Μελέτη του ρόλου του c-myc και των μοριακών αλληλεπιδράσεων στην παγκρεατίτιδα σε συνδυασμό με το πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος

Transcript

1 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Ιατρική Σχολή Μελέτη του ρόλου του c-myc και των μοριακών αλληλεπιδράσεων στην παγκρεατίτιδα σε συνδυασμό με το πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος Ο ρόλος στοιχείων του μικροπεριβάλλοντος κατά την εξέλιξη του πορογενούς αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στη Μοριακή Ιατρική Κατεύθυνση: Λειτουργική Γονιδιωματική & Πρωτεωμική Διπλωματική εργασία ΟΥΡΑΝΙΑ ΦΑΡΗ Βιολόγος

2 Αθήνα 2017 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Δρ. Βασίλειος Γοργούλης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Δρ. Αντωνία Βλάχου, Ειδικός Λειτουργικός Επιστήμονας, ΙΙΒΕΑΑ Δρ. Κωνσταντίνος Βουγάς, Ειδικός Λειτουργικός Επιστήμονας, ΙΙΒΕΑΑ Επιβλέπων: Δρ. Βασίλειος Γοργούλης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ 1

3 Περιεχόμενα ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 5 ABSTRACT... 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 9 Καρκίνος- Καρκινογένεση... 9 Παγκρεατικός καρκίνος Παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα Προέλευση του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος Μοριακό υπόβαθρο του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος Μοντέλα παγκρεατικού καρκίνου Μικροπεριβάλλον του όγκου Ινοβλάστες του στρώματος- Pancreatic stellate cells Εξωκυττάρια ύλη στο PDA Ενδοθηλιακά κύτταρα Ενδοκρινικά κύτταρα Κύτταρα του ανοσοποιητικού Mηχανισμοί καταστολής της ανοσολογικής απόκρισης στο PDA ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Απομόνωση DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Κυτταρομετρία Ροής Ανοσοιστοχημεία Masson s trichrome Enzyme Linked Immunosorbent Assay- ELISA Απομόνωση RNA Υπολογισμός της απόδοσης απομόνωσης και της καθαρότητας του RNA Επώαση με δεοξυριβονουκλεάση Παρασκευή cdna από το RNA με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης Πρωτόκολλο παρασκευής cdna(first-strand cdna) από το RNA με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης (SuperScript TM II RT) Ανάλυση μικροσυστοιχιών

4 Απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενούς (primary) κυτταρικής σειράς από συμπαγή όγκο Ανακαλλιέργεια κυτταρικής σειράς Ξενομεταμόσχευση (Xenotransplantation) σε NOD/SCID ποντίκια Απεικόνιση μέσω Positron Emission Tomography- Computed Tomography- PET/CT ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δημιουργία ενός μοντέλου παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος μέσω εκτοπικής υπερέκφρασης του KRAS* Ανοσολογικό προφίλ του μοντέλου Pdx-1-cre/KRAS*A σε σχέση με το φυσιολογικό Χαρακτηρισμός των τύπων λευκοκυττάρων που ανιχνεύονται στο μοντέλο PDX-1- CRE/KRAS*A κατά την ανάπτυξη πρώιμου και προχωρημένου PDA Χαρακτηρισμός των Τ κυττάρων που ανιχνεύονται στο μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A κατά την ανάπτυξη πρώιμου και προχωρημένου PDA Παρουσία κατασταλτικών κυττάρων μυελοειδούς προέλευσης (MDSC) στο πρώιμο PDA και αύξηση τους κατά την εξέλιξη της ασθένειας Προφίλ κυτταροκινών του μοντέλου PDX-1-CRE/KRAS*A στο πρώιμο και προχωρημένο PDA Απομόνωση CD8+ Τ κυττάρων από παγκρέατα PDX-1-CRE/KRAS*A τα οποία είχαν υποβληθεί σε θεραπεία gemcitabine Διαφορετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση του μοντέλου PDX-1- CRE/KRAS*A σε σχέση με το φυσιολογικό Χαρακτηριστικά που σχετίζονται με δεσμοπλασία ήδη από το πρώιμο PDA Δεσμοπλασία σε όγκους που έχουν προκύψει από xenograft ανθρώπινου παγκρεατικού όγκου σε ποντίκι αλλά και σε όγκους που προήλθαν από ένεση με ανθρώπινη πρωτογενή κυτταρική σειρά παγκρεατικού καρκίνου ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Μοριακής Ιατρικής της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Οι πειραματικές διαδικασίες έλαβαν χώρα κατά το ακαδημαϊκό έτος στο Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά: Τον Δρ. Κωνσταντίνο Βουγά για την καθοδήγηση και τις σημαντικές συμβουλές του κατά την εκπόνηση της διπλωματικής εργασίας Τον Δρ. Βασίλη Γοργούλη και την Δρ. Αντωνία Βλάχου που δέχτηκαν να είναι μέλη της τριμελούς επιτροπής και για τις υποδείξεις τους Τον Δρ. Γιάννη Μοριανό, την Μαρία Σεμιτέκολου και την Γεωργία Ξάνθου για την καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές τους Τα μέλη του εργαστηρίου Βασιλική Στραβοκεφάλου και Κωνσταντίνο Παλαμάρη για όλη την υποστήριξη και τις ευχάριστες στιγμές Τον Δρ. Δημήτρη Στέλλα για την καθοδήγηση, τις πολύωρες συζητήσεις και την υπομονή του 4

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το πορογενές παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (Pancreatic Ductal Adenocarcinoma- PDA) σχετίζεται με κακή πρόγνωση και αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου συσχετιζόμενη με καρκίνο. Οι ήδη υπάρχουσες θεραπείες είναι αναποτελεσματικές και για αυτό το λόγο είναι σημαντική η αναζήτηση νέων προσεγγίσεων που θα μπορούσαν να συνδυαστούν με τα χημειοθεραπευτικά σχήματα. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού στο οποίο η διαγονιδιακή υπερέκφραση του KRAS* οδήγησε στην ανάπτυξη PDA σε ζώα τριών εβδομάδων, εκτιμήθηκε μέσω μικροσυστοιχιών το πρότυπο της έκφρασης γονιδίων. Μετά από αναζήτηση σε διάφορες ομάδες γονιδίων από βάσεις δεδομένων φάνηκε να υπάρχει σημαντική επικάλυψη των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, με γονίδια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα και τον ινωτικό φαινότυπο. Αποσκοπώντας στην ανακάλυψη νέων θεραπειών, διερευνήθηκαν οι τύποι κυττάρων που έφεραν δείκτες του ανοσοποιητικού και διηθούσαν τον παγκρεατικό ιστό των KRAS* ποντικών. Μέσω ανάλυσης των πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής, παρατηρήθηκε διήθηση μυελοειδών κυττάρων καθώς και λεμφοκυττάρων στον παγκρεατικό όγκο. Ωστόσο, ένας πληθυσμός κυττάρων που έφερε δείκτες που σχετίζονται με μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα, φάνηκε να αυξάνεται νωρίτερα κατά την εξέλιξη του όγκου σε σχέση με τους άλλους. Επιπλέον, κυτταροκίνες που έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την προσέλκυση αυτού του πληθυσμού φάνηκαν επίσης αυξημένες στον όγκο σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν την πιθανότητα ύπαρξης ενός ανοσοκαταστασταλτικού μικροπεριβάλλοντος στον όγκο στο συγκεκριμένο μοντέλο ποντικού. Προκειμένου να ενισχυθεί η ανοσοαπόκριση των KRAS* ποντικών έναντι του όγκου, απομονώθηκαν CD8+ T κύτταρα από ποντίκια στα οποία χορηγούταν Gemcitabine για έξι βδομάδες. Τα κύτταρα αυτά ενέθηκαν σε ένα ποντίκι που νοσούσε με PDA και το μέγεθος του όγκου εκτιμήθηκε μέσω PET/CT. Παρόλο που στις δύο βδομάδες παρατηρήθηκε 5

7 μείωση στο μέγεθος του όγκου, το ποντίκι ήταν ετοιμοθάνατο μετά από τρεις βδομάδες. Τέλος, οι παγκρεατικοί όγκοι των KRAS* ποντικών παρουσίαζαν εκτενή ίνωση και η αντίδραση δεσμοπλασίας ήταν ήδη παρούσα σε ποντίκια τριών εβδομάδων. Εκτός από την ύπαρξη κολλαγόνου, οι τομές του ιστού ήταν θετικές στην ανοσοιστοχημεία για ένα δείκτη ενεργοποίησης μυοινοβλαστών. Ακόμη, το ίδιο πρότυπο υπήρχε και σε τομές ιστών από NOD/SCID ποντίκια που έφεραν ξενομοσχεύματα από ανθρώπινους παγκρεατικούς όγκους ή από πρωτογενή ανθρώπινη κυτταρική σειρά παγκρεατικού καρκίνου. Τα αποτελέσματα αυτά που θεωρούνται απλώς διερευνητικά, υποδεικνύουν ότι άλλα συστατικά του όγκου εκτός των ίδιων των καρκινικών κυττάρων διαμορφώνουν την εξέλιξη του. Τα συστατικά του μικροπεριβάλλοντος του όγκου, όπως τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και τα ινωτικά στοιχεία διαμορφώνουν ένα πολύπλοκο δίκτυο αλληλεπίδρασης. Η καλύτερη αποσαφήνιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στον καρκίνο θα μπορούσε να συνεισφέρει στο να βελτιωθούν υπάρχουσες θεραπείες και να ανακαλυφθούν νέοι ελπιδοφόροι στόχοι μελλοντικά. 6

8 ABSTRACT Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDA) carries one of the most dismal prognosis and is the fourth leading cause of death relating to cancer. With current treatments being highly ineffective, it is important to discover new approaches that could be combined with current chemotherapy schemes. Using a mouse model in which transgenic overexpression of KRAS* in the pancreas results in developing PDA in three week old mice, the expression pattern of genes was evaluated through microarrays. When compared to specific gene lists from various databases, there was significant overlap of genes that are involved in the immune system response and in the fibrotic phenotype. In order to discover new targets for therapy, the types of cells that carry immune cell markers and infiltrated the pancreas of KRAS* mice was investigated. A leukocytic infiltration of myeloid and lymphocyte cells was observed through flow cytometry analysis in the pancreatic tumor. However, a population that expressed markers associated with myeloid suppressor cells, was found to be increased earlier than others during tumor progression. Moreover, cytokines that have been associated with the development and recruitment of this population were also found to be increased in tumors compared to normal tissue. These findings indicate the possibility of the existence of a immunosuppressive tumor microenviroment in this particular mouse model. In an attempt to improve the immune response of KRAS* mice against the tumor, CD8+ T cells were isolated from mice that were receiving Gemcitabine treatment for six weeks. These cells were injected intravenously in a mouse that had developed PDA, in order to estimate tumor size through PET/CT. Although a reduction in tumor size was observed two weeks after the injections, the mouse was moribund after three weeks. Finally, the pancreatic tumors of KRAS* mice were extremely fibrotic and the desmoplastic reaction was found to be already present in three week old mice. Except for the presence of collagen, tissue sections were also positive for a marker of myofibroblast activation. In addition, the same pattern was observed in tissue sections 7

9 from NOD/SCID mice carrying xenografts of human derived tumors or primary human pancreatic cancer cell lines. These findings that are considered merely exploratory, suggest that other tumor components beside tumor cells themselves have a role in tumor progression. Tumor microenviroment components such as immune cells and fibrotic elements interact with cancer cells, forming a compex network. A better clarification of the mechanisms that are involved in cancer progression could help improve current treatments and discover new promising therapeutic targets. 8

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καρκίνος- Καρκινογένεση Η ανάπτυξη του καρκίνου ξεκινάει όταν χαθεί η δυνατότητα ελεγχόμενης κυτταρικής διαίρεσης σε κάποιο κύτταρο. Το κύτταρο και οι απόγονοί του πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα και δημιουργούν μια κατάσταση γνωστή ως υπερπλασία. Μετά από κάποιο χρονικό διάστημα και αφού τα κύτταρα υποστούν επιπλέον μεταλλάξεις αρχίζουν να εμφανίζουν μη φυσιολογικά χαρακτηριστικά, όπως διαφορετικό μέγεθος πυρήνων και πολικότητα. Το στάδιο αυτό ορίζεται ως δυσπλασία. Ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός σε συνδυασμό με νέες μεταλλάξεις, οδηγούν σε κύτταρα με περαιτέρω ανώμαλη εμφάνιση και στο σχηματισμό όγκου, ωστόσο η κατάσταση αυτή ονομάζεται in situ carcinoma, καθώς δεν διαπερνάται η βασική μεμβράνη. Αν συμβούν περαιτέρω αλλαγές, οι οποίες επιτρέπουν στα κύτταρα να διαπεράσουν τη βασική μεμβράνη και να εισέλθουν στην κυκλοφορία με δυνατότητα μετάστασης σε νέους ιστούς, τότε το στάδιο ορίζεται ως μεταστατικό καρκίνωμα. Τα κύτταρα για να μετατραπούν σε καρκινικά, αποκτούν σταδιακά κάποια συγκεκριμένα χαρακτηριστικά και μεταξύ αυτών ίσως το πιο αντιπροσωπευτικό είναι ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο οποίος διατηρείται λόγω μεταλλάξεων σε σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από αυξητικούς παράγοντες όπως το μονοπάτι των MAP και PI3 κινασών (Dhillon, Hagan et al. 2007; Yuan and Cantley 2008). Ακόμη, σε αρκετές περιπτώσεις διακόπτεται η αρνητική ανατροφοδότηση που φυσιολογικά υπάρχει ώστε να μην ενεργοποιούνται τα σηματοδοτικά μονοπάτια σε υπερβολικό βαθμό. Για παράδειγμα, οι περισσότερες μεταλλάξεις του γονιδίου RAS, αφορούν την ιδιότητα του ως GTPαση, διακόπτοντας τη φυσιολογική αρνητική ανατροφοδότηση που διασφαλίζει ότι το ενεργό σήμα είναι παροδικό (Amit, Citri et al. 2007). Παράλληλα, τα καρκινικά κύτταρα, διαθέτουν την ικανότητα να αποφεύγουν την καταστολή του πολλαπλασιασμού τους. Οι πιο αντιπροσωπευτικές πρωτεΐνες είναι οι TP53 και RB. Όταν ανιχνεύονται σήματα καταστολής του πολλαπλασιασμού, τότε προκαλείται παύση στην μετάβαση από το ένα στάδιο του κυτταρικού κύκλου στο επόμενο. Απώλεια της λειτουργικότητας αυτών των δύο πρωτεϊνών μπορεί 9

11 επίσης να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό. Παράλληλα, ένα ακόμη χαρακτηριστικό αποτελεί η αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Αρκετές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους αποφεύγεται η απόπτωση (Adams and Cory 2007). Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί και πάλι η απώλεια του TP53, που φυσιολογικά ανιχνεύει τη βλάβη του DNA και οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση. Επιπλέον, η διαδικασία της αγγειογένεσης στους ενήλικες ενεργοποιείται μόνο παροδικά, όπως για παράδειγμα κατά την επούλωση πληγών. Αρκετά, σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται κατά την καρκινογένεση οδηγούν στην έκφραση παραγόντων, όπως του VEGF (Ferrara 2010). Τα αγγεία που δημιουργούνται στους όγκους ωστόσο, δεν έχουν τη φυσιολογική τους μορφή και μπορεί να εμφανίζουν περιττές διακλαδώσεις, μικροαιμορραγία και μη αναμενόμενο πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων. (Baluk, Hashizume et al. 2005). Ακόμη, είναι πλέον γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα διαθέτουν την ικανότητα διήθησης και μετάστασης. Παρατηρούνται αλλαγές στο σχήμα και στην προσκόλλησή τους με άλλα κύτταρα και ιδιαίτερα απώλεια της E- καντχερίνης, ενός μορίου που είναι σημαντικό για τις συνδέσεις των κυττάρων μεταξύ τους (Berx and van Roy 2009). Ταυτόχρονα, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα κύτταρα του σώματος που σταματούν να πολλαπλασιάζονται πέρα από κάποιο αριθμό διαιρέσεων, τα κύτταρα του όγκου διαθέτουν τη δυνατότητα να διαιρούνται απεριόριστα. Φαίνεται ότι με αυτήν την ιδιότητα σχετίζεται η τελομεράση, ένα ένζυμο υπεύθυνο για την προσθήκη τελομερών στο τέλος του DNA. Η τελομεράση η οποία εντοπίζεται ενεργή σε πολλούς τύπους καρκίνου συχνά λόγω γενομικών μεταλλάξεων, εμποδίζει την απώλεια τελομερών και διασφαλίζει ότι τα κύτταρα θα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται απεριόριστα (Jafri, Ansari et al. 2016). Ένα ακόμη χαρακτηριστικό που παρουσιάζουν τα καρκινικά κύτταρα αφορά το μεταβολισμό τους. Ενώ υπό φυσιολογικές συνθήκες παρουσία οξυγόνου τα κύτταρα του οργανισμού χρησιμοποιούν τη γλυκόζη για την παραγωγή ATP, μέσω γλυκόλυσης, κύκλου του Krebs και οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, τα καρκινικά κύτταρα παράγουν ATP κατά κύριο λόγο μόνο μέσω γλυκόλυσης. Για να αντιμετωπίσουν την αρκετά μικρότερη απόδοση ATP που προκύπτει με αυτόν τον τρόπο, αυξάνουν την έκφραση μεταφορέων της γλυκόζης (GLUT1) (Potter, Newport et al. 2016). Θεωρείται ότι κάποια από τα ογκογονίδια που προαναφέρθηκαν, όπως το 10

12 TP53, σχετίζονται με αυτή τη στροφή στη γλυκόλυση (Jones and Thompson 2009). Τέλος, αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να αποφεύγουν την ανίχνευση και την επακόλουθη εξουδετέρωση από το ανοσοποιητικό σύστημα. Η χρήση μοντέλων ποντικών με έλλειψη συστατικών του ανοσοποιητικού στα οποία έγινε επαγωγή της καρκινογένεσης με χημικό τρόπο, συνέβαλε σε αυτό το συμπέρασμα. Συγκεκριμένα, ποντίκια με ελαττωματική ανάπτυξη Τ και ΝΚ κυττάρων είναι πιο επιρρεπή στην εμφάνιση καρκίνου σε σχέση με τους μάρτυρες. (Kim, Emi et al. 2007). Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα καρκινικά κύτταρα αποφεύγουν την αναγνώριση από το ανοσοποιητικό σύστημα αναφέρονται εκτενέστερα παρακάτω. Εικόνα 1: Τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Διατήρηση σήματος πολλαπλασιασμού, αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο, αποφυγή καταστολής της αύξησης, επαγωγή της αγγειογένεσης, ικανότητα διήθησης και μετάστασης, ικανότητα για απεριόριστες διαιρέσεις, αλλαγή του μεταβολισμού, αποφυγή της καταστροφής από το ανοσοποιητικό. Δύο ακόμη χαρακτηριστικά που συμβάλουν στην απόκτηση των άλλων είναι η γενετική αστάθεια και η φλεγμονή. Υπό το πρίσμα της εξέλιξης, αριστερά παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα οργανισμών με μικρή διάρκεια ζωής και δεξιά χαρακτηριστικά παρόμοια με οργανισμών με μεγάλη διάρκεια ζωής (Aktipis, Boddy et al. 2013). 11

13 Δύο άλλα χαρακτηριστικά που συμβάλουν στο ξεκίνημα των άλλων είναι αστάθεια του γονιδιώματος και η φλεγμονή. Η αστάθεια του γονιδιώματος, οδηγεί σε περισσότερες μεταλλάξεις που ευνοούν την επιβίωση κάποιων κλώνων κυττάρων οδηγώντας στην εξέλιξη του όγκου. Η φλεγμονή στην περιοχή του όγκου επίσης μπορεί να ενισχύσει την απόκτηση των χαρακτηριστικών αυτών. Παγκρεατικός καρκίνος Οι παγκρεατικοί όγκοι μπορεί να είναι εξωκρινείς ή ενδογενείς. Οι εξωκρινείς είναι αρκετά συχνότεροι και περιλαμβάνουν το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, τους όγκους των κυψελιδικών κυττάρων και τους κυστικούς όγκους. Οι ενδοκρινείς όγκοι ξεκινούν από την ενδοκρινή μοίρα του παγκρέατος και ταξινομούνται ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου από τον οποίο προήλθαν. Πιο σπάνιες περιπτώσεις όγκων αποτελούν τα σαρκώματα και τα λεμφώματα που εντοπίζονται στο πάγκρεας. Παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα Από τις κατηγορίες αυτές, την πιο συχνή αποτελεί το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα που αφορά πάνω από το 85% των νεοπλασμάτων. Πρόκειται για την τέταρτη αιτία θανάτου συσχετιζόμενη με καρκίνο, με αρκετά χαμηλά ποσοστά επιβίωσης (Niederhuber, Brennan et al. 1995). Εξ αιτίας της έλλειψης ειδικών συμπτωμάτων, η διάγνωση γίνεται σε προχωρημένο στάδιο δυσκολεύοντας την ίαση. Θεραπευτικές επιλογές αποτελούν η χειρουργική επέμβαση, η χημειοθεραπεία και η ραδιοθεραπεία, χωρίς μεγάλα ποσοστά επιτυχίας. Είναι λοιπόν επιτακτική η ανάγκη της αποσαφήνισης των μηχανισμών που οδηγούν στη δημιουργία του αδενοκαρκινώματος, με σκοπό την εύρεση πιο αποτελεσματικής θεραπείας. Το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα είναι μια ασθένεια που σχετίζεται με την προχωρημένη ηλικία, ενώ κάποιοι περιβαλλοντικοί παράγοντες φαίνεται να αυξάνουν τις πιθανότητες εμφάνισής του. Περίπου 10% των περιπτώσεων φαίνεται να έχουν κληρονομική προδιάθεση και έχουν σχέση με γενετικές μεταλλάξεις, ενώ οι υπόλοιπες εμφανίζονται σποραδικά στον πληθυσμό (Lynch, Smyrk et al. 1996). 12

14 Αρχικά, εμφανίζονται στον ιστό βλάβες που εντοπίζονται στους παγκρεατικούς πόρους και ονομάζονται παγκρεατικές ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες (pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN). Οι βλάβες αυτές, ταξινομούνται ανάλογα με το στάδιο δυσπλασίας το οποίο εμφανίζουν σε PanIN-1, PanIN-2 και PanIN-3. Συγκεκριμένα, για την ταξινόμησή τους αξιολογείται ο βαθμός των αρχιτεκτονικών αλλαγών του ιστού, όπως η ψευδοστρωμάτωση και η εμφάνιση θηλωμάτων, καθώς και μεταβολές στη μορφή των κυττάρων, όπως η αλλαγή του κυβοειδούς σχήματος σε υψηλά σωληνοειδή κύτταρα, που μπορεί να χαρακτηρίζονται από μεγαλοπυρήνωση, συνοστισμό κυττάρων, υψηλό ρυθμό μίτωσης και την παρουσία βλέννης. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι αυξημένος στα πιο προχωρημένα στάδια PanIN, γεγονός το οποίο ενισχύει τη θεωρία ότι το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα προκύπτει από τέτοιες βλάβες (Kleeff, Beckhove et al. 2007). Ο φυσιολογικός ιστός των παγκρεατικών πόρων αποτελείται από κυβοειδές επιθήλιο, ενώ απουσιάζει το βλεννώδες επιθήλιο και η ατυπία των κυττάρων. Στο PanIN-1 παρατηρούνται στο επιθήλιο κιονοειδή κύτταρα με μικρούς και στρογγυλούς ή οβάλ πυρήνες οι οποίοι είναι διατεταγμένοι κάθετα στη βασική μεμβράνη. Στο επόμενο στάδιο, παρατηρούνται επιθηλιακές βλεννώδεις βλάβες οι οποίες μπορεί να είναι είτε επίπεδες, είτε θηλοειδές. Παρατηρείται απώλεια της πολικότητας των πυρήνων, μεγέθυνση, συνωστισμός, ψευδοστρωμάτωση και ανίχνευση υπερβολικής χρωματίνης. Οι μιτώσεις που παρατηρούνται είναι σπάνιες αλλά και όταν συμβαίνουν δεν παρατηρείται ατυπία. Στην περίπτωση του PanIN-3, οι βλάβες έχουν συνήθως θηλοειδή μορφή. Εμφανίζεται πραγματική στρωμάτωση, με ομάδες επιθηλιακών κυττάρων να προεκβάλλουν στο στρώμα. Ακόμη, ανιχνεύεται νέκρωση σε κάποιες περιοχές. Τα κύτταρα εμφανίζουν μειωμένη πολικότητα, κυπελοειδή μορφή με πυρήνα προς το στρώμα και βλεννώδες κυταρόπλασμα προς τη βασική μεμβράνη. Οι μιτώσεις που συμβαίνουν, οδηγούν σε μακροπυρήνωση. Σε κάποιες περιπτώσεις οι πόροι μπορούν να παρουσιάζουν χαρακτηριστικά περισσοτέρων του ενός σταδίου. Υπό αυτές τις συνθήκες για την αξιολόγηση του σταδίου PanIN, λαμβάνεται υπό όψη η πιο προχωρημένη μορφή που εντοπίζεται (Hruban, Adsay et al. 2001; Zhang, Zeng et al. 2016). 13

15 Προέλευση του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος Εφ όσον το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα χαρακτηρίζεται από την έντονη παρουσία πόρων και οι αρχικές βλάβες χαρακτηρίζονται από πολλαπλασιασμό των κυττάρων εντός του πόρου, αρχικά η υπόθεση ήταν ότι τα κύτταρα αυτά ήταν υπεύθυνα για τη δημιουργία του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Τα κύτταρα των πόρων θεωρείται ότι παρουσιάζουν έντονη πλαστικότητα και έχουν χαρακτηριστεί ως πολυδύναμα, ικανά να δώσουν γένεση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Η πλαστικότητα που διαθέτουν και η ικανότητα να πολλαπλασιάζονται και να ανανεώνονται τα καθιστά ικανά να αποτελούν στόχους γενετικών μεταλλάξεων που τελικά οδηγούν σε καρκινογένεση.(grapin-botton 2005). Ωστόσο, σε άλλες μελέτες, έχει προταθεί ότι τα κύτταρα των πόρων προήλθαν από μετασχηματισμό των αδενοκυψελιδικών κυττάρων. Θεωρείται αποδεκτό ότι η έκφραση κάποιων μεταγραφικών παραγόντων που καθορίζουν τη διαφοροποίηση του παγκρέατος, μπορούν να επαναπρογραμματίσουν άλλους ενδοδερμικής προέλευσης ιστούς και να οδηγήσουν σε παγκρεατική διαφοροποίηση. Η αλλαγή του φαινότυπου των κυττάρων, συμβαίνει φυσιολογικά κατά την ανάπτυξη και ως απάντηση σε τραυματισμό. Ένας από τους παράγοντες που πρόσφατα φάνηκε να παίζει ρόλο στη μεταπλασία αδενοκυψελιδικών κυττάρων σε κύτταρα των πόρων, είναι ο KLF4 (Wei, Wang et al. 2016). Υπάρχουν όμως και ενδείξεις που υποστηρίζουν ότι οι δομές των πόρων δεν προέρχονται από τη μετα- διαφοροποίηση (transdifferentiation) των αδενοκυψελιδικών κυττάρων αλλά από τα κεντροαδενοκυψελιδικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, το μονοπάτι της PI3K φαίνεται να συμμετέχει σε αυτό μέσω του αναστολέα PTEN (Stanger, Stiles et al. 2005). Επιπλέον, in vitro πειράματα έκφρασης ογκογονιδίων σε ενδοκρινικά κύτταρα, έχουν οδηγήσει την ανάπτυξη παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος σε ποντίκια, δημιουργώντας το ερώτημα αν μπορούν τα νησίδια του Langerhans να αποτελούν τον αρχικό πληθυσμό από τον οποίο προέρχεται το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (Yoshida and Hanahan 1994). 14

16 Μοριακό υπόβαθρο του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος Παρόλο που πολλά ερωτήματα της βιολογίας του παγκρεατικού καρκίνου παραμένουν αναπάντητα, η αναγνώριση γενετικών αλλαγών που συμβαίνουν στην ασθένεια θεωρείται σημαντικό εύρημα, το οποίο μπορεί να οδηγήσει στην καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που συμβάλουν την εμφάνιση της ασθένειας. Με τη χρήση γενετικής μηχανικής, νέα ζωικά μοντέλα μπορούν να συνδέσουν το μοριακό επίπεδο με το επίπεδο της συστημικής φυσιολογίας, δείχνοντας πως γενετικές αλλαγές, μέσω πολύπλοκων σηματοδοτικών μονοπατιών μπορούν να επηρεάσουν την κυτταρική αύξηση, επιβίωση και διαφοροποίηση. Η ανάλυση των μοριακών και παθολογικών χαρακτηριστικών του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος, οδήγησε στην ανακάλυψη συγκεκριμένων μεταλλαγών που συμβαίνουν με συγκεκριμένο πρότυπο. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις είναι αυτές των KRAS, CDKN2A, TP53 και SMAD4/DPC4. Συμβαίνουν με συγκεκριμένη χρονική σειρά, ξεκινώντας από το φυσιολογικό πάγκρεας μέχρι το στάδιο του παγκρεατικού καρκίνου. KRAS Το KRAS γονίδιο κωδικοποιεί μέλος της οικογένειας RAS πρωτεϊνών που προσδένουν GTP. Οι πρωτεΐνες αυτές συμμετέχουν σε αρκετές κυτταρικές λειτουργίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η επιβίωση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός (Shields, Pruitt et al. 2000). Η πιο συχνή μετάλλαξη είναι η σημειακή αλλαγή στο κωδικόνιο 12 KRAS G12D, κατά την οποία η γλυκίνη αντικαθιστάται από το ασπαραγινικό οξύ και οδηγεί σε διαρκώς ενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν η KRAS είναι συνδεδεμένη με GTP, βρίσκεται στην ενεργοποιημένη της μορφή, μετά όμως από υδρόλυση του GTP, η KRAS απενεργοποιείται. Στην περίπτωση όμως που το KRAS έχει μεταλλαχθεί, η ιδιότητα της πρωτεΐνης ως GTPάση χάνεται, με αποτέλεσμα να μένει στην ενεργή της μορφή προσδεδεμένη με GTP, ενεργοποιώντας τους μετέπειτα στόχους της στο σηματοδοτικό μονοπάτι και οδηγώντας σε ανεξέλεγκτο κυτταρικό 15

17 πολλαπλασιασμό (Eser, Schnieke et al. 2014). Οι μεταλλάξεις στο KRAS ογκογονίδιο είναι από τις πρώτες μεταλλάξεις που εμφανίζονται και ανιχνεύονται στο 99% των PanIN και στο 95% των περιπτώσεων παγκρεατικού καρκίνου (Biankin, Waddell et al. 2012; Kanda, Matthaei et al. 2012). CDKN2A Το CDKN2A γονίδιο κωδικοποιεί τις p16 INK4A και p19 ARF που εμφανίζουν ογκοκατασταλτική δράση. Στις περισσότερες περιπτώσεις συμβαίνουν μεταλλάξεις στο εξώνιο 1 του μετάγραφου του p16 INK4A και έχουν αναφερθεί τόσο στον παγκρεατικό καρκίνο όσο και σε μελανώματα. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η p16 INK4A εμποδίζει τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από την G1 στην S φάση, μέσω ελέγχου των CDK4 και CDK6 κινασών, οι οποίες φωσφορυλιώνουν την RB (Retinoblastoma Protein). Απώλεια της δράσης της, οδηγεί σε απώλεια ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και μετάβαση στην S φάση σύνθεσης του DNA (Kim and Sharpless 2006). Η INK4A έχει φανεί να εμπλέκεται και στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία στον παγκρεατικό καρκίνο. Αλλαγές στο CDKN2A που οδηγούν σε απώλεια της λειτουργίας της πρωτεΐνης σε περίπου 80-90% των περιπτώσεων παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος (Rozenblum, Schutte et al. 1997). Ανιχνεύονται αργότερα από τις KRAS μεταλλάξεις σε πιο προχωρημένες βλάβες που εμφανίζουν χαρακτηριστικά δυσπλασίας. TP53 Το TP53 γονίδιο κωδικοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα p53 που ενεργοποιείται μετά από βλάβη στο DNA. Οι λειτουργίες του αφορούν τον έλεγχο της μετάβασης από τη G2 στη Μ φάση, επιτρέποντας την επιδιόρθωση του DNA. Επίσης, παίζει σημαντικό ρόλο στην απόπτωση. Πρόκειται συνήθως για μεταλλάξεις αλλαγής νοήματος που επηρεάζουν την πρόσδεσή του στο DNA (Vogelstein, Lane et al. 2000). Στο παγκρεατικό καρκίνο, τέτοιες μεταλλάξεις εντοπίζονται σε ποσοστό μεγαλύτερο από 50% (Rozenblum, Schutte et al. 1997). Συμβαίνουν σε προχωρημένα 16

18 στάδια PanINs, που εμφανίζουν έντονα χαρακτηριστικά δυσπλασίας. Η απώλεια του p53 πιθανολογείται ότι σχετίζεται με τη γενετική αστάθεια, η οποία εμφανίζεται στην ασθένεια. Οι όγκοι αυτοί χαρακτηρίζονται από ετερογένεια και φαινόμενα ανευπλοειδίας. Κάποιες μελέτες υποστηρίζουν ότι η δυσλειτουργία και η απώλεια των τελομερών μπορούν να συνεισφέρουν σε φαινόμενα αστάθειας (Gorunova, Hoglund et al. 1998). Θεωρείται ότι η απώλεια του p53 μπορεί να επηρεάζει την επιβίωση κυττάρων με μικρότερα τελομερή. SMAD4 Το SMAD4 γονίδιο κωδικοποιεί ένα ρυθμιστή της μεταγραφής του σηματοδοτικού μονοπατιού TGF-β (Transforming Growth Factor beta). Το μονοπάτι TGF-β εμποδίζει τη μετάβαση του κύκλου από τη G1 στην S φάση και παίζει ρόλο στην απόπτωση, ρυθμίζοντας λειτουργίες όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η ομοιόσταση του ιστού (Massague, Blain et al. 2000). Το SMAD4 που αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή του μονοπατιού, υφίσταται στις περισσότερες περιπτώσεις διαγραφή που οδηγεί σε απενεργοποίηση του προϊόντος. Οι μεταλλάξεις αυτές έχουν βρεθεί σε πιο προχωρημένα στάδια PanIN-3 και καρκίνου και αποτελoύν ένδειξη μειωμένης επιβίωσης (Wilentz, Iacobuzio-Donahue et al. 2000). Ο αντίκτυπος που έχει, σχετίζεται με τις υπόλοιπες συνθήκες που επικρατούν, όπως άλλες γενετικές αλλαγές που έχουν συμβεί όπως στο TP53. Ακόμη, ένα ποσοστό παγκρεατικών καρκίνων 10% χωρίς αλλαγή στο SMAD4, είναι δυνατό να εμφανίζουν αλλαγή σε άλλα στοιχεία του μονοπατιού TGF-β όπως στον υποδοχέα του TGF-β ή σε υποδοχέα της ακτιβίνης Α (Jones, Zhang et al. 2008). Η απώλεια του SMAD4 μπορεί ακόμη να συμβάλει στο σχηματισμό του όγκου συμμετέχοντας στην αλληλεπίδραση του όγκου με το στρώμα. Επιγενετικές αλλαγές Σε μικρότερα ποσοστά ανιχνεύονται και αλλαγές που αφορούν την επιγενετική ρύθμιση. Σωματικές μεταλλάξεις κυρίως σε μέλη του συμπλόκου SWI/SNF ανιχνεύονται σε μικρό ποσοστό περίπου 5% παγκρεατικού καρκίνου (Witkiewicz, McMillan et al. 2015). Αυτή η οικογένεια γονιδίων κωδικοποιεί 17

19 πρωτεΐνες των συμπλόκων BAF (BRG1- associated BAF) και PBAF (polybromoassociated BAF), τα οπoία διακόπτουν τις επαφές ιστονών με το DNA. Οι πιο πολλές μεταλλάξεις σε αυτήν την κατηγορία που έχουν περιγραφεί στον παγκρεατικό καρκίνο αφορούν μέλη της οικογένειας BAF. Ενώ οι αλλαγές που συμβαίνουν στα προηγούμενα γονίδια που αναφέρθηκαν, ανιχνεύονται και στα δύο αλλήλια, σε αυτά τα γονίδια απαιτείται αλλαγή μόνο στο ένα αλλήλιο (Masliah-Planchon, Bieche et al. 2015). Δεν είναι απόλυτα ξεκάθαρο το σε ποιο στάδιο συμβαίνουν αυτές οι αλλαγές και το αν συμβαίνουν και προσφέρουν στα κύτταρα πλεονέκτημα επιβίωσης ή αν είναι αποτέλεσμα ετερογένειας του όγκου. Οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν εμφανίζονται να έχουν συνεργατική δράση και επηρεάζουν περισσότερα του ενός σηματοδοτικά μονοπάτια. Για παράδειγμα, μεταλλάξεις στο KRAS φαίνεται ότι εμποδίζουν τη φωσφορυλίωση του p53 και επεμβαίνουν στο μονοπάτι ΤGFβ/SMAD (Cordenonsi, Dupont et al. 2003). Παράλληλα, το μονοπάτι TGFβ επηρεάζει το μονοπάτι RAS-RAF-ERK (Iglesias, Frontelo et al. 2000). Η αποσαφήνιση αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι σημαντική για την εύρεση πιθανών στόχων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπευτικές προσεγγίσεις. 18

20 Εικόνα 2: Τα στάδια του παγκρεατικού καρκίνου. Στάδιο 1: Ένα φυσιολογικό κύτταρο του παγκρέατος αποκτά μία μετάλλαξη (κόκκινο κύτταρο- initiating driver gene mutation). Η μετάλλαξη αυτή φυσιολογικά οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση, αν όμως αυτοί οι μηχανισμοί αποτύχουν παρουσιάζεται πλεονέκτημα επιβίωσης και αύξησης. Στάδιο 2: Το αρχικό κύτταρο και τα κύτταρα που προέρχονται από αυτό συνεχίζουν να διαιρούνται διατηρώντας την αρχική μετάλλαξη. Καθώς ο αριθμός των κυττάρων αυξάνεται οι απόγονοι αποκτούν περισσότερες μεταλλάξεις που οδηγούν σε ετερογένεια του νεοπλάσματος (μπλε, πράσινα και μπεζ κύτταρα- stepwise progression model). Εναλλακτικά, ένα αρχικό γεγονός καταστροφικό για το γένωμα μπορεί να συμβεί σε έναν μόνο κυτταρικό κύκλο, οδηγώντας σε πολλαπλές αλλαγές στα γονίδια ταυτόχρονα (πράσινα κύτταρα- punctuated evolution model). Στάδιο 3: Η εξάπλωση των κυττάρων του αρχικού κλώνου μπορεί να οδηγήσει σε μια ομάδα κυττάρων που μπορούν να διαπεράσουν τη βασική μεμβράνη. Επιπλέον γενετικές αλλαγές, καθώς και σήματα από το μικροπεριβάλλον του όγκου, προωθούν την προσαρμογή των υποκλώνων και την επιλογή εκείνων που ανταποκρίνονται καλύτερα στο περιβάλλον, καθώς και σε νέα περιβάλλοντα (συκώτι, πεύμονας, περιτόναιο) ECM-εξωκυττάρια ύλη, MDSC-κατασταλτικά κύτταρα μυελοειδούς προέλευσης (Makohon-Moore and Iacobuzio-Donahue 2016). Μοντέλα παγκρεατικού καρκίνου Η δημιουργία διαγονιδιακών μοντέλων ποντικών παγκρεατικού καρκίνου με τη χρήση γενετικής μηχανικής, έχει συνεισφέρει σημαντικά τόσο στην αποσαφήνιση των μηχανισμών που οδηγούν στην καρκινογένεση, όσο και στη δοκιμή νέων θεραπευτικών παραγόντων. Δύο καθοριστικά στοιχεία για την ανάπτυξη τέτοιων μοντέλων ήταν αρχικά οι μεταγραφικοί παράγοντες που έχουν σημαντικό ρόλο στην 19

21 ανάπτυξη του παγκρέατος και η εύρεση συχνών μεταλλάξεων που εντοπίζονται στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Αρχικά, οι μεταγραφικοί παράγοντες PDX-1 και P48 αρχίζουν να εκφράζονται περίπου την Ε8,5 και είναι απαραίτητοι για την παγκρεατική μοίρα των κυττάρων (Offield, Jetton et al. 1996). Προκειμένου να εκφραστεί το KRAS* (KRAS G12D ) σε προγονικά κύτταρα παγκρέατος, χρησιμοποιήθηκαν γενετικά στοιχεία που παρεμποδίζουν τη μεταγραφή και μετάφραση, πλαισιωμένα από loxp αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από την cre ρεκομπινάση. Η αλληλουχία Lox-Stop- Lox (LSL) βρίσκεται ανοδικά της αλληλουχίας KRAS που περιλαμβάνει την αντικατάσταση στο κωδικόνιο 12 της γλυκίνης με ασπαρτικό οξύ που οδηγεί σε διαρκώς ενεργή μορφή της πρωτεΐνης, μια από τις πιο κοινές μεταλλάξεις που εντοπίζονται σε παγκρεατικούς όγκους. Το αλλήλιο KRAS G12D εισήχθη στην ενδογενή περιοχή του KRAS και τα ποντίκια διασταυρώθηκαν με άλλα που εξέφραζαν την cre ρεκομπινάση στον παγκρεατικό ιστό κάτω από τον υποκινητή του PDX-1 ή με knock in της cre στον τόπο του p48. Τα ποντίκια PDX-1-CRE, LSL-KRAS G12D AND P48+/- CRE, LSL-KRAS G12D που προέκυψαν εξέφραζαν αυξημένα επίπεδα μεταλλαγμένης KRAS πρωτεΐνης. Εμφάνισαν αντίστοιχα στάδια PanIN με αυτά των ανθρώπων και διεισδυτικό μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα PDA (Hingorani, Petricoin et al. 2003). Με παρόμοιες μεθόδους δημιουργήθηκε ένα αλλήλιο με σημειακή μετάλλαξη του ανθρώπινου ομόλογου TRP53 R17H. Η έκφραση του επιτυγχάνεται μετά από διασταύρωση με PDX-1-CRE ποντίκια. Τα ποντίκια που έφεραν το γονότυπο PDX-1- CRE, LSL-KRAS G12D, LSL-TRP53 R172H/-, εμφανίζουν PanIN αλλοιώσεις, PDA, μεταστάσεις στο συκώτι, εκφράζουν κερατίνη 19 (CK19) και έχουν μικρότερη επιβίωση από τα PDX-1-CRE, LSL-KRAS G12D (Hingorani, Wang et al. 2005). Σε άλλες προσεγγίσεις στόχο αποτέλεσαν γονίδια που έχουν βρεθεί ότι σχετίζονται με παγκρεατικό καρκίνο, όπως τα BRCA2, INK4, SMAD4, TGF-Β. Απώλεια της λειτουργικότητας των πρωτεϊνών που προκύπτουν από αυτά τα γονίδια μέσω knock out τεχνικών σε συνδυασμό όμως πάντα με το αλλήλιο LSL-KRAS G12D, οδήγησαν σε παγκρεατικό καρκίνο στα ποντίκια. Ωστόσο, όσον αφορά μελέτη του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος δεν θα μπορούσε να μην αναφερθεί η χρήση ξενομοσχευμάτων (xenograft) σε ποντίκια. Η διαδικασία περιλαμβάνει την ένεση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων ή την 20

22 μεταμόσχευση μέρους του ανθρώπινου όγκου σε ένα ποντίκι. Προκειμένου ο οργανισμός να δεχτεί το ξένο αυτό μόσχευμα, είναι απαραίτητο ο δέκτης να είναι ανοσοκατεσταλμένος, όπως τα ποντίκια NOD/SCID τα οποία εξαιτίας μεταλλάξεων διαθέτουν ελαττωματική εγγενή ανοσία, προβλήματα στον ανασυνδυασμό V(D)J αλυσίδων στα Β και Τ λεμφοκύτταρα και απουσία της αλυσίδας γάμα του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 2. Υπάρχουν δύο τρόποι που μπορεί να γίνει η τοποθέτηση ενός ξένου μοσχεύματος (Shultz, Ishikawa et al. 2007). Ο πρώτος αφορά την τοποθέτηση του μεταξύ της δερμίδας και του υποκείμενου ιστού στην πλάτη ή στα πλευρά του ζώου (ετεροτοπικό ξενομόσχευμα) και θεωρείται ένας τρόπος γρήγορος, με χαμηλό κόστος και εύκολη ανίχνευση της εξέλιξης του όγκου για την εκτίμηση αντικαρκινικών φαρμάκων (Garrido-Laguna, Uson et al. 2011). Ο άλλος τρόπος αφορά την τοποθέτηση του όγκου στο αντίστοιχο όργανο του ζώου (ορθοτοπικό ξενομόσχευμα) και εμφανίζει το πλεονέκτημα ότι το περιβάλλον μιμείται καλύτερα εκείνο του ασθενούς. Παρόλο που από τεχνικής άποψης πρόκειται για πιο απαιτητική διαδικασία, παρουσιάζει επίσης τη δυνατότητα να ελεγχθεί η απόδοση μιας θεραπείας και το πώς αυτή εξαρτάται από το εκάστοτε όργανο. Τα μοντέλα αυτά έχουν συμβάλει στην μελέτη της έκφρασης γονιδίων κατά τη διήθηση και μετάσταση (Hoffman 1999). Ένα σημαντικό πλεονέκτημα χρήσης ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια είναι ότι φέρουν τα γενετικά και επιγενετικά χαρακτηριστικά του κάθε ασθενούς, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη εξατομικευμένης θεραπείας. Ωστόσο, και οι δύο αυτοί τύποι αποτυγχάνουν να προσομοιώσουν πλήρως ένα πολύ σημαντικό κομμάτι της βιολογίας του καρκίνου όπως θα αναφερθεί και παρακάτω, το μικροπεριβάλλον του όγκου. Μικροπεριβάλλον του όγκου Χαρακτηριστικό του παγκρεατικού όγκου αποτελεί η έντονη παρουσία του στρώματος. Σε αρκετές περιπτώσεις τα συστατικά του στρώματος είναι περισσότερα σε αριθμό από τα καρκινικά κύτταρα. Πρόκειται για ένα δυναμικό περιβάλλον, που 21

23 μεταβάλλεται συνεχώς και παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια. Εμφανίζεται από το στάδιο των PanΙΝ και παρουσιάζει διαφορετικές μορφές μέχρι το στάδιο του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Το στρώμα θωρείται αρκετά σημαντικό κομμάτι του όγκου, το οποίο αλληλεπιδρά με τα καρκινικά κύτταρα και συμβάλει σε αρκετές λειτουργίες. Επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό του όγκου, την επιβίωση, την απόπτωση, τη μετάσταση και την αντίσταση σε φάρμακα. Αποτελείται από αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, όπως ινοβλάστες, μυοϊνοβλάστες, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ενδοθηλιακά και λιπώδη κύτταρα. Επιπλέον, έντονη είναι η παρουσία ακυτταρικών συστατικών, όπως συστατικών της εξωκυττάριας ύλης, κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων. Σε μοριακό επίπεδο, η δημιουργία του στρώματος επηρεάζεται από αρκετά σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Μεταξύ αυτών είναι το TGFβ, IGF-1 και EGF. Η ενεργοποίηση αυτών των μονοπατιών οδηγεί αφ ενός σε έκκριση συστατικών της εξωκυττάριας ύλης και αφ ετέρου σε ενεργοποίηση ενζύμων όπως οι πρωτεϊνάσες. Για παράδειγμα, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι μια οικογένεια πρωτεολυτικών ενζύμων που συμμετέχουν στην αποδόμηση της εξωκυττάριας ύλης. Στον παγκρεατικό καρκίνο, έχουν βρεθεί να υπερεκφράζονται οι MMP2 και MMP9, γεγονός το οποίο σχετίζεται με τη μετανάστευση των κυττάρων. Η εύρεση των συστατικών του μικροπεριβάλλοντος καθώς και των μεταξύ τους σχέσεων του όγκου είναι πολύ σημαντική για την εύρεση νέων διαγνωστικών και θεραπευτικών στόχων. Επίσης, η χρήση ζωικών μοντέλων των οποίων οι ιστολογικές εικόνες μοιάζουν με αυτές των ασθενών και συμπεριλαμβάνουν την παρουσία στρώματος είναι απαραίτητη για τη διεξαγωγή ασφαλέστερων συμπερασμάτων. Παράλληλα κατά την ερμηνεία αποτελεσμάτων είναι σημαντικός ο διαχωρισμός των μοντέλων σε αυτά που προέρχονται με τη χρήση της γενετικής μηχανικής και σε αυτά που στηρίζονται σε χρήση μοσχευμάτων, διότι υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στα συστατικά του μικροπεριβάλλοντος καθώς και στη λειτουργικότητά τους. 22

24 Ινοβλάστες του στρώματος- Pancreatic stellate cells Τα παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (Pancreatic Stellate Cells- PaSCs) εντοπίστηκαν στον ιστό το 1998 από δύο εργαστήρια (Apte MV et al., 1998; Bachem MG et al., 1998). Πρόκειται για κύτταρα που εμφανίζουν αστεροειδή μορφολογία, είναι πλούσια σε βιταμίνη Α και εμφανίζουν συγκεκριμένους δείκτες στην επιφάνεια τους. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, είναι ανενεργά, κάτω όμως από συγκεκριμένες συνθήκες ενεργοποιούνται, υφίστανται μορφολογικές αλλαγές, εκφράζουν a-sma (asmooth muscle actin), και εκκρίνουν συστατικά της εξωκυττάριας ύλης. Τα PaSCs έχουν συσχετιστεί με την παγκρεατική ίνωση. Συνήθως ενεργοποιούνται μετά από καταστροφή των κυττάρων του ιστού και απελευθέρωση κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων από κύτταρα φλεγμονής ή καρκινικά κύτταρα (Erkan, Adler et al. 2012). Για τη μελέτη της λειτουργίας τους, δημιουργήθηκαν αρκετές αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές, ώστε να διερευνηθεί η σχέση των PaSCs με παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Πειράματα με συγκαλλιέργεια PaSCs και κυττάρων παγκρεατικού καρκίνου έδειξαν αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Σε in vivo μοντέλα ένεση καρκινικών κυττάρων σε συνδυασμό με PaSCs οδήγησε σε αυξημένο μέγεθος όγκου και υψηλότερη ικανότητα μετάστασης. Για αυτό το λόγο, τα PaSCs θα μπορούσαν να αποτελέσουν χρήσιμους θεραπευτικούς στόχους. Προκειμένου τα PaSCs να διατηρηθούν στην ενεργή τους μορφή και να εκκρίνουν κολλαγόνο, απαιτούνται διάφορα σηματοδοτικά μόρια, όπως το TGF-β1, τα οποία μπορούν να προέρχονται από καρκινικά κύτταρα ή κύτταρα του ανοσοποιητικού (Bachem, Schunemann et al. 2005). 23

25 Εικόνα 3: Αλληλεπιδράσεις των παγκρεατικών αστεροειδών κυττάρων (PaSCs) με το μικροπεριβάλλον του όγκου και τα καρκινικά κύτταρα. Σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των PaSCs ώστε να εκκρίνουν πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης έχει το μονοπάτι του TGF-β (Kleeff, Beckhove et al. 2007). Εξωκυττάρια ύλη στο PDA To παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα στον άνθρωπο όπως προαναφέρθηκε, χαρακτηρίζεται από έντονη δεσμοπλασία, δηλαδή παρουσία συστατικών της εξωκυττάριας ύλης, όπως κολλαγόνο, φιμπρονεκτίνη, λαμινίνη, πρωτεογλυκάνες καθώς και ενζύμων, όπως μεταλλοπρωτεϊνάσες. H εξωκυττάρια ύλη μπορεί να επηρεάζει την αύξηση, τη διαφοροποίηση και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων. Μέσω αλληλεπίδρασης με τα κύτταρα του όγκου, μπορούν να μεταβάλουν διαδικασίες όπως η αγγειογένεση, η προσκόλληση στο υπόστρωμα και η απόκριση του ανοσοποιητικού (Korc 1998; Bachem, Schunemann et al. 2005). Σε ανθρώπινα δείγματα πολλές φορές τα σημεία του ιστού που διατηρούν τη φυσιολογική τους αρχιτεκτονική είναι λίγα. Η έντονη παρουσία της εξωκυττάριας ύλης, έχει θεωρηθεί ότι μπορεί να συμβάλει στη δημιουργία ενός άκαμπτου περιβάλλοντος, το οποίο δυσκολεύει την παράδοση φαρμακευτικών ουσιών στα καρκινικά κύτταρα (Neesse, Michl et al. 2011). Για το σκοπό αυτό έχουν αναφερθεί κάποιες μελέτες, οι οποίες συνδυάζουν τη χορήγηση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, μαζί με ουσίες που επηρεάζουν την παρουσία στρώματος στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Μια από αυτές περιγράφει τη συγχορήγηση Gemcitabine (γεμσιταβίνης), παράλληλα με την αναστολή του μονοπατιού Sonic Hedgehog, το οποίο είχε φανεί ότι συμβάλει στη δημιουργία 24

26 δεσμοπλασίας (Bailey, Swanson et al. 2008). Το αποτέλεσμα έδειξε μείωση του στρώματος, μεγαλύτερη συγκέντρωση ενός μεταβολίτη του Gemcitabine στον όγκο και αυξημένη επιβίωση (Olive, Jacobetz et al. 2009). Άλλη μια προσέγγιση που ακολουθήθηκε όσον αφορά το στρώμα, ήταν ο συνδυασμός Abraxane (πακλιταξέλης με αλβουμίνη), η οποία στοχεύει τους ινοβλάστες που εκφράζουν την πρωτεΐνη SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine). Ο συνδυασμός με Gemcitabine οδήγησε σε αυξημένη επιβίωση σε κλινική δοκιμή σε όσους ασθενείς εμφάνιζαν υψηλή έκφραση SPARC (Von Hoff, Ramanathan et al. 2011). Ωστόσο, όπως θα αναφερθεί στη συζήτηση τα αποτελέσματα από μελέτες που επιδρούν στο στρώμα του όγκου δεν είναι πάντα ενθαρρυντικά. Εξ αιτίας των θετικών αποτελεσμάτων που παρατηρούνται από τη χρήση ουσιών που μεταβάλουν το στρώμα σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, είναι αρκετά σημαντικό να γίνουν περισσότερες προσπάθειες εύρεσης νέων ουσιών και σε γενετικά τροποποιημένα ζωικά μοντέλα που προσομοιάζουν την αντίδραση της δεσμοπλασίας. Ενδοθηλιακά κύτταρα Αρκετοί συμπαγείς όγκοι χαρακτηρίζονται από χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου. Αυτό οφείλεται στο ότι το αγγειακό σύστημα που δημιουργείται χαρακτηρίζεται από ατέλειες και δεν μπορεί να καλύψει επαρκώς τις αυξημένες μεταβολικές ανάγκες του όγκου (Brown and Wilson 2004). Η έντονη δεσμοπλασία που παρατηρείται στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, επηρεάζει και το αγγειακό σύστημα του όγκου. Η μη φυσιολογική αγγείωση που παρατηρείται, θεωρείται ότι επηρεάζει και την παράδοση θεραπευτικών μορίων στο στόχο. Συγκεκριμένα, οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες δεν είναι δυνατό να έρθουν σε επαφή με όλα τα καρκινικά κύτταρα, μέσω των αγγείων και να τα εξουδετερώσουν. Παρόλο που στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα φαίνεται να εκφράζονται μέλη του VEGF μονοπατιού τόσο στα κύτταρα του όγκου όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, η πυκνότητα μικρών αγγείων είναι μικρότερη σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας (Itakura, Ishiwata et al. 2000). Προκειμένου να αποσαφηνιστεί το αν η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν θεραπευτική προσέγγιση, σε μια κλινική δοκιμή δόθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF σε συνδυασμό με Gemcitabine. Σε 25

27 άλλη προσέγγιση χορηγήθηκε αναστολέας του VEGF υποδοχέα μαζί με Gemcitabine. Η συνολική επιβίωση των ασθενών δεν αυξήθηκε ιδιαίτερα, αποδεικνύοντας ότι μέχρι τώρα οι αντιαγγειογενετικές θεραπείες δεν προσφέρουν ιδιαίτερο πλεονέκτημα στην αντιμετώπιση του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος (Kindler, Niedzwiecki et al. 2010; Kindler, Ioka et al. 2011). Σύμφωνα με μελέτες, τα κύτταρα του όγκου που βρίσκονται σε υποξικές συνθήκες είναι δυνατό να διαθέτουν μεγαλύτερη ικανότητα διήθησης και μετάστασης, οδηγώντας σε πιο επιθετική μορφή της ασθένειας (Le, Denko et al. 2004). Ένας τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνεται αυτό, είναι μέσω ενεργοποίησης εναλλακτικών σηματοδοτικών μονοπατιών. Ένα από αυτά είναι και το HIF (Hypoxia Inducible Factor), το οποίο μπορεί να επηρεάσει μια πληθώρα λειτουργιών όπως ο μεταβολισμός, η επιβίωση και η μετανάστευση (Brahimi-Horn and Pouyssegur 2009). Το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα φαίνεται να χαρακτηρίζεται από υποξία σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό και μάλιστα ορθοτοπικά μοντέλα που παρουσίαζαν υποξία στον όγκο, είχαν πιο μεταστατικό φαινότυπο (Koong, Mehta et al. 2000; Chang, Jurisica et al. 2011). Το γεγονός ότι μέσα στον όγκο εντοπίζονται κύτταρα που μπορούν να επιβιώσουν σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου και εμφανίζουν αντίσταση σε φαρμακευτικούς παράγοντες, δημιουργεί το ερώτημα αν αυτά ακριβώς είναι εκείνα που πρέπει να αποτελέσουν προτεραιότητα της έρευνας. Ενδοκρινικά κύτταρα Η ενδοκρινική μοίρα του παγκρέατος μπορεί να επηρεάσει και αυτή την πορεία του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Οι αλληλεπιδράσεις των εξωκρινών και ενδοκρινών κυττάρων μπορούν να συμβάλουν στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, έχει φανεί ότι η ινσουλίνη μπορεί να επάγει την έκφραση του μεταφορέα γλυκόζης GLUT1, οδηγώντας σε αύξηση των καρκινικών κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν υποδοχείς IGF1, παρουσίαζαν πλεονέκτημα σε σχέση με τα άλλα (Fisher, Boros et al. 1996). Υπάρχουν ακόμη ενδείξεις ότι η καταστροφή των β- κυττάρων, προστατεύει από την ανάπτυξη παγκρεατικού καρκίνου σε πειραματόζωα με χρήση BOP (N-nitrosobis 2-oxopropyl amine) (Fienhold, Kazakoff et al. 1997). Παράλληλα, στατιστικές μελέτες δείχνουν 26

28 συσχέτιση μεταξύ ενδοκρινικών διαταραχών και ανάπτυξης PDA. Για παράδειγμα, η παχυσαρκία θεωρείται ένας παράγοντας κινδύνου. Η μελέτη της συμβολής του μεταβολισμού στην καρκινογένεση, πρόκειται για ένα σχετικά νέο τομέα που φαίνεται να αποτελεί βασικό σημείο της βιολογίας των καρκινικών κυττάρων. Κύτταρα του ανοσοποιητικού Στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, η παρουσία των κυττάρων του ανοσοποιητικού, είναι εμφανής ακόμη και σε ιστολογικές εικόνες. Από τις πρώτες μελέτες που έγιναν στον κλάδο, ήταν το 2007 σε μοντέλο παγκρεατικού καρκίνου. Αναλύοντας το ανοσολογικό προφίλ σε φυσιολογικό ιστό, σε PanIΝ και σε PDA, φάνηκε σταδιακή αύξηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού, φτάνοντας σε ποσοστό μέχρι και περίπου 50% των κυττάρων στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Ωστόσο, τα T λεμφοκύτταρα και ειδικά τα CD8+ κύτταρα είναι ελάχιστα στον ιστό. Μάλιστα, σε αυτή τη μελέτη, ένας τύπος κυττάρων τα κατασταλτικά κύτταρα μυελοειδούς προέλευσης (Myeloid Derived Suppressor Cells- MDSC) αυξάνονται από νωρίς και καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των T κυττάρων (Clark, Hingorani et al. 2007). Ένας άλλος πληθυσμός που έχει μελετηθεί στον παγκρεατικό καρκίνο, είναι τα CD4+CD25+FOXP3+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα. Εξάλειψη αυτού του πληθυσμού σε ποντίκια που φέρουν παγκρεατικό καρκίνο, οδηγεί σε μια ειδική ανοσολογική απόκριση κατά του όγκου (Baecher-Allan and Hafler 2005; Ikemoto, Yamaguchi et al. 2006; Viehl, Moore et al. 2006). Οι υπόλοιποι πληθυσμοί δεν είναι το ίδιο καλά μελετημένοι. Για παράδειγμα ο πληθυσμός των Th17 CD4+ κυττάρων, ο οποίος αυξάνεται μετά από παραγωγή TGFβ/IL-6, μπορεί να οδηγεί σε απόκριση κατά του όγκου, ειδικά όταν ταυτόχρονα γίνεται και εξάλειψη των ρυθμιστικών T- κυττάρων (Yamamoto, Kamigaki et al. 2009). Ωστόσο, δεν είναι ακόμη τελείως ξεκάθαρο αν τα Th17 κύτταρα ενισχύουν ή εμποδίζουν την ανάπτυξη του όγκου (Wilke, Kryczek et al. 2011). Επιπλέον, τα μακροφάγα αποτελούν έναν πληθυσμό που βρίσκεται σε μεγαλύτερο ποσοστό στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Δεν είναι ακόμη ξεκαθαρισμένο το αν ο ρόλος τους στον όγκο προωθεί την αύξησή τους ή την καταστέλλει. Η παρουσία των M2 μακροφάγων, έχει συσχετιστεί με χειρότερη 27

29 πρόγνωση (Kurahara, Shinchi et al. 2011). Αρκετά επικρατής σήμερα είναι η άποψη ότι τα μακροφάγα σε χαμηλότερους αριθμούς μπορεί να έχουν κατασταλτική επίδραση στον όγκο. Ωστόσο, όταν υπάρχουν μεγαλύτεροι αριθμοί μακροφάγων και αλληλεπίδραση με κύτταρα του όγκου, εκκρίνονται κυτταροκίνες όπως ο TNF-a, γεγονός το οποίο μπορεί να προωθεί ένα φαινότυπο που ευνοεί την ανάπτυξη του όγκου (Mytar, Baj-Krzyworzeka et al. 2008; Baran, Bechyne et al. 2009). Ακόμη λιγότερα είναι γνωστά για το ρόλο των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων, των φυσικών φονικών κυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων. Συγκεκριμένα, τα φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ) διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με το αν εκφράζουν σε μεγάλο βαθμό ή όχι το δείκτη CD56. Τα φυσικά φονικά κύτταρα, που εκφράζουν τον δείκτη σε μικρότερο βαθμό είναι πιθανότερο να διαθέτουν κυτταροτοξικές ικανότητες έναντι των καρκινικών κυττάρων. Η παρουσία των ΝΚ κυττάρων σε υψηλό ποσοστό στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, οδηγεί σε καλύτερη πρόγνωση (Degrate, Nobili et al. 2009; Sutlu and Alici 2009). Τα δενδριτικά κύτταρα είναι σπάνια στον όγκο, αλλά υψηλότερος αριθμός σχετίζεται με καλύτερη επιβίωση. Ωστόσο, υποστηρίζεται ότι εξ αιτίας της φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλείται και από τον ίδιο τον όγκο, τα δενδριτικά κύτταρα που προκύπτουν μπορεί να είναι ανώριμα, γεγονός το οποίο επηρεάζει την κλινική εικόνα των ασθενών (Tjomsland, Spangeus et al. 2010; Yamamoto, Yanagimoto et al. 2012). Όσον αφορά τη συμβολή των ουδετερόφιλων, μία μελέτη υποστηρίζει ότι συμμετέχουν τόσο στη μετανάστευση κυττάρων εκκρίνοντας μεταλλοπρωτεϊνάση τύπου 9 (MMP9), όσο και στην αγγειογένεση (Bausch, Pausch et al. 2011). 28

30 Εικόνα 4: Κυτταρικοί πληθυσμοί του μικροπεριβάλλοντος του όγκου. Ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού. Χαρακτηριστικά των κυττάρων του ανοσοποιητικού που σχετίζονται με κατασταλτικούς μηχανισμούς. Έκκριση κυτταροκινών όπως η IL-10, ελαττωματική ενεργοποίηση των Τ- κυτταροτοξικών κυττάρων, παρουσία MDSC κυττάρων, επικράτηση του τύπου M2 μακροφάγων, ανώριμα δενδριτικά κύτταρα. Ακόμη, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν κυτταροκίνες που καταστέλλουν το ανοσοποιητικό και χάνουν την έκφραση μορίων MHC τάξης Ι και αντιγόνων (Kerkar and Restifo 2012). Mηχανισμοί καταστολής της ανοσολογικής απόκρισης στο PDA Παρόλο που το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να εμφανίζεται ενεργοποιημένο κατά την καρκινογέννεση, όπως προκύπτει αποτυγχάνει να εξουδετερώσει τον όγκο. Το γεγονός αυτό, ενδέχεται να είναι αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κυττάρων του όγκου και του ανοσοποιητικού και φαίνεται να οδηγεί στην αποφυγή της ανοσολογικής απόκρισης και στην επιβίωση των 29

31 καρκινικών κυττάρων. Οι πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους επιτυγχάνεται αυτό, περιλαμβάνουν την έκφραση αντιγόνων που δεν αναγνωρίζονται ως ξένα, την έκκριση κυτταροκινών από κύτταρα του όγκου που καταστέλλουν κύτταρα του ανοσοποιητικού, καθώς και αντίστροφα την παραγωγή από στοιχεία του ανοσοποιητικού ουσιών που μπορεί να προωθούν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Αρκετοί διαφορετικοί μηχανισμοί μπορεί να συνδυάζονται μεταξύ τους και είναι πιθανό να υπάρχουν και επιπλέον μηχανισμοί που δεν έχουν ακόμη εκτιμηθεί. Για παράδειγμα, τα καρκινικά κύτταρα όπως αναφέρθηκε διαθέτουν την ικανότητα να αποφεύγουν την απόπτωση, αλλά και να την προκαλούν σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (Samm, Werner et al. 2010). Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές ενώ εκφράζουν το Fas υποδοχέα, παρουσιάζουν αντίσταση στην απόπτωση που μεσολαβείται από πρόσδεση του Fas. Από την άλλη πλευρά, αρκετές καρκινικές σειρές εκφράζουν λειτουργικό προσδέτη FasL, επιτρέποντας στα καρκινικά κύτταρα να προκαλέσουν απόπτωση σε T κύτταρα (von Bernstorff, Spanjaard et al. 1999). Επιπλέον, άλλος ένας τρόπος με τον οποίο ο όγκος επιτυγχάνει να οδηγήσει λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στον ιστό σε απόπτωση, είναι μέσω έκφρασης του TRAIL σε καρκινικά κύτταρα. Παρόλο που υπάρχει διαβάθμιση στην έκφραση του όπως φαίνεται από κυτταρικές σειρές, όταν αλληλεπιδρά με λεμφοκύτταρα που εκφράζουν υποδοχείς του TRAIL, τότε το αποτέλεσμα είναι ο κυτταρικός θάνατος για τα τελευταία (Scaffidi, Kirchhoff et al. 1999; Ibrahim, Ringel et al. 2001). Τα καρκινικά κύτταρα στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα διαθέτουν την ικανότητα να μειώνουν την έκφραση του HLA τάξης Ι, που έχει μεγάλο ρόλο στην εξάλειψη από τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα. Με αυτόν τον τρόπο, τα αντιγόνα δεν παρουσιάζονται πια στα κύτταρα του ανοσοποιητικού, με αποτέλεσμα να μη γίνεται ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων (Pandha, Rigg et al. 2007). Ακόμη, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις στις οποίες τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν μόρια που μπορεί να καταστέλλουν την ενεργοποίηση αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων ή λεμφοκυττάρων. Ένα τέτοιο παράδειγμα στον παγκρεατικό καρκίνο αποτελεί η υψηλή έκφραση του PD-L1 σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός το οποίο σχετίζεται με άσχημη πρόγνωση. Χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι των PDL1 σε in vivo μοντέλο ποντικού που εμποδίζουν την ενεργοποίηση μονοπατιών 30

32 PD1, αυξάνεται η διήθηση από CD8+ T κύτταρα στο σημείο του όγκου. Μάλιστα η συγχορήγηση με gemcitabine έδειξε συνεργιστικό φαινόμενο, δείχνοντας την πιθανότητα για θεραπεία που στοχεύει το μονοπάτι PD-L/PD1 (Nomi, Sho et al. 2007). Ακόμη, σύμφωνα με μια σημαντική πρόσφατη δημοσίευση του 2016, φάνηκε ότι ένας τύπος Τ λεμφοκυττάρων που χαρακτηρίζεται ως γδ+, φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στο ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Συγκεκριμένα, ο πληθυσμός αυτός φάνηκε να συμμετέχει στην καταστολή της ενεργοποίησης των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων, προωθώντας την ογκογένεση, υποδεικνύοντας άλλον ένα μηχανισμό καταστολής του ανοσοποιητικού συστήματος. 31

33 ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν αρχικά, η μελέτη της συνεισφοράς του ανοσοποιητικού συστήματος στην εξέλιξη του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος στο μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η αντίδραση δεσμοπλασίας, καθώς και το αν αυτή συμβαίνει σε αρχικό στάδιο της ασθένειας ή σε προχωρημένο. Τελικός στόχος ήταν η αναζήτηση νέων προσεγγίσεων που θα μπορούσαν σε συνδυασμό με τις ήδη υπάρχουσες (χημειοθεραπείες, χρήση αναστολέων διαφόρων μορίων), να οδηγήσουν σε καταπολέμηση του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. 32

34 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Τα πειραματόζωα στεγάστηκαν στη Μονάδα Ζωϊκών Προτύπων του Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ) υπό στείρες συνθήκες. Η θερμοκρασία του περιβάλλοντος διατηρούταν σταθερή και η πρόσβαση σε νερό και τροφή ήταν ελεύθερη. Η εναλλαγή ημέρας και νύχτας γινόταν κάθε 12 ώρες. Ακολουθήθηκε η ευρωπαϊκή οδηγία χρήσης πειραματοζώων για ερευνητικούς σκοπούς. Για τη διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα διαγονιδιακά ποντίκια PDX-1-CRE/KRAS*A. Τα ζώα αυτά προήλθαν από διασταύρωση στελεχών PDX-1- CRE με KRAS*A. Τα ποντίκια PDX-1-CRE ξεκινούν να εκφράζουν στο πάγκρεας την Ε8,5 το ένζυμο Cre. Το ένζυμο αυτό είναι μια ρεκομπινάση που προέρχεται από το βακτηριοφάγο P1. Αναγνωρίζει συγκεκριμένες αλληλουχίες μήκους 34 bp στο DNA που ονομάζονται loxp. Οι αλληλουχίες αυτές περιέχουν ειδικές θέσεις πρόσδεσης για το ένζυμο, το οποίο τέμνει το δίκλωνο DNA στις θέσεις αυτές και στη συνέχεια οι αλυσίδες του ενώνονται. Με αυτόν τον τρόπο μπορεί να πραγματοποιηθεί ανασυνδυασμός του DNA σε επιλεγμένα σημεία εισάγοντας τις loxp στις κατάλληλες θέσεις. Ανάλογα με τον προσανατολισμό των loxp αλληλουχιών η ενδιάμεσή τους αλληλουχία μπορεί να απαλείφεται ή να αλλάζει προσανατολισμό. Με αυτόν τον τρόπο μέσω του ενζύμου cre ελέγχεται χωρικά η έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Στο μοντέλο KRAS*A οι loxp αλληλουχίες πλαισιώνουν την αλληλουχία αντίστασης στη νεομυκίνη η οποία ακολουθείται από μια περιοχή πολυαδενυλίωσης (poly A). Μετά από επίδραση της Cre, η αλληλουχία αυτή αφαιρείται επιτρέποντας την έκφραση του KRAS*. Απομόνωση DNA Για την απομόνωση DNA, εφαρμόστηκε η μέθοδος HOTSHOT από τον Truett et al., από την οποία προκύπτει DNA που είναι κατάλληλο για αντίδραση PCR. Το DNA που απομονώθηκε χρησιμοποιήθηκε για τη γονοτύπηση ποντικών. 33

35 Διαλύματα Alkaline lysis reagent: NaOH 25 mm EDTA 0,2 mm ph= 12 διατήρηση σε θερμοκρασία δωματίου Neutralization reagent: Tris-HCl 40 mμ ph= 5 διατήρηση σε θερμοκρασία δωματίου Πορεία Τμήμα ουράς 1-2 mm επωάζεται σε 75μL alkaline lysis reagent στους 95 για 90 λεπτά Προσθήκη 75μL neutralization buffer, ανάδευση Διατήρηση στους 4 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιείται συνήθως για την αύξηση της ποσότητας DNA μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας, η οποία βρίσκεται ανάμεσα σε δύο περιοχές γνωστής αλληλουχίας. Για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση, ως εναρκτήρια μόρια (εκκινητές- primers) χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτίδια για μία σειρά από συνθετικές αντιδράσεις, οι οποίες καταλύονται από μία DNA πολυμεράση που έχει απομονωθεί από ένα θερμόφιλο βακτήριο και παρουσιάζει ανθεκτικότητα σε πολύ ψηλές θερμοκρασίες, την Taq πολυμεράση (Tagpolymerase). Έτσι, επιτυγχάνεται η de novo σύνθεση μιας περιοχής του DNA ανοδικά και καθοδικά των δύο εκκινητών. 34

36 Το κάθε ολιγονουκλεοτίδιο-εκκινητής είναι συμπληρωματικό (i) με μία από τις δύο διαφορετικές αλυσίδες της μήτρας DNA και (ii) με τη γειτονική αλληλουχία του προς αύξηση τμήματος DNA. Αρχικά, μέσω θέρμανσης σε υψηλή θερμοκρασία (περίπου 95, πραγματοποιείται αποδιάταξη της μήτρας DNA, και οι δύο αλυσίδες αποχωρίζονται. Έπειτα, το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται σε θερμοκρασία (περίπου 60 που επιτρέπει την υβριδοποίηση των εκκινητών με τις συμπληρωματικές αλυσίδες στο DNA, και τέλος, πραγματοποιείται επιμήκυνση των αναδιαταγμένων εναρκτήριων μορίων με την DNA πολυμεράση σε μια υψηλή θερμοκρασία (περίπου 72. Ο κύκλος της αποδιάταξης, υβριδοποίησης και επιμήκυνσης επαναλαμβάνεται πολλές φορές (25-35 κύκλοι) και τα προϊόντα κάθε κύκλου χρησιμοποιούνται ως μήτρα DNA στους επόμενους κύκλους. Το διάλυμα της αντίδρασης στο τέλος n κύκλων είναι δυνατόν να περιέχει θεωρητικά 2 n μόρια DNA, τα οποία είναι αντίγραφα της αλληλουχίας DNA που βρίσκεται ανάμεσα στα εναρκτήρια μόρια. Συγκεκριμένα, οι αντιδράσεις PCR που έγιναν, περιελάμβαναν τα εξής στάδια: 1. Aποδιάταξη του DNA με θέρμανση στους Yβριδισμός των εκκινητών στο DNA στους 56 ή επιμήκυνση του DNA από την Taq πολυμεράση στους 72 Συνήθως, μετά από 31 κύκλους της διαδικασίας, προέκυπταν 100 ng 1 μg DNA (της συγκεκριμένης ακολουθίας) ξεκινώντας από 50 ng DNA. Η αποτελεσματικότητα μίας αντίδρασης PCR υπολογίζεται από την εξειδίκευση, με την οποία πραγματοποιείται η αύξηση των μορίων του DNA. Μία αντίδραση PCR υψηλής εξειδίκευσης ενισχύει μόνο το προϊόν στόχο που προσδιορίζεται από τους εκκινητές που έχουν επιλεχθεί. Μία αντίδραση υψηλής απόδοσης οδηγεί σε υψηλό ποσό προϊόντος μετά από λίγους κύκλους. Για να παραγματοποιηθεί μια αντίδραση PCR σημαντικοί είναι και οι παράμετροι της συγκέντρωσης Mg +2 και ρυθμιστικού διαλύματος. Επίσης καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη της αντίδρασης έχει η επιλογή των κατάλληλων θερμοκρασιών καθώς και η επιλογή της πολυμεράσης. Πίνακας 1: Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη γονοτύπηση των ζώων Όνομα Αλληλουχία εκκινητή Προϊόν Γονότυπος 35

37 εκκινητή IRES F 5 -TGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCG bp KRAS* Neo R 5 -CCATCTTGTTAATGGCCGATCCCAT-3 Cre F 5 -AAAATTTGCCTGCATTACCG bp CRE Cre R 5 -ATGTTTAGCTGGCCCAAATG-3 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Η μέθοδος αυτή αποτελεί μία κλασική τεχνική για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση του μεγέθους μορίων DNA και RNA. Μόρια DNA μεγέθους 0,05-20 kb μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με το μοριακό τους βάρος σε 0,7-2% κ.ό. οριζόντια πηκτώματα αγαρόζης. Η περιεκτικότητα του πηκτώματος σε αγαρόζη είναι αντιστρόφως ανάλογη των μοριακών βαρών των μορίων DNA που πρόκειται να διαχωριστούν. Το πήκτωμα περιέχει την επιθυμητή ποσότητα αγαρόζης, 1 TBE και βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) σε συγκέντρωση 0,5 μg/ml. Για την παρασκευή του πηκτώματος, η αγαρόζη διαλύεται σε dd H2O με βρασμό για 1-2 λεπτά. Το EtBr προστίθεται μόλις η θερμοκρασία πέσει κάτω από τους 60. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε διάλυμα 1 TBE το οποίο περιέχει 0,5 μg/ml EtBr. Το EtBr ενσωματώνεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA και το σύμπλοκο αυτό γίνεται ορατό όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία. Τέλος, στα δείγματα προστίθεται ποσότητα ίση με το 1/10 του όγκου τους από ειδικό διάλυμα (σακχαρόζη 40%, μπλε της βρωμοφαινόλης 0,25%) για την τοποθέτησή τους στο πήκτωμα. Η υψηλή συγκέντρωση σακχαρόζης εξασφαλίζει την παραμονή του δείγματος στην ειδική υποδοχή του πηκτώματος και η χρωστική χρησιμεύει ως δείκτης μετανάστευσης, γιατί κάθε χρωστική μεταναστεύει με ορισμένη ταχύτητα που εξαρτάται από την περιεκτικότητα του πηκτώματος σε αγαρόζη. Η τοποθέτηση των δειγμάτων γίνεται στον αρνητικό πόλο, ώστε να μεταναστεύσουν με την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου προς τον θετικό πόλο, επειδή τα νουκλεϊκά οξέα λόγω των φωσφορικών ομάδων είναι φορτισμένα αρνητικά. Η μέγιστη τιμή της έντασης του ρεύματος που εφαρμόζεται είναι 120 ma, ώστε να μην υπερθερμανθεί το πήκτωμα. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία 36

38 μήκους κύματος 302 nm, όπου τα μόρια DNA εμφανίζονται ως διακριτές ζώνες λόγω της ενσωμάτωσης του φθορίζοντος EtBr. Κυτταρομετρία Ροής Η κυτταρομετρία ροής είναι μία τεχνική για τη μέτρηση και τον χαρακτηρισμό μικροσκοπικών σωματιδίων σε ρέον υγρό. Μία δέσμη φωτός (συνήθως δέσμη λέιζερ) ενός μεμονωμένου μήκους κύματος κατευθύνεται διαμέσου μιας υδροδυναμικά συγκλίνουσας ροής υγρού. Ένας αριθμός ανιχνευτών περιβάλλουν το σημείο όπου η δέσμη του φωτός διαπερνάει τη ροή του υγρού: ένας σε ευθύγραμμη θέση με τη δέσμη φωτός, κάποιοι άλλοι κάθετοι σε αυτήν και ένας ή περισσότεροι ανιχνευτές φθορισμού. Κάθε σωματίδιο μεταξύ 0.2 και 150 μικρομέτρων αιωρούμενο στο υγρό που περνά διαμέσου της δέσμης, σκεδάζει το φως προς κάποια κατεύθυνση και παράλληλα τα φθορίζοντα χημικά που βρίσκονται στο σωματίδιο ή επί της επιφάνειάς του μπορούν να διεγερθούν και να εκπέμψουν φως άλλου μήκους κύματος από αυτό της πηγής. Αυτός ο συνδυασμός σκεδασμένου και φθορίζοντος φωτός παραλαμβάνεται από τους ανιχνευτές και μετά από αναλύσεις είναι δυνατή η αποκόμιση πληροφοριών σχετικών με τη φυσική και χημική δομή κάθε μεμονωμένου σωματιδίου. Η εμπρόσθια σκέδαση FSC (Forward Scattering) σχετίζεται με τον όγκο του κυττάρου και η πλάγια σκέδαση SSC (Side Scattering) εξαρτάται από την εσωτερική πολυπλοκότητα του σωματιδίου (πχ σχήμα του πυρήνα, αριθμός κυτταροπλασματικών σωματιδίων ή αδρότητα κυτταρικής μεμβράνης). Έτσι, ένας κυτταρομετρητής ροής αποτελείται από τρία συστήματα: 1) σύστημα ροής, 2) οπτικό σύστημα και 3) ηλεκτρονικό σύστημα. Το δείγμα εγχέεται σε ένα αδρανές υγρό, το οποίο με υδροδυναμικές διαδικασίες ρυθμίζει την κίνηση των κυττάρων του ενός πίσω από το άλλο. Η διάμετρος του αυλού μειώνεται καθώς πλησιάζει προς το σημείο ανάλυσης. Στο σημείο ανάλυσης, σε καθένα κύτταρο προσπίπτει μια ακτίνα από μια πηγή laser. Το μήκος κύματος της ακτινοβολίας κυμαίνεται από 400nm-600nm. 37

39 Τα κύτταρα που θα εξεταστούν συνδέονται με μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο των κυττάρων. Επίσης, τα αντισώματα αυτά είναι συζευγμένα με φθορίζουσες ενώσεις. Κάθε φθορίζουσα χρωστική έχει δικό της φάσμα απορρόφησης, που καθορίζεται από τις επιτρεπόμενες στιβάδες, στις οποίες μπορούν να βρεθούν τα διεγερμένα ηλεκτρόνια. Η αποδιέγερση, επιτυγχάνεται μέσω αποβολής θερμότητας και εκπομπής φωτονίων (φθορισμού). Έτσι, η χρωστική που χρησιμοποιείται πρέπει να απορροφά στο μήκος κύματος που εκπέμπει η πηγή laser. Εκτός από το φθορισμό, ανιχνεύονται και άλλα οπτικά σήματα που προέρχονται από το σκεδασμό ακτίνων. Η σκέδαση, δημιουργείται από τη διάχυση της προσπίπουσας ακτίνας προς όλες τις κατευθύνσεις, μετά από σύγκρουσή της με το εξεταζόμενο κύτταρο. Το σκεδασμένο φως ανιχνεύεται υπό διαφορετικές γωνίες ανάλογα με τη διάταξη ειδικών ανιχνευτών (βολταϊκών φωτοδιόδων). Αν η φωτοδίοδος βρίσκεται μπροστά από το κύτταρο μετράται το οριζόντιο σκεδαζόμενο φως (FSC). Αν η φωτοδίοδος είναι κάθετη προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία τότε ανιχνεύεται η κάθετη σκέδαση του φωτός (SSC). Ακόμη, παρατηρείται και απορρόφηση του προσπίπτοντος φωτός. Μετά τη συλλογή των σημάτων από τους κατάλληλους ανιχνευτές, γίνεται μετατροπή του σήματος από αναλογικό σε ψηφιακό. Από το συνδυασμό πολλών διαφορετικών σημάτων φανερώνονται οι συχνότητες κάποιων παραμέτρων. Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για ανάλυση και διαλογή ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρων. Για παράδειγμα, μετά τη χρήση ακτίνας laser, μπορεί, μέσω της μέτρησης έντασης του φθορισμού, να υπολογιστεί ο αριθμός αντισωμάτων που συνδέονται με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, και κατ επέκταση και ο αριθμός των κυττάρων που διαθέτουν το συγκεκριμένο αντιγόνο. Ως αντιγόνα στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν δείκτες διαφόρων πληθυσμών του ανοσοποιητικού συστήματος (Cluster of Differentiation, CD). Διαλύματα: PBS PBS 10x 1,37 M NaCl (Sigma) 27 mm KCl (Mallinckrodt) 38

40 100 mm Na 2 HPO 4 (AppliChem) 20 mm KH 2 PO 4 (Fischer Scientific) Διάλυμα FACS: 1% Fetal Bovine Serum (FBS) 2 mm EDTA σε PBS Πορεία: Απομόνωση παγκρέατος από το ποντίκι και τεμαχισμός σε τμήματα περίπου 1mm σε θρεπτικό DMEM Προσθήκη ενζύμου κολλαγενάσης 1 mg/ml (CoLA, Sigma-Aldrich). Επώαση για 60 λεπτά στους 37 Το εναιώρημα περνάει από strainer κυττάρων 70 μm στο οποίο ασκείται πίεση με τη βοήθεια εμβόλου, προκειμένου να προκύψει εναιώρημα μονών κυττάρων Φυγοκέντρηση στα 300 g για 10 λεπτά στους 20 Ξέπλυμα με PBS Φυγοκέντρηση στα 300 g για 10 λεπτά στους 20 Προσθήκη FACS buffer 1 ml. Ανάδευση και μέτρηση κυττάρων με trypan blue και αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Επώαση με το κατάλληλο αντίσωμα σε 100 μl εναιωρήματος με 10 6 περίπου κύτταρα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι Ξέπλυμα με FACS διάλυμα 1 ml Φυγοκέντρηση σε 300 g για 10 λεπτά Επαναιώρηση σε 200 μl FACS διάλυμα και κυτταρομετρία ροής Πίνακας 2: Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην κυτταρομετρία ροής Αντιγόνο Κωδικός Εταιρεία Αραίωση MHC- FITC BD Biosciences 1:100 F4/80- PE BD Biosciences 1:100 CD11b- P C E Biosciences 1:100 CD11c- P C BD Biosciences 1:100 39

41 CD19- FITC BD Biosciences 1:100 CD8- FITC BD Biosciences 1:100 CD25- PE BD Biosciences 1:100 CD4- P C BD Biosciences 1:100 CD3- P C BD Biosciences 1:100 LY6G- PE BD Biosciences 1:100 LY6C- P C BD Biosciences 1:100 Ανοσοιστοχημεία Η ανοσοιστοχημεία, αναφέρεται ως η διαδικασία, κατά την οποία απεικονίζονται επιλεκτικά αντιγόνα σε μια τομή ιστού, χρησιμοποιώντας την ιδιότητα των αντισωμάτων να προσδένονται ειδικά σε αντιγόνα σε βιολογικούς ιστούς. Η αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύεται με ποικίλους τρόπους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ένα αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο την υπεροξειδάση, το οποίο μπορεί να καταλύσει μια αντίδραση που οδηγεί στην παραγωγή κάποιου χρώματος. Σε άλλες περιπτώσεις το αντίσωμα μπορεί να είναι συνδεδεμένο με ένα φθοριόχρωμα και να οδηγεί σε αντίδραση ανοσοφθορισμού. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα της υπεροξειδάσης η 3, 3 διαμινοβενζιδίνη (DAB), η οποία οξειδώνεται και δίνει χρώμα καφέ. Η επώαση έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες από το DAB substrate kit από την εταιρεία Vector Laboratories. Αρχικά, γίνεται απομόνωση του ιστού από το ζώο και τοποθετείται σε 10% φορμόλη 37-40% φορμαλδεΰδη (Formaldehyde, Fischer Scientific) O/N. Παραδίδεται στο εργαστήριο ιστοχημείας σε αιθανόλη 75%, έτσι ώστε να γίνει εμποτισμός σε παραφίνη. Από τον παραφινοποιημένο ιστό, προκύπτουν τομές πάχους 5μm. Διαλύματα: TBS- Tween: 20 mm Tris ph= 7,5 100 mm NaCl (Sigma) 40

42 0,1% Tween-20 (Fischer Scientific) Κιτρικό νάτριο: 10 mm ph= 6.0 Διάλυμα κάλυψης: 10% Ορός BSA TBS Πορεία: Αποπαραφινοποίηση ιστού: Επώαση των ιστών στους 60 για 15 λεπτά. Ξυλόλη 2x5 λεπτά Ενυδάτωση ιστού: Αιθανόλη 100% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 95% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 80% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 75% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 50% 2x3 λεπτά Ανάκτηση αντιγόνου: Με τη χρήση χύτρας σε διάλυμα κιτρικού νατρίου 10 mm ph= 6.0 Μετά από επαναφορά σε θερμοκρασία δωματίου, ξέπλυμα με TBS-Tween Παρεμπόδιση της ενδογενούς υπεροξειδάσης Επώαση σε διάλυμα Η 2 Ο 2 3% σε σκοτάδι για 15 λεπτά Ξέπλυμα με TBS-Tween Ανοσοχρώση Επώαση με ορό ίδιας προέλευσης με διάλυμα κάλυψης για παρεμπόδιση της μη ειδικής πρόσδεσης για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 41

43 Επώαση με το πρώτο αντίσωμα στους 4 Ο/Ν Ξέπλυμα με TBS-Tween 3x5 λεπτά Επώαση με δεύτερο αντίσωμα το οποίο είναι συζευγμένο με υπεροξειδάση Ξέπλυμα με TBS-Tween 3x5 λεπτά Επώαση με διάλυμα DAB, μέχρι να ανιχνευτεί καφέ χρώση Χρώση και αφυδάτωση του ιστού Επώαση σε διάλυμα αιματοξυλίνης για 30 δευτερόλεπτα Ξέπλυμα με dh 2 O 3x Αιθανόλη 50% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 75% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 80% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 95% 2x3 λεπτά Αιθανόλη 100% 2x3 λεπτά Ξυλόλη 2x3 λεπτά Εγκλεισμός με DPX και στέγνωμα Masson s trichrome Η τεχνική του Masson είναι ένα πρωτόκολλο τριών διαφορετικών χρώσεων που χρησιμοποιείται για να διαχωρίσει τα κύτταρα από το συνδετικό ιστό. Οι περισσότερες συνταγές που χρησιμοποιούνται οδηγούν σε κόκκινο κυτταρόπλασμα και μυϊκές ίνες, μπλε κολλαγόνο και μωβ πυρήνες. Χρησιμοποιούνται τρία διαλύματα και αιματοξυλίνη. Το ένα διάλυμα περιλαμβάνει φουκινικό οξύ, το άλλο φωσφομολυβδικό οξύ και το άλλο μέθυλο μπλε. Διαλύματα: Red of Mallory: 0,5 g Fuchsin acid (Fluka Sigma) 0,5 ml glacial acetic acid 100 ml dh 2 O 42

44 Molybdophosphoric acid: 1 g Molybdophosphoric acid (Bizas) 100 ml dh 2 O Methyl blue: 2 g Methyl blue dodeca (Fluka Sigma) 2,5 ml CH 3 COOH 100 ml dh 2 O Οξινισμένη αιθανόλη: 1% CH 3 COOH σε 100% αιθανόλη Πορεία: Αποπαραφινοποίηση του ιστού μέχρι το στάδιο 50% αιθανόλης Ξέπλυμα με PBS Αιματοξυλίνη για 20 δευτερόλεπτα Ξέπλυμα με dh 2 O x3 Red of Mallory για 5 λεπτά Ξέπλυμα με dh 2 O x3 Molybdophosphoric acid 1% για 2 λεπτά Methyl blue για 2 λεπτά Ξέπλυμα με dh 2 O Αιθανόλη 100% για 2 λεπτά Οξινισμένη αιθανόλη για 2 λεπτά Ξυλόλη x2 για 4 λεπτά DPX Πίνακας 1: Πρωτοταγή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοιστοχημεία Αντιγόνο Κωδικός Εταιρεία Αραίωση CK19 - Max Planck Institute 1/100 σε δ/μα κάλυψης a-sma Ab5694 Abcam 1/100 σε δ/μα κάλυψης 43

45 Πίνακας 2: Δευτεροταγή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοιστοχημεία Αντίσωμα Κωδικός Εταιρεία Αραίωση Peroxidaseconjugated Jackson 1/500 σε donkey Immunoresearch δ/μα κάλυψης anti-rabbit IgG Peroxidaseconjugated Ab6734 Abcam 1/500 σε δ/μα κάλυψης anti-rat IgG Enzyme Linked Immunosorbent Assay- ELISA H ELISA είναι μια τεχνική που επιτρέπει τον προσδιορισμό βιομορίων όπως πρωτεϊνών, σε βιολογικά υγρά ή και σε ιστούς μετά από κατάλληλη επεξεργασία. Συνήθως χρησιμοποιούνται πλαστικά πλακίδια 96 μικροκυψελίδων. Το πλαστικό είναι ειδικής σύνθεσης ώστε να προσροφούνται πάνω του οι πρωτεΐνες. Όπως και σε άλλες ανοσολογικές αναλύσεις μια άγνωστη ποσότητα πρωτεΐνης συνδέεται με ένα συγκεκριμένο αντίσωμα, το οποίο συνδέεται έμμεσα με το ένζυμο υπεροξειδάση. Με την προσθήκη υποστρώματος (H 2 O 2 ) και ενός χρωμογόνου προκύπτει προϊόν χρώματος μπλε. Η αντίδραση σταματά όταν προστίθεται H 2 SO 4 και το χρώμα μετατρέπεται σε κίτρινο. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης που μετράται. Μέσω διαδοχικών αραιώσεων πρότυπων διαλυμάτων και φωτομέτρηση στα 450 nm κατασκευάζεται μια πρότυπη καμπύλη μέσω της οποίας προσδιορίζεται τελικά η συγκέντρωση. Συνήθως για τη διαδικασία χρησιμοποιούνται ειδικά kit που διαθέτουν ειδικά βιοτινυλιωμένα αντισώματα έναντι πρωτεϊνών, HRP με στρεπταβιδίνη και πρότυπα διαλύματα της πρωτεΐνης που προσδιορίζεται. Διαλύματα: 44

46 Διάλυμα πλύσεων: 0,05% Tween 20 σε PBS ph= 7,4 Διάλυμα κάλυψης: 1% BSA σε PBS ph=7,4 Διάλυμα αραίωσης του αντιδραστηρίου: 0,1% BSA 0,05% Tween 20 σε TBS ph=7,4 Διάλυμα υποστρώματος: 1:1 H 2 O 2 and Tetramethylbenzidine (R&D Systems) Διάλυμα πάυσης: 2 M H 2 SO 4 Πορεία: Κάλυψη των 96 μικροκυψελίδων με το αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη 100 μl/μικροκυψελίδα. Επώαση O/N σε θερμοκρασία δωματίου Διάλυμα πλύσεων 3x Διάλυμα κάλυψης 300 μl/ μικροκυψελίδα. Επώαση για 60 λεπτά Διάλυμα πλύσεων 3x Προσθήκη δείγματος/πρότυπου διαλύματος 100 μl/μικροκυψελίδα Διάλυμα πλύσεων 3x Προσθήκη βιοτινυλιωμένου αντισώματος 100 μl/μικροκυψελίδα. Επώαση για 120 λεπτά Διάλυμα πλύσεων 3x Προσθήκη στεπταβιδίνης-hrp 100 μl/μικροκυψελίδα. Επώαση για 20 λεπτά στο σκοτάδι 45

47 Διάλυμα πλύσεων 3x Προσθήκη διαλύματος H 2 SO 4 και ανάδευση Φωτομέτρηση Σχεδιάγραμμα της πειραματικής πορείας που ακολουθήθηκε: Γονοτύπηση ζώων 8-10 ημερών Zώα φυσιολογικά/akras* 21/35 ημερών Απομόνωση παγκρεάτων FACS analysis Ανοσοϊστοχημεία ELISA Απομόνωση RNA Η απομόνωση RNA από τον ιστό του παγκρέατος μπορεί να είναι δύσκολη, εξαιτίας της παρουσίας πολλών RNAασών στο συγκεκριμένο όργανο. Για να εξασφαλιστεί η απομόνωση ικανοποιητικής συγκέντρωσης σε καλή κατάσταση, απαιτείται η χρήση ειδικού διαλύματος που απενεργοποιεί τις RNAσες και η γρήγορη απομόνωση του παγκρέατος από το ζώο. Συνήθως χρησιμοποιείται υγρό άζωτο για άμεση ψύξη του οργάνου και ακολουθεί κατακερματισμός σε τμήματα 1mm.: Πορεία: Αναδιαλύουμε τον ιστό στον κατάλληλο όγκο (1 ml/100gr) αντιδραστηρίου Trizol (Tri Reagent, MRC) και επωάζουμε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθέτουμε 0,2 ml χλωροφόρμιο (ΑppliChem)/1 ml Trizol και, έπειτα από έντονη ανάδευση των δειγμάτων και 2-3 λεπτά επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, τα φυγοκεντρούμε στις rpm για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 2-8 ο C. Μετά τη φυγοκέντρηση, το μίγμα διαχωρίζεται στην κάτω κόκκινη φάση φαινόλης-χλωροφορμίου, τη μεσόφαση και την πάνω άχρωμη υδατική φάση στην οποία βρίσκεται το RNA. Μεταφέρουμε την υδατική φάση σε νέο σωλήνα eppendorf. 46

48 Προσθέτουμε 0,5 ml ισοπροπανόλης/1ml Trizol, αναδεύουμε ισχυρά, επωάζουμε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρούμε στις rpm για 10 λεπτά στους 4 ο C. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο, προσθέτουμε 1 ml 75% αιθανόλης/1 ml Trizol και φυγοκεντρούμε στις rpm για 5 λεπτά στους 4 ο C. Αφού το ίζημα αποξηρανθεί στον αέρα, το αναδιαλύουμε σε DEPC- νερό (QIAGEN). Υπολογισμός της απόδοσης απομόνωσης και της καθαρότητας του RNA Η απόδοση της απομόνωσης προσδιορίζεται φωτομετρικά με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm (1 Α260unit = 40 μg/ml RNA). Το RNA προκειμένου να θεωρηθεί καθαρό δεν πρέπει να περιέχει προσμίξεις DNA ή πρωτεϊνών. Το καθαρό RNA έχει λόγο A260/Α280 = 2. Όταν ο λόγος αυτός είναι μεταξύ τότε το RNA θεωρείται ικανοποιητικής καθαρότητας Επώαση με δεοξυριβονουκλεάση Συνήθως το παρασκεύασμα του RNA περιέχει και γονιδιακό DNA, και απαιτείται κατεργασία με δεοξυριβονουκλεάση (DNase). Στην παρούσα μελέτη για τον καθαρισμό του RNA από προσμίξεις DNA χρησιμοποιήθηκε το kit RQ1 RNasefree DNase της Promega σύμφωνα με το πρωτόκολλο της κατασκευάστριας εταιρίας. Η RQ1 Rnase-free DNase είναι μία δεοξυριβονουκλεάση η οποία επάγει την πέψη τόσο μονόκλωνων όσο και δίκλωνων αλυσίδων DNA σε ολιγοδεοξυριβονουκλεοτίδια κάθε ένα από τα οποία φέρει ελεύθερο το 3 υδροξυλικό του άκρο. Παρασκευή cdna από το RNA με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης Ως αντίστροφη μεταγραφή ορίζεται η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cdna) με μήτρα το RNA. Η σύνθεση του cdna πραγματοποιείται από τις 47

49 αντίστροφες μεταγραφάσες, τα ένζυμα δηλαδή που μπορούν να χρησιμοποιούν ως μήτρα RNA. Πρωτόκολλο παρασκευής cdna(first-strand cdna) από το RNA με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης (SuperScript TM II RT) Πορεία: Χρησιμοποιούνται ng τυχαίοι εκκινητές 1μl Προσθήκη 1ng -5μg συνολικού RNA x μl Προσθήκη dntps mix (10 mm το κάθε ένα) 1μl DEPC νερό έως 12 μl Το δείγμα θερμαίνεται για 5 λεπτά στους 65 ο C και έπειτα τοποθετείται γρήγορα στον πάγο. Μετά από γρήγορη φυγοκέντρηση στο υπερκείμενο προστίθεται 5x First-strand Buffer 4μl 0.1M DTT 2μl Το δείγμα αναμιγνύεται και επωάζεται για 2 λεπτά στους 25 ο C Προστίθεται 1μl (200 units), SuperScript TM II RT και ανάδευση Επώαση για 10 λεπτά στους 25 ο C Ακολουθεί επώαση για 50 λεπτά στους 42 ο C Τέλος, η αντίδραση απενεργοποιείται μέσω θέρμανσης στους 70 ο C για 15 λεπτά Ανάλυση μικροσυστοιχιών Για να μελετηθεί το προφίλ της έκφρασης απομονώθηκε το RNA από φυσιολογικά παγκρέατα ποντικών (n= 4) καθώς και από παγκρέατα ποντικών με PDA (n= 5). Ακολούθησε η παραγωγή βιοτινυλιωμένου crna το οποίο υβριδοποιήθηκε σε ειδικά Chip μικροσυστοιχιών (Mouse Genome Array DNA Chips, 48

50 Affymetrix). Για την ανάλυση και εκτίμηση της έκφρασης γονιδίων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Affymetrix GeneChip Operating Software 1.2, ενώ ο αλγόριθμος MAS 5.0 χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δειγμάτων. Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων επιλέχθηκαν με κάποιες προϋποθέσεις. Οι μέσοι όροι των τιμών έπρεπε να μεταβάλλονται κατά 1,5 και εφόσον μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων p 0,05 (Student s t test). Τα δεδομένα από τη βιβλιογραφία επιλέχθηκαν έτσι ώστε να χρησιμοποιηθούν μόνο δείκτες που αντιπροσωπεύονται στο chip Affymetrix Στη συνέχεια, ανιχνεύτηκε το κατά πόσο η επικάλυψη μεταξύ των δύο λιστών είναι στατιστικά σημαντική. Τα γονίδια που σχετίζονται με την ανοσοαπόκριση επιλέχθηκαν ως Gene Ontology Code: (Πηγή: GSEA MSigDb). Για γονίδια που σχετίζονται με την ίνωση, η λίστα γονιδίων δημιουργήθηκε μέσω του GLAD4U προγράμματος. Απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενούς (primary) κυτταρικής σειράς από συμπαγή όγκο Για την απομόνωση καρκινικών κυττάρων από έναν όγκο και την καλλιέργειά τους ως πρωτογενή κυτταρική σειρά χρησιμοποιούνται διάφορα πρωτόκολλα. Ανάλογα με τη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων, όπως για παράδειγμα αν τείνουν να προσκολλώνται στο τρυβλίο ή αν τείνουν να σχηματίζουν συσσωματώματα που επιπλέουν ακολουθούνται διαφορετικές προσεγγίσεις. Συγκεκριμένα, τα καρκινικά κύτταρα από ανθρώπινους όγκους παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος περιβάλλονται από παχύ και άκαμπτο στρώμα και βρίσκονται μεταξύ ινοβλαστών. Σε αυτήν την περίπτωση ακολουθείται το πρωτόκολλο που περιλαμβάνει τη χρήση θρυψίνης, έτσι ώστε αφενός να αποκολληθούν τα κύτταρα από την εξωκυττάρια ύλη και αφετέρου να διαχωριστούν τα καρκινικά κύτταρα από τους ινοβλάστες, θεωρώντας ότι υπάρχει διαφορά στο πόσο ευαίσθητοι είναι διαφορετικοί τύποι κυττάρων στο συγκεκριμένο ένζυμο. Διαλύματα: Θρεπτικό μέσο: 49

51 10% απενεργοποιημένος ορός βοός (FBS, Gibco) 1% πενικιλίνη- στρεπτομυκίνη (pen/strep, Gibco) σε Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM, Sigma) Πορεία: Αρχικά ο όγκος ξεπλένεται με PBS Ο όγκος κατακερματίζεται σε μικρά τμήματα 2-3 mm Προσθήκη θρυψίνης (0,05%) απευθείας στα τμήματα Τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαμο στους 37 για 5 λεπτά ή παραπάνω μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα Προσθήκη διπλασίου όγκου θρεπτικού μέσου και φυγοκέντρηση στα 300 g για 10 λεπτά Τα κύτταρα μεταφέρονται σε νέο τρυβλίο και διατηρούνται στον επωαστικό στους 37 με 5% CO 2 με θρεπτικό μέσο Ανακαλλιέργεια κυτταρικής σειράς Αφού τα καρκινικά κύτταρα από αποκτούν την εικόνα μιας κυτταρικής σειράς, συνήθως ακολουθούν ανακαλλιέργειες της (passage) κάθε 3-4 μέρες ανάλογα με το ρυθμό πολλαπλασιασμού. Συνίσταται κατά τις πρώτες ανακαλλιέργειες να καταψύχονται κύτταρα σε κρυοπροστατευτικό μέσο, προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνσή τους. Πορεία: Το υπερκείμενο απορρίπτεται και τα κύτταρα ξεπλένονται με PBS Προσθήκη 2 ml θρυψίνη- EDTA (0,05% σε PBS, Gibco) και επώαση στους 37 για 3 λεπτά Προσθήκη 4 ml θρεπτικού μέσου και φυγοκέντρηση στα 300 g για 10 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου και επαιναιώρηση στο θρεπτικό μέσο Προσθήκη σε τρυβλίο και διατήρηση στον επωαστικό στους 37 με 5% CO 2 με θρεπτικό μέσο 50

52 Ξενομεταμόσχευση (Xenotransplantation) σε NOD/SCID ποντίκια Όπως αναφέρθηκε, με τον όρο ξενομεταμόσχευση αναφέρεται η μεταμόσχευση του οργάνου ή των κυττάρων ενός οργανισμού (Xenograft) σε ένα δέκτη διαφορετικού είδους. Στην προκειμένη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκαν τμήματα όγκων ανθρώπινων παγκρεατικών αδενοκαρκινωμάτων και η κυτταρική σειρά που απομονώθηκε και καλλιεργήθηκε από τους συγκεκριμένους όγκους, ενώ σαν δέκτες χρησιμοποιήθηκαν NOD/SCID ποντίκια. Για τα ετεροτοπικά ξενομοσχεύματα, τα τμήματα των όγκων και τα κύτταρα τοποθετούνται μεταξύ δερμίδας και του υποκείμενου ιστού πλευρικά του ζώου. Για τα ορθοτοπικά ξενομοσχεύματα, τα τμήματα των όγκων τοποθετούνται πάνω στο πάγκρεας. Συγκεκριμένα, NOD/SCID ποντίκια τεσσάρων εβδομάδων αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αέριο ισοφλουράνιο 4% και οξυγόνο. Για την ορθοτοπική μεταμόσχευση χρησιμοποιήθηκε επίσης ως αναλγητικό μία μίξη βουπρενορφίνης (0,1 mg/kg) και μελοξικάμης (2 mg/kg). Για την ένεση κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν 10 6 κύτταρα /ποντίκι σε 100 μl αποστειρωμένο PBS. Για την επούλωση πληγών χρησιμοποιήθηκε συγκολλητική ουσία ιστού (Histoacryl) και ειδικοί συνδετήρες (Autoclips). Έπειτα, τα ζώα παρακολουθούνταν για ανίχνευση όγκων, οι οποίοι αφαιρέθηκαν όταν η διάμετρός τους ήταν 1,5 cm 2. Απεικόνιση μέσω Positron Emission Tomography- Computed Tomography- PET/CT Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την απεικόνιση της χωρικής διανομής μεταβολικής ή βιοχημικής δραστηριότητας στο σώμα. Μέσω συνδυασμού με ανατομική απεικόνιση με τη συμβολή ακτινών x, προκύπτει μια δισδιάστατητρισδιάστατη εικόνα. Στη διαδικασία χρησιμοποιούνται ραδιενεργές ουσίες με χαμηλή διάρκεια ημιζωής. Στο εργαστήριο χρησιμοποιείται ραδιενεργό φθόριο (fluorine 18 ) για την ανίχνευση μεταβολισμού της γλυκόζης (fluorodeoxyglucose, FDG) με χρόνο ημιζωής 120 λεπτά. Η τροφή αφαιρέθηκε από τους κλωβούς έξι ώρες πριν την εξέταση. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με ένεση στο περιτόναιο μιας μίξης κεταμίνης (100 mg/kg) και 51

53 ξυλαζίνης (15 mg/kg). Ακολούθησε ενδοφλέβια χορήγηση 150 μci 18 F- FDG σε 150 μl PBS. Στην περίπτωση που ακολούθησε θυσία των ζώων, η πρόσληψη 18 F- FDG ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας την ραδιενέργεια με τη χρήση μετρητή (gamma counter, Minaxi 500 Series). 52

54 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δημιουργία ενός μοντέλου παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος μέσω εκτοπικής υπερέκφρασης του KRAS* Μέσω πλάγιας κατευθυνόμενης μεταλλαξινογένεσης αρχικά δημιουργήθηκε το μεταλλαγμένο KRAS* στο οποίο έχει γίνει αντικατάσταση στη θέση 12 της γλυκίνης (G) με ασπαραγινικό οξύ (D). Στη συνέχεια, ενσωματώθηκαν loxp αλληλουχίες για τη δράση της cre ρεκομπινάσης, μια αλληλουχία για μετάφραση ανεξάρτητα από την ύπαρξη καλύπτρας (IRES- Internal Ribosomal Entry Site) και μια αλληλουχία αντίστασης στη νεομυκίνη, ως δείκτης επιλογής. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε η κασέτα της ακτίνης β (Actb), έτσι ώστε να επιτευχθεί έκτοπη υπερέκφρασή του και δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά ποντίκια. Προκειμένου η υπερέκφραση του να επιτευχθεί ιστοειδικά στο πάγκρεας, ακολούθησε διασταύρωση με ποντίκια που έφεραν τη cre ρεκομπινάση υπό τον υποκινητή του PDX, προσέγγιση που όπως αναφέρθηκε, έχει χρησιμοποιηθεί σε αρκετές μελέτες μέχρι τώρα. Συγκεκριμένα, ο PDX παράγοντας ξεκινάει να εκφράζεται σε έμβυα την Ε8,5. Τα ποντίκια που έφεραν το KRAS* ή το PDX-CRE δεν ανέπτυσσαν όγκους, ενώ τα ποντίκια που έφεραν και τα δύο εμφάνισαν όγκο και μετά από ένα περίπου μήνα ήταν ετοιμοθάνατα. Τα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια (PDX-CRE/KRAS*), είχαν πολλά περισσότερα μετάγραφα KRAS και τριάντα φορές υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης KRAS. Ιστολογικά, το μοντέλο φαίνεται να εκδηλώνει κάποιες παγκρεατικές ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες μετά τη δέκατη μέρα, ενώ τη δέκατη πέμπτη μέρα (p15) εμφανίζονται παγκρεατικές ενδοεπιθηλιακές νεοπλασίες σταδίου 3 (PanIN3). Την εικοστή πρώτη μέρα (p21), παρατηρείται ανάπτυξη παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Μεταστάσεις δεν παρατηρήθηκαν πιθανότατα λόγω του σύντομου θανάτου που επήλθε, καθώς πολύ σπάνια τα ποντίκια επιβίωναν για πάνω από τριάντα πέντε μέρες (p35). Μετά από χρώση αιματοξυλίνης ηωσίνης σε τομές παραφίνης, φαίνεται ότι το αδενοκαρκίνωμα που παρατηρείται, παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες με το ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Ο ιστός παρουσιάζει μεγάλες αδενικές δομές, ενώ σημειώνεται έντονα η παρουσία στρώματος και κυττάρων φλεγμονής. 53

55 Ακόμη, εκτός από την ιστολογική ανάλυση ακολούθησε και ανάλυση των προφίλ των RNA με τη χρήση μικροσυστοιχιών, των παγκρεατικών όγκων των PDX- 1-CRE/KRAS*A ποντικών και σύγκριση με τα μεταγραφώματα ανθρώπινων παγκρεατικών αδενοκαρκινωμάτων, όπως έχουν καταγραφεί σε βάσεις δεδομένων. Παρατηρήθηκαν αρκετές στατιστικά σημαντικές ομοιότητες. Έτσι λοιπόν, κατά την πρώτη εκτίμηση του μοντέλου παρουσιάζεται μια εικόνα αντίστοιχη με αυτή του ανθρώπινου PDA. 54

56 Εικόνα 5: A) Εξαρτώμενη έκφραση του Kras* στην κασέτα Actb. Στην κορυφή απεικονίζεται ένα γενωμικό τμήμα EcoRI (R) που περιλαμβάνει τo γενετικό τόπο της ακτίνης Actb. Φαίνονται με κατεύθυνση 5 προς 3 οι περιοχές IRES, neo συνδεδεμένες με μια poly A αλληλουχία που ακολουθείται από το Kras* cdna. Μετά από knock in σχηματίζεται δικιστρονικό mrna (actin-neo), ενώ μετά από επίδραση της cre σχηματίζεται δικιστρονικό mrna (actin-kras*) B) Τα προϊόντα μετά από PCR, αριστερά της cre και δεξιά Kras*. C) Αριστερά πάγκρεας φυσιολογικού ποντικού, δεξιά πάγκρεας στο οποίο φαίνεται ο όγκος σε ποντίκι PDX-1-CRE/KRAS*A την p30. D) Οι μεταλλάξεις των γονιδίων που συμβαίνουν παράλληλα με τα στάδια των παγκρεατικών ενδοεπιθηλιακών νεοπλασιών και παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. 55

57 Ανοσολογικό προφίλ του μοντέλου Pdx-1-cre/KRAS*A σε σχέση με το φυσιολογικό Για την πρώτη εκτίμηση της συμμετοχής του ανοσοποιητικού συστήματος στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα του μοντέλου PDX-1-CRE/KRAS*A, έγινε εκτίμηση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση μικροσυστοιχιών. Χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια αγρίου τύπου ως μάρτυρες (n=4) και ποντίκια PDX-1-CRE/KRAS*A, με προχωρημένους παγκρεατικούς όγκους (n=5). Αφού έγινε απομόνωση RNA από τα παγκρέατα των ζώων, αντίστροφη μεταγραφή και σήμανση, ακολούθησε εκτίμηση των αποτελεσμάτων και κατασκευή χάρτη. Μελετώντας τον χάρτη, παρατηρείται αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης ορισμένων γονιδίων τα οποία συνδέονται με το ανοσοποιητικό σύστημα. Η έκφραση αρκετών γονιδίων φαίνεται να αυξάνεται στα δείγματα των όγκων σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Μεταξύ αυτών είναι κάποια γονίδια χημοκινών όπως τα CCL19, CCL21, CXL12, καθώς και υποδοχέων τους, όπως τα CCR4, CCR5 και CCR6. Ακόμη, αυξημένη έκφραση σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα παρουσιάζουν τα γονίδια κάποιων ιντερλευκινών όπως τα IL-6, IL-15, IL-16, IL-18 καθώς και γονίδια υποδοχέων ιντερλευκινών. Το ίδιο ισχύει και για τα γονίδια κάποιων μορίων της επιφάνειας λευκών αιμοσφαιρίων όπως τα CD22 και CD28. Αυξημένη έκφραση παρατηρείται και σε γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος, όπως η TRAF6 του μονοπατιού NF- kappab, και μεταγραφικούς παράγοντες, όπως ο ZEB1. Όπως φαίνεται, είναι αρκετές οι ενδείξεις για τη διαφορετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα στο φυσιολογικό και στο πάγκρεας με PDA. Έτσι λοιπόν, δημιουργήθηκαν ερωτήματα για τη συμβολή του ανοσοποιητικού συστήματος στη δημιουργία και εξέλιξη του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος, καθώς και για τα χρονικά σημεία στα οποία στα οποία αυτή η συμβολή παρατηρείται. Επομένως, το επόμενο βήμα ήταν η ανάλυση των πληθυσμών λευκοκυττάρων που ανιχνεύονται στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. 56

58 Εικόνα 6: Διαφορετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα μεταξύ δειγμάτων προχωρημένων παγκρεατικών όγκων από PDX-1-CRE/KRAS*A ποντίκια (T) και δειγμάτων παγκρεάτων ποντικών αγρίου τύπου (N). Στον παραπάνω heatmap απεικονίζονται τα γονίδια που εμφάνισαν διαφορική έκφραση και άνηκαν στη λίστα απόκρισης του ανοσοποιητικού Gene Ontology Code: , Πηγή: GSEA MSigDd. Το γεγονός ότι τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια που ανήκουν στη συγκεκριμένη λίστα υπερεκφράζονται στα δείγματα των όγκων, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το ανοσοποιητικό σύστημα σχετίζεται με το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. 57

59 Χαρακτηρισμός των τύπων λευκοκυττάρων που ανιχνεύονται στο μοντέλο PDX- 1-CRE/KRAS*A κατά την ανάπτυξη πρώιμου και προχωρημένου PDA Για την πρώτη εκτίμηση του ανοσολογικού προφίλ του μοντέλου PDX-1- CRE/KRAS*A, χρησιμοποιήθηκαν αρχικά γενικοί δείκτες μυελοειδών και λεμφοειδών κυττάρων, ώστε να σχηματιστεί μια εικόνα για το για ποιους πληθυσμούς έχει ενδιαφέρον ο περαιτέρω χαρακτηρισμός τους. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ποντίκια που έφεραν είτε το γονίδιο PDX-1-CRE, είτε το KRAS* είτε κανένα από τα δύο. Τα ποντίκια αυτά συγκρίθηκαν με τα διπλά θετικά PDX-1-CRE/KRAS*A. Οι ηλικίες που επιλέχθηκαν ήταν η p21 κατά την οποία ιστολογικά φαίνεται να ξεκινάει ο διεισδυτικός καρκίνος και η p35 κατά την οποία τα ποντίκια εμφανίζουν προχωρημένο καρκίνο με έντονη την παρουσία του στρώματος. Ο αριθμός των ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ομάδα ήταν κατά μέσο όρο πέντε (n=5). Η πρώτη εκτίμηση του γονότυπου των ποντικών κάθε ομάδας έγινε με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (polymerase chain reaction- PCR) σε DNA που απομονώθηκε από δείγμα της ουράς μεταξύ της p8 και p10. Έτσι, επιλέχθηκαν ποντίκια που δεν έδιναν προϊόν για κανένα γονίδιο (normal), ποντίκια που έφεραν ένα από τα δύο γονίδια (PDX-1-CRE ή KRAS*) και ποντίκια που έφεραν και τα δύο (PDX-1-CRE/KRAS*A). Ωστόσο, εκτός της PCR εκτιμήθηκε και ο φαινότυπος των ποντικών, καθώς τα διπλά θετικά ποντίκια που νοσούσαν, ήδη από την p21 είχαν περισσότερο καχεκτική εμφάνιση σε σχέση με τα φυσιολογικά, εμφάνιζαν πρήξιμο στην κοιλιακή χώρα και ήταν λιγότερο δραστήρια. Ακολούθησε θυσία των ζώων, απομόνωση παγκρέατος και επεξεργασία κατά τον τρόπο που αναφέρεται στις μεθόδους μέχρι το στάδιο του εναιωρήματος κυττάρων. Ακολούθησε σήμανση με αντισώματα έναντι των F4/80, CD11b, CD11c, δεικτών που αναφέρονται μεταξύ άλλων σε πληθυσμούς μακροφάγων και δενδριτικών κυττάρων, καθώς και χρώση με αντίσωμα έναντι της CD19 που περιλαμβάνει Β- λεμφοκύτταρα, και έναντι της CD3 για Τ κύτταρα. Μετά τη σήμανση οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Flow Cytometry). Από τους δείκτες που εξετάστηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ πρώιμου και προχωρημένου PDA ήταν για τους δείκτες F4/80, CD11c και CD3, χωρίς όμως να ανιχνεύονται ιδιαίτερες διαφορές μεταξύ φυσιολογικού παγκρέατος και μεταξύ πρώιμου PDA. Ωστόσο, τα κύτταρα 58

60 που φέρουν το δείκτη CD11b παρουσιάζονται ήδη αυξημένα στο πρώιμο PDA σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας και ακόμη περισσότερο στο προχωρημένο PDA, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι πληθυσμοί μπορεί να έχουν κάποιο ρόλο νωρίτερα στην εξέλιξη του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Εικόνα 7: Πρώτη εκτίμηση των πληθυσμών που φέρουν γενικούς δείκτες κυττάρων του ανοσοποιητικού που εντοπίζονται σε παγκρέατα ποντικών αγρίου τύπου (NORMAL PANCREATA) και ποντικών PDX-1-CRE/KRAS*A κατά την p21 (EARLY PDA) και p35 (ADVANCED PDA) με κυτταρομετρία ροής. A) Πληθυσμός κυττάρων θετικός για F4/80, ένα δείκτη που εντοπίζεται σε μακροφάγα κύτταρα B) Πληθυσμός κυττάρων θετικός για CD11b, ένα δείκτη που εντοπίζεται σε μυελοειδή και λεμφοειδή κύτταρα C) Πληθυσμός κυττάρων θετικός για CD11c, ένα δείκτη που εντοπίζεται σε δενδριτικά και μακροφάγα κύτταρα. Το ποσοστό των πληθυσμών αυτών εμφανίζεται αυξημένο ως προς το συνολικό αριθμό κυττάρων του παγκρέατος, υποδεικνύοντας μια φλεγμονώδη απόκριση κατά την εξέλιξη του PDA. (* p, ** p ) 59

61 Χαρακτηρισμός των Τ κυττάρων που ανιχνεύονται στο μοντέλο PDX-1- CRE/KRAS*A κατά την ανάπτυξη πρώιμου και προχωρημένου PDA Εφ όσον η παρουσία CD3+ κυττάρων που έχουν διηθήσει τον όγκο έχει συσχετιστεί σε μελέτες με αυξημένη επιβίωση των ασθενών με PDA (Zhang, Conejo- Garcia et al. 2003) και εξαιτίας του μεγάλου αριθμού που βρέθηκε στο προχωρημένο στάδιο PDA στο μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A, αποφασίστηκε να προσδιοριστεί περαιτέρω ο τύπος των Τ κυττάρων που διηθούν τον ιστό. Έτσι, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία συγκρίνοντας φυσιολογικά ποντίκια με ποντίκια PDX-1-CRE/KRAS*A την p21 και p35. Έγινε απομόνωση παγκρέατος, απομόνωση κυττάρων και προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής. Αυτή τη φορά χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα έναντι των δεικτών CD3, CD4 και CD8, έτσι ώστε να εξακριβωθεί ποιο ποσοστό των κυττάρων άνηκε στην κατηγορία των βοηθητικών Τ κυττάρων και ποιο στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Τα ποσοστά των CD3+CD4+ κυττάρων δεν εμφάνισαν κάποια ιδιαίτερη διαφορά στο πρώιμο PDA σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Ωστόσο, καθώς το PDA εξελίσσεται ο αριθμός των κυττάρων εμφανίζεται αρκετά αυξημένος. Ο αριθμός των CD3+CD8+ κυττάρων στον οποίο θεωρείται ότι ανήκουν και τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα, όπως είναι αναμενόμενο είναι μικρότερος από τον αριθμό των CD3+CD4+, αλλά εμφανίζεται επίσης αυξημένος στο προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα σε σχέση με το πρώιμο ή σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας στο οποίο αυτός ο τύπος κυττάρων είναι σπάνιος. Η παρουσία των CD8+ Τ κυττάρων σε καρκινώματα έχει επίσης συσχετιστεί με μεγαλύτερη επιβίωση και αρκετές μελέτες επικεντρώνονται σε τρόπους με τους οποίους μπορεί να επιτευχθεί η αύξηση του αριθμού τους, μέσα από σχήματα ανοσοθεραπείας σε συνδυασμό με τη χορήγηση χημειοθεραπείας (Ali, Chlon et al. 2016). Και για τις δύο κατηγορίες Τ κυττάρων, τα ποσοστά που προσδιορίστηκαν ως προς τον συνολικό αριθμό κυττάρων του παγκρέατος εμφάνιζαν σχετική ετερογένεια ανάμεσα στα πειραματόζωα, γεγονός το οποίο όπως θα σχολιαστεί παρακάτω έχει συσχετιστεί με διαφορετικές προγνώσεις για την πορεία της ασθένειας. Ακόμη, λόγω αρκετών αναφορών της βιβλιογραφίας στα έντονα ποσοστά CD4+CD25+ T ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) που έχουν προσδιοριστεί στο περιφερικό αίμα ή στους ιστούς ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου (Viehl, Moore et al. 2006; Gallimore and Godkin 2008) και εξ αιτίας της περιγραφής του 60

62 ρόλου τους σε πειραματόζωα (Viehl, Moore et al. 2006), στη συνέχεια διερευνήθηκε ο αριθμός τους στο μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A. Τα CD4+CD25+ Τ ρυθμιστικά κύτταρα που θεωρείται ότι έχουν ρόλο καταστολής του ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ είναι σπάνια στο φυσιολογικό ιστό παγκρέατος, εμφανίζονται σε αυξημένο ποσοστό των συνολικών κυττάρων σε ποντίκια p35. Ωστόσο, για το χαρακτηρισμό των Τ λεμφοκυττάρων ως ρυθμιστικά είναι απαραίτητος και ο προσδιορισμός του δείκτη FOXP3. Στο συγκεκριμένο μοντέλο παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος όμως δεν ανιχνεύθηκε ιδιαίτερη αύξηση των FOXP3+ κυττάρων. Εικόνα 8: Χαρακτηρισμός των Τ κυττάρων στο πάγκρεας φυσιολογικού (NORMAL), πρώιμου (EARLY PDA) και προχωρημένου PDA (ADVANCED PDA). A) Ποσοστό των CD3+ κυττάρων του συνολικού πληθυσμού κυττάρων B) Ποσοστό των CD3+CD4+ κυττάρων του συνολικού πληθυσμού C) Ποσοστό των CD3+CD8+ κυττάρων του συνολικού πληθυσμού D) Ποσοστό των CD4+CD25+ κυττάρων του συνολικού πληθυσμού (** p ) 61

63 Παρουσία κατασταλτικών κυττάρων μυελοειδούς προέλευσης (MDSC) στο πρώιμο PDA και αύξηση τους κατά την εξέλιξη της ασθένειας Στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα έχουν αναφερθεί υψηλά ποσοστά κατασταλτικών κυττάρων μυελοειδούς προέλευσης (MDSC), τόσο στο περιφερικό αίμα εγχειρισμένων ασθενών όσο και σε μοντέλα ποντικών (Karakhanova, Link et al. 2015). Προκειμένου να διαπιστώσουμε αν το μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A ακολουθεί τα δεδομένα αυτά, έγινε και πάλι κυτταρομετρία ροής, στα επιλεγμένα χρονικά σημεία p21 και p35. Αυτή τη φορά η σήμανση έγινε με αντισώματα έναντι των δεικτών CD11b, LY6C και LY6G. Κατά την ανάλυση αφού έγινε επιλογή του πληθυσμού των CD11b+ κυττάρων, στη συνέχεια προσδιορίστηκαν οι πληθυσμοί CD11b+LY6G high LY6C lo και CD11b+LY6C high LY6G -. Ο πρώτος πληθυσμός αφορά πολυμορφοπύρηνα MDSCs, ενώ ο δεύτερος αντανακλά MDSCs μονοκυτταρικής προέλευσης. Ο πληθυσμός των κυττάρων CD11b+LY6G high LY6C lo παρουσιάζει αύξηση με στατιστική σημαντικότητα στα παγκρέατα με προχωρημένο όγκο σε σχέση με τα φυσιολογικά, ενώ ο πληθυσμός CD11b+LY6C high LY6G - δεν εμφανίζει ιδιαίτερες διαφορές. Ωστόσο, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ο πληθυσμός CD11b+LY6G high LY6C lo, εμφανίζεται αυξημένος ήδη από το πρώιμο PDA σε σχέση με τους άλλους, υποδεικνύοντας ότι αυτός ο πληθυσμός μπορεί να έχει μεγαλύτερο ρόλο στην εξέλιξη του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Επίσης, το αυξημένο ποσοστό του πληθυσμού CD11b+LY6G high LY6C lo σε σχέση με τον πληθυσμό CD11b+LY6C high LY6G - συμφωνεί με δεδομένα που προκύπτουν και σε άλλα είδη καρκίνου (Katoh and Watanabe 2015). Προφίλ κυτταροκινών του μοντέλου PDX-1-CRE/KRAS*A στο πρώιμο και προχωρημένο PDA Εφόσον βρέθηκαν πληθυσμοί κυττάρων MDSC αυξημένοι στο μοντέλο PDX- 1-CRE/KRAS*A, στη συνέχεια εκτιμήθηκαν τα επίπεδα κυτταροκινών που έχουν συσχετιστεί στη βιβλιογραφία με τα κύτταρα αυτά ή που έχουν αναφερθεί να έχουν κάποιο ρόλο στο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα. Ακόμη, η έκφραση των γονιδίων των κυτταροκινών GM- CSF, IL-6, είχε φανεί επίσης αυξημένη στους παγκρεατικούς όγκους σε σχέση με τους φυσιολογικούς. Έτσι λοιπόν, με τη χρήση της μεθόδου ELISA, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών GM-CSF και IL-6 που 62

64 αναφέρονται ως παράγοντες σημαντικοί για τα MDSC κύτταρα (Morales, Kmieciak et al. 2010; Sumida, Wakita et al. 2012). Ακόμη, εκτιμήθηκαν τα επίπεδα της IL-10, ως κυτταροκίνη που συνδέεται με ανοσοκαταστολή και τέλος τα επίπεδα της IFN-γ. Τα χρονικά σημεία που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ίδια που επιλέχθηκαν για την κυτταρομετρία ροής και για κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν τρία ποντίκια (n=3). Τόσο ο παράγοντας GM-CSF και η IL-6, εμφανίζονται αυξημένοι σε σχέση με το μάρτυρα ήδη από το πρώιμο PDA αλλά παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική αύξηση στο προχωρημένο PDA, ακολουθώντας το πρότυπο των MDSC κυττάρων. Τα επίπεδα της IL-10 παρουσιάζουν μικρή αύξηση σε σχέση με το μάρτυρα, η οποία όμως δεν είναι στατιστικά σημαντική, ενώ η IFN-γ φαίνεται να μειώνεται σταδιακά καθώς το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα προχωράει σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Η αύξηση των κυτταροκινών GM-CSF και IL-6 σε συνδυασμό με τη και τη μείωση της IFN-γ και την αύξηση των CD11b+LY6G high LY6C lo κυττάρων αποτελούν ενδείξεις πιθανών φαινομένων ανοσοκαταστολής στο μικροπεριβάλλον του προχωρημένο όγκου στο μοντέλο PDX-1-CRE/KRAS*A. 63

65 Εικόνα 9: Ενδείξεις ύπαρξης ενός ανοσοκατεσταλμένου περιβάλλοντος στο μοντέλο PDX-1- CRE/KRAS*A A) Χαρακτηρισμός των μυελοειδών κυττάρων στο πάγκρεας φυσιολογικού (NORMAL), πρώιμου (EARLY) και προχωρημένου (ADVANCED) PDA. Αριστερά, αντιπροσωπευτικά διάγραμμα κυτταρομετρίας ροής ενός ποντικού από κάθε ομάδα. Δεξιά, διάγραμμα των ποσοστών των CD11b+LY6G high LY6C lo του συνολικού πληθυσμού κυττάρων B) Σύγκριση των επιπέδων των κυτταροκινών GM-CSF, IL- 6, IFN-γ και IL- 10 στο πάγκρεας φυσιολογικού (NORMAL), πρώιμου (EARLY) και προχωρημένου (ADVANCED) PDA Απομόνωση CD8+ Τ κυττάρων από παγκρέατα PDX-1-CRE/KRAS*A τα οποία είχαν υποβληθεί σε θεραπεία Gemcitabine Στη συνέχεια θεωρήθηκε ότι ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η διερεύνηση του ανοσολογικού προφίλ και συγκεκριμένα των Τ κυττάρων στα οποία είχε χορηγηθεί Gemcitabine (Ομάδα A) ή Abraxane (Ομάδα B) για διάστημα 6 περίπου εβδομάδων, προκειμένου να φανεί αν επηρεάζεται το ποσοστό τους. Ακόμη, θεωρώντας ότι 64

66 υπάρχουν ενδείξεις ενός ανοσοκατεσταλμένου περιβάλλοντος στο μοντέλο PDX-1- CRE/KRAS*A, σκοπός ήταν να γίνει μια πρώιμη προσπάθεια μιας συμπληρωματικής θεραπείας που θα μπορούσε να συμβάλει στην ενίσχυση του ανοσοποιητικού ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Τα παγκρέατα των ζώων απομονώθηκαν και ένα τμήμα τους αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής με ίδιο τρόπο που πρωτύτερα αναφέρθηκε. Παρατηρήθηκε ότι τα ζώα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία Gemcitabine δεν είχαν ιδιαίτερες αλλαγές στα ποσοστά των CD8+ T και CD4+ Τ κυττάρων. Αντίθετα, τα ποσοστά αυτών των πληθυσμών στο Abraxane φάνηκαν να μειώνονται αρκετά. Επιπλέον, τα παγκρέατα των ποντικών της ομάδας Α φάνηκαν να διαθέτουν περισσότερα CD11c+ MHCII+ κύτταρα συγκριτικά με την ομάδα B. Θεωρώντας ότι τα κύτταρα αυτά αποτελούν πληθυσμούς αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, όπως δενδριτικών και βασισμένοι σε αναφορές που υποστηρίζουν ότι η θεραπεία με Gemcitabine ενδέχεται να συμβάλει στην αντιγονοπαρουσίαση σε CD8+ T naive κύτταρα, έγινε απομόνωση κυτταροτοξικών CD8+ T κυττάρων από τα παγκρέατα τριών ζώων αρσενικού φύλου στα οποία χορηγούταν Gemcitabine μία φορά τη βδομάδα για 45 μέρες. Αφού απομονώθηκαν τα κύτταρα, χορηγήθηκαν ενδοφλέβια σε αρσενικό ποντίκι PDX-1-CRE/KRAS*A 30 ημερών που είχε παγκρεατικό όγκο. Παρόλο που τα κύτταρα αυτά ενέθηκαν σε ένα μόνο ζώο δοκιμαστικά, μέσω PET/CT μετά από διάστημα 15 ημερών φάνηκε μείωση του αρχικού όγκου, παρόλο που δε δόθηκαν συμπληρωματικές χημειοθεραπευτικές θεραπείες. Ωστόσο, σε διάστημα τριών περίπου εβδομάδων μετά τη χορήγηση ο όγκος αυξήθηκε εκ νέου και το ποντίκι ήταν ετοιμοθάνατο, υποδεικνύοντας ότι οι προσπάθειες για ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος παράλληλα με τη χορήγηση χημειοθεραπειών είναι ελπιδοφόρες, αλλά απαιτούνται πιο μόνιμες και δραστικές λύσεις. 65

67 Εικόνα 10: Απομόνωση CD8+ Τ κυττάρων από παγκρέατα PDX-1-CRE/KRAS*A τα οποία είχαν υποβληθεί σε θεραπεία Gemcitabine. A) PET/CT σε ποντίκια πριν (αριστερά) και μετά (δεξιά) τη χορήγηση Abraxane B) PET/CT σε ποντίκια πριν (αριστερά) και μετά (δεξιά) τη χορήγηση Gemcitabine C) Κυτταρομετρία ροής και αντιπροσωπευτικά διαγράμματα των πληθυσμών CD3+CD8+, CD3+CD4+, CD11c+MHCII D) PET/CT σε ποντίκια πριν (αριστερά) και μετά (δεξιά) την ενδοφλέβια ένεση απομονωμένων CD8+ T κυττάρων. Στις δύο βδομάδες φαίνεται να υπάρχει μείωση του αρχικού όγκου 66

68 Διαφορετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση του μοντέλου PDX-1-CRE/KRAS*A σε σχέση με το φυσιολογικό Από τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών και από την αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων, προέκυψαν διαφορές στην έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη διαδικασία της ίνωσης μεταξύ των μαρτύρων (n=4) και PDX-1-CRE/KRAS*A (n=5). Πολλά από τα γονίδια των οποίων η έκφραση εμφανίζεται αυξημένη συμμετέχουν σε μονοπάτια ρύθμισης της ίνωσης. Ένα μονοπάτι μεταξύ αυτών φαίνεται να είναι αυτό του TGF-β (Meng, Nikolic-Paterson et al. 2016). Πολλά γονίδια που συμμετέχουν σε αυτό το μονοπάτι, όπως τα TGF-β1, TGF-β3 και το SMAD3 φάνηκαν να εκφράζονται περισσότερο στα δείγματα των όγκων. Ακόμη, το ίδιο συνέβη και σε γονίδια κολλαγόνου όπως τα COL3A1, COL14A1 και COLA2. Τα δεδομένα αυτά αποτελούν ενδείξεις για την ύπαρξη ενός περιβάλλοντος στο οποίο έχουν ενεργοποιηθεί παράγοντες που οδηγούν στην ίνωση. 67

69 Εικόνα 11: Διαφορετική έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση μεταξύ δειγμάτων προχωρημένων παγκρεατικών όγκων από PDX-1-CRE/KRAS*A ποντίκια (T) και δειγμάτων παγκρεάτων ποντικών αγρίου τύπου (N). Στον παραπάνω heatmap απεικονίζονται τα γονίδια που εμφάνισαν διαφορική έκφραση και άνηκαν στη λίστα γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση με το πρόγραμμα GLAD4U. Το γεγονός ότι τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια που ανήκουν στη συγκεκριμένη λίστα απεικονίζονται στο χάρτη, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η διαδικασία της ίνωσης σχετίζεται με την ασθένεια. 68

70 Χαρακτηριστικά που σχετίζονται με δεσμοπλασία ήδη από το πρώιμο PDA Όπως αναφέρθηκε η έντονη παρουσία δεσμοπλασίας αποτελεί ένα σημαντικό κομμάτι της βιολογίας του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητο τα μοντέλα που προσομοιάζουν την ασθένεια αυτή να διαθέτουν το συγκεκριμένο πρότυπο. Με χρήση ιστοχημείας και χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης σε παγκρέατα φαίνεται το πρότυπο δεσμοπλασίας ήδη στο πρώιμο PDA (p21) και στο προχωρημένο PDA (p35), κατά το οποίο σχεδόν όλος ο φυσιολογικός παγκρεατικός ιστός έχει αντικατασταθεί από ινωτικό ιστό. Παρόμοιο πρότυπο παρουσιάζεται σε όλα τα πειραματόζωα που θυσιάστηκαν στις αντίστοιχες ημερομηνίες. Ο ιστός είναι επίσης θετικός στην ανοσοιστοχημεία με αντίσωμα έναντι της κερατίνης 19 (Cytokeratin 19- CK19). Η CK19 που φυσιολογικά εκφράζεται στο πορογενές επιθήλιο, χρησιμοποιείται για διαγνωστικούς σκοπούς προκειμένου να επιβεβαιωθεί ο επιθηλιακός φαινότυπος σε έναν όγκο. Κατά το μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων, το προφίλ των κερατινών τείνει να διατηρείται αποτελώντας ένα χρήσιμο δείκτη του όγκου. Τα περισσότερα παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα είναι θετικά για την CK19, έτσι είναι αρκετά σημαντικό το ζωικό μοντέλο της ασθένειας να εμφανίζει αυτό το πρότυπο (Chu and Weiss 2002; Barak, Goike et al. 2004). Στο πάγκρεας του ποντικού PDX-1-CRE/KRAS*A, μέσω της χρώσης Masson, εξετάστηκε η κατανομή του συνδετικού ιστού στο πάγκρεας σε ποντίκια με όγκο κατά τη p21 και p35. Με τη χρώση Masson, οι ίνες κολλαγόνου βάφονται με χρώμα μπλε ενώ το κυτταρόπλασμα φαίνεται με χρώμα κόκκινο. Όπως παρατηρείται, κολλαγόνο ανιχνεύεται ήδη την p21 γύρω από τα κύτταρα του όγκου, γεγονός που σημαίνει ότι η έκκριση του έχει ξεκινήσει νωρίτερα από την εμφάνιση του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Επίσης σε συνδυασμό με αυτό, ο ιστός είναι θετικός στην ανοσοιστοχημεία με αντίσωμα κατά της a-sma, που όπως αναφέρθηκε είναι δείκτης ενεργοποίησης μυοϊνοβλαστών, όπως των PaSCs (Pancreatic Stellate Cells). Σε τομή του πρώιμου όγκου, φαίνεται η παρουσία της a-sma σε σχέση με το μάρτυρα, ενώ στην τομή του προχωρημένου όγκου εντοπίζεται σε ακόμα μεγαλύτερο βαθμό. 69

71 Εικόνα 12: Χαρακτηριστικά που σχετίζονται με δεσμοπλασία σε τομές παραφίνης από τα παγκρέατα ποντικών PDX-1-CRE/KRAS*A κατά την p21 (EARLY PDA) και p35 (ADVANCED PDA). A) Χρώση Masson στην οποία με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι ίνες κολλαγόνου του συνδετικού ιστού, ενώ με μωβ χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες των κυττάρων. Θετική χρώση για κολλαγόνο εντοπίζεται ήδη από την p21 B) Χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης C) Ανοσοϊστοχημεία για CK19, με καφέ φαίνεται η θετική χρώση D) Ανοσοϊστοχημεία για a-sma, με καφέ φαίνεται η θετική χρώση. 70

72 Δεσμοπλασία σε όγκους που έχουν προκύψει από xenograft ανθρώπινου παγκρεατικού όγκου σε ποντίκι αλλά και σε όγκους που προήλθαν από ένεση με ανθρώπινη πρωτογενή κυτταρική σειρά παγκρεατικού καρκίνου. Όπως έχει αναφερθεί, στον παγκρεατικό καρκίνο η αντίδραση δεσμοπλασίας είναι έντονη. Η αντίδραση αυτή παρατηρείται και σε ανθρώπινους όγκους παγκρεατικού καρκίνου. Το ίδιο πρότυπο παρατηρείται και σε όγκους σε NOD/SCID ποντίκια που έχουν προέλθει από ξενομόσχευμα ανθρώπινου όγκου. Αυτό όμως που προκαλεί τη μεγαλύτερη εντύπωση είναι ότι ίνωση παρατηρείται και μετά από ένεση ανθρώπινης πρωτογενούς κυτταρικής σειράς παγκρεατικού καρκίνου τα οποία είχαν καλλιεργηθεί σε επωαστικό θάλαμο για εβδομάδες. Τα NOD/SCID ποντίκια όπως προαναφέρθηκε είναι ισχυρά ανοσοκατεσταλμένα και παρουσιάζουν ελαττωματική λειτουργία αρκετών βασικών ανοσολογικών αποκρίσεων. Αρχικά, έγινε απομόνωση των κυττάρων από τον παγκρεατικό ανθρώπινο όγκο και ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων. Επίσης, εφαρμόστηκε πρωτόκολλο κατά το οποίο διαχωρίζονται οι ινοβλάστες του στρώματος. Τα καρκινικά κύτταρα ενέθηκαν σε ποντίκια NOD/SCID ηλικίας 1 μήνα. Στα σημεία που ενέθηκαν τα κύτταρα, αναπτύχθηκαν όγκοι. Μετά από διάστημα 30 ημερών, ακολούθησε απομόνωση των όγκων, παραφινοποίηση και χρώση με αιματοξυλίνη- ηωσίνη ή χρώση Masson. Στις τομές παρατηρείται εκτενής ίνωση και κολλαγόνο, υποδεικνύοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα από μόνα τους μπορούν να προκαλέσουν αντίδραση δεσμοπλασίας, ακόμα και όταν βασικοί ανοσολογικοί μηχανισμοί δεν λειτουργούν σωστά. Επομένως, φαίνεται ότι κάποια από τα σήματα που εκκρίνονται από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα, οδηγούν στην έκκριση συστατικών της εξωκυττάριας ύλης από κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος. 71

73 Εικόνα 13: Ίνωση παρατηρείται και σε άλλα μοντέλα παγκρεατικού καρκίνου. Α)Τομή παραφίνης ανθρώπινου παγκρεατικού όγκου Β) Χρώση Masson σε τομή παραφίνης από xenograft πρώτου κύκλου από ανθρώπινο παγκρεατικό όγκο σε ποντίκι C) Χρώση Masson σε τομή παραφίνης από xenograft δεύτερου κύκλου σε ποντίκι D)Χρώση Masson σε τομή παραφίνης όγκου που προήλθε από ένεση πρωτογενούς κυτταρικής σειράς παγκρεατικού καρκίνου E), F), G), H) Αιματοξυλίνη- Ηωσίνη στις αντίστοιχες τομές παραφίνης 72