ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΟ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΣΤΡΩΜΑ ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ

Transcript

1 ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΟ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΣΤΡΩΜΑ ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΦΗ Κ. ΤΣΙΛΙΜΠΑΡΗ, MD, PhD ιευθύντρια Ινστ. Βιολογίας ΕΚΕΦΕ ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ EΡΓΑΣΤΗΡΙΟ BΙΟΧΗΜΕΙΑΣ / ΠΑΘΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ ΤΟΥ Θερινό Σχολείο 2005 Πέµπτη,, 14 Ιουλίου 2005

2 TO ΚΥΤΤΑΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΤΟΥ: Ο ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ ΚΑΙ ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΤΗΝ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΑΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

3 ΚΥΡΙΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ: ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΕΣ/ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΑ ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ( ΕΛΑΣΤΙΝΗ, ΙΝΟΝΕΚΤΙΝΗ, ΛΑΜΙΝΙΝΗ )

4 ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ: ΙΑΣΥΝ ΕΜΕΝΑ ΜΑΚΡΟΜΟΑΡΙΑΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΠΟΥ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΟΥΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΑ

5 ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΕΣ (GAGs) / ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ: ΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ GAGs: Πολυσακχαριδικές άλυσσοι από επαναλαµβανόµενους δισακχαρίτες Θειϊκή ερµατάνη Υαλουρονικό Οξύ

6 GAGs: ηµιουργούν πορώδη, ενυδατωµένα πηκτώµατα που στηρίζουν τα κύτταρα και επιτρέπουν την ταχεία διάχυση υδατοδιαλυτών ουσιών, καθώς και την κυτταρική µετανάστευση

7 ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ: ΣΥΜΠΛΕΓΜΑΤΑ GAGs ΜΕ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟ ΚΟΡΜΟ ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ ΑΓΓΡΕΓΚΑΝΗ ΡΙΒΟΝΟΥΚΕΛΑΣΗ Ειδη Πρωτεογλυκανών Αγγρεγκάνη Βεταγλυκάνη Ντεκορίνη Περλεκάνη Σεργλυκίνη Συνδεκάνη

8 ΕΙ Η ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥΣ

9 ΚΟΛΛΑΓΟΝΑ: ΤΡΕΙΣ α- ΑΛΥΣΣΟΙ, ΚΑΘΕ ΜΙΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ Gly-X-Y (X: προλίνη, Υ: υδροξυπρολίνη). >13 είδη κολλαγόνου

10 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΩΝ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ

11 ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΣΗ ΜΟΡΙΩΝ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΟΛΥΜΕΡΙΣΜΟ ΤΟΥ: Η ΟΜΗΤΟΥ ΠΟΛΥΜΕΡΟΥΣ ΠΡΟΣ Ι ΕΙ ΣΤΗΡΙΞΗ ΣΤΟ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟ ΙΣΤΟ

12 ΜΕΡΙΚΑ ΚΟΛΛΑΓΟΝΑ, ΟΠΩΣ ΤΟ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ IV ΤΗΣ ΒΑΣΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΕΝ ΠΟΛΥΜΕΡΙΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΙΝΕΣ ΑΛΛΑ ΣΕ ΠΛΕΓΜΑΤΑ

13 ΕΙ Η ΚΟΛΛΑΓΟΝΩΝ

14 ΟΜΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ/ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ

15 ΤΟ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ IV ΤΗΣ ΒΑΣΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΕΝ ΠΟΛΥΜΕΡΙΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΙΝΕΣ ΑΛΛΑ ΣΕ ΠΛΕΓΜΑΤΑ

16 ΙΝΟΝΕΚΤΙΝΗ: ΜΗ ΚΟΛΛΑΓΕΝΙΚΗ ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΪΝΗ, ΜΕ ΠΟΛΛΑΠΛΕΣ ΥΠΟΠΕΡΙΟΧΕΣ ΜΕ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ. ΕΙΝΑΙ ΙΜΕΡΕΣ ΥΟ ΠΟΛΥΠΕΠΤΙ ΙΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝ ΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΙΣΟΥΛΦΙ ΙΚΟΥΣ ΕΣΜΟΥΣ ΣΤΗΝ ΚΑΡΒΟΞΥΤΕΛΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ Υποπεριοχή (domain) διασύνδεσης µε κολλαγόνα Υποπεριοχή διασύνδεσης µε ηπαρίνη(gag) Υποπεριοχή διασύνδεσης µε κύτταρα(rgd)-υπάρχουν και άλλες αλληλουχίες που εξυπηρετούν αυτή την λειτουργία

17 ΕΛΑΣΤΙΝΗ-ΕΛΑΣΤΙΚΕΣ ΙΝΕΣ ΕΛΑΣΤΙΝΗ: Υ ΡΟΦΟΒΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΜΕ ΜΕΓΑΛΗ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΙΤΗΤΑ ΣΕ ΓΛΥΚΙΝΗ ΚΑΙ ΠΡΟΛΙΝΗ, ΠΟΥ ΙΝΕΙ ΙΑΤΑΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟΝ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟ ΙΣΤΟ-ΠΟΛΥΜΕΡΙΖΕΤΑΙΣΕΙΝΙ ΙΑΚΑΙΙΝΕΣΠΟΥ ΙΑΣΥΝ ΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΣΤΑΥΡΟ ΕΣΜΟΥΣ (Crosslinks)

18 Η ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑ ΙΝΟΝΕΚΤΙΝΗ ΜΕ ΤΗΝ ΙΑΣΥΝ ΕΣΗ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΑ, ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΟΝ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟ Ινονεκτίνη Ακτίνη Αποτέλεσµα τηςευθυγράµµισης στους ιστούς: σωστή διευθέτηση ινών και κυττάρων

19 ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΡΑΝΗ: ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΣΤΗ ΒΑΣΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Συστατικά Βασικών Μεµβρανών: Λαµινίνη, Περλεκάνη, Κολλαγόνο IV Λαµινίνη

20 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΜΕΓΕΘΗ ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΣΥΝ ΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ / ΒΑΣΙΚΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ

21 BAΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Εξειδικευµένος τύπος εξωκυττάριας ουσίας Σηµασία βασικής µεµβράνης: Μηχανική υποστήριξη κυττάρων Φιλτράρισµα ουσιών Καθορισµός πολικότητας κυττάρων Κυτταρική διαφοροποίηση Κυτταρική µετανάστευση Μορφολογία κυττάρου Ρύθµιση γονιδιακής έκφρασης panos 2000

22 Βασική µεµβράνη και προσφυτικά (προσκολλητικά) µόρια

23 οµή Βασικής Μεµβράνης (ΒΜ) Σύσταση: Πολύπλοκο δίκτυο µακροµορίων το οποίο περιλαµβάνει: Κολλαγόνο τύπου IV, λαµινίνη, εντακτίνη, πρωτεογλυκάνες (θειική ηπαράνη: περλεκάνη) β 1 α 1 γ 1 7S Μονοµερές NC1 α1 α2 α1 γ α β Τετραµερές ιµερές 7S NC1 ΒΜ Εµφάνιση ΒΜ: σε σαρωτικό ΗΜ σε ΗΜ διέλευσης

24 ιασύνδεση µακροµορίων ΒΜ µε υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας: ιµερείς ιντεγκρινικοί υποδοχείς Σχηµατική αναπαράσταση ιντεγκρινών ιασύνδεση ιντεγκρινικών υποδοχέων: Ηδιασύνδεση ιντεγκρινών µε ΒΜ προκαλεί αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού

25 Κυτταρική πρόσφυση στη ΒΜ διά µέσου ιντεγκρινών Ετεροδιµερή µε α και β υποµονάδες Τουλάχιστον 24 ετεροδιµερή Κάθε ιντεγκρίνη διαµεσολαβεί πολλαπλές αλληλεπιδράσεις κυττάρων µε το εξωκυττάριο στρώµα Υπάρχουν διαφορετικά ιντεγκρινικά διµερή

26 ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΕΣ ( INTEΓΚΡΙΝΙΚΟΙ ΥΠΟ ΟΧΕΙΣ ) Ετεροδιµερείς υποδοχείς για αλληλεπιδράσεις: Kυττάρου-εξωκυττάριας ουσίας Κυττάρου-κυττάρου Αποτελούνται από δύο υποµονάδες, την α και την β που συνδέονται µη οµοιοπολικά Είναι γνωστές 17 α και8 β υποµονάδες Στοεξωκυτταρικότµήµα τηςαυποµονάδας εντοπίζονται περιοχές δέσµευσης δισθενών κατιόντων Τα κυτταροπλασµατικά τµήµατα αλληλεπιδρούν µε τον κυτταροσκελετό

27 Ένα διµερές µπορεί να αναγνωρίζει διαφορετικά µόρια της εξωκυττάριας ουσίας Ένα µόριο της εξωκυττάριας ουσίας µπορεί να αναγνωρίζεται από διαφορετικό διµερές Πρόσδεση ιντεγκρινών στην εξωκυττάρια ουσία Ενεργοποίηση Συνάθροιση Σχηµατισµός εστιακών επαφών (focal adhesions or focal contacts)

28 ΣΥΝ ΕΣΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ- ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ-ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ

29 Αµφίδροµη ιντεγκρινο-εξαρτώµενη εξαρτώµενη σηµατοδότηση (εξω-µέσα και µέσα-έξω έξω)

30 Συνδέτες Ιντεγκρινών

31 Η ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑ ΙΝΟΝΕΚΤΙΝΗ ΜΕ ΤΗΝ ΙΑΣΥΝ ΕΣΗ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΑ, ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΟΝ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΟ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟ Ινονεκτίνη Ακτίνη Αποτέλεσµα της ευθυγράµµισης στους ιστούς: σωστή διευθέτηση ινών και κυττάρων

32 Απεικόνιση εστιακών επαφών µε ανοσοφθορισµό σε κύτταρα καλλιεργηµένα πάνω σε εξωκυττάριο υπόστρωµα

33 Συν-εντοπισµός ιντεγκρινών µε ινίδια κυτταροσκελετού στις εστιακές επαφές α1 ιντεγκρίνη βινκουλίνη

34 ΜΕΤΑ ΟΣΗ ΜΗΝΥΜΑΤΟΣ ΜΕΣΩ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ α) FAK µονοπάτι β) Fyn/Shc µονοπάτι

35 ΜΕΤΑ ΟΣΗ ΜΗΝΥΜΑΤΟΣ ΜΕΣΩ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ α β ΕCΜ p Src p FAK MAPK DNA p jun fos AP-1 κολλαγoνάσες

36 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΙΚΟ ΟΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ Μεταλλοπρωτεάσες (ΜΜΡs)-Ματριξίνες-Κολλαγονάσες ΜΜΡ-2 (Ζελατινάση Α): Ζελατίνη, κολλαγόνο IV, ινονεκτίνη, λαµινίνη, πρωτεογλυκάνες ΜΜΡ-9 (Ζελατινάση Β): Ζελατίνη, κολλαγόνο IV, πρωτεογλυκάνες Αναστολείς µεταλλοπρωτεασών (TIMPs) TIMP-1: Αναστολέας της MMP-9 TIMP-2: Αναστολέας της MMP-2

37 ΣΥΝ ΕΣΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ- ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ-ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ

38 Ιντεγκρινο-εξαρτώµενη εξαρτώµενη πλάτυνση κυττάρων σε υπόστρωµα κολλαγόνου IV

39 Συνεργασία / επικοινωνία οδών σηµατοδότησης που εκκινούν από τους ιντεγκρινικούς υποδοχείς και τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων

40 Η κινάση των εστιακών επαφών FAK, φωσφορυλιώνεται όχι µόνον διά µέσου της πρόσδεσης ιντεγκρινών, αλλά και διά µέσου αυξητικών παραγόντων, π.χ. Ινσουλίνης, µετά από πρόσδεση στον υποδεοχέα ινσουλίνης Πρόσδεση υποδοχέα ινσουλίνης

41 Αύξηση της έκφρασης IRS-1 σε ινοβλάστες σε εναιώρηµα και υπόστρωµα ινονεκτίνης

42 Εκφραση IRS-1 σε υπόστρωµα ινονεκτίνης και βιτρονεκτίνης

43 H έκφραση ΙRS-1 συνοδεύεται από την έκφραση της κινάσης των εστιακών επαφών (FAK). Κύτταρα που δεν εκφράζουν FAK, δεν µπορούν να εκφράσουν ΙRS-1

44 Συνεργασία / επικοινωνία οδών σηµατοδότησης που εκκινούν από τους ιντεγκρινικούς υποδοχείς και τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων Yποδοχέας Ινσουλίνης IRS-1

45 Φυσιολογικές αλληλεπιδράσεις κυττάρων µε υποστρώµατα συνδετικού ιστού απαιτούν φυσιολογικά υποστρώµατα και φυσιολογική έκφραση / λειτουργία ιντεγκρινών. Σε περίπτωση που το υπόστρωµα δεν είναι φυσιολογικό, οι αλληλεπιδράσεις µε κύτταρα τροποποιούνται. Μιά τέτοια περίπτωση αποτελεί η νόσος του Σακχαρώδη διαβήτη

46 ΣΑΚΧΑΡΩ ΗΣ ΙΑΒΗΤΗΣ Κύριο χαρακτηριστικό: Υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης Σηµαντική επίδραση στη φυσιολογική λειτουργία του νεφρού: ιαβητική νεφροπάθεια Επιπτώσεις της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στη λειτουργία των κυττάρων: Τροποποίηση της µετάδοσης µηνύµατος στο εσωτερικό των κυττάρων Ενεργοποίηση µεταγραφικών παραγόντων Τροποποίηση της µεταγραφής Μη ενζυµατική γλυκοσυλίωση των µακροµορίων την βασικής µεµβράνης Χαρακτηριστικές αλλαγές κατά τη διαβητική νεφροπάθεια: Πάχυνση βασικών µεµβρανών (GBM, TBM) ιόγκωση εξωκυττάριας ουσίας µεσαγγειακών κυττάρων (MM) Απώλεια του φράγµατος εκλεκτικής διαπερατότητας

47 ΝΕΦΡΟΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΤΟΥ ΟΜΕΣ

48 Κάψα Bowman/Σπείραµα Σχηµατική αναπαράσταση νεφρώνα

49 Glomerular Cell types

50 ιαβητικές αλλοιώσεις νεφρικού σπειράµατος στο Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο ιέλευσης Φυσιολογικό σπείραµα ιαβητική Νεφροπάθεια

51 Ιn n vitro µελέτη διαβητικών συνθηκών (κυτταροκαλλιέργεια): Αύξηση της συγκέντρωσης γλυκόζης στο θρεπτικό υλικό (25-vs. 5- mm) Τροποποίηση του υποστρώµατος (κολλαγόνου IV) µε επώαση παρουσία γλυκόζης (µη ενζυµατική γλυκοζυλίωση)

52 ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗΣ Σπειραµατικά Επιθηλιακά Νεφρικά Κύτταρα (GEC) Επιθηλιακά Κύτταρα Εγγύς Εσπειραµένου Σωληναρίου(PTEC) In vitro σύστηµα µελέτης διαβήτη: κύτταρα καλλιεργηµένα σε αυξηµένες συγκεντρώσεις γλυκόζης (25 mm)

53 Σε διαβητικές συνθήκες επάγεται η έκφραση κολλαγόνου IV από νεφρικά κύτταρα

54 ΙΑΒΗΤΙΚΗ ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ Χαρακτηριστικές αλλαγές κατά τη διαβητική νεφροπάθεια: Πάχυνση βασικών µεµβρανών του αγγειώδους σπειράµατος και του εγγύς εσπειραµένου σωληναρίου (GBM, TBM) ιόγκωση εξωκυττάριας ουσίας µεσαγγειακών κυττάρων (MM) Αυξηµένη εναπόθεση συστατικών εξωκυττάριας ουσίας Αυξηµένη σύνθεση και παραγωγή Μειωµένη αποικοδόµηση

55 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΙΚΟ ΟΜΗΣΗΣ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ Μεταλλοπρωτεάσες (ΜΜΡs)-Ματριξίνες ΜΜΡ-2 (Ζελατινάση Α): Ζελατίνη, κολλαγόνο IV, ινονεκτίνη, λαµινίνη, πρωτεογλυκάνες ΜΜΡ-9 (Ζελατινάση Β): Ζελατίνη, κολλαγόνο IV, πρωτεογλυκάνες Αναστολείς µεταλλοπρωτεασών (TIMPs) TIMP-1: Αναστολέας της MMP-9 TIMP-2: Αναστολέας της MMP-2

56 ΜΕΤΑ ΟΣΗ ΜΗΝΥΜΑΤΟΣ ΜΕΣΩ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ α β ΕCΜ p Src pfak MAPK DNA p jun fos AP-1 κολλαγονάσες

57 Μειωµένη Φωσφορυλίωση FAK Νεφρικών Σπειραµατικών Επιθηλιακών (GEC) Κυττάρων σε διαβητικές συνθήκες

58 Μειωµένη ενεργοποίηση ΜΑΡΚ GEC κυττάρων σε διαβητικές συνθήκες

59 Μείωση της έκφρασης κολλαγονάσης (MMP-2) σε νεφρικά κύτταρα παρουσία 25 mm γλυκόζης (northern and western analysis) L H MMP-2 L H L H GAPDH 72 kda MMP-2 92 kda 88 kda % Relative mrna level MMP-2 5mM 25mM % Relative protein level mm 25mM 72 kda 68 kda 92 kda 88 kda

60 Αύξηση της έκφρασης αναστολέων κολλαγονασών (ΤΙΜΡ) σε νεφρικά κύτταρα παρουσία 25 mm γλυκόζης L H L H L H TIMP-1 TIMP-2 TIMP-1 GAPDH GAPDH TIMP-2 % Relative mrna level mm 25 mm % Relative protein level D mm 25 mm TIMP-1 TIMP-2 TIMP-1 TIMP-2

61 Τροποποίηση της έκφρασης των κύριων ιντεγκρινικών µονάδων νεφρικών κυττάρων παρουσία 25 mm γλυκόζης Α α3 L H α5 L H α2 αν β1 β3 Β 200 Relative protein level mM 25mM 0 α3 α2 β1 α5 αν β3

62 Kυτταρική προσκόλληση νεφρικών κυττάρων σε φυσιολογικές και διαβητικές συνθήκες: Σε διαβητικές συνθήκες η πρόσδεση των GEC σε κολλαγόνο ΙV είναι µειωµένη 40 % Cell adhesion low high Collagen IV concentration (µg/ml)

63 Κυτταρική πλάτυνση νεφρικών κυττάρων σε διαβητικές συνθήκες Σπειραµατικά Επιθηλιακά Νεφρικά Κύτταρα Νεφρικά Μεσαγγειακά κύτταρα

64 ΜΕΤΑ ΟΣΗ ΜΗΝΥΜΑΤΟΣ ΜΕΣΩ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ α β ΕCΜ p Src pfak MAPK DNA p jun fos AP-1 κολλαγενάσες

65 ΙΑΒΗΤΙΚΗ ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ Χαρακτηριστικές αλλαγές κατά τη διαβητική νεφροπάθεια: Πάχυνση βασικών µεµβρανών του αγγειώδους σπειράµατος και του εγγύς εσπειραµένου σωληναρίου (GBM, TBM) ιόγκωση εξωκυττάριας ουσίας µεσαγγειακών κυττάρων (MM) Αυξηµένη εναπόθεση συστατικών εξωκυττάριας ουσίας Αυξηµένη σύνθεση και παραγωγή Μειωµένη αποικοδόµηση

66 Σε νεφρικό ιστό διαβητικών πειραµατόζωων επιβεβαιώθηκαν τα ευρήµατα που παρατηρήθηκαν σε κυτταροκαλλιέγειες νεφρικών κυττάρων

67 Σε νεφρικό ιστό διαβητικών ασθενών µε νεφροπάθεια επιβεβαιώθηκε τροποποίηση της έκφρασης ιντεγκρινών, όπως παρατηρήθηκε σε κυτταροκαλλιέγειες νεφρικών κυττάρων

68 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Οι αυξηµένες συγκεντρώσεις γλυκόζης/ διαβητικές συνθήκες προκαλούν in vitro και in vivo Aύξηση της έκφρασης κολλαγόνου IV Αλλαγές στην έκφραση και λειτουργία των ιντεγκρινών Μείωση στην έκφραση των µεταλλοπρωτεασών /κολλαγονασών / µατριξινών Αύξηση στην έκφραση των αναστολέων των µεταλλοπρωτεασών Αλλαγές στην αλληλεπίδραση των κυττάρων µε κολλαγόνο IV

69 Κάψα Bowman/Σπείραµα Σχηµατική αναπαράσταση νεφρώνα

70 Ποδοκαλυκίνη Ενδείξεις που επιβεβαιώνουν το µορφογενετικό ρόλο του γλυκοκάλυκα- ποδοκαλυκίνης: Εξουδετέρωση φορτίου υποστροφή ποδίσκων Aποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης σε ποντικούς αδυναµία σχηµατισµού ποδίσκων Doyonnas et. al. 2001

71 Ποδοκαλυκίνη νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων Χαρακτηριστικά πρωτεΐνης Πρωτεΐνικός πυρήνας ~50 kda (Συνολικό ΜΒ: ~ 140 kda) Fawcett et. al., Εξωκυτταρική περιοχή µε(1986) πολλαπλές επαναλήψεις προλίνης, σερίνης, θρεονίνης, ασπαραγίνης = θέσεις γλυκοζυλίωσης Κατάλοιπα σιαλικού οξέος έντονα αρνητικό φορτίο ΒΛΕΝΝΙΝΗ (ΣΙΑΛΟΠΡΩΤΕΪΝΗ) µόριο που συµµετέχει στην κυτταρική πρόσφυση

72 Αθανατοποιηµένα Σπειραµατικά Νεφρικά Επιθηλιακά Κύτταρα + αντί-pclp - αντί-pclp + αντί-pclp - πρώτο αντίσωµα Κλίµακα: 20 µm β-μερκαπταιθανόλη + - Τα κύτταρα εκφράζουν ποδοκαλυκίνη PCLP

73 Επίδραση της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στην έκφραση ποδοκαλυκίνης 5 mm 25 mm 5 mm 25 mm PCLP PCLP Τουµπουλίνη GAPDH Αυθαίρετες Μονάδες Πυκνοµέτρησης * 5 mm γλυκόζη 25 mm γλυκόζη (*) : p< 0,05 Κύτταρα καλλιεργηµένα: σε 5 mm ή σε 25 mm γλυκόζης - αντί-pclp + αντί-pclp + αντί-pclp Η υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης, µειώνει τη γονιδιακή Eκφραση PCLP σε νεφρούς ποντικών έκφραση της PCLP in vitro και in vivo

74 Κυτταρική πρόσφυση σε υπόστρωµα κολλαγόνου IV ή λαµινίνης 5 mm 25 mm Συγκ. Γλυκόζης PCLP Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης mm γλυκόζη 25 mm γλυκόζη Συγκέντρωση κολλαγόνου IV (µg/ml) Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης mm γλυκόζη 25 mm γλυκόζη Συγκέντρωση λαµινίνης (µg/ml)

75 Επίδραση του αντισώµατος αντί-pclp στην κυτταρική πρόσφυση σε υπόστρωµα κολλαγόνου IV ήλαµινίνης: HGEC καλλιεργηµένα σε 5 mm γλυκόζη Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης (*) : p< 0,05 Υπόστρωµα πρόσφυσης: Κολλαγόνο IV 0 1:2500 1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 Αραίωση αντισώµατος αντί-pclp * * * Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης Υπόστρωµα πρόσφυσης: Λαµινίνη Η ποδοκαλυκίνη έχει αντι-προσκολλητική δράση στην αλληλεπίδραση κυττάρων-υποστρώµατος ΒΜ 0 1:2500 1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 Αραίωση αντισώµατος αντί-pclp * * *

76 Επίδραση του αντισώµατος αντί-pclp στην κυτταρική πρόσφυση σε υπόστρωµα κολλαγόνου IV ή λαµινίνης: HGEC καλλιεργηµένα σε 25 mm γλυκόζη (δεν εκφράζουν ποδοκαλυκίνη) 5 mm 25 mm Συγκ. Γλυκόζης 150 Υπόστρωµα πρόσφυσης: Κολλαγόνο IV PCLP Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης Col IV LM 0 1:2500 1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 Αραίωση αντισώµατος αντί-pclp Η έλλειψη ποδοκαλυκίνης αναιρεί την αντιπροσκολλητική δράση

77 Επίδραση του αντισώµατος αντί-pclp στην κυτταρική πρόσφυση σε υπόστρωµα κολλαγόνου IV ή λαµινίνης: HGEC καλλιεργηµένα σε 25 mm γλυκόζη 5 mm 25 mm Συγκ. Γλυκόζης 150 Υπόστρωµα πρόσφυσης: Κολλαγόνο IV PCLP Ποσοστό κυτταρικής πρόσφυσης Col IV LM 0 1:2500 1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 Αραίωση αντισώµατος αντί-pclp Η έλλειψη ποδοκαλυκίνης αναιρεί την αντιπροσκολλητική δράση

78 Συµπερασµατικά: Η ποδοκαλυκίνη αναστέλλει την διασύνδεση (προσκόλληση) των HGEC σε συστατικά της ΒΜ (κολλαγόνο IV, λαµινίνη). Η ποδοκαλυκίνη ανταγωνίζεται τις ιντεγκρίνες που περιέχουν τη β1 υποµονάδα στη διαδικασία της πρόσφυσης σε συστατικά ΒΜ. Συνεπώς: Στην διαφοροποίηση της βασικής / βασεοπλευρικής µορφολογίας των HGEC που προκαλείται από υποστρώµατα ΒΜ, σηµαντικό ρόλο διαδραµατίζει η αυξηµένη έκφραση της αντιπροσφυτικής ποδοκαλυκίνης.

79 Σχηµατική αναπαράσταση του ρόλου της αντιπροσφυτικής σιαλοπρωτεϊνης ποδοκαλυκίνης στη διαµόρφωση υπεγέρσεων της βασικής επιφάνειας των ποδοκυττάρων

80 Συµπεράσµατα για τις αλληλεπιδράσεις σπειραµατικών επιθηλιακών κυττάρων µε το υπόστρωµα τους(gbm) 1. Τα κύτταρα προσκολλώνται στη βασική µεµβράνη κυρίως µε ιντεγκρινικούς υποδοχείς. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι υποδοχείς αυτοί είναι κατά σειρά σηµαντικότητας: α3β1, α2β1, α5β1 2. Παρουσία αυξηµένων συγκεντρώσεων γλυκόζης (συνθήκες διαβήτη) ελαττώνεται το ποσοστό προσκόλλησης σε υποστρώµατα ΒΜ, ενώ οι ιντεγκρινικοί υποδοχείς προσκόλλησης είναι: αvβ3, α5β1 3. Οι ιντεγκρινικοί υποδοχείς ευθύνονται για την «αγκυροβόληση» της βασικής επιφάνειας των κυττάρων στη ΒΜ 4. Την προσκολλητική δράση των ιντεγκρινών ανταγωνίζεται η διαµεµβρανική σιαλοπρωτεϊνη ποδοκαλυκίνη, η οποία λόγω της αντιπροσκολλητικής της δράσης προκαλεί «άπωση» από το υπόστρωµα, σε θέσεις όπου εκφράζεται, σχηµατίζοντας έτσι κατά τόπους υπεγέρσεις και ποδίσκους 5. Η έκφραση της ποδοκαλυκίνης µειώνεται δραµατικά παρουσία αυξηµένης συγκέντρωσης γλυκόζης, γεγονός που συνοδεύεται από αύξηµένηπλάτυνσητωνκυττάρων 6. Η έλλειψη ποδοκαλυκίνης συνοδεύεται από απαλειφή υπεγέρσεων in vitro και ποδίσκων in vivo

81 Νευρο-εκφυλιστική εκφυλιστική Νόσος Alzheimer

82 Τα κύρια µορφολoγικά χαρακτηριστικά της νόσου Α) Λέπτυνση του φλοιού Β) Μεγένθυση της παράπλευρης εγκεφαλικής κοιλίας Γ) Συρρίκνωση του ιππόκαµπου Οι αλλαγές αυτές οφείλονται στην µαζική απώλεια νευρώνων στον κροταφιαίο, βρεγµατικό και ενδοκοιλιακό φλοιό του εγκεφάλου

83 Ιστολογικώς διακρίνουµε ορισµένες κύριες ανωµαλίες που απαντούν στη νόσο Alzheimer Ύπαρξη αδιάλυτων σφαιροειδών σχηµατισµών στον εξωκυττάριο χώρο του εγκεφαλικού φλοιού. (Αµυλοϊδικές ή γερασµένες πλάκες). Υπαρξη αδιαλυτων σχηµατισµών που εκτείνονται στο εσωτερικό των νευρικών κυττάρων (neurofibril tangles) Αµυλοϊδική πλάκα Νευροινιδιακοί κόµποι

84 Αµυλοϊδογενής /Μη Αµυλοϊδογενής Μεταβολισµός της ΑΡΡ Αβ πεπτίδιο: αµινοξέα. Υψηλή συγκέντρωση Αβ Πολυµερισµό α secretase β secretase γ secretase Αµυλοϊδική πλάκα

85 Πρόδροµη Αµυλοϊδική Πρωτεϊνη (ΑPP) ΑPP: ιαµεµβρανική γλυκοπρωτεϊνη. Το γονίδιο του APP εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 21. Εκφράζεται στον εγκέφαλο κυρίως σε 3 ισοµορφές: ΑPP695, APP751, APP770. ΑPPs Μεµβράνη H 2 N A β COOH Signal peptide Zing binding Collagen binding Aβ πεπτίδιο Αβ

86 Aβ πεπτίδιο Ηαµυλοϊδική πρόδροµη πρωτεϊνη(αρρ) αποικοδοµείται από οµάδες ενζύµων που καλούνται σεκρετάσες.(α,β,γ) Αβ πεπτίδιο: Προϊόν αποικοδόµησης του APP από σεκρετάσες β,γ. ΑPPs α-secretase Μεµβράνη H 2 N COOH β secretase γ secretase

87 Αµυλοϊδογενής /Μη Αµυλοϊδογενής Μεταβολισµός της ΑΡΡ Αβ πεπτίδιο: αµινοξέα. Υψηλή συγκέντρωση Αβ Πολυµερισµό α secretase β secretase γ secretase Αµυλοϊδική πλάκα

88 β-secretase BACE: ιαµεµβρανική πρωτεΐνη 70 kda. Yδρολύει τον πεπτιδικό δεσµό Met 595 -Asp 596 της ΑPP. Λειτουργεί ανταγωνιστικά µε τιςαsecretases για το υπόστρωµα ΑΡΡ γ-secretase. Ps1- Ps2 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες Val40-Ile4 Αβ 1-40 Ala42 -Thr43 Αβ 1-42 Μεταλλάξεις των Ps1 και Ps2 οδηγούν σε αυξηµένη παραγωγή του Αβ 1-42 α-secretase Η επίδρασή τους στην ΑΡΡ αυξάνει την έκκριση του sappa, µειώνοντας παραγωγή Αβ πεπτιδίου. την

89 Κολλαγονάσες και Αlzheimer Σε καταστάσεις Alzheimer αυξάνεται η έκφραση των κολλαγονασών (MMP-2, MMP-9) σε νευρογλοιακά κύτταρα (µακροφάγα του ΚΝΣ) ράση κολλαγονάσης (ΜΜΡ-2) Νευροπροστατευτική. Αποικοδόµηση Αβ πεπτιδίου, ράση α σεκρετάσης Νευροτοξική. ράση β σεκρετάσης

90 Νόσος Alzheimer In vitro σύστηµα µελέτης: Καλλιέργεια νευροβλαστικών κυττάρων παρουσία του αµυλοειδούς πεπτιδίου αβ

91 Επίδραση του πεπτιδίου Αβ(1-40) στην έκκριση τηςκολλαγονάσηςβ(μμp-9) Ε n z y m a t ic a c t iv it y o f M M P - 9 in a r b it r a r y d e n s t io m e t r ic u n it s Αβ 48 hrs control Αβ (1-40) 92 kda 82 kda MMP-9 92 kda 82 kda E xpression of MMP -9 in arbitrary denstiom etric units Αβ control Αβ (1-40) 48 hrs TIMP E x p r e s s i o n o f T I M P - 2 i n a r b i t r a r y d e n s t i o m e t r i c u n i t s 50 0 control control Aβ Αβ Aύξηση της έκφρασης της ΜΜΡ-9 σε νευροβλαστικά κύτταρα (SK-N-SH) SH) παρουσία του Aβ πεπτιδιου.

92 Στόχος εργασίας: Μελέτη πιθανής εµπλοκής της ΜΜP-9 στον µεταβολισµό της ΑΡΡ ως σεκρετάση

93 ιαµόλυνση ΗΕΚ/APP APP-695/751 κυττάρων µε pro MMP-9 92 kda MMP-9 Ανοσοαποτύπωση H 2 N sappa ~110kDa a secretase ΑPPs Αβ AB COOH transf. vector Control β secretase 6 Ε 10 Ζυµογραφία Ζελατίνης APP-751 APP-695 MMP-9 MMP-2 sappa MMP-9 92 kda 6E10 Pro MMP-9 vector Pro MMP-9 vector

94 1 2 sapp.a (6E10) ~110kDa Pro-MMP-9 (~92 kda) sapp.a (6E10) ~110kDa Active MMP-9 (83 kda) ctr µg/ml µg/ml µg/ml mg/ml ctr µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml mg/ml Arbitrary Densitometric units Arbitrary Densitometric units Pro-MMP-9 (~92 kda) Active MMP-9 ctrl 50 ng/ml 100 ng/ml 500 ng/ml 1µg/ml ctrl 50 ng/ml 100 ng/ml 250 ng/ml 500 ng/ml 1µg/ml -

95 A Μελέτη της κατανοµής της ΑΡΡ και της ΜΜΡ-9 στην κυτταρική επιφάνεια B Merge Κορυφαία επιφάνεια APP MMP-9 Πλευρική επιφάνεια Γ Βασικη επιφάνεια

96 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Παρουσία ΜΜΡ-9 (κύτταρα συνεπιµολυσµένα µε ΑΡΡ-695/ΜΜΡ-9) και εξωγενούς ΜΜΡ-9 (αποµονωµένη / ενεργοποιηµένη ΜΜΡ-9), παρατηρείται στατιστικώς σηµαντική αύξηση του διαλυτού θραύσµατος sappa της πρόδροµης αµυλοϊδικής πρωτεϊνης. Η δράση της ΜΜΡ-9 ενισχύεται παρουσία PMA (ενεργοποιητής α σεκρετασών), ενώ αναστέλεται παρουσία ειδικών αναστολέων της (SB-3-CT, EDTA). Με χρήση αντι-μμρ-9 και αντι-αρρ αντισωµάτων οι δυο πρωτεϊνες (ΜΜΡ-9, ΑΡΡ) συν κατακρηµνίζονται και συνεντοπίζονται στην κυτταρική επιφάνεια. Συνεπώς: Η ΜΜΡ-9 εµπλέκεται στον µεταβολισµό της ΑΡΡ µε δράση α- σεκρετάσης (νευροπροστατευτική) πιθανόν εµποδίζοντας την εξωκυττάρια συνάθροιση αµυλοειδούς. Η ΜΜΡ-9 συνεντοπίζεται µε την ΑΡΡ στην κυτταρική επιφάνεια Η δράση της ΜΜΡ-9 ως α-σεκρετάση µπορεί να αποδειχθεί χρήσιµη για την παρεµπόδιση της συνάθροισης του αµυλοειδούς εξωκυττάρια, σε νευροεκφυλιστικές καταστάσεις τύπου Alzheimer.

97