ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΦΥΛΟΓΕΝΕΙΑ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΗΣ ATHERINA BOYERI ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΚΡΑΪΤΣΕΚ ΣΠΥΡΙΔΟΥΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, 2011

2 ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Επιβλέπων Καθηγητής: Κίλιας Γ. Μέλη: Αλαχιώτης Σ. Κλώσσα-Κίλια Ε. Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Αλαχιώτης Σ. Κίλιας Γ. Κλώσσα-Κίλια Ε. Μπούρτζης Κ. Παπασωτηρόπουλος Β. Στεφάνου Γ. Φλυτζάνης Κ. Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Θερμοκηπιακών Καλλιεργειών και Ανθοκομίας, Τ.Ε.Ι Μεσολογγίου Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών

3 Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1932, άρθρο 202.

4 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κατά τα έτη Φτάνοντας στο τέλος αυτής της εμπειρίας θεωρώ απαραίτητο να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνέβαλαν με τον τρόπο τους στην ολοκλήρωση της προσπάθειας αυτής. Κατ αρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κίλια, ο οποίος είχε την κύρια επίβλεψη της παρούσας διατριβής. Στο πλαίσιο της πολύχρονης συνεργασίας μας που ξεκίνησε με την εκπόνηση διπλωματικής εργασίας κατά τη διάρκεια των προπτυχιακών σπουδών και συνεχίστηκε με την εκπόνηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης καθώς και την απόκτηση Διδακτορικού Διπλώματος, μου δίδαξε την επιστημονική σκέψη. Οι εποικοδομητικές συζητήσεις που είχαμε κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων αλλά και οι προβληματισμοί που έθετε καλλιέργησαν την κριτική μου σκέψη και θα είμαι ευγνώμων για αυτό. Σημαντικότατο επίσης ρόλο στην εκπόνηση της παρούσας διατριβής είχε και η Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Έλενα Κλώσσα-Κίλια την οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά. Οι συμβουλές της κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ήταν πολύτιμες και πολλές φορές καθοριστικές. Επιπλέον, ο χαρακτήρας της συνέβαλε ουσιαστικά στη δημιουργία ενός ευχάριστου και κυρίως «οικογενειακού» περιβάλλοντος εργασίας, χωρίς εντάσεις. Κυρίως όμως θα ήθελα να ευχαριστήσω τους δύο Καθηγητές για τη βοήθειά τους σε προσωπικό επίπεδο. Χωρίς την αγάπη, τη στήριξη και την εμπιστοσύνη τους δε θα ήταν εφικτή η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Τους ευχαριστώ θερμά και είμαι ευγνώμων για τη διακριτικότητα τους και την ελευθερία κινήσεων που μου παρείχαν σε στιγμές που ήταν απαραίτητο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Καθηγητή κ. Σταμάτη Αλαχιώτη για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή. Οι εύστοχες παρατηρήσεις και συμβουλές του συνετέλεσαν σημαντικά στην όσο το δυνατόν πιο άρτια συγγραφή της παρούσας διατριβής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής: τον Καθηγητή κ Κωνσταντίνο. Μπούρτζη. και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη για την παρουσία τους στην επταμελή επιτροπή, την Καθηγήτρια κ. Γεωργία Στεφάνου τόσο για τη συμμετοχή στην αξιολόγηση της διατριβής όσο και για το ενδιαφέρον της όλα αυτά τα χρόνια και τον Επίκουρο Καθηγητή Βασίλη Παπασωτηρόπουλο για τη συμμετοχή του στην επταμελή επιτροπή, το ενδιαφέρον του και τις αγχολυτικές, με χιούμορ, συμβουλές του κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Δε θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω θερμά τον Ομότιμο Καθηγητή κ. Γεώργιο Γιαννόπουλο που το αμείωτο ενδιαφέρον και η

5 συνεχόμενη ηθική υποστήριξη σε θέματα τόσο εντός όσο και εκτός εργαστηρίου με έχει συγκινήσει. Επιπλέον, ευχαριστώ θερμά την Ομότιμη Καθηγήτρια κ. Αντιγόνη Ζαχαροπούλου για το ενδιαφέρον, τις συμβουλές και υποστήριξη που μου έχει προσφέρει. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Αντώνη Αυγουστίνο για τις συμβουλές του, την ενθάρρυνσή του και την άψογη συνεργασία που είχαμε όποτε χρειάστηκε. Επιπλέον, ευχαριστώ τον Παναγιώτη Κορνήλιο για τις συμβουλές του σε τεχνικά θέματα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους παλιούς και νέους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον υποψήφιο διδάκτορα Στέφανο Μαρτιμιανάκη για την καθοδήγησή του στα πρώτα βήματα μου στο εργαστήριο αλλά και για την αρμονική συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια, καθώς και τις υποψήφιες διδάκτορες Χαρά Παπαϊωάννου και Μαρία Καμηλάρη για την καλή συνεργασία και την κατανόηση που έδειξαν ιδιαίτερα κατά τα τελευταία χρόνια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα τους φίλους μου για την υπομονή τους, την αγάπη και τη στήριξη που μου έχουν προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια. Αποτελούν πολύτιμο και ευχάριστο κομμάτι της ζωής μου και είναι σίγουρο πως η ενθάρρυνσή τους έπαιξε καταλυτικό ρόλο όχι μόνο στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής αλλά και στην καλύτερη διαχείριση δύσκολων καταστάσεων που παρουσιάστηκαν εκτός εργαστηρίου. Για τους γονείς μου, τον πατέρα μου Νικόλαο και τη μητέρα μου Μαρία, το ευχαριστώ είναι το ελάχιστο που μπορώ να πω για ό,τι μου έχουν προσφέρει. Καθότι τα λόγια δεν είναι αρκετά, αναφέρω μόνο πως η στάση ζωής και η δύναμή τους είναι το πολυτιμότερο δίδαγμα για μένα και είναι τα στοιχεία που με καθοδηγούν και με εμπνέουν στην πορεία της ζωής μου. Ευχαριστώ θερμά τον αδερφό μου Αλόι για τη στήριξη και απόλυτη εμπιστοσύνη που μου δείχνει. Τον ευχαριστώ που βρίσκεται πάντα διακριτικά πλάι μου. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου για την οικονομική υποστήριξη, υπό τη μορφή υποτροφίας, που μου παρείχε το πρόγραμμα «Κ. Καραθεοδωρή» του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του έργου «Μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων λιμναίων και θαλάσσιων πληθυσμών της Atherina boyeri (Οικ. Atherinidae)» με επιστημονικό υπεύθυνο την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Κλώσσα-Κίλια Έλενα. Πάτρα, 2011 Κράιτσεκ Σπυριδούλα

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Α.1 Γενικά 1 Α.1.1 Ορισμοί του είδους 1 Α Ειδογενετική πορεία 2 Α Οριοθέτηση του είδους 5 Α.2 Μοριακοί δείκτες στη φυλογένεση 6 Α.2.1 Το μιτοχονδριακό DNA ως μοριακός δείκτης 6 Α.2.2. Δείκτες πυρηνικού DNA 12 Α Ο πυρηνικός δείκτης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη - Ροδοψίνη (rhodopsin- Rh) 17 Α.3 Στοιχεία για τον υπό μελέτη οργανισμό 20 Α.3.1 Το είδος Atherina boyeri 20 α) Διατροφικές συνήθειες 24 β) Διάρκεια ζωής 24 γ) Αύξηση 24 δ) Περίοδος αναπαραγωγής Αναλογία φύλου 25 Α.3.2 Το σύμπλεγμα της Atherina boyeri 26 Α Περί ονοματολογίας 32 Α.4 Σκοπός της παρούσας έρευνας 33 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 35 Β.2.1 Περιοχές δειγματοληψίας 35 Β.2.2 Απομόνωση γενετικού υλικού και μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν 36 Β Αρχή της μεθόδου 36 Β Εφαρμογή της μεθόδου 37 Πρωτόκολλο απομόνωσης ολικού DNA 37 Β.2.3 Ηλεκτροφόρηση ολικού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 38 Β Γενικά 38 Β Εφαρμογή της μεθόδου 39 Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν 39 Πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης 39 Β.2.4 Πολλαπλασιασμός γονιδιακών τμημάτων με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) 40 Β Αρχή της μεθόδου 40 Β Εφαρμογή της μεθόδου 40 Β.2.5 Καθαρισμός προϊόντων PCR 44 Β Αρχή της μεθόδου 44 Β Εφαρμογή της μεθόδου 45 Πρωτόκολλο καθαρισμού προϊόντων PCR 45

7 Β.2.6 Προσδιορισμός αλληλουχίας τμημάτων DNA Sequencing 46 Β Θεωρητικό μέρος 46 Β Ειδικό μέρος 47 Β.2.7 Ποιοτικός έλεγχος αλληλουχιών 47 Β.2.8 Πολλαπλή Στοίχιση Αλληλουχιών (multiple sequence alignment) 48 Β Γενικά 48 Β Ειδικά 48 Β.2.9 Έλεγχος για κορεσμό νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (substitution saturation) 49 Β Γενικά 49 Β Ειδικά 50 Β Επιλογή καταλληλότερου μοντέλου εξέλιξης 51 Β Θεωρητικό μέρος 51 Β Εφαρμογή της μεθόδου 52 Β.2.11 Κατασκευή φυλογενετικών δένδρων 53 Β Μέθοδος Σύνδεσης-γειτόνων (Neighbor-joining, ΝJ) 55 Β Θεωρητικό μέρος 55 Β Ειδικό μέρος 56 Β Μέθοδος Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony, MP) 56 Β Αρχή της μεθόδου 57 Β Εφαρμογή της μεθόδου 57 Β Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία (Bayesian Inference) 57 Β Θεωρητικό μέρος 57 Β Εφαρμογή της μεθόδου 59 Β.2.12 Αξιολόγηση της αξιοπιστίας των δένδρων 60 Β Γενικό - Θεωρητικό μέρος 60 Β Ειδικό μέρος 61 B.2.13 Ανάλυση Μοριακής Διακύμανσης (AMOVA) 61 B Γενικό-Ειδικό μέρος 61 Β.2.14 Ανεξάρτητη ή συνδυασμένη ανάλυση; 62 Β Γενικά 62 Β Ειδικό μέρος 62 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 64 Γ.1 Ανεξάρτητη ανάλυση 64 Γ.1.1 Μιτοχονδριακοί γενετικοί τόποι 64 Γ Γενετικός τόπος D-loop 64 Γ Γενετικός τόπος COI 76 Γ Γενετικός τόπος Cytb 86 Γ.1.2 Πυρηνικός γενετικός τόπος 101 Γ Γενετικός τόπος Rh 101 Γ.2 Ανάλυση Μοριακής Διακύμανσης (AMOVA) 110 Γ.3 Συνδυασμένη ανάλυση 111 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 117

8 Δ.1 Μιτοχονδριακοί γενετικοί τόποι (COI, Cytb, D-loop) 117 Δ.2 Πυρηνικός γενετικός τόπος (ροδοψίνη - Rh) 128 Δ.3 Συνδυασμένη φυλογενετική ανάλυση 133 Δ.4 Σχετικά με την ένθεση ανάμεσα στο trna Glu και το Cytb 134 Δ.5 Αποτελούν διαφορετικό είδος ή όχι οι τρεις τύποι πληθυσμών; 137 Δ.6 Ανακεφαλαίωση-Συμπεράσματα 138 E. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 141 ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 145 Ζ. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 159

9 Α.Εισαγωγή Α. Εισαγωγή Α.1 Γενικά Α.1.1 Ορισμοί του είδους Το ερώτημα «τι ορίζουμε ως είδος;» αποτελεί αναμφίβολα ένα από τα μείζονα θέματα της εξελικτικής βιολογίας. Παρόλο που έχουν περάσει σχεδόν 150 χρόνια από την δημοσίευση του βιβλίου On the origin of species by means of natural selection του Δαρβίνου (Darwin, 1859), τόσο ο ορισμός του είδους όσο και οι γενετικοί μηχανισμοί με τους οποίους προκύπτουν τα είδη δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Έχουν προταθεί αρκετοί ορισμοί, καθένας όμως έχει τα υπέρ και τα κατά του, και συνεπώς είναι δύσκολο να επικρατήσει καθολικά ένας ορισμός (Abbott et al., 2008). Επί του παρόντος, ο πιο αποδεκτός ορισμός, σύμφωνα με τους Conye και Orr (2004), είναι ο βιολογικός ορισμός του είδους (biological species concept BSC) που προτάθηκε από τον Dobzhansky (1937) και τελειοποιήθηκε από τον Mayer (1942). Με τον ορισμό αυτό τίθεται στο επίκεντρο της ειδογενετικής πορείας η πλήρης αναπαραγωγική απομόνωση (Conye & Orr, 2004) και δηλώνεται πως το είδος είναι ομάδες αμφιγονικά αναπαραγόμενων φυσικών πληθυσμών που είναι αναπαραγωγικά απομονωμένες και ανεξάρτητες από άλλες τέτοιες ομάδες (Αλαχιώτης, 2007). Παρόλο που αυτός ο ορισμός είναι ο πιο αποδεκτός έχει ορισμένα μειονεκτήματα. Ένα ενδεικτικό μειονέκτημα είναι πως αν και μπορεί να εφαρμοστεί στους φυλετικά αναπαραγόμενους πληθυσμούς δεν έχει ισχύ γι αυτούς που αναπαράγονται μονογονικά (αφυλετικά, αγενώς). Στις περιπτώσεις μονογονικά αναπαραγόμενων οργανισμών χρησιμοποιείται ο μοριακός ορισμός του είδους (molecular species concept - MSC), σύμφωνα με τον οποίο «είδος θεωρείται ένα σύνολο ατόμων με όμοιες βασικές γονιδιωματικές αλληλουχίες DNA» (Αλαχιώτης, 2007). Μειονέκτημα αποτελεί επίσης το γεγονός ότι αρκετοί οργανισμοί είναι γεωγραφικά απομονωμένοι και είναι συχνά δύσκολο να καθοριστεί εάν οι πληθυσμοί των οργανισμών αυτών που δεν έχουν ανταλλάξει γενετικό υλικό, στο πρόσφατο παρελθόν τουλάχιστον, δεν μπορούν σε κατάλληλες συνθήκες να ανταλλάξουν (Bickford et al., 2007). Μία άλλη δυσκολία για τον ορισμό του είδους αφορά τα είδη που έχουν ζήσει σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, όπως λ.χ. πολλά προγονικά είδη που είναι γνωστά μόνο ως απολιθώματα και δεν μπορούμε να τα ελέγξουμε γενετικά, μοριακά, αλλά ούτε και σύμφωνα με τον βιολογικό ορισμό, ο οποίος αφορά υπάρχοντα είδη στον οποίο δεν περιλαμβάνεται η ιστορική διάσταση (Αλαχιώτης, 2007). Για τις περιπτώσεις αυτές έχει προταθεί από τον Simpson (1951) η έννοια του εξελικτικού είδους (evolutionary species concept - ESC), κατά τον οποίο είδος ορίζεται η γενεαλογία (προγονική-απογονική ακολουθία πληθυσμών) που εξελίσσεται ξεχωριστά από άλλες, έχοντας το δικό της μοναδικό εξελικτικό ρόλο. Ο ορισμός αυτός εφαρμόζεται τόσο σε ζωντανές όσο 1

10 Α. Εισαγωγή και σε αφανισμένες μορφές οργανισμών καθώς επίσης σε φυλετικά και αφυλετικά αναπαραγόμενους οργανισμούς. Ωστόσο, παραμένει ασαφής σχετικά με την ουσιαστική σημασία της έκφρασης «μοναδικό εξελικτικό ρόλο» (Avise, 1994). Ως εκ τούτου δεν διευκρινίζει πως θα διακριθεί μια εξελικτική γραμμή από μια άλλη ώστε να χαρακτηριστεί ως διαφορετικό είδος. Συνεπώς, για τη διάκριση και κατάταξη τέτοιων ειδών χρησιμοποιείται εναλλακτικά ένα κριτήριο που είναι το εξής: όταν οι μορφολογικές διαφορές μεταξύ οργανισμών του παρελθόντος οι οποίοι βρίσκονται σε μορφή απολιθώματος είναι τόσο μεγάλες όσο και μεταξύ ζωντανών ειδών, τότε κατατάσσονται σε διαφορετικά είδη. Τέτοια είδη, που έχουν διαφορετικά ονόματα αλλά ανήκουν στην ίδια εξελικτική γραμμή και έχουν ζήσει σε διαφορετικούς χρόνους, αναφέρονται συχνά ως χρονοείδη (chronospecies) (Αλαχιώτης, 2007). Η ταξινομική κατάταξη των χρονοειδών προβάλλεται στη συλλογιστική ότι οι διαφορές μεταξύ ατόμων διαφορετικών ειδών είναι πολύ μεγαλύτερες σε σχέση με εκείνες μεταξύ ατόμων του ίδιου είδους. Η παραδοχή αυτή είναι η βάση ενός άλλου ορισμού, γνωστού ως φαινετικός ορισμός του είδους (phenetic species concept, PSC), σύμφωνα με το οποίο ως είδος περιγράφεται μία ομάδα οργανισμών οι οποίοι μοιάζουν φαινοτυπικά μεταξύ τους επαρκώς και διαφέρουν από τους οργανισμούς άλλης ομάδας. Πιο πρόσφατη αντίληψη του φαινετικού ορισμού είναι ο φυλογενετικός ορισμός του είδους (phylogenetic species concept - PSC)(Cracraft, 1983), ο οποίος αναφέρεται και ως γενεαλογικός ορισμός του είδους (genealogical species concept - GSC), που ορίζει τα είδη βάσει της μονοφυλετικότητάς τους ως προς την καταγωγή, χωρίς σαφή αναφορά σε αναπαραγωγικούς φραγμούς (Bickford et al., 2007). Α Ειδογενετική πορεία Με τον όρο ειδογενετική πορεία ή ειδογένεση προσδιορίζεται η εξελικτική διαδικασία κατά την οποία ένας πληθυσμός αποκλίνει και σχηματίζει διαφορετικούς και καινούργιους κλάδους, ώσπου τελικά δημιουργούνται διαφορετικά είδη (Staley et al., 2009). Η ειδογένεση φαίνεται πως είναι ένα υποπροϊόν της ενδοειδικής εξέλιξης, που σημαίνει ότι δεν απαιτούνται πρόσθετοι εξελικτικοί μηχανισμοί πέραν εκείνων που προκαλούν αλλαγές μέσα στο είδος. Η εξέλιξη δεν είναι τίποτα άλλο από αλλαγές της γενετικής δομής των πληθυσμών και ως σύνολο είναι μια βαθμιαία πορεία αλλαγών, με το νέο είδος να είναι ο τερματικός σταθμός των αλλαγών του προηγούμενου είδους και η αφετηρία νέων αλλαγών. Προτού όμως η γενετική διαφοροποίηση των πληθυσμών φτάσει στο σημείο εκείνο ώστε να αντανακλά νέα είδη, περνά από διαφοροποιημένες διακριτές καταστάσεις (Αλαχιώτης, 2007). Ζητήματα που σχετίζονται με την ειδογένεση προσελκύουν το ενδιαφέρον τόσο των ερευνητών που ασχολούνται με την πληθυσμιακή γενετική όσο και με 2

11 Α.Εισαγωγή τη συστηματική, καθώς βρίσκεται στο σταυροδρόμι των δύο αυτών κλάδων (Staley et al., 2009). Σύμφωνα με τους Conye και Orr (2004), το κεντρικό πρόβλημα στη μελέτη της ειδογένεσης είναι η κατανόηση των εξελικτικών δυνάμεων που οδηγούν στην πρωταρχική μείωση της ανταλλαγής γονιδίων ανάμεσα στους πληθυσμούς. Για το λόγο αυτό, οι περισσότερες μελέτες εστιάζονται σε ατελώς απομονωμένα taxa ή σε νέα, πρόσφατα σχηματισμένα είδη, όπως π.χ. τα αδελφά είδη, τα είδη δηλαδή που παρουσιάζουν όλα τα χαρακτηριστικά του είδους αλλά δε διακρίνονται μορφολογικά. Η ειδογένεση είναι πιθανό, και πράγματι μπορεί, να συμβαίνει μέσω μίας ποικιλίας μηχανισμών. Μπορεί να συμβεί σε ένα βήμα, όπως γίνεται σε περιπτώσεις πολυπλοειδίας ή μπορεί να συμβεί από προοδευτική υποκατάσταση αλληλομόρφων σε πολλούς γενετικούς τόπους. Επιπλέον, μπορεί να αποτελεί παραπροϊόν της προσαρμογής σε διαφορετικά περιβάλλοντα, ή μπορεί να προκληθεί χωρίς καμία προσαρμογή. Είναι πιθανό να συμβεί ειδογένεση όταν οι πληθυσμοί παραμένουν χωρισμένοι για μεγάλο χρονικό διάστημα εξαιτίας γεωγραφικών φραγμών, αλλά μπορεί επίσης να συμβεί και όταν οι πληθυσμοί κατοικούν στην ίδια μικρή περιοχή και υπάρχει ανάμεσά τους γονιδιακή ροή. Έχει δειχθεί ότι πράγματι υπάρχουν αρκετοί ειδογενετικοί μηχανισμοί, αλλά παραμένει ακόμα αβέβαιο σε ποιους από αυτούς οφείλεται ο σχηματισμός των περισσότερων ειδών που υπάρχουν σήμερα (Butlin et al., 2009). Για να διαχωριστούν γενετικά δύο πληθυσμοί μεταξύ τους, και να οδηγήσουν στο σχηματισμό νέου είδους, είναι απαραίτητο να είναι πλήρως απομονωμένοι. Η απομόνωση αυτή μπορεί να είναι είτε αναπαραγωγική είτε γεωγραφική. Με τον όρο αναπαραγωγική απομόνωση εννοούμε όλους εκείνους τους μηχανισμούς (προσυζευκτικούς ή μετασυζευκτικούς) που εμποδίζουν την αναπαραγωγή μεταξύ δύο συμπατρικών πληθυσμών. Υπάρχουν δύο θεωρίες για την προέλευση και ανάπτυξη της αναπαραγωγικής απομόνωσης. Σύμφωνα με τη μία θεωρία, η αναπαραγωγική απομόνωση είναι ένα συμπτωματικό υποπροϊόν της γενετικής απόκλισης δύο πληθυσμών, οι οποίοι διαφοροποιούνται γενετικά όλο και περισσότερο λόγω προσαρμογής σε διαφορετικά περιβάλλοντα, με αποτέλεσμα να δημιουργηθεί δυσαρμονία στις γονιδιακές δεξαμενές τους, που δεν τους επιτρέπει τελικά να διασταυρωθούν επιτυχώς. Η άλλη θεωρία δέχεται ότι η αναπαραγωγική απομόνωση είναι άμεσο προϊόν της φυσικής επιλογής. Σε οποιαδήποτε περίπτωση τα υβρίδια (μεταξύ των πληθυσμών) έχουν χαμηλότερη αρμοστικότητα από τα μη υβρίδια, η φυσική επιλογή προωθεί την ανάπτυξη των αναπαραγωγικών απομονωτικών μηχανισμών επειδή τα γονίδια που παρεμποδίζουν την υβριδοποίηση έχουν μεγαλύτερη αρμοστικότητα από τα γονίδια που την ευνοούν. Οι δύο αυτές θεωρίες δεν αποκλείονται αμοιβαία. Η αναπαραγωγική απομόνωση συνήθως αρχίζει ως ένα συμπτωματικό παραπροϊόν της γενετικής απόκλισης (διαφοροποίησης των πληθυσμών), αλλά συμπληρώνεται όταν κατευθύνεται άμεσα από τη φυσική επιλογή (όταν τα υβρίδια μεταξύ των πληθυσμών έχουν μικρότερη αρμοστικότητα από τα μη υβρίδια) (Αλαχιώτης, 2007). Η γεωγραφική ειδογένεση περικλείει μια σταδιακή και μακρόχρονη γενετική 3

12 Α. Εισαγωγή διαφοροποίηση πληθυσμών που χωρίστηκαν από γεωγραφικούς φραγμούς. Η γενετική διαφοροποίηση επάγεται στην περίπτωση αυτή, είτε από τη φυσική επιλογή είτε από την τυχαία γενετική εκτροπή (Αλαχιώτης, 2007). Αξίζει να αναφερθεί ότι ανάλογα με τη γεωγραφική κατανομή των υπό μελέτη πληθυσμών έχουν προταθεί τρεις διαφορετικοί τύποι ειδογένεσης: η συμπατρική, η αλλοπατρική και η παραπατρική. Η συμπατρική ειδογένεση πραγματοποιείται χωρίς χωρική απομόνωση και η απόκλιση συμβαίνει κάτω από συνθήκες τυχαίου ζευγαρώματος, ενώ η αλλοπατρική παρατηρείται όταν οι πληθυσμοί που αποκλίνουν είναι σε γεωγραφική απομόνωση και δεν έχουν την ικανότητα να ανταλλάξουν γονίδια. Η παραπατρική ειδογένεση περιγράφει περιπτώσεις στις οποίες υπάρχει ως ένα βαθμό γονιδιακή ροή ανάμεσα στους πληθυσμούς που αποκλίνουν (Abbott et al., 2008) [(οι πληθυσμοί εκτείνονται σε κοντινές αλλά όχι επικαλυπτόμενες εκτάσεις (Bickford et al., 2007)]. Μία άλλη μορφή ειδογένεσης είναι η κβαντική (quantum) ή, όπως αλλιώς αναφέρεται, γρήγορη ή αλματώδης ειδογένεση, κατά την οποία η ανάπτυξη μετασυζευκτικών αναπαραγωγικών απομονωτικών μηχανισμών γίνεται σε μικρά σχετικά χρονικά διαστήματα. Ένα παράδειγμα κβαντικής ειδογένεσης είναι η πολυπλοειδία, η οποία μπορεί να προκύψει σε μία ή δύο γενιές. Οι πολυπλοειδείς πληθυσμοί είναι αναπαραγωγικά απομονωμένοι από τα προγονικά τους είδη και γι αυτό είναι νέα είδη. Το φαινόμενο αυτό είναι πιο διαδεδομένο στα φυτά παρά στα ζώα (Αλαχιώτης, 2007). Ένας άλλος τρόπος μέσω του οποίου μπορούν να σχηματιστούν νέα είδη είναι ο υβριδισμός. Η σημασία του υβριδισμού στην επαγωγή ειδογένεσης έχει αναγνωριστεί καιρό πριν από τους βοτανολόγους ενώ πρόσφατα συζητείται και η επίδρασή του στους ζωικούς οργανισμούς. Υπάρχουν δύο τρόποι υβριδικής ειδογένεσης. Ο πρώτος στηρίζεται στο διπλασιασμό του χρωμοσωματικού αριθμού στο υβρίδιο (αλλοπολυπλοειδής allopolyploidy), ενώ ο δεύτερος δεν περιλαμβάνει αλλαγή στον αριθμό των χρωμοσωμάτων (ομοπλοειδής ειδογένεση homoploid speciation). Έχουν περιγραφεί διάφορα παραδείγματα ομοπλοειδούς υβριδικής ειδογένεσης σε ζωικούς οργανισμούς, και ένα από αυτά είναι στις πεταλούδες του γένους Heliconius. Στο συγκεκριμένο παράδειγμα, το δυνητικά υβριδικό είδος έχει ένα νέο χρωματικό πρότυπο που προέρχεται από συνδυασμό των χρωμάτων που συναντώνται στους δυνητικά πατρικούς του πληθυσμούς. Το υβρίδιο θεωρείται διακριτό είδος και δεν αποδίδεται η ύπαρξή του στη γενετική διείσδυση ενός εκ των πατρικών πληθυσμών γιατί το υβριδικό χρωματικό πρότυπο έχει καθεαυτό άμεση επίδραση στην αναπαραγωγική απομόνωση της υβριδικής μορφής από τους δύο γονείς. Ωστόσο, η διάκριση της μερικής διείσδυσης από τον υβριδισμό είναι πράγματι αρκετές φορές πολύ δύσκολη (Abbott et al., 2008). 4

13 Α.Εισαγωγή Α Οριοθέτηση του είδους Τα τελευταία χρόνια, εκμεταλλευόμενοι την άνθηση των μοριακών τεχνικών και την αλληλούχιση του DNA, οι ερευνητές προσπαθούν να ανακαλύψουν ένα μοριακό δείκτη ο οποίος θα δίνει πληροφορίες τουλάχιστον για κάποιο επίπεδο ειδογένεσης. Αξιοσημείωτες είναι πρόσφατες μελέτες (Müller et al., 2007, Coleman, 2009, Ruhl et al., 2010) στις οποίες η ανάλυση του δεύτερου εσωτερικού μεταγραφόμενου διαχωριστή (Internal Transcribed Spacer 2, ITS2) του πυρηνικού ριβοσωματικού κιστρονίου δίνει ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Η σύγκριση μίας υψηλά συντηρημένης περιοχής 30bp στο 5 - άκρο της έλικας ΙΙΙ του ΙΤS2 σε πληθώρα ευκαρυωτικών οργανισμών (συμπεριλαμβανομένων φυτικών και ζωικών οργανισμών, πρωτίστων, φυκών και μυκήτων) έδωσε τα εξής ενδιαφέροντα αποτελέσματα: η απόλυτη ομοιότητα αυτής της περιοχής υποδεικνύει ικανότητα διασταύρωσης ανάμεσα στους συγκρινόμενους οργανισμούς, ενώ η ύπαρξη έστω και μίας αντισταθμιζόμενης αλλαγής βάσεων (Compensatory Base Changes-CBCs) 1 σε αυτή την περιοχή υποδηλώνει αποτυχία διασταύρωσης. Σύμφωνα με την Coleman AW. (2009), πριν την εμφάνιση της πρώτης CBC στην υψηλά συντηρημένη περιοχή, έχει χαθεί κάθε γαμετική συμβατότητα, εξαιτίας των παράλληλων εξελικτικών αλλαγών στα γονίδια που ελέγχουν τη γονιμοποίηση. Οι Bickfold et al. (2007) υποστηρίζουν όμως πως όσο και αν η πληθώρα αλληλουχιών DNA οδήγησε σε μια νέα εποχή για την ανακάλυψη νέων ειδών, το DNA δεν αποτελεί πανάκεια για τον προσδιορισμό και τον καθορισμό των ειδών. Η ανάλυση μοριακών δεδομένων δεν απαιτεί ιδιαίτερη γνώση της ανατομίας, της οικολογίας, της συμπεριφοράς και της βιογεωγραφίας των υπό μελέτη taxa. Υπάρχουν περιπτώσεις όπου ορισμένοι ερευνητές, όταν οι γενετικές αποστάσεις ανάμεσα σε άτομα ή πληθυσμούς είναι μεγάλες, χαρακτηρίζουν τις γενετικές οντότητες πιθανά είδη. Όμως, σύμφωνα με τους ίδιους ερευνητές (Bickfold et al., 2007) η ιδέα πως μόνο μέσω του προσδιορισμού της αλληλουχίας τμημάτων DNA μπορεί κάποιος να κατατάσσει τους οργανισμούς σε είδη, όσο δελεαστική μπορεί να φαίνεται, είναι υπερβολικά αισιόδοξη και βιολογικά ανέφικτη. Η δυσκολία αυτή συνίσταται κυρίως στο γεγονός ότι το «τι ορίζουμε ως είδος» αποτελεί ακόμα και σήμερα ένα από τα κυρίαρχα θέματα της εξελικτικής βιολογίας, όπως προαναφέρθηκε, καθώς και στην πληθώρα των ορισμών του είδους που έχουν προταθεί. Ως εκ τούτου η κατάταξη των ειδών μόνο βάσει του προσδιορισμού της αλληλουχίας DNA είναι πιθανό να μην ικανοποιεί κάποιους από τους ορισμούς του είδους, όπως για παράδειγμα τον φαινετικό (βλ. Α.1.1 Ορισμοί του είδους). Παρόλα αυτά η πληροφορία του DNA είναι ιδιαίτερα σημαντική και αξιοποιήσιμη σε ικανοποιητικό βαθμό. 1 Αντισταθμιζόμενες αλλαγές βάσεων: προκύπτουν όταν ένα ζεύγος βάσεων αντικατασταθεί από κάποιο άλλο (π.χ. η αλλαγή του ζεύγους G-C με το A-U), χωρίς να χαθεί η συμπληρωματικότητα (Μüller et al., 2007). 5

14 Α. Εισαγωγή Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό πως είναι ιδιαίτερα δύσκολο να διακριθούν οι ανεξάρτητες γενεαλογικές γραμμές κυρίως σε πληθυσμούς που έχουν διαχωριστεί πρόσφατα ή είναι στο στάδιο της ειδογένεσης. Η δυσκολία έγκειται στο γεγονός ότι είναι απίθανο τα πρόσφατα διαχωρισμένα είδη να έχουν αποκτήσει όλες ή έστω αρκετές από τις ιδιότητες που σχετίζονται με τα λειτουργικά κριτήρια (operational criteria) για τον καθορισμό του είδους, όπως π.χ. φαινοτυπική διάκριση, μονοφυλετικότητα και μη εμφάνιση γενετικών «ενδιάμεσων» (υβριδίων). Επιπλέον, ο χρόνος και η σειρά εμφάνισης αυτών των χαρακτηριστικών δεν είναι γενικά προβλέψιμος. Η πλέον επικρατούσα άποψη είναι πως η καλύτερη προσέγγιση για τη μελέτη τέτοιων προβληματικών ομάδων είναι μέσω της χρήσης διαφορετικών τύπων γενετικών δεδομένων (κωδικοποιούντων και μη κωδικοποιούντων περιοχών, πυρηνικών και μιτοχονδριακών μαρτύρων), διαφορετικών μεθόδων ανάλυσης τους (μεθόδων που στηρίζονται/ή όχι σε φυλογενετικά δένδρα), αλλά και διαφορετικών τύπων δεδομένων (γενετικά, μορφολογικά και οικολογικά) (Ross et al., 2010). Με αυτό τον τρόπο είναι πιθανότερο να εξαχθούν οι πιο ουσιαστικές πληροφορίες που σχετίζονται με την απόκτηση των διαφορετικών ιδιοτήτων. Ακόμα όμως και με το συνδυασμό τέτοιων δεδομένων, ενδέχεται να υπάρχει κάποια αμφιβολία σχετικά με τα «όρια-σύνορα» των πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών. Η αμφιβολία αυτή έγκειται στον πιθανό ατελή διαχωρισμό τους, στη γενετική διείσδυση [genetic introgression γονιδιακή ροή από τα γονικά είδη προς τους υβριδικούς πληθυσμούς (Αλαχιώτης, 2007)], στην ανεπαρκή δειγματοληψία ή την ασυμφωνία σχετικά με τη βαρύτητα κάθε λειτουργικού κριτηρίου (Ross et al., 2010). Αναφέρεται χαρακτηριστικά το παράδειγμα του συμπλέγματος Ensatina eschscholtzii (σαλαμάνδρες) όπου αναγνωρίζονται ένα, επτά ή έντεκα είδη ανάλογα με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται, γεγονός που αντανακλά τις πολλαπλές ιδιότητες που αλλάζουν κατά την ειδογένεση (Sites & Marshall, 2004). Α.2 Μοριακοί δείκτες στη φυλογένεση Α.2.1 Το μιτοχονδριακό DNA ως μοριακός δείκτης Η μελέτη της εξέλιξης συχνά απαιτεί την κατανόηση της ιστορίας του πληθυσμού, του είδους ή του κλάδου που μελετάται. Για να εξετασθεί η γενετική ποικιλότητα σε διαφορετικά περιβάλλοντα είναι απαραίτητη η γνώση της ιστορίας αποίκισης των διαφόρων πληθυσμών καθώς και η μεταξύ τους γονιδιακή ροή. Σε συγκριτικές αναλύσεις των διαδικασιών προσαρμογής ή της μοριακής εξέλιξης, αλλά και σε μελέτες βιογεωγραφίας, απαιτείται ο προσδιορισμός των σχέσεων ανάμεσα στα είδη. Η διαλεύκανση αυτών των σχέσεων βασίζεται, σε μεγάλο βαθμό, σε γενετικούς δείκτες (Hurst & Jiggins, 6

15 Α.Εισαγωγή 2005). Θεωρητικά, όλες οι περιοχές του DNA που διαφοροποιούνται μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μελέτες πληθυσμιακής γενετικής ή γενικά σε ενδοειδικές ή διαειδικές μελέτες (Pleines et al., 2009), ωστόσο ο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης, σε μελέτες στο ζωικό βασίλειο είναι το μιτοχονδριακό DNA (mtdna). Το μιτοχονδριακό DNA περιέχεται σε πολλά αντίγραφα μέσα στα μιτοχόνδρια και έχουν προταθεί δύο θεωρίες σχετικά με την προέλευση του γονιδιώματος εντός των συγκεκριμένων οργανιδίων. Σύμφωνα με την πρώτη, το γονιδίωμα των οργανιδίων (μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες) έχουν αυτογενή καταγωγή μέσα στα ευκαρυωτικά κύτταρα και προέρχονται από θραύσματα του πυρηνικού γονιδιώματος που εγκολπώθηκαν σε μεμβράνες και σχημάτισαν τα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες (Cavalier-Smith, 1975, Uzell & Spolsky, 1981). Η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι το γονιδίωμα των οργανιδίων αυτών έχει εξωγενή προέλευση, και συγκεκριμένα προέρχονται από βακτηριακούς προγόνους οι οποίοι εισέβαλαν (ή εγκολπώθηκαν) σε πρώτο-ευκαρυωτικά κύτταρα (Margulis, 1981). Η δεύτερη θεωρία που καλείται «θεωρία ενδοσυμβίωσης» υποστηρίζεται από διάφορες μοριακές αποδείξεις (Gray, 1992). Μία από τις μοριακές αποδείξεις που συνηγορούν υπέρ της ενδοσυμβιωτικής θεωρίας προέρχεται από την αλληλούχιση των rrna γονιδίων. Διαπιστώθηκε ότι οι rrna αλληλουχίες τόσο των χλωροπλαστών όσο και των μιτοχονδρίων έχουν μεγαλύτερη συγγένεια με τις βακτηριακές αλληλουχίες παρά με τις πυρηνικές αλληλουχίες των ευκαρυωτικών. Σήμερα πιστεύεται ότι τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι γενετικές χίμαιρες που περιέχουν ένα μίγμα από διακριτές εξελικτικές γραμμές (Avise, 1994). Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα αποτελεί ένα κυκλικό δίκλωνο «χρωμόσωμα» (εικόνα 1). Οι δύο αλυσίδες του mtdna είναι η βαριά (Heavy), η οποία είναι και η κυρίως μεταφραζόμενη αλυσίδα, και η ελαφριά (Light) (Bibb et al.,1981).το ζωικό mtdna περιέχει συνήθως γονίδια, από τα οποία τα δύο κωδικοποιούν ριβοσωματικό RNA, τα 22 κωδικοποιούν trnas και τα υπόλοιπα 12 ή 13 κωδικοποιούν υπομονάδες των πρωτεϊνών της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων, που συμμετέχουν στην αναπνευστική αλυσίδα και στη σύνθεση ΑΤP. Επιπλέον, υπάρχει μία μη κωδικοποιούσα περιοχή που ορίζεται ως ρυθμιστική περιοχή (control region-cr) εξαιτίας του ρόλου που έχει στην αντιγραφή και τη μεταγραφή των μιτοχονδριακών μορίων. Τα εξώνια είναι συμπαγώς πακεταρισμένα, χωρίς ενδιάμεσα εσώνια. Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα δεν περιέχει ιστόνες, έχει περιορισμένη ικανότητα επιδιόρθωσης και ως εκ τούτου ο ρυθμός σταθεροποίησης των μεταλλάξεων είναι υψηλός (mutation fixation rate) [5-10 φορές υψηλότερος σε σχέση με το πυρηνικό γονιδίωμα, (Brown et al., 1979)]. Η «επιτυχία» του mtdna στις φυλογενετικές μελέτες οφείλεται, εκτός από τα προαναφερθέντα χαρακτηριστικά, και στην έλλειψη ανασυνδυασμού (Clayton, 1992; Hayashi et al., 1985) αλλά και στην εύκολη απομόνωση του (Michaels et al., 1982; Robin & Wong, 1988). Επιπρόσθετα, το mtdna διαφόρων taxa μπορεί να πολλαπλασιαστεί με ευκολία τόσο εξαιτίας του μικρού του μεγέθους όσο και της ύπαρξης πληθώρας συντηρημένων ( universal ) εκκινητών για αρκετούς γενετικούς τόπους. 7

16 Α. Εισαγωγή Επιπλέον, λόγω του απλοειδικού χαρακτήρα του, που οφείλεται στη μητρική κυρίως κληρονομικότητας του, η αλληλουχία του προσδιορίζεται χωρίς κλωνοποίηση. Ο υψηλός εξελικτικός ρυθμός του, σε συνδυασμό με το μικρό δραστικό μέγεθος του, το οποίο είναι περίπου το ένα τέταρτο σε σχέση με αυτό των πυρηνικών δεικτών, δίνει τη δυνατότητα προσδιορισμού πρόσφατων ιστορικών γεγονότων, χωρίς να απαιτείται ιδιαίτερη προσπάθεια κατά την αλληλούχιση (Hurst & Jiggins, 2005). Αξίζει να αναφερθεί ότι στα φυτά, εκτός από ορισμένες σπάνιες εξαιρέσεις, ο ρυθμός εξέλιξης του mtdna είναι ο μικρότερος ανάμεσα στα τρία είδη γονιδιώματος που διαθέτουν (τα άλλα δύο: πυρηνικό και χλωροπλαστικό) (Zhang & Hewitt, 2003). Και τούτο διότι συγκρίνοντας αλληλουχίες φυτικών μιτοχονδριακών, χλωροπλαστικών και πυρηνικών γονιδιωμάτων διαπιστώθηκε πως ο ρυθμός σιωπηλών υποκαταστάσεων στο mtdna είναι κατά ένα τρίτο μικρότερος αυτού του χλωροπλαστικού και μισός αυτού του πυρηνικού, γεγονός που πιθανόν να οφείλεται σε μικρότερο ρυθμό μεταλλάξεων, στο αμινοξικό επίπεδο, του πρώτου (μιτοχονδριακού γονιδιώματος) (Wolfe et al., 1987). Η κατάσταση αυτή αντανακλά πιθανόν διαφορές στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς μεταξύ του μιτοχονδριακού και του χλωριπλαστικού γονιδιώματος. Επιπρόσθετα, το φυτικό mtdna παρουσιάζει αυξημένο ποσοστό ανασυνδυασμού και ως εκ τούτου δεν έχει σημαντική πρακτική χρηστικότητα σε μελέτες πληθυσμιακής γενετικής φυτικών οργανισμών (Zhang & Hewitt, 2003). Εικόνα 1: Σχηματική αναπαράσταση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος των σπονδυλωτών. Τα γονίδια εξωτερικά και εσωτερικά του κύκλου μεταφράζονται από την Η και L αλυσίδα αντίστοιχα. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη απεικονίζονται ως εξής: Cytb-κυτόχρωμα b, COI, COII και COIII- υπομονάδες Ι, ΙΙ και ΙΙΙ της κυτοχρωμικής οξειδάσης, ND1-6-υπομονάδες 1 έως 6 της ΝΑDH αφυδρογονάσης, τα trna απεικονίζονται με τη σύντμηση των αμινοξέων τους (τροποποιημένη από Pereira, 2000). Δεν είναι απαραίτητος ο προσδιορισμός της αλληλουχίας όλων των μεταφραζόμενων τμημάτων του mtdna σε μία μελέτη, ώστε να εξαχθούν αξιόπιστα αποτελέσματα. Έχει δειχθεί ότι 8.8 kilobases (kb), που αποτελούν σχεδόν το μισό της αλληλουχίας της μεταφραζόμενης περιοχής, έχει τον ίδιο βαθμό διαφοροποίησης συγκριτικά με ολόκληρη την περιοχή (Silva et al., 2002). Επιπλέον, η διαχείριση μεγάλου όγκου δεδομένων ενέχει κινδύνους για λάθη κατά τη διαδικασία προσδιορισμού της αλληλουχίας τους (Sun et al., 2006). Ωστόσο, έχουν γίνει λίγες μελέτες με στόχο τον προσδιορισμό των πιο 8

17 Α.Εισαγωγή πληροφοριακών, για φυλογενετικές μελέτες, τμημάτων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Ο Non και οι συνεργάτες του (2007) προσπάθησαν να προσδιορίσουν αυτά ακριβώς τα τμήματα. Χρησιμοποιώντας ολόκληρες αλληλουχίες από 99 ανθρώπινα μιτοχονδριακά γονιδιώματα (94 από την Ινδία και την Ευρασία και 5 από την Αφρική), απάλειψαν διαφορετικές περιοχές και παρατήρησαν διαφορική απώλεια φυλογενετικού σήματος, παρά το γεγονός ότι αφαιρούσαν κάθε φορά τμήματα ίδιου μεγέθους. Αξίζει να αναφερθεί ότι σημαντική μείωση στον επιτυχή προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων παρατηρήθηκε όταν είχαν αφαιρέσει τμήματα των γενετικών τόπων για το 12S rrna, μέρος του 16S rdna και το μεγαλύτερο τμήμα των γονιδίων ΝD 4 (υπομομάδα 4 της αφυδρογονάσης του δινουκλεοτιδίου του νικοτιναμιδίουαδενίνης, NADH dehydrogenase 4) και ND5, ND6 και Cytb (κυτόχρωμα b). Οι συγγραφείς καταλήγουν ουσιαστικά στο να επιβεβαιώσουν την άποψη του Felsenstein (2006), σύμφωνα με την οποία η μελέτη περισσότερων γενετικών τόπων, έστω και αν το συνολικό μέγεθος της αλληλουχίας είναι μικρό, παρέχει περισσότερη πληροφορία σε σχέση με τη μελέτη λιγότερων τόπων με μεγαλύτερο συνολικά μέγεθος αλληλουχίας ή την προσθήκη δειγμάτων. Συνεπώς, ο διαφορετικός ρυθμός εξέλιξης που παρατηρείται ανάμεσα στις διαφορετικές περιοχές του mtdna έχει ως αποτέλεσμα τη χρήση διαφορετικών τμημάτων ως δεικτών στις εκάστοτε φυλογενετικές μελέτες. Το 12S rdna είναι πολύ συντηρημένο και έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως στον προσδιορισμό της φυλογένειας σε ανώτερα ταξινομικά επίπεδα, όπως τα φύλα και τα υποφύλα (Wan et al., 2004). Τo 16S rdna χρησιμοποιείται συνήθως για φυλογενετικές μελέτες όσον αφορά σε μεσαία ταξινομικά επίπεδα, π.χ. οικογένειες και σπάνια γένη. Συγκριτικά με το 12S και το 16S rdnas, τα μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εξελίσσονται πιο γρήγορα και είναι ισχυρότεροι δείκτες στον προσδιορισμό της εξελικτικής ιστορίας σε κατώτερα επίπεδα, όπως π.χ. οι οικογένειες, τα γένη και τα είδη (Wan et al., 2004). Όσον αφορά τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, το γονίδιο για το κυτόχρωμα b (cytb) και για την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI) είναι τα πλέον χρησιμοποιούμενα σε φυλογενετικές μελέτες, και αποτελούν τους δύο από τους τρεις μιτοχονδριακούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Εξαιτίας του σχετικά αργού ρυθμού εξέλιξής του, το Cytb έχει χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα σε διάφορα taxa (Meyer et al., 1990), ενώ σύμφωνα με τους Hillis & Moritz (1990) και Hoelzel (1992) περιέχει αρκετή ποικιλότητα στην αλληλουχία του ώστε να αποτελεί χρήσιμο δείκτη για την εκτίμηση των φυλογενετικών σχέσεων στα ψάρια και σε άλλα σπονδυλωτά στο ενδοειδικό επίπεδο, αλλά και εντός του γένους και των οικογενειών. Όσον αφορά το γονίδιο για την COI, η χρήση του ως μοριακού δείκτη περιλαμβάνει αρκετά πλεονεκτήματα. Αρχικά, η διαθεσιμότητα universal εκκινητών για το συγκεκριμένο τμήμα δίνει τη δυνατότητα του πολλαπλασιασμού του στα περισσότερα, αν όχι όλα, τα ζωικά φύλα (Zhang & Hewitt, 1997). Όπως συμβαίνει και με τα υπόλοιπα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, τα 9

18 Α. Εισαγωγή νουκλεοτίδια της τρίτης θέσης έχουν αυξημένο ποσοστό υποκαταστάσεων, γεγονός που καθιστά το ρυθμό μοριακής εξέλιξης περίπου τρεις φορές υψηλότερο αυτού των 12S ή 16S rdna (Knowlton & Weigt, 1998). Στην πραγματικότητα, η εξέλιξη του συγκεκριμένου γονιδίου είναι αρκετά ταχεία ώστε να μπορεί να επιτευχθεί η διάκριση όχι μόνο κοντινών ειδών, αλλά και φυλογενετικών ομάδων εντός ενός είδους (Cox & Hebert 2001, Wares & Cunningham, 2001). Επιπρόσθετα, παρόλο που το γονίδιο της COI μπορεί να συνδυαστεί με άλλα μιτοχονδριακά γονίδια ώστε να διαλευκανθούν οι φυλογενετικές σχέσεις σε περιπτώσεις που αφορούν πρόσφατα φαινόμενα απόκλισης, το γονίδιο αυτό είναι ικανό να παρέχει βαθύτερη φυλογενετική διάκριση συγκριτικά με κάποιο εναλλακτικό γονίδιο, όπως για παράδειγμα το κυτόχρωμα b (Simmons & Weller, 2001), καθώς αλλαγές στην αμινοξική του αλληλουχία συμβαίνουν με μικρότερο ρυθμό σε σχέση με οποιοδήποτε άλλο μιτοχονδριακό γονίδιο που κωδικοποιεί πρωτεΐνες (Lynch & Jarrell, 1993). Η μιτοχονδριακή ρυθμιστική περιοχή (Control Region/CR ή διαφορετικά Displacement loop/d-loop) είναι η κύρια μη μεταγραφόμενη περιοχή του mtdna μορίου και αποτελεί τον τρίτο μιτοχονδριακό δείκτη που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη. Συνήθως, η CR των σπονδυλωτών υποδιαιρείται σε τρία τμήματα, τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους τόσο στη νουκλεοτιδική σύσταση όσο και στο ρυθμό εξέλιξής τους. Το κεντρικό τμήμα, που περιέχει το σημείο έναρξης αντιγραφής της βαριάς αλυσίδας, είναι αρκετά συντηρημένο. Αντίθετα, τα δύο πλευρικά τμήματα αυτής της περιοχής (τμήματα Ι και ΙΙ) είναι συνήθως υπερμεταβλητά όσον αφορά στις νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις και στον αριθμό των indels (σύντμηση για τις μεταλλάξεις προσθήκης απαλοιφής/insertions-deletions). Εξαιτίας του αυξημένου ρυθμού εξέλιξης των τμημάτων Ι και ΙΙ, η CR θεωρείται κατάλληλη κυρίως για μελέτες στο επίπεδο του είδους. Ένα άλλο χαρακτηριστικό που παρατηρείται σε πολλές, αλλά όχι όλες τις CRs, είναι η παρουσία μικρών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων που έχει παρατηρηθεί διαφοροποίηση στο μέγεθος του mtdna, αυτή οφείλεται στο διαφορετικό αριθμό των επαναλήψεων αυτών στη CR. Ωστόσο, η χρήση των συγκεκριμένων επαναλήψεων ως δεικτών για την υποδιαίρεση πληθυσμών αμφισβητείται (Wan et al., 2004). Η πλειονότητα των φυλογενετικών και εξελικτικών μελετών στηρίζεται, όσον αφορά στη χρήση του mtdna, στη ρυθμιστική περιοχή CR, στα συντηρημένα γονίδια που κωδικοποιούν στοιχεία της αναπνευστικής αλυσίδας ή στις ριβοσωματικές RNA υπομονάδες. Παρόλο που αρκετές μελέτες περιέχουν μιτοχονδριακές trna αλληλουχίες στις αναλύσεις τους, δεν επικεντρώνονται στα μόρια του trna. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα trna γονίδια είναι αρκετά συντηρημένα και συνεπώς φέρουν μικρό αριθμό πολυμορφισμών, που σε ορισμένες περιπτώσεις δεν είναι κατάλληλος για να υποστηρίξει φυλογενετικές μελέτες. Ωστόσο, οι πολυμορφισμοί όμως αυτοί αντιστοιχούν σε αναλογικά μικρότερα γενετικά τμήματα (τα trna γονίδια είναι μικρότερα σε μέγεθος συγκριτικά με τα υπόλοιπα μιτοχονδριακά γονίδια) και επηρεάζουν σημαντικά την βιοχημεία και τη βιωσιμότητα των οργανισμών. 10

19 Α.Εισαγωγή Σύμφωνα με τους Stamatis et al. (2008), η μελέτη των μιτοχονδριακών trnas δύναται να παρέχει μία σχετικά ακριβή εικόνα της εξέλιξης, της φυλογένειας και της φυλογεωγραφικής κατανομής των ειδών. Σε συνδυασμό με τα προαναφερθέντα, οι Miya και Nishida (2000) προσπάθησαν να προσδιορίσουν τη χρηστικότητα των διάφορων περιοχών του mtdna στον προσδιορισμό των σχέσεων σε ανώτερο ταξινομικό επίπεδο των τελεόστεων ιχθύων. Οι ερευνητές κατέταξαν σε πέντε κατηγορίες τα 13 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ανάλογα με το κατά πόσο κατάφεραν να προσδιορίσουν τις αναμενόμενες φυλογεντικές σχέσεις: α) πολύ καλή απόδοση (ND5, ND4, COIII, COI), β) καλή (COII, Cytb), γ) μέτρια (ND3, ND2), δ) κακή (ND1, ATPase 6) και ε) πολύ κακή (ND4L, ND6, ATPase 8). Διαπίστωσαν επίσης πως η ανάλυση που βασίστηκε στο συνδυασμό των αλληλουχιών των 22 trna γονιδίων έδωσε τις προσδοκώμενες φυλογενετικές σχέσεις. Γίνεται αντιληπτό πως το mtdna έχει παραμείνει ο δείκτης που καταδεικνύεται χρήσιμος σε πληθώρα πληθυσμιακών, βιογεωγραφικών και φυλογενετικών μελετών. Ωστόσο, παρόλη τη χρησιμότητά του ως δείκτη, παρουσιάζει ταυτόχρονα και ορισμένα μειονεκτήματα. Η παρουσία μιτοχονδριακών ψευδογονιδίων στο πυρηνικό γονιδίωμα αρκετών οργανισμών δυσχεραίνει τις πληθυσμιακές μελέτες. Αν και υπάρχουν μέθοδοι και τεχνικές που μειώνουν την επιρροή των ψευδογονιδίων στην προετοιμασία των δειγμάτων και στην ανάλυση των δεδομένων, οι μέθοδοι αυτοί έχουν περιορισμένη διαχωριστική ικανότητα. Η αποτελεσματικότητα της χρήσης του mtdna στις πληθυσμιακές-γενετικές μελέτες έχει σαφώς περιοριστεί από αυτό το γεγονός. Επιπλέον, το γεγονός ότι το mtdna αποτελεί ένα μοναδικό απλότυπο θέτει εξαρχής κάποιους περιορισμούς. Ανεξάρτητα από την ποσότητα της πληροφορίας που έχουμε συλλέξει από αυτή την πηγή, έχουμε ερευνήσει μόνο μία εκδοχή (ανάμεσα σε πολλές άλλες) της εξέλιξης. Αυτή η εκδοχή αντανακλά συνήθως τη μητρική ιστορία (με ορισμένες εξαιρέσεις), η οποία μπορεί σαφώς να διαφέρει από τη συνολική ιστορία των πληθυσμών ή του είδους. Συνεπώς, τα συμπεράσματα στα οποία καταλήγουμε μπορεί να είναι βεβιασμένα. Επιπρόσθετα, το γεγονός ότι το δραστικό μέγεθος πληθυσμού του mtdna είναι το ένα τέταρτο συγκριτικά με αυτό των πυρηνικών αυτοσωμικών αλληλουχιών μπορεί να έχει τις εξής επιπτώσεις: α) οι εξελικτικές σχέσεις να υπεραπλουστευθούν μέσω των mtdna δεδομένων, β) η γενετική ποικιλότητα μπορεί να υποτιμηθεί και γ) να αυξηθεί η αβεβαιότητα στη γενεαλογική ανάλυση εξαιτίας της μη ύπαρξης δεσμών ανάμεσα σε μιτοχονδριακούς απλότυπους (Zhang & Hewitt, 2003). Η πιθανή μιτοχονδριακή ετερογένεια (ετεροπλασμία) που έχει αναφερθεί για παράδειγμα σε ανθρώπινους ιστούς (He et al., 2010), αποτελεί ένα λόγο για τον οποίο απαιτείται προσοχή όταν χρησιμοποιείται το mtdna ως δείκτης. Σε συνδυασμό με τα προαναφερθέντα προβλήματα, οι Ballard & Whitlock (2004), ισχυρίζονται ότι η εξέλιξη του mtdna δεν είναι ουδέτερη, αμφισβητώντας με αυτό τον τρόπο την χρηστικότητά του ως μοριακού δείκτη. Η άμεση επιλογή (επιλογή μόνο του mtdna) και η έμμεση επιλογή (επιλογή που βασίζεται σε άλλα γονίδια που έχουν μητρική κληρονομικότητα) είναι φαινόμενα που συχνά καθιστούν τα 11

20 Α. Εισαγωγή συμπεράσματα, που εξάγονται από μιτοχονδριακά δεδομένα, αναξιόπιστα (Hurst & Jiggins, 2005). Αξίζει να αναφερθεί όμως πως ακόμα και αν το μιτοχονδριακό DNA δεν είναι ουδέτερο, υπάρχει η ρύθμιση του μοριακού ρολογιού όπως και στους πυρηνικούς γενετικούς τόπους. Παρά τα μειονεκτήματα που προαναφέρθηκαν, το μιτοχονδριακό γονιδίωμα εξακολουθεί να είναι ο μοριακός εκείνος δείκτης που χρησιμοποιείται κατά κόρον στις φυλογενετικές μελέτες, καθώς τα θετικά είναι αξιοποιήσιμα με αποτελεσματικό τρόπο. Δεν παύει ωστόσο να προτιμάται η χρήση συνδυασμού μοριακών δεικτών τα τελευταία χρόνια, ώστε να έχουμε δεδομένα από περισσότερα γενετικά συστήματα και να περιοριστεί όσο το δυνατόν η όποια επίδραση των μειονεκτημάτων του μιτοχονδριακού DNA στην εξαγωγή συμπερασμάτων. Α.2.2. Δείκτες πυρηνικού DNA Εκτός από το μιτοχονδριακό DNA, η δεύτερη πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τάξη δεικτών είναι οι πυρηνικοί μικροδορυφόροι. Οι μικροδορυφόροι είναι μικρές στοιχισμένες επαναλήψεις DNA μοτίβων που αποτελούνται από μία έως έξι βάσεις (Wan et al., 2004). Η ποικιλία στο μέγεθος αυτών των γενετικών τόπων προκύπτει κυρίως από το «γλίστρημα» των αλυσίδων DNA (DNA slippage) κατά την αντιγραφή τους, που οδηγεί σε αύξηση ή μείωση του αριθμού των επαναλαμβανόμενων μοτίβων (Pleines et al., 2009). Οι απλές αυτές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες είναι ευρέως διαδεδομένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που έχουν μελετηθεί, έχουν υψηλό ποσοστό πολυμορφισμών και υπακούουν στην μεντελική κληρονομικότητα. Η χρήση τους στις πληθυσμιακές-γενετικές μελέτες έχει βοηθήσει τους ερευνητές στον προσδιορισμό της γενετικής δομής πληθυσμών, στον προσδιορισμό της γενετικής ποικιλότητας και της μελέτης της πρόσφατης πληθυσμιακής ιστορίας. Κατά τη χρήση των μικροδορυφόρων απαιτείται προσοχή σε διάφορες παραμέτρους. Ενδεικτικά αναφέρονται: α) Οι εξελικτικές σχέσεις ανάμεσα στα αλληλόμορφα των μικροδορυφόρων είναι πολύπλοκες. Η διαφορά στο μέγεθος μπορεί να μη σχετίζεται άμεσα με απόκλιση (Zhang & Hewitt, 2003). Έχει διαπιστωθεί ότι συμβαίνουν ενθέσεις και απαλοιφές (indels) πολλαπλών νουκλεοτιδίων (1-5) με υψηλή συχνότητα στις περιοχές πλευρικά των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Τα indels αλλάζουν το μέγεθος των προϊόντων που προκύπτουν κατά τον πολλαπλασιασμό τους (μέσω PCR) και ως εκ τούτου μπορεί να μεταναστεύσουν (κατά την ηλεκτροφόρηση) μαζί με αλληλόμορφα που δεν φέρουν indels. Η επιφανειακή αυτή ομολογία μπορεί να παρερμηνευθεί ως διαφορά στο μέγεθος των στοιχισμένων επαναλήψεων και να έχει αποτέλεσμα τη λανθασμένη ταυτοποίηση των αλληλομόρφων, σε περίπτωση που υπολογίζεται μόνο το μέγεθος των αλληλομόρφων. Το φαινόμενο αυτό 12

21 Α.Εισαγωγή ονομάζεται ομοπλασία μεγέθους των μικροδορυφόρων. Η ομοπλασία μεγέθους δεν μπορεί να παρέχει πραγματικές γενεαλογικές πληροφορίες για την εξελικτική ιστορία (Wan et al., 2004). β) Ο ρυθμός μεταλλαξιγένεσης διαφέρει σημαντικά ανάμεσα στους οργανισμούς. Επιπλέον, έχει βρεθεί διαφορά τόσο μεταξύ των διάφορων μικροδορυφορικών τόπων όσο και εντός του ίδιου τόπου. Επιπρόσθετα, ο ρυθμός μεταλλαξιγένεσης ενός συγκεκριμένου τόπου δεν είναι σταθερός με την πάροδο του χρόνου. γ) Η ουδετερότητα ορισμένων μικροδορυφορικών αλληλουχιών αμφισβητείται. Η καθαυτή διαπίστωση, σε αρκετές μελέτες (π.χ. Rico et al., 1996, Martin et al., 2002), της διατήρησης ορισμένων μικροδορυφορικών τόπων ακόμα και μεταξύ μη συγγενικών ειδών αποτελεί ισχυρό στοιχείο για την αμφισβήτηση της ουδετερότητάς τους. Συνεπώς, η χρήση τέτοιων συντηρημένων τόπων ως ουδέτερων δεικτών σε πληθυσμιακές-γενετικές μελέτες πρέπει να γίνεται με προσοχή έως ότου διαπιστωθεί ο λόγος της διατήρησής τους (Zhang & Hewitt, 2003). Όπως γίνεται κατανοητό από τα παραπάνω, επιβάλλεται η εκτενής και συστηματική ανάλυση των αλληλουχιών των μικροδορυφορικών αλληλομόρφων ούτως ώστε να αποσαφηνιστεί ο τρόπος εξέλιξης τους στο μοριακό επίπεδο καθώς και οι μηχανισμοί βάσει των οποίων σταθεροποιούνται μεταλλάξεις σε αυτούς. Χωρίς σαφή γνώση των παραπάνω, η χρήση των μικροδορυφόρων ως δεικτών δεν μπορεί να φτάσει στο μέγιστο των δυνατοτήτων τους, και ως εκ τούτου ο ρόλος τους στις πληθυσμιακές-γενετικές μελέτες δε θα είναι κυρίαρχος (Zhang & Hewitt, 2003). Για να αποκτηθεί πληρέστερη εικόνα για την ιστορία και τη δυνητική εξέλιξη των πληθυσμών είναι απαραίτητα τα γενεαλογικά δεδομένα και από άλλους πυρηνικούς τόπους, όπως οι μοναδικές πυρηνικές πολυμορφικές αλληλουχίες (single copy nuclear polymorphic scnp- sequences). Η περιορισμένη χρήση των scnp δεικτών οφείλεται τόσο στη μειωμένη διαθεσιμότητα scnp δεικτών για τη διεξαγωγή πληθυσμιακών μελετών, όσο και στους ενδοιασμούς των ερευνητών για την καταλληλότητα της χρήσης των δεικτών αυτών στις συγκεκριμένες μελέτες. Επιπλέον, ο ερευνητής που εργάζεται με πυρηνικούς DNA δείκτες έχει να αντιμετωπίσει προκλήσεις σε κάθε στάδιο της μελέτης. Οι προκλήσεις αυτές περιλαμβάνουν την παρουσία ανασυνδυασμού, την επιλογή (όχι ουδετερότητα), την ετεροζυγωτία, τους πολυμορφισμούς ένθεσης/απαλοιφής, τη χαμηλή διαφοροποίηση, τη διαφοροποίηση στο ρυθμό και την ιστορία κάθε γονιδίου, δυσκολίες στην PCR αλλά και κατά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των δεικτών κ.ο.κ. Τα πρόσφατα όμως επιτεύγματα της τεχνολογίας και η αύξηση της δύναμης της στατιστικής έχουν δημιουργήσει πλέον κατάλληλες συνθήκες ώστε να μετατραπεί η ανάλυση πυρηνικών αλληλουχιών σε υπόθεση ρουτίνας (Zhang & Hewitt, 2003). Έχουν γίνει προσπάθειες να κατασκευαστούν συντηρημένοι εκκινητές για την ανάλυση πυρηνικών γονιδίων, σε αντιστοιχία με αυτούς που χρησιμοποιούνται στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Η περίπτωση του πυρηνικού 13

22 Α. Εισαγωγή γονιδιώματος όμως είναι αρκετά πιο πολύπλοκη. Μέχρι στιγμής, έχει επιτευχθεί ο πολλαπλασιασμός των ριβοσωματικών ITS (internal transcribed spacer) περιοχών. Οι εκκινητές που έχουν χρησιμοποιηθεί σε αυτή την περίπτωση είναι αρκετά συντηρημένοι, και ως εκ τούτου έχει επιτευχθεί η εφαρμογή τους σε αρκετά είδη. Ωστόσο, η ποικιλότητα της περιοχής που πολλαπλασιάζουν είναι αρκετά μικρή στο ενδοειδικό επίπεδο. Όσον αφορά τους υπόλοιπους γενετικούς τόπους, η πλειονότητα των «συντηρημένων» εκκινητών που έχουν σχεδιαστεί και χρησιμοποιηθεί σε φυλογενετικές μελέτες εστιάζεται στον πολλαπλασιασμό των γονιδίων που κωδικοποιούν τον παράγοντα επιμήκυνσης-1α (elongation factor-1α - EF-1α), τον παράγοντα επιμήκυνσης-2 (EF-2), την RNA πολυμεράση ΙΙ, τη ντόπα αποκαρβοξυλάση (dopa decarboxylase) και τη φωσφοενολοπυροσταφυλική καρβοξυλάση. Συχνά όμως οι πυρηνικοί αυτοί εκκινητές είτε αποτυγχάνουν να πολλαπλασιάσουν τις αλληλουχίες σε απομακρυσμένες ταξινομικές ομάδες είτε οι πολλαπλασιασμένες αλληλουχίες δεν είναι κατάλληλες για ενδοειδικές μελέτες λόγω της μικρής ποικιλότητας (Zhang & Hewitt, 2003). Την τελευταία δεκαετία παρατηρείται αύξηση των μελετών στις οποίες οι ερευνητές προσπαθούν να βρουν κατάλληλους πυρηνικούς δείκτες για την αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων σε ανώτερα ταξινομικά επίπεδα αλλά και γενικότερα για τη χρήση τους σε φυλογενετικές μελέτες. Ο Chen και οι συνεργάτες του (2008) στην προσπάθειά τους να ελέγξουν την καταλληλότητα έξι πυρηνικών δεικτών για τον προσδιορισμό των σχέσεων των Κυπρινόμορφων (Τάξη Cypriniformes) ορίζουν πέντε κριτήρια που θα πρέπει να ικανοποιούν οι κατάλληλοι πυρηνικοί δείκτες, προσαρμοσμένα βέβαια στη δική τους έρευνα: α) να είναι αρκετά συντηρημένοι ώστε να διατηρούν φυλογενετικό σήμα κατά την διάρκεια των MY (από την εποχή δηλαδή που χρονολογείται το πρώτο απολίθωμα των Κυπρινόμορφων που οι συγκεκριμένοι ερευνητές εξετάζουν), β) να φέρουν σημαντικό ποσοστό ποικιλότητας φυλογενετικά πληροφοριακής, αλλά όχι πολύ αποκλίνουσας ώστε να προκαλεί ομοπλασία και δυσκολίες κατά τον έλεγχο της πρωταρχικής ομολογίας (στοίχισης αλληλουχιών), γ) να είναι εύκολος ο πολλαπλασιασμός τους και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του προϊόντος που προκύπτει, για ένα ευρύ φάσμα ειδών των Κυπρινόμορφων, δ) να έχουν ικανοποιητικό μέγεθος (ιδανικά > 800bp) και ε) τα γονίδιά τους να είναι «μοναδικά αντίγραφα» στο γονιδίωμα. Όταν χρησιμοποιούνται πυρηνικοί δείκτες υπάρχει αβεβαιότητα για το αν οι αλληλουχίες που αναλύονται είναι ορθότροπες (ή ορθόλογες/orthologs), αν πρόκειται δηλαδή πράγματι για ομόλογα μέλη μίας γονιδιακής οικογένειας δύο ή περισσότερων ειδών. Στα ορθότροπα γονίδια η νουκλεοτιδική ομοιότητα οφείλεται στην κοινή τους καταγωγή από ένα κοινό προγονικό γονίδιο, είναι δηλαδή αποτέλεσμα ενός ειδογενετικού γεγονότος (Αλαχιώτης, 2007). Αυτή η ανησυχία προκύπτει από το γεγονός ότι πολλαπλά (ή παράτροπα/paralogous 2 ) 2 Παράτροπα γονίδια (paralogous genes): δύο ή περισσότερα γονίδια, απογονικά ενός διπλασιασμένου προγονικού γονιδίου, με τη νουκλεοτιδική ομοιότητά 14

23 Α.Εισαγωγή αντίγραφα του γονιδίου-στόχου μπορούν να πολλαπλασιαστούν με PCR από το ολικό γενωμικό DNA και συνεπώς οι ερευνητές να συγκρίνουν παράτροπα παρά ορθότροπα γονίδια κατά την φυλογενετική ανάλυση (Martin & Burg, 2002). Το ενδεχόμενο αυτό χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή, ιδιαίτερα κατά την φυλογενετική ανάλυση των Ακτινοπτερύγιων (Actinopterygii-ray-finned) ιχθύων. Έχει προταθεί πως πολλά γονίδια των σπονδυλωτών, που θεωρούνται να έχουν «μοναδικά αντίγραφα» (single-copy), έχουν διπλασιαστεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των Ακτινοπτερύγιων μέσω του φαινομένου του διπλασιασμού του γονιδιώματος των ιχθύων (FSGD- fish genome duplication event) (Christoffels et al., 2004). Το FSGD υπολογίζεται ότι συνέβη περίπου 320ΜΥΑ, πριν την διαφοροποίηση των περισσότερων τελεόστεων (Hoegg et al., 2004). Τα παραπάνω υποδεικνύουν πως παρόλο που η χρήση γονιδίων με «μοναδικά αντίγραφα» είναι απαραίτητη ή τουλάχιστον επιθυμητή κατά τις φυλογενετικές αναλύσεις, κάτι τέτοιο θεωρείται προς το παρόν είτε αδύνατον όσον αφορά τη μελέτη των τελεόστεων ιχθύων (Chen et al., 2008) είτε απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή. Ωστόσο, η χρήση πολλαπλών γενετικών τόπων δεν παύει να αποτελεί την καλύτερη στρατηγική για την επίλυση προβληματικών εξελικτικών σχέσεων της εκάστοτε ταξινομικής ομάδας, σύμφωνα με τους Chen et al.(2008). Ο Chen και οι συνεργάτες του (2003) υποστηρίζουν πως η εμφάνιση κλάδων με την ίδια τοπολογία σε διαφορετικά γονιδιακά δένδρα φαίνεται να είναι η πιο καλή μέθοδος για την αξιολόγηση της αξιοπιστίας των φυλογενετικών συμπερασμάτων που εξάγονται. Είναι αρκετά απίθανο ένας λανθασμένος κλάδος που έχει προκύψει από λανθασμένη ορθολογία να επαναλαμβάνεται κατά την ανάλυση με διαφορετικά ανεξάρτητα γονίδια. Βέβαια, αυτό δεν αποτελεί τρόπο επιβεβαίωσης της ορθολογίας αλλά ενισχύει την άποψη πως η προσεκτική ανάλυση δεδομένων από διαφορετικά γονίδια είναι ικανή να ανιχνεύσει πιθανές παράτροπες αλληλουχίες (Chen et al., 2008). Παρά τις προσπάθειες που γίνονται τα τελευταία χρόνια για την εύρεση κατάλληλων πυρηνικών δεικτών (π.χ. Li et al., 2007), όπως αναφέρθηκε, είναι περιορισμένος ο αριθμός των γενετικών τόπων που έχουν χρησιμοποιηθεί. Τα γονίδια για το 28S ριβοσωματικό RNA και τη S7 ριβοσωμική πρωτεΐνη ήταν οι πρώτοι μοριακοί τόποι που χρησιμοποιήθηκαν (Lê et al., 1989, Chow & Hazama, 1998) και που πρόσφατα έγιναν δημοφιλείς σε μελέτες με τελεόστεους ιχθύες (Chen et al., 2008). Όπως συμβαίνει και με τα μιτοχονδριακά γονίδια που χρησιμοποιούνται ως δείκτες, η «δημοτικότητά» τους αυξάνεται εξαιτίας της ύπαρξης συντηρημένων εκκινητών και της μείωσης των τεχνικών δυσκολιών. Ωστόσο, όταν οποιοδήποτε από τα δύο γονίδια χρησιμοποιηθεί για ανάλυση, ο ερευνητής έρχεται αντιμέτωπος με έναν τεράστιο αριθμό πιθανών στοιχίσεων των αλληλουχιών, κυρίως όταν το πλήθος των δεδομένων είναι εξίσου μεγάλο. Αυτό οφείλεται στο ότι η εκτίμηση της πρωτογενούς ομολογίας μπορεί να βασιστεί ελάχιστα στη δευτεροταγή δομή του τους να οφείλεται στο γεγονός του διπλασιασμού βρίσκονται μαζί στο γονιδίωμα ενός είδους, αλλά χρησιμοποιούνται και σε συγκρίσεις μεταξύ των ειδών. 15