ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 ΣΤΗΝ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΗ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΤΗΣ Β ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α. ΣΑΚΑΝΤΑΜΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 ΣΤΗΝ ΑΝΑΣΤΟΜΩΣΗ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ ΝΙΚΟΛΑΟΥ Γ. ΣΥΜΕΩΝΙΔΗ ΙΑΤΡΟΥ - ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Καθηγητής Νικόλαος Nτόμπρος ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΥ ΤΟΜΕΑ Καθηγητής Γεώργιος Καπετάνος 3

4 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σακαντάμης Αθανάσιος, Καθηγητής (Εισηγητής) Καρβουνάρης Δημήτριος, Καθηγητής Καρακιουλάκης Γεώργιος, Καθηγητής Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σακαντάμης Αθανάσιος, Καθηγητής Καρβουνάρης Δημήτριος, Καθηγητής Καρακιουλάκης Γεώργιος, Καθηγητής Κανέλλος Ιωάννης, Καθηγητής Μακρής Ιωάννης, Καθηγητής Μπασδάνης Γεώργιος, Καθηγητής Τρυγόνης Κωνσταντίνος, Αναπληρωτής Καθηγητής «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Α- ριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, άρθρ και ν. 1268/82, άρθρ. 50 8) 4

5 5 Στους γονείς μου

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΤΟ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ Στοιχεία εμβρυολογίας, ανατομίας, ιστολογίας και φυσιολογίας του παχέος εντέρου του ανθρώπου Εμβρυολογία Ανατομία Ιστολογία Φυσιολογία Στοιχεία ανατομικής και φυσιολογίας του επίμυος Ανατομία Φυσιολογία ΕΠΟΥΛΩΣΗ Φάσεις της επούλωσης Φάση Αιμόστασης Φάση Φλεγμονής Φάση Πολλαπλασιασμού Φάση Αναδιαμόρφωσης Επούλωση του παχέος εντέρου Διαφυγή από την αναστόμωση του παχέος εντέρου ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Γενικά περί Αγγειογένεσης Μορφές της αγγειογένεσης Νεοαγγείωση Αγγειογένεση Τα στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Αγγειοδιαστολή και αυξημένη διαπερατότητα Αποσταθεροποίηση των αγγείων-αποδόμηση της θεμέλιας ουσίας Πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων και μετανάστευση Δημιουργία αυλού και σταθεροποίηση του αγγείου Αγγειογένεση κατά την επούλωση των ιστών Ρύθμιση της αγγειογένεσης Αγγειογένεση και καρκίνος Αγγειογένεση και δημιουργία μεταστάσεων Αγγειογενετική μεταστροφή

8 4 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) Δομικά χαρακτηριστικά της οικογένειας VEGF Υποδοχείς του VEGF O ρόλος του VEGF κατά την αγγειογένεση της επούλωσης Παράγοντας ανάπτυξης των ινοβλαστών (FGF) Ο ρόλος του bfgf στην αγγειογένεση και την επούλωση Προερχόμενος από τα αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας PDGF O ρόλος του PDGF στην επούλωση Ο ρόλος του PDGF στην αγγειογένεση Μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β (TGF-β) Ο ρόλος του TGF-β στην αγγειογένεση Αγγειοποιητίνες Ο ρόλος των αγγειοποιητινών στην αγγειογένεση Ο ρόλος των αγγειοποιητινών στην επούλωση ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Κολλαγόνο Λαμινίνες Τενασκίνες Ιντεγκρίνες Πρωτεογλυκάνες Δομικά χαρακτηριστικά των μεταλλοπρωτεϊνασών Ενεργοποίηση των MMPs Ταξινόμηση Ο ρόλος των MMPs σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις O ρόλος των MMPs στην αγγειογένεση Ζελατινάσες και αγγειογένεση Ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) Δομή Λειτουργία TIMP Ο ρόλος των TIMPs στην αγγειογένεση Ο ρόλος των TIMPs στην επούλωση ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΕΣ - ΣΕΛΕΚΟΞΙΜΠΗ Μεταβολισμός αραχιδονικού οξέος Ταξινόμηση των Μη-Στεροειδών Αντιφλεγμονωδών Φαρμάκων

9 6.3 Μηχανισμός δράσης των Μη-Στεροειδών Αντιφλεγμονωδών Φαρμάκων Κυκλοοξυγενάσες Σελεκοξίμπη Φαρμακοκινητικές ιδιότητες της σελεκοξίμπης στον άνθρωπο Θεραπευτικές ενδείξεις σελεκοξίμπης Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων Πλεονεκτήματα Γαστρεντερικό Μειονεκτήματα Καρδιαγγειακό Κυκλοοξυγενάση-2 και καρκίνος Η έκφραση της COX-2 στον ορθοκολικό καρκίνο ΜΣΑΦ και εκλεκτικοί COX αναστολείς στον ορθοκολικό καρκίνο...89 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ Πειραματόζωα Πειραματική διάταξη Χορήγηση φαρμακευτικής ουσίας Ζύγιση πειραματοζώων - Βάρος Χειρουργική επέμβαση Αναισθησία Προετοιμασία του επίμυος Χειρουργική τεχνική Επανεπέμβαση - Θυσία Μέτρηση της πίεσης διάσπασης Βιοχημική ανάλυση των παρασκευασμάτων Ανίχνευση και ταυτοποίηση των MMP και ΤIMP Kαθαρισμός και απομόνωση ενζυμικής δραστηριότητας MMPs Kλασματοποίηση με καθίζηση με θειικό αμμώνιο Ζυμογράφημα ζελατίνης Πυκνομετρία σάρωσης Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για τον προσδιορισμό του ιστικού αναστολέα των ΜΜΡ-1 (ΤΙΜΡ-1) Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για την ανίχνευση της MMP Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για τον προσδιορισμό του VEGF

10 8.7.9 Προσδιορισμός πρωτεϊνών Ιστολογική εξέταση Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Βάρος σώματος Συμφύσεις Πίεση διάσπασης Σημείο ρήξης Βιοχημική ανάλυση του ιστού της αναστόμωσης Ζυμογραφία σε πήγμα ζελατίνης Σύγκριση ζελατινολυτικής δραστηριότητας σε σχέση με την απόσταση από το σημείο αναστόμωσης Επίδραση της σελεκοξίμπης στη ζελατινολυτική δραστηριότητα Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας με πυκνομετρία σάρωσης Περιεκτικότητα prommp-2 στα δείγματα παχέος εντέρου Περιεκτικότητα TIMP-1 στα δείγματα παχέος εντέρου Περιεκτικότητα VEGF στα δείγματα παχέος εντέρου Ιστολογική εξέταση Φλεγμονώδης διήθηση Ινοβλαστική αντίδραση Αγγειογένεση Πυώδες εξίδρωμα ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ALK: Actin receptor-like Kinase Ang: Angiopoetins APC: Adenomatous Polyposis Coli AUC: Area Under Curve COX: Cyclooxygenase CSF: Colony Stimulating Factor CXC: CXC chemokines, IL-8 cgmp: cyclic Gouanisine Monophosphate EGF: Epidermal Growth Factor enos: endothelial Nitric Oxide Synthetase FAP: Familial Adenomatous Polyposis FGF: Fibroblast Growth Factor HGF: Hepatocellular Growth Factor HIF: Hypoxia Inducible Factor IGF: Insulin-like Growth Factor MIN: Multiple Intestinal Neoplasia MMP: Matrix Metalloproteinases ΜΣΑΦ: Μη-Στεροειδή Αντιφλεγμονώδη Φάρμακα MT-MMP: Membrane Type Matrix Metalloproteinase ΝΟ: Nitric Oxide PAI: Plasminogen Activator Inhibitor PDGF: Platelet Derived Growth Factor PECAM: Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule PGHS: Prostaglandin endoperoxide H Synthetase PlGF: Placental Growth Factor TGF-β: Transforming Growth Factor 11

12 Tie: TIMP: TNF-α: TSP: TX: VEGF: Tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal factor domain Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Tissue Necrosis Factor-α Thrombospondin Thromboxane Vascular Endothelial Growth Factor 12

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η επούλωση αποτελεί μία σύνθετη διαδικασία η οποία έχει σκοπό την αποκατάσταση των ιστικών βλαβών. Αποκτά ιδιαίτερη σημασία, ό- ταν αφορά τις αναστομώσεις του παχέος εντέρου, γιατί η ανεπαρκής ε- πούλωσή τους μπορεί να οδηγήσει σε επικίνδυνες για τη ζωή του ασθενούς αναστομωτικές επιπλοκές μέσα στην πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα και κατά συνέπεια και σε αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα. Η αγγειογένεση, δηλαδή η δημιουργία νέων αγγείων από τα προϋπάρχοντα, είναι απαραίτητη για την επούλωση των ιστών. Τα νεοσχηματισμένα αγγεία συμμετέχουν στον προσωρινό κοκκιώδη ιστό, παρέχοντας οξυγόνο και θρεπικά συστατικά καθώς και δίοδο στα φλεγμονώδη κύτταρα που είναι αναγκαία για τις διεργασίες της επούλωσης. Βασικό ρόλο στην αγγειογένεση διαδραματίζουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα των προϋπαρχόντων αγγείων. Η αγγειογενετική διαδικασία ξεκινά με τον ιστικό τραυματισμό και περιλαμβάνει μια σειρά γεγονότων μεταξύ των οποίων την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης, τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στη εξωκυττάρια ουσία, τη δημιουργία και τέλος τη σταθεροποίηση των αγγείων. Ένα πλήθος παραγόντων που δρουν θετικά ή αρνητικά στην αγγειογένεση συμβάλλουν στη ρύθμισή της, με το τελικό αποτέλεσμα να οφείλεται στην ισορροπία ανάμεσα στους παράγοντες αυτούς. Μεταξύ των παραγόντων αυτών ιδιαίτερη βαρύτητα έχει δοθεί τα τελευταία χρόνια στην έρευνα των μεταλλοπρωτεϊνασών θεμέλιας ουσίας (MMPs) οι οποίες αποδομούν τη βασική μεμβράνη των αγγείων και την εξωκυττάρια ουσία, αλλά και στον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF), ο οποίος είναι ένας ισχυρός αγγειογενετικός παράγοντας. Η κυκλοοξυγενάση (COX) είναι ένα ένζυμο το οποίο καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος στα παράγωγα της προσταγλανδίνης. Δύο ισομορφές της COX έχουν ανακαλυθφεί, η COX-1, η οποία εκφράζεται συστηματικά στους ιστούς και η COX-2, η οποία εκφράζεται μόνο σε απάντηση σε εξωγενή ερεθίσματα, γι αυτό και θεωρείται ότι εμπλέκεται κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η φλεγμονή, ο πόνος και ο πυρετός. Πολλές από τις ανεπιθύμητες ενέργειες των μη-στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ), όπως έλκη-αιμορραγίες γαστρεντερικού και δυσλειτουργίες των αιμοπεταλίων, μπορούν να αποδοθούν στην καταστολή των προερχόμενων από την COX-1 παραγώγων. Αντίθετα, η αναστολή της εξαρτώμενης από την COX-2 σύνθεση των προσταγλανδινών είναι υπεύθυνη για τις αντιφλεγμονώδεις, αναλγητικές και α- ντιπυρετικές δράσεις των ΜΣΑΦ. Επομένως, η υπόθεση ότι η εκλεκτική αναστολή της COX-2 έχει τις θεραπευτικές δράσεις των υπόλοιπων ΜΣΑΦ, αλλά χωρίς τις ανεπιθύμητές τους ενέργειες αποτέλεσε το σκε- 13

14 πτικό για την εξέλιξη των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων (κοξίμπες), μιας νέας τάξης αντιφλεγμονωδών και αναλγητικών παραγόντων με βελτιωμένη ανοχή από το γαστρεντερικό. Κύριες ενδείξεις χορήγησης των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων, όπως η σελεκοξίμπη, είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η οστεοαρθρίτιδα, ενώ τελευταία χρησιμοποιούνται ολοένα και περισσότερο στην περιεγχειρητική περίοδο για αναλγησία. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι τα φάρμακα της κατηγορίας αυτής παρουσιάζουν και αντιαγγειογενετική δράση. Η σελεκοξίμπη έχει λάβει έγκριση για τη χρησιμοποίησή της ως προφυλακτική αγωγή στο σύνδρομο της οικογενούς πολυποδίασης του παχέος εντέρου. Παράλληλα, νεότερες έρευνες εστιάζονται στην καταπολέμηση διαφόρων μορφών καρκίνου με τη χορήγηση της σελεκοξίμπης, μόνης ή σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Τίθεται επομένως το ερώτημα αν η αντιαγγειογενετική δραστηριότητα της σελεκοξίμπης μπορεί να επηρέασει και την επουλωτική διαδικασία των αναστομώσεων παχέος εντέρου. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει το Γενικό και το Ειδικό Μέρος. Στο Γενικό Μέρος γίνεται μία περιληπτική αναφορά στα βασικότερα στοιχεία της Ανατομίας και Φυσιολογίας του παχέος εντέρου του ανθρώπου αλλά και του επίμυος. Ακολουθεί η περιγραφή των σταδίων της ε- πούλωσης, με ιδιαίτερη αναφορά στο ρόλο που διαδραματίζει η αγγειογένεση στη διαδικασία αυτή. Στη συνέχεια γίνεται εκτενέστερη αναφορά στην αγγειογένεση και τη σημασία της καθώς και στους κυριότερους παράγοντες που την επηρεάζουν. Αναλύεται ο ρόλος των μεταλλοπρωτεϊνασών στην αγγειογένεση και την επούλωση και τέλος δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στις ιδιότητες και δράσεις της σελεκοξίμπης και των παρόμοιων με αυτή φαρμάκων. Το Ειδικό Μέρος περιλαμβάνει την περιγραφή των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν, τα αποτελέσμα των πειραμάτων, τη στατιστική τους επεξεργασία, τη συζήτηση, τα συμπεράσματα, την περίληψη και τη βιβλιογραφία. Το πειραματικό μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Επιστημονικής Έρευνας και Πειραματικής Χειρουργικής της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Ιπποκράτειο Γενικό Νοσοκομείο). Οι απαραίτητες εργαστηριακές δοκιμασίες διενεργήθηκαν στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομίας καθώς και το Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, θεωρώ καθήκον μου να εκφράσω τις θερμές και ειλικρινείς μου ευχαριστίες: Στον Καθηγητή Χειρουργικής κ. Αθανάσιο Σακαντάμη, Διευθυντή της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής του Α.Π.Θ., για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου, αναθέτοντάς μου τη μελέτη αυτή 14

15 για την εκπόνηση της διδακτορικής μου διατριβής. Παράλληλα, από το ρόλο του επιβλέποντος, συνέβαλε αποφασιστικά στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής με το ενδιαφέρον με το οποίο επόπτευσε την όλη εργασία, έλεγξε την ορθή εκτέλεσή της και βοήθησε στη διαμόρφωσή της. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου για τη θεωρητική και πρακτική χειρουργική κατάρτιση που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσής μου στη Χειρουργική. Στον Καθηγητή Φαρμακολογίας του Α.Π.Θ. κ. Γεώργιο Καρακιουλάκη, για την πολύτιμη συμβολή του στο σχεδιασμό του ερευνητικού πρωτοκόλλου, τη πραγματοποίηση μεγάλου μέρους των εργαστηριακών εξετάσεων υπό την εποπτεία του στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Α.Π.Θ., καθώς και τη βοήθειά του στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Στην Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ. κ. Ελένη Νενοπούλου η οποία επιμελήθηκε της ιστολογικής εξέτασης των παρασκευασμάτων και της διενέργειας της ανοσοϊστοχημικής μελέτης. Στον Καθηγητή Χειρουργικής του Α.Π.Θ. κ. Δημήτριο Καρβουνάρη, μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής, για την καθοδήγηση και τις εύστοχες συμβουλές του για την πραγματοποίηση αυτής της μελέτης. Στην Επίκουρο Καθηγήτρια Φαρμακολογίας του Α.Π.Θ. κ. Ελένη Παπακωνσταντίνου, για την πολύτιμη βοήθειά της κατά τη διενέργεια των βιοχημικών εξετάσεων. Στους συναδέλφους Κυριάκο Ψαρρά, Ελένη Αιμονιώτου, Απόστολο Τριανταφύλλου, Κωνσταντίνο Παπανικολάου και Δημήτρη Πίσσα για την ουσιαστική βοήθειά τους στο πειραματικό σκέλος αυτής της διατριβής. Στη φιλόλογο κ. Αφροδίτη Νταλιάρη, η οποία επιμελήθηκε της γλωσσικής, γραμματικής και συντακτικής αρτιότητας του κειμένου. Στο προσωπικό της Β Χειρ/κής Προπαιδευτικής Κλινικής και ό- λους όσους προσέφεραν τη βοήθειά τους στην εκπόνηση της διδακτορικής αυτής διατριβής. 15

16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 ΤΟ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ 1.1 Στοιχεία εμβρυολογίας, ανατομίας, ιστολογίας και φυσιολογίας του παχέος εντέρου του ανθρώπου Εμβρυολογία Το πρωτογενές έντερο, το οποίο χωρίζεται στο πρόσθιο, το μέσο και το οπίσθιο έντερο, αναπτύσσεται κατά την τέταρτη εβδομάδα της κυήσεως. Η ανάπτυξη του μέσου εντέρου οδηγεί στο σχηματισμό του λεπτού εντέρου (με αρχή στο σημείο εισόδου του χοληδόχου πόρου) και του παχέος εντέρου μέχρι τη μεσότητα του εγκαρσίου κόλου. Το τμήμα αυτό του εντέρου λαμβάνει την αιμάτωσή του από την άνω μεσεντέριο αρτηρία καθώς και την αντίστοιχη φλεβική και λεμφική αποχέτευση 1. Η συμπαθητική νεύρωση του μέσου αλλά και του οπισθίου εντέρου προέρχεται από το επίπεδο Θ 8 έως Ο 2 διαμέσου σπλαγχνικών νεύρων και των κοιλιακών και των πυελικών πλεγμάτων. Η παρασυμπαθητική νεύρωση προέρχεται από το Χ κρανιακό νεύρο (πνευμονογαστρικό) με προγαγγλιακά κυτταρικά σώματα στο εγκεφαλικό στέλεχος. Η ανάπτυξη του οπισθίου εντέρου οδηγεί στο σχηματισμό του παχέος εντέρου περιφερικότερα από τη μεσότητα του εγκαρσίου κόλου μέχρι και το κεντρικό τμήμα του πρωκτού, καθώς και του κατώτερου τμήματος του ουροποιητικού συστήματος. Το τμήμα αυτό αρδεύεται από την κάτω μεσεντέριο αρτηρία και λαμβάνει παρασυμπαθητική νεύρωση από το επίπεδο των Ι 2 έως Ι 4 2. Το περιφερικό τμήμα του πρωκτικού σωλήνα λαμβάνει την αιμάτωσή του από κλάδους της έσω αιδοιϊκής αρτηρίας και προέρχεται από το εξώδερμα. Το αναπτυσσόμενο μέσο έντερο μεταναστεύει εκτός της περιτοναϊκής κοιλότητας κατά την έκτη εβδομάδα της κύησης. Μέσα στις επόμενες 4 εβδομάδες, το μέσο έντερο στρέφεται κατά 270 με αντιωρολογιακή φορά γύρω από την άνω μεσεντέριο αρτηρία και κατόπιν λαμβάνει την τελική του ανατομική θέση μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα 1. Το αναπτυσσόμενο οπίσθιο έντερο καταλήγει στην κλοάκη, η οποία κατά την 6 η εβδομάδα της κυήσεως διαχωρίζεται από το ορθοπρωκτικό διάφραγμα στο κοιλιακό ουρογεννητικό κόλπωμα και στο ραχιαίο ορθό. Η διαμόρφωση του πρωκτικού σωλήνα τελειώνει στο τέλος της 8 ης εβδομάδας όταν η λεπτή μεμβράνη το πρωκτικού σωλήνα ρήγνυται. Η οδοντωτή γραμμή στον κατώτερο πρωκτό αποτελεί και σημείο μετάβασης το ενδοδέρματος του μέσου εντέρου στο εξώδερμα. 17

18 1.1.2 Ανατομία Το παχύ έντερο και ορθό του ανθρώπου αποτελεί ένα σωλήνα μήκους 150 cm περίπου που εκτείνεται από την ειλεοτυφλική βαλβίδα έως τον ορθοπρωκτικό δακτύλιο όπου μεταπίπτει στον πρωκτικό σωλήνα. Καταλαμβάνει την περιφέρεια της κοιλιακής κοιλότητας και αποτελείται από το τυφλό και το ανιόν κόλο στα δεξιά, το εγκάρσιο κόλο, το κατιόν και το σιγμοειδές κόλο στα αριστερά. Τα διάφορα τμήματα του παχέος εντέρου παρουσιάζουν εναλλαγές ως πρός την κινητικότητα τους. Το τυφλό, το εγκάρσιο και το σιγμοειδές κόλο είναι ευκίνητα ενώ το ανιόν και το κατιόν είναι καθηλωμένα στο οπίσθιο τοίχωμα. Τα γενικά χαρακτηριστικά του είναι η μεγάλη του διάμετρος, η παρουσία των επιπλοϊκών α- ποφύσεων και η παρουσία επιμήκων μυικών ινών που σχηματίζουν τις τρεις κολικές ταινίες. Ανάμεσα στις κολικές ταινίες σχηματίζονται σακκοειδείς διευρύνσεις που ονομάζονται κολικές κυψέλες 1,2. Τυφλό Το τυφλό αποτελεί το πρώτο τμήμα του παχέος εντέρου. Έχει σακκοειδές σχήμα και μήκος 10 εκ. περίπου. Βρίσκεται στο δεξιό λαγόνιο βόθρο και κείται επί του δεξιού λαγονοψοΐτη μυός. Προς τα άνω το τυφλό μεταπίπτει στο ανιόν κόλο, ενώ στο σημείο της μετάπτωσης αυτής δέχεται στο έσω τοίχωμα του τον τελικό ειλεό. Το κύριο στήριγμά του είναι το περιτόναιο, από το οποίο συνήθως περιβάλλεται από όλες τις πλευρές, καθιστώντας το τυφλό ένα ενδοπεριτοναϊκό όργανο. Στην εξωτερική του επιφάνεια, το τυφλό παρουσιάζει τις τρεις κολικές ταινίες οι οποίες συρρέουν στη βάση της σκωληκοειδούς απόφυσης, καθώς και τη συμβολή με τον ειλεό. Εσωτερικά εμφανίζει μηνοειδείς πτυχές, κολικές κυψέλες, την ειλεοκολική βαλβίδα και το στόμιο του αυλού της σκωληκοειδούς απόφυσης 3. H σκωληκοειδής απόφυση εκφύεται μεταξύ έσω και οπισθίου τοιχώματος του τυφλού, 2cm κάτω από την ειλεοτυφλική συμβολή. Πρόκειται για τυφλό σωλήνα διαμέτρου cm και μήκους που κυμαίνεται από 2.5cm έως και πάνω από 20cm. Οι συνήθεις θέσεις της σκωληκοειδούς απόφυσης είναι η οπισθοτυφλική, η οπισθοκολική και η πυελική. Περιβάλλεται από περιτόναιο και κρέμεται από μια περιτοναϊκή πτυχή που λέγεται μεσεντερίδιο στο ελεύθερο χείλος του οποίου πορεύεται η σκωληκοειδική αρτηρία 4. Ανιόν Εγκάρσιο Κατιόν Σιγμοειδές Το ανιόν καλύπτεται από περιτόναιο κατά την πρόσθια και τις πλάγιες επιφάνειες του, ενώ η οπίσθια επιφάνεια συμφύεται χαλαρά με τις οπισθοπεριτοναϊκές δομές. Σπάνια μπορεί να περιβάλλεται από παντού από περιτόναιο, δημιουργώντας ένα βραχύ ανιόν μεσόκολο. Σχετί- 18

19 ζεται ανατομικά με το δεξιό νεφρό και το δεξιό ουρητήρα, το δωδεκαδάκτυλο, το ήπαρ και τη χοληδόχο κύστη. Η δεξιά κολική καμπή αποτελεί το όριο μετάπτωσης με το εγκάρσιο κόλο. Μια πτυχή του περιτοναίου που προέρχεται από τον ηπατονεφρικό σύνδεσμο στηρίζει την καμπή αυτή 4. Το εγκάρσιο εκτείνεται από τη δεξιά κολική καμπή μέχρι την αριστερή κολική καμπή, σημείο που αντιστοιχεί περίπου στον κάτω πόλο του σπληνός, όπου και μεταπίπτει στο κατιόν κόλο. Καλύπτεται από περιτόναιο από όλες τις πλευρές του και στηρίζεται στο οπίσθιο κοιλιακό τοίχωμα με μια πλατιά πτυχή του περιτοναίου, το εγκάρσιο μεσόκολο. Έτσι αποτελεί ενδοπεριτοναϊκό όργανο εκτός από τη δεξιά άκρη του η οποία βρίσκεται σε στενή επαφή με το δωδεκαδάκτυλο και το πάγκρεας. Μια ακόμη πτυχή του περιτοναίου, ο γαστροκολικός σύνδεσμος, συνδέει το μείζον τόξο του στομάχου με το εγκάρσιο κόλο και συμβάλλει στη στήριξη του οργάνου 1,2,4. Η αριστερή κολική καμπή σχηματίζει οξεία γωνία η οποία είναι καθηλωμένη στο διάφραγμα μέσω του φρενοκολικού συνδέσμου, ο οποίος συμβάλλει στην στήριξη του κάτω πόλου του σπληνός 5. Το κατιόν κόλο, εκτείνεται από την αριστερή κολική καμπή έως τον αριστερό λαγόνιο βόθρο στο στόμιο της ελάσσονος πυέλου, όπου μεταπίπτει στο σιγμοειδές κόλο. Καλύπτεται από περιτόναιο από την πρόσθια και τις πλάγιες επιφάνειες του, σπάνια παρουσιάζει κατιόν μεσόκολο, ενώ η ο- πίσθια επιφάνειά του συνδέεται χαλαρά με τις δομές του οπισθοπεριτοναϊκού χώρου 4,5. Το σιγμοειδές κόλο ξεκινά από το άνω στόμιο της ελάσσονος πυέλου μέχρι το επίπεδο του Ι 3 σπονδύλου όπου μεταπίπτει στο ορθό. Χαρακτηρίζεται από το σχήμα του που ομοιάζει με λατινικό S, το μεταβλητό του μήκος και το μεσεντέριό του, το οποίο το καλύπτει από παντού και του προσδίδει ευκινησία. Το σιγμοειδές μπορεί να έλθει σε επαφή με την ουροδόχο κύστη, την πρόσθια επιφάνεια του ανώτερου ορθού, ή, στις γυναίκες, με τη μήτρα και τα εξαρτήματα. Η μετάπτωση του σιγμοειδούς στο ορθό βρίσκεται σε απόσταση 15cm από τον πρωκτικό δακτύλιο και γίνεται αντιληπτή από την συγχώνευση των κολικών ταινιών σε ένα χιτώνα επιμήκους μυός και από την ξαφνική απώλεια των επιπλοϊκών αποφύσεων 4. Ορθό Το ορθό αποτελεί τη συνέχεια του σιγμοειδούς και το τελευταίο τμήμα του παχέος εντέρου. Το μήκος του είναι 12-15cm και εκτείνεται από την ορθοσιγμοειδική συμβολή έως τον αιμορροϊδικό δακτύλιο. Παρουσιάζει δύο μοίρες, την ενδοπυελική και την περινεϊκή. Αρχικά πορεύεται έμπροσθεν του ιερού οστού και του κόκκυγα και στη συνέχεια κάμπτεται προς τα πίσω στο περίνεο μέχρι τον πρωκτό. Σε αντίθεση με την 19

20 ονομασία του, δεν φέρεται ευθέως προς τα κάτω, αλλά σχηματίζει δύο καμπές σε οβελιαίο επίπεδο, την ιερά καμπή, που στρέφει το κυρτό της προς τα πίσω και την περινεϊκή καμπή, που στρέφει το κυρτό της προς τα εμπρός. Η ενδοπυελική μοίρα είναι και ενδοπεριτοναϊκή αλλά μεταπίπτει στο ύψος της ανάκαμψης του περιτοναίου σε εξωπεριτοναϊκό όργανο. Το περιτόναιο καλύπτει τα δύο άνω τριτημόρια του ορθού από εμπρός και πλάγια. Η ανάκαμψη του περιτοναίου προς τα εμπρός, στους άνδρες στην ουροδόχο κύστη και στις γυναίκες στην οπίσθια επιφάνεια του κόλπου και τη μήτρα, οδηγεί στο σχηματισμό του ευθυκυστικού και ευθυμητρικού κολπώματος αντίστοιχα. Ταυτόχρονα παρουσιάζει και τρεις πλάγιες καμπές, σημαντικές για τον έλεγχο της αφόδευσης, που ενδοσκοπικά ε- πισημαίνονται από κυκλοτερείς πτυχές του βλεννογόνου, γνωστές ως βαλβίδες του Houston 1,2. Η στήριξη του ορθού οφείλεται κατά κύριο λόγο στο περίνεο και λιγότερο στο περιτόναιο, την περιτονία του ορθού και τα αγγεία του. Η περιτονία του ορθού το περιβάλλει κυκλοτερώς και προς τα πίσω σχηματίζει την περιτονία του Waldayer, η οποία αποτελεί συνέχεια της προϊεράς περιτονίας. Προς τα πλάγια σχηματίζει τους πλάγιους συνδέσμους και προς τα εμπρός την περιτονία του Denonvillier. Στο χώρο μεταξύ της περιορθικής περιτονίας και του τοιχώματος του ορθού υπάρχει χαλαρός ινολιπώδης ιστός με λεμφοεπιθηλιακά και αγγειακά στοιχεία, που περιγράφεται ως μεσοορθό. Η περινεϊκή μοίρα, μήκους 2-3cm, αρχίζει κάτω από την κορυφή του κόκκυγα, πορεύεται προς τα κάτω και πίσω μέσα από το πυελικό έδαφος και καταλήγει στον πρωκτό Αιμάτωση του παχέος εντέρου Δύο από τα τρία κύρια σπλαγχνικά αγγεία, η άνω και η κάτω μεσεντέριος αρτηρία, αρδεύουν το παχύ έντερο. Το όριο μεταξύ των δύο περιοχών που αρδεύουν τα αγγεία αυτά είναι μεταξύ των κεντρικών δύο τρίτων και του περιφερικού ενός τρίτου του εγκαρσίου το οποίο αποτελεί και το εμβρυολογικό όριο μεταξύ μέσου και οπισθίου εντέρου. Παράπλευρη κυκλοφορία δημιουργείται ανάμεσα στις δύο αυτές αρτηρίες με ένα συνεχές αρτηριακό τόξο που πορεύεται παρά το μεσεντερικό χείλος του παχέος εντέρου σχηματίζοντας την επιχείλιο αρτηρία του Drummond, από την οποία ξεκινούν τα τροφοφόρα αγγεία 1. Το παχύ έ- ντερο είναι αρκετά λιγότερο αγγειοβριθές σε σχέση με το λεπτό έντερο και κατά συνέπεια περισσότερο ευάλωτο στη νέκρωση, επειδή οι επικοινωνίες μεταξύ των γειτονικών αλλά και των αντιθέτων τροφοφόρων αγγείων είναι λίγες 2. Η άνω μεσεντέριος αρτηρία εκφύεται από την κοιλιακή επιφάνεια της αορτής πίσω από το άνω χείλος του παγκρέατος και αρδεύει το τυφλό, τη σκωληκοειδή απόφυση, το ανιόν και μέρος του εγκαρσίου. Πο- 20

21 ρεύεται αρχικά πίσω από την κεφαλή του παγκρέατος, στη συνέχεια διασταυρώνεται με την τρίτη μοίρα του δωδεκαδακτύλου και συνεχίζει με φορά προς τα δεξιά και κάτω μέσα στη ρίζα του μεσεντερίου. Από τη δεξιά πλευρά της εκφύονται οι κολικοί κλάδοι: η μέση και η δεξιά κολική αρτηρία και η ειλεοκολική αρτηρία οι οποίες αρδεύουν το δεξιό κόλο μέχρι και το μέσο τριτημόριο του εγκαρσίου 1,6,7,8. Η κάτω μεσεντέριος αρτηρία προέρχεται από την αριστερή πρόσθια επιφάνεια της αορτής 3-4cm άνωθεν του διχασμού της και πορεύεται προς τα κάτω και αριστερά και εισέρχεται εντός της πυέλου. Από την κάτω μεσεντέριο εκφύονται εντός της κοιλίας η αριστερή κολική αρτηρία και 2-6 σιγμοειδικές αρτηρίες. Μετά τη διασταύρωσή της με την αριστερή κοινή λαγόνια αρτηρία, ονομάζεται άνω αιμορροϊδική αρτηρία. Η α- ριστερή κολική αρτηρία διχάζεται σε έναν ανιόντα κλάδο που αρδεύει την σπληνική καμπή και συμμετέχει στο τόξο του Riolan και σε έναν κατιόντα κλάδο που αρδεύει το κατιόν. Οι σιγμοειδικές αρτηρίες σχηματίζουν τόξα μέσα στο μεσοσιγμοειδές και αναστομώνονται με την αριστερή κολική προς τα άνω και την άνω αιμορροϊδική προς τα κάτω 1,2,6. Το ορθό αιματώνεται από τις τρεις αιμορροϊδικές αρτηρίες: την άνω αιμορροϊδική που αποτελεί τον τελικό κλάδο της κάτω μεσεντερίου αρτηρίας, την μέση αιμορροϊδική που είναι κλάδος της έσω λαγόνιας και την κάτω αιμορροϊδική που είναι κλάδος της έσω αιδοιικής 8. Φλεβική αποχέτευση Οι φλέβες του παχέος εντέρου ακολουθούν τις αντίστοιχες αρτηρίες και οδηγούν στην πυλαία φλέβα μέσω των άνω και κάτω μεσεντερίων κλάδων. Οι φλέβες από το δεξιό κόλον σχηματίζουν την άνω μεσεντέριο φλέβα η οποία στη συνέχεια ενώνεται με τη σπληνική φλέβα σχηματίζοντας την πυλαία φλέβα πίσω από την κεφαλή του παγκρέατος 6. Από το αριστερό κόλον, οι φλέβες αποχετεύουν προς την κάτω μεσεντέριο φλέβα που βρίσκεται αριστερά της αντίστοιχης αρτηρίας και συνεχίζει 5-8 cm άνωθεν της έκφυσής της, όπου ενώνεται με τη σπληνική φλέβα 7. Οι φλέβες από τα άνω δύο τριτημόρια του ορθού αποχετεύουν το αίμα στην άνω αιμορροϊδική φλέβα, η οποία με τη σειρά της εκβάλλει στην πυλαία φλέβα μέσω της κάτω μεσεντερίου φλέβας. Οι φλέβες από το κάτω τριτημόριο του ορθού αποχετεύουν το αίμα μέσω της μέσης και κάτω αιμορροϊδικής φλέβας στην έσω λαγόνιο φλέβα και τη συστηματική κυκλοφορία Λεμφική αποχέτευση Τα λεμφαγγεία που είναι υπεύθυνα για τη λεμφική αποχέτευση του παχέος εντέρου διατάσσονται σε δύο στενά συνδεδεμένες ομάδες: τα ενδοτοιχωματικά λεμφαγγεία και τα εξωτοιχωματικά λεμφαγγεία. Τα ενδο- 21

22 τοιχωματικά λεμφαγγεία σχηματίζονται από την αναστόμωση τριών λεμφαγγειακών τριχοειδικών δικτύων (υποβλεννογόνιου, μυϊκού και υπορογόνιου) τα οποία ξεκινούν σαν τυφλά υποβλεννογόνια λεμφικά τριχοειδή, προοδευτικά αυξάνουν σε μέγεθος και απολήγουν στα εξωτοιχωματικά λεμφαγγεία 8. Τα εξωτοιχωματικά λεμφαγγεία ακολουθούν την πορεία των αντίστοιχων αρτηριών μέχρι την αορτή με αρκετούς λεμφαδένες να παρεμβάλονται στην πορεία της λέμφου. Οι λεμφαδένες αυτοί διαχωρίζονται στους: επικολικούς, οι οποίοι βρίσκονται πάνω στο τοίχωμα του εντέρου, παρακολικούς, που βρίσκονται ανάμεσα στην επιχείλιο αρτηρία και το έντερο, ενδιάμεσους, που ακολουθούν την πορεία των κολικών αγγείων και κύριους, που βρίσκονται στην πορεία της άνω και κάτω μεσεντερίου αρτηρίας 9. Η απαγωγή της λέμφου από τα δύο άνω τριτημόρια του ορθού απολήγει μέσω των λεμφαγγείων που συνοδεύουν την άνω αιμορροϊδική αρτηρία στους κάτω μεσεντέριους λεμφαδένες 10. Από το κατώτερο ορθό και από τον πρωκτικό σωλήνα πάνω από τη γραμμή του Hilton η λέμφος ακολουθεί τα λεμφαγγεία που συμπορεύονται με τη μέση και κάτω αιμορροϊδική αρτηρία και κατευθύνονται προς τους έσω λαγόνιους και μετά στους παραορτικούς λεμφαδένες 11. Η λέμφος από την περιοχή κάτω από τη γραμμή του Hilton οδηγείται προς τους βουβωνικούς λεμφαδένες και σε μικρότερο ποσοστό στους κάτω μεσεντέριους 10, Νεύρωση H νεύρωση του παχέος εντέρου πραγματοποιείται διαμέσου των ινών του συμπαθητικού και του παρασυμπαθητικού νευρικού συστήματος. Με τη δράση του, το παρασυμπαθητικό σύστημα προάγει τον περισταλτισμό, ενώ το παρασυμπαθητικό τον αναστέλλει 8. Όπως και στο λεπτό έντερο, οι νευρικές ίνες που νευρώνουν το παχύ έντερο προέρχονται από τα δύο περιφερικά φυτικά γαγγλιοφόρα πλέγματα, που βρίσκονται στο τοίχωμα του εντέρου, το μυεντερικό (Auerbach) και το υποβλεννογόνιο (Meissner). Τα πλέγματα αυτά ενεργοποιούνται από τις τελικές α- πολήξεις κλάδων του άνω και κάτω μεσεντερίου φυτικού πλέγματος 8. Το δεξιό παχύ κόλον (τυφλό, ανιόν, δεξιό και μέσο τριτημόριο του ε- γκαρσίου) λαμβάνει συμπαθητική νεύρωση που προέρχεται από την κατώτερη θωρακική μοίρα του νωτιαίου μυελού (Θ6-Θ12). Τα θωρακικά σπλαχνικά νεύρα συνάπτονται στα κοιλιακά, προαορτικά και τα γάγγλια της άνω μεσεντερίου και από αυτά οι μεταγαγγλιακές ίνες πορευόμενες μαζί με την άνω μεσεντέριο αρτηρία φτάνουν στο δεξιό κόλον. Η παρασυμπαθητική νεύρωση προέρχεται από τον οπίσθιο κλάδο του πνευμονογαστρικού και το κοιλιακό πλέγμα. Οι ίνες επίσης πορεύονται μαζί με την 22

23 άνω μεσεντέριο αρτηρία και συνάπτονται με τα ενδοτοιχωματικά πλέγματα 2. Στο αριστερό κόλον (αριστερό τριτημόριο εγκαρσίου, κατιόν, σιγμοειδές, άνω ορθό) οι προγαγγλιακές ίνες προέρχονται από την οσφυϊκή μοίρα (Ι1-Ι3) και μέσω των οσφυϊκών συμπαθητικών νεύρων συνάπτονται στο προαορτικό πλέγμα. Μεταγαγγλιακές ίνες ακολουθούν τους κλάδους της κάτω μεσεντερίου και άνω αιμορροϊδικής αρτηρίας στο αριστερό παχύ έντερο και άνω τμήμα του ορθού. Το κατώτερο ορθό νευρώνεται από τα προϊερά νεύρα, που δημιουργούνται από την ένωση του α- ορτικού πλέγματος και των οσφυϊκών σπλαχνικών νεύρων. Κάτω από το επίπεδο του ακρωτηρίου των μαιευτήρων, τα προϊερά νεύρα σχηματίζουν το υπογάστριο πλέγμα, από το οποίο εκφύονται τα δύο κύρια υπογάστρια νεύρα μεταφέροντας συμπαθητική νεύρωση από το υπογάστριο στο πυελικό πλέγμα 2. Από το πυελικό πλέγμα, συνδυασμένες μεταγαγγλιακές παρασυμπαθητικές και συμπαθητικές ίνες διανέμονται στο αριστερό κόλον και άνω ορθό μέσω του κάτω μεσεντερίου πλέγματος και απ ευθείας στο κατώτερο ορθό και άνω πρωκτικό σωλήνα. Το περιπροστατικό πλέγμα στον άνδρα και το γεννητικό πλέγμα στη γυναίκα, αποτελούν υποδιαίρεση του πυελικού πλέγματος και νευρώνει τον προστάτη, τις σπερματοδόχους κύστεις, τα σηραγγώδη σώματα, την ουρήθρα, τον σπερματικό πόρο και τους βολβοουρηθρικούς αδένες. Ο έσω σφιγκτήρας νευρώνεται από το φυτικό νευρικό σύστημα με το συμπαθητικό να αυξάνει τον τόνο του, ενώ το παρασυμπαθητικό τον μειώνει. Ο έξω σφιγκτήρας λαμβάνει αποκλειστικά σωματική νεύρωση από τον κάτω ορθικό κλάδο του αιδοιικού νεύρου 12. Επάνω από το επίπεδο της οδοντωτής γραμμής, το αίσθημα του πόνου μεταβιβάζεται από παρασυμπαθητικές κεντομόλες ίνες, ενώ κάτω από την οδοντωτή γραμμή όπου το επιθήλιο είναι εξαιρετικά ευαίσθητο, νευρώνεται από τις αισθητικές απολήξεις του κάτω ορθικού και περινεϊκού κλάδου του αιδοιϊκού νεύρου Ιστολογία Το τοίχωμα του παχέος εντέρου αποτελείται από τέσσερις χιτώνες, οι οποίοι από έξω προς τα μέσα είναι: ο ορογόνος, ο μυϊκός, ο υποβλεννογόνιος και ο βλεννογόνος. Ο ορογόνος χιτώνας αποτελεί το περισπλάγχνιο πέταλο του περιτοναίου, το οποίο περιβάλλει όλα τα ενδοπεριτοναϊκά τμήματα του παχέος εντέρου. Κάτω από τον ορογόνο χιτώνα υπάρχει χαλαρός συνδετικός ιστός που παρεμβάλλεται ανάμεσα σ αυτόν και στο μυϊκό χιτώνα και αποτελεί το περιεχόμενο των επιπλοϊκών αποφύσεων 8. Στο ορθό το πρόσθιο και τα πλάγια τοιχώματα του άνω τριτημορίου, καθώς και τα πλάγια τοιχώματα του μέσου τριτημορίου καλύπτονται από περιτόναιο, ενώ το κάτω τριτημόριο είναι πλήρως εξωπεριτοναϊκό. 23

24 Ο μυϊκός χιτώνας αποτελείται από δύο στιβάδες, την εσωτερική (κυκλοτερής) και την εξωτερική (επιμήκης). Η εσωτερική στιβάδα είναι συνεχής και αποτελείται από λείες μυϊκές ίνες που φέρονται κυκλοτερώς, είναι παχύτερη στο ορθό και ιδιαίτερα ανεπτυγμένη στον πρωκτό όπου διαμορφώνει τον έσω σφιγκτήρα του πρωκτού. Στη στιβάδα αυτή βρίσκεται και το μυεντερικό πλέγμα του Auerbach. Η εξωτερική μυϊκή στιβάδα αποτελείται από επιμήκεις μυϊκές ίνες οι οποίες περιορίζονται για το μεγαλύτερο μέρος του παχέος εντέρου σε τρεις κολικές ταινίες. Στη σκωληκοειδή απόφυση η στιβάδα αυτή είναι συνεχής και ομότιμη και από αυτή ξεκινούν οι κολικές ταινίες που διατρέχουν το παχύ έντερο μέχρι την ορθοσιγμοειδική συμβολή όπου πλαταίνουν και ενώνονται για να καλύψουν το ορθό σε όλη την περιφέρειά του 13. Ο υποβλεννογόνιος χιτώνας αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ι- στό μέσα στον οποίο πορεύονται αιμοφόρα αγγεία, λεμφαγγεία και νεύρα. Περιέχει το υποβλεννογόνιο νευρικό πλέγμα του Meissner και συμμετέχει στο σχηματισμό των μηνοειδών πτυχών 14. Ο βλεννογόνος του παχέος εντέρου αποτελείται από το επιθήλιο, το χόριο και από τη βλεννογόνια μυϊκή στιβάδα. Το επιθήλιο χαρακτηρίζεται από την ανυπαρξία των λαχνών και διακρίνεται στο καλυπτήριο και σ αυτό των κρυπτών. Το καλυπτήριο επιθήλιο είναι μονόστιβο κυλινδρικό και με πολλά καλυκοειδή κύτταρα, ενώ οι κρύπτες του βλεννογόνου του παχέος εντέρου είναι όμοιες με τις εντερικές κρύπτες του λεπτού ε- ντέρου (αδένες του Lieberkuhn) και περιέχουν τις μητρικές μορφές των επιθηλιακών κυττάρων του παχέος εντέρου. Τα κυλινδρικά κύτταρα έ- χουν ραβδιδιωτή παρυφή η οποία χρησιμεύει στην απορρόφηση του ύδατος, αλάτων και άλλων ουσιών που έχουν εκκριθεί σε άλλα σημεία του γαστρεντερικού σωλήνα. Παράγουν αντισώματα IgA συμμετέχοντας στην άμυνα του οργανισμού καθώς και βλέννη, η οποία επαλείφει το ε- ντερικό περιεχόμενο, βοηθώντας την προώθησή του προς τον πρωκτό 8. Το χόριο περιέχει συνδετικό ιστό, κατά τόπους μονήρη λεμφοζίδια τα οποία εντοπίζονται κυρίως στο τυφλό, τη σκωληκοειδή απόφυση και το ορθό, αλλά και διάσπαρτα μακροφάγα και ενδοκρινικά κύτταρα. Η βλεννογόνιος μυϊκή στιβάδα, η οποία είναι πολύ καλά ανεπτυγμένη, είναι μία μεμβράνη που αποτελείται από λείες μυϊκές ίνες που βρίσκονται ανάμεσα στον υποβλεννογόνιο και το χόριο και περιέχει δίκτυο λεμφαγγείων 8. Το επιθήλιο του βλεννογόνου του πρωκτού παρουσιάζει διαφορές λόγω της διαφορετικής του εμβρυολογικής προέλευσης. Ενώ το ανώτερο τμήμα του μέχρι την οδοντωτή γραμμή που είναι ενδοδερμικής προέλευσης καλύπτεται από μονόστιβο κυλινδρικό επιθήλιο, το τμήμα από την οδοντωτή γραμμή έως τη γραμμή του Hilton (μεταβατική ζώνη ή πρωκτόδερμα) είναι εξωδερμικής προέλευσης και καλύπτεται από μεταβατικό κυβοειδές επιθήλιο με διάσπαρτες περιοχές από πλακώδες επιθήλιο. Σταδιακά οι περιοχές του πλακώδους επιθηλίου γίνονται πυκνότερες 24

25 προς την περιφέρεια και στον πρωκτικό δακτύλιο έχουν αντικαταστήσει πλήρως το μεταβατικό επιθήλιο με πολύστιβο πλακώδες 1. Ο πρόδρομος του πρωκτού έχει χαρακτηριστικά δέρματος με μελανοκύτταρα, σμηγματογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες, θύλακες τριχών και σκούρο χρώμα στους άνδρες Φυσιολογία Το παχύ έντερο αποτελεί όργανο υποδοχής και προώθησης των τελικών προϊόντων της πέψης. Οι κύριες φυσιολογικές λειτουργίες του παχέος εντέρου είναι: η απορρόφηση ύδατος και ηλεκτρολυτών, η περαιτέρω αποδόμηση των εισερχόμενων ουσιών από τη μικροβιακή χλωρίδα, η έκκριση ηλεκτρολυτών και βλέννης, η αποθήκευση ημίρρευστου υλικού και η προώθηση των κοπράνων προς το ορθό και τον πρωκτό 15. Ο διαχωρισμός του παχέος εντέρου σε τυφλό, ανιόν, εγκάρσιο, κατιόν, σιγμοειδές και ορθό εκτός από ανατομικός είναι και λειτουργικός, αφού είναι σήμερα γνωστό ότι το παχύ έντερο είναι ένα ετερογενές όργανο με βιοχημικές, φαρμακολογικές και λειτουργικές ιδιαιτερότητες ανάλογα με τα κατά τόπους τμήματά του. Στο δεξιό κόλον το εντερικό περιεχόμενο παραμένει για παρατεταμένο χρονικό διάστημα αφού ο περισταλτισμός ηρεμίας έχει ρυθμό 1cm/ώρα 16. Η κατακράτηση και ανάμιξη του εντερικού περιεχομένου ε- πιτρέπει τον αερόβιο και αναερόβιο μεταβολισμό των υπολειπόμενων υδατανθράκων και πρωτεϊνών από την εντερική χλωρίδα. Επίσης, το δεξιό κόλον αποτελεί το κύριο σημείο βακτηριακής ανάπτυξης, το ανιόν συμμετέχει στη ρύθμιση του ενδοαυλικού όγκου υγρών και στην απορρόφηση του ύδατος και των ηλεκτρολυτών 17. Το εγκάρσιο χρησιμεύει κυρίως για την ταχεία μεταφορά του εντερικού περιεχομένου από το δεξιό στο αριστερό κόλον και συμμετέχει και στην απορρόφηση H 2 O και Na +. Στο αριστερό κόλον (κατιόν σιγμοειδές) λαμβάνει χώρα η τελική προετοιμασία του ενδοαυλικού περιεχομένου πριν την αφόδευση. Η α- πορροφητική ικανότητα του αριστερού είναι μειωμένη σε σχέση με αυτή του δεξιού κόλου, ενώ σημαντική είναι η αποθηκευτική ικανότητά του η οποία επίσης συμβάλλει και στην εγκράτεια των κοπράνων. Η κύρια απορροφητική λειτουργία του παχέος εντέρου είναι η τελική ρύθμιση της ισορροπίας του ύδατος και των ηλεκτρολυτών στο έ- ντερο. Στο παχύ έντερο μειώνεται ο όγκος του εντερικού περιεχομένου με απορρόφηση 90% του προσαγόμενου ύδατος και ηλεκτρολυτών, το οποίο αντιστοιχεί σε 1-2 λίτρα Η 2 Ο και 200mΕq Na + και Cl - κατά μέσο όρο την ημέρα. Το νάτριο μαζί με το χλώριο απορροφώνται από το παχύ έντερο αντίθετα προς πολύ υψηλή κλίμακα συγκέντρωσης, ειδικά στο άπω κόλον, με δυνατότητα απορρόφησης έως και 400mΕq Νa + ημερησί- 25

26 ως. Με βάση το δεδομένο αυτό, η απάντηση του παχέος εντέρου στην αλδοστερόνη αποτελεί έναν σημαντικό αντιρροπιστικό μηχανισμό στην αφυδάτωση. Η μεταφορά του καλίου στο παχύ έντερο είναι κυρίως παθητική και ακολουθεί την πορεία της ηλεκτροχημικής κλίμακας που δημιουργείται από την ενεργητική μεταφορά του νατρίου. Η διαδικασία της πέψης που λαμβάνει χώρα στο παχύ έντερο οφείλεται στη δράση των μικροοργανισμών που το αποικούν. Το παχύ έντερο αποτελεί το κύριο σημείο βακτηριακού αποικισμού στον άνθρωπο, με αναγνωρισμένα περισσότερα από 400 είδη βακτηρίων 18, με κυριότερους μικροοργανισμούς το κολοβακτηρίδιο, τον εντερόκοκκο, το σταφυλόκοκκο, τον πρωτέα, την ψευδομονάδα, την κλεμπσιέλλα, αναερόβια μικρόβια και μύκητες. Τα βακτήρια συμβάλλουν στο 40-55% της μάζας των στερεών κοπράνων των ανθρώπων που ακολουθούν διατροφή δυτικού τύπου 19. Η χλωρίδα του παχέος εντέρου έχει δράση μεταβολική, τροφική και προστατευτική. Η μεταβολική δράση περιλαμβάνει την αποδόμηση των δύσπεπτων διατροφικών υπολειμμάτων και της βλέννης, την παραγωγή λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου και την παραγωγή βιταμίνης Κ. Οι τροφικές λειτουργίες περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των επιθηλιακών κυττάρων, καθώς και την ομοιόσταση του ανοσοποιητικού συστήματος. Η προστατευτική λειτουργία της εντερικής χλωρίδας οφείλεται στη δράση της ως φραγμού στους παθογόνους μικροοργανισμούς. Η κινητικότητα του παχέος εντέρου χαρακτηρίζεται από τη μεγάλη ανομοιογένεια των τμημάτων του καθώς και το διαλείποντα και απρόβλεπτο χαρακτήρα των περισταλτικών κινήσεων. Έχουν αναγνωρισθεί τριών ειδών περισταλτικές κινήσεις. Έτσι, παρατηρούνται αντίστροφα κύματα, τα οποία φέρονται από τη μεσότητα του εγκαρσίου με κατεύθυνση προς το τυφλό που καθυστερούν την προώθηση του περιεχομένου με αποτέλεσμα την παρατεταμένη ανάδευσή του, το μικροβιακό μεταβολισμό και την απορρόφηση των ουσιών. Ένας άλλος τύπος περισταλτικών κινήσεων είναι οι τμηματικές συσπάσεις του παχέος εντέρου. Αυτές παρατηρούνται συχνότερα στο δεξιό κόλον και αποτελούν τοπικές συσπάσεις της επιμήκους και της κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας του εντέρου οι οποίες απομονώνουν μικρά τμήματα παχέος εντέρου. Ο τρίτος τύπος συσπάσεων είναι οι μαζικές κινήσεις οι οποίες αφορούν ένα μεγάλο τμήμα του εντέρου, έχουν ταχύτητα προώθησης 0,5-1cm/sec, διαρκούν 20-30sec και δημιουργούν ενδοαυλική πίεση mmHg. Οι συσπάσεις αυτές εμφανίζονται 3-4 φορές ημερησίως, ξεκινούν από το εγκάρσιο και εμφανίζονται συνήθως το πρωί μετά την αφύπνιση και μετά από τη λήψη τροφής 20. Μαζική σύσπαση στο σιγμοειδές συμβαίνει κατά τη διάρκεια της αφόδευσης. Το εντερικό νευρικό σύστημα συντονίζει και προγραμματίζει την κινητικότητα του παχέος εντέρου. Η λήψη τροφής προκαλεί αλλαγές στη 26

27 μυοηλεκτρική και κινητική δραστηριότητα του εντέρου που ορίζονται ως γαστροκολική απάντηση. Αποτέλεσμα της απάντησης αυτής είναι η μεταφορά περισσότερου περιεχομένου από τον ειλεό στο παχύ έντερο, η αύξηση των μαζικών εντερικών κινήσεων και η πρόκληση τάσης προς αφόδευση. Η ένταση της γαστροκολικής απάντησης εξαρτάται από τη θερμιδική αξία της τροφής, με το λίπος να αποτελεί το κύριο ερέθισμα Στοιχεία ανατομικής και φυσιολογίας του επίμυος Ανατομία Το παχύ έντερο στον επίμυ παρουσιάζει συνολικό μήκος περίπου 15cm. Αποτελείται από τρία τμήματα: το τυφλό, το κόλον και το ορθό. Το τυφλό συνήθως βρίσκεται στο δεξιό μέρος της περιτοναϊκής κοιλότητας, αλλά το ευμέγεθες μεσεντέριό του, όπως και στο κόλον, του προσδίδει σημαντική ευκινησία με αποτέλεσμα να παρατηρούνται παραλλαγές ως προς την εντόπισή του 22. Οι στιβάδες του τοιχώματος του τυφλού είναι λεπτότερες από αυτές του υπόλοιπου παχέος εντέρου. Παρουσιάζει σχήμα γωνιώδους κώνου με βάση, σώμα και κορυφή. Η βάση έχει δακτυλιοειδές σχήμα, κατεύθυνση κεφαλοουραία και συνεχίζει στο σώμα το οποίο πορεύεται κατά μήκος του πλάγιου περιτοναίου πριν καμφθεί προς τον στόμαχο, όπου καταλήγει στην κορυφή. Λόγω της ευκινησίας του μπορεί να εντοπίζεται και στη μέση γραμμή ή ακόμα και να περιστραφεί έτσι ώστε να παρουσιάζεται με αντίθετη προς τη συνήθη του κατεύθυνση 22. Το κόλον άρχεται από το τυφλό με το ανιόν να αποτελεί ένα λευκωπό σωλήνα που πορεύεται κεφαλοουραία προς το οπίσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Στο ύψος του δεξιού νεφρού στρέφεται πίσω από την πρώτη καμπή του δωδεκαδακτύλου και φέρεται εγκάρσια συνεχίζοντας στο ε- γκάρσιο κόλον. Το εγκάρσιο κόλον, αφού έρθει σε σχέση με την πρώτη μοίρα του δωδεκαδακτύλου, πορεύεται αριστερά προς το περιφερικό τμήμα του στομάχου και τη ρίζα των μεσεντέριων αγγείων. Εκεί σχηματίζει οξεία γωνία μεταπίπτοντας στο κατιόν κόλο. Ενώ το τοίχωμα του ανιόντος κόλου έχει το ίδιο πάχος με αυτό του τυφλού, το εγκάρσιο και το κατιόν εμφανίζουν παχύτερο τοίχωμα λόγω της πάχυνσης του υποβλεννογόνιου χιτώνα και της έξω κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας 22. Η συνέχεια του κατιόντος, το ορθό, διατρέχει την πύελο και καταλήγει στον πρωκτό ο οποίος βρίσκεται ακριβώς κάτω από τη βάση της ουράς. Το τοίχωμα του παχέος εντέρου του επίμυος αποτελείται από: ορογόνο χιτώνα, μυϊκό χιτώνα με έξω επιμήκη και έσω κυκλοτερή στιβάδα, υποβλεννογόνιο χιτώνα από χαλαρό συνδετικό ιστό, αγγεία και λεμφαγγεία και τέλος από βλεννογόνο. 27

28 Εικόνα 1. Το παχύ έντερο του επίμυος Το τυφλό και το αρχικό τμήμα του κόλου εμφανίζουν κυκλοτερείς βλεννογονικές πτυχές οι οποίες στα επόμενα στενότερα τμήματα του παχέος εντέρου μεταπίπτουν σε επιμήκεις, στη βάση των οποίων παρουσιάζονται αιμοφόρα αγγεία που μαζί με το βλεννογόνο αποτελούν το λειτουργικό τμήμα του κόλου (angioplicate lock system) 23. Το τοίχωμα του παχέος εντέρου στα αρχικά του τμήματα είναι λεπτό, στη συνέχεια όμως γίνεται παχύτερο λόγω της αύξησης του πάχους της υποβλεννογόνιας και της μυϊκής στιβάδας Φυσιολογία Η κυριότερη λειτουργία του παχέος εντέρου του επίμυος αποτελεί η απορρόφηση του ύδατος και των ηλεκτρολυτών και κυρίως του νατρίου και του καλίου, καθώς και ο σχηματισμός των κοπράνων που φθάνουν τα 2-3gr ημερησίως. 28

29 2 ΕΠΟΥΛΩΣΗ 2.1 Φάσεις της επούλωσης Η επούλωση των ιστών είναι μία εξαιρετικά δυναμική διαδικασία στην οποία εμπλέκονται πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ μορίων της εξωκυττάριας ουσίας, διαλυτών μεσολαβητών, κύτταρα της περιοχής καθώς και διάφοροι υποτύποι λευκοκυττάρων που διεισδύουν στην περιοχή. Ο άμεσος στόχος της επουλωτικής διαδικασίας είναι η επίτευξη της ακεραιότητας και της ομοιόστασης των ιστών 24,25. Στην περίπτωση της επούλωσης του παχέος εντέρου, όταν ο βλεννογόνος είναι η μόνη τραυματισμένη στιβάδα του τοιχώματος, η αναμόρφωσή του μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της μετανάστευσης και του πολλαπλασιασμού επιθηλιακών κυττάρων από τον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Όταν όμως προκαλείται ολοτοιχωματικός τραυματισμός του παχέος εντέρου, τότε διεγείρεται ινοβλαστική απάντηση που έχει τελικό αποτέλεσμα τη δημιουργία ουλώδους ιστού. Η διαδικασία της επούλωσης περιλαμβάνει τέσσερις φάσεις οι ο- ποίες επικαλύπτουν η μία την άλλη τόσο στο χρόνο όσο και στο χώρο. Οι φάσεις αυτές είναι: Αιμόστασης Φλεγμονής Παραγωγική (πολλαπλασιασμού) Αναδιαμόρφωσης Φάση Αιμόστασης Ο τραυματισμός των ιστών προκαλεί διακοπή της αγγειακής παροχής στην περιοχή του τραυματισμού καθώς και αιμορραγία. Αρχικά τα τραυματισμένα αγγεία συσπώνται κάτω από την επίδραση κατεχολαμινών που παράγονται από τα αιμοπετάλια, όπως η σεροτονίνη και η θρομβαξάνη, οι οποίες έχουν σκοπό να μειώσουν τη ροή αίματος στην περιοχή 26. Αργότερα τα αγγεία διαστέλλονται και γίνονται πιο διαπερατά επιτρέποντας στο πλάσμα και διάφορους τύπους κυττάρων να εισέλθουν στο τραύμα με μεγαλύτερη ευκολία 27. Αγγειοδραστικοί παράγοντες απελευθερώνονται στο τραύμα με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του καταρράκτη της θρόμβωσης και κατά συνέπεια τη διέγερση της διαδικασίας της αιμόστασης 28. Τα αιμοπετάλια όταν έρχονται σε επαφή με το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο των τραυματισμένων αγγείων, συσσωρεύονται και συμβάλλουν στο σχηματισμό του αρχικού θρόμβου. Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων οδηγεί στην ενεργοποίηση της ενδογενούς και της εξωγε- 29

30 νούς οδού του πηκτικού μηχανισμού 29. Ο θρόμβος που δημιουργείται α- ποτελεί το σκελετό πάνω στον οποίο θα μεταναστεύσουν τα κύτταρα που θα δράσουν στην περιοχή, ενώ τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας του θρόμβου καθορίζουν σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες 28. Εκτός από τη χρησιμότητά τους στην αιμόσταση, τα αιμοπετάλια θεωρούνται σημαντικά επειδή εκλύουν αυξητικούς παράγοντες και προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, ρυθμίζοντας την εμπλοκή των φλεγμονωδών κυττάρων, των ενδοθηλιακών κυττάρων και των ινοβλαστών στην περιοχή του τραυματισμού. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και η προσκόλλησή τους στους υπενδοθηλιακούς ιστούς έχει ως αποτέλεσμα την έκλυση μιας ποικιλίας ουσιών οι οποίες τονίζουν τη φλεγμονώδη διαδικασία, όπως οι μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος, πρωτεάσες, λεκτίνες, σεροτονίνη και οι πολυπεπτιδικοί αυξητικοί παράγοντες (κυρίως PDGF και TGFβ) 30. Οι μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος που απελευθερώνονται από τα αιμοπετάλια και ο παράγοντας XII (Hangeman) της πήξης που ενεργοποιείται μέσω της ενδογενούς οδού, οδηγούν στην παραγωγή βραδυκινίνης και στην ενεργοποίηση της αλυσίδας του συμπληρώματος. Ο παράγοντας C5a που παράγεται ασκεί χημειοτακτική δράση προς τα φλεγμονώδη κύτταρα όπως και η καλικρεΐνη, η ινική αλλά και ο παράγοντας TGF-β Φάση Φλεγμονής Μετά τη φάση της αιμόστασης που ξεκινά τη στιγμή του τραυματισμού, ακολουθεί η φάση της φλεγμονής η οποία αποτελεί τη δεύτερη φάση της επουλωτικής διαδικασίας του παχέος εντέρου. Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από τη διήθηση του τραύματος από φλεγμονώδη κύτταρα και ανάπτυξη οιδήματος κυρίως στη βλεννογόνιο μυϊκή στιβάδα 32. Κατά το πρώτο εικοσιτετράωρο τα ουδετερόφιλα αποτελούν τον πιο σημαντικό τύπο κυττάρων, ενώ το δεύτερο εικοσιτετράωρο τα μακροφάγα παίζουν σημαντικότερο ρόλο 33. Η φλεγμονώδης φάση ξεκινά περίπου 24 ώρες μετά το τραύμα και διαρκεί για 4-6 ημέρες. Αμέσως μετά τη δημιουργία του θρόμβου, τα πολυμορφοπύρηνα μεταναστεύουν στην περιοχή του τραύματος σε απάντηση στα παραχθέντα κυτταρικά σήματα. Μαζί με τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές οι οποίοι συσσωρεύονται στην περιοχή, παράγονται και προσταγλανδίνες οι οποίες προκαλούν αγγειοδιαστολή στα γειτονικά αγγεία για να διευκολύνουν την εισροή των πολυμορφοπύρηνων. Οι αυξημένες μεταβολικές ανάγκες της περιοχής δεν είναι δυνατό να καλυφθούν λόγω της διακοπής της τοπικής μικροκυκλοφορίας από τη βλάβη των ιστών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την πτώση του ph και των επιπέδων της μερικής πίεσης οξυγόνου (po 2 ) και άνοδο του γαλακτικού οξέος 34, τα οποία 30

31 προάγουν την επουλωτική διαδικασία μέσω της απελευθέρωσης παραγόντων που είναι απαραίτητοι στη δημιουργία νέας αιματικής παροχής 35. H διαδικασία της δημιουργίας αιματικής παροχής με το σχηματισμό νέων αγγείων ονομάζεται αγγειογένεση και ενεργοποιείται από διάφορους αυξητικούς παράγοντες όπως οι VEGF, bfgf και TGFβ 36. Οι σημαντικότεροι κυτταρικοί παράγοντες της φλεγμονώδους φάσης είναι τα ουδετερόφιλα, τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά α- πομακρύνουν τους νεκρωμένους ιστούς και φαγοκυτταρώνουν βακτηρίδια, ενώ παίζουν σημαντικό ρόλο στην παραγωγή και απελευθέρωση των μεσολαβητών της φλεγμονής (IL-1, -6, -8), του παράγοντα νέκρωσης των όγκων α (TNF-α) και διάφορων αυξητικών παραγόντων 37. Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα συσσωρεύονται στην περιοχή της βλάβης και προσκολλώνται στο ενδοθήλιο των αγγείων. Στο σημείο αυτό, διασπούν τη βασική μεμβράνη του ενδοθηλίου αποδομώντας την ελαστίνη που περιέχεται σ αυτήν με τη βοήθεια της ελαστάσης και άλλων πρωτεασών. Στη συνέχεια μετακινούνται στον εξωκυττάριο χώρο όπου και δρουν φαγοκυτταρώνοντας βακτήρια και παράγοντας μικροβιοκτόνους παράγοντες. Επίσης απελευθερώνουν και φλεγμονώδεις μεσολαβητές, όπως TNF-α και IL-1 που προάγουν την παραγωγή και ενεργοποίηση των ινοβλαστών και επιθηλιακών κυττάρων 38. Μετά από 2-3 η- μέρες τα ουδετερόφιλα μειώνονται σε αριθμό και αντικαθίστανται από μονοπύρηνα. Σε περιπτώσεις όμως στις οποίες ο μικροβιακός παράγοντας εμμένει, η παραμονή των ουδετεροφίλων παρατείνεται και συσσωρεύονται ουσίες, όπως πρωτεάσες και κυτταροκίνες, οι οποίες μπορούν να ο- δηγήσουν ακόμα και σε διάσπαση της αναστόμωσης 37. Περίπου 24 ώρες μετά από τη συσσώρευση των ουδετεροφίλων στην περιοχή της αναστόμωσης, μονοκύτταρα προσελκύονται με τη βοήθεια χημειοτακτικών παραγόντων, τα οποία στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε μακροφάγα 39. Τα μακροφάγα έχουν σκοπό τη φαγοκυττάρωση των βακτηριδίων, καθώς και την αποδόμηση και την απομάκρυνση των προϊόντων της αποδόμησης του συνδετικού ιστού, δηλαδή του κολλαγόνου, της ελαστίνης και των πρωτεογλυκανών. Ταυτόχρονα, παράγουν και απελευθερώνουν προσταγλανδίνες και αυξητικούς παράγοντες, όπως PDGF, TGF-b και FGF που παίζουν σημαντικό ρόλο στην επόμενη φάση του σχηματισμού του κοκκιώδους ιστού. Παράλληλα, εκτός από τις συνθήκες τοπικής ιστικής υποξίας, τα μακροφάγα ευθύνονται και για την έκκριση αυξητικών παραγόντων που συμβάλλουν στην αγγειογένεση, μεσολαβώντας έτσι και στη μετάβαση της φλεγμονώδους φάσης στη φάση πολλαπλασιασμού 40. Τα λεμφοκύτταρα συσσωρεύονται στην περιοχή του τραύματος ταυτόχρονα με τα μακροφάγα και παραμένουν καθ όλη τη διάρκεια της επουλωτικής διαδικασίας μέχρι τη φάση της αναδιαμόρφωσης 41. Παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανοσία και τη φυσιολογική εξέλιξη των 31

32 μηχανισμών της επούλωσης. Παράγουν την ιντερφερόνη-γ η οποία τροποποιεί τους υποδοχείς των μακροφάγων αυξάνοντας την φαγοκυτταρική τους ικανότητα Φάση Πολλαπλασιασμού Κατά τη φάση του πολλαπλασιασμού, ο αρχικά σχηματισμένος ι- νώδης ιστός προοδευτικά αντικαθίσταται από κοκκιώδη ιστό. Οι ινοβλάστες παίζουν τον πιο ουσιαστικό ρόλο στον σχηματισμό του κοκκιώδους ιστού 34,39. Η φάση αυτή αρχίζει μετά την 3η ημέρα της επούλωσης και διαρκεί μέχρι και την 21 η ημέρα 42. Στην παραγωγή του κοκκιώδους ιστού συμβάλλουν διάφοροι χημειοτακτικοί και αυξητικοί παράγοντες, η έκκριση των οποίων έχει ήδη αρχίσει από τη φάση της φλεγμονής. Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής αποκαθίσταται η αιματική παροχή στην περιοχή της αναστόμωσης μέσω της διαδικασίας της αγγειογένεσης και εξελίσσεται και η επιθηλιοποίηση του τραύματος. Οι ινοβλάστες αποτελούν τα πιο σημαντικά κύτταρα στη φάση του σχηματισμού του κοκκιώδους ιστού. Η μετανάστευσή τους στην περιοχή της αναστόμωσης αρχίζει 24 ώρες μετά τον τραυματισμό και ο πολλαπλασιασμός τους συμβαίνει ταυτόχρονα με την αύξηση της βιοσυνθετικής τους δραστηριότητας. Αρχικά παράγουν ινονεκτίνη, μια υψηλού μοριακού βάρους συγκολλητική γλυκοπρωτεΐνη και στη συνέχεια και τις υπόλοιπες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας 43. Η ινονεκτίνη θα χρησιμεύσει ως ο σκελετός πάνω στον οποίο εισρέουν τα κύτταρα που εμπλέκονται στην επούλωση αλλά και ως προσωρινή διάμεση ουσία 44. Ο χαλαρός ιστός ο οποίος αρχικά συντίθεται στο σημείο της αναστόμωσης περιέχει κολλαγόνο, ινοβλάστες, μακροφάγα και νεόπλαστα τριχοειδή σε ένα υπόστρωμα ινικής, ινονεκτίνης, γλυκοζαμινογλυκανών και υαλουρονικού οξέος και ονομάζεται κοκκιώδης ιστός 45. Αφού ξεκινήσει η βιοσυνθετική δραστηριότητα των ινοβλαστών, αυτοί διατάσσονται παράλληλα με τον επιμήκη άξονα του τραύματος και σχηματίζουν συνδετικούς δεσμούς μεταξύ τους, συμβάλλοντας στη μετέπειτα συρρίκνωση του τραύματος 40. Η ενεργοποίηση και μετανάστευση των ινοβλαστών, οι ο- ποίοι βρίσκονται συνήθως σε αδρανή κατάσταση, γίνεται υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων, όπως οι PDGF, TGF-β και EGF 46. Το κολλαγόνο, βασικό συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας, παίζει καθοριστικό ρόλο στη διαδικασία της επούλωσης των ιστών. Η σύνθεση του κολλαγόνου αρχίζει μέσα στις πρώτες 12 ώρες από την πραγματοποίηση της αναστόμωσης. Η συνολική όμως εναπόθεση του κολλαγόνου δεν εξαρτάται μόνο από τη σύνθεσή του αλλά και από την ισορροπία σύνθεσης-αποδόμησής του 47. Το κολλαγόνο αποδομείται από τις κολλαγενάσες, τα επίπεδα των οποίων αυξάνονται σημαντικά μετά τη διενέρ- 32

33 γεια της αναστόμωσης. Ενώ η δράση αυτή παρατηρείται σ όλο το γαστρεντερικό σύστημα, η υψηλότερη δραστικότητα των κολλαγενασών ανευρίσκεται στο παχύ έντερο, γεγονός το οποίο πιθανώς να συμβάλλει στην υψηλότερη πιθανότητα διαφυγής στις αναστομώσεις του παχέος ε- ντέρου 33. Η ισορροπία σύνθεσης-αποδόμησης καθορίζει τη δύναμη και την ακεραιότητα της αναστόμωσης κατά την πρώιμη περίοδο μετά το τραύμα. Η αρχική αποδόμηση του κολλαγόνου στην αναστόμωση οφείλεται εν μέρει στην αυξημένη δράση των κολλαγενασών 48. Τα κολλαγόνα είναι ανθεκτικά στην αποδόμηση εκτός αν οι ειδικές κολλαγενάσες διασπάσουν την τριπλή τους έλικα και τα καταστήσουν πιο ευάλωτα στην αποδόμηση από άλλα ένζυμα. Η δράση των κολλαγενασών αυξάνεται μερικές ώρες μετά το τραύμα, εντοπίζεται αυστηρά στο σημείο της αναστόμωσης και ρυθμίζεται από τους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases - TIMPs) οι ο- ποίοι εμφανίζονται λίγο αργότερα και αναλαμβάνουν το ρόλο αυτό 49,50. Οι κύριες πηγές κολλαγενασών είναι τα πολυμορφοπύρηνα, οι ινοβλάστες και οι ενδοαυλικοί μικροοργανισμοί 33. Υπερπαραγωγή κολλαγενασών κατά τη διάρκεια μολύνσεων ή δημιουργίας αποστημάτων μπορεί να οδηγήσει σε υψηλότερο ποσοστό διαφυγής 48. Σημαντικό ρόλο στην παραγωγική φάση της επούλωσης παίζει η αγγειογένεση, η οποία περιγράφεται εκτενέστερα στο 3 ο κεφάλαιο. Η διαδικασία της επιθηλιοποίησης, με την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν από τα χείλη του τραύματος προς την επουλωτική περιοχή, ενεργοποιείται υπό την παρουσία του EGF (epidermal growth factor) και του TGF-α που παράγονται από ενεργοποιημένα μακροφάγα και αιμοπετάλια 39. Τα επιθηλιακά κύτταρα προέρχονται από τη βασική στιβάδα, πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν μέχρι να σχηματιστεί μία στιβάδα από κύτταρα η οποία θα καλύψει το χάσμα. Η μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων αρχίζει το πρώτο 24ωρο και διαρκεί 72 ώρες 51. Παράγοντες οι οποίοι μπορούν να επιβραδύνουν την επιθηλιοποίηση και να οδηγήσουν στο σχηματισμό ανεπαρκούς ουλής είναι η παρουσία βακτηριδίων και η μεγάλη ποσότητα εξιδρωματικού και νεκρωτικού υλικού Φάση Αναδιαμόρφωσης Η φάση της αναδιαμόρφωσης χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση του κολλαγόνου. Άρχεται την 7 η -8 η μεταναστομωτική ημέρα και είναι δυνατό να διαρκέσει μέχρι και την 90 η ημέρα 52. Η παραγωγή του κολλαγόνου συνεχίζεται για αρκετές εβδομάδες ακόμα μετά από τη σύγκλειση του τραύματος, ενώ παράλληλα πραγματοποιείται και η αναδιαμόρφωση των ιστών που μπορεί να διαρκέσει έως και τρία χρόνια. Για το λόγο αυ- 33

34 τό κλινικά η φάση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο επειδή η ποιότητα και η συνολική ποσότητα κολλαγόνου θα κρίνει την ισχύ της ουλής σε βάθος χρόνου 53. Επίσης, η αναδιαμόρφωση μπορεί να είναι και η αιτία στένωσης της αναστόμωσης μετά από σημαντικό χρονικό διάστημα, έως και 6 μήνες, από τη διενέργειά της. Η αναδιαμόρφωση του ιστού στην περιοχή του τραύματος έχει σκοπό την αποδόμηση του κολαγόνου τύπου ΙΙΙ και την αντικατάστασή του από κολλαγόνο τύπου Ι 39. Η σύνθεση του νέου κολλαγόνου προάγεται με τη δράση του TGF-β και η σύνθεση των κολλαγενασών αυξάνεται με τη δράση του PDGF. Η κολλαγονόλυση προοδευτικά ελαττώνεται και υπερισχύει η εναπόθεση του κολλαγόνου 54. Με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η ιστική αναδόμηση και σχηματίζεται ο επουλωτικός ιστός Επούλωση του παχέος εντέρου Ο υποβλεννογόνιος χιτώνας του παχέος εντέρου είναι ο πιο σημαντικός αφού αυτός είναι που συγκρατεί τις ραφές των αναστομώσεων 56. Αποτελείται από αραιό συνδετικό ιστό που περιέχει την πλειοψηφία των πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας με διαφορετική όμως σύνθεση από αυτή του δέρματος έχοντας περισσότερο κολλαγόνο τύπου Ι και λιγότερο τύπου ΙΙΙ. Παρουσιάζει πλούσια αιμάτωση μέσω αρτηριακού και φλεβικού δικτύου καθώς και ανεπτυγμένο πλέγμα λεμφαγγείων. Οι φάσεις της επούλωσης παρουσιάζονται στο παχύ έντερο όπως και στους υπόλοιπους ιστούς. Όπως και στην επαναεπιθηλιοποίηση του δέρματος, αν ο βλεννογόνος είναι ο μόνος τραυματισμένος χιτώνας, τότε επουλώνεται με μετανάστευση επιθηλιακών κυττάρων από το πλησίον επιθήλιο και πολλαπλασιασμό τους. Σε περίπτωση όμως ολοτοιχωματικής βλάβης του παχέος εντέρου προκαλείται ινοβλαστική αντίδραση η οποία οδηγεί σε δημιουργία ουλής 33. Η φάση της φλεγμονής ξεκινά μετά τον τραυματισμό και χαρακτηρίζεται από κυτταρική διήθηση και δημιουργία οιδήματος. Το οίδημα περιορίζεται κυρίως στον υποβλεννογόνιο χιτώνα και διαρκεί μέχρι το τέλος της δεύτερης εβδομάδας. Τα κοκκιοκύτταρα είναι ο κυρίαρχος τύπος κυττάρων κατά το πρώτο 24ωρο και ακολουθούν τα μακροφάγα 48 ώρες μετά από χειρουργικό τραύμα. Η αγγειογένεση ξεκινά 2-3 ημέρες μετά τον τραυματισμό 57. Οι ινοβλάστες και κυρίως τα λεία μυϊκά κύτταρα παίρνουν μέρος στην παραγωγή των πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας κυρίως υποβλεννογόνια και υπορογόνια. Ο ανασχηματισμός του βλεννογόνου πραγματοποιείται ταχέως στο γαστρεντερικό σύστημα, περίπου σε μία εβδομάδα. Αν όμως ο τραυματισμός του εντέρου είναι σοβαρός και συνοδεύεται από καταστροφή ιστών ή έκχυση βακτηριακού περιεχομένου, τότε η επούλωση θα διαρκέσει περισσότερο και τα γεγονότα θα είναι πιο έντονα 33. Μετά από 1-2 εβδομάδες 34

35 το επιθήλιο έχει αποκατασταθεί πλήρως και βρίσκεται επάνω από μια κοκκιωματώδη εγκοπή του τοιχώματος που αποτελείται από πολλαπλασιαζόμενα λεία μυϊκά κύτταρα και ινοβλάστες 58. Η ανασυγκρότηση της υποβλεννογόνιας στιβάδας είναι απαραίτητη για την επιθηλιακή αναγέννηση. Σημαντική για την αποκατάσταση της δύναμης της αναστόμωσης είναι η εναπόθεση νέας θεμέλιας ουσίας η οποία γεφυρώνει την αναστόμωση. Οι κύριοι τύποι κολλαγόνου κατά την επούλωση είναι οι Ι, ΙΙΙ και V με τον τύπο Ι να αποτελεί τον κυρίαρχο τύπο. Η εναπόθεση του κολλαγόνου εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ νέας παραγωγής και αποδόμησής του. Αμέσως μετά τη δημιουργία της αναστόμωσης και για 2-3 ημέρες, η αναστόμωση συγκρατείται από τις τοποθετημένες ραφές και στεγανοποιείται από ένα θρόμβο ινικής. Κατά την περίοδο αυτή, η σύνθεση της θεμέλιας ουσίας είναι ελάχιστη έως μηδαμινή, αλλά η αποδόμηση του κολλαγόνου της θεμέλιας ουσίας είναι έντονη και παρατεταμένη. Μετά την πάροδο τριών ημερών παρατηρείται αξιόλογη αύξηση στη δύναμη της αναστόμωσης 59, ενώ μετά την έβδομη ημέρα οι πειραματικές αναστομώσεις αποκτούν την πλήρη μηχανική τους ισχύ και ρήγνυνται εκτός της γραμμής των ραμμάτων 48. Αυτό οφείλεται στην ακαμψία της νεοσχηματισμένης αναστόμωσης σε σύγκριση με το παρακείμενο παχύ έντερο και στην αύξηση στη δύναμη της πίεσης διάσπασης μακριά από την αναστόμωση 60. Η ινονεκτίνη είναι μία γλυκοπρωτεΐνη υψηλού μοριακού βάρους η οποία εκφράζεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις στο φυσιολογικό υποβλεννογόνιο χιτώνα. Μερικές ώρες μετά από τον τραυματισμό προάγεται η έκφρασή της στον υποβλεννογόνιο, στον ορογόνο και στο μυϊκό χιτώνα, με την υψηλότερη έκφραση να παρατηρείται κατά τις ημέρες 3-5. Η ινονεκτίνη χρησιμεύει ως σκελετός για τη διείσδυση των κυττάρων της φλεγμονής και ως προσωρινή θεμέλια ουσία. Η έκφρασή της μειώνεται κατά τη φάση του πολλαπλασισμού 60. Μετά από τον τραυματισμό η γονιδιακή έκφραση των κολλαγόνων Ι και ΙΙΙ αυξάνεται φτάνοντας στο υ- ψηλότερο σημείο κατά την 2-3η ημέρα. Παρ όλα αυτά, η συγκέντρωση του κολλαγόνου παρουσιάζει μεγάλη πτώση κατά τις ημέρες 2-3 και στη συνέχεια σταδιακή άνοδο μέχρι την 7 η ημέρα 44,57,61. Η μείωση του κολλαγόνου είναι πιο έκδηλη σε απόσταση 2,5cm πριν και μετά από την αναστόμωση 60. Παρόμοια πορεία παρουσιάζει και το κολλαγόνο τύπου V και η λαμινίνη που ανευρίσκεται στη βασική μεμβράνη. Η ποσότητα και η ποιότητα του νεοσχηματισμένου κολλαγόνου και η αποδόμηση του προϋπάρχοντος καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό τη δύναμη της αναστόμωσης. Η ισορροπία ανάμεσα στη σύνθεση και την αποδόμηση καθορίζει τη δύναμη και την ακεραιότητα της αναστόμωσης κατά την πρώιμη περίοδο μετά τον τραυματισμό. Το κολλαγόνο αποδομείται εξ αιτίας της αυξημένης δράσης των κολλαγενασών, οι οποίες με 35

36 τη σειρά τους ρυθμίζονται από τους ιστικούς αναστολείς των κολλαγενασών (TIMPs), οι οποίοι εμφανίζονται λίγο αργότερα 49, Διαφυγή από την αναστόμωση του παχέος εντέρου Παρά τη συνεχή πρόοδο της χειρουργικής, οι επεμβάσεις του παχέος εντέρου συνεχίζουν να παρουσιάζουν σημαντική μετεγχειρητική νοσηρότητα 62. Η διαφυγή μετά από εκτομή και αναστόμωση του παχέος εντέρου είναι μία επιπλοκή σοβαρή και επικίνδυνη για τη ζωή του ασθενούς που οδηγεί σε αυξημένη θνητότητα, νοσηρότητα και παραμονή στο νοσοκομείο. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στις χειρουγικές τεχνικές και τον εξοπλισμό, η διαφυγή από την αναστόμωση εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό κλινικό πρόβλημα. Η συχνότητα της διαφυγής, αναφέρεται στη διεθνή βιβλιογραφία μεταξύ 2-5% 63. Ως αιτίες της ρήξης της αναστόμωσης έχουν αναφερθεί διάφοροι παράγοντες, μεταξύ των οποίων και η κακή χειρουργική τεχνική, η τάση της αναστόμωσης, η ι- στική υποξία, η υποθρεψία, ο σακχαρώδης διαβήτης και άλλες αιτίες Η διαφυγή από την αναστόμωση τυπικά συμβαίνει μεταξύ της τρίτης και της έβδομης μετεγχειρητικής ημέρας 64. Η κλινική εικόνα των α- σθενών με ρήξη της αναστόμωσης ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος της βλάβης και κυμαίνεται από την απλή καθυστέρηση της ανάρρωσης έως την προχωρημένη σήψη. Οι κλινικές εκδηλώσεις εξαρτώνται από τη θέση και το μέγεθος της διαφυγής και από την πιθανότητα οι πέριξ ιστοί ή το επίπλουν να έχουν απομονώσει τη διαφυγή. Έτσι μία μικρή σε μέγεθος διαφυγή μπορεί να διαγνωσθεί με καθυστέρηση αφού τα μη ειδικά συμπτώματά της (κοιλιακό άλγος, πυρετός, ταχυκαρδία, ειλεός, διάρροια, εντερική απόφραξη, λευκοκυττάρωση) μπορούν να αποδοθούν σε επιβραδυμένη ανάρρωση παρά σε αναστομωτική βλάβη. Για το λόγο αυτό ο χειρουργός πρέπει να έχει υψηλό δείκτη υποψίας για να διαγνώσει την κατάσταση αυτή έγκαιρα, ιδιαίτερα όταν υπάρχουν και οι παράγοντες κινδύνου οι οποίοι αναφέρθηκαν προηγουμένως 64. Η διαγνωστική προσέγγιση της κατάστασης αυτής περιλαμβάνει γενική εξέταση αίματος, η οποία συνήθως αποκαλύπτει λευκοκυττάρωση, απλή ακτινογραφία κοιλίας σε όρθια θέση, η οποία μπορεί να αναδείξει ελεύθερο αέρα υποδιαφραγματικά, υγραερικά επίπεδα λεπτού εντέρου καθώς και υγραερικό ε- πίπεδο στο ευθυκυστικό ή ευθυμητρικό κόλπωμα, υποδηλωτικό αποστήματος 65. Ο έλεγχος με αξονική τομογραφία με ενδοφλέβιο, από του στόματος και δια υπολκυσμού σκιαστικό αποτελεί εξέταση εκλογής για τους ασθενείς με υποψία αναστομωτικής διαφυγής και αναδεικνύει τη δημιουργία αποστήματος και την έξοδο σκιαστικού από τον αυλό του εντέρου 64,66. 36

37 Η μέθοδος αντιμετώπισης της διαφυγής από την αναστόμωση ε- ξαρτάται από τη βαρύτητά της καθώς και από την κλινική κατάσταση του ασθενούς. Από τους ασθενείς στους οποίους πραγματοποιήθηκε αναστόμωση στην πύελο, ένα μεγάλο ποσοστό (36-49%) παρουσίασε διαφυγή μετά από έλεγχο ρουτίνας με υποκλυσμό με γαστρογραφίνη μέσα στην πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα 67. Οι περισσότερες από αυτές ήταν υποκλινικές διαφυγές. Στις περιπτώσεις των ασθενών με μικρού και μετρίου βαθμού διαφυγή και σταθερή αιμοδυναμική και μεταβολική κατάσταση, εφαρμόζονται γενικά υποστηρικτικά μέτρα, όπως διακοπή της σίτισης και χορήγηση αντιβιοτικών βάσει καλλιέργειας. Για την αντιμετώπιση ασθενών που εκτός από ήπια σήψη παρουσίασαν και απόστημα, ενδείκνυται η παροχέτευση του αποστήματος σε συνδυασμό με αντιβιοτική αγωγή. Η παροχέτευση αυτή μπορεί να γίνει είτε διαδερμικά υπό την καθοδήγηση αξονικού τομογράφου ή υπερηχοτομογραφίας, είτε χειρουργικά. Στους ασθενείς που εμφανίζουν έντονη συμπτωματολογία σήψης, κοιλιακό άλγος και ευαισθησία απαιτείται επανεπέμβαση, δημιουργία κεντρικότερης κολοστομίας ή ειλεοστομίας, έκπλυση της περιτοναϊκής κοιλότητας και τοποθέτηση παροχετεύσεων 68. Σε περιπτώσεις γενικευμένης περιτονίτιδας απαιτείται εκτομή του τμήματος του παχέος εντέρου και τελική κολοστομία με βλεννογονικό συρίγγιο ή επέμβαση Hartmann. Ε- πιδιόρθωση της αναστόμωσης, με ή σε συνδυασμό με κεντρικότερη κολοστομία δεν ενδείκνυται στις περιπτώσεις αυτές, διότι υπάρχει υψηλός κίνδυνος υποτροπής της αναστομωτικής βλάβης ή στένωσης της αναστόμωσης 64. Οι αναστομωτικές διαφυγές που δεν αναγνωρίζονται εγκαίρως μπορούν να οδηγήσουν σε εντεροδερματικά συρίγγια. Η συριγγογραφία ή η αξονική τομογραφία εφαρμόζονται για τον εντοπισμό του σημείου της διαφυγής και της παρουσίας πυώδους συλλογής. Αν δεν υπάρχει στένωση περιφερικότερα, τότε η πλειοψηφία των συριγγίων θα ιαθούν μόνο με εξωτερική παροχέτευση του αποστήματος χωρίς χειρουργική παρέμβαση. Άλλα γενικά υποστηρικτικά μέτρα που βοηθούν την επούλωση του συριγγίου είναι η διακοπή της σίτισης, η διόρθωση αναιμίας και ηλεκτρολυτικών διαταραχών και η επαρκής παρεντερική θρέψη του ασθενούς

38 3 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 3.1 Γενικά περί Αγγειογένεσης Το αγγειακό σύστημα εξασφαλίζει επαρκή αιματική ροή στα κύτταρα για την παροχή των απαιτούμενων θρεπτικών ουσιών και του οξυγόνου. Για τη δημιουργία νέων αγγείων επιστρατεύονται δύο μηχανισμοί: η νεοαγγείωση, με την οποία σχηματίζεται το αρχικό αγγειακό δίκτυο και η αγγειογένεση, με την οποία σχηματίζονται τα νέα αγγεία από τα προϋπάρχοντα. Οι μηχανισμοί αυτοί βρίσκονται σε στενή ρύθμιση από την ισορροπία των αγγειογενετικών και των αντιαγγειογενετικών παραγόντων. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες υπερέχουν έναντι των αγγειογενετικών με αποτέλεσμα να μη συμβαίνει η αγγειογένεση, ενώ σε παθολογικές συνθήκες η ισορροπία γέρνει υπέρ της αγγειογένεσης. Το ώριμο αγγειακό δίκτυο προέρχεται από το αντίστοιχο δίκτυο το οποίο αρχικά δημιουργήθηκε στο έμβρυο μέσω της νεοαγγείωσης, μιας διαδικασίας κατά την οποία τα αγγεία σχηματίζονται de novo από τα πρόδρομα επιθηλιακά κύτταρα που ονομάζονται αγγειοβλάστες. Αντίθετα, στην αγγειογένεση τα νέα αγγεία αναπτύσσονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των προϋπαρχόντων αγγείων, όπως τα τριχοειδή και τα μετατριχοειδικά φλεβίδια 69. Η αγγειογένεση σε φυσιολογικές συνθήκες ελέγχεται πλήρως από την ισορροπία μεταξύ των αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων, με τελικό αποτέλεσμα να παρατηρείται μικρή αγγειογενετική δραστηριότητα στους υγιείς ενήλικες. Η επιτάχυνση της αγγειογένεσης είναι μία φυσιολογική απάντηση που παρατηρείται σε καταστάσεις όπως η επούλωση των ιστών, η φλεγμονή, η αναγέννηση του ήπατος, ο γυναικείος αναπαραγωγικός κύκλος και η εμβρυϊκή ανάπτυξη. Αντίθετα, η αγγειογένεση θεωρείται παθολογικό χαρακτηριστικό σε καταστάσεις όπως η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και οι συμπαγείς όγκοι 70. Η αγγειογένεση είναι μία πολύπλοκη διαδικασία στην οποία ε- μπλέκεται ένα μεγάλο πλήθος χυμικών και κυτταρικών στοιχείων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να υπάρχουν πολλές ομοιότητες ανάμεσα στην αγγειογένεση που παρατηρείται κατά τη δημιουργία των όγκων και στη φυσιολογική αγγειογένεση 71. Οι δύο μορφές της αγγειογένεσης διαφέρουν στο ότι η αγγειογένεση των όγκων χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη ε- νός έντονα ελικοειδούς και διατεταμένου μικροαγγειακού δικτύου 72, που εμφανίζει υψηλή αγγειακή διαφυγή 73, εισροή φλεγμονωδών κυττάρων και εναπόθεση ινικής 74. Επιπρόσθετα, η αγγειογένεση των όγκων αποτελεί ένα συνεχές, μη-ελεγχόμενο φαινόμενο σε αντίθεση με την αυτοπεριοριζόμενη φύση της επούλωσης των ιστών και της αναγέννησης. Για το 38

39 λόγο αυτό, ο καρκίνος έχει χαρακτηριστεί σα μια «πληγή που δεν κλείνει ποτέ» Μορφές της αγγειογένεσης Νεοαγγείωση Νεοαγγείωση (vasculogenesis) καλείται η διαδικασία με την οποία δημιουργείται το πρώτο αγγειακό δίκτυο de novo, κυρίως κατά την εμβρυογένεση. Στη φάση αυτή, τα αρχέγονα αγγειακά κύτταρα, οι αγγειοβλάστες, πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν δημιουργώντας το πρώτο απλό αγγειακό δίκτυο 76. Ενώ το πρώτο αυτό αγγειακό δίκτυο αναδύεται, πρώιμα σημεία της αναδιαμόρφωσής του στο έμβρυο γίνονται ορατά. Η αναδιαμόρφωση αυτή ορίζεται ως η αναδιάταξη του αριθμού και της εντόπισης των διάφορων αγγειακών τμημάτων, με σκοπό τη δημιουργία μιας λειτουργικής αναπροσαρμογής χωρίς ιδιαίτερη επέκταση του δικτύου 77. Σε ορισμένα σημεία παρατηρείται συγχώνευση των αγγειακών τμημάτων που οδηγεί στο σχηματισμό μεγαλύτερων αγγείων, ενώ σε άλλα σημεία μεγαλύτερα αγγεία εξαφανίζονται για να δώσουν τη θέση τους σε μικρότερα, αλλά περισσότερα σε αριθμό 78. Η διαδικασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα τη μεταμόρφωση του ομοιόμορφου πρωτογενούς αγγειακού δικτύου στο δευτερογενές το οποίο είναι πιο πολύπλοκα δομημένο Αγγειογένεση Η περαιτέρω επέκταση του πρωτογενούς και δευτερογενούς αγγειακού δικτύου πραγματοποιείται μέσω της αγγειογένεσης (angiogenesis). Η αγγειογένεση αναφέρεται στη δημιουργία νέων αγγείων από προϋπάρχοντα αγγεία 79 μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών: α) την εκβλάστηση (sprouting) ενδοθηλιακών κυττάρων (Εικόνα 2) και β) τη διαίρεση (splitting) του αυλού των αγγείων με εγκολεαστική μικροαγγειακή ανάπτυξη (intussusceptive microvascular growth) (Εικόνα 3). Mια σειρά βιοχημικών και κυτταρικών μηχανισμών έχουν ως στόχο την κινητοποίηση των «εν ηρεμία» ενδοθηλιακών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευσή τους, προκειμένου αυτά να οργανωθούν σε τριχοειδή, με αποτέλεσμα την ικανοποιητική άρδευση μιας υποξαιμικής ή ανεπαρκώς τροφοδοτούμενης περιοχής με θρεπτικά συστατικά. 39

40 3.3 Τα στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Η αγγειογένεση είναι μία εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία κατά την οποία απαιτείται ο συντονισμός πολλών σταδίων που ρυθμίζονται από μία ποικιλία ανταγωνιζόμενων μεταξύ τους μορίων. Τα στάδια της αγγειογένεσης είναι τα ακόλουθα: Αγγειοδιαστολή και αυξημένη διαπερατότητα Το πρώτο στάδιο της αγγειογένεσης περιλαμβάνει την αγγειoδιαστολή του προϋπάρχοντος αγγείου μέσω της δράσης του VEGF και του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) 80. Ο VEGF προάγει τη δραστηριότητα της συνθετάσης του ΝΟ στα ενδοθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα αύξηση των ενδοκυττάριων επιπέδων του ΝΟ. Η αύξηση του ΝΟ διεγείρει την γουανυλ-κυκλάση για την παραγωγή κυκλικού γουανόσινου μονοφωσφορικού οξέος (cyclic gouanisine monophosphate cgmp). Το cgmp οδηγεί σε χαλάρωση τις λείες μυϊκές ίνες των αγγείων. Εκτός από την αύξηση της συγκέντρωσης του ΝΟ, ο VEGF αυξάνει και τη διαπερατότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η αύξηση της διαπερατότητας επιτυγχάνεται με τη δημιουργία στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κυστικών και κενοτοπιακών οργανιδίων που ονομάζονται VVO (vesiculo-vacuolar organelles) 81. Τα κυστίδια και κενοτόπια των VVO επικοινωνούν μεταξύ τους και στοιχίζονται με τρόπο ώστε να διατρέχουν όλο το μήκος του κυτταροπλάσματος από την επιφάνεια προς τον αυλό έως την αντίθετη επιφάνεια. Με αυτόν τον τρόπο διευκολύνουν κατά την αγγειογένεση τη μεταφορά πρωτεϊνών του πλάσματος, όπως το ινωδογόνο και το πλασμινογόνο από τον αυλό του αγγείου προς τους πέριξ ιστούς. Αυτές είναι οι πρωτεΐνες που θα χρησιμοποιηθούν ως σκελετός από τα μεταναστεύοντα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σε μικρότερο ποσοστό, η εξαγγείωση των πρωτεϊνών του πλάσματος συμβαίνει διαμέσου των διακυτταρικών συνδέσεων Αποσταθεροποίηση των αγγείων-αποδόμηση της θεμέλιας ουσίας Πριν από την εκβλάστηση των ενδοθηλιακών κυττάρων προηγείται η απομάκρυνση των τοιχωματικών κυττάρων (λείων μυϊκών ινών, περικυττάρων), η αποδόμηση της βασικής μεμβράνης και η αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας στην περιοχή πέριξ του αγγείου. Η απομάκρυνση των περικυττάρων, σε συνδυασμό με τη δράση του VEGF, έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας των ενδοθηλίων. Με αυτόν 40

41 τον τρόπο διάφορες πρωτεάσες έχουν τη δυνατότητα να εξαγγειωθούν στον περιαγγειακό χώρο και να αποδομήσουν τη βασική μεμβράνη. Κύριοι παράγοντες που εμπλέκονται στο στάδιο αυτό είναι η αγγειοποιητίνη-2, καθώς και ένας αριθμός πρωτεασών μεταξύ των οποίων οι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου, οι χυμάσες και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες θεμέλιας ουσίας 83. Ανάλογα με τη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας που περιβάλλει το αγγείο ενεργοποιούνται οι αντίστοιχες πρωτεάσες Πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων και μετανάστευση Κατά την αγγειογένεση, οι αγγειογενετικοί παράγοντες οι οποίοι προάγουν τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων υπερέχουν έναντι των αγγειοστατικών παραγόντων. Τέτοιοι αγγειογενετικοί παράγοντες είναι οι VEGF, FGF, αγγειοποιητίνες 1 και 2, αγγειογενίνη, ΕGF (επιδερμικός αυξητικός παράγοντας epidermal growth factor), CXCχημειοκίνες και ο IGF-1 (insulin-like growth factor ομοιάζον με την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας) 83. O VEGF και η αγγειοποιητίνη φαίνεται πως αποτελούν ειδικούς μιτογόνους παράγοντες για τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Άλλοι παράγοντες, όπως ο FGF, η αγγειογενίνη, ο EGF, οι CXC-χημειοκίνες και ο IGF-1, προάγουν τον πολλαπλασιασμό σε μία ποικιλία κυττάρων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα, αφού πολλαπλασιαστούν, μεταναστεύουν ακολουθώντας τους χημειοτακτικούς παράγοντες μέσα από την αποδομημένη βασική μεμβράνη προς τον αναδιαμορφωμένο περιαγγειακό χώρο Δημιουργία αυλού και σταθεροποίηση του αγγείου Μετά τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, ακολουθεί η μετανάστευσή τους στην αναδιαμορφωμένη περιοχή γύρω από το αγγείο κάτω από την επίδραση των προαναφερθέντων αγγειογενετικών παραγόντων όπου αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (ιντεγκρίνες α v β 3 ). Στη συνέχεια τα ενδοθηλιακά κύτταρα έρχονται σε μεσοκυττάρια επαφή μέσω της έκφρασης της VE-καδχερίνης και τοποθετούνται σε μονή στιβάδα δημιουργώντας τους σωληνοειδείς σχηματισμούς που χαρακτηρίζουν τα νεόπλαστα τριχοειδή. Ο VEGF παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση του μεγέθους του αγγείου με τις διαφορετικές ισομορφές να έχουν και διαφορετική επίδραση στο μέγεθος. 41

42 Εικόνα 2. Τα στάδια της αγγειογένεσης. Η αγγειογένεση με διακλάδωση των αγγείων είναι διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει: (i) υποδοχή των αγγειογενετικών σημάτων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (EC), (ii) αποχώρηση των περικυττάρων από τη έξω επιφάνεια των τριχοειδών και έκκριση πρωτεασών από τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα (aec) και πρωτεολυτική διάσπαση της βασικής μεμβράνης (μπλε διακεκομένη γραμμή), (iii) χημειοτακτική μετανάστευση των EC υπό την επίδραση αγγειογενετικών παραγόντων, (iv) πολλαπλασιασμός των EC και δημιουργία αυλού μέσω συγχώνευσης με διακυτταρικές συνδέσεις, (v) επιστράτευση των περικυττάρων και εναπόθεση νέας βασικής μεμβράνης και έναρξη της ροής του αίματος. Εικόνα 3. Αγγειογένεση χωρίς διακλάδωση. Η εγκολεαστική μικροαγγειακή α- νάπτυξη ξεκινά με: (i) προσεκβολή των αντίστοιχων τοιχωμάτων του τριχοειδούς προς τον αυλό, (ii) διάτρηση του στρώματος των ενδοθηλιακών κυττάρων και δημιουργία πολλών τριχοειδών (κόκκινο βέλος), (iii) σχηματισμός του αγγειακού δένδρου μέσω δημιουργίας εγκολεαστικής στήλης, συγχώνευση των στηλών και επιμήκυνση των τριχοειδών. 42

43 Οι VEGF 121 και VEGF 165 προκαλούν αύξηση της διαμέτρου του αυλού, ενώ ο VEGF 189 οδηγεί σε μειωμένη διάμετρο. Τέλος, ο νεοσχηματισμένος αγγειακός σωλήνας σταθεροποιείται από τα τοιχωματικά κύτταρα. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω του πολλαπλασιασμού των μεσεγχυματικών κυττάρων της γύρω περιοχής κάτω από την επίδραση του PDGF και της αγγειοποιητίνης-2, τα οποία μεταναστεύουν στην εξωτερική επιφάνεια του ανώριμου αγγείου. Τα μεσεγχυματικά κύτταρα διαφοροποιούνται με τη βοήθεια του TGF-β είτε σε περικύτταρα, που βρίσκονται στη βασική μεμβράνη είτε σε λείες μυϊκές ίνες που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του αγγείου. Η σταθεροποίηση του τοιχώματος ολοκληρώνεται με την οργάνωση των περικυττάρων με αποτέλεσμα το νεόπλαστο τριχοειδές να αποκτά σταθερή αιματική ροή και διαπερατότητα Αγγειογένεση κατά την επούλωση των ιστών Η δημιουργία νέων αγγείων από τα προϋπάρχοντα, δηλαδή η διαδικασία που ονομάζεται αγγειογένεση, είναι απαραίτητη στην επούλωση των ιστών 85. Τα νεοσχηματισμένα αγγεία συμμετέχουν στη δημιουργία προσωρινού κοκκιώδους ιστού και παρέχουν οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά στους αναπτυσσόμενους ιστούς. Παράλληλα, φλεγμονώδη κύτταρα απαιτούνται για την αλληλεπίδραση με τη βασική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων και για τη μετανάστευση διαμέσου αυτής. Η αγγειογένεση ως απάντηση στον τραυματισμό των ιστών, είναι μια δυναμική διαδικασία η οποία ρυθμίζεται από σήματα που προέρχονται τόσο από τη συστηματική κυκλοφορία, όσο και από την περιβάλλουσα εξωκυττάρια ουσία 79. Κύριο ρόλο στην αγγειογένεση παίζουν τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Μετά από τον τραυματισμό, τα κύτταρα αυτά ξεκινούν την αγγειογενετική διαδικασία προάγοντας: την αύξηση της μικροαγγειακής διαπερατότητας την τοπική αποδόμηση της βασικής μεμβράνης τη μετανάστευση και εκβλάστηση μέσα στη γύρω περιοχή τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και δημιουργία κοκκιώδους ιστού τη δημιουργία νέων αγγείων τη σταθεροποίηση των αγγείων και αργότερα υποστροφή των νέων αγγείων στα πλαίσια της αναδιαμόρφωσης των ιστών 86 Όπως ήδη αναφέρθηκε, η επούλωση χωρίζεται αδρά σε διαφορετικές φάσεις οι οποίες αλληλοεπικαλύπτονται, τη φλεγμονώδη φάση, τη φάση του πολλαπλασιασμού και τη φάση της αναδιαμόρφωσης. Σύμφωνα με αυτόν το διαχωρισμό, η αγγειογένεση θεωρείται ότι αποτελεί φαι- 43

44 νόμενο της φάσης του πολλαπλασιασμού, έχοντας όμως υπ όψιν ότι τα σήματα για την αγγειογένεση ξεκινούν ήδη από τη φλεγμονώδη φάση 87. Με τρόπο παρόμοιο με τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων, η οποία είναι απαραίτητη για την επαναεπιθηλιοποίηση του τραύματος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην άκρη των τριχοειδών μεταναστεύουν μέσα στο τραύμα χωρίς όμως να υπόκεινται σε ενεργό πολλαπλασιασμό 88. Κυτταροπλασματικά ψευδοπόδια προβάλλουν από τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά τη 2 η μετατραυματική ημέρα, εκκρίνεται κολλαγενάση και πραγματοποιείται η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων 89. Αυτή η πρώιμη φάση της αγγειογένεσης εξαρτάται από χημειοτακτικούς παράγοντες τους οποίους παρέχουν τα γειτονικά κύτταρα και η θεμέλια ουσία. Η προϋπάρχουσα εξωκυττάρια ουσία και το φαινόμενο του «ελεύθερου χείλους» (απουσία γειτονικών ενδοθηλιακών κυττάρων) είναι απαραίτητη για τη δημιουργία νέων αγγείων 90. Μετά τη μετανάστευση ακολουθεί και ο πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων. Διάφοροι παράγοντες, όπως οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα μακροφάγα, η χαμηλή τάση οξυγόνου, το γαλακτικό οξύ και οι βιογενείς αμίνες, κινητοποιούν τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Οι κυτταροκίνες αυτές αποτελούνται από διαλυτούς αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι δρουν με διαδοχικό, ε- νορχηστρωμένο και συνεργιστικό τρόπο. Οι κυριότεροι παράγοντες αυτοί είναι οι VEGF, b-fgf, PDGF, TGF-β και οι αγγειοποιητίνες. Η φυσιολογική αγγειογένεση ελέγχεται από την ισορροπία και αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων που ευνοούν και αυτών που δρουν κατά της αγγειογένεσης. Έτσι η τραυματική ρήξη της βασικής μεμβράνης, είτε των αγγείων, είτε της επιδερμίδας, οδηγεί σε απελευθέρωση συνδεδεμένων στην εξωκυττάρια ουσία αγγειογενετικών παραγόντων, όπως ο FGF 91. Ταυτόχρονα, η βλάβη στα αγγεία προκαλεί πήξη με συγκόλληση, συσσώρευση και αποκοκκίωση των αιμοπεταλίων με απελευθέρωση πολλών αγγειογενετικών παραγόντων μεταξύ των οποίων και οι TGF-β, PDGF και VEGF, καθώς και κυτταροκίνες οι οποίες επιστρατεύουν μακροφάγα και μονοκύτταρα ως μέρος της φλεγμονώδους απάντησης 87. Ο VEGF δρα στα ενδοθηλιακά κύτταρα προάγοντας την κυτταρική μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό. Επίσης αυξάνει και τη διαπερατότητα των αγγείων με σκοπό τη διαρροή πρωτεϊνών του πλάσματος, όπως το ινωδογόνο, που θα παρέχουν προσωρινά υποστήριξη στα μεταναστεύοντα επιθηλιακά κύτταρα, λευκοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα 91,92. Μέσα στον κοκκιώδη ιστό, ενεργοποιημένα μακροφάγα απελευθερώνουν bfgf, TNF α και μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) 85. Το ΝΟ προάγει την αγγειοδιαστολή και τη μεταγραφή του VEGF από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και με παλίνδρομη θετική ρύθμιση ο VEGF προάγει την έκφραση της ενδοθηλιακής συνθετάσης του ΝΟ (enos) η οποία οδηγεί σε επιπλέον παραγωγή ΝΟ 92. Η υποξία μέσα στον κοκκιώδη ιστό προάγει τη 44

45 μεταγραφή και έκκριση του VEGF από τα μακροφάγα 85. Ο VEGF είναι υπεύθυνος για την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Η αγγειοποιητίνη-1 (Ang-1) αναστέλλει τη διαφυγή από τα αγγεία και επίσης δρα χημειοτακτικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα προάγοντας τη διακλάδωση τους και την έκκριση των πρωτεασών πλασμίνη και MMP-2, προάγοντας την αγγειογένεση 93,94. Ο VEGF επίσης ρυθμίζει θετικά την έκφραση ορισμένων ιντεγκρινών στα ενδοθηλιακά κύτταρα, οι οποίες επιτρέπουν στα κύτταρα να προσκολλώνται και να μεταναστεύουν κατά μήκος του προσωρινού σκελετού που σχηματίζεται στο σημείο του τραύματος 95. Τέλος, τα μεταναστεύοντα ενδοθηλιακά κύτταρα στοιχίζονται σε στερεές χορδές, σχηματίζοντας συνδέσεις με παρακείμενα ενδοθηλιακά κύτταρα δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο τον αυλό 92. Οι λείες μυϊκές ίνες των αγγείων αναστέλλουν τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, σταθεροποιώντας τα νέα αγγεία 92. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και των περικυττάρων και των λείων μυϊκών ινών προάγουν την παραγωγή και ενεργοποίηση του TGF-β, ο οποίος αυξάνει την εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας και συνεισφέρει έτσι στην ωρίμανση και σταθεροποίηση των αγγείων 51,92, Ρύθμιση της αγγειογένεσης Η ρύθμιση της αγγειογενετικής διαδικασίας πραγματοποιείται μέσω μίας λεπτής ισορροπίας μεταξύ αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών (ή αγγειοστατικών) παραγόντων. Στη ρύθμιση αυτή συμμετέχουν τόσο διαλυτοί όσο και συνδεδεμένοι με την κυτταρική μεμβράνη παράγοντες, καθώς και άλλες παράμετροι όπως οι διατμητικές δυνάμεις και η αρτηριακή πίεση 84. Οι κυριότεροι αγγειογενετικοί και αντιαγγειογενετικοί παράγοντες καθώς και οι σημαντικότερες δράσεις τους παρουσιάζονται στον Πίνακα Αγγειογένεση και καρκίνος Η αγγειογένεση είναι ένας μηχανισμός απαραίτητος σε μεγάλο α- ριθμό φυσιολογικών αλλά και παθολογικών γεγονότων. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η αγγειογένεση υπόκειται στενής ρύθμισης, ενώ σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις παρατηρείται δυσλειτουργία της ρύθμισης αυτής. Παραδείγματα τέτοιων καταστάσεων είναι η ψωρίαση, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και ο καρκίνος. Κατά την ανάπτυξη των όγκων, η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την επαρκή θρέψη τους και την απομάκρυνση μεταβολικών προϊόντων από αυτούς

46 Σε μία παθολογική κατάσταση όπως ο καρκίνος, η αγγειογένεση απαιτείται για την επιβίωση του όγκου και για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του. Διάφοροι αγγειογενετικοί παράγοντες που παράγονται από καρκινικά κύτταρα συνδέονται με υποδοχείς των επιθηλιακών κυττάρων διεγείροντας την αύξησή τους αλλά και την παραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων (μεταλλοπρωτεϊνάσες) με τη βοήθεια των οποίων αποδομείται η βασική μεμβράνη και η θεμέλια ουσία η οποία περιβάλλει το αγγείο 97. Οι συνδέσεις ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα αλλοιώνονται, κυτταρικές προσεκβολές προχωρούν μέσα από το κενό που δημιουργείται και έτσι οι αγγειακές εκβλαστήσεις αναπτύσσονται προς την πηγή του ερεθίσματος. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εισβάλλουν μέσα στη θεμέλια ουσία, πολλαπλασιάζονται μέσα στον όγκο, οργανώνονται σε σωληνώδεις σχηματισμούς και αποκτούν βασική μεμβράνη. Μέσα από αυτά τα νεοσχηματισθέντα αγγεία ρέει το αίμα μέσα στον όγκο. Διάφορες καταστάσεις, όπως μηχανικό και μεταβολικό στρες, υποξία, γονιδιακές μεταλλάξεις, μπορούν να διεγείρουν την ανάπτυξη των αγγείων προκαλώντας στροφή προς τους αγγειογενετικούς παράγοντες 98. Η αγγειογένεση των όγκων είναι μία αθροιστική διαδικασία για την οποία απαιτείται α- πώλεια του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και μετατόπιση της ισορροπίας μεταξύ των αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων. Η προαγωγή της αγγειογένεσης είναι ένα τοπικό γεγονός που αφορά ειδικά τα υπερπλαστικά κύτταρα και προηγείται της επιθετικής ανάπτυξης του όγκου 99. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κακοήθης αλλαγή προϋποθέτουν στροφή προς τον αγγειογενετικό φαινότυπο. Ταυτόχρονα μόνο τα υπερπλαστικά κύτταρα που αποκτούν αγγειογενετικές ικανότητες υπόκεινται σε κακοήθη εξαλλαγή 99,100. Υπάρχει παραλληλισμός ανάμεσα στις διαδικασίες της επούλωσης των ιστών και της ανάπτυξης των όγκων, με αποτέλεσμα να θεωρούνται οι όγκοι ότι δρουν σαν υποχρεωτικά παράσιτα που έχουν αναπτύξει την ικανότητα να αποτρέπουν και να υπονομεύουν την επουλωτική αντίδραση του ξενιστή. Μ αυτόν τον τρόπο αποκτούν το υπόστρωμα που χρειάζονται για να αναπτύσσονται και να επεκτείνονται 75,

47 Αγγειογενετικοί παράγοντες Αντιαγγειογενετικοί παράγοντες Παράγοντας Βιολογικές δράσεις Παράγοντας Βιολογικές δράσεις VEGF διαπερατότητας, ενεργοποιητών πλασμινογόνου, κολλαγενασών, πολλαπλασιασμού ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ, μετανάστευση ΕΚ, αγγειογένεση in vivo Αγγειοστατίνη πολλαπλασιασμού ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ, μετανάστευσης ΕΚ, δημιουργίας σωλήνων, αγγειόσταση in vivo FGF Αγγειοποιητίνη-1 Αγγειοποιητίνη-2 Πολλαπλασιασμός ΕΚ, ενεργοποιητών πλασμινογόνου, ιντεγκρινών και άλλων μορίων προσκόλλησης, μετανάστευση ΕΚ, αγγειογένεση in vivo Εκβλάστηση ΕΚ, σταθεροποίηση αγγείων Μετανάστευση ΕΚ, πολλαπλασιασμός ΕΚ, εκβλάστηση ΕΚ μόνο με παρουσία VEGF Ενδοστατίνη Αγγειοποιητίνη-2 TGF-β πολλαπλασιασμού ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ, μετανάστευσης ΕΚ, αναστολή των MMPs, αγγειόσταση in vivo Αποσταθεροποίηση αγγείων μέσω ανταγωνισμού με Ang-1, απόπτωσης ΕΚ πολλαπλασιασμού ΕΚ, μετανάστευσης ΕΚ, ενεργοποιητών πλασμινογόνου, TIMPs, απόπτωσης ΕΚ Αναστολή του FGF πολλαπλασιασμού ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ Αναστολή των FGF και VEGF165, αγγειόσταση in vivo PDGF Πολλαπλασιασμός ΛΜΚ και ΠΚ, σταθεροποίηση αγγείων ΤΝF-α TGF-β δημιουργίας σωλήνων in vitro, σταθεροποίηση CXC χημειοκίνες αγγείων, αγγειογένεση in vivo σε φλεγμονώδες περιβάλλον ΤΝF-α Μετανάστευση ΕΚ, δημιουργία σωλήνων TSP-1, TSP-2 μετανάστευσης ΕΚ, απόπτωσης in vitro, αγγειογένεση in vivo ΕΚ, αγγειόσταση in vivo, ΕGF Πολλαπλασιασμός ΕΚ, αγγειογένεση in MMPs Δημιουργία αγγειοστατίνης vivo CSFs Πολλαπλασιασμός ΕΚ, μετανάστευση PEDF μετανάστευσης ΕΚ, πολλαπλασιασμού ΕΚ ΕΚ, αγγειόσταση in vivo Αγγειογενίνη Πολλαπλασιασμός ΕΚ Αγγειοτροπίνη Μετανάστευση ΕΚ, δημιουργία σωλήνων, αγγειογένεση in vivo CXC χημειοκίνες Πολλαπλασιασμός ΕΚ, μετανάστευση ΕΚ, αγγειογένεση in vivo IGF-1 Πολλαπλασιασμός ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ, προαγωγή VEGF, ενεργοποιητών πλασμινογόνου HGF Μετανάστευση και πολλαπλασιασμός ΕΚ και ΛΜΚ, αγγειογένεση in vivo PECAM-1 Συσσώρευση ΕΚ,, μετανάστευση ΕΚ, σταθεροποίηση αγγείων, απαραίτητη για FGF Ιντεγκρίνες Προσκόλληση ΕΚ, μετανάστευση ΕΚ, απόπτωσης ΕΚ, απαραίτητη για FGF VE-καδχερίνη Σταθεροποίηση αγγείων, απόπτωσης ΕΚ, αγγειογένεση in vivo MMPs Αποδόμηση εξωκυττάριας ουσίας Ερυθροποιητίνη Πολλαπλασιασμός ΕΚ, αγγειογένεση in vivo ΝΟ διαπερατότητας, πολλαπλασιασμός ΕΚ, απελευθέρωση FGF ΕΚ=ενδοθηλιακά κύτταρα, ΛΜΚ=λεία μυϊκά κύτταρα, ΠΚ=περικύτταρα, VEGF=αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας, FGF=παράγοντας ανάπτυξης των ινοβλαστών, PDGF=προερχόμενος από τα αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας, TGFβ=μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας, TNFα=παράγοντας νέκρωσης όγκων α, EGF=επιδερμικός αυξητικός παράγοντας, CSFs=παράγοντες ενεργοποίησης αποικίας, HGF=αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων, PECAM-1=αιμοπεταλιακό ενδοθηλιακό μόριο προσκόλλησης 1, MMP=μεταλλοπρωτεϊνάσες θεμέλιας ουσίας, ΝΟ=μονοξείδιο του αζώτου, TSP=θρομβοσπονδίνη, PEDF=προερχόμενος από μελάχρουν επιθήλιο αυξητικός παράγοντας Πίνακας 1. Κύριοι αγγειογενετικοί και αντιαγγειογενετικοί παράγοντες και ο ρόλος τους στην αγγειογένεση

48 3.6.1 Αγγειογένεση και δημιουργία μεταστάσεων Ο ρόλος της αγγειογένεσης στη δημιουργία απομακρυσμένων μεταστάσεων προϋποθέτει αρχικά την απόσπαση των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτογενή όγκο. Η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για τη μετάσταση αφού τα νεοσχηματισμένα τριχοειδή του όγκου έχουν ελλειπή βασική μεμβράνη με αποτέλεσμα να είναι διαπερατά και να επιτρέπουν τη διείσδυση των καρκινικών κυττάρων 102,103. Για την επιτυχή ανάπτυξη της απομακρυσμένης μετάστασης, τα κύτταρα αυτά πρέπει αρχικά να αποφύγουν τη ανοσιακή απάντηση μέσα στην κυκλοφορία. Όταν φτάσουν στο σημείο της δευτεροπαθούς ανάπτυξης πρέπει να διαπεράσουν το ενδοθήλιο, να αποδομήσουν τη βασική μεμβράνη, να εμφυτευθούν και να πολλαπλασιαστούν δημιουργώντας το δικό τους αγγειακό δίκτυο 104. Έτσι η αγγειογένεση είναι απαραίτητη τόσο κατά την αρχή αλλά και το τέλος της ακολουθίας των γεγονότων της μετάστασης Αγγειογενετική μεταστροφή Μετά τη δημιουργία τους οι περισσότεροι όγκοι παραμένουν in situ χωρίς αγγειογένεση για πολλούς μήνες έως και χρόνια πριν να μεταστραφούν προς τον αγγειογενετικό φαινότυπο. Η αλλαγή αυτή στο φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων καλείται και αγγειογενετική μεταστροφή (angiogenic switch). Η αλλαγή αυτή, κατά την οποία τα υπό φυσιολογικές συνθήκες ανενεργά αγγεία δίνουν γένεση σε νέα αγγεία, διαχωρίζει την προαγγειακή ανενεργή από την αγγειακή φάση που χαρακτηρίζεται από τη ραγδαία αύξηση του μεγέθους του όγκου. Τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται εξίσου και στις δύο φάσεις αλλά στην προαγγειακή φάση η κυτταρική απόπτωση εξισορροπεί τον πολλαπλασιασμό και έτσι ο όγκος διατηρείται σχετικά σταθερός 105. Η ενεργοποίηση της αγγειογενετικής μεταστροφής αποδόθηκε στη σύνθεση και απελευθέρωση αγγειογενετικών παραγόντων αλλά και στη διαταραχή της ισορροπίας αυτών με τους αναστολείς της αγγειογένεσης. 48

49 4 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 4.1 Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) Μεταξύ των διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (Vascular Endothelial Growth Factor VEGF) διαδραματίζει τον πιο καθοριστικό ρυθμιστικό ρόλο στη φυσιολογική αγγειογένεση, στην αγγειογένεση των όγκων και στη νεοαγγείωση. Ασκεί τη βιολογική του δράση κυρίως επί των ενδοθηλιακών κυττάρων και αποτελεί το βασικό ρυθμιστή της αγγειογένεσης. Ονομάζεται και αγγειοτροπίνη (vasculotropin) ή αγγειακός παράγοντας διαπερατότητας (vascular permeability factor) και αποτελεί οικογένεια πεπτιδίων με κοινά δομικά χαρακτηριστικά Δομικά χαρακτηριστικά της οικογένειας VEGF Η οικογένεια του VEGF αποτελείται από επτά μέλη: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F και PlGF (placenta growth factor). Όλα τα μέλη έχουν ένα κοινό VEGF πεδίο. Το πεδίο αυτό περιέχει δεσμούς κυστεΐνης, με έξι σταθερά υπολείμματα κυστεΐνης που δημιουργούν διακυτταρικούς και ενδοκυτταρικούς δισουλφιδικούς δεσμούς σε κάθε άκρο από κάθε μονομερές. Με τη σύνδεση δύο μονομερών σχηματίζεται διμερές με αντιπαράλληλο προσανατολισμό 106. Ο VEGF, ο οποίος αναφέρεται και ως VEGF-A, είναι ο κύριος ρυθμιστής της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης. Πρόκειται για μία ομοδιμερή γλυκοπρωτεΐνη η οποία συνδέεται με την ηπαρίνη μεγέθους 45 kda 107. Το ανθρώπινο γονίδιο του VEGF-A αποτελείται από οκτώ εξόνια (exons), τα οποία διαχωρίζονται από επτά ιντρόνια (introns) 108 και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6p Με την εναλλακτική συγκόλληση (splicing) των εξονίων δημιουργείται μια οικογένεια τεσσάρων διαφορετικών ισομορφών, τα οποία αποτελούνται από 121, 165, 189 και 206 αμινοξέα αντίστοιχα (VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206 ) 108. Αναφέρονται και άλλες, λιγότερο συνήθεις ισομορφές, ό- πως οι VEGF 145, VEGF 183, VEGF και VEGF 165b, με την τελευταία να έχει παραδόξως ανασταλτική επίδραση στην προκαλούμενη από τον VEGF μιτογένεση 111. Ο VEGF σχηματίζει ένα αντιπαράλληλο ομοδιμερές, ομοιοπολικά συνδεδεμένο με δύο δισουλφιδικές γέφυρες μεταξύ των κυστεϊνών Cys- 51 και Cys Αν και το μονομερές του VEGF μοιάζει με αυτό του PDGF, το αμινοτελικό του τμήμα διαφέρει επειδή είναι ελικοειδές

50 Ο VEGF 121 είναι πολυπεπτίδο με ιδιότητες οξέος με αποτέλεσμα να μη μπορεί να συνδεθεί με την ηπαρίνη, ενώ οι VEGF 189 και VEGF 206 που είναι ισχυρά βασικοί, συνδέονται με την ηπαρίνη με υψηλή συγγένεια 113. Επίσης, ο VEGF 121 διαχέεται ελεύθερα, σε αντίθεση με τους VEGF 189 και VEGF 206, οι οποίοι σε ένα μεγάλο ποσοστό τους παραμένουν συνδεδεμένοι στην κυτταρική επιφάνεια και την εξωκυττάρια ουσία. Ο VEGF 165 παρουσιάζει ενδιάμεσες ιδιότητες μιας και ανευρίσκεται τόσο να εκκρίνεται, όσο και να είναι συνδεδεμένος με την κυτταρική ε- πιφάνεια και την εξωκυττάρια ουσία. Οι ισομορφές που συνδέονται με την εξωκυττάρια ουσία απελευθερώνονται από την ηπαρίνη ή την ηπαρινάση ή μέσω κατάτμησής της από την πλασμίνη στο καρβοξυτελικό της άκρο, δημιουργώντας ένα βιοενεργό κλάσμα που αποτελείται από τα πρώτα 110 αμινοτελικά αμινοξέα 113. Εξ αιτίας της σημασίας της ενεργοποίησης του πλασμινογόνου στην αγγειογένεση, αυτός ο πρωτεολυτικός μηχανισμός παίζει σοβαρό ρόλο στην τοπική ρύθμιση της δραστηριότητας και βιοδιαθεσιμότητας του VEGF 114. Όλες οι ισομορφές εκτός από τον VEGF 121 μπορούν να κατατμηθούν από την πλασμίνη με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός μικρότερου VEGF O VEGF 110 διεγείρει την ενδοθηλιακή ανάπτυξη, προάγει την αγγειακή διαπερατότητα 113, αλλά παρουσιάζει μικρότερη μιτωτική δραστηριότητα από αυτή του VEGF Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η πιο ευρέως εκφραζόμενη ισομορφή του VEGF-A είναι ο VEGF 165, ο οποίος έχει και σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση Υποδοχείς του VEGF Τρεις υποδοχείς κινάσης της τυροσίνης στους οποίους συνδέεται ο VEGF έχουν αναγνωριστεί: ο VEGFR-1 (Flt-1), ο VEGFR-2 (KDR ή Flk-1) και ο VEGFR-3 (Flt-4). Κάθε υποδοχέας αποτελείται από επτά πεδία ομοιάζοντα με την ανοσοσφαιρίνη που βρίσκονται εξωκυττάρια, ένα διαμεμβρανικό πεδίο και μία κοινή αλληλουχία κινάσης της τυροσίνης η οποία διακόπτεται από το πεδίο εισόδου της κινάσης VEGFR-2 Ο πιο σημαντικός υποδοχέας του VEGF είναι ο VEGFR-2, όσον αφορά την προκαλούμενη από τον VEGF μιτογένεση και διαπερατότητα. Παρουσιάζει χαμηλότερη συγγένεια για τον VEGF-Α σε σχέση με τον VEGFR Ο VEGFR-2 επίσης συνδέεται και με τους VEGF-C, VEGF-D, και VEGF-E. Κατά την αγγειογένεση, η ενεργοποίηση του υ- ποδοχέα αυτού προάγει την παραγωγή του παράγοντα ενεργοποίησης 50

51 των αιμοπεταλίων (Platelet Activating Factor - PAF) από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, διεγείρει τη μίτωση και τη μετανάστευσή τους και αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα 118,120,121. Ο PAF παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση καθώς εμπλέκεται στη μετακίνηση και προσκόλληση των κυττάρων της φλεγμονής, στην έκφραση ισχυρών αγγειογενετικών παραγόντων όπως ο bfgf, και στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων 121, VEGFR-1 Ο ρόλος του VEGFR-1 δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Μετά από τη διέγερσή του από τον VEGF, ο VEGFR-1 παρουσιάζει αρκετά πιο α- δύναμη δράση κινάσης και αδυνατεί να προκαλέσει μίτωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, παρά το γεγονός ότι έχει μεγαλύτερη συγγένεια προς τον VEGF-Α 119. Φαίνεται ότι έχει ρόλο στη διαίρεση των ενδοθηλιακών κυττάρων στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης των αγγείων πριν από το σχηματισμό του πρωτογενούς αγγειακού δικτύου. Παράλληλα, ο VEGFR-1 παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση. Η σύνδεσή του με τον VEGF 165 προκαλεί χημειοταξία στα πολυμορφοπύρηνα καθώς και μετανάστευση των μονοπύρηνων φαγοκυττάρων κατά μήκος της μονής στιβάδας των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποίησή τους 123. Ο VEGFR-1 συνδέεται και με τον VEGF-Β, αλλά παράγεται ασθενές μιτογόνο σήμα αφού ο VEGF-Β είναι ένας ανεπαρκής μιτογόνος παράγοντας για τα ενδοθηλιακά κύτταρα 118, VEGFR-3 Ο VEGFR-3 ανευρίσκεται αποκλειστικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων, με αποτέλεσμα η ενεργοποίησή του να προκαλεί μίτωση, διαφοροποίηση και επιβίωση των κυττάρων αυτών 120. Η δομική διαφορά του από τους άλλους δύο υποδοχείς του VEGF είναι ότι υφίσταται πρωτεολυτική αποκοπή του εξωκυττάριου πεδίου του σε δύο πολυπεπτίδια τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς 118. Ο VEGFR-3 συνδέεται μόνο με τους VEGF-C και VEGF-D Νευροπιλίνη-1 Η νευροπιλίνη-1 είναι ένας τύπου Ι διαμεμβρανικός υποδοχέας ο οποίος δε δρα ανεξάρτητα, αλλά ως συνυποδοχέας. Περιέχει πέντε διακριτά εξωκυττάρια πεδία που της δίνουν τη δυνατότητα να συνδέεται με 51

52 πολλαπλούς συνδέτες 125. Συνδέεται με τον VEGF-Α 165 και όταν συνεκφράζεται με τον VEGFR-2, ενισχύει τη σύνδεση του VEGF-Α 165 με τον VEGFR-2 στο διπλάσιο έως τετραπλάσιο και τη χημειοταξία των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά 2,5 φορές. Επίσης συνδέεται με τον VEGF-Β 167 και αμφότεροι συνεκφράζονται κυρίως στα λεία μυϊκά κύτταρα που περιβάλλουν μεγάλα αγγεία O ρόλος του VEGF κατά την αγγειογένεση της επούλωσης Αμέσως μετά τον τραυματισμό των ιστών, η αιμορραγία σταματά με την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και τη δημιουργία θρόμβου, ο οποίος αποτελείται από αιμοπετάλια που συγκρατούνται από ένα πλέγμα ινικής, ινονεκτίνη, βιτρονεκτίνη και θρομβοσπονδίνη. Τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια απελευθερώνουν διάφορες κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων και ο VEGF-Α. Ο VEGF-Α προσελκύει κυκλοφορούντα ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα. Αυτή η χημειοτακτική απάντηση μεσολαβείται από τον VEGFR-1, ο οποίος εκφράζεται στα κύτταρα της φλεγμονής 127. Τα προσελκυόμενα ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα, εκτός από τη φαγοκυττάρωση σωματιδίων και απελευθέρωση τοξικών μεταβολιτών και ενζύμων, παράγουν και μια σειρά από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, μεταξύ των οποίων και IL-1β και TNF-α. Οι προερχόμενες από τα λευκά αιμοσφαίρια κυτταροκίνες, μαζί με τον TGF-β που απελευθερώνεται από τα αιμοπετάλια και τους παράγοντες του πλάσματος, προάγουν την έκφραση του VEGF-A στα κερατινοκύτταρα των χειλέων του τραύματος. Επίσης ο VEGF-A εκφράζεται σε απάντηση στην παραγωγή του HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor -1, παράγοντας προαγώμενος από την υποξία) από τις υποξικές περιοχές του τραύματος 128. Κατά την επαναεπιθηλιοποίηση τα ενεργοποιημένα κύτταρα μεταναστεύουν μέσω του νεοσχηματισμένου θρόμβου. Η κίνηση αυτή είναι δυνατή μόνο αν η ινική του θρόμβου έχει διαλυθεί. Το πιο σημαντικό ι- νωδολυτικό ένζυμο είναι η πλασμίνη, που προέρχεται από το πλασμινογόνο του θρόμβου που ενεργοποιείται είτε από το tpa (tissue type Plasminigen Activator, ενεργοποιητής πλασμινογόνου των ιστών), είτε από τον upa (urokinase type Plasmοnigen Activator, ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης). Ο VEGF-A ρυθμίζει την παραγωγή των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου και του PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1, αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου-1) στα ενδοθηλιακά κύτταρα 128. Η ανάπτυξη νέων αγγείων και ινοβλαστών, μαζί με τη σύνθεση των συστατικών της θεμέλιας ουσίας (κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ), μεταβάλλουν το υπόστρωμα ινικής στον κυτταροβριθή και αγγειοβριθή κοκκιώδη ιστό του επουλωθέντος τραύματος. Για τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων απαιτείται η λύση της βασικής μεμ- 52

53 βράνης. Έτσι ο VEGF-A που παράγεται από κερατινοκύτταρα, μονοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, δρα με τρόπο παρακρινικό και αυτοκρινικό στα τριχοειδή της άκρης του τραύματος. Σε αυτά τα ενδοθηλιακά κύτταρα, αυξάνεται η παραγωγή των VEGFR-1 και VEGFR-2 και η ε- νεργοποίησή τους από τον VEGF-Α οδηγεί στην παραγωγή tpa, upa, πλασμίνης και κολλαγενασών που διαλύουν τα συστατικά της βασικής μεμβράνης 126. Ο VEGF-Α επίσης προάγει και την αύξηση της διαπερατότητας του ενδοθηλίου αποδιοργανώνοντας τις πρωτεΐνες συνδέσεως 129. Έτσι δημιουργούνται κενά ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και ελαττωμένη λειτουργία φραγμού με αποτέλεσμα την ενίσχυση της παροχής πρωτεϊνών και κυττάρων στο νεοσχηματισμένο κοκκιώδη ιστό. Η ενεργοποίηση του VEGFR-1 προάγει τη μετανάστευση, του VEGFR-2 προάγει τον πολλαπλασιασμό, ενώ ταυτόχρονα προκαλείται και αύξηση της σύνθεσης των ιντεγκρινών, οι οποίες εκφράζονται παροδικά στα άκρα των τριχοειδών και βοηθούν στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα συναθροίζονται σε συμπαγείς χορδές, οι οποίες μετέπειτα αποκτούν αυλό. Η δράση των VEGF-A 121, VEGF-A 165 στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα ενισχύει τη δημιουργία του αυλού και την σε μήκος αύξηση του αγγείου. Ο VEGF-A δρα και στα περικύτταρα με τρόπο αυτοκρινικό και παρακρινικό διεγείροντας τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευσή τους. Η επιστράτευση των περικυττάρων έπεται του σχηματισμού του ενδοθηλιακού πλέγματος. Το χρονικό διάστημα στο οποίο τα αγγεία διατηρούνται χωρίς περικυτταρική κάλυψη, δίνει τη δυνατότητα στα αγγεία να αναδιαμορφωθούν και να προσαρμοστούν στις φυσιολογικές ανάγκες του ιστού στον οποίο βρίσκονται 130,131. Ο κοκκιώδης ιστός τελικά αναδιαμορφώνεται και το αποτέλεσμα είναι ουλώδης ιστός που αποτελείται κυρίως από πυκνό κολλαγόνο τύπου Ι, με αραιούς ινοβλάστες και αγγεία. 4.2 Παράγοντας ανάπτυξης των ινοβλαστών (FGF) Η οικογένεια του παράγοντα ανάπτυξης των ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factor FGF) αποτελείται από είκοσι μέλη. Πρόκειται για πολυπεπτίδια μικρού μεγέθους τα οποία έχουν έναν κεντρικό πυρήνα με 140 αμινοξέα, εμφανίζουν παρόμοια δομή και παρουσιάζουν διακριτές λειτουργίες 87. Τα δύο πρώτα μέλη της οικογένειας, ο FGF-1 (afgf ή όξινος FGF) και κυρίως ο FGF-2 (bfgf ή βασικός FGF) φαίνεται να εμπλέκονται στην αγγειογένεση 85. Πρόκειται για γλυκοσυλιωμένα πολυπεπτίδια μονής αλύσου με μέγεθος περίπου 18 kda, τα οποία παρουσιάζουν κατά 55% ομοιότητα αλληλουχίας και ασκούν παρόμοιες βιολογικές δράσεις 132. Κύριο χαρακτηριστικό των μορίων αυτών είναι ότι αλληλεπι- 53

54 δρούν με τα ομοιάζοντα την ηπαρίνη μόρια και τις πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης της εξωκυττάριας ουσίας Ο ρόλος του bfgf στην αγγειογένεση και την επούλωση Οι FGF-1 και FGF-2 συντίθενται από διάφορους τύπους κυττάρων τα οποία συμμετέχουν στην αγγειογένεση και την επούλωση των ιστών, όπως φλεγμονώδη κύτταρα, αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες του δέρματος και μπορούν να απελευθερωθούν και από ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από μηχανικό τραυματισμό 134,135,136,137. Η δράση τους α- σκείται με τρόπο είτε παρακρινικό, όταν απελευθερώνονται από την εξωκυττάρια ουσία, είτε αυτοκρινικό, όταν απελευθερώνονται από τα ίδια τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Παρουσιάζουν ισχυρή μιτογόνο δραστηριότητα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και προάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους 135,138. Προάγουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω της θετικής ρύθμισης του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-type plasminogen activator - upa), ο οποίος οδηγεί στη δημιουργία θρόμβου και εναπόθεση ινικής, διευκολύνοντας έτσι τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω του θρόμβου 139. Κατά το σχηματισμό του κοκκιώδους ιστού στη διαδικασία της ε- πούλωσης, ο bfgf βοηθά τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων προάγοντας την ιντεγκρίνη αvβ3 της κυτταρικής τους επιφάνειας, η ο- ποία μεσολαβεί στη σύνδεση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία 140. Η έκφραση της ιντεγκρίνης αvβ3 βοηθά την ενδοθηλιακή μετανάστευση και με την προσέλκυση της MMP-2 στην κυτταρική επιφάνεια, η οποία με τη σειρά της διευκολύνει την αποδόμηση του κολλαγόνου 141. Επειδή έχει αποδειχθεί ότι ο FGF σε ένα μεγάλο ποσοστό βρίσκεται ενδοκυττάρια ή συνδεδεμένος με μόρια της εξωκυττάριας ουσίας 142, η απελευθέρωσή του προϋποθέτει είτε κυτταρικό θάνατο, είτε λύση της εξωκυττάριας ουσίας, γεγονότα τα οποία αμφότερα συμβαίνουν κατά την αγγειογένεση της επούλωσης μετά από ιστικό τραυματισμό. Οι υποδοχείς του FGF που έχουν ανακαλυφθεί έως σήμερα είναι τέσσερις οι FGFR-1, -2, -3, και Ο FGFR-1 είναι ο κύριος υποδοχέας του FGF που εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα με ρόλο τη ρύθμιση του ενδοθηλιακού πολλαπλασιασμού, την έκκριση του upa, τη μετανάστευση και τη δημιουργία των τριχοειδών 138,

55 4.3 Προερχόμενος από τα αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας PDGF Ο προερχόμενος από τα αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας (Platelet-derived growth factor - PDGF) είναι ένας σημαντικός μιτογόνος παράγοντας κυρίως για τα κύτταρα του συνδετικού ιστού. Αρχικά οι ισομορφές του PDGF είχαν απομονωθεί από τα αιμοπετάλια. Στη συνέχεια όμως βρέθηκε ότι ο PDGF παράγεται και από άλλους τύπους κυττάρων, όπως ινοβλάστες, κερατινοκύτταρα, μυοβλάστες, επιθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα 145. Οι ισομορφές του PDGF αποτελούν ομοδιμερή και ετεροδιμερή των Α- και Β- πολυπεπτιδικών αλύσεων και ομοδιμερή των προσφάτως ανακαλυφθεισών C- και D- αλύσεων 146,147. Με αυτόν τον τρόπο προκύπτουν πέντε ισομορφές από τις οποίες τέσσερις είναι ομοδιμερή (ΑΑ, ΒΒ, CC και DD) και ένα ετεροδιμερές (AB). Οι δύο υποομάδες του κάθε διμερούς διατάσσονται με αντιπαράλληλη κατεύθυνση και συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Οι ισομορφές του PDGF ασκούν τις κυτταρικές τους δράσεις μέσω της σύνδεσής τους με τους δομικά παρόμοιους α- και β- υποδοχείς κινάσης τυροσίνης. Η σύνδεση προκαλεί διμερισμό του υποδοχέα. Ανάλογα με τον τύπο του υποδοχέα με τον οποίο εκφράζεται το κύτταρο-στόχος, τα διαφορετικά ισομερή του PDGF δημιουργούν και διαφορετικά συμπλέγματα. Οι PDGF με -Α, -Β και -C αλύσους συνδέονται με τον α- υποδοχέα, ενώ οι PDGF με -Β και -D αλύσους με τον β-υποδοχέα. Έτσι οι PDGF-ΑΑ, -ΑΒ, -ΒΒ και -CC δημιουργούν αα ομοδιμερή υποδοχέα, οι PDGF-ΑΒ και ΒΒ δημιουργούν αβ υποδοχέα και οι PDGF-BB και - DD ββ υποδοχέα 145,146,147. Ο διμερισμός που προκαλεί η σύνδεση με τον υποδοχέα οδηγεί σε φωσφορυλίωσή του 148. Μόρια μετάδοσης σήματος συνδέονται με τους υποδοχείς, ενεργοποιούνται είτε με φωσφορυλίωση, είτε με αλλαγή στη διαμόρφωση του μορίου τους που προκαλείται από τη σύνδεση με τον υποδοχέα, με αποτέλεσμα την εκκίνηση μιας οδού μετάδοσης σήματος O ρόλος του PDGF στην επούλωση Ο PDGF δρα σε διάφορους τύπους κυττάρων που εμπλέκονται στην επούλωση. Ασκεί δράση μιτογόνο και χημειοτακτική στους ινοβλάστες και στα λεία μυϊκά κύτταρα και χημειοτακτική δράση στα ουδετερόφιλα και στα μακροφάγα 150. Επίσης διεγείρει τα μακροφάγα να παράγουν άλλους αυξητικούς παράγοντες σημαντικούς σε διάφορες φάσεις της επουλωτικής διαδικασίας. Έχει αποδειχθεί ότι ο PDGF διεγείρει και 55

56 την παραγωγή διάφορων μορίων της εξωκυττάριας ουσίας όπως ινονεκτίνη, κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες και υαλουρονικό οξύ 151,152,153,154. Επιπρόσθετα, ο PDGF προάγει την παραγωγή και έκκριση κολλαγενάσης από τους ινοβλάστες, παίζοντας ρόλο και στη φάση αναδιαμόρφωσης της επούλωσης 155. Ο PDGF απελευθερώνεται από αιμοπετάλια και εκκρίνεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα των κατεστραμμένων αρτηριών, ενεργοποιημένους ινοβλάστες και επιδερμικά κερατινοκύτταρα 145. Διάφορες μελέτες απέδειξαν την παρουσία του PDGF στο τραύμα 156,157. Με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικών για τις ισομορφές του PDGF αποδείχθηκε η παρουσία του PDGF-ΑΑ σε τριχοειδή και ινοβλάστες προσφάτων τραυμάτων καθώς και σε χρόνια τραύματα. Αντίθετα, ο PDGF απουσίαζε από το φυσιολογικό δέρμα και τα μη επουλωμένα δερματικά έλκη 158. Ο ρόλος του PDGF στην επούλωση αποδεικνύεται και από την έκφραση των υποδοχέων του στο σημείο της επούλωσης. Ενώ οι ινοβλάστες και τα λεία μυϊκά κύτταρα φυσιολογικών ιστών περιέχουν χαμηλές συγκεντρώσεις υποδοχέων PDGF, σε περιπτώσεις φλεγμονής και τραύματος του δέρματος η συγκέντρωση του β-υποδοχέα έχει βρεθεί αυξημένη 159, Ο ρόλος του PDGF στην αγγειογένεση Η έκκριση του PDGF-ΒΒ σε ιστούς των οποίων τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς του PDGF έχει ως αποτέλεσμα τη διέγερση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη δημιουργία οργανωμένων αγγειακών δομών 161,162. Ταυτόχρονα, ο PDGF προάγει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών ινών των αγγείων και των περικυττάρων και την οργάνωσή τους κατά τη διαδικασία δημιουργίας του νεοσχηματισμένου αγγείου Μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β (TGF-β) Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β (Transforming growth factor- β TGF-β) είναι ένας από τους πιο σημαντικούς μεσολαβητές της επούλωσης των ιστών εξ αιτίας των ισχυρών πολυδύναμων επιδρασεών του 87. Ο πολυπεπτιδικός αυτός παράγοντας έχει αναδειχθεί ως ένας από τους κύριους ρυθμιστές της αγγειογένεσης κατά την επούλωση των ιστών με δράσεις στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση, το σχηματισμό τριχοειδών και την εναπόθεση της εξωκυττάριας ουσίας

57 Τρεις ισομορφές του TGF-β έχουν ανακαλυφθεί (TGF-β1, -β2 και -β3), οι οποίες παρουσιάζουν υψηλή ομολογία ως προς την αλληλουχία των αμινοξέων τους. Οι τρεις ισομορφές του TGF-β συνδέονται με τους ίδιους υποδοχείς, προκαλώντας παρόμοιες δράσεις. Η έκφρασή τους ό- μως ρυθμίζεται διαφορετικά ανάλογα με το είδος των κυττάρων στα ο- ποία δρουν 163. Η δράση του TGF-β ασκείται στα κύτταρα μέσω της σύνδεσής του με ειδικούς υποδοχείς σερινικής/θρεονικής κινάσης, τύπου Ι (TGF-βRI) και τύπου ΙΙ (TGF-βRIΙ) 164,165. Στα θηλαστικά, 7 τύπου Ι υποδοχείς (οι οποίοι ονομάζονται και ALK actin receptor-like kinase)από 1 έως 7 και 5 τύπου ΙΙ υποδοχείς έχουν αναγνωριστεί. Αμφότεροι οι υποδοχείς εμπλέκονται στη μετάδοση του σήματος του TGF-β δουλεύοντας συνεργικά. Αφού ο TGF-β συνδεθεί με τον υποδοχέα TGF-βRIΙ δημιουργεί σύμπλεγμα το οποίο στη συνέχεια ενεργοποιεί και τον υποδοχέα TGF-βRI. Ο ενεργοποιημένος TGF-βRI φωσφορυλιώνει κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες οι οποίες μεταδίδουν το σήμα στον πυρήνα του κυττάρου 166. Τα μόρια που παίζουν καθοριστικό ρόλο στην επαγωγή του σήματος από τους υποδοχείς στον πυρήνα του κυττάρου ονομάζονται Smads. Μετά από την ενεργοποίηση του συμπλέγματος των υποδοχέων, τα Smads των υποδοχέων (R-Smads) παρουσιάζονται στον τύπου Ι υποδοχέα και φωσφορυλιώνονται. Στη συνέχεια το πιο κοινό Smad, το Smad4, σχηματίζει ετεροδιμερές σύμπλεγμα με το R-Smad. Το σύμπλεγμα αυτό μετατοπίζεται στον πυρήνα του κυττάρου και ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων 167. Στα περισσότερα κύτταρα, ο TGF-β επάγει το σήμα μέσω του συστήματος TGF-βRI (ALK5) και TGF-βRIΙ. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα όμως, έχει αποδειχθεί ότι ο TGF-β συνδέεται και μεταδίδει το σήμα μέσω των ALK5 και ALK Ένας τρίτος τύπος υποδοχέων του TGF-β είναι οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με βραχύ ενδοκυτταρικό πεδίο, ενδογλίνη και βηταγλυκάνη. Η βηταγλυκάνη παρουσιάζει τον TGF-β στους υποδοχείς TGF-βR και με αυτόν τον τρόπο διευκολύνει την επαγωγή του σήματος. Η ενδογλίνη όμως είναι ο υποδοχέας που παίζει ρόλο στα ενδοθηλιακά κύτταρα που συμμετέχουν ενεργά στην αγγειογένεση. Πρόκειται για μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, το εξωκυττάριο τμήμα της οποίας έχει υψηλή συγγένεια με τον TFG-β1 και TFG-β3 169,170. Η σχέση της ενδογλίνης με την αγγειογένεση αποδείχθηκε σε πειράματα στα οποία πειραματόζωα που στερούνταν του γονιδίου CD105/ενδογλίνης απεβίωσαν ενδομητρίως λόγω ανωμαλιών στην αιμάτωση του λεκιθικού σάκου και του αιμοποιητικού συστήματος 168. Παρ όλα αυτά, ο μηχανισμός με τον οποίο η ενδογλίνη ρυθμίζει την επαγωγή του σήματος δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. 57

58 4.4.1 Ο ρόλος του TGF-β στην αγγειογένεση Ο TGF-β προάγει την αγγειογένεση μέσω της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων, της διαφοροποίησης και της δημιουργίας σωληνοειδών σχηματισμών 171, καθώς και της εναπόθεσης της εξωκυττάριας ουσίας και της θετικής ρύθμισης των υποδοχέων της ιντεγρίνης 172. Πειραματικά μοντέλα επούλωσης in vivo κατέδειξαν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ αυξημένης έκφρασης των τριών TGF-β και των υποδοχέων τους στον κοκκιώδη ιστό 173. Επίσης πειράματα σε επίμυες που στερούνταν του TGF-βRI έδειξαν ενισχυμένο πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, ελαττωμένη σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας και επιβεβαίωσαν περαιτέρω τη σημασία των υποδοχέων του TGF-β στην αγγειογένεση 174. Η σύγχυση που υπάρχει αναφορικά με την επίδραση του TGF-β στην αγγειογένεση σχετίζεται μερικώς με το είδος του μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε. Έτσι ο TGF-β προάγει την αγγειογένεση in vivo αλλά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro 175,176. Η θετική επίδραση του TGF-β στην αγγειογένεση είναι έμμεση και οφείλεται εν μέρει στην επιστράτευση των φλεγμονωδών κυττάρων τα οποία απελευθερώνουν δευτερογενώς αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως VEGF, FGF και PDGF 177. Το γεγονός αυτό εξηγεί την ασυμφωνία μεταξύ της επίδρασης του TGF-β in vivo και in vitro. Τελικώς, διάφορα πειραματικά μοντέλα απέδειξαν ότι η μετάδοση του σήματος μέσω του TGF-β είναι καθοριστική για την αγγειογένεση. Οι οδοί μετάδοσης σήματος στα ενδοθηλιακά κύτταρα στις οποίες ε- μπλέκονται ο TGF-β και οι υποδοχείς του είναι καίριες για αρκετά βήματα της αγγειογενετικής διαδικασίας, μεταξύ των οποίων και η διατήρηση της ακεραιότητας του αγγείου, η επιστράτευση των λείων μυϊκών κυττάρων, η εναπόθεση της εξωκυττάριας ουσίας και η διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε πιο εξειδικευμένο ενδοθήλιο όπως αυτό των αρτηριών και των φλεβών Αγγειοποιητίνες Οι αγγειοποιητίνες (Angiopoietins Ang), όπως και ο VEGF, αποτελούν αυξητικούς παράγοντες με ειδική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το σύστημα των αγγειοποιητινών αποτελείται από τέσσερις αγγειοποιητίνες που έχουν έως τώρα αναγνωριστεί, τις Ang-1, -2, -3 και -4, καθώς και από τους δύο υποδοχείς τους, τους Tie-1 και -2 (tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal factor domain) 87. Και οι τέσσερις αγγειοποιητίνες συνδέονται με τον Tie-2 ο οποίος εκφράζεται είδικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα 178,179. Παρά το γεγονός ότι ο Tie-1 (ή αλλιώς Tie υποδοχέας), έχει στενή σχέση με τον Tie-2 και εκφράζεται όπως και ο 58

59 Tie-2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα, δεν έχει ακόμα ανευρεθεί για αυτόν κάποιος συνδέτης 87. Οι Ang-1 και Ang-2 είναι οι πιο καλά μελετημένες αγγειοποιητίνες. Αμφότερες συνδέονται με τον Tie-2, με τη διαφορά ότι μόνο η Ang-1 μπορεί να φωσφορυλιώσει τον υποδοχέα στα ενδοθηλιακά κύτταρα, χωρίς όμως αυτό να συμβαίνει και στα κύτταρα άλλων ιστών όπου ανταγωνίζεται την Ang Η Ang-2 φαίνεται ότι αποτελεί το φυσικό ανταγωνιστή της Ang-1, εμποδίζοντας την ενεργοποίηση του Tie-2 από την Ang Ο ρόλος των αγγειοποιητινών στην αγγειογένεση Ang-1 Η Ang-1 μαζί με τον VEGF παίζουν σημαντικό και συνεργιστικό ρόλο κατά τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Η Ang-1 εμπλέκεται στη δημιουργία των φυσιολογικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και των περικυττάρων και κατ αυτόν τον τρόπο στη διατήρηση της σταθερότητας των αγγείων 182. Παράλληλα, η Ang-1 προστατεύει τα ενδοθηλιακά κύτταρα από την απόπτωση και διευκολύνει την επιβίωσή τους 183. Έχει αποδειχθεί σε in vivo μελέτες ότι η Ang-1 προάγει τη μετανάστευση και την εκβλάστηση των ενδοθηλιακών κυττάρων που οδηγεί στη δημιουργία σωληνοειδών σχηματισμών 184. Ενώ ο VEGF οδηγεί στο σχηματισμό ανώριμων αγγείων που παρουσιάζουν διαφυγή και αυξημένη διαπερατότητα, η Ang-1 οδηγεί στο σχηματισμό ώριμων και χωρίς διαφυγή αγγείων 185,186. Όταν η Ang-1 υπερεκφράζεται μαζί με τον VEGF, υπερνικά την αγγειακή διαφυγή που προκαλείται από τον VEGF Ang-2 Η Ang-2 φαίνεται ότι εμπλέκεται στη χαλάρωση των μεσοκυττάριων συνδέσεων μεταξύ των περικυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων διευκολύνοντας με αυτόν τον τρόπο την έναρξη της αγγειογένεσης. Η ανασταλτική δράση της Ang-2 στη σύνδεση της Ang-1 με τον υποδοχέα Tie-2 παίζει ρυθμιστικό ρόλο στην αγγειογένεση σε συνάρτηση με την παρουσία ή όχι του VEGF. Σε παρουσία του VEGF οδηγεί σε χαλάρωση των μεσοκυττάριων συνδέσεων και προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενώ σε απουσία του VEGF προάγει την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων

60 4.5.2 Ο ρόλος των αγγειοποιητινών στην επούλωση Κατά την επούλωση των ιστών, η έκφραση του υποδοχέα Tie-2 βρέθηκε αυξημένη ανάμεσα στα νεοσχηματισμένα αγγεία του κοκκιώδους ιστού 187. Ενώ η Ang-1 εκφράζεται συστηματικά στους ενήλικες, η Ang-2, η οποία ανταγωνίζεται τη δράση της Ang-1, βρίσκεται αυξημένη στα σημεία ενεργής αγγειογένεσης 181, συμπεραίνοντας ότι η Ang-2 παίζει ρόλο στην αποσταθεροποίηση των υπαρχόντων αγγείων και τα οδηγεί σε μία πιο ευμετάβλητη κατάσταση. Πειραματικές μελέτες διαταραγμένης επούλωσης ιστών λόγω σακχαρώδους διαβήτη, ανέδειξαν παρατεταμένη αύξηση της έκφρασης της Ang-2 σε συνδυασμό με μειωμένη έκφραση του υποδοχέα Tie

61 5 ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ Mεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (matrix metalloproteinases-mmps) ονομάζονται τα μέλη της πολυμελούς οικογένειας ενδοπεπτιδασών, με κοινή δράση την αποδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Αποτελούν ρυθμιστές της κυτταρικής ανάπτυξης, μετανάστευσης και αναδιαμόρφωσης της εξωκυττάριας ουσίας. Παράγονται από μία ποικιλία κυττάρων, όπως επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και φλεγμονώδη κύτταρα 189. Τα ένζυμα αυτά παίζουν καθοριστικό ρόλο σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών διαδικασιών, όπως η αναδιαμόρφωση και η επούλωση των ιστών, απόπτωση και εμβρυογένεση. Η δράση τους είναι το τελικό αποτέλεσμα της ισορροπίας των μεταλλοπρωτεϊνασών με τους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue inhibitors of metalloproteinases-timps). Η ανεπάρκεια ή απώλεια της φυσιολογικής ρύθμισης των μεταλλοπρωτεϊνασών από τους αναστολείς τους συνδέεται με μια σειρά παθολογικών καταστάσεων όπως αθηροσκλήρυνση, αρθρίτιδα, νεοαγγειογένεση και μετάσταση νεοπλασματικών κυττάρων. 5.1 Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελείται από δύο τμήματα: α) τη βασική μεμβράνη η οποία είναι μία συμπυκνωμένη στιβάδα θεμέλιας ουσίας που επαλείφει τα επιθηλιακά κύτταρα, και β) τη διάμεση θεμέλια ουσία. Το κοινό χαρακτηριστικό και των δύο τμημάτων είναι το γεγονός ότι η βασική δομή τους και η τρισδιάστατη αρχιτεκτονική τους καθορίζεται από έναν σκελετό από μόρια κολλαγόνου. Συνδεδεμένες γλυκοπρωτεΐνες, όπως η λαμινίνη (laminin) και η τενασκίνη (tenascin) και οι πρωτεογλυκάνες προσφύονται στον σκελετό και αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα εντός ή πλησίον της θεμέλιας ουσίας. Οι αλληλεπιδράσεις με τα κύτταρα αυτά διεξάγονται μέσω υποδοχέων με κυριότερους τις ιντεγκρίνες. Η θεμέλια ουσία δεν είναι στατική αλλά αναδιαμορφώνεται συνεχώς μέσω της δράσης πρωτεϊνασών και πιο συγκεκριμένα της ομάδας των μεταλλοπρωτεϊνασών της θεμέλιας ουσίας 190. Τα κύρια συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας εκτός των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι τα εξής: Κολλαγόνο Πρόκειται για πρωτεΐνες πανταχού παρούσες οι οποίες δημιουργούν το σκελετό που είναι υπεύθυνος για τη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας των ιστών στα σπονδυλωτά και σε πολλούς άλλους οργανι- 61

62 σμούς 192. Περισσότερα από 20 διαφορετικά μόρια κολλαγόνου έχουν α- ναγνωριστεί. Σε ιστούς που χρειάζονται αντοχή σε πιεστικές, εκτατικές και διασχιστικές δυνάμεις, τα μόρια κολλαγόνου (τύποι I, II, III, V, και XI) οργανώνονται με τη μορφή τριπλής έλικας σε ινίδια. Άλλοι τύποι κολλαγόνου δημιουργούν δίκτυα, όπως αυτό της βασικής μεμβράνης που αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV. Υπάρχουν και τύποι κολλαγόνου που σχετίζονται με ινώδεις επιφάνειες (VI, IX, XII, XIV), αποτελούν διακυτταρικές πρωτεϊνες (XIII, XVIII) ή σχηματίζουν σφαιροειδείς δομές Λαμινίνες Μαζί με το κολλαγόνο τύπου IV, το νιδογόνο και την περλεκάνη αποτελεί ένα από τα δομικά συστατικά της βασικής μεμβράνης. Έχουν αναγνωριστεί 12 διαφορετικές ισομορφές λαμινινών με κοινά χαρακτηριστικά μεταξύ τους. Συντίθενται από μεγάλη ποικιλία κυττάρων όπως επιθηλιακά κύτταρα, λείες και καρδιακές μυϊκές ίνες, ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του μυελού των οστών. Η δράση τους, η οποία ασκείται μέσω της σύνδεσής τους με τις ιντεγκρίνες 193, είναι διαμεσολαβητική ανάμεσα στα κύτταρα και στην εξωκυττάρια ουσία και κυρίως τη βασική μεμβράνη 194. Εκτενείς μελέτες έδειξαν ότι η απορρύθμιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας συνοδεύεται από ανωμαλίες στη σύνθεση των λαμινινών Τενασκίνες Η οικογένεια των τενασκινών αποτελείται από 5 μέλη που έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μια ποικιλία πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας 196. Αναγνωρίζονται και αποδομούνται από πρωτεάσες της εξωκυττάριας ουσίας όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες. Παίζουν σημαντικό ρόλο στη μορφογένεση καθορίζοντας ποια κύτταρα θα προσκολληθούν στην εξωκυττάρια ουσία και όταν προσκολληθούν, συντονίζουν την κυτταρική διαφοροποίηση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και απόπτωση. Δεν εκφράζονται σε ώριμους ιστούς αλλά εμφανίζονται στην επούλωση και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις, όπως η αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη των όγκων

63 5.1.4 Ιντεγκρίνες Η οικογένεια των ιντεγκρινών αποτελείται από 24 μέλη τα οποία ανευρίσκονται σε όλα τα μέλη του ζωικού βασιλείου 197. Οι ιντεγκρίνες ανευρίσκονται τόσο στην εξωκυττάρια ουσία όσο και ενδοκυττάρια και αποτελούν μόρια προσκόλλησης (adhesion molecules) προσδίδοντας μηχανική συνέχεια μεταξύ του εξωτερικού και του εσωτερικού του κυττάρου. Η αλληλεπίδραση μεταξύ της ιντεγκρίνης και του συνδεόμενου μορίου πυροδοτεί ένα φάσμα επιδράσεων στο κύτταρο με συνέπειες στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη δομή και τη λειτουργική δράση του κυτταρικού σκελετού και τη γονιδιακή μεταγραφή Πρωτεογλυκάνες Οι πρωτεογλυκάνες, μαζί με τα υπόλοιπα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας, έχουν προέχοντα ρόλο στη ρύθμιση κυτταρικών λειτουργιών, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η κίνηση. Χωρίζονται σε οικογένειες, όλες όμως αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό πυρήνα ο οποίος εμπλουτίζεται από γλυκοσαμινογλυκάνες 198. Μια σημαντική οικογένεια πρωτεογλυκανών είναι οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, κάποιες από τις οποίες βρίσκονται στην εξωκυττάρια ουσία (συνδεκάνες, γλυπικάνες) και κάποιες είναι συνδεδεμένες με την κυτταρική μεμβράνη (περλεκάνη, αγκρίνη). Οι συνδεδεμένες με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκάνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση καθώς και στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. Παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια με ευρύ φάσμα κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων. Εμπλέκονται σε μια ποικιλία φυσιολογικών διαδικασιών, καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις όπως στην επούλωση των ιστών και στην ανάπτυξη των όγκων 199. Η εξωκυττάρια ουσία επίσης περιέχει μία κύρια γλυκοσαμινογλυκάνη, το υαλουρονικό οξύ, το οποίο δεν είναι συνδεδεμένο με πρωτεϊνικό πυρήνα πρωτεογλυκανών. Συντίθεται κυρίως από ινοβλάστες και από άλλα στρωματικά κύτταρα και εναποτίθεται στην εξωκυττάρια ουσία σχεδόν σε όλα τα όργανα. Το υαλουρονικό οξύ συμμετέχει στη ρύθμιση πολυάριθμων κυτταρικών λειτουργιών, μεταξύ των οποίων η κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση και επαγωγή σημάτων

64 5.2 Δομικά χαρακτηριστικά των μεταλλοπρωτεϊνασών Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες παράγονται με τη μορφή των προπροενζύμων. Εκκρίνονται από τα κύτταρα συνήθως με τη μορφή ανενεργών προενζύμων (εκτός από τις μεμβρανικές ΜΜPs). Το μόριο του προενζύμου είναι οργανωμένο σε 3 βασικά δομικά πεδία: το αμινοτελικό προπεπτίδιο, την καταλυτική περιοχή και την καρβοξυτελική περιοχή του μορίου (Εικόνα 4). Τα επιμέρους μορφολογικά τμήματα των MMPs είναι τα εξής: Προπεδίο (predomain ή signal peptide) με μήκος αμινοξέα που βρίσκεται πριν από την κυρίως πρωτεΐνη και σηματοδοτεί την έκκριση της πρωτεϊνάσης από το κύτταρο 201. Αμινοτελικό προπεπτίδιο ή πρόδρομο πεδίο (pro-domain) με μήκος αμινοξέα. Η περιοχή αυτή παίζει αυτοανασταλτικό ρόλο μέσω της σύνδεσής της με το άτομο ψευδαργύρου (Zn) της καταλυτικής περιοχής που είναι υπεύθυνο για τη δράση του ενζύμου 202. Όταν το συγκεκριμένο πεπτίδιο αποκοπεί, τότε το ένζυμο ενεργοποιείται 203. Μέσα στο πρόδρομο πεπτίδιο βρίσκεται μια κυστεΐνη (διακόπτης κυστεΐνης cystein switch) η οποία συνδέεται με το άτομο Zn της καταλυτικής περιοχής καθιστώντας το ένζυμο ανενεργό 203. Καταλυτικό πεδίο (catalytic domain) με μήκος περίπου 170 αμινοξέα, αποτελεί την καταλυτική περιοχή και περιέχει ένα άτομο Zn για την καταλυτική δράση και ένα άτομο Zn για τη διατήρηση μιας σταθερής και λειτουργικής διαμόρφωσης. Η θέση της καταλυτικής περιοχής διαφέρει ανάμεσα στις διάφορες MMPs γεγονός που εξηγεί και τις διαφορές στα υποστρώματα 203. Οι MMP-2 και MMP-9 έχουν στο καταλυτικό τους πεδίο τρεις αλληλουχίες με τις οποίες αλληλεπιδρούν με τα κολλαγόνα και τις ζελατίνες που ονομάζονται πεδία ινονεκτίνης τύπου II 208. Καρβοξυτελικό ή ομοιάζον την αιμοπηξίνη πεδίο (haemopexin-like domain) είναι η περιοχή στο C-άκρο με μήκος 210 αμινοξέα. Είναι απαραίτητο για τη σύνδεση με το υπόστρωμα, όπως π.χ. στις κολλαγενάσες για την κατάτμηση της τριπλής έλικας του κολλαγόνου 209 και για την αλληλεπίδραση με τους TIMPs 202. Διαμεμβρανικό πεδίο (transmembrane domain) το οποίο ανευρίσκεται στις μεμβρανικού τύπου MMPs και έχει σκοπό την αγκίστρωση της MMP στην κυτταρική μεμβράνη 203. Εκτός από τα κύρια αυτά πεδία που απαντούν στο σύνολο των MMPs, υπάρχουν και άλλα πεδία μοναδικά για τις αντίστοιχες MMPs που προσδίδουν και την ιδιαιτερότητα στη λειτουργία τους. 64

65 5.3 Ενεργοποίηση των MMPs Οι MMPs συντίθενται με τη μορφή προ-προενζύμων. Το προπεδίο (signal peptide) αφαιρείται κατά τη μετάφραση και δημιουργούνται τα προ-mmps. Η ενεργοποίηση αυτή αποτελεί σημαντικό ρυθμιστικό βήμα στη δράση των MMPs και μπορεί να λάβει χώρα εξωκυττάρια, ενδοκυττάρια ή στην κυτταρική επιφάνεια 210. Οι περισσότερες MMPs εκκρίνονται από το κύτταρο ως προ- MMPs. Η παρουσία περιοχής «δολώματος» ευαίσθητης στις πρωτεϊνάσες στο προπεπτίδιο επιτρέπει στις πρωτεϊνάσες του πλάσματος και των ι- στών ή σε ευκαιριακές πρωτεϊνάσες των βακτηριδίων να ενεργοποιήσουν τις προ- MMPs. Απόσχιση της περιοχής «δολώματος» αφαιρεί μέρος μόνο του προπεπτιδίου και η πλήρης αφαίρεσή του συνήθως καθοδηγείται από την ενδιάμεση MMP που δημιουργείται ή από άλλες ενεργές MMPs (κυρίως από τις MMPs μεμβρανικού τύπου). Ο μηχανισμός αυτός ονομάζεται σταδιακή ενεργοποίηση (stepwise activation) 211. Εικόνα 4. Σχηματική δομή μεταλλοπρωτεϊνασών S: προπεδίο Ι, ΙΙ: διαμεμβρανικό πεδίο Pro: πρόδρομο πεδίο Fn: πεδίο φιμπρονεκτίνης ΙΙ Cat: καταλυτικό πεδίο Zn: ενεργό σημείο ψευδαργύρου Hpx: ομοιάζον την αιμοπηξίνη πεδίο 65

66 Η ενεργοποίηση των MMPs μπορεί να πραγματοποιηθεί και ενδοκυττάρια. Με τον τρόπο αυτό ενεργοποιούνται κυρίως οι ΜΤ- MMPs και η MMP Οι MMPs αυτές διαθέτουν μία αλληλουχία αμινοξέων ανάμεσα στο προπεπτίδιο και στο αμινοτελικό άκρο του καταλυτικού πεδίου, η οποία αναγνωρίζεται από την οικογένεια των σερινοπρωτεϊνασών και επιτρέπει την ενεργοποίησή τους στη συσκευή Golgi 213. Έχοντας αποκτήσει την ενεργό τους μορφή, τα ένζυμα αυτά ανέρχονται στην κυτταρική επιφάνεια επιτρέποντας την ενεργοποίηση και άλλων MMPs. Η ενεργοποίηση των MMPs στην επιφάνεια του κυττάρου, σε συνδυασμό με την εξωκυττάρια ενεργοποίησή τους, έχει το πλεονέκτημα ότι μεγιστοποιεί την πρωτεολυτική δράση του κυττάρου στο άμεσο περιβάλλον του 203. H ενεργοποίηση πάνω στην κυτταρική επιφάνεια αφορά MMPs όπως η MMP-14 η οποία σε συνδυασμό με τον TIMP-2 ενεργοποιούν την προ- MMP-2, η MMP-3 ενεργοποιεί την προ-mmp-9 και το σύμπλεγμα προ- MMP-9/TIMP-1 σε συνδυασμό με την MMP-3 ενεργοποιεί την MMP Η ιδιότητα των MMPs να ενεργοποιούν άλλες MMPs αποτελεί κυρίως ιδιότητα των ζελατινασών και των κολλαγενασών. Οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις διάφορες MMPs για τη σύνθεση και την ενεργοποίησή τους είναι εξαιρετικά πολύπλοκες με απώτερο σκοπό τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των MMPs και των TIMPs και κατ επέκταση την ομοιόσταση των ιστών Ταξινόμηση Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜPs) αποτελούν οικογένεια δομικά παρόμοιων ενζύμων που ανήκουν στη μεγάλη ομάδα των ψευδαργυροεξαρτώμενων μεταλλοπεπτιδασών, οι οποίες ονομάζονται και μετζινκίνες (metzincins) 191. Τα υπόλοιπα τρία μέλη της υπεροικογένειας αυτής είναι οι σερραλυσίνες (serralysins), οι αστακίνες (astacins) και οι ανταμαλυσίνες (adamalysins/adams). Η οικογένεια των MMPs περιλαμβάνει στον άνθρωπο 26 μέλη τα οποία μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τα κοινά τους χαρακτηριστικά και το υπόστρωμά τους. Η ταξινόμηση αυτή δε σημαίνει ότι κάθε κατηγορία δρα αποκλειστικά σε ένα συγκεκριμένο μόνο υπόστρωμα, αλλά παρατηρείται αλληλοεπικάλυψη στη δράση των διαφόρων MMPs στα διάφορα υποστρώματα. Οι MMPs χωρίζονται σε έξι κύριες ομάδες: i. Οι κολλαγενάσες (MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18). Αποδομούν την έλικα των κολλαγόνων Ι, ΙΙ και ΙΙΙ στα χαρακτηριστικά τμήματα των ¾ και ¼ αλλά αποδομούν και αλλά μόρια της εξωκυττάριας ουσίας καθώς και διαλυτές πρωτεΐνες 217. Θεωρούνται οι ισχυ- 66

67 ρότερες MMPs και η δράση τους έχει στόχο κολλαγόνα περισσότερο ανθεκτικά στην πρωτεόλυση, με αποτέλεσμα να καθίστανται αυτά δεκτικά στην αποδόμηση από τις υπόλοιπες MMPs 218. ii. Οι ζελατινάσες (MMP-2 και MMP-9) διασπούν μετουσιωμένα κολλαγόνα (ζελατίνες), ανέπαφο κολλαγόνο τύπου IV της βασικής μεμβράνης, καθώς και μη-μετουσιωμένα κολλαγόνα τύπου V, VII, X, XIV, φιμπρονεκτίνη, αγκρεκάνη και ελαστάση 219. iii. Οι στρωμαλυσίνες (MMP-3, MMP-10, MMP-11) αποδομούν όλες τις μη-κολλαγόνες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, όπως οι πρωτεογλυκάνες, γλυκοπρωτεΐνες, φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη. Το κολλαγόνο τύπου IV αποδομείται από τις στρωμαλυσίνες μόνο όταν αυτές έ- χουν σφαιρική και όχι ελικοειδή διαμόρφωση 191. iv. Οι ματριλυσίνες (MMP-7, MMP-26) χαρακτηρίζονται από τη απουσία του ομοιάζοντος με την αιμοπηξίνη πεδίου 209. Η MMP-7 συντίθεται από τα επιθηλιακά κύτταρα και εκτός από συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας αποδομεί και άλλα μόρια της κυτταρικής επιφάνειας. Η MMP-26 έχει το χαρακτηριστικό ότι σε μεγάλο βαθμό αποθηκεύεται ενδοκυττάρια 220. v. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μεμβρανικού τύπου (membrane type MMPs, ΜΤ- MMPs) περιλαμβάνουν τέσσερις τύπου Ι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-24) και δύο ΜΤ-MMPs συνδεδεμένες με γλυκοφωσφατιδυλινοσιτόλη (MMP-17, MMP-25). Με εξαίρεση την MMP-17 όλες είναι ικανές να ενεργοποιήσουν την προmmp-2 221, ενώ η MMP-14 έχει κολλαγονολυτική δράση στα κολλαγόνα τύπου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ 222. vi. Οι υπόλοιπες MMPs δεν περιλαμβάνονται στις άνωθεν κατηγορίες. Η MMP-12 ή μεταλλοελαστάση, αποδομεί την ελαστίνη, εκφράζεται κυρίως στα μακροφάγα και είναι σημαντική για τη μετανάστευσή τους 223. Η MMP-19 αποδομεί πολλά μόρια της εξωκυττάριας ουσίας και συστατικά της βασικής μεμβράνης 223. H MMP-20 ή εναμελυσίνη εκφράζεται στη νεοσχηματισμένη αδαμαντίνη των οδόντων και αποδομεί την αμελογενίνη 225. Η MMP-21 εκφράζεται σε ποικίλους εμβρυϊκούς και ενήλικες ιστούς και σε βασικοκυτταρικά καρκινώματα και καρκινώματα εκ πλακωδών κυττάρων 226. Η MMP-23 έχει την ιδιαιτερότητα ότι αντί του πεδίου ομοιάζοντος στην αιμοπηξίνη, διαθέτει πεδία που μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνες πλούσια σε κυστεΐνη στο καρβοξυτελικό της άκρο 201. Η MMP-28 ή επιλυσίνη, εκφράζεται κυρίως στα κερατινοκύτταρα και θεωρείται ότι συμβάλλει στην επούλωση των ιστών

68 5.5 Ο ρόλος των MMPs σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις Οι MMPs παίζουν καθοριστικό ρόλο στη συμπεριφορά των κυττάρων σε πολλές φυσιολογικές διεργασίες, όπως η φλεγμονή, η επούλωση των ιστών, η αγγειογένεση και η αύξηση του μεγέθους των όγκων και τη μετάστασή τους. Η κύρια βιολογική δράση των ΜΜΡs είναι η απομάκρυνση της εξωκυττάριας ουσίας με απορρόφηση του ιστού. Η εξωκυττάρια ουσία δεν είναι απλά ένας σκελετός αλλά επίσης δρα και ως αποθήκη πολλών βιολογικά ενεργών μορίων, όπως οι αυξητικοί παράγοντες. Έτσι, η πρωτεολυτική αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας έχει «καθοδηγητικό» ρόλο πάνω στον κυτταρικό φαινότυπο και δρα είτε άμεσα, μέσω σύνδεσης με υποδοχείς με συνέπεια την πυροδότηση ενδοκυττάριων καταρρακτών, είτε έμμεσα, διαμορφώνοντας την απάντηση των κυττάρων στους αυξητικούς παράγοντες 203. Η αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας έχει τη δυνατότητα να αλλάξει τον κυτταρικό φαινότυπο μέσω της επίδρασης των αυξητικών παραγόντων που απελευθερώνονται και μέσω των προϊόντων της αποδόμησής της. Η πρωτεολυτική δράση των MMPs, η οποία είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των κυττάρων, δε δημιουργεί μόνο μία δίοδο για την κυτταρική κίνηση, αλλά διευκολύνει και σημαντικές διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Για παράδειγμα, η αποδόμηση του κολλαγόνου τύπου Ι από τις κολλαγενάσες σχετίζεται με την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών, τη μετανάστευση των κερατινοκυττάρων κατά τη διάρκεια της επαναεπιθηλιοποίησης και την απόπτωση των αμνιακών επιθηλιακών κυττάρων λίγο πριν την έναρξη του τοκετού 204,205,206. Η λειτουργία λοιπόν των MMPs είναι αρκετά πιο σύνθετη και εκλεπτισμένη από απλά την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. 5.6 O ρόλος των MMPs στην αγγειογένεση Η διαδικασία της αγγειογένεσης κατευθύνεται από ένα ολοκληρωμένο κύκλωμα σημάτων, η ρύθμιση του οποίου εξαρτάται από διαλυτούς αγγειογενετικούς παράγοντες, κυτταροκίνες και μη διαλυτά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας τα οποία περιβάλλουν τα συμμετέχοντα αγγεία 228. Η βασική συμβολή των MMPs στην αγγειογένεση προέρχεται από την ικανότητά τους να αποδομούν τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας με σκοπό να ανοίξουν τη δίοδο στα μεταναστεύοντα ενδοθηλιακά κύτταρα. Παράλληλα, οι MMPs συμμετέχουν και με άλλους τρόπους τόσο στην αγγειογενετική όσο και στην αντιαγγειογενετική διαδικασία 229. Στη φυσιολογική αγγειογένεση υπάρχει μια στενά ρυθμιζόμενη ισορροπία με- 68

69 ταξύ των σημάτων των αγγειογενετικών παραγόντων, ενεργοποίησης και μεταφοράς των σημάτων των MMPs, ενδογενών αναστολέων της αγγειογένεσης και αναστολέων των MMPs. Στην παθολογική αγγειογένεση η ισορροπία αυτή διαταράσσεται. Η δράση των MMPs στα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι πολλαπλή. Οι MMPs είναι απαραίτητες για τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη δημιουργία σωληνοειδών σχηματισμών 230. Οι MMPs εμπλέκονται στη διείσδυση των ενδοθηλιακών κυττάρων διαμέσου των φραγμάτων ινικής, με την MT1-MMP να παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ινωδολυτική δραστηριότητα 231. Η MMP-7 (ματριλυσίνη) αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, ρυθμίζει θετικά την ενδοθηλιακή έκφραση των MMP-1 και MMP-2 και προάγει την αγγειογένεση in vivo 232. H εξωγενής MMP-9 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro 233. Οι MMPs αποκόπτουν το εκτοπεδίο της VE-καδχερίνης με αποτέλεσμα να διασπούν τις διακυτταρικές συνδέσεις 234. Πρωτεολυτική διάσπαση του κολλαγόνου τύπου IV αποκαλύπτει τις αvβ3 περιοχές σύνδεσης οι οποίες προάγουν την αγγειογένεση. Η διάσπαση αυτή συσχετίζεται με απώλεια της σύνδεσης με την ιντεγκρίνη α1β1, αύξηση της σύνδεσης στις αvβ3 περιοχές και αυξημένη έκφραση και ενεργοποίηση της MMP Η αποκάλυψη των περιοχών αυτών παρατηρείται στις βασικές μεμβράνες των ενδοθηλιακών κυττάρων στα σημεία αγγειογένεσης και στα αγγεία των όγκων 235. Οι MMPs οι οποίες είναι απαραίτητες για την αγγειογένεση προέρχονται από τα φλεγμονώδη κύτταρα που διεισδύουν στην περιοχή, από τα κύτταρα των όγκων και από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αγγειογενετικοί παράγοντες προάγουν την έκφραση των MMPs στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Κυτταρικά κυστίδια που περιέχουν MMP-2, MMP-9 και MT1- MMP ανευρίσκονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ο αγγειογενετικός ερεθισμός των οποίων από bfgf ή VEGF έχει ως αποτέλεσμα τη διάνοιξή τους 236. Ο VEGF προάγει την έκφραση της MMP-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα 237. Ενώ η λανθάνουσα MMP-2 εκκρίνεται συστηματικά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, η έκθεση των κυττάρων στο κολλαγόνο τύπου Ι (μετά από τη διάσπαση της βασικής μεμβράνης) ή στη φλεγμονώδη κυτταροκίνη TNF-α ρυθμίζει θετικά την έκφραση της MT1-MMP, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση της MMP Παρομοίως, όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκτίθενται στη θρομβίνη (όπως μετά από τραυματισμό και σχηματισμό θρόμβου) προάγεται η ενεργοποίηση της MMP-2. Στην περίπτωση αυτή, η θρομβίνη αλληλεπιδρά με τη θρομβομοδουλίνη, η οποία μετατρέπει την πρωτεΐνη C σε αντιπηκτική πρωτεάση σερίνης, την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, η οποία μετά ενεργοποιεί την προmmp-2 άμεσα 230. Η απελευθέρωση μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) από τα φλεγμονώδη κύτταρα οδηγεί σε θετική ρύθμιση της μεταγραφής της MMP-13 και στην ενεργοποίησή της από τα ενδοθηλιακά κύτταρα 238. Η Ang1, η οποία 69

70 προάγει την εκβλάστηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, προάγει επίσης και την έκκριση της πλασμίνης και της MMP-2 και παράλληλα μειώνει την έκκριση του TIMP-2 από τα κύτταρα αυτά 94. Οι MMPs επίσης αυξάνουν και τη διαθεσιμότητα των αγγειογενετικών παραγόντων. Η αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας απελευθερώνει τους αγγειογενετικούς παράγοντες που κατακρατούνται από αυτήν όπως ο VEGF, bfgf και TGF-β 239. Οι MMP-1 και MMP-13 αποδομούν την περλεκάνη της βασικής μεμβράνης των ενδοθηλιακών κυττάρων α- πελευθερώνοντας bfgf 240. Ο αυξητικός παράγοντας του συνδετικού ι- στού (connective tissue growth factor CTGF) σχηματίζει ένα ανενεργό σύμπλεγμα με τον VEGF 165, με αποτέλεσμα η αποκοπή του συμπλέγματος, μέσω της δράσης των MMP-1, -3, -7, -13, να απελευθερώνει τον ε- νεργό VEGF Ζελατινάσες και αγγειογένεση Οι ζελατινάσες (ζελατινάση Α ή ΜΜP-2, ζελατινάση Β ή MMP-9) είναι γνωστές για την ικανότητά τους να αποδομούν τα κολλαγόνα που βρίσκονται στη βασική μεμβράνη των αγγείων 242. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα παρουσιάζουν συνεχή βασική έκκριση ζελατινάσης Α (MMP-2). Η θρομβίνη, η οποία είναι παρούσα σε υψηλά επίπεδα σε αγγειογενετικές καταστάσεις, όπως ο καρκίνος 243, αλληλεπιδρά με τη θρομβομοδουλίνη πάνω στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C (activated protein C - APC). Με τη σειρά της, η APC ενεργοποιεί τη λανθάνουσα MMP-2 η οποία προκαλεί διάσπαση του τριχοειδικού υποστρώματος. Εκτός από την APC, άλλοι αγγειογενετικοί παράγοντες όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ο ηπατοκυτταρικός αυξητικός παράγοντας συμβάλλουν στην ενεργοποίηση της MMP Καθώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν κατά την αρχική φάση της αγγειογένεσης, η MMP-9 μπορεί να συμμετέχει στην αποδόμηση της βασικής μεμβράνης. Πιθανότατα η MMP-9 να εκκρίνεται από αποθηκευτικά κυστίδια μέσα στα κύτταρα αποδομώντας τοπικά τη βασική μεμβράνη 230. Οι ζελατινάσες απενεργοποιούνται γρήγορα από τους TIMPs 244 και ο α- νασταλτικός αυτός μηχανισμός είναι πολύ σημαντικός γιατί προλαμβάνει την ανεξέλεγκτη πρωτεόλυση. Μετά την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα έρχονται σε επαφή με το κολλαγόνο τύπου Ι, το προεξάρχον κολλαγόνο της διάμεσης ουσίας και μ αυτό τον τρόπο ρυθμίζεται θετικά η MT1-MMP και ενεργοποιείται η MMP-2. Η ενεργοποίηση αυτή διαρκεί σημαντικό χρονικό διάστημα μέχρι το νεοσχηματισμένο τριχοειδές να εκκρίνει τη δική του βασική μεμβράνη. Η βασική αυτή μεμβράνη λειτουργεί ως φραγμός για περαιτέρω επαφή με το κολλαγόνο τύπου Ι. Στην όλη διαδικασία και άλλες MMPs και κυρίως 70

71 οι MT-MMPs παίζουν σημαντικό ρόλο. Έτσι η ίδια η παρουσία του κολλαγόνου τύπου Ι της διάμεσης ουσίας διευκολύνει την αποδόμησή του από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, επιτρέποντας τη μετανάστευσή τους και κατ επέκταση την αγγειογένεση Ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) Η εξωκυττάρια ουσία είναι ένα δυναμικό δίκτυο από αλληλεπιδρώντα μακρομόρια, όπως κολλαγόνα, φιμπρονεκτίνη, λαμινίνη και πρωτεογλυκάνες. Η ανανέωση της εξωκυττάριας ουσίας είναι αναπόσπαστο κομμάτι των φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, όπως η ανάπτυξη, η αναδιαμόρφωση των ιστών, η κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση και η δημιουργία μεταστάσεων 245. Τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας αποδομούνται από διάφορες πρωτεϊνάσες μεταξύ των ο- ποίων και οι MMPs. Προς αποφυγή υπερβολικής πρωτεόλυσης και ιστικής βλάβης, οι πρωτεολυτικές δραστηριότητες ρυθμίζονται με ακρίβεια με διάφορους μηχανισμούς όπως: α) ρύθμιση της μετάφρασης και μεταγραφής των πρωτεασών από αυξητικούς παράγοντες ή κυτταροκίνες, και β) αναστολή της πρωτεολυτικής δραστηριότητας των MMPs κυρίως από τους φυσικούς τους αναστολείς, δηλαδή τους ιστικούς αναστολείς των MMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TIMPs) 246. H πρωτεολυτική δραστηριότητα των MMPs ρυθμίζεται από δύο κύριες κατηγορίες ενδογενών αναστολέων: τις α-μακροσφαιρίνες και τους TIMPs. Οι ανθρώπινες α-μακροσφαιρίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες του πλάσματος μεγέθους 725kDa. Αναστέλλουν τις πρωτεάσες, παγιδεύοντάς τες μέσα στο μόριο της μακροσφαιρίνης και το σχηματιζόμενο σύμπλεγμα απομακρύνεται άμεσα με ενδοκύττωση 247. Οι δράσεις των MMPs σε υ- γρή φάση ρυθμίζονται κυρίως από τις α-μακροσφαιρίνες και τις συναφείς πρωτεΐνες. Οι TIMPs παίζουν σημαντικό ρόλο αναστέλλοντας τις MMPs με αποτέλεσμα η δράση των MMPs να οφείλεται στην ισορροπία MMPs- TIMPs. Απώλεια της ισορροπίας αυτής προς όφελος των MMPs οδηγεί στην ανεξέλεγκτη δράση τους που παρατηρείται σε μια ποικιλία παθολογικών καταστάσεων. Οι TIMPs εκφράζονται σε ευρύ φάσμα κυττάρων και είναι παρόντες στους περισσότερους ιστούς και σωματικά υγρά. Τέσσερις TIMPs (TIMP-1, -2, -3, -4) έχουν αναγνωριστεί στα σπονδυλωτά και η έκφρασή τους ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη και την αναδιαμόρφωση των ιστών

72 5.8.1 Δομή Οι TIMPs αποτελούνται από αμινοξέα (21-34 kda) και υποδιαιρούνται σε δύο περιοχές, την αμινοτελική με μήκος 125 αμινοξέα και την καρβοξυτελική με μήκος 65 αμινοξέα. Όλοι οι TIMPs περιέχουν 12 υπολείμματα κυστεΐνης τα οποία σχηματίζουν έξι δισουλφιδικούς δεσμούς, με αποτέλεσμα την αναδίπλωση της πρωτεΐνης στις δύο περιοχές 246. Η αλληλουχία των αμινοξέων μεταξύ των TIMP-1 και TIMP-2 παρουσιάζει ομοιότητα κατά 40%, ειδικότερα κατά την αμινοτελική περιοχή. Η περιοχή αυτή περιλαμβάνει και την ακολουθία VIRAK (αμινοξέα 18-22), κοινή σε όλους τους TIMPs. Η κρυσταλλογραφική απεικόνιση των TIMP-1 και -2 καταδεικνύει σφηνοειδή μορφή με το μόριό τους να περικλείει ένα β-κύλινδρο με πέντε κλώνους, μία κεντρική ελικοειδή περιοχή που αποτελεί το μεταβατικό τμήμα ανάμεσα στις δύο κύριες περιοχές και την καρβοξυτελική περιοχή 249,250 (Εικόνα 5). Ο TIMP-3 φαίνεται ότι παρουσιάζει διαφορετικές αλληλουχίες από τους TIMP-1 και -2 αλλά διατηρεί τους δισουλφιδικούς δεσμούς και αποτελεί έναν αποτελεσματικό αναστολέα των MMPs. O TIMP-4 παρουσιάζει ταύτιση αλληλουχίας με τους TIMP-2 και -3 σε ποσοστό 50% και με τον TIMP-1 σε ποσοστό 30% 248. Στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ TIMP και MMPs εμπλέκονται διάφορες περιοχές του μορίου των TIMPs μεταξύ των οποίων και τα αμινοξέα γύρω από τον cys1-cys70 δισουλφιδικό δεσμό. Οι περιοχές αυτές είναι σημανικές για την ανασταλτική διαστηριότητά τους και επιβεβαιώνουν ότι η αμινοτελική περιοχή είναι υπεύθυνη για την αναστολή των MMPs 252. Η καρβοξυτελική περιοχή φαίνεται ότι είναι λιγότερο σημαντική στο σχηματισμό συμπλέγματος με τα προένζυμα. Οι δομικές διαφορές μεταξύ των TIMPs, αλλά και η δυνατότητά τους να αναστέλλουν περισσότερες της μιας MMP υποδεικνύει ότι μοιράζονται συγκεκριμένες ιδιότητες 253. Οι TIMP-1, -2 και -4 παρουσιάζονται σε διαλυτή μορφή ενώ ο TIMP-3 ανιχνεύεται κυρίως στην εξωκυττάρια ουσία. Ο τρόπος έκφρασης του TIMP-4 φαίνεται να διαφοροποιείται σε σχέση με τους υπόλοιπους TIMPs αφού το mrna του εντοπίζεται στον εγκέφαλο, καρδιά, ωοθήκες και σκελετικούς μύες οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της αναδιαμόρφωσης της εξωκυττάριας ουσίας, ειδικός για τους ιστούς αυτούς

73 Εικόνα 5. Πρωτογενής δομή των TIMPs. Οι κυστεΐνες συνδέονται σχηματίζοντας έξι δισουλφιδικές γέφυρες. Τα βέλη δείχνουν τους δεσμούς ανάμεσα στις αμινοτελικές και καρβοξυτελικές περιοχές. Με κίτρινο χρώμα απεικονίζονται οι κοινές (VIRAK) περιοχές Λειτουργία Η κύρια λειτουργία των TIMPs είναι ο περιορισμός της δράσης και η αναστολή των MMPs 246,255. Οι TIMPs αποτελούν τους φυσικούς αναστολείς των MMPs των οποίων αναστέλλουν την πρωτεολυτική δραστηριότητα. Για το σκοπό αυτό, σχηματίζουν ένα μη-ομοιοπολικό 1:1 στοιχιομετρικό σύμπλεγμα μεταξύ TIMP-MMP το οποίο είναι ανθεκτικό στη θερμική μετουσίωση και πρωτεολυτική αποδόμηση 256. Παρά το γεγονός ότι όλοι οι TIMPs αναστέλλουν την πρωτεολυτική δραστηριότητα των MMPs, οι TIMPs διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τη διαλυτότητά τους, την αλληλεπίδραση με τα προένζυμα και τη ρύθμιση της έκφρασής τους. Κάθε αναστολέας επιδεικνύει διαφορετική εκλεκτικότητα για τις επιμέρους MMPs, πρακτικά όμως υπάρχουν μόνο μικρές διαφορές ανάμεσα στους TIMPs όσον αφορά την ειδικότητα του υποστρώματος 203. Οι TIMPs συνδέονται με τις MMPs αλλά επίσης έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν συμπλέγματα με τις προ-mmps ρυθμίζοντας κατ αυτόν τον 73

74 τρόπο τη διαδικασία της ενεργοποίησης. Ο TIMP-1 σχηματίζει εκλεκτικά σύμπλεγμα με την προ-mmp-9 257, ο TIMP-2 συνδέεται με την προ- MMP-2 και διευκολύνει την ενζυμική της ενεργοποίηση 258, ο TIMP-3 συνδέεται τόσο με την προ-mmp-2 όσο και με την προ-mmp και ο TIMP-4 συνδέεται με την καρβοξυτελική περιοχή της προ-mmp Οι TIMP-2 και -3, σε αντίθεση με τον TIMP-1, είναι αποτελεσματικοί αναστολείς των μεμβρανικού-τύπου MMPs (ΜΤ-ΜΜPs) οι οποίοι περιέχουν ένα διαμεμβρανικό καρβοξυτελικό πεδίο με το οποίο αγκιστρώνονται στην κυτταρική επιφάνεια 261. Εκτός από την αναστολή των MMPs, οι TIMPs διαθέτουν και επιπρόσθετες ανεξάρτητες λειτουργίες στις οποίες περιλαμβάνονται η κυτταρική διαφοροποίηση, η κυτταρική ανάπτυξη 246 και η απόπτωση 248. Άλλες λειτουργίες συμπεριλαμβάνουν την εμπλοκή τους στην αναστολή της αγγειογένεσης 262, την ωρίμανση των όρχεων 263, την ωορρηξία 264 και την παραγωγή των στεροειδών 263. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι TIMPs έχουν την ιδιότητα να αναστέλλουν τη δράση όλων των γνωστών MMPs και παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ της εναπόθεσης της εξωκυττάριας ουσίας και της αποδόμησής της. Διάφορες παθολογικές διεργασίες (φλεγμονή, χρόνιες εκφυλιστικές παθήσεις και ανάπτυξη όγκων) συσχετίζονται με τη λύση της εξωκυττάριας ουσίας. Οι TIMP-1 και TIMP-2 έχουν αποδειχθεί να αναστέλλουν τη διείσδυση των όγκων και τη μετάσταση σε διάφορα πειραματικά μοντέλα και η δράση αυτή γενικά συνδέεται με την αναστολή των MMPs από τους TIMPs 256,265. Εξ αιτίας αυτής της γενικής ιδιότητας των TIMPs να εμποδίζουν τη δράση των MMPs, δοκιμάζονται ως αντιδιεισδυτικά και αντιαγγειογενετικά μόρια TIMP-1 TIMP-1 ονομάζεται μία γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη με 184 αμινοξέα, χωρίς όμως να είναι απαραίτητη η γλυκοζυλίωση για τη δράση της 267. Περιέχει 12 μόρια κυστεΐνης τα οποία σχηματίζουν δισουλφιδικούς δεσμούς με τρόπο ο οποίος δίνει χαρακτηριστικά αμινοτελικά και καρβοξυτελικά άκρα 268. Στο αμινοτελικό άκρο του TIMP-1 δεσμεύεται το ενεργό κέντρο των MMPs 268. Με τη δέσμευση αυτή, κανένας πεπτιδικός δεσμός δεν είναι ελεύθερος για πρωτεόλυση, με αποτέλεσμα να μην αποδομείται η ΜΜΡ 269. Όταν το σύμπλοκο TIMP/MMP διαχωρίζεται, απελευθερώνεται η MMP και δραστικό TIMP Το καρβοξυτελικό άκρο του TIMP-1 δεσμεύεται με μια περιφερική δομή της MMP αυξάνοντας έτσι τη συνολική σταθερότητα του συμπλόκου 269. Ο TIMP-1 δεσμεύει, επίσης, με μεγάλη συγγένεια την ανενεργό προmmp-9, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο, στο οποίο ο TIMP-1 διατηρεί την ικανότητά του 74

75 να δεσμεύει, διαμέσου του αμινοτελικού άκρου και να αναστέλλει τη δραστηριότητα ενός άλλου ενεργού μορίου 270. Ο TIMP-1 συντίθεται από πολλά κύτταρα και ιστούς 256. Η μεταγραφή του γονιδίου του TIMP-1 gene διεγείρεται από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1, IL-6, OSM, LIF and TNF-α), TGF-β1 και εστέρες phorbol esters 256,271. Πολλές φυσιολογικές δραστηριότητες του TIMP-1 συνδέονται με τη βιολογική δράση των MMPs και μια μη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ της παραγωγής MMP και TIMP σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις, όπως η αρθρίτιδα, η αύξηση του καρκίνου και η διαδικασία της μετάστασης 256. Από την άλλη πλευρά, ο TIMP-1 αποδείχτηκε ότι διεγείρει τη δραστηριότητα των ερυθροκυττάρων (erythroid) 272,273, δραστηριότητα η οποία φαίνεται ότι δεν σχετίζεται με αναστολή των MMP 274. Επίσης, ο TIMP-1 δεσμεύεται σε μερικές κατηγορίες κυττάρων και μετατοπίζεται στον πυρήνα 275. Άλλες μελέτες έδειξαν ότι ο TIMP-1 αναστέλλει την απόπτωση στα Β λεμφοκύτταρα 276, υποδεικνύοντας ότι η δραστηριότητα του ΤΙΜΡ-1 σχετίζεται με την επιβίωση και αύξηση των κυττάρων με μηχανισμούς ανεξάρτητους της αναστολής των MMPs Ο ρόλος των TIMPs στην αγγειογένεση Η έξοδος των κυττάρων από τα αγγεία και η προαγώμενη από τους όγκους αγγειογένεση αποτελούν βασικά στάδια στην πρόοδο των όγκων. Για να πραγματοποιηθούν τα βήματα αυτά απαιτείται η διάσπαση των φραγμάτων της εξωκυττάριας ουσίας όπως είναι η βασική μεμβράνη. Τα φαινόμενα αυτά είναι στενά συνδεδεμένα με την ισορροπία μεταξύ TIMPs/MMPs. Το σκεπτικό της εμπλοκής των MMPs στην αγγειογένεση είναι τόσο ευρέως αποδεκτό ώστε οι περισσότερες σύγχρονες κλινικές δοκιμές στις οποίες χρησιμοποιούνται αναστολείς των MMPs στοχεύουν στην αγγειογένεση των όγκων 277. Ο TIMP-1 εμπλέκεται κυρίως στον έλεγχο της MMP-9, ενός από τα μόρια που μεσολαβούν στη διαδικασία της εξόδου από τα αγγεία, μέσω της αποδόμησης του κολλαγόνου τύπου IV της βασικής μεμβράνης. Έχει αποδειχθεί ότι η προσκόλληση Τ-λεμφοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχει αποτέλεσμα την παροδική αύξηση της έκφρασης του mrna της MMP-9 και στους δύο τύπους κυττάρων 278 και ταυτόχρονα, κυτταροκίνες της φλεγμονής προάγουν την παραγωγή TIMP-1 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα 279. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι τόσο η MMP-9, όσο και η TIMP-1 εμπλέκονται στην έξοδο των κυττάρων από τα αγγεία, αλλά η υπερέκφραση του TIMP-1 κάτω από αυτές τις συνθήκες δεν επαρκεί για να αποτρέψει το φαινόμενο αυτό. Όταν το ενδοθηλιακό κύτταρο ενεργοποιείται από αγγειογενετικούς παράγοντες (κυρίως VEGF και bfgf), αποκτά το διεισδυτικό, χη- 75

76 μειοτακτικό και αναπτυξιακό δυναμικό που είναι απαραίτητο για να ξεφύγει από το προϋπάρχον αγγείο, να προχωρήσει μέσα στην εξωκυττάρια ουσία και να σχηματίσει νέο αγγείο 280. Για το λόγο αυτό η θεραπεία με VEGF οδηγεί τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε υπερ-ρύθμιση της MMP-2 και υπο-ρύθμιση του TIMP-1 και Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και σε βιοψίες καρκίνου του μαστού όπου τα επίπεδα έκφρασης των VEGF και MMP-2 παρουσίασαν στενή συσχέτιση 282. Η τεχνητή υπερ-ρύθμιση του TIMP-2 επιδεικνύει καθαρά αντιαγγειογενετική δράση in vivo και in vitro και αναστολή της διείσδυσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και της αγγείωσης των όγκων 266,283. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η αγγειογένεση διεγείρεται και από την απενεργοποίηση των TIMPs από την καθεψίνη Β (cathepsin B) 284. Χορήγηση καθεψίνης Β έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια από τους TIMP-1 και -2 της ανασταλτικής τους δράσης στις MMPs και κατά συνέπεια της αντιαγγειογενετικής τους δράσης. Εκτός από τη συμβολή της στην προαγωγή της καταστροφής των ιστών, η καθεψίνη Β φαίνεται να αυξάνει και τη δράση των MMPs οδηγώντας σε αύξηση της αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας με αποτέλεσμα να γίνεται πιο εύκολη η διείσδυση στους ιστούς Ο ρόλος των TIMPs στην επούλωση Οι MMPs και οι TIMPs συμβάλλουν στην ομοιόσταση, επαναεπιθηλιοποίηση, σχηματισμό κοκκιώδους ιστού και αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας, γεγονότων που χαρακτηρίζουν την επούλωση των ιστών. Η έκφραση των γονιδίων των TIMP-1 και -3 έχει παρατηρηθεί στα κερατινοκύτταρα τραυμάτων με φυσιολογική επούλωση, σε αντίθεση με τα χρόνια έλκη, στα οποία δεν ανιχνεύθηκε έκφραση των TIMP αυτών 285. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι TIMP-1 και -3 συμμετέχουν στην αναγέννηση της επιδερμίδας, σταθεροποιώντας τη βασική μεμβράνη, ενώ ρυθμίζουν και την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας και την αγγειογένεση στην κοίτη του τραύματος. Απουσία του TIMP-2 πλησίον των χειλέων του τραύματος μπορεί να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη δράση της MMP-2 στα χρόνια έλκη. Οι TIMPs υπόκεινται σε στενή ρύθμιση τόσο χρονικά όσο και τοπικά, με αποτέλεσμα η ανισορροπία ανάμεσά τους και στις MMPs να οδηγεί σε καθυστερημένη επούλωση

77 6 ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΕΣ - ΣΕΛΕΚΟΞΙΜΠΗ 6.1 Μεταβολισμός αραχιδονικού οξέος Τα μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ) πιστεύεται ότι ασκούν την αντιφλεγμονώδη, αναλγητική και αντιπυρετική δράση τους κυρίως από την αναστολή της βιοσύνθεσης των προσταγλανδινών 286. Οι προσταγλανδίνες ή προστανοειδή ανήκουν στη μεγαλύτερη κατηγορία των εικοσανοειδών λιπαρών οξέων και παίζουν ζωτικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες όπως η αναπαραγωγή, η ακεραιότητα των αγγείων και η ανοσία 287. Το αραχιδονικό οξύ είναι πολυακόρεστο λιπαρό οξύ, αποτελείται από 20 μόρια άνθρακα και είναι ο κύριος πρόδρομος των προστανοειδών. Προέρχεται από τις προσλαμβανόμενες τροφές είτε απ ευθείας, είτε μετά από τροποποίηση του λινολεϊκού οξέος. Αφού εστεροποιηθεί σε φωσφολιπίδιο, εντοπίζεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Το αραχιδονικό οξύ μεταβολίζεται μέσω μιας από τρεις κύριες μεταβολικές οδούς: την οδό της κυκλοοξυγενάσης μέσω της οποίας σχηματίζονται τα προστανοειδή, την οδό της λιποξυγενάσης μέσω της οποίας παράγονται οι λευκοτριένες, οι λιποξίνες, οι εποξιλίνες και τα μονοϋδροξυλιπαρά οξέα και την οδό του κυτοχρώματος P 450 από την οποία παράγονται τα εποξυ- και διυδροξυλιπαρά οξέα 289. Επίσης παράγονται και ισοπροστάνες, ισολευκοτριένες και άλλα υπεροξειδωμένα παράγωγα λιπαρών οξέων χωρίς τη δράση ενζύμων. Κατά το πρώτο στάδιο σύνθεσης των προσταγλανδινών, το αραχιδονικό οξύ απελευθερώνεται από τα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης με τη δράση της κυτταροπλασματικής ή της εκκριτικής φωσφολιπάσης Α 2a (cytosolic phospholipase A 2, cpla 2a και secretory phospholipase A 2, spla 2a ) 289. Το επόμενο στάδιο της μεταβολικής οδού καταλύεται από τη συνθετάση του ενδοϋπεροξειδίου της προσταγλανδίνης Η (Prostaglandin endoperoxide H Synthase PGHS), ή όπως ονομάζεται ευρέως κυκλοοξυγενάση (Cyclooxygenase COX) 290. Το ένζυμο αυτό ρυθμίζει τη μετατροπή του ελεύθερου αραχιδονικού οξέος σε υπεροξείδιο της προσταγλανδίνης H 2 (PGH 2 ) σε δύο φάσεις. Κατά την πρώτη φάση (αντίδραση COX) το αραχιδονικό οξύ οξειδώνεται σχηματίζοντας την προσταγλανδίνη PGG 2 ως ενδιάμεσο προϊόν και στη δεύτερη φάση (αντίδραση υπεροξειδάσης) η PGG 2 ανάγεται, από διαφορετική περιοχή του ίδιου ενζύμου, οδηγώντας στο σχηματισμό του ασταθούς υπεροξειδίου PGH Στη μεταβολική οδό της COX, το αραχιδονικό οξύ μετατρέπεται από τους βιοσυνθετικούς μηχανισμούς των προσταγλανδινών σε μία ποικιλία προστανοειδών, μεταξύ των οποίων οι προσταγλανδίνες και οι θρομβοξάνες (ΤΧ) 291. Ειδικές PG συνθάσες μετατρέπουν το υπεροξείδιο της PGH 2 σε τουλάχιστον 5 βιοδραστικά μόρια λιπιδίων που περιλαμβά- 77

78 νουν τις προσταγλανδίνες PGE 2, PGD 2, PGF 2a, PGI 2 και τη θρομβοξάνη Α 2 (ΤΧΑ 2 ) ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου στον οποίο δρουν. Τα προστανοειδή είναι ορμόνες οι οποίες συντίθενται πρακτικά από όλους τους ιστούς των θηλαστικών και ασκούν τη δράση τους στα σημεία σύνθεσης ή κοντά σ αυτά με αυτοκρινικό ή παρακρινικό τρόπο 292. Η συνθετάση της PGD έχει ανευρεθεί στο σπλήνα, στον εγκέφαλο και στα μαστοκύτταρα, η συνθετάση της PGI στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα κύτταρα των λείων μυϊκών ινών, η συνθετάση της PGF στη μήτρα και η συνθετάση της PGE στην πλειονότητα των κυττάρων. Η συνθετάση της θρομβοξάνης Α 2 (ΤΧΑ 2 ) ανευρίσκεται στα αιμοπετάλια, στα μακροφάγα και στους πνεύμονες, ενώ αποτελεί έναν ισχυρό θρομβογόνο και αγγειοσυσπαστικό παράγοντα 293. Οι υποδοχείς μέσω των οποίων οι προσταγλανδίνες ασκούν τη δράση τους ονομάζονται - ανάλογα με την προσταγλανδίνη με την οποία συνδέονται DP, FP, IP TP για τις PGD 2, PGF 2a, PGI 2 και TXA 2 αντίστοιχα, ενώ για τη PGE 2 υπάρχουν 4 διαφορετικοί υποδοχείς (EP1, EP2,EP3, EP4). Οι υποδοχείς ανήκουν στην οικογένεια των GPCRs (G-protein coupled receptors). Τελευταία έχει ανακαλυφθεί και ένας ακόμη υποδοχέας της ίδιας ομάδας, ο PD2 ο οποίος εκφράζεται από τα Th2 κύτταρα και τα εωσινόφιλα και μεσολαβεί σε ορισμένες δράσεις της PGD2 στα κύτταρα αυτά όπως είναι η χημειοταξία 294. Στην Εικόνα 6 παρουσιάζεται σχηματικά ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος. Εικόνα 6. Ο καταρράκτης του αραχιδονικού οξέος 78

79 6.2 Ταξινόμηση των Μη-Στεροειδών Αντιφλεγμονωδών Φαρμάκων Τα ΜΣΑΦ ταξινομούνται σε τέσσερις κατηγορίες: 1. Εκλεκτικοί COX-1 αναστολείς (ασπιρίνη) 2. Μη-εκλεκτικοί COX αναστολείς (ΜΣΑΦ όπως ιμπουπροφένη, ινδομεθακίνη και πιροχικάμη, παρουσιάζουν αναλογία COX-1/COX-2 IC 50 μεταξύ 0,5 και 3,0) 3. Σχετικά εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς (μελοξικάμη, νιμεσουλίδη, δικλοφενάκη) με αναλογία COX-1/COX-2 IC COX-2 αναστολείς με υψηλή εκλεκτικότητα (σελεκοξίμπη και αλλές πειραματικές ουσίες) με αναλογία COX-1/COX-2 IC και ροφεκοξίμπη με αναλογία > Μηχανισμός δράσης των Μη-Στεροειδών Αντιφλεγμονωδών Φαρμάκων Τα φάρμακα αυτά ονομάζονται ΜΣΑΦ επειδή είναι δομικά διαφορετικά από τα στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Παρά το γεγονός ότι τα διάφορα ΜΣΑΦ έχουν και διαφορετική χημική δομή, παρουσιάζουν παρόμοιες θεραπευτικές δράσεις και ανεπιθύμητες ενέργειες. Οι μηχανισμοί με τους όποιους δρουν τα ΜΣΑΦ είναι η αναστολή της σύνθεσης των COX και των λευκοτριενών, πρόληψη της απελευθέρωσης των τοξικών ριζών οξυγόνου και λυσοσωματικών ενζύμων, πρόληψη της συσσώρευσης αιμοπεταλίων, προσκόλληση και χημειοταξία και αποτροπή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. 296 Πρόσφατα προτάθηκαν και άλλοι παράγοντες οι οποίοι παίζουν σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό δράσης των ΜΣΑΦ όπως οι PPARs (peroxisome proliferators-activated receptors), η αναστολή του NF-κB (nuclear factor kappa B), καθώς και άλλοι παράγοντες αντιγραφής. Οι PPARs είναι μέλη της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Τρία μέλη της οικογένειας PPAR-α, PPAR-β/δ και PPAR-γ εκφράζονται ευρέως με διαφορετικές συγκεντρώσεις στους διάφορους ιστούς. Ο ρόλος των PPARs είναι να ρυθμίζουν την αντιγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών, στην ομοιόσταση της γλυκόζης, στην κυτταρική διαφοροποίηση και τέλος αναστέλλουν την ενεργοποίηση ορισμένων γονιδίων που παίζουν ρόλο στη φλεγμονώδη αντίδραση Κυκλοοξυγενάσες Το 1971, οι Vane και συν. 286 απέδειξαν ότι η αντιφλεγμονώδης ι- διότητα των μη-στερινοειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ) ο- 79

80 φείλεται στην ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου κυκλοοξυγενάση (COX). Η COX με τη σειρά της οδηγεί στην ελαττωμένη σύνθεση των προφλεγμονωδών προσταγλανδινών. H COX ή αλλιώς συνθετάση της προσταγλανδίνης Η, καταλύει το πρώτο στάδιο της σύνθεσης των προστανοειδών μετατρέποντας το αραχιδονικό οξύ σε προσταγλανδίνη Η 2, η οποία είναι το κοινό υπόστρωμα για τις ειδικές συνθετάσες προσταγλανδινών. 297 Στις αρχές της δεκαετίας του 90, βρέθηκε ότι η COX εμφανίζεται με δύο ισομορφές την COX-1 και την COX-2. Η COX- 1 εκφράζεται συστηματικά σχεδόν σε όλους τους ιστούς μεσολαβώντας στις φυσιολογικές αντιδράσεις του οργανισμού (π.χ. προστασία του γαστρικού βλεννογόνου, συσσώρευση αιμοπεταλίων). H COX-2 όμως, εκφράζεται από κύτταρα τα οποία εμπλέκονται στη φλεγμονή (π.χ. μακροφάγα, μονοκύτταρα) και με αυτόν τον τρόπο προέκυψε ότι η ισομορφή αυτή είναι πρωτίστως υπεύθυνη για τη σύνθεση των προστανοειδών σε παθολογικές διαδικασίες όπως σε οξείες και χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Επιπρόσθετα, πολλές από τις ανεπιθύμητες ενέργειες των ΜΣΑΦ (έλκη και αιμορραγίες γαστρεντερικού, δυσλειτουργίες αιμοπεταλίων) αποδόθηκαν στην καταστολή των προστανοειδών που προέρχονται από τη δράση της COX-1, ενώ η αναστολή της εξαρτώμενης από την COX-2 σύνθεσης των προσταγλανδινών θεωρείται ότι είναι υπεύθυνη για την αντιφλεγμονώδη, αναλγητική και αντιπυρετική δράση των ΜΣΑΦ. Συνεπώς η υπόθεση ότι η εκλεκτική αναστολή της COX-2 μπορεί να έχει θεραπευτική δράση παρόμοια με αυτή των ΜΣΑΦ, αλλά χωρίς τις ανεπιθύμητες ενέργειες, ήταν το σκεπτικό για την ανάπτυξη των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων ως μία νέα τάξη αντιφλεγμονωδών και αναλγητικών παραγόντων με αυξημένη ανοχή από το γαστρεντερικό σύστημα. 298 Το 2002, οι Simmons και συν. 299 ανέφεραν την ανακάλυψη ενός ακόμα ισοενζύμου της COX, το οποίο ονομάστηκε COX-3 και θεωρήθηκε ότι είναι το ένζυμο-στόχος της ακεταμινοφαίνης, δίνοντας έτσι μια πιθανή εξήγηση για τον τρόπο δράσης της ουσίας αυτής. Δυστυχώς όμως τα περισσότερα πειραματικά δεδομένα κατέληξαν ότι δεν πρόκειται παρά για μία εναλλακτική μορφή της μεταγραφής του mrna της COX-1 (splice variant) και θα πρέπει να ονομαστεί και ανάλογα 300. To ένζυμο αυτό παρουσιάζει στα κυνοειδή δράση κυκλοοξυγενάσης, αλλά στον άνθρωπο και τα τρωκτικά η δράση του είναι ακόμα αδιευκρίνιστη. Επειδή η πρωτεΐνη στον άνθρωπο και στα τρωκτικά έχει εντελώς διαφορετική αλληλουχία αμινοξέων από τις COX-1 και 2 και δεν έχει δράση κυκλοοξυγενάσης, ονομάστηκε COVAP (cyclooxygenase variant protein) για να διαφοροποιηθεί από τις συνθέτουσες προσταγλανδίνη ισομορφές 301. Το αραχιδονικό οξύ, ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ, βρίσκεται σχεδόν αποκλειστικά ως εστέρας στη 2-θέση των φωσφολιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης. Το πρώτο στάδιο σύνθεσης των προσταγλανδινών καταλύεται από τη φωσφολιπάση Α 2 και περιλαμβάνει την υδρόλυση 80

81 των φωσφολιπιδίων και παραγωγή ελεύθερου αραχιδονικού οξέος. Στο επόμενο στάδιο δρα η COX-2 (1 η δράση) μετατρέποντας το ελεύθερο αραχιδονικό οξύ σε ασταθή PGG 2 η οποία γρήγορα μετατρέπεται σε PGH 2 μέσω της 2 ης δράσης της COX-2. Η PGH 2 είναι η κοινή πρόδρομη μορφή όλων των προστανοειδών τα οποία συντίθενται με αντιδράσεις οι οποίες καταλύονται από ειδικά ένζυμα. Καθένα από τα παράγωγα της PGH 2 έχει το δικό του φάσμα βιολογικών ενεργειών 302. Οι COX-1 και COX-2 έχουν κοινά υποστρώματα, δημιουργούν τα ίδια προϊόντα και καταλύουν την ίδια αντίδραση χρησιμοποιώντας τους ίδιους καταλυτικούς μηχανισμούς. Η κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ βοήθησε σημαντικά στην ανάδειξη του μηχανισμού δράσης των ΜΣΑΦ και στην αποσαφήνιση της ειδικότητάς τους, καθοδηγώντας την εξέλιξη νέων φαρμάκων 303. Οι δύο αυτές κυκλοοξυγενάσες είναι παρόμοια ένζυμα που αποτελούνται από στενό και μακρύ κανάλι με μία εγειρμένη φουρκέτα στο άκρο τους. Και οι δύο ισομορφές συνδέονται με την κυτταρική μεμβράνη και έτσι το αραχιδονικό οξύ το οποίο απελευθερώνεται από τις κατεστραμμένες μεμβράνες πλησίον του ανοίγματος του καναλιού, το οποίο είναι υδρόφοβο, προσροφάται, συστρέφεται γύρω από τη φουρκέτα, δύο μόρια οξυγόνου προστίθενται και μία ελεύθερη ρίζα α- φαιρείται με αποτέλεσμα τη δημιουργία του δακτυλίου με 5 άτομα άνθρακα που είναι χαρακτηριστικό των προσταγλανδινών. 304 Η μοναδική δομική διαφορά των δύο ισομορφών, με σημαντικές όμως συνέπειες, είναι η ύπαρξη βαλίνης στη θέση 509 στην COX-2 σε αντίθεση με την ισολευκίνη που υπάρχει στην ίδια θέση στην COX Η διαφορά αυτή προσδίδει στην COX-2 μεγαλύτερη περιοχή σύνδεσης υποστρώματος και κατά συνέπεια πιο ευρύ φάσμα υποστρωμάτων. Ταυτόχρονα, η αντικατάσταση ισολευκίνης/βαλίνης αποτελεί και τη δομική βάση για τους ε- κλεκτικούς αναστολείς της COX-2. Η μικρότερη σε μέγεθος βαλίνη της COX-2 επιτρέπει στους εκλεκτικούς αναστολείς της COX-2 να συνδεθούν με το ένζυμο, ενώ η μεγαλύτερη ισολευκίνη της COX-1 αποτρέπει τη σύνδεση 306. Η δομική διαφοροποίηση των δύο COX εξηγεί και το διαφορετικό βαθμό αναστολής που παρουσιάζει η ασπιρίνη απέναντι στα δύο ένζυμα. Η ασπιρίνη, ως ένας μη αναστρέψιμος αναστολέας, ακετυλιώνει τη σερίνη 530 στην COX-1, καταργώντας τελείως την ικανότητά της να οξειδώνει το αραχιδονικό οξύ. Η COX-2 όμως, μετά παρόμοια ακετυλίωση διατηρεί την ικανότητά της να ακετυλιώνει το αραχιδονικό οξύ, όμως σε 15R-υδροξυεικοσατετραενοϊκό οξύ, αντί σε προσταγλανδίνη G Συνεπώς η ακετυλίωση της σερίνης 530, η οποία είναι απαραίτητη για τον έ- λεγχο της διαμόρφωσης των προσταγλανδινών προάγεται επαρκέστερα μέσω της COX-2. Μία ακόμη δομική διαφορά των δύο ισομορφών της COX είναι η προσθήκη 18 επιπλέον αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο της COX-2 81

82 και η έλλειψη 17 αμινοξέων από το αμινοτελικό της άκρο σε σύγκριση με την COX Η COX-2 εντοπίζεται τόσο στο ενδοπλασματικό δίκτυο όσο και στην πυρηνική μεμβράνη ενώ η COX-1 μόνο στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Η διαφορά του καρβοξυτελικού άκρου της COX-2 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για τον εντοπισμό της στην πυρηνική μεμβράνη. 6.5 Σελεκοξίμπη Η χημική δομή της σελεκοξίμπης (Celecoxib, Celebrex, G.D. Searle & Co., Skokie Illinois) είναι 4-[5-(4-μεθυλφαινυλ)-3-(τριφλουρομεθυλ)-1η-πυραζολ-1-υλ] βενζενο-σουλφοναμίδη (Εικόνα 7). Παρουσιάζει 375 φορές μεγαλύτερη εκλεκτικότητα για την COX-2 σε σύγκριση με τη COX 309. Ο μεθυλφαινυλ δακτύλιος της σελεκοξίμπης συνδέεται με τη θέση 1 του ισοενζύμου COX-2 και ο βενζενοσουλφαμιδικός δακτύλιος συνδέεται σε άλλο σημείο της COX-2 αλλά όχι και στο COX-1 ισοένζυμο 305. Η εκλεκτικότητα της σελεκοξίμπης φαίνεται ότι οφείλεται στην ύπαρξη του φαινυλσουλφοναμιδικού δακτυλίου. Ο δακτύλιος αυτός συνδέεται με έναν θύλακο ο οποίος είναι περιορισμένος Εικόνα 7. Χημική δομή της σελεκοξίμπης στην COX-1 αλλά ελεύθερος στην COX-2 όταν αυτή σχηματίζει σύμπλεγμα με τους μη εκλεκτικούς αναστολείς της. Ο θύλακος αυτός διακλαδίζεται από το κεντρικό κανάλι και οδηγεί στο δραστικό μέρος της COX το οποίο είναι περισσότερο προσιτό στους εκλεκτικούς αναστολείς της COX-2. Αυτό συμβαίνει επειδή το μικρότερο μόριο της βαλίνης στην 82

83 COX-2 αφήνει ένα χάσμα στο τοίχωμα του καναλιού, δίνοντας έτσι πρόσβαση σε έναν πλάγιο θύλακο ο οποίος θεωρείται ότι είναι το σημείο σύνδεσης για τους εκλεκτικούς COX-2 αναστολείς 304. Αντίθετα, η μεγαλύτερη σε μέγεθος ισολευκίνη στη θέση 523 της COX-1 είναι αρκετά ο- γκώδης με αποτέλεσμα να εμποδίζει την πρόσβαση στον πλάγιο θύλακο. Οι COX-1 και COX-2 είναι σημαντικά ένζυμα που επικάθονται στο εσωτερικό στρώμα των ενδοκυτταρικών φωσφολιπιδικών μεμβρανών 305. Η διαφορά που παρατηρείται ανάμεσα στα δύο ισοένζυμα, με την παρουσία της μικρότερης σε μέγεθος βαλίνης στην COX-2, επιτρέπει την σύνδεση της φαινυλσουλφοναμίδης της σελεκοξίμπης στον πλάγιο θύλακο και με αυτόν τον τρόπο είναι υπέυθυνη για την ικανότητα του φαρμάκου να εμποδίζει την ενεργοποίηση της COX Κατά συνέπεια ένας εκλεκτικός COX-2 αναστολέας έχει το θεωρητικό πλεονέκτημα ότι μπορεί να εμποδίσει την εμφάνιση της φλεγμονής και του πόνου ταυτόχρονα μειώνοντας την επίπτωση των γαστρεντερικών ανεπιθύμητων ενεργειών που συνδέονται με την αναστολή της COX-1 και έχουν περιορίσει τη χρήση της ασπιρίνης και άλλων ΜΣΑΦ επειδή αναστέλλουν και τα δύο ισοένζυμα Φαρμακοκινητικές ιδιότητες της σελεκοξίμπης στον άνθρωπο Η μέση μέγιστη συγκέντρωση της σελεκοξίμπης στο πλάσμα (C max ) παρατηρείται 2 ώρες μετά από τη λήψη από το στόμα 310. Τόσο η C max όσο και η περιοχή κάτω από την καμπύλη χρόνου-συγκέντρωσης (AUC area under curve) είναι γραμμική μέσα στο εύρος της θεραπευτικής δόσης. Μετά από πολλαπλή χορήγηση, η σελεκοξίμπη φθάνει ένα σταθερό επίπεδο μέσα σε 5 ημέρες. Η σελεκοξίμπη μπορεί να χορηγηθεί χωρίς να επηρεάζεται από τα γεύματα, αν και δίαιτα πλούσια σε λιπαρά μπορεί να παρατείνει το χρόνο για C max και να αυξήσει την AUC. Όπως και τα παραδοσιακά ΜΣΑΦ, η σελεκοξίμπη παρουσιάζεται σε υψηλό ποσοστό (>97%) συνδεδεμένη με πρωτεΐνες. Η μέση ημίσια ζωή της σελεκοξίμπης (t1/2) είναι 11,5 ώρες 310 και η κάθαρσή της είναι 30l/h. Λιγότερο από το 3% αποβάλλεται ως αναλλοίωτο μόριο από τα ούρα και τα κόπρανα. Ο μεταβολισμός της σελεκοξίμπης πραγματοποιείται στο ήπαρ, κυρίως μέσω του κυτοχρώματος P Ο μεταβολισμός συμβαίνει με υδροξυλίωση και οξείδωση προς ένα ανενεργό μεταβολίτη και η απέκκριση γίνεται κυρίως μέσω των κοπράνων (57%) και λιγότερο μέσω των ούρων (27%) 310. Πρόσφατα δεδομένα δεν αποδεικνύουν αλληλεπιδράσεις της σελεκοξίμπης με αρκετά από τα συχνότερα συνταγογραφούμενα φάρμακα, μεταξύ των οποίων και η μεθοτρεξάτη, η βαρφαρίνη, η φαινυντοΐνη και η τολβουταμίδη 312. Συγχορήγηση σελεκοξίμπης και λιθίου ο- δήγησε σε 17% μείωση της AUC του λιθίου, γεγονός που παρατηρείται 83

84 και με τα παραδοσιακά ΜΣΑΦ 313. Μελέτη αλληλεπίδρασης με τη φλουκοναζόλη και τη κετοκοναζόλη απέδειξε ότι μόνο η φλουκοναζόλη επηρεάζει τη φαρμακοκινητική της σελεκοξίμπης αυξάνοντας σημαντικά τις C max και AUC της σε περίπτωση συγχορήγησης Θεραπευτικές ενδείξεις σελεκοξίμπης Οστεοαρθρίτιδα Η σελεκοξίμπη έλαβε έγκριση από τον εθνικό οργανισμό τροφίμων και φαρμάκων των Η.Π.Α. (FDA) το 1999 για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας. Η σελεκοξίμπη, σε δόσεις mg δις ημερησίως, βρέθηκε σημαντικά πιο αποτελεσματική στην αντιμετώπιση του πόνου της οστεοαρθρίτιδας συγκρινόμενη με το placebo και εξίσου αποτελεσματική συγκρινόμενη με τη ναπροξένη (500mg δις ημερησίως), ενώ προκαλούσε λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες από το γαστρεντερικό σύστημα. 315,316 Επίσης η χορήγηση σελεκοξίμπης σε δόση 200mg ημερησίως προκαλούσε ανάλογη βελτίωση των συμπτωμάτων της οστεοαρθρίτιδας του γόνατος, ενώ η ασφάλεια και η ανεκτικότητα της σελεκοξίμπης ήταν καλύτερη συγκρινόμενη με τη δικλοφενάκη. 317 Μια μεγάλη πολυκεντρική μελέτη διάρκειας 12 εβδομάδων, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η σελεκοξίμπη σε δόση 200 ή 400mg ημερησίως προκαλεί συγκρίσιμη βελτίωση του πόνου, ανάλογη με τη ναπροξένη σε δόση 1000mg και δικλοφενάκη 100mg ημερησίως σε ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα του ισχίου, του γόνατος και της άκρας χειρός. Η αναλογία των συμπτωματικών ελκών ή των επιπλοκών ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα της σελεκοξίμπης σε σύγκριση με την ομάδα των ασθενών που ελάμβαναν άλλα ΜΣΑΦ Ρευματοειδής αρθρίτιδα Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της σελεκοξίμπης σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα έχει αποδειχθεί σε δόσεις mg δις ημερησίως. Η αποτελεσματικότητα αυτή δείχθηκε ανώτερη από το placebo και συγκρίσιμη με τη ναπροξένη (500mg δις ημερησίως) 310,319. Η ενδοσκόπηση του πεπτικού πριν και μετά τη θεραπεία με σελεκοξίμπη, ναπροξένη και placebo, έδειξε παρόμοια επίπτωση γαστροδωδεκαδακτυλικού έλκους στους ασθενείς που ελάμβαναν σελεκοξίμπη και placebo, ενώ η επίπτωση του έλκους ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα της ναπροξένης 319. Σύγκριση της χορήγησης 200mg σελεκοξίμπης με τη δικλοφενάκη SR 75mg δις ημερησίως για 24 εβδομάδες, έδειξε μείωση του α- ριθμού των επώδυνων και πρησμένων αρθρώσεων και κατ επέκταση 84

85 βελτίωση του πόνου της ρευματοειδούς αρθρίτιδας 320. Έλκη στομάχου και δωδεκαδακτύλου ευρέθησαν ενδοσκοπικά στο 15% των ασθενών που ελάμβαναν δικλοφενάκη σε αντίθεση με το 4% των ασθενών που ελάμβαναν σελεκοξίμπη, με στατιστικά σημαντική διαφορά Οικογενής πολυποδίαση του παχέος εντέρου Η οικογενής πολυποδίαση του παχέος εντέρου (FAP, familial adenomatous polyposis) είναι μία σπάνια κληρονομική νόσος η οποία κληρονομείται με τον αυτοσωμικό επικρατούντα χαρακτήρα και οφείλεται στην απενεργοποίηση του ενός αλλήλου του γονιδίου της αδενωματώδους πολυποδίασης του παχέος εντέρου (APC, adenomatous polyposis coli). Τα άτομα με τη νόσο αναπτύσσουν από δεκάδες έως και χιλιάδες αδενωματώδεις πολύποδες στο παχύ έντερο. Αν τα άτομα αυτά δεν υποστούν ριζική χειρουργική εκτομή του παχέος εντέρου, πρακτικά όλα α- ναπτύσσουν ορθοκολικό καρκίνο μέχρι την τρίτη έως την τέταρτη δεκαετία της ζωής τους 321. Αν και οι ασθενείς με FAP αποτελούν μόλις το 1% των περιπτώσεων ορθοκολικού καρκίνου, συνιστούν όμως εξαιρετικό πρότυπο απενεργοποίησης του γονιδίου APC ως ένα πρώιμο γενετικό συμβάν που αφορά και το 85% των καρκίνων που αναπτύσσονται από σποραδικούς αδενωματώδεις πολύποδες. Τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι ΜΣΑΦ όπως η σουλινδάκη και η σελεκοξίμπη καταστέλλει τους αδενωματώδεις πολύποδες και προκαλεί υποχώρηση των ήδη υπαρχόντων πολυπόδων σε ασθενείς με FAP 322. Αρκετές πειραματικές μελέτες έδειξαν ότι οι ΜΣΑΦ και οι κοξίμπες, όπως η σελεκοξίμπη, αναστέλλουν την ανάπτυξη όγκων σε επίμυες APC min (επίμυες που εμφανίζουν πολλαπλές εντερικές νεοπλασίες ως αποτέλεσμα μετάλλαξης στο γονίδιο APC), καθώς και σε άλλα μοντέλα με FAP 323,324. Πολλές μη τυχαιοποιημένες μελέτες αναφέρουν ότι οι ασθενείς που κάνουν τακτική χρήση ασπιρίνης και άλλων ΜΣΑΦ εμφανίζουν χαμηλότερη συχνότητα αδενωματωδών πολυπόδων και χαμηλότερη συχνότητα ορθοκολικού καρκίνου και θανάτων από αυτόν σε σχέση με τους μη χρήστες Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των εκλεκτικών COX-2 αναστολέων Η εμφάνιση της καινούριας κατηγορίας ΜΣΑΦ, των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2, υπόσχεται αυξημένη ασφάλεια εξ αιτίας της μη αναστολής της COX-1 σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις in vivo 318. Η α- σφάλεια αυτή είναι πιο εμφανής σε όργανα και ιστούς στους οποίους μό- 85

86 νο η COX-1 ασκεί σημαντικές και απαραίτητες φυσιολογικές δράσεις όπως στον στόμαχο και στα αιμοπετάλια Πλεονεκτήματα Γαστρεντερικό Οι κυριότερες ανεπιθύμητες δράσεις που συνδέονται με τη χορήγηση των ΜΣΑΦ είναι η εμφάνιση σοβαρών συμβαμάτων από το γαστρεντερικό σύστημα και πιο συγκεκριμένα διάτρησης, εξέλκωσης, στενώσεων και αιμορραγίας τα οποία μπορούν να συμβούν ακόμα και σε ποσοστό 2-4% 326. Οι συνδεόμενες με τη χρήση ΜΣΑΦ σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες από το ανώτερο γαστρεντερικό σύστημα έχουν ως αποτέλεσμα εισαγωγές σε νοσοκομείο και θανάτους στις ΗΠΑ κάθε χρόνο 327. Οι παθολογικές αυτές καταστάσεις αποδίδονται στην αναστολή της COX-1 από τα ΜΣΑΦ που οδηγεί σε ελαττωμένη σύνθεση προσταγλανδινών με επακόλουθη ελάττωση της γαστροπροστασίας. Την υπόθεση αυτή στηρίζει και η παρατήρηση ότι η από του στόματος χορήγηση μισοπροστόλης, ενός συνθετικού ανάλογου των προσταγλανδινών, μειώνει σημαντικά τη συχνότητα αυτών των ανεπιθύμητων ενεργειών 328. Τα νεότερα λοιπόν αναλγητικά τα οποία δεν επηρεάζουν την COX-1 αναμένονται να έχουν λιγότερες σοβαρές γαστρεντερικές επιπλοκές. Μεγάλες πολυκεντρικές μελέτες (VIGOR 329, CLASS 330, TARGET 331, SUCCESS-I 332 ) οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς έχουν ελαττωμένη τοξικότητα στο γαστρεντερικό σε σύγκριση με τα παραδοσιακά ΜΣΑΦ και προκαλούν λιγότερες επιπλοκές. Κλινικές μελέτες επίσης υποστηρίζουν ότι η μειωμένη επίπτωση των ανεπιθύμητων ενεργειών είναι περίπου ίση με αυτή που επιδεικνύεται προσθέτοντας θεραπεία με αναστολείς της αντλίας πρωτονίων μαζί με τα παραδοσιακά ΜΣΑΦ 333. Ο κίνδυνος για σοβαρές γαστρεντερικές επιπλοκές αυξάνει σε ασθενείς με: ηλικία άνω των 65 ετών, ιστορικό πεπτικού έλκους, λήψη κορτικοστεροειδών, λήψη αντιπηκτικών και λήψη α- σπιρίνης. Στους ασθενείς αυτούς θα πρέπει να γίνεται συνετή χρήση των ΜΣΑΦ Μειονεκτήματα Καρδιαγγειακό Το πρόβλημα που προκύπτει από την αναστολή εκλεκτικά της COX-2 είναι ότι μπορεί να παρουσιαστούν μεταβολικές ανισορροπίες που οδηγούν σε υπερπαραγωγή επιβλαβών υποπροϊόντων που μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στο τοίχωμα των αρτηριών και κατά συνέπεια αρτηριακό θρόμβο 335. Όταν αναστέλλεται η COX-2, συντίθεται λιγότερη PGI 2 από το αραχιδονικό οξύ και περισσότερη λευκοτριένη Β 4 και θρομ- 86

87 βοξάνη Α 2 (ΤΧΑ 2 ). Η PGI 2 έχει δράση αγγειοδιασταλτική και αντιθρομβωτική, ενώ αντιθέτως η ΤΧΑ 2 έχει δράση αγγειοσυσπαστική και θρομβωτική. Η ανισορροπία που δημιουργείται από την εκλεκτική αναστολή της COX-2 υπερ της ΤΧΑ 2 οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο ανεπιθύμητων ενεργειών από το καρδιαγγειακό σύστημα 336. Μεγάλες πολυκεντρικές μελέτες και επιδημιολογικές έρευνες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι COX-2 αναστολείς αυξάνουν τον κίνδυνο εμφράγματος του μυοκαρδίου και αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου. Τα στοιχεία αυτά είχαν ως αποτέλεσμα την απόσυρση της ροφεκοξίμπης (Vioxx) και της βαλντεκοξίμπης (Bextra). Ένας ακόμα λόγος που οδήγησε στην απόσυρση της βαλντεκοξίμπης είναι ο υψηλός αριθμός σοβαρών δερματολογικών ανεπιθύμητων ενεργειών της όπως το σύνδρομο Stevens-Johnson. Μερικές έρευνες έδειξαν ότι η σελεκοξίμπη (Celebrex) και η λουμιρακοξίμπη (Prexige) έχουν ελαφρώς καλύτερο προφίλ ασφάλειας από τους υπόλοιπους COX-2 αναστολείς. Επειδή τα οφέλη από τη χορήγηση των ουσιών αυτών φαίνεται πως είναι πιο σημαντικά από τους πιθανούς καρδιαγγειακούς κινδύνους, τα δύο φάρμακα αυτά μαζί με την παρεκοξίμπη (Dynastat) παρέμειναν στην αγορά 331,337. Γενικά οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 αντενδείκνυνται σε ασθενείς με ιστορικό στεφανιαίας νόσου, αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου, συμφορητικής καρδιακής α- νεπάρκειας και προσφάτου αορτοστεφανιαίας παράκαμψης. 6.7 Κυκλοοξυγενάση-2 και καρκίνος Ο ορθοκολικός καρκίνος αποτελεί τον τρίτο σε συχνότητα τύπο καρκίνου και των δύο φύλων και τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Σύντομα μετά την ευρεία χρήση της ασπιρίνης ως αντιπυρετικό, αναλγητικό και αντιφλεγμονώδες φάρμακο στα τέλη του 19 ου αιώνα, α- νακαλύφθηκε μία κατηγορία φαρμάκων με παρόμοιες ιδιότητες, τα μηστεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ). Επιδημιολογικές μελέτες κατέδειξαν ότι η μακροχρόνια χορήγηση ασπιρίνης ή ΜΣΑΦ συνδεόταν με 30-50% μείωση του κινδύνου ορθοκολικού καρκίνου ή αδενωματωδών πολυπόδων ή θανάτου από ορθοκολικό καρκίνο 338. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η διάρκεια και η σταθερότητα της χορήγησης των ΜΣΑΦ ή- ταν πιο σημαντικές από τη χορηγούμενη δοσολογία. Επίσης παρατηρήθηκε η αναστροφή πολυπόδων του ορθού σε μικρό αριθμό ασθενών με σύνδρομο οικογενούς πολυποδίασης του παχέος εντέρου (Familial Adenomatous Polyposis FAP) μετά από χορήγηση του ΜΣΑΦ σουλινδάκη 339. Ακολούθησαν διπλές-τυφλές τυχαιοποιημένες μελέτες σε ασθενείς με FAP που έδειξαν ότι η σουλινδάκη και η σελεκοξίμπη οδηγούν, σε μερικούς ασθενείς σε υποστροφή των πολυπόδων και σε κάποιους ασθε- 87

88 νείς σε πλήρη υποστροφή 322,340,341. Κλινικές δοκιμές σε άλλους πληθυσμούς υψηλού κινδύνου γενικά έδειξαν ευνοϊκή μείωση στον αριθμό και/ή μέγεθος των αδενωμάτων αν και τα αποτελέσματα κρίθηκαν ασυνεπή. Σε νέους ασθενείς με FAP οι οποίοι συμμετείχαν σε τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή πριν από την ανάπτυξη ορθοκολικών αδενωμάτων, η σουλινδάκη δεν εμφάνισε σημαντική επίδραση στην πρόληψη της de novo δημιουργίας αδενωμάτων 342. Πέρα όμως από τα αρχικά, πολλά υ- ποσχόμενα αποτελέσματα, δεν υπάρχουν προς το παρόν επαρκείς ενδείξεις που συνιστούν τη μαζική χρήση των φαρμάκων αυτών για την πρωτογενή πρόληψη του ορθοκολικού καρκίνου 343. Περισσότερες κλινικές δοκιμές που βρίσκονται σε εξέλιξη αναμένεται να δώσουν μια πιο ολοκληρωμένη εκτίμηση για τη χημειοπροφυλακτική δράση των παραγόντων αυτών Η έκφραση της COX-2 στον ορθοκολικό καρκίνο Ο ορθοκολικός καρκίνος έχει μελετηθεί εκτενώς και οι γνώσεις που έχουν αποκτηθεί απέδειξαν ότι τα καρκινώματα αναπτύσσονται σταδιακά από τις ανώμαλες κρύπτες σε αδενώματα με αυξανόμενο βαθμό δυσπλασίας και τελικά σε καρκίνο. Σύμφωνα με αυτή την αλληλουχία αδενώματος-καρκινώματος, η καρκινογένεση προχωρεί μέσω της συσσώρευσης διάφορων γενετικών μεταλλάξεων κατασταλτικών γονιδίων (APC, p53), ογκογονιδίων καθώς και επιγενετικών αλλαγών (μεθυλίωση) 344. Η COX-2 εκφράζεται νωρίς κατά τη διάρκεια αυτών των γεγονότων, με αποτέλεσμα να θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Επιπρόσθετα, αυξημένες συγκεντρώσεις COX-2 βρέθηκαν στον ορθοκολικό καρκίνο σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Η COX- 2 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των μεταλλαγμένων επιθηλιακών κυττάρων, ενώ μερικές μελέτες παρατήρησαν και υπερέκφραση COX-2 και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και μακροφάγα πέριξ του όγκου 344. Μεγάλος αριθμός μελετών έδειξαν αυξημένα επίπεδα COX-2 mrna στα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα του παχέος εντέρου, ενώ η έκφραση της COX-1 βρέθηκε σε φυσιολογικά ή και χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς. Πολυπαραγοντικές αναλύσεις έδειξαν ότι η έκφραση της COX-2 αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για μετάσταση, ο οποίος υπολείπεται μόνο της λεμφαδενικής διασποράς. Επιπρόσθετα, σημαντικά χειρότερη επιβίωση παρατηρήθηκε σε ασθενείς με έκφραση της COX-2 σε σύγκριση με αυτούς χωρίς έκφραση COX Ακολούθησαν και μελέτες οι οποίες επιχείρησαν να συσχετίσουν την έκφραση της COX-2 με την επιβίωση, αλλά επρόκειτο για αναδρομικές μελέτες με μικρό δείγμα 347. Ε- πομένως, περισσότερες ισχυρές αποδείξεις από προοπτικές μελέτες απαι- 88

89 τούνται για να καθορίσουν την κλινική αξία της έκφρασης της COX-2 ως ανεξάρτητου προγνωστικού παράγοντα, παράλληλα με την ταξινόμηση κατά ΤΝΜ. Διάφορα πειραματικά μοντέλα ζώων προσέφεραν ενδείξεις για το ρόλο της COX-2 στην καρκινογένεση του ορθοκολικού καρκίνου. Τα ε- πίπεδα της COX-2 βρέθηκαν αυξημένα σε επίμυες που έφεραν μετάλλαξη (ΜΙΝ, multiple intestinal neoplasia) ανάλογη με αυτή της οικογενούς πολυποδίασης του παχέος εντέρου στον άνθρωπο (APC, adenomatous polyposis coli) 348. Σε μοντέλο χημικά προκληθέντος ορθοκολικού καρκίνου, η COX-2 ανιχνεύεται στις προκαρκινωματώδεις βλάβες και αυξάνεται στα απώτερα στάδια της καρκινικής ανάπτυξης 349. Άμεση απόδειξη του ρόλου της COX-2 στον ορθοκολικό καρκίνο προήλθε από τη χρησιμοποίηση των τεχνικών εξουδετέρωσης γονιδίων (knockout). Στο μοντέλο APC-MIN, η ανάπτυξη εντερικών πολυπόδων υποεξαπλασιάστηκε στους επίμυες στους οποίους εξουδετερώθηκε το γονίδιο για την COX-2. Αν και δεν επιτεύχθηκε πλήρως η πρόληψη της ανάπτυξης πολυπόδων στους επίμυες COX-2-/-MIN, παρ όλα αυτά η μελέτη αυτή αναδεικνύει άμεση γενετική απόδειξη της σημασίας της COX-2 στον ορθοκολικό καρκίνο ΜΣΑΦ και εκλεκτικοί COX αναστολείς στον ορθοκολικό καρκίνο Πολλές πειραματικές, επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες δείχνουν ότι τα ΜΣΑΦ και ιδιαίτερα οι εκλεκτικοί COX-2 αναστολείς, είναι πολλά υποσχόμενοι αντικαρκινικοί παράγοντες 324. Η μακροχρόνια χορήγηση ΜΣΑΦ συνδέεται με χαμηλότερο κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου και αδενωματωδών πολυπόδων και δύο συγκεκριμένα ΜΣΑΦ, η σελεκοξίμπη και η σουλινδάκη, βρέθηκαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη των πολυπόδων και να προκαλούν υποστροφή των ήδη υπαρχόντων πολυπόδων σε τυχαιοποιημένες μελέτες με ασθενείς με FAP. Παρ όλα αυτά ορισμένα αδιευκρίνιστα θέματα που αφορούν την ασφάλεια, την αποτελεσματικότητα, το κατάλληλο δοσολογικό σχήμα και το μηχανισμό δράσης, περιορίζουν τη χρήση τους μόνο στους ασθενείς με FAP για την πρόληψη της πολυποδίασης. Ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής δραστηριότητας των ΜΣΑΦ και των κοξιμπών δεν είναι απόλυτα σαφής. Πρόσφατες ανακαλύψεις στον τομέα της μοριακής βιολογίας έριξαν περισσότερο φως στον ορθοκολικό καρκίνο σε μοριακό επίπεδο. Οι πέντε κύριοι μηχανισμοί με τους οποίους η COX-2 συνεισφέρει στον κακοήθη φαινότυπο και στην ογκογένεση είναι: αναστολή της απόπτωσης 89

90 προαγωγή της διεισδυτικότητας ρύθμιση της φλεγμονής και της ανοσοκαταστολής μετατροπή των καρκινογόνων διέγερση της αγγειογένεσης Η καταστολή της αγγειογένεσης βρίσκεται πρόσφατα στο επίκεντρο της θεραπείας του καρκίνου. Τα αγγεία προμηθεύουν με θρεπτικά συστατικά τα όργανα και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων. Ενδοθηλιακά κύτταρα και νέα αγγεία αναπτύσσονται μέσα στον όγκο ως απάντηση σε διάφορες κυτοκίνες όπως ο VEGF και ο bfgf. Ο VEGF συχνά υπερεκφράζεται στα αδενώματα και στα καρκινώματα, μπορεί να ανιχνευθεί στον ορό ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο και σχετίζεται με το στάδιο της νόσου. Η COX-2 είναι ο κυριότερος μοριακός στόχος των ΜΣΑΦ. Τα φάρμακα αυτά είναι γνωστά για την ανασταλτική τους ικανότητα έναντι των COX. Ταυτόχρονα, η COX-2 εμπλέκεται από τα αρχικά στάδια της αλληλουχίας αδενώματος-καρκινώματος. Οι αποδείξεις ότι η αναστολή της COX-2 έχει χημειοπροστατευτική δράση βασίζονται σε διάφορες in vitro μελέτες, μελέτες σε διάφορα μοντέλα επίμυων με οικογενή πολυποδίαση του παχέος εντερου (FAP familial adenomatous polyposis) και τυχαιοποιημένη μελέτη που επιδεικνύει ότι ο εκλεκτικός COX-2 αναστολέας σελεκοξίμπη προκαλεί υποχώρηση των αδενωμάτων σε ασθενείς με FAP 322,351,352. Επιπρόσθετα, τα επίπεδα προσταγλανδίνης μειώθηκαν στον ορθοκολικό βλεννογόνο των ασθενών με FAP που παρουσίασαν υποχώρηση των αδενωμάτων με χορήγηση σουλινδάκης, υποδηλώνοντας ότι η COX-2 αποτελεί χημειοπροστατευτικό στόχο των ΜΣΑΦ 353,354. Υπάρχουν αποδείξεις για την ύπαρξη χημειοπροστατευτικών μηχανισμών των ΜΣΑΦ ανεξάρτητων από την COX-2. Έτσι τα ΜΣΑΦ προκαλούν απόπτωση σε κύτταρα που στερούνται της COX-2 ενώ οι προσταγλανδίνες δε μπορούν να προστατεύσουν τα κύτταρα από την προκαλούμενη από τα ΜΣΑΦ απόπτωση

91 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ Η αποτυχία της επαρκούς επούλωσης της αναστόμωσης του παχέος εντέρου μετά από κολεκτομή είναι μία σοβαρή και δυνητικά θανατηφόρος επιπλοκή, η οποία επιβαρύνει σημαντικά την μετεγχειρητική νοσηρότητα και θνητότητα. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 (κοξίμπες) είναι μία σχετικά καινούρια και εξελισσόμενη κατηγορία ΜΣΑΦ η οποία υπόσχεται αντιμετώπιση των συμπτωμάτων του πόνου και της φλεγμονής προκαλώντας λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες σε σχέση με τα υπόλοιπα ΜΣΑΦ που αναστέλλουν μη εκλεκτικά τόσο την COX-1 όσο και την COX-2. Νεότερα δεδομένα δείχνουν ότι τα ΜΣΑΦ μπορούν να αποτελέσουν φάρμακα που έχουν ρόλο στην πρόληψη έναντι μερικών τύπων νεοπλασμάτων. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX βρίσκονται σε πλεονεκτική θέση σε σχέση με τα υπόλοιπα ΜΣΑΦ αφού είναι πιο ασφαλείς για μακροχρόνια χορήγηση καθόσον δεν αναστέλλουν τη σύνθεση των προσταγλανδινών και δεν επηρεάζουν τη λειτουργία των αιμοπεταλίων. Εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 όπως η σελεκοξίμπη χορηγούνται ολοένα και σε περισσότερους ασθενείς στην περιεγχειρητική περίοδο, κυρίως για αναλγησία 356,357. Τα προβλήματα τα οποία έχουν προκύψει στα φάρμακα της κατηγορίας αυτής σε σχέση με τις ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν από το καρδιαγγειακό σύστημα αλλά και κάποιες άλλες σπανιότερες (π.χ. σύνδρομο Stevens-Johnson για την βαλντεκοξίμπη) οδήγησαν στην απόσυρση από την κυκλοφορία μερικών από τους ήδη χρησιμοποιούμενους COX-2 αναστολείς (Vioxx-rofecoxib, Bextra-valdecoxib). Αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν ανακύψει από διάφορες μελέτες σχετικά με την υπεροχή των φαρμάκων αυτών όσον αφορά τις ανεπιθύμητες ενέργειες σε σύγκριση με τους υπόλοιπους αναστολείς της COX. Επί του παρόντος υπάρχει μία επιφυλακτική στάση τόσο από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), όσο και από τον αντίστοιχο Ευρωπαϊκό φορέα (EMEA) προς τα φάρμακα αυτά αλλά και συνολικά προς τα ΜΣΑΦ τα οποία επανεξετάζονται και κρίνεται συνολικά το όφελος της μακροχρόνιας χορήγησής τους σε σχέση με τις ανεπιθύμητες ενέργειες που προκαλούν. Παρ όλα αυτά, η έ- ρευνα για την εξέλιξη των κοξιμπών συνεχίζεται και πιστεύεται ότι τα προβλήματα θα ξεπεραστούν με τις 3 ης γενιάς κοξίμπες και τα φάρμακα αυτά θα συνεισφέρουν τόσο στην αντιμετώπιση του χρόνιου πόνου όσο και στη χημειοπροφύλαξη έναντι του καρκίνου. 91

92 Εκτός από την κατηγορία των ασθενών που λαμβάνουν συστηματικά εκλεκτικούς COX-2 αναστολείς για τη θεραπεία του χρόνιου πόνου, οι κοξίμπες μπορούν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν ευρέως στη χημειοπροφύλαξη έναντι συγκεκριμένων μορφών καρκίνου. Η μακροχρόνια χορήγηση σελεκοξίμπης σε ασθενείς με FAP οδήγησε σε μείωση του α- ριθμού και του μεγέθους των πολυπόδων του παχέος εντέρου 340,341,322. Ταυτόχρονα, η προεγχειρητική θεραπεία με σελεκοξίμπη σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο είχε ως αποτέλεσμα τη μεταβολή της έκφρασης γονιδίων που οδήγησαν στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Τα αποτελέσματα αυτά είναι ενδεικτικά της επίδρασης της σελεκοξίμπης και κατ επέκταση και των υπόλοιπων αναστολέων της COX-2 στον ορθοκολικό καρκίνο και θέτει τις βάσεις για ευρύτερες μελέτες στις οποίες η σελεκοξίμπη θα χρησιμοποιείται είτε μόνη είτε σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Το κύριο ερώτημα στο οποίο η παρούσα μελέτη επιχειρεί να δώσει μια απάντηση είναι το αν επηρεάζει η χορήγηση ενός εκλεκτικού αναστολέα της COX-2 (σελεκοξίμπη) την επουλωτική διαδικασία στην αναστόμωση του παχέος εντέρου. Με σκοπό την απάντηση του παραπάνω ερωτήματος, η παρούσα ερευνητική εργασία εστιάστηκε στο αν η χορήγηση της σελεκοξίμπης σε επίμυες: επηρεάζει τη δύναμη της νεοσχηματισμένης αναστόμωσης έτσι όπως αυτή εκφράζεται από τη μέτρηση της πίεσης διάσπασης της αναστόμωσης διαφοροποιεί την αγγειογένεση στην περιοχή της αναστόμωσης μέσω της μέτρησης των νεοσχηματισμένων αγγείων με ανοσοϊστοχημεία αλλοιώνει την επούλωση της αναστόμωσης αναστέλλοντας τη δραστηριότητα των MMPs μέσω της μέτρησης των MMPs και των TIMPs με ζυμογραφία και ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) 92

93 8 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ 8.1 Πειραματόζωα Ο πειραματισμός έγινε σύμφωνα με τις διατάξεις της «Ευρωπαϊκής Σύμβασης για την προστασία των σπονδυλωτών ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς ή επιστημονικούς σκοπούς» και τις άλλες κείμενες διατάξεις περί «Προστασίας ζώων» (Ν.1197/81 αρθρ.4, Ν.2015/92, Π.Δ. 160/91). Τα πειράματα έγιναν στο Εργαστήριο Επιστημονικής Έρευνας και Πειραματικής Χειρουργικής της Β Χειρουργικής Προπαιδευτικής Κλινικής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Ιπποκράτειο Νοσοκομείο). Για την εκπόνηση της πειραματικής μελέτης πάρθηκε ειδική έγκριση από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής της Νομαρχίας Θεσσαλονίκης με Αριθμ. Πρωτ.: 13/6541/ Για την πραγματοποίηση του πειραματικού σκέλους της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 72 άρρενες επίμυες της φυλής Wistar, βάρους gr περίπου. Καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος τα πειραματόζωα στεγάστηκαν σε περιβάλλον σταθερής θερμοκρασίας (20-22 C), υγρασίας, αερισμού και υγιεινής με 12ωρη εναλλαγή ημέρας και νύχτας. Τα ζώα φυλάσσονταν ανά τριάδες σε ξεχωριστούς κλωβούς κατασκευασμένους από plexiglass. Η πρόσβαση στην τροφή και στο νερό ήταν ελεύθερη και συνεχής σε όλη τη διάρκεια του εικοσιτετραώρου ενώ σε όλους χορηγήθηκε η ίδια τυποποιημένη τροφή (φύραμα Νο 510, ΕΛΒΙΖ). Τα πειραματόζωα προήλθαν από αποικία που δημιουργήθηκε στο Θεαγένειο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. 8.2 Πειραματική διάταξη Οι 72 άρρενες επίμυες χωρίστηκαν τυχαία σε δύο κύριες ομάδες των 36 επίμυων, την ομάδα μελέτης και την ομάδα ελέγχου, ανάλογα με τη χορήγηση ή μη φαρμακευτικής ουσίας στα πειραματόζωα. Οι ομάδες αυτές με τη σειρά τους διαιρέθηκαν σε δύο υποομάδες των 18 επίμυων, ανάλογα με το αν η θυσία του πειραματοζώου πραγματοποιήθηκε την 3 η ή την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. Οι ομάδες αυτές είναι: 1. Ομάδα μελέτης (ΟΜ) Στους επίμυες της ομάδας αυτής χορηγήθηκε μέσω στοματογαστρικού καθετήρα η φαρμακευτική ουσία σελεκοξίμπη σε δόση 10mg/kg B.Σ. μία φορά ημερησίως. Η χορήγηση του φαρμάκου 93

94 ξεκίνησε 3 ημέρες προεγχειρητικά και συνεχίστηκε καθημερινά μέχρι και την ημέρα της θυσίας του πειραματοζώου. Ο καθορισμός της δόσης γινόταν μετά από καθημερινό προσδιορισμό του βάρους των επίμυων. 1α. Ομάδα μελέτης Θυσία την 3 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΜ 3 ης ) Η ομάδα αυτή αποτελούταν από 18 επίμυες οι οποίοι θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα. 1β. Ομάδα μελέτης Θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΜ 7 ης ) Η ομάδα αυτή αποτελούταν από 18 επίμυες οι οποίοι θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. 2. Ομάδα ελέγχου (ΟΕ) Στους επίμυες της ομάδας αυτής χορηγήθηκε μέσω στοματογαστρικού καθετήρα με τον ίδιο ακριβώς τρόπο placebo αγωγή μία φορά ημερησίως. Η χορήγηση του placebo ξεκίνησε 3 ημέρες προεγχειρητικά και συνεχίστηκε καθημερινά μέχρι και την ημέρα της θυσίας του πειραματοζώου. 2α. Ομάδα ελέγχου Θυσία την 3 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΕ 3 ης ) Η ομάδα αυτή αποτελούταν από 18 επίμυες οι οποίοι θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα. 2β. Ομάδα ελέγχου Θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΕ 7 ης ) Η ομάδα αυτή αποτελούταν από 18 επίμυες οι οποίοι θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. 8.3 Χορήγηση φαρμακευτικής ουσίας Η φαρμακευτική ουσία χορηγήθηκε ενδογαστρικά σε δοσολογία 10mg/kg ΒΣ/ημέρα, μία φορά ημερησίως μετά από ήπια νάρκωση του πειραματοζώου με βραχυχρόνια παραμονή του σε γυάλινο κλωβό που περιείχε γάζα εμποτισμένη με αιθέρα. Κατόπιν επίτευξης ικανοποιητικής αναισθητοποίησης του πειραματοζώου τοποθετήθηκε ο ρινογαστρικός καθετήρας. Η διαδικασία είναι αρκετά επικίνδυνη, αφού μπορεί ο καθετήρας από λανθασμένους χειρισμούς και λόγω κατάργησης των αντανακλαστικών του επίμυος, να οδηγηθεί προς την αναπνευστική οδό του ε- πίμυος, οπότε η χορήγηση του φαρμάκου να προκαλέσει επιπλοκές από το αναπνευστικό σύστημα, αλλά ακόμα και το θάνατο του πειραματόζωου. Η χορήγηση τόσο της φαρμακευτικής ουσίας όσο και του placebo γινόταν πάντοτε την ίδια ώρα της ημέρας, συνήθως στις 9π.μ. περίπου. 94

95 8.4 Ζύγιση πειραματοζώων - Βάρος Τα πειραματόζωα ζυγίζονταν καθημερινά με ηλεκτρονικό ζυγό στις 9π.μ. περίπου από την εκκίνηση του πειράματος έως και την ημέρα της θυσίας. Το βάρος καταγράφηκε αντίστοιχα προς τον ειδικό κωδικό που είχε δοθεί σε κάθε πειραματόζωο. Με τα αποτελέσματα των ζυγίσεων προσδιορίσθηκε η καμπύλη μεταβολής του σωματικού τους βάρους, η οποία ήταν απαραίτητη για τον υπολογισμό των δόσεων της σελεκοξίμπης. Μελετήθηκε στατιστικά η μεταβολή του σωματικού βάρους των επίμυων μεταξύ του βάρους κατά την έναρξη του πειράματος και τη θυσία. 8.5 Χειρουργική επέμβαση Αναισθησία Με σκοπό την αναισθητοποίηση του πειραματοζώου, τοποθετήθηκαν σε γυάλινο κώδωνα που περιείχε γάζα εμποτισμένη με πτητικό αναισθητικό (αιθέρας). Με τον τρόπο αυτό επιτεύχθηκε γρήγορα ολιγόλεπτη αναισθησία, η οποία επέτρεπε τον ασφαλή χειρισμό του πειραματόζωου και την ενδοπεριτοναϊκή έγχυση υδροχλωρικής κεταμίνης (amp Ketalar, 50mg/ml, Parke-Davis), σε δόση 40 mg/kg ΒΣ, προκειμένου να επιτευχθεί αναισθησία ικανοποιητικής διάρκειας (περίπου 30 min) για τη διενέργεια της χειρουργικής επέμβασης. Η αναισθητοποίηση του πειραματοζώου γίνονταν αντιληπτή μετά την παρέλευση λίγων λεπτών, από σημεία όπως: απουσία κινητικότητας, πτώση του πειραματόζωου, παύση των καταποτικών κινήσεων καθώς και απουσία κινήσεως των τριχών του ρύγχους του. Με τον τρόπο αυτό, εξασφαλίσθηκε αναλγησία και έλεγχος της ευερεθιστότητας για χρονικό διάστημα περίπου μιας ώρας. Καθ όλη τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και της αναισθητοποίησης του πειραματοζώου ελέγχονταν μακροσκοπικά η αναπνοή. Ο τρόπος αυτός αναισθητοποίησης θεωρείται ιδιαίτερα ασφαλής, γεγονός που επιβεβαιώθηκε και στη δική μας πειραματική μελέτη όπου δεν παρατηρήθηκαν θανατηφόρα ή άλλα συμβάματα για τα οποία να μπορεί να ενοχοποιηθεί η αναισθησία Προετοιμασία του επίμυος Μετά την αναισθητοποίηση ακολούθησε ο ευπρεπισμός της κοιλιακής επιφάνειας του πειραματόζωου. Αρχικά έγινε διαβροχή του κοιλιακού τοιχώματος με αραιό υδατικό διάλυμα Cetavlon και ακολούθως ξύ- 95

96 ρισμα του εγχειρητικού πεδίου από το κατώτερο τριτημόριο του προσθίου θωρακικού τοιχώματος μέχρι την ηβική σύμφυση. Στη συνέχεια, το πειραματόζωο ακινητοποιήθηκε στο χειρουργικό τραπέζι, το οποίο αποτελείται από μία επιτραπέζια χοντρή πλάκα από plexiglass (περίπου 30Χ40cm) με εγκοπές στις τέσσερις γωνίες για την ακινητοποίηση του επίμυος. Ιδιαίτερη προσοχή απαιτήθηκε κατά την πρόσδεση των άνω σκελών, η ακινητοποίηση των οποίων έπρεπε να είναι χαλαρότερη, για να μην επηρεαστούν οι ελεύθερες αναπνευστικές κινήσεις του επίμυος. Στη συνέχεια, το χειρουργικό πεδίο επιστρώθηκε με διάλυμα Betadine 10% και καλύφθηκε με αποστειρωμένο οθόνιο μιας χρήσεως. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί ο κίνδυνος πρόκλησης υποθερμίας κατά τη διάρκεια της αναισθησίας, φαινόμενο που οφείλεται σε πληθώρα παραγόντων. Καταρχήν, τα αναισθητικά φάρμακα καταστέλλουν τους μηχανισμούς θερμορρύθμισης του πειραματόζωου, ενώ επιπλέον, παρατηρούνται μεγάλες απώλειες θερμότητας, λόγω του εγχειρητικού τραύματος και της μεγάλης επιφάνειας σώματος του επίμυος σε σχέση με το βάρος του 357. Για την αποφυγή λοιπόν του φαινομένου της υποθερμίας τα πειραματόζωα τοποθετήθηκαν σε θερμοφόρα πάνω στο χειρουργικό τραπέζι ενώ για όλα τα υγρά που χρησιμοποιήθηκαν λήφθηκε φροντίδα ώστε να έχουν περίπου τη θερμοκρασία του σώματος (37 ο C) Χειρουργική τεχνική Πραγματοποιήθηκε μέση τομή στο υπογάστριο του επίμυος, αναγνώριση και διάνοιξη της λευκής γραμμής. Για τη συγκράτηση-διάνοιξη των κοιλιακών τοιχωμάτων χρησιμοποιήθηκε αυτοσυγκρατούμενος διαστολέας Adson-Baby. Το επίπλουν και το λεπτό έντερο έλκονταν με ήπιους χειρισμούς προς τα δεξιά εκτός της περιτοναϊκής κοιλότητας και καλύφθηκαν με υγρό τεμάχιο γάζας. Ακολούθησε η αναγνώριση του παχέος εντέρου και σε σημείο 3cm κεντρικότερα από την ανάκαμψη του περιτοναίου η εκτομή τμήματος εντέρου μήκους 1cm, με προσοχή για την αποφυγή τραυματισμού του μεσεντερικού αγγειακού δικτύου 358 (Εικόνα 8). Μετά την εκτομή, ακολούθησε μηχανικός καθαρισμός, τόσο του κεντρικού όσο και του περιφερικού κολοβώματος του παχέος εντέρου από τα κόπρανα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε τελικοτελική αναστόμωση με διακεκομμένες ραφές Prolene 6-0 (Εικόνα 9). Η πρώτη ραφή τοποθετούνταν στο αντιμεσεντερικό χείλος του εντέρου και η δεύτερη στο μεσεντερικό χείλος, με τις δύο ραφές να χρησιμοποιούνται στη συνέχεια ως οδηγά ράμματα. 96

97 Εικόνα 8. Έξοδος του παχέος εντέρου από το τραύμα και εκτομή του. Εικόνα 9. Τοποθέτηση ραφών για τη δημιουργία της αναστόμωσης 97

98 Εικόνα 10. Ολοκλήρωση της τοποθέτησης των ραφών της αναστόμωσης Εικόνα 11. Σύγκλειση του τραύματος σε δύο στρώματα 98

99 Ξεκινώντας από το μεσεντερικό χείλος ακολούθησαν και οι υπόλοιπες ολοτοιχωματικές ραφές από κάθε πλευρά. Συνολικά απαιτήθηκαν 6-8 ραφές για την ολοκλήρωση της κάθε αναστόμωσης (Εικόνα 10). Πραγματοποιήθηκε έκπλυση της περιτοναϊκής κοιλότητας με φυσιολογικό ορό, επανατοποθέτηση των σπλάγχνων εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας και σύγκλειση του τραύματος σε δύο στρώματα με συνεχή ραφή (Εικόνα 11). Ακολούθησε τοπική αντισηψία της περιοχής του τραύματος. Η επέμβαση είχε διάρκεια περίπου λεπτά. Μετά την ανάνηψη, το κάθε πειραματόζωο τοποθετήθηκε μόνο του σε ξεχωριστό κλωβό, για να αποφευχθεί η κακοποίηση από άλλους επίμυες, όπου και παραμένει μέχρι τη θυσία Επανεπέμβαση - Θυσία Η επανεγχείρηση των πειραματοζώων πραγματοποιήθηκε την 3 η ή την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, ανάλογα με την ομάδα στην οποία εντάχθηκε το κάθε πειραματόζωο και σύμφωνα με τις αρχές ευθανασίας των πειραματοζώων. Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε προνάρκωση με την τοποθέτησή τους σε γυάλινο κλωβό με γάζα εμποτισμένη με αιθέρα και χορήγηση μικρής δόσης κεταμίνης προεγχειρητικά. Έγινε εξέταση του τραύματος των πειραματοζώων για επιπλοκές (διαπύηση, διάσπαση) και στη συνέχεια διάνοιξη του κοιλιακού τοιχώματος. Πραγματοποιήθηκε μακροσκοπική εξέταση της περιτοναϊκής κοιλότητας για τυχόν ύπαρξη εντερικής απόφραξης αλλά και συγκεκριμένα της περιοχής της αναστόμωσης για την ύπαρξη αναστομωτικών επιπλοκών, όπως ενδοκοιλιακών αποστηματίων, διάσπασης της αναστόμωσης, περιτονίτιδας ή στένωσης της αναστόμωσης. Η αξιολόγηση των συμφύσεων καταγράφηκε με βάση τη βαθμολογία της κλίμακας των Knightly και συν. 359 από το 0 έως το 4: 0 χωρίς συμφύσεις 1 μία λεπτή σύμφυση που διαχωρίζεται εύκολα 2 μετρίως εκτεταμένες συμφύσεις που δεν ανθίστανται στην τάση 3 αρκετά εκτεταμένες ασθενείς συμφύσεις με σπλάχνα και περίτονο περιτόναιο 4 πολλές εκτεταμένες συμφύσεις που αφορούν το μεσεντέριο, έντερο, επίπλουν και επεκτείνονται έως το κοιλιακό τοίχωμα Η αναστόμωση χαρακτηρίσθηκε στενωμένη όταν του πάχος του εντέρου ήταν διπλάσιο κεντρικά σε σύγκριση με αυτό περιφερικά της αναστόμωσης. Η ευθανασία προκλήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση θειοπεντάλης (Pentothal). 99

100 8.6 Μέτρηση της πίεσης διάσπασης H καταγραφή της πίεσης διάσπασης των αναστομώσεων βασίστηκε στο μοντέλο που προτάθηκε από τους Van der Ham και συν. 360 Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, αρχικά πραγματοποιήθηκε η εκτομή τμήματος του παχέος εντέρου μήκους 4cm στο μέσο του οποίου βρίσκεται η αναστόμωση, με ιδιαίτερη όμως προσοχή έτσι ώστε να αποφευχθεί η διαταραχή τόσο της αναστόμωσης όσο και των συμφύσεων που την περιβάλλουν. Στη συνέχεια διενεργήθηκε επιμελής καθαρισμός του εντέρου από το κοπρανώδες περιεχόμενό του. Αμφότερα τα άκρα του αφαιρεθέντος τμήματος του εντέρου απολινώθηκαν και ταυτόχρονα στο ουραίο άκρο του εφαρμόσθηκε μανόμετρο καταγραφής της ενδοαυλικής πίεσης και αντλία συνεχούς έγχυσης φυσιολογικού ορού με ρυθμό 1ml/min. Κατά τη διάρκεια της έγχυσης παρακολουθήθηκε η ενδοαυλική πίεση μέχρι τη στιγμή κατά την οποία συνέβη η ρήξη. Η ρήξη αυτή διαπιστώθηκε από την απότομη πτώση της πίεσης έτσι όπως εμφανίσθηκε στο μανόμετρο. Στη συνέχεια καταγράφηκε η πίεση διάσπασης και επισημάνθηκε αν το σημείο της ρήξης βρίσκονταν πάνω στην αναστομωτική γραμμή ή μακριά από την αναστόμωση. 361 Αφού ολοκληρώθηκε η διαδικασία μέτρησης της πίεσης διάσπασης, η αναστόμωση διαχωρίσθηκε επιμήκως σε δύο ίσα τμήματα. Με τον τρόπο αυτό το μισό τμήμα της αναστόμωσης, το οποίο περιελάμβανε τη μισή αναστομωτική γραμμή, αποστάλθηκε για ιστολογική εξέταση και το υπόλοιπο μισό αποστάλθηκε για βιοχημική ανάλυση. Το τμήμα της αναστόμωσης που θα προορίζονταν για ιστολογική ανάλυση τοποθετήθηκε αμέσως μετά τη λήψη του σε διάλυμα φορμόλης 10% για μονιμοποίηση, ενώ το τμήμα της αναστόμωσης που προορίζονταν για βιοχημική ανάλυση τοποθετήθηκε σε βαθιά κατάψυξη στους -70 C. 8.7 Βιοχημική ανάλυση των παρασκευασμάτων Ανίχνευση και ταυτοποίηση των MMP και ΤIMP Η ανίχνευση και ταυτοποίηση των ζελατινασών MMP-2 και MMP- 9 έγινε με τη μέθοδο της ζυμογραφίας και των MMP-2, TIMP-1 και VEGF με ELISA. Τα παρασκευάσματα της αναστόμωσης του παχέος εντέρου μήκους περίπου 2cm διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες, ανάλογα με την απόσταση από το σημείο της χειρουργικής αναστόμωσης. Η πρώτη ομάδα αφορούσε την περιοχή η οποία περιλαμβάνεται σε απόσταση 0,5cm εκατέρωθεν της αναστόμωσης και η δεύτερη ομάδα το υπολειπόμενο κομμάτι των ιστών, το οποίο αντιπροσωπεύει το τμήμα του παχέος εντέρου που 100

101 βρίσκεται μακριά από την αναστόμωση. Ακολούθως, οι ιστοί τεμαχίσθηκαν περαιτέρω με τη βοήθεια χειρουργικής λεπίδας σε μικρά κομμάτια και ομογενοποιήθηκαν με τη χρήση Polytron homogenizer (5 φορές x 10 sec, με μεσοδιαστήματα 1 λεπτού, σε πάγο) σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mm Tris-HCl, ph 7,4, που περιείχε 5 mm CaCl 2. Ακολούθησε περαιτέρω διαλυτοποίηση των ομογενοποιήματος με υπέρηχους σε υδατόλουτρο Clifton Ultrasonic (Nickel-Electro Ltd) για 10sec, διαδικασία που επαναλήφθηκε 5 φορές με ενδιάμεσα διαλείμματα 1 min. Tα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε αποστειρωμένα πλαστικά φιαλίδια στους - 70 C ως την ημέρα που υποβλήθηκαν σε περαιτέρω διαδικασία απομόνωσης και ανάλυσης της ενζυμικής δραστηριότητας Kαθαρισμός και απομόνωση ενζυμικής δραστηριότητας MMPs O καθαρισμός και η απομόνωση της ενζυμικής δραστηριότητας MMPs από τα δείγματα επιτεύχθηκε σύμφωνα με τη μεθοδολογία των Karakiulakis et al. 362,363,364, με καθίζηση με θειϊκό αμμώνιο, στους 4 C. Tα δείγματα αποψύχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα g για 10 λεπτά. Στο υπερκείμενο προστέθηκε σακχαρόζη, ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση 250 mm και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα g για 1 ώρα Kλασματοποίηση με καθίζηση με θειικό αμμώνιο Οι πρωτεΐνες στο g υπερκείμενο κλασματοποιήθηκαν με διαδοχικές καθιζήσεις με θειικό αμμώνιο. Αρχικά, προστέθηκαν 13,61gr (NH 4 ) 2 SO 4 ανά 100ml διαλύματος, για να επιτευχθεί κορεσμός 25%. Tο 25% κορεσμένο με θειικό αμμώνιο πρωτεϊνικό ίζημα ανακτήθηκε μετά από φυγοκέντριση στα g για 30 min. Ακολούθως, το ίζημα εναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμου και προστέθηκαν 14,73 g (NH 4 ) 2 SO 4 ανά 100ml διαλύματος, για να επιτευχθεί κορεσμός 25-50%. Tο 25-50% κορεσμένο με θειικό αμμώνιο πρωτεϊνικό ίζημα ανακτήθηκε με φυγοκέντρηση στα xg για 30 min. Τέλος, η διαδικασία επαναλήφθηκε για να ανακτηθεί το 50-80% κορεσμένο με θειικό αμμώνιο πρωτεϊνικό ίζημα, μετά την προσθήκη 19,6 g (NH 4 ) 2 SO 4 ανά 100ml διαλύματος. Όλα τα υπερκείμενα διαλύματα καθώς και τα ιζήματα (εναιωρημένα σε ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμου) που προέκυψαν από την παραπάνω κλασματοποίηση, τοποθετήθηκαν σε σάκους διαπίδυσης και υποβλήθηκαν σε εξουθενωτική διαπίδυση υπό συχνή (ανά 6 h) έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμου, για 48 h. Το τελικό διαπίδυμα, από όλα τα 101

102 παραπάνω κλάσματα, ελέγχθηκε για ενζυμική δραστηριότητα και πρωτεϊνική συγκέντρωση. Το 25-50% κορεσμένο με θειϊκό αμμώνιο πρωτεϊνικό ίζημα, το οποίο διαπιστώθηκε ότι περιείχε την πλειονότητα της ενζυμικής δραστηριότητας, υποβλήθηκε σε εξουθενωτική διαπίδυση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως έναντι 25mM Tris-HCl, ph 7,5, συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση υπό κενό στους 4 C (Speed Vac Savant SC110A, με ενσωματωμένη παγίδα ατμών RVT4 104, στους -120 C) Ζυμογράφημα ζελατίνης Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται η ύπαρξη των ζελατινασών τόσο σε μορφή προενζύμου, όσο και σε ενεργοποιημένη μορφή 363,364,365. Τα δείγματα προεπωάσθηκαν για 15 min στους 37 o C σε ρυθμιστικό διάλυμα επεξεργασίας δειγμάτων Laemmli, απουσία β-μερκαπτοαιθανόλης και στη συνέχεια υποβλήθηκαν (10 μg πρωτεΐνης σε τελικό όγκο 10 μl) σε ηλεκτροφόρηση σε πήγματα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε SDS (SDS- PAGE) (25 mamp, 2 h, θερμοκρασία δωματίου), που περιέχει 1 mg/ml ζελατίνη κολλαγόνου τύπου Ι. Μετά την ηλεκτροφόρηση, για την απομάκρυνση του SDS, τα πήγματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-HCl, ph 7.5, 5 mm CaCl 2, 1 μm ZnCl 2, 0.02% NaN3, το οποίο περιέχει 2.5% Τriton X-100 και στη συνέχεια επωάσθηκαν για 20 h στους 37 ο C στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.1% Triton X-100. Μετά την επώαση τα πήγματα βάφτηκαν σε διάλυμα Coomassie Brilliant blue R-250 και ακολούθησε αποχρωματισμός με 45% μεθανόλη, 5% οξικό οξύ (Morrissey, 1981). Στις θέσεις που έχουν ηλεκτροφορηθεί τα ένζυμα, λόγω τοπικής αποδόμησης του υποστρώματος, εμφανίζονται διαφανείς ζώνες λύσης. Η ως άνω διαδικασία επαναλήφθηκε παρουσία των χηλικών ενώσεων Na2EDTA (20 mm), 1,10-φαινανθρολίνης (4 mm), ή υδροχλωρικής βενζαμιδίνης (benzamidine hydrochloride) (5 mm), (Sigma Chemical Co), οι οποίες αναστέλλουν μόνο τις ζώνες λύσης που αντιστοιχούν στις ζελατινάσες, καθώς επίσης και παρουσία των αναστολέων πρωτεασών σερίνης, θειόλης και κυστεϊνης, όπως ο φθοριούχος μεθανοσουλφονικός φαινυλεστέρας (phenylmethanesulphonyl fluoride, PMSF) (1 mm) ή N- αιθυλομηλεϊμίδιο (N-ethylmaleimide, NEM) (5 mm), (Sigma Chemical Co). Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας υπολογίσθηκε με ηλεκτροφόρηση και σύγκριση με καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda), ενεργό MMP-2 (64.0 kda), prommp-9 (92.0 kda) και ενεργό MMP-9 (78.0 kda) του εμπορίου (Anawa Trading, Wangen), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων 102

103 πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: β-γαλακτοσιδάση (116 kda), φωσφορυλάση β (97.4 kda), αλβουμίνη βόειου ορού (66.2 kda), αφυδρογονάση του L-γλουταμινικού (55.0 kda), οβαλβουμίνη (42.7 kda), αλδολάση (40.0 kda) και καρβονική ανυδράση (29 kda) (Promega, Madison, WI) Πυκνομετρία σάρωσης Η σύγκριση μεταξύ δειγμάτων των ζωνών λύσης που εμφανίσθηκαν μετά τη ζυμογραφία με αρνητική χρώση, ύστερα από το χρωματισμό των πρωτεϊνών με Coomasie Brilliant Blue R 250, επιτεύχθηκε με ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για τον προσδιορισμό του ιστικού αναστολέα των ΜΜΡ-1 (ΤΙΜΡ-1) Η ύπαρξη αποδομητικής δραστηριότητας σε ένα βιολογικό δείγμα που οφείλεται σε MMP, εξαρτάται από τα επίπεδα των ενζύμων σε σχέση με αυτά των ΤΙΜΡ. Έστω και αν υπάρχει δυνατότητα ενεργοποίησης των προενζύμων των ΜΜΡ, εάν τα επίπεδα των ΤΙΜΡ υπερβαίνουν αυτά των ΜΜΡ, δεν εκδηλώνεται αποδομητική δραστηριότητα. Για το λόγο αυτό μετρήθηκε παράλληλα με τις ζελατινάσες και ο TIMP-1, σε ομογενοποιημένα δείγματα ιστών, σε εναιώρημα που ισοδυναμούσε με 2 μg πρωτεΐνης με ανοσοενζυμογραφία, χρησιμοποιώντας ELISA με σταθερής φάσης συναγωνιστική ELISA (Quantikin ) χρησιμοποιώντας anti-timp-1. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν επισημασμένο με υπεροξειδάση και ως χρωμογόνο χρησιμοποιήθηκε η ο-φαινυλενο-διαμίνη 365. Χρησιμοποιήθηκαν πλακίδια μικροτιτλοποίησης καλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι του ΤΙΜΡ-1. Τα πρότυπα δείγματα ΤΙΜΡ-1 και τα δείγματα ιστών προστέθηκαν στα πλακίδια και ε- πωάσθηκαν, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Για την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένου ανθρώπινου ΤΙΜΡ-1 (R&D Systems): 0, 0,156, 0,312, 0,625, 1,25, 2,5, 5 και 10 ng/ml PBS-T (10 mm phosphate buffer ph 7.2 / 0.14 M NaCl / 0.05% Tween 20). Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντίσωμα του ποντικού δεσμεύει την ποσότητα του ΤΙΜΡ-1 (αντιγόνο) που υπάρχει στα δείγματα. Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και 103

104 αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Ακολούθως προστέθηκε στα φρεάτια 200μl από ένα δεύτερο πολυκλωνικό αντίσωμα αιγών έναντι του TIMP-1 συζευγμένο με υπεροξειδάση και διαλυμένο σε PBS-T, το οποίο επίσης δεσμεύει το ήδη δεσμευμένο με το πρώτο αντίσωμα αντιγόνο TIMP-1 των δειγμάτων. Τα πλακίδια επωάσθηκαν περαιτέρω, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Στη συνέχεια προστέθηκαν 200μl ενός υποστρώματος υπεροξειδάσης (2mg/ml τετραμεθυλοβενζιδίνης, 0.03% Η 2 Ο 2, σε 0.1 M κιτρικού, ph 5.0) στα φρεάτια και ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC) στο σκοτάδι. Η επακόλουθη αντίδραση υπεροξείδασης / υποστρώματος δημιούργησε ένα μπλε διάλυμα. Ακολούθως προστέθηκε H 2 SO4 (2 M), το οποίο σταματά την αντίδραση και μετατρέπει το χρώμα του διαλύματος σε κίτρινο, μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο ELISA reader, στα 450 nm και 540 nm και υπολογίσθηκε η διαφορά μεταξύ των 2 καταγραφών. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η ίδια ποσότητα ιστού η οποία κατεργάστηκε ως ανωτέρω, με την εξαίρεση της προσθήκης του πρώτου αντισώματος. Όλες οι τιμές διορθώθηκαν με την α- φαίρεση του μάρτυρα Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για την ανίχνευση της MMP-2 Η MMP-2 προσδιορίσθηκε με ποσοτική μέθοδο σταθερής φάσης συναγωνιστική ELISA (Quantikin ). Χρησιμοποιήθηκαν πλακίδια μικροτιτλοποίησης καλυμμένα με πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι της MMP-2. Η μέθοδος ανιχνεύει ολική MMP-2 (prommp-2 και MMP- 2). Τα πρότυπα δείγματα MMP-2 και τα δείγματα ιστών προστέθηκαν στα πλακίδια και επωάσθηκαν, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Για την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένης MMP-2 (R&D Systems): 0, 0,78, 0,1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 και 100 ng/ml PBS-T (10 mm phosphate buffer ph 7.2 / 0.14 M NaCl / 0.05% Tween 20). Τα δείγματα ιστών αποψύχθηκαν στους 37 ºC και ελέγχθηκαν για MMP-2 μέσα σε 1 ώρα. Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντίσωμα του ποντικού δεσμεύει την ποσότητα της prommp-2 και MMP-2 (αντιγόνο) που υπάρχει στα δείγματα. Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων 104

105 αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Ακολούθως προστέθηκε στα φρεάτια 200 μl από ένα δεύτερο πολυκλωνικό αντίσωμα αιγών έναντι του MMP-2 συζευγμένο με υπεροξειδάση και διαλυμένο σε PBS- T, το οποίο επίσης δεσμεύει το ήδη δεσμευμένο με το πρώτο αντίσωμα αντιγόνο MMP-2 των δειγμάτων. Τα πλακίδια επωάσθηκαν περαιτέρω, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl ενός υποστρώματος υπεροξειδάσης (2 mg/ml τετραμεθυλοβενζιδίνης, 0.03% Η 2 Ο 2, σε 0.1 M κιτρικού, ph 5.0) στα φρεάτια και α- κολούθησε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC) στο σκοτάδι. Η επακόλουθη αντίδραση υπεροξείδασης / υποστρώματος δημιούργησε ένα μπλε διάλυμα. Ακολούθως προστέθηκε H 2 SO 4 (2 M), το οποίο σταματά την αντίδραση και μετατρέπει το χρώμα του διαλύματος σε κίτρινο, μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο ELISA reader, στα 450 nm και 540 nm και υπολογίσθηκε η διαφορά μεταξύ των 2 καταγραφών. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η ίδια ποσότητα ομογενοποιημένου ιστού η οποία κατεργάστηκε ως ανωτέρω, με την εξαίρεση της προσθήκης του πρώτου αντισώματος. Όλες οι τιμές διορθώθηκαν με την αφαίρεση του μάρτυρα Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για τον προσδιορισμό του VEGF O προσδιορισμός του VEGF πραγματοποιήθηκε σε ομογενοποιημένα δείγματα ιστών, σε εναιώρημα που ισοδυναμούσε με 2μg πρωτεΐνης με ανοσοενζυμογραφία, χρησιμοποιώντας ELISA, με σταθερής φάσης συναγωνιστική ELISA (Quantikin ) χρησιμοποιώντας anti-vegf. Χρησιμοποιήθηκαν πλακίδια μικροτιτλοποίησης καλυμμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι του VEGF. Τα πρότυπα δείγματα VEGF και τα δείγματα ιστών προστέθηκαν στα πλακίδια και επωάσθηκαν, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Για την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένης VEGF (R&D Systems): 0, 0,78, 0,1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 και 100 ng/ml PBS-T (10 mm phosphate buffer ph 7.2 / 0.14 M NaCl / 0.05% Tween 20). Τα δείγματα ιστών αποψύχθηκαν 105

106 στους 37 ºC και ελέγχθηκαν για VEGF μέσα σε 1 ώρα. Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντίσωμα του ποντικού δεσμεύει την ποσότητα του VEGF (αντιγόνο) που υπάρχει στα δείγματα. Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Ακολούθως προστέθηκε στα φρεάτια 200 μl από ένα δεύτερο πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF συζευγμένο με υπεροξειδάση και διαλυμένο σε PBS-T, το οποίο επίσης δεσμεύει το ήδη δεσμευμένο με το πρώτο αντίσωμα αντιγόνο VEGF των δειγμάτων. Τα πλακίδια ε- πωάσθηκαν περαιτέρω, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 1 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC). Ακολούθησε απόπλυση των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl ενός υποστρώματος υπεροξειδάσης (2 mg/ml τετραμεθυλοβενζιδίνης, 0.03% Η 2 Ο 2, σε 0.1 M κιτρικού, ph 5.0) στα φρεάτια και ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ºC) στο σκοτάδι. Η επακόλουθη αντίδραση υπεροξείδασης / υποστρώματος δημιούργησε ένα μπλε διάλυμα. Ακολούθως προστέθηκε H 2 SO 4 (2 M), το οποίο σταματά την αντίδραση και μετατρέπει το χρώμα του διαλύματος σε κίτρινο, μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο ELISA reader, στα 450nm και 540 nm και υπολογίσθηκε η διαφορά μεταξύ των 2 καταγραφών. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ή ίδια ποσότητα ομογενοποιημένου ιστού η οποία κατεργάστηκε ως ανωτέρω, με την εξαίρεση της προσθήκης του πρώτου αντισώματος. Όλες οι τιμές διορθώθηκαν με την αφαίρεση του μάρτυρα Προσδιορισμός πρωτεϊνών Σε κάθε δείγμα ομογενοποιημένου ιστού, αρχικά έγινε προσδιορισμός του ολικού ποσού των πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad, Glattbrugg, Switzerland), χρησιμοποιώντας αλβουμίνη από βόειο ορό (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany) για τον καθορισμό της πρότυπης καμπύλης. Σε όλες τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε ίση ποσότητα πρωτεϊνών, μετά από ανάλογη αραίωση των δειγμάτων. Όλα τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως προς το περιεχόμενο πρωτεΐνης. 106

107 8.8 Ιστολογική εξέταση Τα παρασκευάσματα των αναστομώσεων διαιρέθηκαν επιμήκως σε δύο ίσα τμήματα με σκοπό η μισή αναστόμωση να αποσταλεί για ιστολογική εξέταση και η μισή για βιοχημική ανάλυση. Το τμήμα της αναστόμωσης που στάλθηκε για ιστολογική εξέταση τοποθετήθηκε, αμέσως μετά τη λήψη του, σε διάλυμα φορμόλης 4% για μονιμοποίηση. Στη συνέχεια το τμήμα της αναστόμωσης υποβλήθηκε σε επεξεργασία και μονιμοποίηση σε παραφίνη. Από κάθε ιστοτεμάχιο ελήφθησαν τομές με αντιπροσωπευτικό υλικό πάχους 3-5μm και ακολούθως πραγματοποιήθηκαν χρώσεις αιματοξυλίνης-εωσίνης, καθώς και ανοσοϊστοχημική χρώση με CD34. Χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη πραγματοποιήθηκε σε μία σε κάθε δέκα τομές με σκοπό να αναγνωρισθεί ο νεοσχηματισμένος κοκκιώδης ιστός της αναστόμωσης ο οποίος περιβάλλει τις ραφές της αναστόμωσης πλησίον του φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου. Σε γενικές γραμμές, ο κοκκιώδης αυτός ιστός ξεχώριζε χωρίς δυσκολία από τον περιβάλλοντα ιστό. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Οι τομές παραφίνης αποπαραφινώθηκαν σε κλίβανο στους 60 C κατά τη διάρκεια της νυκτός και μετά με τοποθέτησή τους για 10 λεπτά σε ξυλόλη. Στη συνέχεια ενυδατώθηκαν σε κατιούσα σειρά οινοπνευμάτων 100, 96 και 70, τοποθετήθηκαν σε διάλυμα κιτρικού οξέος με ph 6 και παρέμειναν σε φούρνο μικροκυμάτων στα 450W για 20 λεπτά. Κατόπιν παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3% για τη δέσμευση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια με διάλυμα TBS με ph 7,6. Για τη δέσμευση των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων χρησιμοποιήθηκε background block (Cell Marque Corp. USA) σε αραίωση 1:10 σε διαλύτη (DAKO S2022) για 60 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα επίμυος αντι-cd34 (abcam, [MEC 14.7], ab8158) σε αραίωση 1:100 για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε ξέπλυμα των τομών με διάλυμα TBS για 20 λεπτά και μετά επώαση με αντιορό κόνικλου (Rabbit anti-rat, DAKO, E0448) σε αραίωση 1:200 για 30 λεπτά και κατόπιν ξέπλυμα των τομών με διάλυμα TBS για 20 λεπτά. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε το σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης (Strept AB complex/hrp, DAKO S2002) για 30 λεπτά,και ακολούθησε η τοποθέτηση του χρωμογόνου (διάλυμα DAB + Chromogen, DAKO K0377) και παραμονή για λεπτά. Κατόπιν έγινε ξέπλυμα με διάλυμα πλύσης 1:10 (wash buffer, DAKO S3006) σε απεσταγμένο νερό. Για αντίχρωση έγινε εμβάπτιση των τομών σε Meyer αιματοξυλίνη-εωσίνη για λεπτά, 107

108 ακολούθησε αφυδάτωση σε ανιούσα σειρά οινοπνευμάτων, διαύγαση και επικάλυψη των τομών. To CD34 (Hematopoietic Progenitor Cell Antigen/ Endothelial cell marker,) είναι μία γλυκοζυλιωμένη διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη 140 kd που εκφράζεται στα αρχέγονα (βλαστικά) αιμοποιητικά κύτταρα, στα ενδοθήλια και σε υποπληθυσμό ινοβλαστών. Το μονοκλωνικό αντίσωμα επίμυος CD34 (abcam, [MEC 14.7], ab8158) αλληλεπιδρά με το αντιγόνο CD34. Το αντίσωμα αυτό έχει την ικανότητα να αναγνωρίζει ένα επιτόπιο ευαίσθητο στη νευραμινιδάση, το οποίο βρίσκεται στα ενδοθήλια in vivo και ειδικότερα σε μικρά αγγεία, νεοσχηματισμένα τριχοειδή και α- ναπτυσσόμενες αγγειακές δομές σε εμβρυϊκούς σχηματισμούς. Επιπλέον, το αντίσωμα αντιδρά με τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Η θετικότητα σε ατρακτοειδή κύτταρα είναι κυτταροπλασματική, ενώ σε επιθηλιοειδή ή ευμεγέθη κύτταρα είναι μεμβρανική. Μετά από τη χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη, οι αναστομώσεις ε- ξετάσθηκαν και βαθμολογήθηκαν ιστολογικά χρησιμοποιώντας μία κλίμακα η οποία βασίζεται στην τροποποιημένη κλίμακα των Erlich και Hunt 366. Τα ιστολογικά χαρακτηριστικά τα οποία βαθμολογήθηκαν είναι η φλεγμονώδης διήθηση, η ινοβλαστική αντίδραση, η νεοαγγείωση και το πυώδες εξίδρωμα. Η βαθμολόγηση των χαρακτηριστικών αυτών έγινε με μικρότερο βαθμό το 0 και μεγαλύτερο το 4: 0 απουσία 1 ελάχιστα στοιχεία 2 λίγα στοιχεία 3 αρκετά στοιχεία 4 πολλά στοιχεία Στη συνέχεια έγινε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογίζοντας το μέσο όρο της βαθμολογίας των επιμέρους χαρακτηριστικών στις διάφορες ομάδες του πειράματος και σύγκριση των ομάδων αυτών με τη βοήθεια της δοκιμασίας Mann-Whitney U. 8.9 Στατιστική ανάλυση Για την περιγραφή των ποσοτικών μεταβλητών χρησιμοποιήθηκαν ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση. Η στατιστική ανάλυση του βάρους των επίμυων καθώς και των πιέσεων διάσπασης των αναστομώσεων έγιναν με τη μέθοδο Mann-Whitney U. Η σύγκριση ποιοτικών μεταβλητών, όπως το σημείο ρήξης της αναστόμωσης, πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο Fisher s exact test. 108

109 Τα αποτελέσματα των ζυμογραφιών και των ELISA αναλύθηκαν στατιστικά με τη μέθοδο Student s t-test for unpaired samples, two sided καθώς και με τη μέθοδο ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA). Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε το p<0,05. Για την παραπάνω στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 109

110 Βάροςgr Βάροςgr 9 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 9.1 Βάρος σώματος Όλοι οι επίμυες της πειραματικής μελέτης υποβάλλονταν σε καθημερινή μέτρηση του σωματικού τους βάρους. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε την ίδια συγκεκριμένη ώρα της ημέρας (συνήθως 9 π.μ.) με τη βοήθεια ζυγαριάς ακριβείας μετά από την ήπια αναισθητοποίηση του πειραματοζώου με τη βοήθεια γάζας εμποτισμένης με αιθέρα. Ανάλογα με το σωματικό βάρος καθορίζονταν καθημερινά η δόση της χορηγούμενης φαρμακευτικής ουσίας. Για τις συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων βάρους σώματος των επίμυων χρησιμοποιήθηκε η μη-παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney U, η οποία δεν προϋποθέτει την κανονικότητα των κατανομών και το επίπεδο σημαντικότητας ορίσθηκε στο 0,05. Στην ομάδα ΟΕ 3 ης (ομάδα ελέγχου-θυσία την 3 η μετεγχειρητική ημέρα), ο μέσος όρος του βάρους των επίμυων μειώθηκε κατά τη διάρκεια του πειράματος από 371gr που καταγράφηκε κατά την ημέρα του χειρουργείου σε 368gr κατά την ημέρα της θυσίας, μεταβολή η οποία δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική, p=0,525. Ομάδα Ελέγχου 3ης ημέρας Πορεία Βάρους Ομάδα Ελέγχου 7ης ημέρας Πορεία βάρους Χ/Ο 1η 2η Θυσία Μετεγχειρητική ημέρα Χ/Ο 1η 2η 3η 4η 5η 6η Θυσία Μετεγχειρητική ημέρα Διάγραμμα 1 α, β: Μεταβολή του μέσου σωματικού βάρους των επίμυων από την ημέρα του χειρουργείου έως τη θυσία. 110

111 Βάροςgr Βάροςgr Στην ομάδα ΟΕ 7 ης (ομάδα ελέγχου-θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα), παρατηρήθηκε αύξηση του μέσου όρου του σωματικού βάρους (από 360,58gr σε 364,42gr), διαφορά που όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική, p=0,453. Στα Διαγράμματα 1α και 1β απεικονίζονται σχηματικά οι μεταβολές του μέσου σωματικού βάρους στην πορεία του χρόνου, για τις ομάδες ΟΕ 3 ης και ΟΕ 7 ης από την ημέρα του χειρουργείου έως την ημέρα της θυσίας. Επομένως το μέσο σωματικό βάρος των επίμυων και στις δύο ομάδες παρουσιάζει μία βραχυχρόνια πτώση στην άμεση μετεγχειρητική περίοδο εξ αιτίας του stress του χειρουργείου. Από τη δεύτερη μετεγχειρητική όμως ημέρα, το μέσο βάρος ανακάμπτει, με αποτέλεσμα να παρουσιάζεται ελαφρά μόνο μειωμένο στην ομάδα ΟΕ 3 ης κατά την ημέρα της θυσίας (3 η μετεγχειρητική ημέρα), χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά. Στην ομάδα ΟΕ 7 ης, στην οποία τα πειραματόζωα θυσιάζονται 4 ημέρες αργότερα κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, το μέσο βάρος συνεχίζει να αυξάνεται σε βαθμό που ξεπερνά το προεγχειρητικό μέσο βάρος, χωρίς όμως να παρουσιάζει σταστιστικά σημαντική διαφορά. Στην ομάδα ΟΜ 3 ης (ομάδα μελέτης-θυσία την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) σημειώθηκε μείωση του μέσου όρου του βάρους των επίμυων από 351,92gr κατά την ημέρα του χειρουργείου σε 342,33gr κατά την ημέρα της θυσίας, διαφορά η οποία δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική, p=0,133. Ομάδα Μελέτης 3ης ημέρας Πορεία Βάρους Ομάδα Μελέτης 7ης ημέρας Πορεία Βάρους X/O 1η 2η Θυσία Μετεγχειρητική ημέρα Χ/Ο 1η 2η 3η 4η 5η 6η Θυσία Μετεγχειρητική ημέρα Διάγραμμα 2 α, β: Μεταβολή του μέσου σωματικού βάρους των επίμυων από την ημέρα του χειρουργείου έως τη θυσία. 111

112 Στην ομάδα ΟΜ 7 ης (ομάδα μελέτης-θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) παρατηρήθηκε μείωση του μέσου όρου του βάρους των επίμυων από 355,25gr κατά την ημέρα του χειρουργείου σε 308,3gr κατά την η- μέρα της θυσίας, χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,204. Στα Διαγράμματα 2α και 2β απεικονίζονται σχηματικά οι μεταβολές του μέσου σωματικού βάρους στην πορεία του χρόνου, για τις ομάδες ΟΜ 3 ης και ΟΜ 7 ης, από την ημέρα του χειρουργείου έως την ημέρα της θυσίας. Από τη σύγκριση του μέσου σωματικού βάρους των επίμυων της ομάδας ΟΜ 3 ης ανάμεσα στην ημέρα του χειρουργείου και την ημέρα της θυσίας, παρατηρείται η μη στατιστικά σημαντική μείωση του βάρους η οποία παρατηρείται και στην αντίστοιχη ομάδα επίμυων στους οποίους χορηγήθηκε placebo αγωγή. Στην ομάδα ΟΜ 7 ης όμως, δεν παρατηρήθηκε η αναμενόμενη από την αντίστοιχη ομάδα των μαρτύρων ανάκαμψη του βάρους. Αντίθετα, το μέσο σωματικό βάρος κατά την ημέρα της θυσίας καταγράφηκε μειωμένο σε σύγκριση με αυτό της ημέρας χειρουργείου, αν και χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Στον Πίνακα 2, παρουσιάζονται οι μεταβολές του σωματικού βάρους των επίμυων στο σύνολό τους, τόσο για την ομάδα ελέγχου όσο και για την ομάδα μελέτης, ως μεταβολές των μέσων όρων με τις τυπικές τους αποκλίσεις και τα τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. Πίνακας 2. Μεταβολές σωματικού βάρους μεταξύ ημέρας Χειρουργείου και ημέρας Θυσίας στις επιμέρους ομάδες Ομάδα ημέρα n M.O. SD± SEM Διάμεσος p= * ΟΕ 3ης Ομάδα Ελέγχου (placebo) Χειρ/ου ,1 4,64 377,5 Θυσίας ,8 4, ,525 ΟΕ 7ης Χειρ/ου ,6 32,7 9,4 370,5 Θυσίας , ,1 376,5 0,453 Ομάδα Μελέτης (σελεκοξίμπη) ΟΜ Χειρ/ου ,9 15,7 4, ης Θυσίας ,3 15,2 4, ,133 ΟΜ Χειρ/ου ,2 19,1 5, ης Θυσίας ,5 20,8 6,02 342,5 0,204 M.O.: Μέσος όρος, SD: τυπική απόκλιση, SEM: τυπικό σφάλμα του μέσου, *Δοκιμασία Mann-Whitney U 112

113 Με σκοπό τη διερεύνηση της επίπτωσης της χορήγησης της σελεκοξίμπης στη μεταβολή του σωματικού βάρους στην πορεία του χρόνου, υπολογίσθηκε το σχετικό σωματικό βάρος σε κάθε χρονική στιγμή από την ημέρα του χειρουργείου έως την ημέρα της θυσίας. Το σχετικό βάρος εκφράζεται ως η επί τοις εκατό ποσοστιαία αναλογία του μέσου σωματικού βάρους όπως αυτό καταγράφηκε κατά την ημέρα του χειρουργείου. Στην ομάδα ΟΕ 3 ης το μέσο σωματικό βάρος κατά την ημέρα της θυσίας ήταν το 99,19% του αρχικού βάρους, ενώ η αντίστοιχη μεταβολή στο βάρος για την ομάδα ΟΜ 3 ης ήταν 97,22%. Έτσι παρατηρήθηκε μεγαλύτερη μείωση του σωματικού βάρους στην ομάδα που χορηγήθηκε σελεκοξίμπη σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, αλλά χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (p=0,655). Η ομάδα ΟΕ 7 ης αντίθετα, παρουσίασε στο τέλος του πειράματος αύξηση του μέσου σωματικού βάρους με αποτέλεσμα κατά την ημέρα της θυσίας το μέσο βάρος να αντιπροσωπεύει το 101,06% του μέσου αρχικού βάρους. Στην ομάδα ΟΜ 7 ης όμως, στην οποία χορηγήθηκε σελεκοξίμπη, παρατηρήθηκε συνολικά μείωση του μέσου βάρους στο 98,09% του αρχικού βάρους. Η σύγκριση των δύο αυτών ομάδων δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,189). Στα Διαγράμματα 3α και 3β παρουσιάζονται σχηματικά οι επί τοις εκατό ποσοστιαίες μεταβολές του μέσου σωματικού βάρους από την ημέρα του χειρουργείου έως την ημέρα της θυσίας, τόσο για τις ομάδες που θυσιάσθηκαν την 3 η, όσο και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. Μεταβολή βάρους ΟΕ 3ης & ΟΜ 3ης Μεταβολή βάρους ΟΕ 7ης & ΟΜ 7ης 102,00 101,00 placebo σελεκοξίμπη 102,00 101,00 σελεκοξίμπη placebo Σχετικό βάρος (%) 100,00 99,00 98,00 97,00 Σχετικό βάρος (%) 100,00 99,00 98,00 96,00 97,00 95,00 96,00 X/O 1η 2η Μετεγχειρητική ημέρα Θυσία Χ/Ο 1η 2η 3η 4η 5η 6η Μετεγχειρητική ημέρα Θυσία Διάγραμμα 3 α, β: Σχετικό σωματικό βάρος στην πορεία του χρόνου 113

114 9.2 Συμφύσεις Κατά την επανεγχείρηση του πειραματοζώου πραγματοποιείται η εκτίμηση της δημιουργίας συμφύσεων με τη μακροσκοπική εξέταση της περιτοναϊκής κοιλότητας. Κάθε επίμυς βαθμολογείται σύμφωνα με την κλίμακα των Knightly και συν. 359, σύμφωνα με την οποία με 0 βαθμολογήθηκαν οι επίμυες που δεν παρουσίασαν συμφύσεις, με 1 όταν υπήρχε μία λεπτή σύμφυση που διαχωριζόταν εύκολα, με 2 οι μετρίως εκτεταμένες συμφύσεις που δεν ανθίστανται στην τάση, με 3 οι αρκετά εκτεταμένες ασθενείς συμφύσεις με τα σπλάγχνα και το περίτονο περιτόναιο και με 4 οι πολλές εκτεταμένες συμφύσεις που αφορούν το μεσεντέριο, έ- ντερο, επίπλουν και επεκτείνονται έως το κοιλιακό τοίχωμα. Η κατάταξη των επίμυων ανάλογα με τη βαθμολογία συμφύσεων καθώς και η σύγκριση των επιμέρους ομάδων που θυσιάστηκαν κατά την 3 η και κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα παρουσιάζονται στους Πίνακες που ακολουθούν. Οι συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν αρχικά με τον υπολογισμό των μέσων όρων της βαθμολογίας των επιμέρους ομάδων και στη συνέχεια με τη δοκιμασία Mann-Whitney U test. Οι διαφορές με τιμή του p<0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Το μεγαλύτερο ποσοστό (44%) των επίμυων της ομάδας ελέγχου που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα αξιολογήθηκαν με βαθμολογία 3, δηλαδή πολλές συμφύσεις με λεπτό έντερο και με το επίπλουν. Το ίδιο παρατηρήθηκε και στην ομάδα ελέγχου θυσίας κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα όπου τα μισά πειραματόζωα (50%) εμφάνισαν τον ίδιο βαθμό συμφύσεων. Κανένα από τα πειραματόζωα δεν αξιολογήθηκε με βαθμολογία 0 δηλαδή καθόλου συμφύσεις. Ο μέσος όρος της βαθμολογίας των συμφύσεων ήταν μεγαλύτερος στην ΟΜ 3 ης αλλά, η σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων (ΟΕ 3 ης ΟΜ 3 ης ) δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες (p=0,722), (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Αξιολόγηση συμφύσεων κατά τη θυσία των πειραματοζώων την 3 η μετεγχειρητική ημέρα Ομάδα Μ.Ο.±SD p= OE 3 ης (placebo) ,39±1,2 ΟΜ 3 ης 0,722 (σελεκοξίμπη) ,5±0,78 114

115 Η ομάδα ελέγχου με θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα παρουσίασε μεγαλύτερο μέσο όρο του βαθμού συμφύσεων (2,5) σε σύγκριση με τους επίμυες της ομάδας μελέτης που έλαβαν σελεκοξίμπη και θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (2,39), διαφορά η οποία βρέθηκε στατιστικά σημαντική (p=0,005). Τα πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου παρουσίασαν σε ποσοστό 50% συμφύσεις βαθμού 2, δηλαδή λίγες συμφύσεις που δεν αντέχουν στην τάση, ενώ το ποσοστό αυτό ήταν αρκετά μεγαλύτερο (78%) στην ομάδα μελέτης με θυσία κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (Πίνακας 4). Πίνακας 4. Αξιολόγηση συμφύσεων κατά τη θυσία των πειραματοζώων την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, ομάδα ελέγχου ομάδα μελέτης Ομάδα Μ.Ο.±SD p= ΟΕ 7 ης (placebo) ,77±0,94 ΟΜ 7 ης (σελεκοξίμπη) ,0±0,48 0,005* *στατιστικά σημαντική διαφορά Η σύγκριση του βαθμού των συμφύσεων της ομάδας ελέγχου ανάμεσα στους επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ο- μάδες (p=0,355). Στον Πίνακα 5, παρουσιάζεται η βαθμολόγηση των συμφύσεων ανάμεσα στις δύο ομάδες. Πίνακας 5. Αξιολόγηση των συμφύσεων της ομάδας ελέγχου, θυσία την 3 η μετεγχειρητική ημέρα - θυσία την 7 η μετεγχειρητική ημέρα Ομάδα Μ.Ο.±SD p= OE 3 ης (placebo) ,39±1,2 ΟΕ 7 ης 0,355 (placebo) ,77±0,94 115

116 Αντιθέτως, η σύγκριση των δύο υποομάδων της ομάδας μελέτης (Πίνακας 6) έδειξε ότι οι επίμυες που θυσιάστηκαν κατά την 7 η μετεγειρητική ημέρα παρουσίασαν κατά μέσο όρο μικρότερο βαθμό συμφύσεων, διαφορά η οποία βρέθηκε στατιστικά σημαντική (p=0,021). Έτσι η ομάδα επίμυων που έλαβε σελεκοξίμπη και θυσιάστηκε την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΜ 7 ης ) παρουσίασε στατιστικά μικρότερου βαθμού συμφύσεις από όλες τις ομάδες (p=0,005 συγκρινόμενη με την ΟΕ 7 ης και p=0,021 συγκρινόμενη με την OM 3 ης ). Πίνακας 6. Αξιολόγηση των συμφύσεων της ομάδας μελέτης Ομάδα Μ.Ο.±SD p= ΟΜ 3 ης (σελεκοξίμπη) ,5±0,78 ΟΜ 7 ης 0,021* (σελεκοξίμπη) ,0±0,48 *στατιστικά σημαντική διαφορά Οι ομάδες ελέγχου και μελέτης, ανεξάρτητα από την ημέρα θυσίας, συγκρινόμενες στο σύνολο τους με τη δοκιμασία Mann-Whitney U, δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,166), όπως επίσης και οι ομάδες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΕ 3 ης και ΟΜ 3 ης ), στο σύνολό τους, δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,509) σε σύγκριση με τις ομάδες οι οποίες θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (ΟΕ 7 ης και ΟΜ 7 ης ). Παρατηρήθηκε ότι το σύνολο των επίμυων όλων των ομάδων (ελέγχου μελέτης) παρουσίασε έστω και μία ή λίγες συμφύσεις και κανένα πειραματόζωο δεν βαθμολογήθηκε με 0. Στο Διάγραμμα 4, παρουσιάζονται σχηματικά οι μέσοι όροι της βαθμολογίας των συμφύσεων. 9.3 Πίεση διάσπασης Κατά τη διάρκεια του πειράματος δεν παρατηρήθηκε κανένας θάνατος πειραματόζωου. Έτσι το σύνολο των επίμυων υποβλήθηκε σε επανεπέμβαση κατά την 3 η ή την 7 η μετεγχειρητική ημέρα ανάλογα με την ομάδα στην οποία ανήκε. Πραγματοποιήθηκε μακροσκοπικός έλεγχος για την ανάδειξη τυχόν διαφυγής από την αναστόμωση η οποία μπορεί να εκδηλωθεί ως περιτονίτιδα ή ακόμα και ως περιαναστομωτικό 116

117 Μέσος όρος βαθμολογίας ΟΕ 3ης ΟΜ 3ης ΟΕ 7ης ΟΜ 7ης Ομάδα Διάγραμμα 4. Μέσοι όροι βαθμολογίας συμφύσεων απόστημα. Από τον έλεγχο αυτό δε διαπιστώθηκε καμία περίπτωση αναστομωτικής διαφυγής. Στον Πίνακα 7, παρουσιάζονται κατά ομάδες οι τιμές της πίεσης διάσπασης την 3 η και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα καθώς και ο μέσος όρος, η τυπική απόκλιση και το εύρος της κάθε ομάδας. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ των πιέσεων διάσπασης των αναστομώσεων των επιμέρους ομάδων κατά ζεύγη με τη βοήθεια της μηπαραμετρικής δοκιμασίας Mann-Whitney U. Από τη σύγκριση της ομάδας ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και της ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) προκύπτει ότι στην ομάδα στην οποία χορηγήθηκε σελεκοξίμπη, ο μέσος όρος των πιέσεων διάσπασης (56,3±11,7) βρέθηκε χαμηλότερος από την ομάδα ελέγχου (62,4±9,9), αλλά χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (p=0,132). Παρομοίως πραγματοποιήθηκε σύγκριση και μεταξύ των ομάδων ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα). Ο μέσος όρος των πιέσεων διάσπασης της ΟΕ 7 ης (192,4±17,4) ήταν μεγαλύτερος από αυτό της ΟΜ 7 ης (183±28), αλλά πάλι χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,164). 117

118 Πίνακας 7. Πιέσεις διάσπασης αναστομώσεων (mmhg) α/α Ομάδα Ελέγχου (placebo) Ομάδα Μελέτης (σελεκοξίμπη) ΟΕ 3 ης ΟΕ 7 ης ΟΜ 3 ης ΟΜ 7 ης ΜΟ±SD 62,4±9,9 192,4±17,4 56,3±11,7 183±28 Εύρος ΜΟ: μέσος όρος, SD: τυπική απόκλιση Παρατηρήθηκε μικρή ελάττωση του μέσου όρου των πιέσεων διάσπασης στην ομάδα στην οποία χορηγήθηκε σελεκοξίμπη αλλά επίσης χωρίς σταστιστικά σημαντική διαφορά (p=0,16). Στα διαγράμματα 5α και 5β, παρουσιάζονται οι διασπορές των πιέσεων διάσπασης των αναστομώσεων στους επίμυες που χορηγήθηκε placebo ή σελεκοξίμπη και που θυσιάστηκαν, ανάλογα με την ομάδα τους, τόσο την 3 η όσο και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. Η σύγκριση των ομάδων ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα), δηλαδή των επίμυων στους οποίους χορηγήθηκε placebo αγωγή, αλλά θυσιάστηκαν κατά την 118

119 Πίεση διάσπασηςmmhg Πίεση διάσπασηςmm Hg 3 η και 7 η μετεγχειρητική ημέρα αντίστοιχα, ανέδειξε ότι οι πιέσεις διάσπασης των αναστομώσεων ήταν σαφώς υψηλότερες την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, διαφορά που ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,001). Με τον ίδιο τρόπο συγκρίθηκαν και οι ομάδες ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) και παρατηρήθηκε αύξηση των πιέσεων διάσπασης των αναστομώσεων όταν τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, με στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,001). Οι πιέσεις διάσπασης των ομάδων ελέγχου και μελέτης παρουσιάζονται στα διαγράμματα διασποράς 6α και 6β. Πιέσεις δίασπασης ΟΕ 3ης - ΟΜ 3ης Πιέσεις διάσπασης ΟΕ 7ης - ΟΜ 7ης placebo Ομάδα celecoxib placebo Ομάδα celecoxib Διάγραμμα 5 α, β. Διαγράμματα διασποράς των πιέσεων διάσπασης των ομάδων ελέγχου-μελέτης που θυσιάσθηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα (α) και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα (β). 119

120 Πίεση διάσπασης(mmhg) Πίεση διάσπασης(mm H g) Πίεση διάσπασης(mm H g) Πιέσεις διάσπασης ομάδας ελέγχου (placebo) Πιέσεις διάσπασης ομάδας μελέτης ( celecoxib) η Ημέρα θυσίας 7η 3η Ημέρα θυσίας 7η Διάγραμμα 6 α, β. Διαγράμματα διασποράς των πιέσεων διάσπασης των ομάδων που θυσιάσθηκαν την 3 η και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα στις οποίες χορηγήθηκαν placebo (α) και σελεκοξίμπη (β). Στο διάγραμμα 7, παρουσιάζονται σχηματικά οι μεταβολές στην πίεση διάσπασης μεταξύ των ομάδων ελέγχου (ΟΕ) και μελέτης (ΟΜ) που θυσιάσθηκαν την 3 η και την 7 η μετεγχειρητική ημέρα ΟΕ 3ης ΟΜ 3ης ΟΕ 7ης ΟΜ 7ης Ομάδα Διάγραμμα 7. Θηκόγραμμα πιέσεων διάσπασης των ομάδων ελέγχου μελέτης. Με αστερίσκο απεικονίζονται οι τιμές εκτός των ορίων εμπιστοσύνης 95%. 120

121 9.4 Σημείο ρήξης Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μέτρησης της πίεσης διάσπασης της αναστόμωσης, καταγράφηκε και το σημείο στο οποίο παρατηρήθηκε η ρήξη του παρασκευάσματος του παχέος εντέρου και πιο συγκεκριμένα αν αυτή παρατηρήθηκε στην περιοχή της αναστόμωσης ή μακριά από αυτή. Οι συγκρίσεις των επιμέρους ομάδων έγιναν με τη δοκιμασία Fisher s exact. Στον Πίνακα παρουσιάζονται οι συχνότητες ρήξης στην αναστόμωση ή μακριά από αυτή, ανάλογα με την ομάδα. Πίνακας 8. Συχνότητες ρήξης του παρασκευάσματος του παχέος εντέρου, στην αναστόμωση ή μακριά από αυτή, ανάλογα με την ομάδα. Θυσία την 3 η ΜΤΧ ημέρα Θυσία την 7 η ΜΤΧ ημέρα Μακριά από την αναστόμωση (%) Στην περιοχή της αναστόμωσης (%) ΟΕ 4 (22) 14 (78) ΟΜ 3 (17) 15 (83) ΟΕ 10 (56) 8 (44) ΟΜ 11 (61) 7 (39) Η σύγκριση του σημείου ρήξης της αναστόμωσης μεταξύ της ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική η- μέρα) και της ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=1,0). Παρομοίως, το σημείο ρήξης βρέθηκε να είναι στην περιοχή της αναστόμωσης τόσο για την ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) όσο και την ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα), χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά (p=1,0). Διαφορά επίσης δεν παρατηρήθηκε και στη συνολική σύγκριση όλων των επίμυων της ομάδας ελέγχου (placebo) με την ομάδα μελέτης (σελεκοξίμπη), με το 61% (22/36) των αναστομώσεων να ρήγνυνται στην περιοχή της αναστόμωσης και με το ίδιο ποσοστό 61% να παρατηρείται και στην ομάδα μελέτης. Αντιθέτως, διαφορά στη συχνότητα του σημείου ρήξης παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση μεταξύ της ΟΕ 3 ης και της ΟΕ 7 ης, αφού, με την 121

122 πάροδο των ημερών και την ενδυνάμωση της αναστόμωσης, το σημείο της ρήξης κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα μετακινείται μακριά από την αναστόμωση. Παρ όλα αυτά, δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες (p=0,086) σε αντίθεση με τη σύγκριση μεταξύ των ΟΜ 3 ης και ΟΜ 7 ης κατά την οποία αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο σημείο ρήξης, το οποίο φαίνεται να απομακρύνεται από την αναστόμωση την 7 η μετεγχειρητική ημέρα. Τα ποσοστά του σημείου ρήξης της αναστόμωσης ανάλογα με την ομάδα παρουσιάζονται σχηματικά στο Διάγραμμα Μακριά από την αναστόμωση Στην περιοχή της αναστόμωσης Ποσοστό (%) ΟΕ 3ης ΟΜ 3ης ΟΕ 7ης ΟΜ 7ης Ομάδα Διάγραμμα 8. Ποσοστά του σημείου ρήξης της αναστόμωσης ανάλογα με την ομάδα. 122

123 9.5 Βιοχημική ανάλυση του ιστού της αναστόμωσης Ζυμογραφία σε πήγμα ζελατίνης Η ανάλυση των φυσιολογικών ομογενοποιημένων δειγμάτων παχέος εντέρου (2 μg πρωτεΐνης) με ζυμογραφία ζελατίνης αποκάλυψε πως η ζελατινολυτική δραστηριότητα συμπυκνώνεται στο κλάσμα 25-50% (NH 4 ) 2 SO 4. Εμφανίζονται 3 βασικές ζώνες αποδόμησης της ζελατίνης, με παρόμοιο μοτίβο μετανάστευσης όπως οι κεκαθαρμένες prommp-9 ( kda), prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda) του εμπορίου (Σχήμα 1). Με την ταυτόχρονη ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους, υπολογίστηκε ότι το μοριακό βάρος των 3 ζωνών λύσης είναι 92, 64 και 56 kda, αντίστοιχα. Από τις 3 βασικές ζώνες λύσης, σημαντικά μεγαλύτερη δραστηριότητα εμφανίζεται με Mr 64 kda που αντιστοιχεί στην prommp-2, ενώ δεν εμφανίζεται δραστηριότητα με Mr 78 kda που αντιστοιχεί στην MMP-9 (Σχήμα 1). Παρατηρήθηκε μια αύξηση στις 3 ζώνες λύσης 5-10% στα δείγματα παχέος εντέρου κατά 7 η μετεγχειρητική ημέρα σε σχέση με τα δείγματα παχέος εντέρου κατά την 3 η ημετεγχειρητική μέρα, η οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Για το λόγο αυτό τα δείγματα παχέος εντέρου της 3 η και 7 ης μετεγχειρητικής ημέρες χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης συνεκτιμήθηκαν ανά ομάδα. Για την εξακρίβωση της ταυτότητας των υπευθύνων ενζύμων για τις ζώνες λύσης που παρατηρήθηκαν στα δείγματα παχέος εντέρου από μάρτυρες, η ζυμογραφική ανάλυση επαναλήφθηκε παρουσία εκλεκτικών και μη εκλεκτικών αναστολέων των μεταλλοπρωτεασών, όπως χαρακτηριστικά απεικονίζεται στο Σχήμα 2 για ένα δείγμα ιστού. Η ζελατινολυτική δραστηριότητα (Σχήμα 2, διάδρομος 1) ανεστάλη πλήρως παρουσία των χηλικών ενώσεων Na 2 EDTA (20 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 2), 1,10- φαινανθρολίνη (4 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 3), ή υδροχλωρική βενζαμιδίνη (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 4), αλλά δεν επηρεάστηκε παρουσία του φθοριούχου μεθανοσουλφονικού φαινυλεστέρα (phenylmethanesulphonyl fluoride, PMSF) (1 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 5), ή του N- αιθυλομηλεϊμιδίου (N-ethylmaleimide, NEM) (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 6). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι 92, 64 και 56 kda ζώνες λύσης οφείλονται σε δραστηριότητα μεταλλοπρωτεασών και όχι σε πρωτεάσες σερίνης, θειόλης ή κυστεΐνης. Δεδομένου του μοριακού βάρους των υπευθύνων ενζύμων, του γεγονότος ότι αποδομούν τη ζελατίνη, καθώς επίσης και της παρατήρησης ότι η ενζυμική δραστηριότητα αναστέλλεται από τις χηλικές ενώσεις Na 2 EDTA, 1,10-φαινανθρολίνη και υδροχλωρική βενζαμιδίνη), αλλά δεν 123

124 επηρεάζεται από τις πρωτεάσες σερίνης, θειόλης ή κυστεΐνης, όπως του φθοριούχου μεθανοσουλφονικού φαινυλεστέρα (phenylmethanesulphonyl fluoride, PMSF) ή του N-αιθυλομηλεϊμιδίου (N-ethylmaleimide, NEM), συμπεραίνεται ότι η εν λόγω δραστηριότητα οφείλεται σε prommp-9, prommp-2 και MMP-2, αντίστοιχα Σύγκριση ζελατινολυτικής δραστηριότητας σε σχέση με την απόσταση από το σημείο αναστόμωσης Η ζελατινολυτική δραστηριότητα στα δείγματα παχέος εντέρου από πειραματόζωα μάρτυρες εμφανίζεται σημαντικά αυξημένη στα δείγματα εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης, σε σχέση με τα δείγματα απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης (Σχήμα 1α και 1β). Η παρατήρηση αυτή αφορά και τις 3 μορφές ζελατινασών, δηλαδή την prommp-9, prommp-2 και MMP-2. (α) kda prommp-9 (92.0 kda) MMP-9 (78 kda) prommp-2 (72.0 kda) MMP-2 (64.0 kda) (β) kda 97.4 prommp-9 (92.0 kda) MMP-9 (78 kda) prommp-2 (72.0 kda) MMP-2 (64.0 kda)

125 (γ) kda prommp-9 (92.0 kda) MMP-9 (78 kda) prommp-2 (72.0 kda) MMP-2 (64.0 kda) (δ) kda prommp-9 (92.0 kda) MMP-9 (78 kda) prommp-2 (72.0 kda) MMP-2 (64.0 kda) Σχήμα 1. Χαρακτηριστικές ζυμογραφίες ζελατίνης δειγμάτων παχέος εντέρου (2 μg πρωτεΐνης): (α): δείγματα 3 ης μετεγχειρητικής ημέρας και (β): δείγματα 7 ης μετεγχειρητικής ημέρας από πειραματόζωα μάρτυρες (άνευ χορήγησης σελεκοξίμπης): ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης (Μ) και ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης (Μ/ΑΝ). (γ): δείγματα 3 ης μετεγχειρητικής ημέρας και (δ): δείγματα 7 ης μετεγχειρητικής ημέρας από πειραματόζωα μετά από χορήγηση σελεκοξίμπης: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης (Σ), και ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης (Σ/ΑΝ). Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας στα δείγματα υπολογίσθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου/ζελατίνης, και συγκρίθηκαν με ηλεκτροφόρηση καθαρής μορφής prommp-9 (92.0 kda), MMP-9 (78.0 kda) prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda) του εμπορίου (βέλη δεξιά), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: φωσφορυλάση β (97.4 kda), αλβουμίνη βόειου ορού (66.2 kda), αφυδρογονάση του L-γλουταμινικού (55.0 kda), και οβαλβουμίνη (42.7 kda) (βέλη αριστερά). (α): Διάδρομος 1: δείγματα πρωτεϊνών αναφοράς, διάδρομος 2: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda). (β): Διάδρομος 1: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda). (γ): Διάδρομος 1: δείγματα πρωτεϊνών αναφοράς, διάδρομος 2: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda). (δ): Διάδρομος 1: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda). 125

126 prommp-9 (92.0 kda) MMP-9 (78 kda) prommp-2 (72.0 kda) MMP-2 (64.0 kda) Σχήμα 2: Επίδραση αναστολέων πρωτεασών στη ζελατινολυτική δραστηριότητα. Τυπική ζυμογραφία ζελατίνης απουσία και παρουσία αναστολέων πρωτεασών σε δείγμα παχέος εντέρου απομακρυσμένου από το σημείο αναστόμωσης, από πειραματόζωο χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Διάδρομος 1: δείγμα α- πουσία αναστολέα. Διάδρομος 2-6: δείγμα παρουσία: Na 2 EDTA (20 mm) (διάδρομος 2), 1,10-φαινανθρολίνη (4 mm) (διάδρομος 3), υδροχλωρική βενζαμιδίνη (5 mm) (διάδρομος 4), PMSF (1 mm) (διάδρομος 5), NEM (5 mm) (διάδρομος 6). Βέλη δεξιά: σημεία έκλουσης καθαρής μορφής prommp-9 (92.0 kda), ενεργού MMP-9 (78.0 kda), prommp-2 (72.0 kda) και ενεργού MMP-2 (64.0 kda), του εμπορίου Επίδραση της σελεκοξίμπης στη ζελατινολυτική δραστηριότητα Η χορήγηση σελεκοξίμπης μείωσε σημαντικά τη ζελατινολυτική δραστηριότητα σε σχέση με τους μάρτυρες, τόσο στα δείγματα παχέος εντέρου απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης, όσο και κυρίως στα δείγματα ιστών εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης (Σχήμα 1γ και 1δ). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της 3 η και 7 ης μετεγχειρητικής ημέρας. Για το λόγο αυτό τα δείγματα παχέος εντέρου της 3 η και 7 ης μετεγχειρητικής ημέρες μετά από χορήγηση σελεκοξίμπης συνεκτιμήθηκαν ανά ομάδα Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας με πυκνομετρία σάρωσης Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έγινε με πυκνομετρία σάρωσης, με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Τα αποτελέσματα αρχικά εκφράσθηκαν σε τυχαίες μονάδες και ακολούθως υπολογίσθηκαν ως % της κεκαθαρμένης prommp-2 του εμπορίου 126

127 που ηλεκτροφορήθηκε ταυτόχρονα με τα δείγματα σε κάθε πηκτή. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης για το σύνολο των δειγμάτων απεικονίζεται στο Διάγραμμα 9 η οποία και έδειξε τα α- κόλουθα αποτελέσματα: Ζελατινολυτική δραστηριότητα (%) (***) (***) [***] [***] {***} Μάρτυρες Μάρτυρες/αναστόμωση Σελεκοξίμπη Σελεκοξίμπη/αναστόμωση {***} [***] (*) {**} pro-mmp-9 pro-mmp-2 MMP-2 Διάγραμμα 9. Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης. Τα αποτελέσματα υπολογίσθηκαν ως % της κεκαθαρμένης prommp-2 του εμπορίου που προστέθηκε σε κάθε πηκτή. Τα αποτελέσματα απεικονίζουν το μέσο όρο ± SE για n=32 ιστούς. Κατηγορίες ιστών: Μάρτυρες: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Μάρτυρες/αναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπη: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπη/αναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. ( ) σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα» και «μάρτυρα/αναστόμωση». [ ] σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα» και «σελεκοξίμπη». { } σύγκριση μεταξύ ομάδων «σελεκοξίμπη» και «σελεκοξίμπη/αναστόμωση». * = p < 0,05, ** = p < 0,02, *** = p < 0,01. Σε όλες τις κατηγορίες ιστών εκφράζεται κατά κύριο λόγο η prommp-2. Ο λόγος έκφρασης prommp-2/mmp-2, prommp-9/mmp-9 και prommp-2/prommp-9 για όλα τα δείγματα απεικονίζεται στον Πίνακα

128 Πίνακας 9. Λόγος έκφρασης ΜΜPs στους ιστούς prommp-2/ prommp-2/ Ομάδα prommp-9 MMP-2 «Μάρτυρας» 4,5 3,5 «Μάρτυρας/Αναστόμωση» 2,0 2,0 «Σελεκοξίμπη» 5,5 3,0 «Σελεκοξίμπη/Αναστόμωση» 2,5 2,0 Η δραστηριότητα όλων των MMPs που ανιχνεύθηκαν ήταν αυξημένη στατιστικά σημαντικά στα δείγματα ιστών εκατέρωθεν της αναστόμωσης σε σχέση με τα δείγματα ιστών τα απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης. (Πίνακας 10). Η χορήγηση σελεκοξίμπης προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστηριότητας όλων των MMPs που α- νιχνεύθηκαν (Πίνακας 10). Η μείωση αυτή ήταν μεγαλύτερη στους ι- στούς τους απομακρυσμένους από το σημείο της αναστόμωσης (Πίνακας 10). Πίνακας 10. Σύγκριση της έκφρασης ΜΜPs σε δείγματα παχέος εντέρου μεταξύ διαφορετικών ομάδων ΟΜΑΣ ΜΜP «Μάρτυρας»/ «Μάρτυρας- Αναστόμωση» p «Μάρτυρας»/ «Σελεκοξίμπη» p «Μάρτυρας- Αναστόμωση»/ «Σελεκοξίμπη- Αναστόμωση» p pro-mmp % < 0,01-85 % < 0,01-63 % < 0,01 pro-mmp % < 0,01-61 % < 0,01-56 % < 0,01 MMP % < 0,01-72 % < 0,05-55 % < 0, Περιεκτικότητα prommp-2 στα δείγματα παχέος εντέρου Η περιεκτικότητα σε prommp-2 στα δείγματα ιστών παχέος εντέρου μετρήθηκε με ELISA. Όλα τα δείγματα περιέχουν prommp-2 (Διάγραμμα 10). Τα επίπεδα πρωτεΐνης prommp-2 την 7 η μετεγχειρητική μέρα ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένα σε σχέση με την 3 η μετεγχειρητική μέρα στα δείγματα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης (p < 0,01) (Σχήμα 4). Επίσης, τα επίπεδα πρωτεΐνης prommp-2 στα δείγματα εκατέρωθεν της αναστόμωσης ήταν αυξημένα σε σχέση με τα δείγματα απο- 128

129 μακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης, αλλά η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Η χορήγηση σελεκοξίμπης μείωσε στατιστικά σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης prommp-2 τόσο κατά την 3 η όσο και κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, τόσο στα δείγματα τα απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης (p < 0,02 και p < 0,05, αντίστοιχα), όσο και στα δείγματα εκατέρωθεν της αναστόμωσης, (p < 0,01) (Διάγραμμα 10). Διάγραμμα 10. Τα επίπεδα πρωτεΐνης prommp-2 σε ομογενοποιήματα παχέος εντέρου μειώνονται από τη σελεκοξίμπη. Τα επίπεδα πρωτεΐνης prommp-2 μετρήθηκαν με ELISA σε δείγματα ομογενοποιημένου παχέος εντέρου (2 μg πρωτεΐνης) μετά από per os χορήγηση σελεκοξίμπης. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SΕ, εις τριπλούν προσδιορισμών σε 4 πειραματόζωα. Κατηγορίες ιστών: Μάρτυρες: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Μάρτυρεςαναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπη: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπη-αναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. ( ) σύγκριση μεταξύ ομάδων 3 ης και 7 ης μετεγχειρητικής μέρας. [ ] σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα» και «σελεκοξίμπη». { } σύγκριση μεταξύ ομάδων «σελεκοξίμπη» και «σελεκοξίμπη/αναστόμωση». * = p < 0,05, ** = p < 0,02, *** = p < 0, Περιεκτικότητα TIMP-1 στα δείγματα παχέος εντέρου Η περιεκτικότητα πρωτεΐνης TIMP-1 στα δείγματα ιστών παχέος εντέρου μετρήθηκε με ELISA. Όλα τα δείγματα περιέχουν TIMP-1 (Διά- 129

130 γραμμα 11). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της 3ης και 7ης μετεγχειρητικής ημέρας. Για το λόγο αυτό τα δείγματα παχέος εντέρου της 3ης και 7ης μετεγχειρητικής ημέρες μετά από χορήγηση σελεκοξίμπης συνεκτιμήθηκαν ανά ομάδα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων εκατέρωθεν της αναστόμωσης και των δειγμάτων που ήταν απομακρυσμένα από το σημείο της αναστόμωσης. Η θεραπεία με σελεκοξίμπη δεν επηρέασε στατιστικά σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης TIMP-1 (Διάγραμμα 11). Διάγραμμα 11. Τα επίπεδα πρωτεΐνης TIMP-1 σε ομογενοποιήματα παχέος εντέρου δεν επηρεάζονται από τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Τα επίπεδα πρωτεΐνης TIMP-1 μετρήθηκαν με ELISA σε δείγματα ομογενοποιημένου παχέος ε- ντέρου (2 μg πρωτεΐνης) μετά από per os χορήγηση σελεκοξίμπης. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SΕ, εις τριπλούν προσδιορισμών σε 8 πειραματόζωα Περιεκτικότητα VEGF στα δείγματα παχέος εντέρου Τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF στα δείγματα ιστών παχέος εντέρου μετρήθηκαν με ELISA. Όλα τα δείγματα περιέχουν VEGF (Διάγραμμα 12). Τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF την 7 η μετεγχειρητική ημέρα ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένα σε σχέση με την 3 η μετεγχειρητική ημέρα σε όλα τα δείγματα (p < 0,01) (Διάγραμμα 12). Επίσης, τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF στα δείγματα εκατέρωθεν της αναστόμωσης ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένα σε σχέση με τα δείγματα τα απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης απουσία σελεκοξίμπης. Η χορήγηση σελεκοξίμπης 130

131 μείωσε στατιστικά σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF τόσο κατά την 3 η όσο και κατά την 7 η μετεγχειρητική ημέρα, τόσο στα δείγματα τα απομακρυσμένα από το σημείο αναστόμωσης, όσο και στα δείγματα εκατέρωθεν της αναστόμωσης (Διάγραμμα 12). Διάγραμμα 12. Τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF σε ομογενοποιήματα παχέος εντέρου μειώνονται από τη σελεκοξίμπη. Τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF μετρήθηκαν με ELISA σε δείγματα ομογενοποιημένου παχέος εντέρου (2 μg πρωτεΐνης) μετά από per os χορήγηση σελεκοξίμπης. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SΕ, εις τριπλούν προσδιορισμών σε 4 πειραματόζωα. Κατηγορίες ιστών: Μάρτυρες: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Μάρτυρες-αναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα χωρίς τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπη: ιστοί απομακρυσμένοι από το σημείο αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Σελεκοξίμπηαναστόμωση: ιστοί εκατέρωθεν του σημείου αναστόμωσης από πειραματόζωα μετά τη χορήγηση σελεκοξίμπης. ( ) σύγκριση μεταξύ ομάδων 3 ης και 7 ης μετεγχειρητικής μέρας. [ ] σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα» και «μάρτυρα αναστόμωση». (( )) σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα» και «σελεκοξίμπη», { } σύγκριση μεταξύ ομάδων «μάρτυρα αναστόμωση» και «σελεκοξίμπη/αναστόμωση», * = p < 0,05, ** = p < 0,02, *** = p < 0, Ιστολογική εξέταση Από το τμήμα της αναστόμωσης το οποίο στάλθηκε για ιστολογική εξέταση, ελήφθησαν τομές για χρώση με αιματοξυλίνη εωσίνη καθώς και ανοσοϊστοχημική χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα CD34 για την αναγνώριση των νεοπλάστων αγγείων. Αξιολογήθηκαν ποιοτικά ιστολο- 131

132 γικά χαρακτηριστικά, όπως η φλεγμονώδης διήθηση, η ινοβλαστική αντίδραση, η νεοαγγείωση και το πυώδες εξίδρωμα και βαθμολογήθηκαν με βάση την κλίμακα των Erlich-Hunt με βαθμολογία από το 0 έως το 4. Ακολούθησε στατιστική επεξεργασία με τη βοήθεια της δοκιμασίας Mann-Whitney U Φλεγμονώδης διήθηση Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) έδειξε ότι οι αναστομώσεις των επίμυων που έλαβαν placebo αγωγή παρουσίασαν κατά μέσο όρο μεγαλύτερη βαθμολογία φλεγμονώδους διήθησης (3,8 για την ΟΕ 3 ης 2,67 για την ΟΜ 3 ης ), διαφορά η οποία βρέθηκε στατιστικά σημαντική (p=0,002). Ο μέσος όρος της βαθμολογίας της φλεγμονώδους διήθησης βρέθηκε μειωμένος, αλλά σε μικρότερο βαθμό, στην σύγκριση μεταξύ των ομάδων ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα), χωρίς στατιστική διαφορά (p=0,463). Η σύγκριση της φλεγμονώδους διήθησης στο σύνολο των ο- μάδων ελέγχου και μελέτης έδειξε υψηλότερο μέσο όρο στην ομάδα ε- λέγχου (3,71) σε σχέση με την ομάδα μελέτης με στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,002). Αντίθετα, η σύγκριση των ομάδων της 3 ης και 7 ης η- μέρας στο σύνολό τους δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,877). Τα αποτελέσματα της φλεγμονώδους διήθησης παρουσιάζονται σχηματικά στον Πίνακα 11. Πίνακας 11. Φλεγμονώδης διήθηση ανάλογα με την ομάδα. Βαθμολογία MO±SD p= OE ,8±0,42 3 ης OM ,67±0,77 0,002* OE ,5±0,57 7ης 0,463 OM ,13±0,83 OE vs OM: p=0,002* 3 ης vs 7 ης : p=0,877 ΜΟ: μέσος όρος, SD: τυπική απόκλιση, * στατιστικά σημαντική διαφορά 132

133 9.6.2 Ινοβλαστική αντίδραση Η ινοβλαστική αντίδραση, έτσι όπως αυτή βαθμολογήθηκε κατά την ιστολογική εξέταση των τομών που ελήφθησαν από την αναστόμωση, συγκρίθηκε ανάμεσα στις ομάδες ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) και βρέθηκε ότι ο μέσος όρος της βαθμολογίας ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερος στην ΟΕ 3 ης (3,70) από την ΟΜ 3 ης (2,25) (p=0,003). Η σύγκριση όμως των ομάδων ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτηςεπίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,249) ανάμεσα στους μέσους όρους των ΟΕ 7 ης (3,50) και ΟΜ 7 ης (3,17). Η συνολική σύγκριση των ομάδων ελέγχου και μελέτης αναδεικνύει σημαντικά μεγαλύτερο (p=0,002) το μέσο όρο της ομάδας ελέγχου (3,60) σε σχέση με αυτό της ομάδας μελέτης (2,71). Ο μέσος όρος της βαθμολογίας της ινοβλαστικής αντίδρασης βρέθηκε μεγαλύτερος στο σύνολο της ομάδας της 7 ης ημέρας (3,32) σε σύγκριση με την ομάδα της 3 ης ημέρας (2,91) χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,31). Τα αποτελέσματα της φλεγμονώδους διήθησης παρουσιάζονται σχηματικά στον Πίνακα Αγγειογένεση Η αξιολόγηση της νεοαγγείωσης πραγματοποιήθηκε με την ιστολογική εξέταση των τομών που είχαν υποβληθεί σε ανοσοϊστοχημεία με μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για CD34. Το αντίσωμα αυτό χρωματίζει Πίνακας 12. Ινοβλαστική αντίδραση ανάλογα με την ομάδα. Βαθμολογία MO±SD p= OE ,70±0,675 3 ης OM ,25±1,055 0,003* OE ,50±0,707 7 ης OM ,17±0,718 0,249 OE vs OM p=0,002* 3 ης vs 7 ης : p=0,31 ΜΟ: μέσος όρος, SD: τυπική απόκλιση, * στατιστικά σημαντική διαφορά 133

134 Πίνακας 13. Αγγειογένεση ανάλογα με την ομάδα. Βαθμολογία MO±SD p= OE ±0,81 3 ης OM ,5±0,707 0,554 OE ,2±0,95 7ης 0,22 OM ,5±0,707 OE vs OM p=0,169 3 ης vs 7 ης : p=1,0 ΜΟ: μέσος όρος, SD: τυπική απόκλιση, * στατιστικά σημαντική διαφορά τα νεόπλαστα ενδοθηλιακά κύτταρα στο νεοσχηματισμένο κοκκιώδη ιστό της αναστόμωσης. Καταγράφηκε το ιστολογικό score ανάλογα με την ύπαρξη και τον αριθμό των νεοαγγείων και υπολογίσθηκε ο μέσος όρος (Πίνακας 13). Η σύγκριση του μέσου όρου μεταξύ των ομάδων ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική η- μέρα) και ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) ανέδειξε μικρή μείωση των νεοαγγείων στην ΟΜ 3 ης, χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,554). Παρομοίως βρέθηκε μικρή μείωση στην αγγειογένεση χωρίς σημαντική διαφορά (p=0,22) μεταξύ των ομάδων ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) και ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτηςεπίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα). Δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά κατά τη σύγκριση ανάμεσα στο σύνολο των ομάδων ελέγχου και μελέτης (p=0,169), καθώς και στο σύνολο των ομάδων 3 ης και 7 ης ημέρας (p=1,0) Πυώδες εξίδρωμα Στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερος (p=0,002) βρέθηκε ο μέσος όρος της βαθμολογίας της ΟΕ 3 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα) σε σύγκριση με αυτόν της ΟΜ 3 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 3 η μετεγχειρητική ημέρα). Αντίθετα, ανάμεσα στις ομάδες της 7 ης ημέρας, ο μέσος όρος της βαθμολογίας της ΟΜ 7 ης (Ομάδα Μελέτης-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα) βρέθηκε σημαντικά μεγαλύτερος (p=0,002) από αυτόν της ΟΕ 7 ης (Ομάδα Ελέγχου-επίμυες που θυσιάστηκαν την 7 η μετεγχειρητική ημέρα). Η συνολική σύγκριση μεταξύ των ομάδων ελέγχου και μελέτης δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0,452), καθώς και αυτή μεταξύ των ομάδων της 3 ης και της 7 ης ημέρας (p=0,689) (Πίνακας 14). 134

135 Εικόνα 12. Ανοσοϊστοχημική χρώση με αντίσωμα CD Διακρίνονται με καφέ χρώμα τα νεόπλαστα αγγεία. Εικόνα 13. Ανοσοϊστοχημική χρώση με αντίσωμα CD Διακρίνονται με καφέ χρώμα τα νεόπλαστα αγγεία. 135

136 Εικόνα 14. Ινοβλαστική αντίδραση, αιματοξυλίνη-εωσίνη 400. Εικόνα 15. Πυώδες εξίδρωμα, αιματοξυλίνη-εωσίνη