ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ 5S rrna ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΥ ESCHERICHIA COLI

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ 5S rrna ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΥ ESCHERICHIA COLI"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Π.Μ.Σ στις ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ 5S rrna ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΥ ESCHERICHIA COLI ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Χ. ΚΟΥΒΕΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2008

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Π.Μ.Σ στις ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ 5S rrna ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΥ ESCHERICHIA COLI ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Χ. ΚΟΥΒΕΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Π.Μ.Σ στις ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΟΥ 5S rrna ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΥ ESCHERICHIA COLI ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Χ. ΚΟΥΒΕΛΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ

4 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Δημήτριος Λ. Καλπαξής Διονύσιος Δραΐνας Γεώργιος Ντίνος Διονύσιος Συνετός Χριστόδουλος Φλωρδέλλης Ζαρκάδης Ιωάννης Βύνιος Δημήτριος Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Επίκουρος Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Αναπληρωτής Καθηγητής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Βιοχημείας Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 3

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών: «Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Μετά την ολοκλήρωσή της θέλω να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που συνέβαλαν, ο καθένας με το δικό του τρόπο, στην προσπάθειας αυτή: Το «δάσκαλο», συνεργάτη και φίλο Καθηγητή Δημήτριο Καλπαξή, ο οποίος με την καθοδήγηση, υπομονή και βοήθειά του συντέλεσε ώστε να περατωθεί αυτή η διατριβή με τον καλύτερο δυνατό τρόπο. Τον ευχαριστώ για τις πολύτιμες συμβουλές του, τη μεταφορά του τρόπου σκέψης του και τη μύησή μου στο χώρο της έρευνας. Ακόμα, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για την πολύτιμη ηθική συμπαράσταση για ζητήματα εντός και εκτός εργαστηρίου καθώς και για το κλίμα συνεργασίας που επικρατεί στο εργαστήριο. Τον Επίκουρο Καθηγητή Γιώργο Ντίνο για τη συνεργασία, τις πολύτιμες καθημερινές συμβουλές του, την κατανόηση και την υποστήριξη του όλα αυτά τα χρόνια. Τον Καθηγητή Διονύσιο Δραΐνα για την υποστήριξή του κατά την πορεία της διατριβής μου καθώς και για τη δημιουργία νέου κλίματος στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Διονύσιο Συνετό για τις χρήσιμες παρεμβάσεις του, την άψογη συνεργασία, την υποστήριξη και την κατανόηση καθόλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Τον Καθηγητή Φαρμακολογίας Χριστόδουλο Φλωρδέλλη για την υποστήρηξη του καθώς επίσης και για τις παρατηρήσεις και την θεώρηση της διατριβής μου από διαφορετικό πρίσμα. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Ιωάννη Ζαρκάδη για την βοήθεια, την υποστήρηξη αλλά και την προθυμία να συμμετάσχει στην Εξεταστική Επιτροπή. 4

6 Τον Καθηγητή Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας Δημήτριο Βύνιο για την τιμή που μου έκανε να συμμετάσχει στη Εξεταστική μου Επιτροπή και την ιδιαίτερη υποστήριξη του όλα αυτά τα χρόνια, καθώς τον αισθανόμουν πάντα δίπλα μου. Τα υπόλοιπα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας για το καλό κλίμα επικοινωνίας και συνεργασίας που έχει αναπτυχθεί. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας Νικολέττα Παπαγεωργακοπούλου που με καθοδήγησε προς αυτήν την πορεία και που το γραφείο της ήταν πάντα ανοιχτό όλα αυτά τα χρόνια. Την ερευνητική ομάδα του εργαστηρίου: Το διδάκτορα Αλέξανδρο Πετρόπουλο, για τη μύησή μου στις τεχνικές του εργαστηρίου, τη φιλία και συμπαράστασή του, και το άψογο κλίμα συνεργασίας, Την υποψήφια διδάκτορα Σοφία Πυθαροπούλου, για τη βοήθεια, συμπαράσταση και άψογη συνεργασία, και της οποίας εύχομαι καλή συνέχεια. Τους διδάκτορες, Θοδωρή Κωνσταντινίδη, Σμαράγδα Τσελίκα, Τάσο Βουρεκά, Δήμητρα Καλαβριζιώτη και Τάκη Καραχάλιο καθώς και τις υποψήφιες διδάκτορες Χρυσαυγή Τουμπέκη και Βίκυ Σταματοπούλου για τις πολλές ώρες που μοιραστήκαμε αρμονικά στο Εργαστήριο. Τον Γεώργιο Γερμπανά, για τη φιλία του, καθώς επίσης και τη βοήθεια και συνεργασία του σε αυτή τη διατριβή. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου και τον αδελφό μου Θανάση. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την αδερφή μου Αθανασία, τον σύζυγο της Νικόλαο, και τις ανιψούλες μου Ηλιάνα, Χαρούλα και Μαριάνθη, και τη φίλη μου Γεωργία Μπακαλάρου που ήταν δίπλα μου και με στήριξαν και σε αυτό το κομμάτι της ζωής μου! 5

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ.. 10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εισαγωγή Ριβόσωμα Γενικά χαρακτηριστικά ριβοσωμάτων Δομή ριβοσωματικών υπομονάδων Ριβοσωματικές πρωτείνες Κέντρο αποκωδικοποίησης Πεπτιδυλοτρανσφεράση (PTase): το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος Τούνελ εξόδου Γέφυρες διασύνδεσης των ριβοσωμικών υπομονάδων trnas Το 5S rrna Λειτουργία του ριβοσώματος-πρωτεινική σύνθεση Στάδιο έναρξης 34 Στάδιο επιμήκυνσης 36 Στάδιο τερματισμού Πολυαμίνες Βιολογική δράση των πολυαμινών Επίδραση στη δομή και λειτουργία του RNA Επίδραση στην πρωτεινική σύνθεση Επίδραση των πολυαμινών στη δράση των αντιβιοτικών Επίδραση των πολυαμινών στον κυτταρικό κύκλο και απόπτωση Στόχος Διατριβής ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5. Υλικά-Διαλύματα Υλικά Διαλύματα Ηλεκτροφόρησης και χρώσης Για λειτουργικές μελέτες και παρασκευές Για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους Διαλύματα αντιβιοτικών. 61 ΜΕΘΟΔΟΙ-ΤΕΧΝΙΚΕΣ 6.1 Αναλυτικές Μέθοδοι Φωτομέτρηση Προσδιορισμός συγκέντρωσης ριβοσωμάτων και νουκλεϊκών οξέων Συντελεστές μοριακής απόσβεσης για φωτομετρική ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων. 62 6

8 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πουρομυκίνης Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδος (Thin Layer Chromatography, T.L.C.) Παρασκευές Βιοχημικές παρασκευές ριβοσωματικών συστατικών Καλλιέργειες E.coli κυττάρων-σύστημα ελεύθερων κυττάρων (cell-free system) Παρασκευή κλάσματος S Παρασκευή κλάσματος S Παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων Παρασκευή κλάσματος FWR Διαχωρισμός και απομόνωση 70S ριβοσωματικών συμπλόκων Διαχωρισμός και απομόνωση 30S και 50S ριβοσωματικών υπομονάδων Απομόνωση μείγματος 23S και 5S ριβοσωματικού RNA Διαχωρισμός και απομόνωση 23S και 5S rrna Απομόνωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών της μεγάλης υπομονάδας (TP50) Παρασκευή Ac[ 3 H]Phe-tRNA Παρασκευή αζιδοβενζαμιδινο (ABA)-σπερμίνης- Φωτοσήμανση συγγενείας (Photo-affinity labeling) Σύνθεση της φωτοδραστικής αζιδοβενζαμιδινο (ABA)- σπερμίνης, (ABA)-[ 14 C] σπερμίνης Κινητικές μελέτες σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Φωτοσήμανση του 5S rrna Προσδιορισμός κινητικών σταθερών και αριθμού θέσεων σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Δομικές μελέτες Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting analysis) Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης τροποποιημένων νουκλεοτιδίων με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (Primer extension analysis) Ταυτοποίηση θέσεων σταυροσύνδεσης ΑΒΑ-σπερμίνης Παρασκευή δειγμάτων Φωτοσήμανση 50S ριβοσωμικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων Εκχύλιση του rrna Φωτοσήμανση ελεύθερου 5S rrna Προσδιορισμός θέσεων δέσμευσης ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Χημική Τροποποίηση του 5S rrna Εντοπισμός αλλαγών διαμόρφωσης στο ριβόσωμα

9 6.5. Λειτουργικές μελέτες Ανασυγκρότηση 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων (Reconstitution) Μέτρηση ανασυγκρότησης 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων Μέτρηση της ικανότητας πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στο ριβόσωμα (Binding) Ολική πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στα ανασυσταμένα 70S ριβοσώματα Πρόσδεση Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Α- θέση Πρόσδεση Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Ρ- θέση Αντίδραση πουρομυκίνης Πειραματική πορεία Κινητική ανάλυση και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων Μελέτη της μετατόπισης των υποστρωμάτων (translocation) Πρόσδεση EF-G στο ριβόσωμα GTP υδρόλυση Μελέτη αλλοστερικών σημάτων Αποτελέσματα Κινητική ανάλυση σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Αλλαγές διαμόρφωσης του 5S rrna μετά από φωτοσήμανση με ΑΒΑ-σπερμίνη: Έλεγχος δραστικότητας έναντι του αντιδραστηρίου DMS Επίδραση της φωτοσήμανσης στην ικανότητά του 5S rrna να συναρμολογείται σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες και 70S ριβοσώματα Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του AcPhe-tRNA σε poly(u)-προγραμματισμένα ριβοσώματα (Binding) Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στις καταλυτικές ιδιότητες του ριβοσώματος Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην μετατόπιση των υποστρωμάτων (Translocation) Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του EF-G στο ριβόσωμα Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση Μεταβολές στη διαμόρφωση του ριβοσώματος, επαγόμενες από διαμορφωτικές αλλαγές του 5S rrna Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση του παράγοντα επιμύκηνσης EF-G Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση υποστρώματος στις θέσεις Ρ- και Α- του ριβοσώματος

10 8. Συζήτηση-Συμπεράσματα Δομικές Μελέτες Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στη διαμόρφωση του 5S rrna Λειτουργικές Μελέτες Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην καταλυτική δράση του ριβοσώματος Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην αυθόρμητη, μη ενζυμική μετατόπιση υποστρωμάτων Επίδραση της αλλαγής της διαμόρφωσης του 5S rrna στην EF- G καταλυόμενη μετατόπιση Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και να ενεργοποιούν την EF-G εξαρτώμενη GTP υδρόλυση Επίδραση των διαμορφωτικών αλλαγών του 5S rrna στη δομή λειτουργικών περιοχών του ριβοσώματος Σύνοψη Διατριβής/ Synopsis of thesis Βιβλιογραφία Επιστημονικές εργασίες

11 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Ǻ Angstrom LB- Luria-Bertani- A 260 Οπτική απορρόφηση στα 260nm MgAc Οξεικό μαγνήσιο aa-trna Αμινοακυλο-tRNA mq milliq Η 2 Ο ABA- Αζιδο-βενζαμιδινο- NaAc Οξεικό νάτριο AcPhe- Ακετυλ-φαινυλαλανίνη NH 4 Ac Οξεικό αμμώνιο β-etsh Βήτα-μερκαπτοαιθανόλη o/n overnight BSA Αλβουμίνη ορού βοός PAA Πολυακρυλαμίδιο CMCT 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluene sulphonate PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης cpm counts per minute PDB Protein Data Bank Da dalton Phe Φαινυλαλανίνη dntp Δεόξυ-τριφωσφορικά νουκλεζίδια PI Προ-επώαση ddntp Δι-δεοξυ τριφωσφορικά νουκλεζίδια Poly(U) poly-uridine mrna DMS Διμεθυλ-θειϊκό PTάση Πεπτιδυλοτρανσφεράση E. coli Escherichia coli RNAp RNA πολυμεράση EFG Παράγοντας επιμήκυνσης G RNάση Ριβονουκλεάση EF-Ts Παράγοντας επιμήκυνσης Ts rpm rounds per minute EF-Tu Παράγοντας επιμήκυνσης Τu RRF Παράγοντας Ανακύκλωσης EtOH Αιθανόλη S Μονάδα Svedberg e.u. Ισοδυναμη μονάδα SD Αλληλουχία Shine-Dalgarno IF Παράγοντας έναρξης UV Υπεριώδης ακτινοβολία 10

12 11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

13 Εισαγωγή Το τελευταίο βήμα στην έκφραση της γενετικής πληροφορίας είναι η πρωτεϊνική σύνθεση, μια διαδικασία αρκετά πολύπλοκη, στην οποία τον πρωταρχικό ρόλο έχει το ριβόσωμα. Τα ριβοσώματα είναι μεγάλα ριβονουκλεο-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Από λειτουργικής άποψης, είναι πολυμεράσες που καταλύουν τον πολυμερισμό αμινοξέων σε πρωτεΐνες με βάση το γενετικό κώδικα. Δομικά, παρέχουν την πλατφόρμα πάνω στην οποία το mrna αποκωδικοποιείται και μεταφράζεται σε αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων με την βοήθεια των αμινοακυλο-trnas πρωτεΐνη. Μεταξύ διαφορετικών εξελικτικών ειδών, τα ριβοσώματα εμφανίζουν τόσο ομοιότητες ως προς την οργάνωση και την λειτουργία τους, όσο και διαφορές ως προς την δομή και το πλήθος των ριβοσωματικών συστατικών τους. Επιπλέον, η λειτουργία της μεταφραστικής μηχανής γίνεται πολυπλοκότερη όσο ανεβαίνουμε τις εξελικτικές βαθμίδες. Τα τελευταία χρόνια, ένα μεγάλο μέρος της ερευνητικής δραστηριότητας έχει επικεντρωθεί στη μελέτη της δομής του ριβοσώματος και στην κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας του. Από το 1980 μέχρι και σήμερα, και με την χρήση τεχνικών της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (διακριτική ικανότητα >7 Å) και κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ (διακριτική ικανότητα >2.4 Å) έχουν γίνει σημαντικά βήματα, όσον αφορά την ανάλυση της δομής του ριβοσώματος (Wilson and Nierhaus, 2003). Η ανάπτυξη άλλων τεχνικών, όπως η ανοσο-ηλεκτρονική μικροσκοπία (Scheinman et al, 1992), η σκέδαση νετρονίων (Capel et al, 1987, Walleczek et al, 1988), η σταυροσύνδεση (cross-linking) (Brimacombe et al, 1990) και η ανάλυση αποτυπώματος (footprinting) (Stern et al, 1988), επέτρεψε την πλήρη χαρτογράφηση του ριβοσώματος και την αποκάλυψη σχέσεων δομής και λειτουργίας. Στη συνέχεια, ακολουθεί περιγραφή της δομής και λειτουργίας του προκαρυωτικού ριβοσώματος και συγκεκριμένα του εντεροβακτηρίου Escherichia coli (E.coli). 12

14 1. Ριβόσωμα 1.1. Γενικά χαρακτηριστικά ριβοσωμάτων Το βακτηριακό ριβόσωμα έχει μοριακή μάζα MDa, διάμετρο Å και συντελεστή καταβύθισης 70S. Αποτελείται από δυο άνισες υπομονάδες, την μικρή, 30S, και την μεγάλη, 50S, ριβοσωματική υπομονάδα. Κάθε υπομονάδα είναι μια ριβονουκλεοπρωτείνη, το 1/3 της οποίας αποτελείται από πρωτεΐνη (r-proteins) και τα 2/3 από ριβοσωματικό RNA (r-rna) (Moore, 1988) Δομή ριβοσωματικών υπομονάδων Η 30S υπομονάδα του E.coli ριβοσώματος, μάζας 0.8 MDa, συγκροτείται από ένα είδος rrna, το 16S rrna (1456 νουκλεοτίδια), και 21 πρωτεΐνες (S1-S21). Περιέχει την περιοχή αποκωδικοποίησης του μηνύματος, όπου αλληλεπιδράσεις μεταξύ κωδικονίων του mrna και αντικωδικονίων των trnas προσδιορίζουν την σειρά με την οποία τα αμινοξέα θα συναρμολογηθούν σε πρωτεΐνη, εξασφαλίζοντας έτσι την πιστότητα της μετάφρασης (Wilson and Nierhaus, 2003). Μελέτες παρουσιάζουν την 30S υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος με ανθρωπόμορφη μορφή (Σχήμα 1.1α), όπου ξεχωρίζουν η κεφαλή, ο λαιμός, το σώμα, ο ώμος και η πλατφόρμα. Μελέτες χημικής προστασίας και εξελικτικής συντήρησης έχουν αποκαλύψει την δευτεροταγή δομή του 16S rrna (Gutell et al, 1994, Noller et al, 2005). Οι περιοχές της δευτεροταγούς δομής αντιστοιχούν σε διακριτές δομές της τριτοταγούς διάταξης, που είναι αυτόνομες δομικά. Το γεγονός αυτό επιτρέπει σχετική ανεξαρτησία κινήσεως των περιοχών αυτών κατά τη πρωτεϊνική σύνθεση. Στο Σχήμα 1.2. δίνεται η δομή του 16S rrna. Διακρίνονται τέσσερις περιοχές (domains), η 5, η κεντρική, η 3 μεγάλη και η 3 μικρή. Όπως επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφικές μελέτες, η δομή του 16S rrna περιέχει πάνω από 50 έλικες (Ramakrishnan, 2002), μεταξύ των οποίων παρεμβάλλονται μονές θηλιές (loops). Η 5 περιοχή περιέχει 19 έλικες και σχηματίζει το σώμα της 13

15 30S. Ξεκινά από το λαιμό, και αφού διατρέξει την μάζα του σώματος, επιστρέφει πίσω για να σχηματίσει τον ώμο. Η κεντρική περιοχή περιέχει 9 έλικες και σχηματίζει την πλατφόρμα. Η 3 μεγάλη περιοχή περιέχει 15 ελικοειδές δομές και σχηματίζει την κεφαλή, ενώ η 3 μικρή περιέχει 2 έλικες, και αφού διασχίσει το σώμα της 30S, επιστρέφει στο λαιμό καταλήγοντας σε ένα μονόκλωνο 3 άκρο. Αυτό το τμήμα περιέχει την αντι-shine-dalgarno αλληλουχία, απαραίτητη στην αλληλεπίδραση του mrna με την 30S υπομονάδα κατά το στάδιο της έναρξης της πρωτεΐνοσύνθεσης (Ban et al, 2000, Schluenzen et al, 2000). α) β) Σχήμα 1.1.: Τρισδιάστατη απεικόνιση του προκαρυωτικού ριβοσώματος. Διακρίνονται: α) η μικρή 30S υπομονάδα, head: κεφαλή, neck: λαιμός, body: σώμα, platform: πλατφόρμα, shoulder: ώμος, spur: σπιρούνι και β) η μεγάλη 50S υπομονάδα, L1: L1 προεξοχή, CP: κεντρική προεξοχή, L7/L12 stalk: L7/L12 στέλεχος (Laursen et al, 2005). Η 50S υπομονάδα, μάζας 1.5 MDa, καταλύει την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού και τον τερματισμό της πρωτεΐνη σύνθεσης. Ταυτόχρονα, προστατεύει την νεοσυντιθέμενη αλυσίδα από πρωτεολυτικές δράσεις και την κατευθύνει στο τούνελ εξόδου. Στο εντεροβακτήριο E.coli, αποτελείται από δυο είδη rrna, το 23S (2908 νουκλεοτίδια) και το 5S, (120 νουκλεοτίδια) καθώς και 33 πρωτεΐνες (L1-L33). Παρουσιάζει μια συμπαγή δομή, αποτελούμενη από μια σφαιρική βάση, με τρεις προεξοχές, γνωστές ως L1, 14

16 κεντρική προεξοχή, και L7/L12 στέλεχος (Σχήμα 1.1.β). Στη δευτεροταγή δομή διακρίνονται έξι μεγάλες περιοχές, I-VI, και μια έβδομη, η οποία συγκροτείται από το 5S rrna (Σχήμα 1.3.) (Yusupov et al, 2001). α) β) Σχήμα 1.2.: α) Δευτεροταγής και β) τριτοταγής δομή του 16S rrna με χρωστική αντιστοίχηση προς τη δευτεροταγή δομή (Yusupov et al, 2001). α) β) Σχήμα 1.3.: α) Δευτεροταγής και β) τριτοταγής δομή του 23S rrna με χρωστική αντιστοίχηση προς τη δευτεροταγή δομή (Yusupov et al, 2001). 15

17 1.3. Ριβοσωματικές πρωτεΐνες Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες δεσμεύονται συνήθως σε ειδικές εσοχές που σχηματίζει το rrna, διασυνδέοντας απομακρυσμένες περιοχές της πρωτοταγούς δομής του. Φαίνεται να απουσιάζουν από τη διφασική επιφάνεια των δυο υπομονάδων, και πιο συγκεκριμένα, από περιοχές όπου δεσμεύονται το mrna και τα trnas, καθώς και από την περιοχή όπου εδράζεται το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Οι περισσότερες πρωτεΐνες, και στις δυο υπομονάδες, χαρακτηρίζονται από σφαιρικές δομές, οι οποίες εντοπίζονται κυρίως στην περιφέρεια των υπομονάδων. Μερικές εξ αυτών εκτείνονται με μακριές ουρές (tails) που φτάνουν βαθιά μέσα στον πυρήνα της δομής αλληλεπιδρώντας με το rrna (Ramakrishnan, 2002). Σχήμα 1.4.: Θέσεις ριβοσωματικών πρωτεϊνών και λειτουργίες τους, στην μικρή 30S (A) και στην μεγάλη 50S (B) υπομονάδα (Nissen et al, 2005). Οι 21 πρωτεΐνες της 30S υπομονάδας συγκεντρώνονται κυρίως στην κεφαλή, τον ώμο και την πλατφόρμα. Σχεδόν οι μισές από αυτές έχουν 16

18 σφαιρικές περιοχές και μακριές ουρές. Οι τελευταίες είναι πλούσιες σε βασικά αμινοξέα και βοηθούν στην αναδίπλωση του rrna αλλά και την σταθεροποίηση της τρισδιάστατης δομής του. Η πρωτεΐνη S1, εντοπίζεται στην κυτταροπλασματική επιφάνεια της 30S, και μαζί με τις πρωτεΐνες S7 και S11 βοηθά στην δέσμευση του mrna. Οι S7 και S11 εμπλέκονται στην δέσμευση των trnas στην Ε θέση, ενώ οι S9 και S13 φέρουν ουρές που προσεγγίζουν την Ρ-θέση δέσμευσης των trnas (Σχήμα 1.4.). Οι πρωτεΐνες της 50S υπομονάδας συγκεντρώνονται κυρίως στην κυτταροπλασματική επιφάνεια. Οι L2 και L3, προεκτεινόμενες στο εσωτερικό της μάζας της 50S υπομονάδας σταθεροποιούν την τριτοταγή αναδίπλωση του 23S rrna, άκρως απαραίτητη για την σωστή εκδήλωση της καταλυτικής δράσης του ριβοσώματος, ενώ η L4 και η L22 συμβάλλουν στην αποκατάσταση της δομής και λειτουργίας του καναλιού εξόδου. Τέλος, η L5 και L16 εμπλέκονται στην δέσμευση των trnas στις θέσεις Ρ και Α αντίστοιχα (Σχήμα 1.4.) Κέντρο αποκωδικοποίησης Το κέντρο αποκωδικοποίησης βρίσκεται μεταξύ του άνω τμήματος του σώματος και της κεφαλής της 30S υπομονάδας. Αποτελείται κυρίως από RNA και συγκεκριμένα από τις έλικες h44, h18 και h34. Οι έλικες αυτές έρχονται σε επαφή με το σύμπλοκο κωδικονίου-αντικωδικονίου και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πιστότητα της αποκωδικοποίησης. Η πρωτεΐνη S12 εντοπίζεται κοντά στο κέντρο αποκωδικοποίησης και θεωρείται ότι συμμετέχει στην μεταφραστική πιστότητα (Σχήμα 1.5.). Κατά τη δέσμευση του αμινοακυλο-trna στην περιοχή αποκωδικοποίησης, οι αδενίνες Α1492 και Α1493 της έλικας 44, οι οποίες στην κενή 30S υπομονάδα προσανατολίζονται στο εσωτερικό της έλικας 44, εκτείνονται προς την έλικα κωδικονίου-αντικωδικονίου. Εκεί εμπλέκονται σε νουκλεοτιδικές αλληλεπιδράσεις του mrna και του trna στην πρώτη και δεύτερη θέση του κωδικονίου. Ταυτόχρονα, η G530 της έλικας 18, αλλάζει από 17

19 την syn στην anti διαμόρφωση, επιτρέποντας έτσι την επαφή στην δεύτερη και τρίτη θέση του συμπλόκου κωδικονίου-αντικωδικονίου (Ogle et al, 2001). α) β) Σχήμα 1.5.: Δομή του κέντρου αποκωδικοποίησης: α) Η 30S υπομονάδα, διακρίνονται οι έλικες h44, h18, h34 και η πρωτεΐνη S12. β) Αλλαγές δομής κατά την αποκωδικοποίηση (Ogle et al, 2001) Πεπτιδυλοτρανσφεράση (PTase): το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος Το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος δημιουργείται με τη συμμετοχή, πέντε ελίκων της περιοχής V του 23S rrna, των ελίκων 69 και 70 της περιοχής IV, και ενός μικρού τμήματος της περιοχής ΙΙ. Εντοπίζεται κάτω από την κεντρική προεξοχή της μεγάλης υπομονάδας (Lieberman and Dahlberg, 1995, Yusupov et al, 2001). Ο ακριβής μηχανισμός δράσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, όσο αφορά την κατάλυση της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού, δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Κρυσταλλογραφικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης αποτελείται αποκλειστικά από RNA, χαρακτηρίζοντας έτσι το ριβόσωμα ως ριβοένζυμο. Ιδιαίτερο, όμως, ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι προεκτάσεις των πρωτεϊνών L2, L3, L4 και L27 18

20 οι οποίες προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο της PTase σε μικρή απόσταση (Ban et al, 2000, Nissen et al, 2000, Maguire et al, 2005). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες, μαζί με το 23S, είναι τα ελάχιστα απαραίτητα δομικά συστατικά για την εκδήλωση της καταλυτικής δράσης της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης έχει επιτρέψει σε ορισμένους ερευνητές να υποστηρίζουν κατά καιρούς την άμεση ή έμμεση εμπλοκή των πρωτεϊνών στην καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος (Schulze and Nierhaus, 1982, Franceschi and Nierhaus, 1988, Nissen et al, 2000). Πρέπει, όμως, να τονιστεί ότι η υπόθεση που αποδέχεται το ριβόσωμα ως ριβοένζυμο, έχει υιοθετηθεί ευρύτερα από την επιστημονική κοινότητα. Σχήμα 1.6.: Α) Πρωτεΐνες που προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Β) Το καταλυτικό κέντρο χωρίς το rrna (Nissen et al, 2000) Τούνελ εξόδου Οι νεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται από το ριβόσωμα μέσω ενός τούνελ εξόδου (Σχήμα 1.7.) (Ban et al, 2000, Gabashvili et al, 2001, Wilson et al, 2002). Το τούνελ αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της μεγάλης υπομονάδας, και μέσω αυτού, η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Διασχίζει την 50S υπομονάδα ξεκινώντας από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, στο κάτω τμήμα της κεντρικής προεξοχής, και καταλήγει στη κυτταροπλασματική πλευρά, στη 19

21 βάση της μεγάλης υπομονάδας. Δημιουργεί ένα πόρο μήκους 100 Å και πλάτους Å, ο οποίος φιλοξενεί 30 έως 50 αμινοξέα της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Το τοίχωμά του αποτελείται από νουκλεοτίδια των περιοχών I -V του 23S rrna και από προεκτεινόμενες ουρές (tails) των A) B) Σχήμα 1.7.: Τομή της 50S υπομονάδας όπου διακρίνεται το τούνελ εξόδου Α) Πρόσθια όψη Β) Πλευρική όψη (Nissen et al, 2005). πρωτεϊνών L4 και L22. (Malhotra et al, 1998, Ban et al, 2000, Nissen et al, 2000, Schluenzen et al, 2000, Wimberly et al, 2000, Bashan et al, 2001). Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι πρόκειται για ένα σύνθετο σύστημα αγωγών με επιπλέον εξόδους από την αρχική (Frank et al, 1995a, Frank et al, 1995b, Malhotra et al, 1998, Gabashvili et al, 2001) Γέφυρες διασύνδεσης των ριβοσωμικών υπομονάδων Κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία και κρυσταλλογραφική ανάλυση των 70S ριβοσωμάτων αποκάλυψαν έναν αριθμό συντηρημένων διασυνδέσεων (γεφυρών), μεταξύ των δυο υπομονάδων (Σχήμα 1.8.) (Cate et al, 1999, Frank et al, 1995b, Gabashvili et al, 2000). Οι γέφυρες αυτές, 12 σε αριθμό, παίζουν σημαντικό ρόλο στη σωστή λειτουργική επικοινωνία των υπομονάδων μεταξύ τους, δηλ. στην συνεργασία μεταξύ των υπομονάδων για την διεκπεραίωση της μετατόπισης των υποστρωμάτων, καθώς και την μεταφορά 20

22 σημάτων μεταξύ του κέντρου αποκωδικοποίησης της μικρής υπομονάδας και του κέντρου της πεπτιδυλοτρανφεράσης της μεγάλης (Wilson & Nierhaus, 2003). Σχήμα 1.8.: Γέφυρες διασύνδεσης μεταξύ α) της μικρής και β) της μεγάλης υπομονάδας στο προκαρυωτικό ριβοσώμα (Wilson and Nierhaus, 2003) trnas Η μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη εξαρτάται από μόρια προσαρμογής που αναγνωρίζουν και συνδέονται τόσο με τα κωδικόνια όσο και με τα αμινοξέα. Αυτά τα μόρια είναι τα μεταφορικά RNAs (transfer RNA, trnas). Σχήμα 1.9.: Τριτοταγής δομή των trnas. Διακρίνονται χαρακτηριστικές περιοχές των trnas: το στέλεχος αντικωδικονίου (Anticodon Stem Loop, ASL), το στέλεχος υποδοχής του αμινοξέος (Acceptor stem), το στέλεχος D και το στέλεχος ΤψC. Οι περιοχές αυτές είναι απαραίτητες για την αναγνώριση και δέσμευση των trnas στο ριβόσωμα (Schafer et al, 2002). 21

23 Κάθε μόριο trna απαρτίζεται από περίπου 76 νουκλεοτίδια. Διπλώνεται σε μια τρισδιάστατη δομή σχηματίζοντας ζεύγη βάσεων ανάμεσα σε διαφορετικές περιοχές του με αποτέλεσμα να δημιουργούνται δίκλωνες περιοχές και θηλιές, που του αποδίδουν χαρακτηριστική δομή σχήματος L. Στα άκρα της δομής L εντοπίζονται δυο περιοχές αζευγάρωτων νουκλεοτιδίων. Η μια από αυτές σχηματίζει το αντικωδικόνιο, την ομάδα δηλαδή των τριών νουκλεοτιδίων που θα ζευγαρώσουν με τα νουκλεοτίδια του συμπληρωματικού κωδικονίου του mrna. Η άλλη, βρίσκεται στο 3 άκρο του μορίου με αλληλουχία βάσεων CCA, όπου δεσμεύεται το αμινοξύ ή η πεπτιδυλο-αλυσίδα. Το 3 άκρο του trna σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με βάσεις του 23S rrna, προκειμένου να εγκατασταθεί στην Α ή Ρ θέση του καταλυτικού κέντρου και να προσανατολίσει την πεπτιδυλο- και αμινοξική ομάδα καταλλήλως για την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Έχει βρεθεί πως τα CCA άκρα των Ρ και Α θέσεων trna δεσμεύονται και τοποθετούνται στις θέσεις αυτές αποκλειστικά από το 23S rrna (Nissen et al, 2000, Moore et al, 2003). Για παράδειγμα, τα C74 και C75 των πεπτιδυλο-trnas στην Ρ θέση δημιουργούν ζεύγη βάσεων με νουκλεοτίδια G2252 και G2251 της έλικας 80 της V περιοχής (Σχήμα 1.10.), ενώ και αντίστοιχα, τα αμινοακυλo CCA του trna της Α θέσης έχουν το C75 δεσμευμένο με το νουκλεοτίδιο G2553 της ακραίας θηλιάς της έλικας 92. Περαιτέρω σταθεροποίηση των trnas στις θέσεις αυτές γίνεται μέσω Α minor αλληλεπιδράσεων της Α76 βάσης. Υπάρχουν τρεις θέσεις στο ριβόσωμα, τις οποίες τα trnas μπορούν να καταλάβουν: 1) η θέση Α, στην οποία δεσμεύεται το νεοεισερχόμενο αμινοακυλο trna 2) η θέση Ρ, όπου δεσμεύεται το πεπτιδυλο-trna πριν τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, και 3) η θέση Ε, η οποία αποτελεί τη θέση εξόδου του αποακυλιωμένου ή αφόρτιστου trna. Κατά την μετάφραση, τα trnas κινούνται διαδοχικά σε κάθε μια από τις παραπάνω θέσεις. Ξεκινώντας από την Α περνούν στην Ρ και πριν φύγουν από το ριβόσωμα στην Ε. Εξαίρεση αποτελεί το εναρκτήριο trna, το οποίο δεσμεύεται απευθείας στη Ρ θέση. Βιοχημικές μελέτες και μελέτες κρυσταλλογραφίας και κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αποκάλυψαν την τοπογραφία των θέσεων 22

24 αυτών στο ριβόσωμα. Η θέση Α εντοπίζεται κοντά στο μίσχο L7/L12, η θέση Ρ στο διάκενο μεταξύ του λαιμού της μικρής υπομονάδας και της βάσης της κεντρικής προεξοχής της 50S υπομονάδας, ενώ η θέση Ε κοντά στην προεξοχή της L1 (Brimacombe et al, 1990, Agrawal et al, 1996, Schuwirth et al, 2005). Τα trnas αλληλεπιδρούν με το ριβόσωμα. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις όχι μόνο σταθεροποιούν το trna στις Α, Ρ και Ε θέσεις του καταλυτικού κέντρου, αλλά εμπλέκονται απευθείας σε λειτουργικές διαδικασίες, όπως η αποκωδικοποίηση, η διατήρηση του σωστού μεταφραστικού πλαισίου ανάγνωσης, η μετατόπιση των trnas μέσα στο ριβόσωμα, καθώς και η κατάλυση της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού. Α) Β) Σχήμα 1.10.: Αλληλεπιδράσεις του trna στη Ρ-θέση του ριβοσώματος. Α) Το trna της Ρ-θέσεως αλληλεπιδρά με ριβοσωμικές ουρές πρωτεϊνών (L27, L16, L5, S13 και S9), Β) Αλληλεπιδράσεις του P-tRNA στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Το CCA άκρο του P-tRNA αλληλεπιδρά με διατηρημένες βάσεις A2451, G2251 και G2252 του 23S RNA (Selmer et al, 2006). Στη 30S υπομονάδα, το trna της Ρ-θέσεως αλληλεπιδρά με το 16S rrna μέσω της μικρής αύλακας του στελέχους του αντικωδικονίου του. Οι αλληλεπιδράσεις γίνονται με τα νουκλεοτίδια , και Α790, καθώς και με τμήματα των πρωτεϊνών S13 και S9. Στην Α-θέση, το trna αλληλεπιδρά με τη θηλιά G530, την έλικα 34 και τις βάσεις Α1492 και Α

25 Στην Ε θέση η βάση Α76 του trna παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων G2421 και A2422 του 23S RNA και αλληλεπιδρά με τη διατηρημένη βάση C2394 (Σχήμα 1.11.). Σχήμα 1.11.: Α) Αλληλεπιδράσεις της Ε-θέσεως στο ριβόσωμα. Β) Η βάση Α76 του trna της Ε-θέσεως παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων G2421 A2422 του 23S RNA και αλληλεπιδρά με τη διατηρημένη βάση C2394 (Selmer et al, 2006). Το διάκενο μεταξύ του νουκλεοτιδίου Α790 και των νουκλεοτιδίων G1338 και Α1339 του 16S rrna έχει ιδιαίτερη σημασία για την μετατόπιση του trna από την Ρ- στην Ε-θέση, διότι ανάλογα με το εύρος του εμποδίζει ή διευκολύνει τη μετατόπιση (Σχήμα 1.12.) (Selmer et al, 2006). Σχήμα 1.12: Νουκλεοτίδια που λειτουργούν ως θύρα και εμποδίζουν τη μετατόπιση του trna από την Ρ- στην Ε-θέση. Στο σχηματισμό της θύρας συμμετέχουν οι βάσεις G1338, Α1339 και Α790 της μικρής υπομονάδας (Selmer et al, 2006). 24

26 1.9. Το 5S rrna Το 5S rrna αποτελεί συντηρημένο συστατικό της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας, πρακτικά σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Μοναδική εξαίρεση αποτελούν τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα ορισμένων μυκήτων, σπονδυλόζωων και πρωτίστων (Bogdanov et al, 1995, Dallas et al, 1995). I A II B III C V E IV Θηλιά D Σχήμα 1.13.: Δευτεροταγής δομή του 5S rrna Παρά τις εκτενείς μελέτες και το γεγονός ότι έχει προσδιοριστεί η τριτοταγής δομή του μορίου σε διάλυμα (Lorenz et al, 2000, Funari et al, 2000), η δομή απομονωμένων τμημάτων του (Betzel et al, 1994, Xiong and Sundaralingam 2000) και η δομή του ως συστατικού του ριβοσωματικού συμπλόκου (Ban et al, 2000, Harms et al, 2001, Spahn et al, 2001, Yusupov et al, 2001), ο ακριβής ρόλος του 5S rrna στην πρωτεϊνική σύνθεση παραμένει άγνωστος. Η σπουδαιότητα της παρουσίας του στην πρωτεϊνική 25

27 βιοσυνθετική μηχανή αποδείχτηκε με μελέτες καλλιεργειών E.coli κυττάρων, οι οποίες έδειξαν ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων μειώθηκε αισθητά με την απαλοιφή περισσότερων του ενός 5S rrna γονιδίων (Ammons et al, 1999). Βιοχημικές μελέτες έχουν προτείνει, ότι το 5S rrna λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και της περιοχής II του 23S rrna, υπεύθυνης για την μετατόπιση υποστρωμάτων (Bogdanov et al, 1995, Dokudovskaya et al, 1996), ενώ άλλες έχουν δείξει ότι αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για τη σταθερότητα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Khaitovich and Mankin, 1999). Σχήμα 1.14.: Σύνθεση του 5S rrna στα βακτήρια. Πριν την ενσωμάτωση στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα, το 5S rrna δημιουργεί σύμπλοκο με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες L18, L25 και L5 (Szymansk et al, 2003) Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του 5S rrna είναι υψηλά συντηρημένη στη φύση. Το μόριο αποτελείται από 120 νουκλεοτίδια και έχει μοριακή μάζα 26

28 40 kda. Στη δευτεροταγή του δομή, Σχήμα 1.13., διακρίνονται 5 έλικες (I-V) και 5 θηλιές, δυο ακραίες (C και D), δυο εσωτερικές (B και Ε) και μια κεντρική (θηλιά Α), από την οποία εκτείνονται οι έλικες I, II και V. Στους περισσότερους προκαρυωτικούς οργανισμούς, το mrna για το 5S rrna βρίσκεται στο ίδιο μετάγραφο με εκείνα των γονιδίων για το 16 και 23S rrna (Murdoch and Allison, 1996, Lu and Steitz, 2000). Το ώριμο 5S φαίνεται να είναι το αποτέλεσμα νουκλεολυτικής επεξεργασίας του κοινού μετάγραφου. Πριν αυτό ενσωματωθεί στα ριβοσώματα, δεσμεύεται με τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες L5, L18 και L25 (Σχήμα 1.14.). Σχήμα 1.15.: Τοποθέτηση του 5S rrna στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Το 5S rrna δεν αποτελεί δομικό τμήμα των κέντρων της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, αποκωδικοποίησης και δέσμευσης παραγόντων επιμήκυνσης, ούτε έρχεται σε επαφή με τα Ρ- και Α- δεσμευόμενα trnas. Όμως, η χωροταξική του τοποθέτηση στο ριβόσωμα παρέχει στο 5S rrna ρόλο επιτελικό στη ρύθμιση αυτών των κέντρων. 27

29 Αναλύσεις αποτυπώματος (footprinting analysis) έχουν δείξει, ότι ένα μεγάλο τμήμα του μορίου του 5S rrna εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες. Η πρωτεΐνη L5 προστατεύει ένα μεγάλο τμήμα της έλικας I από προσβολή από την α-σαρκίνη. Παρομοίως, η πρωτεΐνη L18 προστατεύει την έλικα II, μέρος της έλικας III και τις θηλιές B και C, ενώ η L25 προστατεύει την έλικα V, την θηλιά Ε και ένα μεγάλο τμήμα της έλικας IV (Wool, 1996). Το 5S rrna συμπλεκόμενο με τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες L5, L18 και L25, σχηματίζει την κεντρική προεξοχή της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας, (Σχήμα 1.15.). Σχήμα 1.16.: Αλληλεπιδράσεις που συνδέουν το 5S rrna με τις γέφυρες, το κέντρο αποκωδικοποίησης και τα Α-, Ρ-tRNAs (Dinman, 2005). Το άνω τμήμα της κεντρικής προεξοχής αποτελείται από τις έλικες Ι, ΙΙ, και ΙΙΙ του 5S rrna, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με τις θηλιές Α, Β, και C. Το 5S εγκλωβίζεται μεταξύ των ριβοσωματικών πρωτεϊνών L18 και L5, και της έλικας Η85 του 23S rrna. Μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη L5 σχηματίζει τη συντηρημένη γέφυρα B1b/c με τη πρωτεΐνη S13 της μικρής 28

30 υπομονάδας (Gabashvili, et al, 2000, Spahn CM. et al, 2001), (Σχήμα 1.16.). Ιδιαίτερη ρόλο φαίνεται να έχει η C-τελική ουρά της S13, η οποία βρίσκεται μεταξύ των βραχιόνων των αντικωδικονίων των Α και Ρ- trnas, σχηματίζοντας μονοπάτι σύνδεσης μεταξύ του 5S rrna και του κέντρου αποκωδικοποίησης της μικρής υπομονάδας (Stark et al, 2002, Tama et al, 2003). Οι γέφυρες διασύνδεσης των υπομονάδων αποτελούν μέρος του αλλοστερικού αγωγού μετάδοσης σημάτων μεταξύ του κέντρου αποκωδικοποίησης στη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα και των λειτουργικών κέντρων στη μεγάλη υπομονάδα. Στα βακτήρια (Gao et al, 2003) και τη ζύμη (Spahn et al, 2004), η γέφυρα B1b υφίσταται αναδιοργάνωση κατά τη δέσμευση του παράγοντα μετατόπισης στο ριβόσωμα, με αποτέλεσμα οι θέσεις επαφής μεταξύ της L5 και S13 να αλλάζουν κατά τη διαδικασία της μετατόπισης των υποστρωμάτων. Το τμήμα του 5S rrna που αποτελείται από τις έλικες IV, V, και τη θηλιά Ε, συνδέει το άνω τμήμα της κεντρικής προεξοχής με τη θηλιά D του 5S rrna. Η θηλιά D εμπλέκεται άμεσα στην οργάνωση της δομής της περιοχής II του 23S rrna, συνδέοντας το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης με το κέντρο δράσης της GTPασης. Το τμήμα αυτό του 5S rrna δημιουργεί επίσης μια διασύνδεση με την υψηλά συντηρημένη έλικα 38 του 23S rrna, η οποία σχηματίζει μια προεξοχή που εκτείνεται προς τη μικρή υπομονάδα. Στα βακτήρια, αυτή η προέκταση συμμετέχει στο σχηματισμό της γέφυρας B1a με τις πρωτεΐνες S13 (Gabashvili et al, 2000) και S19 (Gao et al, 2003). Όπως η B1b, έτσι και η γέφυρα B1a υφίσταται διαμορφωτικές αλλαγές και αποδιοργανώνεται πλήρως κατά τη δέσμευση του EFG (Gao et al, 2003). Μελέτες κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Stark et al, 1997, Agrawal et al, 1999b) και σταυροσύνδεσης (Osswald et al, 1995, Rinke-Appel et al, 1995) έχουν δείξει, ότι η γέφυρα B1a έρχεται σε επαφή με το trna που δεσμεύεται στην Α-θέση. Η αλληλεπίδραση αυτή συνδέει το 5S rrna με την Α-θέση του κέντρου αποκωδικοποίησης. 29

31 Το τμήμα του 5S rrna που απαρτίζεται από τη θηλιά D και την έλικα IV βρίσκεται κατά μήκος της διαδρομής που συνδέει το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και τη θέσης δέσμευση του παράγοντα επιμήκυνσης EF-G (Σχήμα 1.17.). Πειράματα σταυροσύνδεσης σε E.coli ριβοσώματα έδειξαν ότι οι έλικες II και III του 5S rrna βρίσκονται κοντά στις περιοχές II και V του 23S rrna (Osswald and Brimacombe, 1999). Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν θέσεις σταυροσύνδεσης μεταξύ των νουκλεοτιδίων Σχήμα 1.17.: Αλληλεπίδραση του 5S rrna με τις έλικες 38 και 89 (Dinman, 2005). της έλικας 38 και νουκλεοτιδίων της περιοχής , περιοχή που απαρτίζεται από τις έλικες Επιπλέον, μελέτες έδειξαν ότι το νουκλεοτίδιο U89 της D θηλιάς του 5S rrna σταυροσυνδέεται με νουκλεοτίδια των ελικών 39, 41 και 89 του 23S rrna. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η σταυροσύνδεση του U89 με τα νουκλεοτίδια U958, G1022, G1138 και C2475 τα οποία τοποθετούν τη θηλιά D του 5S rrna κοντά στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και την περιοχή της GTPασης (Sergiev et al, 1998). Η έλικα 89 εκτείνεται παράλληλα με την έλικα 91 και οι ακραίες θηλιές των δυο ελίκων συνδέονται μέσω ζευγών βάσεων. Η αντίθετη πλευρά της ακραίας θηλιάς της έλικας 91 αλληλεπιδρά με την περιοχή SRL (sarcin-ricin loop), τη δεύτερη θέση δέσμευσης παραγόντων επιμήκυνσης. Συμπληρωματικές πληροφορίες έχουν προέρθει και από εργασία των Dokudovskaya et al (1996). 30

32 Ταυτοποιήθηκαν δυο θέσεις σταυροσύνδεσης του U89, η μια στο κατάλοιπο Α960 της έλικας 39 (domain II), και η άλλη στο C2475 στην ακραία θηλιά της έλικας 89 (domain V). Οι θέσεις αυτές βρίσκονται αντίστοιχα κοντά στη περιοχή δέσμευσης του EF-G και το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και οδηγούν στην υπόθεση ότι το 5S rrna διασυνδέει τις λειτουργικές αυτές περιοχές της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην επικοινωνία μεταξύ του κέντρου της GTPασης και της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά την μετατόπιση. Τα παραπάνω επιβεβαιώθηκαν και με μελέτες σε μεταλλαγμένα στελέχη, οι οποίες δείχνουν ότι η έλικα IV/ θηλιά D του 5S rrna επηρεάζει τη λειτουργία της έλικας 42, η οποία συνδέεται με το κέντρο της GTPασης (Kiparisov et al, 2005). Η παρουσία του 5S rrna σε όλους τους οργανισμούς, και ο υψηλός βαθμός συντήρησης της δομής του οδηγεί στο συμπέρασμα ότι διαδραματίζει έναν ουσιαστικό ρόλο στο ριβόσωμα. Εντούτοις, παρά το γεγονός ότι η έλλειψη του 5S rrna κατά την in vitro ανασύσταση 50S E.coli ριβοσωματικών υπομονάδων επηρέασε αρκετές ριβοσωματικές λειτουργίες, ακόμα και οι πιο επηρεασμένες, όπως η δέσμευση του trna στην Α-θέση και η δράση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, παρέμειναν σε ανιχνεύσιμα επίπεδα (Erdmann et al, 1971, Dohme & Nierhaus 1976α). Μελέτες με ανασυσταμένες 50S υπομονάδες (E.coli), ελλιπείς σε 5S, έδειξαν ότι η λειτουργικότητα των 50S υπομονάδων δεν εξαφανίζεται τελείως, αφού 10% της δράσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης παραμένει (Silberklang et al, 1983), ενώ η έλλειψη του 5S μπορεί να αναπληρωθεί από αντιβιοτικά. Συγκεκριμένα η παρουσία μακρολιδίων, κετολιδίων και στρεπτογραμμινών κατά την ανασύσταση 50S υπομονάδων απουσία 5S rrna, αυξάνει κατά 30% την ΡΤase δραστικότητα της 50S υπομονάδας (Khaitovich and Mankin, 1999). 31

33 Σχήμα 1.18.: Μοντέλο περιγραφής αλλοστερικής μετάδοσης πληροφοριών, μέσω του 5S rrna, μεταξύ διαφόρων λειτουργικών κέντρων στο ριβόσωμα. Tο 5S rrna α) μεταδίδει πληροφορίες προς το κέντρο αποκωδικοποίησης στη μικρή υπομονάδα απευθείας μέσω της L5 και έμμεσα, μέσω της γέφυρας Β1b (κόκκινα βέλη), β) επηρεάζει τη διαμόρφωση της Ρ-θέσεως μέσω της έλικας 39 ή μέσω της πρωτεΐνης L5 (μπλε βέλη), γ) ρυθμίζει τη δομική και λειτουργική κατάσταση της Α-θέσεως μέσω της έλικας 38 και της γέφυρας Β1a (πράσινα βέλη), δ) ελέγχει τη λειτουργία μετατόπισης των υποστρωμάτων, (translocation) επηρεάζοντας τη διαμόρφωση του κέντρου της GTPάσης (GAC) που εδράζεται στις έλικες Η41/Η42 μέσω σημάτων που διατρέχουν την έλικα Η39 (μαύρα βέλη), καθώς και τη διαμόρφωση της SRL περιοχής μέσω της οδού 5S rrna H89 H91 SRL (ροζ βέλη) και ε) μεταδίδει μηνύματα προς το κέντρο της ΡΤάσης και συγκεκριμένα στη θηλιά Α των ελίκων Η89 και Η91 ή μέσω της SRL περιοχής με τη διαμεσολάβηση της πρωτεΐνης L3 (καφέ βέλη) (Dinman, 2005). 32

34 2. Λειτουργία του ριβοσώματος-πρωτεϊνική σύνθεση Η πρωτεϊνική σύνθεση, μια αρκετά πολύπλοκη διαδικασία, είναι από τις σπουδαιότερες λειτουργίες του κυττάρου. Η κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού κατέχει κεντρικό ρόλο στην πρωτεϊνική σύνθεση και πραγματοποιείται μέσω της ενζυμικής δραστικότητας των ριβοσωμάτων. Η μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη λαμβάνει χώρα στα ριβοσώματα με μεγάλη ταχύτητα. In vivo, το προκαρυωτικό ριβόσωμα ενσωματώνει αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο στην αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα, ενώ η ακρίβεια της διαδικασίας διατηρείται υψηλή, με ένα λάθος στα αμινοξέα που ενσωματώνονται (Bremer & Dennis, 1996). Οι πρωτεΐνες συντίθεται με κατεύθυνση από το αμινο- προς το καρβοξυ- τελικό άκρο, με την διαδοχική προσθήκη αμινοξέων στο καρβοξυάκρο της αναπτυσσόμενης αλυσίδας. Για τη διαδικασία απαιτούνται ενεργοποιημένα πρόδρομα μόρια, τα αμινοακυλο trnas, στα οποία η καρβοξυλομάδα ενός αμινοξέος εστεροποιείται με την 2 ή 3 υδροξυλομάδα της ακραίας αδενοσίνης του 3 CCA άκρου του trna. Η αντίδραση αμινοακυλίωσης των trnas απαιτεί ATP και καταλύεται από ειδικά ένζυμα, τις συνθετάσες των αμινοακυλο-trnas. Για κάθε ένα από τα 20 αμινοξέα υπάρχει η αντίστοιχη συνθετάση, η οποία αναγνωρίζει αφ ενός το αμινοξύ, και αφετέρου όλα τα trnas που αποκωδικοποιούν αυτό το αμινοξύ. Η πρωτεϊνική σύνθεση διακρίνεται σε τρία στάδια: το στάδιο έναρξης, το στάδιο επιμήκυνσης και το στάδιο τερματισμού. Συνοπτικά, κατά τη διάρκεια της έναρξης το mrna τοποθετείται με το AUG αρχικό κωδικόνιο στην Ρ-θέση της μικρής υπομονάδας, επί της οποίας προσδένεται το εναρκτήριο αμινοακυλο-trna (προεναρκτήριο σύμπλοκο). Επί του συμπλόκου αυτού προσδένεται στη συνέχεια η μεγάλη υπομονάδα, σχηματίζοντας το 70S εναρκτήριο σύμπλοκο. Κατά την επιμήκυνση το ριβόσωμα αποκωδικοποιεί τα διαδοχικά κωδικόνια του mrna, συνθέτοντας την πρωτεΐνη μέχρι τον τερματισμό αυτής. Ο τερματισμός σηματοδοτείτε, όταν ένα κωδικόνιο λήξης βρεθεί στην Α-θέση. Η λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης 33

35 ακολουθείται από απελευθέρωση του πολυ-πεπτιδίου και διαχωρισμό των υπομονάδων. Σε κάθε στάδιο εμπλέκονται οι αντίστοιχοι μεταφραστικοί παράγοντες της έναρξης (ΙFs, Initiation Factors), της επιμήκυνσης (EFs, Elongation Factors) και του τερματισμού ή της απελευθέρωσης (RFs, Release Factors). Στάδιο έναρξης Το στάδιο έναρξης, στους προκαρυωτικού οργανισμούς, ξεκινά με το σχηματισμό ενός προ-εναρκτήριου συμπλόκου που αποτελείται από την μικρή, 30S υπομονάδα, το εναρκτήριο trna (fmet-trna fmet ) και το mrna (30S υπομονάδα mrna fmet-trna fmet στην P-θέση). Τρεις παράγοντες έναρξης (IFs) εμπλέκονται στο στάδιο αυτό: i) ο παράγοντας IF1 (8 kda) που μιμείται τη θηλιά του αντικωδικονίου του trna και όπως έχει δειχθεί προσδένεται στην Α-θέση του ριβοσώματος (Dahlquist and Puglisi, 2000, Carter et al, 2001), ii) o IF2 (97 kda) που είναι μια G-πρωτεΐνη και βοηθάει την πρόσδεση του fmet-trna fmet στην Ρ-θέση του ριβοσώματος (Lockwood et al, 1971) και iii) ο IF3 (20 kda) που αλληλεπιδρά με την Ε-θέση της 30S υπομονάδας και ρυθμίζει τη σύζευξη των δυο υπομονάδων (Dallas and Noller, 2001). Οι παράγοντες IF1 και IF3 φαίνεται να διευκολύνουν την επιλεκτική δέσμευση του fmet-trna fmet στην Ρ-θέση, εμποδίζοντας την πρόσβαση στις γειτονικές Α- και Ε- θέσεις, ενώ η υδρόλυση του GTP που καταλύεται από τον IF2 και ενεργοποιείται από τον IF1 (πιθανόν με άμεση αλληλεπίδραση), συντελεί στην απελευθέρωση του IF2 και των άλλων δυο παραγόντων από το ριβόσωμα μετά την πρόσδεση της μεγάλης υπομονάδας (Luchin et al, 1999). Η σύνθεση λειτουργικών πολυπεπτιδίων απαιτεί την έναρξη στο σωστό κωδικόνιο του mrna. Η θέση αυτή επιλέγεται μέσω σχηματισμού ζευγών βάσεων τύπου Watson-Crick με την αλληλουχία anti-shine-dalgarno (anti- SD) του 16S rrna. Συγκεκριμένα, η πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία Shine- Dalgarno (SD) που προηγείται του AUG κωδικονίου, είναι συμπληρωματική της 16S rrna αντι-sd αλληλουχίας (περιοχή αποτελούμενη από τις βάσεις 34

36 του 16S rrna), πλησίον του 3 άκρου του και βοηθάει στην εύρεση του αρχικού AUG κωδικονίου (Gualerzi and Pon, 1990). Η δέσμευση του mrna στην 30S υπομονάδα διευκολύνεται από τον IF3. Αλληλεπίδραση του IF3 με το 3 άκρο του 16S rrna προκαλεί προβολή του άκρου έξω από την P- θέση ώστε να επιτραπεί η δέσμευση με την Shine-Dalgarno αλληλουχία του mrna (McCutcheon et al, 1999, Carter et al, 2001, Dallas and Noller, 2001). Η ελάχιστη απαίτηση, για σχεδόν όλους τους προκαρυωτικούς οργανισμούς, είναι ο σχηματισμός τουλάχιστον τριών ζευγών στην Shine-Dalgarno περιοχή, ενώ η βέλτιστη απόσταση μεταξύ της αλληλουχίας και του εναρκτήριου κωδικονίου είναι πέντε νουκλεοτίδια (Gren, 1984, Chen et al, 1994). Το mrna παραμένει ενωμένο με την αλληλουχία Shine-Dalgarno κατά το σχηματισμό του πρώτου πεπτιδικού δεσμού (Ηuttenhofer and Noller, 1994). Επίσης, εκτός από το 3 -άκρο του 16S rrna, στην πρόσδεση του mrna στο ριβόσωμα εμπλέκονται και οι πρωτεΐνες S1 και S21 (Gualerzi and Pon, 1990). Ο σχηματισμός του προ-εναρκτήριου συμπλόκου ολοκληρώνεται με την πρόσδεση του εναρκτήριου fmet-trna fmet στην 30S υπομονάδα και το σχηματισμό ζευγών βάσεων με το κωδικώνιο έναρξης AUG. Η πρόσδεση προάγεται από το σύμπλοκο IF2 GTP. O IF2 είναι ο μόνος από τους παράγοντες που αναγνωρίζει και δεσμεύει επιλεκτικά το εναρκτήριο fmettrna fmet. Κατά συνέπεια, όλες οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες ξεκινούν με μεθειονίνη. Όπως αναφέρθηκε πριν, ο IF2 έχει δράση GTPάσης. Η θέση δέσμευσης του fmet-trna fmet βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο του παράγοντα, ενώ οι θέσεις δέσμευσής του με το ριβόσωμα και το GTP εντοπίζονται στην κεντρική του περιοχή (Spurio et al, 2000). Ο σχηματισμός του εναρκτήριου συμπλόκου επιτυγχάνεται με την σύζευξη στο προ-εναρκτήριο σύμπλοκο της 50S υπομονάδας. Την δέσμευση της 50S ακολουθεί η υδρόλυση του GTP του IF2 και η απομάκρυνση των παραγόντων ενάρξεως από το ριβόσωμα. Μετά το σχηματισμό του 70S εναρκτήριου ριβοσωμικού συμπλόκου, το fmet-trna fmet βρίσκεται στην Ρ- θέση, ενώ η Α-θέση είναι κενή (Maitra et al, 1982, Severini et al, 1991). Το άκρο του αντικωδικονίου του εναρκτήριου trna βρίσκεται στη σχισμή της μικρής 35

37 υπομονάδας, μεταξύ κεφαλής και πλατφόρμας, ενώ το 3 CCA-άκρο του trna στην αρχή του τούνελ της 50S υπομονάδας, προς τη βάση της κεντρικής προεξοχής (Malhotra et al, 1998). Στάδιο επιμήκυνσης Το στάδιο επιμήκυνσης είναι από τα βασικότερα στάδια της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Nierhaus et al, 1998ab, Spahn and Nierhaus, 1998, Wilson and Noller, 1998b). Διακρίνονται τρεις βιοχημικές διεργασίες: i) η πρόσδεση του νεοεισερχόμενου αμινοακυλο-trna στην Α-θέση του ριβοσώματος, ii) ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού, και iii) η μετατόπιση των trnas. Στον κύκλο της επιμήκυνσης εμπλέκονται άμεσα τρεις παράγοντες επιμήκυνσης o EF-Tu, ο EF-Ts και o EF-G. i) Πρόσδεση του νεοεισερχόμενου αμινοακυλο-trna στην Α-θέση. H επιμήκυνση του νεοσυντιθέμενου πεπτιδίου ξεκινά, όταν ένα αμινοακυλοtrna (aa-trna), με τη μορφή του τριμερούς συμπλόκου aa-trna EF-Tu GTP, προσδεθεί στην Α-θέση. Στη θέση αυτή αλληλεπιδρά το αντικωδικόνιο του aa-trna με το αντίστοιχο κωδικόνιο του mrna. Η περιοχή αποκωδικοποίησης διαθέτει την ικανότητα να αναγνωρίζει στερεοχημικά τη μικρή αύλακα που σχηματίζεται από το ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ του κωδικονίου του mrna και του αντικωδικονίου του trna. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.4., η περιοχή αποκωδικοποίησης εντοπίζεται στην μικρή υπομονάδα και συγκροτείται από τις έλικες h44 και h34 και το βρόγχο 530 του 16S rrna (Cate et al, 1999, Yusupov et al, 2001). Με την πρόσδεση του mrna και του trna, οι βάσεις Α1492 και Α1493, της έλικας 44, στρέφονται προς την περιοχή αποκωδικοποίησης. Η βάση Α1493 αναγνωρίζει τη μικρή αύλακα του πρώτου ζευγαριού κωδικονίου-αντικωδικονίου. Ταυτόχρονα, σχηματίζονται δεσμοί υδρογόνου μεταξύ της Α1492 και της συντηρημένης C518, καθώς και της υψηλά συντηρημένης σερίνης 46 της S12 (E.coli). H τρίτη βάση του κωδικονίου σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με την G530, αφήνοντας την τρίτη θέση του αντικωδικονίου σχετικά ελεύθερη για wobble αλληλεπιδράσεις (Ogle et al, 2001). Η αρχική αυτή πρόσδεση του aa-trna 36

38 έχει σαν αποτέλεσμα την προσέγγιση της κεφαλής και του ώμου της μικρής κεφαλής και τη σταθεροποίηση της πρόσδεσης του trna. Αυτές οι μεταβολές επάγουν διαμορφωτικές αλλαγές στον EF-Tu, που με τη σειρά τους πυροδοτούν την υδρόλυση του GTP και την απελευθέρωση του παράγοντα. Η μεταφορά του σήματος γίνεται, είτε μέσω αλλαγής της διαμόρφωσης του aatrna, είτε μέσω διαδοχικών αλλαγών κατά μήκος της επιφάνειας επαφής των υπομονάδων (Valle et al, 2002). Μετά την απελευθέρωση του EF-Tu, το 3 - άκρο του aa-trna που φέρει το αμινοξύ περιστρέφεται γύρω από το στέλεχος του αντικωδικονίου και εισέρχεται στο καταλυτικό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Σε αυτό το σημείο, μετά την υδρόλυση του GTP αλλά πριν το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, γίνεται ο τελικός έλεγχος για την εγκατάσταση του aa-trna στην Α-θέση. Το στάδιο αυτό είναι βραδύ για τα συγγενή, και ταχύ για τα πλήρως συμπληρωματικά aa-trna. Η πιθανότητα να απορριφθεί ένα συγγενές aa-trna στο στάδιο αυτό είναι ιδιαίτερα αυξημένη (Ogle et al, 2001, Rodnina and Wintermeyer, 2001). Στο τέλος του σταδίου αποκωδικοποίησης το εναρκτήριο trna βρίσκεται στην Ρ- θέση και το aa-trna στην Α-θέση. Το σύμπλοκο EF-Tu GDP επανέρχεται στην ενεργό «GTP κατάσταση» με αντικατάσταση του GDP από GTP, η οποία καταλύεται από το σύμπλοκο EF-Ts GTP. ii) Σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού. Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού λαμβάνει χώρα στο ενεργό κέντρο του ριβοσώματος, το κέντρο της PTάσης, Σχήμα 2.1. Η α-αμινομάδα του προσδεδεμένου aa-trna στην Α-θέση, προσβάλλει την καρβονυλομάδα του εστερικού δεσμού που συνδέει τη νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα με το trna της P-θέσης. Το aa-trna της Α-θέση γίνεται πεπτιδυλο-trna επιμηκυμένο κατά ένα αμινοξύ, ενώ το πρώην πεπτιδυλο-trna στην P-θέση αποακυλιώνεται. Το κέντρο της PTάσης συγκροτείται από συντηρημένα νουκλεοτίδια (Α2451, U2506, U2585, C2452 και A2602) και τρία αμινοξέα της πρωτεΐνης L27. Αρχικές μελέτες είχαν υιοθετήσει την υπόθεση, ότι ο μηχανισμός κατάλυσης πιθανόν να βασίζεται στην ορθή εγκατάσταση των υποστρωμάτων (template position) ή/και στην οξεοβασική δράση ειδικών 37

39 ομάδων του 23S rrna και του trna. Το πιο πρόσφατο μοντέλο κατάλυσης του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού υποστηρίζει, ότι η βασική ομάδα που ενεργοποιεί την α-αμινοονάδα του aa-trna μέσω απόσπασης Η + είναι το A) B) Γ) Σχήμα 2.1.: Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού. (Α) Σχήμα αντίδρασης. Η α- αμινοομάδα του aa-trna (κίτρινο) προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του πεπτιδυλο-trna στην Ρ-θέση (πορτοκαλί) για την παραγωγή ενός νέου πεπτιδυλtrna στην Α-θέση επιμηκυσμένου κατά ένα αμινοξύ, ενώ στην Ρ-θέση απομένει το αποακυλιωμένο trna. (Β) Δομή ριβοσώματος με προσδεδεμένα τα trnas. (Γ) Μηχανισμός «συντονισμένης γέφυρας πρωτονίου»: Η προσβολή της α- αμινοομάδας στον εστερικό άνθρακα είναι αποτέλεσμα έξι μεταβατικών καταστάσεων, όπου η 2 - ΟΗ ομάδα της Α76 του υποστρώματος της Ρ- θέσης προσλαμβάνει ένα από τα αμινοπρωτόνια, το οποίο τελικά μεταφέρεται στο γειτονικό 3 οξυγόνο. Εναλλακτικά, μπορεί και το μόριο νερού (*) να χρησιμοποιηθεί στη γέφυρα υδρογόνου (Rodnina et al, 2007). (Μπλε: υπόστρωμα trna της Ρ-θέσης, κόκκινο: υπόστρωμα trna Α-θέσης, πράσινα: τα ριβοσωματικά κατάλοιπα που λαμβάνουν μέρος στη σταθεροποίηση της γέφυρας, γκρι: μόρια νερού που επιστρατεύονται και σταθεροποιούν το αναπτυσσόμενο φορτίο) 38

40 2 -ΟΗ της Α76 του πεπτιδυλο-trna. Η ομάδα αυτή με τη σειρά της αποδίδει το πρωτόνιο σε άλλες ομάδες, που είχαν ταυτοποιηθεί με προηγούμενες μελέτες ότι συμμετέχουν στη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού, όπως το 2 ΟΗ του νουκλεοτιδίου Α2451 και το εστεροποιημένο 3 ΟΗ του πεπτιδυλο-trna (Σχήμα 2.1.Γ) (Rodnina et al, 2007). iii) Μετατόπιση των trnas (translocation). Μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, ο παράγοντας EF-G, συμπλοκοποιημένος με GTP, δεσμεύεται στο ριβόσωμα πυροδοτώντας έτσι την μετατόπιση του πεπτίδυλοtrna από την Α- στην Ρ-θέση, την μετατόπιση του αποακυλιωμένου trna από την Ρ- στην Ε-θέση και τη μετακίνηση του mrna κατά ένα κωδικόνιο (10-15 Å). Κατά την μετατόπιση, το GTP υδρολύεται και ο παράγοντας EF-G απελευθερώνεται από το ριβόσωμα με τη μορφή EF-G GDP. Οι παράγοντες EF-Tu και EF-G προσδένονται σε αλληλεπικαλυπτόμενες θέσεις στη βάση του μίσχου L7/L12 (Agrawal et al, 2000, Frank and Agrawal, 2000, Stark et al, 2000), ενώ τμήμα του EF-G καλύπτει την Α-θέση, εμποδίζοντας την παλινδρόμηση του πεπτιδυλο-trna στη θέση αυτή κατά την μετατόπιση (Nierhaus, 1998ab). Η μετατόπιση καθιστά ικανό το επόμενο EF-Tu GTP aatrna σύμπλοκο να έχει πρόσβαση στο νέο κωδικόνιο που παρουσιάζεται στην Α- θέση. Έτσι, ο κύκλος της επιμήκυνσης συνεχίζεται. Μετατόπιση μπορεί να συμβεί in vitro και απουσία του παράγοντα, με βραδύτερο όμως ρυθμό (Nierhaus et al, 1992). Δυο μοντέλα έχουν προταθεί για την περιγραφή του κύκλου επιμύκηνσης: α) το μοντέλο των υβριδικών θέσεων και β) το «α-ε» αλλοστερικό μοντέλο. Το πρώτο μοντέλο βασίζεται σε δομικές μελέτες (Moazed and Noller, 1989b), και εισηγείται την κατάληψη από τα trnas, κατά την μετατόπισή τους, υβριδικών (Α/Ρ, Ρ/Ε) ή αμιγών θέσεων (Α/Α, Ρ/Ρ, Ε) (Σχήμα 2.2.). Η αρχική επιλογή του aa-trna γίνεται σε υβριδική θέση αναγνώρισης Α/Τ, όπου Τ η αρχική θέση πρόσδεσης του τριμερούς συμπλόκου EF-Tu GTP aa-trna στη μεγάλη υπομονάδα. Αμέσως μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, το 3 -άκρο του πεπτιδυλο-trna που είναι δεσμευμένο στη μεγάλη υπομονάδα μετατοπίζεται στην επόμενη θέση 39

41 δέσμευσης, ενώ η θέση του αντικωδικονίου στην μικρή υπομονάδα δεν αλλάζει. Ομοίως το 3 άκρο του αποακυλιωμένου trna μετακινείται από την Ρ- στην Ε-θέση. Με αυτόν τον τρόπο το πεπτιδυλο-trna τοποθετείται στην υβριδική θέση Α/Ρ, ενώ το αποακυλιωμένο trna τοποθετείται στην Ρ/Ε υβριδική θέση. Η υβριδική κατάσταση Α/Ρ-Ρ/Ε πυροδοτεί αλλαγές διαμόρφωσης στο ριβόσωμα και στο παράγοντα μετατόπισης, ενώ ταυτόχρονα το GTΡ υδρολύεται. Συνέπεια αυτών των αλλαγών είναι η μετατόπιση των αντικωδικονίων των trnas από την Α- στην Ρ-θέση και από την Ρ- στην Ε-θέση. Το τελευταίο στάδιο είναι το βραδύτερο στάδιο της μετατόπισης από κινητικής άποψης και οδηγεί στην κατάληψη των θέσεων Ε/Ε και Ρ/Ρ από το αποακυλιωμένο και το πεπτίδυλο-trna, αντίστοιχα. Σχήμα 2.2.: Το μοντέλο των υβριδικών θέσεων για τη μετατόπιση των υποστρωμάτων. Με Α/Ρ παρίσταται η πρόσδεση της περιοχής του αντικωδικονίου του trna στην Α-θέση της μικρής υπομονάδας, με ταυτόχρονη πρόσδεση του βραχίονα υποδοχής στην Ρ-θέση (Noller et al, 1989). 40

42 Σύμφωνα με το «α-ε» αλλοστερικό μοντέλο (Nierhaus, 1990, Nierhaus, 1996), τα trnas δεσμεύονται σε μια κινητή πλατφόρμα του ριβοσώματος, η οποία μετακινείται κατά τη μετατόπιση διατηρώντας τα δυο trnas στο ίδιο ριβοσωματικό περιβάλλον (Σχήμα 2.3.). Η κινητή πλατφόρμα περιλαμβάνει δυο περιοχές δέσμευσης, την «α» και την «ε». Όταν ένα trna καταλαμβάνει την «α» θέση μπορεί να βρίσκεται στην Α-θέση πριν τη μετατόπιση και στην Ρ-θέση μετά την μετατόπιση. Ομοίως, trna δεσμευμένο στην «ε» θέση μπορεί Σχήμα 2.3.: «α-ε» αλλοστερικό μοντέλο μετατόπισης (Nierhaus, 1996). να βρίσκεται στις Ρ και Ε θέσεις, πριν και μετά τη μετατόπιση αντίστοιχα. Με τον τρόπο αυτό η κίνηση των trnas γίνεται ταυτόχρονα και συντονισμένα και στις δυο υπομονάδες. Η λειτουργικότητα των Α και Ε θέσεων χαρακτηρίζεται από ετερότροπο αλλοστερισμό. Όταν δηλαδή η Α θέση είναι δεσμευμένη, η συγγένεια της Ε θέσης για το υπόστρωμα μειώνεται σημαντικά. Έτσι, όταν το aa-trna προσδένεται στην Α-θέση, το κινητό τμήμα «α-ε» 41

43 μετακινείται από τις Ρ-Ε στις Α-Ρ θέσεις. Παράλληλα η θέση Ε μένει κενή, χωρίς ικανότητα δέσμευσης. Σύμφωνα με το αλλοστερικό μοντέλο, η πρόσδεση του aa-trna στην Α-θέση διαιρείται σε δυο επιμέρους στάδια, αυτό της αποκωδικοποίησης και αυτό της εγκατάστασης του aa-trna στην Α-θέση. Όταν το κινητό τμήμα βρίσκεται στην Ρ-Ε θέση, η Α-θέση έχει χαμηλή συγγένεια, με αποτέλεσμα να περιορίζεται η αλληλεπίδραση ριβοσώματοςσυμπλόκου aa-trna EF-Tu GTP στην περιοχή κωδικονίου-αντικωδικονίου. Αφού το συμπληρωματικό trna εγκατασταθεί στην Α-θέση, η κινητή πλατφόρμα επιστρέφει από την Ρ-Ε στην Α-Ρ θέση. Μετά την μετατόπιση το ριβόσωμα είναι έτοιμο για τον επόμενο κύκλο επιμήκυνσης, με το αποακυλιωμένο trna στην Ε-θέση, το πεπτιδυλο-trna στην Ρ-θέση και την Α-θέση κενή και έτοιμη να δεχθεί το επόμενο σύμπλοκο aa-trna EF-Tu GTP. Αναφέρουμε εδώ ότι κινητικές και φασματοσκοπικές μελέτες υποστηρίζουν το υβριδικό μοντέλο (Sharma et al, 2004, Wen et al, 2008), ενώ βιοχημικές μελέτες (Rheinberger et al, 1981, Geigenmuller and Nierhaus, 1990) και μελέτες κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Frank and Agrawal, 2000, Polacek et al, 2000) συνηγορούν υπέρ του δεύτερου μοντέλου. Στάδιο τερματισμού Η προσθήκη αμινοξέων στη νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα περατώνεται, όταν εμφανιστεί κωδικόνιο λήξης στην Α-θέση του ριβοσώματος. Πρωτεϊνικοί παράγοντες απελευθέρωσης (RFs), εμπλέκονται στην απελευθέρωση της αλυσίδας από το ριβόσωμα και στην ανακύκλωση του ριβοσώματος για την επόμενη έναρξη. Η διαδικασία τερματισμού ξεκινά, όταν στην Α-θέση του ριβοσώματος εμφανίζεται κωδικόνιο λήξης (UAA, UAG ή UGA), το οποίο αναγνωρίζεται από τους παράγοντες απελευθέρωσης. Συγκεκριμένα, ο RF1 και ο RF2 αναγνωρίζουν τα κωδικόνια UAG και UGA, αντίστοιχα, ενώ και οι δυο αναγνωρίζουν το τρίτο κωδικόνιο τερματισμού UAA. Οι RF1 και RF2 παράγοντες, παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα στην πρωτοταγή δομή (Caskey et al, 1984, Weiss et al, 1984, Craigen et al, 1985), και 42

44 είναι υπεύθυνοι για την υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και του trna της Ρ- θέσης. Στην διαδικασία τερματισμού εμπλέκεται και τρίτος παράγοντας, ο RF3, του οποίου o κύριος ρόλος είναι να διαμεσολαβεί στην απομάκρυνση των παραγόντων RF1 και RF2. O RF3 GTP είναι υπεύθυνος για την απελευθέρωση των παραγόντων, ενώ η υδρόλυση του GTP αποδεσμεύει τον παράγοντα από το σύμπλοκο (Zavialov et al, 2001). Τέλος, οι παράγοντας ανακύκλωσης του ριβοσώματος RRF και ο EFG επιτυγχάνουν την απελευθέρωση του mrna, του αποακυλιωμένου trna και το διαχωρισμό του 70S ριβοσωματικού συμπλόκου στις υπομονάδες του (Hirashima and Kaji, 1970, Hirashima and Kaji, 1972, Kiel et al, 2003, Woodward et al, 1974). 3. Πολυαμίνες Οι πολυαμίνες είναι πολυκατιοντικές ενώσεις, χαμηλού μοριακού βάρους. Εμπλέκονται σε πλήθος βιολογικών διεργασιών, περιλαμβανομένης της σύνθεσης των DNA, RNA, και πρωτεϊνών, της κυτταρικής ανάπτυξης και της διαφοροποίησης (Stefanelli et al, 1999, Igarashi and Kashiwagi, 2000, Ray et al, 2000). Πουτρεσκίνη : H 3 N NH 3 Σπερμιδίνη: Σπερμίνη: H 3 N H 3 N N H2 NH 3 N H2 H 2 N NH 3 Σχήμα 3.1.: Δομή των πολυαμινών 43

45 Οι πολυαμίνες πουτρεσκίνη, σπερμιδίνη και σπερμίνη, Σχήμα 3.1., είναι βιογενή μόρια και απαντώνται ευρέως τόσο στους προκαρυωτικούς όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Cohen, 1998). Η συγκέντρωση τους στο κύτταρο ρυθμίζεται από την βιοσύνθεσή τους, την αποικοδόμηση αλλά και από την διαμεμβρανική μεταφορά. Στα προκαρυωτικά κύτταρα παρατηρούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις πουτρεσκίνης σε σχέση με την σπερμιδίνη και ελάχιστα ποσά σπερμίνης. Στα ευκαρυωτικά, η σπερμιδίνη και η σπερμίνη απαντώνται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από την πουτρεσκίνη. Στο εντεροβακτήριο E.coli, η συγκέντρωση της πουτρεσκίνης είναι 32.2 mm, της σπερμιδίνης 6.8 mm (Cohen, 1998) ενώ έχει βρεθεί και σπερμίνη σε ελάχιστες ποσότητες (Kamekura et al, 1987). Όσο αφορά την ενδοκυττάρια κατανομή της πουτρεσκίνης και σπερμιδίνης στο E.coli, 3.0 mm και 0.35 mm δεσμεύονται στο DNA, 15.4 mm και 6.17 mm στο RNA, 0.46 mm και 0.05 mm σε φωσφολιπίδια, 0.84 mm και 0.05 mm στο ATP, ενώ 12.5 mm και 0.26 mm αντίστοιχα απαντούν ελεύθερα (Igarashi & Kashiwagi, 2000) Βιολογική δράση των πολυαμινών Ο πολυβασικός χαρακτήρας στις πολυαμίνες προσδίδει ισχυρή συγγένεια προς όξινες ομάδες βιολογικών υποστρωμάτων σε σύγκριση με άλλα μονοσθενή ή δισθενή κατιόντα (Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+ ). Σε φυσιολογικές τιμές pη, οι αμινομάδες των πολυαμινών είναι θετικά φορτισμένες, με αποτέλεσμα οι τελευταίες να δρουν ως πολυκατιόντα, γεγονός που αποτελεί τη βάση της βιολογικής τους δράσης. Η αλληλεπίδρασή τους με ανιοντικά μόρια, όπως νουκλεικά οξέα ή δομές που τα εμπεριέχουν (ριβοσώματα, ιοι), ATP, φωσφολιπίδια και ανιοντικές πρωτεΐνες, έχει σαν αποτέλεσμα την εξουδετέρωση του αρνητικού φορτίου των τελευταίων με αποτέλεσμα την σταθεροποίηση και την προστασία τους από υδρολυτικές επιδράσεις, οξειδωτικές διεργασίες και ακτινοβολία (Tabor & Tabor, 1985, Cohen, 1998, Igarashi & Kashiwagi, 2000). 44

46 Ιδιαίτερης σημασίας είναι η επίδραση των πολυαμινών στο ριβόσωμα και, συνεπώς, στην πρωτεϊνική σύνθεση. Παρατηρήσεις ανοσοηλεκτρονικήςμικροσκοπίας έχουν εντοπίσει πολυαμίνες σε ελεύθερα ριβοσώματα ή σε ριβοσώματα προσδεδεμένα στο ενδοπλασματικό δίκτυο ευκαρυωτικών κυττάρων (Shin et al, 2006) (Σχήμα 3.2.). Μελέτες για την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσής τους στο ριβόσωμα, και ιδίως στο rrna με το οποίο αλληλεπιδρούν, αν και ξεκίνησαν πριν 35 χρόνια, (Stevens and Pascoe, 1972, Millon et al, 1980, Wower et al, 1981), δεν κατέληξαν σε θετικό αποτέλεσμα. Χρησιμοποιώντας μεθόδους σταυροσύνδεσης, οι Kakegawa et al. (1986b) ταυτοποίησαν τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες που επισημαίνονται από πολυαμίνες και κατέληξαν έμμεσα στο συμπέρασμα, ότι προσδένονται κυρίως γύρω από το καταλυτικό κέντρο. Παρά την αλματώδη ανάπτυξη της κρυσταλλογραφίας τα τελευταία χρόνια, οι ακριβείς θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο ριβόσωμα δεν έχουν ακόμα προσδιοριστεί. Δυο φαίνονται να είναι οι λόγοι: i) η σπερμίνη όπως και οι υπόλοιπες πολυαμίνες, είναι μικρά και ευέλικτα μόρια με αποτέλεσμα, με την πάροδο του χρόνου, να απομακρύνονται εύκολα από την περιοχή πρόσδεσης τους κατά την κρυστάλλωση και ii) δεν έχουν επιτευχθεί τόσο μεγάλης διακριτικότητας κρύσταλλοι, ώστε να επιτρέπουν την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσής τους. Μόνο κρυσταλλογραφικές μελέτες σε σύμπλοκα trna με σπερμίνη έχουν αναφερθεί ως τώρα (Cohen, 1998), ενώ NMR και άλλες τεχνικές έχουν περιορισθεί στην ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης μετάλλων ( Tanaka et al, 2002, Banatao et al, 2003). Πρόσφατα, χρήση φωτοδραστικών αναλόγων των πολυαμινών επέτρεψε την ομοιοπολική τους πρόσδεση σε ριβοσωματικά σύμπλοκα και την ταυτοποίηση αρχικά των ριβοσωματικών πρωτεϊνών που σημαίνονται (Amarantos et al, 2001) και στη συνέχεια των θέσεων πρόσδεσής τους στο trna (Amarantos and Kalpaxis, 2000), στο 16S (Amarantos et al, 2002) και στο 23S rrna (Xaplanteri et al, 2005) (Σχήμα 3.2.). Η τεχνική αυτή επέτρεψε επιπρόσθετα, τη μελέτη των διαμορφωτικών αλλαγών που επάγονται στο ριβόσωμα από τη σπερμίνη, καθώς και τη διαλεύκανση σε μοριακό επίπεδο 45

47 Α Β Γ PDB:1VOZ PDB: 1J5A Σχήμα 3.2.: (Α) Θέσεις πρόσδεσης σπερμίνης, όπως ανιχνεύτηκαν από ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Εστιάζοντας, φαίνεται μια έντονη ανοσοαντίδραση με τις πολυαμίνες σε ελεύθερα (πολυσώματα) και σε δεσμευμένα στο ενδοπλασματικό δίκτυο ριβοσώματα (κόκκινα βέλη). Στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια δεν ανιχνεύθηκαν πολυαμίνες (Shin et al., 2006). (Β) Θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών (ροζ) στο 16S του εναρκτήριου ριβοσωματικού συμπλόκου. Με πράσινο χρώμα σημειώνεται η έλικα h44 και με μπλε χρώμα η έλικα h27 (Amarantos et al, 2002). (Γ) Θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών (ροζ) στο 23S rrna. Με πράσινο χρώμα σημειώνεται η περιοχή του καταλυτικού κέντρου και με μπλε ανοιχτό η περιοχή πρόσδεσης μεταφραστικών παραγόντων (Xaplanteri et al, 2005). 46

48 της επίδρασης της σπερμίνης σε διάφορες ριβοσωματικές λειτουργίες, όπως στη σύζευξη των υπομονάδων, στην πρόσδεση των υποστρωμάτων στην Α- και την Ρ- θέση, στη μετατόπιση υποστρωματων και στη δραστικότητα της PΤάσης (Xaplanteri et al, 2005) Επίδραση στη δομή και λειτουργία του RNA Το γεγονός ότι τόσο στα ευκαρυωτικά, όσο και στα βακτηριακά κύτταρα, το μεγαλύτερο ποσοστό των πολυαμινών συναντάτε ως σύμπλοκο με το RNA, υποδεικνύει τη σπουδαιότητα της επίδρασης των πολυαμινών στη λειτουργία του RNA (Miyamoto et al, 1993, Igarashi & Kashiwagi, 2000). Μελέτες μέχρι σήμερα έχουν δείξει πως οι πολυαμίνες ενεργοποιούν τη σύνθεση του RNA in vivo (Young and Srinivasan, 1974, Miyamoto et al, 1993), δεσμεύονται στα ριβοένζυμα επηρεάζοντας τη δραστικότητά τους (Cohen et al, 1998), αλληλεπιδρούν με το mrna επηρεάζοντας τις μεταγραφικές του τροποποιήσεις και τη μεταφραστική του ικανότητα (Cohen et al, 1998) και διεγείρουν την σύνθεση των aa-trna (Takeda and Igarashi, 1969). Οι πολυαμίνες δεσμευόμενες επί των aa-trna σταθεροποιούν την τριτοταγή τους διαμόρφωση (Frydman et al, 1996) και επηρεάζουν το λειτουργικό τους ρόλο κατά τη μετάφραση (Amarantos & Kalpaxis, 2000). Τέλος, προσδενόμενες στο rrna (Amarantos et al, 2001, Amarantos et al, 2002, Xaplanteri et al, 2005), διεγείρουν τη συγκρότηση (assembly) των ριβοσωματικών υπομονάδων (Kakegawa et al, 1986b, Igarashi & Kashiwagi, 2000, Umekage and Ueda, 2006), αυξάνουν το σχηματισμό του 70S ριβοσωμικoύ συμπλόκου και βελτιώνουν τη σταθερότητα του (Stevens and Pascoe, 1972, Bernabeu et al, 1978, Tabor and Tabor, 1984, Kakegawa et al, 1986a, Kalpaxis and Drainas, 1992, Amarantos et al, 2001, Amarantos et al, 2002) Επίδραση στην πρωτεϊνική σύνθεση Η μελέτη του βιολογικού ρόλου των πολυαμινών στην πρωτεϊνική σύνθεση αποτελεί πεδίο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας. Μελέτες, in vivo και in vitro, 47

49 έχουν δείξει πως το ιοντικό περιβάλλον, και επομένως οι πολυαμίνες, είναι καθοριστικός παράγοντας από τον οποίο εξαρτάται η βέλτιστη ριβοσωματική ενεργότητα. Συγκεκριμένα, οι πολυαμίνες μειώνουν τη βέλτιστη συγκέντρωση Mg 2+ που απαιτείται για την πρωτεϊνική σύνθεση (Tabor & Tabor, 1976), δρώντας ως κατιονικοί ανταλλάκτες του Μg 2+ (Snyder and Edwards, 1991, Drainas and Kalpaxis, 1994). Από τις πιο δραστικές πολυαμίνες είναι η σπερμίνη, δεδομένου ότι απαιτείται δέκα φορές μικρότερη συγκέντρωσή της σε σχέση με τη σπερμιδίνη, προκειμένου να επιτευχθεί το ίδιο βιολογικό αποτέλεσμα (Teraoka & Tanaka, 1973, Igarashi et al, 1974, Kalpaxis & Drainas, 1992). Σήμερα, ο πειραματικός διαχωρισμός των σταδίων της πρωτεϊνικής σύνθεσης κατέστησε δυνατή την μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στα διάφορα στάδιά της. Έχει βρεθεί πως οι πολυαμίνες επιδρούν στο σχηματισμό των αμινοακυλο-trnas. Παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων ιόντων Μg 2+, ενεργοποιούν τη συνολική αντίδραση σύνθεσης των αμινοακυλο-trnas. Συγκεκριμένα, η δράση τους δεν εστιάζεται στη συνθετάση των αμινοακυλοtrnas, αλλά στη δέσμευσή τους στο trna, όπου μεταβάλλοντας τη διαμόρφωσή του βελτιώνουν την πρόσδεση στο ένζυμο (Cohen, 1998). Η πρόσδεση των πολυαμινών, και συγκεκριμένα της σπερμίνης και σπερμιδίνης στο trna, βελτιώνει την ικανότητα των τελευταίων να δεσμεύονται στο ριβόσωμα, ιδιαίτερα σε χαμηλές συγκεντρώσεις Mg 2+. Η πρόσδεση αυτή έχει βρεθεί ότι εξαρτάται από την κατάλληλη διαμόρφωση των aa-trnas, (Naranda and Kucan, 1989), γεγονός που συμφωνεί με μελέτες που υποστηρίζουν ότι οι πολυαμίνες επιδρούν στη διαμόρφωση του trna (Holbrook et al, 1978, Quigley et al, 1978, Frydman et al, 1996, Amarantos & Kalpaxis, 2000). Κατά συνέπεια, οι πολυαμίνες επηρεάζουν τόσο το στάδιο έναρξης, όσο και το στάδιο επιμήκυνσης της βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών Στο στάδιο έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης των ευκαρυωτικών οργανισμών, οι πολυαμίνες εμπλέκονται και έμμεσα, παρεμβαίνοντας στη σύνθεση της υπουσίνης, ενός τροποποιημένου αμινοξέος της αλυσίδας του παράγοντα έναρξης eif5a, απαραίτητου για τη δραστικότητα του παράγοντα (Gerner et al, 1986). 48

50 Στο στάδιο της επιμήκυνσης, η επίδραση των πολυαμινών είναι ποιοτική και ποσοτική. Όταν σε in vitro σύστημα προστέθηκαν πολυαμίνες, τα πολυπεπτίδια που συντέθηκαν σε απόκριση ενός mrna, ήταν μεγαλύτερα και προσομοίαζαν τα in vivo προϊόντα, η δε σύνθεσή τους πραγματοποιήθηκε με εντονότερο ρυθμό (Hunter et al, 1977). Η ερμηνεία που αποδόθηκε είναι πως, παρουσία πολυαμινών, η κίνηση των ριβοσωμάτων κατά μήκος του mrna διευκολύνεται, επειδή οι πολυαμίνες συμβάλλουν στην προσπέλαση εμποδίων με αλλαγή της δευτεροταγούς δομής του mrna ή της διαμόρφωση των trnas (Abraham & Pihl, 1980). Επίσης, έχει βρεθεί πως οι πολυαμίνες επηρεάζουν άμεσα τη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Kalpaxis & Drainas, 1993, Drainas & Kalpaxis, 1994). Μελέτες συσχέτισης δομής/λειτουργίας αποκάλυψαν ότι ιδιαίτερη σημασία στην επίδραση των πολυαμινών στην καταλυτική δραστικότητα των ριβοσωμάτων έχει το φορτίο τους και η κατανομή του στην αλειφατική αλυσίδα, καθώς και η ικανότητα περιστροφής των αμινομάδων των πολυαμινών (Snyder and Edwards, 1991, Karahalios et al, 1998a, Karahalios et al, 1999). Τέλος, θετική είναι η επίδραση των πολυαμινών στη μετατόπιση των υποστρωμάτων (translocation), παρουσία ή απουσία του παράγοντα EFG (Xaplanteri et al, 2005). Είναι χαρακτηριστικό, ότι η βέλτιστη in vitro συγκέντρωση του EF-G ελαττώνεται παρουσία σπερμίνης. Πιθανή είναι επίσης η εμπλοκή των πολυαμινών στο στάδιο του τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης. Έχει βρεθεί ότι απουσία τους, τα πολυπεπτίδια που συντίθενται είναι μικρότερα σε μήκος, γεγονός που προσδίδει στις πολυαμίνες σημαντικό ρόλο στο σωστό διάβασμα των κωδικονίων τερματισμού (Weiss et al, 1984). Τέλος, οι πολυαμίνες αυξάνουν την πιστότητα της μετάφρασης, αφού συμβάλλουν στην εξειδίκευση της αλληλεπίδρασης κωδικονίου/αντικωδικονίου (Abraham et al, 1979, Jelenc and Kurland, 1979, Bartetzko and Nierhaus, 1988). Η δράση τους έγκειται κυρίως στη διόρθωση λαθών της πρώτης ή τρίτης θέσης του κωδικονίου (Igarashi et al, 1982, Ito & Igarashi, 1986). Εδώ πρέπει να τονιστεί, πως οι πολυαμίνες βελτιώνουν την πιστότητα της μετάφρασης με την προϋπόθεση ότι οι συγκεντρώσεις των ιόντων Μg 2+ και η θερμοκρασία είναι χαμηλές, διαφορετικά η επίδρασή τους αμφισβητείται (Weiss et al, 1973, Amarantos et al, 2002). 49

51 3.4. Επίδραση των πολυαμινών στη δράση των αντιβιοτικών Οι πολυαμίνες παρεμβαίνουν στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αντιβιοτικών και ριβοσώματος. Παρ' ότι η διερεύνηση του ρόλου των μονοσθενών και δισθενών κατιόντων έχει προσλάβει ευρείες διαστάσεις (Weiss and Morris 1973, Draper, 1995, Polacek and Barta, 1998), αντίστοιχες μελέτες διαλεύκανσης του ρόλου των πολυαμινών στο μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών έχουν πραγματοποιηθεί σε περιορισμένη έκταση (Teraoka and Tanaka, 1973a, Dionne et al, 1975, Goldemberg and Algranati, 1981a, Nastri and Algranati, 1988abc, Nastri et al, 1993, Balasundaram et al, 1999). Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας διερεύνησαν με κινητικές μεθόδους την επίδραση των πολυαμινών σε ορισμένες κατηγορίες αντιβιοτικών. Μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες διεγείρουν την πρόσδεση της χλωραμφαινικόλης στο ριβόσωμα (Xaplanteri et al, 2003), ευνοούν την ανασταλτική δράση της κλινδαμυκίνης και της βλαστισιδίνης (Kouvela et al, 2006), ενώ αντίθετα, επηρεάζουν αρνητικά την δράση της σπιραμυκίνης και των μακρολιδίων τυλοσίνης και ερυθρομυκίνης (Petropoulos et al, 2004, Petropoulos et al, 2008). Τα αποτελέσματα βρίσκονται σε συμφωνία με παλαιότερες μελέτες που έχουν δείξει, ότι προεπώαση των ριβοσωμάτων με σπερμίνη προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση του ριβοσώματος που περιορίζουν την ικανότητά του να προσδένει ερυθρομυκίνη (Teraoka and Tanaka, 1973b) Επίδραση των πολυαμινών στον κυτταρικό κύκλο και απόπτωση Μελέτες έχουν δείξει ότι ραγδαίως αναπτυσσόμενα κύτταρα παρουσιάζουν υψηλές συγκεντρώσεις πολυαμινών και αυξημένη ενεργότητα ως προς την αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης, ένζυμου απαραίτητου κατά την βιοσύνθεση των πολυαμινών, γεγονός που δείχνει το σημαντικό ρόλο που έχουν οι πολυαμίνες στην αναπαραγωγή του κυττάρου (Scheinmam et al, 1992). Τα επίπεδα των πολυαμινών μεταβάλλονται στη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Έχει βρεθεί ότι η ταχύτητα σύνθεσης αυτών φτάνει στο μέγιστο όταν τα κύτταρα αρχίζουν να συνθέτουν DNA και πριν από την 50

52 κυτταρική διαίρεση, ενώ φτάνουν περίπου στο μισό μετά τη μίτωση (Walleczek et al, 1988). Μελέτες εμπλέκουν τις πολυαμίνες στη διαδικασία της απόπτωσης, κατά την οποία παρατηρούνται μεταβολές στην συγκέντρωση των πολυαμινών και στην ενεργότητα βασικών ενζύμων που εμπλέκονται σε αυτή. Ο ρόλος τους στην απόπτωση είναι δύσκολο να καθοριστεί με ακρίβεια, καθώς φαίνεται ότι εμπλέκονται και στην επαγωγή της απόπτωσης αλλά και στην προστασία των κυττάρων από αυτή (Brunton et al, 1991, Mitchell et al, 1992, Piacentini et al, 1991). Ο προστατευτικός ρόλος των πολυαμινών έχει αιτιολογηθεί μέσω της ικανότητάς τους να σταθεροποιούν τα νουκλεινικά οξέα και τις μεμβράνες, δρώντας κατά του οξειδωτικού stress (Schipper et al, 2000, Hughes et al, 2003). 51

53 4. Στόχος διατριβής Το 5S rrna αποτελεί ζωτικό συστατικό του ριβοσώματος, πρακτικά σε όλους τους οργανισμούς. Από την ανακάλυψή του, έχει αποτελέσει αντικείμενο εντατικών μελετών, με διάφορες μεθόδους. Παρά τις εκτενείς μελέτες, ο ακριβής ρόλος του στην πρωτεινική βιοσυνθετική μηχανή παραμένει άγνωστος. Η χωροθέτηση του εντός του ριβοσώματος είναι τέτοια, ώστε να συνδέει όλα τα λειτουργικά κέντρα και πιστεύεται ότι ενεργοποιεί την πρωτεινική σύνθεση με το να σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και να λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών. Καθοριστικός παράγοντας για τη βέλτιστη ριβοσωματική λειτουργία αποτελεί το ιοντικό περιβάλλον και συγκεκριμένα μονοσθενή και δισθενή ιόντα και πολυκατιόντα όπως οι πολυαμίνες. Οι τελευταίες, προσδενόμενες στα ριβοσωματικά συστατικά, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματκή διαμόρφωση και εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος, επηρεάζοντας σχεδόν όλα τα στάδια της πρωτεινικής σύνθεσης. Σκοπός της προκείμενης εργασίας αποτελεί η διαλεύκανση, σε μοριακό επίπεδο, της βιολογικής δράσης των πολυαμινών και συγκεκριμένα της σπερμίνης, στη δομή του 5S rrna. Παράλληλα, στόχος της παρούσας εργασίας είναι διερευνηθεί ο ρόλος του 5S rrna στην πρωτεινική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Μεταβάλλοντας εκλεκτικά τη διαμόρφωση του μορίου, και στη συνέχεια, σχετίζοντας τις προκύπτουσες διαμορφωτικές αλλαγές με μεταβολές στις ριβοσωματικές λειτουργίες, είναι δυνατόν να αντληθούν σημαντικές πληροφορίες για το ρόλο που έχει το 5S rrna στη συγκρότηση του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και στη μετάδοση σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου, των θέσεων πρόσδεσης των πρωτεινοσυνθετικών υποστρωμάτων και των ριβοσωματικών συστατικών που διεκπεραιώνουν τη μετατόπιση. Η επίτευξη των παραπάνω στόχων συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της δομής και λειτουργίας όχι μόνο του 5S rrna ως 52

54 ριβοσωματικού συστατικού, αλλά και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου. 53

55 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 54

56 5. Υλικά Διαλύματα 5.1. ΥΛΙΚΑ Τα ονόματα δίνονται όπως αναφέρονται στους καταλόγους των εταιρειών: Αντιβιοτικά Puromycin dihydrochloride από Sigma-Aldrich, USA Thiostrepton από Sigma-Aldrich, USA Χημικές ουσίες και αντιδραστήρια Αlumina (Al 2 O 3 ) από Merck, GE CMCT από Fluca Biochemicals, USA DMS από Sigma-Aldrich, USA EDTA από Sigma-Aldrich, USA Κethoxal από MP Biomedicals, FR KOH από Merck, GE NaOH από Merck, GE NH 4 Cl από Merck, GE Opti-fluor από PerkinElmer, USA POPOP από Sigma-Aldrich, USA PPO από Sigma-Aldrich, USA Phenol (solution) for RNA από Sigma-Aldrich,USA Spermine από Sigma-Aldrich, USA TEMED από Gibco-BRL, USA Τρις (υδροξυμεθυλ)-αμινομεθάνιο ((CH 3 O) 3 CNH 2 ) από Merck, GE HCl από Merck, GE β-mercaptoethanol (b-etsh) από Fluka (CH 3 COO) 2 Mg από Fluka Biochemicals, USA MgCl 2 από Riedel-de Haen, GE Σπερμιδίνη τριυδροχλωρική, από Sigma-Aldrich Φίλτρα-Μεμβράνες-Στήλες Φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης HA, μέγεθος πόρων 0.45 μm από Millipore, USA Dialysis Tubing Cellulose Membrane (33x21mm) από Sigma-Aldrich, USA Paper Filters 3MM από Whatman, UK QIAGEN R RNA/DNA, Bioanalytica S.A. Sephadex G50 από Pharmacia, USA TLC Silica gel 60F 254 από Merck, GE 55

57 Στελέχη E. coli κυττάρων Η προμήθεια E. coli K12 έγινε από τον Prof. K.H. Nierhaus, Max-Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin, GE Θρεπτικά Υλικά Agar από Difco BD, USA Yeast Extract από SERVA, GE Peptone from meat SERVA, GE Bacto-tryptone από Difco BD, USA Βιοχημικές Ουσίες AMV Reverse Transcriptase από Roche, GE rrna S (E.coli) από Roche, USA Poly(U) από Sigma-Aldrich, USA Loading Buffer 2x for RNA from Fermentas, GE Loading Buffer 6x for DNA from Fermentas, GE RNAse H από Promega RNA Τ4 λιγάση από Promega Acetyl-phosphate από Sigma- Aldrich, USA ATP από Sigma-Aldrich, USA BSA (RNase free) από Pharmacia, USA DNase I from Roche, GE GTP από Sigma-Aldrich, USA dntps από Boehringer Mannheim, GE ddntps από Boehringer Mannheim, GE Phenylalanine από Sigma-Aldrich, USA trna bulk (E.coli) από Sigma- Aldrich, USA Ραδιενεργές Oυσίες [2,6-3 H] Phenylalanine (5 mci/5 ml, 55Ci/mmol) από Moravek Biochemicals, USA [ 14 C]-Spermine (4.22 GBq/mmol, 114 mci/mmol) από Amersham [a- 32 P] datp (10MBq, 111TBq/mmol) από Izotop, HU [a- 32 P] dgtp (10MBq, 400Ci/mmol από Izotop, HU) [ 32 P]pCp 3,5 -διφωσφορική-[5-32 P] κυτιδίνη (250 μci/25μl, 3000 Ci/mmol) από Izotop trna phe (E.coli) από Sigma-Aldrich, USA 56

58 Υλικά Hλεκτροφόρησης Acrylamide από SERVA, GE Agarose (ultra-pure) από Gibco-BRL, USA APS από Fluca Biochemicals, USA Bis-acrylamide από SERVA, GE Εκκινητές από Invitrogen, UK Για το 5S rrna: A: 5 -AUGCCUGGCAGUUCCCU-3 Για το 23S rrna: K3: 5 -CAACCCGAACACCAGTG-3 K4: 5 -TCGCGTACCACTTTAAATG-3 K6: 5 -GAUGUCCGACCAGGAU-3 K14: 5 -CGACGCCGUCGCUGCG-3 Για το 16S rrna: S1: 5 -AGCCACGCCTCAAGGGC-3 S2: 5 -GTGTGACGGGCGGTGTG-3 57

59 5.2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διαλύματα Ηλεκτροφόρησης και Χρώσης: Διαλύματα Συστατικά Ποσότητα Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 8% (separating gel) Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6% (sequencing gel) TBE 10x Urea 40% Acrylamide 19:1 mq-h 2 O 10% APS TEMED TBE 10x Urea 50% Acrylamide 19:1 mq-h 2 O 20% APS TEMED 50% Διάλυμα ακρυλαμιδίου 19:1 Acrylamide Bis-acrylamide Toluidine blue Ρυθμιστικό διάλυμα αποχρωματισμού (Destain buffer) RNA ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (5x) (RNA loading buffer) Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης για ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων TBE (10x) Bradford (5x) Toluidine blue Acetic acid (glacial) mq-h 2 O Methanol Acetic acid (glacial) mq-h 2 O 1M Tris-HCl ph M EDTA ph 8.0 Urea Xylen Cyanol Bromophenol blue mq-h 2 O TBE 1x Urea Xylen Cyanol Bromophenol blue mq-h 2 O Tris Boric acid EDTA mq-h 2 O Brilliant Blue-G EtOH abs H 3 PO 4 mq-h 2 O 2.5ml 10.51g 5ml μέχρι 25ml 200μl 20μl 15ml 63g 18ml μέχρι 150ml 600μl 48μl 190g 10g μέχρι 400ml 100mg 5ml μέχρι 100ml 250ml 80ml 670ml 100μl 20μl 4.8g 5mg 5mg μέχρι 10ml 10μl 4.8g 3mg 3mg μέχρι 10ml 108g 55g 9.3g μέχρι 1lt 0.1g 52.5ml 100ml 47.5ml 58

60 Διαλύματα για λειτουργικές μελέτες και παρασκευές: Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Ρυθμιστικό Διάλυμα Α (Ρ.Δ.Α.) Tris-HCl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg KCl b-etsh Ρυθμιστικό Διάλυμα B (Ρ.Δ.B.) Tris-HCl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg NH 4 Cl ph 7.2 b-etsh Ρυθμιστικό διάλυμα αποσύζευξης υπομονάδων (Dissociation Buffer) Ρυθμιστικό διάλυμα αναδιάλυσης υπομονάδων Ρυθμιστικό διάλυμα σύζευξης 70S ριβοσωμάτων (Association buffer) Ρυθμιστικό διάλυμα αναδιάλυσης TP50 Ρυθμιστικό διάλυμα διαπίδυσης TP50 Ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευής Ac[ 3 H]Phe-tRNA Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg EDTA b-etsh Urea Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg EDTA b-etsh Tris-HCl ph 7.2 KCl (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Ρυθμιστικό διάλυμα φωτοσήμανσης Hepes-KOH ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg Ρυθμιστικό διάλυμα ανασυγκρότησης Hepes-KOH ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg EDTA b-etsh 100mM 10mM 60mM 6mM 100mM 10mM 500mM 6mM 20mM 300mM 1mM 6mM 20mM 30mM 6mM 6mM 100mM 100mM 10mM 6mM 20mM 400mM 4mM 0.2mM 6mM 6M 20mM 400mM 4mM 0.2mM 6mM 100mM 10mM 10mM 6mM 80mM 100mM 6mM 80mM 400mM 4mM 0.2mM 4mM 59

61 Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Ρυθμιστικό διάλυμα υπερφυγοκέντρησης ανασυσταμένων ριβοσωματικών συστατικών Tris-HCl ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Ρυθμιστικό διάλυμα Γ (Ρ.Δ.Γ) Hepes-KOH ph 7.2 NH 4 Cl ph 7.2 (CH 3 COO) 2 Mg b-etsh Bray s PPO POPOP Naphthalene Ethylenoglycol Methanol Dioxane 100mM 100mM 6mM 6mM 40mM 100mM 6mM 6mM 8g 0.4g 120g 40ml 200ml 1760ml Διαλύματα για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους Διαλύματα LB-medium για E. coli Κ12 καλλιέργειες Συστατικά Peptone from meat Yeast Extract KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 Glucose dh 2 O Διάλυμα υβριδοποίησης (4.5x) Hepes-KOH 7.4 KCl Ρυθμιστικό διάλυμα προέκτασης εκκινητή (Extension buffer) dntps Μείγμα προέκτασης για 6 δείγματα (Extension Mix) Διάλυμα αραίωσης ενζύμου αντίστροφης μεταγραφάσης (Dilution buffer) Tris-CH 3 COOH ph 8.3 DTT MgCl 2 datp dttp dctp dgtp Extension buffer dntps [a- 32 P] datp mq-h 2 O Tris-CH 3 COOH ph 8.3 DTT 80% Glycerol σε Η 2 Ο Ποσότητες/ C τελικές (mm) 5.5g 11.1g 18.8g 24.3g 100ml (10% w/v) μέχρι 1lt 225mM 450mM 637.5mM 127.5mM 127.5mM 0.741mM 2.856mM 2.856mM 2.856mM 8μl 4μl 2μl 10μl 50mM 2mM 50% 60

62 Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Chase Mix Διάλυμα κατακρήμνισης Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης DMS (DMS stop) datp dctp dttp dgtp mq-h 2 O EDTA CH 3 COONa Tris-CH 3 COOH ph 7.5 b-etsh CH 3 COONa EDTA 1mM 1mM 1mM 1mM 1mM 300mM 1M 1M 1.5M 0.1mM Διαλύματα αντιβιοτικών Η πουρομυκίνη διαλυτοποιήθηκε σε Η 2 Ο (ph: 7 με ΚΟΗ) και η θειοστρεπτόνη διαλυτοποιήθηκε σε 100% DMSO. 61

63 ΜΕΘΟΔΟΙ-ΤΕΧΝΙΚΕΣ 6.1 Αναλυτικές Μέθοδοι Φωτομέτρηση Προσδιορισμός συγκέντρωσης ριβοσωμάτων και νουκλεϊκών οξέων. Η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων, των υπομονάδων τους και των νουκλεϊκών οξέων προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση αυτών στα 260 nm σε Η 2 Ο. O λόγος των τιμών στα 260 nm και στα 280 nm (Α 260 /Α 280 ) δίνει μια πρώτη εκτίμηση για την καθαρότητα αυτών. Α 260 /Α 280 = 1,8 για το καθαρό DNA Α 260 /Α 280 = 2,0 για το καθαρό RNA Οι παράγοντες ισχύουν για μεγάλου μοριακού βάρους νουκλεϊκά οξέα (Berger, 1987). Στην περίπτωση μικρότερων αλληλουχιών (<100 βάσεων), ο λόγος μπορεί να αλλάξει ανάλογα με τη σύστασή τους. Για παράδειγμα, ο λόγος για πλούσιες σε Α αλληλουχίες είναι > 2,2, ενώ για πλούσιες σε C αλληλουχίας είναι < 1, Συντελεστές μοριακής απόσβεσης για φωτομετρική ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων (Nierhaus, 1990a): 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα : 1 A 260 = 24 pmol 50S ριβοσωματικές υπομονάδες : 1 A 260 = 36 pmol 30S ριβοσωματικές υπομονάδες : 1 A 260 = 72 pmol 23S rrna : 1 A 260 = 37,4 pmol 5S rrna : 1 A 260 = 986,2 pmol trna : 1 A 260 = 1500 pmol 1 A 260 διπλής αλυσίδας του DNA 50 μg 1 A 260 μονής αλυσίδας DNA ή RNA (>100 βάσεων) 40 μg 1 Α 260 μονής αλυσίδας DNA ( <25 βάσεων) 20 μg 1 Α 260 μονής αλυσίδας DNA (30-80 βάσεων) 30 μg 62

64 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνικών παραγόντων (FWR, S-100) που απομονώθηκαν, έγινε με τη μέθοδο Bradford (Bradford, 1976). Η συγκέντρωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών (ΤΡ, Total Protein) προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 230 nm. Οι συντελεστές μετατροπής που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίησή τους ήταν (Nierhaus, 1990a): TP50: 1A 260nm of 50S =36 pmol =1 eu TP50 TP30: 1A 260nm of 30S =72 pmol =1 eu TP30 TP70: 1A 260nm of 70S =24 pmol =1 eu TP70 1A 230nm = 220μg = 10 eu 1A 230nm = 220μg = 8 eu 1A 230nm = 220μg = 10 eu Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πουρομυκίνης Η συγκέντρωση της πουρομυκίνης προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 275 nm σε διάλυμα 0,1 Ν KOH. Ο συντελεστής μετατροπής από Α 275 σε mm, σε λ= 275 nm, βρέθηκε ότι είναι ίσος με 20,3 x 10-3 Α 275 ml -1 M -1 (πάχος φωτομετρικής κυψελίδας = 1 cm) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων (RNA) και νουκλεοτιδίων (ανάλυση αλληλουχίας), καθώς και για τον καθαρισμό του 5S rrna. Σε κάθε περίπτωση το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε ήταν το προτεινόμενο από την εταιρεία BioRad με μικρές τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα: Για το διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων διαφορετικού μεγέθους (3000 nt, 1600 nt και 120 nt) χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 8%/7Μ ουρία, απουσία «stacking gel». Στα δείγματα προστέθηκε ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης 5x για RNA και ηλεκτροφορήθηκαν στα 280 V για 30 min. Η εμφάνιση των ζωνών έγινε με διάλυμα με Toluidine Blue και ακολούθως με συνεχείς πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα αποχρωματισμού (Destain buffer). Για τον καθαρισμό του 5S rrna που 63

65 είχε προεκταθεί στο 3 άκρο με ένα επιπρόσθετο ολιγονουκλεοτίδιο και είχε ραδιενεργά [ 32 Ρ] επισημανθεί, η εμφάνιση των ζωνών έγινε μετά από ξήρανση της πηκτής και ανάλυση σε PhosphoImager (βλέπε επόμενη παράγραφο). Για την εύρεση της αλληλουχίας RNA (sequencing) και την ανάλυση των δειγμάτων προέκτασης εκκινητή (primer extension), χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6%/7Μ ουρία απουσία «stacking gel». Tα ιζήματα των cdna δειγμάτων αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (14-21 μl) και επωάστηκαν αρχικά, στους 25 0 C για 30 min. Στη συνέχεια, τα δείγματα DNA αποδιατάχθηκαν στους 95 0 C για 2,5 min, ψύχθηκαν απότομα στους 0 0 C και ηλεκτροφορήθηκαν (συσκευή πηκτής BioRad για ανάλυση αλληλουχίας) σε προηλεκτροφορημένη πηκτή (15 ma, 20 min), αρχικά στα 15 ma για 20 min, και στη συνέχεια, στα 25 ma για ~3,5 h. Η πηκτή τοποθετήθηκε με προσοχή σε χαρτί Whatmann, ξηράνθηκε για 30 min σε ξηραντήρα πηκτών (DrygerSr, Slab Gel Dryer, Model SE 1160, Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco) και τοποθετήθηκε σε ακτινοευαίσθητη πλάκα αναλυτή PhosphoImager (FUJIFILM FLA-3000, Berthold, AU). Στη συνέχεια η πλάκα υποβλήθηκε σε σάρωση και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στο πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας AIDA της Raytest, DE Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδος (Thin Layer Chromatography, T.L.C.) Η μέθοδος της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδος (T.L.C.) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση κλασμάτων που περιείχαν ΑΒΑσπερμίνη ( ), καθώς επίσης και για τον προσδιορισμό της υδρόλυσης του GTP σε GDP από ριβοσώματα ( 7.5.7). Η μέθοδος στηρίζεται στις διαφορές που παρουσιάζουν τα συστατικά ενός μίγματος στο ρυθμό μετατόπισης επάνω σε πλάκα επιστρωμένη με χρωματογραφικό υλικό. Η μετατόπιση επιτυγχάνεται με τη ροή διαλύτη (κινητή φάση) διαμέσου του χρωματογραφικού υλικού (σταθερή φάση). Το μίγμα των ουσιών που θέλουμε να διαχωρίσουμε τοποθετείται σαν μια κηλίδα, στη μια πλευρά της πλάκας, και το χρωματογράφημα αναπτύσσεται ανοδικά, αφού βυθίσουμε την πλάκα σε ειδική συσκευή ανάπτυξης του 64

66 χρωματογραφήματος. Και στις δυο εφαρμογές, το χρωματογραφικό υλικό ήταν μια ιοντο-ανταλλακτική ρητίνη Παρασκευές Βιοχημικές παρασκευές ριβοσωματικών συστατικών Καλλιέργειες E.coli κυττάρων-σύστημα ελεύθερων κυττάρων (cellfree system) Μεγάλης κλίμακας, υγρές καλλιέργειες E.coli Κ12 κυττάρων (Zaniewski et al, 1984) αναπτύχτηκαν σε θρεπτικό διάλυμα LB-medium. Η επιλογή του στελέχους έγινε με βάση την ιδιότητα του να εκφράζει RNAνουκλεάσες σε μικρό ποσοστό, έτσι ώστε η απομόνωση των ριβοσωμάτων να γίνει υπό ασφαλείς συνθήκες. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περιστροφικά ανακινούμενο επωαστή (orbital incubator, 120 στροφές/min) στους 37 ο C και συλλέχθηκαν στο μέσο της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξής τους (Α 540nm = 0,5-0,6), ώστε να ληφθούν ριβοσώματα με τη μέγιστη ενεργότητα (Dohme et al, 1976b, Kalpaxis et al, 1995). Η συλλογή των κυττάρων έγινε με φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall RC-5B, κεφαλή GSA) στις rpm, για 15 min, στους 4 ο C. Ακολούθησε έκπλυση των κυττάρων, δύο φορές, με ψυχρό διάλυμα 0.9 M KCl (ώστε να παραμένει σταθερή η οσμωτική τους πίεση) και συλλέχτηκαν με φυγοκέντρηση κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 20 ο C μέχρι την στιγμή της χρησιμοποιήσεώς τους (εντός 1 εβδομάδας). Η απόδοση της βακτηριακής ανάπτυξης ήταν 1,5-2,3 g νωπών κυττάρων ανά λίτρο θρεπτικού διαλύματος Παρασκευή κλάσματος S-30 Η παρασκευή του κλάσματος S-30 έγινε σύμφωνα με τους Kalpaxis et al, Το κλάσμα S-30 παρασκευάστηκε από κύτταρα διατηρημένα στην κατάψυξη (-20 o C), αφού αποψύχθηκαν αργά μέχρι τους 4 ο C. Όλοι οι χειρισμοί έγιναν στους 4 ο C, υπό στείρες συνθήκες. 65

67 Ποσότητα E.coli κυττάρων βάρους (32,45 g) τοποθετήθηκε εντός ιγδίου πορσελάνης και αναμείχθηκε με διπλάσια ποσότητα αλουμίνας, μέχρι σχηματισμού ενιαίας πάστας. Ακολούθησε θραύση των κυττάρων της πάστας με γουδοχέρι για 5 min και αιώρηση τους σε 90 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α (Ρ.Δ.Α.) Το ομογενές αιώρημα που προέκυψε φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall RC-5B, κεφαλή SS34) σε rpm (30000g), για 40 min. Το ίζημα (περιείχε αλουμίνα, μεμβρανικά κατάλοιπα και άθραυστα κύτταρα), απομακρύνθηκε και το υπερκείμενο επαναφυγοκεντρήθηκε για 20 min στις ίδιες συνθήκες φυγοκέντρησης. Στο νέο υπερκείμενο προστέθηκε δεοξυριβονουκλεάση Ι (DNase I) σε τελική συγκέντρωση 3 μg/ml και το διάλυμα επωάστηκε στους 4 ο C για 5 min. Μετά την επώαση, το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε και πάλι σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall, κεφαλή SS34, σε rpm, για 30 min. Το ίζημα απομακρύνθηκε και το υπερκείμενο αποτέλεσε το κλάσμα S-30. Το κλάσμα αυτό χρησιμοποιήθηκε στα επόμενα στάδια για την παρασκευή του κλάσματος S-100, του κλάσματος FWR που περιείχε τους παράγοντες μετάφρασης, και των πλυμένων ριβοσωμάτων Παρασκευή κλάσματος S-100 Το κλάσμα S-100 περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες και άλλους, απαραίτητους για την πρωτεινοσύνθεση παράγοντες, όπως μεταφραστικούς παράγοντες, συνθετάσες των aa-trna, trnas κ.λ.π. Η παρασκευή που ακολουθεί έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Kalpaxis et al (1995). Το κλάσμα S-30 φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο Beckman, κεφαλή Ti 75, στις rpm ( g), στους 4 ο C επί 4 h. Για να αποφευχθούν προσμίξεις ριβοσωμικής φύσης, για την παρασκευή του S-100 χρησιμοποιήθηκαν μόνο τα άνω 2/3 του υπερκειμένου. Το 1/3 του όγκου του υπερκειμένου που απέμεινε απομακρύνθηκε με προσοχή, ενώ το ίζημα φυλάχθηκε για την παρασκευή των ριβοσωμάτων. Στα 2/3 του υπερκειμένου προστέθηκε στερεό θειϊκό αμμώνιο, υπό συνεχή ανάδευση, μέχρι το διάλυμα αποκτήσει περιεκτικότητα 80% εκείνης ενός κορεσμένου διαλύματος θειικού 66

68 αμμωνίου. Κατά την διάρκεια της προσθήκης, το ph διατηρήθηκε ίσο με 7,2 με προσθήκη 1 Ν NaOH. Η ανάδευση συνεχίσθηκε για 15 min στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34) σε rpm (30000 g), για 30 min. Το ίζημα διαλυτοποιήθηκε, σε ¼ του αρχικού υπερκειμένου με Ρ.Δ.Α. Στη συνέχεια, το δείγμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 lt (~20 όγκων) ρυθμιστικού διαλύματος Α, για μια νύχτα (o/n) στους 4 ο C, ώστε να απομακρυνθούν μόρια μικρού μοριακού βάρους (<3000 kda). Για πιο αποδοτική διαπίδυση, το διάλυμα διαπίδυσης ανανεώθηκε 4 φορές. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34) σε rpm (30000 g), για 5 min. Το ίζημα απομακρύνθηκε και το υπερκείμενο (κλάσμα S-100), αφού προστέθηκε γλυκερόλη (5%), χωρίσθηκε σε μικρά κλάσματα των 0,5 ml τα οποία, μετά από απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο, φυλάχθηκαν στους 80 ο C. Ακολούθησε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Bradford και υπολογισμός της ενεργότητας κλάσματος S-100 σε μικρής κλίμακας πειράματα σύνθεσης Phe-tRNA Παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων Η παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων έγινε σύμφωνα με τους Kalpaxis et al (1995). Το ίζημα που προέκυψε από την υπερφυγοκέντρηση του κλάσματος S-30, αιωρήθηκε σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος Β (Ρ.Δ.Β) για μια νύχτα, στους 4 ο C. Την επόμενη ημέρα, το αιώρημα που περιείχε τα ριβοσώματα αναδεύτηκε για 10 min στους 4 ο C και φυγοκεντρήθηκε σε υπερφυγόκεντρο Beckman, κεφαλή Ti 75, στις rpm ( g), στους 4 ο C για 6 h. Μετά την φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο φυλάχθηκε για την παρασκευή του κλάσματος FWR. Το ίζημα των ριβοσωμάτων αιωρήθηκε σε 60 ml Ρ.Δ.Β o/n, στους 4 ο C. Ακολούθησε ανάδευση για 10 min στους 4 ο C και υπερφυγοκέντρηση υπό τις ίδιες συνθήκες που αναφέρθηκαν παραπάνω. Το υπερκείμενο της δεύτερης υπερφυγοκέντρησης απορρίφθηκε, ενώ το ίζημα αιωρήθηκε σε 15 ml Ρ.Δ.Α o/n, στους 4 ο C. Την επόμενη μέρα ακολούθησε ανάδευση του διαλύματος, 10 min στους 4 ο C. Το δείγμα 67

69 υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 lt Ρ.Δ.Α για 4 h στους 4 ο C. Ακολούθησε ήπια φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall (κεφαλή SS34, στις 2000 rpm, για 15 min). Το ίζημα απορρίφθηκε, και ακολούθησε φωτομέτρηση του υπερκειμένου στα 260 και 280 nm. Βάσει φωτομετρήσεως στα 260 nm υπολογίσθηκε η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων, ενώ βάσει του λόγου Α 260nm /Α 280nm ελέγχθηκε η καθαρότητα αυτών. Τέλος, το παρασκεύασμα διατηρήθηκε σε μικρά κλάσματα όγκου των μl στους 80 ο C, αφού είχε προηγηθεί απότομη ψύξη αυτών σε υγρό άζωτο. Η απόδοση σε πλυμένα ριβοσώματα ήταν Α 260 /g νωπών κυττάρων Παρασκευή κλάσματος FWR Το κλάσμα FWR περιέχει μεταφραστικούς παράγοντες (IFs, EFs and RRFs) απαραίτητους για την πρωτεϊνική σύνθεση. Για την παρασκευή του ακολουθήθηκε η επόμενη διαδικασία: Στο υπερκείμενο που ελήφθη από την δεύτερη υπερφυγοκέντρηση ( ), προστέθηκε στερεό θειϊκό αμμώνιο υπό συνεχή ανάδευση, στους 4 ο C, μέχρις ότου το διάλυμα αποκτήσει περιεκτικότητα 80% εκείνης ενός κορεσμένου διαλύματος θειϊκού αμμωνίου. Η διατήρηση του ph ίσο με 7,2 έγινε με προσθήκη 1 Ν NaOH. Μετά την προσθήκη όλου του στερεού, η ανάδευση συνεχίσθηκε για 15 min στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm (30000 g), για 30 min. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, ενώ το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε ¼ του αρχικού υπερκειμένου με Ρ.Δ.Α. Στη συνέχεια το δείγμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος Α, για μια νύχτα (o/n) στους 4 ο C (το διάλυμα διαπίδυσης ανανεώθηκε 4 φορές). Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall, κεφαλή SS34, σε rpm, για 5 min. Το ίζημα απομακρύνθηκε ενώ το υπερκείμενο (κλάσμα FWR) αναλύθηκε ως προς πρωτεΐνη με την μέθοδο Bradford. Μετά την προσθήκη γλυκερόλης (5%), χωρίστηκε σε κλάσματα των μl και διατηρήθηκε στους 80 ο C, αφού προηγήθηκε απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο. 68

70 Διαχωρισμός και απομόνωση 70S ριβοσωματικών συμπλόκων Πλυμένα ριβοσώματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 4 lt διαλύματος σύζευξης (αssociation buffer), για μια νύχτα (o/n) στους 4 ο C, προκειμένου να γίνει σύζευξη των υπομονάδων. Για το διαχωρισμό και απομόνωση των 70S ριβοσωμάτων ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση σε κεφαλή Beckman SW28 στις rpm (85000g), στους 4 0 C για 6 h, σε 10-40% διαβάθμιση σουκρόζης, σε διάλυμα σύζευξης. Η συλλογή του κλάσματος 70S ριβοσωμάτων έγινε σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (Α 260 ). Ακολούθησε κατακρήμνιση με προσθήκη 0,65 όγκων απόλυτης EtOH, στους 20 0 C o/n, και φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm (30000g), για 20 min, 4 0 C. Το ίζημα που προέκυψε επαναδιαλύθηκε σε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος αναδιάλυσης ριβοσωμάτων, διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα και φυλάχτηκε στους 80 0 C αφού προηγήθηκε απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο. H συγκέντρωση και καθαρότητα των ριβοσωμάτων προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm. Η τυπική απόδοση ήταν 47,6% Διαχωρισμός και απομόνωση 30S και 50S ριβοσωματικών υπομονάδων 70S ριβοσώματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 4 lt διαλύματος αποσύζευξης (dissociation buffer), για μια νύχτα (o/n) στους 4 ο C, προκειμένου να γίνει διαχωρισμός των ριβοσωμάτων σε υπομονάδες. Σημειώνεται ότι η συγκέντρωση του Mg 2+ διατηρείται αυστηρά στο 1 mm, και όχι χαμηλότερη, προκειμένου να αποφευχθεί η απώλεια του 5S rrna. Για το διαχωρισμό των 30S και 50S υπομονάδων ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση σε κεφαλή Beckman SW28 στις rpm (85000g), στους 4 0 C για 6 h, σε 10-30% διαβάθμιση σουκρόζης, σε διάλυμα αποσύζευξης. Τα κλάσματα των 30S και 50S υπομονάδων συλλέχθησαν σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (Α 260 ) και κατακρημνίστηκαν με προσθήκη 0,65 όγκων απόλυτης EtOH, στους 20 0 C o/n, αφού ρυθμίστηκε πρώτα η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ στα 10 mm. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall, κεφαλή SS34, 69

71 στις rpm (30000g), για 20 min, 4 0 C. Το ίζημα που προέκυψε επαναδιαλύθηκε σε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος αναδιάλυσης υπομονάδων, διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα και φυλάχτηκε στους 80 0 C αφού προηγήθηκε απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο. H συγκέντρωση και καθαρότητα των υπομονάδων προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm. Η τυπική απόδοση για καθαρές 30S και 50S υπομονάδες ήταν 21,5% και 26,7% αντίστοιχα Απομόνωση μείγματος 23S και 5S ριβοσωματικού RNA Για την παρασκευή μείγματος 23S και 5S ριβοσωματικού RNA χρησιμοποιήθηκαν 50S ριβοσωματικές υπομονάδες απομονωμένες από Ε.coli K12 ( ). Σε 50S υπομονάδες προστέθηκε ίσος όγκος φαινόλης. Το μείγμα αναδεύτηκε ισχυρά (vortex) για 5 min και στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm), για 5 min. Στο υπερκείμενο, υδατική φάση, προστέθηκε μισός όγκος φαινόλης-μισός όγκος χλωροφορμίου. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση για 5 min και φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες. Στο υπερκείμενο που προέκυψε προστέθηκε ίσος όγκος χλωροφορμίου και η διαδικασία της ισχυρής ανάδευσης και φυγοκέντρησης, υπό τις ίδιες συνθήκες, επαναλήφθηκε. Στο υδατικό υπερκείμενο που προέκυψε (περιέχει rrna) προστέθηκαν 0,1 όγκοι 3M CH 3 COONa ph 5,5 και 2,5 όγκοι απόλυτης EtOH. Το διάλυμα αφέθηκε για κατακρήμνιση o/n, στους 20 0 C και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm) για 30 min, 4 o C. Το ίζημα που προέκυψε διαλύθηκε σε mq H 2 O και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του rrna στο δείγμα με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm. Η απόδοση ήταν 0,35 Α 260 rrna/a S Διαχωρισμός και απομόνωση 23S και 5S rrna Για το διαχωρισμό και απομόνωση 23S και 5S rrna, μείγμα rrna από 50S υπομονάδες ( ) επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (10 mm Tri- HCl, ph:7,2, 10 mm EDTA, 6 mm b-etsh, 0,1% SDS) στους 90 0 C, για 2 min, 70

72 προκειμένου να γίνει αποδιάταξη του rrna. Ακολούθησε υπερφυγοκέντρηση (26000 rpm, 6 h, στους 4 0 C, Beckman SW28) σε διάλυμα αποσύζευξης-1% μεθανόλη και διαβαθμισμένη πυκνότητα σουκρόζης 2-20%. Τα κλάσματα των 23S και 5S rrna συλλέχθησαν σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (Α 260 ). Στη συνέχεια έγινε προσθήκη 0,1 όγκου 3M CH 3 COONa ph 5,5 και 2.5 όγκων απόλυτης EtOH και τα δείγματα αφέθηκαν για κατακρήμνιση στους 20 0 C o/n. Ακολούθησε φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm) για 30min, 4 o C. Μετά την διάλυση των ιζημάτων σε mq H 2 O, έγινε προσδιορισμός της συγκέντρωσης του rrna στα δείγματα με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm, και στην συνέχεια αποθήκευσή τους στους -80 ο C, ύστερα από απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο. Η απόδοση ήταν 0,16 Α 260 rrna/a S και 0,007 Α 260 rrna/a S για το 23S και 5S rrna, αντίστοιχα. Περαιτέρω καθαρισμός του 5S rrna έγινε με την χρήση στήλης QIAGEN R RNA/DNA, Bioanalytica S.A. Σύμφωνα με τις οδηγίες που συνοδεύουν το kit, σε 3ml δείγματος (5Α 260 5S rrna) προστέθηκε 1ml Buffer QRL1. Ακολούθησε ανάδευση και προσθήκη 9 ml Buffer QRV2. Μετά από ανάδευση, το δείγμα φυγοκεντρήθηκε σε 5000g, για 5 min στους 4 o C και τοποθετήθηκε στη στήλη. Μετά την είσοδο του δείγματος στη στήλη, προστέθηκαν 12 ml Buffer QRW (Buffer πλύσης για απομάκρυνση πρωτεϊνών ενώ ταυτόχρονα τα νουκλεικά οξέα παραμένουν προσροφημένα στη στήλη). Η έκλουση του 5S rrna έγινε με προσθήκη στη στήλη 6 ml Buffer QRW2. Στο δείγμα που προέκυψε προστέθηκε 1 όγκος παγωμένης ισοπροπανόλης. Ακολούθησε ανάδευση, επώαση στο πάγο για 10min, και φυγοκέντρηση σε 15000g για 30 min, στους 4 o C. Το ίζημα που προέκυψε διαλύθηκε σε mq H 2 O και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του 5S rrna στο δείγμα με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm. Η ανάκτηση καθαρού 5S rrna ήταν 42% Απομόνωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών της μεγάλης υπομονάδας (TP50) Για την παρασκευή TP50 χρησιμοποιήθηκαν 50S ριβοσωματικές 71

73 υπομονάδες ( ). Σε 1000 Α 260 /ml 50S υπομονάδων προστέθηκαν δυο όγκοι οξεικού οξέος 100%, αφού προηγουμένως η συγκέντρωση του Mg 2+ ρυθμίστηκε σε 100 mm. To μείγμα αναδεύτηκε ήπια για 45 min, στους 4 0 C, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm) για 30 min στους 4 o C. Στο υπερκείμενο που προέκυψε προστέθηκαν 5 όγκοι ψυχρής ακετόνης και το δείγμα αφέθηκε στους 20 0 C, o/n, για κατακρήμνιση. Ακολούθησε φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, στις rpm) για 20 min στους 4 o C, ώστε να απομακρυνθεί η ακετόνη. Το ληφθέν ίζημα (πρωτεΐνες) αναδιαλύθηκε σε διάλυμα αναδιάλυσης TP50 και υποβλήθηκε σε διαπίδυση, o/n (4 0 C), σε 500 όγκους διαλύματος αναδιάλυσης TP50. Ακολούθησαν 4 συνεχείς διαπιδύσεις, o/n (4 0 C), σε 100 όγκους κάθε φορά διαλύματος διαπίδυσης TP50. Το διαπίδυμα φυγοκεντρήθηκε στα 3000 rpm για 5 min, 4 o C (Sorvall, κεφαλή SS34) και μετρήθηκε η απορρόφηση του στα 230 nm (1:100 αραίωση). Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε κλάσματα, ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους 80 0 C (Nierhaus, 1990a). Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσή τους έγινε με φωτομέτρηση στα 230 nm, ενώ η απόδοση ήταν 0,044 Α 230 TP50/Α S (10 μg ΤP50/A S) Παρασκευή Ac[ 3 H]Phe-tRNA Το Ac[ 3 H]Phe-tRNA αποτέλεσε το υπόστρωμα της P θέσης του ριβοσώματος στα in vitro πειράματα. Η σύνθεσή του επιτεύχθηκε με την προσθήκη στο -CCA άκρο του trna Phe του αμινοξέος φαινυλαλανίνη (Phe), το οποίο στη συνέχεια ακετυλιώθηκε. Η ακετυλίωση αυτή είχε ως στόχο την παρασκευή ενός aa-trna που προσομοιάζει το εναρκτήριο fmet-trna Met. Για την παρασκευή του Ac[ 3 H]Phe-tRNA, 800 Α 260 trna (780 A 260 trna bulk, εμπλουτισμένο με 20 Α 260 trna Phe ) διαλύθηκαν σε 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος παρασκευής Ac[ 3 H]Phe-tRNA και επωάστηκαν για 20 min, στους 37 0 C. Ακολούθησε προσθήκη: ATP (4 mm), GTP (0,1 mm), 5 nmoles [ 3 H-]Phe, 17 nmoles L-Phe, μl κλάσματος S-100 (8 mg/ml), και η επώαση του δείγματος συνεχίστηκε για 45 min, στους 37 0 C. Η ποσότητα του κλάσματος 72

74 S-100 και ο χρόνος επώασης σε κάθε παρασκευή καθορίστηκαν από πιλοτικά πειράματα σύνθεσης [ 3 H]Phe-tRNA μικρής κλίμακας (50 μl). Ο έλεγχος της απόδοσης, έγινε με μετρητή β-ακτινοβολίας (Pharmacia, USA), μετά από προσρόφηση του προϊόντος σε φίλτρο κυτταρίνης (Whatman, 3MM), πλύσιμο τρεις φορές σε ψυχρό διάλυμα 5% TCA και μια φορά σε ψυχρή EtOH και στη συνέχεια τοποθέτηση του φίλτρου σε υγρό σπινθηρισμού. Ο καθαρισμός του προϊόντος ([ 3 H]Phe-tRNA) έγινε με εκχύλιση του μείγματος επώασης με ίσο όγκο διαλύματος φαινόλης 90% και ισχυρή ανάδευση για 3 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση (3000 rpm, 10 min, 25 0 C, Sorvall, κεφαλή SS34) η υδατική φάση συλλέχθηκε, ενώ στην φαινολική φάση προστέθηκαν 2 ml Η 2 Ο. Ακολούθησαν δυο ακόμα εκχυλίσεις στις ίδιες συνθήκες προκειμένου να γίνει η μέγιστη δυνατή ανάκτηση του προϊόντος. Το σύνολο των υδατικών φάσεων κατακρημνίσθηκε με 2,5 όγκους EtOH και, 0,1 όγκους 20% CH 3 COOK ph 6,85 στους 20 0 C o/n. Μετά από φυγοκέντρηση (15000 rpm, 10 min, 4 0 C, Sorvall SS34), το ίζημα πλύθηκε με 70% EtOH και φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες. Ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος με mqη 2 Ο και διαπίδυση σε μεγάλο όγκο H 2 O (4 lt, 4 h, 4 0 C, με δυο αλλαγές). Για την ακετυλίωση του [ 3 H]Phe-tRNA, στο διαπίδυμα προστέθηκε ίσος όγκος κορεσμένου διαλύματος CH 3 COOK ph 5 (0 0 C) και στάγδην 0,15 ml ψυχρού διαλύματος οξικού ανυδρίτη/ml μείγματος επώασης, υπό συνεχή ανάδευση, σε 5 δόσεις ανά 15 min, στους 0 0 C. Το Ac[ 3 H]Phe-tRNA που προέκυψε κατακρημνίστηκε με προσθήκη 0.1 όγκων 20% CH 3 COOK και 2,5 όγκων EtOH και ψύξη στους 20 0 C, o/n. To σχηματισθέν ίζημα φυγοκεντρήθηκε (15000 rpm, 15 min, 4 0 C, Sorvall SS34), αναδιαλύθηκε με mq Η 2 Ο και διαπιδύθηκε σε H 2 O (4 lt, 4 h, 4 0 C, με δυο αλλαγές). Ακολούθησε φωτομέτρηση στα 260 nm ( Α 260 /ml), και υπολογισμός της ειδικής ραδιενέργειας ( dpm/α 260 ). Το δείγμα χωρίσθηκε σε κλάσματα των 0,5 ml και διατηρήθηκε στους 20 0 C. H απόδοση ανάκτησης του trna σε προϊόν (Ac[ 3 H]Phe-tRNA) ήταν 80-85%. 73

75 Παρασκευή αζιδοβενζαμιδινο (ABA)-σπερμίνης- Φωτοσήμανση συγγενείας (Photo-affinity labeling) Η μέθοδος της σταυροσύνδεσης (cross-linking) δίνει τη δυνατότητα ομοιοπολικής σύνδεσης μιας ένωσης (cross-linker), στην οποία έχει προστεθεί μια δραστική ομάδα (π.χ. Ν 3 ), με μια περιοχή-στόχο με την οποία αλληλεπιδρά η ένωση, υπό κανονικές συνθήκες, αλλά με ασθενέστερες δυνάμεις. Αν η δραστική ομάδα είναι φωτοδιεγειρόμενη, τότε η μέθοδος σταυροσύνδεσης ονομάζεται φωτοσήμανση συγγένειας. Τα αντιδραστήρια φωτοσήμανσης χρησιμοποιούνται για την ομοιοπολική σύνδεση γειτονικών ή μη περιοχών εντός ενός ή μεταξύ διαφόρων μακρομορίων ενός βιολογικού συστήματος. Εμφανίζουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων αντιδραστηρίων σταυροσύνδεσης. Το κυριότερο είναι ότι ανιχνεύουν αποκλειστικά άμεσες επαφές ή προσεγγίσεις μεταξύ των προσδετών και των μακρομορίων. Επίσης, κατά την χρήση τους αποφεύγονται ανεπιθύμητες παράπλευρες αντιδράσεις, ενώ ταυτόχρονα παραμένουν ανενεργά μέχρι να προσδεθούν εξειδικευμένα και μη ομοιοπολικά στην περιοχή-στόχο (Σχήμα 6.1.). Όταν διεγερθούν, δεσμεύονται ομοιοπολικά σε αυτήν (Brimacombe et al, 1990), διασφαλίζοντας έτσι την σταθερή επισήμανση των θέσεων πρόσδεσης. Σχήμα 6.1.: Μοντέλο φωτοσήμανσης. Χ: φωτοδραστική ομάδα, Β: διαχωριστής (spacer), S: φυσικός προσδέτης, a: μακρομόριο-στόχος 74

76 Η μέθοδος της σταυροσύνδεσης αποτελεί σημαντικό εργαλείο για δομικές μελέτες στη διακριτική περιοχή 5-20 Ǻ και υπερέχει έναντι της κλασικής ανάλυσης αποτυπώματος (footprinting analysis), λόγω του ότι προσδιορίζει την ακριβή θέση πρόσδεσης του μορίου, χωρίς να επηρεάζεται από αλλοστερικά φαινόμενα ή αλλαγές διαμόρφωσης που μπορούν να περιπλέξουν την ερμηνεία των αποτελεσμάτων Σύνθεση της φωτοδραστικής αζιδοβενζαμιδινο (ABA)-σπερμίνης, (ABA)-[ 14 C] σπερμίνης Το φωτοδραστικό μόριο που επιλέχθηκε για την μελέτη των θέσεων πρόσδεσης της σπερμίνης στο ριβόσωμα, ήταν η ΑΒΑ-σπερμίνη (ABA-SPM) (Σχήμα 6.2A). Η επιλογή του αρυλαζιδίου έναντι ενός αλκυλαζιδίου (RCH 2 N 3 ) έγινε, διότι τα αλκυλαζίδια υπό την επίδραση UV ακτινοβολίας υφίστανται ενδομοριακούς μετασχηματισμούς (Wolf rearrangement) που οδηγούν σε αδρανή προϊόντα (Σχήμα 6.2Β). Κατάλληλη υποκατάσταση του αρωματικού δακτυλίου της αρυλομάδας μπορεί να αυξήσει κατά δυο τάξεις μεγέθους το χρόνο ημίσιας ζωής της ένωσης, ενώ ταυτόχρονα καθιστά το μόριο διεγέρσιμο σε μεγάλα μήκη κύματος ( nm). H σύνθεση της ABA-σπερμίνης (Σχήμα 6.2) πραγματοποιήθηκε, όπως περιγράφεται από τους Clark et al (1991). Σημειώνεται, ότι όλες οι απαιτούμενες εργασίες έγιναν σε σκοτεινό θάλαμο και θερμοκρασία δωματίου. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 250 μmoles σπερμίνης διαλύθηκαν σε 5 ml 20% CH 3 CN ενώ η ρύθμιση του ph στο 10 έγινε με προσθήκη 1 N NaOH. Ακολούθησε προσθήκη 1000 μmoles μεθυλο-4- αζιδοβενζαμιδικό (ΜΑΒΙ), ήδη διαλυμένων σε 30% CH 3 CN, σε 15 ισόποσες δόσεις, σε διάστημα μιας ώρας (σημειώνεται ότι το ΜΑΒΙ δεν κυκλοφορεί πλέον στο εμπόριο και για αυτό το λόγο συντέθηκε από 4-αζιδοβενζονιτρίλιο και μεθυλική αλκοόλη (Amarantos and Kalpaxis, 2000). Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, το ph ήταν υπό συνεχή έλεγχο, ώστε η τιμή του να μη μειωθεί περισσότερο από 9 (το ΜΑΒΙ υδρολύεται εύκολα σε ουδέτερο ή όξινο 75

77 Α 9Ǻ 17.11Ǻ N 3 C OCH 3 + SPM N 3 C NH 2 Cl (+) N H NH 2 Cl N H H N NH 2 (ΜΑΒΙ) (ΑΒΑ-σπερμίνη) Β RCH 2 N 3 U.V RCH 2 N RCH 2 NH (αδρανές) N 2 R N 3 R N (δραστικό) Σχήμα 6.2.: (Α) Σύνθεση ΑΒΑ-σπερμίνης από ΜΑΒΙ με προσθήκη σπερμίνης (SPM). (Β) Προϊόντα φωτόλυσης αλκυλαζιδίων και αρυλαζιδίων. περιβάλλον).η ΑΒΑ-σπερμίνη καθαρίστηκε με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής σε στήλη sulfopropyl Sephadex G50 απουσία φωτός, στους 25 0 C με διάλυμα έκλουσης CH 3 COONH 4 διαβαθμισμένης συγκέντρωσης 0,6-1,6 Μ. Η ταυτοποίηση των κλασμάτων που περιείχαν την ΑΒΑ-σπερμίνη έγινε με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) σε πλάκες Silica gel 60F χρησιμοποιώντας ως διαλύτη ανάπτυξης διάλυμα πυριδίνης, οξικού, νερού και ισοπροπυλικής αλκοόλης σε αναλογία (1:1:2:4). Το κλάσμα που περιείχε ΑΒΑ-σπερμίνη λυοφιλοποιήθηκε και φυλάχτηκε στους 20 0 C, στο σκοτάδι. Σημειώνουμε εδώ, ότι για την παρασκευή ABA-[ 14 C]σπερμίνης ακολουθήθηκε η πορεία που αναφέρεται παραπάνω, με τη διαφορά χρησιμοποιήθηκε ραδιενεργή [ 14 C]σπερμίνη. ότι 76

78 6.3. Κινητικές μελέτες σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Φωτοσήμανση του 5S rrna Για τον προσδιορισμό των κινητικών σταθερών της ομοιοπολικής σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, 174 pmol 5S rrna ενεργοποιήθηκαν αρχικά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωτοσήμανσης για 10 min, στους 37 0 C (σημειώνουμε την αποφυγή Tris και β-ετsh λόγω της παρουσίας πρωτοταγών αμινοομάδων και SH-ομάδων, οι οποίες αδρανοποιούν τη φωτοδραστική ομάδα). Στη συνέχεια το δείγμα επωάστηκε παρουσία ABA- [ 14 C]σπερμίνης για 20 min στους 25 0 C, απουσία φωτός. Tο δείγμα τοποθετήθηκε σε μικροδοχείο, ψύχθηκε στους 4 0 C, και στη συνέχεια ακτινοβολήθηκε για 10 min, από πηγή φωτός 300 nm (UltraViolet-B, ll 40W, 12RS, Phillips), η οποία απείχε 5 cm από το δείγμα. Η φωτοσήμανση τερματίστηκε προσθέτοντας στο διάλυμα επώασης 100 μm DTT (εξουδετερώνει την περίσσεια φωτοδραστικού αναλόγου). Το προιόν της φωτοσήμανσης κατακρημνίσθηκε με 0,1 όγκους 20% CH 3 COOK ph 6,85 και 2,5 όγκους ψυχρής αιθανόλης (-20 0 C o/n). Ακολούθησαν δύο πλύσεις με 2 ml, κάθε φορά, ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος φωτοσήμανσης και μέτρηση της ενσωματωμένης στο ίζημα ραδιενέργειας σε μετρητή σπινθηρισμού β ακτινοβολίας (Rackbeta 1290, Wallac, Pharmacia, USA). Το 5S rrna φωτοσημάνθηκε σε συγκεντρώσεις ABA-[ 14 C]σπερμίνης που κυμαίνονταν από 0,05-2 mm. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα προσδιορισμού της μη εξειδικευμένης πρόσδεσης, στα οποία η φωτοσήμανση πραγματοποιήθηκε με την ταυτόχρονη παρουσία 250-πλάσιας συγκέντρωσης σπερμίνης Προσδιορισμός κινητικών σταθερών και αριθμού θέσεων σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Για κάθε συγκέντρωση ελεύθερης ABA-[ 14 C]σπερμίνης (L), προσδιορίστηκε το ποσό της ομοιοπολικά προσδενόμενης σπερμίνης (Β) στο 77

79 5S rrna. Η τιμή Β διορθώθηκε, λαμβάνοντας υπόψη την μη εξειδικευμένη πρόσδεση, την ακτινοβόληση δηλ. παρουσία περίσσειας σπερμίνης. Ο χρόνος ακτινοβόλησης ήταν τέτοιος (10 min), ώστε να διασφαλίζεται η μέγιστη πρόσδεση στο 5S rrna. Επειδή η συγκέντρωση της ABA-[ 14 C]σπερμίνης ήταν σε περίσσεια υποθέτουμε, ότι η ενσωμάτωση της σπερμίνης στο 5S rrna ακολουθεί μη αντιστρεπτή, ψευδοπρώτης τάξης, αντίδραση σύμφωνα με το κινητικό σχήμα: 1 2 K d nl + R RL n RL * n όπου R είναι το υπό φωτοσήμανση 5S rrna, RL n το αρχικό σύμπλοκο μεταξύ του 5S rrna και της μη-ομοιοπολικά προσδεδεμένης ABA-[ 14 C]σπερμίνης, και RL n*, το τελικό σύμπλοκο μεταξύ R και L (ομοιοπολικά προσδεδεμένη). Το στάδιο (1) αναπαριστά την ισορροπία που αποκαθίσταται στο σκοτάδι, πριν την ακτινοβόληση, και το στάδιο (2) τη φάση ακτινοβόλησης. Η σχέση που συνδέει το Β και την [L] δίνεται από την εξίσωση: Bmax L B = K + L d n n όπου Β max είναι το μέγιστο ποσό της ABA-[ 14 C]σπερμίνης που προσδένεται στο 5S rrna και K d η ολική σταθερά διάστασης του συμπλόκου LR n. Οι τιμές των Β max και Κ d υπολογίστηκαν με ανάλυση μη-γραμμικής συσχέτισης, χρησιμοποιώντας την εξίσωση Hill του προγράμματος Microcal Origin 6.00 (Microcal Software, Inc.). Οι θέσεις δέσμευσης της ABA-[ 14 C]σπερμίνης/μόριο 5S rrna προσδιορίστηκαν διαιρώντας την τιμή Β max με την ποσότητα του 5S rrna. 78

80 6.4. Δομικές μελέτες Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting analysis) Μια πειραματική προσέγγιση για την εύρεση θέσεων δέσμευσης προσδετών, όπως η ΑΒΑ-σπερμίνη, στο ριβοσώμα είναι η τεχνική ανάλυσης αποτυπώματος (Christiansen et al, 1990). Η τεχνική βασίζεται στο γεγονός ότι νουκλεοτίδια του rrna στα οποία δεσμεύονται προσδέτες, σε απόσταση <4,5 Ǻ, προστατεύονται από χημική τροποποίηση. Ως χημικοί τροποποιητές χρησιμοποιούνται διάφορες ριβονουκλεάσες (Τ1,Τ2, CV ή V1), οι οποίες διασπούν υδρολυτικά το ριβοσωματικό κορμό, πλην της περιοχής που προστατεύεται από τον προσδέτη. Εναλλακτικά, ως χημικοί τροποποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντιδραστήρια (DMS, CMCT, KE, DEP και Pso) που τροποποιούν εκλεκτικά βάσεις του rrna, όταν οι τελευταίες βρίσκονται εκτός της περιοχής δέσμευσης του προσδέτη και είναι μονόκλωνες. Και στις δυο περιπτώσεις, οι περιοχές θραύσεως (υδρολυτικά ένζυμα) ή τροποποίησης (τροποποιητικά αντιδραστήρια) μπορούν να ταυτοποιηθούν με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης τροποποιημένων νουκλεοτιδίων με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (Primer extension analysis) Για τον προσδιορισμό των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων, είτε με ομοιοπολική δέσμευση προσδέτη (ΑΒΑ-σπερμίνη), είτε με χημικούς τροποποιητές (DMS, CMCT, KE), χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis). Σύμφωνα με την αρχή της τεχνικής αυτής, η μεταγραφή του rrna σε cdna από το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης (Reverse Transcriptase) διακόπτεται ένα νουκλεοτίδιο πριν την τροποποίηση. Η ανίχνευση της τροποποιημένης βάσης εμφανίζεται ως ζώνη στα αυτοραδιογραφήματα μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6%. Η εύρεση της ακριβούς θέσης της προσδιορίστηκε με ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) που έγινε 79

81 παράλληλα. Οι εκκινητές (primers) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 17-20μερή DNA ολιγονουκλεοτίδια και περιείχαν 50% GC και στο 3 άκρο είχαν G ή C. Για κάθε δείγμα τροποποιημένου rrna παρασκευάστηκαν 9 μl διαλύματος που περιείχε: 2 μl από τον εκκινητή (10 ng/μl), 2 μl από διάλυμα υβριδοποίησης (4,5x), 3 μl mq-h 2 O και 2 μl από το εκχυλισμένο RNA (6 μg). Το rrna αποδιατάχθηκε στους 95 0 C, για 1.5 min και στη συνέχεια, έγινε υβριδοποίηση του εκκινητή στους C, για 10 min. Στο προϊόν προστέθηκαν 4 μl μείγματος προέκτασης (extention mix, περιείχε dntps, a- [ 32 P] ATP), 2 μl από το ένζυμο AMV αντίστροφη μεταγραφάση (1,5 units) και 2 μl mq-h 2 O. Στην περίπτωση των δειγμάτων ανάλυσης αλληλουχίας, αντί mq-h 2 O προστέθηκαν 2 μl από ένα συγκεκριμένο ddntp (ddatp, ddttp, ddctp, ddgtp). Η αντίδραση πολυμερισμού της αντίστροφης μεταγραφάσης έγινε στους 42 0 C, για 1 h και ολοκληρώθηκε με προσθήκη 3,4 μl chase mix (1 mm για κάθε dntp) και επώαση για 30 min. To cdna που δημιουργήθηκε κατακρημνίστηκε με αιθανόλη και ψύξη στους C, o/n. Το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στις rpm για 40 min, αποξηράθηκε σε spead vac για 2 min, και αφού συμπληρώθηκε με 21 μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης, αφέθηκε για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Πριν ηλεκτροφορηθεί, αποδιατάχθηκε για 2 min στους 95 0 C και ψύχθηκε σε πάγο. 7 μl από το τελικό διάλυμα ηλεκτροφορήθηκαν αμέσως σε πηκτή 6% πολυακρυλαμιδίου, ενώ η υπόλοιπη ποσότητα φυλάχτηκε για επαναληπτικό πείραμα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή τοποθετήθηκε προσεκτικά σε χαρτί Whatman, αποξηράνθηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση με PhosphoImager αναλυτή ( 6.1.2) Ταυτοποίηση θέσεων σταυροσύνδεσης ΑΒΑ-σπερμίνης Η δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο rrna ανιχνεύθηκε ως σήμα παύσεων της μεταγραφής από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση. Οι θέσεις παύσεων προσδιορίστηκαν με primer extension analysis. 80

82 Παρασκευή δειγμάτων Η ταυτοποίηση των θέσεων δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης εστιάστηκε στο 5S rrna, είτε αυτό ήταν ελεύθερο σε διάλυμα ( , ), είτε σε 50S ριβοσωμικές υπομονάδες ( ) είτε, σε 70S post ριβοσωματικά σύμπλοκα (ριβοσωματικά σύμπλοκα μετά τη μετατόπιση) ( ). Οι θέσεις πρόσδεσης ταυτοποιήθηκαν σε διάφορες συνθήκες: (i) παρουσία ή μη μεταφραστικών παραγόντων (FWR) κατά την φωτοσήμανση, (ii) φωτοσήμανση με: (α) 50 μμ, (β) 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη Φωτοσήμανση 50S ριβοσωμικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων Η φωτοσήμανση 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S postριβοσωμάτων με το φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης έγινε μετά από ενεργοποίηση αυτών σε ρυθμιστικό διάλυμα φωτοσήμανσης για 10 min, στους 37 0 C. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν παρουσία (α) 50 μm, (β) 300 μm ABA-σπερμίνης για 20 min στους 25 0 C, απουσία φωτός. Μετά το πέρας της επώασης τα δείγματα ψύχθηκαν στους 4 0 C και ακτινοβολήθηκαν από πηγή φωτός 300 nm (UltraViolet-B, ll 40W, 12RS, Phillips) που απείχε 5 cm από το δείγμα. Η φωτοσήμανση τερματίστηκε προσθέτοντας στο διάλυμα επώασης 100 μm DTT. Tο προϊόντα της φωτοσήμανσης κατακρημνίσθηκαν με 0.65 όγκους EtOH (-20 0 C, o/n). Τα ιζήματα που προέκυψαν ύστερα από φυγοκέντρηση των δειγμάτων (12000 rpm, επιτραπέζια φυγόκεντρο, 45 min), διαλύθηκαν σε mq-h 2 O. Ακολούθησε απομόνωση του rrna, όπως περιγράφεται στην επόμενη παράγραφο Εκχύλιση του rrna H απομόνωση του τροποποιημένου rrna έγινε με τρεις διαδοχικές εκχυλίσεις. Συγκεκριμένα, στα δείγματα προστέθηκε ίσος όγκος φαινόλης, ακολούθησε ισχυρή ανάδευση (vortex) για 2 min στους 25 0 C, και επώαση για 1 min, στους 0 0 C. H ανάδευση και επώαση επαναλήφθηκε 5 φορές και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 7000 rpm (επιτραπέζια φυγόκεντρος), για 5 81

83 min, στους 4 0 C. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαδοχική εκχύλιση, αρχικά με ίσο όγκο φαινόλης-χλωροφορμίου (CHCl 3 ), και στη συνέχεια με ίσο όγκο μόνο χλωροφορμίου. Τα τελικά υπερκείμενα κατακρημνίσθηκαν με ψυχρή αιθανόλη και το ιζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις rpm, για 30 min, στους 4 0 C. Στη συνέχεια, τα ιζήματα αποξηράθηκαν για 2 min σε Spead Vac και αναδιαλύθηκαν σε 10 μl mq-h 2 O. Ακολούθησε φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 260 nm και περαιτέρω αραίωση ώστε τα δείγματα να έχουν τελική συγκέντρωση σε rrna 3 μg/μl Φωτοσήμανση ελεύθερου 5S rrna Ελεύθερο 5S rrna ( , ), ενεργοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωτοσήμανσης για 15 min, στους 37 0 C. Για την φωτοσήμανση του 5S rrna ακολουθήθηκε η πορεία που αναφέρεται στην Το φωτοσημασμένο rrna απομονώθηκε με αιθανολική κατακρήμνιση (προσθήκη 1/10 όγκων διαλύματος 3Μ CH 3 COONa ph 5,5 και 2,5 όγκων EtOH, στους C, o/n), φυγοκέντρηση (12000 rpm, επιτραπέζια φυγόκεντρο, 45 min) και διάλυση σε mq-h 2 O. Ακολούθησε φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 260 nm και περαιτέρω αραίωση, ώστε τα δείγματα να έχουν τελική συγκέντρωση 3 μg/μl Προσδιορισμός θέσεων δέσμευσης ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Για τον προσδιορισμό των θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης χρησιμοποιήθηκε DNA primer συμπληρωματικός της περιοχής του 5S rrna. Με τον τρόπο αυτό ελέγχθηκε όλο το 5S rrna εκτός του 3 -άκρου (νουκλεοτίδια ). Για την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στην περιοχή του 5S rrna, φωτοσημασμένο με ΑΒΑ-σπερμίνη 5S rrna σημάνθηκε στο 3 -άκρο με [5-32 P] pcp και T4 RNA λιγάση. Ακολούθησε προέκταση του επισημασμένου 3 -άκρου με σύζευξη 38-ολιγονουκλεοτιδίου [5 -(Α) 21 (G) 10 (A) 7-3 ], χρησιμοποιώντας το ίδιο ένζυμο. Το προιόν 82

84 απομονώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 8% (w/v) πολυακρυλαμίδιο/7μ ουρία. Ακολούθησε primer extension analysis χρησιμοποιώντας ως primer δεοξυ-νουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στο προεκτεινόμενο άκρο (5 -(T) 7 (C) 10-3 ). Για την ταυτοποίηση διακοπών της αντίδρασης προέκτασης εκκινητή, λόγω μη ειδικής φωτοενσωμάτωσης ή αυτόνομων stops, έγιναν πειράματα με μη φωτοσημασμένο 5S rrna, καθώς επίσης και πειράματα στα οποία τα δείγματα φωτοσημάνθηκαν παρουσία 250x περίσσειας ελεύθερης σπερμίνης. Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της primer extension analysis και για την εύρεση τυχόν θέσεων φωτοενσωμάτωσης, μη αναγνωρίσιμων από την αντίστροφη μεταγραφάση, δείγματα φωτοσημασμένα με: (i) 50 μμ (ii) 300 μμ ΑΒΑ-[ 14 C] σπερμίνη, παρουσία ή μη μεταφραστικών παραγόντων, υβριδοποιήθηκαν με επιλεγμένα ζεύγη 11-δεοξυνουκλεοτιδίων, συμπληρωματικών στο 5S rrna, σε απόσταση 40 νουκλεοτιδίων μεταξύ τους. Ακολούθησε πέψη με RNase H και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 8% (w/v) πολυακρυλαμίδιο/7μ ουρία Χημική Τροποποίηση του 5S rrna Η χημική τροποποίηση και η ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει προταθεί από την ερευνητική ομάδα του Noller (Moazed et al, 1989a, Stern et al, 1988), με μερικές τροποποιήσεις που βασίστηκαν σε πιο πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα (Christiansen et al, 1990, Rodriguez-Fonseca et al, 1995, Xiong et al, 2005). Οι χημικοί τροποποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: (i) DMS που μεθυλιώνει το Ν7 της γουανίνης, το Ν1 της αδενίνης και το Ν3 της κυτοσίνης, (ii) CMCT που τροποποιεί το Ν3 της ουρακίλης και το Ν1 της γουανίνης και (iii) κεθοξάλη (KE) που τροποποιεί το Ν1 και Ν2 της γουανίνης (Σχήμα 6.3.). Πλην της τροποποίησης στη θέση Ν7 της γουανίνης από DMS, όλες οι υπόλοιπες αναγνωρίζονται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, το οποίο τερματίζει το σχηματισμό cdna αλυσίδας ένα νουκλεοτίδιο πριν από αυτό που έχει τροποποιηθεί. Κατά συνέπεια, ανάλυση των cdna προϊόντων της αντίστροφης μεταγραφάσης με ηλεκτροφόρηση καθιστά δυνατή την 83

85 ταυτοποίηση των θέσεων τροποποίησης. Η ταυτοποίηση της Ν7 τροποποίησης ανιχνεύεται με άλλη μέθοδο (Ehresmann et al, 1987). Η τροποποίηση του μακρομορίου-στόχου έγινε ως εξής: DMS τροποποίηση: 3 μl DMS (αραιωμένο 1:5 σε EtOH) προστέθηκαν σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος χημικής τροποποίησης, τα οποία περιείχαν 32,3 A 260/ml rrna, (5S, 50S υπομονάδες, 70S post-ριβοσωματικά σύμπλοκα). Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C, για 10 min. Η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη 25 μl διαλύματος DMS stop, και τα προϊόντα απομονώθηκαν με εκχύλιση με φαινόλη. CMCT τροποποίηση: Αντί DMS χρησιμοποιήθηκαν 100 μl CMCT (42 mg/ml). Ακολούθησε επώαση για 20 min, στους 37 0 C. Η αντίδραση διακόπηκε κατευθείαν με εκχύλιση με φαινόλη. ΚΕ τροποποίηση: Αντί DMS χρησιμοποιήθηκαν 5 μl KE (35 mg/ml αραιωμένη σε 20% EtOH). Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C, για 10 min και στη συνέχεια προστέθηκαν 7 μl 500 mm βορικού οξέος. Η διακοπή της αντίδρασης έγινε με εκχύλιση με φαινόλη Εντοπισμός αλλαγών διαμόρφωσης στο ριβόσωμα Για τον εντοπισμό αλλαγών διαμόρφωσης στο ριβόσωμα, που προκλήθηκαν λόγω φωτοσήμανσης του 5S rrna, πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν post- ή pre-ριβοσωματικά σύμπλοκα που περιείχαν φωτοσημασμένο ή μη φωτοσημασμένο 5S rrna, τα οποία στη συνέχεια υπέστησαν χημική τροποποίηση, όπως εδείχθει στη προηγούμενη παράγραφο. Ακολούθησε προσδιορισμός των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή, όπως περιγράφεται στην παράγραφο

86 A O * * H 3 COSOCH NCNCH 2 CH 2 N 3 O CH 3 O CH 3 CH 2 O * * CH 3 CHCCH OO DMS CMCT KE Β O O DMS N 7 H 2 N H 2 N N 1 A N N 9 C' Ri HN 3 CMCT U N CMCT 1 HN KE G N N 9 C' Ri HN 3 DMS C N DMS N O C' Ri H 2 N O C' Ri Αδενίνη Ουρακίλη Γουανίνη Κυτοσίνη Γ Α U G Σχήμα 6.3.: (Α) Χημικοί τροποποιητές (τα άτομα που αντιδρούν είναι σημειωμένα με αστερίσκο). (Β) Τα άτομα στις βάσεις που τροποποιούνται από ένα χημικό τροποποιητή, σημειώνονται με βέλος. (Γ) Τροποποιημένη αδενίνη από DMS, ουρακίλη από CMCT και γουανίνη από ΚΕ (Ehresmann et al, 1987). 85

87 6.5. Λειτουργικές μελέτες Ανασυγκρότηση 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων (Reconstitution) Η διαδικασία ανασυγκρότησης 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων έγινε σύμφωνα με πρωτόκολλο που σχεδιάστηκε από τον Nierhaus (Dolhme and Nierhaus, 1976b), με μικρές τροποποιήσεις. Για την παρασκευή 50S ανασυγκροτημένων ριβοσωματικών υπομονάδων, 23S και 5S rrna (μοριακή αναλογία 23S:5S, 24:1) επωάστηκαν παρουσία TP50 (μοριακή αναλογία 50S:TP50, 1:1) για 20 min, στους 44 0 C σε ρυθμιστικό διάλυμα ανασυγκρότησης. Στη συνέχεια προστέθηκε (CH 3 COO) 2 Mg, ώστε η τελική συγκέντρωση του δείγματος σε ιόντα Mg 2+ να είναι 20 mm και το μίγμα επωάστηκε για άλλα 60 min, στους 50 0 C. Σημειώνεται, πως για τις μελέτες ήταν απαραίτητη η ανασυγκρότηση 50S ριβοσωματικών υπομονάδων, οι οποίες έφεραν είτε άθικτο 5S rrna, είτε 5S rrna φωτοσημασμένο με (i) 50 μμ ή (ii) 300 μμ ABA-σπερμίνη. Για την ανασυγκρότηση 70S ριβοσωμάτων, ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες επωάστηκαν με άθικτες 30S υπομονάδες (μοριακή αναλογία 50S:30S, 1:2) στους 37 0 C για 60 min σε ρυθμιστικό διάλυμα ανασυγκρότησης (Blaha et al, 2002). Σημειώνεται ότι η περίσσεια 30S υπομονάδων βοήθησε, ώστε να αντιδράσει το μέγιστο δυνατό ποσοστό των ελεύθερων 50S υπομονάδων (Blaha et al, 2000). Τα 70S ανασυγκροτημένα ριβοσώματα είτε έφεραν άθικτο 5S rrna, είτε ήσαν ελλιπή σε 5S, είτε έφεραν 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ή 300 μμ ABA-σπερμίνη Μέτρηση ανασυγκρότησης 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων Προκειμένου να μελετηθούν αλλαγές στην ικανότητα ανασυγκρότησης 50S ριβοσωματικών υπομονάδων ή 70S ριβοσωμάτων, παρασκευάσματα ανασυγκρότησης υπέστησαν υπερφυγοκέντρηση (26000 rpm, 6 h, στους 4 0 C, Beckman SW28) σε 10-30% διαβαθμισμένη σουκρόζη σε ρυθμιστικό διάλυμα 86

88 υπερφυγοκέντρησης ανασυσταμένων ριβοσωματικών συστατικών. Το ποσοστό ολικής ανασυγκρότησης προσδιορίστηκε μελετώντας τα προφίλ της απορρόφησης των δειγμάτων στα 260 nm (φωτόμετρο συνεχούς ροής). Σημειώνεται, ότι μελετήθηκαν 50S ανασυγκροτημένες ριβοσωματικές υπομονάδες και 70S ανασυγκροτημένα ριβοσωμάτα ( 6.5.1), τα οποία έφεραν: (i) άθικτο 5S rrna, (ii) ελλιπή σε 5S rrna (iii) φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ή (iv) φωτοσημασμένο 5S rrna με 300 mm ΑΒΑ-σπερμίνη ( ) Μέτρηση της ικανότητας πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στο ριβόσωμα (Binding) Η ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα μελετήθηκε, επωάζοντας Ac[ 3 H]Phe-tRNA με poly(u) προγραμματισμένα, ανασυσταμένα ριβοσωματικά σύμπλοκα, για την πρόσδεση στην Ρ- θέση ή στην Α-θέση. Τα ανασυσταμένα 70S ριβοσωμικά σύμπλοκα που μελετήθηκαν έφεραν: (i) άθικτο 5S rrna, (ii) φωτοσημασμένο 5S rrna με 50μΜ ΑΒΑσπερμίνη και (iii) ελλιπή σε 5S rrna. Πραγματοποιήθηκαν δυο σειρές πειραμάτων: α) πειράματα απουσία ελεύθερης σπερμίνης και β) πειράματα παρουσία 50 μμ σπερμίνης. Για την παρασκευή 70S ριβοσωμάτων με καλυμμένη την Ρ-θέση από trna Phe, ανασυσταμένα 70S ριβοσώματα (100 pmol/ml) ενεργοποιήθηκαν με επώαση στους 37 ο C για 10 min. Τα ριβοσώματα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 25 0 C (6,30 min απουσία σπερμίνης ή 27 min παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης), με 0,37 mg/ml poly(u), 400 μg/ml FWR, 200 pmol/ml trna Phe, 0,4 mm GTP σε ρυθμιστικό διάλυμα Γ (Ρ-ριβοσωματικά σύμπλοκα) Ολική πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στα ανασυσταμένα 70S ριβοσώματα Η ολική πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA προσδιορίστηκε, επωάζοντας 70S ριβοσώματα (100 pmol) σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος που περιείχε: 0,37 mg poly(u), 400 μg FWR, 1000 pmol Ac[ 3 H]Phe-tRNA, 0,4 mm GTP και 87

89 ± 50μΜ σπερμίνη, στους 25 0 C για διάφορους χρόνους. Η αντίδραση διακόπηκε, μετά την παρέλευση του κατάλληλου χρόνου, με προσθήκη του δείγματος σε 2 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος Γ (± 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης) και διήθηση αυτού σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης (το φίλτρο έχει την ιδιότητα να συγκρατεί ριβονουκλεο-πρωτεϊνικά σύμπλοκα). Το φίλτρο πλύθηκε γρήγορα άλλες δυο φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα Γ (± 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης) χωρίς να διέλθει αέρας μέσω αυτού και τέλος, διαλυτοποιήθηκε σε 15 ml υγρού σπινθηρισμού Bray s. Το διάλυμα που προέκυψε, μετρήθηκε σε μετρητή σπινθηρισμού β ακτινοβολίας (Rackbeta 1290, Wallac, Pharmacia, USA). Απουσία σπερμίνης η μέγιστη πρόσδεση παρατηρήθηκε με επώαση του μίγματος στα 6,30 min, στους 25 0 C, ενώ παρουσία ελεύθερης σπερμίνης η μέγιστη πρόσδεση παρατηρήθηκε στα 25 min, στην ίδια θερμοκρασία Πρόσδεση Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Α- θέση Η μελέτη της πρόσδεσης του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Α-θέση των ριβοσωμικών συμπλόκων, έγινε ακολουθώντας την πορεία της προηγούμενης παραγράφου, αλλά χρησιμοποιώντας Ρ-ριβοσωματικά σύμπλοκα Πρόσδεση Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Ρ- θέση Η πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην P- θέση των ριβοσωμικών συμπλόκων προσδιορίστηκε από το γινόμενο της ολικής πρόσδεσης επί το βαθμό της έκτασης της αντίδρασης πουρομυκίνης (2 mm, για 2 min, στους 25 0 C) Αντίδραση πουρομυκίνης Η αντίδραση πουρομυκίνης χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση της δραστικότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Πραγματοποιήθηκε μεταξύ ανασυσταμένων ριβοσωματικών συμπλόκων που είχαν δεσμευμένο trna στην Ε-θέση και Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Ρ- θέση (post-complex) και της πουρομυκίνης. Το αντιβιοτικό αυτό προσδένεται στην Α-θέση ως ψευδο- 88

90 υπόστρωμα και δημιουργεί πεπτιδικό δεσμό με το Ac[ 3 H]Phe-tRNA που είναι δεσμευμένο στην Ρ-θέση. Το προϊόν της αντίδρασης Ac[ 3 Η]Phe-Puro ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της ραδιενέργειάς του (Fico and Coutsogeorgopoulos, 1972) Πειραματική πορεία Post-complex παρασκευάστηκε και προσροφήθηκε σε φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης. Το σύμπλοκο προστέθηκε σε φιαλίδια αντίδρασης (vials), τα οποία περιείχαν 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα Γ, ± 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης, και συγκεκριμένη ποσότητα πουρομυκίνης (0,1 mm, 0,2 mm, 0,4 mm και 2 mm). Η αντίδραση πουρομυκίνης πραγματοποιήθηκε με σταθερή ανάδευση των φιαλιδίων σε ανακινούμενο υδατόλουτρο, στους 25 ο C, και για καθορισμένο χρονικό διάστημα (15 sec-20 min). Μετά το πέρας του επιθυμητού χρόνου, η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 1ml 1Ν ΝaΟΗ. Η ανακίνηση στους 25 ο C συνεχίστηκε για τουλάχιστον 20 min μετά την προσθήκη του ΝaOH, ώστε να επιτευχθεί πλήρης υδρόλυση της περίσσειας του Ac[ 3 H]Phe-tRNA που δεν αντέδρασε. Για τον υπολογισμό του ποσοστού μετατροπής του Ac[ 3 H]Phe-tRNA σε προϊόν (Ac[ 3 H]Phe-Puro), ποσότητα 0,8 ml από το μείγμα επώασης της αντίδρασης μεταφέρθηκε σε φιαλίδιο (vial) και προστέθηκε σε αυτήν σπινθηριστικό υγρό Opti-fluor (5 ml) για μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας (μετρητής β ακτινοβολίας). Με τον τρόπο αυτό προσδιορίστηκε το συνολικό ποσό ραδιενέργειας (N o ), που αντιστοιχεί στο προϊόν Ac[ 3 Η]Phe-Puro και στο Ac[ 3 Η]Phe-tRNA που δεν αντέδρασε. Στη συνέχεια, μεταφέρθηκε ποσότητα 0,8 ml από το μείγμα επώασης σε σωλήνα φυγοκέντρου και προστέθηκαν 2 ml οξικού αιθυλεστέρα. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση σε vortex για 2 min και διαχωρισμός των δυο φάσεων, με φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 20 sec. Από τα 2 ml της οργανικής φάσης ελήφθησαν 1,5 ml, στα οποία προστέθηκε υγρό σπινθηριστικό Opti-fluor (5 ml). Επειδή το προϊόν (Ac[ 3 Η]Phe-Puro) στερείται φορτίων κατανέμεται στην φάση του οξικού αιθυλεστέρα (άνω οργανική φάση), ενώ το ανιόν Ac[ 3 Η]Phe - 89

91 μεταβαίνει στην υδατική φάση. Πολλαπλασιάζοντας την προηγούμενη μέτρηση με τον διορθωτικό παράγοντα 1,33 (2ml/1,5 ml), προσδιορίστηκε το ποσό της ραδιενέργειας που αντιστοιχεί στο προϊόν της αντίδρασης (Ν). Ο λόγος Ν/N 0 x 100 έδωσε το ποσοστό μετατροπής του Ac[ 3 H]Phe-tRNA σε προϊόν (x). Η μέτρηση της ραδιενέργειας διορθώθηκε για την παρεμβολή του διαλύτη (quenching), με ειδικό πρόγραμμα του μετρητή ραδιενέργειας. Παράλληλα με την αντίδραση πουρομυκίνης, πραγματοποιήθηκαν και τυφλά πειράματα, ώστε να προσδιοριστεί το ποσοστό μετατροπής του Ac[ 3 H]PhetRNA σε προϊόν χωρίς την προσθήκη πουρομυκίνης. Η τιμή του τυφλού ήταν περίπου 2% και βρίσκεται στα όρια του φυσιολογικού σφάλματος. Τέλος, στο ποσοστό μετατροπής x έγιναν άλλες δυο σημαντικές διορθώσεις: Επειδή το σύμπλοκο C αποικοδομείται κατά την αντίδραση πουρομυκίνης, ιδίως απουσία πολυαμινών, υπολογίσθηκε το ποσοστό διάσπασής του στους χρόνους που έγινε η αντίδραση. Στη συνέχεια, η τιμή του x διαιρέθηκε με τον παράγοντα Α, ο οποίος ήταν ίσος με το λόγο του ποσοστού του συμπλόκου C που μετρήθηκε στο τέλος της περιόδου επώασης διά του ποσοστού του συμπλόκου C στο χρόνο μηδέν (Drainas & Kalpaxis, 1994). Επειδή κατά τη σύνθεση του συμπλόκου C δημιουργούνται και άλλα σύμπλοκα που δεν αντιδρούν με την πουρομυκίνη, το ποσοστό μετατροπής x διορθώθηκε με τον παράγοντα α. Αυτός ήταν ίσος με την έκταση (extent) της αντίδρασης πουρομυκίνης. Με τη διόρθωση αυτή, οι τιμές του x ανάγονται στη θεωρητική κατάσταση, όπου 100% του προσδενόμενου Ac[ 3 H]Phe-tRNA αντιδρά ποσοτικά με την πουρομυκίνη (Synetos et al, 1987) Κινητική ανάλυση και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων Στο παρακάτω κινητικό σχήμα περιγράφεται η αντίδραση που πραγματοποιείται μεταξύ του ριβοσωματικού συμπλόκου Αc[ 3 Η]PhetRNA 70S ριβόσωμα poly(u) και της πουρομυκίνης: 90

92 K s k 3 C + S CS C' + P Σχήμα 6.4.: Κινητικό σχήμα της αντίδρασης πουρομυκίνης. C είναι το σύμπλοκο Αc[ 3 Η]Phe-tRNA 70S ριβόσωμα poly(u), S είναι η πουρομυκίνη, P είναι το προϊόν (AcPhe-Puro) και C είναι το ριβοσωματικό σύμπλοκο C που δεν έχει AcPhetRNA στη θέση Ρ, με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης. Όταν το υπόστρωμα πουρομυκίνης (S), προστίθεται σε περίσσεια προς το C, η αντίδραση πουρομυκίνης, αν και διμοριακή, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως. Η συγκέντρωση πουρομυκίνης μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και θεωρείται σταθερή. Υπολογισμός των κινητικών σταθερών Κ s και k 3 Ό υπολογισμός των κινητικών σταθερών προκύπτει από την ολοκλήρωση του κινητικού νόμου της αντίδρασης πουρομυκίνης. Η ολική συγκέντρωση (C o ) του συμπλόκου C είναι: C o = C + CS + C, και επειδή C = P προκύπτει: Η ταχύτητα της αντίδρασης δίνεται από τη σχέση : C o - P = C + CS (1) d[p] v = = [ CS] k dt 3 (2) Διαιρώντας τις σχέσεις (2) και (1) κατά μέλη, έπεται: ( 2) ( 1) [ ] v CS k3 = C P = [C] + [CS] o (3) 91

93 Η σταθερά διαστάσεως K s δίνεται από την εξίσωση: K S [ C ][ S] [ ] [ ] = CS = CS [ ][ ] C S K S και με αντικατάσταση του [CS] στην (3) προκύπτει ο διαφορικός κινητικός νόμος της αντίδρασης πουρομυκίνης: [ ][ ] CS v KS Co P = C+ K [ CS ][ ] [ ] v Sk = C P K + o S S 3 k [ S] 3 [ S] v K k S = Co P 1+ K v = ( C )[ ] K + [ S] P Sk 3 [ S] o 3 S S v = C P o [ S] K k S KS + K (4) 3 [ S] S Ο διαφορικός κινητικός νόμος με ολοκλήρωσή γίνεται : [ P] ( Co P) k 3[] S = dt K + [] S [ P] k 3[ S] = P K + [] S d d d[p] k v = dt = C C P K S o S p p = o o t t= 0 S [] S + [] S 3 dt [ ] [ ] ln C o = k3 S C P K + S t=k t obs o S (5) Ολοκληρωμένος κινητικός νόμος Στον ολοκληρωμένο κινητικό νόμο, k obs είναι η φαινομενική σταθερά ψευδοπρώτης τάξεως και ισούται με: k obs = k 3 [S] / K s +[S] (6) Ο ολοκληρωμένος κινητικός νόμος γράφεται και στην εξής μορφή: ln 100 k 100 x = obs t (7) 92

94 όπου x = P/C o 100 αντιστοιχεί στο % ποσοστό του Ac[ 3 H]Phe-tRNA που μετατρέπεται σε προϊόν. Από τη σχέση (7) συμπεραίνεται, ότι η συνάρτηση του ln[100/(100-x)] έναντι του χρόνου t, είναι ευθεία γραμμή (Σχήμα 6.5α). Συνεπώς, από την κλίση της ευθείας αυτής μπορεί κανείς να υπολογίσει την τιμή της k obs για μια συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης. Επαναλαμβάνοντας το πείραμα και για άλλες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, υπολογίζονται οι αντίστοιχες τιμές της k obs. Από τις τιμές αυτές σχεδιάζεται το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (DR-plot), δηλαδή η γραφική παράσταση του 1/k obs έναντι του 1/[S] (εξίσωση 8). 1 k obs KS = k + [ S] KS 1 1 = + [] S k3 [] S k3 3 (8) Εξίσωση διπλού αντιστρόφου Τέτοια διαγράμματα (Σχήμα 6.5β) χρησιμοποιήθηκαν για υπολογισμό των σταθερών K s και k 3, που περιγράφουν την ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. 3,5 1,0 3,0 ln 100 / (100 - x) 0,8 0,6 0,4 [S]=0,1 mm 1/k obs ( min ) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,2 0,5 1/k 3 Κλίση= k obs 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 t -1/K s 0,0 0,5 1, / [S] (μμ -1 ) Σχήμα 6.5: (Α) Θεωρητική ημι-λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης σε μια συγκέντρωση πουρομυκίνης, (Β) Θεωρητικό διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (DR plot) για την αντίδραση πουρομυκίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης 93

95 Μελέτη της μετατόπισης των υποστρωμάτων (translocation) Για τον έλεγχο της μετατόπισης των υποστρωμάτων trnas από την Α- στην Ρ- θέση χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Dinos et al (2004) με μερικές τροποποιήσεις (Σχήμα 6.6). Για την κάλυψη της Ρ-θέσης ριβοσωμάτων από αποακυλιωμένο trna, 1,6 pmoles ανασυσταμένων ριβοσωμάτων τα οποία έφεραν είτε άθικτο, είτε φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ABA-σπερμίνη, επωάστηκαν για 15 min στους 37 0 C, σε τελικό όγκο 12 μl ρυθμιστικού διαλύματος Γ, απουσία/ παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης, το οποίο περιείχε poly(u) (ώστε τελική συγκέντρωση σε poly(u) να είναι 0,37 mg/ml) και περίσσεια trna Phe (μοριακή αναλογία trna Phe : ριβοσώματα, 2 : 1). Διατηρώντας σταθερές τις ιοντικές συνθήκες, προστέθηκε Ac[ 3 H]Phe-tRNA σε μοριακή αναλογία 1,5:1 προς τα ριβοσώματα και το μίγμα επωάστηκε για 30 min στους 37 0 C. Μετά την πρόσδεση του Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Α- θέση του ριβοσώματος (precomplex), ακολούθησε προσθήκη GTP (σε τελική συγκέντρωση 0,12 mm) και του παράγοντα EF-G (σε τελική συγκέντρωση 0,015 μm) και το μίγμα επωάστηκε για διάφορους χρόνους (0-10 min), στους 25 0 C. Σχήμα 6.6.: Σχηματική αναπαράσταση ελέγχου του σταδίου της μετατόπισης. (Ι) 70S προγραμματισμένα ριβοσώματα με poly(u) και αποακυλιωμένο trna Phe στην Ρ- θέση. (ΙΙ) Σχηματισμός προ-μετατοπισμένου συμπλόκου (pre-complex) με προσθήκη Ac[ 3 H]Phe-tRNA. (III) Προσθήκη EF-G και σχηματισμός μετα-μετατοπισμένου συμπλόκου (post-complex) (ΙV) Αντίδραση πουρομυκίνης για την ταυτοποίηση των συμπλόκων. 94

96 Το ποσό του Ac[ 3 H]Phe-tRNA που δεσμεύτηκε στην Α-θέση του ριβοσώματος (pre-complex) υπολογίστηκε με διήθηση του μίγματος σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης και τιτλοδότηση με πουρομυκίνη. Tο ποσό του Ac[ 3 H]PhetRNA που μετατοπίστηκε στην P- θέση (post-complex) ανιχνεύτηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης (2 mm για 2 min, 25 0 C). To διάλυμα πουρομυκίνης περιείχε επιπρόσθετα το αντιβιοτικό θειοστρεπτόνη σε τελική συγκέντρωση 5 mm, έτσι ώστε να αποφεύγεται περαιτέρω μετατόπιση κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Η αυθόρμητη μετατόπιση (spontaneous translocation) μετρήθηκε απουσία του παράγοντα EF-G. Τέλος, έγιναν πειράματα με αυξανόμενη συγκέντρωση EF-G, επωάζοντας το pre-complex με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις EF-G για 5 min, στους 25 0 C Πρόσδεση EF-G στο ριβόσωμα Ρre-ριβοσωματικά σύμπλοκα μελετήθηκαν για την ικανότητα τους να προσδένουν EF-G. Τα σύμπλοκα παρασκευάστηκαν, όπως αναφέρεται στην παράγραφο , χρησιμοποιώντας ακέραιες 30S ριβοσωματικές υπομονάδες ( ) και 50S υπομονάδες είτε ακέραιες, είτε ανασυσταμένες. Η πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 1,6 pmoles pre-ριβοσωματικά σύμπλοκα προγραμματισμένα με poly(u), επωάστηκαν για 30 min στους 25 0 C, σε ρυθμιστικό διάλυμα Γ (παρουσία/απουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης) τελικού όγκου 12 μl, το οποίο περιείχε 1 μμ EF-G, 10 μm GTP, 5 μci[α- 32 P]GTP (400Ci/mmol) και 0,5 mm φουσιδικό οξύ. 6 μl από το δείγμα επώασης διηθήθηκαν σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Ακολούθησε πλύση, 2 φορές, με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα Γ, διαλυτοποίηση του φίλτρου σε 15 ml υγρού σπινθηρισμού Bray s και μέτρηση της ενσωματωμένης ραδιενέργειας σε μετρητή σπινθηρισμού β ακτινοβολίας (Rackbeta 1290, Wallac, Pharmacia, USA). Παράλληλα, έγιναν πειράματα control, στα οποία τα ριβοσωματικά σύμπλοκα επωάστηκαν απουσία EF-G, καθώς επίσης και πειράματα με P- ριβοσωματικά σύμπλοκα ή 70S ριβοσώματα. 95

97 GTP υδρόλυση Για την μελέτη της ικανότητας του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την GTP υδρόλυση του συμπλόκου EFG-GTP, παρασκευάστηκαν δείγματα των 15 μl τα οποία περιείχαν: 1,6 pmoles pre-ριβοσωματικών σύμπλοκων ( ), 8,8 pmol EF-G, 50 μm GTP, 5 μci [α- 32 P]GTP (400Ci/mmol). Τα δείγματα επωάστηκαν, παρουσία/απουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης, στους 4 ο C. Σε συγκεκριμένους χρόνους έγινε λήψη δείγματος (3 μl) και διακοπή της αντίδρασης, με προσθήκη 1 μl 11 M φορμικού οξέος. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε πάγο για 5 min και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν σε g (επιτραπέζια φυγόκεντρος) για 10 min. Ακολούθησε ανάλυση των δειγμάτων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος (TLC) ( ), σε πλάκα PEI-cellulose F, χρησιμοποιώντας ως διάλυμα ανάπτυξης 1 Μ φορμικό οξύ/1 Μ χλωριούχο λίθιο. Η πλάκα υποβλήθηκε σε ανάλυση σε αναλυτή PhosphoImager και η έκταση της υδρόλυσης ποσοτικοποιήθηκε στο πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας AIDA της Raytest, DE Μελέτη αλλοστερικών σημάτων Η επίπτωση της πρόσδεσης της σπερμίνης στο 5S rrna, στη διαμορφωτική κατάσταση του ριβοσώματος και στην ικανότητά του να δεσμεύει προσδέτες (trnas, EFG), μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της χημικής τροποποίησης ( ) ακολουθούμενη από τη τεχνική της προέκτασης εκκινητή ( ). Η μελέτη εστιάστηκε στις περιοχές δέσμευσης του παράγοντα μετατόπισης EF-G (περιοχές SRL και GAC), στις περιοχές αλληλεπίδρασης του παράγοντα με τη μικρή υπομονάδα, καθώς και στις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσώματος. Τα ριβοσωμικά είδη που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη ήταν: α) ακέραια 70S ριβοσώματα, β) ανασυσταμένα 70S ριβοσώματα ( ) που έφεραν είτε άθικτο είτε φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, και γ) ριβοσώματα ελλιπή σε 5S. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν παρουσία ή μη 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Συγκεκριμένα: 96

98 α) Για την μελέτη της επίδρασης της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη δέσμευση του EF-G, παρασκευάστηκαν pre-ριβοσωματικά σύμπλοκα ( ) και υποβλήθηκαν σε χημική τροποποίηση, παρουσία /απουσία EF-G. Με βάση την βιβλιογραφία, μελετήθηκαν τα εξής νουκλεοτίδια: Στη 50S υπομονάδα: Α2530 (έλικα Η91), Α2476 (έλικα Η89), Α2660 (SRL περιοχή), Α1067 (GAC περιοχή) Στη 30S υπομονάδα: Α790, Α1339 Για την επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην επιδεκτικότητα της Ρ- θέσης του ριβοσώματος στους χημικούς τροποποιητές παρασκευάστηκαν post-ριβοσωματικά σύμπλοκα, ενώ για τις αντίστοιχες μελέτες της Α-θέσης χρησιμοποιήθηκαν pre-ριβοσωμικά σύμπλοκα που έφεραν t-rna Phe και Phe-tRNA στις θέσεις Ρ- και Α- αντίστοιχα ( ). Οι μελέτες αυτές πραγματοποιήθηκαν παρουσία/απουσία ψυχρού AcPhe-tRNA Phe-tRNA. Τα νουκλεοτίδια που μελετήθηκαν ήταν: Ρ-θέση: Α) 30S υπομονάδα: A794, C795 B) 50S υπομονάδα: G2252/53, A2451 και U2584/85 A-θέση: Α) 30S υπομονάδα: Α1492/93 B) 50S υπομονάδα: Ψ2555 και Α

99 98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

100 7. Αποτελέσματα 7.1. Κινητική ανάλυση σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Η αρυλάζιδο-ομάδα (ΑΒΑ), απέχει περίπου 9 Ǻ από την Ν 1 -αμινοομάδα της σπερμίνης. Στο σκοτάδι το αζιδοπαράγωγο αντιδρά αντιστρεπτά με το 5S rrna. Με ακτινοβόληση στα 300 nm, οι αρυλαζιδο-ομάδες μετασχηματίζονται σε νιτρένια τα οποία αντιδρούν ταχύτατα και ομοιοπολικά με γειτονικές ομάδες του μορίου στόχου. 174 pmol ελεύθερου 5S rrna, σε ιοντικές συνθήκες 6 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4 +, φωτοσημάνθηκαν με ABA-[ 14 C]σπερμίνη, σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 0,05-2 mm. Σε κάθε συγκέντρωση του ελεύθερου φωτοαναλόγου (L), το ποσό του ομοιοπολικά δεσμευομένου φωτοαναλόγου (Β) προσδιορίστηκε από την προσροφημένη ραδιενέργεια στο μόριο στόχος (5S rrna). Ο χρόνος φωτοσήμανσης ήταν τέτοιος, ώστε να εξασφαλιστούν τα μέγιστα επίπεδα φωτοενσωμάτωσης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε φωτοσήμανση του 5S rrna παρουσία 250-πλασιας συγκέντρωσης ABA- [ 14 C]σπερμίνης. Για τον προσδιορισμό των κινητικών σταθερών της ομοιοπολικής πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, ήταν απαραίτητη η γνώση της εξειδικευμένης πρόσδεσης (specific binding) του παραγώγου στο μόριο. Η εξειδικευμένη πρόσδεση υπολογίστηκε με προσδιορισμό της μηεξειδικευμένης πρόσδεσης (non-specific binding), δηλ. της φωτοσήμανσης που πραγματοποιήθηκε παρουσία 250-πλασιας συγκέντρωσης σπερμίνης, και αφαίρεσης της από την ολική πρόσδεση (total binding). Επίσης η συγκέντρωση του ελεύθερου, μη ενσωματωμένου αζιδο-παραγώγου (L) υπολογίστηκε με αφαίρεση της συγκέντρωσης του εξειδικευμένα προσδεδεμένου αναλόγου σπερμίνης [Β] spec. στο 5S rrna από την ολική συγκέντρωση του ([F] tot. ). [F] free = [F] tot. - [Β] spec. 99

101 Αντιπροσωπευτικές τιμές της [Β] spec. για διάφορες συγκεντρώσεις της [F] tot. και της [F] free της ΑΒΑ-σπερμίνης δίνονται στο Πίνακα 7.1. Πίνακας 7.1.: Τιμές της ποσότητας (pmol) της εξειδικευμένα προσδεδεμένης ABA- [ 14 C]σπερμίνης, [B] spec., στο 5S rrna. Η ποσότητα του 5S rrna που φωτοσημάνθηκε ήταν 174 pmol. [L] tot. (mm) [Β] tot. (pmol) Β non spec. (pmol) [L] free. (mm) [B] spec. (pmol) ,1 1,7 0,098 11, ,8 3,4 0,195 45, ,1 0,29 85, ,8 0,42 238, ,8 11,0 0,58 340, ,6 0,74 635, ,0 0,90 954, ,5 1,40 988, ,0 1, Συντμήσεις: [L] tot. = ολική συγκέντρωση ABA-[ 14 C]σπερμίνης, [Β] tot. = ολική ποσότητα προσδεμένης ABA-[ 14 C]σπερμίνης, Β non spec. = ποσότητα ABA-[ 14 C]σπερμίνης προσδεδεμένης μη εξειδικευμένα, [L] free. = συγκέντρωση ABA-[ 14 C]σπερμίνης ελεύθερη στο διάλυμα, [B] spec. = συγκέντρωση της εξειδικευμένα προσδεδεμένης ABA- [ 14 C]σπερμίνης. Η γραφική παράσταση των τιμών [Β] spec. έναντι [F] free δίνεται στο Σχήμα 7.1. Η σιγμοειδικότητα της παράστασης δικαιολογεί τη χρήση της εξίσωσης Hill Bmax L B = (1) K + L d n n 100

102 για την κινητική ανάλυση της φωτοσήμανσης του 5S rrna με ABA- [ 14 C]σπερμίνη. Στην εξίσωση (1), [L] είναι η συγκέντρωση της ελεύθερης ABA- [ 14 C]σπερμίνης, Β το ποσό της ομοιοπολικά προσδεδεμένης στο 5S rrna ABA-[ 14 C]σπερμίνης, Β max η τιμή του Β σε συνθήκες κορεσμού, n η σταθερά Hill και K d η ολική σταθερά διάστασης του συμπλόκου μεταξύ του αζιδοαναλόγου και του 5S rrna. Οι τιμές των κινητικών σταθερών Β max και K d υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της «μη γραμμικής εξάρτησης» (non linear regression), χρησιμοποιώντας κατάλληλο πρόγραμμα (Microcal Origin 6.00). Διαιρώντας την τιμή Β max με την ποσότητα του 5S rrna, προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ABA-[ 14 C]σπερμίνης/μόριο 5S rrna και βρέθηκαν να είναι 6,25. Σχήμα 7.1.: Καμπύλη εξειδικευμένης πρόσδεσης της ABA-[ 14 C]σπερμίνη στο 5S rrna. Η ποσότητα του 5S rrna που χρησιμοποιήθηκε στο μείγμα φωτοσήμανσης, ήταν 174 pmol. Τα δεδομένα για την χάραξη της καμπύλης ελήφθησαν από τον Πίνακα 7.1. ( ) Ειδική δέσμευση (specific binding) της ABA-[ 14 C]σπερμίνης στο 5S rrna για διάφορες συγκεντρώσεις του αναλόγου, ( ) μη ειδική δέσμευση (nonspecific binding) του 5S rrna παρουσία 250-πλασιας συγκέντρωσης ελεύθερης σπερμίνης. 101

103 7.2. Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Για τη μοριακή ερμηνεία της επίδρασης των πολυαμινών στο 5S rrna, προϋπόθεση αποτελεί η ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης της σπερμίνης στο μόριο. Μια πειραματική προσέγγιση για την ικανοποίηση αυτής της προϋπόθεσης είναι η φωτοσήμανση συγγενείας. Όπως αναφέρθηκε πριν, η φωτοδραστική πολυαμίνη ΑΒΑ-σπερμίνη, περιέχει μια αζιδοβενζαμίδινο (ΑΒΑ-) ομάδα που συνδέεται στην Ν 1 θέση της σπερμίνης. Η (ΑΒΑ-) προέκταση έχει μήκος ~9Ǻ και συνεπώς, τα άτομα του 5S rrna στα οποία προσδένεται ομοιοπολικά, δεν απέχουν περισσότερο του ενός νουκλεοτιδίου από την Ν 1 ομάδα της σπερμίνης. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες (Clark et al, 1991, Amarantos and Kalpaxis, 2000, Amarantos et al, 2001), το φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης (ΑΒΑ-σπερμίνη), συμπεριφέρεται όμοια με την ελεύθερη σπερμίνη και διατηρεί όλες τις βιοχημικές ιδιότητες της μητρικής ένωσης. Συνεπώς, είναι λογικό να θεωρήσουμε ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη προσδένεται σε εξειδικευμένες θέσεις του 5S rrna, που ταυτίζονται με εκείνες, όπου φυσιολογικά αλληλεπιδρά η ελεύθερη σπερμίνη. Ακολουθώντας την πειραματική προσέγγιση προηγουμένων μελετών (Amarantos and Kalpaxis, 2000, Amarantos et al, 2001, Amarantos et al, 2002, Xaplanteri et al, 2005), ταυτοποιήθηκαν οι θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑσπερμίνης με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (primer extension). Ελεύθερο 5S rrna, 50S ριβοσωματικές υπομονάδες και post-ριβοσωμικά σύμπλοκα φωτοσημάνθηκαν σε δυο συνθήκες: (Α) με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, συγκέντρωση στην οποία αναστέλλεται η πρωτεϊνική σύνθεση και (Β) με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνης, συγκέντρωση που προσεγγίζει τα φυσιολογικά επίπεδα πολυαμινών που υπάρχουν στα κύτταρα και που προκαλεί ενεργοποίηση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης παρουσία μεταφραστικών παραγόντων. Η ομοιοπολική δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, λειτούργησε ως φράγμα κατά τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης. Τα cdna τμήματα που προέκυψαν αναλύθηκαν με gel ηλεκτροφόρηση, όπου από την 102

104 ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα ταυτοποιήθηκαν οι θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο μόριο του 5S rrna. - Σχήμα 7.2.: Αυτοραδιογράφημα ανάλυσης προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) των θέσεων δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, όταν φωτοσημαίνεται post-ριβοσωμικό σύμπλοκο. U, A, C, G είναι οι στήλες ανάλυσης της αλληλουχίας. Στήλη 0: μη φωτοσημασμένο δείγμα (control), στήλη 1: δείγμα φωτοσημασμένο με 50 μm ΑΒΑ-σπερμίνη, στήλη 2: δείγμα φωτοσημασμένο με 50 μm ΑΒΑ-σπερμίνη παρουσία περίσσειας ελεύθερης σπερμίνης, στήλη 3: δείγμα τροποποιημένο με DMS, στήλη 4: δείγμα φωτοσημασμένο με 50 μm ΑΒΑ-σπερμίνη και στη συνέχεια τροποποιημένο με DMS. Ο DNA εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε (συμπληρωματικός της περιοχής του 5S rrna) σάρωσε όλο το 5S, εκτός της περιοχής Προκειμένου να μελετηθεί το 3 -άκρο, το 5S rrna προεκτάθηκε, μετά τη φωτοσήμανση του με ΑΒΑ-σπερμίνη, κατά 38 νουκλεοτίδια με ένα ολιγονουκλεοτίδιο που είχε αλληλουχία 5 -(Α) 21 (G) 10 (A) 7-3. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιήθηκε εκκινητής το ολιγο-δεοξυνουκλεοτίδιο 5 -(Τ) 7 (C)

105 συμπληρωματικό με τμήμα της 3 -προέκτασης. Ένα αντιπροσωπευτικό αυτοραδιογράφημα φαίνεται στο Σχήμα 7.2. Οι θέσεις σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, είτε αυτό είναι ελεύθερο σε διάλυμα, είτε συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες, είτε σε post-ριβοσωματικά σύμπλοκα, συνοψίζονται σε μοντέλο της δευτεροταγούς δομής του 5S rrna (Σχήμα 7.3.). Μια πιο αναλυτική παρουσίαση των νουκλεοτιδίων δέσμευσης της ΑΒΑσπερμίνης, κάτω από διάφορες συνθήκες, δίνεται στον Πίνακα 7.2. Ι Θηλιά Β A ΙΙ ΙΙΙ C V Ε ΙV Θηλιά D Σχήμα 7.3.: Θέσεις δέσμευσης της ABA-SPM στην δευτεροταγή δομή του 5S rrna: (Α) φωτοσήμανση ελεύθερου 5S rrna με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη ( ), (Β) φωτοσήμανση με 50 μμ ABA-σπερμίνη σε ελεύθερο 5S rrna ( ), σε 50S ανασυγκροτημένες υπομονάδες ( ) και σε post ριβοσωματικό σύμπλοκο ( ). Το μήκος των βελών υποδηλώνει την ένταση της ζώνης. 104

106 Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.3., η ΑΒΑ-σπερμίνη προσδέθηκε σε όλο το 5S rrna, εκτός της έλικας I. Οι θέσεις πρόσδεσης ήσαν πιο πυκνές στην έλικα III και τη θηλιά C. Σε μονόκλωνες περιοχές, τα νουκλεοτίδια που φωτοσημάνθηκαν ήταν κυρίως A και C (84%), ενώ όσο αφορά τις δίκλωνες περιοχές, το ποσοστό φωτοσήμανσης ήταν περίπου ίδιο και για τα τέσσερα νουκλεοτίδια. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η αντίστροφη μεταγραφάση σταμάτησε σε ένα νουκλεοτίδιο. Βρέθηκαν μόνο τρεις εξαιρέσεις, στις οποίες δυο γειτονικά νουκλεοτίδια φωτοσημάνθηκαν, μεταξύ των οποίων η πλησιέστερη στο 3 -άκρο αντιστοιχούσε σε ισχυρή ζώνη. Το φαινόμενο πιθανόν να οφείλεται σε «τραύλισμα» (stuttering) της αντίστροφης μεταγραφάσης (Brimacombe et al, 1990). Για την διευκρίνηση διακοπών στο rrna, αυτόνομων stops ή μη ειδικής φωτοενσωμάτωσης, έγιναν πειράματα με μη φωτοσημασμένο 5S rrna καθώς και πειράματα παρουσία 250x περίσσειας ελεύθερης σπερμίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.2., σε περίσσεια ελεύθερης σπερμίνης τα αυθεντικά stops πρακτικά εξαφανίζονται. Από το Σχήμα 7.3. και τον Πίνακα 7.2. φαίνεται ότι ο βαθμός φωτοσήμανσης του 5S rrna εξαρτάται από την συγκέντρωση της ΑΒΑσπερμίνης, καθώς επίσης και από την κατάσταση του 5S rrna, δηλ. αν είναι ελεύθερο ή βρίσκεται ενσωματωμένο σε 50S υπομονάδες ή σε postριβοσωματικά σύμπλοκα, όταν αυτό φωτοσημαίνεται. Αύξηση της συγκέντρωσης της ΑΒΑ-σπερμίνης από 50 σε 300 μμ, αυξάνει την επιδεκτικότητα των νουκλεοτιδίων Α52, Α53 και G56 στο φωτοανάλογο, ενώ, μειώνει τη δέσμευση στα νουκλεοτίδια G67 και Α108. Γενικά, η αύξηση της συγκέντρωσης του φωτοαναλόγου αυξάνει τις θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑσπερμίνης κατά μήκος του 5S rrna μορίου. Φωτοσήμανση 50S υπομονάδων και στη συνέχεια ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, είχε σαν αποτέλεσμα την προστασία αρκετών θέσεων δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές C,D και E. Όσο αφορά τα φωτοσημασμένα post-ριβοσωμικά σύμπλοκα, παρατηρήθηκε αλλαγή στη επιδεκτικότητα αρκετών νουκλεοτιδίων. 105

107 Πίνακας 7.2.: Θέσεις σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, όπως προέκυψαν με ανάλυση προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) Μόριο στόχος Μεταφραστικοί παράγοντες κατά την φωτοσήμανση Συγκέντρωση ΑΒΑ-σπερμίνης Θέσεις σταυροσύνδεσης (μμ) Ελεύθερο 5S U32, C37, C38, C42, C43, C49, (A52), (A53), U55, (G56), G67, - 50 rrna A73, U77, U80, U87, (C88), A104, A108, A109 Ελεύθερο 5S U32, C37, C38, C42, C43, C49, (A52), (A53), U55, (G56), G67, + 50 rrna A73, U77, U80, (U87), A104, A108, A109 U32, Α34, C35, C36, C37, C38, C42, C43, A45, A46, C49, A52, Ελεύθερο 5S A53, U55, G56, A57, A58, A59, (A66), (G67), A73, A78, U80, rrna U82, U87, U95, G96, G98, A104, (G107), A108, A109 50S ριβοσωμική (U32), C37, C42, C43, A46, C47, A52, A53, U55, A59, G61, ± 50 υπομονάδα C62, G69, A73, (A108), A109 50S ριβοσωμική C11, G10, C30, (U32), C37, (C42), C43, (A46), C49, A52, (A53), υπομονάδα U55, G61, C62, C71, A73, U74, U77, (U87), A108, A109 Post-σύμπλοκο - 50 U32, C37, (C42), (C43), (G61), (A73), U77, A109 Post-σύμπλοκο + 50 U32, C37, (C42), (C43), (U55), (G61), (A73), U77, A109 Post-σύμπλοκο U32, C36, C37, C42, C49, A53, (A59), U55, G61, C62, C71, A73, U74, (G76), U77, A109 Σε παρένθεση αναγράφονται νουκλεοτίδια που φωτοσημάνθηκαν ελάχιστα, ενώ με έντονους χαρακτήρες τα νουκλεοτίδια που φωτοσημάνθηκαν ισχυρά. 106

108 Συγκεκριμένα, προστατεύτηκαν τελείως τα νουκλεοτίδια A46, C47, A52, Α53, U55, A59, C62, G69, A73 και A108, ενώ τα νουκλεοτίδια U32 και U77 παρουσίασαν αυξημένη επιδεκτικότητα. Ο αυθεντικός χαρακτήρας των θέσεων σταυροσύνδεσης επιβεβαιώθηκε με RNase H θραύση (το ένζυμο θραύει δίκλωνα μόρια DNA/RNA) του 5S rrna, φωτοσημασμένου με ΑΒΑ-[ 14 C]σπερμίνη, παρουσία επιλεγμένων 11- δεοξυ-ολιγονουκλεοτιδίων, συμπληρωματικών σε αλληλουχίες που απείχαν 40 νουκλεοτίδια μεταξύ τους στην πρωτοταγή δομή του 5S rrna. Τα αποτελέσματα δίνονται στον Πίνακα 7.3. Πίνακας 7.3.: Τμήματα 5S rrna φωτοσημασμένα με ABA-[ 14 C]σπερμίνη, όπως προέκυψαν από την RNase H θραύση και αυτοραδιογραφική ανάλυση. Τμήματα Μόριο Στόχος * του 5S 50S ριβοσωμική Ελεύθερο 5S rrna rrna υπομονάδα Post-σύμπλοκο Α Β Α Β Α Β ± ± ± ± * Κάθε μόριο στόχος φωτοσημάνθηκε υπό συνθήκες: (Α) 300 μμ ABA-[ 14 C]σπερμίνη, χωρίς μεταφραστικούς παράγοντες ή (Β) 50 μμ ABA-[ 14 C]σπερμίνη, παρουσία μεταφραστικών παραγόντων. Τα σύμβολα + και συμβολίζουν την παρουσία και απουσία, αντίστοιχα, ραδιενεργών ζωνών που αντιστοιχούν σε περιοχές του 5S rrna. (±, αχνή ζώνη; +, ασθενής έντασης ζώνη; ++, ενδιάμεσης έντασης ζώνη; +++, ισχυρής έντασης ζώνη). 107

109 7.3. Αλλαγές διαμόρφωσης του 5S rrna μετά από φωτοσήμανση με ΑΒΑ-σπερμίνη: Έλεγχος δραστικότητας έναντι του αντιδραστηρίου DMS Για την διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στη διαμόρφωση του 5S rrna, πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποτύπωσης (footprinting), τροποποίησης χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο DMS. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , το αντιδραστήριο τροποποιεί εκλεκτικά αδενίνες και κυτοσίνες (μεθυλιώνει το Ν7 της γουανίνης, το Ν1 της αδενίνης και το Ν3 της κυτοσίνης) μη εμπλεκόμενες σε ζεύγη βάσεων Watson-Crick (Stern et al, 1988). Οι τροποποιημένες αδενίνες και κυτοσίνες δεν αναγνωρίζονται από την αντίστροφη μεταγραφάση και η μεταγραφή διακόπτεται. Οι θέσεις αύξησης της επιδεκτικότητας ή προστασίας έναντι του DMS αναγνωρίζονται ως ζώνες μεγαλύτερης ή μικρότερης έντασης σε σύγκριση με εκείνες του control (μη φωτοσημασμένο 5S rrna). Στο Σχήμα 7.2., η διαδρομή 3 αναφέρεται σε 5S rrna που έχει τροποποιηθεί με DMS, η διαδρομή 4 σε 5S που έχει φωτοσημανθεί με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη και στη συνέχεια τροποποιηθεί με DMS. Αλλαγές στην ένταση των ζωνών υποδηλώνουν αλλαγές στη διαμόρφωση του 5S rrna που έχουν προκύψει από την πρόσδεση της σπερμίνης. Αύξηση στην ένταση της ζώνης σημαίνει αποκατάσταση μιας πιο χαλαρής δομής, ενώ μείωση της έντασης σημαίνει την δημιουργία μιας πιο συνεκτικής δομής. Οι θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης λαμβάνονται υπόψη στην εξαγωγή συμπερασμάτων. Στον Πίνακα 7.4. αναγράφονται τα νουκλεοτίδια που αντιδρούν με το αντιδραστήριο, κάτω από διάφορες πειραματικές συνθήκες. Νουκλεοτίδια που εμφανίζουν ισχυρή δραστικότητα έναντι του DMS, παρουσιάζονται με έντονα σύμβολα, ενώ νουκλεοτίδια με ασθενή δραστικότητα δίνονται εντός παρενθέσεως. Όπως φαίνεται στον πίνακα, η δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωσή του: η θηλιά Α αποκτά μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και Ε και οι έλικες III και V μια πιο συνεκτική δομή. 108

110 Πίνακας 7.4. Δραστικότητα του 5S rrna έναντι του αντιδραστηρίου DMS, όταν το πρώτο αντιδρά ελεύθερο ή ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωμικές υπομονάδες και post-ριβοσωματικά συμπλόκα a Μόριο στόχος: Περιοχές Ελεύθερο 5S rrna 50S ριβοσωμικές υπομονάδες Post-ριβοσωματικό σύμπλοκο του 5S Πειραματικές συνθήκες rrna b : A B A B A B Helix I G10, C114 Helix II C63, A66, G67 C63, A66, G67 G61,C62, A66 G61, G62, A66 G61, C62, A66 G61, A66 U32, A34, C49, U32, C49, A52, C30, U32, C49, A52, Helix III A52, A53, U55, U32, A52, A53, U55 U32, A52, A53 U32, (A52), (A53) A53, U55, G56 A53, U55 G56 Helix IV U80, U82, C90, U95, G96 U80 C90 C90 Helix V A73, A104 A73, A104 C71, A73, U74, A104 A73, (A104) Loop A Loop B Loop C C11, C12, A15, G107, A108, A109 C26, C27, A57, A58, A59 C35, C36, C37, C38, A39, C42, C43, A45 A46 C11, C12, A15, A108, A109 C11, C12, A15, A108, A109 C11, C12, A15, G69, A108, A109 C71, A73 U74, G76, A104 C11, C12, A15, A108, A109 A73, (A104) A57, A58, A59 A57, A58, A59 (A58), A59 (A58), A59 A58, A59 C35, C36, C37, C38, (A39), C42, C43, (A45) C35, C36, C37, C38, A39, C42, C43, A45, A46 (C35), (C36), C37, (C38), (A39), C42, C43, (A45), A46, C47 A35, C36, C37, C38, A39, C42, C43, A45 Loop D U87, C88 U87, C88 U87, (C88) (C88) (C88) (C88) (C88) C11, C12, A15, A108, A109 (C35), (C36), C37, (C38), (A39), C42, C43, (A45) Loop E A78, G98, A99 U77, (A78), (A99) U77, (A78) (A78) U77, (A78) U77, A78 a Σε παρένθεση αναγράφονται νουκλεοτίδια που αντιδρούν λιγότερο και με έντονους χαρακτήρες νουκλεοτίδια που αντιδρούν πιο έντονα με DMS, συγκρινόμενα με control δείγματα b Τα δείγματα φωτοσημάνθηκαν με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, απουσία FWR (συνθήκη Α) ή με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, παρουσία FWR (συνθήκη Β) 109

111 7.4. Επίδραση της φωτοσήμανσης στην ικανότητά του 5S rrna να συναρμολογείτε σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες και 70S ριβοσώματα Δυο παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν την ικανότητα των 50S υπομονάδων να συζευχθούν με 30S υπομονάδες προς σχηματισμό 70S ριβοσωμάτων. Πρώτον, η φωτοσήμανση του 5S rrna μπορεί να επηρεάζει αρνητικά την συναρμολόγηση των 50S υπομονάδων, μειώνοντας το ποσοστό σχηματισμού τους και δεύτερον, να επηρεάζει την ικανότητα των ανασυσταμένων 50S υπομονάδων να συζευχθούν με 30S υπομονάδες προς σχηματισμό των 70S ριβοσωμάτων. Για την διευκρίνιση των παραπάνω, ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες και ανασυγκροτημένα 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα ( ) διαχωρίστηκαν σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (10-30%), και αναλύθηκαν σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (260 nm). Τα διαγράμματα που ελήφθησαν φαίνονται στα Σχήματα 7.4. και 7.5. Τα εκατοστιαία ποσοστά ανασυγκρότησης των 50S υπομονάδων και 70S ριβοσωμάτων δίνονται στον Πίνακα 7.5. Σημειώνεται, η % ικανότητα δημιουργίας 70S ριβοσωμάτων έχει εκφραστεί ως ποσοστό των 50S υπομονάδων που χρησιμοποιήθηκαν (input). Όπως φαίνεται στα Σχήματα 7.4. και 7.5., 50S υπομονάδες, ελλιπείς σε 5S, εμφανίζουν συντελεστή κατακρήμνισης ~47S. Σύζευξη αυτών των υπομονάδων με 30S παρέχει 70S ριβοσώματα που καθιζάνουν σε 62S. Όταν το 5S rrna που χρησιμοποιήθηκε για την ανασυγκρότηση ήταν φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, το ποσοστό σχηματισμού 50S υπομονάδων μειώθηκε, και οι κορυφές που προέκυψαν έδωσαν συντελεστές καθίζησης 50S και 47S. Παρατηρήθηκε όμως ότι το ποσοστό σχηματισμού 70S ριβοσωμάτων ήταν ελαφρώς αυξημένο (73,5%) σε σχέση με τα control-άθικτο 5S rrna (70,0%). Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι, παρόλο που το ποσοστό σχηματισμού 50S μειώθηκε (52,5%), οι υπομονάδες που ανασυγκροτήθηκαν ήταν πλήρως ενεργές. Φωτοσήμανση του 5S rrna με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη επηρέασε ακόμα πιο πολύ αρνητικά το ποσοστό ανασυγκρότησης των 50S 110

112 (15,8%), αλλά και την ικανότητα αυτών να σχηματίζουν 70S ριβοσώματα (22,5%). Πίνακας 7.5.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ανασυγκρότηση 50S ριβοσωματικών υπομονάδων και στην ικανότητά των τελευταίων για σύζευξη με 30S ριβοσωματικές υπομονάδες. 5S rrna % Ανασύστασης σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες % Ικανότητα δημιουργίας 70S ριβοσωμάτων Άθικτο 5S rrna ,0 ± 2.0 Απόν - 65,7 ± 5.0 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μm ABA-σπερμίνη 52,5 ± 7,0 73,5± 5,2 5S rrna φωτοσημασμένο με 300 μm ABA-σπερμίνη 15,8 ± 3,0 22,5± 3,7 111

113 (A) 1 Πυθμένας φυγοκεντρικού σωλήνα 50S 47S Επιφάνεια φυγοκεντρικού σωλήνα Time (min) 1 Abs (260 nm) Time (min) 1 Abs (260 nm) Abs (260 nm) Abs (260 nm) (Β) (Γ) Time (min) 1 (Δ) Time (min) Σχήμα 7.4.: Διάγραμμα ανάλυσης ανασυγκροτημένων 50S ριβοσωμικών υπομονάδων από 23S και ΤΡ50, (A) παρουσία άθικτου 5S rrna, (B) απουσία 5S rrna (Γ) παρουσία φωτοσημασμένου 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη και (Δ) παρουσία φωτοσημασμένου 5S rrna με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη rrna, μετά από φυγοκεντρικό διαχωρισμό σε διαβαθμισμένης πυκνότητας (10-30%) διάλυμα σουκρόζης, και ανάλυση σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (260 nm) ( 50S, 47S υπομονάδες). 112

114 Α) Πυθμένας φυγοκεντρικού σωλήνα 70S 1 62S 50S 47S 30S Επιφάνεια φυγοκεντρικού σωλήνα Abs (260 nm) Β) Abs (260 nm) Γ) Abs (260 nm) Δ) Abs (260 nm) Time (min) Σχήμα 7.5.: Διάγραμμα ανάλυσης ανασυγκροτημένων 70S ριβοσωμάτων από άθικτες 30S υπομονάδες και 50S ανασυγκροτημένες υπομονάδες. Η ανασυγκρότηση των 50S υπομονάδων έγινε από 23S rrna και ΤΡ50, (Α) παρουσία άθικτου 5S rrna, (B) απουσία 5S rrna, (Γ) παρουσία φωτοσημασμένου 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑσπερμίνη και (Δ) παρουσία φωτοσημασμένου 5S rrna με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη rrna, μετά από φυγοκεντρικό διαχωρισμό σε διάλυμα σουκρόζης διαβαθμισμένης πυκνότητας (10-30%) και ανάλυση σε φωτόμετρο συνεχούς ροής (260 nm). Η μοριακή συγκέντρωση των 30S υπομονάδων είναι διπλάσια εκείνης των 50S υπομονάδων. 113

115 7.5. Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του AcPhe-tRNA σε poly(u)-προγραμματισμένα ριβοσώματα (Binding) Η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα, μελετήθηκε επωάζοντας Αc[ 3 Η]Phe-tRNA με poly(u) προγραμματισμένα ανασυσταμένα ριβοσωμικά σύμπλοκα που είχαν προγραμματιστεί με poly(u). Τα 70S ριβοσώματα παρασκευάστηκαν από 30S υπομονάδες και 50S ανασυσταμένες υπομονάδες που έφεραν είτε άθικτο, είτε φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑσπερμίνη. Για τα 62S, ελλιπή σε 5S rrna, ριβοσώματα χρησιμοποιήθηκαν 47S αντί 50S υπομονάδες ( ). Τα ριβοσώματα είχαν τις Ρ-θέσεις κατειλημμένες με trna Phe (δέσμευση στην Α-θέση) ή κενές (ολική δέσμευση). Η πρόσδεση του υποστρώματος μελετήθηκε απουσία / παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης και μετρήθηκε με διήθηση σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Η δέσμευση στην Ρ-θέση προσδιορίστηκε από την ολική δέσμευση τιτλοδοτώντας το προκύπτον Αc[ 3 Η]Phe-tRNA poly(u) 70S ριβοσωματικό σύμπλοκο με πουρομυκίνη (2 mμ, 2min, 25 Ċ). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, δίνονται στο Σχήμα ,4 AcPhe-tRNA / ribosome 0,3 0,2 0,1 P-site A-site 0,0 5S rrna 5S rrna +SPM 5S rrna +ABA-SPM 5S rrna +ABA-SPM +SPM -5S rrna -5S rrna +SPM Σχήμα 7.6: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του AcPhetRNA σε poly(u)-προγραμματισμένα ριβοσώματα (Binding) 114

116 Η ικανότητα για δέσμευση στην Ρ- και Α- θέση ανασυγκροτημένων 70S ριβοσωμάτων που περιείχαν άθικτο 5S rrna, βρέθηκε να είναι 0,171 και 0,092 αντίστοιχα. Η παρουσία ελεύθερης 50 μμ σπερμίνης βελτίωσε σημαντικά την ικανότητα για δέσμευση ΑcPhe-tRNA και στις δυο θέσεις. Περαιτέρω βελτίωση, μικρή αλλά στατιστικά σημαντική, παρατηρήθηκε στην πρόσδεση του ΑcPhe-tRNA στην Ρ-θέση, όταν το 5S rrna που χρησιμοποιήθηκε για την ανασυγκρότηση των ριβοσωμάτων ήταν φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη. Η παρουσία ελεύθερης 50 μμ σπερμίνης επέφερε την ίδια βελτίωση στη πρόσδεση του ΑcPhe-tRNA στα ριβοσώματα αυτά, με εκείνη που παρατηρήθηκε σε ακέραια ριιβοσώματα. Ριβοσώματα ελλιπή σε 5S rrna, παρουσίασαν δραστική μείωση στην ικανότητα δέσμευσης υποστρώματος, και στις δυο θέσεις του ριβοσώματος, ανεξάρτητα από την παρουσία ελεύθερης σπερμίνης Σχήμα Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στις καταλυτικές ιδιότητες του ριβοσώματος. Η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην καταλυτική δράση του ριβοσώματος (ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, PTase), ελέγχθηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης ( 6.5.4). Ανασυγκροτημένα post-ριβοσωματικά σύμπλοκα παρασκευάστηκαν, όπως περιγράφεται στην παράγραφο , και αντέδρασαν με πουρομυκίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις και για διάφορους χρόνους. Από το εκατοστιαίο ποσοστό του AcPhe-tRNA που μετατρέπεται σε προϊόν (x), υπολογίσθηκαν οι τιμές της φαινομενικής σταθεράς (k obs ). Με βάση τις τιμές αυτές, κατασκευάσθηκαν τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου 1/ k obs έναντι του αντιστρόφου της συγκέντρωσης πουρομυκίνης ( ). Από τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου υπολογίσθηκαν οι τιμές της σταθεράς διάστασης Κ s και της καταλυτικής σταθεράς k 3. Στο Σχήμα 7.7. παρουσιάζονται διαγράμματα διπλού αντιστρόφου, για τα διάφορα είδη ανασυγκροτημένων post-ριβοσωματικών συμπλόκων 115

117 που χρησιμοποιήθηκαν, παρουσία ή μη 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Οι τιμές των καταλυτικών σταθερών που προέκυψαν συνοψίζονται στον Πίνακα 7.6. Η δράση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης εκφράζεται μέσω του λόγου k 3 /Κ s. 10,0 1 / k obs 7,5 5,0 2,5-0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1, / [Πουρομυκίνη] (μm -1 ) Σχήμα 7.7.: (Α) Διαγράμματα διπλού-αντιστρόφου (1/k obs έναντι 1/[πουρομυκίνη]). Οι τιμές των k obs υπολογίστηκαν από τις κλίσεις χρονοδιαγραμμάτων, όπως αναφέρεται στην παράγραφο Συμβολισμοί: (τετράγωνα) άθικτο 5S rrna, (κύκλοι) 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑσπερμίνη, (τρίγωνα) ελλιπή σε 5S rrna, κενά σύμβολα: απουσία ελεύθερης σπερμίνης, σκιασμένα σύμβολα: παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Σύμφωνα με τον Πίνακα 7.6., η ενεργότητα της ΡTase ριβοσωμάτων που περιέχουν φωτοσημασμένο το 5S rrna είναι αυξημένη περίπου κατά 30%, σε σχέση με την αντίστοιχη ενεργότητα ριβοσωμάτων που φέρουν άθικτο 5S rrna. Η παρουσία ελεύθερης σπερμίνης βελτιώνει την ενεργότητα της ΡTάσης κατά 60% και στα δυο είδη ριβοσωμάτων. Σε ριβοσώματα ελλιπή σε 5S rrna, η καταλυτική δράση της ΡΤάσης σχεδόν εξαφανίζεται, χωρίς να μπορεί να ανατραπεί η δυσμενής αυτή επίπτωση από την παρουσία ελεύθερης σπερμίνης. 116

118 Πίνακας 7.6.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna ιδιότητες του ριβοσώματος. στις καταλυτικές Ανασυσταμένα postριβοσωματικά σύμπλοκα k 3 (min -1 ) Κ s (mm) PTase δράση (mm -1 min -1 ) k 3 /Κ s % Αύξηση PTάσης Άθικτο 5S rrna 1,314 0,415 3,16 ± 0,18 - Άθικτο 5S rrna +50 μm ελεύθερη σπερμίνη 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη 2,483 0,485 5,12 ± 0,32 62,0 1,628 0,400 4,07 ± 0,20 28,7 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη +50 μm ελεύθερη σπερμίνη 2,029 0,405 5,01 ± 0,25 58,5 Ελλιπή σε 5S rrna 0,267 0,890 0,30 ± 0,02 - Ελλιπή σε 5S rrna +50 μm ελεύθερη σπερμίνη 0,273 0,780 0,35 ± 0, Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην μετατόπιση των υποστρωμάτων (Translocation) Για την μελέτη της επίδρασης της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα του ριβοσώματος να μετατοπίζει AcPhe-tRNA από την Α-στην Ρ- θέση παρασκευάστηκαν δυο είδη pre-ριβοσωματκών συμπλόκων: το πρώτο έφερε άθικτο 5S rrna, και το δεύτερο, φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑσπερμίνη. Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε, 70S poly(u) προγραμματισμένα ριβοσώματα επωάστηκαν με trna Phe για 20 min στους 37 Ċ, ώστε να γίνει πλήρη κάλυψη των Ρ-θέσεων των ριβοσωμάτων. Ακολούθησε προσθήκη Ac[ 3 H]Phe-tRNA και περαιτέρω επώαση, ώστε να επιτραπεί η μη-ενζυμική δέσμευση του AcPhe-tRNA στην Α-θέση (preσύμπλοκo). Στο παρασκεύασμα προστέθηκαν 0,12 mm GTP και 0,015 μμ 117

119 EF-G, απουσία/παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Η μετατόπιση προσδιορίστηκε τιτλοδοτώντας το post-σύμπλοκο που προέκυψε (Ac[ 3 H]PhetRNA στην Ρ-θέση και trna Phe στην Ε-θέση) με διάλυμα που περιείχε 2 mm πουρομυκίνη και 5 μμ θειοστρεπτόνη. Σχήμα 7.8.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην μετατόπιση υποστρωμάτων Αυθόρμητη μετατόπιση Συμβολισμοί: 70S ανασυγκροτημένα pre-ριβοσωμικά σύμπλοκα με: (τετράγωνα) άθικτο 5S rrna, (κύκλοι) 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη; κενά σύμβολα: απουσία ελεύθερης σπερμίνης, σκιασμένα σύμβολα: παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα απουσία EF-G, προκειμένου να προσδιοριστεί η αυθόρμητη μετατόπιση. Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη (Xaplanteri et al, 2005), η σπερμίνη σε συγκέντρωση 50 μμ επιφέρει τη μέγιστη βελτίωση στην ικανότητα του ριβοσώματος για μετατόπιση υποστρωμάτων, όταν η συγκέντρωση Mg 2+ ισούται με 6 mm. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.8., απουσία EF-G, η μετατόπιση βαίνει βραδέως και γραμμικά ως προς το χρόνο, για περίπου 30 min. Παρατηρούμε επίσης, ότι η σπερμίνη, 118

120 ελεύθερη ή ομοιοπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna, βελτιώνει την αυθόρμητη μετατόπιση. Σχήμα 7.9.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην μετατόπιση υποστρωμάτων Εξάρτηση της μετατόπισης από την συγκέντρωση του EF-G Συμβολισμοί: 70S ανασυγκροτημένα pre-ριβοσωμικά σύμπλοκα με: (τετράγωνα) άθικτο 5S rrna, (κύκλοι) 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη; κενά σύμβολα: απουσία ελεύθερης σπερμίνης, σκιασμένα σύμβολα: παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Για να εξετάσουμε την επίδραση της σπερμίνης στην EF-Gκαταλυόμενη μετατόπιση, ο παράγοντας EF-G προστέθηκε σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σε σταθερό ποσό pre-ριβοσωματικού συμπλόκου απουσία και παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. H μετατόπιση έλαβε χώρα για 5 min, στους 25 0 C. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι η έκταση της μετατόπισης αυξάνεται παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων EF-G και φθάνει σε κοινό πλατώ (Σχήμα 7.9.). Από το διάγραμμα φαίνεται, ότι κάθε είδος ριβοσωματικού συμπλόκου απαιτεί διαφορετική συγκέντρωση EF-G για να επιτευχθεί το 50% της μετατόπισης. Παρατηρείται, επίσης, πως η παρουσία σπερμίνης, ελεύθερης ή ομοιοπολικά δεσμευμένης στο 5S rrna, μειώνει τις απαιτήσεις για EF-G. 119

121 Η μείωση των απαιτήσεων σε EF-G μπορεί να εξηγηθεί, είτε λόγω πιθανής ευεργετικής δράσης της σπερμίνης επί της δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα, είτε λόγω θετικής επίδρασης της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε εάν και οι δυο ή μια εκ των δυο εκδοχών είναι ορθή, μελετήθηκε αρχικά η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του EF-G στο ριβόσωμα, και στην συνέχεια, στην υδρόλυση του GTP από τον EF-G Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση του EF-G στο ριβόσωμα Για την μελέτη της ικανότητας των ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G, παρασκευάστηκαν 70S ριβοσώματα από: (i) ακέραιες ριβοσωμικές υπομονάδες (control), (ii) ακέραιες 30S υπομονάδες και ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες, οι οποίες ήσαν είτε ελλιπείς σε 5S, είτε έφεραν άθικτο 5S, είτε έφεραν φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη. Τρία είδη ριβοσωματικών συμπλόκων παρασκευάστηκαν: (i) σύμπλοκα που έφεραν trna Phe στην Ρ-θέση και μη ραδιενεργό AcPhe-tRNA στη Α-θέση (preσύμπλοκα), (ii) σύμπλοκα που έφεραν trna Phe στην Ρ-θέση (P-σύμπλοκα) και (iii) «άδεια» ριβοσώματα, ριβοσώματα δηλαδή που δεν έφεραν υπόστρωμα. Τα σύμπλοκα επωάστηκαν στους 25 o C σε διάλυμα που περιείχε EF-G, [α- 32 P]GTP και φουσιδικό οξύ, ένα αντιβιοτικό που δεσμεύεται στο σύμπλοκο EF-G GDP-ριβόσωμα και εμποδίζει την απελευθέρωση του EF-G GDP από το ριβόσωμα. Μετά από επώαση 30 min, δείγματα διηθήθηκαν σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Η ενσωματωμένη στο φίλτρο ραδιενέργεια μετρήθηκε σε μετρητή ραδιενέργειας β ακτινοβολίας Η χρήση του [α- 32 P]GTP επιτρέπει τον προσδιορισμό της δέσμευσης του EF-G, προσδιορίζοντας την εγκλωβισμένη ραδιενέργεια στα ριβοσώματα σε σχέση με control δείγματα τα οποία επωάστηκαν απουσία EF-G. Σημειώνεται ότι έγιναν δυο σειρές πειραμάτων, απουσία/παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. 120

122 Από τα αποτελέσματα, Πίνακας 7.7., προκύπτει ότι η έκθεση preσυμπλόκων σε ελεύθερη ή ομοιοπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna σπερμίνη ενεργοποιεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. Παρόμοια αποτελέσματα προκύπτουν για τα Ρ-σύμπλοκα και τα «άδεια» ριβοσώματα. Από τον πίνακα φαίνεται, επίσης, ότι η αλληλεπίδραση του EF-G με το ριβόσωμα είναι γενικά πιο διεγερμένη, όταν αποακυλιωμένο trna καταλαμβάνει την Ρ-θέση. Τέλος, είναι φανερό, ότι η απουσία 5S rrna καθιστά τα ριβοσωματικά σύμπλοκα σχεδόν ανενεργά ως προς τη δέσμευση του EF-G. Πίνακας 7.7.: ανασυγκροτημένα ριβοσώματα Δέσμευση του EF-G GTP συμπλόκου σε ακέραια και Ριβοσωματικό είδος EF-G GTP /ριβόσωμα - σπερμίνη + σπερμίνη Pre- P- «άδεια» Pre- P- «άδεια» Ακέραια 0,48 0,79 0,52 0,93 0,98 0,94 Ελλιπή σε 5S rrna 0, , Ανασυγκροτημένα με άθικτο 5S-rRNA 0,17 0,25 0,19 0,44 0,57 0,48 Ανασυγκροτημένα με φωτοσημασμένο 5S-rRNA 0,37 0,54 0,40 0,42 0,52 0, Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση Για την μελέτη της ικανότητας pre-ριβοσωμικών συμπλόκων να ενεργοποιούν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G, παρασκευάστηκαν ανασυγκροτημένα 70S ριβοσώματα από (i) ακέραιες ριβοσωμικές υπομονάδες (control), (ii) ακέραιες 30S υπομονάδες και ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες, οι οποίες είτε ήσαν ελλιπείς σε 5S rrna, είτε έφεραν άθικτο ή φωτοσημασμένο 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη. 121

123 Τα κάθε σύμπλοκο επωάστηκε στους 4 o C σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε EF-G και GTP και αφέθηκε να αντιδράσει για συγκεκριμένους χρόνους. Στο τέλος κάθε χρόνου, έγινε λήψη δείγματος και τερματισμός της αντίδρασης με προσθήκη φορμικού οξέος. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδος Σχήμα 7.10.). Η υδρόλυση του GTP μελετήθηκε παρουσία/απουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης, ενώ πειράματα πραγματοποιήθηκαν και με P-σύμπλοκα και «άδεια» ριβοσώματα. GDP GTP Χρόνος (min) Σχήμα 7.10.: Χρονοδιάγραμμα της GTP υδρόλυσης από ακέραια pre-ριβοσωματικά σύμπλοκα, που επωάστηκαν παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.11, ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με άθικτο ή φωτοσημασμένο το 5S rrna παρουσίασαν όμοια συμπεριφορά ως προς την υδρόλυση GTP. H αρχική ταχύτητα της αντίδρασης ήταν σχεδόν ίδια για τα δυο είδη ριβοσωματικών συμπλόκων, και περίπου ίδια με την ταχύτητα αντίδρασης των ακέραιων ριβοσωμάτων, ανεξάρτητα από την παρουσία ελεύθερης σπερμίνης ή μη (Σχήμα 7.11Α και Β). Παρόμοια 122

124 συμπεριφορά παρουσίασαν τα Ρ-σύμπλοκα και τα «άδεια» ριβοσώματα (Σχήμα 7.12). Σε σχέση με τα Ρ-σύμπλοκα, τα «άδεια» ριβοσώματα και τα preσύμπλοκα ήταν λιγότερο ενεργά ως προς την ενεργοποίηση της GTPασης του EF-G. Σχήμα 7.11.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G εξαρτώμενη GTP υδρόλυση (Α) Χρονοδιάγραμμα της GTP υδρόλυσης pre-ριβοσωματικών συμπλόκων παρουσία 50 μμ ελεύθερης σπερμίνης, (Β) απουσία ελεύθερης σπερμίνης. Συμβολισμοί 70S ανασυγκροτημένα ριβοσώματα με : ακέραιες ριβοσωμικές υπομονάδες ( ), άθικτο 5S rrna ( ), 5S rrna φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη ( ), ελλιπή σε 5S rrna ( ). 123

125 Σχήμα 7.12.: Επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Χρονοδιάγραμμα της GTP υδρόλυσης P-συμπλόκων (ρόμβοι) και «άδειων» ριβοσωμάτων (τρίγωνα). Τα 70S ριβοσώματα ανασυγκροτήθηκαν από 30S υπομονάδες και 50S που έφεραν άθικτο ( ), ή φωτοσημασμένο με 50 μμ ΑΒΑσπερμίνη 5S rrna ( ) Μεταβολές στη διαμόρφωση του ριβοσώματος, επαγόμενες από διαμορφωτικές αλλαγές του 5S rrna. Η επίδραση διαμορφωτικών αλλαγών του 5S rrna, στη δομή και λειτουργία του ριβοσώματος μελετήθηκε με ανάλυση αποτυπώματος (footprinting analysis) λειτουργικών περιοχών του ριβοσώματος, χρησιμοποιώντας την τεχνική της χημικής τροποποίησης νουκλεοτιδίων. Στη συνέχεια, τα τροποποιημένα νουκλεοτίδια μελετήθηκαν ως προς την αύξηση/μείωση της έντασης των ζωνών, επιτρέποντας έτσι την εξαγωγή συμπερασμάτων για την εμπλοκή της διαμόρφωσης του 5S rrna στην επικοινωνία λειτουργικών κέντρων εντός του ριβοσώματος. Οι περιοχές που μελετήθηκαν αφορούσαν τις περιοχές SRL και GAC που εμπλέκονται στη 124

126 μετατόπιση των υποστρωμάτων, άλλες θέσεις αλληλεπίδρασης του GTP με τη μικρή και τη μεγάλη υπομονάδα, και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσώματος Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση του παράγοντα επιμύκηνσης EF-G H μελέτη της ικανότητας του 5S rrna να μεταδίδει σήματα μέσω αλλαγών διαμόρφωσης που επηρεάζουν την δέσμευση του EF-G, εστιάστηκε σε νουκλεοτίδια δέσμευσης και αλληλεπίδρασης του παράγοντα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δραστικότητα έναντι χημικών τροποποιητών νουκλεοτιδίων των περιοχών SRL (Α2660) και GAC (Α1067), καθώς και νουκλεοτιδίων με τα οποία αλληλεπιδρά ο παράγοντας με το ριβόσωμα, τόσο στη μεγάλη [Α2530 (έλικα Η91) και Α2476 (έλικα Η89)], όσο και στη μικρή υπομονάδα (Α790 και Α1339). Τα αυτοραδιογραφήματα που ελήφθησαν δίνονται στο Σχήμα Τα αποτελέσματα της μελέτης των αλλαγών της έντασης των ζωνών που προέκυψαν, συνοψίζονται στο Πίνακα 7.8., όπου σε κάθε περίπτωση σημειώνεται το ποσοστό της έντασης της ζώνης σε σχέση με το control (100). Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι η παρουσία ελεύθερης σπερμίνης διεγείρει την δέσμευση του EF-G σε ακέραια ή ανασυσταμένα με άθικτο 5S rrna ριβοσώματα (διαδρομές 3-10), άλλοτε σε μεγαλύτερο και άλλοτε σε μικρότερο βαθμό. Επίσης, ριβοσώματα περιέχοντα φωτοσημασμένο 5S rrna με ΑΒΑ-σπερμίνη (διαδρομές 15-16), είχαν αυξημένη ικανότητα δέσμευσης EF-G. Όσο αφορά ριβοσώματα ελλιπή σε 5S (διαδρομές 11-14), δε παρατηρήθηκαν αλλαγές στις εντάσεις των ζωνών, ανεξάρτητα από την παρουσία ή μη ελεύθερης σπερμίνης, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η απουσία του 5S rrna από το ριβοσωμικό σύμπλοκο δεν επιτρέπει την δέσμευση του EF-G. Ιδιαίτερη σημασία αποκτά το συμπέρασμα που προκύπτει από τη σύγκριση της έντασης των ζωνών που αφορούν τα νουκλεοτίδια Α790 και Α1339. Συγκεκριμένα, παρατηρούμε ότι η ένταση των σχετικών ζωνών στις 125

127 Ανασυσταμένα ριβοσώματα Ακέραια Ριβοσώματα Άθικτο 5S rrna - 5S rrna +ΑΒΑ-SPM 5S rrna A) U A G C DMS EFG SPM A2660 B) A1067 A2530 Γ) A2476 A790 Δ) A1339 Σχήμα 7.13.: Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφήματα ανάλυσης προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση του παράγοντα μετατόπισης EF-G. Α) SRL περιοχή, Β) GAC περιοχή, Γ) 50S υπομονάδα Δ) 30S υπομονάδα. (U, A, G, C είναι οι στήλες ανάλυσης της αλληλουχίας. Με SPM συμβολίζεται η παρουσία ελεύθερης 50 μμ σπερμίνη. 126

128 Πίνακας 7.8.: Δραστικότητα έναντι DMS νουκλεοτιδίων της μεγάλης και μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, που σχετίζονται με την πρόσδεση του παράγοντα μετατόπισης EF-G. Οι τιμές που εμφανίζονται στον πίνακα παριστάνουν το ποσοστό έντασης των ζωνών που αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια της πρώτης στήλης, σε σύγκριση με την ένταση των ζωνών που αντιστοιχούν σε control δείγματα (κίτρινο φόντο). Ακέραια 5S Άθικτο 5S rrna - 5S rrna Ριβοσώματα rrna +ABA- SPM SPM EF-G SRL A2660 GAC A S A S A S A790 30S A διαδρομές 5 και 9 (παρουσία σπερμίνης) αυξάνεται σε σχέση με αυτήν των αντίστοιχων ζωνών των διαδρομών 3 και 7 (απουσία σπερμίνης). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει, ότι η περιοχή αυτή του 70S ριβοσωματικού συμπλόκου αποκτά μια πιο χαλαρή δομή παρουσία ελεύθερης σπερμίνης Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση υποστρώματος στις θέσεις Ρ- και Α- του ριβοσώματος. H συσχέτιση της διαμορφωτικής κατάστασης του 5S rrna με την ικανότητα του ριβοσώματος να προσδένει το υπόστρωμα στις θέσεις P και A, 127

129 επικεντρώθηκε σε νουκλεοτίδια, τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη δέσμευση των trnas. Ενδεικτικά, μελετήθηκαν : Α) για την Ρ-θέση τα νουκλεοτίδια A794, C795 της 30S υπομονάδας και G2252, G2253, A2451, U2584 και U2585 της 50S υπομονάδας, και Β) για την Α-θέση τα νουκλεοτίδια Α1492, Α1493 της 30S υπομονάδας και τα νουκλεοτίδια Ψ2555 και Α2602 της 50S υπομονάδας. Ανασυσταμένα ριβοσώματα Ακέραια Ριβοσώματα Άθικτο 5S rrna +ΑΒΑ-SPM - 5S rrna 5S rrna A) U A G C Probe AcPhe-tRNA SPM A794 C795 B) G2252 G2253 A2451 U2584 U2585 Σχήμα 7.14.: Αυτοραδιογραφήματα ανάλυσης προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση υποστρώματος στην Ρ-θέση A) της 30S υπομονάδας και B) της 50S υπομονάδα. U, A, C, G είναι οι στήλες ανάλυσης της αλληλουχίας. Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφήματα δίνονται στα Σχήματα και 7.15., αντίστοιχα για τις θέσεις P- και A-, ενώ οι μετρήσεις έντασης των ζωνών που προέκυψαν συνοψίζονται στο Πίνακα

130 Ανασυσταμένα ριβοσώματα Ακέραια Ριβοσώματα Άθικτο 5S rrna +ΑΒΑ-SPM - 5S rrna 5S rrna A) U A G C Probe Phe-tRNA SPM A1492 A1493 B) Ψ2555 Α2602 Σχήμα 7.15.: Αυτοραδιογραφήματα ανάλυσης προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis) της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος και της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση υποστρώματος στην A-θέση A) της 30S υπομονάδας και B) της 50S υπομονάδας. U, A, C, G είναι οι στήλες ανάλυσης της αλληλουχίας. Όπως προκύπτει, η δέσμευση στην Ρ-θέση ενεργοποιείται, σε σημαντικό βαθμό, από την παρουσία σπερμίνης για τα ακέραια ή περιέχοντα άθικτο 5S rrna ριβοσωματικά σύμπλοκα (σύγκρινε την ένταση σχετικών ζωνών στις στήλες 4 και 6, και στις στήλες 8 και 10). Επίσης, σαφής αλλά μικρότερου βαθμού ενεργοποίηση παρατηρείται σε ριβοσωματικά σύμπλοκα περιέχοντα φωτοσημασμένο 5S rrna (σύγκρινε την ένταση σχετικών ζωνών στις στήλες 15 και 16). Εξαίρεση αποτελούν και πάλι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S. Αντίθετα, η δέσμευση του υποστρώματος στην Α-θέση του ριβοσώματος δεν επηρεάζεται σε σημαντικό βαθμό από την παρουσία σπερμίνης, είτε αυτή είναι ελεύθερη, είτε ομοιοπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna. 129

131 Πίνακας 7.9.: Δραστικότητα έναντι χημικών τροποποιητών (DMS, KE, CMCT) νουκλεοτιδίων που εμπλέκονται στη πρόσδεση υποστρώματος στην Ρ- και A-θέση του ριβοσώματος. Οι τιμές που εμφανίζονται στον πίνακα παριστάνουν το ποσοστό έντασης των ζωνών που αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια της πρώτης στήλης, σε σύγκριση με την ένταση των ζωνών που αντιστοιχούν σε control δείγματα (κίτρινο φόντο). Ακέραια Άθικτο 5S rrna - 5S rrna 5S rrna Ριβοσώματα +ABA- SPM SPM Υπόστρωμα Ρ-θέση Α C G2252/ A U2584/ A-θέση Α1492/ Ψ Α

132 ΣΥΖΗΤΗΣΗ -ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 131

133 8. Σηζήτηση-Συμπεράσματα Το 5S rrna, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος, αποτελεί απαραίτητο τμήμα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Παρά τις συστηματικές μελέτες που αφορούν την τριτοταγή δομή ολοκλήρου του μορίου ή τμημάτων του, σε ελεύθερη μορφή (Lorenz et al, 2000, Funari et al, 2000, Xiong et al, 2000, Huber et al, 2001) ή ως συστατικού του ριβοσωματικού συμπλόκου (Ban et al, 2000, Harms et al, 2001, Spahn et al, 2001, Yusupov et al, 2001), ο ακριβής ρόλος του 5S rrna στην πρωτεϊνική σύνθεση δεν είναι πλήρως κατανοητός. Μελέτες σταυροσύνδεσης (cross-linking) σε E.coli ριβοσώματα, οδήγησαν στην υπόθεση ότι το 5S rrna λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και της περιοχής II του 23S rrna, (Bogdanov et al, 1995, Dokudovskaya et al, 1996). Επίσης, καθιέρωσαν το 5S rrna ως απαραίτητο συστατικό για την σταθερότητα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Holmberg et al, 2000). Η σπουδαιότητα της παρουσίας του 5S rrna στην πρωτεϊνική μηχανή επιβεβαιώθηκε, όταν με απαλοιφή γονιδίων του 5S rrna σε E.coli κύτταρα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (Ammons et al, 1999). Εκτός από μονο- και δισθενή ιόντα, οι πολυαμίνες σπερμίνη, σπερμιδίνη και πουτρεσκίνη είναι απαραίτητα συστατικά του ιοντικού περιβάλλοντος του ριβοσώματος, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην δομική και λειτουργική ακεραιότητα αυτών (Michelinaki et al, 1997ab, Cohen 1998, Igarashi and Kashiwagi, 2000). Προσδενόμενες στα ριβοσωματικά συστατικά, επάγουν ειδικές διαμορφώσεις που προάγουν την λειτουργικότητα τους. Μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι παρουσία μεταφραστικών παραγόντων, η σπερμίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις (<100 μμ) προκαλεί αύξηση της δραστικότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ενώ σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αναστολή του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού (Drainas and Kalpaxis, 1994, Karahalios et al, 1999). Παρόμοια δράση παρουσιάζει το φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, η ΑΒΑ-σπερμίνη. Πρόσφατα, η χρήση 132

134 του φωτοδραστικού αυτού αναλόγου επέτρεψε την ομοιοπολική πρόσδεση της σπερμίνης σε ριβοσωματικά σύμπλοκα και την ταυτοποίηση αρχικά των ριβοσωματικών πρωτεϊνών που φωτοσημαίνονται (Amarantos et al, 2001) και στη συνέχεια των θέσεων πρόσδεσής της στο 16S (Amarantos et al, 2002) και στο 23S rrna (Xaplanteri et al, 2005). Ειδικότερα για το 5S rrna, έχει βρεθεί με θερμοδυναμική ανάλυση ότι η παρουσία των πολυαμινών και συγκεκριμένα η σπερμίνη σταθεροποιεί την δευτεροταγή και τριτοταγή του δομή, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση (Kao and Crothers, 1980, Barciszewski et al, 1988). Στην προκείμενη εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rrna στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Συγκεκριμένα, μεταβλήθηκε η τριτοταγής διαμόρφωση του 5S rrna, μέσω εκλεκτικής πρόσδεσης στο μόριο του 5S rrna της ΑΒΑ-σπερμίνης, και συσχετίστηκαν οι προκύπτουσες διαμορφωτικές αλλαγές με μεταβολές στις ριβοσωματικές λειτουργίες Δομικές Μελέτες Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna Προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των πολυαμινών στην δομή και λειτουργία του 5S rrna, προαπαίτηση ήταν ο προσδιορισμός των θέσεων δέσμευσης τους στο μόριο. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της φωτοσήμανσης συγγένειας σε συνδυασμό με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (Primer extension analysis). Η τεχνική βασίζεται στο γεγονός ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη, η οποία δεσμεύεται ομοιοπολικά στις περιοχές με τι οποίες αλληλεπιδρά, λειτουργεί ως φυσικό εμπόδιο στη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης, επιτρέποντας έτσι τον προσδιορισμό των θέσεων πρόσδεσης του αναλόγου στο μόριο του 5S rrna. Το γεγονός ότι η ΑΒΑσπερμίνη παρουσιάζει συναγωνιστικές ιδιότητες δέσμευσης ως προς τη μητρική ένωση, μας επιτρέπει να ανάγουμε τα αποτελέσματα και 133

135 συμπεράσματα από τη δράση του φωτοδραστικού αναλόγου στη δράση της σπερμίνης. Ο αριθμός των θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna που προσδιορίστηκαν με Hill-plot ανάλυση ήταν Οι θέσεις δέσμευσης που προσδιορίστηκαν με την μέθοδο της primer extension analysis ήταν περισσότερες (Πίνακας 7.3.). Η αντίφαση στα αποτελέσματα μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός, ότι οι φαινομενικά επιπρόσθετες θέσεις δέσμευσης βρίσκονται σε γειτονικές περιοχές στην τριτοταγή δομή του 5S rrna και στην πραγματικότητα αντιπροσωπεύουν την ίδια θέση πρόσδεσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.1., πειράματα συναγωνισμού πρόσδεσης χρησιμοποιώντας ως συναγωνιστή την μητρική ένωση σπερμίνη, έδειξαν ότι οι περισσότερες θέσεις δέσμευσης είναι ειδικές. Οι υπόλοιπες θέσεις εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική επιφάνεια της μεγάλης υπομονάδας (C71), στο άνω τμήμα της κεντρικής προεξοχής (U32, A52 και A53) ή βρίσκονται σε ηλεκτροαρνητικές κοιλότητες (Α73, U80),. Ανεξάρτητα όμως από την ειδικότητα της πρόσδεσης, η δέσμευση των πολυαμινών σε συγκεκριμένες περιοχές μπορεί να είναι ευεργετική για την σταθεροποίηση της τριτοταγούς δομής του 5S rrna και της επικοινωνίας του με λειτουργικές περιοχές του 23S rrna. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η πρόσδεση της σπερμίνης εντός και γύρω της θηλιάς Ε, περιοχή που εμπλέκεται στην δέσμευση της ριβοσωματικής πρωτεΐνης L25. Κρυσταλλογραφικές μελέτες τμημάτων του 5S rrna αποτελούμενων από, τη θηλιά Ε (Correll et al, 1997, Dallas and Moore, 1997), ή τη θηλιά Ε σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη L25 (Lu and Steitz, 2000) έχουν δείξει ότι η θηλιά Ε περιέχει επτά μη-συμβατικά Watson-Crick ζεύγη βάσεων, τα οποία σταθεροποιούνται από ιόντα Mg 2+. Επιπλέον μελέτες έχουν δείξει έντονη δέσμευση μονοκατιόντων στην θηλιά Ε του 5S rrna, ακόμη και παρουσία 4-5 mm Mg 2+ (Réblová et al, 2003, Auffinger et al, 2004). Οι περισσότερες από τις μονοκατιοντικές θέσεις δέσμευσης συμπίπτουν (G98, U80), ή είναι πολύ κοντά (G105, G72, U77) σε θέσεις σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης. 134

136 Επίσης, μεγάλης σημασίας είναι το γεγονός, ότι απομακρυσμένες από το κέντρο συμμετρίας (G75-A101) περιοχές καταλαμβάνονται από ελεύθερα διαχεόμενους προσδέτες, όπως φορτισμένες χημικές ομάδες που ανήκουν σε πρωτεΐνες ή αντιβιοτικά. Μια αμινομάδα της L25 πρωτεΐνης έχει βρεθεί ότι δεσμεύεται κοντά στο U80 (Lu and Steitz, 2000). Συνεπώς, η δέσμευση πολυαμινών σε αυτήν την θέση μπορεί απευθείας να επηρεάσει την αλληλεπίδραση του 5S rrna με την L25. Σε αντίθεση, περιοχές που βρίσκονται κοντά στο κέντρο συμμετρίας, εμφανίζουν υψηλή ηλεκτροαρνητική τάση. Αυτό σημαίνει ότι ιόντα που εμπλέκονται με αυτές τις περιοχές εμφανίζουν δυσκολία στο να εκτοπίζονται. Τα παραπάνω επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στην Α73 αντιστέκεται στο συναγωνισμό με μονοκατιόντα (μη παρουσιασθέντα αποτελέσματα). Άλλες θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, οι οποίες μπορεί να παρεμβαίνουν στη δέσμευση πρωτεϊνών, σχετίζονται με τις έλικες II και III και τις θηλιές B και C. Κρυσταλλογραφικές μελέτες (Yusupov et al, 2001, Harms et al, 2001, Schuwirth et al, 2005) έχουν δείξει, ότι οι περιοχές αυτές αποτελούν τις κύριες θέσεις δέσμευσης των πρωτεϊνών L5 και L18. Επιπλέον, μελέτες συμπλόκου της L5 πρωτεΐνης του Thermus thermophilus με ένα 34- ολιγονουκλεοτίδιο, αποτελούμενο από την έλικα III και τη θηλιά C του 5S rrna, έδειξαν ότι τα νουκλεοτίδια C42 και C43 εμπλέκονται σε υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς υδρογόνου με μη πολικά και πολικά άτομα της L5, αντίστοιχα (Perederina et al, 2002). Στη παρούσα μελέτη, αυτά τα κατάλοιπα βρέθηκαν να είναι επιδεκτικά στην ΑΒΑ-σπερμίνη, ανεξάρτητα από την συγκέντρωση του φωτοαναλόγου και ανεξάρτητα από το αν το 5S rrna ήταν ελεύθερο ή μη Διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στη διαμόρφωση του 5S rrna Η διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στη διαμόρφωση του 5S rrna έγινε με πειράματα χημικής τροποποίησης, 135

137 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο DMS. Η φωτοσήμανση του 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη οδηγεί σε σημαντικές αλλαγές στην επιδεκτικότητα αρκετών νουκλεοτιδίων του 5S rrna έναντι του αντιδραστηρίου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 7.4. η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rrna προάγει αλλαγές στην αναδίπλωση του. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή. Οι παραπάνω παρατηρήσεις έρχονται σε συμφωνία με φυσικοχημικές μελέτες (Kao and Crothers, 1980, Barciszewski et al, 1988). Τα αποτελέσματα της χημικής τροποποίησης με DMS, όταν η φωτοσήμανση έγινε με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη, έδειξαν ότι η διαμόρφωση που υιοθετεί το 5S rrna είναι διαφορετική από την καλούμενη Α δομή (Göringer et al, 1984). Επίσης, ανασυσταμένες 50S υπομονάδες, που φέρουν 5S rrna φωτοσημασμένο με 300 μμ ΑΒΑσπερμίνη, φαίνεται ότι συζεύγνoνται σε μικρό βαθμό με 30S υπομονάδες και είναι λειτουργικά ανενεργές (Πίνακες 7.5. και 7.7.) Λειτουργικές Μελέτες Τα αποτελέσματα των δομικών μελετών έδειξαν ότι η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rrna οδηγεί σε αλλαγές της διαμόρφωσής του. Κρίθηκε έτσι ενδιαφέρον να μελετήσουμε, αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα του να συναρμολογείτε σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Βάσει ορισμένων πειραματικών ενδείξεων, οι Kakegewa et al (1986a) ισχυρίστηκαν ότι οι πολυαμίνες δεν επηρεάζουν σημαντικά την in vitro συναρμολόγηση 50S υπομονάδων από 23S rrna, 5S rrna και TP50. Ταυτόχρονα, υπάρχουν στοιχεία (Shpanchenko et al, 1998) που υποστηρίζουν, ότι το 5S rrna υπόκειται σε διαμορφωτικές αλλαγές κατά την συναρμολόγησή του στην κεντρική προεξοχή της 50S υπομονάδας. Για να 136

138 μελετήσουμε την επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητά του να συναρμολογείτε σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσώματα, φωτοσημάναμε το 5S rrna με 50 μμ σπερμίνη και προσδιορίσαμε το ποσοστό συναρμολόγησης του. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό των 50S υπομονάδων που συναρμολογήθηκαν, ύστερα από φωτοσήμανση του 5S rrna, ήταν περίπου μισό αυτού που προσδιορίστηκε όταν χρησιμοποιήθηκε άθικτο 5S rrna. Σε συνδυασμό με την μελέτη των Shpanchenko et al, (1988), η παρατήρηση αυτή οδηγεί στη υπόθεση ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη παρεμποδίζει τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές για τη συναρμολόγηση με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική και κατά συνέπεια λιγότερο ευέλικτη δομή του 5S rrna. Το παραπάνω συμπέρασμα επιβεβαιώνει το γεγονός, ότι το ποσοστό συναρμολόγησης μειώθηκε, όταν χρησιμοποιήθηκε 5S rrna φωτοσημασμένο με 300 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη. Σε αντίθεση, η συναρμολόγηση 70S ριβοσωμικών συμπλόκων από 50S που έφεραν φωτοσημασμένο 5S rrna, δε φαίνεται να επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης. Έτσι, παρόλο που η παρουσία σπερμίνης προκαλεί στο 5S rrna δομικές αλλαγές τέτοιες που εμποδίζουν την συναρμολόγηση 50S υπομονάδων, όταν οι τελευταίες σχηματιστούν, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν αποτελεσματικά με τις 30S υπομονάδες. Η απουσία 5S rrna στο διάλυμα συναρμολόγησης οδηγεί σε ελλειμματικές από δομικής άποψης υπομονάδες με συντελεστή καθίζησης 47S. Οι υπομονάδες αυτές με τη σειρά τους συζεύγνονται σε ικανό ποσοστό με 30S υπομονάδες, αλλά οδηγούν σε ελλειμματικά ριβοσώματα με συντελεστή καθίζησης 62S και δραματική μείωση της λειτουργικότητας τους. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με παλαιότερες παρατηρήσεις (Dohme and Nierhaus, 1976a) και επιβεβαιώνει το σημαντικό ρόλο του 5S rrna στη δομή και λειτουργία του ριβοσώματος. 137

139 Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα. Η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην πρόσδεση υποστρώματος στις θέσεις Ρ- και Α- του ριβοσώματος μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα AcPhe-tRNA και poly(u)- προγραμματισμένα ανασυσταμένα ριβοσώματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωτοσήμανση του 5S rrna με 50 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη οδηγεί σε μικρή, αλλά εμφανή ενεργοποίηση της πρόσδεσης του AcPhe-tRNA στην Ρ-θέση του ριβοσώματος. Το αποτέλεσμα αυτό δικαιολογείται, λαμβάνοντας υπόψη την έντονη δέσμευση της ΑΒΑσπερμίνης στην περιοχή της θηλιάς B θηλιάς C του 5S rrna. Η περιοχή αυτή έχει βρεθεί ότι συμμετέχει σε μονοπάτια μετάδοσης σημάτων, συνδέοντας το 5S rrna με t-rna δεσμευμένο στην Ρ-θέση. Για παράδειγμα, οι Perederina et al (2002) έδειξαν ότι η πρωτεΐνη L5 αλληλεπιδρά με νουκλεοτίδια στο άνω τμήμα της θηλιάς C. Επιπλέον μελέτες έχουν δείξει ότι η L5 αλληλεπιδρά με την θηλιά Τ του t-rna, όταν είναι δεσμευμένο στην Ρ- θέση (Nissen et al, 2000, Yusupov et al, 2001, Harms et al, 2001, Schuwirth et al, 2005). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν επίσης, ότι η φωτοσήμανση του 5S rrna με ΑΒΑ-σπερμίνη δεν επηρεάζει την δέσμευση του AcPhe-tRNA στην Α-θέση του ριβοσώματος. Το αποτέλεσμα αυτό φαίνεται κατ αρχή να βρίσκεται σε αντίθεση με το γεγονός, ότι η C-τελική ουρά της S13 πρωτεΐνης επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του mrna και της περιοχής του αντικωδικονίου ενός trna δεσμευμένου στην Α-θέση (Schuwirth et al, 2005, Berk et al, 2006). Όμως, κρυσταλλογραφικές μελέτες μεγαλυτέρας ανάλυσης σε E.coli ριβοσώματα (Cukras et al, 2005, Sergiev et al, 2005, Liiv and O Connor, 2006) αποκάλυψαν, ότι τα C-τελικά αμινοξέα της S13 είναι ιδιαιτέρως ευέλικτα και δεν αποκαθιστούν σταθερές και ειδικές επαφές με το αντικωδικόνιο τμήμα του trna της Α-θέσης. Επιπλέον, μελέτες με μεταλλαγμένα στελέχη E.coli έδειξαν, ότι η απουσία επαφών μεταξύ της πρωτεΐνης S13 και της Η38 (γέφυρα Β1a) έχει μικρή επίδραση στη δέσμευση 138

140 trna, γεγονός που υποστηρίζει την άποψη ότι η γέφυρα Β1a δεν είναι σημαντική για την επικοινωνία μεταξύ του 5S rrna και trna θέσεων δέσμευσης (Komoda et al, 2006). Ριβοσώματα που φέρουν άθικτο 5S, αλλά και ριβοσώματα που φέρουν φωτοσημασμένο 5S rrna, παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα για δέσμευση AcPhe-tRNA στην Α-θέση, παρουσία ελεύθερης σπερμίνης. Όμως, πρέπει να αναφερθεί ότι στην περίπτωση αυτή, τόσο η 30S υπομονάδα, όσο και το AcPhe-tRNA αλληλεπιδρούν με σπερμίνη (Amarantos et al, 2002), γεγονός που ευνοεί την δέσμευση του trna. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι η απουσία 5S rrna από το ριβόσωμα, προκαλεί δραματική μείωση της δέσμευσης του AcPhe-tRNA, κυρίως στην Α-θέση, αποτέλεσμα που έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Dohme et al, 1976a). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός, ότι στη περίπτωση αυτή η παρουσία ελεύθερης σπερμίνης δεν αναπληρώνει την απουσία του 5S Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην καταλυτική δράση του ριβοσώματος Η επίδραση της δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, στην ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης μελετήθηκε χρησιμοποιώντας 70S ανασυσταμένα ριβοσωματικά σύμπλοκα, τα οποία αντέδρασαν με πουρομυκίνη. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδωσαν την δυνατότητα υπολογισμού της καταλυτικής σταθεράς k cat και της σταθεράς συγγένειας K s. Η ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης προσδιορίστηκε από το λόγο k cat / K s. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν, ότι ριβοσώματα τα οποία φέρουν φωτοσημασμένο 5S rrna παρουσιάζουν αυξημένη δράση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά 30%, σε σύγκριση με τα ριβοσώματα που φέρουν άθικτο 5S rrna. Είναι γνωστό (Rodnina et al, 2007), ότι η κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού απαιτεί την ακριβή τοποθέτηση των Α- και Ρ- υποστρωμάτων μέσα στο καταλυτικό κέντρο, σε συνδυασμό με την υποβοηθούμενη από το υπόστρωμα κατάλυση (substrate assisted catalysis). 139

141 Συνεπώς, φαίνεται ότι εκτός από την επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην συγγένεια για την Ρ-θέση, τα σήματα που μεταδίδονται από το 5S rrna μέσω της πρωτεΐνης L5 επηρεάζουν επίσης τη λειτουργική τοποθέτηση του AcPhe-tRNA μέσα στο καταλυτικό κέντρο. Ένα άλλο μονοπάτι μετάδοσης σημάτων του 5S rrna στην Ρ-περιοχή είναι η διαδρομή από τη θηλιά D του 5S rrna, μέσω της Η39 του 23S rrna, στη Ρ-θέση του καταλυτικού κέντρου (P-loop) (Dontsova et al, 1994, Dokudovskaya et al, 1996, Sergiev et al, 1998, Osswald et al, 1999). Τα πειράματα ταυτοποίησης θέσεων πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna έδειξαν, ότι η θηλιά D αποκτά μια πιο συνεκτική δομή μετά τη φωτοσήμανση. Αυτή η αλλαγή, ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό με τις αλλαγές που βρέθηκε να συμβαίνουν στη διαμόρφωση της περιοχής θηλιά B θηλιά C, μπορεί επίσης να επηρεάζει τις ιδιότητες της Ρ- θέσης. Η συγγένεια της πουρομυκίνης για την Α-θέση δεν μεταβάλλεται μετά από τη φωτοσήμανση του 5S rrna με ΑΒΑ-σπερμίνη. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με παρατηρήσεις των Komoda et al (2006), οι οποίοι αναφέρουν ότι απαλοιφή της Η38, έλικας του 23S rrna που συμμετέχει στη μετάδοση σημάτων μεταξύ του 5S rrna και της Α-θέσης, δεν επηρεάζει σημαντικά την δράση της πεπτιδυλοτρανφεράσης. Ριβοσώματα ελλιπή σε 5S rrna, διατηρούν 10% της δράσης της πεπτιδυλοτρανφεράσης, αποτέλεσμα που έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις, σύμφωνα με τις οποίες το 5S rrna ενισχύει μεν τη ριβοσωματική δραστικότητα (Erdmann et al, 1971, Dohme and Nierhaus, 1976a) αλλά δεν είναι απολύτως απαραίτητο για την εκδήλωσή της (Schulze and Nierhaus, 1982) Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην αυθόρμητη, μη ενζυμική μετατόπιση υποστρωμάτων Αν και εξαιρετικά αργή, η μη-ενζυμική μετατόπιση υποστρωμάτων είναι μετρήσιμη και αποτελεί έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος (Bergemann and Nierhaus, 1983, Southworth et al, 2002). Τα αποτελέσματα της παρούσας 140

142 μελέτης επιβεβαιώνουν την άποψη αυτή. Επίσης, φαίνεται ότι η ιοντική αλληλεπίδραση της σπερμίνης με ολόκληρα ριβοσώματα ή η ομοιοπολική δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna υποκινεί την μη ενζυμική μετατόπιση (EF-G-ανεξάρτητη, αυθόρμητη μετατόπιση), γεγονός που μας προτρέπει να υποθέσουμε ότι αλλαγές στην αναδίπλωση του rrna μπορεί να διαμεσολαβούν αυτή τη διαδικασία. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται από πειράματα χημικής προστασίας, τα οποία έδειξαν ότι κατά την φωτοενσωμάτωση της ΑΒΑ-σπερμίνης, η περιοχή γύρω από τα νουκλεοτίδια G1338-U1341 στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας και η ακραία θηλιά Α790 στην πλατφόρμα, λαμβάνουν μια πιο ανοιχτή διαμόρφωση. Κρυσταλλογραφικές μελέτες σε E.coli ριβοσώματα υποστηρίζουν ότι ο χώρος μεταξύ της G1338-U1341 περιοχής και της Α790 λειτουργεί ως «κλειδαριά», επιτρέποντας ή αποτρέποντας την δίοδο του αντικωδικονίου του trna, όταν το τελευταίο μετακινείται από την Ρ- στην Ε-θέση (Schuwirth et al, 2005, Berk et al, 2006). Τα αλλοστερικά σήματα που προκαλούνται από τις διαμορφωτικές αλλαγές στο 5S rrna μπορεί να διαβιβάζονται σε αυτήν την «κλειδαριά» μέσω των δια-υπομοναδικών γεφυρών Β1 και της πρωτεΐνης S13, της οποίας η C-τελική ουρά εκτείνεται από τις γέφυρες και φτάνει πολύ κοντά στη «κλειδαριά» (Korostelev et al, 2006) Επίδραση της αλλαγής της διαμόρφωσης του 5S rrna στην EF-G καταλυόμενη μετατόπιση Η μετατόπιση, παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων EF-G και GTP, είναι γρήγορη, ακόμη και απουσία πολυαμινών (Xaplanteri et al, 2005). Συνεπώς, η μελέτη της επίδρασης της δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στην EF-G εξαρτώμενη μετατόπιση είναι αδύνατη χωρίς την χρήση ταχέων κινητικών τεχνικών (fast kinetics). Για το λόγο αυτό ακολουθήσαμε μια εναλλακτική πειραματική πορεία. Ο παράγοντας EF-G προστέθηκε σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σε σταθερό ποσό ριβοσωματικού συμπλόκου. Τα αποτελέσματα, έδειξαν ότι η έκταση της μετατόπισης για τα διάφορα είδη ριβοσωματικών συμπλόκων, αυξάνεται παρουσία αυξανόμενων 141

143 συγκεντρώσεων EF-G και φτάνει σε κοινό πλατώ. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι κάθε είδος ριβοσωματικού συμπλόκου απαιτούσε διαφορετική συγκέντρωση EF-G για να επιτευχθεί το 50% της μετατόπισης. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι η παρουσία σπερμίνης, ελεύθερης ή ομοιοπολικά δεσμευμένης στο 5S rrna, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί, είτε μέσω μιας ευεργετικής δράσης της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε μέσω επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP Επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G και να ενεργοποιούν την EF-G εξαρτώμενη GTP υδρόλυση Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές είναι ορθή, μελετήθηκε αρχικά η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF-G. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκθεση των ριβοσωμάτων σε σπερμίνη (ελεύθερη ή ομοιοπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna) προκαλεί αλλαγές διαμόρφωσης τέτοιες, ώστε να ενεργοποιείται η πρόσδεση του EF-G στο ριβόσωμα. Αντίθετα, η αρχική ταχύτητα υδρόλυσης του GTP δεν επηρεάστηκε από την παρουσία σπερμίνης. Συνεπώς, η φωτοενσωμάτωση της ΑΒΑ-σπερμίνης, και άρα η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rrna, δεν φαίνεται να επηρεάζουν την GTP υδρόλυση. Ριβοσώματα ελλιπή σε 5S rrna διατηρούν κάποια EF-G-εξαρτώμενη GTPαση δραστικότητα, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με άλλες μελέτες (Erdmann et al, 1971, Dohme and Nierhaus, 1976a). Η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα συγκροτείται από το κέντρο της GTPάσης (GTPase-associated center, GAC) που βρίσκεται στην περιοχή II του 23S rrna (έλικες Η42-Η44) και τη θηλιά SRL (sarcin-ricin loop,) στην περιοχή VI του 23S rrna (έλικα Η95) (Wilson and Nierhaus, 2003). Παρά το γεγονός ότι σε E.coli ριβοσώματα, απευθείας επαφές του 5S rrna, με τις περιοχές GAC και SRL και τον παράγοντα EF-G δεν έχουν ταυτοποιηθεί 142

144 μέχρι τώρα, έχει υποτεθεί ότι διάφορες διαδρομές μετάδοσης αλλοστερικών σημάτων υφίστανται μεταξύ του 5S rrna, του καταλυτικού κέντρου της ΡΤασης και των περιοχών GAG και SRL. Πειράματα σταυροσύνδεσης και χημικής προστασίας (Dontsova et al, 1994, Dokudovskaya et al, 1996, Sergiev et al, 1998, Osswald and Brimacombe, 1999, Sergiev et al, 2000, Ko et al, 2001) έχουν ταυτοποιήσει επαφές μεταξύ της θηλιάς D του 5S rrna και καταλοίπων των ελίκων Η39 και Η89 του 23S rrna. Η Η39 αλληλεπιδρά με την Η80 στο 23S rrna και βρίσκεται πολύ κοντά στην περιοχή GAC. Η ακραία θηλιά της Η89, όχι μόνο αλληλεπιδρά με το ΕF-G (Noller et al, 2001, Wilson and Nierhaus, 2003), αλλά επίσης σχηματίζει ζεύγη βάσεων με τη ακραία θηλιά της Η91 στο 23S rrna (Yusupov et al, 2001, Schuwirth et al, 2005). Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι η αντίθετη πλευρά της θηλιάς της έλικας Η91 αλληλεπιδρά με τη SRL, τη δεύτερη περιοχή δέσμευσης του EF-G (Schuwirth et al, 2005, Chan et al, 2006). Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζουν διαφοροποιημένη επίδραση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rrna στην EF-G GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, και στην EF-G εξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Οδηγούμαστε έτσι στην υπόθεση ότι, είτε οι περιοχές GAC και SRL έχουν μοναδικές λειτουργίες, είτε ο EF-G κατέχει διακριτές περιοχές, οι οποίες αποκρίνονται διαφορετικά στις αλλαγές της διαμόρφωσης του 5S rrna: Μια περιοχή απαραίτητη για την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, και μια δεύτερη που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της δράσης της GTPασης Επίδραση των διαμορφωτικών αλλαγών του 5S rrna στη δομή λειτουργικών περιοχών του ριβοσώματος Όπως αναφέρθηκε πριν, η θέση δέσμευσης του παράγοντα μετατόπισης EF-G εντοπίζεται στην περιοχή SRL (έλικα Η95 της περιοχής VI του 23S rrna) και GAC (έλικες Η42-Η44 της περιοχής II του 23S rrna). Επίσης, έχει βρεθεί ότι ο EF-G αλληλεπιδρά με τη μικρή (θηλιά 790) και μεγάλη υπομονάδα (έλικα Η89). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αποτυπώματος (footprinting analysis) έδειξαν ότι η παρουσία σπερμίνης ελεύθερης ή 143

145 ομοιοπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna ενισχύει το «αποτύπωμα» του EF-G στο ριβόσωμα, γεγονός που επιβεβαιώνει τις μετρήσεις πρόσδεσης του συμπλόκου EFG GDP φουσιδικό οξύ στο ριβόσωμα. Συνεπώς, με μια επιπλέον μεθολογική προσέγγιση επιβεβαιώνεται η υπόθεση ότι, το 5S rrna, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα. Η ανάλυση αποτυπώματος χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη μελέτη της επίδρασης της φωτοσήμανσης του 5S rrna στη πρόσδεση υποστρώματος στις θέσεις Ρ- και Α- του ριβοσώματος. Η μελέτη επικεντρώθηκε σε νουκλεοτίδια, τα οποία είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι ενέχονται στη δέσμευση των trnas. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν βρίσκονται σε συμφωνία με αυτά που κατεγράφησαν από τις κινητικές μελέτες πρόσδεσης υποστρώματος. Η παρουσία σπερμίνης ενεργοποιεί τη δέσμευση του υποστρώματος στην Ρ- θέση σε σημαντικό βαθμό, ενώ η συγγένεια για την Α-θέση επηρεάζεται ελάχιστα, είτε η σπερμίνη είναι ελεύθερη είτε ομοιπολικά δεσμευμένη στο 5S rrna. Η κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού βασίζεται στην ακριβή τοποθέτηση των Α- και Ρ- υποστρωμάτων στο ενεργό κέντρο. Συνεπώς, τα σήματα που μεταδίδονται από το 5S, μέσω των οδών μετάδοσης αλλοστερικών σημάτων, μπορεί να επηρεάζουν τη λειτουργική τοποθέτηση του υποστρώματος μέσα στο καταλυτικό κέντρο. Σε κάθε μια από τις παραπάνω περιπτώσεις, η απουσία του 5S rrna από το ριβοσωμικό σύμπλοκο είχε δραματικές επιπτώσεις στη συμπεριφορά του ριβοσώματος, αποτέλεσμα αναμενόμενο και σε συμφωνία με τις κινητικές μελέτες πρόσδεσης του EF-G και των υποστρωμάτων στο ριβόσωμα. Ριβοσώματα ελλιπή σε 5S rrna δε δεσμεύουν σε ικανοποιητικό βαθμό EF-G και έχουν μειωμένη συγγένεια ως προς τη δέσμευση υποστρώματος. Η παρουσία ελεύθερης σπερμίνης δεν φαίνεται να αναπληρώνει την απουσία του. Συνδυάζοντας τα παραπάνω οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι το ιοντικό περιβάλλον στο ριβόσωμα γενικότερα, και η διαμόρφωση του 5S rrna ειδικότερα, παίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων προς το καταλυτικό κέντρο και την περιοχή πρόσδεσης EF-G. Είναι πολύ ενδιαφέρον 144

146 να μελετηθεί στο μέλλον, αν ο παράγων EF-Tu που εμπλέκεται στην πρόσδεση των aa-trnas στην Α-θέση ανταποκρίνεται παρομοίως ή διαφορετικά ως προς τον EF-G στη μετάδοση σημάτων από το 5S rrna. 145

147 ΣΥΝΟΨΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ & SYNOPSIS OF THESIS 146

148 9. Σύνοψη της μελέτης Τα τελευταία χρόνια, πολλά εργαστήρια έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στο 5S rrna, το μικρότερο RNA συστατικό του ριβοσώματος. Ο ακριβής ρόλος του 5S rrna στο ριβόσωμα, την πρωτεϊνική βιοσυνθετική μηχανή, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Αποτελέσματα δομικών μελετών τοποθετούν το 5S rrna στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Ευρήματα που αφορούν σχέσεις δομής και λειτουργίας οδηγούν στην υπόθεση, ότι σταθεροποιεί τη δομή του ριβοσώματος και λειτουργεί ως φυσικός μεταδότης πληροφοριών μεταξύ λειτουργικών κέντρων. Από την άλλη πλευρά, το ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία. Μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, καθώς και πολυκατιόντα, όπως οι πολυαμίνες, παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση και συνεπώς εμπλέκονται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος. Προκαρτατικές μελέτες στο εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι οι πολυαμίνες, και συγκεκριμένα η σπερμίνη, σταθεροποιούν την δευτεροταγή και τριτοταγή δομή του 5S rrna, οδηγώντας σε μια πιο συνεκτική διαμόρφωση του μορίου. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της διαμόρφωσης του 5S rrna στην πρωτεϊνική σύνθεση του εντεροβακτηρίου E.coli. Παράλληλος στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στη δομή και λειτουργία τόσο του 5S rrna, όσο και ολοκλήρου του ριβοσωματικού συμπλόκου. Η πρόσδεση των πολυαμινών στο 5S rrna μελετήθηκε με τη μέθοδο της φωτοσήμανσης συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της πρόσδεσης και προσδιορίστηκαν οι θέσεις δέσμευσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna, είτε αυτό ήταν ελεύθερο, είτε ενσωματωμένο σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες ή 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα από E.coli. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σε ελεύθερο 5S rrna, η σπερμίνη προσδένεται κυρίως σε νουκλεοτίδια των ελίκων III και V και στις θηλιές Α, C, D και E. Ενσωμάτωση του 5S rrna σε 50S υπομονάδες ή 70S poly(u)-προγραμματισμένα ριβοσώματα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση 147

149 της επιδεκτικότητας των νουκλεοτιδίων του στην ΑΒΑ-σπερμίνη. Ακολούθησε διερεύνηση των επιπτώσεων της πρόσδεσης του φωτοαναλόγου στη δομή του 5S rrna. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χημικής τροποποίησης, τα οποία αποκάλυψαν ότι ανεξάρτητα από το αν το 5S rrna είναι ελεύθερο ή συναρμολογημένο σε 50S υπομονάδες ή σε 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα, η πρόσδεση της ΑΒΑ-σπερμίνης προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου. Η θηλιά Α υιοθετεί μια πιο χαλαρή δομή, ενώ οι θηλιές C, D και E και η έλικα III μια πιο συνεκτική δομή. Με την διαπίστωση των αλλαγών της διαμόρφωσης του 5S rrna λόγω της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές επηρεάζουν θεμελιώδεις λειτουργίες του ριβοσώματος. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα του να συναρμολογείται σε 50S υπομονάδες και 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσδεση της ΑΒΑσπερμίνη στο 5S rrna, δεν καταργεί την διαδικασία συναρμολόγησης των 50S υπομονάδων, παρεμποδίζει όμως τις απαιτούμενες δομικές αλλαγές με το να σταθεροποιεί μια πιο συνεκτική δομή του 5S rrna, θερμοδυναμικά λιγότερο ευνοϊκή για την πορεία. Παρά το γεγονός ότι η πρόσδεση της σπερμίνης στο 5S rrna επιφέρει στο μόριο δομικές αλλαγές που εμποδίζουν την συναρμολόγηση του σε 50S υπομονάδες, όταν αυτές σχηματιστούν, αποκτούν δομή τέτοια που επιτρέπει την αλληλεπίδρασή τους με τις 30S υπομονάδες. Ωστόσο, η παρουσία του 5S rrna φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό ενεργών 50S υπομονάδων, αφού η απουσία του 5S rrna δεν επιτρέπει ούτε το σχηματισμό ακέραιων υπομονάδων, ούτε την σύζευξη των υπομονάδων προς ακέραια ριβοσωματικά σύμπλοκα. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της φωτοσήμανσης του 5S rrna, αρχικά στην ικανότητα των ριβοσωμάτων να προσδένουν υπόστρωμα και στη συνέχεια, στην καταλυτική δράση αυτών. Φωτοσήμανση του 5S rrna με ΑΒΑ-σπερμίνη προκάλεσε μικρή, αλλά σαφή ενεργοποίηση της πρόσδεσης υποστρώματος στην Ρ-θέση, σε αντίθεση με την πρόσδεση στην Α-θέση, η οποία δε φαίνεται να επηρεάζεται. Σαφής ήταν, επίσης, η επίδραση στην 148

150 ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης: Παρατηρήθηκε αύξηση μέχρι και 30% στη δραστικότητα της ΡΤασης. Ιδιαίτερης σημασίας είναι το εύρημα, ότι ριβοσώματα ελλιπή σε 5S διατηρούν ~10% της δράσης της ΡΤασης, γεγονός που οδηγεί στη υπόθεση ότι το 5S rrna δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού. Ακολούθησε η μελέτη της επίδρασης της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην μετατόπιση υποστρωμάτων, αρχικά στην αυθόρμητη (μη ενζυμική) και στη συνέχεια στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την υπόθεση, ότι η μετατόπιση υποστρωμάτων είναι έμφυτη ιδιότητα του ριβοσώματος. Παράλληλα, κατέδειξαν ότι η πρόσδεση σπερμίνης στο 5S rrna διεγείρει την μη ενζυμική μετατόπιση, πιθανόν μέσω αλλαγών στην αναδίπλωση του rrna, οι οποίες μεταδίδονται στα ριβοσωματικά κέντρα που είναι υπεύθυνα για αυτή τη λειτουργία. Περαιτέρω, η παρουσία σπερμίνης στο 5S rrna, μείωσε τις απαιτήσεις για EF-G. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί είτε με μια πιθανή ευεργετική δράση της σπερμίνης στην δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, είτε με την επίδρασή της στο στάδιο της υδρόλυσης του GTP. Για να διευκρινίσουμε ποια από τις δυο εκδοχές ευσταθεί, μελετήθηκε η επίδραση της αλλαγής διαμόρφωσης του 5S rrna στην ικανότητα ριβοσωμάτων να δεσμεύουν EF- G και στη συνέχεια στην ικανότητα τους να ενεργοποιούν την EF-Gεξαρτώμενη GTP υδρόλυση. Βρέθηκε ότι, η παρουσία σπερμίνης στο μόριο του 5S rrna, ευνοεί τη δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα. Όσο αφορά την ικανότητα του ριβοσώματος να ενεργοποιεί την EF-G-εξαρτώμενη GTP υδρόλυση, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης δεν επηρεάζεται από την παρουσία σπερμίνης, αποτέλεσμα που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rrna δεν επηρεάζει την GTP υδρόλυση. Απουσία του 5S rrna, τα ριβοσώματα διατηρούν κάποια δραστικότητα GTPασης, αλλά δεν είναι ικανά να δεσμεύουν αποτελεσματικά τον EF-G, ακόμη και παρουσία σπερμίνης. Λαμβάνοντας υπόψη, ότι η θέση δέσμευσης του EF-G στο ριβόσωμα βρίσκεται στα domain II και VI του 23S rrna και ότι απευθείας επαφές του 149

151 5S rrna με αυτές τις περιοχές ή με τον EF-G δεν έχουν βρεθεί, οδηγούμαστε στην υπόθεση ότι, το 5S rrna, μέσω αλλοστερικών σημάτων, επηρεάζει την EF-G-GTP δέσμευση στο ριβόσωμα, όχι όμως και την GTP υδρόλυση. Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω, μελετήθηκε η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος και η αλλαγή της διαμόρφωσης του 5S rrna, στη διαμορφωτική κατάσταση θεμελιωδών λειτουργικών κέντρων του ριβοσώματος. Η μελέτη εστιάστηκε στην ικανότητα του 5S rrna να επηρεάζει τα κέντρα πρόσδεσης του EF-G στο ριβόσωμα, καθώς και τις θέσεις Α- και Ρ- του ριβοσωμικού συμπλόκου. Διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση ελεύθερης σπερμίνης με το ριβόσωμα ενισχύει το αποτύπωμα (footprinting) χημικής προστασίας νουκλεοτιδίων υπευθύνων για την πρόσδεση του ΕF-G και τη συγκρότηση της Ρ-θέσης, όχι όμως και της Α-θέσης. Παρόμοια, αλλά μικρότερου βαθμού, ήταν και η επίδραση της προσδενομένης επιλεκτικά ΑΒΑ-σπερμίνης στο 5S rrna. Συμπερασματικά, το 5S rrna περιέχει θέσεις εξειδικευμένης πρόσδεσης πολυαμινών, οι οποίες επηρεάζουν την τριτοταγή του διαμόρφωση. Η δέσμευση της σπερμίνης στο 5S rrna φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά την ικανότητα της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας να δεσμεύει υπόστρωμα, βελτιώνει όμως την καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος και την ικανότητα του να μετατοπίζει τα υποστρώματα. Οι πολυαμίνες ενεργοποιούν την δέσμευση του EF-G στο ριβόσωμα, αλλά ελάχιστα επηρεάζουν την υδρόλυση του GTP από τον EF-G. Εν κατακλείδι, το 5S rrna φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγωγή σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και της περιοχής πρόσδεσης EFG. 150

152 Synopsis In recent years, many research groups have focused their interest on 5S rrna, the smallest RNA component of the ribosome that is preserved in almost all organisms. Its precise role in the ribosome, the protein biosynthetic machine, has not been fully clarified. The results of structural studies place 5S rrna in the large ribosomal subunit. Findings concerning relations between structure and function lead to the assumption that 5S rrna stabilises the structure of the ribosome and acts as natural transmitter of information between functional centres. On the other hand, the ionic environment directly affects ribosome function. Monovalent and divalent ions as well as polycations, such as polyamines, influence the ribosomal conformation, and therefore are involved in the function of the ribosome. Preliminary studies in our laboratory have shown that polyamines, namely spermine, stabilize the secondary and tertiary structure of 5S rrna, leading to a more cohesive configuration of the molecule. The aim of this thesis was to investigate the role of 5S rrna configuration in protein synthesis of the enterobacterium E.coli. At the same time, the biological activity of polyamines in the structure and functioning of both 5S rrna and the whole ribosomal complex was studied. Polyamine binding to 5S rrna was investigated by photoaffinity labeling, using a photoreactive analogue of spermine, ABA-spermine, as a molecular probe. Kinetic study was performed and the number of crosslinking sites of ABA-spermine in free 5S rrna, or 5S rrna incorporated into 50S subunits or 70S ribosomal complexes from E.coli ribosomes was determined. The results revealed that in free 5S rrna spermine binds mainly to nucleotides of helices III and V and loops A, C, D and E. Integration of 5S rrna into 50S subunits or 70S poly (U) programmed ribosomes results in a great reduction of the susceptibility of 5S rrna to ABA-spermine. The impact of the ABA-spermine photo-incorporation into the 5S rrna molecule was 151

153 then investigated. Chemical modification experiments revealed that, regardless of whether 5S rrna is free or assembled in 50S subunits or 70S ribosomal complexes, binding of ABA-spermine causes significant changes in the conformation of the molecule. Loop A adopts a looser structure, while loops C, D, E and helices III and V achieve a more compact folding. With the discovery of changes in the configuration of 5S rrna, due to ABA-spermine s binding, it was interesting to study whether these conformational changes influence fundamental functions of the ribosome. Initially, the effect of changing the configuration of 5S rrna on 50S subunit and 70S ribosomal complex assembly was investigated. The results showed that binding of ABA-spermine to 5S rrna does not eliminate the process of 50S subunit assembly, but impedes the necessary structural changes by stabilising a more coherent structure of 5S rrna, thermodynamically less favourable for the process. Despite the fact that binding of ABA-spermine to 5S rrna results in structural changes that reduce the assembly of 50S subunits, when the later are formed they acquire such a structure that allows their interaction with 30S subunits. Nevertheless, the presence of 5S rrna seems to be necessary for the formation of active 50S subunits, since 5S RNAdepleted ribosomal subunits do not associate with 30S subunits to functional 70S ribosomes. Next, the effect of photolabeling 5S rrna was studied, initially on the ability of ribosomes to bind substrate, and then on their catalytic activity. Photolabeling of 5S rrna with ABA-spermine caused a small but obvious activation in AcPhe-tRNA binding to the P-site. In contrast, binding to the A- site did not appear to be affected. Of great importance was the effect on the activity of peptidyl-transferase; in the presence of spermine, an increase of up to 30% on the activity of PTase was observed. Interestedly, ribosomes that lack 5S rrna maintained ~ 10% of PTase activity, which leads to the assumption that 5S rrna is not absolutely necessary for the formation of peptide bonds. 152

154 The study of the effect of 5S rrna conformational changes on ribosome's ability to translocate substrates followed. Spontaneous (nonenzymatic) translocation was studied first, and then, EF-G-catalyzed translocation. The results confirmed the assumption that translocation of substrates is an inherent property of the ribosome itself, even though extremely slow. At the same time, it was shown that binding of spermine to 5S rrna, stimulates non-enzymatic translocation, possibly through changes in the folding of ribosomal RNA, that are beneficial in translocating trnas. Further, the presence of spermine in 5S rrna reduced the requirements for EF-G. This result can be explained either by a possible beneficial effect of spermine to the binding of EF-G to the ribosome, either through its impact in the process of hydrolysis of GTP. To clarify which of the two versions is accurate, we studied the effect of 5S rrna conformational changes on the ribosomal ability to bind EF-G, and then on their ability to trigger EF-Gdependent GTP hydrolysis. It was found that the presence of spermine in 5S rrna promotes EF-G binding to ribosomes. In contrast, the results of the study showed that the initial rate of GTP hydrolysis was not influenced by the presence of spermine. Ribosomes depleted of 5S rrna retained some GTP activity, but were unable to effectively bind EF-G even in the presence of spermine. Taking into account that EF-G binds in domain II and VI of 23S rrna, but direct contacts of 5S rrna with these areas or with EF-G have not been found, we are led to the conclusion that 5S rrna affects EF-G-GTP binding to ribosomes, through allosteric signals, without affecting the EF-Gmediated GTP hydrolysis. To confirm the above, we studied the effect of the ionic environment and the changes in the tertiary structure of 5S rrna on the conformational state of fundamental functional centres in the ribosome. Specifically, the study was focused on the ability of free spermine or photolabeling 5S rrna with ABA-spermine to affect the SRL and GAC regions of the ribosome as well as the A-and P-sites. It was found that interaction of free spermine with ribosomes intensifies the footprint of EF-G within the ribosome and induces 153

155 the AcPhe-tRNA binding to the P-site, but not to the A-site. Similar, but of lower degree, was the effect 5S rrna labelling by ABA-spermine. In summary, a comprehensive view of the 5S rrna nucleotide residues involved in spermine binding is gained by the present study. The results further suggest that binding of spermine to 5S rrna causes conformational changes in certain regions of the molecule. These changes, although not of the extreme amplitude, enabled us to investigate the functional role of 5S rrna. In light of this role, it seems that PTase center and EF-G binding center are able to coordinate their functions by transmission of allosteric signals through 5S rrna. 154

156 155 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

157 10. Βιβλιογραφία Abraham AK, Olsnes S, Pihl A Fidelity of protein synthesis in vitro is increased in the presence of spermidine. FEBS Lett 101:93-6 Abraham AK, Pihl A Variable rate of polypeptide chain elongation in vitro. Effect of spermidine. Eur J Biochem 106: Agrawal RK, Frank J. 1999a. Structural studies of the translational apparatus. Curr Opin Struct Biol 9: Agrawal RK, Lata RK, Frank J. 1999b. Conformational variability in Escherichia coli 70S ribosome as revealed by 3D cryo-electron microscopy. Int J Biochem Cell Biol 31: Agrawal RK, Penczek P, Grassucci RA, Li Y, Leith A, et al Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science 271: Agrawal RK, Spahn CM, Penczek P, Grassucci RA, Nierhaus KH, Frank J Visualization of trna movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle. J Cell Biol 150: Amarantos I, Kalpaxis DL Photoaffinity polyamines: interactions with AcPhe-tRNA free in solution or bound at the P-site of Escherichia coli ribosomes. Nucleic Acids Res 28: Amarantos I, Xaplanteri MA, Choli-Papadopoulou T, Kalpaxis DL Effects of two photoreactive spermine analogues on peptide bond formation and their application for labeling proteins in Escherichia coli functional ribosomal complexes. Biochemistry 40: Amarantos I, Zarkadis IK, Kalpaxis DL The identification of spermine binding sites in 16S rrna allows interpretation of the spermine effect on ribosomal 30S subunit functions. Nucleic Acids Res 30: Ammons D, Rampersad J, Fox GE S rrna gene deletions cause an unexpectedly high fitness loss in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 27: Auffinger P, Bielecki L, Westhof E Symmetric K+ and Mg2+ ionbinding sites in the 5S rrna loop E inferred from molecular dynamics simulations. J Mol Biol 335: Balasundaram D, Tabor CW, Tabor H Sensitivity of spermidinedeficient Saccharomyces cerevisiae to paromomycin. Antimicrob Agents Chemother 43: Ban N, Nissen P, Hansen J, Moore PB, Steitz TA The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289: Banatao DR, Altman RB, Klein TE Microenvironment analysis and identification of magnesium binding sites in RNA. Nucleic Acids Res 31: Barciszewski J, Bratek-Wiewiorowska MD, Gornicki P, Naskret-Barciszewska M, Wiewiorowski M, et al Comparative calorimetric studies on the dynamic conformation of plant 5S rrna. I. Thermal unfolding 156

158 pattern of lupin seeds and wheat germ 5S rrnas, also in the presence of magnesium and sperminium cations. Nucleic Acids Res 16: Bartetzko A, Nierhaus KH Mg2+/NH4+/polyamine system for polyuridine-dependent polyphenylalanine synthesis with near in vivo characteristics. Methods Enzymol 164:650-8 Bashan A, Agmon I, Zarivach R, Schluenzen F, Harms J, et al Highresolution structures of ribosomal subunits: initiation, inhibition, and conformational variability. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66:43-56 Bergemann K, Nierhaus KH Spontaneous, elongation factor G independent translocation of Escherichia coli ribosomes. J Biol Chem 258: Berger SL Quantifying 32P-labeled and unlabeled nucleic acids. Methods Enzymol 152:49-54 Bergeron RJ, Weimar WR, Wu Q, Feng Y, McManis JS Polyamine analogue regulation of NMDA MK-801 binding: a structure-activity study. J Med Chem 39: Berk V, Zhang W, Pai RD, Cate JH Structural basis for mrna and trna positioning on the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 103: Bernabeu C, Vazquez D, Ballesta JP Proteins associated with rrna in the Escherichia coli ribosome. Biochim Biophys Acta 518:290-7 Betzel C, Lorenz S, Furste JP, Bald R, Zhang M, et al Crystal structure of domain A of Thermus flavus 5S rrna and the contribution of water molecules to its structure. FEBS Lett 351: Blaha G, Burkhardt N, Nierhaus KH Formation of 70S ribosomes: large activation energy is required for the adaptation of exclusively the small ribosomal subunit. Biophys Chem 96: Blaha G, Stelzl U, Spahn CM, Agrawal RK, Frank J, Nierhaus KH Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on trna positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol 317: Bogdanov AA, Dontsova OA, Dokudovskaya SS, Lavrik IN Structure and function of 5S rrna in the ribosome. Biochem Cell Biol 73: Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: Brimacombe R, Gornicki P, Greuer B, Mitchell P, Osswald M, et al The three-dimensional structure and function of Escherichia coli ribosomal RNA, as studied by cross-linking techniques. Biochim Biophys Acta 1050:8-13 Brodersen DE, Nissen P The social life of ribosomal proteins. Febs J 272: Brunton VG, Grant MH, Wallace HM Mechanisms of spermine toxicity in baby-hamster kidney (BHK) cells. The role of amine oxidases and oxidative stress. Biochem J 280 ( Pt 1):

159 Capel MS, Engelman DM, Freeborn BR, Kjeldgaard M, Langer JA, et al A complete mapping of the proteins in the small ribosomal subunit of Escherichia coli. Science 238: Carter AP, Clemons WM, Jr., Brodersen DE, Morgan-Warren RJ, Hartsch T, et al Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit. Science 291: Caskey CT, Forrester WC, Tate W, Ward CD Cloning of the Escherichia coli release factor 2 gene. J Bacteriol 158:365-8 Cate JH, Yusupov MM, Yusupova GZ, Earnest TN, Noller HF X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285: Chan YL, Dresios J, Wool IG A pathway for the transmission of allosteric signals in the ribosome through a network of RNA tertiary interactions. J Mol Biol 355: Chen H, Bjerknes M, Kumar R, Jay E Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli mrnas. Nucleic Acids Res 22: Clark E, Swank RA, Morgan JE, Basu H, Matthews HR Two new photoaffinity polyamines appear to alter the helical twist of DNA in nucleosome core particles. Biochemistry 30: Correll CC, Freeborn B, Moore PB, Steitz TA Metals, motifs, and recognition in the crystal structure of a 5S rrna domain. Cell 91: Craigen WJ, Cook RG, Tate WP, Caskey CT Bacterial peptide chain release factors: conserved primary structure and possible frameshift regulation of release factor 2. Proc Natl Acad Sci U S A 82: Christiansen J, Egebjerg J, Larsen N and Garrett R (1990) Analysis of rrna structure: Experimental and theoritical considerations, in Ribosomes and Protein Synthesis (Spedding G ed) pp , University Press, Oxford, UK. Cukras AR, Green R Multiple effects of S13 in modulating the strength of intersubunit interactions in the ribosome during translation. J Mol Biol 349:47-59 Dahlquist KD, Puglisi JD Interaction of translation initiation factor IF1 with the E. coli ribosomal A site. J Mol Biol 299:1-15 Dallas A, Moore PB The loop E-loop D region of Escherichia coli 5S rrna: the solution structure reveals an unusual loop that may be important for binding ribosomal proteins. Structure 5: Dallas A, Noller HF Interaction of translation initiation factor 3 with the 30S ribosomal subunit. Mol Cell 8: Dallas A, Rycyna R, Moore P A proposal for the conformation of loop E in Escherichia coli 5S rrna. Biochem Cell Biol 73: Dinman JD S rrna: Structure and Function from Head to Toe. Int J Biomed Sci 1:2-7 Dinos G, Wilson DN, Teraoka Y, Szaflarski W, Fucini P, et al Dissecting the ribosomal inhibition mechanisms of edeine and pactamycin: the 158

160 universally conserved residues G693 and C795 regulate P-site RNA binding. Mol Cell 13: Dionne P, Rosano CL, Hurwitz C Effect of tetracycline on puromycininduced polysome degradation: influence of magnesium and polyamines. Antimicrob Agents Chemother 7:571-7 Dohme F, Nierhaus KH. 1976a. Role of 5S RNA in assembly and function of the 50S subunit from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 73: Dohme F, Nierhaus KH. 1976b. Total reconstitution and assembly of 50 S subunits from Escherichia coli Ribosomes in vitro. J Mol Biol 107: Dokudovskaya S, Dontsova O, Shpanchenko O, Bogdanov A, Brimacombe R Loop IV of 5S ribosomal RNA has contacts both to domain II and to domain V of the 23S RNA. Rna 2: Dontsova O, Tishkov V, Dokudovskaya S, Bogdanov A, Doring T, et al Stem-loop IV of 5S rrna lies close to the peptidyltransferase center. Proc Natl Acad Sci U S A 91: Douki T, Bretonniere Y, Cadet J Protection against radiation-induced degradation of DNA bases by polyamines. Radiat Res 153:29-35 Drainas D, Kalpaxis DL Bimodal action of spermine on ribosomal peptidyltransferase at low concentration of magnesium ions. Biochim Biophys Acta 1208:55-64 Draper DE Protein-RNA recognition. Annu Rev Biochem 64: Ehresmann C, Baudin F, Mougel M, Romby P, Ebel JP, Ehresmann B Probing the structure of RNAs in solution. Nucleic Acids Res 15: Erdmann VA, Fahnestock S, Higo K, Nomura M Role of 5S RNA in the functions of 50S ribosomal subunits. Proc Natl Acad Sci U S A 68: Fico R, Coutsogeorgopoulos C Peptidyl transferase: a new method for kinetic studies. Biochem Biophys Res Commun 47: Franceschi FJ, Nierhaus KH Ribosomal protein L20 can replace the assembly-initiator protein L24 at low temperatures. Biochemistry 27: Frank J, Agrawal RK A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 406: Frank J, Verschoor A, Li Y, Zhu J, Lata RK, et al. 1995a. A model of the translational apparatus based on a three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli ribosome. Biochem Cell Biol 73: Frank J, Zhu J, Penczek P, Li Y, Srivastava S, et al. 1995b. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature 376:441-4 Frydman B, Westler WM, Samejima K Spermine Binds in Solution to the TpsiC Loop of trna(phe): Evidence from a 750 MHz (1)H-NMR Analysis. J Org Chem 61: Funari SS, Rapp G, Perbandt M, Dierks K, Vallazza M, et al Structure of free Thermus flavus 5 S rrna at 1.3 nm resolution from synchrotron X-ray solution scattering. J Biol Chem 275:

161 Gabashvili IS, Agrawal RK, Spahn CM, Grassucci RA, Svergun DI, et al Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution. Cell 100: Gabashvili IS, Gregory ST, Valle M, Grassucci R, Worbs M, et al The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol Cell 8:181-8 Gao H, Sengupta J, Valle M, Korostelev A, Eswar N, et al Study of the structural dynamics of the E coli 70S ribosome using real-space refinement. Cell 113: Geigenmuller U, Nierhaus KH Significance of the third trna binding site, the E site, on E. coli ribosomes for the accuracy of translation: an occupied E site prevents the binding of non-cognate aminoacyl-trna to the A site. Embo J 9: Gerner EW, Mamont PS, Bernhardt A, Siat M Post-translational modification of the protein-synthesis initiation factor eif-4d by spermidine in rat hepatoma cells. Biochem J 239: Goldemberg SH, Algranati ID. 1981a. Polyamine requirement for streptomycin action on protein synthesis in bacteria. Eur J Biochem 117:251-5 Goldemberg SH, Algranati ID. 1981b. Polyamines and antibiotic effects on translation. Med Biol 59:360-7 Goringer HU, Szymkowiak C, Wagner R Escherichia coli 5S RNA A and B conformers. Characterisation by enzymatic and chemical methods. Eur J Biochem 144:25-34 Gren EJ Recognition of messenger RNA during translational initiation in Escherichia coli. Biochimie 66:1-29 Gualerzi CO, Pon CL Initiation of mrna translation in prokaryotes. Biochemistry 29: Gutell RR, Larsen N, Woese CR Lessons from an evolving rrna: 16S and 23S rrna structures from a comparative perspective. Microbiol Rev 58:10-26 Harms J, Schluenzen F, Zarivach R, Bashan A, Gat S, et al High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: Hirashima A, Kaji A Factor dependent breakdown of polysomes. Biochem Biophys Res Commun 41: Hirashima A, Kaji A Factor-dependent release of ribosomes from messenger RNA. Requirement for two heat-stable factors. J Mol Biol 65:43-58 Holbrook SR, Sussman JL, Warrant RW, Kim SH Crystal structure of yeast phenylalanine transfer RNA. II. Structural features and functional implications. J Mol Biol 123: Holmberg L, Nygard O Release of ribosome-bound 5S rrna upon cleavage of the phosphodiester bond between nucleotides A54 and A55 in 5S rrna. Biol Chem 381:

162 Hughes A, Smith NI, Wallace HM Polyamines reverse non-steroidal anti-inflammatory drug-induced toxicity in human colorectal cancer cells. Biochem J 374:481-8 Hunter AR, Jackson RJ, Hunt T The role of complexes between the 40-S ribosomal subunit and Met-tRNA-Met-f in the initiation of protein synthesis in the wheat-germ system. Eur J Biochem 75: Huttenhofer A, Noller HF Footprinting mrna-ribosome complexes with chemical probes. Embo J 13: Igarashi K, Hashimoto S, Miyake A, Kashiwagi K, Hirose S Increase of fidelity of polypeptide synthesis by spermidine in eukaryotic cell-free systems. Eur J Biochem 128: Igarashi K, Kashiwagi K Polyamines: mysterious modulators of cellular functions. Biochem Biophys Res Commun 271: Igarashi K, Sugawara K, Izumi I, Nagayama C, Hirose S Effect of polyamines of polyphenylalanine synthesis by Escherichia coli and ratliver ribosomes. Eur J Biochem 48: Ito K, Igarashi K The increase by spermidine of fidelity of protamine synthesis in a wheat-germ cell-free system. Eur J Biochem 156: Jelenc PC, Kurland CG Nucleoside triphosphate regeneration decreases the frequency of translation errors. Proc Natl Acad Sci U S A 76: Kakegawa T, Hirose S, Kashiwagi K, Igarashi K. 1986a. Effect of polyamines on in vitro reconstitution of ribosomal subunits. Eur J Biochem 158:265-9 Kakegawa T, Sato E, Hirose S, Igarashi K. 1986b. Polyamine binding sites on Escherichia coli ribosomes. Arch Biochem Biophys 251: Kalpaxis DL, Drainas D Effect of spermine on peptide-bond formation, catalyzed by ribosomal peptidyltransferase. Mol Cell Biochem 115:19-26 Kalpaxis DL, Drainas D Inhibitory effect of spermine on ribosomal peptidyltransferase. Arch Biochem Biophys 300: Kalpaxis DL, Karahalios P, Papapetropoulou M Growth phase and growth rate dependence of ribosomal peptidyltransferase activity status in Escherichia coli. Biochimie 77: Kao TH, Crothers DM A proton-coupled conformational switch of Escherichia coli 5S ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 77: Karahalios P, Amarantos I, Mamos P, Papaioannou D, Kalpaxis DL Effects of ethyl and benzyl analogues of spermine on Escherichia coli peptidyltransferase activity, polyamine transport, and cellular growth. J Bacteriol 181: Karahalios P, Mamos P, Karigiannis G, Kalpaxis DL. 1998a. Structure/function correlation of spermine-analogue-induced modulation of peptidyltransferase activity. Eur J Biochem 258: Karahalios P, Mamos P, Vynios DH, Papaioannou D, Kalpaxis DL. 1998b. The effect of acylated polyamine derivatives on polyamine uptake mechanism, cell growth, and polyamine pools in Escherichia coli, and the pursuit of structure/activity relationships. Eur J Biochem 251:

163 Khaitovich P, Mankin AS Effect of antibiotics on large ribosomal subunit assembly reveals possible function of 5 S rrna. J Mol Biol 291: Kiel MC, Raj VS, Kaji H, Kaji A Release of ribosome-bound ribosome recycling factor by elongation factor G. J Biol Chem 278: Kiparisov S, Petrov A, Meskauskas A, Sergiev PV, Dontsova OA, Dinman JD Structural and functional analysis of 5S rrna in Saccharomyces cerevisiae. Mol Genet Genomics 274: Ko J, Lee Y, Park I, Cho B Identification of a structural motif of 23S rrna interacting with 5S rrna. FEBS Lett 508:300-4 Komoda T, Sato NS, Phelps SS, Namba N, Joseph S, Suzuki T The A-site finger in 23 S rrna acts as a functional attenuator for translocation. J Biol Chem 281: Korostelev A, Trakhanov S, Laurberg M, Noller HF Crystal structure of a 70S ribosome-trna complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell 126: Kouvela EC, Petropoulos AD, Kalpaxis DL Unraveling new features of clindamycin interaction with functional ribosomes and dependence of the drug potency on polyamines. J Biol Chem 281: Laursen BS, Sorensen HP, Mortensen KK, Sperling-Petersen HU Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 69: Lieberman KR, Dahlberg AE Ribosome-catalyzed peptide-bond formation. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 50:1-23 Liiv A, O'Connor M Mutations in the intersubunit bridge regions of 23 S rrna. J Biol Chem 281: Lockwood AH, Chakraborty PR, Maitra U A complex between initiation factor IF2, guanosine triphosphate, and fmet-trna: an intermediate in initiation complex formation. Proc Natl Acad Sci U S A 68: Lorenz S, Perbandt M, Lippmann C, Moore K, DeLucas LJ, et al Crystallization of engineered Thermus flavus 5S rrna under earth and microgravity conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: Lu M, Steitz TA Structure of Escherichia coli ribosomal protein L25 complexed with a 5S rrna fragment at 1.8-A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 97: Luchin S, Putzer H, Hershey JW, Cenatiempo Y, Grunberg-Manago M, Laalami S In vitro study of two dominant inhibitory GTPase mutants of Escherichia coli translation initiation factor IF2. Direct evidence that GTP hydrolysis is necessary for factor recycling. J Biol Chem 274: Maguire BA, Beniaminov AD, Ramu H, Mankin AS, Zimmermann RA A protein component at the heart of an RNA machine: the importance of protein l27 for the function of the bacterial ribosome. Mol Cell 20:

164 Maitra U, Stringer EA, Chaudhuri A Initiation factors in protein biosynthesis. Annu Rev Biochem 51: Malhotra A, Penczek P, Agrawal RK, Gabashvili IS, Grassucci RA, et al Escherichia coli 70 S ribosome at 15 A resolution by cryo-electron microscopy: localization of fmet-trnafmet and fitting of L1 protein. J Mol Biol 280: McCutcheon JP, Agrawal RK, Philips SM, Grassucci RA, Gerchman SE, et al Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 96: Michelinaki M, Mamos P, Coutsogeorgopoulos C, Kalpaxis DL. 1997a. Aminoacyl and peptidyl analogs of chloramphenicol as slow-binding inhibitors of ribosomal peptidyltransferase: a new approach for evaluating their potency. Mol Pharmacol 51: Michelinaki M, Spanos A, Coutsogeorgopoulos C, Kalpaxis DL. 1997b. New aspects on the kinetics of activation of ribosomal peptidyltransferasecatalyzed peptide bond formation by monovalent ions and spermine. Biochim Biophys Acta 1342: Millon R, Olomucki M, Le Gall JY, Golinska B, Ebel JP, Ehresmann B Synthesis of a new reagent, ethyl 4-azidobenzoylaminoacetimidate, and its use for RNA-protein cross-linking within Escherichia coli ribosomal 30-S subunits. Eur J Biochem 110: Mitchell JL, Diveley RR, Jr., Bareyal-Leyser A, Mitchell JL Abnormal accumulation and toxicity of polyamines in a difluoromethylornithineresistant HTC cell variant. Biochim Biophys Acta 1136: Mitchell JL, Mitchell GK, Carter DD Amine-specificity of the inactivating ornithine decarboxylase modification in Physarum polycephalum. Biochem J 205:551-7 Miyamoto S, Kashiwagi K, Ito K, Watanabe S, Igarashi K Estimation of polyamine distribution and polyamine stimulation of protein synthesis in Escherichia coli. Arch Biochem Biophys 300:63-8 Moazed D, Noller HF. 1989a. Interaction of trna with 23S rrna in the ribosomal A, P, and E sites. Cell 57: Moazed D, Noller HF. 1989b. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342:142-8 Moore PB The ribosome returns. Nature 331:223-7 Moore PB, Steitz TA After the ribosome structures: how does peptidyl transferase work? Rna 9:155-9 Murdoch KJ, Allison LA A role for ribosomal protein L5 in the nuclear import of 5S rrna in Xenopus oocytes. Exp Cell Res 227: Naranda T, Kucan Z Effect of spermine on the efficiency and fidelity of the codon-specific binding of trna to the ribosomes. Eur J Biochem 182:291-7 Nastri HG, Algranati ID. 1988a. Inhibition of protein synthesis by aminoglycoside antibiotics in polyamine-requiring bacteria. Biochem Biophys Res Commun 150:

165 Nastri HG, Algranati ID. 1988b. Protein synthesis in polyamine-deficient bacteria during amino-acid starvation. Biochim Biophys Acta 949:65-70 Nastri HG, Algranati ID Effect of polyamines on plasmid-mediated kanamycin resistance and kanamycin phosphotransferase gene expression in Escherichia coli. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 42:711-7 Nastri HG, Fastame IG, Algranati ID Polyamines modulate streptomycin-induced mistranslation in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1216:455-9 Nierhaus K 1990a in Ribosomes and Protein Synthesis A practical Approach (Spedding G ed), University Press, Oxford. Nierhaus KH. 1990b. The allosteric three-site model for the ribosomal elongation cycle: features and future. Biochemistry 29: Nierhaus KH Protein synthesis. An elongation factor turn-on. Nature 379:491-2 Nierhaus KH, Schilling-Bartetzko S, Twardowski T The two main states of the elongating ribosome and the role of the alpha-sarcin stem-loop structure of 23S RNA. Biochimie 74: Nierhaus KH, Stuhrmann HB, Svergun D. 1998a. The ribosomal elongation cycle and the movement of trnas across the ribosome. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 59: Nierhaus KH, Wadzack J, Burkhardt N, Junemann R, Meerwinck W, et al. 1998b. Structure of the elongating ribosome: arrangement of the two trnas before and after translocation. Proc Natl Acad Sci U S A 95: Nissen P, Hansen J, Ban N, Moore PB, Steitz TA The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289: Noller HF RNA structure: reading the ribosome. Science 309: Noller HF, Hoang L, Fredrick K The 30S ribosomal P site: a function of 16S rrna. FEBS Lett 579:855-8 Noller HF, Yusupov MM, Yusupova GZ, Baucom A, Lieberman K, et al Structure of the ribosome at 5.5 A resolution and its interactions with functional ligands. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66:57-66 Ogle JM, Brodersen DE, Clemons WM, Jr., Tarry MJ, Carter AP, Ramakrishnan V Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292: Osswald M, Brimacombe R The environment of 5S rrna in the ribosome: cross-links to 23S rrna from sites within helices II and III of the 5S molecule. Nucleic Acids Res 27: Osswald M, Doring T, Brimacombe R The ribosomal neighbourhood of the central fold of trna: cross-links from position 47 of trna located at the A, P or E site. Nucleic Acids Res 23: Perederina A, Nevskaya N, Nikonov O, Nikulin A, Dumas P, et al Detailed analysis of RNA-protein interactions within the bacterial ribosomal protein L5/5S rrna complex. Rna 8: Petropoulos AD, Kouvela EC, Dinos GP, Kalpaxis DL Stepwise binding of tylosin and erythromycin to Escherichia coli ribosomes, 164

166 characterized by kinetic and footprinting analysis. J Biol Chem 283: Petropoulos AD, Xaplanteri MA, Dinos GP, Wilson DN, Kalpaxis DL Polyamines affect diversely the antibiotic potency: insight gained from kinetic studies of the blasticidin S AND spiramycin interactions with functional ribosomes. J Biol Chem 279: Piacentini M, Fesus L, Farrace MG, Ghibelli L, Piredda L, Melino G The expression of "tissue" transglutaminase in two human cancer cell lines is related with the programmed cell death (apoptosis). Eur J Cell Biol 54: Polacek N, Barta A Metal ion probing of rrnas: evidence for evolutionarily conserved divalent cation binding pockets. Rna 4: Polacek N, Patzke S, Nierhaus KH, Barta A Periodic conformational changes in rrna: monitoring the dynamics of translating ribosomes. Mol Cell 6: Quigley GJ, Teeter MM, Rich A Structural analysis of spermine and magnesium ion binding to yeast phenylalanine transfer RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 75:64-8 Ramakrishnan V Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: Ray RM, Viar MJ, Yuan Q, Johnson LR Polyamine depletion delays apoptosis of rat intestinal epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 278:C480-9 Reblova K, Spackova N, Stefl R, Csaszar K, Koca J, et al Non-Watson- Crick basepairing and hydration in RNA motifs: molecular dynamics of 5S rrna loop E. Biophys J 84: Rheinberger HJ, Sternbach H, Nierhaus KH Three trna binding sites on Escherichia coli ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 78: Rinke-Appel J, Junke N, Osswald M, Brimacombe R The ribosomal environment of trna: crosslinks to rrna from positions 8 and 20:1 in the central fold of trna located at the A, P, or E site. Rna 1: Rodnina MV, Beringer M, Wintermeyer W How ribosomes make peptide bonds. Trends Biochem Sci 32:20-6 Rodnina MV, Wintermeyer W Fidelity of aminoacyl-trna selection on the ribosome: kinetic and structural mechanisms. Annu Rev Biochem 70: Rodriguez-Fonseca C, Amils R, Garrett RA Fine structure of the peptidyl transferase centre on 23 S-like rrnas deduced from chemical probing of antibiotic-ribosome complexes. J Mol Biol 247: Schafer MA, Tastan AO, Patzke S, Blaha G, Spahn CM, et al Codonanticodon interaction at the P site is a prerequisite for trna interaction with the small ribosomal subunit. J Biol Chem 277: Scheinman A, Atha T, Aguinaldo AM, Kahan L, Shankweiler G, Lake JA Mapping the three-dimensional locations of ribosomal RNA and proteins. Biochimie 74:

167 Schipper RG, Penning LC, Verhofstad AA Involvement of polyamines in apoptosis. Facts and controversies: effectors or protectors? Semin Cancer Biol 10:55-68 Schluenzen F, Tocilj A, Zarivach R, Harms J, Gluehmann M, et al Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell 102: Schulze H, Nierhaus KH Minimal set of ribosomal components for reconstitution of the peptidyltransferase activity. Embo J 1: Schuwirth BS, Borovinskaya MA, Hau CW, Zhang W, Vila-Sanjurjo A, et al Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310: Selmer M, Dunham CM, Murphy FVt, Weixlbaumer A, Petry S, et al Structure of the 70S ribosome complexed with mrna and trna. Science 313: Sergiev P, Dokudovskaya S, Romanova E, Topin A, Bogdanov A, et al The environment of 5S rrna in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rrna. Nucleic Acids Res 26: Sergiev PV, Bogdanov AA, Dahlberg AE, Dontsova O Mutations at position A960 of E. coli 23 S ribosomal RNA influence the structure of 5 S ribosomal RNA and the peptidyltransferase region of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol 299: Sergiev PV, Kiparisov SV, Burakovsky DE, Lesnyak DV, Leonov AA, et al The conserved A-site finger of the 23S rrna: just one of the intersubunit bridges or a part of the allosteric communication pathway? J Mol Biol 353: Severini M, Spurio R, La Teana A, Pon CL, Gualerzi CO Ribosomeindependent GTPase activity of translation initiation factor IF2 and of its G-domain. J Biol Chem 266: Sharma D, Southworth DR, Green R EF-G-independent reactivity of a pre-translocation-state ribosome complex with the aminoacyl trna substrate puromycin supports an intermediate (hybrid) state of trna binding. Rna 10: Shin M, Hirokawa K, Fujiwara K Immunoelectron microscopic study of polyamines in the gastrointestinal tract of rat. Histochem Cell Biol 125: Shpanchenko OV, Dontsova OA, Bogdanov AA, Nierhaus KH Structure of 5S rrna within the Escherichia coli ribosome: iodineinduced cleavage patterns of phosphorothioate derivatives. Rna 4: Silberklang M, RajBhandary UL, Luck A, Erdmann VA Chemical reactivity of E. coli 5S RNA in situ in the 50S ribosomal subunit. Nucleic Acids Res 11: Snyder RD, Edwards ML Effects of polyamine analogs on the extent and fidelity of in vitro polypeptide synthesis. Biochem Biophys Res Commun 176:

168 Southworth DR, Brunelle JL, Green R EFG-independent translocation of the mrna:trna complex is promoted by modification of the ribosome with thiol-specific reagents. J Mol Biol 324: Spahn CM, Beckmann R, Eswar N, Penczek PA, Sali A, et al Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae--trna-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell 107: Spahn CM, Gomez-Lorenzo MG, Grassucci RA, Jorgensen R, Andersen GR, et al Domain movements of elongation factor eef2 and the eukaryotic 80S ribosome facilitate trna translocation. Embo J 23: Spahn CM, Nierhaus KH Models of the elongation cycle: an evaluation. Biol Chem 379: Spurio R, Brandi L, Caserta E, Pon CL, Gualerzi CO, et al The C- terminal subdomain (IF2 C-2) contains the entire fmet-trna binding site of initiation factor IF2. J Biol Chem 275: Stark H, Orlova EV, Rinke-Appel J, Junke N, Mueller F, et al Arrangement of trnas in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell 88:19-28 Stark H, Rodnina MV, Wieden HJ, van Heel M, Wintermeyer W Largescale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation. Cell 100:301-9 Stark H, Rodnina MV, Wieden HJ, Zemlin F, Wintermeyer W, van Heel M Ribosome interactions of aminoacyl-trna and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat Struct Biol 9: Stefanelli C, Bonavita F, Stanic I, Pignatti C, Flamigni F, et al Spermine triggers the activation of caspase-3 in a cell-free model of apoptosis. FEBS Lett 451:95-8 Stern S, Moazed D, Noller HF Structural analysis of RNA using chemical and enzymatic probing monitored by primer extension. Methods Enzymol 164:481-9 Stevens L, Pascoe G The location of spermine in bacterial ribosomes as indicated by 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene and by ethidium bromide. Biochem J 128: Sy D, Hugot S, Savoye C, Ruiz S, Charlier M, Spotheim-Maurizot M Radioprotection of DNA by spermine: a molecular modelling approach. Int J Radiat Biol 75: Synetos D, Coutsogeorgopoulos C Studies on the catalytic rate constant of ribosomal peptidyltransferase. Biochim Biophys Acta 923: Szymanski M, Barciszewska MZ, Erdmann VA, Barciszewski J S rrna: structure and interactions. Biochem J 371: Tabor CW, Tabor H ,4-Diaminobutane (putrescine), spermidine, and spermine. Annu Rev Biochem 45: Tabor CW, Tabor H Polyamines. Annu Rev Biochem 53: Tabor CW, Tabor H Polyamines in microorganisms. Microbiol Rev 49:

169 Takeda Y, Igarashi K Polyamines and protein synthesis. IV. Stimulation of aminoacyl transfer RNA formation by polyamines. Biochem Biophys Res Commun 37: Tama F, Valle M, Frank J, Brooks CL, 3rd Dynamic reorganization of the functionally active ribosome explored by normal mode analysis and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 100: Tanaka Y, Kojima C, Morita EH, Kasai Y, Yamasaki K, et al Identification of the metal ion binding site on an RNA motif from hammerhead ribozymes using (15)N NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 124: Teraoka H, Tanaka K. 1973a. Effect of polyamines on the binding of dihydrostreptomycin and N-acetylphenylalanyl-tRNA to ribosomes from Escherichia coli. Eur J Biochem 40:423-9 Teraoka H, Tanaka K. 1973b. Effect of spermine on the binding of erythromycin to Escherichia coli ribosomes and the peptidyl-transfer reaction. Eur J Biochem 33: Umekage S, Ueda T Spermidine inhibits transient and stable ribosome subunit dissociation. FEBS Lett 580: Valle M, Sengupta J, Swami NK, Grassucci RA, Burkhardt N, et al Cryo- EM reveals an active role for aminoacyl-trna in the accommodation process. Embo J 21: Walleczek J, Schuler D, Stoffler-Meilicke M, Brimacombe R, Stoffler G A model for the spatial arrangement of the proteins in the large subunit of the Escherichia coli ribosome. Embo J 7: Watanabe S Interaction of siomycin with the acceptor site of Escherichia coli ribosomes. J Mol Biol 67: Weiss RB, Murphy JP, Gallant JA Genetic screen for cloned release factor genes. J Bacteriol 158:362-4 Weiss RL, Morris DR Cations and ribosome structure. I. Effects on the 30S subunit of substituting polyamines for magnesium ion. Biochemistry 12: Wen JD, Lancaster L, Hodges C, Zeri AC, Yoshimura SH, et al Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature 452: Wilson DN, Blaha G, Connell SR, Ivanov PV, Jenke H, et al Protein synthesis at atomic resolution: mechanistics of translation in the light of highly resolved structures for the ribosome. Curr Protein Pept Sci 3:1-53 Wilson DN, Nierhaus KH The ribosome through the looking glass. Angew Chem Int Ed Engl 42: Wilson KS, Noller HF. 1998a. Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell 92:131-9 Wilson KS, Noller HF. 1998b. Molecular movement inside the translational engine. Cell 92:

170 Wimberly BT, Brodersen DE, Clemons WM, Jr., Morgan-Warren RJ, Carter AP, et al Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: Woodward WR, Wilairat P, Herbert E Preparation of reticulocyte aminoacyl-trna and the assay of codon recognition properties of isoacceptor trna's in a reticulocyte cell-free system. Methods Enzymol 30:740-6 Wower I, Wower J, Meinke M, Brimacombe R The use of 2- iminothiolane as an RNA-protein cross-linking agent in Escherichia coli ribosomes, and the localisation on 23S RNA of sites cross-linked to proteins L4, L6, L21, L23, L27 and L29. Nucleic Acids Res 9: Xaplanteri MA, Andreou A, Dinos GP, Kalpaxis DL Effect of polyamines on the inhibition of peptidyltransferase by antibiotics: revisiting the mechanism of chloramphenicol action. Nucleic Acids Res 31: Xaplanteri MA, Petropoulos AD, Dinos GP, Kalpaxis DL Localization of spermine binding sites in 23S rrna by photoaffinity labeling: parsing the spermine contribution to ribosomal 50S subunit functions. Nucleic Acids Res 33: Xiong L, Korkhin Y, Mankin AS Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother 49:281-8 Xiong Y, Sundaralingam M Two crystal forms of helix II of Xenopus laevis 5S rrna with a cytosine bulge. Rna 6: Young DV, Srinivasan PR Growth of ribonucleic acid bacteriophage f2 in a conditional putrescine auxotroph of Escherichia coli: evidence for a polyamine role in translation. J Bacteriol 117: Yusupov MM, Yusupova GZ, Baucom A, Lieberman K, Earnest TN, et al Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292: Zaniewski R, Petkaitis E, Deutscher MP A multiple mutant of Escherichia coli lacking the exoribonucleases RNase II, RNase D, and RNase BN. J Biol Chem 259: Zavialov AV, Buckingham RH, Ehrenberg M A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107:

171 ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ 170

172 Α. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ 1. Kouvela E.C., Gerbanas G.V., Xaplanteri M.A., Petropoulos A.D. Dinos G.P and Kalpaxis D.L. (2007) Changes in the conformation of 5S rrna cause alterations in principal functions of the ribosomal nanomachine N.A.R., 35(15): Β. ΑΛΛΕΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 1. Petropoulos A.D., Kouvela E.C., Starosta AL, Wilson DN, Dinos GP, Kalpaxis DL. (2008) Time-Resolved Binding of Azithromycin to Escherichia coli Ribosomes. J Mol Biol Nov 27. [Epub ahead of print]. 2. Petropoulos A.D., Kouvela E.C., Dinos G.P., and Kalpaxis D.L. (2008) Step-wise binding of Tylosin and Erythromycin to Escherichia coli ribosomes, characterized by kinetic and footprinting analysis J.Biol.Chem., 283(8): Kouvela E.C., Petropoulos A.D. and Kalpaxis D.L. (2006) Unraveling new features of clindamycin interaction with functional ribosomes and regulation of the drug potency by polyamines. J.Biol.Chem., 281(32): S. Pytharopoulou, E.C. Kouvela, E. Sazakli, M. Leotsinidis and D.L. Kalpaxis (2006) Evaluation of the global protein synthesis in Mytilus galloprovincialis in marine pollution monitoring: seasonal variability and correlations with other biomarkers. Aquat. Toxicol., 80, Γ. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΣΕ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ 1. Kouvela E.C., Kalpaxis D.L., Ashley G. and Dinos G. (2007) Antimicrobial activity and mode of action of a new ketolide linked 171

173 with an aryl-alkyl-side chain at the O-6 of the lactone ring Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 54, Kouvela E.C., Petropoulos A.D., Dinos G.P. and Kalpaxis D.L. (2007) Mutations U2609C and G754A in 23S ribosomal RNA affect diversely the potency of macrolide antibiotics. Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 54, Kouvela E.C., Karahalios P., Kalpaxis D.L., Fu H., Katz L. and Dinos G. (2006) In vitro studies with new macrolides effective against macrolide resistant strains Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 53, Kalpaxis D.L., Gerbanas G.V., Kouvela E.C. and Dinos G. (2006) Changes in the tertiary structure of 5S rrna cause alterations in principal ribosomal functions Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 53, Petropoulos A.D., Kouvela E.C. & Kalpaxis D.L. (2005) Kinetic and footprinting analysis reveal the clindamycin mode of action in protein synthesis and its regulation by polyamines Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 52, Petropoulos A.D., Kouvela E.C. & Kalpaxis D.L. (2004) Polyamines affect negatively the interaction of ribosomes with a macrolide antibiotic, tylosin Hellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, Newsletter, 51, 1-4 Δ. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ 1. E.C. Kouvela, A.D. Petropoulos and D.L. Kalpaxis, (2006) One molecule of azithromycin binds to Escherichia coli ribosomes via a two-step mechanism. FEBS J., 273, p A.D. Petropoulos, E.C. Kouvela and D.L. Kalpaxis, (2006) Interaction of erythromycin with E. coli ribosomes under physiological ionic conditions. FEBS J., 273, p

174 Ε. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. Κούβελα Α.Χ., Καλπαξής Δ.Λ., Ashley G., Ντίνος Γ.Π. (2007) «Αντιμικροβιακή δραστικότητα και τρόπος δράσης ενός καινούργιου κετολιδίου δεσμευμένου με μια αρυλ-αλκυλ-πλευρική αλυσίδα στην Ο-6 θέση του λακτονικού δακτυλιδίου». 59 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αθήνα, 7-9 Δεκεμβρίου Κούβελα Α.Χ., Πετρόπουλος Α.Δ., Ντίνος Γ.Π. και Καλπαξής Δ.Λ. (2007) «Οι μεταλλάξεις U2609C και U754A επηρεάζουν την δραστικότητα των μακρολιδίων». 59 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αθήνα, 7-9 Δεκεμβρίου Κούβελα Α.Χ., Ξαπλαντέρη Μ., Γερμπανάς Γ.Β., και Καλπαξής Δ.Λ. (2007) «Μονοπάτια μετάδοσης αλλοστερικών σημάτων στα ριβοσώματα: Ο ρόλος του 5S ριβοσωματικού RNA». 29 ο Επιστημονικό Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστημών, Καβάλα, Μαΐου, Κούβελα Α.Χ., Καραχάλιος Π., Καλπαξής Δ.Λ., Fu H., Katz L. και Ντίνος Γ. (2006) «In vitro μελέτες νέων μακρολιδίων δραστικών έναντι ανθεκτικών σε μακρολίδια στελεχών». 58 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Πάτρα, 9-11 Νοεμβρίου, Καλπαξής Δ.Λ., Γερμπανάς Γ.Β., Κούβελα Α.Χ. και Ντίνος Γ. (2006) «Αλλαγές στην τριτοταγή δομή του 5S rrna οδηγούν σε μεταβολές κύριων ριβοσωμικών λειτουργιών». 58 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Πάτρα, 9-11 Νοεμβρίου, Κούβελα Α.Χ., Γκαρνέλης Θ., Παπαιωάννου Δ. και Καλπαξής Δ.Λ. (2006) «Σύνθεση και βιολογική δράση ενός 3-πολυαμινικού παραγώγου της 173

175 χλωραμφαινικόλης». 28 o Επιστημονικό Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστημών, Ιωάννινα, Μαίου, Κούβελα Α.Χ., Πετρόπουλος Α.Δ και Καλπαξής Δ.Λ. ( 2005) «Μηχανισμός δράσεως της κλινδαμυκίνης στην πρωτεϊνική σύνθεση: Επίδραση των πολυαμινών». 27 o Επιστημονικό Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστημών, Ναύπλιο, Μαίου, Κούβελα Α.Χ., Πετρόπουλος Α.Δ. και Καλπαξής Δ.Λ. (2005) «Επίδραση των πολυαμινών στην πρόσδεση της κλινδαμυκίνης στο ριβόσωμα». 1 ο Συνέδριο Βιοεπιστημών Πανεπιστημίου Πατρών, Πάτρα, Μαίου Πετρόπουλος Α.Δ., Κούβελα Α.Χ. και Καλπαξής Δ.Λ. (2005) «Κινητικές μελέτες και ανάλυση αποτυπώματος αποκαλύπτουν τον τρόπο δράσης της κλινδαμυκίνης στην πρωτεϊνική σύνθεση και τη ρύθμισή αυτής από τις πολυαμίνες». 57 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Αθήνα, 9-11 Δεκεμβρίου Πετρόπουλος Α.Δ., Κούβελα Α.Χ. και Καλπαξής Δ.Λ. (2005) «Η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στην αλληλεπίδραση της ερυθρομυκίνης με λειτουργικά ριβοσωματικά σύμπλοκα». 27 o Επιστημονικό Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστημών, Ναύπλιο, Μαίου, Πετρόπουλος Α.Δ., Κούβελα Α.Χ. και Καλπαξής Δ.Λ. (2004) «Οι πολυαμίνες δρουν αρνητικά στην αλληλεπίδραση των ριβοσωμάτων με ένα μακρολίδιο αντιβιοτικό, την τυλοσίνη» 56 η Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Λάρισα, Νοεμβρίου, ΣΤ. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. E.C. Kouvela, A.D. Petropoulos and D.L. Kalpaxis. One molecule of azithromycin binds to Escherichia coli ribosomes via a two-step 174

176 mechanism. 31 st FEBS Congress, Molecules in Health & Disease, Istanbul- Turkey, June, A.D. Petropoulos, E.C. Kouvela and D.L. Kalpaxis. Interaction of erythromycin with E. coli ribosomes under physiological ionic conditions. 31 st FEBS Congress, Molecules in Health & Disease, Istanbul- Turkey, June, D.L. Kalpaxis, S. Pytharopoulou, E.C. Kouvela, E. Sazakli and M. Leotsinidis. Biomonitoring of Gulf of Patras (Greece), using caged mussels. Workshop on the MED POL Biological Effects Programme: Achievements and Future Orientations, Alessandria-Italy, December,

177 176

178 177

179 178

180 179

181 180

182 181

183 182

184 183

185 184

186 185

187 186

188 187

Μάθηµα: Κίνηση πρωτεινών

Μάθηµα: Κίνηση πρωτεινών Μάθηµα: Κίνηση πρωτεινών ιάλεξη 1:Σύνθεση πρωτεινών- Ριβόσωµα Κώστας Τοκατλίδης Η σύνθεση πρωτεινών απαιτεί την µετάφραση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων σε αλληλουχία αµινοξέων Οι συνθετάσες των αµινοακυλο-trna

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 29 Σύνθεση πρωτεϊνών

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 29 Σύνθεση πρωτεϊνών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 29 Σύνθεση πρωτεϊνών Αφού είδαμε πως το DNA αντιγράφεται και μεταγράφεται, τώρα θα εξετάσουμε τη διαδικασία με την παράγονται οι πρωτεϊνες Στην ουσία θα πρέπει να συνδυαστεί ο κώδικας δύο βιβλιοθηκών,

Διαβάστε περισσότερα

Η πεπτιδυλοτρανσφεράση είναι τό ενζυμο το οποίο καταλύει τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού.το ενζυμο διερευνάται εντατικά τα τελευταία 30 χρόνια και εχουν αναπτυχθεί ποικίλες απόψεις οσον αφορά την

Διαβάστε περισσότερα

Θεόδωρος Γ. Κουρέλης Ιατρός Ογκολόγος - Παθολόγος

Θεόδωρος Γ. Κουρέλης Ιατρός Ογκολόγος - Παθολόγος ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΠΑΘΟΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

Μετάφραση - Translation Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις

Μετάφραση - Translation Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Μετάφραση Πρωτεϊνοσύνθεση Μετάφραση - Translation Διαδικασία κατά την οποία η γενετική πληροφορία μετατρέπεται σε λειτουργικά μόρια, τις πρωτεΐνες. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Post-translational modifications

Διαβάστε περισσότερα

ιάλεξη 7 Μετάφραση Ο γενετικός κώδικας Το trna Μηχανισµός µετάφρασης σε προκαρυωτικά Aντιβιοτικά και πρωτεϊνοσύνθεση

ιάλεξη 7 Μετάφραση Ο γενετικός κώδικας Το trna Μηχανισµός µετάφρασης σε προκαρυωτικά Aντιβιοτικά και πρωτεϊνοσύνθεση ιάλεξη 7 Μετάφραση Ο γενετικός κώδικας Το trna Μηχανισµός µετάφρασης σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. Aντιβιοτικά και πρωτεϊνοσύνθεση ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ DNA RNA protein Aντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση Kεντρικό

Διαβάστε περισσότερα

Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ. Ημερομηνία: Κυριακή 23 Οκτωβρίου 2016 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ

Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ. Ημερομηνία: Κυριακή 23 Οκτωβρίου 2016 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ ΤΑΞΗ: ΜΑΘΗΜΑ: Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Ημερομηνία: Κυριακή 23 Οκτωβρίου 2016 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Στις ημιτελείς προτάσεις Α1 Α4 να γράψετε στο

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 1. Με ποιο μηχανισμό αντιγράφεται το DNA σύμφωνα με τους Watson και Crick; 2. Ένα κύτταρο που περιέχει ένα μόνο χρωμόσωμα τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει ραδιενεργό

Διαβάστε περισσότερα

Από τα δεδομένα της πρωτοδιάταξης σε συνδυασμό με τα δεδομένα που λαμβάνονται από ανοσοχημικές

Από τα δεδομένα της πρωτοδιάταξης σε συνδυασμό με τα δεδομένα που λαμβάνονται από ανοσοχημικές Εν αντιθέσει με αυτά που έχουν βρεθεί για τους προκαρυωτικούς οργανισμούς, για τους ευκαρυωτικούς υπάρχουν διαθέσιμες μόνο λίγες ακολουθίες ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Από τα δεδομένα της πρωτοδιάταξης σε συνδυασμό

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΙΚΟΝΑ 2.4 ΣΤΑΔΙΑ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ σ ε λ ί δ α 1 ΕΙΚΟΝΑ 4.2β ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Να συμπληρώσετε τα κενά πλαίσια της εικόνας με την κατάλληλη λέξη ή φράση 2. Να γράψετε τον προσανατολισμό της μετακίνησης του ριβοσώματος

Διαβάστε περισσότερα

Σύνθεση πρωτεϊνών και σημειακές μεταλλάξεις Γ. Παπανικολαόυ MD, PhD

Σύνθεση πρωτεϊνών και σημειακές μεταλλάξεις Γ. Παπανικολαόυ MD, PhD Σύνθεση πρωτεϊνών και σημειακές μεταλλάξεις Γ. Παπανικολαόυ MD, PhD Κεντρικό δόγμα DNA Μεταγραφή RNA Αντιγραφή Αντίστροφη μεταγραφάση Μετάφραση mrna Πρωτείνη RNA γονίδια trna rrna SnRNA microrna κα Ροή

Διαβάστε περισσότερα

Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ι. ΘΕΩΡΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Γίνεται σύνθεση DNA. Γίνεται σύνθεση RNA. Εξασφαλίζεται η διαιώνιση της γενετικής

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ. Πώς από το DNA φτάνουμε στις πρωτεΐνες

ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ. Πώς από το DNA φτάνουμε στις πρωτεΐνες ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ Πώς από το DNA φτάνουμε στις πρωτεΐνες Αντιγραφή του DNA o Ο μηχανισμός αντιγραφής του DNA ονομάζεται ημισυντηρητικός διότι κατά την αντιγραφή του

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΕΝΟΤΗΤΑ 14: Ο ΦΟΡΕΑΣ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ (DNA) 14.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες του DNA αποτελούνται από νουκλεοτίδια τα οποία ενώνονται με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Πιο συγκεκριμένα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΑΜΙΝΩΝ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ 5S ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΟΥ RNA

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΑΜΙΝΩΝ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ 5S ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΟΥ RNA ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΑΜΙΝΩΝ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ 5S ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΟΥ RNA ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΕΡΜΠΑΝΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΣΕ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 1.1.1. Δομή

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ)

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ) ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (Β ΛΥΚΕΙΟΥ) ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθμό κάθε μιας από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1-5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη

Διαβάστε περισσότερα

Κεντρικό δόγμα της βιολογίας

Κεντρικό δόγμα της βιολογίας Κεντρικό δόγμα της βιολογίας DNA RNA Πρωτεΐνη Μεταγραφή Σύνθεση (μονόκλωνου) RNA από ένα δίκλωνο μόριο DNA κυρίως με τη βοήθεια του ενζύμου RNA πολυμεράση Το προϊόν της μεταγραφής ονομάζεται πρωτογενές

Διαβάστε περισσότερα

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 25 : Το καταλυτικό RNA

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 25 : Το καταλυτικό RNA Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 25 : Το καταλυτικό RNA Εικόνα 25.1 Το αυτο-µάτισµα του πρώιµου rrna 35S της Tetrahymena thermophila µπορεί να µελετηθεί µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα. Το αποδεσµευµένο ιντρόνιο σχηµατίζει

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ & ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΝΕΟ & ΠΑΛΑΙΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: 27/05/2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΠ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ Θέμα Α Α1:

Διαβάστε περισσότερα

Ο γενετικός κώδικας και πρωτεϊνική σύνθεση

Ο γενετικός κώδικας και πρωτεϊνική σύνθεση Ο γενετικός κώδικας και πρωτεϊνική σύνθεση Περίγραμμα Ο γενετικός κώδικας συνδέει τα νουκλεοτίδια με τα αμινοξέα Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται με την πρόσδεση στο trna Το ριβοσωμα αποτελείται από RNA και

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα Εργασία στη Βιολογία ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Η ροή της πληροφορίας για το σχηματισμό των πρωτεϊνών, προϋποθέτει τη μεταφορά της από το DNA στο RNA (ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ).

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΑΚΑΒΑΣ 1 ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Μ.Δ.Ε

ΧΡΗΣΤΟΣ ΚΑΚΑΒΑΣ 1 ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Μ.Δ.Ε ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ον. ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ ΤΙ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΞΕΡΩ. 1. Τη δομή της δίκλωνης έλικας πάρα πολύ καλά. 2. Τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων και την επίπτωσή

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 02/12/2012 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις

Ενδεικτικές απαντήσεις ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 8 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ενδεικτικές απαντήσεις

Διαβάστε περισσότερα

) 4 x 10 5 ) 2 x 10 5

) 4 x 10 5 ) 2 x 10 5 1 & ( ) 27 2016 - : ( ) ( ) : (5) 1 5,,,. 1.. DNA. DNA. DNA. RNA. 2.. 46... DNA 1,5 x 10 9. 3. Dolly. DNA.. 1. DNA. 4. (ADA),. AIDS.... 1 5 2 & 5. Ti. Agrobacterium tumefaciens. T 2. DNA.. 1. N,,,. 1.

Διαβάστε περισσότερα

Στάδια Πρωτεινοσύνθεσης

Στάδια Πρωτεινοσύνθεσης Στάδια Πρωτεινοσύνθεσης Ενεργοποίση του αμινοξέος Αμινοξέα, t-rna, RNA,Αμινο ακυλο trna συνθετάση,ατρ ΑΤΡ,Mg Εναρξη Σύνθεσης Πολυπεπτιδικής Αλυσίδας Εναρκτηριο αμινοακυλο t-rna,mrna,gtp,παράγοντες εναρξης

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2.

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2. ΘΕΜΑ Α Α1. γ (το πριμόσωμα) Α2. γ (οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες κάθε γονιδίου) Α3. α (μεταφέρει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ στο ριβόσωμα) Α4. β (αποδιάταξη των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων)

Διαβάστε περισσότερα

Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών

Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών Κεφ. 4 DNA, RNA και η ροή των γενετικών πληροφοριών Η οικογενειακή ομοιότητα, οφείλεται στα κοινά γονίδια. Τα γονίδια πρέπει να εκφραστούν για να έχουν αποτέλεσμα, και η έκφραση αυτή ρυθμίζεται από πρωτεΐνες.

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου

Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου Απρίλιος Μάιος 12 Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου Βιολογία Γενικής Παιδείας Β Λυκείου (Ερωτήσεις που παρουσιάζουν ενδιαφέρον) 1. Τι είναι τα βιομόρια και ποια είναι τα βασικά χαρακτηριστικά τους; Βιομόρια

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. Σύνθεση πρωτεϊνών, επεξεργασία και ρύθμιση της λειτουργίας τους. Δημήτρης Λιακόπουλος

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. Σύνθεση πρωτεϊνών, επεξεργασία και ρύθμιση της λειτουργίας τους. Δημήτρης Λιακόπουλος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Σύνθεση πρωτεϊνών, επεξεργασία και ρύθμιση της λειτουργίας τους Δημήτρης Λιακόπουλος Μετάφραση (translation) Στάδια σχηματισμού μίας πρωτεϊνης: 1. Μετάφραση 2. Αναδίπλωση προς κατάλληλη στερεοδιαμόρφωση

Διαβάστε περισσότερα

BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ - ΠΕΡΙΓΡΑΜΜΑ 5.1 ΈΝΑ ΝΟΥΚΛΕΙΝΙΚΟ ΟΞΥ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΌ ΤΕΣΣΕΡΑ ΕΙΔΗ ΒΑΣΕΩΝ, ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΕΝΟΝΤΑΙ ΣΕ ΈΝΑ ΚΟΡΜΟ ΣΑΚΧΑΡΩΝ ΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ 5.2 ΈΝΑ ΖΕΥΓΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. δ Α4. γ Α5. γ 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ ΣΥΣΤΗΜΑ) ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑΤΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΥΛΗ: ΚΕΦ /12/2017

ΘΕΜΑΤΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΥΛΗ: ΚΕΦ /12/2017 ΘΕΜΑΤΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΥΛΗ: ΚΕΦ 1-2-4 03/12/2017 ΘΕΜΑ A Α. Να επιλέξετε την ορθή πρόταση στα παρακάτω: Α1. Βασική μονάδα οργάνωσης της χρωματίνης αποτελεί το α. νουκλεοτίδιο

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ EIKONA 2.1 Ημισυντηρητικός μηχανισμός αντιγραφής του DNA 1. Να γράψετε τα ένζυμα που (α) προκαλούν ξετύλιγμα των αλυσίδων του αρχικού (μητρικού μορίου) DNA και (β) συνθέτουν τις νέες αλυσίδες του DNA.

Διαβάστε περισσότερα

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους;

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους; Βιολογία Γ Ενιαίου Λυκείου / Θετική Κατεύθυνση κεφαλαιο 2ο: αντιγραφη, εκφραση και ρυθμιση τησ ΓενετικηΣ ΠληροφοριαΣ 1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; Ευκαρυωτικά κύτταρα: στον πυρήνα,

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 24 ΜΑΪΟΥ 2013 ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. α Α4. δ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Σελ. 123 124 σχολ. βιβλίου: «Η διαδικασία που ακολουθείται παράγουν το ένζυμο ADA». Β2. Σελ. 133 σχολ.

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΛΥΣΗΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΛΥΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΛΥΣΗΣ Είδαμε τους μηχανισμούς με τους οποίους καταλύονται οι χημικές/βιολογικές αντιδράσεις (θα επανέλθουμε αν έχουμε χρόνο) Θα εξετάσουμε δύο παραδείγματα ενζύμων και του

Διαβάστε περισσότερα

Σύμφωνα με τις απόψεις που σήμερα επικρατούν η διαδικασία της έναρξης μπορεί να διαιρεθεί σε πέντε στάδια Διάσταση του 80S Ριβοσώματος στη 60S και την 40S υπομοναδα Φόρτιση του 40S S eif-3 συμπλέγματος

Διαβάστε περισσότερα

ΓΩΝΙΕΣ φ, ψ ΚΑΙ ΕΠΙΤΡΕΠΤΕΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΠΕΠΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ

ΓΩΝΙΕΣ φ, ψ ΚΑΙ ΕΠΙΤΡΕΠΤΕΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΠΕΠΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ ΓΩΝΙΕΣ φ, ψ ΚΑΙ ΕΠΙΤΡΕΠΤΕΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΠΕΠΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΩΝΙΑΣ φ φ Ccarbonyl n Ccarbonyl n N Cα n Ccarbonyl n-1 Cα n N φ Ccarbonyl n-1 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΩΝΙΑΣ ψ φ ψ Ccarbonyl n N (Ca

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης. Κεφάλαιο 2 ο Αντιγραφή, έκφραση & ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας

Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης. Κεφάλαιο 2 ο Αντιγραφή, έκφραση & ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης Κεφάλαιο 2 ο Αντιγραφή, έκφραση & ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας Αντιγραφή του DNA Οι Watson & Crick το 1953 μαζί με το μοντέλο της διπλής έλικας, πρότειναν και έναν τρόπο

Διαβάστε περισσότερα

ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΕΥΤΕΡΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΕΥΤΕΡΟ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1) Τμήμα μορίου βακτηριακού DNA έχει την ακόλουθη αλληλουχία βάσεων: 3 TACTGGAATGGTCGCCCCTGCATT 5 a. Ποια είναι η αλληλουχία του συμπληρωματικού κλώνου και ποιος είναι ο προσανατολισμός της. b. Ποιο είναι

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία προσανατολισμού

Βιολογία προσανατολισμού Βιολογία προσανατολισμού ΘΕΜΑ Α Στις προτάσεις από Α1-Α5 να βρείτε την σωστή απάντηση. Α1. Ένας ερευνητής απομόνωσε ένα ασυνεχές γονίδιο από το γονιδίωμα ανθρώπινων κυττάρων. Το γονίδιο συνδέθηκε με βακτηριακό

Διαβάστε περισσότερα

Σελίδες 372 Αντιγραφή Μεταγραφή Ρύθμιση της Γενετική πληροφορίας

Σελίδες 372 Αντιγραφή Μεταγραφή Ρύθμιση της Γενετική πληροφορίας Σελίδες 372 Αντιγραφή Μεταγραφή Ρύθμιση της Γενετική πληροφορίας Ερωτήσεις «Θεωρίας και Επισημάνσεις» Ερωτήσεις «πολλαπλής επιλογής» Ερωτήσεις τύπου «Σωστό Λάθος» Ερωτήσεις «Κρίσεως-Συνδυαστικές» Αναλυτική

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ 1 Ο ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 01/12/2013

ΘΕΜΑ 1 Ο ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 01/12/2013 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 01/12/2013 ΘΕΜΑ 1 Ο Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Τα

Διαβάστε περισσότερα

Ημερομηνία: Κυριακή 29 Οκτωβρίου 2017 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ

Ημερομηνία: Κυριακή 29 Οκτωβρίου 2017 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ ΤΑΞΗ: ΜΑΘΗΜΑ: Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ημερομηνία: Κυριακή 29 Οκτωβρίου 2017 Διάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ Στις ημιτελείς προτάσεις Α1 Α4 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό

Διαβάστε περισσότερα

Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ»

Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ» Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ» DNA RNA: ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ DNA RNA: Βασικά Χαρακτηριστικά Ρόλος Κεντικό Δόγμα της Βιολογίας:

Διαβάστε περισσότερα

8. Σε στέλεχος του βακτηρίου E.coli δε λειτουργεί το γονίδιο που παράγει τον καταστολέα του οπερόνιου της λακτόζης. Ποιο είναι το αποτέλεσμα σε σχέση

8. Σε στέλεχος του βακτηρίου E.coli δε λειτουργεί το γονίδιο που παράγει τον καταστολέα του οπερόνιου της λακτόζης. Ποιο είναι το αποτέλεσμα σε σχέση Γονιδιακή ρύθμιοη 1. Εντοπίστε δύο διαφορές στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα στους προκαρυωτικούς και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Α. Η ρύθμιση της γσνιδιακής έκφρασης στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

Το πλεονέκτημα της χρήσης του DNA των φάγων λ, ως φορέα κλωνοποίησης είναι ότι μπορούμε να ενσωματώσουμε σε αυτόν μεγαλύτερα κομμάτια DNA.

Το πλεονέκτημα της χρήσης του DNA των φάγων λ, ως φορέα κλωνοποίησης είναι ότι μπορούμε να ενσωματώσουμε σε αυτόν μεγαλύτερα κομμάτια DNA. ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 2 ο,4 ο ΚΕΦ. ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Θέμα Α: Α1.β, Α2.δ, Α3.β, Α4.γ, Α5.γ Θέμα Β: Β1. Οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες αποτελούν τα ρυθμιστικά στοιχεία της μεταγραφής

Διαβάστε περισσότερα

Μόρια-κλειδιά των ζωντανών οργανισμών καθώς περιέχουν την γενετική πληροφορία Νουκλεϊκά οξέα:

Μόρια-κλειδιά των ζωντανών οργανισμών καθώς περιέχουν την γενετική πληροφορία Νουκλεϊκά οξέα: Μόρια-κλειδιά των ζωντανών οργανισμών καθώς περιέχουν την γενετική πληροφορία 1. Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) Νουκλεϊκά οξέα: Φορέας της γενετικής πληροφορίας 2. Ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) Συμμετοχή στην

Διαβάστε περισσότερα

Μετάφραση του mrna. mrna Translation. Βιοσύνθεση πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων. Γενικά χαρακτηριστικά

Μετάφραση του mrna. mrna Translation. Βιοσύνθεση πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων. Γενικά χαρακτηριστικά Μετάφραση του mrna mrna Translation Βιοσύνθεση πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων 1 Γενικά χαρακτηριστικά A. Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mrna σε αλληλουχία αμινοξέων- Γενικές έννοιες 1. Γενετικός

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. β Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Β Β1. Η σειρά των βημάτων που οδηγούν στην κατασκευή καρυότυπου είναι: 4, 2, 1, 6, 3, 5 Β2. α.

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 9 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2009 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 04/11/2018 Νότα Λαζαράκη Αλέξανδρος Παπαγιαννακόπουλος ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Σε ένα

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ 1 ο Α. Ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής 1. δ 2. β 3. γ 4. γ 5. β Β. Ερωτήσεις σωστού λάθους 1. Λάθος 2. Σωστό 3. Λάθος 4. Λάθος 5. Σωστό ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

Τηλ: Ανδρέου Δημητρίου 81 & Ακριτών 26 -ΚΑΛΟΓΡΕΖΑ

Τηλ: Ανδρέου Δημητρίου 81 & Ακριτών 26 -ΚΑΛΟΓΡΕΖΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ- ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ (Ιανουάριος 2014) 1 ο ΘΕΜΑ Απαντήστε στις παρακάτω ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής. Μία απάντηση είναι η σωστή. 1. Υβριδοποίηση: Α. Είναι ιδιότητα του DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 04/11/2018 Νότα Λαζαράκη Αλέξανδρος Παπαγιαννακόπουλος ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

Διαβάστε περισσότερα

Δομικές και λειτουργικές μεταβολές σε ριβοσώματα από Staphylococcus epidermidis εξαρτώμενου από την παρουσία του αντιβιοτικού linezolid

Δομικές και λειτουργικές μεταβολές σε ριβοσώματα από Staphylococcus epidermidis εξαρτώμενου από την παρουσία του αντιβιοτικού linezolid ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΠΑΘΟΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Δομικές και λειτουργικές μεταβολές σε ριβοσώματα από Staphylococcus

Διαβάστε περισσότερα

Θέματα πριν τις εξετάσεις. Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία

Θέματα πριν τις εξετάσεις. Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία Θέματα πριν τις εξετάσεις Καλό διάβασμα Καλή επιτυχία 2013-2014 Θέματα πολλαπλής επιλογής Μετουσίωση είναι το φαινόμενο α. κατά το οποίο συνδέονται δύο αμινοξέα για τον σχηματισμό μιας πρωτεΐνης β. κατά

Διαβάστε περισσότερα

Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος

Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΤΕΤΑΡΤΗ 15 ΙΟΥΝΙΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΘΕΜΑ 1 Ο ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Στο οπερόνιο της λακτόζης: Α. Η πρωτεΐνη καταστολέας συνδέεται με το ρυθμιστικό γονίδιο Β. Το

Διαβάστε περισσότερα

1. Ο Griffith στα πειράματά του χρησιμοποίησε:

1. Ο Griffith στα πειράματά του χρησιμοποίησε: ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΧΕΙΜΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 27/11/11 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Ο Griffith στα πειράματά

Διαβάστε περισσότερα

Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού

Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού Ενδεικτικές απαντήσεις στα Θέματα Βιολογίας Προσανατολισμού Θέμα Α Α1) γ Α2) γ Α3) δ Α4) β Α5) β Θέμα Β Β1. Α = υδροξύλιο, Β = πρωταρχικό τμήμα, Γ = θέση έναρξης αντιγραφής, Δ = φωσφορική ομάδα, Ε = τμήμα

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Βιοχημική εξέλιξη ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΑ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΑ Τι είναι ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ DNA ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΑΛΛΑ ΣΥΝΔΕΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ (Δεσμοί, ενέργεια, δομή) ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΖΩΗΣ Υπάρχει μια συνεχή εξελικτική

Διαβάστε περισσότερα

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. β Α4. β Α5. β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ B B1. Ο όρος γονιδιακή έκφραση αναφέρεται συνήθως σε όλη τη διαδικασία με την οποία

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Επιμέλεια: Βουδούρη Καλλιρρόη Ριζηνίας 69 & Λασαίας 21 τηλ.2810313170 www.kmathisi.com ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΟΝΟΜΑ:..

Διαβάστε περισσότερα

ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του

ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ: αφαίρεση ενός μορίου νερού - σύνθεση ενός διμερούς ΥΔΡΟΛΥΣΗ : προσθήκη ενός μορίου νερού - διάσπαση του διμερούς στα συστατικά του ΤΑ ΜΟΝΟΜΕΡΗ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ. 1. ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

28/11/2010 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ. ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (10 μόρια)

28/11/2010 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ. ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (10 μόρια) ΕΠΩΝΥΜΟ:... ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΟΝΟΜΑ:... ΤΜΗΜΑ:... ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ:... ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 28/11/2010 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΤΙΚΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Κεφάλαια: 1 o 2 o ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΤΙΚΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Κεφάλαια: 1 o 2 o ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΤΙΚΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Κεφάλαια: 1 o 2 o ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΖΗΤΗΜΑ 1 ο Να επιλέξτε το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση ή στη φράση που συμπληρώνει σωστά την πρόταση. 1.

Διαβάστε περισσότερα

ΑΣΚΗΣΕΙΣ στο 2 ο κεφάλαιο

ΑΣΚΗΣΕΙΣ στο 2 ο κεφάλαιο ΑΣΚΗΣΕΙΣ στο 2 ο κεφάλαιο 1. Ένας κλώνος ενός γονιδίου προκαρυωτικού κυττάρου έχει την παρακάτω αλληλουχία βάσεων: AAAATGTATACGGGCGCTGATACGGCAAACCCACTCATGTAA Βρείτε: Α) την αλληλουχία των βάσεων του mrna

Διαβάστε περισσότερα

Επίδραση Ορισμένων Μεταλλάξεων του 18S rrna στη Λειτουργία του Ευκαρυωτικού Ριβοσώματος

Επίδραση Ορισμένων Μεταλλάξεων του 18S rrna στη Λειτουργία του Ευκαρυωτικού Ριβοσώματος ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Επίδραση Ορισμένων Μεταλλάξεων

Διαβάστε περισσότερα

Τύποι νουκλεϊκών οξέων

Τύποι νουκλεϊκών οξέων Τύποι νουκλεϊκών οξέων DNA ένας τύπος, μια λειτουργία RNA - 4 τύποι, 4 λειτουργίες Ριβοσωμικό RNA Αγγελιαφόρο RNA Μεταφορικό RNA Καταλυτικό RNA Βιοχημεία Ι Δ-1 Βιοχημεία Ι Δ-2 3 5 φωσφοδιεστερικός δεσμός

Διαβάστε περισσότερα

Β. Σελ 60 σχολικού: «Η αποµόνωση του συνολικού έως και σελ 61 από µία cdna βιβλιοθήκη.». Γ. ι ι α α α ι α α ι α α α! " # $ % & ' ( ) ( ) ( * % + α ι α

Β. Σελ 60 σχολικού: «Η αποµόνωση του συνολικού έως και σελ 61 από µία cdna βιβλιοθήκη.». Γ. ι ι α α α ι α α ι α α α!  # $ % & ' ( ) ( ) ( * % + α ι α ! THΛ: 270727 222594 THΛ: 919113 949422 Απαντήσεις: " # $ % & ' 1=γ, 2=β, 3=γ, 4=β, 5=δ. " # $ % ( ' εδοµένα από την ανάλυση του ποσοστού των βάσεων σε µόρια DNA από διαφορετικούς οργανισµούς έδειχναν

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Προσανατολισμού

Βιολογία Προσανατολισμού ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 1 & 2 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Θέμα Α: Α1.β, Α2.δ, Α3.γ, Α4.γ, Α5.γ Θέμα Β: Β1. Ο 1 ος ιός παρατηρούμε ότι περιέχει Τ, άρα το γενετικό του υλικό είναι DNA, στο οποίο παρατηρούμε ότι δεν

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ DNA. «Το ειδικό ζευγάρωμα των βάσεων που θεωρήσαμε δεδομένο υποδηλώνει άμεσα έναν πιθανό μηχανισμό αντιγραφής του γενετικού υλικού»

ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ DNA. «Το ειδικό ζευγάρωμα των βάσεων που θεωρήσαμε δεδομένο υποδηλώνει άμεσα έναν πιθανό μηχανισμό αντιγραφής του γενετικού υλικού» «Το ειδικό ζευγάρωμα των βάσεων που θεωρήσαμε δεδομένο υποδηλώνει άμεσα έναν πιθανό μηχανισμό αντιγραφής του γενετικού υλικού» Watson & Crick Μια διπλή έλικα η οποία χωρίζεται σε δύο μονούς κλώνους μπορεί

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΒΙΒΛΙΟ ΜΟΥ (YΠΟ ΕΚ ΟΣΗ): ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ

ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΒΙΒΛΙΟ ΜΟΥ (YΠΟ ΕΚ ΟΣΗ): ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΒΙΒΛΙΟ ΜΟΥ (YΠΟ ΕΚ ΟΣΗ): ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ Β ΛΥΚΕΙΟΥ (Περιέχει 67 ερωτήσεις θεωρίας µε απαντήσεις, 116 ασκήσεις ανοικτού- κλειστού τύπου µε µ

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΠ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ / Γ ΛΥΚΕΙΟΥ (ΘΕΡΙΝΑ) ΣΕΙΡΑ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 15/11/2015 ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Δεοξυριβονουκλεοτίδια

Διαβάστε περισσότερα

Το κεντρικό δόγμα (The central dogma)

Το κεντρικό δόγμα (The central dogma) Οι βασικές μοριακές γενετικές διαδικασίες Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση ΠΡΩΤΕΪΝΗ Το κεντρικό δόγμα (The central dogma) Σύσταση νουκλεοτιδίων του DNA και του RNA Α 5 -άκρο Θυμίνη (Θ) Β 5 άκρο Αδενίνη (Α)

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΡΙΤΗ 27 ΜΑΪΟΥ 2008 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. δ 3. β 4. δ 5. β ΘΕΜΑ 2ο 1. Σχολικό βιβλίο, σελ.

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 24 Μαΐου 2013. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 24 Μαΐου 2013. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 24 Μαΐου 2013 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α Α1. Βασική μονάδα οργάνωσης αποτελεί το Γ. νουκλεόσωμα

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. Β Α2. Γ Α3. Α Α4. Α5. Γ ΘΕΜΑ Β ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 22 ΜΑΪΟΥ 2015 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ B1. Α (Σωµατικά κύτταρα στην αρχή της µεσόφασης): 1, 4, 5, 6 Β (Γαµέτες): 2, 3, 7, 8 Β2. (Κάθε

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 2 Α Ν Τ Ι Γ Ρ Α Φ Η

Κεφάλαιο 2 Α Ν Τ Ι Γ Ρ Α Φ Η ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Κεφάλαιο 2 Μεθοδολογία Ασκήσεων Α Ν Τ Ι Γ Ρ Α Φ Η 1 η Κατηγορία: Ασκήσεις στην Αντιγραφή (υπολογιστικές) Αφού αναφέρουμε τον ημισυντηρητικό τρόπο αντιγραφής φτιάχνουμε ένα απλό σχήμα

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 1 ΚΑΙ 2

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 1 ΚΑΙ 2 ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 1 ΚΑΙ 2 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Στις ερωτήσεις 1-5 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό της ερώτησης και δίπλα του το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. 1. Το

Διαβάστε περισσότερα

ΚΟΡΥΦΑΙΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ korifeo.gr. Μάθημα: Βιολογία Προσανατολισμού Εξεταζόμενη ύλη: 1o,2o κεφάλαιο ΘΕΜΑ 1 Ο

ΚΟΡΥΦΑΙΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ korifeo.gr. Μάθημα: Βιολογία Προσανατολισμού Εξεταζόμενη ύλη: 1o,2o κεφάλαιο ΘΕΜΑ 1 Ο Μάθημα: Βιολογία Προσανατολισμού Εξεταζόμενη ύλη: 1o,2o κεφάλαιο ΚΟΡΥΦΑΙΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ korifeo.gr ΘΕΜΑ 1 Ο Να βάλετε σε κύκλο τον αριθμό που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση ή συμπληρώνει σωστά την πρόταση

Διαβάστε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ

Διαβάστε περισσότερα

Μετάφραση (Translation)

Μετάφραση (Translation) Μετάφραση (Translation) Πώς η γενετική πληροφορία που περιέχεται στα νουκλεοτίδια του mrna διερμηνεύεται προκειμένου να παραχθεί η γραμμική αλληλουχία των αμινοξέων στο μόριο της πρωτεΐνης; Εισαγωγή στη

Διαβάστε περισσότερα

φροντιστήρια Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών

φροντιστήρια   Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών Θέμα Α Α1. α. 2 β. 1 γ. 4 δ. 1 ε. 2 Θέμα Β Β1. α. 1-Γ, 2-Γ, 3-Β, 4-Β, 5-Α, 6-B, 7-Α β. 1. Σύμπλοκο έναρξης πρωτεϊνοσύνθεσης: Το σύμπλοκο που

Διαβάστε περισσότερα

Βιοτεχνολογία Φυτών. Μοριακοί Δείκτες (Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία)

Βιοτεχνολογία Φυτών. Μοριακοί Δείκτες (Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία) Βιοτεχνολογία Φυτών ΔΠΘ / Τμήμα Αγροτικής Ανάπτυξης ΠΜΣ Αειφορικά Συστήματα Παραγωγής και Περιβάλλον στη Γεωργία Μοριακοί Δείκτες (Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία) Αριστοτέλης Χ. Παπαγεωργίου Εργαστήριο

Διαβάστε περισσότερα

5 GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG 3 3 CAC GTG GAC TGA GGA CTC CTC 5

5 GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG 3 3 CAC GTG GAC TGA GGA CTC CTC 5 Βιολογία Κατεύθυνσης Γ Λυκείου Απαντήσεις διαγωνίσματος στο Κεφάλαιο 4 ο ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. γ Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. Ο κλώνος είναι μια ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων, ή οργανισμών. B2. Η υβριδοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

Γ1. Το γνώρισμα για το μέγεθος των φτερών ελέγχεται από αυτοσωμικό γονίδιο.

Γ1. Το γνώρισμα για το μέγεθος των φτερών ελέγχεται από αυτοσωμικό γονίδιο. ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 2013 AΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1.γ Α2.β Α3.α Α4.δ Α5.α ΘΕΜΑ Β Β1. Η γονιδιακή θεραπεία εφαρμόστηκε για πρώτη φορά το 1990 σε ένα κορίτσι που έπασχε από έλλειψη της απαμινάσης

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 28 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ ΤΟΥ RNA

Κεφάλαιο 28 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ ΤΟΥ RNA Κεφάλαιο 28 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ ΤΟΥ RNA Η ροή της πληροφορίας για το σχηματισμό των πρωτεϊνών, προϋποθέτει τη μεταφορά της από το DNA στο RNA (ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ) Η διαδικασία της μεταγραφής απαιτεί τη δράση του

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΓΝΩΣΗ. ΘΕΜΑΤΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 15 Μαΐου 2017 Γ ΤΑΞΗΣ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΓΝΩΣΗ. ΘΕΜΑΤΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 15 Μαΐου 2017 Γ ΤΑΞΗΣ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Θέμα Α ΘΕΜΑΤΑ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 15 Μαΐου 2017 Γ ΤΑΞΗΣ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Να επιλέξετε τη σωστή απάντηση στις παρακάτω ερωτήσεις : Α1. Συνέπεια

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ Απαντήσεις Βιολογίας κατεύθυνσης (ΗΜΕΡΗΣΙΟ)

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ Απαντήσεις Βιολογίας κατεύθυνσης (ΗΜΕΡΗΣΙΟ) ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ 2016 Απαντήσεις Βιολογίας κατεύθυνσης (ΗΜΕΡΗΣΙΟ) Μιχάλης Χαλικιόπουλος ΘΕΜΑ Α Α1 β Α2 β Α3 δ Α4 γ Α5 γ ΘΕΜΑ Β Β1 Β2 1 Α 2 Γ 3 Α 4 Β 5 Α 6 Α 7 Γ Τα μεταφασικά χρωμοσώματα ενός κυττάρου διαφέρουν

Διαβάστε περισσότερα

Α3) Στα νουκλεοτίδια του γονιδίου, έχουν νόημα 120 x 3 x 2 = 720 νουκλεοτίδια Στα 100 Υ = ;

Α3) Στα νουκλεοτίδια του γονιδίου, έχουν νόημα 120 x 3 x 2 = 720 νουκλεοτίδια Στα 100 Υ = ; Μάθημα: Βιολογία Προσανατολισμού Εξεταζόμενη ύλη: 1o,2o κεφάλαιο ΚΟΡΥΦΑΙΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ korifeo.gr Απαντήσεις ΘΕΜΑ 1 Ο Α) 3 Β) 3 Γ) 4 Δ) 3 Ε) 4 ΘΕΜΑ 2 Ο Α1) Νπρόδρομου mrna = 300A + 800G + 400C + 500T =

Διαβάστε περισσότερα

Τρισδιάστατη δομή της ριβοσωμικής υπομονάδας 30S

Τρισδιάστατη δομή της ριβοσωμικής υπομονάδας 30S Κεφάλαιο 14 Γονιδιακή έκφραση: Μετάφραση Τρισδιάστατη δομή της ριβοσωμικής υπομονάδας 30S 1 2 Γενικευμένος τύπος αμινοξέος Οι δομές των 20 αμινοξέων που συναντώνται στη φύση, ταξινομημένες σύμφωνα με το

Διαβάστε περισσότερα

Δομή Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση DNA ΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Δομή Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση DNA ΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Δομή Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση DNA ΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΑ ΟΞΕΑ Είναι τα βιοπολυμερή που η δομική τους μονάδα είναι τα νουκλεοτίδια Διακρίνονται στο DNA (δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ), στο RNA (ριβονουκλεϊκό

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΘΕΜΑ Α A1. β Α2. γ Α3. γ Α4. α Α5. δ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΤΕΤΑΡΤΗ 15 ΙΟΥΝΙΟΥ 2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ (ΝΕΟ

Διαβάστε περισσότερα