Πανεπιστήμιο Πατρών Πληροφορική Επιστημών Ζωής Σπύρος Βερναρδής 1270 Βιολόγος

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Πληροφορική Επιστημών Ζωής Σπύρος Βερναρδής 1270 Βιολόγος Χρήση μικροσυστοιχιών DNA για την ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ γενετικά τροποποιημένων εμβρυικών ινοβλαστών ποντικού. Πάτρα 2008

2 Πανεπιστήμιο Πατρών Πληροφορική Επιστημών Ζωής Σπύρος Βερναρδής 1270 Βιολόγος Χρήση μικροσυστοιχιών DNA για την ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ γενετικά τροποποιημένων εμβρυικών ινοβλαστών ποντικού. Πάτρα

3 Περίληψη Η σύγκριση του μεταγραφικού προφίλ με χρήση μικροσυστοιχιών DNA είναι μια τεχνική που βελτιστοποιήθηκε την τελευταία δεκαετία. Η διαδικασία μπορεί να διαχωριστεί σε δύο μέρη: το πειραματικό και το υπολογιστικό. Το πρώτο μέρος αφορά στα βήματα της επιλογής της μικροσυστοιχίας, της απομόνωσης του βιολογικού υλικού, της σήμανσης και της επέκτασης, της υβριδοποίησης και της σάρωσης. Το υπολογιστικό μέρος αφορά στην ποσοτικοποίηση της εικόνας, στην κανονικοποίηση των δεδομένων και στην ανάλυσή τους. Πριν από τα παραπάνω βήματα πρέπει να έχει διατυπωθεί το κατάλληλο βιολογικό ερώτημα. Το βιολογικό ερώτημα που τέθηκε αφορούσε στις διαφορές στη γονιδιακή έκφραση των γενετικά τροποποιημένων εμβρυικών ινοβλαστών του ποντικού οι οποίοι έφεραν έλλειψη του ενός αλληλομόρφου της πρωτεΐνης Geminin σε σύγκριση με ομόζυγους εμβρυικούς ινοβλάστες. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε μικροσυστοιχία δοκιμής με 384 ανιχνευτές γονιδίων ποντικού σε διπλά αντίγραφα. Απομονώθηκε ολικό RNA από τα κύτταρα, σημάνθηκε με απ ευθείας σήμανση και οι cdna στόχοι που προέκυψαν, υβριδοποιήθηκαν στη μικροσυστοιχία. Έπειτα από δοκιμές καθορίστηκαν οι κατάλληλες συνθήκες για ένα ολοκληρωμένο πείραμα σύγκρισης μεταγραφικού προφίλ. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε προκαταρκτική ανάλυση του πειράματος η οποία περιελάμβανε ποσοτικοποίηση της εικόνας που προέκυψε, κανονικοποίηση των δεδομένων και πολυπαραμετρική ανάλυσή τους. Abstract Transcriptional profiling using DNA microarrays was optimized during the last decade. The process can be separated in two parts: the experimental part and the computational part. The first part includes the steps of microarray choice, isolation of the biological material, labeling and amplification, hybridization and scanning. The computational part includes image quantification, data normalization and data analysis. Before the above steps, an appropriate biological question should be formulated. We wished to study differences in the gene expression profile of genetically modified mouse embryonic fibroblasts bearing a knock out allele of the Geminin gene (homozygote +/ Gem), in comparison to wild type embryonic fibroblasts. For this reason, a trial microarray was chosen with 384 gene probes in duplicates. Total RNA was isolated from the cells, directly labeled and the cdna targets synthesized were hybridized to the microarray. After a series of trials, optimal conditions for a complete transcriptional profiling experiment were determined. Initial analysis including quantification of the image, data normalization and further multifunctional analysis was then carried out. 3

4 Περιεχόμενα Α Εισαγωγή... 6 Α.1 Τι είναι οι μικροσυστοιχίες... 7 Α.2 Ιστορικά στοιχεία... 9 Α.3 Πειραματική διαδικασία... 9 Α.3.1 Διατύπωση βιολογικού ερωτήματος Α.3.2 Κατασκευή μικροσυστοιχίας Α Επιλογή τύπου μικροσυστοιχίας και ανιχνευτών που θα ακινητοποιηθούν i) Affymetrix GeneChip ii) Μικροσυστοιχίες εκτύπωσης α) Μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων β) cdnas παράγωγα PCR Α.3.3 Παρασκευή δείγματος Α Απομόνωση βιολογικού υλικού Α Σήμανση επέκταση i) Αντίστροφη μεταγραφή ii) Χρήση RNA πολυμεράσης iii) Διαδικασία Eberwine iv) Επέκταση σήματος με τυραμίδιο A.3.4 Υβριδοποίηση A.3.5 Σάρωση A.3.6 Ανάλυση δεδομένων A Ποσοτικοποίηση A Εξαγωγή αναλογιών A Κανονικοποίηση i) Κανονικοποίηση ολικής έντασης (total intensity normalization) ii) Lowess (locally weighted linear regression) κανονικοποίηση iii) Τυπική απόκλιση (Standard deviation) iv) Φιλτράρισμα αντιγράφων (replicates) A Πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση i) Ομαδοποίηση (Clustering) α) Αποστάσεις β) Ιεραρχική ομαδοποίηση γ) Ομαδοποίηση k means δ) SOMs self organizing maps ii) Οπτικοποίηση (visualization) α) PCA (principal component analysis) β) SAM Significance Analysis of Microarrays γ) Support Vector Machine (SVM) Β Σκοπός Γ Υλικά & Μέθοδοι Γ.1 Υλικά Γ.2 Μέθοδοι Γ.2.1 RNA i) Απομόνωση RNA ii) Συμπύκνωση RNA

5 Γ.2.2 cdna i) Ετοιμασία σημασμένου cdna ii) Υδρόλυση RNA iii)καθαρισμός σημασμένου cdna iv) Αποδιάταξη (denaturation) σημασμένου cdna Γ.2.3 Ετοιμασία πλακιδίων i) Απομάκρυνση περίσσειας ανιχνευτών ii) Μπλοκάρισμα Γ.2.4 Υβριδοποίηση i) Τοποθέτηση πλακιδίων ii) HybArray12 HybEditor iii) Εισαγωγή στόχου iv) Πλυσίματα v) Στέγνωμα Γ.2.5 Σάρωση i) Πριν τη σάρωση ii) Εύκολη σάρωση iii) Σάρωση με χρήση πρωτοκόλλου iv) Δημιουργία πρωτοκόλλου Γ.2.6 Ποσοτικοποίηση i) Χρήση Spotfinder α) Εισαγωγή εικόνων β) Εισαγωγή πλέγματος γ) Ανάλυση Γ.2.7 Κανονικοποίηση και ανάλυση δεδομένων i) Χρήση MIDAS α) Δημιουργία πλάνου β) Εισαγωγή δεδομένων ii) Χρήση MeV α) Εισαγωγή δεδομένων β) Επεξεργασία δεδομένων Δ Αποτελέσματα Δ.1 Βιολογικό ερώτημα Δ.2 Επιλογή μικροσυστοιχίας Δ.3 Επιλογή εμβρυικών ινοβλαστών ως υλικό απομόνωσης Δ.4 Απομόνωση RNA Δ.5 Ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχος RNA Δ.6 Σήμανση και επέκταση Δ.7 Υβριδοποίηση και Σάρωση Δ.8 Εικόνες Δ.9 Ποσοτικοποίηση Δ.10 Κανονικοποίηση Δ.11 Ανάλυση δεδομένων Ε Συζήτηση ΣΤ Βιβλιογραφία Ζ Παράρτημα

6 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

7 Α.1 Τι είναι οι μικροσυστοιχίες Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών αναπτύχθηκε την τελευταία δεκαετία και οδήγησε, από τις μελέτες μεμονωμένων βιολογικών λειτουργιών λίγων συσχετιζόμενων γονιδίων, πρωτεϊνών ή κυτταρικών μονοπατιών σε πιο σφαιρικές προσεγγίσεις της κυτταρικής δραστηριότητας. Η ανάπτυξη της νέας αυτής τεχνολογίας έδωσε νέες, ενδιαφέρουσες πληροφορίες και αύξησε εκθετικά τα διαθέσιμα δεδομένα για την κατανόηση των βιολογικών συστημάτων. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών, όπως και οι άλλες μέθοδοι υψηλής ανάλυσης, κρίνονται πλέον απαραίτητες για την κατανόηση των βιολογικών διεργασιών που λαμβάνουν χώρα στα βιολογικά συστήματα και συμπληρώνουν τις κοινές μεθόδους (Schena, 2003). Από την αρχική της εφαρμογή σαν καινούρια τεχνική για μεγάλης κλίμακας χαρτογράφηση του DNA και αλληλούχιση και την αρχική επιτυχία σαν εργαλείο ανάλυσης του μεταγράφου, η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών εξαπλώθηκε σε πολλές περιοχές προσαρμόζοντας τη βασική επινόηση και συνδυάζοντάς τη με άλλες τεχνικές. Οι DNA μικροσυστοιχίες είναι μια διάταξη μεγάλου αριθμού ανιχνευτών DNA που αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένους γενετικούς τόπους. Οι ανιχνευτές ακινητοποιούνται με ομοιοπολικούς δεσμούς σε μία στερεή επιφάνεια (συνήθως γυάλινη). Με άλλα λόγια, έχουν ακινητοποιηθεί σε γυάλινο πλακάκι, διαστάσεων μικρότερων της ανθρώπινης παλάμης, με τεχνικές της σύγχρονης νανοτεχνολογίας, ανιχνευτές γονιδίων σε συγκεκριμένα σημεία και αυτή η δομή αποτελεί μια μικροσυστοιχία. Στη θέση των ανιχνευτών γονιδίων μπορούν να μπουν ανιχνευτές πρωτεϊνών, τμήματα ιστών, ανιχνευτές μεταβολιτών κ.ά. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιεί μικροσυστοιχίες και επιτρέπει την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, της ποικιλότητας, της αλληλουχίας του DNA, των επιπέδων και τροποποιήσεων των πρωτεϊνών κ.ά. με μαζική και παράλληλη επεξεργασία. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών είναι μια εμπνευσμένη τεχνολογία με ευρείες εφαρμογές σε τομείς όπως η ανάλυση γονιδιώματος, η πρωτεομική, η διάγνωση. Στις μέρες μας, δίνουν τη δυνατότητα ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώματος ενός οργανισμού σε ένα μόνο πείραμα. Στην παρούσα εργασία εστιάζουμε στη χρήση μικροσυστοιχιών για την εξαγωγή συμπερασμάτων που αφορούν στο μεταγραφικό προφίλ, δηλαδή στο πρότυπο έκφρασης γονιδίων σε κύτταρα ή ιστούς. Σε αυτού του τύπου την ανάλυση, πολλά ή όλα τα γονίδια ενός οργανισμού αντιπροσωπεύονται από νουκλεοτιδικές αλληλουχίες (ανιχνευτές) ανά σημείο σε μεγάλη πυκνότητα στο γυάλινο πλακάκι της μικροσυστοιχίας. mrna το οποίο έχει απομονωθεί από κύτταρα ή ιστούς, μετατρέπεται σε DNA και σημαίνεται με φθορίζουσα ουσία. Το σημασμένο δείγμα του DNA, το οποίο έχει προκύψει από το mrna, υβριδοποιείται στο πλακάκι και σαρώνεται με σαρωτή, για να μετρηθεί η ένταση του σήματος κάθε σημείου. Η τιμή της έντασης σήματος θεωρείται ότι είναι αντιπροσωπευτική της ποσότητας του μεταγράφου κάθε γονιδίου στο δείγμα. Στη συνέχεια, τα δεδομένα ανάλυσης εξάγουν συμπεράσματα για το ποια γονίδια εμφανίζουν διαφοροποιήσεις στην ένταση. Αυτή είναι, συνοπτικά, η διαδικασία που ακολουθείται σε ένα πείραμα ανάλυσης του μεταγραφικού προφίλ με μικροσυστοιχίες (Stekel, 2003). 7

8 Εικ. Α.1 Ένα ολοκληρωμένο πείραμα ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες. Απομονώνεται βιολογικό υλικό (mrna) από δύο τύπους κυττάρων, σημαίνεται με διαφορετικές χρωστικές και υβριδοποιείται στο πλακίδιο. Τέλος, σαρώνεται και εξάγεται εικόνα προς επεξεργασία. Μπορεί κανείς να εξάγει χρήσιμες πληροφορίες για τη βιολογική λειτουργία ενός οργανισμού, βρίσκοντας ποια γονίδια επάγονται ή καταστέλλονται σε κάποια φάση του κυτταρικού κύκλου, σε κάποια αναπτυξιακή στιγμή ή σε απόκριση σε ερεθίσματα του περιβάλλοντος, όπως η απόκριση σε ορμόνες ή σε υψηλή θερμοκρασία, για παράδειγμα. Ομάδες γονιδίων των οποίων η έκφραση αυξάνεται ή μειώνεται υπό τις ίδιες συνθήκες, είναι πιθανό να έχουν συσχετιζόμενη βιολογική λειτουργία και, ίσως, κοινή σχέση ρύθμισης Brown & Botstein, 1999). Θα μπορούσαν, παραδείγματος χάριν, να έχουν παρόμοιες αλληλουχίες υποκινητών για ίδιους μεταγραφικούς παράγοντες. Επιπρόσθετα, αν μπορούσε κανείς να αποκομίσει ένα πρότυπο έκφρασης για συγκεκριμένες συνθήκες, θα είχε ένα χρήσιμο εργαλείο στη διάθεσή του, ώστε να είναι σε θέση να χαρακτηρίσει παρόμοιες άγνωστες καταστάσεις. Η γονιδιακή έκφραση είναι άμεσα συσχετιζόμενη με τις βιολογικές λειτουργίες και οι μικροσυστοιχίες υπόσχονται τεράστιο μέγεθος δεδομένων πάνω σε ανθρώπινες ασθένειες, γήρανση, φαρμακευτική δράση, ορμονική δράση, διανοητικές ασθένειες, μεταβολισμό και σε αρκετά ακόμα κλινικά θέματα. Ανοίγουν ένα νέο δρόμο σε μεθόδους διάγνωσης καθώς με την εξέλιξή τους γίνονται όλο και πιο διαθέσιμα σε χρήση σε εργαστήρια και χώρους διάγνωσης (Schena, 1996). 8

9 Α.2 Ιστορικά στοιχεία Τον Οκτώβριο του 1995 γεννήθηκε η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών, όπως την αντιλαμβανόμαστε στις μέρες μας, με τη δημοσίευση ενός άρθρου από τους Schena, M., Shalon, D., Davis R.W. και Brown P.O. το οποίο δημοσιεύτηκε στο Genome Issue του Science. Προπομποί της τεχνολογίας ήταν οι μακροσυστοιχίες σε μεμβράνες που χρησιμοποιούνταν σαν πλατφόρμες. Οι μικροσυστοιχίες ενθουσιάζουν αλλά και προβληματίζουν την επιστημονική κοινότητα την τελευταία δεκαετία. Ακόμα δεν έχουν φτάσει τα όρια των δυνατοτήτων τους και συνεχίζουν να διεισδύουν σε όλο και περισσότερους τομείς της βιολογίας και της ιατρικής (Nuber, 2005). Στην προσπάθεια ανάλυσης του γονιδιώματος πολλών οργανισμών, γεννήθηκε η ανάγκη της λειτουργικής μελέτης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα. Ένα βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση ήταν η αναγνώριση των γονιδιακών προτύπων έκφρασης υπό φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Εντελώς τυχαία, στο Genome Issue του Science το 1995 υπήρχαν δύο άρθρα για ανάλυση προφίλ έκφρασης σε μεγάλη κλίμακα: το άρθρο για τις μικροσυστοιχίες από Schena et al. και το άρθρο για SAGE από Velculescu et al. Φαίνεται ότι οι μικροσυστοιχίες κερδίζουν τον αγώνα. Από το 1995 η εταιρεία Affymetrix εισάγει το δικό της GeneChip με την ιδιαίτερη τεχνολογία και απαγορεύει τη χρήση παρόμοιας τεχνολογίας από άλλους, κατόπιν κατοχύρωσης πατέντας. Έτσι αναπτύσσονται δύο παρόμοιες αλλά και διαφορετικές τεχνολογίες κατασκευής μικροσυστοιχιών. Α.3 Πειραματική διαδικασία Η πειραματική διαδικασία αφορά στα στάδια που πρέπει να ακολουθηθούν κατά τη διεξαγωγή ενός πειράματος μικροσυστοιχιών και φαίνεται στο παρακάτω σχήμα (εικ. Α.2). Εστιάζουμε περισσότερο σε πειράματα ανάλυσης γονιδιακού προφίλ. Ένα πείραμα με μικροσυστοιχίες είναι μια πολύπλοκη ακολουθία διεργασιών που πρέπει να αποπερατωθούν με επιτυχία για να εξασφαλιστεί η αποδεκτή ποιότητα των δεδομένων που θα προκύψουν και των αποτελεσμάτων που θα εξαχθούν. Είναι λογικό να υποθέσει κανείς πως, αφού τα βήματα που ακολουθούνται είναι πολλά και πολύπλοκα, είναι αυξημένες οι πιθανότητες το πείραμα να αποτύχει. Και έτσι είναι. Πρέπει να είμαστε επιφυλακτικοί απέναντι σε δεδομένα μικροσυστοιχιών. Όσο, όμως, τα χρόνια περνούν και οι τεχνικές βελτιώνονται, τόσο πιο εύκολο γίνεται να ολοκληρωθούν σωστά τα πειράματα και τα συμπεράσματα να είναι ασφαλέστερα. Δεν είναι λίγοι αυτοί που αποκαλούν τα πειράματα μικροσυστοιχιών, σύγχρονες αναλύσεις Northern. Σε μια Northern ανάλυση, μόρια mrna απομονώνονται από δύο είδη κυττάρων και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους, σε πήκτωμα, κατόπιν ηλεκτροφόρησης. Στη συνέχεια, γίνεται ηλεκτρομεταφορά σε ειδική επιφάνεια νιτροκυτταρίνης ή νάιλον. Η επιφάνεια εκτίθεται σε διάλυμα σημασμένων ανιχνευτών οι οποίοι ανιχνεύουν συγκεκριμένα μόρια mrna και φθορίζουν. Αν δούμε συνοπτικά τη διαδικασία ανάλυσης γονιδιακού προφίλ με μικροσυστοιχίες, θα λέγαμε ότι, αρχικά, διατυπώνεται ένα βιολογικό ερώτημα το οποίο ελπίζουμε ότι θα απαντηθεί με το τέλος του πειράματος. Στη συνέχεια, προχωράμε στην 9

10 κατασκευή της μικροσυστοιχίας, πράγμα που σημαίνει ότι επιλέγουμε ποιον τύπο μικροσυστοιχίας θα χρησιμοποιήσουμε για να απαντήσουμε στο βιολογικό ερώτημα. Ο τύπος της μικροσυστοιχίας επιλέγεται ως προς τον τρόπο προετοιμασίας του, αλλά και το ποια είναι η διάταξη και το είδος των ανιχνευτών που ακινητοποιούνται στην επιφάνεια. Οι ανιχνευτές είναι πολύ σημαντικοί, καθώς είναι τα μόρια τα οποία θα ανιχνεύσουν τα μόρια cdna του δείγματός. Παράλληλα, ετοιμάζεται το βιολογικό υλικό, δηλαδή απομονώνεται mrna από δύο τύπους κυττάρων, αν χρειαστεί επεκτείνεται και, τέλος, σημαίνεται με διαφορετικές αποχρώσεις για κάθε δείγμα, σε μικροσυστοιχίες εκτύπωσης. Αν χρησιμοποιείται GeneChip της Affymetrix (βλ. παρακάτω) χρειάζεται μόνο το ένα δείγμα κάθε φορά. Κατόπιν, ακολουθεί υβριδοποίηση των σημασμένων στόχων με τους ανιχνευτές της μικροσυστοιχίας. Το επόμενο βήμα είναι η σάρωση της επιφάνειας της μικροσυστοιχίας, απ όπου προκύπτει μια ψηφιακή εικόνα, που προέρχεται από τη διέγερση των ετικετών σήμανσης που βρίσκονται στους στόχους και φθορίζουν σε δεδομένα μήκη κύματος. Σε ένα πείραμα ανάλυσης γονιδιακού προφίλ, οι στόχοι από τα δύο διαφορετικά δείγματα βάφονται ξεχωριστά. Αυτό σημαίνει ότι η εικόνα που θα δώσουν είναι διαφορετική και ανιχνεύεται σε διαφορετικό μήκος κύματος. Αν, για παράδειγμα, το ένα δείγμα έχει σημανθεί με κόκκινο φθορίζον μόριο και το άλλο με πράσινο, δίνεται η δυνατότητα σύγκρισης της έντασης από την εικόνα που θα μας δώσει το κάθε σημείο μετά την υβριδοποίηση. Λόγω του γεγονότος ότι η υβριδοποίηση γίνεται ταυτόχρονα και για τα δύο δείγματα, υπάρχει σαφής ανταγωνισμός μεταξύ των στόχων για τους ανιχνευτές. Οι στόχοι που βρίσκονται σε περίσσεια από το κάθε δείγμα για κάθε γονίδιο, θα υπερισχύσουν έναντι των λιγότερων άλλων και θα καταλάβουν περισσότερους ανιχνευτές στο σημείο. Θα δούμε κόκκινο σημείο αν το συγκεκριμένο γονίδιο υπερεκφράζεται στα κύτταρα του πρώτου δείγματος, θα δούμε πράσινο σημείο αν ισχύει το αντίστοιχο για το δεύτερο δείγμα και, τέλος, θα δούμε κίτρινο σημείο αν η έκφραση είναι παρόμοια (Schena, 2003). Όταν, τέλος, έχουμε την εικόνα, προχωράμε σε ανάλυσή της, από την οποία προκύπτουν ποσοτικοποιημένα δεδομένα. Τα δεδομένα αυτά επεξεργάζονται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή με πληθώρα αλγορίθμων, ώστε να απαλειφθούν τα σφάλματα και να δώσουν συμπεράσματα τα οποία ο άνθρωπος δε θα μπορούσε να εξάγει, λόγω του μεγάλου όγκου. 10

11 Εικ. Α.2 Σχηματοποιημένη πειραματική διαδικασία ενός πειράματος μικροσυστοιχιών. Διατύπωση βιολογικού ερωτήματος Κατασκευή μικροσυστοιχίας Επιλογή τύπου μικροσυστοιχίας : Affymetrix Spotted Oligos cdna Επιλογή ανιχνευτών προς ακινητοποίηση Διάγραμμα 1 Τα βήματα της πειραματικής διαδικασίας ενός πειράματος μικροσυστοιχιών Παρασκευή δείγματος: Απομόνωση βιολογικού υλικού Επέκταση Σήμανση Υβριδοποίηση Σάρωση 11 Ανάλυση δεδομένων Ποσοτικοποίηση, Εξαγωγή αναλογιών Κανονικοποίηση Τυπική απόκλιση Ολικής έντασης LOWESS Φιλτράρισμα αντιγράφων Πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση Ομαδοποίηση Ιεραρχική SOMs k means Οπτικοποίηση PCA SVM SAM

12 Α.3.1 Διατύπωση βιολογικού ερωτήματος Το βιολογικό ερώτημα είναι ανάγκη να διατυπώνεται με ακρίβεια πριν προχωρήσει κανείς στη διαδικασία ενός πειράματος με μικροσυστοιχίες. Ένα ερώτημα θα μπορούσε να είναι: «Ποιες οι διαφορές της γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα στα κύτταρα του πρωτογενούς φλοιού και αυτών της ενδοδερμίδας της ρίζας του φυτού Zea mays;» Η διαδικασία της διατύπωσης ενός τέτοιου ερωτήματος εστιάζει την έρευνα σε συγκεκριμένο στόχο, βοηθάει στην επιλογή κριτηρίων ελέγχου και καθοδηγεί την ανάλυση των δεδομένων και τη μοντελοποίησή τους. Εξαιτίας της ποσότητας των δεδομένων που εξάγονται από την εκτέλεση ενός πειράματος μικροσυστοιχιών, δεν απαιτείται η διατύπωση μιας σαφούς υπόθεσης εξ αρχής. Είναι ασφαλέστερο να διατυπωθεί απλά ένα σαφές ερώτημα. Οι μικροσυστοιχίες δίνουν τη δυνατότητα επαρκούς αποκρυπτογράφησης της γονιδιακής έκφρασης. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών απαντά σε ερωτήματα γονιδιακού προφίλ με ταυτόχρονη ανάλυση πολλών γονιδίων, ακόμα και ολόκληρου του γονιδιώματος. Ακόμα, προχωρά ταχύτερα η προσπάθεια γονοτύπησης οργανισμών, η αποκρυπτογράφηση πολυμορφισμών. Δίνονται απαντήσεις σε ερωτήματα για το ρόλο των πολλαπλών αντιγράφων γονιδίων στο γονιδίωμα με στοχοποίηση ολόκληρου του γονιδιώματος σε τμήματα πάνω στο πλακίδιο. Πρέπει, λοιπόν, να απαντηθεί αν χρειάζεται να ακινητοποιηθεί ολόκληρο το γονιδίωμα, μέρος του γονιδιώματος ή λίγα συσχετιζόμενα γονίδια. Σημαντικό ρόλο στις αποφάσεις για την εξέλιξη του πειράματος, παίζει το βιολογικό υλικό που είναι διαθέσιμο. Αν το δείγμα που επιλέξουμε είναι mrna τότε θα πρέπει να έχουμε κατά νου ότι είναι πιο ασταθές από το DNA, ταυτόχρονα όμως, συλλέγεται με μεγαλύτερη ευκολία. Επίσης, πρέπει να γνωρίζει κανείς αν η ποσότητα του βιολογικού υλικού είναι μικρή ή μεγάλη. Αυτό θα οδηγήσει σε απόφαση για ενίσχυση ή όχι της σήμανσης. Αρκετοί επιστήμονες εστιάζουν σε ερωτήματα αναπτυξιακής φύσης. Εξετάζοντας τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ διαφορετικών ομάδων κυττάρων, γίνεται προσπάθεια να δημιουργηθεί βάση δεδομένων που να περιέχει πληροφορίες για τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κάθε κυτταρικό τύπο. Τέτοιες βάσεις δεδομένων προάγουν τη βαθύτερη κατανόηση των βασικών αναπτυξιακών διαδικασιών. Κρίσιμα βιολογικά ερωτήματα διατυπώνονται και στον τομέα των ασθενειών που προσβάλλουν τον άνθρωπο. Ελέγχονται διάφοροι παράγοντες (γονιδιακοί, διατροφής, περιβάλλοντος κ.τ.λ.) και παρατηρούνται οι διαφοροποιήσεις στις αποκρίσεις συγκεκριμένων κυττάρων σε αυτούς. Περίπου 80% των πειραμάτων με μικροσυστοιχίες στις μέρες μας, αφορούν στον καρκίνο. Στον τομέα ανακάλυψης φαρμάκων διατυπώνονται ερωτήματα για την απόκριση ασθενούντων κυττάρων ή ιστών σε συγκεκριμένες φαρμακευτικές ουσίες. Ένα απλό ερώτημα θα αφορούσε στη διαφοροποίηση της γονιδιακής έκφρασης πριν και μετά τη χορήγηση ενός φαρμάκου. Η προσπάθεια που γίνεται στον τομέα της ιατρικής είναι η ανακάλυψη συγκεκριμένων προτύπων γονιδιακής έκφρασης, για παράδειγμα, τα οποία να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαγνωστικούς σκοπούς στο μέλλον (Schena, 2003). 12

13 Α.3.2 Κατασκευή μικροσυστοιχίας Οι σημερινές τεχνικές κατασκευής μικροσυστοιχιών βρίσκονται στην αιχμή της νανοτεχνολογίας. Προέρχονται από ένα επιτυχημένο «πάντρεμα» της μηχανικής και της βιολογίας. Χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνολογίες, που κάθε μία στοχεύει να κατασκευαστούν μικροσυστοιχίες υψηλής ποιότητας και οικονομικές ταυτόχρονα. Η εξόρυξη δεδομένων (data mining) απαιτεί πολύ χρόνο και πρέπει να είμαστε σίγουροι ότι τα δεδομένα που θα προκύψουν προς ανάλυση είναι αξιόπιστα. Στην κατασκευή των μικροσυστοιχιών μπαίνουν πολλά κριτήρια όπως η τιμή κατασκευής, το περιεχόμενο, η πυκνότητα, το μέγεθος των χαρακτηριστικών (ανιχνευτών και σημείων), η καθαρότητα των χαρακτηριστικών, η αντιδραστικότητα των ανιχνευτών, η ευκολία εφαρμογής. Η τιμή είναι ένας ανασταλτικός παράγοντας εφαρμογής των πειραμάτων μικροσυστοιχιών και απορρέει από την τιμή κατασκευής. Κατά την πορεία της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών και με την πρόοδο της τεχνολογίας, η τιμή συνεχώς μειώνεται. Έτσι αυτός ο σκόπελος δείχνει να ξεπερνιέται. Το περιεχόμενο αφορά στους ανιχνευτές. Είναι σημαντικό να γνωρίζει κανείς πόσοι ανιχνευτές περιέχονται στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας, ποιοι είναι αυτοί, καθώς και ποια είναι η δομή τους. Ακόμα, όταν υπάρχουν πολλαπλά αντίγραφα κάθε σημείου, προτιμάται να βρίσκονται σε γειτονικές θέσεις, ώστε να μπορεί κανείς να ελέγχει αν η μικροσυστοιχία δεν παρουσιάζει κατασκευαστικά προβλήματα, που θα υποδηλώνονταν με διαφορές στην ένταση σήματος μεταξύ αυτών των σημείων (Schena, 2003). Η πυκνότητα αναφέρεται στον αριθμό των σημείων στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. Υπολογίζεται απλά, γνωρίζοντας την απόσταση μεταξύ των κέντρων δύο σημείων και τον αριθμό των σημείων. Η πυκνότητα δίνεται πολλές φορές, σε μονάδα των χιλίων, δηλαδή ένα πλακάκι με σημεία αναφέρεται σαν πλακάκι 25Κ. Είναι ένα σημαντικό κριτήριο γιατί καθορίζει την ποσότητα των δεδομένων που θα εξαχθεί από το πλακάκι ανά περιοχή. Ανάλογα με την τεχνολογία κατασκευής μπορούν στις μέρες μας να προκύψουν πλακάκια με σημεία. Το μέγεθος των χαρακτηριστικών αναφέρεται στο μέγεθος των σημείων της μικροσυστοιχίας και εκφράζεται, συνήθως, σαν μέση διάμετρος σημείου. Ανάλογα με την τεχνολογία που χρησιμοποιείται για την κατασκευή της μικροσυστοιχίας, η διάμετρος ποικίλει από τα μm στα μm. Είναι ένα σημαντικό κριτήριο γιατί καθορίζει την πυκνότητα, για την οποία μιλήσαμε πιο πάνω. Επειδή μικρή διάμετρος σημαίνει και μεγαλύτερη πυκνότητα, άρα και μεγαλύτερος όγκος δεδομένων ανά μονάδα επιφάνειας, οι τεχνολογίες που αποδίδουν μικρότερη πυκνότητα έχουν και μεγαλύτερη αξία. Το μέγεθος των ανιχνευτών είναι μια παράμετρος που θα συζητήσουμε σε άλλο σημείο. Η καθαρότητα των χαρακτηριστικών αφορά στην ομοιογένεια των ανιχνευτών σε κάθε σημείο. Αποκλίσεις από το 100% οφείλονται, για spotted μικροσυστοιχίες, σε υπολείμματα του παραγόμενου από την PCR υλικού (π.χ. εναπομείναντες εκκινητές) και σε προβλήματα κατά την κατασκευή. Πολλές φορές το αναποτελεσματικό πλύσιμο της εκτυπωτικής συσκευής (spotter) αφήνει κατάλοιπα τα οποία επηρεάζουν την καθαρότητα. Εδώ βρίσκεται και ένα από τα σημαντικά πλεονεκτήματα των in situ παραγόμενων μικροσυστοιχιών οι οποίες εγγυώνται υψηλή καθαρότητα. Η αντιδραστικότητα αφορά στην ικανότητα αντίδρασης των ανιχνευτών στο σύνολό τους. Μια ιδανική μικροσυστοιχία έχει 100% αντιδραστικότητα, δηλαδή όλοι οι ανιχνευτές 13

14 είναι σε θέση να αντιδράσουν με τους στόχους. Η πραγματικότητα λέει πως τα επίπεδα αντιδραστικότητας που επιτυγχάνονται συνήθως, είναι της τάξης του 50 60%. Ο παράγοντας αυτός καθορίζεται από το στάδιο της κατασκευής της μικροσυστοιχίας αλλά και από τη διαδικασία του πειράματος, όπου είναι πολύ πιθανό να προκληθεί μερική καταστροφή στους ανιχνευτές λόγω ανεπιθύμητης θερμοκρασίας ή άλλων χημικών προβλημάτων. Τέλος, το κριτήριο που αναφέραμε σαν ευκολία εφαρμογής, αφορά στην ευκολία χρήσης μιας μικροσυστοιχίας στο εργαστήριο. Δηλαδή στο αν μια μικροσυστοιχία απαιτεί ειδική μεταχείριση ή αν είναι συμβατή με αρκετά μηχανήματα και μπορεί να δώσει ικανοποιητικά αποτελέσματα κάτω από πληθώρα συνθηκών. Οι μικροσυστοιχίες που κατασκευάζονται για ευρεία χρήση πρέπει να εξασφαλίζουν ευκολία εφαρμογής και να πληρούν τις απαιτήσεις της νέας τεχνολογίας. Α Επιλογή τύπου μικροσυστοιχίας και ανιχνευτών που θα ακινητοποιηθούν Όταν αποφασίζει κανείς να προχωρήσει στη διεξαγωγή ενός πειράματος, πρέπει, εκ των προτέρων, να έχει αποφασίσει τι τύπο μικροσυστοιχίας θα χρησιμοποιήσει. Αυτή η απόφαση εξαρτάται, σε μεγάλο βαθμό, από τα μηχανήματα που διαθέτει, καθώς πάντα είναι απαραίτητο να ελέγχεται η συμβατότητα των συσκευών με την εκάστοτε μικροσυστοιχία που θα επιλεχθεί. Ο τύπος της μικροσυστοιχίας ελέγχεται ως προς τον τρόπο κατασκευής του και διακρίνεται σε μικροσυστοιχίες που κατασκευάστηκαν με in situ σύνθεση ανιχνευτών και σε μικροσυστοιχίες στις οποίες οι ανιχνευτές εκτυπώθηκαν στην επιφάνεια μετά την παρασκευή τους. Η δεύτερη κατηγορία χωρίζεται, επίσης, σε δύο κατηγορίες σχετικές με το μήκος των ανιχνευτών. Έτσι μιλάμε για μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων και για μικροσυστοιχίες cdna και αναλύονται παρακάτω. Η επιλογή της μικροσυστοιχίας κατευθύνεται, επίσης, άμεσα από το βιολογικό ερώτημα που έχει τεθεί. Έτσι, αν κάποιος θέλει να ελέγξει την έκφραση ολόκληρου γονιδιώματος, για παράδειγμα, στις μέρες μας έχει πολλές επιλογές, καθώς έχει ταυτοποιηθεί το γονιδίωμα πολλών οργανισμών και οι βάσεις δεδομένων γίνονται όλο και πιο εμπιστεύσιμες και πλούσιες σε υλικό. Οι εταιρείες παρέχουν, επίσης, μεγάλη γκάμα μικροσυστοιχιών προς πώληση, απ όπου μπορεί κανείς να επιλέξει αυτό που τον ενδιαφέρει. i) Affymetrix GeneChip Οι GeneChip ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες κατασκευάζονται με in situ σύνθεση μικρών ολιγονουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε γυάλινο πλακάκι με χρήση κατευθυνόμενου φωτός. Η συγκεκριμένη τεχνική επιτρέπει την ακριβή κατασκευή ενός τακτοποιημένου, σε μεγάλο βαθμό, πίνακα DNA ολιγομερών στην επιφάνεια του πλακιδίου (Schena, 2003). Στη μικροσυστοιχία της Affymetrix, κάθε γονίδιο ή νουκλεοτιδική αλληλουχία προς εξέταση αντιπροσωπεύεται από 11 έως 20 μοναδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, μήκους 25 νουκλεοτιδίων. Η ομάδα των ανιχνευτών που αφορά σε συγκεκριμένο γονίδιο ή ομάδα παρόμοιων γονιδίων, είναι γνωστή σαν σετ ανιχνευτών (probe set) και, γενικά, 14

15 καλύπτει μια περιοχή 600 νουκλεοτιδίων του γονιδίου, γνωστή σαν αλληλουχία στόχος (target sequence). Πολλά αντίγραφα κάθε ολιγομερούς βρίσκονται σε διακριτές περιοχές ή κελιά της μικροσυστοιχίας. Επιπρόσθετα, για κάθε ολιγομερές στη μικροσυστοιχία υπάρχει και ένα πανομοιότυπο σε άλλο κελί και διαφέρει μόνο στη 13 η βάση, δηλαδή τη μεσαία. Τα δύο διαφορετικά ολιγομερή καλούνται τέλεια ταιριασμένο (PM perfect matched) και κακοταιριασμένο (ΜΜ mismatched) αντίστοιχα. Οι κακοταιριασμένοι ανιχνευτές προσφέρουν έλεγχο για μη ειδική υβριδοποίηση (Stekel, 2003). Οι ανιχνευτές της μικροσυστοιχίας ετοιμάζονται πάνω στη μικροσυστοιχία με μια φωτο κατευθυνόμενη διαδικασία, η οποία συνδυάζει τη στερεή φάση χημικής σύνθεσης με τεχνικές φωτολιθογραφίας. Χρησιμοποιώντας ειδικές μάσκες ώστε να προσδιορίζονται οι περιοχές έκθεσης στο πλακάκι και με βήματα χημικής σύνθεσης, προκύπτουν υψηλής πυκνότητας συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές συντίθενται σε βηματισμό μίας βάσης τη φορά. Η μάσκα που τοποθετείται κάθε φορά πάνω από το πλακάκι προκύπτει από προγραμματισμό σε υπολογιστή. Η μάσκα επιτρέπει σε συγκεκριμένα σημεία το υπεριώδες φως να περάσει. Τη δεδομένη στιγμή το πλακάκι εκτίθεται, και, πιο σωστά, η 5 περιοχή του ανιχνευτή, σε μία μόνο από τις τέσσερις βάσεις (νουκλεοσιδικός φωσφοραμιδίτης) και η χημική σύνθεση είναι επιτρεπτή μόνο στα σημεία που η δίοδος στο φως είναι ανοικτή. Αυτό συμβαίνει γιατί κάθε πρώτη βάση, που έχει τοποθετηθεί στο πλακάκι με την 3 περιοχή της, στην 5 περιοχή έχει μια χημική ομάδα γνωστή σα MeNPOC (μεθυλονιτροπιπερονυλοκαρβονύλιο). Η χημική ομάδα αυτή είναι σταθερή, εκτός και αν εκτεθεί σε υπεριώδες φως. Την επόμενη στιγμή η μάσκα αλλάζει μορφή και η ίδια ή κάποια άλλη βάση θα προστεθεί σε κάποιους άλλους από τους ανιχνευτές. Η ομάδα MeNOPC υπάρχει σε κάθε προστιθέμενη βάση. Η παραπάνω διαδικασία επιτρέπει την ταυτόχρονη παρασκευή χιλιάδων ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών ταυτόχρονα και εγγυάται την ομοιότητα μεταξύ των παραγόμενων μικροσυστοιχιών, δηλαδή και την πιστότητα των αποτελεσμάτων. 15

16 Εικ. Α.3 Τεχνολογία Affymetrix GeneChip. 1) Επιλογή ολιγονουκλεοτιδίου PM και MM. 2) Προετοιμασία δείγματος και υβριδοποίηση. 3) Σάρωση και εξαγωγή εικόνας. 4) Δεδομένα που προκύπτουν προς επεξεργασία. Το βασικό πλεονέκτημα της παραπάνω τεχνικής για την κατασκευή της μικροσυστοιχίας είναι η ακρίβεια κατασκευής του ανιχνευτή σε συνάρτηση με την ταχύτητα. Από την άλλη, το βασικό μειονέκτημα είναι το μικρό μήκος των ανιχνευτών και η αυξημένη τιμή κατασκευής. Η διαδικασία του πειράματος περιλαμβάνει την απομόνωση του RNA, και πιο ειδικά του mrna, από κύτταρα ή ιστό, το οποίο ελέγχεται ποιοτικά από συγκεκριμένα εργαστήρια, αν η ανάλυση γίνεται από την ίδια την Affymetrix. Στη συνέχεια, παράγεται cdna με αντίστροφη μεταγραφή, το οποίο με in vitro μεταγραφή δίνει μεγάλες ποσότητες mrna σημασμένο με βιοτίνη, μετά από επέκταση. Το συγκεκριμένο βιοτινιλιωμένο mrna ονομάζεται arna ή crna και αποτελεί τους στόχους για τους ανιχνευτές. 16

17 Πριν την υβριδοποίηση, το crna κομματιάζεται με τη βοήθεια θερμότητας και Mg 2+. Οι στόχοι πλέον, αποτελούνται από κομμάτια βάσεων, πράγμα που διευκολύνει τη σωστή υβριδοποίηση. Το crna τοποθετείται στο κοκτέιλ υβριδοποίησης, το οποίο περιέχει άλατα για τη ρύθμιση του ph, και στη συνέχεια ενίεται στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. Η υβριδοποίηση διαρκεί 18 ώρες, περίπου, στους 45 ο C. Μετά την υβριδοποίηση, το πλακάκι εκτίθεται σε φθορίζον μόριο το οποίο αντιδρά με τη βιοτίνη (στρεπταβιδίνη ή φυκοερυθρίνη). Ακολουθούν πλύσεις και σάρωση με σαρωτή ώστε να πάρουμε την εικόνα προς ανάλυση. ii) Μικροσυστοιχίες εκτύπωσης Όταν οι ανιχνευτές δε συντίθενται απευθείας πάνω στο πλακάκι, αλλά εκτυπώνονται στην επιφάνεια μετά την ετοιμασία τους, τότε κάνουμε λόγο για μικροσυστοιχίες εκτύπωσης (spotted). Η ανάπτυξη της νανοτεχνολογίας είναι που έδωσε τη δυνατότητα να τυπώνουμε σε επίπεδο μορίου, χιλιάδες μόρια σε εξαιρετικά περιορισμένο χώρο (Schena, 2003). Οι τεχνολογίες εκτύπωση διακρίνονται σε δύο κύριες κατηγορίες: της εκτύπωσης επαφής (contact printing) και της εκτύπωσης χωρίς επαφή (non contact printing). Οι μέθοδοι της κατασκευής μικροσυστοιχιών γνωστές σαν εκτύπωση επαφής, συμπεριλαμβάνουν κάθε τεχνολογία που εμπλέκει απευθείας επαφή του εκτυπωτικού οργάνου ή του δείγματος που εμπεριέχεται στο εκτυπωτικό όργανο με την επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. Οι συσκευές εκτύπωσης επαφής συμπεριλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια οργάνων μεταφοράς, όπως μικροτοποθετικές ακίδες (microspotting pins), τσιμπίδες και ακίδες σχισμών, τριχοειδή και άλλες παρόμοιες συσκευές. Κατά τη διάρκεια της εκτύπωσης επαφής, το δείγμα βρίσκεται στο εσωτερικό της ακίδας και συγκρατείται από δυνάμεις συνάφειας και από επιφανειακή τάση. Φαίνεται σα σταγόνα έτοιμη να πέσει από ένα καλαμάκι. Οι δυνάμεις συνάφειας είναι αυτές που ασκούνται στο δείγμα από το υλικό της ακίδας (συνήθως ανοξείδωτο ατσάλι) και η επιφανειακή τάση αφορά σε δυνάμεις που ασκούνται από το ίδιο το υγρό υλικό στα μόρια της επιφάνειας. Όταν η σταγόνα αγγίξει την επιφάνεια εκτύπωσης, η επιφάνεια ασκεί μια, αντίθετη στις προηγούμενες δυνάμεις, δύναμη, η οποία αν είναι μεγαλύτερη από τις άλλες, θα κάνει τη σταγόνα να μείνει στη επιφάνεια. Στην τεχνολογία κατασκευής μικροσυστοιχιών, οι τεχνικές εκτύπωσης επαφής είναι αυτές που χρησιμοποιούνται περισσότερο. Όταν γίνεται λόγος για εκτύπωση χωρίς επαφή, εννοείται η τεχνολογία που επιτρέπει εκτύπωση των ανιχνευτών χωρίς άμεση επαφή του εκτυπωτικού οργάνου στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας, δηλαδή μιλάμε για συσκευές εκτόξευσης «μελάνης» με χρήση πιεζοηλεκτρικών κρυστάλλων και μικροσωληνοειδών. Είναι η πιο γρήγορη τεχνική εκτύπωσης και γενικότερα κατασκευής μικροσυστοιχιών, αλλά παραμένει δύσκολη και απαιτητική σε κόστος ώστε χρησιμοποιείται λίγο. Πριν, όμως, αποφασίσει κανείς πως θα τυπώσει στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας τους ανιχνευτές, απαιτείται επεξεργασία του δείγματος των ανιχνευτών σε κατάλληλο διάλυμα προστασίας. Τα διαλύματα εκτύπωσης διαφόρων τύπων που χρησιμοποιούνται έχουν σα σκοπό να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα εκτύπωση, να μειώσουν τη διασπορά του δείγματος, να εξασφαλίσουν ομοιόμορφη μεταφορά, να σταθεροποιήσουν τα δείγματα των ανιχνευτών, να απενεργοποιήσουν τους ανιχνευτές, να 17

18 μειώσουν την ξήρανση του υλικού και να αυξήσουν την ορατότητα των σημείων που εκτυπώνονται. Ακόμα, πρέπει να έχουμε κατά νου, ότι η επιφάνεια εκτύπωσης της μικροσυστοιχίας έχει υποστεί ειδική χημική επεξεργασία, ώστε οι ανιχνευτές να τοποθετηθούν με τον κατάλληλο προσανατολισμό στη μικροσυστοιχία. Η ανάλυση με μικροσυστοιχίες απαιτεί επιφάνεια υψηλής ποιότητας. Η ετοιμασία της μικροσυστοιχίας είναι μια απαιτητική διαδικασία. Η επιφάνεια παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση των μορίων, στην απόδοση των αντιδράσεων, στην ακρίβεια κατά την ανίχνευση και στην ποιότητα των δεδομένων που προκύπτουν. Κατά πολλούς ένα πείραμα μικροσυστοιχιών είναι καλό όσο καλή είναι η επιφάνεια στην οποία λαμβάνει χώρα. Όσο προχωράει η τεχνολογία, η ποιότητα των επιφανειών των μικροσυστοιχιών εξελίσσεται και βελτιώνεται. Μια επιφάνεια πρέπει να είναι σωστών διαστάσεων, λεία, επίπεδη, μεγάλης αντοχής, αποτελεσματική και προσβάσιμη. Το πιο κοινό υλικό που χρησιμοποιείται για τις μικροσυστοιχίες είναι το γυαλί. Το κυρίαρχο συστατικό του γυαλιού είναι το διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ). Συχνά προστίθενται στο υλικό οξείδια μετάλλων για να αυξήσουν το σημείο τήξης του γυαλιού και να προσδώσουν άλλα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Επίσης το γυαλί επικαλύπτεται με αμινικές και αλδεϋδικές ομάδες που επιτρέπουν πιο σταθερές προσκολλήσεις των ολιγονουκλεοτιδίων και των cdnas. Ο δεσμός προσκόλλησης στην επιφάνεια μπορεί να είναι ομοιοπολικός ή μη ομοιοπολικός. Για την ομοιοπολική πρόσδεση προστίθεται αλειφατική αμινομάδα (NH 2 ) στο DNA στόχο και αυτό στη συνέχεια, προσκολλάται στην επιφάνεια, αλληλεπιδρώντας με προσδέτες του γυαλιού. Για cdna στόχους, η αμινομάδα προστίθεται στο 5 άκρο της αλυσίδας του εκκινητή PCR από τον οποίο παράγεται ο ανιχνευτής. Έτσι η προσκόλληση γίνεται πάντα με το 5 άκρο. Ο μη ομοιοπολικός τρόπος πρόσδεσης αφορά μόνο σε cdna στόχους και δεν έχει ευρεία χρήση (Schena, 2003). Οι μικροσυστοιχίες εκτύπωσης, διακρίνονται, ανάλογα με το είδος των ανιχνευτών σε ολιγονουκλεοτιδικές και cdna μικροσυστοιχίες. α) Μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων Ταυτόχρονα με την μεγάλη ανάπτυξη των γονιδιωματικών βάσεων δεδομένων και την αυξανόμενη διαθεσιμότητα των σχετικά φθηνών ολιγονουκλεοτιδίων, υπάρχει μια τάση προς τη χρήση επιμηκών ολιγονουκλεοτιδίων (50 70 nt) σαν ανιχνευτές για εφαρμογές γονιδιακής έκφρασης (Schena, 2003). Τα συγκεκριμένα ολιγονουκλεοτίδια παρέχουν κάποια σημαντικά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τους cdna ανιχνευτές, όπως το γεγονός ότι τα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να συντεθούν απευθείας από βιβλιοθήκες αλληλουχιών και όχι μέσω PCR, κάνοντάς ευκολότερο το να συνθέσει κανείς τους ανιχνευτές. Αντίθετα με τα cdnas, η αλληλουχία των ολιγονουκλεοτιδίων μπορεί να ταυτοποιηθεί με χρήση φασματομετρίας μάζας, πράγμα που για τα cdnas απαιτεί πολύ χρόνο και υψηλό κόστος. Επίσης, τα επιμήκη ολιγονουκλεοτίδια παραμένουν μονόκλωνα και όχι δίκλωνα, πράγμα που δεν απαιτεί την επεξεργασία πριν από την υβριδοποίηση, ούτε επανέρχονται σε αναδιπλούμενη δίκλωνη κατάσταση κατά τη διάρκεια του πειράματος, όπως τα cdnas. Τα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να παραχθούν σε πολύ μεγάλες ποσότητες, γεγονός το οποίο μειώνει το κόστος κατασκευής της μικροσυστοιχίας. Ακόμα, η διασταυρούμενη υβριδοποίηση μειώνεται σημαντικά από τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών, 18

19 πράγμα που οφείλεται στο ότι είναι πιο εύκολο να σχεδιάσει κανείς έναν ανιχνευτή με βάση μοναδικές περιοχές συγκεκριμένου γονιδίου. Η τελευταία δυνατότητα, επίσης, δε μπορεί να προκύψει σε cdna ανιχνευτές. Τα επιμήκη ολιγονουκλεοτίδια διατηρούν και κάποια πλεονεκτήματα έναντι των κοντών ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών (π.χ. 25 nt της Affymetrix). Λόγω της μεγαλύτερης θερμοκρασίας τήξης των επιμηκών ολιγονουκλεοτιδίων σε σύγκριση με τα κοντά, επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται μεγαλύτερες θερμοκρασίες κατά την υβριδοποίηση (60 65 ο C), πράγμα που δίνει αποτελεσματικότερη αποδιάταξη της δευτεροταγούς δομής των ανιχνευτών και, κατ επέκταση επιτυχέστερη υβριδοποίηση. Τα επιμήκη ολιγονουκλεοτίδια, επίσης, αυξάνουν τις πιθανότητες πιο παραγωγικής αλληλεπίδρασης με τους στόχους, πράγμα που αυξάνει το ποσοστό της υβριδοποίησης και τις τελικές εντάσεις σήματος. Η τάση για χρήση επιμηκών ολιγονουκλεοτιδίων για εφαρμογές γονιδιακής έκφρασης γέννησε την ανάγκη για τη διαμόρφωση κατευθύνσεων σχεδίασης, που παρέχουν κριτήρια επιλογής των καταλληλότερων ανιχνευτών για κάθε συγκεκριμένη κωδική αλληλουχία. Οι ανιχνευτές πρέπει να έχουν μήκος nt και να συμπεριλαμβάνουν αλληλουχίες που ενδιαφέρουν (π.χ. ανθρώπινες), αλλά και αλληλουχίες από ετερόλογο οργανισμό (π.χ. Arabidopsis), για να εξασφαλιστεί θετικός και αρνητικός έλεγχος υβριδοποίησης. Επειδή οι περισσότερες διαδικασίες απομόνωσης και σήμανσης αφορούν σε αλληλουχίες που ανταποκρίνονται στο 3 άκρο των μεταγράφων, οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές πρέπει να σχεδιάζονται για το 3 άκρο κάθε cdna ώστε να λάβουμε τη μέγιστη δυνατή υβριδοποίηση. Εκτός από τις περιπτώσεις όπου το mrna στόχος προέρχεται από επέκταση, τα ολιγονουκλεοτίδια πρέπει να σχεδιάζονται χρησιμοποιώντας αλληλουχίες της κωδικής αλυσίδας του mrna. Για να επιτύχει κανείς κοινή θερμοκρασία τήξης για πολλούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, ο σχεδιασμός πρέπει να απορρίψει επαναλαμβανόμενα κομμάτια (π.χ. CG περιοχές), καθώς και μονονουκλεοτιδικές επαναλήψεις (π.χ. polya). Κάθε ανιχνευτής που προκύπτει πρέπει να ελέγχεται και να συγκρίνεται με κάποια μεγάλη και έγκυρη βάση δεδομένων (π.χ. GenBank), με χρήση μηχανών αλληλούχισης και ευθυγράμμισης, όπως το εργαλείο BLAST. Αυτό θα εξασφαλίσει τη μοναδικότητα της αλληλουχίας του ανιχνευτή αλλά και την εγκυρότητά του. Η υπόθεση της κωδικής και μη κωδικής κατεύθυνσης έχει εγείρει την προσοχή των κατασκευαστών ολιγονουκλεοτιδικών μικροσυστοιχιών, αφού η επιλογή λανθασμένης αλληλουχίας μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφικά λάθη στο σχεδιασμό της συστοιχίας. Οι ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες που περιέχουν κωδικές αλληλουχίες υβριδοποιούνται με μοριακούς στόχους που προέρχονται από μη κωδικές αλληλουχίες, όπως μονόκλωνο cdna που προκύπτει από oligodt εκκινητές στο mrna. Πιθανή σύγχυση γύρω από κωδικές και μη κωδικές αλληλουχίες προκύπτει από δύο πηγές. Η πρώτη είναι η αβεβαιότητα για τις βάσεις δεδομένων και η δεύτερη είναι η διαθεσιμότητα πάρα πολλών πρωτοκόλλων σήμανσης, μερικές από τις οποίες χρησιμοποιούν κωδικές αλληλουχίες στόχους και άλλες μη κωδικές. Οι ερευνητές εκμεταλλεύονται, πλέον, τη διαθεσιμότητα υπολογιστικών εργαλείων που κάνουν αυτόματη επιλογή ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών βάσει επιθυμητών παραμέτρων που εισάγονται από το χρήστη. Ένα τέτοιο εργαλείο είναι το Array Designer 4 από την Premier Biosoft International. Επιτρέπει στο χρήστη να καθορίσει παραμέτρους όπως η θερμοκρασία τήξης, το μήκος, το περιεχόμενο CG και τη θέση εντός της κωδικής 19

20 αλληλουχίας. Έτσι, ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών γίνεται γρήγορος, ακριβής και μοιάζει με παιγνίδι. β) cdnas παράγωγα PCR Τα πρώτα πειράματα ανάλυσης μικροσυστοιχιών χρησιμοποίησαν ανιχνευτές που προέρχονταν από PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Η διαδικασία της PCR παρέχει ποσότητες μικρογραμμαρίων ανιχνευτικού υλικού για κάθε τμήμα DNA που μας ενδιαφέρει και από κάθε οργανισμό, όπως βακτήρια, μύκητες, φυτά και ζώα. Τα παράγωγα της PCR για μικροσυστοιχίες προκύπτουν με χρήση κοινών εκκινητών ή ειδικών γονιδίου εκκινητών και τυπώνονται πάνω στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας. Οι ανιχνευτές που προκύπτουν από κοινούς εκκινητές επεκτείνονται χρησιμοποιώντας αλληλουχίες στόχους για τους εκκινητές, οι οποίες μπορούν κατά βούληση να περικλείουν κάθε αλληλουχία που θα επιλέξει κανείς. Με ένα απλό διάλυμα PCR, που περιέχει ένα μόνο ζευγάρι κοινών εκκινητών, είναι πιθανό να πάρει κανείς πολλές χιλιάδες διαφορετικούς ανιχνευτές για χρήση σε μικροσυστοιχία. Η συγκεκριμένη προσέγγιση είναι πολύ χρήσιμη στην έρευνα, γιατί επιτρέπει στους επιστήμονες να επεκτείνουν cdnas ή ESTs από οποιαδήποτε διαθέσιμη βάση δεδομένων, και έτσι, να φτιάξουν μικροσυστοιχίες για κάθε ιστό ή οργανισμό. Οι κοινοί εκκινητές επιτρέπουν σε κάθε διαφορετική αλληλουχία να επεκταθεί με την ίδια επιτυχία, αφού οι εκκινητές έχουν επιλεχθεί να προσδένονται στις συγκεκριμένες αλληλουχίες στόχους, οι οποίες είναι κοινές για κάθε κλώνο. Ένα μικρό μειονέκτημα των κοινών εκκινητών είναι το ότι ο ανιχνευτής που θα προκύψει, θα περιέχει ένα μικρό τμήμα DNA που αντιστοιχεί στην αλληλουχία στόχο. Προσεκτική επιλογή των εκκινητών δίνει τη δυνατότητα αυτός ο παράγοντας να έχει πολύ μικρή σημασία για τον ανιχνευτή που προκύπτει (Schena, 2003). Οι ειδικοί γονιδίου εκκινητές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή μοναδικών ανιχνευτών που προέρχονται από ολικό DNA ή για να επεκτείνουν ανιχνευτές που δεν περιέχουν αλληλουχίες στόχους. Ένα πλεονέκτημα των συγκεκριμένων εκκινητών είναι ότι το υλικό που προκύπτει δεν περιέχει καθόλου τμήματα αντίστοιχα αλληλουχιών στόχων, πράγμα που οφείλεται στη χρήση μοναδικού ζευγαριού εκκινητών για κάθε ξεχωριστό γονίδιο. Μειονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι κάθε ανιχνευτής απαιτεί δύο εκκινητές, και, για παράδειγμα, απαιτούνται εκκινητές για 6000 αλληλουχίες. Αυτό ανεβάζει το κόστος κατακόρυφα. Η χρήση παραγώγων PCR για μελέτες βασισμένες στην υβριδοποίηση έχει έναν αριθμό πλεονεκτημάτων σε σύγκριση με τους ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, και ένα βασικό πλεονέκτημα είναι ότι δε χρειάζονται πληροφορίες για την αλληλουχία του γονιδίου πριν την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Ένας ερευνητής μπορεί, απλά, να επεκτείνει cdnas από μια βιβλιοθήκη με PCR, να τυπώσει στη μικροσυστοιχία τους cdna ανιχνευτές, να υβριδοποιήσει το δείγμα, να αναγνωρίσει τα γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά και να αλληλουχίσει, αν θέλει στη συνέχεια, τα γονίδια για τα οποία δε γνωρίζει την αλληλουχία. Η συγκεκριμένη διαδικασία είναι εξαιρετικά πολλά υποσχόμενη γιατί επιτρέπει άμεση εισαγωγή στη γενωμική ανάλυση οποιουδήποτε οργανισμού, ακόμα και οργανισμών των οποίων το γονιδίωμα δεν έχει ταυτοποιηθεί. Ένα άλλο πλεονέκτημα των συγκεκριμένων ανιχνευτών είναι ότι το μεγάλο τους μέγεθος ( nt) παρέχει μεγάλο βαθμό συμπληρωματικότητας για την υβριδοποίηση και παράγει, σχεδόν σε κάθε 20

21 πείραμα, μεγάλη ένταση σήματος. Ακόμα, η PCR είναι, πλέον, μια τετριμμένη τεχνική που εφαρμόζεται σε κάθε βιολογικό εργαστήριο και μπορεί να δίνει εύκολα υλικό ανιχνευτών σε σύγκριση με την παραγωγή ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών. Ένα μειονέκτημα των παραγώγων PCR είναι ότι οι δίκλωνοι ανιχνευτές που προκύπτουν χρειάζονται αποδιάταξη πριν την εκτύπωση στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας, πράγμα που προϋποθέτει επιπλέον χρόνο στο πείραμα. Η παρουσία και της κωδικής αλλά και της μη κωδικής αλυσίδας στον ανιχνευτή, σημαίνει ότι η υβριδοποίηση με το μονόκλωνο στόχο του δείγματος δε θα πραγματοποιηθεί, εκτός και αν αποδιατιάξουμε με βρασμό της μικροσυστοιχίας, συνήθως, τους δίκλωνους αυτούς ανιχνευτές. Η παρουσία συμπληρωματικών ανιχνευτών στο ίδιο σημείο της επιφάνειας της μικροσυστοιχίας σημαίνει, επίσης, ότι είναι πιθανό το να ξαναζευγαρώσουν οι αλυσίδες κατά τη διάρκεια της υβριδοποίησης, πράγμα που θα εμποδίσει την ανίχνευση του στόχου του δείγματος. Με αυτόν τον τρόπο χάνεται σημαντικό ποσοστό της έντασης σήματος. Ένα δεύτερο σημαντικό μειονέκτημα των παραγώγων PCR είναι ότι το σχετικά μεγάλο τους μήκος, ενώ παρέχει μεγάλη περιοχή για υβριδοποίηση και άρα μεγάλη πιθανότητα να συμβεί, έχει παράλληλα εξαιρετικά αυξημένη την πιθανότητα να συμβεί διασταυρούμενη υβριδοποίηση. Η τελευταία πιθανότητα αυξάνεται, ακόμα περισσότερο, όταν στους στόχους υπάρχουν προς μελέτη συγγενικά γονίδια που μοιράζονται υπολογίσιμη ομοιότητα αλληλουχιών. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι αδύνατο να εξαγάγει κανείς ασφαλή συμπεράσματα. Όπως συμπεραίνει κανείς από τα παραπάνω, σημαντικό σημείο της διαδικασίας παραγωγής ανιχνευτών είναι η επιλογή των κατάλληλων εκκινητών για τη διεξαγωγή της PCR. Παράμετροι όπως το μήκος, η θερμοκρασία τήξης, η αλληλουχία, η δευτεροταγής δομή, ελέγχονται με εργαλεία βιοπληροφορικής, όπως το Array Designer 4, που έχουμε αναφέρει ξανά παραπάνω. Α.3.3 Παρασκευή δείγματος Α Απομόνωση βιολογικού υλικού Σε ένα πείραμα ανάλυσης του γονιδιακού προφίλ έκφρασης, αλλά και σε οποιοδήποτε πείραμα μικροσυστοιχιών, κρίσιμο σημείο είναι η απομόνωση του βιολογικού υλικού που θα χρησιμοποιηθεί σα στόχος. Κατά την ανάλυση του γονιδιακού προφίλ έκφρασης προχωράει κανείς σε απομόνωση RNA από κύτταρα ή ιστούς. Αν δεν προχωρήσει σε σήμανση του mrna, το οποίο αντιπροσωπεύει τη γονιδιακή έκφραση, στο διάλυμα του ολικού RNA, μπορεί να απομονώσει το mrna και να προχωρήσει μεμονωμένα στη σήμανσή του. Ένα τυπικό κύτταρο θηλαστικού περιέχει περίπου 10 5 μg RNA, 80 85% από το οποίο είναι ριβοσωμικό RNA (28S, 18S, 5,8S και 5S). Το περισσότερο από το υπόλοιπο RNA περιέχει μια ποικιλία από trna και snrna. Τα παραπάνω RNA είναι συγκεκριμένου μεγέθους και αλληλουχίας και μπορούν να απομονωθούν επαρκώς με πολλές τεχνικές. Αντιθέτως, το mrna, το οποίο αποτελεί το 1 5% του συνολικού RNA του κυττάρου, είναι 21

22 ετερογενές στο μέγεθος και στην αλληλουχία. Όμως, το περισσότερο από το mrna ενός ευκαρυωτικού κυττάρου φέρει στο 3 άκρο μια ουρά από κατάλοιπα πολυαδενυλικού οξέος, η οποία είναι αρκετά μακριά σε μήκος ώστε να επιτρέπει την απομόνωση του mrna με χρωματογραφία συγγένειας σε oligo(dt) cellulose. Ένα βασικό πρόβλημα στο χειρισμό του RNA είναι η ύπαρξη RNασών στο χώρο, ένζυμα που βρίσκονται σε όλα τα κύτταρα και απελευθερώνονται κατά τη λύση τους. Τα ένζυμα αυτά σπάνε το δεσμό μεταξύ ριβόζης και φωσφοδιεστερικής ομάδας. Για το λόγο αυτό οι χειρισμοί του RNA είναι ιδιαίτερα λεπτοί. Α Σήμανση επέκταση Υπάρχουν δύο προσεγγίσεις στη διαδικασία της σήμανσης: η άμεση σήμανση και η έμμεση σήμανση. Κατά την πρώτη, τα φθορίζοντα μόρια προσδένονται στους στόχους απ ευθείας με ενζυμικό ή χημικό μέσο. Κατά τη δεύτερη, οι στόχοι χρειάζονται ένα ενδιάμεσο μόριο γέφυρα να προσδεθούν, το οποίο, με τη σειρά του, αλληλεπιδρά με τα φθορίζον μόριο. Και οι δύο προσεγγίσεις αποδίδουν στόχους υψηλής ποιότητας, αν και σε κάθε μια υπάρχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Παρακάτω αναλύονται σύγχρονοι τρόποι σήμανσης που ακολουθούν είτε άμεση είτε έμμεση προσέγγιση σήμανσης. i) Αντίστροφη μεταγραφή Είναι η πιο κλασσική μέθοδος άμεσης σήμανσης. Κατά τη διαδικασία, δείγματα mrna απομονώνονται με ολιγο dt και φθορίζοντα νουκλεοτίδια δημιουργούν cdna με χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης, ένζυμο που ξεκινά τη σύνθεση στα καλούπια mrna που έχουν ήδη επάνω τους μεταγραφικούς εκκινητές. Στη συνέχεια, αποβάλλονται και πέπτονται με υδροξείδιο του θείου, αποδίδοντας έτσι ένα μονόκλωνο μίγμα cdna, το οποίο καθαρίζεται για να αποβάλει νουκλεοτίδια που δεν έχουν ενσωματωθεί σε cdnas, άλατα, ένζυμα και άλλα ανεπιθύμητα στοιχεία. Οι φθορίζοντες στόχοι cdna που έχουν προκύψει, υβριδοποιούνται στη μικροσυστοιχία και, στη συνέχεια, είμαστε έτοιμοι να παρατηρήσουμε το πλακάκι, αφού προηγηθούν πολλά πλυσίματα, ώστε να απομακρυνθούν οι στόχοι που δεν μπόρεσαν να υβριδοποιηθούν (Schena, 2003). Από τότε που οι μικροσυστοιχίες μπήκαν στη ζωή μας, η μέθοδος της αντίστροφης μεταγραφής έχει τροποποιηθεί πάρα πολλές φορές και έχει δώσει εκατοντάδες πρωτόκολλα. Κάποια από αυτά χρησιμοποιούν ολικό RNA παρά mrna, πράγμα που μειώνει λίγο την απόδοση της σήμανσης, αλλά σώζει πολύ χρόνο γιατί το ολικό RNA απομονώνεται πολύ πιο εύκολα από το mrna. Κάποια άλλα χρησιμοποιούν εκκινητές των 9 νουκλεοτιδίων αντί για 20 ολιγο dt εκκινητές, για να επιτραπεί η σήμανση mrnas που δεν διαθέτουν poly A ουρά, όπως τα βακτηριακά. Ακόμα, έχουν χρησιμοποιηθεί πολλοί διαφορετικοί τύποι αντίστροφης μεταγραφάσης και φαίνεται ότι κάποιοι από αυτούς αποδίδουν καλύτερη σήμανση από άλλους, ίσως λόγω καλύτερης συγγένειας με τα φθορίζοντα νουκλεοτίδια. Ποικιλία εμφανίζεται και στο στάδιο του καθαρισμού με χρήση είτε καθίζησης με αιθανόλη είτε αποκλεισμό μεγέθους είτε καθαρισμό που βασίζεται σε μεμβράνη. Είναι σημαντικό στάδιο αυτό του καθαρισμού, γιατί τα διαλύματα των στόχων 22

23 που δεν περιέχουν μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια και άλλες προσμίξεις, δίνουν καλύτερα αποτελέσματα εικόνας που οφείλονται σε μείωση του θορύβου. Ένα σημαντικό βήμα της άμεσης σήμανσης με αντίστροφη μεταγραφή, ήταν η ανάπτυξη και εξέλιξη ενός πρωτοκόλλου που εισάγει τη χρήση αμινοαλλύλικών νουκλεοτιδικών αναλόγων, τα οποία επιτρέπουν την άμεση σήμανση των cdna μορίων μέσω αντίδρασης των αμινοαλλυλικών ομάδων με ενεργές χρωστικές. Οι αμινοαλλύλες είναι πρωταρχικές αμίνες που δρουν σαν νουκλεόφιλα και αλληλεπιδρούν με χρωστικές, όπως παράγωγα κυανινών και Alexa, τα οποία περιέχουν ενεργές ομάδες και ζευγαρώνουν τη χρωστική άμεσα στο παραγώμενο DNA μέσω της αμινοαλλυλικής λειτουργίας. Το βασικό πλεονέκτημα αυτής της διαδικασίας είναι ότι, λόγω του μικρού μεγέθους των αμινοαλλυλικών ομάδων, τα αμινοαλλυλικά νουκλεοτιδικά παράγωγα ενσωματώνονται ευκολότερα στο DNA από τις ογκώδεις φθορίζουσες βάσεις. Η πιο αποτελεσματική ενσωμάτωση επιτρέπει πιο ομοιόμορφη σήμανση και, σε πολλές περιπτώσεις, στόχους που φθορίζουν εντονότερα. Το βασικό πλεονέκτημα της άμεσης σήμανσης με αντίστροφη μεταγραφή είναι η απλότητα της μεθόδου. Μόρια στόχοι που σημαίνονται άμεσα εξαλείφουν την ανάγκη αντιδράσεων προ της υβριδοποίησης, πράγμα που μπορεί να είναι επίπονο και χρονοβόρο. Οι μέθοδοι αντίστροφης μεταγραφής είναι, ακόμα, πολύ ευπροσάρμοστες, επιτρέποντας τη χρήση πολλών διαφορετικών φθοριζουσών χρωστικών, όπως φλουροσείνη, Λισσαμίνη, κυανίνη, Alexa, BODIPY, αλλά και αμινοαλλυλικών παραγώγων. Όλες οι παραπάνω έχουν παρουσιάσει καλά αποτελέσματα σε πειράματα μικροσυστοιχιών. Το βασικό μειονέκτημα της άμεσης σήμανσης με αντίστροφη μεταγραφή είναι η μειωμένη ικανότητα απόδωσης σήματος σε σύγκριση με έμμεσες μεθόδους που παρέχουν τη δυνατότητα επέκτασης σήματος. ii) Χρήση RNA πολυμεράσης Είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιείται πολύ στην ετοιμασία στόχων για πειράματα μικροσυστοιχιών. Οι RNA πολυμεράσες που χρησιμοποιούνται είναι μια οικογένεια ενζύμων από φάγους που καταλύουν τη σύνθεση RNA από δίκλωνο DNA καλούπι που περιέχει ειδικούς υποκινητές φάγων. Η κατάλυση από Τ3 ή Τ7 RNA πολυμεράση είναι εξαιρετικά αποδοτική και παράγονται δεκάδες μικρογραμμαρίων RNA με λιγότερο από ένα μικρογραμμάριο αρχικής ποσότητας DNA. Οι χρήσεις στα πειράματα των μικροσυστοιχιών αφορούν σε: σύνθεση παρουσία rntps ώστε να παραχθούν μεγάλες ποσότητες RNA για μεταγενέστερες αντιδράσεις σήμανσης, επέκταση RNA με της μέθοδο Eberwine και σύνθεση παρουσία φθοριζόντων ή μη φθοριζόντων νουκλεοτιδικών αναλόγων για άμεση ή έμμεση σήμανση. Η ενσωμάτωση rntps που έχουν σημανθεί με βιοτίνη για χρήση σε μεταγενέστερη έμμεση διαδικασία σήμανσης φανερώνει την ενζυμολογία της RNA πολυμεράσης (Schena, 2003). Υπάρχει ένας αριθμός πλεονεκτημάτων στη χρήση RNA πολυμεράσης για παραγωγή μορίων στόχων. Το προϊόν είναι RNA και όχι DNA, κάνοντάς το πιο εύκολο να τμηματοποιήσει κανείς το RNA σε μικρά τμήματα για υβριδοποίηση σε ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες. Λόγω της υψηλής απόδοση της αντίδρασης της αντίστροφης μεταγραφής, προκύπτει μια επέκταση με εκατονταπλάσιο προϊόν του RNA σε σύγκριση με το DNA καλούπι, πράγμα που αυξάνει την πιθανότητα να παρατηρήσει κανείς σπάνια κομμάτια του 23