ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Διατμηματικό πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη της επίδρασης των στύλων του Crocus sativus στην από το σελήνιο-επαγόμενη οξειδωτική καταπόνηση αναπτυσσόμενων επίμυων Mητροπούλου Αθανασία Χημικός Πάτρα 2012

2 UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENTS OF CHEMISTRY AND PHARMACY Program of Postgraduate Studies Medicinal Chemistry: Design and Development of Pharmaceutical Products Master of science Effect of Crocus sativus stigmas on selenium inducedoxidative stress in developing rats Mitropoulou Athanasia Chemist Patra

3 Στον αδερφό μου & Στον παππού μου 3

4 Τριμελής Επιτροπή Λάμαρη Φωτεινή, Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπουσα). Κορδοπάτης Παύλος, Καθηγητής του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Μαργαρίτη Μαριγούλα, Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Trilateral Examination Committee Dr Fotini Lamari, Assistant Professor of the Department of Pharmacy, University of Patras (supervisor). Professor Paul Cordopatis, Professor of the Department of Pharmacy, University of Patras. Dr Marigoula Margarity, Assistant Professor of the Department of Biology, University of Patras. 4

5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε από την Μητροπούλου Αθανασία, φοιτήτρια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών <<Ιατρική Χημεία:σχεδιασμός και ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων>> στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το εργαστηριακό κομμάτι πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων κατά το ακαδημαϊκό έτος , υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας δρ. Λάμαρης Φωτεινής. Συγγραφή διατριβής σημαίνει αφιέρωση ενός πολύ μεγάλου χρονικού διαστήματος μπροστά στην οθόνη του υπολογιστή όπου η μόνη σου συντροφιά για ώρες είναι στοίβες από βιβλία, ερευνητικές εργασίες, αναλύσεις, με την ελπίδα κάποια μέρα να οδηγήσουν αξιοποιούμενα στη διαμόρφωση ενός πιο συνεκτικού ερευνητικού θέματος. Τελικά αυτή η τόσο επιθυμητή στιγμή έφτασε. Με την ολοκλήρωση και τη συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που συνέβαλαν, ο καθένας με τον τρόπο του, στην άρτια διεκπεραίωση της. Πριν από όλους θα ήθελα να εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου στην επιβλέπουσα μου κα. Λάμαρη Φωτεινή η οποία μου εμπιστεύθηκε το θέμα της διατριβής αλλά και μου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα. Την ευχαριστώ επίσης γιατί την απλόχερη και σημαντική βοήθεια που μου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια και τον σχεδιασμό των πειραμάτων, την επεξεργασία των αποτελεσμάτων αλλά και κατά τη συγγραφή του κειμένου. Παρά το φόρτο εργασίας της ήταν πάντα πρόθυμη να μου αφιερώσει λίγο χρόνο ώστε να με βοηθήσει σε ότι πρόβλημα προέκυπτε, ενώ ο φιλικός και πρόσχαρος χαρακτήρας την έκανε προσιτή προς συζήτηση οποιουδήποτε θέματος. Θα ήθελα επίσης να την ευχαριστήσω για όλα όσα μου δίδαξε, την υπομονή της, την ανεξάντλητη επιμονή της να μας παρακινεί να κοιτάμε μπροστά, ενθαρρύνοντας με πάντα με αισιοδοξία και καμιά σοκολάτα που και που κυρίως τις πιο δύσκολες στιγμές. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Μαργαρίτη Μαριγούλα για την δυνατότητα που μου έδωσε να πραγματοποιήσω μέρος των πειραμάτων μου στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών καθώς και για την παροχή εργαστηριακού εξοπλισμού όποτε τον χρειάστηκα. Να ευχαριστήσω επίσης όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής, και ιδιαίτερα τον Καθηγητή κ. 5

6 Κορδοπάτη Παύλο και την Επίκουρη Καθηγήτρια κa. Μαγκαφά Βασιλική, για την αρμονική συνεργασία μας καθ όλη την διάρκεια της πειραματικής μου μελέτης. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές και τα μέλη της ομάδας του εργαστηρίου Ενόργανης Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τμήματος Φαρμακευτικής για την προθυμία και την βοήθεια τους όποτε τη χρειάστηκα καθώς και την απλόχερη παραχώρηση των αναγκαίων μέσων για την περάτωση της εργασίας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην υποψήφια Διδάκτορα του Τμήματος Φαρκακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών κα. Φερλέμη Αναστασία-Βαρβάρα για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια της κατά την διάρκεια των πειραμάτων αλλά και στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Την ευχαριστώ για τον χρόνο που διέθεσε, τις συμβουλές της, την προθυμία της οποιαδήποτε στιγμή την χρειαζόμουν χωρίς καμία προσμονή ανταπόδοσης καθώς και για την υπομονή της να με έχει μες στα αυτιά της τις ώρες που περνούσαμε μαζί κάνοντας πειράματα. Ήταν η καλύτερη συνεργάτιδα που θα μπορούσα να είχα. Θα ήταν παράλειψη βέβαια να μην αναφερθώ σε όλες τις φίλες μου από το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων με τις οποίες συνεργαστήκαμε αυτό τον χρόνο, ανταλλάξαμε απόψεις για τα θέματα των ερευνών μας, γελάσαμε, διαφωνήσαμε, πειραχτήκαμε και ζήσαμε μαζί στιγμές που θα μου μείνουν αξέχαστες. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να δώσω στους φίλους μου και τους κοντινούς μου ανθρώπους, οι οποίοι με στήριξαν και με ενθάρρυναν όποτε το είχα ανάγκη και ιδιαίτερα ευχαριστώ από καρδιάς τον Καστούμη Γιώργο για την καθοριστική συνεισφορά του και την ηθική συμπαράσταση του σε κάθε δυσκολία. Τέλος, αλλά πάνω από όλα ευχαριστώ τους γονείς μου και τον αδερφό μου κυρίως για την ηθική, αλλά και οικονομική υποστήριξη τους, όχι μόνο κατά το διάστημα περάτωσης αυτής της εργασίας αλλά καθ όλη την διάρκεια των σπουδών μου. Γιατί είναι οι άνθρωποι που με αγαπούν και με ανέχονται όπως είμαι αλλά και γιατί ήταν δίπλα μου να μου κρατούν το χέρι κάθε φορά που απογοητευόμουν. 6 Μητροπούλου Αθανασία Πάτρα 2012

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες Κυριότερες συντομογραφίες ΚΕΦΑΛΑΙΟ I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ I.1 Οξειδωτικό στρες I.2 Ελεύθερες ρίζες Ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS) Ενεργές μορφές αζώτου (RNS)...14 I.3 Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού..15 I.4 Σελήνιο Βασικές σεληνοπρωτεΐνες Σεληνιώδες νάτριο και καταρράκτης...24 I.5 Εγκέφαλος Δομικές περιοχές του εγκεφάλου (μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα, εγκεφαλικός φλοιός) Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές ασθένειες Σελήνιο (Se) και νόσος του Alzheimer (AD)...30 I.6 Crocus sativus Το όνομα, η προέλευση και η ιστορία του C.sativus O C.sativus και η καλλιεργειά του Γένος κρόκου: Γενικά χαρακτηριστικά. 33 7

8 6.4 Οι χρήσεις του κρόκου Χημική σύσταση των στιγμάτων του C.sativus Απομόνωση και ταυτοποίηση συστατικών Μελέτες για βιολογική δράση των συστατικών του C.sativus...41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ II. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ III. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ III.1 Φυτικό υλικό. 52 III.2 Εκχύλιση Crocus sativus.52 III.3 Πειραματόζωα..53 III.4 Κατεργασία των δειγμάτων. 54 III.5 Αναλυτικές μέθοδοι III.5.1 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων III.5.2 Μέθοδος προσδιορισμού της ενεργότητας της καταλάσης (CAT) III.5.3 Μέθοδοι προσδιορισμού της σουπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) III.5.4 Μέθοδος προσδιορισμού του ικανότητας αναγωγής του Fe III (FRAP) III.5.5 Ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών-μέθοδος Bradford ΚΕΦΑΛΑΙΟ IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 91 8

9 ΑΠΟΔΟΣΗ ΑΓΓΛΙΚΩΝ ΟΡΩΝ BSA bovine serum albumin αλβουμίνη ορού βοοειδούς CAT catalase καταλάση DNPH 2,4-dinitro-phenylhydrazine 2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη GPx glutathione peroxidase υπεροξειδάση του γλουταθείου GSH glutathione γλουταθείο GSSG oxidized glutathione οξειδωμένη μορφή γλουταθείου MDA malondialdehyde μηλονική διαλδεΰδη NO nitric oxide οξείδιο του αζώτου NOS nitric oxide synthase συνθετάση του οξειδίου του αζώτου PBS phosphate buffer saline αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PUFAs polyunsaturated fatty acids πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ROS reactive oxygen species ενεργές μορφές οξυγόνου RNS reactive nitrogen species ενεργές μορφές αζώτου SOD superoxide dismutase δισμουτάση του σουπεροξειδίου TBA thiobarbituric acid θειοβαρβιτουρικό οξύ TBARS thiobarbituric acid reactive substances ενώσεις που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ TCA trichloroacetic acid τριχλωροξικό οξύ 9

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 10

11 I.1 Οξειδωτικό στρες Το οξειδωτικό στρες προκαλείται από διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και της ικανότητας ενός βιολογικού συστήματος να αδρανοποιεί τα τοξικά αυτά ενδιάμεσα και να επισκευάζει τις βλάβες που προκαλούν (Sies, 1997; Storz and Imlay, 1999). Είναι ένας σημαντικός μηχανισμός, ο οποίος μπορεί να συμβάλει στην κυτταροτοξικότητα και σε βλάβες στις διεργασίες της μνήμης και μάθησης μετά από χρόνια καταπόνηση (Murich et al., 2010; Palumbo et al., 2007; Sharma et al., 2009). Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία πολλών νευρογενετικών διαταραχών οι οποίες χαρακτηρίζονται από προοδευτικά νοητικά ελλείμματα (Coyle and Puttfarcken, 1993; Olanow, 1993). Οι ελεύθερες ρίζες είναι προϊόντα του οξειδωτικού μεταβολισμού. Είναι άτομα ή μόρια με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια, τα οποία συμμετέχουν πολύ εύκολα σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής με γειτονικά μόρια. Οι ελεύθερες ρίζες δημιουργούνται είτε από φυσιολογικές διαδικασίες του μεταβολισμού είτε από εξωτερικές πηγές, όπως είναι συγκεκριμένα φάρμακα, η περιβαλλοντική μόλυνση, βαρέα μέταλλα, η κακή διατροφή, το άγχος, η ηλιακή υπεριώδης ακτινοβολία (UV) και άλλες μορφές ιονίζουσας ακτινοβολίας (Cheeseman et al., 1993; Halliwell et al., 1999) (Εικόνα 1). Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες ελευθέρων ριζών: οι ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS) και οι ενεργές μορφές αζώτου (RNS). Εικόνα 1: Πηγές ελευθέρων ριζών. 11

12 Στις περιπτώσεις που η παραγωγή των ελευθέρων ριζών υπερβαίνει την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού, το οξειδωτικό στρες μπορεί να οδηγήσει σε υποβάθμιση των κυτταρικών μεμβρανών, σε κυτταρική δυσλειτουργία και απόπτωση (Lucca et al., 2009). Η παραγωγή των ελευθέρων ριζών προκαλεί αναστρέψιμες και μη αναστρέψιμες βλάβες σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών μορίων συμπεριλαμβανομένου του DNA, των πρωτεϊνών, των λιπιδίων, των υδατανθράκων και άλλων μορίων, οι οποίες επιφέρουν μια αλυσίδα αντιδράσεων που καταλήγουν σε κυτταρικές βλάβες και ασθένειες (Ekmeckcioglu, 2006). I.2 Ελεύθερες ρίζες 2.1 Ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) Οι ROS αποτελούνται από το ανιόν του σουπεροξειδίου (O 2.- ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και τη ρίζα του υδροξυλίου (OH. ). Το μοριακό οξυγόνο είναι ένας ιδανικός τελικός αποδέκτης ηλεκτρονίων. Η υψηλή χημική συγγένεια για ηλεκτρόνια, του προσδίδει μια θερμοδυναμικά μεγάλη κινητήρια δύναμη. Ωστόσο, οι κίνδυνοι παραμονεύουν κατά την αναγωγή του Ο 2. Η μεταφορά τεσσάρων ηλεκτρονίων οδηγεί σε ασφαλή προϊόντα (δύο μόρια ύδατος), αλλά η μερική αναγωγή παράγει επικίνδυνες ενώσεις. Η μεταφορά ενός ηλεκτρονίου στο Ο 2 σχηματίζει το ανιόν του σουπεροξειδίου, ενώ η μεταφορά δύο ηλεκτρονίων οδηγεί σε υπεροξείδιο (Εικόνα 2). Εικόνα 2: Παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνων και εξουδετέρωση αυτών από την δισμουτάση του σουπεροξειδίου και την καταλάση. Οι ενώσεις αυτές, και ιδιαίτερα τα προϊόντα των αντιδράσεων τους με κυτταρικά συστατικά, μπορεί να αποβούν πολύ βλαβερά για τη λειτουργία του κυττάρου. Το ανιόν του σουπεροξειδίου (O 2.- ) αποτελεί πηγή του H 2 O 2 και αναγωγικό μεταλλικών ιόντων. Ο σχηματισμός του 12

13 πραγματοποιείται αυθόρμητα στο πλούσιο σε ηλεκτρόνια περιβάλλον της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων κατά την διάρκεια της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Το ανιόν του σουπεροξειδίου παράγεται επίσης ενδογενώς από τις φλαβινοπρωτεΐνες, όπως την οξειδάση της ξανθίνης. Η αντίδραση του με το μονοξείδιο του αζώτου (NO), το οποίο παλαιότερα ονομαζόταν και παράγοντας χαλάρωσης με ενδοθηλιακή προέλευση (Endothelium Derived Relaxing Factor, EDRF) υποδεικνύει την σημασία του από φυσιολογικής άποψης (Nathan et al., 1994). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ), είναι ένας οξειδωτικός παράγοντας, όχι ιδιαίτερα αντιδραστικός και αποτελεί πηγή ριζών υδροξυλίου παρουσία ενεργών μεταλλικών ιόντων. Η αντίδραση του H 2 O 2 με ιόντα δισθενούς σιδήρου (αντίδραση Fenton) οδηγεί στην παραγωγή ιδιαίτερα δραστικών ριζών υδροξυλίου, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν υπεροξείδωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) και/ή να προκαλέσουν βλάβη στο DNA. Απουσία μεταλλικών καταλυτών (Fe, Co, Ni), το ανιόν του σουπεροξειδίου και το υπεροξείδιο του υδρογόνου εύκολα απομακρύνονται και είναι ουσιαστικά αβλαβή. Ορισμένα οξειδωτικά ένζυμα μπορούν να παράγουν απευθείας το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το H 2 O 2 είναι απαραίτητο στην κυτταρική λειτουργία καθώς ως ουδέτερο μικρό μόριο διαχέεται εύκολα μέσω των κυτταρικών μεμβρανών, αλλά επίσης παράγεται και απομακρύνεται εύκολα με μια σειρά φυσιολογικών διεργασιών. Οι ιδιότητες αυτές το καθιστούν ιδανικό για τη ρύθμιση της μεταγωγής βιολογικών σημάτων μέσω αλυσίδας αντιδράσεων φωσφορυλίωσης και αποφωσφορυλίωσης, που καταλύονται από πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες. Το H 2 O 2 συμμετέχει ενεργά στην οξειδοαναγωγική μεταβίβαση σημάτων στα κύτταρα, που αποτελεί σημαντικό φυσιολογικό μηχανισμό (Rhee, 2006). Η ρίζα του υδροξυλίου (OH. ) αποτελεί τη δραστικότερη ενεργή μορφή οξυγόνου, η οποία αντιδρά με τα περισσότερα βιομόρια. Δεν διαχέεται σε σημαντική απόσταση εντός του κυττάρου, έχει μικρό χρόνο ζωής, αλλά είναι ικανή να προκαλέσει μεγάλη βλάβη στο σημείο παραγωγής της ή σε μικρή ακτίνα. Για παράδειγμα, μπορεί να τροποποιήσει τις πουρίνες και τις πυριμιδίνες και έτσι να προκαλέσει ρήγματα στην διπλή έλικα του DNA (Halliwell, 2006). Άλλες σημαντικές ελεύθερες ρίζες είναι ένα ευρύ φάσμα οργανικών ριζών, οι οποίες προκύπτουν από την αντίδραση ελευθέρων ριζών με βιολογικά μόρια (RH) όπως είναι τα λιπίδια, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες και οι πρωτεΐνες. Οι οργανικές ελεύθερες ρίζες αντιδρούν πολύ γρήγορα με το οξυγόνο και σχηματίζουν υπεροξυ- (ROO - ) ρίζες. Με την σειρά 13

14 τους, οι υπεροξυ- (ROO - ) ρίζες μπορούν να συμμετέχουν σε αντιδράσεις και να παράγουν τις αλκοξυ- (RO - ) ρίζες. Επίσης, άτομα θείου μπορούν να αποτελούν το κεντρικό άτομο σε ελεύθερες ρίζες, οι οποίες ονομάζονται θειούχες ρίζες, RS - και συμμετέχουν σε αρκετές κυτταρικές λειτουργίες, όπως για παράδειγμα στην οξείδωση του γλουταθείου (Burk, 1991). 2.2 Ενεργές μορφές αζώτου (RNS) Ο όρος ενεργές μορφές αζώτου περιλαμβάνει το μονοξείδιο του αζώτου και άλλα μόρια τα οποία σχετίζονται με το ΝΟ όπως S-νιτροζοθειόλες (SNOs), υπεροξυνιτρώδες ανιόν ( - ΟΟΝΟ), τριοξείδιο αζώτου (Ν 2 Ο 3 ) και διοξείδιο του αζώτου (ΝΟ 2 ) τα οποία έχουν παρόμοια δράση σε πληθώρα φυσιολογικών διαδικασιών στα ζωικά και φυτικά κύτταρα (Corpas et al., 2007). Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) είναι ένας σημαντικός αγγελιοφόρος σε πολλές πορείες μεταγωγής σήματος στα σπονδυλωτά. Αυτή η αέρια ελεύθερη ρίζα παράγεται ενδογενώς από αργινίνη, σε μια πολύπλοκη αντίδραση η οποία καταλύεται από την συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου. Για τη σύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου χρειάζονται NADPH και O 2. Το κύριο προιόν της αντίδρασης του ΝΟ με το ανιόν σουπεροξειδίου είναι το υπεροξυνιτρώδες ανιόν ( - ΟΟΝΟ). Τα υπερνιτροζικά ανιόντα είναι προϊόντα με επιβλαβή δράση. Με πρωτονίωση σχηματίζει το υπεροξυνιτρώδες οξύ (ONO 2 H) το οποίο σχηματίζει ΟΗ. και ΝΟ 2 (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Αντιδράσεις μεταξύ του O 2.- και του NO. 14

15 Με ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, το ΝΟ το οποίο είναι μια ιδιαίτερα αντιδραστική ελεύθερη ρίζα, προκαλεί βλάβες στις πρωτεΐνες, στους υδρογονάνθρακες, στα νουκλεοτίδια, στα λιπίδια και μαζί με άλλους φλεγμονώδεις μεσολαβητές έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή κυττάρων και ιστών. Το ΝΟ δρα ισχυρά χαλαρώνοντας τους αρτηριακούς και φλεβικούς μύες και λιγότερο ισχυρά αναστέλλοντας την συσσώρευση αιμοπεταλίων (Nathan et al., 1994). Οι δότες ΝΟ λειτουργούν ως αγγειοδιασταλτικές ουσίες και κατά συνέπεια εκεί στηρίζεται η θεραπευτική τους αξία (Xu et al., 2006). Οι ενεργές μορφές αζώτου έχουν συσχετιστεί με πολλές ασθένειες όπως είναι το άσθμα, η ισχαιμία, το σηπτικό σοκ και η αθηροσκλήρωση μέσω της ενεργοποίησης καναλιών ιόντων (Halliwell et al., 1999). I.3 Αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού Ο οργανισμός μας, όπως όλα τα φυτά και τα ζώα, έχει αναπτύξει για προστασία έναντι των ελευθέρων ριζών διάφορους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς στους οποίους παίρνουν μέρος οργανικές ενώσεις και ένζυμα. Οι ουσίες αυτές έχουν την ικανότητα να καταστέλλουν την καταστροφική οξείδωση των κυττάρων και να θωρακίζουν τον οργανισμό ενάντια σε χρόνιες παθήσεις. Ο ανθρώπινος οργανισμός διαθέτει ενδογενή αντιοξειδωτικά συστήματα τα οποία μπορεί να είναι ενζυμικά (κυτόχρωμα C, η δισμουτάση του σουπεροξειδίου SOD, υπεροξειδάση του γλουταθείου (GPx), η καταλάση CAT) ή μεμβρανικά (α - τοκοφερόλη, συνένζυμο Q10) ή εξωκυττάρια μόρια (ουρικό οξύ, τρανσφερίνη, χολερυθρίνη, γλουταθείο). Παράλληλα ο οργανισμός θωρακίζεται λαμβάνοντας μέσω της διατροφής ενώσεις με αντιοξειδωτική δράση, όπως βιταμίνη Ε, ασκορβικό οξύ, καροτενοειδή και ιχνοστοιχεία όπως Se, Zn, Cu, Mg) (Wojcik et al., 2010) (Εικόνα 4). 15

16 Εικόνα 4: Σύνοψη μηχανισμών σχηματισμού των ελευθέρων ριζών και δράσης αντιοξειδωτικών ενζύμων (Akyol et al., 2001). H δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD), είναι ένα μεταλλοένζυμο το οποίο είναι απαραίτητο για την αυτοοξειδοαναγωγή του Ο 2ˑˉ σε H 2 O 2 και O 2 (Fridovitch, 1986). Τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν δύο μορφές του ενζύμου αυτού, μια που περιέχει μαγγάνιο και βρίσκεται στα μιτοχόνδρια και μια άλλη που περιέχει χαλκό και ψευδάργυρο και βρίσκεται στο κυτοσόλιο. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που σχηματίζεται από τη δισμουτάση του σουπεροξειδίου περισυλλέγεται από την καταλάση (CAT), μια πανταχού παρούσα αιμοπρωτεΐνη η οποία καταλύει την αυτοξειδοαναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και μοριακό οξυγόνο (Michiels et al., 1994). Το ασκορβικό ανιόν (βιταμίνη C), η ιοντισμένη μορφή του ασκορβικού οξέος, δρα ως αναγωγικός παράγοντας (αντιοξειδωτικό). Η βιταμίνη C είναι μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη η οποία δεν χρησιμοποιείται ως συνένζυμο αλλά είναι απαραίτητη για τη δραστικότητα της προλυλουδροξυλάσης. Το ένζυμο αυτό συνθέτει την 4-υδροξυπρολίνη, ένα αμινοξύ που χρειάζεται στο 16

17 κολλαγόνο, το κύριο συστατικό του συνδετικού ιστού στα σπονδυλωτά, αλλά σπάνια βρίσκεται οπουδήποτε αλλού. Η ανεπάρκεια βιταμινών είναι ικανή να προκαλέσει μια σειρά παθολογικών καταστάσεων, για παράδειγμα το σκορβούτο. Στην ασθένεια αυτή η έλλειψη της βιταμίνης C οδηγεί σε ανεπαρκή υδροξυλίωση του κολλαγόνου και επομένως σε ανωμαλίες στις ίνες, οι οποίες αδυνατούν να διατηρήσουν την αντοχή των ιστών σε φυσιολογικά επίπεδα. Η βιταμίνη-ε (α-τοκοφερόλη), δρα ως αντιοξειδωτικό στις μεμβράνες. Αντιδρά με ενεργές μορφές οξυγόνου, όπως οι ρίζες υδροξυλίου, και τις αδρανοποιεί προτού οξειδώσουν τα ακόρεστα λιπίδια της μεμβράνης και καταστρέψουν την δομή τους. Η στειρότητα στους αρουραίους είναι συνέπεια έλλειψης της βιταμίνης Ε. Το ουρικό οξύ είναι ένας εξαιρετικά αποτελεσματικός συλλέκτης αντιδραστικών ριζών οξυγόνου. Είναι τόσο αποτελεσματικό ως αντιοξειδωτικό όσο και το ασκορβικό (Εικόνα 5). Εικόνα 5: Χημικές δομές του ασκορβικού οξέος, της βιταμίνης E και του ουρικού οξέος αντίστοιχα. Το γλουταθείο, ένα γ-γλουταμυλοπεπτίδιο, χρησιμεύει ως ρυθμιστικό μέσο σουλφυδρυλικών ομάδων και ως αντιοξειδωτικό (Εικόνα 6). Το γλουταθείο, που απαντά σε υψηλά επίπεδα στα ζωικά κύτταρα, προστατεύει τα ερυθροκύτταρα από οξειδωτική βλάβη, χρησιμεύοντας ως ρυθμιστικό σουλφυδρυλικών ομάδων. Το γλουταθείο εναλλάσσεται μεταξύ μιας ανηγμένης θειολο-μορφής (GSH) και μιας οξειδωμένης μορφής (GSSG), στην οποία δύο τριπεπτίδια συνδέονται με ένα δισουλφιδικό δεσμό. Το GSSG ανάγεται σε GSH από την αναγωγάση του γλουταθείου, μια φλαβινοπρωτεΐνη που χρησιμοποιεί NADPH ως πηγή ηλεκτρονίων (Εικόνα 7). Ο λόγος GSH προς GSSG στα περισσότερα κύτταρα είναι μεγαλύτερος από 500. Το γλουταθείο έχει καθοριστικό ρόλο στην αποτοξίνωση, μέσω της αντίδρασης του με το υπεροξείδιο του υδρογόνου και τα οργανικά υπεροξείδια, που είναι τα βλαβερά παραπροϊόντα 17

18 της αερόβιας ζωής. Είναι αξιοσημείωτο ότι η υπεροξειδάση του γλουταθείου, έχει ένα τροποποιημένο αμινοξύ που περιέχει ένα άτομο σεληνίου (Se) (Stryer, 2005). Εικόνα 6: Το γλουταθείο είναι ένα γ-γλουταμυλοπεπτίδιο, με τρεις δομικές ομάδες/αμινοξέα. Αποτελείται από ένα κατάλοιπο κυστεΐνης το οποίο συνδέεται στο ένα άκρο με ένα κατάλοιπο γλυκίνης και στο άλλο άκρο με ένα κατάλοιπο γλουταμινικού (το οποίο ενώνεται στην κυστεΐνη με έναν ισοπεπτιδικό δεσμό μεταξύ της πλευρικής καρβοξυλικής ομάδας του γλουταμινικού και της αμινικής ομάδας της κυστεΐνης. Εικόνα 7: Η ανηγμένη (GSH) και η οξειδωμένη (GSSG) μορφή του γλουταθείου. 18

19 I.4 Σελήνιο (Se) Η σημασία του σεληνίου στην βιολογία και την υγεία έχει γίνει σαφής τα τελευταία χρόνια (Rayman et al., 2000; Reeves and Hoffmann., 2009). Οι κυτταρικοί του ρόλοι είναι σημαντικοί για την ζωή και συνεπάγονται ένα ευρύ φάσμα ενζυμικών και μη ενζυμικών λειτουργιών οι οποίες επηρεάζουν μεταγραφικούς παράγοντες, ορμόνες, την μεταγωγή σήματος και συμμετέχουν στην οξειδοαναγωγική ρύθμιση (Bellinger et al., 2009; Papp et al., 2007). Το σελήνιο είναι στοιχείο της ομάδας 16 (VIA) του πίνακα περιοδικότητας με ατομικό αριθμό 34 και ημιμεταλλικό χαρακτήρα. Ανακαλύφθηκε και απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1817 από το Σουηδό J. J. Berzelius που το ονόμασε selene (Σελήνη, η θεά του φεγγαριού) και θεωρούνταν τοξικό μέχρι το 1950, οπού και διαπιστώθηκε η ευεργετική του αξία για τον ανθρώπινο οργανισμό (Schwarz et al., 1958; Trelease et al., 1949). Το σεληνιώδες νάτριο (άνυδρο, Na 2 SeO 3 ή ένυδρο, Na 2 SeO 3 ((H 2 O) 5 ) είναι ένα άλας, άχρωμο στερεό και η πιο κοινή υδατοδιαλυτή ένωση του σεληνίου. Η μέση θανατηφόρος δόση (LD50) για το σεληνιώδες νάτριο σε πειραματόζωα είναι 3 mg/kg. Απεκκρίνεται στα ούρα, τα κόπρανα και κατά την εκπνοή. Για τον διαχείριση των πτωμάτων των πειραματόζωων πρέπει να παίρνονται προφυλάξεις καθώς το σελήνιο ενσωματώνεται και παραμένει σε πρωτεΐνες των ιστών τους (Shearer and Hadjimarkos, 1973). Η συγκέντρωση του σεληνίου μειώνεται με την ηλικία (Berr et al., 1993; Savarino et al., 2001) και μπορεί να διαφέρει ανάλογα την κατάσταση του οργανισμού, π.χ την ιογενή λοίμωξη (Taylor et al., 1997). Ενώ το ανώτερο ανεκτό όριο πρόσληψης σεληνίου είναι 400 μg/ημέρα (National Academy of Sciences, 2000), η βέλτιστη ημερήσια πρόσληψη είναι ακόμα υπό συζήτηση και κυμαίνεται μεταξύ 30 με 85 μg/ημέρα, με κατώτερο όριο για την αποφυγή συμπτωμάτων ανεπάρκειας τα 20 μg/ημέρα (Thomson et al., 2004). Σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες η διατροφική πρόσληψη σεληνίου ακόμα είναι κάτω από τα κατώτερα συνιστώμενα επίπεδα (Combs et al., 2007). Το σελήνιο περιέχεται στα δημητριακά, το κρέας, τα ψάρια και στους ξηρούς καρπούς. Τα συμπληρώματα σεληνίου είναι είτε οργανικά (L-σεληνο-μεθειονίνη) ή ανόργανα (σεληνιώδες νάτριο). Το σελήνιο αφομοιώνεται στον ανθρώπινο οργανισμό και μεταβολίζεται από διαφορετικά μονοπάτια σε υδρίδιο του σεληνίου (H 2 Se), το οποίο χρησιμεύει ως ενδιάμεσο μεταξύ του 19

20 αναγωγικού μεταβολισμού του σεληνίου και του μονοπατιού μεθυλίωσης του καθώς και πρόδρομο για την βιοσύνθεση της σεληνο-κυστεΐνης (selenocysteine) (Εικόνα 8). πρωτεΐνες σεληνιώδες οξύ σεληνο-κυστεΐνη σεληνοπρωτεΐνες σεληνο-μεθειονίνη σεληνο-φωσφατάση αναπνοή ούρα Εικόνα 8: Μεταβολισμός σεληνίου (Meuillet et al., 2004). Εικόνα 9: Χημικές δομές σεληνο-μεθειονίνης και σεληνο-κυστεΐνης. Πολλοί από τους φυσιολογικούς ρόλους του σεληνίου αποδίδονται στην παρουσία τουλάχιστον 25 πρωτεϊνών, των σεληνοπρωτεϊνών οι οποίες είναι απαραίτητες για την ζωή και κυρίως στον σχηματισμό των αμινοξέων σεληνο-μεθειονίνη (SeMet) και σεληνο-κυστεΐνη (Sec) (Papp et al., 2010) (Εικόνα 9). Αρκετές σεληνοπρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί ως αντιοξειδωτικά ένζυμα τα οποία προστατεύουν τα κύτταρα από τη δημιουργία των ελευθέρων ριζών (ROS). 20

21 4.1 Βασικές σεληνοπρωτεΐνες Σεληνοπρωτεΐνες όπως η υπεροξειδάση του γλουταθείου (GPX), η αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TrxR) και η αποιωδιονάση της ιωδοθυρονίνης (DIO) εμπλέκονται στις οξειοδαναγωγικές αντιδράσεις (Papp et al., 2007; Reeves et al., 2009) (Εικόνα 10). οξειδωμένο μόριο σηματοδότησης Κυτταρική Βλάβη Σεληνοπρωτεΐνες ανηγμένο μόριο σηματοδότησης ROS ROS Παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου από: μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση, NADH/NADPH οξειδάση, μονοοξυγενάση, λιποξυγενάση, κυκλοοξυγενάση, οξειδάση της ξανθίνης και άλλα. Εικόνα 10: Ρόλος των σεληνοπρωτεϊνών στη ρύθμιση του οξειδωτικού στρες και την οξειδοαναγωγική κατάσταση των σηματοδοτικών μορίων. Μέσω των αντιοξειδωτικών σεληνοενζύμων οι βλάβες που προκαλούνται από τις ROS μετριάζονται (Reeves and Hoffman, 2009). Η πρώτη σεληνοπρωτεΐνη που προσδιορίστηκε ήταν η υπεροξειδάση του γλουταθείου 1 (GPX1) της οικογένειας των GPXs. Τα σεληνο-εξαρτώμενα GPX ένζυμα δεν ανακυκλώνουν το 21

22 γλουταθείο, μειώνουν την λιπιδική υπεροξείδωση καταλύοντας την μείωση των υπεροξειδίων και είναι γνωστά ως κύρια στοιχεία της αντιοξειδωτικής άμυνας του ανθρώπινου οργανισμού (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Ο ρόλος της καταλάσης και της υπεροξειδάσης του γλουταθείου στην απομάκρυνση υπεροξειδίων του υδρογόνου από τους ανθρώπινους ιστούς. Τα ένζυμα της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης (TrxR) χρησιμοποιούν το NADPH για την αναγωγή της οξειδωμένης θειορεδοξίνης (Trx), σχηματίζοντας ένα ισχυρό οξειδοαναγωγικό σύστημα που ρυθμίζει την οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου και μπορεί επίσης να προστατεύει από το οξειδωτικό στρες. Η οικογένεια των αποιωδιονασών της ιωδοθυρονίνης (DIOs) αποτελείται από τρία ένζυμα τύπου 1, 2 και 3 (DΙΟ1, 2 και 3) τα οποία συνδέουν τις βιολογικές δράσεις του σεληνίου με τον μεταβολισμό των ορμονών του θυρεοειδούς. Άλλες σημαντικές σεληνοπρωτεΐνες είναι οι H, I, M, Sep15, N, O, P, R, S, T και W. Από αυτά τα ένζυμα, η σεληνοπρωτεΐνη P (SelP) εμπλέκεται στην ασθένεια του Alzheimer. Αυτή η παρατήρηση σε συνδυασμό με τα χαμηλά επίπεδα των κυκλοφορούντων SelP κατά την διάρκεια φλεγμονωδών παθήσεων όπως στην σηψαιμία και την ασθένεια Crohns, πιθανόν να υποδεικνύει σχέσεις μεταξύ του σεληνίου, φλεγμονών και νευρολογικών διαταραχών (Reeves et al., 2009). 22

23 Επιπλέον, η αντικαρκινική δράση του σεληνίου έχει περιγραφεί σε ποικιλία μελετών in vitro και σε μοντέλα πειραματόζωων, υποδεικνύοντας ότι τα συμπληρώματα σεληνίου στην ανθρώπινη διατροφή μπορούν να μειώσουν τον κίνδυνο για εμφάνιση καρκίνου (Tato et al., 1994). Tο σελήνιο μειώνει την θνησιμότητα λόγω καρδιαγγειακών παθήσεων, στις οποίες η εμφάνιση υπέρτασης είναι το αρχικό στάδιο και το οποίο μπορεί να συσχετιστεί με το οξειδωτικό στρες (Bello-Klein et al., 2001). Μελέτες έχουν δείξει ότι το σελήνιο προστατεύει έναντι της απόπτωσης που δημιουργείται από την χορήγηση καδμίου με τη ρύθμιση της παραγωγής των ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) και της σηματοδότησης των μιτοχονδριακών μονοπατιών (Zhou et al., 2009). Ακόμη, μελέτες αναφέρουν ότι το σελήνιο μπορεί να βελτιώσει την βλάβη που προκαλείται από την χορήγηση HgCl 2 (El-Shenawy and Hassan, 2008) και παρουσιάζει επίσης ηπατοπροστατευτικές δράσεις έναντι της τοξικότητας του καδμίου (Newairy et al., 2007). Η δράση των σεληνοενζύμων στην μείωση της βλάβης του DNA, στην μείωση του οξειδωτικού στρες, στην βελτίωση της ανοσολογικής απόκρισης, στην αύξηση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53, στην αδρανοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, στην επαγωγή απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων και στην αναστολή της αγγειογένεσης έχουν θεωρηθεί ως πιθανοί μηχανισμοί δράσης (Almondes et al., 2010; Zhuo et al., 2009; Sarveswaran et al., 2010; Ly et al., 2010; Yang et al., 2011). H έλλειψη σεληνίου σχετίζεται με μειωμένα ποσοστά επιβίωσης σε ασθενείς που προσβλήθηκαν από HIV (Rayman, 2000), στις γυναίκες αυξάνει την πιθανότητα (συχνότητα) αποβολών (Barrington et al., 1996) και στους άντρες σχετίζεται με μείωση της κινητικότητας του σπέρματος και των πιθανοτήτων γονιμοποίησης (Scott et al., 1998). Σε υψηλές συγκεντρώσεις πολλές ενώσεις του σεληνίου μπορούν να γίνουν τοξικές (Spallholz, 1994). Οι ιδιότητες των ενώσεων του σεληνίου κυρίως εξαρτώνται από την συγκέντρωση, την χημική μορφή και την μεταβολική τους δραστηριότητα. Ένα κοινό χαρακτηριστικό τους εκφράζοντας την καρκινοστατική δραστηριότητα και την τοξικότητα in vivo και in vitro είναι η αλληλεπίδραση τους με θειόλες και η παραγωγή ελευθέρων ριζών (Kramer and Ames, 1988; Spallholz, 1997). Οι σεληνοενώσεις σε μεγάλη συγκέντρωση έχουν προ-οξειδωτική δράση και τελικά προκαλούν βλάβες στο DNA (Lu et al., 1994, 1995; Zhou et al., 2003; Reid et al., 2004; Wycherly et al., 2004; Waters et al., 2005). 23

24 Χρόνια έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις σεληνίου μπορεί να προκαλέσει μια ασθένεια αποκαλούμενη σελήνωση (selenosis) (Goldhaber, 2003), η οποία χαρακτηρίζεται από τριχόπτωση, γαστρεντερικές ανωμαλίες, δερματικά εξανθήματα και ανωμαλίες στο νευρικό σύστημα. Άλλα αποτελέσματα της τοξικότητας του σεληνίου είναι η διαταραχή της ενδοκρινικής λειτουργίας, της σύνθεσης των ορμονών του θυρεοειδούς και του μεταβολισμού του παράγοντα αύξησης της ινσουλίνης (Navarro-Alarcon and Cabrera-Vique, 2008). Ο μηχανισμός τοξικότητας του σεληνίου δεν έχει διευκρινιστεί αλλά κυρίως αποδίδεται στην ιδιότητα του να επάγει οξειδωτικό στρες in vitro και in vivo (Kitahara et al., 1993; Yan and Spallholz, 1993; Manikandan et al., 2009; Valdiglesias et al., 2009). 4.2 Σεληνιώδες νάτριο και καταρρακτογένεση Ένα από τα πιο γνωστά μοντέλα μελέτης του καταρράκτη σε πειραματόζωα είναι η χορήγηση υψηλής συγκέντρωσης σεληνιώδους νατρίου σε νεογέννητους επίμυες. Ο καταρράκτης, δηλαδή η θόλωση του φακού του ματιού, αποτελεί την κύρια αιτία τύφλωσης παγκοσμίως, σε ποσοστό 42%. Περίπου το 25% του πληθυσμού άνω των 65 ετών και το 50% άνω των 80 ετών αντιμετωπίζουν σοβαρά προβλήματα όρασης λόγω του καταρράκτη (Minassian et al., 2000). Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου σε νεαρούς επίμυες για την πρόκληση πυρηνικού καταρράκτη αναφέρεται σε πειραματικές μελέτες από το 1978 (Ostadalova et al., 1978) και εξελίχθηκε σε ένα εξαιρετικά γρήγορο και ικανοποιητικό μοντέλο (Shearer et al., 1997). Το μοντέλο χρησιμοποιείται ευρέως για την μελέτη των αποτελεσμάτων διαφόρων τάσεων στον φακό και για την αναζήτηση παραγόντων ενάντια στον καταρράκτη (Son et al., 2007). Ο καταρράκτης συνήθως προκαλείται από μια υποδόρια ένεση σεληνιώδους νατρίου μμ/kg σωματικού βάρους σε επίμυες ημερών, ρητά πριν την κρίσιμη περίοδο ωρίμανσης των φακών, η οποία εκτιμάται περίπου στις 16 ημέρες (Shearer et al., 1997). Επαναλαμβανόμενες ενέσεις με μικρότερες δόσεις σεληνιώδους νατρίου (Huang et al., 1992) ή χορήγηση του από το στόμα (Shearer et al., 1983) μπορεί επίσης να προκαλέσει καταρράκτη. Αν και το μοντέλο έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την πρόκληση πυρηνικού καταρράκτη, ύστερα από ημέρες παρατηρείται επίσης και φλοιώδης καταρράκτης (Shearer et al., 1992). Ο φλοιώδης καταρράκτης εξαφανίζεται έπειτα από μερικούς μήνες σε αντίθεση με τον πυρηνικό ο οποίος είναι μόνιμος. 24

25 Η επαγωγή καταρράκτη με χορήγηση σεληνιώδους νατρίου πιθανόν γίνεται μέσω της αύξησης του οξειδωτικού στρες στους ιστούς των φακών, αν και ο ακριβής μηχανισμός δράσης δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί. Μια πιθανή αιτία για την πρόκληση πυρηνικού καταρράκτη μέσω χορήγησης σεληνίου είναι η οξείδωση γλουταθείου στον φακό (Fris et al., 2006). Το σεληνιώδες νάτριο προκαλεί οξείδωση των σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών, γεγονός που οδηγεί σε διατάραξη της ομοιόστασης του ασβεστίου. Η συσσώρευση ασβεστίου στον πυρήνα αυξάνεται, και ενεργοποιείται η καλπαΐνη, η οποία είναι πρωτεολυτικό ένζυμο. Η καλπαΐνη προκαλεί απώλεια των αμινοτελικών άκρων των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, κυρίως των β-κρυσταλλινών (πρωτείνες του φακού). Η αδιαλυτοποίηση των β- και α- κρυσταλλινών και η καθίζηση των γ- κρυσταλλινών δημιουργούν πρωτεϊνικά συσσωματώματα τα οποία σκεδάζουν το φώς, μειώνοντας την διαύγεια του φακού (Shearer et al., 1997). I.5 Εγκέφαλος Ο εγκέφαλος και ο νωτιαίος μυελός αποτελούν το κεντρικό νευρικό σύστημα. Κατά την αρχική εμβρυική ανάπτυξη, ο νωτιαίος μυελός και ο εγκέφαλος ξεκινούν ως μια εξωδερμική νευρική αύλακα, η οποία διευρυνόμενη και σχηματίζοντας πτυχώσεις μετατρέπεται σε έναν επιμήκη κοίλο νευρικό σωλήνα. Το εγκεφαλικό άκρο διευρύνεται και σχηματίζει τα δύο εγκεφαλικά ημισφαίρια, ενώ το υπόλοιπο τμήμα μετατρέπεται στον νωτιαίο μυελό. Ο εγκέφαλος μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε πέντε περιοχές, με βάση την εμβρυϊκή ανάπτυξη: έσχατο εγκέφαλο, οπίσθιο εγκέφαλο, μέσο εγκέφαλο, διάμεσο εγκέφαλο και τελικό εγκέφαλο. Στον εγκέφαλο του ενηλίκου, ο έσχατος εγκέφαλος γίνεται προμήκης μυελός, ο οπίσθιος εγκέφαλος γίνεται γέφυρα και παρεγκεφαλίδα, ο μέσος εγκέφαλος γίνεται τετράδυμο πέταλο και εγκεφαλικά σκέλη, ο διάμεσος εγκέφαλος θάλαμος και υποθάλαμος, ενώ ο τελικός εγκέφαλος αναπτύσσεται στα βασικά γάγγλια και στους διάφορους λοβούς του εγκεφαλικού ημισφαιρίου (Εικόνα 12). 25

26 Εικόνα 12: Όψη του ανθρώπινου εγκεφάλου. Ο εγκέφαλος είναι σχετικά ευάλωτος στη δράση των ROS επειδή μεταβολίζει περίπου το 20% του συνολικού οξυγόνου του σώματος, έχει περιορισμένη αντιοξειδωτική άμυνα (Floyd, 1999), παρουσιάζει υψηλή περιεκτικότητα σε λιπίδια, συγκεκριμένα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και έχει μειωμένη ικανότητα για κυτταρική αναγέννηση (Halliwell, 1992). Η γήρανση θεωρείται ο πιο σημαντικός προδιαθεσικός παράγοντας για τις κοινές νευροεκφυλιστικές διαταραχές, την νόσο του Alzheimer (AD) και την νόσο του Parkinson (PD). Οι περισσότερες θεωρίες επικεντρώνονται στην ιδέα ότι το οξειδωτικό στρες οδηγεί σε μιτοχονδριακές μεταλλάξεις, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και οξειδωτική καταστροφή (Lin et al., 2006). Οι ROS στοχεύουν διάφορα διαφορετικά υποστρώματα στα κύτταρα, προκαλώντας οξείδωση σε πρωτεΐνες, στο DNA και στο RNA ή λιπιδική υπεροξείδωση. Τα προϊόντα οξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, κυρίως του αραχιδονικού και του δοκοεξανοϊκού οξέος, τα οποία είναι άφθονα στον εγκέφαλο, είναι η μηλονική διαλδεΰδη και 4- υδροξυενενάλη (HNE) Η οξειδωτική καταστροφή του DNA και του RNA παράγει την 8-υδροξυ- 26

27 2 -δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG) και την 8-υδροξυ-γουανοσίνη (8-OHG) αντίστοιχα, οι οποίες χρησιμοποιούνται ως δείκτες της οξειδωτικής βλάβης των νουκλεοτιδίων (Toyokumi, 1999). Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται σε ορισμένες νευρολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένων των επιληπτικών κρίσεων (Ashrafi et al., 2007). Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε πειραματόζωα στα οποία προκλήθηκε επιληψία με επαγωγή του 3-μερκαπτοπροπιονικού οξέος έδειξαν αυξημένο οξειδωτικό στρες στην παρεγκεφαλίδα και τον εγκεφαλικό φλοιό (Lores et al., 1998). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το οξειδωτικό στρες προκαλεί βλάβη στον ιππόκαμπο και απόπτωση στα πυραμιδικά κύτταρα (συνιστούν την πλειονότητα των νευρικών κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού και η δράση τους σχετίζεται με ανώτερες γνωστικές και συναισθηματικές λειτουργίες). Οι αλλαγές αυτές συνοδεύονται από μια σημαντική μείωση στους γλυκοκορτικοειδείς υποδοχείς στην CA1 περιοχή του ιππόκαμπου, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής των γλυκοκορτικοειδών (Kobayashi et al., 2009). Έτσι, είναι πιθανό ότι το χρόνιο οξειδωτικό στρες προκαλεί βλάβη στον άξονα υποθαλάμουυπόφυσης-επινεφριδίων (HPA), οδηγώντας σε αυξημένη απελευθέρωση γλυκοκορτικοειδών στα επινεφρίδια, η οποία επηρεάζει τις γνωστικές λειτουργίες. 5.1 Δομικές περιοχές του εγκεφάλου Μεσεγκέφαλος Ο μέσος εγκέφαλος ή μεσεγκέφαλος αποτελείται κυρίως από την οροφή (συμπεριλαμβανομένων των οπτικών λοβών) που περιλαμβάνει πυρήνες που χρησιμεύουν ως κέντρα οπτικών και ακουστικών αντανακλαστικών (στη νευροφυσιολογία ένας πυρήνας είναι μια μικρή συνάθροιση σωμάτων νευρικών κυττάρων εντός του κεντρικού νευρικού συστήματος). Είναι κυρίως ένα κέντρο αναμετάδοσης για την πληροφορία καθώς αυτή μεταφέρεται στα υψηλότερα εγκεφαλικά κέντρα. Ο προμήκης μυελός (η τελική οπίσθια διαίρεση του εγκεφάλου η οποία αποτελεί μια κωνική προέκταση του νωτιαίου μυελού) μαζί με τον μεσεγκέφαλο συνιστούν τον κορμό του εγκεφάλου, μια περιοχή που ελέγχει πολυάριθμες ζωτικές και εν πολλοίς ασυνείδητες δραστηριότητες, 27

28 όπως οι χτύποι της καρδιάς, η αναπνοή, ο αγγειακός τόνος, οι γαστρικές εκκρίσεις και η κατάποση. Παρεγκεφαλίδα Η παρεγκεφαλίδα βρίσκεται ραχιαία του προμήκους μυελού, ελέγχει την ισορροπία, τη στάση του σώματος και την κίνηση. Δεν δημιουργεί κίνηση, αλλά λειτουργεί ως κέντρου ελέγχου της ακρίβειας και των σφαλμάτων της κίνησης (σερβομηχανισμός). Τα Πρωτεύοντα και ιδιαίτερα ο άνθρωπος του οποίου τα χέρια διαθέτουν μια δεξιοτεχνία πολύ ανώτερη των άλλων ζώων, έχουν την πλέον περίπλοκη παρεγκεφαλίδα. Οι κινήσεις των χεριών και των δακτύλων μπορεί να προϋποθέτουν συντονισμό από την παρεγκεφαλίδα για τον συγχρονισμό της σύσπασης και της χαλάρωσης εκατοντάδων μυών. Οι εγκεφαλικές γέφυρες, τμήμα του οπίσθιου εγκεφάλου, περιέχουν πυκνές δέσμες ινών που μεταφέρουν παλμούς από τη μια πλευρά της παρεγκεφαλίδας στην άλλη και επίσης συνδέουν τον προμήκη μυελό και την παρεγκεφαλίδα με άλλες περιοχές του εγκεφάλου. Εγκεφαλικός φλοιός Ο εγκεφαλικός φλοιός αποτελεί το εξωτερικό τμήμα των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Περιλαμβάνει ξεχωριστές αισθητικές και κινητικές περιοχές καθώς και ευρείες σιωπηλές περιοχές που ονομάζονται συνειρμικές περιοχές και έχουν σχέση με τη μνήμη, την κρίση, τη λογική και άλλες λειτουργίες συσχετισμών. Αυτές οι περιοχές δεν έχουν άμεση σχέση με αισθητήρια όργανα ή μυς. Το δεξί και αριστερό ημισφαίριο του εγκεφαλικού φλοιού ενώνονται με ένα είδος γέφυρας, το μεσολόβιο σωμάτιο, έναν νευρικό σύνδεσμο δια του οποίου τα δύο ημισφαίρια μεταφέρουν πληροφορίες και συντονίζουν τις διανοητικές δραστηριότητες. Στον άνθρωπο τα δύο ημισφαίρια του εγκεφάλου εξειδικεύονται σε τελείως διαφορετικές λειτουργίες: το αριστερό ημισφαίριο για την ανάπτυξη της ομιλίας, τις ικανότητες μάθησης και τις μαθηματικές ικανότητες, καθώς και διεργασίες διαδοχικής σκέψης, ενώ το δεξί ημισφαίριο για δραστηριότητες μουσικές, καλλιτεχνικές, διαισθητικές. Κάθε ημισφαίριο ελέγχει την αντίθετη πλευρά του σώματος (Berne et al., 2003). 28

29 5.2 Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές ασθένειες Νόσος του Parkinson (PD) Η νόσος του Parkinson αποτελεί μια από τις πιο κοινές νευρολογικές εκφυλιστικές παθήσεις η οποία χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων (που είναι απαραίτητοι για την εκτέλεση και τον έλεγχο των κινήσεων του σώματος) στα βασικά γάγγλια και τη μέλαινα ουσία, καθώς και από συσσώρευση της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης. Στον εγκέφαλο ασθενών με νόσο του Parkinson, η συγκέντρωση των PUFAs στην μέλαινα ουσία μειώνεται, ενώ τα επίπεδα των δεικτών της λιπιδικής υπεροξείδωσης (MDA και HNE) αυξάνονται (Dalfo et al., 2005). Παρατηρείται επίσης οξειδωτική βλάβη λόγω αύξησης των καρβονυλικών ομάδων των πρωτεϊνών σε σχέση με τους μάρτυρες (Brown et al., 2004). Μελέτες αποδεικνύουν ότι εκτός από τα αυξημένα επίπεδα της 8-OHdG στον εγκέφαλο ασθενών με PD (Seet et al., 2010), έχει παρατηρηθεί μια αύξηση των διαγραφών στο μιτοχονδριακό DNA στην μέλαινα ουσία (Bender et al., 2006). Νόσος του Alzheimer (AD) Μια από τις πιο διαδεδομένες νευροεκφυλιστικές ασθένειες είναι η νόσος του Alzheimer (AD). Η νόσος αποτελεί την πιο κοινή μορφή άνοιας στους ηλικιωμένους με κύρια χαρακτηριστικά την απώλεια μνήμης και κρίσης, σύγχυση, διαταραχές στην ομιλία, ταραχή και ψευδαισθήσεις με συνέπεια την σταδιακή έκπτωση της καθημερινής λειτουργικότητας, και στα προχωρημένα επίπεδα, και της κινητικότητας (Forlenza et al., 2010). Εικόνα 13: Εγκεφαλική ατροφία στη νόσο Alzhaimer. 29

30 Η πολλαπλή αιτιολογία της νόσου εμποδίζει τον προσδιορισμό του ακριβούς μηχανισμού παθογένεσης της. Η αυξημένη εξωκυττάρια εναπόθεση β-αμυλοειδούς πρωτεΐνης (Αβ), η οποία σχηματίζει τις αμυλοειδείς πλάκες, στους ιστούς του εγκεφάλου είναι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της ασθένειας (Selkoe, 2001). Η β-αμυλοειδής πρωτεΐνη είναι μια νευροτοξική ουσία που ενεργοποιεί τη διαδικασία της απόπτωσης, δηλαδή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και έχει ως αποτέλεσμα των θάνατο των νευρικών κυττάρων. Οι αμυλοειδείς πρωτεΐνες ενεργοποιούν τις φλεγμονώδεις διεργασίες, οι οποίες αυξάνουν το οξειδωτικό στρες στους νευρώνες. Το οξειδωτικό στρες με την σειρά του επιταχύνει τους παθογόνους μηχανισμούς που οδηγούν σε περαιτέρω καταστροφή των νευρώνων (Hardy et al., 2002; Markesbery et al., 1999). Σημαντικό είναι το γεγονός ότι το οξειδωτικό στρες αυξάνεται με την ηλικία για αυτό και θεωρείται ένας από τους κύριους παθογόνους μηχανισμούς στην νόσο του Alzheimer (Markesbery, 1997). Το οξειδωτικό στρες προκαλεί αλλαγές στην ομοιόσταση του ATP και του Ca, επαγωγή πρωτεασών και νουκλεασών, καταστροφή των πρωτεϊνών, του DNΑ, των υδατανθράκων και των λιπιδίων. Οι αλδεΰδες που παράγονται, όπως η 4-υδροξυενενάλη (ΗΝΕ) επιφέρουν περαιτέρω επιπτώσεις στο DNA, το RNA και στη σύνθεση των πρωτεϊνών. Επιπλέον, περαιτέρω αλλαγές των δραστηριοτήτων της κινάσης και της φωσφατάσης οδηγεί σε υπερφωσφορυλίωση της TAU πρωτεΐνης και αύξηση της συγκέντρωσης της στα νευροινιδικά τολύπια (NFT). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα οι μικροσωληνίσκοι των νευρικών κυττάρων να χάνουν την σταθερότητα τους, καταρρέει το σύστημα μεταφοράς θρεπτικών συστατικών, να υπάρχει ανεπαρκής επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων με αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο (Ballatore et al., 2007). Σε μακροσκοπικό επίπεδο, οι αμυλοειδείς πλάκες και τα νευροϊνιδικά τολύπια αρχίζουν να εμφανίζονται στον ενδοκρινικό φλοιό και εκτείνονται μέχρι τον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή (Braak et al., 1991), ενώ στα τελευταία στάδια η καταστροφή των νευρώνων εμφανίζεται στον εγκεφαλικό φλοιό (Εικόνα 13). 5.3 Σελήνιο (Se) και νόσος του Alzheimer (AD) Το σελήνιο είναι ένα ζωτικής σημασίας στοιχείο, με το οποίο είναι εμπλουτισμένος ο εγκέφαλος. Τα επίπεδα του μειώνονται με την ηλικία και συγκεκριμένα χαμηλά επίπεδα σεληνίου έχουν συνδεθεί με νοητική δυσλειτουργία και την νόσο Alzheimer. Μελέτες έχουν δείξει ότι σε ασθενείς 30

31 με AD τα επίπεδα του σεληνίου στον εγκέφαλο είναι αυξημένα στον ιππόκαμπο σε σχέση με υγιείς ασθενείς (Leite et al., 2008). Βραχυπρόθεσμη χορήγηση σεληνίου σε επίμυες με άνοια έδειξε ότι βελτιώνει την απώλεια μνήμης και μειώνει την TAU φωσφορυλίωση. Στο σελήνιο έχουν αποδοθεί νευροπροστατευτικές ιδιότητες, αν και ο βασικός μηχανισμός δεν έχει διευκρινιστεί (Gwon et al., 2010; Reeves et al., 2010). Στην νόσο του Alzheimer, αυξημένα επίπεδα λιπιδικής υπεροξείδωσης ανιχνεύθηκαν σε ευπαθείς περιοχές του εγκεφάλου. Η 4-υδροξυενενάλη (ΗΝΕ) είναι ένα από τα κύρια προϊόντα λιπιδικής υπεροξείδωσης και θεωρείται υπεύθυνη για περαιτέρω βλάβη των εγκεφαλικών ιστών σε ασθενείς με Alzheimer (Zarkovic, 2003). Η σχέση μεταξύ της 4-υδροξυενενάλης και της β- αμυλοειδούς πρωτεΐνης είναι αμοιβαία. Σε ασθενείς με AD οι οποίοι έχουν τον γονότυπο ε4/ε4 (ομοζυγωτικά αλλήλια) της απολιποπρωτεΐνης Ε (ΑpoE) τα επίπεδα της ΗΝΕ ήταν υψηλοτέρα σε σχέση με ασθενείς που είχαν άλλους γονότυπους (Montine et al., 1997). Από την άλλη πλευρά, η ΗΝΕ μπορεί να επηρεάσει την β-σεκρετάση η οποία συμμετέχει στην διαδοχική ενδοπρωτεολυτική διάσπαση της ΑβPP (πρόδρομο της β-αμυλοειδούς πρωτεΐνης στο χρωμόσωμα 21) σε Αβ, η οποία με την σειρά της δημιουργεί τις αμυλοειδείς πλάκες και οδηγεί σε έναν κύκλο αυτοενίσχυσης (Esler et al., 2001; Vassar, 2005). Το σεληνιώδες νάτριο αναφέρεται ότι μπλοκάρει την επαγωγή της β-σεκρετάσης από την ΗΝΕ και επομένως μειώνει τα επίπεδα της Αβ (Gwon et al., 2010). I.6 Crocus sativus 6.1 Το όνομα, η προέλευση και η ιστορία του C. sativus. Κρόκος είναι το παραδοσιακό όνομα για τα στίγματα των ανθών του Crocus sativus L το οποίο ανήκει στην οικογένεια Iridaceae. Το γένος Crocus περιλαμβάνει περίπου 85 είδη. Το φυτό είναι βολβώδες και καλλιεργείται επί χιλιετίες. Η ακριβής προέλευση του φυτού και η περιοχή καλλιέργειας του δεν είναι γνωστή. Μπορεί να προήλθε από την Μεσοποταμία ή την Αίγυπτο και θα μπορούσε να είχε εξελιχθεί από έναν η περισσοτέρους προγόνους. Ένας από αυτούς ήταν πιθανώς ο Crocus cartwrightianus. Μια σαφής αναγνώριση του κρόκου χρονολογείται το π.χ. σε τοιχογραφίες στο παλάτι του Μίνωα, στην Κνωσό της Κρήτης, οι οποίες απεικονίζουν γυναίκες να συλλέγουν τον κρόκο γνωστές ως κροκοσυλλέκτριες (Carmona et al., 2006) (Εικόνα 14). 31

32 Εικόνα 14: Τοιχωγραφία Μινωικής εποχής. 6.2 Ο Crocus sativus και η καλλιέργεια του Η περιοχή όπου αναπτύσσεται εξαπλώνεται από την Μεσόγειο θάλασσα μέχρι την Ινδία, το Θιβέτ και την Κίνα. Πρόσφατα, νέες καλλιέργειες δημιουργήθηκαν στο Μεξικό και την Αυστραλία. Η παγκόσμια συνολική ετήσια παραγωγή κρόκου εκτιμάται στους 205 τόνους, με μεγαλύτερη προέλευση από το Ιράν. Στην Ευρώπη, η Ισπανία θεωρείται η χώρα με την μεγαλύτερη παραγωγή με ετήσιες εξαγωγές που φτάνουν περίπου τους 60 τόνους. Όμως, λόγω του ότι η συλλογή του κρόκου είναι μια ακριβή και χρονοβόρα διαδικασία, το μεγαλύτερο μέρος του κρόκου που επανεξάγεται από την Ισπανία είναι στην πραγματικότητα από το Ιράν και το Μαρόκο. Στην πραγματικότητα, η κυριότερη παραγωγός χώρα είναι η Ελλάδα, με ετήσια παραγωγή 4,5 τόνους, ένας αριθμός που σύμφωνα με το δεύτερο διεθνές συμπόσιο για την βιολογία και τεχνολογία του κρόκου (Ιράν, Οκτωβρίου 2006) είχε παραμείνει σταθερό τα τελευταία χρόνια και μακράν ξεπερνά την τρέχουσα ισπανική παραγωγή. Η μείωση παραγωγής κρόκου στην Ευρώπη φαίνεται ότι σχετίζεται με το υψηλό εργατικό κόστος, μιας και η καλλιέργεια του κρόκου απαιτεί αξιόλογη προσπάθεια για τη συντήρηση της, ενώ ακόμη περισσότερη απαιτείται κατά την συγκομιδή του προϊόντος. Η επαναεξαγωγή και η επανασήμανση του κρόκου πιθανώς συμβάλει στην διαπίστωση μιας σχετικά ομοιόμορφης ποιότητας κρόκου ανεξάρτητα από το σήμα προέλευσης. Οι νοθεύσεις είναι συχνές: τουλάχιστον 30% από τα δείγματα κρόκου δεν πληρούν τις προϋποθέσεις ποιότητας ή θεωρούνται απόβλητα προϊόντα (Hensel et al., 2006). 32

33 6.3 Γένος Crocus: Γενικά χαρακτηριστικά Ο κρόκος είναι πολυετές, ποώδες φυτό το οποίο έχει ύψος 10 με 25 εκατοστά, δεν αναπτύσσει καρπούς, ο πολλαπλασιασμός του όμως γίνεται μέσω των βολβών οι οποίοι φυτεύονται κατά τους μήνες Ιούλιο-Αύγουστο. Τα άνθη εμφανίζονται κατά τον Σεπτέμβριο-Οκτώβριο του επόμενου έτους. Το φυτό ανθίζει το φθινόπωρο όταν όλα τα άλλα φυτά ετοιμάζονται να προστατευτούν από τις κακουχίες του χειμώνα, μειώνει την δραστηριότητα του την άνοιξη και παραμένει αδρανές το καλοκαίρι. Τα ιδιαίτερα βοτανικά χαρακτηριστικού αυτού του κρόκου είναι: 1. Οι βολβοί. Έχουν διάμετρο 5-7 εκατοστά, σφαιρικό σχήμα που μοιάζει με κρεμμύδι και προστατεύονται από ινώδη δικτυωτούς χιτώνες. 2. Τα άνθη. Βγαίνουν ένα μέχρι και τρία άνθη από κάθε βολβό που σχηματίζουν μικρά ανορθωμένα χωνάκια. Αποτελούνται από 6 βιολετί πέταλα, τρία εσωτερικά και τρία εξωτερικά, ενωμένα με έναν μακρύ σωλήνα ο οποίος ξεκινά από την κορυφή της ωοθήκης, τρεις κίτρινους στήμονες που προκύπτουν από την κορυφή του προαναφερθέντος σωλήνα και τον στύλο, που χωρίζεται σε τρία στίγματα. Τα στίγματα ειδικότερα, που αποτελούν και την δρόγη του φυτού, έχουν κόκκινο προς το πορτοκαλί στιλπνό χρώμα, έχουν μήκος 25 με 32 χιλιοστά το οποίο είναι δυσανάλογο σε σύγκριση με τα άλλα όργανα του, έτσι τα στίγματα πολλές φορές κρέμονται έξω από το λουλούδι. 3. Τα φύλλα. Τα φύλλα του, μεταξύ 5 και 11 στον αριθμό, που βγαίνουν απ' ευθείας από το βολβό, είναι καταπράσινα με μια λευκή ζώνη στην μέση, σπαθωτά και γραμμωτά, αναπτύσσονται δε κατά τη διάρκεια του χειμώνα και φθάνουν την άνοιξη τα 50 εκατοστά, οπότε και θερίζονται λίγο πριν ξεραθούν (Carmona et al., 2006) (Εικόνα 15). 33 Εικόνα 15: Μορφολογικά χαρακτηριστικά του κρόκου.

34 Η περίοδος συλλογής είναι το φθινόπωρο, όταν τα άνθη είναι ανοιχτά και διαρκεί 3-4 εβδομάδες. Τα άνθη συλλέγονται νωρίς το πρωί με τα χέρια και με τον ίδιο τρόπο αποχωρίζονται οι λοβοί (στίγματα) (Εικόνα 16). Η ξήρανση γίνεται σε σκοτεινά δωμάτια που θερμαίνονται με προοδευτικά ανερχόμενη θερμοκρασία έως τους 40 ο C για 8-12h και σχετική υγρασία 50% (Tsimidou et al., 2004). Η σωστή ξήρανση διατηρεί αναλλοίωτες τις χαρακτηριστικές του ιδιότητες (χρώμα και άρωμα) ενώ παράλληλα βελτιώνεται η ποιότητα του, χωρίς να αποβάλλει τη χρωστική του δύναμη και το αιθέριο έλαιο του (Εικόνα 17). Η ποσότητα των λουλουδιών που απαιτούνται για την παραγωγή 1kg κρόκου κυμαίνεται από έως Εικόνα 16: Συγκομιδή των λουλουδιών και διαχωρισμός στιγμάτων και στημόνων από τα τέπαλα. Εικόνα 17: Ξήρανση και διαλογή του κρόκου. Μοναδική κροκοκαλλιεργούμενη περιοχή της χώρας μας είναι η περιοχή της Κοζάνης, σε μερικά χωριά της οποίας (Κρόκος, Καρυδίτσα, Αγία Παρασκευή, Άνω Κώμη, Κάτω Κώμη, Λευκοπηγή, 34

35 Πετρανά) γίνεται από τον 17 ο αιώνα συστηματική καλλιέργεια του φυτού. Ύστερα δε από τις κατά καιρούς αυξομειώσεις των καλλιεργούμενων εκτάσεων και αφού απειλήθηκε η εξαφάνισή της, κατά τα πρώτα μεταπολεμικά χρόνια ( ) καλύπτει σήμερα γύρω στα 3,000 στρέμματα από τα οποία 1,000 στρέμματα είναι βιολογικής καλλιέργειας και βρίσκονται κατανεμημένα στις κτηματικές περιοχές του Ν.Κοζάνης. Η ετήσια παραγωγή κατά τα τελευταία χρόνια, ήταν γύρω στα 1,200 2,000 κιλά κόκκινου κρόκου. 6.4 Οι χρήσεις του κρόκου Ο Crocus sativus είναι γνωστός από την αρχαιότητα. Στην Μεσοποταμία χρησιμοποιούνταν ως καρύκευμα, σε θρησκευτικές τελετές και γιορτές και ακόμη ως βαφή για τα ρούχα (Pérez, 1995). Σε ολόκληρη την ιστορία το χρώμα του κρόκου ήταν πάντα σύμβολο σοφίας και πνευματικότητας. Οι Αιγύπτιοι και οι Εβραίοι συνήθιζαν να τον χρησιμοποιούν για τον καθαρισμό των ναών (Capel and Girbes, 1988) ενώ στην Ινδία τον χρησιμοποιούσαν στις θρησκευτικές τελετές και ως καλό οιωνό στο μέτωπο (Madan et al., 1965; Alarcón and Sánchez, 1968). Ειδικοί στις αρχαίες βαφές δηλώνουν ότι ο κρόκος δεν χρειαζόταν στερεωτικό χρώματος, ήταν μεγάλης διάρκειας και χρησιμοποιούταν για την βαφή μαλλιού και δέρματος (Boisvert and Acuante, 1993). Οι πολιτικοί και θρησκευτικοί ηγέτες έβαφαν τους χιτώνες τους με τον κρόκο. Εξαιτίας του συναρπαστικού του χρώματος οι γυναίκες το χρησιμοποιούσαν και ως καλλυντικό για να προσελκύουν το ενδιαφέρον των αντρών. Η Κλεοπάτρα (69-30 π.χ) τον χρησιμοποιούσε σε καλλυντικά σκευάσματα και για να βάφει τα νύχια, τα μαλλιά και τα χείλη της. Οι Ρωμαίοι το χρησιμοποιούσαν στην σύνθεση αρωμάτων. Οι θεραπευτικές ιδιότητες του κρόκου ήταν γνωστές από την αρχαιότητα. Ο κρόκος αναφέρεται στο πιο σημαντικό Αιγύπτιο ιατρικό πάπυρο, ως φάρμακο για προβλήματα στα νεφρά ενώ ο Ιπποκράτης ( π.χ.) τον συνιστούσε για την αντιμετώπιση πολλών ασθενειών. Γενικά, ο κρόκος καθώς και το εκχύλισμα του, χρησιμοποιήθηκε στην παραδοσιακή ιατρική ως εφιδρωτικό, αποχρεμπτικό, διεγερτικό, αφροδισιακό, εμμηναγωγό, εκτρωτικό καθώς και στην ομαλή λειτουργία του πεπτικού συστήματος (Basker and Negbi, 1983; Rios et al., 1996). Ακόμη 35

36 χρησιμοποιήθηκε για την θεραπεία οφθαλμικών και δερματικών παθήσεων, πληγών, καταγμάτων, στην πρόληψη της πανούκλας και άλλων επιδημιών, στην θεραπεία της αναιμίας, των ημικρανιών, του βήχα και της φυματίωσης. Μεταξύ του 17 ου και 19 ου αιώνα, η χρήση του κρόκου για τα θεραπευτικά του χαρακτηριστικά μειώθηκε σταδιακά έως ότου σταμάτησε να χρησιμοποιείται στην Δύση. Αναμφισβήτητα, η πιο σημαντική χρήση του κρόκου σήμερα είναι στο φαγητό, λόγω του λεπτού αρώματος, της ευχάριστης γεύσης και του εκπληκτικού κίτρινου χρώματος που ενισχύει την γευστικότητα. Είναι το πιο ακριβό μπαχαρικό στον κόσμο και για αυτό και ονομάζεται Κόκκινος Χρυσός. Αποτελεί κύριο συστατικό σε μερικά από τα πιο γνωστά πιάτα της Μεσογείου όπως: το Rissoto alla Milanese στην Ιταλία, η Bouillabaisse στην Γαλλία και η Paella Valenciana στην Ισπανία και κύριο υλικό σε αρτοπαρασκευάσματα, γλυκά και στο ψωμί (Pellowe, 1989; Pérez, 1995; Winter and Straubinger, 2000). Στην βιομηχανία, χρησιμοποιείται στην παραγωγή λικέρ, βερμούτ, σε σάλτσες και γαλακτοκομικά προϊόντα (Attri et al., 1993; Sen and Rajorhia, 1994). 6.5 Χημική σύσταση των στιγμάτων του Crocus sativus Η χημική σύσταση των στιγμάτων του Crocus sativus L. έχει μελετηθεί εκτενώς. Υπολογίζονται περισσότερες από 150 πτητικές και αρκετές μη πτητικές ενώσεις (ζεαξανθίνη, λυκοπένιο και διάφορα α- και β- καροτενοειδή), περίπου συστατικά έχουν ήδη ταυτοποιηθεί (Winterhaulter and Straubinger, 2000; Iborra et al., 1992; Tarantilis et al., 1994; Li and Wu, 2002; Bolhasani et al., 2005; Carmona et al., 2007). Οι χρωστικές και τα συστατικά τα οποία προσδίδουν άρωμα στον κρόκο θεωρείται ότι σχηματίζονται κατά την ξήρανση της δρόγης μέσω αποικοδομήσεως ενός υποθετικού C 40 καροτενοειδούς, της πρωτοκροκίνης. Η αρχικά σχηματιζόμενη πικροκροκίνη αποικοδομείται περαιτέρω προς σαφρανάλη. Οι κόκκινοι στιγματικοί λοβοί του Crocus sativus περιέχουν τρεις κύριους μεταβολίτες: την κροκίνη, την πικροκροκίνη και την σαφρανάλη (Εικόνα 18). Οι κροκίνες είναι έντονες κίτρινες χρωστικές και αποτελούν τις σημαντικότερες χρωστικές των στύλων. Είναι μονο-γλυκοζιτικοί ή δι-γλυκοζιτικοί εστέρες της κροκετίνης και αποτελούν ασυνήθιστα υδατοδιαλυτά καροτενοειδή λόγω του υψηλού γλυκοζιτικού περιεχομένου τους (Εικόνα 20). 36

37 Η κροκετίνη είναι ένα πολυενικό δικαρβοξυλικό οξύ το οποίο είναι υδρόφοβο και επομένως διαλυτό στα έλαια. Αποτελείται από 16 άτομα άνθρακα ενώ στις θέσεις C-2, C-6, C-11 και C-15 υπάρχουν διακλαδώσεις με μεθύλια. Ανάλογα με την στερεοδιάταξη στην θέση C-6 απαντάται σε cis- ή σε trans- διάταξη ενώ η εστεροποίηση της γίνεται με μονάδες β-d-γλυκόζης και β-dγεντιοβιόζης. Όταν η κροκετίνη εστεροποιείται με δύο υδατοδιαλυτές γεντιοβιόζες (σάκχαρα), μέσω ενός 1,6-β-γλυκοζιτικού δεσμού προκύπτει ένα υδατοδιαλυτό προϊόν. Προϊόντα υδρόλυσης της κροκίνης είναι η γεντιοβιόζη και η κροκετίνη ενώ της πικροκροκίνης είναι η γλυκόζη και η σαφρανάλη (Εικόνα 19).. Εικόνα 18: Κύρια συστατικά του κρόκου (κροκίνη, πικροκροκίνη, σαφρανάλη). Εικόνα 19: Υδρόλυση πικροκροκίνης. 37

38 Εικόνα 20: Χημική δομή κροκινών, γλυκοζυλεστέρες της κροκετίνης (Tarantilis et al., 1995). 6.6 Απομόνωση και ταυτοποίηση συστατικών Με σκοπό τον χαρακτηρισμό των φυτοχημικών των στιγμάτων του Crocus sativus αποτυπώθηκε η <<εικόνα>> των εκχυλισμάτων με μέθοδο HPLC ανάστροφης φάσης προταθείσα για τους στύλους του C.sativus από τον Tarantilis και του συνεργάτες του (Tarantilis et al., 1995). To εκχύλισμα αναλύθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης πριν και μετα την διαδικασία της συμπύκνωσης, προκειμένου να φανούν και οι πτητικές ουσίες οι οποίες κατά την διάρκεια της ξήρανσης απομακρύνονται σε μεγάλο ποσοστό (Εικόνα 21). Η ταυτοποίηση των συστατικών έγινε με σύγκριση των χρόνων έκλουσης των ενώσεων καθώς της καταγραφείσας απορρόφησης στα 250, 308 και 440nm με τα δεδομένα του Tarantilis και των συνεργατών του. 38

39 Εικόνα 21: HPLC ανάλυση εκχυλίσματος στύλων του C.sativus με 50% μεθανόλη-νερό (απ ευθείας εκχύλιση) στα μήκη κύματος 250 (Α),308 (Β), και 440 nm (Γ), με γνωστή μέθοδο (Tarantillis et al., 1995). Ταυτοποιήση κορυφών: 1. πικροκροκίνη, 2. όξινη μορφή πικροκροκίνης (HTCC), 3. καιμπφερόλη, 4. trans-κροκίνη-5, 5. trans-κροκίνη-4, 6. trans-κροκίνη-3, 7. σαφρανάλη, 8. trans-κροκίνη-2, 9. cis-κροκίνη-5, 10. cis-κροκίνη-5, 11. trans-κροκίνη-2, 12. cisκροκίνη-3, 13. cis-κροκίνη-3, 14. cis-κροκίνη-2 (Διδακτορική διατριβή, Χρυσάνθη, 2010). 39

40 Ανάλυση αφεψήματος Ποσότητα 200 mg κρόκου διαλύθηκε σε 150 ml στους 80 ο C και μετά από φυγοκέντρηση αναλύθηκε με HPLC. Παρατηρήθηκε ότι η εκχύλιση που πραγματοποιείται με νερό 80 ο C σε σχέση με την εκχύλιση με υδατικό διάλυμα μεθανόλης (50% v/v) σε θερμοκρασία δωματίου δεν διαφοροποιείται ουσιαστικά (Πίνακας 1). Η ποσοτικοποίηση των εκχυλιζόμενων κροκινών έδειξε ότι η περιεκτικότητα σε κροκίνες είναι σχεδόν ίδια. Η μόνη διαφορά παρατηρείται στην transκροκίνη-4 η οποία φάνηκε να είναι σε υψηλότερη περιεκτικότητα στο αφέψημα. Επομένως, η υψηλή θερμοκρασία του νερού δεν επηρεάζει τη σταθερότητα των εκχυλιζόμενων κροκινών πιθανά λόγω της σύντομης διάρκειας εκχύλισης (Chryssanthi et al., 2011). Πίνακας 1: Ποσοστά (%) κροκινών που εκχυλίζονται με 50% MeOH αλλά και σε αφεψήματα με νερό, στους 80 ο C για 5min. Οι αναλύσεις επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές. Κροκίνες 50% υδατικής MeOH Aφέψημα κρόκου σε για 4 h νερό 80 o Cγια 5 min Trans-κροκίνη ± ± 0.2 Trans-κροκίνη ± ± 0.4 Cis-κροκίνη ± ± 0.1 Trans-κροκίνη ± ± 0.2 Cis-κροκίνη ± ± 0.2 Cis-κροκίνη ± ± 0.3 Η ουσία η οποία είναι υπεύθυνη για την πικρή γεύση του κρόκου είναι η πικροκροκίνη, ένας β- D-γλυκοζίτης, o οποίoς μετατρέπεται στην σαφρανάλη με θερμική ή ενζυματική υδρόλυση κατά την διαδικασία ξήρανσης (Himeno and Sano, 1987; Lozano et al., 1999). Η σαφρανάλη, είναι το κύριο συστατικό του αιθέριου ελαίου, όπου και οφείλεται η χαρακτηριστική μυρωδιά του κρόκου. Άλλες ενώσεις που περιέχονται στον κρόκο είναι φλαβονοειδή, βιταμίνες (συγκεκριμένα ριβοφλαβίνη και θειαμίνη), αμινοξέα, πρωτεΐνες, άμυλο και μέταλλα (Mn, Cu, K, Na, Fe) (Rios et 40

41 al., 1996; Winterhaulter and Straubinger, 2000; Abdullaev, 2002; Diaz-Marta et al., 1998; Bhat and Broker, 1953). Η διαδικασία συλλογής και ξήρανσης μπορεί σημαντικά να επηρεάσει την γεύση και το άρωμα του κρόκου. Ένας καλής ποιότητας κρόκος περιέχει περίπου 30% κροκίνες, 5 με 15% πικροκροκίνη και συνήθως 2,5% πτητικές ενώσεις συμπεριλαμβανομένης της σαφρανάλης (Schmidt et al., 2007). Είναι σημαντικό να τονίσουμε ότι οι κροκίνες ανιχνεύθηκαν και στα λιγότερα ακριβά φρούτα Gardenia (Umetami et al., 1980; Kamikura and Nakazato, 1985; Ichi et al., 1995). Εξαιτίας των περιορισμένων πηγών κρόκου σε διάφορα μέρη του κόσμου, για παράδειγμα στην Κίνα, κάποιες ερευνητικές ομάδες για να αποφύγουν το υψηλό σε κόστος κρόκο εκχύλισαν κροκετίνη και κροκίνη από το φυτό Gardenia Jasminoides Ellis (Kamikura and Nakazato, 1985; Wang et al., 1984) για να τις χρησιμοποιήσουν στις μελέτες τους (Wang et al., 1984; Lin and Wang, 1986). Γνωρίζουμε ότι και τα δύο φυτά περιέχουν τους ίδιους εστέρες κροκετίνης αλλά σε διαφορετική αναλογία. Η πιο σημαντική διαφορά είναι ότι τα στίγματα του Crocus sativus περιέχουν πικροκροκίνη και σαφρανάλη σε αντίθεση με τα φρούτα Gardenia Jasminoides (Carmona et.al., 2006). 6.7 Μελέτες για βιολογική δράση των συστατικών του Crocus sativus Επίδραση του κρόκου στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (Κ.Ν.Σ) Αντικαταθλιπτική δράση Τα κλινικά αποτελέσματα της ομάδας του Akhondzadeh s έδειξαν ότι ο κρόκος είναι ένα ασφαλές και αποτελεσματικό αντικαταθλιπτικό. Για παράδειγμα, σε μια διπλά τυφλή δοκιμή ασθενείς έλαβαν μια δόση κρόκου (30 mg/ημέρα) ή μια δόση ιμιπραμίνης (100 mg/ημέρα) για 6 εβδομάδες. Ο κρόκος σε αυτή την ποσότητα ήταν τόσο αποτελεσματικός στην θεραπεία της ήπιας έως μέτριας κατάθλιψης όσο η ιμιπραμίνη, χωρίς καμία εμφανή παρενέργεια (Akhondzadeh et al., 2004; 2005). Η ίδια δράση παρατηρήθηκε και σε ποντίκια (Hosseinzadeh et al., 2004). 41

42 Σε περαιτέρω προκαταρκτικές μελέτες, ο κρόκος (30 mg/ημέρα για 6 εβδομάδες) συγκρίθηκε με την φλουοξετίνη (Prozac, 20 mg/ημέρα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο κρόκος ήταν αποτελεσματικός τόσο στην κατάθλιψη (ήπια έως μέτρια) όσο και στην επιληψία (Noorbala et al., 2005). Αντισπασμωδική δράση Έρευνες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι το εκχύλισμα του κρόκου καθώς και των πετάλων του έχει αντισπασμωδική δράση (Hosseinzadeh and Talebzadeh, 2005). Σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο όπου χρησιμοποιήθηκε πεντυλενετετραζόλη (PTZ), ένας επαγωγέας σπασμών, η σαφρανάλη έδειξε αντισπασμωδική δράση. Συγκεκριμένα, η σαφρανάλη μείωσε την διάρκεια των επιληπτικών κρίσεων, καθυστέρησε την έναρξη των τονικών σπασμών και προστάτευσε τα πειραματόζωα από τον θάνατο σε αντίθεση με την κροκίνη η οποία δεν έδειξε τέτοια δράση (Hosseinzadeh and Sadeghnia, 2005). Τα αποτελέσματα περαιτέρω ερευνών κατέδειξαν την ευεργετική δράση της σαφρανάλης στο μοντέλο PTZ, πιθανώς μέσω του υποδοχέα του συστήματος GABA-βενζοδιαζεπίνης (Hosseinzadeh and Sadeghnia, 2007). Νευροπροστατευτική δράση Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν έδειξαν ότι η κροκίνη δεν έχει μόνο αντιαποπτωτική δράση έναντι των κυττάρων με φαιοχρωμοκύττωμα (PC-12) αλλά αποτρέπει τον θάνατο τους που προκαλείται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κροκίνη αναστέλλει τον θάνατο των νευρώνων ο οποίος προκαλείται από εξωτερικά και εσωτερικά αποπτωτικά ερεθίσματα σε υψηλά διαφοροποιημένα κύτταρα (νευρώνες) (Soeda et al., 2001). Περαιτέρω έρευνες έδειξαν ότι η κροκίνη ενισχύει την δράση της αναγωγάσης του γλουταθείου και της γ-γλουταμυλοκυστεινυλικής συνθετάσης (γ-gcs), συμβάλλοντας σε μια σταθερή παροχή γλουταθείου, το οποίο με τη σειρά του αναστέλλει την δράση της σφιγγομυελινάσης (nsmase), ενζύμου της μεμβράνης στα PC-12 κύτταρα σε συνθήκες απουσίας γλυκόζης και ορού. Επιπλέον, η κροκίνη αποτρέπει την παραγωγή κεραμιδίου και την φωσφορυλίωση της κινάσης JNK. Η αντιοξειδωτική δράση της κροκίνης είναι μεγαλύτερη από αυτή της α-τοκοφερόλης και αποτρέπει τον σχηματισμό υπεροξειδωμένων λιπιδίων και μερικώς αποκαθιστά την δράση της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD) (Ochiai et al., 2004). 42

43 Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν στον ιππόκαμπο πειραματόζωων διερεύνησαν την επίδραση σαφρανάλης έναντι της οξειδωτικής καταστροφής που προκλήθηκε από ισχαιμική επαναιμάτωση (I/R). Τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας (μέθοδος FRAP) καθώς και μείωση στα επίπεδα της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) στον ιππόκαμπο λόγω της χορήγησης σαφρανάλης σε σύγκριση με την ισχαιμική ομάδα ελέγχου (Hosseinzadeh et al., 2005). Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε μοντέλο οξείας εγκεφαλικής ισχαιμίας πειραματόζωων στα οποία χορηγήθηκε εκχύλισμα κρόκου, επτά ημέρες πριν την μέση απόφραξη αρτηρίας (MCAO), έδειξαν την επίδραση του εκχυλίσματος στα επίπεδα της MDA, της υπεροξειδάσης του γλουταθείου, της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD) και της καταλάσης (CAT) (Saleem et al., 2006). Σε πρόσφατες μελέτες επιβεβαιώθηκε ότι η νευροπροστατευτική δράση του κρόκου οφείλεται κυρίως στην κροκίνη-1, η οποία μπορεί σημαντικά να μειώσει τα εγκεφαλικά ισχαιμικά έμφρακτα τα οποία προκαλούνται από την απόφραξη της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας (MCA) (Zheng et al., 2007). Αρκετές έρευνες πραγματοποιήθηκαν για την επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου, της κροκίνης και της κροκετίνης έναντι προβλημάτων μνήμης και μάθησης. Τα αποτελέσματα δείχνουν την θετική δράση της χορήγησης κρόκου και των συστατικών του σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές και σχετικά προβλήματα μνήμης (Sugiura et al., 1994; Abe and Saito, 2000). Ακόμη αποδεικνύεται η αποτελεσματικότητα του εκχυλίσματος κρόκου στην πρόληψη της μακροπρόθεσμης αύξησης τοξικότητας η οποία προκαλείται από την ακεταλδεΰδη, έναν μεταβολίτη της αιθανόλης (Abe et al., 1999). Καθώς οι προηγούμενες μελέτες έγιναν in vivo, σε μια in vitro έρευνα παρατηρήθηκε ο καθοριστικός ρόλος της κροκίνης στην πρόληψη του μηχανισμού μακροπρόθεσμης αύξησης τοξικότητας, η οποία προκαλείται από χορήγηση αιθανόλης (Sugiura et al., 1995). Η επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου (30 και 60 mg/kg) μελετήθηκε επίσης στην μνήμη επίμυων μέσω της αναγνώρισης αντικειμένων. Η χορήγηση SE έδειξε ότι μπορεί να διαμορφώνει την αποθήκευση ή/και την ανάκτηση πληροφοριών. Τα αποτελέσματα έδειξαν την 43

44 συμμετοχή της κροκίνης στους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την αναγνώριση και την χωρική μνήμη (Pitsikas et al., 2007). Σε έρευνα που πραγματοποιήθηκε στα Τμήματα Βιολογίας και Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, μελετήθηκε η επίδραση εκχυλίσματος κρόκου (60 mg/kg σωματικού βάρους) στις διεργασίες της μνήμης και μάθησης σε ενήλικες και ηλικιωμένους μύες μέσω ελέγχου της ικανότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) της κασπάσης-3 και της οξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου αυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βραχυπρόθεσμη χορήγηση του εκχυλίσματος κρόκου τόσο στους υγιείς ενήλικες όσο και στους ηλικιωμένους μύες ενίσχυσε σημαντικά την γνωστική απόδοση στο τεστ παθητικής αποφυγής μειώνοντας τους δείκτες οξειδωτικού στρες του εγκεφάλου (μειωμένη λιπιδική υπεροξείδωση, υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα στον ολικό εγκέφαλο και μειωμένα επίπεδα της 3-κασπάσης) σε αντίθεση με την AChE η οποία ήταν μειωμένη μόνο στους ενήλικες επίμυες. Έτσι προτάθηκε για πρώτη φορά ότι η θετική επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου σε ηλικιωμένους επίμυες συσχετίζεται με την αντιοξειδωτική προστασία (Papandreou et al., 2011). Έρευνες πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο μας in vitro για την επίδραση του Crocus sativus και των καροτενοειδών του στη συσσώρευση του αμυλοειδούς πεπτιδίου. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν τη σημαντική ανασταλτική δράση του εκχυλίσματος κρόκου στο σχηματισμό των αμυλοειδών πλακών με χρονο-εξαρτώμενο και εξαρτώμενο από την συγκέντρωση τρόπο. Η σύγκριση των συστατικών έδειξε ότι η trans-κροκίνη-4, το κύριο καροτενοειδές συστατικό, αναστέλλει την συσσωμάτωση του Αβ αμυλοειδούς σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από την διμέθυλο-κροκετίνη (Papandreou et al., 2006). Μελέτες που έγιναν για το νευροτροποποιητικό αποτέλεσμα της κροκετίνης σε μοντέλο επίμυων στους οποίους προκλήθηκε Parkinson με χορήγηση 6-υδροξυ-ντοπαμίνης (6-OHDA) έδειξαν τις προληπτικές και θεραπευτικές δυνατότητες της κροκετίνης έναντι της νόσου του Parkinson. Η ενίσχυση του αντιοξειδωτικού συστήματος, η μείωση δευτερογενών προϊόντων της υπεροξείδωσης λιπιδίων (TBARS) και η σημαντική μείωση της ντοπαμίνης και των μεταβολιτών της υποδεικνύουν τον ρόλο της κροκετίνης ως αναστολέα μια σειράς από γεγονότων που οδηγούν σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες (Ahmad et al., 2005). Ιστοπαθολογικές μελέτες απέδειξαν τον σημαντικό εκφυλισμό των νευρώνων στους προσβεβλημένους επίμυες και την νευροπροστατευτική δράση της κροκετίνης στις ομάδες που την έλαβαν. 44

45 Δράση στην αντίσταση στην ινσουλίνη Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν σε απομονωμένα λιποκύτταρα επίμυων στα οποία προκλήθηκε αντίσταση στην ινσουλίνη με χορήγηση παλμιτικού οξέος απέδειξαν ότι οι ανωμαλίες που προκαλούνται λόγω της αντίστασης στην ινσουλίνη μειώθηκαν μετά από χορήγηση κροκετίνης (Xi et al., 2007). Δράση στις καρδιαγγειακές παθήσεις και στην αθηροσκλήρωση Η κροκίνη και η κροκετίνη σε μελέτες που έγιναν σε πειραματόζωα τα οποία έλαβαν τροφή πλούσια σε λίπη (αραβοσιτέλαιο) έδειξαν μείωση των τριγλυκεριδίων στον ορό (Lee et al., 2005). Η κροκίνη σε μια θεραπεία 10 ημερών ( mg/kg) μείωσε σημαντικά τα επίπεδα τριγλυκεριδίων στον ορό, την συνολική χοληστερόλη, τις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και τις λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL) (Sheng et al., 2006). Ακόμη, αποδείχθηκε η υποτριγλυκεριδαιμική και υποχοληστερολαιμική της δράση σε ορτύκια τα οποία ακολουθούσαν διατροφή πλούσια σε λίπη (He et al., 2005). Η κροκετίνη επίσης, μείωσε την LDL και την χοληστερόλη στα ορτύκια (He et al., 2007). Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο έδειξαν ότι η χορήγηση 50 mg κρόκου διαλυμένου σε 100 ml γάλα, 2 φορές την ημέρα, μείωσε σημαντικά τους μηχανισμούς οξείδωσης των λιποπρωτεϊνών, οι οποίοι αποτελούν βασικές αιτίες εμφάνισης της στεφανιαίας νόσου. Με βάση τα αποτελέσματα συμπέραναν ότι ο κρόκος είναι ευεργετικός στις καρδιαγγειακές νόσους, πιθανόν εξαιτίας των αντιοξειδωτικών του ιδιοτήτων (Verma and Bordia, 1998). Στην Κίνα, χρησιμοποιήθηκε ένα δισκίο πολύ-γλυκοζίτη το οποίο περιείχε πολλά συστατικά του κρόκου, μεταξύ των οποίων ήταν η κροκίνη ως το κύριο συστατικό, για την θεραπεία της στεφανιαίας νόσου και της στηθάγχης (Xi., 2007). Η κροκετίνη έχει δείξει ευεργετική δράση στην θεραπεία της αθηροσκλήρωσης σε πειράματα που έγιναν σε κουνέλια, επίμυες και ορτύκια (Giassio, 2004; He et al., 2007; Zheng et al., 2006; Tang et al., 2006; Gainer and Chisolm, 1974; Gainer and Jones, 1975; Pool et al., 1976; Zheng et al., 2005). Η κροκετίνη μείωσε τα επίπεδα των λιπιδίων στον ορό, ανἐστειλε τον σχηματισμό της αορτικής πλάκας και μείωσε την MDA. Έτσι προτάθηκε ότι η κροκετίνη αναστέλλει τον σχηματισμό της αθηροσκλήρωσης λόγω της υπολιπαιδιμικής και αντιοξειδωτικής της δράσης 45

46 (He et al., 2007). Ρυθμίζει την δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων και προστατεύει το μιτοχόνδριο (Xiang et al., 2006). Η προστατευτική δράση της κροκίνης έναντι στην αθηροσκλήρωση μελετήθηκε σε ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής ορτυκιών και βοοειδών (BAEC) και στα λεία μυϊκά κύτταρα τους (SMC) καθώς και σε μακροφάγα πειραματόζωων. Τα αποτελέσματα έδειξαν υπολιπαιδιμική δράση και αναστολή του σχηματισμού της αορτικής πλάκας σε ορτύκια, μείωση της MDA και αύξηση των μειωμένων επιπέδων του NO στον ορό (He et al., 2005). Μελέτες σε κουνέλια απέδειξαν ότι το εκχύλισμα του κρόκου συμβάλει στην προστασία του κολποκοιλιακού κόμβου (AN node) ενάντια της υπερκοιλιακής αρρυθμίας, πιθανόν μέσω ρύθμισης του NO (Khori et al., 2007). Αντικαρκινικές και αντιτοξικές ιδιότητες Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν έδειξαν ότι όλα τα καροτενοειδή του κρόκου παρουσιάζουν διαφορετικούς βαθμούς αντικαρκινικής δραστηριότητας (Abdullaev et al., 2002). Η κροκετίνη ανέστειλε την δημιουργία καρκίνου του λάρυγγα, σε πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε βενζοπυρένιο (Megesh et al., 2005). Επώαση των καρκινικών κυττάρων MCF-7 και MD-MB-231, καρκινικά επιθηλιακά κύταρρα του μαστού, για 48 ώρες με διαφορετικά καροτενοειδή από εκχύλισμα του κρόκου, έδειξε δοσοεξαρτώμενη αναστολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ανεξάρτητη από τους οιστογονικούς υποδοχείς. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής που πραγματοποιήθηκε από την ερευνητική μας ομάδα υποδεικνύουν την ανασταλτική δράση του κρόκου ενάντια στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, ανεξάρτητα από τον βαθμό γλυκοζυλίωσης τους (Chryssanthi et al., 2007). Πλήρης αναστολή ή μείωση της τοξικότητας από χημικές ουσίες παρατηρήθηκε μετά από χορήγηση κρόκου και συστατικών του (Premkumar et al., 2003). Για παράδειγμα, αναφέρεται η προστατευτική δράση του κρόκου έναντι των χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Η αντιγενοτοξική δράση του κρόκου έναντι στην κυκλοφωσφαμίδη αυξήθηκε όταν ο κρόκος συνδυάστηκε με σκόρδο και κουρκουμίνη (Premkumar et al., 2004). 46

47 Αντιοξειδωτική δράση Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος από τα στίγματα του Crocus Sativus σε νερό/μεθανόλη (50/50 v/v) ήταν υψηλότερες από αυτές του εκχυλίσματος της ντομάτας και του καρότου (φρούτα πλούσια σε καροτενοειδή). Ωστόσο, η αντιοξειδωτική δράση της ντομάτας και του καρότου δεν πρέπει να υποτιμάται αφού η συνήθης πρόσληψη αυτών είναι κατά πολύ μεγαλύτερη από αυτή του κρόκου στους ανθρώπους (Papandreou et al., 2006). Το εκχύλισμα κρόκου προστατεύει τα αιμοπετάλια από την συσσωμάτωση και την λιπιδική υπεροξείδωση (Jessie and Krishnakantha., 2005). Μελέτες αναφέρουν ότι το εκχύλισμα των στυλών σε μεθανόλη εμφανίζει υψηλή αντιοξειδωτική δράση σε συγκεντρώσεις πάνω από 2000 ppm. Συγκεκριμένα,η κροκίνη (50 με 65%, σε συγκέντρωση από 500 έως 1000 ppm) έδειξε υψηλή ικανότητα σάρωσης των ελευθέρων ριζών, ενώ η σαφρανάλη έδειξε επίσης υψηλή αντιοξειδωτική δράση, αλλα χαμηλότερη αυτή της κροκίνης (34% σε συγκέντρωση 500 ppm) (Assimopoulou et al., 2005). Έκθεση των PC12 κυττάρων σε γλυκόζη, παρουσία του εκχυλίσματος C.sativus και της κροκίνης, προστάτευσε τα κύτταρα έναντι της επαγόμενης από τη γλυκόζη τοξικότητας μέσω μείωσης της παραγωγής ελευθέρων ριζών (Mousavi et al., 2010). Η κροκετίνη μειώνει την λιπιδική υπεροξείδωση, η οποία προκαλείται από ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS) στα πρωτογενή ηπατοκύτταρα επίμυων (Tseng et al., 1995) και από χορήγηση βενζοπυρενίου (BP) σε πειραματόζωα (Magesh et al., 2006). Σε πρόσφατη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας που πραγματοποιήθηκε με σκοπό την περαιτέρω έρευνα των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του κρόκου έναντι στρεσογόνων καταστάσεων και τον εντοπισμό των βιοενεργών συστατικών, κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) στα οποία προκλήθηκε τοξικότητα με χορήγηση H 2 O 2, επωάστηκαν με εκχύλισμα κρόκου, κροκετίνη και σαφρανάλη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το εκχύλισμα κρόκου και η κροκετίνη παρέχουν ισχυρή προστασία αναστέλλοντας την παραγωγή ROS και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (Papandreou et al., 2011). 47

48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ II. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 48

49 Το οξειδωτικό στρες στο οποίο υπόκεινται τα κύτταρα του οργανισμού μας, με αποτέλεσμα τη φθορά ή καταστροφή τους, αποτελεί μια από τις κύριες αιτίες γήρανσης και ανάπτυξης εκφυλιστικών ασθενειών όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα, ο διαβήτης, ο καρκίνος, η νόσος Alzheimer και η σκλήρυνση κατά πλάκας. Για αυτόν τον λόγο μεγάλο μέρος της ερευνητικής κοινότητας ασχολείται με την μελέτη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων διαφόρων φυτών, εκχυλισμάτων και διατροφικών συμπληρωμάτων. Το σελήνιο (Se) είναι σημαντικό συστατικό πολλών αντιοξειδωτικών ενζύμων. Σε μεγάλες ποσότητες, ωστόσο, είναι ιδιαίτερα τοξικό και καρκινογόνο (Rayman et al., 2012). Το μοντέλο του επαγόμενου μέσω του σεληνιώδους νατρίου καταρράκτη αποτελεί ένα από τα γνωστότερα in vivo μοντέλα για τη μελέτη του καταρράκτη. Το σεληνιώδες νάτριο φαίνεται να εκδηλώνει τη δράση του μέσω της επαγωγής οξειδωτικού στρες στο φακό. Η επίδραση, όμως, του σεληνιώδους νατρίου στον εγκέφαλο δεν έχει μελετηθεί. Ο εγκέφαλος είναι ιδιαίτερα ευάλωτος στην οξειδωτική βλάβη, επειδή χρησιμοποιεί υψηλά επίπεδα οξυγόνου και χαρακτηρίζεται από μεγάλη περιεκτικότητα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Κατά την παρούσα μελέτη επιτελέστηκε το εγχείρημα της μελέτης της επίδρασης της χορήγησης υψηλών συγκεντρώσεων σεληνιώδους νατρίου (μοντέλο καταρρακτογέννεσης) σε εγκεφαλικές περιοχές και στο ήπαρ αναπτυσσόμενων επίμυων. Ένα από τα φυτά της ελληνικής γης το οποίο είναι γνωστό για τις αντιοξειδωτικές του ιδιότητες είναι το φυτό Crocus sativus L. Ο κρόκος, ο <<κόκκινος χρυσός>> όπως αποκαλείται, καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος Κοζάνης για τους αποξηραμένους στύλους του άνθους του. Συγκεκριμένα, η Ελλάδα παράγει ένα από τα καλύτερα είδη κρόκου παγκοσμίως. Αποτελεί μοναδικό προϊόν υψηλής αξίας με πολλές ιδιότητες, που ως σήμερα είναι ευρέως διαδεδομένο κυρίως για τη χρήση του ως καρύκευμα αρίστης ποιότητος. Χημική ανάλυση των στιγμάτων του κρόκου έχει δείξει ότι κύρια συστατικά του είναι ασυνήθιστα υδατοδιαλυτά καροτενοειδή (κροκίνες) ενώ το άγλυκο μέρος τους αποτελεί η κροκετίνη, η οποία ανήκει στην οικογένεια των καροτενοειδών. Σημαντικές ουσίες είναι επίσης η σαφρανάλη (μονοτερπενική αλδεΰδη) και η πικροκροκίνη η οποία προέρχεται από τη γλυκοζυλίωση της σαφρανάλης. Πιθανώς να υπάρχουν και ίχνη φλαβονοειδών, όπως η καιμπφερόλη και η κερσετίνη (Pitsikas et al., 2007). Επιστημονικές έρευνες υποδεικνύουν ότι έχει σημαντικές αντιοξειδωτικές (Mousavi et al., 2010), αντικαρκινικές (Chryssanthi et al., 2009) και νευροπροστατευτικές (Papandreou et al., 2011) ιδιότητες. 49

50 Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης σε επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές (φλοιός, μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα) καθώς και στο ήπαρ, της χορήγησης σε αναπτυσσόμενους επίμυες υψηλών συγκεντρώσεων σεληνιώδους νατρίου (Na 2 SeO 3 ) καθώς και της συγχορήγησης μεθανολικού εκχυλίσματος κρόκου. Συγκεκριμένα εκτιμήθηκε η έκταση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, με προσδιορισμό της μηλονικής διαλδεΰδης, καθώς και η αντιοξειδωτική κατάσταση των εγκεφαλικών περιοχών με το προσδιορισμό της δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων σουπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και καταλάση (CAT) και της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (FRAP). 50

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ III. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 51

52 III.1 Φυτικό Υλικό Χρησιμοποιήθηκαν εμπορικά διαθέσιμα αποξηραμένα στίγματα του Crocus sativus του Αναγκαστικού Συνεταιρισμού Κροκοπαραγωγών Κοζάνης (Εικόνα 22). Έτος συγκομιδής Εικόνα 22: Στίγματα Crocus sativus. III.2 Εκχύλιση Crocus sativus Αποξηραμένα στίγματα Crocus sativus υπεβλήθησαν σε εκχύλιση με διαλύτη μεθανόλη/νερό 50/50 v/v (18ml ανά 250mg δρόγης) για 4h υπό ανάδευση και απουσία φωτός, σε θερμοκρασία δωματίου. Οι συνθήκες αυτές (απουσία φωτός, χαμηλές θερμοκρασίες) επιλέχθηκαν επειδή τα καροτενοειδή -κύρια συστατικά των στύλων του Crocus sativus είναι ιδιαίτερα φωτοευαίσθητα και θερμοευαίσθητα. Στη συνέχεια το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus φυγοκεντρήθηκε για 7 min σε 6000 rpm και υπέστη ξήρανση υπό κενό για 4h. Πριν την χορήγηση του στα πειραματόζωα το εκχύλισμα διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό (διάλυμα NaCl 0,9% w/v) και αποστειρώθηκε μετά από διήθηση σε ειδικά φίλτρα με μεμβράνη διαμέτρου πόρων 0,2μm (Whatman Ltd GE Healthcare, Αγγλία). III.3 Πειραματόζωα Τα πειραματόζωά που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν νεογνά επίμυων (Wistar). Τα νεογνά ζούσαν σε κλουβιά μαζί με τους γονείς τους στους οποίους παρέχονταν τροφή και νερό σε αφθονία και υπό κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας. 52

53 Τα νεογνά χωρίστηκαν σε 4 ομάδες: α) ομάδα μαρτύρων: μάρτυρες (n=9), στην οποία χορηγείται ενέσιμα φυσιολογικός ορός, β) ομάδα Se: ομάδα στην οποία χορηγείται το σεληνιώδες νάτριο (n=8), γ) ομάδα CrSeCr: ομάδα στην οποία χορηγείται το σεληνιώδες νάτριο και το εκχύλισμα του κρόκου πριν και μετά την χορήγηση σεληνιώδους νατρίου (n=9) και δ) ομάδα SeCrCr: ομάδα στην οποία χορηγείται το σεληνιώδες νάτριο και το εκχύλισμα του κρόκου μετά την χορήγηση σεληνιώδους νατρίου (n=8). Σε επίμυες 9 ημερών της ομάδας CrSeCr χορηγήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 60mg εκχυλίσματος κρόκου/kg σωματικού βάρους (Εικόνα 23). Εικόνα 23: Υποδόρια ένεση (subcutaneous injection) σε επίμυ. Εικόνα 24: Ενδοπεριτοναϊκή ένεση (intraperitoneal injection) σε επίμυ. 53

54 Την 10 η ημέρα χορηγήθηκε με υποδόρια ένεση σεληνιώδες νάτριο σε συγκέντρωση 20 μmol/kg σωματικού βάρους Na2SeO3 (Gupta et al., 2003; 2005). Οι ενέσεις που έγιναν στους επίμυες ήταν όγκου 20μL (Εικόνα 23). Την 11 η ημέρα χορηγήθηκαν στην ομάδα SeCrCr με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 60mg εκχυλίσματος κρόκου/kg σωματικού βάρους και την 12 η ημέρα χορηγήθηκαν στις ομάδες SeCrCr και CrSeCr με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 60mg εκχυλίσματος κρόκου/kg σωματικού βάρους (Εικόνα 24). Την 21 η ημέρα οι επίμυες αναισθητοποιήθηκαν με διαιθυλαιθέρα και στη συνέχεια θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό. Μετά τη θυσία απομονωθήκαν οι υπό μελέτη ιστοί (εγκεφαλικός φλοιός, μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα, ήπαρ) και αποθηκεύτηκαν σε βαθιά κατάψυξη. III.4 Κατεργασία των δειγμάτων Οι ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 30mΜ, ph=7,6. H ομογενοποίηση πραγματοποιήθηκε σε ομογενοποιητή glass-teflon (Thomas USA BB287) σε τελική συγκέντρωση 10% w/v. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε rpm για 20 min, στους 4 ο C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρισης, το υπερκείμενο διατηρείται σε βαθιά κατάψυξη. Για τον προσδιορισμό των διαφόρων παραμέτρων πραγματοποιήθηκε αραίωση του φλοιού (100 mg/ml), της παρεγκεφαλίδας (50 mg/ml), του μεσεγκέφαλου (25 mg/ml) και του ήπατος (100 mg/ml) στα 12,5 mg/ml. III.5 Αναλυτικές μέθοδοι Οι παράμετροι που επιλέχθηκαν να προσδιοριστούν είναι η υπεροξείδωση των λιπιδίων μέσω προσδιορισμού της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA), η δραστικότητα της καταλάσης (CAT), της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου (SOD) και η ικανότητα αναγωγής του σιδηρικατιόντος (FRAP). III.5.1 Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων Αρχή μεθόδου Η λιπιδική υπεροξείδωση προσδιορίζεται από δευτερεύοντα προϊόντα, όπως είναι η μηλονική διαλδεΰδη (MDA). Η αντίδραση της MDA με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) έχει ευρέως 54

55 χρησιμοποιηθεί στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων (Εικόνα 25). Η μέτρηση της έντασης φθορισμού στα μήκη κύματος διέγερσης 515 nm και εκπομπής 553 nm παρέχει μεγάλη ευαισθησία (Nurten et al., 2006). Εικόνα 25: Αντίδραση της μηλονικής διαλδεΰδης με το θειοβαρβουτυρικό οξύ. Ο σχηματισμός του προϊόντος MDA-TBA 2 συμβαίνει με μια πυρηνόφιλη προσβολή του C-1 της MDA από τον C- 5 του TBA, με απώλεια ενός μορίου ύδατος και την αντίδραση με ένα δεύτερο μόριο TBA, για τον σχηματισμό του έγχρωμου προϊόντος. Η ένταση του χρώματος του συμπλόκου δείχνει την έκταση της υπεροξείδωσης λιπιδίων. Πειραματική διαδικασία Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: 2,6-δι-τερτ-βουτυλ-4-μεθυλ-φαινόλη (BHT) 99% (Acros Organics) θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) 98% (Acros Organics) υδροξείδιο του νατρίου (NaOH) 99% (Merck) μηλονική διαλδεΰδη 97% (Acros Organics) τριχλωροοξικό οξύ (TCA) 99.5% (Panreac) αιθανόλη 95% (Applichem) Σε 250μL δείγματος ή προτύπων MDA ( μΜ) προστίθενται 25μL διαλύματος BHT (2,6-δι-τερτ-βουτυλ-4-μεθυλ-φαινόλη) 90mM σε αιθανόλη για την αποφυγή περαιτέρω λιπιδικής υπεροξείδωσης (Jentzsch et al., 1996). Με την προσθήκη 12.5 μl διαλύματος 55

56 NaOH (10 mm) τα δείγματα υδρολύθηκαν σε ήπιες αλκαλικές συνθήκες στους 60 0 C για 30min υπό ανάδευση με σκοπό την απελευθέρωση της δεσμευμένης MDA (Grotto et al., 2007, Papandreou et al., 2009). Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες κατακρημνίζονται με την προσθήκη 750μL 10% τριχλωροξικού οξέος. Ακολουθεί παραμονή των δειγμάτων στον πάγο για 15min. Ύστερα τα μίγματα φυγοκεντρούνται (10000g, 15min) και τα υπερκείμενα που λαμβάνονται (~900μL) επωάζονται με 500μL θειοβαρβιτουρικού οξέος (0.8% w/v ΤΒΑ) σε υδατόλουτρο για 90min στους 95 o C. Στα υπερκείμενα (~800μL) στη συνέχεια προστίθεται 1 ml n-βουτανόλης, ακολουθεί ανάδευση, η πάνω φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα και προστίθεται n-βουτανόλη έως και τα 2mL. Στη συνέχεια ακολουθεί μέτρηση του φθορισμού σε μήκος κύματος εκπομπής 553nm (emission wavelenght) και μήκος κύματος διέγερσης 515nm (excitation wavelenght), (excitation slit 15 και emission slit 10) σε φθορισμόμετρο (Perkin Elmer LS55 fluorescence spectrometer). Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης προετοιμάστηκαν πρότυπα διαλύματα MDA εύρους συγκεντρώσεων μμ. Τα δείγματα και τα πρότυπα MDA αναλύθηκαν εις τριπλούν. Τα επίπεδα MDA εκφράστηκαν ως μmol MDA/g ιστού. III.5.2 Μέθοδος προσδιορισμού της ενεργότητας της καταλάσης (CAT) Αρχή μεθόδου Η καταλάση είναι ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο το οποίο απαντά στα περισσότερα αερόβια κύτταρα. Καταλύει την μετατροπή του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε δυο μόρια νερού και οξυγόνο (καταλυτική δράση). Για τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστηριότητας χρησιμοποιείται η περοξειδική της δράση. Η μέθοδος βασίζεται στην περοξειδική δράση του ενζύμου παρουσία των υποστρωμάτων της μεθανόλης και ικανοποιητικής συγκέντρωσης υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η φορμαλδεΰδη που παράγεται προσδιορίζεται φωτομετρικά με τη χρωστική Purpald. Συγκεκριμένα η Purpald σχηματίζει ετεροκυκλικό δικυκλικό μόριο με την αλδεΰδη, το οποίο όταν οξειδωθεί αποκτά ένα μωβ χρώμα (Lars et al., 1988) (Εικόνα 26). καταλυτική δράση: περοξειδική δράση: 56

57 Εικόνα 26: Προσδιορισμός της φορμαλδεΰδης με την χρωστική Purpald. Εικόνα 27: Μικροπλάκα τύπου ELISA (96 well plates). Πειραματική διαδικασία Τα υλικά και τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: διάλυμα φωσφορικού καλίου 100 mm ph 7,0 (KH 2 PO 4 ) 99.5% (Merck) 57

58 διάλυμα φωσφορικού καλίου 25 mm ph 7,5 (KH 2 PO 4 ) 99.5% (Merck) διάλυμα φορμαλδεΰδης 37% (Merck) αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) 99% (Applichem) αλβουμίνη ορού βοοειδούς (BSA) (Pan Biotech GmbH) υδροξείδιο του καλίου (KOH) 85% (Merck) μεθανόλη 99% (Carlo-Erba) υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) 30% (Carlo-Erba) χρωστική Purpald 70 mm 99% (Sigma-Aldrich) υπεριωδικό κάλιο (KIO 4 ) 99% (Alfa Aesar) Η πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: σε μικρόπλακα τύπου ELISA (96-κελίων) προστίθενται 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (100 mm), ph 7,0, 30 μl μεθανόλης, 20 μl διαλύματος φορμαλδεΰδης διαφορετικών συγκεντρώσεων (0-75 μμ) ή διαλύματος καταλάσης εύρους συγκέντρωσης ( μg/ml) ή δείγματος (διαλυμένα σε 25 mm διαλύματος φωσφορικού καλίου, ph 7,5, 1 mm EDTA και 0,1% w/v BSA). Στην συνέχεια προστίθενται 20 μl H 2 O 2 συγκέντρωσης 8.82 M για την έναρξη της αντίδρασης και τα δείγματα επωάζονται στους 25 ο C για 20 min. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 30 μl διαλύματος KOH (10M) για τον τερματισμό της αντίδρασης και 30 μl χρωστικής Purpald (αντιδρά με την αλδεΰδη) και τα δείγματα επωάζονται στους 25 ο C για 10 min. Μετά το πέρας της επώασης προστίθενται 10 μl KIO 4 συγκέντρωσης 220 mm με σκοπό την οξείδωση του δικυκλικού μορίου, τα δείγματα επωάζονται για 5 min και αμέσως μετράται η απορρόφηση στα 540 nm σε φωτόμετρο τύπου ELISA. Για την κατασκευή πρότυπη καμπύλης προετοιμάστηκαν πρότυπα διαλύματα φορμαλδεΰδης εύρους συγκέντρωσης 0-75 μμ. Η ενεργότητα της καταλάσης εκφράστηκε ως nmol/min/mg ιστού. III.5.3 Μέθοδος προσδιορισμού της σουπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) Αρχή μεθόδου Το ένζυμο σουπεροξειδική δισμουτάση απαντάται σε τρεις μορφές ανάλογα με το μέταλλο που περιέχει (Cu/Zn-, Mn-, Fe-SOD). Καταλύει την μετατροπή δυο ριζών σουπεροξειδίου σε μοριακό οξυγόνο και υπεροξείδιο του υδρογόνου. 58

59 Η μέθοδος χρησιμοποιεί την οξειδάση της ξανθίνης, μια φλαβινοπρωτεΐνη που περιέχει μολυβδαίνιο και σίδηρο και οξειδώνει την υποξανθίνη προς ξανθίνη και στη συνέχεια προς ουρικό οξύ. Το μοριακό οξυγόνο, που είναι ο οξειδωτικός παράγοντας και στις δυο αντιδράσεις, ανάγεται προς Η 2 Ο 2 και ρίζες σουπεροξειδίου (Fridovitch et al., 1986). Οι ρίζες σουπεροξειδίου αποτελούν υπόστρωμα για τη SOD. Παράλληλα, οι ρίζες σουπεροξειδίου ανάγουν ένα άλας τετραζολίου σε φορμαζάνη, που απορροφά στην ορατή περιοχή. Επομένως, όσο πιο μεγάλη είναι η δραστικότητα της SOD, τόσο πιο μικρή είναι η συγκέντρωση της φορμαζάνης και συνεπώς η απορρόφηση στα 450 nm (Εικόνα 28). Εικόνα 28: Η μετατροπή της ξανθίνης σε ουρικό οξύ και υπεροξείδιο του υδρογόνου παράγει ρίζες σουπεροξειδίου. Τα ανιόντα σουπεροξειδίου μετατρέπουν το άλας τετραζολίου σε ένα έγχρωμο προϊόν (formazan dye) που απορροφά το φως. Παράλληλα, η δραστικότητα της SOD.- μειώνει τη συγκέντρωση των O 2 και συνεπώς του έγχρωμου προϊόντος. 59

60 Ο προσδιορισμός της σουπεροξειδικής δισμουτάσης έγινε σύμφωνα με το Superoxide Dismutase Assay Kit της Cayman Chemical Company (Cat No , Lot No ). Πειραματική διαδικασία Τα περιεχόμενα του πακέτου προσδιορισμού είναι τα εξής: διάλυμα Α: 50 mμ Tris-HCl, ph 8,0, 0,1 mμ διαιθυλενοτριαμινοπεντοοξικό οξύ (DTPA) και 0,1 mμ υποξανθίνη διάλυμα Β: 50 mμ Tris-HCl, ph 8,0 πρότυπο διάλυμα SOD από ερυθροκύτταρα βοοειδών διάλυμα οξειδάσης της ξανθίνης διάλυμα τετραζολίου Η πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: σε μικρόπλακα τύπου ELISA (96-κελίων) προστίθενται 200 μl διαλύματος τετραζολίου (50 μl διαλύματος τετραζολίου αραιωμένα σε ml του διαλύματος Α), 10 μl προτύπου διαλύματος σουπεροξειδικής δισμουτάσης εύρους συγκέντρωσης 0-0,75 U/ml (20 μl διαλύματος SOD αραιωμένα σε 1.98 ml του διαλύματος Β), ή δειγμάτων (αραιωμένα στο διάλυμα Β) και 20 μl διαλύματος οξειδάσης της ξανθίνης (50 μl οξειδάσης της ξανθίνης αραιωμένα σε 1.95 ml του διαλύματος Β). Τα δείγματα επωάζονται για 20 min σε θερμοκρασία δωματίου και μετράται η απορρόφηση στα 450 nm. Η δραστικότητα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης εκφράστηκε ως U/mg ιστού και υπολογίστηκε με χρήση πρότυπης καμπύλης. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιήθηκε ο τύπος: λόγος LR-y-τεταγμένη κλίση ευθείας παράγοντας αραίωσης Για να βρούμε την τιμή LR διαιρούμε την μέση τιμή των απορροφήσεων του πρώτου προτύπου διαλύματος συγκέντρωσης 0 U/ml με τον εαυτό της και η τιμή που προκύπτει καλείται standard Α. Για να βρούμε την LR της επόμενης συγκέντρωσης διαιρούμε το standard A με την μέση τιμή των απορροφήσεων της. 60

61 Πίνακας 2: Πρότυπα διαλύματα σουπεροξειδικής δισμουτάσης. Πρότυπα SOD Ονομασία A B C D E F G Συγκέντρωση προτύπου (U/ml) Απορρόφηση Απορρόφηση Μέση τιμή απορροφήσεων LR Κάθε πείραμα αναλύθηκε εις διπλούν Για παράδειγμα για το LR του Α θα έχουμε std A=μέση τιμή απορροφήσεων του Α/μέση τιμή απορροφήσεων του Α [(0.2635/0.2635)=1], για το LR του Β θα έχουμε std Β= standard Α/μέση τιμή απορροφήσεων Β [(1/0.1705)=1.545] και ούτω καθεξής. III.5.4 Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας αναγωγής του Fe lll Antioxidant Power, FRAP). (Ferric Reducing Αρχή μεθόδου Η μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας πραγματοποιείται με εκτίμηση των επιπέδων των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών μηχανισμών στον οργανισμό. Η μέθοδος FRAP αποτελεί μια γρήγορη και άμεση φασματοφωτομετρική μέθοδο υπολογισμού της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας διαφόρων βιολογικών δειγμάτων, όπως του πλάσματος. Σε συνθήκες χαμηλού pη η μέθοδος προσδιορίζει την ικανότητα των αντιοξειδωτικών να ανάγουν την άχρωμη οξειδωμένη μορφή [Fe(TPTZ) 2 ] 3+ στο σύμπλοκο μπλε χρώματος [Fe(TPTZ) 2 ] 2+ (Benzie et al., 1996) (Εικόνα 29). 61

62 Εικόνα 29: Αναγωγή του άγχρωμου συμπλόκου [Fe(TPTZ) 2 ] 3+ στο σύμπλοκο μπλε χρώματος [Fe(TPTZ) 2 ] 2+. Πειραματική διαδικασία Τα υλικά και τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl 3 x6h 2 O) (Applichem) ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 300 mm ph 3,6 (Carlo-Erba) 2,4,6-τριπυριδιλο-s-τριαζίνη (TPTZ) 99% (Fluka) ένυδρος θειικός σίδηρος (FeSO 4 x7h 2 O) 99% (Riedel-de Haёn) Αναλυτικά, η πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: σε μικρόπλακα τύπου ELISA (96-κελίων) τοποθετούνται 52 μl ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος, στα οποία προστίθενται 60 μl διαλύματος θειικού σιδήρου (πρότυπες ενώσεις) ή 60 μl δείγματος και τέλος 88 μl του αντιδραστηρίου της FRAP (300 mm ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος, ph 3.6, 10 mm TPTZ και 20 mm FeCl 3 x6h 2 O). Μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου της FRAP μετράται αμέσως η απορρόφηση στα 490nm. Η προσθήκη των δειγμάτων στο αντιδραστήριο της FRAP οδηγεί σε αύξηση της απορρόφησης στα 490 nm. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων εκφράστηκε ως nmol FeSO 4 /g ιστού και υπολογίστηκε με χρήση πρότυπης καμπύλης (Papandreou et al., 2009). 62

63 III.5.5 Ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών-μέθοδος Bradford Η μέθοδος Bradford χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης σε βιολογικά δείγματα. Βασίζεται στην ηλεκτροστατικής φύσης αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με την χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250 σε όξινες συνθήκες, η οποία προκαλεί μετατόπιση της μέγιστης απορρόφησης της χρωστικής από τα 465 στα 595nm (Εικόνα 30). O υπολογισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης ενός αγνώστου δείγματος υπολογίζεται βάσει μιας πρότυπης καμπύλης, η οποία προκύπτει από την απορρόφηση στα 595nm μιας σειράς δειγμάτων που περιέχουν γνωστές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Εικόνα 30: Αντίδραση της χρωστικής ουσίας Coomassie Brilliant Blue G-250 με τις περιεχόμενες πρωτεΐνες των βιολογικών δειγμάτων και σχηματισμός του συμπλόκου πρωτεϊνών-χρωστικής ουσίας. Πειραματική διαδικασία Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: αντιδραστήριο Bradford (Applichem) αλβουμίνη ορού βοοειδούς (BSA) (Pan Biotech GmbH) 63

64 Η πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: σε μικρόπλακα τύπου ELISA (96-κελίων) τοποθετούνται 5 μl δείγματος στα οποία προστίθενται 250 μl αντιδραστηρίου Bradford. Τα δείγματα επωάζονται στους 37 ο C για 45min και στη συνέχεια μετράται η απορρόφηση στα 595 nm. Για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιήθηκε πρότυπο διάλυμα αλβουμίνης ορού βοοειδούς σε τελικές συγκεντρώσεις mg/ml. Στατιστική ανάλυση Για την στατιστική ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα GraphPad Instat 3 for Macintosh. Αρχικά ελέγχθηκε αν τα δείγματα ακολουθούν τη κανονική κατανομή με τα τεστ κανονικότητας Anderson-Darling και Kolmogorov-Smirnov που είναι και τα δύο ECDF (Empirical cumulative distribution function) βασισμένα τεστ. Για τα δεδομένα που ακολουθούν την κανονική κατανομή έγινε έλεγχος υποθέσεων για τη μέση τιμή δύο δειγμάτων με το two-sample t-test. Για τα δεδομένα που δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή χρησιμοποιήθηκε το non-parametric Mann-Whitney. Στατιστικά σημαντική διαφορά, p<0,05. 64

65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 65

66 Ένταση φθορισμού IV.1 Προσδιορισμοί στους μάρτυρες Μέθοδος προσδιορισμού της υπεροξείδωσης λιπιδίων Η υπεροξείδωση λιπιδίων είναι το αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανών. Η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) αποτελεί έναν οξειδωτικό δείκτη, ως κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Αρχικά παρασκευάζεται ένα διάλυμα MDA συγκέντρωσης 1000μΜ με την προσθήκη 8.334μL διαλύματος μηλονικής διαλδεΰδης (97%) σε 1mL αιθανόλης 95% και 49ml ddh 2 O. Στη συνέχεια, παρασκευάζεται ένα διάλυμα MDA συγκέντρωσης 100μΜ με αραίωση του διαλύματος συγκέντρωσης 1000μΜ σε διάλυμα HCl 0.1N. Από το διάλυμα των 100μΜ παρασκευάζονται διαλύματα MDA συγκέντρωσης μμ με διαδοχικές αραιώσεις με ddh 2 O. Η μέθοδος έδειξε καλή γραμμικότητα (R 2 =1) για τα πρότυπα διαλύματα σε εύρος συγκεντρώσεων μm y = x R² = Συγκέντρωση MDA (μm) Γράφημα 1: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού της MDA. Η MDA προσδιορίστηκε φθορισμομετρικά στα 553 nm (μήκος κύματος εκπομπής) μετά από διέγερση στα 515 nm. Τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών περιοχών των μαρτύρων παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Συγκεκριμένα οι τιμές της MDA στον μεσεγκέφαλο είναι σημαντικά υψηλότερες από αυτές στον εγκεφαλικό φλοιό και στη 66

67 παρεγκεφαλίδα. Τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης του ήπατος ήταν σαφώς υψηλότερα από αυτά των εγκεφαλικών περιοχών. Πίνακας 3: Επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων στους ιστούς των μαρτύρων. Συγκέντρωση MDA (μmol/g ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Φλοιός 0.022±0.005 Παρεγκεφαλίδα 0.024±0.003 Μεσεγκέφαλος 0.115±0.004 # Ήπαρ 0.250±0.069 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-παρεγκεφαλίδας (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά παρεγκεφαλίδας-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Πίνακας 4: Βιβλιογραφικές αναφορές στα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε εγκεφαλικές περιοχές μύων και επίμυων. Πηγή βιβλιογραφίας Sathyasaikumar et al., 2007 Vasilopoulou et al., 2011 Bokara et al., 2008 Amara et al., 2009 Τιμή MDA στους μάρτυρες 35 nmol/g ιστού (εγκ.φλοιός), 32 nmol/g ιστού (παρεγκεφαλίδα) (ενήλικοι επίμυες) 3.13±0.22 μmol/g πρωτεΐνης (εγκ.φλοιός), 2.10±0.13 μmol/g πρωτεΐνης (παρεγκεφαλίδα), 1.45±0.08 μmol/g πρωτεΐνης (μεσεγκέφαλος), 1.59±0.16 μmol/g πρωτεΐνης (ήπαρ) (ενήλικοι μύες) 2.3 μmol/g ιστού (εγκ.φλοιός) (20 ημερών επίμυες) 1.1 μmol/g ιστού (παρεγκεφαλίδα) (20 ημερών επίμυες) 82.1±1.78 nmol/g ιστού (παρεγκεφαλίδα) (ενήλικοι επίμυες) 67

68 Μέθοδος προσδιορισμού της ενεργότητας της καταλάσης (CAT) Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν γνωστές συγκεντρώσεις φορμαλδεΰδης 0 έως 75 μm. Τα πρότυπα διαλύματα της φορμαλδεΰδης παρασκευάζονται σε 25 mm διαλύματος φωσφορικού καλίου, ph 7,5, 1 mm EDTA και 0,1% BSA. Η μέθοδος έδειξε καλή γραμμικότητα (R 2 =0.9948) για τα πρότυπα διαλύματα. Γράφημα 2: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού της CAT. Η CAT προσδιορίστηκε φωτομετρικά στα 540 nm. Πίνακας 5: Επίπεδα ενεργότητας καταλάσης στους ιστούς των μαρτύρων. Ενεργότητα CAT (nmol/min/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Φλοιός 0.09±0.03 Παρεγκεφαλίδα 0.44±0.02 Μεσεγκέφαλος 0.11±0.05 Ήπαρ 25.7±3.57 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-παρεγκεφαλίδας (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά παρεγκεφαλίδας-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Μεταξύ των μαρτύρων, τα επίπεδα της καταλάσης του ήπατος ήταν πολύ μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά στις εγκεφαλικές περιοχές. Μεταξύ των εγκεφαλικών περιοχών οι τιμές της CAT στην παρεγκεφαλίδα ήταν υψηλότερες. 68

69 Πίνακας 6: Παρουσιάζονται οι βιβλιογραφικές τιμές μαρτύρων για την μέθοδο CAT. Πηγή βιβλιογραφίας Shati et al., 2011 Atif et al., 2008 Bokara et al., 2008 Τιμή CAT στους μάρτυρες 86.1±3.1 U/g ιστού (ολικό ομογενοποίημα εγκέφαλου)(ενήλικοι μύες, είδος Balb/c) 78.7±1.7 U/g ιστού (ολικό ομογενοποίημα εγκέφαλου) (ενήλικοι μύες, είδος C57BL/6) 6.62±0.32 nmol/min/mg πρωτεΐνης (εγκ.φλοιός) (επίμυες) 4.8 μmol/min/mg πρωτεΐνης (εγκ.φλοιός) (20 ημερών επίμυες) 2.6 μmol/min/mg πρωτεΐνης (παρεγκεφαλίδα) (20 ημερών επίμυες) Μέθοδος προσδιορισμού της σουπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) Ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν γνωστές συγκεντρώσεις σουπεροξειδικής δισμουτάσης 0 έως 75 U/ml. Τα πρότυπα διαλύματα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης παρασκευάζονται σε διάλυμα 50mΜ Tris-HCl, pη=8. Η μέθοδος έδειξε καλή γραμμικότητα (R 2 =0.9973) για τα πρότυπα διαλύματα. LR Γράφημα 3: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού της SOD. Η SOD προσδιορίστηκε φωτομετρικά στα 450 nm. 69

70 Πίνακας 7: Επίπεδα σουπεροξειδικής δισμουτάσης στους ιστούς των μαρτύρων. Ενεργότητα SOD (U/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Φλοιός 0.73±0.06 Παρεγκεφαλίδα 0.51±0.06 Μεσεγκέφαλος 0.33±0.07 # Ήπαρ 8.12±1.14 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-παρεγκεφαλίδας (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά παρεγκεφαλίδας-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Μεταξύ των μαρτύρων, τα επίπεδα της SOD του ήπατος ήταν πολύ μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά στις εγκεφαλικές περιοχές. Πίνακας 8: Παρουσιάζονται οι βιβλιογραφικές τιμές μαρτύρων για την μέθοδο SOD. Πηγή βιβλιογραφίας Agay et al., 2005 Τιμή SOD στους μάρτυρες 43.3±3.0 U/mg πρωτεΐνης (ήπαρ) (επίμυες) Jihen et al., 2009 Shati et al., 2011 Bokara et al., U/mg πρωτεΐνης (ήπαρ) (ενήλικοι επίμυες) 27.7±0.05 U/g ιστού ( ολικό ομογενοποίημα εγκέφαλου) (ενήλικοι μύες, είδος Balb/c) 93.6±0.15 U/g ιστού (ολικό ομογενοποίημα εγκέφαλου) (ενήλικοι μύες, είδος C57BL/6) 0.23 U/mg πρωτεΐνης (εγκ.φλοιός) (20 ημερών επίμυες) 0.21 U/mg πρωτεΐνης (παρεγκεφαλίδα) (20 ημερών επίμυες) 70

71 Απορρόφηση Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας αναγωγής του Fe III (FRAP) Στη μέθοδο FRAP ως πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα FeSO 4 γνωστής συγκέντρωσης (0.01 έως 1 mμ). Η μέτρηση της απορρόφησης στα 490nm για διαφορετικές συγκεντρώσεις FeSO 4 έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή γραμμικότητα (R 2 =0.9980) y = x R² = Συγκέντρωση FeSO 4 x7h 2 O Γράφημα 4: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού αντιοξειδωτικής δράσης δειγμάτων με τη μέθοδο FRAP. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων FeSO 4. Πίνακας 9: Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ιστών των μαρτύρων. nmol FeSO 4 /g ιστού Ιστοί Μάρτυρες Φλοιός 4.80±0.14 Παρεγκεφαλίδα 7.34±0.68 Μεσεγκέφαλος 5.51±0.51 # Ήπαρ 10.46±0.96 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-παρεγκεφαλίδας (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά παρεγκεφαλίδας-μεσεγκέφαλου (p<0,05) 71

72 Απορρόφηση Οι τιμές της FRAP στην παρεγκεφαλίδα είναι υψηλότερες από αυτές στον εγκεφαλικό φλοιό και στον μεσεγκέφαλο, με μεγαλύτερη στατιστική διαφορά μεταξύ φλοιού-παρεγκεφαλίδας (34.58%). Πίνακας 10: Παρουσιάζονται οι βιβλιογραφικές τιμές μαρτύρων για την μέθοδο FRAP. Πηγή βιβλιογραφίας Papandreou et al., 2009 Ghadrdoost et al., 2011 Τιμή FRAP στους μάρτυρες 8.639±0.204 μmol FeSO 4 /g ιστού (ολικό ομογενοποίημα εγκέφαλου) (ενήλικες μύες) 0.28 μmol FeSO 4 /mg πρωτεΐνης (ιππόκαμπος) (ενήλικες μύες) Ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών-μέθοδος Bradford Ως πρότυπη ουσία στη μέθοδο Bradford χρησιμοποιήθηκε η BSA σε συγκεντρώσεις 0.05 έως 1.4 mg/ml. Η μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm για τις διαφορετικές συγκεντρώσεις της BSA έδειξε ότι η μέθοδος παρουσιάζει καλή γραμμικότητα (R 2 =0.9976) y = x R² = Συγκέντρωση BSA (mg/ml) Γράφημα 5: Πρότυπη καμπύλη προσδιορισμού της συγκέντρωσης πρωτεΐνης των δειγμάτων με τη μέθοδο Bradford. Κατασκευάστηκε με τη βοήθεια προτύπων διαλυμάτων BSA. 72

73 Πίνακας 11: Συγκέντρωση περιεχόμενης πρωτεΐνης στους ιστούς των μαρτύρων. mg πρωτεΐνης/mg ιστού Ιστοί Μάρτυρες Φλοιός 19.97±3.36 Παρεγκεφαλίδα 15.85±1.64 Μεσεγκέφαλος 14.30±1.79 # Ήπαρ 123.4±18.5 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-παρεγκεφαλίδας (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ εγκ.φλοιού-μεσεγκέφαλου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά παρεγκεφαλίδας-μεσεγκέφαλου (p<0,05) IV.II. Επίδραση του οξειδωτικού παράγοντα στους επίμυες Επίδραση σεληνιώδους νατρίου και συγχορήγησης εκχυλίσματος κρόκου στην ανάπτυξη των πειραματόζωων. Το σεληνιώδες νάτριο χορηγήθηκε με υποδόρια ένεση σε επίμυες 10 ημερών σε συγκέντρωση 20 μmol/kg σωματικού βάρους. Πίνακας 12: Επίδραση σεληνιώδους νατρίου και συγχορήγησης εκχυλίσματος κρόκου στην ανάπτυξη των πειραματόζωων. Βάρος ζώων (g) Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr 39.8± ± ± ±5.3 73

74 Σωματικό βάρος ζώων (g) Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=8 * Στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) Το σωματικό βάρος των ζώων όλων των ομάδων ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένα (Se: 13.21%, CrSeCr: 13.83%, SeCrCr: 10.69%) συγκριτικά με τους μάρτυρες. Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου και του εκχυλίσματος C.sativus στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης των ιστών Πίνακας 13: Συγκέντρωση πρωτεΐνης στους υπό μελέτη ιστούς. mg πρωτεΐνης/mg ιστού Ιστοί Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Φλοιός 19.97± ± ± ±2.70 # Παρεγκεφαλίδα 15.85± ± ± ±1.62 Μεσεγκέφαλος 14.30± ± ±2.21 # 12.08±2.27 Ήπαρ 123.4± ± ± ±16.02 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-κρόκου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Se-κρόκου (p<0,05) 74

75 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην υπεροξείδωση λιπιδίων των ιστών Όσον αφορά στην επίδραση του σεληνιώδους νατρίου, τα επίπεδα της MDA αυξήθηκαν (34.83%) στον φλοιό σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Στο ήπαρ η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου μείωσε τα επίπεδα της MDA και μάλιστα η μείωση αυτή είναι στατιστικώς σημαντική (47.79%). Πίνακας 14: Επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων στους ιστούς. Συγκέντρωση MDA (μmol/g ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se Φλοιός 0.022± ±0.010 Παρεγκεφαλίδα 0.024± ±0.005 Μεσεγκέφαλος 0.115± ±0.015 Ήπαρ 0.250± ±0.043 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στα επίπεδα της καταλάσης Ο οξειδωτικός παράγοντας επηρέασε μόνο τα επίπεδα της CAT στο ήπαρ. Συγκεκριμένα, η χορήγηση Se μείωσε την ενεργότητα της CAT σημαντικά, κατά 40% σε σχέση με τους μάρτυρες. Πίνακας 15: Επίπεδα καταλάσης στους ιστούς. Ενεργότητα CAT (nmol/min/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se Φλοιός 0.09± ±0.01 Παρεγκεφαλίδα 0.44± ±0.03 Μεσεγκέφαλος 0.11± ±0.03 Ήπαρ 25.7± ±6.18 * 75

76 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στα επίπεδα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης Ο οξειδωτικός παράγοντας δεν επηρέασε τα επίπεδα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης σε καμία περιοχή σε σχέση με τους μάρτυρες. Πίνακας 16: Επίπεδα υπεροξειδικής δισμουτάσης στους ιστούς των μαρτύρων. SOD (U/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se Φλοιός 0.73± ±0.02 Παρεγκεφαλίδα 0.51± ±0.08 Μεσεγκέφαλος 0.33± ±0.08 Ήπαρ 8.12± ±2.37 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 Επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στην ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (FRAP) Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου αύξησε τα επίπεδα της FRAP στο ήπαρ και έδειξε μια τάση αύξησης στον φλοιό. Συγκεκριμένα, η αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας ήταν σημαντική μόνο στο ήπαρ κατά 17.67% σε σχέση με τους μάρτυρες. Πίνακας 17: Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας των υπό μελέτη ιστών. nmol FeSO 4 /g ιστού Ιστοί Μάρτυρες Se Φλοιός 4.80± ±0.30 Παρεγκεφαλίδα 7.34± ±0.41 Μεσεγκέφαλος 5.51± ±0.54 Ήπαρ 10.46± ±

77 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) IV.III. Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στο πειραματικό μοντέλο Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην υπεροξείδωση λιπιδίων των ιστών Στην ομάδα CrSeCr η MDA ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη στο μεσεγκέφαλο (23.03%), σε σύγκριση με τα αυξημένα επίπεδα υπεροξείδωσης που εντοπίστηκαν στην ομάδα Se. Όσο αναφορά την επίδραση του κρόκου στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας σε σχέση με τους μάρτυρες, η MDA ήταν στατιστικώς μειωμένη στην ομάδα CrSeCr (29.62%). Στο ήπαρ η MDA ήταν σημαντικά μειωμένη και στις δύο ομάδες του φυτού σε σχέση με τους μάρτυρες χωρίς η μείωση αυτή να είναι στατιστικώς σημαντική. Πίνακας 18: Επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων στους ιστούς. Συγκέντρωση MDA (μmol/g ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Φλοιός 0.022± ± ± ±0.053 Παρεγκεφαλίδα 0.024± ± ,017±0.004 # 0.019±0.007 Μεσεγκέφαλος 0.115± ± ±0.018 # 0.114±0.025 Ήπαρ 0.250± ± ± ±0.077 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-κρόκου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Se-κρόκου (p<0,05) 77

78 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus στην ενεργότητα της καταλάσης Στο ήπαρ η ομάδα CrSeCr έδειξε μεγαλύτερη ενεργότητα CAT από την ομάδα του Se και ίδια με αυτή των μαρτύρων. Αντίθετα, στην ομάδα SeCrCr η ενεργότητα της CAT εξακολουθεί να είναι μειωμένη σε σχέση με τους μάρτυρες. Στην παρεγκεφαλίδα, στην ομάδα CrSeCr η ενεργότητα της καταλάσης ήταν στατιστικά μειωμένη τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες (25.10%), όσο και με την ομάδα του σεληνίου (24.45%). Πίνακας 19: Επίπεδα καταλάσης στους ιστούς. Ενεργότητα CAT (nmol/min/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Φλοιός 0.09± ± ± ±0.03 Παρεγκεφαλίδα 0.44± ± ±0.06 # 0.44±0.05 Μεσεγκέφαλος 0.11± ± ± ±0.04 Ήπαρ 25.7± ±6.18 * 25.2± ±1.83 # Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-κρόκου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Se-κρόκου (p<0,05) 78

79 Επίδραση του εκχυλίσματος των στύλων του σουπεροξειδικής δισμουτάσης C.sativus στην ενεργότητα της Στην παρεγκεφαλίδα η χορήγηση του εκχυλίσματος του κρόκου έδειξε μεγαλύτερη ενεργότητα σουπεροξειδικής δισμουτάσης στις ομάδες CrSeCr (15.67%) και SeCrCr (23.45%) σε σχέση με τους μάρτυρες. Αντίθετα, στο ήπαρ η χορήγηση του εκχυλίσματος του κρόκου οδήγησε σε μικρότερη ενεργότητα σουπεροξειδικής δισμουτάσης στις ομάδες CrSeCr (47.82%) και SeCrCr (50.66%) σε σχέση με τους μάρτυρες. Πίνακας 20: Επίπεδα υπεροξειδικής δισμουτάσης στους ιστούς. Ενεργότητα SOD (U/mg ιστού) Ιστοί Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Φλοιός 0.73± ± ± ±0.08 # Παρεγκεφαλίδα 0.51± ± ±0.08 # 0.67±0.06 # Μεσεγκέφαλος 0.33± ± ± ±0.01 Ήπαρ 8.12± ± ±0.78 # 4.00±0.93 # Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-κρόκου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Se-κρόκου (p<0,05) 79

80 Επίδραση του εκχυλίσματος του C.sativus στην αντιοξειδωτική ικανότητα των υπό μελέτη ιστών (FRAP) Όπως προκύπτει από τον πίνακα, η χορήγηση εκχυλίσματος των στύλων του C.sativus προκάλεσε αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας στον φλοιό στην ομάδα SeCrCr τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες (17.82%), όσο και σε σχέση με την ομάδα του σεληνίου (15.65%). Αύξηση παρατηρήθηκε και στο ήπαρ, στην ομάδα CrSeCr σε σχέση με τους μάρτυρες (16.90%). Πίνακας 21: Επίδραση του εκχυλίσματος του C.sativus στην αντιοξειδωτική ικανότητα των υπό μελέτη ιστών. nmol FeSO 4 /g ιστού Ιστοί Μάρτυρες Se CrSeCr SeCrCr Φλοιός 4.80± ± ± ±0.14 # Παρεγκεφαλίδα 7.34± ± ±0.79 # 7.87±1.01 Μεσεγκέφαλος 5.51± ± ± ±0.70 Ήπαρ 10.46± ± ±0.57 # 11.1±0.51 Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη Μέση Τιμή ± τυπικό σφάλμα για n=6 *Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-se (p<0,05) # Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ μαρτύρων-κρόκου (p<0,05) Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ Se-κρόκου (p<0,05) 80

81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 81

82 Δεδομένου ότι το οξειδωτικό στρες σχετίζεται άμεσα με την παθογένεια αρκετών εκφυλιστικών νόσων, στις μέρες μας υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες διαφόρων φυτών. Από την αρχαιότητα ακόμα ο άνθρωπος αναζητούσε στα φυτά την ανακούφιση των πόνων του ή την θεραπεία του. Αρκετοί κλασσικοί συγγραφείς και γιατροί της αρχαιότητας έχουν γράψει διάφορα συγγράμματα για τις ευεργετικές ιδιότητες και τον τρόπο χρήσης των φυτών. Ένα από τα πιο γνωστά φυτά της ελληνικής χλωρίδας το οποίο παραδοσιακά καταναλώνεται ως καρύκευμα, με αντιοξειδωτικές και νευροπροστατευτικές ιδιότητες είναι ο κρόκος Κοζάνης. Το σελήνιο είναι ένα ιχνοστοιχείο απαραίτητο για τον οργανισμό σε μικρές ποσότητες. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις όμως είναι ιδιαίτερα τοξικό και καρκινογόνο. Η τοξικότητα του εξαρτάται από τις προ-οξειδωτικές του ιδιότητες (Stewart et al., 1999). Απαντάται σε διάφορες μορφές όπως το σεληνιώδες νάτριο, η σεληνο-μεθειονίνη και η σεληνο-κυστεΐνη. Οι υψηλές συγκεντρώσεις του σεληνιώδους νατρίου προάγουν τον σχηματισμό της ρίζας του σουπεροξειδίου και τη δημιουργία βλαβών στο DNA. Η τοξικότητα του σεληνίου οφείλεται επιπλέον στην ικανότητα του να καταλύει την οξείδωση των θειολών, οδηγώντας τα κύτταρα σε απόπτωση (Drake, 2006). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση σε επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές (φλοιός, μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα) καθώς και στο ήπαρ, της χορήγησης σε αναπτυσσόμενους επίμυες υψηλών συγκεντρώσεων σεληνιώδους νατρίου. Χρησιμοποιήθηκε η δόση που χρησιμοποιείται για την πρόκληση καταρράκτη και μελετήθηκε η επίδραση αυτής στην ανάπτυξη των ζώων, σε οξειδωτικές παραμέτρους του ήπατος και διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών. Αρχικά προσδιορίστηκε η πιθανή επίδραση του σεληνιώδους νατρίου στο σωματικό βάρος των αναπτυσσόμενων επίμυων. Το σεληνιώδες νάτριο χορηγήθηκε την δέκατη ημέρα στους επίμυες με υποδόρια ένεση σε συγκέντρωση 20 μmol/kg (0.345 mg/kg) σωματικού βάρους. Τα αποτελέσματα φανερώνουν πως η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου μείωσε στατιστικώς σημαντικά το βάρος των ζώων σε σχέση με τους μάρτυρες σε ποσοστό 13%. Η χορήγηση κρόκου δεν ανέστειλλε την προκαλούμενη από το σελήνιο μείωση του σωματικού βάρους. Τα αποτελέσματα μας συμφωνούν με τους Wang et al. (1992), οι οποίοι παρατήρησαν ότι η υποδόρια χορήγηση υψηλής συγκέντρωσης σεληνιώδους νατρίου (30 μmol/kg) σε αναπτυσσόμενους επίμυες (Sprague-Dawley rats) μείωσε στατιστικώς σημαντικά το σωματικό βάρος των ζώων σε σχέση με τους μάρτυρες. Επιπλέον, σε εργασία των Zhang et al. (2008) αναφέρεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε συγκέντρωση 2 mg/kg σωματικού βάρους 82

83 σε νεαρούς μύες για 14 ημέρες μείωσε σημαντικά το βάρος των ζώων, υποδεικνύοντας ότι η μείωση της ανάπτυξης σε μύες ή επίμυες οφείλεται στην δηλητηρίαση από το σελήνιο (Thorlacius-Ussing, 1990; Gronbaek et al., 1995). Ο μηχανισμός με τον οποίο το σεληνιώδες νάτριο δρά ανασταλτικά στην ανάπτυξη των νεαρών επίμυων παραμένει άγνωστος. Αντίθετα με τα δικά μας αποτελέσματα, σε εργασία των Orhan et al. (1999) αναφέρεται ότι η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου σε αναπτυσσόμενους επίμυες (Wistar-albino pups) σε συγκέντρωση 25 μmol/kg σωματικού βάρους δεν επηρέασε το σωματικό βάρος των ζώων σε σχέση με τους μάρτυρες. Μελέτη σε ενήλικες επίμυες με χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε συγκέντρωση mg/kg έδειξε ότι δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στο βάρος των ζώων (Santamaria et al., 2003). Με την μελέτη αυτή συμφωνούν και οι Thirunavukkarasu et al. (2008) όπου η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε συγκέντρωση 4 mg/kg, για διάφορες χρονικές περιόδους, σε ενήλικους επίμυες δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στο σωματικό βάρος των ζώων σε σχέση με τους μάρτυρες. Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου προκάλεσε στατιστικώς σημαντική μείωση (48%) της MDA στο ήπαρ και της ενεργότητας της καταλάσης, καθώς και αύξηση της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος (18%). Σε εργασία των Zhang et al. (2008) αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε συγκέντρωση 2 mg/kg για 14 ημέρες σε νεαρούς μύες προκάλεσε αύξηση της συγκέντρωσης της ηπατικής αναγωγάσης της θειορεδοξίνης 1 (TrxR 1), η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην άμυνα του οργανισμού έναντι του οξειδωτικού στρες. Η TrxR 1 ανάγει το σεληνιώδες νάτριο σε στοιχειακό σελήνιο το οποίο έχει μικρότερη τοξικότητα (Kumar et al., 1992). Τα κύτταρα τα οποία υπερεκφράζουν την TrxR 1 είναι περισσότερο ανθεκτικά στην επαγόμενη από το σεληνιώδες νάτριο κυτταροτοξικότητα (Madeja et al., 2005). Παράλληλα, στην εργασία των Zhang et al. (2008) το σεληνιώδες νάτριο μείωσε τη SOD και τη GST. Σε εργασία των Zeng et al. (2009) αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου στην δίαιτα ενήλικων επίμυων (Big Blue rats) σε συγκεντρώσεις 0.2 ή 2 mg/kg σωματικού βάρους για 6 εβδομάδες προκάλεσε αύξηση της συγκέντρωσης του σεληνίου στο ήπαρ, αύξηση της συγκέντρωσης της ηπατικής αναγωγάσης της θειορεδοξίνης 1 (TrxR 1) και της ηπατικής GPx. Τα παραπάνω αποτελέσματα πιθανώς συνάδουν με την αντιοξειδωτική δράση του σεληνίου, η οποία ασκείται μέσω της ενσωμάτωσης του στα σεληνιο-εξαρτώμενα ένζυμα. Τα σεληνιο-εξαρτώμενα ένζυμα (σεληνο-πρωτεΐνες όπως η GPx, η αποιωδιονάση της ιωδοθυρονίνης και η TrxR), τα οποία απαιτούν την παρουσία ενός ατόμου σεληνίου στο ενεργό τους κέντρο ώστε να είναι λειτουργικά, έχουν σημαντικές βιολογικές λειτουργίες, με κυριότερη την προστασία των κυττάρων από το οξειδωτικό στρες (Crocin, 2000). 83

84 Σε εργασία των Nakayama et al. (2007) σχετικά με την πρόσληψη σεληνίου από τους ιστούς μυών οι οποίοι ακολουθούσαν δίαιτες με διαφορετική περιεκτικότητα σεληνίου καθώς και μυών στους οποίους δεν εκφράζεται το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την σεληνο-πρωτεΐνη 1 (Sepp 1) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: η Sepp 1 συντίθεται κυρίως στο ήπαρ και είναι υπεύθυνη για την κατανομή του σεληνίου στους ιστούς των πειραματόζωων, καθώς και για την ομοιόσταση του. Υπάρχει μια ιεραρχία των ιστών στην πρόσληψη του σεληνίου μέσω της δίαιτας. Συγκεκριμένα, οι νεφροί, το ήπαρ και οι όρχεις παρουσίαζαν υψηλότερη συγκέντρωση σεληνίου σε σχέση με τον εγκέφαλο και τους μύες, ενώ ο εγκέφαλος και οι μύες παρουσίαζαν μεγαλύτερη ικανότητα διατήρησης των επιπέδων του σεληνίου όταν μειώνονταν τα προσλαμβανόμενα μέσω της διατροφής αποθέματα. Παράλληλα, παρατηρήθηκε αύξηση της GPx με αύξηση της συγκέντρωσης του σεληνίου. Η αντιοξειδωτική κατάσταση ενός ιστού είναι πολύπλοκο σύστημα. Είναι αμφιλεγόμενο κατά πόσο η αυξημένη έκφραση ενός και μόνου αντιοξειδωτικού ενζύμου είναι ευεργετική και φαίνεται ότι υπάρχει μια ισορροπία και ρύθμιση όλων των παραγόντων που εμπλέκονται. Σύμφωνα με τη δική μας εργασία τα ζώα που έλαβαν το σεληνιώδες νάτριο είχαν τη μισή συγκέντρωση ηπατικής MDA και αυξημένη FRAP σε σύγκριση με τους μάρτυρες, τα οποία υποδεικνύουν αντιοξειδωτική ενίσχυση. Παρόλα αυτά, η ηπατική CAT μειώθηκε και αυτό το αποτέλεσμα ίσως να απορρέει από αυτή την ενίσχυση. Πιθανόν αφού δεν παρατηρήθηκε υπεροξείδωση, να μην ήταν αναγκαίο να λειτουργήσουν όλα τα αντιοξειδωτικά συστήματα γι αυτό μειώθηκε η ηπατική CAT αλλά και η SOD παρέμεινε σταθερή. Η χορήγηση κρόκου, ενός αντιοξειδωτικού μίγματος, μειώνει περαιτέρω την ηπατική SOD. Η χορήγηση του μεθανολικού εκχυλίσματος κρόκου στο ήπαρ διατήρησε ίδια τα επίπεδα σε σχέση με τους μάρτυρες και δεν προκάλεσε περαιτέρω σημαντικές αλλαγές. Όμως, προκάλεσε αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας του ήπατος στην ομάδα CrSeCr σε σχέση με την ομάδα του σεληνίου. Τα αποτελέσματα μας συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας που έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με την αντιοξειδωτική δράση του C.sativus (Μεταπτυχιακή διατριβή, Δημακοπούλου, 2008). Βέβαια σε ένα τέτοιο σύστημα θα είχε ενδιαφέρον να μελετηθεί η δραστηριότητα της GPx ή της ΤrxR. Για παράδειγμα οι Agay et al. (2005) παρατήρησαν ότι η μειωμένη δραστηριότητα της υπεροξειδάσης του γλουταθείου (GPX1) σχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) σε πειραματόζωα με μειωμένη πρόσληψη σεληνίου μέσω της διατροφής. Η SOD και η GPX1 θεωρούνται τα πιο σημαντικά ένζυμα για τον έλεγχο της οξειδωτικής καταστροφής και μπορούμε να υποθέσουμε ότι η αύξηση της SOD συμβαίνει ως αποτέλεσμα της αναστολής της υπεροξειδάσης του γλουταθείου. 84

85 Ο εγκέφαλος είναι ιδιαίτερα ευάλωτος στις ελεύθερες ρίζες λόγω του υψηλού μεταβολικού του ρυθμού, του υψηλού περιεχομένου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, της υψηλής συγκέντρωσης σιδήρου σε ορισμένες εγκεφαλικές περιοχές και των μέτριων επιπέδων των αντιοξειδωτικών. Ο εγκέφαλος έχει φτωχή δραστηριότητα καταλάσης και μέτρια δραστηριότητα της SOD και της GPx (Coyle et al., 1993). Σε εργασία των Aspberg et al. (1992) μελετήθηκε η εξέλιξη των αντιοξειδωτικών ενζύμων της CAT και της GPx στον εγκέφαλο των αναπτυσσόμενων επίμυων μέχρι την 45 η μέρα της ζωής τους και παρατηρήθηκε ότι η CAT έδειξε την μεγαλύτερη δραστηριότητα την πρώτη βδομάδα μετά την γέννηση ενώ η GPx ήταν αρχικά σε χαμηλά επίπεδα και έδειξε την μεγαλύτερη αύξηση την 45 η μέρα. Οι Mavelli et al. (1982) αναφέρουν μειωμένα επίπεδα CAT στον εγκέφαλο ενήλικων επίμυων (60 ημερών) σε σχέση με τους νεογέννητους επίμυες και αύξηση της SOD με αύξηση της ηλικίας. Τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών των μαρτύρων. Συγκεκριμένα, οι τιμές MDA του μεσεγκέφαλου (0,115 μmol/g ιστού) είναι σημαντικά υψηλότερες από αυτές της παρεγκεφαλίδας (0,024 μmol/g ιστού) και του εγκεφαλικού φλοιού (0,022 μmol/g ιστού). Επιπλέον, οι εγκεφαλικές περιοχές των επίμυων-μαρτύρων παρουσιάζουν διαφορετική αντιοξειδωτική ικανότητα (όπως αυτή προσδιορίζεται από την FRAP). Συγκεκριμένα, η παρεγκεφαλίδα παρουσιάζει την μεγαλύτερη FRAP, ακολουθεί ο φλοιός και τελευταίος έρχεται ο μεσεγκέφαλος. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα προσδιοριζόμενα επίπεδα MDA ο μεσεγκέφαλος με την υψηλότερη MDA έχει και την χαμηλότερη ικανότητα αναγωγής τους σιδηρι-κατιόντος (FRAP). Τα αποτελέσματα μας βρίσκονται σε συμφωνία με βιβλιογραφικές αναφορές οι οποίες κάνουν λόγο για την ύπαρξη ιστο-ειδίκευσης όσον αφορά στην αντιοξειδωτική ισχύ των διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών, καθώς επίσης και στην δυνατότητα να ανταπεξέρχονται σε έκθεση διαφόρων οξειδωτικών παραγόντων των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών. Σε εργασία των Nakayama et al. (2007) σε ζώα μάρτυρες (μύες) και σε ότι αφορά στα επίπεδα σεληνίου μεταξύ των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών, τα υψηλότερα επίπεδα Se προσδιορίστηκαν στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας, ακολούθως στον φλοιό και τα χαμηλότερα στον μεσεγκέφαλο, γεγονός που συνηγορεί με μεγαλύτερη αντιόξειδωτική προστασία της παρεγκεφαλίδας. Σε εργασία των Kazi et al. (2012) αναφέρεται ότι τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης της παρεγκεφαλίδας, του εγκεφαλικού φλοιού και του ιππόκαμπου των επίμυων-μαρτύρων κυμαίνονταν στα ίδια επίπεδα, ενώ η CAT της παρεγκεφαλίδας των ζώων- 85

86 μαρτύρων ήταν υψηλότερη από του φλοιού, αποτελέσματα τα οποία συμφωνούν με την δική μας μελέτη. Επιπρόσθετα, σε εργασία των Sathyasaikumar et al. (2007) αναφέρεται ότι η παρεγκεφαλίδα των επίμυων-μαρτύρων έδειξε υψηλότερα επίπεδα καταλάσης σε σχέση με τον φλοιό, αποτέλεσμα τα οποίο συμφωνεί με την δική μας μελέτη. Επιπλέον, σε μελέτη των Manikandan et al. (2005) σε ζώα επίμυες-μάρτυρες και σε ότι αφορά στην ενεργότητα του ενζύμου καταλάση, εμφάνισαν την μεγαλύτερη τους ενεργότητα στην παρεγκεφαλίδα, ακολούθως στον μεσεγκέφαλο και την χαμηλότερη στον φλοιό, αποτέλεσμα το οποίο συμφωνεί με την δική μας μελέτη. Στην ίδια εργασία αναφέρεται ότι η παρεγκεφαλίδα παρουσίασε μεγαλύτερη SOD σε σχέση με τον μεσεγκέφαλο, αποτέλεσμα το οποίο συμφωνεί με την δική μας μελέτη. Σε εργασία των Srivastava et al. (2005) ο μεσεγκέφαλος των φυσιολογικών επίμυων επέδειξε τη μεγαλύτερη λιπιδική υπεροξείδωση σε σχέση με τον εγκεφαλικό φλοιό και την παρεγκεφαλίδα. Τέλος, και οι Mandavilli et al., 1996 δείχνουν ότι η παρεγκεφαλίδα είναι πιο θωρακισμένη έναντι μιας οξειδωτικής βλάβης λόγω των υψηλότερων επιπέδων των αντιοξειδωτικών ενζύμων της καταλάσης και της υπεροξειδάσης του γλουταθείου H βιοχημική βάση για την ιστο-ειδίκευση που παρατηρείται ως προς τα επίπεδα υπεροξείδωσης των λιπιδίων, δεν είναι ξεκάθαρη. Οι διαφορές στη σύσταση και την αποστολή των εγκεφαλικών περιοχών, ίσως εξηγεί τις παρατηρούμενες διαφορές (Srivastava et al., 2005). Συγκεκριμένα, ο μεσεγκέφαλος αποτελείται από την οροφή και το κάλυμμα. Τμήμα του καλύμματος του μεσεγκεφάλου αποτελεί η μέλαινα ουσία η οποία συμπεριλαμβάνεται στο σύστημα των βασικών γαγγλίων. Οι νευρώνες της μέλαινας ουσίας παράγουν τον νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη. Η ντοπαμίνη του εγκεφάλου θεωρείται ότι διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην νευροτοξικότητα (Bing et al., 1994). Παράλληλα, η μέλαινα ουσία είναι πλούσια σε σίδηρο και η έλλειψη σεληνίου προκαλεί μια δευτερογενή παραγωγή σιδήρου (secondary overload iron). Η προκαλούμενη από τον σίδηρο λιπιδική υπεροξείδωση φαίνεται ότι αυξάνει την απορρόφηση ντοπαμίνης στον εγκέφαλο των ζώων (Rafalowska et al., 1989). Σε εργασία των Sathyasaikumar et al. (2007) αναφέρεται ότι αξιολογήθηκε η απόκριση εγκεφαλικών περιοχών, συγκεκριμένα του εγκεφαλικού φλοιού και της παρεγκεφαλίδας, ενήλικων επίμυων έναντι του οξειδωτικού στρες, επαγόμενο από το θειοακεταμίδιο (ΤΑΑ). Ο εγκεφαλικός φλοιός παρουσίασε μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες σε σχέση με την περιοχή της παρεγκεφαλίδας, αποτέλεσμα το οποίο συμφωνεί με την δική μας μελέτη. Σε εργασία των Srivastava et al. (2005) αξιολογήθηκε η απόκριση εγκεφαλικών περιοχών φυσιολογικών ενήλικων επίμυων έναντι του οξειδωτικού στρες που επάγεται από το ισχυρό 86

87 εντομοκτόνο εξαχλωρο-κυκλοεξάνιο. Ο φλοιός των φυσιολογικών επίμυων παρουσίασε την υψηλότερη υπεροξείδωση λιπιδίων σε σχέση με την παρεγκεφαλίδα και τον μεσεγκέφαλο, αποτέλεσμα το οποίο συμφωνεί με την δική μας μελέτη. Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση της υπεροξείδωσης λιπιδίων μόνο στην περιοχή του φλοιού σε ποσοστό 35%. Στην περιοχή του μεσεγκέφαλου παρατηρείται μια τάση αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης η οποία όμως δεν είναι στατιστικώς σημαντική. Σε σχετική εργασία αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε συγκέντρωση 5 μg/kg σωματικού βάρους καθημερινά για 20 ημέρες σε νεαρούς επίμυες προκαλεί αύξηση στην υπεροξείδωση λιπιδίων στον φλοιό (Guzmán et al., 2003). Σε εργασία των Macevilly et al. (1995) σε αναπτυσσόμενους αρσενικούς επίμυες αναφέρεται ότι ο φλοιός, η παρεγκεφαλίδα και το ραβδωτό σώμα παρουσιάζουν μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι του οξειδωτικού στρες, που προκαλείται από χρόνια ανεπάρκεια της βιταμίνης Ε, σε σχέση με τον μεσεγκέφαλο, τον υποθάλαμο και το εγκεφαλικό στέλεχος. Σε εργασία των Atif et al. (2008) αποδεικνύεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε αρσενικούς επίμυες συγκέντρωσης 0.3 mg/kg για 15 ημέρες δεν επηρέασε τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης στον ιππόκαμπο, το ραβδωτό σώμα και τον εγκεφαλικό φλοιό και δεν έδειξε κάποια αλλαγή στα επίπεδα της CAT, της GPx και της αναγωγάσης της γλουταθείου (GR). Επίσης, αναφέρεται ότι η χορήγηση σεληνιώδους νατρίου σε μικρότερες δόσεις και για μικρότερο χρονικό διάστημα δεν έδειξε προστατευτική δράση έναντι της οξειδωτικής καταστροφής στις διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές. Στη δική μας εργασία η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου στα πειραματόζωα δεν επηρέασε σημαντικά την αντιοξειδωτική ισχύ της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκέφαλου. Από τις παραπάνω μελέτες διαπιστώνουμε επομένως ότι όλες οι εγκεφαλικές περιοχές δεν παρουσιάζουν την ίδια αντιοξειδωτική ικανότητα και ούτε έχουν την ίδια ευαισθησία σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Οι λόγοι στους οποίους οφείλεται αυτή η ιστο-ειδίκευση δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστοί. Η διαφορετική απόκριση σε οξειδωτικούς παράγοντες πιθανότατα να οφείλεται στο γεγονός ότι ορισμένες εγκεφαλικές περιοχές έχουν μεγαλύτερο οξειδωτικό φορτίο ή χαμηλότερη αντιοξειδωτική προστασία, χωρίς όμως να ισχύει πάντοτε αυτό. Για παράδειγμα, τα υψηλότερα επίπεδα δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων της CAT και της GPx στην παρεγκεφαλίδα έναντι των υπόλοιπων περιοχών να καθιστούν αυτή περισσότερο ανθεκτική έναντι του οξειδωτικού στρες (Mandavilli et al., 1996). Πιθανά και η προσβασιμότητα των ιστών στους οξειδωτικούς παράγοντες να είναι διαφορετική (διαφορετική βιοδιαθεσιμότητα τοξικών/οξειδωτικών παραγόντων). 87

88 Η χορήγηση του εκχυλίσματος του C. sativus στα πειραματόζωα μας δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης στις περιοχές του φλοιού και της παρεγκεφαλίδας σε σχέση με τα πειραματόζωα που χορηγήθηκε μόνο το σεληνιώδες νάτριο και όχι το εκχύλισμα του κρόκου. Η σταθερότητα του φλοιού σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες αλλά και αντιοξειδωτικές, αναφέρεται σε μελέτη των Haque et al. (2006) όπου η χορήγηση πράσινου τσαγιού (κατεχίνες) έδειξε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση στον ιππόκαμπο των πειραματόζωων, σε αντίθεση με τον εγκεφαλικό φλοιό όπου δεν επηρεάστηκε. Τα αποτελέσματα αυτά σχετικά με την σταθερότητα του φλοιού συμφωνούν με μελέτη των Vasilopoulou et al. (2011) όπου η χορήγηση του αφεψήματος του Sideritis clandestina (γνωστό και ως τσάι του βουνού) σε ενήλικες μύες, έδειξε ότι ο εγκεφαλικός φλοιός και ο περιφερειακός ιστός του ήπατος παρέμειναν ανεπηρέαστοι, σε αντίθεση με την παρεγκεφαλίδα και τον μεσεγκέφαλο όπου τα επίπεδα της μηλονικής διαλδεΰδης μειώθηκαν στους μύες που κατανάλωσαν το φυτικό εκχύλισμα σε σχέση με τους μάρτυρες. Στον μεσεγκέφαλο η μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων που παρατηρήθηκε ήταν στατιστικώς σημαντική στην ομάδα CrSeCr τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες (19.24%) όσο και με την ομάδα του σεληνίου (23.03%). Ο μεσεγκέφαλος ο οποίος συμπεριλαμβάνει τη μέλαινα ουσία, η οποία στέλνει ντοπαμινεργικές προβολές στο ραβδωτό και περιέχει υψηλά ποσοστά ντοπαμίνης (μεγάλο οξειδωτικό φορτίο), ίσως είναι πιο ευαίσθητος στις μεταβολές της αντιοξειδωτικής του κατάστασης γι αυτό και ο κρόκος προκάλεσε αυτές τις στατιστικά σημαντικές μεταβολές. Επιπλέον, με την χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus παρατηρήθηκαν μικρές αλλά σημαντικές αλλαγές, ιδιαίτερα στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας. Στην παρεγκεφαλίδα η μείωση των επιπέδων της υπεροξείδωσης λιπιδίων που παρατηρήθηκε ήταν στατιστικώς σημαντική στην ομάδα CrSeCr σε σχέση με τους μάρτυρες. Συγκεκριμένα το ποσοστό της μείωσης ήταν 30%. Παράλληλα, στην παρεγκεφαλίδα η χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση της δραστικότητας της σουπεροξειδικής δισμουτάσης και στις δυο ομάδες του κρόκου, τόσο σε σχέση με τους μάρτυρες, όσο και σε σχέση με τα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε μόνο το σεληνιώδες νάτριο. Ακόμη, το εκχύλισμα του κρόκου προκάλεσε αύξηση της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος στην ομάδα CrSeCr σε σχέση με τους μάρτυρες και μείωση της ενεργότητας της καταλάσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες και την ομάδα του σεληνίου. 88

89 Σε εργασία της ερευνητικής μας ομάδας (Linardaki et al. 2012) αναφέρεται για πρώτη φορά ότι η κροκετίνη, ο κύριος μεταβολίτης του κρόκου, εντοπίστηκε στον εγκέφαλο των επίμυων στους οποίους χορηγήθηκε για μικρό χρονικό διάστημα εκχύλισμα κρόκου ενδοπεριτοναϊκά. Η ανίχνευση της κροκετίνης αποδεικνύει ότι αυτή η ένωση περνάει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Η διαφορετική βιοδιαθεσιμότητα των μεταβολιτών του κρόκου ίσως είναι υπεύθυνη για τον τρόπο δράσης του εκχυλίσματος κρόκου στις διάφορες εγκεφαλικές περιοχές. Συνοψίζοντας, η παρούσα εργασία αποτελεί μια από τις πρώτες προσπάθειες διερεύνησης της επίδρασης υψηλών συγκεντρώσεων σεληνίου στον εγκέφαλο και στο ήπαρ αναπτυσσόμενων επίμυων. Η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου με υποδόρια ένεση σε συγκέντρωση 20 μmol/kg (0.345 mg/kg) σωματικού βάρους δεν επέφερε δραματικές αλλαγές στην αντιοξειδωτική άμυνα του εγκεφάλου παρά το γεγονός ότι προκάλεσε καταρράκτη. Η μόνη σημαντική αλλαγή ήταν η αύξηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης του φλοιού. Επιπλέον, με την χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus σε δύο διαφορετικές ομάδες παρατηρήθηκαν κάποιες αλλαγές, οι οποίες ήταν γενικά προστατευτικές ως προς την αντιοξειδωτική ισορροπία και εμφάνιζαν ιστο-ειδίκευση. Συγκεκριμένα, στην παρεγκεφαλίδα η χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση της δραστικότητας της σουπεροξειδικής δισμουτάσης, της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος και μείωση της ενεργότητας της καταλάσης. 89

90 ΚΕΦΑΛΑΙΟ VI. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 90