεμβαίνουν στις συντηκογόνες ιδιότητές τους. Η πρόσληψη των λιποσωμάτων από τα κύτταρα του ΔΕΣ μπορεί να παρεμποδιστεί στερεοχημικά, τροποποιώντας την επιφάνειά τους με την προσθήκη πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται "αόρατα" λιποσώματα (stealth liposomes) μακράς κυκλοφορίας (Borison O. et al., 1996) (Σχήμα 15)

59 Σχήμα 15. Σχηματική αναπαράσταση στερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων. Τα προηγούμενα χρόνια τα λιποσώματα που χρησιμοποιούνταν στις in vivo μελέτες ήταν λιποσώματα συντιθέμενα από ουδέτερα λιπίδια όπως σφιγγομυελίνη ή φωσφατιδυλοχολίνη με την παρουσία χοληστερόλης ή ακόμη και τη χρήση κάποιων φορτισμένων λιπιδίων (Gregoriadis G.,1988). Η παρουσία της χοληστερόλης εξασφάλιζε τη σταθερότητα των λιποσωμάτων απέναντι στις πρωτεΐνες του πλάσματος (Mayhew E. et al., 1979, Szoka F. And Papahadjopoulos D., 1981), ενώ η παρουσία φορτισμένων λιπιδίων εξασφάλιζε την αποφυγή συσσωμάτωσης και την αύξηση της ικανότητας εγκλωβισμού. Τέτοιου είδους συστάσεις αναφέρονται πλέον ως συμβατικά λιποσώματα conventional liposomes (CL) ενώ τα λιποσώματα με την παρουσία πολυμερών χαρακτηρίζονται ως sterically stabilized liposomes (SL). Γενικά ο χρόνος ημιζωής των συμβατικών λιποσωμάτων αυξάνει με την ελάττωση του μεγέθους τους και η προσθήκη χοληστερόλης τα σταθεροποιεί περισσότερο. Επίσης ουδέτερη λιπιδική διπλοστοιβάδα είναι λιγότερο ευαίσθητη σε υδρόφοβες ή αλληλεπιδράσεις φορτίων με τις πρωτεΐνες του πλάσματος ή με κυτταρικούς υποδοχείς επιφάνειας

60 Μηχανισμός προστασίας των λιποσωμάτων από την πολυαιθυλενογλυκόλη Η προστατευτική δράση της πολυαιθυλενογλυκόλης αποδίδεται στη στερεοχημική παρεμπόδιση των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα λιποσώματα και τις πρωτεΐνες του πλάσματος (Papisov, 1998). Μάλιστα, για τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα σε διαμόρφωση brush, ο Papisov αναλύει τη στερεοχημική παρεμπόδιση σε δύο διαφορετικούς τύπους: ο πρώτος τύπος παρεμπόδισης αναφέρεται σα στερεοχημική προστασία (steric shielding), σύμφωνα με τον οποίο οι αλυσίδες της πολυαιθυλενογλυκόλης προστατεύουν τα λιποσώματα από την προσέγγιση ξένων μορίων, ενώ ο δεύτερος τύπος παρεμπόδισης αναφέρεται σα στερεοχημικός φραγμός (steric obstruction), σύμφωνα με τον οποίο η απευθείας επαφή ανάμεσα σε κάποιο μόριο και τη λιποσωμική επιφάνεια καθίσταται μηχανικά δύσκολη ή αδύνατη. Η πολυαιθυλενογλυκόλη δημιουργεί μια προστατευτική στοιβάδα διάχυσης, παρεμποδίζοντας τη διάχυση των πρωτεϊνών από το αίμα προς τη λιποσωμική επιφάνεια. Ενώ το ένα άκρο της πολυαιθυλενογλυκόλης είναι συνδεδεμένο στη λιποσωμική επιφάνεια, η υπόλοιπη αλυσίδα διατηρεί την ελευθερία κίνησής της. Έτσι το πολυμερές παραμένει διαλυμένο και περιελίσσεται τυχαία γύρω από το σημείο σύνδεσης (Μilner, 1991). Οι Torchilin et al (Torchilin et al., 1995) αναφέρουν ότι μόνο εάν ένα πολυμερές συνδυάζει υδροφιλικότητα και ευλυγισία μπορεί να προστατεύει τα λιποσώματα, ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Όσο πιο ευλίγιστο είναι το πολυμερές τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των πιθανών διαμορφώσεων και τόσο μεγαλύτερος είναι ο ρυθμός μετάβασης από τη μια διαμόρφωση στην άλλη. Αυτό σημαίνει ότι τα υδατοδιαλυτά και ευλίγιστα πολυμερή υπάρχουν σαν μια κατανομή πιθανών διαμορφώσεων πάνω από τα λιποσώματα. Έτσι οι πρωτεΐνες του πλάσματος πρέπει να διαπεράσουν αυτό το νέφος για να προσεγγίσουν τη λιποσωμική επιφάνεια. Επίσης, καθώς η αλυσίδα της πολυαιθυλενογλυκόλης αλλάζει συνεχώς διαμορφώσεις το ανοσοποιητικό σύστημα δεν είναι σε θέση αν παράγει τα κατάληλα αντισώματα (Woodle et al., 1992)

61 Οι Bogdanov et al (Bogdanov et al., 1993) αναφέρουν ότι η παρουσία ενός υδρόφιλου περιβλήματος στη λιποσωμική επιφάνεια εμποδίζει την προσέγγιση των οψωνινών Εναλλακτικές οδοί χορήγησης Τα λιποσώματα μπορούν εναλλακτικά να χορηγηθούν ενδομυϊκά, υποδόρια και ενδοπεριτοναΐκά, οπότε τα ίδια και οι παγιδευμένες σ αυτά δραστικές ουσίες εισέρχονται κυρίως στο λεμφικό σύστημα, ένα ποσοστό τους στους λεμφικούς κόμβους και το υπόλοιπο ποσοστό καταλήγει μέσω των λεμφικών αγγείων στο ήπαρ και το σπλήνα. Άλλες παρεντερικές οδοί χορήγησης είναι η ενδοτραχειακή η ενδοαρτηριακή και η τοπική. Η στοματική χορήγηση αντενδεικνύεται εξαιτίας της καταστρεπτικής δράσης των φωσφολιπασών και των χολικών αλάτων του εντέρου. Παρόλα αυτά με κατάλληλη λιπιδική σύσταση το λιπόσωμα μπορεί να έχει επαρκή σταθερότητα στις συγκεκριμένες in vivo συνθήκες (Kokkona et al., 2000) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Εξαιτίας της ικανότητάς τους να προφυλάσσουν και να μεταφέρουν πλήθος υδρόφοβων και υδρόφιλων μακρομορίων, τα λιποσώματα χρησιμοποιούνται εκτενώς ως συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Η τάση που έχουν να υφίστανται φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα μπορεί να γίνει θετικά εκμεταλλεύσιμη στην κατανομή φαρμάκων. Τα φάρμακα που εγκλωβίζονται σε λιποσώματα (και άλλους σωματιδιακούς φορείς π.χ. νανοσωματίδια) είναι δυνατό να απελευθερώνονται αργά μετά την αποικοδόμηση του μεταφορέα τους. Αυτή η βραδεία και ελεγχόμενη αποδέσμευση έχει μεγάλα πλεονεκτήματα στον περιορισμό των διακυμάνσεων της συγκέντρωσης στο πλάσμα για φάρμακα με στενό θεραπευτικό εύρος ενώ ταυτόχρονα επιτυγχάνεται μείωση της τοξικότητας και αύξηση της εκλεκτικότητας προς το στόχο. Η αντιμικροβιακή θεραπεία μολύνσεων από ιούς, βακτήρια και πρωτόζωα, η θεραπεία διαφορετικών τύπων καρκίνου, η γονιδιακή θεραπεία, η θεραπεία με

62 ενζυμική υποκατάσταση σε κληρονομικές μεταβολικές ανωμαλίες, τοπική θεραπεία όπως οφθαλμική (Mezei M. et al., 1992), η θεραπεία αρθρίτιδας και η χορήγηση λιποσωμάτων με εγκλωβισμένη αιμοσφαιρίνη (αιμοσώματα) για την αναπλήρωση αίματος σε επείγουσες καταστάσεις όπου δεν υπάρχει διαθέσιμος κατάλληλος δότης είναι μερικά μόνο παραδείγματα από τις πάρα πολλές θεραπευτικές εφαρμογές λιποσωμάτων, όπως προέκυψαν από επιτυχή πειράματα σε ζώα (Torchillin V.P., 1985). Τα οφέλη της χρήσης λιποσωμάτων ως μεταφορείς φαρμάκων συνοψίζονται στο ακόλουθο παράδειγμα: Οι ανθρακυκλίνες ανήκουν στην κατηγορία φυσικών αντιβιοτικών, με μηχανισμό δράσης, κυρίως την παρεμβολή τους στις βάσεις του DNA (μεταξύ κυτοσίνης και γουανίνης) και χρησιμοποιούνται στη θεραπεία οξείας λευχαιμίας, σαρκώματος, καρκίνου του στήθους, των ωοθηκών, του πνεύμονα και του προστάτη. Ωστόσο, όπως συμβαίνει και με άλλα κυτταροστατικά, η χρήση τους συνοδεύεται από σοβαρές ανεπιθύμητες παρενέργειες όπως αλωπεκία, καρδιοτοξικότητα, ναυτία. Προκλινικές μελέτες σε ζώα έχουν αποκαλύψει ότι εάν οι ανθρακυκλίνες χορηγούνται με τη χρήση λιποσωμάτων, παρατηρείται μείωση της πρόσληψης φαρμάκου από τους ιστούς της καρδιάς και ως εκ τούτου μείωση της καρδιοτοξικότητας (Forssen E. et al., 1981). Χάρη σε αυτές τις ιδιότητές τους τα λιποσώματα έχουν χρησιμοποιηθεί και σε περιπτώσεις όπου είναι απαραίτητη η βελτίωση της βιοσυμβατότητας όπως συμβαίνει στη δημιουργία ιατρικών διατάξεων και συσκευών οι οποίες έρχονται σε άμεση επαφή με το ανθρώπινο αίμα, για παράδειγμα συσκευές αιμοδιαλύσεως, συσκευές πλασμαφαιρέσεως, προσθετικές καρδιακές βαλβίδες, συσκευές εξωσωματικής κυκλοφορίας σε εγχειρήσεις ανοιχτής καρδιάς, αγωγοί by pass, καθετήρες αγγειοπλαστικής, ενδοαγγειακές προσθέσεις και πολλές άλλες. Είναι γνωστό ότι όταν το αίμα βρίσκεται σε επαφή με μία τεχνητή επιφάνεια ένα σύμπλεγμα περίπλοκων αλληλεπιδράσεων λαμβάνει χώρα: προσρόφηση πρωτεϊνών, κυτταρική (κυρίως αιμοπεταλίων) συγκόλληση, ενεργοποίηση των μηχανισμών πήξης του αίματος, ενεργοποίηση συμπληρώματος και τελικά σχηματισμός ινώδους και θρόμβου

63 1. 2 ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ Τα αρσονολιποσώματα, είναι λιποσώματα τα οποία περιέχουν αρσονολιπίδια. Διακρίνονται σε απλά, τα οποία περιέχουν μόνο αρσονολιπίδια, και σε μικτά, τα οποία περιέχουν επιπλέον φωσφολιπίδια και /ή χοληστερόλη. Τα αρσονολιπίδια είναι μια νέα τάξη λιπιδίων, των οποίων η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός έγινε πρόσφατα (Tsivgoulis et al., 1991 a,b, Serves et al., 1992,1993). Πρόκειται για λιπίδικά ανάλογα των φωσφονολιπιδίων, στα οποία το άτομο του φωσφόρου αντικαθίσταται από το άτομο του αρσενικού, όπως φαίνεται στο σχήμα 16. RCOO RCOO RCOO O RCOO O As OH P OH OH OH Σχήμα 16. Αρσονολιπίδια, λιπιδικά ανάλογα των φωσφονολιπιδίων. Έχουν συντεθεί τέσσερα διαφορετικά αρσονολιπίδια ως προς το μήκος των πλευρικών αλυσίδων: αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα λαουρικού οξέος (R= C 11 H 23, [C 12 ]), αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού οξεος (R= C 13 H 27, [C 14 ]), αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος (R= C 15 H 31, [C 16 ]), και αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα στεαρικού οξέος (R= C 17 H 35, [C 18 ]). Τα αρσονολιπίδια είναι ασθενή οξέα σε σύγκριση με το φωσφατιδικό οξύ, PA (για τα αλειφατικά αρσονικά οξέα, pk a1 ~4 και pk a2 ~9 (Doak et al., 1970), ενώ για το φωσφατιδικό οξύ pk a1 ~2 και pk a2 ~7.5 (Trauble et al., 1974) σε διπλοστοιβάδες). Επιπλέον, τα αρσονολιπίδια μπορούν να μεταφέρουν ιόντα Ca 2+ και Mg 2+ μέσα από μία οργανική φάση πιο γρήγορα από ότι το φωσφατιδικό οξύ (Gortzi et al., 2001). Το άτομο του αρσενικού είναι μεγαλύτερο από το άτομο του φωσσφόρου, με

64 αποτέλεσμα η πολική κεφαλή των αρσονολιπιδίων να είναι μεγαλύτερη από αυτή των φωσφολιπιδίων. Ωστόσο, η πιο σημαντική ιδιότητά τους είναι η ικανότητα του ατόμου του αρσενικού να ανάγεται από την πεντασθενή (As V) στην τρισθενή (As III) οξειδωτική βαθμίδα από θειόλες (Timotheatou et al., 1996). Τέτοιες αλληλεπιδράσεις in vivo με θειόλες οι οποίες βρίσκονται επάνω στην κυτταρική μεμβράνη ή μέσα στο κυτταρόπλασμα, μπορούν να μεταβάλλουν τα χαρακτηριστικά του κυττάρου, καθιστώντας τα αρσονολιπίδια δραστικά απέναντι σε καρκινικά κύτταρα όταν αυτά περιέχουν μια συγκεκριμένη ποσότητα θειολομάδων ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Λόγω της υψηλής θερμοκρασίας μετάπτωσης των αρσονολιπιδίων (Serves et al., 1993) η οποία κυμαίνεται από ο C, και της τάσης τους για αφρισμό, τα αρσονολιποσώματα δεν μπορούν να παρασκευαστούν με συμβατικές μεθόδους παρασκευής λιποσωμάτων, όπως αυτές που αναφέρονται στην προηγούμενη ενότητα. Η μέθοδος ενός βήματος (one step method) (Talsma et al 1994) βρέθηκε ότι είναι αποτελεσματική για την παρασκευή αρσονολιποσωμάτων (Fatouros et al., 2001). Στη μέθοδο ενός βήματος το κάθε διάλυμα του λιπιδίου προστίθεται σε φιαλίδιο και ο οργανικός διαλύτης απομακρύνεται σε ρεύμα αζώτου. Η προς εγκλωβισμό ουσία προθερμαίνεται για αρκετή ώρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου και προστίθεται ζεστή στο φιαλίδιο. Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει ανάδευση υπό θέρμανση, με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων για τουλάχιστον 4 ώρες. Μετά το σχηματισμό των πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων (MLV), τα δείγματα αφήνονται για annealing, για μία ώρα περίπου στην ίδια υψηλή θερμοκρασία χωρίς ανάδευση. Η παρασκευή των μικρών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) γίνεται με χρήση ακίδας υπερήχων για 15 λεπτά

65 ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Μορφολογία Οι Fatouros et al. (Fatouros et al., 2001) μελέτησαν τη μορφολογία των αρσονολιποσωμάτων με ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης (ΤΕΜ). Τα μικτά αρσονολιποσώματα, τύπου MLV, με φωσφολιπίδια (φωσφατιδυλοχολίνη ή διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη) και/ ή χοληστερόλη είναι ως επί τω πλείστον δισκοειδή ή σφαιρικά. Η ίδια παρατήρηση ισχύει και για τα απλά αρσονολιποσώματα με πλευρική αλυσίδα μυριστικού (C 14 ), παλμιτικού (C 16 ) και στεαρικού (C 18 ) οξέος. Εξαίρεση αποτελούν τα απλά αρσονολιπίδια με πλευρική αλυσίδα λαουρικού οξέος (C 12 ), των οποίων η δομή είναι επιμήκης. Η εξέταση των αρσονολιποσωμάτων με οπτική μικροσκοπία επιβεβαίωσε τις παραπάνω παρατηρήσεις. Τα απλά πολυστοιβαδιακά αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική ομάδα λαουρικού οξέος σχηματίζουν περίεργες επιμήκεις δομές (tubles), οι οποίες επανασχηματίζονται άμεσα και μετά τη μείωση του μεγέθους τους με χρήση ακίδας υπερήχων. Χρησιμοποιώντας τη τεχνική της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, βρέθηκε ότι πράγματι όταν το αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα λαουρικού οξέος διασπείρεται σε νερό με τη μέθοδο του ενός βήματος παράγονται επιμήκεις (>5μm) σωληνοειδείς δομές (tubules). Με τη χρήση ακίδας υπερήχων, για παρασκευή μικρών μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων (SUV), οι δομές αυτές σπάνε σε κύβους (cubes) ή σε κυλίνδρους (barrels), και πράγματι επανασχηματίζονται τάχιστα. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες, με μείωση του μεγέθους με ακίδα υπερήχων, τα αρσονολιπίδια με πλευρικές αλυσίδες μυριστικού, παλμιτικού και στεαρικού οξέος σχηματίζουν δισκοειδή μονοστοιβαδιακά αρσονολιποσώματα με διαμέτρους της τάξης των 80 nm περίπου. Με προσθήκη χοληστερόλης τα αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος ομαλοποιούνται και σχηματίζονται κάποια μεγάλα επίπεδα φύλλα, ενώ η παρουσία φωσφατιδυλοχολίνης σε αναλογία PC:Ars(C 16 ):Chol = 8:12:10 οδηγεί στο σχηματισμό ελλειπτικών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων

66 Μέγεθος Οι Fatouros et al. (Fatouros et al., 2001) εξέτασαν το μέγεθος των αρσονολιποσωμάτων με φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (photon correlation spectroscopy, PCS). Το μέγεθος των απλών αρσονολιποσωμάτων, τύπου MLV, κυμαίνεται από nm και οι παρασκευές αυτές είναι εξαιρετικά ομοιογενείς όσον αφορά το μέγεθος τους. Το μέγεθος αυτό επηρεάζεται ελαφρά από το μήκος των πλευρικών αλυσίδων των αρσονολιπιδίων. Πράγματι, τα αρσονολιπίδια με πλευρικές αλυσίδες λαουρικού (C 12 ), παλμιτικού (C 16 ) και στεαρικού (C 18 ) σχηματίζουν μικρότερα λιποσώματα, ενώ το αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού οξέος (C 14 ) σχηματίζει λίγο μεγαλύτερα λιποσώματα. Τα αρσονολιποσώματα C 18 σχηματίζουν γρήγορα μεγάλα συσσωματώματα, τα οποία καθιζάνουν γρήγορα, όπως αποκαλύπτουν οι μετρήσεις με οπτική μικροσκοπία (light microscopy) και σκέδαση ακτίνων laser (laser scattering). Έτσι το μικρό τους μέγεθος μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι αυτό αντιστοιχεί στα αιωρούμενα σωματίδια. Η προσθήκη φωσφολιπιδίων ή χοληστερόλης έχει διαφορετική επίδραση στο μέγεθος των αρσονολιποσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα η προσθήκη χοληστερόλης σε αναλογία Ars:Chol = 1:1 δεν μεταβάλλει τη διάμετρο των αρσονολιποσωμάτων C 12, παρατηρείται μια μικρή αύξηση στη διάμετρο των αρσονολιποσωμάτων C 14, ενώ η διάμετρων των αρσονολιποσωμάτων C 16 και C 18 αυξάνει σημαντικά. Από την άλλη η προσθήκη διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνης σε αναλόγια Ars:DSPC = 1:1 οδηγεί σε σημαντική αύξηση του μεγέθους των αρσονολιποσωμάτων C 12, αλλά δεν επηρεάζει το μέγεθος των αρσονολιποσωμάτων που παρασκευάζονται από τα μεγαλύτερα αρσονολιπίδια. Στον επόμενο πίνακα αναγράφονται οι τιμές της διαμέτρου των πολυστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες ελήφθησαν από τους Fatouros et al

67 Πίνακας 1. Διάμετρος (σε nm) λιποσωμάτων (MLV) τα οποία περιέχουν αρσονολιπίδια και παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (απλά αρσονολιποσώματα και μικτά αρσονολιποσώματα με χοληστερόλη ή διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη) (Fatouros et. al, 2001). Αρσονολιπίδιο Ars Ars:Chol Ars:DSPC 1:1 1:1 C ±6 247±13 346±19 C ±22 384±16 - C ±41 362±18 247±13 C ±23 427±61 290±22 Όταν το μέγεθος των αρσονολιποσωμάτων τύπου MLV μειωθεί με τη χρήση ακίδας υπερήχων (SUV) παρατηρείται μια σημαντική ελάττωση του μεγέθους τους της τάξης του 50%. Πράγματι, το μέγεθος των απλών μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων κυμαίνεται από nm, χωρίς να παρατηρείται κάποια επίδραση του μήκους των πλευρικών αλυσίδων των αρσονολιπιδίων. Στον επόμενο πίνακα αναγράφονται οι τιμές της διαμέτρου των μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες ελήφθησαν από τους Fatouros et. al. Πίνακας 2. Διάμετρος (σε nm) λιποσωμάτων (SUV), τα οποία περιέχουν αρσονολιπίδια και παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (απλά αρσονολιποσώματα και μικτά αρσονολιποσώματα με χοληστερόλη ή φωσφατιδυλοχολίνη) (Fatouros et al., 2001). Αρσονολιπίδιο Ars Ars:Chol PC:Ars:Chol PC:Ars:chol 2:1 12:8:10 17:3:10 C ±10 102,5±8,5 72,6±8,4 62,8±7.5 C ±15 107,9±8,9 87,0±6,8 76,4±3,1 C ,2±9,6 110,8±8,7 90,9±6,6 78,0±5,7 C ,3±6,8 93,4±5,4 76,8±6,7 Τέλος σε μετρήσεις μεγέθους που έγιναν σχετικά με την τάση των αρσονολιποσωμάτων για συσσωμάτωση βρέθηκε ότι τα απλά αρσονολιποσώματα,

68 τύπου MLV, από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού οξέος (C 14 ) συσσωματώνονται μετά την επώαση τους στους 37 C. Τα μικτά αρσονολιποσώματα Ars:Chol = 2:1, τύπου SUV, συσσωματώνονται ελαφρά, ενώ τα μεικτά αρσονολιποσώματα PC:Ars:Chol έχουν περίπου το ίδιο μέγεθος μετά από 24 ώρες επώασης.. Σε κάθε περίπτωση πάντως το ποσοστό αύξησης της μέσης διαμέτρου των αρσονολιποσωμάτων ήταν μικρότερο από 23% γεγονός που σημαίνει ότι τα λιποσώματα αυτά είναι σχετικά σταθερά όσον αφορά το μέγεθός τους. Οι Piperoudi et al. (Piperoudi et al., 2005) εξέτασαν το μέγεθος μικτών αρσονολιποσωμάτων (C 16 ) από φωσφατιδιλοχολίνη και δυστεαροϋλοφωφατιδυλοχολίνη με διαφορετική περιεκτικότητα σε αρσονολιπίδιο ή / και επικάλυψη με PEGlipids. Στον επόμενο πίνακα αναγράφονται οι τιμές της διαμέτρου των μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες ελήφθησαν από τους Piperoudi et al. Πίνακας 3. Διάμετρος (σε nm) μεικτών αρσονολιποσώματων με χοληστερόλη και / ή PEG-lipids (SUV), τα οποία παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (Piperoudi et al., 2005). PC:Chol PC:Ars:Chol PC:Ars:Chol DSPC:Chol DSPC:Ars:Chol DSPC:Ars:Chol (2:1) (17:3:10) (12:8:10) (2:1) (17:3:10) (12:8:10) 81,4±3,8 78,6±1,8 66,9±2,4 96,0±3,2 99,9±1,1 79,88±0,93 DSPC:Chol (2:1) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (17:3:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (14:6:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (12:8:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (4:16:10) +8% PEG 106,2±2,7 99,5±2,8 101,3±1,6 103,2±1,7 101±5,0-48 -

69 ζ-δυναμικό zeta Οι Fatouros et al. (Fatouros et al., 2001) μελέτησαν το ηλεκτρικό δυναμικό ή ζ-δυναμικό των αρσονολιποσωμάτων με φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (photon correlation spectroscopy, PCS). Ο υπολογισμός του ζ-δυναμικού έγινε σύμφωνα με την εξίσωση Smolowkovski. Η εισαγωγή αρσονολιπιδίων σε λιποσωμικές παρασκευές οδηγεί σε υψηλό αρνητικό επιφανειακό φορτίο. Μάλιστα, μετά την εφαρμογή υπερήχων με ακίδα υπερήχων για τη μείωση του μεγέθους και την παρασκευή μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων, οι τιμές του ζ-δυναμικού αυξάνουν (σε απόλυτη τιμή σε σχέση με τα MLV αρσονολιποσώματα. Τα μεικτά SUV αρσονολιποσώματα με φωσφατιδυλοχολίνη ή/και χοληστερόλη, σε PH=7.4 έχουν ζ-δυναμικό κυμαινόμενο από -69 έως -28mV, το οποίο επηρεάζεται ελαφρά από το μήκος των πλευρικών αλυσίδων του αρσονολιπιδίου, αλλά κυρίως από τη λιπιδική σύσταση, όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 4. ζ-δυναμικό (σε mv) λιποσωμάτων, τα οποία περιέχουν αρσονολιπίδια και παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (απλά αρσονολιποσώματα και μικτά αρσονολιποσώματα με χοληστερόλη ή/και φωσφατιδυλοχολίνη) (Fatouros et al., 2001). Αρσονολιπίδιο PC:Ars:chol 17:3:10 (SUV) PC:Ars:Chol 12:8:10 (SUV) Ars:Chol 2:1 (SUV) Ars (SUV)* Ars (MLV)* C 12-23,9±1,9-42,0±2,8-63,5±6,3-50,8±0,6-46,4±1,3 C 14-28,2±1,1-43,0±2,6-65,4±1,5-51,3±0,8-44,1±2,7 C 16-42,1±2,9-50,3±1,0-69,5±2,3-57,2±1,3-57,7±1,1 C 18-32,1±2,3-48,4±1,2-59,2±3,1-40,1±2,1-38,5±2,0 *λιποσωμικές παρασκευές σε απεσταγμένο νερό

70 Πράγματι οι τιμές του ζ-δυναμικού μειώνονται όταν ένα μέρος του αρσονολιπιδίου αντικαθίσταται από φωσφατιδυλοχολίνη. Από την άλλη πλευρά, το μήκος των πλευρικών αλυσίδων του αρσονολιπιδίου δεν έχει κάποια σημαντική επίδραση στις τιμές του ζ-δυναμικού των αρσονολιποσωμάτων, αν και τα αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο C 16 έχουν υψηλότερο δυναμικό. Επιπλέον, η ιονική ισχύς του μέσου, όπως είναι αναμενόμενο, επηρεάζει το ζ-δυναμικό, αφού οι μετρούμενες τιμές σε νερό είναι χαμηλότερες από τις αντίστοιχες σε ρυθμιστικό διάλυμα με ph=7.4. Οι Piperoudi et al. (Piperoudi et al., 2005) μελέτησαν το ηλεκτρικό δυναμικό ή ζ-δυναμικό μικτών αρσονολιποσωμάτων (C 16 ) από φωσφατιδιλοχολίνη και δυστεαροϋλοφωφατιδυλοχολίνη με διαφορετική περιεκτικότητα σε αρσονολιπίδιο και / ή επικάλυψη με PEG-lipis με φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (photon correlation spectroscopy, PCS). Ο υπολογισμός του ζ-δυναμικού έγινε σύμφωνα με την εξίσωση Smolowkovski. Στον επόμενο πίνακα αναγράφονται οι τιμές της διαμέτρου των μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες ελήφθησαν από τους Piperoudi et al. Πίνακας 5 ζ-δυναμικό (σε mv) μεικτών αρσονολιποσώματων με χοληστερόλη και / ή PEG-lipids (SUV), τα οποία παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (Piperoudi et al., 2005). PC:Chol PC:Ars:Chol PC:Ars:Chol DSPC:Chol DSPC:Ars:Chol DSPC:Ars:Chol (2:1) (17:3:10) (12:8:10) (2:1) (17:3:10) (12:8:10) +0,66±0,24-14,86±0,90-32,3±0,23-4,92±0,88-17,38±0,75-26,8±0,80 DSPC:Chol (2:1) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (17:3:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (14:6:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (12:8:10) +8% PEG DSPC:Ars:Chol (4:16:10) +8% PEG -1,66±0,36-4,04±0,86-3,62±0,8-2,98±0,98-4,62±0,

71 Ικανότητα εγκλωβισμού και σταθερότητα αρσονολιποσωμάτων Οι Fatouros et al. (Fatouros et al., 2001) μελέτησαν τη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων, στα οποία εγκλωβίστηκε μια υδατοδιαλυτή και φθορίζουσα ουσία (5, (6) carboxyfluorescein, (CF)) ή μια ουσία της οποίας ο φθορισμός εξαρτάται από το ph (8-hydroxypyrenetrisulfonic acid trisodium salt, (HPTS)), με μέτρηση της έντασης φθορισμού (fluorescence intensity, FI) πριν και μετά την προσθήκη κατάλληλου απορρυπαντικού. Τα απλά MLV αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού (C 14 ) και παλμιτικού οξέος (C 16 ) είναι ιδιαίτερα σταθερά κατά την επώασή τους με ρυθμιστικό διάλυμα TBS (ph=7.4) στου 37 C, σε αντίθεση με τα απλά αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα λαουρικού (C 12 ) και στεαρικού (C 18 ) οξέος, τα οποία συγκρατούν λιγότερο από 10% της εγκλωβισμένης CF, κατω από τις ίδιες συνθήκες επώασης. Οι παρατηρήσεις αυτές μπορούν να αποδοθούν στις περίεργες δομές των απλών αρσονολιποσωμάτων (C 12 ) και στη συσσωμάτωση των απλών αρσονολιποσωμάτων (C 18 ). Η προσθήκη χοληστερόλης σε αναλογία Ars:Chol = 1:1 οδηγεί σε σημαντική αύξηση της σταθερότητας των πολυστοιβαδιακών, ενώ η προσθήκη διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνης σε αναλογία DSPC:Ars = 1:1 σταθεροποιεί σημαντικά τα αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα λαουρικού οξέος (C 12 ), σε μικρό βαθμό τα αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού (C 14 ) και στεαρικού (C 18 ), αλλά σταθεροποιεί τα λιποσώματα από αρσoνολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος C 16 κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης. Όταν η επώαση των MLV αρσονολιποσωμάτων γίνεται παρουσία βοείου ορού (πρωτεϊνών), η σταθερότητά τους μειώνεται έντονα και η εγκλωβισμένη CF διαφεύγει μέσα από τα αρσονολιποσώματα μετά από λίγες ώρες επώασης. Η μείωση του μεγέθους οδηγεί σε σημαντική αύξηση της σταθερότητας. Σε πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας το αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα μυριστικού οξέος (C 14 ) βρέθηκε ότι η ικανότητα εγκλωβισμού των μεικτών SUV αρσονολιποσωμάτων, τα οποία εγκλωβίζουν CF ή HPTS, είναι συγκρίσιμη με τι τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για τα μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Batrzi et al, 1973). Επιπλέον, κατά την επώαση των SUV αρσονολιποσωμάτων Ars(C 14 ):Chol = 2:1, PC:Ars(C 14 ):Chol = 17:3:10, PC:Ars(C 14 ):Chol = 12:8:10 με ρυθμιστικό διάλυμα, η συγκράτηση της εγκλωβισμένης CF είναι πολύ υψηλή, ενώ η

72 συγκράτηση της εγκλωβισμένης HPTS είναι ακόμα μεγαλύτερη, πιθανόν γιατί σε ph=7.4 η χρωστική αυτή είναι ιονισμένη. Τέλος η συγκράτηση της εγκλωβισμένης HPTS παρουσία ορού πρωτεϊνών από τα μεικτά SUV αρσονολιποσώματα PC:Ars(C 14 ):Chol = 12:8:10 είναι σχετικά μεγάλη, αφού λιγότερο από το 40% της εγκλωβισμένης χρωστικής απελευθερώνεται μετά από 24 h επώασης. Oι Piperoudi et al. (Piperoudi et al., 2005) μελέτησαν την επίδραση της λιπιδικής σύστασης και της εισαγωγής λιπιδίων που είναι συζευγμένα με υδρόφιλη πολύαιθυλενογλυκόλη, PEG- lipids, στη σταθερότητα μικτών αρσονολιποσωμάτων από αρσονολιπίδιο με πλευρικές αλυσίδες παλμιτικού οξέος παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος και (πρωτεϊνών) ορού. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι μικτά αρσονολιποσώματα με φωσφατιδυλοχολίνη σταθεροποιούνται μερικώς αλλά όχι σημαντικά καθώς αυξάνει το ποσοστό του αρσονολιπιδίου ενώ η προσθήκη διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνης σταθεροποιεί μερικώς τα αρσονολιποσώματα παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος. Όσον αφορά στην προσθήκη των PEG lipids, σε ποσοστό 8% επί του συνόλου των mol των υπόλοιπων λιπιδίων, παρατήρησαν ότι στα μικτά αρσονολοποσώματα με διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη η προσθήκη των PEG lipids μειώνει την διαφυγή τις εγκλωβισμένης ουσίας, πιθανών λόγω των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του αρσονολιπιδίου και του εκάστοτε PEG lipid (DPPE- PEG 2000 ή DSPE-PEG 2000 ) που αναγκάζουν τις αλυσίδες τις πολυαιθυλενογλυκόλης να διαλυθούν μέσα στους πόρους ή τις ατέλειες της διπλοστοιβάδας. Παρουσία πρωτεϊνών ορού οι (Piperoudi et al) παρατήρησαν ότι καθώς αυξάνεται το ποσοστό του αρσονολιπιδίου επιτυγχάνεται η διαφυγή της εγκλωβισμένης ουσίας στα μικτά αρσονολιπωσώμτα με φωσφατιδυλοχολίνη (PC) ή με διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC). Επίσης η αντικατάσταση της φωσφατιδυλοχολίνης με διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη βελτιώνει σημαντικά τη σταθερότητα των δειγμάτων. Στη περίπτωση αυτή, η μείωση της ρευστότητας της λιποσωμικής μεμβράνης συνεπάγεται μειωμένη προσρόφηση των πρωτεϊνών του ορού και αυξημένη σταθερότητα. Όσων αφορά στην προσθήκη των PEG lipids, σε ποσοστό 8% του συνόλου των mol των υπόλοιπων λιπιδίων, παρατήρησαν διαφορετικές επιδράσεις ανάλογα με την λιπιδική σύσταση των δειγμάτων και το εκάστοτε PEG lipid (DPPE-PEG 2000 ή DSPE-PEG 2000 ). Στα μικτά αρσονολιποσώματα από διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη ή προσθήκη DSPE-PEG 2000 σε ποσοστό 8 % σταθεροποιεί τα αρσονολιποσώματα

73 όταν η σύστασή τους σε αρσονολιπίδιο υπερβεί μία κρίσιμη τιμή η οποία είναι 20 % αρσονολιπίδιο. Οι τιμές του ποσοστού % συγράτηση μετά από 24h επώαση, όταν η περιεκτικότητα σε αρσονολιπίδιο είναι μεγαλύτερη από 20 % (περίπτωση 40 και 80 % αρσονολιπίδιο), είναι μεγαλύτερες από 70 % και η αυξημένη αυτή σταθερότητα πρέπει να οφείλεται στην αυξημένη υδροφιλικότητα της λιποσωμικής επιφάνειας, η οποία είναι πλέον ικανή να απωθεί τις πρωτεΐνες του ορού Αλληλεπιδράσεις αρσονολιποσωμάτων με κύτταρα Το τριοξείδιο του αρσενικού (As 2 O 3 ) χρησιμοποιείται κατά της λευχαιμίας. Έχει βρεθεί ότι μειώνει τη βιωσιμότητα και ανάπτυξη ή / και προκαλεί απόπτωση σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων σε κυτταροκαλλιέργειες. Κλινικές μελέτες αναφέρουν ότι το τριοξείδιο του αρσενικού προκαλεί πλήρη ύφεση (remission) σε ασθενείς με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (acute promyelocytic leukemia, APL), οι οποίοι υποτροπιάζουν με χημειοθεραπείες ή με χορήγηση all-trans ρετινοϊκού οξέος. Ωστόσο ένα σημαντικό μειονέκτημα για την ευρεία χρήση θεραπευτικών παραγόντων, με βάση το αρσενικό είναι η υψηλή τοξικότητα τους (Westervelt et al., 1997). Πρόσφατα αποδείχτηκε ότι το τριοξείδιο του αρσενικού μειώνει τη βιωσιμότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις με τρόπο που εξαρτάται από το και τη χορηγούμενη δόση (Robose et al., 2000). Διάφορες μελέτες αναφέρουν ότι το τριοξείδιο του αρσενικό είναι δραστικό κατά της APL σε δόσεις που κυμαίνονται από 0,06-0,20 μg/κg. Μέσα σε αυτό το εύρος δεν παρατηρείται κάποια συσχέτιση ανάμεσα στη δόση και την αποτελεσματικότητα. Αύξηση της χορηγούμενης δόσης πέρα από το εύρος αυτό αναφέρεται ότι προκαλεί σοβαρές τοξικές αντιδράσεις, οι οποίες συμπεριλαμβάνουν νεφρική ανεπάρκεια και παράλυση (Westervelt et al., 1997). Η τοξικότητα του αρσενικού (ΙΙΙ) μπορεί να μειωθεί αλλάζοντας την οξειδωτική βαθμίδα σε αρσενικό (V). Μια άλλη προσέγγιση για τη μείωση της τοξικότητας των φαρμάκων είναι η ενσωμάτωση τους σε σταθερές λιποσωμικές παρασκευές, με πολύ καλά αποτελέσματα ιδίως για κυτταροτοξικά φάρμακα. Οι Gortzi et al. (Gortzi et al., 2002) σε μια προσπάθεια να συνδυάσουν την αντικαρκινική δράση των ενώσεων που περιέχουν αρσενικό και τη μειωμένη τοξικότητα και αυξημένη δραστικότητα των λιποσωμικών παρασκευών που περιέχουν κυτταροτοξικούς παράγοντες, μελέτησαν την επίδραση των

74 αρσονολιποσωμάτων από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος (C 16 ) το οποίο δίνει σχετικά σταθερά μονοστοιβαδιακά αρσονολιποσώματα, στη βιωσιμότητα καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων σε κυτταροκαλιέργειες. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν SUV αρσονολιποσώματα με διάφορες λιπιδικές συστάσεις, δύο σειρές φυσιολογικών και τρεις σειρές καρκινικών κυττάρων. Μετά την επώαση των αρσονολιποσωμάτων με δεδομένο αριθμό κυττάρων έγινε εκτίμηση της βιωσιμότητάς τους. Βρέθηκε ότι τα αρσονολιποσώματα προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, η οποία εξαρτάται από το χρόνο χορήγησης και τη δόση (έναρξη αναστολής: σε συγκέντρωση 10-6 Μ). αντίθετα δεν παρατηρήθηκε κάποια επίδραση στα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ το τριοξείδιο του αρσενικού είναι τοξικό σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις αρσενικού. Επιπλέον μορφολογικές μελέτες αποκάλυψαν ότι δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στα φυσιολογικά κύτταρα σε αντίθεση με τα καρκινικά. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν ιδιαίτερα ενθαρρυντικά και γι αυτό το λόγω πραγματοποιήθηκαν από τους Antimisiaris et al. (Antimisiaris et al., 2005) πειράματα μελέτης της in vivo κατανομής αρσονολιποσωμάτων σε ποντίκια Mελέτη in vivo κατανομής αρσονολιποσωμάτων Οι Antimisiaris et al. (Antimisiaris et al., 2005) μελέτησαν την κατανομή μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος (C 16 ) και χοληστερόλης [PC/Ars(C 16 )/Chol 12:8:10 mol/mol/mol] σε ποντίκια balb-c. Μια δόση αρσονολιπιδίου 5mg/Kg βάρους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε ποντίκια balb-c. Τα ποντίκια στη συνέχεια θανατώθηκαν σε δεδομένες χρονικές στιγμές μετά τη χορήγηση της δόσης και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα μετρήθηκε με φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης με φούρνο γραφίτη, μετά από χώνευση των δειγμάτων με πυκνό νιτρικό οξύ. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι υψηλό ποσοστό της χορηγούμενης δόσης απομακρύνεται γρήγορα από τον οργανισμό, αφού μια ώρα μετά τη χορήγηση μόνο το 30% της δόσης ανιχνεύτηκε στους ιστούς του πειραματόζωου. Μετά από αυτό η απομάκρυνση του αρσενικού είναι αργή με χρόνο ημιζωής 30h. Οι ιστοί με τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε αρσενικό είναι : τα νεφρά-σπλήνας

75 στομάχι ακολουθούμενοι από τους πνεύμονες, ήπαρ, έντερο-καρδιά, δέρμα + τρίχωμα και αίμα. Το γεγονός ότι τα αρσονολιποσώματα παραμένουν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους πνεύμονες μπορεί να οφείλεται σε αύξηση του μεγέθους τους λόγω συσσωμάτωσης. Πράγματι οι Fatouros et al. (Fatouros et al., 2005) δημοσίευσαν ότι τα αρσονολιποσώματα συσσωματώνονται και συντήκονται σε μεγαλύτερα σωματίδια παρουσία δισθενών ιόντων όπως Ca 2+. Για το λόγω αυτό κρίνεται σκόπιμο να συνεχιστούν οι μελέτες με άλλου τύπου αρσονολιποσώματα όπως είναι τα σταθεροποιημένα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας

76 - 56 -

77 1. 3 ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να διερευνήσουμε κατά πόσο μια in vitro μελέτη σταθερότητας αρσονολιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης σχετίζεται με την τοξικότητά τους ενάντια σε καρκινικά κύτταρα. Τα αρσονολιποσώματα είναι μια νέα τάξη λιποσωμάτων τα οποία περιέχουν αρσονολιπίδια που αποτελούν λιπιδικά ανάλογα των φωσφονολιπιδίων. Προκαταρκτικές μελέτες της αλληλεπίδρασης των αρσονολιποσωμάτων με καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα έδειξαν ότι τα νέα αυτά λιποσώματα είναι τοξικά ενάντια σε καρκινικά κύτταρα και προκαλούν αλλαγές στη μορφολογία τους σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Είναι πολύ πιθανόν λοιπόν τα αρσονολιποσώματα να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον σε αντικαρκινικές θεραπείες είτε ως έχουν είτε αφού εγκλωβίσουν κάποιο αντικαρκινικό φάρμακο. Πρόσφατα παρασκευασμένα αρσονολιποσώματα επικαλυμμένα με πολυαιθυλενογλυκόλη παρουσίασαν αυξημένη σταθερότητα παρουσία (πρωτεινών) ορού. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το γεγονός ότι δεν συσσωματώνονται παρουσία δισθενών κατιόντων καθιστά τα σταθεροποιημένα αυτά αρσονολιποσώματα ικανά ως προς τεχνολογική άποψη για χρήση σε αντικαρκινική θεραπεία. Το επόμενο βήμα είναι η μελέτη της επίδρασης τους στη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, ώστε να διαπιστωθεί ότι διατηρούν και τη δραστικότητά τους. Τα αρσονολιπίδια As (V) έχει αποδειχθεί ότι παρουσία θειολών ανάγονται σε λιποθειοαρσονώδεις εστέρες As (ΙΙΙ). Η ιδιότητά τους αυτή πιθανότατα αποτελεί και τον κύριο μηχανισμό κυτταροτοξικότητά τους. Θα ήταν ενδιαφέρων λοιπόν να διαπιστώσουμε την επίδραση της λιπιδικής σύστασης και της εισαγωγής λιπιδίων συζευγμένων με υδρόφιλα πολυμερή στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων in vitro παρουσία θειολών και πιο συγκεκριμένα γλουταθειόνης η οποία είναι και η κύρια θειόλη των κυττάρων. Για το σκοπό παρασκευάστηκαν μικρά μονοστοιβαδιακά (SUV) αρσονολιποσώματα από αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος (C 16 ), φωσφολιπίδια (φωσφατιδυλοχολίνη ή διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη) και χοληστερόλη με διαφορετικές συστάσεις. Έπειτα έγινε εισαγωγή DSPE-PEG 2000 και

78 εκτιμήθηκε η συγκράτηση μιας υδατοδιαλυτής, φθορίζουσας ουσίας, της καλσεΐνης παρουσία διαλύματος γλουταθειόνης. Εάν πράγματι το αρσενικό των αρσονολιποσωμάτων αλληλεπιδρά με τη γλουταθειόνη, αναμένεται πιθανότατα να επάγεται διαφυγή της χρωστικής που είναι εγκλωβισμένη, λόγω της αλληλεπίδρασης αυτής. Είναι άρα πιθανό η σταθερότητά τους παρουσία θειολών να αποτελεί δείκτη της δραστικότητάς τους μιας και η τοξικότητά τους ενάντια σε καρκινικά κύτταρα οφείλεται κυρίως σε αλληλεπίδραση με τις θειόλες των κυττάρων όπως αναφέρθηκε προηγούμενος. Στη συνέχεια με σκοπό να εκτιμηθεί η κυτταροτοξικότητά τους υπολογίστηκε η % βιωσιμότητα των PC3 με MTT assay ύστερα από επώαση των κυττάρων με τα λιποσώματα αυτά

79 Πειραματικό μέρος

80 - 60 -

81 2.1 ΥΛΙΚΑ Για τη μελέτη της σταθερότητας των αρσονολιποσωμάτων χρησιμοποιούνται τα παρακάτω υλικά: Φωσφατιδυλοχολίνη από αυγό (egg phosphatidylcholine, PC) από την Lipid Products Διστεαροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (distearoylphosphatidylcholine, DSPC) από την Avanti Polar Lipids Xοληστερόλη (cholesterol) από την Sigma Αρσονολιπίδιο με πλευρική αλυσίδα παλμιτικού οξέος Διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη 2000 (dipalmitoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol 2000, DPPE-PEG 2000 ) από την Avanti Polar Lipids Διστεαροϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευγμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη 2000 (distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol 2000, DSPE-PEG 2000 ) από την Avanti Polar Lipids Για την παρασκευή των διαλυμάτων των λιπιδίων χρησιμοποιούνται οι παρακάτω οργανικοί διαλύτες: Χλωροφόρμιο Μεθανόλη Άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούναται είναι: Καλσεϊνη (calcein) από τη Sigma- Aldrich για την παρασκευή διαλύματος 100mΜ καλσεϊνης, 1mM EDTA από τη Serva (ρύθμιση του ph στο 7,4 με NaOH ή ΗCl) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒS (Tris (Tris [hydroxymethyl] aminomethane) buffer saline) από τη Sigma, NaCl, νατραζίδιο (συντηρητικό) (NaN 3 ) από τη Sigma για την παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος TBS

82 Απορρυπαντικό Triton-X100 από την Sigma-Aldrich για την παρασκευή διαλύματος 10% v/v Triton-X100 Διάλυμα L-γλουταθειόνης (GSH) 10mM, (η γλουταθειόνη είναι από την Sigma-Aldrich). Παρασκευή λιποσωμάτων Για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα διαλύματα λιπιδίων: Διάλυμα DSPC:Ars:Chol (17:3:10) 25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Διάλυμα DSPC:Ars:Chol (12:8:10) 25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Διάλυμα PC:Ars:Chol (17:3:10) 25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Διάλυμα PC:Ars:Chol (12:8:10) 25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Διάλυμα DSPC:Ars:Chol (17:3:10) + 8% mol DSPE-PEG 25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Διάλυμα DSPC:Ars:Chol (12:8:10) + 8% mol DSPE-P25mg/ml ως προς το συνολικό λιπίδιο Τα παραπάνω διαλύματα παρασκευάστηκαν με τη διάλυση της απαιτούμενης ποσότητας των αντίστοιχων λιπιδίου σε μορφή σκόνης, σε μίγμα χλωροφορμίουμεθανόλης σε αναλογία 2:1 αντίστοιχα, ώστε να παρασκευαστούν οι παραπάνω συγκεντρώσεις. Παρασκευή ισότονου ρυθμιστικού διαλύματος TBS Ζυγίζονται 1,21 g Tris, 8,2 g NaCl και 0,2 g NaN 3 και μεταφέρονται σε ποτήρι ζέσεως του 1L. Aκολουθεί προσθήκη 1L απεσταγμένου νερού. Η ρύθμιση του ph μέχρι 7,4 γίνεται με διάλυμα 37% HCl

83 Παρασκευή διαλύματος καλσεΐνης 100mM Ζυγίζονται 1,245 g στερεής καλσεΐνης και 0,0052 g EDTA και μεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 25ml. Ακολουθεί προσθήκη 6 ml ρυθμιστικού διαλύματος TBS ( ph=7,4) και 6 ml διαλύματος ΝαΟΗ 0,5 Ν και η κωνική φιάλη τοποθετείται σε θερμαντική πλάκα υπό ανάδευση. Μετά τη διάλυση των στερεών συστατικών και το σχηματισμό ομοιογενούς μίγματος ακολουθεί η ρύθμιση του ph μέχρι ph=6,5-7 με διάλυμα ΝαΟΗ 1 Ν. Επακολουθεί προσθήκη διαλύματος ΝαΟΗ 0,5 Ν για τη ρύθμιση του ph μέχρι ph=7,4. Το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα TBS ( ph=7,4) μέχρι τελικού όγκου 20 ml. Έπειτα το διάλυμα επιστρέφεται στην κωνική φιάλη και το ph ρυθμίζεται τελικά μέχρι ph=7,4 με διάλυμα ΝαΟΗ 0,1 Ν. Το διάλυμα καλσεΐνης διατηρείται στους 4 ο C. Για τη μελέτη επίδρασης των αρσόνολιποσωμάτων στην βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιηθήκαν τα ακόλουθα υλικά: Πειραματικό υλικό. Στην παρούσα εργασία το πειραματικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν τα PC3 καρκινικά κύτταρα προστάτη. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PBS ph 7,4. Για την Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος χρησιμοποιούνται NaHPO 4, KH2PO 4, NaCl και KCl από τη Sigma. Η ρύθμιση του ph γίνεται με HCl. Το διάλυμα πριν χρησιμοποιηθεί αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο. Διάλυμα τρυψίνης/εdta. Το διάλυμα αυτό αγοράζεται έτοιμο και φυλάσεται για μεγάλο χρονικό διάστημα, μοιρασμένο σε μικρές ποσότητες στους -20 C. Για μικρό χρονικό διάστημα διατηρείται στους 4 C. Θρεπτικό μέσο HAM S F12*. Το διάλυμα αυτό αγοράζεται έτοιμο και εμπλουτίζεται με αντιβιοτικά (Pen-Step), δικαρβονικό νάτριο και L- γλουταμίνη

84 Πλήρες θρεπτικό μέσο HAM S F12. Για την Παρασκευή του πλήρους θρεπτικού μέσου χρησιμοποιείται το θρεπτικό μέσο HAM S F12* το οποίο εμπλουτίζεται με 10% ορό (FBS). Διάλυμα MTT(5mg/ml). Για την Παρασκευή του διαλύματος αυτού χρησιμοποιείται MTT από τη Sigma το οποίο διαλύεται σε PBS. Στη συνέχεια διηθείται διαμέσω αποστειρωμένων ηθμών (0,2μm) ΟΡΓΑΝΑ-ΧΡΗΣΗ Για τα πειράματα σταθερότητας χρησιμοποιούνται τα παρακάτω όργανα : Φθορισμόμετρο Shimatzu RF-1501 για τη μέτρηση της έντασης του φθορισμού (fluorescence intensity) των δειγμάτων (Σχήμα 17) Λουτρό υπερήχων για τη μείωση του μεγέθους των λιποσωμικών διασπορών (Branson 1200) Ακίδα υπερήχων για τη μείωση του μεγέθους των λιποσωμικών διασπορών (Vibra Cell) (Σχήμα 18) Φυγόκεντρος Heraeus Biofuge 28RS για τον καθαρισμό των δειγμάτων υδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας και ανακίνησης Julabo για την επωαση των δειγμάτων Μηχανικός αναδευτήρας (Micrel) Περιστρεφόμενος εξατμιστήρας (Buchi RE 111) (Σχήμα 19) Συσκευή μέτρησης ph (ph-μετρο) (TUV Bayern GS) Αναλυτικός ζυγός Για τη μελέτη επίδρασης των αρσόνολιποσωμάτων στην βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιηθήκαν τα ακόλουθα υλικά: Μικροσκόπιο Θάλαμος νηματικής ροής Επωαστής Φωτόμετρο τύπου ELISA

85 Σχήμα 17. Φθορισμόμετρο Shimatzu RF-1501 Σχήμα 18. Ακίδα υπερήχων Vibra Cell. Σχήμα 19. Περιστρεφόμενος εξατμιστήρας (Buchi RE 111) 2. 3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΠΟΛΥΣΤΟΙΒΑΔΙΑΚΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ (MLV) Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLV) παρασκευάζονται με δυο μεθόδους, ανάλογα με τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων (T c ). Τα λιποσώματα που περιέχουν φωσφολιπίδια και χοληστερόλη παρασκευάζονται με τη μέθοδο του λεπτού υμενίου (thin film method), ενώ τα λιποσώματα που περιέχουν και αρσονολιπίδιο, το οποίο έχει υψηλή T C, παρασκευάζονται με τη μέθοδο ενός βήματος (one step method)

86 Μέθοδος λεπτού υμενίου Στη μέθοδο του λεπτού υμενίου τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη των 50 ml τα διαλύματα των λιπιδίων. Οι οργανικοί διαλύτες απομακρύνονται με τη χρήση περιστρεφόμενου εξατμιστήρα (rotary evaporator) (Σχήμα 19) ενώ η θερμοκρασία στο υδατόλουτρο ρυθμίζεται ανάλογα με τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων. Μετά το σχηματισμό ενός λεπτού υμενίου στα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης, η περίσσεια οργανικού διαλύτη απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου. Ακολουθεί ενυδάτωση του υμενίου με διάλυμα της προς εγκλωβισμό ουσίας (διάλυμα 100mM calcein, 1mM EDTA, ph=7,4). Προκυμένου να αποκολληθεί το υμένιο από τα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης εφαρμόζεται μηχανική ανάδευση (vortex), έτσι ώστε να ληφθεί μια θολερή διασπορά, στην οποία υπάρχουν πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους. Η μείωση του μεγέθους της λιποσωμικής διασποράς επιτυγχάνεται με τη χρήση λουτρού υπερήχων (bath sonicator) για 15 λεπτά. Τέλος τα λιποσώματα αφήνονται για annealing, για μια περίπου ώρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων, μια διαδικασία κατά την οποία τακτοποιούν ατέλειες της μεμβράνης τους Μέθοδος ενός βήματος Στη μέθοδο ενός βήματος, η οποία χρησιμοποιείται για την παρασκευή των αρσονολιποσωμάτων, προστίθεται σε φιαλίδιο το κάθε λιπίδιο ξεχωριστά και απομακρύνονται οι οργανικοί διαλύτες με ρεύμα αζώτου. Η προς εγκλωβισμό ουσία (διάλυμα 100mM καλσεΐνης, 1mM EDTA, ph=7,4) προθερμαίνεται για αρκετό χρόνο σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του αρσονολιπιδίου και προστίθεται ζεστή στο φιαλίδιο. Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει ανάδευση υπό θέρμανση, με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του αρσονολιπιδίου για τουλάχιστον 4 ώρες. Τέλος τα λιποσώματα αφήνονται για annealing, για μια περίπου ώρα στην ίδια υψηλή θερμοκρασία χωρίς ανάδευση

87 2. 4 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΙΚΡΩΝ ΜΟΝΟΣΤΟΙΒΑΔΙΑΚΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ (SUV) Τα μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUV) παρασκευάζονται από τα μεγάλα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLV) με τη χρήση της ακίδας υπερήχων (probe sonicator). Τα δείγματα τοποθετούνται σε σωληνάκια και σε αυτά εφαρμόζονται υπέρηχοι για 5 λεπτά και παραπάνω αν χρειαστεί μέχρι να ληφθεί μια διαυγής διασπορά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές / λεπτό για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν μεγάλα λιποσώματα ή ρινίσματα τιτανίου από τη λιποσωμική διασπορά. Τα ρινίσματα αυτά αποκολλώνται λόγω της μεγάλης δύναμης τριβής, η οποία αναπτύσσεται ανάμεσα στην ακίδα και τη διασπορά, τέλος τα δείγματα αφήνονται για annealing, για μια περίπου ώρα σε θερμοκρασία πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων ώστε να ηρεμίσουν και να τακτοποιήσουν τη δομή τους ΛΙΠΙΔΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Η λιπιδική σύσταση (άθροισμα φωσφολιπιδίων και αρσονολιπιδίου (Ars)) διατηρείται σταθερή και ίση με 5mg/ml. Επίσης, σε όλες τις λιποσωμικές παρασκευές η μοριακή αναλογία των λιπιδίων προς τη χοληστερόλη διατηρείται σταθερή και ίση με 2:1. Οι συστάσεις, οι οποίες μελετούνται αρχικά είναι οι παρακάτω: PC:Chol = 2:1 PC:Ars :Chol = 17:3:10 [mol:mol:mol] (10% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm) PC:Ars :Chol = 12:8:10 [mol:mol:mol] (27% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm) DSPC:Chol = 2:1 DSPC:Ars:Chol = 17:3:10 [mol:mol:mol] (10% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm) DSPC:Ars:Chol = 12:8:10 [mol:mol:mol] (10% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm)

88 Στη συνέχεια παρασκευάζονται λιποσώματα των οποίων η επιφάνεια επικαλύπτεται με 8% επί του συνόλου των mole των λιπιδίων και της χοληστερόλης DSPE-PEG Πιο συγκεκριμένα μελετούνται οι παρακάτω συστάσεις: DSPC:Ars:Chol = 17:3:10 [mol:mol:mol] (10% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm) DSPC:Ars:Chol = 12:8:10 [mol:mol:mol] (27% συνολικού λιπιδίου σε Ars-Palm) 2. 6 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ in vitro ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Καθαρισμός λιποσωμάτων από τη μη εγκλωβισμένη καλσεΐνη Μετά την παρασκευή των δειγμάτων (SUV) ακολουθεί απομάκρυνση της μη εγκλωβισμένης ουσίας (καλσεΐνη) με τη βοήθεια στήλης (1x35cm), η οποία περιέχει γέλη Sephadex G-50 (Pharmacia). Ως εκλούτης χρησιμοποιείται ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα PBS, έτσι ώστε τα λιποσώματα να παραμένουν σταθερά από οσμωτική άποψη. Η γέλη αυτή σχηματίζει ένα πορώδες δίκτυο, το οποίο λειτουργεί ως μοριακό κόσκινο, επιτρέποντας την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο των ιόντων και μορίων που έχουν μέγεθος μικρότερο από το μέγεθος των πόρων του. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους, όπως τα λιποσώματα, αποκλείονται και εκλούονται πρώτες Επώαση λιποσωμάτων Μετά τη συλλογή των λιποσωμικών κλασμάτων ακολουθεί επώαση αυτών στο υδατόλουτρο, στους 37 ο C υπό ήπια ανακίνηση (40 rpm). Πιο συγκεκριμένα 100μl δείγματος μεταφέρονται σε δοκιμαστικό σωλήνα και αναμιγνύονται με 500μl ρυθμιστικού διαλύματος PBS ή διαλύματος γλουταθειόνης (GSH) 10 mm (αναλογία 1:5 v/v). Οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται στο υδατόλουτρο

89 Μέτρηση συγκράτησης καλσεΐνης Από 0 έως 24 ώρες και ανά τακτά χρονικά διαστήματα (0, 2,4,6,8 και 24 ώρες) λαμβάνονται δείγματα για μέτρηση της έντασης φθορισμού. Μια μικρή ποσότητα δείγματος (20μl) μεταφέρεται σε δοκιμαστικό σωλήνα και ακολουθεί προσθήκη 4ml ρυθμιστικού διαλύματος PBS. Μετράται η ένταση του φθορισμού, τιμή η οποία οφείλεται στην καλσεΐνη που έχει διαφύγει από τα λιποσώματα. Η καλσεΐνη η οποία παραμένει μέσα στα λιποσώματα, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης (100mM) παρουσιάζει απόσβεση και δε φθορίζει. Στη συνέχεια προστίθενται 0,4 ml διαλύματος Triton X-100 και ακολουθεί καλή ανάδευση με vortex και μέτρηση εκ νέου της έντασης του φθορισμού. Η προσθήκη του απορρυπαντικού επιφέρει τη λύση των λιποσωμάτων, με αποτέλεσμα να απελευθερώνεται η εγκλωβισμένη μέσα στα λιποσώματα καλσεΐνη. Με τον τρόπο αυτό η καλσεΐνη αραιώνεται στο ρυθμιστικό διάλυμα με αποτέλεσμα να φθορίζει. Έτσι η δεύτερη αυτή μέτρηση αντιστοιχεί στο σύνολο της καλσεΐνης είτε αυτή παραμένει μέσα στα λιποσώματα είτε έχει διαφύγει. Οι μετρήσεις της έντασης φθορισμού (fluorescence intensity, FI) πραγματοποιούνται σε λ ex =470nm, λ em =520nm υπό σταθερή θερμοκρασία (25 C). Από τις μετρήσεις αυτές υπολογίζεται η συγκράτηση της καλσεΐνης, % Latency, και το συγκριτικό ποσοστό συγκράτησης της καλσεΐνης, % retention. Το % Latency δίνεται από τον παρακάτω τύπο: 1,1 AT.. BT.. % la t e n cy = 100 1,1 AT.. Όπου Β.Τ. (befor triton X-100) είναι η μέτρηση πριν την προσθήκη του απορρυπαντικού και Α.Τ (after triton X-100) είναι η μέτρηση μετά την προσθήκη του απορρυπαντικού ( σπάσιμο λιποσωμάτων). Ο συντελεστής 1,1 με τον οποίο πολλαπλασιάζεται η τιμή Α.Τ. είναι διόρθωση λόγω αραίωσης. lanetcy() t % retention = 100 latency( t = 0)

90 2. 7 ΜΕΛΕΤΗ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΑΡΣΟΝΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΗ ΒΙΩΣΗΜΟ- ΤΗΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Kαλλιέργεια και ανακαλλιέργεια κυττάρων PC3. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε φλάσκες των 75 cm (Σχήμα 20) με πλήρες θρεπτικό μέσο HAM S F 12 στους 37 C, σε ατμόσφαιρα 5% CO 2 και 100% υγρασία. Όταν τα κύτταρα καταλάβουν το 100% της επιφάνεις προσκόλλησης, τότε αποκολλώνται ενζυμικά από τη φλάσκα, αραιώνονται με υγρό θρεπτικό μέσο και ανακαλλιεργούνται σε 3 καινούριες φλάσκες. Σχήμα 20. Σχηματική παράσταση φλάσκας 75 cm. Αρχικά γίνεται παρατήρηση της φλάσκας στο μικροσκόπιο. Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Τα κύτταρα που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα της φλάσκας θεωρούνται υγιή. Αυτά τα οποία έχουν πιο σφαιρική μορφή και επιπλέουν στον υγρό θρεπτικό μέσο θεωρούνται νεκρά. Εκτός από τη θέση και τη μορφολογία των κυττάρων παρατηρείται και η συγκέντρωση τους από την οποία εξαρτάται το αν θα πραγματοποιηθεί η ανακαλλιέργεια. Εφόσον τηρούνται οι προϋποθέσεις για καλλιέργεια, η φλάσκα μεταφέρεται σε θάλαμο νηματικής ροής για να επιτευχθούν οι στείρες συνθήκες για την πραγματοποίηση της διαδικασίας. Ακολουθεί ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα της φλάσκας δυο φορές με PBS. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομένοντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν

91 αναστολείς της τρυψίνης. Για την αποκόλληση των κυττάρων προστίθεται διάλυμα τρυψίνης, το οποίο διασπά τους δεσμούς μεταξύ των κυττάρων και της υπεύθυνης για την προσκόλληση επιφάνειας. Η παραμονή των κυττάρων στην τρυψίνη δεν πρέπει να γίνεται για μεγάλα χρονικά διαστήματα, έτσι ώστε να μη μειώνεται η βιωσιμότητα των κυττάρων. Η αποκόλληση των κυττάρων παρατηρείται στο μικροσκόπιο. Αμέσως μόλις αυτή ολοκληρωθεί, αναστέλλεται η τρυψίνη με προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου. Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε αποστειρωμένο φυγοκεντρικό σωλήνα και ακολουθεί φυγοκέντρηση των κυττάρων στις 1600 rpm για 4 λεπτά. Τα κύτταρα επαναιωρούνται σε καινούριο θρεπτικό μέσο με αναρροφήσεις με πιππέτα. Ο λόγος της επαναιώρησης είναι για να μην υπάρχουν συσσωματώματα κυττάρων τα οποία θα εμπόδιζαν τη μέτρηση τους στο αιμοκυτταρόμετρο. Αμέσως μετά την επαναιώρηση των κυττάρων, λαμβάνονται με πιππέτα 10μl από το εναιώρημα και τοποθετούνται στην ειδική υποδοχή του αιμοκυτταρόμετρου (Σχήμα 21). Σχήμα 21. Αιμοκυτταρόμετρο Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Είναι η πιο άμεση και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιμοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη και βαθμονομημένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια από αυτές διακρίνεται μια βαθμονόμηση σε μορφή

92 τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1mm. Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παραλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους μόλις 2,5 μm και χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων. Επίσης εμφανίζει διαβαθμίσεις (χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα) που εξυπηρετούν στην καταμέτρηση των κυττάρων (Σχήμα 22). μετρήσιμα Μη μετρήσιμα Σχήμα 22. Σχηματική παράσταση της μέτρησης κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο. Έτσι ο αριθμός των κυττάρων που βρίσκουμε σε ένα από αυτά τα τετράγωνα πολλαπλασιάζεται επί 9 που είναι αριθμός των συνολικών τετραγώνων και επί 10 3, και προκύπτει ο αριθμός των κυττάρων / ml Πειραματική διαδικασία για τον υπολογισμό της %βιωσιμότητας των PC3 κυττάρων υστέρα από επώαση με αρσονολιποσώματα. Αφού μετρηθεί ο αριθμός των κυττάρων υπολογίζεται η ποσότητα εναιωρήματος κυττάρων που περιέχει κύτταρα και τοποθετείται σε

93 μικροπλακίδια 24 κυψελίδων. Η κάθε κυψελίδα συμπληρώνεται με κατάλληλο όγκο θρεπτικού μέσου ώστε να περιέχει συνολικό όγκο 500μl (Σχήμα 23). Σχήμα 23. Στο σχήμα αυτό απεικονίζεται ένα μικροπλακίδιο 24 κυψελίδων με κύτταρα. Στη συνέχεια το μικροπλακίδιο τοποθετείται στον επωαστή για 16 ώρες. Ο χρόνος αυτός είναι απαραίτητος για να προσκολληθούν τα κύτταρα στον πυθμένα των κυψελίδων. Ύστερα τοποθετούνται τα λιποσώματα σε διάφορες δόσεις για να επωαστούν με τα κύτταρα για 24 ώρες. Μετά την επώαση των κυττάρων με τα λιποσώματα ακολουθεί υπολογισμός της βιωσιμότητάς τους. Έτσι σε κάθε κυψελίδα τοποθετούνται 50 μl διαλύματος MTT (5mg/ml) το οποίο μετατρέπεται σε κρυστάλλους φορμαζάνης από μιτοχονδριακά ένζυμα μόνο όταν το κύτταρο βρίσκεται σε φυσιολογική κατάσταση και ακολουθεί επώαση για 2 ώρες (για το σχηματισμό των κρυστάλλων). Στη συνέχεια το θρεπτικό μέσο αναρροφάται και σε κάθε κυψελίδα προστίθενται 500μl DMSO για τη διάλυση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η μετατροπή του MTT σε κρυστάλλους φορμαζάνης είναι ένδειξη της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων. Για τη διάλυση των κρυστάλλων μετά την προσθήκη DMSO πραγματοποιείται επώαση στους 37 C και ανάδευση. Ακολουθεί μεταφορά 200μl από κάθε κυψελίδα σε δοχεία μικροπλακιδίων ELISA 96 κυψελίδων και φωτομέτρηση στα 590 nm, χρησιμοποιώντας φωτόμετρο ELISA. Σε μια κυψελίδα τοποθετούνται 200μl DMSO και η απορρόφηση του χρησιμοποιείται ως μάρτυρας. Από τις οπτικές απορροφήσεις υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων με βάση την πρότυπη καμπύλη που έχει κατασκευαστεί, σύμφωνα με το αντίστοιχο πρωτόκολλο