Απεικονιστική μελέτη της εργαστηριακής διέγερσης αιμοπεταλίων οφειλόμενης σε πυριτικό άλας

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟΝ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΝ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΣΤΕΡΕΑΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Πτυχιακή Εργασία Απεικονιστική μελέτη της εργαστηριακής διέγερσης αιμοπεταλίων οφειλόμενης σε πυριτικό άλας Γκόνη Ιωάννα Επιβλέπων: Αναπλ. Καθηγητής Δ. Σταμόπουλος ΑΘΗΝΑ 2017

2

3 Ευχαριστίες Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον καθηγητή μου κ. Δημοσθένη Σταμόπουλο, Αναπληρωτή Καθηγητή στον τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης του τμήματος Φυσικής Αθηνών, για τις γνώσεις που μου προσέφερε, αλλά και για την υποστήριξή του κατά τη διάρκεια διεκπεραίωσης της παρούσας εργασίας. Η παρούσα πτυχιακή εργασία εκπονήθηκε σε εργαστηριακούς χώρους του τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης του Τμήματος Φυσικής του Ε.Κ.Π.Α. και του Ινστιτούτου Νανοεπιστήμης και Νανοτεχνολογίας του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε Δημόκριτος. Συγκεκριμένα, οι αναγκαίες μετρήσεις με το Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης πραγματοποιήθηκαν στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε Δημόκριτος. Ως εκ τούτου θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον Διευθυντή Ερευνών E. Devlin, υπεύθυνο του συγκεκριμένου οργάνου. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το τμήμα Φυσικής για τις υποδομές του αλλά και τα μέλη ΔΕΠ για την αμέριστη αρωγή και συμπαράσταση που μου παρείχαν κατά τα χρόνια των προπτυχιακών μου σπουδών. Κλείνοντας, θα ήθελα να εκφράσω τις βαθιές μου ευχαριστίες πρώτα από όλα στην οικογένειά μου για τη στήριξη που πάντα μου προσφέρει, αλλά και στους φίλους μου που ήταν δίπλα μου με κάθε τρόπο κατά τη διάρκεια των προπτυχιακών μου σπουδών. i

4

5 Περιεχόμενα Ευχαριστίες Περίληψη Abstract i vi x 1 Εισαγωγή Έμμορφα στοιχεία περιφερικού αίματος Ερυθροκύτταρα Λευκοκύτταρα Αιμοπετάλια Φυσική αιμόσταση Πρωτογενής αιμόσταση Δευτερογενής αιμόσταση Παθήσεις της πήξης του αίματος Θρομβοπενία Θρομβοφιλία Έλεγχος της πήξης του αίματος Αντιπηκτικοί παράγοντες Αντιθρομβωτικοί παράγοντες Θρομβολυτικοί παράγοντες Απεικονιστικές τεχνικές φυσικής με εφαρμογή στην κυτταρική βιολογία Σκοπός της πτυχιακής εργασίας Πειραματικές Τεχνικές Οπτικό μικροσκόπιο ή Μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου Μικροσκόπιο ατομικής δύναμης Πρωτόκολλο εργαστηριακής επεξεργασίας δειγμάτων Πειραματικά αποτελέσματα, συμπεράσματα και μελλοντικοί στόχοι Χρήση πυριτικού άλατος Σειρά δειγμάτων απουσία EDTA iii

6 Δείγμα ολικού αίματος απουσία πηκτικού παράγοντα και EDTA Δείγμα ολικού αίματος απουσία EDTA, υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα για 5 λεπτά Δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα, απουσία EDTA και υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα Σειρά δειγμάτων παρουσία EDTA Δείγμα πλούσιο σε αιμοπετάλια υπό την επίδραση EDTA για μία ώρα Δείγμα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα για 5 λεπτά Δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, υπό την επίδραση 200mg πηκτικού παράγοντα και διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου 10% Συμπεράσματα Γενικά συμπεράσματα σχετικά με τις πειραματικές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν Ειδικά συμπεράσματα σχετικά με το βιοϊατρικό πρόβλημα που μελετήθηκε Δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε κοινούς εργαστηριακούς σωλήνες, απουσία αντιπηκτικού παράγοντα Δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer, παρουσία αντιπηκτικού παράγοντα Μελλοντικοί στόχοι Αʹ 58 Βʹ 59 Βιβλιογραφία 65

7 v

8 Περίληψη Το αίμα αποτελείται από το πλάσμα (άμορφο συστατικό), μέσα στο οποίο αιωρούνται κύτταρα (έμμορφα συστατικά). Συγκεκριμένα, αυτά είναι τα ερυθρά αιμοσφαίρια, τα λευκά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. Τα τελευταία είναι δισκοειδή με διάμετρο 2-3μm. Απαντώνται σε δύο καταστάσεις, μη ενεργοποιημένα (για λόγους ευκολίας θα τα αποκαλούμε άθικτα ) και διεγερμένα. Τα αιμοπετάλια συντελούν καθοριστικό ρόλο στην πήξη του αίματος, καθώς μέσω μίας πολύπλοκης διαδικασίας σχηματίζουν τον αιμοστατικό αιμοπεταλιακό θρόμβο που φράζει το σημείο τραυματισμού ενός αγγείου, σταματώντας την αιμορραγία. Έτσι, από άθικτα οδηγούνται στην ενεργοποιημένη κατάστασή τους. Σε αυτήν την κατάσταση είτε μεταβάλλουν το σχήμα τους αποκτώντας ψευδοπόδια, είτε μεταβάλλουν το μέγεθός τους, είτε εκλύουν τα κοκκία τους, είτε τέλος δημιουργούν συσσωματώματα. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η απεικονιστική μελέτη των ερυθροκυττάρων και των αιμοπεταλίων παρουσία του εμπορικά διαθέσιμου πηκτικού παράγοντα από την εταιρεία SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν Οπτικό Μικροσκόπιο (ΟΜ) και Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) για την διερεύνηση άθικτων (μη ενεργοποιημένων) αιμοπεταλίων σε σύγκριση με ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Ο συνδυασμός συμβατικών μεθόδων με προηγμένες τεχνικές μικροσκόπησης δίνει μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα της τοπολογίας των κυττάρων. Η υψηλή διακριτική ικανότητα του ΜΑΔ, μας επιτρέπει την καταγραφή τόσο των κυττάρων αλλά και συγκεκριμένων λεπτομερειών των επιφανειών τους, δηλαδή της μεμβράνης τους. Στο παρασκευαστικό κομμάτι της μελέτης δημιουργήσαμε τις εξής κατηγορίες δειγμάτων: 1) δείγματα ολικού αίματος, 2) δείγματα ολικού αίματος παρουσία 50mg πηκτικού παράγοντα, 3) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία 50mg πηκτικού παράγοντα, 4) δείγματα πλούσια σε αιμοπετάλια παρουσία EDTA, 5) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 50mg πηκτικού παράγοντα, 6) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 100mg πηκτικού παράγοντα, 7) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 200mg πηκτικού παράγοντα, 8) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, 200mg πηκτικού παράγοντα και διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου συγκέντρωσης 10%. Στο Παράρτημα Β παρατίθεται συγκεντρωτικός πίνακας με λεπτομέρειες vi

9 για τις ακριβείς αναλογίες/συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Τα αρχικά δείγματα ολικού αίματος λήφθηκαν με τη μέθοδο της φλεβοκέντησης απο τον δότη (Δ.Σ.) και υποβλήθηκαν στην ελάχιστη δυνατή επεξεργασία. Για την συλλογή των δειγμάτων αυτών χρησιμοποιήθηκαν πρότυποι δοκιμαστικοί σωλήνες τύπου BD Vacutainer με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Ethylenediaminetetraacetic acid ή EDTA) ως αντιπηκτικό και κοινοί πλαστικοί εργαστηριακοί δοκιμαστικοί σωλήνες χωρίς αντιπηκτικό. Συνοπτικά, πειραματικά πραγματοποιήσαμε φυγοκέντριση των δειγμάτων ώστε να απομονώσουμε τα ερυθροκύτταρα, τα αιμοπετάλια και το αυτόλογο πλάσμα. Συνεχίζοντας, υποβάλλουμε τα δείγματα στις απαραίτητες αραιώσεις με χρήση αυτόλογου πλάσματος, ώστε να επιτύχουμε την επιθυμητή τιμή κυτταροκρίτη 5%-10%. Έτσι, με τη χρήση κυτταρικού φυγοκεντρητή, δημιουργήσαμε μονοστρωματικά υμένια ερυθροκυττάρων και αιμοπεταλίων ώστε να είναι παραγωγική η μελέτη στο ΜΑΔ. Πριν από αυτή πάντα, με τη χρήση ΟΜ πραγματοποιούμε έναν αρχικό έλεγχο των ποσοτικών και ποιοτικών χαρακτηριστικών των υμενίων. Τέλος, ακολουθεί η μελέτη στο ΜΑΔ κατά την οποία μέσω μίας αιχμηρής ακίδας (διάμετρος αιχμής της τάξης των 10nm) επιτυγχάνεται η καταγραφή της μορφολογίας του υπό μελέτη δείγματος. Στη σειρά δειγμάτων τα οποία προσωρινά αποθηκεύτηκαν σε κοινούς εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες, δηλαδή απουσία EDTA, μετά την αιμοληψία παρατηρήσαμε τα πιο κάτω. Αρχικά καταγράφουμε το γεγονός ότι κατά την φυγοκέντρηση αυτών των δοκιμαστικών σωλήνων για 5 λεπτά στα 1200g δημιουργήθηκε γέλη στο υπερκείμενο, λόγω της έντονης μηχανικής καταπόνησης του δείγματος και της απουσίας αντιπηκτικού παράγοντα. Στο δείγμα ολικού αίματος (χωρίς αραίωση) καταγράφηκε ότι ο πηκτικός παράγοντας προάγει την απώλεια κυτταροπλάσματος στα ερυθροκύτταρα αφού αυξάνει το ποσοστό στο οποίο παρατηρείται μερική απώλεια και δημιουργεί έστω και ένα μικρό ποσοστό στο οποίο παρατηρείται ολική απώλεια κυτταροπλάσματος. Ακόμα, παρατηρήθηκε ότι σε χρονικό παράθυρο 5 λεπτών δράσης του πηκτικού παράγοντα συντελείται άμεση ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Όσον αφορά τα δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρατηρήθηκε ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων σε χρόνο 2 λεπτών. Η διαφορά στον χρόνο ενεργοποίησης των δειγμάτων ολικού και αραιωμένου αίματος έγκειται στο γεγονός ότι στα τελευταία έχουμε χρησιμοποιήσει την ίδια ποσότητα πηκτικού παράγοντα, κατ όγκο δείγματος, με το δείγμα ολικού αίματος, όμως ο αιμοπεταλιοκρίτης είναι σημαντικά μικρότερος λόγω της αραίωσης που κάναμε. Αντίθετα, στη σειρά δειγμάτων που προσωρινά αποθηκεύτηκε σε εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer που εμπεριέχουν τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA, το δείγμα αναφοράς παρουσιάζει αυθορμήτως ενεργοποιημένα αιμοπετάλια μετά από μία ώρα παραμονής στον εργαστηριακό πάγκο και ταυτόχρονα συσσωματώματα θραυσμάτων αιμοπεταλίων. Επιπλέον, στα δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυ- vii

10 viii τόλογο πλάσμα παρατηρείται ότι ακόμα και υπό την επίδραση υψηλότερης συγκέντρωσης του πηκτικού παράγοντα από τη συνιστώμενη, η δράση του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA είναι ισχυρότερη από αυτή του συγκεκριμένου πηκτικού παράγοντα, καθώς οι διεργασίες πήξης βρίσκονται σε πρώιμο στάδιο. Συνεπώς, αν και σε συγκεκριμένα δείγματα χρησιμοποιήσαμε πηκτικό παράγοντα σε μεγαλύτερη συγκέντρωση από τη συνιστώμενη, η ύπαρξη του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA αναστέλλει ικανοποιητικά τη δράση του. Τέλος, σε ένα δείγμα που αποθηκεύτηκε σε εργαστηριακό δοκιμαστικό σωλήνα γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer που εμπεριέχει τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA και πηκτικό παράγοντα, χρησιμοποιήσαμε διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου για να διερευνήσουμε τη πιθανή αποπτωτική του δράση στα ερυθροκύτταρα και στα αιμοπετάλια (μέσω μηχανισμών ομοιόστασης). Παρατηρήθηκε ανισοκυττάρωση των ερυθροκυττάρων η οποία επιδεινώθηκε ελαφρώς με τον χρόνο. Ακόμα, παρατηρούνται εναποθέσεις βιολογικού υλικού με συγκεκριμένη φορά στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων, πιθανά προερχόμενες από την ολική αποκοκκίωση των αιμοπεταλίων τα οποία στο γονικό δείγμα (πριν την προσθήκη διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου) ήταν ενεργοποιημένα με ψευδοπόδια και μερική αποκοκκίωση. Χαρακτηριστικό των εναποθέσεων αυτών είναι ότι παρουσιάζουν ένα κρίσιμο μέγεθος ανάπτυξης, πέρα από το οποίο σταματούν να αναπτύσσονται περαιτέρω και τείνουν να κολλάνε μεταξύ τους.

11

12 Abstract Blood consists of plasma, in which cells are suspended. In particular, these are red blood cells, white blood cells and platelets. The latter are disc-shaped with a diameter of 2-3 μm. They are responded to in two states, inactive (for convenience we will call them intact ) and excited. Platelets play a crucial role in blood clotting, as they form a hemostatic clotting by a complicated process which stops bleeding. So, from intact are driven to their activated state. In this situation either they change their shape by acquiring pseudopods, or they change their size, either emit their granules or finally create aggregates. The present study presents the imaging study of erythrocytes and platelets in the presence of the commercially available coagulant from SARSTEDT, a silicate salt as a coating on Polypropylene beads (PP), see Appendix A. In particular, an Optical Microscope (OM) and an Atomic Force Microscope (AFM) were used to investigate intact (unactivated) platelets as compared to activated platelets. The combination of conventional methods with advanced microscopy techniques gives a more comprehensive picture of cell topology. The high resolution of the AFM allows us to record both the cells and specific details of their surfaces. In the preparative part of the study, we created the following sample categories: 1) whole blood samples, 2) whole blood samples in the presence of 50 mg of coagulant, 3) samples of diluted blood in autologous plasma in the presence of 50 mg of coagulant, 4) Samples of diluted blood in autologous plasma in the presence of EDTA and 50 mg of coagulant, 6) diluted blood samples in autologous plasma in the presence of EDTA and 100 mg of coagulant, 7) diluted blood samples in autologous plasma in the presence of EDTA and 200 mg Coagulation factor, 8) diluted blood samples in autologous plasma in the presence of EDTA, 200 mg of coagulating agent and 10% concentration of calcium chloride. A summary table is given in Appendix B detailing the exact ratios/concentrations that were used. Initial whole blood samples were obtained by venipuncture and subjected to minimum processing. BD Vacutainer type test tubes with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) as anticoagulant and common plastic test tubes without anticoagulant were used to collect these samples. Briefly, we experimentally centrifuged the samples to isolate red blood cells, platelets and autologous plasma. Following that, the samples are subjected to the necessary dilutions using autologous plasma to achieve the desired 5%- x

13 10% cytokrite value. Thus, using a cytospinner, we created monolayer red blood cell and platelet films so that the AFM study is productive. Prior to this, using OM we initially perform an initial test of the quantitative and qualitative characteristics of the films. In the series of samples that were temporarily stored in common laboratory test tubes, without EDTA, we observed the following. We initially record that the centrifugation of these test tubes for 5 minutes at 1200g produced gel in the supernatant due to the intense mechanical stress of the sample and the absence of anticoagulant. In the whole blood sample (without dilution) it was recorded that the coagulant promotes the loss of cytoplasm in the erythrocytes as it increases the rate at which partial loss is observed and creates even a small percentage in which a total loss of cytoplasm is observed. Still, it was observed that immediate activation of the platelets was occurred in a 5 minute time frame of the coagulant effect. With regard to blood samples in autologous plasma, platelet activation was observed at 2 minutes. The difference in the time of activation of the whole and diluted blood samples lies in the fact that in the latter we used the same amount of coagulant, by volume of sample, with the whole blood sample, but plateletlite is significantly lower due to the dilution we made. In contrast, in the series of samples temporarily stored in BD Vacutainer tubes containing the EDTA anticoagulant, the reference sample spontaneously displays activated platelets after one hour on the laboratory bench and at the same time platelets aggregates. In addition, in diluted blood samples in autologous plasma, it is observed that even under the effect of a higher concentration of coagulant than recommended, the action of the EDTA anticoagulant is stronger than that of the specific coagulant as the coagulation processes are at an early stage. Therefore, although in specific specimens we used coagulative agent at a higher concentration than recommended, the existence of the EDTA anticoagulant is satisfactorily inhibiting its activity. Finally, in a sample stored in a BD Vacutainer test tube containing the EDTA anticoagulant and a coagulant, we used calcium chloride solution to investigate its potential apoptotic effect on erythrocytes and platelets (via homeostasis mechanisms). A red blood cell anisocytosis was observed which was deteriorated slightly over time. Still, deposits of biological material are present on the surface of red blood cells, possibly originating from total platelet degranulation, which in the parent sample (prior to the addition of calcium chloride solution) were activated by pseudopods and partial degranulation. Characteristic of these deposits is that they have a critical growth size, beyond which they stop growing further and tend to stick together. xi

14

15 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 1.1 Έμμορφα στοιχεία περιφερικού αίματος Το αίμα είναι ένας ζωντανός ιστός που βρίσκεται σε ρευστή κατάσταση και αποτελείται από μεγάλη ποικιλία συστατικών και διαλυμένων χημικών ουσιών (υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, ορμόνες κ.ά.). Αποτελεί το 7% του βάρους του ανθρώπινου σώματος και κατά συνέπεια ο μέσος ενήλικας έχει συνολικό όγκο αίματος περίπου 5 λίτρα. Το ανθρώπινο αίμα αποτελείται από ένα υποκίτρινο υγρό, το πλάσμα (άμορφο συστατικό), μέσα στο οποίο αιωρούνται κύτταρα (έμμορφα συστατικά). Το χρώμα του πλάσματος οφείλεται, κατά κύριο λόγο, στο προϊόν αποδόμησης της αιμοσφαιρίνης, την χολερυθρίνη. Όπως βλέπουμε στο Σχήμα 1.1, τα έμμορφα συστατικά του αίματος είναι τα ερυθρά αιμοσφαίρια, τα λευκά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. [1] Σχήμα 1.1: Από αριστερά προς τα δεξιά: ερυθροκύτταρο, θρομβοκύτταρο και λευκοκύτταρο 1

16 Ερυθροκύτταρα Τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή ερυθροκύτταρα (RBC) περιέχουν την αιμοσφαιρίνη στην οποία οφείλεται και το κόκκινο χρώμα του αίματος. Βασική τους λειτουργία είναι να προσλαμβάνουν το οξυγόνο από τους πνεύμονες και να το μεταφέρουν στους διάφορους ιστούς και στα κύτταρα. Από εκεί παραλαμβάνουν το διοξείδιο του άνθρακα, το οποίο αποβάλλεται κατά την επιστροφή τους στους πνεύμονες. Με αυτόν τον μηχανισμό, εξασφαλίζεται η βιωσιμότητα των κυττάρων, των ιστών, των οργάνων και εν γένει του οργανισμού μας. Ως προς την μορφολογία τους, κατά την κυκλοφορία τους στο καρδιαγγειακό σύστημα, έχουν σχήμα αμφίκοιλων δίσκων διαμέτρου 7 8 μm και πάχους περίπου 2 μm. Το σχήμα τους οφείλεται εν μέρει στην ύπαρξη περίσσειας μεμβράνης, η οποία δίνει στα ερυθρά αιμοσφαίρια αρκετή πλαστικότητα και τα καθιστά ικανά να περνούν μέσω των τριχοειδών ή άλλων στενών σχηματισμών με μικρή διάμετρο. Η μεμβράνη των ερυθρών αποτελείται από μία διπλή στιβάδα λιποειδών μέσα στην οποία διαπλέκονται οι διάφορες πρωτεΐνες της μεμβράνης. Πρόκειται για μία πολύπλοκη δυναμική κατασκευή που επιτελεί τον ρόλο του βιολογικού φραγμού του κυττάρου, ελέγχοντας ποιες χημικές ουσίες μπορούν να την διαπεράσουν και σε ποιο βαθμό, ώστε να μην διαταράσσεται η εξωκυτταρική-ενδοκυτταρική ισορροπία. Σε παθολογικές καταστάσεις παρατηρείται η εμφάνιση σφαιροκυττάρων, στοχοκυττάρων, εμπύρηνων ερυθρών, μικροκυττάρων, μακροκυττάρων, ανισοκυττάρωση, ποικιλοκυττάρωση κ.ά. Επειδή τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι απύρηνα και δεν έχουν οργανίδια, δεν μπορούν να αναπαραχθούν, ούτε να διατηρήσουν τη φυσιολογική δομή τους για μεγάλο χρονικό διάστημα. Παρατηρείται ότι στατιστικά ο αριθμός τους παραμένει σταθερός, ενώ ο μέσος όρος ζωής τους είναι 120 ημέρες. Αυτό συμβαίνει καθώς παράγονται στον μυελό των οστών με έναν κριτικό αριθμό παραγωγής ώστε να αναπληρώνονται οι καθημερινές απώλειές τους ανάλογα με τον χρόνο επιβίωσής τους όταν εξέλθουν στην κυκλοφορία. Η συνεχής προσφορά νέων κυττάρων εξασφαλίζεται με τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων που αποτελούν υπό φυσιολογικές συνθήκες ανεξάντλητη πηγή παραγωγής αιμοποιητικών κυττάρων. Η διαφοροποίηση, ο πολλαπλασιασμός και η ωρίμανση των αρχέγονων κυττάρων στον μυελό ρυθμίζεται από ένα σύνολο χυμικών και κυτταρικών παραγόντων. Καθώς πραγματώνεται η κυτταρική διαφοροποίηση, οι πρόδρομες μορφές των ερυθροκυττάρων (πολυχρωματόφιλες ερυθροβλάστες) αρχίζουν να παράγουν αιμοσφαιρίνη. Στη συνέχεια, χάνουν τους πυρήνες και τα οργανίδιά τους. Τα νέα ερυθροκύτταρα στον μυελό των οστών περιέχουν λίγα ριβοσώματα και για αυτό παρουσιάζουν μια δικτυωτή μορφή (δικτυοερυθροκύτταρα). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, μόνο τα ώριμα ερυθροκύτταρα, τα οποία έχουν χάσει τα ριβοσώματά τους, αφήνουν το μυελό των οστών και εισέρχονται στην κυκλοφορία. Η διαδικασία

17 της παραγωγής νέων ερυθροκυττάρων διαρκεί περίπου 7 ημέρες. Στο στάδιο της γήρανσης πια, το ερυθροκύτταρο υφίσταται τροποποιήσεις στην πλασματική του μεμβράνη που το καθιστούν πιο ευάλωτο σε αναγνώριση από τα μακροφάγα, με συνέπεια τη φαγοκύτωσή του στον σπλήνα, στο ήπαρ και στο μυελό των οστών. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται ερυθρόπτωση. Μερικές παθολογικές καταστάσεις στις οποίες παρατηρείται υπέρμετρη ερυθρόπτωση είναι οι εξής: ελονοσία, σιδηροπενία, δρεπανοκυτταρική αναιμία, σηψαιμία κ.ά. Ως αιματοκρίτης ορίζεται η ποσοστιαία αναλογία του συμπαγούς όγκου των ερυθροκυττάρων στην μονάδα όγκου του αίματος. Ο αιματοκρίτης προσδιορίζεται με την φυγοκέντριση ενός δείγματος αίματος μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα. Κατά την επίδραση της δύναμης της βαρύτητας τα ερυθροκύτταρα ωθούνται στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα και το πλάσμα παραμένει στο υπερκείμενο, ενώ τα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια σχηματίζουν ένα πολύ λεπτό στρώμα ανάμεσά τους. Ο αιματοκρίτης ενός φυσιολογικού ατόμου είναι περίπου 45% στους άνδρες και 42% στις γυναίκες Λευκοκύτταρα Τα λευκά αιμοσφαίρια ή λευκοκύτταρα (WBC) είναι άχρωμα ή λευκού χρώματος με πυρήνα. Έχουν σχήμα σφαιρικό όταν είναι ακίνητα, ενώ μπορούν να κινούνται με αμοιβαδικές κινήσεις. Η διάμετρός τους κυμαίνεται στα 7 21 μm. Υπάρχουν πέντε κύριοι τύποι λευκών αιμοσφαιρίων στην κυκλοφορία του αίματος. Τα λευκοκύτταρα ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες: τα κοκκιοκύτταρα (τα οποία εμφανίζουν ειδικά κοκκία στο κυτταρόπλασμά τους με τη χρήση χρωματισμένων επιχρισμάτων) και τα ακοκκιοκύτταρα (τα οποία δεν εμφανίζουν ειδικά κοκκία). Τα κοκκιοκύτταρα περιλαμβάνουν τα βασεόφιλα, τα ηωσινόφιλα, τα ουδετερόφιλα και φέρουν ένα μονήρη πολύλοβο πυρήνα που μπορεί να προσλάβει διαφορετικά σχήματα. Ενώ, τα ακοκκιοκύτταρα περιλαμβάνουν τα μονοκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα και φέρουν σχετικά μη λοβωτούς πυρήνες. Η πλειοψηφία των λευκοκυττάρων σε ποσοστό 55% 70% είναι ουδετερόφιλα, σε ρόλο φαγοκυττάρων. Όπως τα ερυθρά αιμοσφαίρια, έτσι και τα λευκοκύτταρα δημιουργούνται από μη-διαφοροποιημένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Αυτά που βρίσκονται στον ερυθρό μυελό των οστών μπορούν να μετατραπούν σε οποιονδήποτε από τους πέντε τύπους λευκοκυττάρων. Αυτά στον σπλήνα και στους λεμφαδένες μπορούν να μετατραπούν σε λεμφοκύτταρα ή μονοκύτταρα. Αυτά στον θύμο αδένα μετατρέπονται σε Τ λεμφοκύτταρα. Ανάλογα με τον τύπο λευκοκυττάρου υπάρχει διαφορετικός χρόνος ζωής, αλλά μπορούμε να σχολιάσουμε ότι ο μέσος όρος ζωής των λευκοκυττάρων είναι 1 3 ημέρες. Βασικός ρόλος των λευκοκυττάρων είναι η άμυνα του οργανισμού μας, καταπολεμώντας μικρόβια, ιούς και άλλους εισβολείς. Έχουν την δυνατότητα να κατευθύνονται προς τις περιοχές του οργανισμού όπου αυτός έχει προσβληθεί με αμοιβαδικές κινήσεις, να διεισδύουν σε ιστούς και να επι-

18 4 στρέφουν στη συνέχεια στην κυκλοφορία. Η κίνησή τους κατευθύνεται από χημικές ουσίες που απελευθερώνονται από τραυματισμένα κύτταρα, μία διαδικασία που ονομάζεται χημειοτακτισμός. Μετά την επαφή με ένα αντιγόνο και την αναγνώρισή του, τα ουδετερόφιλα ή τα μακροφάγα το φαγοκυτταρώνουν σε ένα μικρό κενοτόπιο, το οποίο συντήκεται με ένα λυσόσωμα, ώστε τα λυσοσωμικά ένζυμα να πέψουν το φαγοκυτταρωμένο υλικό. Ο αριθμός των λευκοκυττάρων στο αίμα είναι συχνά ένας δείκτης της νόσου. Υπάρχουν συνήθως μεταξύ λευκά αιμοσφαίρια σε ένα λίτρο αίματος και αποτελούν το 1% του αίματος σε έναν υγιή ενήλικα. Η αύξηση του αριθμού των λευκοκυττάρων πάνω από τα ανώτατα όρια ονομάζεται λευκοκυττάρωση και υποδεικνύει μία οξεία λοίμωξη ή διαδικασία νόσου. Ενώ, μία μείωση κάτω από το κατώτατο όριο ονομάζεται λευκοπενία και υποδεικνύει είτε ανοσολογική ανεπάρκεια ή μια σαρωτική λοίμωξη που έχει εξαντλήσει τα αποθέματα των λευκών αιμοσφαιρίων. [2] Αιμοπετάλια Τα αιμοπετάλια ή θρομβοκύτταρα είναι μικρά, δισκοειδή, διάφανα, κυτταρικά θραύσματα με διάμετρο 2 3 μm. Έχουν περιορισμένο χρόνο ζωής στο περιφερικό αίμα, μόλις μερικές ημέρες (5 9 ημέρες). Αριθμούν ανά κυβικό χιλιοστό αίματος. Τα αιμοπετάλια μπορούν να βρεθούν σε δύο καταστάσεις: άθικτα και ενεργοποιημένα. Στην περίπτωση που είναι ενεργοποιημένα, διακρίνονται σε τρεις μορφολογικούς τύπους: σφαιρικός/διεγερμένος, δενδριτικός, απλωμένος. Επίσης, είναι γνωστό ότι ο σπλήνας στον ανθρώπινο οργανισμό λειτουργεί ως μία αποθήκη αιμοπεταλίων, εγκλωβίζοντας υπό φυσιολογικές συνθήκες το 30% 40% των αιμοπεταλίων. Τα αιμοπετάλια παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πήξη του αίματος και την αιμόσταση, δηλαδή την αναστολή της αιμορραγίας. Μέσω μιας πολύπλοκης διαδικασίας, σχηματίζουν τον αιμοστατικό αιμοπεταλιακό θρόμβο που φράζει το σημείο τραυματισμού ενός αγγείου, σταματώντας έτσι την αιμορραγία. Σε επόμενο κεφάλαιο (βλ. Κεφάλαιο: 1.2 Φυσική αιμόσταση) θα αναπτυχθούν πλήρως οι μηχανισμοί πήξης του αίματος στον οργανισμό μας. Όπως τα ερυθρά αιμοσφαίρια, έτσι και τα αιμοπετάλια δημιουργούνται από μη-διαφοροποιημένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Η διαφοροποίηση, ο πολλαπλασιασμός και η ωρίμανση των αρχέγονων κυττάρων στον μυελό των οστών ρυθμίζεται από ένα σύνολο χυμικών και κυτταρικών παραγόντων. Κύριος ρυθμιστής της παραγωγής αιμοπεταλίων είναι η θρομβοποιητίνη. Η θρομβοποιητίνη είναι πρωτεΐνη που παράγεται στο ήπαρ και διεγείρει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των μεγακαρυοκυττάρων. Από το προγονικό κύτταρο γεννώνται οι δεσμευμένες για τη μεγακαρυοτική σειρά προγονικές προβαθμίδες CFU-MEG που με πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση θα δώσουν γένεση στο πρώτο μορφολογικά αναγνωρισμένο κύτταρο, τον μεγακαρυοβλάστη. Στη συνέχεια, ο μεγακαρυοβλάστης

19 πολλαπλασιάζεται με ενδομιτώσεις, δίνοντας γένεση στο προμεγακαρυοκύτταρο. Και αυτό αντίστοιχα στο κοκκιώδες μεγακαρυοκύτταρο. Το μεγακαρυοκύτταρο έχει πλούσιο πρωτόπλασμα με σχηματισμένα στην περιφέρειά του ώριμα αιμοπετάλια. Τα αιμοπετάλια είναι τμήματα του πρωτοπλάσματος κλεισμένα μέσα σε κυτταρική μεμβράνη. Η απόσπαση των θρομβοκυττάρων από το μεγακαρυοκύτταρο γίνεται όταν αυτό φθάσει σε ένα ορισμένο σημείο ωρίμανσης. Δημιουργούνται επιμήκη ψευδοπόδια του κυτταροπλάσματος τα οποία προβάλλουν από το χώρο του μυελού των οστών, όπου βρίσκονται τα κύτταρα αυτά, προς το εσωτερικό των τριχοειδών. Στα ψευδοπόδια αυτά δημιουργούνται περισφίξεις που οδηγούν τελικά στην απόσπαση τμημάτων του κυτταροπλάσματος τα οποία αποτελούν πλέον τα αιμοπετάλια. Η διαδικασία παραγωγής αιμοπεταλίων όπως περιγράφηκε παραπάνω φαίνεται στο Σχήμα 1.2 και διαρκεί περίπου 10 ημέρες. 5 Σχήμα 1.2: Απεικόνιση σχηματισμού των αιμοπεταλίων Η καταστροφή των αιμοπεταλίων φυσιολογικά γίνεται κυρίως στον σπλήνα, επίσης όμως στο ήπαρ και στους πνεύμονες. Υπολογίζεται ότι ο μυελός των οστών ενός φυσιολογικού ενήλικα περιέχει 10 8 μεγακαρυοκύτταρα, ένα μεγακαρυοκύτταρο παρουσιάζει προαιμοπετάλια και παράγει περίπου 3000 αιμοπετάλια. Καθημερινά παράγονται περίπου αιμοπετάλια, ώστε να διατηρείται ο αριθμός των αιμοπεταλίων στην περιφέρεια φυσιολογικός. Κάθε ανωμαλία των αιμοπεταλίων ονομάζεται θρομβοκυτταροπάθεια και μπορεί να είναι είτε χαμηλός αριθμός αιμοπεταλίων (θρομβοπενία), είτε ποιοτική μειονεξία των αιμοπεταλίων (θρομβασθένεια), είτε αυξημένος αριθμός των αιμοπεταλίων (θρομβοκυττάρωση). Άν ο αριθμός των αιμοπεταλίων είναι χαμηλός, μπορεί να προκληθεί σοβαρή αιμορραγία. Αντίθετα, αν ο αριθμός των αιμοπεταλίων είναι πολύ υψηλός, σχηματίζονται θρόμβοι αίματος (θρόμβωση), οι οποίοι μπορεί να φράξουν αιμοφόρα αγγεία. Σε επόμενο κεφάλαιο θα μελετηθούν οι ακραίες περιπτώσεις της θρομβοφιλίας και της θρομβοπενίας (βλ. Κεφάλαιο: 1.3 Παθήσεις της πήξης του αίματος).

20 6 Η κατασκευαστική και η μορφολογική ιδιαιτερότητα των αιμοπεταλίων, είναι αυτή που τους επιτρέπει να επιτελέσουν το έργο τους μετά από διαδοχικές μεταβολές του σχήματός τους, επιτυγχάνοντας την επίσχεση της αιμορραγίας στο σημείο της βλάβης του αγγείου. Τα αιμοπετάλια αποτελούνται από την μεμβράνη, τον γλυκοκάλυκα, τον κυτταρικό σκελετό και το κυτταρόπλασμα. Η μεμβράνη του αιμοπεταλίου έχει πάχος 7 9 nm και είναι διάτρητη από ένα σύστημα μικροσωληναρίων, το οποίο αυξάνει την έκταση αλλά και την λειτουργικότητά της. Όπως η μεμβράνη των ερυθροκυττάρων, έτσι και εδώ η μεμβράνη του αιμοπεταλίου αποτελεί ένα φυσικό και χημικό φραγμό, επιτρέποντας την ενεργό δίοδο ιόντων και μεταβολιτών. Τα κύρια συστατικά της είναι τα λιπίδια (35%), οι πρωτεΐνες (57%) και οι υδατάνθρακες (8%), ενώ στην εξωτερική της επιφάνεια υπάρχει πλήθος υποδοχέων. Η μεμβράνη των αιμοπεταλίων έχει ασύμμετρη όψη και δομή. Αποτελείται από τρεις στιβάδες, δύο φωσφολιπιδικές και μία πρωτεϊνική που βρίσκεται ανάμεσά τους. Η λιπιδική στοιβάδα απαρτίζεται εξωτερικά από σφιγγομυελίνη και φωσφατιδυλοχολίνη, με ουδέτερο ηλεκτρικό φορτίο, που δεν παίρνει μέρος στην αιμόσταση. Αντίθετα, εσωτερικά αποτελείται κυρίως από φωσφατιδυλοσερίνη και φωσφατιδυλεθανολαμίνη και έχει αρνητικό φορτίο με προπηκτικές ιδιότητες. Ο γλυκοκάλυκας έχει πάχος nm και αποτελείται από πρωτεΐνες, βλεννοπολυσακχαρίδες και σε μεγάλη ποσότητα από σιαλικό οξύ, που μαζί με τις γλυκοπρωτεΐνες αποδίδουν τον ορό του γλυκοκάλυκα και προσδίδουν το ηλεκτραρνητικό φορτίο στη μεμβράνη. Ο κυτταρικός σκελετός αποτελείται από τη δέσμη των μικροσωληναρίων και την ινώδη συσκευή στο κεντρικότερο μέρος. Η περιφερική δέσμη των μικροσωληναρίων αποτελείται από 7 20 σωληνάρια, τα οποία σχηματίζουν κύκλο κάτω από τη μεμβράνη. Δομικό υλικό τους είναι η πρωτεΐνη θρομβοσθενίνη. Επίσης, μετέχουν στη διατήρηση του σχήματος των αιμοπεταλίων. Η ινώδης συσκευή του κυτταρικού σκελετού αποτελείται από τα σωληναριακά συστήματα των πυκνών σωληναρίων, το σύστημα των ανοικτών σωληνίσκων και τις σύσταλτες πρωτεΐνες. Το σύστημα των πυκνών σωληναρίων βρίσκεται αμέσως κάτω από το σύστημα των μικροσωληναρίων και προς το εσωτερικό του αιμοπεταλίου. Αποτελεί κύρια αποθήκη ελεύθερων ιόντων ασβεστίου τα οποία παίζουν τον κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση αλλά και στη ρύθμιση του μεταβολισμού των αιμοπεταλίων. Το σύστημα των ανοικτών σωληναρίων αποτελεί δίκτυο που απλώνεται σε όλο το πρωτόπλασμα και επικοινωνεί και με την επιφάνεια του κυττάρου. Τα ανοικτά σωληνάρια αποτελούν την επέκταση της κυτταρικής μεμβράνης του αιμοπεταλίου προς το εσωτερικό του. Οι κυριότερες λειτουργίες του συστήματος αυτού είναι αφενός ότι επιτρέπει την είσοδο και τη μετακίνηση εξωγενούς υλικού προς το εσωτερικό του κυττάρου και αφετέρου ότι συμβάλλει στη μετακίνηση των κοκκίων του πρωτοπλάσματος προς το κέντρο του, όταν τα αιμοπετάλια διεγερθούν. Μερικές από τις συσταλτές πρωτεΐνες είναι οι εξής: ακτίνη, μυοσίνη, προφυλίνη,

21 ακτομυοσίνη κ.ά. Το κυτταρόπλασμα περιέχει πλήθος σωματιδίων, τα οποία αποτελούν κυρίως τόπους αποθήκευσης πρωτεϊνών αλλά και άλλων ουσιών, που είναι πρωταρχικής σημασίας για τη λειτουργία των αιμοπεταλίων. Αυτά είναι: τα Δ- κοκκία(ή πυκνά κοκκία), τα Α-κοκκία, τα Λ-κοκκία(λυσοσωματικά ένζυμα), τα μιτοχόνδρια, τα κοκκία γλυκογόνου και τα κοκκία θρομβοξάνης. Αναφορικά, στα πυκνά κοκκία είναι αποθηκευμένες ουσίες όπως ADP, ATP, 5-HT κ.ά. Ενώ στα Α-κοκκία, β-θρομβοσφαιρίνη, ο παράγοντας Von Willebrand, ινωδογονεκτίνη κ.ά. [3] Φυσική αιμόσταση Η αιμόσταση είναι ένας βασικός αμυντικός μηχανισμός του οργανισμού μας, ο οποίος περιλαμβάνει ένα σύνολο πολύπλοκων βιοχημικών μηχανισμών και μηχανισμών αλληλεπίδρασης μεταξύ παραγόντων της πήξης, κυττάρων του αίματος (αιμοπεταλίων κατά κύριο λόγο) και του ενδοθηλίου του αγγείου. Σκοπός της είναι η προστασία του οργανισμού από την αιμορραγία, όταν υπάρχει τραυματισμός και ταυτόχρονα, τη διατήρηση του αίματος στα αγγεία σε ρευστή κατάσταση, ώστε να εμποδίζεται η θρόμβωση. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η ενδοαυλική επιφάνεια του αγγείου είναι κατ εξοχήν αντιθρομβωτική. Το άθικτο ενδοθήλιο ενισχύει την αγγειοδιαστολή, αναστέλλει την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και των λευκοκυττάρων και προλαμβάνει τη θρόμβωση. Διάφοροι παράγοντες επηρεάζουν τη φυσιολογική αιμόσταση, μεταξύ των οποίων πρωτεύοντα ρόλο παίζουν η ποιότητα των αιμοφόρων αγγείων, η ποσοτική και ποιοτική επάρκεια των αιμοπεταλίων καθώς και οι πρωτεΐνες του πλάσματος. Για περιγραφικούς λόγους ο φυσιολογικός μηχανισμός τη αιμόστασης διακρίνεται σε 3 φάσεις: Την πρωτογενή αιμόσταση, που περιλαμβάνει τη σύσπαση του τραυματισμένου αγγείου και τη δημιουργία ενός πρωτογενούς αιμοπεταλιακού θρόμβου, Τη δευτερογενή αιμόσταση, που περιλαμβάνει τη δημιουργία ενός πλέγματος ινώδους που σταθεροποιεί τον θρόμβο, Την ινωδόλυση, διαδικασία που αποτρέπει την υπερβολική αύξηση του θρόμβου και μεσολαβεί στη διάλυσή του. Οι παραπάνω φυσιολογικοί αιμοστατικοί μηχανισμοί αντιμετωπίζουν αποτελεσματικότερα τις αιμορραγίες των μικρών αγγείων (τριχοειδή, φλεβίδια) Πρωτογενής αιμόσταση Ο τραυματισμός ενός αγγείου προκαλεί την άμεση (εντός δευτερολέπτων) συστολή του, περιορίζοντας έτσι την απώλεια αίματος. Ο αγγειακός μηχανισμός ενεργοποιείται μέσω νευρικών ερεθισμάτων εξαιτίας του πόνου αλλά

22 8 και μέσω της απελευθέρωσης αγγειοσυσπαστικών ουσιών όπως η σεροτονίνη, η επινεφρίνη και η νοραδρεναλίνη από τα αιμοπετάλια. Ο αγγειοσπασμός διαρκεί περίπου λεπτά. Ο μηχανισμός αυτός είναι γρήγορος και αποτελεσματικός στα πολύ μικρά αγγεία. Στην περίπτωση που ο τραυματισμός είναι εκτεταμένος και το αγγείο μεγάλο απαιτούνται επιπρόσθετες διεργασίες. Ακολουθεί ο σχηματισμός λευκού θρόμβου από τα αιμοπετάλια. Ονομάζεται και λευκός θρόμβος γιατί στο εσωτερικό του δεν παγιδεύονται ερυθρά αιμοσφαίρια. Αρχικά τα αιμοπετάλια προσκολλούνται με το υπενδοθήλιο μέσω του παράγοντα Von Willebrand (VWF). Το μόριο αυτό συνδέεται με το κολλαγόνο του υπενδοθηλίου και στη συνέχεια με τον υποδοχέα της γλυκοπρωτεΐνης Ib (GPIb) που βρίσκεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Αμέσως μετά την προσκόλληση τα αιμοπετάλια ενεργοποιούνται, μεταβάλλοντας το σχήμα τους και εκλύοντας τα κοκκία τους. Το περιεχόμενο των κοκκίων έχει ιδιότητες που ενεργοποιούν την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Εκλύονται ουσίες όπως ATP, ADP, σεροτονίνη και ο αιμοπεταλιακός παράγων 3. Η ADP συμβάλλει στην ενεργοποίηση κι άλλων αιμοπεταλίων, η σεροτονίνη προκαλεί αγγειοσύσπαση και ο αιμοπεταλιακός παράγοντας 3 είναι λιποπρωτεΐνη που περιέχει αραχιδονικό οξύ. Ταυτόχρονα, στο κυτταρόπλασμα ενισχύεται η μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε A2 θρομβοξάνη που επιτείνει την αγγειοσυστολή. Η έκκριση του ADP και της A2 θρομβοξάνης προκαλεί την ενεργοποίηση και άλλων αιμοπεταλίων, ενισχύοντας έτσι την διαδικασία της συσσώρευσης. Τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια ενώνονται μεταξύ τους μέσω μορίων (ινωδογόνο, φιμπρονεκτίνη και βιτρονεκτίνη). Η γλυκοπρωτεΐνη GPIIb/IIIa και η γλυκοπρωτεΐνη GPIb των αιμοπεταλίων παίζουν τον ρόλο της γέφυρας και συμμετέχουν στη δημιουργία ενός πρωτογενούς αιμοστατικού θρόμβου. Στο Σχήμα 1.3 παρουσιάζεται σχηματικά η παραπάνω διαδικασία. Σχήμα 1.3: Μηχανισμός ενεργοποίησης και προσκόλλησης των αιμοπεταλίων Η ανεπιθύμητη αύξηση του μεγέθους του θρόμβου ελέγχεται από τα μη κατεστραμμένα γειτονικά ενδοθήλια κύτταρα με την παραγωγή μονοξει-

23 δίου του αζώτου (NO) και προστακυκλίνης (P Gl 2 ), όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.4. Το μονοξείδιο του αζώτου δεν έχει μόνο αγγειοδιασταλτική δράση, αλλά αναστέλλει την προσκόλληση, την ενεργοποίηση και την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Η προστακυκλίνη αποτελεί σημαντικό αναστολέα της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Έτσι, ενώ τα αιμοπετάλια διαθέτουν ένζυμα που σχετίζονται με τη σύνθεση της θρομβοξάνης A2 από το αραχιδονικό οξύ, τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα περιέχουν διαφορετικά ένζυμα τα οποία μετατρέπουν τις ενδιάμεσες ουσίες που σχηματίζονται από το αραχιδονικό οξύ όχι σε θρομβοξάνη A2 αλλά σε προστακυκλίνη. [4] 9 Σχήμα 1.4: Μηχανισμός ελέγχου του μεγέθους του θρόμβου Δευτερογενής αιμόσταση Καθώς σχηματίζεται το αιμοπεταλιακό πήγμα, σχεδόν ταυτόχρονα ενεργοποιούνται οι πρωτεΐνες πήξης του πλάσματος με αποτέλεσμα μέσα σε 3 6 λεπτά τον σχηματισμό αιμοστατικού πήγματος. Το σύστημα πήξης αποτελείται από πρωτεΐνες του πλάσματος, κυτταρικά στοιχεία και συστατικά του αγγειακού ενδοθηλίου. Σε φυσιολογικές συνθήκες, οι περισσότεροι παράγοντες του συστήματος, είτε δεν είναι εκτεθειμένοι στην κυκλοφορία, είτε κυκλοφορούν σε ανενεργό μορφή. Η εμφάνιση αγγειακής βλάβης έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του μηχανισμού της πήξης και τη μετατροπή των παραγόντων αυτών σε βιολογικά δραστικούς. Το κλασσικό μοντέλο της πήξης περιγράφει ένα καταρράκτη από αντιδράσεις που αποτελούν διαδοχική ενεργοποίηση των διαφόρων παραγόντων της πήξης μέσω δύο οδών. Ο καταρράκτης της πήξης ισοδυναμεί με τον μηχανισμό της πήξης. Αποτελείται από ένα σύνολο διαδοχικών αντιδράσεων, οι οποίες ενεργοποιούνται με καταλυτικό μηχανισμό και έχουν ως τελικό στόχο τη μετατροπή με πολυμερισμό του διαλυτού ινωδογόνου σε αδιάλυτο ινώδες και στη συνέχεια σε πλέγμα ινικής, με τη δράση της ενεργοποιημένης θρομβίνης. Αναλυτικά ο καταρράκτης της πήξης παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.5. Περιγράφεται μέσω δύο διαφορετικών οδών: της ενδογενούς και της εξωγενούς. Και οι δύο συγκλίνουν στην ενεργοποίηση του παράγοντα Χ. Στη συνέχεια ακολουθείται κοινή οδός με τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Η ενεργοποίηση της ενδογενούς οδού γίνεται μέσω του συστήματος επαφής. Αντίθετα, η ενεργοποίηση της εξωγενούς οδού γίνεται από παράγοντες που απελευθερώνονται από τους τραυματισμένους ιστούς.

24 10 Σχήμα 1.5: Το κλασσικό μοντέλο του καταρράκτη της πήξης μέσω δύο διαφορετικών οδών, της εξωγενούς οδού με ενεργοποίηση του ιστικού παράγοντα και της ενδογενούς οδού με ενεργοποίηση του συστήματος επαφής Η ενδογενής οδός της πήξης προκαλείται με ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙΙ επάνω στο κατεστραμένο ενδοθήλιο. Η ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙΙ προάγεται από την προκαλλικρεΐνη, από το κινινογόνο και από τον παράγοντα ΧΙ. Σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα, που εντοπίζεται στην μη-φυσιολογική περιοχή, το οποίο ενεργοποιεί τον παράγοντα ΧΙΙ. Στη συνέχεια ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΧΙΙa δρώντας σαν ένζυμο, καταλύει την ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ, ο οποίος ακολούθως ενεργοποιεί τον παράγοντα ΙΧ. Η ενεργοποίηση του παράγοντα ΙΧ από τον ΧΙa απαιτεί την παρουσία ιόντων ασβεστίου. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΙΧ συνδέεται με τον παράγοντα VIII (αντιαιμοροφιλικό παράγοντα). Με τη μεσολάβηση ιόντων ασβεστίου και ενός φωσφολιποειδούς, ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΙΧ ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ σε Xa. Η ενεργοποίηση αυτή πραγματοποιείται συνήθως στην κυτταροπλασματική μεμβράνη των αιμοπεταλίων που έχουν ενεργοποιηθεί. Μπορεί όμως να συμβεί και επάνω στο αγγειακό ενδοθήλιο. Η εξωγενής οδός ενεργοποιείται όταν ο ιστικός παράγοντας (TF-tissue factor) εκτίθεται στην κυκλοφορία. Ο ιστικός παράγοντας είναι μία γλυκοπρωτεΐνη η οποία εκφράζεται σε διάφορα είδη κυττάρων και κυρίως στα ενδοθηλιακά. Μετά από αγγειακή βλάβη, ο εκτεθειμένος στην επιφάνεια των κυττάρων ιστικός παράγοντας έρχεται σε επαφή με τον παράγοντα VII, με τον οποίο εμφανίζει υψηλή συγγένεια και σχηματίζει πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου ισχυρό σύμπλεγμα με την ενεργοποιημένη μορφή του (σύμπλεγμα TF/FVIIa). Το σύμπλεγμα TF/VIIa έχει δύο στόχους: την ενεργοποίηση του παράγοντα Χ σε Xa και την ενεργοποίηση του παράγοντα ΙΧ σε ΙΧa. Στην κοινή οδό o FXa σχηματίζει σύμπλεγμα με τον FVa, πάνω στην επιφάνεια του αιμοπεταλίου, το οποίο καταλύει τη μετατροπή μεγάλων πο-

25 σοτήτων προθρομβίνης, σε θρομβίνη. Αυτή η εκρηκτική παραγωγή θρομβίνης είναι ικανή να αποσπάσει από το ινωδογόνο τα ινωδοπεπτίδια Α και Β και να ενεργοποιήσει τον παράγοντα FXII. Τα παραγόμενα μονομερή του ινώδους πολυμερίζονται, δημιουργώντας έναν ασταθή θρόμβο, ο οποίος υπό την επίδραση του παράγοντα ΧΙΙΙa μετατρέπεται σε αδιάλυτο θρόμβο ινώδους. Ο θρόμβος αυτός προστατεύεται από την ινωδόλυση, μέσω του ενεργοποιημένου από τη θρομβίνη αναστολέα της ινωδόλυσης, ο οποίος δραστηριοποιείται σε υψηλές συγκεντρώσεις θρομβίνης. Βέβαια ο αποτελεσματικός έλεγχος της διαδικασίας του σχηματισμού του θρόμβου είναι αναγκαίος, έτσι ώστε ο θρόμβος να περιορίζεται στο σημείο της βλάβης αλλά και να λύεται ικανοποιητικά όταν αυτό απαιτείται. Ο περιορισμός επιτυγχάνεται με δύο κύριους μηχανισμούς, με τους οποίους ρυθμίζεται η δράση της θρομβίνης. Ένα άμεσο σύστημα αναστολέων των πρωτεασών της σερίνης, που περιλαμβάνουν την αντιθρομβίνη (ΑΤ) και τον αναστολέα της οδού του ιστικού παράγοντα (Tissue Factor Pathway Inhibitor:TFPI). Η αντιθρομβίνη απενεργοποιεί κυρίως τη θρομβίνη και τους παράγοντες ΙΧa,Xa,XIa δημιουργώντας συμπλέγματα 1 : 1, ενώ ο TFPI αναστέλλει τον ιστικό παράγοντα (εξωγενής οδός), Ένα έμμεσο σύστημα που αποτελείται από την πρωτεΐνη C και τον συμπαράγοντά της, την πρωτεΐνη S (είναι Κ-βιταμινοεξαρτώμενες πρωτεΐνες). Η οδός της πρωτεΐνης C ενεργοποιείται από το σύμπλεγμα θρομβίνης/θρομβομοντουλίνης που βρίσκεται στο ενδοθήλιο. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C με την παρουσία του συμπαράγοντά της, την πρωτεΐνη S, είναι ικανή να απενεργοποιήσει τους Va και VIIIa αναστέλλοντας αποτελεσματικά το σύμπλεγμα της προθρομβινάσης και το σύμπλεγμα της τενάσης. Τελικό στάδιο της διαδικασίας της πήξης είναι η ινωδόλυση, δηλαδή η διάλυση του θρόμβου. Παράλληλα με τη δημιουργία του θρόμβου, δραστηριοποιείται το ινωδολυτικό σύστημα. Πρόκειται για ένα σύνολο ενζύμων και αναστολέων που αποτελούν τον κύριο αμυντικό μηχανισμό, ο οποίος προστατεύει από την θρόμβωση. Περιλαμβάνει ένα ανενεργό προένζυμο, το πλασμινογόνο (PG), το οποίο αφού μετατραπεί σε ενεργό ένζυμο, την πλασμίνη (PL), διασπά την ινική σε διαλυτά προϊόντα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.6, το μόριο του ινωδογόνου εμφανίζει τρεις οζώδεις περιοχές, μία στο μέσον του μορίου που φέρεται ως περιοχή Ε, και δύο στα άκρα του μορίου εκατέρωθεν της περιοχής Ε, που φέρονται ως περιοχές D. Η δράση της πλασμίνης επί του ινωδογόνου προκαλεί αρχικά διάσπαση του τριμερούς D-E-D και σχηματισμό του διμερούς E-D και του μονομερούς D. Στη συνέχεια, γίνεται διάσπαση του διμερούς D-E με αποτέλεσμα τα τελικά προϊόντα της διάσπασης του ινωδογόνου από την πλασμίνη να είναι τα μονομερή D και E. 11

26 12 Σχήμα 1.6: Ο πολυμερισμός του ινωδογόνου και τα προϊόντα λύσεώς του 1.3 Παθήσεις της πήξης του αίματος Όπως έχει αναφερθεί και στο κεφάλαιο 1.1, κάθε ανωμαλία των αιμοπεταλίων ονομάζεται θρομβοκυτταροπάθεια και μπορεί να χαρακτηρίζεται είτε από χαμηλό αριθμό αιμοπεταλίων (θρομβοπενία), είτε από ποιοτική μειονεξία των αιμοπεταλίων (θρομβασθένεια), είτε από αυξημένο αριθμό των αιμοπεταλίων (θρομβοκυττάρωση). Οι θρομβοκυτταροπάθειες μπορεί να είναι είτε συγγενείς (π.χ. Σύνδρομο Fanconi), είτε νεογνικές (π.χ. διήθηση μυελού), είτε επίκτητες (π.χ. οφειλόμενη σε ιονίζουσα ακτινοβολία) Θρομβοπενία Η θρομβοπενία ή θρομβοκυτταροπενία είναι η παθολογική κατάσταση όπου ο αριθμός των αιμοπεταλίων σε κυκλοφορία είναι μικρότερος του κατώτερου φυσιολογικού (< ανά κυβικό χιλιοστό αίματος). Πρόκειται για διαταραχή των αιμοπεταλίων που είναι είτε επίκτητη είτε συγγενής. Η θρομβοπενία μπορεί να προκληθεί από μία ποικιλία αιτιών. Τα αίτια μπορεί να οφείλονται κυρίως σε: Μειωμένη παραγωγή αιμοπεταλίων, λόγω ιογενών λοιμώξεων που προσβάλλουν τον μυελό των οστών, όπως η ερυθρά, η ανεμοβλογιά, η ηπατίτιδα C, διάφορες μορφές καρκίνου του μυελού των οστών (λευχαιμία, λεμφώματα κλπ), ανεπάρκεια βιταμίνης B12 και φυλλικού οξέος, Αυξημένη καταστροφή αιμοπεταλίων, λόγω διαφόρων φαρμάκων, όλων σχεδόν των κατηγοριών,

27 Ιδιοπαθή θρομβοπενική πορφύρα. Πρόκειται για μία κατάσταση κατά την οποία το ανοσοποιητικό σύστημα επιτίθεται με αντισώματα κατά των υγιών αιμοπεταλίων του οργανισμού, Σπληνικό εγκλωβισμός. Η αυξημένη κατακράτηση των αιμοπεταλίων στον σπλήνα μπορεί να οδηγήσει σε χαμηλό αριθμό αιμοπεταλίων ή σε μεταβολή της λειτουργίας του σπλήνα. Όταν ο σπλήνας διογκώνεται μπορεί να κατακρατήσει μεγαλύτερο του συνήθους αριθμό αιμοπεταλίων. Συχνές αιτίες θρομβοπενίας λόγω διόγκωσης του σπλήνα είναι η κίρρωση του ήπατος λόγω χρόνιας ηπατίτιδας B ή ηπατίτιδας C, καθώς και διάφοροι τύποι καρκίνου του αίματος, Διαταραχή αραίωσης των πηκτικών παραγόντων που μπορεί να προέλθει από την χορήγηση αρκετών μονάδων ερυθρών αιμοσφαιρίων σε βραχύ χρονικό διάστημα και Ψευδο-θρομβοκυτταροπενία. Πρόκειται για συχνή κατάσταση που οφείλεται σε λανθασμένο υπολογισμό του αριθμού των αιμοπεταλίων, είτε λόγω κακής αιμοληψίας είτε λόγω της επίδρασης του αντιπηκτικού παράγοντα (συνήθως EDTA) των δοκιμαστικών σωλήνων στο δείγμα. Μία σημαντική πτώση των αιμοπεταλίων προκαλεί ασθενή πήξη του αίματος με αποτέλεσμα πιθανές επικίνδυνες αιμορραγίες στα εσωτερικά όργανα. Βασικά συμπτώματα που παρατηρούνται είναι η εύκολη πρόκληση εκτεταμένων εκχυμώσεων (μελανιών), η εμφάνιση εξανθήματος (χρώματος κοκκινωπούπορφυρού) συνήθως στο κάτω μέρος των κνημών, η παρατεταμένη αιμορραγία ακόμα και μετά από μικροτραυματισμούς, η αναιτιολόγητη αυθόρμητη αιμορραγία από τα ούλα ή τη μύτη, η παρουσία αίματος στα ούρα ή στα κόπρανα και η βαριά περίοδος στον γυναικείο πληθυσμό Θρομβοφιλία Η θρομβοφιλία ή θρομβοκυττάρωση είναι η παθολογική κατάσταση κατά την οποία ο υπέρμετρος πολλαπλασιασμός των μεγακαρυοκυττάρων του μυελού των οστών οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των αιμοπεταλίων (> ανά κυβικό χιλιοστό αίματος). Μπορεί να είναι είτε συγγενής είτε επίκτητη. Η θρομβοφιλία μπορεί να προκληθεί από μία ποικιλία αιτιών. Τα αίτια μπορεί να οφείλονται σε: Ιστική φλεγμονή όπως η νόσος του κολλαγόνου των αγγείων και η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, Κακοήθειες, Μυελοϋπερπλαστικές διαταραχές όπως η γνήσια πολυκυτταραιμία, η ιδιοπαθής μυελοΐνωση, η ιδιοπαθής θρομβοκυττάρωση, η χρόνια μυελογενής λευχαιμία,

28 14 Σπληνεκτομή ή υποσπληνισμό, Υπερπαραγωγή θρομβοποιητίνης με αποτέλεσμα τη συνεχή ενεργοποίηση του υποδοχέα της Mpl και Δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ένα από τα βασικά κλινικά συμπτώματα είναι η θρόμβωση. Ο κίνδυνος της θρόμβωσης αυξάνεται με την ηλικία και συνήθως εκδηλώνεται σε ασυνήθιστες θέσεις, όπως οι νεφρικές, οι εγκεφαλικές φλέβες, η μεσεντέρια, η ηπατική ή η πυλαία φλέβα. Ακόμη παρατηρούνται τα εξής κλινικά ευρήματα: η ύπαρξη ελαφράς σπληνομεγαλίας, η ελαφρά αύξηση των λευκών αιμοσφαιρίων, η αύξηση του αριθμού των μεγακαρυοκυττάρων χωρίς άλλες μορφολογικές διαταραχές. Η θρομβοφιλία έχει συνδεθεί με επαναλαμβανόμενες αποβολές και πιθανώς με ποικίλες επιπλοκές κατά την εγκυμοσύνη, όπως η περιορισμένη ενδομήτρια ανάπτυξη του εμβρύου, η θνησιγένεια ή και πρόωρη αποκόλληση του πλακούντα. Οι πιο συχνοί τύποι συγγενούς θρομβοφιλίας είναι εκείνοι που εμφανίζονται λόγω υπερβολικής δραστηριότητας κάποιων πηκτικών παραγόντων. Οι πιο κοινές από αυτές είναι ο παράγοντας V Leiden και η μετάλλαξη της προθρομβίνης. Οι σπάνιες μορφές συγγενούς θρομβοφιλίας προκαλούνται συνήθως από έλληψη φυσικών αντιπηκτικών. Στατιστικά είναι πιθανότερο να προκαλέσουν θρόμβωση. Οι βασικές είναι η έλλειψη αντιθρομβίνης ΙΙΙ, η έλλειψη πρωτεΐνης C ή S. Ηπιότερη είναι η μετάλλαξη του παράγοντα XIII. Ένας αριθμός επίκτητων θρομβοφιλιών αυξάνουν τον κίνδυνο θρόμβωσης. Παραδείγματος χάριν, το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο. Προκαλείται από αντισώματα ενάντια σε συστατικά της κυτταρικής μεμβράνης, κυρίως το αντιπηκτικό (αντίσωμα) του λύκου, αντισώματα της αντι-καρδιολιπίνης και το αντίσωμα της αντί-β2-γλυκοπρωτεΐνης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το σύνδρομο αυτό μπορεί να προκαλέσει αρτηριακή ή φλεβική θρόμβωση. 1.4 Έλεγχος της πήξης του αίματος Αντιπηκτικοί παράγοντες Η χορήγηση αντιπηκτικών παραγόντων έχει σκοπό την παρεμπόδιση του σχηματισμού και τον περιορισμό του μεγέθους του θρόμβου στο σημείο της αγγειοσύσπασης. Συγκεκριμένα, τα αντιπηκτικά φάρμακα αναστέλλουν τη θρομβίνη, καθώς και κάποιους από τους παράγοντες που συμμετέχουν στο μηχανισμό της πήξης, αποτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την περαιτέρω παραγωγή ινικής. Βασικοί πρωταγωνιστές σε αυτήν την κατηγορία είναι η ηπαρίνη και οι ανταγωνιστές της βιταμίνης Κ.

29 Η ηπαρίνη είναι μια γλυκοζοαμινογλυκάνη, παρασκεύασμα μεγάλου μοριακού βάρους. Αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαριτών και πεντασακχαριτών, με αποτέλεσμα να είναι ένα ανομοιογενές μόριο. Αναστέλλει την θρομβίνη και τους παράγοντες Xα, ΙΧα, ΧΙα, ΧΙΙα. Επίσης έχει αντιθρομβωτική δράση, καθώς συνδέεται με την αντιθρομβίνη (ΑΤ), δημιουργώντας το σύμπλεγμα ΑΤ/ΗΠ. Έτσι η θρομβίνη που συνδέεται στο πιο πάνω σύμπλεγμα καθίσταται ανενεργή. Φυσιολογικά η βιταμίνη Κ συμμετέχει στην σύνθεση και στην ενεργοποίηση των βασικών παραγόντων πήξης (II, VII, IX και X), καθώς και των πρωτεϊνών της πήξης C και S. Η χορήγηση ανταγωνιστών της βιταμίνης Κ αναστέλλει την ηπατική αναγωγάση που είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της βιταμίνης Κ. Με τελικό αποτέλεσμα να ελαττώνεται η παραγωγή των βασικών παραγόντων και των πρωτεϊνών πήξης, προκαλώντας έτσι αντιπηκτική δράση. Η αποτελεσματικότητα της δράσης τους δεν είναι απολύτως προβλέψιμη καθώς επηρεάζονται τόσο από την δίαιτα τόσο από την χορήγηση άλλων φαρμακευτικών σκευασμάτων. Ανταγωνιστές της βιταμίνης Κ περιλαμβάνουν τα φάρμακα βαρφαρίνη, ασενοκουμαρόλη, κ.ά Αντιθρομβωτικοί παράγοντες Όπως η χορήγηση αντιπηκτικών παραγόντων έχει σκοπό την παρεμπόδιση του σχηματισμού και τον περιορισμό του μεγέθους του θρόμβου στο σημείο της αγγειοσύσπασης, το ίδιο αποτέλεσμα έχει και η χορήγηση αντιθρομβωτικών παραγόντων. Η διαφορά έγκειται στο γεγονός ότι τα αντιθρομβωτικά φάρμακα αποτρέπουν τη συσσώρευση και συγκόλληση των αιμοπεταλίων, σε αντίθεση με τα αντιπηκτικά που συμβάλλουν στις πρωτεΐνες του πλάσματος. Χορηγούνται σε πάσχοντες από: στεφανιαία νόσο, έμφραγμα του μυοκαρδίου και αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια. Γνωστοί αντιθρομβωτικοί παράγοντες είναι η ασπιρίνη, η κλοπιδογρέλη, η τικλοπιδίνη, η διπυριδαμόλη και οι ανταγωνιστές των γλυκοπρωτεϊνικών υποδοχέων GPIIb/IIIa των αιμοπεταλίων Abciximab. Συγκεκριμένα, η ασπιρίνη (ακετυλοσαλικυλικό οξύ) αναστέλλει τη δράση της κυκλοξυγενάσης των αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα την αναστολή του σχηματισμού της θρομβοξάνης (ΤΧΑ2) προσταγλαδίνη. Ακόμα, αναστέλλει την έκλυση ADP. Η τικλοπιδίνη, με βασικό συστατικό την θειενοπυριδίνη, αναστέλλει την προκαλούμενη από το ADP συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Προκαλώντας αποκλεισμό των υποδοχέων ADP της μεμβράνης των αιμοπεταλίων. H διπυριδαμόλη αποτελεί αναστολέα της φωσφοδιεστεράσης, αποκλείοντας την επαναπρόσληψη αδενοσίνης στα αιμοπετάλια. Αποτέλεσμα αυτού είναι η παρουσία χαμηλών επιπέδων ADP. Τέλος, οι ανταγωνιστές του υποδοχέα GPIIb/IIIa αναστέλλουν την πρόσδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα και την ακόλουθη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, ανεξάρτητα από τον παράγοντα που προκάλεσε την αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση. Η χορήγηση των αντιθρομβωτικών φαρμάκων αναστέλλει τη λειτουργικό-

30 16 τητα των αιμοπεταλίων για μία εβδομάδα περίπου. Η διακοπή της αγωγής, αποκαθιστά τη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων σε 7 10 ημέρες Θρομβολυτικοί παράγοντες Οι θρομβολυτικοί παράγοντες είναι πρωτεολυτικά ένζυμα, τα οποία προκαλούν τη διάσπαση του ινώδους και έτσι διαλύουν τους πρόσφατα σχηματισμένους θρόμβους. Αυτό επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου για να σχηματισθεί πλασμίνη, η οποία αποικοδομεί το ινώδες και διαλύει τους θρόμβους. Τα συνηθέστερα φάρμακα είναι η στρεπτοκινάση, η ουροκινάση, η αλτεπλάση, η ρετεπλάση, η τενεκτεπλάση, η ανιστρεπλάση. Η στρεπτοκινάση απομονώνεται από τον αιμολυτικό στρεπτόκοκκο. Αρχικά είναι αδρανής, μέχρι να συνδεθεί με το πλασμινογόνο του πλάσματος. Το σύμπλεγμα που προκύπτει, ενεργοποιεί τη μετάπτωση του πλασμινογόνου προς πλασμίνη. Ενώ, η αλτεπλάση είναι προϊόν ανασυνδυασμού, αντίγραφο του φυσικού t-pa. Η ρετεπλάση και η τενεκτεπλάση είναι επίσης προϊόντα ανασυνδυασμού, παρόμοια με τον φυσικό t-pa, αλλά δεν έχουν ακριβώς την ίδια δομή. Συνδέονται αποκλειστικά με το πλασμινογόνο που είναι συνδεδεμένο στο ινώδες που βρίσκεται μέσα στο θρόμβο. [5] 1.5 Απεικονιστικές τεχνικές φυσικής με εφαρμογή στην κυτταρική βιολογία Η ανάγκη της μη επεμβατικής απεικόνισης στο επίπεδο της κυτταρικής βιολογίας οδήγησε στην ανακάλυψη μεθόδων απεικόνισης. Η επιλογή της πιο κατάλληλης τεχνικής για το σχεδιασμό ενός συγκεκριμένου πειράματος βασίζεται στη γνώση των δυνατοτήτων και των περιορισμών κάθε τεχνικής. Στον κλάδο της Κυτταρικής Βιολογίας εφαρμόζονται μέθοδοι και τεχνικές, αρκετές από τις οποίες στηρίζονται στη χρήση διαφόρων τύπων μικροσκοπίων. Σε αυτό το κεφάλαιο θα αναφερθούμε στο Οπτικό Μικροσκόπιο (ΟΜ), στο Μικροσκόπιο Φθορισμού, στο Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης (ΗΜΣ), στο Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ), στο Μικροσκόπιο Ατομικής Ακουστικής Δύναμης και στις Οπτικές Λαβίδες. Ο οφθαλμός του ανθρώπου ως φακός μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως οπτικό όργανο. Μπορούμε με γυμνό οφθαλμό να διακρίνουμε αντικείμενα διαστάσεων της τάξης των μm. Ο περιορισμός αυτός στην απεικόνιση αίρεται με τη χρήση του οπτικού μικροσκοπίου, το οποίο είναι οπτικό όργανο για την παρατήρηση αντικειμένων υπό μεγέθυνση, με τη βοήθεια του φωτός. Τα βασικά τμήματά του είναι η πηγή φωτός, ο συγκεντρωτικός φακός, ο αντικειμενικός φακός και ο προσοφθάλμιος φακός. Υπάρχει όμως και πάλι κάποιο όριο στις λεπτομέρειες που μπορούμε να διακρίνουμε με το φωτονικό μικροσκόπιο. Ο περιοριστικός παράγοντας οφείλεται στο φαινόμενο της περίθλασης. Όταν στην πορεία μιας ακτινοβολίας παρεμβάλλεται ένα σωματίδιο

31 πολύ μικρό, της τάξης μεγέθους του μήκους κύματος λ της ακτινοβολίας, τότε δημιουργούνται δευτερογενή κύματα. Σε επόμενο κεφάλαιο (βλ. Κεφάλαιο: 2.1 Οπτικό Μικροσκόπιο) θα αναπτυχθεί πλήρως η αρχή λειτουργίας του συγκεκριμένου οργάνου. Σημειώνεται ότι υπάρχουν δύο τρόποι λειτουργίας του, μέσω ανακλώμενου είτε μέσω διερχόμενου, από τα προς παρατήρηση αντικείμενα φωτός. [6] Ο φθορισμός είναι χαρακτηριστικό φαινόμενο πολλών μορίων (βιολογικών και μη) κατά το οποίο το μόριο εκπέμπει φως όταν αυτό διεγερθεί από κάποια ακτινοβολία. Το μόριο διεγείρεται και μέρος της ενέργειας που προσλαμβάνει (hν 1 ), την αποδίδει (hν 2 ) με μεγαλύτερο μήκος κύματος. Η εκπομπή ακτινοβολίας φθορισμού σταματάει αμέσως με την παύση της διεγείρουσας ακτινοβολίας. Για την ακρίβεια, ο χρόνος επαναφοράς των ηλεκτρονίων από τη διεγερμένη στη βασική κατάσταση, δηλαδή ο χρόνος μεταξύ απορρόφησης και εκπομπής κατά τον φθορισμό, είναι sec. Επομένως μία φθορίζουσα ουσία μπορεί να διεγερθεί με μια ακτινοβολία της περιοχής του υπεριώδους, η οποία δεν είναι ανιχνεύσιμη στον ανθρώπινο οφθαλμό, και να παραχθεί μία ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού φωτός. Χαρακτηριστική ιδιότητα κάποιων δομών είναι ο αυτοφθορισμός. Δηλαδή, ενδογενείς ουσίες (βιταμίνες) ή οργανίδια (μιτοχόνδρια), φθορίζουν. Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της μικροσκοπίας φθορισμού όμως είναι ο ετεροφθορισμός. Δηλαδή, ο εντοπισμός εξωγενών ουσιών που φθορίζουν. Έτσι είναι δυνατή η ανίχνευση βιομορίων τα οποία σημαίνονται με φθορίζοντα μόρια. Συνεπώς, για να ανιχνεύσουμε φθορίζουσες ουσίες αντικαθιστούμε το λευκό φως του συνηθισμένου μικροσκοπίου με υπεριώδες, τους αντικειμενικούς φακούς με άλλους ειδικούς φακούς (που δεν απορροφούν το υπεριώδες φως), ενώ παράλληλα παρεμβάλλουμε κατάλληλα φίλτρα. Συγκεκριμένα όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.7, τα βασικά τμήματα αυτών των μικροσκοπίων είναι τα ακόλουθα: Η φωτεινή πηγή: παρέχει ενέργεια υπό μορφή φωτονίων. Συνηθέστερα χρησιμοποιούνται λυχνίες υδραργύρου ή αλογόνου, Ο διεγερτικός ηθμός (Διάφραγμα): αφήνει να περάσει μόνο η ακτινοβολία που διεγείρει το φθοριόχρωμα, Ο συμπυκνωτής φακός: κατευθύνει και εστιάζει το επιλεγμένο φως που εκπέμπεται από την φωτεινή πηγή, Ο αντικειμενικός φακός: συγκεντρώνει το φως που εκπέμπεται από το δείγμα/παρασκεύασμα, Το διχροϊκό κάτοπτρο: επιτρέπει τη διέλευση των επιλεγμένων μηκών κύματος προς μία μόνο κατεύθυνση, Το φίλτρο φραγμού: αφήνει να περάσει μόνο η ακτινοβολία που αντιστοιχεί στα μήκη κύματος του φθορισμού και 17

32 18 Ο προσοφθάλμιος φακός: μεγεθύνει και καθιστά ορατό το φθορισμό του δείγματος. Σχήμα 1.7: Σχηματική διάταξη φωτεινών ακτίνων μικροσκοπίου με υπεριώδη φωτισμό Η ανάγκη για μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα και εστιακό βάθος οδήγησε στην κατασκευή του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης. Πρόκειται για ηλεκτρονικό μικροσκόπιο το οποίο επιτρέπει τη μεγεθυσμένη απεικόνιση ενός αντικειμένου (δείγματος) με διακριτική ικανότητα της τάξης των 0.1 nm. Στο οπτικό μικροσκόπιο, τα προσπίπτοντα φωτόνια κατευθύνονται μέσω οπτικών φακών εστίασης και διαφραγμάτων. Κατά αντιστοιχία, στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο το οποίο χρησιμοποιεί μία λεπτή δέσμη ηλεκτρονίων (ενέργειας από 0 kev έως 50 kev), ο χειρισμός της δέσμης ηλεκτρονίων που προσπίπτει στο δείγμα, όσο και εκείνων που σκεδάζονται, πραγματοποιείται με τη χρήση ηλεκτρομαγνητικών φακών. Στο Σχήμα 1.8 παρουσιάζεται το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης το οποίο αποτελείται από την ηλεκτρονική οπτική κολόνα, στην οποία δημιουργείται η ηλεκτρονική δέσμη, και από το θάλαμο δειγμάτων και ανιχνευτών. Η ηλεκτρονική οπτική κολόνα περιέχει το θάλαμο ηλεκτρονικού πιστολιού (ή κανονιού) (electron gun) και την περιοχή ηλεκτρομαγνητικών φακών. Ο θάλαμος ηλεκτρονικού πιστολιού, η πηγή ηλεκτρονίων, βασίζεται στη θερμιονική εκπομπή ενός θερμαινόμενου νήματος βολφραμίου (T 2800K). Η εκπεμπόμενη δέσμη ηλεκτρονίων επιταχύνεται με τη βοήθεια ηλεκτροδίων που βρίσκονται σε υψηλή τάση (kv - MV). Στη συνέχεια, η δέσμη ηλεκτρονίων αφού διέλθει από μία ακολουθία ηλεκτρομαγνητικών φακών εστίασης και διαφραγμάτων καταλήγει σε δέσμη ηλεκτρονίων με διάμετρο 2 10 nm (beam-spot). Οι μαγνητικοί φακοί είναι ηλεκτρομαγνητικά πηνία, τοποθετημένα έτσι ώστε η δέσμη ηλεκτρονίων να εισέρχεται κατά μήκος του άξονα τους. Η προσπίπτουσα δέσμη προκαλεί κυρίως την εκπομπή δευτερογενών ηλεκτρονίων (SE = Secondary Electrons) και οπισθοσκεδαζόμενων ηλεκτρονίων (BSE = Back-Scattered Electrons). Εκπέμπονται επίσης ηλεκτρόνια που έχουν υποστεί ελαστική σκέδαση ή χαμηλή απώλεια ενέργειας, καθώς και ακτίνες Χ.

33 Μέσω της αλληλεπίδρασης των πρωτογενών ηλεκτρονίων της δέσμης και των ηλεκτρονίων από άτομα του δείγματος παράγεται ιονισμός. Δηλαδή απελευθέρωση δευτερογενών ηλεκτρονίων (SE) από άτομα του δείγματος. Τα δευτερογενή ηλεκτρόνια αλληλεπιδρούν μέσα στο δείγμα και είτε επανασυνδέονται με θετικά ιόντα είτε καταγράφονται από κατάλληλους ανιχνευτές. Στην πλειοψηφία τους, χαρακτηρίζονται από μικρή ενέργεια, της τάξης των μερικών δεκάδων ev. Αυτά που ανιχνεύονται προέρχονται από τις επιφανειακές στοιβάδες του δείγματος. Επίσης, ως δευτερογενή ηλεκτρόνια μπορούν να θεωρηθούν τα πρωτογενή ηλεκτρόνια της δέσμης, τα οποία στο τέλος της τροχιάς τους φτάνουν στην επιφάνεια του δείγματος με ενέργεια μερικών ev. Τα οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια είναι τα πρωτογενή ηλεκτρόνια της δέσμης που προσκρούονται στην επιφάνεια του δείγματος, υφίστανται έναν αριθμό σκεδάσεων από τους πυρήνες των ατόμων στο εσωτερικό του δείγματος και εξέρχονται από αυτό προς όλες τις διευθύνσεις. Στην ακραία περίπτωση που υφίστανται μηδενική απώλεια ενέργειας, ουσιαστικά υφίστανται ελαστική κρούση στην επιφάνεια του δείγματος. Συνεπώς, τα οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια χαρακτηρίζονται από ένα ολόκληρο φάσμα ενεργειών μέχρι και την αρχική ενέργεια της προσπίπτουσας δέσμης. Κατά την αλληλεπίδραση της δέσμης ηλεκτρονίων με το δοκίμιο παράγονται επίσης ακτίνες Χ. Προέρχονται από την αποδιέγερση των ιονισμένων ατόμων του δείγματος. Οι ακτίνες αυτές είναι χαρακτηριστικές του είδους του ατόμου και της στοιβάδας από την οποία προέρχονται. Μέσω της καταγραφής και της ανάλυσής τους (στοιχειακή ανάλυση) μπορούμε να γνωρίζουμε τη χημική σύσταση του δείγματος. Ανάλογα με την επιλογή του σήματος που θα χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της απεικόνισης, αναδεικνύονται διαφορετικά χαρακτηριστικά του δείγματος, δεδομένου ότι τόσον η παραγωγή δευτερογενών ηλεκτρονίων όσο και ο συντελεστής οπισθοσκέδασης εξαρτώνται από τις τοπικές τιμές της γωνίας πρόσπτωσης (τοπογραφικά χαρακτηριστικά), τον μέσο ατομικό αριθμό (πληροφορίες για τη σύνθεση) και τον κρυσταλλικό προσανατολισμό (κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά). Η μικροσκόπηση με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης απαιτεί ιδιαίτερη προετοιμασία του δείγματος. Συγκεκριμένα το δείγμα θα πρέπει να είναι καλός αγωγός του ηλεκτρισμού και ανθεκτικό σε συνθήκες υπερυψηλού κενού. Ο περιορισμός της αγωγιμότητας οφείλεται στο γεγονός ότι το ηλεκτρικό ρεύμα της δέσμης πρέπει να κλείνει το κύκλωμα, διαφορετικά θα συσσωρεύεται πάνω στην εξεταζόμενη επιφάνεια, εάν το αντικείμενο δεν είναι γειωμένο ή μονωτής. Η διαρκής συσσώρευση φορτίου (charging effect) οδηγεί στον εντοπισμό αρνητικού δυναμικού, το οποίο αντιτίθεται στην περαιτέρω πρόσκρουση του αρνητικού φορτίου της δέσμης, την απωθεί με αποτέλεσμα η τελική εικόνα να μην είναι εφικτό να διακρίνουμε χαρακτηριστικά της μορφολογίας τους. Δείγματα τα οποία δεν είναι ηλεκτρικά αγώγιμα υφίστανται 19

34 20 την διαδικασία της επιμετάλλωσης. Συγκεκριμένα, εισάγονται σε ένα θάλαμο μεσαίου κενού στον οποίο γίνεται εξάχνωση χρυσού συνηθέστερα. Τα άτομα του χρυσού διαχέονται προς όλες τις κατευθύνσεις από το σημείο της εξάχνωσης και καλύπτουν οποιαδήποτε επιφάνεια βρίσκεται στην διαδρομή τους. Έτσι επιτυγχάνεται επιμετάλλωση της επιφάνειας των δειγμάτων από ένα αγώγιμο στρώμα. Σημαντικό είναι το αγώγιμο στρώμα αυτό να έχει πάχος μόλις μερικών nm ώστε να μην υπερκαλύπτονται οι τοπογραφικές ιδιαιτερότητες του δείγματος. Ο δεύτερος περιορισμός πηγάζει από το γεγονός ότι τόσο ο θάλαμος παραγωγής της ηλεκτρονιακής δέσμης όσο και η περιοχή των ηλεκτρομαγνητικών φακών βρίσκονται υπό κενό, ώστε να μην σκεδάζεται (απώλεια ενέργειας) η δέσμη από οποιοδήποτε ενδιάμεσο αέριο. Συνεπώς, όσα δείγματα δεν περιέχουν υγρά που να εξατμίζονται υπό κενό μπορούν να μελετηθούν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. [7] [8] Σχήμα 1.8: Σχηματική απεικόνιση του Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης Η ανάγκη για την παροχή τρισδιάστατης εικόνας (3D) των επιφανειών σε ατομική κλίμακα οδήγησε στην κατασκευή του μικροσκοπίου σάρωσης σήραγγας (STM). Το γεγονός ότι οι υπό μελέτη επιφάνειες πρέπει να είναι ηλεκτρικά αγώγιμες, οδήγησε στην κατασκευή του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης (ΜΑΔ), στο οποίο οι υπό μελέτη επιφάνειες είναι αγώγιμες και μη. Τα μέρη από τα οποία αποτελείται είναι το προς εξέταση δείγμα, ο πιεζοηλεκτρικός σαρωτής, ο βραχίονας, η ακίδα, το λέιζερ και η τετραστοιχεία φωτοδιόδων. Σε επόμενο κεφάλαιο (βλ. Κεφάλαιο: 2.2 Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης) θα αναπτυχθεί πλήρως η αρχή λειτουργίας του συγκεκριμένου οργάνου. Σε εξέλιξη του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης, το μικροσκόπιο ατομικής ακουστικής δύναμης είναι συνδυασμός ακουστικής και μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFAM). Εκτός από την τρισδιάστατη τοπογραφία σε κλίμακα

35 ατόμου, μπορούν να καταγραφούν το μέτρο ελαστικότητας, το μέτρο διάτμησης και ο λόγος Poisson, δηλαδή οι ποσοτικές και ποιοτικές ελαστικές ιδιότητες του δείγματος. Η κύρια διαφορά μεταξύ AFAM και ΜΑΔ είναι η προσθήκη ενός πιεζοηλεκτρικού ηχοβολέα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.9. Δηλαδή, τα μέρη από τα οποία αποτελείται είναι το προς εξέταση δείγμα, ο πιεζοηλεκτρικός σαρωτής, ο βραχίονας, η ακίδα, το λέιζερ, η τετραστοιχεία φωτοδιόδων και ο ηχοβολέας. 21 Σχήμα 1.9: Σχηματική απεικόνιση της λειτουργίας του Μικροσκοπίου Ατομικής Ακουστικής Δύναμης Το υπό μελέτη δείγμα τοποθετείται επάνω στον ηχοβολέα, ο οποίος είναι τοποθετημένος στην κορυφή του σαρωτή. Διαμήκη κύματα, συχνότητας 3 10 khz επάγονται από τον ηχοβολέα, τα οποία ανακλώνται από την επιφάνεια του δείγματος, προκαλώντας κατακόρυφες μετατοπίσεις. Έτσι, κατά την διάρκεια που η ακίδα βρίσκεται σε επαφή με το δείγμα, ο βραχίονας διεγείρεται. Σημειώνεται ότι ο βραχίονας στο σημείο που καταλήγει η ακίδα έχει κάποια αγώγιμη επίστρωση, συνηθέστερα χρυσού, η οποία ανακλά το φως του λέιζερ στις φωτοδιόδους. Με αποτέλεσμα οι δονήσεις που διαδίδονται στον βραχίονα να ανιχνεύονται από την τετραστοιχεία των φωτοδιόδων. Ο βρόχος ανάδρασης του μικροσκοπίου χρησιμοποιείται ώστε ο βραχίονας να διατηρεί το πλάτος ταλάντωσής του στην προκαθορισμένη συχνότητα διέγερσης, επαναπροσδιορίζοντας τη θέση του. Τέλος, επισημαίνεται το γεγονός ότι το μικροσκόπιο ατομικής ακουστικής δύναμης λειτουργεί αποτελεσματικά τόσο σε συνθήκες ατμόσφαιρας, όσο σε συνθήκες κενού αλλά και σε υγρό περιβάλλον. [9] [10] Τέλος, οι οπτικές λαβίδες αποτελούν όργανα τα οποία χρησιμοποιώντας μια ισχυρά εστιασμένη δέσμη λέιζερ κατευθύνουν αντικείμενα της τάξης μεγέθους από nm-μm. Θα πρέπει το μέγεθος του σωματιδίου να είναι πολύ μεγαλύτερο από το μήκος κύματος της δέσμης λέιζερ. Η αρχή λειτουργίας

36 22 περιγράφεται ως εξής μία δέσμη λέιζερ εστιάζεται από έναν αντικειμενικό φακό υψηλής ποιότητας σε ένα σημείο στο επίπεδο του δείγματος. Αυτό το σημείο δημιουργεί μία οπτική παγίδα, η οποία είναι ικανή να περιορίζει ένα μικρό σωματίδιο στο κέντρο της. Οι δυνάμεις που αισθάνεται το σωματίδιο αυτό είναι δύο ειδών. Η μία προέρχεται από την σκέδαση της δέσμης λέιζερ και η δεύτερη από την αλληλεπίδραση του σωματιδίου με το λέιζερ. Συγκεκριμένα, σε μία τυπική οπτική λαβίδα το φως προέρχεται από ένα λέιζερ, στη z διεύθυνση, του οποίου η ένταση έχει Gaussian μορφή. Όταν αυτό το φως αλληλεπιδρά με ένα σωματίδιο, οι ακτίνες φωτός σκεδάζονται σύμφωνα με τους νόμους της ανάκλασης και της διάθλασης. Το άθροισμα των δυνάμεων από όλες τις ακτίνες χωρίζεται σε δύο συνιστώσες: τη δύναμη σκέδασης (δείχνει προς την κατεύθυνση του προσπίπτοντος φωτός) και η δύναμη βαθμίδας (που προκύπτει από την κλίση της Gaussian μορφής της έντασης και δείχνει προς το επίπεδο xy στο κέντρο της δέσμης). Η δύναμη βαθμίδας είναι μία δύναμη επαναφοράς που έλκει το σωματίδιο στο κέντρο. Από την άλλη, η βασική αρχή πίσω από τη δύναμη σκέδασης είναι η μεταφορά ορμής σχετιζόμενη με τη σκέδαση που υφίσταται η δέσμη λέιζερ. Το φως μεταφέρει ορμή που είναι ανάλογη με την ενέργεια του και με την κατεύθυνση της διάδοσης. Οποιαδήποτε αλλαγή στην κατεύθυνση του φωτός, μέσω ανάκλασης ή διάθλασης, οδηγεί σε αλλαγή της ορμής του φωτός. Αν ένα σωματίδιο σκεδάζει το φως, αλλάζοντας την ορμή του, η αρχή διατήρησης της ορμής απαιτεί το σωματίδιο να μεταβάλλει την ορμή του κατά ίση και αντίθετη φορά. Εάν η συνεισφορά στη δύναμη σκέδασης των διαθλασμένων ακτίνων είναι μεγαλύτερη από εκείνη των ανακλώμενων, τότε μία δύναμη επαναφοράς δημιουργείται κατά μήκος του άξονα z, δημιουργώντας μία σταθερή παγίδα. Στην περίπτωση που το σωματίδιο μετατοπιστεί από το κέντρο της παγίδας, η δύναμη επαναφοράς δρα σαν οπτικό ελατήριο, δηλαδή η δύναμη είναι ανάλογη προς τη μετατόπιση από το κέντρο της παγίδας. Στην πράξη το σωματίδιο ακολουθεί συνεχώς κίνηση Brown. [11] [12] Αναφορικά, οι οπτικές λαβίδες έχουν χρησιμοποιηθεί στην παγίδευση διηλεκτρικών σφαιρών, ιών, ζωντανών κυττάρων, ακόμα και τμήματος DNA. Σε επίπεδο βιολογίας, δύο από τις κύριες εφαρμογές των οπτικών παγίδων είναι η μελέτη των μοριακών κινητήρων και των φυσικών ιδιοτήτων του DNA. Προσαρτώντας σφαιρίδια στα άκρα των κλώνων του DNA και παγιδεύοντάς τα, μπορούν να μετρηθούν η ελαστικότητα του DNA καθώς και οι δυνάμεις υπό τις οποίες το DNA σπάει ή υφίσταται αλλαγή φάσης. 1.6 Σκοπός της πτυχιακής εργασίας Τα τελευταία χρόνια πραγματοποιούνται πολλές έρευνες με σκοπό τον προσδιορισμό των πολλαπλών λειτουργιών των αιμοπεταλίων στον οργανισμό μας. Συγκεκριμένα, ερευνητική ομάδα το 2010 ερεύνησε το ρόλο των αιμοπεταλίων στην αυτοάνοση ασθένεια ρευματοειδής αρθρίτιδα. Εντόπισαν

37 κυστίδια μικροσωματιδίων αιμοπεταλίων, τα οποία προήλθαν από ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, στο υγρό άρθρωσης ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα, αλλά όχι σε αρθρικό υγρό από ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα. Συμπερασματικά, διαπίστωσαν ότι τα επαγόμενα αυτά μικροσωματίδια από την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων ενισχύουν τη φλεγμονή στην αρθρίτιδα. [13] Επίσης, δεύτερη ερευνητική ομάδα ερεύνησε την επίδραση των αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι απελευθερώνονται από τα αιμοπετάλια, στην ανθρώπινη betadefensin-2. Η ανθρώπινη betadefensin-2 (hbd-2) είναι ένα αντιμικροβιακό πεπτίδιο που εκφράζεται σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα που εμφανίζουν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση ενάντια στα βακτήρια που σχετίζονται με οποιοδήποτε τραύμα. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την επαγωγή της ανθρώπινης betadefensin-2 με συμπύκνωμα θρομβοκυττάρων, η οποία μπορεί να συμβάλλει στη θεραπεία χρόνιων και μολυσμένων πληγών. [14] Σύμφωνα με όσα έχουν αναφερθεί σε αυτό το εισαγωγικό κεφάλαιο, ενδιαφέρον παρουσιάζει η μελέτη της συμπεριφοράς των αιμοπεταλίων κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Στην παρούσα εργασία θα διερευνήσουμε την ανταπόκριση των κυττάρων περιφερικού αίματος, με επίκεντρο τα αιμοπετάλια, κατά την ωρίμανσή τους με πηκτικό παράγοντα. Για τον σκοπό αυτόν χρησιμοποιείται ο εμπορικά διαθέσιμος πηκτικός παράγοντας από την εταιρεία SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α. Για να διερευνηθεί η δράση του πηκτικού παράγοντα, εξετάζονται τόσο δείγματα τα οποία έχουν αποθηκευτεί προσωρινά σε κοινούς πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες απουσία αντιπηκτικού παράγοντα, αλλά και δείγματα τα οποία έχουν αποθηκευτεί σε δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer, δηλαδή παρουσία αιθυλενοδιαμινοτετραοξικoύ οξέος (Ethylenediaminetetraacetic acid ή EDTA) ως αντιπηκτικό. Σκοπός της εργασίας είναι η απεικονιστική μελέτη των ερυθροκυττάρων και των αιμοπεταλίων παρουσία πυριτικού άλατος σε νανοσκοπική κλίμακα. Συνεπώς, η ακραία διακριτική ικανότητα που απαιτείται παρέχεται από όργανα όπως το ΜΑΔ. Η υψηλή διακριτική ικανότητα του οργάνου αυτού, μας επιτρέπει την καταγραφή τόσο των κυττάρων αλλά και συγκεκριμένων λεπτομερειών των επιφανειών τους, δηλαδή της μεμβράνης τους. Προκειμένου να πραγματοποιηθεί ένας αρχικός ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχος των μακροσκοπικών χαρακτηριστικών των βιολογικών δειγμάτων χρήσιμο είναι και το ΟΜ, καθώς αποτελεί μία γρήγορη και χωρίς ιδιαίτερη προετοιμασία, των δειγμάτων, μέθοδο μικροσκόπησης. Βέβαια για μικρές συγκεντρώσεις του πηκτικού παράγοντα ή σε μικρό χρονικό παράθυρο δράσης του, οι διεργασίες πήξης βρίσκονται σε πρώιμο στάδιο. Σε αυτή την περίπτωση, οι μορφολογικές μεταβολές των κυτταρικών σειρών δεν χαρακτηρίζονται ως μακροσκοπικές, αλλά ως μικροσκοπικές. Συνεπώς, είναι απαραίτητη η χρήση του ΜΑΔ ώστε να διαπιστωθεί η πρώιμη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και η πιθανή συμμετοχή των ερυθροκυττάρων. Συγκεκριμένα στην παρούσα εργασία παρασκευάστηκαν οι εξής κατηγορίες δειγμάτων: 1) δείγματα ολικού αίματος, 23

38 24 2) δείγματα ολικού αίματος παρουσία 50mg πηκτικού παράγοντα, 3) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία 50mg πηκτικού παράγοντα, 4) δείγματα πλούσια σε αιμοπετάλια παρουσία EDTA, 5) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 50mg πηκτικού παράγοντα, 6) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 100mg πηκτικού παράγοντα, 7) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και 200mg πηκτικού παράγοντα, 8) δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, 200mg πηκτικού παράγοντα και διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου συγκέντρωσης 10%. Τέλος, επισημαίνουμε ότι οι δειγματοληψίες στις παραπάνω κατηγορίες δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν σε χρόνους ωρίμανσης του πηκτικού παράγοντα από 2 έως και 45 λεπτών. Αναλυτικές λεπτομέρειες για τα προαναφερθέντα δείγματα παρατίθενται στην ενότητα 2.3 Πρωτόκολλο εργαστηριακής επεξεργασίας δειγμάτων και στο Παράρτημα Β.

39 Κεφάλαιο 2 Πειραματικές Τεχνικές 2.1 Οπτικό μικροσκόπιο ή Μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου Με τη χρήση σύγχρονου φωτονικού μικροσκοπίου είναι δυνατή η παρατήρηση αντικειμένων διαμέτρου μέχρι και 0, 1 μm, άρωντας το φράγμα του μεγέθους που δύναται να παρατηρήσει ο ανθρώπινος οφθαλμός. Η διάμετρος των υπό μελέτη κυττάρων της παρούσας εργασίας κυμαίνεται στα 2 21 μm, με αποτέλεσμα η χρήση οπτικού μικροσκοπίου να είναι απαραίτητη. Το κυρίως τμήμα ενός σύγχρονου φωτονικού μικροσκοπίου είναι το οπτικό σύστημα, το οποίο όπως βλέπουμε στο Σχήμα 2.1 αποτελείται από δύο συγκλίνοντες ομοαξονικούς φακούς, τον προσοφθάλμιο και τον αντικειμενικό. Ο αντικειμενικός φακός σχηματίζει ένα πραγματικό και ανεστραμμένο είδωλο του παρατηρούμενου αντικειμένου μέσα στο σωλήνα του μικροσκοπίου. Καθώς, η απόσταση μεταξύ προσοφθάλμιου και αντικειμενικού φακού είναι μεγαλύτερη από το άθροισμα των εστιακών τους αποστάσεων, το είδωλο που σχηματίζεται λόγω του προσοφθάλμιου φακού είναι φανταστικό, μεγεθυσμένο είδωλο του πραγματικού αντεστραμμένου ειδώλου του αντικειμενικού φακού. Σχήμα 2.1: Σχηματική απεικόνιση διαδικασίας μεγέθυνσης αντικειμένου Με τη διάταξη αυτή, οι δύο αυτοί φακοί συνεισφέρουν στην ολική μεγεθυντική ισχύ του οπτικού μικροσκοπίου. Ο λόγος του μεγέθους του τελικού 25

40 26 ειδώλου προς το μέγεθος του αντικειμένου ονομάζεται μεγέθυνση. Η ολική μεγέθυνση του μικροσκοπίου είναι ίση με τη μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού πολλαπλασιαζόμενη επί τη μεγέθυνση του προσοφθάλμιου. Δύο άλλα μεγέθη, τα οποία χαρακτηρίζουν ένα μικροσκόπιο είναι το αριθμητικό άνοιγμα (NA = Numerical Aperture) και η διακριτική ικανότητα (R =Resolution), η οποία προσδιορίζεται από το αριθμητικό άνοιγμα NA και το μήκος κύματος λ του φωτός που χρησιμοποιείται για το φωτισμό του αντικειμένου. Το αριθμητικό άνοιγμα NA ορίζεται ως το γινόμενο NA = n sinθ, όπου n είναι ο δείκτης διάθλασης του μέσου που παρεμβάλλεται μεταξύ αντικειμένου και αντικειμενικού φακού (για τον αέρα n 1) και θ είναι το μισό γωνιακό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Βέβαια, το σημαντικότερο χαρακτηριστικό ενός μικροσκοπίου είναι η διακριτική ικανότητά του (R m ), δηλαδή η μικρότερη απόσταση δύο παρακείμενων σημείων του υπό παρατήρηση αντικειμένου τα οποία είναι διακρίσιμα στο τελικό είδωλο. Δίνεται από τη σχέση R m = 0.61 λ/na. Θεωρώντας ότι η διακριτική ικανότητα του ανθρώπινου οφθαλμού είναι R e 200 μm και έστω R m η διακριτική ικανότητα ενός συγκεκριμένου αντικειμενικού φακού, τότε η μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση ενός μικροσκοπίου είναι M = Re R m. Στην περίπτωση που η ολική μεγέθυνση είναι μεγαλύτερη από τη μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση, έχουμε την κενή μεγέθυνση, καθώς δεν είναι δυνατόν να διακριθεί καμία επιπλέον λεπτομέρεια με την περαιτέρω αύξηση της μεγέθυνσης. Για να διασφαλίσουμε αξιόπιστη παρατήρηση, θα πρέπει να γνωρίζουμε τα ενδεχόμενα οπτικά σφάλματα. Σε αυτά περιλαμβάνονται σφαιρικές διαταραχές, χρωματικές διαταραχές και παραμόρφωση του οπτικού πεδίου. Επιδιορθώσεις των σφαλμάτων γίνεται αρχικά από τον αντικειμενικό φακό, ο οποίος είναι σύνθετος και αποτελείται από επιμέρους φακούς. Τα υπόλοιπα οπτικά σφάλματα μετά το πέρασμα της φωτεινής δέσμης από τον αντικειμενικό φακό διορθώνονται από το συνδυασμό φακών κατά μήκος του οπτικού σωλήνα, αν υπάρχουν. Συγκεκριμένα, οι απλοί φακοί έχουν σφαιρικές επιφάνειες οι οποίες σχετίζονται με διαταραχές εικόνας και παραμορφώσεις. Αποτέλεσμα της σφαιρικής φύσης των φακών είναι παράλληλες ακτίνες οι οποίες προσπίπτουν στο κέντρο ή την περιφέρεια του φακού να εστιάζονται σε ελαφρώς διαφορετικά σημεία του οπτικού άξονα. Συνεπώς, κάθε φωτεινό σημείο περιβάλλεται από φωτεινό στεφάνι ή σειρά φωτεινών δακτυλίων και η τελική εικόνα είναι θολή. Οι χρωματικές διαταραχές οφείλονται στο γεγονός ότι ο φακός διαθλά τις ακτίνες φωτός με διαφορετικό τρόπο ανάλογα με το μήκος κύματός τους. Μήκη κύματος στην περιοχή του μπλε ( 475 nm) διαθλώνται στο εσωτερικό του οπτικού άξονα σε σχέση με τα μήκη κύματος στην περιοχή του ερυθρού ( 700 nm), ενώ μήκη κύματος στην περιοχή του πράσινου ( 530 nm) διαθλώνται σε ενδιάμεσο σημείο του οπτικού άξονα. Αποτέλεσμα των χρωματικών διαταραχών είναι κάθε φωτεινό σημείο να περιβάλλεται από στεφάνι χρωμάτων, το χρώμα του οποίου μεταβάλλεται ανάλογα με το ση-

41 μείο εστίασης του αντικειμενικού φακού και συνεπώς η τελική εικόνα είναι θολή. Τέλος, η παραμόρφωση του οπτικού πεδίου είναι σφάλμα κατά το οποίο το αντικείμενο δεν απεικονίζεται σε επίπεδη, αλλά σφαιρική επιφάνεια. Συνεπώς, δεν μπορούμε να εστιάσουμε σε όλη την έκταση της εικόνας αλλά μόνο σε ένα τμήμα αυτής. [15] [16] 27 Σχήμα 2.2: Σχηματική απεικόνιση σφαιρικών διαταραχών Σχήμα 2.3: Σχηματική απεικόνιση χρωματικών διαταραχών 2.2 Μικροσκόπιο ατομικής δύναμης Το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης παρέχει τρισδιάστατες εικόνες υψηλής ανάλυσης της επιφάνειας του δείγματος. Η διακριτική ικανότητά του είναι της τάξης του 0.1 nm. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 2.4, το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης αποτελείται από 1) το δείγμα προς εξέταση, 2) τον πιεζοηλεκτρικό σαρωτή, 3) το βραχίονα, 4) την ακίδα, 5) το διοδικό λέιζερ και 6) την τετραστοιχεία φωτοδιόδων. Σχήμα 2.4: Σχηματική απεικόνιση του Μικροσκοπίου Ατομικής Δύναμης

42 28 Μέσω της ακίδας, η οποία είναι προσαρτημένη στο ελεύθερου άκρου του βραχίονα, επιτυγχάνεται η ανίχνευση της επιφάνειας του δείγματος. Τα χαρακτηριστικά μεγέθη του βραχίονα είναι α) το μήκος του μm, β) το πλάτος του μm, γ) το πάχος του μm. Ενώ τα συνηθέστερα υλικά από τα οποία είναι κατασκευασμένος είναι πυρίτιο (Si) ή νιτρίδιο του πυριτίου (Si 3 N 4 ). Η αρχή λειτουργίας του οργάνου βασίζεται στις δυνάμεις αλληλεπίδρασης της ακίδας με την επιφάνεια του δείγματος. Η ακίδα πλησιάζει την επιφάνεια σε πολύ μικρή απόσταση και παρατηρούμε μια παραμόρφωση του βραχίονα λόγω των δυνάμεων αλληλεπίδρασης. Οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μπορούν να περιγραφούν με τη θεωρία Van der Waals. Το δυναμικό αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο ατόμων σε απόσταση r μεταξύ τους μπορεί να προσεγγιστεί από τη συνάρτηση Lennard - Jones: V LJ (r) = A r B όπου Α και Β σταθερές. 12 r6 Σαρώνοντας την επιφάνεια του δείγματος μέσω της ακίδας, κάθε τοπογραφική ανωμαλία που εντοπίζεται, ισοδυναμεί σε μεταβολή του μέτρου της δύναμης αλληλεπίδρασης μεταξύ των ατόμων της ακίδας και των ατόμων του δείγματος. Αυτές οι μεταβολές μπορούν να μετρηθούν με τη χρήση λέιζερ και της τετραστοιχείας των φωτοδιόδων, σε ρόλο ανιχνευτή. Το διαφορικό σήμα των άνω και κάτω φωτοδιόδων παρέχει το σήμα του ΜΑΔ, το οποίο είναι μια ευαίσθητη μέτρηση της κάθετης εκτροπής του βραχίονα. Μέσω συστήματος ανάδρασης, ο πιεζοηλεκτρικός σαρωτής αναπροσαρμόζει την κατακόρυφη θέση του (άξονας z), με αποτέλεσμα η δύναμη αλληλεπίδρασης στη νέα θέση του δείγματος να παραμένει σταθερή. Σημειώνεται ότι οι συντεταγμένες του σαρωτή κατά τους άξονες x,y είναι γνωστές και αμετάβλητες. Η τελική εικόνα προέρχεται μέσω ανάλυσης των z-μετατοπίσεων του σαρωτή και της σάρωσης του βραχίονα στο x-y επίπεδο από εξειδικευμένο λογισμικό υπολογιστή. Υπάρχουν τρεις βασικοί τρόποι λειτουργίας του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης, η ημιαστατική επαφή (contact mode), η ταλαντούμενη επαφή (non contact mode) και η διακοπτόμενη επαφή (tapping mode). Κατά την ημιαστατική επαφή, η ακίδα έρχεται σε επαφή με την επιφάνεια του δείγματος κατά την διάρκεια της σάρωσης. Στην ταλαντούμενη επαφή, η ακίδα ταλαντεύεται επάνω στην επιφάνεια του δείγματος χωρίς οριακά να την αγγίζει. Η μικροσκοπία ατομικής δύναμης αποτελεί μηχανικό τρόπο μικροσκόπησης, έτσι τα υπό μελέτη δείγματα δεν απαιτείται να είναι αγώγιμα. Ακόμα, μπορούν να μελετηθούν υδάτινα δείγματα, τα οποία κατακλύζουν εφαρμογές στη βιολογία. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί ακίδα από διαμάντι, το ΜΑΔ παρέχει τη δυνατότητα της εγχάραξης. Σημαντική παρατήρηση αποτελεί το γεγονός ότι η διακριτική ικανότητα της μεθόδου εξαρτάται κυρίως από την καταλληλότητα της ακίδας. Ο όρος καταλληλότητα της ακίδας, υποδεικνύει τη γεωμετρία της ακίδας συναρτήσει της μορφολογίας της επιφάνειας του δείγματος, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.5. Άλλες δύο παράμετροι από τις οποίες εξαρτάται η διακριτική ικανότητα είναι το βήμα (Step) αλλά και το Set Point (SP) της σάρωσης.

43 29 Σχήμα 2.5: Η διακριτική ικανότητα περιορίζεται από την πεπερασμένη καμπυλότητα της αιχμής της ακίδας στην αριστερή παράσταση Με επανειλημμένες χρήσεις της ίδιας ακίδας σε μετρήσεις ΜΑΔ είναι αναπόφευκτη η φθορά της. Οφείλεται στη λείανση που υφίσταται η αιχμή της ακίδας, λόγω της επαφής της με την επιφάνεια του δείγματος κατά τη σάρωση. Έτσι, συνεπάγεται αύξηση της ενεργής διατομής της αιχμής, δηλαδή μείωση της διακριτικής ικανότητας της ακίδας. Ακόμα, η απεικονιστική ποιότητα μπορεί να μεταβληθεί στην περίπτωση που έχουμε προσάρτηση ξένου υλικού ή θραύση της ακίδας. [17] [18] 2.3 Πρωτόκολλο εργαστηριακής επεξεργασίας δειγμάτων Αρχικά επισημαίνουμε το γεγονός ότι o δότης (Δ.Σ.) δεν λάμβανε κάποιο είδος φαρμακευτικής αγωγής κατά την διάρκεια της μελέτης και δεν υπήρχε κάποια καταγεγραμμένη χρόνια ή πρόσφατα διαπιστωμένη ασθένεια που να σχετίζεται με αιματολογικές διαταραχές. Για την συλλογή των δειγμάτων αίματος χρησιμοποιήθηκαν πρότυποι δοκιμαστικοί σωλήνες τύπου Vacutainer με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Ethylenediaminetetraacetic acid ή EDTA) ως αντιπηκτικό και κοινοί πλαστικοί εργαστηριακοί δοκιμαστικοί σωλήνες. Για την προετοιμασία των υμενίων αίματος χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα υάλινα πλακίδια μικροσκοπίου. Τα δείγματα ολικού αίματος, τα οποία μελετήθηκαν, λήφθηκαν με φλεβοκέντηση. Επίσης, η επεξεργασία τους πραγματοποιήθηκε σε χρονικό διάστημα δύο ωρών μετά την συλλογή, ώστε να αποφευχθούν αλλοιώσεις στα χαρακτηριστικά των κυτταρικών σειρών. Προσπαθούμε τα δείγματά μας να υποβάλλονται στην ελάχιστη δυνατή επεξεργασία. Ακόμα και οι αραιώσεις, που απαιτούνται για να ρυθμίσουμε τον αιματοκρίτη όταν ετοιμάζουμε τα υμένια, γίνονται με τη χρήση αυτόλογου πλάσματος. Άρα το μόνο μη βιοσυμβατό υλικό που έρχεται σε επαφή με τα κύτταρα του αίματος είναι το

44 30 υπόστρωμα πάνω στο οποίο γίνεται η επίστρωσή τους. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ΜΑΔ διότι ικανοποιεί την ακραία απαίτηση υπερυψηλής διακριτικής ικανότητας στην κλίμακα των νανομέτρων (10 9 m), η οποία μας προσφέρει επιπλέον πληροφορίες κατά τη μελέτη βιολογικών δειγμάτων. Έτσι, αποκτούμε πληροφορίες όχι μόνο για τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με το σχήμα ολόκληρου του κυττάρου αλλά επιτρέπεται η λεπτομερής καταγραφή συγκεκριμένων χαρακτηριστικών των επιφανειών τους. Οι μετρήσεις εκτελέστηκαν σε noncontact τρόπο σάρωσης με βραχίονα που κατέληγε σε αιχμηρή ακίδα κατασκευασμένη από νιτρίδιο του πυριτίου. Η ακίδα αυτή υποβάλλεται σε εξαναγκασμένη ταλάντωση και ιχνηλατεί προοδευτικά την επιλεγμένη περιοχή με κατάλληλο βήμα (5-500nm), καταγράφοντας το σήμα της μορφολογίας σε ψηφιακή μορφή. Απεικόνιση με ΟΜ και ΜΑΔ: Η επίστρωση του αίματος για την παρασκευή των υμενίων έγινε σε υάλινα αντικειμενοφόρα πλακίδια μικροσκοπίου διαστάσεων 75 25mm και πάχους περίπου 1mm, των οποίων η επιφάνειά είχε καθαριστεί με αιθανόλη. Για την επίστρωση ακολουθείται η εξής διαδικασία: το υάλινο πλακίδιο τοποθετείται πάνω σε μία ηλεκτρονικά ελεγχόμενη πλατφόρμα, η οποία περιστρέφεται με παραμέτρους ταχύτητας και χρονικής διάρκειας απόλυτα καθορισμένες. Έτσι με την εναπόθεση μίας μικρής ποσότητας από το δείγμα αίματος πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα (30-100μL, ανάλογα με το μέγεθος που θέλουμε να έχει το υμένιο αίματος), η πλατφόρμα ξεκινά να περιστρέφεται και η φυγόκεντρος δύναμη που ασκείται παράγει ένα υμένιο αίματος. Για να είναι παραγωγική η μικροσκόπηση με το ΜΑΔ, επιθυμούμε τη δημιουργία μονοστρωματικών υμενίων πυκνής επιφανειακής κάλυψης από ομοιόμορφα διεσπαρμένα αλλά διακριτά κύτταρα. Συνεπώς, πρέπει να ρυθμιστούν με ακρίβεια τέσσερις παράμετροι, η τιμή του κυτταροκρίτη του δείγματος, η ταχύτητα περιστροφής (ΤΠ σε στροφές ανά λεπτό) της πλατφόρμας, η απόσταση (cm) που εναποθέτουμε τη σταγόνα δείγματος από τον άξονα περιστροφής και η χρονική διάρκεια της περιστροφής (sec). Ο όρος κυτταροκρίτης, αντιστοιχεί στον αιμοπεταλιοκρίτη ή τον αιματοκρίτη ανάλογα με τη φύση των δειγμάτων. Αποτέλεσμα της ρύθμισης των ορθών τιμών αυτών των παραμέτρων (HCT=5%-10%, ταχύτητα περιστροφής= στροφές ανά λεπτό, απόσταση=2-3cm και χρονική διάρκεια=5-15sec) είναι η παραγωγή στην αντικειμενοφόρο πλάκα ενός υμενίου από κύτταρα, τα οποία είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα με μικρές αποστάσεις μεταξύ τους αλλά σαφώς διαχωρισμένα. Πριν από τη μελέτη με ΜΑΔ, προηγείται η οπτική μικροσκόπηση των επιστρωμένων υμενίων ώστε να πραγματοποιηθεί ένας αρχικός έλεγχος των ποσοτικών και ποιοτικών τους χαρακτηριστικών. Για τη λήψη εικόνων ΟΜ χρησιμοποιήθηκε ένα συμβατικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης. [19] Από την αιμοληψία στην παρασκευή των υμενίων: Χρησιμοποιούμε τον εξής συμβολισμό:

45 η σειρά δειγμάτων 1 αντιστοιχεί σε δείγματα τα οποία αποθηκεύτηκαν προσωρινά μετά την αιμοληψία σε κοινούς πλαστικούς εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες και συγκέντρωσης C του εμπορικά διαθέσιμου πηκτικού παράγοντα από την εταιρεία SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α η σειρά δειγμάτων 2 αντιστοιχεί σε δείγματα τα οποία αποθηκεύτηκαν προσωρινά μετά την αιμοληψία σε κοινούς πλαστικούς εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες και συγκέντρωσης C του εμπορικά διαθέσιμου 2 πηκτικού παράγοντα από την εταιρεία SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α 31 η σειρά δειγμάτων 1 αντιστοιχεί σε δείγματα τα οποία αποθηκεύτηκαν προσωρινά μετά την αιμοληψία σε εμπορικά διαθέσιμους εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer που εμπεριέχουν τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA και συγκέντρωσης C του εμπορικά διαθέσιμου πηκτικού παράγοντα από την εταιρεία SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α η σειρά δειγμάτων 2 αντιστοιχεί σε δείγματα τα οποία αποθηκεύτηκαν προσωρινά μετά την αιμοληψία σε εμπορικά διαθέσιμους εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer που εμπεριέχουν αντιπηκτικό παράγοντα τον EDTA και συγκέντρωσης C του εμπορικά διαθέσιμου πηκτικού παράγοντα από την εταιρεία 2 SARSTEDT, πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α Στο παρασκευαστικό κομμάτι, σύμφωνα με την εταιρία που μας παρέχει τον πηκτικό παράγοντα, 1g πηκτικού παράγοντα χρησιμοποιείται σε 10mL ολικού αίματος. Χρησιμοποιούμε τα eppendorf 1 και eppendorf 2 τα οποία περιέχουν 100mg και 50mg πηκτικού παράγοντα αντίστοιχα. Συνεπώς για να επιτύχουμε τις συγκεντρώσεις C και C θα προσθέσουμε 1mL αίματος 2 (με αιματοκρίτη περίπου 5%-10%) στα eppendorf 1 και eppendorf 2, όπως προβλέπεται στις οδηγίες του αντιδραστηρίου. Καθώς το χρονικό παράθυρο πήξης είναι λεπτά, δεν θα έχουμε τον χρόνο να διεκπεραιώσουμε το πρακτικό κομμάτι της διαδικασίας της προετοιμασίας ταυτόχρονα με το πείραμα. Άρα, πριν την αιμοληψία προετοιμάζουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες και τις υάλινες αντικειμενοφόρους πλάκες. Συγκεκριμένα, ονομάζουμε δύο eppendorfs ως RB1 και RB2 τα οποία θα περιέχουν από 0.5mL ολικού αίματος (RB: reservoir blood) και δύο eppendorfs ως RP 1 και RP 2 τα οποία θα περιέχουν από περίπου 1mL πλάσματος μετά την φυγοκέντρηση των δοκιμαστικών σωλήνων (RP: reservoir plasma). Ακόμα, προετοιμάζουμε τα υάλινα πλακίδια μικροσκοπίου για να φτιάξουμε τα παρασκευάσματά μας μετά την αιμοληψία. Ονομάζουμε τα υάλινα

46 32 πλακίδια ως εξής: 1/5 δειγματοληψία από το eppendorf1 μετά από χρόνο 5 λεπτών 1/15 δειγματοληψία από το eppendorf1 μετά από χρόνο 15 λεπτών 1/30 δειγματοληψία από το eppendorf1 μετά από χρόνο 30 λεπτών 2/5 δειγματοληψία από το eppendorf2 μετά από χρόνο 5 λεπτών 2/15 δειγματοληψία από το eppendorf2 μετά από χρόνο 15 λεπτών 2/30 δειγματοληψία από το eppendorf2 μετά από χρόνο 30 λεπτών Ακολουθούμε τα ίδια βήματα και για τις σειρές δειγμάτων 1 και 2 με τη μόνη διαφορά, όπως έχουμε αναφέρει πιο πάνω, ότι τα δύο αρχικά δείγματα ολικού αίματος (3mL το καθένα) έχουν τοποθετηθεί σε δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος που εμπεριέχουν τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA. Μετά την αιμοληψία από τον κάθε δοκιμαστικό σωλήνα που δεν εμπεριέχει αντιπηκτικό μεταγγίζουμε από 0.5mL στο RB1 και RB2. Συνεχίζοντας, φυγοκεντρούμε τους δύο κοινούς πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες χωρίς αντιπηκτικό στα 1200g για 5 λεπτά. Παρατηρούμε τη δημιουργία γέλης στο υπερκείμενο. Προφανώς αυτό είναι αποτέλεσμα της έντονης μηχανικής καταπόνησης του δείγματος λόγω της απουσίας αντιπηκτικού. Καταφέραμε να απομονώσουμε συνολικά περίπου 1mL ημι-πηγμένου πλάσματος το οποίο τοποθετήσαμε στο RP 1 και μετά από έντονη χειροκίνητη ανακίνηση φάνηκε να ρευστοποιείται σχεδόν ολοκληρωτικά. Έπειτα, από το RP 1 δημιουργήσαμε μονοστρωματικό παρασκεύασμα σε υάλινο πλακίδιο όπως περιγράφηκε πιο πάνω, το οποίο ονομάσαμε RP 1. Βλέποντας τη τάση του δείγματος να πήζει άμεσα, μοιράσαμε την ποσότητα του πηκτικού παράγοντα του eppendorf 1 σε δύο ίσες ποσότητες στο eppendorf 1α και στο eppendorf 1β (άρα τα eppendorf 1α, eppendorf 1β και eppendorf 2 έχουν πλέον την ίδια ποσότητα (50mg) πηκτικού παράγοντα). Στη συνέχεια, στο eppendorf1α προσθέτουμε 800μL από το RP 1 και 200μL RB1 και θα εφαρμόσουμε το πρωτόκολλο σε χρόνους 2, 5, 10 λεπτών. Επειδή τα εργαστηριακά πλακίδια που θα χρησιμοποιήσουμε τα είχαμε προετοιμάσει (καθαρίσει-ονομάσει) πριν την δειγματοληψία, κάνουμε την εξής αντιστοίχηση: το πλακίδιο 1/5 θα αντιστοιχεί στο 1α2 (δειγματοληψία από το eppendorf 1α μετά από χρόνο 2 λεπτών) το πλακίδιο 1/15 θα αντιστοιχεί στο 1α5 (δειγματοληψία από το eppendorf 1α μετά από χρόνο 5 λεπτών) το πλακίδιο 1/30 θα αντιστοιχεί στο 1α10 (δειγματοληψία από το eppendorf 1α μετά από χρόνο 10 λεπτών).

47 Ακόμα, μετά από χρόνο 20 λεπτών πραγματοποιούμε δειγματοληψία και δημιουργούμε το πλακίδιο 1α20. Ύστερα από μία ώρα παραμονής στο εργαστηριακό πάγκο χωρίς κάποιο πρόσθετο, επεξεργαζόμαστε το eppendorf RB2. Χωρίς να πραγματοποιήσουμε κάποια αραίωση, δημιουργούμε το πλακίδιο RB2A, το οποίο χρησιμοποιούμε ως πλακίδιο αναφοράς. Στη συνέχεια, προσθέτουμε στο eppendorf RB2 τον πηκτικό παράγοντα του eppendorf 1β. Πραγματοποιούμε δειγματοληψία σε δύο και πέντε λεπτά, δημιουργώντας τα αντίστοιχα εργαστηριακά πλακίδια RB2β και RB2γ. Μία ώρα μετά την αιμοληψία ξεκινάμε την επεξεργασία των σειρών 1 και 2. Εξαιτίας της επίδρασης του πεδίου βαρύτητας (1G) σε αυτό το χρονικό διάστημα, τα δείγματα αυτά παρουσιάζουν ήπια ιζηματοποίηση με μεγάλο ποσοστό των λευκοκυτάρρων και των αιμοπεταλίων να βρίσκονται στο υπερκείμενο, το οποίο είναι περίπου τα 2 του συνολικού όγκου. Απομονώνουμε 5 από το καθένα 1000μL υπερκείμενου και τα τοποθετούμε στα eppendorfs prp1 και prp2 (prp: platelet rich plasma) αντίστοιχα. Αυτό πραγματοποιείται με πέντε διαδοχικές αναρροφήσεις των 200μL, ώστε να μην αναταράξουμε το σύστημα. Για να επαληθεύσουμε ότι τα eppendorfs prp1 και prp2 όντως είναι πλούσια σε αιμοπετάλια, συλλέγουμε 50μL από το καθένα και δημιουργούμε τα αντίστοιχα υάλινα πλακίδια prp1 και prp2. Με τη χρήση του οπτικού μικροσκοπίου επιτυγχάνεται επαλήθευση και συνεπώς χρησιμοποιούμε τα prp1 και prp2 ως δείγματα αναφοράς. Χρησιμοποιούμε τα eppendorf 1 και eppendorf 2 τα οποία περιέχουν 100mg και 50mg πηκτικού παράγοντα αντίστοιχα. Στη συνέχεια, προσθέτουμε τον πηκτικό παράγοντα του eppendorf 1 στο prp1 και τον πηκτικό παράγοντα του eppendorf 2 στο prp2. Σε καθένα από αυτά προσθέτουμε 100μL του ιζηματοποιημένου στο 1G ολικού αίματος για να πετύχουμε την επιθυμητή περιοχή αιματοκρίτη (5%-10%). Είναι σημαντικό πάντα να θυμόμαστε να ομογενοποιούμε πριν οποιαδήποτε δειγματοληψία. Με τη δημιουργία των δειγμάτων 1 και 2 κάνουμε ήπια χειροκίνητη ανάδευση και δημιουργούμε τα μονοστρωματικά υμένια σε υάλινα πλακίδια στους προκαθορισμένους χρόνους των 5, 15, 30 λεπτών. Ονομάζουμε τα υάλινα πλακίδια ως εξής: 33 1 /5 δειγματοληψία από το eppendorf 1 μετά από χρόνο 5 λεπτών 1 /15 δειγματοληψία από το eppendorf 1 μετά από χρόνο 15 λεπτών 1 /30 δειγματοληψία από το eppendorf 1 μετά από χρόνο 30 λεπτών 2 /5 δειγματοληψία από το eppendorf 2 μετά από χρόνο 5 λεπτών 2 /15 δειγματοληψία από το eppendorf 2 μετά από χρόνο 15 λεπτών 2 /30 δειγματοληψία από το eppendorf 2 μετά από χρόνο 30 λεπτών

48 34 Μετά από χρόνο 45 λεπτών πραγματοποιούμε δειγματοληψία και δημιουργούμε τα εργαστηριακά πλακίδια 1 /45 και 2 /45 αντίστοιχα. Ύστερα από παρατήρηση στο ΟΜ του πλακιδίου 1 /45, διαπιστώνουμε ότι υπάρχει μηδαμινή ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και για αυτό τον λόγο διπλασιάσαμε την ποσότητα του πηκτικού παράγοντα στο prp1. Στη συνέχεια, διεξάγουμε δειγματοληψία σε 5, 15 και 30 λεπτά, δημιουργώντας τα αντίστοιχα πλακίδια 1 /2C/5, 1 /2C/15 και 1 /2C/30. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου 10%. Προσθέσαμε 200μL στο prp1, το οποίο πλέον έχει όγκο 700μL καθώς έχουμε φτιάξει 7 πλακίδια από αυτό. Διεξάγουμε δειγματοληψία σε 2, 5 και 15 λεπτά, δημιουργώντας τα αντίστοιχα πλακίδια 1 /2C/CaCl 2 /2, 1 /2C/CaCl 2 /5 και 1 /2C/CaCl 2 /15. Αναλυτικός συγκεντρωτικός πίνακας με όλες τις λεπτομέρειες επεξεργασίας των δειγμάτων παρατίθεται στο Παράρτημα Β.

49 Κεφάλαιο 3 Πειραματικά αποτελέσματα, συμπεράσματα και μελλοντικοί στόχοι 3.1 Χρήση πυριτικού άλατος Η συζήτηση των αποτελεσμάτων της μελέτης θα γίνει με βάση τόσο τη σύσταση/αναλογία των δειγμάτων αλλά και τον χρόνο στον οποίο πραγματοποιήθηκε η δειγματοληψία τους. Ως τονούμενα χαρακτηρίζονται όλα τα παρασκευάσματα που αποθηκεύτηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος παρουσία του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA. Αντίθετα, τα μη τονούμενα παρασκευάσματα αποθηκεύτηκαν σε κοινούς δοκιμαστικούς σωλήνες απουσία του αντιπηκτικού Σειρά δειγμάτων απουσία EDTA Ξεκινώντας με τη σειρά δειγμάτων, τα οποία αποθηκεύτηκαν μετά την αιμοληψία σε κοινούς εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες, δηλαδή απουσία του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA, παρατηρήθηκαν τα εξής Δείγμα ολικού αίματος απουσία πηκτικού παράγοντα και EDTA Χρησιμοποιώντας το δείγμα RB2A, το οποίο είναι δείγμα ολικού αίματος (χωρίς αραίωση) απουσία πηκτικού παράγοντα και EDTA και το οποίο επεξεργάσθηκε ύστερα από μία ώρα παραμονής στον εργαστηριακό πάγκο, ως δείγμα αναφοράς παρατηρούμε τα εξής. Με τη χρήση του Οπτικού Μικροσκοπίου (ΟΜ), όπως φαίνεται στα Σχήμα 3.1 και Σχήμα 3.2, διαπιστώνουμε ότι υπάρχουν τόσο περιοχές του δείγματος στις οποίες συντελείται ήπια ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων αλλά και περιοχές στις οποίες τα αιμοπετάλια είναι εμφανώς ενεργοποιημένα. Χαρακτηριστικά, κατά τη μελέτη 12 οπτικών πεδίων μεγέθυνσης 20 εντοπίσθηκαν 40 αιμοπετάλια από τα οποία μόλις 35

50 36 10 ήταν ενεργοποιημένα, ποσοστό 25%. Συνεπώς στο δείγμα RB2A, ενώ παρέμεινε για χρονικό διάστημα μιας ώρας στον εργαστηριακό πάγκο χωρίς κανένα πρόσθετο, ούτε πηκτικό παράγοντα ούτε EDTA, παρατηρείται στην έκτασή του μία μέση ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Σχήμα 3.1: ΟΜ 20: Περιοχή του δείγματος RB2A στην οποία παρατηρείται ήπια ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων Σχήμα 3.2: ΟΜ 20: Περιοχή του δείγματος RB2A στην οποία παρατηρείται έντονη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων Θα συνεχίσουμε τη συζήτηση επικεντρώνοντας στα ερυθροκύτταρα, τα οποία εμφανίζονται σχηματικά ελαφρώς παραμορφωμένα. Συγκεκριμένα σε πληθυσμό 885 ερυθροκυττάρων, ποσοστό 8.8% παρουσιάζει απώλεια κυτταροπλάσματος σε μέρος του. Ταυτόχρονα στο δείγμα αναφοράς παρατηρείται η ύπαρξη Cigar-Shape ερυθροκυττάρων. Συνηθέστερα συσχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως η κληρονομική ελλειπτοκυττάρωση και η σιδηροπενική αναιμία. Τα πιο πάνω καταγράφονται στο Σχήμα 3.3. Σχήμα 3.3: ΟΜ 20: Σχηματική παραμόρφωση των ερυθροκυττάρων και εμφάνιση Cigar-Shape στο δείγμα RB2A

51 Όπως έχουμε αναφέρει το ΟΜ μας παρέχει τη δυνατότητα της παρατήρησης των κυτταρικών σειρών, αλλά χαρακτηριστικά τους μικρότερα των 200nm δεν μπορούν να διακριθούν λόγω του ορίου περίθλασης. Έτσι για να μπορέσουμε να καταγράψουμε αποτελεσματικότερα ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά των δειγμάτων καταφεύγουμε στο ΜΑΔ. Το ΜΑΔ μας παρέχει τρισδιάστατες ψηφιακές εικόνες υψηλής ανάλυσης της επιφάνειας των κυτταρικών σειρών καθώς η διακριτική ικανότητά του είναι της τάξης των μερικών νανομέτρων. Στην αριστερή εικόνα του Σχήματος 3.4 παρουσιάζουμε μια συλλογή ερυθροκυττάρων 2 εκ των οποίων έχουν απώλεια κυτταροπλάσματος. Συγκεκριμένα, στο ερυθροκύτταρο της κάτω αριστερής γωνίας της εικόνας εστιάζουμε με τη λεπτή διακεκομμένη έλλειψη στο μέρος του ερυθροκυττάρου που έχει υποστεί σημαντική απώλεια κυτταροπλάσματος. Κατά μήκος της παχιάς διακεκομμένης γραμμής καταγράφουμε την τομογραφία του κυττάρου την οποία παρουσιάζουμε στη δεξιά εικόνα του Σχήματος 3.4. Παρατηρούμε ότι στο αριστερό τμήμα της τομογραφίας έχουμε έντονη απώλεια κυτταροπλάσματος, ενώ στο δεξί τμήμα της έχουμε τη φυσιολογική αναμενόμενη εικόνα. Η διάφορα του αριστερού από το δεξί τμήμα είναι της τάξης των 0.4μm. 37 Σχήμα 3.4: Δείγμα RB2A: Στην αριστερή εικόνα με χρήση ΜΑΔ εντοπίζουμε με τη λεπτή διακεκομμένη έλλειψη το μέρος του ερυθροκυττάρου που έχει υποστεί σημαντική απώλεια κυτταροπλάσματος. Ενώ στη δεξιά εικόνα, παρουσιάζουμε τη κυτταρική τομογραφία της παχιάς διακεκομμένης ευθείας Δείγμα ολικού αίματος απουσία EDTA, υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα για 5 λεπτά Συνεχίζουμε με το δείγμα RB2γ. Το συγκεκριμένο δείγμα είναι ολικό αίμα (χωρίς αραίωση) χωρίς αντιπηκτικό, στο οποίο αφού προσθέσαμε 50mg πηκτικού παράγοντα το αφήσαμε να ωριμάζει υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 5 λεπτά. Η σημαντικότερη παρατήρηση που

52 38 έχουμε να κάνουμε για το συγκεκριμένο δείγμα είναι η εμφάνιση μικρού ποσοστού ερυθροκυττάρων τα οποία έχουν χάσει πλήρως το κυταρρόπλασμά τους, τα οποία ονομάζονται φαντάσματα (διεθνής όρος-ghosts). Συγκεκριμένα στο δείγμα RB2γ σε πληθυσμό 1162 ερυθροκυττάρων εμφανίζονται 8 (ποσοστό 0.69%). Διευκρινίζουμε ότι στο δείγμα RB2A δεν παρατηρήσαμε κανένα φάντασμα ερυθροκυττάρου. Στο Σχήμα 3.5 με τη βοήθεια του πρόσθετου κόκκινου βέλους, υποδεικνύεται ένα αντιπροσωπευτικό ερυθροκύτταρο φάντασμα. Ακόμα, στον ίδιο πληθυσμό 1162 ερυθροκυττάρων παρατηρήσαμε μερική απώλεια κυτταροπλάσματος στα ερυθροκύτταρα σε ποσοστό 13.6%. Να υπενθυμίσουμε ότι το αντίστοιχο ποσοστό στο δείγμα αναφοράς RB2A ήταν 8.8%. Δύο ασφαλή πρώτα συμπεράσματα είναι ότι ο πηκτικός παράγοντας προάγει την απώλεια κυτταροπλάσματος στα ερυθροκύτταρα καθότι αυξάνει το ποσοστό στο οποίο παρατηρείται μερική απώλεια και δημιουργεί έστω και ένα μικρό ποσοστό στο οποίο παρατηρείται ολική απώλεια κυτταροπλάσματος. Θα συνεχίσουμε τη συζήτηση επικεντρώνοντας στα αιμοπετάλια. Στο σύνολο των οπτικών πεδίων που παρατηρήθηκαν δεν εντοπίσθηκαν αιμοπετάλια, ενώ διάσπαρτα κοκκία είναι συσσωρευμένα στο δεξί τμήμα του υάλινου πλακιδίου που μελετήθηκε. Οι μεταβολές που υποδεικνύουν την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων είναι 4: α) η αύξηση σχήματος/μεγέθους, β) η εμφάνιση ψευδοποδίων, γ) η αποκοκκίωσή τους και δ) η δημιουργία συσσωματωμάτων τους. Στο συγκεκριμένο δείγμα έχουμε εμφανή αποκοκκίωση των αιμοπεταλίων, όπως αντιπροσωπευτικά φαίνεται στο Σχήμα 3.6. Συνεπώς, συγκρίνοντας τις εικόνες των δειγμάτων RB2γ και RB2A συμπεραίνουμε ότι στο χρονικό παράθυρο των πέντε λεπτών δράσης του πηκτικού παράγοντα, συντελείται άμεση ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Σχήμα 3.5: ΟΜ 20: Μερική/Ολική απώλεια κυτταροπλάσματος των ερυθροκυττάρων και απουσία αιμοπεταλίων σε όλη την έκταση του δείγματος RB2γ Σχήμα 3.6: ΟΜ 20: Εντονότερα παραμορφωμένα ερυθροκύτταρα και διάσπαρτα κοκκία εντοπισμένα στο δεξί τμήμα του υάλινου πλακιδίου του δείγματος RB2γ

53 Δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα, απουσία EDTA και υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα Όπως παρατηρήσαμε στις εικόνες ΟΜ του δείγματος RB2γ που παρουσιάσαμε πιο πάνω, η επιφανειακή κάλυψη του υάλινου πλακιδίου από ερυθροκύτταρα είναι μεγάλη έτσι που η καταγραφή πληροφορίας για τα αιμοπετάλια είναι δύσκολη και ως εκ τούτου πιθανά αναξιόπιστη. Καταλαβαίνουμε ότι το δείγμα RB2γ είναι ακατάλληλο για μελέτη με το ΜΑΔ (βλέπε σχετική συζήτηση στην ενότητα 2.3 Πρωτόκολλο εργαστηριακής επεξεργασίας δειγμάτων). Επιπλέον, το δείγμα RB2γ μελετήθηκε μόνο για μία συγκεκριμένη τιμή του χρόνου ωρίμανσης (5 λεπτά). Κρίθηκε λοιπόν σκόπιμο να μελετήσουμε αναλυτικότερα τη συγκεκριμένη σειρά δειγμάτων έχοντας κάνει κατάλληλη αραίωση του ολικού αίματος σε αυτόλογο πλάσμα και για ένα μεγαλύτερο χρονικό παράθυρο ωρίμανσης. Έτσι λοιπόν συνεχίζουμε με τη σειρά δειγμάτων 1α2, 1α10, 1α20 η οποία αποτελείται από δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα, απουσία EDTA και επιπλέον υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα. Εδώ πρέπει να τονίσουμε ότι στη συγκεκριμένη σειρά δειγμάτων 1α2, 1α10 και 1α20 έχουμε χρησιμοποιήσει την ίδια ποσότητα πηκτικού παράγοντα, κατ όγκο δείγματος, με το δείγμα RB2γ, όμως ο αιμοπεταλιοκρίτης είναι σημαντικά μικρότερος λόγω της αραίωσης που κάναμε. Αναμένουμε λοιπόν ότι πιθανά η επίδραση του πηκτικού παράγοντα θα είναι εντονότερη. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν σε χρόνο 2, 10 και 20 λεπτών αντίστοιχα. Συγκριτικά με το δείγμα αναφοράς RB2A στο οποίο, όπως ήδη έχουμε αναφέρει, παρουσιάζεται μία μέση ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων (Σχήμα 3.7), σε αυτή τη σειρά δειγμάτων παρατηρείται πλήρης ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Συγκεκριμένα, δεν παρατηρούμε καθόλου αιμοπετάλια βγάζοντας το συμπέρασμα ότι έχουν υποστεί πλήρη θραυσματοποίηση/αποκοκκίωση (Σχήμα 3.8, 3.9 και 3.10 για τα δείγματα 1α2, 1α10 και 1α20, αντίστοιχα). Ακόμα, στα δείγματα 1α2 και 1α10 με τη χρήση ΟΜ παρατηρούμε επιπλέον συσσωματώματα άγνωστης προέλευσης, τα οποία πρόκειται είτε για θραύσματα αιμοπεταλίων είτε για κρυσταλλικούς σχηματισμούς. Τα δείγματα αυτά περιέχουν τις κυτταρικές σειρές του αίματος και πυριτικό άλας ως επικάλυψη σε σφαιρίδια Polypropylene (PP), βλέπε Παράρτημα Α. Το τελευταίο είναι απόλυτα αδιάλυτο, συνεπώς η πιθανότητα κρυσταλλικών σχηματισμών απορρίπτεται. Το γεγονός ότι τα συσσωματώματα αυτά δεν εντοπίζονται στο δείγμα 1α20 με τη χρήση ΟΜ, μας οδηγεί στο ΜΑΔ για διερεύνηση. Τέλος, στα δείγματα 1α2, 1α10 και 1α20 παρατηρούμε ότι τα ερυθροκύτταρα παρουσιάζουν φυσιολογικό σχήμα και μέγεθος. Τα πιο πάνω αποτυπώνονται στα Σχήμα 3.8, Σχήμα 3.9 και Σχήμα

54 40 Σχήμα 3.7: ΟΜ 20: Μέση ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων στο δείγμα αναφοράς RB2A Σχήμα 3.9: ΟΜ 20: Παρουσία κοκκίων (μπλε-οριζόντια βέλη) και συσσωματωμάτων (κόκκινακάθετα βέλη) στο δείγμα 1α10 Σχήμα 3.8: ΟΜ 20: Παρουσία κοκκίων (μπλε-οριζόντια βέλη) και συσσωματωμάτων (κόκκινακάθετα βέλη) στο δείγμα 1α2 Σχήμα 3.10: ΟΜ 20: Παρουσία κοκκίων (μπλε-οριζόντια βέλη) και απουσία συσσωματωμάτων στο δείγμα 1α20 Λόγω της υπερυψηλής διακριτικής ικανότητας του ΜΑΔ (της τάξης των νανομέτρων) αναμένουμε μια σχετική ταύτιση των ψηφιακών εικόνων του με αυτές του ΟΜ. Σχετική, επειδή στο ΟΜ συσσωματώματα μικρότερα των 200nm δεν μπορούν να εντοπισθούν. Για να διευκρινίσουμε λοιπόν τη μορφολογία των συσσωματωμάτων και των κοκκίων που παρατηρούμε σε αυτά τα δείγματα, τα μελετήσαμε αναλυτικά με το ΜΑΔ την ίδια χρονική περίοδο που έγινε και η μελέτη με το ΟΜ.

55 41 Σχήμα 3.11: ΜΑΔ: Απουσία συσσωματωμάτων και κοκκίων στο δείγμα αναφοράς RB2A Σχήμα 3.12: ΜΑΔ: Παρουσία μικρού αριθμού συσσωματωμάτων και μεγάλου αριθμού κοκκίων στο δείγμα 1α2 Σχήμα 3.13: ΜΑΔ: Παρουσία μεγάλου αριθμού συσσωματωμάτων και μικρού αριθμού κοκκίων δείγμα 1α10 Σχήμα 3.14: ΜΑΔ: Παρουσία συσσωματωμάτων και κοκκίων, περίπου ίδιου πληθυσμού στο δείγμα 1α20 Παρατηρούμε ότι στη μικροσκόπηση ΜΑΔ των Σχημάτων 3.12, 3.13 και 3.14 υπάρχει έντονη ποσοτική διαφορά των διασκορπισμένων συσσωματωμάτων και κοκκίων στον ελεύθερο χώρο των δειγμάτων 1α2, 1α10 και 1α20 σε σχέση με τα αποτελέσματα ΟΜ των Σχημάτων 3.8, 3.9 και Για αυτό το λόγο, επαναλάβαμε την ΟΜ των δειγμάτων 1α2, 1α10 και 1α20 προσπαθώντας να εντοπίσουμε κοινές περιοχές με την αρχική ΟΜ. Η αρχική ΟΜ πραγματοποιήθηκε στις 23 Δεκεμβρίου 2016, ενώ η επαναληπτική στις 25

56 42 Φεβρουαρίου Αυτά τα συγκριτικά αποτελέσματα ΟΜ παρουσιάζονται στα Σχήματα Σχήμα 3.15: ΟΜ 20: Δείγμα 1α2 στην αρχική μικροσκόπηση Σχήμα 3.16: ΟΜ 20: Δείγμα 1α2 στην επαναληπτική μικροσκόπηση Σχήμα 3.17: ΟΜ 20: Δείγμα 1α10 στην αρχική μικροσκόπηση Σχήμα 3.18: ΟΜ 20: Δείγμα 1α10 στην επαναληπτική μικροσκόπηση

57 43 Σχήμα 3.19: ΟΜ 20: Δείγμα 1α20 στην αρχική μικροσκόπηση Σχήμα 3.20: ΟΜ 20: Δείγμα 1α20 στην επαναληπτική μικροσκόπηση Κατά την επαναληπτική μικροσκόπηση είμαστε σε θέση να εντοπίσουμε συσσωματώματα και κοκκία και στα τρία δείγματα. Βέβαια και στις τρεις επαναληπτικές μικροσκοπήσεις δεν επιτύχαμε το ίδιο επίπεδο εστίασης ώστε να μπορούμε να τις συγκρίνουμε αξιόπιστα με τις αρχικές. Όπως καταλαβαίνουμε ανάλογα με το επιλεγμένο επίπεδο εστίασης αποτυπώνονται διαφορετικά χαρακτηριστικά του δείγματος. Πρέπει να τονίσουμε ότι με τη χρήση ΜΑΔ, πρακτικά πραγματοποιούμε μικροσκόπηση με απόλυτα μηχανικό τρόπο. Συνεπώς, οποιοδήποτε μορφολογικό χαρακτηριστικό έγκειται στη διακριτική ικανότητα του οργάνου θα αποτυπωθεί στη ψηφιακή εικόνα. Αντίθετα, με τη χρήση ΟΜ είναι δυνατόν να χάσουμε πληροφορίες των μορφολογικών χαρακτηριστικών, ακόμα και αν αυτά είναι μεγαλύτερα της διακριτικής ικανότητας του οργάνου, λόγω λανθασμένης επιλογής επιπέδου εστίασης. Άρα, ένα βασικό μειονέκτημα του ΟΜ έναντι του ΜΑΔ αποτελεί το γεγονός ότι με το ΟΜ καταγράφουμε μία στατική εικόνα σε ένα συγκεκριμένο επίπεδο εστίασης. Αντίθετα, με το ΜΑΔ καταγράφουμε μία δυναμική πληροφορία σε ψηφιακή μορφή. Έτσι, σε μετέπειτα χρόνο από τη μικροσκόπηση υπάρχει η δυνατότητα να επανεπεξεργαστούμε τη ψηφιακή εικόνα και να αναδείξουμε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της, τα οποία υπάρχουν σε διάφορα επίπεδα εστίασης με χρήση της δυνατότητας αναπροσαρμογής της κλίμακας χρώματος με τη κλίμακα ύψους (z-coloration). Για να γίνει κατανοητή αυτή η δυνατότητα, στα Σχήμα 3.21-Σχήμα 3.24 χρησιμοποιείται για τέσσερις υψομετρικές κλίμακες στην περιοχή του δείγματος 1α2 που απεικονίζεται στο Σχήμα 3.12.

58 44 Σχήμα 3.21: ΜΑΔ: Δείγμα 1α2, κλίμακα ύψους 0.887μm-1.387μm Σχήμα 3.22: ΜΑΔ: Δείγμα 1α2, κλίμακα ύψους 0.592μm-1.090μm Σχήμα 3.23: ΜΑΔ: Δείγμα 1α2, κλίμακα ύψους 0.257μm-0.755μm Σχήμα 3.24: ΜΑΔ: Δείγμα 1α2, κλίμακα ύψους 0μm-0.492μm Συνεπώς, καταλαβαίνουμε ότι τόσο τα συσσωματώματα όσο και τα κοκκία υπήρχαν στα αντίστοιχα υάλινα πλακίδια κατά την αρχική ΟΜ στις 23 Δεκεμβρίου 2016, αλλά δεν εντοπίσθηκαν λόγω της λανθασμένης επιλογής επιπέδου εστίασης. Ενώ, με χρήση ΜΑΔ έγινε δυνατή η καταγραφή τους και η αποσαφήνιση της λάθους πληροφορίας που αποκτήσαμε από τα δεδομένα ΟΜ. Τέλος, στο πεδίο παρατήρησης του δείγματος 1α20 καταγράφουμε ένα λευκό αιμοσφαίριο, το οποίο όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.25 παρουσιάζει φυσιολογική διάμετρο ( 16.11μm). Όπως γνωρίζουμε, τα λευκοκύτταρα ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες: τα κοκκιοκύτταρα (τα οποία εμφανίζουν ειδικά κοκκία στο κυτταρόπλασμά τους με τη χρήση χρωματισμένων επιχρισμάτων) και τα ακοκκιοκύτταρα (τα οποία δεν εμφανίζουν ειδικά κοκκία). Τα κοκκιοκύτταρα περιλαμβάνουν τα βασεόφιλα, τα ηωσινόφιλα, τα ουδετερόφιλα και φέρουν ένα μονήρη πολύλοβο πυρήνα που μπορεί να προσλάβει

59 διαφορετικά σχήματα. Ενώ, τα ακοκκιοκύτταρα περιλαμβάνουν τα μονοκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα και φέρουν σχετικά μη λοβωτούς πυρήνες. Από το Σχήμα 3.25 και το Σχήμα 3.26 δεν μπορούμε να αποσαφηνίσουμε απόλυτα αν το συγκεκριμένο λευκοκύτταρο είναι μονοπύρηνο ή διπύρηνο, καθώς φαίνεται να υπάρχει ένας ισθμός που ενώνει τις δύο περιοχές του πυρήνα. Συνεπώς, μόνο με τη χρήση ΟΜ και χρωστικών ουσιών μπορούμε να συμπεράνουμε τη φύση του λευκοκύτταρου. 45 Σχήμα 3.25: ΜΑΔ: Λευκό αιμοσφαίριο στην πλήρη κλίμακα ύψους-χρώματος, στο δείγμα 1α20 Σχήμα 3.26: ΜΑΔ: Λευκό αιμοσφαίριο σε επιλεγμένη υποπεριοχή της κλίμακας ύψους-χρώματος, στο δείγμα 1α20 Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι το ΟΜ και το ΜΑΔ, λειτουργούν συμπληρωματικά στην κατανόηση των υπό διερεύνηση φαινομένων αφού οι πληροφορίες που καταγράφουν είναι διαφορετικής προέλευσης και ως εκ τούτου αναδεικνύουν διαφορετικά φυσικά χαρακτηριστικά Σειρά δειγμάτων παρουσία EDTA Κατά την παρατήρηση της σειράς δειγμάτων, τα οποία αποθηκεύτηκαν μετά την αιμοληψία σε εργαστηριακούς δοκιμαστικούς σωλήνες γενικής αίματος τύπου BD Vacutainer που εμπεριέχουν τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA, καταγράφηκαν τα εξής αποτελέσματα Δείγμα πλούσιο σε αιμοπετάλια υπό την επίδραση EDTA για μία ώρα Χρησιμοποιώντας το δείγμα prp1, το οποίο είναι πλούσιο σε αιμοπετάλια, παρουσία αποκλειστικά του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA και το οποίο επεξεργάσθηκε ύστερα από μία ώρα παραμονής στον εργαστηριακό πάγκο ως δείγμα αναφοράς, παρατηρούμε τα εξής. Με τη χρήση ΟΜ, όπως

60 46 φαίνεται στο Σχήμα 3.26, διαπιστώνουμε ότι μεγάλο μέρος των αιμοπεταλίων είναι ενεργοποιημένα. Συγκεκριμένα, κατά τη μελέτη 9 οπτικών πεδίων μεγέθυνσης 20 εντοπίσθηκαν 38 αιμοπετάλια από τα οποία 15 ήταν ενεργοποιημένα, ποσοστό 39.5%. Συνεπώς, παρά το γεγονός ότι το δείγμα prp1 παρέμεινε στον εργαστηριακό πάγκο για χρονικό διάστημα μιας ώρας με την παρουσία αποκλειστικά του αντιπηκτικού EDTA, στην έκτασή του παρατηρείται ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Σχήμα 3.27: OM 20: Ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων στο δείγμα prp1 Για να καταφέρουμε να καταγράψουμε σε νανοσκοπική κλίμακα τα χαρακτηριστικά των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, συνεχίζουμε τη διερεύνηση με το ΜΑΔ. Στη δεύτερη μέθοδο μικροσκόπησης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.28 και στο Σχήμα 3.29, παρατηρούμε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, είτε μέσω του μηχανισμού αύξησης του μεγέθους τους, είτε μέσω του μηχανισμού αποκοκκίωσής τους, είτε μέσω του μηχανισμού δημιουργίας ψευδοποδιών. Στην τελευταία περίπτωση, το αιμοπετάλιο με σκοπό να σχηματίσει τα ψευδοπόδια χάνει μάζα από το κύριο σώμα του, με αποτέλεσμα να μειώνει τον όγκο του και να καταλήγει σε υψομετρικά χαμηλότερο επίπεδο από αυτό του πλάσματος που το περιβάλλει. Για αυτόν τον λόγο στο Σχήμα 3.29 απεικονίζεται σκοτεινότερο από το πλάσμα που το περιβάλλει. Η εμφάνιση ψευδοποδίων αποτελεί ουσιαστικά τον μηχανικό τρόπο με τον οποίο τείνουν τα αιμοπετάλια να συγκολληθούν. Ακόμα, παρατηρούνται διάσπαρτα συσσωματώματα θραυσμάτων αιμοπεταλίων με χαρακτηριστικό λόγο μήκος/πλάτος 2.1, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 3.30.

61 47 Σχήμα 3.28: ΜΑΔ: Ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο μέσω του μηχανισμού αύξησης του μεγέθους του ( 6μm) και αποκοκκίωσης του στο δείγμα αναφοράς prp1 Σχήμα 3.29: ΜΑΔ: Ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο μέσω του μηχανισμού δημιουργίας ψευδοποδίων ( 4μm) στο δείγμα αναφοράς prp1 Σχήμα 3.30: ΜΑΔ: Συσσωμάτωμα θραυσμάτων αιμοπεταλίων στο δείγμα αναφοράς prp1 Κανονικά τα αιμοπετάλια αυτού του δείγματος αναφοράς θα έπρεπε να είναι άθικτα (μη ενεργοποιημένα) αφού δεν υποβλήθηκαν σε καμία ουσιαστική επεξεργασία. Η ήπια ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων που εμφανίζεται στα δεδομένα ΟΜ (Σχήμα 3.27) και ΜΑΔ (Σχήματα 3.28 και 3.29) αποδίδεται σε ιδιαιτερότητα του δότη.

62 Δείγμα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα για 5 λεπτά Συνεχίζουμε με το δείγμα 2 /5, το οποίο είναι δείγμα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και υπό την επίδραση 50mg πηκτικού παράγοντα για 5 λεπτά. Πρόκειται για το δείγμα που είδαμε στην προηγούμενη ενότητα στο οποίο εκτός από τα 50mg πηκτικού παράγοντα προσθέσαμε και 0.5mL ολικού αίματος το οποίο είχε ιζηματοποιηθεί στον εργαστηριακό πάγκο ( 1g) για μία ώρα. Ως εκ τούτου η ενεργή συγκέντρωση πηκτικού παράγοντα στο συγκεκριμένο δείγμα ήταν 50mg στο 1.5mL, η οποία είναι υποτριπλάσια της συνιστώμενης (το συγκεκριμένο αντιδραστήριο πηκτικού παράγοντα πρέπει να έχει συγκέντρωση 1000mg στα 10mL αίματος-βλέπε Παράρτημα Α ). Αναμένουμε λοιπόν στο συγκεκριμένο δείγμα να έχουμε από μηδενική έως ήπια ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων (μη ξεχνάμε ότι αυτό το δείγμα έχει αντιπηκτικό παράγοντα). Με τη χρήση ΟΜ, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.31 παρατηρούμε ότι κάποια αιμοπετάλια είναι περισσότερο ενεργοποιημένα από άλλα. Χαρακτηριστικά, κατά τη μελέτη 32 οπτικών πεδίων μεγέθυνσης 20 εντοπίσθηκαν 69 αιμοπετάλια από τα οποία 25 εμφανίζονται ενεργοποιημένα, ποσοστό 36.2%. Όσον αφορά τα ερυθροκύτταρα, στην πλειοψηφία τους εμφανίζουν φυσιολογική διάμετρο αλλά σε ποσοστό 37.1% (πληθυσμός στατιστικής: 350 ερυθροκύτταρα) παρουσιάζουν απώλεια μέρους του κυτταροπλάσματός τους. Σχήμα 3.31: OM 20: Με το κόκκινο βέλος επισημαίνουμε ένα εμφανώς ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο στο δείγμα 2 /5 Από τη μικροσκόπηση με χρήση ΜΑΔ, παρουσιάζουμε αντιπροσωπευτικές εικόνες στα Σχήμα 3.32 και Σχήμα Στο Σχήμα 3.32 παρατηρούμε ότι στη πλειοψηφία τους τα αιμοπετάλια είναι μη ενεργοποιημένα, ενώ αντίστοιχα στο Σχήμα 3.33 ο σχηματισμός αυτός αποτελεί θραύσμα αιμοπεταλίου ή αιμοπεταλίων εντάσσοντάς τον στην ευρύτερη περίπτωση της αποκοκκίωσης.

63 49 Σχήμα 3.32: ΜΑΔ: Μη ενεργοποιημένα, στη πλειοψηφία τους, αιμοπετάλια στο δείγμα 2 /5 Σχήμα 3.33: ΜΑΔ: Συσσωμάτωμα θραυσμάτων αιμοπεταλίων στο δείγμα 2 /5 Συμπεραίνουμε λοιπόν, ότι σε μικρές συγκεντρώσεις και μικρούς χρόνους δειγματοληψίας, η δράση του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA είναι ισχυρότερη από αυτή του συγκεκριμένου πηκτικού παράγοντα. Παρόμοια συμπεριφορά εντοπίζεται και στα δείγματα: 2 /30, 1 /5, 1 /30, 1 /2C/5, 1 /2C/15, 1 /2C/30. Για να αναδείξουμε αυτή την πανομοιότυπη συμπεριφορά των δειγμάτων, παραθέτουμε αντιπροσωπευτική εικόνα του δείγματος 1 /2C/30 στο Σχήμα Το δείγμα αυτό είναι δείγμα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA και υπό την επίδραση 200mg πηκτικού παράγοντα (συγκέντρωση λίγο υψηλότερη από την προτεινόμενη-δείτε συζήτηση στην αρχή της παρούσας ενότητας) για 30 λεπτά. Σχήμα 3.34: ΜΑΔ: Μη ενεργοποιημένα, στη πλειοψηφία τους, αιμοπετάλια στο δείγμα 1 /2C/30 Σχήμα 3.35: ΜΑΔ: Ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο στο δείγμα 1 /2C/30

64 50 Παρατηρούμε ότι τα αιμοπετάλια στην πλειοψηφία τους είναι μη ενεργοποιημένα. Στο Σχήμα 3.35 παρουσιάζουμε ένα από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, το οποίο έχει αυξήσει το μέγεθός του στη μια διάσταση ( 10μm). Αν και στο δείγμα 1 /2C/30 εμπεριέχεται 4 φορές μεγαλύτερη ποσότητα πηκτικού παράγοντα από ότι το δείγμα 2 /5 και η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε σε μεγαλύτερο χρόνο, το ποσοστό των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων είναι αυξημένο αλλά ουσιαστικά οι διεργασίες της πήξης είναι σε πρώιμο στάδιο. Συνεπώς, αν και χρησιμοποιούμε μεγαλύτερη συγκέντρωση από τη συνιστώμενη του αντιδραστηρίου, η ύπαρξη του αντιπηκτικού παράγοντα EDTA αναστέλλει ικανοποιητικά τη δράση του συγκεκριμένου πηκτικού παράγοντα Δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, υπό την επίδραση 200mg πηκτικού παράγοντα και διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου 10% Τέλος, μελετάμε τη σειρά δειγμάτων 1 /2C/CaCl 2 /2 και 1 /2C/CaCl 2 /15, η οποία αποτελείται από δείγματα αραιωμένου αίματος σε αυτόλογο πλάσμα παρουσία EDTA, υπό την επίδραση 200mg πηκτικού παράγοντα και διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου 10%. Είναι γνωστό από τη διεθνή αρθρογραφία ότι το ασβέστιο προκαλεί ή/και προάγει τις διαδικασίες απόπτωσης των κυττάρων, όταν μπαίνει ενδοκυττάρια. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιήσαμε το χλωριούχο ασβέστιο για να αυξήσουμε την εξωκυττάρια συγκέντρωσή του, ελπίζοντας ότι με διαδικασίες ομοιόστασης θα αυξήσουμε και την ενδοκυττάρια συγκέντρωσή του. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν σε χρόνο 2 και 15 λεπτών αντίστοιχα. Μελετώντας το δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /2 με ΟΜ συμπεραίνουμε ότι η επίδραση του διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου είναι άμεσα αισθητή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.36, στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /2 παρατηρείται διάλυση των συσσωματωμάτων, τα οποία εντοπίζονταν στα προηγούμενα δείγματα. Ακόμα, οι σχηματισμοί που βρίσκονται διάσπαρτοι στον ελεύθερο χώρο του δείγματος μπορεί να είναι κρυσταλλικοί σχηματισμοί οφειλόμενοι στο διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου, κυστίδια ερυθροκυττάρων ή μικροκοκκία αιμοπεταλίων. Όσον αφορά τα ερυθροκύτταρα, αυτά παρουσιάζουν αμυδρή ετερογένεια στο μέγεθός τους. Χρησιμοποιώντας μετρήσεις ΜΑΔ σε πληθυσμό 14 ερυθροκυττάρων, συμπεραίνουμε ότι παρουσιάζουν μέση διάμετρο 7.63±0.61μm.

65 51 Σχήμα 3.36: OM 20: Διάσπαρτοι σχηματισμοί στον ελεύθερο χώρο και αλλοίωση γεωμετρικών χαρακτηριστικών (διάμετρος) των ερυθροκυττάρων στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /2 Με το πέρας δεκαπέντε 15 λεπτών, παρατηρούμε ότι τα χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων έχουν αλλοιωθεί έντονα στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /15. Στο Σχήμα 3.37, παρατηρείται έντονη ανισοκυττάρωση και ήπια δυσμορφία του σχήματος των ερυθροκυττάρων. Χρησιμοποιώντας μετρήσεις ΜΑΔ σε πληθυσμό 18 ερυθροκυττάρων, συμπεραίνουμε ότι αυτά παρουσιάζουν μέση διάμετρο 7.50±0.65μm. Σχήμα 3.37: OM 20: Διάσπαρτοι σχηματισμοί στον ελεύθερο χώρο και εντονότερη αλλοίωση χαρακτηριστικών των ερυθροκυττάρων στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /15 Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι όταν αυξάνεται η ενδοκυττάρια συγκέντρωση ελεύθερου ασβεστίου, παρατηρείται μεγάλη απώλεια καλίου με παράλληλη έξοδο χλωρίου και ύδατος. Αυτό είναι το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του διαύλου καλίου. Πειραματικά έχει δειχθεί ότι ο πολυμερισμός της αιμοσφαιρίνης οδηγεί σε παροδική αύξηση του ενδοκυττάριου Ca

66 52 με ταυτόχρονη διάνοιξη του διαύλου καλίου και αφυδάτωση των ερυθροκυττάρων. [20] Σχήμα 3.38: ΜΑΔ: Ανισοκυττάρωση των ερυθροκυττάρων στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /2 Σχήμα 3.39: ΜΑΔ: Εμφανής ανισοκυττάρωση των ερυθροκυττάρων στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /15 Συγκρίνοντας το Σχήμα 3.38 και το Σχήμα 3.39 παρατηρούμε ότι η ανισοκυττάρωση επιδεινώνεται ελαφρώς με το πέρας του χρόνου. Η αύξηση της εξωκυτταριακής συγκέντρωση Ca με χρήση διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου, είχε ως αποτέλεσμα μέσω μηχανισμών ομοιόστασης την αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ασβεστίου. Έτσι, προάγονται οι αποπτικές διεργασίες οδηγώντας σε γήρανση των ερυθροκυττάρων και τελικά σε θάνατό τους. Με τη χρήση του ΜΑΔ ένα επιπλέον χαρακτηριστικό των δειγμάτων αυτών αναδείχθηκε. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν διάσπαρτοι σχηματισμοί και στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων με συγκεκριμένη φορά. Διαφαίνεται ότι υπάρχει ένα κρίσιμο μέγεθος πάνω από το οποίο σταματούν να αναπτύσσονται περαιτέρω οι σχηματισμοί αυτοί και τείνουν να κολλάνε μεταξύ τους σχηματίζοντας φολιδωτή μορφή. Παρατηρείται ότι το κρίσιμο αυτό μέγεθος επιτυγχάνεται όταν ο λόγος μήκος/πλάτος 3.5 (πληθυσμός στατιστικής: 10 σχηματισμοί) στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /2, ενώ αντίστοιχα στο δείγμα 1 /2C/CaCl 2 /15 όταν ο λόγος μήκος/πλάτος 2.1 (πληθυσμός στατιστικής: 23 σχηματισμοί). Ακόμα, η μονότονη φορά που εντοπίζεται μπορεί να οφείλεται είτε στον τρόπο που περιστρέφεται η πλατφόρμα κατά την επίστρωση του υάλινου πλακιδίου είτε σε συστηματικό λάθος (artifact) της ακίδας κατά τη σάρωση του δείγματος. Τα πιο πάνω παρουσιάζονται στο Σχήμα 3.40-Σχήμα Για να μπορέσουμε να καταγράψουμε τη δομή των σχηματισμών αυτών στην επιφάνεια των αντίστοιχων ερυθροκυττάρων, χρησιμοποιούμε το σήμα της φάσης του ΜΑΔ. Συγκεκριμένα στο Σχήμα 3.42 και στο Σχήμα 3.43, έχουμε επιλέξει να μεγεθύνουμε τις περιοχές που επισημαίνονται στο Σχήμα

67 3.40 και στο Σχήμα 3.41 αντίστοιχα. Όπως φαίνεται από το Σχήμα 3.42 και το Σχήμα 3.43, οι σχηματισμοί αυτοί αποτελούν ένα άμορφο βιολογικό υλικό, καθώς οι κρυσταλλικοί σχηματισμοί με χρήση ΜΑΔ παρουσιάζουν συνηθέστερα οξείες επιφάνειες. 53 Σχήμα 3.40: ΜΑΔ: Ερυθροκύτταρο του δείγματος 1 /2C/CaCl 2 /2, στου οποίου την επιφάνεια παρατηρούνται εναποθέσεις βιολογικού υλικού (σήμα τοπογραφίας) Σχήμα 3.41: ΜΑΔ: Ερυθροκύτταρο του δείγματος 1 /2C/CaCl 2 /15, στου οποίου την επιφάνεια παρατηρούνται εναποθέσεις βιολογικού υλικού (σήμα τοπογραφίας) Σχήμα 3.42: ΜΑΔ: Ανάδειξη της δομής των εναποθέσεων που παρατηρούμε στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων με χρήση του σήματος φάσης του ΜΑΔ για το ερυθροκύτταρο που φαίνεται στο Σχήμα 3.40 Σχήμα 3.43: ΜΑΔ: Ανάδειξη της δομής των εναποθέσεων που παρατηρούμε στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων με χρήση του σήματος φάσης του ΜΑΔ για το ερυθροκύτταρο που φαίνεται στο Σχήμα 3.41