ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΥΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΟΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΓΡΟΤΙΚΟΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕ ΘΕΜΑ:

Transcript

1 [1] ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΥΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΟΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΓΡΟΤΙΚΟΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΥΝΕΡΓΑΖΟΜΕΝΑ ΤΜΗΜΑΤΑ: ΔΙΟΙΚΗΣΗΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΩΝ ΑΓΡΟΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕ ΘΕΜΑ: ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΖΩΟΤΡΟΦΗΣ ΓΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΣΤΙΣ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΕΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΛΕΚΚΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ-ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΓΡΙΝΙΟ 2014

2 [2] ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΛΕΚΚΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ-ΓΕΩΠΟΝΟΣ-ΖΩΟΤΕΧΝΗΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΖΩΟΤΡΟΦΗΣ ΓΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΣΤΙΣ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΕΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Τριμελής Συμβουλευτική επιτροπή Καλφακάκου Βασιλική, Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων (Επιβλέπουσα). Ευαγγέλου Άγγελος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Κιόρτσης Δημήτριος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων.

3 [3] ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΛΕΚΚΑΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ-ΓΕΩΠΟΝΟΣ-ΖΩΟΤΕΧΝΗΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΖΩΟΤΡΟΦΗΣ ΓΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΩΝ ΣΤΙΣ ΛΙΠΙΔΑΙΜΙΕΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Τριμελής Συμβουλευτική επιτροπή Καλφακάκου Βασιλική, Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων (Επιβλέπουσα). Ευαγγέλου Άγγελος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Κιόρτσης Δημήτριος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Αγγελίδης Χαράλαμπος, Καθηγητής Βιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Βεζυράκη Πάτρα, Αν. Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου. Ευαγγέλου Άγγελος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Κιόρτσης Δημήτριος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Καλφακάκου Βασιλική, Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Μπαϊρακτάρη Ελένη, Αν. Καθηγήτρια Κλινικής Χημείας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων. Παπαδοπούλου Χρυσάνθη, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων.

4 [4] Η παρούσα διατριβή είναι αφιερωμένη στη μνήμη του Πατέρα μου.

5 [5] Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, στα πλαίσια του Διαπανεπιστημιακού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών, << Πιστοποίηση Αγροτικών προϊόντων ποιότητας >>. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς την επιβλέπουσα της διδακτορικής μου διατριβής κ. Καλφακάκου Βασιλική, Καθηγήτρια Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, για την παρότρυνση πραγματοποίησης αυτής της διατριβής, την υποστήριξη, την επιστημονική καθοδήγηση κατά την διάρκεια της έρευνας, άλλα και τις καθοριστικές συμβουλές της για τη διαμόρφωση του τελικού κειμένου. Ιδιαιτέρα ευχαριστώ τα δυο μέλη της τριμελούς επιτροπής, κυρίους Ευαγγέλου Άγγελο, Ομότιμο Καθηγητή Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και Κιόρτση Δημήτριο, Καθηγητή Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, για την ουσιαστική βοήθεια τους σε όλα τα στάδια της ερευνητικής αυτής προσπάθειας. Επιθυμώ επίσης να εκφράσω τις ειλικρινείς ευχαριστίες μου στα μελή της επταμελούς επιτροπής : κυρία Βεζυράκη Πάτρα Αν. Καθηγήτρια Φυσιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, για την διαρκή επίβλεψη και βοήθεια, πραγματοποίησης των in vivo πειραμάτων στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής, κυρία Μπαϊρακτάρη Ελένη Αν. Καθηγήτρια Κλινικής Χημείας Ιατρικής Σχόλης του Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, για την διαρκή υποστήριξη και την εξαιρετικά πολύτιμη βοήθεια στην διεξαγωγή των Βιοχημικών και μεταβονομικών αναλύσεων των δεδομένων στο εργαστήριο Κλινικής Χημείας Ιατρικής Σχόλης, κυρία Παπαδοπούλου Χρυσάνθη, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, για τις πολύτιμες συμβουλές της σε θέματα που αφορούν κανονισμούς ποιότητας και διαχείρισης των πειραματικών Ζωικών μοντέλων και διατροφών. κύριο Αγγελίδη Χαράλαμπο, Καθηγητή Βιολογίας Ιατρικής Σχόλης Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, για την παραχώρηση του διαγονιδιακού στελέχους ποντικών απαραίτητο εργαλείο για την πραγματοποίηση της παρούσας διατριβής, καθώς και την εμπειρία και τη γνώση που μου προσέφερε, για τον πειραματικο χειρισμό τους. Θεωρώ υποχρέωση μου να ευχαριστήσω τον Δρ. Κολιό Γεώργιο, Βιοχημικό, για την από κοινού διεξαγωγή των απαραίτητων βιοχημικών αναλύσεων στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων, καθώς και την Δρ. Κωσταρά Χριστίνα για

6 [6] την αναντικατάστατη βοήθεια της στην διεξαγωγή των μεταβονομικών αναλύσεων των μετρήσεων του ΝΜR. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη κ. Αντώνιου Κατερίνα, Αν. Καθηγήτρια Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, για την πολύτιμη συμβολή της στην επίλυση προβλημάτων που σχετίζονται με την διαχείριση των πειραματικών μοντέλων σε ζώα. Ευχαριστώ το φίλο και συνεργάτη Δρ. Δεληγιάννη Ιωάννη, συνοδοιπόρο σε αυτή την διαδρομή, για τη συνεχή συμπαράσταση και τις συζητήσεις επιστημονικού ενδιαφέροντος. Ευχαριστώ επίσης τα μέλη του εργαστηρίου Φυσιολογίας και ιδιαίτερα τους Ζερικιότη Στέλιο, Ζαχαρίου Χριστιάνα, Γκιούλη Μαρία, Ίριδα Δήμα, Βαγγέλη Κονταργύρη, Νίκο Γκάλκο και Παναγιώτη Γρίβα, καθώς και τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες του εργαστηρίου Βιολογίας Κασιούμη Παναγιώτα και Βραζέλη Εύη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Δρ. Ζελοβίτη Ιωάννη και τον Επίκουρο Καθηγητή του Εργαστηρίου Φυσιολογίας Καρκαμπούνα Σπυρίδωνα για την ένταξη και εκπαίδευση μου στο εργαστήριο Φυσιολογίας δημιουργώντας μου την ευκαιρία για την πορεία μου στο εργαστήριο αυτό που ολοκληρώνεται σήμερα. Τέλος αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την αμέριστη ηθική και υλική υποστήριξη καθώς και για την αταλάντευτη πίστη στις επιλογές μου.

7 [7] Παρασκευή και Πιστοποίηση ζωοτροφής για πειραματική μελέτη των επιδράσεων των μετάλλων στις λιπιδαιμίες Production and Verification of animal nutrition for experimental research on the effects of metals in lipidemias

8 [8] Περιεχόμενα Α. Εισαγωγή 1. Απαραίτητα ιχνοστοιχεία Zn και Cu Ιδιότητες. Φυσιολογία Διατροφή και μεταλλικά ιχνοστοιχεία Zn και Cu Σχέση Zn, Cu και λιπιδίων Ψευδάργυρος και λιπίδια Zn και HDL Cu και λιπίδια Zn, Cu και οξειδωτικό στρες Ψευδάργυρος (Zn) και οξειδωτικό στρες Χαλκός Cu και οξειδωτικό στρες Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ) Δομή μεταλλοθειονινών Αντιοξειδωτικές ικανότητας MTs MTs και οξειδωτικό stress Δισμουτάση του σουπεροξειδίου (superoxide dismutase-sod) Μεταβολισμός λιπιδίων Τύποι λιπιδίων Η χοληστερόλη (CL) Τα τριγλυκερίδια(τg) Τα φωσφολιπίδια (PL) Φωσφατιδυλοχολίνη λεκιθίνη, (Phosphatidylocholine PC) Τα λιπαρά οξέα (FA) Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά (CM) Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Απολιποπρωτεΐνες Σχέση λιπιδίων με λιποπρωτεΐνες Φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και (HDL). 44

9 [9] Σφιγγομυελίνη (SM) φυσιολογικός ρόλος, στο μεταβολισμό των λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών Λιπαρά οξέα (FA) και (HDL) Λιπίδια και οξειδωτικό στρες Οξείδωση της LDL Οξείδωση και αντιοξειδωτικές ιδιότητες της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (HDL) Οξειδωτικό στρες και διατροφή Δίαιτες υψηλών λιπαρών Διατροφικοί παράγοντες με ρόλο αντιοξειδωτικό Heat Shock proteins (HSPs) Οικογένεια Heat Shock Proteins Hsp Δίαιτα υψηλών λιπαρών και Hsp Ζωικά πειραματικά μοντέλα στις λιπιδαιμίες και την αθηροσκλήρωση Χοίροι Κόνικλος Ινδικά χοιρίδια (Guinea Pig) Επίμυες Άλλα ζωικά μοντέλα Μυς (ποντικός) Διαγονιδιακά και (Gene Targeted ) μοντέλα ποντικών..69 Β. Υλικά και μέθοδοι 1. Ζώα πειράματος και πειραματικές δίαιτες, πειραματικοί χειρισμοί Ομάδες ζώων-χρονική διάρκεια-στέγαση Σύνθεση δίαιτας πειραματοζώων Θανάτωση Συλλογή ιστών και αποθήκευσή τους Τεχνικές προσδιορισμού αντιοξειδωτικού προφίλ (TAC και SOD) Μέτρηση δραστηριότητας της υπεροξειδιο- δισμουτάσης-sod Μέθοδος μέτρησης Ολικής αντιοξειδωτικής Ικανότητας (ΤAC) Φασματοφωτομετρία Ατομικής Απορρόφησης (ΑΑS) Μέθοδος Ατομικής Απορρόφησης με φλόγα Φασματοφωτομετρία Ατομικής απορρόφησης Πέψη ιστών...78

10 [10] 4. Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου( 1 H NMR) Βασικές αρχές Επίδραση παλμών Ελευθέρως φθίνουσα επαγωγή (Free induction decay-fid) Μετασχηματισμός Fourier (Fourier Transformation, FT) 4.2. Χαρακτηριστικά του φάσματος NMR Αριθμός σημάτων στο φάσμα NMR Εμβαδόν κορυφών πρωτονίων στο NMR Τεχνικές αναγνώρισης προτύπων Η έννοια και η ανάλυση των Πολυμεταβλητών δεδομένων Προεπεξεργασία των δεδομένων Principal Component Analysis, PCA Partial Least-Squares Discriminant Analysis, PLS-DA Orthogonal Signal Correction, OSC Αξιολόγηση των μοντέλων (Validation of models) Αναλύσεις αίματος -Βιοχημικές Αναλύσεις-Μέτρηση επιπέδων ινσουλίνης μέτρηση επιπέδων ινσουλίνης με την μέθοδο της Elisa Βιοχημικές αναλύσεις όρου αίματος πειραματοζώων με αυτόματο αναλυτή Triglyceride Cholesterol HDL-cholesterol Γλυκόζη (Glucose, GL).92 Γ. Αποτελέσματα 1.Μεταβολές βάρους Βιοχημικές εξετάσεις αίματος Μετρήσης μεττάλλων Zn,Cu Ολική αντιοξειδωτικη ικανότητα πλασματος - (ΤAC) Σουπεροξείδιο δισμουτάση ερυθροκυτάρων ( SOD) NMR μεταβονομική ανάλυση λιπιδίων Επίδραση διατρογικού Zn.111

11 [11] 6.2 Επίδραση γονιδίου HSP Δ. Συζήτηση Συμπεράσματα..165 Ε. Ανασκόπηση-Περίληψη Ελληνική Αγγλική.178 Στ. Βιβλιογραφία Abreviations 1H NMR AA ABCA1,G1 ALA Full Name Proton nuclear magnetic resonance Arachidonic acid ATP-binding cassette sub-family (A1,G1) α-linolenic acid AP2 Activating Protein 2 Apo's ATP CL CM CTP DHA, 22:6 DIAL DU E+A ECI EPA 20:5 FXR GSH GSSG HDL HFD Apolipoprotein's Adenosine triphosphate Colesterol chylomicra pyrimidine nucleoside triphosphate docosahexaenoic acid Διαλλυλικά Λιπαρά οξέα degree of unsaturation eicosapentaenoic acid+arachidonic acid Δ3-Δ2-enoyt-CoA-isomerase eicosapentaenoic acid Farnesoid X receptor Glutathione (tripeptide) Glutathione disulfide High-density lipoprotein High Fat Diet

12 [12] Hip HNF-4 Hop HSE Hsp- interacting protein Hepatocyte nuclear factors Hsp-organizing protein Heat Shock Element HSF1 Heat Shock transcription Factor 1 Hsp's HSR HTGL IDL IL-6 JNK Lp(a) LA LCAT LDL LDLReceptors LPL MDA Heat Shock Protein's Heat Shock Response hepatic triglyceride lipase Intermediate-density lipoproteins Interleukine Jun N-terminal kinases Lipoprotein(a) Linolenic acid Lecithin cholesterol acyltransferase Low-density lipoprotein Low-Density Lipoprotein (LDL) Receptor Lipoprotein lipase Multivarial Data Analysis MTF1 Metal regulatory transcription factor 1 MTs MUFA n-3,n-6 NADP nfa nf-kb OSC oxldl PC Metallothioneins monounsaturated fatty acids Omega-3,6 fatty acid Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate natural Fatty acids Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Orthogonal Signal Correction Oxidized low-density lipoprotein receptor Phosphatidylcholines

13 [13] PCA PEMT PL PLS - DA PLTP Principal component analysis Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase Phospholipids Partial least squares regression - Discriminant Analysis Phospholipid transfer protein PON-1 Paraoxonase 1 PPARs PUFA RAR RNS ROS RXR SFA SM SOD Peroxisosome- proliferetion-activaded-reseptors Polyunsaturated fatty acids Retinoic acid receptor Reactive nitrogen species Radical Oxygen Species Ret inoid-x- receptor saturated fatty acid sphingomyelin Superoxide Dismutases SP (3,1) Transcription Factor (1,3) SR-B SREPs T3 TAC TNF TNF-a UFA class B scavenger receptors Steroid Ragulatory Element- Binding Proteins Triiodothyronine Total antioxidant capacity Tumor Necrosis Factor Tumor necrosis factors-a Unesterified fatty acid USF1,2 Upstream stimulatory factor (1,2) USF1,2 Upstream stimulatory Factor 1,2 VLDL Very-low-density lipoprotein ZNF202 Zinc Finger Protein 202 Δ(6),(9) Desaturase(6),(9)

14 [14] ΣΚΟΠΟΣ Διερεύνηση της 1. Επίδρασης του Ζn στην μεταβονομική των λιπιδίων 2. Επίδρασης των Hsp70, παρουσία Ζn, στην μεταβονομική των λιπιδίων 3. Συμμετοχής αντιοξειδωτικών μηχανισμών και 4. Προσδιορισμός των συγκεντρώσεων διατροφικού Ζn με επιπτώσεις στο προφίλ των λιπιδίων αίματος και ήπατος

15 [15] Εισαγωγή 1. Απαραίτητα ιχνοστοιχεία Zn και Cu. Ιδιότητες. Φυσιολογία O ψευδάργυρος (Zn) είναι μέταλλο μετάπτωσης της ομάδας ΙΙΒ των στοιχείων του περιοδικού πίνακα, το 27ο μέταλλο στη σειρά,όσον αφορά την αφθονία στο φλοιό της γης και το πιο άφθονο ιχνοστοιχείο στο ανθρώπινο σώμα, απαραίτητο για τους περισσότερους ζωντανούς οργανισμούς. Πραγματοποιεί σταθερούς δεσμούς με τα μόρια και ταυτόχρονα η στερεοχημική ευελιξία του τον κάνει ευπροσάρμοστο στις δομικολειτουργικές ανάγκες των πρωτεϊνών και των ένζυμων [Vallee B.L. and D.S. Auld. 1989, Vallee B.L. and D.S. Auld. Biochemistry 1990, and Vallee B.L. and D.S. Auld Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990]. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες δεν υφίσταται αναγωγή ή οξείδωση και αυτό τον καθιστά ιδιαίτερα σταθερό σε βιολογικά περιβάλλοντα. Ο Zn δεν συναντάται ελεύθερος στους οργανισμούς. Η στερεοχημική του προσαρμοστικότητα οδηγεί σε πολλαπλά γεωμετρικά σχήματα, τα οποία αριθμούν από το 2 έως το 8 δηλ. τετράπλευρα, τριγωνικά, οκτάεδρα, πυραμίδες [Cotton F.A. and G. Wilkinson 1988] από αυτά τα 4, 5 και 6, είναι αυτά που πιο συχνά παρατηρούνται στις βιολογικές λειτουργίες του ψευδαργύρου. Ο Zn βρίσκεται τόσο στους φυτικούς όσο και στους ζωικούς ιστούς και αποτελεί ένα από τα κυριότερα ιχνοστοιχεία του ανθρώπινου οργανισμού. Παίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση, στην ανοσοαπόκριση, στο οξειδωτικό stress την απόπτωση και γήρανση. Η απορρόφηση του Zn λαμβάνει χώρα στο λεπτό έντερο και κυρίως στο δωδεκαδάκτυλο. Κυμαίνεται από 25-90% μετά από του στόματος λήψη και επηρεάζεται από διαιτητικούς παράγοντες. Για παράδειγμα μειώνεται με την ταυτόχρονη χορήγηση φυτικών πρωτεϊνών, ασβεστίου και φωσφόρου και αυξάνεται με την ταυτόχρονη χορήγηση ζωικών πρωτεϊνών. Ο μηχανισμός της απορρόφησης του ψευδαργύρου δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί αλλά φαίνεται να διευκολύνεται από τη μεταλλοθειονίνη και από τη σύνδεση του μετάλλου με άλλες πρωτεΐνες. Μετά από την από του στόματος λήψη, το μέταλλο ανιχνεύεται στον ορό μετά από λεπτά, ενώ οι μέγιστες συγκεντρώσεις στο πλάσμα ανευρίσκονται μετά από 2-4 ώρες. Ο Zn αποθηκεύεται κυρίως στους σκελετικούς μύες, αλλά σημαντικές συγκεντρώσεις βρίσκονται ακόμη στο πάγκρεας, τον προστάτη, το ήπαρ και τον αμφιβληστροειδή.

16 [16] Η μέση ημερήσια πρόσληψη Zn κυμαίνεται στα 5-22mg. Το μέσο σωματικό φορτίο Zn στον ενήλικα υπολογίζεται σε 2gr. Το ολικό αίμα περιέχει 900μg/dl, εξ αυτών μg/dl περιέχονται στον ορό, ενώ στα λευκά αιμοσφαίρια βρίσκεται το 3% της συνολικής ποσότητας ψευδαργύρου του αίματος. Ο ψευδάργυρος βρίσκεται στον οργανισμό συνδεδεμένος με ένζυμα ως τμήμα του ενεργού κέντρου τους όπως π.χ η καρβονική ανυδράση ή με πρωτεΐνη και ειδικότερα σφαιρίνη η οποία δρα και ως μεταφορέας του μετάλλου αυτού. Ο ψευδάργυρος εκτός της καρβονικής ανυδράσης, αποτελεί βασικό στοιχείο σε περισσότερα από 500 μεταλλοένζυμα και μεταγραφικούς παράγοντες μεταξύ των οποίων είναι, η υπεροξειδίου - δισμουτάση (SOD), αλκοολική αφυδρογονάση, καρβοξυπεπτιδάση και η γαλακτική αφυδρογονάση. Αποτελεί τέλος συστατικό της πολυμεράσης του DNA η οποία είναι απαραίτητη για την κυτταρική διαίρεση. Έτσι, η ανεπάρκεια του Zn οδηγεί σε μειωμένη σύνθεση DNA και RNA με αποτέλεσμα τη μείωση της πρωτεϊνοσύνθεσης. Επίσης, ο ψευδάργυρος εμποδίζει το σχηματισμό ελεύθερων ριζών οξυγόνου και o βιολογικός χρόνος ημιζωής του μετάλλου ανέρχεται στις 300 ημέρες. Αποβάλλεται κυρίως από τα κόπρανα και σε μικρότερο ποσοστό από τον ιδρώτα και τα ούρα. Το γάλα του θηλασμού περιέχει επίσης σημαντικές ποσότητες Zn. Είναι γνωστό ότι τα βαρέα μέταλλα ασκούν τοξικές δράσεις στα διάφορα βιολογικά συστήματα [Nordberg, 1984, Revis, 1978]. Επιπρόσθετα, εξαιτίας του μεγάλου χρόνου ημιζωής τους, τα βαρέα μέταλλα επάγουν φαινόμενα συσσώρευσης, τα οποία με τη σειρά τους προκαλούν εκθετική αύξηση της συγκέντρωσής τους στο αίμα και τους ιστούς. Εκτός από τις καρκινογόνες επιδράσεις των ενώσεων αυτών ή την συμμετοχή τους σε χρόνιες αναπνευστικές παθήσεις, πολλά από αυτά έχουν δράσεις ισχυρών νευροτοξινών. Μέταλλα όπως το Cd, o Cu, το Cr, o Zn και άλλα είναι συχνά στόχοι έρευνας για την αξιολόγηση των επιτρεπτών, επωφελών και τοξικών τους συγκεντρώσεων σε διάφορα βιολογικά συστήματα και κυτταρικές σειρές. Σήμερα η έλλειψη ή η περίσσεια μεταλλικών στοιχείων συσχετίζεται με πολλές ασθένειες γι αυτό και ο ακριβής τους προσδιορισμός στο ανθρώπινο σώμα, τα τρόφιμα και το περιβάλλον είναι απαραίτητος. Ο Zn είναι ένα μέταλλο με σπουδαίο διατροφικό ρόλο και απαραίτητο ιχνοστοιχείο για όλες τις μορφές ζωής. Η διατροφική έλλειψή του αναγνωρίσθηκε ως εξαιρετικής σημαντικότητας παράγοντας για την δημόσια υγεία[prasad AS ]. Ο ρόλος του Zn συνδέεται με την ανάπτυξη, την εξέλιξη, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ανοσολογική απόκριση, την νευρική και την αναπαραγωγική λειτουργία και καθημερινά αναγνωρίζεται η συμμετοχή του στην γενετική και βιοχημική ταυτότητα πολλών κυτταρικών συστημάτων.

17 [17] Ο χαλκός (Cu) είναι ευρύτατα διαδεδομένος στη φύση. Απαντά σε όλα σχεδόν τα φυτά, καθώς και σε όλα τα όργανα του ανθρώπου και των περισσότερων ζώων. Η ημερήσια πρόσληψη χαλκού από τις τροφές υπολογίζεται σε 1,2-5mg. Το 50% περίπου του προσλαμβανόμενου χαλκού απορροφάται από το γαστρεντερικό. Το πόσιμο ύδωρ περιέχει χαλκό σε συγκεντρώσεις 0,2mg/lit ενώ τα συντηρημένα τρόφιμα mg/kgr. Ο Cu είναι απαραίτητο συστατικό ορισμένων ενζύμων, μεταξύ των οποίων είναι η τυροσινάση η οποία συμμετέχει στη σύνθεση της μελανίνης, η κυτοχρωμική οξειδάση, η υπεροξειδική δεσμουτάση, η αμινοξειδάση και η ουρική οξειδάση. Είναι επίσης απαραίτητος για την απορρόφηση του σιδήρου από το γαστρεντερικό. Η σιδηροπενική αναιμία συνοδεύεται στην παιδική ηλικία και από έλλειψη χαλκού. Ο χαλκός προάγει ακόμη τη δέσμευση της ισταμίνης από τις πρωτεΐνες του πλάσματος. Σε δηλητηρίαση με ψευδάργυρο ή μολυβδαίνιο ανταγωνίζεται τη δράση τους. Ανεπάρκεια χαλκού συνοδεύεται και από μικροκυτταρική υπόχρωμη αναιμία η οποία οφείλεται σε διαταραχή της σύνθεσης αιμοσφαιρίνης. Ο χαλκός και οι ενώσεις του εισέρχονται στον οργανισμό κυρίως μέσω του γαστρεντερικού σωλήνα και κυρίως το δωδεκαδάκτυλο, με μηχανισμό ενεργού μεταφοράς, ενώ σπανιότερα μέσω του αναπνευστικού βλεννογόνου. Η απορρόφηση αυξάνεται σε περιπτώσεις ένδειας χαλκού και μειώνεται σε νοσήματα του λεπτού εντέρου. Ο ψευδάργυρος και το μολυβδαίνιο αναστέλλουν την απορρόφηση του χαλκού. Στον ορό το μέταλλο μεταφέρεται αρχικά με την αλβουμίνη και στη συνέχεια με τη σερουλοπλασμίνη,με την οποία συνδέεται σε ποσοστό 95% περίπου. Ο χρόνος ημιζωής του μέταλλου υπολογίζεται στις ώρες, ενώ του συνολικού φορτίου σε σερουλοπλασμίνη-cu σε 145 ώρες. Μετά την απορρόφηση το μέταλλο κατανέμεται κυρίως στο ήπαρ, τους νεφρούς και το μυελό των οστών όπου βρίσκεται συνδεδεμένο με τη μεταλλοθειονίνη. Ανευρίσκεται ακόμη στους μύες, την καρδιά, τον εγκέφαλο και τα οστά. Στο αίμα, ο χαλκός απαντά σε συγκεντρώσεις μg/dl και η περιεκτικότητα των έμμορφων στοιχείων του αίματος είναι κατά πού μεγαλύτερη από εκείνη του πλάσματος. Στα ούρα οι φυσιολογικοί ενήλικες αποβάλλουν ποσότητα μικρότερη από 100μg/24ωρο. Σε παθολογικές καταστάσεις όμως, όπως είναι η αιμοχρωμάτωση, διάφορες λοιμώξεις και η νόσος Wilson, οι συγκεντρώσεις αυτές ανευρίσκονται αυξημένες. Κύρια οδός αποβολής του χαλκού θεωρούνται τα κόπρανα μετά την απέκκριση του μετάλλου από τη χολή η οποία θεωρείται η κατεξοχήν απεκκριτική οδός. Σε μικρότερες ποσότητες απεκκρίνεται από τα ούρα, το σίελο, το έντερο και το γάλα.

18 [18] 1.1 Διατροφή και μεταλλικά ιχνοστοιχεία Zn και Cu. Ο ψευδάργυρος ανευρίσκεται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στο κόκκινο κρέας, τα θαλασσινά και σε ορισμένα δημητριακά όπως είναι το σιτάρι. Ανεπάρκεια του ψευδαργύρου μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή πρόσληψη ή σε διάφορες χρόνιες καταστάσεις όπως είναι τα σύνδρομα δυσαπορρόφησης, η χρόνια νεφρική ή ηπατική νόσος, ο καρκίνος. Οι κυριότερες εκδηλώσεις της ανεπάρκειας του ψευδαργύρου είναι η αναστολή της ανάπτυξης στα παιδιά, η χρόνια διάρροια, η αλωπεκία, δερματικές και οφθαλμικές βλάβες, διαταραχές της άμυνας του οργανισμού, διαταραχές στο μεταβολισμό των υδατανθράκων και λιπιδίων. Ο χαλκός ανευρίσκεται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στους ξηρούς καρπούς, τα δημητριακά και τα θαλασσινά. Έλλειψη χαλκού μπορεί να οδηγήσει σε αναιμία, ουδετεροπενία, καθυστέρηση της ανάπτυξης, οστεοπόρωση και διαταραχές του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων. 1.2 Σχέση Zn, Cu και λιπιδίων (μεταβολισμός λιπιδίων ) Ψευδάργυρος και λιπίδια Ο Zn παίζει σημαντικό ρόλο σε πολυάριθμες βασικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης, ανοσολογικές διεργασίες, σύνθεση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, υδατανθράκων και μεταβολισμό λιπιδίων. Ο Zn έχει αναγνωριστεί ως απαραίτητο στοιχείο για την δραστηριότητα πολλών ενζύμων [Kechrid Z,et. al. 2012]. Ένα ακόμα σημαντικό στοιχείο του ψευδαργύρου είναι και ότι αποτελεί συστατικό πολλών μεταγραφικών παραγόντων, γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταβολές της κατάστασης του Zn στον οργανισμό αυτόματα μεταφράζεται σε αλλαγές της γονιδιακής έκφραση. [Hanas, J. S., et. al. 1983] Συνοψίζοντας τις αλλαγές στο μεταβολισμό των λιπιδίων που πραγματοποιούνται στον οργανισμό, ως αποτέλεσμα της έλλειψης ή της αυξημένης πρόσληψης Zn συμβαίνουν τα ακόλουθα : Όσον αφορά την έλλειψη, είναι δημοσιευμένο και κλινικά αποδειγμένο σε πολλές μελέτες ότι, η έλλειψη Zn παρουσιάζει παρόμοια συμπτώματα με εκείνα της ανεπάρκειας των απαραίτητων λιπαρών οξέων (essential fatty acids-efa) [Odutuga AA 1982].

19 [19] Επίσης μελέτες σε επίμυες που έλαβαν διατροφή ελλειμματική σε Zn έδειξαν ότι παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στο σχηματισμό λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών, καθώς και αλλαγές στην σύνθεση των λιπαρών οξέων των λιπιδίων σε διάφορα όργανα. [Xinwei Li.et. al Wu, J. Y.,,et. al. 1984] Σημαντική παρατήρηση,σε μελέτες ελλειμματικής σε Ζn διατροφής είναι η σχετικά υψηλότερη συσσώρευση τριγλυκεριδίων triglycerides (TG) στο ήπαρ ζώων εργαστηρίου [Eder, K. & Kirchgessner, M Eder, K. & Kirchgessner, M. 1994]. Η προαναφερόμενη παρατήρηση συνοδεύεται και από διατάραξη των γονιδίων/ πρωτεϊνών. Ένζυμα που απαιτούνται για τον ηπατικό μεταβολισμό (triacylglycerol turnover) και β- οξείδωσης των λιπαρών οξέων παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα mrna σταθερής κατάστασης (Steadystate) ενώ εκείνα της de novo λιπογένεσης παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα. Μία λειτουργική συσχέτιση αυτών των αλλαγών αποτελεί και η αυξημένη δραστηριότητα των ενζύμων που εμπλέκονται στην οδό της σύνθεσης των λιπαρών οξέων όπως η ακετυλο CoA καρβοξυλάση και συνθάση λιπαρών οξέων (acetyl -CoA carboxylase and fatty acid synthase) [Eder, K. & Kirchgessner, M ]. Έτσι φαίνεται ότι η αυξημένη συγκέντρωση τριγλυκεριδίων TG προέρχεται και από την de novo σύνθεση καθώς και από την μειωμένη κατανομή και απελευθέρωση των TG από το ήπαρ. [Eder, K. & Kirchgessner, M ] Η παραπάνω παρατήρηση ενισχύεται και από το γεγονός ότι άλλες μελέτες έδειξαν μια μειωμένη έκφραση του γονιδίου της καρβοξυλεστεράσης, που αποτελεί και λειτουργικό ισοδύναμο της όρμονο - ευαίσθητης λιπάσης (hormone sensitive lipase) [ Hui, D. Y. & Howles, P. N. 2002] αποτέλεσμα της οποίας είναι η μειωμένη ροή λιπαρών οξέων από το ήπαρ προς τη VLDL (Very-low-density lipoprotein)-συναρμολόγηση [Alam, M., et. al. 2002] και κατά συνέπεια μειωμένη έξοδο TG στην κυκλοφορία. Μια άλλη σημαντική δυσλειτουργία που επιφέρει η έλλειψη Zn στην κατάσταση των λιπιδίων στους οργανισμούς είναι και αυτή της διαφοροποίησης των λιπαρών οξέων. Έχει αναφερθεί από παλιότερα βιβλιογραφικά στοιχεία μια συσχέτιση μεταξύ Zn και δεσατουρασών (desaturases)όσον αφορά την μετατροπή κορεσμένων λιπαρών οξέων σε ακόρεστα,(κυρίως Δ_5 και Δ_6) [K.J. Jenkins and J.K.G. Kramer 1992]. Ωστόσο νεότερες μοριακές μελέτες αναφέρουν ότι παρότι τα επίπεδα της έκφρασης των (ντε)αποσατουρασών παραμένουν αμετάβλητα στην δράση του Zn, εν τούτοις διάφορα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση και μετατροπή των λιπαρών οξέων όπως (CYP4Α3 και CYP2C23) τα όποια συμβάλουν στον μεταβολισμό κορεσμένων(saturated fatty acid SFA), ακόρεστων λιπαρών οξέων (Unesterified fatty acid UFA)[Cowart, L. A., et. al. 2002

20 [20] ], επίσης το ένζυμο (Δ3,Δ2-enoyl-CoA isomerase (ECI) το οποίο εμπλέκεται στις διεργασίες β οξείδωσης που λαμβάνει χώρα στα υπεροξεισώματα ( peroxisomal-oxidation) των UFA και είναι απαραίτητο για την κατάτμηση του ελαϊκού οξέος φαίνεται να επηρεάζονται από τα επίπεδα Zn [Gurvitz, A., et. al. 1999]. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις ολεϊκού οξέος που συνοδεύουν την έλλειψη Zn αποδόθηκαν αρχικά στην αυξημένη δραστηριότητα της Δ9 δεσατουράσης (Δ9-desaturase), νεώτερα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η αποδόμηση του ολεϊκού οξέος μπορεί να απορυθμίζεται από τα χαμηλότερα επίπεδα (Δ3-Δ2-enoyt-CoAisomerase) ECI. Συνεπώς μπορεί να συμπεράνει κανείς ότι η μειωμένη είσοδος και οξείδωση των λιπαρών οξέων στα μιτοχόνδρια και η μειωμένη αποδόμηση στα υπεροξεισώματα, που σχετίζεται με την έλλειψη Zn, μπορεί να οφείλεται στη μείωση των ενζύμων που απαιτούνται για διαδικασίες οξείδωσης όπως της ECI και (L-3-OH acyl CoA dehydrogenases, carnitine acyltransferases) και όχι τόσο στην αυξημένη ενεργότητα της Δ9. [tom Dieck H, et. al. 2000]. Επιπλέον έχει παρατηρηθεί ότι το σύστημα εισαγωγής των λιπαρών οξέων στη εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη που εκφράζεται μέσω της (Acyl transferses carnitin) παρουσιάζει μειωμένα επίπεδα. Αυτό μπορεί να μας οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι μέσω της μειωμένης οξείδωσης λιπαρών οξέων απο τα μιτοχονδριακά μονοπάτια, παρουσιάζονται αυξημένα επίπεδα λιπαρών οξέων και κυρίως αυτών μικρής και μεσαίας αλυσίδας άνθρακα. [tom Dieck H, et. al. 2005] Μια πιθανή εξήγηση των παραπάνω παρατηρήσεων ως προς την ηπατική λιπιδική συσσώρευση, είναι η σχέση του Zn με τους πρωτεϊνικούς υποδοχείς (Peroxisome proliferator-activated receptor alpha PPAR-a) και (Sterol Regulatory Element-Binding Proteins SREBP-1). Τα PPARs περιέχουν στο τομέα δέσμευσης του DNA (DNA binding domain) δύο δακτυλίους ψευδαργύρου ως δομικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την σωστή λειτουργία των πρωτεϊνών. Καθώς οι PPARs ενεργοποιούνται, δεσμεύονται σε συγκεκριμένες θέσεις πρόσδεσης του DNA (response element PPARe) προς μεταγραφή και ενεργοποίηση του γονιδίου-στόχου σε ετεροδιμερή σύμπλοκα κυρίως με (9-cis-retinoic acid x receptor (RXR) και πρόσθετων πυρηνικών υποδοχέων (coactivators & corepressors). Στο ήπαρ οι PPAR παρουσιάζουν ισχυρή ρυθμιστική αλληλεπίδρασή με τους SREBP οι οποίοι και ρυθμίζουν την υπεροξείδωση των λιπαρών οξέων μέσω της μιτοχονδριακής υπεροξειδωτικής οδού, καθώς και την σύνθεση και απελευθέρωση των λιπιδίων. [tom Dieck H, et. al. 2005]

21 [21] Εικ. 1 Πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων η έλλειψη Zn δυνατόν να μεταβάλλει την γονιδιακή έκφραση πρωτεϊνών στον ηπατικό μεταβολισμό των λιπιδίων Zn και HDL (High-density lipoprotein) Τελευταία έχουν ερευνηθεί οι δράσεις του Zn σε σχέση με τον μεταβολισμό της λιποπρωτεΐνης (High-density lipoprotein HDL). Ένας Zn- Finger μεταγραφικός παράγων ο ZNF202 έχει αναγνωριστεί και συσχετιστεί με τον μεταβολισμό της HDL.[ Gerd Schimitz, et. al.2004]. Το χρωμόσωμα 11q23 αποτελεί ένα νέο γονιδιακό τόπο της low HDL που σχετίζεται με οικογενή [Kort EN et. al.2000, Zannis VI, et al. 2001] υπο-α-λιποπρωτεϊναιμία και παρουσιάζει σαφή διαφορά από το γονιδικό τόπο του συμπλέγματος (cluster) των απόλιποπρωτεινών AI/ CII /AIV/AV. [Kort EN et al 2000, Zannis VL et. Al 2001]. Ο καινούριος ταυτοποιημένος γονιδιακός τόπος περιέχει και το γονίδιο του Zinc Finger Transcription Factor (ZNF202) οι οποίος εμπλέκεται σε μια πλειάδα γονιδίων στόχων που σχετίζονται με την διαδικασία της αντίστροφής μεταφοράς της χοληστερόλης όπως: apolipoproteine (ApoE), lipoprotein lipase (LPL), phospolipid transfer protein (PLTP),

22 [22] Lecithin cholesterol acyltransferase LCAT,HTGL, PEMT,ATP-binding cassette transporters A1,G1 ABCA1,G1. (Πιν. 1) Φαίνεται λοιπόν πως ο ZNF202 παίζει κεντρικό ρόλο στον μεταγραφικό έλεγχο του μεταβολισμού της CL και των TG. Έχει παρατηρηθεί ότι η ρύθμιση της έκφρασης του ZNF202mRNA είναι αντιστρόφως ανάλογη με τα γονίδια στόχους ABCA1 και ApoE κατά το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων (μακροφάγων). Πιν.1 : Γονίδια - στόχοι του ZNF202 και σχετιζόμενες ες μεταβολικές ασθένειες. Απολιποπρωτεΐνη Ε (apo E): Κυρία λειτουργία της apo E είναι η διευκόλυνση της εκροής της κυτταρικής χοληστερόλης. Η apo E ρυθμίζεται αρνητικά από τoν καταστολέα της, τoν ZNF 202, κατά την διαφοροποίησή των μονοκυττάρων και τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων.

23 [23] Phospholipid Transfer Protein (PLTP): H PLTP μεταφέρει φωσφολιπίδια και τριγλυκερίδια, κυρίως από πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες σε «εν τη γενέσει» σωματίδια HDL, με λιπόλυση μέσω λιποπρωτεϊνικής λιπάσης, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση μικρών φτωχών σε λιπίδια pre-β-hdl σωματιδίων. Ταυτόχρονα παράγονται και μεγάλα α-hdl σωματίδια. Έχει ενδιαφέρον ότι αύξηση της ενεργότητας της PLTP έχει ανιχνευθεί σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 [1993.Jauhiainen M]. Ο PLTP-υποκινητής περιέχει ένα επιβεβαιωμένο σημείο δέσμευσης για τον ZNF202 καθώς και μέλη της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων (Πίν.1). ATP-binding cassette transporters A1 and G1 (ABCA1 ABCG1): Η ABCA1 δρα ως ένας βασικός ρυθμιστής της κυτταρικής εκροής λιπιδίων και του μεγέθους της «δεξαμενής» HDL του πλάσματος. Μεταλλάξεις του γονιδίου έχουν συσχετισθεί με οικογενή σύνδρομα ανεπάρκειας HDL [Tu AY 1993]. Και για τους δύο υποκινητές των ABCA1 και ABCG1, έχει διαπιστωθεί η ειδική δέσμευση του ZNF202 και μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή ενεργότητας του υποκινητή από τον ZNF202 [Porsch-Ozcurumez M 2001]. Ακόμη, η εκροή χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων ρυθμιζόμενης από την HDL και την apoai- παρουσίασε σημαντική μείωση σε κύτταρα RAW264.7 διαμολυσμένα με ZNF202 (ZNF202 transfected RAW254.7 cells). Αυτή η ισχυρή αναστολή της κυτταρικής αποβολής λιπιδίων, όχι μόνο παρατηρήθηκε σε βασικό επίπεδο, αλλά επίσης καταργείται σχεδόν παντελώς η εξαρτώμενη-από-οξυστερόλες επαγωγή της εκροής λιπιδίων που ρυθμίζεται από την ABCA1 [Porsch-Ozcurumez M et. al 2001]. Τα στοιχεία αυτά αποτελούν μια πολύ καλή απόδειξη ότι η ZNF202 αποτρέπει ακόμη και την LXR/RXR-ρυθμιζόμενη επαγωγή και στους δύο υποκινητές. Λιποπρωτεϊνική λιπάση (Lipoprotein lipase): Η LPL είναι το κύριο ένζυμο υπεύθυνο για την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων της κυκλοφορίας. Επιπρόσθετα της υδρολυτικής της δράσης, η LPL μπορεί να υποκινεί τη δέσμευση σωματιδίων στον υποδοχέα-ldl, τον υποδοχέα-vldl και άλλα μέλη της οικογένειας των LDL-σχετιζόμενων υποδοχέων, με αποτέλεσμα την πρόσληψη λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων. Στους ιστούς που εκφράζουν τη LPL περιλαμβάνονται οι σκελετικοί και καρδιακοί μύες, λιπώδης ιστός και αφρώδη κύτταρα.[ Preiss-Landl et. al K2002, O Brien KD et. al. 1992] Η γονιδιακή έκφραση του LPL καταστέλλεται από την ZNF202 και επάγεται από τις οξυστερόλες μέσω των ετεροδιμερών LXR/RXR και επίσης ενεργοποιείται από τα PPAR/RXR ετεροδιμερή ή τον SREBP-1[Zhang Y et. al 2001, Schoonjans K et. al. 1996, Schoonjans K et. al. 2000]. Στα μακροφάγα, η γλυκόζη προκαλεί αύξηση της έκφρασης της LPL, με τη συμμετοχή μίας περιοχής δέσμευσης AP1.[ Sartippour MR et. al.1998].

24 [24] Lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT):H LCAT είναι ένα βασικό ένζυμο στο μεταβολισμό της HDL, μετατρέποντας την απολιποπρωτεΐνη ΑΙ, που περιέχει pre-β-hdl πρόδρομα μόρια, σε ώριμα πλούσια σε χοληστερυλεστέρες- μόρια α-hdl. Μεταλλάξεις του LCAT γονιδίου σε ανθρώπους με μερική ή ολική απουσία ενεργότητας LCAT στο πλάσμα, οδηγούν σε ασθένεια fish eye disease και οικογενή ανεπάρκεια της LCAT (familial LCAT deficiency), οι οποίες χαρακτηρίζονται από σημαντικά μειωμένα επίπεδα HDL στο πλάσμα και θόλωση του κερατοειδούς. Έτσι, η ρυθμιστική ελάττωση της έκφρασης του γονιδίου LCAT από την ZNF202, μέσω του αναγνωρισμένου μοτίβου GnT (-1101/-1087) στον υποκινητή της LCAT, μπορεί να έχει κλινική σημασία (Πίν. 1)[ Santamarina-Fojo S, et. Al. 2000]. Ηπατική λιπάση τριγλυκεριδίων (Hepatic triglyceride lipase HTGL): H HTGL έχει σημαντική ενζυμική δραστηριότητα, αλλά επίσης μπορεί να ενισχύσει την πρόσληψη κατάλοιπων λιποπρωτεϊνών, μέσω ρύθμισης του υποδοχέα της LDL, σαν ενζυμικώς ανενεργή πρωτεΐνη. H HTGL ενισχύει τον καταβολισμό της VLDL μέσω δέσμευσής στον υποδοχέα της LDL. Εκτός από τη θέση δέσμευσης για τον ZNF202, ο υποκινητής της HTGL έχει επίσης θέσεις απόκρισης για το camp, οιστρογόνα, στερόλες και θυρεοειδικές ορμόνες, και δυνητικά για τις AP 2 (Activating protein 2), Oct-1 και CCAT/enhancer binding protein (C/EBP) (Πίνακας 2). Έχει ενδιαφέρον ότι ξεχωριστοί πολυμορφισμοί στον υποκινητή του γονιδίου HTGL έχουν συσχετισθεί με δυσλιπιδαιμία και αντίσταση στην ινσουλίνη, καθώς και με την απόκριση σε αγωγή μείωσης λιπιδίων.[ Medh JD et. al. 1999, Sensel MG et.al.1990, Zambon A et. al.2001] Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase (PEMT): Το γονίδιο της PEMT αποτελεί ακόμα ένα στόχο της ZNF202. Η PEMT καταλύει τη μετατροπή της φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης σε φωσφατιδυλοχολίνη, που αποτελεί το κύριο φωσφολιπίδιο σε όλες τις κλάσεις των λιποπρωτεϊνών στα θηλαστικά. Έως και 30% της φωσφατιδυλοχολίνης που συντίθεται στα ηπατοκύτταρα δημιουργείται με μετατροπή της φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης μέσω του μονοπατιού της PEMT. Το στάδιο αυτό, όχι μόνο συμβάλλει στην παραγωγή ηπατικής φωσφατιδυλοχολίνης, αλλά επίσης ελέγχεται έτσι η «δεξαμενή» της ηπατικής φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης. Η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη διαπιστώθηκε ότι αναστέλλει την ενεργοποίηση της SREBP στη Drosophila, ασκώντας έτσι ρυθμιστικό έλεγχο (feedback control) στη σύνθεση των λιπαρών οξέων και φωσφολιπιδίων παρόμοια με τη χοληστερόλη. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα σύνδεσμο μεταξύ της δραστηριότητας της ZNF202 και μιας δυνητικής αύξησης στα επίπεδα

25 [25] της κυτταρικής φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης μέσω καταστολής της PEMT και ενεργοποίησης των SREBPs.[ Walkey CJ et. al.1999, Shields DJ et. al.2001, Dobrosotskaya IY et. al 2002]. Πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη (Proteolipid protein): Η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη του κεντρικού νευρικού συστήματος και της και αποτελεί ακόμη έναν δυνητικό στόχο της ZNF202. Οι λειτουργίες της πρωτεολιπιδικής πρωτεΐνης περιλαμβάνουν την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση και τη σταθεροποίηση της δομής του ελύτρου μυελίνης. Μεταλλάξεις του γονιδίου της πρωτεολιπιδικής πρωτεΐνης έχουν σαν αποτέλεσμα σοβαρές μυελινικές διαταραχές όπως η ασθένεια Pelizaeus- Μerzbacher και η σπαστική παραπληγία τύπου 2.Εφ όσον η ZNF202 έχει σημαντική έκφραση στο ΚΝΣ, η καταστολή της πιθανόν να έχει κλινική σημασία για διαταραχές του μεταβολισμού της σφιγγομυελίνης. [Yool DA et. al. 2000] Eικόνα 2α. Τα κωδικοποιούντα εξόνια απεικονίζονται σαν μαύρα κουτιά, τα μη κωδικοποιούντα σαν γκρίζα κουτιά. Οι σχετικές πρωτεϊνικές περιοχές υποδεικνύονται με τα ονόματα των motif τους. Το ZNF202 γονίδιο αποτελείται από 10 εξόνια. Η περιοχή του υποκινητή (promotor), προς το άκρο-5, περιλαμβάνει ένα GC box, μία θέση σύνδεσης PU.1 και ένα E-box. Λόγω εναλλακτικού διαχωρισμού (splicing) εμφανίζονται 2 διαφορετικές ισομορφές, η ZNF202m1 είναι πλήρης και περιλαμβάνει περιοχές SCAN,KRAB και μια περιοχή ψευδαργυρικού δακτύλου (ZnF), η άλλη ZNF202m3 αποτελείται μόνο από μια SCAN περιοχή.

26 [26] Εικόνα 2β.Τα ομοδιμερή του ZNF202 εισέρχονται στον πυρήνα και προκαλούν έναρξη των μηχανισμών σιώπησης της μεταγραφικής δραστηριότητας που διαμεσολαβείται από την ΚΑΡ-1(KRAB-associated protein-1) και έτσι απωθείται η διαμεσολαβούμενη από τον LXR (liver X receptor)επαγωγή του γονιδίου. Αντίθετα η SPD1 (SCAN domain protein) αναστέλλει την κατασταλτική δραστηριότητα του ZNF202 και ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1) μέσω ενεργοποίησης του PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) και στη συνέχεια επαγωγή της έκφρασης του LXR. ZnF, zinc finger; RXR, retinoid X receptor. Οι πρωτείνες της περιοχής SCAN ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1) Cu και λιπίδια Από διάφορες μελέτες έχει αναφερθεί ότι η ανεπάρκεια χαλκού (Cu) σε επίμυες προκαλεί υπερχοληστεριναιμία, καθώς παρατηρείται αυξημένη συγκέντρωση (ανηγμένης μορφής της γλουταθειόνης (GSH) ) που με την σειρά της αυξάνει την δραστηριότητα του 3- υδροξυλ-3-μεθυλ-γλουταρυλ συνένζυμου Α (3-hydroxyl-3-methyl-gloytaryl coenzyme A (HMG-CoA)), το οποίο δρα ως περιοριστικό ένζυμο που σχετίζεται με την μείωση του ρυθμού σύνθεσης της χοληστερόλης. [T. E. Engle 2010]. Αυξημένη συγκέντρωση του ηπατικού χαλκού (Cu) μπορεί να ρυθμίσει την βιοσύνθεση της χοληστερόλης έμμεσα μέσω οξείδωσης της γλουταθειόνης. Μείωση της οξείδωσης της

27 [27] γλουταθειόνης συμβάλει γενικά στην αναστολής της μείωσης των επιπέδων αυτής [Kim, S., et. al ]. Ένα ακόμα σύστημα μεταβολισμού των λιπιδίων πιθανώς σχετίζεται με αυτό των ντεσατουρασών (Fatty acyl desaturase systems) το οποίο είναι ένας μηχανισμός που εξηγεί την παρατηρούμενη αύξηση των ακόρεστων λιπαρών οξέων UFA. Διατροφή με υψηλές συγκεντρώσεις CuSO4 (250mg/Kg τροφής ) σε χοίρους φαίνεται να αυξάνει τη δραστηριότητα των ντεσατουρασών μέσω της παρατηρούμενης μείωσης της αναλογίας στεατικού/παλμιτικού οξέος με ταυτόχρονη αύξηση των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου [ Jenkins, K. J., et. al. 1989], τα οποία συμφωνούν με την αύξηση των ντεσατουρασών (Δ-9) σε επίμυες μετά την αύξηση του διαιτητικού χαλκού (Cu).[ Cunnane S. C ] 1.3 Zn, Cu και οξειδωτικό στρες Οι δραστικές ρίζες αποτελούν προϊόντα του φυσιολογικού κυτταρικού μεταβολισμού, είναι γνωστές ως προοξειδωτικά και παίζουν διττό ρόλο, άλλοτε είναι ευεργετικές για τα κύτταρα και τους οργανισμούς και άλλοτε βλαπτικές. Οι ευεργετικές δράσεις των ελευθέρων ριζών οξυγόνου παρατηρούνται σε χαμηλές/μέτριες συγκεντρώσεις και αφορούν σε φυσιολογικούς ρόλους στην κυτταρική απόκριση στο στρες, στη μεταγωγή σήματος, στην κυτταρική διαφοροποίηση, στη μεταγραφή γονιδίων, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη φλεγμονή και στην απόπτωση. Οι βλαβερές δράσεις των δραστικών ριζών οξυγόνου ασκούνται στα βιομόρια, στις πρωτεΐνες, στα νουκλεϊνικά οξέα, στα λιπίδια και μπορεί να προκαλέσουν κυτταρική/ ιστική βλάβη, από την οποία ο οργανισμός προστατεύεται με μια σειρά αντιοξειδωτικών ουσιών. Οι αντιοξειδωτικές ουσίες παράγονται ενδογενώς ή προέρχονται από εξωτερικές πηγές και περιλαμβάνουν ένζυμα όπως η καταλάση, η δισμουτάση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, η αναγωγάση της γλουταθειόνης, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, μέταλλα όπως το Se, το Mn, ο Cu και ο Zn, βιταμίνες όπως οι Α, C και Ε, καθώς και άλλες ουσίες όπως η γλουταθειόνη. Ως οξειδωτικό στρες ορίζεται η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των προοξειδωτικών και των αντιοξειδωτικών ουσιών του κυττάρου και οφείλεται είτε σε αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου είτε σε ανεπάρκεια των κυτταρικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών.

28 [28] Ψευδάργυρος (Zn) και οξειδωτικό στρες Είναι γνωστό ότι υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ των ιόντων χαλκού, ψευδαργύρου και οξειδωτικού στρες και οφείλεται κυρίως στον βιολογικό ρόλο των Cu + και Zn + στην παραγωγή οξειδωτικών ουσιών. Παρ όλα αυτά η μοναδικότητα του Zn, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μεταβατικά (transition) μέταλλα στο σώμα(π.χ Cu2+, Fe3+ ), έγκειται στο ότι δεν διαθέτει έντονες οξειδοαναγωγικές ιδιότητες. Έχει προταθεί ότι στην πρώιμη εξέλιξη ο Fe3+ είχε το ρόλο του Zn2+ σαν συμπαράγοντας στις προγονικές μορφές των δομών Zn-fingers (δάκτυλοι ψευδαργύρου) [Berg JM, et. al. 1996]. Ο ψευδάργυρος Zn αποτελεί στοιχείο που προστατεύει το κύτταρο από τις οξειδωτικές βλάβες που μπορούν να προέλθουν από τον σχηματισμό των ελεύθερων ριζών μέσω διαφόρων δράσεων όπως 1) σταθεροποίηση της κυτταρικής μεμβράνης, 2) διατήρηση των επίπεδων μεταλλοθειονινών (ΜΤ) που δρουν ως συλλέκτες ελευθέρων ριζών (Free radical scavengers), 3)ως ενεργό συστατικό της υπεροξειδιο δισμουτάσης (SODs), 4) ως προστατευτικός παράγοντας των θειολών, 5) την παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ χημικών ουσιών και σιδήρου (Fe), προς σχηματισμό ελεύθερων ριζών, επίσης 6) ως αναστολέας της οξειδάσης ( NADPH ) ενός (scavenger of radical).[chasapis CT, et. al. 2012]. Ανεπάρκεια ψευδαργύρου που οφείλεται σε μειωμένη πρόσληψη ή σε κάποια δυσλειτουργία της απορρόφησης,συνδέεται με αυξημένα επίπεδα οξειδωτικής βλάβης των λιποπρωτεϊνών και του μορίου του DNA [Prasad AS 2009]. Η παρατεταμένη έλλειψη Ψευδαργύρου καθίστα τον οργανισμό επιρρεπή σε διαφορές βλάβες που οφείλονται στο οξειδωτικό στρες. Ειδικότερα παρουσιάζονται αυξημένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων σε υποχονδριακές και μικροσωμιακές μεμβράνες, καθώς και οσμωτική δυσλειτουργία των μεμβρανών των ερυθρών κυττάρων, σε αντίθεση με την επάρκεια ψευδάργυρου η οποία αποτρέπει την υπεροξείδωση λιπιδίων καθιστώντας τον ψευδάργυρο ένα στοιχειό που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία του κυττάρου από το οξειδωτικό στρες [Tapiero H, et. al. 2003].

29 [29] Εικ.3 Ο Zn ως αντιοξειδωτικός,αντί - φλεγμονώδης και αντιθρομβωτικός παράγοντας μέσω αναστολής της παραγωγής ROS που οδηγεί σε οξείδωση LDL και ενεργοποίηση του NF-KB Χαλκός Cu και οξειδωτικό στρες Ο χαλκός Cu απαντάται στους έμβιους οργανισμούς υπό δυο τύπους σύμφωνα με τον βαθμό οξείδωσης, ως δισθενής Cu (II) και ως μονοσθενής Cu(I). Ως βασικό ιχνοστοιχείο ο Cu είναι συμπαράγοντας πολλών ενζύμων που εμπλέκονται σε αντιδράσεις, όπως της ασκορβικής οξειδάσης του κυτοχρώματος C (cytochrome C ascorbate oxidase) και της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD). Ένας ακόμα ενζυμικός ρόλος του χαλκού Cu σχετίζεται με την μεταφορά ηλεκτρόνιων σε διάφορα βιολογικά συστήματα [ Valko et al Jomova K, et. al. 2011]. Ο χαλκός Cu μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες με δυο μηχανισμούς 1) Μέσω κατάλυσης άμεσα των (ROS) με αντιδράσεις τύπου Fenton [ Liochev SI, et. al. 2002, Prosek R, Sisson DD, et. al. 2007]

30 [30] 2) Μέσω μείωσης των επιπέδων γλουταθειόνης λόγω αυξημένων επιπέδων χαλκού Cu [Speisky H, et. al. 2009]. Οι δυο μορφές του ιοντικού χαλκού, δισθενής Cu(II) και μονοσθενής Cu(I) μπορούν να δράσουν σε διάφορες αντιδράσεις οξειδοαναγωγής ως έξης: Το ιόν του δισθενή Cu (II) παρουσία ενός ανιόντος υπεροξειδίου ή βιοαναγωγικών, όπως το ασκορβικό οξύ ή το GSH, μπορεί να παραξει μονοσθενή Cu(I) που με την σειρά του να αντιδρά με δραστικές μορφές υπεροξειδίου του υδρογόνου H 2 O 2 σε αντιδράσεις τύπου Fenton [Barbusinski 2009]: Cu(II) + O2 Cu(I) + O2 Cu(I) + H2O2 Cu(II) + OH + OH Οι ρίζα του υδροξυλίου είναι εξαιρετικά οξειδωτική και μπορεί με την σειρά της να προκαλέσει αντίδραση οξείδωσης σε παρακείμενα βιολογικά μόρια όπως λιπίδια μέσω αφαίρεσης υδρογόνου (H) από την καρβονύλικη αλυσίδα, σχηματίζοντας μια λιπιδική ρίζα από ακόρεστα λιπαρά. Επίσης μπορει να προκαλεσει ρήξη του DNA μέσω δραστικών μορφών (ROS ) O χαλκός υπό τις δυο μορφές Cu (II) και Cu(I) είναι περισότερο δραστικος από το σιδηρο Fe στη ρήξη του μορίου του DNA. [Moriwaki, H., et. al. 2008]. 1.4 Μεταλλοθειονίνες (ΜΤ) Οι μεταλλοθειονίνες ( Metallothioneins, MTs) αρχικά αναγνωρίσθηκαν ως μικρού μοριακού βάρους, πλούσιες σε κυστεΐνη πρωτεΐνες που δεσμεύουν Zn. Από το 1957 που ανακαλύφθηκαν [M. Margoshes,1957] έως και σήμερα, αποτελούν αντικείμενο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος αλλά ο ρόλος τους στα μεταβολικά μονοπάτια παραμένει αρκετά απροσδιόριστος. Η δέσμευση των ιόντων Zn φανερώνει ένα σημαντικό ρόλο των MTs στον κυτταρικό οξειδοαναγωγικό μεταβολισμό καθώς και την κατανομή και την ομοιόσταση του Zn. Οι Μεταλλοθειονίνες φαίνεται να διανέμουν τον ενδοκυττάριο ψευδάργυρο κατά την ταχεία μεταφορά του από και προς τα ένδο- και έξω-κυττάρια πρωτεϊνικά συμπλέγματα

31 [31] [Krezel A, et.al., 2007]. Οι αντιοξειδωτικές ικανότητες τους και η δράση τους στην ομοιόσταση του Zn είναι καίριες στον προστατευτικό τους ρόλο έναντι παρουσίας ιονίζουσων και UV ακτινοβολιών, τοξικών βαρέων μετάλλων(hg και Cd), υπεροξείδωσης των λιπιδίων και ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) [Sato M. et.al., 2002] Δομή μεταλλοθειονινών Σήμερα 4 ισομορφές των μεταλλοθειονινών είναι ταυτοποιημένες (ΜΤ- 1/ΜΤ-4), από τις οποίες οι 1 και 2 βρίσκονται σε όλα τα όργανα, η ΜΤ-3 στο ΚΝΣ, ενώ η λιγότερο γνωστή ΜΤ-4 είναι κυρίως εντοπισμένη στους στρωματοποιημένους (stratified) ιστούς (δέρμα και έντερο). [M. Vasak, 2005]. Η δομή των ΜΤs είναι μοναδική και για πολλούς συναρπαστική. Με ιδιαίτερα μικρό μοριακό βάρος ~7kDa, οι 4 ισομορφές αποτελούνται από αμινοξέα, με 20 Εικ.4 : Οι α και β υπομονάδες των μεταλλοθειονινών. [S.G.Bell] διατηρημένα κατάλοιπα κυστεϊνης και τουλάχιστον 5 λυσίνης (8 στις ΜΤ-1 και 2). Αν και δεσμεύουν κυρίως Zn έχει βρεθεί ότι μπορούν να συνδεθούν με μια μεγάλη γκάμα ιόντων μετάλλων όπως Cd, Cu,Hg,Ag,Au,Bi,As,Co,Fe,Pb και Pt [K. E. Duncan,2006]. Μόλις το 1991 με χρήση φασματομετρίας NMR και κρυσταλλογραφίας ακτινών-χ φάνηκε ότι η πρωτεϊνική τους διάταξη αποτελείται απο 2 δομικές περιοχές (α και β domains) με τις κυστεϊνες να δημιουργούν ένα «σύμπλεγμα» (cluster) γύρω απο τα άτομα των μετάλλων [N.Romero-Isart, 2002]. Στην α περιοχή ( C terminal) 4 άτομα Zn δεσμεύονται σε 11 κατάλοιπα κυστεϊνης (cys), ενώ στην β (Ν terminal) 3 άτομα Zn σε 9 Cys κατάλοιπα. Η διαμόρφωση αυτή περιέχει συνολικά 28 ενδομοριακούς δεσμούς Zn-S και είναι υπεύθυνη για την ισχυρή δέσμευση του Zn στις 2 περιοχές καθώς και για τις ιδιότητες των ΜΤs ως δότών Zn. Οι α και β υπομονάδες δεν παρουσιάζουν ίδια συγγένεια προς τoν Zn, καθώς η β φαίνεται να αντιδρά ταχύτερα με οξειδωτικούς παράγοντες [Stephen G. Bell, 2009] Αντιοξειδωτικές Ικανότητες των ΜΤs Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (Radical Oxygen Species-ROS) αποτελούν χημικά ενεργά μόρια που περιέχουν οξυγόνο (π.χ ιόντα οξυγόνου, υπεροξείδια) και είναι ισχυρά αντιδρωντα εξ αιτίας της παρουσίας ελεύθερου ηλεκτρονικού φορτίου. Τα ROS

32 [32] δημιουργούνται φυσιολογικά στον μεταβολισμό του οξυγόνου και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη κυτταρική ομοιόσταση και επικοινωνία. Όταν επιδρούν εξωγενείς στρεσογόνοι παράγοντες (π.χ UV ή θερμικό σοκ, διατροφή ) τα επίπεδα ROS μπορεί να αυξηθούν δραματικά με αποτέλεσμα οξειδωτικό στρες και καταστροφή κυτταρικών δομών[devasagayam, 2004].Οι βασικές επιβλαβείς επιδράσεις των ROS στο κύτταρο είναι η καταστροφή στο DNA, η υπεροξείδωση των λιπιδίων, η οξείδωση αμινοξέων στις πρωτεΐνες και συμπαραγόντων ενζύμων.. Οι ισχυρές αντιοξειδωτικές ικανότητες που φαίνεται να έχουν οι μεταλλοθειονίνες έχουν γίνει αντιληπτές σε πειραματικά μοντέλα τρωκτικών [K.-S. Min et.al., 1992] καθώς και in vitro σε σειρές ηπατικών κυττάρων [T.Dalton et.al., 1994]. Έχει αποδειχθεί ότι οι ισομορφές 1 και 2 των ΜΤ είναι ικανές να δεσμεύουν ένα ευρύ φάσμα ROS μεταξύ άλλων υπεροξειδίου, υπεροξειδίου του υδρογόνου, ρίζες υδροξυλίου και οξείδια του νατρίου [M. V. R. Kumari et.al., 1998]. Συγκεκριμένα φαίνεται ότι οι ΜΤ έχουν την ιδιότητα να φυλακίζουν ρίζες υδροξυλίου, που είναι από τους κυρίως υπαίτιους για το σχηματισμό ελεύθερων ριζών οξυγόνου και μάλιστα, 300 φορές ισχυρότερα από την γλουταθειόνη [M. Sato et.al., 2002]. Οι συνδέσεις κυστεϊνης θείου στις οποίες είναι πλούσιες οι ΜΤs παρουσιάζουν την ικανότητα οξείδωσης ή αναγωγής με τη σύγχρονη απελευθέρωση ή δέσμευση Zn και την δημιουργία ή σχάση δισουλφιδικών δεσμών. Αυτός ο οξειδοαναγωγικός μηχανισμός προσδίδει αντιοξειδωτικές ικανότητες στις MTs, με κύριο ρυθμιστή τον κυτταρικό Zn. Καθώς το αναγωγικό δυναμικό των MTs είναι ιδιαίτερα χαμηλό (λιγότερο από -366mV), ένας αριθμός απο φυσιολογικούς οξειδωτικούς παράγοντες όπως δισουλφίδια και ενώσεις σεληνίου μπορούν να επηρεάσουν την οξείδωση των ΜΤs. [A. Krezel et.al., 2007]. Οι ΜΤs αντιδρούν με τα δισουλφίδια της γλουταθειόνης (GSSG) απελευθερώνοντας Zn. Στις αντιδράσεις μεταφοράς Zn, οι ΜΤs δεν απελευθερώνουν και τα 7 ιόντα Zn. Η ανηγμένη δομή της GSSG, το τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης (GSH), αποτελεί ένα ισχυρό κυτταρικό αντιοξειδωτικό παράγοντα και τα 2 αυτά μόρια περιλαμβάνουν το 90% του μη δεσμευμένου σε πρωτεΐνες κυτταρικού θείου. Το κλάσμα GSH/GSSG θεωρείται σημαντικός αντιοξειδωτικός δείκτης. Η GSSG οξειδώνει την ΜΤ, προκαλώντας την απελευθέρωση και μεταφορά του Zn, ενώ η GSH μεσολαβεί στην μεταφορά του απο ένζυμα σε θειόλες (Τ). Η συγκέντρωση του GSSG είναι καθοριστική για την αντίδραση της ταχύτητας, ενώ η GSH απουσία της πρώτης αποτρέπει την ΜΤ να απελευθερώσει ιόντα Zn. Ο μηχανισμός αυτός προτάθηκε ως ο πιο ολοκληρωμένος σχετικά πρόσφατα[bell et.al., 2009]

33 [33] Εικ.5: Ο οξειδοαναγωγικός κύκλος των ΜΤs και η σύνδεσή τους με την ομοιόσταση του Zn, υπό τον έλεγχο των GSH/GSSH και της ATP ΜΤs και Οξειδωτικό stress Τόσο οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) όσο και αζώτου (RNS) είναι γνωστό ότι προκαλούν οξειδωτικές βλάβες και εμπλέκονται με νευροεκφυλιστικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένων των: πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση (ALS), Parkinson και Alzheimer, καθώς και καρδιαγγειακές παθήσεις, ρευματοειδείς παθήσεις, αθηροσκληρώσεις, διαβήτη, μυϊκές δυστροφίες και γήρας. Η παραγωγή ROS και RNS είναι συνδεδεμένη με το μεταβολισμό και την αναπνοή και στο μεταβολισμό τους εμπλέκονται ένζυμα όπως η καταλάση, το σουπεροξείδιο της δυσμουτάσης και πεπτίδια όπως η γλουταθειόνη (GSH) [ A. Y. Andreyev, et.al. 2005]. In vitro, οι ΜΤs αλληλεπιδρούν με πλήθος ROS (σουπεροξείδιο, υπεροξείδιο του υδρογόνου, ρίζες υδροξυλίου, νιτρικό οξύ και υπεροξυνιτρικό) με επακόλουθη απελευθέρωση Zn[Y. J. Kang,et.al. 2006].Τα ROS και το οξειδωτικό στρες αυξάνουν την έκφραση των MTs μέσω του MTF-1(metal response element-binding transcription factor-1) που είναι η κύρια ρυθμιστική πρωτεΐνη για την έκφραση των ΜΤs. Η επαγωγή των ΜΤs μέσω της δέσμευσης του Zn στον MTF-1 έχει γίνει αντιληπτή in vivo σε συνθήκες οξειδωτικού στρες αλλά και υπο την παρουσία τοξικών μετάλλων[m. S. Stitt,et.al. 2006]. Ο εκτεταμένος ρόλος των MΤs και του Zn στον έλεγχο του οξειδωτικού προφίλ φαίνεται απο την απελευθέρωση του Zn σε συνθήκες οξειδωτικού στρες αλλά και την αλληλεπίδραση

34 [34] τους με ένα πλήθος οξειδοαναγωγικών μορίων σημαντικών για την ομαλή λειτουργία των κυττάρων Δισμουτάση του σουπεροξειδίου (superoxide dismutase-sod) Οι δισμουτάσες του υπεροξειδίου είναι ένζυμα που ανακαλύφθηκαν από τον McCold και Fridovich to 1969, οι ποίοι απομόνωσαν μια πρωτεΐνη των ερυθροκυττάρων (erythrocuptein) η οποία καταλύει την αντίδραση μετατροπής του υπεροξειδίου του υδρογόνου [McCold JM, Fridovich I.1969]. Η οικογένεια αυτών των ένζυμων (SODs) έχει την ικανότητα κατάλυσης της ιδίας αντίδρασης με υπόστρωμα πάντα το Ο.- : 2 Ο.- + 2Η + Η 2 Ο 2 +Ο 2 Στην φύση οι SODs δρουν ως αντιοξειδωτικά ενζυμα απαραίτητα για την ανάπτυξη αερόβιων οργανισμών, εξουδετερώνοντας το Ο.- βιομόρια από εκτεταμένες βλάβες, όπως αυτές του DNA τους. Οι SODs ανάλογα με το μέταλλο που απαιτείται για την εκδήλωση της ενζυματικής τους δραστηριότητας, μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις τάξεις [Bannister JV, et. al.1987:, Hassan HM. 1988] - SOD χαλκού ψευδαργύρου (Cu, Zn-SOD) Ανευρίσκεται στα ευκαρυωτικά κύτταρα. - SOD μαγγανίου (Mn -SOD) Ανευρίσκεται στα προκαρυωτικά κύτταρα και στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών κυττάρων. - SOD σιδήρου (Fe- SOD) Ανευρίσκεται μόνο στα προκαρυωτικά κύτταρα. προστατεύοντας έτσι τα διάφορα Εικ.6 SOD χαλκού ψευδαργύρου (Cu, Zn-SOD) Στα κύτταρα των θηλαστικών βρίσκονται οι δυο από αυτές τις μορφές SODs. Η πρώτη (Cu, Zn-SOD) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, η δε (Mn -SOD) στα μιτοχόνδρια. Οι μορφές (Cu, Zn-SOD) έχουν μοριακό βάρος γύρω στα 32 kda και χωρίζονται σε δυο υπομονάδες που η κάθε μια περιέχει ένα άτομο Cu και ένα άτομο Zn.[Fridovich I. 1995]

35 [35] 2. Μεταβολισμός λιπιδίων. 2.1 Τύποι λιπιδίων Τα σημαντικότερα λιπίδια του πλάσματος είναι η χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια, τα φωσφολιπίδια και τα λιπαρά οξέα. Άλλες λιποδιαλυτές ουσίες, παρούσες σε πολύ μικρότερες ποσότητες αλλά μεγάλης φυσιολογικής σημασίας είναι οι στεροειδείς ορμόνες, οι λιποδιαλυτές βιταμίνες κ.ά. Τα λιπίδια αποτελούν την κύρια πηγή ενέργειας για τον ανθρώπινο οργανισμό και είναι σημαντικά συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών διότι παρέχουν τη σταθερότητα στις μεμβράνες και επιτρέπουν την διαμεμβρανική μεταφορά των ουσιών μεταξύ των κυττάρων. Τα λιπίδια στο αίμα μεταφέρονται με τις λιποπρωτεΐνες Η χοληστερόλη (CL) Είναι μια στεροειδής αλκοόλη υψηλού μοριακού βάρους. Αποτελείται από ένα πυρήνα κυκλοϋπερυδροφαινανθρενίου, ενώ επιπλέον διαθέτει μια υδροξυλομάδα στη θέση 3, δυο μεθυλομάδες στις θέσεις 10 και 13, αλειφατική αλυσίδα με 8 άτομα άνθρακα στη θέση 17 και ένα διπλό δεσμό σε θέση 5,6. (εικ.7)η προέλευσή της στον ανθρώπινο οργανισμό είναι είτε ενδογενής (ηπατική βισύνθεση) είτε εξωγενής (διατροφή). To 70% της χοληστερόλης βρίσκεται, τον λιπώδη ιστό και τα μυϊκά κύτταρα, ενώ το υπόλοιπο 30% μεταφέρεται με τις λιποπρωτεΐνες. Τα 2/3 της χοληστερόλης του πλάσματος βρίσκονται σε εστεροποιημένη μορφή, ενώ το 1/3 σε ελεύθερη. Xρησιμοποιείται για την βιοσύνθεση και επιδιόρθωση των κυτταρικών μεμβρανών, τη σύνθεση των χολικών οξέων, της βιταμίνης D και είναι πρόδρομη ένωση των στεροειδών ορμόνών. Εικ.7 Tο μόριο της χοληστερόλης (CL)

36 [36] Τριγλυκεριδία (ΤG) Αποτελούνται από ένα μόριο γλυκερόλης συνδεμένο με τρία μόρια λιπαρών οξέων, συνήθως διαφορετικά, τα οποία μπορεί να είναι είτε κορεσμένα είτε ακόρεστα (εικ 8). Η πηγή προέλευσης των τριγλυκεριδίων στον ανθρώπινο οργανισμό μπορεί να είναι είτε ενδογενής είτε εξωγενής. Τα τριγλυκερίδια, τα οποία αποτελούν το 95% του λίπους στους ιστούς, μεταφέρονται στο πλάσμα με τις πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες, τα χυλομικρά και τις πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL). Κατά τον μεταβολισμό τους τα λιπαρά οξέα απελευθερώνονται στα κύτταρα και η γλυκερόλη χρησιμοποιείται για τη βιοσύνθεση νέων μορίων τριγλυκεριδίων [Marshall., 1998, σελ 285] Εικ.8 Mόριο τριγλυκεριδίου Τα φωσφολιπίδια (PL) Είναι ενώσεις παρόμοιες με τα τριγλυκερίδια με τη διαφορά ότι ένα μόριο λιπαρού οξέος έχει αντικατασταθεί από μια πολική φωσφορική ομάδα και μια αζωτούχα βάση. Είναι αμφίφιλα μόρια δηλαδή περιέχουν μια πολική υδρόφιλη ομάδα και μια μη πολική υδρόφοβη αλυσίδα λιπαρού οξέος (Εικ 9). Σχηματίζονται με τη σύνδεση δυο λιπαρών οξέων, ατόμων άνθρακα, συνήθως το ένα κορεσμένο και το άλλο ακόρεστο, ενός μορίου γλυκερόλης και μιας πολικής ομάδας φωσφορικού οξέος. Η φωσφορική ομάδα μπορεί να συνδεθεί με χολίνη, αιθανολαμίνη, σερίνη ή ινοσιτόλη και να σχηματιστεί η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) (λεκιθίνη)( Εικ 9), φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, φωσφατιδυλοσερίνη ή φωσφατιδυλοινοσιτόλη, αντίστοιχα. Η σφιγγομυελίνη (SM) είναι το

37 [37] μόνο φωσφολιπίδιο του πλάσματος το οποίο δεν έχει στο μόριό του σκελετό γλυκερόλης αλλά σφιγγοσίνης Εικ.9 Το μόριο του φωσφολιπιδίου (PL) Φωσφατιδυλοχολίνη λεκιθίνη, (Phosphatidylocholine PC) Η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) περιγράφηκε αρχικά το 1847 ως συστατικό του κρόκου του αβγού και ονομάστηκε λεκιθίνη από την ελληνική λέξη Λέκιθος [M. Gobley 1850 ( )]. Περιέχει δυο λιπαρά οξέα εστεροποιημένα σε μια γλυκερόλη, ένα δεσμό φωσφοδιεστέρα που συνδέει την τρίτη υδρόξυλ ομάδα με χολίνη [A. Strecker Chem. Pharm. 1868](Εικ. 10) Εικ. 10 Το μόριο της φωσφατιδυλοχολίνη (PC) Τα μόρια (PC) περιλαμβάνουν ένα πλήθος διαφορετικού τύπου και μήκους καθώς και θέσης του διπλού δεσμού ενώσεις. Στο ήπαρ η (PC) περιέχει μια κορεσμένη ακυλ-αλυσίδα στη θέση Sn-1 (π.χ. 16:00 παλμιτικό οξύ ) και ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ (π.χ. αραχιδονικό οξύ) στη θέση Sn-2 [Laura K. Cole, et. al. 2012, A. Yamashita, et. al ]. Η (PC) είναι κύριο συστατικό των ευκαρυωτικών κυτταρικών μεμβρανών και πρόδρομο μόριο σηματοδότησης [G. van Meer, et. al. 2008] και βασικό στοιχείο των λιποπρωτεϊνών [V.P. Skipski 1967] της χολής [D. Alvaro 1986] και του επιφανειοδραστικού παράγοντα των πνευμόνων [J. Perez-Gil, et. al. 2008].

38 [38] Το ήπαρ είναι σημαντικό όργανο τόσο στην σύνθεση όσο και τη παραγωγή λιποπρωτεϊνών του πλάσματος.τα (PL) ως συστατικό των μεμβρανών των λιποπρωτεϊνών παρέχουν προστασία στον υδρόφοβο πυρήνα τους που αποτελείται από τριγλυκερίδια (TG) και εστέρες χοληστερόλης (CE), λόγω της φύσης των μορίων τους [Jonas, M.A. Phillips 2008]. Η (PC) είναι το κύριο φωσφολιπιδικό (PL) συστατικό όλων των κατηγοριών των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος. Είναι γνωστό ότι είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό και λειτουργία της μεμβράνης των λιποπρωτεϊνων [Laura K. C. et. al.2012]. Στα θηλαστικά δύο είναι οι οδοί βιοσύνθεσης της (PC) de novo: Η κυρία οδός η οποία εμφανίζεται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα είναι CDP-choline pathway που περιγράφτηκε από τον Eugene Kennedy την δεκαετία του 1950 γι αυτό και πολλές φορές αναφέρεται και ως Kennedy pathway. Το Kennedy pathway αποτελείται από τρία ενζυμικά βήματα: 1) η κινάση- χολίνης καταλύει την φωσφορυλίωση της χολίνης χρησιμοποιώντας ATP, 2) η CTP phosphocholine cytidylyltransferase ( CT ) καταλύει την αντίδραση μεταξύ φωσφοχολίνης και CTP για να σχηματίσει CDP- choline, 3) η CDP choline 1,2 - diacylglycerol cholinephosphotransferase καταλύει την ανταλλαγή της CMP και διακυλ-γλυκερίνης προς σχηματισμό PC. Τα PC μπορεί επίσης να παραχθούν ενδογενώς από ένα δεύτερο μονοπάτι μέσω τριών διαδοχικών μεθυλιώσεων της (φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης)(pe) από την φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη N μεθυλτρανσφεράσης ( PEMT ) [Jonas, M.A. Phillips, 2008]. Η PEMT οδός είναι ποσοτικά σημαντική μόνο στο ήπαρ όπου συμβάλλει περίπου στο 30% της συνολικής ηπατικής σύνθεσης (PC). H βιοσύνθεση της (PC) πραγματοποιείται στο ήπαρ, η οποία με την σειρά της καθορίζει και τα επίπεδα των λιποπρωτεϊνών, κυρίως της (VLDL) και (HDL) στο πλάσμα. Έχει δειχθεί από διάφορες μελέτες ότι: Μειωμένη βιοσύνθεση (PC) στο ήπαρ σχετίζεται με χαμηλή VLDL στο πλάσμα. Διαγονιδιακοί μύες, με απομονωμένες τις δύο οδούς βιοσύνθεσης της (PC) -(PEMT ή CTα) ενζύμων- παρουσίασαν μειωμένες ποσότητες VLDL (έως και 50% λιγότερο apob100) σε σύγκριση με τα ζώα έλεγχου. [R.L. Jacobs, Lingrell S et. al.(2008.] Τα λιπαρά οξέα (FA) Είναι το κύριο συστατικό των τριγλυκεριδίων και των φωσφολιπιδίων. Στους ζωντανούς οργανισμούς απαντούν κυρίως λιπαρά οξέα μακριάς αλυσίδας (>12 άτομα άνθρακα), ενώ ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι, και τον αριθμό των διπλών δεσμών στο μόριό

39 [39] τους διακρίνονται σε κορεσμένα, εάν δεν υπάρχουν διπλοί δεσμοί, μονοακόρεστα εάν υπάρχει ένας διπλός δεσμός και σε πολυακόρεστα εάν υπάρχουν δυο ή περισσότεροι διπλοί δεσμοί. Το μήκος και ο βαθμός ακορεστότητας των λιπαρών οξέων καθορίζουν τις φυσικές τους ιδιότητες καθώς επίσης και τις ιδιότητες των λιπιδίων των οποίων αποτελούν συστατικά (Εικ 11) COOH Ελαϊκό οξύ COOH Λινελαϊκό οξύ Εικ Λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες είναι ετερογενή μεγαλομοριακά σύμπλοκα λιπιδίων και ειδικών πρωτεϊνών, των απολιποπρωτεϊνών (Apo) διαμέτρου nm, που διασφαλίζουν την μεταφορά στην συστηματική κυκλοφορία και τη διανομή στους ιστούς λιπιδίων (χοληστερόλη,τριγλικεριδία, φωσφολιπίδια ) και λιποδιαλυτών μορίων (βιταμίνες και ορισμένα φάρμακα). Το λιποπρωτεϊνικό σύμπλοκο έχει σφαιρική δομή, που διευκολύνει τη διαλυτότητα του στο υδάτινο περιβάλλον του πλάσματος. Ειδικότερα, το σύμπλοκο αποτελείται από υδρόφοβο λιπώδη πυρήνα, που περιέχει κυρίως τριγλυκερίδια και εστέρες χοληστερόλης, και υδρόφιλη επιφάνεια, που περιέχει πρωτεϊνικά στοιχειά συνδεδεμένα, ανάλογα με το βαθμό υδροφιλίας ή υδροφοβίας τους, με φωσφολιπίδια (κυρίως λεκιθίνες) και ελεύθερη χοληστερόλη. Ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών είναι η ενεργητική διαδικασία εναλλαγής λιπιδίων και απολιποπρωτεϊνών μεταξύ τους και μεταξύ τον ιστών, οι ιδιαιτερότητες της οποίας διαμορφώνουν και τον ιδιαίτερο κίνδυνο ανάπτυξης αθηρωματικής πλάκας. Οι λιποπρωτεΐνες διαχωρίζονται α) βάσει της πυκνότητας (density), με την μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης σε 5 κλάσματα: τα χυλομικρά (CM d<0.96g/ml) τις

40 [40] VLDL (πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες d= g/ml), τις IDL (ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες d= ml), τις LDL (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες, d= g/ml), και τις HDL (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες, d= g/ml. β) βάσει του φορτίου, ηλεκτροφορετικά σε 4 λιποπρωτεϊνικά κλάσματα, τα χυλομικρά, τις β-λιποπρωτεΐνες, τις προ-β-λιποπρωτεΐνες και τις α-λιποπρωτεΐνες. [Κ.Κωτσοβασίλης 2003] Χυλομικρά (CM) Τα χυλομικρά είναι τα μεγαλύτερα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια, με τη μικρότερη πυκνότητα. Συντίθενται στο έντερο και μεταφέρουν κυρίως τα τριγλυκερίδια και την χοληστερόλη των τροφών στα κύτταρα των διαφορών ιστών μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας. Τα τριγλυκεριδία των τροφών που προσδένονται στα χυλομικρά, υδρολύονται από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) στο αγγειακό ενδοθήλιο των τριχοειδών του λιπώδους ιστούς, του σκελετικού και καρδιακού μυός και του μαστού στην διάρκεια της γαλουχίας. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα που προέρχονται από την παραπάνω υδρόλυση, είτε χρησιμοποιούνται για τις ενεργειακές ανάγκες των κυττάρων, είτε αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό σε συμπαγές σώμα άνυδρου λίπους, αφού προηγούμενος επαναεστεροποιηθούν σε τριγλυκερίδια. Η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από την LPL μειώνει τον αρχικό όγκο των χυλομικρών και αυξάνει την περιεκτικότητα τους σε χοληστερόλη. Τα μετασχηματισμένα αυτά χυλομικρά φτάνουν στα ηπατικά κύτταρα και διασπώνται. [Indra Remasamy. 2013] VLDL (πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες). Οι VLDL συντίθενται κυρίως στο ήπαρ αλλά και στο λεπτό έντερο, έχουν διάμετρο 30-70nm και μεταφέρουν τριγλυκερίδια και χοληστερόλη από την συστηματική κυκλοφορία και το ήπαρ στους ιστούς. Περιέχουν τριγλυκερίδια σε ποσοστό >55% των λιπιδίων των VLDL ενώ οι απολιποπρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν ποσοστό έως 10% της ολικής μάζας των VLDL. Στην κυκλοφορία, τα τριγλυκερίδια των VLDL υδρολύονται από την LPL και την ηπατική λιπάση σε γλυκερόλη και λιπαρά οξέα. Τα λιπαρά οξέα μεταφέρονται στην συστηματική κυκλοφορία συνδεδεμένα με λευκωματίνη και είτε χρησιμοποιούνται άμεσα από τους διάφορους ιστούς για ενεργειακούς σκοπούς, είτε αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό. Με τον τρόπο που οι VLDL μετασχηματίζονται μειώνεται συνήθως η διάμετρος και η πυκνότητά τους και μεταπίπτουν

41 [41] σε σωματίδια που ονομάζονται LDL (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες) [Indra Remasamy. 2013] LDL (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες) Οι LDL αντιπροσωπεύουν την τελική μορφή αποικοδόμησης των VLDL και διαχωρίζονται σε LDL 1 (IDL) και LDL 2 είναι σωματίδια διαμέτρου 15-25nm και περιέχουν κυρίως χοληστερόλη σε ποσοστό 70% περίπου του συνόλου των λιπιδίων των LDL, την οποία μεταφέρουν και εναποθέτουν στους ιστούς και τα κύτταρα που φέρουν ειδικούς υποδοχείς LDL. Οι απολιποπρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν το 25% της ολικής μάζας των LDL. Η αύξηση των επιπέδων LDL, λόγω έλλειψης υποδοχέων, συνδέεται άμεσα με κίνδυνο καρδιαγγειοπαθειών. Στον ορό φυσιολογικού ατόμου, οι LDL αντιπροσωπεύουν περίπου το 60% των κυκλοφορούντων λιποπρωτεϊνών. [Indra Remasamy. 2013] HDL (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες) Η HDL είναι οι λιποπρωτεΐνες, μέσης διαμέτρου 6-14nm μεταφέρουν χοληστερόλη από τα περιφερικά κύτταρα στο ήπαρ, όπου δεσμεύονται σε ειδικούς ηπατικούς υποδοχείς των HDL και αποικοδομούνται. Περιέχουν χοληστερόλη σε περιεκτικότητα 40% και φωσφολιπίδια σε ποσοστό 50% των ολικών λιπιδίων. Οι απολιποπρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν το 50% της μάζας του μορίου της HDL. Οι HDL συντίθενται κυρίως στο ήπαρ και λιγότερο στο έντερο και εμπλουτίζονται στην κυκλοφορία με χοληστερόλη και φωσφολιπίδια που προέρχονται από τη λιπόλυση των χυλομικρών και των IDL. Επιπλέoν, οι HDL λειτουργούν ως υποδοχείς των προϊόντων αποικοδόμησης άλλων λιποπρωτεϊνών, όπως των χυλομικρών και φωσφολιπιδίων, προσδένοντας απόλιποπρωτεΐνες (ApoC-I,-II,-III και ApoE) και φωσφολιπίδια, υποβοηθώντας με αυτό τον τρόπο τη σταδιακή τους απομάκρυνση. Ειδικότερα, το ελεύθερο υδροξύλιο της χοληστερόλης των HDL εστεροποιείται στην κυκλοφορία με ταυτόχρονη μεταφορά λιπαρού οξέος (κυρίως του λινολεϊκού ) από τις λεκιθίνες (φωσφολιπίδια) των χυλομικρών, αντίδραση που καταλύεται από το ενζυμο λεκιθινο-χοληστερο-ακυλοτρανσφεράση (LCAT). Ακολούθως, οι εστέρες της χοληστερόλης των HDL αποικοδομούνται στο ήπαρ σε ελεύθερη χοληστερόλη, που καταβολίζεται σε χολικά οξέα και αλλά συστατικά βιοσύνθεσης μεμβρανών και ορμονών. Με τη μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης, οι HDL διαχωρίζονται σε τρεις υποτάξεις: HDL1, HDL2 και HDL3. Οι HDL1 έχουν μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε εστέρες χοληστερόλης. Στην κυκλοφορία υπερέχουν σημαντικά οι υποτάξεις HDL2 και HDL3, με μοριακά βάρη 400 και 200 kda και μέση διάμετρο 10 και 8 nm, αντίστοιχα.

42 [42] Οι HDL κατέχουν κεντρική θέση στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών. Ο ρόλος τους είναι πολύ σημαντικός στη μεταφορά λιπιδίων μεταξύ διαφόρων λιποπρωτεϊνών και μεταξύ λιποπρωτεϊνών και κυττάρων και αποτελούν τη βασική οδό επιστροφής της χοληστερόλης των περιφερικών κυττάρων στο ήπαρ. Πιο αναλυτικά, ο μεταβολισμός των HDL διαγράφει την ακόλουθη πορεία: Οι νεοσχηματιζόμενες στο ήπαρ, δισκοειδούς μορφής, HDL αποτελούνται από φωσφολιπίδια, χοληστερόλη, ApoΑ-Ι, -II, ApoE, ApoC και το ένζυμο LCAT. Απελευθερώνονται στο πλάσμα, όπου αρχίζει ο εμπλουτισμός τους με λιπίδια, προερχόμενα από τις επιφανειακές στιβάδες των χυλομικρών, των VLDL και των IDL, με την καταλυτική δράση της LPL. Η χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια, οι ApoE, ApoΑ-Ι και ApoC μεταφέρονται από τα χυλομικρά, τις VLDL και τις IDL και εμπλουτίζουν την επιφάνεια των HDL. Η ελεύθερη χοληστερόλη εστεροποιείται με την καταλυτική δράση της LCAT, που υπάρχει στα σωματίδια των HDL, παρουσία και της ApoΑ-Ι, που δρα ως ενεργοποιητής. Η εστεροποιημένη χοληστερόλη μετακινείται στον πυρήνα των HDL για να σχηματιστούν οι HDL3, οι οποίες στη συνέχεια δεσμεύουν τη χοληστερόλη των περιφερικών κυττάρων με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: Πρώτον, στο επίπεδο των μακροφάγων, οι HDL3 εισέρχονται στα κύτταρα χωρίς να αποικοδομηθούν, συνδέουν την ελεύθερη χοληστερόλη και επανεξέρχονται. Δεύτερον, στο επίπεδο όλων των άλλων κυττάρων του οργανισμού, οι HDL3 συνδέονται στους ειδικούς υποδοχείς των μεμβρανών. Οι υποδοχείς αναγνωρίζουν την ApoΑ-Ι, -II και -ΙV. Η σύνδεση αυτή ενεργοποιεί τη μετακίνηση της ενδοκυττάριας ελεύθερης χοληστερόλης προς την πλασματική μεμβράνη, διαμέσου του κυκλικού ΑΜP, της διακυλογλυκερόλης και της κινάσης C. Η ελεύθερη χοληστερόλη ακολούθως συνδέεται στις HDL3 με απλή διάχυση. Με την καταλυτική δράση της LCAT, η ελεύθερη χοληστερόλη εστεροποιείται με ένα λιπαρό οξύ, που προέρχεται από ένα μόριο λεκιθίνης. Η εστεροποιημένη χοληστερόλη μετακινείται από την επιφάνεια στο κέντρο των HDL3. Ο εμπλουτισμός των HDL3 με μόρια εστεροποιημένης χοληστερόλης οδηγεί στο σχηματισμό των HDL2. Οι HDL2 αποβάλλουν ένα μέρος της εστεροποιημένης χοληστερόλης που κατευθύνεται στις VLDL και IDL, ενώ συγχρόνως, με την καταλυτική δράση της LPL του πλάσματος, δέχονται ένα μέρος των τριγλυκεριδίων και το σύνολο σχεδόν των ApoC και ApoE των IDL. Οι διεργασίες αυτές μετασχηματίζουν τις IDL σε σωματίδια LDL2 τελικής μορφής. Η εστεροποιημένη χοληστερόλη στον πυρήνα των LDL και των HDL δεσμεύεται στο ήπαρ με τρεις διαφορετικές διεργασίες. Πρώτον, με τα λιποσώματα που περιέχουν τις ApoΒ (VLDL, LDL) και συνδέονται στους μεμβρανικούς υποδοχείς που αναγνωρίζουν την ApoΕ. Δεύτερον, με τη μεταφορά και τη σύνδεση των ApoΕ στις HDL αναγνωρίζεται το σύμπλοκο από τους ηπατικούς υποδοχείς της ApoΕ. Τρίτον, οι HDL, που περιέχουν σε μεγάλο ποσοστό

43 [43] την ApoΑ-Ι, αναγνωρίζονται άμεσα από τους μεμβρανικούς ηπατικούς υποδοχείς της ApoΑ- Ι.[ [Indra Remasamy 2013, Sissel Lund-Katz znd Michael C] (εικ 12). Εικ.12. Η σύνθεση και μετασχηματισμός της HDL Απολιποπρωτεΐνες Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί 14 βασικές απολιποπρωτεΐνες. Ορισμένες από αυτές, όπως η εντερικής προέλευσης ApoB-48, είναι ισχυρά συνδεδεμένες στα χυλομικρά, ενώ η ηπατικής προέλευσης ApoB-100 είναι ισχυρά συνδεδεμένη στις VLDL και LDL, όπου και παραμένουν χωρίς να εναλλάσσονται μεταξύ των διαφόρων λιποπρωτεϊνών. Αντίθετα, άλλες απολιποπρωτεΐνες, όπως οι ApoA-I, -II, E, C-II και C-III, εναλλάσσονται μεταξύ διαφορετικών τάξεων λιποπρωτεϊνών. Οι βασικές πρωτεΐνες των HDL είναι οι ApoA-I και A-II, των χυλομικρών και VLDL οι ApoB-48 και -100 και των LDL πρακτικά μόνο η ApoB-100. [Κ.Κωτσοβασίλης 2003] (Πίνακας 2).

44 [44] Ιδιότητες απολιποπρωτεϊνών Απολιποπρωτεΐνες Συνενζυμική δράση Λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) ενεργοποίηση Λεκιθινο-χοληστερολο-ακετυλο-τρανσφεράση (LCAT) ενεργοποίηση Λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) αναστολή Μεταβολισμός εστέρων χοληστερόλης Σύνδεση απολιποπρωτεϊνών με κυτταρικούς υποδοχείς Υποδοχείς χυλομικρών Υποδοχείς HDL Υποδοχείς LDL Δομικές πρωτεΐνες Χυλομικρά Ηπατικά VLDL HDL ApoC-II ΑpoA-I, ApoC-I ApoC-III ApoD ApoE ApoA-I ApoB-100, ApoE ApoB-48 ApoB-100 ApoA-I, ApoA-II Πίν. 2 οι κυριότερες βιολογικές δράσεις των απολιποπρωτεϊνών [Biochemistry the chemical reactions of living cells (David E. Metzer)] 2.3 Σχέση λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών Φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και (HDL) Από μελέτες σε ζώα στα οποία απουσιάζουν ειδικά ενζυμα βιοσύνθεσης (PC) δημιουργήθηκε μια σχέση μεταξύ των επιπέδων ηπατικής PC και του μεταβολισμού της HDL. Τα επίπεδα των PC και χοληστερόλης σε ΗDL ήταν χαμηλότερα σε Pemt - / - ποντίκια (κατά %) και σε LCTα ποντίκια ( κατά % ) από ό, τι αντίστοιχων wild type ποντικών [R.L. Jacobs, et al., 2004, A.A. Noga, et. al. 2003]. Το αποτέλεσμα αυτό

45 [45] παρουσιάζει ενδιαφέρον γιατί αντίστοιχη πτώση της παροχής χολίνης μέσω της τροφής (απαραίτητης στη βιοσύνθεση (PC) ) δεν έδειξε ανάλογη πτώση στην κυκλοφορία των HDL στο πλάσμα [Z.M. Yao, D et. al. 1989]. Δεδομένης της σπουδαιότητας του ήπατος στο σχηματισμό και την έκκριση των HDLs. [M. Timmins, et al., 2005], καθώς και της βιοσύνθεσης της (PC), ερευνήθηκαν μονοπάτια για την πιθανή σχέση μεταξύ της κυτταρικής (PC) διαθεσιμότητας και του μεταβολισμού της HDL. Σε πειράματα που έγιναν σε πρωτογενείς καλλιέργειες ηπατοκυττάρων που απομονώθηκαν από LCTα ποντίκια, η apo A1 - εξαρτώμενη έκκριση (PC) και (CL) ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη των ζώων ελέγχου [R.L. Jacobs 2000]. Αυτή η μείωση πιθανότατα οφείλεται σε μια μείωση 50% στην έκφραση του ηπατικού ( ABCA1 ) [R.L. Jacobs 2008], το οποίο διευκολύνει τη μεταφορά των φωσφολιπιδίων και της χοληστερόλης σε apo A1 [A. Brooks-Wilson, et al., 1999]. Εν κατακλείδι μπορούμε να συνοψίσουμε ότι, το ήπαρ είναι σημαντικό τόσο για τη σύνθεση της PC όσο και το μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος. Όταν η ηπατική βιοσύνθεση PC είναι μειωμένη, είτε λόγω ανεπάρκειας χολίνης /μεθειονίνης ή λόγω απουσίας ειδικών βιοσυνθετικών ενζύμων της PC ( PEMT ή CTα ), τα επίπεδα VLDLs και HDLs στο πλάσμα μειώνονται. Αυτή η υπολιπιδαιμία είναι το αποτέλεσμα της μειωμένης έκκρισης των σωματιδίων από το ήπαρ, σε συνδυασμό με την αυξημένη πρόσληψη ώριμων λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία. Η ηπατική PC έχει σημαντικές επιπτώσεις στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών επηρεάζοντας τη βιολογική δραστικότητα και έκφραση των βασικών συστατικών που ρυθμίζουν την παραγωγή της ηπατικής λιποπρωτεΐνες ( apo Β υποβάθμιση), καθώς και την έκφραση των ABCA1 ή και του υποδοχέα κάθαρσης Β1 ) [Laura K. Cole, et. al.2012] Σφιγγομυελίνη (SM) φυσιολογικός ρόλος στο μεταβολισμό των λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών Η Σφιγγομυελίνη (SM) εμφανίζει όλα τα δομικά χαρακτηριστικά των φωσφολιπιδικών ενώσεων, διαφοροποιούμενη από αυτά, μόνο στο μοριακό σκελετό καθώς περιέχει σφιγγοσίνη και όχι γλυκερόλη. Η Σφιγγομυελίνη (SM) όπως και τα φωσφολιπίδια είναι μόρια που συμβάλουν στην δομή και λειτουργία τον κυτταρικών μεμβρανών χάρη στην ιδιότητα να συμπεριφέρονται ως δίπολα με την πολική υδρόφιλη ομάδα στο ένα άκρο και τη πολική υδρόφοβη αλυσίδα λιπαρού οξέος στο άλλο που προσδίδει στο μόριο τους την ικανότητα να σχηματίζουν διπλές μεμβράνες με συγκεκριμένες ιδιότητες. [Tilla S. 2007, Megha Bakht O, London E.

46 [46] 2006, Xu X, et. al. 2001]. Ως εκ τούτου αποτελούν βασικό συστατικό των μεμβρανών των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος και τις καθιστούν ικανές για βασικές λειτουργίες, όπως εκροή, απορρόφηση,σύνθεση και μετατροπή της χοληστερόλης,σε χολικά οξέα, εστέρες Χοληστερόλης και μεταβολιτών της. Η ABCG1 μεσολαβεί στη εκροή της (SM) και της χοληστερόλης από τις κυτταρικές μεμβράνες ανάλογα με τα επίπεδα και την διανομή τους στην μεμβράνη. [Ramprasath VR, et. al ]. Επιπλέον η (SM) καθώς και οι μεταβολίτες τους ( κεραμίδιο, γλυκοσυλιοκεραμιδιο) παίζουν σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση των διαφόρων ενζύμων όπως, φωσφατασών, πρετεϊνοκινασών, φωσφολιπασών που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τη φλεγμονώδη απόκριση. [Tilla S. Worgall. 2007, Hannun YA, et. al. 2001]. Η (SM) έχει ισχυρή συγγένεια με την χοληστερόλη και συσχέτιση με την ποσότητα της χοληστερίνης στις μεμβράνες των κυττάρων, η μεταβολική ρύθμιση τους δε φαίνεται ισχυρά συνδεδεμένη μεταξύ τους. [Slotte. 1999]. Έχει αποδειχθεί ότι μικκύλια εμπλουτισμένα σε (SM) μειώνουν σημαντικά την διαλυτότητα της χοληστερόλης σε σύγκριση με τα αντίστοιχα των (PL) [Ramprasath VR, et. al ]. Επίσης άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι οι (SM) αλληλεπιδρούν φυσικά και λειτουργικά με στερόλες, (PL) και λιπαρά μέσω των (SREBPs), που είναι υπεύθυνες για τι ενεργοποίηση 33 γονιδίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των λιπιδίων. [Horton JD et. al ]. Έτσι μπορεί να υποστηρίχθεί βάσει επιστημονικών μελετών ότι η αναστολή σύνθεσης (SM) επηρεάζει τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος. Αύξηση της έκφρασης Apo A1 και της LCAT προκάλεσε αυξημένες συγκεντρώσεις της αντι αθηρογόνου (HDL ), [ Dong J, et. al.2006], καθώς και μείωση αθηρωματικών βλαβών και συσσώρευση μακροφάγων, μια επίδραση ανεξάρτητη από την συγκέντρωση λιπιδίων στο πλάσμα. [Dong J, Liu J et. al Hojjati MR et. al.2005]. Σε άλλες μελέτες απεδείχθει ότι υπερέκφραση της ηπατικής σύνθεσης σε ποντίκια μετατόπισε την συγκέντρωση χοληστερίνης του πλάσματος στις αθηργόνες non HDL λιποπρωτεΐνες.[schissel SL, et. al.1996, Jeong T, et. al.1998]. Γενικά μπορούμε να πούμε ότι υπάρχει ένα επιθυμητό προφίλ στο λόγο της συγκέντρωσης (SM)/(PC) που σχετίζεται με την μείωση του καρδιαγγειακού συμβάντος. [Tilla S. Worgall. 2007]. Σφιγγομυελίνη (SM) και λιποπρωτεΐνες, (HDL). Όπως έχει αναφερθεί οι SM διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών, είναι τα δεύτερα πιο άφθονα μετά τα PL λιπίδια στο πλάσμα θηλαστικών. Συναντάται σε όλες τις σημαντικές λιποπρωτεΐνες ως μέρος των στιβάδων τους. Έως 18%

47 [47] των συνολικών PL του πλάσματος εμφανίζεται ως SM, και ο λόγος SM/Φωσφατιδυλοχολίνη ( PC) ποικίλλει ευρέως μεταξύ των υποκατηγοριών λιποπρωτεϊνών. Τις μικρότερες συγκεντρώσεις παρουσιάζουν οι HDL και αυξάνουν στις non-hdl (LDL, VLDL,) [Lee CY, et. al.2006] Έτσι φαίνεται ότι οι SM επιδρούν στις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος με: 1) Ενίσχυση της ευαισθησίας των λιποπρωτεϊνών προς συσσωμάτωση, που μπορεί να οφείλεται κυρίως στη δράση των μεταβολιτών του (SM) όπως το κεραμίδιο [Dong J.,2006]. 2) Επίδραση της (SM) στην ενεργότητα της LPL μέσω διαφοροποίησης του υποστρώματος της. Παρατηρήθηκε ότι η περιεκτικότητα του υποστρώματος σε (SM) είναι αντίστροφως ανάλογη της κινητικής του ενζύμου LPL [Itaru Arimoto et. al ] και 3) Δραστική μείωση της δράσης της LCAT η όποια είναι υπεύθυνη για την μεταφορά και ενσωμάτωση της ελεύθερης χοληστερόλης (FC) από ο πλάσμα στις διάφορες μορφές των HDL λιποπρωτεϊνων, αυτό είναι σημαντικό γιατί με αυτόν τον τρόπο συντελείται η ωρίμανση του μορίου της HDL από τα πρώιμα δισκία της HDL (Apo A1) σε ώριμες μορφές HDL 3, διαδικασία κατά την οποία πραγματοποιείται η αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης στον οργανισμό. [ Subbaiah PV, et. al.2012] Λιπαρά οξέα (FA) και (HDL) Τα λιπαρά οξέα (FAs) είναι τα κύρια ενεργειακά μόρια καθώς και δομικό συστατικό των τριγλυκεριδίων και των φωσφολιπιδίων. Στους ζωντανούς οργανισμούς απαντούν κυρίως λιπαρά οξέα μακριάς αλυσίδας (>12 άτομα άνθρακα), ενώ ανάλογα με την ύπαρξη ή όχι, και τον αριθμό των διπλών δεσμών στο μόριό τους διακρίνονται σε (SFA), εάν δεν υπάρχουν διπλοί δεσμοί, μονοακόρεστα (MUFA) εάν υπάρχει ένας διπλός δεσμός και σε πολυακόρεστα (PUFA) εάν υπάρχουν δυο ή περισσότεροι διπλοί δεσμοί. Το μήκος και ο βαθμός ακορεστότητας των λιπαρών οξέων καθορίζουν τις φυσικές τους ιδιότητες καθώς επίσης και τις ιδιότητες των λιπιδίων των οποίων αποτελούν συστατικά. Επιπλέον, τα (FA) είναι αγγελιοφόροι σημάτων μέσω της αλληλεπίδρασης τους με υποδοχείς π.χ. ως συστατικό των (PL) : φωσφατιδυλοχολίνη(pc), φωσφατιδυλοινοσιτολη (PI), καθώς και μέσω των (FA) όπως τα n-3 είκοσιπενταενικό (eicosapentaenoic acid (EPA 20:5), docosahexaenoic acid (DHA 22:6) με τους πυρηνικούς υποδοχείς (PPARs). Η σύνθεση των λιπαρών οξέων διαφέρει από είδος σε είδος και από ιστό σε ιστό. Στα ζώα και φυτικούς ιστούς, τα πιο άφθονα FA είναι εκείνα με 16 και 18 άτομα άνθρακα, δηλαδή το παλμιτικό,στεατικό, ελαϊκό και λινελαϊκό. Στα λιπαρά οξέα των θηλαστικών το μήκος της αλυσίδας του άνθρακα αποτελείται από άτομα άνθρακα, με 0-6 διπλούς δεσμούς

48 [48]. Ωστόσο, λιπαρά οξέα με αλυσίδα μικρότερη από 14 και μεγαλύτερη από 22 άτομα άνθρακα υπάρχουν μόνο σε μικρές συγκεντρώσεις. Περίπου το ήμισυ των FA στα φυτά και τα ζώα είναι ακόρεστα και περιέχουν 1-6 διπλούς δεσμούς. [ Tvrzicka E, et. al. 2011]. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ( PUFA) και οι μεταβολίτες τους έχουν μια ποικιλία φυσιολογικών ρόλων: Παροχή ενέργειας, δόμηση μεμβράνών, κυτταρική σηματοδότηση και ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Απαιτήσεις σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα δεν μπορούν να καλυφθούν από τις de novo μεταβολικές διεργασίες μέσα στους ιστούς των θηλαστικών. [Angel Catala 2008] Τα ζώα και ο άνθρωπος είναι απολύτως εξαρτημένα από τα φυτά για την παροχή των δύο μεγάλων προδρόμων ουσιών, των n- 6 και n- 3 λιπαρών οξέων, C18: 2 n- 6 λινολεϊκό και C18 : 3 n- 3 λινολενικό οξύ. (ALA) τα όποια καλούνται και απαραίτητα. [ Das, U.N. 2006] Ο οργανισμός μέσω επιμήκυνσης των αλυσίδων του άνθρακα και τον αποκορεσμό που πραγματοποιείται παρουσία των ντεσατουρασών (πρόσθεση διπλών δεσμών σε συγκεκριμένες θέσεις ανάλογα και με τον τύπο της ντεσατουράσης )μπορεί και συνθέτει τα n-3 και n-6 (ΑΑ 20:4 ) [Alice Mühlroth, et. al. 2013]. Παρόλο που ο ανθρώπινος οργανισμός είναι σε θέση να συνθέσει αυτά τα μόρια η ικανότητα του είναι περιορισμένη, για αυτό και τα n-3(ω-3) (EPA 20:5), (DHA 22:6) τα προσλαμβάνει από τις τροφές ιδίως τους υδρόβιους οργανισμούς που είναι πολύ αποτελεσματικοί στην σύνθεση τους. [Alice Mühlroth et. al. 2013, Das, U.N. 2006, 7, Khozin-Goldberg. 2011]. Τα εικοσανοειδή αυτά μόρια παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο καθώς προσδίδουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες στα TGs και PC που τα καθιστούν συστατικό των μεμβρανών των κυττάρων και λιποπρωτεϊνών.[angel Catala 2008]. Οι μεμβράνες του εγκέφαλου. περιέχουν επίσης μεγάλες ποσότητες αραχιδονικού (ΑΑ) 20:4 n-6) καθώς και DHA, στα PL του, που είναι απαραίτητες για την οπτική και γνωσιακή λειτουργία τους. Οι ευεργετικές δράσεις τους έχουν μελετηθεί αρκετά [Martins, D.A. et. al. 2013, Kremmyda, et. al , Sinn, N. Milte, et. al. 2012,], και είναι αντί-ιικές, αντιβακτηριδιακές,αντίμυκητισιακές. Οι ιδιότητες αυτές φαίνεται να προκύπτουν από την σχέση τους με την αλλαγή της ρευστότητας των PL στις μεμβράνες, καθώς και στην σύνθεση και λειτουργεία τους, την έκφραση γονιδίων και παραγωγή εικοσανοειδών. [Riediger, N.D. et. al. 2009,] Τα εικοσοπενταενοϊκό οξύ ( eicosapentaenoic acid - EPA 20:5 n-3 ) καθώς και αραχιδονικό οξύ (arachidonic acid - ΑΑ 20:4 n-6) είναι πρόδρομα εικοσανοειδών (προσταγλαδίνες, ορμόνες ) (Εικ 13) που εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές ρυθμιστικές λειτουργίες.

49 [49] Τα εικοσανοειδή που προέρχονται από EPA έχουν αντί-αγγειογενετική δράση ενώ αυτά από ( ΑΑ 20:4n-6) έχουν προ αγγειογενετική δράση. Μια άλλη λειτουργεία που χαρακτηρίζει αυτά τα μόρια (EPA), (DHA ) n-3 είναι η ικανότητα τους, λόγω συγγένειας με τους πυρηνικούς υποδοχείς (PPARs), να επηρεάζουν το μεταβολισμό λιπιδιών και τον ενεργειακό μεταβολισμό. Έχει δειχθεί ότι τα n-3 PUFA μέσω της σύνδεσης με τον PPARa,προκαλούν μείωση στην VLDL [ Tvrzicka E, et. al 2011], λόγω της καταστολής του δεσμευτικού στοιχείου (SREBP-1). Άλλες επιδράσεις παρουσιάζονται στην ενεργότητα της LPL και στην μείωση της δραστηριότητας της ApoC-iii [Nasopoulou, C. et. al 2012, 47, Tur, J.A et. al ]. Καθώς έχει αναγνωριστεί πληθώρα ευεργετικών επιδράσεων των PUFA, οι επιστημονικές κοινότητες έχουν προτείνει την ημερήσια πρόσληψη ενδεικτικά ΕPA+DHA 500mg/day για τις Ηνωμένες Πολιτείες και 250mg/day για την Νορβηγία. Επίσης είναι σημαντικό να συνυπολογιστεί ότι εκτός από το ποσό PUFA της ημερησίας πρόσληψης, σημαντικό ρόλο παίζει και η αναλογία n-6/n-3 FA καθώς EPA 20:5 n-3 και ΑΑ 20:4 n-6 ως πρόδρομα μόρια των εικοσανοειδών ανταγωνίζονται για τα κοινά ενζυμα όπως (λιποξυγενάση κυκλοξυγενάση, P-450), με αποτέλεσμα να καθορίζουν και τις αντίστοιχες αναλογίες τον παραγόμενων από αυτά εικοσανοειδών. [Hibbeln, J.R. et. al 2006]. Ο λόγος n-6/n-3 στα FAs στην τυπική δυτική δίαιτα είναι 15/1-16,7/1. Μια αναλογία n-6/n-3 στα FAs 4/1 η και λιγότερο φαίνεται να μειώνει το κίνδυνο πολλών χρόνιων παθήσεων όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα, καρκίνο του παχέος έντερου και μαστού καθώς και το άσθμα. [Alice Mühlroth. et. al 2013] Εικ.13 Μεταβολισμός των απαραίτητων λιπαρών οξέων [A. Catala / Biochemical and Biophysical Research Communications 399 (2010) ].

50 [50] 2.4 Λιπίδια και οξειδωτικό στρες Η οξείδωση των λιπιδίων είναι η κυριότερη αιτία της αλλοίωσης των τροφίμων Συστήματα όπως το φώς, η θερμότητα, τα ενζυμα, τα μέταλλα, οι μεταλλοπρωτείνες και οι μικροοργανισμοί, καταλύουν διαδικασίες οξείδωσης των λιπιδίων [Fereidoon Sshahidi.2005]. Τα λιπίδια υφίστανται επίσης αυτό-οξείδωση, η οποία ορίζεται σαν η τυχαία αντίδραση οξυγόνου (Ο 2 ) με αυτά. Η διαδικασία επιταχύνεται σε υψηλές θερμοκρασίες οπότε ονομάζεται θερμική οξείδωση.[ E. G. Perkins, et. al 1992, M. Gordon, et. al 2001]. Τα ακόρεστα λιπαρά οξέα (UFA) είναι αυτά που υφίστανται τέτοιες αντιδράσεις, και απαντούν είτε ως ελεύθερα λιπαρά οξέα, ως τριάκυλο-γλυκερόλες, ή ως φωσφολιπίδια. Η αυτό-οξείδωση και η θερμική οξείδωση αποδίδεται σε αντιδράσεις ελευθέρων ριζών οι οποίες ακολουθούν 3 βήματα [Kamal-Eldin, M. et. al, 2003]: Έναρξη (Initiation) : Εξέλιξη (Propagation): Λήξη (Termination):

51 [51] Τα υπεροξείδια (Hydroperoxides) των λιπιδίων έχουν αναγνωριστεί σαν τα πρωτογενή προϊόντα της υπεροξείδωσης. Η αποδόμηση των υπεροξειδίων αποδίδει, αλδεΰδες, κετόνες, αλκοόλες, υδρογονάνθρακες, υδατάνθρακες, πτητικά οργανικά οξέα και εποξειδια που είναι γνωστά ως δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης. [ J. Velasco, et. al 2004] Τα λιπίδια των βιολογικών μεμβρανών περιέχουν κυρίως φωσφολιπίδια τα οποία αποτελούνται επί το πλείστον από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) και είναι κατά κύριο λόγο ευαίσθητα στην υπεροξείδωση. Από την ομάδα (-CH 2 -) αποσπάται ένα (Η) και αφήνει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο επί του άνθρακα (C) του (-. CH-) Η παρουσία ενός διπλού δεσμού στο λιπαρό οξύ εξασθενεί τον δεσμό (C-H) για το άτομο του άνθρακα (C) που βρίσκεται κοντά στο διπλό δεσμό με συνέπεια να διευκολύνεται η απόσπαση (Η). Η αρχική αντίδραση της ρίζας του (. ΟΗ) με τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) παράγει μια λιπιδιακή ρίζα (L. ) που με την σειρά της αντιδρά με μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) προς σχηματισμό μιας υπεροξυλικής ρίζας λιπιδίου (LOO. ), με την σειρά της η ρίζα (LOO. ) μπορεί να αφαιρέσει υδρογόνο από ένα γειτονικό λιπαρό οξύ σε μια αλυσιδωτή αντίδραση προς σχηματισμό υπεροξειδίων (LOOH) και ριζών λιπιδίων (L. ) [Angel Catala Lipid 2008]. Επιπλέον τα υπεροξείδια (LOOH) μπορούν να αντιδράσουν με ιόντα (Fe + ) σε μια αναγωγική διαδικασία προς σχηματισμό αλκοξυλ ρίζας (LO. ) λιπιδίων προς μια ακόμα αλυσιδωτή αντίδραση αφαίρεσης υδρογόνου (Η) από τα παρακείμενα λιπίδια. [Buettner, G.R., 1993] Οξείδωση της LDL Μια άμεση συνέπεια της οξείδωσης των λιπιδίων στον οργανισμό είναι και αυτή την οξείδωσης των λιποπρωτεϊνών. Συγκεκριμένα η οξείδωση της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας LDL διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της αρτηριοσκλήρυνσης, αιτία για την οποία έχει μελετηθεί εκτενέστατα και αποτελεί έναν δείκτη κινδύνου για καρδιαγγειακές παθήσεις στον άνθρωπο. [Parthasarathy S, et. al 2008, Steinberg D. Et. al. 2010]. Η δημιουργία αθηρωματικής πλάκας στο ενδοθήλιο του τοιχώματος των αγγείων, πραγματοποιείται μετά την συσσώρευση αφρωδών κυττάρων στην περιοχή, τα οποία σχηματίζονται από μακροφάγα που κατευθύνονται στην εν λόγω θέση. [Steinberg D 2002] Ο μηχανισμός αφρωδών κυττάρων λιπιδιακού περιεχομένου δεν είναι απολύτωςς κατανοητός, έχει προταθεί αυτός της οξειδωμένης LDL.

52 [52] Ως γνωστόν η πρόσληψη της LDL από τους υποδοχείς της είναι μια διαδικασία κατά την οποία μειορυθμίζεται η περίσσια της κυτταρικής χοληστερόλης στο πλάσμα μέσω του(srebp) και διατηρείται έτσι σε φυσιολογικά επίπεδα. Παρόλα αυτά διάφορες άλλες μορφες της LDL όπως η οξειδωμένη (oxldl) η ακετυλιωμενη LDL φαίνεται να προάγουν την διαδικασία σχηματισμού αφρωδών κυττάρων μετά την έλευση των μακροφάγων, τα οποία παίζουν το ρόλο καθαριστών των (oxldl).[ Steinberg D. 2002, Brown MS, et. al 1986, Horton JD et. al 2002]. Μπορεί να υποστηριχτεί ότι μορφές της LDL όπως η (oxldl ) παρουσιάζουν μια προαθηρογόνα κατάσταση στον οργανισμό λόγω της αύξησης παραγόντων στο ενδοθήλιο όπως: διέγερση των ενδοθηλιακών κυττάρων και μονοκυττάρων, αύξηση φλεγμονωδών κυτοκινών, χημειοκυτοκινών, μορίων προσκόλλησης, διέγερση μονοκυττάρων/μακροφάγων προς αύξηση του ιστικού παράγοντα καθώς και των μεταλλοπρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας με τελικό προϊόν το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων.[steinberg D. 2009]. Παρ όλο ότι το μόριο της LDL είναι ισχυρά προστατευμένο από αντιοξειδωτικά συστήματα, όπως αυτό της α-τοκοφερόλης [Itabe H. 2009], μπορεί να οξειδωθεί από μη ενζυμικά συστήματα, με την μετάβαση μεταλλικών ιόντων, αίμης και πολλών καταλυτών [Steinberg D. 2009]. Η διαδικασία της οξείδωσης της LDL εμφανίζεται σε δύο σταδία. [ Stocker R, Keaney Jr JF. 2005]. Αρχικά οξειδώνονται τα λιπίδια των μεμβρανών των LDL, διαδικασία κατά την οποία δεν επηρεάζονται οι απολιποπρωτεΐνες B100,αυτες οι LDL ( = ελάχιστα οξειδωμένες LDL,επάνοδος στην κυκλοφορία) διατηρούν την συνάφεια για τους LDL υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυτάρων και ενεργοποιούν αντι-αποπτωτική σηματοδότηση και επαγωγή φλεγμονής με αύξηση χημειοκινών και κυτοκινών οξείδωση περαιτέρω του μορίου της LDL, στο επίπεδο των απολιποπρωτεϊνών της μεμβράνης τους(= έντονα οξειδωμένες oxldl) με αποτέλεσμα την αναγνώριση από τους υποδοχείς κάθαρσης των ενδοτοχωματικών μακροφάγων και σχηματισμό των αφρωδών κυτάρων [Hiroshi Yoshida and Reiko Kisugi. 2010].

53 [53] Εικ. 14 Μηχανισμοί της LDL-οξείδωσης και σχηματισμός αφρωδών κυττάρων (μακροφάγων ) στο τοίχωμα της αρτηρίας. [Hiroshi Yoshida and Reiko Kisugi. 2010]

54 [54] Εικ.15 Διάγραμμα των βημάτων λιπο-υπεροξείδωσης φωσφολιπιδίων που περιέχουν δοκοσα-εξα-ενοϊκό οξύ (22:6 n-3) R1= λιπαρό οξύ, R2= κλασματικά προϊόντα οξείδωσης λιπαρών οξέων. [Angel Catala 2008]

55 [55] Οξείδωση και αντιοξειδωτικές ιδιότητες της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (HDL) Η HDL Λιποπρωτεΐνη είναι ένας από τους σημαντικότερους μεταφορείς χοληστερίνης (CL) στο αίμα, μέσω της ικανότητας της να προάγει την κυτταρική εκροή χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα προς απέκκριση στο ήπαρ, διαδικασία που καλείται αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης [Eugene A Podrez 2010] Παρόλα αυτά πρόσφατες μελέτες έχουν πρόσδώσει στην HDL σημαντικές αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ικανότητες. [ Kontush, and Chapman MJ 2006, Navab M, et al. 2000]. Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες της HDL μπορεί να είναι άμεσες ή έμμεσες. Η HDL μπορεί να αναστείλει άμεσα την οξείδωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) ή και άλλα στοιχεία που περιέχουν φωσφολιπίδια (PL). Μια πρώτη τέτοια λειτουργία είναι και αυτή της αφαίρεσης των προϊόντων οξείδωσης από τις οξειδωμένες LDL (oxldl) παίζοντας το ρόλο ενός ταμιευτήρα οξειδωμένων λιπιδίων. Επιπλέον μπορεί να διαδραματίσει με έμμεσο τρόπο την αναστολή της οξείδωσης μέσω του φυσιολογικού της ρόλου της αντίστροφης μεταφοράς της χοληστερόλης, καθώς και των αντιφλεγμονωδών λειτουργιών της. [Ansell BJ, et. al 2007]. Έχει δε αποδειχθεί ότι η HDL συσσωρεύει οξειδωμένα φωσφολιπίδια όπως : υπεροξείδια, λυσο-φωσφατιδυλοχολίνη και F2 ισοπροστάνες (hyperoxides, lysophoshatidylocholine,(lyso-pc), F2 isoprostanes). [ Bowry VW, et. al 1992, Proudfoot JM, 2009]. Αυτή η διαδικασία εξυπηρετεί πολλούς σκοπούς με πρώτον, αυτόν της μεταφοράς υδρουπεροξειδίου του λιπιδίου από τις LDL, με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της έναρξης αλυσιδωτής αντίδρασης οξείδωσης των λιπιδίων. Δεύτερον, μερικά από τα προϊόντα της οξείδωσης των (PL) χρησιμοποιούνται ως συνδέτες για τους υποδοχείς κάθαρσης τύπου Β (SR-B)(Serve as scavenger receptors type B) οι οποίοι προωθούν την πρόσληψη των τροποποιημένων λιποπρωτεϊνών από τα μακροφάγα [Podrez EA, et. al 2002, Valiyaveettil M, Podrez EA. 2009]. Είναι ενδιαφέρον πως κατά την διάρκεια της οξείδωσης των (PL) είναι παρόντες στην HDL, και συγκεκριμένα στην οξειδωμένη της μορφή (oxhdl) παρουσιάζουν υποδοχείς διαφορετικούς, που προσδίδουν στο μόριο της HDL λειτουργίες αντίθετες από αυτές των (oxldl) [Valiyaveettil M, et. al 2008].

56 [56] Η μετάβαση των οξειδωμένων (PL) προς τις (HDL) ακολουθείται από αποικοδόμηση των προϊόντων οξείδωσης από ένζυμα της (HDL) ή μεταφορά στο ήπαρ προς αποικοδόμηση προστατεύοντας τον οργανισμό από παθολογικές επιδράσεις.[ Heinecke JW 1987]. Κανονικά η HDL έχει υψηλά επίπεδα αντιοξειδωτικών. Πρωτεΐνες και ένζυμα με υψηλή αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση[ansell BJ, et. al 2007], ωστόσο όταν οι αντιοξειδωτικές και αντί φλεγμονώδεις ιδιότητες του μορίου της HDL καταστέλλονται από διάφορους παθολογικούς παράγοντες όπως η φλεγμονή, η HDL μετατρέπεται σε δυσλειτουργικό προφλεγμονώδες μόριο. [Navab M, Reddy et. al 2009, Ansell BJ, et. al 2007], που χαρακτηρίζεται από μειωμένα επίπεδα αντιφλεγμονωδών και αντιοξειδωτικών παραγόντων (ApoA-I, PON1). Οι δυσλειτουργικές HDL περιέχουν επίσης οξειδωμένα φωσφολιπίδια (PL) και λυσοφωσφολιπίδια και δεν μπορούν να προωθήσουν την εκροή χοληστερόλης ή να εμποδίσουν την οξείδωση της LDL. Εκτός από τις αλλαγές στην σύσταση των HDL που συμβαίνουν σε παθολογικές καταστάσεις τα πρωτεϊνικά ή λιπιδικά στοιχεία τους μπορεί να τροποποιηθούν χημικά. [Ferretti G, et. al 2006], μεταβάλοντας την φυσιολογική προστατευτική λειτουργιά της HDL. Η HDL είναι ευαίσθητη στην οξειδωτική τροποποίηση από ποικίλα οξειδωτικά όπως ιόντα μέταλλων, υδροξύλια και ρίζες υδροξυλίων, αλδεΰδες και μυελοϋπεροξειδάση ( MPOcatalysed oxidative ApoA-I), με αποτέλεσμα την απώλεια των (ABCA-1) και κατ επέκταση τη μη λειτουργικότητα του μορίου, στην φυσιολογική διαδικασία της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης και μετατροπή της HDL σε ένα προφλεγμονώδες μόριο. [Bergt C, et. al 2004, Zheng L, et. al 2004].

57 [57] 3. Οξειδωτικό στρες και διατροφή 3.1 Δίαιτες υψηλών λιπαρών Η παχυσαρκία είναι ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας που συνδέεται άμεσα με καρδιοαγγειακές και μεταβολικές παθήσεις και δευτερογενώς με νευρικές βλάβες. Τα τελευταία χρόνια οι περιπτώσεις παχυσαρκίας στις βιομηχανικές (δυτικές) χώρες αυξάνονται στατιστικά αποτελέσματα εμφανίζουν ότι πάνω απο το 17% των παιδιών και 32%των ενηλίκων στις Ηνωμένες Πολιτείες θεωρούνται παχύσαρκοι. Άλλωστε και η χώρα μας δεσπόζει στις πρώτες θέσεις της παιδικής παχυσαρκίας στην Ευρώπη. Η παχυσαρκία και οι επιπλοκές που συνδέονται με αυτήν όπως ο διαβήτης, η δυσλιπιδαιμία, η αθηροσκλήρωση και κάποιες μορφές καρκίνου μελετώνται όλο και εντονότερα τα τελευταία χρόνια με την βοήθεια νέων αναλυτικών τεχνικών. Πρόσφατα με τη χρήση διατροφογενετικής (nutrigenomics) ανάλυσης μελετήθηκαν 31 γονίδια που εμπλέκονται με την παχυσαρκία σε πειραματικό μοντέλο ποντικών (C57Bl/6J) που έλαβαν δίαιτα υψηλών λιπαρών. Τα αποτελέσματα εμφάνισαν αύξηση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την β-οξείδωση και σύνθεση των λιπαρών οξέων και παράλληλη μείωση σ αυτά που σχετίζονται με την βιοσύνθεση στερολών και αντιοξειδωτικών πρωτεϊνών[e.kim et.al., 2010]. Το οξειδωτικό stress και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία προτείνονται συχνά σαν κεντρικοί μηχανισμοί σε διάφορους ιστούς παχύσαρκων μοντέλων και σχετίζονται με την εμφάνιση διαβητικών επιπλοκών όπως χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και διαβητική νευροπάθεια. Αυξημένες εκπομπές H 2 O 2 από τα μιτοχόνδρια κυττάρων νεφρού συμβάλλουν στην μεταβολή την οξειδοαναγωγικής ισορροπίας και την παραγωγή ROS σε πειραματικά ποντίκια υπό δίαιτα υψηλών λιπαρών[c.ruggerio et.al. 2011]. Επιπρόσθετα, μελέτη σε νευρικά κύτταρα φλοιού του εγκεφάλου επίμυων έδειξαν ότι διατροφή υψηλών λιπαρών προκαλεί νευρικό οξειδωτικό stress, φλεγμονή και ενεργοποίηση του παράγοντα nfκb μέσω της βιοχημικής οδού της NADPH οξειδάσης [X.Zhang et.al. 2005].

58 [58] Εικ 16 Δίαιτα υψηλών λιπαρών (High fat Diet) και μεταβολικό σύνδρομο[sunil K. Panchal et al. 2010] 3.2 Διατροφικοί παράγοντες με ρόλο αντιοξειδωτικό Δίαιτα υψηλών λιπαρών και Zn Πρώτη φορά το 1930 ο ψευδάργυρος αποδείχθηκε ότι αποτελεί αναπόσπαστο στοιχείο της κρυσταλλικής δομής της ινσουλίνης και απο τότε πολλές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για να φωτίσουν τη σχέση μεταξύ του ψευδαργύρου και της δράσης της ινσουλίνης. Μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει ότι ο ψευδάργυρος είναι σε θέση όχι μόνο να σταθεροποιήσει τη δημιουργία των εξαμερών ινσουλίνης, μια μορφή αποθήκευσης της ινσουλίνης στα β-κύτταρα, αλλά και να βελτιώσει επίσης τη δέσμευση της ινσουλίνης στους υποδοχείς του ήπατος και να αναστείλει την αποδόμησή της [Arquilla ER 1978]. Σε μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τρωκτικά,συμπληρωματική χορήγηση ψευδαργύρου εξασθένησε την υπεργλυκαιμία και την υπερινσουλιναιμία σε αυτά [Simon SF et.al 2001]. Σε περιπτώσεις ανεπάρκειας Zn ο οργανισμός είναι πιο ευπαθής σε οξειδωτικό stress και υπεροξείδωση των λιπιδίων. Ενώ αντίθετα η παρουσία του Zn αποτρέπει την λιπιδιακή υπεροξείδωση και πιθανώς δρά σαν αναστολέας της NADPH οξειδάσης [Tapiero H, 2003].

59 [59] Συμπληρώματα Zn έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνουν τον γλυκαιμικό έλεγχο σε διαβήτη τύπου 1 και 2 αλλά ο μοριακός μηχανισμός δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως. Ο Zn παρουσιάζει ινσουλινομιμητικά αποτελέσματα μειώνοντας την παραγωγή κυτοκινών και ενισχύοντας την μεταγωγή του σήματος ινσουλίνης. Οι νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP) σε γονιδιακούς τόπους πρωτεϊνικών και ενζυμικών ψευδαργυρομόριων είναι ελάχιστα μελετημένοι, αλλά φαίνεται να είναι σημαντικοί για τον μεταβολισμό των λιπιδίων[lietz G, 2009]. Μελέτες δείχνουν ότι ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 έχει συσχετιστεί με γονιδιακούς πολυμορφισμούς στα γονίδια τόσο του μεταφορέα του Zn, ZNT-8, που είναι υπεύθυνος για τροφοδότηση Zn στα β-παγκρεατικά κύτταρα, όσο και στο γονίδιο της μεταλλοθειονίνης 1 [Jansen J.et.al 2009]. Επιπρόσθετα SNP στην περιοχή του προμότορα της IL-6 (-174/G/C) φάνηκε να επηρεάζει την έκφραση των ΜΤs αλλά και την διαθεσιμότητα Zn [Mocchegiani E, 2008]. Οι πολυπαραγοντικές αλληλεπιδράσεις του ψευδαργύρου σε γονιδιακούς τόπους δεν είναι πλήρως αναγνωρισμένες. Όπως προαναφέρθηκε περισσότερα από 500 ένζυμα και μεταγραφικοί παράγοντες εώς τώρα είναι αποδεδειγμένο οτι εξαρτώνται από τον Zn και οι μορφές «δακτύλου» Zn (zinc-finger), που έχουν την ικανότητα σύνδεσης με DNA, RNA, πρωτεΐνες και με μικρά σηματοδοτικά μόρια είναι απαραίτητες για πλήθος φυσιολογικών κυτταρικών λειτουργιών και έκφραση γονιδίων. Η αλληλεπίδραση αυτή επηρεάζει ορισμένες κυτοκίνες (IL-6 και TNF-α) και πρωτεΐνες του στρες (HSP70-2) και επιδρά στην επιτυχή γήρανση και στις ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία, όπως ο διαβήτης τύπου 2, η αθηροσκλήρωση και διάφορες λοιμώξεις. [E.Mocchegiani, 2010]. Η ινσουλίνη είναι ο κύριος ρυθμιστής του μεταβολισμού των λιπών και υδατανθράκων και έχει φανεί ότι η ρύθμιση και έκκριση της συνδέεται άμεσα με τον Zn. Μάλιστα ο προμότορας των γονιδίων της (Ins1 και Ins2) βρέθηκε οτι περιέχει περιοχές ευαίσθητες σε μέταλλα (MRE) στις οποίες συνδέεται ο μεταγραφικός παράγοντας Mtf-1 και ενεργοποιεί την γονιδιακή έκφραση της ινσουλίνης στα παγκρεατικά-β κύτταρα.πρόσφατη μάλιστα έρευνα έδειξε ότι ο μεταφορέας ψευδαργύρου ZnT7 παίζει σημαντικό ρόλο στην έκφραση των επιπέδων ινσουλίνης, ρυθμίζοντας την δράση του Mtf-1. Η υπερέκφραση δε του ZnT7 σε παγκρεατικά κύτταρα στην ίδια μελέτη έδειξε υψηλά επίπεδα έκκρισης ινσουλίνης[l. Huanga. 2010].

60 [60] Εικ. 17: Λήψη δίαιτας υψηλών λιπαρών για παρατεταμένο χρονικό διάστημα οδηγεί στην ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS, μειώνει την μεταγραφική έκφραση των δεσμευτών ελευθέρων ριζών (free radical scavengers) καθώς και την ενεργότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων [Jue Cui et.al. 2009]. 3.3 Heat Shock proteins (HSPs) Γενικά Χαρακτηριστικά Κατά την μετάφραση των πρωτεϊνών, καθώς όλα τα αλληλεπιδρώντα αμινοξέα δεν είναι ακόμη παρόντα, δεν είναι δυνατό οι νέες πολυπεπτιδικές αλυσίδες να σχηματίσουν όλους τους απαραίτητους δεσμούς που σταθεροποιούν την τελική πρωτεϊνική δομή. Ο κορεσμός του ένδο- και έξω-κυττάριου περιβάλλοντος σε πρωτεΐνες διαδραματίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη σταθερά αναδίπλωσης των πολυπεπτιδίων. Οι πρωτεΐνες μοριακοί «συνοδοί» (chaperones) έχουν την δυνατότητα να αναγνωρίζουν και επιλεκτικά να δεσμεύουν μη ενσωματωμένες πρωτεΐνες και να τις μετατρέπουν σε σταθερά μόρια.[ R. J. Ellis, 1990]. Τα πρωτεϊνικά μόρια συνοδοί διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο αποτρέποντας λάθη στην πρωτεϊνική δόμηση και συσσώρευση μη-αναδιπλωμένων ενδιάμεσων. Σήμερα είναι γνωστό ότι οι μοριακοί πρωτεϊνικοί συνοδοί (Chaperones) και ομο-συνοδοί (Co-chaperones) συγκροτούν μοριακές νανομηχανές οι οποίες επιδιορθώνουν (μέσω πρωτεϊνικής αναδίπλωσης) ή απομακρύνουν από το κύτταρο (μέσω μηχανισμών καταβολισμού) λανθασμένα πρωτεϊνικά υποστρώματα. Μέσω αυτών των μηχανισμών το

61 [61] κύτταρο αυξάνει την ικανότητα επιβίωσης διότι αφενός μεν αυξάνει τα φυσιολογικά μόριά του και αφετέρου απομακρύνει τα κατεστραμμένα και μη-λειτουργικά πρωτεϊνικά υποστρώματα. Σε περιπτώσεις στρες τα μη-φυσιολογικά υποστρώματα αυξάνονται και εμπλέκονται στον δρόμο των φυσιολογικών μορίων εμποδίζοντας έτσι τα μεταβολικά μονοπάτια να προσφέρουν τα προϊόντα τους και να επιτευχθεί ομοιοστασία των κυττάρων. [F. U. Hartl, 1996]. Οι μοριακοί συνοδοί αποτελούνται απο ποικίλες εξελικτικά διατηρημένες πρωτεΐνες, οι περισσότερες των οποίων ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των Hsp s Οικογένεια Heat Shock Proteins Οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ Hsp (Heat shock proteins) αποτελούν μια οικογένεια πρωτεϊνών, η λειτουργία των οποίων είναι να προστατεύουν τα κύτταρα από περιβαλλοντικά ή παθοφυσιολογικά ερεθίσματα, ούτως ώστε να επιβιώνουν σε καταστάσεις ανάγκης και να επανακτούν τη φυσιολογική τους λειτουργικότητα. Οι Hsps ταξινομούνται σε διαφορετικές οικογένειες με βάση το μοριακό τους βάρος: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 και τις μικρότερες ομάδες των Hsps. Θεωρείται ότι εξελικτικά πιο διατηρημένες είναι οι πρωτεΐνες συνοδοί της οικογένειας των Hsp70 [P. J. Muchowski,et al. 2005]. Πίνακας 3: Υποκυτταρική εντόπιση και λειτουργίες των ομάδων Hsp [Muchowski et.al 2005].

62 [62] Σχεδόν όλες οι ομάδες των Hsp έχουν τουλάχιστον ένα μέλος τους εκφρασμένο σε σταθερά επίπεδα που συμμετέχει σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η ενδοκυττάρια μεταφορά και η τρισδιάστατη δόμηση των πρωτεϊνών (housekeeping role), ενώ άλλες πρωτεΐνες συνοδοί των Hsp παράγονται αποκλειστικά ή σε αυξημένα επίπεδα σε καταστάσεις ανάγκης ανάλογα με τον τύπο και το είδος του ερεθίσματος. Το κοινό χαρακτηριστικό στις σταθερά εκφραζόμενες και στις επαγόμενες Hsps είναι ότι δεσμεύουν τα εκτεθειμένα υδροφοβικά τμήματα των μη αναδιπλωμένων πολυπεπτιδίων, ώστε να επιτραπεί η δόμηση, η μεταφορά και η συνδεσμολογία του πολυπεπτιδίου, μέσω ενός κύκλου δέσμευσης και απελευθέρωσης [B. Bukau, et al., 2006] Hsp70 Η οικογένεια των Hsp70 κυμαίνεται σε μεγέθη απο 70 έως 78 kda και έχει αποδειχθεί ότι είναι η πιο άφθονα εκφρασμένη Hsp στα κύτταρα, φθάνοντας έως και 1-2% των κυτταρικών πρωτεϊνών [Madden LA et.al., 2008].Οι πιο μελετημένες Hsp72 και Hsp73 εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, εμφανίζουν όμοια χαρακτηριστικά, με κύρια διαφορά την εύκολη επαγωγή της Hsp72 απο το στρες [Noble EG et.al. 2008]. Σαν ομο-συνοδοί πρωτεΐνες οι Hsp70 αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες για την αποφυγή δημιουργίας συσσωματωμάτων και υποβοήθηση της σωστής αναδίπλωσης τους. Στις σημαντικές λειτουργίες των Hsp συμπεριλαμβάνονται η μετατόπιση πρωτεϊνών, η αντιαποπτωτική τους δράση και η αντι-φλεγμονώδης τους απόκριση. Η αντιφλεγμονώδης δράση των Hsp70 στηρίζεται στην αλληλεπίδραση τους με πρωτεΐνες που σχετίζονται με των πυρηνικό παράγοντα j B(NF-jB), διακόπτοντας την μεταφορά του στον πυρήνα και συνεπώς την φλεγμονώδη αντίδραση [Homem de Bittencourt Jr PI et.al.,2007].σχετικά πρόσφατα οι Hsp βρέθηκε να επηρεάζουν την κυτταρική επικοινωνία[calderwood SKet.al, 2007], την ανοσοποιητική απάντηση [Johnson JD et.al. 2006] και να εμπλέκονται σε καταστάσεις χρόνιων παθήσεων[kampinga HH et.al.,2007]. Η ρύθμιση της έκφρασης των Hsp γίνεται με τους μεταγραφικούς παράγοντες HSF και τα στοιχεία HSE στην περιοχή του προμότορα του Hsp γονιδίου. Σε φυσιολογικές συνθήκες ο HSF είναι ανενεργός και μονομερώς συνδεδεμένος με τις κυτταροπλασματικές Hsp70, χάνοντας την ικανότητα δέσμευσης στο DNA. Σε συνθήκες στρες του κυττάρου ή παρουσία ξεδιπλωμένων πρωτεϊνών, οι Hsp70 απελευθερώνουν τον HSF και δεσμεύουν τις μη φυσιολογικές πρωτεΐνες (δράση συνοδών). Ο απελευθερωμένος HSF έπειτα απο συγκεκριμένες φωσφορυλιώσεις, τριμερίζεται (trimerisation) και μπορεί να συνδεθεί ισχυρά με τις περιοχές HSE του DNA, εκκινώντας έτσι την μεταγραφή των Hsp mrna [Noble

63 [63] EG et.al. 2008].Οποιαδήποτε μη θανατηφόρα έκθεση σε στρεσογόνους παράγοντες προκαλεί την εμφάνιση των Hsp70 στο κυτταρόπλασμα [Madden LA et.al., 2008]. Εικ 18: Ενεργοποίηση της απόκρισης του θερμικού σοκ. Α) Σε ηρεμία ο HSF-1 είναι ανενεργός και συνδεδεμένος με την HSP70. B) Σε συνθήκες μή θανατηφόρου στρες και υπό την παρουσία μετουσιωμένων πρωτεϊνών (DP) η HSP70 συνδέεται με αυτές ελευθερώνοντας την HSF-1 η οποία εκκινεί την μεταγραφή του Hsp70 mrna. C) Μετά την προσαρμογή στο στρεσογόνο παράγοντα τα επίπεδα HSP70 στο κύτταρο είναι υψηλότερα και συνδέονται με τον HSF-1 διακόπτοντας την περαιτέρω παραγωγή HSP70. [M. Krause et. al., 2011] Η παρουσία και η αύξηση των Hsp είναι σημαντική για την προσαρμογή του κυττάρου στο στρες. Σε περιπτώσεις αναστολής ή απουσίας τους το αποτέλεσμα είναι αυξημένη ευαισθησία του κυττάρου σε στρεσογόνα ερεθίσματα[rubio E et.al., 2002]. Έπειτα απο μια στρεσογόνα κατάσταση στο κύτταρο ο Hsp70 συνδέεται και πάλι με τον HSF, αποτρέποντας έτσι την δέσμευση του στο HSE και την παραγωγή περαιτέρω Hsp70. Τελικά τα αυξημένα επίπεδα των Hsp70 επιφέρουν προσαρμογή του κυττάρου στον στρεσογόνο παράγοντα Δίαιτα υψηλών λιπαρών και Hsp70 Προαναφέρθηκε ότι οι Hsps έχουν μελετηθεί ευρέως ως προς τις ικανότητες τους να συμβάλουν στην σωστή πρωτεϊνική αναδίπλωση, την κυτταρική προστασία σε στρες και την συνολική ομοιόσταση του κυττάρου. Πρόσφατα φάνηκε ότι σε επίμυες υπο δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD), θερμική θεραπεία μπορεί να βελτιώσει την ανοχή στη γλυκόζη και την ευαισθησία των μυών στην ινσουλίνη, μειώνοντας την ενεργοποίηση των στρες κινασών [Gupte AA et.al 2009]. Συγκεκριμένα η Hsp70 φαίνεται να δρα ως αναστολέας της JNK εvώ η Hsp25 της IKKβ [Alford K. et.al., 2007]. Σε άλλη in vivo μελέτη σημειώθηκε οτι έκφραση της Hsp70 προστατεύει από αντίσταση ινσουλίνης που προκαλείται σε παχυσαρκία μέσω παρεμπόδισης της φωσφορυλίωσης της JNK [Chung J et.al.,2008]. Η ενεργοποίηση των κυττοκινών εξ αιτίας χαμηλών επιπέδων Hsp στους ιστούς με ινσουλινο-αντίσταση είναι

64 [64] σχετικά νέα θεωρία στις μελέτες μεταβολικών παθήσεων και διαβήτη και σύμφωνα με τον Chung J. η πρόκληση έκφρασης Hsp θα μπορούσε να αποτελέσει ελπιδοφόρα νέα θεραπευτική προσέγγιση στην θεραπεία της αντίστασης ινσουλίνης. Πιο πρόσφατη μελέτη σε μοντέλο πειραματοζώων υπό υψηλή δίαιτα λιπαρών και με διαβήτη τύπου-2 έδειξε ότι η φαρμακευτική αύξηση των επιπέδων των Hsp27 και 70 μειώνει την αντίσταση ινσουλίνης, την δυσλιπιδαιμία, την δυσλειτουργία των β-κυττάρων και μερικώς ρυθμίζει το οξειδωτικό stress [Sharma AK et.al 2011]. Σύγχρονη κλινική μελέτη σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 ίδιας ηλικίας έδειξε ότι ενώ τα επίπεδα του αντιοξειδωτικού συστήματος της γλουταθειόνης (GSSG) μειώνονται, τα επίπεδα των Hsps αυξάνονται στο πλάσμα. Η αυξημένη έκφραση τους θεωρείται ότι έχει διατηρηθεί έπειτα από το αρχικό συστεμικό οξειδωτικό stress[calabrese V et.al 2012]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει έρευνα που εξέτασε την επίδραση της αυξημένης πρόσληψης διατροφικών λιπαρών και την ηλικία στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Hsp70. Έχει παρατηρηθεί ότι σε μεγαλύτερες ηλικίες η Hsp70 μειώνεται,ενώ τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα αυξάνονται με σύγχρονη εμφάνιση αντίστασης της ινσουλίνης. Παρόλα αυτά η έρευνα αυτή, με χρήση πειραματικών πιθήκων που υποβλήθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών έως και για 6 χρόνια, έδειξε ότι η διατροφή είναι ίσως πιο σημαντικός παράγοντας απ ότι η ηλικία για να καθοριστούν τα επίπεδα της Hsp70 [Kavanagh K et al 2012]. 3.4 Ζωικά πειραματικά μοντέλα στις λιπιδαιμίες και την αθηροσκλήρωση. Τα ζωικά πειραματικά μοντέλα έχουν διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην κατανόηση των λιπιδαιμιών, μιας αιτίας που επάγει σοβαρές βλάβες στον οργανισμό. Παρόλο αυτά η επιστήμη στερείται ένα ζωικό μοντέλο αξιόπιστο για την πλήρη κατανόηση του φαινομένου αυτού.[ Fatemeh Ramezani Kapourchali et. al 2014]. Η επιστήμη των ζώων εργαστηρίου έχει προσφέρει αρκετά γενετικά τροποποιημένα και διαγονιδιακά μοντέλα που προσμοιάζουν την ανθρώπινη αθηρωμάτωση, ωστόσο κάθε ένα από αυτά έχει διάφορους περιορισμούς, πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, γι αυτό και οι διάφορες λιπιδαιμικές μελέτες έχουν αναπτυχθεί ανάλογα με τον πειραματικό σχεδιασμό που έχει επιλεγεί για την προσομοίωση της νόσου. π.χ δίαιτες υψηλών λιπαρών (High Fat Diets). Μπορεί να ειπωθεί ότι μια σωστή πειραματική προσέγγιση θα ήταν ένα ιδανικό ζωικό μοντέλο για την μελέτη της ανθρώπινης νόσου που θα διαθέτει όλα εκείνα τα

65 [65] χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένων της διαθεσιμότητας, τις προσιτές τιμές, καθώς και τη στενή ομοιότητα με τις ανθρώπινες παραμέτρους Χοίροι Οι χοίροι έχουν χρησιμοποιηθεί για την επαγωγή της στεφανιαίας αθηροσκλήρωσης από διάφορα εργαστήρια [Holvoet P, et. al 1998], ωστόσο το μοντέλο αυτό απαιτεί υψηλά επίπεδα διαιτητικής χοληστερόλης, μέχρι και (4% w/w ). Έχουν επίσης επιλεγεί διάφορα στελέχη με γενετικές μεταλλάξεις των λιποπρωτεϊνών (Lpb5, Lpr1,Lpu1) που προσφέρονται για μοντέλα λιπιδαιμιών χωρίς χρήση πειραματικών διαιτών. Παρότι οι χοίροι παρουσιάζουν αθηρωματικές βλάβες εκτός της στεφανιαίας αρτηρίας καθώς και της λαγόνιας αρτηρίας χρειάζονται έναν μεγάλο χρόνο ανάπτυξης της νόσου, περίπου 2έτη.[Prescott MF, et. al 1991] Κουνέλι Ο κόνικλος είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ζωικό μοντέλο και προσαρμόζεται πολύ καλά σε μοντέλα διατροφικής τροποποίηση που προκαλούν λιπιδαιμίες και αθηροσκλήρωση. Παρουσιάζουν διαφορές ομοιότητες του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών με τους ανθρώπους οι οποίες περιλαμβάνουν, την απολιποπρωτεΐνη Β100, την ηπατική λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), και την δραστηριότητα (ενεργότατα) του (Cholestero- ester- transfer- protein,(cetp ) στο πλάσμα, διατηρώντας επίσης την ικανότητα πρόσληψης διαιτητικής χοληστερίνης σε υψηλά ποσοστά [Fatermeh Ramezani Kapourchali, et. al Hoeg JM, et. al 1996]. Παρόλα αυτά τα ζώα αυτά παρουσιάζουν έλλειψη ηπατικής λίπασης που καθιστά των μεταβολισμό τον λιπιδίων διαφορετικό από αυτόν του ανθρώπου. Τροποποίηση της δίαιτας είναι συνήθης προσέγγιση η οποία επάγει αθηρωματικές βλάβες στο αορτικό τόξο της θωρακικής αορτής άλλα όχι σε αυτή της κοιλιακής, η οποία επηρεάζεται συνήθως στον άνθρωπο. Οι κόνικλοι (New Zealand White) είναι το πιο συνηθισμένο στέλεχος, άλλα έχουν επιλεγεί επίσης και άλλα σύμφωνα με τα γενετικά τους χαρακτηριστικά, όπως το (WHHL) και το (St Thomas Hospital STH) τα οποία είναι ελλειμματικά ως προς τους υποδοχείς LDL κ.λ.π.[ Szeto A, et. al Aliev G, et. al 1998].

66 [66] Έχουν παραχθεί και μερικά διαγονιδιακά στελέχη κονίκλων, κύριος πάνω σε (New Zealand White) στέλεχος, με τροποποιήσεις στης απόλιποπρωτεΐνες ApoA-I για τον έλεγχο των HDL [Aliev G, Burnstock G 1998] Ινδικά χοιρίδια (Guinea Pig) Το ινδικό χοιρίδιο παρουσιάζει εντυπωσιακά χαρακτηριστικά όσον αφορά τη σχέση του με τον ανθρώπινο οργανισμό, στο λιπιδαιμικό προφίλ. Το μεγαλύτερο ποσό της χοληστερόλης του πλάσματος μεταφέρεται από της LDL. Επίσης τα ζώα αυτά εκφράζουν τη (CETP),την λιποπρωτεϊνική λιπάση καθώς και την (LCAT) παρόμοια με τον ανθρώπινο οργανισμό [ Xiangdong Li, et. al 2011]. Με δίαιτα υψηλών λιπαρών το ινδικό χοιρίδιο επάγει αορτική συσσώρευση χοληστερόλης η οποία καταστέλλεται με διαιτητικούς ή φαρμακευτικούς παράγοντες. Χρησιμοποιούνται επίσης και για τη διερεύνηση του μεταβολισμού των τριγλυκεριδίων [ Fernandez, M.L., and Volek, J.S. 2006]. Ωστόσο τα ινδικά χοιρίδια δεν παρουσιάζουν αθηρωματικές αλλοιώσεις και είναι δύσκολα σε χειρουργικούς χειρισμούς. επιπλέον δε απουσιάζουν διάφορα αντισώματα για μελέτες της φλεγμονώδους αντίδρασης.[xiangdong Li, et. al 2011] Επίμυες (αρουραίος) Οι επίμυες είναι ένα ζωικό μοντέλο που χρησιμοποιείται ευρύτατα σε πειραματικά μοντέλα, εν τούτοις παρουσιάζουν κάποια μειονεκτήματα όσον αφορά μοντέλα δισλιπιδαιμίας. Ο επίμυς δεν παράγει (CETP) πλάσματος και θεωρείται γενικά ανθεκτικός στην αθηρογένεση, επίσης το 80% της χοληστερίνης του πλάσματος βρίσκεται στις HDL. Ένας ακόμα μειονέκτημα είναι ότι οι επίμυες παρουσιάζουν μεγάλη αποτελεσματικότητα στην μετατροπή της χοληστερίνης σε χολικά οξέα και επίσης αλλοιώσεις που παρατηρούνται στα αγγεία των επιμύων δεν είναι παρόμοιες με αυτές του ανθρώπου. Γενικά οι επίμυες παρουσιάζουν υποαπεκκριτικότητα χοληστερόλης και για αυτό η τροποποίηση της δίαιτας σε λιπιδαιμικά πειράματα πρέπει μαζί με τις υψηλές συγκεντρώσεις χοληστερόλης και λιπαρών,να περιέχουν και ένα ποσοστό χολικού οξέος και θείοουρακίλης [Joris, I et. al.1983]. Λίγα είναι τα στελέχη με κληρονομικά χαρακτηριστικά υπερλιπιδαιμίας όπως τα (Zucker Dibetic Fatty Rats (fa/fa), Otsuka Long-Evens, Kushima Fatty Rats, Goto Kakizaki Rats).[ Sunil K.

67 [67] Panchal and Lindsay Brown. 2011]. Και ελάχιστα στελέχη διαγονιδιακών που υπερεκφράζουν ανθρώπινα γονίδια, όπως τα (DS hypertensive strain of rats) που υπερεκφράζουν το γονίδιο του (CETP). [Herrera, V.L.M., et. al 1999] Άλλα ζωικά μοντέλα Κύνες [Geer JC, Guitry MA. 1965], χάμστερ [Dillard A, et. al 2010] και πτηνά [Wagner WD, et. al 1973] έχουν χρησιμοποιηθεί σε πειράματα αθηροσκλήρωσης. Μειονεκτήματα τα οποία παρουσιάζουν είναι αιτία που δεν είναι δημοφιλή ως ζώα εργαστηρίου.[fatemeh Ramezani Kapourchali, et. al 2014] Μυς (ποντικός) Επί του παρόντος, το ποντίκι είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο είδος για μελέτες δυσλιπιδαιμίας και αθηροσκλήρωσης. Το ποντίκι και ο άνθρωπος παρουσιάζουν διάφορες παραμέτρους που μπορεί να επηρεάσουν την αθηροσκλήρωση. Οι βλάβες που παρουσιάζουν τα ποντίκια κατά την διάρκεια ενός δυσλιπιδαιμικού αρτηριοσκληρωτικού πειραματικού μοντέλου, δεν είναι πανομοιότυπες με αυτές του ανθρώπου. Στους ανθρώπους οι βλάβες συμβαίνουν στα στεφανιαία, καρωτιδικά και περιφερικά αγγεία π.χ. λαγόνια αρτηρία, ενώ στα ποντίκια στην αορτική ρίζα και στο αορτικό τόξο με αρκετές παθολογοανατομίες διαφορές στον τύπο της αλλοίωσης της ενδοθηλιακής στιβάδας των αγγείων. Επίσης το μέγεθος του ζώου αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για χειρουργικούς χειρισμούς, παρόλο που τα τελευταία χρονιά η πρόοδος της ανοσοϊστοχημείας έχει περιορίσει το εν λόγω πρόβλημα. [ Godfrey S. Getz and Catherine A. Reardon. 2012]. Μια ακόμα σημαντική διάφορα με τον ανθρώπινο οργανισμό είναι και αυτή της χοληστερόλης του πλάσματος, ενώ η ανθρώπινη χοληστερόλη μεταφέρεται κυρίως από τις LDL στο πλάσμα, στο ποντίκι περίπου το 80% της χοληστερόλης του πλάσματος βρίσκεται στις HDL και επιπλέον παρουσιάζει διαφορές στα διάφορα κλάσματα της HDL που γνωρίζουμε ότι παρουσιάζουν διαφορετική αντιαθηρογόνο δράση. [Davidson WS, et. al. 2009] Τα ποντίκια επίσης δεν εκφράζουν την (CETP) στο πλάσμα τους. [Davidson MH. 2010].

68 [68] Παρ όλα αυτά πολλά από τα κρίσιμα χαρακτηριστικά της αθηρωματικής διαδικασίας είναι κοινά. Κύρια πλεονεκτήματα του ποντικού σχετίζονται με το χαμηλό κόστος αγοράς και συντήρησης, την ευκολία αναπαραγωγής, ευκολία γενετικού χειρισμού, καθώς και την δυνατότητα να παρουσιάζουν τα αθηρωματικά αποτελέσματα σε εύλογο χρονικό διάστημα. Υπάρχει μεγάλος αριθμός καθαρόαιμων στελεχών (inbred strains) που το κάθε ένα παρουσιάζει διαφορετική ευαισθησία στην ανάπτυξης αθηροσκλήρωσης με αποτέλεσμα να υπάρχει μεγάλη δυνατότητα τροποποίησης του γονιδίου ή γονιδιακού προφίλ που εμπλέκεται στον προσδιορισμό της ευαισθησίας ή αντίστασης σε αθηροσκλήρωση. Την ιδιότητα αυτή έχουμε εκμεταλλευτεί για να δημιουργήσουμε αιμομικτικά στελέχη καθαρόαιμων ποντικών με συγκριμένα χαρακτηριστικά (π.χ. C57BL/6 ob/ob), και πιο πρόσφατα διαγονιδιακά στελέχη που προορίζονται για την ερεύνα συγκεκριμένων παραμέτρων της νόσου.[teupser D, et. al Smith JD, et. al Sunil K. Panchal and Lindsay Brown 2011,]. Έτσι τα καθαρόαιμα στελέχη ποντικών (inbred strains) μέσω των πανομοιότυπων γενετικών χαρακτηριστικών παρέχουν σημαντική γνώση στους μηχανισμούς της ασθένειας και παρόλο που δε παρουσιάζουν όμοιες αθηρωματικές βλάβες με τον άνθρωπο παρόλα αυτά με την χρήση μια τροποποιημένης δίαιτας υψηλών λιπαρών /χοληστερόλης (High Fat Diet) παρατηρούνται αθηρωματικές αλλοιώσεις, όπως αυτες των αφρωδών κυττάρων σε μικρό χρονικό διάστημα, παρόλο που δεν μπορούμε να υποστηρίξουμε αν αυτό οφείλεται σε αθηρωματική διαδικασία ή φλεγμονή που προκαλείτε από την διατροφή. Οι διατροφές αυτές μπορούν να αυξήσουν μέσω της περίσσειας χοληστερόλης την (VLDL) έναντι της (HDL) η οποία μεταφέρει το σύνολο της χοληστερόλης του πλάσματος, και αυτό εν μέρει διαφέρει μεταξύ των καθαρόαιμων στελεχών. Έτσι μπορούμε να κατατάξουμε αυτά τα στελέχη με βάση την ευαισθησία τους στην αναπτύξει διατροφικής υπερλιπιδαιμίας, με το στέλεχος (C57BL/6) να είναι το πλέον ευαίσθητο στην ανάπτυξη αθηρωμάτωσης και το (C3H) το ποιο ανθεκτικό και το (BALB/c) σε μια ενδιάμεση θέση. [ Susanne Zadelaar, et. al 2007]. Παρά την εκτεταμένη χρήση των καθαρόαιμών στελεχών ποντικών στην έρευνα της αθηροσκλήρωσης ο αριθμός τους μειώνεται καθώς η ανάπτυξη διαγονιδιακών στελεχών γίνεται όλο και πιο συχνή.

69 [69] Εικ. 19 Σύγκριση μεταξύ διαφόρων ζωικών μοντέλων και των ανθρώπων, τον επιπέδων λιποπρωτεϊνικής χοληστερόλης [Fernandez et al., 1999; Ramaswamy et al., 1999; Fernandez and Volek, 2006]. HDL: high-density lipoprotein, LDL: low-density lipoprotein, VLDL: very low-density lipoprotein Διαγονιδιακά και (Gene Targeted ) μοντέλα ποντικών. Αρκετά διαγονιδιακά και (Gene Targeted ) μοντέλα ποντικών έχουν δημιουργηθεί για την ανάπτυξη δισλιπιδαιμίας και την μελέτη της αθηροσκλήρωσης. Η αυξημένη ευαισθησία των ζώων αυτών στην ανάπτυξη αρτηριοσκληρωτικής βλάβης οφείλεται στην υπερέκφραση, ή υποέκφραση, ή και την απουσία γονιδίων που ρυθμίζουν των μεταβολισμό διαφόρων στοιχείων εξέλιξης της νόσου, π.χ ρύθμιση και μεταβολισμό λιποπρωτεϊνών. Αυτά τα στελέχη παρέχουν ενδείξεις για τις μεταβολικές ανωμαλίες των λιπιδίων και τον τύπο των αθηρωματικών βλαβών που σχηματίζονται. Τα πιο συνήθη μοντέλα που χρησιμοποιούνται, είναι αυτά που υπερεκφράζουν την απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoE+/+) στις διάφορες ισομορφές της και αυτά που υποεκφράζουν ή δεν εκφράζουν την ApoE ή τους υποδοχείς της LDL (LDL-/-), αυτά τα μοντέλα μπορούν να αυξήσουν υπέρμετρα το ποσό της χοληστερόλης στις VLDL και LDL του πλάσματος κάτω από συγκεκριμένες δίαιτες [Andres deluna. 2008].

70 [70] Άλλα στελέχη που έχουν δημιουργηθεί για τον έλεγχο της αθηροσκλήρωσης είναι και αυτά που σχετίζονται με την τροποποίηση γονιδίων έκφρασης άλλων απολιποπρωτεϊνών (ApoB48,ApoB100) ή πυρηνικών υποδοχέων υπεύθυνων για τον μεταβολισμό των λιπιδίων όπως αυτά που υπερεκφράζουν ή δεν εκφράζουν τους PPERa, PPERd. Σήμερα που ο γονιδιακός χάρτης των ποντικών είναι γνωστός, μπορούμε να υπερεκφράσουμε ή να καταστείλουμε η να προσθέσουμε γονίδια και να στοχεύσουμε ένα πειραματικό μοντέλο πάνω σε αυτά. Έχουμε προαναφερθεί στην σχέση μεταξύ της δυσλιπιδαιμίας με την HSP70 καθώς και την σχέση της με τiς πειραματικές δίαιτες υψηλών λιπαρών. Υπάρχουν σήμερα τέτοια στελέχη που υπερκφράζουν την ανθρώπινη HSP70.[ Plumier JC, et. al 1995]. Καθώς έχουν μελετηθεί και τεκμηριωθεί σε πειραματικές μελέτες η καρδιοπροστατευτική ικανότητα της HSP70 σε σχέση με το έμφραγμα αλλά και την ισχαιμία [Naka K.K. et. al. 2014], εν τούτοις δεν υπάρχει κάποια ερεύνα σε ζώα που υπερεκφράζουν την HSP70 και διατρέφονται με δίαιτες υψηλών λιπαρών. Πιν. 4 : Επίδραση του γενετικού υπόβαθρου ποντικών και της διατροφής τους, στον έλεγχο των αθηρωματικών βλαβών. [Adres deluna 2008]

71 [71] Υλικά και μέθοδοι 1.Ζώα πειράματος και πειραματικές δίαιτες 1.1 Ομάδες ζώων-χρονική διάρκεια-στέγαση Για την παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν 40 ενήλικα αρσενικά ποντίκια του στελέχους C57Bl/6 * DBA και 42 ενήλικα αρσενικά ποντίκια του ίδιου στελέχους τα οποία έχουν τροποποιηθεί γενετικώς ώστε να υπερεκφράζουν το ανθρώπινο γονίδιο της Hsp70 [Plumier JC, et. al. 1995]. Κάθε μια από τις παραπάνω ομάδες διαιρέθηκε σε 4 επιμέρους ομάδες με 6-12 πειραματόζωα ανά υποομάδα. Τα πειραματόζωα κάθε υποομάδας έλαβαν διαφορετικής σύνθεσης δίαιτα. Πιο συγκεκριμένα, μια από τις παραπάνω υποομάδες έλαβε διατροφή chow diet με συγκεκριμένη σύνθεση βιταμινών και μετάλλων AIN93G, ενώ οι υπόλοιπες 3 ομάδες έλαβαν διατροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά αλλά διαφορετική περιεκτικότητά σε ψευδάργυρο (3, 30 και 300mg Zn υπό τη μορφή ZnSO4/kgr τροφής αντίστοιχα). Σε κάθε περίπτωση η τροφή χορηγήθηκε κατά βούληση. Επίσης, το χορηγούμενο νερό είχε προηγουμένως φιλτραριστεί για την απομάκρυνση του Zn και άλλων βαρέων μετάλλων, ενώ τα κάγκελα και η ποτίστρα των κλωβών οξινίστηκαν με διάλυμα νιτρικού οξέως (20%V/V) για την μείωση των καταλοίπων του μετάλλου Διατροφή Αριθμός F1/F1 Αριθμός Transgenic Tg/Tg Chow Diet (30 Zn) 6 10 High Fat Diet (3 Zn) High Fat Diet (30 Zn) 9 8 High Fat Diet (300 Zn) Πιν.5 Οι ομάδες των ζώων πειράματος. Οι πατρικές γενεές των διαγονιδιακών ζώων που χρησιμοποιήθηκαν για αναπαραγωγή είχαν ελεγχθεί και πιστοποιηθεί με PCR από την ομάδα του καθηγητή Χ. Αγγελίδη στο εργαστήριο Βιολογίας για την παρουσία του γονιδίου της ανθρώπινης Hsp70 σε ομόζυγη κατάσταση (Tg/Tg). Ο απογαλακτισμός των πειραματόζωων της θυγατρικής γενεάς που προέκυψε πραγματοποιήθηκε την 21 η ημέρα από τη γένηση. Τα αρσενικά πειραματόζωα της γενιάς αυτής τοποθετήθηκαν σε κλωβούς με 4-5 πειραματόζωα ανά κλωβό. Σε κάθε

72 [72] κλωβό, τα ζωα σημάνθηκαν με την μέθοδο της κοπής των αυτιών. Για τις επόμενες 10 ημέρες, όλα τα πειραματόζωα σιτίστηκαν με chow diet έως την ηλικία του ενός μηνός. Στη συνέχεια, ακολούθησε σίτιση με διαφορετική δίαιτα ανά ομάδα όπως αναφέρθηκε παραπάνω και για χρονικό διάστημα διάρκειας 10 εβδομάδων. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, πραγματοποιήθηκαν εβδομαδιαίες μετρήσεις του βάρους των ζώων σε ζυγό ακριβείας για την εκτίμηση της αύξησης του σωματικού βάρους, καθώς επίσης και εβδομαδιαίος έλεγχος της γενικότερης κατάστασης των ζώων. Ο χειρισμός των πειραματοζώων έγινε σύμφωναμε τους διεθνείς κανόνες σωστής πρακτικής πειραματοζώων (Directive 2010/63/EU -FELASA ). Σε όλη τη διάρκεια του πειραματικού μέρους οι χειρισμοί γίνονταν με γνώμονα το λιγότερο άγχος-stress για τα ζώα και τις καλύτερες συνθήκες διαβίωσης τους. Τα πειραματόζωα στεγάζονταν σε χώρο ελεγχόμενου περιβάλλοντος μειωμένων παθογόνων, με δωδεκάωρους κύκλους νύχτας-μέρας και θερμοστάτη χώρου ο C. Όλος ο πειραματικός προγραμματισμός είχε με άξονα τη διατήρηση των 3 ων R (reduce, replace, refine) δηλαδή την μείωση του απαιτούμενου αριθμού ζώων για την αναγκαία στατιστική σημαντικότητα αποτελεσμάτων, την αντικατάσταση της χρήσης του in vivo πειραματικού μοντέλου σε in vitro όποτε είναι δυνατό και την εκλέπτυνση της ποιότητας ζωής των πειραματόζωων. 1.2 Σύνθεση δίαιτας πειραματοζώων Η δίαιτα παρασκευάστηκε από την εταιρία (mucedoola s.r.l italy)συμφώνα με την ατομική συνταγή την οποία προσέφερε το εργαστήριο Φυσιολογίας για το σκοπό, της κάλυψης των πειραματικών απαιτήσεων του πειράματος της εν λόγω εργασίας. Η δίαιτα παρασκευάστηκε σε μορφή πάστας και διατηρήθηκε σε αεροστεγείς συσκευασίες του 1Kg σε θερμοκρασία C. Η σύνθεση τις δίαιτας ως αναφορά τα απαραίτητα στοιχεία βιταμινών και μετάλλων έγινε σύμφωνα με το διατροφικό πρότυπο του αμερικανικού ινστιτούτου διατροφής ζώων εργαστήριου (American institute of nutrition AIN93G) και ανταποκρίνεται στις αναπτυξιακές ανάγκες τρωκτικών εργαστηρίου μέχρι το στάδιο της ενηλικίωσης τους. Ο αριθμός της παρτίδας παραγωγής είναι ( για την HFD Zn3, για την HFD Zn30, για την HFD Zn300). Η αναλυτική σύνθεση της δίαιτας φαίνεται στον παρακάτω πιν. 6.

73 [73] HFD Zn30 HFD Zn3 HFD Zn300 Σογιέλαιο Λαρδί Πρωτεΐνη αβγού Άμυλο καλαμποκιου Maltodextrin Σουκρόζη Σελουλόζη AIN93 mineral mix zinc free mg/kg Zn 44 no Zn mg/kg Zn KH 4 PO AIN93 vitamin mix Choline bitartrete Biotin premix Πιν. 6: Σύνθεση των τριών HFD: 3mg, 30mg, 300mg Zn /kg τροφής 1.3-Θανάτωση Συλλογή ιστών και αποθήκευσή τους. Μετά την συμπλήρωση της 10 ης εβδομάδας του πειράματος τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν μετά από μέτρηση του σωματικού τους βάρους και του μήκους του σώματός τους. Αρχικά τα πειραματόζωα αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση κεταμίνης (0,3 ml ketaset 100mg/ml). Ακολούθησε συλλογή αίματος από τον οφθαλμό των πειραματόζωων και θανάτωση με απαγχονισμό. Η όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τους διεθνείς κανόνες σωστής πειραματικής πρακτικής (FELASA).Για τη συλλογή των ιστών πραγματοποιήθηκε τομή της κοιλιακής χώρας και προσεκτική απομάκρυνση της καρδιάς και του ήπατος. Τα παραπάνω όργανα ξεπλύθηκαν Με τη μέθοδο perfusion in situ με την χρήση ισότονου διάλυματος φωσφορικού άλατος (PBS), καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και τοποθετήθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (-80 ο C).

74 [74] 2. Τεχνικές προσδιορισμού αντιοξειδωτικού προφίλ ( TAC και SOD) 2.1 Μέτρηση δραστηριότητας της υπεροξειδάσης δισμουτάσης-sod Η δισμουτάση του υπεροξειδίου(sod), είναι ένα ένζυμο το οποίο καταλύει τη μετατροπή ανιόντων υπεροξειδίου σε υπεροξείδιο του υδρογόνου και αποτελεί ένα από τα πιο αποτελεσματικά ενδοκυττάρια ενζυμικά συστήματα έναντι του οξειδωτικού στρες. Η δυσμουτάση του υπεροξειδίου απαντά σε αρκετές ισομορφές, οι οποίες διαφέρουν κυρίως ως προς τη φύση του μετάλλου του ενεργού τους κέντρου άλλα και τη σύνθεση των αμινοξέων,τον αριθμό των υπομονάδων τους και άλλα χαρακτηριστικά. Στον άνθρωπο απαντούν τρεις μορφές SOD, η κυτταροπλασματική CuZn-SOD, η μιτοχονδριακή MnSOD και η εξωκυττάρια SOD. Η SOD έχει την ικανότητα να καταστρέφει τις ρίζες οξυγόνου με απίστευτα υψηλές ταχύτητες αντίδρασης με τη διαδοχική οξείδωση και την αναγωγή του μετάλλου του ενεργού της κέντρου με τον εξής μηχανισμό : Εικ. 20: Αρχή μεθόδου μέτρησης της SOD M (n+1) +-SOD + O 2 M n +-SOD + O 2 // M n +-SOD + O 2 + 2H + M (n+1) +-SOD + H 2 O 2 Για να καθορίσουμε τα επίπεδα ενός τόσο σημαντικού αντιοξειδωτικού ενζύμου υπό τις διαφορετικές συγκεντρώσεις ιόντων Zn στα ερυθρά αιμοσφαίρια χρησιμοποιήσαμε βιομηχανικό kit μέτρησης ενεργότητας SOD (Lot# BCBD6760) σε φωτόμετρο ELISA. Η αρχή της συγκεκριμένης μεθόδου στηρίζεται στην χρώση ενός υδατοδιαλυτού άλατος του τετραζολίου (WST-1 ), το οποίο παρουσία ανιόντων υπεροξεδίου δημιουργεί υδατοδιαλυτή πορφυρή χρώση φορμαζάνης. Ο ρυθμός μείωσης του Ο 2 σχετίζεται γραμμικά με τη δραστικότητα της οξειδάσης της ξανθίνης και η οποία αναστέλλεται από την υπεροξειδάση της δισμουτάσης (Εικ.20). Έτσι δίνεται η δυνατότητα υπολογισμού της δραστικότητας της SOD με μέτρηση της απορρόφησης με φωτόμετρο ELISA. Για να σπάσουν τα κυτταρικά τοιχώματα των ερυθρών αιμοσφαιρίων και να απελευθερωθούν τα αντιοξειδωτικά ένζυμα χρησιμοποιήθηκε υπότονο δ/μα NaCl (0.45%). Πιο συγκεκριμένα, σε 250μL ερυθρών αιμοσφαιρίων προστέθηκαν 750μL δ/τος NaCl 0.45%. Στη συνέχεια, τα ερυθρά αναδεύτηκαν με τη βοήθεια πιππέτας Pasteur για να σπάσουν τα

75 [75] τοιχώματα και ακολούθησε ανάδευση σε Vortex. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στις 3500 στροφές και το χωρίς κυτταροσκελετικά κατάλοιπα υπερκείμενο διάλυμα συλλέχθηκε για να μετρηθεί σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρείας παραγωγής του kit μέτρησης 2.2 Μέθοδος μέτρησης Ολικής αντιοξειδωτικής Ικανότητας Μια επιπρόσθετη μέθοδος για να εκτιμήσουμε το οξειδωτικό προφίλ στις ομάδες των πειραματόζωων μας είναι η TAC (Total Antioxidant Capacity assay ή Blue CrO 5 ). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη χρήση ενός ισχυρού οξειδωτικού, του υπεροξειδίου του χρωμίου (Cr(O 2 ) 2 H 2 O ή εν συντομία CrO 5 ). Η ουσία αυτή είναι προϊόν της αντίδρασης : (NH 4 ) 2 Cr 2 O 7 + 4H 2 O 2 + 2H + 2Cr(O 2 ) 2 H 2 O + 4H 2 O + αμμωνιακό άλας Το υπεροξείδιο του χρωμίου είναι ένα βαθυκύανο προϊόν σχετικά σταθερό σε πολικούς οργανικούς διαλύτες με μέγιστο φωτομετρικής απορρόφησης λ= 569 nm σε ισοαμυλική αλκοόλη, και λ=566 nm σε ανθρακικό προπυλεστέρα. Για το όξινο περιβάλλον της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν οξέα όπως το H 2 SO 4. Όταν τα προϊόντα της αντίδρασης 1 αναμιχθούν με οργανικό διαλύτη, π.χ ισοαμυλική αλκοόλη, το σχηματιζόμενο CrO 5 μεταφέρεται στην οργανική φάση του διφασικού διαλύματος ( διάλυμα 1). Τα αντιοξειδωτικά μόρια οποιασδήποτε ουσίας ή βιολογικού δείγματος, εάν προστεθούν στο ως άνω διάλυμα 1,καταστέλλουν το βαθυκύανο χρώμα του CrO 5. Ο βαθμός καταστολής του χρώματος του διαλύματος 1, ελεγχόμενος φωτομετρικά, αντιστοιχεί στην Αντιοξειδωτική Ικανότητα ( ή την οξειδωτική κατάσταση ) του υπό εξέταση δείγματος. Με βάση τα παραπάνω η μέθοδος βαθμονομήθηκε όσον αφορά την Αντιοξειδωτική Ικανότητα (διάλυμα 1) σε αντιστοιχία με συγκέντρωση α-τοκοφερόλης (βιταμίνη-ε), ως πρότυπου αντιοξειδωτικού σώματος [Charalampidis PS, 2009] Με την παραπάνω μέθοδο εκτιμάται η αντιοξειδωτική ικανότητα του συνόλου των αντιοξειδωτικών παραγόντων (π.χ. ασκορβικό οξύ ή γλουταθειόνες) που μπορεί να υπάρχουν στο πλάσμα του αίματος των ζώων που χρησιμοποιήσαμε. Σαν δ/μα μάρτυρα για το φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιήσαμε γνωστής συγκέντρωσης (0,1Μ) βιταμίνη Ε (ατοκοφερόλη) διαλυμένη σε ισοβουτανόλη. Η αναλογία των αντιδραστηρίων σε κάθε καλυπτρίδα ήταν: 480μl ισοβουτανόλης/160μl H 2 SO 4 / 160μl διχρωμικού αμμωνίου και 8μl ορού δείγματος. Το κάθε δείγμα μετρήθηκε στο φασματοφωτόμετρο μετά το πέρας 3 λεπτών (χρόνος αντίδρασης) και η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα εκτιμάται από τον τύπο:

76 [76] TAC= Τιμή blank Tιμή δείγματος / Τιμή blank Τιμή μάρτυρα. Για τις μετρήσεις το φασματοφωτόμετρο ρυθμίζεται σε φάσμα απορρόφησης 569nm. 3. Ατομική Απορρόφηση Στη μέθοδο της ατομικής απορρόφησης οι βασικές αρχές είναι οι ακόλουθες: Τα προς ανάλυση μεταλλικά άλατα, που προκύπτουν μετά την όξινη πέψη των δειγμάτων, φέρονται σε ατομική κατάσταση και παρεμβάλλονται στην διαδρομή της εκπεμπόμενης φωτεινής συχνότητας του φωτόμετρου. Για κάθε μέταλλο χαρακτηριστικά φάσματα φωτεινών συχνοτήτων ενεργοποιούνται στη πηγή του φωτόμετρου με τη βοήθεια μιας κοίλης λυχνίας καθόδου (hollow cathode lamp). Τα άτομα του μετάλλου τότε απορροφούν επιλεκτικά την ακτινοβολία που εκπέμπεται. Ως γνωστόν όταν ακτινοβολία μήκους κύματος λ περνά από νέφος ατόμων, ένα μέρος της απορροφάται λόγω της διέγερσης των ατόμων (Μº + hν Μ*). Επομένως η ένταση της ακτινοβολίας στο μήκος κύματος που αντιστοιχεί στην ενέργεια του φωτονίου hν θα μειωθεί. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση του ατόμου τόσο μεγαλύτερη θα είναι και η μείωση στην ενέργεια της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Κάθε είδος ατόμου απαιτεί φωτόνια συγκεκριμένης ενέργειας, σε συγκεκριμένα μήκη κύματος, για να παράγει διεγερμένα άτομα αυτού του στοιχείου. Τελικά η μείωση της έντασης του σήματος του ανιχνευτή του φωτόμετρου υπακούει στον νόμο των Lambert- Beer, που ορίζει πως όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από ομοιογενές υλικό, η ισχύς της ακτινοβολίας μειώνεται ανάλογα με τον αριθμό των απορροφούμενων σωματιδίων στη διαδρομή του φωτός: Α= log Po/P= a b c όπου Α η απορρόφηση, Ρο η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, Ρ η ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας, a η απορροφητικότητα (σταθερά), b το μήκος της διαδρομής που διανύθηκε και c η συγκέντρωση. Άρα η απορρόφηση σχετίζεται με τη συγκέντρωση του μετάλλου. 3.1 Μέθοδος Ατομικής Απορρόφησης με φλόγα Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιπέδων Zn και Cu στον ορό αίματος. Για την ατομοποίηση ενδιάμεσης σταθερότητας στοιχείων, χρησιμοποιείται η

77 [77] φλόγα αέρα- ασετιλίνης, που φτάνει σε θερμοκρασία 2300º C. Το δείγμα φέρεται προς μέτρηση σε υγρή κατάσταση και μετατρέπεται σε αερόλυμα με τη βοήθεια νεφελοποιητή, μεταφέρεται από ρεύμα αερίων στον καυστήρα και μετά τη μίξη του με τα αέρια της φλόγας καίγεται και ατομοποιείται. Ένα σταθερό σήμα, του οποίου η ένταση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του μετάλλου, καταγράφεται κατά το χρονικό διάστημα που το δείγμα εκτίθεται στη φλόγα. Για τη μέτρηση του Zn με φλόγα χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα S1= 0,5 μg/ml και S2= 1μg/ml (ppm) Zn υπό νιτρική μορφή που παρασκευάστηκαν με διαδοχικές αραιώσεις από πυκνό πρότυπο διάλυμα ZnNO3 συγκέντρωσης 1mg/ml (Spectrosol, BDH Chemicals Ltd Poole England). Για τη μέτρηση του Cu με φλόγα χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα S1= 0,5 μg/ml και S2= 1μg/ml (ppm) Cu υπό νιτρική μορφή που παρασκευάστηκαν με διαδοχικές αραιώσεις από πυκνό πρότυπο διάλυμα CuNO3 συγκέντρωσης 1mg/ml (Spectrosol, BDH Chemicals Ltd Poole England). Οι ρυθμίσεις λειτουργίας του οργάνου για τον Zn ήταν: Μήκος κύματος (λ): 213,9 nm Εύρος σχισμής (slit): 0,7 nm NORM Ένταση ρεύματος : 15 ma Πηγή φωτός: Κοίλη λυχνία καθόδου Zn Φλόγα: Μείγμα ασετιλίνης- αέρα, οξειδωτική Ευαισθησία: 0,018 μg/ml Zn για 1% απορρόφηση(0,5 μg/ml έχουν απορρόφηση 0,12) 3.2 Φασματοφωτομετρία Ατομικής απορρόφησης Για τις μετρήσεις των μετάλλων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης (AAS) Perkin- Elmer 560, με φλόγα και φούρνο γραφίτη HGA Το σύστημα περιλαμβάνει επίσης διορθωτή υποστρώματος με λάμπα δευτερίου (background corrector). Κάθε μέτρηση επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δείγματα υπό υγρή μορφή υπόκεινται σε ανάλυση: περίπου 2 ml για κάθε μέτρηση στη φλόγα και 20μl για κάθε μέτρηση στο φούρνο.

78 [78] Τυφλά διαλύματα καθώς και πρότυπα διαλύματα μετάλλων χρησιμοποιήθηκαν για τη βαθμονόμηση του φωτόμετρου. Τα πρότυπα αναλύονται στην αρχή και στο τέλος μιας σειράς αναλύσεων και περιοδικά όταν υπάρχουν πολλά δείγματα, ενώ τα τυφλά ανάμεσα σε κάθε δείγμα ή πρότυπο για την επαλήθευση της σταθερότητας των μετρήσεων. Η βαθμονόμηση του οργάνου γίνεται έτσι ώστε να δίνονται απευθείας μετρήσεις συγκέντρωσης, εάν οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων και των προτύπων είναι μέσα στο γραμμικό εύρος της καμπύλης, με την χρήση ενός τυφλού και ενός προτύπου στο ανώτερο άκρο του γραμμικού εύρους της καμπύλης. Για τη μέτρηση του ψευδαργύρου και χαλκού χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα 0,5 και 1 ppm Zn και Cu υπό νιτρική μορφή. Στη συνέχεια προέκυψαν οι καμπύλες βαθμονόμησης (αναφοράς) από τις απορροφήσεις των προτύπων υδατικών διαλυμάτων του μετάλλου συναρτήσει των συγκεντρώσεων τους. Τα δείγματα καθορίζονται από τις καμπύλες βαθμονόμησης εφόσον βρίσκονται εντός του γραμμικού εύρους. Οι συγκεντρώσεις των μετάλλων υπολογίζονται τελικά από τον τύπο: Συγκέντρωση (μg/ml)= Καθαρή Απορρόφηση δείγματος x Συγκέντρωση προτύπου Καθαρή Απορρόφηση προτύπου Ο τύπος αυτός για τα υγρά και τα στερεά δείγματα διαμορφώνεται αντίστοιχα ως εξής: Μέταλλο (μg/ml)= Συγκέντρωση (μg/ml) x Αραίωση Μέταλλο (ppm)= Συγκέντρωση (μg/ml) x Όγκος δείγματος (ml) x Αραίωση Βάρος πέψης (g) 3.3 Πέψη ιστών Όλοι οι ιστοί που συλλέχθηκαν κατά τα προηγούμενα στάδια (ερυθρά αιμοσφαίρια και ήπαρ) συντηρήθηκαν στους -20 ο C σε ερμητικά κλειστά σωλήνες Falcon έως την χρήση τους. Την ημέρα των πέψεων τα δείγματα ζυγίζονταν και τοποθετούνταν σε οβίδες πέψης από Teflon, μαζί με 5 ml δ/μα HΝΟ 3 65% (63,013 g/mol) προς Η 2 Ο 2 30% (34,01 g/mol) 2:1. Οι οβίδες σφραγίζουν και τοποθετούνται σε φούρνο μικροκυμάτων εντός απαγωγού για 15 λεπτά ώστε υπό συνθήκες υψηλής πίεσης και θερμοκρασίας να γίνει απόλυτη πέψη των ιστών. Το κάθε διάλυμα που περιέχει πλέον απελευθερωμένα από τα πρωτεϊνικά τους σύμπλοκα τα μέταλλα των ιστών, μεταφέρεται σε σωλήνα Falcon και αφού καταγραφεί ο όγκος του

79 [79] για τυχόν απώλειες συμπληρώνεται με δις-απεσταγμένο ddh 2 O έως τον όγκο των 10 ml. Όλα τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν για την μέθοδο της ατομικής απορρόφησης και τις διαδικασίες πέψης των ιστών επεξεργάστηκαν με δ/μα 10% νιτρικού οξέος για απομάκρυνση υπολειμμάτων μετάλλων (διαδικασία οξίνισης ) 4. Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου( 1 H NMR) 4.1. Βασικές αρχές Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, 1 Η NMR spectroscoopy) είναι μια αναλυτική τεχνική με εφαρμογές στη Φυσική, Χημεία, Βιοχημεία, Βιοφυσική και την Ιατρική. Το φαινόμενο του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού βασίζεται σε διεγέρσεις μαγνητικών πυρήνων οι οποίοι είναι τοποθετημένοι σε ισχυρό μαγνητικό πεδίο. Η συχνότητα της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας που προκαλεί τις διεγέρσεις αντιστοιχεί στην περιοχή των ραδιοσυχνοτήτων (3x10 8-3x10 6 Hz). Εικ. 21 Επίδραση του παλμού στην κατεύθυνση του ανύσματος της μαγνήτισης Οι πυρήνες όλων των στοιχείων περιέχουν φορτία και όταν περιστρέφονται, λόγω των ιδιοπεριστροφών τους (spin), συμπεριφέρονται ως μαγνητικά δίπολα και επάγουν μαγνητικά πεδία κάθετα στο επίπεδο περιστροφής. Το μέγεθος του δημιουργούμενου διπόλου αποτελεί θεμελιώδη πυρηνική ιδιότητα που καλείται πυρηνική μαγνητική ροπή (μ) μ= γh[ι(ι+1)] 1/2 2π

80 [80] όπου h είναι η σταθερά του Planck, γ μια πυρηνική σταθερά που ονομάζεται γυρομαγνητικός λόγος και Ι η γωνιακή στροφορμή. Υπάρχουν τρία είδη πυρήνων: α) πυρήνες που έχουν άρτιο ατομικό και μαζικό αριθμό, δεν παρουσιάζουν γωνιακή στροφορμή (Ι=0), δεν εκδηλώνουν μαγνητικές ιδιότητες και επομένως δεν δίνουν σήματα NMR, β) πυρήνες που έχουν περιττό μαζικό αριθμό και περιττό ή άρτιο ατομικό αριθμό, παρουσιάζουν ημιακέραιους αριθμούς spin δηλαδή I=n(1/2) και γ) πυρήνες που έχουν άρτιο μαζικό αριθμό και περιττό ατομικό αριθμό οι οποίοι παρουσιάζουν ακέραιους αριθμούς spin. Οι πυρήνες με Ι=1/2 παρουσιάζουν συμμετρική σφαιρική κατανομή του φορτίου τους και είναι κυρίως αυτοί που χρησιμοποιούνται στην φασματοσκοπία NMR σε αντίθεση με τους πυρήνες με Ι 1 που παρουσιάζουν ελλιψοειδή κατανομή φορτίου (Χατζηιωάννου και Κουππάρη., 1997, σελ 312, Attua-ur-Rahman and Choudhary MI., 1996, pg 18) Επίδραση παλμών Αρχικά, η μαγνήτιση του πυρήνα είναι παράλληλη με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο σε μια διεύθυνση παράλληλη προς τον άξονα +z. Με την εφαρμογή ενός παλμού κατά μήκος ενός κάθετου προς τον z άξονα (π.χ. κατά μήκος του +x, -x, +y ή -y) η μαγνήτιση αλλάζει διεύθυνση. Όταν ο παλμός εφαρμοστεί κατά μήκος του άξονα x, ένα γραμμικό πεδίο δημιουργείται κατά μήκος του άξονα y. Ο βαθμός με τον οποίο η μαγνήτιση του άξονα z αποκλίνει καθορίζεται από τον χρόνο εφαρμογής του παλμού. Με τον όρο παλμός 90 εννοούμε ότι προκαλείται απόκλιση του ανύσματος της μαγνήτισης κατά 90 μοίρες. Εάν ο χρόνος εφαρμογής ενός παλμού 90 είναι t μs, τότε απαιτείται το μισό χρονικό διάστημα (t/2 μs) για να αποκλίνει η μαγνήτιση κατά 45, ενώ το διπλάσιο (2t μs) για να αποκλίνει κατά 180 (Εικ.21). Η διάρκεια εφαρμογής ενός παλμού είναι αντιστρόφως ανάλογη του εύρους συχνοτήτων δηλαδή για να γίνει διέγερση των πυρήνων σε μεγάλο εύρος συχνοτήτων πρέπει να εφαρμοστεί ένας παλμός μικρής διάρκειας και αντίστροφα (Attua-ur-Rahman and Choudhary MI., 1996, pg 23) Ελευθέρως φθίνουσα επαγωγή (Free induction decay-fid) Όταν το άνυσμα της μαγνήτισης βρίσκεται κατά μήκος του άξονα z δεν προκύπτει κάποιο σήμα NMR. Όταν ένας παλμός εφαρμοστεί κατά μήκος του άξονα x αφενός μεν η μαγνήτιση αποκλίνει από τον άξονα z και εμφανίζεται κατά μήκος του άξονα y, αφετέρου οι πυρήνες που βρίσκονται εντός του εύρους συχνοτήτων που δημιουργεί ο παλμός, αποκλίνουν ταυτόχρονα κατά την ίδια γωνία. Η ένταση του σήματος θα είναι μέγιστη

81 [81] αμέσως μετά την εφαρμογή του παλμού κατά μήκος του άξονα x. Κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης, το άνυσμα της μαγνήτισης θα μετακινηθεί από τον άξονα y προς τον άξονα x και το σήμα θα εξασθενίσει μέχρι που θα λάβει την τιμή μηδέν όταν φτάσει στον άξονα x (Εικ.22a). Καθώς μετατοπίζεται προς τον Εικ. 22 Σχέση a) της θέσης του ανύσματος της μαγνήτισης με b) το άξονα -y, εμφανίζεται αρνητικό σήμα το σήμα συνάρτησης χρόνου και c) το σήμα συνάρτησης συχνότητας οποίο λαμβάνει τη μέγιστη αρνητική τιμή όταν το άνυσμα μετακινηθεί στον άξονα - y. Καθώς το άνυσμα μετακινείται προς τον άξονα - x, το αρνητικό σήμα λαμβάνει πάλι την τιμή μηδέν και έπειτα λαμβάνει θετικές τιμές μέχρι να φτάσει στον άξονα y (Εικ.22b). Η σχέση της θέσης του ανύσματος της μαγνήτισης με το σήμα και την φάση του σήματος φαίνεται στην Εικ. 22 Η εκθετικά φθίνουσα συνάρτηση του σήματος με το χρόνο η οποία περιέχει και το φάσμα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ονομάζεται ελευθέρως φθίνουσα επαγωγή (Free Induction Decay-FID) (Attua-ur-Rahman and Choudhary MI., 1996, pg31) Μετασχηματισμός Fourier (Fourier Transformation, FT) Τα δεδομένα στον NMR φασματογράφο λαμβάνονται συναρτήσει του χρόνου και για να χρησιμοποιηθούν πρέπει να μετατραπούν συναρτήσει της συχνότητας. Η μετατροπή των δεδομένων συνάρτησης χρόνου σε φάσμα συνάρτησης της συχνότητας πραγματοποιείται με τον μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transformation), μια μαθηματική συνάρτηση στην οποία συσχετίζονται τα δεδομένα συνάρτησης χρόνου f(t) με τα δεδομένα συνάρτησης συχνότητας f(ω) με τον Cooley-Tukey αλγόριθμο: όπου F(ν) είναι η συνάρτηση συχνότητας και f(t) είναι η αντίστοιχη σχέση χρόνου για το σήμα (δηλαδή η FID).

82 [82] 4.2. Χαρακτηριστικά του φάσματος NMR Το φάσμα NMR που περιλαμβάνει πολλές κορυφές απορρόφησης (σήματα), οι σχετικές θέσεις των οποίων απεικονίζουν διαφορές στο χημικό περιβάλλον των πρωτονίων, μπορεί να δώσει λεπτομερή πληροφορία σχετικά με τη μοριακή δομή των ενώσεων. Θα εξετάσουμε τα χαρακτηριστικά του φάσματος NMR: 1. τον αριθμό των σημάτων, όπου είναι εφικτή η άντληση πληροφοριών σχετικά με τον αριθμό των διαφορετικών ειδών πρωτονίων που υπάρχουν στο μόριο μιας ένωσης 2. τις θέσεις των σημάτων, από τις οποίες αντλούνται πληροφορίες σχετικά με το ηλεκτρονιακό περιβάλλον κάθε είδους πρωτονίων 3. τις εντάσεις των σημάτων που δίνουν πληροφορίες για τον αριθμό των πρωτονίων που υπάρχουν σε κάθε είδος και 4. τη σχάση του σήματος σε επιμέρους κορυφές, που δίνει πληροφορίες σχετικά με το περιβάλλον του πρωτονίου σε σχέση με τα γειτονικά πρωτόνια Αριθμός σημάτων στο φάσμα NMR Σε ένα δεδομένο μόριο, πρωτόνια με το ίδιο περιβάλλον απορροφούν στην ίδια (εφαρμοζόμενη) ένταση πεδίου, ενώ πρωτόνια με διαφορετικό περιβάλλον απορροφούν σε διαφορετικές (εφαρμοζόμενες) εντάσεις πεδίου. Τα πρώτα ονομάζονται χημικώς ισοδύναμα πρωτόνια, ενώ τα τελευταία χημικώς μη-ισοδύναμα. Ο αριθμός των σημάτων στο φάσμα NMR δίνει πληροφορίες για τον αριθμό των ισοδύναμων πρωτονίων και τα είδη των πρωτονίων που υπάρχουν σε ένα μόριο. CH 3 -CH 2 -Cl CH 3 -CH 2 -CH 2 -Cl a b a b c 2 NMR σήματα 3 NMR σήματα Εμβαδόν κορυφών πρωτονίων στο φάσμα NMR Για την ποσοτική σύγκριση των κορυφών διαφόρων πρωτονίων υπολογίζονται τα εμβαδά των κορυφών. Η περιοχή κάτω από ένα σήμα NMR είναι ευθέως ανάλογη του αριθμού των πρωτονίων που προκαλούν το σήμα. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των πρωτονίων που διεγείρονται τόσο μεγαλύτερο είναι το ποσό της ενέργειας που

83 [83] απορροφάται και συνεπώς είναι μεγαλύτερη η περιοχή κάτω από την κορυφή απορρόφησης Τεχνικές αναγνώρισης προτύπων Η έννοια και η ανάλυση των Πολυμεταβλητών δεδομένων Η μελέτη των βιολογικών συστημάτων πραγματοποιείται με τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό πολλών δεδομένων τα οποία ονομάζονται πολυμεταβλητά (multivariate data) διότι πολλές μεταβλητές μετρώνται σε πολλά δείγματα ή χρονικά διαστήματα. Η ανάλυση των δεδομένων αυτών είναι αρκετά δύσκολη. Εκτός από τις κλασσικές μεθόδους στατιστικής, τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στην ανάλυση των δεδομένων αυτών με άλλες τεχνικές. Με τον όρο Multivariate Data Analysis, MDA (Ανάλυση Πολυμεταβλητών Δεδομένων) εννοούμε την ανάλυση που πραγματοποιείται με σκοπό την ανάκτηση της πιο σημαντικής πληροφορίας από πίνακες που περιέχουν πολυάριθμα πειραματικά δεδομένα (Erikson et al., 2007, pg 7). Η Multivariate Data Analysis συχνά αποκαλείται και Pattern Recognition, PR (Αναγνώριση Προτύπων) διότι αποβλέπει στην εύρεση ενός data pattern (μοντέλου δεδομένων) για τον χαρακτηρισμό ή την ταξινόμηση μιας ή περισσοτέρων κλάσεων παρατηρήσεων (classes observations) (Wold et al., 1984). Το pattern (μοντέλο) μιας κλάσης περιέχει πληροφορίες για τις σχέσεις και τις αναλογίες που χαρακτηρίζουν τις παρατηρήσεις της κλάσης αυτής καθώς επίσης για το πόσο όμοιες ή όχι είναι οι variables (μεταβλητές) του υπό μελέτη συστήματος. Οι στατιστικές μέθοδοι που εφαρμόζονται στην Multivariate Data Analysis διακρίνονται σε δυο κατηγορίες: τις supervised και unsupervised μεθόδους (Lindon et al., 2001). Με τις unsupervised τεχνικές επιτυγχάνεται η ανάλυση των δεδομένων και η ερμηνεία τους πραγματοποιείται με τα scores plot (γράφημα συντεταγμένων) στα οποία φαίνεται εάν υπάρχουν τάσεις ομαδοποίησης μεταξύ των δειγμάτων και τα loadings plots (γραφήματα φορτίων) στα οποία φαίνονται οι μεταβλητές που συνεισφέρουν στις παρατηρούμενες τάσεις ομαδοποίησης. Με τις supervised τεχνικές χρησιμοποιούνται γνωστές πληροφορίες από τα δεδομένα με τις οποίες γίνεται, πριν τη δημιουργία του στατιστικού μοντέλου, προεπιλεγμένα η ταξινόμηση των δειγμάτων σε ομάδες ή υποομάδες. Για την αξιολόγηση (validation) των στατιστικών

84 [84] μοντέλων επιλέγεται τυχαία ένας αριθμός δειγμάτων από το σύνολο αυτών και αποτελεί την ομάδα βαθμονόμησης (calibration set) και ελέγχεται η ορθή ή όχι ταξινόμηση ενός άλλου αριθμού δειγμάτων που επίσης έχει επιλεχθεί τυχαία από το σύνολο των δειγμάτων και αποτελεί την ομάδα ελέγχου (test set). Στις unsupervised μεθόδους ανήκει η Principal Component Analysis, PCA, ενώ στις supervised η Partial Least Squares, PLS και η Partial Least Squares-Discriminant Analysis, PLS-DA Προεπεξεργασία των δεδομένων Τα φάσματα NMR μετατρέπονται με τη χρήση κατάλληλων προγραμμάτων σε πίνακες πολυμεταβλητών δεδομένων και έπειτα πραγματοποιείται η ανάλυση αυτών με εφαρμογή των τεχνικών PR. Όπως φαίνεται από την (Εικ. 23) κάθε φάσμα NMR, που αντιστοιχεί σε μια παρατήρηση ή δείγμα (odservation), διαιρείται σε ίσου εύρους τμήματα (bins), που αντιστοιχούν σε μια συγκεκριμένη φασματική περιοχή μετατόπισης (δ, ppm) και αποτελούν τις μεταβλητές (variables). bin Εικ. 23: Διαίρεση της αλειφατικής περιοχής του φάσματος 1 H NMR βιολογικού δείγματος σε φασματικές περιοχές ίσου εύρους σε ppm. ( Τις γραμμές στον πίνακα δεδομένων αποτελούν τα δείγματα (observations), ενώ τις στήλες οι τιμές της έντασης για κάθε bin (Craig et al., 2006). Πριν την εφαρμογή κάποιας τεχνικής PR, γίνεται κατάλληλη προ-επεξεργασία (preprocessing) των δεδομένων δηλαδή κανονικοποίηση (normalization) και scaling. Η κανονικοποίηση εφαρμόζεται κατά μήκος των γραμμών του πίνακα με τέτοιο τρόπο ώστε τα φασματοσκοπικά δεδομένα να καταστούν άμεσα συγκρίσιμα μεταξύ τους. Η διαδικασία του scaling εκτελείται σε κάθε

85 [85] στήλη του πίνακα δηλαδή σε κάθε μεταβλητή (bin). Η πιο συχνή διαδικασία στη μεταβονομική είναι η αφαίρεση από όλες τις τιμές της στήλης του μέσου όρου αυτών και ονομάζεται mean-centering Principal Component Analysis, PCA Η ανάλυση PCA αποτελεί το αρχικό στάδιο για την ανάλυση των πολυμεταβλητών δεδομένων (Wold et al., 1984, Wold et al., 1987). Δημιουργούνται ανεξάρτητοι συνδυασμοί των αρχικών μεταβλητών που ονομάζονται Principal Components, PC (Κύριες Συνιστώσες), οι οποίοι αφενός μεν είναι ανεξάρτητοι μεταξύ τους, αφετέρου να περιέχουν όσο γίνεται μεγαλύτερο μέρος της διακύμανσης των αρχικών μεταβλητών. Η πρώτη PC είναι ένας γραμμικός συνδυασμός των αρχικών μεταβλητών και περιέχει τη μέγιστη διακύμανση των δεδομένων, ενώ η δεύτερη ένας άλλος γραμμικός συνδυασμός ορθογώνιος ως προς τον πρώτο και περιέχει την επόμενη πιο ολοκληρωμένη περιγραφή των δεδομένων. Η γραφική παράσταση των δυο πρώτων PC περιέχει το μέγιστο βαθμό πληροφορίας, ενώ οι επόμενες PC εκφράζουν όλο και λιγότερο ποσοστό από τη διακύμανση των δεδομένων. Όπως φαίνεται από την (Εικ.24) σε κάθε παρατήρηση (observation) αντιστοιχεί μια μοναδική προβολή (projection) σε ένα επίπεδο 2 διαστάσεων με άξονες τις 2 πρώτες PC (comp 1 t( 1 ), comp 2 t( 2 )). Από το επίπεδα αυτό προκύπτουν δυο γραφήματα: το scores plot (γράφημα συντεταγμένων) στο οποίο απεικονίζονται οι σχέσεις που υπάρχουν ανάμεσα στις παρατηρήσεις (εντοπισμός ομάδων, τάσεων ομαδοποίησης ή ακραίων συμπεριφορών) και το loadings plot (γράφημα φορτίων) στο οποίο απεικονίζεται η επίδραση των μεταβλητών στο στατιστικό μοντέλο καθώς και οι μεταξύ τους σχέσεις. Τα δυο αυτά γραφήματα είναι αλληλοεξαρτώμενα καθώς η διάταξη των μεταβλητών στο γράφημα των φορτίων ερμηνεύει την διάταξη των δειγμάτων στο γράφημα συντεταγμένων (Trygg et al., 2007).

86 [86] Εικ. 24: Το PCA μοντέλο προσεγγίζει τη διακύμανση μεταξύ των δεδομένων. Η ερμηνεία του βασίζεται στο scores plot (γράφημα συντεταγμένων) και το loadings plot (γράφημα φορτίων) Partial Least-Squares Discriminant Analysis, PLS-DA Η Partial Least-Squares Discriminant Analysis, PLS-DA (Διακριτική Ανάλυση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων) όπως αναφέρθηκε ανήκει στις supervised μεθόδους καθώς τα δείγματα με βάση κάποιες ποιοτικές μεταβλητές που τα χαρακτηρίζουν όπως το γένος, η νόσος ταξινομούνται σε έναν πίνακα Υ. Οι ποιοτικές αυτές μεταβλητές συμβολίζονται με τις μεταβλητές ταξινόμησης π.χ. 1 αν το δείγμα ανήκει σε μια ομάδα και 0 αν δεν ανήκει (Εικ.25) (Trygg et al., 2007). Με τη μέθοδο αυτή προσδιορίζονται εκείνες οι μεταβλητές που συμβάλλουν στο βέλτιστο διαχωρισμό μεταξύ των υπό μελέτη ομάδων (Εικ.26). Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πραγματοποιείται με τη βοήθεια δυο γραφημάτων, όπως στην PCA ανάλυση, το scores plot (γράφημα συντεταγμένων) και το regression coefficients plot (γράφημα των συντελεστών παλινδρόμησης) (Εικ. 26). Εικ. 25: Τα δεδομένα των κλάσεων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία μιας επιπλέον στήλης Υ, η οποία θα περιλαμβάνει τις μεταβλητές ταξινόμησης (dummy variables) που θα υποδηλώνουν την κλάση που ανήκει κάθε δείγμα (Trygg et al., 2007). Εικ.26: Αριστερά το scores plot και δεξιά το regression coefficients plot του PLS-DA μοντέλου. Στο γράφημα των συντεταγμένων φαίνεται ο διαχωρισμός των ασθενών με νόσο 3 αγγείων (μπλε τετράγωνα) και των ασθενών με φυσιολογικά αγγεία (κόκκινα τρίγωνα) (Brindle et al., 2002), ενώ στο

87 [87] γράφημα των συντελεστών παλινδρόμησης εμφανίζονται οι περιοχές του φάσματος του ορού που συμβάλλουν στον διαχωρισμό των δυο ομάδων Orthogonal Signal Correction, OSC Η Orthogonal Signal Correction, OSC είναι μια τεχνική η οποία ανακαλύφθηκε από τον Wold και τους συνεργάτες του το 1998 (Wold et al., 1998). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ένα φίλτρο δηλαδή μια μαθηματική συνάρτηση για την αφαίρεση της συστηματικής διακύμανσης (systematic variation) των δεδομένων του πίνακα Χ που ουσιαστικά δεν συνεισφέρει στην εξαγωγή των αποτελεσμάτων και είναι μαθηματικώς ανεξάρτητη από τα δεδομένα του πίνακα Υ (Εικ.27). Τα στατιστικά μοντέλα που προκύπτουν μετά την εφαρμογή της τεχνικής φιλτραρίσματος ερμηνεύονται με αντίστοιχα γραφήματα όπως στην περίπτωση των PCA και PLS-DA μοντέλων. Εικ.27: Η γεωμετρική απεικόνιση των PLS-DA και OSC/PLS-DA μοντέλων. Στο αριστερό γράφημα που αφορά το PLS-DA μοντέλο, δεν μπορεί να διαχωριστεί η μεταξύ των ομάδων διακύμανση από αυτή εντός των ομάδων. Στο δεξί γράφημα που αφορά το OSC/PLS-DA μοντέλο διαχωρίζονται οι δυο αυτές διακυμάνσεις με αποτέλεσμα με την δεύτερη συνιστώσα (Comp 2) να διαχωρίζονται οι δυο ομάδες μεταξύ τους (Trygg et al., 2007) Αξιολόγηση των μοντέλων (Validation of models) Για την αξιολόγηση των στατιστικών μοντέλων που δημιουργούνται μια από τις τεχνικές που χρησιμοποιείται είναι η cross validation η οποία εκτιμάται με τις παραμέτρους

88 [88] R 2 (explained variation) και Q 2 (predicted variation). Η παράμετρος R 2 δίνει μια ποσοτική εκτίμηση της προσαρμογής του στατιστικού μοντέλου στα δεδομένα (goodness of fit) και υπολογίζεται βάσει της εξίσωσης: R 2 =1-RSS/SSX tot.corr. όπου ο όρος SSX tot.corr. (Sum of Squares of all X variables) εκφράζει την ολική διακύμανση των δεδομένων του πίνακα Χ και RSS είναι το άθροισμα τετραγώνων των υπολοίπων (Residuals sum of squares). Η παράμετρος Q 2 υπολογίζεται με βάση την εξίσωση: Q 2 =1-PRESS/SSX tot.corr. όπου ο όρος PRESS (Press Predicted Residual Error Sum of Squares) είναι το άθροισμα τετραγώνων των προβλεπόμενων σφαλμάτων των υπολοίπων και δίνει μια συνολική εκτίμηση της ικανότητας πρόβλεψης του στατιστικού μοντέλου (goodness of prediction). Οι δύο αυτές παράμετροι είναι αδιάστατα μεγέθη με την R 2 να είναι πάντα μεγαλύτερη της Q 2 και την Q 2 να μπορεί να λάβει και αρνητικές τιμές. Όσο αυξάνει η πολυπλοκότητα του μοντέλου με τη χρήση περισσοτέρων PC, τόσο η R 2 τείνει στο 1 και η Q 2 μειώνεται. Συνεπώς η επιλογή του βέλτιστου αριθμού των PC έγκειται στον συμβιβασμό της αυξανόμενης R 2 και της μειούμενης Q 2 όπως φαίνεται στην (Εικ.28) Εικ.28: Ο κατακόρυφος άξονας αναπαριστά την παράμετρο R 2 (explained variation) και Q 2 (predicted variation) και ο οριζόντιος άξονας απεικονίζει την πολυπλοκότητα του μοντέλου (Erikson et al., 2001). Η αξιοπιστία των στατιστικών μοντέλων που δημιουργούνται με την PLS-DA τεχνική, ελέγχεται με την εσωτερική ή εξωτερική αξιολόγηση (internal or external validation). Με την εξωτερική αξιολόγηση γίνεται αποτίμηση της ικανότητας πρόβλεψης ενός στατιστικού

89 [89] μοντέλου με τη χρήση δεδομένων τα οποία όμως δεν συμμετέχουν στη δημιουργία του μοντέλου. Τα νέα αυτά δεδομένα αποτελούν την ομάδα εξωτερικής αξιολόγησης (prediction set) των οποίων το μοντέλο στοχεύει να προβλέψει κάποια ιδιότητα. Στις περιπτώσεις που ο αριθμός των δειγμάτων είναι μικρός ή δεν υπάρχουν διαθέσιμα νέα δεδομένα, η ικανότητα πρόβλεψης του μοντέλου μπορεί να γίνει με την εσωτερική αξιολόγηση (held-back data) με τη χρησιμοποίηση κατάλληλης ομάδας ελέγχου ή ομάδας εσωτερικής αξιολόγησης (test set). Τα δεδομένα της ομάδας αυτής έχουν επιλεγεί τυχαία κατά τη διαδικασία βαθμονόμησης του στατιστικού μοντέλου. Συνήθως το 20% των αρχικών δεδομένων επιλέγεται τυχαία από όλες τις ομάδες για να αποτελέσει την ομάδα ελέγχου και το υπόλοιπο 80% αποτελεί την ομάδα βαθμονόμησης. Τα ποσοστά ταξινόμησης (calibration rates) εκτιμώνται με τη βοήθεια δυο παραμέτρων: της ειδικότητας (specificity) και της ευαισθησίας (sensitivity). 5.Αναλύσεις Αίματος- Βιοχημικές Αναλύσεις-Μέτρηση επιπέδων ινσουλίνης Το αίμα που συλλέχθηκε από όλα τα πειραματόζωα επεξεργάστηκε για να διαχωριστούν το πλάσμα από τα ερυθρά, ώστε να χρησιμοποιηθούν ξεχωριστά σε κάθε μία από τις παρακάτω αναλυτικές μεθόδους. Τα δείγματα αρχικά φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά στις 3500 στροφές για να γίνει πλήρης διαχωρισμός του πλάσματος και των ερυθρών αιμοσφαιρίων και ύστερα τοποθετήθηκαν (πλάσμα και ερυθρά σε ξεχωριστά μαρκαρισμένα eppedorf) στους -76 o C μέχρι να αναλυθούν. 5.1 Μέτρηση επιπέδων ινσουλίνης με την μέθοδο της Elisa Για την μέτρηση των επιπέδων ινσουλίνης στον ορό των πειραματόζωων χρησιμοποιήθηκε το βιομηχανικό kit (Insulin Mouse Elisa, ALPCO). Η αρχή της συγκεκριμένης μεθόδου βασίζεται στην ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των μορίων ινσουλίνης στον ορό των πειραματοζώων. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της ινσουλίνης μυός, σε πολυτριβλία και ακολούθησε προσθήκη των δειγμάτων μαζί με την κατάλληλη Eικ.29

90 [90] ποσότητα διαλύματος δευτεροταγούς αντισώματος (horseradish peroxidase enzymelabeled monoclonal antibody-hrp) έτσι ώστε τα μόρια ινσουλίνης να παγιδευτούν ανάμεσα στα δυο αντισώματα (Εικ.29). Ακολούθησε πλύση των τρυβλίων με wash buffer, προσθήκη TMB Substrate και επώαση υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστέθηκε stop solution και η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450nm Για την μέτρηση των επιπέδων ινσουλίνης στον ορό των πειραματόζωων χρησιμοποιήθηκε το βιομηχανικό kit (Insulin Mouse Elisa, ALPCO). Η αρχή της συγκεκριμένης μεθόδου βασίζεται στην ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των μορίων ινσουλίνης στον ορό των πειραματοζώων. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της ινσουλίνης μυός, σε πολυτρυβλία και ακολούθησε προσθήκη των δειγμάτων μαζί με την κατάλληλη ποσότητα διαλύματος δευτεροταγούς αντισώματος (horseradish peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody-hrp) έτσι ώστε τα μόρια ινσουλίνης να παγιδευτούν ανάμεσα στα δυο αντισώματα (εικ. 29). Ακολούθησε πλύση των τρυβλίων με wash buffer, προσθήκη TMB Substrate και επώαση υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστέθηκε stop solution και η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450nm. 5.2 Βιοχημικές αναλύσεις όρου αίματος πειραματοζώων με αυτόματο αναλυτή. Το αναλυτικό σύστημα βιοχημικού ελέγχου που χρησιμοποιήθηκε είναι : OLYMPUS AU 2700 Beckman coulter.(εικ.30) εικ.30 Olympus AU Triglyceride Η αρχή δοκιμασίας της μεθόδου βασίζεται σε μια σειρά συζευγμένων ενζυμικών αντιδράσεων. Τα τριγλυκερίδια του δείγματος υδρολύονται μέσω ενός συνδυασμού μικροβιακών λιπασών δίνοντας γλυκερόλη και λιπαρά οξέα. Η γλυκερόλη φωσφωρυλιώνεται από το αδενοσινοτριφωσφορικό (ATP) παρουσία γλυκεροκινάσης (GK)

91 [91] και παράγει 3-φωσφορική γλυκερόλη. Η 3-φωσφορική γλυκερόλη οξειδώνεται από το μοριακό οξυγόνο παρουσία οξειδάσης της φωσφορικής γλυκερόλης (GPO) δίνοντας υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και φωσφορική διυδροξθακετόνη. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που σχηματίζεται αντιδρά με 4-αμινοφαιναζόνη και Ν,Ν-δις-(4-θειοβουτυλ)- 3 5-διμεθυλανιλινη, δινάτριο άλας ( MADB) παρουσία υπεροξειδάσης (POD) για την παραγωγή ενός χρωμοφόρου, το οποίο μετράται στα 660/800nm. Η αύξηση τηςαπορρόφησης σε αυτό το εύρος είναι ανάλογη της περιεκτικότητας του δείγματος σε τριγλυκερίδια (TG). Lipases Triglycerides > Glycerol + Fatty acids GK Glycerol + ATP > Glycerol-3-phosphate + ADP GPO Glycerol-3-phosphate + O > Dihydroxyacetonephosphate + H 2 O 2 2 POD 2H 2 O aminoantipyrine > Quinoneimine + HCl + 4H 2 O + 4-chlorophenol Cholesterol Η αρχή της μεθόδου χρησιμοποιεί μια σειρά ενζυμικών αντιδραστηρίων για την μέτρηση της χοληστερόλης (CL) στον ορό και το πλάσμα. Στη διαδικασία αυτή οι χοληνεστέρες του δείγματος υδρολύονται από χοληνεστεράση (CHE). Η παραγόμενη ελεύθερη χοληστερόλη οξειδώνεται από χοληνεστεροξειδάση (CHO) σε χοληστένη -3- ονη με ταυτόχρονη παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου(h 2 O 2 ) το οποίο συνδέεται οξειδωτικά με 4-αμινοαντιμυρινη και φαινόλη υπό την παρουσία υπεροξειδάσης (POD) και την παραγωγή ενός χρωμοφόρου. Η ερυθρή χρωστική κινονεϊμίνη σχηματίζεται μετράται φασματοφωτομετρικά στα 540/600 nm. Cholesterol Esterase Cholesterol Ester + H2O > Cholesterol + RCOOH Cholesterol Oxidase Cholesterol + O > Cholestene-3-one + H2O2 Peroxidase 2H2O2 + 4-Aminoantipyrine + Phenol > Quinoneimine + 4H2O

92 [92] HDL-cholesterol Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην χρήση ενός αντί αντίσωμα της ανθρώπινης λιποπρωτεΐνης β που δεσμεύεται στην επιφάνια των HDL λιποπρωτεϊνών καθώς και στης (LDL, VLDL, και χυλομικρά). Τα σύμπλοκα αντιγόνου αντισώματος που σχηματίζονται αναστέλλουν τις ενζυμικές αντιδράσεις παρουσία ενός εζυμικού παράγοντα. Η χοληστερόλη της HDL πολιτικοποιείται με την παρουσία ενός χρωμογόνου συστήματος ενζύμων. Anti human-β-lipoprotein Antibody LDL,VLDL and chylomicrons > Antigen-antibody complexes Cholesterol esterase HDL-cholesterol + H 2 O + O > Cholest-4-en-3-one + Fatty acids + H 2 O 2 Cholesterol oxidase Peroxidase H 2 O aminoantipyrine > Blue dye + 2H 2 O N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulpho-propyl)- 3.5-dimethoxy-4-fluoroanilide(F-DAOS) Γλυκόζη (Glucose, GL) Συμφώνα με την αρχή της δοκιμής, η γλυκόζη φωσφορυλύεται από εξοκινάση (HK) με παρουσία (ATP) και ιόντων μαγνησίου(mg) για την παραγωγή 6-φωσφορικής γλυκόζης και διφωσφορικής αδενοσίνης (ADP). Η δεϋδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6P- DH) οξειδώνει ειδικά την 6-φωσφορική γλυκόζη σε 6-φωσφορικό γλυκονικό με ταυτόχρονη αναγωγή του NAD + σε NADH. Η αύξηση της απορροφητικότητας στα 340nm είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο δείγμα. HK, Mg2+ Glucose + ATP G-6-P + ADP G6P-DH G-6-P + NAD+ 6-Phosphogluconate + NADH + H+

93 [93] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΣ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΥΛΙΚΩΝ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Κεταμίνης (0,3 ml ketaset 100mg/ml) διάλυμα φωσφορικού άλατος (PBS) Sigma tablets δυσμουτάση του υπεροξειδίου(sod)kit : sigma SOD Assay Kit Lot# BCBD6760 κυβέτες που μέτραγες TAC: REF (10x4x45mm) μέτρηση ινσουλίνης kit : (Insulin Mouse Elisa, ALPCO) αντιπηκτικό ορού αίματος: heparin LEO 5000 i.u/ml.αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA, C4H11NO3, ΜΒ= g/ml, Sigma-Aldrich) 2.Χλωριούχο Νάτριο (NaCl, ΜΒ=58.44g/ml, Merck) 3.Θειική δεξτράνη (Dextran-Sulfate, Dextralip, ΜΒ=50.000g/ml, 5gr, Sigma-Aldrich) 4.Ένυδρο χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl2.6H2O, MB=203.30g/mol, Merck) 5.Ένυδρο μονοόξινο φωσφορικό νάτριο (Na2HPO4.2H2O, ΜΒ= g/mol, Merck) 6.Ένυδρο δισόξινο φωσφορικό νάτριο (NaH2PO4.H2O, ΜΒ= g/mol, Merck) 7.Μεθανόλη (LAB-SCAN) 8.Χλωροφόρμιο (LAB-SCAN) 9.Δευτεριωμένη μεθανόλη (Methanol-d4 με βαθμό δευτερίωσης 99.8%, Aldrich) 10.Δευτεριωμένο χλωροφόρμιο (CDCl3 με βαθμό δευτερίωση 99.8%, Merck) Διάλυμα θειικής δεξτράνης συγκεντρώσεως 20g/L και ph=7 Διάλυμα MgCl2.6H2O συγκεντρώσεως 1Μ και ph=7 Διάλυμα θειικής δεξτράνης: χλωριούχου μαγνησίου (Dextran Sulfate: MgCl2.6H2O) Διάλυμα NaCl συγκέντρωσης 0.15Μ Διάλυμα NaCl (0.15M) - EDTA (1mM) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (Phosphate buffer solution, PBS)

94 Gramms [94] Αποτελέσματα Μεταβολές βάρους WT (F1/F1) Week1 Week2 Week3 Week4 Week5 Week6 Week7 Week8 Week9 Week10 Chow Diet 20, , , , , , , , , ,6045 HFD 300 Zn 19, , , , , , , , , ,1625 HFD 30 Zn 20, , , , , , , , , ,0833 HFD 3 Zn 19, , , , , , , , , ,1462 Πιν. 7 Εβδομαδιαία αύξηση βάρους WT ( F1/F1) ποντικών,που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn,300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής) WΤ: άγριο στέλεχος ποντικών C57Bl/6xCBA 40 Body Weight- Wild Type F1/F1 mice Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Week Διαγ.1.Ιστόγραμμα μεταβολής του βάρους WT (F1/F1) ποντικών ανά εβδομάδα, που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn (300 mg Zn /kg τροφής,30 mg Zn /kg τροφής,3 mg Zn /kg τροφής) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής)

95 [95] 2 1,8 Ρυθμός % μεταβολής Βάρους F1/F1 1,6 1,4 Γραμμική (Chow Diet) Γραμμική (HFD 300 Zn) Γραμμική (HFD 30 Zn) Γραμμική (HFD 3 Zn) 1, Εβδομάδες Διαγ.1α WT ( F1/F1) ποντικών,που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn,300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής Ο ρυθμός μεταβολής των βαρών μεταξύ των HFD διαιτών Zn δείχνει ότι τα ζώα που εκτέθηκαν σε HFD δίαιτα ανεπαρκή σε Zn εμφανίζουν την ταχύτερη αύξηση βάρους ( Διαγ1α )καθώς και το μεγαλύτερο τελικό βάρος (Πιν 7 Διαγ1). Ο μικρότερος ρυθμός ανάπτυξης παρατηρήθηκε στα ζώα που έλαβαν διατροφή μη εμπλουτισμένη σε λιπίδια (chow diet)

96 Gramms [96] Μεταβολές βάρους Tg/Tg Week1 Week2 Week3 Week4 Week5 Week6 Week7 Week8 Week9 Week10 Chow Diet 16, , , , , , , , , ,2250 HFD , , , , , , , , , ,7833 Zn HFD 30 Zn 18, , , , , , , , , , HFD 3 Zn 19, , , , , , , , , ,1667 Πιν. 8 Εβδομαδιαία αύξηση βάρους των Tg/Tg ποντικών,που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn,300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής) Tg/Tg: διαγονιδιακά ποντίκια C57Bl/6xCBA που υπερεκφράζουν την hhsp70 (ανθρώπινη πρωτεϊνη70 θερμικού Shock) 40 Body Weight- Transgenic mice Tg/Tg Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Week Διαγ.2.Μεταβολές βάρους Tg/Tg ποντικών ανά εβδομάδα, που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn (300 mg Zn /kg τροφής,30 mg Zn /kg τροφής,3 mg Zn /kg τροφής) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής

97 [97] 2 1,8 Ρυθμός % μεταβολής Βάρους Tg/Tg 1,6 1,4 Γραμμική (Chow Diet) Γραμμική (HFD 300 Zn) Γραμμική (HFD 30 Zn) Γραμμική (HFD 3 Zn) 1, εβδομάδες Διαγ2α των Tg/Tg ποντικών,που εκτέθηκαν σε δίαιτα υψηλών λιπαρών (HFD) και σε διαφορετικά επίπεδα Zn,300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου (φυσιολογικά λιπαρά και 30 mg Zn /kg τροφής). Τα Τg/Tg ζώα εμφανίζουν μικρότερα αρχικά και τελικά βάρη σε σύγκριση προς τα WT. Ο ρυθμός μεταβολής του βάρους των ζώων στα τρανσγενικά Τg/Tg ποντίκια εμφανίζεται αυξημένος στα ποντίκια που έλαβαν HFD και 300 mg Ζn/kg τροφής, ωστόσο το μεγαλύτερο τελικό βάρος εμφανίζουν τα Zn (31,16g) Πιν.8,Διαγ.2,Διαγ2α.

98 mg/dl [98] ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ ΟΡΟΥ F1/F1 Chol mg/dl Tg/Tg Chol mg/dl Chow Diet 97,33333 Chow Diet 106,6 HFD 3Zn mg/kg 196,4 HFD 3Zn mg/kg 147,3 HFD 30Zn mg/kg 192,8 HFD 30Zn mg/kg 147,75 HFD 300Zn mg/kg 166,25 HFD 300Zn mg/kg 174,5 Πιν.9Επίπεδα ολικής χοληστερόλης (mg/kg) στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Cholesterol WT TG 50 0 Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Διαγ.3.Επίπεδα ολικής χοληστερόλης (mg/kg) στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) WT Chd vs WT p<0,001 Tg/Tg Chd vs Tg/Tg p<0,001 WT vs Tg/Tg p<0,001 WT vs Tg/Tg p<0,05 Tg/Tg HFD 30 vs Tg/Tg HFD 300 p<0,05 Η ολική χοληστερόλη πλάσματος εμφανίζει στατιστικά σημαντική αύξηση σε όλες τις ομάδες ζώων που έλαβαν δίαιτα με υψηλά λιπαρά. Εμφανίζεται όμως σημαντικά μικρότερη στα διαγονιδιακά (Tg) ποντίκια που τέθηκαν σε διατροφικές συνθήκες HFDZn 30 ή HFDZn 3, σε σχέση με τα ποντίκια ελέγχου (WT). (Πιν.9,Διαγ.3).Το εύρημα υποσημαίνει τον προστατευτικό ρόλο της hhsp70 στην υπερλιπιδαιμία,όταν ο διατροφικός Zn κυμαίνεται μεταξύ ανεπαρκών (3 mg /kg τροφής) και φυσιολογικών επιπέδων ( 30 mg /kg τροφής ). (Πιν. 9 και Διαγ.3)

99 [99] ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΑ ΟΡΟΥ F1/F1 TG mg/dl Tg/Tg TG mg/dl Chow Diet 143 Chow Diet 100,6 HFD 3Zn mg/kg 160,4615 HFD 3Zn mg/kg 109,3333 HFD 30Zn mg/kg 109,625 HFD 30Zn mg/kg 96,71429 HFD 300Zn mg/kg 91,66667 HFD 300Zn mg/kg 122,5833 Πιν. 10Επίπεδα τριγλυκεριδίων στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Triglycerides WT TG 0 Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Διαγ.4.Επίπεδα τριγλυκεριδίων στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) WT Chd vs Tg/Tg Chd p<0,05 WT vs Tg/Tg p<0,05 Τα επίπεδα τριγλυκεριδίων στο πλάσμα των πειραματοζώων δεν εμφανίζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών που έλαβαν δίαιτα χωρίς αυξημένα λιπαρά και αυτών που έλαβαν HF δίαιτα. Το εύρημα αποδίδεται στην μικρή συμμετοχή των non HDL, κυρίων φορέων των τριγλυκεριδίων, στα ποντίκια. (Πιν. 10.και Διαγ.4).

100 [100] ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ HDL ΟΡΟΥ F1/F1 HDL mg/dl Tg/Tg HDL mg/dl Chow Diet 69,38333 Chow Diet 66,48 HFD 3Zn mg/kg 133,7769 HFD 3Zn mg/kg 107,0917 HFD 30Zn mg/kg 135,1556 HFD 30Zn mg/kg 111,925 HFD 300Zn mg/kg 121,6917 HFD 300Zn mg/kg 123,8417 Πιν.11.Επίπεδα λιποπρωτεϊνης HDL στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Chow Diet HFD 300 Zn HDL HFD 30 Zn HFD 3 Zn WT TG Διαγ.5.Επίπεδα λιποπρωτεϊνης HDL στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) WT Chd vs WT p<0,0001 Tg/Tg Chd vs Tg/Tg p<0,0001 WT vs Tg/Tg p< 0,01 WT vs Tg/Tg p< 0,05 Τα επίπεδα των HDL, που αποτελούν και την κύρια αντιπροσώπευση των λιπιδίων του πλάσματος στα ποντίκια, είναι σημαντικά αυξημένα σε όλες τις ομάδες των ζώων που σιτίστηκαν με δίαιτες υψηλών λιπαρών (HFD).Το προφίλ μεταβολής της HDL τόσο των WT όσο και των Tg ζώων είναι ανάλογο των μεταβολών που παρατηρούνται στην ολική χοληστερόλη στις αντίστοιχες ομάδες ζώων.(πιν.9, 11. και Διαγ.3,5). Τα τρανσγενικά ζώα εμφανίζουν σημαντικά μικρότερα επίπεδα στις HF δίαιτες με Zn 3 και 30 mg/kg τροφής σε σύγκριση με τα WT ζώα στις αντίστοιχες δίαιτες.( p<0.01 & p<0.05 )

101 [101] ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΓΛΥΚΟΖΗ ΟΡΟΥ F1/F1 Glucose mg/dl Tg/Tg Glucose mg/dl Chow Diet 211 Chow Diet 186,1 HFD 3Zn mg/kg 269,9231 HFD 3Zn mg/kg 230,75 HFD 30Zn mg/kg 324 HFD 30Zn mg/kg 201,8 HFD 300Zn mg/kg 259,2 HFD 300Zn mg/kg 278,6667 Πιν.12 Επίπεδα γλυκόζης στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Glucose WT TG 50 0 Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Διαγ.6.Επίπεδα γλυκόζης στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Tg/Tg vs Tg/Tg 0 p<0,01 WT vs Tg/Tg p<0,01 Wt Chd vs WT p<0,05

102 [102] ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ ΟΡΟΥ F1/F1 Insulin ng/ml Tg/Tg Insulin ng/ml Chow Diet 0,8795 Chow Diet 0,929 HFD 3Zn mg/kg 3, HFD 3Zn mg/kg 3, HFD 30Zn mg/kg 1, HFD 30Zn mg/kg 2, HFD 300Zn mg/kg 1, HFD 300Zn mg/kg 2, Πιν.13Επίπεδα ινσουλίνης στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Insulin Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn WT TG Διαγ.7.Επίπεδα ινσουλίνης στο πλάσμα F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) WT HFD 300 vs Tg/Tg 0 p< 0,05 Τα επίπεδα γλυκόζης κατόπιν αιμοληψίας των ζώων, η οποία διενεργήθηκε στο τέλος της πειραματικής περιόδου φαίνεται, να είναι αυξημένα στα WT ζώα που τέθηκαν σε υπερλιπιδική δίαιτα. (p<0.05).αντίθετα τα Tg ζώα που ακολούθησαν HF δίαιτα δεν εμφάνισαν σημαντική αύξηση της γλυκόζης ορού με διατροφικό Ζn 30 mg/kg τροφής σε σύγκριση με τα WT (p<0.01).σημαντική αύξηση της γλυκόζης αίματος εμφάνισε η ομάδα Τg που σιτίστηκε με HFD 300 mgzn/kg τροφής σε σύγκριση με την ομάδα Tg HFD 30 mgzn/kg τροφής (p<0,01). (Πιν. 12,13. και Διαγ. 6,7). Οι τιμές της ινσουλίνης των WT και Tg ζώων είναι υψηλότερες στις ομάδες που έλαβαν είτε υψηλές συγκεντρώσεις Zn (300mg Zn /kg) είτε ανεπαρκείς συγκεντρώσεις (3 mg Zn /kg).τα Tg HFD ζώα εμφάνισαν

103 Copper μg/g ιστού [103] σημαντικά υψηλότερες τιμές ινσουλίνης από τα WT HFD, ιδιαίτερα τα ΤgHFD 300 (p< 0,05) και ΤgHFD 3.Οι συγκεντρώσεις Ινσουλίνης εμφανίζουν σε όλες τις ομάδες WT και Tg αντίστροφη κατανομή προς την γλυκόζη εκτός των ομάδων WT &Tg HFD 300. ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ: ΣΥΓΚΕΝΤΩΣΕΙΣ Cu ΣΤΟ ΗΠΑΡ F1/F1 Cu μg/g Tg/Tg Cu μg/g Chow Diet 5,619 Chow Diet 5,671 HFD 3Zn mg/kg 5,352 HFD 3Zn mg/kg 6,779 HFD 30Zn mg/kg 5,815 HFD 30Zn mg/kg 6,702 HFD 300Zn mg/kg 6,083 HFD 300Zn mg/kg 5,928 Πιν.14 Επίπεδα Cu στον ιστό ήπατος F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) 8 7 Cu (Liver) WT 3 Tg Chow Diet HFD 300Zn mg/kg HFD 30Zn mg/kg HFD 3Zn mg/kg Διαγ.8.Επίπεδα Cu στον ιστό ήπατος F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου)

104 Zn μg/g ιστού [104] ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ: ΣΥΓΚΕΝΤΩΣΕΙΣ Zn ΣΤΟ ΗΠΑΡ F1/F1 Zn μg/g Tg/Tg Zn μg/g Chow Diet 25,222 Chow Diet 27,882 HFD 3Zn mg/kg 28,339 HFD 3Zn mg/kg 29,095 HFD 30Zn mg/kg 27,119 HFD 30Zn mg/kg 28,255 HFD 300Zn mg/kg 29,519 HFD 300Zn mg/kg 26,804 Πιν.15 Επίπεδα Zn ιστό ήπατος F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) 35 Zn (liver) WT Tg 5 0 Chow Diet HFD 300Zn mg/kg HFD 30Zn mg/kg HFD 3Zn mg/kg Διαγ.9.Επίπεδα Zn σε ιστό ήπατος F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Οι μεταβολές των ηπατικών επιπέδων των μετάλλων μεταξύ των ομάδων με διαφορετικό διατροφικό περιεχόμενο ως προς τον Zn δεν είναι σημαντικές. Τα επίπεδα ηπατικού Cu των Tg ζώων εμφανίζονται υψηλότερα στην ομάδα των Zn 3 mg/kg τροφής και χαμηλότερα στην ομάδα των Zn 300 mg/kg τροφής αλλά χωρίς στατιστική

105 Zinc μg/g [105] σημαντικότητα. Τα επίπεδα του ηπατικού Zn δεν εμφανίζουν σημαντικές μεταβολές μεταξύ των διατροφικών ομάδων τόσο των WT όσο και των Tg ποντικών. (Πιν.15 Διαγ.9) ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ: ΣΥΓΚΕΝΤΩΣΕΙΣ Cu ΣΤΑ ΕΡΥΘΡΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ F1/F1 Cu μg/g Tg/Tg Cu μg/g Chow Diet 0,43 Chow Diet 0, HFD 3Zn mg/kg 0, HFD 3Zn mg/kg 0, HFD 30Zn mg/kg 0,428 HFD 30Zn mg/kg 0,44155 HFD 300Zn mg/kg 0,44444 HFD 300Zn mg/kg 0, Πιν.16 Επίπεδα Cu στα ερυθρά αιμοσφαίρια F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου 0,60 0,50 Cu (erythrocytes) 0,40 0,30 0,20 0,10 WT TG 0,00 CD 300 mg/kg 30 mg/kg 3 mg/kg Διαγ.10.Επίπεδα Cu στα ερυθρά αιμοσφαίρια F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου)

106 Zinc μg/g [106] ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ: ΣΥΓΚΕΝΤΩΣΕΙΣ Ζn ΣΤΑ ΕΡΥΘΡΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ F1/F1 Zn μg/g Tg/Tg Zn μg/g Chow Diet 6,67 Chow Diet 7, HFD 3Zn mg/kg 6, HFD 3Zn mg/kg 6, HFD 30Zn mg/kg 6,78253 HFD 30Zn mg/kg 6, HFD 300Zn mg/kg 6,69733 HFD 300Zn mg/kg 8, Πιν.17 Επίπεδα Zn στα ερυθρά αιμοσφαίρια F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Zn (erythrocytes)) Chow Diet HFD 300 mg/kg HFD 30 mg/kg HFD 3 mg/kg WT TG Διαγ.11. Επίπεδα Zn τα ερυθρά αιμοσφαίρια F1/F1 και Τg/Tg ποντικών, εκτεθέντων σε δίαιτα υψηλών λιπαρών και διαφορετικών συγκεντρώσεων Zn (300 mg Zn /kg τροφής (0Zn),30 mg Zn /kg τροφής(),3 mg Zn /kg τροφής (Zn) και Chow Diet: δίαιτα ελέγχου) Τα επίπεδα του ερυθροκυταρικού Cu δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διατροφικών ομάδων Zn. Χαμηλότερες συγκεντρώσεις Cu εμφανίζονται στην ομάδα διατροφής HFD Zn 3mg/kg τροφής και υψηλότερες στην HFD Zn 300mg/kg τροφής, κατανομή που διαφοροποιείται από αυτή του ηπατικού Cu.

107 [107] Ο ερυθροκυταρικός Zn εμφανίζεται υψηλότερος στην ομάδα διατροφής HFD Zn 300 mg/kg και μικρότερος στην ομάδα HFD Zn 3 mg/kg, όπως αναμενόταν και συμφωνεί με την κατανομή του ηπατικού Zn που παρατηρείται στις αντίστοιχες ομάδες ζώων. (Πιν.17, Διαγ.11). TAC Από την μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (TAC) με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο στο πλάσμα του αίματος των διαφόρων ομάδων πειραματοζώων είχαμε τα παρακάτω αποτελέσματα: TAC in plasma F1/F1 Tg/Tg Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn Πίν. 18 Αποτελέσματα μετρήσεων της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσμα του αίματος WT(F1/F1) και Tg/Tg πειραματοζώων. 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 TAC * * * * * Chow Diet HFD 300 Zn HFD 30 Zn HFD 3 Zn WT TG Διάγ. 12.Γραφική απεικόνιση των μετρήσεων της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσμα του αίματος F1/F1 και Tg/Tg ζώων. F1/F1 : C57Bl/6xCBA.ποντίκια, Tg: