Εξγαζηεξηαθή Δηεξεύλεζε ηεο αλζεθηηθόηεηαο ηεο Φπκαηίσζεο. Δξ. ΕΛΕΝΗ ΦΑΚΙΡΗ Αλ. Δ/ληξηα Κιηληθή Μηθξνβηνιόγνο ηζκαλόγιεην Γεληθό Ννζνθνκείν Αηηηθήο

Transcript

1 Εξγαζηεξηαθή Δηεξεύλεζε ηεο αλζεθηηθόηεηαο ηεο Φπκαηίσζεο Δξ. ΕΛΕΝΗ ΦΑΚΙΡΗ Αλ. Δ/ληξηα Κιηληθή Μηθξνβηνιόγνο ηζκαλόγιεην Γεληθό Ννζνθνκείν Αηηηθήο

2 Σύπνη κπθνβαθηεξηδηαθήο Φπζηθή αληνρή εηδηθή ηνπ είδνπο αληνρήο Αληνρή άγξηνπ ηύπνπ (wild type resistance) ελδνγελήο αληνρή Ρηθακπηθίλε: 1 ζηνπο 100 εθαηνκ. κηθξννξγαληζκνύο (10-8 ) Ιζνληαδίδε, ζηξεπηνκπθίλε, εζακβνπηόιε, θαλακπθίλε θαη παξαακηλνζαιηθπιηθό νμύ: 10-6 Εζεηνλακίδε, θαπξενκπθίλε, θπθινζεξίλε θαη ζεηαθεηαδόλε: 10-3 πλδπαζκόο ηζνληαδίδεο θαη ξηθακπηθίλεο:10-14 πλδπαζκόο 3 θαξκάθσλ: έσο 10-20

3 Σύπνη κπθνβαθηεξηδηαθήο αληνρήο Αληνρή άγξηνπ ηύπνπ (wild type resistance) Η πηζαλόηεηα αλάπηπμεο αληνρήο εμαξηάηαη από ηνλ ζπλνιηθό αξηζκό ησλ κπθνβαθηεξηδίσλ ζηνλ αζζελή Δίδεηαη από ηνλ ηύπν: P=1-(1-r) n Ρ: πηζαλόηεηα αλάπηπμεο αληνρήο ζηε ζπγθεθξηκέλε πεξίπησζε n: ν ζπλνιηθόο αξηζκόο ησλ κπθνβαθηεξηδίσλ πήιαην: n =10 8 έωο 10 9

4 Γελεηηθή βάζε ηεο αληνρήο αληνρή ρξωκνζωκηαθήο πξνέιεπζεο ζπγθεθξηκέλεο κεηαιιάμεηο πνπ ζπκβαίλνπλ ζε αλεμάξηεηεο γνληδηαθέο πεξηνρέο δε κεηαθέξεηαη νξηδόληηα από κηθξννξγαληζκό ζε κηθξννξγαληζκό είλαη δηαθνξεηηθή γηα θάζε θάξκαθν δηαζηαπξνύκελε αληνρή κεηαμύ θαξκάθωλ κε παξόκνηα ρεκηθή δνκή

5 Πνιπαληνρή πζζώξεπζε πνηθίιωλ κεηαιιάμεωλ ζε δηάθνξα γνλίδηα Οη κεηαιιάμεηο απηέο αθνξνύλ ηνπο δηαθνξεηηθνύο ζηόρνπο δξάζεο ηωλ αληίζηνηρωλ θαξκάθωλ

6 Πνιπαληνρή Εμέιημε ηωλ γεγνλόηωλ ε απνηπρεκέλν ζεξαπεπηηθό ζρήκα, πξνζζήθε λένπ αληη-tb θαξκάθνπ, νδεγεί ζε πνιπαληνρή

7 Τπεξαλζεθηηθά ζηειέρε XDR XDR = MDR-tb + αληνρή ζε θινπνξνθηλνιόλεο + ηνπιάρηζηνλ 1-3 iv δεπηεξεύνληα αληηθπκαηηθά θαπξενκπθίλε, θαλακπθίλε, ακηθαζίλε (λένο νξηζκόο Οθηώβξηνο 2006) XDR-TB: ΗΠΑ 4% ησλ MDR-TB Ληζνπαλία 19% ησλ MDR-TB Ν. Κνξέα 15% ησλ MDR-TB ε ζηειέρε από 49 ρώξεο ( ): MDR-TB: 20% XDR-TB: 2%

8 ΑΠΟΜΟΝΩΗ XDR ζηειερώλ (%) επί ηωλ MDR ηειέρε XDR/MDR (%) /14 (14,3) /15 (40) /11 (9,1) ύλνιν 9/40 (22,5) Πεγή:. Καλαβάθε θαη ζπλ. Εζληθό Κέληξν Αλαθνξάο Μπθνβαθηεξηδίσλ, Φεβξνπάξηνο 2007

9 Aληηθπκαηηθά Φάξκαθα 1944 Streptomycin 1946 PAS 1952 Isoniazid Pyrazinamide Cycloserine 1959 Ethionamide 1962 Ethamputol 1969 Rifampin

10 Γνθηκή Δπαηζζεζίαο ζηα αληηθπκαηηθά θάξκαθα (Drug Susceptibility testing - DST) Πόηε γίλεηαη? Πξώηε απνκόλσζε ηνπ κπθνβαθηεξηδίνπ ηεο θπκαηίσζεο ε θαιιηέξγεηα κεηά από 3 κήλεο ζεηηθή Αλ δελ ππάξρεη ηθαλνπνηεηηθή αληαπόθξηζε ζηε ζεξαπεία, επαλαιακβάλεηαη ε DST ζην λέν ζηέιερνο πνπ απνκνλώλεηαη

11 Everybody was Willing to Accept One Single Method for DST, but Ended up with Three Different Ones.. Absolute Concentration Method Resistant Ratio Method Proportion Method Meetings WHO 1963 and 1969 Georges Canetti

12 ΜΔΘΟΓΟΙ ΠΡΟΓΙΟΡΙΜΟΤ ΔΤΑΙΘΗΙΑ Mtb ΣΑ ΑΝΣΙΦΤΜΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Κιαζηθέο Μέζνδνη Μέζνδνο ηεο απνιύηνπ πεξηεθηηθόηεηαο ζε αληηθπκαηηθά θάξκαθα Absolute concentration Method Μέζνδνο ππνινγηζκνύ ηνπ ιόγνπ αλζεθηηθόηεηαο κεηαμύ ηνπ ππό εμέηαζε θαη ηνπ πξόηππνπ ζηειέρνπο Η37Rv Resistant Ratio Μέζνδνο ηεο αλαινγίαο ησλ αλζεθηηθώλ βαθηεξηδίσλ πξνο ηνλ όιν πιεζπζκό ηνπ κηθξνβίνπ Proportion method Μέζνδνο κε ρξήζε πγξώλ ζξεπηηθώλ πιηθώλ Bactec 460

13 Πόηε έλα ζηέιερνο είλαη αλζεθηηθό in vitro; Αλζεθηηθό: είλαη έλα ζηέιερνο όηαλ αλαπηύζζεηαη ζε πνζνζηό >1%, παξνπζία ηεο θξηηηθήο ζπγθέληξσζεο ηνπ αληη-tb θαξκάθνπ Κξηηηθή αλαινγία Πνζνζηό >1% ηνπ πιεζπζκνύ Κξηηηθή ζπγθέληξωζε Η ρακειόηεξε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ πνπ αλαζηέιιεη ην 95% ηωλ άγξηωλ ζηειερώλ ηνπ Μ.tb, ελώ δελ αλαζηέιιεη ζηειέρε πνπ απνκνλώζεθαλ από αζζελείο ζηνπο νπνίνπο ρνξεγήζεθε ζεξαπεία ρσξίο αληαπόθξηζε

14 M24-A NCCLS /CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institude) πγθεληξώζεηο αληη-tb θαξκάθωλ θαη θξηηηθέο αλαινγίεο (critical proportions) The Current Standard Drug Μέζνδνο Αλαινγηώλ: Canetti (1εο γξακκήο Φάξκαθα) LJ κg/ml 7H10 κg/ml 7H11 κg/ml Bactec 460 κg/ml INH RIF EMB PZA

15 ηέιερνο αλζεθηηθό ζηε INH INH αλζεθηηθό ζηε RIF, ή ζε 2 ηνπιάρηζηνλ θάξκαθα ηεο 1εο γξακκήο ειέγρνληαη όια ηα αληη- Tb 2εο γξακκήο θάξκαθα 2 εο γξακκήο Φάξκαθα Drug 7H10κg/ml 7H11κg/ml Capreomycin Ethionamide 5 10 Ethamputol Kanamycin 5 6 Ofloxacin 2 2 p-aminosalicylic acid 2 8 Rifabutin Streptomycin

16 Canetti Middlebrook 7H10 Agar M. Tuberculosis McF ml of dilutions 10-2 to C + CO 2 Controls (no drug) vs containing quadrants Read if there are>50 colonies on control Allow 3 weeks

17 Μέζνδνη αλίρλεπζεο αληνρήο ζηα αληηθπκαηηθά Μέζνδνο αλαινγηώλ ζηεξεά ζξεπηηθά πιηθά: 3-4 εβδνκάδεο ζπζηήκαηα ηαρείαο αλίρλεπζεο : 5-14 εκέξεο Μέζνδνο MIC ηαηλίεο E-test : 5, 7 ή 10 εκέξεο Μέζνδνο κπθνβαθηεξηνθάγνπ * luciferase reporter : 2 εκέξεο *Ο κπθνβαθηεξηνθάγνο κπνξεί λα πνιιαπιαζηαζηεί κόλν ζηα δωληαλά κπθνβαθηεξίδηα

18 Ηκηαπηόκαηα ζπζηήκαηα Bactec 460 (Becton Dickinson) ESP II (Trek Diagnostics System) MGΙT 960 (Becton Dickinson) MB/BacT ALERT 3D system (biomerieux) Πνιύ θαιή κέηξηα 10

19 Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 161, Number 4, April 2000, AMERICAN THORACIC SOCIETY Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children n

20 Canetti Löwenstein-Jensen Agar Proportion method MIGT CDC SM SM INH INH RIF ETH ETH 1 κg/ml 4 κg/ml 0.1 κg/ml 0.4 κg/ml 1 κg/ml 5 κg/ml 7.5 κg/ml 4 κg/ml 0,2 κg/ml 40 κg/ml 2 κg/ml ΝΝΘΑ 5 κg/ml 10 κg/ml 0,2 κg/ml 1 κg/ml 20 κg/ml 40 κg/ml 2 κg/ml 4 κg/ml

21 Ππξαδηλακίδε Δξα ζε όμηλν ph (ph 5.6) κόλν ελδνθπηηαξίσο Δελ γίλεηαη δνθηκή επαηζζεζίαο ζε ζηεξεά ζξεπηηθά πιηθά Επηηπρήο ζε εκηαπηόκαηα ζπζηήκαηα (πγξά ΜGIT) Αλίρλεπζε γνληδίσλ αληνρήο (pnca)

22 Μέζνδνη Αλίρλεπζεο Μεηαιιάμεωλ Μπθνβαθηεξηδίωλ DNA sequencing (gold standard) RFLP Single strand conformation polymorphism (SSCP) Heteroduplex analysis Line probe assay Molecular beacons Oligonucleotide ή DNA κηθξνζπζηνηρίεο Amplification refractory mutation system

23 Μνξηαθέο κέζνδνη αλίρλεπζεο αληνρήο ζηα αληηθπκαηηθά INNO-LiPA RIF. TB assay (Innogenetics) Αληνρή ζηε ξηθακπηθίλε (rpob) GenoType MTBDR (Hain) Αληνρή ζηε ξηθακπηθίλε (rpob) θαη ηζνληαδίδε (katg) Real-time PCR Αληνρή ζηε ξηθακπηθίλε (rpob), ηζνληαδίδε (katg) θαη εζακβνπηόιε (embb) Sequencing θαη PCR-SSPC* Αληνρή θαη ζε άιια αληηθπκαηηθά (rpob, katg, inha/maba, oxyr, Rrs, Rpsl, emba,b,c, pnca, gyra, gyrb) *PCR-single-strand conformation polymorphism

24 Έιεγρνο ηεο αληνρήο κε Μνξηαθέο Μεζόδνπο Πνζνζηό αληνρήο % RIF rpob / RNA polymerase EMB embb / arabinosil transferase SM rpsl / S12 ribosomal protein rrs / 16S rrna

25 Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics) Άκεζε αλίρλεπζε M. tuberculosis θαη αληνρή ζηε RIF Εηδηθόηεηα: 100% Επαηζζεζία: 80%- 100% ε R2: Asp516Val R4a: His526Tyr R4b: His526Asp R5: Ser531Leu

26 Αλίρλεπζε ησλ ζπρλόηεξσλ κεηαιιάμεσλ ηαπηόρξνλα ζηα rpob θαη katg γνλίδηα, ππεύζπλα γηα ηελ αληνρή ζε ξηθακπηθίλε θαη ηζνληαδίδε Δπαηζζεζία: 99% γηα RIF, 88.4% γηα ΙΝΗ Δηδηθόηεηα: 100%

27 Αλίρλεπζε κεηαιιάμεσλ κε real-time PCR θαη beacon probes Αιιεινπρία κεηαιιαγκέλνπ ζηειέρνπο Αιιεινπρία άγξηνπ ηύπνπ Με πβξηδηζκόο (molecular-beacon off) Επαηζζεζία: 89-98% Εηδηθόηεηα: % Proc Am Thorac Soc, 2006 Τβξηδηζκόο (molecular-beacon on)

28 DNA Mηθξνζπζηνηρίεο (ε θηβωηόο ηνπ Νώε ηεο Ν βηνρεκείαο) Οιηθό mrna ζεκαίλεηαη κε θζνξίδνπζα ρξσζηηθή θαη πβξηδίδεηαη κε ηα όκνηα ζηνηρεία πνπ βξίζθνληαη επάλσ ζηε ζπζηνηρία Κάζε θειίδα ηεο ζπζηνηρίαο ελώλεηαη κε ην αληίζηνηρν θζνξίδνλ κόξην ηνπ δηαι/ηνο πξνθαιώληαο θζνξηζκό αλάινγν κε ην επίπεδν έθθξαζεο θάζε γνληδίνπ Gryadunov D, Clin Microbiol Infect, 2005 ~95% αληνρή ζηε RIF ~80% αληνρή ζηελ ΙΝΗ Φ

29 DNA sequencing ( εύξεζε ηεο αιιεινπρίαο θαηά Sanger) Σα λνπθιενηίδηα είλαη ζπλδεδεκέλα κε ζεκαζκέλν ηρλεζέηε. Καζέλα κε δηαθνξεηηθό ρξώκα. Σν κεράλεκα κπνξεί λα δεη ην ρξώκα θαη δηαβάδεη ηελ αιιεινπρία Υξεζηκνπνηεί ην πξντόλ ηεο PCR αιιά κία αιπζίδα θάζε θνξά Είλαη ε θαιύηεξε κέζνδνο γηα ηε κειέηε κεηαιιάμεσλ, αιιά θνζηίδεη αξθεηά

30 Γηαηί θάλνπκε Μνξηαθέο Σερληθέο? Άκεζε αλίρλεπζε κπθνβαθηεξηδίσλ ηαπηνπνίεζε είδνπο έιεγρνο επαηζζεζίαο παξαθνινύζεζε αληαπόθξηζεο αζζελνύο ζηε ζεξαπεία? ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΕ ΔΟΚΙΜΑΙΕ

31 Mνξηαθέο ηερληθέο απαηηνύλ Τπνδνκή Εξγαζηεξηαθή εκπεηξία θαη ηθαλόηεηα σζηή επηινγή ησλ δεηγκάησλ Παξαθνινύζεζε ησλ εμειίμεσλ ησλ κεζόδσλ

32 Πιενλεθηήκαηα Μνξηαθώλ Σερληθώλ Μείσζε επηθίλδπλσλ απνβιήησλ ζην εξγαζηήξην Μείσζε ρξόλνπ εμέηαζεο Απνηειέζκαηα λσξίηεξα από ηελ θαιιηέξγεηα αθήο θαζνξηζκόο κεηάιιαμεο Μεηνλεθηήκαηα Μνξηαθώλ Σερληθώλ Δπζθνιίεο αμηνιόγεζεο ησλ απνηειεζκάησλ θαη εθαξκνγήο ζηελ θιηληθή πξάμε πρλά πξέπεη λα ειέγρνληαη πνιιά γνλίδηα γηα λα ππάξρεη ζαθήο εηθόλα αληνρήο Η κειέηε ησλ γνληδίσλ αληνρήο δελ έρεη νινθιεξσζεί πκπεξάζκαηα Πνιύηηκε ε ζπκβνιή ηνπο Απαξαίηεηε ε θιαζηθή κέζνδνο

33 Good and Bad News Parsons et al Front Biosci.9, Μία ζεκεηαθή κεηάιιαμε ζην Μ.tb δελ νδεγεί ζε αληνρή ζε >1 αληηβηνηηθά πξώηεο γξακκήο Μία κόλε γελεηηθή κεηάιιαμε δελ νδεγεί ζε θαηλόηππν MDR Η αληνρή ζε ζπγθεθξηκέλα αληηβηνηηθά κπνξεί λα αθνξά κεηάιιαμε ζε έλα ή πεξηζζόηεξα γνλίδηα ή νκάδεο γνληδίσλ

34 Δπίπεδα Πιεξνθνξίαο Γελεηηθή Πιεξνθνξία Έιεγρνο επαηζζεζίαο Βηνρεκηθή ηαπηνπνίεζε Καιιηέξγεηα Μηθξνζθνπηθή εμέηαζε Αμία Πιεξνθνξίαο & θόζηνο

35 Αξηζκόο θξνπζκάηωλ Γειωζέληα θξνύζκαηα θπκαηίωζεο εξγαζηήξηα 1200 θιηληθνί γηαηξνί Έηε

36 Πεγή:. Καλαβάθε θαη ζπλ. Πλεύκσλ 2005, 18:

37 ΤΥΝΟΣΗΣΑ ΑΠΟΜΟΝΩΗ ΜΤΚΟΒΑΚΣΗΡΙΔΙΟΤ ΦΤΜΑΣΙΩΗ ΚΑΙ ΑΝΣΟΥΓ ΣΑ ΑΝTΙΦΤΜΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΣΗΝ ΠΓΡΙΟΔΟ Γ.Παπαεσζηαζίοσ,Κ.Παύιοσ,Α.Υαραιαμποπούιοσ, Μ.Καμπερογηάκκε,Α.Κοζμοπούιοσ,.Μαμούτα,Γ.Φαθίρε, Γ.Παπαθράγθας. Γργαζηήρηο Κιηκηθής Μηθροβηοιογίας ηζμακόγιεηο ΓΝΑ Απεηθοκηζηηθή παράζηαζε ηες ακζεθηηθόηεηας ζηα πρωηεύοκηα ακηηθσμαηηθά θάρμαθα, ζηειετώκ M.tb, από εμεδαπούς θαη αιιοδαπούς αζζεκείς θαηά ηεκ τροκηθή περίοδο Ειιελεο Αιινδαπνί 0 SM INH RIF EMB

38 Mycobacterium growth indicator tube (MGIT) for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to 4 primary antituberculous drugs E. Fakiri, G. Drossos, Κ. Pavlou, A. Adam, E. Mylona, E. Papafrangas Clinical Microbiology Laboratory Sismanoglion General Hospital of Attica-Greece ESM, Italy 2003 Conclusions Agreement between MGIT and L.J. for the M. tuberculosis strains observed: 74,6% in low concentrations and 98,6% in high concentrations Full agreement of results was found in all reference strain

39 Sensitivity, specificity, PPV & NPV of the Drug κg/ml MGIT AST system Sensitivity % specificity % PPV NPV SM SM INH INH RIF EMB EMB total 90,1 96,8 86,5 98,1

40 Πεγή: Εζληθό Κέληξν Αλαθνξάο Μπθνβαθηεξηδίσλ ηζκαλόγιεην Γεληθό Ννζνθνκείν Αηηηθήο

41 Eur Respir J 2005; 25: Copyright Journals ERS Ltd 2005 Drug resistance in tuberculosis D. A. Mitchison Medical Microbiology, St George's Hospital Medical School, London, UK In practice, the proportion method seems to yield reasonably accurate results in experienced hands. However, there are two reasons why it should never have been adopted as a standard procedure, as follows. 1) The time spent on a proportion test is far greater than on an MIC test, since serial dilutions have to be set up and colonies counted. 2) The criteria for resistance are. The current author believes that it is time to consider whether proportion tests should continue to be considered as standard tests by the WHO and whether they might be replaced by simpler tests that are at least as accurate.

42 Πνηνηηθόο έιεγρνο (QC) Επηηήξεζε ηεο αθξίβεηαο θαη επζηνρίαο ηεο πξαγκαηνπνίεζεο ηεο δηαδηθαζίαο σζηή πξνεηνηκαζία, ζπληήξεζε θαη ρξήζε ησλ ρξεζηκνπνηνπκέλσλ πιηθώλ θαη θαξκάθσλ Καηάιιειε εθπαίδεπζε ηνπ πξνζσπηθνύ πνπ εθηειεί θαη αμηνινγεί ηηο δνθηκαζίεο Πξόηππα ηειέρε (Reference Strains)

43 Πξόηππα ηειέρε (Reference Strains) Γελεηηθή ζηαζεξόηεηα Η37Rv (ATCC 27294) επαίζζεην ζέ όια Όηαλ εμεηάδνληαη θαη νη 2 ζπγθεληξώζεηο ηεο ΙΝΗ πξνηείλεηαη λα ειέγρεηαη πξόηππν ζηέιερνο αλζεθηηθό ζηε ρακειή ζπγθέληξσζε θαη επαίζζεην ζηελ πςειή ηεο ΙΝΗ Σα δηαζέζηκα ζήκεξα κνλναλζεθηηθά ζηειέρε είλαη αλζεθηηθά ζηηο πςειέο ζπγθεληξώζεηο θαη επνκέλσο επηθίλδπλα γηα ην πξνζσπηθό

44 This report presents drug susceptibility data for TB isolates tested in 2005 and adjusted results for 2004 isolates (to reflect duplicate removal and late reporting) across Canada as of May 2006 Discussions are under- way with the provincial/territorial laboratories regarding second line drug resistance reporting to begin with the Tuberculosis Drug Resistance in Canada 2006 report

45 Γνθηκαζία επαηζζεζίαο Απάληεζε: ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζξεπηηθό πιηθό κέζνδνο πνπ εθαξκόζηεθε Αληνρή ζηηο ρακειέο ζπγθεληξώζεηο έιεγρνο θαη ζηηο πςειέο ζπγθεληξώζεηο πξνζαξκνγή ηεο δνζνινγίαο ησλ αληη-tb θαξκάθσλ Σα ζηειέρε M. tb πνπ είλαη αλζεθηηθά ζηε RIF ή ζε 2 ηνπιάρηζηνλ θάξκαθα ηεο 1εο γξακκήο ειέγρνληαη θαη ζηα αληη- Tb 2εο γξακκήο. σζηή θαηαγξαθή θαη δήισζε Επαλέιεγρνο δηπιά δεισζέλησλ Πξνζζήθε θαζπζηεξεκέλσλ απνηειεζκάησλ

46 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΚΣΙΜΗΗ ΔΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΔΚΣΙΜΗΗ

47

48 INH+RF INH+RF+SM INH+RF+EMB INH+RF+SM+EMB ΤΝΟΛΟ % Πνζνζηά αληνρήο Πίμακας ΙΙΙ Ποζοζηά θαιμοηύπωμ MDR και πολσαμθεκηικώμ ζηελετώμ M. Tuberculosis καηά ηημ περίοδο ,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

49 Πίμακας IV Επί ηοις εκαηό αμηοτή ζηα πρωηεύομηα αμηιθσμαηικά θάρμακα ηωμ απομομωθέμηωμ ζηελετώμ καηά ηημ τρομική περίοδο ,00% 10,00% 8,00% 6,00% 4,00% 2,00% 0,00% ηξεπηνκπθίλε Ιζνληαδίδε Ρηθακπηθίλε Εζακβνπηόιε ηρεπηομσθίκε Ιζοκηαδίδε Ρηθαμπηθίκε Γζαμβοσηόιε σκοιηθά 10,95% 6,67% 3,33% 1,50%