1 η Εργαστηριακή ημέρα

Transcript

1

2

3 Περιεχόμενα 1 η Εργαστηριακή ημέρα... 2 ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ... 2 ΠΕΙΡΑΜΑ 1: ΤΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΦΑΣΜΑ ΤΟΥ ΚΥΤΟΧΡΩΜΑΤΟΣ... 7 ΠΕΙΡΑΜΑ 2: ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΟΥ ΔΙΝΙΤΡΟΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑ 3: ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΜΕ ΕΜΠΟΡΙΚΟ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ η Εργαστηριακή ημέρα ΠΕΙΡΑΜΑ 4: ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΠΑΡΑ-ΝΙΤΡΟΦΑΙΝΟΛΗΣ (pnp) ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑ 5: ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ β-γαλακτοζιδαση ΠΕΙΡΑΜΑ 6: ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΙΜΒΕΡΤΑΣΗ η Εργαστηριακή ημέρα ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑ 7: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ β-γαλακτοζιδασησ ΠΕΙΡΑΜΑ 8: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΧΑΡΤΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ η Εργαστηριακή ημέρα ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑ 9: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΣΤΑΘΕΡΩΝ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΙΝΒΕΡΤΑΣΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑ 10: ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ η Εργαστηριακή ημέρα ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑ 11: ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ DNA ΑΠΟ ΤΗ ΖΥΜΗ Saccharomyces cerevisiae ΠΕΙΡΑΜΑ 12: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ DNA ΑΠΟ ΤΗ ΖΥΜΗ Saccharomyces cerevisiae η Εργαστηριακή ημέρα ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΚΑΤΑΛΥΣΗ ΣΕ ΜΗ ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑ 13 : ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕΤΕΣΤΕΡΟΠΟΙΗΣΗΣ Π-ΝΙΤΡΟΦΑΙΝΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ η Εργαστηριακή ημέρα ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑ 14: ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΜΕΣΩ ΕΓΚΛΩΒΙΣΜΟΥ ΣΕ ΠΗΓΜΑ η Εργαστηριακή ημέρα ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ ΠΕΙΡΑΜΑ 15: ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ η Εργαστηριακή ημέρα ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΡΟΑΠΟΝΙΤΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕ ΤΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ASM1 ΣΕ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ AQUASIM η Εργαστηριακή ημέρα ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑ 16: ΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗ ΜΕ ΘΕΙΙΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ- ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ η Εργαστηριακή ημέρα ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΡΡΗΞΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑ 17: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΡΡΗΞΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... 92

4

5 1 η Εργαστηριακή ημέρα ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Σκοπός της άσκησης είναι η εξοικείωση των σπουδαστών με φωτομετρικές μεθόδους μέτρησης. Πραγματοποιείται λήψη φάσματος απορρόφησης κυτοχρώματος και ταυτοποίηση του είδους αυτού. Ακολούθως κατασκευάζονται καμπύλες αναφοράς του σακχάρου γλυκόζη με δύο μεθόδους, τη μέθοδο δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS) και ενζυμικά με χρήση εμπορικού διαγνωστικού σκευάσματος. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Γενικά Η φωτομετρία είναι μία από τις πιο σημαντικές αναλυτικές μεθόδους. Χρησιμοποιείται κυρίως στον ποσοτικό προσδιορισμό ουσιών, μετρώντας την ένταση της απορροφούμενης από αυτές ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Ο όρος απορρόφηση αναφέρεται στο φαινόμενο εκείνο κατά το οποίο μία χημική ουσία Μ (μόριο, ιόν ή άτομο), που βρίσκεται διαλελυμένο σε διαφανές μέσο, απορροφά επιλεκτικά συχνότητες από το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα σύμφωνα με την παρακάτω δράση: Μ + hv M* Μετά τη διέγερση το Μ επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση, εκπέμποντας συνήθως θερμότητα: M* M + θερμότητα Ο χρόνος αποδιέγερσης είναι πολύ μικρός και κυμαίνεται μεταξύ 10-6 και 10-9 sec. Το ποσό θερμότητας που εκπέμπεται είναι πολύ μικρό και, για αραιά διαλύματα, θεωρείται αμελητέο. 2. Ο νόμος του Βeer Ο νόμος του Beer είναι η μαθηματική έκφραση της σχέσης μεταξύ της απορροφούμενης ακτινοβολίας και της συγκέντρωσης της χρωμοφόρου ένωσης. Ορίζεται ένας χώρος όγκου V= Sb (Σχήμα 1.1) ο οποίος περιέχει n απορροφώντα σωματίδια. Στο χώρο αυτό και κάθετα στην επιφάνεια S προσπίπτει παράλληλη δέσμη μονοχρωματικής ακτινοβολίας αρχικής έντασης P o. Η δέσμη μετά τη διέλευση της από το χώρο αυτό εξέρχεται με ισχύ P (<P o ). 2

6 Po S b dx P Σχήμα 1.1 Έστω ένα διαφορικό μήκος του χώρου αυτού, dx, το οποίο ορίζει το διαφορικό όγκο dv (=Sdx) στον οποίο περιέχονται dn απορροφώντα σωματίδια (Σχήμα 1.1). Είναι δυνατή η απόδοση σε κάθε απορροφόν σωματίδιο μιας διαφορικής επιφάνειας α, κάθετης στη διεύθυνση της φωτεινής δέσμης, απορροφάται ένα φωτόνιο (Σχήμα 1.2). Εάν δηλαδή κάποιο φωτόνιο προσπίπτει σε κάποια από τις επιφάνειες αυτές, απορροφάται αμέσως. Το άθροισμα όλων αυτών των επιφανειών μέσα στο στοιχειώδη όγκο dv (το οποίο εκφράζει τη συνολική επιφάνεια απορρόφησης μέσα σε αυτόν) είναι ds = adn. Ο λόγος της συνολικής επιφάνειας απορρόφησης προς τη συνολική επιφάνεια (ds/s) αντιπροσωπεύει την πιθανότητα απορρόφησης ενός φωτονίου καθώς αυτό διέρχεται από το στοιχειώδη όγκο dv. Η ένταση της φωτεινής δέσμης που εισέρχεται στο στοιχειώδη όγκο, Px, είναι ανάλογη του αριθμού των φωτονίων ανά μονάδα επιφάνειας και χρόνου. Έστω dp x η απορροφηθείσα ισχύς ανά μονάδα χρόνου μέσα στο στοιχειώδη όγκο dv. Το κλάσμα της απορροφηθείσας έντασης -dp x /P x εκφράζει και αυτό την πιθανότητα απορρόφησης ενός φωτονίου κατά τη διέλευσή του από το στοιχειώδη όγκο dv. Μη απορροφηθέν φωτόνιο Απορροφηθέν φωτόνιο α Αποροφηθέν μόριο Σχήμα 1.2 Διεύθυνση ακτινοβολίας Το αρνητικό πρόσημο υποδηλώνει την ελάττωση της έντασης της δέσμης. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω, ισχύει: 3

7 dp x P x ds S (1) Aντικαθιστώντας στην (1) όπου ds = adn και αθροίζοντας για το συνολικό αριθμό των σωματιδίων στον όγκο V, ισχύει: P dp n x adn P (2) S P0 Ολοκληρώνοντας την (2) προκύπτει ότι: x ln P P 0 0 an S Αντικαθιστώντας στην εξίσωση (3) την επιφάνεια S ως συνάρτηση του όγκου (S=V/b), και μετατρέποντας το φυσικό σε δεκαδικό λογάριθμο με ταυτόχρονη αλλαγή προσήμου, προκύπτει: (3) P0 log P and V (4) Ο λόγος n/v στην εξίσωση (4) είναι ουσιαστικά η συγκέντρωση των σωματιδίων (αριθμός σωματιδίων ανά μονάδα όγκου) και η μετατροπή της στη συνηθισμένη μονάδα συγκέντρωσης moles/l, γίνεται ως εξής: c n( σωματιδια ) 1( mole ) n V l 1 ( ) V ( σωματιδια) moles l Αντικαθιστώντας την παραπάνω σχέση στην εξίσωση (4) προκύπτει: και τελικά : P0 log P a b c (5) log P0 εbc=a=-logt (6) P Η σχέση (6) αποτελεί τη μαθηματική έκφραση του νόμου του Beer. Ο λόγος της εξερχόμενης προς την εισερχόμενη ένταση ακτινοβολίας P/P 0 ονομάζεται διαπερατότητα (transmittance) και συμβολίζεται με Τ. Ο δεκαδικός λογάριθμος του αντιστρόφου της διαπερατότητας, ονομάζεται απορρόφηση (absorbance) του διαλύματος και συμβολίζεται με Α. Η σταθερά ε ονομάζεται μοριακή απορροφητικότητα (ή συντελεστής μοριακής εξαφάνισης) της συγκεκριμένης ουσίας και έχει μονάδες (l/mole/cm, ή Μ -1. cm -1 ). Eάν η συγκέντρωση της ουσίας εκφράζεται σε οποιαδήποτε άλλη μονάδα τότε η αντίστοιχη σταθερά ονομάζεται απλά απορροφητικότητα (ή συντελεστής εξαφάνισης και συμβολίζεται με k) έχοντας μονάδες που εξαρτώνται από τις εκάστοτε μονάδες συγκέντρωσης. Η μοριακή 4

8 απορροφητικότητα εξαρτάται από τη δομή της συγκεκριμένης ουσίας, τη θερμοκρασία και το μήκος κύματος της προσπίπτουσας φωτεινή δέσμης. 3. Αποκλίσεις από το νόμο του Beer Η γραμμικότητα μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης όπως αυτή εκφράζεται από τη σχέση (6) ισχύει ικανοποιητικά μέχρι συγκεντρώσεις της τάξης του 0.01 Μ. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις η μέση απόσταση μεταξύ των ουσιών που απορροφούν ελαττώνεται μέχρι του σημείου ώστε τα ηλεκτρονιακά νέφη ενός μορίου να επηρεάζουν (π.χ. καλύπτουν) τα αντίστοιχα των γειτονικών του μορίων. Εμφανίζεται δηλαδή επικάλυψη των θεωρητικών επιφανειών α που ορίστηκαν στις προηγούμενες παραγράφους, με αποτέλεσμα το γινόμενο adn να είναι μεγαλύτερο από την πραγματική επιφάνεια απορρόφησης ds. 4. Όργανα φωτομέτρησης Τα όργανα που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της απορρόφησης ενός διαλύματος είναι τα φωτόμετρα. Τα βασικά μέρη ενός φωτομέτρου (Σχήμα.1.3) είναι τα εξής: Φωτεινή πηγή. Ως πηγή φωτεινής ακτινοβολίας χρησιμοποιούνται ειδικές λάμπες. Για την περιοχή του ορατού φάσματος υπάρχουν λάμπες βολφραμίου που εκπέμπουν ακτινοβολία μήκους κύματος από 380 έως 800 nm. Στην περιοχή του υπεριώδους ( nm) χρησιμοποιούνται λάμπες δευτερίου. Μονοχρωμάτορας. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από φωτεινή πηγή αποτελείται από συνεχές φάσμα μηκών κύματος. Το φάσμα αυτό μπορεί να αναλυθεί με τη βοήθεια διάταξης που ονομάζεται μονοχρωμάτορας. Ο τελευταίος προκαλεί περίθλαση του φωτός και με τη βοήθεια σχισμής, εξαιρετικά μικρής διαμέτρου, γίνεται δυνατή η απομόνωση ακτίνας φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος. Ανίχνευση του δείγματος. Η μονοχρωματική δέσμη φωτός μετά το μονοχρωμάτορα, διαχωρίζεται σε δύο ίσης έντασης δέσμες περνώντας από ένα ειδικό πρίσμα. Η μία από τις δέσμες περνά μέσα από την κυψελίδα του δείγματος, ενώ η άλλη χρησιμεύει ως δέσμη αναφοράς. Στη συνέχεια και οι δύο δέσμες οδηγούνται σε ειδικούς φωτοηλεκτρικούς ανιχνευτές, όπου συγκρίνονται οι εντάσεις τους και ποσοτικοποιείται η απορρόφηση του δείγματος. 5

9 Λάμπα Βολφραμίου Σχισμή Εισόδου Φράγμα Περίθλασης Ανακλαστήρας Λάμπα Δευτερίου Ανιχνευτής Σχισμή Εξόδου Χώρος Δείγματος Φίλτρο Ανιχνευτής Δείγμα Πρίσμα Διαχωρισμού Ανακλαστήρας Σχήμα 1.3 6

10 ΠΕΙΡΑΜΑ 1: ΤΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΦΑΣΜΑ ΤΟΥ ΚΥΤΟΧΡΩΜΑΤΟΣ Κάθε ένωση, ανάλογα με τις χαρακτηριστικές ομάδες που έχει στη μοριακή της δομή, απορροφά διαφορετική ποσότητα ακτινοβολίας ανάλογα με το μήκος κύματος. Η συνάρτηση της απορρόφησης ως προς το μήκος κύματος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας δίνει το λεγόμενο φάσμα της ένωσης, το οποίο είναι χαρακτηριστικό για τη συγκεκριμένη ένωση. Έτσι, είναι δυνατό να ταυτοποιηθεί ποιοτικά μία ουσία σε ένα διάλυμα, συγκρίνοντας το φάσμα της με τα φάσματα γνωστών ενώσεων. Τα κυτοχρώματα Τα κυτοχρώματα είναι αιμοπρωτείνες οι οποίες βρίσκονται σε όλα τα αερόβια είδη. Πρόκειται για μεταφορείς ηλεκτρονίων που λαμβάνουν μέρος στις αναπνευστικές και φωτοσυνθετικές αλυσίδες αντιδράσεων μεταφοράς ηλεκτρονίων. Το κύριο χαρακτηριστικό της δομής τους είναι η ύπαρξη ενός προσθετικού μορίου αίμης στο μόριό τους. Το άτομο του σιδήρου, που βρίσκεται στο κέντρο κάθε αίμης, είναι υπεύθυνο για τη δράση του συνολικού μορίου του κυτοχρώματος, μεταφέροντας ηλεκτρόνια με κυκλικές μεταπηδήσεις από την οξειδωμένη στην ανηγμένη του μορφή (Fe 3+ Fe 2+ ). Υπάρχουν τρία βασικά είδη κυτοχρώματος (a, b και c) τα οποία διακρίνονται μεταξύ τους από τις διαφορετικές πλευρικές αλυσίδες της αίμης του μορίου τους (Εικόνα 1.1). Ανάλογα με το είδος της αίμης, τα κυτοχρώματα παρουσιάζουν διαφορετικά φάσματα απορρόφησης στην περιοχή του ορατού φωτός. Αντίστοιχες διαφορές εμφανίζονται μεταξύ της οξειδωμένης και ανηγμένης μορφής του ιδίου τύπου κυτοχρώματος. Τα φάσματα κυτοχρωμάτων στην ανηγμένη τους μορφή παρουσιάζουν τρία μέγιστα (α, β και γ), οι περιοχές των οποίων δίνονται στον Πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1 Περιοχή μεγίστης απορρόφησης, nm α β γ Κυτόχρωμα a δεν υπάρχει Κυτόχρωμα b Κυτόχρωμα c

11 Αίμη κυτοχρώματος a Αίμη κυτοχρώματος b Αίμη κυτοχρώματος c Εικόνα 1.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιείται διάλυμα κυτοχρώματος συγκέντρωσης 10-5 Μ (σε ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0) στην οξειδωμένη του μορφή. 2. Δημιουργείται η βασική γραμμή (base line) για την επιθυμητή περιοχή μηκών κύματος : 350 nm nm, με τοποθέτηση καθαρού διαλύτη στην κυψελίδα και μηδενισμό των απορροφήσεων για όλη την περιοχή μηκών κύματος. 3. Στη συνέχεια στην κυψελίδα τοποθετείται το διάλυμα του κυτοχρώματος και πραγματοποιείται σάρωση της προαναφερθείσας περιοχής, λαμβάνοντας έτσι το φάσμα απορρόφησης της οξειδωμένης μορφής του κυτοχρώματος. Βρίσκονται τα 8

12 μήκη κύματος των μεγίστων του φάσματος και καταγράφονται οι απορροφήσεις τους. 4. Λαμβάνεται συγκεκριμένη ποσότητα (1.5 ml) διαλύματος οξειδωμένου κυτοχρώματος στην οποία προστίθενται 0.02 ml διαλύματος αναγωγικού (1Μ, Na 2 S 2 O 4 σε ρυθμιστικό με ph 7.0). Εμφανίζεται αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος. Η παραπάνω ποσότητα αναγωγικού είναι σε περίσσεια σε σχέση με τη συγκέντρωση του κυτοχρώματος, οπότε μπορεί να θεωρηθεί ότι ανάγεται το σύνολο του κυτοχρώματος. Με τρόπο ανάλογο αυτού που αναφέρεται στο 3 λαμβάνεται το φάσμα απορρόφησης της ανηγμένης μορφής του κυτοχρώματος. Βρίσκονται τα μήκη κύματος των μεγίστων του φάσματος και καταγράφονται οι απορροφήσεις τους. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Από τις απορροφήσεις των κορυφών της ανηγμένης μορφής προσδιορίστε τον τύπο του κυτοχρώματος, με τη βοήθεια του Πίνακα Υπολογίστε τη μοριακή απορροφητικότητα του κυτοχρώματος στα εκάστοτε μέγιστα (οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή). Το μήκος της κυψελίδας είναι b=1cm. Ποια είναι η μετατόπιση σε nm του μεγίστου γ από την πλήρως οξειδωμένη στην πλήρως ανηγμένη μορφή; 3. Διάλυμα του συγκεκριμένου κυτοχρώματος με ολική συγκέντρωση 10-5 Μ (οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή) έχει απορρόφηση στα 550 nm ίση με 0,120. Από τα πειραματικά σας αποτελέσματα να υπολογίσετε το ποσοστό της ανηγμένης μορφής στο συγκεκριμένο διάλυμα. (Μήκος κυψελίδας 1cm). 4. Σας δίνεται διάλυμα 500 ml, ph=7.0, που περιέχει άγνωστη συγκέντρωση 5 τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤΡ, ε =14300 M -1. cm -1, στα 260 nm και ph=7.0). Έχετε τοποθετήσει 4 ml του διαλύματος αυτού σε μία κυψελίδα χαλαζία πλάτους 1 cm και ύψους 4 cm και έχετε προσδιορίσει το Α 260 του διαλύματος Ποια είναι η μοριακότητα του διαλύματος ΑΤΡ; Πόσα moles ΑΤΡ υπάρχουν στα 500 ml διαλύματος; Πόσα moles ATP υπάρχουν στην κυψελίδα; 9

13 ΠΕΙΡΑΜΑ 2: ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΟΥ ΔΙΝΙΤΡΟΣΑΛΙΚΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ Η μέτρηση αναγωγικών σακχάρων πραγματοποιείται με τη φωτομετρική μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS). Ως αναγωγικό σάκχαρο ορίζεται το σάκχαρο εκείνο που έχει ελεύθερο το ημιακεταλικό υδροξύλιο. Η μέθοδος βασίζεται στο σχηματισμό συμπλόκου ανάμεσα στο προαναφερθέν υδροξύλιο και το δινιτροσαλικυλικό οξύ κατά τη θέρμανση σε θερμοκρασία πάνω από τους 70 o C. To σύμπλοκο αυτό, εμφανίζει μέγιστο απορρόφησης στα 540 nm. Η γλυκόζη είναι αναγωγικό σάκχαρο και κατά συνέπεια είναι δυνατό να μετρηθεί με τη μέθοδο αυτή. Στην παρούσα άσκηση θα κατασκευαστεί η καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης με τη μέθοδο DNS. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιείται πρότυπο διάλυμα γλυκόζης συγκέντρωσης 1.0 mg/ml. Πραγματοποιούνται αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος με απιονισμένο νερό έτσι ώστε να προκύψουν διαλύματα γλυκόζης τελικής συγκέντρωσης 0.2, 0.4, 0.8, και 1.0 mg/ml. 2. Σε δέκα δοκιμαστικούς σωλήνες (δύο για κάθε συγκέντρωση γλυκόζης και δύο για το άγνωστης συγκέντρωσης διάλυμα γλυκόζης) προστίθενται 0.5 ml διαλύματος δινιτροσαλικυλικού οξέος και 0.5 ml από το κάθε διάλυμα γλυκόζης. Τα προκύπτοντα διαλύματα αναμιγνύονται καλά. 3. Στη συνέχεια σε δύο ακόμα δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται 0.5 ml διαλύματος δινιτροσαλικυλικού οξέος και 0.5 ml απιονισμένου νερού (τυφλό). 4. Όλοι οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε νερό που βράζει έτσι ώστε σχηματιστεί το σύμπλοκο μεταξύ της γλυκόζης και του δινιτροσαλυκιλικού οξέος. Μετά από ακριβώς 5 min απομακρύνονται οι δοκιμαστικοί σωλήνες από το νερό και προστίθεται σε κάθε ένα από αυτούς 4 ml απιονισμένο νερό. 5. Επιλέγεται στο φωτόμετρο το μήκος κύματος των 540 nm. Μηδενίζεται το όργανο με το διάλυμα που περιέχει το απιονισμένο νερό, και μετρώνται οι απορροφήσεις των διαλυμάτων γνωστής και άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης. 6. Εάν η λαμβανόμενη απορρόφηση του αγνώστου διαλύματος είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προτύπου διαλύματος γλυκόζης συγκέντρωσης 2 mg/ml, τότε πραγματοποιείται αραίωση ώστε να ληφθεί απορρόφηση μέσα στα όρια των απορροφήσεων των προτύπων διαλυμάτων. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε τους μέσους όρους των μετρήσεων και κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης (απορρόφηση ως προς την αντίστοιχη συγκέντρωση του 10

14 προτύπου διαλύματος). Υπολογίστε τη βέλτιστη ευθεία με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. 2. Υπολογίστε τις συγκεντρώσεις των αγνώστων διαλυμάτων γλυκόζης χρησιμοποιώντας την εξίσωση της ευθείας του προηγούμενου ερωτήματος. 3. Θέλετε να προσδιορίσετε την συγκέντρωση διαλύματος σακχαρόζης χρησιμοποιώντας μόνο τη μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS). Αναφέρετε τι πρόβλημα υπάρχει κατά την διαδικασία του προσδιορισμού και πως μπορείτε να το λύσετε ώστε να γίνει σωστά ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της σακχαρόζης. 4. Ποια από τα παρακάτω σάκχαρα δε δίνουν αντίδραση με το δινιτροσαλικυλικό οξύ; Φουκόζη, ερυθρόζη, ταλόζη, γαλακτόζη, λακτόζη, ριβόζη, ισομαλτόζη, μελιβιόζη, ρουτινόζη, σοφορόζη, τρεχαλόζη, σταχυόζη, βερμπασκόζη, ραφφινόζη, γεντιανόζη. 5. Να αναφέρετε μία ακόμη φασματοφωτομετρική μέθοδο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αναγωγικών σακχάρων. Πώς συγκρίνεται η ευαισθησία της με αυτήν της μεθόδου του δινιτροσαλικυλικού οξέος; 11

15 ΠΕΙΡΑΜΑ 3: ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΜΕ ΕΜΠΟΡΙΚΟ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ Στην παρούσα άσκηση η μέτρηση της γλυκόζης θα πραγματοποιηθεί ενζυμικά με τη χρησιμοποίηση ειδικού εμπορικού διαγνωστικού σκευάσματος (kit). Η συγκεκριμένη μέθοδος βασίζεται στη μετατροπή της γλυκόζης σε ένα προϊόν ερυθρού χρώματος το οποίο είναι αποτέλεσμα της διαδοχικής δράσης των ενζύμων οξειδάση και υπεροξειδάση της γλυκόζη. Αρχικά η γλυκόζη με τη δράση της οξειδάσης της γλυκόζης μετατρέπεται σε γλυκονικό οξύ με την ταυτόχρονη παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ακολούθως το υπεροξείδιο του υδρογόνου παρουσία αμινοφαιναζόνης και κάποιου φαινολικού παραγώγου με τη δράση της υπεροξειδάσης μετατρέπεται σε κάποιο προϊόν ερυθρού χρώματος το οποίο παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στα 510 nm. Γλυκόζη GOD Γλυκονικό οξύ + H 2 O 2 H 2 O 2 + Aμινοφαιναζόνη + Φαινολικό παράγωγο ΡOD Προϊόν (ερυθρού χρώματος) GOD: γλυκόζη οξειδάση, POD: υπεροξειδάση Το διάλυμα εργασίας παρασκευάζεται μεταφέροντας ποσοτικά ένα φιαλίδιο ενζύμων σε ένα φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος και είναι σταθερό 45 ημέρες στους 4 ο C. Μετά την ανασύσταση η περιεκτικότητα του αντιδραστηρίου είναι: ρυθμιστικό διάλυμα 200 mm ph 8.0, οξειδάση της γλυκόζη 18 ΙU/ml, υπεροξειδάση 10 U/ml, αμινοφαιζόνη 0.25 mm, παράγωγο φαινόλης 10 mm, συμπαράγοντες. Το διάλυμα εργασίας θα παρασκευαστεί από τον υπεύθυνο της άσκησης. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιείται πρότυπο διάλυμα γλυκόζης συγκέντρωσης 1.0 mg/ml. Πραγματοποιούνται αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος με απιονισμένο νερό έτσι ώστε να προκύψουν διαλύματα γλυκόζης τελικής συγκέντρωσης 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 και 1.0 mg/ml. 2. Σε δώδεκα δοκιμαστικούς σωλήνες (δύο για κάθε συγκέντρωση γλυκόζης και δύο για το άγνωστης συγκέντρωσης διάλυμα γλυκόζης) προστίθενται 1.0 ml διαλύματος εργασίας και 0.05 ml από το κάθε διάλυμα γλυκόζης. Τα προκύπτοντα διαλύματα αναμιγνύονται καλά. 3. Στη συνέχεια σε δύο ακόμα δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται 1.0 ml διαλύματος εργασίας και 0.05 ml απιονισμένου νερού (τυφλό). 4. Όλοι οι δοκιμαστικοί σωλήνες επωάζονται σε λουτρό θερμοκρασίας 37 ο C για 15 min. 12

16 5. Επιλέγεται στο φωτόμετρο το μήκος κύματος των 510 nm. Μηδενίζεται το όργανο με το διάλυμα που περιέχει το απιονισμένο νερό, και μετρώνται οι απορροφήσεις των διαλυμάτων γνωστής και άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης. 6. Εάν η λαμβανόμενη απορρόφηση του αγνώστου διαλύματος είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προτύπου διαλύματος γλυκόζης συγκέντρωσης 1 mg/ml, τότε πραγματοποιείται αραίωση ώστε να ληφθεί απορρόφηση μέσα στα όρια των απορροφήσεων των προτύπων διαλυμάτων. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε τους μέσους όρους των μετρήσεων και κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης (απορρόφηση ως προς την αντίστοιχη συγκέντρωση του προτύπου διαλύματος). Υπολογίστε τη βέλτιστη ευθεία με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. 2. Υπολογίστε τις συγκεντρώσεις των αγνώστων διαλυμάτων γλυκόζης χρησιμοποιώντας την εξίσωση της ευθείας του προηγούμενου ερωτήματος. 3. Μετά από ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε βιοχημικό εργαστήριο σε δείγμα αίματος με την ενζυμική μέθοδο (ακολουθώντας τις προηγούμενες συνθήκες) η απορρόφηση βρέθηκε ίση με όταν το δείγμα αραιώθηκε 5 φορές. Είναι φυσιολογικά τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα του ασθενούς; ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Stryer, L. (1988) Biochemistry, W.H. Freeman and Company, New York, 3 rd edition. 2. Lehninger, A.L. (1983) Principles in Biochemistry, Worth Publishers, INC. 3. Miller, G.L., (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3), Bailey, J.E. & Ollis, D.F. (1987). Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, 2 nd edition. 5. G. Tranter, J. Holmes, J. Lindon (2000). Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry, Academic Press, London, UK 6. M. Chaplin J. Kennedy (1994). Carbohydrate Analysis, IRL at Oxford 7. (δομή σακχάρων) 8. I. Κλώνης (1997). Ενζυμική Βιοτεχνολογία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 9. Μ. Καλογερής & Χ. Σταμάτης (2006). Οδηγός Εργαστηριακών Ασκήσεων Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών & Τεχνολογιών, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων 13

17 2 η Εργαστηριακή ημέρα ΠΕΙΡΑΜΑ 4: ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΠΑΡΑ ΝΙΤΡΟΦΑΙΝΟΛΗΣ (pnp) Η παρα- νιτροφαινόλη (pnp, με μοριακό τύπο O 2 N-C 6 H 4 -OH), αποτελεί μία συχνά χρησιμοποιούμενη οργανική ένωση στις βιοχημικές αναλύσεις. Πρόκειται για ένα ασθενές οξύ το οποίο διίσταται ως εξής : O 2 N-C 6 H 4 -OH O 2 N-C 6 H 4 -O - + H + Σε μήκος κύματος 410 nm μόνο η ιονισμένη μορφή απορροφά την προσπίπτουσα οπτική ακτινοβολία. Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η απορρόφηση των διαλυμάτων της παρα-νιτροφαινόλης εξαρτάται από το ph. H εξίσωση Henderson- Hasselbach συσχετίζει το λόγο της συγκέντρωσης της ιονισμένης προς τη συγκέντρωση της μη ιονισμένης μορφής ενός οξέος με το ph του διαλύματος στο οποίο βρίσκεται το εν λόγω οξύ: ph PK a log A AH Από τις συνήθεις εφαρμογές της φωτομετρίας αποτελεί ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της υπό εξέταση ουσίας σε άγνωστο διάλυμα. Αυτό επιτυγχάνεται με την κατασκευή καμπύλης αναφοράς για τη συγκεκριμένη ένωση. Μία τέτοια καμπύλη λαμβάνεται μετρώντας την απορρόφηση διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης της συγκεκριμένης ένωσης (στο μήκος κύματος που αυτή απορροφά) και υπολογίζοντας στη συνέχεια την ευθεία ελαχίστων τετραγώνων η οποία θα πρέπει να προκύψει με βάση το νόμο του Beer. Η συγκέντρωση της ουσίας σε διάλυμα προσδιορίζεται πολύ εύκολα από την παραπάνω ευθεία, εάν μετρηθεί η απορρόφησή της στο ίδιο μήκος κύματος και υπό τις ίδιες συνθήκες. Η μέθοδος αυτή θα εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό αγνώστων διαλυμάτων παρα-νιτροφαινόλης. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιείται πρότυπο διάλυμα παρα-νιτροφαινόλης συγκέντρωσης 0.3 mm. Το διάλυμα αυτό αραιώνεται με απιονισμένο νερό έτσι ώστε να προκύψουν διαλύματα παρα-νιτροφαινόλης τελικής συγκέντρωσης 0.05, 0.1, 0.15, 0.25 και 0.3 mm και τελικού όγκου 2 ml. 2. Σε 2.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ph 10.0 προστίθεται 0.5 ml από κάθε διάλυμα παρα-νιτροφαινόλης. Τα προκύπτοντα διαλύματα αναμιγνύονται καλά. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται δύο φορές για κάθε συγκέντρωση παρα- 14

18 νιτροφαινόλης, που αναφέρεται παραπάνω (συνολικά ετοιμάζονται δέκα δοκιμαστικοί σωλήνες). 3. Σε 0.5 ml αγνώστου διαλύματος παρα- νιτροφαινόλης προστίθενται 2.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ph Επαναλαμβάνεται η διαδικασία δύο φορές για κάθε άγνωστο διάλυμα. 4. Επιλέγεται στο φωτόμετρο μήκος κύματος 410 nm. Μηδενίζεται το όργανο με ρυθμιστικό διάλυμα ph 10.0 (τυφλό), και μετρώνται οι απορροφήσεις των διαλυμάτων γνωστής και άγνωστης συγκέντρωσης παρα-νιτροφαινόλης. 5. Εάν η λαμβανόμενη απορρόφηση του αγνώστου διαλύματος είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προτύπου διαλύματος παρα- νιτροφαινόλης συγκέντρωσης 0.3 mm, τότε αραιώνεται ώστε να ληφθεί απορρόφηση μέσα στα όρια των απορροφήσεων των προτύπων διαλυμάτων. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε τους μέσους όρους των μετρήσεων και κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς της παρα- νιτροφαινόλης (απορρόφηση ως προς την αντίστοιχη συγκέντρωση του προτύπου διαλύματος). Υπολογίστε τη βέλτιστη ευθεία με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Από την κλίση της ευθείας αυτής προσδιορίστε τη μοριακή απορροφητικότητα της παρα- νιτροφαινόλης σε ph Aπό την εξίσωση της ευθείας του προηγούμενου ερωτήματος υπολογίστε τις συγκεντρώσεις των αγνώστων διαλυμάτων παρα- νιτροφαινόλης. 3. Γιατί χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα με ph 10.0 για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς της παρα- νιτροφαινόλης ; mg παρα-νιτροφαινόλης (μοριακό βάρος 140 g/mole) διαλύονται σε 20 ml διαλύματος 0.1 Μ ΝαΟΗ. 0.1 ml από το προκύπτον διάλυμα μεταφέρονται σε 4.9 ml ρυθμιστικού διαλύματος με ph 8.0. Ποια είναι η απορρόφηση του διαλύματος αυτού στα 415 nm ; (ε=15000 M -1. cm -1, για το ανιόν της παρα-νιτροφαινόλης στα 415 nm, μήκος κυψελίδας b=1cm, pk a = 7.13). 5. Ποσότητα 0.1 ml διαλύματος παρα-νιτροφαινόλης 1 mm, προστίθεται σε 2.9 ml διαλύματος αγνώστου ph. Η απορρόφηση στα 410 nm του τελικού διαλύματος μετρήθηκε ίση με 0.4. Ποιο είναι το ph του διαλύματος; 15

19 ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Στην παρούσα άσκηση πραγματοποιείται μέτρηση της ενεργότητας δύο υδρολυτικών ενζύμων της γαλακτοζιδάσης και της ιμβερτάσης ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τα ένζυμα είναι βιο-καταλύτες πρωτεϊνικής φύσης. Καταλύουν χημικές αντιδράσεις ελαττώνοντας την ενέργεια ενεργοποίησης τους, επιταχύνοντας τις αντιδράσεις φορές χωρίς ουσιαστικά να παίρνουν μέρος σε αυτές. Ως καταλύτες, τα ένζυμα χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό εξειδίκευσης αναφορικά με το υπόστρωμα στο οποίο δρουν και από ορισμένες ιδιότητές τους. Στην πρώτη περίπτωση το ένζυμο καταλύει την αντίδραση μόνο μιας χημικής ένωσης ή ομάδας συγγενών χημικών ενώσεων. Στη δεύτερη περίπτωση ένα ένζυμο καταλύει μόνο μία καθορισμένη αντίδραση επιφέροντας στο υπόστρωμα ορισμένη μετατροπή που χαρακτηρίζεται από αυστηρή στερεοειδίκευση. Σήμερα πάνω από ένζυμα έχουν βρεθεί, πολλά από τα οποία έχουν απομονωθεί σε καθαρή ομοιογενή μορφή και τουλάχιστον 200 από αυτά έχουν κρυσταλλωθεί. Η β-γαλακτοζιδάση (λακτάση) είναι το ένζυμο εκείνο που καταλύει την υδρόλυση του β-d-γαλακτοζιδικού δεσμού. Με το δεσμό αυτό συνδέονται η γλυκόζη και η γαλακτόζη σχηματίζοντας το μόριο της λακτόζης (Σχήμα 2.1). Η λακτόζη είναι βασικό συστατικό του γάλακτος και άρα περιέχεται τόσο στα προϊόντα όσο και στα απόβλητα των βιομηχανιών γαλακτοκομικών προϊόντων. Η ύπαρξη της στα προϊόντα αυτά τα κάνει δύσπεπτα για ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού της γης, ο οργανισμός των οποίων δεν παράγει τη β-γαλακτοζιδάση, ένζυμο απαραίτητο για τη χώνευση της λακτόζης. Επιπλέον, στη σταθερότητα του β- γαλακτοζιδικού δεσμού οφείλεται και η δυσκολία στο βιολογικό καθαρισμό των αποβλήτων των βιομηχανιών γαλακτοκομικών προϊόντων (τυρογάλατος). Από τα προηγούμενα συνάγεται και η βιομηχανική σημασία της β-γαλακτοζιδάσης. Στην άσκηση θα χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα αντί της λακτόζης η ένωση ορθο-νιτρο-φαίνυλο-β-d-γαλακτοπυρανόζη (onpg, Σχήμα 2.2). Η ένωση αυτή αποτελείται από ένα μόριο γαλακτόζης και ένα μόριο ορθο-νιτροφαινόλης ενωμένα με β- D-γαλακτοζιδικό δεσμό. Η β-γαλακτοζιδάση αναγνωρίζει και υδρολύει το δεσμό αυτό. Στην ουσία το μόριο της οnpg αποτελεί απομίμηση του μορίου της λακτόζης. Η β-γαλακτοδιζάση που θα χρησιμοποιηθεί στη συγκεκριμένη άσκηση έχει παραχθεί εξωκυτταρικά από το μύκητα Aspergillus niger. Ο μύκητας αυτός αναπτύχθηκε σε βυθισμένη καλλιέργεια. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε το πίτυρο σίτου και ως πηγή αζώτου το (NH 4 ) 2 HPO 4. Μετά το τέλος της ζύμωσης η κυτταρική μάζα απομακρύνθηκε με διήθηση και το προκύπτον διήθημα χρησιμοποιήθηκε ως πηγή ενζύμου. Ιμβερτάση είναι το ένζυμο εκείνο που καταλύει την υδρόλυση του δισακχαρίτη σακχαρόζη σε γλυκόζη και φρουκτόζη διασπώντας τον α-1,2 γλυκοζιδικό δεσμό με τον οποίο είναι ενωμένα τα δυο τελευταία σάκχαρα στο μόριο του πρώτου (Σχήμα 2.3). 16

20 Σχήμα 2.1. Δράση β-γαλακτοζιδάσης σε λακτόζη Σχήμα 2.2. ο-νιτρο-φαίνυλο-β-d-γαλακτοπυρανόζη (onpg) Ιμβερτάση Σακχαρόζη Γλυκόζη Σχήμα 2.3. Δράση ιμβερτάσης σε σακχαρόζη Φρουκτόζη 17

21 Στα ένζυμα είναι δύσκολος ο ακριβής προσδιορισμός των μοριακών βαρών τους. Έτσι, η συγκέντρωσή τους εκτιμάται σε σχέση με τη συγκεκριμένη δράση την οποία καταλύουν. Η ενζυμική δράση μετράται με τη μονάδα ενεργότητας (Unit) η οποία ορίζεται ως το ποσό του ενζύμου που προκαλεί συγκεκριμένη αλλαγή στο υπόστρωμα υπό ορισμένες συνθήκες. Για τη β-γαλακτοδιζάση ως 1 Unit ορίζεται το ποσό του ενζύμου που απελευθερώνει 1 μmol ορθο-νιτροφαινόλης ανά λεπτό, υπό συνθήκες περίσσειας υποστρώματος (οnpg), σε ph 4.0 και θερμοκρασία 50 o C. Για την ιμβερτάση ως 1 Unit ορίζεται ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου η οποία υδρολύει 1 μmole υποστρώματος (σακχαρόζη) ανά λεπτό, υπό συνθήκες περίσσειας υποστρώματος, σε ph 4.5 και θερμοκρασία 50 o C. ΠΕΙΡΑΜΑ 5: ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ β ΓΑΛΑΚΤΟΖΙΔΑΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες που τοποθετούνται σε παγόλουτρο, προστίθενται 2.5 ml διαλύματος οnpg συγκέντρωσης 0.3 mm, σε ρυθμιστικό με ph Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα που θα χρησιμοποιηθεί ως τυφλό (για το μηδενισμό του φωτομέτρου) προστίθενται 0.2 ml απιονισμένου νερού και στους άλλους δύο 0.2 ml ενζύμου. Μετά την ανάμιξή τους οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 50 ο C. 3. Μετά την πάροδο ακριβώς 10 λεπτών, οι σωλήνες τοποθετούνται σε πάγο, και σε καθένα από αυτούς προστίθεται 0.5 ml Νa 2 CO 3, 30% κ.ό. 4. Επιλέγεται στο φωτόμετρο το μήκος κύματος των 410 nm. Πραγματοποιείται φωτομέτρηση. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Με βάση τον ορισμό της μονάδας ενζυμικής ενεργότητας (Unit) και με τη βοήθεια της σχέσης C=0.744A 410 (όπου C: ποσότητα onp στο δοκιμαστικό σωλήνα σε μmoles, Α 410 : η απορρόφηση στα 410 nm) υπολογίστε τα Units/ml διαλύματος της β-γαλακτοζιδάσης. 2. Ποιος ο ρόλος του προστιθέμενου Na 2 CO 3 ; 3. Μετά την προσθήκη του Na 2 CO 3, το μίγμα της ενζυμικής αντίδρασης πρέπει να παραμείνει στο παγόλουτρο ή όχι και γιατί; 4. Ποια η διαφορά μεταξύ α- και β-γαλακτοζιδάσης; 18

22 ΠΕΙΡΑΜΑ 6: ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΙΜΒΕΡΤΑΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Σε τέσσερις δοκιμαστικούς σωλήνες οι οποίοι έχουν τοποθετηθεί σε παγόλουτρο, προστίθενται από 4.5 ml διαλύματος σακχαρόζης (100 g/l, σε ρυθμιστικό διάλυμα με ph 4.5). 2. Στους τρεις από τους σωλήνες προστίθενται από 0.5 ml διαλύματος ενζύμου ενώ στον τέταρτο (ο οποίος θα χρησιμοποιηθεί ως τυφλό) προστίθενται 0.5 ml απιονισμένου Η 2 Ο. Και οι τέσσερις δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε λουτρό θερμοκρασίας 50 ο C για την πραγματοποίηση της ενζυμικής δράσης. 3. Μετά από 15 min, όλοι οι σωλήνες επανατοποθετούνται στο παγόλουτρο. 4. Λαμβάνονται 0.5 ml από κάθε σωλήνα και προσδιορίζονται τα συνολικά αναγωγικά σάκχαρα με τη μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS) (βλέπε Πείραμα 2, 1ης Εργαστηριακής ημέρας) ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Με βάση τις παρακάτω καμπύλες αναφοράς για τη γλυκόζη και τη φρουκτόζη, προσδιορίστε τη συγκέντρωση των δυο παραπάνω σακχάρων στο αντιδρόν μίγμα των 5 ml (Λάβετε υπ' όψιν πως τα δυο αυτά σάκχαρα παράγονται ισομοριακά κατά τη δράση της ινβερτάσης) Γλυκόζη: C = * A 540 Φρουκτόζη: C = * A 540 όπου C, η συγκέντρωση του εκάστοτε σακχάρου σε g/l. 2. Υπολογίστε τη συνολική ποσότητα σε μmoles, της σακχαρόζης η οποία υδρολύθηκε σε κάθε σωλήνα. 3. Σύμφωνα με τον ορισμό της μονάδας ενεργότητας της ινβερτάσης υπολογίστε τη συγκέντρωση ινβερτάσης σε Units/ml, τόσο στο αντιδρόν μίγμα όσο και στο αρχικό ενζυμικό διάλυμα. (Μέσος όρος των τριών σωλήνων όπου περιέχουν το δείγμα). 4. Γιατί το ένζυμο που υδρολύει το γλυκοζιτικό δεσμό στο μόριο της σακχαρόζης ονομάζεται ινβερτάση; 5. Λόγω έλλειψης του αντιδραστηρίου DNS για τον προσδιορισμό της ενεργότητας της ινβερτάσης σας προτείνεται αντί της μεθόδου DNS να αξιοποιήσετε την ενζυμική μέθοδο μέτρησης της γλυκόζης που παρουσιάστηκε σε προηγούμενη εργαστηριακή ημέρα. Τι θα κάνετε; 19

23 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. The Enzymes (1970), ed. P.D. Boyer, Academic Press. 2. R. R. Alexander & J. M. Griffiths (1993). Basic Biochemical Methods, Wiley- Liss Inc. New York. 3. R. Boyer (2000). Modern Experimental Biochemistry, 3 rd Edition, Benjamin/Cummings, San Fransisco 20

24 3 η Εργαστηριακή ημέρα ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Στην παρούσα εργαστηριακή ημέρα θα εξεταστεί η επίδραση του ph στην ενεργότητα του ενζύμου β-γαλακτοζιδάση. Στη συνέχεια θα γίνει ποιοτικός προσδιορισμός των συστατικών ενός μίγματος αμινοξέων με τη μέθοδο της χρωματογραφίας χάρτου. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση πραγματοποιείται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, το οποίο δημιουργείται με βάση τη διάταξη στο χώρο των αμινοξέων που το αποτελούν. Οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων διαθέτουν συνήθως ιονισμένες ομάδες (καρβοξύλια, αμίνες, υδροξύλια). Από το βαθμό ιονισμού εξαρτάται ο βαθμός πρόσδεσης καθώς και ο προσανατολισμός του υποστρώματος (ή των υποστρωμάτων) στο ενεργό κέντρο. Ακόμα πολλές από τις ομάδες αυτές λαμβάνουν και ενεργό μέρος στην αντίδραση, μέσω των κλασσικών μηχανισμών κατάλυσης οξέως βάσεως. Από τα παραπάνω γίνεται κατανοητό ότι η δραστικότητα των ενζύμων είναι συνάρτηση του ph, στο οποίο πραγματοποιείται η ενζυμική αντίδραση. Τα περισσότερα ένζυμα έχουν ένα χαρακτηριστικό βέλτιστο ph όπου η ενεργότητά τους είναι η μέγιστη δυνατή. Σε πολλά ένζυμα το διάγραμμα ενεργότητας σε σχέση με το ph προσομοιάζει την καμπύλη κανονικής κατανομής. Αρκετά όμως ένζυμα δίνουν καμπύλες διαφορετικές. Η σχέση ph-ενεργότητας εξαρτάται από πολλούς παράγοντες. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι: α) η επίδραση του ph στη διαμόρφωση του ενζύμου, β) η επίδραση του ph στη σύνδεση ενζύμου-συνενζύμου ή προσθετικής ομάδας, γ) η επίδραση του ph στις ομάδες του υποστρώματος που ιονίζονται δ) η επίδραση του ph στη σύνδεση ενζύμου-υποστρώματος και στους καταλυτικούς μηχανισμούς. Με βάση ορισμένες παραδοχές και με την προϋπόθεση ότι δεν συμβαίνουν αναντίστρεπτες μεταβολές στη δομή του ενζύμου, η ταχύτητα μιας ενζυμικής δράσης σε σταθερή θερμοκρασία, δίνεται από τη σχέση: v v max [ S ] Ka H Km[ 1 ] [ H ] Kb S όπου v max η μέγιστη ταχύτητα της ενζυμικής δράσης και K α, K b σταθερές διάστασης. 21

25 ΠΕΙΡΑΜΑ 7: ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ β ΓΑΛΑΚΤΟΖΙΔΑΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες που τοποθετούνται σε παγόλουτρο, προστίθενται από 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος με ph 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 και 6.0. Χρησιμοποιούνται δύο σωλήνες για το κάθε ph και δύο επιπλέον σωλήνες στους οποίους προστίθενται 2 ml απιονισμένου νερού και οι οποίοι θα χρησιμοποιηθούν ως λευκό κατά τη φωτομέτρηση. 2. Σε όλους τους σωλήνες προστίθεται 0.5 ml διαλύματος onpg συγκέντρωσης 10 μmoles / ml. 3. Σε δύο σωλήνες που προορίζονται για λευκό προστίθενται 0.25 ml νερού ενώ στους υπόλοιπους σωλήνες από 0.25 ml ενζύμου, και στη συνέχεια τοποθετούνται όλοι μετά από ανάδευση σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 50 ο C. 4. Μετά την πάροδο ακριβώς 15 min οι σωλήνες τοποθετούνται σε πάγο και προστίθεται σε όλους 0.5 ml διαλύματος Na 2 CO 3 30 % β/ο. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 410 nm, αφού πρώτα μηδενιστεί το φωτόμετρο με τα δύο λευκά. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε την ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης σε κάθε τιμή ph, με τρόπο ανάλογο αυτού που εργαστήκατε, στην προηγούμενη άσκηση. 2. Κατασκευάστε τη γραφική παράσταση της εξάρτησης της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης ως προς το ph του διαλύματος. Ποιο είναι το άριστο ph για τη δράση της β-γαλακτοζιδάσης; 3. Από τα δεδομένα σας υπολογίστε τις σταθερές διάστασης K a και K b. 4. Ποια η σχέση ανάμεσα στο βέλτιστο ph για τη δράση ενός ενζύμου και στο ισοηλεκτρικό σημείο του; Ποια η σχέση ανάμεσα στο βέλτιστο ph για τη δράση ενός ενζύμου και στο ph στο οποίο εμφανίζει τη μέγιστη σταθερότητά του; 5. Υπεύθυνος για τη δράση ενός ενζύμου είναι ο ιοντισμός της πλευρικής ομάδας ενός καταλοίπου ιστιδίνης που βρίσκεται στο καταλυτικό του κέντρο. Για την πρόσδεση του υποστρώματος στο ένζυμο απαραίτητη προϋπόθεση αποτελεί η μη πρωτονιωμένη (ιοντισμένη) μορφή ενός καταλοίπου γλουταμινικού οξέος. Μπορούν να γίνουν προβλέψεις σχετικά με το αναμενόμενο βέλτιστο ph για τη δράση του ενζύμου; 22

26 6. Για να μελετηθεί το φαινόμενο της επίδρασης του ph στην ταχύτητα των ενζυμικών δράσεων, θεωρείται ότι το ενεργό κέντρο του ενζύμου αποτελείται από μία βασική ομάδα - [CΟO] - και από μία όξινη -[ΝΗ 3 ] +. Έτσι η ενεργή μορφή του ενζύμου παρίσταται ως εξής: - OΟC NH 3 + E Οι ισορροπίες που λαμβάνουν χώρα με την προσθήκη οξέος ή βάσεως είναι οι ακόλουθες : ΗOΟC NH OΟC NH ΟOC NH 2 E E E Από τις τρεις ενεργές μορφές θεωρείται ότι μόνο η μεσαία είναι η ενεργή ενώ οι δύο ακραίες ανενεργές. Η άριστη τιμή του ph για την ενζυμική δράση θα είναι εκείνη για την οποία η συγκέντρωση της ενεργής μορφής γίνεται μέγιστη. Θεωρώντας ότι το σύστημα βρίσκεται ισορροπία και λαμβάνοντας υπόψιν τις βασικές παραδοχές της θεωρίας της ενζυμικής κινητικής, αποδείξτε τη σχέση μεταξύ της ταχύτητας της ενζυμικής δράσης και του ph που σας δόθηκε στην προηγούμενη παράγραφο. Σχηματικά ο μηχανισμός της ενζυμικής δράσης είναι ο ακόλουθος: H + + E - Ka K α = [E - ] [H + ] [EH] EH + S + H + K b k! k -1 EHS k 2 EH + P Κ b = [EH] [H + ] [EH 2 + ] EH

27 ΠΕΙΡΑΜΑ 8: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΧΑΡΤΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Πρόκειται για μια χρωματογραφική τεχνική για τον ποιοτικό προσδιορισμό των συστατικών ενός δείγματος. Στη συγκεκριμένη περίπτωση θα χρησιμοποιηθεί για τον ποιοτικό προσδιορισμό των συστατικών ενός μίγματος αμινοξέων. Το ρόλο της σταθερής φάσης παίζει η τρισδιάστατη δομή του χαρτιού (κυτταρίνη). Το δείγμα τοποθετείται υπό μορφή μικρών κηλίδων (spots) στη μια άκρη του χαρτιού. Η άκρη αυτή εμβαπτίζεται στη συνέχεια στο διαλύτη ο οποίος αρχίζει να "ανεβαίνει" μέσω τριχοειδών δυνάμεων, καλύπτοντας όλη την επιφάνεια του χαρτιού. Η κίνηση του διαλύτη παρασύρει και τα αμινοξέα του δείγματος τα οποία αρχίζουν να "μεταναστεύουν" προς τα επάνω. Η αλληλεπίδραση των αμινοξέων με τη σταθερή φάση έχει ως αποτέλεσμα το μήκος μετανάστευσης να διαφοροποιείται για το κάθε αμινοξύ, ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του (μοριακό βάρος, πολικότητα, κ.λ.π.) με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό των αμινοξέων του αρχικού δείγματος. Μετά το τέλος της έκλουσης (ο διαλύτης έχει διατρέξει ένα μεγάλο μέρος της επιφάνειας του χαρτιού) ακολουθεί ξήρανση του χαρτιού για την απομάκρυνση του διαλύτη και εμποτισμός του με διάλυμα νινιδρύνης. Η τελευταία ουσία αντιδρά με τα αμινοξέα δημιουργώντας ένα έγχρωμο προϊόν (συγκεκριμένο για το κάθε αμινοξύ) το οποίο και χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό της θέσης του κάθε αμινοξέος στο χαρτί. Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιείται με τον προσδιορισμό του συντελεστή μετανάστευσης, R f, ο οποίος ορίζεται από το λόγο: R H H όπου: Η spot, η απόσταση που έχει διανύσει το συγκεκριμένο αμινοξύ, και Η S, η απόσταση όπου έχει διανυθεί από το μέτωπο του διαλύτη. f spot S ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιούνται ειδικά φύλλα χαρτιού χρωματογραφίας διαστάσεων 18x22 cm. Σε απόσταση 1.5 cm από τη μια πλευρά (των 18 cm) του χαρτιού σημειώνουμε 7 σημεία σε απόσταση 2 cm μεταξύ τους. 2. Εφαρμόζουμε τα δείγματα των πέντε προτύπων διαλυμάτων αμινοξέων και των δύο αγνώστων επάνω στα επτά σημάδια με τη μορφή μικρών κηλίδων (1% υδατικά διαλύματα). 3. Προσθέτουμε το διαλύτη έκλουσης (n-βουτανόλη / οξικό οξύ / νερό, σε αναλογίες 12/3/5, ο/ο/ο) στο γυάλινο δοχείο χρωματογραφίας. 4. Τοποθετούμε το χαρτί χρωματογραφίας με τη μορφή κυλίνδρου στον πάτο του δοχείου χρωματογραφίας, με τη πλευρά των κηλίδων των δειγμάτων προς τα κάτω. 5. Κλείνουμε το δοχείο και αφήνουμε το χαρτί μέσα σε αυτό για 45 περίπου λεπτά. 24

28 6. Βγάζουμε το χαρτί από το δοχείο, σημειώνουμε με ένα μολύβι την απόσταση όπου έχει ανέλθει ο διαλύτης, και αφήνουμε το χαρτί να στεγνώσει. 7. Ανοίγουμε τον κύλινδρο, απλώνουμε επάνω το διάλυμα νινυδρίνης (5 %, β/ο σε ακετόνη) και τοποθετούμε τον κύλινδρο στο φούρνο για 5 λεπτά, έτσι ώστε να χρωματιστούν τα αμινοξέα. 8. Σημαδεύουμε το κέντρο της κάθε κηλίδας που έχει εμφανιστεί, και μετράμε την απόστασή του από την άκρη του χαρτιού. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Για κάθε ένα από τα δείγματα των πρότυπων διαλυμάτων αμινοξέων προσδιορίστε το χρώμα και το συντελεστή R f των αμινοξέων που έχουν εμφανιστεί. 2. Με βάση τα παραπάνω προσδιορίστε την ποιοτική σύσταση των δύο αγνώστων δειγμάτων αμινοξέων. 3. Για τη συγκεκριμένη τεχνική που εφαρμόστηκε, ποια αμινοξέα (πολικά ή μη πολικά) εμφανίζουν θεωρητικά το μεγαλύτερο συντελεστή R f και γιατί; 4. Πώς θα επηρεαστεί ο συντελεστής R f των αμινοξέων που συμβολίζονται με L και D, αντίστοιχα, στο συγκεκριμένο σύστημα εάν αυξηθεί α) το ποσοστό του νερού και β) το ποσοστό της n-βουτανόλης στο μίγμα του διαλύτη έκλουσης; 5. Μπορεί η αντίδραση των αμινοξέων με τη νινυδρίνη να αξιοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεϊνης που περιέχεται σε κάποιο δείγμα; ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Gacesa, P. & Hubble, J. (1987). Enzyme Technology, Open University Press - Milton Keynes/ Taylor & Francis. 2. Segel, L.H. (1975). Enzyme Kinetics, John Wiley & Sons, New York. 3. Fundamentals of Biotechnology (1987), Prave P., Faust, U., Sitting, W., Sukatsch D.A. eds, VCH Publishers. 4. E.Stahl & M. Ashworth (1988). Thin Layer Chromatography: a laboratory handbook, 2 nd edition, Springer-Verlag, Berlin. 5. E. Hahn-Deinstrop (2000). Applied Thin-Layer Chromatography Best Practice and Avoidance of Mistakes, WileyVCH Publishers. 6. J. Colligan, B. Dunn, D. Speicher, D. Wingfield (2003). Current Protocols in Protein Science John Wiley & Sons Inc, Seattle, Washington 25

29 4 η Εργαστηριακή ημέρα ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Ο σκοπός της παρούσας εργαστηριακής άσκησης είναι η μελέτη της κινητικής της ενζυμικής δράσης μέσω του προσδιορισμού των κινητικών σταθερών του ενζύμου ινβερτάση. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η γενική εξίσωση της δράσης ελευθέρων ενζύμων (υπό διαλυτή μορφή) γράφεται ως εξής : όπου οι κύριες υποθέσεις είναι: 1. Υπάρχει μόνο ένα S. 2. Το Ε είναι απαλλαγμένο από κάθε άλλη μορφή δραστικότητας. 3. Η διάσπαση του ΕS οδηγεί στο σχηματισμό του προϊόντος χωρίς τη δυνατότητα επανασχηματισμού του ΕS, γεγονός που εξασφαλίζεται όταν [Ρ] [S]. Με άλλα λόγια, η ταχύτητα της αντίδρασης εξετάζεται στο αρχικό της στάδιο. 4. [Ε] [S], οπότε και [ΕS] [S]. Ο σχηματισμός του ΕS δεν αλλοιώνει σημαντικά τη συγκέντρωση του υποστρώματος S. Αυτό σημαίνει ότι το ενδιαφέρον επικεντρώνεται στις χαμηλές συγκεντρώσεις του ενζύμου. 5. ΥΠΟΘΕΣΗ Briggs- Haldane: Η ταχύτητα σχηματισμού του ΕS ισούται με την ταχύτητα εξαφάνισής του, δηλαδή η συγκέντρωση [ΕS] παραμένει σταθερή. ή όπου : k 1 [S][E] =k 2 [ES] +k -1 [ES] = (k 2 + k -1 )[ES] E k k k ES S K k k K m k m ES S (1) Η K m ονομάζεται σταθερά Michaelis-Menten Από το ισοζύγιο του ενζύμου θέτοντας [Ε Τ ] την ολική (αρχική) συγκέντρωση του ενζύμου, σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή της δράσης του Ε θα ισχύει : [Ε Τ ] =[Ε] +[ΕS] 26

30 και λόγω της (1): Λύνοντας ως προς [ES]: 1 E ES K ES ES K m m T S S ES ET K m S S Σύμφωνα με την υπόθεση (3), η ταχύτητα σχηματισμού του προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης είναι δυνατόν να υπολογιστεί από τη σχέση: (2) dp v k ES dt 2 (3) και αντικαθιστώντας στην (3) την τιμή του [ES] από τη (2) : S k2 ET S v K m Το γινόμενο k 2 [E T ] αντιπροσωπεύει, σύμφωνα με την (3), τη μέγιστη τιμή που μπορεί να πάρει η v, όταν όλο το ένζυμο Ε μετατραπεί σε ES οπότε [E T ]=[ES] max δηλαδή: (4) v max = k 2 [E T ] (5) Ο συνδυασμός των (4) και (5) οδηγεί στην εξίσωση Michaelis-Menten : vmaxs v (6) Km S όπου : v : ταχύτητα παραγωγής προϊόντων ανά ml ενζύμου (μmoles/sec/ml) v max : μέγιστη ταχύτητα (μmoles/sec/ml) [S] : συγκέντρωση υποστρώματος (μmoles /ml) : σταθερά Michaelis-Menten (μmoles /ml) K m Η σταθερά Michaelis-Menten ισούται αριθμητικά με εκείνη τη συγκέντρωση υποστρώματος, στην οποία η ενζυμική ταχύτητα είναι ίση με το μισό της μέγιστης ταχύτητας v max. H τιμή της σταθεράς K m είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του ενζύμου. Για τις ενζυμικές δράσεις που υπακούουν στην κινητική Michaelis - Menten, η συνάρτηση της ταχύτητας της δράσης με τη συγκέντρωση του υποστρώματος S έχει, σύμφωνα με τη σχέση (6), την ακόλουθη μορφή. 27

31 v max Vo v =v max /2 S 1/2 = K Μ [ S ] Σχήμα 4.1. Διάγραμμα Michaelis - Menten Από το Σχήμα 4.1 παρατηρείται ότι σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης αυξάνει γραμμικά με τη συγκέντρωση του τελευταίου. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις υποστρώματος η ταχύτητα τείνει στην τιμή v max. Από το διάγραμμα v, S είναι δύσκολος ο υπολογισμός των v max και K m, αν όμως αντιστρέψουμε τη σχέση (1) παίρνουμε εξίσωση της μορφής y=ax+b η οποία είναι: 1 Km 1 1 v v max [ S] v max (7) Με τη βοήθεια της εξίσωσης (7) κατασκευάζεται διάγραμμα με συντεταγμένες 1/ v ως προς 1/ S, γνωστό ως διάγραμμα Lineweaver - Burk (Σχήμα 4.2) από το οποίο είναι δυνατό να υπολογιστούν οι σταθερές. 1/v 10 5 Κλίσηç = K M / v max /v max 5-1/K M 1/[S] Σχήμα 4.2. Διάγραμμα Lineweaver - Burk Στην περίπτωση υψηλών συγκεντρώσεων υποστρώματος είναι δυνατό να εμφανιστεί παρεμπόδιση της ενζυμικής δράσης από το υπόστρωμα, η οποία εκφράζεται με μια επιπρόσθετη αντίδραση της μορφής: K I ES S ESS όπου K I, η σταθερά ισορροπίας της παραπάνω δράσης, δηλαδή: 28

32 ES S K I [ ][ ] [ ESS] (8) Στην παραπάνω αντίδραση υποθέτουμε πως το υπόστρωμα είναι δυνατό να προσδεθεί στο ενεργό σύμπλοκο ES, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός ανενεργού συμπλόκου της μορφής ESS. Ακολουθώντας τις ίδιες παραδοχές με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή της εξίσωσης (6) και λαμβάνοντας υπ όψιν την παραπάνω σταθερά ισορροπίας, Κ Ι, η εξίσωση Michaelis - Menten μετασχηματίζεται στην: K m max[ S] 1 2 [ S] [ ] K S I (9) η οποία μας δίνει την ταχύτητα της ενζυμικής δράσης στην περίπτωση όπου εμφανίζεται το φαινόμενο της παρεμπόδισης από το υπόστρωμα. ΠΕΙΡΑΜΑ 9: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΣΤΑΘΕΡΩΝ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΙΝΒΕΡΤΑΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Χρησιμοποιείται διάλυμα 500 g/l σακχαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα με ph 4.5. Χρησιμοποιώντας το ίδιο ρυθμιστικό πραγματοποιούνται αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος έτσι ώστε να προκύψουν διαλύματα με τελικές συγκεντρώσεις σακχαρόζης 2, 5, 10, 30, 50, 100, 300 και 500 g/l. 2. Σε δοκιμαστικούς σωλήνες, προστίθενται 4.5 ml από το κάθε διάλυμα (δυο δοκιμαστικοί σωλήνες για την κάθε συγκέντρωση). Όλοι οι σωλήνες μαζί με δύο επιπλέον οι οποίοι περιέχουν 4.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος τοποθετούνται σε παγόλουτρο. 3. Σε όλους τους σωλήνες (ενώ βρίσκονται ακόμα στον πάγο) προστίθενται από 0.5 ml διαλύματος ινβερτάσης. 4. Ακολουθεί επώαση των δειγμάτων για 15 min σε λουτρό θερμοκρασίας 50 ο C. Μετά τα 15 min όλοι οι σωλήνες επανατοποθετούνται στο παγόλουτρο. 5. Λαμβάνεται 0.5 ml από τον κάθε σωλήνα και ακολουθεί προσδιορισμός των συνολικών αναγωγικών σακχάρων με την εφαρμογή της μεθόδου του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS) (βλέπε Πείραμα 2, 1ης Εργαστηριακής ημέρας ή Παράρτημα) ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 29

33 1. Υπολογίστε την ποσότητα ισομοριακού διαλύματος γλυκόζης - φρουκτόζης που έχει παραχθεί σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Υπολογίστε την ποσότητα σακχαρόζης που έχει υδρολυθεί στον όγκο αντίδρασης για κάθε μια αρχική συγκέντρωση υποστρώματος [S], (μέσος όρος μεταξύ των δυο δειγμάτων της κάθε συγκέντρωσης). 2. Από τα παραπάνω αποτελέσματα υπολογίστε την ταχύτητα της αντίδρασης V, (μmole σακχαρόζης που υδρολύθηκαν / min / ml αντιδρώντος μίγματος) σε κάθε τιμή της αρχικής συγκέντρωσης υποστρώματος. Kατασκευάστε το διάγραμμα της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης ως συνάρτηση της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος. 3. Από το γράφημα προσδιορίστε σε ποιες αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος εμφανίζεται παρεμπόδιση της ενζυμικής αντίδρασης από το υπόστρωμα? 4. Λαμβάνοντας υπ όψιν μόνο τα κατάλληλα πειραματικά σημεία προσδιορίστε την Κ m για την ινβερτάση. 5. Χρησιμοποιώντας το σύνολο των πειραματικών σας σημείων προσδιορίστε την σταθερά ισορροπίας Κ Ι. 6. Αποδείξτε την τροποποιημένη σχέση Michaelis-Menten για την περίπτωση της παρεμπόδισης από το υπόστρωμα (εξίσωση 9). 7. Στην περίπτωση ενζύμων που δε δέχονται παρεμπόδιση από το υπόστρωμα, σε ποιο εύρος αρχικών συγκεντρώσεων υποστρώματος πρέπει να έχουν πραγματοποιηθεί οι πειραματικές μετρήσεις για τον προσδιορισμό της Κ m έτσι ώστε να θεωρούνται αξιόπιστα τα αποτελέσματα; 8. Ποιο θα είναι το αποτέλεσμα στην τιμή των κινητικών σταθερών (V max, Κ m ) αν διπλασιαστεί η συγκέντρωση του χρησιμοποιούμενου ενζύμου; 9. Γιατί είναι σημαντικό να γνωρίζει κανείς την τιμή των κινητικών σταθερών (V max, Κ m ) ενός ενζύμου; 10. Ποιες άλλες γραφικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των κινητικών σταθερών (V max, Κ m ) ενός ενζύμου; 30

34 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Στην άσκηση αυτή, θα αναγνωριστούν με οπτικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου τα μορφολογικά χαρακτηριστικά από διαφορετικούς μικροοργανισμούς, όπως ζύμες (όπως Saccharomyces cerevisiae), νηματωειδείς μυκήτες (όπως Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa), βασιδιομυκήτες (όπως Pleurotus sp.), βακτήρια (όπως Escherichia coli) και μικροφύκη (όπως Tetraselmis marinae). ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Για την παρατήρηση μικροοργανισμών χρησιμοποιείται μία ποικιλία από οπτικά μικροσκόπια, όπως φωτεινού πεδίου (bright-field), σκοτεινού πεδίου (dark-field), αντίθεσης φάσεων (phase-contrast) και φθορισμού (fluorescence). Τα οπτικά μικροσκόπια εκμεταλλεύονται το ορατό φωτός για την ανίχνευση μικρών αντικειμένων και είναι ίσως τα πιο γνωστά και συχνότερα χρησιμοποιούμενα εργαλεία στις βιολογικές επιστήμες. Στο μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου το φως μέσω ενός κατόπτρου στοχεύεται προς το δείγμα από την κάτω πλευρά της αντικειμενοφόρου πλάκας, περνάει από έναν αντικειμενοφόρο (μεγεθυντικό) φακό και καταλήγει στον οφθαλμό μέσω ενός δεύτερου μεγεθυντικού φακού, του προσοφθάλμιου. Η μεγέθυνση της εικόνας που επιτυγχάνεται κάθε φορά υπολογίζεται από το γινόμενο της μεγέθυνσης του αντικειμενοφόρου φακού (συνήθως είναι αναγράφεται πάνω στον φακό, π.χ. 10x, 40x ή 100x) επί την μεγέθυνση του προσοφθάλμιου (συνήθως 10x). Χρήσιμες συμβουλές για παρατήρηση στο μικροσκόπιο : Πάντα αρχίζουμε την παρατήρηση του αντικειμένου με τον φακό με την μικρότερη μεγέθυνση (π.χ. 10x) Αφού εστιάσουμε στο δείγμα μας και εφόσον χρειάζεται, αυξάνουμε την μεγέθυνση τοποθετώντας φακό μεγαλύτερης μεγεθυντικής ικανότητας (π.χ. 40x). Χρησιμοποιούμε μόνο τον μικρομετρικό κοχλία για την εστίαση σε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις. Για να ελαττώσουμε την καταπόνηση των ματιών, κρατάμε και τα δύο μάτια ανοιχτά όταν παρατηρούμε στο μικροσκόπιο. Επίσης, κοιτάμε λίγο πιο ψηλά από το επίπεδο των προσοφθάλμιων φακών για να μειώσουμε την παρεμβολή των βλεφαρίδων στο οπτικό πεδίο. 31

35 ΠΕΙΡΑΜΑ 10: ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Λαμβάνεται μια σταγόνα καλλιέργειας από κάθε μικροοργανισμό και τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Το δείγμα καλύπτεται με καλυπτρίδα και τοποθετείται στο μικροσκόπιο. 3. Εστιάζεται το δείγμα αρχικά στη μεγέθυνση 10x και εφόσον χρειάζεται σε μεγαλύτερη (40x). 4. Παρατηρούνται και καταγράφονται τα χαρακτηριστικά του κάθε μικροοργανισμόυ. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Να σχεδιάσετε τα μορφολογικά χαρακτηριστικά σύμφωνα με το παρακάτω πρότυπο για κάθε μικροοργανισμό που παρατηρήσατε. Μικροοργανισμός : Μεγέθυνση : Μικροοργανισμός : Μεγέθυνση : Μικροοργανισμός : Μεγέθυνση : Μικροοργανισμός : Μεγέθυνση : 32