Υπό: Παύλου Κορδοπάτη & Βασιλικής Μαγκαφά ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ (Ο ΗΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ) Υπό: Παύλου Κορδοπάτη & Βασιλικής Μαγκαφά ΠΑΤΡΑ 2005

2 - i - ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το παρόν τεύχος αποτελεί έναν πρόδρομο οδηγό ορθής διεξαγωγής των Εργαστηριακών Ασκήσεων οι οποίες αποτελούν και το ουσιαστικό περιεχόμενο του μαθήματος "Μεθοδολογία Απομόνωσης και Ταυτοποίησης Φυσικών Προϊόντων Ι". Οι Εργαστηριακές Ασκήσεις στο ευρύτερο πεδίο των Φυσικών Προϊόντων αποτελούν βασική εκπαίδευση των φοιτητών του Τμήματος Φαρμακευτικής και όχι μόνον. Το είδος και ο αριθμός των επελέγησαν με γνώμονα την ανάγκη ισορρόπησης μεταξύ της σημασίας των βασικών πειραμάτων απομόνωσης και ταυτοποίησης φυσικών προϊόντων αφενός και των χρονικών περιορισμών τους οποίους θέτει το Πρόγραμμα Σπουδών αφετέρου. Η Φύση αποτελεί πλούσια πηγή φυσικών προϊόντων με ποικίλη βιολογική δράση. Ως εκ τούτου η απομόνωση χρωστικών, αρωμάτων, ευφραντικών ουσιών και ουσιών φαρμακευτικής σημασίας από εύκολα διαθέσιμες πηγές, όπως και κυρίως τα φυτά, είναι δραστηριότητες τόσο παλαιές όσο το ανθρώπινο είδος και κατά συνέπεια απλές αλλά και σημαντικές. Ιδιαίτερος στόχος του συγκεκριμένου εργαστηριακού μαθήματος είναι η μύηση των φοιτητών σε ασφαλή και υπεύθυνο τρόπο εργασίας, γεγονός το οποίο αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για τη συνεργασία μεταξύ των μελών μιας επιστημονικής ομάδος. Προς την κατεύθυνση αυτή συμβάλλει η βαθιά γνώση της Χημείας στην οποία στηρίζονται οι Εργαστηριακές Ασκήσεις, του ορθού τρόπου διεξαγωγής αυτών, της επικινδυνότητας των χρησιμοποιουμένων αντιδραστηρίων και του τρόπου εξουδετέρωσης και ασφαλούς αποθήκευσής τους. Από τη θέση αυτή εκφράζονται θερμές ευχαριστίες προς τους υποψηφίους ιδάκτορες κ. Ευάγγελο Μπισύρη και κ. Σπυρίδωνα Παπαζαχαρία για την πολύτιμη βοήθειά τους στη διαμόρφωση του τελικού κειμένου, το οποίον και τίθεται στην κρίση των φοιτητών μας. Οι παρατηρήσεις των τελευταίων θα μας είναι ιδιαίτερα χρήσιμες. Πάτρα, Σεπτέμβριος 2005 Παύλος Κορδοπάτης Βασιλική Μαγκαφά

3 - iii - ΑΠΟΣΠΑΣΜΑ ΠΡΟΕ ΡΙΚΟΥ ΙΑΤΑΓΜΑΤΟΣ ΥΠ' ΑΡΙΘ. 51/Φ.Ε.Κ. 38/ ΙΕΞΑΓΩΓΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Α. Γενικά 1. Οι Εργαστηριακές ασκήσεις γίνονται με σκοπό να εξοικειωθούν οι εκπαιδευόμενοι με εργαστηριακές τεχνικές και μεθοδολογία. Επιδιώκεται η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο: α) τεκμηριώνεται βιβλιογραφικά κάθε πείραμα που προγραμματίζεται β) καταστρώνεται η εκτέλεσή του γ) χρησιμοποιούνται οι απαραίτητες συσκευές και όργανα δ) επεξεργάζονται, παρασκευάζονται ή και απομονώνονται τα τελικά προϊόντα ε) εκτιμάται ποσοτικά ένα φυσικό μέγεθος και στ) ελέγχονται τα αποτελέσματα. 2. Οι ημέρες και οι ώρες των ασκήσεων των φοιτητών καθορίζονται σύμφωνα με το πρόγραμμα σπουδών. Η ώρα προσέλευσης και αποχώρησης των φοιτητών πρέπει να τηρείται επακριβώς. Ανώτατο όριο καθυστέρησης 10 λεπτά κατά την προσέλευση. Η αποχώρηση γίνεται με τη λήξη του εργαστηριακού χρόνου ή άλλως μετά την ολοκλήρωση της άσκησης.

4 - iv - 3. Δεν επιτρέπεται η απομάκρυνση των φοιτητών από το Εργαστήριο την ώρα της άσκησης εκτός αν δοθεί άδεια από τον υπεύθυνο του Εργαστηρίου. 4. Η ομαλή λειτουργία του Εργαστηρίου δεν πρέπει να διακόπτεται καθ όλη τη διάρκεια του ακαδημαϊκού έτους. Προς το σκοπό αυτό: α) Τα μέλη ΔΕΠ αποφεύγουν να απασχολούν τους φοιτητές για εξετάσεις προόδου κ.α., κατά τις ώρες των εργαστηριακών ασκήσεων β) Οι φοιτητές αποφεύγουν να κάνουν συνελεύσεις ή να απασχολούν γενικά τους ασκούμενους κατά τη διάρκεια της άσκησής τους στο Εργαστήριο. Σε ειδικές περιπτώσεις οι εκπρόσωποι των φοιτητών έρχονται σε συνεννόηση με τον υπεύθυνο του Εργαστηρίου δύο τουλάχιστον ημέρες πριν. Β. Μελέτη, Εξέταση και ιεξαγωγή Ασκήσεων 1. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εκδήλωση του αποτελέσματος τμηματικών ή πτυχιακών εξετάσεων είναι η επιτυχής ολοκλήρωση όλων των εργαστηριακών ασκήσεων που προβλέπονται από το πρόγραμμα σπουδών. 2. Ο αριθμός των επιτρεπομένων απουσιών δεν μπορεί σε καμιά περίπτωση να υπερβαίνει το 10% του αριθμού των εργαστηριακών ασκήσεων. Φοιτητής του οποίου οι απουσίες ξεπερνούν το ποσοστό αυτό υποχρεώνεται να επανασκηθεί την επόμενη χρονιά σε χρόνο που καθορίζεται από το Εργαστήριο, ανάλογα με την ευχέρεια άσκησης φοιτητών που έχει. 3. Ο ασκούμενος φοιτητής οφείλει να γνωρίζει το θεωρητικό μέρος της άσκησης προετοιμαζόμενος κατάλληλα, εφόσον έχει ενημερωθεί από το προσωπικό του Εργαστηρίου. Ο τρόπος εκτίμησης της θεωρητικής και πρακτικής απόδοσης κάθε φοιτητή καθώς και η βαθμολογία του καθορίζονται από το Εργαστήριο. Γ. Παραλαβή Υλικού, Αντιδραστηρίων και Οργάνων 1. Τα όργανα, τα σκεύη και τα αντιδραστήρια για τις ασκήσεις διατίθενται από το Εργαστήριο.

5 - v - 2. Οι ασκούμενοι φοιτητές υποχρεώνονται μετά το πέρας των εργαστηριακών ασκήσεων να παραδώσουν το εργαστηριακό υλικό στην κατάσταση που το παρέλαβαν. 3. Τα όργανα δεν χρησιμοποιούνται από τους φοιτητές πριν δοθούν οδηγίες από τα μέλη ΔΕΠ και ΕΔΤΠ, είναι ιδιαίτερα προσεκτικοί κατά τη χρήση τους και αναφέρουν κάθε τυχόν βλάβη στους υπευθύνους. Μετά το πέρας της άσκησης τα όργανα καθαρίζονται και τακτοποιούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του προσωπικού του Εργαστηρίου. 4. Σε περίπτωση απώλειας εργαστηριακού υλικού ή θραύσεως υάλινου σκεύους εξ υπαιτιότητας των, οφείλουν να το αντικαταστήσουν.. Τάξη και Καθαριότητα Για την ομαλή και απρόσκοπτη λειτουργία του Εργαστηρίου πρέπει να τηρούνται οι παρακάτω όροι: 1. Δεν επιτρέπεται η παρουσία ξένων προσώπων στο Εργαστήριο κατά τη διάρκεια των ασκήσεων. 2. Οι φοιτητές προσέρχονται φορώντας άσπρη εργαστηριακή μπλούζα. 3. Δεν επιτρέπεται το κάπνισμα από οποιονδήποτε ευρισκόμενο στον Εργαστηριακό χώρο. 4. Δεν επιτρέπεται η λήψη τροφών και ποτών ως και η διατήρησή τους στον Εργαστηριακό χώρο. 5. Κάθε φοιτητής οφείλει να διατηρεί την εργαστηριακή θέση του απολύτως εν τάξει και καθαρή. 6. Οι φοιτητές οφείλουν να ακολουθούν τις οδηγίες του προσωπικού προς τους διαφόρους χειρισμούς. 7. Οι φοιτητές δεν επιτρέπεται να εκτελούν πειράματα ή μετρήσεις που δεν περιλαμβάνονται στο πρόγραμμα ή δεν έχουν υποδειχθεί από τους υπευθύνους του Εργαστηρίου. 8. Η απόρριψη των αχρήστων ουσιών (στερεών ή υγρών), γίνεται σύμφωνα με τις οδηγίες των υπευθύνων.

6 - vi - Ε. Ασφάλεια Φοιτητών Η ασφάλεια των ασκουμένων αποτελεί πρώτιστο μέλημα των υπευθύνων του Εργαστηρίου με την προϋπόθεση ότι οι ασκούμενοι φοιτητές έχουν πλήρη γνώση της άσκησης πριν την έναρξη του Εργαστηρίου και τηρούν τους βασικούς κανόνες ασφαλείας όπως συνοψίζονται κατωτέρω: α) Εργασία με Τοξικές Ουσίες: Όλες οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την άσκηση των φοιτητών πρέπει να θεωρούνται επικίνδυνες για την υγεία και να μεταχειρίζονται ανάλογα. Κατά τη χρήση τους πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα ή το αναπνευστικό σύστημα. Κανόνες Προφύλαξης από Τοξικές Ουσίες i. Εργασίες με πτητικές τοξικές ουσίες γίνονται υποχρεωτικά σε απαγωγούς οι οποίοι λειτουργούν κανονικά. ii. Ελέγχονται πάντα και με ιδιαίτερη προσοχή οι στρόφιγγες αερίων. Οι αντίστοιχοι σωλήνες παροχής αερίου πρέπει να είναι σε πολύ καλή κατάσταση. iii. Δεν χρησιμοποιούνται σιφώνια με το στόμα για την αναρρόφηση τοξικών διαλυμάτων ή ουσιών. Τα κατάλληλα όργανα παρέχονται από το Εργαστήριο. iv. Συνιστάται στους φοιτητές να έχουν στη θέση τους μια καθαρή πετσέτα, χαρτοπετσέτες και σαπούνι. v. Οι ασκούμενοι φοιτητές (αυτονόητα και το υπεύθυνο προσωπικό του Εργαστηρίου) πρέπει να γνωρίζουν αν οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται είναι τοξικές και σε ποιο βαθμό. vi. Η βοήθεια σε περίπτωση ατυχήματος πρέπει να είναι άμεση. vii. Κατά την εργασία με ιδιαίτερα τοξικές ουσίες χρησιμοποιούνται προστατευτικά γάντια και γυαλιά τα οποία διατίθενται από το Εργαστήριο.

7 - vii - β) Εργασία με Εύφλεκτες Ουσίες: i. Δεν πρέπει να υπάρχουν λύχνοι αναμμένοι χωρίς λόγο. ii. Δεν επιτρέπεται να υπάρχουν στους χώρους των Εργαστηρίων μεγάλες ποσότητες διαλυτών. iii. Τηρούνται σχολαστικά οδηγίες που δίνονται για τον τρόπο θέρμανσης και χειρισμού εύφλεκτων ουσιών (υδρόλουτρα, μανδύες, κ.λ.π.). iv. Ο μεγαλύτερος κίνδυνος από ατυχήματα με εύφλεκτες ουσίες οφείλεται στην έλλειψη της απαραίτητης προσοχής και τάξης, τόσο στην εργαστηριακή θέση όσο και κατά τη διάρκεια των ασκήσεων. Εύφλεκτες ουσίες δεν επιτρέπεται να μένουν πάνω στον πάγκο, όταν οι ασκούμενοι φοιτητές εργάζονται και προπαντός όταν υπάρχουν λύχνοι αναμμένοι. v. Στις αίθουσες ασκήσεων πρέπει να υπάρχουν πυροσβεστικά σημεία με πυροσβεστήρες. γ) Υποχρεώσεις Προσωπικού i. Οι υπεύθυνοι των ασκήσεων υποχρεώνονται να προσέρχονται τουλάχιστον 10 λεπτά πριν από την έναρξη των ασκήσεων και μαζί με το ΕΔΤΠ θα πρέπει να έχουν φροντίσει για την προπαρασκευή των αντιδραστηρίων και οργάνων, ώστε απρόσκοπτα να αρχίζει η άσκηση των φοιτητών σε καθορισμένη ώρα. ii. Σε όλη τη διάρκεια των ασκήσεων οι υπεύθυνοι των ασκήσεων οφείλουν να παρευρίσκονται στο Εργαστήριο. Οι φοιτητές σε καμιά περίπτωση δεν μένουν μόνοι τους ασκούμενοι.

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΑΠΟΣΠΑΣΜΑ ΠΡΟΕΔΡΙΚΟΥ ΔΙΑΤΑΓΜΑΤΟΣ (Εργαστηριακές Ασκήσεις) i iii ΕΝΟΤΗΤΑ Α ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΝΑΛΓΗΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 3α. ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΤΗΣ ΒΟΡΝΕΟΛΗΣ ΠΡΟΣ ΚΑΜΦΟΡΑ ΑΣΚΗΣΗ 3β. ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΣΤΕΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΞΥΛΟΜΑΔΑΣ ΕΝΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΟΣ ΕΝΟΤΗΤΑ Β ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΥΓΕΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΚΑΡΥΟΦΥΛΛΑ ΑΣΚΗΣΗ 2α. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΙΝΝΑΜΩΜΑΛΔΕΫΔΗΣ ΑΠΟ ΦΛΟΙΟ ΚΙΝΝΑΜΩΜΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 2β. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΗΣ ΣΕΜΙΚΑΡΒΑΖΟΝΗΣ ΤΗΣ ΚΙΝΝΑΜΩΜΑΛΔΕΫΔΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 3. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΕΝΟΤΗΤΑ Γ ΛΙΠΟΕΙΔΗ ΑΣΚΗΣΗ 1α. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΡΙΜΥΡΙΣΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΜΥΡΙΣΤΙΚΙΝΗΣ ΑΠΟ ΜΟΣΧΟΚΑΡΥΑ ΑΣΚΗΣΗ 1β. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΤΡΙΜΥΡΙΣΤΙΝΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΖΕΛΑΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΕΝΟΤΗΤΑ Δ ΠΟΥΡΙΝΕΣ ΑΣΚΗΣΗ 1α. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΑΠΟ ΦΥΛΛΑ ΤΕΪΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 1β. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΑΠΟ ΣΠΕΡΜΑΤΑ ΚΑΦΕ ΑΣΚΗΣΗ 1γ. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΑΛΙΚΥΛΙΚΗΣ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2a. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΘΕΟΒΡΩΜΙΝΗΣ ΑΠΟ ΣΠΕΡΜΑΤΑ ΚΑΚΑΟ ΑΣΚΗΣΗ 2β. ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΑΠΟ ΘΕΟΒΡΩΜΙΝΗ ΕΝΟΤΗΤΑ Ε ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΖΕΪΝΗΣ ΚΑΙ ΛΑΚΤΟΖΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΓΑΛΑ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΜΑΝΝΙΤΟΛΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΗΚΤΙΝΗΣ ΑΠΟ ΠΕΡΙΚΑΡΠΙΟ ΛΕΜΟΝΙΩΝ

9 ΑΣΚΗΣΗ 4. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΑΜΥΛΟΥ ΑΠΟ ΓΕΩΜΗΛΑ ΑΣΚΗΣΗ 5. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΩΝ ΕΝΟΤΗΤΑ ΣΤ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ ΑΣΚΗΣΗ 1α. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΣΠΕΡΙΔΙΝΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΦΛΟΙΟ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 1β. ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΕΣΠΕΡΙΔΙΝΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΑΡΙΝΓΙΝΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΦΛΟΙΟ ΓΚΡΕΪΠ-ΦΡΟΥΤ (ΚΙΤΡΟΥ) ΕΝΟΤΗΤΑ Ζ ΚΑΡΟΤΕΝΟΕΙΔΗ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΕΣ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΣΠΑΝΑΚΙΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΛΥΚΟΠΕΝΙΟΥ ΑΠΟ ΤΟΜΑΤΕΣ ΑΣΚΗΣΗ 3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΨΑΝΘΙΝΗΣ ΑΠΟ ΠΑΠΡΙΚΑ ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ

10 - 1 - ΕΝΟΤΗΤΑ Α ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Ο καθορισμός της δομής και η μελέτη των ιδιοτήτων μιας ουσίας προϋποθέτουν την απομόνωσή της σε καθαρή κατάσταση. Για τον καθαρισμό των οργανικών ενώσεων υπάρχουν διάφορες μέθοδοι, όπως η ανακρυστάλλωση, η απόσταξη, η εξάχνωση κ.α. Για το διαχωρισμό όμως ουσιών με παραπλήσια δομή χρησιμοποιείται κυρίως η μέθοδος της χρωματογραφίας η οποία είναι όχι μόνο αποτελεσματική αλλά και εύκολη και γρήγορη. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο φάσεων, μιας ακίνητης (stationary phase) και μιας κινητής (mobile phase). Η κινητή φάση μετακινεί τα συστατικά του μίγματος επί της ακίνητης με διαφορετική ταχύτητα. Μια ουσία, η οποία συγκρατείται ισχυρότερα από την ακίνητη φάση, μετακινείται με μικρότερη ταχύτητα από κάποια άλλη, η οποία συγκρατείται λιγότερο ισχυρά. Επειδή τα μόρια του μίγματος κατανέμονται συγχρόνως και στις δύο φάσεις αποκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία για κάθε κατηγορία μορίων. Η κατανομή των μορίων ενός δείγματος μεταξύ των δύο φάσεων εξαρτάται από μια σταθερά ισορροπίας, η οποία ονομάζεται συντελεστής κατανομής κ. Οι συγκεντρώσεις της ουσίας στις δύο φάσεις και ο συντελεστής κατανομής συνδέονται μεταξύ τους με τη σχέση κ=c A /C B, όπου C A η συγκέντρωση της ουσίας στην ακίνητη φάση και C B η συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Ανάλογα με τη φυσική κατάσταση της κινητής και της ακίνητης φάσης διακρίνονται τα παρακάτω είδη χρωματογραφίας:

11 Αέρια χρωματογραφία (GC, κινητή φάση αέριο), η οποία διακρίνεται σε δυο κατηγορίες: Χρωματογραφία αερίου-στερεού (GSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία αερίου-υγρού (GLC, ακίνητη φάση υγρό, προσροφημένο επί κατάλληλου αδρανούς στερεού υλικού) 2. Υγρή χρωματογραφία (LC, κινητή φάση υγρό), η οποία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: Χρωματογραφία υγρού-στερεού (LSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία υγρού-υγρού (LLC, ακίνητη φάση υγρό προσροφημένο επί κατάλληλου στερεού υλικού) Στην ενότητα αυτή θα αναπτυχθούν μόνο οι αρχές της υγρής χρωματογραφίας. Στην υγρή χρωματογραφία ανάλογα με το μηχανισμό κατανομής των ουσιών του μίγματος μεταξύ των φάσεων διακρίνονται τα εξής είδη: Χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) Στη μέθοδο αυτή ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται κατάλληλο στερεό υλικό με προσροφητικές ικανότητες, ενώ ως κινητή υγρό. Ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος στηρίζεται στην εκλεκτική προσρόφηση των συστατικών του επί της ακίνητης φάσης. Όταν το υγρό κινείται επί της επιφανείας της ακίνητης φάσης, τότε για κάθε συστατικό του μίγματος αποκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία προσρόφησης-εκρόφησης μορίων. Μόρια τα οποία προσροφώνται ισχυρότερα μετακινούνται με μικρότερη ταχύτητα επί της ακίνητης φάσης με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό τους από κάποια άλλα τα οποία προσροφώνται λιγότερο ισχυρά. Τα πιο γνωστά προσροφητικά υλικά, με ισχυρή προσροφητική ικανότητα, είναι το τριοξείδιο του αργιλίου (Alumina) και το διοξείδιο του πυριτίου (Silica gel). Άλλα υλικά, με μικρότερη προσροφητική ισχύ, είναι το οξείδιο του μαγνησίου (Magnesia), το ανθρακικό ασβέστιο, η κυτταρίνη κ.ά. Τα ισχυρά προσροφητικά υλικά (π.χ. Alumina, Silica gel) συγκρατούν ισχυρότερα τα συστατικά ενός μίγματος (ισχυρότερα τα πολικά σε σχέση με τα μη πολικά) απ ότι τα λιγότερο ισχυρά προσροφητικά υλικά. Όσον αφορά την κινητή φάση υπάρχει δυνατότητα επιλογής μεταξύ αρκετών διαλυτών. Η ισχύς έκλουσης ενός διαλύτη εξαρτάται τόσο από την ακίνητη φάση όσο και από τη φύση των ουσιών οι οποίες εκλούονται. Ένας πολικός διαλύτης με μεγάλη ικανότητα μετακίνησης (π.χ. ακετονιτρίλιο, αιθανόλη, μεθανόλη) μετακινεί ταχύτερα τα

12 - 3 - συστατικά του μίγματος απ ότι κάποιος άλλος με μικρότερη πολικότητα (π.χ. διχλωρομεθάνιο, οξικός αιθυλεστέρας, τολουόλιο, πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο). Σε πολλές περιπτώσεις χρησιμοποιούνται μίγματα διαλυτών ή και σειρές από μίγματα με σειρά αυξανόμενης πολικότητας (βαθμίδωση ισχύος εκλούσεως). Χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο μη αναμειγνυόμενων υγρών, λόγω διαφορετικής διαλυτότητας. Το ένα υγρό αποτελεί την κινητή φάση, ενώ η ακίνητη φάση αποτελείται από ένα λεπτό στρώμα του άλλου υγρού το οποίο βρίσκεται στην επιφάνεια ενός αδρανούς στερεού υλικού όπως, γη διατόμων, διοξείδιο του πυριτίου, στερεά υλικά πολυσακχαριτικής φύσεως (Sephadex) κ.ά. Από τους διαλύτες οι οποίοι θα επιλεγούν ο περισσότερο πολικός (συνήθως νερό) προσροφάται αρχικά στην επιφάνεια του στερεού υλικού (κορεσμός) και εν συνεχεία προστίθεται η κινητή φάση. Χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion-exchange chromatography) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό ιονισμένων ουσιών. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην εκλεκτική επιβράδυνση των ιονισμένων σωματιδίων του μίγματος λόγω ανταλλαγής τους με ιόντα της στατικής φάσης. Η κινητή φάση μπορεί να είναι νερό ή υδατικό διάλυμα οξέος, βάσεως και άλατος, ή κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα. Η ακίνητη φάση είναι συνήθως πολυμερές το οποίο φέρει όξινους ή βασικούς υποκαταστάτες σε ορισμένες θέσεις του (ιονανταλλακτική ρητίνη). Η επιλογή της ιονανταλλακτικής ρητίνης καθώς και της κινητής φάσης εξαρτάται από τη φύση των προς διαχωρισμό ιονισμένων ουσιών. Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό ιχνοποσοτήτων ανιόντων και κατιόντων σε μια ποικιλία δειγμάτων, όπως νερά, εκχυλίσματα εδαφών, τρόφιμα, βιομηχανικά και περιβαλλοντικά δείγματα, κ.ά. Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion chromatography) ή χρωματογραφία διηθήσεως πηκτής (gel filtration chromatography) Σε αυτό το είδος της χρωματογραφίας ως ακίνητη φάση χρησιμοποιούνται πηκτές (γέλες, gels) από ορισμένα διασυνδεόμενα πολυμερή, τα οποία φέρουν διάφορες ομάδες (υδροξυλομάδες, αμιδικές ομάδες, ακετυλιωμένες υδροξυλομάδες κ.ά.). Τέτοια υλικά είναι τα πολυμερή της δεξτράνης (Sephadex G), της αγαρόζης (Sepharose B), του πολυακρυλαμιδίου (Bio-Gel P) κ.ά. Οι ομάδες αυτές έχουν τη

13 - 4 - δυνατότητα προσρόφησης διαφόρων διαλυτών. Η προσρόφηση αυτή επιφέρει διόγκωση των κόκκων του gel, μέσω διάνοιξης της δομής των διασυνδεόμενων πολυμερών αλυσίδων, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται στους κόκκους πόροι διαφόρων μεγεθών. Έτσι, αν χρησιμοποιηθεί ένα τέτοιο υλικό ως ακίνητη φάση και ως κινητή φάση κάποιος κατάλληλος διαλύτης ή μίγμα διαλυτών μπορεί να γίνει κλασμάτωση των ουσιών ενός μίγματος με βάση το μέγεθος των μορίων του. Τα μεγάλα μόρια που δεν χωρούν στους πόρους ελίσσονται μεταξύ των κόκκων και εκλούονται πρώτα, ενώ τα μικρότερα μόρια τα οποία εισχωρούν στους πόρους κινούνται με μικρότερες ταχύτητες. Η ικανότητα των πηκτών μοριακού αποκλεισμού να κατακρατούν ουσίες μικρού μοριακού βάρους αξιοποιείται για την απομάκρυνση μικρομοριακών αντιδραστηρίων και προϊόντων από μεγαλομόρια, μετά από κάποια χημική αντίδραση ή στάδιο καθαρισμού. Χρωματογραφία συγγενείας (affinity chromatography) Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην εξειδικευμένη αλληλεπίδραση μεταξύ μιας ουσίας, η οποία έχει ακινητοποιηθεί στη στερεή στατική φάση, και ενός μόνο συστατικού από ένα πολύπλοκο μίγμα. Έτσι, όταν το διάλυμα του μίγματος διαβιβασθεί σε ένα τέτοιο υλικό, θα κατακρατηθεί μόνο το ένα συστατικό, εξαιτίας της εξειδικευμένης αντιδράσεως του με τη στατική φάση, ενώ τα άλλα συστατικά θα εκλουσθούν. Εν συνεχεία, το συστατικό το οποίο έχει συγκρατηθεί εκλούεται με την προσθήκη ενός υγρού το οποίο αλλάζει τις συνθήκες έτσι ώστε να εξασθενήσει η σύνδεση του συνδεδεμένου συστατικού. Η τεχνική αυτή βρίσκει εφαρμογή κυρίως σε διαχωρισμούς ουσιών βιοχημικού ενδιαφέροντος. Η υγρή χρωματογραφία ανάλογα με την εφαρμοζόμενη πειραματική τεχνική διακρίνεται σε χρωματογραφία στήλης και επίπεδη χρωματογραφία (σε χαρτί ή λεπτή στοιβάδα). Κατά την τεχνική της επίπεδης χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) η ακίνητη φάση επιστρώνεται με κατάλληλο τρόπο επάνω σε γυαλί ή φύλλο πλαστικού ή αλουμινίου (φορέας επίστρωσης). Το πάχος επίστρωσης μπορεί να είναι από 0.15 mm μέχρι 2 mm. Ως υλικά επίστρωσης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν διοξείδιο του πυριτίου (Silica gel), τριοξείδιο του αργιλίου (Alumina), κυτταρίνη σε μορφή σκόνης ή ακόμα και ρητίνες με όξινες ή βασικές ομάδες. Τα υλικά αυτά είναι συνήθως αναμεμιγμένα με μικρή ποσότητα γύψου (10-

14 - 5-15%) για καλύτερη προσκόλληση πάνω στο φορέα επίστρωσης. Όταν πρόκειται να διαχωριστούν σχετικώς μη πολικά μόρια όπως, υδρογονάνθρακες, αιθέρες, αλδεΰδες, κετόνες κ.ά. ως υλικό επίστρωσης προτιμάται η Alumina, ενώ για τον διαχωρισμό περισσότερο πολικών μορίων όπως, αλκοολών, καρβοξυλικών οξέων, αμινών, κ.ά., η Silica gel. Ως κινητή φάση (διαλύτης ανάπτυξης) χρησιμοποιούνται διάφοροι διαλύτες (διχλωρομεθάνιο, εξάνιο, τολουόλιο, οξικός αιθυλεστέρας, πετρελαϊκός αιθέρας, ακετόνη, μεθανόλη κ.ά.) ή και μίγματα διαλυτών. Όταν ο διαλύτης ανάπτυξης είναι οργανικός διαλύτης ή μίγμα οργανικών διαλυτών τότε ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος γίνεται κυρίως βάσει του μηχανισμού προσρόφησης, ενώ στην περίπτωση όπου ο διαλύτης περιέχει και νερό τότε ταυτόχρονα με τα φαινόμενα προσρόφησης παρατηρούνται και φαινόμενα κατανομής σε μεγάλο βαθμό. Η συσκευή η οποία χρησιμοποιείται στη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας αποτελείται από υάλινο δοχείο με κάλυμμα (δοχείο ανάπτυξης). Μέσα στο δοχείο τοποθετείται ο διαλύτης (στοιβάδα διαλύτη 0.5 cm) και το δοχείο κλείνεται ώστε να επιτευχθεί κορεσμός του χώρου από τους ατμούς του διαλύτη. Για να γίνει γρήγορα ο κορεσμός, τοποθετείται στο πλαϊνό τοίχωμα του δοχείου διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με διαλύτη ανάπτυξης, το άκρο του οποίου είναι εμβαπτισμένο στο διαλύτη. Η τοποθέτηση του δείγματος στο πλακίδιο γίνεται με τριχοειδές σωληνάκι, υπό μορφή κηλίδας, 1 cm περίπου από τη βάση του πλακιδίου. Επάνω στο ίδιο πλακίδιο μπορούν να τοποθετηθούν περισσότερες από μία κηλίδες (διαφορετικών δειγμάτων) στο ίδιο ύψος από τη βάση του πλακιδίου και σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους (1-1.5 cm).

15 - 6 - Μετά την ξήρανση της κηλίδας το πλακίδιο τοποθετείται στο δοχείο ανάπτυξης. Ο διαλύτης ανάπτυξης ανεβαίνει στο πλακίδιο αργά-αργά λόγω τριχοειδών φαινομένων συμπαρασύροντας και τα συστατικά του δείγματος σε διαφορετικές αποστάσεις (ανάπτυξη χρωματογραφήματος). Όταν το μέτωπο ανάπτυξης του διαλύτη πλησιάζει το επάνω άκρο του πλακιδίου τότε αυτό απομακρύνεται από το θάλαμο ανάπτυξης και σημειώνεται το μέτωπο του διαλύτη με μολύβι. Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, το πλακίδιο ξηραίνεται (με ρεύμα αέρα ή στο φούρνο) και ακολουθεί ο προσδιορισμός των θέσεων των κηλίδων. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται εμφάνιση του χρωματογραφήματος. Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι οι κηλίδες πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρές και να προέρχονται από αραιά διαλύματα των δειγμάτων (~1-1.5%), έτσι ώστε μετά την εμφάνιση του χρωματογραφήματος να μην παρατηρούνται ουρές κάτω από τις κηλίδες ή υπερκάλυψη αυτών.

16 - 7 - Χρωματογραφική πλάκα πριν την ανάπτυξη Χρωματογραφική πλάκα μετά την ανάπτυξη Για την ανίχνευση των κηλίδων των δειγμάτων χρησιμοποιούνται: 1. Φυσικές μέθοδοι, όπως η υπεριώδη ακτινοβολία (χρησιμοποιούνται ειδικές πλάκες φθορίζουσες στο υπεριώδες φως οπότε στις θέσεις όπου υπάρχει ουσία η οποία απορροφά εμφανίζονται σκούρες κηλίδες) 2. Χημικές μέθοδοι, όπως ο ψεκασμός με ειδικά αντιδραστήρια, όταν οι ουσίες οι οποίες χρωματογραφούνται μπορούν να δώσουν έγχρωμα παράγωγα με τα αντιδραστήρια αυτά και η έκθεση σε χώρο ο οποίος περιέχει ατμούς ενός αερίου αντιδραστηρίου, π.χ. ΝΗ 3, I 2, Η 2 S. Μερικά παραδείγματα αντιδραστηρίων εμφάνισης κηλίδων δίνονται στον Πίνακα I Πίνακας Ι. Αντιδραστήρια ανίχνευσης διαφόρων ενώσεων Σύστημα ανίχνευσης Κατηγορία ενώσεων Παρατηρούμενο χρώμα Ατμοί αμμωνίας Φαινόλες Κηλίδες διαφόρων χρωμάτων Ατμοί Cl Αρωματικές αμίνες Κηλίδες διαφόρων χρωμάτων 0.5 % υδατικό διάλυμα PdCl 2 με λίγες σταγόνες π. Cl Ουσίες οι οποίες περιέχουν θείο και σελήνιο Κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 0.5% 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη σε 2Μ Cl Αλδεΰδες και κετόνες Κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 0.3% νινυδρίνη σε βουτανόλη-1 με 3% οξικό οξύ και θέρμανση στους 125 C Αμινοξέα και αμίνες Μπλε, κόκκινες και κίτρινες κηλίδες 50% 2 S 4 και θέρμανση στους 150 C Γενική χρήση Μαύρες κηλίδες Διάλυμα ανισαλδεΰδης-θειϊκού οξέος και θέρμανση στους 110 C Γενική χρήση Μαύρες κηλίδες

17 - 8 - Ο βαθμός συγκράτησης μιας ουσίας στην επίπεδη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας εκφράζεται με τον παράγοντα επιβράδυνσης R f, ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος της αποστάσεως που κινήθηκε η ουσία προς την απόσταση που κινήθηκε ο διαλύτης. Η απόσταση που κινήθηκε ο διαλύτης μετριέται από τη θέση του μετώπου, ενώ η απόσταση του δείγματος μετριέται από το κέντρο της κηλίδας ή από το σημείο που αντιστοιχεί στη μέγιστη πυκνότητά της. Η τιμή του R f επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως π.χ. από τη σύσταση του διαλύτη αναπτύξεως, από τη φύση του υλικού επίστρωσης, κ.ά. Σε καθορισμένες όμως συνθήκες αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση μιας άγνωστης ουσίας, συγκρίνοντας την τιμή του R f αυτής με τις τιμές των R f γνωστών ουσιών στις ίδιες συνθήκες. Υπολογισμός της τιμής του R f Για τον καλύτερο και αποτελεσματικότερο διαχωρισμό των κηλίδων των συστατικών ενός πολύπλοκου μίγματος χρησιμοποιείται η δισδιάστατη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Κατά την τεχνική αυτή η κηλίδα του δείγματος τοποθετείται στη γωνία (1cm από κάθε άκρο) μιας τετράγωνης χρωματογραφικής πλάκας. Αρχικά το χρωματογράφημα αναπτύσσεται με ένα σύστημα διαλυτών και εν συνεχεία, αφού στραφεί κατά 90, αναπτύσσεται ξανά με άλλο σύστημα διαλυτών.

18 - 9 - ισδιάστατη ανάπτυξη ενός χρωματογραφήματος Συμπερασματικά η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας είναι γρήγορη και απλή μέθοδος και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως τεχνική καθοδήγησης για: τον έλεγχο της καθαρότητας μιας ενώσεως (εμφάνιση μιας ή περισσοτέρων κηλίδων σε διαφορετικά χρωματογραφήματα με διαφορετικούς διαλύτες ανάπτυξης) ή της πολυπλοκότητας ενός μίγματος τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των εφαρμοζομένων μεθόδων διαχωρισμού και καθαρισμού μιας ενώσεως τον καθορισμό των ιδανικών συνθηκών για τον καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος σε μεγάλη κλίμακα (π.χ. με υγρή χρωματογραφία στήλης) την ποιοτική μελέτη της πορείας μιας χημικής αντίδρασης και τον καθορισμό των βέλτιστων συνθηκών πραγματοποιήσεως αυτής για την ταυτοποίηση φαρμάκων, εκχυλισμάτων φυτών και βιοχημικών παρασκευασμάτων ή για την ανίχνευση νοθειών και μολύνσεων τροφίμων Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον ποσοτικό διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος. Στην περίπτωση αυτή οι διαχωριζόμενες ουσίες απομονώνονται με απόξυση του προσροφητικού υλικού στην περιοχή κάθε κηλίδας, εκχύλιση αυτού με κατάλληλο διαλύτη και ταυτοποίηση του εκχυλίσματος με κατάλληλη αναλυτική τεχνική. Οι αρχές της τεχνικής της επίπεδης χρωματογραφίας σε χαρτί είναι παρόμοιες με αυτές της επίπεδης χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Στην τεχνική αυτή αντί για

19 τις χρωματογραφικές πλάκες χρησιμοποιείται ένα κομμάτι χαρτί το οποίο αποτελείται κυρίως από πολύ καθαρή κυτταρίνη. Η κυτταρίνη έχει μεγάλη συγγένεια με το νερό και άλλους πολικούς διαλύτες και τους συγκρατεί ανθεκτικά σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου. Έτσι, ο κύριος μηχανισμός διαχωρισμού είναι η κατανομή μεταξύ δύο υγρών, ενός πολικού (συνήθως νερό) καθηλωμένου στο χαρτί (στατική φάση) και ενός λιγότερου πολικού (οργανικός διαλύτης ή και μίγμα οργανικών διαλυτών), ο οποίος κινείται στο χαρτί (κινητή φάση). Ο καλύτερος και ταχύτερος διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος επιτυγχάνεται όταν οι δύο φάσεις των διαλυτών δεν αναμιγνύονται. Μπορεί όμως να συμβεί σε μικρή κλίμακα και προσρόφηση, καθώς και ιονανταλλαγή. Σήμερα κυκλοφορούν στο εμπόριο διάφορες τροποποιημένες μορφές χαρτιού εμποτισμένου με αλουμίνα, διοξείδιο του πυριτίου, ιονανταλλακτικές ρητίνες κ.ά. Η συσκευή της χρωματογραφίας σε χαρτί αποτελείται από ένα υποστήριγμα, ένα μικρό δοχείο για το διαλύτη κι ένα μεγάλο αεροστεγές δοχείο στο οποίο γίνεται η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος. Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος μπορεί να είναι: α) ανοδική κατά την οποία το δοχείο του διαλύτη βρίσκεται στο κάτω μέρος και ο διαλύτης ανεβαίνει μέσα από το χαρτί με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων, β) καθοδική κατά την οποία το δοχείο του διαλύτη βρίσκεται στην κορυφή του κλειστού δοχείου και το χαρτί διπλώνεται σε σχήμα U με μια μικρή αρχική ανύψωση από το δοχείο του διαλύτη και γ) κυκλική ή οριζόντια κατά την οποία χρησιμοποιείται κυκλικό χαρτί και η κυκλική κίνηση του διαλύτη σχηματίζει ομόκεντρους δακτυλίους αντί κηλίδων. Τρόποι αναπτύξεως χρωματογραφημάτων στην επίπεδη χρωματογραφία χάρτου Για δύσκολους διαχωρισμούς χρησιμοποιείται και η δισδιάστατη ανάπτυξη κατά την οποία αφού γίνει η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος με ένα διαλύτη, ακολούθως το

20 χαρτί απομακρύνεται και μετά την εξαέρωση του διαλύτη στρέφεται κατά 90 0 και αναπτύσσεται για δεύτερη φορά με έναν άλλο διαλύτη με διαφορετικές ιδιότητες έκλουσης. Η εμφάνιση των χρωματογραφημάτων γίνεται με τις μεθόδους οι οποίες έχουν περιγραφθεί στην ενότητα της επίπεδης χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Η χρωματογραφία σε χαρτί είναι κατάλληλη για δείγματα της περιοχής των μg και μίγματα ουσιών τα οποία έχουν μεγάλη χημική συγγένεια. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό μετάλλων σε κράματα, για τον έλεγχο της καθαρότητας διαφόρων ουσιών, φαρμακευτικών προϊόντων, τροφίμων, καλλυντικών, τη μελέτη της ωρίμανσης και της ζύμωσης, για την ανίχνευση των νοθειών και των μολύνσεων σε τρόφιμα και ποτά, κ.ά. παλαιότερη και πιο συνηθισμένη χρωματογραφική μέθοδο υγρής χρωματογραφίας, είναι η χρωματογραφία στήλης. Ανάλογα με τους χρωματογραφικούς μηχανισμούς διαχωρισμού, οι οποίοι λαμβάνουν χώρα, διακρίνονται τα παρακάτω είδη χρωματογραφίας στήλης: Χρωματογραφία προσροφήσεως (adsorption chromatography) Χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) Χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion-exchange chromatography) Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (molecular exclusion chromatography) Χρωματογραφία συγγένειας (affinity chromatography) Οι αρχές των μεθόδων αυτών έχουν αναφερθεί παραπάνω. Στην κλασσική υγρή χρωματογραφία η χρησιμοποιούμενη στήλη είναι υάλινος σωλήνας, ο οποίος φέρει πορώδες διάφραγμα στην μια του άκρη. Ως εναλλακτική λύση χρησιμοποιείται προχοΐδα και αντί για πορώδες διάφραγμα τοποθετείται υαλοβάμβακας ο οποίος συγκρατεί στοιβάδα άμμου 3 mm.

21 Χρωματογραφική στήλη Ο τρόπος πληρώσεως και η προετοιμασία της στήλης ποικίλλουν, ανάλογα με τον εφαρμοζόμενο μηχανισμό διαχωρισμού. Ειδικότερα στη χρωματογραφία προσροφήσεως η κατάλληλη ποσότητα στατικής φάσης μπορεί να προστεθεί στη στήλη με δύο τρόπους: α) Το στερεό υλικό (συνήθως Alumina) προστίθεται απ ευθείας στη στήλη και κατά διαστήματα συμπιέζεται με κατάλληλη γυάλινη ράβδο. Αφού η στήλη γεμίσει μέχρι το επιθυμητό σημείο, προστίθεται ο διαλύτης έκλουσης (η υγρή κινητή φάση) και η στήλη εκλούεται με το διαλύτη μέχρι να απομακρυνθούν οι φυσαλίδες του αέρα β) Η στρόφιγγα της στήλης κλείνεται και η στήλη γεμίζει κατά το 1/3 με διαλύτη. Το στερεό υλικό (συνήθως Silica gel) αναμιγνύεται με αρκετή ποσότητα διαλύτη και αναδεύεται έως ότου απομακρυνθούν οι φυσαλίδες του αέρα που θα δημιουργηθούν. Το μίγμα αυτό προστίθεται στη στήλη είτε δια μιας είτε σταδιακά, ενώ η στήλη δονείται (με ελαφρά κτυπήματα) για να γίνει το γέμισμα ομοιόμορφα. Ακολούθως, ανοίγεται η στρόφιγγα της στήλης για να απομακρυνθεί ο διαλύτης που βρίσκεται πάνω από την επιφάνεια του στερεού υλικού. Ποτέ δεν αφήνεται η επιφάνεια του υγρού να κατέβει κάτω από την επιφάνεια του στερεού (διαφορετικά η στήλη ξηραίνεται).

22 Μετά την πλήρωση, η στήλη εκπλένεται με τον διαλύτη έκλουσης (η διαδικασία λέγεται εξισορρόπηση της στήλης). Μετά την εξισορρόπηση η στήλη είναι έτοιμη να δεχθεί το προς διαχωρισμό δείγμα. Για να γίνει η προσθήκη του δείγματος, πρέπει η επιφάνεια του υγρού έκλουσης να ταυτιστεί με την επιφάνεια του στερεού. Στη συνέχεια προστίθεται το δείγμα διαλυμένο στον ελάχιστο δυνατό όγκο διαλύτη έκλουσης, με τη βοήθεια σιφωνίου (ή πιπέτας Pasteur), του οποίου το κάτω άκρο σχεδόν εγγίζει την επιφάνεια της στήλης. Όταν το δείγμα απορροφηθεί, προστίθεται στη στήλη με τον ίδιο τρόπο μικρή ποσότητα διαλύτη (περίπου ίσου όγκου με τον όγκο του δείγματος) για να προωθηθεί το δείγμα μέσα στη στήλη. Ένας άλλος τρόπος εισαγωγής του δείγματος είναι η ανάμιξη του διαλύματος αυτού με μικρή ποσότητα στερεού προσροφητικού υλικού και τοποθέτηση του μίγματος ως λεπτή ζώνη στην κορυφή της στήλης. Μετά την τοποθέτηση του δείγματος η στήλη εκλούεται με τον διαλύτη έκλουσης για τη χρωματογράφηση του δείγματος. Η ροή της κινητής φάσεως μέσα από τη στήλη πετυχαίνεται συνήθως με σιφωνισμό του διαλύτη από μια δεξαμενή, η οποία βρίσκεται υψηλότερα από τη στήλη. Η κατάλληλη ταχύτητα ροής εξαρτάται από τη διάμετρο της στήλης και την επιδιωκόμενη διαχωριστικότητα. Για τον καλύτερο έλεγχο της ταχύτητας ροής μπορούν να χρησιμοποιηθούν περισταλτικές αντλίες χαμηλής πιέσεως. Για την εύρεση του κατάλληλου συστήματος έκλουσης γίνονται δοκιμές με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Για να επιτευχθεί καλός διαχωρισμός θα πρέπει τα R f των συστατικών του μίγματος να διαφέρουν τουλάχιστον κατά Σύστημα Α (ακατάλληλο για έκλουση της στήλης) Σύστημα Β (κατάλληλο για έκλουση της στήλης) Επιλογή συστήματος έκλουσης μιας χρωματογραφικής στήλης για το διαχωρισμό μίγματος δύο συστατικών

23 Πλήρωση και ανάπτυξη μιας χρωματογραφικής στήλης

24 Όταν οι ενώσεις του δείγματος είναι έγχρωμες, τότε είναι δυνατή η παρακολούθηση του διαχωρισμού με γυμνό μάτι και η συλλογή των κατάλληλων κλασμάτων. Στην περίπτωση όπου οι ουσίες είναι άχρωμες συλλέγονται κλάσματα συγκεκριμένου όγκου. Μετά τη συλλογή των κλασμάτων γίνεται ανάλυση αυτών για να προσδιοριστεί σε ποια από αυτά υπάρχει ουσία. Ένας απλός και γρήγορος τρόπος ελέγχου της καθαρότητας των κλασμάτων αποτελεί η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Έλεγχος της καθαρότητας των κλασμάτων μιας χρωματογραφικής στήλης με TLC Τα τελευταία χρόνια εκτός από την απλή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως η χρωματογραφία στήλης με πίεση (flash column chromatography). Η τεχνική αυτή απαιτεί λιγότερο χρόνο και είναι περισσότερο αποτελεσματική. Αυτό οφείλεται στη χρησιμοποιούμενη σίλικα, η οποία είναι λεπτότερη και επιτρέπει καλύτερη προσρόφηση, ενώ η εφαρμογή της πιέσεως αυξάνει την ικανότητα διαχωρισμού μειώνοντας το χρόνο έκλουσης και περιορίζοντας την εξάπλωση των ζωνών των συστατικών του δείγματος. Στην περίπτωση αυτή ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος μπορεί να επιτευχθεί και όταν τα R f αυτών διαφέρουν λιγότερο από 0.2. Η κλασική χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως στην προκατεργασία πολύπλοκων δειγμάτων, τα οποία χρειάζονται προκαταρκτικό διαχωρισμό, πριν αναλυθούν με μία ενόργανη αναλυτική τεχνική. Εξαιτίας των χρησιμοποιούμενων στηλών (σχετικά μεγάλης διαμέτρου και πληρωμένες με μεγάλης διαμέτρου σωματίδια πληρωτικού υλικού) και των μικρών ταχυτήτων ροής της κινητής φάσεως, ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για ένα διαχωρισμό με την κλασική χρωματογραφία στήλης είναι σχετικά μεγάλος. Με την ανάπτυξη της υγρής χρωματογραφίας υψηλής

25 αποδόσεως (igh Performance Liquid Chromatography, PLC) οι χρόνοι διαχωρισμού μειώθηκαν σημαντικά. Κατά την τεχνική αυτή το υλικό πληρώσεως της στήλης είναι λεπτότατου διαμερισμού (σωματίδια πολύ μικρής διαμέτρου) και έχει υψηλή σφαιρική κανονικότητα έτσι, ώστε να επιτυγχάνονται μεγάλου βαθμού ομοιομορφία και πυκνότητα πληρώσεως. Η υψηλή πυκνότητα πληρώσεως όμως με αυτά τα πολύ μικρά σωματίδια μειώνει τη ταχύτητα ροής της κινητής φάσεως μέσα από τη στήλη (μεγάλη αντίσταση μεταφοράς) και για να επιτευχθεί μία λογική ταχύτητα ροής απαιτείται η εφαρμογή υψηλής πιέσεως στην κινητή φάση. Τα βασικά τμήματα μιας συσκευής PLC είναι: 1) σύστημα παροχής κινητής φάσεως, 2) σύστημα εισαγωγής δείγματος, 3) στήλη, 4) ανιχνευτής και 5) καταγραφέας. Η τεχνική PLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασισμένους σε προσρόφηση, κατανομή, ιονανταλλαγή και μοριακό αποκλεισμό, ενώ για κάθε μία εφαρμογή διατίθενται από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες οι κατάλληλες στήλες. Έχουν επίσης αναπτυχθεί υλικά πληρώσεως (κυρίως μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου του πυριτίου) με χημικά συνδεδεμένες στατικές φάσεις (chemically bonded stationary phases). Στην περίπτωση αυτή εάν η στατική φάση είναι άπολη και η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών διαλυτών-νερού τότε η τεχνική ονομάζεται υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσεως (Reversed Phase igh Performance Liquid Chromatography, RP-PLC). Σε ένα καλό χρωματογραφικό σύστημα αναλύσεως πρέπει να επιτυγχάνεται διαφορετική ταχύτητα μετακινήσεως των ζωνών των συστατικών, λόγω του διαφορετικού βαθμού συγκρατήσεως τους στη στατική φάση. Η PLC μπορεί να

26 χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μειγμάτων ουσιών ποικίλης προελεύσεως. Αποτελεί την τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης και χρησιμοποιείται ευρέως στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων. Ακολούθως δίνονται τρία παραδείγματα εφαρμογής της επίπεδης χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας. Παραδείγματα εφαρμογής της χρωματογραφίας στήλης δίνονται στην Ενότητα Ζ. ΑΣΚΗΣΗ 1 ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Η ανίχνευση των αμινοξέων στηρίζεται σε μια χαρακτηριστική αντίδραση μεταξύ της ελεύθερης αμινομάδας αυτών και της νινυδρίνης κατά την οποία παράγονται έγχρωμα παράγωγα: N 2 -C(R)-C Αμινοξύ C C Νινυδρίνη C C C-N=C C RC C 2 Εγχρωμο παράγωγο Ο σχηματισμός των εγχρώμων παραγώγων μπορεί να γίνει και όταν η αμινομάδα των αμινοξέων δεν είναι ελεύθερη αλλά προστατεύεται με κάποια προστατευτική ομάδα, αρκεί η ομάδα αυτή να απομακρύνεται κατά τη διαδικασία εμφάνισης του χρωματογραφήματος.

27 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Δοκιμαστικοί σωλήνες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ποτήρια ζέσεως Φούρνος Λάμπα UV Υλικά και αντιδραστήρια Αμινοξέα Αιθανόλη Βουτανόλη-1 Ακετονιτρίλιο Πυριδίνη Οξικό οξύ Διάλυμα νινυδρίνης Στερεό Ι 2 Πλάκες TLC (Kieselgel GF 254 ) Πειραματική διαδικασία Σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ, Δ, Ε, ΣΤ, Ζ και Χ. Το δείγμα Α περιέχει διάλυμα αλανίνης (1%), το δείγμα Β διάλυμα φαινυλαλανίνης (1%), το δείγμα Γ διάλυμα λυσίνης (1%), το δείγμα Δ διάλυμα σερίνης (1%), το δείγμα Ε διάλυμα προλίνης (1%), το δείγμα ΣΤ διάλυμα Ν α -βουτυλοξυκαρβονυλο-αλανίνης (Boc-Ala), το δείγμα Ζ διάλυμα Ν α -9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλο-αλανίνης (Fmoc-Ala) και το δείγμα X μίγμα δύο ή περισσοτέρων εκ των παραπάνω ενώσεων. 2 N C C 2 N C C 2 N C C 2 N C C C C 3 C 2 C 2 C 2 N C 2 C 2 C 2 N 2 Αλανίνη Φαινυλαλανίνη Λυσίνη Σερίνη Προλίνη

28 C C 3 C C 3 C N C C C 3 2 C C N C C C 3 Boc-Ala Fmoc-Ala Σε μια πλάκα 10x10 cm σημειώνονται με μολύβι η γραμμή εκκίνησης και τα σημεία τοποθέτησης των δειγμάτων και εν συνεχεία με τριχοειδή σωληνάκια γίνεται η τοποθέτηση των δειγμάτων (όπως έχει περιγραφθεί στο θεωρητικό μέρος). Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος γίνεται: 1) με σύστημα διαλυτών αιθανόλης/νερού (8:2, v/v) και 2) με σύστημα διαλυτών 1- βουτανόλης/οξικού οξέος/νερού/πυριδίνης (4:1:1:2, v/v). Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, σημειώνεται η θέση του μετώπου του υγρού ανάπτυξης και η πλάκα ξηραίνεται στο φούρνο στους 100 C. Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται αρχικά με υπεριώδη ακτινοβολία (σημειώνονται οι κηλίδες) και εν συνεχεία με ψεκασμό με διάλυμα νινυδρίνης και θέρμανση στους 120 C. ΑΣΚΗΣΗ 2 ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΝΑΛΓΗΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Όπως είναι γνωστό μια καθαρή ένωση μπορεί να ταυτοποιηθεί από τις φυσικές ιδιότητες της (σημείο τήξεως, σημείο ζέσεως, πυκνότητα, κ.ά.) και την αναγνώριση των δραστικών ομάδων της με διάφορες φασματοσκοπικές μεθόδους (IR, UV, NMR, MS). Η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, όπως έχει ήδη αναφερθεί, είναι μια γρήγορη μέθοδος η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της πολυπλοκότητας ενός μίγματος και την ταυτοποίηση των συστατικών του, συγκρίνοντας τα R f αυτών με τα R f ήδη γνωστών ενώσεων. Στη συγκεκριμένη

29 άσκηση γίνεται ταυτοποίηση ενώσεων τα οποία αποτελούν δραστικά συστατικά αναλγητικών φαρμάκων. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Δοκιμαστικοί σωλήνες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ποτήρια ζέσεως Φούρνος Λάμπα UV Υλικά και αντιδραστήρια Δραστικά συστατικά φαρμάκων Οξικός αιθυλεστέρας Βουτανόλη-1 Οξικό οξύ Στερεό Ι 2 Πλάκες TLC (Kieselgel GF 254 ) Πειραματική διαδικασία Σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ, Δ, Ε, ΣΤ και Χ. Το δείγμα Α περιέχει διάλυμα σαλικυλαμιδίου, το δείγμα Β διάλυμα καφεΐνης, το δείγμα Γ διάλυμα 2-(4-ισοβουτυλο-φαινυλο)προπιονικού οξέος (ibuprofen), το δείγμα Δ διάλυμα 2-[(2,3-διμεθυλοφαινυλο)αμινο]βενζοϊκού οξέος (μεφαιναμικό οξύ, mefenamic acid), το δείγμα Ε διάλυμα Ν-(4-υδροξυφαινυλο)ακεταμιδίου (παρακεταμόλη, acetaminophen), το δείγμα ΣΤ διάλυμα ακετυλοσαλικυλικού οξέος (acetylsalicylic acid) και το διάλυμα Χ μίγμα δύο ή περισσοτέρων εκ των παραπάνω ενώσεων. CN 2 3 C N C 3 N 3 C C 3 C2 N N C 3 C C C 3 Σαλικυλαμίδιο Καφεΐνη 2-(4-ισοβουτυλοφαινυλο) προπιονικό οξύ Τα διαλύματα των δραστικών συστατικών των φαρμάκων λαμβάνονται με λειοτρίβηση του δισκίου, τοποθέτηση της σκόνης σε δοκιμαστικό σωλήνα, προσθήκη μίγματος διχλωρομεθανίου-αιθανόλης (1:1, v/v), θέρμανση σε υδρόλουτρο για 5 λεπτά, φυγοκέντριση και παραλαβή του υπερκείμeνου υγρού

30 N C 3 C N C 3 C 3 CC 3 C Ν-(4-υδροξυφαινυλο) ακεταμίδιο Μεφαιναμικό οξύ Ακετυλοσαλικυλικό οξύ Σε μια πλάκα 10x8 cm σημειώνονται με μολύβι η γραμμή εκκίνησης και τα σημεία τοποθέτησης των δειγμάτων και εν συνεχεία με τριχοειδή σωληνάκια γίνεται η τοποθέτηση των δειγμάτων (όπως έχει περιγραφθεί στο θεωρητικό μέρος). Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος γίνεται: 1) με σύστημα διαλυτών οξικού αιθυλεστέρα/οξικού οξέος (98:2, v/v) και 2) με σύστημα διαλυτών 1-βουτανόλης/οξικού οξέος/νερού (4:1:1, v/v). Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, σημειώνεται η θέση του μετώπου του υγρού ανάπτυξης και η πλάκα ξηραίνεται στο φούρνο στους 100 C. Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται αρχικά με παρατήρηση σε θάλαμο υπεριώδους ακτινοβολίας όπου και σημειώνονται οι κηλίδες των δειγμάτων. Εν συνεχεία η πλάκα τοποθετείται σε δοχείο το οποίο περιέχει κρυστάλλους Ι 2. Το δοχείο αφού κλεισθεί θερμαίνεται ελαφρά σε ατμόλουτρο μέχρι την εμφάνιση των κηλίδων. ΑΣΚΗΣΗ 3α ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΟΞΕΙ ΩΣΗΣ ΤΗΣ ΒΟΡΝΕΟΛΗΣ ΠΡΟΣ ΚΑΜΦΟΡΑ Μια τυπική αντίδραση των δευτεροταγών αλκοολών αποτελεί η οξείδωσή τους προς κετόνες με την επίδραση διαφόρων οξειδωτικών αντιδραστηρίων, όπως Cr 3, Na 2 Cr 2 7 και KMn 4 κ.α. Παράδειγμα τέτοιας αντιδράσεως είναι και η οξείδωση της βορνεόλης προς καμφορά. Ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για την ολοκλήρωση της οξείδωσης μπορεί να καθοριστεί παρακολουθώντας την πορεία της αντιδράσεως με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας.

31 C C 3 3 C C 3 C 3 Cr 3 C 3. S 2 4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Δοκιμαστικοί σωλήνες Ογκομετρικοί κύλινδροι Ποτήρια ζέσεως Φούρνος Λάμπα UV Υλικά και αντιδραστήρια Βορνεόλη Καμφορά Cr 3 2 S 4 Στερεό Ι 2 Οξικός αιθυλεστέρας Πετρ. Αιθέρας Πλάκες TLC (Kieselgel GF 254 ) Πειραματική διαδικασία Αρχικά ετοιμάζονται τρία διαλύματα. Το πρώτο διάλυμα (Α) περιέχει 2% βορνεόλη σε αιθέρα, το δεύτερο (Β) περιέχει 10% Cr 3 και 5% 2 S 4 σε νερό και το τρίτο (Γ) 2% καμφορά σε αιθέρα. Σε δοκιμαστικό σωλήνα (Δ) αναμιγνύονται 1 ml από τα διαλύματα (Α), (Β) και (Γ). Σημειώνεται η ώρα ανάμιξης και το μίγμα αναδεύεται. Σε μία πλάκα TLC τοποθετούνται κηλίδες από τα διαλύματα (Α) και (Γ) και από την αιθερική στοιβάδα του μίγματος της αντιδράσεως (Δ). Η πλάκα τοποθετείται στο θάλαμο αναπτύξεως ο οποίος περιέχει ως υγρό ανάπτυξης το σύστημα πετρελαϊκός αιθέρας: οξικός αιθυλεστέρας 4:1 (v/v). Μετά από 10 min ετοιμάζεται μια νέα πλάκα TLC με κηλίδες από τα διαλύματα (Α), (Γ) και (Δ). Ακολουθεί η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται κάθε 10 min και για χρονικό διάστημα 40 min κατά τη διάρκεια του οποίου ο δοκιμαστικός σωλήνας της αντιδράσεως αναδεύεται περιοδικά. Οι πλάκες μετά την ανάπτυξή τους τοποθετούνται σε δοχείο το οποίο

32 περιέχει κρυστάλλους Ι 2. Το δοχείο αφού κλεισθεί θερμαίνεται ελαφρά σε ατμόλουτρο μέχρι την εμφάνιση των κηλίδων. Από την εμφάνιση των χρωματογραφημάτων διαπιστώνεται ότι η καμφορά κινείται περισσότερο από τη βορνεόλη. Επίσης συγκρίνοντας την ένταση των κηλίδων της βορνεόλης και της καμφοράς εξάγονται συμπεράσματα για την πορεία της αντιδράσεως και το χρόνο ολοκλήρωσής της. ΑΣΚΗΣΗ 3β ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΣΤΕΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΞΥΛΟΜΑ ΑΣ ΕΝΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΟΣ Η καρβοξυλομάδα του C-τελικού αμινοξέος, κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης, πρέπει να προστατεύεται κατάλληλα προς αποφυγή δημιουργίας παραπροϊόντων από την προσβολή του καρβονυλίου από διάφορα πυρηνόφιλα αντιδραστήρια συμπεριλαμβανομένων και των ελεύθερων αμινομάδων. Η καρβοξυπροστατευτική ομάδα, η οποία κάθε φορά επιλέγεται, πρέπει να χαρακτηρίζεται από υψηλή σταθερότητα καθ' όλη τη διάρκεια της σύνθεσης και από εκλεκτικότητα κατά την απομάκρυνσή της. Ο πιο απλός και συνηθισμένος τρόπος προστασίας του καρβονυλίου είναι η εστεροποίησή του. Οι κυριότεροι εστέρες οι οποίοι χρησιμοποιούνται για την προστασία της καρβοξυλομάδας είναι: α) μεθυλ- και αιθυλ-εστέρες, β) βενζυλεστέρες, γ) τριτοταγείς βουτυλεστέρες, δ) παρα-νιτρο-βενζυ-λεστέρες, κ.ά. Στην συγκεκριμένη άσκηση θα γίνει η παρασκευή του μεθυλεστέρα της αλανίνης. Ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για την ολοκλήρωση της εστεροποίησης μπορεί να καθοριστεί παρακολουθώντας την πορεία της αντιδράσεως με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Η σύνθεση του μεθυλεστέρα επιτυγχάνεται με την κλασική μέθοδο της όξινης καταλυόμενης εστεροποίησης, όπως για παράδειγμα μέσω διοχέτευσης αερίου υδροχλωρίου ή με τη χρήση SCl 2 σε αιώρημα του αμινοξέος σε μεθανόλη. 2 N CC C 3 Cl ή SCl 2 Me Cl 2 N CC C 3 C 3 Αλανίνη Υδροχλωρικός μεθυλεστέρας της αλανίνης

33 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Όργανα και σκεύη Υλικά και αντιδραστήρια Δοκιμαστικοί σωλήνες Αλανίνη Ογκομετρικοί κύλινδροι Θειονυλοχλωρίδιο Ποτήρια ζέσεως Μεθανόλη Φούρνος Ακετονιτρίλιο Λάμπα UV Διάλυμα νινυδρίνης Πλάκες TLC (Kieselgel GF 254 ) Πειραματική διαδικασία Σε δοκιμαστικό σωλήνα αναμιγνύονται 4 ml μεθανόλης, 0,4 ml θειονυλοχλωριδίου και 100 mg αλανίνης. Σημειώνεται η ώρα ανάμιξης και το μίγμα αναδεύεται παροδικά με υάλινη ράβδο. Μετά από 60 min σε μία πλάκα TLC τοποθετείται μια κηλίδα από το μίγμα της αντίδρασης και μια κηλίδα αναφοράς από διάλυμα αλανίνης. Η πλάκα τοποθετείται σε θάλαμο αναπτύξεως ο οποίος περιέχει ως υγρό ανάπτυξης το σύστημα ακετονιτριλίου: νερού 5:1 (v/v). Μετά την ανάπτυξή της ψεκάζεται με διάλυμα νινυδρίνης και θερμαίνεται στο φούρνο στους 100 C. Μετά την εμφάνιση των κηλίδων, εάν παρατηρηθεί ότι η εστεροποίηση δεν έχει ολοκληρωθεί, προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης και άλλη ποσότητα θειονυλοχλωριδίου (0,2 ml). Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται περιοδικά με TLC έως ότου ολοκληρωθεί. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. D.L. Paiva, G.M. Lampman and G.S. Kriz Introduction to rganic Laboratory Techniques, Second Edition Saunders college publishing, New York (1998) 2. L. M. arwood, C.J. Moody and J. M. Percy Experimental rganic Chemistry, Second Edition Blackwell Science Ltd, London (1999) 3. R.L. Pecsok, L.D. Shields, T. Cairns and I.G. McWilliam, Σύγχρονες Μέθοδοι στη Χημική Ανάλυση, (Απόδοση στα Ελληνικά Σταύρος Βολιώτης), Εκδόσεις Γ. Α. Πνευματικός, Αθήνα (1980) 4. Θ. Π. Χατζηιωάννου και Μ. Α. Κουπάρη, Ενόργανη Ανάλυση, Εκδόσεις Δ. Μαυρομμάτη, Αθήνα (1990) 5. Δ. Παπαϊωάννου, Γ. Σταυρόπουλος και Θ. Τσεγενίδης Σημειώσεις Πειραματικής Οργανικής Χημείας, Εκδόσεις Πανεπιστημίου Πατρών, Πάτρα (1996)

34 ΕΝΟΤΗΤΑ Β ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ Με το γενικό όρο πτητικά ή αιθέρια έλαια (aetherolea) χαρακτηρίζεται μια μεγάλη ομάδα φυσικών προϊόντων. Τα προϊόντα αυτά είναι πολυσύνθετα, αρωματικής οσμής, πτητικά μίγματα τα οποία περιέχουν πολλές διαφορετικές ενώσεις (κυρίως παράγωγα φαινυλοπροπανίου και τερπενίων). Πολλά από αυτά είναι γνωστά από την αρχαιότητα (π.χ. λιβάνι ή μύρο), ενώ σήμερα άνω των 200 αιθέριων ελαίων έχουν καταγραφεί σε διαφόρους εμπορικούς καταλόγους, μερικά εκ των οποίων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Τα περισσότερα από τα αιθέρια έλαια έχουν υψηλό δείκτη διαθλάσεως και συνήθως είναι οπτικώς ενεργά. Έχουν μικρή διαλυτότητα στο νερό αλλά διαλύονται εύκολα σε οργανικούς διαλύτες. Τα αιθέρια έλαια απαντώνται σε ειδικά ανεπτυγμένα όργανα των φυτών διαφόρων τύπων, π.χ. σε αδενώδεις τρίχες των φύλλων, μίσχων και ανθέων. Στον φυτικό ιστό είναι δυνατόν επίσης να υπάρχουν εκκριτικοί σωλήνες ή κοιλότητες ή ελαιοκύτταρα. Τα αιθέρια έλαια λαμβάνονται από τις δρόγες με τέσσερις κυρίως μεθόδους: 1. Απορρόφηση από καθαρό λίπος. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για τη λήψη αιθερίων ελαίων τα οποία περιέχονται σε ευαίσθητους ιστούς όπως είναι τα πέταλα των ανθέων. Κατά τη μέθοδο αυτή νωπά άνθη (ολόκληρα ή κατατμημένα) έρχονται σε επαφή με καθαρό λίπος το οποίο είναι επιστρωμένο πάνω σε πλάκες ως λεπτή στοιβάδα. Το αιθέριο έλαιον απορροφάται από το λίπος και εν συνεχεία εκχυλίζεται. Τα άνθη αντικαθίστανται από καιρόν εις καιρόν με νέα. Η μέθοδος είναι γνωστή ως εξανθοσμία (Εnfleurage).

35 Εκχύλιση με συγκεκριμένο διαλύτη. Στη μέθοδο αυτή η απομάκρυνση του διαλύτη πρέπει να διεξάγεται σε όσον το δυνατό χαμηλότερη θερμοκρασία ώστε να μην υπάρχει απώλεια πτητικών συστατικών του αιθερίου ελαίου. 3. Μηχανική εκπίεση εν ψυχρώ και εφαρμογή υψηλής πιέσεως. Το εκ πιέσεως λαμβανόμενο υγρό είναι γαλάκτωμα ελαίου σε νερό και το αιθέριο έλαιο παραλαμβάνεται με φυγοκέντρηση. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται κυρίως για την παραλαβή ελαίων των καρπών του γένους Citrus τα οποία είναι ιδιαιτέρως ευπαθή σε υδρόλυση και οξείδωση. 4. Απόσταξη μεθ υδρατμών. Κατά τη μέθοδο αυτή το φυτικό υλικό αναμιγνύεται με νερό, και μέσα από τη μάζα του διαβιβάζεται ατμός παραγόμενος από εξωτερική πηγή. Κατά την διέλευση του μέσα από το φυτικό υλικό, ο ατμός συμπαρασύρει το αιθέριο έλαιο. Με τη μέθοδο αυτή απομονώνονται πολλά πτητικά αιθέρια έλαια χωρίς τον κίνδυνο αποσυνθέσεως τους, αφού αποστάζουν σε θερμοκρασίες κάτω των 100 C (Σ.Ζ νερού). Τα πτητικά έλαια και τα φυτικά υλικά τα οποία περιέχουν τα έλαια αυτά, είναι φυσικά προϊόντα μεγάλης οικονομικής σημασίας. Χρησιμοποιούνται κυρίως στην αρωματοποιία, την κοσμετολογία και τη βιομηχανία τροφίμων (καρυκεύματα). Στην φαρμακευτική, τα πτητικά έλαια χρησιμοποιούνται για να προσδώσουν στα φάρμακα ευχάριστη οσμή ή γεύση. Μικρός αριθμός αιθέριων ελαίων ή καθαρές ενώσεις οι οποίες απομονώνονται από τα έλαια αυτά, χρησιμοποιούνται απευθείας ως φάρμακα. Πίνακας 1. Προέλευση και χρήσεις διαφόρων αιθέριων ελαίων Αιθέριο έλαιο Φυτό Δρόγη Κύριο δραστικό συστατικό Χρήσεις Καρυοφύλλων Eugenia caryophyllata Άνθη Ευγενόλη Οδοντιατρική Ανίσου Pimpinella anisum Καρπός Ανηθόλη Αποχρεμπτικό, βελτιωτικό γεύσεως Ευκαλύπτου Eucalyptus globulus Φύλλα Ευκαλυπτόλη Παθήσεις αναπνευστικού Κινναμώμου Cinnamomum ceylanicum Φλοιός Κινναμωμαλδεΰδη Καρύκευμα, βελτιωτικό Cinnamomum cassia γεύσεως Λεμονιού Citrus limonum Περικάρπιο Λεμονένιο Βελτιωτικό γεύσεως, αρωματοποιΐα Ροδέλαιο Rosa centifolia Άνθη Γερανιόλη, Αρωματοποιΐα Κιτρονελλόλη Μίνθης Mentha piperita Φύλλα Μινθόλη Βελτιωτικό γεύσεως Καμφοράς Cinnamomum camphora Ξύλο Καμφορά Ρευματικοί πόνοι

36 Eugenia caryophyllata α) βλαστός με άνθη β) άνθη και τομές αυτών ΑΣΚΗΣΗ 1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΥΓΕΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΚΑΡΥΟΦΥΛΛΑ Το αιθέριο έλαιο των γαρυφάλλων (Caryophylli aetheroleum) παραλαμβάνεται από τα γαρύφαλλα ή καρυόφυλλα (αποξηραμένα άνθη του φυτού Eugenia caryophyllata) με απόσταξη μεθ υδρατμών. Το έλαιο είναι άχρωμο ή ελαφρά κιτρινωπό (στον αέρα γίνεται καστανό), αρτυματώδους οσμής και γεύσης καυστικής. Το κύριο συστατικό του είναι η ευγενόλη (84-95%). Παρόντα είναι επίσης σεσκιτερπένια (α- και β- καρυοφυλλένιο) ακετυλο-ευγενόλη και μικρές ποσότητες εστέρων, κετονών και αλκοολών. Με επίδραση αλκαλίων η ευγενόλη, η οποία είναι μια φαινόλη, μετατρέπεται σε υδατοδιαλυτό άλας. Ο σχηματισμός υδατοδιαλυτού άλατος διευκολύνει τον διαχωρισμό της από τα άλλα ελαιώδη συστατικά καθώς και από τη μικρή ποσότητα της ακετυλο-ευγενόλης τα οποία υπάρχουν στο γαρυφαλέλαιο.