ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ

Transcript

1 1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ - ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμός: 2830 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΙΠΠΟΚΡΑΤΗ Ι. ΚΟΡΑΝΤΖΗ ΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 2

3 3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεώργιος Φούντζηλας Βασιλική Γαρυπίδου Παντελής Ζεμπεκάκης Καθηγητής (Επιβλέπων) Καθηγήτρια Αναπλ. Καθηγητής Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεώργιος Φούντζηλας Βασιλική Γαρυπίδου Παντελής Ζεμπεκάκης Ιωάννης Κλωνιζάκης Μιχαήλ Δανιηλίδης Γεώργιος Μπασδάνης Βασιλική Κωτούλα Καθηγητής (Επιβλέπων) Καθηγήτρια Αναπλ. Καθηγητής Καθηγητής Καθηγητής Καθηγητής Επικ. Καθηγήτρια «Ή έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8)

4 4

5 5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ν. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

6 6

7 7 Στους γονείς μου

8 8

9 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΕΙΣΑΓΩΓH ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Β. ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Γ. ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝ ΟΘΗΛΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR -VEGF).. 39.INTEΡΛEYKINH-8 (IL-8) Ε. ΜΕΤΑΤΡΕΠΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ-β (TGF-β). 45 ΣΤ. ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΕΠΙ ΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ 2 (HER2) 47 Ζ. ΜΟΝΟΞΕΙ ΙΟ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ (ΝΟ).. 49 Η. ΟΣΤΕΟΠΟΝΤΙΝΗ (OPN).. 51 Θ. ΜΕΤΡΟΝΟΜΙΚΗ ΧΗΜΕΙΟΘΕΡΑΠΕΙΑ... 53

10 10 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Β. ΥΛΙΚΟ-ΑΣΘΕΝΕΙΣ Γ.ΜΕΘΟ ΟΙ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ.... ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.... ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί το συχνότερο καρκίνο στις γυναίκες και τη δεύτερη αιτία θανάτου από νεοπλασματικά νοσήματα. Κάθε γυναίκα έχει περίπου 13% κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού κατά τη διάρκεια της ζωής της, ενώ ο καρκίνος του μαστού προκαλεί ετησίως θανάτους σε αναλογία ανά εκατομμύριο πληθυσμού. Αν υπολογιστεί η μακρά πορεία των νόσων, υπό διάφορες, συχνά πολυδάπανες θεραπείες, καταλαβαίνει κανείς το μέγεθος του προβλήματος από άποψη κοινωνική και οικονομική. Προέκταση βέβαια των παραπάνω είναι και η τεράστια απώλεια παραγωγικού δυναμικού. Κατά συνέπεια καθίσταται απαραίτητη η αναζήτηση νέων προγνωστικών και προβλεπτικών δεικτών που θα βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της παθογένειας της νόσου και στην ανάπτυξη νέων θεραπειών. Ο σημαντικός ρόλος που αποδίδεται από πρόσφατες μελέτες στην αγγειογένεση μας έστρεψε να διερευνήσουμε την έκφραση παραγόντων με γνωστό ρόλο στην αγγειογένεση. Μελετήσαμε την έκφραση των παραγόντων αυτών σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού και τον τρόπο που μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας η οποία δρούσε αντιαγγειογενετικά. Στο σημείο αυτό αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμώς τον επικεφαλής της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής της διατριβής Καθηγητή Γ. Φούντζηλα που εκτός από επιβλέποντας είναι και ο κύριος εμπνευστής της έρευνας αυτής. Ευχαριστώ θερμώς τα μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Β. Γαρυπίδου και Αναπληρωτή Καθηγητή Π. Ζεμπεκάκη που με καθοδήγησαν σε θεωρητικό και πρακτικό επίπεδο καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Η εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας της Κλινικής Παθολογικής Ογκολογίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης και στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του Νοσοκομείου Μετροπόλιταν. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιστημονικά

12 12 υπεύθυνη του Εργαστηρίου Μοριακής Ογκολογίας Επίκουρη Καθηγήτρια Β. Κωτούλα, τον βιολόγο κ. Κ. Καλογερά και τη συνάδελφο κα. Ε. Φούντζηλα που με βοήθησαν στη διεκπεραίωση των μετρήσεων. Ευχαριστώ θερμώς τη στατιστικολόγο κα. Α. Ελευθεράκη για τη βοήθεια στη στατιστική ανάλυση των δειγμάτων, τη νοσηλεύτρια κα. Μ. Μαλλιότα για τη βοήθεια στη συλλογή των δειγμάτων και την κα. Σ. αλλίδου για την επιμέλεια του κειμένου. Επίσης, για τη τεχνική βοήθεια κατά την προετοιμασία και εκτέλεση των πειραμάτων, ευχαριστώ όλο το ιατρικό και παραϊατρικό προσωπικό των εργαστηρίων όπου εκπονήθηκε η παρούσα διατριβή. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τις ασθενείς και τις υγιείς μάρτυρες που δέχτηκαν τις απαραίτητες αιμοληψίες για την ολοκλήρωση της εργασίας.

13 13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Ang bfgf angiopoietin, αγγειοποιητίνη basic fibroblast growth factor, βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών BMPs CEPs DCIS ECAMs bone morphogenetic proteins, οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες endothelial progenitor cell, ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα ductal carcinoma in situ, in situ καρκίνωμα των πόρων endothelial cell adhesion molecules, μόρια προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων ECD EGF ELISA extracellular domain, εξωκυττάριος τομέας epidermal growth factor, επιδερμικός αυξητικός παράγοντας enzyme-linked immunosorbent assay, ενζυμική μέθοδος ανοσοπροσρόφησης σταθερής φάσης FISH fluorescence in situ hybridization, φθορίζων in situ υβριδισμός GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, διεγερτικός παράγοντας των αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων GTP HER guanosine triphosphate, τριφωσφορική γουανοσίνη human epidermal growth factor receptor, υποδοχέας ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα HGF HIF ICAMs hepatocyte growth factor, ηπατοκυτταρικός αυξητικός παράγοντας hypoxia inducible factor, επαγόμενος από υποξία παράγοντας inter-cellular adhesion molecules, μόρια προσκόλλησης μεταξύ των κυττάρων

14 14 IGF IL MMPs insulin-like growth factor, αυξητικός παράγοντας τύπου ινσουλίνης interleukin, ιντερλευκίνη matrix metalloproteinase, μεταλλοπρωτεϊνάσες εξωκυττάριας ουσίας NF-kB NO OPN OS PDGF nuclear factor kb, πυρηνικός παράγοντας kb nitric oxide, μονοξείδιο του αζώτου osteopontin, οστεοποντίνη overall survival, ολική επιβίωση platelet-derived growth factor, προερχόμενος από αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας PECAM platelet-endothelial cell adhesion molecule, μόριο προσκόλλησης αιμοπεταλίων-ενδοθηλιακών κυττάρων PF4 PFS PI3K PIGF PS platelet factor 4, παράγοντας 4 των αιμοπεταλίων progression free survival, επιβίωση χωρίς επιδείνωση νόσου phosphoinositide kinase 3, κινάση 3 της φωσφατιδυλινοσιτόλης placental growth factor, αυξητικός παράγοντας του πλακούντα performance status, κατάσταση φυσικής ικανότητας qrt-pcr quantitative real time polymerase chain reaction, ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου -R receptor, υποδοχέας RNA ribonucleic acid, ριβονουκλεϊκό οξύ -S synthase, συνθετάση TGF transforming growth factor, μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας

15 15 TIMP tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεινασών TNF TSP TTP VEGF tumor necrosis factor, παράγοντας νέκρωσης των όγκων thrombospondin, θρομβοσπονδίνη time to progression, χρόνος χωρίς εξέλιξη νόσου vascular endothelial growth factor, αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας VPF vascular permeability factor, παράγοντας αύξησης της αγγειακής διαπερατότητας

16 16

17 17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι Hanahan και Weinberg, στην κλασική πλέον εργασία τους The Hallmarks of Cancer σχετικά με την πολύπλοκη διαδικασία της καρκινογένεσης, εκθέτουν τις έξι βασικές ιδιότητες που αποκτούν τα κύτταρα κατά τη διαδικασία της εξαλλαγής τους. Αυτές περιλαμβάνουν την επάρκεια σε αυξητικά σήματα, την έλλειψη ευαισθησίας σε αντιμιτωτικά σήματα, την ικανότητα διήθησης και μετάστασης, την ικανότητα απεριόριστου πολλαπλασιασμού, τη δυνατότητα αγγειογένεσης και την ικανότητα αποφυγής της διαδικασίας της απόπτωσης. Όλα τα παραπάνω έχουν μελετηθεί σε διάφορα νεοπλάσματα και έχει αποδειχθεί βάσει μελετών η συσχέτισή τους με τα επίπεδα διάφορων παραγόντων στον ορό των ασθενών. Αυτοί είναι συνήθως αυξητικοί παράγοντες, οι οποίοι ενέχονται στην ενεργοποίηση διάφορων μοριακών οδών μεταγωγής σήματος και παρουσιάζουν προγνωστικό και προβλεπτικό χαρακτήρα. Παρότι η μελέτη της ενεργοποίησης αυτών των οδών μεταγωγής σήματος είναι εντατική και διεξοδική, πολλά στοιχεία για τον τρόπο ενεργοποίησης τους, τον μηχανισμό αναστολής τους και τη σημασία τους στην καρκινογένεση δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητά. Η περαιτέρω κατανόηση αυτών των διεργασιών θα συμβάλει και στον σχεδιασμό νέων, ειδικότερων και λιγότερο τοξικών στοχευμένων θεραπειών (targeted therapies). Αναφορικά με τον καρκίνο του μαστού, είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι έχει συντελεστεί μεγάλη πρόοδος στην κατανόηση της παθογένειας του, στην αναγνώριση προγνωστικών και προβλεπτικών δεικτών και στη θεραπεία του. Παρ όλα αυτά, το γεγονός ότι αποτελεί τη συχνότερη νεοπλασία στις γυναίκες και τη δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτου των γυναικών από νεοπλασματικές νόσους, καθιστά επιτακτική την ανάγκη αναζήτησης νέων μοριακών δεικτών. Οι δείκτες αυτοί θα διευκόλυναν την καλύτερη κατανόηση της παθογένειας της νόσου και την ανάπτυξη νέων θεραπειών, με τελικό

18 18 στόχο τη μετατροπή του καρκίνου του μαστού σε ένα χρόνιο και δυνητικά ιάσιμο νόσημα, ακόμη και όταν βρίσκεται σε προχωρημένο στάδιο. Λαμβάνοντας υπόψη τα προανεφερθέντα και δεδομένου του βασικού ρόλου της αγγειογένεσης στη διαδικασία της καρκινογένεσης, επιλέξαμε να μελετήσουμε με ELISA τα επίπεδα των παραγόντων, οι οποίοι σχετίζονται με την αγγειογένεση, στο πλάσμα ασθενών και υγιών μαρτύρων. Οι παράγοντες αυτοί είναι: α) η IL-8, β) ο TGF-β1, γ) ο HER2, δ) το NO, ε) η OPN και στ) ο VEGF-Α. Eπίσης, μετρήθηκε με qrt-pcr σε δείγματα περιφερικού αίματος η μεταγραφική δραστηριότητα των αντίστοιχων γονιδίων τους. Στην προκείμενη διατριβή μελετήσαμε τα επίπεδα των παραγόντων που σχετίζονται με την αγγειογένεση στο περιφερικό αίμα 159 ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού, πριν και μετά τη χορήγηση δοσιταξέλης (Docetaxel) συγκριτικά με αυτά σε 39 μάρτυρες. Η δοσιταξέλη ανήκει στην κατηγορία των ταξανών και συγκαταλέγεται στους αντινεοπλασματικούς παράγοντες με ευρύ φάσμα δράσης στους συμπαγείς όγκους. Η χορήγηση του φαρμάκου έγινε με μετρονομικό τρόπο, κατά τον οποίον κυτταροτοξικά φάρμακα χορηγούνται σε σχετικά μικρές δόσεις συνεχώς ή σε πολύ συχνά χρονικά διαστήματα, με αποτέλεσμα να δρουν αντιαγγειογενετικά, αφού είναι δεδομένη η ευαισθησία των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων των νεοπλασιών στην παρατεινόμενη χορήγηση χαμηλών δόσεων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Πραγματοποιήθηκαν συγκρίσεις των τιμών των παραπάνω παραγόντων των ασθενών με αυτές των μαρτύρων, καθώς και συγκρίσεις των τιμών μεταξύ των διαφόρων υποομάδων των ασθενών. Η στατιστική ανάλυση των παραπάνω συγκρίσεων μας οδήγησε σε συμπεράσματα που θα αναλυθούν στη συνέχεια. Η επιλογή των εξετασθέντων παραγόντων πραγματοποιήθηκε βάσει του γνωστού προγνωστικού και προβλεπτικού ρόλου τους σε άλλα νεοπλάσματα, του κεντρικού ρόλου τους στην αγγειογένεση, του βασικού ρόλου της αγγειογένεσης στη διαδικασία της καρκινογένεσης και του περιορισμένου αριθμού μελετών στη βιβλιογραφία για το μετρονομικό τρόπο χορήγησης δοσιταξέλης στον καρκίνο του μαστού.

19 19 Η παρούσα ερευνητική εργασία αποτελείται από δύο μέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό μέρος γίνεται προσπάθεια συνοπτικής παρουσίασης των υπαρχόντων δεδομένων στη βιβλιογραφία που αφορούν τον καρκίνο του μαστού (επιδημιολογία και παθογένεση), την αγγειογένεση, τους αγγειογενετικούς παράγοντες που μελετήσαμε, τη μετρονομική χημειοθεραπεία, παράθεση εικόνων και σχημάτων για την παρουσίαση των κυτταρικών οδών μεταγωγής σήματος και συνοπτική αξιολόγηση του ρόλου των παραγόντων που μετρήσαμε στις οδούς αυτές. Στο ειδικό μέρος παρουσιάζονται το υλικό και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν, τα αποτελέσματα και η στατιστική τους ανάλυση, η συζήτηση των αποτελεσμάτων και τα συμπεράσματα. Μετά το ειδικό μέρος παρατίθεται περίληψη στην Ελληνική και την Αγγλική γλώσσα, καθώς και η σχετική βιβλιογραφία.

20 20

21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 21

22 22

23 23 Α. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες και η δεύτερη αιτία θανάτου από νεοπλασματικά νοσήματα, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα. Αποτελεί την κυριότερη αιτία θανάτου για γυναίκες ετών 1. Πολλοί παράγοντες έχουν ενοχοποιηθεί για την πρόκληση του καρκίνου του μαστού, όπως η πρώιμη έναρξη έμμηνης ρύσης, η καθυστερημένη εμμηνόπαυση, η μεγάλη ηλικία της γυναίκας κατά την πρώτη της κύηση, η χαμηλή κοινωνικοοικονομική κατάσταση, η άτυπη υπερπλασία και άλλες καλοήθεις βλάβες του μαστού. Οι παράγοντες αυτοί αντιστοιχούν στο 55% των περιπτώσεων. Επιπλέον, στο 15% των ασθενών με καρκίνο του μαστού διαπιστώνεται κληρονομική επιβάρυνση, ενώ έχουν αναγνωριστεί διάφορα γενετικά σύνδρομα, όπως το σύνδρομο μαστών- ωοθηκών, η νόσος Cowden και το σύνδρομο Li-Fraumeni, στα οποία υπάρχει αυξημένος κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του μαστού 2. Στις Η.Π.Α βρέθηκε ότι κάθε γυναίκα έχει 13% πιθανότητα ανάπτυξης διηθητικού καρκίνου του μαστού κατά τη διάρκεια της ζωής της 3, ενώ ο διηθητικός καρκίνος του μαστού αποτελεί το 32% του συνόλου των κακοηθειών που παρατηρούνται στις γυναίκες 4. Η νόσος αυτή παρουσίαζε αύξηση μέχρι τη δεκαετία του 1990, αριθμώντας 110 νέες περιπτώσεις ανά γυναίκες ετησίως, ενώ την τελευταία δεκαετία παρουσιάζει μείωση τόσο της εμφάνισης όσο και της θνητότητας. Η μείωση αυτή δικαιολογείται με την ευρύτερη διάδοση της μαστογραφίας, η οποία συσχετίζεται με πρωΐμότερη διάγνωση και αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης λόγω των νεότερων θεραπειών 3. Η κατανομή της συχνότητας του καρκίνου του μαστού εμφανίζει σημαντική γεωγραφική και φυλετική διαφοροποίηση. Η Βόρεια Αμερική και η υτική Ευρώπη παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη συχνότητα (110 νέες περιπτώσεις ανά γυναίκες ετησίως), ενώ η Αφρική παρουσιάζει τη μικρότερη (10 νέες περιπτώσεις ανά γυναίκες ετησίως) 5-6. Οι διαφορές αυτές δικαιολογούνται λόγω των διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, του προσδόκιμου επιβίωσης, του τρόπου καταγραφής των

24 24 νεοπλασιών και της αυξημένης συχνότητας καρκινογόνων παραγόντων στις δυτικές κοινωνίες 7-8. Η θνητότητα που οφείλεται στον καρκίνο του μαστού παρουσίασε πτώση σε όλες τις ηλικιακές ομάδες κατά την τελευταία δεκαετία, κυρίως στις γυναίκες κάτω των 70 ετών. Η πτώση αυτή, όμως, συμβαίνει κυρίως στις αναπτυγμένες χώρες, με αντίθετη τάση στις υπόλοιπες. Η πρώιμη διάγνωση και οι νέες θεραπείες, από κοινού με άλλους παράγοντες, φαίνεται ότι συμβάλλουν στο γεγονός αυτό, όπως έγινε με τη σημαντική μείωση των περιπτώσεων καρκίνου μαστού που διαπιστώθηκαν στις Η.Π.Α το 2003, λόγω της διακοπής χρήσης των θεραπειών ορμονικής υποκατάστασης στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες μετά από τα αποτελέσματα της περίφημης μελέτης WHI (Women s Health Initiative Study) Σε ανεπτυγμένες χώρες, όπως οι Η.Π.Α, μόνο στο 5% των ασθενών παρατηρούνται μεταστάσεις κατά την αρχική διάγνωση, ενώ στα 2/3 των ασθενών παρουσιάζεται νεοπλασία εντοπισμένη μόνο στο μαστό 4. Αντίθετα, στις αναπτυσσόμενες χώρες παρατηρούνται στο 50% μεταστάσεις κατά την αρχική διάγνωση, γεγονός που εξηγεί και την αυξημένη θνητότητα σε αυτές τις χώρες Η πενταετής επιβίωση ασθενών με μεταστάσεις είναι μόνο 10% και περιορίζεται σε ασθενείς με καλή γενική κατάσταση και περιορισμένη μεταστατική νόσο 13. Βάσει επιδημιολογικών μελετών έχουν εντοπισθεί διάφοροι παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση καρκίνου του μαστού, αν και ο παθογενετικός μηχανισμός δράσης δεν έχει εξακριβωθεί για πολλούς από αυτούς (Πίνακας 1) Η ηλικία και το φύλο αποτελούν τους ισχυρότερους από αυτούς, με τη νόσο να εμφανίζεται 100 φορές συχνότερα στις γυναίκες. Η καμπύλη αύξησης της επίπτωσης της νόσου παρουσιάζει πολύ μεγάλη κλίση μέχρι τα 50 έτη, οπότε αρχίζει και ελαττώνεται η αύξηση της συχνότητας. Παρ όλα αυτά η κλίση της καμπύλης παραμένει θετική μέχρι τα 80 έτη 4. Ολοκληρώνοντας, θα μπορούσαμε να εντάξουμε στους κυριότερους προγνωστικούς παράγοντες του καρκίνου του μαστού το μέγεθος του όγκου, τη λεμφαγγειακή διήθηση, την ύπαρξη διηθημένων λεμφαδένων, το βαθμό διαφοροποίησης και τον ιστολογικό τύπο του όγκου. Από τους νεότερους

25 25 προγνωστικούς παράγοντες φαίνεται ότι σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η πυκνότητα ανάπτυξης νεόπλαστων αγγείων στον όγκο, δεδομένης της έντονης αγγειογενετικής δραστηριότητας του καρκίνου του μαστού, ο οποίος είναι ένας από τους καρκίνους με τη μεγαλύτερη πυκνότητα νεόπλαστων αγγείων 1, Πίνακας 1: Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη καρκίνου μαστού. Ηλικία Φύλο Μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1, BRCA2 Σύνδρομο Li-Fraumeni Άλλα γενετικά σύνδρομα Δυτικός τρόπος ζωής Διαιτητικοί παράγοντες Οικογενειακό ιστορικό καρκίνου μαστού ή ωοθηκών σε συγγενείς πρώτου βαθμού Καλοήθη νοσήματα μαστού Έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία Προηγούμενη διάγνωση καρκίνου μαστού Πρώιμη εμμηναρχή ή καθυστερημένη εμμηνόπαυση Ατοκία ή κύηση σε μεγάλη ηλικία Αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ Αντισυλληπτικά Ορμονοθεραπεία Εθνικότητα και φυλή Προηγούμενη διάγνωση καρκίνου ενδομητρίου, κολοορθικού καρκίνου ή καρκίνου ωοθηκών Άλλοι παράγοντες

26 26 Β. ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Ο όρος αγγειογένεση στα ελληνικά χρησιμοποιείται για να αποδώσει δύο αγγλικούς όρους: τον όρο vasculogenesis, δηλαδή την αρχική δημιουργία αγγείων που συμβαίνει στο έμβρυο και τον όρο angiogenesis, δηλαδή τη δημιουργία νέων αιμοφόρων αγγείων με βάση τα ήδη υπάρχοντα. Η δεύτερη αυτή διεργασία είναι μια διαδικασία που χρησιμοποιεί ο οργανισμός για την ανάπλαση των ιστών μετά από τραυματισμούς και κατά την ωορρηξία. Παθολογικές μορφές αγγειογένεσης συναντούμε σε διάφορα νοσήματα, όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, στη ψωρίαση, στη διαβητική αμφιβληστροπάθεια, καθώς και στην ανάπτυξη των νεοπλασμάτων. Αντίθετα, ελαττωμένη αγγειογένεση μπορεί να οδηγήσει σε βαριές μορφές στεφανιαίας νόσου, καρδιακή ανεπάρκεια και αδυναμία ανάπλασης των ιστών μετά από τραυματισμούς Μέχρι το 1960 επικρατούσε η άποψη ότι η υπεραιμία και η αυξημένη αγγειοβρίθεια που παρατηρείται στους όγκους οφείλονται σε απλή διάταση προϋπαρχόντων αγγείων, ως αποτέλεσμα ανεπιθύμητων δράσεων των μεταβολιτών και των προϊόντων νέκρωσης του όγκου 26. Η ιδέα ότι η ανάπτυξη δικτύου νέων αιμοφόρων αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων, διατυπώθηκε για πρώτη φορά από την ερευνητική ομάδα του Folkman τη δεκαετία του Τα πειράματα του Folkman απέδειξαν ότι η πλήρης έλλειψη αγγειογένεσης οδηγούσε σε περιορισμό του μεγέθους του όγκου στο 1 mm 3, ενώ η μετάβαση σε αγγειογενετικό φαινότυπο οδηγούσε σε αύξηση του μεγέθους του μέχρι και κατά φορές 27,28. Βάσει των συγκεκριμένων παρατηρήσεων, προτάθηκε η υπόθεση ότι η αύξηση του μεγέθους του όγκου και η ανάπτυξη μεταστάσεων εξαρτώνται από τη διαδικασία της αγγειογένεσης και επομένως η αναστολή αυτής της διαδικασίας θα μπορούσε να αποτελέσει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου Η αγγειογένεση αποδείχτηκε ότι είναι μία δυναμική διαδικασία, η οποία περιλαμβάνει πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, κινητοποίηση αρχέγονων κυττάρων από το μυελό, χημειοτακτική κίνησή τους προς συγκεκριμένο σημείο, διαφοροποίηση και αναστόμωση τριχοειδών, ωρίμανση

27 27 των αγγείων και ανάπτυξη των περικυττάρων (pericytes). Για το λόγο αυτό, οδηγηθήκαμε στην αναζήτηση παραγόντων που επάγουν ή αναστέλλουν αυτή τη διαδικασία Η αγγειογένεση είναι απαραίτητη, αλλά όχι επαρκής διαδικασία για τη συνεχιζόμενη ανάπτυξη των όγκων. Απόδειξη αυτού συνιστούν οι πολλές καλοήθεις βλάβες, όπως τα αδενώματα των επινεφριδίων, που παρουσιάζουν έντονη αγγειογένεση 34. Επίσης, η διαδικασία της μετάστασης απαιτεί είσοδο των κακοηθών κυττάρων στην κυκλοφορία, επιβίωση τους μέσα σε αυτήν, εξαγγείωση στα όργανα-στόχους και περαιτέρω ανάπτυξή τους με δημιουργία νέων αγγείων. Συνεπώς και εδώ η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο 35 (Εικόνα 1). Άλλες εναλλακτικές μορφές «αγγειογένεσης» είναι η δημιουργία τοιχωμάτων αγγείων από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα (vascular mimicry), κάτι που συμβαίνει συχνά σε μεταστάσεις από μελάνωμα οφθαλμού 36, καθώς και η χρήση από τον όγκο των ήδη υπαρχόντων αγγείων σε περιοχές με υψηλή αγγείωση (co-option), όπως σε όγκους εγκεφάλου 37. Εικόνα 1: Μηχανισμός δημιουργίας μετάστασης (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis, Oncogene (2000) 19, ).

28 28 Η μεταστατική διαδικασία, όπως αναφέρθηκε, είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη σε μοριακό επίπεδο. Απαιτεί τη συγχρονισμένη δράση πολλών παραγόντων, όπως των γονιδίων MST1, NM23, MTA1, MKK4, KAI-1 38 και χρειάζεται αλληλεπίδραση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του μικροπεριβάλλοντος του όγκου 39. Αυτό γίνεται με την ενεργοποίηση διάφορων πρωτεασών (πλασμίνη, μεταλλοπρωτεάσες) και την αλληλεπίδραση των κυττάρων μέσω ειδικών μορίων προσκόλλησης (ιντεγκρίνες, καντχερίνες). Έχει βρεθεί ότι τα ενεργοποιημένα σχετιζόμενα με τον όγκο ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν αυξημένα επίπεδα ECAMs, όπως είναι τα ICAMs 1-3, το PECAM και διάφορες σελεκτίνες, κάτι που είναι πιθανό να οφείλεται σε διέγερση τους από διάφορες κυττοκίνες 40. Τα ECAMs συμμετέχουν σε πολλές λειτουργίες, όπως στην ανοσιακή και φλεγμονώδη απάντηση, στην ανάπτυξη νεοαγγείωσης, στην αύξηση της ικανότητας διήθησης των νεοπλασματικών κυττάρων και στη δημιουργία μεταστάσεων 41. Η πρώτη απόδειξη της συσχέτισης της πυκνότητας των νεοσχηματισθέντων αγγείων με τη μεταστατική ικανότητα του όγκου βρέθηκε στο μελάνωμα 42. Μελανώματα με βάθος διήθησης πάνω από 1 mm εμφανίζουν μεγαλύτερη πιθανότητα για ανάπτυξη μεταστάσεων, γεγονός που συνδυάζεται με αυξημένη ανάπτυξη νεοαγγείων στο χόριο Επίσης, είναι γνωστό από νεκροτομικές μελέτες ότι η συχνότητα in situ νεοπλασμάτων μαστού, προστάτη και θυρεοειδούς είναι πολύ μεγαλύτερη από τη συχνότητα των αντίστοιχων διηθητικών νεοπλασμάτων. Αυτό οφείλεται στο ότι η διηθητική ανάπτυξη των όγκων και η δημιουργία μεταστάσεων απαιτεί την ενεργοποίηση της διαδικασίας της αγγειογένεσης, διαφορετικά οι όγκοι παραμένουν σε λανθάνουσα κατάσταση Το ερέθισμα και η σηματοδότηση για την έναρξη της αγγειογένεσης φαίνεται ότι ξεκινά από μία υποομάδα καρκινικών κυττάρων, τα οποία διατηρούν ενεργά διάφορα μονοπάτια αρχέγονων βλαστικών κυττάρων και αντιδρούν με ιδιαίτερο τρόπο στην υποξία 47. Έπειτα, τα νεοσχηματισθέντα αγγεία συντελούν στην ανάπτυξη του συνόλου των καρκινικών κυττάρων του όγκου. Πρέπει να επισημανθεί ότι ακόμα και οι όγκοι με την εντονότερη αγγειογένεση περιέχουν και καρκινικά κύτταρα που δεν εκφράζουν τον αγγειογενετικό φαινότυπο 46.

29 29 Αρχικά, στη φάση πριν την ενεργοποίηση της διαδικασίας της αγγειογένεσης, η διάμετρος του νεοπλάσματος δεν ξεπερνά τα 2 mm, περιέχει λιγότερο από 10 6 καρκινικά κύτταρα και ο όγκος του δεν υπερβαίνει τα λίγα κυβικά χιλιοστά 29,48. Αυτό εξηγείται από την απουσία ικανού αγγειακού δικτύου για την τροφοδότηση του όγκου με οξυγόνο και την έλλειψη θρεπτικών στοιχείων και αυξητικών παραγόντων, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μικροπεριβάλλον με χαμηλό ph, χαμηλά επίπεδα γλυκόζης και έντονη υποξία. Σε αυτή την κατάσταση υπάρχει ισορροπία των ρυθμών πολλαπλασιασμού και θανάτου των καρκινικών κυττάρων του όγκου Η περαιτέρω ανάπτυξη του όγκου απαιτεί τη δημιουργία νέων αγγείων, με την ενεργοποίηση της διαδικασίας της αγγειογένεσης. Έτσι, δίνεται προσωρινή λύση στο πρόβλημα της έλλειψης θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου και στην απομάκρυνση των προϊόντων του μεταβολισμού, με αποτέλεσμα οι όγκοι να αποκτούν ικανό μέγεθος και να γίνονται συμπτωματικοί. Αιματουρία, αιμόπτυση ή συμπτωματολογία εγκεφαλικού οιδήματος προκαλούνται από την αυξημένη διαπερατότητα των νεοσχηματισθέντων αγγείων του όγκου 53. Μια άλλη λειτουργία που επιτελούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα αυτών των αγγείων, είναι η παραγωγή διάφορων αυξητικών παραγόντων με αυτοκρινή και παρακρινή δράση. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι IGF-I και IGF-II, o PDGF, o bfgf, GM-CSF και οι IL-1,6,8. Παρατηρείται δηλαδή μια αμφίδρομη σχέση, όπου τα καρκινικά κύτταρα διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και το αντίστροφο. Επιπρόσθετα, η υποξία σε ορισμένες περιοχές του όγκου αυξάνει τους υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων για αυξητικούς παράγοντες, όπως o VEGF 53. Η αγγειογένεση διεγείρεται ή καταστέλλεται από τη δράση διάφορων μεταβολικών μονοπατιών. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p53/p21 ρυθμίζουν την αγγειογένεση μειώνοντας την έκφραση του VEGF και αυξάνοντας την έκφραση της TSP , ενώ τα ογκογονίδια K-RAS και HER2/neu διεγείρουν την αγγειογένεση αυξάνοντας την έκφραση του VEGF 56. Μόρια προσκόλλησης, όπως η ιντεγκρίνη ανβ3 και η λαμινίνη, παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση, στη διηθητική ικανότητα του όγκου και στην ανάπτυξη μεταστάσεων Η απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων επηρεάζεται από τους ίδιους παράγοντες (BCL2, B-RAF) 59 και η χορήγηση

30 30 αγγειοστατίνης και ενδοστατίνης σε πειραματικά μοντέλα δρα αυξάνοντας το ρυθμό απόπτωσης καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων Τέλος, διάφοροι αγγειογενετικοί παράγοντες και μόρια προσκόλλησης που προέρχονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα ρυθμίζουν την είσοδο και τη δραστικότητα των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στον όγκο Όλα τα παραπάνω δύνανται να οδηγήσουν σε αύξηση του μεγέθους του όγκου κατά φορές από το μέγεθος του στη λανθάνουσα κατάσταση, μέσα σε λίγους μόνο μήνες 65. Τα νέα αγγεία δε συντελούν μόνο στην αύξηση του μεγέθους του όγκου, αλλά δημιουργούν και το κατάλληλο περιβάλλον για την ανάπτυξη μεταστάσεων, γεγονός που αποδίδεται στο ότι με την αύξηση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων, αυξάνεται και η πιθανότητα να βρεθούν κάποια που θα έχουν αναπτύξει το μεταστατικό φαινότυπο, ενώ βρίσκουν και την κατάλληλη δίοδο για να εισέλθουν στη συστηματική κυκλοφορία και να κατευθυνθούν στα όργανα-στόχους, όπου θα δημιουργηθούν οι μεταστάσεις 53. Η μετάβαση στον αγγειογενετικό φαινότυπο απαιτεί μεταβολή στην ισορροπία μεταξύ θετικών και αρνητικών παραγόντων, δηλαδή αύξηση των προαγγειογενετικών παραγόντων σε σχέση με τους αντιαγγειογενετικούς 66. Υπάρχουν πολλοί αυξητικοί παράγοντες που διεγείρουν την αγγειογένεση, οι περισσότεροι από τους οποίους δρουν σε υποδοχείς με δραστικότητα τυροσινικής κινάσης (Εικόνα 2). Αυτό γίνεται είτε άμεσα, με τη δράση αυτών των παραγόντων απευθείας στα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε έμμεσα, με τη διέγερση της έκκρισης από άλλα κύτταρα παραγόντων που στη συνέχεια θα δράσουν στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τέτοιοι δευτερογενείς παράγοντες είναι η IL-6, η IL-8, ο G-CSF, ο EGF, o TGF-β, τα ανδρογόνα και τα οιστρογόνα Οι σημαντικότεροι θετικοί ρυθμιστές της αγγειογένεσης είναι οι FGFs, ο VEGF, o TGF-a, ο TGF-β, ο TNF-a, ο PDGF και ο HGF. Ο πρώτος παράγοντας με αγγειογενετική δράση που ανακαλύφθηκε ήταν ο bfgf. Ο PDGF παίζει σημαντικό ρόλο κυρίως στην ανάπτυξη των περικυττάρων και στην ωρίμανση των νεοσχηματισθέντων αγγείων

31 31 Εικόνα 2: ομή υποδοχέων με δράση τυροσινικής κινάσης (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Croce CM, N Engl J Med, 358:502, January 31, 2008). Οι περισσότεροι από τους αγγειογενετικούς παράγοντες συνδέονται με την ηπαρίνη και έτσι μπορούν να συνδεθούν με τις θειικές ηπαράνες στο εξωκυττάριο δίκτυο και την επιφάνεια των κυττάρων. Η σύνδεση αυτή σταθεροποιεί τον αγγειογενετικό παράγοντα, αυξάνει το χρόνο ημίσειας ζωής του και διευκολύνει τη σύνδεση του με υποδοχείς υψηλής συγγένειας (high affinity receptors) 71. Εκτός όμως από τους παράγοντες που επάγουν την αγγειογένεση, υπάρχουν και πολλοί που δρουν αντιαγγειογενετικά. Σημαντικότεροι από αυτούς είναι η προλακτίνη, η αγγειοστατίνη, η ενδοστατίνη, ο TGF-β, η TSP-1, o PF4 και οι TIMP 1-3. Τα ρυθμιστικά μόρια της αγγειογένεσης έχουν πολύπλευρη προέλευση, αφού παράγονται από καρκινικά κύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα, στρωματικά κύτταρα, όπως μακροφάγα και λεμφοκύτταρα και από τα αιμοφόρα αγγεία 35. Η σχετική συμμετοχή τους είναι δυνατό να μεταβάλλεται ανάλογα με τον τύπο του όγκου και την περιοχή όπου αυτός εντοπίζεται. Μπορεί επίσης να μεταβάλλεται η δράση τους ανάλογα με το μέγεθος του όγκου και διάφορα άλλα χαρακτηριστικά του 33. Στον Πίνακα 2 φαίνονται οι κυριότεροι παράγοντες που προάγουν και αναστέλλουν την αγγειογένεση.

32 32 Πίνακας 2: Παράγοντες που επιδρούν στην αγγειογένεση. Προαγγειακοί VEGF FGFs TGF-a, β HER2 TNF-a PDGF Αντιαγγειογενετικοί Προλακτίνη Αγγειοστατίνη Ενδοστατίνη TGF-β TSP-1 PF4 HGF TIMP 1-3 EGF ΝΟ IL-6, 8 OPN GM-CSF Ανδρογόνα Οιστρογόνα NO Ang-1, 2 Η ταχεία ανάπτυξη του όγκου, η αυξημένη διηθητικότητα του και η δημιουργία μεταστάσεων απαιτεί μετάβαση στον αγγειογενετικό φαινότυπο (angiogenic switch) Το φυσιολογικό και υγιές σώμα διατηρεί μια απόλυτη ισορροπία των ρυθμιστών της αγγειογένεσης και η παραγωγή των αυξητικών παραγόντων είναι σχετικά μικρής διάρκειας, με αποτέλεσμα να μην αναπτύσσονται ανεξέλεγκτα τα κύτταρα και τα νέα αγγεία 22. Στον καρκίνο η παραγωγή τόσο των διεγερτικών παραγόντων όσο και των ανασταλτικών

33 33 παραγόντων της αγγειογένεσης εξαρτάται από το είδος του πρωτοπαθούς όγκου, ενώ μπορεί να μεταβάλλεται και από το είδος της θεραπείας, όπως συμβαίνει με την αύξηση της ενδοστατίνης κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας 45. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να υπερεκφράζουν προαγγειογενετικούς παράγοντες, να κινητοποιούν προαγγειογενετικούς παράγοντες από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία ή να παράγουν χημειοτακτικούς παράγοντες για κύτταρα πλούσια σε προαγγειογενετικούς παράγοντες, όπως είναι τα αιμοπετάλια και τα μακροφάγα. Έτσι, δημιουργείται μια νέα ισορροπία υπέρ των προαγγειογενετικών παραγόντων και «ανοίγει» ο διακόπτης για την αγγειογένεση (angiogenic switch) 49. Η δημιουργία ενός μικροπεριβάλλοντος που επάγει την αγγειογένεση οφείλεται σε πολλούς παράγοντες. Τέτοιοι παράγοντες είναι το μεταβολικό στρες (υποξία, οξέωση, χαμηλά επίπεδα γλυκόζης), το μηχανικό στρες, η φλεγμονώδης αντίδραση και η μεταβολή της ισορροπίας μεταξύ ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων 45, Κυριότερος από αυτούς είναι η υποξία, που οδηγεί σε υπερέκφραση πολλών προαγγειογενετικών παραγόντων (VEGF, PDGF, TGF-β, FGF, HGF), οι οποίοι επάγουν την αγγειογένεση και συμβάλλουν στην αύξηση του μεγέθους του όγκου 76. Το πέρασμα στον αγγειογενετικό φαινότυπο μπορεί να καθυστερήσει ακόμα και για χρόνια, ενώ αντίθετα μπορεί να συμβεί ακόμη και στο προδιηθητικό στάδιο ανάπτυξης του όγκου 53. Οι όγκοι δημιουργούν νέα αγγεία με έξι μηχανισμούς, από τους οποίους ο σημαντικότερος είναι η δημιουργία νέων αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα. Η διαδικασία περιλαμβάνει πολλαπλά, συντονισμένα, διαδοχικά και ανεξάρτητα στάδια, που έχουν ως αποτέλεσμα την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης των προϋπαρχόντων αγγείων, τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και τη διήθηση του εξωκυττάριου δικτύου Τα παραπάνω επιτυγχάνονται με τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη δημιουργία του αυλού των νέων τριχοειδών, που ακολουθείται από την ωρίμανση και τη σταθεροποίηση των νεόπλαστων αγγείων. Αυτή η διαδικασία ξεκινά με την παραγωγή διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων από τα καρκινικά κύτταρα ή το γειτονικό στρώμα, που διεγείρουν την παραγωγή των MMPs και άλλων πρωτεϊνασών,

34 34 ενζύμων που διασπούν τη βασική μεμβράνη των τριχοειδών 36, Στη συνέχεια, έχουμε τη μετακίνηση των ενδοθηλιακών κυττάρων προς το αγγειογενετικό «σήμα», το οποίο λαμβάνουν από τη μάζα των καρκινικών κυττάρων και ακολούθως τον πολλαπλασιασμό τους, που οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους του «μίσχου» του νέου «βλαστού-αγγείου» (tube formation). Έπειτα, δημιουργείται νέος αυλός, βασική μεμβράνη και περιαγγειακή υποστήριξη από περικύτταρα (Εικόνα 3). Αυτή η διαδικασία είναι κοινή στην καρκινογένεση και στην επούλωση των τραυμάτων, αν και τα αγγεία του όγκου παρουσιάζουν ανατομικές και λειτουργικές διαταραχές 45,82-83 (Εικόνα 4). Εικόνα 3: Αγγειογένεση (Παραχωρήθηκε από Angiogenesis Foundation: Understanding angiogenesis; understanding.html).

35 35 Εικόνα 4: Αγγεία φυσιολογικού ποντικιού και ποντικιού με υπερέκφραση VEGF (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Mcdonald DM., Nat Med, 2003 Jun;9(6):713-25). Ένας δεύτερος μηχανισμός αγγειογένεσης είναι η δημιουργία νέων αγγείων από αρχέγονα κύτταρα προερχόμενα από το μυελό, όπως συμβαίνει επίσης κατά τη δημιουργία του εμβρυϊκού αγγειακού συστήματος 84. Αυτή η διαδικασία φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντική στην αρχική ανάπτυξη του όγκου, ενώ στον καρκίνο του μαστού ο μηχανισμός αυτός συμμετέχει κυρίως στην ανάπτυξη του φλεγμονώδους υπότυπου Ένας τρίτος μηχανισμός νεοαγγείωσης είναι ο «εγκολεασμός», ο διαχωρισμός δηλαδή των μεγάλων μητρικών αγγείων σε μικρότερα θυγατρικά αγγεία. Η παραπάνω διεργασία είναι ταχεία και συντελεί στην αναδιαμόρφωση του αγγειακού δικτύου 36,79. Η τέταρτη μορφή αγγειογένεσης είναι η σπειραματοειδής αγγειογένεση (glomeruloid angiogenesis). Τα σπειραματοειδή σωμάτια είναι χαρακτηριστικά στα γλοιοβλαστώματα, αλλά παρατηρούνται και στον καρκίνο του μαστού 87, ενώ είναι παρεμφερή με τα σπειράματα στο νεφρό και αποτελούνται από ένα δίκτυο τριχοειδών που σε ορισμένες περιπτώσεις επενδύονται από βασική μεμβράνη και περιβάλλονται από περικύτταρα. Η παρουσία τους σχετίζεται με σημαντικά χαμηλότερη επιβίωση 88, ενώ για τη δημιουργία τους απαιτείται η παρουσία VEGF 89. Ο πέμπτος μηχανισμός νεοαγγείωσης είναι το φαινόμενο της «αγγειακής μίμησης» (vascular mimicry), η οποία ορίζεται ως ένα ολοκληρωμένο δίκτυο τριχοειδών αποτελούμενο από καρκινικά κύτταρα, αντί

36 36 για αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα 90 (Εικόνα 5). Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν όχι μόνο να πάρουν τη μορφολογία των ενδοθηλιακών κυττάρων, αλλά και να αποκτήσουν και φαινοτυπικά γνωρίσματα του ενδοθηλίου. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός αγγειογένεσης έχει παρατηρηθεί σε μελανώματα, καρκίνους των ωοθηκών και του μαστού ενώ χαρακτηρίζεται από αδυναμία ανταπόκρισης στους συμβατικούς αντιαγγειογενετικούς παράγοντες 36. Εικόνα 5: Εναλλακτικοί τρόποι αγγειογένεσης (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Hendrix MJ, et al. Nat Rev Cancer, 2003 Jun;3(6):411-21). Τέλος, ως έκτος μηχανισμός ανάπτυξης αγγείων παρίσταται και ο μηχανισμός της «ενσωμάτωσης» (co-option), ο οποίος παρατηρείται σε περιοχές με πλούσια αγγείωση, όπως ο εγκέφαλος, όπου ο όγκος μπορεί να ενσωματώσει τα υπάρχοντα αγγεία και να τα χρησιμοποιήσει για την αύξηση του μεγέθους του 37. Η διαδικασία της δημιουργίας νέων αγγείων από τον όγκο απαιτεί τουλάχιστον τρία ξεχωριστά γεγονότα. Αρχικά πρέπει να υπάρξει εντοπισμένη λύση της μεμβράνης του προϋπάρχοντος αγγείου και ακολούθως

37 37 μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων προς τα προαγγειογενετικά ερεθίσματα του όγκου και πολλαπλασιασμός τους για τη δημιουργία νέων τριχοειδών. Οι περισσότεροι από τους γνωστούς αγγειογενετικούς παράγοντες προκαλούν ένα ή δύο και σπάνια και τα τρία παραπάνω γεγονότα 79. Η δημιουργία νέων αγγείων συνδέεται επίσης σε μεγάλο βαθμό με την ικανότητα του όγκου να αποδομεί τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 91. Τα νέα αγγεία πρέπει να μπορούν να επιμηκύνονται, ώστε να διατηρούν την επαφή τους με τον αυξανόμενο σε μέγεθος όγκο 76. Τη δεκαετία του 1980 διατυπώθηκε για πρώτη φορά η θεωρία ότι σε αντίθεση με τα φυσιολογικά αγγεία, στα οποία το ενδοθήλιο είναι σταθερό, τα καρκινικά αγγεία έχουν πολλές διακλαδώσεις, πολύ μεγαλύτερη διαπερατότητα από τα φυσιολογικά αιμοφόρα αγγεία και σχηματίζουν ένα ελικοειδές, χαοτικό και αποδιοργανωμένο δίκτυο, με φτωχή κάλυψη από περικύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα 92. Τα νεόπλαστα αγγεία επομένως είναι δομικά και λειτουργικά ανώμαλα, με αργή ροή και δύσκολη διάκριση των αρτηριακών από τα φλεβικά στοιχεία Λόγω της ανώμαλης αυτής δομής τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να διέλθουν εύκολα στην κυκλοφορία, να μεταναστεύσουν σε απομακρυσμένες περιοχές και να δημιουργήσουν μεταστάσεις. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, που σχηματίζουν μια απλή στιβάδα γύρω από τα τριχοειδή αγγεία, πολλαπλές στιβάδες νεοπλασματικών κυττάρων περιβάλλουν τα νεόπλαστα αγγεία, δημιουργώντας μια τριχοειδική «περιχειρίδα». Η εξάρτηση των καρκινικών κυττάρων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα εξηγεί εν μέρει και την αποτελεσματικότητα της αντιαγγειογενετικής θεραπείας 49. Εκτός των άλλων, χαρακτηριστικό των νεόπλαστων αυτών αγγείων είναι η περιοδική τους απόφραξη, η διάρκεια της οποίας εκτείνεται από λίγα λεπτά της ώρας μέχρι αρκετές ώρες, δημιουργώντας με τον τρόπο αυτό συνθήκες υποξίας. Ο μηχανισμός της απόφραξης αυτής δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά φαίνεται να σχετίζεται με συσσώρευση λευκοκυττάρων ή με διακυμάνσεις της μέσης πίεσης 92. Παραδόξως, παρά τον αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης των νεόπλαστων τριχοειδών, η προσφορά οξυγόνου και φαρμάκων είναι μικρότερη από τους φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα τη σταδιακή μείωση της συγκέντρωσης των

38 38 χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στον όγκο 97. Οι όγκοι δεν αυξάνουν την παροχή του αίματος σε αυτούς, αλλά αντιθέτως την ελαττώνουν. Στα αρχικά στάδια της αγγειογένεσης οι όγκοι, που είναι συνήθως μικρότεροι από 1-2 mm 3, αιματώνονται ικανοποιητικά. Αντιθέτως, όταν γίνονται κλινικά εμφανείς, η αυξημένη μέση πίεση στα τριχοειδή του όγκου και η σχετική απουσία λεμφαγγείων έχουν ήδη προκαλέσει αγγειακή συμπίεση και κεντρική νέκρωση. Η αντιαγγειογενετική θεραπεία αυξάνει τη συγκέντρωση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στον όγκο, ελαττώνοντας τη μέση πίεση και μειώνοντας τη μάζα των καρκινικών κυττάρων 34. Επίσης, τα νεοπλασματικά αγγεία στερούνται προστατευτικών μηχανισμών, όπως λειτουργικών περιαγγειακών κυττάρων, που χρειάζονται για να προστατεύουν τα αγγεία από μεταβολές της συγκέντρωσης του οξυγόνου ή άλλων ουσιών. Τέλος, το τοίχωμα των καρκινικών αγγείων δεν αποτελείται από μια ομοιογενή στιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων, αλλά μπορεί να επενδύεται μόνο από καρκινικά κύτταρα ή από ένα μωσαϊκό καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Η παρουσία των καρκινικών κυττάρων στα αγγεία έχει σημαντική επίδραση στη δημιουργία μεταστάσεων και στο σχεδιασμό της αντιαγγειογενετικής θεραπείας 33. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση της νεοπλασματικής αγγειακής πυκνότητας και του κινδύνου για μεταστάσεις, της επιβίωσης χωρίς νόσο, της συνολικής επιβίωσης και γενικά της πρόγνωσης της νόσου. Ειδικότερα, στον καρκίνο του μαστού ο αριθμός των νεόπλαστων τριχοειδών που μετρούνται σε ιστολογικά παρασκευάσματα σχετίζεται άμεσα με την παρουσία μεταστάσεων και μπορεί να αποτελέσει έναν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα της δημιουργίας μεταστάσεων στους επιχώριους μασχαλιαίους λεμφαδένες ή σε απομακρυσμένες θέσεις Το γεγονός αυτό οδήγησε τους ερευνητές στο συμπέρασμα ότι η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την αύξηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου, τη διήθηση των ιστών και την εμφάνιση μεταστατικής νόσου 42,100. Εξάλλου, είναι γνωστό ότι η μετάβαση στον αγγειογενετικό φαινότυπο μπορεί να οδηγήσει σε μετατροπή του DCIS σε διηθητικό καρκίνωμα 101.

39 39 Γ. ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝΔΟΘΗΚΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VEGF) Η ανακάλυψη του VEGF το 1983 αποτέλεσε κρίσιμο σημείο στην έρευνα της αγγειογένεσης και στην προσπάθεια ανακάλυψης αντιαγγειογενετικών θεραπειών. Αρχικά είχε ονομαστεί VPF, λόγω της ιδιότητας του να αυξάνει φορές πιο ισχυρά από την ισταμίνη τη διαπερατότητα των τριχοειδών αγγείων 102. Επίσης, ο VEGF ασκεί ισχυρή μιτογόνο δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα Η οικογένεια του VEGF αποτελείται από πέντε μέλη, τους VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D και τον PlGF και τους τρεις υποδοχείς VEGFR-1 ή Flt-1, VEGFR-2 ή Flk-1/KDR και VEGFR-3 ή Flt (Εικόνα 6). Εικόνα 6: Μέλη της οικογένειας VEGF και η δράση στους υποδοχείς τους (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Kerbel RS, N Eng J Med 358:2039, May 8, 2008).

40 40 Ο πληρέστερα μελετημένος παράγοντας της οικογένειας είναι ο VEGF- A, που υπάρχει σε 4 ισομορφές λόγω εναλλακτικής συναρμογής (splicing) του RNA που μεταγράφεται από το γονίδιο. Στους ανθρώπους οι συχνότερες ισομορφές είναι οι VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189 και VEGF 206, όπου ο αριθμός υποδηλώνει τον αριθμό των αμινοξέων της πρωτεΐνης. Οι VEGF 189 και VEGF 206 είναι συνδεδεμένες με θειική ηπαράνη και παραμένουν στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία ή στην επιφάνεια των κυττάρων μέχρι να ενεργοποιηθούν από πρωτεάσες, ενώ η VEGF 165 βρίσκεται τόσο συνδεδεμένη, όσο και ελεύθερη στην κυκλοφορία. Αντίθετα, η VEGF 121 βρίσκεται μόνο σε ελεύθερη μορφή. Οι ελεύθερες κυκλοφορούσες μορφές, δηλαδή ο VEGF 121 και ο VEGF 165, είναι αυτές που ασκούν κυρίως την αγγειογενετική δράση 108 (Εικόνα 7). Αυτές συνδέονται σε δύο υποδοχείς με δράση τυροσινικής κινάσης, που βρίσκονται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τον VEGFR-1 (flt-1) και τον VEGFR-2 (KDR), ο οποίος είναι και ο κύριος υποδοχέας που επάγει το σήμα, παρότι ο VEGFR-1 έχει δεκαπλάσια συγγένεια σύνδεσης με τον VEGF. Μία διαλυτή μορφή του VEGFR-1 δρα ως ανταγωνιστικός μηχανισμός, ενώ άλλες πρωτεΐνες όπως οι νευροπιλίνες, υποδοχείς στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, αυξάνουν τη σύνδεση του VEGF-A με τον υποδοχέα του Εικόνα 7: Ισομορφές του VEGF-A (Παραχωρήθηκε από Vascular endothelial growth factor in Wikipedia, en.wikipedia.org/wiki/file:vegf_isoforms.png).

41 41 Η σύνδεση του VEGF-A στον VEGFR-2 προκαλεί το διμερισμό και την τρανσφωσφορυλίωση του υποδοχέα στις τυροσίνες 951, 1054, 1059, 1175 και Η Υ1175 φωσφορυλίωση οδηγεί σε ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C-γ και ακολούθως σε ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C. Ακολούθως, έχουμε παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης και αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, καθώς και ενεργοποίηση του μονοπατιού craf- MEK-MAP κινάσης, κάτι που γίνεται με εναλλακτική ενεργοποίηση του craf και όχι μέσω Shc-Grb2 σχηματισμού Ras-GTP, που είναι ο κλασικός δρόμος ενεργοποίησης του μονοπατιού. O VEGF-A αποτελεί τον κυριότερο αγγειογενετικό παράγοντα και επάγει τόσο τη φυσιολογική, όσο και την παθολογική αγγειογένεση (Εικόνα 8). Απενεργοποίηση του ενός μόνο αλληλίου του VEGF-A ή εναλλακτικά των δύο αλληλίων των υποδοχέων του προκαλεί θάνατο του εμβρύου 113. Ο VEGF επάγει την αγγειογένεση με πολλαπλούς μηχανισμούς. ιεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και την μετανάστευση τους προς τις περιοχές όπου είναι απαραίτητη η αγγειογένεση, αυξάνει την παραγωγή αναστολέων της απόπτωσης, βελτιώνοντας τις δυνατότητες επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και κινητοποιεί τα CEPs από το μυελό προς τα σημεία της αγγειογένεσης. Επίσης, ο VEGF αυξάνει τη διαπερατότητα των αγγείων, προκαλώντας εξαγγείωση διαφόρων πρωτεϊνών, οι οποίες συμμετέχουν στην δημιουργία της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που υποστηρίζει την ανάπτυξη των νεοσχηματισθέντων αγγείων και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Τέλος, ο VEGF επάγει την απελευθέρωση διαφόρων ουσιών που συμβάλλουν στην ενδοκυττάρια σηματοδότηση (second messengers), όπως του NO Ο VEGF βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα στους περισσότερους κακοήθεις όγκους και αποτελεί κακό προγνωστικό παράγοντα Η αυξημένη αυτή μεταγραφή του γονιδίου του VEGF οφείλεται κυρίως στην υποξία και στην ενεργοποίηση της μεταγραφικής οδού του επαγόμενου από την HIF-1α/HIF1-β, μέσω της αναστολής της υδροξυλίωσης του HIF-1α σε συνθήκες υποξίας (Εικόνα 9). Η μεταγραφή του VEGF επηρεάζεται

42 42 επίσης από την αύξηση της δράσης διαφόρων ογκογονιδίων (RAS, Src, οικογένεια HER) και την ελάττωση της δράσης διαφόρων ογκοκατασταλτικών γονιδίων (p53, PTEN, VHL) Τέλος, ο VEGF-C και ο VEGF-D συντελούν στην λεμφαγγειογένεση, δρώντας μέσω του VEGFR , ενώ ο VEGF-B δρα κυρίως στην εμβρυική ζωή μέσω του VEGFR-1. Ο PlGF δρα και αυτός μέσω του υποδοχέα VEGFR Εικόνα 8: Ενεργοποίηση του υποδοχέα VEGFR-2 (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Croce CM, N Engl J Med, 358:502, January 31, 2008).

43 43 Εικόνα 9: ράση της μεταγραφικής οδού HIF-1α/HIF-1β σε συνθήκες υποξίας (Παραχωρήθηκε από VH gene in Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Hematology, atlasgeneticsoncology.org/ Genes/ VHLID132.html).

44 44 Δ. ΙΝΤΕΡΛΕΥΚΙΝΗ 8 (IL-8) Η IL-8 αποτελεί μέλος της οικογένειας των μικρών εκκρινόμενων α- χυμοκινών. Οι παράγοντες αυτοί θεωρήθηκε αρχικά ότι προέρχονται από τα μονοκύτταρα και ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονή δηλαδή στη χημειοταξία όσο και στην ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων. Η IL-8 αυξάνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, επάγει την μεταστατική τους ικανότητα και δρα προαγγειογενετικά Η IL-8 εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα, τα ουδετερόφιλα, τα μακροφάγα και από τα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ η ρύθμιση έκφρασης του γονιδίου της γίνεται από το μονοπάτι της PI3K 132. Η IL-8 αυξάνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης λευκοκυττάρων και των CD11b/CD18 στα ουδετερόφιλα και συντελεί στην αυξημένη διαπερατότητα των τριχοειδών, γεγονός που αυξάνει τη συγκέντρωση των λευκοκυττάρων στις εστίες φλεγμονής 133. Πολλοί όγκοι, όπως ο καρκίνος του μαστού, του πνεύμονα, της ουροδόχου κύστης, του προστάτη και του μελανώματος παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση IL-8. Στον καρκίνο του μαστού αυξημένα επίπεδα της IL-8 στον ορό συσχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση, διηθητική και μεταστατική ικανότητα του όγκου, αλλά και παραδόξως με καλύτερη απάντηση στη θεραπεία Η έκφραση της IL-8 αυξάνεται από την υποξία και την οξέωση 136, ενώ είναι ελαττωμένη σε όγκους με θετικούς οιστρογονικούς υποδοχείς 137. Η υποξία επίσης επάγει την έκφραση των παραγόντων VEGF και του NF-kΒ, που στη συνέχεια αυξάνουν τη μεταγραφή της IL

45 45 Ε. ΜΕΤΑΤΡΕΠΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ β (TGF-β) O TGF-β, αποτελεί μέλος μιας οικογένειας αυξητικών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική ανάπτυξη και σε πολλά νοσήματα του ανθρώπου 139 και περιλαμβάνει τις BMPs, τις ακτιβίνες (activins) και τις ινχιμπίνες (inhibins). Ο TGF-β παράγεται από πολλά είδη κυττάρων και σχεδόν κάθε κύτταρο έχει υποδοχείς του TGF-β (Εικόνα 10). Ο παράγοντας αυτός συμμετέχει σε πολυάριθμες κυτταρικές λειτουργίες, όπως στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην αγγειογένεση, στην κυτταρική διαφοροποίηση, καθώς στη διαδικασία προσκόλλησης και μετανάστευσης των κυττάρων. Συμμετέχει ενεργά στο σχηματισμό των λείων μυϊκών ινών των αγγείων, αναστέλλει in vivo την κυτταρική ανάπτυξη φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων και διεγείρει in vitro τον πολλαπλασιασμό κυττάρων μεσεγχυματογενούς προέλευσης που συνθέτουν στοιχεία της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Όλα τα προαναφερθέντα επιτυγχάνονται με διάφορους μηχανισμούς, μεταξύ των οποίων συμπεριλαμβάνεται η διέγερση των ινοβλαστών για παραγωγή πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο σχηματισμό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και για παραγωγή πρωτεϊνών κυτταρικής προσκόλλησης (κολλαγόνο, ινονεκτίνη, ιντεγκρίνες). Επίσης, ελαττώνεται η παραγωγή ενζύμων που διασπούν το εξωκυττάριο δίκτυο, όπως της ηπαρινάσης, και αυξάνεται η παραγωγή αναστολέων αυτών των ενζύμων, όπως των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών Ο TGF-β εκκρίνεται σε ανενεργή μορφή και ενεργοποιείται με τη δράση της πλασμίνης, της θομβοσπονδίνης-1, καθώς και από διάφορες ιντεγκρίνες. Η έκκριση του TGFβ αναστέλλεται από την ινσουλίνη και τα οιστρογόνα, ενώ η χορήγηση αντιοιστρογόνων, όπως της ταμοξιφένης, αυξάνει την παραγωγή του και την προαποπτωτική του δράση 143. Πρέπει επίσης να τονιστεί ότι στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης ο TGF-β δρα ως ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ σε πιο προχωρημένα στάδια προάγει την ανάπτυξη του όγκου και τη δημιουργία μεταστάσεων, μέσω της διέγερσης του σχηματισμού στρώματος, της αύξησης

46 46 της αγγειογένεσης και της αυξημένης ανοσοκαταστολής που προκαλεί 139, Πέντε διαφορετικοί υπότυποι TGF-β έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα και τρεις από αυτούς εκφράζονται στα θηλαστικά. Πρόκειται για διμερή πεπτίδια με μοριακό βάρος 25 kda, που αποτελούνται από δύο όμοιες πεπτιδικές αλυσίδες 112 αμινοξέων. O TGF-β1 εκφράζεται σε κύτταρα του ενδοθηλιακού, αιμοποιητικού και συνδετικού ιστού, ο TGF-β2 σε ενδοθηλιακά και νευρικά κύτταρα και ο TGF-β3 σε μεσεγχυματογενή κύτταρα 110, ενώ ο TGF-β1 και ο TGF-β3 έχουν ισχυρότερη ανασταλτική δράση από τον TGFβ Έχει βρεθεί ότι ο TGF-β1 διαδραματίζει ρόλο στην εμφάνιση υπέρτασης 149, διαφόρων διαταραχών της νεφρικής λειτουργίας 150, καθώς και στην καρκινογένεση 151. Εικόνα 10: Μηχανισμός δράσης του TGF-β (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Blobe GC, N Engl J Med May 4;342(18):1350-8).

47 47 ΣΤ. ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ 2 (HER2) Ο υποδοχέας HER2/neu ανήκει στην υποκατηγορία Ι υποδοχέων τυροσινικής κινάσης και κωδικοποιείται από το γονίδιο ERBB2, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17q21. Στην ίδια οικογένεια ανήκουν ο EGFR, o ErbB-3 (HER-3) και ο ErbB-4 (HER-4) Όλα τα μέλη της οικογένειας αποτελούνται από μια εξωκυττάρια περιοχή δέσμευσης του συνδέτη (ligand), μια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή και μια ενδοκυττάρια περιοχή με δραστικότητα τυροσινικής κινάσης (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Μηχανισμός δράσης της οικογένειας υποδοχέων τυροσινικής κινάσης ErbB (Παραχωρήθηκε από Cell Signaling Technology, tyrosine.jsp).

48 48 Η δέσμευση του συνδέτη στους υποδοχείς ErbB προκαλεί το σχηματισμό ομοδιμερών και ετεροδιμερών, ενεργοποίηση της περιοχής της κινάσης, φωσφορυλίωση συγκεκριμένων τυροσινών και τελικά ενεργοποίηση ενδοκυττάριων μονοπατιών μεταγωγής σήματος. Κανένας συνδέτης δεν συνδέεται με το HER2, ενώ ο HER3 δεν έχει δραστικότητα τυροσινικής κινάσης, οπότε τα ομοδιμερή τους δεν είναι ενεργά 157. Ο HER2/neu διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού, όπου η υπερέκφρασή του συσχετίζεται με όγκους χαμηλής διαφοροποίησης και μεγαλύτερου μεγέθους, με συχνότερη διήθηση των μασχαλιαίων λεμφαδένων, αντίσταση στη χημειοθεραπεία και γενικότερα φτωχότερη πρόγνωση (ιδιαίτερα πριν τη χρησιμοποίηση ειδικών θεραπειών, όπως το trastuzumab) Περίπου 20-30% των ασθενών με καρκίνο μαστού παρουσιάζουν υπερέκφραση του HER Στον καρκίνο του μαστού η υπερέκφραση HER2 συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση VEGF και Ang-2, γεγονός που οδηγεί σε αυξημένη αγγειογένεση Επιπλέον, πολλές μελέτες αποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο του HER2 στη μοριακή οδό μεταγωγής ενδοκυττάριου σήματος στα ενδοθηλιακά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης και της αύξησης της δραστικότητας του μεταγραφικού παράγοντα c-jun. Τα παραπάνω μονοπάτια μεταγωγής σήματος ενεργοποιούνται επίσης και από άλλους υποδοχείς που συμμετέχουν στην αγγειογένεση, όπως οι υποδοχείς του VEGF 166.

49 49 Ζ. ΜΟΝΟΞΕΙΔΙΟ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ (ΝΟ) Το NO παράγεται από την L-αργινίνη, μέσω της συνθετάσης του NO (NOS), από τις 3 ισομορφές της οποίας η επαγόμενη μορφή (inos) παράγει τα μεγαλύτερα ποσά NO και έχει συσχετισθεί με πολλές παθολογικές καταστάσεις. Το NO λειτουργεί ως ρυθμιστικός παράγοντας στο αγγειακό, νευρικό και ανοσοποιητικό σύστημα και συμβάλλει στην προσκόλληση και ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων Αυξημένα επίπεδα NO και inos στους ιστούς συσχετίζονται με ανάπτυξη όγκων και εμφάνιση μεταστάσεων σε εργαστηριακές μελέτες, ενώ η αυξημένη έκφραση inos στον καρκίνο του μαστού έχει συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση (Εικόνα 12). Το NO αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της αγγειογένεσης, αφού αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα, συντελεί στην αποδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, επάγει την έκφραση του VEGF, αυξάνει τον ρυθμό πολλαπλασιασμού και την ικανότητα μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και επάγει την προαγγειογενετική δράση της Ang-1, της ινσουλίνης και των οιστρογόνων Το NO είναι απαραίτητο για την αγγειογενετική δράση του VEGF, όπως αποδεικνύεται από το γεγονός ότι σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών η απουσία έκφρασης NOS στο ενδοθήλιο εμπόδισε την προαγγειογενετική δράση του VEGF και από το ότι οι αναστολείς του ενδοθηλιακού NOS αναστέλλουν και την αγγειογένεση από τη χορήγηση VEGF Επίσης, φαίνεται ότι η επαγωγή της αγγειογένεσης μέσω του VEGF και του HGF εξαρτάται από την παρουσία NO , κάτι που δε ισχύει για τον bfgf 176,178. Η αγγειογενετική δράση του NO είναι εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του 179. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη μεταναστευτική ικανότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων, σε συγκεντρώσεις πάνω από 300 nmol/l ασκεί κυτταροστατική δράση, ενώ σε ακόμη μεγαλύτερες συγκεντρώσεις προκαλεί κυτταρικό θάνατο Τέλος, ένας ακόμη μηχανισμός μέσω του οποίου ο NO δρα προαγγειογενετικά είναι η ανασταλτική δράση του στην παραγωγή της αγγειοστατίνης, ενός αντιαγγειογενετικού πεπτιδίου 182.

50 50 Εικόνα 12: Μηχανισμός δράσης του NO (Παραχωρήθηκε από people/204370/photos-videos/item/545863).

51 51 Η.ΟΣΤΕΟΠΟΝΤΙΝΗ (OPN) Η OPN είναι μια εκκρινόμενη γλυκοπρωτεΐνη από ινοβλάστες, οστεοβλάστες, οστεοκύτταρα, μακροφάγα και ενδοθηλιακά κύτταρα, η οποία αποτελείται από 298 αμινοξέα. Η καλσιτριόλη προάγει τη σύνθεση της. Η OPN συνδέεται με ασβέστιο και ιντεγκρίνες και συμμετέχει στην αντίδραση του οργανισμού σε στρεσογόνα ερεθίσματα, στη φλεγμονή, στην επούλωση τραυμάτων και στην ανοσιακή απάντηση. Συμμετέχει ακόμη στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης, της επασβέστωσης της αορτικής βαλβίδας, στην επούλωση του μυοκαρδίου μετά από έμφρακτο, στην προσκόλληση και μετανάστευση κυττάρων και στην ανάπτυξη νεοπλασιών και εμφάνιση μεταστάσεων Η σύνδεση της OPN με τις ιντεγκρίνες εξηγεί το ρόλο της στην αυξημένη μεταστατική ικανότητα του όγκου, λόγω της μεταγωγής σήματος μέσω των ιντεγκρινών, της αύξησης της προσκόλλησης και της μετανάστευσης των κυττάρων που προκαλείται. Κύριος υποδοχέας της OPN είναι η ιντεγκρίνη α ν β 3, ενώ αλληλεπιδρά και με τις ιντεγκρίνες α 4 β 1, α 8 β 1 και α 9 β Η OPN εκφράζεται σε περιορισμένο αριθμό φυσιολογικών ιστών, ενώ αποτελεί προγνωστικό παράγοντα στον καρκίνο του μαστού Μπορεί επίσης να δρα ως κυτταροκίνη και ως μόριο του εξωκυττάριου δικτύου. Εκφράζεται σε διάφορα είδη κυττάρων, όπως λευκοκύτταρα, οστεοβλάστες, λεία μυϊκά κύτταρα, ενώ δρα και ως ισχυρός προαγγειογενετικός παράγοντας, δρώντας αντιαποπτωτικά και προάγοντας τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων 187, (Εικόνα 13). Στο μαστό η OPN εκφράζεται κυρίως στα εκκριτικά κύτταρα 194, ενώ στον καρκίνο του μαστού αυξάνει την παραμονή των καρκινικών κυττάρων στο λεμφικό σύστημα και την πιθανότητα λεμφαδενικών μεταστάσεων 187. Ο ρόλος της στην καρκινογένεση είναι πολλαπλός και ασκείται μέσω αλληλεπιδράσεων με διάφορες πρωτεάσες, όπως την πλασμίνη, και διάφορες μεταλλοπρωτεϊνάσες, με την συμμετοχή της στη μεταγωγή σήματος από διάφορους αυξητικούς παράγοντες (RAS, HGF), με την ενεργοποίηση διάφορων κυτταρικών υποδοχέων και με την προαγγειογενετική της δράση 183, Η ΟPN, σε συνεργασία με τον VEGF, ενισχύει και τη

52 52 μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Ο VEGF αυξάνει την έκφραση της OPN και της ιντεγκρίνης α ν β 3 και αυξάνει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων διαμέσου της οδού α ν β , ενώ πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι και η OPN μπορεί να αυξήσει την έκφραση του VEGF στα καρκινικά κύτταρα Η πυκνότητα των νεοσχηματισθέντων αγγείων είναι σημαντικά υψηλότερη σε αδενοκαρκινώματα σταδίου Ι στον πνεύμονα που υπερεκφράζουν ταυτόχρονα τον VEGF και την OPN, γεγονός που ερμηνεύεται από τη συνεργική δράση των δύο παραγόντων στην αγγειογένεση 199. Εικόνα 13: Μοντέλο που δείχνει το ρόλο της OPN στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου και της νεοαγγείωσης (Παραχωρήθηκε ευγενικά από Chakraborty G et al Current Molecular Medicine 2006, 6, ).