- PDF Free Download

Transcript

1

2

3

4

5

6 Σύμφωνα με τις απόψεις που σήμερα επικρατούν η διαδικασία της έναρξης μπορεί να διαιρεθεί σε πέντε στάδια Διάσταση του 80S Ριβοσώματος στη 60S και την 40S υπομοναδα Φόρτιση του 40S S eif-3 συμπλέγματος με GTP και Met- trnaf Δέσμευση του mrna στο 43S σύμπλεγμα εναρξης Διευθέτηση της 40S υπομονάδος στον κώδωνα έναρξης Πρόσδεση της 60S ριβοσωμικής υπομονάδος

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21 Τρισδιάστατη δομή του παράγοντος έναρξης IF-1 από τους προκαρυωτικούς οργανισμούς όπως αποκαλύπτεται από την Φασματοφωτομετρία με NMR

22 Δύο όψεις ενός μοντέλου της 30S ριβοσωμικής υπομονάδος με fmet- trnaf και του παράγοντα έναρξης IF-3 όπως παρουσιάζεται σε ένα μοντέλλο που δημιουργήθηκε με την βοήθεια συγχρόνων τεχνικών ηλεκτρονικής μικροσκοπίας.ο IF-3 παρουσιάζεται μεγενθυση

23 Τρισδιάστατη δομή του αμινοτελικού και καρβοξυτελικού άκρου του IF-3 όπως παρουσιάζεται με κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ

24 Δομή σε υψηλή διακριτική ικανότητα των παραγόντων eif-1a και ei F-1 η μικρή περιοχή όπου βρίσκεται το καρβοξύλιο παρουσιάζεται με κόκκινο ενώ συγκεκριμένες περιοχές προς τα καρβοξύλιο και την αμινομάδα δεν εμφανιζονται γιατί στερούνται δομής Στον eif-1 με κόκκινο εμφανίζεται η δομή του πτυσσόμενου πεδίου και με μπλε η α-ελικα

25

26

27 Χαρακτηριστικά του παράγοντα έναρξης eif-2 Ο παράγοντας eif-2 θεωρείται κλειδί στην πρωτεινοσύνθεση μια και το τετραμερές σύμπλεγμα eif-2 2 GTP Met-tRNA trna φαίνεται ότι είναι υποχρεωτικό ενδιάμεσο στην δέσμευση του t-rna της μεθειονίνης Υπό συνθήκες δυναμικής ισορροπίας σημαντικό ρόλο για την λειτουργία του παράγοντος και τον σχηματισμό του τετραμερούς συμπλέγματος παίζει η ανακύκλωση του eif-2 Αυτή εξασφαλίζεται μέσω της ανταλλαγής του νουκλεοτιδίου της Γουανίνης η οποία καταλύεται από τον παράγοντα έναρξης eif-2b (ή( GEF) Σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό του τετραμερούς συμπλέγματος εκτός του eif-2 παίζουν και άλλοι παράγοντες όπως CoeIF-2A και eif-3 Η φωσφορυλίωση ενός ή περισσοτέρων συστατικών από εκείνα πού εμπλέκονται στην λειτουργία του eif-2 φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντική διεργασία

28 Δομικές μονάδες των υπομονάδων eif-2 και eif-2b Παρουσιάζονται οι θέσεις στις οποίες γίνεται η φωσφορυλίωση η θέση του μπλοκ των λυσινών και του δακτυλου ψευδαργύρου καθως και η θέση στην οποία γίνεται η δέσμευση του GTP

29 Στοιχεία του παράγοντος eif-2 τα οποία και αποτελούν πιθανές θέσεις ρύθμισης Η πλέον πιθανή πρωτείνη για ρύθμιση φαίνεται ότι είναι η ε-υπομονάδα του eif-2b η οποία φωσφορυλιώνεται από την κινάση της Καζείνης Η φωσφορυλίωση της ε υπομονάδος του eif-2b οδηγεί in vitro στην κατά πέντε φορές διέγερση του παράγοντος ο οποίος είναι υπεύθυνος για την ανταλλαγή του νουκλεοτιδίου της Γουανίνης Εάν και κατά πόσο η φωσφορυλίωση της ε-υπομονάδος σχετίζεται In vivo με την ρύθμιση της μετάφρασης εξακολουθεί να παραμένει αναπάντητο ερώτημα Μια σειρά από πειράματα εισηγούνται οτι η φωσφορυλίωση της υπομονάδος του eif-2 συνεισφέρει ουσιαστικά στην ανακύκλωση του eif-2

30 Η επιλογή του mrna και η δέσμευση του στο ριβόσωμα προωθείται τουλάχιστον από τρεις παράγοντες έναρξης Τον eif-4a ο οποίος έχει ενεργότητα ΑΤΡ-ασης η οποία εξαρτάται από το RNA. O παράγοντας συμμετέχει στην αποδιάταξη της δευτεροταγούς δομής του μηνύματος Τον eif-4b ο οποίος επίσης συμμετέχει στην αποδιάταξη του mrna Τον eif-4f ο οποίος αναγνωρίζει την m7g η οποία βρίσκεται στο κάλυμμα στο 5 άκρο του μηνύματος

31 Οι παράγοντες της ομάδος 4 επιτελούν δύο βασικές λειτουργίες εμπλέκονται με την επιλογή του μηνύματος αλλά και την δέσμευση του στο ριβόσωμα Συγκεκριμένα Ο πάράγοντας έναρξης eif-4a ο οποίος έχει και ενεργότητα ΑΤΡ-ασης η οποία εξαρτάται από το RNA εμπλέκεται στην αποδιάταξη της δευτεροταγούς δομής του μηνύματος Ο παράγοντας έναρξης eif-4b επίσης εμπλέκεται στην αποδιάταξη του μηνύματος Ο eif-4f φαίνεται να αναγνωρίζει την αλληλουχία m7g η οποία ευρίσκεται στο 5 ακρο Οι παραπάνω παράγοντες έχουν μελετηθεί σε αρκετή λεπτομέρεια έχει προσδιορισθεί η πρωτοδιάταξη καθώς και οι διάφορες περιοχές οι οποίες εμπλέκονται σε εξειδικευμένες λειτουργίες

32 Διαγραμματική παρουσίαση σημαντικών περιοχών οι οποίες εντοπίζονται στους παράγοντες έναρξης eif-4a,eif 4A,eIF-4B,eIF-4G,eIF-4H4H

33 Δομή του συμπλέγματος eif-4e m7gdp σε υψηλή διακριτική ικανότητα Η δομή βασίζεται σε κρυσταλλογραφική ανάλυση του συμπλόκου. Το m7gdp που είναι ανάλογο του καπέλου παρουσιάζεται με χρώμα χρυσαφί και τοποθετείται στην αναδίπλωση Τα τρία παράγωγα της τρυπτοφάνης τα οποία αντεπιδρούν με το m7gdp παρουσιάζονται πράσινα

34 Μοντέλλο για τον τρόπο δέσμευσης των διαφόρων παραγόντων έναρξης στο mrna O eif-4f είναι ο πρώτος παράγοντας ο οποίος δεσμεύεται στο mrna.δεσμεύεται κατά τρόπο πού είναι ανεξάρτητος από την υδρόλυση του ΑΤΡ.Η παρουσία του καλύμματος είναι ο κύριος παράγοντας πού προσδιορίζει τον συναγωνισμό των mrna για την περιορισμένη ποσότητα των παραγόντων eif-4f που απαντά στην φυσιολογική κατάσταση Ο eif-4b δεσμεύεται στον eif-4f εάν δεν έχει δεσμευθεί στο προηγούμενο στάδιο Ο eif-4a δεσμεύεται στο σύμπλεγμα (eif-4f+eif-4b 4B +mrna) και λειτουργεί κατά τρόπο πού εξαρτάται από την υδρόλυση του ΑΤΡ για το ξεδίπλωμα του mrna To περιεχόμενο της δευτεροταγούς δομής στην μη κωδογόνο περιοχή που βρίσκεται στο 5 άκρο μπορεί εν μέρει να προσδιορίσει την ανταγωνιστικότητα των mrnas κύρια δια μέσου της αυξημένης ζήτησης που διαμορφώνεται για τον eif-4a

35 Ρύθμιση μέσω της τροποποίησης του παράγοντος έναρξης eif-4b Ο παράγοντας έναρξης eif-4b είναι ένας πολλαπλά φωσφορυλιωμένος παράγοντας σε οκτώ ή περισσότερα παράγωγα σερίνης Οι παράγοντες που συμμετέχουν στις αντιδράσεις φωσφορυλίωσης δεν έχουν ακόμη διευκρινισθεί πλήρως Υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης κατά αναλογία με όσα συμβαίνουν με την S6 φαίνεται να σχετίζονται με την ενεργοποίηση της πρωτεινοσύνθεσης Μεταβολή της ενεργότητος του eif-4b που να οφείλεται στην φωσφορυλίωση δεν έχει ακόμη αποδειχθεί Η πρωτεϊνική κινάση C φαίνεται να συμμετέχει σε ενα τουλάχιστον δρόμο ενεργοποίησης

36 Λειτουργία του Παράγοντος 4Ε Ο παράγοντας έναρξης 4Ε είναι μέρος ενός συμπλέγ ματος παραγόντων έναρξης (εδώ περιλαμβάνονται eif- 4A.eIF-4B 4B και eif-4g Ο eif-4e δεσμεύεται κατ ευθεία στο κάλυμμα του mrna δημιουργώντας τον χώρο για την διασύνδεση των eif-4a,b και G υπομονάδων στο 5 άκρο Η συσσώρευση αυτών των παραγόντων έναρξης στο RNAπιστευεται ότι σχετίζεται με το ξετύλιγμα των δευτεροταγών δομών στις 5 μη μεταφραζόμενες περιοχές του mrna και ως εκ τούτου διευκόλυνση της αποδοτικότητας έναρξης της μετάφρασης Οι δύο φωσφοπρωτείνες οι οποίες πιστευεται οτι συμμετέχουν στην ρύθμιση αυτού του συμπλέγματος των παραγόντων είναι οι πρωτεΐνες δέσμευσης 4Ε-ΒΡ1 και 4Ε- ΒΡ2

37

38 Ρυθμιση του σχηματισμού του eif-4f από τις 4E-BPs Οι πρωτείνες 4E-BP και eif-4g συναγωνίζονται ως προς το ποιά θα δεσμευθεί στην κοινή θέση δεσμευσης που υπάρχει στην πρωτείνη eif-4e που δεσμευεται στο καπέλλο Η δεσμευση της 4Ε-BP στον eif-4e ρυθμίζεται με φωσφορυλίωση Διαφοροι τυποι εξωκυτταρικών ερεθισμάτων ενεργοποιούν ενδοκυτταρικά μονοπάτια τα οποία οδηγούν σε υπερφωσφορυλίωση τις 4Ε-BPs η οποία προκαλεί μια ελάττωση της συγγένειας προς την eif-4e η οποία με την σειρά της οδηγεί στην απελευθερωση της Η ελευθερη eif-4e μπορεί στην συνέχεια να αντεπιδρά με την eif-4g δημιουργώντας το λειτουργικό σύμπλεγμα eif-4f Η ελάττωση της φωσφορυλίωσης των 4E-BPs αυξάνει την συγγενεια τους για eif-4e που οδηγει σε αναστολή δημιουργιας συμπλέγματος Jump to first page

39 Ο σχηματισμός του eif-4f ενός παράγοντα εναρξης ιδιαίτερα σημαντικού στην δημιουργία του εναρκτήριου συμπλέγματος ρυθμίζεται από μια οικογένεια πρωτεινών που καταστελλουν την μετάφραση τις 4Ε- BPs Οι 4E-BPs αναστέλλουν την μετάφραση των m-rna των οποίων η μετάφραση εξαρτάται από την παρουσία του καπέλλου ενώ αφήνουν ανεπηρέαστα ολα τα mrna τα οποία μεταφράζονται χωρίς να χρειάζονται καπέλλο Jump to first page

40 Οι παράγοντες επιμήκυνσης διακρίνονται σε δύο κατηγορίες.σε αυτούς πού απαιτούνται για την πρόσθεση του αμινοακυλο t-rna στα ριβοσώματα καί σε αυτούς που συμμετέχουν στην πορεία της μετακίνησης του ριβοσώματος κατά μήκος τού mrna Οι πρωτεΐνες οι οποίες διευκολύνουν τα στάδια επιμήκυνσης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι eef-1a και eef-2 βρίσκονται σε ενεργό μορφή μόνο όταν βρίσκονται δεσμευμένες σε GTP και όχι όταν βρίσκονται δεσμευμένες σε GDP.Παράγοντες πού βρίσκονται ενωμένοι με GDP πρέπει να αναγεννούν το GDP για να ξαναγίνουν λειτουργικές

41 Στα προκαρυωτικά κύτταρα (και στα μιτοχόνδρια) ο κύκλος επιμήκυνσης καταλύεται από τρία πολυπεπτίδια που συνιστούν τους παράγοντες επιμήκυνσης EF-1A (προηγούμενα ονομαζόταν EF-Tu Tu) EF-1B (προηγούμενα ονομαζόταν ΕF-Ts) EF-2 2 ( προηγούμενα ονομαζόταν ΕF-G G ) Οι δύο παράγοντες EF-1A και EF-2 είναι πρωτεΐνες που δεσμεύουν GTP/GDP Ο παράγοντας EF-1B είναι ένας παράγοντας ανταλλαγής του νουκλεοτιδίου της Γουανίνης για το EF-1A

42 Η αναγκαιότητα παρέμβασης του EF-1B για να υπάρξει παράγοντας επιμήκυνσης υπό την ενεργό μορφή για την πρωτεινοσύνθεση προκύπτει από δύο στοιχεία Το Kd του EF-1A για την GTP είναι γύρω στα 10-6 Μ Ενώ το αντίστοιχο για τον GDP είναι 10-8 Μ άρα η διάσπαση του συμπλοκου EF-1AGDP είναι ιδιαίτερα χαμηλή. Με δεδομένη την αναλογία GTP/GDP υπό φυσιολογικές συνθήκες οτι είναι 10:1 o EF-1A τον περισσότερο χρόνο θα πρέπει να είναι αδρανής

43 Χαρακτηριστικά του EF-1A Πρωτεΐνη με γύρω στα 400 αμινοξέα και με Μ.Β 44 KDa Ιδιαίτερα καλά συντηρημένη μεταξύ των προκαρυωτικών και των μιτοχονδρίων Ο ρόλος του παράγοντα EF-1A είναι να δεσμεύεται στο aatrna και να προστατεύει τον αμινοτελικό δεσμό από την υδρόλυση και κατά συνέπεια βοηθά την δέσμευση του aatrna στο ριβόσωμα Συγκροτείται από τρεις δομικές περιοχές εκ των οποίων η περιοχή 1 αποτελείται περίπου από 200 αμινοξέα και οι περιοχές 2 και 3 από 100 αμινοξέα Ο EF-1A από τους προκαρυωτικούς είναι μικρότερος από εκείνους που απαντούν στα αρχαιοβακτήρια και τους ευκαρυωτικούς Ο EF-1A που απομονώνεται από τα μιτοχόνδρια παρουσιάζει μία προέκταση 10 αμινοξέων προς το καρβοξυτελικό ακρο

44 Δομή του EF-1AGDP που απομονώνεται από τούς προκαρυωτικούς οργανισμούς.η περιοχή 1 παρουσιάζεται κίτρινη και οι περιοχές 2 και 3 πράσινες

45 Δομή τού συμπλέγματος EF-1A GDP πού απομονώνεται από τα μιτοχόνδρια βοδιού. Η πρόσθετη αλληλουχία αμινοξέων πού ευρίσκεται στον παράγοντα επιμήκυνσης παρουσιάζεται με μπλε

46 Χαρακτηριστικά του ΕF-1B O EF-1B είναι μία πρωτεΐνη 282 αμινοξέων με μοριακή μάζα 30 KDa Η λειτουργία του EF-1B είναι να καταλύει την ανταλλαγή του νουκλεοτιδίου GTP μεταξύ του EF-1AGDP και EF-1AGTP Ο παράγοντας έχει απομονωθεί από την E.coli και τον Thermos Thermophilus και παρουσιάζει σημαντική συντηρητικότητα.οι βασικές πτυχώσεις είναι όμοιες Ο παράγοντας που απομονώθηκε από την E.coli παρουσιάζει στοιχεία εσωτερικών επαναλήψεων δίδοντας μια ψευδοσυμμετρία δύο πτυχώσεων στο μόριο. Ενω αυτός που απομονώθηκε από τον Thermos thermophilus λειτουργεί υπό την διμερή μορφή

47 Χαρακτηριστικά EF-2 Πρωτεΐνη γύρω στα 700 αμινοξέα με Μ.Β. Γύρω στα 77KDa Η λειτουργία του EF-2 υπό μορφή συμπλέγματος με GTP εντοπίζεται στην κατάλυση της πορείας μετακίνησης Συγκρίσεις αλληλουχιών σε διάφορους οργανισμούς απεκάλυψαν εκτεταμένες ομοιότητες στο αμινοτελικό άκρο του μορίου Στα μόρια πού απομονώνονται από ευκαρυωτικούς οργανισμούς εντοπίσθηκαν πρόσθετες περιοχές και ουσιαστική διαφοροποίηση στην καρβοξυτελική περιοχή Το GTP και GDP δεσμεύονται στον παράγοντα επιμήκυνσης EF-2 με όμοιες συγγένειες

48 Δομές του EF-1A.EF-1B από την E.coli (Α) και τον Thermos Thermophilus (B) O EF-1B παρουσιάζεται σε μεγένθυση Η ψευδοσυμμετρία δύο πτυχώσεων στην εικόνα Α εμφανίζεται κατακόρυφα στο επίπεδο της εικόνος ενώ στο τμήμα Β κάθετα Αν και τα εξατομικευμένα στοιχεία του συμπλέγματος έχουν όμοιες δομές οι συνολικές δομές είναι εντελώς διαφορετικές

49 Σύγκριση των δομών των τετραμερών συμπλεγμάτων του EF-1A και του ΕF-2. Σ αυτή την εικόνα η περιοχή 1 των πρωτεινών είναι κόκκινη η περιοχή 2 είναι πράσινη ενώ με βαθύ μπλε παρουσιάζεται η α- έλικα η οποία είναι πρόσθετη στον παράγοντα ΕF-2 και με ανοικτό μπλε η περιοχή 3 του EF-1A

50 Παράγοντες Επιμήκυνσης Προκαρυωτικά ΕF1A (Προηγ. EF-Tu) EF1B (Προηγ. EF-Ts) EF-2 (Προηγ. ΕF-G) Ευκαρυωτικά eef1a (Προηγ.eEF-1a η EF-1a) eef1b (Προηγ. eef-1βγδ) eef2, eef3 Στον πίνακα πού παρουσιάζεται απεικονίζεται η αντιστοιχία πού σήμερα υπάρχει στην ονοματολογία των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών με την ονοματολογία που υπήρχε προηγούμενα σε παρρένθεση.σε γεικές γραμμές οι ευκαρυωτικοί παράγοντες είναι μεγαλύτεροι από τους προκαρυωτικούς

51 Τόσο στα In vivo όσο και στα In vitro συστήματα γρήγορα διαπιστώθηκε ότι η σύνθεση πού παρετηρείτο για την α- σφαιρίνη ήταν μεγαλύτερη εκείνης που παρετηρείτο για την β-σφαιρίνη Με την βοήθεια In vitro συστημάτων διαπιστώθηκε Αύξηση της συγκέντρωσης του μηνύματος αλλά διατήρηση της συγκέντρωσης των ριβοσωμάτων και των άλλων παραγόντων δεν οδηγεί σε καμία μεταβολή στην αναλογία Διατήρηση σταθερής της ποσότητος του μηνύματος αλλά μεταβολή της συγκέντρωσης των άλλων παραγόντων οδηγεί σε μεταβολή της αναλογίας αυξάνοντας την σύνθεση της β ως προς την α Συμπέρασμα είναι ότι ειδικοί παράγοντες που διευκολύνουν την σύνθεση της β γλοβίνης πρέπει να υπαρχουν στα μη ειδικά συστατικά

52 Ρυθμιση της ενεργότητος των παραγόντων επιμήκυνσης γίνεται μέσω φωσφορυλίωσης Ο eef-1a τα τρία συστατικά του eef-1b και ο EF-2 Χαρακτηριστικά της φωσφορυλίωσης του EF-2 O ΕF-2 φωσφορυλιώνεται στο αμινοτελικό ακρο και συγκεκριμένα εκεί οπου δεσμευονται τα νουκλεοτίδια της Γουανίνης Τουλάχιστον στα θηλαστικά υποστηρίζεται ότι η φωσφορυλίωση αναστέλλει την ενεργότητα του παράγοντα Οι κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης του παράγοντα είναι Thr 56 Thr 53 και Thr 58 H κινάση πού είναι υπευθυνη για την φωσφορυλίωση είναι ενζυμο τού οποίου η ενεργότητα εξαρτάται από το Ca και η οποία εχει ωνομασθεί eef-2 κινάση Το cdna που κωδικοποιεί για την συγκεκριμένη κινάση εχει κλωνοποιηθεί και η συγκεκριμένη κινάση φαίνεται να ανήκει σε συγκεκριμένη ομάδα κινασών